(57)【要約】  本発明は、サケ科の魚においてピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性を予測する方法であって、サケ科の魚において、QTL内の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定する工程と、アレルの判定に基づいて、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚の能力を予測する工程とを含み、QTLは、(a)サケ科の魚がギンザケである場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21(GenBank識別番号NC_034194.1)に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置するか、或いは;(b)サケ科の魚がギンザケでない場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21に対応する連鎖群に、又はその連鎖群に対応するサケ科の魚の染色体に位置するQTLである、方法に関する。本発明は、更にそのような方法及び関連する方法に有用なプローブ及びアレイに関する。
2020521511.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サケ科の魚においてピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性を予測する方法であって、前記サケ科の魚において、QTL内の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定する工程と、前記アレルの判定に基づいて、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性である前記サケ科の魚の能力を予測する工程とを含み、前記QTLは、
(a)前記サケ科の魚がギンザケである場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21(GenBank識別番号NC_034194.1)に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置するか、或いは;
(b)前記サケ科の魚がギンザケでない場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21に対応する連鎖群に、又はその連鎖群に対応するサケ科の魚の染色体に位置するQTLである、方法。
【請求項２】
前記サケ科の魚がギンザケである場合、前記QTLが、GenBank配列NW_018086972.1又はNW_018107982.1に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記サケ科の魚がニジマスである場合、前記QTLが、ニジマスのゲノムの染色体4に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記サケ科の魚がタイセイヨウサケである場合、前記QTLが、タイセイヨウサケのゲノムの染色体6に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記1つ又は複数のDNA多型が、Table 3(表3)に示されているものから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記アレルの判定に基づいて、SRSの発症に対する抵抗性を予測するための、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記1つ又は複数のDNA多型は、AX-169575201である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記1つ又は複数のDNA多型は、AX-169631492及びAX-169660070からなるか、又はそれらを含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記サケ科の魚は、タイセイヨウサケ(すなわち、Salmo salar)、ニジマス(すなわち、Oncorhynchus mykiss)又はギンザケ(すなわち、Oncorhynchus kisutch)であってもよい、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項1から9のいずれか一項に規定の1つ又は複数の前記DNA多型に特異的な、ハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１１】
前記プローブは、1つの前記多型の抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含む核酸とハイブリダイズするが、同じ条件下でその多型の非抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含むヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない、請求項9に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１２】
前記プローブは、1つの前記多型の非抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含む核酸とハイブリダイズするが、同じ条件下でその多型の抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含むヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない、請求項10に記載のハイブリダイゼーションプローブ。
【請求項１３】
請求項10から12のいずれか一項に記載の複数のプローブを含む、SNP検出パネル。
【請求項１４】
AX-169575201及び/又はAX-169631492並びにAX-169660070に特異的なプローブを含む、請求項13に記載のSNP検出パネル。
【請求項１５】
サケ科の魚から採取されたサンプル中において、請求項1から14のいずれか一項に規定の1つ又は複数のDNA多型に存在する前記アレルを判定するためのキットであって、前記DNA多型と隣接する領域に特異的なPCR増幅のためのプライマーを含む、キット。
【請求項１６】
サケ科の魚において、請求項1から15のいずれか一項に規定の1つ又は複数の前記DNA多型に存在する前記アレルを検出する方法であって、a.前記サケ科の魚からサンプルを得る工程と、b.前記1つ又は複数の多型のそれぞれのどのアレルが前記サンプル中に存在するかを検出する工程を含む、方法。
【請求項１７】
請求項10から12に記載のハイブリダイゼーションプローブ、請求項13又は14に記載の検出パネル或いは請求項15に記載のキットのいずれかを工程b.で使用して、どのアレルが前記サンプル中に存在するかを検出する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
サケ科の魚のサンプル中の、サケ科の魚においてピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する方法であって、前記DNA多型は、請求項1から17のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、方法。
【請求項１９】
サケ科の魚のピシリケッチア・サルモニス感染を起こすリスクの指標を得るための方法であって、
