(57)【要約】電位依存性カルシウムチャネル補助サブユニットα２δ−１は、例えばてんかんおよび神経障害性疼痛において治療効果を発揮することが知られているガバペンチノイド化合物の標的／受容体である。ガバペンチノイドは、α２δ−１のＮ末端に位置するＲＲＲモチーフ内でアルギニン（Ｒ）を結合することによってそれらの作用を発揮することが知られている。本発明は、ＶＧＣＣ＿ａ２ドメイン内およびα２δ−１のＩＫＡＫアミノ酸配列内に位置するガバペンチノイドの新規結合部位を記載する。このような新たに同定されたアミノ酸結合部位は、神経障害性疼痛、ならびにα２δ−１が関与する他の障害および状態における治療特性を有する新規化合物の同定および特徴付けにおいて有用性を見出す。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号５に実質的に示されるアミノ酸配列の断片からなり、配列番号２０に実質的に示されるアミノ酸配列を包含する、単離されたα２δ−１ペプチド。
【請求項２】
前記断片が配列番号２０として本明細書中で言及されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、さらに、配列番号５内に配置されるような配列番号２０と同等の断片のＮ末端および／またはＣ末端に位置する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸に対応する、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが、配列番号２０〜２３のいずれか１つに実質的に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１または２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号２０〜２３の最初の４つのアミノ酸が変異、改変または置換されておらず、好ましくは、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３の第４のアミノ酸（すなわち、Ｋ（リジン））が変異、改変または置換されていない、請求項３に記載のペプチド。
【請求項５】
前記ペプチドがＲＲＲモチーフも包含するか、またはＲＲＲモチーフを包含する別個のペプチドに結合している、先行する請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドと結合または相互作用することができる抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載のペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項８】
前記核酸が、配列番号２０に実質的に示されるアミノ酸配列をコードする、請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項９】
請求項７または８のいずれかに記載の核酸を含む遺伝子構築物。
【請求項１０】
請求項９に記載の遺伝子構築物を含む組換えベクター。
【請求項１１】
請求項９に記載の遺伝子構築物、または請求項１０に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
単離されたα２δ−１組換えペプチドを調製する方法であって、（ｉ）請求項１１に記載の少なくとも１つの細胞を培養すること；および（ｉｉ）単離されたα２δ−１組換えペプチドを作製するために細胞からペプチドを単離することを含む方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれかに記載のα２δ−１ペプチドを含む膜、ミセルまたはリポソーム、または請求項１２に記載の方法によって得られるかまたは得ることができるα２δ−１ペプチド。
【請求項１４】
前記膜、ミセル、リポソームまたはα２δ−１ペプチドが組換え体である、請求項１３に記載の膜、ミセル、リポソームまたはα２δ−１ペプチド。
【請求項１５】
前記膜が原形質膜またはオルガネラ膜である、請求項１４に記載の膜、ミセル、リポソームまたはα２δ−１ペプチド。
【請求項１６】
電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１タンパク質に結合する薬剤を同定するための結合アッセイ試験系であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、または実質的に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むペプチドを含む、結合アッセイ試験系。
【請求項１７】
前記試験系が、前記単離されたペプチドに結合する陽性対照を含む、請求項１６に記載の試験系。
【請求項１８】
前記試験系が、前記単離されたペプチドに結合しない陰性対照を含む、請求項１６または１７に記載の試験系。
【請求項１９】
電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１タンパク質に結合する薬剤を同定する方法であって、薬剤と請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドまたは実質的に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むペプチドとの間の結合を検出することを含む方法。
【請求項２０】
前記方法が、吸光度、蛍光強度、ルミネセンス、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、逆表面プラズモン共鳴（ｒＳＰＲ）、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、均質時間分解蛍光(HTREF /TR−ＦＲＥＴ）、αスクリーン技術、蛍光寿命、フラグメント相補性またはＦＬＩＰＲ(カルシウム読み出し用）、ＥＬＩＳＡ、放射性リガンド結合アッセイまたは免疫沈降を使用することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記試験物質と前記ペプチドとの間の結合を検出する前に、前記方法が、前記試験物質と、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、または実質的に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むペプチドとを接触させる工程を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
治療において、もしくは薬剤として、または診断に使用するための、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項２３】
α２δ−１サブユニットが治療標的である医学的状態の治療において使用するための、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法によって同定される薬剤であって、医学的状態は末梢神経系疼痛、神経障害性疼痛、中枢神経系疼痛、痛覚過敏、触覚異痛、線維筋痛、レストレスレッグ症候群、てんかん、全身性不安障害、偏頭痛、社会恐怖症、パニック障害、狂犬病、双極性障害、飲酒、がん、尿路感染症、閉塞性肺疾患、性機能障害、川崎病、心血管障害（狭心症、心不全など）、および呼吸器障害（喘息、慢性閉塞性肺疾患など）から選択される、薬剤。
【請求項２４】
α２δ−１サブユニットが治療標的である状態を治療、予防または改善する方法であって、そのような治療を必要とする対象に、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法によって同定される薬剤の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２５】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法によって同定される薬剤と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む薬剤の医薬組成物。
【請求項２６】
単離されたα２δ−１ペプチドを含むペプチドの、それに結合する薬剤を同定するための使用であって、前記ペプチドは、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチド、または実質的に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むペプチドである、使用。
【請求項２７】
α２δ−１サブユニットが治療標的である医学的状態を治療するために使用することができる薬剤を同定するための単離α２δ−１ペプチドの使用であって、該ペプチドは、請求項１〜５のいずれか１項に記載のペプチドであるか、または実質的に配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むペプチドである、使用。
【請求項２８】
前記医学的状態が、末梢神経系疼痛、神経障害性疼痛、中枢神経系疼痛、痛覚過敏、触覚異痛、線維筋痛、レストレスレッグ症候群、てんかん、全身性不安障害、偏頭痛、社会恐怖症、パニック障害、狂犬病、双極性障害、飲酒、がん、尿路感染症、閉塞性肺疾患、性機能障害、川崎病、心血管障害（狭心症、心不全など）、および呼吸器障害（喘息、慢性閉塞性肺疾患など）から選択される、請求項２９または３０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）に関し、特に、排他的ではないが、電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１サブユニット内に位置する新規ペプチドに関し、これは例えば、ガバペンチノイドのための結合部位を形成する。本発明はまた、単離されたペプチドを含む試験系、およびペプチドに結合する薬剤を同定する方法にも及ぶ。本発明はまた、ペプチドを調製する方法、ペプチドを使用して同定される薬剤、単離されたペプチドに結合することができる抗体、ペプチドの変異バージョンを発現する動物、およびそれらの使用を包含する。
【背景技術】
【０００２】
電位依存性カルシウム（ＣａＶ）チャネルは、神経伝達物質放出および筋収縮を含む興奮性細胞における多くの重要な機能のための必須成分である。α１サブユニットはカルシウムチャネル遮断薬に結合することが見出され、細孔形成チャネルサブユニットであることが同定された。βおよびα２δサブユニットは、補助サブユニットまたは補助サブユニットと呼ばれた［１］。
【０００３】
４つのα２δサブユニット遺伝子が同定されている。ＣＡＣＮＡ２Ｄ１はα２δ−１をコードし、これは骨格筋において最初に同定された。それは、心筋および平滑筋ならびに脳に存在する。α２δ−２およびα２δ−３をコードするＣＡＣＮＡ２Ｄ２およびＣＡＣＮＡ２Ｄ３遺伝子は、ニューロンおよびいくつかの他の組織において差次的に発現される［２］。α２δ−４をコードするＣＡＣＮＡ２Ｄ４は、主に非ニューロンである発現を示した［３］。
【０００４】
α２δ−１サブユニットは、いくつかの細胞接着および細胞外マトリックスタンパク質（配列番号１）への結合に関与することが知られているフォンウィルブランド因子Ａ（ＶＷＦ−ＡまたはVW A)ドメインを含む特定のドメインを含む。ＶＷＡドメインは、それらの金属イオン依存性接着部位（ＭＩＤＡＳ）モチーフを介して、タンパク質−タンパク質相互作用に関与する。α２δサブユニットには、ＶＷＡドメインの下流に位置する２つの細菌化学感覚様またはキャッシュドメインも存在する［４］。
【０００５】
ＶＷＡ＿ＮおよびＶＷＦ−Ａドメイン、２つの細菌化学感覚ドメイン（ＣＡＣＨＥ１およびＣＡＣＨＥ２）、ならびに電位依存性カルシウムチャネルα２ドメイン（ＶＧＣＣ＿α２）のおおよその位置を図１に示す。
【０００６】
α２δサブユニットおよびそれらの結合リガンドは、神経障害性疼痛、てんかん［１，５，１０］、ならびに下部尿路症状（ＷＯ２００４０５４５６０ Ａ１）、閉塞性肺疾患（ＷＯ２００４０５４５７７ Ａ１）、性機能障害（ＵＳ７４３２２９９ Ｂ２）および川崎病（ＥＰ ２ １１６ ６１８ Ａ１）を含む多くの疾患および状態における治療標的と考えられている。
【０００７】
さらに、ノックアウトマウスにおけるα２δ−１サブユニットの標的化破壊は致死的ではなく、これらの動物は高親和性ガバペンチン結合部位を欠いており、基底心筋収縮性および弛緩が有意に減少し、Ｌ型Ｃａ電流ピーク電流振幅が減少したことを実証している［９］。
【０００８】
α２δ−１サブユニットはまた、癌における治療標的として［１６、ＷＯ ２０１２／１１３２６６］およびシナプス形成の調節にも関与している［１７、ＵＳ２０１１１０４１８１ Ａ１］。
【０００９】
α２δ−１が、神経損傷（神経障害性疼痛）に関連する慢性疼痛の開発において中枢の役割を果たすことは十分に確立されている［１、５］。
実験的な末梢神経損傷は、損傷した感覚ニューロン（三叉神経ニューロンおよびＤＲＧ）におけるα２δ−１ ｍＲＮＡレベルの上昇、ならびにＤＲＧおよび脊髄におけるα２δ−１タンパク質の対応する増加を生じる［６、７］。
【００１０】
疼痛におけるα２δ−１サブユニットの役割は、トランスジェニック動物（マウス）モデルを用いてさらに調査されている。トランスジェニックマウスにおけるニューロン組織のみにおけるα２δ−１の過剰発現は、痛覚過敏および触覚異痛症の損傷に無関係なニューロパシー表現型を明らかにしたことが示されている。これは、神経障害性疼痛表現型の発生に関与するサブユニットとしてα２δ−１を明確に確立する［８］。Ｎａｉｖｅ α２δ−１−／−マウスは機械的および寒冷感受性において顕著な行動欠損を示したが、熱侵害受容閾値には変化がなかった。より低い機械的感度は、背角広ダイナミックレンジニューロンの減少したインビボ電気生理学的応答によって反映された。ＣａＶ２．２レベルは、α２δ−１−／−から脳および脊髄シナプトソームにおいて減少する。機械的過敏症を軽減する抗てんかん薬プレガバリンの能力は、部分坐骨結紮ニューロパシーα２δ−１−／−マウスにおいて失われる。次いで、α２δ−１が、神経障害性疼痛のこの神経損傷モデルにおける機械的過敏症の迅速な発症に必須であることが結論的に示された［９、１３］。
【００１１】
プレガバリン（ＰＧＢ）は鎮痛、抗痙攣および抗不安活性を有する合成分枝鎖γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）であり、電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα２δ−１およびα２δ−２に強力かつ選択的に結合することを示している［１０、ＷＯ２００８００４０６７ Ａ２］。
【００１２】
ガバペンチンおよびプレガバリンは抗てんかん薬であり、神経因性疼痛（すなわち、鎮痛活性を示す）においても治療的使用を有する［１０］。両方の化合物は、ＶＷＡドメインのＮ末端に位置するＲＲＲモチーフに位置するアミノ酸上のα２δ−１およびα２δ−２に結合する［１１、１２］。それらは、２１７位（すなわち、成熟α２δ−１タンパク質のタンパク質配列に対応する配列番号１の２４１位）でアルギニン（Ｒ）に特異的に結合する。α２δ−１受容体へのガバペンチノイドの結合は先行技術［１］に示されるように、それらの鎮痛効果のために必要である。プレガバリンの結合は２３ｎＭのＩＣ５０を示したが、ＮＶＡ１３０９の結合はヒト電位依存性カルシウムチャネルサブユニットα２δ−１を過剰発現する組換え膜を用いて、２．１ｎＭのＩＣ５０を示した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７７９３７）。α２δ−１のＲＲＲモチーフに突然変異を有するノックイン突然変異マウス（ＲＲＡに突然変異したＲＲＲ）では、プレガバリンが神経損傷から生じる慢性疼痛を軽減するのにもはや有効ではなかった［１３、ＷＯ２００４０８９０７１ Ａ１］。これらのデータはさらに、α２δ−１が神経障害性疼痛におけるガバペンチノイド薬物の治療効果の原因となるタンパク質標的であることを確認した。
