(57)【要約】【課題】  力学的負荷が軽減された腱・靱帯の強度の低下を予防・治療することのできる腱・靱帯の劣化予防・治療剤および劣化予防・治療方法を提供すること。【解決手段】オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を有効成分とする腱・靱帯の劣化予防・治療剤および腱・靱帯の力学的負荷が軽減された状態の動物に、前記劣化予防・治療剤を投与することを特徴とする腱・靱帯劣化の予防・治療方法。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を有効成分とする腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
【請求項２】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗体である請求項第１項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
【請求項３】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、オステオポンチンのＮ末端フラグメントである請求項第１項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
【請求項４】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（１）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項第１項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
（１）ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ
【請求項５】
オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分が、次の（２）で示されるアミノ酸配列を含むペプチドである請求項第１項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
（２）ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ
【請求項６】
腱・靱帯の劣化が、力学的負荷の軽減によるものである請求項第１項ないし第５項の何れかの項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
【請求項７】
マトリックスメタロプロテアーゼ−１３の発現を阻害するものである請求項第１項ないし第６項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤。
【請求項８】
腱・靱帯の力学的負荷が軽減された状態の哺乳動物に、請求項第１項ないし第７項の何れかの項記載の腱・靱帯の劣化予防・治療剤を投与することを特徴とする腱・靱帯劣化の予防・治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腱・靱帯の劣化予防・治療剤に関し、更に詳細には、力学的負荷が軽減された状態において発生する、腱・靱帯の強度の低下を予防・治療することのできる腱・靱帯の劣化予防・治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、交通事故による外傷や、スポーツ事故による外傷に起因し、骨折などの治療を受ける患者数が増加してきている。現在、骨折に対する治療方法としては、ギプス固定が一般的に行われている。しかし、このギプス固定には、長期間固定を行うと、筋肉が発生する力を伝える組織である腱や、関節の安定性を制御する靭帯の力学的負荷が軽減された状態となり、腱・靭帯の強度低下が起こる結果、その回復に一定の時間を要するという問題点がある。特に、老年期での骨折は若年期における骨折よりも回復がさらに遅れ、それをきっかけに寝たきり状態を引き起こす可能性もあるため深刻である。このように、一旦骨折などの外傷を受けた場合、スポーツや社会に復帰するのには時間がかかり、社会的にも大きな損失となっている。【０００３】
このような、骨折など四肢の故障に伴う腱・靱帯の強度低下の予防・治療としては、手術を行なって骨折部を固定し、その後早期にリハビリを開始することで、スポーツや社会に復帰するのを早める試みが行われている。しかし、手術を行わずに、早期にスポーツや社会に復帰させることが可能であれば、患者への侵襲は明らかに少なくなり、医療経済的にもコストの削減が見込めるが、未だそのような方法は報告されていなかった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、本発明の課題は、力学的負荷が軽減された状態において生じる、腱・靱帯の強度の低下を予防し、また治療することのできる腱・靱帯の劣化予防・治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、これまで非膠原性細胞外マトリックス蛋白質として同定（Franzen A, et al.,  Biochem J. 1985  Dec 15;232(3):715-24.）され、力学的負荷減少に応答して起こる破骨細胞による骨吸収（Muneaki Ishijima,  et al.,  J Exp Med. 2001  Feb  5;  193(3):399-404.）、骨リモデリング（Kunihiro Terai,  et al., J Bone Miner  Res. 1999  Jun;14(6):839-49.）や損傷骨格筋再生過程（Akira Hirata, et  al., Am J Pathol.
