(57)【要約】  本明細書において、細胞培養、ならびに、２Ｄコーティング培養、３Ｄ細胞培養、および注入を含む生物医学的応用のためのジェランガムヒドロゲルの調製および応用が記載される。そのような応用のためのジェランガム材料には、水溶性低アシルジェランガム、高アシルジェランガム、修飾ジェランガム、およびジェランガム混合物と他の化学分子／生体分子との混合物が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上の水溶性高アシルジェランガムポリマーと、
１種以上の水溶性低アシルジェランガムポリマーと、
１種以上の水溶性化学修飾ジェランガムポリマーまたは１種以上のペプチド修飾ジェランガムポリマーと、を含む、多糖ヒドロゲルのための組成物。
【請求項２】
形成された前記多糖ヒドロゲルが注入用途に適したソフトゲルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多糖類ヒドロゲルをせん断力によって液体状態に変換させるか、または前記せん断力が一旦停止するとそのヒドロゲル状態を回復させることによって、前記ソフトゲルが、せん断減粘および自己修復レオロジー特性を示す、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記せん断力が、ピペット操作、シリンジ注入、もしくはポンプ灌流、またはこれらの組み合わせによって働く、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
形成された前記多糖ヒドロゲルがハードゲルである、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ハードゲルがピペット操作またはせん断により破壊されると、前記ハードゲルがより小さなゲル粒子に分解し、そして１種以上の生物活性分子についての親和性を有するようなレオロジー特性を有する３−Ｄゲル構造を前記ハードゲルが示す、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ハードゲルが、約１０Ｐａよりも大きい貯蔵弾性率値を有する、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記ハードゲルが約８０℃以下の温度でそのゲル形成を維持するが、外力で乱された場合にはより小さなゲル粒子に分解することが可能である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
前記１種以上の化学修飾ジェランガムポリマーが、
ａ）天然または合成由来のポリマー、化学修飾ポリマーまたはコポリマー、ヒアルロン酸塩、キトサン、コラーゲン、ポリエチレングリコール抗凝固剤、造影剤、化学療法剤、およびシグナル伝達経路分子からなる群より選択される有機分子、ならびに
ｂ）生物活性ガラス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムおよび鉄からなる群より選択される無機分子、からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記１種以上の生物活性分子が、加熱前にジェランガム溶液に加えられ、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、成長因子、成長ホルモン、抗体、酵素、細胞受容体、細胞リガンド、抗生物質、抗微生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＲＥＤＶ、ＹＩＧＳＲＹ、ポリリジンを含む、ＮＨ２基、ＣＯＯＨおよびＣＯＮＨ２基を有する機能性ペプチド分子からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ソフトゲルは、余分なリン酸緩衝液、細胞培養培地、もしくはイオン溶液、またはそれらの組み合わせの水溶液に前記ソフトゲルを浸すことにより、ハードゲルに変換される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１２】
１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、前記多糖ヒドロゲル系に接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、前記多糖ヒドロゲルに懸濁または捕捉されている、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記１種以上の生物活性分子が、前記１種以上の生物活性分子の生物活性を維持しながら、前記多糖ヒドロゲルに接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉されている、請求項５に記載の組成物。
【請求項１５】
前記１種以上の生物活性分子が、前記１種以上の生物活性分子の生物活性を維持しながら、前記多糖ヒドロゲルに懸濁または捕捉されている、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
ペプチドによって修飾されたジェランガムの溶液は、混合物としての前記ジェランガム溶液にペプチドを加え、次いで約１００℃以上の温度および約１ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの圧力で、約３〜約３０分の時間の間加熱することによって形成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物は、約０．００１％〜約２０％の前記１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の前記１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の前記１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、約０．００００１％〜約３０％の前記１種以上の生物活性分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が約１０Ｐａの貯蔵弾性率値を有する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、約０．０１％〜約１０％の前記１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約１０％の前記１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約１０％の前記１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、約０．００１％〜約２０％の前記１種以上の生物活性分子をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が約１０〜約２００００Ｐａの貯蔵弾性率値を有する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載の多糖ヒドロゲルを形成するための方法であって、
