(57)【要約】本開示は、様々なヒト疾患の治療に有用な、治療用タンパク質および該タンパク質を含む薬学的組成物に関する。特定の局面では、開示された治療用タンパク質は、ヒト胃腸炎症性疾患および上皮細胞バリア機能または完全性の低下に関連する胃腸状態を治療するのに有用である。さらに、開示された治療用タンパク質は、とりわけクローン病および潰瘍性大腸炎を含めて、ヒト炎症性腸疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃腸上皮細胞バリア機能障害を治療する方法であって、
a.  それを必要とする患者に、
i.  SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む治療用タンパク質、および
ii. 薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物を投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が胃腸壁の完全性の低下に関連する疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が胃腸粘膜上皮の完全性の低下に関連する疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が腸上皮の完全性の低下に関連する疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎、過敏性腸症候群、腸内感染症、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）感染症、代謝性疾患、肥満、2型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝臓障害、アルコール性脂肪性肝炎、セリアック病、壊死性腸炎、胃腸障害、短腸症候群、GI粘膜炎、化学療法誘発性粘膜炎、放射線誘発性粘膜炎、口腔粘膜炎、間質性膀胱炎、神経障害、認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、自閉症、化学療法関連脂肪性肝炎（CASH）、および前述の疾患の小児バージョンからなる群より選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が炎症性腸疾患である、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
胃腸上皮細胞バリア機能障害がクローン病である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
胃腸上皮細胞バリア機能障害が潰瘍性大腸炎である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１９】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２０】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２１】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２２】
前記投与することが、直腸、非経口、静脈内、局所、経口、皮膚、経皮、または皮下投与を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項２３】
前記投与することが、患者の口、胃腸管腔、および/または腸への投与である、請求項1に記載の方法。
【請求項２４】
患者が胃腸上皮細胞バリア機能障害に関連する少なくとも1つの症状の軽減を経験する、請求項1に記載の方法。
【請求項２５】
患者が、腹痛、血便、膿の混じった便、発熱、体重減少、頻繁な下痢、倦怠感、食欲減退、しぶり、および直腸出血からなる群より選択される胃腸上皮細胞バリア機能障害に関連する少なくとも1つの症状の軽減を経験する、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
前記投与することが患者の胃腸の炎症を軽減する、請求項1に記載の方法。
【請求項２７】
前記投与することが患者の腸粘膜の炎症を軽減する、請求項1に記載の方法。
【請求項２８】
前記投与することが患者の腸組織におけるムチンの産生を増加させる、請求項1に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与することが患者における腸上皮創傷治癒を増加させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与することが患者における腸上皮細胞の増殖を増加させる、請求項1に記載の方法。
【請求項３１】
患者に少なくとも1つの第2の治療剤を投与することをさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３２】
患者に少なくとも1つの第2の治療剤を投与することをさらに含み、該第2の治療剤が抗下痢薬、5-アミノサリチル酸化合物、抗炎症剤、抗生物質、抗体、抗サイトカイン剤、抗炎症性サイトカイン剤、ステロイド、コルチコステロイド、および免疫抑制剤からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３３】
a.  SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、治療用タンパク質；および
b.  薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
【請求項３４】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
治療用タンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
直腸、非経口、静脈内、局所、経口、皮膚、経皮、または皮下投与用に製剤化された、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
治療用タンパク質が患者の胃腸管腔および/または腸内で活性を有するように製剤化された、請求項33に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項５０】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５１】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５２】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５３】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５４】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５５】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５６】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５７】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５８】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項５９】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６０】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６１】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６２】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６３】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６４】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項49に記載の発現ベクター。
【請求項６５】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項６６】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項６７】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項６８】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項６９】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７０】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７１】
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７２】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７３】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７４】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７５】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７６】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７７】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７８】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項７９】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８０】
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８１】
外因性ポリヌクレオチドが宿主細胞特異的シグナル配列をさらにコードする、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８２】
外因性ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、およびSEQ ID NO:20からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
原核細胞である、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８４】
大腸菌（Escherichia coli）細胞である、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８５】
真核細胞である、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８６】
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項65に記載の宿主細胞。
【請求項８７】
タンパク質を生産する方法であって、コードされた該タンパク質の発現に十分な条件下で、請求項65に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項８８】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された治療用タンパク質。
【請求項８９】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９０】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９１】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９２】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９３】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９４】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９５】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９６】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９７】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９８】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項９９】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１００】
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０１】
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０２】
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０３】
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０４】
前記タンパク質がインビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０５】
前記タンパク質が、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を、該タンパク質の非存在下で行った該アッセイと比較して、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％増加させる、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０６】
前記タンパク質が、キナーゼ阻害剤の対照と比較して、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【請求項１０７】
前記タンパク質が、スタウロスポリンまたはミオシン軽鎖キナーゼの対照と比較して、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、請求項88に記載の単離された治療用タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年12月28日に出願された米国仮特許出願第62/611,334号、2017年12月19日に出願された米国仮特許出願第62/607,706号、および2017年4月7日に出願された米国仮特許出願第62/482,963号の優先権の恩典を主張するものであり、それぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
電子申請されたテキストファイルの説明
本明細書と共に電子申請されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる：配列表のコンピュータ読み取り可能形式のコピー
ファイル名：SEGE_001_03WO_SeqList_ST25.txt；作成日：2018年4月4日；ファイルサイズ：約45.3キロバイト。
【０００３】
分野
本開示は、とりわけ、胃腸炎症性疾患および上皮バリア機能障害の治療に適用される、新規タンパク質および該タンパク質を含む薬学的組成物に関する。いくつかの態様では、本明細書に記載のタンパク質および薬学的組成物は、異常な透過性の上皮バリアならびに炎症性腸疾患または障害に関連する疾患状態の治療または予防に特に適用される。
【背景技術】
【０００４】
背景
炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease：IBD）は、原因不明の多様な疾患であり、胃腸粘膜への病理組織学的損傷を伴った、頻繁な、血の混じった便通をもたらす（Zhang et al., 2017, Front Immunol, 8:942（非特許文献1））。疾患の明確な誘因は十分には特定されていないが、疾患進行に関する1つの提案は、腸のバリア機能の破壊が細菌または細菌成分を粘膜組織に移行させることを示唆している（Coskun, 2014, Front Med (Lausanne), 1:24（非特許文献2）; Martini et al., 2017, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 4:33-46（非特許文献3））。細菌の移行は炎症性シグナル伝達の活性化を引き起こし、それがさらなるバリア破壊を誘発して、バリア破壊、細菌移行、炎症の周期的な増幅ループが生じる。現在の多くの治療法は炎症を標的としているが、粘膜の治癒を促進する治療法の欠如は、上皮の修復と腸バリア完全性を促進する新規治療法の機会を提供する。
【０００５】
細菌の移行がIBDの誘因になり得るという仮説から発展して、より最近の研究は、腸内微生物叢の有害な変化、つまりディスバイオシス（dysbiosis：腸内菌共生バランスの失調）がIBDの発症を促進する可能性があることを実証している。
【０００６】
現在、市場で入手可能な多くのIBD治療薬は、論じられたIBD関連の炎症反応を標的にして、それを抑制することのみに狙いを定めている。有益ではあるが、この狭い治療作用様式は、この疾患の病因において上皮バリアの完全性が果たす大きな貢献を無視している。
【０００７】
したがって、当技術分野では、免疫系の炎症反応を抑制するだけでなく、個人の上皮バリア機能をも回復させるように協調して作用する、治療薬の開発に対する大きなニーズが存在している。また、タンパク質治療薬の製造および/または加工を通して安定であるだけでなく、長期貯蔵条件下でも安定である、本明細書に記載されるようなタンパク質治療薬の生産が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Zhang et al., 2017, Front Immunol, 8:942
【非特許文献２】Coskun, 2014, Front Med (Lausanne), 1:24
【非特許文献３】Martini et al., 2017, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 4:33-46
【発明の概要】
【０００９】
開示の概要
本開示は、炎症性腸疾患（IBD）などの胃腸障害を患っている対象を効果的に治療できる治療薬への医学界の重要なニーズに対処するものである。一局面では、上皮バリアの完全性を維持しかつ/または上皮バリアの修復を改善できる新規なタンパク質治療薬が提供される。いくつかの態様では、上皮バリアは腸上皮バリアである。こうしたタンパク質治療薬はまた、対象者の腸の炎症を抑制し、かつ/または腸の炎症に伴う症状を軽減することができる。
【００１０】
本明細書で提供されるタンパク質治療薬は、胃腸上皮細胞のバリア機能または完全性の低下に関連し得る多くの疾患および/または症状を治療するのに有用である。
【００１１】
いくつかの態様では、本開示は、腸内微生物叢に由来する新規なタンパク質治療薬および該タンパク質治療薬を利用する方法を教示する。特定の態様では、SEQ ID NO:19に対して少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、腸内微生物叢に由来するタンパク質が提供される。いくつかの態様では、該治療用タンパク質は、SEQ ID NO:3と同一のアミノ酸配列を含まない。さらに他の態様では、該治療用タンパク質は、天然に存在しないアミノ酸配列を含む。
【００１２】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む。他の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。さらに他の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、SEQ ID NO:19と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで該アミノ酸配列は、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:3に対して少なくとも1、2、3または4つのアミノ酸置換を有する。他の態様では、該アミノ酸配列は、SEQ ID NO:3に対して少なくとも2つで、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35未満のアミノ酸置換を有する。さらに他の態様では、治療用タンパク質は、天然に存在しないアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの態様では、前記タンパク質はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。SEQ ID NO:3に関する他の態様では、X53はN、S、T、M、R、Qであり、かつ/またはX83はN、RもしくはKであり、かつ/またはX84はGもしくはAであり、かつ/またはX147はC、S、T、M、V、L、AもしくはGであり、かつ/またはX151はC、S、T、M、V、L、A、もしくはGである。さらに他の態様では、X53はN、SもしくはKであり、かつ/またはX83はNもしくはRであり、かつ/またはX84はGもしくはAであり、かつ/またはX147はC、V、LもしくはAであり、かつ/またはX151はC、S、V、LもしくはAである。
【００１５】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、長さが約200〜250アミノ酸、210〜250アミノ酸、220〜250アミノ酸、220〜240アミノ酸、230〜250アミノ酸、230〜240アミノ酸、または230〜235アミノ酸、220〜275アミノ酸、220〜260アミノ酸、230〜260アミノ酸、240〜250アミノ酸、250〜260アミノ酸、230〜256アミノ酸、240アミノ酸〜256アミノ酸、245アミノ酸〜256アミノ酸である。他の態様では、治療用タンパク質は、長さが220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259または260アミノ酸である。
【００１６】
いくつかの態様では、本開示は、SEQ ID NO:19またはその変異体を含む治療用タンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを教示する。他の態様では、該抗体またはそのフラグメントは、SEQ ID NO:3と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合しない。さらに他の態様では、該抗体またはそのフラグメントは、SEQ ID NO:19と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合するが、SEQ ID NO:3と同一のアミノ酸配列を含むタンパク質に結合しない。
【００１７】
いくつかの態様では、前記タンパク質はインビトロアッセイで上皮細胞層のバリア機能を増加させる；その増加は、該アッセイで該タンパク質の非存在下におけるバリア機能と対比しての増加である。他の態様では、そのインビトロアッセイは経上皮電気抵抗（transepithelial electrical resistance：TEER）アッセイである。さらに他の態様では、バリア機能の増加は、該アッセイで該タンパク質の非存在下における電気抵抗よりも少なくとも5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、または90％大きい電気抵抗の増加である。いくつかの態様では、上皮細胞層は腸の上皮細胞層である。さらに他の態様では、腸の上皮細胞層は腸細胞と杯細胞を含む細胞層である。
【００１８】
いくつかの態様では、前記タンパク質はインビトロアッセイで細胞からの炎症性サイトカインの分泌を減少させる。他の態様では、該インビトロアッセイは、該タンパク質の存在下および非存在下における単球系細胞と熱死滅大腸菌（E. coli）とのインキュベーションを含む。さらに他の態様では、少なくとも1つの炎症性サイトカインは、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、およびIL-23からなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの態様では、前記タンパク質はインビトロアッセイで細胞からの抗炎症性サイトカインの分泌を増加させる。他の態様では、該インビトロアッセイは、該タンパク質の存在下および非存在下における単球と熱死滅大腸菌とのインキュベーションを含む。さらに他の態様では、少なくとも1つの抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびTGF-βからなる群より選択される。
【００２０】
いくつかの態様では、前記タンパク質はそのタンパク質を投与された対象の腸組織病理を軽減させる。いくつかの態様では、その対象は、化学物質で処理することによって腸組織の損傷を有するように誘導された。他の態様では、その対象は、腸組織の損傷を引き起こす化学物質のデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）により処理された。さらに他の態様では、対象は哺乳動物である。さらに他の態様では、動物はげっ歯類である。他の態様では、対象は非ヒト霊長類である。
【００２１】
いくつかの態様では、治療用タンパク質は、該タンパク質を投与された対象における胃腸の炎症を軽減する。他の態様では、該タンパク質は対象における腸粘膜の炎症を軽減する。さらに他の態様では、該タンパク質は対象における腸上皮細胞のバリア機能または完全性を改善する。
【００２２】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、そのタンパク質を投与された対象において、腸組織中のムチンの量を増加させる。
【００２３】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、そのタンパク質を投与された対象において、腸上皮細胞の創傷治癒を増加させる。他の態様では、該タンパク質は、インビトロアッセイにおいて腸上皮細胞の創傷治癒を増加させる。
【００２４】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、そのタンパク質を投与された対象において、結腸短縮（colon shortening）を防止または低減する。
【００２５】
いくつかの態様では、治療用タンパク質は、そのタンパク質を投与された対象の血液、血漿、血清、組織および/または粘膜中のサイトカインを調節する（すなわち、増加または減少させる）。
【００２６】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、前記対象の血液、血漿、血清、組織および/または粘膜中の少なくとも1つの炎症性サイトカインのレベルを低下させる。他の態様では、少なくとも1つの炎症性サイトカインは、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、およびIL-23からなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、前記対象の血液、血漿、血清、組織および/または粘膜中の少なくとも1つの抗炎症性サイトカインのレベルを増加させる。他の態様では、少なくとも1つの抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびTGF-βからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、前記対象の血液、血漿、血清、組織および/または粘膜中の少なくとも1つの抗炎症性サイトカインのレベルを低下させる。他の態様では、少なくとも1つの抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびTGF-βからなる群より選択される。
【００２９】
いくつかの態様では、本開示は、新規タンパク質治療薬をコードするポリヌクレオチドおよび宿主細胞内で該核酸を発現させる方法を教示する。特定の態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19と少なくとも約70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％同一であるタンパク質をコードする配列を含む。他の態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19と少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％同一でありかつSEQ ID NO:3と100％未満同一であるタンパク質をコードする配列を含む。さらに他の態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1またはSEQ ID NO:3の天然に存在しない変異体であるタンパク質をコードする。さらに他の態様では、該ポリヌクレオチドは組換え宿主細胞での発現のためにコドン最適化される。さらに他の態様では、該ポリヌクレオチドは大腸菌での発現のためにコドン最適化される。
【００３０】
いくつかの態様では、本開示は、SEQ ID NO:20と少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％同一である配列を含む核酸を教示する。他の態様では、該核酸は、SEQ ID NO:20と少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％同一でありかつSEQ ID NO:4と100％未満同一である配列を含む。さらに他の態様では、該核酸は、SEQ ID NO:2またはSEQ ID NO:4の天然に存在しない変異体である配列を含む。
【００３１】
いくつかの態様では、前記タンパク質は、N末端および/またはC末端で化学的に修飾される。他の態様では、該タンパク質のN末端はアセチル化により化学修飾される。さらに他の態様では、C末端はアミド化により化学修飾される。
【００３２】
いくつかの態様では、前記タンパク質はペグ化される。
【００３３】
いくつかの態様では、前記タンパク質は実質的に精製され、また、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化、メチル化、アセチル化、または脂質付加により修飾される。
【００３４】
いくつかの態様では、前記タンパク質は第2のタンパク質に融合される。他の態様では、第2のタンパク質は、免疫グロブリンFcドメインまたはヒト血清アルブミンタンパク質ドメインである。
【００３５】
いくつかの局面では、本開示は、SEQ ID NO:19に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む治療用タンパク質、および薬学的に許容される担体を含む、炎症性腸疾患を治療するための薬学的組成物を提供する。いくつかの態様では、治療用タンパク質は精製されるか、実質的に精製される。いくつかの態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む。別の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3と同一の配列を含まないか、または該タンパク質はSEQ ID NO:3の天然に存在しない変異体である。他の態様では、該タンパク質は、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。さらに他の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
いくつかの態様では、薬学的組成物は直腸、非経口、静脈内、局所、経口、皮膚、経皮、または皮下投与用に製剤化される。他の態様では、薬学的組成物は液体、ゲル、またはクリームである。さらに他の態様では、薬学的組成物は腸溶コーティングを含む固体組成物である。
【００３７】
いくつかの態様では、薬学的組成物はクリーム、カプセル、液体、ゲル、またはエマルジョンである。
【００３８】
いくつかの態様では、薬学的組成物は遅延放出をもたらすように製剤化される。他の態様では、遅延放出は胃腸管への放出である。さらに他の態様では、遅延放出は口腔、小腸、大腸および/または直腸への放出である。
【００３９】
いくつかの態様では、薬学的組成物は持続放出をもたらすように製剤化される。他の態様では、持続放出は胃腸管への放出である。さらに他の態様では、持続放出は口腔、小腸、大腸および/または直腸への放出である。さらに他の態様では、持続放出組成物は、約1〜20時間、1〜10時間、1〜8時間、4〜12時間、または5〜15時間にわたって治療用製剤を放出する。
【００４０】
いくつかの態様では、薬学的組成物は第2の治療剤をさらに含む。他の態様では、第2の治療剤は、抗下痢薬、5-アミノサリチル酸化合物、抗炎症剤、抗生物質、抗サイトカイン剤、抗炎症性サイトカイン剤、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制剤、JAK阻害剤、抗インテグリン生物製剤、抗IL12/23R生物製剤、およびビタミンからなる群より選択される。
【００４１】
いくつかの態様では、薬学的組成物はプロテアーゼ阻害剤をさらに含む。さらに他の態様では、プロテアーゼ阻害剤は、糞便の存在下および/または血液の存在下で治療用タンパク質の分解を阻害する。
【００４２】
上述したように、これらの新規タンパク質治療薬は、対象における上皮バリア機能および完全性を促進することができる。いくつかの態様では、上皮バリア機能は腸上皮バリア機能である。さらに、該タンパク質の治療効果には、IBD個体における炎症性免疫反応の抑制が含まれる。したがって、本開示は、胃腸が炎症状態の宿主、および胃腸上皮バリアの完全性が損なわれた疾患状態の宿主を治療するために、教示された治療用タンパク質を利用する方法についての詳細な指針を提供する。
【００４３】
いくつかの態様では、患者の炎症性腸疾患または障害を治療する方法が提供され、その方法は、該患者に、i）SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む治療用タンパク質；およびii）薬学的に許容される担体；を含む薬学的組成物を投与することを含む。該方法の他の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:19と同一のアミノ酸配列を含む。さらに他の態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:3と同一ではないか、またはSEQ ID NO:3の天然に存在しない変異体である。
【００４４】
いくつかの態様では、前記患者は腸に炎症があると診断されている。他の態様では、腸の炎症は小腸および/または大腸にある。さらに他の態様では、腸の炎症は直腸にある。さらに他の態様では、患者は回腸嚢炎（pouchitis）があると診断されている。
【００４５】
いくつかの態様では、前記患者は腸に潰瘍があると診断されている。他の態様では、該患者は、排液性の腸管皮膚瘻および/または直腸膣瘻であると診断されている。
【００４６】
いくつかの態様では、前記患者はクローン病（CD）であると診断されている。他の態様では、CDは軽度のCDである。さらに他の態様では、CDは中等度から重度のCDである。さらに他の態様では、該患者は小児CDと診断されている。
