(57)【要約】異種遺伝子を含む合成カルビン回路を発現するヌクレオチド配列発現系を含む酵母であって、少なくとも、ａ）リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(EC番号：4.1.1.39)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(RuBisCO遺伝子)；及びｂ）リブロースリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.1.19)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PRK遺伝子)；を含み、前記酵母は任意で、目的の遺伝子(GOI)を発現する異種発現構築物を含む、及び／又は、前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子の各々は、ペルオキシソーム輸送シグナル(PTS)をコードするヌクレオチド配列と融合されている。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成カルビン回路の異種遺伝子を含む、合成カルビン回路を発現するヌクレオチド配列発現系を含む酵母であって、少なくとも
ａ）リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(EC番号：4.1.1.39)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(RuBisCO遺伝子)；及び
ｂ）リブロースリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.1.19)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PRK遺伝子)を含むこと；
ここで、前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子の各々は、ペルオキシソーム輸送シグナル(PTS)をコードするヌクレオチド配列と融合され、
ここで、任意で、前記酵母は目的の遺伝子(GOI)を発現する異種発現構築物をさらに含む
ことを特徴とする、酵母。
【請求項２】
合成カルビン回路の異種遺伝子を含む、合成カルビン回路を発現するヌクレオチド配列発現系を含み、さらに、目的の遺伝子(GOI)を発現する異種発現構築物を含む酵母であって、前記合成カルビン回路が、少なくとも以下の異種遺伝子:
ａ）リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(EC番号：4.1.1.39)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(RuBisCO遺伝子)；及び
ｂ）リブロースリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.1.19)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PRK遺伝子)
を含むことを特徴とする酵母。
【請求項３】
前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子がそれぞれ、ペルオキシソーム輸送シグナル(PTS)をコードするヌクレオチド配列と融合されて、酵母ペルオキシソームにおいて合成カルビン回路を発現する、請求項１又は２に記載の酵母。
【請求項４】
合成カルビン回路を完成させるための１又は複数の内在性遺伝子を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項５】
前記合成カルビン回路が、以下のいずれかである、１又は複数のさらなる異種遺伝子を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の酵母：
ａ）ホスホグリセリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.2.3)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PGK1遺伝子)、及び／又は
ｂ）グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(EC番号：1.2.1.12)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TDH3遺伝子)；及び／又は
ｃ）トリオース-リン酸イソメラーゼ(EC番号：5.3.1.1)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TPI1遺伝子)；及び／又は
ｄ）トランスケトラーゼ(EC番号：2.2.1.1)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TKL1遺伝子)
ここで、任意で、前記PGK1、TDH3、TPI1、及びTKL1遺伝子の１つ以上又はそれぞれは、PTSをコードするヌクレオチド配列と融合される。
【請求項６】
合成カルビン回路が、以下の異種遺伝子：前記RuBisCO遺伝子、前記PRK遺伝子、前記PGK1遺伝子、前記TDH3遺伝子、前記TPI1遺伝子、及び前記TKL1遺伝子を含む、請求項５に記載の酵母。
【請求項７】
ａ）前記RuBisCO遺伝子は、チオバシラス・デニトリフィカンス起源であり、好ましくは、配列番号３７として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、リブロース-二リン酸カルボキシラーゼを発現する変異体を含む；及び／又は
ｂ）前記PRK遺伝子は、ホウレンソウ起源であり、好ましくは配列番号３８として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、リブロースリン酸キナーゼを発現する変異体を含む；及び／又は
ｃ）前記PGK1遺伝子は、オガタエア・ポリモルファ起源であり、好ましくは配列番号３９として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、ホスホグリセリン酸キナーゼを発現する変異体を含む；及び／又は
ｄ）前記TDH3遺伝子は、オガタエア・ポリモルファ起源であり、好ましくは配列番号４０として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を発現する変異体を含む；及び／又は
ｅ）前記TPI1遺伝子は、オガタエア・パラポリモルファ起源であり、好ましくは配列番号４１として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、トリオース-リン酸イソメラーゼを発現する変異体を含む、及び／又は
ｆ）前記TKL1遺伝子は、オガタエア・パラポリモルファ起源であり、好ましくは、配列番号４２として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、トランスケトラーゼを発現する変異体を含む
請求項１〜６のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項８】
前記酵母が、該酵母のサイトゾル中に１つ以上の分子シャペロンを発現する異種遺伝子をさらに含み、該シャペロンは、前記酵素の少なくとも１つの共有結合性フォールディング及び／又はアセンブリを補助する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項９】
前記シャペロンが、少なくとも
ａ）大腸菌起源のGroEL、好ましくは、配列番号４３として特定されるヌクレオチド配列によってコードされるもの、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、分子シャペロンを発現する変異体；及び
ｂ）大腸菌起源のGroES、好ましくは配列番号８として特定されるヌクレオチド配列によってコードされるもの、又はその機能的に活性な変異体であって、少なくとも９０％の配列同一性を有し、分子シャペロンを発現する変異体
である、請求項８に記載の酵母。
【請求項１０】
前記合成カルビン回路の前記異種遺伝子の１つ以上が、前記酵母における発現のためにコドン最適化されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１１】
前記酵母が、ピキア、コマガタエラ、ハンゼヌラ、オガタエア、カンジダ、及びトルロプシスからなる群より選択される属のものであり、好ましくは、ピキア・パストリス、コマガタエラ・パストリス、Ｋ.ファフィー、及びＫ.シュードパストリスからなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の酵母。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵母を、細胞培養において培養する方法であって、炭素源として気体状二酸化炭素及び／又は溶解CO32-及び／又はHCO3-化合物を用いて、増殖相で前記酵母を培養し、それによって細胞培養において蓄積された酵母バイオマスを得ることを含む、方法。
【請求項１３】
前記酵母が、メタノールによって誘導可能であるプロモーターに作動可能に連結された前記異種遺伝子を含み、前記増殖相は培養培地にメタノールを添加することによって開始される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炭素源を使用して生産相で前記蓄積酵母バイオマスを培養して、前記POI及び代謝産物をそれぞれ産生することをさらに含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１５】
合成カルビン回路を含む酵母において有機生成物を産生する方法であって、この際、生成物の全有機炭素の少なくとも20％が、気体状二酸化炭素及び／又は溶存CO32-及び／又はHCO3-化合物である炭素源に由来する、方法。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の酵母の使用であって、気体状二酸化炭素及び／又は溶存CO32-及び／又はHCO3-化合物である炭素源を用いて、POI及び／又は代謝産物を産生するための、前記酵母の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成カルビン回路を発現する異種遺伝子を組み込んだ酵母、及び二酸化炭素を固定しながら酵母を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
温室効果ガスの排出と関連する気候変動は、我々の社会にとって最も差し迫った問題の一つである。化石資源の代わりにCO2を工業的製造プロセスのための炭素源として使用することは、温室効果ガスの排出を著しく制限する可能性がある。バイオテクノロジーは、バイオベースの経済にとって重要な技術の一つである。多くの飼料及び食品用途、ならびに基礎化学及び医薬品の製造は、触媒としての微生物から始まる。これらのプロセスは主に、糖などの植物由来の資源に基づくが、大気CO2に直接的に基づくことはまれである。しかし、植物由来炭素の増加は、土地利用の変化や地球への他の有害な影響につながっている。したがって、生産生物の直接的な二酸化炭素固定が望ましい。最も自然な炭素固定生物はエネルギー源として(太陽)光を使用し、これは、それらを成長のための有機炭素から完全に独立させ、有益である。しかしながら、液体微生物培養物では光分布が巨大な技術的問題であり得、そして通常、このような生物の増殖及び生産速度は非常に低い。バイオテクノロジー生産のための古典的な宿主生物は、生産速度に関してはるかに効率的であるが、有機炭素に依存する。
【０００３】
二酸化炭素固定経路の遺伝子工学は、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)又は細菌系大腸菌(Escherichia coli)のような酵母系について実行可能であることが既に示されている。酵母、S.セレビシエにおいて、二酸化炭素固定が、エタノール産生の増強をもたらすマルトース又はキシロース同時発酵と共に実行可能であることが示された(Guadalupe-Medina et al. Biotechnol. Biofuels 2013, 6:125; Li et al. Scientific Reports 2017, 7:43875)。しかしながら、このシステムでは、NADHの形成においてエネルギー供給から炭素同化を切り離すことは不可能である。したがって、バイオマスは、CO2からだけでなく、キシロース、マルトース、又はグルコース及びガラクトースのような他の糖からも同化される。
【０００４】
E.coliにおいて、バイオマスを産生する機能的カルビン回路が設計され、これは、ATP及びNADHを産生するエネルギー供給経路から切り離された。ここでは、エネルギー産生基質としてピルビン酸塩を使用した。しかし、最初に設計されたクローンは、CO2及びピルビン酸塩の存在下での増殖を可能にするためのさらなる進化工程を必要とした(Antonovsky et al. Cell 2016, 166:115-125)。第２の単一炭素分子(メタノールなど)の存在下でのみ高い二酸化炭素同化能力を有する酵母株は存在しない。メタノールは、グリーンエネルギーを適用することによって、固定化二酸化炭素からも形成することができる貴重な再生可能原料である。
【０００５】
WO 2015/177800 A2は、炭素固定が可能な組換え微生物、例えば細菌又は酵母を開示している。関連遺伝子、例えばRuBisCOは、サイトゾル中で発現される。二酸化炭素の他に、有機炭素源、例えばペントース、ヘキソース又は有機酸がバイオマス生産に必要である。
【０００６】
US 2017/0002368 A1／WO 2015/107469 A1は、機能性IタイプRuBisCO酵素及びクラスIIホスホリブロキナーゼを発現するように改変された酵母を開示する。これらの酵素の発現は、カルビン回路を再現することが開示されており、酵母に二酸化炭素の使用を可能にすると言われている。一例として、S.セレビシエが改変され、サイトゾル中に異種RuBisCO遺伝子を発現する。二酸化炭素の他に、グルコースが追加の炭素源として使用される。
【０００７】
Peng-Feng Xiaら(ACS Synthetic Biology 2016,6(2):276-283)は、キシロース発酵S.セレビシエへの合成還元ペントースリン酸経路を記載する。
Freyら(Journal of American Chemical Society 2016,138(32):10072-10075)は、2つの酵素、RuBisCO及び炭酸脱水酵素(CO)を被包するための、シアノバクテリア炭素固定オルガネラであるカルボキシソームの合成模倣物を記載している。
【０００８】
ピキア・パストリス(Pichia pastoris)(syn.Komagataella sp.)は、十分に確立された微生物宿主生物である。P.パストリスのための多数の株エンジニアリング・アプローチは、種々の産物についての生産性を改善し、そしてまた、産生目的のためのプロモーターにも労力が傾けられた。それは、その高いタンパク質分泌能力について周知であり、そして複数のタンパク質が、この微生物細胞工場において現在産生されている(Gasser et al. Microb. Cell Fact. 2013, 14:196)。近年、この酵母においてメチロトローフのライフスタイルがどのように達成されるかが記載された(Rusmayer et al. BMC Biol. 2015, 13:80)。
【０００９】
広く使用されている微生物細胞工場が、炭素を固定すること、及び、高い生産速度と植物由来炭素の低い需要との組み合わせを可能にすることが非常に望ましい。目的は、高い成長及び生産速度を特徴とするものの、現在使用されている株よりも低い炭素源要求量を特徴とする、バイオベース生産のためのシャーシセル(chassis cell)を提供することである。このようなシャーシセルは、低カーボンフットプリントにて、化学物質又は医薬タンパク質を製造するために使用することができた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、バイオマス及びバイオベース生産物の製造に使用するための、二酸化炭素を固定することができる改良された微生物を設計することである。
この目的は、特許請求の範囲の主題によって解決され、本明細書でさらに説明される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明によれば、バイオマス産生のための、又は、(小)代謝産物、化学物質、組換えタンパク質又は細胞バイオマスを含む一連の様々な産物クラスを産生するために、宿主細胞として使用するための、異種遺伝子を組み込んだ合成(人工)カルビン回路を発現する酵母が提供される。
【００１２】
特定の実施形態によれば、前記酵母は、合成カルビン回路の異種遺伝子を含む合成カルビン回路を発現するヌクレオチド配列発現系を含み、これは、少なくとも
ａ）リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(EC番号：4.1.1.39)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(RuBisCO遺伝子)；及び
ｂ）リブロースリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.1.19)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PRK遺伝子)を含み；
ここで、任意で、前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子の各々は、ペルオキシソーム輸送シグナル(PTS)をコードするヌクレオチド配列と融合され、
ここで、任意で、前記酵母は、目的の遺伝子(GOI＝gene of interest)を発現する異種発現構築物をさらに含む。
【００１３】
PTSは、酵母ペルオキシソームへのそれぞれの遺伝子の発現を促進する。酵母ペルオキシソームにおけるRuBisCO及びPRK遺伝子の発現は、二酸化炭素のみからのバイオマス同化をサポートすることが有利に証明されている。従って、二酸化炭素での増殖を可能にするために必要な全ての酵素を含有するように、炭素固定酵母株を設計することができる。
【００１４】
さらに、特定の実施形態によれば、前記酵母は、合成カルビン回路をサイトゾル中に発現する。このような実施形態は、PTSをコードするヌクレオチド配列を有さない、合成カルビン回路の異種遺伝子の１つ以上、又は各々を使用し得る。
【００１５】
別の特定の実施形態によれば、前記酵母は、合成カルビン回路の異種遺伝子を含む合成カルビン回路を発現するヌクレオチド配列発現系を含み、さらに、目的の遺伝子(GOI)を発現する異種発現構築物を含み、前記合成カルビン回路は、少なくとも以下の異種遺伝子を含む:
ａ）リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(EC番号：4.1.1.39)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(RuBisCO遺伝子)；及び
ｂ）リブロースリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.1.19)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PRK遺伝子)。
【００１６】
具体的には、GOIは、目的のタンパク質(POI)、又は炭素源を代謝産物に変換する１つ以上の酵素をコードする。
【００１７】
具体的には、前記炭素源はC1炭素分子、好ましくはCO2、CO32-、HCO3-及び/又はメタノールである。
【００１８】
具体的には、合成カルビン回路は機能的であり、二酸化炭素をバイオマスに同化するために、及び二酸化炭素を炭素源として使用するためにそれぞれ必要なすべての酵素を含んでいる。異種RuBisCO及びPRK遺伝子の他に、１つ以上のさらなる内在性又は異種遺伝子が組み込まれ得、そしてカルビン回路をサポートするこのような酵母によって発現され得る。
【００１９】
具体的には、本明細書に記載される酵母は、合成カルビン回路を完了するために、前記異種遺伝子に加えて１つ以上の内在性遺伝子を含む。
具体的には、前記合成カルビン回路は、１つ以上のさらなる異種遺伝子を含む。具体的には、前記１つ以上の異種遺伝子は、以下のいずれかである：
ａ）ホスホグリセリン酸キナーゼ(EC番号：2.7.2.3)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(PGK1遺伝子)、及び／又は
ｂ）グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(EC番号：1.2.1.12)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TDH3遺伝子)；及び／又は
ｃ）トリオース-リン酸イソメラーゼ(EC番号：5.3.1.1)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TPI1遺伝子)；及び／又は
ｄ）トランスケトラーゼ(EC番号：2.2.1.1)のクラス由来の酵素をコードする遺伝子(TKL1遺伝子)
この際、任意で、前記PGK1、TDH3、TPI1、及びTKL1遺伝子の１つ以上又はそれぞれは、PTSをコードするヌクレオチド配列と融合される。
【００２０】
あるいは、前記PGK1、TDH3、TPI1、及びTKL1遺伝子の１つ以上が、前記酵母に対して内在性又は自己性であり、異種遺伝子と共発現されてもよい。
具体的には、前記異種遺伝子は、前記RuBisCO遺伝子、前記PRK遺伝子、前記PGK1遺伝子、前記TDH3遺伝子、前記TPI1遺伝子、及び前記TKL1遺伝子を含む。
具体的には、合成カルビン回路は、以下の異種遺伝子を含む：前記RuBisCO遺伝子、前記PRK遺伝子、前記PGK1遺伝子、前記TDH3遺伝子、前記TPI1遺伝子、及び前記TKL1遺伝子。
【００２１】
具体的には、