水溶性ジェランガムポリマーを、約４℃〜約９９℃の範囲の温度で０．００１％ｗ／ｖより高い固形分を含む水ベースの溶媒に溶解する工程と、
前記溶液を約１００℃以上の温度および約１ｐｓｉ以上の圧力で３分間以上加熱する工程と、
溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、細胞培養培地またはイオン溶液と直接混合して前記多糖ヒドロゲルの形成をトリガーすることによって、約４℃〜約６０℃の範囲の温度で網状化させる工程であって、
前記多糖ヒドロゲルの貯蔵弾性率（Ｇ’）は混合の際に増加し、３０分間以内に約１０Ｐａを超え、その結果、前記系が３Ｄ増殖のためにそのヒドロゲルマトリックス内に懸濁した生物活性分子を維持する、網状化させる工程と、
化学物質または生物活性分子が、形成された前記多糖ヒドロゲルに接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉されるように、前記化学物質または生物活性分子を加える工程と、を含む、方法。
【請求項２２】
前記水ベースの溶媒が、水、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、生理食塩水、および細胞培養培地を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記固形分が約０．００１％（ｗ／ｖ）〜１０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記溶液と約０．０１％（ｗ／ｖ）以上のイオン濃度のトリガー溶液とが約１００：１〜約１：１の比率範囲で混合されると、ソフトヒドロゲルが形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記溶液と約０．０１％（ｗ／ｖ）の高イオン濃度のトリガー溶液とが約１：１〜約１：１００の比率範囲で混合されると、ハードヒドロゲルが形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記溶液と約０．０１％（ｗ／ｖ）の通常のイオン濃度のトリガー溶液とが約１：１〜約１：２０の比率範囲で混合されると、ハードヒドロゲルが形成される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記溶液が、網状化の前に、約１００℃〜約１３２℃、好ましくは約１００℃〜約１２１℃の範囲の温度に加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶液が、網状化の前に、約１ｐｓｉ〜約２５ｐｓｉの範囲の圧力下で加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記溶液が、網状化の前に、約１ｐｓｉ〜約１５ｐｓｉの範囲の圧力下で加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶液が、網状化の前に、約１分〜約３０分間加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
前記溶液が、網状化の前に、約５分〜約２０分間加熱される、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
前記形成されたソフトゲルが、細胞培養培地の水溶液またはイオン溶液に浸されることにより、ハードゲル系に変換される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項３３】
請求項１１に記載の方法により形成され相互変換されたヒドロゲル系であって、前記生物活性分子は、前記ジェランガム溶液またはトリガー溶液と混合することにより、ヒドロゲル形成の前もしくは後、またはヒドロゲルと周囲の培地との交換の前もしくは後に前記ヒドロゲル系に加えることができる、ヒドロゲル系。
【請求項３４】
請求項１に記載の組成物に由来する、多糖ヒドロゲルの使用であって、細胞生存率アッセイ、生死アッセイ、ハイスループットスクリーニング、蛍光染色および画像化、組織学的分析、ならびに３Ｄバイオプリンティングを含む、創薬および生物医学的応用向けの汎用プラットフォームとしての、使用。
【請求項３５】
生細胞が、前記ヒドロゲルの上部で増殖するか、または前記ヒドロゲルに埋め込まれ、カプセル化され、そして前記ヒドロゲルを破壊すること、およびＤＩ水または低イオン濃度溶液で前記ヒドロゲルを溶解することによって、ヒドロゲル系から回収される、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記ヒドロゲル中でのインビトロ３Ｄ細胞培養のための２段階手順が提供され、前記手順は、
１）生細胞が、前記ヒドロゲルの形成前にジェランガム溶液または細胞培養培地などのトリガー溶液と混合され、前記細胞は前記ソフトヒドロゲル内で均質に懸濁され、ピペット操作または注入により個々の細胞培養プレートまたは様々な容器に移す準備ができていることと、
２）一旦、前記ソフトゲルを最終容器に配置したら、追加のトリガー溶液を前記ソフトゲルの上部に加えるか、または前記ソフトゲルを囲んで、前記ソフトゲルを前記ハードヒドロゲルに変換し、前記３Ｄマトリックス構造がさらに安定化され、栄養または他の生体分子が前記ヒドロゲル系に加えられ、前記ヒドロゲルと周囲の培地との間で交換されることと、を含む、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
２Ｄヒドロゲルコーティング細胞培養研究のための請求項３４に記載の使用であって、前記ソフトヒドロゲルが前記培養プレートの表面に直接加えられて、前記細胞培養プレートをコーティングし、そして、生細胞をヒドロゲルの上部に加えて、２Ｄで増殖させることができ、一部の細胞は、上部からヒドロゲルに浸透し、３Ｄ構造として増殖できる、使用。
【請求項３８】
前記水溶性ジェランガムポリマーにクエン酸ナトリウムを加えて、ジェランガムポリマー溶液を形成する工程と、
前記ジェランガムポリマー溶液のｐＨを中性ｐＨに調整する工程と、をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３９】
