(57)【要約】  本発明は、モルホロジー、サイズ及び組成が均一なナノ結晶を用い、その独特な光学特性に基づいて、分析物の多重検出をする方法及びアッセイを提供する。本方法及びアッセイは、複合環境サンプルにおいて、微生物及び／又は微生物ベースの薬剤を検出するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境又は食品サンプル中の標的分析物を検出する方法であって、
前記サンプルを、前記サンプル中の前記分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性しておいた複数のナノ結晶と接触させる工程と、
前記サンプル中の前記分析物に結合した前記ナノ結晶を、未結合のナノ結晶から分離する工程と、
前記分析物に結合した前記ナノ結晶を検出する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記ナノ結晶は、独特な光学的サインを生成する、独特で均一なモルホロジー、サイズ及び／又は組成物を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記独特な光学的サインは、立ち上がり及び／又は減衰時間で発現される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ結晶は、アップコンバージョン蛍光体粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ結晶は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジミウム（Ｎｅ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）から選択される少なくとも１つの希土類元素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ結晶は、４ｎｍ〜４００ｎｍのサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ結晶は、１０−８秒以上発光する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ結晶は、９００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長で励起し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ結晶は、９６０ｎｍ〜９８０ｎｍの波長で励起する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ結晶は、４００ｎｍ〜１２，０００ｎｍの波長で発光する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ結晶は、β相粒子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ結晶は、量子ドット、カーボンナノチューブ、金粒子、銀粒子及び磁気又は染料ドープ粒子から選択される第２のレポーターと組み合わせられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分析物に特異的に結合する前記エンティティは、抗体、タンパク質、アプタマーポリペプチド、又はポリヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ゲノム分析を用いて、培養できない微生物又は微生物の混合集団の遺伝子配列情報から特異的エピトープを識別し、前記培養できない微生物に特異的に結合する遺伝学的に同一のエピトープに対する結合剤を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記分析物は、バクテリア、酵母、菌類、又はウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記分析物は、農業病原体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記農業病原体は、カンキツグリーニング病、ジャガイモ疫病、うどんこ病、赤色斑、タバコモザイクウイルス、火傷病及び／又はピアス病の原因となる病原体から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルは、土壌又は植物材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルは、植物組織である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分析物は、微生物ベースの薬剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記微生物ベースの薬剤は、微生物バイオサーファクタント又はマイコトキシンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプルは、食品であり、前記分析物は、マイコトキシンである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、動物からの生物学的サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記生物学的サンプルは、血液、糞便、粘液、唾液又は組織サンプルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルは、水サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記水サンプルは、飲料水、地下水、地表水及び廃水から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルは、微生物を含有する市販品である、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記市販品は、農業に用いられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記市販品は、食品である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物は、プロバイオティクスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記微生物は、病原体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記分析物は、微生物であり、前記分析物の検出感度は、１０１ＣＦＵ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ナノ結晶を調整して、サンプル中の自然発生発色団からのバックグラウンド干渉を排除する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
多数の独立調整ナノ結晶が、単一サンプルから多数の分析物の分析を促進するために、単一担体に多重アレイで配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
５以上の分析物が、同時に分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法は、サンプルが得られた１００ヤード以内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法は、サンプルが得られた１０分以内で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記検出工程は、一回の読み出しで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記検出は、２０分未満で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記分析物の前記検出、定量化及び／又は追跡は、農家、取締官、コンプライアンス係官又は流通業者によりなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記分析は、商品の製造直後から前記商品の使用直前までのサプライチェーンの任意の点で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
個々の試験からのデータは、前記試験を行った場所から離れた場所からアクセス可能なデータベースに転送される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記データを用いて、有益な微生物の性能を評価する、又は病原体の動きを評価する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイを用いて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイは、イムノアッセイである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記アッセイは、ポータブル検出デバイスを用いて実施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポータブル検出デバイスは、ＬＥＤ及びカメラを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポータブル検出デバイスは、携帯電話である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アッセイは、複数フロー技術を用いて実施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
ラテラルフロー試験片は、１つ以上のサンプル受入領域及び１つ以上の標的捕捉ゾーンを含む固体担体を有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記固体担体は、プラスチック又はガラス基材へとエッチング又は成形されたニトロセルロース又は工学マイクロ流体チャネルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的捕捉ゾーンは、表面変性されて、前記環境サンプルにおいて、微生物又は微生物ベースの薬剤に特異的に結合する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
請求項１〜５２の前記アッセイを実施するためのデバイス。
【請求項５４】
前記標的分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性されたナノ結晶を含む、請求項５３に記載のデバイス。
【請求項５５】
前記ナノ結晶は、独特な光学的サインを生成する、独特で均一なモルホロジー、サイズ及び／又は組成物を有する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項５６】
前記独特な光学的サインは、立ち上がり及び／又は減衰時間で発現される、請求項５５に記載のデバイス。
【請求項５７】
前記ナノ結晶は、アップコンバージョン蛍光体粒子である、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項５８】
前記ナノ結晶は、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジミウム（Ｎｅ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）から選択される少なくとも１つの希土類元素を含む、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項５９】
前記ナノ結晶は、４ｎｍ〜４００ｎｍのサイズを有する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６０】
前記ナノ結晶は、１０−８秒以上発光する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６１】
前記ナノ結晶は、９００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長で励起し得る、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６２】
前記ナノ結晶は、９６０ｎｍ〜９８０ｎｍの波長で励起する、請求項６１に記載のデバイス。
【請求項６３】
前記ナノ結晶は、４００ｎｍ〜１２，０００ｎｍの波長で発光する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６４】
前記ナノ結晶は、β相粒子である、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６５】
前記ナノ結晶は、量子ドット、カーボンナノチューブ、金粒子、銀粒子及び磁気又は染料ドープ粒子から選択される第２のレポーターと組み合わせられる、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６６】
前記分析物に特異的に結合する前記エンティティは、抗体、タンパク質、アプタマーポリペプチド、又はポリヌクレオチドである、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６７】
前記ナノ結晶を調整して、サンプル中の自然発生発色団からのバックグラウンド干渉を排除する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６８】
多数の独立調整ナノ結晶が、単一サンプルから多数の分析物の分析を促進するために、単一担体に多重アレイで配置される、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項６９】
個々の試験からのデータは、前記試験を行った場所から離れた場所からアクセス可能なデータベースに転送される、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項７０】
ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイである、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項７１】
前記ラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイは、イムノアッセイである、請求項７０に記載のデバイス。
