(57)【要約】  本発明は、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム送達システム、その調製方法および使用を提供する。前記セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、活性化ＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドである。このセラソーム送達システムは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療に用いられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、活性化ＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドである、ことを特徴とする、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム送達システム。
【請求項２】
前記セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドであることを特徴とする、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システム。
【請求項３】
表面がターゲティングリガンドによって部分的に修飾されるセラソーム小胞を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のセラソーム送達システム。
【請求項４】
前記セラソーム小胞は、内部に親水性空洞を有する脂質二重層からなる閉鎖小胞であり、この小胞の表面は、無機ポリシロキサン網状構造およびカップリングされたターゲティングリガンドを有することを特徴とする、請求項３に記載のセラソーム送達システム。
【請求項５】
前記脂質二重層は、セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子とを含む成分により形成されることを特徴とする、請求項４に記載のセラソーム送達システム。
【請求項６】
前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子との重量比は、１〜１０：０．２〜１：１〜９、または３〜７：０．５〜１：１．５−２．５、または４〜６：０．５：２であることを特徴とする、請求項５に記載のセラソーム送達システム。
【請求項７】
前記セラソーム単量体分子は、セラソームを形成できる無機−有機複合脂質分子であり、前記無機−有機複合脂質分子は、シロキサン構造を有する頭部と疎水性尾部で構成され、この疎水性尾部は疎水性有機二分子鎖であることを特徴とする、請求項５または６に記載のセラソーム送達システム。
【請求項８】
前記セラソーム単量体分子は、以下の一般式を有する単量体分子であり、
（Ｒ１Ｏ）３Ｓｉ−Ｌ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）
ただし、
Ｒ１はＣ１−６アルキルを表し、
Ｌは、４〜１２個の炭素原子（好ましくは４〜１０個の炭素原子）および１〜２個の窒素原子からなるリンカーであり、ここで、以下の条件下で、前記リンカーにける０〜１個の炭素原子はオキソ基で置換され、つまりカルボニル基が形成され、条件（１）：前記リンカーにカルボニル基が存在する場合、このカルボニル基が窒素原子に隣接し；条件（２）：前記リンカーにおける１個の窒素原子が四級化され、且つこの四級化された窒素原子が適合な対イオンと塩を形成し、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立してＣ１０−２４アルキル又はＣ１０−２４アルケニルを表す、
ことを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項９】
前記セラソーム単量体分子は、
【化１】
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、
【化２】
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、および
【化３】
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から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１０】
前記脂質二重層の成分は他の脂質分子を含むことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１１】
前記他の脂質分子は、中性リン脂質、負に帯電したリン脂質、および正に帯電した脂質から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１２】
前記他の脂質分子は正に帯電した脂質であることを特徴とする、請求項１０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１３】
前記正に帯電した脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）および１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）から選択される１つ以上であり、好ましくは１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）であることを特徴とする、請求項１２に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１４】
前記脂質は、ホスファチジルコリン、グリセロリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セリンホスファチド、およびホスファチジン酸から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１５】
前記他の脂質分子はホスファチジルコリンであることを特徴とする、請求項１０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１６】
前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、５０ｎｍ〜４００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜３００ｎｍであり、好ましくは１５０ｎｍ〜２５０ｎｍであり、１８０ｎｍ〜２２０ｎｍであることを特徴とする、請求項３〜１５のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１７】
前記ターゲティングリガンドは、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、およびモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、ＩＭ７、或いは、ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体から選択されることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１８】
前記ターゲティングリガンドは、分子量が５万〜４０万Ｄａであり、好ましくは８万〜１５万Ｄａであり、好ましくは約１０万Ｄａであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１９】
前記セラソームは、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患の診断、予防および／または治療のための物質を担持することを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２０】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質を担持することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２１】
前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラークに関連する疾患の診断、予防および／または治療のための薬物、ペプチド、核酸、およびサイトカインから選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項２０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２２】
前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質であることを特徴とする、請求項２０に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２３】
前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質はトレーサーであることを特徴とする、請求項２２に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２４】
前記トレーサーは、ＣＴ用トレーサーおよびＭＲＩ用トレーサーから選択されることを特徴とする、請求項２３に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２５】
前記ＣＴ用トレーサーは、ヨード系ナノスケール造影剤、金系ナノスケール造影剤、酸化タンタル系ナノスケール造影剤、ビスマス系ナノスケール造影剤、ランタニド系ナノスケール造影剤、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され、
好ましくは、ヨード系ナノスケール造影剤、または金系ナノスケール造影剤、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され、
好ましくは、イオヘキソール、イオカルミン酸、イオベルソール、イオジキサノール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロル、イオパミドール、イオキシラン、アセトリゾ酸、イオジパミド、イオベンザミン酸、イオグリカミン酸、ジアトリゾ酸、イオタラム酸ナトリウム、パントパック、イオパン酸、ヨードアルフィオン酸、アセトリゾ酸ナトリウム、ナトリウムヨードメサメート（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｏｍｅｔｈａｍａｔｅ）、プロピリオドン、ジオドン、イオトロラン、イオピドール、エンドグラフィン（ｅｎｄｏｇｒａｆｉｎ）、イオタラム酸、メグルミンジアトリゾエート、メトリゾ酸、メトリザミド、ヨウ素化油またはエチヨード化油、或いは類似の構造を有する他のトレーサーから選択される、ことを特徴とする、請求項２４に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２６】
前記ＭＲＩ用トレーサーは、縦緩和造影剤および横緩和造影剤から選択されることを特徴とする、請求項２４に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２７】
前記ＭＲＩ用トレーサーは、常磁性造影剤、強磁性造影剤および超常磁性造影剤から選択されることを特徴とする、請求項２４に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２８】
前記ＭＲＩ用トレーサーは、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびその線状や環状のポリアミンポリカルボキシレートキレート、およびそのマンガンポルフィリンキレート、高分子ガドリニウムキレート、生体高分子修飾ガドリニウムキレート、葉酸修飾ガドリニウムキレート、デンドリマー造影剤、リポソーム修飾造影剤およびガドリニウム含有フラーレン、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され
好ましくは、ガドペンテト酸メグルミン、ガドテル酸メグルミン、ガドベン酸ジメグルミン、ガドジアミド、クエン酸鉄アンモニウム発泡顆粒、常磁性酸化鉄、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択されることを特徴とする、請求項２４に記載のセラソーム送達システム。
【請求項２９】
前記物質は、ＣＤ４４活性化剤であり、
好ましくは、ＣＤ４４抗体ｍＡｂ、またはＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ−α、ＬＰＳであることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３０】
前記物質は、分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である、低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体であり、
好ましくは、前記低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体は、分子量が２５００〜４５００Ｄａの範囲であり、好ましくは３０００〜４０００Ｄａの範囲であり、好ましくは３４１１Ｄａであることを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３１】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質、およびＣＤ４４活性化剤を同時に担持することを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３２】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、および分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持することを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３３】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断のための物質、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、必要に応じてＣＤ４４活性化剤、および必要に応じて分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持することを特徴とする、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３４】
前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質であり、
好ましくは、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質が、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害剤、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰｓ阻害剤、β受容体遮断薬、および上記薬物の活性構造フラグメントを含むそれらの薬学的に許容される塩から選択される１つ以上であり、
好ましくは、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質が、ロバスタチン；アトルバスタチン；ロスバスタチン；シンバスタチン；フルバスタチン；ピタバスタチン；プラバスタチン；ベザフィブラート；シプロフィブラート；クロフィブラート；ゲムフィブロジル；フェノフィブラート；プロブコール；エボロクマブ、アリロクマブ、ボコシズマブ、ＲＧ７６５２、ＬＹ３０１５０１４およびＬＧＴ−２０９などの抗ＰＣＳＫ９抗体；ＡＬＮ−ＰＣＳｓｃなどのアンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチド；ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３３ａ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２７ａ／ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０６ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−７５８、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１９ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２６、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−９３、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２８−２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４４、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４５アンチセンス鎖およびロックド核酸のようなそれらの核酸類似体などの核酸；またはＢＭＳ−９６２４７６などのアドネクチン；アセメタシン；トロキセルチン；ジピリダモール；シロスタゾール；チクロピジン塩酸塩；オザグレルナトリウム；クロピドグレル；プラスグレル；シロスタゾール；チロフィバン；ベラプロストナトリウム；チカグレロル；カングレロル；チロフィバン；エプチフィバチド；アブシキシマブ；ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬；未分画ヘパリン；クレキサン；フラキシパリン；フォンダパリヌクスナトリウム；ワルファリン；ダビガトラン；リバロキサバン；アピキサバン；エドキサバン；ビバリルジン；エノキサパリン；テデルパリン；アルデパリン；ビスヒドロキシクマリン；硝酸クマリン；クエン酸ナトリウム；ヒルジン；アルガトロバン；ベナゼプリル；カプトプリル；エナラプリル；ペリンドプリル；フォシノプリル；リシノプリル；モエキシプリル；シラザプリル；ペリンドプリル；キナプリル；ラミプリル；トランドラプリル；カンデサルタン；エプロサルタン；イルベサルタン；ロサルタン；テルミサルタン；バルサルタン；オルメサルタンまたはタソサルタン；ニフェジピン；ニカルジピン；ニトレンジピン；アムロジピン；ニモジピン；ニソルジピン；ニルバジピン；イスラジピン；フェロジピン；ラシジピン；ジルチアゼム；ベラパミル；クロルヘキシジン；ミノサイクリン；ＭＭＩ−１６６；メトプロロール；アテノロール；ビソプロロール；プロプラノロール；カルベジロール；バチマスタット；マリマスタット；プリノマスタット；ＢＭＳ−２７９２５１；ＢＡＹ  １２−９５６６；ＴＡＡ２１１；ＡＡＪ９９６Ａ；ナセトラピブ；エバセトラピブ；トルセトラピブおよびダルセトラピブ；ならびに、それらの有効なフラグメントまたは薬学的に許容される塩、および上記薬物の活性構造フラグメントを含む薬学的に許容される塩からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項１９〜２２または３１〜３３のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムおよび薬学的に許容される担体を含む薬物。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム含む診断用製剤。
【請求項３７】
ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患の予防および／または治療のための薬物の調製への、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムの使用。
【請求項３８】
不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための薬物の調製への、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムの使用
【請求項３９】
不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断のための診断用製剤の調製への、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムの使用
【請求項４０】
前記不安定プラークは、破綻したプラーク、びらんを起こしたプラーク、および部分的に石灰化した結節性病変から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記不安定プラーク関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血−潜在性冠状動脈性心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎動脈アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症を含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、心原性ショックから選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項３８または３９に記載の使用。
【請求項４２】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムを投与することを含む、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患を予防および／または治療する方法。
【請求項４３】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムを投与することを含む、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を予防および／または治療する方法。
【請求項４４】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムを投与することを含む、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患を診断する方法。
【請求項４５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムを投与することを含む、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断する方法。
【請求項４６】
前記不安定プラークは、破綻したプラーク、びらんを起こしたプラーク、および部分的に石灰化した結節性病変から選択される１つ以上である、請求項４３または４５に記載の方法
【請求項４７】
前記不安定プラーク関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血−潜在性冠状動脈性心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎動脈アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症を含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、心原性ショックから選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項４３または４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的指向性薬物送達の技術分野に属し、具体的に、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム（ｃｅｒａｓｏｍｅ）送達システム、特に不安定プラーク（ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）を標的とするセラソーム送達システムに関する。さらに、本発明は、前記セラソーム送達システムの調製方法および使用、特に不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、主に急性心筋梗塞と心臓突然死を伴う急性心血管イベントは、人間の健康にとって最大の脅威となっている。統計によると、世界中で毎年約２０００万人が急性心血管イベントで死亡している。中国での状況も楽観的ではない。毎年７０万人以上が急性心筋梗塞と心臓突然死で亡くなり、これは中国人の健康を脅かす最も注目すべき病気の１つとなっている。研究では、ほとんどの急性心筋梗塞および心臓突然死は、アテローム性動脈硬化プラークによって引き起こされることが示された。１９７０年代以来、慢性アテローム性動脈硬化プラークによる急性冠症候群（ＡＣＳ）および脳卒中の発生過程とメカニズムを模索してきた。
【０００３】