前記ソフトヒドロゲルが、注入に適した繊維構造を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ハードヒドロゲルが凝集構造を含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本願は、２０１７年４月１０日に出願された米国特許出願第６２／４８３，８３１号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の実施形態の分野は、細胞培養および様々な他の生物医学的応用のためのヒドロゲルの使用に関する。より具体的には、本発明の実施形態は、２Ｄコーティング培養、３Ｄ細胞培養、および注入を含むがこれらに限定されない、細胞培養および生物医学的応用のためのジェランガムヒドロゲルの調製および応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
相互作用する多くのさまざまな細胞型の生体系の複雑な挙動を予測するための、そして情報をもたらすかまたは有用である研究のために組織の解剖学または生理学を再現するための、２Ｄ細胞培養の能力の不足に気づいている人々が増加しつつある。３Ｄ細胞培養モデルは、生体内の細胞が経験する自然環境のより正確な表現であり、これは、より現実的な生化学的応答および生理学的応答との細胞間相互作用を可能にする。３Ｄ細胞培養において、細胞は、温度の変化、ｐＨ、栄養吸収、輸送、および分化など、内部および外部の刺激に対して、それらが生体内でするのにより類似して、挙動しおよび応答する。したがって、科学者は、薬物スクリーニング、組織工学、前臨床研究、細胞療法、および基本的な細胞生物学研究の分野において、２Ｄ細胞培養から３Ｄ細胞培養に焦点を移している。
【０００４】
生体内の細胞増殖条件を模倣するために、３Ｄ足場の網状構造は、直列化され、高含水量を有し、そして正確な３Ｄ空間サポート、適切な機械的強度、酸素、栄養素、廃棄物、および可溶性因子の容易な輸送などの他の多くの望ましい特性を持たせる必要がある。細胞のカプセル化と単離の両方の間に細胞が快適に生き残ることを保証するために、ゾルゲル変換のための穏やかでかつ細胞適合性の条件が好ましい。さらに、３Ｄ細胞培養のために使用される生体材料の注入可能な特性は、癌治療（創薬のための電子写真研究）、組織再生、３Ｄバイオプリンティングなどの下流応用のために決定的に重要である。
【０００５】
現在市販されている３Ｄ細胞培養用の材料は、ヒドロゲル、ポリマーマトリックス、ハンギングドロッププレート、低粘着性プレート、微細パターン表面、および磁気浮上として分類できる。ヒドロゲル足場は、３Ｄ細胞培養を促進する上で、これまでで最も有望なアプローチとして実証されている。しかし、３Ｄ細胞培養用のためのほとんどの既存の生体材料（ヒドロゲル足場を含む）は、生理学的条件（例えば、乏しい足場構造、望ましくない成長因子、およびプレゲル溶液の望ましくないｐＨまたは温度）、細胞のカプセル化のための複雑な操作工程、培養足場からの細胞単離の困難さ、および生成物の再現性に制限されている。加えて、現在市販されているヒドロゲル材料においては、せん断減粘や物理的強度の急速な回復などの注入可能な特性は非常にまれである。この欠点は、これらの３Ｄ細胞培養技術から生成されたデータに影響するだけでなく、下流分析のためのこの技術の応用および臨床応用もまた制限する。
【０００６】
関連技術の例を以下に記載する。
米国特許出願第２００８／０２２０５２６号は、細胞培養表面のためのコーティングに関する。より詳細には、本発明は、天然由来のゴム、植物ゴム、ガラクトマンナンゴムまたはそれらの誘導体を含む、ゴムに由来するかまたはゴムを含有する細胞培養表面のためのコーティングに関する。本発明はまた、そのようなコーティングを有する製造品（例えば、細胞培養容器および実験器具）、これらのコーティングを細胞培養表面に適用する方法、およびコーティングされた細胞培養容器を使用する方法に関する。
【０００７】
米国特許第９，５７９，４１７号は、表現型を維持し、生存可能でありかつ増殖性のままでありながら、材料内に広がる付着細胞を閉じ込め／カプセル化することが可能である、細胞接着性ジェランガムスポンジ様ヒドロゲルに関する。これらの材料を取得するために使用される方法論には、ヒドロゲルの調製、凍結、凍結乾燥、ならびに、細胞を含み、および生理活性分子を含むか／含まない生理食塩水を用いる再水和が含まれる。他のヒドロゲルのために使用されるような、細胞接着の特徴を伴うスポンジ様ヒドロゲルのプレ機能化および／またはポスト機能化は使用されない。ヒドロゲルにおいては観察されないこれらの材料の細胞接着特性は、前駆体ヒドロゲルとは似ていない、スポンジとヒドロゲルの間の物理的特性によって部分的に説明される。主に異なる物理的特性は、形態、微細構造、含水量、および機械的性能である。スポンジ様ヒドロゲルの形成に関与するパラメーターを操作することにより、ジェランガムのスポンジ様ヒドロゲルの物理的特性および生物学的性能を調整できる。生理活性分子は、スポンジ様ヒドロゲルの生物学的性能を修飾するために、細胞がある場合でもない場合でも、取り込むこともできる。これらの材料は、生体工学、組織工学、再生医療、および生物医学応用の状況において適用することができる。
【０００８】
中国特許出願第１０６４７４５６０号は、生物学的材料の技術分野に関し、ヒドロゲル材料の３Ｄ生物学的プリンティング、ならびにその調製方法および応用を開示している。本発明のヒドロゲル材料は、以下の質量パーセント成分を含む：０．５〜１０％を形成するためのヒドロゲル材料および／またはその誘導体、ＰＥＧおよび／またはその誘導体０．１〜２０％、架橋開始剤０〜１％、生物活性成分０〜１５％、残りの溶媒。本発明は、相互浸透二重ネットワーク構造を形成する生理学的環境である、ヒドロゲル材料およびＰＥＧ二重ネットワークヒドロゲルの形態に基づいており、これは、より良好な構造およびサイズ安定性、生理学的条件下での高速ゲル、良好な生体適合性を有する細胞、免疫拒絶が少ないこと、細胞のカプセル化率が高いこと、機械的強度が制御可能であること、生分解性であることなどを有する。そして、生物学的プリンティングの３Ｄに適用されたものは、遅い硬化速度を克服し、硬化条件は厳しく、機械的特性は制限され、細胞の適合性は乏しく、明らかな利点と良好な工業化の見通しがある。
【０００９】
ＰＣＴ特許出願第ＷＯ２０１４０２５３１２号は、その上に付着され、および／またはその中に封入された１種以上の生細胞を含む、ヒドロゲル微粒子の製造方法に関するが提供される。本発明の方法は、ヒドロゲル形成剤を水性媒体に溶解して溶液を形成すること、溶液中に１種以上の生細胞を懸濁して細胞懸濁液を形成すること、細胞懸濁液を有機油に分散させてマイクロエマルジョンを形成すること、およびそのマイクロエマルジョンを、ヒドロゲル形成剤が、その上に付着され、および／またはその中に封入された１種以上の生細胞を含むヒドロゲル微粒子を形成することを可能にする条件に供することを含む。分解性ヒドロゲルと、１種以上の生細胞を有する少なくとも１種のヒドロゲル微粒子との混合物を含む組成物、および組織工学のための足場の製造方法もまた提供される。
