(57)【要約】  バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むバナナ植物が提供される。バナナの貯蔵寿命の延長方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むバナナ植物。
【請求項２】
バナナの貯蔵寿命の延長方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞を、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、前記エチレン生合成経路をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）前記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法。
【請求項３】
前記植物から果実を収穫する工程をさらに備える請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記植物が、前記ＤＮＡ編集剤をコードする導入遺伝子を欠く請求項１又は請求項２に記載の植物又は方法。
【請求項５】
前記変異がホモ接合型である請求項１から請求項４のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項６】
前記エチレン生合成経路における前記成分をコードする前記ゲノム配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理されたものである請求項１、請求項４又は請求項５に記載の植物又はその祖先。
【請求項７】
前記変異が、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）及び置換からなる群から選択される請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項８】
前記エチレン生合成経路における前記成分が、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）及びＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）からなる群から選択される請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の植物又は方法。
【請求項９】
植物プロモーターに動作可能に連結されているバナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ編集剤が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである請求項２から請求項８のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡ編集剤がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集システムのものである請求項２から請求項８のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１２】
前記エチレン生合成経路における前記成分が、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１３】
前記エチレン生合成経路における前記成分が、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１４】
前記エチレン生合成経路における前記成分が、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１５】
前記エチレン生合成経路における前記成分が、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）及びＭａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）からなる群から選択される請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１６】
前記ＤＮＡ編集剤が、前記エチレン生合成経路における前記成分をコードする複数の核酸配列を特異的に標的とする核酸座標に向けられている請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１７】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号４７〜配列番号５４からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号４７に示される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ編集剤が配列番号４７に示される核酸を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号４７〜配列番号５４に示される複数の核酸配列を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号４７、配列番号４９又は配列番号５０に示される複数の核酸配列を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ編集剤が、配列番号５１及び配列番号５３に示される複数の核酸配列を含む請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物、方法又は核酸構築物。
【請求項２３】
請求項１、請求項４から請求項８、請求項１０及び請求項１１のいずれか一項に記載の植物の植物部分。
【請求項２４】
果実である請求項２３に記載の植物部分。
【請求項２５】
乾燥している請求項２４に記載の果実。
【請求項２６】
バナナの製造方法であって、
（ａ）請求項１、請求項４から請求項８、請求項１０及び請求項１１のいずれか一項に記載の植物を成長させる工程と、
（ｂ）前記植物から果実を収穫する工程と
を備える方法。
【請求項２７】
バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムバナナＤＮＡを含む加工バナナ製品。
【請求項２８】
前記バナナ植物は非遺伝子組換えのものである請求項１から請求項８及び請求項１０から請求項２７のいずれか一項に記載の植物又は方法又は加工製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、バナナの貯蔵寿命を延長するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
栽培されるバナナ及びプランテンは、バショウ属に属する巨大な草本植物である。それらは不稔性かつ単為結実性であり、そのため、果実は種なしで発生する。栽培されている雑種及び種は、ほとんど三倍体であり（２ｎ＝３ｘ＝３３；いくつかは二倍体又は四倍体である）、ほとんどは、野生で見つけられた変異体から繁殖されてきた。
【０００３】
バナナは、世界の食用作物のトップ１０のうちの１つである。バナナは、栽培品種によって、生でも食べられるし、調理して食べられもする。バナナの約６０％はデザート果実として生で食され、他の４０％は蒸熱、煮込み、焙煎、及び揚げ等のプロセスによって調理される。１．２億トン超のバナナ果実が毎年生産され、３大産地であるインド、ウガンダ及び中国は、自国で生産するもののほとんどすべてを自国で消費している。
【０００４】
バナナはクリマクテリック型果実に属し、収穫後に、青いバナナは、果肉が柔らかくなり、甘味が増し、及び芳香物質が生成され、次いで、その食餌としての価値が高まりうるまで、内生エチレンの生成、デンプン及びプロトペクチン等の加水分解を含むその追熟プロセスを通してクリマクテリック型変化を受ける必要がある。
【０００５】
従来は、バナナは前もって収穫され、その輸送及び貯蔵の期間は追熟の進行により延長されていた。しかしながら、バナナ果実は、輸送過程の間のエチレンの生成に起因して追熟を受けることが多い可能性がある。さらには、果実は熟し過ぎて腐る可能性があり、このマーカーの価値を著しく低下させる。従って、エチレンの生合成の制御は、バナナの追熟を制御する方法を提供するために使用することができる。
【０００６】
エチレンは、気体として存在する植物ホルモンであり、植物におけるいくつかの生理的反応及び生化学反応に影響を及ぼすことができる。エチレンは、植物の成長、発生及びストレス応答に重要な役割を果たし、例えば、植物が洪水、機械的損傷、細菌感染、葉及び花の老化、果実追熟等に曝されたとき、植物はエチレンを生成する。エチレンの生合成経路は、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）シンターゼによるメチオニンのＡｄｏＭｅｔへの変換、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）シンターゼ（ＡＣＳ）によるＡｄｏＭｅｔからのＡＣＣの合成、次いでＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）によるＡＣＣのエチレンへの酸化を含む（図１を参照。Ｒｕｄｕｓら、２０１３、第３５巻、第２号、２９５−３０７頁から改変）。ＡＣＯはエチレンの生合成経路で使用される最後の酵素であるということが知られており、その結果として、ＡＣＯ遺伝子又はそのタンパク質発現に対する阻害は、エチレンの生合成を阻害／ノックダウンすることができ、さらには果実の後熟を遅延させるという目的を成し遂げることができる。
【０００７】
ほとんどの他の主要食用作物とは異なり、バナナは遺伝的に改良することが難しい。課題は、ほとんどすべてのバナナ栽培品種及び在来種は三倍体であり、高レベルの雄性不妊及び雌性不妊を伴うということである。いくつかの国際的な協定による育種プログラムがあり、これらのうちの多くは新しい栽培品種を開発している。しかしながら、バナナを戻し交配することは事実上不可能であり、従って新しい形質を現在の栽培品種に遺伝子移入する可能性は排除される。
【０００８】
従って、食物生産に対する世界的な需要を高めるという課題を満足させるために、農業生産性の向上（例えば収量の増大又は遺伝子操作による害虫耐性）に向けた典型的なアプローチは、変異育種、又は形質転換による作物種のゲノムへの新規な遺伝子の導入に頼ってきた。これらのプロセスは、本質的に非特異的であり、相対的に非効率的である。例えば、植物形質転換方法は、外来性ＤＮＡを送達するが、このＤＮＡはランダムな位置でゲノムに組み込まれる。従って、望ましい特質を持つ遺伝子導入植物系統を特定して単離するために、１つの構築物あたり数百ものユニークなランダム組み込みイベントを生成すること、及びその後の所望の個体についてのスクリーニングが必要である。結果として、従来の植物形質操作は、労力を要し、時間がかかり、そして予測できない仕事である。さらには、これらの組み込みのランダム性のため、意図されないゲノムの破壊に起因する多面的効果が起こったか否かを予測することが困難になる。
【０００９】
現在の形質転換プロセスのランダム性は、導入遺伝子イベント候補の特定及び選択のための数百ものイベントを必要とする（機能的ゲノム研究から特定された遺伝子候補よりも形質転換及びイベントスクリーニングが律速になる）。加えて、ゲノム内の組み込みの場所によっては、ゲノム位置の効果の結果として遺伝子発現カセットが異なるレベルで発現される可能性がある。結果として、操作された遺伝子又は形質を持つ植物系統の生成、単離及び特性解析は、極めて労力と費用とを要するが、成功の可能性が低いプロセスである。遺伝子導入イベントの選択に関連する障害に加えて、遺伝子の隔離及び商業的応用のために遺伝子導入植物を環境に放出することについて必要な厳格さの程度に関連するいくつかの主要な懸念が起こっている。
【００１０】
ゲノム編集技法の最近の進展により、生細胞においてＤＮＡ配列を変更することが可能になった。ゲノム編集は、従来の作物育種方法又は標準的な遺伝子操作（遺伝子導入又はＧＭ）方法よりも精密である。植物の細胞の中の数十億ものヌクレオチド（遺伝子の基本単位）のうちのわずかに数個だけを編集することにより、これらの新しい技法は、厳しい気候でよりよく成長し、虫害に抵抗し、又は栄養摂取を向上するための作物を手に入れる最も効果的な方法である可能性がある。この技法が精密であるほど、より少ない遺伝子材料が変更されるので、植物の挙動に対する他の効果についての不確実性は下がる。
【００１１】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９ゲノム編集技術を使用する植物遺伝子操作の最も確立された方法は、宿主のゲノムへの新しいＤＮＡの挿入を必要とする。この挿入物、トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、成功裏のＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９ゲノム編集を成し遂げるために、数個の転写単位を保有する。これらは共通に、遺伝子導入植物について選択するための抗生物質耐性遺伝子、Ｃａｓ９機構、及びいくつかのｓｇＲＮＡ単位からなる。ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込みのため、このようにして生成された植物は、遺伝子導入又は遺伝子組換え（ＧＭ）として分類される。ゲノム編集が宿主の中で樹立されると、このＴ−ＤＮＡ骨格は有性繁殖（実生繁殖）及び育種により取り除くことができる。というのも、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９機構は、もはや表現型を維持するために必要とされないからである。しかしながら、上述のように、バナナ種は単為結実性であり（生存可能な種を産生しない）、このため、有性生殖によるＴ−ＤＮＡ骨格の除去は不可能である。
【００１２】
さらなる背景技術としては以下が挙げられる。
米国特許出願公開第２０１３００９７７３２号明細書、
米国特許出願公開第２０１４００７５５９３号明細書、
Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＤＮＡ  ｏｒ  ＲＮＡ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６．７：１２６１７頁、
Ｗｏｏ，Ｊ．Ｗ．ら、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５．３３（１１）：１１６２−４頁、
Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６．７：１３２７４頁、
Ｌｕｏ，Ｓ．ら、Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ，２０１５．８（９）：１４２５−７頁、
Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ２０１７  ＰｌｏｓＯｎｅ  １２（２）：ｅ０１７２６３０、
Ｃｈｉａｎｇら、２０１６．ＳＰ１，２，３．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｐｒ  １５；６：２４３５６。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１３００９７７３２号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１４００７５５９３号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｒｕｄｕｓら、２０１３．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ．第３５巻、２９５−３０７頁
【非特許文献２】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ら、Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＤＮＡ  ｏｒ  ＲＮＡ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６．７：１２６１７頁
【非特許文献３】Ｗｏｏ，Ｊ．Ｗ．ら、ＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１５．３３（１１）：１１６２−４頁
【非特許文献４】Ｓｖｉｔａｓｈｅｖ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｉｚｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，２０１６．７：１３２７４頁
【非特許文献５】Ｌｕｏ，Ｓ．ら、Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ，２０１５．８（９）：１４２５−７頁
【非特許文献６】Ｈｏｆｆｍａｎｎ  ２０１７  ＰｌｏｓＯｎｅ  １２（２）：ｅ０１７２６３０
【非特許文献７】Ｃｈｉａｎｇら、２０１６．ＳＰ１，２，３．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１６  Ａｐｒ  １５；６：２４３５６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムを含むバナナ植物（バショウ）が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナの貯蔵寿命の延長方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞を、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、上記エチレン生合成経路をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、当該方法は、上記植物から果実を収穫する工程をさらに備える。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物は、上記ＤＮＡ編集剤をコードする導入遺伝子を欠く。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異はホモ接合型である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物又はその祖先は、エチレン生合成経路における上記成分をコードするゲノム配列に向けられたＤＮＡ編集剤で処理されたものである。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異は、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）及び置換からなる群から選択される。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）及びＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）からなる群から選択される。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、植物プロモーターに動作可能に連結されている、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物が提供される。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムのものである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを含むＤＮＡ編集システムのものである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）及びＭａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）からなる群から選択される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、上記エチレン生合成経路における上記成分をコードする複数の核酸配列を特異的に標的とする核酸座標向けられている。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７〜配列番号５４からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７に示される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は配列番号４７に示される核酸を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７〜配列番号５４に示される複数の核酸配列を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７、配列番号４９又は配列番号５０に示される複数の核酸配列を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号５１及び配列番号５３に示される複数の核酸配列を含む。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バナナ植物は非遺伝子組換えのものである。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、本明細書に記載される植物の植物部分が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物部分は果実である。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記果実は乾燥している。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナの製造方法であって、
（ａ）本明細書に記載される植物を成長させる工程と、
（ｂ）上記植物から果実を収穫する工程と
を備える方法が提供される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を含むゲノムバナナＤＮＡを含む加工バナナ製品が提供される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナのエチレン生合成経路における成分であるタンパク質をコードするゲノム核酸配列に導入された機能喪失型変異を含むバナナ植物、又はその部分であって、上記変異は、上記機能喪失型変異を欠くバナナ植物と比べて上記タンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じるバナナ植物、又はその部分が提供される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物は、上記バナナのエチレン生合成経路における成分である１以上のタンパク質をコードする１以上のゲノム核酸配列に導入された１以上の非天然の機能喪失型変異を含み、上記１以上の変異は、各々、上記機能喪失型変異を欠くバナナ植物と比べて上記タンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じる。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記１以上のタンパク質は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）及びＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）からなる群から選択される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＡＣＳタンパク質ゲノム核酸配列は、Ｍａ０１＿ｇ０７８００．１（配列番号１）、Ｍａ０１＿ｇ１２１３０．１（配列番号２）、Ｍａ０２＿ｇ１０５００．１（配列番号３）、Ｍａ０３＿ｇ１２０３０．１（配列番号４）、Ｍａ０３＿ｇ２７０５０．１（配列番号５）、Ｍａ０４＿ｇ０１２６０．１（配列番号６）、Ｍａ０４＿ｇ２４２３０．１（配列番号７）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０．１（配列番号８）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０．１（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３７４００．１（配列番号１０）、Ｍａ０５＿ｇ０８５８０．１（配列番号１１）、Ｍａ０５＿ｇ１３７００．１（配列番号１２）、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０．１（配列番号１３）、及びＭａ１０＿ｇ２７５１０．１（配列番号１４）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の核酸配列を含むか、又はＭａ０１＿ｇ０７８００．１（配列番号１）、Ｍａ０１＿ｇ１２１３０．１（配列番号２）、Ｍａ０２＿ｇ１０５００．１（配列番号３）、Ｍａ０３＿ｇ１２０３０．１（配列番号４）、Ｍａ０３＿ｇ２７０５０．１（配列番号５）、Ｍａ０４＿ｇ０１２６０．１（配列番号６）、Ｍａ０４＿ｇ２４２３０．１（配列番号７）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０．１（配列番号８）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０．１（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３７４００．１（配列番号１０）、Ｍａ０５＿ｇ０８５８０．１（配列番号１１）、Ｍａ０５＿ｇ１３７００．１（配列番号１２）、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０．１（配列番号１３）、及びＭａ１０＿ｇ２７５１０．１（配列番号１４）からなる群から選択される核酸配列であり、上記ＡＣＯタンパク質ゲノム核酸配列は、Ｍａ０９＿ｇ０４３７０．１（配列番号１５）、Ｍａ０６＿ｇ１７１６０．１（配列番号１６）、Ｍａ１１＿ｇ０５４９０．１（配列番号１７）、Ｍａ００＿ｇ０４４９０．１（配列番号１８）、Ｍａ０７＿ｇ１５４３０．１（配列番号１９）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０．１（配列番号２０）、Ｍａ１０＿ｇ１６１００．１（配列番号２１）、Ｍａ０５＿ｇ０８１７０．１（配列番号２２）、Ｍａ０６＿ｇ１４４３０．１（配列番号２３）、Ｍａ０５＿ｇ０９３６０．１（配列番号２４）、Ｍａ１１＿ｇ２２１７０．１（配列番号２５）、Ｍａ０５＿ｇ３１６９０．１（配列番号２６）、Ｍａ０７＿ｇ１９７３０．１（配列番号２７）、Ｍａ０６＿ｇ０２６００．１（配列番号２８）、Ｍａ１０＿ｇ０５２７０．１（配列番号２９）、Ｍａ０６＿ｇ１４３７０．１（配列番号３０）、Ｍａ１１＿ｇ０５４８０．１（配列番号３１）、Ｍａ０６＿ｇ１４４１０．１（配列番号３２）、Ｍａ０６＿ｇ１４４２０．１（配列番号３３）、Ｍａ０６＿ｇ３４５９０．１（配列番号３４）、Ｍａ０２＿ｇ２１０４０．１（配列番号３５）、Ｍａ１１＿ｇ０４２１０．１（配列番号３６）、Ｍａ０５＿ｇ１２６００．１（配列番号３７）、Ｍａ０４＿ｇ２３３９０．２（配列番号３８）、Ｍａ０３＿ｇ０６９７０．１（配列番号３９）、Ｍａ０５＿ｇ０９９８０．１（配列番号４０）、Ｍａ０４＿ｇ３６６４０．