【請求項７２】
前記デバイスの一コンポーネントとして、ポータブル検出ユニットを含む、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項７３】
前記ポータブル検出ユニットは、ＬＥＤ及びカメラを含む、請求項７２に記載のデバイス。
【請求項７４】
前記ポータブル検出ユニットは、携帯電話である、請求項７３に記載のデバイス。
【請求項７５】
前記アッセイは、複数フロー技術を用いて実施される、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項７６】
ラテラルフロー試験片は、１つ以上のサンプル受入領域及び１つ以上の標的捕捉ゾーンを含む固体担体を有する、請求項５４に記載のデバイス。
【請求項７７】
前記固体担体は、プラスチック又はガラス基材へとエッチング又は成形されたニトロセルロース又は工学マイクロ流体チャネルである、請求項７６に記載のデバイス。
【請求項７８】
前記標的捕捉ゾーンは、表面変性されて、前記環境サンプルにおいて、微生物又は微生物ベースの薬剤に特異的に結合する、請求項７６に記載のデバイス。
【請求項７９】
ＰＣＲを用いて標的ポリヌクレオチド配列を検出するアッセイであって、
プライマー配列を用いて、前記標的ポリヌクレオチド配列を増幅し、前記プライマー配列の少なくとも１つが、ナノ結晶に結合している、アッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１７年５月１８日出願の米国仮出願第６２／５０７，８９５号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより援用される。
【背景技術】
【０００２】
農業、林業及び食品、栄養添加剤、繊維及び天然材料を製造するその他手段は、数多くの環境課題のために、益々困難に面している。このような課題としては、病虫害抵抗性、極端な温度や害虫が挙げられる。
【０００３】
収率を高め、病原体、害虫や疾病から作物を保護するために、農業従事者は、合成化学薬品や化学肥料の使用に頼るところが大きかったが、乱用や不適切な適用をすると、こうした物質は、地表水へ流出し、地下水に浸出し、空気中へ蒸発する可能性がある。空気汚染や水質汚染の源として、こうした物質は、益々綿密に検査されて、責任ある使用が、環境学的かつ商業的に必要不可欠とさせている。適正に使用しても、特定の肥料や農薬の過度の依存や長期使用は、土壌生態系を劣化させ、ストレス耐性を減じ、病虫害抵抗性を増大し、植物や動物の成長や生命力を阻害する。
【０００４】
農業従事者に、地球規模で、持続可能に植物や栄養補助食品を成長させ、そして、林業従事者に、持続可能に繊維や構造材料を製造させることができるよう、微生物の使用が広がっている。バクテリア、酵母、菌類、その副生成物のような微生物は、農業、畜産、林業、土壌、水及びその他天然資源の修復をはじめとする多くの状況において有用である。
【０００５】
農業従事者は、生きた微生物、微生物由来のバイオ製品、これらの組み合わせ、例えば、農薬といった生物剤の使用を益々受け入れている。こうした生物剤は、従来の農薬に勝る重要な利点がある。利点としては、１）従来の化学農薬に比べ害が少ない、２）より効率的かつ特異的、３）生分解が早いことが多く、環境汚染が少なくなる、等が挙げられる。
【０００６】
微生物及び微生物ベースの薬剤の使用については非常に大きな可能性があるものの、環境において、こういった微生物及び微生物ベースの薬剤を検出したり追跡する能力は限られている。微生物及び微生物ベースの薬剤を検出し追跡する能力は、作物、花き、芝、木材や動物の成長用をはじめとする、農業にとって特に利点がある。
【０００７】
このように、病原体を含む微生物、有益な微生物、又は微生物ベースの薬剤の現場での検出は、環境における変化を反映するものであり、植物の健康を改善するための適切な行動をとることを促すものである。さらに、環境における微生物病原体を検出しモニタリングすることはまた、人の健康を促進するのにも有益である。
【０００８】
微生物を検出するのに用いる従来の手順には、検体を培養し、微生物活性を検出することが含まれる。概して、標的微生物は、かかる標的微生物に特異的な培養媒体においてイノキュレートされ、成長のための全栄養分が提供される。検体は未処理の天然サンプル、又は例えば、膜ろ過により予備処理されたサンプルであってもよい。
【０００９】
検出方法において、一般的に、特定の標的に結合し、検出可能な信号を生成する少なくとも１つの分析試薬を用いる。分析試薬は、通常、高度の特異性や親和性で標的に結合する抗体やオリゴヌクレオチド等のプローブ分子、そして、適切な機器により検出可能な共有結合蛍光染料分子のような検出可能な標識を含む。典型的に、プローブ分子の結合特性が検出方法の特異性を定義し、関連標識の検出能が検出方法の感度を決める。
【００１０】
蛍光染料による検出方法には、好感度、低バックグラウンド、正確な測定といった多大な利点があり、生物医学的研究において有用な結果をもたらすことが多いが、農業において微生物や微生物ベースの薬剤を検出したり追跡するのには不向きである。その理由としては、１）大半の一般的なフルオロフォアは、スペクトルのＵＶ／可視部分に吸収及び発光帯の両方がある芳香族有機分子であり、２）蛍光発光の寿命が通常短く、約１〜１００ｎｓであり、３）光脱色のために、長い検出時間にわたって蛍光信号を統合することができないことが多く、４）フルオロフォアの検出には、精密機器が必要なことである。
【００１１】
このように、正確な診断情報を得るために、多大なサンプル作製工程を必要とすることなく、環境において、即時かつ容易に有益な微生物、微生物ベースの薬剤や病原体を検出し、追跡するデバイス及び方法が求められている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、微生物、微生物ベースの薬剤及び／又はその他分析物を、環境及び食品サンプルにおいて効率的かつ正確に検出、定量、追跡する方法及びデバイスを提供する。サンプルは、例えば、家畜やその他動物からの土、水、油、廃棄物、食品、葉及び／又は生物学的サンプルである。
【００１３】
分析物は、微生物の存在や活性から生じ得る微生物、微生物ベースの薬剤及び／又は分析物である。微生物は、有益な微生物や農業病原体を含む病原体である。
【００１４】
好ましい実施形態において、本発明は、当該分析物を即時に、効率的かつ正確に検出、定量及び／又は追跡するインフィールド診断アッセイを提供する。利点として、多数の分析物を同時に検出することができる。さらに、複合サンプルにおいて、軽微なサンプル作製又はサンプル作製なしで、分析物を低濃度で検出することができる。
【００１５】
利点として、本発明のアッセイは、当該の１つ以上の分析物（例えば、有益な微生物、微生物ベースの薬剤及び／又は病原体）の存在を識別したり、定量するための検出標識として調整可能なナノ結晶を用いることが挙げられる。調整可能なことで、サンプル中のクロモフォア等バックグラウンド干渉のフィルタリングが容易になる。また、調整可能なことで、多数の分析物を同時に検出することもできる。アッセイでは、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、又は２０以上の分析物を１つのサンプルから同時に検出する。
【００１６】
ナノ結晶には、均一なモルホロジーと均一なサイズという特徴がある。さらに、ナノ結晶は、光学発光スペクトルプロフィール、光学吸収スペクトルプロフィール、光強度依存プロフィール、光学寿命サイン（立ち上がり及び減衰時間）及び表面機能性といった独特な光学及び磁気特性を有している。例えば、ナノ結晶を表面変性すると、当該分析物に特異的に結合させることができる。表面変性は、例えば、ナノ結晶を抗体、タンパク質、アプタマー、ヌクレオチド及び／又はその他化合物に結合させることによりなされる。
【００１７】
一実施形態において、ナノ結晶は、作用するエネルギーを吸収したのち、吸収したエネルギーを放出する無機ルミネッセント又は電磁活性材料である。一実施形態において、ナノ結晶は、ストークス（ダウンコンバージョン）蛍光体である。フォトンの形態でエネルギーを吸収し、低周波数（低エネルギー、長波長）帯フォトンを放出する蛍光体は、ダウンコンバージョン蛍光体である。
【００１８】
他の実施形態において、ナノ結晶はアンチストークス（アップコンバージョン）蛍光体である。低周波数で２つ以上のフォトンの形態でエネルギーを吸収し、高周波数（高エネルギー、短波長）帯で放出する蛍光体は、アップコンバージョン蛍光体である。
【００１９】
一実施形態において、ナノ結晶は、希土類（ＲＥ）含有粒子である。ＲＥ元素としては、イットリウムと、ランタノイド（Ｌｎ）系列の元素、すなわち、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジミウム（Ｎｅ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）が挙げられる。
【００２０】
一回のアッセイで２つ以上の分析物を検出するのに、異なる励起や放出波長及び／又は異なる立ち上がり及び減衰レートでナノ結晶を用いると有利である。
【００２１】
本方法は、当該分析物を有すると推測される環境又は食品サンプルを提供し、サンプルを複数のナノ結晶と接触し、分析物に結合したナノ結晶を検出する工程を含む。
【００２２】
本発明に従って、検出、定量及び／又は追跡できる微生物としては、これらに限られるものではないが、バクテリア、古細菌、酵母、菌類、ウイルス、原生動物及び多細胞生物が挙げられる。本発明による分析物である微生物ベースの薬剤としては、これらに限られるものではないが、微生物、微生物代謝物及びその他微生物成長副生成物が挙げられる。一実施形態において、本発明は、さらに、微生物及び／又は微生物ベースの薬剤に応答して、エンティティ（例えば、動植物）により生成される生成物を検出する方法を提供する。
【００２３】
利点として、本発明のアッセイを用いて、環境や食物連鎖における分析物の追跡を促進することができる。
【００２４】
本発明のアッセイは、広範囲の設定に用いることができ、これらに限られるものではないが、例えば、作物、家畜、林業、芝管理、花き、牧草地、養殖、廃水処理、食物連鎖及び動物の健康のために用いることができる。
【００２５】
特定の実施形態において、本発明の方法は、サンプルを担体に適用して、分析アッセイの実施を促進する工程を含む。担体の表面は、例えば、分析物に特異的に結合その他結び付く抗体、タンパク質、アプタマー、ヌクレオチド及び／又はその他化合物と結び付く。アッセイは、例えば、ラテラルフローフォーマット、多重ウェルアレイ又はマイクロ流体力学を利用する。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、検出可能な標識中のナノ結晶が、アップコンバージョン蛍光体（ＵＣＰ）であるラテラルフロー又はマイクロ流体アッセイフォーマットを提供する。一実施形態において、検出デバイスは、アップコンバージョン放出波長を検出する。他の実施形態において、検出デバイスは、蛍光体寿命サインを検出する。
【００２７】
アップコンバージョンナノ結晶（ＵＣＮＣ）やサブミクロン蛍光体粒子のような蛍光体粒子のサイズ、モルホロジー、吸収、放出、立ち上がり時間、減衰時間、パワー密度を調節する能力によって、無数の独特のサインにより、材料を形成することが可能となる。希土類ＵＣＮＣプラットフォームの汎用性によって、単一レーダーシステムを用いて広い検出能力をもてる可能性が大幅に増える。さらに、希土類ナノ粒子又はサブミクロン粒子の独特なスペクトルフィンガープリントを光学的に調節する能力によって、極めて有利な多重化能力が提供される。
【００２８】
本発明の方法によって、複合サンプルにおいて、当該の微生物及び／又は微生物ベースの薬剤の即時の、感度のある、安価な検出及び／又は定量を行うことができる。本発明による標識としてのナノ結晶の使用によって、例えば、食品、農業及び家畜サンプル等の複合環境及び触診サンプルにおいて、低レベルの分析物標的を検出することのできる即時の、多重化、特異的アッセイプラットフォームが提供される。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、微生物、微生物ベースの薬剤及び／又はその他分析物を効率的かつ正確に検出、定量及び／又は追跡する方法及びデバイスを提供する。分析物は、土壌、水、食品、廃棄物、オイル、植物及び動物からの生物学的サンプル等の環境又は食品サンプルである。微生物は、例えば、農業病原体及び動物病原体をはじめとする有益な微生物又は病原体である。
【００３０】
本発明の方法は、当該の１つ以上の分析物（例えば、有益な微生物、微生物ベースの薬剤及び／又は病原体）を検出するための検出標識としてナノ結晶を用いる。利点として、多数の分析物を、一回のアッセイで同時に検出することができる。
【００３１】
本発明によれば、ナノ結晶は、調節可能な物理的特性を示し、利点として、制御されたサイズ均一性、形状選択性及び表面機能性を有する。例えば、ナノ結晶は、表面変性されて、当該分析物へ特異的に結合させることができる。表面変性は、ナノ結晶を、例えば、抗体、タンパク質、アプタマー、ヌクレオチド及び／又はその他化合物に結合することによりなされる。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、サンプル中の分析物を検出する方法であって、
該サンプルを、標的分析物に特異的に結合するエンティティにより表面変性しておいた複数のナノ結晶と接触させる工程と、
該分析物に結合した該ナノ結晶を、未結合のナノ結晶から分離する工程と、
該分析物に結合した該ナノ結晶を検出する工程とを含む。
【００３３】
本発明により検出、定量及び／又は追跡された微生物は、原核生物又は真核生物の微生物であり、これらに限られるものではないが、バクテリア（例えば、胞子又は植物、グラム陽性又はグラム陰性）、古細菌、酵母、菌類（例えば、糸状菌類及び菌胞子）、ウイルス、原生動物又は多細胞生物が挙げられる。場合によっては、特に興味深い微生物は、病原体のものである。「病原体」という用語は、任意の病原性微生物を指している。他の例において、微生物は有益である。
【００３４】
特定の実施形態において、本方法を用いて、任意で、複合環境サンプルにおいて、カンキツグリーニング病を生じさせる病原体を検出する。黄竜病としても知られるカンキツグリーニング病は、師部限定特殊原核生物α−プロテオバクテリアCandidatus Liberibacter spp.、Ca. africanus及びCa. L. americanusにより生じる。
