(57)【要約】細胞における組換え事象および／または再編成事象の検出のための方法およびアッセイ法が本明細書に記載される。いくつかの態様において、該方法および／または該アッセイ法はリニア増幅媒介(LAM)-PCRに関する。いくつかの態様において、該組換え事象はV(D)J組換え事象である。2020507326.tif 000021
2020507326.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介（LAM）-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
【請求項２】
前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
以下の工程を含む、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、該Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
【請求項４】
検出されたレパートリーが、V(D)J組換え事象および／または体細胞超突然変異（SMH）を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
検出されたレパートリーが、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、およびCDR3レパートリーを含む、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、およびパイエル板から得られた細胞からなる群より選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
工程（a）を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程；および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のプライマーの各々が、異なるV、D、および／またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数のプライマーの各々が、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
集団的に前記複数のプライマーが、JH1、JH2、JH3、またはJH4の各々における1つの配列に特異的にアニーリングする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
集団的に前記複数のプライマーが、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在するJH、JK、およびJL遺伝子セグメントの各々における少なくとも1つの配列に特異的にアニーリングする、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、標的にされた前記遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする、請求項1〜16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記ソース細胞が初代幹細胞である、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
工程（a）を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞と、V(D)J組換えまたはSHMを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記再編成事象が、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、
AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞
からなる群より選択される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
工程（c）の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記親和性タグがビオチンである、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３０】
前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記親和性精製が、工程（c）の産物を基質に結合することを含む、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記基質がビーズである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、請求項1〜33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、請求項1〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
工程（c）の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、請求項1〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、請求項1〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、請求項1〜38のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
工程（e）において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、請求項1〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞が工程（a）の前に組織中に存在する、請求項1〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、請求項1〜41のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、請求項1〜42のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、請求項1〜45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項1〜46のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
ブロッキング消化工程（f）が省略される、請求項1〜47のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
末端修復が工程（c）の前に実施されない、請求項の1〜48いずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32および43〜65より選択される、請求項1〜50のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119条（e）の下、2017年2月13日に出願された米国特許仮出願第62/458,244号の恩典を主張し、その内容は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された助成金番号AI020047の下で政府支援によってなされた。米国政府は、本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子提出されている配列表を含有し、これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。2018年2月9日に作成されたASCIIコピーは、701039-086701-PCT_SL.txtと命名され、16,157バイトサイズである。
【０００４】
技術分野
本明細書に記載の技術は、細胞における組換え事象および／または再編成事象、例えば、V(D)J組換えのハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく方法を介した検出に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
V(D)J組換え事象の同定および特徴決定は、免疫系の理解の促進と抗体に基づく治療学の開発および最適化との両方とって興味深い。V(D)J組換えを検出する既存のDNAに基づく方法は、上流縮重Vプライマーおよび下流縮重Jプライマーの使用に依拠しており、これは、全てではないがほとんどのV(D)Jエクソンをカバーすることができ、かつ、推定されるエクソンの不均一なカバレッジを提供することができる。加えて、そのようなアプローチは、これらの2つのプライマー間の再編成された配列しか検出せず、したがって、RAGによって生成された結合をほとんどのオフターゲット配列に対して見いだすことはないと考えられる。RNAに基づくアプローチは、減少した転写レベルが原因で非生産的再編成を大幅に過小評価し、発現の欠如が原因で遺伝子座内の多くのオフターゲット再編成を見逃す。
【発明の概要】
【０００６】
概要
組換え事象および／または再編成事象、例えば、Ig遺伝子座における組換え事象および／または再編成事象を検出するための増強されたHTGTSアプローチが本明細書に記載される。本明細書に記載のアッセイ法および方法は、任意のそのような事象の検出および特徴決定を既存の方法より高感度および低バイアスで可能にする。
【０００７】
いずれかの態様の一局面において、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法が本明細書に記載され、該方法は、
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介 (LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程
を含む。
【０００８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、組換え事象は、V(D)J組換え事象である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、または発生期Tリンパ球からなる群より選択される。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、抗原で免疫化された動物から得られた細胞を提供する工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む細胞を提供する工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、胚中心Bリンパ球である。
【０００９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（a）を実施する前に、動物を抗原で免疫化する工程；および動物から細胞を得る工程をさらに含む。
【００１０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数のプライマーは、異なるV、D、またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする。
【００１１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、ソース細胞は、人工多能性幹細胞である。いずれかの局面のいくつかの態様において、ソース細胞は、初代幹細胞である。
【００１２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞またはソースは、工程（a）を実施する前に、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、細胞と、V(D)J組換えを開始させる1種類または複数種類の試薬とを接触させる工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、V(D)J組換えを開始させる試薬は、イマチニブである。
【００１３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である。
【００１４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、再編成事象は、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞からなる群より選択される。
【００１５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、親和性タグを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（c）の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性タグはビオチンである。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性精製は、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性精製は、工程（c）の産物を基質に結合する工程を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、基質は、ビーズである。
【００１６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR工程のために使用されるプライマーは、バーコード配列を含む。
【００１７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、断片化は、超音波処理または制限酵素消化によって実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、断片化は、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、工程（c）の産物をアダプターにライゲーションする工程は、産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む。
【００１８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、3〜10個のヌクレオチド長である。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、5〜6個のヌクレオチド長である。
【００１９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターは、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む。
【００２０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、工程（e）において産生されたPCR産物は、シーケンシングの前に選択されたサイズである。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、工程（a）の前に組織中に存在する。いずれかの局面のいくつかの態様において、シーケンシングは、次世代シーケンシング法を使用して実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、ヒト以外の機械によって実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、ヒト以外の機械は、コンピュータ実行可能ソフトウェアを含む。
【００２１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールを提供する工程をさらに含む。
【００２２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメント工程の結果は、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである。
【００２３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いずれかの局面のいくつかの態様において、ブロッキング消化工程（f）は省略される。いずれかの局面のいくつかの態様において、末端修復は、工程（c）の前に実施されない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】前駆（プロ）B細胞および脾臓B細胞におけるVHおよびDH使用頻度のリニア増幅媒介ハイスループットゲノムワイド転座シーケンシング適応レパートリーシーケンシング（HTGTS-Rep-seq）のグラフを示す。VHレパートリーおよびVDJH結合からのインフレームまたは非生産的情報が左側に示され；DJH結合におけるD使用頻度が右側に示される。上部にある図式上のプライマーによって示される通りのJH4コーディング末端プライマーを使用してライブラリーを生成した。精製したプロB細胞および脾臓B細胞由来の野生型129sve DNAからライブラリーを調製した。
【図２】HTGTS-Rep-seqの図式を示す。一例として、簡略化されたIgH遺伝子座が上部に示される。V(D)J配列は、DJ配列およびJ生殖系列配列と一緒に、逆転写された全メッセンジャーRNA（mRNA）からまたは断片化された全ゲノムDNAからJH特異的ビオチン化プライマーを用いてリニア増幅される。次いで、増幅された産物が、Illumina社のMiseqまたは他のハイスループットシーケンシング法によるペアエンドシーケンシングのために、HTGTSライブラリーとして濃縮および調製される（Frock et al., Nat Biotech, 2015； Hu et al., Nat Protoc, 2016）。次いで、シーケンシングデータが、ゲノムアライメントおよびIgBlastのためのカスタムパイプラインに供される。
【図３】図3Aは、2つのライブラリーからの代表的な脾臓B細胞由来または骨髄プロB細胞由来のIgH遺伝子座において同定されたV-DJ連結またはD-J連結の遺伝子座ワイドビューを示す。白色の箱図は、JHセグメントを表し、そして、網掛け三角形は、組換えシグナル配列（RSS）を表す。矢印は、プライマー部位および配向を示す。線形プロットの上の黒色の線は、V、D、およびJセグメントの位置を示す。VH配列が上流リーダー配列から下流RSSまで読み取られる慣例は、（+）によって定義され；反対配向は、（-）によって定義される。図3Bは、脾臓B細胞レパートリーまたはプロB細胞レパートリーのいずれかにおいて用いられる偽VHまたは機能的VHの比率を示す。図3Cは、代表的なライブラリーからのv-Ablウイルスで形質転換されたB細胞株由来のIgκ遺伝子座において同定されたV-J連結の遺伝子座ワイドビューを示す。標識は、（図3A）と同じである。灰色の箱図は、偽Jκを表す。RSは、隣接しているVセグメントまたはJセグメントのない真正なRSSを示し；それはしばしば、V(D)J組換えの間に用いられて、非生産的VJκが生成される対立遺伝子上のIgκ遺伝子座を部分的に欠失させる。図3Dは、v-Ablで形質転換されたB細胞株レパートリーにおいて用いられる偽VKまたは機能的VKの比率を示す。
【図４】図4A〜4Bは、前記アッセイ法を使用して、インフレームおよびアウトオブフレームV(D)Jエクソンを識別および定量することもできることを実証する。図4Aは、脾臓B細胞またはプロB細胞における用いられる機能的VHの度数プロットを示す。Y軸は、図3A〜3Dの代表的なライブラリーからの個々のVH上の組み合わされたインフレームリードおよびアウトオブフレームリードの数を示す。IgBlast解析後にデータを抽出した。図4Bは、v-Ablで形質転換されたB細胞株のVκについて、図4Aと同じく示す。
【図５】図5A〜5Cは、IgHまたはIgkライブラリーから抽出されたステッチペアエンドIlumina Miseq配列の2つの例を示す。図5Aは、代表的なプロB細胞ライブラリーから取得されたVHの長さの分布を示す。リカバーされたVDJエクソンの約33％は、285bpよりも長いまたはそれに等しいVHアライメントを有した（3353/11431）。この百分率は、より長いリード長をもたらすハイスループットシーケンシング法を使用することによって、容易に大きく改善させることができる。図5Bは、代表的なJH4ライブラリーから抽出されたステッチペアエンドリード配列の例を示す。下流JH4に位置する遺伝子座特異的プライマーが示される。JHおよびDHセグメントが示される。VH CDR1、CDR2、およびCDR3が示される。アダプター配列（リニア増幅されたPCR断片上にライゲーションされる）が示される。図5Bは、SEQ ID NO: 33を開示する。図5Cは、図5Aと同じく示されるが、ステッチVJκリードの例が示される。図5Cは、SEQ ID NO: 34を開示する。
【図６】1つまたは複数のプロセッサ1030と1つまたは複数のプロセッサ1030による実行のための1つまたは複数のプログラム1050を保存しているメモリ1040とを備える、コンピュータデバイスまたはシステム1000を示す。
【図７】図7A〜7Fは、C57BL/6マウスの部分的に濃縮されたプロB細胞および精製した脾臓B細胞におけるVHDJHおよびDJHレパートリーのHTGTS-Rep-seqを示す。図7Aは、VH、DH、JH、およびCH領域を示すマウスIgH遺伝子座の図式を示す。矢印は、JH4コーディング末端ベイトプライマーを示す。図7Bは、プロB細胞（上部）およびIgM+脾臓B細胞（下部）におけるVHDJH結合から生産的および非生産的情報を得たVHレパートリーを示す。最も高頻度に用いられたVHのいくつかを、表示の通り矢印で強調している。図7Cは、図7Bに記載のHTGTS-Rep-seqライブラリーにおける16種類のファミリーにわたる機能的VHおよび偽VHの使用数を示す。図7Dは、図7Bに記載のライブラリーからの生産的および非生産的VHDJH結合の百分率全体の平均を示す円グラフを示す。図7Eは、表示の通りプロB細胞およびIgM+脾臓B細胞におけるVHDJHおよびDJH結合におけるD使用頻度を示す。図7Fは、表示の通りプロB細胞およびIgM+脾臓B細胞におけるDJH:VHDJHの比を示す。データは全て、平均±SEM、N=3によって示される。
【図８】図8A〜8Cは、4つのJHベイトにわたるIgM+脾臓B細胞におけるVHDJHおよびDJHレパートリーを示す。図8Aは、表示の通り各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞における、VHDJH結合から生産的および非生産的情報を得たVHレパートリー（左）ならびに生産的および非生産的VHDJH結合の百分率全体の平均を示す円グラフ（右）を示す。図8Bは、各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞におけるDJH結合におけるD使用頻度の比較を示す。図8Cは、各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞におけるDJH:VHDJHの比の比較を示す。データ全てについて平均±SEM、N=3。他の解析詳細は、図7A〜7Fに記載の通りである。
【図９】図9A〜9Cは、Jκ5ベイトプライマーを使用したC57BL/6マウスのIgM+脾臓B細胞におけるVJκレパートリーのHTGTS-Rep-seqを実証する。図9Aは、VκおよびJκを示すマウスIgκ遺伝子座の図式を示す。灰色のバーは、機能的Vκと、それぞれ下流Jκへの収束および縦列転写配向を示す。黒色のバーは、偽Vκを示す。矢印は、Jκ5コーディング末端ベイトプライマーを示す。図9Bにおいて、左パネル:個別のJκ5ベイトプライマー（上部）または組み合わせたJκベイトプライマー（下部）からのJκ5ベイトプライマーを用いた、IgM+脾臓B細胞におけるVJκ結合から生産的および非生産的情報を得たVκレパートリー。4つの異なるJκの中のいくつかの差次的に用いられたVκを、表示の通り矢印で強調している。右パネル:生産的および非生産的VJκ結合の百分率全体を示す円グラフ。2回の繰り返しからの代表的な結果が示される。図9Cは、図9Bに記載のライブラリーにおける20種類のファミリーにわたる機能的Vκおよび偽Vκの使用数を示す。
【図１０】図10A〜10Bは、少量の開始ゲノムDNAから代表的なVHDJHレパートリーを生成することができることを実証する。図10Aは、IgM+脾臓B細胞における、JH4コーディング末端ベイトプライマーを使用して表示量のゲノムDNAからクローニングされた、VHDJH結合から生産的および非生産的情報を得たVHレパートリー（左）ならびに生産的および非生産的VHDJH結合の百分率全体の平均を示す円グラフ（右）を示す。平均±SEM、N=3。図10Bは、図7Cの通り編成した、ファミリーによって分けたVH使用数を示す。
【図１１】図11A〜11Bは、HTGTS-Rep-seqについての図式を示す。図11Aは、V（暗灰色）、D（黒色）、およびJ（明灰色）を示す、V(D)J組換えを介したDJおよびVDJ再編成の生成の図式を示す。代表的なDJおよびVDJ結合事象が示される。図11Bは、HTGTS-Rep-seq法の概観の図式を示す。簡潔に述べると、B細胞集団由来のゲノムDNAを、超音波処理し、1つの特異的Jセグメントの下流にアニーリングするビオチン化プライマーを用いてリニア増幅する。ビオチン標識した一本鎖DNA産物を、ストレプトアビジンビーズを用いて濃縮して、そして、3’末端を6-ヌクレオチドランダムヌクレオチドを含有するブリッジアダプター（長方形の箱で強調）とバイアスのない様式でライゲーションする。次いで、Illumina社のMiseqでの2×300bpシーケンシングのために産物を調製した。生成されたリードを、前記方法において記載されたIg/TCR-レパートリー解析パイプラインで解析した。
【図１２】図12A〜12Fは、129SVEマウスのプロB細胞およびIgM+脾臓B細胞におけるVHDJHおよびDJHレパートリーのHTGTS-Rep-seqを示す。図12Aは、VH（機能的=灰色；偽＝黒色）、DHおよびJHを示すマウスIgH遺伝子座の図式を示す。矢印は、JH4コーディング末端ベイトプライマーを示す。図12Bは、プロB細胞（上部）およびIgM+脾臓B細胞（下部）におけるVHDJH結合から生産的および非生産的情報を得たVHレパートリーを実証する。最も高頻度に用いられたVHのいくつかを、表示の通り矢印で強調している。平均±SEM、N=3。図12Cは、図12Bに記載のHTGTS-Rep-seqライブラリーにおける16種類のファミリーにわたる機能的VHまたは偽VHの使用数を示す。図12Dは、プロB細胞（上部）およびIgM+脾臓B細胞（下部）における生産的および非生産的VHDJH結合の百分率全体の平均±SEMを示す円グラフを示す。図12Eは、表示の通りプロB細胞およびIgM+脾臓B細胞におけるDJH結合におけるD使用頻度を示す。平均±SEM、N=3。図12Fは、表示の通りプロB細胞およびIgM+脾臓B細胞におけるDJH：VHDJHの比の比較を示す。平均±SEM、N=3。解析の詳細は、図7A〜7Fに記載の通りである。
【図１３】図13A〜13Cは、4つの異なるJHベイトを使用した129SVEマウスのIgM+脾臓B細胞におけるVHDJHおよびDJHレパートリーの比較を示す。図13Aは、個々のJHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞における、VHDJH結合から生産的および非生産的情報を得たVHレパートリー（左）ならびに生産的および非生産的VHDJH結合の百分率全体の平均±SEMを示す円グラフ（右）を示す。図13Bは、各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞におけるDJH結合におけるD使用頻度の比較を示す。図13Cは、各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞におけるDJH：VHDJHの比の比較を示す。パネル全てについて平均±SEM、N=3。他の解析詳細は、図7A〜7Fに記載の通りである。
【図１４】図14A〜14Bは、JH1-4についてのJHコーディング末端長全体にわたるインフレームVHDJH比率を実証する。図14Aは、JH1-4の生殖系列配列のアライメントを示す。該配列をmm9ゲノムから抽出したが、129SVEとC57BL/6との間で高度に保存されている。WGXGをコードしている配列は赤色である。JH長を矢印でマークしており、ここで、1は、ベイトプライマーの最も近位にあるヌクレオチドを示す。図14Aは、それぞれ、登場順でSEQ ID NO 35〜38を開示する。図14Bにおいて、折れ線グラフは、各JHベイトについて表示のJH長を保持している、総V(D)J結合10,000個当たりの数を示す（右のx軸）。棒グラフは、保持された各JH長でのインフレームV(D)Jエクソンの百分率を示す（左のx軸）。平均±SEM、N=3。