【００４７】
いくつかの態様では、前記患者は短腸症候群または過敏性腸症候群と診断されている。
【００４８】
いくつかの態様では、前記患者は粘膜炎と診断されている。他の態様では、粘膜炎は口腔粘膜炎である。さらに他の態様では、粘膜炎は、化学療法誘発性粘膜炎、放射線療法誘発性粘膜炎、化学療法誘発性口腔粘膜炎、または放射線療法誘発性口腔粘膜炎である。さらに他の態様では、粘膜炎は胃腸の粘膜炎である。さらに他の態様では、胃腸の粘膜炎は小腸、大腸または直腸の粘膜炎である。
【００４９】
いくつかの態様では、CDと診断された患者への前記投与は、排液性の腸管皮膚瘻および/または直腸膣瘻の数の減少をもたらした。他の態様では、前記投与は、瘻孔形成疾患（fistulizing disease）を有する成体患者において瘻孔閉鎖を維持する。
【００５０】
他の態様では、前記患者は潰瘍性大腸炎（UC）と診断されている。他の態様では、UCは軽度のUCである。さらに他の態様では、UCは中等度から重度のUCである。さらに他の態様では、該患者は小児UCと診断されている。
【００５１】
いくつかの態様では、前記患者はIBDからの臨床的寛解期にある。他の態様では、該患者はUC、小児UC、CDまたは小児CDからの臨床的寛解期にある。
【００５２】
いくつかの態様では、前記患者は、クローン病または潰瘍性大腸炎以外の炎症性腸疾患または障害を有する。他の態様では、該患者は炎症性腸疾患に関連する症状を少なくとも1つ有する。
【００５３】
いくつかの態様では、前記投与は、患者の胃腸の炎症を軽減し、かつ/または炎症性腸疾患に伴う腸粘膜の炎症を軽減する。他の態様では、該投与は、患者の腸上皮細胞のバリア機能または完全性を改善する。
【００５４】
いくつかの態様では、前記投与後、患者は炎症性腸疾患または障害に関連する少なくとも1つの症状の軽減を経験する。他の態様では、少なくとも1つの症状は、腹痛、血便、膿の混じった便、発熱、体重減少、頻繁な下痢、倦怠感、食欲減退、悪心、けいれん、貧血、しぶり（tenesmus）、および直腸出血からなる群より選択される。さらに他の態様では、投与後、患者は下痢の頻度の減少、便に混じった血液の減少、および/または直腸出血の減少を経験する。
【００５５】
いくつかの態様では、患者は従来の治療法に対して不十分な応答を経験している。他の態様では、従来の治療法は、アミノサリチル酸、コルチコステロイド、チオプリン、メトトレキサート、JAK阻害剤、スフィンゴシン1-リン酸（S1P）受容体阻害剤、抗インテグリン生物製剤、抗IL12/23Rもしくは抗IL23/p10生物製剤、および/または抗腫瘍壊死因子の剤もしくは生物製剤による治療である。
【００５６】
いくつかの態様では、前記投与は、患者の血液、血漿、血清、粘膜または組織中のサイトカインのレベルを調節する（すなわち、増加または減少させる）。
【００５７】
いくつかの態様では、前記投与は、患者における少なくとも1つの炎症性サイトカインのレベルを抑制する。他の態様では、少なくとも1つの炎症性サイトカインは、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、およびIL-23からなる群より選択される。
【００５８】
いくつかの態様では、前記投与は、患者の血液、血漿、血清、粘膜または組織中の少なくとも1つの抗炎症性サイトカインのレベルを増加させる。他の態様では、少なくとも1つの抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびTGF-βからなる群より選択される。
【００５９】
いくつかの態様では、前記投与は、患者の血液、血漿、血清、粘膜または組織中の少なくとも1つの抗炎症性サイトカインのレベルを低下させる。他の態様では、少なくとも1つの抗炎症性サイトカインは、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびTGF-βからなる群より選択される。
【００６０】
いくつかの態様では、前記投与は、患者の腸管腔内のムチンの量を増加させる。
【００６１】
いくつかの態様では、前記投与は、患者における腸上皮細胞の創傷治癒を増加させる。
【００６２】
いくつかの態様では、前記投与は、患者における結腸短縮を防止または低減する。
【００６３】
いくつかの態様では、前記投与は、患者への薬学的組成物の直腸、静脈内、非経口、経口、局所、皮膚、経皮または皮下投与を含む。他の態様では、該投与は胃腸管腔への投与である。
【００６４】
いくつかの態様では、前記患者はまた、少なくとも1つの第2の治療剤を投与される。他の態様では、少なくとも1つの第2の治療剤は、抗下痢薬、抗炎症剤、抗体、抗生物質、または免疫抑制剤からなる群より選択される。さらに他の態様では、少なくとも1つの第2の治療剤は、アミノサリチル酸、ステロイド、またはコルチコステロイドである。他の態様では、少なくとも1つの第2の治療剤は、アダリムマブ、ペゴル、ゴリムマブ、インフリキシマブ、ベドリズマブ、ウステキヌマブ、トファシチニブ、およびセルトリズマブまたはセルトリズマブペゴルからなる群より選択される。
【００６５】
いくつかの局面では、発現ベクターが提供され、該ベクターは、SEQ ID NO:19に対して少なくとも70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む。
【００６６】
いくつかの態様では、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。他の態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。さらに他の態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:3と同一ではないアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。
【００６７】
いくつかの局面では、発現システムが提供され、該システムには、宿主細胞および前述の外因性ポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００６８】
いくつかの態様では、宿主細胞は原核細胞または真核細胞である。他の態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞、酵母細胞または細菌細胞である。さらに他の態様では、細菌細胞は大腸菌である。さらに他の態様では、哺乳動物細胞はCHO細胞である。
【００６９】
いくつかの局面では、前記タンパク質を生産する方法が提供される。
【００７０】
いくつかの態様では、前記タンパク質を生産する方法は、前述の宿主細胞を前述の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトするステップ；形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、前述の外因性ポリヌクレオチドによってコードされる前述のタンパク質の発現に十分な条件下で培養するステップを含む。他の態様では、該方法は、形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞および培地から該タンパク質を精製するステップをさらに含む。
【００７１】
いくつかの態様では、腸上皮バリア機能関連疾患などの疾患を治療する方法が提供され、その方法では、本出願および配列表で開示された任意の配列が利用される。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図1Aおよび図1Bは、炎症によって誘発されたバリア破壊後の、上皮バリア完全性のSG-11による回復を示し、これは実施例2に記載される。
【図２】図2Aは、熱死滅（heat killed）大腸菌（HK大腸菌）により誘導されたTNF-α産生に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例3に記載される。図2Bは、HK大腸菌により誘導されたIL-23産生に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例3に記載される。
【図３】図3は、HK大腸菌により誘導されたIL-10産生に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例4に記載される。
【図４】図4は、HK大腸菌で刺激した後のムチン発現に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例5に記載される。
【図５】図5は、実施例6に記載されるように、上皮細胞創傷治癒に対するSG-11投与の効果を示す。
【図６】図6は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける上皮中心バリア機能リードアウトに対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。
【図７】図7は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおけるバリア機能障害に応答する炎症性リードアウトに対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。
【図８】図8は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける体重に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。
【図９】図9は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける肉眼的病変に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。
【図１０】図10A、10Bおよび10Cは、炎症性腸疾患のDSSモデルからの近位（図10A）、遠位（図10B）および近位と遠位の両方（図10C）の組織の病理組織学的解析の結果を示し、これは実施例7に記載される。
【図１１】図11Aは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の長さに対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。図11Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の重さ対長さ比に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例7に記載される。
【図１２】図12は、炎症性腸疾患のDSSモデルのSG-11治療後の上皮バリアの完全性を示し、これは実施例8に記載される。
【図１３】図13は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおけるバリア機能の炎症中心リードアウトを示し、これは実施例8に記載される。
【図１４】図14は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける体重減少の予防を示し、これは実施例8に記載される。
【図１５】図15Aは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の長さに対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例8に記載される。図15Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の重さ対長さ比に対するSG-11投与の効果を示し、これは実施例8に記載される。
【図１６】図16A、16Bおよび16Cは、炎症性腸疾患のDSSモデルからの近位（図16A）、遠位（図16B）および近位と遠位の両方（図16C）の組織の病理組織学的解析の結果を示し、これは実施例8に記載される。
【図１７】図17は、SG-11（SEQ ID NO:7）とロゼブリア属（Roseburia）菌種由来の類似のタンパク質配列との多重配列アラインメント解析の結果を示す。
【図１８】図18は、図18A、図18B、図18C、図18D、図18E、図18F、図18G、図18H、および図18Iからの条件がSG-11の安定性に及ぼす影響を示す。図18A〜図18Iに関連する条件については、実施例14を参照されたい。
【図１９】図19は、図19A、図19B、図19C、図19D、図19E、図19F、図19G、図19H、および図19Iからの条件がSG-11V5の安定性に及ぼす影響を示す。図19A〜図19Iに関連する条件については、実施例14を参照されたい。
【図２０】図20は、炎症によって誘発されたバリア破壊後の、上皮バリア完全性のSG-11およびSG-11変異体による回復を示し、これは実施例15に記載される。
【図２１】図21Aおよび図21Bは、SG-11およびSG-11変異体で炎症性腸疾患のDSSモデルを治療した後の上皮バリア完全性を示し、これは実施例16に記載される。
【図２２】図22Aおよび図22Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおけるバリア機能の炎症中心リードアウトを示し、これは実施例16に記載される。
【図２３】図23Aおよび図23Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける体重減少に対するSG-11またはSG-11変異体による治療の効果を示し、これは実施例16に記載される。
【図２４】図24は、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける肉眼的病変に対するSG-11またはSG-11変異体の投与の効果を示し、これは実施例16に記載される。
【図２５】図25Aおよび図25Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の長さに対するSG-11またはSG-11変異体による治療の効果を示し、これは実施例16に記載される。
【図２６】図26Aおよび図26Bは、炎症性腸疾患のDSSモデルにおける結腸の重さ対長さ比に対するSG-11またはSG-11変異体による治療の効果を示し、これは実施例16に記載される。
【図２７】図27Aは、SG-11（SEQ ID NO:7）とSG-11変異体（SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19）との多重配列アライメント解析の結果を示し、図27Bは、多重配列アライメント解析に基づくパーセント同一性マトリックスの結果を示す。本明細書に記載する多重アライメント解析では、EMBL-EBIにより提供されたClustal Omegaプログラムを使用した。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
詳細な説明
本開示は、胃腸障害に伴う症状に苦しんでいる対象を治療するのに有用な新規タンパク質治療薬を提供する。例えば、これらのタンパク質は、上皮バリア機能および/または完全性を促進または増強することができる。該タンパク質はまた、IBD個体における炎症性の免疫反応を抑制することもできる。本明細書に記載のタンパク質治療薬は、胃腸上皮細胞のバリア機能または完全性の低下および腸の炎症に関連する多くの疾患を治療するのに有用である。
【００７４】
本開示では、元のタンパク質と同等またはそれ以上の治療活性を有するタンパク質変異体も提供されるが、該タンパク質変異体は、タンパク質治療薬品の製造および加工を通じて、さらには長期貯蔵条件下で、向上した安定性を有する。
【００７５】
定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願で使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解している意味を有するものとする。一般的に、本明細書に記載される化学、分子生物学、細胞および癌生物学、免疫学、微生物学、薬理学、タンパク質・核酸化学に関連して使用される命名法ならびにそれらの技術は、当技術分野で周知であって、よく使用されるものである。したがって、以下の用語は当業者によって十分に理解されていると考えられるが、ここに開示される主題の説明を容易にするために、以下の定義が示される。
【００７６】
本明細書全体を通して、用語「含む」（comprise）または「含む」（comprises）もしくは「含む」（comprising）などの変形は、記載された成分または成分のグループの包含を意味するが、他の成分または成分のグループの除外を意味するものではないことが理解されよう。
【００７７】
用語「１つの（a）」または「１つの（an）」は、その実在物の1つ以上を指し、すなわち、複数の指示対象を指すことができる。したがって、用語「１つの（a）」または「１つの（an）」、「1つ以上」、「1つまたは複数」および「少なくとも1つ」は、本明細書では相互交換可能に使用される。また、不定冠詞「１つの（a）」または「１つの（an）」による「要素」（an element）への言及は、文脈上、1つおよび1つのみの要素が存在することが明確に要求されない限り、2つ以上の要素が存在する可能性を排除しない。
【００７８】
用語「〜を含めて」（including）は、「〜を含むがこれらに限定されない」（including but not limited to）を意味するために使用される。「〜を含めて」と「〜を含むがこれらに限定されない」は相互交換可能に使用される。
【００７９】
本明細書で使用する用語「胃腸」または「胃腸管」、「消化管」、および「腸」は、口、食道、胃、小腸、大腸、直腸、肛門を含めて、口から肛門に至る一連の中空器官を指すために相互交換可能に使用することができる。「胃腸」または「胃腸管」、「消化管」、および「腸」という用語は、消化管の特定の部分に限定されることを必ずしも意図しない。
【００８０】
本明細書で使用する用語「SG-11」は、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むタンパク質、および本明細書に記載されるような同じまたは類似の機能活性を有するその変異体をも指す。したがって、SG-11は、本明細書では、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、もしくはSEQ ID NO:9、またはそれらの変異体もしくは断片を含む、またはそれらからなるタンパク質を指すことができる。SG-11変異体の例は、SEQ ID NO:11（SG-11V1)、SEQ ID NO:13（SG-11V2)、SEQ ID NO:15（SG-11V3)、SEQ ID NO:17（SG-11V4)、およびSEQ ID NO:19（SG-11V5)を含むが、これらに限定されない。米国仮特許出願（2017年4月7日出願の第62/482,963号、2017年12月19日出願の第62/607,706号、2017年12月28日出願の第62/611,334号；本明細書はこれらの優先権を主張しており、それぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられる）では、用語「実験タンパク質1」およびその変異体が使用されたが、この用語は本明細書で使用されるSG-11またはその変異体と同義である。
【００８１】
「シグナル配列」（「プレ配列」、「シグナルペプチド」、「リーダー配列」、または「リーダーペプチド」とも呼ばれる）は、新生タンパク質のN末端に位置するアミノ酸の配列を指し、細胞からのタンパク質の分泌を促進することができる。結果として生じる細胞外タンパク質の成熟型はシグナル配列を欠いており、シグナル配列は分泌過程の間に切断される。
【００８２】
本明細書で使用する用語「配列同一性」、「同一性パーセント」、「相同性パーセント」、または例えば「〜と50％同一の配列」を含む記述は、比較のウィンドウにわたって、配列がヌクレオチドごとにまたはアミノ酸ごとに同一である程度を指す。したがって、「配列同一性の割合」は、以下により計算することができる：比較のウィンドウにわたって2つの最適にアライメントされた配列を比較する；両方の配列中に同一の核酸塩基（例：A、T、C、G、I）または同一のアミノ酸残基（例：Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、CysおよびMet）が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を求める；一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割る；その結果に100を掛けると配列同一性の割合が得られる。
【００８３】
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は本明細書では交換可能に使用される）の計算は、次のように行うことができる。2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、これらの配列を最適な比較目的でアライメントさせることができる（例えば、最適なアライメントのために第1および第2のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、また、比較目的で非相同配列を無視することができる）。特定の態様では、比較目的でアライメントされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも30％、好ましくは少なくとも40％、より好ましくは少なくとも50％、60％、さらにより好ましくは少なくとも70％、80％、90％、または100％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第1の配列のある位置が第2の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められる場合、両分子はその位置で同一である。これらの2つの配列間の同一性パーセントは、該2つの配列の最適なアライメントのために導入する必要があるギャップの数と各ギャップの長さを考慮して、これらの配列によって共有された同一位置の数の関数である。
【００８４】
少なくとも2つの核酸またはポリペプチドの文脈において「実質的に類似」および「実質的に同一」という語句は、典型的には、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比較して、少なくとも約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％または99.8％もの配列同一性を有する配列を含むことを意味する。いくつかの態様では、実質的に同一のポリペプチドは1つまたは複数の保存的アミノ酸置換によってのみ異なる。いくつかの態様では、実質的に同一のポリペプチドは免疫学的に交差反応性である。いくつかの態様では、実質的に同一の核酸分子はストリンジェントな条件下で（例えば、中等度〜高度ストリンジェンシーの範囲内で）互いにハイブリダイズする。
【００８５】
本明細書で使用する用語「ヌクレオチド（の）変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチドの置換、欠失、および/または挿入を指す。例えば、変異は、サイレントな置換、付加または欠失をもたらす改変を含むが、コードされたタンパク質の特性もしくは活性または該タンパク質の作り方を変更しない。
【００８６】
関連（および誘導体）タンパク質には、「変異体」タンパク質が含まれる。変異体タンパク質は、少数のアミノ酸残基によって、別のタンパク質（すなわち、親タンパク質）と、および/または互いと相違し得る。変異体は、それが由来する親タンパク質と比較して、1つまたは複数のアミノ酸変異（例えば、アミノ酸の欠失、挿入または置換）を含むことができる。
【００８７】
「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一のアミノ酸配列、または1つまたは複数の「保存的置換」を有するアミノ酸配列をコードする核酸を指す。保存的置換の例は、次のグループのいずれかのアミノ酸を同じグループの別のアミノ酸に交換することである（米国特許第5,767,063号；Kyte and Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157:105-132参照）。（1）疎水性：ノルロイシン、Ile、Val、Leu、Phe、Cys、Met；（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr；（3）酸性：Asp、Glu；（4）塩基性：Asn、Gln、His、Lys、Arg；（5）鎖の方向に影響する残基：Gly、Pro；（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe；および（7）小型のアミノ酸：Gly、Ala、Ser。したがって、アミノ酸に関して、用語「保存的置換」は、1つまたは複数のアミノ酸が別の化学的に類似する残基で置き換えられることを意味し、この置換は一般に、タンパク質の機能特性に影響を与えない。例としては、小型のアミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、芳香族アミノ酸などの、類似の特性をもつアミノ酸残基の置換が含まれる。いくつかの態様では、本開示は、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:17で特定されるアミノ酸配列に対して、少なくとも1つの天然に存在しない保存的アミノ酸置換を有するタンパク質を提供する。保存的アミノ酸置換のいくつかの一般的な代表例を以下に示す。
【００８８】
用語「アミノ酸」または「任意のアミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸（例：α-アミノ酸）、天然ではないアミノ酸、修飾アミノ酸、および天然ではないつまり非天然アミノ酸を含めて、ありとあらゆるアミノ酸を指す。それはD-アミノ酸とL-アミノ酸の両方を含む。天然アミノ酸には、自然界に見られるもの、例えば無数のタンパク質のビルディングブロックを形成するペプチド鎖へと結合する23種のアミノ酸、が含まれる。これらは主にL立体異性体であるが、少数のD-アミノ酸は、例えば、細菌のエンベロープおよび一部の抗生物質に存在する。20種の「標準」天然アミノ酸を上の表に示す。「非標準」天然アミノ酸は、ピロリシン（メタン産生生物および他の真核生物に見られる）、セレノシステイン（多くの非真核生物ならびに大部分の真核生物に存在する）、およびN-ホルミルメチオニン（細菌、ミトコンドリアおよび葉緑体において開始コドンAUGによりコードされる）である。「天然ではない」または「非天然」アミノ酸は、自然界で発生するかまたは化学的に合成される、非タンパク質構成アミノ酸（つまり、天然でコードされない、または遺伝子コードに見られないもの）である。140種を超える非天然アミノ酸が知られており、何千もの組み合わせが可能である。「修飾」アミノ酸には、アミノ酸上に天然には存在しない基（複数可）または化学部分を含むように化学修飾されたアミノ酸（例：天然アミノ酸）が含まれる。
【００８９】
本明細書で使用する「合成ヌクレオチド配列」または「合成ポリヌクレオチド配列」とは、自然界に存在することが知られていないか、または天然に存在しないヌクレオチド配列のことである。一般に、そのような合成ヌクレオチド配列は、他の天然に存在するヌクレオチド配列と比較して、少なくとも1つのヌクレオチドの違いを含むだろう。本明細書で使用する「合成アミノ酸配列」または「合成ペプチド配列」または「合成ポリペプチド配列」または「合成タンパク質配列」とは、自然界に存在することが知られていないか、または天然に存在しないアミノ酸配列のことである。一般に、そのような合成アミノ酸配列は、他の天然に存在するアミノ酸配列と比較して、少なくとも1つのアミノ酸の違いを含むだろう。
【００９０】
本明細書で使用する「合成タンパク質」または「合成治療用タンパク質」とは、天然に存在するアミノ酸配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸が異なるアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含むタンパク質を意味する。すなわち、「合成タンパク質」は、天然に存在するアミノ酸配列と比較して、所定のアミノ酸位置に少なくとも1つの天然に存在しない置換修飾を含むように改変されたアミノ酸配列を含む。
【００９１】
核酸配列またはアミノ酸配列の配列同一性％または配列相同性％に関して本明細書で使用される「約」という用語は、0.1％の増分で±1.0％までを意味する。例えば、「約90％」の配列同一性には、89.0％、89.1％、89.2％、89.3％、89.4％、89.5％、89.6％、89.7％、89.8％、89.9％、90％、90.1％、90.2％、90.3％、90.4％、90.5％、90.6％、90.7％、90.8％、90.9％、および91％が含まれる。配列同一性％の文脈で使用されない場合、「約」は、問題の値の文脈に応じて、±1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、または10％を意味する。
【００９２】
ほとんどの場合、本明細書で使用される天然および非天然のアミノアシル残基の名称は、有機化学命名法に関するIUPAC委員会および“Nomenclature of α-Amino Acids (Recommendations, 1974)” Biochemistry, 14(2), (1975)に記載される生化学命名法に関するIUPAC-IUB委員会により提案された命名規則に従う。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるアミノ酸およびアミノアシル残基の名称および略語がそれらの提案と異なる場合には、それらが読者に明らかにされるであろう。
【００９３】
本明細書を通して、天然アミノ酸がそれらのフルネーム（例：アラニン、アルギニンなど）で言及されない限り、それらは従来の3文字または1文字の略語（例：アラニンの場合はAlaまたはA、アルギニンの場合はArgまたはRなど）で指定される。特に明記しない限り、アミノ酸の3文字および1文字の略語は、そのアミノ酸のL異性体を指す。本明細書で使用する用語「L-アミノ酸」はペプチドの「L」異性体を指し、反対に用語「D-アミノ酸」はペプチドの「D」異性体（例えば、Dasp、(D)AspまたはD-Asp；Dphe、(D)PheまたはD-Phe）を指す。所望の機能がペプチドによって保持される限り、D異性体のアミノ酸残基を任意のL-アミノ酸残基に置き換えることができる。D-アミノ酸は、1文字略語を使用して言及される場合、慣例により小文字で示すことができる。
【００９４】
あまり一般的でないアミノ酸または非天然アミノ酸の場合、それらがフルネーム（例えば、サルコシン、オルニチンなど）で言及されない限り、それらの残基には3文字または4文字コードが頻繁に使用される；例えば、SarまたはSarc（サルコシン、すなわちN-メチルグリシン）、Aib（α-アミノイソ酪酸）、Dab（2,4-ジアミノブタン酸）、Dapa（2,3-ジアミノプロパン酸）、γ-Glu（γ-グルタミン酸）、Gaba（γ-アミノブタン酸）、β-Pro（ピロリジン-3-カルボン酸）、8Ado（8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸）、Abu（2-アミノ酪酸）、βhPro（β-ホモプロリン）、βhPhe（β-ホモフェニルアラニン）およびBip（β,βジフェニルアラニン）、Ida（イミノ二酢酸）などを含む。
【００９５】
本明細書に開示される配列の中には、配列のアミノ末端（N末端）に「Hy-」部分、および配列のカルボキシ末端（C末端）に「-OH」部分または「-NH2」部分のいずれかを組込んでいる配列がある。そのような場合、特に明記しない限り、問題の配列のN末端の「Hy-」部分は、N末端の遊離の第1級または第2級アミノ基の存在に対応して、水素原子を示し、一方、配列のC末端の「-OH」または「-NH2」部分は、それぞれ、C末端のヒドロキシ基、またはアミド（CONH2）基の存在に対応して、アミノ基を示す。本開示の各配列において、C末端の「-OH」部分はC末端の「-NH2」部分に置き換えることができ、逆の場合もある。
【００９６】
本明細書で使用する用語「Ac」は、ポリペプチドのC末端またはN末端のアシル化によるアセチル保護を指す。本明細書に示される特定のペプチドでは、ペプチドのC末端に位置するNH2はアミノ基を示す。本明細書で使用する用語「カルボキシ」は-CO2Hを指す。
【００９７】
本明細書で使用する用語「薬学的に許容される塩」は、本開示のペプチド、タンパク質または化合物の塩または双性イオン形態を表し、それらの塩は水または油に可溶性または分散性であり、過度の毒性、刺激およびアレルギー反応なしに疾患の治療に適しており、合理的なベネフィット/リスク比に見合っており、それらの意図された用途に効果的である。塩は、化合物の最終的な単離・精製中に、またはアミノ基を適切な酸と反応させることにより別々に、調製することができる。代表的な酸付加塩としては、以下が挙げられる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3-フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、およびウンデカン酸塩。また、本開示の化合物中のアミノ基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；硫酸ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミル；デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステリルの塩化物、臭化物、およびヨウ化物；ならびにベンジルおよびフェネチルの臭化物で四級化することができる。治療上許容される付加塩を形成するために使用できる酸の例には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸などの無機酸、およびシュウ酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸などの有機酸が含まれる。薬学的に許容される塩は、適切には、例えば酸付加塩および塩基性塩の中から、選択された塩であり得る。酸付加塩の例には、塩化物塩、クエン酸塩および酢酸塩が含まれる。塩基性塩の例には、ナトリウムまたはカリウムイオンなどのアルカリ金属カチオン、カルシウムまたはマグネシウムイオンなどのアルカリ土類金属カチオン、ならびに置換アンモニウムイオンの中からカチオンを選択する塩が含まれる。薬学的に許容される塩のその他の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”, 第17版, Alfonso R. Gennaro (編集), Mark Publishing Company, Easton, PA, USA, 1985（およびその最新版）；“Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology”, 第3版, James Swarbrick (編集), Informa Healthcare USA (Inc.), NY, USA, 2007；およびJ. Pharm. Sci. 66: 2 (1977)に記載されている。また、適切な塩のレビューについては、Stahl and Wermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use （Wiley-VCH, 2002）”を参照されたい。
【００９８】
本明細書で使用する場合、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」という用語は、そうした配列の最小サイズの特性を有する一部、または完全長分子のより大きな断片（完全長までの分子を含む）を意味する。
【００９９】