ａ）前記RuBisCO遺伝子は、細菌起源、好ましくはチオバシラス属(チオバチルス属)であり；及び／又は
ｂ）前記PRK遺伝子は、植物起源、好ましくはヒユ科であり；及び／又は
ｃ）前記PGK1遺伝子は、酵母起源、好ましくはオガタエア(Ogataea)属であり；及び／又は
ｄ）前記TDH3遺伝子は、酵母起源、好ましくはオガタエア属であり；及び／又は
ｅ）前記TPI1遺伝子は、酵母起源、好ましくはオガタエア属であり；及び／又は
ｆ）前記TKL1遺伝子は、酵母起源、好ましくはオガタエア属である。
【００２２】
具体的には
ａ）前記RuBisCO遺伝子は、チオバシラス・デニトリフィカンス(Thiobacillus denitrificans)起源であり、好ましくは、図５の配列番号１に示す酵素コードヌクレオチド配列（特に、配列番号３７として特定されるヌクレオチド配列）を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（リブロース-二リン酸カルボキシラーゼを発現する）を含む；及び／又は
ｂ）前記PRK遺伝子は、ホウレンソウ(Spinacia oleracea)起源であり、好ましくは図５の配列番号２に示す酵素コードヌクレオチド配列、特に配列番号３８として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（リブロースリン酸キナーゼを発現する）を含む；及び／又は
ｃ）前記PGK1遺伝子は、オガタエア・ポリモルファ起源であり、好ましくは図５の配列番号３に示す酵素コードヌクレオチド配列、特に配列番号３９として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（ホスホグリセリン酸キナーゼを発現する）を含む；及び／又は
ｄ）前記TDH3遺伝子は、オガタエア・ポリモルファ起源であり、好ましくは図５の配列番号４に示す酵素コードヌクレオチド配列、特に配列番号４０として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を発現する）を含む；及び／又は
ｅ）前記TPI1遺伝子は、オガタエア・パラポリモルファ(Ogatae parapolymorpha)起源であり、好ましくは図５の配列番号５に示す酵素コードヌクレオチド配列、特に配列番号４１として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（トリオース-リン酸イソメラーゼを発現する）を含む、及び／又は
ｆ）前記TKL1遺伝子は、オガタエア・パラポリモルファ起源であり、好ましくは、図５の配列番号６に示す酵素コードヌクレオチド配列、特に配列番号４２として特定されるヌクレオチド配列を含むか、又は、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体（トランスケトラーゼを発現する）を含む。
【００２３】
具体的には、前記それぞれの酵素をコードし、さらにPTSコード配列を含むヌクレオチド配列は、配列番号１〜６からなる群より選択される。このような配列は、3'末端にPTSコード配列を含む。代表的なPTSコード配列は、配列番号４４として特定される「TCCAAGTTG」、又は「TCTAAGTTG」(配列番号４５)である。
【００２４】
しかしながら、前記ヌクレオチド配列は、本明細書中にさらに記載されるように、代替のPTSコード配列を含み得ることが十分に理解される。PTSは、遺伝子及び遺伝子コード酵素をそれぞれ、酵母ペルオキシソーム中に発現させる。PTSを含む酵素配列を使用する合成カルビン回路は、本明細書では「ペルオキシソームカルビン回路」と呼ばれる。
【００２５】
具体的には、PTSコード配列を含まないそれぞれの酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７〜４２からなる群より選択される。PTSコード配列の非存在下では、遺伝子コード酵素は酵母サイトゾルに標的化される。PTSを含まない酵素配列を使用する合成カルビン回路は、本明細書では「サイトゾルカルビン回路」と呼ばれる。
【００２６】
特定の実施形態によれば、前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子の各々は、酵母ペルオキシソームにおいて合成カルビン回路を発現するために、PTSをコードするヌクレオチド配列と融合される。
【００２７】
代替的な実施形態によれば、前記RuBisCO遺伝子及び前記PRK遺伝子の一方又は両方は、例えば、前記酵母のサイトゾル中に前記遺伝子を発現させるために、PTSをコードするヌクレオチド配列を欠いている。
【００２８】
具体的には、前記PTSは、３〜９のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含む。
具体的には前記PTSは、任意の組み合わせにおける、セリン、リジン、ロイシン、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、アラニン、アルギニン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、及びメチオニンからなる群より選択される３〜５のアミノ酸からなるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなり、そのようなPTSは本明細書ではPTS1とも呼ばれる。具体的には、前記PTS1は、SKL、VNL、DKL、TKL、ARL、AKl、PNL、ARF、又はPMLのいずれかであるアミノ酸配列である。選択されたPTS1は、前記異種遺伝子の発現を、前記酵母のペルオキシソーム区画に向けるために最適化することができる。
【００２９】
具体的には、前記PTS1は、セリン、リジン、及びロイシンからなる群より選択される３〜５のアミノ酸を含むか、又はそれらからなる。
具体的には、前記PTS1は、好ましくは、前記異種遺伝子発現産物の１つのカルボキシ末端に融合される。
【００３０】
特定の実施形態によれば、前記PTSは、配列番号１２として特定される配列を含む５〜９のアミノ酸を含むか、又はそれらからなり、そのようなPTSは、本明細書ではPTS2とも呼ばれる：
配列番号１２：XX(X)nXX,
ここで、１位におけるXは、R、又はKのいずれかであり；
ここで、２位におけるXは、L、V、又はIのいずれかであり；
ここで、３位におけるXは、１以上(ｎ＝１〜５)のアミノ酸であり、それぞれが、任意のアミノ酸である；
ここで、４位におけるXは、H、又はQのいずれかであり；
ここで、５位におけるXは、L、又はAのいずれかである。
【００３１】
言い換えれば、配列番号１２として特定される配列は、以下のものである：
XXXXXXXXX,
ここで、１位におけるXは、R、又はKのいずれかであり；
ここで、２位におけるXは、L、V、又はIのいずれかであり；
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、存在しないか、又は任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、存在しないか、又は任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、存在しないか、又は任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、存在しないか、又は任意のアミノ酸であり；
ここで、８位におけるXは、H、又はQのいずれかであり；
ここで、９位におけるXは、L、又はAのいずれかである。
【００３２】
代表的なPTSは、配列番号１３〜３６のいずれかによって特定されるアミノ酸配列を含むか、又はそれらからなるPTSからなる群より選択される：
配列番号１３：RLXXXXXHL
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１４：RLXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１５：RLXXXXXQL
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１６： RLXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１７： RVXXXXXHV
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１８： RVXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号１９： RVXXXXXQV
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２０： RVXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２１： RIXXXXXHI
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２２： RIXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２３： RIXXXXXQI
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２４： RIXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２５： KLXXXXXHL
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２６： KLXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２７：KLXXXXXQL
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２８：KLXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号２９：KVXXXXXHV
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３０：KVXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３１：KVXXXXXQV
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３２：KVXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３３：KIXXXXXHI
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３４：KIXXXXXHA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３５：KIXXXXXQI
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
配列番号３６：KIXXXXXQA
ここで、３位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、４位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、５位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、６位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
ここで、７位におけるXは、任意のアミノ酸であり；
【００３３】
具体的には、前記PTSは、前記異種遺伝子発現産物のアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかに融合されるか、又はPTSをコードするヌクレオチド配列が任意の位置で遺伝子配列に組み込まれ、それによってペルオキシソーム発現をもたらすように融合される。
【００３４】
具体的には、前記酵母は、分子シャペロンなどのヘルパー因子を発現するようにさらに操作される。
具体的には、前記酵母は該酵母のサイトゾル中に１つ以上の分子シャペロンを発現する異種遺伝子をさらに含み、該シャペロンは、前記酵素の少なくとも１つの共有結合性フォールディング及び／又はアセンブリを補助する。具体的には、前記シャペロンは、RuBisCO酵素の正しいフォールディングのためのヘルパー因子であり、それによって酵素機能をサポートする。
【００３５】
具体的には、前記シャペロンは、熱ショックタンパク質及びシャペロニンファミリーのタンパク質、好ましくは細菌起源のタンパク質の群から選択される。
【００３６】
具体的には、前記シャペロンは、少なくとも
ａ）大腸菌起源のGroEL、好ましくは、図５の配列番号７に示されるシャペロンコードヌクレオチド配列、特に配列番号４３として特定されるヌクレオチド配列によってコードされるもの、又は分子シャペロンを発現する、少なくとも９０％の配列同一性を有する前述のいずれかの機能的に活性な変異体；及び
ｂ）大腸菌起源のGroES、好ましくは配列番号８として特定されるヌクレオチド配列によってコードされるもの、又は分子シャペロンを発現する、少なくとも９０％の配列同一性を有するその機能的に活性な変異体である。
【００３７】
具体的には、例えばピキア属のメチロトローフ酵母及び非メチロトローフ酵母は、異種RuBisCO及びPRK遺伝子に加えて、酵母のペルオキシソーム区画において発現され得る内在性遺伝子PGK1、TDH3、TPI1、及びTKL1、ならびに酵母サイトゾルにおける内在性遺伝子GroEL及びGroESを含み、それによって機能的カルビン回路を発現する。さらに、１つ以上の内在性遺伝子の過剰発現が有利であり得る。したがって、カルビン回路の関連酵素を発現する内在性遺伝子のいずれも、例えば、適切なプロモーター工学によって、又はヘルパー因子を共発現することによって、過剰発現され得る。あるいは、内在性のものと同じタイプの酵素を発現する異種遺伝子を、酵母にさらに導入するか、又は内在性のものに代えてもよい。
【００３８】
別の実施形態では、RuBisCO、PRK、PGK1、TDH3、TPI1、及びTKL1遺伝子のそれぞれが、酵母に対して異種であり、宿主細胞ペルオキシソームにおける発現のために酵母のゲノムに組み込まれることが有利である。さらに、GroEL及びGroES遺伝子の各々は酵母に対して異種であり、宿主細胞サイトゾルにおける発現のために酵母のゲノムに組み込まれる。
【００３９】
具体的には、前記合成カルビン回路又は前記シャペロンの前記異種遺伝子の１つ以上、又は目的の遺伝子(GOI)を発現する異種発現構築物において使用される任意の配列の１つ以上（特にGOI）が、前記酵母における発現のためにコドン最適化される。具体的には、本明細書に記載の異種遺伝子の各々が、コドン最適化される。
【００４０】
具体的には、前記異種遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結される。具体的には、前記異種遺伝子の各々が、プロモーターに作動可能に連結される。
【００４１】
特異的プロモータータイプには、少なくとも恒常的、誘導性、合成、コンパートメント特異的及び発生段階特異的プロモーターが含まれる。
【００４２】
具体的には、前記プロモーターは、天然のメタノール誘導遺伝子の発現を促進するメタノール誘導性プロモーターのいずれかである(Gasser, B., Steiger, M. G., & Mattanovich, D. (2015). Methanol regulated yeast promoters: production vehicles and toolbox for synthetic biology. Microbial Cell Factories, 14:196).
具体的には、前記プロモーターは、恒常型の任意のプロモーターである。
【００４３】
特定の実施形態によれば、前記酵母は、目的のタンパク質(POI)を発現するさらなるヌクレオチド配列発現系、又は炭素源を代謝産物に、特に、有機小分子発酵産物（これは、酵母宿主細胞により発現される代謝経路によって産生される）に変換する１つ以上の酵素を含む。具体的には、プロモーターがGOIに作動可能に連結され、特にGOIは、POI又は代謝産物産生のために使用される酵素をコードするヌクレオチド配列であり、このプロモーターは、POIをコードするヌクレオチド配列と天然には関連しない。POIは、特に異種ポリペプチド又はタンパク質である。具体的には、POIは真核生物タンパク質、好ましくは哺乳動物タンパク質である。特定の場合において、POIは、多量体タンパク質、特に二量体又は四量体である。
【００４４】
具体的には、GOI発現カセットは、POIの分泌を可能にするシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、前記シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、POIをコードするヌクレオチド配列の5'末端に隣接して位置する。
【００４５】
具体的には、前記炭素源は、C1炭素分子、好ましくはCO2、CO3、HCO3-、及び／又はメタノールである。
【００４６】
具体的には、前記代謝産物は、有機酸、好ましくはクエン酸、乳酸、グルコン酸、ギ酸、コハク酸、シュウ酸、リンゴ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、酒石酸、イタコン酸、アスコルビン酸、又はフマル酸のいずれか；脂質、好ましくは脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、スフィンゴ脂質、ステロール、又は脂質のいずれか；アルコール、好ましくはエタノール、ブタノール、プロパノール、ブタンジオール、又はプロパンジオールのいずれか；ポリオール、好ましくはアラビトール、エリスリトール、又はキシリトールのいずれか；及び炭水化物、好ましくはグルコース、フルクトース、又はキシロースのいずれかからなる群より選択される。
【００４７】
具体的には、前記代謝産物は、酵母中に天然に存在する経路によって産生される酵母代謝産物であるか、又は１つ以上の異種遺伝子を使用するために人工的なものである。
【００４８】
具体的には、前記POIは、治療用タンパク質又は工業的に関連する技術的酵素からなる群より選択される。具体的には、治療用タンパク質の群からの前記POIは、好ましくは、抗体分子又はその抗原結合フラグメント、酵素及びペプチド、タンパク質抗生物質、毒素融合タンパク質、炭水化物-タンパク質結合体、構造タンパク質、調節タンパク質、ワクチン及びワクチン様タンパク質又は粒子、処理酵素、成長因子、ホルモン及びサイトカインのいずれかである。具体的には、工業用酵素の群からの前記POIは、好ましくは、加水分解酵素、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、又はリガーゼの群から誘導される任意のものである。
【００４９】
加水分解酵素の群からの具体的なPOIは、化学結合の加水分解を触媒する酵素、又はその改変された(遺伝子操作された)変異体である。加水分解酵素の群からの具体的なPOIの中には、アミラーゼ、リパーゼ、マンナナーゼ、β-キシラナーゼ、ペクチナーゼ、α-フコシダーゼ、シアリダーゼ、フィターゼ、セルラーゼ、又はプロテアーゼがある。
【００５０】
トランスフェラーゼの群からの具体的なPOIは、官能性化学基の転移を触媒する酵素、又はその改変された変異体である。トランスフェラーゼの群からの具体的なPOIの中には、メチルトランスフェラーゼ、ヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ、カルボキシトランスフェラーゼ、カルバモイルトランスフェラーゼ、又はトランスグルタミナーゼがある。
【００５１】
オキシドレダクターゼの群からの具体的なPOIは、還元又は酸化を触媒する酵素、又はその改変された変異体である。オキシドレダクターゼの群からの具体的なPOIの中には、乳酸デヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ又はポリフェノールオキシダーゼがある。
【００５２】
リアーゼの群からの具体的なPOIは、C-O、C-CもしくはC-Nの形成における化学結合を触媒する酵素、又はその改変された変異体である。リアーゼの群からの具体的なPOIの中には、ピルビン酸デカルボキシラーゼ又はアスパラギン酸アンモニアリアーゼがある。
【００５３】
イソメラーゼの群からの具体的なPOIは、１つの化学アイソフォームを別の化学アイソフォームに変換する酵素、又はその改変された変異体である。イソメラーゼの群からの具体的なPOIの中には、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ、又はキシロースイソメラーゼがある。
【００５４】
リガーゼの群からの具体的なPOIは、共有結合の形成を触媒する酵素、又はその改変された変異体である。リガーゼ群からの具体的なPOIの中には、スクロースシンターゼ、又はガンマ-グルタミルシステインシンテターゼがある。
【００５５】
特定POIは、抗体などの抗原結合分子、又はそのフラグメントである。特定POIの中には、抗体、例えば、モノクローナル抗体(mAb)、免疫グロブリン(Ig)又は免疫グロブリンクラスG(IgG)、重鎖抗体(HcAb's)、又はそのフラグメント、例えば、フラグメント-抗原結合(Fab)、Fd、一本鎖可変フラグメント(scFv)、又は、改変されたその変異体、例えばFv二量体(二重特異性抗体)、Fv三量体(三重特異性抗体)、Fv四量体、又はミニボディ及びVH又はVHH又はV-NARのような単一ドメイン抗体がある。さらなる抗原結合分子は、例えば、改変されたクニッツドメイン、アドネクチン、アフィボディ、アンチカリン(Anticalin)、及び設計アンキリン反復タンパク質(DARPin)のような(代替の)足場タンパク質から選択され得る。
【００５６】
具体的には、前記酵母は、宿主細胞又は宿主細胞株とも呼ばれる組換え細胞又は細胞株である。具体的には、前記酵母は、POI又は代謝産物を産生する産生細胞株である。具体的には、POI又は代謝産物を発現する酵母は、シャーシセルとして提供され、これは、POI又は代謝経路をコードする関連遺伝子を酵母ゲノムに導入することによって又はエピソーム発現によって、産生細胞株を調製する状態になっている。