【００３５】
本明細書に記載した方法は、カンキツグリーニング病に感染又は感染する可能性のある木又はその他植物で用いるのに好適である。植物の例を挙げると、これらに限られるものではないが、オレンジ由来品種が挙げられ、具体的には、Citrus sinensis（ネーブルオレンジ）、レモン（C. limon）、ライム（C. latifolia）、グレープフルーツ（C. paradise）、ダイダイ（C. aurantium）及びマンダリン（C. reticulata）がある。
【００３６】
他の具体的な実施形態において、本発明を用いて、ジャガイモ疫病、うどんこ病、赤色斑、タバコモザイクウイルス、火傷病及び／又はピアス病の原因となる植物病原体を検出、定量及び／又は追跡する。
【００３７】
サンプルとしては、これらに限られるものではないが、水、土壌、食品、植物、空気、廃棄物、動物由来の生物学的サンプル、ごみ、及び表面から集めたサンプルが挙げられる。
【００３８】
これらに限られるものではないが、スポンジ、ワイプ、綿棒（例えば、巻き付けた繊維製品）、フィルム、ブラシ（例えば、剛性又は変形性剛毛）等及びこれらの組み合わせをはじめとする様々な方法で集めることができる。
【００３９】
一実施形態において、分析物は、微生物ベースの薬剤である。本発明による微生物ベースの薬剤としては、これらに限られるものではないが、微生物、微生物代謝物、その他微生物成長副生成物を含む組成物が挙げられる。特定の実施形態において、微生物ベースの薬剤は、微生物バイオサーファクタント又はマイコトキシンである。
【００４０】
本発明のアッセイを用いて、環境又は食物連鎖における微生物、微生物ベースの薬剤、その他分析物の追跡を促進することができる。
【００４１】
好ましい実施形態において、ナノ結晶は、希土類含有格子、均一な三次元サイズ、均一な多面体モルホロジーを有する結晶形態の単分散粒子である。好ましくは、単分散粒子は、均一な細部と形状により、超格子へ自己集合可能である。
【００４２】
一実施形態において、ナノ結晶は、作用するエネルギーを吸収したのち、吸収したエネルギーを放出する無機ルミネッセント又は電磁活性材料である。かかるナノ結晶は、吸収光の除去後、１０−８秒以上発光し続ける蛍光体として作用しうる。蛍光体の残光又は燐光の半減期は、典型的に、約１０−６秒〜数日である。
【００４３】
特定の実施形態において、本発明によるナノ結晶は、ストークス（ダウンコンバージョン）蛍光体である。フォトンの形態でエネルギーを吸収し、低周波数（低エネルギー、長波長）帯フォトンを放出する蛍光体は、ダウンコンバージョン蛍光体である。
【００４４】
他の実施形態において、ナノ結晶はアンチストークス（アップコンバージョン）蛍光体である。低周波数で２つ以上のフォトンの形態でエネルギーを吸収し、高周波数（高エネルギー、短波長）帯で放出する蛍光体は、アップコンバージョン蛍光体である。アップコンバージョン蛍光体は、例えば、近赤外光、低エネルギー、長波長光により照射され、高エネルギー、短波長の可視光を放出する。
【００４５】
一実施形態において、ナノ結晶は、希土類（ＲＥ）含有粒子である。ＲＥ元素は、イットリウム及びランタノイド（Ｌｎ）系列の元素、すなわち、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジミウム（Ｎｅ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）を含む。
【００４６】
特定の実施形態において、本発明のダウンコンバージョンナノ結晶は、１ｎｍ〜４００ｎｍ、好ましくは、１０ｎｍ〜４００ｎｍの波長で励起する。
【００４７】
他の実施形態において、本発明のアップコンバージョンナノ結晶は、７００ｎｍ〜２０００ｎｍ、好ましくは、８００ｎｍ〜１５００ｎｍ、より好ましくは、９００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長で励起する。特定の実施形態において、アップコンバージョンナノ結晶は、９６０ｎｍ〜９８０ｎｍの波長で励起する。
【００４８】
一実施形態において、本発明のナノ結晶は、４００ｎｍ〜１２，０００ｎｍの波長で発光する。
【００４９】
一実施形態において、本アッセイで用いるナノ結晶は、量子ドット、カーボンナノチューブ、磁気及び染料ドープナノ粒子のような第２のレポーターと組み合わせられる。ナノ結晶と、他の波長変換及び吸収材料との組み合わせによって、更なる多重化や機能性が実現する。アップコンバージョンナノ結晶と、アップコンバージョンナノ結晶の放出を同じ捕捉抗体で吸収するダウンコンバージョン量子ドットのような２つの相互補完粒子は標的に結合する。９８０ｎｍの光で活性化すると、量子ドット自体は放出しないが、アップコンバージョンナノ結晶に近接しているときは、ナノ結晶は、必要なエネルギーを伝達して、量子ドットを活性化する。２つの粒子が十分に近接したときのみ、特定の標的に結合する。マイクロ流体システムにおいて、結合効果は、リアルタイムで定量化される。
【００５０】
ナノ結晶に磁気特性を追加すると、粒子は、磁石によりアッセイへと流れるため、分析前により早い処理時間が可能となる。磁気特性もまた、検出中に読まれる。他の金属と組み合わせられた希土類結晶は、常磁性及び強磁性といった異なる特性を示す。
【００５１】
ナノ結晶でコートされた有機染料は、フィルターを形成し、スペクトル干渉に有益である。ランタノイドラインは時折重なり、有機材料を添加すると、スペクトルの特定の領域がブロックされて、単一放出となる。
【００５２】
異なるサイズ、寿命及び／又はモルホロジーを有する多数のナノ結晶は、複合環境サンプルと組み合わせられ、そこに導入されて、多数の分析物検出に用いることのできる多数の独特な検出可能標識を提供する。希土類ナノ結晶は、例えば、三価希土類（又はランタノイド）金属に属する比較的長い燐光寿命のため有利である。
【００５３】
特定の標的を識別するために、異なる標識を用いて、一回のアッセイで２つ以上の分析物を検出するのに、異なる励起及び／又は波長でナノ結晶を用いると有利である。例えば、蛍光体波長、強度振幅及び分析物の数を同時に測定するために、赤外（ＩＲ）、紫外（ＵＶ）又は電子励起により、多数のスペクトル分離色（例えば、青色、緑色、赤色）を生成することができる。特に、捕捉分子と共有結合したナノ結晶の免疫細胞化学を利用すると、環境サンプルにおいて少量の分析物の高感度検出が可能となる。
【００５４】
利点として、ナノ結晶を用いたアッセイの多重特性によって、サンプル成分からの干渉なしで、複合環境又は食品サンプルにおいて、当該分析物を検出することができる。例えば、調節可能な特性を持つナノ結晶によって、土壌や植物サンプル中に存在する干渉発色団から当該分析物を定量化することができる。
【００５５】
一実施形態において、本発明はまた、ナノ結晶を作製する方法も提供する。本方法は、反応容器において、溶媒に少なくとも１つの前駆体金属塩を溶解し、反応容器を、少なくとも約３４０℃の温度を有する加熱塩浴に入れ、塩浴に熱を加えて、溶液中の前駆体金属塩を即時に分解して単分散粒子を形成し、塩浴中の反応容器を十分な時間保持して、単分散粒子のサイズを増大し、塩浴から反応容器を除去し、周囲温度溶媒で反応を冷却する工程を用いる。
【００５６】
利点を挙げると、本発明によれば、１０３ＣＦＵ／ｍＬ以下の微生物検出感度で高感度アッセイを行うことができる。好ましい実施形態において、感度は、１０２ＣＦＵ／ｍＬ、より好ましくは、１０１ＣＦＵ／ｍＬである。このように、アッセイでは、１０１ＣＦＵ／ｍＬ〜１０９ＣＦＵ／ｍＬ以上で、複合サンプルにおける微生物を検出することができる。
【００５７】
本発明はまた、０．００１ｎｇ／ｍＬという低い微生物ベースの薬剤の検出感度での、高感度アッセイも提供する。
【００５８】
利点として、アッセイは、現場で実施することができる。特定の実施形態において、サンプルが得られたところから、１０００、５００、２５０、１００、５０、２０、１０、５又は僅か１ヤード以内又はそれ以下でアッセイが行われる。さらに、サンプルが採取されたときから、６０、４５、３０、２０、１０、５、又は僅か１分以内又はそれ以下でアッセイが行われる。
【００５９】
一実施形態において、本方法は、複合環境サンプルにおける１つ以上の分析物を同時に検出するのに用いることができる。検出は、６０分以下、５０分以下、４０分以下、３０分以下、２０分以下、１０分以下、又は５分以下で行うことができる。好ましい実施形態において、ＰＣＲや標準ＥＬＩＳＡを用いるアッセイに比べて、アッセイは、より迅速に、及び／又は少ないサンプル作製で実施される。結果は、アッセイ完了時に即時に読まれ、格納され、他の場所へ転送される。例えば、結果は、保管や更なる分析のために電子的に転送される。例えば、結果は、電子保管クラウドやその他格納されたデータベースへ転送される。
【００６０】
これらのツールを用いて、製造直後と、適用直前の農業従事者の現場の両方で、製品仕様の品質管理と評価ができる。これによって、局所微生物発酵システムや任意のシステムにおいて、現在ある他の方法よりも迅速で、安価で、より精密なため、極めて有益な即時の製品リリースが促される。
【００６１】
本発明のアッセイを用いてまた、消費者が購入した微生物製品の特徴を確認することもできる。本発明のこの態様は、多くの生物製剤が経時により効力を失い、購入又は使用時には、記載された効力より劣るため、大いに価値がある。この態様はまた、在庫管理に役立ち、単一微生物のもの、又は数種を含むもののうち、どの製品が仕様外であるか判断される。
【００６２】
植物の栄養、成長及び適正な機能は、天然マイクロフローラの数の多さや分布に応じて異なり、つまりは、土壌肥沃度、耕作、水分、温度、通気、有機物及び多くのその他因子に影響される。干ばつ、可変の雨量及びその他環境変化、例えば、線虫類やその他害虫の増殖は、これら因子に影響し、土壌の多様性や植物の健康に影響する。これらの環境変数が、地理、ある年の季節性、年による違い等、多次元で現れる。それはまた、特定の農場内や、さらには、１エーカー以下という小さな領域にも、動物種族間や、同種属の個々の動物にも存在する。本発明のアッセイを用いて、メタ及びミクロ環境内での微生物（有益及び病原性）の存在及び生態学を即時かつ正確に分析することは、資産を強化し、病原体を管理し、ビジネスの効率と経済的な成果を上げようとする、農業従事者、取締係官、コンプライアンス係官、基本生産者、サプライチェーンの販売代理店、その他組織や個人にとって、大きな力を与えるものである。
【００６３】
ナノ結晶
本発明に有用なナノ結晶は、作用するエネルギーを吸収したのち、吸収したエネルギーを放出する無機ルミネッセント又は電磁活性材料である。かかるナノ結晶は、吸収光の除去後、１０−８秒以上発光し続ける蛍光体として作用しうる。蛍光体の残光又は燐光の半減期は、典型的に、約１０−６秒〜数日である。
【００６４】
本発明のナノ結晶は、組成、サイズ及び／又はモルホロジー（又は形状）に基づいて、異なる光学特性を有する。一実施形態において、本発明は、少なくとも２種類のナノ結晶の組み合わせに関わり、各タイプが、希土類含有格子、均一な三次元サイズ及び均一な多面体モルホロジーの単一の純粋な結晶相を有する複数の単分散粒子であり、単分散粒子の種類は、組成、サイズ又はモルホロジーで互いに異なる。好ましい実施形態において、単分散粒子の種類は、同じ組成であるが、異なるモルホロジーを有する。
【００６５】
一実施形態において、本発明によるナノ結晶は、ストークス（ダウンコンバージョン）蛍光体である。フォトンの形態でエネルギーを吸収し、低周波数（低エネルギー、長波長）帯フォトンを放出する蛍光体は、ダウンコンバージョン蛍光体である。
【００６６】
他の実施形態において、ナノ結晶は、アンチストークス（アップコンバージョン）蛍光体である。低周波数で２つ以上のフォトンの形態でエネルギーを吸収し、高周波数（高エネルギー、短波長）帯で放出する蛍光体は、アップコンバージョン蛍光体である。アップコンバージョン蛍光体は、例えば、近赤外光、低エネルギー、長波長光により照射され、高エネルギー、短波長の可視光を放出する。
【００６７】
一実施形態において、ナノ結晶は、希土類（ＲＥ）含有粒子である。ＲＥ元素としては、イットリウムと、ランタノイド（Ｌｎ）系列の元素、すなわち、ランタン（Ｌａ）、セリウム（Ｃｅ）、プラセオジム（Ｐｒ）、ネオジミウム（Ｎｅ）、プロメチウム（Ｐｍ）、サマリウム（Ｓｍ）、ユーロピウム（Ｅｕ）、ガドリニウム（Ｇｄ）、テルビウム（Ｔｂ）、ジスプロシウム（Ｄｙ）、ホルミウム（Ｈｏ）、エルビウム（Ｅｒ）、ツリウム（Ｔｍ）、イッテルビウム（Ｙｂ）及びルテチウム（Ｌｕ）が挙げられる。
【００６８】
特定の実施形態において、本発明のナノ結晶は、イットリウム含有格子又はランタノイド含有格子の希土類含有格子を有している。格子は、＋３酸化状態にあるイットリウム（Ｙ）又はランタノイド（Ｌｎ）を含む。ハロゲン化物（フッ化物、Ｆ−、好ましい）、酸化物、オキシ硫化物、オキシハロゲン化物（例えば、ＯＣｌ）、硫化物等のアニオンの存在により、格子において電荷は平衡している。アルカリ金属、すなわち、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）及びセシウム（Ｃｓ）及び／又はアルカリ土類金属、ベリリウム（Ｂｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）及びバリウム（Ｂａ）も母格子の成分であってもよい。アルカリ金属又はアルカリ土類金属は、「格子変形剤」と呼ばれることが多い。
【００６９】
ナノ結晶は、サイズが異なってもよい。一実施形態において、本発明の結晶は、最大寸法が１ｎｍ〜１，０００ｎｍ、好ましくは、５ｎｍ〜７５０ｎｍ、より好ましくは、１０ｎｍ〜５００ｎｍ、最も好ましくは、２０ｎｍ〜４００ｎｍのサイズのナノ結晶として記載されている。少なくとも１つの寸法が１μｍ〜４００μｍの大きな結晶は、本発明の他の実施形態を表している。結晶のサイズは、結晶をつくる元素の化学量論比、粒子を作製するのに用いる前駆体の化学量論比、反応時間に応じて異なる。
【００７０】
本発明に従って用いるナノ結晶は、ＲＥ含有格子の単一純結晶相を有するのが好ましい。一実施形態において、ナノ結晶は、α、β又は立方体相結晶である。好ましい実施形態において、ナノ結晶は、六角形（β）相粒子である。
【００７１】
本発明の単分散粒子の合成については、格子中に存在するアルカリ金属又はアルカリ土類金属が、結晶の対称性を決め、粒子のモルホロジーを制御し、ルミネッセント粒子の光学特性のような粒子の他の特性の独立した調整を可能とする。例えば、ＬｉＹＦ４、ＮａＹＦ４及びＫＹＦ４の結晶対称性は、それぞれ、正方、六角及び三角である。
【００７２】