本明細書で使用する用語「プライマー」は、標的ポリヌクレオチドにアニーリングすることができるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１００】
本明細書で使用する「組換え構築物」、「発現構築物」、「キメラ構築物」、「構築物」、および「組換えDNA構築物」という語句は、本明細書で交換可能に使用され、当業者によく知られている。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」とは、ポリペプチドの発現のために、そのポリペプチドの生産用の組換え発現ベクターを導入することができる細胞または細胞株を指す。
【０１０２】
本明細書で使用する用語「単離された」、「精製された」、「分離された」、および「回収された」とは、天然で会合している少なくとも1つの成分から取り出された物質（例えば、タンパク質、核酸、または細胞）を指し、該物質は、例えば、それを含有するサンプルの少なくとも90重量％、または少なくとも95重量％、または少なくとも98重量％の濃度で取り出される。例えば、これらの用語は、天然状態（例えば、無傷の生物系など）で見られるときに通常付随している成分を実質的または本質的に含まない物質を指すことができる。
【０１０３】
用語「患者」、「対象」および「個体」は交換可能に使用することができ、ヒトまたは非ヒト動物のいずれかを指す。これらの用語には、ヒト、非ヒト霊長類、家畜（例：ウシ、ブタ）、ペット（例：イヌ、ネコ）、げっ歯類（例：マウス、ラット）などの哺乳類が含まれる。特定の態様では、これらの用語はヒト患者を指す。例示的な態様では、これらの用語は、胃腸の炎症性疾患にかかっているヒト患者を指す。
【０１０４】
本明細書で使用する「改善された」とは、疾患状態の確認された特性が改善されることを含むように広く解釈されるべきであり、該特性は、対照と比較して、または問題の特性に関連する既知の平均量と比較して、問題の疾患と一般的に相関しているか、または問題の疾患を示している、と当業者によって見なされる。例えば、本開示のタンパク質の適用に伴う「改善された」上皮バリア機能は、本開示のタンパク質で治療されたヒトの上皮バリア完全性を、未治療のヒトの上皮バリア完全性と比較することによって実証され得る。あるいは、本開示のタンパク質で治療されたヒトの上皮バリア完全性を、当業者に公知の科学的または医学的刊行物に示されるような、ヒトの平均上皮バリア完全性と比較することができる。本開示では、「改善された」は、データが統計的に有意（すなわち、p＜0.05）であることを必ずしも要求しない；むしろ、ある値（例えば、平均治療値）が別の値（例えば、平均対照値など）と異なることを示す定量化可能な差異は、「改善された」のレベルに達し得る。
【０１０５】
本明細書で使用する「阻害しかつ抑制する」および同様の用語は、いくつかの態様では完全な阻害または抑制が望ましいかもしれないが、完全な阻害または抑制を必要とすると解釈されるべきではない。かくして、「阻害された免疫反応」または「炎症性サイトカインの阻害」は絶対的な阻害を必要としない。
【０１０６】
したがって、本明細書で使用する用語「増加する」、「抑制する」、「減少する」、またはそれらの文法上同等の用語は、基準（例：ベースライン）測定に相対的な値、例えば、同等の条件下で得られた測定（本明細書に記載の治療を開始する前の同じ個体での測定、または本明細書に記載の治療を行わない対照個体（複数可）での測定など）に相対的な値を示す。いくつかの態様では、適切な対照は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載の治療を開始する前の同じ個体での測定、または本明細書に記載の治療を行わない対照個体（複数可）での測定である。
【０１０７】
本明細書で使用する用語「IBD」または「炎症性腸疾患」とは、個体が慢性または再発性の免疫反応および胃腸（GI）管の炎症を有している状態を指す。2つの最も一般的な炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病（CD）である。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「治療有効量」は、あらゆる医療処置に当てはまる合理的なベネフィット/リスク比で、治療対象に治療効果を与える治療剤（例えば、本開示のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質）の量を指す。そのような治療効果は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーにより測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果を示唆するか、または効果を感じる）であり得る。いくつかの態様では、「治療有効量」は、関連する疾患または病気を治療する、改善する、もしくは予防する（例えば、その発症を遅らせる）のに有効な、かつ/または、例えば疾患に伴う症状を改善する、疾患を予防するもしくはその発症を遅らせる、および/または疾患の症状の重症度もしくは頻度を低下させるなどによって、検出可能な治療効果または予防効果を示すのに有効な、治療剤または組成物の量を指す。治療有効量は、通常、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで投与される。特定の治療剤の治療有効量（および/または有効な投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路に、または他の治療薬との併用に応じて、変化し得る。あるいは、またはさらに、特定の患者に対する具体的な治療有効量（および/または単位用量）は、様々な要因に依存し、例えば、治療される疾患の特定の形態；病気または病気前の重症度；使用される特定の治療剤の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および/または使用される特定の治療剤の排泄率または代謝率；治療期間；ならびに医学の分野でよく知られている同様の要因に依存し得る。本開示は、胃腸の炎症性疾患または胃腸上皮バリアの機能不全を伴う疾患などの、様々な疾患を治療するために、新規タンパク質、およびそれを含む組成物の治療有効量を利用する。投与されるタンパク質またはそれを含む組成物の治療有効量は、いくつかの態様では、IBDに伴う炎症を軽減するか、胃腸上皮バリアの完全性および/または機能を修復するであろう。
【０１０９】
本明細書で使用する用語「治療」（「治療する」または「治療すること」）は、それが特定の疾患、障害および/または状態（例えば、慢性または再発性の免疫反応および胃腸（GI）管の炎症）の1つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に軽減する、改善する、緩和する、抑制する、その発症を遅らせる、その重症度を軽減する、および/またはその発生率を低下させるという点で、望ましい効果を達成する治療レジメンに従って、治療剤（例えば、本開示のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質）を投与することを指す；いくつかの態様では、治療レジメンに従って治療剤を投与することは、望ましい効果を達成することと相関する。そのような治療は、関連する疾患、障害および/または状態の徴候を示さない対象に対する治療、および/または疾患、障害および/または状態の初期の徴候のみを示す対象に対する治療であり得る。あるいは、またはさらに、そのような治療は、関連する疾患、障害および/または状態の1つ以上の確立された徴候を示す対象に対する治療であり得る。いくつかの態様では、治療は、関連する疾患、障害および/または状態を患っていると診断された対象に対する治療であり得る。いくつかの態様では、治療は、関連する疾患、障害および/または状態の発症リスクの高まりと統計的に相関する1つ以上の感受性因子をもつことが知られている対象に対するものであり得る。
【０１１０】
「薬学的」とは、組成物、試薬、方法などが薬学的効果を発揮できること、さらには組成物が安全に対象に投与され得ることを意味する。「薬学的効果」とは、限定するものではないが、組成物、試薬または方法が、哺乳動物対象、例えばヒト、などの少なくとも1つの個体において、対象集団の少なくとも5％で、少なくとも10％で、少なくとも20％で、少なくとも30％で、少なくとも50％で、または同様の割合で、所望の生化学的、遺伝的、細胞的、生理学的、または臨床的効果を刺激できることを意味し得る。「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、または米国薬局方もしくは動物での安全な使用、特にヒトでの安全な使用に関する一般的に認定された他の薬局方に記載されていることを意味する。「薬学的に許容されるビヒクル」または「薬学的に許容される賦形剤」とは、本明細書に記載のタンパク質と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤または担体を指す。
【０１１１】
「予防する」または「予防」とは、疾患または障害に罹患するリスクの低減（すなわち、疾患にさらされているか、疾患にかかりやすい素因があるかもしれないが、まだ疾患の症状を経験または発現していない対象において、疾患の臨床症状の少なくとも1つを発症させないこと、あるいは治療を行わない場合よりも低い重症度で症状を発症させること）を指す。「予防」または「防止」は、疾患または障害の発症を遅らせることを指すこともある。
【０１１２】
本明細書に教示される治療用の薬学的組成物は、1つまたは複数の天然物を含むことができる。しかし、特定の態様では、治療用の薬学的組成物それ自体は自然界に存在しない。さらに、特定の態様では、治療用の薬学的組成物は、自然界に存在しうる個々の天然の対応物または組成物成分と比較して、著しく異なる特性を有する。すなわち、特定の態様では、本明細書に教示される薬学的組成物（治療有効量の精製タンパク質を含む）は、自然界に存在しうる該組成物の単一の個々の成分と比較して、全体として該組成物に著しく異なる特性を付与する少なくとも1つの構造的および/または機能的特性を有する。裁判所は、自然界に存在しうる個々の成分と比較して著しく異なる特性を有する、天然物を含む組成物は、法定の主題（statutory subject matter）であると判断している。かくして、教示された治療用の薬学的組成物は全体として著しく異なる特性を有する。これらの特性は、本明細書に教示されるデータおよび実施例に示される。
【０１１３】
本開示の詳細をここに記載する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料は、本開示の実施または試験に使用することができるが、例示的な方法および材料をここで説明する。本開示の他の特徴、目的および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【０１１４】
微生物叢に由来する治療用タンパク質−本開示の概説
多くの疾患および障害は、胃腸上皮細胞バリア機能または完全性の低下に関連している。こうした疾患および障害は多面的であり、数多くの方法で診断的に見つかっている。そのような疾患の1つが炎症性腸疾患（IBD）であり、その発生率および有病率は時がたつにつれて世界中の様々な地域で増加しており、世界的な疾病としてのその発生を示している（Molodecky et al., Gastroenterol 142:46-54, 2012）。IBDは、慢性または再発性の免疫反応と胃腸（GI）管の炎症を伴う状態を表す総称である。2つの最も一般的な炎症性腸疾患は潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病（CD）である。両方とも、GI免疫システムの異常な応答を特徴とする。通常、免疫細胞は感染から生体を保護している。しかし、IBDを抱えている人々では、この免疫システムが腸内の食物、細菌、その他の物質を病原体と間違えて、炎症反応が腸の内膜に発生し、慢性的な炎症を引き起こす。これが起こると、患者はIBDの症状を経験する。
【０１１５】
IBDは消化管の全体または一部の慢性炎症を伴う。通常、UCとCDのどちらにも、例えば、重度の下痢、腹痛、倦怠感、体重減少などが生じる。IBDおよび関連疾患は消耗性であり、時には生命を脅かす合併症につながる可能性がある。
【０１１６】
腸バリアの完全性に関して、腸上皮の完全性の喪失は、IBDにおいて重要な病因的役割を担っている（Maloy, Kevin J.; Powrie, Fiona, “Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease,” (2011) Nature. 474 (7351): 298-306）。腸内微生物叢の有害な変化は、腸上皮への損傷をもたらす不適切なまたは無制御の免疫反応を誘発すると仮定される。この極めて重要な腸上皮バリアの破壊は、微生物叢のさらなる浸潤を可能にし、さらなる免疫反応を次々に誘発する。したがって、IBDは、一部には、上皮バリア機能の欠陥を引き起こし得る腸内微生物叢に対する過剰な免疫反応によって推進される、多因子性の疾患（multifactorial disease）である。
【０１１７】
IBD患者の微生物叢プロファイリングは、しばしばロゼブリア属菌種（Roseburia spp）などの潜在的に有益な微生物を犠牲にして、付着侵襲性大腸菌を含めたプロテオバクテリア門（Proteobacteria）の菌種が増加する、といった明確に区別できるプロファイルを明らかにした（Machiels et al., 2014, Cut, 63:1275-1283; Patterson et al., 2017, Front Immunol, 8:1166; Shawki and McCole, 2017, Cell Mol Gastroenterol Hepatol, 3:41-50）。さらに、ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）の減少は、潰瘍性大腸炎患者のディスバイオシス（dysbiosis：細菌叢の構成異常）と結び付いていた。IBDに罹患した個体は、フィルミクテス門（Firmicutes）（すなわち、ラクノスピラ科（Lachnospiraceae））およびバクテロイデス門（Bacteroidetes）が減少するなど、共生細菌の生物多様性が30〜50％減少していることが判明した。炎症性腸疾患の原因での腸内フローラの役割のさらなる証拠は、IBDに罹患した個体が、罹患していない個体よりも、診断の2〜5年前に抗生物質を処方されていた可能性が高い、ことである。Aroniadis OC, Brandt LJ, “Fecal microbiota transplantation: past, present and future,” (2013) Curr. Opin. Gastroenterol. 29 (1) (2013): 79-84を参照されたい。
【０１１８】
保護用の細菌群集、プロバイオティクス、および細菌由来の代謝産物は、様々な臨床および前臨床研究で疾患を改善することが実証されている。例えば、糞便微生物移植（FMT）実験はIBD患者においてある程度の成功を示したが、FMTにはまだ課題が存在する（Moayyedi et al., 2015, Gastroenterology, 149:102-109 e106; Qazi et al., 2017, Gut Microbes, 8:574-588; Narula et al., 2017, Inflamm Bowel Dis, 23:1702-1709）。他の研究では、VSL＃3、ラクトバシラス属菌種（Lactobacillus spp.）、ビフィドバクテリウム属菌種（Bifidobacterium spp.）などのプロバイオティクスによる治療もまた、ヒトおよび動物モデルで有益な効果を有することが示された（Srutkova et al., 2015, PLoS One, 10:e0134050; Pan et al., 2014, Benef Microbes, 5:315-322; Huynh et al., 2009, Inflamm Bowel Dis, 15:760-768; Bibiloni et al., 2005, Am J Gastroenterol, 100:1539-1546）。さらに、細菌の産物、例えばL.ラムノサス（L. rhamnosus）GG由来のp40およびA.ムシニフィラ（A. muciniphila）由来のAmuc-1100は、それぞれ、バリア機能を促進し、IBDおよび代謝性疾患の動物モデルにおいて保護することが示された（Yan et al., 2011, J Clin Invest, 121:2242-2253; Plovier et al., Nat Med, 23:107-113）。
【０１１９】
生きている微生物集団を使用して病気を治療することは、一般的になりつつあるが、そのような方法は、投与された細菌が宿主または患者の体内で生き残り、かつ有益で治療的な方法で宿主組織と相互作用する能力にかかっている。ここに提供される別のアプローチは、宿主内で細胞機能に影響を与えて、治療効果をもたらすことができる、微生物によってコードされたタンパク質およびその変異体を特定することである。そのようなタンパク質は、例えば、実質的に単離または精製された治療用の細菌由来タンパク質を含む薬学的組成物として、または治療用タンパク質を外因性タンパク質として発現するように遺伝子操作された生きたバイオ治療薬（細菌）として投与することができる。さらに、治療用タンパク質の投与を含む治療方法は、腸（小腸、大腸、直腸）に限定されず、口腔粘膜炎などの消化管内の他の障害の治療をも含むことができる。
【０１２０】
胃腸の炎症性疾患に治療上適用し得る微生物由来のタンパク質を特定するために、健康なヒトまたはIBD（UC）と診断されたヒトの粘膜生検を分析して、これらの粘膜生検の微生物組成を調べた。健常者と患者からの細菌プロファイルの比較により、有益である（患者に対して健常者で数が多い）または有害である（患者に対して健常者で数が少ない）可能性の高い細菌が特定された。有益と特定された細菌種の中に、上記の研究と一致するロゼブリア・ホミニスがあった。次に、広範なバイオインフォマティクス解析を実施して、該細菌によってコードされるタンパク質を予測し、その後該細菌によって分泌される可能性が高いタンパク質を特定した。続いて、分泌タンパク質であると予測されたタンパク質は、上皮バリアの完全性、サイトカインの産生および/または放出、創傷治癒に対する各タンパク質の効果を研究するために、一連のインビトロアッセイを使用して特性評価された。上皮バリアの完全性を高めるように機能していると特定されたタンパク質は、その後、大腸炎のインビボマウスモデルで評価された。そのようなタンパク質の1つである本明細書で「SG-11」として特定されたタンパク質は、上皮バリアの完全性を改善するための、および上皮バリアの完全性に関連する疾患および障害を治療しかつIBDなどの炎症性胃腸疾患を治療するための、治療効果を与えるその能力を示すインビトロおよびインビボの両活性を実証した；これについては、以下で詳しく説明する。
【０１２１】
SG-11タンパク質
本明細書でSG-11と呼ばれるタンパク質は、ロゼブリア・ホミニスのゲノムに存在する768ヌクレオチド配列（SEQ ID NO:2）内にコードされている。ロゼブリア・ホミニス株の完全なゲノム配列は、GenBankアクセッション番号CP003040に見い出すことができる（該配列はその全体が参照により本明細書に組み入れられる）。ロゼブリア・ホミニス株の16S rRNA遺伝子配列は、GenBankアクセッション番号AJ270482に見い出すことができる。ロゼブリア・ホミニスのゲノム配列によってコードされる該全長タンパク質は、256アミノ酸の長さであり（SEQ ID NO:1）、ここで、残基1〜24はシグナルペプチドであると予測され、このシグナルペプチドはインビボで切断されて232アミノ酸の成熟タンパク質（SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4によりコードされる）を生成する。組換えSG-11を、N末端メチオニン（コドンATGによりコードされる）を含むように発現させると、233アミノ酸の成熟タンパク質（SEQ ID NO:7）が生成される。
【０１２２】
実施例、例えば実施例1に詳述されるように、SG-11は、市販されて日常的に使用される様々な発現ベクターで組換えにより発現させた。例えば、SG-11（SEQ ID NO:3を含むタンパク質）は、発現および精製後に切断されるGSTタグおよびプロテアーゼ部位を含む目的のタンパク質を発現するpGEX発現ベクター、N末端のFLAGタグを付加するpET-28発現ベクター、およびN末端タグを持たないSEQ ID NO:7からなるSG-11タンパク質の発現に用いたpD451発現ベクターを使用して発現させた。これらのタンパク質を用いて繰り返し行った実験から、異なるタンパク質発現システムとDNA構築物の使用から生じるマイナーなN末端および/またはC末端の変化は、インビボおよびインビトロアッセイで同等の機能活性を保持していたことが明らかにされた。特に明記しない限り、本明細書中の用語「SG-11」は、本明細書にSEQ ID NO:3として示されるアミノ酸配列、およびSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むタンパク質のそのような変異体（SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7を含むが、これらに限定されない）を指すと理解される。SG-11変異体は、アミノ酸残基の変化（置換、挿入、欠失）だけでなく、融合構築物および翻訳後修飾（リン酸化、グリコシル化など）のような修飾を含むことができる。SG-11タンパク質およびそれをコードする核酸のいくつかの具体例を以下の表1に示す。
【０１２３】
（表１）
2020516615.tif 000002
2020516615.tif 000003
2020516615.tif 000004
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【０１２４】
疾患における上皮バリア機能
近年の研究により、IBDの病因における遺伝的要因と環境的要因の両方の主要な役割が特定された。Markus Neurath, “Cytokines in Inflammatory Bowel Disease,” Nature Reviews Immunology, Vol. 14., 329-342 (2014)。こうしたIBDリスク因子の組み合わせは、上皮バリア機能に有害な変化を引き起こし、それにより管腔抗原（例えば、共生微生物叢からの細菌抗原）の腸壁への移行を可能にするようである。同文献。続いて、そのような環境的誘因に対する異常かつ過剰な反応、例えば炎症性サイトカイン放出の増加が、遺伝的に感受性の高い宿主において無症状のまたは急性の粘膜炎症を引き起こす。同文献。したがって、IBDにおける適切な上皮バリア機能の重要性は明白であり、急性の腸炎症を解消できない対象者では、粘膜免疫系の無制御の活性化によって誘発される慢性的な腸炎が発症する。特に、粘膜の免疫細胞、例えばマクロファージ、T細胞、および自然リンパ球（ILC）のサブセットは、例えば胃腸管の慢性炎症を促進し得るサイトカインを産生することによって、共生微生物叢からの微生物の産物または抗原に応答するようである。その結果、患者に適切な上皮バリア機能を回復させることは、IBDを解消する上で極めて重要であり得る。
【０１２５】
SG-11の治療活性は、一部には、上皮バリア機能に対するその有益な効果によってインビトロおよびインビボの両方で確認された。実施例2に示されるように、SG-11は、上皮バリアの完全性を高めるのに活性であり、これはインビトロ経上皮電気抵抗（TEER）アッセイで示される。TEERアッセイは、上皮細胞層の構造的および機能的完全性に対する効果を測定するための周知の方法である（Srinivasan et al., 2015, J Lab Autom, 20:107-126; Beduneau et al., 2014, Eur J Pharm Biopharm, 87:290-298; Zolotarevsky et al., 2002, Gastroenterology, 123:163-172; Dewi, et al. (2004) J. Virol. Methods. 121:171-180;およびMandic, et al. (2004) Clin. Exp. Metast. 21:699-704）。本明細書で実施され説明されるアッセイは、腸上皮の構造的および機能的要素をより正確にモデル化するために、腸細胞と杯細胞で構成された上皮単層からなる。細胞間の密着結合が形成されるまで該細胞を培養して、経上皮電気抵抗の測定によりバリアの機能的能力を評価する。熱死滅大腸菌などの傷害を加えると、上皮層全体の電気抵抗が減少する。TEERアッセイに有用な対照試薬には、スタウロスポリンおよびミオシン軽鎖キナーゼ阻害剤が含まれる。スタウロスポリンは、ストレプトマイセス・スタウロスポレウス（Streptomyces staurosporeus）に由来する広範囲のキナーゼ阻害剤であり、アポトーシスを誘導する。この試薬は、ギャップ結合の約98％を破壊して、TEERアッセイで電気抵抗を減少させる。ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）は、炎症性サイトカインによって誘導されるシグナル伝達カスケードの末端エフェクターであり、結合部周囲のアクトミオシンリングの収縮を引き起こし、結果的にギャップ結合の分離をもたらす。MLCKを阻害することにより、密着結合の破壊が防止される。TEERアッセイにおけるMLCK阻害剤は、TEERアッセイでの電気抵抗の減少を少なくしたり防いだりするはずである。
【０１２６】
いくつかの態様では、本明細書に記載のSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、インビトロTEERアッセイで評価される、上皮バリア機能の完全性を高めるその能力により特徴付けることができる。SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、該タンパク質の非存在下で実施されるTEERアッセイと比較して、TEERアッセイで電気抵抗を少なくとも約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％増加させることができる。
【０１２７】
さらに、実施例6には、SG-11タンパク質が、腸または粘膜の上皮バリアなどの上皮バリアの維持または修復において役割を果たす働きである、上皮創傷治癒を増強または促進できることが示される。
【０１２８】
インビトロでバリア機能の完全性を修復するSG-11の効果を考慮して、IBDのげっ歯類モデルで損傷を軽減するSG-11の能力についてインビボで分析した。実施例7および8（SG-11）および実施例16（SG-11変異体）には、IBDに対する剤の研究に広く受け入れられているモデルである、DSS（デキストラン硫酸ナトリウム）動物モデルを用いて実施された研究が記載されている（Chassaign et al., 2014, Curr Protoc Imunol, 104:Unit-15.25; Kiesler et al., 2015, Cell Mol Gastroenterol Hepatol）。DSSは硫酸化された多糖であり、結腸上皮に対して直接的に毒性を示し、ギャップ結合の破壊によるバリア機能の低下につながる上皮細胞の損傷を引き起こす。これらの実験では、マウスに大腸炎を誘発する前（実施例7）または誘発した後（実施例8）に、マウスをSG-11で治療した。陽性対照として、グルカゴン様ペプチド2（GLP2）の安定した類似体であるGly2-GLP2をも用いてマウスを治療した。Gly2-GLP2は、上皮細胞の増殖を促進し、かつ実験マウス大腸炎モデルで結腸損傷を軽減することが知られている。DSS研究の結果から、SG-11タンパク質は、IBD治療薬の臨床効果の重要な指標である、DSSモデルでの体重減少を抑えるのに有効であったことが示される。SG-11による治療はまた、肉眼的病変および腸の病理組織学的解析のスコアを低下させた。
【０１２９】
SG-11による治療は、実施例7では、4Kda-FITC腸透過性リードアウトを改善し、かつLPS結合タンパク質（LBP−LPS曝露のマーカー）の血清レベルを低下させたが、実施例8では、SG-11またはGly2-GLP2による治療に対する有意な効果が観察されなかったことに留意されたい。通常の飲料水との交換およびSG-11またはGly2-GLP2による治療に先立って、実施例8の動物をDSSで7日間処理したことを考えると、これは驚くことではない。この事前のDSSへの曝露は、腸上皮への損傷、破壊された上皮バリアを横切るLPSの移行、およびLBP分泌の誘導をもたらす。しかし、4KDa-FITCデキストラン測定に基づくと、DSSを通常の飲料水と交換した後、3〜4日以内に上皮バリアの修復が速やかに起こるようである（データは示さず；図12）。したがって、測定時（6日間の治療後）に、未治療動物に対する治療動物での4KDa-FITC透過性リードアウトの改善を検出することは困難である。さらに、血清中のLBPのレベルは、治療的処置の前に長期間DSSに曝露された動物ではバリア機能の修復と無関係であり得る（実施例8）。例えば、DSS曝露中にLPSの移行により活性化された肝細胞は、大量のLPBを産生して分泌する。したがって、理論に拘束されるものではないが、短期間の研究では、肝細胞の不活性化およびDSS処理動物の血清からのLBPのクリアランスのための時間が十分でない可能性がある。それゆえに、研究を継続して、より後の時点で血清LBPを測定することにより、血清LBPレベルの低下が示されるであろうが、LBPが血清からクリアランスされる前に治療動物と未治療動物の両方でバリア機能が回復する場合には、血清LBPの低下は両動物で似通っていると考えられる。
【０１３０】
SG-11の変異体
SG-11の治療的価値および疾患治療へのその使用を考慮して、このタンパク質をさらに特性評価して、該タンパク質の薬学的製剤化および長期保存を最適化するやり方でその一次構造を変えるように配列を改変した。
【０１３１】
実施例9に記載されるように、SEQ ID NO:7を使用して、GenBank非冗長タンパク質データベースのBLAST検索を実行し、SG-11の機能的ホモログであるかまたはSG-11と同様の機能（複数可）を備えた、類似のアミノ酸配列を有するタンパク質を同定した。3つのそのようなタンパク質が同定され、それぞれの予測された成熟配列（N末端シグナルペプチドを含まない）をSEQ ID NO:7とアライメントさせて、比較的保存された該タンパク質内の領域および個々の位置を特定した。これらの3つのタンパク質は、SEQ ID NO:21 (GenBankアクセッション番号WP_006857001に由来)、SEQ ID NO:22 (GenBankアクセッション番号WP_075679733に由来)、およびSEQ ID NO:23 (GenBankアクセッション番号WP_055301040に由来)として本明細書に開示される（図17）。したがって、本明細書には、これらの3つのタンパク質の1つまたはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物、ならびに治療を必要とする対象に、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23のいずれか1つまたはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物を投与することを含む、バリア機能障害を伴う疾患および/または胃腸疾患もしくは障害を治療する方法が提供される。
【０１３２】
SG-11の変異体であるSG-11V5のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列の具体的な例を以下の表2に示す。
【０１３３】
（表２）
2020516615.tif 000006
【０１３４】
薬学的製剤および臨床用途で使用するためのSG-11タンパク質の安定性を高めるために、精製したSG-11タンパク質の翻訳後修飾（PTM）を特定して特性解析するための研究を実施した。これらの実験を実施例10〜11に記載する。そのような解析から、SG-11タンパク質は少なくともメチオニンの酸化およびアスパラギンの脱アミドのPTMを受けることがあるとわかった。さらに、実施例12に記載した実験では、SG-11のシステインは、精製された活性タンパク質の機能的コンフォメーションでジスルフィド結合を形成しそうになく、SG-11の遊離スルフヒドリル基は精製タンパク質を含む溶液中で凝集を引き起こす可能性があることが示唆される。これらの安定性研究に基づいて、多重配列アライメント（図17）で見られたSG-11の残基の保存された性質にもかかわらず、（SEQ ID NO:7を基準にして）位置147および/または151のシステインを異なるアミノ酸で置換できるかどうかを試験することにした。また、位置53および83の保存されたアスパラギンの置換も検討された。具体的な例では、SEQ ID NO:7のSG-11配列は、C147VおよびC151Sの置換を導入してSEQ ID NO:11（SG-11V1)を生成するように改変される。C147VおよびC151Sの置換は、提供されたSG-11変異体のSG-11V2（SEQ ID NO:13；G84D、C147V、C151Sを含む)、SG-11V3（SEQ ID NO:15；N83S、C147V、C151Sを含む)、SG-11V4（SEQ ID NO:17；N53S、G84D、C147V、C151Sを含む)、およびSG-11V5（SEQ ID NO:19；N53S、N83S、C147V、C151Sを含む)にも存在する。
【０１３５】
実施例13は、SG-11（SEQ ID NO:7）と比較して、SG-11V5ではPTM（メチオニンの酸化とアスパラギンの脱アミド）が有意に減少することを示す。この減少は異なる温度でも、異なる保存バッファー中でも観察された。実施例14は、システイン置換を含むSG-11変異体（SG-11V5；SEQ ID NO:19）が保存バッファー中で該タンパク質の凝集に影響を及ぼすかどうかを判定するために実施した実験を記載する。その結果から、異なる保存バッファー中で試験した場合、SG-11V5変異体はSG-11（SEQ ID NO：7）と比較して凝集が少ないことが示される。
【０１３６】
注目すべきことに、SG-11V5を生成するために置換されたアミノ酸はSG-11タンパク質の比較的保存された領域に存在するにもかかわらず、これらの4つの残基を、機能的活性を失うことなく、置換することが可能であった（実施例15および16、以下でより詳細に説明する）。
【０１３７】
本明細書に記載の実験データおよび解析に基づいて、SG-11（例えば、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:5）の想定された変異体は、SEQ ID NO:7のアミノ酸N53、N83、G84、C147およびC151のいずれか1つまたは複数を置換するようにデザインされた（示された置換はSEQ ID NO:7を基準にした残基位置である）。この変異体の具体例は、以下の表3にSEQ ID NO:33として提供され、ここで、位置53、83、84、147および151のそれぞれの残基はXとして示され、Xは、これらの5つの残基のうちの1つ以上がそれぞれ可能性のある20種のアミノ酸のいずれかに置換され得ることを示す。いくつかの態様では、該タンパク質はSEQ ID NO:33のアミノ酸配列を含む。他の態様では、X53はN、S、T、M、R、Qであり、かつ/またはX83はN、RもしくはKであり、かつ/またはX84はGもしくはAであり、かつ/またはX147はC、S、T、M、V、L、AもしくはGであり、かつ/またはX151はC、S、T、M、V、L、AもしくはGである。さらに他の態様では、X53はN、SもしくはKであり、かつ/またはX83はNもしくはRであり、かつ/またはX84はGもしくはAであり、かつ/またはX147はC、V、LもしくはAであり、かつ/またはX151はC、S、V、LもしくはAである。