１９８９年、Ｍｕｌｌｅｒのグループ（Ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ｏｆ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１９８９；７９（４）：７３３−４３）は、「不安定プラーク」の概念を提案し、このような「プラーク」がほとんどの急性心血管および脳血管イベントの根本的な原因であると認定した。不安定プラーク（「ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ」や「ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ」とも呼ばれる）とは、血栓を形成する傾向があるか、または「犯罪プラーク（ｃｒｉｍｉｎａｌ  ｐｌａｑｕｅ）」に急速に進行する可能性が高いアテローム性動脈硬化プラークを指し、主に破綻したプラーク、びらんを起こしたプラーク、および部分的に石灰化した結節性病変を含む。多数の研究により、ほとんどの急性心筋梗塞および脳卒中は、軽度から中程度の狭窄を有する不安定プラークの破裂と、それに続く血栓の形成によって引き起こされることが示されている。Ｎａｇｈａｖｉのグループ（Ｎｅｗ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ．Ｃｕｒｒ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ  Ｒｅｐ．２００１；３（２）：１２５−３５）は、不安定プラークの組織学的定義と基準を提供した。主な基準には、活動性炎症、薄い線維性被膜と大きな脂質コア、表面での血小板凝集を伴う内皮剥離、プラークの亀裂または損傷、および重度の狭窄が含まれる。副次的な基準には、表面石灰化プラーク、光沢を有する黄色プラーク、プラーク内出血、および陽性リモデリングが含まれる。したがって、不安定プラークに対して、早期の介入が不可欠である。しかし、不安定プラークによる血管狭窄の程度は、通常高くないため、多くの患者が前駆症状を示さない。このため、臨床における不安定プラークの早期診断は非常に難しく、不安定プラークの危険性は非常に高い。従って、如何に不安定プラークをできるだけ早く正確に特定および診断して、効果的な介入を実施することは、急性心筋梗塞の予防と治療における早急に解決すべき課題となっている。
【０００４】
現在、一般的に不安定プラークの診断に用いられる技術は、主に冠動脈造影法、血管内超音波（ＩＶＵＳ）、光干渉断層法（ＯＣＴ）などを含むが、これらの技術は、いずれも診断感度および精度の低い侵襲的検査であるだけでなく、これらの診断技術は費用が高く、ある程度臨床的な普及を制限する。したがって、現在、不安定プラークに対する非侵襲的な診断技術や製剤が必要である。
【０００５】
また、不安定プラークを治療する方法は、主に全身投与によるものであり、例えば、スタチン系薬物（ヒドロキシメチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤）、アスピリン、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）阻害剤および／またはフィブラートなどの経口投与が挙げられる。これらの薬物は、全身の血中脂肪の調節、炎症の抑制、プロテアーゼおよび血小板産生の抑制などによって、プラークにおける脂質を減らし、血管のリモデリングを改善し、プラークを安定化するように作用する。しかしながら、臨床応用では、不安定プラークを治療するための現在の薬物の治療効果は満足できない。例えば、臨床で一般的に使用されるスタチン系薬物は、経口投与時の生物学的利用能が比較的低く、シンバスタチンでは５％未満であり、アトルバスタチンでは約１２％であり、ロスバスタチンでは約２０％である。動物実験において、スタチン系薬物の投与量を１ｍｇ／ｋｇ以上に増やした場合のみに、線維性被膜の厚さを増加させ、プラークの体積を減少させる役割を果たした。これにより、スタチンの経口投与の安定性とプラークの反転の効果がボトルネックになった。現在、臨床試験において、スタチン系薬物の経口投与による脆弱性プラークの治療には、不安定プラークを安定化させるために集中的な大量投与が必要であるが、全身的なスタチン系薬物の大量投与による治療は、重篤な副作用（例えば、肝機能異常、横紋筋融解症、ＩＩ型糖尿病など）の発生率が増加するリスクもあることが確認された。
【０００６】
全身投与では、通常、薬物が体内に入った後、活性成分のごく一部のみが実際に病変部位に作用できる。これは、薬物の有効性を制限し、副作用を引き起こす根本的な原因である。標的指向性薬物送達システムとは、標的指向性薬物送達能力を有する薬物送達システムを指す。特定の経路を介して投与される後、標的薬物送達システムに含まれる薬物は、標的プローブを有する担体によって標的部位で特異的に濃縮される。標的指向性薬物送達システムにより、薬物は、特定の病変部位を標的とし、標的病変部位で有効成分を放出することができる。したがって、標的指向性薬物送達システムは、標的病変部位に比較的高濃度の薬物をもたらし、血液循環中の薬物の量を減らすことで、副作用を抑えながら薬物の効果を改善し、正常な組織や細胞への損傷を減らす。
【０００７】
現在、標的指向性薬物送達システムで一般的に使用されるナノキャリアは、リポソームである。リポソームは、薬物の効果を改善して副作用を減らすという利点があるが、生体内での安定性が低いため循環時間が不十分であり、最終的に薬物の生物学的利用能の向上に限界がある。また、リポソームは、生体外での安定性も不十分であり、保存中のリン脂質の酸化や加水分解を容易に引き起こし、且つリポソーム小胞同士が互に凝集して融合しやすく、その中に封入された薬物が漏れやすいという問題がある。これらの問題は、標的指向性薬物送達システムの開発をある程度制限する。
【０００８】
さらに、不安定プラークの診断および治療の分野では、ナノキャリアをターゲティングリガンドで修飾することにより不安定プラークを診断する技術もある。しかし、臨床応用において、このような不安定プラークを標的とする標的プローブの主要な問題は、標的部位に対するこれらの製剤の特異性が十分ではないことである。例えば、このような製剤は、ほとんどマクロファージを標的部位として選択するが、マクロファージは全身に存在するため、前記プローブの標的特異性は十分ではない。したがって、不安定プラークを標的とする標的指向性製剤の開発の難しさは、不安定プラーク内の細胞に顕著な標的特異性を持つ標的部位の発見にある。
【０００９】
ＣＤ４４は、リンパ球、単球、内皮細胞などの表面に広く分布する接着分子である。ＣＤ４４分子の主なリガンドは、ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、「ＨＡ」と略される）である。発現細胞の活性化状態に基づいて、ＣＤ４４は、相対的な静止状態（ＨＡに結合できない）、誘導された活性化状態（活性化した後にＨＡに結合できる）、および構造的に活性化された状態（活性化しなくてもＨＡに結合できる）に分類することができる。ほとんどの正常細胞の表面のＣＤ４４は、相対的な静止状態となり、ＨＡに結合できない。
【００１０】
以前の大量の研究は、ＣＤ４４が顕著な標的特異性を有する理想的な標的部位ではないことを示した。これは、ＣＤ４４が人体内に、特に細網内皮に富む器官の表面に広く分布しているためである。したがって、ＣＤ４４を標的部位とする標的指向性薬物送達システムの開発では、標的細胞の表面のＣＤ４４がＨＡに対する親和性が不十分で顕著な特異性を提供できなければ、そのような標的指向性薬物送達システムは特異的な標的特性を持たないという問題がある。
【００１１】
したがって、不安定プラークに存在する特定の標的部位および不安定プラークの標的化に適した標的指向性化薬物送達システムを見つけることにより、不安定プラークを特異的に標的としながら、薬物の安定かつ持続的な放出を達成できる標的指向性薬物送達システムを開発することが、医療分野で解決すべき技術的問題となっている。
【００１２】
今まで、主に不安定プラーク内に存在するマクロファージ、単球、内皮細胞、リンパ球および平滑筋細胞の表面におけるＣＤ４４の発現状態またはＨＡに対する親和性に関する報告がない。また、ＨＡとＣＤ４４との相互作用および不安定プラークの特定の微小環境のいずれかを利用して、薬物の安定かつ持続的な放出を達成しながら、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断または治療する標的薬物送達システムの設計に関する先行技術もない。
【発明の概要】
【００１３】
（１）発明の概要
本発明者らは、正常細胞と比較して、不安定プラークにおける内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの細胞の表面のＣＤ４４が、不安定プラークの微小環境（炎症因子など）によって活性化されるため、ＨＡへの結合能力は数十倍に急増することを発見した。この発見は、不安定プラークにおける細胞表面に存在する大量の活性化ＣＤ４４分子が、ＨＡをターゲティングリガンドとする標的指向性薬物送達システムの理想的な標的部位を提供することを示唆した。そのため、本発明は、活性化ＣＤ４４分子を特異的に標的とする、特に不安定プラークを標的とする標的薬物送達システムを提供する。
【００１４】
また、本発明者らは、不安定プラークにコレステロールなどの脂質が大量存在し、これらの脂質が乳化剤として作用し、通常の標的指向性薬物送達システムのリポソームの安定性に大きな影響を及ぼした結果、リポソームは破壊または侵食（抽出）されて急速に崩壊し、リポソームに封入された薬物が予定より早く放出され、薬物の持続放出の役割を果たすことができないことも発見した。一方、リポソームの代わりに新規の薬物送達システムであるナノキャリアを使用する場合、不安定プラークに封入された薬物の放出特性は、脂質侵食からの影響を受けずに大幅に改善され、不安定プラークにおける微小環境での良好な安定性が維持され、薬物の持続放出を可能にする。このため、本発明は、薬物の安定かつ持続的な放出を達成しながら、不安定プラークを特異的に標的とすることができる標的指向性薬物送達システムをさらに提供する。
【００１５】
また、本発明者らは、ＣＤ４４活性化剤の担持が病変細胞の表面におけるＣＤ４４のさらなる活性化を促進し、ＨＡに対するＣＤ４４の標的親和性を短時間で増幅し、細胞表面にカップリングされた標的セラソーム組成物の濃度を著しく増加させ、不安定プラークのトレーサー診断および治療に積極的な意義を示すことも発見した。このため、本発明の前記標的指向性薬物送達システムは、ＣＤ４４活性化剤を担持することができ、短時間でトレーサーまたは治療剤化合物の濃度を著しく増加させて診断感度または治療効果を改善することができる。
【００１６】
さらに、本発明者らは、不安定プラークにおいて、ＣＤ４４の高レベルの活性化および過剰発現とともに、内因性高分子ＨＡが刺激により大量に生成され、細胞表面のＣＤ４４に結合し、不安定プラークにおけるマクロファージやリンパ球などの細胞の凝集を促進することを発見した。このような細胞表面のＣＤ４４に結合する内因性ＨＡは、薬物の侵入に対するバリアを形成し、薬物の生物学的利用能を低下させる可能性がある。このため、本発明の前記標的指向性薬物送達システムでは、低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合することができるヒアルロン酸誘導体が担持され、これらは、細胞表面における内因性ＨＡに競合的に結合することにより、細胞表面で内因性ＨＡが形成されたバリアを解消し、薬物が病変細胞に順調に侵入することに役立ち、顕著な治療効果を提供する。
【００１７】
つまり、本発明は以下の態様に関する。
【００１８】
本発明は、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム送達システムを提供する。
【００１９】
また、本発明は、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを提供する。
【００２０】
また、本発明は、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを調製する方法を提供する。
【００２１】
また、本発明は、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムと、薬学的に許容される担体とを含む薬物を提供する。
【００２２】
また、本発明は、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを含む診断用製剤を提供する。
【００２３】
また、本発明は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を予防および／または治療するための薬物の調製への、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの使用を提供する。
【００２４】
また、本発明は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための診断用製剤の調製への、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの使用を提供する。
【００２５】
また、本発明は、必要とする対象に、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを投与することを含む、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療の方法を提供する。
【００２６】
また、本発明は、必要とする対象に、本発明の前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを投与することを含む、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断の方法をさらに提供する。
【００２７】
以下、本発明の技術構成の具体的な実施形態およびそれらの意味を詳細に説明する。
【００２８】
（２）技術用語およびその意味
本明細書で言及される用語は、以下の意味を有する。
【００２９】
「不安定プラーク（ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ）」は「ｕｎｓｔａｂｌｅ  ｐｌａｑｕｅ」とも呼ばれ、血栓を形成する傾向があるか、または「犯罪プラーク（ｃｒｉｍｉｎａｌ  ｐｌａｑｕｅ）」に急速に進行する可能性が高いアテローム性動脈硬化プラークを指し、主に破綻したプラーク、びらんを起こしたプラーク、および部分的に石灰化した結節性病変を含む。多数の研究により、ほとんどの急性心筋梗塞および脳卒中は、軽度から中程度の狭窄を有する不安定プラークの破裂と、それに続く血栓の形成とによって引き起こされることが示されている。不安定プラークの組織学的発現には、活動性炎症、薄い線維性被膜と大きな脂質コア、表面での血小板凝集を伴う内皮剥離、プラークの亀裂または損傷、および重度の狭窄、ならびに、表面石灰化プラーク、光沢を有する黄色プラーク、プラーク内出血、および陽性リモデリングが含まれる。
【００３０】
「不安定プラーク関連疾患」とは、主に、病気の発生と発展が「不安定プラーク」に関連する疾患、「不安定プラーク」を特徴する疾患、または「不安定プラーク」に続発する疾患を指す。「不安定プラーク関連疾患」として、主にアテローム性動脈硬化症、冠状動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血−潜在性冠状動脈性心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎動脈アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、および上肢アテローム性動脈硬化症を含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、心原性ショックなどの疾患が挙げられる。
【００３１】
「標的指向性薬物送達システム」とは、標的指向性薬物送達の能力を有する薬物送達システムを指す。特定の経路を介した投与の後、標的指向性薬物送達システムに含まれる薬物は、特別な担体または標的弾頭（例えば、ターゲティングリガンド）の作用によって標的部位で特異的に濃縮される。標的指向性薬物送達を実現するための現在知られている手段として、様々な微粒子送達システムの受動的標的化特性の利用、微粒子送達システムの表面への化学修飾の導入、特定の物理的および化学的特性の利用、抗体媒介標的指向性薬物送達の利用、リガンド媒介標的指向性薬物送達の利用、プロドラッグ標的指向性薬物送達の利用などが挙げられる。その中でも、リガンド媒介標的指向性薬物送達は、ある器官および組織における特定の受容体がその特定のリガンドに特異的に結合できる特性を利用し、薬物担体とリガンドを組み合わせることで、薬物を特定の標的組織に導く。
【００３２】
「セラソーム」は、１９９０年代後半に開発された新規の構造的に安定した脂質キャリアである。本発明の前記セラソームは、活性物質の送達システムであり、形態的には、内部に親水性空洞を有する脂質二重層からなる閉鎖小胞である。前記脂質二重層は、セラミック単量体分子を含む脂質成分からなるものである。前記セラソミック単量体分子は、セラソームを形成できる無機−有機複合脂質分子であり、この分子は、シロキサン構造を有する頭部と疎水性尾部とで構成され、この疎水性尾部は疎水性有機二分子鎖である。前記セラソーム単量体分子は、通常、トリアルコキシシリル化脂質であり、このトリアルコキシシリル化脂質は、ｉｎ  ｓｉｔｕゾルゲル（ｓｏｌ−ｇｅｌ）プロセスでシロキサン結合（Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ）を形成することで、セラソームの表面にその自身が剛性を有する無機ポリシロキサン網状構造が形成される。本発明で使用される不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、「不安定プラークにおける細胞表面に存在する多数の活性化ＣＤ４４分子がＨＡに特異的に結合する」という知見に基づいて設計されたリガンド媒介標的指向性薬物送達システムである。
【００３３】
「ヒアルロン酸（ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ、「ＨＡ」と略される）」は、（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ１１）ｎの式で表される高分子ポリマーである。これは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンの単位からなる高級多糖類である。Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンはβ−１，３−グリコシド結合により連結され、二糖単位はβ−１，４−グリコシド結合により連結される。ヒアルロン酸は、その独特な分子構造と物理的および化学的特性で、例えば、関節の潤滑、血管壁の透過性の調節、タンパク質、水、および電解質の拡散と輸送の調節、創傷治癒の促進など生体内のさまざまな重要な生理学的機能を示す。ヒアルロン酸が特別な保水効果を持ち、今まで自然界で見られる最高の保湿特性を持つ物質であることが特に重要である。
【００３４】
本発明で使用される「ヒアルロン酸の誘導体」とは、ヒアルロン酸が不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合する能力を維持することができるヒアルロン酸の任意の誘導体を指す。ヒアルロン酸の薬学的に許容される塩、低級アルキル（１〜６個の炭素原子を含むアルキル）エステル、生体内で加水分解または他の手段によりヒアルロン酸を形成できるプロドラッグなどが挙げられるが、これらに限定されない。ある物質が「ヒアルロン酸の誘導体」であるかどうかは、この物質が不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合する能力を測定することにより判断し、これは当業者が備えている技術の範囲内である。
【００３５】
「ＣＤ４４分子」は、リンパ球、単球、内皮細胞などの細胞の細胞膜に広く発現される膜貫通プロテオグリカン接着分子であり、細胞外セグメント、膜貫通セグメント、および細胞内セグメントの３つのセグメントからなる。ＣＤ４４分子は、細胞と細胞との間、および細胞と細胞外マトリックスとの間の複数の相互作用を媒介し、生体内の複数の信号の伝達に関与し、細胞の生物学的機能を変化させることができる。ＣＤ４４分子の主要なリガンドはヒアルロン酸であり、ＣＤ４４分子とヒアルロン酸の受容体−リガンド結合により、細胞外マトリックスにおける細胞の接着および／または遊走を決定する。さらに、ＣＤ４４分子はヒアルロン酸の代謝にも関与する。
【００３６】
「アルキル」は、所定の個数の炭素原子を有する分岐鎖および直鎖の両方を含む飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「Ｃ１−６アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチル、ネオペンチルなどの１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキルを意味する。同様に、「Ｃ１０−２４アルキル」は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の炭素原子を有するアルキルを意味する。
【００３７】
「アルケニル」は、所定の個数の炭素原子および１個以上（好ましくは１、２、３、４、５または６個などの１〜６個）の炭素−炭素二重結合（鎖における任意の安定点に存在する可能性がある）を有する直鎖または分岐鎖を含む不飽和脂肪族炭化水素基を意味する。例えば、「Ｃ１０−２４アルケニル」は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４個の炭素原子および１個以上（好ましくは、１、２、３、４、５または６個などの１〜６個）の炭素−炭素二重結合を有する。
【００３８】
「約」は、その後の数値の±５％の範囲内のすべての値からなる集合を表す。
【００３９】
（３）発明の詳細な説明
本発明の一態様によれば、本発明は、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム送達システムを提供し、前記セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、活性化ＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドである。
【００４０】
本発明の一態様によれば、本発明は、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを提供し、前記セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドである。
【００４１】
本発明の一態様によれば、本発明は、セラソーム小胞を含む、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを提供し、前記セラソーム小胞の表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾される。
【００４２】
一実施形態において、前記セラソーム小胞は、内部に親水性空洞を有する脂質二重層からなる閉鎖小胞であり、この小胞の表面は、無機ポリシロキサン網状構造およびカップリングされたターゲティングリガンドを有する。
【００４３】
一実施形態において、前記脂質二重層は、セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子とを含む成分により形成される。
【００４４】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子との重量比は、１〜１０：０．２〜１：１〜９である。
【００４５】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子の重量比は、２〜１０：１〜３：０〜３である。
【００４６】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子の重量比は、３〜７：１．５〜２．５：１．５〜２．５である。
【００４７】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子の重量比は、３〜７：０．５〜１：１．５〜２．５である。
【００４８】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子の重量比は、４〜６：０．５：２である。
【００４９】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子の重量比は、４〜６：２：２である。
【００５０】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子は、セラソームを形成できる無機−有機複合脂質分子であり、前記無機−有機複合脂質分子は、シロキサン構造を有する頭部と疎水性尾部で構成され、この疎水性尾部は疎水性有機二分子鎖である。
【００５１】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子は、以下の一般式を有する単量体分子である。
（Ｒ１Ｏ）３Ｓｉ−Ｌ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）
ただし、
Ｒ１はＣ１−６アルキルを表し、
Ｌは、４〜１２個の炭素原子（好ましくは４〜１０個の炭素原子）および１〜２個の窒素原子からなるリンカーであり、ここで、以下の条件下で、前記リンカーにける０〜１個の炭素原子はオキソ基で置換され、つまりカルボニル基が形成され、条件（１）：前記リンカーにカルボニル基が存在する場合、このカルボニル基が窒素原子に隣接し；条件（２）：前記リンカーにおける１個の窒素原子が四級化され、且つこの四級化された窒素原子が適合な対イオンと塩を形成し、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立してＣ１０−２４アルキル又はＣ１０−２４アルケニルを表す。
【００５２】
一実施形態において、前記セラソーム単量体分子は、
【化１】
2020516686.tif 000003
、
【化２】
2020516686.tif 000004
、および
【化３】
2020516686.tif 000005
から選択される１つ以上である。
【００５３】
一実施形態において、前記脂質二重層の成分は他の脂質分子を含む。
【００５４】
一実施形態において、前記他の脂質分子は、中性リン脂質、負に帯電したリン脂質、および正に帯電した脂質から選択される１つ以上である。
【００５５】