【００５７】
具体的には、本明細書において宿主細胞とも呼ばれる前記酵母は、メチロトローフ酵母、メチロトローフ酵母に由来するもの、又は野生型メチロトローフ酵母から改変されたものである。
【００５８】
RuBisCO及びPRK及び4つの補助段階を除く関連酵素のほとんどが、メチロトローフ酵母のペルオキシソーム中に既に存在しているので、単一の炭素源としてメタノールで増殖する能力は、この生物へカルビン回路を設計するのに都合が良いことが判明した。
【００５９】
具体的には、前記酵母は、ピキア(Pichia)、コマガタエラ(Komagataella)、ハンゼヌラ(Hansenula)、オガタエア、カンジダ(Candida)、及びトルロプシス(Torulopsis)からなる群より選択される属のものである。
具体的には、前記酵母は、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、コマガタエラ・パストリス(Komagataella pastoris)、K.ファフィー(K. phaffii)、及びK.シュードパストリス(K. pseudopastoris)からなる群より選択される。特に好ましい酵母は、ピキア・パストリス, コマガタエラ・パストリス, K.ファフィー、又はK.シュードパストリス(例えば、P.パストリス株CBS 704(Centraalbureau voor Schimmelcultures、NL)、CBS 2612、CBS 7435、CBS 9173-9189、DSMZ 70877、X-33、GS115、KM71及びSMD1168のいずれかなど）。
【００６０】
具体的には、前記酵母は、それぞれの内在性遺伝子機能又は発現をノックアウトするために、内因性DAS1遺伝子座及び／又はDAS2遺伝子座を操作することによって産生される。
【００６１】
具体的には、前記酵母は、それぞれの内在性遺伝子機能又は発現をノックアウトするために、内因性AOX1遺伝子座を操作することによって産生される（例えば、内因性DAS1遺伝子座及び／又はDAS2遺伝子座を操作することに加えて）。
【００６２】
野生型メチロトローフ酵母において、前記内在性遺伝子の１つ又は複数をノックアウトすると、酵母は、メタノール利用経路における同化の第１のステップをコードする遺伝子をもはや含まないが、本明細書に記載の目的のために依然として「メチロトローフ」と呼ばれる。
【００６３】
具体的には、メタノール利用経路の同化ブランチは、本明細書中に記載される異種遺伝子の１つ以上を、DAS1及びDAS2遺伝子座のいずれか１つ又は両方に、そして必要に応じてAOX1遺伝子座にも導入することによってノックアウトされる。特定の例によれば、両方の遺伝子、RuBisCO及びPRK遺伝子は、AOX1及び／又はDAS1及び／又はDAS2遺伝子座の一つのみに組み込まれる。
【００６４】
別の実施形態において、本明細書中に記載される異種遺伝子の１つ以上が、メタノール利用経路の任意の内在性遺伝子を妨害又は中断することなく(例えば、適切なノックイン方法によって)導入される。
【００６５】
具体的には、ピキア・パストリスの少なくとも２つの天然遺伝子、特にDAS1(ORF ID：PP7435_Chr3-0352)及びDAS2(ORF ID：PP7435_Chr3-0350)が、前記異種遺伝子によって置換される。
【００６６】
具体的には、P.パストリスAOX1の天然遺伝子(ORF ID：PP7435_Chr4-0130)が、前記異種遺伝子のいずれかによって置換される。
具体的には、P.パストリスゲノム中の３つの遺伝子、すなわちAOX1、DAS1及びDAS2が削除され、以下の異種遺伝子、PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES及びRuBisCOがゲノム中に組み込まれる（特に、AOX1、DAS1及びDAS2ノックアウト部位で）。
【００６７】
具体的には、TDH3、PRK及びPGK1が、PAOX1、PFDH1及びPALD4プロモータの制御下でAOX1遺伝子座に組み込まれる。具体的には、RuBisCO、GroEL、及びGroESを、PDAS1、PPDC1及びPRPP1bプロモータの制御下でDAS1遺伝子座に導入する。具体的には、TKL1及びTPI1が、PDAS2及びPSHB17プロモータの制御下でDAS2遺伝子座に導入される。
【００６８】
具体的には、プロモーターは、異種遺伝子を発現するために選択され、これは遺伝子組込みのそれぞれの遺伝子座で細胞に内因性である。具体的には、天然内因性プロモータを用いて、異種遺伝子、例えば、P.パストリスの天然PAOX1及び／又はPDAS1、及び／又はPDAS2の１つ以上を発現させる。
あるいは、外因性又は合成プロモーターが使用され得る。
【００６９】
具体的には同種プロモーター(同じ種であるが、異なる位置に導入される)を使用することができる。あるいは、酵母宿主細胞に対して異種であるプロモーターを使用することができる。代表的な同種プロモーターは、好ましくはメタノールによって誘導される内在性遺伝子のプロモーターのいずれかである(例えば、SHB17のプロモーター配列(ORF ID：PP7435_Chr2-0185))、PSHB17は、コード配列の500〜1000bps上流である)(Gasser, B., Steiger, M. G., & Mattanovich, D. (2015). Methanol regulated yeast promoters: production vehicles and toolbox for synthetic biology. Microbial Cell Factories, 14:196)。
【００７０】
特定の実施形態によれば、前記異種遺伝子の１つ以上の発現を制御するプロモーターは、メタノール誘導性である。代表的なプロモーターは、PSHB17: (PP7435_chr2 (340617…341606), PALD4: PP7435_chr2 (1466285…1467148), PFDH1: PP7435_chr3 (423504…424503), PAOX1: PP7435_chr4 (237941…238898), PDAS1: PP7435_chr3 (634140…634688), PDAS2: PP7435_chr3 (632201…633100), PPMP20 PP7435_ Chr1-1351 (2418089…2419089), PFBA1-2 PP7435_Chr1 (1163622…114622), PPMP47 PP7435_Chr3 (2033195…2034195), PFLD PP7435_Chr3 (262519…263519), PFGH1 PP7435_Chr3 (555586…556586), PTAL1-2 cbs7435 (644081…645081)のいずれか、又はメタノール誘導性遺伝子の任意の他のプロモーター配列である(Gasser, B., Steiger, M. G., & Mattanovich, D. (2015). Methanol regulated yeast promoters: production vehicles and toolbox for synthetic biology. Microbial Cell Factories, 14:196)。
【００７１】
別の特定の実施形態によれば、前記異種遺伝子の１つ以上の発現を制御するプロモーターは、恒常的である。代表的なプロモーターは、PGAP PP7435_Chr2 (1585003…1586003), PTEF2 PP7435_Chr1 (2751497…2752497), PRPL2A PP7435_Chr4 (1576422…1577422), PCS1 PP7435_Chr1 (4023…5023), PFBA1-1 PP7435_Chr1 (679746…680746), PRPP1B PP7435_Chr4 (46235…463235), PGPM1 PP7435_Chr3 (646226…647226), PPDC1 PP7435_Chr3 (1860826... 1861826), PPOR1  PP7435_Chr2 (737738… 738738), PLAT1 PP7435_Chr1 (637999… 638999), PPpPfk PP7435_Chr4 (1169499… 1170499)、又はPADH2 PP7435_Chr2 (1519404… 1520404)のいずれかである。
【００７２】
具体的には、酵母は、本明細書に記載される異種遺伝子の各々が、前記異種遺伝子と天然には関連しないプロモーターの制御下にあるように操作される。
【００７３】
本発明はさらに、炭素源として気体状二酸化炭素及び／又は溶解CO32-及び／又はHCO3 -化合物を用いて、増殖相で酵母を培養し、それによって細胞培養において蓄積された酵母バイオマスを得ることを含む、細胞培養において本明細書に記載の酵母を培養する方法を提供する。
【００７４】
具体的には、酵母バイオマスは、少なくとも0.1g/L 細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも1g/L 細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも10g/L 細胞乾燥重量まで蓄積される。典型的には、蓄積された酵母バイオマスは発酵装置中で培養され、この際、酵母は10〜20g/L 細胞乾燥重量の間で培養される。
【００７５】
特定の実施例によれば、組換え酵母は、バッチ(回分培養)、フェドバッチ(流加培養)又は連続培養条件下、及び／又は、気体状二酸化炭素及び／又は溶解CO32-及び／又はHCO3-化合物を、例えば単独の炭素源として、又は１以上の追加の炭素源との組合せで含む培地で培養される。
【００７６】
具体的には、バッチ相が第１の工程ａ）として実施され、フェドバッチ相又は連続相は第２の工程ｂ）として実施される。
【００７７】
具体的には、第２の工程ｂ）は、フェドバッチ相又は連続相において、追加の炭素源、好ましくはC1炭素源を提供する供給培地を使用する。
特定の態様によれば、酵母はフェドバッチモードで培養される。
【００７８】
具体的には、酵母は、プロモーターに作動可能に連結された前記異種遺伝子を組み込み、この際、好ましくはプロモーターは、メタノールによって誘導可能であり、前記増殖相は培養培地にメタノールを添加した後に続き、それによって、機能的カルビン回路の発現を誘導する。
【００７９】
具体的には、機能的カルビン回路の発現は、それぞれの異種酵素コードヌクレオチド配列がPTS配列に融合される場合、ペルオキシソーム内である。
【００８０】
あるいは、それぞれの異種酵素コードヌクレオチド配列がPTS配列に融合されない場合、機能的カルビン回路の発現はサイトゾル内である。
【００８１】
具体的には、前記方法は、炭素源を使用して生産相で前記蓄積酵母バイオマスを培養して、前記POI及び代謝産物をそれぞれ産生することをさらに含む（例えば、単一の炭素源として、又は１つ以上の追加の炭素源と組み合わせて）。
【００８２】
特定の態様によれば、本発明は、POIをコードする目的の異種遺伝子で形質転換されたこのような酵母を利用してPOIを産生する方法を提供し、ここで、この酵母は、本明細書中にさらに記載される合成カルビン回路を発現する。
【００８３】
別の特定の態様によれば、本発明は、代謝産物産生のために酵母によって使用される酵素をコードする目的の異種遺伝子で形質転換されたこのような酵母を利用して、酵母代謝産物を産生する方法を提供し、ここで、この酵母は、本明細書中にさらに記載される合成カルビン回路を発現する。
【００８４】
別の特定の態様によれば、本発明は、本明細書にさらに記載される合成カルビン回路を発現するこのような酵母を利用して、酵母バイオマスを産生する方法を提供する。
【００８５】
具体的には、前記増殖相はバッチモードで行われ、前記生産相はフェドバッチモード又は連続モードで行われる。
【００８６】
本明細書中に記載されるように、酵母は、合成(又は完全にもしくは部分的に異種の)炭素固定モジュールを導入するための代謝工学を受けた。カルビン回路の生成のための異種遺伝子の発現は、ペルオキシソームに向けられ、これは非常に有効であることが判明した。それにより、二酸化炭素を、バイオマス生産のための唯一の炭素源として使用することができる。具体的には、培養培地に二酸化炭素を通気した。
【００８７】
特定の態様によれば、本発明はさらに、本明細書に記載の合成カルビン回路を含む酵母において、POI又は代謝産物などの有機生成物を産生する方法を提供し、この際、生成物の全有機炭素の、少なくとも20％又は少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％又は100％のうちのいずれかが、気体状二酸化炭素及び／又は溶存CO32-及び／又はHCO3-化合物である炭素源に由来する。具体的には、そのような炭素源は、構造炭素、すなわち有機物質の構造に組み込まれた炭素原子として使用される。
【００８８】
特定の態様によれば、本発明は、気体状二酸化炭素源及び／又は溶存CO32-及び／又はHCO3-化合物である炭素源を用いて（例えば、単独の炭素源として、又は追加の炭素源との組合せで）、POI及び／又は代謝産物を産生するための本明細書に記載の酵母の使用をさらに提供する。
【００８９】
驚くべきことに、酵母ピキア・パストリスの遺伝子改変された株を提供できることが判明し、これはバイオマスを蓄積でき、大気中の二酸化炭素を固定することができる一方、エネルギーは有機炭素によって供給される。機能的カルビン回路のすべての反応は、ペルオキシソーム又はサイトゾルのいずれかに有利に標的化され得、その結果、全C1同化経路が同じ細胞コンパートメントに局在化することが可能になり、そして共通の炭素代謝から分離することが可能になる。これにより、炭素代謝は２つのサブシステムに分割された：一方はバイオマス同化のためにCO2に依存し、他方は、エネルギー源(例えば、還元当量の生成のための)として、メタノールのような炭素源に依存する。このモジュール設計により、エネルギー供給モジュールを別のモジュールに交換することが可能になった。例えば、水素のような他の還元型基質を使用してNADHを生成し、それにより正味の炭素固定を可能にすることができる。
【００９０】
特定の例によれば、新規なP.パストリス株が、二酸化炭素をバイオマスに効率的に同化する能力を有する代謝工学によって作製された。この技術を用いて、バイオテクノロジー用途のための貴重な資源として二酸化炭素を利用し、それを異なるバイオベースの製品に同化することが可能であった。例えば、改変されたP.パストリス株は、唯一の炭素源としてCO2を使用することができる。エネルギー供給のために、NADHを産生する任意の供給源が、モジュール代謝設計によって使用され得る。この目的のために、メタノール酸化を使用することができる。この酵母系は、大腸菌又はサッカロマイセス・セレビシエのようなCO2固定のための他の改変された系より有意に優れている。
【００９１】
本明細書に記載の合成カルビン回路を利用する酵母又はP.パストリスプラットフォームの利点は、100g/Lを超える非常に高い細胞密度までバイオマスを蓄積する能力である。したがって、この微生物シャーシ(microbial chassis)に基づくCO2固定プラットホームでは、高スペース-時間収率が達成される。さらに、特殊な光バイオリアクターを必要とせずに、従来のバイオリアクターを培養のために使用することができる。このプラットフォームは、小代謝産物、化学物質、組換えタンパク質又は細胞バイオマスを含む異なる産物クラスのために開発され得る。
【００９２】
本明細書中に記載される例において、二酸化炭素同化経路は、ペルオキシソームに標的化され、P.パストリスの天然のホルムアルデヒド同化能力に取って代わった。メタノールは、NADHの形成において還元当量を生成するためにのみ使用された。このエネルギー発生工程は、二酸化炭素の正味の固定のために行われた。しかしながら、NADHを得ることができる代替の還元型基質を使用することができる(例えば、グリセロール、グルコース、キシロース、マルトース、キシリトール、アラビトール、ソルビトール、エタノール)。
【００９３】
別の例では、二酸化炭素同化経路をサイトゾルに標的化した。このような酵母は、人工発現系を用いたPOI又は酵母代謝産物の産生のために有利に使用された。
【００９４】
一例として、表５(実施例２)に列挙した遺伝子のコード配列をピキア・パストリスに組み込んだ。異種遺伝子RuBisCO、PRK、PGK1、TDH3、TPI1及びTKL1のＣ末端タンパク質配列を、それぞれ、ペルオキシソームにおいて前記遺伝子の発現を指向するPTSを含むように設計した。ヘルパー因子(シャペロン)をコードするGroEL及びGroES遺伝子をサイトゾルで発現させた。
【００９５】
実施例の節でさらに記載するように、ピキアゲノム中の３つの遺伝子、すなわちaox1、das1及びdas2を欠失させ、８つの遺伝子を前記ゲノムに組み込んだ。簡単に述べると、P.パストリス以外の種に由来する異種遺伝子(PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES、及びRuBisCO)を、AOX1、DAS1、及びDAS2の３つの欠失部位でゲノムに組み込んだ。カルビン回路の一部である全ての導入された遺伝子(特に、PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、及びRuBisCO遺伝子)は、ペルオキシソームへのコンパートメント化を可能にするために、Ｃ末端ペルオキシソーム標的化シグナル(PTS)を含むように操作されている。GroEL、GroESは、PTSを含まず、サイトゾル中で発現した。前記異種遺伝子のコード配列を、P.パストリス由来のメタノール誘導性プロモーター及びP.パストリス由来のターミネーター配列などの適切なプロモーター及びターミネーター配列と組み合わせた。全ての発現カセットは、３つの前述の遺伝子、aox1、das1及びdas2を置換するために、それぞれの組込み部位に隣接した。
【００９６】
さらなる実施例によれば、ピキアゲノム中の３つの遺伝子、すなわちaox1、das1及びdas2を欠失させ、８つの遺伝子をゲノムに組み込んだ。簡単に述べると、PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES及びRuBisCOを、AOX1、DAS1及びDAS2の３つの欠失部位でゲノムに組み込んだ。遺伝子のコード配列(CDS)を、P.パストリス由来のメタノール誘導性プロモーター及びP.パストリス由来のターミネーター配列と組み合わせた。全ての発現カセット(プロモーター、CDS、ターミネーター)を、ゴールデンゲート(Golden Gate)クローニングによって構築し、それぞれの組み込み部位に隣接させて、上記の３つの遺伝子、aox1、das1及びdas2を置換した。３つの言及された遺伝子座での相同組換えによる組み込みを容易にするために、CRISPR/Cas9戦略に従った。簡単に述べると、Cas9の発現カセット及びgRNA発現構築物を担持するプラスミドを、線状DNA組み込みフラグメントと一緒に同時形質転換した。gRNAは、aox1、das1又はdas2遺伝子座のいずれかを標的とするように設計された（コード配列の５'末端に近い(aox1、das1)に又は５'末端(das2)）。コロニーPCRによって、組み込まれたDNA構築物を有する株をスクリーニングした後、選択圧を解放することによって、CRIPSR/Cas9プラスミドは容易に失われる。従って、いかなる追加の選択マーカーも必要とせずに、組み込まれた発現カセットのみを担持する株を作製した。正しい組み込みを、PCR及び３つの組み込み遺伝子座のSanger配列決定によって検証した。
【００９７】
炭素同化はまた、サイトゾルに局在化した代謝経路で起こり得ることを示すことができた。
【００９８】
代謝工学戦略(P.パストリスのサイトゾルにおける３つの遺伝子の欠失及び８つのタンパク質の発現)に従うことによって、酵母ピキア・パストリスにおける機能的カルビン回路を確立することが可能であった。これにより、ピキア・パストリスのバイオマスへの二酸化炭素の固定及びその同化が可能になった。メタノールの同化経路は、DAS1、DAS2欠失のためにブロックされたので、メタノールはNADHの形成において還元当量を生成するためにのみ使用された。このエネルギー発生工程は、二酸化炭素の正味の固定に必要であった。しかしながら、NADHを産生し得る他の還元された基質(例えば、H2)もまた、代替として使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】改変されたGaT_pp_10株(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)は、メタノール及びCO2の存在下で成長することができるが、GaT_pp_12及びGaT_pp_13は成長しない。CBS7435 wt細胞は、メタノールがバイオマス及びエネルギー生成のために利用され得るので、両方の基質の存在下で十分に増殖する。細胞をバッチ相(16.0 g*L-1)で、〜10 g*L-1の細胞乾燥質量(CDW)まで培養し、次いで0.5〜1.0％メタノールパルス及び一定流入の5％ CO2を供給した。CDW値はOD測定値(相関：1 OD単位＝0.191g CDW*L-1)から計算され、標準誤差バーは４つの測定値の標準誤差を示す。
【図２】メタノール取り込み速度測定中の増殖。CBS7435 wt及びRuBisCO陽性GaT_pp_10株(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)のみが、メタノール及びCO2で増殖することができた。GaT_pp_12株及びGaT_pp_13株は、観察された時間枠内でいかなる増殖も示さなかった。
【図３】取り込み速度決定試験中のメタノール消費。実施例４に示す発酵１の培養６日目に、メタノール取り込み速度を決定した。CBS7435 wt細胞が最も高いメタノール利用を示し、改変されたGaT_pp_10株(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)がそれに続いた。RuBisCOを欠く株(GaT_pp_12及びGaT_pp_13)は、遅いメタノール利用を示した(図２の対応する線の比較)。