【０１３８】
いくつかの態様では、前記タンパク質はSEQ ID NO:34のアミノ酸配列を含み、ここで、X53はN以外の任意のアミノ酸であり、X83はN以外の任意のアミノ酸であり、X84はG以外の任意のアミノ酸であり、X147はC以外の任意のアミノ酸であり、かつ/またはX151はC以外の任意のアミノ酸である。
【０１３９】
（表３）
2020516615.tif 000007
【０１４０】
別の例では、教示されたタンパク質の特定のアミノ酸は、例えば、基質分子、受容体、抗体の抗原結合領域といった結合部位などの構造との相互作用的な結合能力の大幅な低下なしに、タンパク質構造内で他のアミノ酸に置換することができる。したがって、これらのタンパク質は、開示されたタンパク質（例えば、SEQ ID NO:3またはその変異体を含む）の生物学的機能等価物である。いわゆる「保存的」変化は、その構造変化が計画された機能を果たすタンパク質の能力に影響を与えるものではないため、タンパク質の生物活性を破壊しない。したがって、本発明者らは、本開示の目的を依然として満たしながら、本明細書に開示された遺伝子およびタンパク質の配列に様々な変更を加えることができると考えている。
【０１４１】
また、SG-11の変異体も本明細書に提供される：SEQ ID NO:11（C147V、C151S；「SG11-V1」)、SEQ ID NO:13（G84D、C147V、C151S；「SG11-V2」)、SEQ ID NO:15（N83S、C147V、C151S；「SG11-V3」)、SEQ ID NO:17（N53S、G84D、C147V、C151S；「SG11-V4」)、およびSEQ ID NO:19（N53S、N83S、C147V、C151S；「SG11-V5」)。
【０１４２】
重要なことに、SEQ ID NO:19を含むSG-11変異体タンパク質は、TEERアッセイ（実施例15）およびインビボDSSマウスモデル（実施例16）の両方においてその活性を維持した；これは、SG-11の変異体が野生型SG-11と同等の治療機能を維持できることを示している。具体的には、インビトロTEER実験とインビボDSSモデル実験を実施したが、その際SG-11（SEQ ID NO:7）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）を並行して使用した。実施例15では、SG-11とSG-11V5がインビトロでTEERを低下させる本質的に同じ機能的能力を有することが示される。実施例7および8（DSSモデルマウスをDSS処理の前または後にSG-11で治療した）に記載されるように、SG-11とSG-11変異体のインビボ効力を比較するために実施例16を実施した。実施例16では、DSS処理前（実施例16Aに記載）およびDSS処理後（実施例16Bに記載）に該タンパク質をマウスに投与することも比較した。SG-11およびSG-11変異体は、体重減少（図23Aおよび23B）ならびに肉眼的病変の臨床スコア（図24）を低減させた。再度、SG-11は腸透過性および血清LBPレベルを低下させたが、SG-11V5は実施例16Aにおいて腸透過性および血清LBPレベルを用量依存的（図21Aおよび図22A）に低下させることが示される。実施例7および8で観察された結果と同様に、SG-11およびSG-11変異体タンパク質は、実施例16B（ここでは、DSSによる長期攻撃後に治療用タンパク質が投与され、結果が限られた期間にわたって観察された）において腸透過性または血清LBPレベルを低下させなかった。上述したように、研究の継続によって透過性と血清LBPレベルの両方の低下が示されると考えられる。
【０１４３】
これらのデータを考慮して、本明細書では、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含むタンパク質またはその断片と少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％同一である治療用タンパク質が提供される。別の態様では、治療用タンパク質は、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:7またはその断片に対して少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、治療用タンパク質は、SEQ ID NO:19またはSEQ ID NO:5と同一のアミノ酸配列を含む。あるいは、治療用タンパク質は、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の変異体であるものであり得、その場合、治療用タンパク質はSEQ ID NO:7に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、治療用変異体タンパク質は、SEQ ID NO:3の天然に存在しない変異体を含む。別の言い方をすれば、治療用タンパク質は、SEQ ID NO:3に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個の天然に存在しないアミノ酸置換を含む。いくつかの態様では、治療用タンパク質は、SEQ ID NO:7の残基2から残基233までの配列と同一のアミノ酸配列を含まない。
【０１４４】
いくつかの態様では、SG-11タンパク質は、1つまたは複数のアミノ酸の挿入または欠失により改変または変化させることができる。挿入は、該タンパク質のN末端および/またはC末端への1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または1〜10、1〜20、1〜30、1〜40もしくは1〜50）のアミノ酸の付加であり得、かつ/またはN末端アミノ酸とC末端アミノ酸の間にある位置での1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または1〜10、1〜20、1〜30、1〜40もしくは1〜50）のアミノ酸の挿入であり得る。同様に、1つまたは複数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9または1〜10、1〜20、1〜30、1〜40もしくは1〜50）のアミノ酸の欠失が、N末端とC末端のいずれかに、および内部に存在し得る。
【０１４５】
いくつかの態様では、SEQ ID NO:3に対して少なくとも1つの天然に存在しないアミノ酸置換を含む改変型または変異体タンパク質が提供される。他の態様では、変異体タンパク質は、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7に対して1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸置換を含む。さらなる態様では、改変型タンパク質は、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11（SG-11V1)、SEQ ID NO:13（SG-11V2)、SEQ ID NO:15（SG-11V3)、SEQ ID NO:17（SG-11V4)、またはSEQ ID NO:19（SG-11V5)に示されるアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
いくつかの態様では、本開示による治療用タンパク質は、例えばSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7に示される全長成熟タンパク質の1つ以上の活性をも保持する変異体タンパク質（例えば、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、またはSEQ ID NO:19）のいずれか1つを包含する。
【０１４７】
また、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列も想定される。単一のポリペプチド配列をコードする2つのポリヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重の性質のために比較的低い配列同一性を共有できることは、当業者に周知である。例えば、233アミノ酸の配列をコードするポリヌクレオチドのあらゆるコドンがその3番目の位置に少なくとも1つの置換を含んでいた場合、2つのポリヌクレオチド間の配列同一性は約67％であると計算される。本開示のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:19と少なくとも70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、または100％同一であるタンパク質をコードする配列を含む。したがって、いくつかの態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8と少なくとも67％同一であるか、SEQ ID NO:20またはその断片と約67％〜100％、70％〜100％、75％〜100％、80％〜100％、90％〜100％または95％〜100％同一である配列を含む。いくつかの態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18もしくはSEQ ID NO:20、またはその断片の配列を含む。
【０１４８】
いくつかの態様では、教示されたタンパク質は、SEQ ID NO:3を含むまたはそれからなるタンパク質と比較して、著しく異なる構造的および/または機能的特性を有する。
【０１４９】
本明細書で使用する用語「SG-11変異体」は、例えば、SEQ ID NO:3の配列を含むタンパク質と同一または同一でなく、かつPTMまたは第2の作用物質（例：タンパク質またはペプチド）への融合もしくは連結などによってさらに改変された、SG-11タンパク質を含むことができる。
【０１５０】
タンパク質のPTMはインビボで起こり、官能基もしくはタンパク質の共有結合的付加、調節サブユニットのタンパク質分解による切断、またはタンパク質全体の分解により、プロテオームの機能的多様性を高めることができる。本開示に従って調製され単離されたタンパク質は、インビボまたはインビトロで1つまたは複数のPTMを受けることができる。修飾のタイプは、該タンパク質が発現している宿主細胞に依存し、限定するものではないが、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、ニトロシル化（例：S-ニトロシル化）、メチル化、アセチル化（例：N-アセチル化）、脂質付加（ミリストイル化、N-ミリストイル化、S-パルミトイル化、ファルネシル化、S-プレニル化、S-パルミトイル化）およびタンパク質分解を含み、これらは正常細胞生物学および病因のほぼ全ての面に影響を与える可能性がある。本明細書に開示される単離および/または精製されたSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、上記の翻訳後修飾の1つまたは複数を含み得る。
【０１５１】
SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、N末端および/またはC末端ドメインがペプチド結合を介して第2のタンパク質に融合された融合タンパク質であり得る。当業者に周知の一般的に使用される融合パートナーには、ヒト血清アルブミンとその結晶化可能な断片、またはIgGの定常ドメインFcが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、システイン残基を含む第2のタンパク質またはペプチドに、ジスルフィド結合を介して連結される。
【０１５２】
前述のように、本明細書に記載のタンパク質の構造に修飾および/または変更（例えば、置換、挿入、欠失）を加えることが可能である。したがって、本開示は、これらのタンパク質およびそれらをコードする核酸の配列の変異を企図しており、それにもかかわらず、それらは様々なインビトロおよびインビボアッセイならびに本開示の治療面で評価される機能活性に関して相当の活性を保持することができる。機能等価物に関して、当業者にはよく理解されるように、許容レベルの等価の生物学的活性を有する分子を保持しながら、該分子の特定の部分に加えることができる変更の数には制限があるという概念は、「生物学的機能等価性」のタンパク質および/またはポリヌクレオチドの定義に内在している。
【０１５３】
また、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、対象に投与したとき、疾患関連の体重減少を軽減し、臨床病理スコアを改善し、かつ/または対象における結腸短縮を最小限にすることができるものであると考えられる。いくつかの態様では、対象は、遺伝的もしくは臨床的に誘発された炎症性障害または上皮バリア機能不全を有する哺乳動物である。あるいは、動物は上皮バリア機能の低下または腸の炎症性障害を伴う特発性胃腸障害を有する。他の態様では、哺乳動物はヒト、非ヒト霊長類、またはげっ歯類である。げっ歯類はマウスまたはラットであり得る。
【０１５４】
いくつかの態様では、本開示によるSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、インビトロアッセイまたは該タンパク質を投与された対象においてサイトカインの産生および/または分泌を調節することができるものである。いくつかの態様では、サイトカインの分泌はインビトロで減少する。インビトロアッセイまたは該タンパク質を投与された対象において産生および/または分泌されたサイトカインのレベルは、該対象の血液、血清、および/または血漿中で測定される可能性が高い。該タンパク質の投与は、炎症性サイトカイン、例えば、TNF-α、IL-17、IL-1β、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-25、IL-33、IL-8、MCP-1、MIP-3α、CXCL1、およびIL-23の1つまたは複数、の血清レベルを低下させることができる。あるいは、サイトカインは抗炎症性のサイトカインであり、その場合、該タンパク質の投与は、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α、TGF-βなどの抗炎症性サイトカインの血清レベルを増加させる。
【０１５５】
いくつかの態様では、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）などの対象に投与されたとき、胃腸の炎症を軽減する機能的能力がある。他の態様では、該タンパク質は、対象に投与された場合、炎症性（すなわち炎症誘発性）サイトカインを減少させる機能的能力を有する。さらに他の態様では、該タンパク質は、対象に投与されたとき、TNF-αおよび/またはIL-23を減少させることができる。さらに他の態様では、該タンパク質は、対象に投与されたとき、抗炎症性サイトカインを増加させる機能的能力がある。いくつかの局面では、本開示のタンパク質は、対象に投与されたとき、IL-10を増加させることができる。
【０１５６】
本開示によるSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、対象（例えば、げっ歯類、非ヒト霊長類、またはヒト）に投与されたとき、胃腸の上皮細胞バリア機能を改善する、疾患関連の体重減少を軽減する、臨床スコアを改善する、結腸の長さおよび/または結腸の重さ対長さリードアウトを改善する、ムチン遺伝子発現（例：muc2発現）を誘導または増加する、胃腸（例えば、小腸、大腸、口腔および/または食道）の粘膜バリアの構造的完全性および/または機能性を高める、および/または胃腸管の炎症を軽減することができるものである。
【０１５７】
いくつかの態様では、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7に対する前記アミノ酸の置換、挿入および/または欠失から生じるSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:19のタンパク質と実質的に同じレベルの機能的活性を維持する（例えば、熱死滅大腸菌などによって上皮細胞層が破壊されたTEERアッセイで電気抵抗を増加させることができる）。変異体タンパク質は、限定するものではないが、胃腸（口腔、食道、腸を含む）粘膜の炎症、腸上皮細胞のギャップ結合の完全性の損傷を含めて、炎症性疾患および/またはバリア機能障害を含むがこれらに限定されない、様々な疾患を治療または予防するための治療薬として有用であり得る。いくつかの態様では、改変されたタンパク質は、炎症性疾患および/またはバリア機能障害を患っているか、またはその素因がある個体に投与されたとき、1つまたは複数の以下の効果を有する：例えば炎症により誘発されたバリア破壊後の、上皮バリアの完全性の改善；1つまたは複数の免疫細胞による少なくとも1つの炎症性サイトカイン（例えば、TNF-αおよび/またはIL-23）の産生の抑制；上皮細胞におけるムチン産生の誘導；および/または上皮創傷治癒の改善。さらに、改変型または変異体SG-11タンパク質は、以下のような、しかしそれらに限定されない障害または疾患の治療または予防に使用することができる：炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、短腸症候群、GI粘膜炎、口腔粘膜炎、化学療法誘発性粘膜炎、放射線誘発性粘膜炎、壊死性腸炎、回腸嚢炎、代謝性疾患、セリアック病、炎症性腸症候群、または化学療法関連脂肪性肝炎（CASH）。
【０１５８】
例えば実施例6で、実証されるように、SG-11タンパク質は上皮創傷治癒を促進することができる。したがって、本明細書では、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列またはその変異体もしくは断片を含む治療用タンパク質が提供され、該タンパク質はインビトロアッセイで創傷治癒を高めることができる。
【０１５９】
治療方法
本明細書に記載のSG-11タンパク質は、その変異体（例えば、アミノ酸の置換、欠失、挿入）、修飾体（例えば、グリコシル化、アセチル化）、SG-11断片およびそれらの融合体を含めて、胃腸管内の炎症および/または胃腸管内の上皮バリア機能不全に関連する障害があると診断されたまたは該障害を患っている対象の治療に使用することが企図される。
【０１６０】
本明細書では、本開示に記載のSG-11タンパク質またはその断片もしくは変異体を含有する薬学的組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象の治療方法が提供される。該対象は、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、小児UC、クローン病、小児クローン病、短腸症候群、GI粘膜炎、口腔粘膜炎、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸）および/または直腸の粘膜炎、化学療法誘発性粘膜炎、放射線誘発性粘膜炎、壊死性腸炎、回腸嚢炎、代謝性疾患、セリアック病、過敏性腸症候群、または化学療法関連脂肪性肝炎（CASH）であると診断されたものであり得る。本明細書に記載のSG-11薬学的組成物の投与は、創傷治癒の用途にも有用であり得る。
【０１６１】
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患（IBD）には、古典的には、潰瘍性大腸炎（UC）とクローン病（CD）が含まれる。炎症性腸疾患の病因は不明である。遺伝的素因が示唆されており、また、細菌、ウイルス、おそらく食事性抗原を含めて、多くの環境要因が進行する腸の炎症カスケードの引き金となり得る。同上。IBDは重度の下痢、疼痛、倦怠感、および体重減少を引き起こす可能性がある。IBDは消耗性であり、時には生命にかかわる合併症につながる。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の治療方法は、上記の症状のいずれか1つ以上を軽減、予防または排除するのに有効であり、この方法は、それを必要とする患者に、治療有効量の、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を含有する薬学的組成物を投与することを含む。いくつかの態様では、この治療方法は寛解をもたらす。
【０１６２】
潰瘍性大腸炎
潰瘍性大腸炎は、大腸（結腸）および直腸の最も内側のライニングに、長期にわたる炎症と痛み（潰瘍）を引き起こす炎症性腸疾患である。
【０１６３】
潰瘍性大腸炎は通常、多くの患者では結腸全体を含むように、直腸から近位に広がる、浅い連続した炎症を呈する。瘻孔、裂傷、膿瘍および小腸の病変は存在しない。限局性疾患（例えば、直腸炎）の患者は通常、軽度であるが頻繁に再発する症状を示し、一方、全大腸炎の患者は、一般的に重度の症状を示し、しばしば入院が必要である。Botoman et al., “Management of Inflammatory Bowel Disease,” Am. Fam. Physician, Vol. 57(1):57-68 (Jan 01, 1998)（内部の引用文は省略）。したがって、潰瘍性大腸炎は、大腸（結腸）および直腸の最も内側のライニングに長期にわたる炎症と痛み（潰瘍）を引き起こすIBDである。
【０１６４】
クローン病
潰瘍性大腸炎とは異なり、クローン病は口から肛門までの腸管全体を巻き込んで、不連続な局所的潰瘍形成、瘻孔形成、および肛門周囲の病変を伴うことがある。回腸末端部は一般に最も影響を受け、通常、様々な程度の結腸病変を伴う。一部の患者には裂傷および瘻孔形成を伴う肛門周囲疾患がある。クローン病患者の2〜3％のみが上部胃腸管の臨床的に重大な病変を有する。Botoman et al., “Management of Inflammatory Bowel Disease,” Am. Fam. Physician, Vol. 57(1):57-68 (Jan 01, 1998)（内部の引用文は省略）。したがって、クローン病は消化管のライニングの炎症を引き起こすIBDである。クローン病では、炎症が罹患組織の奥深くまで広がることが多い。そうした炎症は消化管の様々な領域、すなわち大腸、小腸またはその両方を巻き込むことがある。膠原線維性大腸炎とリンパ球浸潤大腸炎も炎症性腸疾患と考えられるが、通常は、古典的な炎症性腸疾患とは別の疾患とみなされる。
【０１６５】
炎症性腸疾患の臨床パラメータ
先に述べたように、炎症性腸疾患には潰瘍性大腸炎とクローン病が含まれる。これらの疾患を治療する際に投与された本明細書に記載のタンパク質の有効性を評価するために利用できる多数のスコアおよび臨床マーカーが存在しており、当業者に公知である。
【０１６６】
IBDの患者を評価するには、2つの一般的なアプローチがある。1つ目は粘膜の目視検査を含み、IBDは胃腸管の炎症と潰瘍の出現によって立証されるという事実を考慮して、粘膜損傷の兆候の観察によるものである。粘膜の評価を可能にする手法はどれも使用することができる。例としては、バリウム注腸、X線、および内視鏡検査が挙げられる。内視鏡検査は、食道と胃と十二指腸（食道胃十二指腸鏡検査）、小腸（小腸鏡検査）、または大腸/結腸（結腸鏡検査、S状結腸鏡検査）の検査であり得る。これらの技術を使用すると、炎症、潰瘍、およびポリープなどの異常な増殖の領域が特定される。
【０１６７】
胃腸管のこの目視検査に基づくスコアリングシステムはIBDの状態および重症度を判定するために存在しており、また、これらのスコアリングシステムは、患者が異なる医療専門家によって評価される可能性があるにもかかわらず、これらの疾患の診断およびモニタリングにおいて、ならびに臨床研究評価において、様々な患者の均一評価が確実に行われるようにすることを目的としている。UCの目視検査に基づく評価の例は、Daperno M et al (J Crohns Colitis. 2011 5:484-98)において考察され、比較されている。
【０１６８】
臨床スコアリングシステムも同じ目的で存在している。内視鏡検査または粘膜の他の検査に関する所見がこれらの臨床スコアリングシステムに組込まれるが、これらのスコアリングシステムには、排便回数、直腸出血、医師の全般評価などの症状に基づくデータも組込まれる。IBDはクオリティ・オブ・ライフに影響する様々な症状を有するため、これらのスコアリングシステムのいくつかでは、症状の定量化だけでなくクオリティ・オブ・ライフへの影響の定量的評価も考慮されている。
【０１６９】
UCのスコアリングシステムの一例はMayoスコアリングシステム（Schroeder et al., N Eng J Med,1987, 317:1625-1629）であるが、それほど一般的には使用されていない他のスコアリングシステムも存在しており、以下が含まれる：潰瘍性大腸炎の内視鏡的重症度指数（Ulcerative Colitis Endoscopic Index of Severity：UCEIS）スコア（Travis et al, 2012, Gut, 61:535-542）；Baronスコア（Baron et al., 1964, BMJ, 1:89）；潰瘍性大腸炎の大腸内視鏡的重症度指数（Ulcerative Colitis Colonoscopic Index of Severity：UCCIS）（Thia et al., 2011, Inflamm Bowel Dis, 17:1757-1764）；Rachmilewitz内視鏡指数（Rachmilewitz, 1989, BMJ, 298:82-86）；Sutherland指数（潰瘍性大腸炎活動指数（UC Disease Activity Index：UCDAI）スコアリングシステムとしても知られる；Sutherland et al., 1987, Gastroenterology, 92:1994-1998）；Mattsスコア（Matts, 1961, QJM, 30:393-407）；およびBlackstone指数（Blackstone, 1984, Inflammatory bowel disease. In: Blackstone MO (編) Endoscopic interpretation: normal and pathologic appearances of the gastrointestinal tract, 1984, pp. 464-494）。レビューについては、Paine, 2014, Gastroenterol Rep 2:161-168を参照されたい。したがって、本明細書では、UCと診断されかつUCに罹患している対象を治療するための方法も企図されており、この方法では、治療は、本明細書に記載のSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を投与することを含み、その治療は、UCEISスコア、Baronスコア、UCCISスコア、Rachmilewitz内視鏡指数、Sutherland指数、および/またはBlackstone指数の測定により判定されるような、UC病状の軽減をもたらす。
【０１７０】
CDのスコアリングシステムの一例は、クローン病活動指数（Crohn's Disease Activity Index：CDAI）（Sands B et al 2004, N Engl J Med 350 (9): 876-85）である；ほとんどの主要な研究は、応答または疾患の寛解を定義するためにCDAIを採用している。CDAIスコアの計算には、以下の評価が含まれる：7日間にわたる液体便の数、7日間にわたる腹痛の事例と重症度、7日間にわたる全般的な健康状態、腸管外合併症（例えば、関節炎/関節痛、虹彩炎/ブドウ膜炎、結節性紅斑、壊疽性膿皮症、アフタ性口内炎、肛門裂傷/瘻孔/膿瘍、および/または37.8℃を超える発熱）、7日間にわたる抗下痢薬の使用、腹部腫瘤の存在、ヘマトクリット、および理想体重/観測体重の比または標準体重からのパーセント偏差としての体重。CDAIスコアに基づいて、CDは無症候性寛解（0〜149ポイント）、軽度から中等度の活動性CD（150〜220ポイント）、中等度から重度の活動性CD（221〜450ポイント）、または重度の活動性劇症疾患（451〜1000ポイント）のいずれかに分類される。いくつかの態様では、CDと診断された患者に治療有効量のSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を投与することを含む治療方法は、CDの診断スコアの低下をもたらす。例えば、該スコアは、診断を、重度の活動性から軽度もしくは中等度の活動性に、または無症候性寛解に変えることができる。
【０１７１】
Harvey-Bradshaw指数は、臨床パラメータのみで構成されるCDAIのより単純なバージョンである（Harvey et al., 1980, Lancet 1(8178):1134-1135）。炎症性腸疾患のアンケート（Inflammatory Bowel Disease Questionnaire：IBDQ）ではクオリティ・オブ・ライフへの影響も取り上げられる（Irvine et al., 1994, Gastroenterology 106: 287-296）。代替方法には、CDEISおよびSES CDがさらに含まれる（例えば、Levesque, et al. (2015) Gastroentrol. 148:37 57を参照されたい）。
【０１７２】
いくつかの態様では、IBD、例えばUC、を治療する方法が提供され、その治療はMayoスコアを低減させるのに有効である。Mayoスコアは、UCの重症度を評価するために使用される内視鏡スケールと臨床スケールを組み合わせたもので、1〜12のスケールを有する。Mayoスコアは、排便回数、直腸出血、軟性直腸S状結腸鏡検査または大腸内視鏡検査の所見、および医師の全般評価のサブスコアから成っている（Paine, 2014, Gastroenterol Rep 2:161-168）。直腸出血に関して、血液の筋が半分以下の便に見られる場合は1ポイントが割り当てられ、血液がほとんどの便に見られる場合は2ポイントが割り当てられ、純粋な血液が通過した場合は3ポイントが割り当てられる。排便回数に関して、通常の1日1回の排便数には0ポイントが割り当てられ、通常よりも1回または2回多い排便には1ポイントが割り当てられ、通常よりも3回または4回多い排便には2ポイントが割り当てられ、通常よりも5回またはそれ以上多い排便には3ポイントが割り当てられる。内視鏡検査成分に関して、スコア0は正常な粘膜または非活動UCを示し、スコア1は軽度の脆弱性（friability）、血管パターンの減少、および粘膜紅斑の所見のある軽度の疾患に対して与えられ、スコア2は脆弱性、びらん、血管パターンの完全な消失、および顕著な紅斑を伴う中等度の疾患に対して与えられ、スコア3は潰瘍形成および特発性出血に対して与えられる（Schroeder et al., 1987, N Engl J Med, 317:1625-1629）。医師による全般評価では、正常の所見には0ポイント、軽度の大腸炎には1ポイント、中等度の大腸炎には2ポイント、重度の大腸炎には3ポイントが割り当てられる。したがって、いくつかの態様では、SG-11治療用タンパク質またはその変異体もしくは断片で治療された患者は、その患者が直腸出血、便に見られる血液の筋、内視鏡検査のサブスコア、および医師の全般評価の少なくとも1つにおいてMayoスコアの少なくとも1、2または3ポイントの低下を経験する場合に、治療に成功している。いくつかの態様では、UCと診断された患者に治療有効量のSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を投与することを含む治療方法は、UCの診断スコアの低下をもたらす。例えば、該スコアは、Mayoスコアなどの診断スコアを、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11ポイントだけ変更し得る。
【０１７３】
回腸嚢炎
さらにまたはあるいは、本明細書に記載のSG-11治療用タンパク質または変異体を含有する組成物および投与方法は、回腸嚢炎の治療に使用することができる。回腸嚢炎は、UCの治療で外科的に作られた回腸嚢の内膜の炎症である。具体的には、重度のUC患者は、罹患した結腸を除去され、回腸肛門吻合術（IPAA）またはJ-pouch術と呼ばれる手術によって腸が再接続される。回腸嚢炎の症例は多くの患者で再発することがあり、再発性の急性嚢炎または今後も延々と続く慢性嚢炎のいずれかとして現れる。したがって、本明細書では、回腸嚢炎、急性回腸嚢炎または再発性回腸嚢炎を治療する方法が提供される。
【０１７４】
回腸嚢炎の活動性は、寛解（活動性嚢炎なし）、軽度から中等度の活動性（排便回数の増加、切迫感、および/またはまれな失禁）、または重度の活動性（頻繁な失禁および/または患者が脱水のため入院）として分類することができる。回腸嚢炎の持続期間は、急性（4週間以下）または慢性（4週間以上）として定義され、そのパターンは一過性型（1〜2回の急性エピソード）、再発型（3回以下のエピソード）または持続型として分類され得る。医学的治療に対する応答は治療応答性または治療抵抗性として分類することができ、どちらの場合も投薬治療が指定される。したがって、いくつかの態様では、回腸嚢炎と診断された対象を治療する方法が提供され、この方法では、SG-11またはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物による治療が、回腸嚢炎の重症度の低下をもたらし、かつ/または寛解を生じさせる。
【０１７５】
粘膜炎および粘膜バリア
胃腸（GI）管の粘膜は、上皮バリアと免疫細胞と微生物を巻き込んだ複雑な微小環境である。健康な結腸では微妙なバランスが保たれている。内腔微生物は上皮と粘液からなるバリアによって宿主免疫系から物理的に分離されている。IBDの病因は、完全には解明されていないが、粘膜バリアの機能不全により変化した常在細菌叢に対する不適切な宿主反応が関係している可能性がある。Boltin et al., “Mucin Function in Inflammatory Bowel Disease An Update,” J. Clin. Gastroenterol., Vol. 47(2):106-111 (Feb. 2013)を参照されたい。
【０１７６】
粘膜炎は、癌治療（特に化学療法および放射線）が腸管（口から肛門に至る）の内面を覆っている急速に分裂する上皮細胞を破壊して、粘膜組織を潰瘍形成および感染にさらす状態にしておく場合に発生する。粘膜としても知られる粘膜組織は、気道および消化管などの、空気と連通する全ての身体通路の内面を覆っており、粘液を分泌する細胞および関連する腺がある。口腔粘膜と呼ばれる、口を覆っているこのライニングの部分は、体の最も敏感な部分の1つであり、化学療法と放射線に対して特に脆弱である。口腔は粘膜炎が最もよく発生する場所である。口腔粘膜は粘膜毒性とその結果としての粘膜炎の最も頻度の高い部位であるが、粘膜炎は食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸）および直腸を含む消化管全体に沿って発生し得ることが理解される。いくつかの態様では、SG-11またはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物は、口、食道、胃、小腸（十二指腸、空腸、回腸）、大腸（結腸）、および/または直腸の粘膜炎を治療するのに有効である。
【０１７７】
口腔粘膜炎は、痛み、食事ができない結果としての栄養上の問題、粘膜の開いた傷口による感染のリスク増加など、いくつかの問題につながる可能性がある。それは患者のクオリティ・オブ・ライフに大きな影響を及ぼし、かつ用量制限的であり得る（つまり、その後の化学療法の用量を減らす必要がある）。世界保健機関は、口腔粘膜炎を診断するための口腔毒性スケールを定めている：グレード1：痛み±紅斑；グレード2：紅斑、潰瘍、患者は固形物を摂取できる；グレード3：広範囲の紅斑を伴う潰瘍、患者は固形物を摂取できない；グレード4：栄養摂取ができない程度の粘膜炎。グレード3とグレード4の口腔粘膜炎は重度の粘膜炎と見なされる。したがって、本明細書では、口腔粘膜炎と診断された対象を治療する方法が提供され、この方法では、SG-11またはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物の投与により、口腔毒性のグレードがグレードスケール1〜4の少なくとも1ポイントだけ低下する。