【００１０】
ＰＣＴ特許出願第２０１４０１７５１３号は、細胞および／または組織を培養するための方法に関し、この方法は、培養培地組成物を使用して細胞および／または組織を浮遊状態で培養することによって特徴付けられ、アモルファス構造は液体培養培地中で形成され、溶液中に均一に分散され、溶液の粘度を実質的に増加させることなく細胞および／または組織を実質的に保持し、その結果、培地組成組成物が構造物沈降を防ぐ効果、およびその他の効果を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述の技術はいずれも、本発明の実施形態によって対処される問題のすべてに対処するものではない。２Ｄコーティング培養、３Ｄ細胞培養、および注入を含むがこれらに限定されない、細胞培養およびさまざまな生物医学的応用に適したジェランガムヒドロゲル系を調製するための組成物および方法を見出すための満たされていない必要性が明確に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の実施形態の１つにおいて、１種以上の水溶性高アシルジェランガムポリマーと、１種以上の水溶性低アシルジェランガムポリマーと、１種以上の水溶性化学修飾ジェランガムポリマーとを有する多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が存在する。
【００１３】
少なくとも一実施形態において、クエン酸ナトリウムがジェランガムポリマー溶液に加えられ、ジェランガムポリマー溶液のｐＨは中性ｐＨ（およそ６〜８のｐＨ）に調整される。
【００１４】
少なくとも一実施形態において、ジェランガムの乾燥粉末は、１）２−プロパノールの追加および一晩乾燥、または２）凍結乾燥によって調製される。
【００１５】
少なくとも一実施形態において、ジェランガムは、室温で水または水性溶液に溶解される。
【００１６】
本発明の別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、形成される多糖ヒドロゲルは、注入用途のために適したソフトゲルであり、そこに生物活性分子をさらに加えることができ、ヒドロゲル中にカプセル化でき、そして使用のために異なる位置に送達できる。
【００１７】
一実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、多糖類ヒドロゲルをせん断力によって液体状態に変換させるか、またはせん断力が一旦停止すると、そのヒドロゲル状態を回復させることによって、ソフトゲルが、せん断減粘および自己修復レオロジー特性を示し、さらにゲルゾル状態は多数回変換することができる。
【００１８】
別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、せん断力は、ピペット操作、シリンジ注入、またはポンプ灌流によって発揮される。
【００１９】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、形成された多糖がハードゲルであり、そこに生体活性分子をさらに加えることができ、ヒドロゲル中にカプセル化できる。
【００２０】
一実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、ハードゲルが、ピペット操作または注入（せん断）により破壊され、ハードゲルがより小さなゲル粒子に分解し、そして生物活性分子についての親和性を有し、そして生物活性分子によって修飾できるようなレオロジー特性を有する３−Ｄゲル構造を示す。
【００２１】
本発明の実施形態の別の態様において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、ヒドロゲルは、約１０Ｐａを超える貯蔵弾性率の値を有する。
【００２２】
別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、ハードゲルが約８０℃以下の温度でそのゲル形成をインタクトに維持するが、外力で乱された場合には小さなゲル粒子に分解することができる。
【００２３】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の化学分子は、ａ）天然または合成由来のポリマー、化学修飾ポリマーまたはコポリマー、ポリペプチド、ヒアルロン酸塩、キトサン、コラーゲン、ポリエチレングリコール抗凝固剤、造影剤、化学療法剤、およびシグナル伝達経路分子からなる群より選択される有機分子、ならびに、ｂ）生物活性ガラス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムおよび鉄からなる群より選択される無機分子、からなる群より選択される。
【００２４】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物を調製するための組成物が提供され、ジェランガム溶液に加えることができる１種以上の生物活性分子が、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、成長因子、成長ホルモン、抗体、酵素、細胞受容体、細胞リガンド、抗生物質、抗微生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＲＥＤＶ、ＹＩＧＳＲＹ、ポリリジンを含む、ＮＨ２基、ＣＯＯＨ基およびＣＯＮＨ２基を有する機能性ペプチド分子からなる群より選択される。
【００２５】
本発明のなお別の実施形態において、混合物としてのジェランガム溶液にペプチドを加えて、次いで約１００℃以上の温度および約１ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの圧力で、より好ましくは約１ｐｓｉ〜約３０ｐｓｉの圧力で、約３〜約３０分、より好ましくは約５〜約２０分の時間の間加熱することによる、生物活性分子修飾（例えば、ペプチド修飾）ジェランガム溶液を調製するための方法が提供される。このような生物活性分子修飾ジェランガム溶液は、細胞培養培地と混合されることによって、多糖ヒドロゲルを形成するために使用できる。
【００２６】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、ソフトゲルは、余分なリン酸緩衝液、細胞培養培地、もしくはイオン溶液、またはそれらの組み合わせの水溶液に浸されることにより、またはそれに加えることにより、ハードゲルに変換される。