本発明の粒子の化学組成は、独特の多角モルホロジーを与える。イットリウム含有格子の代表例としては、これらに限られるものではないが、ＬｉＹＦ４、ＢａＹＦ５、ＢａＹ２Ｆ８ＮａＹＦ４、ＫＹＦ４、Ｙ２Ｏ２Ｓ、Ｙ２Ｏ３等が挙げられる。ランタノイド含有格子は、ランタノイド系列の元素を有するものである。ランタノイド含有格子の代表例としては、これらに限られるものではないが、ＬａＦ３、ＣｅＦ３、ＰｒＦ３、ＮｅＦ３、ＰｍＦ３、ＳｍＦ３、ＥｕＦ３、ＧｄＦ３、ＴｂＦ３、ＤｙＦ３、ＨｏＦ３、ＥｒＦ３、ＴｍＦ３、ＹｂＦ３ＬｕＦ３、ＮａＧｄＦ４、Ｇｄ２ＯＳ２、ＬｉＨｏＦ４、ＬｉＥｒＦ４、ＣｅＯ、ＳｒＳ、ＣａＳ、ＧｄＯＣｌ等が挙げられる。
【００７３】
一実施形態において、粒子の化学組成には、組成に独特の特性を付与するドープ剤や格子変性剤が含まれていてもよい。
【００７４】
ナノ結晶のモルホロジーは、球状、六角形、立方体、ロッド形、ダイアモンド形、マッシュルームやダンベルのような変わった形状とすることができる。利点として、ＵＣＮＣは、光脱色せず、同時信号積分による、長期露光で高パワー密度励起が可能である。発光効率が減少することなく、無期限に貯蔵できるため、照射と分析を繰り返すことができる。以前の無機マーカーとは異なり、ナノ結晶は均一で、濃度に基づいて、一貫した信号を与える。結晶がアモルファスで、原子の分布が一貫していない場合は、構造に欠陥が生じ、放出された光学信号は定量できない。本発明は、結晶の均一なモルホロジーを利用する。リモートコントロールと同様に、試験中、赤外パルス光が結晶から放出される。かかる特性によって、複合環境サンプルにおける分析物の定量が促される。
【００７５】
Ａ．ダウンコンバージョン蛍光体
ダウンコンバージョン蛍光体材料としては、ＲＥ元素ドープ酸化物、ＲＥ元素ドープオキシ硫化物、ＲＥ元素ドープフッ化物が挙げられる。ダウンコンバージョン蛍光体としては、Ｙ２Ｏ３：Ｇｄ、Ｙ２Ｏ３：Ｄｙ、Ｙ２Ｏ３：Ｔｂ、Ｙ２Ｏ３：Ｈｏ、Ｙ２Ｏ３：Ｅｒ、Ｙ２Ｏ３：Ｔｍ、Ｇｄ２Ｏ３：Ｅｕ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｐｒ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｓｍ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｅｕ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｔｂ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｈｏ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｅｒ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｄｙ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｔｍ、Ｙ２Ｏ２Ｓ：Ｅｕ（赤色）、Ｙ２Ｏ３：Ｅｕ（赤色）及びＹＶＯ４：Ｅｕ（赤色）が例示される。ダウンコンバージョン蛍光体のその他の例としては、他のランタノイドでドープされたフッ化ナトリウムガドリニウム、例えば、ＮａＧｄＦ４：Ｔｂがあり、Ｔｂは、Ｅｕ、Ｄｙ、Ｐｒ、Ｃｅ等で置換できる。ランタノイドフッ化物もまた、ダウンコンバージョンフッ化物として知られており、例えば、ＴｂＦ３、ＥｕＦ３、ＰｒＦ３及びＤｙＦ３がある。
【００７６】
Ｂ．アップコンバージョン蛍光体
少なくとも１つの活性剤対でドープされた上述したようなＲＥ含有母格子から誘導された蛍光体は、増感剤（吸収剤としても知られている）とエミッターを含む。好適なアップコンバージョン蛍光体母格子としては、フッ化ナトリウムイットリウム（ＮａＹＦ４）、フッ化ランタン（ＬａＦ３）、オキシ硫化ランタン、オキシ硫化ＲＥ（ＲＥ２Ｏ２Ｓ）、オキシフッ化ＲＥ（ＲＥ４Ｏ３Ｆ６）、オキシ塩化ＲＥ（ＲＥＯＣｌ）、フッ化イットリウム（ＹＦ３）、没食子酸イットリウム、フッ化ガドリニウム（ＧｄＦ３）、フッ化バリウムイットリウム（ＢａＹＦ５、ＢａＹ２Ｆ８）及びオキシ硫化ガドリニウム（式中、ＲＥは、Ｙ、Ｇｄ、Ｌａ又はその他ランタノイド元素である）が挙げられる。好適な活性剤対は、イッテルビウム／エルビウム、イッテルビウム／ツリウム及びイッテルビウム／ホルミウムから選択される。アップコンバージョンに好適なその他活性剤対を用いてもよい。
【００７７】
ＲＥ含有母格子と、これら３つの活性剤対との組み合わせにより、少なくとも３つの異なる放出スペクトル（赤、緑及び青色可視光）による少なくとも３つの蛍光体が提供される。通常、吸収剤は、イッテルビウムであり、放出中心は、エルビウム、ホルミウム、テルビウム及びツリウムから選択されるが、本発明の他のアップコンバージョン蛍光体粒子は、他の吸収剤及び／又はエミッターを含有していてもよい。吸収剤：放出中心のモル比は、典型的に、少なくとも約１：１、通常、少なくとも約３：１〜５：１、好ましくは少なくとも約８：１〜１０：１、より好ましくは、少なくとも約１１：１〜２０：１、典型的に、約２５０：１未満、通常、約１００：１未満、より一般的には、約５０：１〜２５：１であるが、所望の特性（例えば、化学特性、製造効率、励起及び放出波長、量子効率又はその他考慮事項）に基づいて、専門家によって様々な比率が選択される。例えば、Ｙｂ濃度が増えると、吸収特性が僅かに変化し、生体医療に有用である。さらに、他の希土類及び遷移金属ドープ剤の導入、ドーピング濃度の変更、母格子変性は全て、スペクトルプロフィール及び立ち上がり及び減衰時間をさらに調整可能とする。
【００７８】
吸収剤（例えば、イッテルビウム）の放出中心（例えば、エルビウム、ツリウム又はホルミウム）に対する最適な比は、特定の吸収剤／エミッター対及び所望のスペクトルプロフィール及び寿命に応じて異なる。例えば、Ｙｂ：Ｅｒ対の吸収剤：エミッター比は、典型的に、約１：１〜約１００：１、一方、Ｙｂ：Ｔｍ及びＹｂ：Ｈｏ対の吸収剤：エミッターの比は、典型的に、約５００：１〜約２０００：１である。これらの異なる比は、結晶中のＹｂレベルに対するＥｒ、Ｔｍ、又はＨｏの異なるマッチングエネルギーレベルに起因し得る。たいていの用途について、アップコンバージョン蛍光体は、最良の量子効率のために、約１０−３０％のＹｂと、約１−２％のＥｒ、約０．１−０．０５％のＨｏ、又は約０．１−０．０５％のＴｍのいずれかを含むと都合が良い。ただし、その他の処方も用いることができる。
【００７９】
ある実施形態において、無機蛍光体は、最適には、約９００〜１０００ｎｍ、好ましくは、約９６０〜９８０ｎｍの赤外線により励起される。例えば、限定されるものではないが、式ＹＦ３：Ｙｂ０．１０Ｅｒ０．０１の微晶質無機蛍光体は、約９８０ｎｍの励起波長で、最大ルミネッセンス強度を示す。本発明のアップコンバージョン蛍光体は、典型的に、可視〜近赤外範囲に最大放出がある。例えば、特定の活性剤対は、特徴的な放出スペクトルを有する。イッテルビウム−エルビウム対は、蛍光体ホストに応じて、可視スペクトルの赤（６６０ｎｍ）又は緑（５４０ｎｍ）部分に最大放出があり、イッテルビウム−ホルミウム（５３５ｎｍ）対は、通常、緑部分に最大放出があり、イッテルビウム−ツリウムは、典型的に、青（４８０ｎｍ）、赤（６３５ｎｍ）及び赤外（８００ｎｍ）範囲に最大放出があり、イッテルビウム−テルビウムは、通常、緑（５４５ｎｍ）範囲に最大放出がある。例えば、Ｙ０．８０Ｙｂ０．１９Ｅｒ０．０１Ｆ２は、スペクトルの緑部分に最大放出がある。
【００８０】
本発明の蛍光体粒子は、９８０ｎｍでなく、９１５ｎｍで励起し、そこでは、水の吸収が大きくなり、組織がより加熱される。選択した比はまた、選択した特定の吸収剤−エミッター対に応じて異なり、所望の特性に従った参照値から計算することができる。大半の比について、放出特性を大幅に変えないが、冷却はどこかの時点でなされるようにして、活性剤の比を変更することにより、粒子モルホロジーを制御することもできる。
【００８１】
Ｃ．組成、モルホロジー及びサイズに基づく粒子特性
単分散粒子の特性は、様々なやり方で調整することができる。単分散粒子の特性、特性吸収及び放出スペクトルは、組成を調節する、例えば、母格子を選択したり、ドーピングにより、調整される。利点として、均一な多面体モルホロジーを与えると、単分散粒子は、異方性を示すことである。同じ組成であるが、異なる形状の粒子は、その形状及び／又はサイズのために、異なる光学特性を示す。
【００８２】
一実施形態において、単分散粒子の組成及び／又は形状を変えると、異なる減衰寿命が得られる。異なるスペクトル減衰寿命により、互いに差別化できる独特な蛍光体粒子が得られる。本発明によれば、同じ組成であるが、異なるモルホロジーの単分散粒子が得られるので、一つの組成であるものの（特に、医薬品や医療デバイス等の規制産業において）、独特の光学特性によってモルホロジーが区別できる。
【００８３】
このように、得られる特性吸収や放出スペクトルに加えて、本発明の単分散粒子の立ち上がり及び減衰時間はまた、粒子サイズやモルホロジーによって調整することもできる。立ち上がり時間は、最初の励起フォトンが吸収された時から、最初の放出フォトンが観察されるまでで測定される。減衰時間は、放出減衰の傾斜、又は励起源がオフになって、放出が停止するのに蛍光体が要する時間により測定される。励起エネルギーレベルから、電子が枯渇するのに要する時間とも言える。ドープ剤の比を変えることにより、立ち上がり及び減衰時間は信頼性よく変更することができる。
【００８４】
典型的に、励起状態占有率は、一時速度論により励起パルスをオフしたのち、減衰法則、Ｉ（ｔ）＝Ｉ０ｅｘｐ（−ｔ／τ）に従って、指数関数的に減衰する。一重指数関数的減衰については、Ｉ（ｔ）＝時間依存強度、Ｉ０＝時間０での強度（又は振幅）及びτ＝平均時間である。蛍光体（又はフルオロフォア）は、励起状態（又は＜ｔ＞）で寿命に等しい。（寿命τは、合計減衰率の逆数である、τ＝（Ｔ＋ｋｎｒ）−１、励起後時間ｔで、Ｔは放出レート、ｋｎｒは非発光減衰レートである）。概して、寿命の逆数は、励起状態でなくなるレートの合計である。ルミネッセンス寿命は、ｌｎｌ（ｔ）対ｔのプロットの傾斜（ｌ／τに等しい）から単に求められる。それは、強度を元の値の範囲（時間０）まで減じるのに必要な時間でもある。このように、既知の放出波長が与えられ、指数関数的減衰則をフィッティングする数多くのパラメータをモニターして、特定の蛍光体又は蛍光体のグループを識別し、例えば、独特の偽造防止コード、サイン又はラベル／タガントを開発するのに用いることができる。
【００８５】
たいていの場合、寿命は、結晶の組成又は全体の粒子サイズを変えることにより制御される。しかしながら、粒子モルホロジー及び均一性を、本発明の単分散粒子のように制御することにより、目視上別のモルホロジーを有し、そのモルホロジーに独特の寿命を有する粒子を、様々なモルホロジーの中で同一の化学組成を維持しながら、作製することができる。この特徴によって、極めて複合的な光学サイン又はタガントが可能となり、これは、例えば、アッセイ、生体医療、光学コンピューティングやセキュリティや認証等の様々な分野において、シリアライズ及び多重化アッセイや分析に用いられる。
【００８６】
粒子サイズやモルホロジーは、化学量論前駆体金属塩比、塩浴の加熱速度、反応時間等の反応条件を変えることにより制御される。塩浴中の初期加熱速度は、どの結晶面が最も早く成長するか選択することにより、モルホロジーを決めるのに重要である。最終粒子サイズは、塩浴における合計反応時間や前駆体比により決まる。反応容器が、塩浴の温度に達したのち、容器が塩浴中にある時間が長ければ長いほど、粒子は大きく成長する。
【００８７】
Ｄ．超格子集合
サイズ及びモルホロジーが均一なため、本発明の単分散粒子は、超格子構造へ自己集合することができる。超格子構造は、集合体における最低自由エネルギー配座を表す。この均一性は、本発明による均一なサイズ及びモルホロジーをもつ単分散粒子により得られるものである。超格子は、界面自己重合により形成され、異なる長さスケールによる階層構造が構築される。
【００８８】
本発明の単分散粒子の超格子は、粒子を溶媒に懸濁させ、表面にドロップキャストすることにより形成される。溶媒が徐々に蒸発するにつれて、粒子は超格子へと位置と配向順の両方で配列される。粒子を分散する溶媒としては、これらに限られるものではないが、ベンゼン、四塩化炭素、クロロベンゼン、クロロホルム、シクロヘキサン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、エタノール、ヘプタン、ヘキサン、ペンタン、テトラヒドロフラン、トルエン等を用いることができ、ヘキサンのような非極性有機溶媒が好ましい。
【００８９】
本発明の超格子は、本発明の単分散粒子、特に、本発明の単分散ナノ粒子の透明フィルムである。超格子を形成するために、構成粒子は、同一又は略同一のサイズと形状でなければならない。両方の条件が揃うと、均一でパターン化された粒子の単層が形成される。本発明の単分散粒子は、均一なサイズ及び均一なモルホロジーのための基準を満たすことが有利である。本発明の粒子のサイズが小さく均一なため、散乱光はなく、その結果、透明フィルムが得られる。
【００９０】
ナノ結晶の機能化
一実施形態において、ナノ結晶は、１つ以上の捕捉原子により機能化されている。これは、例えば、ナノ結晶を、抗体、タンパク質、ポリペプチド、アプタマー、ヌクレオチド及び／又は標的微生物や微生物ベースの薬剤といった分析物に特異的に結合するその他化合物に結合することによる。他の実施形態において、分析物標的はまた、病原体微生物による感染に応じて発現される任意のホスト生体分子とすることもできる。
【００９１】
本明細書で用いる「特異的」とは、特異的な標的のみを認識したり、非特異的な分子に結合するよりも、特異的な標的に対して、非常に高い結合親和性を有する抗体又はその他エンティティを指す。結合親和性は、エピトープと、抗体抗原結合部位間の相互作用の強さの尺度である。高親和性抗体は、低親和性抗体よりも短い時間で、大量の抗体に結合する。このように、結合親和性定数は大きく異なり、１０５ｍｏｌ−１未満〜１０１２ｍｏｌ−１を超える。
【００９２】
好ましい実施形態において、抗体は、全長重軽鎖又はその断片を有する完全抗体分子を含み、これらに限られるものではないが、上記したもののいずれかのＦａｂ、変性Ｆａｂ、Ｆａｂ'、変性Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二、三又は四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体及びエピトープ結合断片（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ、２００５、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６−１１３６；Ａｄａｉｒ  ａｎｄ  Ｌａｗｓｏｎ、２００５、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ  ２（３）、２０９−２１７を参照のこと）。抗体は、標的微生物の表面で発現する、例えば、タンパク質やタンパク質のエピトープに特異的とすることができる。