【図１５】図15A〜15Cは、組み合わせの4つのJHベイトを使用した129SVEマウスにおけるIgM+脾臓B細胞のVHDJH使用頻度プロファイルを示す。図15Aは、IgH遺伝子座の図式を図7A〜7Fの通り示す。赤色の矢印は、各JHの下流に結合する混合プライマーを示す。図15Bは、JHセグメントベイトによって分けられたVH使用頻度プロファイルを示す。組み合わせたプライマーHTGTS-Rep-seqライブラリーの2回の繰り返しから1つの代表的なプロファイルをここに示した。図15Cは、各JHコーディング末端ベイトプライマーを使用したIgM+脾臓B細胞におけるDJH結合におけるD使用頻度を示す。
【図１６】図16A〜16Bは、異なるJκベイトを使用したC57BL/6マウスのIgM+脾臓B細胞におけるIgκレパートリーを示す。図16Aは、Igκ遺伝子座の図式を図3の通り示す。矢印は、使用されたJκベイトプライマーの位置を示す。図16Bは、IgM+脾臓B細胞における、Vκ使用頻度プロファイルおよびJκベイトによって分けられたVJκの生産的/非生産的の全体比を示す。パネル毎に、個別のJκベイトプライマー（上部）または組み合わせたJκプライマー（下部）からの各Jκベイトプライマーを用いた、VJκ結合から生産的および非生産的情報を得た代表的なVκレパートリーを示す。4つの異なるJκの中のいくつかの差次的に用いられたVκを、表示の通り矢印で強調している（図9も参照のこと）。2回の繰り返しからの代表的な結果が示される。
【図１７】図17A〜17Dは、生産的VHDJHおよびVJκエクソンのCDR3の長さ分布およびコンセンサスモチーフを示す。図17Aは、JH4ベイトプライマーを用いて作製されたC57BL/6の部分的に濃縮されたプロBライブラリーにおける生産的VHDJHエクソンのCDR3の長さ分布を示す。いずれかの末端上がコンセンサスシステインおよびトリプトファンと隣接している11〜13aa長のCDR3配列のサブセットについて、コンセンサスCDR3モチーフプロットを作製した。図17B：図17Aの通りであるが、C57BL/6脾臓BライブラリーをJH4ベイトプライマーを用いて作製した。図17C：図17Aの通りであるが、C57BL/6脾臓Bライブラリーを4つのJHベイトプライマーを用いて作製した。（図17A〜17C）について平均±SEM、N=3。図17D：図17Aの通りであるが、C57BL/6脾臓BライブラリーをJκ5プライマーを用いて作製した。本発明者等のCDR3配列解析におけるいくつかのエラーが、Illumina社のMiseqを含む現行のハイスループットシーケンシング法のシーケンシングエラーの基礎レベルと、V(D)Jエクソンを含有するより長いDNA断片の配列全体をカバーするのに十分でないリード長（最大600bp）に起因することに気付いたことに留意されたい。しかしながら、本発明者等は、解析にオーバーラップ結合リードだけを含めることによっておよび／またはリード品質の閾値を増加させることによって、そのような潜在的な曖昧さを排除した。
【図１８】図18A〜18Bは、特異的CDR3リードの特徴決定を示す。図18Aは、図10からの各技術的反復ライブラリーについての特異的CDR3配列の比率を示す。平均±SEM、N=3。図18Bは、様々な量の出発物質での技術的反復ライブラリー間の同一のCDR3配列の数を示す。
【図１９】図19A〜19Dは、3種類のNP-CGG免疫化（10d）C57BL/6マウスの脾臓GCおよびナイーブB細胞由来のVH1-72のVH使用頻度、クローン型（CDR3）選択、およびSHMパターンを示す。
【図２０】図20A〜20Bは、3種類のNP-CGG免疫化（10d）C57BL/6マウス由来の、脾臓とPPナイーブB細胞との間および脾臓とPP GC B細胞との間のVH使用頻度の比較を示す。
【図２１】図21A〜21Dは、PP GC対ナイーブB細胞のVH使用頻度、ならびに、WTおよびAID-/-C57BL/6マウスからのクローン型（CDR3）選択を示す。
【図２２】図22A〜22Bは、同じマウス由来の異なる個々のPPにおけるPP GC対ナイーブB細胞のVH使用頻度を示す。
【図２３】PP GCにおける最も高度に富化されたVH1-47およびVH11-2は、突然変異を蓄積したが、CDR領域突然変異においていかなる循環選択も示さなかったことを実証する。
【図２４】実施例5において使用されるIgHレパートリーを検出するための実験アプローチを示す。
【図２５】図25Aは、高度に縮重性の（degenerative）領域より選択されたJH1-4プライマーの場所を示す。図25Aは、それぞれ、登場順でSEQ ID NO 39〜42を開示する。図25Bは、hVH1-2ベイトから作製されたhVH1-2DJ連結における各JHの比を示し、混合JH1-4ベイトから作製されたライブラリーと比較した。
【図２６】図26Aは、表示の個々のNP-CGG免疫化マウスにおける脾臓およびPP GCにおけるVH使用頻度を示す。図26Bは、PP GCにおけるVH1-72のSHMパターンを示す。
【図２７】図27A〜27Bは、個々の非免疫化マウス由来のPP GC対ナイーブB細胞のVH使用頻度およびVH11-2クローン型選択を示す。
【図２８】図28A〜28Bは、個々のAID-/-マウス由来のPP GC対ナイーブB細胞のVH使用頻度を示し、PPナイーブB細胞の平均VHレパートリーをWTマウスとAID-/-マウスとの間で比較した。図28Cは、表示のAID-/-マウス由来のPP GC対ナイーブB細胞のVL使用頻度を示す。
【図２９】図29Aは、それほど富化されなくともPP GCにおいて最も高頻度に用いられたVH1-72が配列内在性SHMを蓄積したことを実証する。図29Bは、上位VH1-47のクローン型のSHMパターンを示す。
【図３０】精製したヒト末梢血B細胞由来のHTGTS-Rep-seq IGH、IGK、IGLレパートリーを示す。パネルは、それぞれ、JH4、Jλ2/3、およびJκ1のコーディング末端に対するプライマーを介したIGH、IGL、およびIGK V使用頻度を示す。インフレームおよび非生産的再編成が示される。機能的Vは、ほとんどのD/Jが遠位から近位（左から右）に列記され、用いられた偽V(*)および非局在/オルフォン（orphon） V(#)がそれに続く。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
細胞における組換え事象および／または再編成事象を同定する、ロバストなリニア増幅媒介ハイスループットゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）法が本明細書に記載される。いずれかの局面のいくつかの態様において、組換え事象は、V(D)J組換え事象である。該方法は、Ig遺伝子座での組換えおよび／または再編成を同定することに特に関連する。
【００２６】
前記方法は、それ故、例えば、V(D)J組換えを、例えば、同定および／または特徴決定を望むものにとって有用である。同方法を使用して、V(D)J組換えに対する作用物質の効果をスクリーニングすることもできる。
【００２７】
いずれかの態様の一局面において、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法が本明細書に記載され、該方法は、（a）細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；（b）任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；（c）（i）少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介（LAM）-PCRによってゲノムDNAから一本鎖ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物を産生し、かつ／または（ii）少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によってmRNAから相補的DNA（cDNA）を産生する工程；（d）工程（c）において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；ランダムヌクレオチドの近位部；および3’オーバーハングを含む、工程；（e）工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによって、ネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；（f）任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；（g）ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに（h）配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程を含む。
【００２８】
いずれかの態様の一局面において、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法が本明細書に記載され、該方法は、
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程
を含む。
【００２９】
本明細書において使用される場合、「Igレパートリー」は、V(D)J組換え、体細胞超突然変異、活性化、選択などの少なくとも1つが起こった後に細胞または生物において生じるIg遺伝子の配列の群（またはそのような配列の一部）を指す。単一生物から得られた個々の細胞のIgレパートリーは変動し得る。Igレパートリーの検出においては、サンプル（例えば、細胞または細胞の群）中の全てのIg配列を検出することもできるし、それらの配列の部分を検出することもできる（例えば、使用されるJ遺伝子セグメントであるが、使用されるV遺伝子セグメントではないか；または、使用されるJ遺伝子セグメントであるがSHMではない）。本明細書に記載の方法は、Igレパートリーの全ての部分を検出するのに好適である。
【００３０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、Igレパートリーを検出する工程は、少なくともV(D)J組換え事象および／または体細胞超突然変異（SMH）を検出することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、Igレパートリーを検出する工程は、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、D使用頻度、J使用頻度、およびCDRレパートリーの1つまたは複数を検出することを含む。
【００３１】
ゲノムDNAまたはmRNAを抽出する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、各々が参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、Tan and Yiap. J Biomed and Biotechnol 2009; およびVarma et al. Biotechnol J 2007 2:386-392を参照されたい。いずれかの局面のいくつかの態様において、市販のキット、例えばWIZARD Genomic DNA Purification Kit（Cat. No. A1120; Promega, Madison, WI）またはReliaPrep（商標）RNA Cell and Tissue Miniprep Systems（Cat. No. Z6010; Promega, Madison WI）を使用して、ゲノムDNAまたはmRNAの抽出を実施することができる。
【００３２】
超音波処理、制限酵素消化、ランダム剪断、高頻度切断制限酵素による制限、噴霧化、音響剪断、ポイントシンク剪断、針剪断、およびフレンチプレスを非限定的に含む当技術分野において公知の任意の方法によって、DNAおよび／またはmRNAサンプルを断片化することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、核酸サンプルの断片化を制限酵素消化によって実施することができる。典型的には4bp毎に切断する高頻度切断酵素は、当業者に周知であり、そして、標的ゲノムに対するそれらの効果を、標的ゲノム配列を鋳型として使用してインシリコでスクリーニングすることができる。例えば、MspIは、ヒト細胞における好適な高頻度切断酵素であるが、当業者は、任意の所与のゲノムの必要性に従って、酵素を簡単に置き換えることができる。本明細書において使用される場合、用語「断片化されたDNAサンプル」または「断片化されたmRNAサンプル」は、断片化プロセスの前と比較して統計学的に有意なより多くの数の二本鎖切断（DSB）がサンプル中に存在するように断片化プロセスを受けた、核酸のサンプルを指す。いずれかの局面のいくつかの態様において、断片化された核酸サンプルはもはや、無傷の染色体を含まない。当業者は、その強度および継続期間を含む断片化プロセスを容易に選択することができ、この断片化プロセスは所望の程度の断片化を提供し、例えば、所望のサイズの核酸分子の集団をもたらす。
【００３３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、核酸サンプルの断片化を超音波処理によって実施することができる。超音波処理は、例えば、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第20140234847号（に記載の通り、制限消化によって達成される特定の断片化と異なる、ランダムなバイアスのない断片化を提供する。いずれかの局面のいくつかの態様において、末端修復は、断片化の後でLAM-PCRの前に実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、末端修復は、断片化の後ではあるがLAM-PCRの前には実施されない。
【００３４】
本明細書に記載の様々な局面のいくつかの態様において、ゲノムDNAおよび／またはmRNAは、特定の高頻度切断酵素によって消化されるよりもむしろ、剪断される。酵素は、ジャンクションエンリッチメントゲノムワイドにおいてバイアスを有し得る。
【００３５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載の方法および組成物は、PCRを実施することに関する。PCRは、関心対象の核酸配列を特異的に増幅する、すなわち、その存在量を増加させるプロセスを指し、いずれかの局面のいくつかの態様においては、その前のポリメラーゼ伸長の産物が連続的な伸長ラウンドの鋳型として働く場合に起こる指数関数的増幅を指す。本発明に係るPCR増幅レジメンは、少なくとも1回、例えば、少なくとも1回、少なくとも2回、少なくとも5回、10回、15回、20回、25回、30回、35回、またはそれ以上の反復サイクルを含み、各サイクルは、（1）鎖の分離（例えば、熱変性）；（2）鋳型分子へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および（3）アニーリングしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長の工程を含む。当業者は、これらの工程の各々にとって必要な条件および時間を考案することができる。本明細書に記載の方法に係る増幅レジメンは、サーマルサイクラーで実施されることが好ましく、その多くは市販されている。
【００３６】
リニア増幅媒介PCR（LAM-PCR）は、既知の配列（ベイト）に対するプライマーを使用して標的核酸配列から一本鎖DNA（ssDNA）を産生するPCRの一種類であり、ここで、PCR産物は、プライマーがアニーリングする部位から下流の配列を含む。PCR産物の配列は、例えば、組換え事象および／または再編成事象がベイト配列の近くで起こった場合、未知であり得る。次いで、ssDNAを二本鎖DNA（dsDNA）に変換し、さらなるPCR増幅反応を実行することができる。LAM-PCRは、例えば、各々が参照によってその全体が本明細書に組み入れられる、Schmidt et al. Nature Methods 2007 4:1051-7；米国特許第6,514,706号；米国特許出願第US2007/0037139号、およびHarkey et al., (2007) Stem Cells Dev., June; 16(3): 381-392にさらに詳細に記載されている。いずれかの局面のいくつかの態様において、LAM-PCR工程は、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生することができる。
【００３７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載の方法および組成物は、逆転写反応、例えば、RNA鋳型（cDNA）、プライマー、およびRNA依存性DNAポリメラーゼを使用した反応を実施することによる逆転写酵素反応を実施することに関する。逆転写を実施するためのプロトコールおよび試薬は、当技術分野において周知であり、市販されている。いずれかの局面のいくつかの態様において、逆転写工程は、mRNAからcDNA産物を産生することができる。
【００３８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、LAM-PCR工程は、一次遺伝子座特異的プライマーを使用して実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、逆転写工程は、一次遺伝子座特異的プライマーを使用して実施される。
【００３９】
一次遺伝子座特異的プライマーは、少なくとも1つのV、D、もしくはJセグメントにおける既知の配列、V、D、もしくはJセグメントに隣接する配列、または再編成に関与すると知られている/その疑いのある配列に隣接する配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、少なくとも1つのV、D、またはJセグメントの既知の配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、V、D、またはJセグメントに隣接する配列、例えば、V、D、またはJセグメントの10bp、20bp、30bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、または1kb以内の配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、V、D、またはJセグメントに隣接する配列、例えば、V、D、またはJセグメントの10bp、20bp、30bp、50bp、100bp、200bp、300bp、または400bp以内の配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、再編成に関与すると知られているまたはその疑いのある配列に隣接する配列、例えば、再編成に関与すると知られているまたはその疑いのある配列の10bp、20bp、30bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、または1kb以内の配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、再編成に関与すると知られているまたはその疑いのある配列に隣接する配列、例えば、再編成に関与すると知られているまたはその疑いのある配列の10bp、20bp、30bp、50bp、100bp、200bp、300bp、または400bp以内の配列に特異的にアニーリングすることができるプライマーである。
【００４０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または複数の二次遺伝子座特異的プライマーを使用して、例えば、複数の遺伝子座における組換えおよび/もしくは再編成を検出することができ、かつ/または、同じ遺伝子座における複数の個々の組換え事象および/もしくは再編成事象を検出することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または複数の二次遺伝子座特異的プライマーを使用して、例えば、複数の推定される組換え事象および／または再編成事象を検出することができ、例えば、複数の推定される事象の中で起こる１つまたは複数の事象をスクリーニングすることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次または二次遺伝子座特異的プライマーは、異なるV、D、もしくはJ遺伝子セグメントに、異なるV、D、もしくはJセグメントに隣接する配列に、同じV、D、もしくはJ遺伝子セグメントの異なる部分に、および／または、同じV、D、もしくはJセグメントに隣接する異なる配列に特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、LAM-PCR工程、逆転写酵素、および／またはネステッドPCR工程の一方または両方を多重様式で実施することができ、例えば、複数のプライマーは、同じ反応混合物中に存在する。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数のプライマーは、別個の反応混合物中に存在し、例えば、これらは並行して使用される。
【００４１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーは、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、そして、各一次遺伝子座特異的プライマーは、異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、かつ、集団的に一次遺伝子座特異的プライマーは、細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに、V(D)J組換えの前にそれが存在している場合、特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、かつ、集団的に一次遺伝子座特異的プライマーは、JH1、JH2、JH3、およびJH4の各々に特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、かつ、集団的に一次遺伝子座特異的プライマーは、V(D)J組換えの前に細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJH、Jκ、およびJλ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする。
【００４２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、かつ、各一次遺伝子座特異的プライマーは、異なるV、D、および／またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、複数の一次遺伝子座特異的プライマーが使用され、かつ、集団的に一次遺伝子座特異的プライマーは、細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるV、D、および／またはJ遺伝子セグメントに、V(D)J組換えの前にそれが存在している場合に、特異的にアニーリングする。
【００４３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、標的にされた遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、標的にされた遺伝子セグメントの最も縮重した領域に特異的にアニーリングする。
【００４４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、一次遺伝子座特異的プライマーは、親和性タグ、例えば、適切な親和性ドメインを有する基質を使用した親和性精製のための親和性タグを含むことができる。親和性ドメインおよびタグの対は、非共有結合的手段によって2つの分子を複合体化することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、第一の遺伝子座特異的プライマーは、親和性ドメインが特異的に結合することができる親和性タグを含むことができる。多数の親和性タグおよびドメインは当技術分野において周知であり、例えば、Lichty et al. Protein Expr Purif 2005 41:98-105; Zhao et al. J Analytical Methods in Chemistry 2013; Kimple et al. Current Protocols in Protein Science 2004 36:939:9.1-9.9.19;およびGiannone et al. Methods and Protocols "Protein Affinity Tags" Humana Press 2014に記載されており、それらの各々は、参照によってその全体が本明細書に組み入れられる。適合可能な親和性ドメインおよび親和性タグ対合の非限定例は、抗体またはその抗原結合断片およびエピトープ；抗His抗体またはその抗原結合断片およびHisタグ；抗HA抗体またはその抗原結合断片およびHAタグ；抗FLAG抗体またはその抗原結合断片およびFLAGタグ；抗myc抗体またはその抗原結合断片およびmycタグ；抗V5抗体またはその抗原結合断片およびV5タグ；抗GST抗体またはその抗原結合断片およびGSTタグ；抗MBP抗体またはその抗原結合断片およびMBPタグ；アプタマーおよびそのアプタマーによって認識される標的分子；例えば、ストレプトアビジンおよびビオチンを含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性タグおよび／またはドメインは、分子の一端、例えば10ヌクレオチド以内の末端にまたはその近くに位置する。親和性タグおよび／またはドメインは、抗体、抗原、レクチン、タンパク質、ペプチド、核酸（DNA、RNA、PNA、およびそれらの混合物である核酸またはヌクレオチド誘導体もしくは類似体を含む核酸）；受容体分子、例えばインスリン受容体；受容体に対するリガンド（例えば、インスリン受容体に対するインスリン）；および別の分子に対する親和性を有する生物分子、化学分子または他の分子であることができるが、それらに限定されない。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性ドメインは、アプタマーであることができる。
【００４５】
親和性ドメインおよびタグを使用して2つの分子を複合体化する一例は、ビオチン-アビジンまたはビオチン-ストレプトアビジンコンジュゲーションである。このアプローチでは、一緒にコンジュゲートされるべき分子のメンバーの一方（例えば、ヌクレアーゼまたは鋳型核酸）がビオチン化され、他方がアビジンまたはストレプトアビジンとコンジュゲートされる。タンパク質などの分子をビオチン化するために多くの市販キットが使用可能である。例えば、アミノオキシ-ビオチン（AOB）を使用して、アルデヒドまたはケトン基を有する分子にビオチンを共有結合的に付着させることができる。さらに、プライマーを、ビオチンアクセプターペプチド、例えば、AviTagまたはアクセプターペプチド（APと称される；Chen et al., 2 Nat. Methods 99 (2005)）にカップリングさせることができる。アクセプターペプチド配列は、E. coli酵素ビオチンリガーゼ（BirA; Id.）による部位特異的ビオチン化を可能にする。親和性ドメイン/タグによるコンジュゲーションを使用する別の非限定例は、ビオチン-サンドイッチ法である。例えば、Davis et al., 103 PNAS 8155 (2006)を参照のこと。このアプローチでは、一緒にコンジュゲートされるべき2つの分子がビオチン化され、次いで、四価ストレプトアビジンを使用して一緒にコンジュゲートされる。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性タグは、ビオチンであることができる。
【００４６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（c）において産生されたPCR産物（LAM-PCRまたは逆転写の産物）を親和性精製によって単離する工程をさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性精製は、工程（c）において産生されたPCRおよび／または逆転写産物を、基質、例えばビーズおよび／またはカラムに結合することを含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、基質は、ビーズであることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、親和性精製は、ビオチンとストレプトアビジンとの結合、例えば、ビオチンタグ化PCR産物をストレプトアビジンを含むビーズ、基質、および／またはカラムに結合することを含むことができる。