１（配列番号４１）、Ｍａ１１＿ｇ０４１８０．１（配列番号４２）、Ｍａ１１＿ｇ０２６５０．１（配列番号４３）、及びＭａ００＿ｇ０４７７０．１（配列番号４４）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の核酸配列を含むか、又はＭａ０９＿ｇ０４３７０．１（配列番号１５）、Ｍａ０６＿ｇ１７１６０．１（配列番号１６）、Ｍａ１１＿ｇ０５４９０．１（配列番号１７）、Ｍａ００＿ｇ０４４９０．１（配列番号１８）、Ｍａ０７＿ｇ１５４３０．１（配列番号１９）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０．１（配列番号２０）、Ｍａ１０＿ｇ１６１００．１（配列番号２１）、Ｍａ０５＿ｇ０８１７０．１（配列番号２２）、Ｍａ０６＿ｇ１４４３０．１（配列番号２３）、Ｍａ０５＿ｇ０９３６０．１（配列番号２４）、Ｍａ１１＿ｇ２２１７０．１（配列番号２５）、Ｍａ０５＿ｇ３１６９０．１（配列番号２６）、Ｍａ０７＿ｇ１９７３０．１（配列番号２７）、Ｍａ０６＿ｇ０２６００．１（配列番号２８）、Ｍａ１０＿ｇ０５２７０．１（配列番号２９）、Ｍａ０６＿ｇ１４３７０．１（配列番号３０）、Ｍａ１１＿ｇ０５４８０．１（配列番号３１）、Ｍａ０６＿ｇ１４４１０．１（配列番号３２）、Ｍａ０６＿ｇ１４４２０．１（配列番号３３）、Ｍａ０６＿ｇ３４５９０．１（配列番号３４）、Ｍａ０２＿ｇ２１０４０．１（配列番号３５）、Ｍａ１１＿ｇ０４２１０．１（配列番号３６）、Ｍａ０５＿ｇ１２６００．１（配列番号３７）、Ｍａ０４＿ｇ２３３９０．２（配列番号３８）、Ｍａ０３＿ｇ０６９７０．１（配列番号３９）、Ｍａ０５＿ｇ０９９８０．１（配列番号４０）、Ｍａ０４＿ｇ３６６４０．１（配列番号４１）、Ｍａ１１＿ｇ０４１８０．１（配列番号４２）、Ｍａ１１＿ｇ０２６５０．１（配列番号４３）、及びＭａ００＿ｇ０４７７０．１（配列番号４４）からなる群から選択される核酸配列である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記タンパク質成分をコードするゲノム核酸配列は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の核酸配列を含むか、又はＭａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記タンパク質成分をコードするゲノム核酸配列は、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の核酸配列を含むか、又はＭａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される核酸配列である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記タンパク質成分をコードするゲノム核酸配列は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、及びＭａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一の核酸配列を含むか、又はＭａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、及びＭａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）からなる群から選択される核酸配列である。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記非天然の機能喪失型変異は、ＤＮＡ編集剤を使用して導入されたものである。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物は、上記ＤＮＡ編集剤をコードする導入遺伝子、選択マーカー若しくはレポーターをコードする導入遺伝子を含まないか、又は上記ＤＮＡ編集剤、選択マーカー若しくはレポーターのいずれをコードする導入遺伝子も含まない。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓからなる群から選択されるＤＮＡ編集システムを含んでいた。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓであった。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異はホモ接合性である。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記変異は、欠失、挿入、挿入／欠失（インデル）、及び置換からなる群から選択される。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、ＤＮＡ編集剤及びＤＮＡターゲティング剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物であって、このターゲティング剤は、バナナのエチレン生合成経路におけるタンパク質成分をコードするゲノム核酸配列に機能喪失型変異を導入するためにそのゲノム核酸配列に対する編集剤を標的とし、これらの編集剤及びターゲティング剤は植物プロモーターに動作可能に連結されており、上記変異は、上記機能喪失型変異を欠くバナナ植物と比べて上記タンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じる核酸構築物が提供される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤及び上記ＤＮＡターゲティング剤は、請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の植物のゲノムにおいて上記変異のうちの１つを生成する。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＤＮＡターゲティング剤は、上記エチレン生合成経路における成分をコードする複数のゲノム核酸配列に共通である核酸を標的とするように設計されている。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡターゲティング剤は、配列番号４７〜配列番号５４からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７に示される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【００６１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７に示される核酸を含む。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸構築物は、配列番号４７〜配列番号５４に示される核酸配列から選択される  を含む２以上のＤＮＡ編集剤を含む。
【００６３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸構築物は、配列番号４７、配列番号４９又は配列番号５０に示される核酸配列から選択される  を含む２以上のＤＮＡ編集剤を含む。
【００６４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸構築物は、配列番号５１及び配列番号５３に示される核酸配列を含む少なくとも２つのＤＮＡ編集剤を含む。
【００６５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナの貯蔵寿命の延長方法であって、
（ａ）バナナ植物の１以上の細胞を請求項１４から請求項２２のいずれか一項に記載の核酸構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）上記エチレン生合成経路の上記タンパク質成分をコードするゲノム核酸配列の中に機能喪失型変異を生成する工程であって、この変異は上記タンパク質のレベルの低下又は活性の低下を生じる工程と、
（ｃ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓであり、上記ＤＮＡターゲティング剤はｓｇＲＮＡである。
【００６７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記バナナのエチレン生合成経路におけるタンパク質成分をコードするゲノム核酸配列は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【００６８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡターゲティング剤は、ｓｇ−１８３（配列番号４７）、ｓｇ−１８４（配列番号４８）、ｓｇ−１８８（配列番号４９）、ｓｇ−１８９（配列番号５０）、ｓｇ−１９０（配列番号５１）、ｓｇ−１９１（配列番号５２）、ｓｇ−１９４（配列番号５３）、及びｓｇ−１９５（配列番号５４）からなる群から選択される。
【００６９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記機能喪失型変異は本明細書に記載されるとおりである。
【００７０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）タンパク質をコードする遺伝子の中に変異を含み、当該変異体バナナ植物におけるこのＡＣＳタンパク質の活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、遺伝子Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）に変異を含み、遺伝子Ｍａ０９＿ｇ１９１５０はタンパク質１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）をコードし、この変異体バナナ植物におけるタンパク質ＡＣＳの活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、遺伝子Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）に変異を含み、遺伝子Ｍａ０４＿ｇ３５６４０はタンパク質１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）をコードし、この変異体バナナ植物におけるタンパク質ＡＣＳの活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、遺伝子Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）に変異を含み、遺伝子Ｍａ０４＿ｇ３１４９０はタンパク質１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）をコードし、この変異体バナナ植物におけるタンパク質ＡＣＳの活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナが提供される。
【００７４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）タンパク質をコードする遺伝子に変異を含み、当該変異体バナナ植物におけるこのＡＣＯタンパク質の活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、遺伝子Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）に変異を含み、遺伝子Ｍａ０１＿ｇ１１５４０はタンパク質ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）をコードし、この変異体バナナ植物におけるタンパク質ＡＣＯの活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナの果実は、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、変異体バナナを含む変異体バナナ植物であって、この変異体植物は、遺伝子Ｍａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）に変異を含み、遺伝子Ｍａ０７＿ｇ１９７３０はタンパク質ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）をコードし、この変異体バナナ植物におけるタンパク質ＡＣＯの活性は、上記変異を欠くバナナ植物由来のそのタンパク質の活性と比べて低下しており、上記変異体バナナは、上記変異を欠くバナナ植物由来のバナナよりもゆっくり追熟する変異体バナナ植物が提供される。
【００７７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、バナナの製造方法であって、
（ａ）本明細書に記載される植物を成長させる工程と、
（ｂ）上記植物から果実を収穫する工程と
を備える方法が提供される。
【００７８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物、又はその部分、は植物部分である。
【００７９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記植物部分は果実である。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様によれば、上記植物部分を含む加工バナナ製品が提供される。
【００８１】
特段の記載がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び／又は科学用語は、本発明が関係する技術分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料を本発明の実施形態の実施又は試験で使用することができるが、例示的な方法及び／又は材料が以降で記載される。矛盾する場合、定義を含めこの特許明細書が優先することになる。加えて、材料、方法及び例は説明のためのものにすぎず、必ずしも限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態が、添付の図面を参照して、単なる例として本明細書に記載される。ここで図面を詳細に具体的に参照するにあたり、示される特定のものは、例として、そして本発明の実施形態の説明のための記述のために示されているということが強調される。これに関して、図面を参照した記載により、本発明の実施形態をどのように実施してよいかが当業者に明らかになる。
【００８３】
【図１】図１は、Ｂｌｅｅｃｋｅｒ及びＫｅｎｄｅ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ  １６：１−１８から採ったエチレン生合成経路のスキームである。
【図２】図２は、ゲノム編集イベントを含む細胞の選択方法の一実施形態のフロー図である。
【図３】図３は、ｍＣｈｅｒｒｙプラスミドを用いたバナナプロトプラストの陽性のトランスフェクションを示す。１×１０６のバナナプロトプラストが、ＰＥＧを使用し、ｍＣｈｅｒｒｙ（蛍光マーカー）を保有するプラスミドｐＡＣ２０１０を用いてトランスフェクションされた。トランスフェクション後３日目に、蛍光顕微鏡のもとでトランスフェクション効率が分析された。この図は、バナナプロトプラストを示し、上側のパネルは明視野のものであり、下側のパネルは蛍光によるものである。
【図４Ａ】図４Ａは、陽性のｍＣｈｅｒｒｙバナナのＦＡＣＳ濃縮を示す。１×１０６バナナプロトプラストが、ＰＥＧを使用し、蛍光マーカーｍＣｈｅｒｒｙを保有するプラスミドｐＡＣ２０１０を用いてトランスフェクションされた。トランスフェクションから３日後に、プロトプラストはＦＡＣＳにより分析され、すべてのｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞がソートされ、収集された。
【図４Ｂ】図４Ｂは、陽性のｍＣｈｅｒｒｙバナナプロトプラストのＦＡＣＳ濃縮を示す。ｍＣｈｅｒｒｙバナナプロトプラストの濃縮が、蛍光顕微鏡法により確認された。未ソートの（上側のパネル）及びソートされた（下側のパネル）トランスフェクションされたプロトプラストが、トランスフェクション後３日目に蛍光顕微鏡を用いて撮像された。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、一過性の形質転換イベントを示す、経時的なｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストの減少を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを保有するプラスミドを用いてトランスフェクションされたバナナプロトプラストが、トランスフェクション後３日目（図５Ａ）及び１０日目（図５Ｂ）に撮像された。図５Ｃ。ＦＡＣＳによる測定によると、トランスフェクション後２５日目までのｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの数の漸進的な減少が認められた。１００％は、トランスフェクション後３日目のｃｈｅｒｒｙ発現細胞の割合を表す。
【図６Ａ】図６Ａは、未ソートの、そしてＦＡＣＳの前に撮像されたプロトプラストについての一過性の形質転換イベントを示す経時的なｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストの減少を示す。マレーヤマバショウプロトプラストが、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを保有するプラスミド（ｐＡＣ２０１０）を用いて、又はＤＮＡなしでトランスフェクションされた。未ソートのプロトプラストが、示されているように、トランスフェクション後３日目、６日目及び１０日目に撮像された。顕微鏡写真は、時間に沿ったｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの数及び強度の漸進的な減少を示す。ＢＦ（明視野）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ソート後の、ＦＡＣＳ後に撮像されたプロトプラストについての一過性の形質転換イベントを示す経時的なｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの減少を示す。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光マーカーを保有するプラスミド（２０１０）を用いてトランスフェクションされたマレーヤマバショウプロトプラストがソートされ、示されているように、トランスフェクション後３日目、６日目及び１０日目に撮像された。顕微鏡写真は、時間に沿ったｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの数及び強度の漸進的な減少を示す。ＢＦ（明視野）。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、トマト及びマレーヤマバショウにおけるシステム１からシステム２への移行期の間のエチレン生合成及び調節の模式図である。トマト（図７Ａ）及びバナナ果実（図７Ｂ）の追熟の間の、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（Ｓ−Ａｄｏ−Ｍｅｔ）から１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）へ、そしてエチレンへのエチレンの２工程生化学的経路の単純化されたスキーム並びにシステム１〜システム２の移行に関与する遺伝子。システム１からシステム２への移行は、ＡＣＣシンターゼ（ＡＣＳ）遺伝子及びＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーの遺伝子発現の調節に依存する。紫色のボックスは、さらなる分析のために選択されたトマト遺伝子を示す。トマトスキームは、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ及びＧｒｉｅｒｓｏｎ，２００２．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｏｔａｎｙ、第５３巻、第３７７号、２０３９−２０５５頁；Ｃａｒａ及びＧｉｏｖａｎｎｏｎｉ，２００８．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１７５巻、１０６−１１３頁；並びにＰｅｃｈら、２０１２．Ａｎｎｕａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第４４巻、２７５−３０４頁から改変した。バナナスキームは、トマトの知見並びにＬｉｕら、１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、第１２１巻、１２５７−１２６５頁及びＲｕｄｕｓら、２０１３．Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｐｌａｎｔ．第３５巻、２９５−３０７頁に基づいた。
【図８】図８は、ＡＣＣシンターゼ（ＡＣＳ）遺伝子の進化的関係の模式図である。進化歴は近隣結合法を使用して推察された。関連するタクソンがブートストラップ検定（１０００複製物）において一緒にクラスター化した複製ツリーの百分率が、色づけされた枝として示されている（赤色＜２０％；青色５０％；緑色＞９０％）。破線の紫色のボックスは、トマト果実の追熟の際に関与することが示されており、かつマレーヤマバショウのゲノムにおいて密に関連する遺伝子を検索するためのクエリ配列として使用されたトマト遺伝子を示す。橙色の遺伝子ＩＤは、果実追熟に関与する特徴付けられたトマト遺伝子に対する最も近いホモログである可能性が高いマレーヤマバショウ候補遺伝子を示す。
【図９】図９は、ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）遺伝子の進化的関係の模式図である。進化歴は近隣結合法を使用して推察された。関連するタクソンがブートストラップ検定（１０００複製物）において一緒にクラスター化した複製ツリーの百分率が、色づけされた枝として示されている（赤色＜２０％；青色５０％；緑色＞９０％）。紫色又は赤色の遺伝子ＩＤは、果実の追熟の際に特徴づけられており、かつマレーヤマバショウのゲノムにおいて密に関連する遺伝子を検索するためのクエリ配列として使用された、それぞれシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）又はトマト由来の遺伝子を示す。橙色の遺伝子ＩＤは、果実追熟に関与する特徴付けられたトマト遺伝子に対する（トマト及びシロイヌナズナに対する）最も近いホモログである可能性が高いマレーヤマバショウ候補遺伝子を示す。
【図１０】図１０はｓｇＲＮＡ選択の例を示す。目的の配列におけるｓｇＲＮＡを発見及び設計するための公開されているアルゴリズムを使用した後に、手作業によるキュレーション工程が、タンパク質機能にとって重要であることが経験的に示されているか又は予測されてきた領域（赤色のボックス）とオーバーラップするｓｇＲＮＡの選択を確実にする。青色のボックスは、ｓｇＲＮＡが設計された位置をハイライトする。本発明の実施形態によれば、青色及び赤色のボックスとオーバーラップするｓｇＲＮＡが選択される。
【図１１】図１１は、マレーヤマバショウ果実における選択されたＡＣＳ候補遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。実験条件は、Ｄ’Ｈｏｎｔら、２０１２  Ｎａｔｕｒｅ．２０１２  Ａｕｇ  ９；４８８（７４１０）：２１３−７に記載されている。果実は開花後に（４０日、６０日及び９０日）収穫され、バナナ果実の追熟におけるトランスクリプトーム変化を確認するためにアセチレンで処理されずに（−）又はアセチレンで処理されて（＋）、２０℃で５日間保たれた。ＲＮＡｓｅｑデータは、アセチレン処理がバナナＡＣＳ候補遺伝子Ｍａ０４＿ｇ３５６４０の遺伝子発現に変化を誘導することを示した。
【図１２】図１２は、マレーヤマバショウ果実における選択されたＡＣＯ候補遺伝子の遺伝子発現を示すグラフである。実験条件は、Ｄ’Ｈｏｎｔら、２０１２、前出、に記載されている。果実は開花後に（４０日、６０日及び９０日）収穫され、バナナ果実の追熟におけるトランスクリプトーム変化を確認するためにアセチレンで処理されずに（−）又はアセチレンで処理されて（＋）、２０℃で５日間保たれた。ＲＮＡｓｅｑデータは、アセチレン処理がバナナＡＣＯ候補遺伝子Ｍａ０７＿ｇ１９７３０の遺伝子発現に変化を誘導することを示した。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｄは、候補遺伝子Ｍａ０９＿１９１５０における変異の存在を明らかにするシークエンシング解析及びＴ７アッセイを示す。（図１３Ａ）他のＡＣＳ遺伝子を有する保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡが設計され選択された相対的位置を示すＭａ０９＿１９１５０遺伝子座を表すポンチ絵。（図１３Ｂ）Ｍａ０９＿１９１５０遺伝子座は、このｓｇＲＮＡ領域の外部の特異的プライマーを用いて増幅され、配列解析及びＴ７Ｅ１アッセイのために、ｐＢＬＵＮＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングされた。（図１３Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定された変異検出。「Ｃｔｒ」はｓｇＲＮＡを有しない対照プラスミドを示し、ＷＴはトランスフェクションしていない試料（ＤＮＡなし）を示す。０７及び０８は、使用したｓｇＲＮＡの組み合わせである。（図１３Ｄ）特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示されている。小さい欠失が分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｃは、候補遺伝子Ｍａ０４＿３５６４０における変異の存在を明らかにするＴ７アッセイ結果を示す。（図１４Ａ）他のＡＣＳ遺伝子を有する保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡが設計され選択された相対的位置を示すＭａ０４＿３５６４０遺伝子座を表すポンチ絵。（図１４Ｂ）Ｍａ０４＿３５６４０遺伝子座は、Ｔ７Ｅ１アッセイのために、このｓｇＲＮＡ領域の外部の特異的プライマーを用いて増幅された。（図１４Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定された変異検出。「Ｃｔｒ」はｓｇＲＮＡを有しない対照プラスミドを示し、ＷＴはトランスフェクションしていない試料（ＤＮＡなし）を示す。０７及び０８は、使用したｓｇＲＮＡの組み合わせである。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｄは、候補遺伝子Ｍａ０４＿３１４９０における変異の存在を明らかにするシークエンシング解析及びＴ７アッセイを示す。（図１５Ａ）他のＡＣＳ遺伝子を有する保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡが設計され選択された相対的位置を示すＭａ０４＿３１４９０遺伝子座を表すポンチ絵。（図１５Ｂ）Ｍａ０４＿３１４９０遺伝子座は、このｓｇＲＮＡ領域の外部の特異的プライマーを用いて増幅され、配列解析及びＴ７Ｅ１アッセイのために、ｐＢＬＵＮＴ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングされた。（図１５Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定された変異検出。「Ｃｔｒ」はｓｇＲＮＡを有しない対照プラスミドを示し、ＷＴはトランスフェクションしていない試料（ＤＮＡなし）を示す。０７及び０８は、使用したｓｇＲＮＡの組み合わせである。（図１５Ｄ）特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示されている。ＷＴ及び小さい欠失が分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃは、候補遺伝子Ｍａ０７＿１９７３０における変異の存在を明らかにするＴ７アッセイ結果を示す。（図１６Ａ）他のＡＣＯ遺伝子を有する保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡが設計され選択された相対的位置を示すＭａ０７＿１９７３０遺伝子座を表すポンチ絵。（図１６Ｂ）Ｍａ０７＿１９７３０遺伝子座は、Ｔ７Ｅ１アッセイのために、このｓｇＲＮＡ領域の外部の特異的プライマーを用いて増幅された。（図１６Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定された変異検出。「Ｃｔｒ」はｓｇＲＮＡを有しない対照プラスミドを示し、ＷＴはトランスフェクションしていない試料（ＤＮＡなし）を示す。１１及び１２は、使用したｓｇＲＮＡの組み合わせである。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｃは、候補遺伝子Ｍａ０１＿１１５４０における変異の存在を明らかにするＴ７アッセイを明らかにするＴ７アッセイ結果を示す。（図１７Ａ）他のＡＣＯ遺伝子を有する保存された領域に基づいてｓｇＲＮＡが設計され選択された相対的位置を示すＭａ０１＿１１５４０遺伝子座を表すポンチ絵。（図１７Ｂ）Ｍａ０１＿１１５４０遺伝子座は、Ｔ７Ｅ１アッセイのために、このｓｇＲＮＡ領域の外部の特異的プライマーを用いて増幅された。（図１７Ｃ）Ｔ７Ｅ１アッセイによって測定された変異検出。「Ｃｔｒ」はｓｇＲＮＡを有しない対照プラスミドを示し、ＷＴはトランスフェクションしていない試料（ＤＮＡなし）を示す。１１及び１２は、使用したｓｇＲＮＡの組み合わせであり、２３１は野生型ｇＤＮＡである。