一実施形態において、前記脂質は、ホスファチジルコリン、グリセロリン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、セリンホスファチド、およびホスファチジン酸から選択される１つ以上である。
【００５６】
一実施形態において、前記他の脂質分子はホスファチジルコリンである。
【００５７】
一実施形態において、前記他の脂質分子は正に帯電した脂質である。
【００５８】
一実施形態において、前記正に帯電した脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）および１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）から選択される１つ以上である。
【００５９】
一実施形態において、前記脂質は、１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）である。
【００６０】
一実施形態において、前記ターゲティングリガンドは、分子量が５万〜４０万Ｄａである。
【００６１】
一実施形態において、前記ターゲティングリガンドは、分子量が８万〜１５万Ｄａである。
【００６２】
一実施形態において、前記ターゲティングリガンドは、分子量が約１０万Ｄａである。
【００６３】
一実施形態において、前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、５０ｎｍ〜４００ｎｍである。
【００６４】
一実施形態において、前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、５０ｎｍ〜３００ｎｍである。
【００６５】
一実施形態において、前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、１５０ｎｍ〜２５０ｎｍである。
【００６６】
一実施形態において、前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、１８０ｎｍ〜２２０ｎｍである。
【００６７】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、前記送達システムにおけるターゲティングリガンドは、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、およびモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、ＩＭ７、或いは、ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体から選択される。
【００６８】
本発明のセラソーム送達システムでは、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患の診断、予防および／または治療のための物質が担持される。
【００６９】
一実施形態において、前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質を担持する。
【００７０】
一実施形態において、前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラークに関連する疾患の診断、予防および／または治療のための薬物、ペプチド、核酸、およびサイトカインから選択される１つ以上である。
【００７１】
一実施形態において、前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質である。
【００７２】
一実施形態において、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質はトレーサーである。
【００７３】
一実施形態において、前記トレーサーは、ＣＴ用トレーサーおよびＭＲＩ用トレーサーから選択される。
【００７４】
一実施形態において、前記ＣＴ用トレーサーは、ヨード系ナノスケール造影剤、金系ナノスケール造影剤、酸化タンタル系ナノスケール造影剤、ビスマス系ナノスケール造影剤、ランタニド系ナノスケール造影剤、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択される。
【００７５】
一実施形態において、前記ＣＴ用トレーサーは、ヨード系造影剤または金ナノ粒子、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択される。
【００７６】
一実施形態では、前記ＣＴ用トレーサーは、イオヘキソール、イオカルミン酸、イオベルソール、イオジキサノール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロル、イオパミドール、イオキシラン、アセトリゾ酸、イオジパミド、イオベンザミン酸、イオグリカミン酸、ジアトリゾ酸、イオタラム酸ナトリウム、パントパック、イオパン酸、ヨードアルフィオン酸、アセトリゾ酸ナトリウム、ナトリウムヨードメサメート（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｏｍｅｔｈａｍａｔｅ）、プロピリオドン、ジオドン、イオトロラン、イオピドール、エンドグラフィン（ｅｎｄｏｇｒａｆｉｎ）、イオタラム酸、メグルミンジアトリゾエート、メトリゾ酸、メトリザミド、ヨウ素化油またはエチヨード化油、或いは類似の構造を有する他のトレーサーから選択される。
【００７７】
一実施形態において、前記ＭＲＩ用トレーサーは、縦緩和造影剤および横緩和造影剤から選択される。
【００７８】
一実施形態において、前記ＭＲＩ用トレーサーは、常磁性造影剤、強磁性造影剤および超常磁性造影剤から選択される。
【００７９】
一実施形態において、前記ＭＲＩ用トレーサーは、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびその線状や環状のポリアミンポリカルボキシレートキレート、およびそのマンガンポルフィリンキレート、高分子ガドリニウムキレート、生体高分子修飾ガドリニウムキレート、葉酸修飾ガドリニウムキレート、デンドリマー造影剤、リポソーム修飾造影剤およびガドリニウム含有フラーレン、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択される。
【００８０】
一実施形態において、前記ＭＲＩ用トレーサーは、ガドペンテト酸メグルミン、ガドテル酸メグルミン、ガドベン酸ジメグルミン、ガドジアミド、クエン酸鉄アンモニウム発泡顆粒、常磁性酸化鉄、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択される。
【００８１】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、ＣＤ４４活性化剤が担持される。一実施形態において、前記ＣＤ４４活性化剤は、ＣＤ４４抗体ｍＡｂ、またはＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ−α、ＬＰＳである。
【００８２】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である、低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体が担持される。
【００８３】
一実施形態において、前記低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体は、分子量が２５００〜４５００Ｄａの範囲である。
【００８４】
一実施形態において、前記低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体は、分子量が３０００〜４０００Ｄａの範囲である。
【００８５】
一実施形態において、前記低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体は、分子量が約３４１１Ｄａである。
【００８６】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質、およびＣＤ４４活性化剤を同時に担持する。
【００８７】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、および分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持する。
【００８８】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断のための物質、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、必要に応じてＣＤ４４活性化剤、および必要に応じて分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持する。
【００８９】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質が担持される。
【００９０】
一実施形態において、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質は、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害剤、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰｓ阻害剤、β受容体遮断薬、および上記薬物の活性構造フラグメントを含むそれらの薬学的に許容される塩から選択される１つ以上である。
【００９１】
一実施形態において、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質は、ロバスタチン；アトルバスタチン；ロスバスタチン；シンバスタチン；フルバスタチン；ピタバスタチン；プラバスタチン；ベザフィブラート；シプロフィブラート；クロフィブラート；ゲムフィブロジル；フェノフィブラート；プロブコール；エボロクマブ、アリロクマブ、ボコシズマブ、ＲＧ７６５２、ＬＹ３０１５０１４およびＬＧＴ−２０９などの抗ＰＣＳＫ９抗体；ＡＬＮ−ＰＣＳｓｃなどのアンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチド；ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３３ａ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２７ａ／ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０６ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−７５８、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１９ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２６、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−９３、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２８−２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４４、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４５アンチセンス鎖およびロックド核酸のようなそれらの核酸類似体などの核酸；またはＢＭＳ−９６２４７６などのアドネクチン；アセメタシン；トロキセルチン；ジピリダモール；シロスタゾール；チクロピジン塩酸塩；オザグレルナトリウム；クロピドグレル；プラスグレル；シロスタゾール；チロフィバン；ベラプロストナトリウム；チカグレロル；カングレロル；チロフィバン；エプチフィバチド；アブシキシマブ；未分画ヘパリン；クレキサン；フラキシパリン；フォンダパリヌクスナトリウム；ワルファリン；ダビガトラン；リバロキサバン；アピキサバン；エドキサバン；ビバリルジン；エノキサパリン；テデルパリン；アルデパリン；ビスヒドロキシクマリン；硝酸クマリン；クエン酸ナトリウム；ヒルジン；アルガトロバン；ベナゼプリル；カプトプリル；エナラプリル；ペリンドプリル；フォシノプリル；リシノプリル；モエキシプリル；シラザプリル；ペリンドプリル；キナプリル；ラミプリル；トランドラプリル；カンデサルタン；エプロサルタン；イルベサルタン；ロサルタン；テルミサルタン；バルサルタン；オルメサルタンまたはタソサルタン；ニフェジピン；ニカルジピン；ニトレンジピン；アムロジピン；ニモジピン；ニソルジピン；ニルバジピン；イスラジピン；フェロジピン；ラシジピン；ジルチアゼム；ベラパミル；クロルヘキシジン；ミノサイクリン；ＭＭＩ−１６６；メトプロロール；アテノロール；ビソプロロール；プロプラノロール；カルベジロール；バチマスタット；マリマスタット；プリノマスタット；ＢＭＳ−２７９２５１；ＢＡＹ  １２−９５６６；ＴＡＡ２１１；ＡＡＪ９９６Ａ；ナセトラピブ；エバセトラピブ；トルセトラピブおよびダルセトラピブ；ならびに、それらの有効なフラグメントまたは薬学的に許容される塩、および上記薬物の活性構造フラグメントを含む薬学的に許容される塩からなる群から選択される１つ以上である。
【００９２】
本発明のセラソーム送達システムにおいて、前記セラソーム送達システムは、セラソーム小胞を含み、このセラソーム小胞の表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、このターゲティングリガンドは、ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体である。
【００９３】
本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、本分野で公知の方法のいずれかに従って調製される。例えば、本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、薄膜分散法により調製される。
【００９４】
それで、本発明の一態様によれば、本発明は、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを調製する方法を提供する。この方法は以下の工程を含む。
【００９５】
１）適合な量のセラソームモノマー分子、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子、必要に応じて他の脂質分子、および必要に応じて不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための脂溶性物質を適合な有機溶媒に溶解する。
【００９６】
２）回転蒸発またはその他の適合な条件下で有機溶媒を除去して、工程１）における成分を容器の壁に薄膜化させる。
【００９７】
３）不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための、水溶性物質を必要に応じて含む水系媒体を添加し、４０〜６０℃の一定温度で薄膜中の成分を完全に水和させ、粗セラソーム小胞懸濁液を調製する。
【００９８】
４）工程３）で得られた粗セラソーム小胞懸濁液を、超音波、振とう、均質化、圧搾または他の適合な方法で処理して、精製されたセラソーム小胞懸濁液を調製する。
【００９９】
５）必要に応じて、透析により、工程４）で得られた精製セラソーム小胞懸濁液に含まれる担持されていない、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および/または治療のための物質を除去する。
【０１００】
６）工程４）又は５）で得られた精製セラソーム小胞懸濁液を少なくとも２４時間置き、シロキサンの加水分解縮合を促進して、無機ポリシロキサン網状構造を形成する。
【０１０１】
７）水性条件下で、適量の１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）およびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）カップリング剤を添加して、ターゲティングリガンドのカルボキシル基を活性化させ、活性化されたターゲティングリガンドを調製する。
【０１０２】
８）活性化されたターゲティングリガンドを、工程６）で得られたセラソーム小胞懸濁液に添加し、活性化されたターゲティングリガンドとジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子との間に、アミド結合を形成することにより結合させ、不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを調製する。
【０１０３】
本発明の一態様によれば、本発明は、前記セラソーム送達システムと薬学的に許容される担体とを含む薬剤を提供する。
【０１０４】
一実施形態において、前記薬剤は、前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムおよび薬学的に許容される担体を含む。
【０１０５】
本発明の一態様によれば、本発明は、前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを含む診断用製剤を提供する。
【０１０６】
一実施形態では、前記診断用製剤は、前記不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを含む。
【０１０７】
本発明の一態様によれば、本発明は、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患の診断、予防および／または治療のための薬物の調製への、本発明のセラソーム送達システムの使用を提供する。
【０１０８】
一実施形態では、本発明は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための薬物の調製への、前記セラソーム送達システムの使用を提供する。
【０１０９】
本発明の一態様によれば、本発明は、本発明のセラソーム送達システムを投与することを含む、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患の診断、予防および／または治療の方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態において、本発明は、本発明のセラソーム送達システムを投与することを含む、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療の方法を提供する。
【０１１１】
一実施形態において、前記不安定プラークは、破綻したプラーク、びらんを起こしたプラーク、および部分的に石灰化した結節性病変から選択される１つ以上である。
【０１１２】
一実施形態において、前記不安定プラーク関連疾患は、冠状動脈アテローム性硬化性心疾患、アテローム性動脈硬化症、血管腫、血栓塞栓症、狭心症、心筋梗塞、心臓突然死、心不全、心原性ショック、虚血性心筋症、脳卒中から選択される１つ以上である。
【０１１３】
本発明は、上記実施形態（様々な好ましい実施形態を含む）のいずれかの任意の組み合わせを含む。また、任意の所定範囲について、本発明は、その範囲の端点値、その範囲内の任意の特定の値、およびその範囲内の任意の２つの特定の値で構成されるサブ範囲を含む。
【０１１４】
つまり、本発明のセラソーム送達システムは、ＣＤ４４分子の活性化に関連する疾患に対して以下の利点を有する。
【０１１５】
１）本発明のセラソーム送達システムは、活性化されたＣＤ４４分子に特異的に結合でき、薬物の安定した持続放出を実現することができる。
【０１１６】
２）不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４は、細胞外マトリックスの微小環境によって誘導されることにより活性化され、大量に過剰発現し、且つＣＤ４４−ＨＡの親和性が著しく向上するため、不安定プラークにおけるＣＤ４４とＨＡとの相互作用は、非常に顕著な特異的親和性を示す。したがって、不安定プラークにおけるＣＤ４４は、本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの好適な標的として作用する。
【０１１７】
３）本発明の不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、不安定プラークを能動的に標的として進入し、病変細胞に結合することができる。したがって、このセラソーム送達システムは、病変部での担持物質の持続放出を実現し、病変部の物質の濃度を著しく増加し、維持することにより、この送達システムの診断または治療の効果を改善することができる。
【０１１８】
４）本発明の不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を封入することができる。上記低分子ヒアルロン酸およびその誘導体は、細胞表面の内因性ヒアルロン酸との競合的に結合することにより、細胞表面の内因性ヒアルロン酸によるバリアを解消し、それにより診断または治療活性物質が病変細胞へ順調に侵入することに役立つ。
【０１１９】
５）不安定プラークには、酸化された低密度リポタンパク質（ｏｘ−ＬＤＬ）を大量に含む巨大な脂質プールがある。リポソームは、このような内部環境で不安定で、崩壊しやすいため、放出制御機能を実現できない。一方、本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、不安定プラークの脂質プールにおいて比較的安定であり、薬物を連続的に放出することができるため、病変部の薬物濃度を維持することができる。
【０１２０】
６）本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムでは、ＣＤ４４の活性化を促進する物質、すなわち、ＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ−αおよびＬＰＳなどのＣＤ４４活性化剤が担持される。ＣＤ４４活性化剤が担持される場合、病変細胞の表面のＣＤ４４のさらなる活性化が促進され、ヒアルロン酸に対するＣＤ４４の標的親和性が短時間で増幅され、細胞表面に結合した標的指向性セラソーム組成物の濃度が大幅に増加されることは、トレーサーまたは治療剤の化合物の濃度を短時間で大幅に増加させ、診断の分解能または治療効果を高めるため、不安定プラークのトレーサー診断と治療に積極的な意義を示す。
【０１２１】
６）不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムは、良好な機械的安定性、熱安定性および不安定プラーク微小環境における安定性、および良好な貯蔵安定性を有する。セラソーム単量体分子は、Ｓｉ−Ｃ、Ｓｉ−Ｏ結合を含み、このような化学組成は、その生物分解を可能にする。セラソーム小胞には、脂溶性物質、両性化合物、または水溶性物質を担持しても良い。セラソーム小胞の表面の無機ポリシロキサン網状構造の縮合度と空隙を調整することで、セラソーム小胞の形態安定性を破壊することなく、生体内および生体外での活性物質の放出を制御できる。
【０１２２】
なお、当業者は、従来の技術に基づいて本発明に開示された内容を参照することにより、本発明を実施できる。さらに、当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に類似の改善および同等の置換を行うことができ、これらの類似の改善および同等の置換は、当業者には明らかであり、本発明に含まれることが意図されている。例えば、本発明のセラソーム送達システムに担持可能な物質として、セラソームに組み込まれて診断、予防および/または治療のために用いられる限り、本発明に記載される物質を含むが、これらに限定されない。一般に、上記物質が水相および有機溶媒の両方に不溶性の物質または水相および有機溶媒の両方に非常に良い可溶性の物質でない限り、容易にセラソームに組み込まれる。好ましくは、上記物質は、脂溶性物質、両性化合物または水溶性物質である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
以下、本発明の内容を十分に理解するために、好適な実施形態および添付の図面を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。
【図１】図１は、本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムを構築する概略図である。
【図２】図２は、ロスバスタチンを担持したＣＬ１がＨＡに結合する前（黒、下線）および後（赤、上線）の赤外線スペクトルを含む、ＨＡ−ＣＬ１の赤外線スペクトルを示す。
【図３】図３は、４℃で９０日保存した、本発明のセラソーム送達システムおよび対照としてのリポソーム送達システムの粒子サイズの変化を示すグラフである。
【図４】図４は、４℃で９０日保存した、本発明のセラソーム送達システムおよび対照としてのリポソーム送達システムの薬物の封入率の変化を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明のセラソーム送達システムおよび対照としてのリポソーム送達システムの累積薬物放出率の変化を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の３つのセラソーム送達システムの累積薬物放出率の変化を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例４で構築されたマウスアテローム性動脈硬化不安定プラークモデルの核磁気共鳴画像を示す。
【図８】図８は、本発明のセラソーム送達システムおよび対照としてのリポソーム送達システムを投与したマウスの頸動脈プラークにおける薬物曝露の百分率を示すグラフである。
【図９】図９は、マウスモデルの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４含有量の測定結果（半定量的積分で表される）を示すグラフである。