【００４７】
一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写および／またはPCRから生じた産物を、任意で単離（例えば、親和性精製）後、アダプター分子にライゲーションさせることができる。ライゲーション工程では、典型的には、1.5ng/マイクロL未満で濃縮された核酸（例えば、DNA）を使用する。約1.0〜約2.5ng/マイクロLで変動する濃度を使用することができ、そして、当業者は、ルーチン法を使用して核酸濃度を最適化することができる。
【００４８】
アダプター分子は、ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部と；ランダムヌクレオチドを含む近位部と3’オーバーハングとを含む、二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばdsDNA分子である。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの遠位部および近位部の3’末端は、例えば、3’ジデオキシヌクレオチド、例えば3’ddCを提供することによって、自己ライゲーションを防止するように修飾される。いずれかの局面のいくつかの態様において、3’オーバーハングを含まないアダプターの末端、例えば、遠位部を含む末端は、平滑末端化される。いずれかの局面のいくつかの態様において、3’オーバーハングを、ss-DNA PCR産物および／または逆転写産物にアニーリングすることができる。
【００４９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、3〜10個のヌクレオチド長であることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、5〜6個のヌクレオチド長であることができる。いくつかの態様において、近位部は、固定されたいくつかのヌクレオチドを有することができる。
【００５０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプター分子の近位部は、3’オーバーハングからなることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、3〜10個のヌクレオチド長であることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの近位部は、5〜6個のヌクレオチド長であることができる。
【００５１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターは、バーコード配列を、例えば、遠位部と近位部との間にさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプターの遠位部は、ネステッドPCR工程において使用されるアダプター特異的プライマーに相補的である配列を含む。
【００５２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、一本鎖PCR産物をアダプターにライゲーションする工程は、PCR産物と、同じ遠位部および種々のランダム近位部配列を有するアダプターの集団とを接触させることを含むことができる。
【００５３】
ネステッドPCR工程では、最初の反応、例えば、LAM-PCR反応および／または逆転写反応によって産生された増幅配列にアニーリングするプライマーを使用して、PCR反応が実施され、最終産物の特異性を増加させる。したがって、アダプターおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いて、ライゲーションされたDNA産物に対して実施されるネステッドPCRは、組換えおよび／または再編成の部位周辺の核酸配列を増幅および／または複製する。理論上、使用することができるネステッドPCRのラウンド数に下限または上限はない。いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCRは、少なくとも1ラウンド、少なくとも2ラウンド、または少なくとも3ラウンドを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCRは、1ラウンド、2ラウンド、または3ラウンドを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCRは、1ラウンド、2ラウンド、3ラウンド、1〜2ラウンド、1〜3ラウンド、または1〜5ラウンドを含む。より多くのラウンドは、すでに過剰出現している配列の増幅を増加させることができるだけなのでそれほど有用ではない-同じ遺伝子座に対して独立したプライマーセットを使用することによって、ネステッドPCR（典型的には、2ラウンドを用いる）を使用して、増幅反応の特異性を増加させる。いずれかの局面のいくつかの態様において、第三のラウンドまたは反応は、シーケンシング、例えば、454シーケンシングに必要なバーコードを加えることができる。そのような第三のラウンドまたは反応は、バーコード付きプライマーがラウンド2（またはネステッドPCR工程）で使用される場合または追加のバーコードが必要とされない他のシーケンシング法を使用する場合、省略することができる。本発明の全ての態様のいくつかの局面において、1ラウンドのネステッドPCRおよび追加のラウンドを実施して、タグまたは標識をPCR産物に導入し、これによって、組換えおよび／または再編成の部位の配列を解析するために特定のシーケンシングプロトコールが適用可能となる。本発明の全ての態様のいくつかの局面において、2ラウンドのネステッドPCRおよび追加のラウンドを実施して、タグまたは標識をPCR産物に導入し、これによって、組換えおよび／または再編成の部位の配列を解析するために特定のシーケンシングプロトコールが適用可能となる。
【００５４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR工程において使用される二次遺伝子座特異的プライマーは、LAM-PCRまたは逆転写工程において使用される一次遺伝子座特異的プライマーと重複し得る。いずれかの局面のいくつかの態様において、二次遺伝子座特異的プライマーの3’末端が、一次遺伝子座特異的プライマーの3’末端よりも、組換えおよび／または再編成の部位により近く（例えば、少なくとも1ヌクレオチドより近く、1〜2ヌクレオチドより近く、1〜3ヌクレオチドより近く、1〜5ヌクレオチドより近くなど）アニーリングするように、プライマーが設計される。いずれかの局面のいくつかの態様において、二次遺伝子座特異的プライマーの配列は、一次遺伝子座特異的プライマーの配列の一部を含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、二次遺伝子座特異的プライマーの配列は、一次遺伝子座特異的プライマーの配列の3’部位を含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、二次遺伝子座特異的プライマーの配列は、一次遺伝子座特異的プライマーの配列を含むことができる。
【００５５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR工程のために使用されるプライマーの1つまたは複数は、バーコード配列を含むことができる。本明細書において使用される場合、「バーコード」は、標的分子の同定のためのバーコードまたはタグとして使用されるDNA配列を指す。いずれかの局面のいくつかの態様において、DNA配列は、解析されている生物のゲノムに対して外因性および／または外来である。
【００５６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ライゲーションされたDNAを、ブロッキング酵素で、例えば、1）ネステッドPCR後であるがシーケンシングの前に、または2）ネステッドPCRの前に消化することができる。ブロッキング酵素消化は、組換えされていないおよび／または再編成されていない標的にされた対立遺伝子の増幅を、後続の工程、例えば、ネステッドPCRまたはシーケンシングの間、ブロッキングすることができる。ブロッキング酵素は、典型的には、組換えまたは再編成が起こる遺伝子座のDNA配列に基づき、それぞれ個別に選択される必要がある−組換えされていない／再編成されていない産物を酵素制限部位、例えばI-SceI制限部位を過ぎて切断することで、これらを組換えされた／再編成された産物に不在にする、任意の一般的な制限酵素を、ブロッキング酵素として使用することができる。選択は、ルーチンであり、それぞれ個々の配列に基づく。したがって、当業者は、アッセイ法のための好適なブロッキング酵素を容易に見いだすことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、ブロッキング消化は、実施されず、例えば、ブロッキング消化は、省略される。
【００５７】
本明細書において使用される場合、用語「ブロッキング酵素」は、組換えされていないおよび／または再編成されていない産物を、組換えおよび／または再編成の部位の一次遺伝子座特異的プライマーに対して遠位で切断する制限酵素を指す。ブロッキング酵素は、組換えされていない／再編成されていない産物を、組換えおよび／または再編成の部位の一次遺伝子座特異的プライマーに対して近位で切断しない。したがって、ブロッキング酵素およびその配列特異性は、前記方法において使用されるDNAおよび／またはmRNAの特定の配列、一次遺伝子座特異的プライマーの配列ならびに組換えおよび／または再編成によって決定される。適切な特異性を備えた任意の制限酵素を用いることができる。当業者は、そのようなパラメーターを考慮して、必要な特異性を備えた制限酵素を容易に選択することができる。
【００５８】
ネステッドPCR産物のDNAシーケンシングを当技術分野において公知の任意の方法によって実施することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、シーケンシングを次世代シーケンシング法によって実施することができる。本明細書において使用される場合、「次世代シーケンシング」は、数千〜数百万のシーケンシング反応を並行して実施および読み出しすることにより従来のシーケンシング法（例えば、サンガーシーケンシング）で可能であったものを超える速度でオリゴヌクレオチドを配列決定する能力を有する、オリゴヌクレオチドシーケンシング技術を指す。次世代シーケンシング法/プラットフォームの非限定例は、大規模並列シグネチャーシーケンシング（Massively Parallel Signature Sequencing）（Lynx Therapeutics）；454パイロシーケンシング（454 Life Sciences/Roche Diagnostics）；固相リバーシブルダイターミネーターシーケンシング（Solexa/Illumina）:SOLiD技術（Applied Biosystems）；イオン半導体シーケンシング（ION Torrent）；DNAナノボールシーケンシング（Complete Genomics）；ならびにPacific Biosciences、Intelligen Bio-systems、Oxford Nanopore TechnologiesおよびHelicos Biosciencesから入手可能な技術を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、シーケンシングプライマーは、選択された次世代シーケンシング法と適合可能な部分を含むことができる。次世代シーケンシング技術ならびに関連するシーケンシングプライマーの制約および設計パラメーターは、当技術分野において周知である（例えば、参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Shendure, et al., "Next-generation DNA sequencing," Nature, 2008, vol. 26, No. 10, 1135-1145; Mardis, "The impact of next-generation sequencing technology on genetics," Trends in Genetics, 2007, vol. 24, No. 3, pp. 133-141; Su, et al., "Next-generation sequencing and its applications in molecular diagnostics" Expert Rev Mol Diagn, 2011, 11(3):333-43; Zhang et al., "The impact of next-generation sequencing on genomics", J Genet Genomics, 2011, 38(3):95-109; (Nyren, P. et al. Anal Biochem 208: 17175 (1993); Bentley, D. R. Curr Opin Genet Dev 16:545-52 (2006); Strausberg, R. L., et al. Drug Disc Today 13:569-77 (2008)；米国特許第7,282,337号；米国特許第7,279,563号；米国特許第7,226,720号；米国特許第7,220,549号；米国特許第7,169,560号；米国特許第6,818,395号；米国特許第6,911,345号；米国公報第2006/0252077号；同第2007/0070349号；および同第20070070349号を参照されたい）。
【００５９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR産物は、シーケンシングの前に選択されたサイズであることができる。任意の合理的なサイズを選択して、例えば、非特異的増幅産物、例えばポリプライマー増幅産物を除くことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、例えば、非特異的ポリプライマー増幅産物を除くために、約400bp〜約1kbのネステッドPCR産物を選択することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、例えば、非特異的ポリプライマー増幅産物を除くために、約200bp〜約1kbのネステッドPCR産物を選択することができる。
【００６０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR産物の配列を、参照配列および／または抗原受容体データベースに対してアライメントして、例えば、組換えおよび/もしくは再編成から生じる配列、組換え事象に関与するV、D、および/もしくはJセグメント、または、組換えおよび/もしくは再編成に関連するバリアント、突然変異および/もしくは超突然変異の存在を同定することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR産物の配列を、参照配列に対してアライメントすることができる。参照配列は、組換えおよび／または再編成に関与するDNA配列を含む配列であることができる。あるいは、参照配列は、関連する1つの遺伝子座（複数の遺伝子座）において生じる既知の組換えおよび／または再編成産物を含む配列であることができる。参照配列は、例えば、解析されている細胞タイプ由来のゲノム配列であることができる。
【００６１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、ネステッドPCR産物の配列を、抗原受容体データベースに対してアライメントすることができる。抗原受容体データベースは、抗原受容体をコードする配列またはコードするように組換えされ得る配列、例えば、Ig遺伝子、V遺伝子セグメント、D遺伝子セグメント、および／またはJ遺伝子セグメントを含む。抗原受容体データベースは、当技術分野において公知であるか、または、データから構築することができる。例示的なデータベースは、IgBLASTであり、これは、ワールドワイドウェブ上のncbi.nlm.nih.gov/igblast/で自由に使用可能であり、ユーザーが組換えされた配列を入力して生殖系列遺伝子配列のデータベースからマッチを得ることができる。
【００６２】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程をヒト以外の機械によって実施することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、ヒト以外の機械は、コンピュータ実行可能ソフトウェアを備えることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含むことができる。
【００６３】
図6は、1つまたは複数のプロセッサ1030と1つまたは複数のプロセッサ1030による実行のための1つまたは複数のプログラム1050を保存しているメモリ1040とを備える、コンピュータデバイスまたはシステム1000を示す。
【００６４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、デバイスまたはコンピュータシステム1000は、デバイスまたはコンピュータシステム1000の1つまたは複数のプロセッサ1030による実行のための1つまたは複数のプログラム1050を保存している、非一過性コンピュータ可読記憶媒体1060をさらに備えることができる。
【００６５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、デバイスまたはコンピュータシステム1000は、情報を、外部デバイス（示さず）、1つまたは複数のプロセッサ1030、メモリ1040、非一過性コンピュータ可読記憶媒体1060および1つまたは複数の出力デバイス1070からなる群のいずれか1つに送るまたはそこから受け取るように構成することができる、1つまたは複数の入力デバイス1010をさらに備えることができる。1つまたは複数の入力デバイス1010は、アンテナ1020、トランシーバー（示さず）などの無線通信のための手段を介して無線で情報を外部デバイスに送るまたはそこから受け取るように構成することができる。
【００６６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、デバイスまたはコンピュータシステム1000は、情報を、外部デバイス（示さず）、1つまたは複数の入力デバイス1010、1つまたは複数のプロセッサ1030、メモリ1040および非一過性コンピュータ可読記憶媒体1060からなる群のいずれか1つに送るまたはそこから受け取るように構成することができる、1つまたは複数の出力デバイス1070をさらに備えることができる。1つまたは複数の出力デバイス1070は、アンテナ1080、トランシーバー（示さず）などの無線通信のための手段を介して無線で情報を外部デバイスに送るまたはそこから受け取るように構成することができる。
【００６７】
一局面において、組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）および検出のためのコンピュータによって実行される方法であって、1つまたは複数のプロセッサおよび1つまたは複数のプロセッサによる実行のための1つまたは複数のプログラムを保存しているメモリを有するデバイス上、配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列に対してアライメントして、組換え事象および／または再編成事象ならびに該事象に関与する親配列の部位を同定するための命令を含む1つまたは複数のプログラムを含む、方法が本明細書に記載される。
【００６８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、アライメントプログラムによって実施される。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントプログラムは、Bowtie2である。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、アライメントを決定するための最適経路探索アルゴリズムを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、多重分離配列リードを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、多重分離配列リードは、fastq-multxツールを使用することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、アダプター配列をトリミングすることを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アダプター配列をトリミングする工程は、SeqPrepユーティリティを使用することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、Bowtie2を使用してリードを参照配列またはデータベースにマッピングすることを含み、50を超えるアライメントスコアを有していると報告された上位50個のアライメントは、完全な25ntの局所アライメントを表す。
【００６９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、リードの組成を記載するアライメントの最適配列を選択するための最適経路探索アルゴリズムを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、フィルタリングを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、フィルタリングは、ベイトアライメントおよびプレイアライメントを含む。本明細書において使用される場合、「ベイト」は、一次遺伝子座特異的プライマーがアニーリングするであろう配列、またはその配列に隣接する配列を指す。「プレイ」配列は、組換え事象および／または再編成事象の前にベイト配列と隣接していないが組換えおよび／または再編成過程の後にベイト配列と隣接している配列である。いずれかの局面のいくつかの態様において、ベイトアライメントは、標的にされた部位（例えば、プライマーがアニーリングする部位）を越えて10ヌクレオチド超伸長しない。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、ベクター制御、複数の部位とのオフセットニッキング、および遠位の標的にされた部位の使用を含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、不要なアライメントと選択されたプレイアライメントとを比較することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、不要なアライメントのいずれかが、プレイアライメントに関してカバレッジおよびスコア閾値の両方を上回る場合、リードは、低いマッピング品質に起因してフィルタリングされる。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、ベイトアライメントを、プライマーを過ぎて10ヌクレオチド伸長させて、推定されるミスプライミング事象および他の人工物を除去することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、ベイトアライメントの終点とプレイアライメントの開始点の座標を全リードにわたって比較することによって、潜在的な重複を除去することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、リードが別のリードのベイトおよびプレイアライメントの2nt以内にベイトアライメントオフセットおよび2nt以内にプレイアライメントオフセットを有する場合、リードを重複としてマークすることを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、フィルタリング後ストリンジェンシーを適用して、30ntより大きいギャップおよび50ntより短いベイト配列を有する連結を除去することを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程は、テロメア反復配列へプレイアライメントしたリードを除去することを含む。
【００７０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、コンピュータによって実行される方法は、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法と共に使用され、検出のための方法は、（a）細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；（b）任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；（c）少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによってゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によってmRNAからcDNAを産生する工程；（d）工程（c）において産生された一本鎖PCR産物またはcDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、アダプターが、ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；ランダムヌクレオチドの近位部；および3’オーバーハングを含む、工程；（e）工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；（f）任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；（g）ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定されたネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに（h）配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程を含む。
【００７１】
一局面において、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のためのコンピュータシステムが本明細書に記載され、該コンピュータシステムが、1つまたは複数のプロセッサおよび1つまたは複数のプログラムを保存しているメモリを備え、1つまたは複数のプログラムが、配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列および／またはデータベースに対してアライメントして、組換え事象および／または再編成事象を同定および／または特徴決定するための命令を含む。
【００７２】
一局面において、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための1つまたは複数のプログラムを保存している非一過性コンピュータ可読記憶媒体が本明細書に記載され、1つまたは複数のプログラムが、コンピュータシステムの1つまたは複数のプロセッサによる実行のためであり、1つまたは複数のプログラムが、配列決定されたネステッドPCR産物を参照配列および／またはデータベースに対してアライメントして、組換え事象および／または再編成事象を同定および／または特徴決定するための命令を含む。
【００７３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、現代のアライメントプログラム、例えば、BOWTIE2（商標）を使用して、参照配列にアライメントする。いずれかの局面のいくつかの態様において、最適経路探索アルゴリズムを使用して、アライメントを決定することができる。そのようなアルゴリズムの使用は、連結における破断のさらなる特徴決定および／またはペアエンドリードの使用を可能にする。
【００７４】
例示的な態様において、ea-utilsのFASTQ-MULTX（商標）ツール（ワールドワイドウェブ上のcode.google.com/p/eautils/で使用可能）およびSEQPREP（商標）ユーティリティ（ワールドワイドウェブ上のgithub.com/jstjohn/SeqPrepで使用可能）をそれぞれ使用して、配列リードを多重分離およびアダプター配列をトリミングすることができる。BOWTIE2（商標）（ワールドワイドウェブ上のbowtiebio.sourceforge.net/bowtie2/manual.shtmlで使用可能）を使用して、リードを参照配列にマッピングすることができる。上位アライメント、例えば上位10、20、30、40、50個、またはそれより多くのアライメントを使用することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、閾値アライメントスコアを超えるアライメントスコアを有するアライメント（または上位アライメント）を使用することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、閾値アライメントスコアは50であることができ、これは完全な25ntの局所アライメントを表す。
