(57)【要約】  本発明は、肺癌、特には非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、さらにより特には類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣ、を予防又は処置する為の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣからなる群から選択される肺癌に作用された患者における肺癌を予防又は処置する方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項２】
モノクロナール抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及びそのＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項３】
下記の抗体からなる群から選択されるモノクロナール抗体である、請求項１又は２に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤：
ａ）配列番号２を含む軽鎖及び配列番号４を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  ＶＬ及びＶＨ配列）；
ｂ）配列番号６を含む軽鎖及び配列番号８を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  ＶＬ及びＶＨ配列）；
ｃ）配列番号１０を含む軽鎖及び配列番号１２を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３軽鎖及び重鎖）；
ｄ）配列番号１４を含む軽鎖及び配列番号１６を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ軽鎖及び重鎖）。
【請求項４】
下記の配列を含む複数のＣＤＲを含むモノクロナール抗体である、請求項１に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤：
ＣＤＲＬ−１：ＲＡＳＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｘ４Ｘ５Ａ、ここで、Ｘ１及びＸ２は独立してＳ又はＰであり、Ｘ３はＲ又はＷ又はＧであり、Ｘ４はＴ又はＤであり、Ｘ５はＩ又はＴである；
ＣＤＲＬ−２は、ＰＴＳＳＬＸ６Ｓであり、ここで、Ｘ６はＫ又はＥである；並びに、
ＣＤＲＬ−３は、ＬＱＷＳＳＹＰＷＴである；
ＣＤＲＨ−１は、ＫＡＳＧＹＸ７ＦＴＸ８Ｘ９ＨＩＨであり、ここで、Ｘ７はＳ又はＴであり、Ｘ８はＳ又はＧであり、及びＸ９はＹ又はＮである；
ＣＤＲＨ−２は、ＷＩＹＰＸ１０ＤＤＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧであり、ここで、ＸwはＧ又はＥである  、並びに、
ＣＤＲＨ−３は、ＧＤＲＦＡＹである。
【請求項５】
上記結合性剤が、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項６】
ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体である、請求項１に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項７】
ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体を発現する細胞である、請求項１に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項８】
ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体を発現する、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞又はＣＡＲマクロファージである、請求項７に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項９】
前記ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤が、１以上の別個の抗癌剤と組み合わされている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法で使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤。
【請求項１０】
肺癌に作用された個体が、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＡＭＨＲＩＩ結合性剤での癌処置に応答性であるかを判断する方法であって、上記個体から予め得られた腫瘍組織サンプルが、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現するかを決定する工程を含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺癌処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、肺組織の悪性の形質転換及び増殖であり、全世界における年間１３０万の死亡例に関係している。肺癌は、男性では癌関連死の最も多い原因であり、女性では２番目に多い原因である。
【０００３】
世界保健機構は、肺癌を４つの主要な組織型：（１）扁平上皮細胞癌（ＳＣＣ：squamous  cell  carcinoma）、（２）腺癌（adenocarcinoma）、（３）大細胞癌（large  cell  carcinoma）、及び（４）小細胞肺癌（ＳＣＬＣ：small  cell  lung  carcinoma）に分類する。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ：non-small  cell  lung  carcinoma）という語は、扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞癌を含む。
【０００４】
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、その予後及び管理がほぼ同一であるので、共にグループ化される。３つの主要なサブタイプ：肺扁平上皮細胞癌、肺腺癌、及び肺大細胞癌が存在する。肺癌の２９％を占める扁平上皮細胞癌は、より大きな気管支においても開始するが、増殖はより低速である。これらの腫瘍のサイズは、診断によって異なる。腺癌は、ＮＳＣＬＣの最も多いサブタイプであり、肺癌の３２％を占める。腺癌は、肺のガス交換表面近傍で開始する形態である。腺癌のほとんどの症例は喫煙と関連する。但し、喫煙したことのない人々（「非喫煙者」）においても、腺癌は肺癌の最も多い形態である。腺癌のサブタイプである細気管支肺胞癌は、女性の非喫煙者においてより一般的であり、処置に対して異なる応答を有しうる。ＮＳＣＬＣのその他のサブタイプは、神経内分泌肺腫瘍（ＮＥ：neuroendocrine  lung  tumors）、腺房型肺癌（ＡＴ：acinar-type  lung  cancer）、及び急速増殖の形態であり、肺表面近傍で増殖する肺癌の９％を占める大細胞癌である。
【０００５】
小細胞肺癌（ＳＣＬＣ、「燕麦細胞癌」とも呼ばれる）は、あまり一般的ではない肺癌の形態である。これは、より大きな呼吸管内で開始し、急速に増殖してきわめて大型となる傾向を有する。最も一般的に関係する発癌遺伝子はＬ−ｍｙｃである。「燕麦」細胞は、これを内分泌／腫瘍随伴症候群と関連付ける高密度な神経分泌顆粒を含有する。この細胞は、化学療法に対して当初は感受性がより高いが、最終的には不良な予後をもたらし、診察時には転移していることが多い。この種の肺癌は、喫煙と強く関連している。
【０００６】
その他の種類の肺癌として、癌様体、腺様嚢胞癌（円柱腫）、及び粘膜表皮癌が挙げられる。
【０００７】
疾患が進行期に達するまで、臨床症状は多くの場合認められないので、初期の検出は困難である。現在のところ、診断は、胸部Ｘ線の使用、喀痰に含まれる細胞の種類の分析、及び気道の光ファイバー検査により支援される。処置レジメンは、癌の型及び病期により決定され、手術、放射線療法及び／又は化学療法を含む。この疾患に対する療法にかなりの研究がなされているにもかかわらず、肺癌は処置するのがなおも困難なままである。
【０００８】
公知の肺癌処置として、手術、化学療法、放射線療法、及び標的薬物療法が挙げられる。
【０００９】
標的療法、特に標的免疫療法が、より従来型の化学療法又は放射線処置が無効である肺癌患者に有益である潜在的可能性がある。標的免疫療法は、モノクロナール抗体の使用と関係する。
【００１０】
モノクロナール抗体のベバシズマブ（抗ＶＥＧＦ抗体）及びラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２抗体）は、腫瘍による新規血管の生成を阻止することを目的とするが、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）は、別の増殖因子の作用を阻止することによって増殖を標的とする。現在のところ、肺癌患者用に承認された標的抗体として、少なくとも２つの免疫チェックポイント阻害剤（ペンブロリズマブ／抗ＰＤ１及びニボルマブ／抗ＰＤ１）が存在する。今日、長期にわたり持続する寛解及びより長期の生存率は、そのような免疫に基づく処置、例えばチェックポイント阻害剤、モノクロナール抗体、処置用ワクチン、及び養子細胞療法、を用いて得ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、当技術分野において、既存療法の代替でありうる又はそれを補完しうる、肺癌の療法の為の更なるツールに対する必要性がなおも存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、肺癌を予防又は処置する為に使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤に関する。従って、本発明は、肺癌に作用された患者の肺癌を予防又は処置する方法で使用されるヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤に関する。
【００１３】
肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の中から選択され得、特には、類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣでありうる。
【００１４】
好ましい実施態様において、ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、細胞膜においてＡＭＨＲＩＩを十分な発現レベルで発現する上記で特定された肺癌を処置する為に使用される。
【００１５】
最も好ましい実施態様において、上記の十分な発現レベルは、本明細書で別途詳記されるＡＭＨＲＩＩ発現スコア値の閾値として表される。
【００１６】
幾つかの実施態様において、上記ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体からなる。
【００１７】
幾つかの実施態様において、上記ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ：Antibody  Drug  Conjugate）からなる。
【００１８】
幾つかの実施態様において、上記ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体からなる。
【００１９】
幾つかの実施態様において、上記ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体を発現する細胞、例えば、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞又はＮＫ  Ｔ細胞、からなる。
【００２０】
幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、１以上の別個の抗癌剤と組み合わせられる。
【００２１】
本発明はまた、個体が、上記で定義されたようなＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して適格性を有するかどうか判断する方法であって、上記個体から予め得られた肺腫瘍組織サンプルが、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現するか決定する工程を含む上記方法に関する。
【００２２】
本発明は、個体が上記で定義されたようなＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して応答性であるかどうか判断する方法であって、上記個体から予め得られた肺腫瘍組織サンプルが、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現するか決定する工程を含む上記方法に関係する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、３Ｃ２３モノクロナール抗体の複数の変異体（variants）について、そのＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を例証する図である。図１Ａは、変異体のＶＨドメインを例証する。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、３Ｃ２３モノクロナール抗体の複数の変異体について、そのＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を例証する図である。図１Ｂは、各抗体変異体のＶＬドメインを例証する。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ａは、癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ  ｍＲＮＡ発現を例証する。横座標：図２Ａの左側から右側：ＨＣＴ１１６（結腸直腸癌）、ＣＯＶ４３４−ＷＴ（ヒト卵巣の顆粒膜腫瘍）、Ｋ５６２（ヒト骨髄性白血病）、及びＯＶ９０（ヒト悪性乳頭状漿液性腺癌）。縦座標：ＲＴ−ｑＰＣＲ（ＲＱ）によりアッセイされたＡＭＨＲＩＩ  ｍＲＮＡ発現レベル（任意単位表示）。
【図２Ｂ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ｂ：図２Ａと同一の癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩタンパク質膜発現：ＨＣＴ１１６（図２Ｂ）。横座標：蛍光シグナル強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位表示）。縦座標：細胞数。
【図２Ｃ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ｃ：図２Ａと同一の癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩタンパク質膜発現：ＣＯＶ４３４−ＷＴ（図２Ｃ）。横座標：蛍光シグナル強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位表示）。縦座標：細胞数。
【図２Ｄ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ｄ：図２Ａと同一の癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩタンパク質膜発現：Ｋ５６２（図２Ｄ）。横座標：蛍光シグナル強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位表示）。縦座標：細胞数。
【図２Ｅ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ｅ：図２Ａと同一の癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩタンパク質膜発現：ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ（図２Ｅ）。横座標：蛍光シグナル強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位表示）。縦座標：細胞数。
【図２Ｆ】図２Ａ〜図２Ｆは、様々な癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩ発現を例証する図である。図２Ｆ：図２Ａと同一の癌細胞株によるＡＭＨＲＩＩタンパク質膜発現：ＯＶ９０（図２Ｆ）。横座標：蛍光シグナル強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位表示）。縦座標：細胞数。
【図３Ａ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ａは、肺扁平上皮細胞癌患者由来の異種移植から得られた細胞（Ｒｅｆ  Ｌｕ７８６０）によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。横座標：蛍光強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位）。縦座標：細胞数。図３Ａにおいて：（ｉ）左側のピーク：無関係のアイソタイプ抗体と共にインキュベートした細胞；（ｉｉ）右側のピーク：３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共にインキュベートした細胞。
【図３Ｂ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｂは、大細胞肺癌患者由来の異種移植から得られた細胞（Ｒｅｆ  Ｌｕ７１６６）によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。縦座標：細胞数。図３Ｂにおいて：（ｉ）左側のピーク：無関係のアイソタイプ抗体と共にインキュベートした細胞；（ｉｉ）右側のピーク：３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共にインキュベートした細胞。
【図３Ｃ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｃは、肺扁平上皮細胞癌患者由来の異種移植から得られた細胞（Ｒｅｆ  Ｌｕ７２９８）によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。縦座標：細胞数。図３Ｃにおいて：（ｉ）左側のピーク：無関係のアイソタイプ抗体と共にインキュベートした細胞；（ｉｉ）右側のピーク：３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共にインキュベートした細胞。
【図３Ｄ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｄは、肺扁平上皮患者由来の異種移植から得られた細胞（Ｒｅｆ  Ｌｕ７４１４）によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。縦座標：細胞数。図３Ｄにおいて：（ｉ）左側のピーク：無関係のアイソタイプ抗体と共にインキュベートした細胞；（ｉｉ）右側のピーク：３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共にインキュベートした細胞。
【図３Ｅ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｅは、多形性細胞肺癌患者由来の異種移植から得られた細胞（Ｒｅｆ  Ｌｕ７５５８）によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。縦座標：細胞数。図３Ｅにおいて：（ｉ）左側のピーク：無関係のアイソタイプ抗体と共にインキュベートした細胞；（ｉｉ）右側のピーク：３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共にインキュベートした細胞。
【図３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｆは、外科的に切除されたヒトＮＳＣＬＣの健康な周辺部から得られた細胞によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する（そのＦＡＣＳプロファイルは図３Ｇにおいて例証される）。横座標：蛍光強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位）。縦座標：細胞数。
【図３Ｇ】図３Ａ〜図３Ｇは、フローサイトメトリーにより測定された、様々な肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現について例証する。図３Ｇは、外科的に切除されたヒトＮＳＣＬＣの新鮮なサンプルから得られた細胞によるＡＭＨＲＩＩタンパク質の膜発現について例証する。横座標：蛍光強度（ＦＬ２−Ａ色素）（任意単位）。縦座標：細胞数。
【図４】図４は、ヒト肺癌細胞を異種移植された動物の相対体重変化について例証する。処置は、ＳＣ１３１移植後の１８日目に開始した。２０ｍｇ／ｋｇでのビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）及びＧＭ１０２が、ｉ．ｖ．により、２週間毎に、３週間投与された。２０ｍｇ／ｋｇでのドセタキセルが、低速ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与された。５ｍｇ／ｋｇでのシスプラチン及び１００ｍｇ／ｋｇでのゲムシタビンが、ｉ．ｐ．により、１週間毎に、１〜３週間投与された。最初の群サイズ：９動物。縦座標：相対体重（ｋｇ）（平均±ｓｅｍ）。横座標：●  ビヒクル；■  ＧＭ１０２（２０ｍｇ／ｋｇ）；▲  ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）；▼  ＧＭ１０２とドセタキセルとの組み合わせ；◆  シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）とゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせ；〇  ＧＭ１０２、シスプラチン、及びゲムシタビンとの組み合わせ。
【図５】図５は、ヒト肺癌細胞を異種移植された動物において、その他の抗癌剤と組み合わせたとき、又は組み合わせないときに、３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体により誘発された腫瘍増殖変化について例証する。処置は、ＳＣ１３１移植後の１８日目に開始した。２０ｍｇ／ｋｇでのビヒクル及びＧＭ１０２が、ｉ．ｖ．により、２週間毎に、３週間投与された。２０ｍｇ／ｋｇでのドセタキセルが、低速ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与された。５ｍｇ／ｋｇでのシスプラチン及び１００ｍｇ／ｋｇでのゲムシタビンが、ｉ．ｐ．により、１週間毎に、１〜３週間投与された。最初の群サイズ：９動物。縦座標：腫瘍容積（ｍｍ３）（平均±ｓｅｍ）。横座標：●  ビヒクル；■  ＧＭ１０２（２０ｍｇ／ｋｇ）；▲  ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）；▼  ＧＭ１０２とドセタキセルとの組み合わせ；◆  シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）とゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせ；〇  ＧＭ１０２、シスプラチン、及びゲムシタビンとの組み合わせ。
【図６】図６は、ヒト肺癌細胞を異種移植された動物において、その他の抗癌剤と組み合わせたとき、又は組み合わせないときの３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の抗腫瘍活性について例証する。処置は、ＳＣ１３１移植後の１８日目に開始した。２０ｍｇ／ｋｇでのビヒクル及びＧＭ１０２が、ｉ．ｖ．により、２週間毎に、３週間投与された。２０ｍｇ／ｋｇでのドセタキセルが、低速ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与された。５ｍｇ／ｋｇでのシスプラチン及び１００ｍｇ／ｋｇでのゲムシタビンが、ｉ．ｐ．により、１週間毎に、１〜３週間投与された。最初の群サイズ：９動物。縦座標：ＴＣ（％）。横座標：●  ビヒクル；■  ＧＭ１０２（２０ｍｇ／ｋｇ）；▲  ドセタキセル（２０ｍｇ／ｋｇ）；▼  ＧＭ１０２とドセタキセルとの組み合わせ；◆  シスプラチン（５ｍｇ／ｋｇ）とゲムシタビン（１００ｍｇ／ｋｇ）との組み合わせ；〇  ＧＭ１０２、シスプラチン、及びゲムシタビンとの組み合わせ。
【図７】図７は、扁平上皮非小細胞肺癌腫瘍の異種移植を異種移植された動物において、ＧＭ１０２（低フコース抗ＡＭＨＲＩＩ抗体）により誘発された腫瘍増殖変化について例証する。各破線曲線：ビヒクル溶液の投与を受けた異種移植された動物。各連続曲線：ＧＭ１０２の投与を受けた異種移植された動物。横座標：処置開始後の期間（日数）。縦座標：腫瘍容積（ｍｍ３）。
【図８Ａ】図８Ａ及び図８Ｂは、扁平上皮非小細胞肺癌腫瘍の異種移植で異種移植された動物において、処置開始後２８日経過したときにＧＭ１０２（低フコース抗ＡＭＨＲＩＩ抗体）により誘発された腫瘍増殖変化について例証する。図８Ａ、縦座標：腫瘍容積（ｍｍ３）。図８Ａ、横座標：（ｉ）左側：ビヒクル溶液の投与を受けた異種移植された動物；（ｉｉ）右側：ＧＭ１０２の投与を受けた異種移植された動物。図８Ａ：試験が行われた異種移植された動物それぞれの絶対的な結果。
【図８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは、扁平上皮非小細胞肺癌腫瘍の異種移植で異種移植された動物において、処置開始後２８日経過したときにＧＭ１０２（低フコース抗ＡＭＨＲＩＩ抗体）により誘発された腫瘍増殖変化について例証する。図８Ｂ、縦座標：腫瘍容積（ｍｍ３）。図８Ｂ、横座標：（ｉ）左側：ビヒクル溶液の投与を受けた異種移植された動物；（ｉｉ）右側：ＧＭ１０２の投与を受けた異種移植された動物。図８Ｂ：図８Ａで示された結果から計算された平均値±標準偏差。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明者等は、ＡＭＨＲＩＩ受容体が、非小細胞肺癌組織、特に類表皮腫（epidemo&iuml;d）ＮＳＣＬＣ、腺癌（adenocarcinoma）ＮＳＣＬＣ、大細胞（large cells）ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌（pleiomorphic  cell  carcinoma）ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌（squamous  cell  carcinoma）ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌（neuroendocrine）ＮＳＣＬＣのサブタイプ、の細胞膜において発現していることを思いがけずに明らかにした。反対に、ＡＭＨＲＩＩは、ＳＣＬＣ又は神経内分泌若しくは腺房サブタイプに由来するＮＳＣＬＣにおいて膜レベルで検出されなかった。