a)前記サケ科の魚のサンプル中の、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する工程
を含み、前記DNA多型は、請求項1から18のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型であり、前記DNA多型の存在は、前記サケ科の魚がピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であることを示す、方法。
【請求項２０】
請求項1から19のいずれか一項に規定のQTLにおける1つ又は複数の多型を検出する方法であって、サケ科の魚からサンプルを得る工程と、前記サンプルをアッセイして、前記サケ科の魚の1つ又は複数の遺伝子バリアントを検出する工程とを含み、前記サケ科の魚の1つ又は複数の遺伝子バリアントは、請求項1から19のいずれか一項に規定の1つ又は複数の前記DNA多型から選択される、方法。
【請求項２１】
ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚を検出するための、ピシリケッチア・サルモニス感染と関連づけられるDNA多型の使用であって、前記DNA多型は、請求項1から20のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、使用。
【請求項２２】
ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有する通常の確率よりも高い確率を有する子孫を生み出す方法であって、
(a)サケ科の魚のサンプル中の、ピシリケッチア・サルモニス感染と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する工程と、
(b)ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性である前記サケ科の魚を使用して、子孫を生み出す工程と
を含み、前記DNA多型は、請求項1から21のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型であり、前記DNA多型の存在は、前記サケ科の魚がピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であることを示す、方法。
【請求項２３】
種親として使用するためのサケ科の魚を選択する方法であって、前記サケ科の魚は、請求項1から10、16から20、22のいずれかいずれか一項に記載の方法による予測に基づいて選択される、方法。
【請求項２４】
請求項1から10、16から20、22から23のいずれか一項に記載の方法によりピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であると特定されたサケ科の魚から採取されたサケ科の魚の卵から養殖する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染に対して抵抗性を持つサケ科の魚(salmonids)の能力を予測する方法、特に、ピシリケッチア・サルモニス(Piscirickettsia salmonis)に対する抵抗性を予測する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
サケリケッチア症候群(Salmon Rickettsial Syndrome)(SRS、ピシリケッチア症としても知られている)は、水産養殖産業において相当な経済的損失及び動物福祉問題を引き起こす細菌性疾患である。例えば、チリのサケ養殖産業では、年間の損失が1億5千万米ドルを上回る。SRSの原因病原微生物であるピシリケッチア・サルモニスは、1989年のチリの養殖ギンザケ(Coho salmon)間の疾患大流行において病原体として最初に特定され、それ以来、チリの南から北半球のすべての養殖されるサケ科の種、例えば、タイセイヨウサケ、ニジマス、及びギンザケにおいて感染性が示されてきた。この病原体は、サケ科の魚の単球/マクロファージにおいて感染、複製、及び増殖する能力を有し、腎臓、肝臓、脾臓、腸、脳、卵巣、及び鰓を含むいくつかの器官のコロニー形成を特徴とする全身感染症をもたらす。この病原体は、時間とともに進化し、集団発生毎に更に伝染性が強くなり、処置に対して抵抗性になった。抗生剤の使用により、病原体の増殖を抑制することもできるが、疾患の大流行を止める際の処置は成功しなかった。必要に応じた市販のワクチンも有効であるとは証明されていない。
【０００３】
SRSと闘うための有効な方法がない場合、採用可能なアプローチの1つは、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性が高い傾向にある魚の選択的な養殖である。この方法は、そのような抵抗性に関して認められた能力に基づいて種親を選択することを含む。任意の所与の魚が必要とされる抵抗性を持っているかどうかを判断するために、魚の集団に対して負荷試験を実施する場合がある。そのような試験は、最初に、通常、集団の一部の魚に直接細菌を注射することにより魚を細菌に曝露することを伴い、注射を受けた魚は、その後、排菌魚(shedder)として働くため、集団の他の魚を感染させる。5〜8週間の期間の後、死んだ魚は、分析されて、その死因が細菌感染症であったことを確認し、生き残っている魚は、感染に対して抵抗性の傾向があるものとして登録される。このアプローチに対する極めて重大な制約の1つは、感染の垂直伝播を回避するためにすべての試験魚を殺さなければならないことである。この結果として、抵抗性の傾向を有すると特定されたすべての魚は、種親候補として維持できなくなる。この問題に対する一般的な解決手段は、負荷試験された抵抗性を示す動物の同胞、すなわち、無作為に選択された未試験の最良の同胞群の代表から種親を確立することである。このアプローチは、『家系選択』と呼ばれることが多い。家系選択は、同胞間の類似性に頼るものである。しかしながら、家系間の遺伝的変異が集団の全遺伝的変異の50%を占める一方で、残りの50%の遺伝的変異は、家系内の遺伝的変異から生じるため、この予測方法は、可能性が限定される。
【０００４】
種親を選択する代替的な方法は、所望の表現型形質と関連づけられる遺伝子マーカーの有無の検出(すなわち、マーカー利用選抜(Marker Assisted Selection)、MAS)に基づいてもよい。本発明者らは、ギンザケにおいてそのようなマーカーを特定しようとした別のグループを認識している。この他のグループの研究は、審査された論文として公開されていないが、この比較的小さな研究からの最も有望な結果が、ピシリケッチア・サルモニス感染と中程度の関連しかない一塩基多型(SNP)であることが理解される(p=10-5から10-6の有意水準を有する)。このSNPは、ヘムオキシゲナーゼ-2に対する遺伝子を含むタイセイヨウサケ染色体Ssa03と一致する領域に位置すると考えられる(Barriaら、http://biorxiv.org/content/early2017/04/04/124099; doi: https://doi.org/10.1101/124099)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Barriaら、http://biorxiv.org/content/early2017/04/04/124099; doi: https://doi.org/10.1101/124099
【非特許文献２】Axiom 2.0 Assay Manual Workflow User Guide(http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/axiom_2_assay_manual_workflow_prepguide.pdf)