【００１３】
従って、ガバペンチノイドは、種々の状態を治療するのに有効であることがよく知られている。しかしながら、それらの有効性を考慮すると、臨床的に使用できるガバペンチノイドはほとんど同定または開発されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】ＷＯ２００４０５４５６０ Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２００４０５４５７７ Ａ１
【特許文献３】ＵＳ７４３２２９９ Ｂ２
【特許文献４】ＥＰ ２ １１６ ６１８ Ａ１
【特許文献５】ＷＯ ２０１２／１１３２６６
【特許文献６】ＵＳ２０１１１０４１８１ Ａ１
【特許文献７】ＷＯ２００８００４０６７ Ａ２
【特許文献８】ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７７９３７
【特許文献９】ＷＯ２００４０８９０７１ Ａ１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、α２δ−１サブユニットに結合することによって電位依存性カルシウムチャネルの機能を変化させる薬剤を同定する新しい方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
したがって、本発明の第１の態様によれば、実質的に配列番号５に示されるアミノ酸配列の断片からなり、実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列を包含する単離α２δ−１ペプチドが提供される。
【００１７】
ガバペンチノイド、ガバペンチンおよびプレガバリンの結合に関与する既知のＲＲＲモチーフと同様に、第１の態様によるペプチドは、電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１サブユニットのＶＧＣＣ＿ａ２ドメインに由来する。ＲＲＲモチーフは、第１の態様によるペプチドとは異なる; in situではＲＲＲモチーフが成熟α２δ−１タンパク質のＶＷＡドメインの上流に位置する（図１および２を参照のこと）。従って、第１の局面によるペプチドに対応するα２δ−１サブユニットの領域は、ＲＲＲモチーフとは独立して、特定のガバペンチノイドによって結合され得る（実施例を参照のこと）。したがって、第１の態様によるペプチドは、α２δ−１サブユニットに結合する新しい薬剤を同定するために使用することができる。これらの薬剤はガバペンチノイドまたは非ガバペンチノイドであり得、それらは電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１サブユニットが役割を果たす状態を処置するために使用され得る。
【００１８】
α２δ−１サブユニットは、電位依存性カルシウムチャネルの補助サブユニットまたは補助サブユニットである。これは、電位依存性カルシウムチャネルのα１サブユニットとは異なり、このような電位依存性チャネルの細孔形成サブユニットの１たないため、補助サブユニットまたは補助サブユニットと呼ばれる。一実施形態では、ヒトα２δ−１サブユニットが以下のように、本明細書で配列番号１と呼ばれる配列を含む： 
【００１９】
MAAGCLLALTLTLFQSLLIGPSSEEPFPSAVTIKSWVDKMQEDLVTLAKTASGVNQLVDIYEKYQDLYTVEPNNARQLVEIAARDIEKLLSNRSKALVRLALEAEKVQAAHQWREDFASNEVVYYNAKDDLDPEKNDSEPGSQRIKPVFIEDANFGRQISYQHAAVHIPTDIYEGSTIVLNELNWTSALDEVFKKNREEDPSLLWQVFGSATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAASPKDMLILVDVSGSVSGLTLKLIRTSVSEMLETLSDDDFVNVASFNSNAQDVSCFQHLVQANVRNKKVLKDAVNNITAKGITDYKKGFSFAFEQLLNYNVSRANCNKIIMLFTDGGEERAQEIFNKYNKDKKVRVFTFSVGQHNYDRGPIQWMACENKGYYYEIPSIGAIR
INTQEYLDVLGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLKNQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSETLKPDNFEESGYTFIAPRDYCNDLKISDNNTEFLLNFNEFIDRKTPNNPSCNADLINRVLLDAGFTNELVQNYWSKQKNIKGVKARFVVTDGGITRVYPKEAGENWQENPETYEDSFYKRSLDNDNYVFTAPYFNKSGPGAYESGIMVSKAVEIYIQGKLLKPAVVGIKIDVNSWIENFTKTSIRDPCAGPVCD
CKRNSDVMDCVILDDGGFLLMANHDDYTNQIGRFFGEIDPSLMRHLVNISVYAFNKSYDYQSVCEPGAAPKQGAGHRSAYVPSVADILQIGWWATAAAWSILQQFLLSLTFPRLLEAVEMEDDDFTASLSKQSCITEQTQYFFDNDSKSFSGVLDCGNCSRIFHGEKLMNTNLIFIMVESKGTCPCDTRLLIQAEQTSDGPNPCDMVKQPRYRKGPDVCFDNNVLEDYTDCGGVSGLNPSLWYIIGIQFLLLWLVSGSTHRLL
［配列番号１］ 
【００２０】
第１の態様による単離されたα２δ−１ペプチドは以下のように、本明細書において配列番号５と呼ばれるアミノ酸配列の断片を含んでもよい： 
【００２１】
QPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSETLKPDNFEESGYTFIAPRDYCN 
［配列番号５］ 
【００２２】
配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号１によるα２δ−１サブユニットの断片である。
【００２３】
別の実施形態において、フラグメントは以下のように、本明細書中で配列番号２０と呼ばれるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る： 
【００２４】
IKAK 
［配列番号２０］ 
【００２５】
配列番号５のアミノ酸配列は、配列番号２０のアミノ酸配列を包含する。したがって、配列番号５のアミノ酸配列は配列番号２０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、さらにＮ末端およびＣ末端アミノ酸を含む。従って、別の実施形態において、フラグメントは配列番号２０として本明細書中に言及されるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得、そしてさらに、配列番号５内に配置されるような配列番号２０と等価なフラグメントのＮ末端および／またはＣ末端に位置する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸に対応する、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のＮ末端および／またはＣ末端アミノ酸を含む。
【００２６】
別の実施形態において、フラグメントは以下のように、本明細書中で配列番号２１と呼ばれるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る： 
【００２７】
IKAKLE 
［配列番号２１］ 
【００２８】
別の実施形態において、フラグメントは以下のように、本明細書中で配列番号２２と呼ばれるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る： 
【００２９】
IKAKLEET 
［配列番号２２］ 
【００３０】
別の実施形態において、フラグメントは以下のように、本明細書中で配列番号２３と呼ばれるアミノ酸配列を含み得るか、またはそれからなり得る： 
【００３１】
IKAKLEETITQA 
［配列番号２３］ 
【００３２】
α２δ−１ペプチドは、配列番号２０〜２３のいずれか１つに実質的に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなってもよい。好ましくは、配列番号２０〜２３の最初の４つのアミノ酸が変異、改変または置換されていない。最も好ましくは配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３の４番目のアミノ酸（すなわち、Ｋ（リジン））は変異、改変または置換されていない。
【００３３】
ＲＲＲモチーフは、ガバペンチノイド、ガバペンチンおよびプレガバリンのための既知の結合部位である。したがって、別の実施形態では、第１の態様によるペプチドはまた、ＲＲＲモチーフを包含してもよく、またはＲＲＲモチーフを包含する別個のペプチドに結合されてもよい。
【００３４】
第２の態様によれば、第１の態様によるペプチドまたは以下の態様のいずれかで言及されるペプチドと結合または相互作用することができる抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００３５】
抗体は第１の態様による単離されたα２δ−１ペプチドまたは以下の態様のいずれかで言及されるペプチドに対して免疫特異性を有する全抗体（すなわち、免疫グロブリン）であってもよく、好ましくは、抗体がその細胞外ドメインまたはその機能的断片である。このような抗体フラグメントは、対応する全長抗体の少なくとも１つの抗原結合領域を保持する。抗体またはその断片は、ヒト化抗体またはその断片であってもよい。抗体またはその機能的フラグメントは、ヒトモノクローナルまたはポリクローナル抗体またはその機能的フラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、ＶＬフラグメント、ＶＨフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントであり得る。
【００３６】
抗体は、単鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)または二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）であり得る。抗体または機能性断片は、一価、二価または多価であってもよい。一価抗体は、軽鎖（Ｌ）とジスルフィド架橋によって会合された重鎖（Ｈ）を含む二量体（ＨＬ）である。二価抗体は、少なくとも１つのジスルフィド架橋によって会合された２つの二量体を含む四量体（Ｈ２Ｌ２）である。多価抗体はまた、例えば、複数のダイマーを連結することによって産生され得る。抗体分子の基本構造は２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖からなり、これらは非共有結合的に会合し、ジスルフィド結合によって連結され得る。各重鎖および軽鎖は、約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域、および鎖の残りの部分に定常配列を含む。可変領域は抗体分子の抗原結合部位を形成し、抗原、すなわち第１の態様によるペプチドに対するその特異性を決定する、いくつかの超可変領域、または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。重鎖および軽鎖のＣＤＲのいずれかの側にはフレームワーク領域があり、これはＣＤＲをアンカーし、配向させるアミノ酸の比較的保存された配列である。抗体フラグメントは、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ヒトまたはヒト化抗体」は、α２δ−１ペプチドに対して免疫特異性を示す特定のヒト抗体中に見出されるのと実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲ配列番号を含む、モノクローナル抗体のような抗体を意味し得る。重鎖または軽鎖ＣＤＲと実質的に同じアミノ酸配列は、参照配列と比較した場合、かなりの量の配列同一性を示す。このような同一性は、特定のヒト抗体のアミノ酸配列を表すものとして明確に知られているか、または認識可能である。実質的に同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲアミノ酸配列は例えば、アミノ酸の小さな修飾または保存的置換を有し得る。このようなヒト抗体は、α２δ−１組換えペプチドに選択的に結合するその機能を維持する。
【００３８】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は例えば、ファージライブラリー、リンパ球、またはハイブリドーマ細胞による産生などの組換え方法によって産生される実質的にまたは完全にヒトＣＤＲ配列番号を有するモノクローナル抗体を含み得る。
【００３９】
抗体は、組換え抗体であってもよい。用語「組換えヒト抗体」は、組換えＤＮＡ技術を使用して産生されるヒト抗体を含み得る。
【００４０】
「抗原結合領域」という用語はその標的抗原に対して特異的結合親和性を有する抗体の領域、例えばα２δ−１ペプチドまたはそのエピトープを意味することができ、結合領域は超可変ＣＤＲまたはその機能的部分であってもよく、ＣＤＲの「機能的部分」という用語は、標的抗原に対して特異的親和性を示すＣＤＲ内の配列を意味することができる。ＣＤＲの機能的部分は、α２δ−１ペプチドに特異的に結合するリガンドを含み得る。
【００４１】
用語「ＣＤＲ」は、重鎖および軽鎖の超可変領域を意味することができる。抗体の重鎖および軽鎖の各々には、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上のＣＤＲが存在し得る。通常、各鎖上に少なくとも３つのＣＤＲが存在し、これらは、一緒に構成される場合、抗原結合部位（すなわち、抗原が結合するかまたは特異的に反応する三次元結合部位）を形成する。しかし、いくつかの抗体の重鎖には４つのＣＤＲが存在し得ることが仮定されている。
【００４２】
ＣＤＲの定義はまた、互いに対して比較される場合、アミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。特定のＣＤＲまたはその機能的部分を包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変化する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられると、どの残基が特定のＣＤＲを含むかを日常的に決定することができる。
【００４３】
抗体の「機能的断片」という用語は機能的活動を保持する抗体の一部を意味することができ、機能的活動は例えば、抗原結合活動または特異性であってもよい。機能的活動は例えば、抗体定常領域によって提供されるエフェクター機能であってもよい。また、「機能的断片」という用語は例えば、ヒトモノクローナル抗体のプロテアーゼ消化または還元によって、および当業者に公知の組換えＤＮＡ法によって産生される断片を含むことも意図される。ヒトモノクローナル抗体機能性フラグメントは例えば、個々の重鎖または軽鎖およびそのフラグメント（例えば、ＶＬ、ＶＨおよびＦｄ）；一価フラグメント（例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ’）；二価フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２）；一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ);ならびにＦｃフラグメントを含む。