【００９３】
キメラ抗体を含む抗体を、本発明に従って用いることができる。キメラ抗体は、軽重鎖遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントで構成されるよう遺伝子工学操作された免疫グロブリン遺伝子によりエンコードされた抗体である。キメラ抗体は抗原性が低い。多価抗体は、多特異性又は単一特異性であってよい。
【００９４】
本発明で用いる抗体は、購入したり、業界で公知のファージディスプレイ法をはじめとする様々な方法を用いて生成することができる。また、マウスその他哺乳類を含む生物を用いて、抗原を発現させてよい。
【００９５】
抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＡ）又はサブクラスとすることができる。一実施形態において、本発明で用いる抗体は、ＩｇＧクラスであり、ＩｇＧのサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４から選択される。
【００９６】
本発明で用いる抗体は、抗体の活性を変えるための１つ以上の突然変異体を含んでいてよい。
【００９７】
抗原としては、これらに限定されるものではないが、安定した細胞表面分子、周囲、外在、分泌、内在、貫通膜分子を含む過渡原形質膜成分が例示される。ある実施形態において、分子は、細胞の原形質膜の外部で露出される。他の実施形態において、抗原決定基は、表面露出せず、例えば、細胞分解の際に露出する。特定の実施形態において、抗原は、既知の構造で、既知又は記載された機能を有する分子で、これらに限られるものではないが、糖タンパク質、リポタンパク質及び細胞壁固定タンパク質が挙げられ、抗原のエピトープもまた非タンパク質ベースの生体分子であってよい。
【００９８】
他の実施形態において、表面抗原及び／又は表面抗原のエピトープは、ゲノム配列情報に基づいて選択される。抗原の識別には、当該の特定のモチーフの配列情報に基づいて、業界で公知の生物学的ソフトウェア（例えば、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｒａｇｉｎｉ  Ｔｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１２，５（１１），５１８４−５１８７を参照のこと）を用いてよい。例えば、ＳｉｇｎａｌＰ、ＬｉｐｏＰ、ＰＳＯＲＴｂ及びＴＭＨＭＭＳのようなプログラムを用いて、当該抗原のフィルタリングと選択をすることができる。
【００９９】
具体的に、ＳｉｇｎａｌＰ  ４．１サーバーは、異なる生体、例えば、グラム陽性原核生物、グラム陰性原核生物及び真核生物からのアミノ酸配列におけるシグナルペプチド切断部位の存在と位置を予測する。この方法には、開裂部位の予測と、いくつかの人工ニューラルネットワークの組み合わせに基づいたシグナルペプチド／非シグナルペプチドの予測とが含まれる。ウェブサイトアドレスは、www.cbs.dtu.dk/services/SignalPである。
【０１００】
ＴＭＨＭＭサーバーは、疎水性アミノ酸を探すことによりタンパク質中の膜貫通螺旋を予測した。アルゴリズムは、螺旋の数及びペプチドの長さの強調された貫通を予測した。ウェブアドレスは、www.cbs.dtu.dk/services/TMHMMである。ｌｉｐｏＰサーバーは、利用できるリポタンパク質シグナルペプチドにより、リポタンパク質を予測した。ウェブアドレスは、www.cbs.dtu.dk/services/LipoPである。
【０１０１】
ＰＳＯＲＴｂは、局在部位や関連確率を予測する。タンパク質の細胞内局在は、アミノ酸配列情報に基づいて行われた。タンパク質の細胞内局在は、シグナルペプチドや膜貫通アルファ螺旋の存在といった、タンパク質の一次構造に存在するいくつかの特徴により影響された。ウェブアドレスは、http://www.psort.org/psortb/である。
【０１０２】
利点として、本発明の方法を用いて、培養液中での成長が難しい、又は不可能な、或いは、培養液中で成長するが、非常に遅い微生物を検出することができる。本発明の方法は、非常に少ない数の微生物を検出できるため、本発明のアッセイを行う前に、数を増やすために、培養液中のサンプルから微生物を成長させる必要はない。従って、本発明のアッセイを用いて、標準実験室条件や培養液中での培養を修正できず、数を倍にするのに１、２、５、１０、２４、７２時間以上かかる、あるいは、培養液中で全く成長しない微生物を検出することができる。このように、本発明のアッセイを用いて、パスツリアのような有益な微生物やカンキツグリーニング病やゼブラチップ病を生じる病原体を検出、定量及び／又は追跡することができる。ウイルスも検出することができる。
【０１０３】
培養の難しい微生物のための捕捉分子は、上述したようにして、また、メタゲノムシーケンシングを通して、識別される抗原に基づくものとすることができる。メタゲノミクスは、環境サンプルから直接回収された遺伝物質の研究である。従来のシーケンシングでは、ＤＮＡのソースとして同一の細胞の培養が必要とされる。しかしながら、環境サンプル中の多くの微生物は培養できないため、シーケンスできない。バイオインフォマティクスの進化、ＤＮＡ増幅の改良及び計算能力の増強が、環境サンプルから回収されたＤＮＡシークエンスの分析に多いに役立っており、ショットガンシーケンシングのメタゲノミクスサンプルへの適用を可能としている。ショットガンシーケンシングのランダムな性質によって、従来の培養技術を用いて培養されない生物の多くが、少なくともいくつかのシーケンスセグメントにより確実に表されるようになる。
【０１０４】
病原体微生物のゲノムは、遺伝子の水平伝播により得られる病原性遺伝子島を含むことが多い。これらの遺伝子島は、病原性生体のゲノムに含まれるが、非病原性関連種には典型的に含まれない。病原性遺伝子島ＤＮＡ配列は、特定の抗体に対して優れた標的である病原性因子に対してコードすることが多い。病原性遺伝子島は、バイオインフォマティクス分析により識別され、サブクローニングされ、発現され、抗体生成の純粋な抗原として用いることができる。
【０１０５】
メタゲノミクスデータ分析の最初の工程は、可能性のある真核生物起源の冗長な低品質配列の除去を含む、特定のプレフィルタリング工程の実施が含まれることが多い。次に、メタゲノミクス分析は、典型的に、集合コンティグにおけるコーディング領域のアノテーションにおいて２つのアプローチを用いる。1つ目のアプローチは、単純なＢＬＡＳＴサーチにより、シーケンスデータベースで既に公開されている遺伝子の相同性に基づいて、遺伝子を識別することである。２つ目は、まず、シーケンスの固有の特徴を用いて、関連生体から遺伝子トレーニングセットに基づいて、コーディング領域を予測する。これは、ＧｅｎｅＭａｒｋ及びＧＬＩＭＭＥＲのようなプログラムにより採られるアプローチである。このアプローチによって、シーケンスデータベースにおける相同性を欠いたコーディング領域の検出が促される。
【０１０６】
メタゲノミクスシーケンシングは、ウイルスコミュニティの研究に特に有用である。ウイルスは、共有ユニバーサル系統マーカーがないため（バクテリア及び古細菌については１６Ｓ  ＲＮＡ、真核生物については１８Ｓ  ＲＮＡ）、環境サンプルからウイルスコミュニティの遺伝的多様性にアクセスする唯一の方法は、メタゲノミクスによる。
【０１０７】
本発明によれば、メタゲノムシーケンシングを、例えば、微生物の複合混合物を有するリーフサンプルで実施することができる。メタゲノムシーケンシングを用いると、ＤＮＡコーディングシーケンスを識別することができ、これをクローニング及びエンジニアリングして、ペプチド及び／又はフルタンパク質を発現し、これを用いて、培養できない微生物を検出、定量及び／又は追跡するために、ラテラルフローアッセイ（又はその他アッセイ）に用いる抗体を生成することができる。
【０１０８】
一実施形態において、ナノ結晶の表面を、表面変性剤、例えば、ポリアクリル酸のようなポリマー、マレイン酸／ポリアクリル酸及びブロックコポリマーのようなコポリマーや、不活性シリカ層でコートして、捕捉分子の粒子表面への接合を可能としたり、改善してもよい。各種の捕捉分子に接合したナノ結晶は、独特で均一なモルホロジー、サイズ及び／又は組成を有し、独特の光学寿命サインを生成する。
【０１０９】
一実施形態において、捕捉分子の接合は、業界に公知の方法を用いてなされる。通常、接合は、求核剤に結合するカルボン酸活性試薬を用いてなされる。特定の実施形態において、捕捉分子の接合は、化学標識、架橋及び固相固定化のための、カルボキシレート基のアミン反応性エステル調製用のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）及び／又はスルホ−ＮＨＳを介してなされる。ＮＨＳエステル及びチオールに加えて、イミドエステルを、タンパク質架橋及び標識のために試薬に組み込まれるアミン特異性官能基として用いることもできる。
【０１１０】
アッセイフォーマット
特定の実施形態において、本発明の方法は、環境サンプル中の標的微生物及び／又は微生物ベースの薬剤が、担体に固定その他結び付く工程を含む。この工程は、担体の表面を、捕捉分子、例えば、抗体、タンパク質、ヌクレオチド及び／又は標的微生物や微生物ベースの薬剤を特異的に認識するその他化合物により処理することによりなされる。捕捉分子は、当該標的を特異的に捕捉するナノ結晶の表面を官能化させるのに用いられる同一又は異なる分子であってよい。
【０１１１】
本発明による分離工程は、業界に公知の方法によりなされてよい。分離方法には、これらに限られるものではないが、洗浄、灌流、透析がある。
【０１１２】
通常は必要ないが、本発明の特定の実施形態において、常磁性ＵＣＮＣの使用等、濃縮技術を用いて、サンプルを濃縮して、感度及び／又は選択性をさらに高めることができる。
【０１１３】
Ａ．ラテラルフローアッセイ
好ましい実施形態において、本発明は、サンプル中の当該分析物の有無や量を試験するのに用いるラテラルフローアッセイを用いる。一実施形態において、抗体（又はその他結合液）が、固体担体に固定されて、標的分析物を捕捉することによって、固定された分析物を観察することにより、検出や定量を促す「サンドイッチ」アッセイを用いる。
【０１１４】
一実施形態において、本発明のアッセイは、ラテラルフロー試験片で行われる。ラテラルフロー試験片は、サンプル受容領域と標的捕捉ゾーンの配置された固体担体を有する。固体担体はまた、ラテラルフロー試験片が、サンプルの適切なキャリア液に露出されたとき、サンプル受領領域から標的捕捉ゾーンまでのサンプルの毛細管流も提供する。かかる固体担体の材料としては、例えば、有機又は無機ポリマー、天然及び合成ポリマーがある。好適な固体担体のより具体的な例を挙げると、これらに限られるものではないが、ガラスファイバー、セルロース、ナイロン、架橋デキストラン、様々なクロマトグラフィー用ペーパー、Ｄｉｏｍａｔ（登録商標）及びニトロセルロースがある。好ましい実施形態において、固体担体の材料は、ニトロセルロースである。更なる実施形態において、ラテラルフロー試験片は、１つ以上の標的捕捉ゾーンを含む。
【０１１５】
一実施形態において、ラテラルフロー試験片は、特定の波長の光、例えば、赤外、可視、ＵＶ光や、電子ビームを指向し、刺激すると、ナノ結晶により放出される戻り波長を捕捉するデバイスで用いるようにできている。このようなデバイスは、好ましくは、手持ち形である。
【０１１６】
更なる実施形態において、本発明は、例えば、携帯電話カメラで読み取ることのできる、オリゴヌクレオチド又は抗体に結合した希土類ナノ結晶のラテラルフローアッセイを利用する高感度で、特異性があり、定量可能な診断プラットフォームを提供する。アッセイは、ＤＮＡ増幅を必要とせず、広範囲の農業病原体を検出するのに適用することができる。具体的な例として、アッセイを用いて、キャッサバ中のXanthomonas axonopodis pv. manihotis（白葉枯病）を検出することができる。
【０１１７】
農夫症の検出方法は、歴史的に、実験室分析を必要とするため、リソースが制限された設定で、使用が制限される。従来のラテラルフローアッセイは、現場設定で利用しやすいが、ＰＣＲのようなラボベースの方法よりも一般的に感度が低い。光学読み取り装置を、ラテラルフローアッセイと組み合わせると、目視読み取りにけた違いの改善が得られる。しかしながら、光学読み取り装置は、分散使用には費用がかかる。
【０１１８】
一実施形態において、本発明のアッセイは、オリゴヌクレオチドに接合したナノ結晶を用いることにより、この問題に取り組むものであり、そして、これは、ラテラルフローアッセイフォーマットに用いられる。ナノ結晶の高効率と感度によって、ＤＮＡ増幅工程の必要性と光学読み取り装置の使用が排除される。むしろ、読み取り装置は、ＬＥＤフラッシュやカメラのような複雑でない技術のものを用いることができる。フラッシュやカメラは、例えば、典型的に、標準的な携帯電話に組み込まれているようなものとすることができる。
【０１１９】
利点として、携帯電話（又は同様のデバイス）からの結果を記録すると、データの転送と集約が促進される。これを用いて、よりバランスのとれたデータセットを作製することができ、例えば、機械学習を適用すると、農夫症の発生の予測を改善することができる。
【０１２０】
特定の実施形態において、本発明は、ラテラルフローアッセイフォーマットを提供するものであり、検出可能な標識のナノ結晶は、アップコンバージョン蛍光体レポーターを構成するものである。連続フロー技術は、捕捉分子によりカバーされたナノ結晶のようなレポーターの使用を許すものである。特定の実施形態において、従来のアッセイに比べて、フローレートを早くし、フロー時間を短くすることができる。
【０１２１】
ラテラルフロー試験片が、サンプルの適切なキャリア液体に露出されると、固体担体は、サンプル受容領域から標的捕捉ゾーンまでサンプルの毛細管流も提供する。
【０１２２】
一実施形態において、ラテラルフロー試験片又はマイクロ流体デバイスは、１つ以上のサンプル受容領域／チャネルを含み、多数のサンプルを適用することができる。各試料は、異なる分析物を含んでいても、同じ分析物を含んでいてもよい。他の実施形態において、サンプル受容領域は、サンプルを、検出システムと相互作用するのに好適なものとさせるバッファー塩や界面活性剤で含侵された吸収パッドを含む。