【図４】改変されたGaT_pp_10株(技術的複製GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)における増殖は、炭素源としてのCO2の供給に依存する。改変されたGaT_pp_10(GaT_pp_10a(〇)及びGaT_pp_10b(◇))におけるバイオマス形成の経過を、RuBisCOを欠くコントロール株(GaT_pp_12a(□))(GaT_pp_12b(△))と比較して示す。細胞を〜10 g*L-1のCDWまでバッチ相(16.0gグリセロール*L-1、t0で開始)で培養し、その後0.5％メタノール(w/v)で誘導し(t1にて)、その後1％(w/v)メタノールをパルスで供給した(t2、発酵２の終了まで)。誘導後、GaT_pp_10b及びGaT_pp_12bのみに5％CO2を共供給した。3日後(t3)及び明白な発育(GaT_pp_10b)の出現後、CO2補給量はGaT_pp_10b及びGaT_pp_12bでは0％に設定し、GaT_pp_10a及びGaT_pp_12aでは5％に増加した。CDW値はOD測定値(相関：1 OD単位＝0.191 g CDW*L-1)から計算され、標準誤差バーは４つの測定値の標準誤差を示す。
【図５】異種遺伝子のヌクレオチド配列  PTS：下線  終止コドン：太字及びイタリック体のTAA  図５に示されるように、遺伝子コード配列のいくつかは、PTSをコードするヌクレオチド配列及び／又は終止コドンをさらに含む。遺伝子コード配列はこのようなPTSコード配列と共に、又は無しで、そして任意にTAA又は代替終止コドン(存在する場合)と共に使用され得ることが十分に理解される。  配列番号１：チオバシラス・デニトリフィカンスのRuBisCO酵素型IIのヌクレオチド配列。配列番号１として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCCAAGTTG」(配列番号４４)、及び３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号２：ホウレンソウ(Spinacia oleracea)のPRK酵素型IIのヌクレオチド配列。配列番号２として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCCAAGTTG」(配列番号４４)からなる。  配列番号３：オガタエアポリモルファのPGK1酵素のヌクレオチド配列。配列番号３として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCTAAGTTG」(配列番号４５)、及び３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号４：オガタエアポリモルファのTDH3酵素のヌクレオチド配列。配列番号４として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCTAAGTTG」(配列番号４５)、及び３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号５：オガタエア・パラポリモルファのTPI1酵素のヌクレオチド配列。配列番号５として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCTAAGTTG」(配列番号４５)、及び３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号６：オガタエア・パラポリモルファのTKL1酵素のヌクレオチド配列。配列番号６として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端で開始する酵素コード配列、続いてPTSコード配列「TCTAAGTTG」(配列番号４５)、及び３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号７：大腸菌のGroELシャペロンタンパク質のヌクレオチド配列。配列番号７として特定されるヌクレオチド配列は、５'末端から開始する酵素コード配列、続いて、３'末端の終止コドン「TAA」からなる。  配列番号８：大腸菌のGroESシャペロンタンパク質のヌクレオチド配列。配列番号８として特定されるヌクレオチド配列は、酵素コード配列からなる。  配列番号３７：チオバシラス・デニトリフィカンスのRuBisCO酵素型IIのヌクレオチド配列。配列番号３７として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号３８：ホウレンソウのPRK酵素型IIのヌクレオチド配列。配列番号３８として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号３９：オガタエアポリモルファのPGK1酵素のヌクレオチド配列。配列番号３９として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号４０：オガタエアポリモルファのTDH3酵素のヌクレオチド配列。配列番号４０として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号４１：オガタエア・パラポリモルファのTPI1酵素のヌクレオチド配列。配列番号４１として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号４２：オガタエア・パラポリモルファのTKL1酵素のヌクレオチド配列。配列番号４２として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さない酵素コード配列からなる。  配列番号４３：大腸菌のGroELシャペロンタンパク質のヌクレオチド配列。配列番号４３として特定されるヌクレオチド配列は、終止コドンを有さないシャペロンコード配列からなる。
【図６】改変されたGaT_pp_22株(GaT_pp_22 I及びGaT_pp_22 II)は、メタノール及びCO2の存在下で成長することができる。細胞をバッチ相(15.0 g*L-1)で細胞乾燥質量(CDW)が〜8 g*L-1になるまで培養し、次いで0.5〜1.0％(v/v)のメタノールパルス及び5％のCO2の一定流入を供給した。CDW値はOD測定値(相関：1 OD単位＝0.191g CDW*L-1)から計算され、標準誤差バーは４つの測定値の標準誤差を示す。
【図７】カルボキシペプチダーゼB(CpB)(GaT_pp_31)を発現する株の上清。サンプルを、MOPS泳動バッファー中のNuPAGE(商標)10％ Bis-Trisタンパク質ゲル(ThermoFischer Scientific, US)上で分離し、銀染色した；１は、YNB培地を含有する0.5％(v/v)メタノール中のGaT_pp_31株の接種時の上清サンプル、２は、GaT_pp_31株(メタノール濃度は1％(v/v)に維持した)の接種後７２時間での上清サンプル、プロテインラダー 左：PageRuler(商標)Prestained Protein Ladder(ThermoFischer Scientific, US)、プロテインラダー 右：BenchMark(商標)Protein Ladder(ThermoFischer Scientific, US)、写真を後処理し、不要なレーンをImageJを使用して切除した。
【図８】ヒト血清アルブミン(HSA)GaT_pp_35(P)及びGaT_pp_38(C)を発現する株の上清。サンプルを、MOPS泳動バッファー中のNuPAGE(商標)10％ Bis-Trisタンパク質ゲル(ThermoFischer Scientific, US)上で分離し、銀染色した  １〜４：0.5％メタノールを補充したYNB中への接種の0時間後(1)、24時間後(2)、48時間後(3)及び72時間後(4)のペルオキシソーム(P)バージョンの経路を有するGaT_pp_35の上清サンプル：  ５：空のレーン  ６〜１３：２つの異なるクローンの接種（GaT_pp_38 (クローン１：6/8/10/12, クローン２:7/9/11/13)）の0時間後(6,7)、24時間後(8,9)、48時間後(10,11)及び72時間後(12,13)のサイトゾル(P)バージョンの経路を有するGaT_pp_38の上清サンプル：GaT_pp_38の２つの異なるクローン(クローン１：6/8/10/12、クローン２：7/9/11/13)、プロテインラダー 左：PageRuler(商標)Prestained Protein (ThermoFischer Scientific, US)
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本明細書を通して使用される特定の用語は、以下の意味を有する。
本明細書で使用される「カルビン回路」という用語は、二酸化炭素固定を確実にするために微生物及び植物によって利用されるプロセス、遺伝子及び酵素として理解される。このプロセスにおいて、二酸化炭素及び水は、代謝及び細胞プロセスに必要な有機化合物に変換される。有機化合物を産生するために天然のカルビン回路を利用する種々の野生型生物が存在する(例えば、シアノバクテリア、又は紅色細菌又は緑色細菌)。カルビン回路は、適切な調節が生じることを確実にするために種々の酵素を必要とし、３つの主要な相：炭素固定、還元、及びリブロースの再生に分けることができる。これらの相の各々は、厳密に調節され、独特で特異的な酵素を必要とする。
【０１０１】
カルビン回路の第１相の間に、炭素固定が生じる。二酸化炭素は、リブロース1,5-二リン酸と結合して、２つの3-ホスホグリセリン酸分子を形成する。この特異的反応を触媒する酵素は、リブロース-二リン酸カルボキシラーゼ(RuBisCO)である。RuBisCOは炭素固定のプロセスにおいて利用される最初の酵素であり、その基質であるリブロース1,5-二リン酸を酵素的に処理することができる。
【０１０２】
カルビン回路の第２相の間に、還元が生じる。第１相で合成された3-ホスホグリセリン酸分子は、グリセルアルデヒド-3-リン酸に還元される。
【０１０３】
カルビン回路の第３相の間に、RuBisCOの再生が生じる。この特定の相は、適切な調節を確実にするために必要とされる種々の酵素が存在する一連の反応を含む。この相は、初期の相で産生された3-ホスホグリセリン酸分子の、リブロース1,5-二リン酸への逆転換を特徴とする。このプロセスに関与する酵素には、トリオースリン酸イソメラーゼ、アルドラーゼ、フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ、トランスケトラーゼ、セドヘプツラーゼ-1,7-ビスホスファターゼ、ホスホペントースイソメラーゼ、ホスホペントースエピメラーゼ、及びホスホリブロキナーゼが含まれる。以下は、この特定の相に現れる順序における、各酵素、及びリブロース1,5-二リン酸の再生におけるその役割の簡単な要約である。
【０１０４】
カルビン回路の重要な酵素は、リブロース-1,5-二リン酸カルボキシラーゼ/オキシゲナーゼ(RuBisCO)複合体であり、二酸化炭素分子を捕捉することによってリブロース-1,5-二リン酸を２分子の3-ホスホグリセリン酸に変換する。リブロースリン酸キナーゼはホスホリブロキナーゼ(PRK)とも呼ばれる。
【０１０５】
複数のRuBisCOの形態が存在し(Tabita et al., J Exp Bot, 59, 1515-24, 2008)、そのうち最も代表的なものはI型及びII型である。I型は、２種類のサブユニット：大サブユニット(RbcL)及び小サブユニット(RbcS)からなる。機能的酵素複合体は、８つのＬサブユニット及び８つのＳサブユニットから構成されるヘキサデカマー(hexadecamer)である。これらのサブユニットの正確なアセンブリはさらに、少なくとも１つの特異的シャペロン： RbcXの介入を必要とする(Liu et al., Nature, 463, 197-202, 2010)。II型ははるかに単純であり、２つの同一のRbcLサブユニットから形成される二量体である。
【０１０６】
II型 RuBisCO酵素は、例えば、シャペロン(特に、例えば、細菌シャペロン、例えば、GroES及びGroEL)とRuBisCO遺伝子(例えば、チオバシラス・デニトリフィカンス、配列番号１)を共発現する組換え微生物から得ることができる。
【０１０７】
RuBisCOの基質であるリブロース-1,5-二リン酸は、PRKによって触媒されるリブロース-5-リン酸とATPとの反応によって形成される。２つのクラスのPRKが知られている：プロテオバクテリアにおいて遭遇するクラスI酵素は八量体であるが、シアノバクテリア及び植物において見出されるクラスIIの酵素は四量体又は二量体である(Hariharan, T., Johnson, P. J., & Cattolico, R. A. (1998). Purification and characterization of phosphoribulokinase from the marine chromophytic alga Heterosigma carterae. Plant Physiology, 117(1), 321-9.)。II型PRKは、PRK遺伝子(例えば、Spinacia oleacea由来(配列番号２))によってコードされている。
【０１０８】
RuBisCO及び／又はPRKを含む野生型酵母は存在せず、これが酵母が非独立栄養性(又は従属栄養性)生物として理解される理由である。しかしながら、他のカルビン回路酵素は、それらが他の酵母代謝過程で使用されるので、存在する。
【０１０９】
光合成生物に存在する天然のカルビン回路とは対照的に、合成カルビン回路としてのみ機能的カルビン回路を発現するように酵母を設計することができる。合成カルビン回路は、本明細書では、少なくともRuBisCO及びPRK酵素をコードする異種遺伝子を利用するカルビン回路として理解される。バイオマス前駆体として使用される炭水化物の産生のために、炭素固定経路が酵母において活性である(すなわち、天然に存在しないか又は天然でない合成炭素固定経路を介して二酸化炭素を利用する)場合、このような合成カルビン回路は、本明細書において機能的であると理解される。したがって、本明細書に記載される異種遺伝子は、それらが機能して炭素固定を引き起こすことができるよう、互いに関連して配置される方法で(例えば、ペルオキシソームのような同じ細胞コンパートメント内、又はカルボキシソームに類似する合成コンパートメント内に)発現される。合成カルビン回路の機能性は、以下のように試験することができる：提案された経路の機能性は、13C標識二酸化炭素を炭素源とする増殖によって、全ての前記異種酵素を発現する任意の改変された生物において検証することができる。二酸化炭素に由来する13Cは、バイオマスを形成するバイオマス前駆体代謝物(3-ホスホグリセリン酸、グリセルアルデヒド3リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、リブロース-5-リン酸、リボース-5-リン酸、セドヘプツロース-1,7-二リン酸及びリブロース-1,5-二リン酸を含む)に取り込まれる。13C標識は、公開されたLC-MS及びGC-MSプロトコルに従って測定できる(Russmayer, H., Buchetics, M., Gruber, C., Valli, M., Grillitsch, K., Modarres, G., Gasser, B. (2015). Systems-level organization of yeast methylotrophic lifestyle. BMC Biology, 13(1), 80; Mairinger, T., Steiger, M., Nocon, J., Mattanovich, D., Koellensperger, G., Hann, S., 2015. GC-QTOFMS based determination of isotopologue and tandem mass isotopomer fractions of primary metabolites for 13C-metabolic flux analysis. Anal. Chem. acs.analchem.5b03173. doi:10.1021/acs.analchem.5b03173)。
【０１１０】
用語「炭素分子」は、本明細書では「炭素基質」として理解され、微生物のエネルギー源として適切な発酵性炭素基質、典型的には有機炭素化合物を生成する炭素源を意味するものとする。C1炭素源は、分子又はイオン当たり１個の炭素原子のみを含む無機化合物又は有機化合物である。本明細書に記載されるバイオマス生産及び他の発酵プロセスのための基質として使用される代表的なC1炭素分子は、天然ガス、二酸化炭素(気体又は可溶化形態)、一酸化炭素、メタノール及び合成ガス(一酸化炭素及び水素の混合物)を含む。炭素源は、単一の炭素源として、又は異なる炭素源の混合物として使用することができる。
【０１１１】
本明細書中で使用される用語「細胞株」は、長期間にわたって増殖する能力を獲得した特定の細胞型の確立されたクローンを指す。用語「宿主細胞株」は、代謝経路の内因性又は組換え遺伝子(単数又は複数)を発現するために使用される細胞株を指し、ポリペプチド、及びそのようなポリペプチドによって媒介される細胞代謝産物をそれぞれ産生する。１つ以上の異種遺伝子との組換えのために(その遺伝子を細胞ゲノムに組み込むために)準備される細胞株は、本明細書において、「シャーシ」細胞株とも呼ばれる。「生産宿主細胞株」又は「生産細胞株」は、POI又は代謝産物などの生産プロセスの産物を得るためにバイオリアクター中で培養/養殖するためにすぐに使用できる細胞株であると一般に理解される。本明細書中に記載される酵母宿主又は酵母細胞株は、POI又は宿主細胞代謝産物を産生するために培養/養殖され得る組換え酵母生物として特に理解される。
【０１１２】
宿主細胞株に関して、「発酵」とも呼ばれる「細胞培養」又は「培養」(本明細書では「培養する」と同義的に使用される)という用語は、細胞の活性又は静止状態での増殖、分化又は継続的生存に有利な条件下での、人工的な、例えばインビトロ環境における細胞の維持であることを意味する（特に、産業界において公知の方法による制御されたバイオリアクターにおける）。培養する場合、細胞培養物は、細胞培養物の培養をサポートするのに適した条件下で、培養容器中の細胞培養培地、又は基質と接触させられる。特定の実施形態では、本明細書に記載の培養培地が、当技術分野で周知の標準的な細胞培養技術に従って細胞を培養するために使用される。いくつかの局面において、酵母の増殖のために使用され得る培養培地が提供される。
【０１１３】
細胞培養培地は、制御された、人工の、及びインビトロの環境において細胞を維持し、増殖させるために必要な栄養素を提供する。細胞培養培地の特性及び組成は、特定の細胞要件に応じて変化する。重要なパラメーターには、浸透圧、pH、及び栄養製剤が含まれる。栄養素の供給は、当技術分野で知られている方法に従って、連続モード又は不連続モードで行うことができる。本明細書中に記載される方法において使用される培養培地は、組換えタンパク質を産生するために特に有用である。
【０１１４】
バッチプロセスは、細胞の培養に必要なすべての栄養素が初期培養培地中に含まれる（発酵の間にさらなる栄養素を追加供給することなく）培養モードであるが、フェドバッチプロセスでは、バッチ相の後に、１つ以上の栄養素が供給によって培養物に供給される供給相が続く。栄養供給の目的は、同じく組換えタンパク質の量を増加させるためにバイオマスの量を増加させることである。
【０１１５】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、フェドバッチ法である。特に、所望の組換えPOI又は代謝経路をコードする核酸構築物で形質転換された宿主細胞は、所望の組換えPOI又は細胞代謝産物を産生するために、増殖相培地中で培養され、生産相培地に移行される。
【０１１６】
別の実施形態において、本明細書中に記載される宿主細胞は、連続モード(例えば、ケモスタット)で培養される。連続発酵プロセスは、バイオリアクターへの、新鮮な培養培地の規定された一定かつ連続的な供給速度によって特徴付けられ、それによって、培養ブロスは同時に、同一の規定された一定かつ連続的な除去速度でバイオリアクターから除去される。培養培地、供給速度及び除去速度を同じ一定レベルに保つことによって、バイオリアクター中の培養パラメーター及び条件は一定に保たれる。
【０１１７】
本明細書中に記載される安定な細胞培養は、特に、約２０世代、好ましくは少なくとも３０世代、より好ましくは少なくとも４０世代、最も好ましくは少なくとも５０世代の培養後でさえ、POI又は代謝産物産生レベルを高い、例えば少なくともμgレベルに保つ、遺伝的特性を維持する細胞培養を指すと特に理解される。具体的には、工業的規模の生産に使用される場合に大きな利点と考えられる安定な組換え宿主細胞株が提供される。
【０１１８】
本明細書に記載される細胞培養は、特に、栄養素の供給に基づく培養モード（特に、フェドバッチ又はバッチ法、又は連続もしくは半連続法(例えば、ケモスタット)）と組み合わせて、工業的製造規模での方法（例えば、ボリューム及び技術システムの両方に関して）に特に有利である。
【０１１９】
用語「発現」又は「発現系」又は「発現カセット」は、以下のように理解される。所望のコード配列及び制御配列を操作可能な連結で含有する核酸分子は、前記コード配列を発現するために宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするために使用され、それによって、コードされたタンパク質又は宿主細胞代謝産物を産生する。形質転換を行うために、発現系を、ベクター（例えばPOIをコードする目的の遺伝子を含むベクター）に含めることができる。しかしながら、関連DNAは宿主染色体に組み込まれてもよい。発現は、例えば、POI又は代謝産物を含む、分泌又は非分泌発現産物を指し得る。
【０１２０】
本明細書中で使用される用語「発現構築物」又は「ベクター」又は「プラスミド」は、クローン化組換えヌクレオチド配列、すなわち組換え遺伝子の転写、及び適切な宿主生物におけるそれらのmRNAの翻訳に必要とされるDNA配列として定義される。発現ベクター又はプラスミドは通常、宿主細胞における自己複製のための起点、選択マーカー(例えば、アミノ酸合成遺伝子又は抗生物質(例えば、ゼオシン、カナマイシン、G418又はハイグロマイシン)に対する耐性を付与する遺伝子)、多数の制限酵素切断部位、適切なプロモーター配列及び転写ターミネーターを含み、これらの構成要素は、共に作動可能に連結される。本明細書中で使用される用語「プラスミド」及び「ベクター」は、自己複製ヌクレオチド配列ならびにゲノム組み込みヌクレオチド配列を含む。典型的な発現カセットは、核酸分子の５'末端から３'末端の方向に、プロモーター、１つ以上のコード配列、及びターミネーターを含む。
