【手続補正書】
【提出日】平成30年6月7日(2018.6.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）
A−（Xaa0）m−B      （Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0〜100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法：
N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、−（Xaa0）m−、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0〜10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいい、認識配列1及び2の有無は任意である。）；
前記mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程と；
アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチドライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を任意で含むペプチド（ただし、認識配列１、認識配列２、及びリーダー配列を含まないペプチドは除く。）の存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0〜50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいい、リーダー配列の有無は任意である。）、を含み、
Cys、Ser、Thr、及び2,3-ジアミノ酸のアナログは、以下の構造：
Cysのアナログ；
【化１】
2017160272.tif 000001
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
Serのアナログ；
【化２】
2017160272.tif 000002
Thrのアナログ；
【化３】
2017160272.tif 000003
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
2,3-ジアミノ酸のアナログ；
【化４】
2017160272.tif 000004
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
により表されるアナログである、方法。
【請求項２】
下記式（Ｉ）
A−（Xaa0）m−B      （Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0〜100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物と、前記式（Ｉ）で示されるペプチドをコードするmRNAとの複合体を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーの製造方法であって：
N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、−（Xaa0）m−、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNAライブラリーを製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0〜10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいい、認識配列1及び2の有無は任意である。）；
前記mRNAライブラリーの各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程と；
前記ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させ、ペプチド−mRNA複合体ライブラリーを製造する工程と；
アゾリン骨格導入酵素と、前記ペプチド−mRNA複合体ライブラリーとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を任意で含むペプチド（ただし、認識配列１、認識配列２、及びリーダー配列が存在しないペプチドを除く。）の存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここでリーダー配列は、0〜50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいい、リーダー配列の有無は任意である）、を含み、
Cys、Ser、Thr、及び2,3-ジアミノ酸のアナログは、以下の構造：
Cysのアナログ；
【化５】
2017160272.tif 000005
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
Serのアナログ；
【化６】
2017160272.tif 000006
Thrのアナログ；
【化７】
2017160272.tif 000007
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
2,3-ジアミノ酸のアナログ；
【化８】
2017160272.tif 000008
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
により表されるアナログである、方法。
【請求項３】
前記式（Ｉ）において、−（Xaa0）m−が、−（Xaa1−Xaa2）n−であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
前記アゾリン化合物には、Xaa1及びXaa2のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つを、以下の(i)〜(iv)の少なくとも1つの特徴を有するペプチドとする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
【請求項５】
前記−（Xaa0）m−で示されるペプチドの少なくとも1つを、配列番号：１０〜５７のいずれかで表されるペプチドとする、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記アゾリン化合物の少なくとも1つが、アゾリン骨格を5以上有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記mRNAライブラリーの各mRNAは、前記リーダー配列を含むペプチドが、前記認識配列1、−（Xaa0）m−、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとの融合ペプチドとして発現されるように構成されている、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記アゾリン骨格の導入後、リーダー配列を前記前駆体ペプチドから切断する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記アゾリン骨格を導入する工程において、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、−（Xaa0）m−、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとが別個のペプチドである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、前記アゾリン化合物を大環状化する工程を含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
アゾール化合物ライブラリーの製造方法であって、
請求項１から１０のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーの製造方法において、
前記アゾリン骨格の導入工程の後、アゾリン骨格が導入されたライブラリーと、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む方法（ここでリーダー配列は、0〜50アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列をいい、リーダー配列の有無は任意である。）。
【請求項１２】
前記アゾール骨格導入酵素は、PatGのペプチダーゼドメインを欠損した変異体または点変異によってペプチダーゼ活性をなくした変異体、GodEからなる群より選択される少なくとも一つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
下記式（Ｉ）
A−（Xaa0）m−B      （Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0〜100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物を2種以上含むアゾリン化合物ライブラリーであって：
前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、総アミノ酸数が7又は8でなく、
Cys、Ser、Thr、及び2,3-ジアミノ酸のアナログは、以下の構造：
Cysのアナログ；
【化９】
2017160272.tif 000009
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
Serのアナログ；
【化１０】
2017160272.tif 000010
Thrのアナログ；
【化１１】
2017160272.tif 000011
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
2,3-ジアミノ酸のアナログ；
【化１２】
2017160272.tif 000012
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