【００７５】
いずれかの局面のいくつかの態様において、最適経路探索アルゴリズムを使用して、リードの組成を記載する、典型的にはアライメントを見いだす、アライメントの最適配列を選択することができる。アライメントされたリードを、例えば、以下の条件でフィルタリングすることができる:（1）リードがベイトアライメントおよびプレイアライメントの両方を含まなければならない、（2）ベイトアライメントが標的にされた部位を越えて10ヌクレオチド超伸長できない。いずれかの局面のいくつかの態様において、ベクター制御および複数の部位とのオフセットニッキングのために、遠位の標的にされた部位を使用することができる。不要なアライメントを、選択されたプレイアライメントと比較することができる；不要なアライメントのいずれかが、プレイアライメントに関してカバレッジおよびスコア閾値の両方を上回る場合、リードを、低いマッピング品質に起因してフィルタリングすることができる。
【００７６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、推定されるミスプライミング事象および他の潜在的な人工物を除去するために、ベイトアライメントは、プライマーを過ぎて10ヌクレオチド伸長させることができる。ベイトアライメントの終点とプレイアライメントの開始点の座標を全リードにわたって比較することによって、潜在的な重複を除去することができる。リードが別のリードのベイトおよびプレイアライメントの2nt以内にベイトアライメントオフセットおよび2nt以内にプレイアライメントオフセットを有する場合、リードを重複としてマークすることができる。フィルタリング後ストリンジェンシーを適用して、所定のヌクレオチド長（例えば、10nt、20nt、30nt、40nt、50ntなど）より大きいギャップおよび所定の長さ（例えば、70nt、60nt、50nt、40nt、30ntなど）より短いベイト配列を有する連結を除去することができる。テロメア反復配列へプレイアライメントしたリードを除去することもできる。
【００７７】
上記の特定されたモジュールまたはプログラムの各々は、上記の機能を実施するための命令のセットに対応する。これらのモジュールおよびプログラム（すなわち、命令のセット）は、別個のソフトウェアプログラム、手順またはモジュールとして実行される必要はなく、したがって、これらのモジュールの様々なサブセットが、様々な態様において、組み合わされてもそうでなければ再配置されてもよい。いずれかの局面のいくつかの態様において、メモリは、上で特定されたモジュールおよびデータ構造のサブセットを保存し得る。さらに、メモリは、上記されていない追加のモジュールおよびデータ構造を保存し得る。
【００７８】
本開示の例証される局面はまた、通信ネットワークを通じてつながっている遠隔処理デバイスによってある特定のタスクが実施される分散コンピューティング環境で実践されてもよい。分散コンピューティング環境では、プログラムモジュールを、局部メモリ記憶デバイスおよび遠隔メモリ記憶デバイスの両方に設置することができる。
【００７９】
さらに、本明細書に記載の様々なコンポーネントが、対象のイノベーションの態様を実行するために適切な価値のコンポーネントおよび回路要素を含むことができる電気回路を含むことができることが認識されるべきである。さらに、様々なコンポーネントの多くを1つまたは複数の集積回路（IC）チップ上に実装できることを認識することができる。例えば、一態様において、コンポーネントのセットを単一ICチップに実装することができる。他の態様において、それぞれのコンポーネントの1つまたは複数が、別個のICチップ上で組み立てられるかまたは実装される。
【００８０】
上記したものは、本発明の態様の例を含む。当然ながら、特許請求される主題を説明するために、コンポーネントまたは方法論の全ての考えられる組み合わせを説明することは不可能であるが、対象のイノベーションの多くのさらなる組み合わせおよび並べ替えが可能であることが認識されるべきである。したがって、特許請求される主題は、添付の特許請求の精神および範囲内にある全てのそのような変更、改変および変形を包含することを意図している。さらに、対象の開示の例証される態様の上記の説明は、要約に記載のものを含め、網羅的であることも、開示される態様をまさにその開示された形態に限定するものでもない。例証を目的に特定の態様および例が本明細書に記載されているが、当業者が認識できるように、そのような態様および例の範囲内にあると見なされる様々な改変が可能である。
【００８１】
特に、かつ、上記のコンポーネント、デバイス、回路、システムなどによって実施される様々な機能に関して、そのようなコンポーネントを説明するために使用される用語は、特に指示のない限り、記載のコンポーネントの特定の機能を実施する任意のコンポーネント（例えば、機能的等価物）に対応することを意図しており、開示される構造と構造的に等価でなくとも、特許請求される主題の本明細書に例示される例示的な局面において機能を実施する。この点に関して、また、本イノベーションが、システムだけでなく、特許請求される主題の様々な方法の行為および／またはイベントを実施するためのコンピュータ実行可能命令を有するコンピュータ可読記憶媒体を含むことも認識されよう。
【００８２】
前述したシステム/回路/モジュールは、いくつかのコンポーネント/ブロック間の相互作用に関して記載されている。そのようなシステム/回路およびコンポーネント/ブロックは、それらのコンポーネントもしくは特定のサブコンポーネント、特定のコンポーネントもしくはサブコンポーネントのいくつか、および／または追加のコンポーネントを含むことができ、前述したものの様々な並べ替えおよび組み合わせに従うことを認識することができる。サブコンポーネントはまた、ペアレントコンポーネント（階層的）内に含まれるのではなく、他のコンポーネントに通信可能に結合されたコンポーネントとして、実装することもできる。追加的に、1つまたは複数のコンポーネントを、集約的機能性を提供する単一コンポーネントに組み合わせても、いくつかの別個のサブコンポーネントに分割してもよく、そして、任意の1つまたは複数の中間層、例えば管理層を提供して、統合的機能性を提供するために、そのようなサブコンポーネントに通信可能に結合させてもよいことに留意すべきである。本明細書に記載の任意のコンポーネントはまた、本明細書には具体的に記載されていないが当業者に公知である1つまたは複数の他のコンポーネントと相互作用してもよい。
【００８３】
加えて、対象のイノベーションの特定の特徴は、いくつかの実施態様のただ1つに関して開示され得るが、所望される場合および任意の所与のまたは特定の用途に対して有利となり得る場合、そのような特徴は、他の実施態様の1つまたは複数の他の特徴と組み合わせてよい。さらに、用語「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「有する」、「含有する」、それらの変形および他の類似の言葉が、詳細な説明または特許請求の範囲のいずれかで使用される限り、これらの用語は、あらゆる追加のまたは他の要素を除外することなく、オープンな移行句としての用語「含む（comprising）」と同様に包括的であることを意図している。
【００８４】
本出願において使用される場合、用語「コンポーネント」、「モジュール」、「システム」などは、一般に、ハードウェア（例えば、回路）、ハードウェアとソフトウェアの組み合わせ、ソフトウェア、または1つまたは複数の特定の機能性を有する演算機械に関連するエンティティのいずれかである、コンピュータ関連のエンティティを指すことを意図している。例えば、コンポーネントは、プロセッサ（例えば、デジタルシグナルプロセッサ）上で作動するプロセス、プロセッサ、オブジェクト、実行ファイル、実行のスレッド、プログラムおよび／またはコンピュータであり得るが、それらに限定されない。例証として、コントローラ上で作動するアプリケーションおよびコントローラは共に、コンポーネントであることができる。1つまたは複数のコンポーネントが、プロセスおよび／または実行のスレッド内に存在してよく、そして、あるコンポーネントが、1つのコンピュータに局在しても、かつ／または、2つまたはそれ以上のコンピュータ間に分配されてもよい。さらに、「デバイス」は、特注のハードウェア；ソフトウェアの実行によってハードウェアが特定の機能を実施することを可能にする、特別に製造された汎用ハードウェア；コンピュータ可読媒体に保存されているソフトウェア；またはそれらの組み合わせの形態をとることができる。
【００８５】
さらに、語「例」または「例示的な」は、本明細書において、例、事例または例証として機能することを意味するために使用される。「例示的な」として本明細書に記載される任意の局面または設計は、必ずしも、他の局面または設計よりも好ましいまたは有利であると解釈されるべきではない。むしろ、語「例」または「例示的な」の使用は、概念を実体のある様式で提示することを意図している。本出願において使用される場合、用語「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を意味することを意図している。すなわち、特に規定のない限り、または文脈から明白である場合を除き、「XがAまたはBを用いる」は、自然の包括的な並べ替えのいずれかを意味することを意図している。すなわち、XがAを用いるか；XがBを用いるか；またはXがAおよびBの両方を用いる場合、「XがAまたはBを用いる」は、前述の事例のいずれかで満たされる。加えて、冠詞「1つの（a）」および「1つの（an）」は、本出願および添付の特許請求の範囲において使用される場合、一般に、特に規定のない限り、または、単数形を指示していると文脈から明白である場合を除き、「1つまたは複数」を意味すると解釈されるべきである。
【００８６】
コンピューティングデバイスは、典型的には、コンピュータ可読記憶媒体および／または通信媒体を含むことができる多種多様な媒体を含み、これらの2つの用語は、本明細書において、以下の通りに互いに異なって使用される。コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータによってアクセスできる任意の使用可能な記憶媒体であることができ、典型的には非一過性であり、そして、揮発性および不揮発性媒体と、リムーバブルおよび非リムーバブル媒体の両方を含むことができる。例として、かつ、非限定的に、コンピュータ可読記憶媒体は、コンピュータ可読命令、プログラムモジュール、構造化データまたは非構造化データなどの情報の保存のための任意の方法または技術に関連して、実装することができる。コンピュータ可読記憶媒体は、RAM、ROM、EEPROM、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、CD-ROM、デジタル多用途ディスク（DVD）もしくは他の光ディスク記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶装置デバイス、または、所望の情報を保存するために使用できる他の有形および／または非一過性媒体を含むことができるが、それらに限定されない。コンピュータ可読記憶媒体は、その媒体に保存されている情報に関する多種多様な操作のために、1つまたは複数のローカルまたはリモートコンピューティングデバイスによって、例えば、アクセス要求、クエリーまたは他のデータ検索プロトコルを介して、アクセスすることができる。
【００８７】
他方、通信媒体は、典型的には、コンピュータ可読命令、データ構造、プログラムモジュールまたは他の構造化データもしくは非構造化データを、変調されたデータシグナル、例えば、搬送波または他の輸送機構などの一過性であることができ、かつ、任意の情報伝達または輸送媒体を含む、データシグナルで具体化する。用語「変調されたデータシグナル」またはシグナルは、情報を1つまたは複数のシグナルでコードするような様式でその特徴の1つまたは複数が設定または変化されたシグナルを指す。例として、かつ、非限定的に、通信媒体は、有線ネットワークまたは直接有線接続などの有線媒体、ならびに、音響、RF、赤外線、および他の無線媒体などの無線媒体を含む。
【００８８】
上記の例示的なシステムを考えると、記載の主題に従って実行され得る方法論は、様々な図のフローチャートを参照してより良く認識されよう。説明の簡素化のために、該方法論は、一連の行為として示されかつ記載される。しかしながら、この開示に従う行為は、本明細書に提示も記載もされない他の行為と共に、様々な順序でかつ/または同時に、行うことができる。さらに、例示される行為の全てが、開示される主題に従う方法論を実行するために必要とされるわけではない。加えて、当業者であれは、該方法論を、状態図またはイベントを介して一連の相互関係のある状態として代替的に表すこともできると理解および認識されよう。追加的に、本明細書において開示される方法論を、製造品に保存して、そのような方法論をコンピューティングデバイスに輸送および移送することを容易にすることができることが理解されるべきである。製造品という用語は、本明細書において使用される場合、任意のコンピュータ可読デバイスまたは記憶媒体からアクセス可能なコンピュータプログラムを包含することを意図している。
【００８９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程の結果は、ディスプレイモジュール上に表示される。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程の結果は、コンピュータモニター上に表示される。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメントする工程の結果は、印刷可能媒体を通して表示される。ディスプレイモジュールは、コンピュータ可読情報をコンピュータから受け取ってその情報をユーザーに表示するように構成された任意の好適なデバイスであることができる。非限定例は、例えば、汎用コンピュータ、例えば、Intel PENTIUM型プロセッサ、Motorola PowerPC、Sun UltraSPARC、Hewlett-Packard PA-RISCプロセッサ、カリフォルニア州サニーベールのAdvanced Micro Devices（AMD）から入手可能な多種多様なプロセッサのいずれか、または任意の他のタイプのプロセッサ、ビジュアルディスプレイデバイス、例えばフラットパネルディスプレイ、カソードレイチューブなど、ならびに様々なタイプのコンピュータプリンタに基づくものを含む。
【００９０】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメント結果に基づいたコンテンツの表示のためのユーザーインタフェースを提供するため、ワールドワイドウェブブラウザが使用される。本発明の他のモジュールを、ウェブブラウザインタフェースを有するように適応させることができることを理解すべきである。ウェブブラウザを経由して、ユーザーは、アライメント結果からデータを検索するための要求を構築することができる。したがって、ユーザーは、典型的には、グラフィカルユーザーインタフェースにおいて従来用いられている、ボタン、プルダウンメニュー、スクロールバーなどのユーザーインタフェース要素にポイントを合わせ、クリックする。
【００９１】
いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメント工程の結果は、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである。いずれかの局面のいくつかの態様において、アライメント工程の結果は、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルとして表示される。多数の組換え事象および／または再編成事象の並行反応または多重反応のいずれかでの検出、ならびに参照配列／データベースに対する事象のアライメントは、組換え/再編成連結の点突然変異、インデル、および／または変異、ならびに任意でそのような事象の相対頻度の同定をもたらすことができる。
【００９２】
本明細書に記載の方法およびアッセイ法の細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、植物細胞、神経細胞、線維芽細胞、インビトロ細胞、またはインビボ細胞を非限定的に含む、任意のタイプの細胞であることができる。細胞は、DNAを含有する限りは、どんなタイプのものであることもできる。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、培養で維持することができる細胞であることができる。細胞は、初代細胞または不死化細胞であることができる。また、分化した細胞も部分的に分化した細胞も、胚性幹細胞を含む多能性細胞および幹細胞も使用することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、哺乳動物細胞である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、ヒト細胞である。
【００９３】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む細胞であることができ、例えば、細胞は、胚中心Bリンパ球であることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、または発生期Tリンパ球である。いずれかの局面のいくつかの態様において、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、および／またはパイエル板から得られた細胞。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である。いずれかの局面のいくつかの態様において、当業者に周知の活性化条件を使用して細胞を活性化し、細胞分裂および組換え事象を誘導することができる。
【００９４】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、工程（a）の前に、組織中、例えば、インビボで存在することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、工程（a）の前に、動物中に存在することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、工程（a）の前に、抗原で免疫化された動物中に存在することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、抗原で免疫化された動物から得られた細胞を提供する工程をさらに含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（a）の前に、動物を抗原で免疫化する工程、および動物から細胞を単離する工程をさらに含む。
【００９５】
V(D)J組換えを、工程（a）を実施する前に、細胞または細胞源において誘導することができる。非限定例として、V(D)J組換えを、RAG1/2エンドヌクレアーゼの形質導入および／または異所性発現によって、細胞、組織または動物において誘導することができる。V(D)J組換えを誘導することができる作用物質のさらなる非限定例は、イマチニブ（すなわち、GLEEVEC、メシラート、またはSTI-571）である。いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、v-ablで形質転換されたB細胞である。
【００９６】
用語「作用物質」は、一般に、細胞、組織、または対象に投与されるレベルで通常存在しないまたは存在しない任意のエンティティを指す。作用物質を、ポリヌクレオチド；ポリペプチド；低分子；および抗体またはその抗原結合断片を非限定的に含む群より選択することができる。ポリヌクレオチドは、RNAまたはDNAであることができ、一本鎖または二本鎖であることができ、例えば、ポリペプチドをコードする核酸および核酸類似体を含む群より選択することができる。ポリペプチドは、関心対象の機能を保持する天然に存在するポリペプチド、突然変異ポリペプチドまたはその断片であることができるが、それらに限定されない。作用物質のさらなる例は、核酸アプタマー、ペプチド−核酸（PNA）、ロックド核酸（LNA）、有機低分子または無機低分子；糖；オリゴ糖；多糖；生物学的巨大分子、ペプチド模倣体；核酸類似体および誘導体；細菌、植物、真菌または哺乳動物の細胞または組織などの生物学的材料から作られた抽出物ならびに天然に存在する組成物または合成組成物を含むが、それらに限定されない。作用物質を培地に適用して、そこで、作用物質を細胞と接触させ、その効果を誘導することができる。あるいは、作用物質をコードする核酸配列の細胞への導入と、細胞内での核酸および／またはタンパク質環境刺激の産生をもたらすその転写の結果として、作用物質は、細胞内にあることができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、作用物質は、合成および天然に存在する非タンパク質性エンティティを非限定的に含む、任意の化学的エンティティまたは部分である。ある特定の態様において、作用物質は、例えば、マクロライド、レプトマイシン、および関連する天然産物またはその類似体を含む、非置換または置換アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分より選択される化学的部分を有する低分子である。作用物質は、所望の活性および／または特性を有することが知られているか、または、多様な化合物のライブラリーより選択することができる。本明細書において使用される場合、用語「低分子」は、「天然産物様」である化合物を指すことができるが、用語「低分子」は、「天然産物様」化合物に限定されない。むしろ、低分子は、典型的には、いくつかの炭素-炭素結合を含有しかつ約50ダルトン超で約5000ダルトン（5kD）未満の分子量を有するという点で特徴決定される。好ましくは、低分子は、3kD未満、なおさらに好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満の分子量を有する。いくつかの場合には、低分子は、700ダルトンに等しいまたはそれ未満の分子質量を有することが好ましい。
【００９７】
いずれかの局面のいくつかの態様において、方法は、工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、ソース細胞は、初代幹細胞である。いずれかの局面のいくつかの態様において、ソース細胞は、人工多能性幹細胞（IPSC）である。V(D)J組換えを開始させるための特定の細胞および／または組織の分化法、例えば、Bリンパ球またはTリンパ球系列への細胞の分化法は、当技術分野において公知である。
【００９８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、再編成事象は、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う。
【００９９】
いずれかの局面のいくつかの態様において、細胞は、AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞であることができる。
【０１００】
一局面において、V、D、またはJセグメントの400bp内に特異的にアニーリングする少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを含むキットが本明細書に記載される。いずれかの局面のいくつかの態様において、キットは、ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；ランダムヌクレオチドの近位部；および3’オーバーハングを含む、アダプターをさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、キットは、少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーをさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、キットは、少なくとも1つのネステッドPCRプライマーをさらに含むことができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、キットは、親和性ドメインを含む基質をさらに含むことができ、ここで、一次または二次遺伝子座特異的プライマーは、親和性タグを含む。いずれかの局面のいくつかの態様において、キットは、細胞をさらに含むことができる。
【０１０１】
キットは、少なくとも1つの試薬、例えば、一次および／または二次遺伝子座特異的プライマーを含む任意の製造品（例えば、包装または容器）であり、製造品は、本明細書に記載の方法を実施するためのユニットとして促進販売、流通または販売される。本明細書に記載のキットは、任意で、本明細書に記載の方法を実施するために有用な追加のコンポーネントを含むことができる。例として、キットは、本明細書に記載の方法に係る反応の1つまたは複数を実施するために好適な流体および組成物（例えば、緩衝液、dNTPなど）、本明細書に記載の通りの方法の性能を説明する指示書などを含むことができる。追加的に、キットは、指示リーフレットを含み得、かつ/または、得られた結果の関連性についての情報を提供し得る。
【０１０２】
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるいくつかの用語および語句の意味を以下に提供する。特に指定のない限りまたは文脈から黙示的でない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。本発明の範囲が特許請求の範囲によってのみ限定されるので、定義は、特定の態様を説明する上で助けとなるように提供され、特許請求される発明を限定することを意図するものではない。特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。当技術分野における用語の使用法と本明細書に提供されるその定義との間に明らかな矛盾がある場合、本明細書内に提供される定義が優先されるものとする。
【０１０３】
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここにまとめる。
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「接触させる」は、作用物質を少なくとも1つの細胞に送達または曝露させるための任意の好適な手段を指す。例示的な送達法は、細胞培養培地への直接送達、灌流、注射、または当業者に周知の他の送達法を含むが、それらに限定されない。
【０１０５】
様々な態様において、本明細書に記載の方法は、少なくとも1つのプライマー、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCR増幅レジメンを実施することに関する。本明細書において使用される場合、「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型に配列特異的にアニーリングし、鋳型依存性ポリメラーゼに対する基質として役立つ3'末端を提供して、ポリヌクレオチド鋳型に相補的である伸長産物を産生することができる、DNAまたはRNAポリヌクレオチド分子またはその類似体を指す。開始および伸長のための条件は、通常、少なくとも1つであるがより好ましくは4つ全ての異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘導剤が、好適な緩衝液（この状況で「緩衝液」は、溶媒（一般に水性）＋必須補因子およびpH、イオン強度などに影響を及ぼす試薬を含む）中、好適な温度で存在することを含む。本明細書に記載される方法において有用なプライマーは、一般に、一本鎖であり、そして、プライマーおよびその相補体はアニーリングして、二本鎖ポリヌクレオチドを形成することができる。本明細書に記載の方法および組成物に係るプライマーは、300個未満または300個のヌクレオチド長、例えば、300、もしくは250、もしくは200、もしくは150、もしくは100、もしくは90、もしくは80、もしくは70、もしくは60、もしくは50、もしくは40個未満または300、もしくは250、もしくは200、もしくは150、もしくは100、もしくは90、もしくは80、もしくは70、もしくは60、もしくは50、もしくは40個のヌクレオチド長であることができ、かつ好ましくは、30個のヌクレオチド長もしくはそれより短いヌクレオチド長、または20個のヌクレオチド長もしくはそれより短いヌクレオチド長、または15個のヌクレオチド長もしくはそれより短いヌクレオチド長であるが、少なくとも10個のヌクレオチド長であることができる。