【０１７８】
結腸短縮
潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜に影響を及ぼす特発性の炎症性腸疾患であり、臨床的には下痢、腹痛、血便を特徴とする。疾患の広がりは様々であり、直腸のみ（潰瘍性直腸炎）、結腸の左側から脾湾曲部まで、または大腸全体（全大腸炎）を巻き込むことができる。疾患の重症度も組織学的にかなり変化し、最小限から赤らんだ潰瘍形成および異形成にまで及んでいる。癌が発生することがある。潰瘍性大腸炎の典型的な組織学的（顕微鏡的）病変は陰窩膿瘍であり、ここでは陰窩の上皮が破壊されて、内腔が多形核細胞で満たされる。粘膜固有層には白血球が浸潤している。陰窩が破壊されると、正常な粘膜構造が失われ、その結果生じる瘢痕が結腸を短縮しかつ狭くすることがある。こうして、結腸短縮は大腸炎の結果であり得、診断に使用されることが多い。例えば、非侵襲性の単純な腹部X線は、急性疾患の患者の横行結腸のガス状輪郭を示すことができる。結腸の短縮および結腸膨起紋理（haustral markings）の消失は、単純写真のみならず二重造影バリウム注腸によっても実証され得る。潰瘍性疾患の徴候には、粘膜細部の消失、敷石充填欠損（cobblestone filling defects）、および病変のセグメント領域が含まれる。www.hopkinsmedicine.org/gastroenterology_hepatology/_pdfs/small_large_intestine/ulcerative_colitis.pdfに見られる“Ulcerative Colitis: Introduction - Johns Hopkins Medicine”を参照されたい。
【０１７９】
さらに、当技術分野で認められている大腸炎のインビボモデルは、該モデルで大腸炎の重症度を評価する際に結腸の長さの短縮化を利用している。Kim et al., “Investigating Intestinal Inflammation in DSS-induced Model of IBD,” Journal of Visualized Experiments, Vol. 60, pages 2-6 (February 2012)を参照されたい。
【０１８０】
非IBD疾患における上皮バリア機能
不適切に機能する上皮バリアは、例えばIBDおよび粘膜炎への関与を次第に強めている。さらに、不適切に機能する上皮バリアが引き起こし、関連し、相関し、かつ/または悪化させることが研究により示されている他の多くの疾患がある。こうした疾患には以下が含まれる：（1）代謝性疾患、例えば、肥満、2型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、非アルコール性脂肪肝疾患（NAFLD）、肝臓障害、およびアルコール性脂肪性肝炎（ASH）；（2）セリアック病；（3）壊死性腸炎；（4）過敏性腸症候群（IBS）；（5）腸内感染症（例：クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile））；（6）その他の胃腸障害全般；（7）間質性膀胱炎；（8）神経障害または認知障害（例：アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、自閉症）；（9）化学療法関連脂肪性肝炎（CASH）；（10）上記疾患の小児バージョン。例えば、Everard et al., “Responses of Gut Microbiota and Glucose and Lipid Metabolism to Prebiotics in Genetic Obese and Diet-Induced Leptin-Resistant Mice,” Diabetes, Vol. 60, (November 2011), pgs. 2775-2786; Everard et al., “Cross-talk between Akkermansia muciniphila and intestinal epithelium controls diet-induced obesity,” PNAS, Vol. 110, No. 22, (May 2013), pgs. 9066-9071; Cani et al., “Changes in Gut Microbiota Control Metabolic Endotoxemia-Induced Inflammation in High-Fat Diet-Induced Obesity and Diabetes in Mice,” Diabetes, Vol. 57, (June 2008), pgs. 1470-1481; Delzenne et al., “Targeting gut microbiota in obesity: effects of prebiotics and probiotics,” Nature Reviews, Vol. 7, (November 2011), pgs. 639-646を参照されたい。その結果、患者に適切な上皮バリア機能を回復することは、前述の疾患状態を消散させる上で極めて重要であり得る。
【０１８１】
口、食道、胃、小腸、大腸、直腸などの消化管の内腔で適切に機能する上皮バリアは、胃腸管および消化管内の微生物叢を制御しかつ維持する上で重要である。微生物叢の生態系には、環境、バリア、組織、粘液、ムチン、酵素、栄養素、食物、および胃腸管と消化管に常在する微生物群落が含まれる。腸粘膜バリアの完全性と透過性は、多くの重要なやり方で健康に影響を及ぼす。
【０１８２】
ムチン分泌の変化による胃腸障害での粘膜バリアの完全性の喪失は、宿主免疫の変化、管腔微生物因子、または直接作用する遺伝的または環境的決定要因に関連している可能性がある。したがって、粘液バリアの不均衡はIBDの病因の中心となり得る。Boltin et al., “Mucin Function in Inflammatory Bowel Disease An Update,” J. Clin. Gastroenterol., Vol. 47(2):106-111 (Feb. 2013)。
【０１８３】
ムチンは胃腸管の内面を覆っている粘液層の主要成分である。ヒトゲノムには、分泌型または膜結合型ムチンをコードする少なくとも21のムチン（MUC）遺伝子が知られている。正常な大腸内の主なムチンはMUC1、MUC2、MUC3A、MUC3B、MUC4、MUC13、およびMUC17.1である。MUC2は、杯細胞で産生される腸粘液の主要な分泌型のゲル形成成分である。Boltin et al., “Mucin Function in Inflammatory Bowel Disease An Update,” J. Clin. Gastroenterol., Vol. 47(2):106-111 (Feb. 2013)を参照されたい。MUC1、3A、3B、4、13、17.1などのさらなる分泌型ムチンと一緒になって、杯細胞のMUC2分泌は、結腸上皮細胞上に保護バリアを形成して、上皮細胞にダメージを与えるか免疫反応をプライミングする可能性のある腸内容物への曝露を少なくしている。
【０１８４】
IBDの炎症メカニズム
特定のサイトカイン類がIBDに関与していることを示す重要な証拠がある。最近の研究から、サイトカインがクローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（IBD）の病因に重要な役割を果たしており、それらが炎症反応の多くの面を制御していることが実証された。Markus Neurath, “Cytokines in Inflammatory Bowel Disease,” Nature Reviews Immunology, Vol. 14., 329-342 (2014)。特に、IBDで生じる炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの不均衡は、炎症の消散を妨げて、代わりに疾患の永続化と組織の破壊をもたらす。同文献。最近の研究は、疾患の進行に重要な意味を持つ調節性サイトカインのネットワークの存在を示唆している。同文献。したがって、SG-11が炎症性および抗炎症性サイトカインの産生および/または分泌に及ぼす効果を研究するための実験を行った。
【０１８５】
炎症性サイトカイン
簡単に言えば、炎症性サイトカインは、細胞のシグナル伝達において重要であって、全身性の炎症を促進するサイトカインである。それらは主に活性化されたマクロファージにより産生され、炎症反応のアップレギュレーションに関与している。炎症性サイトカインは、アップレギュレーション後に応答を引き出す小さなメディエーター分子の翻訳をコードする遺伝子から生じる。インターロイキン-1（IL-1）、IL6、IL-12、IL-18、IL-23、CD40L、腫瘍壊死因子（TNF）、例えばTNF-α、γインターフェロン（IFN-γ）、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、およびMCP-1は、炎症性サイトカインとして十分に特徴付けられている。炎症は、炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインの相互作用を特徴とする。
【０１８６】
炎症性サイトカインの生物学的活性を低下させることは、一部の疾患の治療に役立つ可能性がある。例えば、IL-1またはTNF-αのブロックは、関節リウマチ、炎症性腸疾患、または移植片対宿主病の患者を助けることに成功した。Strober W, Fuss IJ (May 2011), “Proinflammatory cytokines in the pathogenesis of inflammatory bowel diseases,” Gastroenterology, Vol. 140 (6): 1756?67を参照されたい。
【０１８７】
抗炎症性サイトカイン
簡単に言えば、抗炎症性サイトカインは、炎症性サイトカインの応答を調節する一連の免疫調節分子である。したがって、これらの分子は、炎症性サイトカインによって引き起こされる炎症反応を調節し、低減させるのに役立っている。抗炎症性サイトカインには、例えば、IL4、IL-10、IL-13、IFN-α、およびトランスフォーミング増殖因子β（TGF-β）が含まれ、抗炎症性サイトカインとして認識されている。
【０１８８】
本明細書に教示された方法のいくつかの態様では、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物の投与は、該組成物を投与された患者において免疫細胞による少なくとも1つの炎症性サイトカイン（例：TNF-αおよび/またはIL-23）の産生を低下させることができる。いくつかの態様では、該投与は、該患者において免疫細胞による少なくとも1つの抗炎症性サイトカイン（例：IL-10）の産生を増加させることができる。いくつかの態様では、該投与は、該患者において免疫細胞による少なくとも1つの抗炎症性サイトカイン（例：IL-10）の産生を低下させることができる。いくつかの態様では、該投与は、該患者において上皮細胞でのムチン産生の改善および/または上皮創傷の治癒をもたらすことができる。
【０１８９】
治療に使用される投薬レジメンは、所望の治療効果、投与経路、および治療期間に依存する。用量は、疾患の性質と重症度、患者の体重、患者がその後従う特別食、併用薬物、および当業者が認識している他の要因に応じて、患者ごとに異なるだろう。
【０１９０】
一般的に、0.0001〜10mg/kg体重/日の治療用タンパク質の投与量レベルが患者、例えば炎症性腸疾患を抱えている患者に投与される。投与量範囲は一般に、患者1人あたり1日約0.5mg〜100.0gであり、単回投与または複数回投与で投与することができる。
【０１９１】
いくつかの局面では、投与量範囲は、患者1人あたり1日約0.5mg〜10g、患者1人あたり1日0.5mg〜9g、患者1人あたり1日0.5mg〜8g、患者1人あたり1日0.5mg〜7g、患者1人あたり1日0.5mg〜6g、患者1人あたり1日0.5mg〜5g、患者1人あたり1日0.5mg〜4g、患者1人あたり1日0.5mg〜3g、患者1人あたり1日0.5mg〜2g、または患者1人あたり1日0.5mg〜1gである。
【０１９２】
いくつかの局面では、投与量範囲は、患者1人あたり1日約0.5mg〜900mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜800mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜700mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜600mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜500mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜400mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜300mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜200mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜100mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜50mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜40mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜30mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜20mg、患者1人あたり1日約0.5mg〜10mg、または患者1人あたり1日約0.5mg〜1mgである。
【０１９３】
治療用タンパク質を含む併用療法
治療用タンパク質を含む本明細書に教示される薬学的組成物は、他の治療法および/または薬学的組成物と組み合わせることができる。例えば、炎症性腸疾患の患者は、その疾患を治療するために医師によって処方された医薬品をすでに服用していてよい。いくつかの態様では、本明細書に教示される薬学的組成物は、患者の既存の医薬品と併せて投与することができる。
【０１９４】
例えば、本明細書に教示される治療用タンパク質は、以下の1つまたは複数と組み合わせることができる：抗下痢薬、5-アミノサリチル酸化合物、抗炎症剤、抗生物質、抗体、例えば炎症性サイトカインを標的とする抗体、例えば抗サイトカイン剤を標的とする抗体、例えば抗TNF-α（例：アダリムマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、インフリキシマブ、V565）または抗IL-12/IL-23（例：ウステキヌマブ、リサンキズマブ、ブラジクマブ、ウステキヌマブ）、JAK阻害剤（例：トファシチニブ、PF06700841、PF06651600、フィルゴチニブ、ウパダシチニブ）、抗インテグリン剤（例：ベドリズマブ、エトロリズマブ）、S1P阻害剤（例：エトラシモド、オザニモド、アミセリモド）、組換え細胞ベースの剤（例：Cx601）、ステロイド、コルチコステロイド、免疫抑制薬（例：アザチオプリン、メルカプトプリン）、ビタミン、および/または特殊な食事。
【０１９５】
化学療法または放射線療法を受けており、かつ粘膜炎、例えば口腔粘膜炎を患っているか、発症するリスクがある癌患者には、口腔粘膜炎などの粘膜炎の治療に使用される剤と組み合わせて、本開示による薬学的組成物を投与することができる。いくつかの態様では、治療方法は、粘膜炎の患者に、SG-11またはその変異体もしくは断片を含む薬学的組成物と、アミフォスチン、ベンゾカイン、ベンジダミン、ラニチジン、オメプラゾール、カプサイシン、グルタミン、プロスタグランジンE2、ビタミンE、スクラルファート、およびアロプリノールからなる群より選択される1つまたは複数の第2の治療剤との組み合わせを投与することを含む。
【０１９６】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様では、第2の治療剤は、本明細書に記載のSG-11タンパク質と併せて、同時にまたは連続して、投与される。いくつかの態様では、該タンパク質と第2の治療剤は、疾患、状態もしくは症状の治療または予防のために相乗的に作用する。他の態様では、該タンパク質と第2の治療剤は、疾患、状態もしくは症状の治療または予防のために相加的に作用する。
【０１９７】
SG-11治療用タンパク質を含む薬学的組成物
本明細書では薬学的組成物が提供され、該組成物は、本開示によるSG-11タンパク質、その変異体もしくは断片、またはその薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される賦形剤とを含有する。いくつかの態様では、薬学的組成物は、口、食道、小腸、大腸、直腸および/または肛門などの胃腸管腔への投与用に製剤化される。
【０１９８】
いくつかの態様では、該組成物は、該タンパク質の供給源に関連する1つまたは複数の他の物質、例えば産生宿主細胞由来の細胞成分、または該タンパク質の化学合成に関連する物質を含む。他の態様では、薬学的組成物は、本明細書に記載の1つまたは複数の第2の活性な作用物質を含むように製剤化される。さらに、該組成物は、活性な作用物質（複数可）または組成物自体の構造的および/または機能的活性を保存する成分を含んでもよい。そのような成分には、限定するものではないが、抗酸化剤、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン（例：メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１９９】
用語「薬学的」または「薬学的に許容される」とは、必要に応じて、例えばヒトなどの動物に投与した場合、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じないか、または生じないことが好ましい組成物を指す。薬学的組成物の調製または追加の活性成分は、本開示を踏まえて当業者に公知であり、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990に例示されている。さらに、動物（例：ヒト）への投与の場合、製剤はFDA生物学的基準局（FDA Office of Biological Standards）が要求する無菌性、発熱性、一般的な安全性および純度の基準を満たす必要があることが理解されよう。
【０２００】
本開示の薬学的組成物は、意図される投与経路、およびそれが例えば固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるのかどうかに従って、製剤化される。好ましい態様では、該組成物は直腸に投与されるが、局所的に、注射により、点滴により、経口的に、髄腔内に、鼻腔内に、皮下に、粘膜により、標的細胞を直接浸す局所灌流により、カテーテルを介して、洗浄（lavage）を介して、または他の方法もしくは前述の任意の組み合わせで投与することもでき、当業者には公知であろう。治療有効量の該タンパク質を含む液体製剤は、浣腸、カテーテル、バルブ注射器の使用により直腸に投与することができる。坐剤は直腸送達用に製剤化された固体剤形の例である。一般に、坐剤の場合、従来の担体には、例えば、ポリアルキレングリコール、トリグリセリドまたはそれらの組み合わせが含まれる。特定の態様では、坐剤は、例えば、約0.5％〜約10％および/または約1％〜約2％の範囲の活性成分を含む混合物から形成され得る。注射用の液体組成物は、典型的には、注射用の滅菌生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水、または当技術分野で公知の他の注射用担体をベースにしている。他の液体組成物には、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。経口投与用などの固体組成物は、錠剤、丸薬、カプセル剤（例えば、硬シェルまたは軟シェルのゼラチンカプセル）、バッカル組成物、トローチ、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハー、またはそれらの組み合わせの形態であり得る。そのような液体および固体組成物中の活性な作用物質、すなわち本明細書に記載のタンパク質は、典型的には約0.05重量％〜10重量％の構成成分であり、残りは注射用担体などである。
【０２０１】
薬学的組成物は、本開示の治療用タンパク質を含む活性な作用物質の長時間にわたる放出、例えば、30〜60分にわたる、または1〜10時間、2〜8時間、8〜24時間などにわたる放出を提供する、制御放出または持続放出組成物として製剤化することができる。あるいは、またはさらに、該組成物は宿主体内の特定の部位に放出されるように製剤化される。例えば、該組成物は、胃などの酸性環境での活性な作用物質の放出を防止して、小腸、結腸または直腸のより中性または塩基性の環境でのみ放出を可能にする、腸溶コーティングを持ち得る。あるいは、またはさらに、該組成物は口腔、小腸または大腸での遅延放出を提供するように製剤化されてもよい。
【０２０２】
上記の製剤のそれぞれは、意図される投与経路に応じて、少なくとも1つの薬学的に許容される賦形剤または担体を含むことができ、例えば、直腸投与では固体、静脈内もしくは非経口投与またはカニューレを介した投与では液体を含み得る。本明細書で使用する「薬学的に許容される担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例：抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩類、保存剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、そのような同様の材料、およびそれらの組み合わせが含まれ、当業者には公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 第18版, Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照されたい）
【０２０３】
投与のための薬学的組成物は、正確な投薬を容易にするために単位剤形で存在し得る。典型的な単位剤形には、事前に計量されて充填された液体組成物のアンプルもしくは注射器、または固体組成物の場合には坐剤、丸薬、錠剤、カプセル剤などが含まれる。そのような組成物のいくつかの態様では、活性な作用物質、すなわち本明細書に記載のタンパク質は、構成成分（約0.1〜50wt/wt％、1〜40wt/wt％、0.1〜1wt/wt％、または1〜10wt/wt％）であり得、残りは様々なビヒクルまたは担体、および所望の剤形を形成するのに役立つ加工助剤である。
【０２０４】
患者に投与される本開示の単位剤形中の実際の投与量は、身体的および生理学的要因、例えば、体重、疾患の重症度、治療される病気のタイプ、以前のまたは同時の治療的介入、患者の特発性疾患（idiopathy）および投与経路により決定され得る。いずれにしても、投与を担当する医師が組成物中の有効成分の濃度および個々の対象に適切な用量を決定するだろう。
【０２０５】
タンパク質発現システムおよびタンパク質生産
本明細書では、本開示の単離されたタンパク質を生産するための組成物および方法、ならびに該タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび該発現ベクターを保有する宿主細胞が提供される。
【０２０６】
本開示のタンパク質は、通常の組換え方法で、例えば、SG-11治療用タンパク質、その変異体または断片をコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することにより、調製することができる。そのようなベクターを含む宿主細胞も提供される。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得、宿主細胞の例には、大腸菌、酵母、または哺乳動物細胞が含まれる。本明細書に記載のタンパク質のいずれかを生産する方法がさらに提供され、該方法は、宿主細胞を目的のタンパク質の発現に適した条件下で培養するステップ、およびその細胞培養物から目的のタンパク質を回収するステップを含む。その後、回収されたタンパク質は、インビトロおよびインビボの方法で使用するため、ならびに薬学的に許容される組成物に製剤化するために、単離および/または精製され得る。いくつかの態様では、該タンパク質は大腸菌などの原核細胞で発現され、該タンパク質の単離・精製は、ヒトまたは他の動物での治療用途に許容されるレベルにまでエンドトキシンを低下させるステップを含む。
【０２０７】
発現ベクター
本明細書では、本開示のタンパク質またはその変異体および/もしくは断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが提供される。本開示のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、標準的な組換え技術を用いて取得することができる。所望のコードポリヌクレオチド配列は、供給源の細菌、すなわちロゼブリア・ホミニス、のゲノムDNAから増幅され得る。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機を使用して合成され得る。得られたら、ポリペプチドをコードする配列は、宿主細胞内で異種（外因性）ポリヌクレオチドを複製して発現できる組換えベクターに挿入される。当技術分野で公知の、入手可能な多くのベクターを本開示の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主に、ベクターに挿入される核酸のサイズと、ベクターで形質転換される特定の宿主細胞とに依存する。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅もしくは発現、またはその両方）およびそれが存在する特定の宿主細胞との適合性に応じて、様々な成分を含んでいる。ベクターの成分には、一般に、複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボソーム結合部位（RBS）、シグナル配列、異種核酸挿入物および転写終結配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０８】
一般に、宿主細胞との適合性がある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主と共に使用される。ベクターは通常、複製部位と、形質転換細胞の表現型選択を提供できるマーキング配列とを保持する。例えば、大腸菌は典型的には、大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322、pUC、pETまたはpGEXベクターを用いて形質転換される。このようなベクターは、アンピシリン（Amp）およびテトラサイクリン（Tet）耐性をコードする遺伝子を含むため、形質転換細胞を識別するための簡便な手段を提供する。これらのベクターおよびそれらの誘導体または他の微生物プラスミドもしくはバクテリオファージは、内因性タンパク質の発現のために微生物によって使用され得るプロモーターを含んでもよいし、含むように改変されてもよい。
【０２０９】
本開示の発現ベクターは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された、上流（5'）に位置する非翻訳調節配列のプロモーターを含むことができ、該プロモーターはそのコード配列の転写を調節する。原核生物のプロモーターは、通常、誘導性プロモーターと構成的プロモーターの2つのクラスに分類される。誘導性プロモーターは、培養条件の変化、例えば栄養素の有無または温度の変化に反応して、その制御下にあるコードポリヌクレオチドの増大したレベルの転写を開始するプロモーターである。種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知であり、当業者は所望の発現レベルに従ってプロモーターを選択することができる。原核細胞宿主と共に使用するのに適したプロモーターには、lac、trp、tac、trc、araなどの大腸菌プロモーター、ラムダおよびT5プロモーターなどの大腸菌によって認識されるウイルスプロモーター、T7バクテリオファージ由来のT7およびT7lacプロモーターが含まれる。T7プロモーターを含むベクターを保有する宿主細胞は、例えば、T7ポリメラーゼを発現するように操作される。そのような宿主細胞としては、大腸菌BL21(DE3)、Lemo21(DE3)、およびNiCo21(DE3)細胞が挙げられる。いくつかの態様では、プロモーターは化学的または環境的要因の制御下にある誘導性プロモーターである。
【０２１０】
さらに有用なプラスミドベクターには、pINベクター（Inouye et al., 1985）；およびその後の精製と分離または切断のために可溶性のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質を生成するのに使用されるpGEXベクターが含まれる。他の適切な融合タンパク質は、β-ガラクトシダーゼ、ユビキチンなどとの融合タンパク質である。
【０２１１】
原核および真核の両宿主細胞で発現させるのに適したベクターは当技術分野で知られており、いくつかを本明細書でさらに説明する。
【０２１２】
本開示のベクターは、翻訳された組換えタンパク質が宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ことを可能にするシグナル配列をさらに含むことができる。異種ポリペプチドに固有のシグナル配列を認識およびプロセシングしない原核宿主細胞の場合は、そのシグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ipp、または熱安定性エンテロトキシンII（STII）リーダー、LamB、PhoE、PeIB、OmpAおよびMBPからなる群より選択される原核生物シグナル配列と置き換えられる。真核細胞発現システムで使用される周知のシグナル配列には、インターロイキン-2、CD5、免疫グロブリンκ軽鎖、トリプシノーゲン、血清アルブミン、およびプロラクチンが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１３】
本明細書に記載のSG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片は、融合タンパク質またはポリペプチドとして発現させることができる。よく使用される融合パートナーには、ヒト血清アルブミンとその結晶性断片、またはIgGの定常ドメインFcが含まれるが、これらに限定されない。ヒスチジンタグまたはFLAGタグもまた、発現培地または組換え細胞溶解物からの組換えタンパク質の精製を簡略化するために使用され得る。融合パートナーは、目的のタンパク質のN末端および/またはC末端に融合させることができる。
【０２１４】
宿主細胞
本明細書でベクター中のDNAをクローニングまたは発現させるのに適した宿主細胞には、原核生物、酵母、または高等真核生物の細胞が含まれる。宿主細胞として使用するために多数の細胞株および培養物が入手可能であり、それらは、例えば、生きた培養物および遺伝物質のアーカイブとして役立つ組織のATCC（American Type Culture Collection）を通じて入手することができる。ベクターの複製および/または発現に利用可能な細胞タイプとしては、限定するものではないが、以下が挙げられる：細菌、例えば大腸菌（例：大腸菌RR1株、大腸菌LE392、大腸菌B、大腸菌X 1776（ATCC番号31537）ならびに大腸菌W3110（F-、λ-、原栄養性、ATCC番号273325）、DH5α、JM109、およびKC8、桿菌、例えば枯草菌（Bacillus subtilis）；および他の腸内細菌科、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Salmonella typhimurium）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、種々のシュードモナス属（Pseudomonas）菌種、ならびに多数の市販されている細菌宿主、例えば、SURE（登録商標）コンピテント細胞およびSOLOPACK（商標）Gold細胞（STRATAGENE（登録商標）社, La Jolla)。特定の態様では、大腸菌などの細菌細胞が宿主細胞として特に企図される。
【０２１５】
ベクターの複製および/または発現のための真核宿主細胞の例としては、限定するものではないが、HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos、およびPC12が挙げられる。さらなる真核宿主細胞には、酵母（例：ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae））および昆虫由来の細胞（例：ツマジロクサヨトウ（Spodoptera frugiperda）、イラクサキンウワバ（Trichoplusia ni））が含まれる。様々な細胞タイプおよび生物からの多くの宿主細胞が利用可能であり、当業者には公知であろう。同様に、ウイルスベクターを、真核または原核宿主細胞、特に該ベクターの複製または発現を許容するものと共に、使用することもできる。適切な宿主細胞の選択は当業者の技能の範囲内であるとみなされる。
【０２１６】
組換えDNAが染色体外要素または染色体組込み体のいずれかとして複製可能であるように、組換えDNA、すなわち発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより関心対象の発現ベクターを保有する宿主細胞を作製する方法は、よく知られている。トランスフェクションの方法、例えばCaPO4およびエレクトロポレーションによる方法は、当業者に公知である。使用する宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的な技術を用いて実施される。上記のSambrook et al.に記載されるような、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションは、一般的に、丈夫な細胞壁バリアを含む原核細胞または他の細胞に使用される。哺乳動物細胞宿主系の形質転換の一般的な側面は、米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母への形質転換は通常、Van Solingen et al., J. Bact, 130:946 (1977)およびHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。DNAを細胞に導入するための他の方法には、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンを使用した導入が含まれる。哺乳動物細胞を形質転換するための様々な技法については、Keown et al., Methods in Enzymology. 185:527-537 (1990)およびMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照されたい。
【０２１７】
したがって、本明細書では、関心対象のSG-11治療用タンパク質配列（例えば、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、または本明細書に記載されるその変異体および/もしくは断片）をコードするポリヌクレオチドを含む上記の組換えベクターまたは発現ベクターが提供される。該ポリヌクレオチドは、例えば、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、またはその変異体もしくは断片のいずれか1つであり得る。さらに、本開示では、該ベクターを保有する宿主細胞が教示される。宿主細胞は、上で詳述したように真核細胞または原核細胞であり得る。好ましい態様では、宿主細胞は原核細胞である。さらに好ましい態様では、宿主細胞は大腸菌である。