【図１０】図１０は、マウスモデルの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４のＨＡに対する結合力の測定結果（結合力の積分で表される）を示すグラフである。
【図１１】図１１は、マウスモデルの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４のそれぞれのリガンド/抗体に対する結合力の測定結果（結合力の積分で表される）を示すグラフである。
【図１２】図１２は、マウスモデルのプラーク外のマクロファージおよび動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４のＨＡに対する結合力の測定結果（結合力の積分で表される）を示すグラフである。
【図１３】図１３は、マウスモデルのプラーク外のマクロファージおよび動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４のそれぞれのリガンド/抗体に対する結合力の測定結果（結合力の積分で表される）を示すグラフである。
【図１４】図１４は、マウスモデルの頸動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム送達システムの生体内での治療効果（プラーク進行の百分率で表される）を示すグラフである。
【図１５】図１５は、マウスモデルの頸動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム送達システムの生体内での追跡効果（ＣＴ値で表される）を示すグラフである。
【図１６】図１６は、動脈の不安定プラークに対するセラソーム−ＨＡ−イオジキサノール送達システムの生体内でのＣＴ追跡を示す。
【図１７】図１７は、動脈不安定プラークに対するセラソーム−ＨＡ−ガドテル酸メグルミン送達システムの生体内でのＭＲＩ追跡を示す。
【図１８】図１８は、動脈不安定プラークに対するそれぞれのモノクローナル抗体−ＣＤ４４−セラソーム−ガドテル酸メグルミン送達システムの生体内でのＭＲＩ追跡を示す。
【図１９】図１９は、動脈不安定プラークに対するそれぞれのリガンド−ＣＤ４４−セラソーム−ガドジアミド送達システムの生体内でのＭＲＩ追跡を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
以下、本発明をさらに理解するために、実施例を参照して本発明の具体的な実施形態を詳細に説明するが、これらの説明は、本発明の特徴および利点をさらに理解することのみを意図しており、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１２５】
実施例１：本発明で使用される３つのセラソーム単量体
本発明のセラソーム送達システムで使用されるセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は既知であり、記載されている調製方法に従って得られる。
セラソーム単量体Ｃ１：Ｎ，Ｎ−ジセチル−Ｎα−（６−（（３−トリエトキシシリル）プロピルジメチルアンモニオ）ヘキサノイル）アラニンアミドブロミドの調製については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１（３），１２２７−１２３４を参照する。
【化４】
2020516686.tif 000006
【０１２６】
セラソーム単量体Ｃ２：Ｎ，Ｎ−ジセチル−Ｎ’−（３−トリエトキシシリルプロピル）スクシンアミドの調製については、Ｊ．Ａｍ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００２，１２４，７８９２−７８９３を参照する。
【化５】
2020516686.tif 000007
【０１２７】
セラソーム単量体Ｃ３：Ｎ，Ｎ−ジセチル−Ｎ’−［（３−トリエトキシシリル）プロピル］尿素の調製については、Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ，２００３，４３８−４３９，２０−２６を参照する。
【化６】
2020516686.tif 000008
【０１２８】
実施例２：送達システムの調製
１．治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製
この実施例において、治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムにおけるセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
【０１２９】
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法は、具体的には以下の工程を含む。
【０１３０】
（１）セラソーム小胞懸濁液の調製
６ｍｇのＣ１（５ｍｇのＣ２または４ｍｇのＣ３）、２ｍｇの１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）および２ｍｇのジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）を丸底フラスコに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。回転蒸発（５５℃の水浴、９０ｒ／分、３０分）によって有機溶媒を完全に除去して、フラスコの壁に薄膜を形成した。１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、フラスコを５０℃の恒温水浴に入れ、薄膜を３０分間で十分に水和させて、粗セラソーム小胞懸濁液を調製した。粗セラソーム小胞懸濁液を水浴で１０分間超音波処理した後、プローブ型超音波装置で懸濁液を５分間（振幅２０、間隔３秒間）超音波処理し、セラソーム小胞懸濁液を十分に分散して形成された安定した系、即ち、精製セラソーム小胞懸濁液を得た。精製セラソーム小胞懸濁液中の未封入のロスバスタチンは、透析バッグによって除去された。次いで、セラソーム小胞懸濁液を少なくとも２４時間放置して、セラソーム単量体分子をセラソームの表面にその自身が剛性を有する無機ポリシロキサン網状構造を形成することを促進した。
【０１３１】
（２）ヒアルロン酸（「ＨＡ」）の活性化およびカップリング
ＨＡ（分子量約１００ＫＤａ）１ｇを超純水に完全に溶解し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）０．１ｇおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）０．１２ｇをカップリング剤として添加し、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、アセトンを加えて活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、真空で乾燥させて、活性化ＨＡを得た。この活性化ＨＡを０．１ｍｇ・ｍＬ−１の水溶液に調製し、０．２ｍＬの溶液を上記工程（１）で得られたセラソーム小胞懸濁液に移して溶解させ、活性化ＨＡにおける活性化カルボキシル基と、セラソーム小胞の脂質二重層に組み込まれたＤＳＰＥ分子のアミノ基とを、アミド結合を介してカップリングした。治療剤を担持した３つのセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒを得た。
【０１３２】
ＨＡとＣＬとのカップリングは、赤外線特性評価によって確認された。赤外線特性評価に使用するサンプルは、ロスバスタチンを担持したＨＡ−ＣＬ１＠Ｒサンプルである。その調製方法は、以下の通りである。６ｍｇのＣ１および１ｍｇのＤＳＰＥを丸底フラスコに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。回転蒸発（５５℃の水浴、９０ｒ／分、３０分）によって有機溶媒を完全に除去して、フラスコの壁に薄膜を形成した。１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、フラスコを５０℃の恒温水浴に入れ、薄膜を３０分間で十分に水和させた。水浴で１０分間超音波処理し、さらにプローブ型超音波装置で５分間（振幅２０、間隔３秒間）超音波処理して、セラソーム小胞を得た。セラソーム小胞を少なくとも２４時間放置して、セラソーム単量体分子をセラソームの表面にその自身が剛性を有する無機ポリシロキサン網状構造を形成することを促進した。０．１ｇのＨＡ（分子量約１００ＫＤａ）を超純水に十分に溶解し、１０ｍｇのＥＤＣ・ＨＣｌおよび１２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳカップリング剤を加えて、カルボキシル基を活性化した。室温で反応液を１時間撹拌した後、アセトンを加えて活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、真空で乾燥させて、活性化ＨＡを得た。この活性化ＨＡを０．１ｍｇ・ｍＬ−１の水溶液に調製し、０．２ｍＬの溶液を上記工程（１）で得られたセラソーム小胞懸濁液に移して溶解させ、活性化ＨＡにおける活性化カルボキシル基と、セラソーム小胞の脂質二重層に組み込まれたＤＳＰＥ分子のアミノ基とを、アミド結合を介してカップリングした。標的指向性セラソームＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ１を得た。カップリング反応の開始から２４時間後、１２０００ｒｐｍの高速遠心分離によりＨＡ−ＣＬ１＠Ｒを分離して、真空乾燥した後、赤外線スペクトルの特性評価に使用した。図２に示すように、１１００ｎｍの吸収ピークはセラソームの存在を示し、１７００ｎｍおよび２９１０ｎｍの吸収ピークはセラソームとＨＡとのカップリングを示した。
【０１３３】
２．低分子ヒアルロン酸を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＬＭＨＡおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＬＭＨＡの調製
この実施例において、低分子ヒアルロン酸を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＬＭＨＡおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＬＭＨＡは、薄膜分散法によって調製される。上記３つのセラソーム送達システムにおけるセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、約３４１１Ｄａの分子量の低分子ヒアルロン酸（（Ｃ１４Ｈ２１ＮＯ１１）ｎの分子式、ｎ＝９、以下、「ＬＭＨＡ」と略される）を担持した。これらの唯一の違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
【０１３４】
ＨＡ−ＣＬ１＠ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＬＭＨＡおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＬＭＨＡの具体的な調製方法は、上記セラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これら方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、分子量３４１１Ｄａ（濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）の低分子ヒアルロン酸の水溶液１０ｍＬを使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入の低分子ヒアルロン酸を透析バッグで除去したことにある。
【０１３５】
３．治療剤および低分子ヒアルロン酸を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、およびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡの調製
この実施例において、治療剤であるロスバスタチンおよび低分子ヒアルロン酸を同時に担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、およびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムにおけるセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、治療剤であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）および約３４１１Ｄａの分子量の低分子ヒアルロン酸を同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）と１０ｍＬの分子量３４１１Ｄａの低分子ヒアルロン酸水溶液（濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）と同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のロスバスタチンおよび低分子ヒアルロン酸を透析バッグで除去したことにある。
【０１３６】
４．ＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｓの調製
この実施例において、ＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂ（「Ｓ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、１０ｍＬのＣＤ４４抗体ｍＡｂ水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のＣＤ４４抗体ｍＡｂをデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
同様に、ＣＤ４４活性化剤は、ＬＰＳを使用して調製することもでき、同様の結果が得られた。
【０１３７】
５．治療剤およびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋Ｓ、およびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋Ｓの調製
この実施例において、治療剤およびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、治療薬であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）とＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂ（「Ｓ」と略される）とを同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
【０１３８】
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）および１０ｍＬのＣＤ４４抗体ｍＡｂ水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のロスバスタチンおよびＣＤ４４抗体ｍＡｂをデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
同様に、ＣＤ４４活性化剤は、ＬＰＳを使用して調製することもでき、同様の結果が得られた。
【０１３９】
６．トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｔ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＴおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｔの調製
この実施例において、トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｔ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＴおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｔは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＭＲＩ用トレーサーであるガドペンテト酸（「Ｔ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｔ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＴおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｔの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、１０ｍＬのガドペンテト酸の水溶液（濃度３ｍｇ／ｍＬ）を使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のガドペンテト酸を透析バッグで除去したことにある。
同様に、トレーサーは、ガドテル酸メグルミンまたはガドジアミドを使用して調製することもでき、同様の結果が得られた。
【０１４０】
７ａ．トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの調製
この実施例において、トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＴトレーサーである金ナノ粒子（「ＡｕＮＰｓ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、１０ｍＬ金ナノ粒子溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）を使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入の金ナノ粒子をデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
【０１４１】
７ｂ．トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠イオジキサノール、ＨＡ−ＣＬ２＠イオジキサノールおよびＨＡ−ＣＬ３＠イオジキサノールの調製
【０１４２】
この実施例において、トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＩおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＴトレーサーであるイオジキサノールまたはイオプロミド（「Ｉ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
【０１４３】
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＩおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、１０ｍＬイオジキサノールまたはイオプロミド溶液（濃度１μｇ／ｍＬ）を使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のイオジキサノールまたはイオプロミドをデキストランゲルカラムで分離して除去したことにある。
【０１４４】
８ａ．トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓの調製
この実施例において、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を同時に担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＴトレーサー金ナノ粒子（「ＡｕＮＰｓ」「ＨＡ」と略される）およびＣＤ４４活性化剤−−ＣＤ４４抗体ｍＡｂ（「Ｓ」と略される）を同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰＳ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰＳ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰＳ＋Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質上同じである，これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬの金ナノ粒子溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）および１０ｍＬのＣＤ４４抗体ｍＡｂの水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入の金ナノ粒子およびＣＤ４４抗体ｍＡｂをデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
【０１４５】
８ｂ．トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｉ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉ＋Ｓの調製
この実施例において、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を同時に担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｉ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉ＋Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＴトレーサーであるイオジキサノールまたはイオプロミド（「Ｉ」と略される）およびＣＤ４４活性化剤−ＬＰＳ（「Ｓ」と略される）を同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｉ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉ＋Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍｌのイオジキサノールまたはイオプロミド水溶液（１μｇ／ｍＬ）および１０ｍｌのＬＰＳの水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のイオジキサノールまたはイオプロミドおよびＬＰＳをデキストランゲルカラムＧ−２００で分離して除去したことにある。
【０１４６】
９．治療剤、低分子ヒアルロン酸、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓの調製
この実施例において、治療剤ロスバスタチン、低分子ヒアルロン酸、トレーサーであるガドペンテト酸およびＣＤ４４活性化剤を同時に担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、治療剤であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）、分子量約３４１１Ｄａの低分子ヒアルロン酸、ＭＲＩトレーサーであるガドペンテト酸（「Ｔ」と略される）およびＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂ（「Ｓ」と略される）を同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ＋ＬＭＨＡ＋Ｔ＋Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）、１０ｍＬの分子量３４１１Ｄａの低分子ヒアルロン酸の水溶液（濃度０．５ｍｇ／ｍＬ）、１０ｍＬのガドペンテト酸水溶液（濃度３．０ｍｇ／ｍＬ）および１０ｍＬのＣＤ４４抗体ｍＡｂの水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入のロスバスタチン、低分子ヒアルロン酸、ガドペンテト酸およびＣＤ４４抗体ｍＡｂをデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
同様に、ＣＤ４４活性化剤ではＬＰＳを使用し、トレーサーではガドテル酸メグルミンを使用して、調製することもでき、同様の結果が得られた。
【０１４７】
１０．ブランクセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１、ＨＡ−ＣＬ２、ＨＡ−ＣＬ３（比較例として）の調製
この実施例において、ブランクセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１、ＨＡ−ＣＬ２、ＨＡ−ＣＬ３は、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質をいずれも担持しなかった。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１、ＨＡ−ＣＬ２、ＨＡ−ＣＬ３の具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）の代わりに純水を使用し、且つ透析によって未封入物質を除去する工程を省略したことにある。
【０１４８】
１１．治療剤を担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｒ、ＣＬ２＠ＲおよびＣＬ３＠Ｒ（比較例として）の調製
この実施例において、治療剤を担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｒ、ＣＬ２＠ＲおよびＣＬ３＠Ｒは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって修飾されなく、且つ不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＣＬ１＠Ｒ、ＣＬ２＠ＲおよびＣＬ３＠Ｒの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（２）を省略したことにある。