【００２５】
語「ＡＭＨＲＩＩ」は、ヒト抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体を表す。ヒトＡＭＨＲＩＩの配列は、本明細書では配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）１８として記載されている（シグナルペプチドＭＬＧＳＬＧＬＷＡＬＬＰＴＡＶＥＡ（配列番号１７）を欠いている）。
【００２６】
本明細書で使用される場合、語「ＰＤＸ」は、「患者由来の異種移植（Patient-Derived  Xenograft）」という表現に対する頭文字である。患者由来の異種移植は、癌のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）モデルにおいて高頻度で使用され、患者の腫瘍に由来する組織又は細胞が移植される、すなわち免疫不全のヒト以外の哺乳動物、例えば免疫不全マウス、内に「グラフトされる」。
【００２７】
本明細書の実施例に示されるように、本発明者等は、ＡＭＨＲＩＩは、肺癌組織の細胞膜において発現しており、その頻度は検討される肺癌サブタイプに応じて変化することを見出した。
【００２８】
本発明者等の知識に従うと、肺癌細胞内でのＡＭＨＲＩＩの膜発現は、本明細書において初めて明らかにされた。
【００２９】
実例として、本明細書の実施例に示されるように、ＡＭＨＲＩＩは、扁平上皮ＮＳＣＬＣ又は大細胞ＮＳＣＬＣに作用された患者を起源とする腫瘍組織に由来する癌細胞によるよりも、類表皮腫ＮＳＣＬＣ又は腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ肺癌に作用された患者を起源とする腫瘍組織に由来する癌細胞による方が頻繁に発現している。比較的高頻度で検出されるということは、これら４種類の肺癌のうちの１つに作用された癌患者は、ＡＭＨＲＩＩを標的とする抗癌処置に対して、より高頻度で適格性を有する、すなわちより高頻度で応答性であることを意味するが、しかしそのような抗癌処置は、神経内分泌ＮＳＣＬＣに作用された患者の処置に関係する頻度はより低くなることを意味する。
【００３０】
本明細書の実施例に示されるように、任意のＮＳＣＬＣ肺癌は、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤により処置され得、但し、上記非婦人科腫瘍に由来する腫瘍細胞がその膜でＡＭＨＲＩＩを発現し、従って腫瘍細胞の膜においてＡＭＨＲＩＩタンパク質の存在が、任意の方法に従い検出又は決定できる。
【００３１】
従って、本明細書の実施例に提供される実験データは、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤、ここでは抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体が同一であっても、ＡＭＨＲＩＩ標的タンパク質が腫瘍細胞膜において発現していれば、異なる複数のＮＳＣＬＣ肺癌を処置する為に有効であることを示す。
【００３２】
ところで、標的結合性分子、例えば標的結合性抗体、からなる抗癌有効成分の分野において、同一の有効成分が異なる複数の癌を処置する為に有効である状況は前例がない。実例として、ペンブロリズマブと命名された抗ＰＤ１抗体は、異なる様々な種類の癌（但し、上記癌は同一の生理学的特性を共有する）の処置において有用な有効成分として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。
【００３３】
本明細書で使用される場合、肺癌細胞の細胞膜においてＡＭＨＲＩＩが発現することとは、上記肺癌細胞は、所与の定量可能なレベルで、又は上記定量可能なレベルよりも高いレベルでＡＭＨＲＩＩを発現することを意味する。
【００３４】
幾つかの実施態様に従うと、肺癌に作用された個体のＡＭＨＲＩＩ結合分子による処置に対する応答性は、上記個体から予め集められたサンプルに由来する肺癌細胞がその膜でＡＭＨＲＩＩを発現するかを判断することにより評価されうる。
【００３５】
幾つかの実施態様に従うと、肺癌に作用された個体のＡＭＨＲＩＩ結合性分子による処置に対する応答性は、上記個体から予め集められたサンプルに由来する肺癌細胞が、ＡＭＨＲＩＩを、その膜で決定済みの閾値を上回り発現するか判断することにより評価されうる。
【００３６】
非婦人科癌に作用された患者のＡＭＨＲＩＩ結合性剤、例えば抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、による処置に対する応答性を判断する為の幾つかの実施態様で使用されうるＡＭＨＲＩＩ膜発現レベルは、様々な技法を用いて評価されうるが、そのような技法として、（ｉ）腫瘍細胞膜においてＡＭＨＲＩＩを発現する、腫瘍サンプルに含まれる腫瘍細胞のパーセント（％）、（ｉｉ）腫瘍細胞膜に位置するＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数、及び（ｉｉｉ）試験される腫瘍細胞サンプルに含まれる腫瘍細胞のＦＡＣＳ  ＡＭＨＲＩＩシグナルプロファイルが挙げられる。
【００３７】
幾つかの実施態様に従うと、肺癌に作用された個体において予め集められた腫瘍サンプルに含まれる肺癌細胞は、膜性ＡＭＨＲＩＩが上記腫瘍サンプルに含まれる肺腫瘍細胞の５％又はそれ超において検出されるとき、膜性ＡＭＨＲＩＩを発現するものとして評価されうる。
【００３８】
従って、幾つかの実施態様において、肺癌に作用された個体は、上記個体から予め集められた腫瘍サンプルに含まれる肺腫瘍細胞の５％又はそれ超が、その膜でＡＭＨＲＩＩを発現するとき、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に応答しているものと判断される。
【００３９】
膜ＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現する腫瘍細胞の頻度（例えば、パーセント（％））を決定する為の方法は、本明細書の実施例を含め、本明細書において別途で開示される。
【００４０】
幾つかの実施態様に従うと、肺癌に作用された患者のＡＭＨＲＩＩ結合性剤、例えば、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、による癌処置に対する応答性は、上記患者から予め集められた腫瘍サンプルに含まれる腫瘍細胞の膜に存在するＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数を決定することにより評価されうる。
【００４１】
幾つかの実施態様において、肺癌に作用された患者は、上記患者から予め集められた腫瘍サンプルに含まれる腫瘍細胞により発現される膜ＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数が、ＡＭＨＲＩＩタンパク質１００００個又はそれ超であるとき、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対して応答性である、例えば抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による処置に対して応答性であるものとして分類されうる。
【００４２】
肺腫瘍細胞膜において発現されるＡＭＨＲＩＩタンパク質の数の評価は、（ａ）患者から予め集められた腫瘍組織サンプルに由来する細胞を含有するサンプルを、ＡＭＨＲＩＩタンパク質と特異的に結合する検出可能な化合物、例えば蛍光標識された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、と共にインキュベートする工程、及び更に（ｂ）上記サンプルに由来する各試験対象細胞に結合した上記検出可能な化合物の数、例えば蛍光標識された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の数を決定する工程を含む従来法を使用することにより実施されうる。腫瘍細胞膜において発現されるＡＭＨＲＩＩタンパク質の数の評価は、本明細書の実施例に示されるように、例えば、周知の蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ：fluorescence  activated  cell  sorting）技術を使用することにより実施されうる。
【００４３】
なおも別の実施態様において、肺癌に作用された患者は、上記患者から予め集められた腫瘍サンプルに含まれる腫瘍細胞のＡＭＨＲＩＩ  ＦＡＣＳプロファイルの分析により、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対して応答性であるとして分類されうる、例えば抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による処置に対して応答性であるとして分類されうる。
【００４４】
これらのなおもその他の実施態様に従うと、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）の方法において、（ｉ）アイソタイプの蛍光標識抗体と共にインキュベートされた腫瘍細胞から得られた平均蛍光強度（ＭＦＩ）値と、（ｉｉ）抗ＡＭＨＲＩＩ蛍光標識抗体と共にインキュベートされた腫瘍細胞の平均蛍光強度との比が、１．５又はそれ超であるとき、肺癌に作用された患者は、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対して応答性として分類されうる、例えば抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による処置に対して応答性であるとして分類されうる。
【００４５】
上記平均蛍光強度比を判断するには、アイソタイプ抗体及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の両方が、本明細書の実施例に示されるように、同一の蛍光剤、例えばＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社により商品化されているＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８色素、で標識される。
【００４６】
幾つかの更なる実施態様において、肺癌の個体のＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対する応答性は、（ｉ）ＡＭＨＲＩＩ結合性剤で処置されうる、肺癌由来の膜ＡＭＨＲＩＩ発現肺癌細胞と、（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩ結合性剤で処置されえない、肺癌由来の膜ＡＭＨＲＩＩ発現肺癌細胞との間を区別することを可能にするＡＭＨＲＩＩ発現スコアを計算することにより決定されうる。
【００４７】
従って、本発明者等は、肺癌に作用された患者、特に本明細書に記載されているＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して適格性を有する患者、すなわち本明細書に記載されているＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して特に応答性である患者、として、細胞膜においてＡＭＨＲＩＩを、関連する細胞標的の破壊を構成するのに十分高いレベルで発現する癌腫瘍を有する患者が挙げられることを明確にした。
【００４８】
次に、このような更なる実施態様に従うと、本発明者等は、肺癌患者から得られた癌細胞サンプル中で測定されたＡＭＨＲＩＩの発現が最低限度のレベルにあれば、それは、上記患者がＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対して応答性であること、従って上記患者は本明細書に記載されているＡＭＨＲＩＩ結合性剤で処置されうることを確認しうることを明確にした。
【００４９】
従って、上記個体から予め集められたサンプルに含まれる肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現レベルが、（ｉ）膜性ＡＭＨＲＩＩを発現する腫瘍細胞の頻度、例えばその膜でＡＭＨＲＩＩを発現する腫瘍細胞のパーセント（％）、及び（ｉｉ）上記腫瘍細胞によるＡＭＨＲＩＩ膜発現のレベル、例えば細胞１個当たりの膜性ＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数の両方について判断することにより評価されるときにも、肺癌に作用された個体のＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対する応答性がやはり判断されうる。
【００５０】
従って、このような更なる実施態様の幾つかにおいて、本発明者等は、ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤に対する、例えば抗ヒトＡＭＨＲＩＩ抗体に対する肺癌患者の応答性は、上記患者から予め集められた腫瘍細胞のサンプルにおいて、（ｉ）上記サンプルに含まれる腫瘍細胞がその膜におけるヒトＡＭＨＲＩＩタンパク質について最低限度の平均数を示すこと、及び（ｉｉ）その膜でヒトＡＭＨＲＩＩを発現する細胞の頻度、例えばその膜でヒトＡＭＨＲＩＩを発現する細胞のパーセント（％）が少なくとも閾値にあることを必要とすることを確認した。
【００５１】
従って、（ｉ）ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して適格性を有さない肺癌患者、すなわちＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して非応答性である肺癌患者と、（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して適格性を有する肺癌患者、すなわちＡＭＨＲＩＩ結合性剤、例えば抗ヒトＡＭＨＲＩＩ抗体による癌処置に対して応答性である肺癌患者との間の区別を可能にする特別なＡＭＨＲＩＩ発現スコア値を決定する為にも使用されうる、更なる方法についても本明細書において記載される。
【００５２】
より正確には、上記方法の実施態様に従うと、本明細書に記載されている肺癌に作用された患者で、本明細書に記載されているＡＭＨＲＩＩ結合性剤で抗肺癌処置されうる患者は、好ましくは膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値が１．０又はそれ超であることが確認された患者である。
【００５３】
膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコアは、試験対象の肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ発現の免疫組織化学的評価に基づきうるが、それは、肺癌に作用された個々人を起源とする複数の肺癌細胞サンプルから決定された膜性ＡＭＨＲＩＩスコアの平均値であり、その場合、所与の肺癌細胞サンプルに対する個々の膜性ＡＭＨＲＩＩスコアには、（ｉ）ＡＭＨＲＩＩ発現が検出不能な場合には「０」が割り振られ、（ｉｉ）有意なＡＭＨＲＩＩ発現が検出される場合には「１」が割り振られ、及び（ｉｉｉ）高いＡＭＨＲＩＩ発現が検出される場合には「２」が割り振られ、及び（ｉｖ）ＡＭＨＲＩＩの過剰発現が検出される場合には「３」が割り振られる。
【００５４】
実際、（ｉ）上記免疫組織化学的評価を通じて膜性ＡＭＨＲＩＩ発現レベルに割り振られたスコアと（ｉｉ）肺癌細胞１個について発現されるＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数との間には関連性が存在する。個々の膜性ＡＭＨＲＩＩスコアの割り振りを可能にする膜性ＡＭＨＲＩＩ発現レベルは、肺癌患者から予め集められた肺腫瘍細胞のサンプルから開始して、細胞１個当たりの膜性ＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数を決定することによりやはり評価されうることも本明細書の実施例において明らかにされる。
【００５５】
肺癌に作用された個体のＡＭＨＲＩＩ結合性剤による処置に対する、すなわち抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による処置に対する、応答性を判断する上記実施態様に従うと、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコアは、所与の肺癌細胞サンプルについて、（ｉ）上記肺癌細胞サンプル内のＡＭＨＲＩＩ発現細胞の頻度、及び（ｉｉ）上記ＡＭＨＲＩＩ発現細胞による膜性ＡＭＨＲＩＩ発現のレベルの両方を考慮することにより決定される。一般的に、所与の肺癌細胞サンプルの膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコアは、下記の式（Ｉ）：
Ｅスコア＝ＦＲＥＱ×ＡＭＨＲＩＩ＿ＬＥＶＥＬ、
により決定される。ここで、式中
Ｅスコアは、所与の肺癌細胞サンプルに対する膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値を意味し、
ＦＲＥＱは、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現が検出される上記肺癌細胞サンプルに含まれる細胞の頻度を意味し、
ＡＭＨＲＩＩ＿ＬＥＶＥＬは、上記所与の肺癌細胞サンプルに含まれるＡＭＨＲＩＩ発現細胞による膜性ＡＭＨＲＩＩの発現レベルを意味する。
【００５６】
実例として、（ｉ）細胞の５０％がＡＭＨＲＩＩを発現し（ＦＲＥＱ値＝０．５）、及び（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩ発現レベル（ＡＭＨＲＩＩ＿ＬＥＶＥＬ）＝２であるときに、Ｅスコア＝１．０が所与の肺癌細胞サンプルについて決定される。
【００５７】
幾つかの実施態様において、ＡＭＨＲＩＩ発現スコア（又はＥスコア）は、本明細書の実施例に示されるように免疫組織学的方法により決定される。これらの好ましい実施態様に従うと、ＡＭＨＲＩＩ膜発現は、ＡＭＨＲＩＩに対して特異的な検出可能抗体を使用すること、並びに（ｉ）細胞に結合した上記抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を有する上記細胞の頻度を決定すること、及び（ｉｉ）上記検出可能抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が膜発現したＡＭＨＲＩＩに結合した後に、その抗体により生み出されるシグナルの強度を決定することにより評価される。
【００５８】
本明細書の実施例に示されるように、頻度が異なるにもかかわらず、１．０又はそれ超の膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコアを有するＡＭＨＲＩＩ発現肺癌細胞が、様々な癌について確認された。
【００５９】
ＡＭＨＲＩＩ膜発現のレベルを決定する場合、細胞膜におけるＡＭＨＲＩＩの検出は、ＡＭＨＲＩＩに対して高い親和性及び高い特異性を有する抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体を使用することにより最も好ましく実施されるはずであり、それは３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体による実施例において例証される。
【００６０】
更に、ＡＭＨＲＩＩスコアを決定するという観点から免疫組織化学的方法によりＡＭＨＲＩＩ発現を決定することは、最も好ましくは、上記サンプルを適切な検出試薬（例えば、高親和性抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体、例えばＡＭＨＲＩＩへの結合について５５．３ｐＭのＫｄ値を有するモノクロナール３Ｃ２３Ｋ抗体）と接触させる前に、肺組織サンプルを慎重に事前処理することと関係する。サンプルを事前処理すれば、細胞表面において発現されるＡＭＨＲＩＩ分子の検出試薬に対する利用能を高めることができるはずである。実例として、本明細書の実施例において示されるように、事前処理法は、特別な工程、例えば（ｉ）マイクロウェーブ発生源への曝露により高温で脱蝋する工程、と、（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩ結合性の試薬、例えばストレプトアビジンコンジュゲート検出可能試薬とその後複合体化しうるビオチン化された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、の結合により生み出されるシグナルを増幅する為のシステムとの適切な組み合わせを含む。脱蝋する事前処理工程は、事前の組織固定工程に起因する検出シグナル消衰効果を逆転させるのに重要と思われる。本発明者等は、ＡＭＨＲＩＩ検出可能性は、組織固定工程で使用されるホルマリンの作用に対して特に敏感であることを明らかにした。
【００６１】
これは、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、肺癌に作用された患者の処置において意義のある処置剤でありうるものの、特定の患者が本明細書に記載されているＡＭＨＲＩＩ結合性剤による投与を受けることを判断する際には、腫瘍由来の肺癌細胞のＡＭＨＲＩＩ発現について予め試験するのが好ましいことも意味する。
【００６２】
更に、本発明者等は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が、肺癌を処置する為に有利に使用されうることを明らかにした。
【００６３】
従って、本発明者等は、ＡＭＨＲＩＩを標的とする医薬品が、このような種類の癌、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣを予防又は処置する為の新規処置ツールとして有用であることを、本明細書において明らかにした。
【００６４】
本発明に従うと、「を含む（comprising）」という表現、例えば「の工程を含む」、は、「からなる（consisting  of）」、例えば「の工程からなる」、としても理解され、「からなる（consisting  of）」、例えば「の工程からなる」、としても理解される。
【００６５】
ＡＭＨ受容体（ＡＭＨＲ又はＡＭＨＲ２又はＡＭＨＲＩＩ）は、ＴＧＦ−ベータ関連タンパク質に対するＩＩ型受容体のファミリーに属する単一の膜貫通ドメインを有するセリン／トレオニンキナーゼである。ＩＩ型受容体はそれ自体リガンドと結合するが、しかしシグナル伝達にはＩ型受容体の存在を必要とする。Ｉｍｂｅａｕｄら（1995年,  Nature  Genet,  Vol.  11:  382-388）は、ヒトＡＭＨＩＩ型受容体遺伝子をクローン化した。ヒトＡＭＨ受容体タンパク質は、５７３個のアミノ酸からなる：５７３個のアミノ酸のうちの１７、１２７、２６、及び４０３個が、シグナル配列、細胞外ドメイン（ＥＣＤ：extracellular  domain）、膜貫通ドメイン、及びセリン／トレオニンキナーゼドメインを含有する細胞内ドメインをそれぞれ形成する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、語「ＡＭＨＲＩＩ」とは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するヒト抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体を云う。
【００６７】
抗ミュラー管ホルモンホルモン受容体（ＡＭＨＲＩＩ）の発現は、免疫骨髄細胞の大規模な浸潤を受ける腫瘍である婦人科癌の技術分野においてすでに記載されている。ＡＭＨＲＩＩは、婦人科癌を処置する為の標的分子として識別されている。ＡＭＨＲＩＩを標的とする抗体が、このような癌を処置する為の処置ツールとして製造されている。卵巣癌を処置する為の、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２００８／０５３３３０号、及び同第２０１１／１４１６５３号に記載されている１２Ｇ４抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及びその変異体、並びにＰＣＴ出願に記載されている３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が特に引用されうる。抗ＡＭＨＲＩＩ抗体薬物コンジュゲートの使用による卵巣癌に対する特異的処置戦略について開示したＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号もまた記載されうる。
【００６８】
抗ミュラー管ホルモン受容体遺伝子（ＡＭＨＲＩＩ遺伝子）の発現は、Ｂｅｃｋらによっても記載されている（2016年,  cells  Reports,  Vol.  16:  657-671）。この著者らは、ＡＭＨシグナリングが、上皮可塑性、生存シグナリング、及びＮＳＣＬＣにおける選択的薬物耐性に対する重要な寄与因子であることを明らかにした。Ｂｅｃｋらの研究（２０１６年）は、特に、ｓｉＲＮＡを使用することによって様々な目的とする遺伝子の発現を調節することを通じて、抗ミュラー管ホルモンやそのＩＩ型受容体を含む、ＮＳＣＬＣ腫瘍のサブセット内のこれまでに定義されていないオートクリンシグナリング軸（Ｈｓｐ９０阻害剤のガネテスピブ及び承認済みの化学療法剤シスプラチンに対する応答にとって重要）の同定及び特徴付けについて報告することにより、ＮＳＣＬＣの病因における細胞内機構に対する見識をもたらした。この著者らは、ウェスタンブロット実験を通じて、３つの細胞株の細胞、すなわちＡ５４９及びＨ１２９９内に存在するＡＭＨ及びＡＭＨＲ２タンパク質（その産生はＳｉＲＮＡによって個々の遺伝子を標的とすることによりブロックされる）が少ないことも見出した。
【００６９】
本発明者等は、ＡＭＨＲＩＩが、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞、よりいっそう特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣを含む、様々なヒト肺癌細胞の表面においても発現していることをこのたび思いがけず見出した。本発明者等は、（ｉ）癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ遺伝子発現と、（ｉｉ）同じ癌細胞による細胞膜ＡＭＨＲＩＩタンパク質発現との間に関連性は認められないことも明らかにした。