2003 Jul;163(1):203-15.）での関係が報告されているオステオポンチン（Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ：以下、「ＯＰＮ」ともいう）について、未だ知られていない作用を検索していたところ、意外にも腱・靱帯の力学的負荷軽減による効果を調節する作用も有することを見出した。そしてこのＯＰＮまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体が、腱・靱帯の劣化予防・治療剤、すなわち、力学的負荷が軽減された状態での腱・靱帯の強度低下を防止し、また、治療できる剤となりうることを見出した。更に、上記劣化予防・治療剤を腱・靱帯の力学的負荷が軽減された状態の哺乳動物に投与することにより腱・靱帯の劣化を予防・治療しうることを見出し、本発明を完成した。【０００６】
すなわち、本発明はオステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体を有効成分とする腱・靱帯の劣化予防・治療剤を提供するものである。【０００７】
また、本発明は腱・靱帯の力学的負荷が軽減された状態の哺乳動物に、上記劣化予防・治療剤を投与することを特徴とする腱・靱帯劣化の予防・治療方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の腱・靱帯の劣化予防・治療剤は、これに含有されるオステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体の働きにより、力学的負荷が軽減された状態での腱・靱帯の強度低下を予防し、また治療することができる。【０００９】
従って、この劣化予防・治療剤を骨折等の力学的負荷が軽減された状態の哺乳動物に投与すれば、力学的負荷の軽減による腱・靱帯の強度低下が起こらないため、スポーツや社会への復帰を早めることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の腱・靱帯の劣化予防・治療剤の有効成分であるオステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分に対する抗体（以下、「ＯＰＮ抗体」という）は、オステオポンチンまたはそのフラグメントペプチド部分を認識するものであれば特に制限無く使用することができ、例えば、以下に説明する方法により得られるものや、株式会社免疫生物研究所から次の商品名で市販されているものが使用できる。
Anti-Human
Osteopontin (10A16) Mouse IgG MoAb （製品番号：10011）
Anti-Human
Osteopontin (1B20) Mouse IgG MoAb  （製品番号：10191）
Anti-Human
Osteopontin (O-17) Rabbit IgG Affinity purify (製品番号：18625)【００１１】
本発明で使用されるＯＰＮ抗体のうち、好ましいものの例としては、ＲＧＤ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリンとオステオポンチンまたはそのフラグメントとの結合を阻害する抗オステオポンチン抗体（以下、「ＯＰＮ阻害抗体」という）が挙げられる。【００１２】
このＯＰＮ阻害抗体は、ＲＧＤ配列を認識するインテグリン、例えばαｖβ１、αｖβ３、αｖβ５等とＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害し、かつ、ＳＶＶＹＧＬＲ配列を認識するインテグリン、例えばα９β１、α４β１、α４β７等とＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃまたはそれらのＮ末端フラグメントとの結合を阻害できるものであればどのような抗体でもよい。ＳＶＶＹＧＬＲ配列は、ヒトＯＰＮ（アクセッションナンバー：Ｊ０４７６５）の１６２番目のセリンから１６８番目のアルギニンまでの配列である。【００１３】
上記ＯＰＮ阻害抗体は、上記のような性質を保持する抗体であれば、その製法は特に限定されず、例えばＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃや、これらのＮ末端フラグメント、あるいは次の（１）で示されるアミノ酸配列またはその相当配列を含んでいるペプチド（以下、これらを「ＯＰＮ関連ペプチド」と総称する）を抗原として用いることにより作成できる。なお、ここでいうＯＰＮのフラグメントとは、ＯＰＮがタンパク質分解酵素等により分解されたフラグメントをいい、例えばトロンビンにより分解されたフラグメントをいう。【００１４】
（１）ＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲ（配列番号１）【００１５】