【００２７】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、多糖ヒドロゲル系に接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉されている。
【００２８】
本発明の別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、多糖ヒドロゲルに懸濁または捕捉されている。
【００２９】
本発明の別の実施形態において、ハード多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、多糖ヒドロゲル系に接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉されている。
【００３０】
本発明のなお別の実施形態において、ハード多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の生物活性分子が、それらの生物活性を維持しながら、多糖ヒドロゲルに懸濁または捕捉されている。
【００３１】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、１種以上の低アシルジェランガムポリマーは、繰り返しごとに約１〜４グリセリン酸および２回の繰り返しごとに１〜４酢酸のアシル化度の範囲を有する。
【００３２】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、組成物は、約０．００１％〜約２０％の１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、約０．００００１％〜約３０％の１種以上の生物活性分子をさらに含む。
【００３３】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、組成物が約１０Ｐａより高い貯蔵弾性率値を有する。
【００３４】
本発明の別の実施形態において、ハードヒドロゲル系は、約１００℃以下の温度においてそのゲル形成を維持することができる。
【００３５】
本発明のなお別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、組成物は、約０．０１％〜約５％の１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約５％の１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約５％の１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、約０．００１％〜約１０％の１種以上の生物活性分子をさらに含む。
【００３６】
本発明の一実施形態において、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、組成物が１０〜約２００００Ｐａの貯蔵弾性率値を有する。
【００３７】
本発明の別の実施形態において、ハードゲル系は約８０℃以下の温度でそのヒドロゲル形成を維持できる。
【００３８】
本発明のなお別の実施形態において、水溶性ジェランガムポリマーを、約４℃〜約８０℃の範囲の温度で０．００１％ｗ／ｖより高い固形分を有する水ベースの溶媒に溶解する工程と、溶液を約１００℃以上の温度および約１〜１０ｐｓｉ以上の圧力で３分間以上加熱する工程と、溶液を、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、細胞培養培地またはイオン溶液と直接混合して全体の混合物をヒドロゲル系に変換するようにトリガーすることによって、約４℃〜約５０℃の範囲の温度で網状化させる工程であって、系の貯蔵弾性率（Ｇ’）は混合の際に増加し、３０分間以内に１０Ｐａを超え、その結果、系が３Ｄ増殖のためにそのヒドロゲルマトリックス内に懸濁した生物活性分子を維持することができる、網状化させる工程と、化学物質または生物活性分子が、形成された多糖ヒドロゲルに接触、付着、懸濁、埋め込み、または捕捉できるように、化学物質または生物活性分子を加える工程と、を含む、多糖ヒドロゲルを形成するための方法が提供される。
【００３９】
本発明の一実施形態において、多糖ヒドロゲルを形成するための方法が提供され、水ベースの溶媒は、水、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、生理食塩水、細胞培養培地、イオン溶液、アルブミン、血清、およびキシログルカンを含む。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、多糖ヒドロゲルを形成するための方法が提供され、固形分は約０．００１％（ｗ／ｖ）〜５０％（ｗ／ｖ）の範囲の量で使用される。
【００４１】
本発明のなお別の実施形態において、ソフト多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、形成されたソフトゲル系は、１０ｍｇ／Ｌ以上のイオン濃度の追加のトリガー溶液をソフトヒドロゲル系に加えることにより、ハードゲル系に変換される。
【００４２】
本発明の別の実施形態において、ソフト多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、形成されたソフトゲルは、細胞培養培地の水溶液またはイオン溶液に浸されることにより、ハードゲル系に変換される。
【００４３】
本発明の一実施形態において、ソフト多糖ヒドロゲルを調製するための組成物が提供され、これは、上述の変換方法を使用することによってハードヒドロゲルに変換され、生物活性分子は、ジェランガム溶液またはトリガー溶液と混合することにより、ヒドロゲル形成の前後またはヒドロゲルと周囲の培地の交換の前後にヒドロゲル系に加えることができる。
【００４４】
本発明のなお別の実施形態において、細胞生存率アッセイ、生死アッセイ、ハイスループットスクリーニング、蛍光染色および画像化、組織学的分析、および３Ｄバイオプリンティングを含む、創薬および生物医学的応用向けの汎用プラットフォームとしての、上述の組成物に由来する、多糖ヒドロゲルの使用が提供される。
【００４５】
本発明の一実施形態において、上述の組成物に由来する、多糖ヒドロゲルの使用が提供され、生細胞は、ヒドロゲルの上部で増殖するか、またはヒドロゲルに埋め込まれ、カプセル化され、そしてヒドロゲルを破壊すること、およびＤＩ水または低イオン濃度溶液でヒドロゲルを溶解することによって、ヒドロゲル系から回収される
【００４６】