【図１８】図１８は、遺伝子Ｍａ０１＿１１５４０における変異のシークエンシング解析を示す。特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示されている。ＷＴ及びインデルが分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図１９】図１９は、候補遺伝子Ｍａ０１＿１１５４０における変異のシークエンシング解析を示す。特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示され、挿入は緑色の文字で示されている。ＷＴ及び小さいインデルが分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図２０Ａ】図２０Ａは、種々のｓｇＲＮＡを有する候補遺伝子Ｍａ０１＿１１５４０における変異のシークエンシング解析を示す。特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示されている。ＷＴ配列、小さい欠失及び大きい欠失が分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、種々のｓｇＲＮＡを有する候補遺伝子Ｍａ０１＿１１５４０における変異シークエンシング解析を示す。特異的ｓｇＲＮＡによってガイドされるゲノム編集機械の発現によって誘導される変異体ＤＮＡ配列が野生型（ＷＴ）配列と配列比較される。ＰＡＭは灰色でハイライトされて示され、ｓｇＲＮＡは赤色の文字で示されている。ＷＴ配列、小さい欠失及び大きい欠失が分析したいくつかのクローンで見つかった。
【図２１】図２１は、標的としたＡＣＳ遺伝子におけるゲノム編集イベントの根拠のまとめを示す。ゲノム編集イベントは、（ｉ）ＰＣＲ、クローニング及びシークエンシング；並びに（ｉｉ）Ｔ７ＥＩアッセイによって評価された。Ｙ＝インデルが検出された；Ｎ＝検出されたインデルなし；Ｘ＝不確定のデータ。
【図２２】図２２は、標的としたＡＣＯ遺伝子におけるゲノム編集イベントの根拠のまとめを示す。ゲノム編集イベントは、（ｉ）ＰＣＲ、クローニング及びシークエンシング；並びに（ｉｉ）Ｔ７ＥＩアッセイによって評価された。Ｙ＝インデルが検出された；Ｎ＝検出されたインデルなし；Ｘ＝不確定のデータ。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｅは、トランスフェクションされたバナナプロトプラストの再生を示す。図２３Ａ。新しく単離されたプロトプラストであり、これがプラスミドｐＡＣ００７、ｐＡＣ２００８、ｐＡＣ２０１０、ｐＡＣ２０１１又はｐＡＣ２０１２を用いたトランスフェクションに供された。図２３Ｂ。最初の細胞分裂がプロトプラスト単離及びトランスフェクションの４８時間後に起こる。図２３Ｃ。胚形成細胞（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ）のマイクロカルスが１〜２ヶ月後に発生する。図２３Ｄ。胚形成細胞からの前胚の発生；図２３Ｅ。球状胚；図２３Ｆ。再生されたバナナの栄養分体。
【図２４】図２４Ａは、トランスフェクションされたバナナプロトプラストの再生を示す。図２４Ａ。ＭＳ塩及びビタミンを含有する発芽培地（ＧＭ）中でトランスフェクションされたバナナプロトプラストから誘導された成熟胚。図２４Ｂ〜図２４Ｃ。胚は、移しかえから１〜２週間後に発芽し始める。図２４Ｄ。ＧＭ（発芽培地）への移しかえから３〜４週間後の発芽胚であり、苗条の伸長のための増殖培地に移される準備が整っている。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｅは、貯蔵寿命を延ばすための撃ち込まれたバナナ胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）の再生を示す。図２５Ａ。撃ち込み後３日齢の増殖培地でのＥＣＳ；図２５Ｂ。撃ち込みから一週間後の撃ち込まれたＥＣＳの増殖；図２５Ｃ。撃ち込みから一ヶ月後、胚は撃ち込まれたＥＣＳから、胚発生培地（ＥＤＭ）で発生する；図２５Ｄ。成熟培地での胚；図２５Ｅ。球状胚。
【図２６（１）】図２６は、ＡＣＯ及びＡＣＳの配列並びに本発明のいくつかの実施形態に従って使用されるｓｇＲＮＡｓ、ｓｇＲＮＡ結合部位及びプライマーを示す。赤色のハイライトは、標的配列に沿ったｓｇＲＮＡの位置を表し、色コードは図中に与えられている。
【図２６（２）】図２６（１）の続きを示す。
【図２６（３）】図２６（２）の続きを示す。
【図２６（４）】図２６（３）の続きを示す。
【図２６（５）】図２６（４）の続きを示す。
【図２６（６）】図２６（５）の続きを示す。
【図２６（７）】図２６（６）の続きを示す。
【図２６（８）】図２６（７）の続きを示す。
【図２６（９）】図２６（８）の続きを示す。
【図２６（１０）】図２６（９）の続きを示す。
【図２６（１１）】図２６（１０）の続きを示す。
【図２６（１２）】図２６（１１）の続きを示す。
【図２６（１３）】図２６（１２）の続きを示す。
【図２６（１４）】図２６（１３）の続きを示す。
【図２６（１５）】図２６（１４）の続きを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８４】
本発明は、そのいくつかの実施形態では、バナナの貯蔵寿命を延長するための組成物及び方法に関する。
【００８５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用において以下の記載に示され又は実施例によって例示される詳細に必ずしも限定されないということを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、又は種々のやり方で実行又は実施することができる。
【００８６】
最も単純な不飽和炭化水素（二重結合を持つ２個の炭素）であるエチレンは、植物の生活環の中の実質的にすべての生理的なプロセスを制御する気体状植物ホルモンである。エチレンは、種子休眠性及び発芽、根の成長及び根粒形成、苗条及び葉の形成、花及び果実の発生、様々な器官の老化及び器官脱離、植物生体防御機構、並びに他の植物ホルモンとのいくつかの相互作用におけるシグナル伝達変化に関与する。エチレンは適正な植物の成長、発生、及び生存にとって疑いなく必須ではあるが、いくつかの例では、エチレンは植物にとって有害でもありうる。冷却、熱、栄養欠乏、嫌気生活、創傷及び病原体感染を含めた種々のストレスに曝された植物におけるエチレンレベルの上昇並びにその結果としての植物の成長及び健康に対する損傷の増大が報告されている。従って、追熟、老化又はストレス状態のもとで生成されるエチレンの量を遺伝的に改変し、これにより、より堅牢かつ／又は望ましい形質を持つ植物を作出することに対するかなり大きい商業的な関心がある。
【００８７】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓゲノム編集技術を使用する植物遺伝子操作の最も確立された方法は、宿主のゲノムへの新しいＤＮＡの挿入を必要とする。この挿入物、トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）は、成功裏のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介ゲノム編集を成し遂げるために、いくつかの転写単位を保有する。これらは共通に、遺伝子導入植物について選択するための抗生物質耐性遺伝子、Ｃａｓ機構、及びいくつかのｓｇＲＮＡ単位からなる。ゲノムへの外来ＤＮＡの組み込みのため、このようにして生成された植物は、遺伝子導入又は遺伝子組換え（ＧＭ）として分類される。ゲノム編集が宿主の中で樹立されると、Ｔ−ＤＮＡは有性繁殖及び育種により取り除くことができる。というのも、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９機構は、もはや表現型を維持するために必要とされないからである。しかしながら、バナナ等の生存可能な種を産生しない単為結実性作物については、有性生殖によるＴ−ＤＮＡの除去は不可能である。
【００８８】
本発明の実施形態は、バナナのエチレン生合成経路におけるゲノム編集のための標的の特定に関する。
【００８９】
従って、バナナ植物においてエチレンレベルを低下させることはバナナ果実の貯蔵寿命の延長をもたらす可能性があるが、このエチレンレベルを低下させるために、エチレンの生合成に関与する遺伝子、例えばＡＣＳ及びＡＣＯ（図７Ａ、図７Ｂ）のノックアウトが試みられた。しかしながら、バナナゲノムは、これらの遺伝子に相同的である複数の配列を含有する。
【００９０】
機能的なＡＣＳ及びＡＣＯをコードするバナナゲノム内のより優れた標的遺伝子を特定するために、モデル又は作物種における特徴づけられた経路由来の相同配列が特定された。このプロセスは、系統発生解析により遺伝子の進化歴を再構築すること、一般組織及び標的組織における候補の発現を検証することにより候補を選別すること、及び適切なｓｇＲＮＡ設計を確実にするために（ミスマッチを回避するために）候補遺伝子をシークエンシング（配列決定）することを目指す、ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の比較分析のための一連の逐次的工程を伴った。この手順により、遺伝子の選択、ノックアウトのための最適化された標的領域（保存的かつ潜在的に触媒的なドメイン）の特定及び適切なｓｇＲＮＡの設計が可能になった。
【００９１】
エチレン生合成経路における複数の遺伝子に向けられたｓｇＲＮＡを用いたバナナプロトプラストのトランスフェクションの後、本発明者らは、重複性による補償を回避するために、鍵となる遺伝子、例えばＭａ０７＿ｇ１９７３０及びＭａ０４＿ｇ３５６４０において並びにそのファミリーの他の遺伝子においてロバストなゲノム編集を特定することができた。このようなプロトプラストも、長い貯蔵寿命を有するバナナ植物を得るように、再生プロトコルに供した（図８〜２５Ａ〜Ｅを参照）。
【００９２】
従って、一態様によれば、バナナの貯蔵寿命の延長方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞を、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、上記エチレン生合成経路をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【００９３】
本明細書で使用する場合、用語「バナナ」は、プランテンを含めてバショウ属の植物を指す。
【００９４】
特定の実施形態によれば、バナナは三倍体である。
【００９５】
二倍体及び四倍体を含めて他の倍数性も想定される。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「植物」は、植物全体（１又は複数）、接ぎ木された植物（穂木）、これらの植物及び植物部分の祖先及び子孫を指し、種子、果実、苗条、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織及び器官を含む。
【００９７】
特定の実施形態によれば、上記植物部分は果実である。
【００９８】
特定の実施形態によれば、上記植物部分は種子である。
【００９９】
「種子」は、顕花植物の繁殖単位であって、別のそのような植物に発生することができる繁殖単位を指す。
【０１００】
特定の実施形態によれば、上記細胞は胚細胞である。
【０１０１】
特定の実施形態によれば、上記細胞は体細胞である。
【０１０２】
上記植物は、懸濁培養液、プロトプラスト、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含めたいずれの形態にあってもよい。
【０１０３】
特定の実施形態によれば、上記植物部分はＤＮＡを含む。
【０１０４】
以下は、本教示に従って使用することができる栽培品種の非限定的なリストである。
【０１０５】
ＡＡ群
二倍体マレーヤマバショウ（Ｍｕｓａ  ａｃｕｍｉｎａｔａ）、野生のバナナ植物及び栽培品種の両方
Ｃｈｉｎｇａｎバナナ
Ｌａｃａｔａｎバナナ
Ｌａｄｙ  Ｆｉｎｇｅｒバナナ（Ｓｕｇａｒバナナ）
Ｐｉｓａｎｇ  ｊａｒｉ  ｂｕａｙａ（Ｃｒｏｃｏｄｉｌｅ  ｆｉｎｇｅｒｓバナナ）
Ｓｅｎｏｒｉｔａバナナ（Ｍｏｎｋｏｙ、Ａｒｎｉｂａｌバナナ、Ｃｕａｒｅｎｔａ  ｄｉａｓ、Ｃａｒｉｎｏｓａ、Ｐｉｓａｎｇ  Ｅｍｐａｔ  Ｐｕｌｕｈ  Ｈａｒｉ、Ｐｉｓａｎｇ  Ｌａｍｐｕｎｇ）［１２］
Ｓｉｎｗｏｂｏｇｉバナナ
【０１０６】
ＡＡＡ群
三倍体マレーヤマバショウ、野生のバナナ植物及び栽培品種の両方
Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ亜族
「Ｄｗａｒｆ  Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ」
「Ｇｉａｎｔ  Ｃａｖｅｎｄｉｓｈ」（「Ｗｉｌｌｉａｍｓ」）
「Ｇｒａｎｄ  Ｎａｉｎ」（「Ｃｈｉｑｕｉｔａ」）
「Ｍａｓａｋ  Ｈｉｊａｕ」
「Ｒｏｂｕｓｔａ」
「Ｒｅｄ  Ｄａｃｃａ」
Ｄｗａｒｆ  Ｒｅｄバナナ
Ｇｒｏｓ  Ｍｉｃｈｅｌバナナ
Ｅａｓｔ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ｈｉｇｈｌａｎｄバナナ（ＡＡＡ−ＥＡ亜族）
【０１０７】
ＡＡＡＡ群
四倍体マレーヤマバショウ、野生のバナナ及び栽培品種の両方
Ｂｏｄｌｅｓ  Ａｌｔａｆｏｒｔバナナ
Ｇｏｌｄｅｎ  Ｂｅａｕｔｙバナナ
【０１０８】
ＡＡＡＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種（Ｍｕｓａ×ｐａｒａｄｉｓｉａｃａ）の四倍体栽培品種
Ａｔａｎバナナ
Ｇｏｌｄｆｉｎｇｅｒバナナ
【０１０９】
ＡＡＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種の三倍体栽培品種。この群は、「純粋の」プランテン又はアフリカプランテン  −  その多様性の中心は中央アフリカ及び西アフリカである  −  から構成されるプランテン亜族を含み、中央アフリカ及び西アフリカでは、おそらく２０００〜３０００年前にアジアからの先祖のプランテンの導入のあと、非常に多くの栽培品種が栽培化された。
【０１１０】
Ｉｈｏｌｅｎａ及びＭａｏｌｉ−Ｐｏｐｏ’ｕｌｕ亜族は、パシフィックプランテンと呼ばれる。
【０１１１】
Ｉｈｏｌｅｎａ亜族  −  太平洋地域で栽培化された料理用バナナの亜族
Ｍａｏｌｉ−Ｐｏｐｏ’ｕｌｕ亜族  −  太平洋地域で栽培化された料理用バナナの亜族
Ｍａｑｕｅｎｏバナナ
Ｐｏｐｏｕｌｕバナナ
Ｍｙｓｏｒｅ亜族  −  料理用及びデザートのバナナ［１５］
Ｍｙｓｏｒｅバナナ
Ｐｉｓａｎｇ  Ｒａｊａ亜族
Ｐｉｓａｎｇ  Ｒａｊａバナナ
プランテン亜族
Ｆｒｅｎｃｈプランテン
Ｇｒｅｅｎ  Ｆｒｅｎｃｈバナナ
Ｈｏｒｎ  プランテン  ＆  Ｒｈｉｎｏ  Ｈｏｒｎバナナ
Ｎｅｎｄｒａｎバナナ
Ｐｉｎｋ  Ｆｒｅｎｃｈバナナ
Ｔｉｇｅｒバナナ
Ｐｏｍｅ亜族
Ｐｏｍｅバナナ
Ｐｒａｔａ−ａｎａバナナ（Ｄｗａｒｆ  Ｂｒａｚｉｌｉａｎバナナ、Ｄｗａｒｆ  Ｐｒａｔａ）
Ｓｉｌｋ亜族
Ｌａｔｕｎｄａｎバナナ（Ｓｉｌｋバナナ、Ａｐｐｌｅバナナ）
その他
Ｐｉｓａｎｇ  Ｓｅｒｉｂｕバナナ
ｐｌｕバナナ
【０１１２】
ＡＡＢＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種の四倍体栽培品種
Ｋａｌａｍａｇｏｌバナナ
Ｐｉｓａｎｇ  Ａｗａｋ（Ｄｕｃａｓｓｅバナナ）
【０１１３】
ＡＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種の二倍体栽培品種
Ｎｅｙ  Ｐｏｏｖａｎバナナ
【０１１４】
ＡＢＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種の三倍体栽培品種
Ｂｌｕｅ  Ｊａｖａバナナ（Ｉｃｅ  Ｃｒｅａｍバナナ、Ｎｅｙ  ｍａｎｎａｎ、Ａｓｈ  プランテン、Ｐａｔａ  ｈｉｎａ、Ｄｕｋｕｒｕ、Ｖａｔａ）
Ｂｌｕｇｇｏｅ亜族
Ｂｌｕｇｇｏｅバナナ（ｏｒｉｎｏｃｏ（オリノコ）及び「ｂｕｒｒｏ」としても知られる）
Ｓｉｌｖｅｒ  Ｂｌｕｇｇｏｅバナナ
Ｐｅｌｉｐｉｔａバナナ（Ｐｅｌｉｐｉａ、Ｐｉｌｉｐｉａ）
Ｓａｂａ亜族
Ｓａｂａバナナ（Ｃａｒｄａｂａ、Ｄｉｐｐｉｇ）
Ｃａｒｄａｂａバナナ
Ｂｅｎｅｄｅｔｔａバナナ
【０１１５】
ＡＢＢＢ群
マレーヤマバショウとリュウキュウバショウとの間の交雑種の四倍体栽培品種
Ｔｉｐａｒｏｔバナナ
【０１１６】
ＢＢ群
二倍体リュウキュウバショウ（Ｍｕｓａ  ｂａｌｂｉｓｉａｎａ）、野生のバナナ
【０１１７】
ＢＢＢ群
三倍体リュウキュウバショウ、野生のバナナ及び栽培品種
Ｋｌｕａｉ  Ｌｅｐ  Ｃｈａｎｇ  Ｋｕｔ
【０１１８】
特定の実施形態によれば、上記植物は、植物細胞、例えば胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
【０１１９】
特定の実施形態によれば、上記植物細胞はプロトプラストである。
【０１２０】
このプロトプラストはいずれかの植物組織、例えば根、葉、胚細胞懸濁液、カルス又は実生組織に由来する。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「エチレン生合成経路における成分」は、バナナにおけるエチレン生合成にとって必須であるポリペプチド、例えば酵素を指す。具体的には、Ｐｅｃｈら（２０１０，Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｐｌａｎｔ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ，ａｃｔｉｏｎ、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、ドルトレヒト（Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）所収、１１５−１３６頁）により総説されているように、エチレン生合成は、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）から始まり、２つの鍵となる工程を備える（図１）。
【０１２２】
エチレンの生合成経路は、Ｓ−アデノシル−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ、ＳＡＭ）シンターゼによるメチオニンのＡｄｏＭｅｔへの変換を含む。１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸シンターゼ（ＡＣＳ）［ＥＣ４．４．１．１４］は、ＳＡＭの１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）への環化を触媒し、この環化は、この経路における律速反応と考えられることが多い。ＡＣＳは、５’−メチルチオアデノシン（ＭＴＡ）も生成し、ＭＴＡはメチオニンを生成するために再利用される。最終工程である、ＡＣＣのエチレンへの酸素依存的変換はＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）［ＥＣ１．１４．１７．４］により触媒される。ＡＣＣは、ＡＣＣの炭素Ｃ−２及びＣ−３の修飾によりエチレンへと変換されるが、Ｃ−１はシアニドへと変換され、カルボキシル基は二酸化炭素へと変換される。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、上記ＡｄｏＭｅｔシンターゼはバナナＡｄｏＭｅｔである。
【０１２４】
すべての受入番号は、Ｐａｈａｎｇ（２ｎ＝２２）アセンブリ、第２版と名付けられた生殖質コレクション系統の公開されているゲノムＭ．ａｃｕｍｉｎａｔａ（マレーヤマバショウ）倍加半数体に対応する。
【０１２５】
すべての受入番号は、Ｐａｈａｎｇ（２ｎ＝２２）アセンブリ、第２版と名付けられた生殖質コレクション系統の公開されているゲノムＭ．ａｃｕｍｉｎａｔａ（マレーヤマバショウ）倍加半数体に対応する。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、ＡＣＳは以下のものである。
＞Ｍａ０１＿ｇ０７８００．１（配列番号１
＞Ｍａ０１＿ｇ１２１３０．１（配列番号２）；
＞Ｍａ０２＿ｇ１０５００．１（配列番号３）；
＞Ｍａ０３＿ｇ１２０３０．１（配列番号４）；
＞Ｍａ０３＿ｇ２７０５０．１（配列番号５）；
＞Ｍａ０４＿ｇ０１２６０．１（配列番号６）；
＞Ｍａ０４＿ｇ２４２３０．１（配列番号７）；
＞Ｍａ０４＿ｇ３１４９０．１（配列番号８）；
＞Ｍａ０４＿ｇ３５６４０．１（配列番号９）；
＞Ｍａ０４＿ｇ３７４００．１（配列番号１０）；
＞Ｍａ０５＿ｇ０８５８０．１（配列番号１１）；
＞Ｍａ０５＿ｇ１３７００．１（配列番号１２）；
＞Ｍａ０９＿ｇ１９１５０．１（配列番号１３）；又は
＞Ｍａ１０＿ｇ２７５１０．１（配列番号１４）
【０１２７】
特定の実施形態によれば、ＡＣＯは以下のものである。
＞Ｍａ０９＿ｇ０４３７０．１（配列番号１５）；
＞Ｍａ０６＿ｇ１７１６０．１（配列番号１６）；
＞Ｍａ１１＿ｇ０５４９０．１（配列番号１７）；
＞Ｍａ００＿ｇ０４４９０．１（配列番号１８）；
＞Ｍａ０７＿ｇ１５４３０．１（配列番号１９）；
＞Ｍａ０１＿ｇ１１５４０．１（配列番号２０）；
＞Ｍａ１０＿ｇ１６１００．１（配列番号２１）；
＞Ｍａ０５＿ｇ０８１７０．１（配列番号２２）；
＞Ｍａ０６＿ｇ１４４３０．１（配列番号２３）；
＞Ｍａ０５＿ｇ０９３６０．１（配列番号２４）；
＞Ｍａ１１＿ｇ２２１７０．１（配列番号２５）；
＞Ｍａ０５＿ｇ３１６９０．１（配列番号２６）；
＞Ｍａ０７＿ｇ１９７３０．１（配列番号２７）；
＞Ｍａ０６＿ｇ０２６００．１（配列番号２８）；
＞Ｍａ１０＿ｇ０５２７０．１（配列番号２９）；
＞Ｍａ０６＿ｇ１４３７０．１（配列番号３０）；
＞Ｍａ１１＿ｇ０５４８０．１（配列番号３１）；
＞Ｍａ０６＿ｇ１４４１０．１（配列番号３２）；
＞Ｍａ０６＿ｇ１４４２０．１（配列番号３３）；
＞Ｍａ０６＿ｇ３４５９０．１（配列番号３４）；
＞Ｍａ０２＿ｇ２１０４０．１（配列番号３５）；
＞Ｍａ１１＿ｇ０４２１０．１（配列番号３６）；
＞Ｍａ０５＿ｇ１２６００．１（配列番号３７）；
＞Ｍａ０４＿ｇ２３３９０．２（配列番号３８）；
＞Ｍａ０３＿ｇ０６９７０．１（配列番号３９）；
＞Ｍａ０５＿ｇ０９９８０．１（配列番号４０）；
＞Ｍａ０４＿ｇ３６６４０．１（配列番号４１）；
＞Ｍａ１１＿ｇ０４１８０．１（配列番号４２）；
＞Ｍａ１１＿ｇ０２６５０．１（配列番号４３）；又は
＞Ｍａ００＿ｇ０４７７０．１（配列番号４４）
【０１２８】
特定の実施形態によれば、ＡＣＯは、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０．１（配列番号２０）及び／又はＭａ０７＿ｇ１９７３０．１（配列番号２７）である。
【０１２９】
特定の実施形態によれば、ＡＣＳは、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０．１（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０．１（配列番号９）及び／又はＭａ０４＿ｇ３１４９０．１（配列番号８）である。
【０１３０】
上記遺伝子のうちの各々のものの天然に存在する機能的ホモログであって、例えば、上記の遺伝子に対して少なくとも少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を提示し上で定義されたとおりＡＣＳ活性又はＡＣＯ活性を有するものも想定される。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「配列同一性」又は「同一性」又は２つの核酸配列若しくはポリペプチド配列に関して本明細書で使用する文字通りの等価物は、整列させた（配列比較した）ときに同じである２つの配列の中の残基への言及を含む。タンパク質に言及する際に配列同一性のパーセントが使用される場合、同一ではない残基位置は保存的アミノ酸置換によって異なっていることが多く、保存的アミノ酸置換ではアミノ酸残基が類似の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、それゆえ分子の機能的特性を変化させないということが認識される。配列が保存的置換において異なる場合、パーセント配列同一性は、置換の保存的性質について補正するために上向きに調整されてもよい。このような保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」又は「類似性」を有すると考えられる。この調整を行うための手段は当業者にとって周知である。典型的には、これは保存的置換を完全ミスマッチよりはむしろ部分ミスマッチとして点数化し、これによりパーセント配列同一性を大きい値にすることを伴う。このように、例えば、同一のアミノ酸がスコア１を与えられ、非保存的置換がスコア０を与えられる場合、保存的置換は０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換の点数化は、例えばＨｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ  ＪＧ．のアルゴリズム［Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２，８９（２２）：１０９１５−９］に従って算出される。