ヒトＯＰＮ阻害抗体は、好ましくは上記（１）の配列を含んでいるペプチドを抗原として用いることにより作製される。より好ましくは、ＯＰＮ−ａ（アクセッションナンバー：Ｊ０４７６５）の１５３番目バリン残基から１６９番目セリン残基までのペプチド（２）を抗原として用い、以下常法に従って処理することによって得ることができる。抗原性を高めるためには、上記ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物を抗原として用いることが好ましい。【００１６】
（２）ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ（配列番号２）【００１７】
また、実験動物としてマウスを用い、ＯＰＮに関連する疾患等の研究を行う場合は、マウスのＯＰＮに対応するＯＰＮ阻害抗体を用いることが望ましく、そのような抗体は、好ましくは、例えば下記のＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ配列を含んでいるペプチド（３）を抗原として用いることにより作製される。【００１８】
（３）ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ（配列番号３）【００１９】
ＯＰＮ阻害抗体の調製において、上記ＯＰＮ関連ペプチドと結合させる生体高分子化合物の例としては、スカシ貝のヘモシアニン（以下「ＫＬＨ」という）、卵白アルブミン（以下、「ＯＶＡ」という）、ウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）、ウサギ血清アルブミン（以下「ＲＳＡ」という）、サイログロブリン等が挙げられ、このうちＫＬＨおよびサイログリブリンがより好ましい。【００２０】
上記ＯＰＮ関連プペチドと生体高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無水物法 (B. F. Erlanger et al., (1954): J. Biol.  Chem.,  234,  1090-1094)または活性化エステル法（A. E. Karu et al., (1994): J. Agric. Food  Chem.,  42,  301-309）等の公知の方法によって行うことができる。【００２１】
混合酸無水物法において用いられる混合酸無水物は、ＯＰＮ関連ペプチドを通常のショッテン−バウマン反応に付すことにより得られ、これを生体高分子化合物と反応させることにより目的とするペプチド−高分子化合物結合体が作製される。この混合酸無水物法において使用されるハロ蟻酸エステルとしては、例えばクロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチル等が挙げられる。当該方法におけるペプチドとハロ蟻酸エステルと高分子化合物の使用割合は、広い範囲から適宜選択され得る。【００２２】
なお、ショッテン−バウマン反応は塩基性化合物の存在下に行われるが、当該反応に用いられる塩基性化合物としては、ショッテン−バウマン反応に慣用の化合物、例えば、トリエチルアミン、トリメチルアミン、ピリジン、ジメチルアニリン、Ｎ−メチルモルホリン、ジアザビシクロノネン（ＤＢＮ）、ジアザビシクロウンデセン（ＤＢＵ）、ジアザビシクロオクタン（ＤＡＢＣＯ）等の有機塩基、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩基等を使用することができる。【００２３】
また、上記反応は、通常、−２０℃から１００℃、好ましくは０℃から５０℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から２時間である。【００２４】
得られた混合酸無水物と生体高分子化合物との反応は、通常マイナス２０℃から１５０℃、好ましくは０℃から１００℃において行われ、反応時間は５分から１０時間程度、好ましくは５分から５時間である。混合酸無水物法は一般に溶媒中で行われるが、溶媒としては、混合酸無水物法に慣用されているいずれの溶媒も使用可能であり、具体的にはジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素類、ジエチルエーテル、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメトキシエタン等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸トリアミド等の非プロトン性極性溶媒等が挙げられる。【００２５】
一方、活性化エステル法は、一般に以下のように行うことができる。まず、ＯＰＮ関連ペプチドを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にてＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化エステルを生成する。【００２６】