【０１２１】
本明細書において、例えば酵素活性の文脈において使用される「機能的」という用語は、機能的に活性な分子を指すものとする。機能的酵素は、酵素基質を認識し、基質の変換生成物への変換を触媒する触媒中心を特徴とする。酵素変異体は、標準試験システムにおいてそれらの酵素活性を決定したときに、機能的であると考えられるものであり、例えば、酵素活性は、親(改変されていないか又は野生型酵素)の活性の少なくとも50％、又は少なくとも60％、70％、80％、90％、100％、又はさらに100％を超える。
【０１２２】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、コード配列又は機能的RNAの発現を制御することができるDNA配列を指す。プロモーター活性は、その転写効率によって評価することができる。これは、プロモーターからのmRNA転写の量の測定値によって（例えばノーザンブロッティングによって）直接的に、又はプロモーターから発現される遺伝子産物の量の測定値によって間接的に決定され得る。
【０１２３】
「メタノール誘導性プロモーター」は、本明細書中では、生物（特にメチロトローフ微生物）のメタノール異化経路の遺伝子の発現を制御する、天然に存在するプロモーター又は野生型プロモーターとして理解される。
【０１２４】
P.パストリスのようなメチロトローフ酵母におけるメタノール異化経路によれば、メタノールは酵母ペルオキシソーム中に受動的に拡散する。そこで、２つの異なるアルコールオキシダーゼアイソザイム(Aox1、Aox2)の１つによってホルムアルデヒドに変換される。ホルムアルデヒドは、メタノール異化経路を介して、いくつかの工程でさらに酸化されてCO2になり得る。あるいは、ホルムアルデヒドは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ(Das)と呼ばれる特殊なトランスケトラーゼ酵素によって触媒される反応である、キシルロース5-リン酸との縮合反応を介して、ペントースリン酸経路に組み込まれる。この反応は、ジヒドロキシアセトン(DHA)の分子及びグリセルアルデヒド3-リン酸の分子を生じる。これらの反応はそれぞれ、メチロトローフ酵母のペルオキシソームで生じる。
【０１２５】
天然又は野生型プロモーター配列の代替として、このような天然又は野生型プロモーター配列(本明細書中では親プロモーターと理解される)の機能的変異体を使用することができ、これは、少なくとも９０％の配列同一性を有し、そして実質的に同様の様式で遺伝子の発現を制御する際に機能的であり、例えば、親プロモーターの誘導性プロモーター又は構成的プロモーターである。
【０１２６】
ヌクレオチド又はアミノ酸配列又はタンパク質に関して本明細書中で使用される場合、用語「異種」は、外来性である（すなわち、天然には見出されないか、又は天然ではあるが異なる種において見出されるなど、所与の宿主細胞に対して「外因性」である）か；又は所与の(野生型)宿主細胞において天然に見出される(例えば、「内因性」である)が、異種構築物の状況下にある（例えば、異種核酸を使用する）のいずれかの化合物を指す。内因的に見出される異種ヌクレオチド配列はまた、非天然的に産生されうる（例えば、予想されるよりも大きい又は天然に見出されるよりも大きい細胞内の量で）、又は細胞の非天然コンパートメント内で産生されうる。異種ヌクレオチド配列、又は異種ヌクレオチド配列を含む核酸は、おそらく内因性ヌクレオチド配列とは配列が異なるが、内因性に見出されるのと同じタンパク質をコードする。具体的には、異種ヌクレオチド配列は、天然の宿主細胞と同じ関係で見出されないものである。任意の組換え又は人工ヌクレオチド配列は、異種であると理解される。異種ポリヌクレオチドの例は、コードヌクレオチド配列の発現を制御するプロモーターと天然では関連していないヌクレオチド配列である。
【０１２７】
本明細書中に記載されるように、合成カルビン回路の酵素は、異種であり得るか、又は異種核酸分子もしくは遺伝子によってコードされ得る。コード配列は、酵母宿主細胞に内在性であるか、又は異種であるプロモーターに作動可能に連結され得る。典型的には酵母は、プロモーター及びコード配列を含む組換えヌクレオチド配列を含むように設計され、これらは天然では互いに関連していないか、又は天然では互いに作動可能に連結されていない。
【０１２８】
異種化合物のさらなる例は、転写制御エレメント、例えば、ポリヌクレオチドの発現を制御するプロモーター、又は終結シグナル配列に作動可能に連結されたPOIコードポリヌクレオチドである(ポリヌクレオチドは、通常はこれらに作動可能に連結されていない)。
【０１２９】
特定の微生物において発現されるべき異種炭素固定酵素は、その微生物において天然に発現される酵素、又はカルビン回路の改善された機能のために過剰発現される必要がある酵素によって異なる。酵母宿主細胞に導入され、組換え酵母によって発現される異種遺伝子は、任意の起源、例えば真核生物又は原核生物、その人工変異体、又は合成のものであり得る。
【０１３０】
本明細書中に記載される代表的な異種遺伝子は、天然に存在する遺伝子又はポリヌクレオチド、又は宿主細胞に内在性のものからなるが、本明細書中に記載されるようにPTSに人工的に連結されている。このような構築物は天然には存在しない人工構築物であり、従って、合成又は人工のものである。
【０１３１】
本明細書中に記載されるカルビン回路の異種酵素は、野生型酵素の相同体及び機能的変異体をも指し、これはそれぞれの酵素活性を有して機能的であり、配列に対する１つ以上のアミノ酸の挿入、置換、又は欠失を含む(例えば、デフォルトパラメーターを使用してNational Center of Biotechnology Information(NCBI)のBlastPソフトウェアを使用して決定される際、例えば、酵素の天然アミノ酸配列に対して少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は少なくとも95％の配列同一性を有する酵素タンパク質)。
【０１３２】
代表的なRuBisCOは、天然に存在するRuBisCO酵素をコードする野生型RuBisCO遺伝子、又は天然に存在するRuBisCO酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、RuBisCOは細菌起源であってもよく、好ましくはThiobacillus、Sideroxydans、Leptothrix、Methylobacillus、Sulfuritalea、Gallionellales、Rhodoferax、Rhodoferax、Burkholderiales、Thiomonas、Thiothrix、Halothiobacillus、Acidihalobacter、Limnohabitans、Acidithiobacillus、Lamprocystis、Thiocystis、Allochromatium、又はThiorhodococcu属起源である。特定の例によれば、RuBisCOは、Thiobacillus denitrificans、Thiobacillus sp. 65-29、Thiobacillus sp. 65-1402、Thiobacillus thioparus、Thiobacillus sp. GWE1_62_9、Thiobacillus thiophilus、Thiobacillus sajanensis、Thiobacillus sp. 65-1059、Thiobacillus sp. SCN 63-374、Sideroxydans lithotrophicus、Sulfuritalea hydrogenivorans、 Rhodoferax fermentans、Thiomonas intermedia、Halothiobacillus neapolitanus、Acidihalobacter prosperus、Acidithiobacillus caldus、Lamprocystis purpurea、Allochromatium warmingii、又はThiorhodococcus drewsii起源のRuBisCO遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号１として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的リブロース-二リン酸カルボキシラーゼを発現する)を含む。
【０１３３】
代表的なPRKは、天然に存在するPRK酵素をコードする野生型PRK遺伝子、又は天然に存在するPRK酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、PRKは植物起源であってもよく、好ましくはヒユ科、ウリ科 キク科、セリ科、マメ科、ヤナギ科、イワタバコ科、イネ科、アブラナ科、アマモ科、シオミドロ科、又はアオイ科起源であってもよい。特定の例によれば、PRKは、Spinacia oleracea起源、又はBeta vulgaris subsp. Vulgaris、Cucumis sativus、Cucumis melo、Helianthus annuus、Daucus carota subsp. sativus、Vigna angularis、Populus tomentosa、Dorcoceras hygrometricum、Triticum aestivum、Noccaea caerulescens、Brassica napus、Zostera marina、Zea mays、Ectocarpus siliculosus、又はCorchorus capsularis起源のPRK遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号２として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的リブロース-リン酸キナーゼを発現する)を含む。
【０１３４】
代表的なPGK1は、天然に存在するPGK1酵素をコードする野生型PGK1遺伝子、又は天然に存在するPGK1酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、PGK1は、酵母起源であってもよく、好ましくは、Ogataea、Wickerhamomyces、Pichia、Cyberlindnera、Kuraishia、Cyberlindnera、Pachysolen、Meyerozyma、Brettanomyces、Babjeviella、Scheffersomyces、Hyphopichia、Schwanniomyces、Kluyveromyces、Hanseniaspora、Lachancea、Zygosaccharomyces、Eremothecium、Zygosaccharomyces、Hanseniaspora、Kazachstania、Saccharomyces、Komatagella、Yarrowia、Hansenula、又はCandida属起源である。特定の例によれば、PGK1は、Ogataea polymorpha起源、又はOgataea parapolymorpha、Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8、Pichia kudriavzevii、Cyberlindnera fabianii、Kuraishia capsulata CBS 1993、Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460、Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260、Brettanomyces bruxellensis AWRI1499、Babjeviella inositovora NRRL Y-12698、 Scheffersomyces stipitis CBS 6054、Schwanniomyces polymorphus、Kluyveromyces lactis、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guilliermondii、Saccharomyces cerevisiae S288C、Klyveromyces marxianus、Komagataella pastoris、Komagataella phaffii、Yarrowia lipolytica、Candida boidinii、又はCandida albicans起源のPGK1遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号３として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的ホスホグリセリン酸キナーゼを発現する)を含む。
【０１３５】
代表的なTDH3は、天然に存在するTDH3酵素をコードする野生型TDH3遺伝子、又は天然に存在するTDH3酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、TDH3は、酵母起源であってもよく、好ましくは、Ogataea、Wickerhamomyces、Pichia、Cyberlindnera、Kuraishia、Cyberlindnera、Pachysolen、Meyerozyma、Brettanomyces、Babjeviella、Scheffersomyces、Hyphopichia、Schwanniomyces、Kluyveromyces、Hanseniaspora、Lachancea、Zygosaccharomyces、Eremothecium、Zygosaccharomyces、Hanseniaspora、Kazachstania、Saccharomyces、Komatagella、Yarrowia、Hansenula、又はCandida属起源である。特定の例によれば、TDH3は、Ogataea polymorpha起源、又はOgataea parapolymorpha、Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8、Pichia kudriavzevii、Cyberlindnera fabianii、Kuraishia capsulata CBS 1993、Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460、Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260、Brettanomyces bruxellensis AWRI1499、Babjeviella inositovora NRRL Y-12698、 Scheffersomyces stipitis CBS 6054、Schwanniomyces polymorphus、Kluyveromyces lactis、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guilliermondii、Saccharomyces cerevisiae S288C、Klyveromyces marxianus、Komagataella pastoris、Komagataella phaffii、Yarrowia lipolytica、Candida boidinii、又はCandida albicans起源のTDH3遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号４として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素を発現する)を含む。
【０１３６】
代表的なTPI1は、天然に存在するTPI1酵素をコードする野生型TPI1遺伝子、又は天然に存在するTPI1酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、TPI1は、酵母起源であってもよく、好ましくは、Ogataea、Wickerhamomyces、Pichia、Cyberlindnera、Kuraishia、Cyberlindnera、Pachysolen、Meyerozyma、Brettanomyces、Babjeviella、Scheffersomyces、Hyphopichia、Schwanniomyces、Kluyveromyces、Hanseniaspora、Lachancea、Zygosaccharomyces、Eremothecium、Zygosaccharomyces、Hanseniaspora、Kazachstania、Saccharomyces、Komatagella、Yarrowia、Hansenula、又はCandida属起源である。特定の例によれば、TPI1は、Ogataea parapolymorpha起源、又はOgataea polymorpha、Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8、Pichia kudriavzevii、Cyberlindnera fabianii、Kuraishia capsulata CBS 1993、Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460、Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260、Brettanomyces bruxellensis AWRI1499、Babjeviella inositovora NRRL Y-12698、Scheffersomyces stipitis CBS 6054、Schwanniomyces polymorphus、Kluyveromyces lactis、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guilliermondii、Saccharomyces cerevisiae S288C、Klyveromyces marxianus、Komagataella pastoris、Komagataella phaffii、Yarrowia lipolytica、Candida boidinii、又はCandida albicans起源のTPI1遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号５として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的トリオース-リン酸イソメラーゼを発現する)を含む。
【０１３７】
代表的なTKL1は、天然に存在するTKL1酵素をコードする野生型TKL1遺伝子、又は天然に存在するTKL1酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、TKL1は、酵母起源であってもよく、好ましくは、Ogataea、Wickerhamomyces、Pichia、Cyberlindnera、Kuraishia、Cyberlindnera、Pachysolen、Meyerozyma、Brettanomyces、Babjeviella、Scheffersomyces、Hyphopichia、Schwanniomyces、Kluyveromyces、Hanseniaspora、Lachancea、Zygosaccharomyces、Eremothecium、Zygosaccharomyces、Hanseniaspora、Kazachstania、Saccharomyces、Komatagella、Yarrowia、Hansenula、又はCandida属起源である。特定の例によれば、TKL1は、Ogataea parapolymorpha起源、又はOgataea polymorpha、Wickerhamomyces anomalus NRRL Y-366-8、Pichia kudriavzevii、Cyberlindnera fabianii、Kuraishia capsulata CBS 1993、Pachysolen tannophilus NRRL Y-2460、Meyerozyma guilliermondii ATCC 6260、Brettanomyces bruxellensis AWRI1499、Babjeviella inositovora NRRL Y-12698、Scheffersomyces stipitis CBS 6054、Schwanniomyces polymorphus、Kluyveromyces lactis、Hanseniaspora uvarum、Hanseniaspora guilliermondii、Saccharomyces cerevisiae S288C、Klyveromyces marxianus、Komagataella pastoris、Komagataella phaffii、Yarrowia lipolytica、Candida boidinii、又はCandida albicans起源のTKL1遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号６として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的トランスケトラーゼを発現する)を含む。
【０１３８】
代表的なシャペロンは、本明細書中に記載されるように、酵母宿主細胞に対して異種又は内因性である遺伝子によってコードされ得る。このようなシャペロンは、RuBisCO遺伝子によってコードされる機能的RuBisCO酵素のフォールディングをサポートするシャペロンとして、特異的に機能的である。
【０１３９】