【００４４】
用語「ＶＬ断片」は、ＣＤＲを含む軽鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の軽鎖の断片を意味することができる。ＶＬフラグメントは、軽鎖定常領域配列をさらに含み得る。
【００４５】
用語「ＶＨ断片」は、ＣＤＲを含む重鎖可変領域の全部または一部を含むヒトモノクローナル抗体の重鎖の断片を意味することができる。
【００４６】
「Ｆｄ断片」という用語は第１の重鎖定常領域、すなわち、ＶＨおよびＣＨ−１に結合した重鎖可変領域を意味することができる。「Ｆｄ断片」は、軽鎖、または重鎖の第２および第３の定常領域を含まない。
【００４７】
用語「Ｆｖ断片」は重鎖および軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、重鎖および軽鎖の定常領域が存在しない、ヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合断片を意味することができる。重鎖および軽鎖の可変領域には、例えば、ＣＤＲが含まれる。例えば、Ｆｖ断片は、重鎖および軽鎖の両方の約１１０アミノ酸のアミノ末端可変領域の全部または一部を含む。
【００４８】
用語「Ｆａｂフラグメント」は、Ｆｖフラグメントよりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合断片を意味し得る。例えば、Ｆａｂフラグメントは、可変領域、ならびに重鎖および軽鎖の第１の定常ドメインの全部または一部を含む。従って、Ｆａｂフラグメントは例えば、重鎖および軽鎖の約１１０〜約２２０のアミノ酸残基をさらに含む。
【００４９】
用語「Ｆａｂ’フラグメント」は、Ｆａｂフラグメントよりも大きいヒトモノクローナル抗体の一価抗原結合フラグメントを意味し得る。例えば、Ｆａｂ’フラグメントは、軽鎖のすべて、重鎖の可変領域のすべて、ならびに重鎖の第１および第２の定常ドメインのすべてまたは一部を含む。例えば、Ｆａｂ’フラグメントは、重鎖のアミノ酸残基２２０〜３３０のいくつかまたは全てをさらに含み得る。
【００５０】
用語「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、ヒトモノクローナル抗体の二価抗原結合断片を意味することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は例えば、２つの重鎖および２つの軽鎖の可変領域の全部または一部を含み、さらに、２つの重鎖および２つの軽鎖の第１の定常ドメインの全部または一部を含むことができる。
【００５１】
用語「一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)」は、短いリンカーペプチドと連結された重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合を意味し得る。
【００５２】
用語「二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）」は、より短い連結ペプチドによって互いに連結された２つのｓｃＦｖを含む二重特異性抗体を意味し得る。
【００５３】
第３の態様によれば、第１の態様のペプチドをコードする単離された核酸が提供される。
【００５４】
好ましくは、核酸が第１の局面による組換えα２δ−１ペプチドをコードするか、または配列番号２０に実質的に示されるアミノ酸配列を含む。
【００５５】
第４の態様によれば、第３の態様による核酸を含む遺伝子構築物が提供される。
【００５６】
第５の態様によれば、第４の態様による遺伝子構築物を含む組換えベクターが提供される。
【００５７】
第６の局面によれば、第４の局面に従う遺伝子構築物、または第５の局面に従う組換えベクターを含む宿主細胞が提供される。
【００５８】
第７の態様によれば、単離されたα２δ−１組換えペプチドを調製する方法であって、（ｉ）第６の態様による少なくとも１つの細胞を培養するステップと、（ｉｉ）単離されたα２δ−１組換えペプチドを作製するために細胞からペプチドを単離するステップとを含む方法が提供される。
【００５９】
第８の側面によれば、α２δ−１ペプチドを構成する膜、ミセル、リポソームが第１の側面から、あるいは第７の側面に基づく方法で得られ、または得られたα２δ−１ペプチドがある。
【００６０】
好ましくは、膜、ミセル、リポソームまたはα２δ−１ペプチドは組換え体である。膜は、原形質膜またはオルガネラ膜であってもよい。
【００６１】
第９の局面によれば、電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１タンパク質に結合する結合アッセイ技術または薬剤を同定することが提供され、このアッセイ技術は、第１の局面によるペプチド、または実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む。
【００６２】
アッセイ技術は、単離されたペプチドに結合するポジティブコントロールを含み得る。
陽性対照は、試験系の単離されたペプチドに結合する薬物、ペプチドまたは薬剤であってもよい。陽性対照はＮＶＡ１３０９であってもよく、これは本明細書において式Ｉと呼ばれる。
【００６３】
式Ｉ： 
［（１Ｒ，５Ｓ，６Ｓ）−３−エチル−６−（１Ｈ−テトラゾール−５−イルメチル）−６−ビシクロ［３．２．０］ヘプト−３−エニル］メタンアミン 
【００６４】
試験系は、単離されたペプチドに結合しない陰性対照を含んでもよい。
陰性対照は、薬物、ペプチド、または試験系の単離されたペプチドに結合しない薬剤であり得る。
【００６５】
好ましい実施形態では、試験システムが陽性対照および陰性対照を含むことができる。試験システムはまた、必要に応じて、さらなる対照を含んでもよい。試験システムはまた、使用説明書を含んでもよい。
【００６６】
試験系は、第１の態様のペプチド、または基質に結合した第１１の態様の方法において言及されるペプチドを含んでもよい。ペプチドは、基質によって直接的または間接的に結合され得る。
【００６７】
第１０の態様によれば、配列番号２０の配列に対応する野生型α２δ−１タンパク質の領域に突然変異を含む遺伝子改変非ヒト哺乳動物が提供される。
【００６８】
変異は、１つ以上の点変異であり得る。点突然変異は、置換、挿入、欠失またはフレームシフト突然変異であり得る。
【００６９】
変異は、配列番号２０の配列に対応するα２δ−１タンパク質の領域におけるリジンの一方または両方の置換または欠失であり得る。好ましくは、変異が第２のリジンの欠失または置換である。置換は、保存的置換または類似のアミノ酸の置換であり得る。
【００７０】
人間以外の動物は、肉食動物（ネコもしくはイヌ）、げっ歯類（マウスもしくはラット）、ウサギ、野ウサギ、サル、または類人猿などである。
【００７１】
第１１の態様によれば、電位依存性カルシウムチャネルのα２δ−１タンパク質に結合する薬剤を同定する方法であって、薬剤と第１の態様によるペプチドとの間の結合を検出すること、または配列番号２０に実質的に示されるアミノ酸配列を含むペプチドを含む方法が提供される。
【００７２】
第１１の局面による方法は、単離されたペプチドに結合するガバペンチノイドおよび非ガバペンチノイドを同定するために使用され得る。α２δ−１タンパク質に結合する新規ガバペンチノイドを同定する公知の方法は試験物質（すなわち、単離されたα２δ−１ペプチドに結合することができると疑われる薬剤）と、α２δ−１ペプチドの上流に位置するＲＲＲモチーフを含む膜結合３Ｄタンパク質との間の結合を検出することを含み得る。しかしながら、第１の局面に従うか、または第１１の局面の方法において言及されるペプチドはガバペンチノイド（例えば、ＮＶＡ１３０９）に結合するために、三次／三次元（３Ｄ）構造を必要としない。これは、試験物質が結合し得る部位（すなわち、ペプチド／タンパク質）の産生および発現を単純化するため、有利である。
【００７３】
さらに、ペプチド線状構造の結果として、それはアッセイ／技術／試験系、例えば、吸光度、蛍光強度、ルミネセンス、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、逆表面プラズモン共鳴（ｒＳＰＲ）、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析／飛行時間（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、均質時間分解蛍光(HTREF /TR−ＦＲＥＴ）、αスクリーン技術、蛍光寿命、フラグメント相補性またはＦＬＩＰＲ(カルシウム読み出しのための）において使用され得、これは全長α２δ−１タンパク質の三次／３Ｄ構造と適合し得ない。第１の局面のペプチド間の結合を検出するために使用され得る代替のアッセイ／技術／試験系（または第１１の局面の方法において言及される）は、ＥＬＩＳＡ、放射性リガンド結合アッセイおよび免疫沈降であり得る。
【００７４】
したがって、第１１の態様による方法は、吸光度、蛍光強度、ルミネセンス、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、逆表面プラズモン共鳴（ｒＳＰＲ）、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析／飛行時間（ＭＡＬＤＩ／ＴＯＦ）、蛍光偏光、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、時間分解蛍光（ＴＲＦ）、均質時間分解蛍光(HTREF /TR−ＦＲＥＴ）、αスクリーン技術、蛍光寿命、フラグメント相補性、ＦＬＩＰＲ、ＥＬＩＳＡ、放射性リガンド結合アッセイまたは免疫沈降を使用することを含み得る。
【００７５】
好ましくは、試験剤とペプチドとの間の結合を検出する前に、第１１の局面による方法はまた、試験剤と第１の局面によるペプチド、または実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むペプチドとを接触させる工程を包含する。
【００７６】
薬剤は、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、ペプチド、小分子または抗体であってもよい。
【００７７】
小分子は、９００ダルトン以下の分子量を有する有機化合物である。
【００７８】
ガバペンチノイドはα２δ−１サブユニットを含む電位依存性カルシウムチャネルの活性を調節（すなわち、阻害または増強）し得る薬剤である。好ましくは、ガバペンチノイドがα２δ−１サブユニットを含む電位依存性カルシウムチャネルの活性を調節する薬剤である。電位依存性カルシウムチャネルの活性は、電位依存性チャネルの細孔形成α１サブユニットを通るカルシウムイオンの通過に応答して生成される電流に対応する。この活性は、パッチクランピング、電圧クランピング、および他の電気生理学的技術を含む、当該分野で公知の種々の技術を使用して測定され得ることが理解される。したがって、ガバペンチノイドは、α２δ−１サブユニットを含む電位依存性カルシウムチャネルの活性または電流を調節する薬剤であり得る。好ましくは、ガバペンチノイドが以下の式ＩＩによって定義されるＧＡＢＡ環を含むγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の誘導体である：
【化１】
2020521507.tif 000003
［式ＩＩ］ 
【００７９】
第１２の態様によれば、治療または薬剤として、または診断において使用するための、第１１の態様による方法によって同定された薬剤が提供される。
【００８０】
第１３の態様によれば、α２δ−１サブユニットが治療標的であり、医学的状態が、疼痛、神経障害性疼痛、末梢神経系疼痛、中枢神経系疼痛、痛覚過敏、触覚異痛、線維筋痛、レストレスレッグ症候群、てんかん、全身性不安障害、偏頭痛、社会恐怖症、パニック障害、マニア、双極性障害、およびアルコール離脱、癌、尿路感染症、閉塞性肺疾患、性機能障害、川崎病、心血管障害（狭心症、心臓発作、心不全など）、および呼吸障害（喘息および慢性閉塞性肺疾患など）から選択される、医学的状態の治療に使用するための、第１１の態様による方法によって同定される薬剤が提供される。
【００８１】
第１４の局面において、α２δ−１サブユニットが治療標的である状態を処置、予防または改善する方法が提供され、この方法はこのような処置を必要とする被験体に、第１１の局面による方法によって同定される薬剤の治療有効量を投与する工程を包含する。
【００８２】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による組成物および薬剤は任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、ウマ）、ペットを治療するために使用されてもよく、または他の獣医学的適用において使用されてもよい。しかしながら、最も好ましくは、対象はヒトである。
【００８３】
α２δ−１サブユニットが治療標的である状態は疼痛、神経障害性疼痛、末梢神経系疼痛、中枢神経系疼痛、痛覚過敏、触覚異痛、線維筋痛、レストレスレッグ症候群、てんかん、全身性不安障害、偏頭痛、社会恐怖症、パニック障害、狂犬病、双極性障害、およびアルコール離脱、癌、尿路感染症、閉塞性肺疾患、性機能障害、川崎病、心血管障害（例えば、狭心症、心臓発作、心不全）および呼吸障害（例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患）から選択される状態であり得る。
【００８４】
第１５の態様によれば、第１１の態様による方法によって同定される薬剤を含む薬剤の医薬組成物、および薬学的に許容されるビヒクルが提供される。
【００８５】
第１６の局面によれば、単離されたα２δ−１ペプチドを含むペプチドの、それに結合する薬剤を同定するための使用が提供され、ここで、ペプチドは、第１の局面に従うペプチド、または実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含むペプチドである。  
【００８６】
それに結合する薬剤は、ガバペンチンイドであり得る。
【００８７】
第１７の局面によれば、α２δ−１サブユニットが治療標的である医学的状態を処置するために使用され得る薬剤を同定するための単離α２δ−１ペプチドの使用が提供され、ここで、ペプチドは、第１の局面に従うペプチドであるか、または実質的に配列番号２０に示されるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
医学的状態は、疼痛、神経障害性疼痛、末梢神経系疼痛、中枢神経系疼痛、痛覚過敏、触覚異痛、線維筋痛、レストレスレッグ症候群、てんかん、全身性不安障害、偏頭痛、社会恐怖症、パニック障害、狂犬病、双極性障害、およびアルコール離脱、癌、尿路感染症、閉塞性肺疾患、性機能障害、川崎病、心血管障害（狭心症、心臓発作、心不全など）、および呼吸障害（喘息および慢性閉塞性肺疾患など）から選択され得る。
【００８９】
本発明による薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および組成物は本明細書に記載される任意の状態の治療、予防、または発症の遅延のために、単剤療法において使用され得る薬剤において使用され得ることが理解される。あるいはこのような薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および本発明による組成物は本明細書中に記載される状態のいずれかの発症を処置、予防または遅延するための公知の治療の補助剤として、またはこれらと組み合わせて使用され得る。