【０１３２】
同一性は、例えば国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを含むいずれかの相同性比較ソフトウェアを使用して、例えばデフォルトパラメータを使用することにより決定することができる。
【０１３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記同一性は、全体的な同一性、すなわち、本発明の核酸配列全体にわたる同一性であり、その一部分にわたる同一性ではない。
【０１３４】
本明細書で使用する場合、「植物」は、植物全体（１又は複数）、接ぎ木された植物、これらの植物及び植物部分の祖先及び子孫を指し、種子、果実、苗条、茎、根（塊茎を含む）、台木、若枝、並びに植物の細胞、組織及び器官を含む。
【０１３５】
上記植物は、懸濁培養液、プロトプラスト、胚、成長点領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉、及び小胞子を含めたいずれの形態にあってもよい。
【０１３６】
特定の実施形態によれば、上記植物部分はＤＮＡを含む。
【０１３７】
特定の実施形態によれば、上記バナナ植物は、バナナ育種系統、より好ましくはエリート系統のものである。
【０１３８】
特定の実施形態によれば、上記バナナ植物はエリート系統のものである。
【０１３９】
特定の実施形態によれば、上記バナナ植物は純粋種系統のものである。
【０１４０】
特定の実施形態によれば、上記バナナ植物は、バナナ変種又は育種対象の生殖質（ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｇｅｒｍｐｌａｓｍ）のものである。
【０１４１】
用語「育種系統」は、本明細書で使用する場合、野生の変種又は在来種とは異なり、商業的に価値があるか又は農学的に望ましい特徴を有する、栽培されるバナナの系統を指す。この用語は、エリート育種系統又はエリート系統への言及を含み、このエリート育種系統又はエリート系統は、商業用のＦ１雑種を生産するために使用される実質的にホモ接合の系統の、通常近交系の植物を表す。エリート育種系統は、多数の農学的に望ましい形質を含むより優れた農学的性能のための育種及び選択により得られる。エリート植物は、エリート系統由来のあらゆる植物である。より優れた農学的性能は、本明細書中に規定される農学的に望ましい形質の所望の組み合わせを指し、その農学的に望ましい形質の大部分、好ましくはすべてが、非エリート育種系統と比べてエリート育種系統において向上していることが望ましい。エリート育種系統は、実質的にホモ接合性であり、好ましくは近交系である。
【０１４２】
用語「エリート系統」は、本明細書で使用する場合、より優れた農学的性能のための育種及び選択から得られたあらゆる系統を指す。エリート系統は、好ましくは、複数の、好ましくは少なくとも３、４、５、６又はこれ以上の本明細書に規定される望ましい農学的形質（のための遺伝子）を有する系統である。
【０１４３】
用語「栽培品種」及び「変種」は、本明細書中で互換的に使用され、商業化される目的、例えば、自身による消費用又は商業化用に農産物を生産するために農業者及び栽培者によって使用される目的で育種、例えば、交雑及び選択によって意図的に開発された植物を表す。用語「育種対象の生殖質」は、「野生」状態以外の生物の状態を有する植物を表し、この「野生」状態は、植物又は系統種の本来の栽培されていない状態、又は天然状態を意味する。
【０１４４】
用語「育種対象の生殖質」としては、半自然、半野生、雑草、伝統的栽培品種、在来種、育種材料、研究材料、育種用系統、合成集団、雑種、創始株（ｆｏｕｎｄｅｒ  ｓｔｏｃｋ）／基礎集団、近交系（雑種栽培品種の親）、分離集団、変異体／遺伝材料（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｔｏｃｋ）、市場クラス及び後生的な／改良された栽培品種が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「純粋種」、「純系」又は「近交系」は、互換的であり、反復的な自家受粉及び／又は戻し交配によって得られる実質的にホモ接合性の植物又は植物系統を指す。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、「ゲノムを改変する（こと）」は、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする少なくとも１つの対立遺伝子に少なくとも１つの変異を導入することを指す。いくつかの実施形態によれば、改変（すること）は、エチレン生合成経路における成分の各対立遺伝子に変異を導入することを指す。少なくともいくつかの実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分の２つの対立遺伝子上の変異はホモ接合型である
【０１４６】
いくつかの実施形態によれば、エチレン生合成経路における成分をコードする２つの対立遺伝子上の変異は非相補的である。
【０１４７】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、上記エチレン生合成経路における成分の標的配列を改変し、「オフターゲット」活性を欠く、すなわちバナナゲノムの中の他の配列を改変しない。
【０１４８】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、バナナゲノム中の非必須遺伝子に対する「オフターゲット活性」を備える。
【０１４９】
非必須は、上記ＤＮＡ編集剤を用いて改変されたときに、農業的に価値ある態様（例えば、栄養価、香り、バイオマス、収量、生物的／非生物的なストレス耐性等）で標的ゲノムの表現型に影響を及ぼさない遺伝子を指す。
【０１５０】
オフターゲット作用は、当該技術分野で周知であり本明細書に記載される方法を使用してアッセイすることができる。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、「機能喪失型」変異は、エチレン生合成経路の成分がエチレン又はその前駆体の合成を促進する能力の低下（すなわち、機能障害）又はエチレン又はその前駆体の合成を促進することができなくなることを生じるゲノム異常を指す。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、「能力の低下」は、その機能喪失型変異を欠く野生型酵素のエチレン生合成経路活性（すなわち、エチレンの合成）と比べて低下したエチレン生合成経路活性中の上記成分の活性を指す。特定の実施形態によれば、活性の低下は、同じアッセイ条件下での野生型酵素の活性と比べて、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はこれ以上にもなる。エチレン生合成は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又はレーザーベースのアッセイにより小さい植物片において測定することができる（Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕ  ＳＭ，Ｍａｎｄｏｎ  Ｊ，Ａｒｓｌａｎｏｖ  Ｄ，Ｄｅ  Ｐｅｓｓｅｍｉｅｒ  Ｊ，Ｈｅｒｍａｎｓ  Ｃ，Ｈａｒｒｅｎ  ＦＪＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ａｎｎ  Ｂｏｔ−Ｌｏｎｄｏｎ．２０１３；１１１（３）：３４７−６０）。
【０１５３】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、（エチレン生合成経路の成分をコードする遺伝子における異常の場所によっては）エチレン生合成経路の成分、ｍＲＮＡ又はタンパク質、の発現を生じない。
【０１５４】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、エチレン生合成経路の上記成分の発現を生じるが、この成分はエチレン若しくはその前駆体を合成することができないか、又は非効率的にしか合成できない。
【０１５５】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、欠失、挿入、挿入−欠失（インデル）、逆位、置換及びこれらの組み合わせ（例えば、欠失及び置換、例えば欠失及びＳＮＰ）からなる群から選択される。
【０１５６】
特定の実施形態によれば、上記機能喪失型変異は、１Ｋｂ未満又は０．１Ｋｂ未満である。
【０１５７】
特定の実施形態によれば、「機能喪失型」変異は、何らかのα発現産物の生成を阻害するようにエチレン生合成経路の成分をコードする遺伝子の５’にある（例えば、エクソン１）。
【０１５８】
特定の実施形態によれば、この「機能喪失型」変異は、エチレン又はその前駆体の合成を促進する（エチレン又はその前駆体の合成に寄与する）ことができないままの発現産物、すなわち、不活性タンパク質の産生を可能にする遺伝子の中のいずれかにある。この遺伝子の調節エレメント、例えばプロモーターにおける変異も本明細書に提示される。
【０１５９】
上述のように、当該バナナ植物は、エチレン生合成経路の成分をコードする遺伝子の少なくとも１つの対立遺伝子における機能喪失型変異を含む。
【０１６０】
特定の実施形態によれば、上記変異はホモ接合性である。
【０１６１】
一態様によれば、バナナの貯蔵寿命の延長方法であって、
（ａ）バナナ植物細胞を、バナナのエチレン生合成経路における成分をコードする核酸配列に向けられたＤＮＡ編集剤に供し、上記エチレン生合成経路をコードする核酸配列の中に機能喪失型変異を生じる工程と、
（ｂ）上記植物細胞から植物を再生する工程と
を備える方法が提供される。
【０１６２】
特定の実施形態によれば、当該方法は、上記植物から果実を収穫する工程をさらに備える。
【０１６３】
特定の実施形態によれば、果実は、追熟の７〜１４日前にまだ緑色で堅いまま収穫される。各バナナ成体植物は単一の果房を生成し、この果房は多くのバナナ果実又は「子房」によって形成されており、バナナ果実又は「子房」はいくつかの果段で房になっている（ＦＡＯ、２０１４）。バナナの果房は、鋭利な弓なりのナイフ又はマチェーテを使用して「果段」によって切断される（通常２〜３人が関与する）。
【０１６４】
本明細書で使用する場合、「貯蔵寿命の延長」は、当該技術分野で周知である方法（後述の実施例の節を参照）によってアッセイされる場合に、上記機能喪失型変異を含まない同じ遺伝的背景のバナナ植物の貯蔵寿命と比べて、そして貯蔵寿命によって明らかにされると、ゲノムに機能喪失型変異（本明細書に記載されるとおり）を有する収穫されたバナナ果実の貯蔵寿命の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％又はさらには９５％の延長を指す。貯蔵寿命は、果実の色及び粘稠度を追跡することにより推定される。
【０１６５】
以降は、核酸変更を目的の遺伝子に導入するために使用される方法及びＤＮＡ編集剤、並びにそれを実行するために本開示の特定の実施形態に従って使用することができる薬剤の種々の非限定的な例の説明である。
【０１６６】
遺伝子操作されたエンドヌクレアーゼを使用するゲノム編集  −  このアプローチは、典型的にはゲノム中の所望の場所（１又は複数）で二本鎖を切断し、特定の二本鎖切断を作り出すために人工的に遺伝子操作されたヌクレアーゼを使用する逆遺伝学的方法を指し、この二本鎖切断は、次に相同組換え（ＨＲ）又は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の細胞の内因的過程により修復される。ＮＨＥＪは二本鎖切断のＤＮＡ末端に直接結合するが、ＨＲは、失われたＤＮＡ配列を切断部位で再生するための鋳型（すなわち、Ｓ期の間に形成される姉妹染色分体）として相同的なドナー配列を利用する。特定のヌクレオチド改変をゲノムＤＮＡに導入するために、所望の配列を含有するドナーＤＮＡ修復鋳型がＨＲの際に存在する必要がある（外因的に提供される一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡ）。
【０１６７】
ゲノム編集は、従来からの制限エンドヌクレアーゼを使用して実施することができない。なぜなら、多くの制限酵素はＤＮＡ上の数個の塩基対をその標的として認識し、これらの配列がゲノムにわたって多くの場所で見出されることになることが多く、所望の場所に限定されない複数の切断部位を生じるからである。この課題を克服し部位特異的な単鎖切断又は二本鎖切断を作り出すために、いくつかの別個のクラスのヌクレアーゼがこれまでに発見され生物工学的に扱われてきた。これらとしては、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられる。
【０１６８】
メガヌクレアーゼ  −  メガヌクレアーゼは、一般に４つのファミリーに分類される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックスファミリー及びＨＮＨファミリー。これらのファミリーは、触媒活性及び認識配列に影響を及ぼす構造モチーフを特徴とする。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーのメンバーは、保存されたＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフの１コピー又は２コピーのいずれかを有することを特徴とする。これら４ファミリーのメガヌクレアーゼは、保存された構造要素に関して、従ってＤＮＡ認識配列特異性及び触媒活性に関して互いに大きく隔てられている。メガヌクレアーゼは、微生物種において一般に見出され、非常に長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有するというユニークな特性を有し、このためメガヌクレアーゼは、天然に、所望の場所での切断に非常に特異的なものになっている。
【０１６９】
これは、ゲノム編集において部位特異的二本鎖切断を行うために活用することができる。当業者はこれらの天然に存在するメガヌクレアーゼを使用することができるが、しかしながら、このような天然に存在するメガヌクレアーゼの数は限られている。この課題を克服するべく、ユニークな配列を認識するメガヌクレアーゼ変異体を作り出すために、変異生成及び高スループットスクリーニング方法が使用されてきた。例えば、種々のメガヌクレアーゼが融合され、新しい配列を認識するハイブリッド酵素が作り出されてきた。
【０１７０】
あるいは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ相互作用性のアミノ酸を、配列特異的メガヌクレアーゼを設計するために変更することができる（例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書を参照）。メガヌクレアーゼは、例えば、Ｃｅｒｔｏ，ＭＴら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１２）  ９：０７３−９７５；米国特許第８，３０４，２２２号明細書；米国特許第８，０２１，８６７号明細書；米国特許第８，１１９，３８１号明細書；米国特許第８，１２４，３６９号明細書；米国特許第８，１２９，１３４号明細書；米国特許第８，１３３，６９７号明細書；米国特許第８，１４３，０１５号明細書；米国特許第８，１４３，０１６号明細書；米国特許第８，１４８，０９８号明細書；又は米国特許第８，１６３，５１４号明細書に記載されている方法を使用して設計することができ、これらの各々の内容は、参照によりその全体を本明細書に援用する。あるいは、部位特異的な切断特性を有するメガヌクレアーを、市販の技術、例えばプレシジョン・バイオサイエンシーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のＤｉｒｅｃｔｅｄ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）ゲノム編集技術を使用して得ることができる。
【０１７１】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮ  −  遺伝子操作されたヌクレアーゼの２つの別個のクラス、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、ともに、標的の二本鎖切断を生成することに有効であることが明らかになっている（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２０１０；Ｋｉｍら、１９９６；Ｌｉら、２０１１；Ｍａｈｆｏｕｚら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０）。
【０１７２】
基本的に、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの制限エンドヌクレアーゼ技術は、特定のＤＮＡ結合ドメイン（それぞれ、一系列のジンクフィンガードメイン又はＴＡＬＥリピート）に連結されている非特異的なＤＮＡ切断酵素を利用する。典型的には、ＤＮＡ認識部位及び切断部位が互いに隔てられている制限酵素が選択される。切断性部分が分離され、次いでＤＮＡ結合ドメインに連結され、これにより所望の配列に対して非常に高い特異性を有するエンドヌクレアーゼが得られる。このような特性を有する例示的な制限酵素はＦｏｋＩである。加えて、ＦｏｋＩは、ヌクレアーゼ活性を有するには二量化を必要とするという利点を有し、これは、各ヌクレアーゼパートナーがユニークなＤＮＡ配列を認識するため特異性が劇的に増すことを意味する。この効果を増強するため、ヘテロ二量体として機能できるだけであり増大した触媒活性を有するＦｏｋＩヌクレアーゼが遺伝子操作された。ヘテロ二量体機能性のヌクレアーゼは、望ましくないホモ二量体活性の可能性を回避し、従って二本鎖切断の特異性を高める。
【０１７３】
このように、例えば特定部位を標的にするために、ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮは、ヌクレアーゼ対として構築され、この対の各メンバーは、標的部位で隣接する配列に結合するように設計される。細胞における一過性発現の際に、ヌクレアーゼはその標的部位に結合し、ＦｏｋＩドメインはヘテロ二量化して二本鎖切断を作り出す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路によるこれらの二本鎖切断の修復は、小さい欠失又は小さい配列挿入を生じることが多い。ＮＨＥＪによってなされる各修復はユニークであるので、単一のヌクレアーゼ対の使用により、標的部位に一定範囲の異なる欠失を有する対立遺伝子の系列を生成することができる。
【０１７４】
一般に、ＮＨＥＪは比較的正確であり（ヒトの細胞のＤＳＢの約８５％が検出から約３０分以内にＮＨＥＪによって修復される）、遺伝子編集では、ＮＨＥＪのエラーが頼られる。というのも、修復が正確であるとき、ヌクレアーゼは、修復産物が変異原性であり認識／切断部位／ＰＡＭモチーフが消失／変異されるまで、又は一過性に導入されたヌクレアーゼがもはや存在しなくなるまで切断を続けることになるからである。
【０１７５】
欠失は、典型的には長さが数塩基対〜数百塩基対のいずれの範囲にも及ぶが、より大きい欠失が、２対のヌクレアーゼを同時に使用することにより、細胞培養液中で成功裏に生成されている（Ｃａｒｌｓｏｎら、２０１２；Ｌｅｅら、２０１０）。加えて、標的の領域に対する相同性を有するＤＮＡの断片（フラグメント）が上記ヌクレアーゼ対と併用されて導入されるとき、上記二本鎖切断は相同組換え（ＨＲ）を経由して修復され、特定の改変が生成されうる（Ｌｉら、２０１１；Ｍｉｌｌｅｒら、２０１０；Ｕｒｎｏｖら、２００５）。
【０１７６】
ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの両方のヌクレアーゼ部分は類似の特性を有するが、これらの遺伝子操作されたヌクレアーゼの間の差は、それらのＤＮＡ認識ペプチドにある。ＺＦＮは、Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーに依存し、ＴＡＬＥＮはＴＡＬＥに依存する。これらのＤＮＡ認識ペプチドドメインはともに、それらドメインが組み合わせでそれらのタンパク質に天然に見出されるという特徴を有する。Ｃｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガーは、通常３ｂｐ離れたリピートで見出され、様々な核酸相互作用性のタンパク質で多様な組み合わせで見出される。他方、ＴＡＬＥは、リピートにおいて上記アミノ酸と認識されたヌクレオチド対との間の１対１の認識比で見出される。ジンクフィンガー及びＴＡＬＥはともに繰り返しパターンで起こるため、異なる組み合わせを試して、実に様々な配列特異性を作り出すことができる。部位特異的ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼを作製するためのアプローチとしては、例えば、とりわけ、モジュールアセンブリ（三塩基配列と関係づけられたジンクフィンガーが一列につなぎ合わされ、必要とされる配列をカバーするようにする）、ＯＰＥＮ（ペプチドドメイン対三塩基ヌクレオチドの低ストリンジェンシー選抜、及びその後の細菌系におけるペプチド組み合わせ対最終の標的の高ストリンジェンシー選抜）、及びジンクフィンガーライブラリーの細菌ワンハイブリッドスクリーニングが挙げられる。ＺＦＮは、例えばＳａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から商業的に設計及び入手することもできる。
【０１７７】
ＴＡＬＥＮを設計及び入手するための方法は、例えばＲｅｙｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１２  Ｍａｙ；３０（５）：４６０−５；Ｍｉｌｌｅｒら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１１）２９：１４３−１４８；Ｃｅｒｍａｋら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）３９（１２）：ｅ８２及びＺｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１１）２９（２）：１４９−５３に記載されている。Ｍｏｊｏ  Ｈａｎｄと名付けられた最近開発されたウェブベースのプログラムが、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃによって、ゲノム編集への応用のためのＴＡＬ及びＴＡＬＥＮ構築物を設計するために導入された（ｗｗｗ．ｔａｌｅｎｄｅｓｉｇｎ．ｏｒｇによってアクセスすることができる）。ＴＡＬＥＮは、例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標）（リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カリフォルニア州）から商業的に設計及び入手することもできる。
【０１７８】
Ｔ−ＧＥＥシステム（ＴａｒｇｅｔＧｅｎｅ’ｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｅｎｇｉｎｅ）  −  ポリペプチド部分及び特異性付与核酸（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＳＣＮＡ）を含有する、インビボで、標的細胞中で会合し所定の標的核酸配列と相互作用することができるプログラム可能な核タンパク質分子複合体が提供されている。このプログラム可能な核タンパク質分子複合体は、標的核酸配列内の標的部位を特異的に改変及び／若しくは編集すること、並びに／又はその標的核酸配列の機能を改変することができる。核タンパク質組成物は、（ａ）キメラポリペプチドをコードし、（ｉ）標的部位を改変することができる機能ドメイン、及び（ｉｉ）特異性付与核酸と相互作用することができる連結ドメインを含むポリヌクレオチド分子と、（ｂ）（ｉ）標的部位に隣接している標的核酸の領域に相補的なヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）上記ポリペプチドの連結ドメインに特異的に結合することができる認識領域を含む特異性付与核酸（ＳＣＮＡ）とを含む。この組成物は、特異性付与核酸及び標的核酸の塩基対形成を通しての標的核酸に対する分子複合体の高い特異性及び結合能力を用いて、所定の核酸配列標的を正確に、信頼性高くかつ費用効率よく改変することを可能にする。この組成物は、遺伝毒性がより低く、そのアセンブリがモジュール式であり、カスタマイズを要しない単一のプラットフォームを利用し、専門の中核施設の外での独立の使用にとって実用的であり、かつより短い開発期間及び低減されたコストを有する。
【０１７９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（本明細書で「ＣＲＩＳＰＲ」とも呼ばれる）  −  多くの細菌及び古細菌は、侵入するファージ及びプラスミドの核酸を分解することができる内在性のＲＮＡベースの適応免疫系を含有する。これらのシステムは、ＲＮＡ成分を産生するｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ（ＣＲＩＳＰＲ：クラスター化され、規則的に間隔があいた短い回文構造の繰り返し）ヌクレオチド配列と、タンパク質成分をコードするＣＲＩＳＰＲ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）遺伝子とからなる。このＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）は、特定のウイルス及びプラスミドのＤＮＡに対して相同性を有する短鎖を含有し、Ｃａｓヌクレアーゼを対応する病原体の相補的核酸を分解するように導くガイドとして作用する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（化膿レンサ球菌）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの研究により、下記の３つの成分がＲＮＡ／タンパク質複合体を形成し、一緒になれば配列特異的ヌクレアーゼ活性には十分であることが示された：Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、標的配列に対して相同性を有する２０塩基対を含有するｃｒＲＮＡ、及びトランス活性化型ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（Ｊｉｎｅｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１２）３３７：８１６−８２１．）。
【０１８０】
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの融合物から構成される合成のキメラのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡに相補的なＤＮＡ標的をインビトロで開裂させるように導くことができるということがさらに実証された。合成ｇＲＮＡと併用したＣａｓ９の一過性発現は、様々な異なる種において標的とされた二本鎖切断を生成するために使用することができるということも実証された（Ｃｈｏら、２０１３；Ｃｏｎｇら、２０１３；ＤｉＣａｒｌｏら、２０１３；Ｈｗａｎｇら、２０１３ａ，ｂ；Ｊｉｎｅｋら、２０１３；Ｍａｌｉら、２０１３）。