GroELは、例えば、天然に存在するGroELシャペロンをコードする野生型GroEL遺伝子、又は天然に存在するGroELシャペロンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、GroELは、細菌起源であってもよく、好ましくは、Escherichia、Thiobacillus、Bacillus、Lactobacillus、Pseudomonas、Atlantibacter、Klebsiella、Pectcobacterium、Shimwellia、Franconibacter、Pantoea、Mangrovibacter、Nissabacter、Cronobacter、Rouxiella、Plesiomonas、Morganella、又はYersinia属起源である。特定の例によれば、GroELは、Escherichia coli起源、又はShigella flexneri、Atlantibacter hermannii、Klebsiella aerogenes、Shimwellia blattae、Enterobacter cloacae、Pantoea alhagi、Providencia stuartii、Moellerella wisconsensis、Thiobacillus denitrificans、Bacillus subtilis、Lactobacillus plantarum、又はPseudomonas putida起源のGroEL遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号７として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的シャペロンを発現する)を含む。
【０１４０】
GroESは、例えば、天然に存在するGroESシャペロンをコードする野生型GroES遺伝子、又は天然に存在するGroESシャペロンをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドによってコードされ得る。例えば、GroESは、細菌起源であってもよく、好ましくは、Escherichia、Thiobacillus、Bacillus、Lactobacillus、Pseudomonas、Atlantibacter、Klebsiella、Pectcobacterium、Shimwellia、Franconibacter、Pantoea、Mangrovibacter、Nissabacter、Cronobacter、Rouxiella、Plesiomonas、Morganella、又はYersinia属起源である。特定の例によれば、GroESは、Escherichia coli起源、又はShigella flexneri、Atlantibacter hermannii、Klebsiella aerogenes、Shimwellia blattae、Enterobacter cloacae、Pantoea alhagi、Providencia stuartii、Moellerella wisconsensis、Thiobacillus denitrificans、Bacillus subtilis、Lactobacillus plantarum、又はPseudomonas putida起源のGroES遺伝子によってコードされ、例えば、配列番号８として特定されるヌクレオチド配列、又はその機能的に活性な変異体(少なくとも90％又は95％の配列同一性を有し、機能的シャペロンを発現する)を含む。
【０１４１】
親配列と比較した際の変異体の「配列同一性」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列が、対応する位置に、ある程度まで、最大で100％近くの程度まで、同じ又は保存された塩基対を有するという、同一性(又は相同性)の程度を示す。相同配列は、典型的には、少なくとも約50％のヌクレオチド配列同一性、好ましくは少なくとも約60％の同一性、より好ましくは少なくとも約70％の同一性、より好ましくは少なくとも約80％の同一性、より好ましくは少なくとも約90％の同一性、より好ましくは少なくとも約95％の同一性を有する。
【０１４２】
ポリペプチド配列又はタンパク質配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(％)」は、配列を整列させ、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために間隙を導入した後であって、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、特定のポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１４３】
例えば、プロモーター又は遺伝子のヌクレオチド配列に関する「同一性パーセント(％)」は、配列を整列させ、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成するために間隙を導入した後であって、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない、DNA配列中のヌクレオチドと同一である候補DNA配列中のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列同一性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である種々の方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。
【０１４４】
本明細書中に記載される目的のために、２つの配列間の配列同一性は、以下の代表的なパラメーター：Word Size: 11; Expect value: 10; Gap costs: Existence＝5 , Extension＝2; Filter＝low complexity activated; Match/Mismatch Scores: 2,-3; Filter String: L; mに設定されたblastn又はblastpを用いて、NCBI BLASTプログラムバージョン2.2.29(Jan-06-2014)を使用して決定される。
【０１４５】
本明細書で使用される「代謝産物」という用語は、細胞代謝経路(単数又は複数)の酵素によって触媒される代謝反応の産物を指し、前記酵素の反応物、産物、及び補因子分子を含む。代謝産物は、細胞増殖及び／又は生産性インヒビターもしくはその中間体の合成を触媒する酵素をコードする細胞代謝経路(単数又は複数)と同じ経路において生じ得るか、又は分岐経路において合成され得る。
【０１４６】
本明細書中で使用される「作動可能に連結された」という用語は、１つ以上のヌクレオチド配列の機能が、核酸分子上に存在する少なくとも１つの他のヌクレオチド配列によって影響されるような様式での、単一の核酸分子上でのヌクレオチド配列の関連性を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、組換え遺伝子のコード配列と作動可能に連結されている。さらなる例として、シグナルペプチドをコードする核酸は、それが分泌形態のタンパク質(例えば、成熟タンパク質のプリフォーム又は成熟タンパク質)を発現し得る場合、POIをコードする核酸配列に作動可能に連結されている。具体的には、互いに作動可能に連結されるこのような核酸は、直接連結され得る(すなわち、シグナルペプチドをコードする核酸とPOIをコードする核酸配列との間にさらなるエレメント又は核酸配列を含まずに)。
【０１４７】
プロモーター配列は、典型的には、プロモーターがコード配列の転写を制御する場合、コード配列に作動可能に連結されていると理解される。プロモーター配列がコード配列と天然には関連しない場合、その転写は、天然(野生型)細胞におけるプロモーターによって制御されないか、又はその配列が異なる連続配列と組み換えられるかのいずれかである。
【０１４８】
本明細書で使用される「ペルオキシソーム輸送シグナル」(PTS＝peroxisomal targeting signal)という用語は、コード配列に連結されるか、又はコード配列内に位置する場合（例えば、Ｃ末端トリペプチド又は5〜9個のアミノ酸からなるＮ末端ペプチドをコードするヌクレオチド配列として）、発現産物の発現を、宿主細胞のペルオキシソームに導く短い核酸配列を指すものとする。このような機能性PTSにより、酵素をペルオキシソームに再配置することができる。ピキア・パストリスを含むほとんどの生物は、２つの異なる標的化システムを有する。１つ目(PTS1)は、ペルオキシソームへの標的化を達成するために受容体Pex5を使用する。２つ目(PTS2)は、受容体としてPex7を使用する。機能的PTSは、受容体Pex5(PTS1)又はPex7(PTS2)のいずれかによって特異的に認識され、それによって受容体を活性化し、そのようなPTSと融合した遺伝子の発現を宿主細胞ペルオキシソームに導くアミノ酸配列である。
【０１４９】
PTS1をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、PTSがそれぞれの遺伝子発現産物のカルボキシ末端で融合されるように、３'末端で遺伝子に連結される。それによって、遺伝子発現産物のアミノ酸配列のＣ末端は、PTSのＮ末端に直接連結される。
【０１５０】
PTS2をコードするヌクレオチド配列は、典型的には、PTSがそれぞれの遺伝子発現産物のアミノ末端に又はアミノ末端に近接して融合されるように、５'末端で遺伝子に連結されるか、又は５'末端に近接して組み込まれる。それによって、遺伝子発現産物のアミノ酸配列のＮ末端は、PTS2のＣ末端に直接連結される。
【０１５１】
所与のタンパク質配列における標的シグナルを決定するために、以下のツールを使用することができる： PTS1プレディクター(Neuberger G, Maurer-Stroh S, Eisenhaber B, Hartig A, Eisenhaber F. Motif refinement of the peroxisomal targeting signal 1 and evaluation of taxon-specific differences. J Mol Biol. 2003 May 2;328(3):567-79.)、又はPTS予測ツールWoLF PSORT(Horton P, Park K-J, Obayashi T et al. WoLF PSORT: protein localization predictor. Nucleic Acids Res 2007;35:W585-7.)。
【０１５２】
本明細書中で使用される用語「目的のタンパク質」(POI＝protein of interest)は、宿主細胞において組換え技術によって産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。より具体的には、このタンパク質は、宿主細胞中に天然に存在しないポリペプチド(すなわち異種タンパク質)であってもよく、又は宿主細胞に対して天然(すなわち宿主細胞に対して相同なタンパク質)であってもよいが、例えば、POIをコードする核酸配列を含む自己複製ベクターでの形質転換によって、又はPOIをコードする核酸配列の１つ以上のコピーを宿主細胞のゲノム中に組み換える技術による組み込みによって、又はPOIをコードする遺伝子の発現を制御する１つ以上の調節配列(例えば、プロモーター配列)の組換え改変によって、産生される。
【０１５３】
POIは、任意の真核生物ポリペプチド、原核生物ポリペプチド又は合成ポリペプチドであり得る。具体的には、それはヒト又は動物タンパク質を含む哺乳動物タンパク質であり得る。それは、分泌タンパク質又は細胞内タンパク質であり得る。POIは、天然に存在するタンパク質、又は人工タンパク質であり得る。本発明の方法及び酵母宿主細胞はまた、天然に存在するタンパク質の機能的変異体、誘導体又は生物学的に活性なフラグメントの組換え産生のために提供される。
【０１５４】
本明細書中で言及されるPOIは、真核生物の宿主細胞と相同的(又は同種)の産物、又は異種の産物であってもよく、そして好ましくは治療的、予防的、診断的、分析的又は工業的使用のために調製される。
【０１５５】
POIは、好ましくは、酵母細胞中で、好ましくは分泌タンパク質として産生される異種組換えポリペプチド又はタンパク質である。好ましい産生タンパク質の例は、免疫グロブリン、免疫グロブリンフラグメント、アプロチニン、組織因子経路インヒビター又は他のプロテアーゼインヒビター、及びインスリン又はインスリン前駆体、インスリン類似体、成長ホルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、形質転換成長因子ａ又はｂ、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド１(GLP-1)、グルカゴン様ペプチド２(GLP-2)、GRPP、第VII因子、第VIII因子、第XIII因子、血小板由来成長因子１、血清アルブミン、酵素、例えば、リパーゼもしくはプロテアーゼ、又は加水分解酵素、トランスフェラーゼ、オキシドレダクターゼ、リアーゼ、イソメラーゼもしくはリガーゼの群のいずれかの酵素、又は天然タンパク質と同様の機能を有する、機能的ホモログ、機能的等価変異体、誘導体及び生物学的に活性な断片である。POIは、天然タンパク質に構造的に類似していてもよく、天然タンパク質のＣ末端及びＮ末端又は側鎖のいずれか又は両方への１つ以上のアミノ酸の付加、天然アミノ酸配列中の１つ以上の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、天然タンパク質のいずれか又は両方の末端又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、又は天然アミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、天然タンパク質から誘導されてもよい。このような修飾は、上記のタンパク質の複数について周知である。
【０１５６】
POIはまた、宿主細胞において生化学反応を提供する基質、酵素、インヒビター又は補因子から選択されてもよく、その目的は、前記生化学反応又はいくつかの反応のカスケードの産物を得ること、例えば、宿主細胞の代謝産物を得ることである。代表的な産物は、ビタミン(例えば、リボフラビン)、有機酸、及びアルコールであってもよく、これは、本明細書中に記載される組換えタンパク質又はPOIの発現後に、増加した収率で得ることができる。
【０１５７】
本明細書で使用される「組換え」という用語は、「遺伝子工学によって調製される、又は遺伝子工学の結果である」ことを意味するものとする。したがって、「組換え微生物」は、少なくとも１つの「組換え核酸」を含む。本明細書に記載される酵母は、組換え酵母として理解される。組換え微生物は、発現ベクター又はクローニングベクターを含み得るか、又は組換え核酸配列を含むように遺伝子操作されている。
【０１５８】
「組換えタンパク質」は、宿主においてそれぞれの組換え核酸を発現させることによって産生される。「組換えプロモーター」は、本明細書中に記載されるような機能的に活性なプロモーターとしてのその使用に適切な、遺伝子改変された非コードヌクレオチド配列である。
【０１５９】
一般に、本明細書中で言及される組換え核酸又は生物は、当業者に周知の組換え技術によって産生され得る。本発明によれば、従来の分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を、当業者の範囲内で使用することができる。このような技術は文献で全て説明されている（例えば、Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, (1982)を参照）。
【０１６０】
本明細書に記載の特定の実施形態によれば、組換え構築物は、プロモーター及びPOIをコードする関連遺伝子をベクター又は発現構築物に連結することによって調製される。このようなベクター又は発現構築物を用いて宿主細胞を形質転換することによって、遺伝子を宿主細胞ゲノムに安定に組み込むことができる。
【０１６１】
発現ベクターにはクローニングベクター、改変クローニングベクター、及び特異的に設計されたプラスミドが含まれ得るが、これらに限定されない。宿主細胞における組換え遺伝子の発現に適した任意の発現ベクターを使用することができる。このようなベクターは、典型的には宿主生物に応じて選択される。
【０１６２】
適切な発現ベクターは、典型的には、酵母宿主細胞においてPOIをコードするDNAを発現するのに適したさらなる調節配列を含む。調節配列の例としては、オペレーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、ならびに転写及び翻訳の開始及び終結を制御する配列が挙げられる。調節配列は、発現されるDNA配列に作動可能に連結され得る。
【０１６３】
宿主細胞における組換えヌクレオチド配列の発現を可能にするために、発現ベクターは、コード配列の５'末端に隣接するプロモーター(例えば、目的の遺伝子又はPOIの分泌を可能にするシグナルペプチド遺伝子の上流に)を提供してもよい。それにより、転写が、このプロモーター配列によって調節され、開始される。
【０１６４】
本明細書で使用される「シグナルペプチド」という用語は特に、天然シグナルペプチド、異種シグナルペプチド、又は天然シグナルペプチドと異種シグナルペプチドとのハイブリッドを指すものとし、特に、POIを産生する宿主生物に対して異種であっても同種であってもよい。シグナルペプチドの機能は、POIが分泌されて小胞体に入ることを可能にすることである。これは、通常、原形質膜の外側にタンパク質の輸送を誘導し、それによって異種タンパク質を分離及び精製することを容易にする短い(3〜60アミノ酸長)ペプチド鎖である。いくつかのシグナルペプチドは、タンパク質が輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。
【０１６５】
代表的なシグナルペプチドは、S.セレビシエα接合因子プレプロペプチド由来のシグナル配列、及びP.パストリス酸性ホスファターゼ遺伝子(PHO1)及び細胞外タンパク質X(EPX1)(WO2014067926A1)由来のシグナルペプチドである。
【０１６６】
本明細書に記載の形質転換体は、発現ベクターDNA、例えばプラスミドDNAを宿主に導入し、POI又は宿主細胞代謝産物を高収率で発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。宿主細胞は、電気パルス法、プロトプラスト法、酢酸リチウム法、及びそれらの改変法のような、真核細胞の形質転換のために慣用的に使用される方法によって、それらが外来DNAを組み込むことができるように処理される。P.パストリスは、好ましくはエレクトロポレーションによって形質転換される。微生物による組換えDNA断片の取り込みのための好ましい形質転換方法には、化学的形質転換、エレクトロポレーション、又はプロトプラスト化による形質転換が含まれる。本明細書中に記載される形質転換体はこのようなベクターDNA(例えば、プラスミドDNA)を宿主に導入し、そして関連するタンパク質又は宿主細胞代謝産物を高収率で発現する形質転換体を選択することによって得ることができる。
【０１６７】
細胞培養産物は、組換え宿主細胞株を適切な培地中で培養し、発現されたPOI又は代謝産物を培養物から単離し、そして任意で適切な方法によってそれを精製することによって産生され得る。
【０１６８】
本明細書に記載されるPOI製造のためのいくつかの異なるアプローチが好ましい。関連タンパク質及び本明細書に記載の調節エレメントの少なくとも１つをコードする組換えDNAを保有する発現ベクターで酵母宿主細胞を形質転換し、形質転換細胞の培養物を調製し、培養物を増殖させ、転写及びPOI産生を誘導し、発酵プロセスの産物を回収することによって、物質を発現させ、処理し、任意に分泌させることができる。
【０１６９】
本明細書中に記載される宿主細胞は、以下の試験： ELISA、活性アッセイ、HPLC、又は他の適切な試験によって、その発現能力又は収率について具体的に試験される。
【０１７０】
本発明は特に、パイロット規模又は工業規模での発酵プロセスを可能にする。工業的方法スケールは、好ましくは少なくとも10 L、特に少なくとも50 L、好ましくは少なくとも1 m3、好ましくは少なくとも10 m3、最も好ましくは少なくとも100 m3の容積を使用する。
【０１７１】
工業規模における生産条件が好まれ、これは、例えば、100 L〜10 m3又はそれ以上の反応器容積におけるフェドバッチ培養(数日の典型的なプロセス時間を採用)、又は約50〜1000 L又はそれ以上の発酵器容積における連続法(希薄化率は約0.02〜0.15h-1)を指す。
【０１７２】
適切な培養技術は、バッチ相から開始し、続いて短い指数関数的フェドバッチ相を高い比増殖速度で、さらに続いてフェドバッチ相を低い比増殖速度で、バイオリアクター中で培養することを包含し得る。別の適切な培養技術は、バッチ相、続いて、低希釈率での連続培養相を包含し得る。
【０１７３】
調節エレメント及び／又はPOIをコードする遺伝子で形質転換された本明細書に記載の形質転換酵母は、好ましくはまず、炭素固定を使用して、効率的に多数の細胞まで増殖する条件で培養され得る。次いで、細胞株を高収率POI産生のために培養する場合、発現産物を産生するために培養技術を選択する。
【０１７４】
好ましい実施形態は、バイオマスを提供するためのバッチ培養と、それに続く高収率POI産生のためのフェドバッチ培養とを含む。
【０１７５】
少なくとも1 g/L細胞乾燥重量、より好ましくは少なくとも10 g/L細胞乾燥重量、好ましくは少なくとも20 g/L細胞乾燥重量の細胞密度を得るために、増殖条件下でバイオリアクター中で、本明細書に記載の宿主細胞株を培養することが好ましい。パイロット規模又は工業規模で、バイオマス生産のこのような収率を提供することが有利である。
【０１７６】
本明細書に記載のバイオマスの蓄積を可能にする増殖培地、特に基礎増殖培地は、典型的には炭素源、窒素源、硫黄源、及びリン酸塩源を含まないか、又は限定された量で含む。典型的には、このような培地は、微量元素及びビタミンをさらに含み、アミノ酸、ペプトン又は酵母抽出物をさらに含み得る。
【０１７７】
好ましい窒素源としては、NH4H2PO4、又はNH3、又は(NH4)2SO4が挙げられる；
好ましい硫黄源としては、MgSO4、又は(NH4)2SO4、又はK2SO4が挙げられる；