【００９０】
本発明による薬剤、ガバペンチノイドおよび非ガバペンチノイドは特に、組成物が使用される様式に依存して、多数の異なる形態を有する組成物中で組み合わされ得る。従って、例えば、組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮パッチ、リポソーム懸濁液、または処置を必要とするヒトまたは動物に投与され得る任意の他の適切な形態の形態であり得る。本発明による医薬のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものでなければならないことが理解されるであろう。
【００９１】
本発明による薬剤、ガバペンチノイドおよび非ガバペンチノイドを含む医薬は、多くの方法で使用することができる。例えば、経口投与が必要とされ得、この場合、薬剤は例えば、錠剤、カプセルまたは液体の形態で経口摂取され得る組成物内に含まれ得る。本発明のガバペンチノイドを含む組成物は吸入（例えば、鼻腔内）によって投与され得る。組成物はまた、局所使用のために処方され得る。例えば、クリームまたは軟膏を皮膚に塗布することができる。
【００９２】
本発明による薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイドおよび組成物はまた、徐放または遅延放出デバイス内に組み込まれ得る。このようなデバイスは例えば、皮膚上または皮膚下に挿入され得、そして薬剤は、数週間または数ヶ月にわたって放出され得る。デバイスは、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。このようなデバイスは本発明に従って使用される薬剤での長期間の処置が必要とされ、そして通常、頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合に、特に有利であり得る。
【００９３】
好ましい実施形態では本発明による薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および組成物は血流中への注射によって、または治療を必要とする部位に直接、被験体に投与され得る。例えば、医薬は、腫瘍またはニューロンに少なくとも隣接して、またはその中に注射され得る。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）であり得る。
【００９４】
薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および必要とされる組成物の量はその生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、これは投与の様式、モジュレーターの物理化学的特性、ならびにそれが単剤療法として使用されているか、または併用療法において使用されているかに依存することが理解される。投与の頻度はまた、処置される対象内の薬剤または抗体の半減期によって影響される。投与される最適な投薬量は、当業者によって決定され得、そして使用される特定の薬剤、医薬組成物の強度、投与の様式、および本明細書中に言及される任意の状態の進行によって変化する。患者の年齢、体重、性別、食事、及び投与の時間を含めた治療される個々の患者に依存した追加のファクターにより、投与量を調節する必要があるであろう。
【００９５】
一般に、本発明による薬剤の０．０１μｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重の間の１日用量を、どの薬剤が使用されるかに応じて、本明細書に記載の状態のいずれかを治療、改善、または予防するために使用することができる。より好ましくは、１日用量が０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、最も好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００９６】
薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイドまたは組成物は、本明細書に記載の状態の開始前、開始中または開始後に投与することができる。１日用量は単回投与（例えば、１日１回の注射）として与えられ得る。あるいは薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および組成物は１日に２回以上の投与を必要とし得る。一例として、薬剤は２５ｍｇ〜７０００ｍｇ(すなわち、７０ｋｇの体重を仮定する）の２回（または治療される疾患の重症度に応じてそれ以上）の１日用量として投与されてもよい。治療を受けている被験者は、覚醒時に第１の用量を、次いで夕方（２用量レジメンである場合）またはその後３時間または４時間隔で第２の用量を服用することができる。あるいは、徐放デバイスを使用して、反復用量を投与する必要なしに、患者に本発明による薬剤の最適用量を提供してもよい。
【００９７】
公知の手順（例えば、製薬産業によって慣用的に使用される手順（例えば、インビボ実験、臨床試験など））は本発明の薬剤および正確な治療レジメン（例えば、薬剤の日用量および投与頻度）を含む特定の処方物を形成するために使用され得る。
【００９８】
薬剤の「治療有効量」は被験体に投与される場合、薬剤、ガバペンチノイド、非ガバペンチノイド、および本明細書に記載の状態のいずれかを処置するために必要とされるか、または所望の効果（例えば、神経障害性疼痛を阻害すること）を生じる組成物の量で任意の量である。
【００９９】
例えば、使用される薬剤の治療有効量は、約０．０１ｍｇ〜約８００ｍｇ、好ましくは約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇであり得る。薬剤の量は、約０．１ｍｇ〜約２５０ｍｇ、最も好ましくは約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇの量であることが好ましい。
【０１００】
本明細書中で言及される「薬学的に受容可能なビヒクル」は、医薬組成物を処方する際に有用であることが当業者に公知で任意の公知の化合物または公知の化合物の組み合わせである。
【０１０１】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。固体の薬学的に許容されるビヒクルは、風味剤、滑沢剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性結合剤、甘味料、保存剤、染料、コーティング、または錠剤崩壊剤としても作用し得る１つ以上の物質を含み得る。ビヒクルはまた、封入材料であってもよい。粉末において、ビヒクルは、本発明による微細に分割された活性剤と混合された微細に分割された固体である。錠剤において、活性剤（例えば、ペプチドまたは抗体）は、適切な割合で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され得、そして所望の形状およびサイズに圧縮され得る。粉末および錠剤は、好ましくは９９％までの活性剤を含有する。適切な固体ビヒクルとしては、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が挙げられる。別の実施形態では、医薬ビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０１０２】
しかしながら、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシルおよび加圧組成物を調製する際に使用される。本発明による活性剤は、水、有機溶媒、両者の混合物または薬学的に許容される油または脂肪のような薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁され得る。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、保存剤、甘味料、風味剤、懸濁剤、増粘剤、着色剤、粘度調節剤、安定剤または浸透圧調節剤などの他の適切な医薬添加剤を含有することができる。経口および非経口投与のための液体ビヒクルの適切な例としては、水（上記のような添加剤、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を部分的に含有する）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、ならびに油（例えば分別ココナッツ油およびアラキス油）が挙げられる。非経口投与の場合、ビヒクルは、オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。
滅菌液体ビヒクルは、非経口投与のための滅菌液体形態組成物において有用である。加圧組成物のための液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される噴射剤であり得る。
【０１０３】
無菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は例えば、筋肉内、髄腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内および特に皮下注射によって利用することができる。薬剤、組成物または抗体は、滅菌水、生理食塩水、または他の適切な滅菌注射可能媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁され得る滅菌固体組成物として調製され得る。
【０１０４】
本発明の薬剤および組成物は他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビタンモノレエート、ポリソルベート８０（ソルビトールおよびエチレンオキシドと共重合したその無水物のオレエートエステル）などを含有する滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与され得る。薬剤、ガバペンチンイド、ノンガバペンチンイド、および発明に従った組成は、液体または固形のいずれでも経口投与が可能である。経口投与に適した組成物には、ピル、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末のような固体形態、溶液、シロップ、エリキシール、及び懸濁液のような液体形態が含まれる。非経口投与に有効な形態には、無菌溶液、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。
【０１０５】
本発明は、改変体またはその断片を含む、本明細書中で言及される任意の配列のアミノ酸または核酸配列を実質的に含む、任意の核酸またはペプチドまたはその改変体、誘導体またはアナログに及ぶことが理解される。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「フラグメント」は本明細書中で言及される配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性、例えば、本明細書中に記載される核酸またはポリペプチドと４０％の同一性を有する配列であり得る。
【０１０６】
参照される配列のいずれかに対して５０％を超える、より好ましくは６５％、７０％、７５％を超える、さらにより好ましくは８０％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列もまた想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列が本明細書中で言及される配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、本明細書中で言及される配列のいずれかと１００％の同一性を有し得る。
【０１０７】
当業者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算する方法を理解するであろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージを計算するためには、最初に２つの配列のアラインメントを調製し、続いて配列同一性値を計算しなければならない。２つの配列についての同一性パーセンテージは（ｉ）配列を整列させるために使用される方法（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ(異なるプログラムで実施される））、または３Ｄ比較からの構造的整列；ならびに（ｉｉ）整列方法によって使用されるパラメータ（例えば、局所対全体整列、使用される対スコアマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＰＡＭ２５０、Ｇｏｎｎｅｔなど））、およびギャップペナルティ（例えば、機能的形態および定数）に依存して、異なる値をとり得る。
【０１０８】
アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算する多くの異なる方法が存在する。例えば、アイデンティティの数を、（ｉ）最短配列の長さ;(ｉｉ)アラインメントの長さ;(ｉｉｉ)配列の平均長さ;(ｉｖ)非ギャップ位置の数；または（ｉｖ）オーバーハングを除く等価位置の数で割ることができる。さらに、同一性パーセンテージはまた、長さに強く依存することが理解される。したがって、配列の対が短いほど、偶然に起こることが予想される配列同一性は高くなる。
【０１０９】
したがって、タンパク質またはＤＮＡ配列の正確なアラインメントは複雑なプロセスであることが理解されるであろう。一般的な多重アラインメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ(Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４、Nucleic Acids Research、２２、４６７３−４６８０; Thompsonら、１９９７、Nucleic Acids Research、２４、４８７６−４８８２）は、本発明によるタンパク質またはＤＮＡの多重アラインメントを生成するための好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷの適切なパラメーターは、以下の通りであり得る：ＤＮＡアラインメントについて: Gap Open Penalty = １５．０、Gap Extension Penalty = ６．６６、およびMatrix = Identity。タンパク質アラインメントについては: Gap Open Penalty = １０．０、Gap Extension Penalty = ０．２、およびMatrix = Gonnet。
ＤＮＡおよびタンパク質アラインメントについて: ENDGAP=−１、およびGAPDIST = ４。
当業者は最適な配列アラインメントのために、これらのパラメーターおよび他のパラメーターを変化させることが必要であり得ることを認識する。
【０１１０】
好ましくは２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセンテージの計算が次いで、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算され得、ここで、Ｎは配列が同一の残基を共有する位置の数であり、そしてＴはギャップを含むが、オーバーハングを除く、比較される位置の総数である。従って、２つの配列間の同一性パーセンテージを計算するための最も好ましい方法は（ｉ）例えば、上記に記載されるように、適切なパラメーターの設定を使用して、ＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを使用して配列アラインメントを調製すること；および（ｉｉ）ＮおよびＴの数値を以下の式に挿入することを包含する：配列同一性=(Ｎ/Ｔ)*１００。