【０１０６】
いずれかの局面のいくつかの態様において、本明細書に記載のPCR反応は、プライマーのセットの使用に関する。本明細書において使用される場合、用語「プライマーのセット」は、フォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも2つのプライマーの一群を指し、その一方が標的核酸配列の第一の鎖にアニーリングし、そして、他方が第一の鎖の相補体にアニーリングする。いずれかの局面のいくつかの態様において、プライマー対サブセットの第一のプライマーは、標的核酸配列の第一の鎖にアニーリングすることができ、そして、プライマー対サブセットの第二のプライマー（例えば、リバースプライマー）は、その鎖の相補体にアニーリングすることができる。標的および／またはその相補体にアニーリングする場合のプライマーの配向は、プライマー対サブセットの一方のプライマーのプライマー伸長から進行する核酸合成が、プライマー対サブセットの第二のプライマーの少なくとも1つの領域に相補的である核酸配列を産生するような配向であることができる。核酸標的および／または配列の「第一の鎖」は、標的ヌクレオチドおよび／または標的部位遺伝子座の配列を含む二本鎖核酸のいずれかの鎖であることができるが、いったん選択されれば、その相補体を第二の鎖として定義する。したがって、本明細書において使用される場合、「フォワードプライマー」は、核酸標的の第一の鎖にアニーリングするプライマーであるが、同じセットの「リバースプライマー」は、核酸標的の第一の鎖の相補体にアニーリングするプライマーである。本明細書において使用される場合、標的核酸に特異的なプライマーの状況下で使用される場合の「特異的」は、プライマーが標的核酸にアニーリングしてその増幅を媒介するが、サンプル中に存在する非標的配列にアニーリングすることもその増幅を媒介することもないアニーリング温度が存在するような、プライマーと標的との間の相補性のレベルを指す。
【０１０７】
プライマーを製造する方法は、当技術分野において周知であり、そして、多数の販売業者が、本明細書に記載の方法および組成物に係るプライマーを提供するために好適なオリゴヌクレオチド合成サービスを提供している（例えば、INVITROGEN（商標） Custom DNA Oligos; Life Technologies; Grand Island, NYまたはIDTのcustom DNA Oligos; Coralville, IA）。
【０１０８】
いずれかの局面のいくつかの態様において、プライマーの1つまたは複数をSEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択することができる。いずれかの局面のいくつかの態様において、プライマーの1つまたは複数は、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含むことができる。
【０１０９】
（表４）
2020507326.tif 000003
2020507326.tif 000004
2020507326.tif 000005
【０１１０】
PCRは、核酸ポリメラーゼの使用を必要とする。本明細書において使用される場合、語句「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオシド三リン酸の鋳型依存性重合を触媒して鋳型核酸配列に相補的なプライマー伸長産物を形成する、酵素を指す。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニーリングするプライマーの3’末端で合成を開始し、鋳型の5’末端の方向に進行する。多数の核酸ポリメラーゼが当技術分野において公知であり、市販されている。好ましい核酸ポリメラーゼの一群は、熱安定性であり、すなわち、これらは、相補的核酸のアニーリング鎖を変性するのに十分な温度、例えば94℃または時により高い温度に供された後に機能を保持している。当技術分野において理解されている通り、PCRは、反応混合物の加熱を一般に伴う鎖の分離工程を含むサイクルを必要とすることができる。本明細書において使用される場合、用語「鎖の分離」または「鎖を分離する工程」は、相補的二本鎖分子がオリゴヌクレオチドプライマーへのアニーリングに使用可能な2本の一本鎖に分離されるような核酸サンプルの処理を意味する。より具体的には、本明細書に記載の方法に係る鎖の分離は、核酸サンプルをそのTm超に加熱することによって達成される。一般に、核酸ポリメラーゼに好適な緩衝液中の核酸分子を含有するサンプルについて、94℃への加熱が鎖の分離を達成するのに十分である。例示的な緩衝液は、50mM KC1、10mM Tric-HCl（25℃で、pH 8.8）、0.5〜3mM MgCl2および0.1％ BSAを含有する。
【０１１１】
また当技術分野において理解されている通り、PCRは、鋳型核酸にプライマーをアニーリングする工程を必要する。本明細書において使用される場合、「アニーリングする」は、2本の相補的なまたは実質的に相補的な核酸鎖がハイブリダイズする、より詳細には、PCRの状況において使用される場合に鋳型依存性ポリメラーゼ酵素に対するプライマー伸長基質が形成されるようにハイブリダイズすることを可能にすることを指す。プライマー-標的核酸のアニーリングのための条件は、プライマーの長さおよび配列によって変動し、プライマーについての算出Tmに基づく。一般に、増幅レジメンにおけるアニーリング工程は、温度を、鎖の分離工程後に、プライマー配列についての算出Tmに基づく温度まで、そのようなアニーリングを可能にするのに十分な時間低下させることを伴う。Tmは、多数の広く使用可能なアルゴリズム（例えば、OLIGOTM（Molecular Biology Insights Inc. Colorado）プライマー設計ソフトウェアおよびVENTRO NTI（商標）（Invitrogen, Inc. California）プライマー設計ソフトウェアならびにPrimer3およびOligo Calculatorを含むインターネットで使用可能なプログラム）のいずれかを使用して、当業者が容易に予測することができる。例えば、Tmは、NetPrimerソフトウェア（Premier Biosoft; Palo Alto, CA; そして、ワールドワイドウェブ上のhttp://www.premierbiosoft.com/netprimer/netprlaunch/Help/xnetprlaunch.htmlで自由に使用可能な）を使用して算出できる。プライマーのTmはまた、NetPrimerソフトウェアによって使用される以下の式を使用して算出することもでき、これは、参照によってその全体が本明細書に組み入れられるFrieir et al. PNAS 1986 83:9373-9377により詳細に記載されている。Tm=ΔH/(ΔS＋R*ln(C/4))＋16.6 log([K+]/(1+0.7[K+]))−273.15、式中、ΔHは、らせん形成についてのエンタルピーであり；ΔSは、らせん形成についてのエントロピーであり；Rは、モル気体定数（1.987cal/℃*mol）であり；Cは、核酸濃度であり；そして、[K+]は、塩濃度である。ほとんどの増幅レジメンについて、アニーリング温度は、予測Tmより約5℃低い温度へ選択されるが、Tmにより近いおよびそれより高い温度（例えば、予測Tmより1℃〜5℃低いまたは予測Tmより1℃〜5℃高い）を使用することができ、同様に、例えば、予測Tmより5℃超低い（例えば、6℃低い、8℃低い、10℃低い、またはそれより低い）温度を使用することができる。一般に、アニーリング温度がTmにより近いほど、アニーリングはより特異的である。PCR増幅レジメン中のプライマーがアニーリングできる時間は、反応の容量に大きく依存し、容量が大きいほどより長い時間を必要とするが、これはまたプライマーおよび鋳型の濃度にも依存し、鋳型に対するプライマーの相対濃度が高いほど、相対濃度がより低い場合よりも短い時間で済む。容量および相対プライマー/鋳型濃度に依存して、増幅レジメンにおけるプライマーアニーリング工程は、1秒間〜5分間のオーダーであることができるが、一般に、10秒間〜2分間、好ましくは30秒間〜2分間のオーダーであろう。本明細書において使用される場合、「実質的にアニーリングする」は、検出可能レベルの特異的に増幅された産物を産生するのに十分なPCR増幅レジメン中のアニーリングの程度を指す。
【０１１２】
PCRはまた、各サイクルにおけるアニーリングされたプライマーのポリメラーゼ伸長にも依拠する。本明細書において使用される場合、用語「ポリメラーゼ伸長」は、アニーリングされたプライマーの3’末端上への、核酸ポリメラーゼによる、少なくとも1つの相補的ヌクレオチドの鋳型依存性組み込みを意味する。ポリメラーゼ伸長は、好ましくは、1を超えるヌクレオチド、好ましくは、鋳型の完全長に相当するヌクレオチドまでのものでかつ鋳型の完全長に相当するヌクレオチドを含むものが付加される。ポリメラーゼ伸長のための条件は、ポリメラーゼの性質によって変動する。ポリメラーゼ伸長のために使用される温度は、一般に、酵素の既知の活性特性に基づく。しかし、アニーリング温度が、例えば、酵素にとっての至適温度より低い必要がある場合、しばしば、より低い伸長温度を使用することが許容される。一般に、酵素はその至適伸長温度未満においても少なくとも部分的な活性を保持するが、最も一般的に使用されている熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Taqポリメラーゼおよびそのバリアント）によるポリメラーゼ伸長は、65℃〜75℃、例えば、68〜72℃で実施される。
【０１１３】
プライマー伸長は、アニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を許容する条件下で実施される。本明細書において使用される場合、用語「伸長産物が生成されるようなアニーリングされたオリゴヌクレオチドの伸長を許容する条件」は、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する、例えば、温度、塩および補因子濃度、pHならびに酵素濃度を含む条件のセットを指す。そのような条件は、使用される核酸ポリメラーゼの性質によって変動するが、多数の有用なポリメラーゼ酵素のための条件が当業者に周知である。1つの例示的な条件セットは、50mM KC1、10mM Tric-HCl（25℃でpH 8.8）、0.5〜3mM MgCl2、200uM 各dNTP、および0.1％ BSA、72℃であり、この条件下で、Taqポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「増幅された産物」または「PCR産物」は、ヌクレオチド配列において鋳型核酸配列および／またはその相補的配列に対応する、特定の標的核酸配列および／またはその相補的配列の一部のコピーである、PCR反応から生じるポリヌクレオチドを指す。増幅された産物は、二本鎖または一本鎖であることができる。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において互換的に使用され、隣接残基のアルファ-アミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基のことを指す。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、そのサイズまたは機能に関わらず、修飾アミノ酸（例えば、リン酸化、糖化、グリコシル化など）およびアミノ酸類似体を含む、アミノ酸のポリマーを指す。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、しばしば相対的に大きいポリペプチドに関して使用される一方で、用語「ペプチド」は、しばしば小さいポリペプチドに関して使用されるが、当技術分野におけるこれらの用語の使用法は重複する。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書において、遺伝子産物およびその断片に言及する場合に互換的に使用される。したがって、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、断片および他の等価体、前述したもののバリアント、断片および類似体を含む。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」または「核酸配列」は、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはその類似体の単位を包含する、任意の分子、好ましくはポリマー分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであることができる。一本鎖核酸は、変性した二本鎖DNAの一方の核酸鎖であることができる。あるいは、それは、任意の二本鎖DNAに由来しない一本鎖核酸であることができる。一局面において、核酸は、DNAであることができる。別の局面において、核酸はRNAであることができる。好適な核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の好適な核酸分子は、mRNAを含むRNAである。
【０１１７】
用語「統計的に有意な」または「統計的に」は、統計的有意性を指し、一般に、2標準偏差（2SD）またはそれより大きい相違を意味する。
【０１１８】
作業例以外でまたは特に指示のない限り、本明細書において使用される成分の量または反応条件を表す全ての数値は、全ての事例において用語「約」によって修飾されるものと理解すべきである。用語「約」は、百分率に関連して使用される場合、±1％を意味することができる。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語「含む（comprising）」または「含む（comprises）」は、組成物、方法、および該方法または該組成物に必須であるその各コンポーネントに関して使用されるが、必須であるか否かを問わず明記されていない要素の包含も受け入れる。
【０１２０】
用語「からなる」は、態様の説明に列記されていないいかなる要素も含まない、本明細書に記載の通りの組成物、方法およびその各コンポーネントを指す。
【０１２１】
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の態様にとって必要な要素を指す。この用語は、その態様の基本的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【０１２２】
単数形の用語「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、語「または」は、文脈が明確に他のことを示していない限り、「および」を含むことを意図する。本明細書に記載の方法および材料と類似または等価な方法および材料をこの開示の実践または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が以下に記載される。略称「例えば（e.g.）」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非限定的な例を指すために使用される。したがって、略称「例えば」は、用語「例えば（for example）」と同義である。
【０１２３】
細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10:0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)、およびCurrent Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., edsに見いだすことができる。
【０１２４】
特に指示のない限り、本発明は、例えば、全て参照によってそれらの全体が本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995);またはMethods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques Vol.152, S. L. Berger and A. R. Kimmel Eds., Academic Press Inc., San Diego, USA (1987); Current Protocols in Protein Science (CPPS) (John E. Coligan, et. al., ed., John Wiley and Sons, Inc.), Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.)、および Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)に記載されているような標準的な手順を使用して実施された。
【０１２５】
他の用語は、本明細書において本発明の様々な局面の説明内で定義される。
【０１２６】
参照文献、発行された特許、公開された特許出願、および同時係属特許出願を含む、本出願全体を通じて引用される全ての特許および他の刊行物は、例えば、本明細書に記載の技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照によって本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前に単にそれらの開示のために提供される。この点に関して、本発明者等が、先行発明によってまたは任意の他の理由で、そのような開示に先行する資格を有しないことを承認するものと解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関する声明または内容に関する表示は全て、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関するいかなる承認も認められない。
【０１２７】
本開示の態様の説明は、網羅的であることも、本開示をまさにその開示された形態に限定するものでもない。本開示の具体的な態様およびその例は、例証を目的として本明細書に記載されているが、関連する技術分野の当業者に認識されるように様々な等価な改変が本開示の範囲内で可能である。例えば、方法の工程または機能が所与の順序で示されているが、代替的な態様が、異なる順序で機能を実施してもよく、機能が実質的に同時に実施されてもよい。本明細書に提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載の様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、必要ならば、上記の参照文献および出願の組成、機能、および概念を用いるように改変することで、本開示の別のさらなる態様を提供することができる。さらに、生物学的な機能的等価性を考慮することによって、いくつかの変更を、種類または量の点で生物学的または化学的な作用に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造に施すことができる。これらのおよび他の変更を、詳細な説明に照らして、本開示に施すことができる。そのような改変は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることを意図する。
【０１２８】
前述の態様のいずれかの具体的な要素は、他の態様における要素と組み合わせるかまたは置換することができる。さらに、本開示のある特定の態様に関連する利点がこれらの態様に照らして記載されている一方で、他の態様もそのような利点を提示し得るが、本開示の範囲内に入るために全ての態様が必ずしもそのような利点を提示する必要はない。
【０１２９】
本明細書に記載の技術は、以下の実施例によってさらに例証されるが、該実施例は、決して、さらに限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３０】
本明細書に記載の技術のいくつかの態様は、以下の番号付きの項目のいずれかに従って定義されることができる。
1.  以下の工程を含む、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介（LAM）-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
2.  前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、項目1の方法。
3.  前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、または発生期Tリンパ球からなる群より選択される、項目2の方法。
4.  抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目2または3の方法。
5.  体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目2〜4のいずれかの方法。
6.  前記細胞が胚中心Bリンパ球である、項目5の方法。
7.  工程（a）を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程；および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、項目2〜6のいずれかの方法。
8.  複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、項目1〜7のいずれかの方法。
9.  前記複数のプライマーが、異なるV、D、またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目8の方法。
10.  工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、項目1〜9のいずれかの方法。
11.  前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、項目10の方法。
12.  前記ソース細胞が初代幹細胞である、項目10の方法。
13.  工程（a）を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、項目1〜12のいずれかの方法。
14.  前記細胞と、V(D)J組換えを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、項目1〜13のいずれかの方法。
15.  V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、項目14の方法。
16.  前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、項目15の方法。
17.  前記再編成事象が、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、項目1の方法。
18.  前記細胞が、
AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞
からなる群より選択される、項目1または17の方法。
19.  前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、項目1〜18のいずれかの方法。
20.  工程（c）の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、項目19の方法。
21.  前記親和性タグがビオチンである、項目19または20の方法。
22.  前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、項目21の方法。
23.  前記親和性精製が、工程（c）の産物を基質に結合することを含む、項目20〜22のいずれかの方法。
24.  前記基質がビーズである、項目23の方法。
25.  前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、項目1〜24のいずれかの方法。
26.  前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、項目1〜25のいずれかの方法。
27.  前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、項目1〜26のいずれかの方法。
28.  工程（c）の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、項目1〜27のいずれかの方法。
29.  前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、項目1〜28のいずれかの方法。
30.  前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、項目1〜29のいずれかの方法。
31.  前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、項目1〜30のいずれかの方法。
32.  工程（e）において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、項目1〜31のいずれかの方法。
33.  前記細胞が工程（a）の前に組織中に存在する、項目1〜32のいずれかの方法。
34.  前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、項目1〜33のいずれかの方法。
35.  前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、項目1〜34のいずれかの方法。
36.  前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、項目35の方法。
37.  前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、項目35の方法。
38.  前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、項目34〜37のいずれかの方法。
39.  前記細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜38のいずれかの方法。
40.  ブロッキング消化工程（f）が省略される、項目1〜39のいずれかの方法。
41.  末端修復が工程（c）の前に実施されない、項目1〜40のいずれかの方法。
42.  前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32より選択される配列を含む、項目1〜41のいずれかの方法。
43.  前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32より選択される、項目1〜41のいずれかの方法。
【０１３１】
本明細書に記載の技術のいくつかの態様は、以下の番号付きの項目のいずれかに従って定義されることができる。
1.  以下の工程を含む、細胞における組換え事象および／または再編成事象のハイスループットなゲノムワイド転座シーケンシング（HTGTS）に基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介（LAM）-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、組換え事象および／または再編成事象を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
2.  前記組換え事象がV(D)J組換え事象である、項目1の方法。
3.  以下の工程を含む、細胞におけるIgレパートリー配列のハイスループットなレパートリーシーケンシングに基づく検出のための方法：
a. 細胞からゲノムDNAおよび／またはmRNAを抽出する工程；
b. 任意で、断片化されたDNAおよび／またはmRNAサンプルを産生する工程；
c. 少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いるリニア増幅媒介(LAM)-PCRによって、ゲノムDNAから一本鎖PCR産物を産生し、かつ／または
少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーを用いる逆転写によって、mRNAからcDNAを産生する工程；
d. 工程（c）において産生された該一本鎖PCR産物または該cDNAをアダプターにライゲーションすることによって、ライゲーションされたDNAおよび／またはcDNA産物を産生する工程であって、該アダプターが、