【非特許文献３】Affymetrix社の「best practices」の推奨(http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/axiom_best_practice_supplement_user_guide.pdf)
【非特許文献４】Affymetrix Power Toolsプログラム(http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/tools/powertools.affx)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する動物の抵抗性をアッセイするためのマーカー、特に、試験動物を種親として使用する可能性を保持しながらピシリケッチア・サルモニス感染に対する個体の抵抗性の検出を可能にする方法が必要とされている。
【０００７】
それゆえに、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚の能力を予測するための代替的な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の発明者らは、以下の大規模な実験を用いて、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性又は非抵抗性と関連づけられるDNA多型が位置する新規の量的形質座位(quantitative trait locus)(QTL)を特定した。本発明者らは、QTL領域内で見出される1つ又は複数の多型の解析に基づいてピシリケッチア・サルモニス感染に抵抗するサケ科の魚の能力を予測することができることを発見した。これらの多型の予測力は、今までに開示されているいかなるものよりも大きいことがわかった。
【０００９】
したがって、本発明の第1の態様において、サケ科の魚においてピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性を予測する方法であって、サケ科の魚において、QTL内の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定する工程と、アレルの判定に基づいてピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚の能力を予測する工程とを含み、QTLは、
(a)サケ科の魚がギンザケである場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置するか、或いは;
(b)サケ科の魚がギンザケでない場合、ギンザケゲノム内の連鎖群21に対応する連鎖群に、又はその連鎖群に対応するサケ科の魚の染色体に位置するQTLである、方法が提供される。例えば、サケ科の魚がニジマスである場合、QTLは、ニジマス染色体4に位置すると予想される。サケ科の魚がタイセイヨウサケである場合、QTLは、タイセイヨウサケのゲノムの染色体6に位置する可能性もある。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
当業者によって理解されると予想されるように、連鎖群は、共遺伝するDNAマーカーの群である。十分なデータが利用できる場合、連鎖群は、染色体に相当し、2つの間の違いは、基となる情報源のみに帰する(遺伝データがただ1つの情報源だけである場合、『連鎖群』という用語が使用される)。十分な遺伝データが利用できない場合、不十分な遺伝データのために、2つ以上の連鎖群が同一の染色体に対応する場合もある。連鎖群21は、ギンザケゲノムに見出されることが当該技術分野において認められた連鎖群である。この連鎖群は、GenBbank受託番号NC_034194(例えば、NCBIリファレンス配列NC_034194.1)によって定義されうる。この連鎖群は、以下の方法によりまとめられた:1)いわゆる、足場、配列情報のみに基づいて作製される連続的な配列(一般に、数万又は数十万のそのような足場があることになる)を生成するために次世代シーケンシングが使用された。2)この足場は、足場内に位置するDNAマーカーの遺伝様式を使用して配列され、方向付けられた。本発明者らは、NW_018086972.1又はNW_018107982.1に対応するギンザケゲノムの領域がNC_034194に対応する領域(すなわち、それと同じ染色体上)と連鎖することを発見した)。このように、本発明のQTLは、ギンザケにおいてはGenBank配列NW_018086972.1若しくはNW_018107982.1内、又は別のサケ科の魚においては対応する配列内に見出すことができる。
【００１１】
ピシリケッチア・サルモニスがSRSに関する原因病原微生物であるという事実を考慮して、本発明の方法は、アレルの判定に基づいてSRSの発症に対する抵抗性を予測するために使用することができる。
【００１２】
ピシリケッチア・サルモニス感染、及び結果として生じるSRSの発症は、ギンザケでまず特定されたが、これは、それ以来、サケ科の魚に対する全般的な問題であることがわかってきた。更に、ギンザケにおいて本発明者らが特定したQTLは、サケ科の種全体にわたって高度に保存されているゲノムの部分にある。本発明者らは、例えば、ギンザケとニジマスの間に大きな程度のシンテニーがあることを発見し、これは、ギンザケの全染色体(連鎖群)とニジマスの特定の染色体又は染色体腕の間に一般に緊密な関係があることを意味する。したがって、本発明のQTLの有用性は、必然的に任意のサケ科の魚において抵抗性を予測することにまで広がる。したがって、ギンザケに本方法が適用される場合、ギンザケのQTL(すなわち、ギンザケゲノム内の連鎖群21に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置する)が参照される。ただし、本方法がサケ科の魚の別の種に適用される場合、それは、ギンザケゲノム内の連鎖群21に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置するQTLに対応するQTLであり、それが本方法において参照される。
【００１３】
当業者によって理解されると予想されるように、本発明のQTLに対応するQTLは、ギンザケのQTLのオルソログであり、本方法が適用されるサケ科の魚の種(すなわち、本方法の対象)に備わっている。本発明の多型が見出される、任意の所与のサケ科の魚における対応するQTLの確立は、ギンザケに関して本明細書で示した教示を考慮すれば、当業者の通常の能力の範囲内に十分入る。任意の所与の動物における既知のドメインから、他の動物における対応するドメインを特定することができる。(例えば、Clustal Omega解析を使用して)例えば、既知のQTLをコードする核酸の複数のアライメント解析を行うことができる。
【００１４】