【０２１８】
いくつかの態様では、関心対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドはコドン最適化される。タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列にコドン最適化アルゴリズムを適用して、発現用宿主のコドン使用頻度バイアスに基づいて特定のアミノ酸の適切なコドンを選択するようにする。多くのコドン最適化アルゴリズムでは、mRNAの構造、宿主のGC含量、リボソーム進入部位などの他の要因も考慮される。コドン最適化アルゴリズムおよび遺伝子合成サービスプロバイダーの例を以下に示す：AUTM: www.atum.bio/services/genegps；GenScript: www.genscript.com/codon-opt.html；ThermoFisher: www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/gene-synthesis/geneart-gene-synthesis/geneoptimizer.html；およびIntegrated DNA Technologies: www.idtdna.com/CodonOpt。その後、ヌクレオチド配列を合成して、適切な発現ベクターにクローニングすることができる。本開示におけるコドン最適化配列には、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18およびSEQ ID NO:20が含まれる。
【０２１９】
タンパク質の生産方法
本明細書に記載のタンパク質を生産する方法が提供されるが、これらの方法は当業者に周知である。タンパク質の生産のために本明細書に記載の発現またはクローニングベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、従来の栄養培地で培養される；該培地は、必要に応じて、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択および/または維持し、かつ/または所望のタンパク質配列をコードする遺伝子を発現させるように改変される。培地、温度、pHなどの培養条件は、過度の実験をすることなく当業者によって選択され得る。一般的に、細胞培養の生産性を最大に高めるための原理、プロトコル、および実践的技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M. Butler編, (IRL Press, 1991)およびMolecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)に見い出すことができる。
【０２２０】
一般的に、「精製された」とは、非タンパク質性成分と他の様々なタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを取り除くために分別にかけられた特定のタンパク質組成物を指し、該組成物はその活性を実質的に保持する。こうした活性は、例えば、本明細書で以下に記載されるか、または所望のタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドについて当業者には知られているような、タンパク質アッセイにより評価され得る。
【０２２１】
「実質的に精製された」という用語が使用される場合、これは、特定のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが、組成物中のタンパク質の約50％またはそれ以上を構成するなど、組成物の主要成分を形成している組成物を指す。好ましい態様では、実質的に精製されたタンパク質は、組成物中のタンパク質の60％、70％、80％、90％、95％、99％超、またはそれ以上でさえも構成する。
【０２２２】
本開示に適用される「均質に精製された」ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、該ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質が他のタンパク質および生物学的成分を実質的に含まない純度を有することを意味する。例えば、精製されたペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、他のタンパク質成分が十分に除かれているため、分解シーケンシングを成功裏に実施することができる。
【０２２３】
特定の態様での使用には好ましいが、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドが常に最も精製された状態で提供されるという一般的な必要条件は存在しない。実際、それほど十分には精製されていないタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（それにもかかわらず、天然状態と比較して、所望のタンパク質組成物が濃縮されている）は、特定の態様において有用であると考えられる。
【０２２４】
タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの精製度を定量化するための様々な方法は、本開示を踏まえて当業者には公知である。これらには、例えば、画分の特定のタンパク質活性を測定すること、またはゲル電気泳動により画分内のポリペプチドの数を評価することが含まれる。
【０２２５】
別の例は、特定の結合パートナーを用いて特定の融合タンパク質を精製することである。そのような精製方法は当技術分野でルーチンに使用されている。本開示は特定のタンパク質のDNA配列を提供するので、現時点では任意の融合タンパク質の精製方法が実施可能である。これは以下により例示される：特定のタンパク質-グルタチオンS-トランスフェラーゼ融合タンパク質の作成、大腸菌での発現、およびグルタチオン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィーを用いた均一への単離、またはタンパク質のN末端もしくはC末端へのポリヒスチジンタグの付加、その後Niアフィニティクロマトグラフィーを用いた精製。しかし、多くのDNAおよびタンパク質が公知であるか、または本明細書に記載の方法を用いて同定および増幅され得ることを考えると、どのような精製方法も現時点で利用可能である。
【０２２６】
他の態様では、ペプチドが濃縮された調製物を、精製された調製物の代わりに使用することができる。本文書では、精製されたものを使用するときはいつでも、濃縮されたものをも使用することができる。調製物は、精製方法で濃縮されるだけでなく、野生型と比較したときの細菌によるペプチドの過剰発現または過剰生産によっても濃縮され得る。これは、組換え法を使用して、または野生型細胞からのペプチドの発現を誘導する条件を選択することによって、達成することができる。
【０２２７】
組換え発現された本開示のポリペプチドは、培地または宿主細胞溶解物から回収することができる。適切な精製法には、例えば、以下によるものが含まれる：イオン交換（アニオンまたはカチオン）カラムでの分別；エタノール沈殿；逆相HPLC；シリカまたはDEAEなどのカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；SDS-PAGE；硫酸アンモニウム沈殿；ゲルろ過またはサイズ排除クロマトグラフ（SEC）、例えばSephadex G-75の使用；および本開示のポリペプチドのエピトープタグ付き形態と結合する金属キレートカラム。様々なタンパク質精製方法を使用することができ、そのような方法は当技術分野で知られており、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載されている。選択される精製ステップ（複数可）は、例えば、使用される生産プロセスおよび生産される特定のポリペプチドの性質に依存するであろう。
【０２２８】
本発明のポリペプチドを調製するために、当技術分野で周知の代替方法を使用することができる。例えば、ポリペプチドまたはその一部をコードする配列は、固相法を使用した直接的なペプチド合成によって生成される（例えば、Stewart et al., 1969, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif.; Merrifield. J. 1963, Am. Chem. Soc., 85:2149-2154参照）。インビトロタンパク質合成は、手動法を用いて、または自動化により実施することができる。自動合成は、例えば、Applied Biosystemsペプチド合成機（Foster City, Calif.）を使用して、メーカーの指示に従って行うことができる。本発明のポリペプチドまたはその一部の様々な部分を別々に化学合成し、化学的または酵素的方法を用いて合体させて全長ポリペプチドまたはその一部を生成することができる。
【０２２９】
いくつかの態様では、本開示は、異種ポリペプチドまたはアミノ酸配列に融合された本明細書に記載のポリペプチドのいずれかを含むキメラ分子、および該キメラ分子をコードするポリヌクレオチドを提供する。そのようなキメラ分子の例には、免疫グロブリンのFc領域のエピトープタグ配列に融合された本明細書に記載のポリペプチドのいずれかが含まれるが、これらに限定されない。
【０２３０】
組換え細菌送達システム
本開示は、精製タンパク質を含む従来の薬学的製剤以外の送達システムを利用することを企図している。いくつかの態様では、本開示は、組換え細菌送達システム、ファージ媒介送達システム、キトサン-DNA複合体、またはAAV送達システムを利用する。
【０２３１】
1つの特定の組換え細菌送達システムは、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）に基づくものである。本質的に、治療用タンパク質（例えば、SEQ ID NO:3）をコードする遺伝子を発現ベクターにクローニングし、次いで該ベクターでL.ラクチスを形質転換することができる。その後、該L.ラクチスは患者に投与される。例えば、以下を参照されたい：Bratt, et al., “A phase 1 trial with transgenic bacteria expressing interleukin-10 in Crohn's disease,” Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2006, Vol. 4, pgs. 754-759 (「我々は、チミジル酸シンターゼ遺伝子が成熟ヒトインターロイキン-10をコードする合成配列で置き換えられた遺伝子組換えラクトコッカス・ラクチス（LL-Thy12）を用いて、クローン病患者を治療した。」)；Shigemori, et al., “Oral delivery of Lactococcus lactis that secretes bioactive heme oxygenase-1 alleviates development of acute colitis in mice,” Microbial Cell Factories, 2015, Vol. 14:189（「乳酸菌の遺伝子組換え株（gmLAB）を使用した治療用タンパク質の粘膜送達は、新しい治療戦略として研究されつつある。」）；Steidler, et al., “Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10,” Science, 2000, Vol. 289, pgs. 1352-1355（「サイトカインのインターロイキン10（IL-10）は、炎症性腸疾患（IBD）の治療について臨床試験で有望視されている。2つのマウスモデルを使用して、我々は、IL-10の治療用量が該サイトカインを分泌するように遺伝子操作された細菌の局所送達によって低減され得ることを示す。IL-10を分泌するラクトコッカス・ラクチスの胃内投与はデキストラン硫酸ナトリウムで処理したマウスで大腸炎の50％減少を引き起こし、かつIL-102/2マウスで大腸炎の発症を防止した。このアプローチは、ヒトにおける費用効率の高いIBD長期管理のための良好な方法につながる可能性がある。」）；Hanniffy, et al., “Mucosal delivery of a pneumococcal vaccine using Lactococcus lactis affords protection against respiratory infection,” Journal of Infectious Diseases, 2007, Vol. 195, pgs. 185-193（「ここで、我々は、肺炎球菌疾患から保護するための粘膜ワクチンとして、肺炎球菌表面タンパク質A（PspA）を細胞内で産生するラクトコッカス・ラクチスを評価した。」）；およびVandenbroucke, et al., “Active delivery of trefoil factors by genetically modified Lactococcus lactis prevents and heals acute colitis in mice,” Gastroenterology, 2004, Vol. 127, pgs. 502-513（「我々は、経口投与されたL.ラクティスによるマウスTFFのin situ分泌を伴う急性および慢性大腸炎の新しい治療アプローチをプラスに評価した。この新規アプローチは、ヒトの急性および慢性大腸炎と上皮損傷の効果的な管理につながる可能性がある。」）。
【０２３２】
別の態様では、SG-11タンパク質またはその変異体もしくは断片を送達するために「合成細菌」を使用することができ、ここでは、プロバイオティクス細菌がSG-11治療用タンパク質を発現するように操作される（例えば、Durrer and Allen, 2017, PLoS One, 12:e0176286参照）。
【０２３３】
ファージは、特定のDNAペイロードを送達するように、または宿主特異性を変えるように遺伝子操作されてきた。ファージ、プラスミド、トランスポゾンなどの導入方法は、形質導入、形質転換、接合伝達などのプロセスを介して、操作されたDNA配列を微生物群集に送達しかつ循環させるために使用することができる。本開示の目的において、操作されたファージは本開示のタンパク質の1つの可能な送達システムであり得ると理解することで十分である。その送達システムは、前記タンパク質をコードする核酸をファージに組込み、該ファージを利用して該核酸を宿主微生物に送達することによる。その後、該微生物は、そのゲノムへと該核酸をファージに送達させた後で、該タンパク質を産生するであろう。
【０２３４】
前述の操作ファージアプローチと同様に、治療用タンパク質をコードする核酸を、患者の微生物叢に存在する宿主微生物に組込むために、トランスポゾン送達システムを利用することができる。Sheth, et al., “Manipulating bacterial communities by in situ microbiome engineering,” Trends in Genetics, 2016, Vol. 32, Issue 4, pgs. 189-200を参照されたい。
【０２３５】
以下の実施例は、本開示を例示することを意図したものであり、限定するものではない。
【実施例】
【０２３６】
以下の実験では、IBDのインビボモデルと組み合わせたインビトロ実験のロバストな混合モデルを利用して、教示されたタンパク質および方法の治療能力を実証する。
【０２３７】
実施例1
SG-11とその変異体の発現
以下の実施例に記載される実験では、SG-11（SEQ ID NO:3）をコードするポリヌクレオチドは、ロゼブリア・ホミニス（A2-183；DSM 16839タイプ株；例えば、Duncan, S. H., Aminov, R. I., Scott, K. P., Louis, P., Stanton, T. B., Flint, H. J. (2006)参照）由来のゲノムDNAのPCR増幅により得られた。ロゼブリア・ファエシス（Roseburia faecis）の新種、ロゼブリア・ホミニスの新種およびロゼブリア・イヌリニボランス（Roseburia inulinivorans）の新種の申し出は、ヒト糞便からの分離株に基づいていた。Int. J. Syst. Evol. Microbiol. Vol. 56, pgs. 2437-2441。次いで、コードするポリヌクレオチドを誘導性発現ベクターにサブクローニングし、当技術分野でルーチンの培養および精製方法を用いて、以下に詳述するSG-11またはその変異体を発現および精製するために、大腸菌BL21(DE3)細胞を形質転換するのに使用した。
【０２３８】
SG-11（SEQ ID NO:3を含む）の発現
以下に記載する本開示に関連する様々な実験で使用するためのSG-11のアミノ酸配列（SEQ ID NO:5）を含むタンパク質の発現および精製は、遺伝子または遺伝子断片の誘導可能な高レベルの細胞内発現のためにデザインされたpGEXベクターシステムを使用して達成された。大腸菌での発現は、アミノ末端にGST部分があり、カルボキシル末端に目的タンパク質があるタグ付きタンパク質をもたらす。このベクターは、化学的に誘導可能な高レベル発現のためのtacプロモーターと、大腸菌宿主内での使用のための内部laq1q遺伝子を持っている。
【０２３９】
SG-11（R.ホミニス DSM 16839からのSEQ ID NO:3）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを、pGEX-6P-1（GE Healthcare Life Science社, Pittsburgh, PA）の多重クローニング部位（BamHIおよびNotI部位）に挿入して、SG-11をGST融合タンパク質として発現させ、次に、これをPrecisionプロテアーゼ部位で切断し、以下の表4に示すSEQ ID NO:5のアミノ酸配列（SEQ ID NO:6によってコードされる）を有するSG-11を生成した。このタンパク質は2つの代替方法で発現および精製させた。最初の方法では、BL21(DE3)形質転換体を、100μg/mlカルベニシリンと1μg/mlクロラムフェニコールを含むLB中で30℃にて増殖させた。OD600＝0.6の培養密度に達したとき、発現を0.4mM IPTGで4時間誘導した。細胞を遠心分離により収集し、超音波処理で溶解し、可溶性溶解物をGST樹脂カラムにアプライした。結合したタンパク質をPBSで洗浄し、その後、PreScissionプロテアーゼを添加してGSTタグのC末端でタンパク質を切断することにより、精製されたタグフリーのSG-11Cを溶出した。
【０２４０】
同じpGEX発現構築物を使用する別の発現および精製方法は、形質転換BL21(DE3)細胞を50μg/mlカルベニシリン含有LB中で37℃にて増殖させることにより実施した。培養物がOD600＝0.7の密度に達したら、それらを16℃に冷却し、発現を1mM IPTGにより16℃で15時間誘導した。細胞を収集し、超音波処理で溶解し、可溶性溶解物をGSTrapカラムにアプライした。結合したタンパク質をHEPES緩衝液で洗浄し、その後、HRV3Cプロテアーゼを添加してGSTタグのC末端でタンパク質を切断することにより、精製されたタグフリーのSG-11（SEQ ID NO:5）を溶出した。SDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルー染色で確認されたタンパク質を含む溶出画分を特定してプールし、HiTrap Q HPアニオン交換カラム、次にSuperdex 75 (26/60)分取サイズ排除カラム（SEC）にアプライして最終調製物を得た。
【０２４１】
（表４）
2020516615.tif 000008
【０２４２】
シグナルペプチドを持たない成熟SG-11タンパク質の発現および精製は、pD451-SRベクターシステム（AUTM, Newark, CA）を用いて行った。この発現ベクターはIPTG誘導性T7プロモーターを利用している。SG-11（SEQ ID NO:3）をコードするポリヌクレオチド（SEQ ID NO:4）をAUTM（Newark, CA）でコドン最適化して、本明細書にSEQ ID NO:8として提供されるコドン最適化コード配列を得た。このコドン最適化コード配列をpD451-SRベクターに挿入した。得られた構築物は、本明細書にSEQ ID NO:7として提供される233アミノ酸のSG-11タンパク質の発現をもたらす。
【０２４３】
該構築物で形質転換されたBL21(DE3)細胞を自動誘導培地MagicMedia（ThermoFisher社）で増殖させた。この培養物を25℃で振とうしながら8時間インキュベートし、その後16℃で最大72時間インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレット化し、50mM NaCl、2mg/mlリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤を含む100mM Tris-HCl, pH8.0に再懸濁した後、該懸濁液にTriton X-100を加えた。次いで、細胞を超音波処理し、標準カラムクロマトグラフィー技術によるタンパク質の精製のために、遠心分離により澄明な溶解物を調製した。
【０２４４】
SG-11（SEQ ID NO:7）は、HiTrap Q HPとこれに続くMono Qの2つのアニオン交換カラムで精製した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色で確認された部分精製タンパク質を含む画分を、Mono Qでさらに精製した。Mono Qの精製プロトコルは、HiTrap Qのそれと同じであった。SG-11含有画分をプールし、バッファー（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、および10％グリセロール）で透析した。純度と均一性をSDS-PAGEおよび分析用SECのSuperdex 200 Increase 3.2/300により分析したところ、該調製物は純度が約92.7％であると評価された。
【０２４５】
pD451-SRベクターシステムは、SG-11変異体のSG-11V5（SEQ ID NO:19）を発現させて精製するためにも使用された。発現構築物を作成するために、SG-11のコドン最適化配列（SEQ ID NO:8）を、SG-11V5（SEQ ID NO:19）をコードするSEQ ID NO:20のポリヌクレオチドを生成するように改変した。SG-11V5コード配列をpD451-SRベクターにクローニングした。
【０２４６】
該構築物で形質転換されたBL21(DE3)細胞を増殖させ、SG-11（SEQ ID NO:7）の発現について上述したように、澄明な溶解物の調製のために処理した。
【０２４７】
SG-11V5タンパク質は、HiTrap Q精製と、これに続く疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）HiTrap Butyl HPによって澄明な溶解物から精製した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色で確認されたSG-11V5含有画分をプールし、バッファー（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、および10％グリセロール）で透析した。調製に関して記載された全てのカラムクロマトグラフィーは、AKTAタンパク質精製システム（GE Healthcare Life Sciences社, Pittsburgh, PA）を用いて実施した。
【０２４８】
精製済みのタンパク質は、SDS-PAGEおよびクーマシーブリリアントブルー染色後、参照としてウシ血清アルブミンを使用するデンシトメトリーにより定量化した。エンドトキシンのレベルは、Endosafe（登録商標）nexgen-MCS（商標）（Charles River社, Wilmington, MA）を用いてメーカーの指示に従って測定した。本明細書に記載のアッセイに使用されるタンパク質のエンドトキシンレベルは、1EU/mgよりも低かった。
【０２４９】
発現構築物を作成したが、ここでは、SG-11のN末端にFLAGタグ（DYKDDDDK; SEQ ID NO:32）を有するSG-11（SEQ ID NO:3）をコードするポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO:4）を保持および発現させるためにpET-28ベクター（Sigma Millipore社）を使用した。完全なFLAGタグ付きSG-11タンパク質の配列は、本明細書にSEQ ID NO:9として提供される（SEQ ID NO:10によってコードされた）。この構築物を使用するタンパク質発現は、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）により誘導可能なT7プロモーターの制御下にある。N末端のFLAGタグは、PCRおよびDYKDDDDKをコードするオリゴヌクレオチドを使用して該構築物に組込まれた。形質転換された宿主細胞を2xYT培地中37℃で一晩増殖させた。次に、一晩培養物を新鮮な2xYT培地に接種して、37℃で4時間インキュベートした。その後、4時間培養物をMagicMedia（商標）大腸菌発現培地（ThermoFisher社）に接種した（1％接種）。細胞を25℃で8時間、次に16℃で72時間まで増殖させた後、遠心分離により回収した。タンパク質は、澄明な溶解物からの回収を可能にする可溶性形態として発現された。発現タンパク質をHiTrapQアニオン交換カラム、続いてSuperdex 200 Increase 10/300 GL SECを使用して精製した。純度と均一性をSDS-PAGEおよび分析用SECのSuperdex 200 Increase 3.2/300により分析したところ、該調製物は純度が約93.3％であると評価された。
【０２５０】
安定性分析のためのSG-11タンパク質の調製
SG-11（SEQ ID NO:7）およびその変異体であるSG-11V5（SEQ ID NO:19）は、HiTrap Q HPとこれに続くMono Qの2つのアニオン交換カラムで精製した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色で確認された部分精製タンパク質を含む画分を、Mono Qでさらに精製した。Mono Qの精製プロトコルは、HiTrap Qのそれと同じであった。SG-11含有画分をプールし、バッファー（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、および10％グリセロール）で透析した。
【０２５１】
SG-11V5の場合は、HiTrap Qで精製した後、タンパク質を疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）HiTrap Butyl HPでさらに精製した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色で確認されたSG-11V5含有画分をプールし、バッファー（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、および10％グリセロール）で透析した。調製に関して記載された全てのカラムクロマトグラフィーは、AKTAタンパク質精製システム（GE Healthcare Life Sciences社, Pittsburgh, PA）を用いて実施した。
【０２５２】
精製済みのタンパク質は、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色後、参照としてウシ血清アルブミンを使用するデンシトメトリーにより定量化した。エンドトキシンのレベルは、Endosafe（登録商標）nexgen-MCS（商標）（Charles River社, Wilmington, MA）を用いてメーカーの指示に従って測定した。本明細書に記載のアッセイに使用されるタンパク質のエンドトキシンレベルは、1EU/mgよりも低かった。
【０２５３】
実施例2
炎症により誘発されたバリア破壊後の上皮バリア完全性の回復に対するSG-11の効果
以下の実験では、胃腸上皮バリアの完全性を回復させる本明細書に記載のSG-11タンパク質またはその変異体の治療能力を実証する。したがって、この実験は、胃腸の炎症性疾患または上皮バリア完全性/機能の障害を伴う疾患を治療するための治療用タンパク質の機能的有用性の実証である。
【０２５４】
アッセイはトランスウェルプレートで以下に記載するように実施した；そこでは、細胞を分離するために透過性の膜を利用して複数の細胞タイプの共培養を行った。頂端（上側）チャンバーで、腸細胞と杯細胞の混合物からなるヒト結腸上皮細胞を、該細胞が経上皮電気抵抗（TEER）の測定で評価して密着結合の形成とバリアの機能的能力を獲得するまで培養した。基底側チャンバーでは、単球を別々に培養した。上皮細胞を炎症性サイトカインで刺激した。このアッセイでは、上皮バリア機能、muc2遺伝子発現、およびサイトカインの産生に対する治療用タンパク質、すなわちSG-11、の効果を測定した。
【０２５５】
細胞培養：  HCT8ヒト腸細胞株（ATCCカタログ番号CCL-244）は、10％ウシ胎児血清、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10μg/mlゲンタマイシンおよび0.25μg/mlアムホテリシンを補充したRPMI-1640培地（cRPMI）で維持した。HT29-MTXヒト杯細胞（Sigma-Aldrich社, St. Louis, MO；カタログ番号12040401）は、10％ウシ胎児血清、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、10μg/mlゲンタマイシンおよび0.25μg/mlアムホテリシンを含むDMEM培地（cDMEM）で維持した。上皮細胞をトリプシン処理により継代し、液体窒素ストックからの解凍後に5〜15継代を使用した。U937単球（ATCCカタログ番号700928）は浮遊培養としてcRPMI培地に維持し、5×105〜2×106個/mlの細胞を維持するために必要に応じて希釈により分割した。U937細胞は液体窒素ストックからの解凍後に18継代までを使用した。
【０２５６】
上皮細胞培養：  HCT8腸細胞とHT29-MTX杯細胞の混合物を、前述のようにトランスウェルプレートの頂端チャンバーに、それぞれ9：1の比率で播種した（Berget et al., 2017, Int J Mol Sci, 18:1573; Beduneau et al., 2014, Eur J Pharm Biopharm, 87:290-298）。各ウェルに合計105個の細胞を播種した（ウェルあたり9×104個のHCT8細胞と1×104個のHT29-MTX細胞）。上皮細胞を培養フラスコからトリプシン処理し、生細胞をトリパンブルーカウント法により判定した。各細胞タイプの正確な容量を単一のチューブにまとめて遠心分離した。その細胞ペレットをcRPMIに再懸濁し、トランスウェルプレートの頂端チャンバーに加えた。細胞を37℃＋5％CO2で8〜10日間培養し、培地を2日ごとに交換した。
【０２５７】
単球培養：  上皮細胞培養の6日目に、2×105個/ウェルのU937単球を96ウェルレシーバープレートに播種した。細胞を37℃＋5％CO2で培養し、4日間にわたって培地を24時間ごとに交換した。
【０２５８】
共培養アッセイ：  8〜10日間の培養後、腸細胞を含むトランスウェルプレートを、トランスウェルプレートの基底側チャンバーに加えた10ng/ml IFN-γにより37℃＋5％CO2で24時間処理した。24時間後、上皮細胞培養プレートに新鮮なcRPMIを添加した。経上皮電気抵抗（TEER）リードアウトをIFN-γ処理後に測定して、治療前のTEER値として使用した。次に、SG-11を1μg/ml（40nM）の最終濃度でトランスウェルプレートの頂端チャンバーに加えた。炎症で誘発されたバリア破壊を防止するための陽性対照として、ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）阻害剤ペプチド18（BioTechne社, Minneapolis, MN）を50nMで使用した（Zolotarevskky et al., 202, Gastroenterology, 123:163-172）。アポトーシスを誘発しかつバリア破壊を悪化させるための陰性対照として、細菌由来分子のスタウロスポリンを100nMで使用した（Antonsson and Persson, 2009, Anticancer Res, 29:2893-2898）。化合物を腸細胞上で1時間または6時間インキュベートした。試験化合物とのプレインキュベーション後、腸細胞を含むトランスウェルインサートを、U937単球を含むレシーバープレートの頂部に移した。次に、熱死滅大腸菌（HK大腸菌）（80℃に40分間加熱した細菌）を頂端側と基底側の両方のチャンバーに感染多重度（MOI）10で加えた。トランスウェルプレートを37℃＋5％CO2で24時間インキュベートし、治療後のTEER測定を行った。TEERアッセイは、成熟SG-11タンパク質（SEQ ID NO:5またはSEQ ID NO:9）を用いて実施した。
【０２５９】
データ解析：  オーム（Ω）での生の電気抵抗値を、トランスウェルインサートの表面積（0.143cm2）に基づいて平方センチメートルあたりのオーム（Ωcm2）に変換した。10日間の培養で発生する示差抵抗を調整するために、個々のウェルの治療後のΩcm2読み取り値を治療前のΩcm2読み取り値に対して正規化した。次に、正規化したΩcm2値を未処理サンプルの平均Ωcm2値からの変化パーセントとして表した。
【０２６０】
SG-11タンパク質は、上皮細胞と単球の両方を熱死滅大腸菌（HK大腸菌）に曝露する1時間前（図1A）または6時間前（図1B）に添加した。熱死滅大腸菌は、炎症性メディエーターを産生するように単球を誘導し、TEERの減少によって示される上皮単層の破壊をもたらす。ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）阻害剤を対照化合物として利用した；これは、抗菌性の免疫反応によって引き起こされるバリア破壊を防止し、かつ/またはバリア喪失を逆転させることがわかっている。スタウロスポリンは、上皮細胞のアポトーシスおよび/または死を引き起こし、したがってTEERの劇的な減少をもたらす対照化合物として使用した；これは、上皮細胞のバリア完全性/機能の破壊および/または喪失を示す。図1Aでは、SG-11は、TEERをHK大腸菌による55.8％の破壊から62％に増加させた。図1Bでは、SG-11は、TEERをHK大腸菌による53.5％の破壊から60.6％に増加させた。図1Aおよび図1Bのグラフは、2つの個別の実験（n＝6）からプールされたデータを表す。
【０２６１】
実施例3
熱死滅大腸菌により誘導されるTNF-αおよびIL-23産生に対するSG-11の効果
以下の実験では、サイトカイン産生により測定される免疫活性化を低下させる本明細書に記載のSG-11タンパク質またはその変異体の治療能力を実証する。これにより、この実験は、サイトカインレベルの調節が宿主の疾患状態に影響を与える場合に、胃腸の炎症性疾患または上皮バリア完全性/機能の障害を伴う疾患を治療するための治療用タンパク質の潜在的な機能的有用性を実証する。
【０２６２】