ネステッドPCR増幅用のPCRプライマーを設計するために使用できる既知のDNA配列の遠位部；
ランダムヌクレオチドの近位部；および
3’オーバーハング
を含む、該工程；
e. 工程（d）のライゲーションされた産物を使用して、アダプター特異的プライマーおよび少なくとも1つの二次遺伝子座特異的プライマーを用いるネステッドPCRを実施することによってネステッドPCR産物を産生し、それによって、該Igレパートリー配列を含む核酸配列を増幅する工程；
f. 任意で、工程（e）のPCR産物を制限酵素で消化して、再編成されていないベイト含有断片をブロックする工程；
g. ネステッドPCR産物を配列決定することによって、配列決定された該ネステッドPCR産物を産生する工程；ならびに
h. 配列決定された該ネステッドPCR産物を参照配列または抗原受容体データベースに対してアライメントする工程。
4.  検出されたレパートリーが、V(D)J組換え事象および／または体細胞超突然変異（SMH）を含む、項目3の方法。
5.  検出されたレパートリーが、Ig重鎖、Ig軽鎖、V使用頻度、およびCDR3レパートリーを含む、項目3または4の方法。
6.  前記細胞が、成熟Bリンパ球、発生期Bリンパ球、成熟Tリンパ球、発生期Tリンパ球、胚中心から得られた細胞、およびパイエル板から得られた細胞からなる群より選択される、項目1〜5のいずれかの方法。
7.  抗原で免疫化された動物から得られた前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目1〜6のいずれかの方法。
8.  体細胞超突然変異を起こしたV(D)Jエクソンを含む前記細胞を提供する工程をさらに含む、項目1〜7のいずれかの方法。
9.  前記細胞が、胚中心Bリンパ球またはパイエル板Bリンパ球である、項目8の方法。
10.  工程（a）を実施する前に、
動物を抗原で免疫化する工程；および
該動物から細胞を得る工程
をさらに含む、項目1〜9のいずれかの方法。
11.  前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、J遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目1〜10のいずれかの方法。
12.  複数の一次遺伝子座特異的プライマーおよび／または二次遺伝子座特異的プライマーの使用をさらに含む、項目1〜11のいずれかの方法。
13.  前記複数のプライマーの各々が、異なるV、D、および／またはJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目12の方法。
14.  前記複数のプライマーの各々が、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在する各異なるJ遺伝子セグメントに特異的にアニーリングする、項目13の方法。
15.  集団的に前記複数のプライマーが、JH1、JH2、JH3、またはJH4の各々における1つの配列に特異的にアニーリングする、項目14の方法。
16.  集団的に前記複数のプライマーが、V(D)J組換えの前に前記細胞または生物のゲノム中に存在するJH、JK、およびJL遺伝子セグメントの各々における少なくとも1つの配列に特異的にアニーリングする、項目14の方法。
17.  前記少なくとも1つの一次遺伝子座特異的プライマーが、標的にされた前記遺伝子セグメントの縮重領域に特異的にアニーリングする、項目1〜16のいずれかの方法。
18.  工程（a）を実施する前に、ソース細胞またはソース組織を分化させてV(D)J組換えを開始させる工程をさらに含む、項目1〜17のいずれかの方法。
19.  前記ソース細胞が人工多能性幹細胞である、項目18の方法。
20.  前記ソース細胞が初代幹細胞である、項目18の方法。
21.  工程（a）を実施する前に、前記細胞またはソースが、RAG1/2エンドヌクレアーゼを用いて形質導入されて、V(D)J組換えを開始する、項目1〜20のいずれかの方法。
22.  前記細胞と、V(D)J組換えまたはSHMを開始させる1つまたはそれ以上の試薬とを接触させる工程をさらに含む、項目1〜21のいずれかの方法。
23.  V(D)J組換えを開始させる前記試薬がイマチニブである、項目22の方法。
24.  前記細胞が、v-ablウイルスで形質転換されたB細胞である、項目23の方法。
25.  前記再編成事象が、がん遺伝子および／またはRAGオフターゲット切断部位を伴う、項目1〜24のいずれかの方法。
26.  前記細胞が、
AID発現細胞；がん細胞；RAGエンドヌクレアーゼ発現細胞；または神経系細胞
からなる群より選択される、項目1〜25のいずれかの方法。
27.  前記一次遺伝子座特異的プライマーが親和性タグを含む、項目1〜26のいずれかの方法。
28.  工程（c）の産物を親和性精製によって単離する工程をさらに含む、項目27の方法。
29.  前記親和性タグがビオチンである、項目27または28の方法。
30.  前記親和性精製が、ビオチンとストレプトアビジンとを結合する工程を含む、項目29の方法。
31.  前記親和性精製が、工程（c）の産物を基質に結合することを含む、項目28〜30のいずれかの方法。
32.  前記基質がビーズである、項目31の方法。
33.  前記ネステッドPCR工程のために使用される前記プライマーがバーコード配列を含む、項目1〜32のいずれかの方法。
34.  前記断片化が、超音波処理または制限酵素消化によって実施される、項目1〜33のいずれかの方法。
35.  前記断片化が、ゲノムDNAをランダムに剪断することによって、または高頻度切断制限酵素を用いて実施される、項目1〜34のいずれかの方法。
36.  工程（c）の産物をアダプターにライゲーションする工程が、該産物と、同じ遠位部配列およびランダム近位部配列を有するアダプター集団とを接触させる工程を含む、項目1〜35のいずれかの方法。
37.  前記アダプターの近位部が3〜10個のヌクレオチド長である、項目1〜36のいずれかの方法。
38.  前記アダプターの近位部が5〜6個のヌクレオチド長である、項目1〜37のいずれかの方法。
39.  前記アダプターが、遠位部と近位部との間にバーコード配列を含む、項目1〜38のいずれかの方法。
40.  工程（e）において産生された前記PCR産物が、シーケンシングの前に選択されたサイズである、項目1〜39のいずれかの方法。
41.  前記細胞が工程（a）の前に組織中に存在する、項目1〜40のいずれかの方法。
42.  前記シーケンシングが、次世代シーケンシング法を使用して実施される、項目1〜41のいずれかの方法。
43.  前記アライメントする工程がヒト以外の機械によって実施される、項目1〜42のいずれかの方法。
44.  前記ヒト以外の機械がコンピュータ実行可能ソフトウェアを備える、項目43の方法。
45.  前記アライメントする工程の結果をディスプレイするためのディスプレイモジュールをさらに含む、項目43の方法。
46.  前記アライメント工程の結果が、V(D)J再編成のセット全体にわたるヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の突然変異プロファイルである、項目1〜45のいずれかの方法。
47.  前記細胞が哺乳動物細胞である、項目1〜46のいずれかの方法。
48.  ブロッキング消化工程（f）が省略される、項目1〜47のいずれかの方法。
49.  末端修復が工程（c）の前に実施されない、項目の1〜48いずれかの方法。
50.  前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32または43〜65より選択される配列を含む、項目1〜49のいずれかの方法。
51.  前記プライマーの1つまたは複数が、SEQ ID NO:1〜32および43〜65より選択される、項目1〜50のいずれかの方法。
【実施例】
【０１３２】
実施例1：RAGオンターゲットおよびオフターゲットを研究するためのLAM-HTGTSアプローチ
LAM-HTGTSは、DSB関連ベイト配列に結合するプレイ配列を同定する（Frock et al. 2015）。V(D)J組換えは、V、D、およびJセグメントの境界での連結を伴う再編成を生成するので、これらの遺伝子セグメントのいずれかに対するプライマーをベイトとして用いて、RAGによって生成されたDSBの部位を、V(D)J組換えを受ける前駆リンパ球または先駆リンパ球と成熟リンパ球の両方において同定して、さかのぼって発生早期に起こったV(D)J組換え事象を同定することができる。内因性のRAGによって生成されたDSBを用いるLAM-HTGTSは、RAGによって生成されたオンターゲット連結およびオフターゲット連結を発生期B細胞系列およびT細胞系列において同定するが、これは、先行アッセイ法においては検出できなかった（Hu et al., 2015；Zhao et al.,；また以下を参照）。ベイトプライマーが存在するDSBの部位がどれかに応じて、LAM-HTGTSは、染色体または切除サークルに存在する結合（Hu et al., 2015）を含め、全てのV(D)Jコーディング結合または対応するRSS結合を同定する（例えば、Hu et al., 2015）。定量的かつ極めて高感度である他に、LAM-HTGTSは、生産的および非生産的結合に関してバイアスがなく、単一ベイトPCRプライマーしか必要とせず、欠失結合と逆結合の両方を読み出し、そして、先行アッセイ法では見ることができなかったCACオフターゲットで生じるものなどの非常に低頻度の組換え事象でさえ容易に同定する。LAM-HTGTSはまた、これらの結合をいくつかのMb長組換えドメイン全体にわたって検出する（Hu et al., 2015）。加えて、LAM-HTGTSを使用して、V(D)J結合中間体の様々なタイプの結合を、例えば特定のDJH再編成の結合を追跡することによって、追跡することができる（Hu et al., 2015）。LAM-HTGTSはまた、個々のDまたはVをLAM-HTGTSベイトとして使用することによって、それらの結合を明らかにする。
【０１３３】
LAM-HTGTSを、HTGTS-Rep-seqと呼ばれるより標準的なレパートリーシーケンシング法に変換するために、ベイトプライマーをベイトJのコーディング末端の近くに移動させ、MiSeq 300bp×2ペアエンドシーケンシングを用いて、リカバーされた連結におけるV配列の長さを取得することを含め、その方法に対して改変を行った。また、IgBLASTを含むようにLAM-HTGTSパイプラインを改変して、インフレームまたは非生産的連結、相補性決定領領域（CDR）および突然変異に関する総合的な情報を提供する解析パイプラインを生成した。HTGTS-Rep-seqは、先行アプローチより優れている。この点に関して、先行のDNAに基づくアプローチは、上流縮重Vプライマーおよび下流縮重Jプライマーの使用に依拠しており、これは、全てではないがほとんどのV(D)Jエクソンをカバーするがおそらく全てを等しくはカバーしないと考えられる。加えて、そのようなアプローチは、これらの2つのプライマー間の再編成された配列しか検出せず、したがって、RAGによって生成された結合をほとんどのオフターゲット配列に対して見いだすことはないと考えられる（Georgiou et al., 2014）。RNAに基づくアプローチは、1つの下流プライマー（Jまたは定常領域から）しか必要とせず、したがって、先行のDNAに基づくアッセイ法におけるバイアスを取り除くが、これらのアプローチは、減少した転写レベルが原因で非生産的再編成を大幅に過小評価し、発現の欠如が原因で遺伝子座内の多くのオフターゲット再編成を見逃すと考えられる（Georgiou et al., 2014）。対照的に、HTGTS-Rep-seqは、単一プライマーまたはプライマークラス（例えば、JまたはDプライマー）からの線形伸長を必要とし、インフレームおよびアウトオブフレーム再編成を検出し、そして、先行アッセイ法では見ることができないRSS融合に続発するいくつかの遺伝子座におけるロバストなクラスの結合さえ検出する（Hu et al., 2015）。
【０１３４】
HTGTS-Rep-seqは、所与のJに対するプライマーを使用することによって、マウスおよびヒトのIgH、Igλ、およびIgκ遺伝子座由来のV(D)Jレパートリーを解析するために用いられてきた。前記アプローチおよび生成されるレパートリーデータを例証するために、図1に示す通り、軸の上に示されるマウスプロB細胞および軸の下の成熟脾臓B細胞由来のDNAに対して、ベイトとしてRAGによって生成されたJH4セグメントコーディング末端をHTGTS-Rep-seq解析して、レパートリーを直接比較できた。アッセイ法が、異なるDセグメントのDJH4再編成における相対使用ならびに異なるVHセグメントのインフレームおよび非生産的の両方における相対使用を比較的定量的に提供することに留意されたい（図1）。したがって、精製したプロB細胞において、DJH4再編成の頻度は、V(D)JH4再編成の頻度を大きく超えるが、脾臓においては、これらは、理想的な30/70比により厳密に近いレベルで起こる（図1）。加えて、VH81X再編成は、プロB細胞では群を抜いて豊富な再編成である（非生産的がインフレームの2倍多い）一方で、VH81X再編成は、VH81Xインフレーム再編成の陰性選択に起因して予想される通り、脾臓B細胞では全体に対する比率は低く、そして、ほとんど全てが非生産的である（Guo et al., 2011b; Alt et al., 2013）。様々な再編成タイプの比率は、ある特定の遠位VHの選択的再編成およびこれらのいくつかの成熟レパートリーにおける選択的提示を含め、全ての実験を通して一致している（図1）。このアプローチは、様々なマウスのIgおよびTCR遺伝子座に対して、かつ、全てのヒトのIg遺伝子座に対して上手く機能する。前記方法は、速く、比較的安価であり、そして、精製したB系列集団またはT系列集団由来のわずか200ngのDNAを用いることができる。
【０１３５】
実施例2
現在、免疫療法市場および抗体研究分野は共に、関心対象の抗原に対する新規の高親和性抗体の発見を容易にできかつワクチン開発を理解する助けとなり得る、バイアスのないハイスループットアッセイ法を至急探し求めている。そのようなアッセイ法はまた、新規の抗体の工学設計を容易にすると考えられる。この必要性に取り組むために、ハイスループットアプローチを介してレパートリーシーケンシングを実施および体細胞超突然変異を解明する新規アプローチが本明細書に記載される。
【０１３６】
本明細書に記載の方法は、所与のJセグメントの下流の領域を特異的に認識してシーケンシングのためのV(D)Jエクソンを増幅する単一プライマーを用いる、リニア増幅法に関し；したがって、本アッセイ法は、Vセグメントファミリー全てに等しく結合することができない縮重Vプライマーを用いる既存の方法に内在するバイアスを克服する。LAM-HTGTSは、任意の細胞源、例えば前駆細胞、先駆細胞、末梢細胞および細胞株由来のゲノムDNA（またはmRNA）中のVセグメントファミリー全てに由来するV(D)Jエクソンを決定および定量することができる（しかし、本発明者等の方法は、いくつかのアプローチでmRNAが受け入れられている根拠を除いている）。
【０１３７】
前記方法を実証するために、VHおよびVκ使用頻度を調べた。図3A〜3Dは、前駆B（プロB）細胞および末梢脾臓B細胞からのVH使用頻度パターンの例とプロB細胞株からのVκ使用頻度パターンの例を示す。とりわけ、VHファミリー全てからの機能的VHの大部分が、プロB細胞および成熟B細胞において用いられており、そして、1つの機能的VKを除く全てが、v-Ablで形質転換されたプロB細胞株において用いられていた。これらのデータは、本方法が既存の方法とは対照的に明らかなバイアスを有していないことを実証する。
【０１３８】
図4A〜4Bは、アッセイ法を使用して、インフレームおよびアウトオブフレームV(D)Jエクソンを識別および定量することもできることを実証する。ステッチペアエンドIliumina Miseq配列を、IgHまたはIgκライブラリーから抽出した。完全CDR1、CDR2およびCDR3が、ステッチ配列全体の30％超に含まれた；したがって、この方法を使用して、体細胞超突然変異を研究することができる（図5A〜5C）。これまでのところ、特定の免疫応答（例えば、ワクチン接種実験中の）を追跡するのに不可欠であるこの特性は、任意の他の方法では報告されていない。
【０１３９】
実施例3
本明細書に記載の方法は、以下の点で以前の方法と異なる。
1. HTGTS-Rep-seqライブラリーを生成するためにmRNAを使用することができる。
2. プライマーを、意図するベイトコーディング末端の20〜50bp下流に置くことができ；先行方法では、プライマーは、コーディング末端から少なくとも100bpであった。
3. 本明細書に記載のプライマーは、普遍的プライマーであり、全てのユーザーからのHTGTS-Rep-seqライブラリーにこれを使用することができる。
（表１）
2020507326.tif 000006
2020507326.tif 000007
4. HTGTS-Rep-seqに酵素ブロッキングは必要ないが、ほとんどの先行HTGTS用途は酵素ブロッキングを必要とする。
5. V(D)J再編成は、ほとんどの用途において、一般的な転座よりも高頻度に生じると予想されるので、通常、先行方法よりも少ない量の出発物質をHTGTS-Rep-seqのために使用することができる。
6. 重複全てが通常HTGTS-Rep-seq解析において維持される一方で、これは先行HTGTS用途のほとんどで当てはまらない。
7. IgBlastを使用して、HTGTS-Rep-seqライブラリーを解析し；したがって、HTGTS-Rep-seqは、抗原受容体遺伝子座内のV、D、およびJの使用頻度に関する情報を与える。
8. HTGTS-Rep-seqパイプライン（IgBlastを使用した）は、単離されたV(D)Jエクソンについての生産的および非生産的再編成情報を提供する。
9. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、単離されたV(D)JエクソンについてのCDR3情報を提供する。
10. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、いくつかのV(D)Jエクソンについての体細胞超突然変異情報を提供する一方で、先行の適用解析パイプラインでは突然変異は無視される。
11. HTGTS-Rep-seqパイプラインは、配列決定された断片中の1つの（V-J組換え）または2つの（V-D-J組換え）V含有結合についての情報を提供する。
12. LAM-HTGTSパイプラインは、配列決定された断片中のD-J結合およびRAGオフターゲット結合についての情報を与える。
13. HTGTS-Rep-seqを使用して、配列リード類似性によって定義されたクローン系列を同定し、アノテーションされていないV対立遺伝子および／またはセグメントを同定することができる。
【０１４０】
300bp×2 miseqシーケンシングはHTGTS-Rep-seqのために用いることができる。
【０１４１】
実施例4：抗体レパートリーを解明するための高感度かつバイアスのないアプローチ
発生期Bリンパ球は、V(D)J組換えを受けて、生殖系列V、D、およびJ遺伝子セグメントを、免疫グロブリン（Ig）重鎖（H）および軽鎖（L）の抗原結合可変領域をコードするエクソンにアセンブルする。IgH鎖およびIgL鎖は会合して、B細胞受容体（BCR）を形成し、そこに抗原が結合するとB細胞が活性化され、BCRを抗体として分泌する。膨大な数のクローン非依存的なB細胞の各々が、IgH可変領域およびIgL可変領域の特異的セットを発現する。V(D)J組換えが膨大な初代B細胞レパートリーを生成できることは、多数の異なるV、D、およびJセグメントのコンビナトリアルアソートメントと、抗原接触のための相補性決定領域3（CDR3）を生成するそれらのセグメント間の連結の多様化と相まってもたらされる。一次抗体レパートリーの含量を綿密に評価するための、最終的には、一次抗体レパートリーがどのように二次突然変異および親和性成熟プロセスによってさらに形作られるかを研究するためのアプローチは、B細胞発生、ワクチンおよび抗体分野にとって極めて重要である。抗体レパートリーを定量するための、HTGTSレパートリーシーケンシング（HTGTS-Rep-seq）と称される、バイアスのない高感度で容易に使用可能なアッセイ法が本明細書に記載される。HTGTS-Rep-seqは、前駆および成熟マウスB細胞系列から、特定のJプライマーの使用を介して、IgHおよびIgL V(D)Jエクソンの大多数を定量的に同定し、IgHおよびIgL V(D)Jエクソンはそれらの特異的CDR3配列を含む。HTGTS-Rep-seqはまた、生産的構成または非生産的構成のいずれかにおいてDJH中間体およびV(D)Jエクソンを正確に定量する。HTGTS-Rep-seqは、クローン性B細胞増大を含むヒトサンプルの研究に、また抗体親和性成熟プロセスの追跡にも有用であるはずである。
【０１４２】
抗体は、適応免疫系のB細胞によって生成され、様々な病原体を排除する。V(D)J組換えと呼ばれる体細胞遺伝子再編成プロセスは、抗体遺伝子セグメントをアセンブルして、抗体の抗原結合領域をコードする配列を形成する。多数の新しく生成したB細胞の各々は、特異的抗原結合配列を有する異なる抗体を産生し；該B細胞は集団的に、個体の一次抗体レパートリーを形成する。様々なヒト疾患を処置するための特異的抗体の有用性を考慮すると、一次抗体レパートリーを解明するためのアプローチが極めて重要である。バイアスがなくかつ高感度である、HTGTS-Rep-seqと呼ばれる、抗体レパートリーの新規な高カバレッジ解析法が本明細書に記載される。
【０１４３】
序論
Bリンパ球抗原受容体（BCR）は、同一の免疫グロブリン重鎖（IgH）およびIg軽鎖（IgL）から構成される。抗体は、BCRの分泌形態である。V(D)J組換えプロセスは、生殖系列V、D、およびJ遺伝子セグメントを、BCRの抗原結合可変領域エクソンをコードするエクソンにアセンブルする。RAG 1および2エンドヌクレアーゼ（RAG）は、V、DおよびJ遺伝子セグメントとそれらの隣接する組換えシグナル配列（RSS）との間でDNA二本鎖破断（DSB）を生成することによって、V(D)J組換えを開始する（1）。このプロセスでは、V、D、およびJコーディング末端は、古典的非相同末端結合によって結合される前に、開口されなければならずかつさらにプロセシングされることの多い、共有結合ヘアピンとして生成される（2）。V、D、Jコーディング末端のプロセシングは、連結領域におけるヌクレオチドの欠失または挿入の生成を伴うことができる（2）；V(D)J組換えプロセスのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ成分によるヌクレオチドの高頻度のデノボ付加を含む（3）。とりわけ、V(D)J連結領域は、相補性決定領領域3（CDR3）として知られている抗体可変領域の主要抗原接触領域をコードし、したがって、これらの連結多様化プロセスは、抗体多様性に大きく寄与する。
【０１４４】
マウスIgH遺伝子座は、2.7メガ塩基（Mb）に及ぶ。IgHのいくつかのMb遠位部に数百個のVHがあり、その数は、ある特定のマウス系統において実質的に変動する（4）。VHは、13個のDHを含有する50kbの領域からおよそ100kb上流に位置し、その後、数kb下流に、4つのJHを含有する2kbの領域が続く。IgH定常領域（CH）エクソンは、JHの下流に位置する。VHDJHエクソンのアセンブルに続いて、転写がVHの上流で始まり、CHエクソンの下流で終了し、V(D)JおよびCH部分が、一次転写物のスプライシングを介して、最終的なIgHメッセンジャーRNA（mRNA）に融合される。ランダムな連結多様化機序に起因して、アセンブルしたIgH V(D)Jエクソンのわずか約1/3だけが、V(D)JおよびCHエクソンが同じリーディングフレームで置き換わることでIgHポリペプチドをコードする生産的（機能的VHを伴うインフレーム）再編成を生成する、インフレームスプライシング事象をもたらすことができ、残部は、非生産的（アウトオブフレーム、終止コドンを伴うまたは偽VHを用いるインフレーム）である（5）。IgL鎖可変領域エクソンは、ただVおよびJセグメントからアセンブルされるが、それ以外はIgHのものと類似した基本原理に従う。マウスIgκ軽鎖遺伝子座は、3.2 Mbに及び、3.1 Mb領域における数百個のVκが、5つのJκから20kb下流で分離されている；一方で、Igλ軽鎖遺伝子座は、より小さくかつより単純である（6）。RNAスプライシングは再度、アセンブルしたVJLエクソンを対応するCLエクソンに結合する。
【０１４５】
B細胞発生の間、V(D)J組換えは、特異的レパートリーを確保しかつ望ましくない再編成を防止するように調節される。IgH V(D)J組換えは、前駆B（プロB）細胞において段階特異的に起こり、その後、IgL遺伝子座の組換えが先駆B（プレB）細胞において起こる。IgH V(D)J組換えは、順序付けられており、DからJHへの結合が、通常両方の対立遺伝子上で起こり、その後、VHがDJH複合体へ付加する（図11A）（2）。加えて、IgH V(D)J組換えのVHからDJHへの工程は、生産的再編成によってフィードバック調節され、依然としてDJH構成にある場合にはV(D)J組換えをその他の対立遺伝子上で停止させる（2）。対照的に、初期の非生産的IgH V(D)J再編成は、VHからDJHへの再編成がその他の対立遺伝子上で起こることを妨げはしない。そのようなフィードバック調節は、一般に、典型的な比率が40/60の2つのIgH V(D)J再編成（一方が生産的）を有する成熟B細胞と1つのIgH V(D)J＋DJH再編成を有する成熟B細胞を導く（7）。VHからDJHの再編成はまた、数百の上流VHの多様な使用を生成するように調節される。近位VH、とりわけ最も近位のVH(VH81X)は、プロB V(D)J再編成において幾分過剰使用されるが、VHのものとは別個の染色体ドメインにおけるDHおよびJHの隔離（8、9）は、遺伝子座縮小の現象と相まって（10、11）、最も遠位のVHでさえ使用可能にする。その後、プロB細胞における幾分バイアスのある一次VHレパートリーが細胞選択機序に供されて、新たに生成されたB細胞においてより正常化された一次レパートリーが生成される（12）。
【０１４６】
各B細胞は、特異的BCRを発現し、そして、各々個々のマウスまたはヒトは、一次レパートリーにおいて最大1013個またはそれより多くの全く異なったBCRを生成する能力を有し（13）、これらの大部分は、IgHおよびIgL CDR3の連結多様化によって生成される（14）。この点に関して、一次抗体レパートリーに寄与するIgHおよびIgL可変領域エクソンを定量的に同定できることは、免疫応答および免疫疾患へのこのレパートリーの寄与を解明する上で大変興味深い（15）。次世代シーケンシングを用いるいくつかの重要なレパートリーシーケンシングアッセイ法が開発されてきた。これらのアプローチは、ゲノムDNAまたはmRNAのいずれかからのレパートリーライブラリーの生成を伴う（15）。ほとんどのDNAに基づく先行アプローチは、特定のVHファミリーのメンバーを同定するように各々設計されている上流縮重Vプライマー、および下流縮重Jプライマーの使用に依拠しており；必ずしも全てではないが多くのV(D)Jエクソンをカバーするがおそらく全てを等しくカバーしないアプローチである。RNAに基づくアプローチは、一般に、1つの下流プライマー（Jまたは定常領域から）しか必要とせず、したがって、先行のDNAに基づくアッセイ法におけるバイアスを取り除くが；これらのアプローチは、減少した転写レベルが原因で非生産的再編成を大幅に過小評価し得る（15）。加えて、シーケンシング技術が常にV(D)Jエクソン長全体をカバーできるとは限らないので、5'RACE由来の相補的DNA長が長いことはまた難題をもたらし得る。
【０１４７】
本明細書に記載の方法は、DSB関連ベイト配列に対する単一プライマーを用いて、ベイト-プレイ連結にわたってリニア増幅を実施し、ベイトDSBに結合した全てのプレイ配列をバイアスのない様式で同定する。V(D)J組換えは、V、D、およびJセグメントの境界での連結を伴う再編成を生成するので；これらの遺伝子セグメントのいずれかに対するプライマーをベイトとして用いて、RAGによって生成されたDSBの部位を、V(D)J組換えを受ける前駆リンパ球または先駆リンパ球と成熟リンパ球の両方において同定して、さかのぼって発生早期に起こったV(D)J組換え事象を同定することができる。とりわけ、本明細書に記載の方法は、先行アッセイ法（22）によって検出できなかった、RAGによって生成されたDJH結合、切除サークルにおけるRSS結合および発生期B細胞系列におけるオフターゲット連結を同定し、このことは、このアッセイ法が高感度であることを例証している。
【０１４８】
結果