本発明者らは、本発明のDNA多型が、2つの型のいずれかとして存在する可能性があり、すなわち、DNA多型は、2つのアレルを有することを発見した。一方のアレルは、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性が予測されると特徴づけることができ(すなわち、抵抗性アレル)、他方は、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する非抵抗性が予測されると特徴づけることができる。サケ科の魚は、二倍体生物であるため、2コピーの多型を持つ(染色体の各セットにおいて1コピーが見出される)。したがって、本発明の第1の態様におけるアレルを判定する工程は、存在するDNA多型の各コピーが抵抗性アレルであるか、又は非抵抗性アレルであるかを判断するために、染色体の各セットにあるDNA多型を解析する工程を含んでもよい。本発明の方法に供されたサケ科の魚がDNA多型に関して2コピーの抵抗性アレルを有すると判定された(すなわち、サケ科の魚が抵抗性アレルに関してホモ接合型である)場合、そのサケ科の魚は、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有することが予測される。反対に、本発明の方法に供されたサケ科の魚がDNA多型に関して2コピーの非抵抗性アレルを有すると判定された(すなわち、非抵抗性アレルに関してホモ接合型である)場合、サケ科の魚は、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有さないと予測され、更に、ヘテロ接合体は、中間である。本方法によってピシリケッチア・サルモニス抵抗性を有すると予測されるサケ科の魚が、ピシリケッチア・サルモニスへの曝露から生き延びる通常の確率よりも高い確率を有することを結論づけることができる。反対に、ピシリケッチア・サルモニス抵抗性を有さないと予測されるサケ科の魚が、ピシリケッチア・サルモニスへの曝露から生き延びる通常の確率よりも低い確立を有することを結論づけることができる。
【００１５】
問題となっているDNA多型は、本方法の対象であるサケ科の魚に関して本発明のQTL領域に見出されるいずれか1つ又は複数のDNA多型であってもよく、これは、ピシリケッチア・サルモニス抵抗性に関する上記の予測される能力を与える。例えば、ギンザケでは、本発明のDNA多型は、公開されたギンザケゲノムリファレンス(GenBank識別名NC_034194.1)の連鎖群21又はそのゲノムリファレンス内の2つの独立した足場(GenBank識別名NW_018086972.1及びNW_018107982.1)のうちの1つにマッピングされた。公開されたゲノムリファレンスは、ドラフト配列であり、これは、ゲノムリファレンスのその後のバージョンでは、独立した足場が最後には連鎖群21に融合される可能性もあることを意味する。本発明者の調査に基づいて、NW_018086972.1及びNW_018107982.1に対応する足場は、実際、NC_034194.1のように同じ物理的染色体に対応する。したがって、本発明の1つ又は複数の多型は、連鎖群21に備わっている可能性もある。
【００１６】
ギンザケにおいて本出願人が特定した、連鎖群21内の、抵抗性表現型と強い相関性を有する多型の例を、Table 3(表3)に示す。したがって、本発明の多型は、Table 3(表3)に示されるいずれか1つ又は複数であってもよい。例えば、本発明の多型は、AX-169575201、AX-169638230、AX-169658111、AX-169600905、AX-169538214、AX-169531903、AX-169525869、AX-169664625、AX-169624356、AX-169638609、AX-169679883、AX-169598899、AX-169663696、AX-169631492のうちのいずれか1つ又はいずれかの組合せであってもよい。本発明の多型は、したがって、AX-169575201であってもよい。
【００１７】
サケ科の魚がギンザケでない場合、多型は、Table 3(表3)に示されたもののいずれか1つ又は複数に対応する多型であってもよい。当業者によって理解されると予想されるように、Table 3(表3)に示された多型に対応する多型は、それが対応する多型のオルソログである。任意の所与のサケ科の魚における本発明の対応する多型の確立は、ギンザケに関して本明細書で示した教示を考慮すれば、当業者の通常の能力の範囲内に十分入る。任意の所与の動物における既知のドメインから、他の動物における対応するドメインを特定することができる。(例えば、Clustal Omega解析を使用して)、例えば、既知の多型をコードする核酸の複数のアライメント解析を行うことができる。したがって、例えば、サケ科の魚がニジマスである場合、多型は、Table 4(表4)に示されたもののいずれか1つ又は組合せであってもよい。
【００１８】
多型は、SRSに対する抵抗性を予測する能力によって選択され、すべてが共通の原因突然変異と連鎖不平衡(LD)にある可能性がある。後者のDNA多型は、一塩基多型(SNP)、複数のヌクレオチド多型、付加突然変異、又は欠失突然変異であってもよい。上で示したDNA多型のそれぞれのタイプは、個々に本発明の方法における判定する工程に関して本発明の一部と考えられる。
【００１９】
本方法が2つのDNA多型とともに利用される場合、2つのDNA多型は、1つの単位を構成すると予想される。以降、ハプロタイプと呼ぶ。それぞれのハプロタイプは、個々のDNA多型においてDNA多型アレルの4つの異なる組合せに対応する4つの異なるアレルを有する可能性がある(例えば、ハプロタイプがアレルA及びTを有する1つのDNA多型、並びにアレルT及びGを有する1つのDNA多型から構成される場合、4つの可能性のあるハプロタイプアレルは、A-T、A-G、T-T、及びT-Gである。これら4つのアレルのそれぞれは、上述の単一のDNA多型の方法と類似した様式で、抵抗性アレル又は非抵抗性アレルのいずれかになると予想される。このように、4つのアレルA-T、A-G、T-T、及びT-Gを有するハプロタイプの仮説の場合、A-T、A-G、及びT-Tのすべてが抵抗性アレルであるのに対し、T-Gは非抵抗性アレルであることになろう。その場合、1コピーのA-Tアレル及び1コピーのA-Gアレルを有する動物はSRSに対して抵抗性であり、1コピーのA-T及び1コピーのT-Gを有する動物は半抵抗性であり、更に、2コピーのT-Gを有する動物は非抵抗性と予想される。『ハプロタイプ』、『ハプロタイプアレル』及び『DNA多型アレル』という用語は、当業者に十分に理解されると予想される通常の意味をとる。ただし、誤解を避けるために、『DNA多型アレル』は、本発明のDNA多型の部位にある2つの異なるヌクレオチド配列のうちの1つを意味することもある(一方のアレルが「抵抗性アレル」であり、他方が「非抵抗性アレル」である)。『ハプロタイプ』とは、たいていひとまとまりとして(すなわち、組み換えを伴わずに)親から子供へ遺伝する1組の密接に連鎖する(同一の染色体上に互いに近接して位置する)DNA多型を意味する。『ハプロタイプアレル』とは、二倍体動物において単一の染色体コピーに見出されると予想されるもの等の、ハプロタイプを構成するDNA多型のアレルの組合せを意味する。例えば、2つの多型は、Table 3(表3)から選択された任意の2つであってもよい。或いは、2つの多型のうちの1つは、Table 3(表3)から選択され、1つはTable 4(表4)から選択されてもよい。或いは、多型は、1つがTable 3(表3)から選択され、1つがTable 7(表7)から選択されてもよい。例えば、多型は、Table 7(表7)のもの、すなわち、AX-169631492及びAX-169660070であってもよい。AX-169631492にシトシン塩基(C)及びAX-169660070にアデニン(A)塩基を有するハプロタイプが、抵抗性(R)アレルと関連づけられると予想される。他の3つのハプロタイプのうちAX-169631492-C+AX-169660070-C、及びAX-169631492-A+AX-169660070-Aが半抵抗性の動物と関連すると考えられると予想される。一方、AX-169631492-A+AX-169660070-Cは、非抵抗性の動物と関連すると考えられる。
【００２０】