カップリング剤としては、縮合反応に慣用されている通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾール、水溶性カルボジイミド等が挙げられる。また、有機溶媒としては、例えばＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド、ジオキサン等が使用できる。反応に使用するペプチドとＮ−ヒドロキシコハク酸イミド等のカップリング剤のモル比は好ましくは１：１０〜１０：１、最も好ましくは１：１である。反応温度は、０〜５０℃、好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜２時間である。反応温度は各々の融点以上沸点以下の温度で行うことができる。【００２７】
カップリング反応後、反応液を生体高分子化合物を溶解した溶液に加え反応させると、例えば生体高分子化合物が遊離のアミノ基を有する場合、当該アミノ基とペプチドのカルボキシル基の間に酸アミド結合が生成される。反応温度は、０〜６０℃、好ましくは５〜４０℃、より好ましくは２２〜２７℃で、反応時間は５分〜２４時間、好ましくは１〜１６時間、より好ましくは１〜２時間である。【００２８】
上記の方法によるＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との反応物を、透析、脱塩カラム等によって精製することにより、ＯＰＮ関連ペプチドと生体高分子化合物との結合物（以下、単に「結合物」ということがある）を得ることができる。【００２９】
次に、上のようにして得られた結合物を抗原として用いる抗体の作製法および当該抗体を用いる免疫化学的測定法について説明する。尚、抗体の調製にあたっては、公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研究法（日本生化学会編）等に記載の方法を適宜利用することができる。【００３０】
上記結合体を使用して、本発明のポリクローナル抗体を作製するには、当該結合物で動物を免疫し、当該動物から抗体を採取すれば良い。【００３１】
すなわち、まず、例えば、ＯＰＮ関連ペプチド−サイログロブリン結合物等の結合物をリン酸ナトリウム緩衝液（以下、「ＰＢＳ」という）に溶解し、これとフロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、あるいはミョウバン等の補助剤とを混合したものを、免疫原として用いて、哺乳動物を免疫する。【００３２】
免疫される動物としては当該分野で常用されるものであればいずれも使用できるが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等を挙げることができる。また、免疫の際の免疫原の投与法は、皮下注射、腹腔内注射、静脈内注射、筋肉内注射のいずれでもよいが、皮下注射または腹腔内注射が好ましい。免疫は、１回または適当な間隔で複数回、好ましくは１週間ないし５週間の間隔で複数回、行うことができる。【００３３】
次いで、常法に従い、免疫した動物から血液を採取して、血清を分離し、ポリクローナル抗体画分を精製することにより、ＯＰＮ阻害抗体を得ることができる。また、常法に従い、前記結合物で動物を免疫して得た免疫細胞と、ミエローマ細胞とを融合させてハイブリドーマを得、当該ハイブリドーマの培養物から抗体を採取することによってモノクローナル抗体としてＯＰＮ阻害抗体を得ることもできる。【００３４】
また、上記したＯＰＮ阻害抗体は常法により上記抗体の定常領域を治療対象とするヒトの抗体と同じ定常領域を持つように遺伝子工学的に改変してキメラ抗体（欧州特許公開公報 ＥＰ０１２５０２３参照）やヒト化抗体（欧州特許公開公報 ＥＰ０２３９４００またはＥＰ０４５１２６、国際公開公報 ＷＯ０３／０２７１５１参照）としてもよい。【００３５】
更に、このようにして得られたＯＰＮ阻害抗体については、さらに抗原認識領域をプローテアーゼ等で切り出したＦｖ、ＦａｂやＦ（ａｂ’）２のかたちで用いることもできる。【００３６】
かくして得られるＯＰＮ抗体等を有効成分とすることで、本発明の腱・靱帯の劣化予防・治療剤を得ることができる。この腱・靱帯の劣化予防・治療剤は、力学的負荷が軽減された状態のヒトに投与することが好ましい。ここでいう力学的負荷が軽減された状態とは、具体的には、骨折治療等によるギプス固定治療を受けている患者や、寝たきりのヒト、宇宙飛行士等をいう。この腱・靱帯の劣化予防・治療剤の投与量としては、力学的負荷が軽減された状態の程度（固定期間や、運動可能の程度）、年齢や使用する製剤の剤型あるいは抗体の結合力価等により異なるが、例えば通常大人一日当り０.１〜１００ｍｇ／ｋｇ程度、好ましくは０.５〜８０ｍｇ／ｋｇ程度である。なお、本発明の腱・靱帯の劣化予防・治療剤は、ヒト以外の哺乳動物にも使用することができ、その例としては、骨折治療を受けているウマや犬、猫等が挙げられる。【００３７】
上記腱・靱帯の劣化予防・治療剤の剤型の例としては注射剤、点滴用剤などの非口経剤が挙げられ、これらには本発明の効果を損なわない範囲で、通常医薬組成物の製造に使用される他の任意成分を加えることができる。このような任意成分としては、例えば、保存剤、抗酸化剤、緩衝剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、界面活性剤、等張化剤等が挙げられる。【００３８】