LAM-HTGTS適応レパートリーシーケンシングの概説。HTGTS-Rep-seqライブラリーについて、Jセグメントのベイトコーディング末端を用いて、マウスIgH DJHレパートリーを、プロB細胞および末梢B細胞の両細胞由来の生産的および非生産的の両方のIgH V(D)Jレパートリーと共に、バイアスのない様式で同定した。同様に、末梢B細胞由来のマウスの生産的および非生産的Igκレパートリーも同定した。解析される全てのサンプルについて、所与のタイプのB細胞のプールから単離されたゲノムDNAを超音波処理して、およそ1kbの平均サイズを有する、したがってIgH V(D)JもしくはDJ再編成、Igκ VJ再編成、または再編成されていないJHもしくはJκを保有すると予想される断片を生成した（図11B）。
【０１４９】
特定のJHまたはJκセグメントのコーディング末端の下流の配列にアニーリングするビオチン化ベイトプライマーは、ベイトJセグメントを含有する任意の断片のリニア増幅を可能にする。後続のストレプトアビジン精製、アダプターライゲーションおよびライブラリー構築工程は、過去に記載されている通り行われる（16）（図11B）。VおよびDのより正確なアライメントのためのより長いシーケンシングリードを生成するために、ベイトプライマーを、ベイトJのコーディング末端の近くに位置付け、そして、MiSeq 2×300bpペアエンドシーケンシングを用いて、リカバーされた連結における完全長V(D)J配列を取得した。バイオインフォマティクス解析のために、LAM-HTGTSパイプラインをIgBlast（23）と組み合わせて、生産的または非生産的連結およびCDR3配列に関する総合的な情報を提供する解析パイプラインを生成した。
【０１５０】
HTGTS-Rep-seqのために、全ての重複を含む全てのリカバーされた連結を、過去に記載されている理由で解析用に維持することができる（22）。実験変動を制御するために、相関係数（r）値が0.99である高度に再現可能なレパートリーをもたらした同じ脾臓B細胞DNAサンプルから、3つの技術的反復HTGTS-Rep-seqライブラリーを生成した（表2）。3匹の異なるマウスのプロB細胞または脾臓B細胞由来の生物学的反復IgHまたはIgL HTGTS-Rep-seqライブラリーでさえ、相関解析は、データセットのほとんどで、r値が0.9を超える高度に再現可能なレパートリーを明らかにした（表2および3）。しかしながら、後述する通り、そのようなライブラリーのある特定の局面、例えば、全レパートリーにおける特異的CDR3の画分の詳細な解析は、予想される生物学的変動を明らかにした（表2）。
【０１５１】
HTGTS-Rep-seqは発生期B細胞および成熟B細胞においてIgH VHDJHおよびDJHレパートリーを明らかにする
初代プロB細胞IgHレパートリーと末梢Bリンパ球のものとの間の相違を検出するHTGTS-Rep-seqの能力を試験するために、野生型C57BL/6マウスの骨髄から初代B220+CD43+IgM-プロB細胞を濃縮し、そして、脾臓からB220+IgM+ B細胞を精製した。これらの細胞集団から単離されたゲノムDNA 2μgを使用して、JH4コーディング末端ベイトプライマーを用いたHTGTS-Rep-seqを実施し、VHDJH4およびDJH4再編成を取得した（図7A；表2）。両方の細胞タイプ由来のライブラリーは、IgH可変領域遺伝子座全体にわたって、VHDJH4再編成におけるVHの広範な使用頻度を示したが、いくつかのVH（例えば、VH5-2、VH2-2、VH3-6、VH1-26、VH1-64、VH1-72、VH1-81）がより高頻度に用いられた（図7B）。C57BL/6 IgH遺伝子座は、16種類のファミリーに分類された、およそ110個の潜在的に機能的なVHおよび74個の偽VHを有する（24）。JH4コーディング末端ベイトを用いて生成されたIgHレパートリーライブラリーでは、VHDJHエクソンにおいて全16種類のファミリー由来の107の機能的VHの他に、比較的保存されたRSSを有する21個の偽VHが検出された（図17C）。とりわけ、HTGTS-Rep-seqによって検出されない3つの「機能的」VH（VH1-62-1、VH2-6-8、VH7-2）は、別のハイスループットレパートリーシーケンシング法（25）によっても発見できず、このことは、これらが、V(D)J組換えを受ける能力に関して実際に非機能的であり得ることを示している。
【０１５２】
VHからDJHへの再編成は、プロB段階で起こり、3つのうちの1つだけがインフレームであると予想される（5）。VHDJH4エクソンにおいて、HTGTS-Rep-seqは、平均で65％を生産的として同定し、それに応じて、35％が非生産的であった（図7D）。この比は、2つの非生産的再編成を有するプロB細胞が陰性選択され、一方の対立遺伝子上に生産的再編成を有するものが陽性選択される動的な分化プロセスを反映する可能性が高い（12）。プロB細胞の発生中の生産的V(D)JH再編成からのフィードバック機序に大いに起因して、脾臓B細胞のおよそ40％が、両対立遺伝子上のVHDJH再編成（一方が生産的、一方が非生産的）を表示し、残りの60％が1つの生産的VHDJHおよび1つのDJH再編成を有する（5）。したがって、脾臓B細胞の集団は、理論上、約71％の生産的VHDJHエクソンおよび29％の非生産的VHDJHエクソンを有すると予想される。実際に、脾臓B細胞DNA由来のHTGTS-Rep-seqライブラリーにおいて非常に似た生産的/非生産的VHDJH4エクソン比（73:27）が観察された（図7D）。HTGTS-Rep-seqによって明らかにされたDJH結合では、プロB細胞および脾臓成熟B細胞の両細胞由来のライブラリーにおいて、DH1-1（DFL16.1としても知られている）が最も高頻度に使用された（図7E）。さらに、脾臓B細胞の場合と比較して、プロB細胞においてはるかに高い百分率のDJHエクソンが観察され（45％対25％；図7E、7F）、このことは、発生期プロB細胞における両対立遺伝子上のDからJHへの再編成がVHからDJHへの再編成に先行することと一致する（5、26、27）。
【０１５３】
129SVEマウスにおけるバイアスのある近位VH使用頻度がHTGTS-Rep-seqによって明らかにされた。129SVEマウス系統のIgH遺伝子座は、C57BL/6 IgH遺伝子座よりも多くのVHを含有し、幾らか異なる構成を持つ（24）。129SVEマウスおよび細胞株がV(D)J組換え研究において高頻度に使用されていることを考慮すれば、同じJH4ベイトプライマーを使用して、129SVE骨髄プロB細胞および脾臓B細胞からHTGTS-Rep-seqライブラリーも生成した（表3）。129SVE IgH遺伝子座VH配列は、可変VH領域に最大およそ1Mbでアノテーションされるが、該遺伝子座の比較的大きいより遠位の領域内に位置しているVH配列は、完全にアノテーションされない。したがって、近似の129SVE VHDJHレパートリーを生成するために、VH8-2から開始するC57BL/6バックグラウンド由来の既知の129SVE VH配列およびアノテーションされた遠位VH配列全ての組み合わせに対してIgblast解析を実行した（図12A、12B）。C57BL/6ライブラリーと同様に、VHが広く使用され、そして、15個のVHファミリーの133個の全く異なったメンバーのうち128個の機能的VH＋34の偽VHが検出された（図12C）。
【０１５４】
C57BL/6マウスにおけるIgH VHDJH4レパートリーとは対照的に、近位VH、とりわけVH5-2（VH81Xとしても知られている）およびVH2-2の、129SVEマウスにおける高度にバイアスのある使用頻度が見いだされた（図7B、12B）。129SVEマウスのプロB細胞では、全てのVHDJH4エクソンの9.5％（1.7％生産的；7.7％非生産的）で、そして、脾臓B細胞では、全てのVHDJH4エクソンの約4％（0.3％生産的；3.5％非生産的）で、D-近位VH5-2が使用された（図12B）。対照的に、C57BL/6の濃縮されたプロB細胞および精製した脾臓B細胞において、それぞれ、VHDJH4エクソンの約3.5％（0.7％生産的；2.8％非生産的）および約1.8％（0.15％生産的；1.6％非生産的）だけに、VH5-2が出現した（図7B）。両対立遺伝子全体の他の高度に用いられたVH（VH2-2、VH5-4、VH3-6、VH1-26、VH1-55、VH8-8、VH1-64、VH1-72、VH1-81）とは対照的に、脾臓B細胞におけるVH5-2を含有するVHDJH4結合の大部分が両方のマウス系統において非生産的であったが、このことは、ほとんどのVH5-2を含有する生産的再編成が、それらの自己反応性またはIgL鎖もしくは代理IgL鎖との適切な対合の欠如に起因して選択されるとの過去の報告と一致する（28〜30）。129SVEマウス系統に対してC57BL/6マウス系統においてVH5-2遺伝子体、RSSおよび下流が保存されているが、129SVE系統の一次レパートリーにおける大きく増加されたVH5-2使用の根拠はまだ明確になっていない。
【０１５５】
129SVEプロB細胞ライブラリーにおけるVHDJHおよびDJH再編成の比較はまた、生産的/非生産的VHDJHエクソンの比較的低い比（129SVEにおける39:61対C57BL/6における65:35）の他に、VHDJH/DJH再編成のより低い比（129SVEにおける約45:55対C57BL/6における約55:45）を明らかにした（図7D〜7F；12D〜12F）。VH5-2再編成は、これらの相違に実質的に寄与しなかった。両方のプロB細胞ライブラリーを4週齢のマウスで生成し、129SVEにおける生産的VHDJHエクソンの相対比率がC57BL/6プロB細胞と比較して低いことは、これらの2種類のマウス系統のB細胞チェックポイント選択の異なったタイミングによる可能性があることが示唆された。両マウス系統について、脾臓B細胞ライブラリーは、同等な生産的/非生産的比ならびにVDJ/DJ比を示した（図7D〜7F；12D〜12F）。
【０１５６】
IgM+脾臓B細胞VHDJHエクソンは異なるJHにわたって類似のVH使用頻度プロファイルを呈する。また、IgH遺伝子座における他の3つのJHに対してベイトプライマーを設計し、C57BL/6マウスおよび129SVEマウスの両方の脾臓B細胞からライブラリーを作製して、異なるJH間でのVHおよびD使用を比較した。これらのアッセイ法は、4つの異なるJHについて類似のVHおよびD使用レパートリーを明らかにしたが、このことは、VHDJH結合における特定のVHまたはDの選択が、C57BL/6マウスと129SVEマウスの両方におけるJH間で実質的に変動しなかったことを示している（図8A、13A）。しかしながら、非生産的VHDJH再編成のより高い比率は、JH1およびJH4ベイトライブラリーと比較して、JH2およびJH3ベイトを使用して見いだされた（図8A、13A）。この点に関して、安定な抗体構造にとって極めて重要なJHコーディング末端から高度に保存されたWGXGモチーフへの配列ストレッチ（24）は、JH1およびJH4セグメントと比べてJH2およびJH3セグメントにおいてより短い（図14A）。したがって、いくつかのVHDJH2およびVHDJH3結合部位は、WGXGコード配列に非常に密接して位置し、不安定な抗体構造に起因して選択され得る（図14B）。さらに、4つのJH間でのDH使用頻度プロファイルについておよびJH4ベイトライブラリーのより大きなVHDJH:DJH結合比について、適度な相違が観察され、これは、V(D)J組換えを開始する組換え中心におけるこれらのJHの相対位置を潜在的に反映し得る（31）（図8B、8Cおよび13B、13C）。最後に、組み合わされたJH HTGTS-Rep-seqプライマーの4つのセットを用いて、129SVE脾臓B細胞からHTGTS-Rep-seqライブラリーを調製した（図15A、表3）。1つのHTGTS-Rep-seqライブラリーにおいて全てのVHDJH1-4エクソンを検出することを可能にしたこのアプローチは、個々のJHプライマーを用いて検出されたものと類似した汎用V(D)Jレパートリーを明らかにした（図15対13）。
【０１５７】
HTGTS-Rep-seqは多様なIgκ VJ再編成を検出する。マウスでは、Igκ遺伝子座は、IgL発現B細胞の大部分を生成する（32）。Vκ遺伝子座構成は、VH遺伝子座のものとは全く異なる。Dセグメントを有しないこと、それ故、直接VκからJκへの再編成を受けることに加えて、Vκ遺伝子座は、Jκセグメントに対して直接および逆方向の両方に構成されたVセグメントを含有する（6）（図9A）。したがって、いくつかのVκについて、Jκへの結合は、VHからDJHへの結合のように欠失的に起こるが、他のものについては、介在する配列の反転によって起こる。直接および逆Vκは、一般に、全く異なったクラスタにおいて起こるが、個々に散在されることもある（図9A）。まずIgκレパートリーを評価するために、C57BL/6脾臓B細胞由来のゲノムDNA 1μgに対してJκ5コーディング末端ベイトプライマーを使用してHTGTS-Rep-seqを実施した。IgH遺伝子座と同じく、Vκの広範な使用頻度がまた、遺伝子座全体からJκまで観察された（図3A、B）。20個のVκファミリーにわたる100個の機能的Vκの全てがHTGTS-Rep-seqによって検出され、そして、62個の偽Vκのうち11個がまた検出された（図9C）。本発明者等は、脾臓B細胞において生産的/非生産的VJκ結合を63:37比で見いだしたが（図9B）、これは、予測される67:33の比よりもわずかに低い（33）。この小さな偏差は、Igλ陽性細胞における非生産的VJκ結合の存在を反映している可能性がある（32）。
【０１５８】
また、脾臓B細胞DNAからHTGTS-Rep-seqライブラリーを生成して、VJκ結合を3つの他の機能的Jκセグメントから別々にまたは全ての4つのJκプライマーの組み合わせから取得した。異なるJHプライマーを有するIgHレパートリーとは対照的に、Igκレパートリーは、異なるJκベイト間で一見すると異なるいくつかのVκ（例えば、Vκ6-15、Vκ6-23、Vκ19-93、Vκ10-96、Vκ1-135）の使用を示した。さらに、他のJκプライマーライブラリーからの生産的/非生産的の比は、Jκ5プライマーで観察されたものよりもわずかに低かった（Jκ1:53:47、Jκ2；60:40、Jκ4:53:47対Jκ5:63:37）（図16）。これらの使用および比の相違は、逐次的なVJκ組換え事象の発生を反映している可能性が高い（34）。この状況において、Jκ5の上流に3つのJκを有する非生産的VJκ結合を含有する対立遺伝子は、非生産的VJκの上流の再編成されていないVκを残りのJκに結合する能力を有する（34）。この二次的な再編成が反転可能である場合、非生産的VJκ結合は、ゲノムにおいて保持され、HTGTS-Rep-seqによって検出されるVJκ1、VJκ2、またはVJκ4結合の非生産的画分を増やすと考えられる。このシナリオを考慮すれば、末端再編成事象であるVJκ5再編成は、本明細書に記載の通り、理論的な生産的/非生産的の比を反映すると予想される。
【０１５９】
HTGTS-Rep-seqは特徴的なCDR3特性を明らかにした。プロB細胞および脾臓B細胞における生産的VHDJHおよびVJκ再編成からのCDR3配列を解析した。プロB細胞および脾臓B細胞における生産的VHDJHエクソンのCDR3は、11〜15aaにピークを有する3〜24アミノ酸（aa）の多様な範囲の長さを示した（図17A、17B）。非免疫化のプロB細胞および脾臓B細胞由来の特異的サブセットから作製された、これらのVHDJHエクソンのコンセンサスCDR3モチーフは、同じVHが寄与したaa配列とJH4が寄与したaa配列を予想通り共有した（図17A、17B）。JH2およびJH3の遺伝子体がJH1およびJH4のものより短いことを考慮すれば、VHDJH2およびVHDJH3エクソンの平均長は、VHDJH1およびVHDJH4のものより短かった（長さ中央値11aa対13aa）（図17C）。生産的VHDJHエクソンとは対照的に、脾臓B細胞由来のおよそ85％の生産的VJκエクソンは、9aaのCDR3長を示した。VJκ CDR3モチーフはまた、予想される隣接システインおよびフェニルアラニンを示した（図17D）。したがって、HTGTS-Rep-seqは、様々なベイト遺伝子座から予想されるCDR3の特徴を有する配列を産生する。
【０１６０】
少量の出発物質でHTGTS-Rep-seqを用いることができる。JH4コーディング末端ベイトから、同じC57BL/6マウスの脾臓B細胞から各々精製された2μg、500ng、および100ngのDNA量から開始して、ライブラリーを生成した。2μgおよび500ngのゲノムDNAから生成されたライブラリーは、VH使用頻度および生産的/非生産的再編成比についてほとんど同一であった（r>0.97）（図10A、10B；表2）。100ngのゲノムDNAから生成されたライブラリーから検出されたVHの数のわずかな減少が見られたものの、これらはなお、類似のレパートリープロファイル（r=約0.8）および生産的/非生産的比を呈し（図10A、10B）、このことは、HTGTS-Rep-seqを使用して、わずか20,000個のB細胞から十分な代表的VHDJHレパートリーライブラリーを生成することができることを実証している。
【０１６１】
これらのタイトレーションされたライブラリーにおいて特異的CDR3配列の百分率を比較することによって、V(D)JH連結多様性をさらに評価した（35）。特異的CDR3配列を含有するV(D)Jエクソンの比率が、出発物質の量の低減と共に実質的に減少したことが見いだされたが（図18A）、このことは、DNA出発物質の量が多ければ、高度に多様なIgH CDR3レパートリーのより大きな画分を検出可能であることを示している。シーケンシングエラーは、理論上、CDR3多様性の過大評価を小さくするが、これらのサンプルにおけるCDR3の多大な生物学的多様性はとても高かったので、2μgのDNAライブラリーの3つの技術的反復間の検出されたV(D)JH CDR3配列で非常に小さなオーバーラップ部分が観察され（<1％）、そして、500ngまたは100ngのDNAライブラリー反復サブセット間ではさらに低くなる（図18B）。したがって、VH使用頻度に関して代表的なV(D)JHライブラリーを生成するのにDNAは100ngで十分であるが、さらに2μgのDNAは、IgH CDR3の計り知れない多様性のごく一部を明らかにする。
【０１６２】
考察
HTGTS-Rep-seqは、わずか1つのベイトPCRプライマーしか必要とせず、欠失および逆V(D)J結合の両方を読み出し、そして、先行レパートリーシーケンシングアッセイ法では発見できない低頻度組換え事象を同定するために容易に適応できる、DNAに基づく方法である（22）。加えて、HTGTS-Rep-seqを使用して、生産的および非生産的Vエクソン使用頻度を総合的に研究することができる。また、HTGTS-Rep-seqを用いて、V(D)J中間体の頻度を、最も注目すべきは特定のDJH再編成の頻度を定量的に同定することによって、発生的に評価することができる（22）（図7E、7F）。また、個々のDまたはVをベイトとして使用することによってそれらの結合パターンを明らかにするために、HTGTS-Rep-seqを適応させることもできる。したがって、このアッセイ法またはその適応は、発生中または免疫応答中に起こるレパートリーの変化を検出するために有用である。
【０１６３】
HTGTS-Rep-seqは、VH使用頻度の代表的なプロファイルを取得するのに、マウス脾臓B細胞由来のわずか100ngのゲノムDNA（潜在的にはより少ない）しか必要としない。したがって、この技法は、比較的少数の細胞に適用することができ、正確なレパートリープロファイルをもたらすことができる。いくつかの態様において、本明細書に記載の方法は、超音波処理されたDNA断片、例えば、全Jκ領域のすぐ下流に配列を含有するDNA断片を濃縮する初期工程を含むことができる。
【０１６４】
わずか1つのJプライマーまたはJプライマーのセットを用いるリニア増幅をHTGTS-Rep-seqによって使用できることは、先行のDNAに基づくレパートリーシーケンシング法によって必要とされる縮重Vプライマーのセット（Jプライマーと一緒に）を用いる必要性を回避し、その結果、異なるVファミリーまたはファミリー内のVの様々な増幅効率を導くことができる（15）。DNAに基づくことで、HTGTS-Rep-seqはまた、集団におけるIg再編成の頻度を、発現レベルに関係なく、これらが生産的であるか非生産的であるかに関わらず、定量的に取得することによって、RNAに基づく方法のある特定の用途に対する主な制限も無視する。多重PCRまたは細胞間の種々の発現レベルに起因するバイアスに取り組む現行の手段は、普遍的識別子（25、36、37）または単一細胞法（38）の使用を含むが、HTGTS-Rep-seqは、追加の費用もランダムバーコードを用いてプライマーを合成する工程または単一細胞をソーティングする工程もなしに、集団レパートリープロファイルを正確に同定することができる。
【０１６５】
特筆すべきは、約15,000の特異的V(D)J再編成が3つの技術的反復の各々由来の配列であった実験において、特異的CDR3配列の1％未満のオーバーラップが見いだされたことであり、このことは、このアプローチの高い感度を強調している。この高感度HTGTS-Rep-seqアプローチを、ヒトサンプルへの適用に簡単に適応することができる。その点に関して、HTGTS-Rep-seqの感度は、がんを含むある特定の免疫系疾患の状況において起こるクローン性Bリンパ球またはTリンパ球の増大の診断に役立つ、クローン再編成（まさにDJH再編成）を同定するための低費用で迅速な方法を提供する。最後に、本発明者等のライブラリーでは、結合した配列のおよそ3分の1が、およそ370bpのV(D)Jエクソンの全長をカバーし、このことによって、HTGTS-Rep-seqは、免疫応答の抗体親和性成熟中のB細胞レパートリーにおいて見られる特定のCDRを含む特定のV(D)Jエクソンの優占集団の追跡に適用可能になる。この適用は、ハイスループットシーケンシング技術がより一層の長さおよび精度を達成するように進展するにつれて、強化することができる。
【０１６６】
材料および方法
マウス。野生型129SVEおよびC57BL/6マウスを、Charles River Laboratories Internationalから購入した。全ての動物実験は、ボストン小児病院の動物管理使用委員会によって承認されたプロトコール下で実施した。
【０１６７】
骨髄および脾臓からのB細胞単離。ソーティングによってかつ赤血球の枯渇後に、骨髄由来プロB（B220+IgM-CD43+）細胞を、129SVEマウスから精製するか、または、C57BL/6マウスから濃縮した。単一細胞懸濁液を、B220-APC、CD43-PEおよびIgM-FITC抗体で染色した。脾臓静止B細胞を、ビオチン/ストレプトアビジンビーズ法（B220陽性選択（Miltenyi #130-049-501））またはEasySep（商標）CD43陰性B細胞選択（Stem Cell Technologies #19754）を使用して精製した。
【０１６８】
HTGTS-Rep-seq。HTGTS-Rep-seqを記載の通り実施した（16）。プライマーを表1に列記する。DJH結合解析のために、標準的なLAM-HTGTSバイオインフォマティクスパイプライン（16）を用いた。VHDJHおよびVJκの同定のために、MiSeqリードを、ea-utilsスイーツのfastq-multxツール（code.google.com/p/ea-utils/）を使用して多重分離し、cutadaptソフトウェア（code.google.com/p/cutadapt/_）でアダプターをトリミングした。次いで、ea-utilsスイーツからのfastq結合ツールを使用してペアリードを結合させた（オーバーラップ領域≧10bpおよびミスマッチ率≦8％）。次いで、リードを、結合リードおよび未結合リードとしてクループ化し、以下の解析で別々に解析する。デフォルトパラメーターを使用し、V(D)J遺伝子データベースに対する結合リードおよび未結合リードを使用して、Igblastn（23）を用いた。V(D)J遺伝子配列を、IMGT（24）から得て、手動でキュレートし、これを使用してigblastn配列データベースを作成した。様々なストリンジェンシーを適用して、V、D、J遺伝子にアライメントすることができるリードをフィルタリングした（igblastスコア>150、総アライメント長>100、全ミスマッチ比<0.1）。未結合リードでは、R1およびR2リードにおいて同定された上位V遺伝子はマッチしなければならない。処理されたigblast結果に基づいてV遺伝子の使用頻度を計算することができる。上述した処理および解析を実行するために「HTGTSrep」と呼ばれるパイプラインが開発されており、Bitbucketでダウンロードすることができる。bitbucket.org/adugduzhou/htgtsrep。シーケンシングおよび処理データをGEOデータベースGSE82126に保存した。
【０１６９】
参照文献
2020507326.tif 000008
2020507326.tif 000009
2020507326.tif 000010
【０１７０】
（表２）C57BL/6マウスのHTGTS-Rep-seqライブラリーからのVDJH結合解析の概要
2020507326.tif 000011
2020507326.tif 000012
&マウス1、2、3は、3匹の異なるマウスから実験を実施したことを意味し；繰り返し1、2、3は、同じマウス由来のDNAを使用して実験を実施したことを意味する。
*相関係数値（r）は、エクセルのCORREL関数を介して生産的V(D)Jエクソンの2セットから導出した（％）。その値が大きいほど、2セットのデータは類似する。
【０１７１】
（表３）129SVEマウス由来のHTGTS-Rep-seqライブラリーの概要
2020507326.tif 000013
2020507326.tif 000014
【０１７２】
実施例5：HTGTS-V(D)J SHM-seqはパイエル板胚中心B細胞において生成された抗体レパートリーの性質に関する洞察を示す
Bリンパ球は、2つの主な機序を通して、それらの抗原受容体レパートリーを多様化する：V(D)J組換えおよびSHM1。V(D)J組換えは、骨髄で起こり、そして、生殖系列V、（D）およびJセグメントのコンビナトリアルアセンブルを、抗原接触のための相補性決定領域3（CDR3）を生成するそれらの間の連結の多様化と相まって引き起こす1。抗原活性化胚中心B細胞において2、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）によって開始されるSHMは、V(D)J配列全体にわたる短いホットスポットモチーフに点突然変異を導入する3。濾胞中に存在しているナイーブB細胞が抗原によって活性化されるようになると、これらは、濾胞間領域に移動し、同族T細胞と相互作用して、これらのB細胞の完全活性化およびT細胞にとってのT濾胞性ヘルパー（TFH）細胞表現型の獲得を導く。次いで、比較的高い抗原親和性を有するTFH細胞およびB細胞は、濾胞の中心に戻り、GCの形成を施す2,4。GC内部では、B細胞は、暗帯域で急速増殖およびSHMを受けて、抗原提示濾胞樹状細胞（FDC）およびTFH細胞によって選択される明帯域に向かい5、そこで、改善された抗原結合親和性を有するB細胞が陽性選択されて、暗帯域に再度侵入し、そして、減少した親和性または不活性化B細胞受容体（BCR）を有するものが陰性選択されて、アポトーシスを受ける。2つの帯域間の再循環は、B細胞増殖、SHM、および選択の繰り返されたラウンドを容易にし、BCRクローン性増大および親和性成熟を導く。選択されたB細胞はまた、AIDによって開始されるクラススイッチ組換え（CSR）を受けて、これらが産生する抗体のクラスを変化させ、最終的に、形質細胞およびメモリB細胞に分化することができる。
【０１７３】
全身性二次リンパ組織とは異なり、パイエル板（PP）は、病原体による特定の免疫化または感染の非存在下で構成的GC活性を有する腸管関連リンパ組織（GALT）である6。無菌マウスははるかに少ないPPおよび最小GC B細胞を有するので、これらのGCは、腸管微生物叢に高度に依存する7,8。他の部位での従来のGCと同じく、共生細菌に対するPP GC応答は、強くT細胞依存性およびCD40依存性である9,10。それにも関わらず、いくつかの研究によって、PPにおけるGC応答を誘導および継続するための抗原認識要件が、他のリンパ組織においてよりも厳しくない可能性があることが示唆された。実際のBCRを産生することなくBCR経路シグナル伝達を維持する内因性免疫グロブリン重鎖（IgH）遺伝子の代わりにEBV LMP2A遺伝子を保有するマウスでは、脾臓においてではなくPPにおいてGC形成可能であった11。特異的な事前再編成されたVDJノックイン（4-ヒドロキシ-3-ニトロフェニルアセチル（NP）特異的重鎖をコードする）を有するマウスでは、PP由来の正常な量のGC B細胞が検出され、そして、VHエクソンは、固有のパターンを有する広範囲に及ぶSHMを含有した12。
【０１７４】