【０１８１】
ゲノム編集のためのＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムは、２つの明確に異なる成分、ｇＲＮＡ及びエンドヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を含有する。
【０１８２】
ｇＲＮＡは、典型的には、標的相同配列（ｃｒＲＮＡ）と、ｃｒＲＮＡを単一のキメラ転写物の中でＣａｓ９ヌクレアーゼに連結する内在性の細菌ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）との組み合わせをコードする２０ヌクレオチド配列である。このｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は、ｇＲＮＡ配列と相補的ゲノムＤＮＡとの間の塩基対形成により標的配列に動員される。Ｃａｓ９の結合の成功のために、ゲノム標的配列は、標的配列直下に正しいプロトスペーサー隣接モチーフ（Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ：ＰＡＭ）配列も含有する必要がある。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体の結合はＣａｓ９をゲノム標的配列に局在化させ、これによりＣａｓ９はＤＮＡの両方の鎖を切断して二本鎖切断を引き起こすことができる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮを用いる場合のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓによって生成されたこの二本鎖切断は、ＨＲ（相同組換え）又はＮＨＥＪ（非相同末端結合）により修復されることが可能で、ＤＮＡ修復の間の特異的配列改変を受けやすい。
【０１８３】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つの機能ドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ、を有し、これらは各々異なるＤＮＡ鎖を切断する。これらのドメインの両方が活性であるとき、Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡにおいて二本鎖切断を引き起こす。
【０１８４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの顕著な優位点は、合成ｇＲＮＡを簡単に作り出すことができることと合わせたこのシステムの高効率である。これは、異なるゲノム部位での改変物を標的にする、及び／又は同じ部位の異なる改変物を標的にするように容易に改変されることが可能なシステムを作り出す。加えて、複数の遺伝子の同時ターゲティングを可能にするプロトコルが確立されている。変異を有する細胞の大部分は、標的とされた遺伝子において二対立遺伝子変異を提示する。
【０１８５】
しかしながら、ｇＲＮＡ配列とゲノムＤＮＡ標的配列との間の塩基対形成相互作用におけるみかけの柔軟性により、標的配列に対する不完全なマッチもＣａｓ９によって切断されることが可能になる。
【０１８６】
単一の不活性触媒ドメイン、ＲｕｖＣドメイン又はＨＮＨドメイン、のいずれかを含有するＣａｓ９酵素の改変型は「ニッカーゼ」と呼ばれる。ただ１つの活性なヌクレアーゼドメインを有するため、Ｃａｓ９ニッカーゼは、標的ＤＮＡの一本の鎖だけを切断し、単鎖切断又は「ニック」を生じる。単鎖切断、又はニック、は、ＰＡＲＰ（センサー）及びＸＲＣＣ１／ＬＩＧ  ＩＩＩ複合体（ライゲーション）等（これらに限定されない）のタンパク質が関与する単鎖切断修復機構によりたいてい修復される。単鎖切断（ＳＳＢ）がトポイソメラーゼＩ毒（ポイズン）により、又は天然に存在するＳＳＢでＰＡＲＰ１を捕捉する薬物により生成されれば、これらは存在し続けるであろうし、その細胞がＳ期に入り、複製フォークがそのようなＳＳＢに遭遇すれば、このようなＳＳＢは末端を１つしか持たないＤＳＢ（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄｅｄ  ＤＳＢ）になり、これはＨＲによって修復できるだけである。しかしながら、Ｃａｓ９ニッカーゼによって導入された２つの近接する反対鎖のニックは、「ダブルニック」ＣＲＩＳＰＲシステムと呼ばれることが多いものにおいて二本鎖切断として処理される。基本的に非平行ＤＳＢであるダブルニックは、他のＤＳＢのように、遺伝子標的に対する所望の効果、ドナー配列の存在、及び細胞周期の期（ＨＲは存在量が非常に低く、細胞周期のＳ期及びＧ２期においてのみ起こることができる）に応じてＨＲ又はＮＨＥＪによって修復されることが可能である。このように、特異性及び低下したオフターゲット作用が非常に重要である場合、ごく近傍にありゲノムＤＮＡの反対鎖上にある複数の標的配列を用いて２つのｇＲＮＡを設計することによりダブルニックを作り出すためにＣａｓ９ニッカーゼを使用することで、オフターゲット作用が低減されるであろう。というのも、いずれのｇＲＮＡ単独では、ゲノムＤＮＡを変えることが不可能ではないとしてもこれらのイベントの可能性が高くないニックを生じるであろうからである。
【０１８７】
２つの不活性触媒ドメインを含有するＣａｓ９酵素の改変型（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９、又はｄＣａｓ９）は、ｇＲＮＡ特異性に基づいてＤＮＡに結合することはなお可能であるが、ヌクレアーゼ活性を有しない。このｄＣａｓ９は、ＤＮＡ転写制御因子が不活性酵素を既知の制御ドメインに融合することにより遺伝子発現を活性化又は抑制するためのプラットフォームとして利用することができる。例えば、ゲノムＤＮＡ中の標的配列にｄＣａｓ９単独で結合することで遺伝子転写を妨げることができる。
【０１８８】
標的配列を選択及び／又は設計するのを支援するために利用できるツール、並びに様々な種の様々な遺伝子について生物情報学的に決定されたユニークなｇＲＮＡのリストがいくつか公開されており、例えばＦｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ研究室のＴａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｂｏｕｔｒｏｓ研究室のＴａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒ（Ｅ−ＣＲＩＳＰ）、ＲＧＥＮ  Ｔｏｏｌｓ：Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ、ＣａｓＦｉｎｄｅｒ：ゲノム中の特定のＣａｓ９標的を特定するためのＦｌｅｘｉｂｌｅアルゴリズム、及びＣＲＩＳＰＲ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｆｉｎｄｅｒがある。
【０１８９】
本開示において使用することができるｇＲＮＡの非限定的な例としては、後述する実施例の節に記載されるものが挙げられる。
【０１９０】
ＣＲＩＳＰＲシステムを使用するためには、ｇＲＮＡ及びＣａｓ９の両方が標的細胞の中に存在するか、又はリボ核タンパク質複合体として送達される必要がある。挿入ベクターが単一のプラスミドに両方のカセットを含有してもよいし、又はそれらのカセットは２つの別個のプラスミドから発現される。ＣＲＩＳＰＲプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅからのｐｘ３３０プラスミド等、市販されている。また、植物ゲノムを改変するための、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）−ガイドＲＮＡ技術及びＣａｓエンドヌクレアーゼの使用は、Ｓｖｉｔａｓｈｅｖら、２０１５，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１６９（２）：９３１−９４５；Ｋｕｍａｒ及びＪａｉｎ，２０１５，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｂｏｔ  ６６：４７−５７により、並びに米国特許出願公開第２０１５００８２４７８号に少なくとも開示されており、これらは個々に参照によりその全体を本明細書に援用される。
【０１９１】
「ヒットエンドラン（ｈｉｔ  ａｎｄ  ｒｕｎ）」又は「インアウト（ｉｎ−ｏｕｔ）」  −  は２工程組換え手順を伴う。第１工程では、正／負二重選択マーカーカセットを含有する挿入型ベクターが使用され、所望の配列変更が導入される。この挿入ベクターは、標的座位に対して相同性を有する単一の連続領域を含有し、目的の変異を保有するように改変される。このターゲティング構築物は、相同性を有する領域内の１つの部位で制限酵素を用いて線状化され、細胞に導入され、正の選択が実施されて、相同組換えイベントが単離される。相同配列を保有するＤＮＡは、プラスミド、一本鎖又は二本鎖のオリゴとして提供されてもよい。これらの相同的な組換え体は、選択カセットを含めた介在するベクター配列によって隔てられている局所的な重複を含有する。第２工程では、標的クローンが、重複した配列間の染色体内組換えにより選択カセットを失った細胞を特定するための負の選択に供される。この局所的な組換えイベントは上記重複を除去し、組換えの部位に応じて、対立遺伝子は導入された変異を保持するか、又は野生型に復帰するかする。最終結果は、何らの外来性配列の保持もない所望の改変の導入である。
【０１９２】
「二重置換（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）」又は「タグ及び交換（ｔａｇ  ａｎｄ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）」戦略  −  は、上記ヒットエンドランアプローチに類似した２工程選択手順を伴うが、２つの異なるターゲティング構築物の使用を必要とする。第１工程では、変異が導入されるべき場所の近くに正／負二重選択カセットを挿入するために、３’及び５’相同性アームを有する標準的なターゲティングベクターが使用される。上記システム成分が細胞に導入されて正の選択がかけられた後で、ＨＲイベントを特定することができよう。次に、所望の変異に相同性を有する領域を含有する第２ターゲティングベクターが標的クローンに導入され、負の選択がかけられ、上記選択カセットが除去され、変異が導入される。最終の対立遺伝子は、望まれない外来性配列を解消しつつ所望の変異を含有する。
【０１９３】
部位特異的リコンビナーゼ  −  Ｐ１バクテリオファージ由来のＣｒｅリコンビナーゼ及び酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（出芽酵母）由来のＦｌｐリコンビナーゼは、各々ユニークな３４塩基対ＤＮＡ配列（それぞれ「Ｌｏｘ」及び「ＦＲＴ」と呼ばれる）を認識する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼであり、Ｌｏｘ部位又はＦＲＴ部位のいずれかに隣接している配列は、それぞれＣｒｅリコンビナーゼ又はＦｌｐリコンビナーゼの発現の後に、部位特異的組換えにより容易に除去されることが可能である。例えば、Ｌｏｘ配列は、１３塩基対逆方向リピートに隣接する非対称の８塩基対スペーサ領域から構成される。Ｃｒｅは、この１３塩基対逆方向リピートに結合してスペーサ領域内の鎖切断及び再連結を触媒することにより、上記３４塩基対ｌｏｘ  ＤＮＡ配列を組換える。スペーサ領域でＣｒｅによってなされる突出型（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）ＤＮＡ切断は６塩基対によって隔てられ、同じオーバーラップ領域を有する組換え部位だけが再結合することを確実にするための相同性センサーとして作用するオーバーラップ領域を与える。
【０１９４】
基本的に、部位特異的リコンビナーゼシステムは、相同組換えイベントの後の選択カセットの除去のための手段を与える。このシステムは、時間的に又は組織特異的に不活性化又は活性化されうる条件付きの変更された対立遺伝子の生成も可能にする。なお、Ｃｒｅリコンビナーゼ及びＦｌｐリコンビナーゼは、３４塩基対のＬｏｘ又はＦＲＴの「傷痕」を残す。残るＬｏｘ又はＦＲＴ部位は、通常、改変された遺伝子座のイントロン又は３’ＵＴＲに残され、現在の証左は、これらの部位は、通常遺伝子機能を顕著には妨げないということを示唆する。
【０１９５】
このように、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ及びＦｌｐ／ＦＲＴ組換えは、目的の変異、２つのＬｏｘ又はＦＲＴ配列及び典型的には２つのＬｏｘ又はＦＲＴ配列の間に置かれた選択カセットを含有する３’及び５’相同性アームを持つターゲティングベクターの導入を伴う。正の選択がかけられ、目的の変異を含有する相同組換えイベントが特定される。負の選択と併用したＣｒｅ又はＦｌｐの一過性発現は、選択カセットの切除を生じ、カセットが失われた細胞を選択する。最終の目的の対立遺伝子は外来性の配列のＬｏｘ又はＦＲＴ傷痕を含有する。
【０１９６】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９である。
【０１９７】
例示のｇＲＮＡ配列が本明細書に提示される。
【０１９８】
＞Ｍａ０４＿ｇ３１４９０
ＧＡＣＴＣＴＡＡＧＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧ（配列番号４５）；
＞Ｍａ０９＿ｇ１９１５０／Ｍａ０４＿ｇ３５６４０／Ｍａ０４＿ｇ３１４９０
ＧＣＡＧＣＴＡＡＣＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＡＡＧＧ（配列番号４６）。
【０１９９】
特定の実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）、Ｍａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【０２００】
特定の実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０４＿ｇ３５６４０（配列番号９）及びＭａ０７＿ｇ１９７３０（配列番号２７）からなる群から選択される。
【０２０１】
特定の実施形態によれば、上記エチレン生合成経路における上記成分は、Ｍａ０９＿ｇ１９１５０（配列番号１３）、Ｍａ０４＿ｇ３１４９０（配列番号８）及びＭａ０１＿ｇ１１５４０（配列番号２０）からなる群から選択される。
【０２０２】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、上記エチレン生合成経路における上記成分をコードする複数の核酸配列を特異的に標的とする核酸座標に向けられている。
【０２０３】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７〜配列番号５４（ｓｇＲＮＡ：１８３、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９４及び１９５）からなる群から選択される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【０２０４】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７（ｓｇＲＮＡ：１８３）に示される核酸配列に少なくとも９９％同一の核酸配列を含む。
【０２０５】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７（ｓｇＲＮＡ：１８３）に示される核酸を含む。
【０２０６】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７〜配列番号５４（ｓｇＲＮＡ：１８３、１８４、１８８、１８９、１９０、１９１、１９４及び１９５）に示される複数の核酸配列を含む。
【０２０７】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号４７、配列番号４９及び／又は配列番号５０（ｓｇＲＮＡ：１８３、１８８、１８９）に示される複数の核酸配列を含む。
【０２０８】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤は、配列番号５１及び／又は配列番号５３（ｓｇＲＮＡ：１９０及び１９４）に示される複数の核酸配列を含む。
【０２０９】
上記ＤＮＡ編集剤は、通常、発現ベクターを使用して植物細胞に導入される。
【０２１０】
このように、本発明の一態様によれば、バナナのエチレンの生合成の成分をコードする遺伝子にハイブリダイズし、上記遺伝子の編集を容易にすることができるＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列を含む核酸構築物（コンストラクト）であって、この核酸配列が、上記ＤＮＡ編集剤をバナナの細胞において発現するためのシス作用性調節エレメントに動作可能に連結されている核酸構築物が提供される。
【０２１１】
本発明の実施形態は、上記のもの等のあらゆるＤＮＡ編集剤に関する。
【０２１２】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集剤は、エンドヌクレアーゼを含み、このエンドヌクレアーゼはＤＮＡターゲティングモジュールの補助ユニット（例えば、ｓｇＲＮＡ、又は本明細書中で「ｇＲＮＡ」とも呼ばれる）を含んでも又は有してもよい。
【０２１３】
特定の実施形態によれば、上記ＤＮＡ編集剤はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡである。
【０２１４】
特定の実施形態によれば、当該核酸構築物は、ＤＮＡ編集剤のエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又は上記のエンドヌクレアーゼ）をコードする核酸配列をさらに含む。
【０２１５】
別の特定の実施形態によれば、上記エンドヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡは異なる構築物からコードされ、これにより各々が、植物細胞において活性なシス作用性調節エレメント（例えば、プロモーター）に動作可能に連結される。
【０２１６】
本発明のいくつかの実施形態の特定の実施形態では、調節配列は植物で発現可能なプロモーターである。
【０２１７】
いくつかの実施形態に係る方法において有用な構築物は、当業者にとっては周知である組換えＤＮＡ技術を使用して構築されてよい。このような構築物は、市販され、植物への形質転換に好適であり、形質転換細胞（トランスフォーム細胞）における目的の遺伝子の発現に好適である可能性がある。
【０２１８】
本明細書で使用する場合、句「植物で発現可能」は、加えられるか又は含有される何らかの付加的な調節エレメントを含めたプロモーター配列が、植物の細胞、組織又は器官、好ましくは単子葉植物又は双子葉植物の細胞、組織若しくは器官における発現を少なくとも誘導、付与、活性化又は増強することができることを指す。本発明のいくつかの実施形態の方法に有用なプロモーターの例としては、Ａｃｔｉｎ、ＣＡＮＶ  ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ＧＯＳ２が挙げられるが、これらに限定されない。種々の組織、又は発生段階で活性であるプロモーターも使用できる。
【０２１９】
本発明のいくつかの実施形態のポリペプチドの核酸配列は、植物発現のために最適化されてもよい。このような配列改変の例としては、目的の植物種において通常見出されるＧ／Ｃ含有量により近づくための変更されたＧ／Ｃ含有量、及びコドン最適化と一般に呼ばれる、植物種において変則的に見出されるコドンの除去が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２０】
植物細胞は、本発明のいくつかの実施形態の核酸構築物を用いて安定に又は一過性に形質転換されてもよい。安定的な形質転換では、本発明のいくつかの実施形態の核酸分子は植物ゲノムに組み込まれ、従ってその植物は、安定な及び遺伝性の形質を表す。一過性の形質転換では、核酸分子は形質転換された細胞によって発現されるが、ゲノムに組み込まれず、従ってその植物は、一過性の形質を表す。
【０２２１】
特定の実施形態によれば、上記植物は、ＤＮＡ編集剤を用いて一過性にトランスフェクションされる。
【０２２２】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ３プロモーターを含む。Ｐｏｌ３プロモーターの例としては、ＡｔＵ６−２９、ＡｔＵ６２６、ＡｔＵ３Ｂ、ＡｔＵ３ｄ、ＴａＵ６が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｐｏｌ２プロモーターを含む。Ｐｏｌ２プロモーターの例としては、ＣａＭＶ３５Ｓ、ＣａＭＶ１９Ｓ、ユビキチン、ＣＶＭＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２４】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは３５Ｓプロモーターを含む。
【０２２５】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、Ｕ６プロモーターを含む。
【０２２６】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物中のプロモーターは、少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸剤に動作可能に連結されたＰｏｌ３（例えば、Ｕ６）プロモーター及び／又は上記ゲノム編集剤をコードする核酸配列若しくは蛍光レポーター（後述の特定の実施形態に記載されているとおり）をコードする核酸配列に動作可能に連結されたＰｏｌ２（例えば、ＣａｍＶ３５Ｓ）プロモーターを含む。
【０２２７】
特定の実施形態によれば、上記構築物は、アグロバクテリウム媒介形質転換による一過性発現に有用である（Ｈｅｌｅｎｓら、２００５，Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １：１３）。一過性形質転換の方法は本明細書中にさらに記載される。
【０２２８】
特定の実施形態によれば、上記構築物に含まれる核酸配列は、上記植物ゲノムへの組み込みを回避するよう、ｓｇＲＮＡ配列中のいずれのガイド配列以外の上記植物細胞のゲノムに相同的な配列を欠く。
【０２２９】
ある実施形態では、上記核酸構築物は非組み込み性構築物であり、好ましくは上記蛍光レポーターをコードする核酸配列も非組み込み性である。本明細書で使用する場合、「非組み込み性」は、目的の植物のゲノムへの組み込みを促進するように積極的には設計されていない構築物又は配列を指す。例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の遺伝子形質転換用の機能的Ｔ−ＤＮＡベクターシステムは非組み込み性ベクターシステムではない。というのも、このシステムは、植物ゲノムに組み込まれるように積極的に設計されているからである。同様に、目的の植物のゲノムへの蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列の相同組換えを促進するための、目的の植物のゲノムに相同的な隣接配列を有するその蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列は、非組み込み性の蛍光レポーター遺伝子配列又は選択マーカー配列ではないであろう。
【０２３０】
種々のクローニングキットを、本発明のいくつかの実施形態の教示に従って使用することができる。
【０２３１】
特定の実施形態によれば、上記核酸構築物はバイナリーベクターである。バイナリーベクターの例は、ｐＢＩＮ１９、ｐＢＩ１０１、ｐＢｉｎＡＲ、ｐＧＰＴＶ、ｐＣＡＭＢＩＡ、ｐＢＩＢ−ＨＹＧ、ｐＢｅｃｋｓ、ｐＧｒｅｅｎ又はｐＰＺＰ（Ｈａｊｕｋｉｅｗｉｃｚ，Ｐ．ら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５，９８９（１９９４）、及びＨｅｌｌｅｎｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ５，４４６（２０００））である。
【０２３２】
ＤＮＡ送達の他の方法（例えばトランスフェクション、電気穿孔、撃ち込み（ボンバードメント）、ウイルス接種）で使用されることができる他のベクターの例は、ｐＧＥ−ｓｇＲＮＡ（Ｚｈａｎｇら  Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｓ．２０１６  ７：１２６９７）、ｐＪＩＴ１６３−Ｕｂｉ−Ｃａｓ９（Ｗａｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４  ３２，９４７−９５１）、ｐＩＣＨ４７７４２：：２ｘ３５Ｓ−５’ＵＴＲ−ｈＣａｓ９（ＳＴＯＰ）−ＮＯＳＴ（Ｂｅｌｈａｎら、Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１３  １１；９（１）：３９）である。
【０２３３】
本明細書に記載される実施形態は、ゲノム編集イベントを含む細胞の選択方法であって、
（ａ）バナナ植物の細胞を、ゲノム編集剤（上記のとおり）及び蛍光レポーターを含む核酸構築物で形質転換する工程と、
（ｂ）フローサイトメトリ又は撮像を使用して、蛍光レポーターによって発せられる蛍光を呈する形質転換細胞を選択する工程と、
（ｃ）上記ＤＮＡ編集剤によって生成されたゲノム編集イベントを含むが上記ＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡを欠く細胞を得るために、上記ＤＮＡ編集剤によるゲノム編集イベントを含む形質転換細胞を、上記ＤＮＡ編集剤の発現を失うのに十分な時間のあいだ培養する工程と
を備える方法にも関する。
【０２３４】
いくつかの実施形態によれば、当該方法は、工程（ｃ）後に、上記形質転換細胞において、上記蛍光レポーターの発現の喪失を検証する工程をさらに備える。
【０２３５】
いくつかの実施形態によれば、当該方法は、工程（ｃ）後に、上記形質転換細胞において、上記ＤＮＡ編集剤の発現の喪失を検証する工程ことをさらに含む。
【０２３６】
当該方法の非限定的な実施形態は、図１のフロー図に記載されている。
【０２３７】
特定の実施形態によれば、上記植物は、植物細胞、例えば胚細胞懸濁液中の植物細胞である。
【０２３８】
特定の実施形態によれば、この植物細胞はプロトプラストである。
【０２３９】
このプロトプラストはいずれかの植物組織、例えば根、葉、胚細胞懸濁液、カルス又は実生組織に由来する。
【０２４０】
植物細胞に、例えばプロトプラストを使用してＤＮＡを導入する方法はいくつかあり、当業者はどれを選択するべきかを知っているであろう。
【０２４１】