【０１１１】
類似の配列を同定するための代替的な方法は、当業者に公知である。例えば、実質的に類似のヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で本明細書中に言及される任意の配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によってコードされる。ストリンジェントな条件下では、３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃でフィルター結合ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズし、続いて０．２×ＳＳＣ／０．１% SDS中で約２０−６５℃で少なくとも１回洗浄することを意味する。あるいは実質的に類似のポリペプチドが本明細書中に記載されるポリペプチド配列とは少なくとも１個であるが、５、１０、２０、５０または１００未満のアミノ酸だけ異なり得る。
【０１１２】
遺伝子コードの縮重のために、本明細書に記載される任意の核酸配列が、それによってコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、変化または変化され得、その改変体を提供し得ることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変された配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生じる。他の適切な変異体は相同なヌクレオチド配列を有するが、それが置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって改変され、保存的変化を生じる配列の全てまたは一部を含むものである。例えば、小さな非極性疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リジン、アルギニンおよびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。従って、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置換され得るかが理解され、そして当業者は、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知る。
【０１１３】
アミノ酸置換： 
【０１１４】
アミノ酸置換はペプチド配列に対して、例えば、１、２、３、４、５、１０、２０または３０までの置換に対してなされ得る。保存的置換は、アミノ酸を、類似の化学構造、類似の化学的特性または類似の側鎖体積の他のアミノ酸で置換する。導入されるアミノ酸は、それらが置換するアミノ酸と同様の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、または電荷を有し得る。あるいは、保存的置換が既存の芳香族または脂肪族アミノ酸の代わりに、芳香族または脂肪族である別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は当該分野で周知であり、そして以下の表１に定義されるような２０個の主要アミノ酸の特性に従って選択され得る。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これはまた、表２のアミノ酸側鎖についてのハイドロパシースケールを参照することによって決定され得る。
【表１】
2020521507.tif 000004
【表２】
2020521507.tif 000005
【０１１５】
保存的置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。このような置換は一般に、タンパク質の活性を維持することが所望される場合、表３に従って行われる。表２はタンパク質中のアミノ酸を置換することができ、典型的には保存的置換とみなされるアミノ酸を示す。
【表３】
2020521507.tif 000006
【０１１６】
類似の置換は、アミノ酸配列中の少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されたものである。このような置換は一般に、タンパク質の活性を維持することが所望される場合、表４に従って行われる。表４はタンパク質中のアミノ酸を置換することができ、典型的には構造的および機能的置換とみなされるアミノ酸を示す。例えば、表４の第１列の残基は第２列の残基で置換されてもよく、さらに、表４の第２列の残基は、第１列の残基で置換されてもよい。
【表４】
2020521507.tif 000007
【０１１７】
表２のものよりも保存性が低い置換は（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクの維持に対するそれらの効果がより有意に異なる残基を選ぶことによって選択することができる。一般に、タンパク質特性の最大の変化を生じると予想される置換は（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルが疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニルで置換され（または）、（ｂ）システインまたはプロリンが（または）任意の他の残基で置換され（または）、（ｃ）陽性側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルが電気陰性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルで置換され（または）、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが側鎖を有さないもの、例えば、グリシンで（または、を）置換されるものである。
【０１１８】
本明細書に記載される特徴（添付の任意の請求項、要約書、および図面を含む）のすべて、および／またはそのように開示される任意の方法またはプロセスのステップのすべては、そのような特徴および／またはステップの少なくともいくつかが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【０１１９】
本発明をより良く理解し、本発明の実施形態をどのように実施することができるかを示すために、例として、添付の図面を参照する 
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１によってコードされるヒトα２δ−１サブユニットのトポロジードメイン／特徴を示す概略図である。
【図２】図２は、ヒトα２δ−１サブユニットのドメイン構成を示す概略図である。これは、ＶＧＣＣ＿α２ドメイン内のＣＡＣＮＡ２Ｄ１ドメインおよびα２δ−１組換えペプチド配列のトポロジーを具体的に示す。
【図３】図３は、構築物１（配列番号２）の概略図である。これはガバペンチン／プレガバリン結合部位モチーフを含むが、ＶＧＧＣ−α２ドメインの下流にＶＷＡ＿Ｎ、ＶＷＦ＿Ａおよびカルボキシ末端領域を欠く、切断α２δ−１断片である。
【図４】図４は、構築物２（配列番号３）の概略図である。これはガバペンチン／プレガバリン結合部位モチーフを含有するが、ＶＧＧＣ−α２ドメインの下流にＶＷＡ＿Ｎ、ＶＷＦ＿Ａおよびカルボキシ末端領域を欠き、かつＣａｃｈｅ １ドメインも欠く、切断α２δ−１断片である。
【図５】図５は、固定化α２δ−１構築物１へのＮＶＡ１３０９の結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。
【図６】図６は、固定化α２δ−１構築物２へのＮＶＡ１３０９の結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。
【図７】図７は、固定化α２δ−１構築物１および２へのプレガバリンの結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。
【図８Ａ】図８Ａおよび８Ｂは、切断α２δ−１構築物１および２に対する化合物ＮＶＡ１３０９およびプレガバリンの特異的プラズモン結合を示す。
【図８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、切断α２δ−１構築物１および２に対する化合物ＮＶＡ１３０９およびプレガバリンの特異的プラズモン結合を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、ブランク−減算センサグラムオーバーレイを示す。固定化ペプチド１（ガバペンチン／プレガバリン結合部位を含む）へのＮＶＡ１３０９の結合を示すプラズモンセンサグラム。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９ＡのＲＵ４００値を示す。
【図１０】図１０は、固定化ペプチド１（Ｐ１）へのプレガバリンの結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。
【図１１】図１１は、ＶＧＧＣ＿α２ドメインを含有する固定化α２δ−１組換えペプチドへのＮＶＡ１３０９の結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。
【図１２】図１２は、ＶＧＧＣ＿α２ドメインを含有するα２δ−１組換えペプチドを固定化した化合物ＮＶＡ１３０９の特異的プラズモン結合を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、固定化ペプチド３（カルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域（Ｉ））へのＮＶＡ１３０９の結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。ブランク − 減算センサグラムオーバーレイ。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３ＡのＲＵ４００値を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａは、固定化ペプチド４へのＮＶＡ１３０９の結合についてのプラズモンセンサグラムを示す。ブランク − 減算センサグラムオーバーレイ。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４ＡのＲＵ４００値を示す。
【図１５】図１５は、固定化ペプチドＰ４およびＰ６へのＮＶＡ１３０９の結合についてのＲＵ４００プロットである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ペプチドＰ４へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:センサグラムオーバーレイ。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ペプチドＰ１３へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:センサグラムオーバーレイ。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ペプチドＰ４およびＰ１３へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:ＲＵ４００プロット。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ペプチドＰ１４へのＮＶＡ１３０９の結合を示す: センサグラムオーバーレイ。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ペプチドＰ４およびＰ１４へのＮＶＡ１３０９の結合を示す：ＲＵ４００プロット。
【図１８Ａ】図１８Ａは、ペプチドＰ４へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:センサグラムオーバーレイ。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、ペプチドＰ１５へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:センサグラムオーバーレイ。
【図１８Ｃ】図１８Ｃは、ペプチドＰ４およびＰ１５へのＮＶＡ１３０９の結合を示す:ＲＵ４００プロット。
【図１９】図１９は、Biacore CM５センサーチップ表面上の化合物ＮＶＡ１３０９の共有結合固定化を示す。
【図２０】図２０は、「ＶＧＧＣ＿ａ２ドメインを含むα２δ−１組換えペプチドの、Biacore CM５光学センサーチップの表面に共有結合したＮＶＡ１３０９への特異的プラズモン結合を示す。
【図２１】図２１は、α２δ−１組換えペプチド／ＮＶＡ１３０９結合曲線の数学的センサグラムフィッティング（Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１結合モデル）を示す。
【図２２Ａ】図２２（Ａ〜Ｄ）は、ヒト組換えα２δ−１タンパク質（ＰＲ１−４）−ＮＶＡ１３０９結合曲線をコードするα２δ−１構築物（Ｐ１−Ｐ４）のプラズモンセンサグラムフィッティングを示す。
【図２２Ｂ】図２２（Ａ〜Ｄ）は、ヒト組換えα２δ−１タンパク質（ＰＲ１−４）−ＮＶＡ１３０９結合曲線をコードするα２δ−１構築物（Ｐ１−Ｐ４）のプラズモンセンサグラムフィッティングを示す。
【図２２Ｃ】図２２（Ａ〜Ｄ）は、ヒト組換えα２δ−１タンパク質（ＰＲ１−４）−ＮＶＡ１３０９結合曲線をコードするα２δ−１構築物（Ｐ１−Ｐ４）のプラズモンセンサグラムフィッティングを示す。
【図２２Ｄ】図２２（Ａ〜Ｄ）は、ヒト組換えα２δ−１タンパク質（ＰＲ１−４）−ＮＶＡ１３０９結合曲線をコードするα２δ−１構築物（Ｐ１−Ｐ４）のプラズモンセンサグラムフィッティングを示す。
【実施例】
【０１２１】
本発明者らは、ガバペンチノイド、ＮＶＡ１３０９の結合プロフィールにおける個々のα２δ−１ドメインの有意性を調査することを決定した。比較例として、プレガバリンとガバペンチンを用いた。組換え合成ＤＮＡクローニングによって２つの切断α２δ−１タンパク質を生成し、ＣＨＯ細胞中でＨｉｓタグ化ＧＳＴ融合タンパク質として一時的に発現させた。また、従来技術［１３］で確立されているように、優勢なプレガバリン結合領域を欠く酵母（ＣＡＣＮＡ２Ｄ１; CUSABIO、カタログ番号ＣＳＢ−ＹＰ００４４０７ＨＵ）で産生されたＣＡＣＮＡ２Ｄ１（ヒトα２δ−１）組換えペプチドも使用されている。
【０１２２】
図２は、ＣＡＣＮＡ２Ｄ１ドメインおよびＶＧＣＣ＿α２ドメインを含むα２δ−１組換えペプチド配列のトポロジーを概略的に示す。さらに、α２δ−１組換えペプチドを、定義されたα２δ−１領域を表す合成ペプチドのセットおよびその突然変異体誘導体と共に、標的結合実験に使用した。リアルタイム結合評価のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて、ＮＶＡ１３０９が組換え全長α２δ−１タンパク質に高い親和性で結合するが、ＶＧＣＣ＿α２ドメインを含むα２δ−１組換えペプチドに結合するが、ガバペンチノイド（Ｒ２１７）の既知の結合部位には結合しないことが予想外に示されたことが見出された。化合物ＮＶＡ１３０９はまた、先行技術（Ｒ２１７）に記載されるプレガバリン／ガバペンチン結合部位を含む合成ペプチドに特異的に結合し、α２δ−１組換えペプチド内に含まれるα２δ−１ ＶＧＣＣ＿α２ドメインのカルボキシ末端アミノ酸領域内の部位に独立して結合することも見出された。この新規かつ予想外の発見は、先行技術において同定されていないヒトＣＡＣＮＡ２Ｄ１上のガバペンチノイド化合物の新規かつ独立した標的結合部位の存在を仮定している。これらの予想外の発見に関連する支持データは、以下の実施例において詳細に議論される。