【００７０】
ヒト肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ表面発現に関する本発明者等の知見は、肺癌患者から予め得られたヒト肺腫瘍組織サンプルを使用して実施された、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による免疫組織化学アッセイに特に由来する。また、ヒト肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ表面発現に関係する本発明者等の知見は、マウスを対象として、ヒト一次肺癌細胞の異種移植に由来する肺腫瘍組織サンプルにおいて実施された、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体による免疫組織化学アッセイからも得られた。
【００７１】
本発明者等は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、腫瘍細胞表面においてＡＭＨＲＩＩを発現するヒト肺癌、特に本明細書で開示されるＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌（非小細胞肺癌、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む）を処置する為に有用であることも明らかにした。特に、良好な抗癌活性が、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、並びに化学的抗癌剤、例えば周知の抗癌剤であるドセタキセル、シスプラチン、及び／又はゲムシタビン、と組み合わせた抗ＡＭＨＲＩＩ抗体について明らかにされた。
【００７２】
本発明者等は、当技術分野におけるＡＭＨＲＩＩ発現性の婦人科癌に対して証明済みの抗腫瘍能力を有する抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌、特に本明細書で開示されるＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌、例えば非小細胞肺癌、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣ、を予防又は処置する為にも有用であることを明らかにした。
【００７３】
より正確には、３Ｃ２３Ｋと命名される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、上記抗ＡＭＨＲＩＩ抗体処置が、１以上の別個の抗癌剤、例えばドセタキセル、シスプラチン、及び／又はゲムシタビン、を用いた処置と組み合わせられる場合を含め、ヒト肺癌に対して、特に本明細書で開示される非小細胞肺癌に対して、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で抗腫瘍活性を発揮することが、本明細書の実施例において明らかにされる。
【００７４】
なおも更に、本発明者等は、抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ抗体は、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で検出可能な毒性イベント、特に有意な体重減少、を誘発しないことも明らかにした。
【００７５】
従って、本発明は、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、より具体的には類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択される非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、を予防又は処置する為に使用する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤に関する。
【００７６】
本発明はまた、肺癌、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択される肺癌、の予防又は処置を目的とする医薬を調製する為のヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤の使用に関する。
【００７７】
本発明は、肺癌、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択される肺癌、を予防又は処置する為の方法であって、それを必要としている個体に本明細書で開示されるＡＭＨＲＩＩ結合性剤を投与する工程を含む上記方法に関する。
【００７８】
本発明に従い使用されうるＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＭＩＳ天然リガンド活性の模倣を必要としない。従って、本発明に従い使用されうるＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、それがＡＭＨＲＩＩに結合する際に、何らかの細胞シグナル伝達経路を活性化させるという必要性は認められない。むしろ、上記薬剤は、抗ＡＭＨＲＩＩ細胞毒性免疫コンジュゲート、ＡＤＣＣ誘発性若しくはＡＤＣ誘発性の抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、又はＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞を含む、細胞毒性誘発活性、例えば細胞毒性誘発物、をもっぱら目的として使用されるので、上記薬剤がＡＭＨＲＩＩに結合する能力が唯一必要とされる。
【００７９】
ＡＭＨＲＩＩ結合性剤
本明細書で使用される場合、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩに特異的に結合する任意の薬剤を含み、適切に提示された場合、上記薬剤が細胞膜発現型ＡＭＨＲＩＩに結合した後に、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩを発現する標的細胞の死を引き起こす。
【００８０】
本明細書に記載されている肺癌の処置で使用されるＡＭＨＲＩＩ結合性剤はまた、本明細書において「処置用ＡＭＨＲＩＩ結合性剤」と呼ばれうる。
【００８１】
一般的に、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩに特異的に結合するタンパク質又は核酸を含む。
【００８２】
ＡＭＨＲＩＩ結合性タンパク質は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、又は抗ＡＭＨＲＩＩ抗体のＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメントに由来する１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ：Complementary  Determining  Region）を含むタンパク質を主に含み、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性タンパク質は、操作された細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞又はＣＡＲマクロファージ、により、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ：Chimeric  Antigen  Receptor）として発現されうるものと理解される。
【００８３】
ＡＭＨＲＩＩ結合性核酸は、ＡＭＨＲＩＩに対するその特異的結合特性について特に選択された核酸アプタマーを主に包含する。
【００８４】
幾つかの好ましい実施態様において、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体又はそのＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメントである。
【００８５】
最も好ましい実施態様において、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体又はそのＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメントである。
【００８６】
これらの好ましい実施態様に従うと、抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体は、キメラ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、ヒト化抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、及びヒトＡＭＨＲＩＩ抗体、並びにＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメント、及びそのＡＭＨＲＩＩ結合性誘導体を包含する。
【００８７】
様々なＡＭＨＲＩＩ抗体が、当技術分野において公知であり、またＡＭＨＲＩＩ結合性剤として、本発明に従い使用されうる。本発明を実施する為に、当業者は、例証的には、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ社より参照番号ＭＨＨ−５７として上市されている組換えヒト抗ＡＭＨＲＩＩを使用しうる。
【００８８】
幾つかの実施態様において、本発明に従い使用されうる抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２００８／０５３３３０号で開示されるヒト化１２Ｇ４抗体である。
【００８９】
幾つかのその他の実施態様において、上記抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１１／１４１６５３号に記載されているヒト化抗体であり、そのヒト化抗体は３Ｃ２３抗体並びにその変異体を含み、その変異体は３Ｃ２３Ｋヒト化抗体を含む。
【００９０】
なおも更なる実施態様において、上記抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号に記載されている抗体である。これらの更なる実施態様に従うと、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号は、上記抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が細胞毒性剤とリンクしている抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の形態にあるＡＭＨＲＩＩ結合性剤を開示した。
【００９１】
ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体に対するモノクロナール抗体（及びそのヒト化誘導体）が、卵巣癌の処置を目的として当技術分野において開発されている（本明細書により参考としてそのまま援用されている欧州特許第２０９７４５３Ｂ１号明細書及び米国特許第８，２７８，４２３号明細書を参照）。
【００９２】
本発明に従い使用されうるＡＭＨＲＩＩ結合性剤の中でも、当業者は、モノクロナール抗体１２Ｇ４（ｍＡｂ  １２Ｇ４）、又はＡＤＣを形成する為に薬物若しくは検出可能な標識と共に誘導体化されたそのような抗体を含む、そのキメラ若しくはヒト化変異体を使用しうる。ｍＡｂ１２Ｇ４を産生するハイブリドーマは、２００６年９月２６日付けのブダペスト条約の合意に基づき、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パスツール研究所、２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５、フランス）に保管されており、ＣＮＣＭ寄託番号１−３６７３を有する。ｍＡｂ１２Ｇ４の軽鎖及び重鎖の可変ドメインは、ｍＡｂ  １２Ｇ４の相補性決定領域（ＣＤＲ）と同様に配列決定されている（本明細書により参考としてそのまま援用されている欧州特許第２０９７４５３Ｂ１号明細書及び米国特許第８，２７８，４２３号明細書を参照）。ｍＡｂ  １２Ｇ４及びそのキメラ又はヒト化変異体は、本明細書に開示するように、ＡＤＣの製造で使用可能である。
【００９３】
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＦＲ２０１１／０５０７４５（国際公開第２０１１／１４１６５３号）、及び米国特許第９，０１２，６０７号明細書は、そのそれぞれが本明細書により参照としてそのまま組み込まれており、マウス１２Ｇ４抗体に由来する新規のヒト化抗体について開示する。このようなヒト化抗体は、本発明の目的に照らし、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤として使用されうる。ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１１／１４１６５３号で開示される特別な実施態様において、抗体は、３Ｃ２３及び３Ｃ２３Ｋとして識別される抗体である。このような抗体の核酸配列及びポリペプチド配列は、本明細書において配列番号１〜１６として提供される。本発明の幾つかの観点では、目的とする抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、「配列番号〜を含む軽鎖、及び配列番号〜を含む重鎖を含む」と呼ばれうる。従って、様々な実施態様において、特に好ましい抗体は、ＡＤＣの生成用を含め、
ａ）配列番号２を含む軽鎖及び配列番号４を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  ＶＬ及びＶＨ配列）；
ｂ）配列番号６を含む軽鎖及び配列番号８を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  ＶＬ及びＶＨ配列）；
ｃ）配列番号１０を含む軽鎖及び配列番号１２を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３軽鎖及び重鎖）；
ｄ）配列番号１４を含む軽鎖及び配列番号１６を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ軽鎖及び重鎖）
を含む。
【００９４】
他の抗体（例えば、ヒト化又はキメラ抗体）は、図１Ａ及び図１Ｂに提示される重鎖及び軽鎖配列（例えば、抗体、例えば図内に開示されるＣＤＲ配列を含有するヒト化又はキメラ抗体）に基づくことができ、ＡＤＣの形成を含め、それを目的として抗ＭＡＨＲＩＩ結合性剤として使用されることができる。従って、本発明はまた、下記の配列を含む（又はそれからなる）複数のＣＤＲを含む／含有する抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の使用に関する：
ＣＤＲＬ−１：ＲＡＳＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｘ４Ｘ５Ａ（配列番号６５）、ここで、Ｘ１及びＸ２は独立してＳ又はＰであり、Ｘ３はＲ又はＷ又はＧであり、Ｘ４はＴ又はＤであり、Ｘ５はＩ又はＴである；
ＣＤＲＬ−２は、ＰＴＳＳＬＸ６Ｓ（配列番号６６）であり、ここで、Ｘ６はＫ又はＥである；並びに、
ＣＤＲＬ−３は、ＬＱＷＳＳＹＰＷＴ（配列番号６７）である；
ＣＤＲＨ−１は、ＫＡＳＧＹＸ７ＦＴＸ８Ｘ９ＨＩＨ（配列番号６８）であり、ここで、Ｘ７はＳ又はＴであり、Ｘ８はＳ又はＧであり、及びＸ９はＹ又はＮである；
ＣＤＲＨ−２は、ＷＩＹＰＸ１０ＤＤＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号６９）であり、ここで、Ｘ１０はＧ又はＥである、並びに、
ＣＤＲＨ−３は、ＧＤＲＦＡＹ（配列番号７０）である。
【００９５】
本発明はまた、肺癌、特に非小細胞肺癌及び小細胞肺癌を処置する為の、そのような抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を使用して生成されるＡＤＣの使用に関する。
【００９６】
本出願の範囲内にある抗体（例えば、キメラ又はヒト化の）として、下記の表に開示される抗体が挙げられる：或いは、ＡＭＨＲＩＩに特異的に結合するヒトモノクロナール抗体が、ＡＤＣを調製するのに使用されることができる。３Ｃ２３Ｋ抗体は、
ＶＨアミノ酸配列について配列番号１９
ＶＬアミノ酸配列について配列番号３６
により定義される。
【００９７】
下記の表１は、本発明に従い使用されうる抗ＡＭＨＲＩＩヒト化抗体をリスト化する。
【００９８】
【表１】
2020516655.tif 000002
2020516655.tif 000003
【００９９】
抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体のＡＭＨＲＩＩ結合性フラグメント又はＡＭＨＲＩＩ結合性誘導体
語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクロナール抗体（完全長又は天然のモノクロナール抗体を含む）、ポリクロナール抗体、多価抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び所望の生物学的活性を示す限り、抗体フラグメント（下記参照）を含む。
【０１００】
従って、本明細書で使用される場合、語「抗体」とは、例として、限定されることなく、任意の脊椎動物、例えば哺乳動物、例えばヒト、ヤギ、ウサギ、及びマウス、において免疫応答期間中に産生されるＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、その組み合わせ、及び類似した分子、並びに非哺乳動物の種、例えばサメ免疫グロブリン、を含む、免疫グロブリン又は免疫グロブリン様の分子を全体として指す。別途特に指摘されない限り、語「抗体」は、ＡＭＨＲＩＩに特異的に結合し、その他の分子（すなわち、ＡＭＨＲＩＩとは無関係である分子）との結合を実質的に排除する天然の免疫グロブリン及び「抗体フラグメント」又は「抗原結合性フラグメント」を含む。語「抗体」は、遺伝子操作された形態、例えばキメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）、も含む。Ｐｉｅｒｃｅ社のカタログ及びハンドブック、１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、１１１）；Kuby,  J.,  Immunology,  7th  Ed.,  W.H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  2013年も参照。
【０１０１】
語「モノクロナール抗体」とは、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在しうる自然発生的な突然変異の可能性はあるものの、それを除き同一である。モノクロナール抗体は、きわめて特異的であり、単一の抗原を標的とする。更に、異なる決定要素（エピトープ）を標的とする異なる抗体を一般的に含むポリクロナール抗体調製物とは対照的に、各モノクロナール抗体は、抗原上の単一の決定要素を標的とする。修飾語「モノクロナール」は、任意の特別な方法による抗体の製造を必要とするとは解釈されない。例えば、本発明に基づき使用されるモノクロナール抗体は、Kohler  et  al,  Nature  256:495  (1975年)により最初に記載されたハイブリドーマ法により作成されうる、又は組換えＤＮＡ法により作成されうる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。「モノクロナール抗体」は、例えば、Clackson  et  al,  Nature  352:624-628  (1991年)  or  Marks  et  al,  J.  MoI  Biol.  222:581-597  (1991年)に記載されている技術を使用してファージ抗体ライブラリーからも単離されうる。
【０１０２】
語「抗体フラグメント」とは、天然の抗体の一部分を指し、また天然の抗体の抗原決定可変領域を云う。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント、直鎖抗体、ｓｃＦｖ抗体、及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
「抗体重鎖」とは、本明細書で使用される場合、抗体が自然発生的な立体構造を有するとき、その全抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちのより大きな方を云う。
【０１０４】
「抗体軽鎖」とは、本明細書で使用される場合、抗体が自然発生的な立体構造を有するとき、その全抗体分子中に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちのより小さい方を指し、κ及びλ軽鎖は２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを云う。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは、特定の抗原を認識し、それに結合する抗体の２つの可変性の鎖（重鎖及び軽鎖）の部分を云う。ＣＤＲは、可変性の鎖の最も可変性の部分であり、抗体にその特異性を付与する。可変性の重鎖（ＶＨ）及び可変性の軽鎖（ＶＬ）のそれぞれには３つのＣＤＲが存在し、従って抗体分子１個当たり合計６つのＣＤＲが存在する。ＣＤＲは、抗原のエピトープと結合する役割を主に有する。各鎖のＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と一般的に呼ばれ、Ｎ末端から開始し連続して番号付けされ、また所定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別されるのが一般的である。従って、ＶＨＣＤＲ３は、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに位置する一方、ＶＬＣＤＲ１は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。ＬＨＲと結合する抗体は、特定のＶＨ領域及びＶＬ領域の配列、従って特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合性部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体間で異なるのはＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の限定された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこのような位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ：specificity  determining  residue）と呼ばれる。
【０１０６】
「フレームワーク領域」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、ＦＲｌ、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４として識別される４つのＦＲを一般的に有する。ＣＤＲが、Ｋａｂａｔに従い定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は残基１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、及び９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）あたりに配置され、また重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基内の残基１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、及び１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）あたりに配置される。
【０１０７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般的に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含み、同リンカーはｓｃＦｖが抗原と結合する為の所望の構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖをレビューするには、Pluckthun  in  The  Pharmacology  of  Monoclonal  Antibodies,  VoI  113,  Rosenburg  and  Moore  eds.  Springer-  Verlag,  New  York,  pp.  269-315  (1994年)を参照すること。
【０１０８】
語「ダイアボディ」とは、２つの抗原結合性部位を有する小さな抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬ）内で、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と繋がった重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上において２つのドメイン間で対形成可能となるには短すぎるリンカーを使用することにより、それらのドメインは、別の鎖の相補的なドメインと対形成することを強いられ、２つの抗原結合性部位を創出する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger  et  al,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  90:6444-6448  (1993年)により十分に記載されている。
【０１０９】