核酸の送達は、本発明の実施形態では、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド及び／若しくはタンパク質又は核酸及びペプチドの組み合わせを植物細胞に送達するための方法において当業者にとって公知であるいずれの方法によって植物細胞に導入されてもよく、その方法としては、例えば以下が挙げられるが、これらに限定されない：プロトプラストの形質転換による（例えば、米国特許第５，５０８，１８４号明細書を参照）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる（例えば、Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５）  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１８３−８を参照）；電気穿孔による（例えば、米国特許第５，３８４，２５３号明細書を参照）；炭化ケイ素繊維を用いたかき混ぜによる（例えば、米国特許第５，３０２，５２３号明細書及び米国特許第５，４６４，７６５号明細書を参照）；アグロバクテリウム媒介の形質転換による（例えば、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、米国特許第５，５９１，６１６号明細書、米国特許第５，６９３，５１２号明細書、米国特許第５，８２４，８７７号明細書、米国特許第５，９８１，８４０号明細書及び米国特許第６，３８４，３０１号明細書を参照）；ＤＮＡ被覆粒子の加速による（例えば、米国特許第５，０１５，５８０号明細書、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、米国特許第５，５３８，８８０号明細書、米国特許第６，１６０，２０８号明細書、米国特許第６，３９９，８６１号明細書及び米国特許第６，４０３，８６５号明細書を参照）並びにナノ粒子、ナノ担体及び細胞膜透過ペプチドによる（国際公開第２０１１２６６４４Ａ２号パンフレット；国際公開第２００９０４６３８４Ａ１号パンフレット；国際公開第２００８１４８２２３Ａ１号パンフレット）。
【０２４２】
トランスフェクション（形質移入）の他の方法としては、トランスフェクション試薬の使用（例えばＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ（サーモフィッシャー））、デンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏ，Ｊ．Ｆ．ら、１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３，４８９７−９０２）、細胞膜透過ペプチド（Ｍａｅら、２００５，Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １６６９（２）：１０１−７）又はポリアミン（Ｚｈａｎｇ及びＶｉｎｏｇｒａｄｏｖ，２０１０，Ｓｈｏｒｔ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙａｍｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１４３（３）：３５９−３６６）が挙げられる。
【０２４３】
特定の実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）へのＤＮＡの導入は電気穿孔によって行われる。
【０２４４】
特定の実施形態によれば、植物細胞（例えば、プロトプラスト）へのＤＮＡの導入は撃ち込み／微粒子銃によって行われる。
【０２４５】
特定の実施形態によれば、ＤＮＡをプロトプラストに導入するために、当該方法は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に媒介されるＤＮＡ取り込みを含む。さらなる詳細については、Ｋａｒｅｓｃｈら（１９９１）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．９：５７５−５７８；Ｍａｔｈｕｒら（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４：２２１−２２６；Ｎｅｇｒｕｔｉｕら（１９８７）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８：３６３−３７３を参照。次に、プロトプラストは、プロトプラストが細胞壁を発達させ、分裂を開始してカルスを形成し、シュートを及び根を発達させ、植物全体を再生することを可能にする条件下で培養される。
【０２４６】
一過性形質転換は、改変植物ウイルスを使用するウイルス感染によっても行うことができる。
【０２４７】
植物宿主の形質転換に有用であることが示されたウイルスとしては、ＣａＭＶ、ＴＭＶ、ＴＲＶ及びＢＶが挙げられる。植物ウイルスを使用する植物の形質転換は、米国特許第４，８５５，２３７号明細書（ＢＧＶ）、欧州特許出願公開第６７，５５３号明細書（ＴＭＶ）、特開昭６３−１４６９３号公報（ＴＭＶ）、欧州特許出願公開第１９４，８０９号明細書（ＢＶ）、欧州特許出願公開第２７８，６６７号明細書（ＢＶ）；及びＧｌｕｚｍａｎ，Ｙ．ら、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１７２−１８９頁（１９８８）に記載されている。外来ＤＮＡを、植物を含めた多くの宿主で発現することにおいて使用するための偽ウイルス粒子は国際公開第８７／０６２６１号パンフレットに記載されている。
【０２４８】
植物における非ウイルス性の外来性核酸配列の導入及び発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上述の参考文献並びにＤａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）  １７２：２８５−２９２；Ｔａｋａｍａｔｓｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８７）  ６：３０７−３１１；Ｆｒｅｎｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８６）  ２３１：１２９４−１２９７；及びＴａｋａｍａｔｓｕら。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９０）  ２６９：７３−７６によって実証されている。
【０２４９】
ウイルスがＤＮＡウイルスである場合、好適な改変はウイルス自体に対して行うことができる。あるいは、外来ＤＮＡを有する所望のウイルスベクターを構築することの簡単さのため、ウイルスＤＮＡは最初に細菌プラスミドにクローニングされてもよい。この後、このウイルスＤＮＡは、上記プラスミドから取り出すことができる。ウイルスがＤＮＡウイルスであれば、細菌の複製開始点がウイルスＤＮＡに結合していることが可能で、ウイルスＤＮＡは、次にその細菌によって複製される。このＤＮＡの転写及び翻訳は、ウイルスＤＮＡを包むことになるコートタンパク質をもたらす。ウイルスがＲＮＡウイルスであれば、そのウイルスは、一般にｃＤＮＡとしてクローニングされ、プラスミドに挿入される。次に、このプラスミドが上記構築物のすべてを作製するために使用される。ＲＮＡウイルスが、ウイルスＲＮＡを包むコートタンパク質（１又は複数）をもたらすための、プラスミドのウイルス配列の転写及びウイルス遺伝子の翻訳によって産生される。
【０２５０】
本発明のいくつかの実施形態の構築物に含まれるもの等の非ウイルス性の外来性核酸配列の導入及び植物における発現のための植物ＲＮＡウイルスの構築は、上記の参考文献及び米国特許第５，３１６，９３１号明細書によって実証されている。
【０２５１】
１つの実施形態では、天然のコートタンパク質コード配列がウイルス核酸から欠失しており、非天然の植物ウイルス性コートタンパク質コード配列、並びに植物宿主中で発現し、組換え植物ウイルス核酸をパッケージ化すること、及び上記組換え植物ウイルス核酸による宿主の全身感染を確実にすることができる非天然のプロモーター、好ましくは上記非天然のコートタンパク質コード配列のサブゲノムプロモーターが挿入されている植物ウイルス核酸が提供される。あるいは、タンパク質が産生されるように、コートタンパク質遺伝子は、非天然の核酸配列をその内部に挿入することにより不活性化されてもよい。この組換え植物ウイルス核酸は、１以上のさらなる非天然のサブゲノムプロモーターを含有してもよい。各非天然のサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子又は核酸配列を植物宿主中で転写又は発現することができ、互いに及び天然のサブゲノムプロモーターと組み換わることができない。複数の核酸配列が含まれる場合には、非天然の（外来の）核酸配列が、上記天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーター又は上記天然及び非天然の植物ウイルスサブゲノムプロモーターに隣接して挿入されてもよい。この非天然の核酸配列は宿主植物中で、上記サブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現され、所望の産物が産生される。
【０２５２】
第２の実施形態では、上記天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列の代わりに非天然のコートタンパク質サブゲノムプロモーターのうちの１つに隣接して置かれていることを除いて第１実施形態のように組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２５３】
第３実施形態では、上記天然のコートタンパク質遺伝子がそのサブゲノムプロモーターに隣接しており、１以上の非天然のサブゲノムプロモーターがウイルス核酸に挿入されている組換え植物ウイルス核酸が提供される。この挿入された非天然のサブゲノムプロモーターは、隣接する遺伝子を植物宿主中で転写又は発現することができ、互いに及び天然のサブゲノムプロモーターと組み換わることができない。上記配列が宿主植物中で、上記サブゲノムプロモーターの制御下で転写又は発現され、所望の産物が産生されるように、非天然の核酸配列がこの非天然のサブゲノム植物ウイルスプロモーターに隣接して挿入されてもよい。
【０２５４】
第４実施形態では、上記天然のコートタンパク質コード配列が非天然のコートタンパク質コード配列によって置き換えられていることを除いて上記第３実施形態のように組換え植物ウイルス核酸が提供される。
【０２５５】
上記ウイルスベクターは、組換え植物ウイルスを産生するための組換え植物ウイルス核酸によってコードされるコートタンパク質によって包まれている。この組換え植物ウイルス核酸又は組換え植物ウイルスは、適切な宿主植物を感染させるために使用される。この組換え植物ウイルス核酸は、所望のタンパク質を産生するための、宿主中での複製、宿主の全身への広がり、及び宿主中での外来の遺伝子（１又は複数）（単離された核酸）の転写又は発現が可能である。
【０２５６】
用いられる形質転換／感染方法にかかわらず、本教示は、本明細書に記載される核酸構築物（１若しくは複数）を含む任意の細胞、例えば植物細胞（例えば、プロトプラスト）又はバクテリア細胞にさらに関する。
【０２５７】
形質転換の後、細胞は、蛍光レポーター（すなわち、蛍光タンパク質）によって発せられる蛍光を呈する形質転換細胞を選択するために、フローサイトメトリに供される。
【０２５８】
本明細書で使用する場合、「蛍光タンパク質」は、蛍光を発し、通常はフローサイトメトリ又は撮像により検出可能であり、それゆえそのようなタンパク質を発現する細胞の選択の基礎として使用することができるポリペプチドを指す。
【０２５９】
レポーターとして使用することができる蛍光タンパク質の例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及び赤色蛍光タンパク質ｄｓＲｅｄである。蛍光レポーター又は他のレポーターの非限定的な一覧は、ルミネセンスにより検出可能なタンパク質（例えばルシフェラーゼ）又は比色分析により検出可能なタンパク質（例えばＧＵＳ）を含む。特定の実施形態によれば、蛍光レポーターはＤｓＲｅｄ又はＧＦＰである。
【０２６０】
この分析は、通常は形質転換後、２４〜７２時間以内、例えば４８〜７２時間以内、２４〜２８時間以内に行われる。一過性発現を確実にするために、抗生物性選択、例えば選択マーカーに対する抗生物質は用いられない。この培養物はなお抗生物質を含んでよいが、それは選択マーカーに対するものではない。
【０２６１】
植物細胞のフローサイトメトリは、通常、蛍光活性化セルソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：ＦＡＣＳ）によって実施される。蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）は細胞を含めた粒子をその粒子の蛍光特性に基づいて分離するための周知の方法である（例えばＫａｍａｒｃｈ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５１：１５０−１６５を参照）。
【０２６２】
例えば、ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳは、４８８ｎｍレーザーによって励起されたプロトプラストの緑色対赤色の発光スペクトルの可視化を利用する。ＧＦＰ陽性プロトプラストは、赤色発光に対する緑色発光の比の上昇によって区別することができる。
【０２６３】
以下は、Ｂａｓｔｉａａｎら、Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１０；（３６）：１６７３から改変した非結合プロトコルである。この文献は、参照により本明細書に援用される。ＦＡＣＳ装置は市販されており、例えばＦＡＣＳＭｅｌｏｄｙ（ＢＤ）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ）がある。
【０２６４】
１００μｍノズル及び２０ｐｓｉ（約０．１３８ＭＰａ）シース圧を用いてフローストリームが設定される。細胞密度及び試料注入速度は、最良の収率又は達成可能な最も大きい速度、例えば１０，０００，０００細胞／ｍｌ以下が望まれるか否かに基づいて、特定の実験に対して調整することができる。プロトプラストの沈降を防ぐために、試料はＦＡＣＳ上で撹拌される。ＦＡＣＳの詰まりが問題になれば、３つの可能なトラブルシューティング工程がある：１．試料ラインの逆流を実施する、２．密度を下げるためにプロトプラスト懸濁液を希釈する、３．遠心分離及び再懸濁後に濾過工程を繰り返すことによりプロトプラスト溶液を清浄にする。この装置は、４８８ｎｍレーザーによる励起後の前方散乱光（ＦＳＣ）、側方散乱光（ＳＳＣ）、並びにＧＦＰについて５３０／３０ｎｍ及び赤色スペクトル自己蛍光（ＲＳＡ）について６１０／２０ｎｍの発光を測定するように準備されている。これらは、実質的に、ＧＦＰ陽性プロトプラストを単離するために使用される唯一のパラメータである。以下の電圧設定値が使用できる：ＦＳＣ  −６０Ｖ、ＳＳＣ  ２５０Ｖ、ＧＦＰ  ３５０Ｖ及びＲＳＡ  ３３５Ｖ。なお、最適の電圧設定値は、ＦＡＣＳごとに異なり、セルソーターの耐用期間全体にわたってなお調整される必要がある。
【０２６５】
プロセスは、前方散乱光対側方散乱光についてのドットプロットを組み立てることにより開始される。測定されるイベントがプロットの中心にくるように電圧設定値が印加される。次に、緑色蛍光シグナル対赤色蛍光シグナルのドットプロットが作成される。野生型（非ＧＦＰ）プロトプラスト懸濁液を見るときに、測定されるイベントがプロットで中央に集まった対角線上の集団を与えるように電圧設定値が印加される。ＧＦＰマーカーラインに由来するプロトプラスト懸濁液は、野生型試料では決して見られない緑色蛍光イベントの明確な集団を生成することになる。ＧＦＰとＲＳＡとの間のスペクトルのオーバーラップを調整するために、コンペンセーション制約が設定される。適正なコンペンセーション制約設定値は、非ＧＦＰプロトプラスト及びデブリからのＧＦＰ陽性プロトプラストのより良好な分離を可能にすることになる。本願で使用する制約は以下のとおりである：ＲＳＡ、マイナス１７．９１％ＧＦＰ。ゲートはＧＦＰ陽性イベントを特定するように設定され、非ＧＦＰプロトプラストの陰性対照が、ゲート境界を画定することを支援するために使用される必要がある。小さいデブリを分析から外すために前方散乱光カットオフが実行される。カットオフの配置を決定するのを助けるためにＧＦＰ陽性イベントがＦＳＣ対ＳＳＣプロットで可視化される。例えば、カットオフは５，０００に設定される。なお、ＦＡＣＳは、デブリをソートイベントとしてカウントすることになり、高レベルのデブリを有する試料は、予測とは異なるＧＦＰ陽性イベントパーセントを有する可能性がある。これは必ずしも問題ではない。しかしながら、試料中にデブリが多いほど、ソートに長い時間がかかることになる。実験に応じて及び分析する対象の細胞型の存在量に応じて、ＦＡＣＳの精度モードはソートされた細胞の最適収率又は最適純度のいずれかを求めて設定される。
【０２６６】
ＦＡＣＳソーティングの後、蛍光マーカーを提示する形質転換された植物細胞（例えば、プロトプラスト）の正に選択されたプールが集められ、そしてアリコート（一定分量）がこのＤＮＡ編集イベントを試験する（任意の工程。図１を参照）ために使用されてもよい。あるいは（又は任意の検証する工程に続いて）、クローンがコロニー、すなわちクローン（少なくとも２８日）及びマイクロカルスへと発生するまで、クローンが選択（例えば、選択マーカーに対する抗生物質）の不存在下で培養される。培養下の少なくとも６０〜１００日間（例えば、少なくとも７０日、少なくとも８０日）の後、カルスの細胞の一部が、ＤＮＡ編集イベント及びＤＮＡ編集剤の存在、つまりそのＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の喪失（これは当該方法の一過性を指摘する）について分析（検証）される。
【０２６７】
このように、クローンは、求められる編集の種類、例えば、挿入、欠失、挿入−欠失（インデル）、逆位、置換及びこれらの組み合わせに応じて本明細書中で「変異」又は「編集」とも呼ばれるＤＮＡ編集イベントの存在について検証される。
【０２６８】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集イベントは、これがなければ従来の育種によって目的の植物に導入されることが可能な欠失、一塩基対置換、又は第２植物由来の遺伝子材料の挿入を含む。
【０２６９】
特定の実施形態によれば、ゲノム編集イベントは、従来の育種を通しては導入できないと思われる目的の植物のゲノムへの外来ＤＮＡの導入を含まない。
【０２７０】
配列変更の検出方法は当該技術分野で周知であり、その例としては、ＤＮＡシークエンシング（例えば、次世代シークエンシング）、電気泳動、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイ、並びにＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮａｓｅプロテクション、インサイツハイブリダイゼーション、プライマー伸長法、サザンブロット、ノーザンブロット及びドットブロット解析等のハイブリダイゼーションアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。一塩基多型（ＳＮＰ）の検出のために使用される種々の方法、例えばＰＣＲを伴うＴ７エンドヌクレアーゼ、ヘテロ二本鎖及びＳａｎｇｅｒシークエンシングも使用することができる。
【０２７１】
ＤＮＡ編集イベント、例えばインデルの存在の別の検証方法は、ミスマッチのＤＮＡを認識してこれを切断する構造選択的な酵素（例えばエンドヌクレアーゼ）を利用するミスマッチ切断アッセイを含む。
【０２７２】
ミスマッチ切断アッセイは、インデルの検出について簡便で費用効率が高い方法であり、それゆえゲノム編集により誘導された変異を検出するための代表的な手順である。このアッセイは、ミスマッチ部分及び複数のヌクレオチドによって形成される追加らせんループ（ｅｘｔｒａｈｅｌｉｃａｌ  ｌｏｏｐ）でヘテロ二本鎖ＤＮＡを切断し、２以上のより断片（フラグメント）を与える酵素を使用する。得られた断片がサイズで類似しておらず従来のゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）により簡単に分離できるように、予測されるヌクレアーゼ切断部位を外して約３００〜１０００ｂｐのＰＣＲ産物が生成される。末端標識された消化産物も自動のゲル電気泳動又はキャピラリー電気泳動によって分析できる。遺伝子座のインデルの頻度は、ＰＣＲ増幅産物及び切断されたＤＮＡバンドの積分強度を測定することにより推定することができる。消化工程には１５〜６０分かかり、ＤＮＡ調製工程及びＰＣＲ工程が加えられるときには、アッセイ全体は３時間未満で完了することができる。
【０２７３】
２つの択一的な酵素が、通常、このアッセイで使用される。Ｔ７エンドヌクレアーゼ１（Ｔ７Ｅ１）は、ミスマッチの上流にある第１、第２又は第３のホスホジエステル結合で不完全マッチのＤＮＡを認識して切断するリゾルバーゼである。Ｔ７Ｅ１ベースのアッセイの感度は０．５〜５％である。対照的に、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ．、オマハ（Ｏｍａｈａ）、ネブラスカ州、米国）は、オランダミツバ由来のミスマッチ特異的ヌクレアーゼのＣＥＬファミリーのメンバーである。これは、一塩基多型（ＳＮＰ）又は小さいインデルの存在に起因するミスマッチ部分を認識して切断し、ミスマッチの下流の両方のＤＮＡ鎖を切断する。このヌクレアーゼは、１２ｎｔまでのインデルを検出することができ、約３％、すなわち３２コピーに１つという低い頻度で存在する変異に感受性がある。
【０２７４】
編集イベントの存在のさらに別の検証方法は、高分解能融解曲線分析を含む。
【０２７５】
高分解能融解曲線分析（ＨＲＭＡ）は、ゲノム標的（９０〜２００ｂｐ）にまたがるＤＮＡ配列を、蛍光染料を組み込んでリアルタイムＰＣＲにより増幅すること、及びこれに続く増幅産物の融解曲線分析を伴う。ＨＲＭＡは、挿入染料が熱変性の間に二本鎖ＤＮＡから放出されるときの蛍光の喪失に基づく。この分析は、増幅産物の温度依存的変性プロファイルを記録し、融解プロセスが１又は複数の分子種を伴うかを検出する。
【０２７６】
さらに別の方法はヘテロ二本鎖移動度アッセイである。変異も、再ハイブリダイズしたＰＣＲ断片を直接未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分析することにより、検出することができる。この方法は、ポリアクリルアミドゲル中でのヘテロ二本鎖ＤＮＡ及びホモ二本鎖ＤＮＡの泳動の差を利用する。インデルによって引き起こされるマッチＤＮＡ鎖とミスマッチＤＮＡ鎖との間の角度は、未変性条件下ではヘテロ二本鎖ＤＮＡがホモ二本鎖ＤＮＡよりも著しく小さい速度で泳動し、それらは移動度に基づいて簡単に区別できるということを意味する。１４０〜１７０ｂｐの断片は１５％ポリアクリルアミドゲル中で分離できる。そのようなアッセイの感度は、最適条件下では０．５％に近づくことができ、これはＴ７Ｅ１に近い。ＰＣＲ産物の再アニール後、このアッセイの電気泳動部分には約２時間を要する。
【０２７７】
編集イベントの存在の他の検証方法は、Ｚｉｓｃｈｅｗｓｋｉ  ２０１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  １（１）：９５−１０４に詳しく記載されている。
【０２７８】
陽性クローンは、ＤＮＡ編集イベントについてホモ接合性であってもよく又はヘテロ接合性であってもよいということは分かるであろう。当業者は、目的の用途に従ってクローンをさらなる培養／再生のために選択する。
【０２７９】
所望のＤＮＡ編集イベントの存在を提示するクローンは、ＤＮＡ編集剤の存在、つまりＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ配列の喪失（これは当該方法の一過性を指摘する）についてさらに分析される。
【０２８０】
これは、例えば、ＧＦＰの蛍光検出又はｑ−ＰＣＲによりＤＮＡ編集剤の発現（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質での）を分析することにより行うことができる。
【０２８１】
あるいは又は加えて、細胞は、本明細書に記載される核酸構築物又はその部分、例えばレポーターポリペプチド又はＤＮＡ編集剤をコードする核酸配列の存在について分析される。
【０２８２】
蛍光レポーター又はＤＮＡ編集剤をコードするＤＮＡ（例えば、蛍光顕微鏡法、ｑ−ＰＣＲ及び／又はサザンブロット、ＰＣＲ、シークエンシング等のいずれかの他の方法によって確認される）を示さないが、所望のＤＮＡ編集イベント（１又は複数）［変異（１又は複数）］を含むクローンが、さらなる処理のために単離される。
【０２８３】
それゆえ、これらのクローンは保存することができる（例えば、凍結保存される）。
【０２８４】
あるいは、細胞（例えば、プロトプラスト）は、カルスへと発生する一群の植物細胞へとまず成長し、次いで植物組織培養方法を使用してそのカルスからシュートを再生すること（不定芽形成（ｃａｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ））により植物全体へと再生されてもよい。カルスへのプロトプラストの成長及びシュートの再生は、植物の種それぞれについて誂えられる必要がある組織培地中での植物成長調節物質の適正なバランスを必要とする。
【０２８５】
プロトプラストも、プロトプラスト融合と呼ばれる技術を使用する植物育種のために使用されてよい。異なる種に由来するプロトプラストは、電場又はポリエチレングリコールの溶液を使用することにより融合するように誘導される。この技術は、組織培養において体細胞雑種を生成するために使用されてもよい。
【０２８６】
プロトプラスト再生の方法は当該技術分野で周知である。いくつかのファクター、つまり遺伝子型、ドナー組織及びその前処理、プロトプラスト単離のための酵素処理、プロトプラスト培養の方法、培養、培地、及び物理的環境が、プロトプラストの単離、培養、及び再生に影響を及ぼす。詳細な総説のために、Ｍａｈｅｓｈｗａｒｉら、１９８６、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌｓ：  ３−３６．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎを参照。
【０２８７】
再生された植物は、当業者が適切と考える場合には、さらなる育種及び選択に供されてもよい。
【０２８８】
上記植物又はその細胞は、ＤＮＡ編集剤をコードする導入遺伝子を欠く。
【０２８９】
最終系統、植物又は中間育種産物の表現型は、例えばエチレン生合成経路の成分をコードする遺伝子の配列、ｍＲＮＡ若しくはタンパク質のレベル（量）でのその発現、そのタンパク質の活性を決定すること、及び／又は果実の特性（貯蔵寿命）を分析すること等により、分析することができる。
【０２９０】
エチレン産生：エチレン生合成は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又はレーザーベースのアッセイ（Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕ  ＳＭ，Ｍａｎｄｏｎ  Ｊ，Ａｒｓｌａｎｏｖ  Ｄ，Ｄｅ  Ｐｅｓｓｅｍｉｅｒ  Ｊ，Ｈｅｒｍａｎｓ  Ｃ，Ｈａｒｒｅｎ  ＦＪＭ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ．Ａｎｎ  Ｂｏｔ−Ｌｏｎｄｏｎ．２０１３；１１１（３）：３４７−６０）により小さい植物片において測定することができる。
【０２９１】
本明細書及び後述の実施例の中で説明されるように、本発明者らは、安定な遺伝子組換えを回避しつつゲノム編集剤（１又は複数）を用いてバナナを形質転換することができた。
【０２９２】
従って、本発明の方法論は、選択可能又はスクリーニング可能なレポーターの組み込みを伴わないゲノム編集を可能にする。
【０２９３】
このように、本発明の実施形態は、本発明の教示に従って生成された遺伝子編集イベント（１又は複数）を含む植物、植物細胞及び植物の加工産物にさらに関する。