【０１２３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ） 
【０１２４】
α２δ−１標的分子の異なる領域を含む組換え断片および合成ペプチドへのガバペンチノイド、ＮＶＡ１３０９の結合を、表面プラズモン共鳴(SPR; Biacore)技術を用いて調べた。
【０１２５】
プラズモン技術による生体分子相互作用分析は光学センサーチップを適用し、分子間の結合事象をリアルタイムで研究することを可能にする。標的結合強度を評価し、正確な結合速度（オン／オフ速度、親和性）を決定するためには、μｇ量の非標識タンパク質（例えば、抗体／抗原、組換え受容体、リガンド）または低分子化合物（例えば、薬物候補）のみで十分である。
【０１２６】
［実施例１］切断された組換えα２δ−１タンパク質へのガバペンチノイドＮＶＡ１３０９およびプレガバリンの結合、構築物１（配列番号２）および構築物２（配列番号３） 
【０１２７】
結合実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を用いて行った。組換え構築物１および構築物２を、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリング試験系を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅアミンカップリングプロトコールに従って、共有結合アミンカップリング化学によって、Biacore CM５光学センサーチップの２つの異なるフローセル（それぞれ、ＦＣ２およびＦＣ３）の表面に固定化した。ヒトＩｇＧを、アッセイ内バックグラウンド結合対照として参照フローセルＦＣ１に固定化した。化合物ＮＶＡ１３０９を漸増濃度で分析物として注入し、結合反応をリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターした。
【０１２８】
報告されたプレガバリン結合部位を含む２つの組換え切断α２δ−１フラグメント（構築物１および２；図３および４を参照のこと）はＮＶＡ１３０９に結合するが、プレガバリンに結合しないことが見出された。これらの２つの切断α２δ−１タンパク質は、組換え合成ＤＮＡクローニングによって生成され、ＣＨＯ細胞においてｈｉｓタグ付きＧＳＴ融合タンパク質として一時的に発現された。
【０１２９】
構築物１ 
【０１３０】
構築物１（配列番号２）は、以下の(a)〜(c)を欠失している： 
【０１３１】
a)von Willebrand因子Ａ型（ＶＷＡ）およびＣａｃｈｅドメインを含むタンパク質のＮ末端に見出されるアミノ末端ＶＷＡ＿Ｎドメイン。
これは脊椎動物、ショウジョウバエおよびＣ．Εｌｅｇａｎｓで見出されているが、他の真核生物ではまだ同定されていない。これは、おそらく、いくつかの電位依存性カルシウムチャネルサブユニットの機能に関与している； 
ｂ)完全なVon Willebrand因子Ａ型ドメイン；および
ｃ）（ｉ）ガバペンチン／プレガバリン結合部位モチーフを含むＶＧＧＣ−α２ドメインの下流のすべてのカルボキシ末端領域、（ｉｉ）α２δ−１および種々の細菌走化性受容体を含む広範囲のタンパク質における小分子認識において役割を果たすと予測されるＣａｃｈｅ １ドメイン、ならびに（ｉｉｉ）ＣａｃｈｅドメインのＮ末端への種々のニューロン電位依存性カルシウムチャネル（ＶＧＣＣ）サブユニットに存在する特定のドメインであるＶＧＧＣ＿ａ２ドメイン。
【０１３２】
構築物２ 
【０１３３】
構築物２（配列番号３）は構築物１と同じであるが、Ｃａｃｈｅ １ドメインも欠いている。
【０１３４】
センサグラムの運転条件は、以下の通りであった： 
【０１３５】
化合物原液： ２０ｍＭ、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液 
化合物作業原料濃度０．６６〜３．６２ ｍＭ 
実行バッファ: HBS-P 
流量：３０μｌ／ｍｉｎ 
【０１３６】
結果は、図５および図６において、ヒトＩｇＧ参照から差し引いた曲線として提示される。
【０１３７】
プレガバリンを、化合物ＮＶＡ１３０９について適用された最高濃度に対応する５００μＭの濃度で分析物として注入した（図７を参照のこと）。
【０１３８】
サブトラクティブ結合センサグラムは両方の切断されたタンパク質がインタクトなガバペンチン／プレガバリン結合モチーフ（ＲＲＲ）を含んでいたが、切断されたα２δ−１リガンドの両方へのプレガバリン結合の欠如を明らかに示す（図３および４を参照のこと）。アナライトとしてガバペンチンを用いても同様のデータが得られ、α２δ−１構築物１および２の両方について結合は観察されなかった。
【０１３９】
４００秒で測定した相対プラズモン応答単位をとる。参照報告点としての注射後（ＲＵ４００；早期解離相）、化合物ＮＶＡ１３０９の濃度依存性結合、および切断された組換えα２δ−１構築物へのプレガバリン結合の欠如が明らかに実証される。ＮＶＡ１３０９およびプレガバリンの切断α２δ−１断片への特異的プラズモン結合を図８Ａおよび８Ｂに示す。
【０１４０】
［実施例２］α２δ−１のガバペンチン／プレガバリン結合部位を含む合成ペプチドへのガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９の結合 
【０１４１】
３つのグリシンおよび末端システインからなる可撓性スペーサーにカルボキシ末端が融合したα２δ−１のＶＷＦ＿Ａドメインの上流に報告されたガバペンチン／プレガバリン結合部位を含む合成ペプチドを作製した（ペプチド１、Ｐ１；配列番号４）： 
【０１４２】
P1: RTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAGGGC
［配列番号４］ 
【０１４３】
このペプチドを、Ｂｉａｃｏｒｅチオールカップリング手順に従って、バイアコアチオールカップリング試験系（Biacore Thiol Coupling Test system）を使用して、Biacore CM５光学センサーチップの表面（ＦＣ２）にカルボキシ末端システインを介して共有結合させた。チオールカップリングは固定化ペプチド分子の均一な表面提示を可能にし、ペプチドのアミノ酸配列によって決定される立体配座を採用する自由を提供する。化合物ＮＶＡ１３０９を、増加する濃度で分析物として注入し、そして結合反応を、ブランクＦＣ１デキストラン参照表面から差し引いた曲線として提示されるリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターした。
【０１４４】
センサグラムの運転条件は、以下の通りであった： 
【０１４５】
化合物原液： ５０ｍＭ、ＤＭＳＯ 
化合物作業原料希釈：０．５〜２ｍＭ 
実行バッファ: HBS-P 
流量：３０μｌ／ｍｉｎ 
【０１４６】
４００秒で測定した相対プラズモン応答単位をとる。
参照報告点としての注射後（ＲＵ４００；初期解離相）、報告されたガバペンチン／プレガバリン結合部位を含む合成ペプチドへの化合物ＮＶＡ１３０９の濃度依存的結合が明確に実証される（図９Ａおよび９Ｂ参照）。
【０１４７】
分析物としてのプレガバリンはペプチドＰ１リガンドへの結合について陽性プラズモンシグナルを生じず、これは実施例１に示されるデータを確認した（図１０を参照のこと）。
【０１４８】
［実施例３］既知のガバペンチン／プレガバリン結合部位ではなく、ＶＧＣＣ＿ａ２ドメインを含むα２δ−１組換えペプチド（配列番号５）へのガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９の結合 
【０１４９】
ＶＧＧＣ＿α２ドメインを含み、カルボキシ末端付近に単一のシステインを含むα２δ−１組換えペプチドを、共有結合チオールカップリング化学に続いて、Biacore Thiol Coupling Test systemを使用して、Biacore CM５光学センサーチップの表面に固定化した。この固定化プロセスは、ランダム化アミンカップリング手順よりも、センサーチップ表面へのリガンド分子の立体的により均一な付着を提供する。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、アッセイ内バックグラウンド結合対照として参照フローセルＦＣ１に固定した。化合物ＮＶＡ１３０９を、増加する濃度で分析物として注入し、そして結合反応を、ＢＳＡ参照から差し引いた曲線として提示されるリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターした（図１１を参照のこと）。
【０１５０】
センサグラムの運転条件は、以下の通りであった： 
【０１５１】
化合物原液： ５０ｍＭ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ＤＭＳＯ 
化合物作業希釈：０．５〜２ｍＭ 
実行バッファ: HBS-P 
流量：３０μｌ／ｍｉｎ 
【０１５２】
相対プラズモン応答単位は４００秒で測定した。注射後（ＲＵ４００；早期解離相）、参照報告点として、α２δ−１組換えペプチドへの化合物ＮＶＡ１３０９の濃度依存的結合が明確に実証される（図１１および１２を参照のこと）。
【０１５３】
［実施例４］α２δ−１のＶＧＧＣ＿α２ドメインのカルボキシ末端アミノ酸領域を含む合成ペプチドへのガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９の特異的結合 
【０１５４】
３つのグリシンおよび末端システインからなる可撓性スペーサーにカルボキシ末端が融合したα２δ−１のＶＧＧＣ＿α２ドメインのカルボキシ末端を表す合成ペプチドを構築した（ペプチド３；配列番号６）： 
【０１５５】
ペプチドＰ３、カルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域(I)+ GGGCアンカー 
【０１５６】
P3: TYSFYIKAKLEETITQARYSETGGGC
［配列番号６］ 
【０１５７】
このペプチドを、Ｂｉａｃｏｒｅチオールカップリング手順に従って、Biacore Thiol Coupling Test systemを使用して、Biacore CM５光学センサーチップの表面（ＦＣ２）にカルボキシ末端システインを介して共有結合させた。このストラテジーは固定化ペプチド分子の均一な表面提示を可能にし、そしてペプチドのアミノ酸配列によって決定される立体配座を採用する自由を提供する。化合物ＮＶＡ１３０９を、増加する濃度で分析物として注入し、そして結合反応を、ブランクＦＣ１デキストラン参照表面から差し引かれた曲線として提示されるリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターした（図１３Ａを参照のこと）。
【０１５８】
センサグラムの運転条件は、以下の通りであった： 
【０１５９】
化合物原液： ５０ｍＭ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ＤＭＳＯ 
化合物作業希釈：０．５〜２ｍＭ 
実行バッファ: HBS-P(Biacore) 
流量：３０μｌ／ｍｉｎ 
【０１６０】
４００秒で測定した相対プラズモン応答単位をとる。注射後（ＲＵ４００；早期解離相）、参照報告点として、α２δ−１ ＶＧＧＣ＿α２領域（Ｉ）ドメインのカルボキシ末端に相同な化合物ＮＶＡ１３０９のペプチドＰ３への濃度依存結合が明確に実証される（図１３Ｂ参照）。
【０１６１】
［実施例５］ＶＧＧＣ＿α２標的ドメインのカルボキシ末端領域上のガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９結合部位のマッピング：コアアミノ酸配列IKAKLEETITQAへの結合 
【０１６２】
ペプチド３(配列番号６）に含まれるコアアミノ酸シークエンスIKAITQAGGGC（ペプチド４; 配列番号７）からなるフレキシブルスペーサ（３グリシンとターミナルシステインからなる伸縮空間）に、カーボキシターミナルを融合した合成ペプチドを構築した： 
【０１６３】
P4: IKAKLEETITQAGGGC
［配列番号７］ 
【０１６４】
このペプチドを、Ｂｉａｃｏｒｅチオールカップリング手順に従って、実施例４に記載されるように、Biacore CM５光センサーチップの表面（ＦＣ２）にカルボキシ末端システインを介して共有結合させた。化合物ＮＶＡ１３０９を、増加する濃度で分析物として注入し、そして結合反応を、ブランクＦＣ１デキストラン参照表面から差し引いた曲線として提示されるリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターした（図１４Ａおよび１４Ｂ）。
【０１６５】
センサグラムの運転条件は、以下の通りであった： 
【０１６６】
化合物原液： ５０ｍＭ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ） 
化合物作業希釈：０．５〜２ｍＭ 
実行バッファ: HBS-P 
流量：３０μｌ／ｍｉｎ 
【０１６７】
３つのグリシンおよび末端システイン：（ペプチドＰ６；配列番号８）からなる可撓性スペーサーにカルボキシ末端融合した、最終的な下流ＶＧＧＣ＿α２アミノ酸に伸長したペプチドＰ４のカルボキシ末端半分から開始して、追加のペプチドを合成した： 
【０１６８】
P6: ETITQARYSETLKPGGGC
［配列番号８］ 
【０１６９】
このペプチドを、Ｂｉａｃｏｒｅチオールカップリング手順を用いて、新しいBiacore CM５光学センサーチップの表面（ＦＣ３）にカルボキシ末端システインを介して共有結合させた。ペプチドＰ４を陽性参照対照としてＦＣ２上に固定化し、フローセルＦＣ１を陰性バックグラウンド結合参照としてブランクのままにした。化合物ＮＶＡ１３０９を、増加する濃度で分析物として注入し、結合反応を、前の実施例に記載されるようなリアルタイムセンサグラムの生成によってモニターし、そしてブランクＦＣ１デキストラン参照表面から差し引かれた曲線として提示した。
【０１７０】
ペプチドＰ４およびＰ６についてブランクから差し引かれたセンサグラムから得られた相対SPR R４００報告ポイント応答単位を、図１５に直接比較して示す。
【０１７１】
実施例５に開示される実験の結果は、α２δ−１ ＶＧＧＣ＿α２ドメインのカルボキシ末端における配列番号ストレッチＩＫＡＫＬＥＥＴＩＴＱＡが化合物ＮＶＡ１３０９の新規結合部位を規定することを明確に実証する。ペプチドＰ６（配列番号８）に示されるように、この配列のアミノ末端部分の欠失およびＶＧＧＣ＿α２のカルボキシ末端のさらなる伸長は、ＮＶＡ１３０９結合能力の有意な損失をもたらした。従って、ペプチドＰ４のアミノ末端部分（配列番号７）、ＩＫＡＫＬＥは、化合物ＮＶＡ１３０９標的結合に寄与する。
【０１７２】
［実施例６］新規ＶＧＧＣ＿α２ガバペンチノイド結合部位の分子特性決定（ペプチドＰ４スキャニング） 
【０１７３】
一連の３つの濃度プラズモン結合実験を、ペプチドＰ４配列（配列番号７）に由来するペプチドを用いて行った。これらのペプチドは、結合化合物ＮＶＡ１３０９における単一ペプチド４含有（Ｐ４）アミノ酸残基の有意性を決定するために設計された。以下のペプチドを調製した： 
【０１７４】
ペプチドＰ８（配列番号９） 
これは、逆ペプチドＰ４ + GGGCアンカーである。
【０１７５】
AQTITEELKAKIGGGC
［配列番号９］ 
【０１７６】
ペプチドＰ９（配列番号１０） 
これはＰ４類似体であり、すべてのアミノ酸が最も類似したもの+ GGGCアンカーによって置換されていた。
【０１７７】
LRVRIDDSLSNVGGGC
［配列番号１０］ 
【０１７８】
ペプチドＰ１０（配列番号１１） 