本発明の別の実施形態において、上述の組成物に由来する、多糖ヒドロゲルの使用が提供され、ヒドロゲル中でのインビトロ３Ｄ細胞培養のための便利な２段階手順が提供され、手順は、１）生細胞が、ヒドロゲル形成前に多糖溶液または細胞培養培地などのトリガー溶液と混合することができることを包含する。細胞はソフトヒドロゲルに均質に懸濁され、ピペット操作または注入により個々の細胞培養プレートまたは様々な容器に移す準備ができており；および２）一旦、ソフトゲル（細胞を伴う）を最終容器に配置したら、追加のトリガー溶液をソフトゲルの上部に加えるか、またはソフトゲルを囲んで、ソフトゲルをハードヒドロゲルに変換することができ、３Ｄマトリックス構造はさらに安定化され、栄養または他の生体分子をヒドロゲル系に加えることができ、ヒドロゲルと周囲の培地との間で交換される。
【００４７】
本発明のなお別の実施形態において、２Ｄヒドロゲルコーティング細胞培養のための、上述の組成物に由来する多糖ヒドロゲルの使用が提供され、ソフトヒドロゲルは培養プレートの表面に直接加えられて、細胞培養プレートをコーティングし、次いで、生細胞をヒドロゲルの上部に加えて、２Ｄで増殖させることができ、一部の細胞は、上部からヒドロゲルに浸透し、３Ｄ構造として増殖できる。
【００４８】
本発明の目的は、細胞培養、ならびに、２Ｄコーティング培養、３Ｄ細胞培養、および注入を含むがこれらに限定されない、様々な生物医学的応用のために適している、ジェランガムヒドロゲル系を調製するための組成物および方法を提供する。そのような応用のためのジェランガム材料には、水溶性低アシルジェランガム、高アシルジェランガム、修飾ジェランガム、およびジェランガム混合物と他の化学分子／生体分子との混合物が含まれる。生体分子は、ヒドロゲル形成およびヒドロゲルと周囲の培地の交換の前後にヒドロゲル系に加えることができる。細胞は、ジェランガム溶液またはトリガー溶液との混合によるヒドロゲル形成前またはその間に、ヒドロゲル系に加えることができる。細胞は、ヒドロゲルの上部で増殖でき、または細胞コロニーなどの３Ｄ構造のためにカプセル化して増殖できる。細胞は、ヒドロゲルを破壊すること、およびＤＩ水または低イオン濃度溶液でヒドロゲルを溶解することによって、ヒドロゲルから回収できる。このようなヒドロゲル系は、創薬、３Ｄバイオプリンティング、ハイスループットスクリーニング、および医学デバイスのための汎用プラットフォームを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の実施形態のソフトヒドロゲルおよびハードヒドロゲルの特性を詳述する図である。
【図２】本発明の実施形態のソフトヒドロゲルおよびハードヒドロゲルの形成を詳述する図である。
【図３】異なる混合比率でのヒドロゲル形成のレオロジーデータを例解するグラフである。
【図４】本発明の実施形態のヒドロゲル中のベータＴＣ３細胞およびＩｎｓ−１細胞の３Ｄ細胞培養の画像を例解する。
【図５】本発明の実施形態のヒドロゲル中のＢＬ５細胞の２Ｄ細胞培養の画像を例解する。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ジェランガムは、細菌Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ（以前のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｄｅａ）によって産生される水溶性の陰イオン性莢膜多糖類である。ジェランを産生する細菌は、１９７８年に米国ペンシルベニア州の天然池のユリ植物組織からＭｅｒｃｋ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｃ．の旧Ｋｅｌｃｏ部門によって発見および分離された。これは、最初は、様々な微生物の増殖のために固体培養培地中の寒天を置き換えるために、著しく低い使用レベルでの代替ゲル化剤として同定された。（Ｋａｎｇ  Ｋ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｇａｒ−ｌｉｋｅ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂａｓｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ＆  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９８２  ４３：１０８６−１０９１）。「ＧＥＬＲＩＴＥ」という商標を有する最初のジェランガムの市販製品は、その後、様々な臨床細菌培地のゲル化剤として適切な寒天代替物として同定された。（Ｓｈｕｎｇｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，ＧＥＬＲＩＴＥ  ａｓ  ａｎ  Ａｇａｒ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ，  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８３  ４６（４）：８４０−５）。食品添加物としては、ジェランガムは日本で最初に食品用途のために承認された（１９８８）。その後、ジェランガムは、米国、カナダ、中国、韓国、欧州連合など、他の多くの国々で食品、非食品、化粧品、および医薬品の用途のために承認されている。これは、増粘剤、乳化剤、安定剤として広く使用されている。
【００５１】
ジェランガムは、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓの適切な菌株を容易に入手可能な炭水化物源を用いて発酵させることにより製造される。ジェランガムの構成糖は、モル比２：１：１のグルコース、グルクロン酸およびラムノースである。これらは一緒に結合されて、直鎖四糖繰り返し単位を含む一次構造を与える（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１２４，ｐ．１２３，１９８３；Ｊａｎｓｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．１２４，ｐ．１３５，１９８３）。天然または高アシル型のジェランガムにおいて、２つのアシル置換基、酢酸およびグリセリン酸が存在する。両方の置換基は同じグルコース残基上に位置し、平均して、繰り返し単位ごとに１つのグリセリン酸と２つの繰り返し単位ごとに１つの酢酸が存在する。低アシル型のジェランガムにおいては、アシル基が除去されて、そのような基を実質的に欠いている直鎖繰り返し単位が産生する。ガムの脱アシル化は、通常、発酵ブロスをアルカリで処理することにより行われる。
【００５２】
以下の表１に、様々なレベルのアシル（Ａ−高アシルジェランガム）、無／低アシルジェランガム（Ｂ）、またはメタクリル化ジェランガムなどの化学修飾ジェランガム（Ｃ）とのジェランガム（５×１０４Ｄａ〜２×１０６Ｄａの範囲の分子量の）を示す。
【表１】
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【００５３】