【０２９４】
このように、本発明の教示は、本明細書に記載される植物の一部分又はその加工産物にも関する。
【０２９５】
バナナ果実、及びバナナ果実に基づく製品並びにそれらの製造方法は、本明細書に記載される植物を使用して想定される。
【０２９６】
増粘剤、着色剤及び香料、主要栄養素及び微量栄養素についての代替供給源、栄養補助食品、家畜飼料、天然繊維、並びに天然の生理活性化合物及び生物肥料の供給源として役立つ、種々の食品及び非食品の用途における皮、葉、偽茎、柄及び花房等のバナナ副製品及びその製造方法も想定される。
【０２９７】
特定の実施形態によれば、加工製品はＤＮＡを含む。
【０２９８】
本願から成立した特許の有効期間の間に、多くの関連するＤＮＡ編集剤が開発されることが予想され、用語ＤＮＡ編集剤の範囲は、すべてのこのような新しい技術を事前に含むことが意図されている。
【０２９９】
本明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。
【０３００】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（…を含む、…を備える」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（…を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ（…を有する）」及びこれらの接合語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含む（備える）が、これらに限定されない）」を意味する。
【０３０１】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（…からなる）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（…を含み、かつ…に限定される）」を意味する。
【０３０２】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（…から実質的になる）」は、組成物、方法又は構造は、追加の原料、工程及び／又は部品を含んでもよいが、それは、その追加の原料、工程及び／又は部品が請求項に係る組成物、方法又は構造の基本で新規な特徴を実質的に変えない場合に限られるということを意味する。
【０３０３】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」又は「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」は、ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（複数の化合物）、及びこれらのｍｉｘｔｕｒｅｓ（混合物）を含んでもよい。
【０３０４】
本願全体にわたって、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定と解釈されるべきではないということを理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
【０３０５】
本明細書中で数値範囲が示されている場合にはいつでも、その数値範囲は、示された範囲内のあらゆる引用された数値（分数又は整数）を含むことが意図されている。句、第１の示された数と第２の示された数との間「にわたる／の範囲」、及び第１の示された数から第２の示された数まで（第１の示された数〜第２の示された数）「にわたる／の範囲」は、本明細書中で互換的に使用され、その第１及び第２の示された数並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことが意図されている。
【０３０６】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、与えられた課題を成し遂げるためのやり方、手段、技法及び手順を指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に公知であるか、又は化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者によって公知のやり方、手段、技法及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技法及び手順が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０７】
特定の配列表に言及されるとき、そのような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シークエンシングエラー、クローニングエラーから生じるわずかな配列変化、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じる他の変更を含む配列も包含すると理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【０３０８】
本願に開示されるあらゆる配列番号は、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマット又はＲＮＡ配列フォーマットでのみ表されている場合であっても、配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができるということは理解される。例えば、ある与えられた配列番号はＤＮＡ配列フォーマットで表される（例えば、チミンについてＴと書かれている）が、それは、与えられた核酸配列に対応するＤＮＡ配列、又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の現実の種類に応じて、ＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルについてＵと書かれている）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、又は示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、いずれかの置換を有して開示された配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
【０３０９】
明確性のために、別個の実施形態に関して記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴が、別個に若しくはいずれかの好適なサブコンビネーションにおいて、又は適宜本発明のいずれかの他の記載された実施形態において提供されてもよい。種々の実施形態に関して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能である場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。
【０３１０】
本明細書中でこれまで記載された及び添付の特許請求の範囲でクレームされる本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的にサポートされる。
【０３１１】
本明細書で使用する場合、用語「約」は±１０％を指す。
【０３１２】
用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ（…を含む、…を備える」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（…を含む）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ（…を有する）」及びこれらの接合語は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（含む（備える）が、これらに限定されない）」を意味する。
【０３１３】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ（…からなる）」は、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ（…を含み、かつ…に限定される）」を意味する。
【０３１４】
用語「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ（…から実質的になる）」は、組成物、方法又は構造は、追加の原料、工程及び／又は部品を含んでもよいが、それは、その追加の原料、工程及び／又は部品が請求項に係る組成物、方法又は構造の基本で新規な特徴を実質的に変えない場合に限られるということを意味する。
【０３１５】
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈と明らかに矛盾する場合を除いて複数の指示対象を含む。例えば、用語「ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（化合物）」又は「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ（少なくとも１つの化合物）」は、ａ  ｐｌｕｒａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（複数の化合物）、及びこれらのｍｉｘｔｕｒｅｓ（混合物）を含んでもよい。
【０３１６】
本願全体にわたって、本発明の種々の実施形態は、範囲形式で提示されてもよい。範囲形式での記載は単に便宜及び簡潔さのためであり、本発明の範囲に対する変更できない限定と解釈されるべきではないということを理解されたい。従って、範囲の記載は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考えられるべきである。例えば、１〜６等の範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲、並びにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、３、４、５、及び６を具体的に開示したと考えられるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず当てはまる。
【０３１７】
本明細書中で数値範囲が示されている場合にはいつでも、その数値範囲は、示された範囲内のあらゆる引用された数値（分数又は整数）を含むことが意図されている。句、第１の示された数と第２の示された数との間「にわたる／の範囲」、及び第１の示された数から第２の示された数まで（第１の示された数〜第２の示された数）「にわたる／の範囲」は、本明細書中で互換的に使用され、その第１及び第２の示された数並びにそれらの間のすべての分数及び整数を含むことが意図されている。
【０３１８】
本明細書で使用する場合、用語「方法」は、与えられた課題を成し遂げるためのやり方、手段、技法及び手順を指し、それらには、化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者に公知であるか、又は化学、薬理学、生物学、生化学及び医学の分野の当業者によって公知のやり方、手段、技法及び手順から容易に開発されるやり方、手段、技法及び手順が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１９】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」は、状態の進行を排除すること、実質的に阻害すること、緩慢化すること若しくは逆転させること、状態の臨床症候若しくは美的症候を実質的に改善すること、又は状態の臨床症候若しくは美的症候の外観を実質的に予防することを含む。
【０３２０】
特定の配列表に言及されるとき、そのような言及は、その相補的配列に実質的に対応する配列、例えば、シークエンシングエラー、クローニングエラーから生じるわずかな配列変化、又は塩基置換、塩基欠失若しくは塩基付加を生じる他の変更を含む配列も包含すると理解されたい。ただし、そのような変化の頻度は、５０ヌクレオチドに１未満、あるいは１００ヌクレオチドに１未満、あるいは２００ヌクレオチドに１未満、あるいは５００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０００ヌクレオチドに１未満、あるいは５，０００ヌクレオチドに１未満、あるいは１０，０００ヌクレオチドに１未満である。
【０３２１】
本願に開示されるあらゆる配列番号は、その配列番号がＤＮＡ配列フォーマット又はＲＮＡ配列フォーマットでのみ表されている場合であっても、その配列番号が言及される文脈に応じて、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列のいずれかを指すことができるということは理解される。例えば、ある配列番号はＤＮＡ配列フォーマットで表される（例えば、チミンについてＴと書かれている）が、それは、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ分子核酸配列のＲＮＡ配列のいずれかを指すことができる。同様に、いくつかの配列は、記載される分子の現実の種類に応じて、ＲＮＡ配列フォーマットで表されている（例えば、ウラシルについてＵと書かれている）が、それは、ｄｓＲＮＡを含むＲＮＡ分子の配列、又は示されたＲＮＡ配列に対応するＤＮＡ分子の配列のいずれかを指すことができる。いずれにせよ、いずれかの置換を有して開示された配列を有するＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方が想定される。
【０３２２】
明確性のために、別個の実施形態に関して記載される本発明の特定の特徴が、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔さのために、単一の実施形態に関して記載される本発明の種々の特徴が、別個に若しくはいずれかの好適なサブコンビネーションにおいて、又は適宜本発明のいずれかの他の記載された実施形態において提供されてもよい。種々の実施形態に関して記載される特定の特徴は、それらの要素がなければその実施形態が動作不能である場合を除き、それらの実施形態の必須の特徴と考えられるべきではない。
【０３２３】
本明細書中でこれまで記載された及び添付の特許請求の範囲でクレームされる本発明の種々の実施形態及び態様は、以下の実施例で実験的にサポートされる。
【実施例】
【０３２４】
これより以下の実施例が参照されるが、この実施例は、上記の記載と一緒になって、本発明のいくつかの実施形態を限定せずに説明する。
【０３２５】
全般的に、本明細書で使用される命名法及び本発明で利用する実験室手順は、分子技法、生化学的技法、微生物学的技法及び組換えＤＮＡ技法を含む。このような技法は、文献に十分に説明されている。例えば下記を参照。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、メリーランド州（Ｍａｒｙｌａｎｄ）（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｂｉｒｒｅｎら（編）「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９８）；米国特許第４，６６６，８２８号明細書；米国特許第４，６８３，２０２号明細書；米国特許第４，８０１，５３１号明細書；米国特許第５，１９２，６５９号明細書及び米国特許第５，２７２，０５７号明細書に示される方法論；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓによる「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  −  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編）、「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）、コネチカット州（１９９４）；Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ（編）、「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９８０）；利用可能なイムノアッセイは、特許文献及び科学文献に詳細に記載されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書；米国特許第３，８３９，１５３号明細書；米国特許第３，８５０，７５２号明細書；米国特許第３，８５０，５７８号明細書；米国特許第３，８５３，９８７号明細書；米国特許第３，８６７，５１７号明細書；米国特許第３，８７９，２６２号明細書；米国特許第３，９０１，６５４号明細書；米国特許第３，９３５，０７４号明細書；米国特許第３，９８４，５３３号明細書；米国特許第３，９９６，３４５号明細書；米国特��第４，０３４，０７４号明細書；米国特許第４，０９８，８７６号明細書；米国特許第４，８７９，２１９号明細書；米国特許第５，０１１，７７１号明細書及び米国特許第５，２８１，５２１号明細書を参照；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．、及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．、（１９８４）及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、サンディエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）、カリフォルニア州（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらのすべては、参照により、本明細書中にすべて示されているが如く援用される。他の一般的な参考文献は、本明細書全体にわたって提供されている。これらの文献の中にある手順は当該技術分野で周知であると考えられるが、読者の便宜のために提供されている。上記文献に含まれるすべての情報は、参照により本明細書に援用される。
【０３２６】
材料及び方法
胚発生カルス及び細胞懸濁液の生成及び維持
胚発生カルスを、Ｍａ、１９８８（Ｍａ  Ｓ．Ｓ．１９９１  Ｓｏｍａｔｉｃ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｎｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｂａｎａｎａ。Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  ｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ｃｒｏｐｓ、台北、台湾、１９８８年３月８〜９日所収、１８１−１８８頁）及びＳｃｈｏｏｆｓ、１９９７（Ｓｃｈｏｏｆｓ  Ｈ．１９９７．Ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｕｓａ．ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ、ＫＵＬｅｕｖｅｎ、ベルギー）によって記載されているように、未熟な雄花又は茎頂等の初期外植片から発生させる。胚形成細胞懸濁液は、新しく発生した高胚発生のカルスから液体媒体中で開始する。この培地の８０％を、最初の細胞懸濁液が十分に樹立するまで（６〜９ヶ月）まで、１２〜１４日ごとに新しくした。
【０３２７】
ｓｇＲＮＡクローニング
利用したトランスフェクションプラスミドは、１、Ｇ７終結配列によって終結したＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるｅＧＦＰ；２、Ｍａｓ終結配列によって終結したＣａＭＶ３５ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓ９（ヒトコドンに最適化済み）；３、ガイド１のためにｓｇＲＮＡを駆動するＡｔＵ６プロモーター；４、ガイド２のためにｓｇＲＮＡを駆動するＡｔＵ６プロモーターを含む４つのモジュールから構成された。ｐＣＡＭＢＩＡ又はｐＲＩ−２０１−ＡＮ  ＤＮＡ等のバイナリーベクターを使用することができる。
【０３２８】
外来性レポーター遺伝子ＧＦＰを標的とすることによる遺伝子編集システムの検証
ここで提案する非遺伝子組換えＧＥシステムを、外来性遺伝子（ＧＦＰ）のＤＮＡを標的とすることにより検証し最適化した。異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ−ＩＩＩ）プロモーターの強さを分析するために、ｓｇＲＮＡを、上記ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９複合体中のｅＧＦＰを標的とするために設計し、次いで形質転換細胞においてｅＧＦＰ発現をノックアウトすることにおける異なるプロモーターの効果を試験した。
【０３２９】
具体的には、プラスミド（例えばｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１９）は、異なるｐｏｌ−ＩＩ及びｐｏｌ−ＩＩＩプロモーター（例えばＣＡＭＶ３５Ｓ、Ｕ６）によって駆動されるＣａｓ９、ｅＧＦＰ、ｄｓＲＥＤ、及びｓｇＲＮＡ−ＧＦＰを含有する４つの転写単位を含有していた。これらのプラスミドをプロトプラスト培養物にトランスフェクションし、２４〜７２時間のインキュベーション時間の後にＦＡＣＳにより分析した。ｄｓＲＥＤ（又はｍＣｈｅｒｒｙ、ＲＦＰ）発現における高頻度は、高いトランスフェクション効率を示し、ｅＧＦＰ発現における低頻度は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による成功裏の遺伝子編集を示した。それゆえ、最低のｅＧＦＰ：ｄｓＲＥＤ発現比を示した系統は、選んだｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターであった。というのも、それは、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９複合体による最高の割合のｅＧＦＰ不活化を引き起こしたからである。
【０３３０】
最終プラスミド設計
一過性発現のために、４つの転写単位を含有するプラスミドを使用した。第１転写単位は、Ｃａｓ９の発現を駆動するＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター及びタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）ターミネーターを含有していた。次の転写単位は、ｅＧＦＰの発現を駆動する別のＣａＭＶ−３５Ｓプロモーター及びｎｏｓターミネーターからなっていた。第３及び第４の転写単位は、各々、標的遺伝子に対するｓｇＲＮＡ（上述のように、各ベクターは、２つのｓｇＲＮＡを含む）を発現するシロイヌナズナＵ６プロモーターを含有していた。
【０３３１】
プロトプラスト単離
植物材料（例えば葉、カルス、細胞懸濁液）を、消化溶液（１％セルラーゼ、０．５％マセロザイム（ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ）、０．５％ドリセラーゼ（ｄｒｉｓｅｌａｓｅ）、０．４Ｍマンニトール、１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２）中、室温で４〜２４時間、ゆっくりと振盪しながらインキュベーションすることにより、プロトプラストを単離した。消化後、残りの植物材料をＷ５溶液（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）で洗浄し、プロトプラスト懸濁液を４０μｍ濾過器により濾過した。８０ｇで、室温、３分間の遠心分離の後、プロトプラストを２ｍｌのＷ５緩衝液に再懸濁し、氷中で重力により沈殿させた。最終のプロトプラストペレットを２ｍｌのＭＭｇ（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ  ＭａｇＣｌ２、４ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）に再懸濁し、血球計数器を使用してプロトプラスト濃度を決定した。プロトプラスト生存率をトリパンブルー染色を使用して推定した。
【０３３２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）媒介プラスミドトランスフェクション。バナナのプロトプラストのＰＥＧ−トランスフェクションを、Ｗａｎｇら（２０１５）［Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、Ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＰＥＧ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｇｒａｐｅ  ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｅｎｚｙｍｅｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉａ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｅ，２０１５．１９１：８２−８９頁］によって報告された戦略の改変版を使用して行った。プロトプラストをＭＭｇ溶液中で２〜５×１０６プロトプラスト／ｍｌの密度に再懸濁した。１００〜２００μｌのプロトプラスト懸濁液を、プラスミドが入っているチューブに加えた。プラスミド：プロトプラスト比は、形質転換効率に大きく影響を及ぼし、それゆえプロトプラスト懸濁液中のプラスミド濃度の範囲、５〜３００μｇ／μｌをアッセイした。ＰＥＧ溶液（１００〜２００μｌ）をこの混合物に加え、１０〜６０分の範囲の種々の長さの時間にわたり２３℃でインキュベーションした。ＰＥＧ４０００濃度を最適化し、２００〜４００ｍＭマンニトール、１００〜５００ｍＭ  ＣａＣｌ２溶液中の２０〜８０％ＰＥＧ４０００の範囲をアッセイした。次いで、このプロトプラストをＷ５中で洗浄し、８０ｇで３分間遠心分離し、予め１ｍｌ  Ｗ５に再懸濁し、暗所で２３℃でインキュベーションした。２４〜７２時間のインキュベーション後、蛍光を顕微鏡法により検出した。
【０３３３】
電気穿孔
関連する遺伝子（上記表２のリストを参照）を標的とするＰｏｌ２駆動ＧＦＰ／ＲＦＰ、Ｐｏｌ２駆動ＮＬＳ−Ｃａｓ９及びＰｏｌ３駆動ｓｇＲＮＡを含有するプラスミドを、電気穿孔（ＢＩＯＲＡＤ−ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒＩＩ；Ｍｉａｏ及びＪｉａｎ  ２００７  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２（１０）：２３４８−２３５３）を使用して上記細胞に導入した。５００μｌのプロトプラストを電気穿孔キュベットに移し、１００μｌのプラスミド（１０〜４０μｇ  ＤＮＡ）と混合した。プロトプラストを１３０Ｖ及び１，０００Ｆで電気穿孔にかけ、室温で３０分間インキュベーションした。１ｍｌのプロトプラスト培地を各キュベットに加え、このプロトプラスト懸濁液を小さいペトリ皿の中へと注ぎ込んだ。２４〜４８時間のインキュベーションの後、蛍光を顕微鏡法により検出した。
【０３３４】
蛍光タンパク質発現細胞のＦＡＣＳソーティング