本方法が3つ以上のDNA多型とともに利用される場合、3つ以上のDNA多型は、2つのDNA多型に関して記載されている状況と類似した様式でハプロタイプを構成すると予想される。3つ以上のDNA多型はすべて、Table 3(表3)に示されている任意のものから選択されてもよい。或いは、1つ又は複数がTable 3(表3)から選択され、1つ又は複数がTable 4(表4)から選択されてもよい。或いは、1つがTable 3(表3)から、2つがTable 7(表7)から選択されてもよい。
【００２１】
本方法は、任意のサケ科の魚、すなわち、サケ科の中の任意の種に適用されてもよい。そのような種の例は、タイセイヨウサケ(すなわち、Salmo salar)、ニジマス(すなわち、Oncorhynchus mykiss)、及びギンザケ(すなわち、Oncorhynchus kisutch)である。したがって、サケ科の魚は、ギンザケ又はタイセイヨウサケであってもよい。サケ科の魚は、ギンザケであってもよい。
【００２２】
サケ科の魚において有無を判定する工程は、サケ科の魚から採取されたサンプルに対して行われてもよい。サンプルは、当業者に容易に理解されると予想されるように、核酸材料の分析が可能ないかなるサンプルであってもよい。誤解を避けるために、サンプルは、骨格筋組織サンプル、血液サンプル、肝臓サンプル、心臓サンプル及び/又はヒレを切り取ったものであってもよい。
【００２３】
当業者は、個々のサケ(又は別の生物)においてDNA多型アレルの有無を試験することができるすべての利用可能な方法、すなわち、DNA多型のジェノタイピングのためのすべての利用可能な方法を十分に認識していると予想される。例えば、本方法は、試験対象のサケの配列解析を含む場合もある。或いは、本方法は、多型の部位で終結するDNAフラグメントの一塩基伸長(例えば、Sequenom社のiPLEXアッセイ及びIllumina社のInfiniumアッセイ)、アレル特異的PCR(例えば、Fluidigm社のSNPtypeアッセイ又はKBiosciences社のKASParアッセイ)、異なるアレルと相補的なプローブの競合ハイブリダイゼーション(例えば、Applied Biosystems社のTaqManアッセイ)、或いはシーケンシングによるジェノタイピング(genotyping-by-sequencing)、すなわち、次世代シーケンシングデータ(Illumina HiSeqデータ等)からのジェノタイプの推測を含む場合もある。
【００２４】
したがって、本発明の別の態様において、上記のDNA多型の1つ又は複数に対して特異的なハイブリダイゼーションプローブが提供される。プローブは、上記の1つの多型の抵抗性アレル型、又はそのコンプリメント(compliment)を含む核酸とハイブリダイズすることができるが、同じ条件下(例えば、温度及び/又はバッファー)でその多型の非抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含むヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない。或いは、プローブは、上記の1つの多型の非抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含む核酸とハイブリダイズすることができるが、同じ条件下(例えば、温度及び/又はバッファー)でその多型の抵抗性アレル型、又はそのコンプリメントを含むヌクレオチド配列とはハイブリダイズしない。
【００２５】
本発明の別の態様において、上記の複数のプローブを備えたSNP検出パネルが提供される。例えば、SNPパネルは、AX-169575201、又はその対応する多型に対するプローブを含んでもよい。SNP検出パネルは、Table 3(表3)及び若しくはTable 7(表7)に示される多型又はその対応する多型のすべて或いはそのいずれかの組合せを含んでもよい。プローブは、基板に結合されていてもよい。
【００２６】
いずれか1つ又は複数のプローブ又はSNP検出パネルは、例えば、サケ科の魚において、1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定するために、本発明の第1の態様の方法に使用されてもよい。
【００２７】
本発明の別の態様において、サケ科の魚から採取されたサンプル中において、上記の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定するためのキットであって、1つ又は複数の上記のDNA多型と隣接する領域に特異的なPCR増幅のためのプライマーを含む、キットが提供される。
【００２８】
本発明の別の態様において、サケ科の魚のサンプル中の、サケ科の魚においてピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する方法であって、DNA多型は、本発明のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、方法がある。
【００２９】
本発明の別の態様において、サケ科の魚のピシリケッチア・サルモニス感染を起こすリスクの指標を得るための方法であって、
a.サケ科の魚のサンプル中の、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する工程
を含み、DNA多型は、先行する請求項のいずれかに規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型であり、DNA多型の存在は、サケ科の魚がピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であることを示す、方法が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様において、先行する請求項のいずれかに規定のQTLにおける1つ又は複数の多型を検出する方法であって、サケ科の魚からサンプルを得る工程と、サンプルをアッセイして、サケ科の魚の1つ又は複数の遺伝子バリアントを検出する工程とを含み、サケ科の魚の1つ又は複数の遺伝子バリアントは、先行する請求項のいずれかに規定の1つ又は複数のDNA多型から選択される、方法が提供される。
【００３１】
本発明の別の態様において、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚を検出するための、ピシリケッチア・サルモニス感染と関連づけられるDNA多型の使用であって、DNA多型は、先行する請求項のいずれかに規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、使用が提供される。
【００３２】
本発明の別の態様において、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性を有する通常の確率よりも高い確率を有する子孫を生み出す方法であって、
(a)サケ科の魚のサンプル中の、ピシリケッチア・サルモニス感染と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する工程と、
(b)ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であるサケ科の魚を使用して、子孫を生み出す工程と
を含み、DNA多型は、先行する請求項のいずれかに規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型であり、DNA多型の存在は、サケ科の魚がピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であることを示す、方法が提供される。
【００３３】