【０１４９】
１２ａ．トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ（比較例として）の調製
この実施例において、トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠ＡｕＮＰＳ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰＳおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰＳは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって修飾されなく、且つＣＴトレーサー金ナノ粒子（「ＡｕＮＰｓ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＣＬ１＠ＡｕＮＰＳ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰＳおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰＳの具体的な調製方法は、上記７に記載のトレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（２）を省略したことにある。
【０１５０】
１２ｂ．トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｉ、ＣＬ２＠ＩおよびＣＬ３＠Ｉ（比較例として）の調製
この実施例において、トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｉ、ＣＬ２＠ＩおよびＣＬ３＠Ｉは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって修飾されなく、且つＣＴトレーサーであるイオジキサノール（「Ｉ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＣＬ１＠Ｉ、ＣＬ２＠ＩおよびＣＬ３＠Ｉの具体的な調製方法は、上記７に記載のトレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＩおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｉの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（２）を省略したことにある。
【０１５１】
１３．治療剤を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒ（比較例として）の調製
この実施例において、治療剤を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒは、薄膜分散法によって調製された。上記リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒのリポソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質であるロスバスタチン（「Ｒ」と略される）を担持した。
【０１５２】
ＨＡ−ＰＬ＠Ｒの具体的な調製方法は、以下の通りである
（１）リポソーム小胞懸濁液の調製：
４ｍｇのジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、１ｍｇのコレステロール、１ｍｇのジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）（質量比４：１：１）を秤量し、１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。ゆっくり回転蒸発（６５℃の水浴、９０ｒ／分、３０分間）して有機溶媒を除去し、容器の壁に薄膜を形成した。丸底フラスコに１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２．０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、フラスコを５０℃の恒温水浴に入れ、薄膜を十分に水和させて、粗リポソーム小胞懸濁液を調製した。粗リポソーム小胞懸濁液を水浴で超音波処理した後、プローブ型超音波装置で３分間（振幅２０、間隔３秒間）超音波処理し、リポソーム小胞を十分に分散して形成された安定した系、即ち、精製リポソーム小胞懸濁液を得た。精製リポソーム小胞懸濁液中の未封入のロスバスタチンは、透析バッグによって除去された。
【０１５３】
（２）ヒアルロン酸（「ＨＡ」）的活性化およびカップリング：
ＨＡ（分子量約１００ＫＤａ）１ｇを超純水に完全に溶解し、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）０．１ｇおよびＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）０．１２ｇをカップリング剤として添加し、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、無水エタノールを加えて活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、真空で乾燥させて、活性化ＨＡを得た。この活性化ＨＡを０．１ｍｇ・ｍＬ−１の水溶液に調製し、０．２ｍＬの溶液を上記工程（１）で得られたリポソーム小胞懸濁液に移して溶解させ、活性化ＨＡにおける活性化カルボキシル基と、リポソーム小胞の脂質二重層に組み込まれたＤＳＰＥ分子のアミノ基とを、アミド結合を介してカップリングした。治療剤を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを得た。
【０１５４】
１４ａ．トレーサーを担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｔ（比較例として）の調製
この実施例において、トレーサーを担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｔは、薄膜分散法によって調製された。上記リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｔのリポソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つＭＲＩトレーサーであるガドペンテト酸（「Ｔ」と略される）を担持した。
ＨＡ−ＰＬ＠Ｔの具体的な調製方法は、上記１３に記載の治療剤を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２．０ｍｇ／ｍＬ）の代わりに、１０ｍＬのトレーサーであるガドペンテト酸の水溶液（濃度３．０ｍｇ／ｍＬ）を使用し、且つ精製リポソーム小胞懸濁液における未封入のトレーサーであるガドペンテト酸を透析バッグで除去したことにある。
同様に、トレーサーは、ガドテル酸メグルミンを使用して調製することもでき、同様の結果が得られた。
【０１５５】
実施例３：本発明のセラソーム送達システムの性質の調査
この実施例において、実施例２で調製された治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒを例として、本発明のセラソーム送達システムは、安定かつ制御可能な性質を有することため、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および治療に適することを証明した。一方、本実施例において、比較の便宜上、実施例２で調製された治療薬を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを比較例として使用した。
【０１５６】
１．薬物濃度の測定法
ロスバスタチンは、強い紫外線吸収特性を有するため、ロスバスタチンの紫外線吸収特性を利用して、ＨＰＬＣ−ＵＶ法（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）でその含有量を測定することができる。標準定量式は、ＨＰＬＣクロマトグラフィーピークのピーク面積（Ｙ）に対する異なる濃度のロスバスタチン溶液の濃度（Ｘ）で確立された。
【０１５７】
２．流体力学径の測定
本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ、ならびに比較例としてのリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒの流体力学径は、レーザーパーティクルアナライザー（ＢＩ−Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ／９０  Ｐｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）によって測定され、結果は表１に示す。
【０１５８】
３．封入率の測定
１．０ｍＬのセラソーム小胞懸濁液に過剰量のＨＣｌを添加することにより懸濁液を強酸性環境にした。さらに、超音波処理を利用して、セラソーム小胞からの薬物の放出を加速した。ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）で得られた液体中の薬物含有量を測定し、式１により封入率を算出した。
【０１５９】
［式１］
2020516686.tif 000009
【０１６０】
４．薬物担持率の測定
薬物担持率の測定方法は、計算方法がわずかに異なる以外、封入率を測定する方法と同様である。に過剰量のＨＣｌを添加することにより懸濁液を強酸性環境にした。さらに、超音波処理を利用して、セラソーム小胞からの薬物の放出を加速した。ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）で得られた液体中の薬物含有量を測定し、式２により薬物担持率を算出した。
【０１６１】
［式２］
2020516686.tif 000010
【０１６２】
【表１】
2020516686.tif 000011
【０１６３】
５．長期安定性の調査
本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ、ならびに対照としてのリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを、４℃で保存し、異なる時点でサンプリングし、レーザーパーティクルアナライザー（ＢＩ−Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ／９０Ｐｌｕｓ、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）によってその流体力学径の変化を検出した。結果は図３に示す。リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒの粒子径は、保存時間とともに大幅に増加したことが分かった。これは、リポソーム小胞が不安定で、凝集または融合しやすいことによる可能性が非常に高い。さらに、安定性が低いため、リポソーム小胞は、体内の細網内皮系によって容易に除去され、半減期が短くなり、ヒトへの適用が制限される。
これに対して、ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの平均流体力学径は、９０日の保存後もほとんど変化せず、試験期間において相分離、凝集などの現象は見られなかった。ＨＡ−ＰＬ＠Ｒの平均流体力学径は、１８３ｎｍから約２μｍに増加し、外観から、１０日の保存後に明らかな沈殿が現れ、９０日の保管後に、ＨＡ−ＰＬ＠Ｒは綿状沈殿物の形態になり、再分散できなかった。本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒは、リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒよりも優れた保存安定性を有することがわかる。したがって、長期血中滞留性（ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ）標的指向性薬物送達システムとしての応用の可能性がある。
【０１６４】
６．長期封入率の調査
本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒ、ならびに対照としてのリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを、４℃で保存し、異なる時点でサンプリングし、遊離薬物を限外濾過および遠心分離により除去して、その封入率の変化を検出した。結果を図４に示す。
図に示されるように、セラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒは、９０日の静置後、薬物含有量が有意な変化はなかった。一方、リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒの薬物含有量は、約３０％まで劇的に低下した。これは、封入された薬物の放出速度が脂質二重層の性質に密接に関係していることを示した。セラソーム小胞の表面にある無機ポリシロキサン網状構造は、内部の脂質二重層構造を効果的に保護し、脂質二重層の透過性を低下させるため、薬物は漏れにくくなった。一方、リポソーム小胞は、表面に無機ポリシロキサン網状構造よる保護効果がないため、安定性が低く、薬物は漏れしやすくなった。
上記データによって、本発明のセラソーム送達システムの長期保存安定性が優れており、４℃で３ヶ月間保存しても、粒子径がほとんど変化せず、且つ薬物の漏れ率が低いことが明らかとなった。
【０１６５】
７．生体外での薬物放出性の調査
２ｍＬの本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒおよび２ｍＬの対照としてのリポソーム送達システムＨＡＰＬ＠Ｒを、透析バッグに入れて密封した。次に、透析バッグを５０ｍＬの放出媒介（ＰＢＳ溶液、ｐＨ＝７．４）に入れ、３７℃で１２０時間インキュベートした。異なる時点で２ｍＬの放出液を採取し、同量のＰＢＳ溶液を補充した。ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２４８７、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）によって放出液中の薬物含有量を検出し、式３に従って累積薬物放出率を算出した。
【０１６６】
［式３］
2020516686.tif 000012
式３の各パラメータの意味は以下の通りである。
ＣＲＰ：累積薬物放出率
Ｖｅ：放出液の交換容積、ここで、Ｖｅは２ｍＬである。
Ｖ０：放出系中の放出液の体積、ここで、Ｖ０は５０ｍＬである。
Ｃｉ：ｉ回目の交換およびサンプリング時の放出液中の薬物濃度、単位はμｇ／ｍＬである。
Ｍ薬物：セラソームまたはリポソーム送達システム中の薬物の合計質量、単位はμｇである。
ｎ：放出液の交換の回数
Ｃｎ：放出液のｎ回目の交換後に測定された放出系中の薬物濃度
【０１６７】
生体外での放出は、ナノ粒子送達システムを評価するための重要な指標である。図５は、本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒおよび対照としてのリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒの累積薬物放出率の変化を示すグラフである。グラフに示すように、リポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒは、３０時間以内にほぼ１００％の薬物を放出した。セラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒは、最初の３時間でより速く放出し、３時間以内に約１５％放出した。その後、薬物放出率は徐々に低下し、１２０時間かかても５９．５％の薬物しか放出されなかった。初期段階での速い薬物放出速度は、セラソーム小胞の表面に部分的に吸着または沈殿した、急速に溶解して放出媒介に拡散できる薬物の放出挙動が原因である可能性がある。後の段階での薬物放出は、主にセラソーム小胞に封入された薬物の放出であり、持続的且つゆっくりとした放出挙動を特徴とした。生体外放出試験の結果は、セラソーム小胞の表面が無機ポリシロキサン網状構造で覆われるため、セラソーム小胞からの薬物の放出を効果的に遅らせることができ、脂質二重層間の空隙が減少し、脂質二重層の密度が増加した。生体外放出試験の結果は、薬物担体としてのセラソーム小胞が徐放性および持続的な放出特性を有することを示した。
【０１６８】
さらに、類似の研究により、本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの生体外での薬物放出特性が似ている。中でも、ＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの薬物放出速度は最も速い（図６を参照）。これは、本発明の３つのセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒが類似の薬物放出メカニズムおよび特性を有することを示した。
【０１６９】
実施例４：本発明のセラソーム送達システムの生体内での放出安定性の調査
この実施例において、実施例２で調製されたロスバスタチンを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ２＠Ｒを例として用い、本発明のセラソーム送達システムは、リポソーム送達システムと比較して、不安定なプラークで比較的安定した状態を保つことができ、長期間持続的に薬物を放出する効果を実現することを証明した。一方、比較の便宜上、この実施例において、比較例として、実施例２で調製されたロスバスタチンを担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを用いた。
【０１７０】
実験方法：
ＡｐｏＥ−／−ＳＰＦマウス（１８匹、１０週齢、体重２０±１ｇ）を実験動物とした。マウスに適応型の高脂肪食（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りはマウスの通常飼料）を供した４週間後、４０ｍｇ／ｋｇの用量で１％のペントバルビタールナトリウム（１ｍｇのペントバルビタールナトリウムを１００ｍｌの生理食塩水に加えて調製）の腹腔内注射により麻酔した。次に、マウスを仰臥位で手術プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）のアルコールで首を中心として消毒し、首の皮膚を縦に切断し、前頸部を鈍く分離し、鼓動した左総頸動脈が気管の左側に観察された。総頸動脈を慎重に分岐部まで分離し、長さ２．５ｍｍ、内径０．３ｍｍのシリコンカニューレを左総頸動脈の外周に配置し、カニューレの近位および遠位部分をフィラメントで狭めて固定した。局所的な締め付けは、近位端の急速な血流を引き起こし、せん断力が増加し、血管の内膜を損傷した。頸動脈を復位させ、首の皮膚を断続的に縫合した。すべての操作は、１０倍の実体顕微鏡で行われた。手術から目覚めた後、マウスをケージに戻し、周囲温度を２０〜２５℃に維持し、１２時間明−１２時間暗でサイクルした。手術後４週目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、１ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ社、米国）を１０週間にわたって週２回腹腔内注射して、慢性炎症を誘発した。手術後８週目に、マウスを５０ｍｌのシリンジ（十分な通気孔を確保）に入れて、１日６時間、週５日、合計６週間で、拘束性精神的ストレスを引き起こした。マウスにおけるアテローム性動脈硬化不安定プラークのモデルは、手術後１４週目に完成した。図７（ａ）および７（ｂ）は、上記マウスアテローム性動脈硬化不安定プラークモデルの核磁気共鳴画像を示す。矢印が指す部分から、左頸動脈プラークが形成されており、モデリングが成功することを示唆しており、右頸動脈は通常の動脈血管壁として比較のために用いられる。
【０１７１】
使用した標的指向性送達システムに応じて、マウスを群当たり６匹で３つの群にランダムに分かれた。即ち、セラソーム送達システム群１（実施例２で調製されたロスバスタチンを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒを使用した）、セラソーム送達システム群２（実施例２で調製されたロスバスタチンを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ２＠Ｒを使用した）、およびリポソーム送達システム群（実施例２で調製されたロスバスタチンを担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒを使用し、比較例とした）である。
【０１７２】
実験の当日に、上記３つの群に対して、体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇの単回用量で静脈内注射により、ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＰＬ＠Ｒを投与した。それぞれマウスの。動脈不安定プラークにおける薬物曝露の百分率（実験薬物を注射した後の不安定プラークでのロスバスタチン濃度の経時的な変化を反映するもの）は、液体クロマトグラフィー質量分析法で測定した。
【０１７３】
（１）標準溶液の調製
０．０１４１ｇのロスバスタチンを正確に秤量し、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、メタノールで溶解し、マークまで希釈し、振盪し、濃度５６．４μｇ／ｍＬのロスバスタチン参照物質ストック溶液を調製した。ロスバスタチン標準物質ストック溶液をメタノールで希釈して、１０、１、０．５、０．１２５、０．０５、０．０２５、０．０１、０．００２、０．０００４μｇ／ｍＬの一連の標準溶液を作成し、４℃で保存した。
【０１７４】
（２）内部標準溶液の調製
アセトアミノフェン０．００３８ｇを正確に秤量し、２５ｍＬのメスフラスコに入れ、メタノールで溶解し、マークまで希釈し、振盪し、濃度０．１５２ｍｇ／ｍＬのアセトアミノフェンストック溶液を調製した。アセトアミノフェンストック溶液をメタノールで希釈して、１５．２ｎｇ／ｍＬの内部標準溶液を作成し、４℃で保存した。
【０１７５】
（３）頸動脈サンプルの前処理
投与前および投与後２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、１６８時間（７日）に動物を殺処分（各時点で１匹のマウス）した。頸動脈プラークをすばやく取り出して生理食塩水に入れ、表面の水を濾紙で吸収し、各プラークから１ｃｍのサンプルを切り取り、湿重量を計量し、１ｍｌの生理食塩水を加えて均質化してホモジネート液を調製した。
ホモジネート液１ｍｌを取り、メタノール２０μＬ、濃度１５．２ｎｇ／ｍＬの内部標準溶液１００μＬ、１０％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液１００μＬ、酢酸エチル５ｍＬを加え、均一に混合し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。有機層溶液４ｍｌを取り、窒素で乾燥させた。次に、２００μＬの移動相（０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液とアセトニトリル（４０：６０、ｖ／ｖ））で溶解し、溶液を１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、サンプルボトルに移した。
【０１７６】
（４）標準曲線のサンプルの調製
一連の濃度のロスバスタチン溶液１０μＬを取り、５００μＬのブランク血漿を添加し、ボルテックスして均一に混合し、それぞれ２００、２０、１０、２．５、１、０．５、０．２、０．０４、０．００８ｎｇ／ｍＬの濃度のロスバスタチン模擬薬物含有血漿サンプルを調製した。血漿処理による操作（１５．２ｎｇ／ｍＬの内部標準溶液５０μＬ、１０％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液５０μＬおよび酢酸エチル２．５ｍＬを加えて均一に混合し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、有機層溶液２ｍｌを取り、窒素で乾燥させた後、１００μＬの移動相で溶解し、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を採取し、サンプルボトルに移した）に従って標準曲線を確立した。ロスバスタチンのピーク面積と内部標準のピーク面積の比を縦座標（ｙ）として、血中濃度を横座標（ｘ）として、重み付き最小二乗法により線形回帰を行った。
【０１７７】
（５）液体クロマトグラフィー質量分析
液相分離は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ｍｏｄｕｌａＲＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（東京、日本国）を使用して実施した。上記システムは、１つのＤＧＵ−２０Ａ３Ｒ真空脱気装置、２つのＬＣ−２０ＡＤＸＲ溶媒送達モジュール、１つのＳＩＬ−２０ＡＣＸＲオートサンプラー、１つのＳＰＤ−Ｍ２０Ａ  ＰＤＡシステム、および１つのＣＢＭ−２０Ａコントローラーを含む。この液体クロマトグラフィシステムは、ＥＳＩインターフェースを備えたＡＢＳｃｉｅｘ  ５５００  Ｑｔｒａｐ質量分析計（ＦｏｓｔｅＲＣｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）とオンラインで接続された。Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １．６．２、ＡＢＳｃｉｅｘ）は、データの取得と処理に用いられた。