プラスミド／ＲＮＡ送達から４８時間後に、細胞を収集し、そしてＧＦＰ／編集剤発現細胞について濃縮するためにフローサイトメーターを使用して蛍光タンパク質発現についてソートした［Ｃｈｉａｎｇ，Ｔ．Ｗ．ら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）  ｎｉｃｋａｓｅ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｔｏ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，２０１６．６：２４３５６頁］。この濃縮工程により、抗生物質選択を省略して、蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡを一過性に発現する細胞だけを収集することが可能になる。これらの細胞は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による標的遺伝子の編集及び対応する遺伝子発現の喪失についてさらに試験することができる。
【０３３５】
コロニー形成
蛍光タンパク質陽性細胞を一部サンプリングし、ＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験のために使用し、一部は液体媒体中において高希釈でプレーティングし、２８〜３５日間コロニー形成させた。コロニーを採集し、成長させ、２つのアリコートに分けた。１つのアリコートをＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験並びにＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリー試験（下記参照）のために使用し、他方をその状態が検証されるまで培養液中で保った。ＧＥ及びＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリーであることを明確に示すものだけを次の段階へと選択した。
【０３３６】
暗所で２０日後（ＧＥ分析のために分けてから、すなわち６０日目から。従って全体で８０日目）、グルコース（０．４６Ｍ）及び０．４％アガロースに減らしたこと以外は同じ培地にコロニーを移し、低照度でインキュベーションした。６週間後、アガロースをスライスし、０．３１Ｍグルコース及び０．２％ゲルライト（登録商標）を含むプロトプラスト培地に置いた。１ヶ月後、プロトコロニー（すなわちカルス）を再生培地（半分量ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）へと継代培養した。再生された栄養分体を低照度で２８℃の固体培地（０．８％寒天）に置いた。２ヶ月後、栄養分体を土壌に移し、８０〜１００％湿度の温室の中に置いた。
【０３３７】
遺伝子改変について及びＣＲＩＳＰＲシステムＤＮＡの不存在についてのスクリーニング
各コロニーから、ＤＮＡを、ＧＦＰソートしたプロトプラスト（任意の工程）のアリコートから、及びプロトプラスト由来のコロニーから抽出し、標的とした遺伝子に隣接しているプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施した。陽性コロニーを植物を再生するために使用することになるため、コロニーをサンプリングするために測定を行う。Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡを用いないこと以外は同じ方法に供したプロトプラスト由来の対照反応物を含め、これを野生型（ＷＴ）と考える。ＰＣＲ産物を、次に、ＷＴと比べて産物サイズの何らかの変化を検出するためにアガロースゲルで分離した。ＷＴ産物とは異なるＰＣＲ反応産物をｐＢＬＵＮＴ又はＰＣＲ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））にクローニングした。あるいは、シークエンシングを使用して、上記編集イベントを検証した。得られたコロニーを採集し、プラスミドを単離し、変異の性質を判定するために配列決定した。ＣＲＩＳＰＲシステムＤＮＡ／ＲＮＡを含まないことを検証するために、及びゲノムＤＮＡレベルで変異を検出するために、ドメイン変更又は対応するタンパク質の完全な喪失を生じると予測される変異を有するクローン（コロニー又はカルス）を全ゲノムシークエンシング用に選んだ。
【０３３８】
所望のＧＥを提示する陽性クローンを最初に顕微鏡法分析により（ＷＴと比べて）ＧＦＰ発現について試験した。次に、ＧＦＰ陰性植物を、Ｃａｓ９配列又はその発現カセットのいずれかの他の配列に特異的な（又は次世代シークエンシング、ＮＧＳ）プライマーを使用するＰＣＲによってＣａｓ９カセットの存在について試験した。上記構築物の他の領域も、もとの構築物の何もゲノムの中にはないことを確認するために試験できる。
【０３３９】
植物再生
エチレン産生：エチレン生合成は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又はレーザーベースのアッセイ（Ｃｒｉｓｔｅｓｃｕら、２０１３、前出）により小さい植物片において測定することができる。
【０３４０】
実施例２
バナナのＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子におけるゲノム編集並びに植物再生
【表１】
2020521512.tif 000002
【０３４１】
ｓｇＲＮＡｓ及び標的配列は図２６に記載している。
【０３４２】
マレーヤマバショウ細胞懸濁液からのプロトプラストの効率的な単離のためのロバストなプロトコルを、上記実施例１に従って行い、その後、目的の遺伝子（内在性のＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子）を標的とするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９機構を保有するプラスミドを用いてそのプロトプラストをトランスフェクションし、ＦＡＣＳソーティングを使用してレポーターを発現する細胞を濃縮する。この目的を果たすために、本発明者らは、（ｉ）胚形成材料を生成して維持し、（ｉｉ）その材料からプロトプラストを単離し、（ｉｉｉ）ＡＣＳ遺伝子及び／又はＡＣＯ遺伝子を標的とする特異的なプラスミドを用いてトランスフェクションし、（ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及び目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡを保有する細胞（例えば、ｍＣｈｅｒｒｙ）の代理としての蛍光マーカーを発現する細胞を濃縮し、（ｖ）ソートしたプロトプラストをプロトプラスト再生パイプラインに進め、栄養分体を再生した。
【０３４３】
マレーヤマバショウ植物材料由来の生存可能なプロトプラストを回収できるか否かを試験するために、バナナ植物の材料（細胞懸濁液）を、消化溶液中、室温で４〜２４時間、ゆっくりと振盪しながらインキュベーションした。消化後、この植物材料を洗浄し、濾過し、２ｍｌのＭＭＧ緩衝液（０．４Ｍマンニトール、１５ｍＭ  ＭａｇＣｌ２、４ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ５．６）に再懸濁した。プロトプラスト濃度を決定し、１×１０６に調整した。次に、ＤＮＡプラスミドｐＡＣ２０１０（蛍光マーカーとしてのｍＣｈｅｒｒｙを保有する）を、バナナ由来のプロトプラストとともにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下でインキュベーションした。このプロトプラスト中のｍＣｈｅｒｒｙの発現を、トランスフェクション後３日目に蛍光顕微鏡により検出した（図３）。
【０３４４】
遺伝子編集した植物を回収することにおける次の工程は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及び目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをバナナプロトプラスト中に送達し、そのような複合体を保有する細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により濃縮し、これにより、一過性に上記蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及び上記ｓｇＲＮＡを発現する成功裏にトランスフェクションしたバナナ細胞を分離することである。ＦＡＣＳを使用して、陽性のｍＣｈｅｒｒｙ発現プロトプラストを濃縮し収集した（図４Ａ）。ソートしたプロトプラストはまだインタクトであり、蛍光顕微鏡によると実際に蛍光マーカーを発現する（図４Ｂ）ことを確認した。
【０３４５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びマレーヤマバショウプロトプラスト中の目的の遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡのトランスフェクションの一過性を、次に調べた。本発明者らのすべてのプラスミドは蛍光マーカー（例えばｄｓＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ）、Ｃａｓ９、及びｓｇＲＮＡｓ（Ｕ６プロモーターに制御され、目的の内在性遺伝子を標的とする）からなっているため、トランスフェクションしたバナナプロトプラストにおける上記蛍光マーカーの発現を経時的に観察し、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの数を、どのくらい長くＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びｓｇＲＮＡが発現されうるかの指標を得るための代理として使用した（図５Ａ〜図５Ｃ）。ＦＡＣＳを使用して、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストの百分率を経時的に定量し、トランスフェクション後３日目（３ｄｐｔ）のｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストの総数を１００％に設定した。すでに１０ｄｐｔで、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストは、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストの初期数の３０％が減少し、２５ｄｐｔまでに、トランスフェクションしたバナナプロトプラストのほぼ８０％が何らの蛍光も示さないということが見出された（図５Ｃ）。ソートしなかったバナナプロトプラストにおいても、３ｄｐｔ（図５Ａ；図６Ａ）、６ｄｐｔ（図６Ａ）及び１０ｄｐｔ（図５Ｂ；図６Ａ）で顕微鏡法によりｍＣｈｅｒｒｙ発現をモニタリングし、これにより実際にｍＣｈｅｒｒｙ発現が経時的に減少することを確認した。さらに、ソートしたバナナプロトプラストの蛍光顕微鏡は、ＦＡＣＳ（図４Ａ）によって見られるように、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストの数及び強度の漸進的な減少（図６Ｂ）を示す。すべてを合わせて考慮すると、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体及びｓｇＲＮＡを保有するベクターの発現は一過性であり、さらなるＣａｓ９活性又は植物ゲノムへの組み込みは予想されないということを示す。
【０３４６】
バナナ植物においてエチレンレベルを低下させることはバナナ果実の貯蔵寿命の延長をもたらす可能性があるが、バナナ植物においてエチレンレベルを低下させるために、エチレンの生合成に関与する遺伝子、例えばハイライトしたＡＣＳ及びＡＣＯ（図７Ａ、図７Ｂ）のノックアウトを試みた。しかしながら、バナナゲノムは、これらの遺伝子に相同的である複数の配列を含有する。
【０３４７】
機能的なＡＣＳ及びＡＣＯをコードするバナナゲノム内の遺伝子を特定するために、モデル又は作物種における特徴づけられた経路由来の相同配列が特定された。このプロセスは、系統発生解析により遺伝子の進化歴を再構築すること、一般組織及び標的組織における候補の発現を検証することにより候補を選別すること、及び適切なｓｇＲＮＡ設計を確実にするために（ミスマッチを回避するために）候補遺伝子をシークエンシングすること目指す、ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の比較分析のための一連の逐次的工程を伴う。この手順により、遺伝子の選択、ノックアウトのための最適化された標的領域（保存的かつ潜在的に触媒的なドメイン）の特定、及び適切なｓｇＲＮＡの設計が可能になった。
【０３４８】
このパイプラインは、共通の祖先を持つ相同タンパク質は類似の機能を有する可能性があり、系統発生的再構築を行うことにより、遺伝子ファミリーが確立され進化の文脈における機能的多様性について評価されるとの仮定に基づく。これは、大規模のゲノム重複を経験した植物種及び発展した遺伝子ファミリーにとって特に重要である。しかしながら、遺伝子ファミリー内のパラログは、必ずしも同じ機能を有さず、そしてこのプロセスの一部は、ファミリー内の遺伝子の選択物を、個々に又は重複性をも考慮するための群として標的とすることになる。
【０３４９】
手短に言えば、エチレンの合成には、３工程反応が関与する。酵素Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ（Ｓ−ＡｄｏＭｅｔ）はメチオニンのアデノシル化を触媒する。次いで、Ｓ−ＡｄｏＭｅｔは、酵素ＡＣＣシンターゼ（ＡＣＳ）によりエチレン生合成に関わる第１化合物、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）へと代謝される。最後に、ＡＣＣは、酵素ＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）によりエチレンへと変換される（図７Ａ）（Ｃａｒａ及びＧｉｏｖａｎｎｏｎｉ．２００８．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．第１７５巻、１０６−１１３頁）。追熟の間、バナナのようなクリマクテリック型果実では、ＡＣＣシンターゼ（ＡＣＳ）及びＡＣＣオキシダーゼ（ＡＣＯ）の両方が誘導され、エチレン生合成の調節に寄与する（図７Ｂ）（Ｌｉｕら、１９９９．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ．第１２１巻、１２５７−１２６５頁）。エチレンの制御は２システムプロセスとして提案されており、このプロセスでは、システム１は正常な栄養成長の間は機能的であり、エチレンは自己抑制的な役割を有し、非クリマクテリック型果実の組織を含めすべての組織で検出される基礎的なエチレンレベルを産生することに関与するのに対して、システム２は、クリマクテリック型果実の追熟及びおそらく老化のあいだ機能する（図７Ａ〜図７Ｂ）。移行段階では、ＲＩＮ、ＣＮＲ等の追熟調節遺伝子が特定されており、システム１に対する負のフィードバックをもたらすエチレンの自己触媒反応につながる特異的なＡＣＳ遺伝子（ＬｅＡＣＳ４）の誘導も特定されている。加えて、他のＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子（ＬｅＡＣＳ２、４及びＬｅＡＣＯ１、４）が誘導され、これらはシステム２を介する高エチレン産生に関与する（図７Ａ）（Ｃａｒａ及びＧｉｏｖａｎｎｏｎｉ．２００８．Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．第１７５巻、１０６−１１３頁）。
【０３５０】
マレーヤマバショウの全ゲノム配列解析は、バショウ属系統における特定の祖先の全ゲノム重複（ＷＧＤ）及び遺伝子分画（ｇｅｎｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）に対するその影響を明らかにした（Ｄ’Ｈｏｎｔら、２０１２．Ｎａｔｕｒｅ．第４８８巻；Ｍａｒｔｉｎら、２０１６．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１７：２４３）。さらに、エチレン生合成及びシグナル伝達に関与するいくつかのバナナ遺伝子ファミリーがＷＧＤを通して進化し、優先的に保持されたことが報告されている（Ｊｏｕｒｄａら、２０１４．Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．第２０２巻、９８６−１０００頁）。興味深いことに、このエチレン経路における主要遺伝子は発展し、遺伝子発現プロファイルはＷＧＤ由来の遺伝子のうちのいくつかについての機能的重複性を示唆した（Ｊｏｕｒｄａら、２０１４．Ｎｅｗ  Ｐｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔ．第２０２巻、９８６−１０００頁）。それゆえ、候補遺伝子の選択には慎重な評価が必要である。
【０３５１】
エチレン生合成経路は、トマトにおいて十分に研究されており、システム１及び２に添う工程に関与するＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子が特徴付けられている。これらの特徴付けられた遺伝子をクエリ配列として使用した。これらの遺伝子は、ＡＣＳ及びＡＣＯについてそれぞれ図９及び図１０でハイライトされている。類似性検索は、ＡＣＳファミリー及びＡＣＯファミリーの両方がバナナに存在することを明らかにし（それぞれ図８、図９）、いくつかのＡＣＳ及びＡＣＯの遺伝子候補をさらなる研究のために選択した。明確に異なるバナナ変種におけるこれらの候補のシークエンシングにより、図１０に示すｓｇＲＮＡの具体的な設計及び選択が可能になった。加えて、これらの遺伝子の可能性のある役割に関するいくらかの見通しを得るために、追熟するバナナ果実の公開されている発現データをすべてのＡＣＳ及びＡＣＯの候補遺伝子（ＡＣＳ：Ｍａ０９＿ｇ１９１５０；Ｍａ０４＿ｇ３５６４０；Ｍａ０４＿ｇ３１４９０。ＡＣＯ：Ｍａ０１＿ｇ１１５４０；Ｍａ０７＿ｇ１９７３０）（それぞれ図１１及び図１２）について検索した。バナナトランスクリプトームデータベースからの各遺伝子のＲＰＫＭデータは、ＡＣＳ  Ｍａ０４＿ｇ３５６４０及びＡＣＯ  Ｍａ０７＿ｇ１９７３０がエチレン生合成を低下させるために標的とすべき候補遺伝子であることを示した（それぞれ図１１及び図１２）。本発明の実施形態は、ロバストな表現型を得るために他のＡＣＯ遺伝子及び／又はＡＣＳ遺伝子を標的とすることも想定する。
【０３５２】
ＡＣＳ遺伝子（Ｍａ０９＿ｇ１９１５０；Ｍａ０４＿ｇ３５６４０；Ｍａ０４＿ｇ３１４９０）を、図１３Ａ、図１４Ａ及び図１５Ａに示す２対のｓｇＲＮＡを用いて標的とした。これらのｓｇＲＮＡは、上記候補遺伝子のエクソン１とエクソン３との間に位置し、これらの領域は、すべての３つの候補遺伝子の中で高度に保存されているため、選択した。同様に、ＡＣＯ遺伝子（Ｍａ０１＿ｇ１１５４０；Ｍａ０７＿ｇ１９７３０）を、図６Ａ及び図１７Ａに示す２対のｓｇＲＮＡを用いて標的とした。これらのｓｇＲＮＡは上記２つの候補遺伝子のエクソン１とエクソン４との間に位置し、それらｓｇＲＮＡは各遺伝子について個々に設計されているが、トランスフェクションプラスミドにおいて組み合わされる。ｓｇＲＮＡを、Ｕ６  ｐｏｌ３プロモーターによって駆動されるｍＣｈｅｒｒｙ、Ｃａｓ９、及び２つのｓｇＲＮＡを含有するトランスフェクションプラスミドにクローニングした。
【０３５３】
次に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体並びにＡＣＳ候補遺伝子及びＡＣＯ候補遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡをバナナプロトプラストにトランスフェクションし、そのような複合体を保有する細胞を蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）により濃縮した。ｍＣｈｅｒｒｙマーカーを使用して、トランスフェクション後３日目（３ｄｐｔ）に、上記蛍光タンパク質、Ｃａｓ９及び上記ｓｇＲＮＡを一過性に発現するトランスフェクションしたバナナ細胞を分離し、ソートし、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性バナナプロトプラストを収集した。６ｄｐｔに、５０００個のソートしたプロトプラストからＤＮＡを抽出した（Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｎ  Ｄｎｅａｓｙ抽出キット）。図１３Ａ、図１４Ａ、図１５Ａ、図１６Ａ、図１７Ａに示すプライマーを使用して感度向上のためにネステッドＰＣＲを実施した。すべての候補ＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子についての増幅した領域のアガロースゲルを図１３Ｂ、図１４Ｂ、図１５Ｂ、図１６Ｂ、図１７Ｂに示す。ＡＣＯ遺伝子Ｍａ０１＿ｇ１１５４０についてだけ、約３５０ｂｐの明確な欠失が認められる（図１７Ｂ）。
【０３５４】
上記ｓｇＲＮＡ及び上記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体が活性であり、すべての他のＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子においてゲノム編集イベントを誘導するか否かを評価するために、Ｔ７Ｅ１アッセイを実施した。すべてのｓｇＲＮＡの組み合わせがすべてのＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子（ＡＣＳ：Ｍａ０９＿ｇ１９１５０；Ｍａ０４＿ｇ３５６４０；Ｍａ０４＿ｇ３１４９０。ＡＣＯ：Ｍａ０１＿ｇ１１５４０；Ｍａ０７＿ｇ１９７３０）においてゲノム編集イベントを誘導するということを見出した（図１３Ｃ、図１４Ｃ、図１５Ｃ、図１６Ｃ、図１７Ｃ）。さらに、クローニング及びシークエンシングにより、上記遺伝子のいくつかについてのＴ７Ｅ１結果を確認し、使用したｓｇＲＮＡのうちのいくつかは、図１３Ｄ、図１５Ｄ、図１８、図１９、図２０Ａ、図２０Ｂに示すように、実際にインデルを誘導するということを見出した。結論として、これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、内在性のＡＣＳ遺伝子及びＡＣＯ遺伝子に精密な変異を導入するために成功裏に使用できること、及びｓｇＲＮＡの設計及び選択がゲノム編集の効率に影響することを明らかにする。
【０３５５】
並行して、さらなるソートしたｍＣｈｅｒｒｙ陽性プロトプラストをプロトプラスト再生に進めた。手短に言えば、ソートしたプロトプラストを液体媒体中において高希釈でプレーティングし、２８〜３５日間コロニー形成させた。コロニーを採集し、成長させ、２つのアリコートに分けた。１つのアリコートをＤＮＡ抽出及びゲノム編集（ＧＥ）試験並びにＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリー試験のために使用し、他方をその状態が検証されるまで培養液中で保った。ＧＥ及びＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡフリーであることを明確に示すものだけを次の段階へと選択した。
【０３５６】
暗所で２０日後（ＧＥ分析のために分けてから、すなわち６０日目から。従って全体で８０日目）、グルコース（０．４６Ｍ）及び０．４％アガロースに減らしたこと以外は同じ培地にコロニーを移し、低照度でインキュベーションした。６週間後、アガロースをスライスし、０．３１Ｍグルコース及び０．２％ゲルライト（登録商標）を含むプロトプラスト培地に置いた。１ヶ月後、プロトコロニー（すなわちカルス）を再生培地（半分量ＭＳ＋Ｂ５ビタミン、２０ｇ／ｌスクロース）へと継代培養した。（図２３Ａ〜図２３Ｅ）。次に、成熟胚をＭＳ塩及びビタミンを含有する発芽培地（ＧＭ）に通し、この培地でこの胚は、移動から１〜２週間後に発芽し始める。３〜４週間後、発芽胚は苗条の伸長のための増殖培地に移される準備が整っている（図２４Ａ〜Ｄ）。
【０３５７】
加えて、バナナ胚形成細胞懸濁液（ＥＣＳ）を、貯蔵寿命を延ばすために、トランスフェクションのために使用したのと同じプラスミド（ｐＡＣ２００７、ｐＡＣ２００８、ｐＡＣ２０１０、ｐＡＣ２０１１、及びｐＡＣ２０１２）で撃ち込んだ。撃ち込み後３日齢のＥＣＳ、細胞を増殖培地に移し、撃ち込んだＥＣＳから胚が発生するにつれて、胚を胚発生培地（ＥＤＭ）及び成熟培地（図２５Ａ〜Ｅ）に通した。
【０３５８】
本発明がその特定の実施形態と併せて説明されたが、多くの代替、改変及び変更が当業者に明らかであろうことは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨及び幅広い範囲に入るすべてのそのような代替、改変及び変更を包含することが意図されている。
【０３５９】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願がそれぞれ具体的に及び個々に参照により本明細書に援用されると示されているのと同じ程度に、参照によりその全体が本明細書に援用される。加えて、本願でのあらゆる参考文献の引用又は特定は、そのような参考文献は本発明の先行技術として利用できるということの自白とは解釈されないものとする。節の見出しが使われているところでは、それらは、必ずしも限定するものではないと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ−２４Ｄ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２６（１）】
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【図２６（２）】
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【図２６（３）】
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【図２６（４）】
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【図２６（５）】
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【図２６（６）】
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【図２６（７）】
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【図２６（８）】
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【図２６（９）】
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【図２６（１０）】
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【図２６（１１）】
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【図２６（１２）】
2020521512.tif 000059
【図２６（１３）】
2020521512.tif 000060
【図２６（１４）】
2020521512.tif 000061
【図２６（１５）】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020521512.tif 000064
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