これらの上記の知見は、SHMおよび／または遺伝子変換によって、ニワトリ、ヒツジおよびウサギにおいて示された通り13〜15、PP GCが、マウスおよびヒトにおいて、抗原非特異的に抗体多様化の部位として働き得るか否かという問題を提起した。他方で、C57BL/6マウスにおけるコレラトキシンにコンジュゲートされたNP-ハプテン（NP-CT）を用いた繰り返された経口免疫化は、PPにおいて強いGC応答を刺激し、オリゴクローナルおよび親和性成熟されたNP特異的抗体を生成することが見いだされたが16、このことは、マウスPP GCが従来のBCR依存的に機能することができることを示している。NP-CTの経口免疫化が腸管微生物叢由来抗原によるものと同じタイプのGC応答を誘導するか否かは不明であった。さらに、トランスジェニックマウス研究は、それらの解釈の範囲によって制限されている。したがって、PP B細胞およびそれらが産生するB細胞受容体/抗体において、特定の免疫化の非存在下で、潜在的には腸管微生物叢に応答して、GCがどのように形成および機能するかという当分野で最も興味ある問題が残った。完全一次V(D)Jレパートリーを有するWT C57BL/6マウスにおける免疫学分野におけるこの主な問題に取り組むために、BCR V(D)Jレパートリーおよび自然発生するPP GCのSHMを、関与するIgHおよびIgL鎖の完全SHMを含むレパートリーを単一PP由来のGCにおいてアッセイしてそれらを免疫化に応答した脾臓GC B細胞のものと比較するのに十分な感度で研究するための、HTGTS-V(D)J SHM-seqと呼ばれるハイスループットレパートリーシーケンシングアッセイ法が本明細書に記載される。
【０１７５】
概要
脾臓またはPP胚中心B細胞の生理学的抗体レパートリーを解明するため、かつ、それを選択または成熟し得るメカニズムに発展させるため、ハイスループット抗体レパートリーシーケンシングアッセイ法（HTGTS-V(D)J SHM-seq）を開発し、これは、脾臓B細胞抗原特異的応答を追跡し、かつ、V使用頻度の完全IgHおよびIgLレパートリー、CDR3ならびにPP GC B細胞における現SHMパターンを解明するのに十分に高感度である。普遍的ナイーブB細胞レパートリーからのC57BL/6マウスのPPおよび脾臓サンプルを使用し、そして、そこからGCレパートリーを異なる様式で形成するレパートリー細胞を選択した。PP GCにおいて、特定のVHおよびクローン型選択がマウスを通してかつ個々のPPを通してさえも観察されたが、これは、特定の抗原選択の非存在下で固有のSHMターゲティングパターンを主に表す広範囲に及ぶ体細胞超突然変異（SHM）のパターンを示す。AIDは、この拘束されたBCR選択がPP GCにおいて起こるのに必須ではないが、選択されたVDJのスペクトルに影響を及ぼさない。
【０１７６】
PP GCにおけるIgκ軽鎖レパートリーに関して類似の現象が起こることがさらに示される。同じまたは異なるマウス由来の個々のPPからのGCにおける優性IgHおよびIgLクローン型の比較は、選択されたBCRおよびそれによって特異的抗体を形成するために一緒に選択される可能性の高い特異的なIgHおよびIgL鎖の対の削減を可能する。これらの知見は、マウス慢性PP GCにおける特異的で希少なBCRを有するB細胞のための非常に強い選択があることを示し、このことは、そのBCRが、腸管抗原の認識に寄与し得る配列固有の親和性成熟を有する「生得的PP BCR」を表すという非常に興味深い可能性と一致する。
【０１７７】
この新規の方法は、健康または消化管疾患の状況におけるヒトPPに適用することができる。これらの希少抗体を同定することができるので、標的特異性をアッセイするためおよび生物学的活性をさらに定義するために見いだされる特定の抗体を産生することによってマウス研究を拡張することができる。レパートリーシーケンシング法の新規の改変はまた、広域中和抗体の生成を誘導するように設計された抗原によるワクチン接種後のHIVマウスワクチン接種モデルにおける免疫応答の追跡を可能にすることもできる。追加的に、データは、PP応答が微生物叢または食品抗原の状況において起こることを実証する。
【０１７８】
結果
HTGTS-V(D)J-SHM-seqの概説
HTGTS-V(D)J SHM-seqは、V使用頻度およびCDR3レパートリーに加えて、Ig重鎖およびIg軽鎖の両方のレパートリー全体にわたる完全長V(D)J SHMプロファイルを提供する。この方法は、DNAに基づくことおよびJセグメントプライマーだけを使用したリニア増幅を用いるという点で高度に非バイアスである。IgHレパートリーについて（図24）、超音波処理されたゲノムDNA（例えば、GC B細胞から）から、混合ビオチン化JH1、JH2、JH3、JH4ベイトプライマーを使用して、VDJ連結の全てをリニア増幅した。次いで、増幅産物を、ストレプトアビジンビーズで濃縮し、Illumina社のMiseq（商標）に基づく次世代シーケンシングのために過去に記載の通りタグ化した17,18。
【０１７９】
SHM解析のためのリカバーされた連結における完全長V(D)J配列を取得するために、ベイトプライマーを、JHのコーディング末端の最も近くに位置付け、そして、MiSeq 2×300-bpペアエンドシーケンシングを使用した。JH1-4プライマーを、それらの使用頻度がJH1-4 VDJ連結の本当の組成を反映するように、高度に縮重性の領域より選択した（図25A）。この点に関して、hVH1-2が成熟脾臓B細胞レパートリーにおいてVH使用頻度の半分を占めるように、IGCR1欠失を有するマウスVH81XとヒトVH1-2（hVH1-2）を交換したマウスモデルを用い19、そこで、ライブラリーをhVH1-2ベイトから作製して、hVH1-2DJ連結における各JHの比を決定し、混合JH1-4ベイトから作製したライブラリーと比較した（図25B）。
【０１８０】
2つのベイトからのJHの比は、相関係数r=0.94でかなりマッチした。同様に、IgLレパートリーを真にバイアスのない様式でアッセイするように混合JKおよびJLプライマーも最適化した。同じPP GCサンプルをIgHおよびIgLレパートリーの両方についてアッセイすることによって、重鎖および軽鎖の両方のV(D)J配列を同定することができ（図28A、28C）、したがって、HTGTS-V(D)J SHM-seqは、新たな潜在的に生理学的に重要な腸管生成抗体を同定することができる発見方法である。必要な細胞数を数万まで最小化するよう実験条件も最適化し、それで分析を単一PP由来のGCに対して行うことができた。
【０１８１】
（表５）
2020507326.tif 000015
【０１８２】
バイオインフォマティクスパイプラインをより厳しいフィルタを実行するように改変して、SHM解析のために使用される連結リードの品質管理、ならびに、SHMプロファイリング、クローナルクラスタリング、突然変異選択および系統樹などを含む総合的な下流解析の組み入れを確保した（図24）。転写レベルによって影響されるmRNAに基づくレパートリーシーケンシング法とは異なり、HTGTS-V(D)J SHM-seqアプローチは、DNAを鋳型として使用し、生産的および非生産的の両VDJ結合の正確な測定を与える17。複数のサンプルからの非生産的VDJ配列を採用することによって、ほぼ全てのマウスVHについて固有の突然変異パターンデータベースを作成し、これは、GC応答におけるSHM選択解析を強く容易にする。
【０１８３】
NPによって誘導される脾臓GC IgHレパートリー
特異的免疫応答を追跡するHTGTS-V(D)J SHM-seqを検証するために、十分に特徴決定された免疫原:ニワトリガンマグロブリンにコンジュゲートされたNP（NP-CGG）を用いた。C57BL/6マウスをNP-CGGで腹腔内（IP）免疫化して、脾臓GC応答を刺激した。脾臓を免疫化の10日後収集し、B220+GL7+CD38- GC B細胞およびB220+GL7-CD38+非GC B細胞をFACSによってソーティングし、そして、両集団についてHTGTS-V(D)J SHM-seqライブラリーを構築した。解析用のGCおよびナイーブB細胞のより純粋な集団を得るために、かつ、FACSソーティング中の潜在的なクロスコンタミネーションを排除するために、B220+GL7+CD38-サンプルについての突然変異リードをGC B細胞としておよびB220+GL7-CD38+サンプルについての非突然変異リードをナイーブB細胞として維持することによって、Miseqリードをさらにフィルタした。脾臓GC B細胞由来のIgHレパートリーとナイーブB細胞由来のIgHレパートリーを比較することによって、以前の研究によって同定されたNP抗体に対して使用された優性VH20〜22であるVH1-72（V186.2）の顕著なGCエンリッチメントを生産的VDJ連結において検出することが可能であった（図19A）。クローン性解析は、VH1-72連結内の上位2つの優性クローン型が、上位クローンとしてアッセイされた全ての3つのマウスによって共有されたことを明らかにし（図19B）、このことは、脾臓GCにおける強いBCR選択を示している。両方のクローン型は、DH1-1（DFL16.1）およびJH2を含有し、優性DおよびJセグメントがNP応答について報告され20〜22、それぞれ33ntおよび36ntの異なるCDR3長を有していた（図19B）。
【０１８４】
さらに、増加したNP親和性23に特徴的な、CDR1におけるTrpからLeuへの変化をコードする98位のVH1-72における点突然変異の顕著な選択（図19C）がまた検出された。この点突然変異は、NP-CGG免疫化の10日後の早い時期に伝統的なPCRアッセイ法によって同定されなかったことに留意されたい22,24。同様に、脾臓GC B細胞由来のIgLレパートリーとナイーブB細胞由来のIgLレパートリーを比較することによって、VL1の顕著なGCエンリッチメントが生産的VDJ連結において検出され（図19D）、これは、以前の研究によって同定されたNP抗体に対して使用される優性VLである20〜22。したがって、HTGTS-V(D)J SHM-seqによって、免疫化後かなり早い段階に脾臓においてNP特異的BCR選択の既知の特徴の全てを同定することが可能であったが25、このことは、このアッセイ法の体液性免疫応答の先例のない追跡感度および特徴決定されていない免疫原についての抗原特異的特徴を正確に同定するその潜在的能力を実証している。
【０１８５】
PPおよび脾臓による共有ナイーブレパートリー
同じNP-CGG IP免疫化マウスにおいて、また、各マウスから小腸に沿ってPPを全て切開し、そして、B220+GL7+CD38- GC B細胞およびB220+GL7-CD38+非GC B細胞をFACSによって単離した。HTGTS-V(D)J SHM-seqによって、PP由来のナイーブおよびGC B細胞 IgHレパートリーを測定し、脾臓のものと比較した。驚くことに、PPおよび脾臓ナイーブB細胞のVHレパートリーは、全ての3匹のマウスで同一であり（図20A）、相関係数r=0.99であったが、このことは、これらの組織間のナイーブB細胞の循環を示している。これと一致して、内因性PP B細胞の移動を3日間にわたって光変換技法を使用して追跡する研究は、PPと脾臓との間での顕著なナイーブB細胞交換を見いだした26。さらに、異なるマウス間のナイーブB細胞についての安定なVH組成は、極めて小さなエラーバーによって反映される通り（図20A）、共通のベースラインIgHレパートリーが全てのマウスにわたって用いられることを示している。
【０１８６】
一方、PPのGC VHレパートリーは、各マウスにおいて脾臓のものとはかなり異なっており（図20B、図26A）、低い相関係数（r=0.56）であった。NP特異的選択は、免疫化の経路から予想される通りPP GCにおいて検出されなかった。具体的には、PP GCにおけるVH1-72使用頻度は、2匹のマウスにおいて最小であり、そして、ナイーブBレパートリーと比較して第三のマウスにおいて高められていたが（図26A）、98位にNP結合親和性を増加させる重要な突然変異はなかった（図26B）。したがって、PP GCおよび脾臓GCは、異なる刺激源に応答している。脾臓GC VHレパートリーだけが異なるNP-CGG免疫化マウス間でわずかに変動したが、PP GC VHレパートリーは、マウス間で高度に変動可能であり（図20B、図26A）、このことは、PP GCレパートリーが、共同飼育マウス間で変動すると考えられる多様な抗原、おそらく常在細菌叢関連抗原のプールによって形づけられることを示している。あるいは、それは、ニワトリ、ヒツジ、およびウサギ由来のPP GCの場合13〜15と同様に、抗原非特異的BCR多様化によって説明される可能性がある。
【０１８７】
VDJ選択はPP GC応答の基礎をなす
マウス全体のPP GCレパートリーの比較的大きな変動を考慮すれば、クローナル選択がPP GCの形成および機能において役割を果たしているかどうかを理解するために、6匹のよりナイーブなマウス由来のPPレパートリーをアッセイした。NP-CGG IP免疫化は、PP GC応答を刺激しなかったので、NP-CGG-免疫化マウスを、6匹のナイーブマウスと共に、PP GC対ナイーブIgHレパートリーの解析に含めた。PP GCにおいてBCR依存性クローナル選択がなかった場合、各マウスについてのVHのランダムエンリッチメントが予想され、したがって、9匹のマウス由来の平均のVHレパートリーは、共通のナイーブB細胞レパートリーと似ていると考えられる。代わりに、PP GCとナイーブVHレパートリーとの間の相関係数は低く（r=0.65）、いくつかのVH（VH1-47、VH11-2、VH6-6、VH6-3）の顕著なエンリッチメントがある（図21A、図27A）。VH1-47およびVH11-2がナイーブレパートリー中にほとんど存在せず、それぞれ、PP GCレパートリーにおけるその使用頻度の平均14.3倍および43.6倍の増加があったことに留意されたい。VH6-6およびVH6-3の頻度は、5.2および2.6倍増加した。具体的には、VH1-47は、4匹のマウスにおいて大きく富化され、そして、DH2-1、JH4、および36nt CDR3を含有したその上位クローン型は、3匹のマウスによって共有された（図21B）。VH11-2は、4匹のマウスにおいて富化され、上位2つのクローン型が各々2匹のマウスによって共有された（図27B）。それ故、強いBCR依存性クローナル選択は、PPにおけるGC応答の基礎になる。
【０１８８】
この選択は、GC B細胞において特異的に発現される27AIDに依存せず（図21C）、そして、その欠損は、マウスおよびヒトにおいてSHMおよびCSRの欠陥をもたらす28,29。PPにおけるCSRは、腸管粘膜系を保護する主要なIgアイソフォームであるIgA抗体を優先的に生成する30。AID-/-マウスでは、PP GCのVHレパートリーはここでも同じく、ナイーブレパートリーと比較して高度に変動可能であり（r=0.51）（図21C、図28A）、VH1-15の顕著な選択があり、その上位クローン型は、アッセイされた全ての3匹のマウスによって共有された（図21D）。このクローン型は、33nt CDR3をJH1およびいくつかの推定されるDHと共に含有した。したがって、PP GCにおけるクローナル選択は、SHMまたはCSRの非存在下で起こり得る。AID-/-マウスのPP GCにおけるVDJ選択パターンは、同じナイーブレパートリー（r=0.98）を共有したとしても、WTマウスのものと異なるように見えたことに留意されたい（図28B）。AID欠損は、PPにおいてGC過形成をもたらし、小腸において嫌気性細菌叢の100倍増大を伴うことが報告されている31,32。この点に関して、WTおよびAID-/-PP GC B細胞の異なるクローン型パターンは、腸管細菌叢組成の既知の差異を反映し得る。
【０１８９】
局所抗原は単一PP GCプールを形成する
6〜12個のPPが典型的にはC57BL/6マウスにおいて見いだされ、小腸の長さに沿って分布していた33。腸管微生物叢の組成が消化（GI）管に沿って異なる場所で変化し、腸上部で好気性の種が多く、腸下部および大腸で嫌気性菌が群生していることが知られている31。一例として、セグメント糸状性細菌（SFB）がGI管に沿って近位から遠位の方向に次第に増加することが見いだされた34。PP GC応答が局所共生細菌によって影響されるかどうかを理解するために、HTGTS-V(D)J SHM-seqアプローチを使用して、同じマウスにおいて個々のPP由来のGCおよびナイーブB細胞レパートリーを調べた（図22A）。全体のGC VH組成は、同一のナイーブレパートリーにも関わらず、5つの連続的な単一PP間で高度に変動可能であった（図22B）。それにも関わらず、いくつかのVH:PP3およびPP5におけるVH1-47、PP5、およびPP6におけるVH1-15、PP6、およびPP7におけるVH1-82およびVH1-12（図22B）が、1を超えるPPで富化していることが見いだされ、このことは、PP GCにおける抗原特異的BCR選択を裏付けている。VH1-47がより近位PPにおいて優占的に用いられ、そして、VH1-15、VH1-82およびVH1-12が主に遠位PPに関与する距離効果がこの選択に観察され、小腸に沿った微生物叢種の変化と相関している可能性が高い。
【０１９０】
興味深いことに、PP3およびPP5は、生産的VH1-47（A）および非生産的VH9-3（B）の共通クローン型を共有した（図22B）。AおよびBの頻度は、PP3またはPP5のいずれかで等しかったが、このことは、これらが、PP間で循環して2つのPPにおけるある特定の抗原に対して選択された同じBCRクローン由来の2つの対立遺伝子であったことを示している。これは、同じマウスにおけるPP間のB細胞交換の強い証拠である。この見解の裏付けとして、光変換実験によってナイーブおよびメモリB細胞の両方がPP間で循環することが報告されている26。したがって、本明細書において、BCR依存性GC選択が、PPにおいて、異なるマウス由来の全PPおよび同じマウス由来の単一PPの両レベルで起こることが実証される。
【０１９１】
選択されたBCRは固有のSHMを蓄積する
マウスVB1-8 VDJ IgHエクソンを使用して、PP GCにおいて、VHエクソンが選択なしで突然変異する12。この知見は、PP GC B細胞の慢性活性化が、細胞選択の非存在下で、SHMを介した一次抗体レパートリーの増大を可能にし得るという非常に興味深い可能性を提起した。あるいは、VB1-8モデルにおいて生産的VDJ配列が1つしかなかったので、SHM選択の欠乏は、VB1-8エクソンが任意の腸管抗原とマッチしない可能性に起因し得る。PP GCにおいて腸管抗原に応答して循環的に富化されたいくつかのVH（図21A）が同定されたので、それらの突然変異パターンを調査した。驚くことに、プールされた非生産的配列から生成された固有の突然変異パターンと比較して、PP GCにおける最も高度に富化されたVH1-47およびVH11-2は、突然変異を蓄積したが、CDR領域突然変異においていかなる循環選択も示さず（図23）、このことは、PPにおける親和性成熟の欠如を示している。VB1-8モデルの過去の知見と一致して、ナイーブレパートリーにおける高いベースラインレベルに起因する可能性の高い、顕著に富化されていないにも関わらずPP GCにおいて最も高頻度に用いられた同じVH1-72（図21A）はまた、配列内在性SHMを蓄積した（図29A）。したがって、PP GCは、SHM選択において従来のGCとは異なって挙動すると考えられる。
【０１９２】
参照文献
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2020507326.tif 000017
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【０１９３】
実施例6
HTGTS-Rep-seqを使用して、末梢血B細胞由来のヒトIGH、IGK、およびIGLレパートリーを解析した（図30）。
【０１９４】
（表６）
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【図１】
2020507326.tif 000022
【図２】
2020507326.tif 000023
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
2020507326.tif 000034
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2020507326.tif 000036
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ａ−３】
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【図８Ａ−４】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ−１】
2020507326.tif 000051
【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ａ−３】
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【図１３Ａ−４】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ−１】
2020507326.tif 000070
【図１４Ｂ−２】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ−１】
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【図１５Ｂ−２】
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【図１５Ｂ−３】
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【図１５Ｂ−４】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ−１】
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【図１６Ｂ−２】
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【図１６Ｂ−３】
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【図１６Ｂ−４】
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【図１６Ｂ−５】
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【図１６Ｂ−６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ−１】
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【図１９Ａ−２】
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【図１９Ｂ−１】
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【図１９Ｂ−２】
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【図１９Ｃ−１】
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【図１９Ｃ−２】
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【図１９Ｄ−１】
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【図１９Ｄ−２】
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【図２０Ａ−１】
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【図２０Ａ−２】
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【図２０Ｂ−１】
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【図２０Ｂ−２】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ−１】
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【図２１Ｃ−２】
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【図２１Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ−１】
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【図２２Ｂ−２】
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【図２２Ｂ−３】
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【図２２Ｂ−４】
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【図２２Ｂ−５】
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【図２２Ｂ−６】
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【図２２Ｂ−７】
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【図２２Ｂ−８】
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【図２２Ｂ−９】
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【図２２Ｂ−１０】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ−１】
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【図２６Ａ−２】
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【図２６Ａ−３】
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【図２６Ａ−４】
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【図２６Ａ−５】
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【図２６Ａ−６】
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【図２６Ｂ−１】
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【図２６Ｂ−２】
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【図２７Ａ−１】
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【図２７Ａ−２】
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【図２７Ａ−３】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ−１】
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【図２８Ａ−２】
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【図２８Ｂ−１】
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【図２８Ｂ−２】
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【図２８Ｃ−１】
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【図２８Ｃ−２】
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【図２９Ａ−１】
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【図２９Ａ−２】
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【図２９Ｂ−１】
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【図２９Ｂ−２】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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