【０１７８】
Ｃｏｒｔｅｃｓ  ＴＭ  ＵＰＬＣ  Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×２．１ｍｍ内径（ｉｄ）、１．６μｍ粒度）（Ｗａｔｅｒｓ社、米国）を使用してクロマトグラフィーを実施し、カラム温度およびサンプルチャンバ温度をそれぞれ４０℃および４℃に設定した。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸水溶液とアセトニトリル（４０：６０、ｖ／ｖ）、サンプル注入量は２μｌ、流量は０．２ｍＬ／ｍｉｎ、単一サンプルの分析時間は４分間とした。
【０１７９】
質量分析は、陽イオンスキャンモードで、イオン源としてＥＳＩ源を使用した。スプレー電圧を４５００Ｖに設定し、ソース温度を５００℃に設定した。各化合物は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）によって検出された。各成分のイオンチャネルは、ロスバスタチンカルシウムｍ／ｚ  ４８２．２→２５８．２、アセトアミノフェンｍ／ｚ  １５２．２→１１０とした。各化合物の衝突エネルギーおよびコーン電圧は、ロスバスタチン４３Ｖおよび１００Ｖ、アセトアミノフェン２３Ｖおよび１００Ｖに最適化した。ロスバスタチンカルシウムとアセトアミノフェンの保持時間は、それぞれ２．０７ｍｉｎと１．４９ｍｉｎであった。
【０１８０】
（６）標準曲線
ロスバスタチンの線形範囲、相関係数（ｒ）、線形方程式およびＬＬＯＱを表２に示す。表に示すように、ロスバスタチンのＲ値は０．９９９より大きく、定量分析の要件を満たす。
【０１８１】
【表２】
2020516686.tif 000013
【０１８２】
結果を図８に示す。図に示すように、ＨＡ−ＰＬ＠Ｒを注射した後、モデルマウスの不安定プラークにおけるロスバスタチンの濃度は、短時間でピークに達した後、急速に低下した。これは、リポソーム小胞が不安定プラークで不安定であり、崩壊しやすく、急速な薬物漏出にもたらすことを示す。これに対して、ＨＡ−ＣＬ１＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ２＠Ｒを注射した後、モデルマウスの不安定プラークにおけるロスバスタチンの濃度は、比較的に速くピークに達し、濃度は比較的長期間にわたって穏やかに減少した。これは、本発明のセラソーム送達システムが不安定プラークで安定した状態を保つことができ、長期間にわたって薬物を持続的に放出する効果を実現できることを示す。
【０１８３】
実施例５：標的グメカニズムの調査
この実施例において、不安定プラークにおける内皮細胞の表面のＣＤ４４の密度およびＨＡに対する親和性を調査したことで、本発明に係る不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの標的として、不安定プラーク内のＣＤ４４を選択することに対して、実験的な根拠を提供する。
【０１８４】
１）マウス動脈不安定プラークの内皮細胞表面および正常な動脈血管壁の内皮細胞表面のＣＤ４４含有量の比較
上記実施例４に記載の方法に従って、アテローム性動脈硬化プラークのマウスモデルを構築した。正常な動脈血管の内皮細胞とモデルマウスの動脈不安定プラークの内皮細胞を採取して、免疫組織化学染色と画像分析によってＣＤ４４含有量を測定した。具体的な実験方法は以下の通りである。
【０１８５】
マウス頸動脈アテローム硬化性不安定プラーク標本を採取し、１０ｍＬ／Ｌのホルムアルデヒド水溶液で固定し、パラフィンで包埋し、４μｍに切断し、通常の方法で脱ろうし、水和させ、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体法（ＳＡＢＣ）によってＣＤ４４含有量を検出した。標本を３０ｍＬ／ＬのＨ２Ｏ２水溶液に浸漬して内因性ペルオキシダーゼの活性を遮断し、さらにクエン酸緩衝液に入れ、抗原マイクロ波修復（ａｎｔｉｇｅｎ  ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｒｅｐａｉｒ）を行った。次に、５０ｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキング液を滴下し、室温で２０分間放置した。さらに、マウス抗ＣＤ４４ポリクローナル抗体（１：１００）を滴下し、４℃の冷蔵庫に一晩置き、３７℃で１時間インキュベートした。洗浄した後、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧを滴下し、３７℃で３０分間反応させた。次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＳＡＢＣ複合体を滴下し、３７℃で２０分間インキュベートした。上記各ステップにおいていずれもＰＢＳで洗浄した。
【０１８６】
最後に、ＤＡＢで発色（発色は顕微鏡で制御された）し、ヘマトキシリンで再び染色し、サンプルを脱水し、密封した。ＢＩ−２０００画像分析システムの免疫組織化学分析システムにより切片を分析した。正常な動脈血管の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞について、それぞれ３つの切片を採取し、５つの代表的な視野をランダムに選択した。ＣＤ４４の陽性発現は、細胞膜と細胞質は黄褐色／茶褐色で、且つ背景は鮮明であり、また、色が濃いほどＣＤ４４の発現が強くなる。
【０１８７】
黄褐色の粒子は見られないことは、ＣＤ４４の陰性発現を意味する。正常な動脈血管の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞の陽性細胞の平均吸光度（Ａ）値を測定し、比較した。結果を図９に示す。
【０１８８】
図９は、モデルマウスの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４含有量の測定結果（半定量的積分で表される）を示す。図に示すように、動脈不安定プラークの内皮細胞表面のＣＤ４４含有量は、正常な動脈血管の内皮細胞表面のＣＤ４４含有量の約２．３倍である。
【０１８９】
２ａ）ＨＡに対するマウスの動脈不安定プラークの内皮細胞の表面および正常な動脈血管壁の内皮細胞の表面のＣＤ４４の親和性の比較
【０１９０】
モデルマウスの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞を採取し、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアミノフルオレセインで標識されたヒアルロン酸（「ＦＬ−ＨＡ」で表される）を加え、サンプルは、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（体積分率１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分間後、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、両方の細胞の表面でのＦＬ−ＨＡの結合力の積分（正常な動脈血管壁の内皮細胞の結合力は１とする）を算出した。結果を図１０に示す。
【０１９１】
図１０に示すように、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＦＬ−ＨＡの結合力の積分は、正常な動脈血管壁の内皮細胞の約２４倍である。これは、正常な動脈血管壁の内皮細胞の表面のほとんどのＣＤ４４がリガンドＨＡに結合できない静止状態となるが、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４が内部環境における炎症因子などの因子の影響で活性化され、ＨＡに対する親和性は著しく増加することを示す。
【０１９２】
２ｂ）リガンドおよび抗体に対するマウスの動脈不安定プラークの内皮細胞の表面および正常な動脈血管壁の内皮細胞の表面のＣＤ４４の親和性の比較
【０１９３】
ＣＤ４４の天然リガンドとして、ＨＡ、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、およびモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、ＩＭ７などが挙げられる。
【０１９４】
モデルマウスの正常な動脈血管壁の内皮細胞および動脈不安定プラークの内皮細胞を採取し、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアミノフルオレセインで標識されたリガンド／抗体を添加し、サンプルは、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（体積分率１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分間後、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、両方の細胞の表面でのＦＬ−リガンド／抗体の結合力の積分（正常な動脈血管壁の内皮細胞のＣＤ４４のリガンド／抗体に対する結合力は１とする）を算出した。結果を図１１に示す。
【０１９５】
図１１に示されるように、ＨＡに対する動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４の結合力の積分は、正常な動脈血管壁の内皮細胞約２４倍である。これは、正常な動脈血管壁の内皮細胞の表面のほとんどのＣＤ４４がリガンドＨＡに結合できない静止状態となるが、動脈不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４が内部環境における炎症因子などの因子の影響で活性化され、ＨＡに対する親和性は著しく増加することを示す。
【０１９６】
ＣＤ４４の他のリガンドは、ＨＡと似ている。ＧＡＧに対する不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の２２倍であり；コラーゲンに対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の２１倍であり；ラミニンに対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１６倍であり；フィブロネクチンに対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１８倍であり；セレクチンに対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１９倍であり；オステオポンチンに対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１７倍である。
【０１９７】
ＣＤ４４のモノクローナル抗体についても同様の結果が観察された。ＨＩ４４ａに対する不安定プラークの内皮細胞の表面のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１５倍であり；ＨＩ３１３に対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の２１倍であり；Ａ３Ｄ８に対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１７倍であり；Ｈ９０に対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の９倍であり；ＩＭ７に対する不安定プラークの内皮細胞のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の８倍である。
【０１９８】
３ａ）ＨＡに対するプラーク外のマクロファージおよび動脈の不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４の親和性の比較
【０１９９】
モデルマウスの腹腔内のマクロファージおよび動脈不安定プラーク内のマクロファージを採取し、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアミノフルオレセインで標識されたヒアルロン酸（「ＦＬ−ＨＡ」で表される）を加え、サンプルは、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（体積分率１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分間後、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、両方の細胞の表面でのＦＬ−ＨＡの結合力の積分（ＨＡに対するプラーク外のマクロファージの表面のＣＤ４４の結合力は１とする）を算出した。結果を図１２に示す。
【０２００】
図１２に示すように、動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＦＬ−ＨＡの結合力は、プラーク外のマクロファージの表面のＦＬ−ＨＡの結合力の約４０倍である。これは、動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４も、内部環境における炎症因子などの因子の影響で活性化され、ＨＡに対する親和性は著しく増加することを示す。
【０２０１】
上記実験の結果に基づいて、以下の結論が得られる。正常細胞（例えば、正常な動脈血管壁の内皮細胞、プラーク外のマクロファージなど）と比較して、不安定プラーク内の細胞（内皮細胞、マクロファージなどを含み、動脈不安定プラークの発達に重要な影響を与える）の表面のＣＤ４４の密度が明らかに増加し、ＨＡに対する親和性が顕著に強化されるため、ＨＡリガンドに対する動脈不安定プラーク内のＣＤ４４の特異的親和性は、正常細胞よりはるかに高く、本発明の不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの優れた標的として非常に有利である。
【０２０２】
３ｂ）リガンド／抗体に対するプラーク外のマクロファージおよび動脈の不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４の親和性の比較
【０２０３】
モデルマウスの腹腔内のマクロファージおよび動脈不安定プラーク内のマクロファージを採取し、濃度１０ｍｇ／ｍｌのアミノフルオレセインで標識されたリガンド／抗体を加え、サンプルは、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内に、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（体積分率１０％の牛胎児血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンを含む）で培養した。３０分間後、フローサイトメトリー（ＣｙｔｏＦＬＥＸ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）で平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し、両方の細胞の表面でのＦＬ−ＨＡの結合力の積分（リガンド／抗体に対するプラーク外のマクロファージの表面のＣＤ４４の結合力は１とする）を算出した。結果を図１３に示す。
【０２０４】
図１３に示すように、動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４−ＨＡの結合力は、プラーク外のマクロファージの表面のＣＤ４４−ＨＡの結合力の約４０倍である。これは、動脈不安定プラーク内のマクロファージの表面のＣＤ４４も、内部環境における炎症因子などの因子の影響で活性化され、ＨＡに対する親和性は著しく増加することを示す。
【０２０５】
ＣＤ４４の他のリガンドは、ＨＡと似ている。ＧＡＧに対する不安定プラークのマクロファージの表面のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３３倍であり；コラーゲンに対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３８倍であり；ラミニンに対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３７倍であり；フィブロネクチンに対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３５倍であり；セレクチンに対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３３倍であり；オステオポンチンに対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の３３倍である。
【０２０６】
ＣＤ４４のモノクローナル抗体についても同様の結果が観察された。ＨＩ４４ａに対する不安定プラークのマクロファージの表面のＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１７倍であり；ＨＩ３１３に対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の２０倍であり；Ａ３Ｄ８に対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１６倍であり；Ｈ９０に対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の９倍であり；ＩＭ７に対する不安定プラークのマクロファージのＣＤ４４の結合力の積分は、正常細胞の１０倍である。
【０２０７】
上記実験の結果に基づいて、以下の結論が得られる。正常細胞（例えば、正常な動脈血管壁の内皮細胞、プラーク外のマクロファージなど）と比較して、不安定プラーク内の細胞（内皮細胞、マクロファージなどを含み、動脈不安定プラークの発達に重要な影響を与える）の表面のＣＤ４４の密度が明らかに増加し、リガンドに対する親和性が顕著に強化されるため、リガンドに対する動脈不安定プラーク内のＣＤ４４の特異的親和性は、正常細胞よりはるかに高く、本発明の不安定プラークを標的とするセラソーム送達システムの優れた標的として非常に有利である。
【０２０８】
実施例６：動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム送達システムの影響に関する生体内での実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明の治療薬を担持したセラソーム送達システムの生体内での治療効果を検証することである。
【０２０９】
実験方法：
（１）遊離ロスバスタチンの生理食塩水溶液を調製した。治療薬を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、治療薬と低分子ヒアルロン酸を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋ＬＭＨＡ、治療薬とＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋Ｓ、治療薬を担持したリポソーム送達システムＨＡ−ＰＬ＠Ｒおよびヒアルロン酸ナノミセルシステムＰＤＬＬＡ／Ｃｈｏｌ−ＨＡ＠Ｒ（比較例として）は、上記実施例２に記載の方法により調製された。
【０２１０】
ヒアルロン酸ナノミセルシステム（ＰＤＬＬＡ／Ｃｈｏｌ−ＨＡ＠Ｒ）の調製：１ｇのコレステロールを３０ｍＬのアセトンに溶解し、１ｇの無水コハク酸を加えた。反応溶液を７０℃で３時間撹拌した。溶媒を減圧蒸留により除去し、粗生成物を溶解し、水／無水エタノール（１：１０）から再結晶して、コハク酸コレステリルを得た。５００ｍｇのコハク酸コレステリルを秤量し、２０ｍＬの無水クロロホルムに溶解し、１ｍＬの塩化チオニルを含むクロロホルム６ｍＬを滴下した。滴下完了後、系の温度を６０℃に昇温し、反応を５時間続けた。未反応の塩化チオニルおよびトリクロロメタンを減圧蒸留により除去して、淡緑色の油を得た。５００ｍｇのヒアルロン酸（１０ｋＤ）を６０ｍＬのジメチルスルホキシドに溶解し、１ｍＬのトリエチルアミンを添加し、コレステロールコハク酸アシル塩化物のジメチルスルホキシド溶液５ｍＬを秤量し、窒素保護下でコレステロールコハク酸アシル塩化物をゆっくり添加し、系を８０℃の恒温で７時間反応させた。反応が完了した後、加熱を停止した。反応生成物を水に対して７２時間透析した後、凍結乾燥してコレステロール変性ヒアルロン酸（Ｃｈｏｌ−ＨＡ）を得た。
【０２１１】
５０ｍｇのＣｈｏｌ−ＨＡおよび５０ｍｇのポリ乳酸（ＰＤＬＬＡ）を秤量し、１０ｍＬのＤＭＦに一緒に溶解し、マグネティックスターラーで完全に混合されるまで２４時間攪拌した。得られたポリマー溶液をカットオフ分子量３０００の透析バッグに注ぎ、５００ｍＬの脱イオン水に対して４時間透析した後、水相を２ｗｔ％のロスバスタチン溶液に置き換え、さらに透析を４８時間続けた。次に、透析バッグをすぐに２０ｍＬのロスバスタチン溶液（１ｍｇ・ｍＬ−１）に入れて２４時間インキュベートした後、１Ｌの脱イオン水に対して４時間透析した。その間に脱イオン水を１時間に１回交換して未封入の薬物を除去した。得られたナノベシクル（ｎａｎｏｖｅｓｉｃｌｅ）溶液を透析バッグから取り出し、凍結乾燥して、ロスバスタチンを担持したナノキャリアＰＤＬＬＡ／Ｃｈｏｌ−ＨＡ＠Ｒを得た。
【０２１２】
（２）動脈不安定プラークのＡｐｏＥ−／−マウスモデルの確立
ＡｐｏＥ−／−ＳＰＦマウス（３０匹、５〜６週齢、体重２０±１ｇ）を実験動物とした。マウスに適応型の高脂肪食（脂肪１０％（ｗ／ｗ）、コレステロール２％（ｗ／ｗ）、コール酸ナトリウム０．５％（ｗ／ｗ）、残りはマウスの通常飼料）を供した４週間後、４０ｍｇ／ｋｇの用量で１％のペントバルビタールナトリウム（１ｍｇのペントバルビタールナトリウムを１００ｍｌの生理食塩水に加えて調製）の腹腔内注射により麻酔した。次に、マウスを仰臥位で手術プレートに固定し、７５％（ｖ／ｖ）のアルコールで首を中心として消毒し、首の皮膚を縦に切断し、前頸部を鈍く分離し、鼓動した左総頸動脈が気管の左側に観察された。総頸動脈を慎重に分岐部まで分離し、長さ２．５ｍｍ、内径０．３ｍｍのシリコンカニューレを左総頸動脈の外周に配置し、カニューレの近位および遠位部分をフィラメントで狭めて固定した。局所的な締め付けは、近位端の急速な血流を引き起こし、せん断力が増加し、血管の内膜を損傷した。頸動脈を復位させ、首の皮膚を断続的に縫合した。すべての操作は、１０倍の実体顕微鏡で行われた。手術から目覚めた後、マウスをケージに戻し、周囲温度を２０〜２５℃に維持し、１２時間明−１２時間暗でサイクルした。手術後４週目に、リポ多糖（ＬＰＳ）（０．２ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水、１ｍｇ／ｋｇ、Ｓｉｇｍａ社、米国）を１０週間にわたって週２回腹腔内注射して、慢性炎症を誘発した。手術後８週目に、マウスを５０ｍｌのシリンジ（十分な通気孔を確保）に入れて、１日６時間、週５日、合計６週間で、拘束性精神的ストレスを引き起こした。マウスにおけるアテローム性動脈硬化不安定プラークのモデルは、手術後１４週目に完成した。
【０２１３】
（３）実験動物の群分けおよび治療：
実験動物をランダムに以下の群に分け、群当たり６匹である。
不安定プラークモデルの対照群：この群の動物は治療的処置を受けない。
ロスバスタチンを胃内投与した群：体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇの用量で胃内投与を行った。
ロスバスタチンを静脈内投与した群：体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
ＨＡ−ＰＬ＠Ｒ群：体重１ｋｇあたりロスバスタチン５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
ＰＤＬＬＡ／Ｃｈｏｌ−ＨＡ＠Ｒ群：体重１ｋｇあたりロスバスタチン５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ群：体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
ＨＡ−ＣＬ１Ｒ＋ＬＭＨＡ群：体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇおよび分子量３４１１Ｄａの低分子ヒアルロン酸１．２５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
ＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ＋Ｓ群：体重１ｋｇ当たりロスバスタチン５ｍｇおよびＣＤ４４抗体ｍＡｂ  １．７５ｍｇの用量で静脈内投与を行った。
不安定プラークモデルの対照群の他、治療群の治療は、１日おきに１回、合計５回行われた。各群の動物について、治療の前後に頸動脈ＭＲＩスキャンを実施してプラークおよび管腔面積を検出し、プラーク進行の割合を算出した。
プラーク進行の割合＝（治療後のプラーク面積−治療前のプラーク面積）／管腔面積。
【０２１４】
実験の結果：
図１４は、動脈不安定プラークに対する本発明の治療薬を担持したセラソーム送達システムの体内での治療効果を示す。図に示すように、マウスの動脈不安定プラークについては、胃内投与でも静脈内投与でも、遊離ロスバスタチンは一定の治療効果を示しますが、不安定プラークの継続的な成長を止めることができなかった。遊離ロスバスタチンと比較して、リポソーム送達システムまたはヒアルロン酸ナノミセル送達システムでロスプラスタチンを投与した場合、不安定プラークに対するロスプラスタチンの治療効果はある程度改善されたが、不安定プラークの継続的な成長を止めることはできなかった。一方、本発明のセラソーム送達システムでロスプラスタチンを投与した場合、不安定プラークに対するロスバスタチンの治療効果は著しく改善され、プラーク成長を逆転（即ち、プラークを減少させる）させる治療効果が示された。特に、本発明者らは、ロスバスタチンが低分子ヒアルロン酸またはＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂと組み合わせてセラソーム送達システムで併用して投与された場合、ロスバスタチンが、マウスの体内の動脈不安定プラークに対して非常に顕著な治療効果があることを意外に発見した。つまり、本発明のセラソーム送達システムを使用した治療剤の投与は、遊離薬物の投与およびリポソーム送達システムを使用した場合と比較して、動脈不安定プラークの成長を著しく逆転させ、より良い治療効果をもたらす。