好ましいリン酸塩源としては、NH4H2PO4、又はH3PO4、又はNaH2PO4、KH2PO4、Na2HPO4、又はK2HPO4が挙げられる。
【０１７８】
さらに典型的な培地成分としては、KCl、CaCl2、及び微量元素、例えば、Fe、Co、Cu、Ni、Zn、Mo、Mn、I、Bが挙げられる；
好ましくは、培地はビタミンB7を補充される。
【０１７９】
酵母のための、特に本明細書に記載の機能的カルビン回路を発現するP.パストリスのための典型的な増殖培地は、二酸化炭素、炭酸塩、メタノール、グリセロール、ソルビトール又はグルコースのような炭素源を限られた量でのみ含む。限られた量は、好ましくは少なくとも10 mg/L、好ましくは少なくとも100 mg/L、最も好ましくは少なくとも1 g/Lである。
【０１８０】
生産相では、産生培地が特に、限られた量の追加の炭素源のみを用いて使用される。限られた量は、好ましくは少なくとも10 mg/L、好ましくは少なくとも100 mg/L、最も好ましくは少なくとも1 g/Lである。酵母のための、特に本明細書中に記載されるような機能的カルビン回路を発現するP.パストリスのための典型的な産生培地は、利用可能な炭素源(例えば、C1炭素源だけでなく、グルコース、グリセロール、ソルビトール又はメタノール)を含む。
【０１８１】
発酵は、好ましくは3〜7.5の範囲のpHで実施される。
典型的な発酵時間は、20℃〜35℃、好ましくは22〜30℃の範囲の温度で約24〜120時間である。
【０１８２】
具体的には、細胞を、所望のPOI又は代謝産物の発現をもたらすのに適した条件下で培養し、これらは、細胞又は培養培地から精製することができる（発現系及び発現タンパク質の性質に応じて、例えばタンパク質がシグナルペプチドに融合されているかどうか、及びタンパク質が可溶性であるか膜結合であるかどうかに応じて）。当業者によって理解されるように、培養条件は、宿主細胞の型及び使用される特定の発現ベクターなどの因子に従って変化する。
【０１８３】
POIは、好ましくは少なくとも1 mg/L、好ましくは少なくとも10 mg/L、好ましくは少なくとも100 mg/L、最も好ましくは少なくとも1 g/Lの収率を生じる条件を用いて発現される。
【０１８４】
代謝産物は、好ましくは少なくとも1 mg/L、好ましくは少なくとも10 mg/L、好ましくは少なくとも100 mg/L、最も好ましくは少なくとも1 g/Lの収率を生じる条件を用いて発現される。
【０１８５】
本明細書中に開示される方法は、POIの発現（分泌形態で、又は細胞内産物としてのいずれかで）を可能にする条件下で、前記組換え宿主細胞を培養することをさらに含んでもよいことが理解される。次いで、組換えPOI又は宿主細胞代謝産物は、細胞培養培地から単離されることができ、そして当業者に周知の技術によってさらに精製されてもよい。
【０１８６】
本明細書中に記載される方法に従って産生されたPOIは、典型的には、最新技術を使用して単離及び精製されることができる（これには、所望のPOIの濃度の増加、及び／又は、少なくとも１つの不純物の濃度の減少が含まれる）。
【０１８７】
宿主細胞からの組換え発現産物の分泌は、酵母細胞が破壊されて細胞内タンパク質を放出する場合に生じるタンパク質の複雑な混合物からではなく、培養上清から生産物が回収されるので、精製プロセスが容易であるという理由などから、一般に有利である。
【０１８８】
培養された形質転換細胞を、音響的又は機械的、酵素的又は化学的に破壊して、所望のPOIを含有する細胞抽出物を得てもよい（そこからPOIを単離し、精製する）。
【０１８９】
組換えポリペプチド又はタンパク質産物を得るための単離及び精製方法としては、塩析及び溶媒沈殿のような溶解度の相違点を利用する方法、限外濾過及びゲル電気泳動のような分子量の相違点を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーのような電荷の相違点を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーのような特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーのような疎水性の相違点を利用する方法、及び等電点電気泳動のような等電点の相違点を利用する方法などの方法が使用できる。
【０１９０】
高度に精製された生成物は、混入タンパク質を本質的に含まず、好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも95％、又はさらには少なくとも98％から100％までの純度を有する。精製された生成物は、細胞培養上清の精製によって、又は細胞デブリから得てもよい。
【０１９１】
単離及び精製方法としては、以下の標準的な方法が好ましい：細胞破壊(POIが細胞内で得られる場合)、細胞(デブリ)分離、及び精密濾過又はタンジェンシャルフローフィルター(TFF＝Tangential Flow Filter)又は遠心分離による洗浄、沈殿又は熱処理によるPOI精製、酵素消化によるPOI活性化、イオン交換(IEX)などのクロマトグラフィーによるPOI精製、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除(SEC)又はHPLCクロマトグラフィー、濃縮物のPOI沈殿及び限外濾過工程による洗浄。
【０１９２】
単離及び精製されたPOI又は代謝産物は、ウェスタンブロット、HPLC、活性アッセイ、又はELISAなどの従来の方法によって同定することができる。
【０１９３】
好ましい酵母宿主細胞は、メチロトローフ酵母、例えばピキア又はコマガタエラ、例えばピキア・パストリス、又はコマガタエラ・パストリス、又はK.ファフィー(K. phaffii)、又はK.シュードパストリスに由来する。宿主の例としては、P.パストリスなどの酵母が挙げられる。P.パストリス株の例には、CBS 704(=NRRL Y-1603 = DSMZ 70382)、CBS 2612(=NRRL Y-7556)、CBS 7435(=NRRL Y-11430)、CBS 9173-9189(CBS株：CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands)、及びDSMZ 70877(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)が挙げられるが、X-33、GS115、KM71及びSMD1168などのInvitrogenからの株も含まれる。S.セレビシエ株の例には、W303、CEN.PK及びBYシリーズ(EUROSCARFコレクション)が含まれる。上記の株は全て、形質転換体を産生し、異種遺伝子を発現するために成功的に使用されている。
【０１９４】
本明細書中に記載される好ましい酵母宿主細胞(例えば、P.パストリス又はS.セレビシエ宿主細胞)は、生産宿主とは異なる異種又は組換えプロモーター配列（P.パストリス株又はS.セレビシエ株に由来してもよい）を含む。別の特定の実施形態において、本明細書に記載される宿主細胞は、宿主細胞と同じ属、種又は株に由来するプロモーターを含む、本明細書に記載の組換え発現構築物を含む。
【０１９５】
POIが宿主細胞に相同なタンパク質、すなわち宿主細胞に天然に存在するタンパク質である場合、宿主細胞におけるPOIの発現は、その天然プロモーター配列と異種プロモーター配列との交換によって調節されてもよい。
【０１９６】
特定の実施形態によれば、POI産生方法は、POIをコードする組換えヌクレオチド配列を使用し、これは宿主細胞ゲノムへの組み込みに適したプラスミド上に提供される(細胞当たり単一コピーで又は複数コピーで)。POIをコードする組換えヌクレオチド配列はまた、自己複製プラスミド上に提供されてもよい(細胞当たり単一コピーで又は複数コピーで)。
【０１９７】
本明細書に記載の好ましい方法は、真核生物発現ベクター、好ましくは酵母発現ベクターであるプラスミドを使用する。発現ベクターには、クローニングベクター、改変クローニングベクター、及び特異的に設計されたプラスミドが含まれ得るが、これらに限定されない。本明細書中に記載される方法において使用される好ましい発現ベクターは、宿主細胞における組換え遺伝子の発現に適切な任意の発現ベクターであってもよく、そして宿主生物に依存して選択される。組換え発現ベクターは、宿主生物のゲノム中で複製することができるか、又は宿主生物のゲノム中に組み込むことができる任意のベクター(宿主ベクターとも呼ばれる)、例えば、本明細書中に記載されるようなDNA構築物を保有する酵母ベクターであってもよい。好ましい酵母発現ベクターは、オガタエア属、ハンゼヌラ属、ピキア属、カンジダ属、及びトルロプシス属によって代表されるメチロトローフ酵母からなる群より選択される酵母における発現のためのものである。
【０１９８】
具体的には、pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、pGAPHis、又はpPUZZLEに由来するプラスミドを、ベクターとして用いる。
【０１９９】
好ましい実施形態によれば、組換え構築物は、関連遺伝子をベクターに連結することによって得られる。これらの遺伝子は、このようなベクターを使用して宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞ゲノムに安定に組み込まれ得る。遺伝子によってコードされるポリペプチドは、形質転換体を培養し、このようにして得られた形質転換体を適切な培地中で培養し、培養物から発現されたPOIを単離し、そして発現された生成物のために適切な方法によってそれを精製することによって（特にPOIを混入タンパク質から分離することによって）、組換え宿主細胞株を使用して産生され得る。
【０２００】
発現ベクターは、１つ以上の表現型選択マーカー(例えば、抗生物質耐性を付与するか、又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子)を含み得る。酵母ベクターは一般に、酵母プラスミド由来の複製起点、自己複製配列(ARS)、又は代わりに、宿主ゲノムへの組み込みに使用される配列、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択マーカーを含む。
【０２０１】
POI、プロモーター及びターミネーターをそれぞれコードするDNA配列、調節エレメント及び遺伝子を連結し、組込み又は宿主複製に必要な情報を含む適切なベクターにそれらを挿入するために使用される手順は、当業者に周知であり、例えば、JSambrookら(A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989)によって記載されている。
【０２０２】
また、マルチクローニング部位を有するベクターであるマルチクローニングベクターを使用することができ、所望の異種遺伝子をマルチクローニング部位に組み込んで発現ベクターを提供することができる。発現ベクターにおいて、プロモーターは、POIの遺伝子の上流に配置され、そして遺伝子の発現を調節する。マルチクローニングベクターの場合、POIの遺伝子はマルチクローニング部位に導入されるので、プロモーターはマルチクローニング部位の上流に配置される。
【０２０３】
組換え宿主細胞を得るために提供されるDNA構築物は、確立された標準的な方法(例えば、ホスホラミダイト法)によって合成的に調製されてもよい。DNA構築物はまた、ゲノム又はcDNA起源のものであってもよく、例えば、ゲノム又はcDNAライブラリーを調製し、そして標準的な技術(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989)に従って、合成オリゴヌクレオチドプローブを使用するハイブリダイゼーションによって、ポリペプチドの全部又は一部をコードするDNA配列をスクリーニングすることによって得られる。最後に、DNA構築物は、合成及びゲノム起源の混合物、合成及びcDNA起源の混合物、又はゲノム及びcDNA起源の混合物であってもよく、これは、標準的な技術に従って、合成、ゲノム又はcDNA起源のフラグメントを、必要に応じて、DNA構築物全体の種々の部分に対応するフラグメントをアニーリングすることによって調製される。
【０２０４】
別の好ましい実施形態では、酵母発現ベクターを、例えば相同組換えによって、酵母ゲノムに安定に組み込むことができる。
【０２０５】
前述の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、このような実施例は本発明の１つ以上の実施形態を実施する方法を単に代表するものであり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０２０６】
［実施例］
以下の実施例において、ペルオキシソームを標的とするか、又はサイトゾルにおいて発現される機能的カルビン回路を含むピキア・パストリス株がどのように作製できるかを示す。実施例２では、DNA構築部分を説明し、実施例３ではピキア・パストリス株の構築及びスクリーニングを説明する。細胞を培養及び増殖させるために使用される培地の組成は、実施例１に記載される。ペルオキシソームを標的とした完全に機能的なカルビン回路を含む主な株は、"GaT_pp_10"という識別子をもち、次のような遺伝子型をもつ：Δ(aox1)1(das1)2(das2)3 ::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3.
【０２０７】
実施例４では、この株(GaT_pp_10)は、メタノール及び二酸化炭素の存在下で増殖できるが、カルビン回路の一部を欠くコントロール株(GaT_pp_12、GaT_pp_13)は増殖できないことが示される。これは、この株が機能的カルビン回路を発現することを示す。
【０２０８】
実施例５では、GaT_pp_10の増殖が、炭素源CO2に依存することがさらに示される。エネルギー源としてメタノールのみの存在下では、増殖は観察されない。また、この実施例によって、改変された株の増殖が、分子シャペロンGroEL及びGroESの同時発現なしで可能であることも示される。
【０２０９】
さらなる実施例において、カルビン回路を含むP.パストリス株を用いて、代謝産物(乳酸、実施例６)又はタンパク質(カルボキシペプチダーゼB又はヒト血清アルブミン、実施例７)のような有用な生成物がどのようにして産生され得るかが概説される。実施例８は、機能的カルビン回路を発現する株への、天然P.パストリスAox1、Das1及びDas2の影響を示す。最後に、実施例９では、13C標識法により、GaT_pp_10株の二酸化炭素固定能に関するさらなるエビデンスが得られることが示されている。
【０２１０】
実施例１０では、サイトゾルにおいてカルビン回路を発現する株がどのように設計されたかを説明する。この株は固有の識別子GaT_pp_22を有し、以下の遺伝子型を有する:
Δ(aox1)1(das1)2(das2)3 ::(cTDH3, cPRK, cPGK1)1(cRuBisCO, GroEL, GroES)2(cTKL1, cTPI1)3
【０２１１】
実施例１１では、この株(GaT_pp_22)が、メタノール及び二酸化炭素の存在下で増殖できることが示され、これはサイトゾルで発現された合成カルビン回路の機能性を実証する。実施例１２及び１３では、GaT_pp_22株により、どのようにして付加価値のある化学物質(乳酸、実施例１２、及びイタコン酸、実施例１３)を、CO2及びメタノールで産生できるかを示す。さらに、サイトゾルカルビン回路を発現する株において、どのように蛋白質(カルボキシペプチダーゼB又はヒト血清アルブミン、実施例１４)を産生できるかについて概説する。
【０２１２】
実施例１  培地調製物
大腸菌(DH 10B)培養のためにLB培地を使用した。手順を以下に記載する。
【０２１３】
LB培地(10.0 g*L-1大豆ペプトン(Quest)、5.0 g*L-1酵母抽出物(MERCK)及び5.0 g*L-1 NaCl、4N NaOHでpH＝7.4〜7.6に調整)を調製し、500mlのショットボトルに等分した。121℃で20分間オートクレーブすることによって滅菌を行った。
【０２１４】
酵母ペプトン(YP)培地を、振盪フラスコ中のピキア・パストリス(CBS7435 wt)の培養に使用し、その手順は以下の通りとした。
【０２１５】
YP-培地(20.0 g*L-1大豆ペプトン(Quest)、10.0 g*L-1酵母抽出物(MERCK)、4N NaOHでpH＝7.4〜7.6に調整)を、炭素源を加える前にオートクレーブ処理した。10倍のグルコースストック(220 g*L-1 D(+)-グルコース一水和物)を調製し、オートクレーブ処理によって滅菌した。10倍のグルコースストックを、1/10の比でYP培地に添加し、YPD培地を得た。
【０２１６】
バイオリアクター培養のために、グリセロール含有バッチ培地(BatchGly)を以下のように調製した。
【０２１７】
BatchGlyを表１に従って調製した。グリセロール含有バッチ培地のpH(4.9〜5.1)をHCl(25％)で調整し、オートクレーブ処理したガラス瓶中に濾過(0.22μmフィルターユニット)することによって滅菌を行った。ビオチン溶液をd-ビオチンで調製し(RO-H2O中0.2 g*L-1)、55〜60℃に加温しながら攪拌して完全な溶解を確実にし、続いて滅菌ろ過(0.22μmフィルターユニット)を行った。微量元素溶液を表３に従って調製した。
【０２１８】
標識培地(LM)の調製は、表２に従って行った。調製後、培地を滅菌濾過した(0.22μmフィルターユニット)。25％のNH3を用いてバイオリアクター中でpHを調整した。
【０２１９】
表１:炭素源としてグリセロールを含有するバッチ培地(BatchGly)の組成（供給者の情報付き）。微量元素溶液は表２に従って自己調製(sp＝self-prepared)した
2020521476.tif 000002
【０２２０】
2020521476.tif 000003
【０２２１】
2020521476.tif 000004
【０２２２】
生産宿主として改変された株を試験するために、酵母ニトロゲンベース(YNB＝Yeast Nitrogen Base)培地を調製した(表４に最終濃度を示す)。
2020521476.tif 000005
【０２２３】
実施例２ プラスミド及び線状DNAフラグメント構築
全ての発現カセット(プロモーター、CDS、ターミネーター)を、ゴールデンゲートクローニング(Engler et al. PloS One 4 (5): e5553. doi:10.1371/journal.pone.0005553.)によって構築し、上記の３つの遺伝子aox1、das1及びdas2を置換するために、それぞれの組み込み部位に隣接させた。すべての線状DNAフラグメント及びガイドRNA(gRNA)／hCas9プラスミドの構築に使用されるクローニング・ワークフローは、公開されたプラスミドDNA構築物のワークフロー(Sarkari, et al. 2017 Bioresource Technology. doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004.)に従って達成された。
【０２２４】
表５に記載の遺伝子のコード配列(CDS)を、ピキア・パストリス CBS7435 wt由来のメタノール誘導性プロモーター及びターミネーター配列と組み合わせた(表６)。
【０２２５】
表５：ピキア・パストリス(Centraalbureau voor Schimmelcultures, NL, genome sequenced by (Kuberl et al., 2011; Valli et al., 2016))における合成カルビン回路の生成に必要な遺伝子（遺伝子源、酵素学的命名法に従う、EC番号）。Ｃ末端タンパク質配列は、トリペプチドSKLをコードする各CDSの３'末端に９ヌクレオチドを付加することによって、ペルオキシソーム移行シグナル(PTS＝peroxisome targeting signal)を含むように設計した。標的化は、PTS予測ツール（Research Institute of Molecular Pathology (IMP), Vienna (Neuberger et al. 2003, Journal of Molecular Biology;doi.org/10.1016/S0022-2836(03)00319-X) *Uniprot: Universal Protein Resourcによって提供される）を使用することによって、コンピュータシミュレーションで評価した。
【０２２６】
2020521476.tif 000006
【０２２７】
表６：提唱された合成カルビン回路における遺伝子調節エレメント(プロモーターPXXX及びターミネーターTXXX)。必要とされる全ての遺伝子(表７も参照)は、P.パストリスCBS7435(Centraalbureau voor Schimmelcultures, NL, genome sequenced by Kuberl et al., 2011, Valli et al. 2016)に由来する強力なメタノール誘導性プロモーターによって制御される。GroEL及びGroESは、中等強度の構成的プロモーターによって調節される。
【０２２８】
2020521476.tif 000007
【０２２９】
この研究では、ピキア・パストリスの３つの天然遺伝子、AOX1(ORF ID: PP7435_Chr4-0130)、DAS1(ORF ID: PP7435_Chr3-0352)、及び、DAS2(ORF ID: PP7435_Chr3-0350)を、表５に列挙した遺伝子で置き換え、相同組換えによるDNA損傷修復機構に依拠するCRISPR/Cas9媒介系によって、組み込み事象を促進した。DSBの導入時に、組み込まれる遺伝子に隣接する相同領域からなるDNA鋳型フラグメントを提供することにより、P.パストリスにおいて遺伝子置換を高精度で非常に効率的に行うことができる。使用されるCRISPR/Cas9系の設計は、(Gao et al. 2014 Journal of Integrative Plant Biology 56 (4): 343-49. doi:10.1111/jipb.12152.; Weninger et al. 2016. Journal of Biotechnology 235: 139-49. doi:10.1016/j.jbiotec.2016.03.027)に従って開発された。使用されるプラスミドの構築を以下に記載する。