単球による炎症性サイトカインTNF-αおよびIL-23の産生は、実施例2で実施した共培養TEERアッセイの基底側チャンバーからの組織培養上清において測定した。TEERの読み取り後、上清を10,000g、4℃で5分間遠心分離して細胞破片を除去した。Luminex分析は、メーカーの指示（Magpix機器およびxPonentソフトウェアバージョン4.2；Luminex Corporation（Austin, TX））に従って実施した。Luminex分析を行って、単球により産生されたTNF-αおよびIL-23のpg/ml濃度を測定した。Luminex分析では、単一のサンプルからの複数のサイトカイン類の定量化のためにビーズベースのシステムを利用する。ELISAと同様に、Luminexビーズは捕捉抗体でコーティングされており、サンプルとのインキュベーションにより、標的を捕捉抗体に結合させることができる。ビーズを洗浄し、結合した標的の定量化のために蛍光標識した検出抗体とインキュベートする。サイトメトリー解析を使用して、異なった蛍光色素がロードされたビーズ集団を識別し、検出抗体シグナルを測定することによってサイトカインレベルを定量化する。
【０２６３】
未処理の細胞、およびHK大腸菌処理の前にSG-11と6時間プレインキュベートした細胞におけるTNF-αおよびIL-23産生は、1.0に設定されたHK大腸菌により誘発されるpg/ml濃度に対して正規化した。SG-11とのプレインキュベーションはTNF-αとIL-23の両方の産生を減少させた。結果を図2A（TNF-α）および図2B（IL-23）に示す。図2Aおよび図2Bのグラフは、2つの個別の実験（n＝6）からプールされたデータを表す。
【０２６４】
実施例4
熱死滅大腸菌によって誘導されるIL-10産生に対するSG-11の効果
以下の実験では、IL-10産生に対するSG-11投与の効果をTEERアッセイで測定する。
【０２６５】
IL-10の産生は、単球を含む実施例2に記載の共培養TEERアッセイの基底側チャンバーからの組織培養上清において測定した。ルミネックス分析を実施して、単球によって産生されたIL-10のpg/ml濃度を測定した。未処理の細胞、およびHK大腸菌処理の前にSG-11と6時間プレインキュベートした細胞におけるIL-10産生は、1.0に設定されたHK大腸菌により誘発されるpg/ml濃度に対して正規化した。SG-11とのプレインキュベーションはIL-10産生を0.89に減少させた。結果を図3に示す。図3のグラフは、2つの個別の実験（n＝6）からプールされたデータを表す。
【０２６６】
実施例5
熱死滅大腸菌で刺激した後のムチン発現に対するSG-11の効果
以下の実験では、胃腸組織におけるムチン発現を増加させる、本明細書に記載のSG-11タンパク質の効果を測定する。したがって、この実験は、増加したムチン発現が有益である場合に、胃腸管の炎症性疾患、または上皮バリア完全性/機能の障害を伴う疾患を治療するための治療用タンパク質SG-11の機能的有用性の実証である。
【０２６７】
実施例2に記載の共培養TEERアッセイの頂端側チャンバーからの上皮細胞単層において遺伝子発現を測定した。上皮細胞単層から全RNAを単離し、cDNAを合成した。HK大腸菌を24時間加える前にSG-11（1μg/ml；40nM）で6時間処理したHCT8およびHT29-MTX細胞から生成されたcDNAに対してqRT-PCRを実施した。muc2遺伝子の発現を平均倍率変化±SEMとしてグラフ化する。統計分析はHK大腸菌と比較した一元配置ANOVAにより行い、多重比較のためにフィッシャーのLSD検定を使用した。
【０２６８】
muc2遺伝子発現の分析は、HK大腸菌処理のみが未処理の細胞と比べて13.6倍の増加をもたらしたことを明らかにした（p＝0.0007）。HK大腸菌で刺激しかつSG-11で処理した細胞は、HK大腸菌を上回ってさらに1.4倍増加した（p＝0.03）（図4）。図4のグラフは、単一の実験（n＝3）からのデータを表す。HK大腸菌に応答して、muc2産生の著しい増加が観察された。
【０２６９】
実施例6
上皮細胞の創傷治癒に対するSG-11の効果
以下の実験では、胃腸上皮細胞の創傷治癒を増加させる本明細書に記載のタンパク質の治療能力を実証する。したがって、この実験は、上皮細胞の創傷治癒の増加が有益である場合に、胃腸の炎症性疾患または上皮バリア完全性/機能の障害を伴う疾患を治療するための治療用タンパク質SG-11の機能的有用性の実証である。
【０２７０】
各ウェルの中央部に細胞の付着を防ぐプラグを含む96ウェルのOris Cell Migrationアッセイをメーカー（Platypus Technologies, Madison, WI）の指示に従って使用した。
【０２７１】
遊走アッセイプレートを使用前に室温に温め、細胞の添加に先立って100％コンフルエンスウェルからプラグを取り外した。HCT8腸細胞株とHT29-MTX杯細胞株を9：1の比率で使用し、ウェルあたり合計5×104個の細胞を加えた（4.5×104個のHCT8細胞および0.5×104個のHT29-MTX細胞）。細胞を37℃＋5％CO2で24時間インキュベートした。その後、全ての対照ウェルおよびサンプルウェルからプラグを取り外した。対照ウェルは、希釈ビヒクルで処理した細胞をブランクとして、30ng/mlの上皮増殖因子（EGF）で処理した細胞を陽性対照として、100nMのスタウロスポリンで処理した細胞を陰性対照として含んでいた（全てをcRPMIで希釈した）。サンプルウェルは、cRPMIで希釈した1μg/mlの濃度のSG-11タンパク質（SEQ ID NO:5および/またはSEQ ID NO:9）を含んでいた。100％および0％ウェルをcRPMIで培養した。細胞に処理を加えて、37℃＋5％CO2で48時間インキュベートした。生細胞を染色する前に、0％ウェルからプラグを取り外した。処理培地を除去し、0.9mM CaCl2および0.5mM MgCl2を含むPBSで細胞を洗浄した。緑色蛍光の生存性色素Calcenin AMを、0.9mM CaCl2および0.5mM MgCl2を含むPBS中の0.5μg/mlの濃度で、全ウェルに添加し、37℃＋5％CO2で30分間インキュベートし、該色素を除去し、細胞を0.9mM CaCl2および0.5mM MgCl2を含むPBSで洗浄して、蛍光を測定した。細胞播種の前にプラグを取り外した100％ウェルの相対蛍光値を最大効果として設定し、染色直前までプラグが所定の位置に残っていた0％ウェルをベースラインとして使用した。サンプルを100％サンプルと0％サンプル間で正規化し、値を増殖パーセントとして表した。
【０２７２】
図5に示すように、SG-11で処理すると、増殖の有意な増加が観察された。対照化合物は予想通りに創傷治癒を調節し、EGFは増殖を増加させ、スタウロスポリンは細胞増殖を抑制した。図5のグラフは、5つの実験（n＝15）からプールされたデータを表す。データは、SEQ ID NO:5のSG-11を1つの実験で使用し、SEQ ID NO:9を4つの実験で使用した、5つの独立した反復実験を表す。
【０２７３】
実施例7
SG-11は炎症性腸疾患の同時DSSモデルで治療活性を示す
実施例7および8は、インビボモデルで炎症性腸疾患を治療する本明細書に記載のタンパク質の能力を実証する。したがって、この実験は、重要な機能および可能性のある作用機序モードを説明した前述のインビトロモデルが、炎症性腸疾患のインビボモデルシステムにつながることの実証である。具体的には、実施例7および8のマウスをデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）で処理したが、この化学物質は腸上皮の損傷を誘発し、それにより腸バリアの完全性および機能を低下させることが知られている。DSSマウスは、広く受け入れられた大腸炎のモデルである。実施例7では、DSSの投与とほぼ同時（投与の6時間前）にマウスをSG-11タンパク質で処理した。実施例8では、SG-11タンパク質で処理する前に、マウスをDSSで6日間処理した。
【０２７４】
実施例7で提示されるグラフは、それぞれ10匹のマウスを使用した3つの独立した実験（n＝30）からプールされたデータを表す。これらの実験で使用したSG-11タンパク質は、N末端タグを含まず、SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む成熟タンパク質（シグナルペプチドなし）であった。2つの実験では、SG-11タンパク質がSEQ ID NO:5から成っていた；3番目の実験では、SG-11タンパク質がSEQ ID NO:7から成っていた。
【０２７５】
8週齢のC57BL/6マウスをケージに5匹ずつ収容し、7日間餌と水を自由に与えた。7日間の順応期間後、飲料水に2.5％DSSを添加したのと同時に治療を開始した。腹腔内（i.p.）注射後の蛍光標識ウシ血清アルブミンによる予備追跡研究は、該タンパク質がi.p.送達後6時間で結腸に到達することを実証した。これらの結果に基づいて、飲料水に2.5％DSSを添加する6時間前に、マウスを50nmol/kgのSG-11（1.3mg/kg）またはGly2-GLP2（0.2mg/kg）でi.p.治療した。この初期治療の6時間後、飲料水を、2.5％DSSを含む水に変えた。マウスを飲料水中の2.5％デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）で6日間処理した。SG-11またはGly2-GLP2を朝と夕（8時間および16時間ごと）に1日2回（b.i.d.）、50nmol/kgでi.p.注射することにより治療を続けた。新鮮な2.5％DSS飲料水を2日ごとに用意した。
【０２７６】
6日目に、マウスを4時間絶食させた後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した4KDaデキストラン[4KDa-FITC] 600mg/kgを強制経口投与した。4KDa-FITCの強制投与の1時間後に、マウスを安楽死させ、血液を採取し、血清中のFITCシグナルを測定した。ビヒクルで処理したDSSマウスと比較して、未処理マウスでは上皮バリアを越えた4KDa-FITCデキストランの移行の有意な増加が観察された。さらに、ビヒクルで処理したDSSマウスと比較して、DSSを投与してSG-11で治療したマウスでは、4KDa-FITCデキストランの有意な減少が観察された。SG-11の場合に観察された4KDa-FITCデキストラン移行の程度は、Gly2-GLP2の陽性対照と同様であった。結果を図6に示し、平均±SEMとして表す。図6のグラフは、3つの独立した実験（n＝30）からプールされたデータを表す。
【０２７７】
SG-11は炎症性腸疾患の同時DSSモデルでバリア機能の炎症中心リードアウトを改善する
SG-11はまた、SG-11を投与したまたは投与しないDSS動物の血液中のLPS結合タンパク質（LBP）のレベルに対するその効果を評価した。炎症性腸疾患を有する患者の臨床疾患活動性に関連しているLPS結合タンパク質（LBP）を、実施例7に記載のDSSモデルで試験されたマウスの血清中でELISAにより測定した。DSSに応答して、LBP濃度の有意な増加が観察された。さらに、ビヒクルで処理したDSSマウスと比較して、DSSを投与してSG-11で治療したマウスではLBPの有意な減少が観察された。さらに、Gly2-GLP2で治療したDSSマウスとSG-11で治療したDSSマウスの間に有意差が観察されたため、対照ペプチドGly2-GLP2と比較して、SG-11はLBP濃度に対してより大きな影響を与えた。結果を図7に示し、平均±SEMとして表す。図7のグラフは、3つの独立した実験（n＝30）からプールされたデータを表す。
【０２７８】
SG-11は炎症性腸疾患の同時DSSモデルで体重減少を防止する
炎症性腸疾患に苦しむ動物の体重減少を改善するための本明細書に記載のタンパク質の治療能力をも評価した。体重減少は炎症性腸疾患の重大かつ潜在的に危険な副作用である。
【０２７９】
この実施例に記載したDSSモデルに含まれるマウスの体重を毎日測定した。0日目の開始体重からの変化パーセントを各マウスについて決定した。DSS処理マウスへのSG-11投与は、ビヒクル処理DSSマウスと比較して体重を有意に改善した。SG-11で治療したマウスの6日目の体重減少は、Gly2-GLP2で観察された体重減少に似通っていた。結果を図8に示す。図8のグラフは、2つの独立した実験（n＝20）からプールされたデータを表す。
【０２８０】
SG-11は炎症性腸疾患のDSSモデルで肉眼的病変を有意に軽減する
この実施例で行った同時DSSモデルに含まれるマウスで肉眼的病変を観察した。DSS処理マウスへのSG-11投与は、ビヒクル処理DSSマウスと比較して肉眼的病変を有意に改善した。DSSを投与して、Gly2-GLP2またはSG-11で治療したマウス間で、臨床スコアの差は観察されなかった。使用したスコアリングシステムは次のとおりであった：（0）＝肉眼的病変なし、（1）＝糞中に見られる血液の筋、（2）＝完全に血性の糞塊、（3）盲腸に見られる血性の糞便物質、（4）盲腸での血性糞便物質および軟便、（5）＝直腸出血。結果を図9に示す。図9のグラフは、3つの独立した実験（n＝30）からプールされたデータを表す。これらのデータは、SG-11が糞便中の血液などのIBDの症状を改善する上で治療的に有効であることを示している。
【０２８１】
さらに、DSSモデル動物からの近位および遠位結腸組織に対して病理組織学的分析を実施した。近位（図10A）および遠位（図10B）の結腸スコア（範囲0〜4）、ならびに近位および遠位結腸スコアの合計を表す結腸の総合スコア（図10C）（0〜8のスケールで評価）が示される。LMA＝粘膜構造の喪失、Edema＝浮腫、INF＝炎症、TMI＝全層性炎症、MH＝粘膜過形成、DYS＝異形成。グラフは2つの独立した実験からプールされたデータを表し、平均±SEMとしてプロットされる。統計分析は、DSS＋ビヒクルと比較した一元配置ANOVA、続いて多重比較のためのフィッシャーのLSD検定により行った。
【０２８２】
SG-11はDSS処理に応答して結腸短縮作用を最小限に抑える
以下の実験では、結腸短縮を防止するまたは最小限に抑える能力を示すことによって、インビボモデルで炎症性腸疾患を治療する本明細書に記載のタンパク質の治療能力を実証する。
【０２８３】
結腸の長さは、実施例7に記載のDSSモデルに含まれるマウスで測定した。DSS処理マウスへのSG-11投与は、DSSによって誘発される結腸短縮を防止した。結腸の長さの有意な改善がGly2-GLP2で観察され、Gly2-GLP2処理はSG-11処理と比べて有意な改善が見られた。結果を図11Aに示す。さらに、DSSに曝露されたマウスをGly2-GLP2またはSG-11のいずれかで治療すると、結腸の重さ対長さの比の有意な改善が生じた（図11B）。図11Aおよび11Bのグラフは3つの独立した実験（n＝30）からプールされたデータを表す。データは平均±SEMとしてグラフ化され、3つの独立した実験（n＝30）からプールされる。統計分析は一元配置ANOVA、続いてフィッシャーのLSD多重比較検定により行った。
【０２８４】
実施例8
SG-11は炎症性疾患のDSSモデルで治療活性を示す
この実施例では、7日間のDSS処理後にSG-11タンパク質をマウスに投与した場合の、DSSマウスモデルにおけるSG-11の効果を調べる実験を行った。これは、DSS処理の直前にSG-11タンパク質をマウスに投与した上記実施例7の治療レジメンとは相違する。この実施例は、インビボモデルで炎症性腸疾患を治療する本明細書に記載のタンパク質の治療能力をさらに実証し、それゆえに、重要な機能および可能性のある作用機序モードを説明した前述のインビトロモデルが、炎症性腸疾患のインビボモデルシステムにつながることを実証する。
【０２８５】
8週齢の雄C57BL/6マウスをケージごとに5匹収容し、7日間餌と水を自由に与えた。7日間の順応期間後、マウスに2.5％DSSを含む飲料水を7日間与えた。7日間のDSS投与中、2日ごとに新鮮な2.5％DSS水を調製した。この治療的DSS研究では、動物を治療するために使用したSG-11を、そのN末端でFLAGタグ（DYKDDDDK；SEQ ID NO:31）に融合させた。
【０２８６】
7日目に通常の飲料水に戻し、50nmol/kgのSG-11（1.3mg/kg）またはGly2-GLP2（0.2mg/kg）のi.p.治療を開始した。朝と夕（8時間および16時間ごと）に1日2回（b.i.d.）6日間治療を施した。
【０２８７】
以下に詳述するように、治療の結果を、体重および肉眼的病変を含む動物の健康状態、結腸組織の病理、バリア破壊の評価、LPS結合タンパク質のレベルについて解析した。
【０２８８】
体重は朝の治療中に毎日測定した。次に、結腸組織を採取し、長さをセンチメートルで測定し、組織の重さを量った。糞便物質を結腸から洗い流し、結腸組織を鉗子1本で穏やかに処理することにより残留PBSを除去した。次に、結腸組織の重さを測定し、mg/mmで表した結腸の重さ対長さの比を決定した。重さの測定に続いて、近位および遠位結腸組織をRNAおよびタンパク質分析のために保存し、残りの組織を病理組織学のために10％中性緩衝ホルマリン中に固定した。統計分析は、血清4KDa-FITC移行、血清LBP濃度、結腸の長さ、および結腸の重さ対長さ比について、DSS＋ビヒクルと比較した一元配置ANOVAで行ったが、体重の分析については二元配置ANOVAを行った。全ての分析において、多重比較のためのフィッシャーのLSD検定を使用した。グラフは2つの実験からプールされたデータを表し、平均値±SEMとしてプロットされる。
【０２８９】
この治療モデルでは、確立されたDSS傷害の回復が測定された。DSSを飲料水から除去した後では未治療マウスも回復を示すため、4KDa-FITCシグナルの増加は6日間のDSS処理後に観察されなかった（図12）。さらに、Gly2-GLP2またはSG-11による治療後にLBPの減少も観察されなかった（図13）。したがって、バリア機能リードアウトの変化は、DSSの治療モデルでは観察されなかった。
【０２９０】
治療用DSSモデルでは、バリア機能リードアウトの変化が観察されなかったが、体重（図14）、結腸の長さ（図15A）、および結腸の重さ対長さ（図15B）などの、臨床パラメータの有意な改善は認められた。バリア機能リードアウトと同様に、血便に基づく肉眼的病変スコアリングシステムは、DSSマウスでさえも6日間の処理後に回復したので、もはや適切でなかった。しかし、肉眼で見える血液は結腸に残っていなかったが、肥厚した結腸がまだ観察された。肉眼的病変所見から、厚い結腸の発生頻度の減少がSG-11治療により観察された（DSS＋ビヒクルで88％、DSS＋SG-11で25％、フィッシャーの正確検定でp＜0.0001、データは示さず）。
【０２９１】
病理組織学的解析を、上記の治療用DSSモデルからの近位および遠位結腸組織に対して実施した。近位（図16A）および遠位（図16B）の結腸スコア（範囲0〜4）、ならびに近位および遠位結腸スコアの合計を表す結腸の総合スコア（範囲0〜8）（図16C）が示される。LMA＝粘膜構造の喪失、Edema＝浮腫、INF＝炎症、TMI＝全層性炎症、MH＝粘膜過形成、DYS＝異形成。グラフは2つの独立した実験からプールされたデータを表し、平均±SEMとしてプロットされる。統計分析は、DSS＋ビヒクルと比較した一元配置ANOVA、続いて多重比較のためのフィッシャーのLSD検定により行った。
【０２９２】
SG-11およびGly2-GLP2による治療は、粘膜構造スコアの若干ではあるが有意な減少をもたらした；炎症スコアおよび全層性炎症スコアに変化はなかった。実施例7で得られた結果と同様に、病理組織学的変化の同様のパターンがSG-11およびGly2-GLP2により観察され、SG-11が上皮細胞を標的とし得るという追加の証拠をもたらした。
【０２９３】
実施例9
安定で治療的に活性なSG-11変異体のデザイン
SG-11は、共生細菌ロゼブリア・ホミニスに由来する治療用タンパク質である。DSSモデルにおいてプロバイオティクスとしてR. ホミニスを投与すると、腸のバリア機能（4KDa-FITCおよびLBP）、体重および臨床スコアの改善を伴う有効性が実証された（データは示さず）。
【０２９４】
翻訳後修飾（PTM）は治療用タンパク質の組換え生産に影響を与える可能性があり、また、治療用タンパク質は、大規模な発現および精製中ならびに長期保存中に起こり得る翻訳後修飾（PTM）の影響を受ける可能性がある。そのようなPTMには、メチオニンの酸化、アスパラギンの脱アミド、2つのシステイン間の分子間および/または分子内ジスルフィド結合が含まれるが、これらに限定されない。PTMのリスクを軽減しようとして、タンパク質の安定性に影響を与える可能性のある残基を置き換えることにより、SG-11の改変を行った。タンパク質安定性の改善とインビトロおよびインビボ活性の維持に関する研究は、実施例9〜14に記載される。
【０２９５】
第1のステップとして、SG-11アミノ酸配列（SEQ ID NO:7）を類似の原核生物タンパク質にアライメントした。検索結果に基づいて特定された残基は、治療用タンパク質の安定性を高めるためのアミノ酸置換に使用することができる。
【０２９６】
最初に、GenBank非冗長タンパク質データベース（NCBI BLAST/デフォルトパラメータ/BLOSUM62マトリックス）のBlast検索を実行して、SG-11と相同であり得る他の原核生物タンパク質を同定した。同定されたタンパク質配列を図17に示す。SEQ ID NO:21は、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）由来の仮想タンパク質（GenBank：WP_006857001.1；BLAST E値：3e-90）である；SEQ ID NO:22は、ロゼブリア属菌種（Roseburia sp.）831b由来の仮想タンパク質（GenBank:WP_075679733.1；BLAST E値：4e-58）である；およびSEQ ID NO:23は、ロゼブリア・イヌリニボランス由来の仮想タンパク質（GenBank: WP_055301040.1；BLAST E値：1e-83）である。
【０２９７】
SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23のそれぞれは、示したタンパク質の予測された成熟型（シグナルペプチドを欠く）であり、N末端メチオニンを含む。これらの配列とSG-11（SEQ ID NO:7）との多重配列アラインメントを実施して、これらのタンパク質間で保存された領域を特定した。このアライメントを図17に示す。このアライメントを使用して、特定のアミノ酸（複数可）を置換することの潜在的な影響を評価するために、異なるタンパク質間で最も保存されている残基を特定した。SG-11のいくつかの部分は、ある程度または高度に保存されており、該タンパク質の特定の位置にあるアミノ酸は、アライメントされたタンパク質の4つ全てで、または4つのタンパク質の少なくとも2つ（複数位置）もしくは3つ（複数位置）で同一である。SG-11のこれらのホモログ間の高い配列保存は、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23もまた、健康な上皮バリアを維持する上で重要な機能を保有し得ることを示唆する。したがって、本開示は、本開示の疾患を治療するためにSEQ ID NO：21〜23を利用する方法、およびそれらを作成する方法を提供する。
【０２９８】
実施例10
SG-11の翻訳後修飾（PTM）の分析
LC/MS/MSを使用して、特にPTMを受けやすいSG-11の残基を特定するための研究を実施した。この分析は、1）SG-11のアミノ酸配列（SEQ ID NO:9）を確認するために、および2）生物学的活性と免疫原性の低下を引き起こす可能性のある翻訳後修飾、特に脱アミドと酸化を調べるために、LakePharma社（Belmont, CA）によって実施された。
【０２９９】
ペプチドマッピングとPTM分析のために、サンプルをDTTおよびIAAで処理した後、トリプシン消化を行った。次に、消化したサンプルを、Protein BEH C18カラムを用いたXevo G2-XS QTOF質量分析計に接続されたWaters ACQUITY UPLCで分析した。
【０３００】
ペプチドマッピングおよび配列決定により、予測されたアミノ酸配列が確認され、複数の脱アミド部位と1つの酸化部位も示された。それらの中で、N53の7.84％およびN83の3.77％が脱アミド化されている。表6に示したこれらの結果は、N53とN83が非ストレス条件下での脱アミドの主要な部位であることを示している。N53は、最初の位置にメチオニンを有する成熟SG-11（SEQ ID NO:7）の53番目の位置にあるアスパラギン（Asn; N）を示す。
【０３０１】
（表６）SG-11の翻訳後修飾
2020516615.tif 000009
1 SG-11（SEQ ID NO:7）におけるアミノ酸位置
2 全ペプチドイオン強度に対して正規化した
3 修飾ありまたは修飾なしの対応する前駆体の全強度に対して正規化した
【０３０２】
実施例11
SG-11の強制分解
SG-11（SEQ ID NO:9）はまた、精製済みの組換えSG-11の安定性をさらに特徴づけるために、以下の表7に示す一連のストレス条件下で試験した。ストレスを受けたサンプルを、凝集物および/または分解物の存在についてSEC-HPLCで分析した。脱アミドおよび酸化のレベルを決定するためにLC/MS/MSを実施した。
【０３０３】
（表７）
2020516615.tif 000010
【０３０４】
この分析では、SG-11（SEQ ID NO:9）は、pH4およびpH9での試験を除き、PBS＋10％グリセロール（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、10％グリセロール、pH8.0）中に1mg/mlの濃度で存在した。pH4の場合は、SG-11（SEQ ID NO:9）を酢酸ナトリウムバッファー（50mM酢酸ナトリウム、150mM NaCl、pH4）中に1mg/mlの濃度で調製した。pH9の場合は、SG-11（SEQ ID NO:9）をCAPSO（3-シクロヘキシルアミノ-2-ヒドロキシ-1-プロパンスルホン酸）バッファー（50mM CAPSO、150mM NaCl、pH9）中に1mg/mlの濃度で調製した。
【０３０５】
この分析は、4℃で処理したSG-11（SEQ ID NO:9）サンプルが低レベルの凝集物を含むことを示す。温度を上げていくと、凝集が増加した。37℃で、大きな凝集が生じた。対照的に、機械的ストレスおよび凍結と融解の繰り返しは、タンパク質の凝集も分解も引き起こさない。
【０３０６】
3つのサンプルを、それぞれ、40℃での2週間のインキュベーション、酸化（H2O2処理）または高pH9のいずれかで処理し、実施例10に記載したようにPTMについてLC/MS/MSで分析した。以下の表8に示すように、N83の有意な脱アミドが40℃でのサンプル処理後に起こり、ほぼ100％の脱アミドが生じた。過酸化水素で処理したサンプルでは、N83の有意な脱アミド（37％）とM200の酸化（63.9％）が観察された。N53の7.84％は処理をしなくとも脱アミド化された。
【０３０７】
（表８）
2020516615.tif 000011
2020516615.tif 000012
1 SG-11（SEQ ID NO:7）におけるアミノ酸位置
【０３０８】
還元後、このアッセイではシステイン残基の酸化をブロックするために、遊離システインをヨードアセトアミドで人工的にカルバミドメチル化した。
【０３０９】
実施例12
システイン残基およびSG-11の安定性
SG-11（SEQ ID NO：9）の安定性は、バッファーC（100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、0.5Mソルビトール）中37℃で1週間、および4℃で3週間インキュベートした後に評価した。安定性は、バッファーD（100mMリン酸ナトリウム、pH7.0、10％グリセロール）で平衡化した分析用サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）で凝集物の形成をモニタリングすることにより評価した。解凍したてのタンパク質と比較して、4℃で3週間保存した後に目立った変化は観察されず、両サンプルとも1.57mLで単一のピークを示した。しかし、37℃で1週間インキュベートした後、サンプルは、最小のピークである1.57mLでの単量体ピークに加えて、1.29および1.41mLで凝集体ピークを明確に示した。凝集の原因は次のように考察された。SG-11には（SEQ ID NO:7に対して）位置147および151に2つのシステイン残基が存在する。エルマン試薬アッセイにより、SG-11（SEQ ID NO:9）に遊離スルフヒドリル基が存在することが明らかになり、Cys147および/またはCys151は安定なジスルフィド結合を形成していないことが示された。遊離スルフヒドリル基は好ましくない分子間ジスルフィド結合を形成することにより凝集を引き起こす可能性があるため、β-メルカプトエタノールなどの還元剤の存在が凝集を防止できるかどうかを調べた。37℃での4日間のインキュベーション後に、β-メルカプトエタノールなしでは凝集が形成されたのとは対照的に、バッファー（50mMリン酸ナトリウム、150mM NaClおよび10％グリセロール）中の2.5％（v/v）β-メルカプトエタノールの存在下では凝集が大幅に抑制された。これらの結果から、Cys147および/またはCys151は凝集を引き起こす遊離スルフヒドリル基を提供することが示唆された。
【０３１０】
実施例13
SG-11変異体の翻訳後修飾
SG-11タンパク質は高温で安定であるが、37℃で1週間のうちに凝集物を形成することは、下流の処理段階で問題になる可能性がある。LC/MS/MSで見つかったアスパラギン残基の脱アミドもリスク因子である。SEQ ID NO:3またはその変異体を含むタンパク質の製造性を改善するために、SG-11変異体（例えば、SG-11V1 (SEQ ID NO:11)、SG-11V2 (SEQ ID NO:13)、SG-11V3 (SEQ ID NO:15)、SG-11V4 (SEQ ID NO:17)およびSG-11V5 (SEQ ID NO:19)）のデザインでは、実施例10〜12の結果を考慮して、有害なPTMの出現を減らすようにした。
【０３１１】
実施例13〜16では、アミノ酸置換がSG-11変異体SG-11V5（SEQ ID NO:19；SEQ ID NO:7に対してN53S、N83S、C147V、C151Sを含む）の安定性と機能に及ぼす影響を特徴付けるために行った実験を記載する。SG-11V5（実施例1に記載のように発現させて精製した）。
【０３１２】
SG-11（SEQ ID NO:9）をストレス条件にさらしたときにPTMが観察されたことにより（実施例11）、SG-11V5（SEQ ID NO:19）を実施例11に記載の方法を用いて翻訳後修飾についてLC-MS/MSで分析し、SG-11（SEQ ID NO:7）のPTMと比較した。
【０３１３】
この分析では、野生型SG-11（SEQ ID NO:7）とSG-11V5（SEQ ID NO:19）のPTMを比較した。最初の分析（以下の表9に示す結果）では、タンパク質をバッファー1（50mM NaPO4-、pH8、150mM NaCl、10％グリセロール）中に1mg/mlの濃度で保存し、4℃または40℃で2週間保存した。次に、タンパク質をDTTおよびIAAで処理してからトリプシン消化を行った。次に、消化したサンプルを、Protein BEH C18カラムを使用したXevo G2-XS QTOF質量分析計に接続されたWaters ACQUITY UPLCで分析した。LC-MS/MSによるタンパク質の分析により、SG-11V5タンパク質は、4℃と40℃の両方で、SG-11と比較して、開始メチオニンの酸化およびN137の脱アミドの割合が有意に低いことが示された。
【０３１４】
（表９）
2020516615.tif 000013
【０３１５】
2番目の分析では、SG-11（SEQ ID NO:7）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）タンパク質をそれぞれ、様々なバッファーに入れて40℃で保存した。その結果を以下の表10に示す。この実験で使用した保存バッファーは、表10に示すように、10％ソルビトール含有（＋Sor）または10％ソルビトール不含（−Sor）および10％グリセロール含有（＋Gly）または10％グリセロール不含（−Gly）の100mM NaPO4-、pH7であった。表10のデータが示すように、SG-11（SEQ ID NO:7）タンパク質と比較して、SG-11V5（SEQ ID NO:19）タンパク質では、最初の位置のメチオニンの酸化が全てのバッファー条件で大幅に減少した。また、これらの2つのタンパク質のN137脱アミドのレベルにも違いがあり、少なくともグリセロールの存在によって、さらにソルビトールとグリセロールの両方の存在によっても、N137脱アミドの大きな減少が生じた。これらのデータは、SG-11タンパク質のアミノ酸の置換が溶液中の該タンパク質のPTMにかなり有益な効果を及ぼし得ることを示している。
【０３１６】
（表１０）
2020516615.tif 000014
【０３１７】
実施例14
SG-11変異体の構築および安定性分析
SG-11タンパク質は高温で非常に安定しているが、37℃で1週間のうちに凝集物を形成することは、下流の処理段階で問題になる可能性がある。LC/MS/MSで見つかったアスパラギン残基の脱アミドもリスク因子である。SEQ ID NO:3またはその変異体を含むタンパク質の製造性を改善するために、SG-11（SEQ ID NO:7）として示されるタンパク質を、次の4つの置換を含むように変異させた：N53S、N83S、C147VおよびC151S。4つの置換を含むこの変異体は、SG-11V5と指定され、本明細書ではSEQ ID NO:19として提供される。精製したSG-11およびSG-11V5の安定性は、異なる保存バッファー処方物中で試験された。SG-11V5（SEQ ID NO:19）はSEQ ID NO:7に対して約98.3％の配列同一性を有する。
【０３１８】
SG-11の安定性分析
図18は、諸条件がSG-11（SEQ ID NO:7）の安定性に及ぼす影響を示す。具体的には、精製したSG-11（SEQ ID NO:7）をpH5.2（図18A、18Bおよび18C）、pH7.0（図18D、18Eおよび18F）およびpH8.0（図18G、18Hおよび18I）中でインキュベートした。添加剤の影響も3つの異なるpH条件で試験した：150mM NaCl（図18A、18Dおよび18G）；150mM NaClと100mMアルギニン（図18B、18Eおよび18H）；および150mM NaClと0.5Mソルビトール(図18C、18Fおよび18I)。安定性は分析用SECで分析した。矢印は単量体型の保持時間を示す。
【０３１９】
SG-11V5の安定性分析
図19は、諸条件がSG-11V5（SEQ ID NO:19）の安定性に及ぼす影響を示す。SG-11V5（SEQ ID NO:19）をpH5.2（図19A、19Bおよび19C）、pH7.0（図19D、19Eおよび19F）およびpH8.0（図19G、19Hおよび19I）中でインキュベートした。添加剤の影響も3つの異なるpH条件で試験した：150mM NaCl（図19A、19Dおよび19G）；150mM NaClと100mM Arg（図19B、19Eおよび19H）；および150mM NaClと0.5Mソルビトール(図19C、19Fおよび19I)。安定性は分析用SECで分析した。矢印は単量体型の保持時間を示す。
【０３２０】
pH7.0で100mMアルギニンの存在下では、精製SG-11（SEQ ID NO:7）タンパク質の凝集物形成は大幅に抑制された。しかし、初期保持時間でいくつかの小さなピークが観察され、単量体型以外の異なる型が存在することが示された。この実施例で試験した全ての条件下で、SG-11V5（SEQ ID NO:19）は大量の凝集を示さなかった。添加剤なしでは、個別の単量体ピークが観察された。1.34mLでの小さな凝集ピークは、100mMアルギニンまたは0.5Mソルビトールによって抑制された。精製したSG-11（SEQ ID NO:7）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）はpH5.2で沈殿した。
【０３２１】
温度が上昇すると、脱アミドによる凝集および分解に対するタンパク質の感受性が高まる可能性がある。脱アミドおよび凝集に関連する潜在的な不安定性を最小限に抑えるために、変異N53S、N83S、C147VおよびC151SをSG-11に導入した。こうして、SG-11V5はpH7.0およびpH8.0で改善された安定性を示した。