【０２１５】
さらに、同様の研究により、動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの治療効果が類似していることがわかった。本発明の３つのセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒが類似の薬物放出メカニズムおよび特性を有することを示した。
【０２１６】
実施例７：動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム送達システムの生体内での追跡実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明のトレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を検証することである。
【０２１７】
実験方法：
（１）市販の金ナノ粒子溶液を用い、上記実施例２に記載の方法により、ＣＴ用トレーサー金ナノ粒子を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、およびトレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ（比較例として）を調製した。
【０２１８】
（２）上記実施例４に記載の方法に従って、アテローム硬化性プラークのマウスモデルが構築された。
【０２１９】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例４と同じ）を１６週間与えた。２４匹のモデルマウスを、遊離ナノ金粒子群（６匹、市販のナノ金粒子溶液を与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、ＣＬ１＠ＡｕＮＰＳ群（６匹、ＣＬ１＠ＡｕＮＰＳを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、およびＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂの投与量は約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与４時間後にＣＴイメージングを行い、各群のアテローム硬化性プラークの識別を観察した。
【０２２０】
実験の結果：
図１５は、動脈不安定プラークに対する本発明のトレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を示す。
【０２２１】
図に示すように、遊離ナノ金粒子は、マウスの動脈不安定プラークに対して一定の追跡効果を示す。ナノ金粒子を非標的指向性セラソーム送達システムに担持した場合、遊離の金ナノ粒子と比較して、不安定プラークに対する金ナノ粒子の追跡効果はある程度改善された。金ナノ粒子を、本発明に係る表面がターゲティングリガンドであるヒアルロン酸で修飾されたセラソーム送達システムに担持した場合、不安定プラークに対する金ナノ粒子の追跡効果が著しく改善された。特に、本発明者らは、金ナノ粒子がＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂと組み合わせてセラソーム送達システムで併用して投与された場合、金ナノ粒子が、マウスの体内の動脈不安定プラークに対して非常に顕著な追跡効果があることを意外に発見した。つまり、本発明の表面がターゲティングリガンドであるヒアルロン酸で修飾されたセラソーム送達システムを使用して投与することは、金ナノ粒子の投与および非標的指向性セラソームを使用した場合と比較して、不安定プラークに対する金ナノ粒子の認識効果を著しく改善し、より良い追跡効果をもたらす。
【０２２２】
さらに、同様の研究により、動脈不安定プラークに対する本発明のトレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの追跡効果が類似していることがわかった。本発明の３つのセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓが類似の薬物放出メカニズムおよび特性を有することを示した。
【０２２３】
実施例８：動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム−ＨＡ−イオジキサノール送達システムの生体内での追跡（ＣＴ追跡）実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明のＣＴ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を検証することである。
【０２２４】
実験方法：
（１）市販のイオジキサノール原薬を使用し、上記実施例１に記載の方法により、ＣＴ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ、およびトレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｉ（比較例として）を調製した。
【０２２５】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２２６】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。３０匹のモデルマウスを、ブランク群（６匹）、イオジキサノール群（６匹、市販のイオジキサノール原薬を投与し、イオジキサノールの投与量は０．６６ｍｇ／ｋｇ体重）、ＣＬ１＠Ｉ群（６匹、ＣＬ１＠Ｉを与え、イオジキサノールの投与量は０．６６ｍｇ／ｋｇ体重）、ＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠Ｉを与え、イオジキサノールの投与量は０．６６ｍｇ／ｋｇ体重）、およびＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓを与え、イオジキサノールの投与量は０．６６ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＣＤ４４活性化剤−ＬＰＳの投与量は約０．０２３ｍｇ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与７２時間後にＣＴイメージングを行い、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【０２２７】
実験の結果：
図１６は、動脈不安定プラークに対する本発明のトレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を示す。図に示すように、イオジキサノールの静脈内投与では、マウスの体内の動脈不安定プラークに対する追跡効果は示されなかった。イオジキサノールの静脈内投与と比較して、非標的指向性セラソーム送達システムに担持する場合、不安定プラークに対するイオジキサノールの追跡効果がある程度改善された。イオジキサノールを、本発明の表面がターゲティングリガンドであるヒアルロン酸で修飾されたセラソーム送達システムに担持した場合、不安定プラークに対するイオジキサノールの追跡効果が著しく改善された。特に、本発明者らは、イオジキサノールがＣＤ４４活性化剤−ＬＰＳと組み合わせてセラソーム送達システムで併用して投与された場合、マウスの体内の動脈不安定プラークに対して非常に顕著な追跡効果があることを意外に発見した。つまり、本発明の表面がターゲティングリガンドであるヒアルロン酸で修飾されたセラソーム送達システムを使用して投与する場合は、イオジキサノールの投与および非標的指向性セラソームを使用した場合と比較して、動脈不安定プラークに対するイオジキサノールの認識効果を著しく改善し、より良い追跡効果をもたらす。
【０２２８】
実施例９：動脈不安定プラークに対する本発明のセラソーム−ＨＡ−ガドテル酸メグルミン送達システムの生体内での追跡（ＭＲＩ追跡）実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明のＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を検証することである。
【０２２９】
実験方法：
（１）市販のガドテル酸メグルミン原薬を使用し、上記実施例１に記載の方法により、ＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムおよびブランクセラソーム送達システム（比較例として）を調製した。
【０２３０】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２３１】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。１８匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、低濃度ガドテル酸メグルミンセラソーム群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、高濃度ガドテル酸メグルミンセラソーム群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【０２３２】
実験の結果：
図１７は、動脈不安定プラークに対する本発明のトレーサーを担持したセラソーム送達システムの生体内での追跡効果を示す。図に示すように、ブランクセラソームは、マウスの動脈不安定プラークに対する追跡効果を示さなかった。ブランクセラソーム群と比較して、ガドテル酸メグルミンを標的指向性セラソーム送達システムに担持する場合、不安定プラークに対する追跡効果が著しく改善され、且つ用量に依存して向上した。つまり、本発明のセラソーム−ＨＡ−ガドテル酸メグルミン送達システムを使用して投与する場合は、ブランクセラソーム送達システムを使用した場合と比較して、動脈不安定プラークに対する認識効果を表し、より良いＭＲＩ追跡効果をもたらす。
【０２３３】
実施例１０：動脈不安定プラークに対する本発明の多種ＣＤ４４モノクローナル抗体−セラソーム−ガドテル酸メグルミン送達システムの生体内での追跡（ＭＲＩ追跡）実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明のＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームの表面に多種のＣＤ４４モノクローナル抗体が組み込まれたナノ送達システムの生体内での追跡効果を検証することである。
【０２３４】
実験方法：
（１）市販のガドテル酸メグルミン原薬を使用し、上記実施例１に記載の方法により、異なるＣＤ４４モノクローナル抗体を標的プローブとするＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームナノ送達システムを調製した。
【０２３５】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２３６】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例５と同じ）を１６週間与えた。２４匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ｈ１４４ａ群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ａ３Ｄ８群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ｈ９０群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【０２３７】
実験の結果：
図１８は、動脈不安定プラークに対する本発明の多種ＣＤ４４モノクローナル抗体をプローブとするナノ送達システムの生体内での追跡効果を示す。図に示すように、ブランクセラソーム群と比較して、本発明の多種ＣＤ４４モノクローナル抗体を標的プローブとするセラソームナノシステム（ガドテル酸メグルミン−セラソーム−ＨＩ４４ａナノシステム、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ａ３Ｄ８ナノシステム、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ｈ９０ナノシステムを含む）は、いずれも動脈不安定プラークに対する認識効果を示し、より良いＭＲＩ追跡効果をもたらす。
【０２３８】
実施例１１：動脈不安定プラークに対する本発明の多種ＣＤ４４リガンド−セラソーム−ガドジアミド送達システムの生体内での追跡（ＭＲＩ追跡）実験
本実施例の目的は、動脈不安定プラークに対する本発明のＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームの表面に多種のＣＤ４４リガンドが組み込まれたナノ送達システムの生体内での追跡効果を検証することである。
【０２３９】
実験方法：
（１）市販のガドジアミド原薬を使用し、上記実施例１に記載の方法により、異なるＣＤ４４リガンドを標的プローブとするＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームナノ送達システムを調製した。
【０２４０】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２４１】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例５と同じ）を１６週間与えた。４２匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、ＨＡ−セラソーム群（６匹）、コラーゲン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ラミニン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、フィブロネクチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、セレクチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、オステオポンチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【０２４２】
実験の結果：
図１９は、動脈不安定プラークに対する本発明の多種ＣＤ４４リガンドをプローブとするナノ送達システムの生体内での追跡効果を示す。図に示すように、ブランクセラソーム群と比較して、本発明の多種ＣＤ４４リガンド（ＨＡ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチンを含む）を標的プローブとするセラソームナノシステムは、いずれも動脈不安定プラークに対する認識効果を示し、より良いＭＲＩ追跡効果をもたらす。
【０２４３】
実施例１２：本発明のＨＡ−多種の粒子径のセラソーム−イオジキサノール送達システムの組織分布
本実施例の目的は、本発明のＣＴ用トレーサーを担持した（異なる粒子径の）セラソームナノ送達システムの組織分布を検証することである。
【０２４４】
実験方法：
（１）市販のイオジキサノール原薬を使用し、以下の方法により、異なる粒子径のセラソームナノ送達システムを調製（ＨＡの分子量は１０万Ｄａ）した。
【０２４５】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２４６】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例５と同じ）を１６週間与えた。３６匹のモデルマウスを、粒子径２８０ｎｍのセラソーム群（１２匹）、粒子径２００ｎｍのセラソーム群（１２匹）、粒子径１６０ｎｍのセラソーム群（１２匹）にランダムに分けた。担体に市販のイオジキサノール原薬を担持し、イオジキサノールの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌで、投与量は１０ｍｌ／ｋｇであった。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の４つの時点に組織を採取（各時点で３匹）し、各群の動物のイオジキサノールの組織分布を観察した。
【０２４７】
実験の結果：
表３は、本発明のＣＴ用トレーサーを担持した異なる粒子径のセラソームナノ送達システムの組織分布を示す。表に示すように、本発明の上記２００ｎｍのセラソームは、他の粒子径のセラソーム群と比較して、動脈不安定プラークでより濃縮される。
【０２４８】
【表３】
2020516686.tif 000014
【０２４９】
実施例１３：本発明の多種の分子量のＨＡ−セラソーム−イオジキサノール送達システムの組織分布
本実施例の目的は、本発明のＣＴ用トレーサーを担持した、異なる分子量のＨＡを認識リガンドとするセラソームナノ送達システムの組織分布を検証することである。
【０２５０】
実験方法：
（１）市販の原料イオジキサノールを使用し、以下の方法によりセラソームナノ送達システム（セラソーム粒子径２００ｎｍ）を調製した。１ｇのヒアルロン酸ナトリウムＨＡ１、ＨＡ２、ＨＡ３（それぞれの分子量は、２０万Ｄａ、１０万Ｄａ、３万Ｄａ）をそれぞれ超純水に完全に溶解し、０．１ｇの１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）および０．１２ｇのＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ）をカップリング剤として添加し、カルボキシル基を活性化した。溶液を室温で１時間撹拌した後、アセトンを加えて活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、真空で乾燥させて、活性化ＨＡを得た。この活性化ＨＡを０．１ｍｇ・ｍＬ−１の水溶液に調製し、０．２ｍＬの溶液を上記工程で得られたリポソーム小胞懸濁液に移して溶解させ、活性化ＨＡにおける活性化カルボキシル基と、リポソーム小胞の脂質二重層に組み込まれたＤＳＰＥ分子のアミノ基とを、アミド結合を介してカップリングした。治療剤を担持したリポソーム送達システムＨＡ１−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ２−ＣＬ１＠ＲおよびＨＡ３−ＣＬ１＠Ｒを得た。
【０２５１】
（２）上記実施例６に記載の方法に従って、アテローム硬化性不安定プラークのマウスモデルが構築された。
【０２５２】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例５と同じ）を１６週間与えた。３６匹のモデルマウスを、ＨＡ１−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）、ＨＡ２−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）、ＨＡ３−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）にランダムに分けた。担体に市販のイオジキサノール原薬を担持し、イオジキサノールの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌで、投与量は１０ｍｌ／ｋｇであった。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の４つの時点に組織を採取（各時点で３匹）し、各群の動物のイオジキサノールの組織分布を観察した。
【０２５３】
実験の結果：
表４は、本発明のＣＴ用トレーサーを担持した異なる分子量のＨＡ−セラソームナノ送達システムの組織分布を示す。表に示すように、本発明の上記１０万ＤａのＨＡは、他の分子量のＨＡと比較して、動脈不安定プラークでより濃縮される。
【０２５４】
【表４】
2020516686.tif 000015
【０２５５】
本発明の様々な態様は、上述の実施例によって例示された。上記実施例は、単に説明を明確にするための例示であり、実施形態を限定するものではない。当業者にとっては、上記説明に基づいて、他の形態の変更または変形を行うこともできる。ここですべての実施形態を例示する必要も方法もない。それから生じる明らかな変更または変形は、依然として本発明の範囲内である。
【図１】
2020516686.tif 000019
【図２】
2020516686.tif 000020
【図３】
2020516686.tif 000021
【図４】
2020516686.tif 000022
【図５】
2020516686.tif 000023
【図６】
2020516686.tif 000024
【図７】
2020516686.tif 000025
【図８】
2020516686.tif 000026
【図９】
2020516686.tif 000027
【図１０】
2020516686.tif 000028
【図１１】
2020516686.tif 000029
【図１２】
2020516686.tif 000030
【図１３】
2020516686.tif 000031
【図１４】
2020516686.tif 000032
【図１５】
2020516686.tif 000033
【図１６】
2020516686.tif 000034
【図１７】
2020516686.tif 000035
【図１８】
2020516686.tif 000036
【図１９】
2020516686.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月8日(2020.1.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セラソームの表面は、ターゲティングリガンドによって部分的に修飾され、前記ターゲティングリガンドは、活性化ＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドである、活性化ＣＤ４４分子を標的とするセラソーム送達システムであって、
好ましくは、前記セラソーム送達システムは、不安定プラークを標的とし、前記ターゲティングリガンドは、不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるリガンドであることを特徴とする、セラソーム送達システム。
【請求項２】
前記セラソーム送達システムは、セラソーム小胞を含み、前記セラソーム小胞は、内部に親水性空洞を有する脂質二重層からなる閉鎖小胞であり、この小胞の表面は、無機ポリシロキサン網状構造およびカップリングされたターゲティングリガンドを有し、
好ましくは、前記脂質二重層は、セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子とを含む成分により形成されることを特徴とする、請求項１に記載のセラソーム送達システム。
【請求項３】
前記セラソーム単量体分子と、共有結合でターゲティングリガンドにカップリングしたジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）分子と、必要に応じて他の脂質分子との重量比は、１〜１０：０．２〜１：１〜９、または３〜７：０．５〜１：１．５−２．５、または４〜６：０．５：２であることを特徴とする、請求項２に記載のセラソーム送達システム。
【請求項４】
前記セラソーム単量体分子は、セラソームを形成できる無機−有機複合脂質分子であり、前記無機−有機複合脂質分子は、シロキサン構造を有する頭部と疎水性尾部で構成され、この疎水性尾部は疎水性有機二分子鎖であり、
好ましくは、前記セラソーム単量体分子は、以下の一般式を有する単量体分子であり、
（Ｒ１Ｏ）３Ｓｉ−Ｌ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（Ｒ２）（Ｒ３）
ただし、
Ｒ１はＣ１−６アルキルを表し、
Ｌは、４〜１２個の炭素原子（好ましくは４〜１０個の炭素原子）および１〜２個の窒素原子からなるリンカーであり、ここで、以下の条件下で、前記リンカーにける０〜１個の炭素原子はオキソ基で置換され、つまりカルボニル基が形成され、条件（１）：前記リンカーにカルボニル基が存在する場合、このカルボニル基が窒素原子に隣接し；条件（２）：前記リンカーにおける１個の窒素原子が四級化され、且つこの四級化された窒素原子が適合な対イオンと塩を形成し、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立してＣ１０−２４アルキル又はＣ１０−２４アルケニルを表し、
より好ましくは、前記セラソーム単量体分子は、
【化１】
2020516686.tif 000038
、
【化２】
2020516686.tif 000039
、および
【化３】
2020516686.tif 000040
から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項２または３に記載のセラソーム送達システム。
【請求項５】
前記脂質二重層の成分は他の脂質分子を含み、
好ましくは、前記他の脂質分子は、中性リン脂質、負に帯電したリン脂質、および正に帯電した脂質から選択される１つ以上であり、
より好ましくは、前記正に帯電した脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−ｃｈｏｌ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）および１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）から選択される１つ以上であり、好ましくは１，２−ジオレオイルオキシプロピル−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウムブロミド（ＤＯＴＡＰ）であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項６】