ダイアボディ又は二重特異性抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）様分子と非ＩｇＧ様分子の２つの分類に概ね分割されることができる。ＩｇＧ様ｂｓＡｂは、Ｆｃ媒介式のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：antibody-dependent  cell-mediated  cytotoxicity）、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ：complement-dependent  cytotoxicity）、及び抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ：antibody-dependent  cellular  phagocytosis）、を保持する（Spiess  et  al.,  2015年,  Mol  Immunol.,  Vol.  67(2)  :  95-106）。ｂｓＡｂのＦｃ領域は、精製を容易にし、また溶解度及び安定性を改善する。ＩｇＧ様フォーマットの二重特異性抗体は、そのより大きなサイズ及びＦｃＲｎ媒介式のリサイクリングに起因してより長い血清半減期を通常有する（Kontermann  et  al.,  2015年,  Bispecific  antibodies.  Drug  Discov  Today  Vol.  20(7)  :  838-47）。非ＩｇＧ様のｂｓＡｂは、サイズがより小型であり、組織貫通性が強化されている（Kontermann  et  al.,  2015年,  Bispecific  antibodies.  Drug  Discov  Today  Vol.  20(7)  :  838-47）。
【０１１０】
幾つかの好ましい実施態様に従うと、本発明に従う二重特異性抗体は、（ｉ）ＡＭＨＲＩＩと結合する第１の抗原結合性部位、及び（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩとは異なる標的抗原、特に癌細胞又は腫瘍微環境の免疫細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ、又はマクロファージ、により発現されうる標的抗原と結合する第２の抗原結合性部位を備える。幾つかの実施態様において、そのような二重特異性抗体では、上記第２の抗原結合性部位は、ＣＤ３である標的抗原と結合し、Ｔ細胞の関与を可能にする。この標的抗原は、ＰＤＬ１がＴ細胞又はＣＤ１６をロック解除してＮＫ又はマクロファージを活性化させることも可能にする。
【０１１１】
本明細書で定義されるモノクロナール抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の部分が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖（複数可）の残りの部分は、別の種に由来する、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗ＡＭＨＲＩＩ抗体（免疫グロブリン）、並びに所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを特に含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；及びMorrison  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  81  :6851-6855  (1984年））。
【０１１２】
本明細書で定義されるモノクロナール抗体は、ヒト化抗ＡＭＨＲＩＩ抗体も含む。ヒト以外（例えば、マウス）の抗体の「ヒト化」形態は、ヒト以外の免疫グロブリンに由来する最低限度の配列を含有するキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高度可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するヒト以外の種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類、の高度可変領域に由来する残基に置き換わっているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。幾つかの事例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応するヒト以外の残基に置き換わっている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体において見出されない残基を含みうる。このような改変は、抗体性能を更に精緻化する為になされる。一般的に、ヒト化抗体は、高度可変ループのすべて又は実質的にすべてが、ヒト以外の免疫グロブリンの高度可変ループに対応し、ＦＲ領域のすべて又は実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリン配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、一般的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含む。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、一般的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も任意選択で含む。更なる詳細については、Jones  et  al.,  Nature  321:522-525  (1986年);  Riechmann  et  al.,  Nature  332:323-329  (1988);  and  Presta,  Curr.  Op.  Struct.  Biol.  2:593-596  (1992年)を参照すること。
【０１１３】
本明細書で定義されるモノクロナール抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、抗ＡＭＨＲＩＩヒト抗体を更に含む。「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有し、及び／又は本明細書に開示されるヒト抗体を作成する為の任意の技術を使用して作成された抗体である。ヒト抗体のこの定義は、ヒト以外の抗原結合性残基を含むヒト化抗体を特に除外する。ヒト抗体は、当技術分野において公知の様々な技術を使用して製造されることができる。１つの実施態様において、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、その場合、ファージライブラリーがヒト抗体を発現する（Vaughan  et  al  Nature  Biotechnology  14:309-314  (1996年):  Sheets  et  al  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  95:6157-6162  (1998年））;  Hoogenboom  and  Winter,  J.  MoI.  Biol,  227:381  (1991年);  Marks  et  al,  J.  MoI.  Biol,  222:581  (1991年））。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を遺伝子導入動物、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているマウスに導入することによっても作成されることができる。免疫を誘発すると、遺伝子の再配列、アセンブリ、及び抗体レパートリーを含むあらゆる点で、ヒトに認められるものに酷似しているヒト抗体生成が観察される。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；同第５，５４５，８０６号明細書；同第５，５６９，８２５号明細書；同第５，６２５，１２６号明細書；同第５，６３３，４２５号明細書；同第５，６６１，０１６号明細書、及び下記の科学出版物：Marks  et  al.,  Bio/Technology  10:  779-783  (1992年);  Lonberg  et  al.,  Nature  368:  856-859  (1994年);  Morrison,  Nature  368:812-13  (1994年);  Fishwild  et  al.,  Nature  Biotechnology  14:  845-51  (1996年);  Neuberger,  Nature  Biotechnology  14:  826  (1996年);  Lonberg  and  Huszar,  Intern.  Rev.  Immunol.  13:65-93  (1995年)に記載されている。或いは、ヒト抗体は、標的抗原を標的とする抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により調製されうる（そのようなＢリンパ球は個体から回収されうる、又はイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）で免疫化される場合もある）。例えば、Cole  et  al,  Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy,  Alan  R.  Liss,  p.  77  (1985年);  Boerner  et  al.,  J.  Immunol,  147  (l):86-95  (1991年)；及び米国特許第５，７５０，３７３号明細書を参照すること。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「抗体突然変異体」又は「抗体変異体」とは、種依存性抗体のアミノ酸残基のうちの１以上が改変されている、種依存性抗体のアミノ酸配列変異体を云う。そのような突然変異体は、種依存性抗体と１００％に欠ける配列同一性又は類似性を必然的に有する。１つの実施態様において、抗体突然変異体は、種依存性抗体の重鎖又は軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％、のアミノ酸配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有する。この配列に関する同一性又は類似性は、配列をアライメントし、配列同一性のパーセント（％）が最大となるように、必要な場合にはギャップを導入した後の、種依存性抗体残基と同一である（すなわち、同一残基）、又は類似している（すなわち、一般的な側鎖特性に基づき同一の群に属するアミノ酸残基、下記参照）候補配列内のアミノ酸残基のパーセント（％）として本明細書において定義される。可変ドメイン外の抗体配列のＮ末端、Ｃ末端、又は内部において延長、欠損、又は挿入があっても、いずれも配列同一性又は類似性に影響を及ぼすとはみなされない。
【０１１５】
ヒト化抗体は、当技術分野において公知の技術に従い、ＣＤＲドメインをコードする核酸配列を取得し、ヒト化抗体を構築すること製造されうる。従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術に基づくヒト化抗体を製造する為の方法は当技術分野において周知されている（例えば、Riechmann  L.  et  al.  1988年;  Neuberger  M  S.  et  al.  1985年を参照）。抗体は、例えば、ＣＤＲ−グラフティング（欧州特許第２３９，４００号明細書；ＰＣＴ公報国際公開第９１／０９９６７号；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１明細書；及び同第５，５８５，０８９明細書）、ベニヤリング又はリサーフェイシング（欧州特許第５９２，１０６号明細書；同第５１９，５９６号明細書；Padlan  E  A  (1991);  Studnicka  G  M  et  al.  (1994年);  Roguska  M  A.  et  al.  (1994年））、及びチェインシャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号明細書）を含む、当技術分野において公知の様々な技術を使用してヒト化されることができる。そのような抗体を調製する為の一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願公開第１２５０２３号明細書及び国際公開第９６／０２５７６号を参照）。
【０１１６】
例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を増強する為に、本明細書で定義される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体をエフェクター機能に関して改変するのが望ましい場合もある。これは、抗体のＦｃ領域内に１以上のアミノ酸置換を導入することにより達成されうる。代替的又は付加的に、システイン残基（複数可）がＦｃ領域に導入されうるが、これによりこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。そのように生成されるホモ二量体抗体は、改善した内部移行能力、並びに／又は増加した補体媒介式の細胞殺傷及び抗体依存性細胞性細胞毒性活性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron  et  al,  J.  Exp  Med.  176:1191-1195  (1992年)  and  Shopes,  B.  J.  Immunol.  148:2918-2922  (1992年)を参照。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体は、Wolff  et  al.  Cancer  Research  53:2560-2565  (1993年)に記載されるように、ヘテロ二機能性架橋剤を使用しても調製されうる。或いは、デュアルＦｃ領域を有し、これにより強化された補体溶解及びＡＤＣＣ能力を有しうる抗体が操作されることができる。Stevenson  et  al.  Anti-  Cancer  Drug  Design  3:219-230  (1989年)を参照。国際公開第００／４２０７２号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）は、ヒトエフェクター細胞の存在下でＡＤＣＣ機能が改善している抗体で、そのＦｃ領域内にアミノ酸置換を含む抗体について記載する。好ましくは、ＡＤＣＣが改善している抗体は、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４において置換を含む（Ｅｕの残基ナンバリング）。好ましくは、変化したＦｃ領域は、これらの位置の１、２、又は３箇所において置換を含む又はそれからなるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。そのような置換は、ＣＩｑ結合及び／又はＣＤＣを増加させる置換（複数可）と組み合わせられる。
【０１１７】
ＣＩｑ結合性及び／又は補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）が変化している抗体は、国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６，１９４，５５１Ｂ１号明細書、同第６，２４２，１９５Ｂ１号明細書、同第６，５２８，６２４Ｂ１号明細書、及び同第６，５３８，１２４号明細書（Ｉｄｕｓｏｇｉｅら）に記載されている。抗体は、そのＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３、及び／又は３３４のうちの１以上においてアミノ酸置換を含む（Ｅｕの残基ナンバリング）。
【０１１８】
幾つかの実施態様において、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、糖鎖工学によって操作された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、語「糖鎖工学によって操作する（glycoengineering）」とは、結合性タンパク質組成物のグリコフォームプロファイルを変化させる為の当該技術分野において承認されている任意の方法を云う。そのような方法として、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）が異種のグリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシダーゼを発現するように遺伝子操作され、その遺伝子操作された宿主細胞内で結合性タンパク質組成物を発現させることが挙げられる。その他の実施態様において、糖鎖工学法は、特定のグリコフォームプロファイルに偏った条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「糖鎖工学によって操作された抗体」として、（ｉ）ハイパーガラクトシル化Ｆｃフラグメントを含む抗体、（ｉｉ）アマンノシル化Ｆｃフラグメント含む、ハイポマンノシル化Ｆｃフラグメントを含む抗体、及び（ｉｉｉ）アフコシル化Ｆｃフラグメントを含む、ハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを含む抗体が挙げられる。本明細書で使用される場合、糖鎖工学によって操作されたフラグメントとして、下記の変化したグリコシル化：（ｉ）ハイパーガラクトシレーション、（ｉｉ）ハイポマンノシレーション、及び（ｉｉｉ）ハイポフコシレーションのうちの１以上を含む群内から選択される変化したグリコシル化を有するＦｃフラグメントが挙げられる。従って、本発明に従い使用される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体に由来する、糖鎖工学によって操作されたＦｃフラグメントとして、ハイパーガラクトシル化、ハイポマンノシル化、及びハイポフコシル化Ｆｃフラグメントの例が挙げられる。
【０１２１】
当業者は、非改変型Ｆｃフラグメントよりも高い親和性を伴いながらＦｃ受容体に結合することが公知である、ハイパーガラクトシル化Ｆｃフラグメント、ハイポマンノシル化Ｆｃフラグメント、及びハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを含む抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を取得する為の周知技術を参照しうる。
【０１２２】
糖鎖工学によって操作された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体として、「低フコース」Ｆｃフラグメントとも呼ばれるハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを含む抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が挙げられる。
【０１２３】
イムノコンジュゲート、特に抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）
本発明の為に使用されうるＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、細胞毒性剤、例えば化学療法剤、毒素（例えば、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素的に活性な毒素又はその断片）、又は放射性同位体（すなわち、ラジオコンジュゲート）、にコンジュゲートした、本明細書で定義される抗体を含む。そのような抗体コンジュゲートとして、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号に記載されているコンジュゲートが挙げられる。ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号は、抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ抗体、並びに３Ｃ２３Ｋ  ＡＤＣコンジュゲートについて特に開示したが、それらについて、非婦人科ヒト癌に対するイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での抗癌活性が本明細書において明らかにされる。
【０１２４】
細胞毒性剤は、酵素的に活性な毒素を含む。使用されることができる酵素的に活性な毒素及びその断片として、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性の活性な断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites  fordii）タンパク質、ダイアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ（Phytolacca  americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica  charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（saponaria  officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコセセンスが挙げられる。
【０１２５】
様々な放射性核種が、ラジオコンジュゲート抗体を製造する為に利用可能である。
【０１２６】
抗体と細胞毒性剤とのコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号において開示されているカップリング剤、を使用して作成される。
【０１２７】
抗ＡＭＨＲＩＩ  ＡＤＣ抗体コンジュゲートの好ましいイムノコンジュゲートは、ＰＣＴ出願番号  国際公開第２０１７／０２５４５８号に記載されているコンジュゲートである。
【０１２８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、及びＣＡＲマクロファージを含むＣＡＲ細胞
幾つかの実施態様において、ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩ結合性受容体、又はＡＭＨＲＩＩ結合性受容体を発現する細胞、特にＡＭＨＲＩＩ結合性受容体を発現する、ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＡＭＨＲＩＩ結合性受容体ＮＫ細胞、又はＡＭＨＲＩＩ結合性受容体を発現するＣＡＲマクロファージである。
【０１２９】
従って、幾つかの実施態様において、ヒトＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体、最も好ましくは、そのＡＭＨＲＩＩ結合性領域が本明細書で開示されるモノクロナール抗ＡＭＨＲＩＩ抗体に由来する、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体である。
【０１３０】
一般的に、ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体は、（ｉ）細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、及び（ｉｉｉ）細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ：Chimeric  Antigen  Receptor）から構成され、その場合、細胞外ドメインは、本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体に由来するＡＭＨＲＩＩ結合性部分である。幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体の細胞外ドメインは、（ｉ）本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体に由来するＣＤＲを含む抗体ＶＨ鎖、及び（ｉｉ）本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体に由来するＣＤＲを含む抗体ＶＬ鎖を含む。幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体の細胞外ドメインは、本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖を含む。幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体の細胞外ドメインは、本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体のＶＨ鎖及びＣＨ鎖に由来するＣＤＲをそれぞれ含むＳｃＦｖである。幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性の操作された受容体の細胞外ドメインは、本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体のＶＨ鎖及びＣＨ鎖をそれぞれ含むＳｃＦｖである。
【０１３１】
そのようなＡＭＨＲＩＩ結合性受容体を発現する細胞、特にそのようなＡＭＨＲＩＩ結合性受容体を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、又はＣＡＲマクロファージからなるＡＭＨＲＩＩ結合性剤も本明細書に含まれる。
【０１３２】
語「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）とは、本明細書で使用される場合、抗原に結合する能力を有する細胞外ドメイン、細胞外ドメインの起源であるポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を云う。「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、時に「キメラ受容体」、「Ｔ−ボディ」、又は「キメラ免疫受容体（ＣＩＲ：chimeric  immune  receptor）」と呼ばれる。「ＡＭＨＲＩＩに結合する能力を有する細胞外ドメイン」とは、ＡＭＨＲＩＩに結合することができる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」とは、細胞内でシグナルを伝達して生物学的プロセスの活性化又は阻害を引き起こすドメインとして機能することが知られている任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜に分布することが知られており、また細胞外ドメインとシグナリングドメインとをリンクさせるように機能することができる任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のリンカーとして機能する「ヒンジドメイン」を任意選択で含みうる。