【０１２３】
更なる実施形態において、ラテラルフロー試験片は、１つ以上の標的捕捉ゾーンを含む。捕捉ゾーンの表面は、例えば、環境サンプルにおける微生物又は微生物ベースの抗原である、当該分析物に特異的に結合するエンティティで変性されている。捕捉ゾーンの表面の変性は、固体担体を、例えば、抗体、タンパク質、ヌクレオチド及び／又はその他化合物へ結合することによりなされる。かかる変性は、ナノ結晶に提要されたのと同じ、又は異なる変性であってよい。各分析物捕捉ゾーンは、異なる種の分析物を結合してもよいし、同じ種の分析物を結合してもよい。各分析捕捉ゾーンが、同じ種の分析物に結合するラテラルフロー試験片において、結合は、異なる濃度の分析物で生じる。捕捉ゾーンは、分析物捕捉ゾーンを通して、サンプル受容領域からサンプル及び溶媒フローを引き付ける限りは、いかなる形状であってもよい。
【０１２４】
一実施形態において、ラテラルフロー試験片は、いくつかある場合には、偽陽性及び偽陰性結果に寄与するｐＨ変化（例えば、ｐＨ２〜１２）、イオン強度、粘度及び生物学的マトリックスに耐久性を示す。
【０１２５】
アップコンバージョンルミネッセンスは、ナノ結晶による２つ以上の低エネルギー（長波長、典型的に赤外）フォトンの吸収に続き、１つの高エネルギー（短波長）フォトンの放出に基づく。ＵＣＰを用いたラテラルフローアッセイのいくつかの態様は、内容を参照することにより組み込まれる、Ｃｏｒｓｔｊｅｎｓら（２０１４）、Ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｔｅｓｔ  ｆｏｒＮｅｕｒｏｃｙｓｔｉｃｅｒｃｏｓｉｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｕｐ−Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ａ  Ｌｉｇｈｔｗｅｉｇｈｔ  Ｓｔｒｉｐ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＰｌｏＳ  Ｎｅｇｌ．  Ｔｒｏｐ．  Ｄｉｓ．  ８（７）：ｅ２９４４に記載されている。
【０１２６】
Ｂ．ＰＣＲアッセイ
他の実施形態において、本発明の材料及び方法をＰＣＲ手順と組み合わせて、高感度アッセイを行う。均一なサイズのナノ結晶ＵＣＰを、オリゴヌクレオチドプライマーの５'末端のナノ結晶に結合した１つの（又は両方の）ＰＣＲプライマーを用いた増幅により生成されたＰＣＲ生成物へ組み込むと、検出に用いられる標準レポーター分子に比べて、優れたアッセイ特性が与えられる。
【０１２７】
利点として、一般的に用いられているレポーター分子と異なり（例えば、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペロキシダーゼ）、ナノ結晶から生成されたシグナルは、背景蛍光も他の生物学的分子による干渉もない。さらに、ＵＣＰシグナルは２０年以上続くため、シグナルは、一時的に積分されて、アッセイの感度が増大し得る。利点として、ナノ結晶のサイズの均一性とモルホロジーにより、ＵＣＰのオリゴヌクレオチドへの化学量論的結合が可能となり、アッセイの感度、定量化及びダイナミックレンジが改善される。
【０１２８】
さらに、光学特性を補完するナノ結晶レポーター対は、単一シーケンス、タンパク質、細胞等で特定の標的マーカーの共在化を決めるよう設計された様々な同種ベースのシステム及びアッセイで用いることができる。補完的なナノ結晶対は、互いに近接すると、ナノ結晶Ａからの放出が、ナノ結晶Ｂを活性化するような独特の光学特性を示す。具体的な例において、９８０ｎｍの励起及び８００ｎｍの放出のＮａＹＦ４：ＹｂＴｍ組成物は、 ８０８ｎｍの励起及び約９８０ｎｍの放出サインのＮａＹＦ４：ＹｂＴｍＮｄ組成物を励起することができる。
【０１２９】
光学的に補完するナノ結晶レポーターは、（１）共在化標的の識別、（２）同種混合物（分離していない）における特定の結合事象の識別、（３）特定のオリゴヌクレオチド シーケンスに沿ったマーカーの存在及び共在化の多重識別を可能とする。標的の数が少ないと考えらえるアッセイ標的について、例えば、周知の磁気ベースの技術を用いた標的種の安価な濃縮を容易に実施することができる。
【０１３０】
Ｃ．多重ウェルアッセイ
他の実施形態において、本発明のアッセイは、高処理量設定で、マルチウェルアレイ、例えば、８、１２、２４、４８、９６、１９２、３８４ウェルアレイで実施される。
【０１３１】
分析物
本発明は、環境サンプルにおいて、微生物、微生物ベースの薬剤及び／又はその他分析物を効率的かつ正確に、検出、定量及び／又は追跡する方法及びデバイスを提供する。
【０１３２】
分析物は、微生物の存在又は活性から生じた微生物、微生物ベースの薬剤及び／又は分析物である。微生物は、農業病原体をはじめとする有益な微生物又は病原体である。
【０１３３】
本発明に従って検出、定量及び／又は追跡される微生物としては、これらに限られるものではないが、古細菌、酵母、菌類、ウイルス、原生動物及び多細胞生物が挙げられる。本発明に従って分析物となり得る微生物ベースの薬剤としては、これらに限られるものではないが、微生物、微生物代謝物及びその他微生物成長副生成物を含む組成物が挙げられる。
【０１３４】
一実施形態において、本発明は、さらに、微生物及び／又は微生物ベースの薬剤に応答して、エンティティ（動物や植物）により生成される生成物を検出する方法を提供する。
【０１３５】
一実施形態において、本方法は、農業病原体により感染したエンティティにより生成された生成物を検出する。エンティティは、植物や、葉、幹、根及び花をはじめとする植物の一部とすることができる。環境サンプルとしては、これらに限られるものではないが、可溶植物エキスや不溶植物エキスが挙げられる。
【０１３６】
特定の実施形態において、微生物及び／又は微生物ベースの薬剤に応答してエンティティにより生成された生成物は、タンパク質、ポリペプチド、ヌクレオチド及び／又はその他分子である。生成物は、環境又は食品サンプルに分泌される。
【０１３７】
Ａ．有益な微生物
本発明に従って検出可能な微生物としては、これらに限られるものではないが、古細菌、酵母、菌類、ウイルス、原生動物、又は多細胞生物が挙げられる。
【０１３８】
一実施形態において、微生物は、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアをはじめとするバクテリアである。これらのバクテリアは、これらに限られるものではないが、例えば、Escherichia coli、Rhizobium（例えば、Rhizobium japonicum、Sinorhizobium meliloti、Sinorhizobium fredii、Rhizobium leguminosarum biovar trifoliiやRhizobium etli）、Bradyrhizobium（例えば、Bradyrhizobium japanicumやB. parasponia）、Bacillus（例えば、Bacillus subtilis、Bacillus firmus、Bacillus laterosporus、Bacillus megaterium、Bacillus amyloliquifaciens）、Azobacter（例えば、Azobacter vinelandiiやAzobacter chroococcum）、Arhrobacter（例えば、Agrobacterium radiobacter）、Pseudomonas（例えば、Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens（Kluyver)）、Azospirillium（例えば、Azospirillumbrasiliensis）、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter（例えば、C. xyli subsp. xyliやC. xyli subsp. cynodontis）、cyanobacteria、Pantoea（例えば、Pantoea agglomerans）、Sphingomonas（例えば、Sphingomonas paucimobilis）、Streptomyces（例えば、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces qriseus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces aureusやStreptomyces kasugaenis）、Streptoverticillium（例えば、Streptoverticillium rimofaciens）、Ralslonia（例えば、Ralslonia eulropha）、Rhodospirillum（例えば、Rhodospirillum rubrum）、Xanthomonas（例えば、Xanthomonas campestris）、Erwinia（例えば、Erwinia carotovora）、Clostridium（例えば、Clostridium bravidaciensやClostridium malacusomae）及びこれらの組み合わせである。
【０１３９】
特定の実施形態において、本方法を用いて、環境にあるBacillus subtilisを検出及び／又は追跡することができる。一実施形態において、微生物は、Bacillus subtilis菌株、サーファクチンの有効な製造源である、例えば、B. subtilis var. locuses菌株Ｂ１及びＢ２を含む。
【０１４０】
一実施形態において、微生物としては、菌類（酵母を含む）、これらに限られるものではないが、例えば、Starmerella、Mycorrhiza（例えば、vesicular-arbuscular mycorrhizae（ＶＡＭ）、arbuscular mycorrhizae（ＡＭ）、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、Fusarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma（例えば、Trichoderma reesei、T. harzianum、T. viride及びT. hamatum）、Rhizopus spp、内生菌（例えば、Piriformis indica）、Saccharomyces（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii sequela及びSaccharomyces torula）、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces（例えば、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis）、Pichia spp（例えば、Pichia pastoris）、Wickerhamomyces（例えば、Wickerhamomyces anomalus）のようなキラー酵母及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４１】
より具体的には、本方法を用いて、害虫の制御、バイオレメディエーション、油回収の改善、その他有用な目的を可能とする１つ以上の生存真菌株を検出することができる。例えば、Starmerella bombicola、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、Candida stellate、Candida kuoi、Candida sp. NRRL Y-27208、Rhodotorula bogoriensis sp.、Wickerhamiella domericqiae、及びその他Starmerella系統群のソホロ脂質生成菌株が挙げられる。
【０１４２】
他の実施形態において、微生物は、酵母である。数多くの酵母種が、本発明による生成に好適であり、これらに限られるものではないが、Saccharomyces（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii sequela及びSaccharomyces torula）、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces（例えば、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis）、Pichia spp（例えば、Pichia pastoris）及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４３】
特定の実施形態において、微生物はキラー酵母の菌株から選択される。他の実施形態において、微生物は、Wickerhamomyces anomalus菌株である。
【０１４４】
Pichia anomala及びHansenula anomalaとしても知られるWickerhamomyces anomalusは、食品や穀類製造に関連していることが多く、低ｐＨ、高浸透圧、少量の酸素又は酸素なしで、様々な炭素源で成長でき、様々な環境で生存できる。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明は、環境において、W. anomalus酵母菌株及びその変異体を検出する方法を提供する。変異体を製造する手順は、微生物学業界において周知されている。例えば、紫外線及びニトロソグアニジンは、これまで広く用いられている。一実施形態において、微生物は、Starmerella酵母系統群、例えば、Starmerella bombicolaである。
【０１４６】
一実施形態において、微生物は、古細菌や又は真正細菌であり、これらに限られるものではないが、Methanobacteria、Methanococci、Methanomicrobia、Methanopyri、Halobacteria、Halococci、Thermococci、Thermoplasmata、Thermoproetei、Psychrobacter、Arthrobacter、Halomonas、Pseudomonas、Hyphomonas、Sphingomonas、Archaeoglobi、Nanohaloarchaea、好極限性細菌古細菌、例えば、好熱菌、好塩菌、好酸性菌、好冷菌及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４７】