上記したように、本発明のＯＰＮ抗体により、力学的負荷減少による腱・靱帯の劣化を防止することができるが、そのメカニズムについて本発明者は以下のように考えている。【００３９】
まず、力学的負荷減少によって起こるコラーゲン線維径減少において、力学的負荷減少の初期段階では、ＯＰＮが力学的負荷減少に応答し発現が増加する。その後、それが引き金となってマトリックスメタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ−１３）の発現が上昇し、発現されたＭＭＰ−１３によりコラーゲン線維径が減少する。【００４０】
一方、力学的負荷減少によっておこる腱・靭帯の劣化およびリモデリング過程において、ＯＰＮが調節因子として重要な機能を有し、そのメカニズムとして、ＯＰＮがＭＭＰ−１３発現を制御することにより腱・靭帯のリモデリング過程に影響を及ぼす。  【００４１】
このように、力学的負荷が軽減された際のコラーゲン線維径減少や腱・靭帯のリモデリングにＯＰＮの発現が関与しているのであるから、その働きをＯＰＮ抗体で阻害すれば、力学的負荷が軽減された状態であっても、ＯＰＮが発現せず、その結果、ＭＭＰ−１３が発現されず、コラーゲン線維径が減少することもなく、腱・靱帯の劣化を予防・治療しうるものと考えられる。
【実施例】
【００４２】
以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。【００４３】
参 考 例  １
下記のＲＴ−ＰＣＲ法および免疫組織染色法を利用し、腱・靱帯中でのＯＰＮの発現およびその局在を確認した。【００４４】
（１）Ｒ Ｔ − Ｐ Ｃ Ｒ 法：
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、オス、６−７週）の膝蓋腱６個分を１標本としてＲＴ−ＰＣＲを行った。標本は液体窒素で凍結し、ディスメンブレーター（１９００回転、４分間）にて粉末状とした。この粉末に１ｍｌのトリゾールと２００μｌのクロロホルムを加えた後、遠心分離し、上清を抽出した。この上清に５００μｌのイソプロピルアルコールを加え、遠心分離し、上澄液を除去してから７５％エタノールにてリンスした。次いで、これを３０μｌの水に溶かし総ＲＮＡを抽出した。【００４５】
得られた２０μｌの総ＲＮＡは、Ｐｄ（Ｎ）６（Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ：アマシャム社製）のプライマーによってｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲを施行した。次いで、２μｌのサンプル、５μｌの１０×Ｅｘｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＮＴＰ、３５.５μｌの蒸留水、０.５μｌのＥｘ−Ｔａｑ、１μｌのセンスプライマー、１μｌのアンチセンスプライマーの合計５０μｌを用いてＰＣＲを施行した。ＰＣＲの各ステップは、熱変性が９４℃で３０秒、アニ−ルが５５℃で３０秒、伸長反応が７２℃で１分（３０サイクル）であった。ｍＯＰＮ−ａおよびＧ３ＰＤＨに用いたプライマーデザイン（配列番号４〜７）は以下の通りである。【００４６】
（ プ ラ イ マ ー ）
ｍＯＰＮ−ａ−５'：５'−ＡＣＧＡＣＣＡＴＧＡＧＡＴＴＧＧＣＡＧＴＧ−３'（配列番号４）
ｍＯＰＮ−ａ−３'：５'−ＴＴＡＧＴＴＧＡＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＧＡ−３'（配列番号５）
Ｇ３ＰＤＨ ５'：５'−ＡＣＣＡＣＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＡＣ−３'（配列番号６）
Ｇ３ＰＤＨ ３'：５'−ＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡ−３'（配列番号７）【００４７】
（２）免 疫 組 織 染 色：
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、オス、６−７週）の右膝蓋腱を摘出し、１０％リン酸緩衝ホルマリン液に保存固定した。次いで、この固定した膝蓋腱を４μｍに薄切りしたパラフィン切片をキシレンにより脱パラフィンし、更にアルコールおよび水で洗浄し、ｐＨ６.０のクエン酸緩衝液でマイクロウェーブ処理を１０分間行った。その後１％のＨ２Ｏ２−メタノールによりペルオキシダーゼ除去をし、抗マウスオステオポンチン抗体(×２００、免疫生物研究所製)を添加し、４℃にて一昼夜反応させた。次いでこれに二次抗体としてＥＮＶＩＳＩＯＮ（Ｋ４００２：ＤＡＫＯ社製）を３０分反応させた後、ＤＡＢにて発色させ、更にヘマトキシリンで核染色、脱水、透徹、封入した。なお、各反応の間はＰＢＳで５分間３回の洗浄を行った。【００４８】
（３）結 果： 
ＲＴ−ＰＣＲ法の結果は、腱組織中にＯＰＮｍＲＮＡの発現があることを示していた(図１)。また、免疫組織学的染色法の結果からは、線維芽細胞細胞質周辺に局在するＯＰＮが確認できた(図２)。【００４９】