【０１３３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）又はリガンドがＴ細胞の活性化を促進する能力を有するＴ細胞シグナリングドメインに連結している、遺伝子操作された自系のＴ細胞である（Maher,  J.  (2012年)  ISRN  Oncol.2012:278093;  Curran,  K.J.  et  al.  (2012)  J.  Gene  Med.14:405-415;  Fedorov,  V.D.  et  al.  (2014年)  Cancer  J.20:160-165;  Barrett,  D.M.  et  al.  (2014年)  Annu.  Rev.  Med.65:333-347）。
【０１３４】
「細胞内シグナリングドメイン」とは、Ｔ細胞内部に見出される、又は見出されるように操作されたＣＡＲの部分を意味する。「細胞内シグナリングドメイン」は、Ｔ細胞の原形質膜内でＣＡＲを繋ぎ止める「膜貫通ドメイン」を含有する場合もあれば、含有しない場合もある。１つの実施態様において、「膜貫通ドメイン」及び「細胞内シグナリングドメイン」は、同一のタンパク質（例えば、ＣＤ３ζ）に由来するが、その他の実施態様において、細胞内シグナリングドメイン及び膜貫通ドメインは、異なるタンパク質に由来する（例えば、ＣＤ３ζの膜貫通ドメイン及びＣＤ２８分子の細胞内シグナリングドメイン、又はその逆）。
【０１３５】
「同時刺激エンドドメイン」とは、Ｔ細胞同時刺激分子に由来する細胞内シグナリングドメイン又はそのフラグメントを意味する。Ｔ細胞同時刺激分子の非限定的なリストは、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２７、ＣＤ２７０、ＣＤ３０、及びＩＣＯＳを含む。同時刺激エンドドメインは、同一の又は異なる同時刺激エンドドメインに由来する膜貫通ドメインを含む場合もあれば、含まない場合もある。
【０１３６】
「細胞外抗原結合性ドメイン」とは、ＡＭＨＲＩＩを特異的に認識し、それと結合するＣＡＲの部分を意味する。
【０１３７】
好ましい実施態様において、「細胞外結合性ドメイン」は、抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体に由来する。例えば、「細胞外結合性ドメイン」は、モノクロナール抗体に由来するＦａｂドメインの全部又は一部を含みうる。特定の実施態様において、「細胞外結合性ドメイン」は、特定の抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体の相補性決定領域を含む。なおも別の実施態様において、「細胞外結合性ドメイン」は、本明細書で定義される抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体から得られる単鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
【０１３８】
好ましい実施態様において、細胞外結合性ドメインは、本明細書に記載されている抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体のうちの任意の１つ、特に３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体に由来する。
【０１３９】
Ｉ．細胞外抗原結合性ドメイン
１つの実施態様において、本発明のＣＡＲは、本明細書に記載されている抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体のうちの１つに由来する細胞外抗原結合性ドメインを含む。
【０１４０】
１つの実施態様において、細胞外結合性ドメインは、下記のＣＤＲ配列を含む：
ＣＤＲＬ−１は、ＲＡＳＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｘ４Ｘ５Ａ（配列番号６５）であり、ここで、Ｘ１及びＸ２は独立にＳ又はＰであり、Ｘ３はＲ又はＷ又はＧであり、Ｘ４はＴ又はＤであり、Ｘ５はＩ又はＴであり；
ＣＤＲＬ−２は、ＰＴＳＳＬＸ６Ｓ（配列番号６６）であり、ここで、Ｘ６は、Ｋ又はＥであり；
ＣＤＲＬ−３は、ＬＱＷＳＳＹＰＷＴ（配列番号６７）であり；
ＣＤＲＨ−１は、ＫＡＳＧＹＸ７ＦＴＸ８Ｘ９ＨＩＨ（配列番号６８）であり、ここで、Ｘ７はＳ又はＴであり、Ｘ８はＳ又はＧであり、Ｘ９はＹ又はＮであり、
ＣＤＲＨ−２は、ＷＩＹＰＸ１０ＤＤＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号６９）であり、ここで、Ｘ１０はＧ又はＥであり、
ＣＤＲＨ−３は、ＧＤＲＦＡＹ（配列番号７０）である。
【０１４１】
ＩＩ．κＭａｂ  ｓｃＦｖのＶＬドメインとＶＨドメインとの間のリンカー
更なる実施態様において、抗ＡＭＨＲＩＩ  ＶＬは、可撓性リンカーを介して抗ＡＭＨＲＩＩ  ＶＨとリンクしている。特に、可撓性リンカーは、約１０〜３０個のアミノ酸（例えば、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、又は５個のアミノ酸）からなるグリシン／セリンリンカーであり、構造（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。
【０１４２】
ＩＩＩ．細胞外抗原結合性ドメインと細胞内シグナリングドメインとの間のスペーサー
細胞外抗原結合性ドメインは、「スペーサー」の使用により、細胞内シグナリングドメインとリンクしている。スペーサーは、抗原の認識及びそれとの結合が容易となるように抗原結合性ドメインが配向可能となるのに十分可撓性であるように設計される。スペーサーは、抗ＡＭＨＲＩＩ免疫グロブリンそれ自体に由来しうるが、またＩｇＧ１ヒンジ領域、又はＩｇＧのＣＨ２及び／若しくはＣＨ３領域を含みうる。
【０１４３】
ＩＶ．細胞内シグナリングドメイン
細胞内シグナリングドメインは、ＣＤ３鎖の全部又は一部を含む。ＣＤは、ＣＤ２４７としても知られているが、ＣＤ４又はＣＤ８のＴ細胞コレセプターと共に、細胞外抗原認識を細胞内シグナルカスケードに結びつける役割を有する。
【０１４４】
ＣＤ３ζシグナリングドメインを含めることに付加して、同時刺激分子を組み込むことにより、マウスモデル及び臨床トライアルにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞活性が増強することが明らかにされている。ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ２７０、ＣＤ３０、及びＯＸ−４０を含むいくつかが検討されている。
【０１４５】
特定の実施態様において、（ｉ）単離された細胞の集団にＣＡＲをコードする核酸配列を形質導入する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）の上記核酸配列が瑕疵なく形質導入された細胞の部分集団を選択する工程とを含む、或いはそれらの工程から実質的になるＣＡＲ発現細胞を生み出す方法が開示される。幾つかの実施態様において、単離された細胞は、Ｔ細胞、動物のＴ細胞、哺乳動物のＴ細胞、ネコのＴ細胞、イヌのＴ細胞、又はヒトのＴ細胞であり、これによりＣＡＲ  Ｔ細胞が生成する。特定の実施態様において、単離された細胞は、ＮＫ細胞、例えば動物のＮＫ細胞、哺乳動物のＮＫ細胞、ネコのＮＫ細胞、イヌのＮＫ細胞、又はヒトのＮＫ細胞であり、これによりＣＡＲ  ＮＫ細胞が生成する。
【０１４６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ  Ｔ細胞、及びＣＡＲマクロファージの療法への応用
本明細書に記載されているＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、及びＣＡＲマクロファージを含むＣＡＲ細胞は、ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺腫瘍を処置する為に使用されうる。本発明のＣＡＲ細胞は、好ましくは本明細書に記載されている肺癌、特に非小細胞肺癌又は小細胞肺癌に作用された患者のＡＭＨＲＩＩ発現性の肺腫瘍を処置する為に使用される。
【０１４７】
本発明のＣＡＲ細胞は、単独で、或いは賦形剤、公知の抗癌処置薬、及び／又はその他のコンポーネント、例えばサイトカイン若しくは免疫賦活性であるその他の細胞集団、と組み合わせて投与されうる。
【０１４８】
本開示の方法の観点は、それを必要としている対象において腫瘍の増殖を阻害し、及び／又はそれを必要としている癌患者を処置する為の方法と関連する。幾つかの実施態様において、腫瘍は、固形肺腫瘍である。
【０１４９】
本明細書に開示されるＣＡＲ細胞は、単独で、或いは賦形剤、公知の抗癌処置薬、及び／又はその他のコンポーネント、例えばサイトカイン若しくは免疫賦活性であるその他の細胞集団、と組み合わせて投与されうる。ＣＡＲ細胞は、第１ライン、第２ライン、第３ライン、第４ライン、又は更なる療法でありうる。ＣＡＲ細胞は、その他の療法と組み合わせられることができる。そのような療法の非限定的な例として、化学療法剤又は生物学的製剤が挙げられる。適切な処置レジメンは処置担当医師又は獣医師により決定される。
【０１５０】
本発明のＣＡＲを含む医薬組成物は、処置される又は阻止される疾患に適する方式で投与されうる。投与の量及び頻度は、患者の状態、並びに患者の疾患の型及び重症度等の因子により決定されるが、適切な用量は臨床トライアルにより決定されうる。
【０１５１】
療法への応用
本明細書で別途すでに開示されているように、（ｉ）本明細書で開示される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、（ｉｉ）本明細書で開示される抗体薬物コンジュゲート、及び（ｉｉｉ）本明細書で開示されるＣＡＲ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞、ＣＡＲ  ＮＫ細胞、及びＣＡＲマクロファージを含む）を含む、本明細書で開示されるＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、より正確には類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣを予防又は処置する為に使用されうる有効成分からなる。
【０１５２】
抗腫瘍抗原抗体又は抗腫瘍抗原ＣＡＲ細胞を利用する癌処置法は、当業者に周知されている。
【０１５３】
幾つかの実施態様において、癌患者は、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤、例えば抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、抗ＡＭＨＲＩＩ  ＡＤＣ、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、による処置を実施する前に、患者の腫瘍細胞がＡＭＨＲＩＩをその表面において発現しているか判断する為に試験される。
【０１５４】
ＡＭＨＲＩＩの膜発現を検出する為のそのような予備的なテストは、低頻度でＡＭＨＲＩＩを発現する肺癌の処置にとって好ましい。対照的に、ＡＭＨＲＩＩの膜発現を検出する為のそのような予備的なテストは、ＡＭＨＲＩＩを高頻度で発現する癌、例えば実例として類表皮腫ＮＳＣＬＣ、の処置では実施されない場合もある。
【０１５５】
従って、幾つかの実施態様において、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣ、を含む、ＡＭＨＲＩＩ陽性の肺癌に作用された個体の予防又は処置に使用する為の本明細書で定義されるＡＭＨＲＩＩ結合性剤に関する。
【０１５６】
本発明は、ＡＭＨＲＩＩ陽性の肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣ、を含む肺癌）に作用された個体の予防又は処置用の医薬を調製する為のＡＭＨＲＩＩ結合性剤の使用に関する。
【０１５７】
本発明はまた、ＡＭＨＲＩＩ陽性の肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、多形性細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣを含む）に作用された個体を予防又は処置する為の方法であって、上記個体に抗ＡＭＨＲＩＩ結合性剤を投与する工程を含む上記方法に関する。
【０１５８】
個体から予め得られた肺癌組織サンプル上で細胞表面ＡＭＨＲＩＩタンパク質発現を検出する方法を実施することにより、上記個体は、ＡＭＨＲＩＩ陽性癌に作用された個体として指定されうる。細胞表面ＡＭＨＲＩＩタンパク質発現の検出は、当業者に周知されている様々な方法に従い実施されうる。細胞表面ＡＭＨＲＩＩタンパク質発現の検出法として、特に本明細書の実施例において例証される免疫組織化学法並びに蛍光活性化セルソーティング法が挙げられる。
【０１５９】
本発明はまた、個体が、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して適格性を有するかどうか、すなわち個体が、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して応答性であるかどうか判断する方法であって、上記個体から予め得られた肺腫瘍組織サンプルが、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現するかどうか判断する工程を含む上記方法に関する。
【０１６０】
従って、本発明はまた、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、特に類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣを含む群から選択されるＮＳＣＬＣ、に作用された個体が、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して適格性を有する、すなわちＡＭＨＲＩＩ結合性剤による癌処置に対して反応性であるかどうか判断する方法であって、
ａ）上記患者から得られた癌細胞がその膜でＡＭＨＲＩＩを発現しているか判断すること、
ｂ）上記肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩの膜発現が工程ａ）において確認された場合には、上記患者は、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して適格性を有する、すなわちＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して反応性であると結論付けること
の工程を含む上記方法に関する。
【０１６１】
上記方法の好ましい実施態様において、（ｉ）ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値が工程ａ）において決定されるとき、及び（ｉｉ）上記ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値が閾値スコア値又はそれ超であるとき、上記患者は、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して適格性を有する（すなわち、反応性である）と、工程ｂ）において結論される。ＡＭＨＲＩＩスコア値は、最も好ましくは、本明細書で別途記載されている式（Ｉ）を使用することにより計算される。
【０１６２】
従って、好ましい実施態様に従うと、方法の工程ａ）は、免疫組織化学法、例えば本明細書の実施例において示される方法、により実施される。
【０１６３】
工程ａ）において使用される癌細胞は、上記癌患者から予め集められた生検組織サンプルに由来するのが一般的である。
【０１６４】
好ましくは、工程ａ）は、本明細書に特に記載されているもののなかから選択された抗ＡＭＨＲＩＩ抗体、特に３Ｃ２３Ｋ抗体を使用することにより実施され、そのＡＭＨＲＩＩ結合性は、周知の抗体検出技術、例えば本明細書の実施例において開示される技術、に従い、二次標識抗体を使用することにより検出されうる。
【０１６５】
好ましくは、上記肺癌の群に含まれる肺癌に作用された患者は、下記の式（Ｉ）
【０１６６】
Ｅスコア＝ＦＲＥＱ×ＡＭＨＲＩＩ＿ＬＥＶＥＬ
（式中、
Ｅスコアは、所与の癌細胞サンプルに対する膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値を意味し、
ＦＲＥＱは、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現が検出される上記肺癌細胞サンプルに含まれる細胞の頻度を意味し、
ＡＭＨＲＩＩ＿ＬＥＶＥＬは、上記所与の肺癌細胞サンプルに含まれるＡＭＨＲＩＩ発現細胞によるＡＭＨＲＩＩの膜発現レベルを意味する）
に従い、Ｅスコア値の決定を可能にするスコアリング法を実施したときに、上記癌患者を起源とする癌細胞サンプルにおいて、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値が１．０又はそれ超と決定されるとき、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による肺癌処置に対して適格性を有する（すなわち、応答性である）と判断される。
【０１６７】
従って、本発明は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）に作用された患者を処置する為の方法であって、
ａ）上記個体から予め得られた腫瘍組織サンプルが、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩタンパク質を発現するか判断すること、
ｂ）ＡＭＨＲＩＩの細胞表面発現が工程ａ）において確認された場合には、上記個体を、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤で処置すること
の工程を含む上記方法に関する。
【０１６８】
最も好ましい実施態様において、上記腫瘍サンプルが、上記式（Ｉ）に従い計算された膜性ＡＭＨＲＩＩ発現スコア値（Ｅスコア）について、１．０又はそれ超（１．５又はそれ超のＥスコア値を含む）を有するとき、ＡＭＨＲＩＩ発現が工程ａ）において確認される。
【０１６９】
上記方法の最も好ましい実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、本明細書で定義される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体若しくはそのフラグメント、又は本明細書で定義されるＣＡＲ細胞（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞若しくはＣＡＲ  ＮＫ細胞）からなる。
【０１７０】
幾つかの実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性剤は、唯一の抗癌有効成分として使用される。
【０１７１】
幾つかのその他の実施態様において、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による抗癌処置は、上記個体に、放射線療法処置及び化学療法処置を含む１以上の更なる抗癌処置を実施することも含む。
【０１７２】
従って、そのようなその他の実施態様に従うと、上記ＡＭＨＲＩＩ結合性剤による抗癌処置は、上記個体に１以上の更なる抗癌有効成分を投与することも含む。
【０１７３】
組み合わせ療法
本明細書の実施例で示されるように、有効な抗肺癌肺療法は、抗ＡＭＨＲＩＩモノクロナール抗体が、１以上の別個の抗癌剤と組み合わせられる療法を含む。本明細書の実施例は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体が、ドセタキセルと、又はシスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせと組み合わせられる肺癌に対する組み合わせ療法について例証する。
【０１７４】
「抗癌剤」は、例えば、高分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質等）の生合成を妨害する、又は細胞の増殖を阻害する、又はアポトーシス又は細胞毒性により細胞死をもたらすことができる任意の分子として定義される。抗癌剤のなかでも、アルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、及び挿入剤、代謝抵抗物質、切断試薬、チューブリンを妨害する薬剤、モノクロナール抗体が記載されうる。
【０１７５】
「薬学的に許容されるビヒクル」とは、生体系、例えば細胞、細胞培養物、組織、又は微生物、と適合性を有する無毒性の物質を云う。
【０１７６】
特別な観点に従うと、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体、特に本明細書に記載されている抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む医薬組成物に関する。
【０１７７】
幾つかの実施態様において、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体、特に本明細書に記載されている抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む医薬組成物に関する。
【０１７８】
幾つかの実施態様において、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む医薬組成物であって、抗癌剤が、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、及びシスプラチンとゲムシタビンの組み合わせを含む群から選択される、上記医薬組成物に関する。
【０１７９】
抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と組み合わせて使用されうるその他の抗癌剤として、パクリタキセル、又は白金塩、例えばオキサリプラチン、シスプラチン及びカルボプラチン、が挙げられる。
【０１８０】
抗癌剤は、白金塩、小分子、モノクロナール抗体、さもなければ抗血管新生ペプチボディ以外の化学療法剤からも選択される。
【０１８１】
白金塩以外の化学療法剤として、挿入剤（ＤＮＡの複製及び転写を遮断する）、例えばアントラサイクリン（ドキソルビシン、ペグ化されたリポソームドキソルビシン）、トポイソメラーゼ阻害剤（カンプトテシン及び誘導体：カレニテシン、トポテカン、イリノテカン）、さもなければＳＪＧ−１３６、ヒストンデアセチラーゼの阻害剤（ボリノスタット、ベリノスタット、バルプロ酸）、アルキル化剤（ベンダムスチン、グルホスファミド、テモゾロミド）、抗有糸分裂性植物アルカロイド、例えばタキサン（ドセタキセル、パクリタキセル）、ビンカアルカロイド（ビノレルビン）、エポチロン（ＺＫ−エポチロン、イクサベピロン）、代謝抵抗物質（ゲムシタビン、エラシタラビン、カペシタビン）、キネシンスピンドルタンパク質（ＫＳＰ）阻害剤（イスピネシブ）、トラベクテジン、さもなければオンブラブリン（コンブレタスタチンＡ−４誘導体）、が挙げられる。
【０１８２】
小分子の中では、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤：オラパリブ、イニパリブ、ベリパリブ、ルカパリブ、ＣＥＰ−９７２２、ＭＫ−４８２７、ＢＭＮ−６７３、キナーゼ阻害剤、例えばチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）、が挙げられ、そのなかでも、抗ＶＥＧＦＲ分子（ソラフェニブ、スニチニブ、セジラニブ、バンデタニブ、パゾパニブ、ＢＩＢＦ１１２０、セマクサニブ、カボザンチニブ、モテサニブ）、抗ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ分子（エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ）、抗ＰＤＧＦＲ分子（イマチニブ、ＢＩＢＦ１１２０）、抗ＦＧＦＲ分子（ＢＩＢＦ１１２０）、オーロラキナーゼ／チロシンキナーゼ阻害剤（ＥＮＭＤ−２０７６）、Ｓｒｃ／Ａｂｌキナーゼ阻害剤（サラカチニブ）、又はペリホシン、テムシロリムス（ｍＴＯＲ阻害剤）、アルボシジブ（サイクリン依存性キナーゼ阻害剤）、ボラセルチブ（ＰＬＫ１（ｐｏｌｏ様キナーゼ１）タンパク質の阻害剤）、ＬＹ２６０６３６８（チェックポイントキナーゼ１（ｃｈｋ１）の阻害剤）、ＧＤＣ−０４４９（ヘッジホッグ経路阻害剤）、ジボテンタン（ＥＴＡ受容体のアンタゴニスト）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ（プロテアソーム阻害剤）、サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＮＦ−α、ＩＮＦ−γ、が特筆されうる。
【０１８３】
抗体のなかでも、抗ＶＥＧＦ：ベバシズマブ、抗ＶＥＧＦＲ：ラムシルマブ、抗ＨＥＲ２／ＥＧＦＲ：トラスツズマブ、ペルツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ＭＧＡＨ２２、マツズマブ、抗ＰＤＧＦＲα：ＩＭＣ−３Ｇ３、抗葉酸受容体：ファーレツズマブ、抗ＣＤ２７：ＣＤＸ−１１２７、抗ＣＤ５６：ＢＢ−１０９０１、抗ＣＤ１０５：ＴＲＣ１０５、抗ＣＤ２７６：ＭＧＡ２７１、抗ＡＧＳ−８：ＡＧＳ−８Ｍ４、抗ＤＲＳ：ＴＲＡ−８、抗ＨＢ−ＥＧＦ：ＫＨＫ２８６６、抗メソテリン：アマツキシマブ、ＢＡＹ９４−９３４３（免疫毒素複合体）、カツマキソマブ（ＥｐＣＡＭ／ＣＤ３二重特異性抗体）、抗ＩＬ２Ｒ：ダクリズマブ、抗ＩＧＦ−１Ｒ：ガニツマブ、抗ＣＴＬＡ−４：イピリムマブ、抗ＰＤ１：ニボルマブ及びペンブロリズマブ、抗ＣＤ４７：Ｗｅｉｓｓｍａｎ社Ｂ６Ｈ１２及びＨｕ５Ｆ９、Ｎｏｖｉｍｍｕｎｅ社５Ａ３Ｍ３、ＩＮＨＩＢＲＸ２Ａ１、Ｆｒａｚｉｅｒ社ＶｘＰ０３７−０１ＬＣ１抗体、抗Ｌｅｗｉｓ  Ｙ：Ｈｕ３Ｓ１９３、ＳＧＮ−１５（免疫毒素複合体）、抗ＣＡ１２５：オレゴボマブ、抗ＨＧＦ：リロツムマブ、抗ＩＬ６：シルツキシマブ、抗ＴＲ２：ティガツズマブ、抗α５β１インテグリン：ボロシキシマブ、抗ＨＢ−ＥＧＦ：ＫＨＫ２８６６が特筆されうる。抗血管新生ペプチボディは、ＡＭＧ３８６及びＣＶＸ−２４１より選択される。
【０１８４】
より具体的には、薬学的に許容されるビヒクル、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体と組み合わせて、有効成分として含む医薬組成物が、本明細書において記載され、その場合、抗癌剤は、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、及びシスプラチンとゲムシタビンとの組み合わせを含む群から選択される。
【０１８５】
よりいっそう具体的には、本明細書では、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む医薬組成物であって、突然変異したヒト化モノクロナール抗体が本明細書において３Ｃ２３Ｋと呼ばれ、抗癌剤が、ドセタキセル、シスプラチン、ゲムシタビン、及びシスプラチンとゲムシタビンの組み合わせを含む群から選択される、上記医薬組成物が記載される。