高アシル型のジェランガムは、ガム濃度が臨界濃度よりも高い場合、ゲル形成のためのいかなる物質の追加も必要としない。高アシルジェランガムは、その溶液が設定温度よりも下に冷却されると、柔らかく、弾力性のある、もろくないゲルを産生する。高アシルジェランガムゲルは、熱で柔らかくなり、設定温度に近い温度で融解する。低アシルジェランガムポリマーは、典型的には、繰り返しごとに約１〜２グリセレン酸および２回の繰り返しごとに１〜２酢酸の範囲のアシル化度を有する。低アシル型ジェランガムは、一般に、ゲル形成のために塩または酸などのゲル化剤を必要とする。例えば、低アシルジェランガムは、ゲル化促進陽イオン、好ましくはカルシウムやマグネシウムなどの二価陽イオンの存在下で冷却すると、硬くて弾力のないもろいゲルを形成する。
【００５４】
一般的に、上記のジェランガムは、０℃を超える温度で、０．００１％ｗ／ｖ〜１０％ｗ／ｖの濃度で水に溶解できるが、一方、すべてのタイプのジェランガムは８０℃より高い温度で水に完全に溶解できる。このように形成されたジェランガム水溶液は、溶解後または０℃より高い温度および約４〜１０のｐＨの加熱冷却サークル後に液体形態で維持することができる。
【００５５】
上記のジェランガムは、カルボキシル部分の位置（すなわち、下図の赤丸のＣＯＯ基）で、官能基を有するペプチドまたは分子と共有結合を通して修飾できる。このような修飾は、ジェランガムとペプチド／分子混合溶液を、高圧（１５ｐｓｉなど）で１２１℃以上の温度に３分間以上加熱することによって実行できる。加えて、前述のジェランガム溶液はまた、機能的なペプチドまたは分子と、共有結合を伴うことなく、混合することもできる。
【００５６】
本発明は、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物を提供し、ジェランガムを修飾する１種以上の化学分子は、ａ）天然または合成起源のポリマー、化学修飾ポリマーまたはコポリマー、ポリペプチド、ヒアルロン酸、キトサン、コラーゲン、ポリエチレングリコール抗凝固剤、造影剤、化学療法剤、およびシグナル伝達経路分子；ならびにｂ）生物活性ガラス、ヒドロキシアパタイト、リン酸カルシウムおよび鉄からなる群から選択される無機分子、からなる群から選択される。
【００５７】
本発明の一実施形態によれば、上記のような、水溶性低アシルジェランガム、高アシルジェランガム、修飾ジェランガム、およびジェランガム混合物と他の化学分子／生物学的分子とのジェランガムの混合物は、細胞培養およびその他の生物医学応用のためのジェランガムのそのような応用のために適しているジェランガムの選択されたグループは、室温で水に溶解できるか、室温で液体型に溶解した状態を維持でき、中性ｐＨ（ｐＨ４〜１０）を実行でき、周囲の温度が冷蔵庫の温度以上になると液体または半ゲル状態を維持できる。ジェランガム溶液は、より高い濃度を達成するために、０．００１〜１０％の様々な濃度の固形物含有または化学修飾（例、メタクリレート）を有することができる。
【００５８】
ジェランガム溶液の調製方法は、固形分が約０．００１％ｗ／ｖ〜１０％（ｗ／ｖ）の水ベースの溶液にジェランガムを溶解し、１ｐｓｉ〜約４０ｐｓｉの範囲の圧力、好ましくは約１ｐｓｉから約３０ｐｓｉの範囲の圧力で、約３〜約３０分間、好ましくは約５分〜約２０分の時間、溶液を約１００℃〜約１５０℃、好ましくは約１００℃〜約１２１℃の範囲の温度に加熱することを包含する。このような調製方法はまた、生物学的分子修飾ジェランガム溶液の調製にも適用される。このような生体分子は、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、成長因子、成長ホルモン、抗体、酵素、細胞受容体、細胞リガンド、抗生物質、抗微生物剤、抗菌剤、抗真菌剤、アルブミン、血清、ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶ、ＲＥＤＶ、ＹＩＧＳＲＹ、ポリリジンを含むＮＨ２、ＣＯＯＨおよびＣＯＮＨ２基を有する機能性ペプチド分子からなる群から選択される。このような調製方法において使用される水性溶媒は、水、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）、生理食塩水、細胞培養培地、イオン溶液、アルブミン、血清およびキシログルカンを含む。
【００５９】
本発明は、多糖ヒドロゲルを調製するための組成物を提供し、組成物は、約０．００１％〜約２０％の１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．００１％〜約２０％の１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、約０．００００１％〜約３０％の１種以上の生物活性分子をさらに含む。
【００６０】
好ましい実施形態において、組成物は、約０．０１％〜約５％の１種以上の高アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約５％の１種以上の低アシルジェランガムポリマー、約０．０１％〜約５％の１種以上の修飾ジェランガムポリマーを含み、さらに約０．００１％〜約１０％の１種以上の生物活性分子を含む。
【００６１】
ジェランガム溶液は、水ベースの溶媒と直接混合することにより、ヒドロゲルにトリガーでき、この溶媒には、約４℃〜約６０℃の範囲の温度のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）、細胞培養培地またはイオン溶液が含まれるがこれらに限定されない。系の貯蔵弾性率（Ｇ’）は混合時に増加し、３０分以内に約１０Ｐａを超え、好ましい実施形態において、系の貯蔵弾性率（Ｇ’）は約１０〜２００００Ｐａを超え、このことは、系が、３Ｄ増殖のためにそのヒドロゲルマトリックス内で細胞を懸濁するために十分により強いことを示す。このヒドロゲル形成のために使用するトリガー溶液は、血清、緩衝液、純粋な一価、二価または多価カチオンまたはその混合物を有するイオン溶液、または上記溶液の混合物を含むまたは含まない任意のタイプの細胞培養培地であり得る。
【００６２】
ここで図１および２を参照すると、ヒドロゲルを形成する溶液の混合比率およびイオン濃度に応じて、異なるレオロジー特性を有する２種類のヒドロゲルを形成することができる。ジェランガム溶液とトリガー溶液を１００：１〜１：１の比率で混合すると、繊維構造を含むソフトヒドロゲルが形成できる。好ましくは、混合比率は４：１〜１：１である。ソフトヒドロゲルはせん断減粘と自己修復レオロジー特性を備えているため、せん断力（ピペット操作、シリンジ注入、ポンプ灌流など）によりヒドロゲルを液体状態に変換できるが、一旦、外力がなくなるとそのヒドロゲル状態が急速に回復する。ゲル−ゾル状態は複数回変換できる。細胞と生体分子をヒドロゲル内に埋め込んで、注入により異なる場所に送達することができる。混合は、典型的には、約４〜約６０℃の温度で、好ましくは室温〜約３７℃で行われる。イオントリガー溶液には、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋などの１種以上の正イオン分子が含まれる。イオン濃度は０．０１％よりも高い。