本発明の別の態様において、サケ科の魚においてQTLのマーカーとして働く上述の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを検出する方法であって、a.サケ科の魚からサンプルを得る工程と、b.1つ又は複数の多型のそれぞれのどのアレルが前記サンプル中に存在するかを検出する工程をと含む、方法が提供される。工程b.は、アレルの差異を判定するために多型をジェノタイピングすることができる当業者に公知の任意の方法を含んでもよく、その例は上に示されている。したがって、本方法は、上記のプローブ、SNP検出パネル又はキットのいずれか1つ又はその組合せの使用を含んでもよい。本方法は、サケ科の魚において本発明の第1の態様の1つ又は複数の多型の抵抗性アレルを検出するためであってもよく、本方法は、a.サケ科の魚からサンプルを得る工程と、b.サンプルをアレル特異的なハイブリダイゼーションプローブと接触させ、アレルとプローブの間の結合を検出することによって、サンプル中にアレルが存在するかどうかを検出する工程を含む。
【００３４】
本発明によるピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有すると予測されるサケ科の魚は、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有する通常の確率よりも高い確率を有する子孫を生み出す通常よりも高い可能性がある。したがって、本発明の別の態様において、種親として使用するためのサケ科の魚を選択する方法であって、サケ科の魚は、本発明の第1の態様の方法による予測に基づいて選択され、サケ科の魚がピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性になる、方法が提供される。
【００３５】
本発明の更に別の態様において、本発明の第1の態様の方法によりピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性であると特定されたサケ科の魚から採取されたサケ科の魚の卵から養殖する方法が提供される。
【００３６】
本発明の実施形態は、以下の添付の図面を参照して本明細書の後ろに更に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】ギンザケの連鎖群21(GenBank識別番号:NC_034194.1)にマッピングされた配列の位置によるSRS抵抗性に関するSNP座位の有意性(-log10(p値))を示すグラフである。x軸にある値は、配列上の塩基番号に対応する。実線上又はその上にあるSNPは、ボンフェローニ補正に基づいて実験的に有意なSNPである。良好なジェノタイプ品質のマッピングされたSNPのみが含まれた。
【図２】最も有意なSNP座位の異なるジェノタイプに関するCOHAB及びIP負荷されたギンザケの平均死亡率を示すグラフである。AA=罹患しやすいホモ接合体、AR=ヘテロ接合体、RR=抵抗性のホモ接合体。
【実施例】
【００３８】
負荷試験
AquaGen Chili社の養殖中核集団(breeding nucleus)の3年目クラスからの138の完全同胞家系に属する合計2050匹のギンザケ二年子から生存データを得た(2014年クラス)。養殖中核集団のすべてのギンザケは、AquaGen Chile社によってチリで養殖された多世代のサケの子孫である。元の養殖サケは、米国で生まれたサケに由来する。各二年子には、試験前にPassive Integrated Transponder(PIT)タグを付けた。負荷試験は、共生モデルに従って行い、ここでは、50%の魚に排菌魚として腹腔内注射(IP)をし、残りの50%をこれらのIP魚とともに配置し、共生によって感染させた(共生魚(cohabitants又はcohab))。この試験は、Fundacion Chile's Research Station(Puerto Montt、チリ)で実施した。各家系から(1から20匹の間に及ぶ)平均16匹の魚を11m3の1つの水槽に割り当て、2週間順応させた。この期間中、塩分及び水温を徐々に上げて、100%の海水(32ppm)及び14〜15℃にした。その後、IP魚(各家系に8匹の魚)をベンゾカインで麻酔し、0.1mlのP.サルモニス(菌株PM-18856、ニジマスから単離)の腹腔内注射によって感染させた。負荷の間、感染後63日間(DPI)、実験魚を毎日観察し、各家系群の死亡率を毎日記録した。すべての死んだ魚に関しては死亡時に、又は生き残った魚に関しては負荷の終わりに体重を記録した。解剖検査をそれぞれの死んだ魚に対して実施し、P.サルモニスを確認し、死因として他の病原体を棄却するために死んだ魚のサンプルにおいて分子診断を行った。分子診断は、P.サルモニスを確認し、死因として他の病原体を棄却するために死んだ魚のサンプルにおけるqRT-PCRを伴った。RT-PCR増幅のために、LightCycler(登録商標)480 IIサーマルサイクラー中でLigthCycler(登録商標)480 RNA Master Hydrolysis Probe Kit(Roche社)を使用した。すべてのRT-PCRは、taqmanプローブケミストリーを使用して実施した。ヒレサンプルをすべての魚から採取し、エタノール中、-20℃でDNA抽出まで保存した。DNA抽出をLaboratory ADL Diagnostic Chileで実施した後、続くジェノタイピングのためにNorwegian University of Life Sciencesの一部であるCentre for Integrative Genetics(Cigene)に送った。
【００３９】
5年目クラス(2016年クラス)では、242の家系に属する2879匹のギンザケ二年子の新しい群が、SRSに対する負荷であった。上記の同じモデル(共生モデル)に従って負荷試験を行った。ただし、魚の数が更に多いため負荷は、11m3の2つの水槽で実施した。各家系から(4から7匹の間に及ぶ)平均6匹の魚を各タンクに割り当てた。負荷の間、感染後79日間(DPI)、実験魚を毎日観察し、各家系群の死亡率を毎日記録した。
【００４０】
ジェノタイピング
(DNA品質が不良なため除外した少数を除いて)試験のすべての魚、全部で2025匹の個体をジェノタイピングした。そのうち、IP群に1042匹の魚及び共生群に983匹の魚がいた。全部で、138の完全同胞家系がデータ中に存在した。AquaGen社が所有するAffymetrix社(サンディエゴ、CA、米国)のカスタムAxiomアレイを使用して個々のギンザケをジェノタイピングした。SNP-チップは、ギンザケゲノムに全体に分散した220,000のSNPを含んだ。
【００４１】
Axiom 2.0 Assay Manual Workflow User Guide(http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/axiom_2_assay_manual_workflow_prepguide.pdf)に従ってジェノタイピングを行った。遺伝子型判定は、Affymetrix社の「best practices」の推奨(http://media.affymetrix.com/support/downloads/manuals/axiom_best_practice_supplement_user_guide.pdf)に従って、Affymetrix Power Toolsプログラム(http://www.affymetrix.com/estore/partners_programs/programs/developer/tools/powertools.affx)を使用して行った。
【００４２】
5年目クラス(2016年クラス)からの遺伝物質を、220,000のSNPのうちの72,016のサブセットのみジェノタイピングしたことを除いて上述の手順に従って、(元のSNP-チップの派生物である)第2のSNP-チップを使用してジェノタイピングした。