【０１８６】
特定の態様では、静脈内又は腹腔内経路による投与を目的とする製剤において、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む医薬組成物が本明細書に記載されている。
【０１８７】
別の特別な観点では、本発明は、抗癌剤、及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、静脈内又は腹腔内経路により投与することを目的とする製剤としての上記組成物に関する。
【０１８８】
別の特別な観点では、本発明は、抗癌剤及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、モノクロナール抗体及び抗癌剤が、分離、同時、又は連続して投与することを目的とする、上記組成物に関する。
【０１８９】
抗体及び抗癌剤は、１つの同じ医薬組成物内で組み合わせられうる、又は同時若しくは連続して投与されうる、分離した医薬組成物の形態で使用されうる。特に、製品は分離して、すなわち同時に、又は例えば時間間隔を設けて独立に投与されうる。
【０１９０】
より具体的には、本発明は、抗癌剤及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、上記抗体及び抗癌剤が、同一の医薬組成物内で組み合わされている、上記組成物に関する。
【０１９１】
別の特別な観点に従うと、本発明は、抗癌剤及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、患者に投与される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の処置有効量が、約０．０７ｍｇ〜約３５０００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約７０００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約１４００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約７００ｍｇ、より好ましくは約０．７ｍｇ〜約７０ｍｇの範囲内にある上記組成物に関する。
【０１９２】
別の特別な観点に従うと、本発明は、抗癌剤及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、患者に投与される抗癌剤の処置有効量が、約１０ｍｇ〜約７００ｍｇの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ〜約３５０ｍｇの範囲内にあり、好ましくは約１１０ｍｇである、上記組成物に関する。
【０１９３】
別の特別な観点に従うと、本発明は、抗癌剤及びＡＭＨＲＩＩに結合する抗体を含む、肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される組成物であって、患者に投与される抗体の処置有効量が約７０ｍｇであり、患者に投与される抗癌剤の用量が約１１０ｍｇである、上記組成物に関する。
【０１９４】
好ましい実施態様において、抗癌剤、特にドセタキセル、又はシスプラチンとゲムシタビンの組み合わせの投薬量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、又は約０．１ｍｇ〜２０ｇ／日、の範囲である。
【０１９５】
変法として、より高い初期ローディング用量、その後に１以上の低用量が投与される場合もある。別の変法では、それほど高くない初期ローディング用量、その後に１以上のより高用量が投与される場合もある。
【０１９６】
特別な実施態様において、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及び抗癌剤は、約１０／１〜約０．０１／１、特に約１０／１〜約０．０５／１、又は約５／１〜約０．１／１の範囲の抗体／抗癌剤重量比で使用されうる。
【０１９７】
実例を挙げるならば、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及びドセタキセルは、本明細書の実施例に示されるように、１／１の抗体／ドセタキセル重量比で使用されうる。
【０１９８】
なおも実例を挙げるならば、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及びシスプラチンは、本明細書の実施例に示されるように、４／１の抗体／シスプラチン重量比で使用されうる。
【０１９９】
いっそう実例を挙げるならば、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体及びゲムシタビンは、本明細書の実施例に示されるように、０．２／１の抗体／ゲムシタビン重量比で使用されうる。
【０２００】
本発明は、ヒト抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲＩＩ）に結合する抗体及び抗癌剤を、ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌を予防又は処置するように意図された医薬品として、同時に、連続して、又は分離して使用する為の複合化した調製物の形態で含む製品について更に記載する。
【０２０１】
本明細書に開示されるＡＭＨＲＩＩ結合性剤、特に本明細書に開示される抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、経口投与、皮下投与、及び静脈内投与を含む様々な方法で投与されうる。
【０２０２】
語「処置有効量」とは、哺乳動物において疾患又は障害を処置する為に有効な薬剤の量を云う。癌の場合、薬物の処置有効量は、癌細胞の数を低下させ；腫瘍サイズを低下させ；癌細胞が末梢臓器に浸潤するのを阻害し（すなわち、ある程度低速化させ、好ましくは停止させ）；腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度低速化させ、好ましくは停止させ）；腫瘍増殖をある程度阻害し；及び／又は障害と関連した症状のうちの１以上をある程度緩和しうる。薬物が増殖を阻止し、及び／又は既存の癌細胞を殺傷しうる範囲で、薬物は、細胞増殖抑制性及び／又は細胞毒性でありうる。癌療法では、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での有効性は、例えば、生存期間、無増悪生存（ＰＦＳ：progression  free  survival）期間、応答率（ＲＲ：response  rate）、応答期間、及び／又は生活の質を評価することにより測定されることができる。
【０２０３】
本発明に基づき使用される薬剤の処置用製剤（例えば、抗体）は、任意選択的な薬学的に許容される担体、添加物、又は安定剤{Remington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition,  Osol,  A.  Ed.  (1980年)}と共に、所望の純度を有する抗体を混合することにより、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で保管用として調製される。許容される担体、添加物、又は安定剤は、レシピエントに対して採用された用量及び濃度において非毒性であり、バッファー、例えばホスフェート、シトレート、及びその他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡ；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトール；造塩性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体｛例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばツイーン（商標）、プルロニック（商標）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、を含む。
【０２０４】
有効成分は、例えばコアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中、或いはマクロエマルジョン中に封入されうる。そのような技術は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences  16th  edition,  Osol,  A.  Ed.  (1980年)に開示されている。
【０２０５】
イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での投与で使用される製剤は無菌でありうる。これは、滅菌濾過膜を通じた濾過により容易に実現される。
【０２０６】
本明細書に記載されているような医薬組成物は、任意の適する投与経路により、例えば非経口、経口、舌下、膣腔、直腸、又は経皮的な経路により、好ましくは静脈内、皮下、又は皮内注射により投与されうる。筋肉内、腹腔内、関節滑液嚢内、髄腔内、又は腫瘍内の注射も可能である。注射は、ボーラスの形態で、又は連続輸液により実施されうる。抗体組成物及び抗癌剤の組成物が、個別に投与されるとき、このような組成物は、同一又は異なる投与形態でありうる。
【０２０７】
非経口投与用の調製物として、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁物、又はエマルジョンを挙げうる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、又は注射用の有機エステル、例えばエチルオレエート、である。水性ビヒクルは、水、アルコール／水の溶液、及びエマルジョン又は懸濁物を含む。
【０２０８】
本明細書に記載されているような医薬組成物は、１以上の薬学的に許容される添加物又はビヒクルを有利に含む。例えば、薬学的用途に適合性を有し、当業者にとって公知の生理食塩水、生理学的溶液、等張溶液、緩衝化溶液、が記載されうる。組成物は、分散剤、可溶化剤、安定剤、防腐剤等から選択される１以上の薬剤又はビヒクルを含有しうる。製剤（液体及び／又は注射用及び／又は固体）で使用可能な薬剤又はビヒクルは、特にメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア等である。組成物は、注射用懸濁物、ゲル剤、油剤、錠剤、坐剤、散剤、硬ゼラチンカプセル剤、軟カプセル剤等の形態で製剤化されうる。
【０２０９】
特別な態様に従うと、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む医薬組成物であって、患者に投与される抗体の処置上有効な量が、約０．０７ｍｇ〜約３５０００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約７０００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約１４００ｍｇ、好ましくは約０．７ｍｇ〜約７００ｍｇ、及びより好ましくは約０．７ｍｇ〜約７０ｍｇの範囲内である、上記医薬組成物に関する。
【０２１０】
有効成分の投薬量は、特に投与方法に依存し、当業者により容易に決定される。抗体の処置上有効な量（単位用量）は、１週間に１回以上、数週間又は数ヶ月間にわたり投与する際に、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、及びより好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、まで変化しうる。有効な単位用量は、従って体重７０ｋｇの「平均的」患者について計算される用量から容易に推測されうる。
【０２１１】
別の特別な態様に従うと、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む医薬組成物であって、患者に投与される抗癌剤の処置上有効な量が、約１０ｍｇ〜約７００ｍｇの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ〜約３５０ｍｇの範囲内であり、好ましくは約１１０ｍｇである、上記医薬組成物に関する。
【０２１２】
抗癌剤の投薬量は、特に投与方法に依存し、当業者により容易に決定される。処置上有効な量（単位用量）は、１週間に１回以上、数週間又は数ヶ月間にわたり投与する際に、０．２ｍｇ／ｍ２〜１０ｇ／ｍ２、好ましくは０．２ｍｇ／ｍ２〜１ｇ／ｍ２、好ましくは２ｍｇ／ｍ２〜１ｇ／ｍ２、好ましくは２０ｍｇ／ｍ２〜１ｇ／ｍ２、より好ましくは２０ｍｇ／ｍ２〜０．５ｇ／ｍ２、まで変化しうる。有効な単位用量は、従って体表面積が約１．８ｍ２である「平均的」患者について計算される用量から推測されうる。
【０２１３】
よりいっそう特別な態様に従うと、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルと組み合わせて、有効成分として、抗癌剤、及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を含む医薬組成物であって、患者に投与される抗癌剤の処置上有効な量が、約１１０ｍｇであり、患者に投与される抗体の処置上有効な量が、約７０ｍｇである、上記医薬組成物に関する。
【０２１４】
本発明は、ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌を予防又は処置する際に医薬品として使用される、抗癌剤とヒト抗ミュラー管ホルモンＩＩ型受容体（ＡＭＨＲＩＩ）に結合する抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを含む組成物についても記載する。
【０２１５】
本発明は、下記の実施例により更に例証されるが、いかなる場合においてもそれに限定されない。
【実施例】
【０２１６】
実施例１：差次的なＡＭＨＲＩＩ遺伝子発現及びＡＭＨＲＩＩタンパク質発現
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．細胞株及び培養
ＣＯＶ４３４  ＷＴ細胞株（ＥＣＡＣＣ番号０７０７１９０９）が、１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）で補充されたＤＭＥＭ／ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ社）内で維持された。４００μｇ／ｍｌのジェネテシン（Ｇｉｂｃｏ社）が、ＣＯＶ４３４  ＭＩＳＲＩＩトランスフェクト細胞株に添加された。赤白血病Ｋ５６２細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４３（商標）が、１０％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＩＭＤＭ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）内、懸濁状態で培養され、Ｔ７５フラスコ内、細胞１×１０５〜１×１０６個／ｍｌの間の密度において維持された。ＯＶ９０細胞株（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１１７３２（商標）、卵巣漿液性腺癌）が、最終濃度１．５ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを含有するＭＣＤＢ１０５培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）と、１５％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充された、最終濃度２．２ｇ／ｌの重炭酸ナトリウムを含有する培地１９９（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）との１：１混合物中で培養された。ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒ細胞株（副腎皮質癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２１２８（商標））が、ｉＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）、２．５％のＮｕ−Ｓｅｒｕｍ（Ｆａｌｃｏｎ社）、及びペニシリン／ストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭ：Ｆ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）内で維持された。細胞は、８％のＣＯ２を含む加湿雰囲気で、３７℃において増殖され、培地は、細胞株に応じて１週間に１回又は２回交換された。
【０２１７】
Ａ．２．ＲＴ−ｑＰＣＲによるＡＭＨＲ２  ｍＲＮＡの相対的定量
ＲＮＡの抽出。１〜５×１０６個の細胞ペレットから得られた全ＲＮＡが、製造業者の指示に従い、Ｔｒｉｚｏｌ（登録商標）Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して調製された。要するに、フェノール／クロロホルム抽出後、溶解した細胞のＲＮＡがシリカマトリックスに吸着され、ＤＮＡｓｅ処理され、次に３０μｌのＲＮＡｓｅフリーの水で洗浄及び溶出された。ＲＮＡ濃度及び品質は、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて評価された。
【０２１８】
ｃＤＮＡ合成。Ｍａｘｉｍａ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ社）、及びオリゴｄＴプライマーを使用して、プライミングについて２５℃で１０分間、及び逆転写について５０℃で１５分間、その後に逆転写酵素の不活性化について８５℃で５分間インキュベーションすることにより、ＲＮＡ（１μｇ）が逆転写された。
【０２１９】
定量的ＰＣＲ。最終容積が２０μｌのＬｕｍｉｎａｒｉｓ  Ｃｏｌｏｒ  ＨｉＧｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｍｂｉｏｎ社）を使用して、９６ウェルマイクロプレート内、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ４８０（Ｒｏｃｈｅ社）において定量的ＰＣＲが実施された。下記のプライマーが使用された：ＡＭＨＲ２の場合、フォアワード５’−ＴＣＴＧＧＡＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＧＣＴＧ−３’（配列番号７１）、及びリバース５’−ＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴ−３’（配列番号７２）；ＴＢＰの場合、フォアワード５’−ＴＧＣＡＣＡＧＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＡＡ−３’（配列番号７３）、及びリバース５’−ＣＡＣＡＴＣＡＣＡＧＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡ−３’（配列番号７４）。ｃＤＮＡテンプレート（ＲＮＡ１００ｎｇに相当）及び下記のプロトコール：ＵＤＧ事前処理、５０℃で２分間；変性、９５℃で１０分間；その後に、９５℃で１５秒間／６０℃で３０秒間／７０℃で３０秒間からなる４０回のサイクル、を使用して増幅が実施された。ゲノムＤＮＡ及び二量体プライマーの存在しないことを管理する為に、各実験の終了時に融解曲線分析が実施された。ｃＤＮＡサンプル及び対照（「無テンプレートサンプル」及び「無逆転写産物ＲＮＡ」）のそれぞれが二重で試験された。サイクル閾値（Ｃｔ）の平均値が計算され、ＡＭＨＲ２の相対的定量（ＲＱ）が、２−ΔΔＣｔ（式中、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔｓａｍｐｌｅ−ΔＣｔｃａｌｉｂｒａｔｏｒ、及びΔＣｔ＝ＣｔＡＭＨＲ２−ＣｔＴＢＰ）として表された。ＨＣＴ１１６サンプルが、キャリブレータとして、ＴＢＰが標準化用のハウスキーピング遺伝子として使用された。
【０２２０】
下記の表２は、上記Ｑ−ＰＣＲ法を使用した試験細胞株内のＡＭＨＲＩＩ発現レベルを表す。
【０２２１】
【表２】
2020516655.tif 000004
【０２２２】
Ａ．３．フローサイトメトリー分析による膜ＡＭＨＲ２発現の評価
蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析では、細胞４×１０５個を、２５μｇ／ｍｌの３Ｃ２３Ｋと共に４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−ＢＳＡ（２％）を用いて洗浄した後、蛍光物質にコンジュゲートした抗種二次抗体により一次抗体が検出された。３Ｃ２３Ｋが、フィコエリトリンにコンジュゲートした抗ヒトＦ（ａｂ’）２により検出された（１：１０００、Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ＩＭ０５５０）。ＰＢＳで洗浄した後、再懸濁された細胞のＦＡＣＳ分析が、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ（商標）Ｃ６フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）のＦＬ２チャンネルにおいて実現された。
【０２２３】
Ｂ．結果
結果は図２に示される。結果は、ＣＯＶ４３４−ＷＴ細胞株はヒトＡＭＨＲＩＩタンパク質について明白な膜発現レベルを有するものの、組換え細胞株ＣＯＶ４３４−ＷＴのＡＭＨＲＩＩ遺伝子発現レベルは、細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９５Ｒについて測定されたＡＭＨＲＩＩ遺伝子発現レベルの約３％に過ぎないことを示した。
【０２２４】
このような結果は、ＡＭＨＲＩＩ遺伝子発現と膜ＡＭＨＲＩＩタンパク質発現との間において、厳密には相関関係が認められないことを示した。
【０２２５】
実施例２：肺癌（ヒト腫瘍サンプル）におけるＡＭＨＲＩＩ発現
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．目的
ビオチン化された３Ｃ２３Ｋモノクロナール抗体を使用して抗ミュラー管ホルモン受容体２型（ＡＭＨＲ２）の発現を検出する為の、マウス（ＰＤＸ）を対象としたヒト癌細胞異種移植の免疫組織化学試験。
【０２２６】
Ａ．２．プロトコール及び試験法
細胞株：ホルムアルデヒド酢酸アルコール（ＡＦＡ）中において、セルブロックの構成で固定化された。
ヒト腫瘍：外部サンプルについてホルマリン中で固定、及びキュリー研究所（Ｃｕｒｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から入手したスライドについてＡＦＡ中で固定
免疫組織化学（ＩＨＣ：Immunohistochemistry）技術は、サンプルを脱蝋し、ｐＨ９でアンマスキングした後に可能であった（ＥＺ  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒマイクロウェーブ中、９０℃で１５分間、その後に２０分間冷却）。
免疫ペルオキシダーゼ技術、及びＤＡＢ発色基質の顕在化による抗ミュラー管ホルモン受容体ＩＩ型の検出。
内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、スライドは、希釈されたビオチン化一次抗体（１／８００、８μｇ／ｍＬ）と共に室温で９０分間インキュベートされた。組織切片は、次にＰＢＳで洗浄され、アビジン／ビオチンＡＢＣ［Ｖｅｃｔｏｒ社］複合体と共に３０分間インキュベートされた。免疫反応シグナルがＤＡＢ基質溶液を使用して検出された（ＤＡＢ＋基質バッファー／液体ＤＡＢ＋クロモゲン、１０分間インキュベーション）。最終的に、切片は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｌｉｌｌｉｅの変法）を用いて軽度に対比染色された。
免疫組織化学染色手順において、陰性対照が、一次抗体をアイソタイプの対照免疫グロブリン（Ｒ５６５）又は抗体希釈剤単独（陰性バッファー対照）と置換することにより取得された。
陽性対照が、ＡＭＨＲ２トランスフェクトＣＯＶ４３４細胞及びヒト顆粒膜腫瘍サンプルを使用することにより取得された。
処理後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＩＭＳによるデジタル化により、切片が観察された。全ての試料は、病理学者２名により独立にスコア化された。
標識の局在化が詳記された：細胞質及び／又は膜。
強度が、下記のスコアリングシステムを通じて腫瘍細胞膜及び／又は細胞質の明白な褐色標識として分類された：標識の強度は、陰性の場合０、弱い場合１、中程度の場合２、及びＣＯＶ４３４陽性対照で示されるように強い場合には３として定義された。
頻度は、ＡＭＨＲＩＩを発現する細胞のパーセント（％）として定義された。壊死性のエリアは分析から除外された。グローバル組織学的スコアが、頻度×膜発現と細胞質発現とを足し合わせた強度スコアの平均値（０〜３）を使用することにより規定された。
全てのスライドが遅滞なく保管された。
【０２２７】
Ｂ．結果
様々な一次ヒト肺癌細胞によるＡＭＨＲＩＩ膜発現の結果が、下記の表３にも示されており、ＡＭＨＲＩＩ発現スコアが、異なる肺癌サンプルのパネルについて提示されている。
【０２２８】
【表３】
2020516655.tif 000005
【０２２９】
結果は、複数のヒト肺癌サンプル内で、特にＮＳＣＬＣ由来の腫瘍サンプルにより、及びより正確には類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及び扁平上皮細胞癌ＮＳＣＬＣ、及び神経内分泌ＮＳＣＬＣからなる群の中から選択されるＮＳＣＬＣに作用された患者起源の腫瘍サンプルにより、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩが発現していることを示した。
【０２３０】
実施例３：肺癌におけるＡＭＨＲＩＩ発現
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．目的
患者由来の異種移植（ＰＤＸ）又は新鮮なヒト腫瘍サンプルを起源とするヒト肺癌細胞の試験が、ビオチン化された３Ｃ２３Ｋモノクロナール抗体を使用して、抗ミュラー管ホルモン受容体型２（ＡＭＨＲ２）発現を検出する為に開始された。
【０２３１】
Ａ．２．フローサイトメトリーによるＡＭＨＲＩＩ膜発現分析
分析用の細胞の調製
組織は、手術１時間内に切除され、１〜ｍｍ２の断片に細分化され、ペニシリン（１０％）、ストレプトマイシン（１０％）、及びゲンタマイシン（０．１ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有するＲＰＭＩ内で洗浄された。