一実施形態において、微生物は、ウイルスであり、これらに限られるものではないが、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ヘルペス系列のウイルス、帯状疱疹、インフルエンザ、ライノウイルス、麻疹、ムンプス、エンテロウイルス等が挙げられる。
【０１４８】
特定の実施形態において、ＳＬＰ生成のための微生物は、Candida sp.、Cryptococcus sp.、Cyberlindnera samutprakarnensis JP52（T）、Pichia anomala、Rhodotorula sp.、又はWickerhamiella sp.とすることができる。
【０１４９】
さらに特定の実施形態において、ＭＥＬ生成のための微生物は、Pseudozyma sp.、Candida sp.、Ustilago sp.、Schizonella sp.、又はKurtzmanomyces sp. とすることができる。
【０１５０】
その他微生物菌株、例えば、ポリマーを消化したり、大量の、例えば、グリコリピドバイオサーファクタント、酵素、溶剤又はその他有用な代謝物を蓄積することのできるその他微生物菌株もまた、本発明に従って用いることができる。例えば、本発明において有用な代謝物としては、マンノタンパク質、ベータグルカン及びバイオ乳化及び表面／界面張力減少特性を有するその他代謝物が挙げられる。
【０１５１】
Ｂ．病原体
一実施形態において、本発明は、環境サンプルにおいて病原体を検出する方法を提供する。病原体としては、これらに限られるものではないが、Yersinia、Klebsiella、Providencia、Erwinia、Enterobacter、Salmonella、Serratia、Aerobacter、Escherichia、Pseudomonas、Shigella、Vibrio、Aeromonas、Streptococcus、Staphylococcus、Micrococcus、Moraxella、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、Eberthella、Francisella、Haemophilus、Bacteroides、Listeria、Erysipelothrix、Acinetobacter、Brucella、Pasteurella、Flavobacterium、Fusobacterium、Streptobacillus、Calymmatobacterium、Legionella、Treponema、Borrelia、Leptospira、Actinomyces、Nocardia、Rickettsia、Micrococcus、Mycobacterium、Neisseria又はCampylobacter属のものが挙げられる。
【０１５２】
病原体としては、これらに限られるものではないが、病原体ウイルス、例えば、パピローマウイルス、パルボウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクチンウイルス、アレナウイルス、コロナウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、インフルエンザウイルス、ピコルナウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ラブドウイルス又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）属のものが挙げられる。
【０１５３】
病原体としては、さらに、これらに限られるものではないが、 Taenia、Hymenolepsis、Diphyllobothrium、Echinococcus、Fasciolopsis、Heterophyes、Metagonimus、Clonorchis、Fasciola、Paragonimus、Schistosoma、Enterobius、Trichuris、Ascaris、Ancylostoma、Necator、Wuchereria、Brugi、Loa、Onchocerca、Dracunculus、Naegleria、Acanthamoeba、Plasmodium、Trypanosoma、Leishmania、Toxoplasma、Entamoeba、Giardia、Isospora、Cryptosporidium、Enterocytozoa、Strongyloides又はTrichinella属のものが挙げられる。
【０１５４】
本発明によれば、病原体としては、これらに限られるものではないが、真菌、例えば、白癬、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリコーシス、コクシジオイデス症、パラコクシジオイド症、ムコール症、カンジダ症、皮膚糸状菌症、プロトテコーシス、ジベルばら色粃糠疹、マイセトーマ、パラコクシジオイド症、黒色菌糸症、シュードアレシェリア症、砂毛症又はニューモシスチス肺炎が挙げられる。
【０１５５】
一実施形態において、本発明による病原体としては、これらに限られるものではないが、ウシの血疹性口内炎ウイルス（ＢＰＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＶＨ）、牛ウイルス性下痢（ＢＶＤ）、口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）、ブルータングウイルス（ＢＴＶ）、ブタ水胞症ウイルス（ＳＶＤ）、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳ）、水胞性口炎ウイルス（ＶＳＶ）及びブタ水疱疹ウイルス（ＶＥＳＶ）が挙げられる。
【０１５６】
特定の実施形態において、本発明による病原体は、Neisseria meningitides、Streptococcus agalactiae、Staphylococcus aureus、Porphyromonas gingivalis、Chlamydia pneumoniae、Bacillus anthracis、Streptococcus suis、Echinococcus granulosus、Streptococcus sanguinis及びHelicobacter pyloriである。
【０１５７】
一実施形態において、本発明による病原体は、人の健康や作物の成長にとって脅威となる毒性分子を生成する。例えば、Aspergillus flavusやAspergillus parasiticusは、穀物やその他作物、例えば、ピーナツ、コーン、米や大豆を汚染する可能性のある極めて毒性のあるアフラトキシンであるアフラトキシンＢ１（ＡＦＢ１）を生成する。病原体により生成されるその他の毒素としては、これらに限られるものではないが、オクラトキシンＡ、ボツリヌストキシン、志賀毒素１、志賀毒素２及びブドウ球菌エンテロトキシンが挙げられる。
【０１５８】
植物
本発明の方法により試験できる植物としては、列作物（例えば、コーン、大豆、モロコシ、ピーナツ、ジャガイモ等）、農作物（例えば、アルファルファ、小麦、穀類等）、樹木作物（例えば、ウォールナッツ、アーモンド、ペカン、ヘーゼルナッツ、ピスタチオ等）、柑橘作物（例えば、オレンジ、レモン、グレープフルーツ等）、果物作物（例えば、リンゴ、ナシ等）、芝作物、花き作物（例えば、花、ブドウ等）、野菜（例えば、トマト、ニンジン等）、つる作物（例えば、グレープ、イチゴ、ブルーベリー、ブラックベリー等）、林業（例えば、マツ、トウヒ、ユーカリ、ポプラ等）、牧草管理（牧草家畜をサポートするのに用いられる混合植物）が挙げられる。
【０１５９】
本発明の生成物及び方法から利益に得られる植物としては、上科緑色植物亜界に属する全ての植物が挙げられ、特に、単子葉及び双子葉植物、例えば、飼料や牧草、花き、食品作物、樹木や低木が含まれ、Acer spp.、Actinidia spp.、Abelmoschus spp.、Agave sisalana、Agropyron spp.、Agrostis stolonifera、Allium spp.、Amaranthus spp.、Ammophila arenaria、Ananas comosus、Annona spp.、Apium graveolens、Arachis spp、Artocarpus spp.、Asparagus officinalis、Avena spp.（例えば、Avena sativa、Avena fatua、Avena byzantina、Avena fatua var. sativa、Avena hybrida）、Averrhoa carambola、Bambusa sp.、Benincasa hispida、Bertholletia excelsea、Beta vulgaris、Brassica spp.（例えば、Brassica napus、Brassica rapa ssp. [canola、oilseed rape、turnip rape]）、Cadaba farinosa、Camellia sinensis、Canna indica、Cannabis sativa、Capsicum spp.、Carex elata、Carica papaya、Carissa macrocarpa、Carya spp.、Carthamus tinctorius、Castanea spp.、Ceiba pentandra、Cichorium endivia、Cinnamomum spp.、Citrullus lanatus、Citrus spp.、Cocos spp.、Coffea spp.、Colocasia esculenta、Cola spp.、Corchorus sp.、Coriandrum sativum、Corylus spp.、Crataegus spp.、Crocus sativus、Cucurbita spp.、Cucumis spp.、Cynara spp.、Daucus carota、Desmodium spp.、Dimocarpus longan、Dioscorea spp.、Diospyros spp.、Echinochloa spp.、Elaeis（例えば、Elaeis guineensis、Elaeis oleifera）、Eleusine coracana、Eragrostis tef、Erianthus sp.、Eriobotrya japonica、Eucalyptus sp.、Eugenia uniflora、Fagopyrum spp.、Fagus spp.、Festuca arundinacea、Ficus carica、Fortunella spp.、Fragaria spp.、Ginkgo biloba、Glycine spp.（例えば、Glycine max、Soja hispida 又はSoja max）、Gossypium hirsutum、Helianthus spp.（例えば、Helianthus annuus）、Hemerocallis fulva、Hibiscus spp.、Hordeum spp.（例えば、Hordeum vulgare）、Ipomoea batatas、Juglans spp.、Lactuca sativa、Lathyrus spp.、Lens culinaris、Linum usitatissimum、Litchi chinensis、Lotus spp.、Luffa acutangula、Lupinus spp.、Luzula sylvatica、Lycopersicon spp.（例えば、Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme）、Macrotyloma spp.、Malus spp.、Malpighia emarginata、Mammea americana、Mangifera indica、Manihot spp.、Manilkara zapota、Medicago sativa、Melilotus spp.、Mentha spp.、Miscanthus sinensis、Momordica spp.、Morus nigra、Musa spp.、Nicotiana spp.、Olea spp.、Opuntia spp.、Ornithopus spp.、Oryza spp.（例えば、Oryza sativa、Oryza latifolia）、Panicum miliaceum、Panicum virgatum、Passiflora edulis、Pastinaca sativa、Pennisetum sp.、Persea spp.、Petroselinum crispum、Phalaris arundinacea、Phaseolus spp.、Phleum pratense、Phoenix spp.、Phragmites australis、Physalis spp.、Pinus spp.、Pistacia vera、Pisum spp.、Poa spp.、Populus spp.、Prosopis spp.、Prunus spp 、Psidium spp.、Punica granatum、Pyrus communis、Quercus spp.、Raphanus sativus、Rheum rhabarbarum、Ribes spp.、Ricinus communis、Rubus spp.、Saccharum spp.、Salix sp.、Sambucus spp.、Secale cereale、Sesamum spp.、Sinapis sp.、Solanum spp.（例えば Solanum tuberosum、Solanum integrifolium又はSolanum lycopersicum）、Sorghum bicolor、Spinacia spp.、Syzygium spp.、Tagetes spp.、Tamarindus indica、Theobroma cacao、Trifolium spp.、Tripsacum dactyloides、Triticosecale rimpaui、Triticum spp.（例えば、Triticum aestivum、Triticum durum、Triticum turgidum、Triticum hybernum、Triticum macha、Triticum sativum、Triticum monococcum又はTriticum vulgare）、Tropaeolum minus、Tropaeolum majus、Vaccinium spp.、Vicia spp.Vigna spp.、Viola odorata、Vitis spp.、Zea mays、Zizania palustris、Ziziphus spp.から選択される。
【０１６０】