【００４３】
統計分析:
試験の終わりの生存を表現型として使用した。まず、負荷試験の終わりの生存に関する直鎖状モデルをフィッティングした(いかなるSNPの効果も含まない)。このモデルは、潜在的に異なる遺伝形質としてIP及びCOHAB下の生存を処理した。このモデル(モデル0)を以下のとおり定義した。
【数１】
2020521511.tif 000003
式中、
【数２】
2020521511.tif 000004
は、2つの形質(それぞれIP及びCOHABに関する試験の終了時の生存)に関する表現型のベクトルであり、
【数３】
2020521511.tif 000005
は、2つの形質(系統の影響による形質)に関する固定効果のベクトルであり、
【数４】
2020521511.tif 000006
は、2つの形質に関する変量相加的遺伝子効果のベクトルであり、
【数５】
2020521511.tif 000007
は、相加的遺伝(共)分散行列であり、Aは、分子血縁係数行列(numerator relationship matrix)であり、
【数６】
2020521511.tif 000008
は、2つの形質に関する変量残差のベクトルである。このモデルは、ASREMLソフトウェアパッケージを使用して分析した(Gilmour, A. R、B. J. Gogel、B. R. Cullis及びR. Thompson、2009 ASRemlユーザーガイドリリース3.0、pp. VSN International Ltd社、ヘメル・ヘムステッド)。推定遺伝率及び遺伝学的相関性を下記Table 1(表1)に示す。
【００４４】
【表１】
2020521511.tif 000009
【００４５】
上からわかるとおり、試験の終了時の生存として判定されたSRS抵抗性に関する遺伝率は、観察規模で判定された場合でも、高く(約0.4)、IP及びCOHABに関しては同様である。更に、2つの形質間の遺伝学的相関性は、1に近く(約0.9)、これは、遺伝的抵抗性がIP及びCOHAB下ではほとんど同じ遺伝形質であることを示す。
【００４６】
上記モデルの制限付き最尤法(REML)の値の対数を(下記)モデル1の対数REML値と比較することによってGWASを実施して、以下のモデルにおいて座位iの効果を推定した：
【数７】
2020521511.tif 000010
式中、mi1及びmi2は、それぞれIP及び共生魚の座位iにおけるジェノタイプ(ホモ接合体、ヘテロ接合体及び他方のホモ接合体に対して、0、1又は2として符号化した)のベクトルである一方で、γi1及びγi2は、同じ座位の2つの形質に関するアレル置換効果(allele substitution effect)である。したがって、独立座位効果は、IP及びCOHABに関してフィットする。同じ固定効果が両モデルに適合することを考えるとREML値は同等にすぎず、それにより、アレル置換効果を以下の変量として定義した：
【数８】
2020521511.tif 000011
【００４７】
所与の座位のジェノタイプが不明な動物を両モデルから取り除いた。その後、この2つのモデルを、以下の尤度比検定統計量を使用して比較した。
【数９】
2020521511.tif 000012
式中、lnL0及びlnL1は、それぞれモデル0及び1のREML尤度の自然対数である。2の自由度でカイ二乗検定を使用して有意性を検定した(モデル1には2つの追加の分散成分が含まれたため)。各座位の効果を別々に1つずつ検定した、すなわち、220kの検定を実施した。これは、偽陽性のリスクを低下させるために多重検定に対する補正(ボンフェローニ補正)を行わなければならなかったことを意味する。
【００４８】
結果:
GWASにより、(ニジマスの染色体4に対応する)単一の配列にマッピングされた極めて有意なSNPが明らかになった。図1では、配列位置にプロットされた良質なマッピングされたSNPの有意性(-10In(P))を示す。
【００４９】
図1からわかるとおり、極めて有意な多数のSNPが存在する。QTLは、配列の末端(最も有意なおよそ50Mb)に向かって位置する。Table 2(表2)及び図2は、単一の最も有意な座位の異なるジェノタイプに関する死亡率を示す。
【００５０】
【表２】
2020521511.tif 000013
【００５１】
最も一般的なジェノタイプは、好ましくないホモ接合体であり(>50%、Table 2(表2))、改善に対する十分な余地を示した。
【００５２】
第2のステップで新しいGWASを実施した。ここでは、上記解析における単一の最も有意な座位が、座位交互作用による固定系統として含まれた(系統固有のジェノタイプ効果、SNPアレルの数に対する回帰ではなく)。その後、このモデルを(回帰として)他のSNPの効果を更に含むモデルと比較した。再び、同じ配列上のいくつかの座位が有意として現れた。
【００５３】
列挙されているすべての有意なSNPを、3つの配列(NC_034194.1、NW_018086972.1、及びNW_018107982.1)に更にマッピングした。列挙されている有意なQTLを持つこれらの配列内の領域は、ニジマスの同一の染色体とオルソロガスであることがわかった。この結果は、したがって、ギンザケにおいてSRS抵抗性に影響を及ぼす単一の極めて有意なQTLを指す。単一の最も有意な座位は、IP及びCOHAB感染下のSRS抵抗性におけるそれぞれ16%及び46%(この位置の周辺の追加のSNPが含まれる場合は更に)の遺伝的変異を説明する。
【００５４】
後に、第2の負荷試験(2016年クラス)からの材料を確認のためのGWASにおいて検定した。このGWASでは、IP注射した魚及び共生魚に関して共通のアレル置換効果が仮定されたことを除いて、上記のとおりに統計分析を行った。このGWASの結果は、すべてのSNPが抵抗性アレルに大きな正のアレル置換効果を有した(Table 6(表6))と言う意味では、SRSに対する抵抗性を予測するTable 3(表3)のSNPの能力を確認した。
【００５５】
ハプロタイプに組み合わされたときに、SRSに対する抵抗性を判定することに関して優れていることが判明すると予想されるSNPの組合せを特定するためにハプロタイプに基づくアプローチを利用した。このアプローチは、ハプロタイプの診断的挙動が、ハプロタイプの周辺に位置する、2つのアレルを有する単一の原因突然変異によるものであると仮定した。2つのデータセット(2014年クラス及び2016年クラス)に関して、個々に以下のアプローチに従った。最初に、ジェノタイプを、ソフトウェアFimputeを使用して段階的に調整した。次に、すでに特定された診断的SNPを軸としてギンザケ連鎖群21の領域を1つ選び出した。この領域は、NC_034194.1の配列内の位置14,893,760から34,893,760までに及んだ。次に、この領域内の各SNPを、それ自体から10,000塩基対を超えて離れていない場所に位置するすべてのSNPと組み合わせた。その後、SNPのすべての組に関して、以下の手順に従った。1)2-SNPハプロタイプを、データセットに属する各動物から抽出し、2)4つの可能性のあるハプロタイプアレルのそれぞれに対する、Q又はq(基となる原因突然変異における2つのアレル)のすべての可能性のある割り当てに関して、2-SNPハプロタイプを基となるQTLのアレルに変換し、3)これらの原因突然変異ジェノタイプが与えられれば、上記の手順に従ってゲノムワイド関連解析を行った。この方法により、高い診断力を持つ2-SNPの組合せ、並びに基となる原因突然変異において高抵抗性アレルと連鎖したハプロタイプ(それぞれの組合せ内)が特定された。
【００５６】