【００６３】
凝集構造を含むハードヒドロゲルは、ジェランガム溶液とトリガー溶液を１：１〜１：１００の比率で混合するか、トリガー溶液が高イオン濃度を含む場合に形成できます。好ましくは、図３に示されるように、混合比率は１：１〜１：４であり、トリガー溶液は０．０２％ｗ／ｖより高いイオン（例えば、Ｃａ２＋）濃度を有する。好ましい実施形態において、ヒドロゲル形成のための混合範囲は、４：１ｖ／ｖ（１部の細胞培養培地と混合した４部のジェランガム溶液）〜１：４（４部の細胞培養培地と混合した１部のジェランガム溶液）である。ハードヒドロゲルは硬くてもろく、ずり減粘および自己回復性レオロジー特性を有さない。外力で乱されると、ハードヒドロゲルは壊れて小さなゲル粒子になることがある。ハードヒドロゲルは、８０℃の水浴に配置するときにヒドロゲルの形成を維持できる。前述の好ましい実施形態では、形成されたハードヒドロゲルは、８０℃まで高い温度ではそのヒドロゲル形成を維持することができる。
【００６４】
さらに、追加のリン酸緩衝液、細胞培養培地、またはイオン溶液で覆うこと、またはそれらに浸すことなどにより、追加のイオン溶液をヒドロゲル系に加える場合、ソフトゲルをハードゲルに変換できる。一例として、８００μＬの１％ジェランガム溶液を２００μＬのＤＭＥＭ培地と混合すると、ソフトゲルが形成される。ソフトゲルが形成された後、１ｍＬのＤＭＥＭ培地をソフトゲルの上部に加えると、１２時間以内にソフトヒドロゲルがハードヒドロゲルに変換される。
【００６５】
この変換は、このヒドロゲル系でのインビトロ３Ｄ細胞培養のために便利な２工程の手順を提供する。生物活性分子を細胞培養液と直接混合してから、後でヒドロゲルに加えたジェランガム溶液と混合することができる。このような生体分子は、細胞、ペプチド、タンパク質、脂質、多糖類、成長因子、成長ホルモン、抗体、酵素、細胞受容体、血清、細胞リガンド、抗生物質、抗微生物剤、抗菌剤、抗真菌剤などであり得る。
【００６６】
ヒドロゲル形成の前に、生細胞をジェランガム溶液または細胞培養培地などのトリガー溶液と混合することができる。細胞はソフトヒドロゲルに均一に懸濁されており、ピペット操作または注入により個々の良好なプレートまたは様々な容器に移す準備ができている。一旦ソフトゲル（細胞を含む）を最終容器に入れたら、余分なトリガー溶液をソフトゲルの上部に加えるか、またはソフトゲルを囲んで、これをハードヒドロゲルに変換することができる。この手順により、３Ｄマトリックス構造がさらに安定化されるのみならず、栄養または他の生体分子をヒドロゲル系に加え、ヒドロゲルと周囲の培地との間で交換することもまた可能にする。埋め込まれた細胞は３Ｄコロニーとして増殖し、創薬、ハイスループットスクリーニング、または基本的な生物学的研究のために使用できる。同様の手順を使用して、細胞培養プレートまたはデバイスをコーティングすることができ、ソフトゲルを培養プレートの表面に直接加え、次に生細胞をヒドロゲルの上部に加えて２Ｄで増殖させることができる。このタイプの応用は、細胞の移動と浸潤の研究のために使用でき、一部の細胞は、上部からヒドロゲルに浸透し、３Ｄ構造として増殖できる。細胞は、ＤＩ水または低イオン濃度溶液を用いてヒドロゲルを破壊すること、およびヒドロゲルを溶解することにより、ヒドロゲルから回収できる。
【００６７】
機能性ペプチド、タンパク質、成長因子、薬物化合物などの生体分子は、ヒドロゲル形成およびヒドロゲルと周囲の培地の交換の前後にヒドロゲル系に加えることができる。この特性により、この３Ｄ細胞培養ヒドロゲル系は、細胞生存率アッセイ、生死アッセイ、蛍光染色および画像化、ならびに組織学的分析のために適している。さらに、生物活性化合物は、化学修飾によってジェランガム分子に共有結合することもでき、ヒドロゲルマトリックスと細胞間の相互作用を増加できる。
【００６８】
全体として、ヒドロゲルは、３Ｄ細胞培養、２Ｄコーティング、遅延放出、注入、バイオプリンティングなどのための様々な生体活性分子のためのキャリアとして使用できる。
【実施例】
【００６９】
実施例１（図４に示される）：ＤＭＥＭ培地中５×１０５細胞／ｍＬでベータＴＣ３細胞懸濁液を調製する。
１％ｗ／ｖジェランガム溶液を調製する。４：１比率（ｖ／ｖ）でジェランガム溶液を細胞懸濁液と混合する。混合直後にゲル化が開始し、Ｇ’の増加を示す。Ｇ’＞５０ｐａを示すまで、１５分間、ソフトゲルを形成させることができる。ベータＴＣ３細胞は、ヒドロゲル内で懸濁される。その後、ソフトゲルの上部に追加のＤＭＥＭ培地を加え、ヒドロゲルは、Ｇ’の増加を示すことによってさらに安定化される。ハードゲルは、２時間（または一晩）後に形成し、５００Ｐａよりも高いＧ’を示す。ベータＴＣ３細胞は、ヒドロゲル中で増殖でき、３日後に３Ｄコロニーを形成する。
【００７０】
実施例２（図４に示される）：ＲＰＭＩ培地中５×１０５細胞／ｍＬでＩｎｓ−１細胞懸濁液を調製する。
１％ｗ／ｖジェランガム溶液を調製する。１：１比率（ｖ／ｖ）でジェランガム溶液を細胞懸濁液と混合する。混合直後にゲル化が開始し、Ｇ’の増加を示す。Ｇ’＞５０ｐａを示すまで、１５分間、ソフトゲルを形成させることができる。Ｉｎｓ−１細胞は、ヒドロゲル内で懸濁される。その後、ソフトゲルの上部に追加のＲＰＭＩ培地を加え、ヒドロゲルは、Ｇ’の増加を示すことによってさらに安定化される。ハードゲルは、２時間（または一晩）後に形成し、３００Ｐａよりも高いＧ’を示す。Ｉｎｓ−１細胞は、ヒドロゲル中で増殖でき、３日後に３Ｄコロニーを形成する。
【００７１】
本発明の多くの要素は、本発明をこの分野で独特にする。この新規性は、体のサイズとフィットネスレベルの両方の観点から、様々なユーザが適切な運動形態で使用することを可能にする、本発明のほぼすべての態様についての様々なオプションによって例解されている。さらに、本発明の任意のユーザに利用可能である広範囲の運動が存在し、ユーザは、上肢および下肢の筋肉群を同時に使用する運動を行うことができる。
【００７２】
本発明をある程度詳細に説明してきたが、本開示は例解のみのためになされたものであり、部品の構造および配置の詳細における多くの変更は、本発明の技術思想および範囲から逸脱することなく行うことができることが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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