当該植物の更なる例としては、これらに限られるものではないが、コーン（Zea mays）、アブラナ科（例えば、セイヨウアブラナ、ニホンアブラナ、カラシナ）、特に、種子油の原料として有用なアブラナ科のもの、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ）、米（イネ）、ライ麦（Secale cereale）、モロコシ属（ソルガムビコロ、ホウキモロコシ）、ヒエ（例えば、トウジンビエ（Pennisetum glaucum）、きび（Panicum miliaceum）、あわ（Setaria italica）、シコクビエ（Eleusine coracana)）、ヒマワリ（Helianthus annuus）、ベニバナ（Carthamus tinctorius）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、タバコ（Nicotiana tabacum）、ジャガイモ（Solanum tuberosum）、ピーナツ（Arachis hypogaea）、綿（Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum）、スイートポテト（Ipomoea batatus）、キャッサバ（Manihot esculenta）、コーヒー（Coffea spp.）、ココナツ（Cocos nucifera）、パイナップル（Ananas comosus）、柑橘樹（Citrus spp.）、cocoa（Theobroma cacao）、茶（Camellia sinensis）、バナナ（Musa spp.）、アボカド（Persea americana）、イチジク（Ficus casica）、グアバ（Psidium guajava）、マンゴー（Mangifera indica）、オリーブ（Olea europaea）、パパイヤ（Carica papaya）、カシュー（Anacardium occidentale）、マカダミア（Macadamia integrifolia）、アーモンド（Prunus amygdalus）、テンサイ（Beta vulgaris）、サトウキビ（Saccharum spp.）、オーツ、大麦、野菜、花き及び球果植物が挙げられる。
【０１６１】
野菜には、トマト（Lycopersicon esculentum）、レタス（例えば、Lactuca sativa）、サヤインゲン（Phaseolus vulgaris）、ライマメ（Phaseolus limensis）、エンドウ（Lathyrus spp.）及びキュウリ属、例えば、キュウリ（C. sativus）、カンタロープ（C. cantalupensis）及びマスクメロン（C. melo）が含まれる。花きには、ツツジ（Rhododendron spp.）、アジサイ（Macrophylla hydrangea）、ハイビスカス（Hibiscus rosasanensis）、バラ（Rosa spp.）、チューリップ（Tulipa spp.）、ラッパズイセン（Narcissus spp.）、ペチュニア（Petunia hybrida）、カーネーション（Dianthus caryophyllus）、ポインセチア（Euphorbia pulcherrima）及びキクが含まれる。本実施形態を実施するのに用いられるコニファーには、例えば、マツ、例えば、テーダマツ（Pinus taeda）、スラッシュマツ（Pinus elliotii）、ポンデローサマツ（Pinus ponderosa）、コントルタマツ（Pinus contorta）及びラジアータパイン（Pinus radiata)、ベイマツ（Pseudotsuga menziesii）、アメリカツガ（Tsuga canadensis）、シトカトウヒ（Picea glauca）、レッドウッド（Sequoia sempervirens）、モミ、例えば、ヨーロッパモミ（Abies amabilis）及びバルサムモミ（Abies balsamea）、スギ、例えば、ウェスタンレッドシダー（Thuja plicata）及びアラスカイエローシダー（Chamaecyparis nootkatensis）が含まれる。本実施形態の植物には、農作物（例えば、コーン、アルファルファ、ヒマワリ、アブラナ、大豆、綿、ベニバナ、ピーナツ、モロコシ、小麦、雑穀、タバコ等）、例えば、コーンや大豆植物が含まれる。
【０１６２】
芝としては、これらに限られるものではないが、アニュアルブルーグラス（Poa annua）、アニュアルライグラス（Lolium multiflorum）、カナダブルーグラス（Poa compressa）、チューイングフェスク（Festuca rubra）、イトコヌカグサ（Agrostis tenuis）、コヌカグサ（Agrostis palustris）、クレステッドホイートグラス（Agropyron desertorum）、フェアウェイホイートグラス（Agropyron cristatum）、ハードフェスク（Festuca longifolia）、ケンタッキーブルーグラス（Poa pratensis）、カモガヤ（Dactylis glomerate）、ペレニアルライグラス（Lolium perenne）、レッドフェスク（Festuca rubra）、レッドトップ（Agrostis alba）、ラフブルーグラス（Poa trivialis）、シープフェスク（Festuca ovine）、スムーズブロムグラス（Bromus inermis）、トールフェスク（Festuca arundinacea）、チモシー（Phleum pretense）、ベルベットベントグラス（Agrostis canine）、アレチタチドジョウツナギ（Puccinellia distans）、ヒメカモジグサ（Agropyron smithii）、バミューダグラス（Cynodon spp.）、セントオーガスチングラス（Stenotaphrum secundatum）、ノシバ（Zoysia spp.）、バヒアグラス（Paspalum notatum）、カーペットグラス（Axonopus affinis）、センチピードグラス（Eremochloa ophiuroides）、キクユグラス（Pennisetum clandesinum）、サワスズメノヒエ（Paspalum vaginatum）、ブルーガンマ（Bouteloua gracilis）、バッファローグラス（Buchloe dactyloids）、シデエンツグラマ（Bouteloua curtipendula）が挙げられる。
【０１６３】
当該植物としてはさらに、当該種、油料種植物及びマメ科植物を与える穀物植物が挙げられる。当該種としては、穀物種、例えば、コーン、小麦、大麦、米、ソルガム、ライ、雑穀等が挙げられる。油料種子植物としては、綿、大豆、ベニバナ、ヒマワリ、アブラナ、トウモロコシ、アルファルファ、パーム、ココナツ、アマ、ヒマシ、オリーブ油等が挙げられる。マメ科植物としては、ビーンズと豆が挙げられる。ビーンズとしては、グアー、ローカストビーン、フェヌグリーク、大豆、ガーデンビーンズ、ササゲ、リョクトウ、ライマメ、ソラマメ、レンズマメ、ヒヨコマメ等が挙げられる。
【０１６４】
植物疾病
本発明に従って、検出可能な植物疾病としては、以下のものが例示される。
小麦の疾病：赤カビ病（Fusarium graminearum、F. avenacerum、F. culmorum、Microdochium nivale）、雪腐病（Typhula sp.、Micronectriella nivalis）、裸黒穂病（Ustilago tritici、U. nuda）、黒粒病（Tilletia caries）、葉枯病（Mycosphaerella graminicola）及びコムギいもち病（Leptosphaeria nodorum）、
コーンの疾病：黒穂病（Ustilago maydis）及び褐斑病（Cochliobolus heterostrophus）、
柑橘類の疾病：黒点病（Diaporthe citri）、赤カビ病（Elsinoe fawcetti）、青かび病（Penicillium digitatum、P. italicum）及びカンキツグリーニング病（Candidatus Liberibacter spp.）、
リンゴの疾病：花腐れ（Monilinia mali）、うどんこ病（Podosphaera leucotricha）、黒斑病（Alternaria alternata apple pathotype）、赤カビ病（Venturia inaequalis）、苦腐れ（Colletotrichum acutatum）及び根頭腐敗（Phytophtora cactorum）、
ナシの疾病：赤カビ病（Venturia nashicola、V. pirina）、黒斑病（Alternaria alternata Japanese pear pathotype）、赤星病（Gymnosporangium haraeanum）及び果実腐敗症（Phytophtora cactorum）、
モモの疾病：赤腐れ（Monilinia fructicola）、赤カビ病（Cladosporium carpophilum）及びホモプシス腐敗病（Phomopsis sp.）、
ブドウの疾病：炭疽病（Elsinoe ampelina）、晩腐病（Glomerella cingulata）、黒斑病（Guignardia bidwellii）、べと病（Plasmopara viticola）及び灰色カビ病（Botrytis cinerea）、
柿の疾病：炭疽病（Gloeosporium kaki）及び斑点病（Cercospora kaki、Mycosphaerella nawae）、
ゴードの疾病：炭疽病（Colletotrichum lagenarium）、標的斑点病（Corynespora cassiicola）、つる枯病（Mycosphaerella melonis）、つる割病（Fusarium oxysporum）、べと病（Pseudoperonospora cubensis）及び疫病（Phytophthora sp.）、
トマトの疾病：夏疫病（Alternaria solani）、トマト半身萎ちょう病（Cladosporium fulvum）、及び疫病（Phytophthora infestans）、
アブラナ科野菜の疾病：黒斑病（Alternaria japonica）、白斑（Cercosporella brassicae）及びべと病（Peronospora parasitica）、
菜種の疾病：菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）及び灰斑病（Alternaria brassicae）、
大豆の疾病：紫斑病（Cercospora kikuchii）、黒とう病（Elsinoe glycines）、ダイズ黒とう病（Diaporthe phaseolorum var. sojae）、さび病（Phakopsora pachyrhizi）及び落葉病（Phytophthora sojae）、
小豆の疾病：灰色カビ病（Botrytis cinerea）及び菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）、
インゲン豆の疾病：灰色カビ病（Botrytis cinerea）、菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）及びインゲン豆炭疽病（Colletotrichum lindemthianum）、
ピーナツの疾病：斑点病（Cercospora personata）、褐色葉枯病（Cercospora arachidicola）及び白絹病（Sclerotium rolfsii）、
ジャガイモの疾病：夏疫病（Alternaria solani）及び葉枯れ病（Phytophthora infestans）、
綿の疾病：つる割病（Fusarium oxysporum）、
タバコの疾病：褐斑病（Alternaria longipes）、炭疽病（Colletotrichum tabacum）、べと病（Peronospora tabacina）及びタバコ疫病（Phytophthora nicotianae）、
テンサイの疾病：セルコスポラ斑点病（Cercospora beticola）、葉枯れ（Thanatephorus cucumeris）、根腐れ（Thanatephorus cucumeris）及び黒根病（Aphanidermatum cochlioides）、
バラの疾病：黒斑病（Diplocarpon rosae）及びうどんこ病（Sphaerotheca pannosa）、
キク及びキク科植物の疾病：べと病（Bremia lactucae）及び葉枯れ（Septoria chrysanthemi-indici）、
様々な植物の疾病： Pythium spp.により生じる疾病（Pythium aphanidermatum、Pythium debarianum、Pythium graminicola、Pythium irregulare、Pythium ultimum）、灰色カビ病（Botrytis cinerea）、菌核病（Sclerotinia sclerotiorum）及びRhizoctonia spp.により生じる立枯れ（Rhizoctonia solani）、
ダイコンの疾病：黒斑病（Alternaria brassicicola）、
芝の疾病：ドラースポット（Sclerotinia homeocarpa）、褐色斑及びラージパッチ、
バナナの疾病：シガトーカ病（Mycosphaerella fijiensis、Mycosphaerella musicola、Pseudocercospora musae）、
並びに、コウジカビ属、ペニシリウム属、フザリウム属、トリコデルマ属、ティエラビオプシス属、クロカビ属、ムコール属、フォーマ属及びディプロディア属のバクテリアにより生じる種子の疾病又は様々な植物の成長の初期段階における疾病が例示される。
【０１６５】
疾病は、根由来、葉状、植物の維管束系に存在、又は昆虫による媒介によるものであり、植物の全てのバクテリア、ウイルス及び菌病原体が含まれる。
【０１６６】
本明細書で参照言及した特許、特許出願、仮出願及び文献は全て、本明細書による明白な教示に矛盾しない限り、図表を含め全体として、参照により援用される。
【０１６７】
本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであり、様々な修正又は変更は、当業者であれば示唆されるものであり、本出願の趣旨及び範囲に含まれるべきものと考えられる。
【国際調査報告】
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