組織断片は、コラゲナーゼ及びＤＮＡｓｅ（２ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、３７℃において高速振盪させながら２〜４時間消化された。
粘液及び大きなデブリは、４０−ｌｍ細胞ストレーナーを通じた濾過により除去された。
生存細胞が、フィコールグラジエント遠心分離により取得された。
【０２３２】
再懸濁腫瘍細胞上のＡＭＨＲＩＩ結合性部位の定量は、ＱｕａｎｔｕｍＴＭ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）を使用して、製造業者の指示に従い実施された：
要するに、ヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分に対して特異的なマウス抗ヒトＩｇＧを用いて、その異なる校正済みの量で標識された４つのミクロビーズ集団が、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋで染色された。ＦＡＣＳチューブにおいて、キットに含まれる各バイアルの一滴が、ＰＢＳ１×（５０μｌ）に添加される：
１−ビーズＢ（ブランク）
２−ビーズ１＋３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ、１０μｇ／ｍＬ
３−ビーズ２＋３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ、１０μｇ／ｍＬ
４−ビーズ３＋３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ、１０μｇ／ｍＬ
５−ビーズ４＋３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ、１０μｇ／ｍＬ（必要な場合には、濃度は２５μｇ／ｍｌまで高めることができた）
各ビーズ集団は、異なる量のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋと結合して、対応する蛍光強度を生成し、その強度はＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩサイトメーター（ＢＤ社）上で分析される。
校正曲線は、その割り振られた抗体結合能（ＡＢＣ：Antibody  Binding  Capacity）に対して各ビーズ集団の平均蛍光強度をプロッティングすることにより生成された。
【０２３３】
細胞は、エッペンドルフチューブ（１．５ｍｌ）内で通常染色された。
全ての遠心分離工程は、４℃において実施された。
全てのインキュベーション工程は、抗体の内部移行を回避する為に４℃で実施された。
細胞３．５百万個（トリプシン処理されたＣＯＶ４３４−ＭＩＳＲＩＩ又は新たに解離させた腫瘍細胞）が、２００〜３００ｇで５分間遠心分離され、ＰＢＳ（１チューブ当たり５００μｌ）で１回洗浄された。
氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳを用いて洗浄され（２００〜３００ｇで３分間）、７００μｌのＰＢＳ１×中に再懸濁され、下記の表４に記載されている条件の為にＦＡＣＳチューブにより１００μｌ分配する：
【０２３４】
【表４】
2020516655.tif 000006
【０２３５】
ＰＢＳ／１％ＦＢＳ中の抗体３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ４８８と共に、４℃で３０分間インキュベーションする
ＰＢＳ／２％ＢＳＡ中で２回洗浄する（２００〜３００ｇで３分間）
ＰＢＳ中で２回洗浄する（２００〜３００ｇで３分間）
ＰＢＳ（３００〜４００μｌ）を添加し、できる限り速やかにＦＡＣＳ上で分析する。
このプロトコールは、膜の完全性を維持する為に、細胞外染色する為の固定工程を一切含まない。従って、膜ＡＭＨＲＩＩのみが検出される。
【０２３６】
Ａ．３．免疫組織化学：プロトコール及び試験法
細胞株：ホルムアルデヒド酢酸アルコール（ＡＦＡ）中において、セルブロックの構成で固定化された
ヒト腫瘍：外部サンプルについてホルマリン中で固定、及びキュリー研究所から入手したライドについてＡＦＡ中で固定
免疫組織化学（ＩＨＣ）技術は、サンプルを脱蝋し、ｐＨ９でアンマスキングした後に可能であった（ＥＺ  Ｒｅｔｒｉｅｖｅｒマイクロウェーブ中、９０℃で１５分間、その後に２０分間冷却）。
免疫ペルオキシダーゼ技術、及びＤＡＢ発色基質の顕在化による抗ミュラー管ホルモン受容体ＩＩ型の検出。
内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした後、スライドは、希釈されたビオチン化一次抗体（１／８００、８μｇ／ｍＬ）と共に室温で９０分間インキュベートされた。組織切片は、次にＰＢＳで洗浄され、アビジン／ビオチンＡＢＣ［Ｖｅｃｔｏｒ社］複合体と共に３０分間インキュベートされた。免疫反応シグナルがＤＡＢ基質溶液を使用して検出された（ＤＡＢ＋基質バッファー／液体ＤＡＢ＋クロモゲン、１０分間インキュベーション）。最終的に、切片は、Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｌｉｌｌｉｅの変法）を用いて軽度に対比染色された。
免疫組織化学染色手順において、陰性対照が、一次抗体をアイソタイプの対照免疫グロブリン（Ｒ５６５）又は抗体希釈剤単独（陰性バッファー対照）と置換することにより取得された。
陽性対照が、ＡＭＨＲ２トランスフェクトＣＯＶ４３４細胞及びヒト顆粒膜腫瘍サンプルを使用することにより取得された。
処理後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＩＭＳによるデジタル化により、切片が観察された。全ての試料は、病理学者２名により独立にスコア化された。
標識の局在化が詳記された：細胞質及び／又は膜。
強度が、下記のスコアリングシステムを通じて腫瘍細胞膜及び／又は細胞質の明白な褐色標識として分類された：標識の強度は、陰性の場合０、弱い場合１、中程度の場合２、及びＣＯＶ４３４陽性対照で示されるように強い場合には３として定義された。
頻度は、ＡＭＨＲＩＩを発現する細胞のパーセント（％）として定義された。壊死性のエリアは分析から除外された。グローバル組織学的スコアが、頻度×膜発現と細胞質発現とを足し合わせた強度スコアの平均値（０〜３）を使用することにより規定された。
全てのスライドが遅滞なく保管された。
【０２３７】
Ｂ．結果
ａ）対照
陰性対照及びアイソタイプ対照は、腫瘍細胞上で反応性が欠損していた。
陽性対照サンプル（増幅されたＣＯＶ４３４  ＡＭＨＲＩＩ）は、拡散性の細胞免疫染色を示した（強度スコア：３）。標識は均質であり（頻度スコア：１００％）、細胞質及び膜の局在化が認められた。
陽性の顆粒膜対照サンプルは、強い腫瘍細胞の免疫染色を示した（強度スコア３）。標識は均質であり（頻度スコア：１００％）、細胞質及び膜の局在化が認められた。
【０２３８】
ｂ）ＩＨＣにより評価された患者由来異種移植（ＰＤＸ）サンプルのＡＭＨＲＩＩ発現
指摘すべき重要事項として、ＡＦＡ中で処理されたサンプルと比較して、サンプルがホルマリン中で固定化されたとき、ＡＭＨＲ２の膜発現が過小評価されるように思われることが挙げられる。
【０２３９】
マウス内の様々なヒト腫瘍異種移植によるＡＭＨＲＩＩ膜発現の結果が、表５に表され、ＡＭＨＲＩＩ発現スコアが、異なる癌細胞型のパネルについて提示されている。
【０２４０】
ヒト腫瘍異種移植によるＡＭＨＲＩＩ発現の結果の一部が、下記の表５にまとめられている。
【０２４１】
【表５】
2020516655.tif 000007
【０２４２】
結果は、複数のヒト肺癌異種移植物内で、特にＮＳＣＬＣ由来の腫瘍サンプルにより、より正確には類表皮腫ＮＳＣＬＣ、腺癌ＮＳＣＬＣ、大細胞ＮＳＣＬＣ、及びまだ同定されていないサブタイプである幾つかのＮＳＣＬＣからなる群の中から選択されるＮＳＣＬＣに作用された患者を起源とする腫瘍サンプルにより、細胞表面においてＡＭＨＲＩＩが発現していることを示した。
【０２４３】
ｃ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価された患者由来異種移植（ＰＤＸ）サンプルのＡＭＨＲＩＩ発現。
図３Ａ〜３Ｅに示される結果は、ＡＭＨＲＩＩは、検討される肺癌の種類を問わず、肺癌患者由来の異種移植を起源とする腫瘍細胞の膜において発現していることを示している。図３Ａ〜３Ｅに示される結果は、ＡＭＨＲＩＩの膜タンパク質発現は、肺扁平上皮細胞癌（図３Ａ、図３Ｃ、図３Ｄ）、大細胞肺癌（図３Ｂ）、及び多形性細胞肺癌（図３Ｅ）に見出されることを示している。
【０２４４】
更に、同一の肺癌細胞について、同一試験サンプル内で、（ｉ）細胞１個当たりのＡＭＨＲＩＩの数、並びに（ｉｉ）ＡＭＨＲＩＩ癌細胞のパーセント（％）が測定された。結果は下記の表６に示される。
【０２４５】
【表６】
2020516655.tif 000008
【０２４６】
表６では、（ｉ）腫瘍細胞膜に存在するＡＭＨＲＩＩタンパク質の平均数を決定することにより、及び（ｉｉ）腫瘍サンプル内の膜性ＡＭＨＲＩＩ陽性細胞のパーセント（％）を決定することにより、各腫瘍サンプル内のＡＭＨＲＩＩ発現が評価された。対応する腫瘍サンプルが「陽性」又は「陰性」のどちらに設定されるかの表示は、表６の左カラムに提示されている。「陽性」の表示は、肺癌患者の腫瘍細胞が、その膜でＡＭＨＲＩＩを有意に発現していることを意味する。「陰性」の表示は、ＡＭＨＲＩＩ発現は腫瘍細胞膜において有意に検出されないことを意味する。
【０２４７】
表６の結果は、全ての腫瘍サンプルが、発現レベルこそ様々ではあるが、膜性ＡＭＨＲＩＩを発現したことを示している。
【０２４８】
ｄ）フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により評価された新鮮なヒト腫瘍サンプルのＡＭＨＲＩＩ発現
図３Ｆ及び図３Ｇで示される結果は、ＡＭＨＲＩＩは、外科的に切除されたヒトＮＳＣＬＣを起源とする腫瘍細胞の膜において発現している（図３Ｇ）一方、ＡＭＨＲＩＩは、同一の患者に由来する健康な周辺部を起源とする細胞の膜においては発現していないことを示している（図３Ｆ）。
【０２４９】
ｅ）結論
ＡＭＨＲ２タンパク質発現が、ＡＭＨＲ２転写について陽性の肺癌ＰＤＸモデルにおいて確認された。これらのＰＤＸは、肺（ＩＣ８ＬＣ１０及びＳＣ１３１癌から調製された。発現のレベルは中程度であったが、しかし有意であり、グローバルスコア１〜１．５により特徴付けられた。このようなデータは、婦人科癌以外の癌がＡＭＨＲ２を発現した可能性があることを示唆する。
【０２５０】
このようなモデルは、抗ＡＭＨＲ２療法を特徴付ける為に将来使用されることができると考えられる。
【０２５１】
実施例４：ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌に対する抗ＡＭＨＲＩＩ抗体のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での有効性
１．目的の概要
免疫不全のメスマウス内で発現させたＳＣ１３１患者由来の非小細胞肺異種移植モデルにおいて、単一の薬剤として、又はドセタキセル、若しくはシスプラチン／ゲムシタビンの組み合わせと組み合わせて使用されるＧａｍａｍａｂ社のテスト化合物、ＧＭ１０２（本明細書において３Ｃ２３Ｋ抗体とも呼ばれる）の抗腫瘍効果を分析すること。
【０２５２】
２．方法
６２．５〜２２０．５ｍｍ３の間まで皮下増殖させたＳＣ１３１腫瘍（Ｐ２２．１．３／０）を有するマウス５４匹が、平均及びメジアン腫瘍容積がそれぞれ１３０．７６及び１２６．００ｍｍ３に達したときに処置に割り振られた。
【０２５３】
有効性試験ＸＴＳ−１５２６は、マウス９匹ずつの６群から構成された：
群１では、ビヒクルが、５ｍｌ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与された；
群２では、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与された；
群３では、ドセタキセルが、２０ｍｇ／ｋｇで、低速ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与された；
群４では、２０ｍｇ／ｋｇで、低速ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与されるドセタキセルと組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与された；
群５では、１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与されるゲムシタビンと組み合わせて、シスプラチンが、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与された；
群６では、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されるシスプラチン及び１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されるゲムシタビンと組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与された。
【０２５４】
非組み入れ有効性試験マウスから、１群当たりマウス８匹を含む２つの群が試験された：
群７では、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×３投与されるシスプラチンと組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与された；
群８では、１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×３投与されるゲムシタビンと組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与された。
【０２５５】
実験期間中に週３回、腫瘍が測定され、マウスが秤量された。新鮮な腫瘍サンプルが、急速凍結組織及びホルマリン固定サンプル用として、Ｄ２８（組み入れ２及び３について）又はＤ３１（組み入れ１について）に追加投与されなかった１群当たりマウス３匹から収集された。急速凍結組織のみが、後続する分析用として送付された。ホルマリン固定サンプルは、サンプリング後に廃棄された。
【０２５６】
３．試験の目的
この報告に記載されている実験は、ＧＭ１０２のコードを有するＧａｍａｍａｂｓ社の１つのテスト化合物について、患者由来の非小細胞肺異種移植モデルＳＣ１３１を対象として、単独で、又はドセタキセルと、若しくはシスプラチン／ゲムシタビンの組み合わせと組み合わせて使用したときに、その抗腫瘍効果を確認することを目的とした。
【０２５７】
試験項目：ＧＭ１０２（本明細書において３Ｃ２３Ｋとも呼ばれる）
抗ＡＭＨＲ２製品、ＧＭ１０２は、抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨＲ２）の受容体を標的とする、或いはミュラー管阻害性物質受容体ＩＩ（ＭＩＳＲＩＩ）として知られているヒト化ｍＡｂである。ＡＭＨＲ２は、子宮内期間中に、雌内部生殖器官前駆体（ミュラー索）のレベルにおいて存在し、成人期では卵巣（顆粒膜細胞）及び睾丸（ライディッヒ細胞）に限定される。ＡＭＨＲ２は、約６５％の婦人科癌、例えば卵巣及び子宮内膜の癌、においても発現している（Bakkum  JN,  Gynecol  Oncol,  2007;  Sahli  I,  Biochem,  2004;  Anttonen  M,  Lab  Invest,  2011;  Song  JY,  Int  J.  Oncol,  2009年）。
【０２５８】
ＧＭ１０２抗体は、ＡＭＨＲ２トランスフェクトヒト腫瘍細胞株を使用したマウス異種移植モデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが明らかにされている。この効能は、腫瘍のレベルにおいてイネーブリング最適化抗体により引き起こされる免疫エフェクター細胞の関与に立脚するものとして文書化されている。更に、ＧＭ１０２の効能は、卵巣癌で使用される主要な化学療法剤であるカルボプラチン及びパクリタキセルと共に用いれば相乗的であることが明らかにされている（Jacquet  A.,  Cancer  Res,  2012年）。
【０２５９】
ヒト腫瘍異種移植モデル
癌センターで処置された患者からインフォームドコンセントを得た上で、様々な組織学的起源のヒト腫瘍サンプルが取得され、免疫不全マウスにおいて移植可能な異種移植物として確立された。グラフトされたサンプルは、一次腫瘍由来の残渣物、又は処置前後に取得された腫瘍転移である。このような患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルが、事前のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での培養を行わずに確立され、組織学、細胞遺伝学、遺伝的及びその他の生物学的マーカー、及びその標準療法（ＳＯＣ）である療法に対する応答について試験された。
【０２６０】
ＳＣ１３１腫瘍モデルは、突然変異したＥＧＦＲ（Ｒ４５１Ｆ）及びＫｒａｓ（Ｇ１２Ｖ）、並びに野生型のＴＰ５３及びＰＴＥＮを含む非小細胞肺癌の皮膚転移に由来した。
【０２６１】
ＳＣ１３１は、ドセタキセル及びシスプラチン／ゲムシタビンの組み合わせに対する低応答例であり、試験されたその他の薬剤に対する非応答例である（データはスイスヌードマウスにおいて取得された）。
【０２６２】
ＳＣ１３１腫瘍モデルは、６０〜２００ｍｍ３の範囲にある最大の腫瘍を取得するのに、移植の日から約１７日、且つ２０００ｍｍ３に達するのに３５〜４０日を要する。
【０２６３】
ＳＣ１３１は悪液質の特徴を示す。
【０２６４】
４．材料
４．１．動物及び維持条件
体重１８〜２５グラムの非近交系胸腺欠損（ｎｕ／ｎｕ）メスマウス（《ＨＳＤ：胸腺欠損ヌード−Ｆｏｘｎ１ｎｕ》）（ＥＮＶＩＧＯ社、Ｇａｎｎａｔ、フランス）が、操作前少なくとも６日間、食品及び水に適宜アクセスできる動物施設内で順化させる為に割り振られた（下記表７）。
【０２６５】
【表７】
2020516655.tif 000009
【０２６６】
４．２．動物福祉に関する記載
ＣＥＲＦＥ施設内での動物使用許可が、Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ  ｄｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｅｒｅ  ｄｅ  ｌ’Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ｅｔ  ｄｅ  ｌａ  Ｐｅｃｈｅ、フランス（合意番号Ｂ−９１−２２８−１０７）より取得された。動物の飼育及び動物舎は、実験動物の保護に関するフランスの規制法令に準拠する。
【０２６７】
全ての実験は、実験動物の保護に関するフランスの法令に準拠し、及びフランス農林水産省庁（Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ）によってＧｕｉｌｌａｕｍｅ  Ｌａｎｇに対して発行された、脊椎動物実験に対する現在有効なライセンス（Ｎｏ．Ａ−７５−１９２７、２０１２年４月１５日付け；有効期間：５年）に準拠して実施された。
【０２６８】
４．３．動物の飼育
マウスは、順化期間中に最多７匹の動物、実験段階においては最多６匹の動物からなる群内に収容された。マウスは、滅菌処理され塵埃を含まないベディングコブ材を備えた、ポリスルホン（ＰＳＵ）プラスチックの個別換気されたケージ（ＩＶＣ）（２１３Ｗ×３６２Ｄ×１８５Ｈ（ｍｍ）、Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ、米国）内に収容された。飼料及び水は滅菌処理された。動物は、明光−暗光サイクル（人工光による１４時間の概日周期）、並びに管理された室内温度及び湿度の下で収容された。
【０２６９】
依頼時に、環境条件がモニタリングされ、データは、Ｃｅｎｔｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｏｕｓｅ  Ａｒｃｈｉｖｅｓに保持された。
【０２７０】
４．４．飼料及び水の供給
飲料水が適宜提供された。各マウスには、完全なペレット飼料（１５０−ＳＰ−２５タイプ、ＳＡＦＥ）が試験全体を通じて提供された。動物飼料及び水の分析証明書がＣＥＲＦＥ施設において保持された。
【０２７１】
４．５．動物の識別
全ての動物が、各実験前に秤量され、耳部パンチナンバリングシステムにおける固有パターンにより識別された。
【０２７２】
各ケージは、ケージ番号、マウスの系統及び数、腫瘍コード、実験日を示すペーパータグにより識別された。
【０２７３】
４．６．テスト化合物及び製剤化
ＰＢＳ１×ビヒクルが、ＰＢＳ１０×（Ｓｉｇｍａ社ＰＢＳ１０×、＃Ｐ５４９３−１Ｌ、バッチＳＬＢＪ２８４８）を無菌の脱イオン水中で１／１０に希釈することにより調製された。これは、処置分量及びＧＭ１０２希釈用として４℃で３０日間保管された。
【０２７４】
ＧＭ１０２（３Ｃ２３Ｋ）濃縮分量（バッチＬＰ０１［Ｒ１８Ｈ２−ＬＰ０１］）が、２０１６年、７月７日に入手され（濃度１０．１ｍｇ／ｍｌ、容量５ｍｌのバイアル４個）、４℃で保管された。各投与日に、ストック溶液が、２ｍｇ／ｍｌの作業溶液を取得する為に、冷却ＰＢＳ１×で希釈された。この溶液は、氷上又は４℃で保たれ、処置まで遮光され、次にバイアルは注射期間中、室温に保たれた。処置後の残りの作業溶液は廃棄された。
【０２７５】
１０ｍｇ／ｍｌのドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ社、バッチ６Ｆ２５５Ａ−有効期限：２０１８年３月）ストック溶液は、各投与前に、２ｍｇ／ｍｌの作業濃度を取得する為に０．９％のＮａＣｌで１／５に希釈されなければならない。ストック溶液は再構成後、４℃及び遮光で１ヶ月間安定である。
【０２７６】
０．５ｍｇ／ｍｌのシスプラチン（シスプラチンＴｅｖａ、バッチ１５Ａ３０ＭＦ−有効期限：２０１７年１月）ストック溶液は既製品であった。この溶液は室温で保管され、供給業者の有効期限まで遮光される。
【０２７７】
４０ｍｇ／ｍｌのゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）、Ｌｉｌｌｙ社、バッチＣ４４２９３７Ｄ、有効期限：２０１８年２月）ストック溶液は、各投与前に、１０ｍｇ／ｍｌの作業濃度を取得する為に０．９％のＮａＣｌで１／４に希釈されなければならない。ストック溶液は再構成後、４℃及び遮光で１ヶ月間安定である。
【０２７８】
５．方法
５．１．腫瘍グラフトモデルの誘発
同一継代の腫瘍が、マウス３〜２４匹（ドナーマウス、継代（ｎ−１））に対して皮下移植された。この腫瘍が７００〜２０００ｍｍ３に達したとき、ドナーマウスは頸椎脱臼により命を奪われ、腫瘍は無菌的に切除及び切り分けられた。壊死性のエリアを除去した後、腫瘍は、およそ２０ｍｍ３の大きさを有する断片に裁断され、グラフティング前に培養培地に移された。
【０２７９】
マウス８９匹が、１００ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミン（バッチ５Ｄ９２−有効期限：２０１７年３月、Ｖｉｒｂａｃ社）及び１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（バッチＫＰ０ＡＸ９Ｘ、Ｂａｙｅｒ社）を用いて麻酔下に置かれ、次に皮膚がクロルヘキシジン溶液で滅菌され、肩甲間部のレベルにおいて切開され、２０ｍｍ３の腫瘍断片が皮下組織内に配置された。皮膚はクリップを用いて閉鎖された。
【０２８０】
同一実験のマウスすべてが同一日に移植を受けた。
【０２８１】
５．２．処置段階
ＸＴＳ−１５２６有効性のパートでは、６２．５〜２２０．５ｍｍ３まで皮下増殖させたＳＣ１３１腫瘍（Ｐ２２．１．３／０）を有するマウス５４匹が、処置群毎に均一な平均及びメジアン腫瘍容積を得る為に、その腫瘍容積に従い割り振られた。処置は、最多マウス５匹を収容するボックスに無作為に割り付けられ、腫瘍移植後１８日経過して開始された（スタッガード式の組み入れ法により６０％の組み入れ率）。試験では、最初１群当たりマウス５匹が組み込まれ、２日後には１群当たりマウス４匹が組み込まれるスタッガード式の組み入れ法が採用された。処置開始後３１日経過した後、試験は終了した。
【０２８２】
【表８】
2020516655.tif 000010
【０２８３】
追加の群７及び群８では、腫瘍サイズはより大きく、より不均一であった。動物は、移植後３２日経過して組み込まれた。
【０２８４】
【表９】
2020516655.tif 000011
【０２８５】
５．３．腫瘍測定及び動物の観察
腫瘍容積は、処置期間中、１週間に３回、カリパスを用いて腫瘍径を測定することにより評価された。式ＴＶ（ｍｍ３）＝［長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２］／２が使用され、式中、長さ及び幅は、それぞれ腫瘍の最長径及び最短径である。
【０２８６】
全ての動物は、処置期間中、１週間に３回秤量された。異なる幾つかの処置について、副作用が下記のように決定された：
相対体重（ＲＢＷ：Relative  body  weight）が、測定毎に、体重を処置開始時の体重で割り算することにより計算される。
個々の体重減少率（％）（％ＢＷＬ）＝１００−（ＢＷｘ／ＢＷ０×１００）（式中、ＢＷｘは、処置期間中のある日のＢＷであり、ＢＷ０は処置初日のＢＷである）。
【０２８７】
マウスは、身体的外見、挙動、及び臨床的変化について毎日観察される。
【０２８８】
全ての疾病の兆候が、あらゆる行動学的変化又は処置に対する反応と共に、動物毎に記録された。
【０２８９】
５．４．ＸＴＳ−１５２６治験デザイン
表９にまとめられるように、合計８群が使用された。群１〜群６において、各群はマウス９匹を当初含んだ。群７及び群８では、各群はマウス８匹を当初含んだ。
【０２９０】
群１では、ビヒクルが、５ｍｌ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、３週間投与された。
【０２９１】
群２では、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、３週間投与された。
【０２９２】
群３では、ドセタキセルが、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、Ｄ０に１回投与された。
【０２９３】
群４では、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、Ｄ０に１回投与されるドセタキセルと組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、１又は２週間投与された。
【０２９４】