【０３２２】
実施例15
SG-11V5のインビトロ機能解析
SG-11変異体、例えばSG-11V5が、SG-11タンパク質について示された（例えば、実施例2を参照）上皮バリア機能の維持に関連した機能性を維持していることを実証するために、インビトロTEERアッセイを行った。
【０３２３】
細胞培養を実施例2に記載したように行った。簡単に説明すると、8〜10日間の培養後、腸細胞を含むトランスウェルプレートを、トランスウェルプレートの基底側チャンバーに加えた10ng/mlのIFN-γにより37℃＋5％CO2で24時間処理した。24時間後、上皮細胞培養プレートに新鮮なcRPMIを加えた。経上皮電気抵抗（TEER）の読み取り値をIFN-γ処理後に測定して、治療前のTEER値として使用した。次に、SG-11（SEQ ID NO:9）またはSG-11V5（SEQ ID NO:19）を1μg/ml（40nM）の最終濃度でトランスウェルプレートの頂端チャンバーに加えた。ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）阻害剤ペプチド18（BioTechne社, Minneapolis, MN）を、炎症誘発バリア破壊を防止するための陽性対照として50nMで使用した（Zolotarevskky et al., 202, Gastroenterology, 123:163-172）。化合物を腸細胞上で6時間インキュベートした。試験化合物とのプレインキュベーション後、腸細胞を含むトランスウェルインサートを、U937単球を含むレシーバープレートの上部に移した。次に、熱死滅した大腸菌（HK大腸菌）（80℃に40分間加熱した細菌）を頂端側と基底側の両方のチャンバーに感染多重度（MOI）10で加えた。トランスウェルプレートを37℃＋5％CO2で24時間インキュベートし、治療後のTEER測定を行った。SG-11（SEQ ID NO:9）はTEERをHK大腸菌による78.6％破壊から89.5％に増加させ（p＜0.0001）、一方SG-11V5（SEQ ID NO:19）は89.1％に増加させた（p＜0.0001）（図20）。HK大腸菌と比較した一元配置ANOVA、続いてフィッシャーのLSD多重比較検定を使用して、統計分析を行った。図20のグラフは、2つの個別の実験（n＝12）で行った4つのプレートからプールされたデータを表す。
【０３２４】
実施例16
SG-11V5のインビボ機能解析
次に、実施例7および8で上述したように実施したDSS動物モデル実験を、SG-11またはSG-11V5（SEQ ID NO:19）を並行して試験するために繰り返した。これらの実験では、SG-11またはSG-11V5を（実施例7のように）DSS処理の開始と同時に、または事前のDSS投与後に、マウスに投与した。唯一の相違は、実施例8のマウスがSG-11またはSG-11V5（SEQ ID NO:19）で、6日間ではなく4日間治療されたことである。
【０３２５】
最初のDSSマウスモデル（実施例16A；実施例7と同じ方法）では、0日目にマウスを試験化合物で腹腔内（i.p.）処理し、6時間後にDSS処理を開始した。投与された用量には、SG-11（SEQ ID NO:9）についての50nmol/kg（1.3mg/ml）、およびGly2-GLP2（0.2mg/kg）、ならびに16nmol/kg（0.4mg/ml）、50nmol/kg（1.3mg/ml）および158nmol/kg（4.0mg/kg）を含むSG-11V5（SEQ ID NO:19）についての用量反応が含まれていた。マウスを飲料水中の2.5％DSSで6日間（0日目から6日目まで）処理した。治療用タンパク質による治療をDSS曝露期間中1日2回施した。
【０３２６】
2番目の実験（実施例16B；実施例8と同じ方法）では、マウスに2.5％DSSを含む飲料水を7日間与えた。7日目に通常の飲料水に戻し、50nmol/kgのSG-11（SEQ ID NO:9）（1.3mg/kg）、SG-11V5（SEQ ID NO:19）（1.3mg/kg）、またはGly2-GLP2（0.2mg/kg）のi.p.治療を開始した。治療は朝と夕（8時間および16時間ごと）に1日2回（b.i.d.）、4日間施した。両方のDSSモデル（実施例16Aおよび16B）では、DSS投与中に2日ごとに新鮮な2.5％DSS水を用意した。
【０３２７】
各DSS実験の終わりに、マウスを4時間絶食させた後、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した4KDaデキストラン[4KDa-FITC] 600mg/kgを強制経口投与した。4KDa-FITCの強制投与の1時間後に、マウスを安楽死させ、血液を採取し、血清中のFITCシグナルを測定した。最初のモデルでは、上皮バリアを越えた4KDa-FITCデキストランの移行の有意な増加が、未処理のマウスと比較して、ビヒクルで処理したDSSマウスで観察された。これらの結果を図21Aに示す：SG-11（SEQ ID NO：9）は4KDa-FITCシグナルを有意に減少させた（p＝0.04）。SG-11V5（SEQ ID NO：19）も4KDa-FITCシグナルを減少させたが、その差は統計的有意性に達しなかった（p＝0.21）。図21Bでは、実施例8の以前の結果と同様に、4KDa-FITCの増加が観察されなかったため、SG-11またはSG-11V5治療の効果は観察されなかった。両方のグラフのデータは平均±SEMとしてプロットされ、各図は個別の実験（n＝10/群）からのデータを表す。
【０３２８】
炎症性腸疾患のDSSモデルでのバリア機能の炎症中心リードアウトに対するSG-11V5の効果
上記DSSモデルの完了時に、実施例7で詳述したプロトコルに従って、LBPレベルをバリア機能の炎症中心リードアウトとして測定した。両方のDSSモデル（実施例16Aおよび16B）の完了時に、血液を採取して、血清を分離した。市販のELISAキット（Enzo Life Sciences社, Farmingdale, NY）を使用して、血清中のLPS結合タンパク質（LBP）レベルを測定した。結果を図22A（実施例16A）および図22B（実施例16B）に示す。実施例16AのDSSモデルでは、DSS曝露に応答してLBPの有意な増加が観察された。SG-11（SEQ ID NO:9）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）の50nmol/kg用量で、LBPの同様の減少が観察されたが、どちらも統計的に有意ではなかった。しかし、158nmol/kgの高用量のSG-11V5（SEQ ID NO:19）治療は、LBP産生の有意な減少をもたらした（p＝0.003）（図22A）。実施例16BのDSSモデルでは、DSSへの曝露がLBP産生の有意な増加をもたらした（図22B）。しかし、どの治療でもLBPの減少は観察されず、SG-11（SEQ ID NO:9）とSG-11V5（SEQ ID NO:19）の両方について同様の結果が観察された。理論に拘束されるものではないが、循環中のLBPの半減期（12〜24時間と報告）が長いため、治療開始前にLBP応答が誘発される（DSSが投与される）モデルにおいて全身LBPレベルの低下を観察することは難しいと考えられる（Behrendt, D., J. Dembinski, A. Heep, and P. Bartmann. 2004. Lipopolysaccharide binding protein in preterm infants. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 89: F551-554）。
【０３２９】
炎症性腸疾患のDSSモデルでの体重に対するSG-11およびSG-11V5の効果
実施例16Aと実施例16Bの両方の実験モデルを通して体重を測定した。実施例16AのDSSモデル（図23A）では、50nmol/kgのSG-11（SEQ ID NO:9）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）治療について、体重の同様の傾向が観察され、158nmol/kgのSG-11V5（SEQ ID NO:19）では、6日目に体重の有意な改善が観察された。同様のパターンが治療用DSSモデルでも観察され、SG-11（SEQ ID NO：9）とSG-11V5（SEQ ID NO：19）は50nmol/kg用量で同様の体重変化を示し、両方とも11日目に統計的に改善された体重変化があった（p＜0.05）。図23Aおよび図23Bでは、データは平均±SEMとしてグラフ化され、各グラフは個別の実験からのデータを表す。DSS＋ビヒクル群と比較した二元配置ANOVAをフィッシャーのLSD多重比較検定と共に使用して、統計分析を行った。
【０３３０】
炎症性腸疾患のDSSモデルでの肉眼的病変に対するSG-11およびSG-11V5の効果
結腸組織の肉眼的病変観察は、上記実施例7に記載したように実施例16Aについて行った。簡単に説明すると、目に見える血液と糞塊コンシステンシー（consistency）のレベルに基づいたスコアリングシステムを使用した。使用したスコアリングシステムは次のとおりであった：（0）＝肉眼的病変なし、（1）＝糞中に見られる血液の筋、（2）＝完全に血性の糞塊、（3）盲腸に見られる血性の糞便物質、（4）盲腸での血性糞便物質および軟便、（5）＝直腸出血。SG-11（SEQ ID NO:9）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）について同様の結果が50nmol/kgの用量で得られた；SG-11V5（SEQ ID NO:19）では用量依存的効果が観察され、160nmol/kg用量は有意な改善をもたらした（p＜0.002）。図24に示すデータは平均±SEMとして表され、個別の実験からのデータを含む。一元配置ANOVA、続いてフィッシャーのLSD多重比較検定を使用して、統計分析を行った。
【０３３１】
炎症性腸疾患のDSSモデルでの結腸の長さに対するSG-11およびSG-11V5の効果
実施例16からのDSSモデルは、結腸の長さに対するSG-11およびSG-11変異体タンパク質の効果についても分析された。結腸の長さの測定を実施例16A（図25A）または実施例16B（図25B）のDSSモデルで行った。両方のDSSモデルでSG-11（SEQ ID NO:9）およびSG-11V5（SEQ ID NO:19）により同様の結果が得られ、両治療レジメンは結腸の長さの有意な増加をもたらした。しかしながら、実施例16AのDSSモデルでは、結腸の長さに対する用量依存的効果がSG-11V5（SEQ ID NO:19）で観察されなかった。両方のグラフのデータは平均±SEMとして表され、個別の実験からのデータを表す。DSS＋ビヒクルと比較した一元配置ANOVA、続いてフィッシャーのLSD多重比較検定を使用して、統計分析を行った。
【０３３２】
炎症性腸疾患のDSSモデルでの結腸の重さ対長さ比に対するSG-11およびSG-11V5の効果
実施例16からのDSSモデルは、結腸の重さ対長さ比に対するSG-11およびSG-11変異体タンパク質の効果についても分析された。結腸の重さ対長さ比は、実施例16A（図26A）および実施例16B（図26B）のDSSモデル治療レジメンにおいてSG-11（SEQ ID NO:9）とSG-11V5（SEQ ID NO:19）の間で類似していた。実施例16Aの治療では、全ての治療および用量が結腸の重さ対長さ比を有意に改善した（p＜0.05）。実施例16Bの治療レジメンでは、SG-11（SEQ ID NO:9）とSG-11V5（SEQ ID NO:19）は両方とも、結腸の重さ対長さ比を有意に改善した（p＜0.01）が、陽性対照Gly2-GLP2は改善しなかった。フィッシャーのLSD多重比較検定を使用して、DSS＋ビヒクルと比較した一元配置ANOVAにより統計分析を行った。データは平均±SEMとしてグラフ化され、各図は単一の実験からのデータを表す。
【０３３３】
上記の開示は、理解を明確にするための例示および実施例によって多少詳しく説明されているが、当業者には明らかなように、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、特定の変更および修正を加えることができる。したがって、上記説明は本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０３３４】
表11は、本開示のSEQ ID NOを詳細な情報と共に示す。
【０３３５】
（表１１）
2020516615.tif 000015
2020516615.tif 000016
2020516615.tif 000017
【０３３６】
本開示の番号付き実施態様
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示には以下の番号付き実施態様が明記される。
【０３３７】
治療の方法
１．
胃腸上皮細胞バリア機能障害を治療する方法であって、
a.  それを必要とする患者に、
i.  SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む治療用タンパク質、および
ii. 薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物を投与すること
を含む、方法。
２．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が胃腸壁の完全性の低下に関連する疾患である、項1に記載の方法。
３．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が胃腸粘膜上皮の完全性の低下に関連する疾患である、項1または２の方法。
４．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が腸上皮の完全性の低下に関連する疾患である、項1〜3のいずれか1つの方法。
５．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸嚢炎、過敏性腸症候群、腸内感染症、クロストリジウム・ディフィシル感染症、代謝性疾患、肥満、2型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝臓障害、アルコール性脂肪性肝炎、セリアック病、壊死性腸炎、胃腸障害、短腸症候群、GI粘膜炎、化学療法誘発性粘膜炎、放射線誘発性粘膜炎、口腔粘膜炎、間質性膀胱炎、神経障害、認知障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、自閉症、化学療法関連脂肪性肝炎（CASH）、および前述の疾患の小児バージョンからなる群より選択される少なくとも1つである、項1〜4のいずれか1つの方法。
６．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が炎症性腸疾患である、項1〜5のいずれか1つの方法。
７．
胃腸上皮細胞バリア機能障害がクローン病である、項1〜6のいずれか1つの方法。
８．
胃腸上皮細胞バリア機能障害が潰瘍性大腸炎である、項1〜6のいずれか1つの方法。
９．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜8のいずれか1つの方法。
１０．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜9のいずれか1つの方法。
１１．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜10のいずれか1つの方法。
１２．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜11のいずれか1つの方法。
１３．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜12のいずれか1つの方法。
１４．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項1〜13のいずれか1つの方法。
１５．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
１６．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
１７．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
１８．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
１９．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
２０．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
２１．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜14のいずれか1つの方法。
２２．
前記投与することが、直腸、非経口、静脈内、局所、経口、皮膚、経皮、または皮下投与を含む、項1〜21のいずれか1つの方法。
２３．
前記投与することが、患者の口、胃腸管腔、および/または腸への投与である、項1〜22のいずれか1つの方法。
２４．
患者が胃腸上皮細胞バリア機能障害に関連する少なくとも1つの症状の軽減を経験する、項1〜23のいずれか1つの方法。
２５．
患者が、腹痛、血便、膿の混じった便、発熱、体重減少、頻繁な下痢、倦怠感、食欲減退、しぶり、および直腸出血からなる群より選択される胃腸上皮細胞バリア機能障害に関連する少なくとも1つの症状の軽減を経験する、項1〜24のいずれか1つの方法。
２６．
前記投与することが患者の胃腸の炎症を軽減する、項1〜25のいずれか1つの方法。
２７．
前記投与することが患者の腸粘膜の炎症を軽減する、項1〜25のいずれか1つの方法。
２８．
前記投与することが患者の腸組織におけるムチンの産生を増加させる、項1〜25のいずれか1つの方法。
２９．
前記投与することが患者における腸上皮創傷治癒を増加させる、項1〜25のいずれか1つの方法。
３０．
前記投与することが患者における腸上皮細胞の増殖を増加させる、項1〜25のいずれか1つの方法。
３１．
患者に少なくとも1つの第2の治療剤を投与することをさらに含む、項1〜30のいずれか1つの方法。
３２．
患者に少なくとも1つの第2の治療剤を投与することをさらに含み、該第2の治療剤が抗下痢薬、5-アミノサリチル酸化合物、抗炎症剤、抗生物質、抗体、抗サイトカイン剤、抗炎症性サイトカイン剤、ステロイド、コルチコステロイド、および免疫抑制剤からなる群より選択される、項1〜31のいずれか1つの方法。
【０３３８】
薬学的組成物
１．
a.  SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、治療用タンパク質；および
b.  薬学的に許容される担体
を含む、薬学的組成物。
２．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1に記載の薬学的組成物。
３．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1または2の薬学的組成物。
４．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜3のいずれか1つの薬学的組成物。
５．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれか1つの薬学的組成物。
６．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜5のいずれか1つの薬学的組成物。
７．
治療用タンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項1〜6のいずれか1つの薬学的組成物。
８．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
９．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１０．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１１．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１２．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１３．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１４．
治療用タンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの薬学的組成物。
１５．
直腸、非経口、静脈内、局所、経口、皮膚、経皮、または皮下投与用に製剤化された、項1〜14のいずれか1つの薬学的組成物。
１６．
治療用タンパク質が患者の胃腸管腔および/または腸内で活性を有するように製剤化された、項1〜15のいずれか1つの薬学的組成物。
【０３３９】
発現ベクター
１．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
２．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1に記載の発現ベクター。
３．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1または2の発現ベクター。
４．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜3のいずれか1つの発現ベクター。
５．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれか1つの発現ベクター。
６．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜5のいずれか1つの発現ベクター。
７．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項1〜6のいずれか1つの発現ベクター。
８．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
９．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１０．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１１．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１２．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１３．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１４．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１５．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
１６．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの発現ベクター。
【０３４０】
宿主細胞
１．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
２．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1に記載の宿主細胞。
３．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1または2の宿主細胞。
４．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜3のいずれか1つの宿主細胞。
５．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれか1つの宿主細胞。
６．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜5のいずれか1つの宿主細胞。
７．
コードされるタンパク質が、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項1〜6のいずれか1つの宿主細胞。
８．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
９．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１０．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１１．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１２．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１３．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１４．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１５．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１６．
コードされるタンパク質がSEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの宿主細胞。
１７．
外因性ポリヌクレオチドが宿主細胞特異的シグナル配列をさらにコードする、項1〜16のいずれか1つの宿主細胞。
１８．
外因性ポリヌクレオチドが、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、およびSEQ ID NO:20からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸配列を含む、項1〜17のいずれか1つの宿主細胞。
１９．
原核細胞である、項1〜18のいずれか1つの宿主細胞。
２０．
大腸菌（Escherichia coli）細胞である、項1〜19のいずれか1つの宿主細胞。
２１．
真核細胞である、項1〜18のいずれか1つの宿主細胞。
２２．
チャイニーズハムスター卵巣細胞である、項1〜18および21のいずれか1つの宿主細胞。
２３．
タンパク質を生産する方法であって、コードされた該タンパク質の発現に十分な条件下で、項1〜22のいずれか1つの宿主細胞を培養することを含む、方法。
【０３４１】
単離されたタンパク質
１．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、単離された治療用タンパク質。
２．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1に記載の単離された治療用タンパク質。
３．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1または2の単離された治療用タンパク質。
４．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜3のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
５．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
６．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜5のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
７．
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、およびSEQ ID NO:19からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、項1〜6のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
８．
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
９．
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１０．
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１１．
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１２．
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１３．
SEQ ID NO:13のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１４．
SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１５．
SEQ ID NO:17のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１６．
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜7のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１７．
前記タンパク質がインビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、項1〜16のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１８．
前記タンパク質が、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を、該タンパク質の非存在下で行った該アッセイと比較して、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％増加させる、項1〜17のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
１９．
前記タンパク質が、キナーゼ阻害剤の対照と比較して、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、項1〜18のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
２０．
前記タンパク質が、スタウロスポリンまたはミオシン軽鎖キナーゼの対照と比較して、インビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、項1〜19のいずれか1つの単離された治療用タンパク質。
【０３４２】
合成治療用タンパク質
１．
SEQ ID NO:19に対して少なくとも約90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、合成治療用タンパク質。
２．
SEQ ID NO:19に対して少なくとも約95％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1のタンパク質。
３．
SEQ ID NO:19に対して少なくとも約97％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1または2のタンパク質。
４．
SEQ ID NO:19に対して少なくとも約98％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜3のいずれか1つのタンパク質。
５．
SEQ ID NO:19に対して少なくとも約99％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項1〜4のいずれか1つのタンパク質。
６．
SEQ ID NO:19のアミノ酸配列を含む、項1〜5のいずれか1つのタンパク質。
７．
147位のアミノ酸がバリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
８．
151位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
９．
147位のアミノ酸がバリンであり、かつ151位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１０．
84位のアミノ酸がアスパラギン酸である、項1〜5のいずれか1つのタンパク質。
１１．
84位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、147位のアミノ酸がバリンであり、かつ151位のアミノ酸がセリンである、項1〜5のいずれか1つのタンパク質。
１２．
83位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１３．
83位のアミノ酸がセリンであり、147位のアミノ酸がバリンであり、かつ151位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１４．
53位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１５．
53位のアミノ酸がセリンであり、84位のアミノ酸がアスパラギン酸であり、147位のアミノ酸がバリンであり、かつ151位のアミノ酸がセリンである、項1〜5のいずれか1つのタンパク質。
１６．
53位のアミノ酸がセリンであり、83位のアミノ酸がセリンであり、147位のアミノ酸がバリンであり、かつ151位のアミノ酸がセリンである、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１７．
147位のアミノ酸がシステインではなく、151位のアミノ酸がシステインではなく、83位のアミノ酸がアスパラギンではなく、かつ/または53位のアミノ酸がアスパラギンではない、項1〜6のいずれか1つのタンパク質。
１８．
前記タンパク質がインビトロ経上皮電気抵抗アッセイで電気抵抗を増加させる、項1〜17のいずれか1つのタンパク質。
１９．
項1〜17のいずれか1つのタンパク質および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
２０．
胃腸上皮細胞バリア機能障害を治療する方法であって、
a.  それを必要とする患者に、
i.  SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、および/またはSEQ ID NO:19に対して少なくとも約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む治療用タンパク質、および
ii. 薬学的に許容される担体
を含む薬学的組成物を投与する；
ことを含む、方法。
【０３４３】
参照による組込み
本明細書で引用された全ての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０３４４】
しかしながら、本明細書で引用された参考文献、論文、刊行物、特許、特許公報、および特許出願についての言及は、それらが有効な先行技術を構成するまたは世界中のあらゆる国で共通の一般常識の一部を形成することを承認するまたは何らかの形で示唆するものではなく、そのように解釈されるべきではない。
【０３４５】
参考文献
2020516615.tif 000018
2020516615.tif 000019
2020516615.tif 000020
2020516615.tif 000021
【図１】
2020516615.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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