参 考 例  ２
力学的負荷軽減による膝蓋腱の超微細構造解析：
ＯＰＮノックアウトマウス（ＯＰＮ ＫＯ ｍｉｃｅ、オス７匹、雌３匹、６週、体重２０−３０ｇ）はリットリング（Rittling；Rutgers University, Dept. of Cell Biology and Neuroscience,
Nelson Labs, 604 Alison Rd., Piscataway, NJ 088548082. Tel.:732-445-222）より入手した。このＯＰＮノックアウトマウスは野生系マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、オス４匹、雌４匹、６週、体重２０−３０ｇ）と９回バッククロスさせた。これらのマウスをネンブタール(２５ｍｇ／ｋｇ)腹腔内麻酔を施行し、次いでマイクロ顕微鏡下に右大腿神経を切除し、右膝蓋腱を負荷軽減状態とした。このマウスを術後６週目で安楽死させ、右大腿四頭筋の萎縮を肉眼で観察した。その結果、右大腿四頭筋は、神経切除を行っていない左側に比べ萎縮していることが確認できた(図３)。【００５０】
この神経切除の効果を確認したのち、それぞれのマウスの左右両方の膝蓋腱を採取した。次いで、これを２％グルタールアルデヒド水溶液で前固定し、１％四酸化オスミウム水溶液で後固定を行った。固定後、更に上昇エタノール脱水を行い、エポン樹脂で包埋して標本を作製した。この標本を膝蓋腱に垂直に約８０ｎｍの厚さで切り、酢酸ウランとクエン酸鉛の二重染色を行い透過型電子顕微鏡による観察を行った。各標本の膝蓋腱の超微細構造を、図４のＡ〜Ｄに示す。図４中、Ａは野生型マウス大腿神経切除後６週（右膝蓋腱）、Ｂは野生型マウスのコントロール（左膝蓋腱）、ＣはＯＰＮノックアウトマウス大腿神経切除後６週（右膝蓋腱）、ＤはＯＰＮノックアウトマウスのコントロール（左膝蓋腱）である。【００５１】
上記で観察された部位を写真にとり、コンピューター解析（Ｗｉｎ Ｒｏｏｆ：三谷商事株式会社製）によってアトランダムにコラーゲン線維径や１μｍ２あたりの面積率を計測した。コラーゲン繊維径のヒストグラムを図５に示す。図５中、Ａは野生型マウス、ＢはＯＰＮノックアウトマウスであり、縦軸はコラーゲン線維の数（本）、横軸はコラーゲン線維径（ｎｍ）を示す。【００５２】
更に、コラーゲン線維径平均値および面積率について、大腿神経を切除してない左膝蓋腱を基準として標準化比（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｒａｔｉｏ）およびｔ検定による統計学的解析を行い、野生型マウスとＯＰＮノックアウトマウスとの比較を行った。その結果を図６に示す。図６中、Ａはコラーゲン線維径平均値、Ｂは腱１μｍ２あたりの面積率である。【００５３】
この統計学的解析では、野生型マウスは大腿神経を切除したことによる力学的負荷が軽減された状態ではコラーゲン線維径平均値および腱１μｍ２あたりの面積率はともに有意差有りで減少していた。一方、ＯＰＮノックアウトマウスは大腿神経を切除してもコラーゲン線維の径および腱１μｍ２あたりの面積率はともに変化がなかった。【００５４】
参 考 例  ３
力学的負荷軽減による腱リモデリング過程における分子生物学的解析：
（１）ＯＰＮの経時的発現変化
マイクロ顕微鏡下で野生型マウス（オス、６−７週）の右大腿神経切除を行い、右膝蓋腱を負荷軽減状態とした。右大腿神経切除後、１日、３日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日および４２日にそれぞれを安楽死させ、右膝蓋腱６個分を１標本としてリアルタイムＰＣＲを行ない、ＯＰＮの発現を調べた。このＯＰＮの発現量を、Ｇ３ＰＤＨを基準として標準化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ Ｒａｔｉｏ）を行った。その結果を図７に示す。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのキット（ロシュ製）により作製したサンプルを用い、Ｌｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（ロシュ製）を用いて行った。各ステップは、熱変性を９４℃で３０秒、アニールを６８℃で３０秒、伸長反応を７２℃の１分（３０サイクル）であった。プライマーは参考例１と同様のものを用いた。【００５５】
参 考 例   ４
力学的負荷軽減による膝蓋腱におけるＭＭＰ−１３発現解析：
（１）ＭＭＰ−１３の経時的発現変化
マイクロ顕微鏡下で野生型マウス（６−７週齢）の右大腿神経切除を行い、右膝蓋腱を負荷軽減状態とした。右大腿神経切除後、３日、７日、１４日、２１日にそれぞれを安楽死させ、右膝蓋腱２０個分を１標本としてリアルタイムＰＣＲを行い、ＭＭＰ−１３の発現を調べた。このＭＭＰ−１３の発現量はＧ３ＰＤＨを基準として定量、標準化を行った。その結果を図８に示す。リアルタイムＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ
ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉのキット（ロシュ製）により作製したｃＤＮＡサンプルを用い、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（ロシュ製）を用いて解析を行った。各ステップは、熱変性を９４℃で３０秒、アニールを６５℃で３０秒、伸長反応を７２℃の１分（４０サイクル）であった。ＭＭＰ−１３に用いたプライマーデザイン（配列番号８および９）は以下の通りである。なお、Ｇ３ＰＤＨに用いたプライマー（配列番号６および７）は参考例１と同様のものである。【００５６】
（ プ ラ イ マ ー ）
ＭＭＰ−１３ ５'：５'−ＣＡＴＣＣＡＴＣＣＣＧＴＧＡＣＣＴＴＡＴ−３'（配列番号８）
ＭＭＰ−１３ ３'：５'−ＧＣＡＴＧＡＣＴＣＴＣＡＣＡＡＴＧＣＧＡ−３'（配列番号９）【００５７】
（２）ＯＰＮノックアウトマウスにおけるＭＭＰ−１３の発現変化
（ Ｒ Ｔ − Ｐ Ｃ Ｒ 法 ）
野生型マウス（６−７週齢）およびＯＰＮノックアウトマウス（ＯＰＮ  ＫＯ  ｍｉｃｅ）（６−７週齢）を、マイクロ顕微鏡下で右大腿神経切除を行い、右膝蓋腱を負荷軽減状態とした。右大腿神経切除後、０日および１４日後に安楽死させ、それぞれのマウスの膝蓋腱２０個分をそれぞれ１標本としてＲＴ−ＰＣＲを行った。【００５８】
標本は液体窒素で凍結し、ディスメンブレーター（１９００回転、４分間）にて粉末状とした。この粉末に１ｍｌのトリゾールと２００μｌのクロロホルムを加えた後、遠心分離し、上清を抽出した。この上清に５００μｌのイソプロピルアルコールを加え、遠心分離し、ペレットを７５％エタノールにてリンスした。次いで、これを３０μｌの蒸留水に溶かしトータルＲＮＡとした。【００５９】
得られた２０μｌのトータルＲＮＡは、Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔ（アマシャム社製）を用いてｃＤＮＡに逆転写し、ＰＣＲを行いＭＭＰ−１３の遺伝子発現を検討した。ＰＣＲの各ステップは、熱変性が９４℃で１５秒、アニールが６３℃で３０秒、伸長反応が７２℃で３０秒（３５サイクル）であった。プライマーは上記（１）と同じものを使用した。結果を図９に示す。【００６０】
（ リ ア ル タ イ ム Ｐ Ｃ Ｒ ）
さらに、上記で得られた術後０日および１４日後の野生型マウスおよびＯＰＮノックアウトマウスそれぞれの膝蓋腱標本を用い、上記（１）と同様にリアルタイムＰＣＲを行い、ＭＭＰ−１３の発現量を調べた。このＭＭＰ−１３の発現量はＧ３ＰＤＨを基準として定量評価を行った。その結果を図１０に示す。【００６１】
（３）結果
ＯＰＮは、正常な状態から大腿神経切除後３日目までは増加するものの、その後大腿神経切除後の１週まで下降していった。その後大腿神経切除後の６週までの期間は、ＯＰＮの発現はほとんどみられなかった。一方、ＭＭＰ−１３は大腿神経切除後３日目まで減少するものの、その後大腿神経切除後の１４日目まで上昇し、その後下降していった（図８）。さらに、ＯＰＮノックアウトマウスを使用して、０日から力学的負荷軽減後１４日目のＭＭＰ−１３発現変化率を野生型マウスと比較した実験では、野生型マウスでは３０倍上昇したのに対し、ＯＰＮ  ノックアウトマウスでは６倍のみの上昇であった（図９、１０）。以上の結果より、ＯＰＮはＭＭＰ−１３の発現機構の調節に関与している可能性を示した。【００６２】
以上の参考例１〜４により、力学的負荷が軽減された際のコラーゲン線維径減少や腱・靭帯のリモデリングにＯＰＮの発現が関与していると考えられるので、その働きをＯＰＮ阻害抗体等で阻害すれば、力学的負荷が軽減された腱・靱帯の劣化を予防・治療しうることが示唆された。【００６３】
実 施 例  １
ヒトＯＰＮ阻害抗体の製造：
下に示すような、ヒトＯＰＮの内部配列（Ｖ１５３からＳ１６９）に対応する合成ペプチド（２Ｋ１ペプチド）を用意し、免疫化に使用した。【００６４】
２Ｋ１ペプチド：ＶＤＴＹＤＧＲＧＤＳＶＶＹＧＬＲＳ【００６５】
２Ｋ１ペプチドは、αｖβ３とα９β１インテグリンレセプターを認識するＲＧＤとＳＶＶＹＧＬ配列を有する。【００６６】
この２Ｋ１ペプチドを、サイログロブリンと結合し、これを用い常法に従ってマウスを免疫化した。免疫化されたマウスの脾単球細胞と融合パートナー、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３をポリエチレングリコール仲介細胞融合に付し、文献（J. Immunol., 146:3721-3728）に述べた方法によりハイブリドーマを選択した。選択は、固定化されたＧＳＴ／ＯＰＮａとＣＨＯ細胞から導いたＯＰＮ−ａには反応するが、ＧＳＴには反応しないように見えるハイブリドーマを選ぶことにより行った。【００６７】