これは、Ｐ４、正に荷電した側鎖Ａ置換+ GGGCアンカーに由来する。
【０１７９】
IAAALEETITQAGGGC
［配列番号１１］ 
【０１８０】
ペプチドＰ１１（配列番号） 
これは、Ｐ４、負に荷電した側鎖Ａ置換+ GGGCアンカーに由来する。
IKAKLAATITQAGGGC
［配列番号１２］ 
【０１８１】
ペプチドＰ１２（配列番号１３） 
これは、Ｐ４極性側鎖Ａ置換+ GGGCアンカーに由来する。
【０１８２】
IKAKLEEAIAQAGGGC
［配列番号１３］ 
【０１８３】
合成ペプチドを、Ｂｉａｃｏｒｅチオールカップリング手順に従って末端システインを介して光センサーチップに共有結合させ、プラズモン結合実験を、先の実施例に記載したのと全く同じ条件下で行った。単一ペプチドの相対結合強度を３つの濃度ＲＵ４００値から読み取り、ペプチドＰ４参照の結合パーセンテージとして計算した（Ｐ４: RU４００＝１００％）。この実施例の比較結果を表１に要約する。
【表５】
2020521507.tif 000008
【０１８４】
逆ペプチドＰ８への結合の欠如によって支持されて、ペプチドＰ４スキャニング実験の結果は化合物ＮＶＡ１３０９のペプチドＰ４への結合特異性を確認し、完全なＮ末端アミノ酸モチーフＩＫＡＫＬＥがＮＶＡ１３０９結合に特に重要であることを示す。
【０１８５】
［実施例７］ヒトα２δ−１電位依存性カルシウムチャネルサブユニットのＶＧＣＣ＿ａ２ドメイン内のガバペンチノイドＮＶＡ１３０９の新規結合部位のより詳細な同定 
【０１８６】
ヒトα２δ−１のＶＧＣＣ＿ａ２ドメイン内のＮＶＡ１３０９の結合配列内の機能的アミノ酸残基を同定するために、本発明者らはペプチドＰ４（配列番号７）、Ｐ１３（配列番号１４）、Ｐ１４（配列番号１５）およびＰ１５（配列番号１６）を合成し、使用した。詳細については以下を参照されたい。
【０１８７】
ペプチドＰ４ 
陽性結合参照（１００％相対結合）：α２δ−１ ＶＧＣＣ−２ドメイン（ＭＰ３)+ GGGCアンカーのカルボキシ末端領域に相同。
【０１８８】
IKAKLEETITQAGGGC
［配列番号７］ 
【０１８９】
ペプチドＰ１３ 
Ｐ４アナログ; K２ Ａ置換+ GGGCアンカー。
【０１９０】
IAAKLEETITQAGGGC
［配列番号１４］ 
【０１９１】
ペプチドＰ１４ 
Ｐ４アナログ; K４ Ａ置換+ GGGCアンカー。
【０１９２】
IKAALEETITQAGGGC
［配列番号１５］ 
【０１９３】
ペプチドＰ１５ 
Ｐ４ + GGGCアンカーのアミノ末端部分。
【０１９４】
IKAKGGGC
［配列番号１６］ 
【０１９５】
ペプチドＰ４を、チオールカップリング化学を用いて、参照標的リガンドとしてのBiacore CM５光学センサーチップのフローセル２（ＦＣ２）の表面にカルボキシ末端システインを介して共有結合させた。ペプチドＰ１３は、同じセンサーチップのフローセル３（ＦＣ３）の表面に共有結合的にチオールカップリングされた。ブランクのカルボキシル−デキストラン表面を表すフローセルＦＣ１を、ネガティブ（ブランク）結合参照として使用した。
【０１９６】
ペプチドＰ４およびＰ１３に対するＮＶＡ１３０９の結合分析 
【０１９７】
ペプチドＰ４およびＰ１３へのＮＶＡ１３０９の結合を、濃度依存性センサグラムの生成によって分析した。
（背景減算センサグラムＦＣ２−ＦＣ１およびＦＣ３−ＦＣ１）（図１６Ａ−Ｃ）。
【０１９８】
ペプチドＰ４およびＰ１４に対するＮＶＡ１３０９の結合分析 
【０１９９】
ペプチドＰ１４に対するＮＶＡ１３０９のペプチドＰ４およびＰ１４への結合を、ペプチドＰ１４についての濃度依存性センサグラムの生成によって分析した（図１７Ａ、バックグラウンド減算センサグラムＦＣ４−ＦＣ１を参照のこと）。Ｐ１４データをペプチドＰ４（ＦＣ２−ＦＣ１；図１６Ａ）について得られた対応する値と比較したＲＵ４００プロットを図１７Ｂに示す。
【０２００】
ペプチドＰ４およびＰ１５に対するＮＶＡ１３０９の結合分析 
【０２０１】
ペプチドＰ４およびＰ１５へのＮＶＡ１３０９の結合を、以下の図１８Ａ〜Ｃに示す濃度依存センサグラム（背景差分センサグラムＦＣ４−ＦＣ１およびＦＣ３−ＦＣ１）の生成によって、新しいBiacore CM５センサーチップ上で分析した。
【０２０２】
図１６〜１８に示されるデータは、新たに発見されたＶＧＣＣ＿ａ２標的への化合物ＮＶＡ１３０９の結合の特異性を確認する。オンチップ参照としてペプチドＰ４を使用すると、表２に示される相対ＲＵ４００値および結合スコアは一致し、標的上の化合物ＮＶＡ１３０９結合についてのＩＫＡＫ配列、特に４位のリジン（Ｋ）の重要性を強調する。
Ｐ４のカルボキシ末端半分（ＥＴＩＴＱＡ）自体は、ＮＶＡ１３０９と相互作用するのに十分ではないことが見出された。
【表６】
2020521507.tif 000009
【０２０３】
実施例８−Biacore CM５光学センサーチップの表面に共有結合的に固定化されたガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９上のＶＧＣＣ＿ａ２ドメインを含有するα２δ−１組換えタンパク質（配列番号５）の結合 
【０２０４】
前の実施例に提示されたデータを確認し、組換え全長α２δ１構築物（配列番号１）のような大きなタンパク質を用いたＢｉａｃｏｒｅ プラズモン実験を可能にするために、図１９に概略的に示されるように、化合物ＮＶＡ１３０９の単一の第一級アミノ基をデキストランマトリックスのカルボキシル基に共有結合することによって、化合物ＮＶＡ１３０９をリガンドとして使用することを可能にするプラズモンプロトコルが確立された。
【０２０５】
化合物ＮＶＡ１３０９のセンサーチップへの化学的カップリングは化合物ＮＶＡ１３０９をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２ｍＭに希釈した５０ｍＭストック溶液中に適用し、続いてＢｉａｃｏｒｅアミンカップリング試験系において推奨されるプロトコールに従って達成した。
【０２０６】
以下のリガンドをBiacore CM５センサーチップの表面に結合させた： 
フローセル１（ＦＣ１）：アミン（エタノールアミン）活性化ブランク表面 
フローセル２（ＦＣ２）：非関連蛋白質１（．．ＲＵ） 
フローセル３（ＦＣ３）：非関連タンパク質２（．．ＲＵ） 
フローセル４（ＦＣ４): NVA１３０９（４４ ＲＵ） 
【０２０７】
α２δ−１組換えペプチド（１μＭ）を、分析物として全てのフローセルに通した。
ＦＣ１減算センサグラムを図２０に示す。
【０２０８】
固定化ＮＶＡ１３０９に結合するα２δ−１組換えペプチドの親和性を推定するために、結合センサグラムを、Ｌａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用アルゴリズム（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェア）を適用する数学的曲線フィッティングによって分析した（図２１を参照のこと）。
【０２０９】
α２δ−１組換えペプチドＶＧＣ＿α２−ＮＶＡ１３０９相互作用の速度論を、図２１に示す曲線フィッティングに基づいて速度論的結合定数(k-on; ka、k-off; KD)を決定することにより評価し、平衡解離定数kd = KD/kaを計算し、化合物−標的結合親和性の単一濃度推定値を得た。
【表７】
2020521507.tif 000010
【０２１０】
［実施例９］ヒト組換え全長α２δ−１タンパク質（配列番号１）およびその誘導体（配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９）の、Biacore CM５光学センサーチップの表面上に共有結合的に固定化された化合物ＮＶＡ１３０９への結合
【０２１１】
組換え全長α２δ−１タンパク質およびアラニンで置換された単一アミノ酸残基を含有する突然変異体を、標準的なＤＮＡクローニングおよび発現技術によって生成し、アミノ結合化合物ＮＶＡ１３０９へのプラズモン結合のための分析物として使用した。表４に示す分析物タンパク質を調査した：
【表８】
2020521507.tif 000011
【０２１２】
ＰＲ１は天然の野生型ヒトα２δ−１タンパク質を表し、ＰＲ２は先行技術および文献に報告されるように、ＲＲＲモチーフ内のガバペンチン／プレガバリンの結合部位として記載される単一のアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換を含む。ＰＲ３は実施例７に開示されるように、α２δ−１標的上のガバペンチノイドＮＶＡ１３０９の新規結合部位に相当する単一のリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含む。ＰＲ４タンパク質は、ＰＲ２およびＰＲ３におけるように両方の点突然変異を含む。
【０２１３】
各α２δ−１構築物を、ＮＶＡ１３０９センサーチップ表面にわたって３つの濃度で分析物として流した。（ＮＶＡ１３０９表面密度＝２０４ＲＵ）。
【０２１４】
速度論的結合定数（ｋ−on; ka, k−off; kd)を、ブランクアミン活性化減算センサグラムから数学的センサグラムフィッティングによって決定した。適合曲線を図２２（Ａ−Ｄ）に示す。
【０２１５】
速度定数の計算のために、ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ ４．１ソフトウェアを使用することによって、質量輸送制限補正（適用可能な場合）を補足したＬａｎｇｍｕｉｒ １：１相互作用アルゴリズムを適用した。平衡解離定数KD = KD/kaを計算した。全ての組換えタンパク質について得られた動力学的結合定数および計算された親和性を表５にまとめる。
【表９】
2020521507.tif 000012
【０２１６】
結論 
【０２１７】
I-NVA１３０９は、ターゲットとの相互作用の新しいメカニズムを示す
【０２１８】
ＮＶＡ１３０９は、先行技術に記載されているガバペンチノイド（プレガバリン／ガバペンチン）とは異なる分子相互作用メカニズムによってα２δ−１に結合するガバペンチノイドである。ＮＶＡ１３０９は両方の組換え切断α２δ−１タンパク質に結合することができたが、プレガバリンについては結合シグナルは得られなかった。これらの２つの切断されたα２δ−１フラグメントへのプレガバリンの結合は、先行技術および公開された文献［１３］において特許請求されるように予想された。
【０２１９】
この驚くべき発見は標的相互作用の様式に関して、化合物ＮＶＡ１３０９とプレガバリンとの間の基本的な差異を明確に実証する：文献［１８］に仮定されるように、プレガバリンがその既知の結合領域（ＲＲＲモチーフ）と相互作用するためには完全長α２δ−１タンパク質の無傷の三次元フォールディングが必要であり、そのような構造的拘束はＮＶＡ１３０９に必須ではないことが示された。
【０２２０】
この予想外の知見は、化合物ＮＶＡ１３０９がα２δ−１のＶＷＡドメインの上流に報告されたＰＧＢ結合領域を排他的に含む短い合成ペプチド（ペプチドＰ１；配列Ｉｄ ４）にも結合することができることを示すことによって、さらに拡張された。対照的に、プレガバリンはこのペプチドに結合することができなかった。
【０２２１】
II-NVA１３０９はα２δ−１内の新規標的領域と相互作用する 
【０２２２】
化合物ＮＶＡ１３０９は、報告されたプレガバリン結合配列の下流に位置するα２δ−１タンパク質のＶＧＧＣ＿α２ドメイン内の領域に独立して結合することが見出された。
酵母で発現され、ＶＧＧＣ＿α２ドメインを含むが、先行技術のプレガバリン／ガバペンチン結合部位(ＲＲＲ)(配列Ｉｄ５）では知られていないα２δ−１組換えペプチドをプラズモン結合実験に使用した。
【０２２３】
予想外に、化合物ＮＶＡ１３０９は、プレガバリンおよびガバペンチンの結合部位と呼ばれる文献において、ＶＷＦ＿Ａドメインの上流のα２δ−１領域を欠く組換えα２δ−１組換えペプチドに特異的に結合することができた。結合は特異的であることが証明され（ウシ血清アルブミン、陰性結合対照としてのＢＳＡ）、また濃度依存性であった。
【０２２４】
ＶＧＧＣ＿α２結合領域内の合成ペプチドを使用するプラズモン結合分析を、化合物ＮＶＡ１３０９を用いて実施し、特異的結合領域を、ＶＧＧＣ＿α２ドメインのカルボキシ末端アミノ酸部分までさらに狭めた。これは、このカルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域を含む合成ペプチド（ペプチドＰ３；配列番号６）へのＮＶＡ１３０９結合を実証することによって達成された。より短いペプチド（ペプチドＰ４（配列番号７）、およびペプチドＰ６（配列番号８）、ならびにアラニン置換アミノ酸残基を含有するＰ４ペプチド誘導体、Ｐ９（配列番号１０）、ペプチドＰ１０（配列番号１１）、ペプチドＰ１１（配列番号およびペプチドＰ１２（配列番号１３））を用いたさらなるプラズモン結合実験は、標的化合物ＮＶＡ１３０９相互作用に関与する新規結合領域としての配列ＩＫＡＫＬＥＥＴＩＴＱＡを含むアミノ酸のストレッチの同定を可能にした。
【０２２５】
化合物ＮＶＡ１３０９と組換え全長α２δ−１タンパク質（配列番号１）およびα２δ−１組換えペプチド（配列番号５）との特異的相互作用を、化合物ＮＶＡ１３０９をリガンドとして使用するプラズモン分析によって、その単一の一次アミノ基を介して光学センサーチップ表面に共有結合させた後、および溶液中の分析物として組換えタンパク質を適用することによって確認した。先行技術（配列番号１４）に記載されるように、プレガバリン結合部位内に含まれるそれぞれのアミノ酸残基および／または新たに検出されたカルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域ＩＫＡＫＬＥＥＴＩＴＱＡ(配列番号１５、配列番号１６）内に含まれるアミノ酸残基のアラニン置換を含む単一組換え全長α２δ−１変異タンパク質もまた、共有結合的に固定化された化合物ＮＶＡ１３０９に結合することが示された。
【０２２６】
プラズモンセンサグラムから得られた動的結合定数の決定は化学的に固定化された化合物ＮＶＡ１３０９に対する種々の分析物の結合親和性（ＫＤ値）の計算を可能にし、５〜８０ｎＭの範囲にあることが見出された。これらの新規かつ予想外の発見は先行技術で報告されているように、ガバペンチノイドガバペンチンおよびプレガバリンの標的相互作用結合特性とは異なる、ガバペンチノイド化合物ＮＶＡ１３０９との標的相互作用の独特の様式を仮定している。さらに、これらの知見は、潜在的にユニークな生物学的／薬理学的特性を有する新規な電位依存性カルシウムチャネルモジュレーターの同定のために使用される新規かつ発明的な基礎を構成する。
【０２２７】
したがって、実施例１〜９に開示される結果は、電位依存性カルシウム（ＣａＶ）チャネルの補助α２δ−１サブユニットのＶＧＧＣ＿α２ドメイン内のガバペンチノイド化合物の新規結合部位の同定および分子特性決定を記載する。この標的部位は高親和性結合ポケットを生成するために、ＶＷＡドメインの上流に位置する先行技術において報告されたガバペンチン／プレガバリン結合部位と相乗的に作用し得る。しかし、新たに同定された新規なＶＧＧＣ＿α２位置結合部位はまた、新規な治療活性カルシウムチャネルモジュレーターの同定および開発のための独立した標的として作用し得る。
【０２２８】
配列表 
【０２２９】
ペプチドアミノ酸配列
【０２３０】
配列番号１（ヒト全長α２δ−１、ナンバリングはシグナルペプチドを含む）： 
MAAGCLLALTLTLFQSLLIGPSSEEPFPSAVTIKSWVDKMQEDLVTLAKTASGVNQLVDI
YEKYQDLYTVEPNNARQLVEIAARDIEKLLSNRSKALVRLALEAEKVQAAHQWREDFASN
EVVYYNAKDDLDPEKNDSEPGSQRIKPVFIEDANFGRQISYQHAAVHIPTDIYEGSTIVL