群５では、１００ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、２又は３週間投与されるゲムシタビンと組み合わせて、シスプラチンが、５ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、２又は３週間投与された。
【０２９５】
群６では、５ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、１又は２週間投与されたシスプラチンと、１００ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、１又は２週間投与されたゲムシタビンとを組み合わせて、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、１又は２週間投与された。
【０２９６】
群７では、５ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、３週間投与されたシスプラチンと共に、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、３週間投与された。
【０２９７】
群８では、１００ｍｇ／ｋｇで、腹腔内経路により、１週間に１回、３週間投与されたゲムシタビンと共に、ＧＭ１０２が、２０ｍｇ／ｋｇで、静脈内経路により、１週間に２回、３週間投与された。
【０２９８】
全ての処置用量は、各注射において体重調整された。
【０２９９】
【表１０】
2020516655.tif 000012
【０３００】
５．５．体重減少又は有害事象の場合に実施された処置
腫瘍測定及び体重モニタリングの日（１週間に３回）に、何らかの副作用が認められた場合、又は組み入れ日と比較して体重減少≧１５％が認められた場合には、治験依頼者は、副作用／問題を発見したときから最短遅延内で通知を受けた。
【０３０１】
次に、下記の処置が実施された：
懸念される動物について処置が中止された；体重減少＜１０％の場合には処置が再開された
ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、体重減少が認められた群全体に対して与えられ、対応する動物が体重減少＜１０％となるまで毎日秤量された；体重減少＜１０％の場合には、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が中止された。
【０３０２】
５．６．倫理的絶命基準
動物は、下記の基準に基づき命を奪われた：
処置初日と比較して、連続４８時間（３回測定）体重減少（ＢＷＬ）≧２０％。
挙動又は臨床徴候の全体的な変化。
腫瘍容積≧２０００ｍｍ３。
【０３０３】
５．７．エンドポイント／試験終了
倫理的絶命基準に達したマウスのみが、しかるべき時に命を奪われた。
【０３０４】
実験期間終了時に、全ての実験群が終了した。
【０３０５】
実験のエンドポイントは下記の通りであった：
４週間の処置段階
フォローアップ段階は含まれない。
【０３０６】
５．８．血液、腫瘍、及び組織のサンプリング
５．８．１．腫瘍サンプリング
５．８．１．１．ＦＦＰＥ用の腫瘍サンプリング
腫瘍の半分がＦＦＰＥ用として処理された：腫瘍は１０％のホルマリン中で２４時間固定され、７０％エタノールに移され、次にパラフィン包埋する為に下記住所のＨｉｓｔａｌｉｍに送られた（すなわち、［メインの試験からの］ＦＦＰＥ腫瘍サンプル１７例）：
【０３０７】
ホルマリン固定の正確なサンプリング時刻及び時間が、腫瘍サンプリング毎に付記された。
【０３０８】
修正案５の編集中に、治験依頼者はＦＦＰＥサンプルの廃棄を決定した。
【０３０９】
５．８．１．２．急速凍結用の腫瘍サンプリング
腫瘍の半分が急速凍結用として処理された：腫瘍が３×３×３ｍｍの小片に裁断され、液体窒素中で急速凍結され、次に保管する為に−８０℃に移された（すなわち、［メインの試験からの］１７例＋［忍容性２群試験からの］６例の急速凍結された腫瘍サンプル）。
【０３１０】
正確なサンプリング時刻が、腫瘍サンプリング毎に付記された。
【０３１１】
５．９．データ分析
５．９．１．データ処理
全ての生データが、番号が付された記録簿内に綴じられた該当する書式に記録され、保管され、及びコンピューターシステムにより処理された。
【０３１２】
０日目は、処置の第１日目とみなされた。この定義に従い、実験日がその後番号付けされた。
【０３１３】
記録は、平均値±平均値の標準誤差（ｍ±ｓｅｍ）として表される。
【０３１４】
平均相対体重曲線が、実験群毎に、時間に対して平均ＲＢＷをプロッティングすることにより取得される。Δ相対体重（対照群の相対体重に対する処置群の相対体重）は統計分析に使用される。
【０３１５】
平均体重減少率（％）（％ＢＷＬ）＝１００−（平均ＢＷｘ／平均ＢＷ０×１００）（式中、ＢＷｘは処置期間中のある日の平均ＢＷであり、ＢＷ０は、処置初日の平均ＢＷである）。
【０３１６】
腫瘍増殖曲線が、実験群毎に、時間に対して平均腫瘍容積（ｍｍ３）をプロッティングすることにより取得された。Δ腫瘍容積（対照群の相対的な腫瘍容積に対する処置群の相対的腫瘍容積）が統計分析に使用された。
【０３１７】
個々の腫瘍増殖遅延（ＴＧＤ：tumor  growth  delay）は、個々の腫瘍が初期腫瘍容積の３〜５倍に達するのに必要とされる時間（日数）として計算された。メジアン増殖遅延／群が計算され、表で報告された。
【０３１８】
腫瘍増殖遅延インデックス（ＴＧＤＩ：tumor  growth  delay  index）が、処置群におけるメジアン増殖遅延を対照群のメジアン増殖遅延で割り算することにより計算された。
【０３１９】
処置群（Ｔ）の平均腫瘍容積と対照群の平均腫瘍容積（Ｃ）との間のパーセント比が計算された。
【０３２０】
統計分析が、マン・ホイットニーのノンパラメトリック比較検定により測定毎に実施された。各処置群は、対照群と比較された。
【０３２１】
腫瘍の安定化（ＴＳ：tumor  Stabilization）は、連続した少なくとも３回の測定期間中に、一定の腫瘍サイズを呈するマウスの数として定義された。
【０３２２】
部分的な腫瘍退縮（ＰＲ：Partial  tumor  Regression）は、連続した少なくとも３回の測定期間中に、初期の腫瘍サイズよりも小さい腫瘍サイズを呈するマウスの数として定義された。
【０３２３】
完全な腫瘍退縮（ＣＲ：Complete  tumor  Regression）は、連続した少なくとも３回の測定期間中に、０〜１３．５ｍｍ３の腫瘍サイズを呈するマウスの数として定義された。
【０３２４】
無腫瘍生存体（ＴＦＳ：Tumor  Free  Survivor）は、Ｇｒｏｕｐ  Ｄａｙ  Ｅｎｄまでに記録された完全な腫瘍退縮の数として定義された。
【０３２５】
６．結果
６．１．忍容性データ、臨床観察所見
処置期間中の平均体重変化率（％）が、図４において例証される。
【０３２６】
この試験では、マウスは、実験期間中、１週間に３回秤量された。
【０３２７】
群１では、５ｍｌ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与されたビヒクルは良好な忍容性を示したが、しかし腫瘍の悪液質効果が、１６日目に最大８．３％の平均体重減少、及び２８日目に最大１７．６％の個別体重減少を誘発した。その他の有害事象は認められなかったが、しかし腫瘍の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、１８、２１、２５、及び２６日目に、第２回組み入れからの動物に与えられた。
【０３２８】
群２では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与されたＧＭ１０２は、良好な忍容性を示したが、対照群１で認められたような腫瘍の悪液質効果に対応して、１４日目に最大９．８％の平均体重減少、及び１６日目に最大１６．８％の個別体重減少が認められた。その他の有害事象は認められなかったが、しかし腫瘍の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、１１、１６、１８日目、２１日目〜２７日目まで、第２回組み入れからの動物に与えられた。マウス＃２７が、臨床徴候を一切示さずに２７日目に死亡したことが判明した。
【０３２９】
群３では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与されたドセタキセルは、対照群１と比較して、統計的に有意な（４日目からｐ＜０．０１）最大１７．０％の平均体重減少（１６日目）、及び最大２３．８％の個別体重減少（１９日目）を誘発した。その他の有害事象は認められなかったが、しかし腫瘍の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、７日目〜２７日目まで（第１回組み入れからの動物に対しては３１日目まで）群全体に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に４匹のマウスの命が奪われなければならなかった。
【０３３０】
群４では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与されたドセタキセルと組み合わせて、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与されたＧＭ１０２は、対照群１と比較して、統計的に有意な（４日目からｐ＜０．０１）最大１８．１％の平均体重減少（１４日目）、及び最大２４．１％の個別体重減少（２３日目）を誘発した。その他の有害事象は認められなかったが、しかし腫瘍の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、４日目及び５日目、次に７日目〜２７日目まで群全体に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に５匹のマウスの命が奪われなければならなかった。
【０３３１】
群５では、１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与されたゲムシタビンと組み合わせて、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与されたシスプラチンは、対照群１と比較して、１１日目に統計的に有意な（２日目からｐ＜０．０１）最大１７．５％の平均体重減少、及び最大３０．１％の個別体重減少を誘発した。化合物の組み合わせの複合した毒性及び腫瘍増殖の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、２日目及び３日目に、第２回組み入れからの動物に、次に４日目及び７日目、次に９日目〜２７日目まで（第１回組み入れからの動物では３１目まで）群全体に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に４匹のマウスの命が奪われなければならず、１匹のマウスが１２日目に死亡したことが判明した。
【０３３２】
群６では、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されたシスプラチン、及び１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されたゲムシタビンと組み合わせて、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与されたＧＭ１０２は、対照群１と比較して、１１日目に有意な（２日目からｐ＜０．００１）最大２１．１％の平均体重減少、及び最大２７．５％の個別体重減少を誘発した。化合物の組み合わせの複合した毒性及び腫瘍増殖の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、２日目及び３日目に第２回組み入れからの動物に、次に４日目〜２７日目まで（第１回組み入れから動物では３１日目まで）、群全体に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に７匹マウスの命が奪われなければならなかった。
【０３３３】
追加の群７では、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×３投与されたシスプラチンと共に２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与されたＧＭ１０２は、腫瘍増殖の悪液質効果と組み合わさって、１８日目に有意な最大１２．３％の平均体重減少、及び２８日目に最大２８．９％の個別体重減少を誘発した。化合物の組み合わせの複合した毒性、及び腫瘍増殖の悪液質効果に起因して、９日目及び１１日目に、次に第１３日目〜２８日目まで、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が動物に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に２匹のマウスの命が奪われなければならず、１匹のマウスが死亡したことが判明した。更に、５／８のマウスが、８日〜試験終了まで落屑又は／及び皮膚乾燥を示した。
【０３３４】
追加の群８では、１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×３投与されたゲムシタビンと共に、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与されたＧＭ１０２は、腫瘍増殖の悪液質効果と組み合わさって、１１日目に有意な最大１３．４％の平均体重減少、及び２８日目に最大２６．４％の個別体重減少を誘発した。化合物の組み合わせの複合した毒性、及び腫瘍増殖の悪液質効果に起因して、ＤｉｅｔＧｅｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）が、２日目〜４日目、７日目〜９日目、１１日目及び１２日目、次に第１４日目〜２８日目まで動物に与えられた。ＤｉｅｔＧｅｌが与えられたにもかかわらず、試験終了前に３匹のマウスの命が奪われなければならず、１匹のマウスが死亡したことが判明した。更に、６／８のマウスが、４日目〜試験終了まで落屑又は／及び皮膚乾燥を示した。
【０３３５】
６．２．抗腫瘍効果データ
腫瘍増殖曲線（経時的な平均腫瘍容積）が、図４で例証される。処置群毎のパーセントＴ／Ｃ値が表１１に提示されており、図５及び図６で例証される。統計分析は表１２に示される。
【０３３６】
この試験では、腫瘍は、実験期間中、１週間に３回測定される。
【０３３７】
群２では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×３投与されたＧＭ１０２は、抗腫瘍効果を一切示さず、１６日目（対照群の最終日）に、ＴＧＤＩ＝１．３３及び最良Ｔ／Ｃ＝７４．６８％であった。
【０３３８】
群３では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与されたドセタキセルは、強く統計的に有意な（マン・ホイットニー検定により、対照群１と比較して、Ｄ４においてｐ＜０．０１、次にＤ７〜Ｄ１６においてｐ＜０．００１）抗腫瘍効果を示し、１６日目（対照群の最終日）に、ＴＧＤＩ＞２．７１及び最良Ｔ／Ｃ＝１１．００％であった。更に、７／９で一過性の腫瘍安定化、及び２／９で一過性の部分的な腫瘍退縮が処置期間中に認められた。
【０３３９】
群４では、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、Ｄ０に１回投与されたドセタキセルと組み合わせて、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与されたＧＭ１０２は、強く統計的に有意な（マン・ホイットニー検定により、対照群１と比較して、Ｄ４においてｐ＜０．０１、次にＤ７〜Ｄ１４においてｐ＜０．００１）抗腫瘍効果を示し、１６日目（群４の最終日、ｎ＝６）に、ＴＧＤＩ＞２．７１及び最良Ｔ／Ｃ＝１１．３４％であった。更に、６／９で一過性の腫瘍安定化、及び３／９で一過性の部分的な腫瘍退縮が処置期間中に認められた。
【０３４０】
群５では、１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与されたゲムシタビンと組み合わせて、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×２又は３投与されたシスプラチンは、統計的に有意な（マン・ホイットニー検定により、対照群１と比較して、Ｄ４においてｐ＜０．０１、次にＤ７〜Ｄ１１においてｐ＜０．００１）抗腫瘍効果を示し、１６日目（群５の最終日、ｎ＝６）に、ＴＧＤＩ＝２．３０及び最良Ｔ／Ｃ＝２７．１６％であった。更に、５／９で一過性の腫瘍安定化が処置期間中に認められた。
【０３４１】
群６では、５ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されたシスプラチン、及び１００ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｐ．により、ｑｗｋ×１又は２投与されたゲムシタビンの組み合わせと共に、２０ｍｇ／ｋｇで、ｉ．ｖ．により、２ｑｗｋ×１又は２投与されたＧＭ１０２は、統計的に有意な（マン・ホイットニー検定により、対照群１と比較して、Ｄ２においてｐ＜０．０５、次にＤ４〜Ｄ１１においてｐ＜０．００１）抗腫瘍効果を示し、１１日目（群６の最終日、ｎ＝７）に、ＴＧＤＩ＝１．９８、及び最良Ｔ／Ｃ＝３３．７１％であった。更に、６／９で一過性の腫瘍安定化が処置期間中に認められた。
【０３４２】
追加の群７及び８では、登録時の平均腫瘍容積が高めであったことに起因して、対照群１との比較は不可能であったが、しかし幾つかの一過性の腫瘍安定化が、ＧＭ１０２／シスプラチンの組み合わせでは５／８について、及びＧＭ１０２／ゲムシタビンの組み合わせでは６／８について処置期間中に認められた。
【０３４３】
７．結論
結果及び考察
ＳＣ１３１腫瘍モデルの悪液質効果は予想よりも大きく、ビヒクル及びＧＭ１０２処置群の両方で類似した体重減少を引き起こした。従って、単独使用されるＧＭ１０２は良好な忍容性を示したとみなすことができる。
【０３４４】
一方、その他の４つの群で認められた毒性は、標準療法のドセタキセル、シスプラチン、及びゲムシタビンに一部起因し、各群内のマウスの約半分において死亡を誘発した。
【０３４５】
単独使用されたＧＭ１０２抗体は、２５％の腫瘍増殖阻害を誘発したが、その効果は統計的有意性までは達しなかった一方、標準療法群は強い腫瘍増殖阻害を示した。このモデルはその膜性ＡＭＨＲＩＩ発現に基づき最初に選択されたので（ＩＨＣにより１＋とスコア化された）、この結果は驚くべきことであった。但し、この試験と並行して、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現がＳＣ１３１ＰＤＸ腫瘍において評価されたとき、数回の継代を経た後に、膜性ＡＭＨＲＩＩ発現が減少したことが指摘された（０．２＋にスコア化された；４０％の陽性細胞が０．５％でスコア化された）。このデータは、ＡＭＨＲＩＩ発現は、ある種のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）モデルにおいて不安定であること、及び膜性の発現がＡＭＨＲＩＩ抗腫瘍効果にとって重要であることを確認した。
【０３４６】
同じ理由から、ＧＭ１０２をこのような標準療法と組み合わせても、抗腫瘍活性の増強は認められない。
【０３４７】
実施例５：ＡＭＨＲＩＩ発現性の肺癌に対する抗ＡＭＨＲＩＩ体抗のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での有効性
Ａ．材料及び方法
Ａ．１．組織免疫化学によるＡＭＨＲＩＩ膜発現
間接的免疫蛍光検査法が、従ってＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８にコンジュゲートした抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ抗体を用いて開発された。次にウサギ抗ＡＦ４８８抗体、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体を用いて、シグナル増幅が２工程で実施された。
【０３４８】
凍結組織切片が、クリオスタットＬｅｉｃａ  ＣＭＤ１９５０を用いて−２０℃に保つことにより作成される。凍結された組織は、ＯＣＴ化合物と共に金属ディスク上に取り付けられ、凝固したら、ディスクホルダー上に取り付けられた。７μｍの切片が実現し、Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｍｅｎｚｅｌ  Ｇｌａｓｅｒ社）上に配置され、−２０℃で速やかに保管された。
【０３４９】
凍結切片スライドがＰＢＳ１×で再水和され、次に３００μｌの冷却アセトン（ＶＷＲ  Ｐｒｏｌａｂｏ社）を用いてそれを覆うことにより、−２０℃で１０分間固定化され、全ての組織が溶液により全部回収されることを保証する為にパラフィルムを用いて回収された。ＰＢＳでリンスした後、スライドは、抗体と組織コンポーネントとの間の非特異的な相互作用をブロックする為に、３００μｌのブロッキングバッファー（ＰＢＳ１×−ＢＳＡ（２％）−ヤギ血清（１０％）−トリトンＸ１００（０．１％））を用いて、加湿ボックス内、ＲＴにおいて１時間処理された。ブロッキングバッファー中で１０μｇ／ｍｌに希釈された３Ｃ２３Ｋ−ＡＦ４８８又はアイソタイプ対照Ｒ５６５−ＡＦ４８８が、加湿ボックス内、ＲＴにおいて３０分間適用された。ＰＢＳ１×−トリトンＸ１００（０．１％）で３回洗浄（３×１０分間）後、ブロッキングバッファー中で１／５００に希釈された抗ＡＦ４８８抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が、ＲＴで３０分間インキュベーションする為に（３００μｌ）添加された。ＰＢＳ１×−トリトンＸ１００（０．１％）で３回洗浄（３×１０分間）後、ブロッキングバッファー中で１／５００に希釈されたＡＦ６４７コンジュゲート抗ウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が、ＲＴで３０分間インキュベーションする為に（３００μｌ）添加された。ＰＢＳ１×−トリトンＸ１００（０．１％）による洗浄（３×１０分間）が行われ、次に０．５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）が１０分間適用された。ＰＢＳ及びＨ２Ｏでリンスした後、スライド切片が、気泡を回避しながらＤＡＫＯ社蛍光封入剤１滴（５０μｌ）と共にカバースリップ（２４×５０ｍｍ、Ｋｎｉｔｔｅｌ  Ｇｌａｓｓ社）の下に取り付けられ、画像化されるまで暗光、４℃で保管された。
【０３５０】
画像取得が、Ｍｅｔａｖｕｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社）により制御されたＣｏｏｌＳｎａｐ  ＥＺ  ＣＣＤカメラが装備された蛍光顕微鏡Ｌｅｉｃａ  ＤＭ５０００Ｂを使用して実施された。画像の後処理が、ＩｍａｇｅＪフリーソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して実施される。
【０３５１】
Ａ．２．ヒト肺腫瘍異種移植
ヌードマウスに異種移植を行って連続継代し、その異種移植から腫瘍断片が取得された。ドナーマウスから取り出した後、腫瘍は断片（端部長さ３〜４ｍｍ）に裁断され、１０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＰＢＳ内に配置された。レシピエント動物は、イソフルランの吸入により麻酔され、側腹部の皮下に片側又は両側腫瘍移植を受けた。
【０３５２】
ＬＸＦＥ２２２６扁平上皮非小細胞肺癌モデル腫瘍異種移植物が、マウス１匹当たり腫瘍１個で皮下に移植された（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから入手したＮＭＲＩ−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）。実験は２群のマウスから構成され、そのうちの３匹がフローサイトメトリーにより膜性ＡＭＨＲＩＩ発現を検出する為に１５日目に安楽死させられた。第１群はビヒクル対照群であり、第２群は治験抗体ＧＭ１０２の投与を受け、２０ｍｇ／ｋｇの用量レベルで、腹腔内（ｉ．ｐ．）に週２回投与された。
【０３５３】
最適な効果に到達した日に群メジアン相対腫瘍容積（ＲＴＶ）を比較することにより、抗腫瘍効果が最低Ｔ／Ｃ値として評価された。実験は、２週間の無投薬観察期間後の４３日目に終了した。
【０３５４】
治験デザイン：
【０３５５】
【表１１】
2020516655.tif 000013
【０３５６】
Ｂ．結果
Ｂ．肺腫瘍に対するＧＭ１０２抗ＡＭＨＲＩＩ抗体のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）活性
腫瘍増殖曲線（経時的な平均腫瘍容積）が、図７で例証される。腫瘍は、実験期間中に１週間に３回測定された。
【０３５７】
図７及び図８に示される結果は、ＧＭ１０２抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は処置を受けた全ての異種移植された動物において強い抗腫瘍活性を示したことを示す。
【０３５８】
２８日目の腫瘍増殖の指標は、ＧＭ１０２抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は腫瘍容積の劇的な低下を引き起こしたことを例証するが（ｐ＜０．００１）、それは、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は（ｉ）腫瘍増殖を阻止し、及び（ｉｉ）腫瘍異種移植に当初含まれた腫瘍細胞の溶解を有効に引き起こしたことを意味する。
【０３５９】
従って、実施例５の結果は、抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、ＡＭＨＲＩＩタンパク質をその膜で実際に発現する肺癌細胞に対してきわめて有効な抗腫瘍効果を、ＡＭＨＲＩＩコード遺伝子の発現レベルによらず発揮することを示した。
【０３６０】
【表１２】
2020516655.tif 000014
【０３６１】
【表１３】
2020516655.tif 000015
【図１Ａ】
2020516655.tif 000016
【図１Ｂ】
2020516655.tif 000017
【図２Ａ】
2020516655.tif 000018
【図２Ｂ】
2020516655.tif 000019
【図２Ｃ】
2020516655.tif 000020
【図２Ｄ】
2020516655.tif 000021
【図２Ｅ】
2020516655.tif 000022
【図２Ｆ】
2020516655.tif 000023
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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