1つのSNPの組合せが特に診断に役立つことがわかった(Table 7(表7))。2つのSNPは、AX-169631492及びAX-169660070であった。このSNPの組合せは、2014年クラス並びに2016年クラスにおいて最も有意なものであった。ハプロタイプとSRS生存の間の関連に関する検定のp値は、2つの年クラスにおいて、それぞれ3.04995E-44及び6.15085e-22であった。SNPの組合せは、以下の様式でSRSに対する抵抗性を予測するために使用することができ、種親候補を、2つのSNPに関してジェノタイピングすることができる。2つのSNPのジェノタイプは、次に、ソフトウェアPhase又は類似のソフトウェアを使用してハプロタイプに変換することができる。最後に、ハプロタイプを、基となる原因座位のアレルに変換することができる。この変換は、以下のとおりに進む。AX-169631492にシトシン塩基(C)及びAX-169660070にアデニン(A)塩基を有するハプロタイプ(AX-169631492-C+AX-169660070-Aと示す場合もある)は、基となる原因突然変異における抵抗性(R)アレルと関連づけられる。他の3つのハプロタイプ(AX-169631492-C+AX-169660070-C、AX-169631492-A+AX-169660070-C、及びAX-169631492-A+AX-169660070-A)はすべて、基となる原因突然変異における非抵抗性アレル(冒される(Affected)のA)又は半抵抗性アレルと関連づけられる。このように、基となる原因突然変異に2コピーのRアレルを有することがわかった動物は、特に高いSRSに対する抵抗性を有することになる。
【００５７】
【表３】
2020521511.tif 000014
【００５８】
【表４】
2020521511.tif 000015
【００５９】
【表５Ａ】
2020521511.tif 000016
【表５Ｂ】
2020521511.tif 000017
【００６０】
【表６】
2020521511.tif 000018
【００６１】
【表７】
2020521511.tif 000019
【００６２】
本発明の特定の態様、実施形態又は例と関連して記載されている特徴、整数、特性、多型又は群は、不適合でない限り本明細書に記載されている任意の他の態様、実施形態又は例に適用できることが理解されるべきである。本明細書(添付の特許請求の範囲、要約及び図面のいずれも含む)において開示されているすべての特徴、及び/又はそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスのすべての工程は、そのような特徴及び/又は工程の少なくとも一部が相互に排他的である組合せを除いて、いずれかの組合せとして組み合わされてもよい。本発明は、前述のあらゆる実施形態の細部に限定されない。本発明は、本明細書(添付の特許請求の範囲、要約及び図面のいずれも含む)において開示されている特徴のあらゆる新規のもの、又はあらゆる新規の組合せにまで、或いはそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスの工程のあらゆる新規のもの、又はあらゆる新規の組合せにまで拡大する。
【００６３】
読者の注目は、本出願に関連するこの明細書と同時に、若しくはそれに先行して出願され、この明細書とともに公開されているすべての論文及び文書に向けられ、すべてのそのような論文及び文書の内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020521511.tif 000020
【図２】
2020521511.tif 000021
【配列表】
2020521511000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月1日(2019.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ギンザケにおけるピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性を予測する方法であって、前記方法が、前記ギンザケにおいて、QTL内の1つ又は複数のDNA多型に存在するアレルを判定する工程と、前記アレルの判定に基づいて、ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有する前記ギンザケの能力を予測する工程とを含み、前記QTLは、ギンザケゲノム内の連鎖群21(GenBank識別番号NC_034194.1)に、又はその連鎖群に対応するギンザケの染色体に位置する、方法。
【請求項２】
前記QTLが、GenBank配列NW_018086972.1又はNW_018107982.1に位置する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記1つ又は複数のDNA多型が、Table 3(表3)に示されるものから選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記アレルの判定に基づいて、SRSの発症に対する抵抗性を予測するための、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記1つ又は複数のDNA多型は、AX-169575201である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記1つ又は複数のDNA多型は、AX-169631492及びAX-169660070からなるか、又はそれを含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ギンザケ由来のサンプル中の、サケにおけるピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する方法であって、前記DNA多型は、請求項1から6のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、方法。
【請求項８】
ギンザケのピシリケッチア・サルモニス感染を起こすリスクの指標を得るための方法であって、前記方法が、
a)前記ギンザケ由来のサンプル中の、ピシリケッチア・サルモニス感染に対する抵抗性と関連づけられるDNA多型に存在するアレルを検出する工程を含み、前記DNA多型は、請求項1から7のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型であり、前記DNA多型の存在は、前記ギンザケがピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有することを示す、方法。
【請求項９】
請求項1から8のいずれか一項に規定のQTLにおける1つ又は複数の多型を検出する方法であって、前記方法が、ギンザケからサンプルを得る工程と、前記サンプルをアッセイして、サケ科の魚の1つ又は複数の遺伝子バリアントを検出する工程とを含み、前記ギンザケの1つ又は複数の遺伝子バリアントは、請求項1から8のいずれか一項に規定の前記DNA多型の1つ又は複数から選択される、方法。
【請求項１０】
ピシリケッチア・サルモニス感染に対して抵抗性を有するギンザケを検出するための、ピシリケッチア・サルモニス感染と関連づけられるDNA多型の使用であって、前記DNA多型は、請求項1から9のいずれか一項に規定のいずれか1つ又は複数のDNA多型である、使用。
【請求項１１】
種親として使用するためのギンザケを選択する方法であって、前記ギンザケは、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法による予測に基づいて選択される、方法。
【国際調査報告】
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