NELNWTSALDEVFKKNREEDPSLLWQVFGSATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRR
RPWYIQGAASPKDMLILVDVSGSVSGLTLKLIRTSVSEMLETLSDDDFVNVASFNSNAQD
VSCFQHLVQANVRNKKVLKDAVNNITAKGITDYKKGFSFAFEQLLNYNVSRANCNKIIML
FTDGGEERAQEIFNKYNKDKKVRVFTFSVGQHNYDRGPIQWMACENKGYYYEIPSIGAIR
INTQEYLDVLGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLK
NQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTIN
LRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYI
DKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSETLKPDNFEESGYTF
IAPRDYCNDLKISDNNTEFLLNFNEFIDRKTPNNPSCNADLINRVLLDAGFTNELVQNYW
SKQKNIKGVKARFVVTDGGITRVYPKEAGENWQENPETYEDSFYKRSLDNDNYVFTAPYF
NKSGPGAYESGIMVSKAVEIYIQGKLLKPAVVGIKIDVNSWIENFTKTSIRDPCAGPVCD
CKRNSDVMDCVILDDGGFLLMANHDDYTNQIGRFFGEIDPSLMRHLVNISVYAFNKSYDY
QSVCEPGAAPKQGAGHRSAYVPSVADILQIGWWATAAAWSILQQFLLSLTFPRLLEAVEM
EDDDFTASLSKQSCITEQTQYFFDNDSKSFSGVLDCGNCSRIFHGEKLMNTNLIFIMVES
KGTCPCDTRLLIQAEQTSDGPNPCDMVKQPRYRKGPDVCFDNNVLEDYTDCGGVSGLNPS
LWYIIGIQFLLLWLVSGSTHRLL
【０２３１】
配列番号２（組換えα２δ−１切断１、構築物１）： 
ATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAASPKGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLKNQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSET
【０２３２】
配列番号３（組換えα２δ−１切断２、構築物２）： 
ATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAASPKGRPMVLAGDKAKQVQKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSET
【０２３３】
配列番号４（プレガバリン結合部位を含むペプチドＰ１）： 
RTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAGGGC
【０２３４】
配列番号５（組換えＣＡＣＮＡ２Ｄ１（Ｃｕｓａｂｉｏ）断片）： 
QPKPIGVGIP TINLRKRRPN IQNPKSQEPV TLDFLDAELE NDIKVEIRNK MIDGESGEKTFRTLVKSQDE RYIDKGNRTY TWTPVNGTDY SLALVLPTYS FYYIKAKLEE TITQARYSETLKPDNFEESG YTFIAPRDYCN 
【０２３５】
配列番号６（ペプチドＰ３、カルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域(I)+ GGGCアンカー）： 
TYSFYIKAKLEETITQARYSETGGGC 
【０２３６】
配列番号７（ペプチドＰ４、カルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域(II)+ GGGCアンカー）： 
IKAKLEETITQAGGGC 
【０２３７】
配列番号８（ペプチドＰ６、カルボキシ末端ＶＧＧＣ＿α２領域(IV)+ GGGCアンカー）： 
ETITQARYSETLKPGGGC 
【０２３８】
配列番号９（ペプチドＰ８、逆ペプチドＰ４ + GGGCアンカー）： 
AQTITEELKAKIGGGC 
【０２３９】
配列番号１０（ペプチドＰ９、Ｐ４類似体−最も類似したもの+ GGGCアンカーによって置換された全てのａａ）： 
LRVRIDDSLSNVGGGC 
【０２４０】
配列番号１１（ペプチドＰ１０、Ｐ４類似体−正に荷電した側鎖Ａ−置換+ GGGCアンカー）： 
IAAALEETITQAGGGC 
【０２４１】
配列番号１２（ペプチドＰ１１、Ｐ４類似体−負に荷電した側鎖Ａ−置換+ GGGCアンカー）： 
IKAKLAATITQAGGGC     
【０２４２】
配列番号１３（ペプチドＰ１２、Ｐ４類似体−極性側鎖Ａ置換+ GGGCアンカー）： 
IKAKLEEAIAQAGGGC  
【０２４３】
配列番号１４（ペプチドＰ１３、アラニン(A)+ GGGCアンカーで置換された位置２（Ｋ）のリシンを有するＰ４類似体）： 
IAAKLEETITQAGGGC
【０２４４】
配列番号１５（ペプチドＰ１４、アラニン(A)+ GGGCアンカーで置換された位置４（Ｋ）のリシンを有するＰ４類似体）： 
IKAALEETITQAGGGC
【０２４５】
配列番号１６（ペプチドＰ１５、Ｐ４ + GGGCアンカーのアミノ末端部分のみを含むＰ４類似体）： 
IKAKGGGC
【０２４６】
配列番号１７（Ｒ２１７Ａ変異を有する全長ヒトα２δ−１組換えタンパク質ＰＲ２）： 
EPFPSAVTIKSWVDKMQEDLVTLAKTASGVNQLVDIYEKYQDLYTVEPNNARQLVEIAARDIEKLLSNRSKALVRLALEAEKVQAAHQWREDFASNEVVYYNAKDDLDPEKNDSEPGSQRIKPVFIEDANFGRQISYQHAAVHIPTDIYEGSTIVLNELNWTSALDEVFKKNREEDPSLLWQVFGSATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRAPWYIQGAASPKDMLILVDVSGSVSGLTLKLIRTSVSEMLETLSDDDFVNVASFNSNAQDVSCFQHLVQANVRNKKVLKDAVNNITAKGITDYKKGFSFAFEQLLNYNVSRANCNKIIMLFTDGGEERAQEIFNKYNKDKKVRVFTFSVGQHNYDRGPIQWMACENKGYYYEIPSIGAIRINTQEYLDVLGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLKNQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAKLEETITQARYSETLKPDNFEESGYTFIAPRDYCNDLKISDNNTEFLLNFNEFIDRKTPNNPSCNADLINRVLLDAGFTNELVQNYWSKQKNIKGVKARFVVTDGGITRVYPKEAGENWQENPETYEDSFYKRSLDNDNYVFTAPYFNKSGPGAYESGIMVSKAVEIYIQGKLLKPAVVGIKIDVNSWIENFTKTSIRDPCAGPVCDCKRNSDVMDCVILDDGGFLLMANHDDYTNQIGRFFGEIDPSLMRHLVNISVYAFNKSYDYQSVCEPGAAPKQGAGHRSAYVPSVADILQIGWWATAAAWSILQQFLLSLTFPRLLEAVEMEDDDFTASLSKQSCITEQTQYFFDNDSKSFSGVLDCGNCSRIFHGEKLMNTNLIFIMVESKGTCPCDTRLLIQAEQTSDGPNPCDMVKQPRYRKGPDVCFDNNVLEDYTDCGGVSGLNPSLWYIIGIQFLLLWLVSGSTHRLL
【０２４７】
配列番号１８（Ｋ６３４Ａ突然変異を有する全長ヒトα２δ−１組換えタンパク質ＰＲ３）： 
EPFPSAVTIKSWVDKMQEDLVTLAKTASGVNQLVDIYEKYQDLYTVEPNNARQLVEIAARDIEKLLSNRSKALVRLALEAEKVQAAHQWREDFASNEVVYYNAKDDLDPEKNDSEPGSQRIKPVFIEDANFGRQISYQHAAVHIPTDIYEGSTIVLNELNWTSALDEVFKKNREEDPSLLWQVFGSATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRRPWYIQGAASPKDMLILVDVSGSVSGLTLKLIRTSVSEMLETLSDDDFVNVASFNSNAQDVSCFQHLVQANVRNKKVLKDAVNNITAKGITDYKKGFSFAFEQLLNYNVSRANCNKIIMLFTDGGEERAQEIFNKYNKDKKVRVFTFSVGQHNYDRGPIQWMACENKGYYYEIPSIGAIRINTQEYLDVLGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLKNQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAALEETITQARYSETLKPDNFEESGYTFIAPRDYCNDLKISDNNTEFLLNFNEFIDRKTPNNPSCNADLINRVLLDAGFTNELVQNYWSKQKNIKGVKARFVVTDGGITRVYPKEAGENWQENPETYEDSFYKRSLDNDNYVFTAPYFNKSGPGAYESGIMVSKAVEIYIQGKLLKPAVVGIKIDVNSWIENFTKTSIRDPCAGPVCDCKRNSDVMDCVILDDGGFLLMANHDDYTNQIGRFFGEIDPSLMRHLVNISVYAFNKSYDYQSVCEPGAAPKQGAGHRSAYVPSVADILQIGWWATAAAWSILQQFLLSLTFPRLLEAVEMEDDDFTASLSKQSCITEQTQYFFDNDSKSFSGVLDCGNCSRIFHGEKLMNTNLIFIMVESKGTCPCDTRLLIQAEQTSDGPNPCDMVKQPRYRKGPDVCFDNNVLEDYTDCGGVSGLNPSLWYIIGIQFLLLWLVSGSTHRLL
【０２４８】
配列番号１９（Ｒ２１７Ａ＋Ｋ６３４Ａ変異を有する全長ヒトα２δ−１組換えタンパク質ＰＲ４）： 
EPFPSAVTIKSWVDKMQEDLVTLAKTASGVNQLVDIYEKYQDLYTVEPNNARQLVEIAARDIEKLLSNRSKALVRLALEAEKVQAAHQWREDFASNEVVYYNAKDDLDPEKNDSEPGSQRIKPVFIEDANFGRQISYQHAAVHIPTDIYEGSTIVLNELNWTSALDEVFKKNREEDPSLLWQVFGSATGLARYYPASPWVDNSRTPNKIDLYDVRRAPWYIQGAASPKDMLILVDVSGSVSGLTLKLIRTSVSEMLETLSDDDFVNVASFNSNAQDVSCFQHLVQANVRNKKVLKDAVNNITAKGITDYKKGFSFAFEQLLNYNVSRANCNKIIMLFTDGGEERAQEIFNKYNKDKKVRVFTFSVGQHNYDRGPIQWMACENKGYYYEIPSIGAIRINTQEYLDVLGRPMVLAGDKAKQVQWTNVYLDALELGLVITGTLPVFNITGQFENKTNLKNQLILGVMGVDVSLEDIKRLTPRFTLCPNGYYFAIDPNGYVLLHPNLQPKPIGVGIPTINLRKRRPNIQNPKSQEPVTLDFLDAELENDIKVEIRNKMIDGESGEKTFRTLVKSQDERYIDKGNRTYTWTPVNGTDYSLALVLPTYSFYYIKAALEETITQARYSETLKPDNFEESGYTFIAPRDYCNDLKISDNNTEFLLNFNEFIDRKTPNNPSCNADLINRVLLDAGFTNELVQNYWSKQKNIKGVKARFVVTDGGITRVYPKEAGENWQENPETYEDSFYKRSLDNDNYVFTAPYFNKSGPGAYESGIMVSKAVEIYIQGKLLKPAVVGIKIDVNSWIENFTKTSIRDPCAGPVCDCKRNSDVMDCVILDDGGFLLMANHDDYTNQIGRFFGEIDPSLMRHLVNISVYAFNKSYDYQSVCEPGAAPKQGAGHRSAYVPSVADILQIGWWATAAAWSILQQFLLSLTFPRLLEAVEMEDDDFTASLSKQSCITEQTQYFFDNDSKSFSGVLDCGNCSRIFHGEKLMNTNLIFIMVESKGTCPCDTRLLIQAEQTSDGPNPCDMVKQPRYRKGPDVCFDNNVLEDYTDCGGVSGLNPSLWYIIGIQFLLLWLVSGSTHRLL
【０２４９】
配列番号 ２０ 
IKAK
【０２５０】
配列番号 ２１ 
IKAKLE
【０２５１】
配列番号 ２２ 
IKAKLEET
【０２５２】
配列番号 ２３ 
IKAKLEETITQA
【０２５３】
配列番号２４（ＰＧＢ結合部位） 
VRRRPWYIQGAAS
【０２５４】
配列番号２５（ＲＲＲモチーフ） 
RRR
【０２５５】
非特許文献
【表１０】
2020521507.tif 000013
2020521507.tif 000014
【図１】
2020521507.tif 000015
【図２】
2020521507.tif 000016
【図３】
2020521507.tif 000017
【図４】
2020521507.tif 000018
【図５】
2020521507.tif 000019
【図６】
2020521507.tif 000020
【図７】
2020521507.tif 000021
【図８Ａ】
2020521507.tif 000022
【図８Ｂ】
2020521507.tif 000023
【図９Ａ】
2020521507.tif 000024
【図９Ｂ】
2020521507.tif 000025
【図１０】
2020521507.tif 000026
【図１１】
2020521507.tif 000027
【図１２】
2020521507.tif 000028
【図１３Ａ】
2020521507.tif 000029
【図１３Ｂ】
2020521507.tif 000030
【図１４Ａ】
2020521507.tif 000031
【図１４Ｂ】
2020521507.tif 000032
【図１５】
2020521507.tif 000033
【図１６Ａ】
2020521507.tif 000034
【図１６Ｂ】
2020521507.tif 000035
【図１６Ｃ】
2020521507.tif 000036
【図１７Ａ】
2020521507.tif 000037
【図１７Ｂ】
2020521507.tif 000038
【図１８Ａ】
2020521507.tif 000039
【図１８Ｂ】
2020521507.tif 000040
【図１８Ｃ】
2020521507.tif 000041
【図１９】
2020521507.tif 000042
【図２０】
2020521507.tif 000043
【図２１】
2020521507.tif 000044
【図２２Ａ】
2020521507.tif 000045
【図２２Ｂ】
2020521507.tif 000046
【図２２Ｃ】
2020521507.tif 000047
【図２２Ｄ】
2020521507.tif 000048
【国際調査報告】
2020521507.tif 000049
2020521507.tif 000050