により表されるアナログである、アゾリン化合物ライブラリー。
【請求項１４】
前記式（Ｉ）において、−（Xaa0）m−が、−（Xaa1−Xaa2）n−であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から10より選択される整数を示す。］、
前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１３に記載のアゾリン化合物ライブラリー：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログ又はこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
【請求項１５】
前記アゾリン化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、請求項１３又は１４に記載のアゾリン化合物ライブラリー。
【請求項１６】
上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、請求項１３から１５のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリー。
【請求項１７】
下記式（Ｉ）
A−（Xaa0）m−B      （Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0〜100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾール骨格が導入されているアゾール化合物を2種以上含むアゾール化合物ライブラリーであって：
前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つは、総アミノ酸数が7又は8でなく、
Cys、Ser、Thr、及び2,3-ジアミノ酸のアナログは、以下の構造：
Cysのアナログ；
【化１３】
2017160272.tif 000013
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
Serのアナログ；
【化１４】
2017160272.tif 000014
Thrのアナログ；
【化１５】
2017160272.tif 000015
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
2,3-ジアミノ酸のアナログ；
【化１６】
2017160272.tif 000016
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
により表されるアナログである、アゾール化合物ライブラリー。
【請求項１８】
前記式（Ｉ）において、−（Xaa0）m−が、−（Xaa1−Xaa2）n−であり
［式中、n個のXaa1は、それぞれ独立に任意のアミノ酸を示し、n個のXaa2は、それぞれ独立にCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸を示し、nは、1から20より選択される整数を示す。］、
前記式（Ｉ）で示されるペプチドの少なくとも1つが、以下の(i)から(iv)の少なくとも1つの特徴を有する、請求項１７に記載のアゾール化合物ライブラリー：
(i) mが2から40である（但し、7及び8を除く）；
(ii) nが1から20である（但し、3及び4を除く）；
(iii) Xaa1の少なくとも1つがCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログから選択されるアミノ酸である；及び
(iv) Xaa1の少なくとも1つが親水性アミノ酸である。
【請求項１９】
前記アゾール化合物のそれぞれが、そのペプチド部分をコードするmRNAとの複合体を形成している、請求項１７又は１８に記載のアゾール化合物ライブラリー。
【請求項２０】
上記式（Ｉ）で示されるペプチドのN末端及びC末端に、アゾリン骨格導入酵素の認識配列の全部または一部が結合している、請求項１７から１９のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリー。
【請求項２１】
標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１３から１６のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２２】
標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するスクリーニング方法であって、
請求項２から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１５または１６に記載のアゾリン化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
前記標的物質と結合したアゾリン化合物を選択する工程と、
前記選択したアゾリン化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
請求項１１又は１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１７から２０のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、を含む方法。
【請求項２４】
標的物質に結合するアゾール化合物を同定するスクリーニング方法であって、
請求項１１または１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１９または２０に記載のアゾール化合物ライブラリーと、標的物質とを接触させ、インキュベートする工程と、
前記標的物質と結合したアゾール化合物を選択する工程と、
前記選択したアゾール化合物のmRNAの塩基配列を解析する工程と、を含む方法。
【請求項２５】
標的物質に結合するアゾリン化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法で製造されたアゾリン化合物ライブラリー又は請求項１３から１６のいずれか１項に記載のアゾリン化合物ライブラリーを含む、キット。
【請求項２６】
前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
標的物質に結合するアゾール化合物を同定するためのスクリーニング用キットであって、
請求項１１又は１２に記載の方法で製造されたアゾール化合物ライブラリー又は請求項１７から２０のいずれか１項に記載のアゾール化合物ライブラリーを含む、キット。
【請求項２８】
前記ライブラリーが、固相担体に固定されている、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
下記式（Ｉ）
A−（Xaa0）m−B      （Ｉ）
［式中、m個のXaa0は、任意のアミノ酸を示すが、少なくとも1つはCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログからなる群より選択されるアミノ酸であり、mは、2から40より選択される整数を示し、A及びBは、それぞれ独立に0〜100アミノ酸からなるペプチドを示す。］
で示されるペプチドにおいて、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格が導入されているアゾリン化合物の製造方法であって：
N末端から順に、アゾリン骨格導入酵素による認識配列1、−（Xaa0）m−、及びアゾリン骨格導入酵素による認識配列2を含む前駆体ペプチドをコードするmRNA製造する工程と（ここで、認識配列1及び2は、0〜10アミノ酸からなるアゾリン骨格導入酵素による認識配列をいい、認識配列1及び2の有無は任意である。）；
前記mRNAを用いて、無細胞翻訳系により前記前駆体ペプチドを発現させる工程と；
アゾリン骨格導入酵素と、前記前駆体ペプチドとを、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を任意で含むペプチド（ただし、認識配列１、認識配列２、及びリーダー配列を含まないペプチドは除く。）の存在下で反応させ、Xaa0のCys、Ser、Thr、2,3-ジアミノ酸、及びこれらのアナログの少なくとも1つにアゾリン骨格を導入する工程と（ここで、前記リーダー配列を含むペプチドと、前記認識配列1、−（Xaa0）m−、及び認識配列2を含む前駆体ペプチドとは別個のペプチドであり、リーダー配列の有無は任意である。）、を含み、
Cys、Ser、Thr、及び2,3-ジアミノ酸のアナログは、以下の構造：
Cysのアナログ；
【化１７】
2017160272.tif 000017
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
Serのアナログ；
【化１８】
2017160272.tif 000018
Thrのアナログ；
【化１９】
2017160272.tif 000019
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
2,3-ジアミノ酸のアナログ；
【化２０】
2017160272.tif 000020
［式中、Rは、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数1−10のアルキル基又は置換基を有していてもよい芳香族基を示す。］
により表されるアナログである、方法。
【請求項３０】
アゾール化合物の製造方法であって、
請求項２９に記載の方法で製造したアゾリン化合物と、アゾール骨格導入酵素とを、アゾール骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドの存在下又は非存在下で反応させ、アゾリン骨格の少なくとも１つをアゾール骨格に変換する工程を含む、方法。
【請求項３１】
アゾリン化合物又はアゾール化合物の製造用キットであって、アゾリン骨格導入酵素又はアゾール骨格導入酵素と、アゾリン骨格導入酵素の基質のリーダー配列を含むペプチドとを含むキット。