２Ｋ１ペプチドで免疫したマウスから、２Ｋ１と名付けたモノクローナル抗体を得た。なお、モノクローナル抗体２Ｋ１を産生するハイブリドーマをＨｕｍａｎ Ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ２Ｋ１と名付けて２００１年６月２０日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）にＦＥＲＭ ＢＰ−７８８３として寄託した。【００６８】
試 験 例  １
ＯＰＮおよびそのトロンビン消化物とＯＰＮ阻害抗体の反応性：
上記で得られた２Ｋ１抗体のＯＰＮおよびそのトロンビン消化物に対する結合能を、ウエスタンブロット法を用いて試験した。２Ｋ１抗体はＯＰＮ−ａ、ＯＰＮ−ｂ、ＯＰＮ−ｃおよびＯＰＮ−ａのトロンビン消化物であるＮハーフＯＰＮと反応することがわかった。更に、この２Ｋ１抗体は、大腸菌から生産した非グリコシル化フォームの組換えＯＰＮと結合するばかりでなく、ＣＨＯ細胞から生産されたグリコシル化フォームの組換えＯＰＮ（J. Cell. Biochem. 77: 487-498, 2002）とも反応した。【００６９】
実 施 例  ２
マウスＯＰＮ阻害抗体の製造：
下に示すような、ヒトＯＰＮのＳＶＶＹＧＬＲ配列に相当するマウスＯＰＮのＳＬＡＹＧＬＲ配列と、ＲＧＤ配列とを有する下記のマウスオステオポンチンの内部配列（Ｃ＋Ｖ１３８からＲ１５３）に対応する合成ペプチド（Ｍ５ペプチド）を用意し、実施例１と同様にしてＭ５抗体を作製した。得られたＭ５抗体はマウスＯＰＮと反応した。【００７０】
Ｍ５ペプチド：ＣＶＤＶＰＮＧＲＧＤＳＬＡＹＧＬＲ
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明の腱・帯の劣化予防・治療剤は、これに含有されるＯＰＮ抗体の働きにより、力学的負荷が軽減された状態の腱・靱帯の強度低下を予防・治療することができる。【００７２】
従って、この劣化予防・治療剤は骨折等の力学的負荷が軽減された患者の腱・靱帯の強度低下を防ぐことが可能であると共に、寝たきりになった患者等に使用して回復した後の社会復帰を容易にすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】野生型マウスの膝蓋腱を標本としたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図面である。
【図２】免疫染色の結果を示す図面である（Ａ：野生型マウスのＨＥ染色、Ｂ：野生型マウスの抗ＯＰＮ抗体による免疫染色、Ｃ：ＯＰＮノックアウトマウスの抗ＯＰＮ抗体による免疫染色）。
【図３】大腿四頭筋のＨＥ染色の結果を示す図面である（Ａ：野生型マウス、１：右大腿神経切除後６週、２：コントロール６週、Ｂ：ＯＰＮノックアウトマウス、３：右大腿神経切除後６週、４：コントロール６週）。
【図４】膝蓋腱の超微細構造を示す図面である（Ａ：野生型マウス大腿神経切除後６週（右膝蓋腱）、Ｂ：野生型マウスのコントロール（左膝蓋腱）、Ｃ：ＯＰＮノックアウトマウス大腿神経切除後６週（右膝蓋腱）、Ｄ：ＯＰＮノックアウトマウスのコントロール（左膝蓋腱）、写真中のバー（−）は１μｍを示す）。
【図５】コラーゲン線維径のヒストグラムである（Ａ：野生型マウス、Ｂ：ＯＰＮノックアウトマウス）。
【図６】コラーゲン繊維径平均値と１μｍ２あたりの面積率を示す図面である（Ａ：コラーゲン線維径平均値、野生型マウス＝０.６７７±０.０５３、ＯＰＮノックアウトマウス＝１.１０３±０.０７９、Ｐ＝０.０００６、Ｂ：腱１μｍ２あたりの面積率、野生型マウス＝０.６９６±０.０３６、ＯＰＮノックアウトマウス＝０.９７９±０.０４３、Ｐ＝０.０００２）
【図７】リアルタイムＰＣＲによるＯＰＮ発現量と経過日数との関係を示す図面である。
【図８】大腿神経切除処置後の野生型マウスのリアルタイムＰＣＲによるＯＰＮ発現量およびＭＭＰ−１３発現量と経過日数との関係を示す図面である。
【図９】大腿神経切除処置後０日および１４日後のマウスの膝蓋腱を標本としたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図面である。
【図１０】リアルタイムＰＣＲによるＭＭＰ−１３発現量と経過日数との関係を示す図面である。
【図５】
2005049083.tif 000002
【図６】
2005049083.tif 000003
【図７】
2005049083.tif 000004
【図８】
2005049083.tif 000005
【図９】
2005049083.tif 000006
【図１０】
2005049083.tif 000007
【図１】
2005049083.tif 000008
【図２】
2005049083.tif 000009
【図３】
2005049083.tif 000010
【図４】
2005049083.tif 000011
【配列表】
2005049083000001.app
【国際調査報告】
2005049083.tif 000012
2005049083.tif 000013
2005049083.tif 000014
2005049083.tif 000015
2005049083.tif 000016
2005049083.tif 000017