前記セラソーム小胞の粒子径の範囲は、５０ｎｍ〜４００ｎｍであり、好ましくは５０ｎｍ〜３００ｎｍであり、好ましくは１５０ｎｍ〜２５０ｎｍであり、１８０ｎｍ〜２２０ｎｍであることを特徴とする、請求項２〜５のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項７】
前記ターゲティングリガンドは、ＧＡＧ、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、セレクチン、オステオポンチン（ＯＰＮ）、およびモノクローナル抗体ＨＩ４４ａ、ＨＩ３１３、Ａ３Ｄ８、Ｈ９０、ＩＭ７、或いは、ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体から選択され、
好ましくは、前記ターゲティングリガンドは、分子量が１万〜４０万Ｄａであり、好ましくは８万〜１５万Ｄａであり、好ましくは約１０万Ｄａであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項８】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質を担持し、
好ましくは、前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラークに関連する疾患の診断、予防および／または治療のための薬物、ペプチド、核酸、およびサイトカインから選択される１つ以上であり、
より好ましくは、前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム。
【請求項９】
前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断するための物質はトレーサーであり、
好ましくは、前記トレーサーは、ＣＴ用トレーサーおよびＭＲＩ用トレーサーから選択され、  前記ＣＴ用トレーサーは、ヨード系ナノスケール造影剤、金系ナノスケール造影剤、酸化タンタル系ナノスケール造影剤、ビスマス系ナノスケール造影剤、ランタニド系ナノスケール造影剤、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され、
好ましくは、ヨード系ナノスケール造影剤、または金系ナノスケール造影剤、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され、
好ましくは、イオヘキソール、イオカルミン酸、イオベルソール、イオジキサノール、イオプロミド、イオビトリドール、イオメプロル、イオパミドール、イオキシラン、アセトリゾ酸、イオジパミド、イオベンザミン酸、イオグリカミン酸、ジアトリゾ酸、イオタラム酸ナトリウム、パントパック、イオパン酸、ヨードアルフィオン酸、アセトリゾ酸ナトリウム、ナトリウムヨードメサメート（ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｄｏｍｅｔｈａｍａｔｅ）、プロピリオドン、ジオドン、イオトロラン、イオピドール、エンドグラフィン（ｅｎｄｏｇｒａｆｉｎ）、イオタラム酸、メグルミンジアトリゾエート、メトリゾ酸、メトリザミド、ヨウ素化油またはエチヨード化油、或いは類似の構造を有する他のトレーサーから選択され、かつ、
前記ＭＲＩ用トレーサーは、Ｇｄ−ＤＴＰＡおよびその線状や環状のポリアミンポリカルボキシレートキレート、およびそのマンガンポルフィリンキレート、高分子ガドリニウムキレート、生体高分子修飾ガドリニウムキレート、葉酸修飾ガドリニウムキレート、デンドリマー造影剤、リポソーム修飾造影剤およびガドリニウム含有フラーレン、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択され
好ましくは、ガドペンテト酸メグルミン、ガドテル酸メグルミン、ガドベン酸ジメグルミン、ガドジアミド、クエン酸鉄アンモニウム発泡顆粒、常磁性酸化鉄、または類似の構造を有する他のトレーサーから選択されることを特徴とする、請求項８に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１０】
前記物質は、ＣＤ４４活性化剤であり、
好ましくは、ＣＤ４４抗体ｍＡｂ、またはＩＬ５、ＩＬ１２、ＩＬ１８、ＴＮＦ−α、ＬＰＳ、あるいは分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である、低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体であり、
好ましくは、前記低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体は、分子量が２５００〜４５００Ｄａの範囲であり、好ましくは３０００〜４０００Ｄａの範囲であり、好ましくは３４１１Ｄａであることを特徴とする、請求項８に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１１】
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断、予防および／または治療のための物質、およびＣＤ４４活性化剤を同時に担持し、あるいは、
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、および分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持し、あるいは、
前記セラソームは、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の診断のための物質、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質、必要に応じてＣＤ４４活性化剤、および必要に応じて分子量が２０００〜５０００Ｄａの範囲である低分子ヒアルロン酸または不安定プラークにおける細胞表面のＣＤ４４分子に特異的に結合できるヒアルロン酸誘導体を同時に担持することを特徴とする、請求項８に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１２】
前記物質は、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質であり、
好ましくは、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質が、スタチン系薬物、フィブラート系薬物、抗血小板薬、ＰＣＳＫ９阻害剤、抗凝固薬、アンジオテンシン変換酵素阻害剤（ＡＣＥＩ）、カルシウムイオン拮抗薬、ＭＭＰｓ阻害剤、β受容体遮断薬、および上記薬物の活性構造フラグメントを含むそれらの薬学的に許容される塩から選択される１つ以上であり、
好ましくは、前記不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患の予防および／または治療のための物質が、ロバスタチン；アトルバスタチン；ロスバスタチン；シンバスタチン；フルバスタチン；ピタバスタチン；プラバスタチン；ベザフィブラート；シプロフィブラート；クロフィブラート；ゲムフィブロジル；フェノフィブラート；プロブコール；エボロクマブ、アリロクマブ、ボコシズマブ、ＲＧ７６５２、ＬＹ３０１５０１４およびＬＧＴ−２０９などの抗ＰＣＳＫ９抗体；ＡＬＮ−ＰＣＳｓｃなどのアンチセンスＲＮＡｉオリゴヌクレオチド；ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３３ａ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２７ａ／ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０６ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−３０２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−７５８、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１０ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１９ｂ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−２６、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−９３、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１２８−２、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４４、ｍｉｃｒｏＲＮＡ−１４５アンチセンス鎖およびロックド核酸のようなそれらの核酸類似体などの核酸；またはＢＭＳ−９６２４７６などのアドネクチン；アセメタシン；トロキセルチン；ジピリダモール；シロスタゾール；チクロピジン塩酸塩；オザグレルナトリウム；クロピドグレル；プラスグレル；シロスタゾール；チロフィバン；ベラプロストナトリウム；チカグレロル；カングレロル；チロフィバン；エプチフィバチド；アブシキシマブ；ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体拮抗薬；未分画ヘパリン；クレキサン；フラキシパリン；フォンダパリヌクスナトリウム；ワルファリン；ダビガトラン；リバロキサバン；アピキサバン；エドキサバン；ビバリルジン；エノキサパリン；テデルパリン；アルデパリン；ビスヒドロキシクマリン；硝酸クマリン；クエン酸ナトリウム；ヒルジン；アルガトロバン；ベナゼプリル；カプトプリル；エナラプリル；ペリンドプリル；フォシノプリル；リシノプリル；モエキシプリル；シラザプリル；ペリンドプリル；キナプリル；ラミプリル；トランドラプリル；カンデサルタン；エプロサルタン；イルベサルタン；ロサルタン；テルミサルタン；バルサルタン；オルメサルタンまたはタソサルタン；ニフェジピン；ニカルジピン；ニトレンジピン；アムロジピン；ニモジピン；ニソルジピン；ニルバジピン；イスラジピン；フェロジピン；ラシジピン；ジルチアゼム；ベラパミル；クロルヘキシジン；ミノサイクリン；ＭＭＩ−１６６；メトプロロール；アテノロール；ビソプロロール；プロプラノロール；カルベジロール；バチマスタット；マリマスタット；プリノマスタット；ＢＭＳ−２７９２５１；ＢＡＹ  １２−９５６６；ＴＡＡ２１１；ＡＡＪ９９６Ａ；ナセトラピブ；エバセトラピブ；トルセトラピブおよびダルセトラピブ；ならびに、それらの有効なフラグメントまたは薬学的に許容される塩、および上記薬物の活性構造フラグメントを含む薬学的に許容される塩からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする、請求項８または１１に記載のセラソーム送達システム。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムおよび薬学的に許容される担体を含む薬物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のセラソーム送達システム含む診断用製剤。
【請求項１５】
好ましくは、前記不安定プラーク関連疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈硬化性心疾患（急性冠症候群、無症候性心筋虚血−潜在性冠状動脈性心疾患、狭心症、心筋梗塞、虚血性心疾患、突然死、ステント内再狭窄を含む）、脳動脈硬化症（脳卒中を含む）、末梢血管アテローム性動脈硬化症（頸動脈アテローム性動脈硬化症、腎動脈アテローム性動脈硬化症、下肢アテローム性動脈硬化症、上肢アテローム性動脈硬化症を含む）、大動脈解離、血管腫、血栓塞栓症、心不全、心原性ショックから選択される１つ以上であることを特徴とする、不安定プラークまたは不安定プラーク関連疾患を診断、予防および／または治療するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のセラソーム送達システムの使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
実施例１：本発明で使用される３つのセラソーム単量体
本発明のセラソーム送達システムで使用されるセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３は既知であり、参考文献に記載されている調製方法に従って得られる。
セラソーム単量体Ｃ１：Ｎ，Ｎ−ジセチル−Ｎα−（６−（（３−トリエトキシシリル）プロピルジメチルアンモニオ）ヘキサノイル）アラニンアミドブロミドの調製については、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１（３），１２２７−１２３４を参照する。
【化４】
2020516686.tif 000041
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
ＨＡとＣＬとのカップリングは、赤外線特性評価によって確認された。赤外線特性評価に使用するサンプルは、ロスバスタチンを担持したＨＡ−ＣＬ１＠Ｒサンプルである。その調製方法は、以下の通りである。６ｍｇのＣ１および１ｍｇのＤＳＰＥを丸底フラスコに秤量し、１０ｍＬのクロロホルムで溶解した。回転蒸発（５５℃の水浴、９０ｒ／分、３０分）によって有機溶媒を完全に除去して、フラスコの壁に薄膜を形成した。１０ｍＬのロスバスタチン水溶液（濃度２ｍｇ／ｍＬ）を添加し、フラスコを５０℃の恒温水浴に入れ、薄膜を３０分間で十分に水和させた。水浴で１０分間超音波処理し、さらにプローブ型超音波装置で５分間（振幅２０、間隔３秒間）超音波処理して、セラソーム小胞を得た。セラソーム小胞を少なくとも２４時間放置して、セラソーム単量体分子をセラソームの表面にその自身が剛性を有する無機ポリシロキサン網状構造を形成することを促進した。０．１ｇのＨＡ（分子量約１００ＫＤａ）を超純水に十分に溶解し、１０ｍｇのＥＤＣ・ＨＣｌおよび１２ｍｇのｓｕｌｆｏ−ＮＨＳカップリング剤を加えて、カルボキシル基を活性化した。室温で反応液を１時間撹拌した後、アセトンを加えて活性化ＨＡを沈殿させた。沈殿物を濾過し、エタノールで洗浄し、真空で乾燥させて、活性化ＨＡを得た。この活性化ＨＡを０．１ｍｇ・ｍＬ−１の水溶液に調製し、０．２ｍＬの溶液を上記工程（１）で得られたセラソーム小胞懸濁液に移して溶解させ、活性化ＨＡにおける活性化カルボキシル基と、セラソーム小胞の脂質二重層に組み込まれたＤＳＰＥ分子のアミノ基とを、アミド結合を介してカップリングした。標的指向性セラソームＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ１を得た。カップリング反応の開始から２４時間後、１２０００ｒｐｍの高速遠心分離によりＨＡ−ＣＬ１＠Ｒを分離して、真空乾燥した後、赤外線スペクトルの特性評価に使用した。図２に示すように、１１００ｃｍ−１の吸収ピークはセラソームの存在を示し、１７００ｃｍ−１および２９１０ｃｍ−１の吸収ピークはセラソームとＨＡとのカップリングを示した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
８ａ．トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓの調製
この実施例において、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を同時に担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって部分的に修飾され、且つ、ＣＴトレーサー金ナノ粒子（「ＡｕＮＰｓ」「ＨＡ」と略される）およびＣＤ４４活性化剤−−ＣＤ４４抗体ｍＡｂ（「Ｓ」と略される）を同時に担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載の上記セラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓ＋ＳおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓの具体的な調製方法は、上記１に記載の上記治療剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｒ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＲおよびＨＡ−ＣＬ３＠Ｒの調製方法と実質上同じである，これらの方法の違いは、工程（１）において、１０ｍＬの金ナノ粒子溶液（濃度１ｍｇ／ｍＬ）および１０ｍＬのＣＤ４４抗体ｍＡｂの水溶液（濃度０．７ｍｇ／ｍＬ）を同時に使用し、且つ精製セラソーム小胞懸濁液における未封入の金ナノ粒子およびＣＤ４４抗体ｍＡｂをデキストランゲルカラムＧ−１００で分離して除去したことにある。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４９】
１２ａ．トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰｓ（比較例として）の調製
この実施例において、トレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰｓは、薄膜分散法によって調製された。上記３つのセラソーム送達システムのセラソーム小胞の表面は、いずれもターゲティングリガンドであるヒアルロン酸（「ＨＡ」と略される）によって修飾されなく、且つＣＴトレーサー金ナノ粒子（「ＡｕＮＰｓ」と略される）を担持した。これらの違いは、上記３つのセラソーム送達システムの調製に使用されるセラソーム単量体分子が、それぞれ実施例１に記載のセラソーム単量体Ｃ１、Ｃ２およびＣ３であることにある。
ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの具体的な調製方法は、上記７に記載のトレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ、ＨＡ−ＣＬ２＠ＡｕＮＰｓおよびＨＡ−ＣＬ３＠ＡｕＮＰｓの調製方法と実質的に同じである。これらの方法の違いは、工程（２）を省略したことにある。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例４と同じ）を１６週間与えた。２４匹のモデルマウスを、遊離ナノ金粒子群（６匹、市販のナノ金粒子溶液を与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ群（６匹、ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重）、およびＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓ群（６匹、ＨＡ−ＣＬ１＠ＡｕＮＰｓ＋Ｓを与え、ナノ金粒子の投与量は０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり、ＣＤ４４活性化剤−ＣＤ４４抗体ｍＡｂの投与量は約０．０７ｍｇ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与４時間後にＣＴイメージングを行い、各群のアテローム硬化性プラークの識別を観察した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２４】
実験方法：
（１）市販のイオジキサノール原薬を使用し、上記実施例２に記載の方法により、ＣＴ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ、トレーサーおよびＣＤ４４活性化剤を担持したセラソーム送達システムＨＡ−ＣＬ１＠Ｉ＋Ｓ、およびトレーサーを担持した非標的指向性セラソーム送達システムＣＬ１＠Ｉ（比較例として）を調製した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
実験方法：
（１）市販のガドテル酸メグルミン原薬を使用し、上記実施例２に記載の方法により、ＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソーム送達システムおよびブランクセラソーム送達システム（比較例として）を調製した。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３１】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。１８匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、低濃度ガドテル酸メグルミンセラソーム群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．０５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、高濃度ガドテル酸メグルミンセラソーム群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
実験方法：
（１）市販のガドテル酸メグルミン原薬を使用し、上記実施例２に記載の方法により、異なるＣＤ４４モノクローナル抗体を標的プローブとするＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームナノ送達システムを調製した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。２４匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ｈ１４４ａ群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ａ３Ｄ８群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ガドテル酸メグルミン−セラソーム−Ｈ９０群（６匹、市販のガドテル酸メグルミン原薬を投与し、ガドテル酸メグルミンの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
実験方法：
（１）市販のガドジアミド原薬を使用し、上記実施例２に記載の方法により、異なるＣＤ４４リガンドを標的プローブとするＭＲＩ用トレーサーを担持したセラソームナノ送達システムを調製した。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。４２匹のモデルマウスを、ブランクセラソーム群（６匹）、ＨＡ−セラソーム群（６匹）、コラーゲン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、ラミニン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、フィブロネクチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、セレクチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）、オステオポンチン−ガドジアミド−セラソーム群（６匹、市販のガドジアミド原薬を投与し、ガドジアミドの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌ、投与量は１０ｍｌ／ｋｇ体重）にランダムに分けた。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の複数の時点にＭＲＩを実施し、各群の動物のアテローム硬化性不安定プラークの識別を観察した。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。３６匹のモデルマウスを、粒子径２８０ｎｍのセラソーム群（１２匹）、粒子径２００ｎｍのセラソーム群（１２匹）、粒子径１６０ｎｍのセラソーム群（１２匹）にランダムに分けた。担体に市販のイオジキサノール原薬を担持し、イオジキサノールの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌで、投与量は１０ｍｌ／ｋｇであった。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の４つの時点に組織を採取（各時点で３匹）し、各群の動物のイオジキサノールの組織分布を観察した。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５２】
（３）モデルマウスに高脂肪食（実施例６と同じ）を１６週間与えた。３６匹のモデルマウスを、ＨＡ１−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）、ＨＡ２−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）、ＨＡ３−ＣＬ１＠Ｒ群（１２匹）にランダムに分けた。担体に市販のイオジキサノール原薬を担持し、イオジキサノールの投与濃度は０．５ｍｇ／ｍｌで、投与量は１０ｍｌ／ｋｇであった。各実験群の動物に、対応するトレーサーを尾静脈から注射し、投与前および投与後の４つの時点に組織を採取（各時点で３匹）し、各群の動物のイオジキサノールの組織分布を観察した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
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【国際調査報告】
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