【０２３０】
酵素の天然配列Aox1、Das1及びDas2を置換するために必要な隣接領域を、PCR(NEB、Q5(登録商標) High-Fidelity DNA Polymerase)によって、CBS7435 wt細胞からのゲノムDNA(gDNA)抽出物から増幅した。ゲノムDNAを、YPD培地中で増殖させた2mLの一晩培養物から抽出した。gDNAは、供給者のプロトコル(Promega, Wizard(登録商標)Genomic DNA Purification Kit)に従って調製した。簡単に述べると、プロモーター及びターミネーター配列を、それぞれのプライマーを用いてPCRによってゲノムから増幅した。増幅後、配列を確認し、アガロースゲル電気泳動(SYBR(登録商標)Safe又はMidori GreenでDNA染色)によって精製し、それぞれのバンドを切り出し、供給者のプロトコル(PROMEGA-Wizard(登録商標)SV Gel及びPCR Clean-Up System)に従って調製した。
【０２３１】
以下において、これらの配列を、融合部位を有するそれぞれのバックボーン(BB)1ベクターにクローニングした(これは、後のコード配列との組合せを可能にする)。ゴールデンゲートプラスミドをワンポット反応で組み立てた。各反応について、40 fmolのプラスミド又はPCRフラグメント(合されたもの)を使用した。反応混合物は、100 UのT4リガーゼ(New England Biolabs Ipswich, MA)及び20 UのBsaI(New England Biolabs Ipswich, MA)(BB1又はBB3反応について)又はBpiI(BbsI)(ThermoFischer Scientific, US)(BB2反応について)を、20mMのATP(New England Biolabs Ipswich, MA)が補充された、dH2O希釈CutSmartバッファー(New England Biolabs Ipswich, MA)中に含有した。各反応混合物を、Thermocyclerを使用してPCR管中でインキュベートした(37℃1分及び16℃2.5分で45リピート、続いて50℃/5分及び80℃/10分)。次いで、この反応混合物を、Echoli DH10B株への形質転換のために直接使用した。すべてのゴールデンゲート手順は(Sarkari, et al. 2017 Bioresource Technology. doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004.)に従って実施した。
【０２３２】
化学的にコンピテントな細胞の100μLアリコートを、ゴールデンゲート反応混合物と穏やかに混合し、氷上で10分間インキュベートし、続いて42℃で90秒間熱ショックを行った。熱処理後、細胞を再び氷上で5〜10分間冷却した。1mLのLB培地の添加後、形質転換細胞を37℃で30分間(BB1及びBB3におけるカナマイシンでの選択のため)及び60分間(BB2におけるアンピシリンでの選択の場合)再生した。再生後、細胞を、選択的LB-寒天プレート上に３つの異なる希釈度で蒔いた(20μL、200μL、及び遠心沈殿及び小容量のLB培地中で再懸濁後の残りの細胞)。プレートを約16時間/37℃でインキュベートし、そこからのそれぞれの抗生物質を含む2mLのLB培地に単一コロニーを接種し、再び12〜16時間インキュベートした。
【０２３３】
これらの培養から、供給者のプロトコル((HiYield(登録商標) Plasmid Mini Kit, SLG, Gauting, Ger)に従ってミニ調製を行い、適切な酵素で酵素消化した後、アガロースゲル電気泳動及びサンガー配列決定法によりチェックした。他のCBS7435 wt由来プロモーター(PALD4, PFDH1, PSHB17, PPDC1 及びPRPP1B)及びターミネーター(TIDP1, TRPB1t, TRPS2t, TRPS3t 及びTRPBS17Bt)を調製し(CBS7435 wt遺伝子座IDを表４に列挙する)、それぞれのBB1プラスミドにクローニングした。Tdh3及びPgk1のコード配列を、オガタエア・ポリモルファ(CBS 4732)由来のgDNA及びオガタエア・パラポリモルファ(CBS 11895)由来のgDNA由来のTkl1及びTpi1から、上記の手順に従って増幅した。シャペロンGroEL及びGroES(大腸菌)、PRK(ホウレンソウ)及びcbbM(チオバシラス・デニトリフィカンス)をコードする配列はコドン最適化され、GeneArtから購入された。BB1における全ての隣接領域/プロモーター、コード配列(CDS)及びターミネーターのクローニング後、それぞれのプロモーター-CDS-ターミネーターフラグメントをBB2レベルで組み合わせた(表６に示す組み合わせ)。ゴールデンゲート反応及び形質転換を上記のように実施し、プラスミドの完全性を、制限消化及びアガロースゲル電気泳動によってチェックした。BB3においてそれぞれの発現カセットを組み合わせる最後の工程は、BB3ベクターの改変バージョン(最初のプロモーターの５'及び最後のターミネーターの３'にさらなる外部BpiI部位を有する)で行われ、これは通常のBsaI媒介アセンブリ後のフラグメントの切除を可能にした(表７の「線状フラグメントについてのプラスミド」欄も参照)。これらのプラスミドの完全性を、最終的に、BpiI(BbsI)(T ThermoFischer Scientific, US)による制限消化、続いてアガロースゲル電気泳動、及び部分的にサンガー配列決定法によってチェックした。正しいプラスミドアセンブリに割り当てられたクローンを増幅し、10％グリセロール凍結ストック中で-80℃で凍結した。これらの凍結ストックから、LB培地を含む100mLフラスコに接種し、37℃/250rpmで12〜16時間培養した。次いで、細胞を回収し、供給者のプロトコル(HiSpeed Midi Kit, Qiagen)に従ってプラスミドミディ調製(midi preparation)のために使用した。次に、ミディ調製からの全プラスミド材料を、BpiI(BbsI)(ThermoFischer Scientific, US)で消化し、サンプルを分取アガロースゲル電気泳動で精製した。３つの天然遺伝子座の置換のためのそれぞれのバンドを、供給者のプロトコルに従って、わずかな改変を伴って精製した。同じバンドに由来する全てのゲルスライスを15mLのファルコン管中で溶解し、次いで、ローディング工程を数回繰り返して、１つ又は２つのカラムに充填した。溶出工程を50μLで行い、３回繰り返した。最終溶液を、-20℃で保存する前にゲル電気泳動によって再びチェックした。
【０２３４】
ガイドRNA(gRNA)、hCas9、エピソーム複製のためのARS/CEN配列、及び形質転換後、G418でP.パストリスを選択するための耐性カセットを有するプラスミドを、(Sarkari, et al. 2017 Bioresource Technology. doi:10.1016/j.biortech.2017.05.004.)に記載されるように、ゴールデンゲートクローニングを使用して構築した。
【０２３５】
異なる遺伝子座を標的とするためのゲノム認識部位(CRSIPR/Cas9使用)は、以下の通りであった：
CTAGGATATCAAACTCTTCG (AOX1, 配列番号９)、
TGGAGAATAATCGAACAAAA (DAS1, 配列番号１０) 、及び
CGACAAACTATAAGTAGATT (DAS2, 配列番号１１)
【０２３６】
融合PCRをアガロースゲル電気泳動によってチェックし、それぞれのバンドを、ゴールデンゲートアセンブリにおけるさらなる使用のために精製した。gRNAストレッチをBB3プラスミドに組み立て、hCas9のエピソーム発現(ARS/CEN)、及びP.パストリスでの選択のためのG418用の耐性カセットを可能にした。プラスミドは、gRNAプロモーター(PGAP)とBpiI制限部位を含むターミネーター(Ttef1)の間のリンカー配列を示した。精製したプラスミドを、最初に通常のBsaI BB1反応でクローニングし、さらにBpiI反応を用いてhCas9 BB3プラスミドにクローニングした。適切な酵素による制限消化によって同定された、正しく組み立てられたプラスミドを、サンガー配列決定法によって検証した。その後、ミディ調製を行い、DNA濃度(gRNAプラスミド及び線状置換フラグメントに由来する両方)を、NanoDrop測定によって決定した。
【０２３７】
実施例３  ペルオキシソームを標的とする機能的カルビン回路を発現するピキア・パストリス株の構築
GaT_pp_10及びコントロールP.パストリス株を作製するために、P.パストリスゲノム中の３つの遺伝子、すなわちAOX1(ORF ID: PP7435_Chr4-0130)、DAS1(ORF ID: PP7435_Chr3-0352)及びDAS2(ORF ID: PP7435_Chr3-0350)を欠失させ、８つの遺伝子PGK1、TDH3、TPI1、PRK、TKL、GroEL、GroES及びRuBisCOをゲノム中に組み込んだ(表５及び６)。
【０２３８】
3.1 ピキア・パストリスの形質転換
P.パストリス形質転換は、以下に記載されるエレクトロポレーションを用いて、化学的にコンピテントな細胞を用いて行った。10mLのYPDプレ培養物に、P.パストリスの単一コロニー(CBS7435 wt又はそれぞれのクローン)を接種し、一晩(o/n; 〜16時間)インキュベートした(シェーカー; 180rpm; 28℃)。翌日、100mLの主培養物を接種した。プレ培養物からの接種体積は、主培養物が約16時間のインキュベーション(シェーカー; 180rpm; 28℃)後に、1.2〜3.0の間の最終ODに達するように、以下に示すように計算した。
【数１】
2020521476.tif 000008
ODm 時間t後のOD600主培養物(算出には、OD600 1.5を使用)
Vm 主培養物の容積[mL]
tm 主培養物のインキュベーション時間[h](少なくとも15h)
μ 28℃でのYPDにおけるP.パストリス野生型について0.3 h-1
ODpre OD600プレ培養物
【０２３９】
主培養物の接種後、ODを測定し、細胞を50mlのファルコン管で遠心法(5分; 1500gと4℃)により収集し、10mlの前処理液(0.6Mのソルビトール、10mM Tris-HCl、10mDM TT、100mM LiCl)に再懸濁した。この混合物を30分間インキュベートし(シェーカー; 180rpm; 28℃)、氷冷ソルビトール(1M)を用いて50mLまで満たした後、5分間遠心分離した(1500×g; 4℃)。次いで、細胞ペレットを45mLの氷冷ソルビトール(1M)中で合わせ、遠心分離(5分; 1500×g; 4℃)によって収集した。この洗浄工程を繰り返し、次いで、細胞を500μLの氷冷ソルビトールに再懸濁し、氷上で予め冷却したエッペンドルフ管(-20℃)にアリコート(80μL)した。アリコートを、形質転換に使用するまで-80℃で保存した。
【０２４０】
エレクトロ-コンピテントP.パストリス細胞の80μLアリコートを、1μgのそれぞれのgRNA-Cas9プラスミド及び1500〜2000nmolの線状置換フラグメントと非常に穏やかに混合した(形質転換混合物の総体積は110μLを超えなかった)。陰性コントロールとして、細胞を等容量の滅菌dH2Oで形質転換した。次いで、混合物を氷上の2mmエレクトロポレーションキュベット中で5分間冷却した。エレクトロポレーター(2000 V、25μF及び186Ω)でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーションの直後に、キュベットを1mLのYPD培地でフラッシュし、次いで全内容物をエッペンドルフ管に移した。細胞を、サーモブロックを用いて28℃で1.5〜2時間、エッペンドルフ管中で再生した。次いで、細胞を、500μg/mLのG418を補充した選択的YPDプレート上に蒔き、そして単一コロニーが出現するまで、28℃で48〜72時間インキュベートした。これらのプレートから、単一コロニーを採取し、選択的G418プレート上で２回リストリーク(restreak)した。陽性クローンをコロニーPCRによって同定し、さらにエピソームgRNA/hCas9プラスミドの喪失が生じるまでYPDプレート上でリストリークした。これは、YPD上での各リストリーク継代後に、選択プレート上でリストリークすることによってチェックした。プラスミドを含まないコロニーに由来する陽性クローンを、10mLのYPD接種のために使用し、1mLのアリコートを、10%グリセロール(v/v)の存在下、-80℃で保存した。
【０２４１】
3.2 コロニーPCRによる形質転換体の検証
操作した遺伝子座の完全性を、G418補充YPDプレート上での２回の選択ラウンド後に、コロニーPCRによってチェックした。この目的のために、単一コロニーに滅菌チップを接触させ、PCR管中の10μLのNaOH(0.02M)に細胞材料を再懸濁した。管を99℃で10分間インキュベートし、その後室温まで冷却した。これらの細胞溶解物から、3μLをPCR鋳型として直接使用した。適切なプライマーを、AOX1、DAS1及びDAS2遺伝子座の正確な置換事象の検出のために使用した。適切なクローンの遺伝子座配列を、サンガー配列決定法によって検証した。
【０２４２】
3.3 遺伝子操作ワークフロー
表７：株構築の概要：野生型(wt)株としてピキア・パストリスCBS7435(Centraalbureau voor Schimmelcultures, NL, genome sequenced by Kuberl et al., 2011, Valli et al. 2016)から出発して得られた遺伝子型を有する各形質転換体の名称及び親を示す。CO2同化に必須のすべての遺伝子を含む株を、GaT_pp_10と命名する。GaT_pp_12及びGaT_pp_13は、重要な酵素RuBisCO及びPRKを欠くコントロール株である。
【０２４３】
2020521476.tif 000009
【０２４４】
上記の手順を、表７に概説されるワークフローに従って、全ての株の構築に適用した(プロモーター、CDS及びターミネーターの組合せについては、表５及び表６を参照)。最初の工程は、P.パストリスCBS7435 wtのAOX1を、TDH3、PRK及びPGK1をコードする発現カセットで置換することであり、これはGaT_pp_04株をもたらし、TDH3及びPGK1の場合は、GaT_pp_05株をもたらした。組込み事象は、gRNA／hCas9プラスミドGaT_B3_003との同時形質転換によって促進され、これはAOX1の５'プライム末端に二本鎖切断(DSB＝double strand break)を生じる。操作は、gRNA/hCas9プラスミドGaT_B3_012及びそれぞれの線状フラグメントとの同時形質転換を用いて、DAS1遺伝子座で継続された。GaT_pp_06の生成のために、GaT_pp_04のDAS1遺伝子座をRuBisCO、GroEL及びGroES(GaT_B3_016に由来する線状フラグメント)で置換した。同じ親株において、DAS1を、シャペロンGroEL及びGroESを含まないRuBisCO発現のための発現カセット(GaT_B3_17)及びCDSを含まないノックアウトカセット(GaT_B3_018)で置換し、得られた株をそれぞれGaT_pp_07及びGaT_pp_08と命名した。GaT_pp_05株において、DAS1を同じノックアウトカセットで置換し、形質転換した株をGaT_pp_09と名付けた。最後の操作工程では、DAS1のCDSを、GaT_B3_014との同時形質転換によって、Tkl1及びTpi1をコードする発現カセット(GaT_B3_027に由来する)で置き換え、DAS2の３'にDSBを生じさせた。得られた株は、GaT_pp_10、GaT_pp_11、GaT_pp_12及びGaT_pp_13であった。３つの株全ての最終的な改変遺伝子型は、表７に記載され、表６は、その中で使用される調節エレメントを示す。
【０２４５】
実施例４ 機能的カルビン回路を含むDAS1/DAS2欠失株は、二酸化炭素及びメタノールの存在下で増殖する
バイオリアクター中での培養のためのプレ培養物を、以下に記載されるように調製した。
【０２４６】
YPDプレート上に、GaT_pp_10、GaT_pp_12、GaT_pp_13及びCBS7435 wtの凍結ストック溶液からレストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、100mLのYPD培地の接種のために使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を50mLのファルコン管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄し、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁した。この懸濁液から、サンプルを採取し、ODを測定した。500mlのBatchGly(初期OD＝1.0又は0.19 g*L-1 CDW)培地の接種に必要な容量を計算した。
【０２４７】
バイオリアクター培養は、1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で、最大作業体積1.0Lで行った。培養温度は28℃に制御し、pHは12.5％水酸化アンモニウムの添加により5.0に制御し、攪拌速度を400〜1200rpmに制御することによって溶存酸素濃度を20％飽和以上に維持し、空気流量は6〜45 sL*h-1で維持した。
【０２４８】
上記のプレ培養物に由来する細胞を接種のために使用し、バイオリアクター中の初期体積を0.5L、初期光学濃度(600nm)を1.0又は0.19 g*L-1とした。グリセロールバッチは、約16時間(CBS7435 wt)、36時間(GaT_pp_12、GaT_pp_13)及び40時間(GaT_pp_10)後に終了した。全菌株の蓄積バイオマスは、約10 g*L-1 CDWであった。
【０２４９】
発酵の開始点で、サンプルを採取し、最初の初期ODを３回測定した。OD測定値は、0.2〜0.5の吸光度範囲で、携帯型分光光度計(C8000 Cell Density Meter、WPA、Biowave)を用いて行った。出発点からのサンプリング材料も、HPLC分析のために採取した。HPLC分析の手順を以下に記載する。
【０２５０】
HPLC分析のために、2mLの細胞懸濁液を遠心分離し(13,000rpm、3分)、上清を、清浄なエッペンドルフ管にピペットで移した。自動サンプル採取装置に適したガラス管にサンプルを移す前に、900μLの上清を100μLの40mM H2SO4と混合し、2mlシリンジ上の0.22μmフィルターユニットを用いて濾過した。
【０２５１】
グリセロール、グルコース、メタノール及びクエン酸塩を、同定及び定量のための純粋な標準を使用して、従前に記載されているようにHPLCによって測定した(Blumhoff, et al. 2013 Metabolic Engineering 19. 26-32. doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003)。HPLCは、Aminex HPX-87 H((300×7.8 mm, BioRad, Hercules, CA)カラムを備えていた。屈折率検出器(RID-10 A, Shimadzu)を、グリセロール、グルコース、メタノール及びクエン酸塩の検出に使用した。移動相として0.004M H2SO4を用いて、0.6mL/分の流速で60℃にてカラムを操作した。
【０２５２】
グリセロールバッチ相の後、培養の間、サンプルを少なくとも１日に１回採取した。HPLCサンプルを上記のように調製した。細胞密度は以下に記載するように、OD測定値及び細胞乾燥質量(CDW)の測定値によって決定した。
【０２５３】
細胞乾燥重量の測定のために、2mLの細胞懸濁液からの細胞ペレットを水で１回洗浄し、遠心分離した(13,000rpm、3分)。洗浄工程の後、細胞ペレットを予め秤量したガラス管に移し、110℃で24時間乾燥させた。乾燥後、ガラス管を再び秤量し、細胞乾燥質量を以下の式で計算した:
CDW[g/L]＝(ガラス管(中身の入った状態)[g]−ガラス管(空)[g]) * 500
【０２５４】
各培養について、CDW測定を２回行った。
バッチ後、全てのバイオリアクターを、入口接続部に無菌的に接続されている、0.22μmフィルターユニットに接続された5mL注射器を使用して、0.5％メタノール(v/v)の添加により誘導した。
【０２５５】
入口のガス中のCO2は、誘導相の間、1％に設定した。
誘導相の後、細胞を0.5％メタノール(v/v)でパルスし、前述のようにサンプリングを行った。各メタノール添加後、サンプリングを、前述のようにHPLC及びOD分析のために繰り返した。
【０２５６】
誘導後の第二パルスは、メタノールを0.75％(v/v)の濃度で添加することによって行い、入口の空気中のCO2濃度は5％とした。サンプリングは、上述のように行った。
【０２５７】
第３パルスから開始して、メタノール添加を、発酵１の終わりまで１日１回、1％(v/v)まで増加させた。サンプリング・レジメンは、前述のように維持した。
培養の最終日に、バイオリアクターにおけるメタノール取り込み速度を、後の項に記載されるように決定した。
細胞を1％メタノールに供給し、先に記載したようにサンプリングした。そこから出発して、培養の日を通して約1時間のタイムスパンで24時間後まで、HPLC測定及びOD測定のために、サンプルを採取した。
【０２５８】
結果  実施例４
改変されたGaT_pp_10株は、エネルギー源としてメタノール、及び唯一の炭素源としてCO2の存在下で、増殖を示した。
【０２５９】
図１は、改変されたGaT_pp_10株(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)が、エネルギー源としてのメタノール及び唯一の炭素源としてのCO2の存在下で、良好に成長することができることを示す。RuBisCOを欠く株(GaT_pp_12及びGaT_pp_13)は、メタノール及びCO2のみを供給した場合、バッチ終了後に有意な増殖を示さなかった。RuBisCO陰性株の能力の欠損は、メタノールがもはやバイオマスに組み込まれないことを明確に示した。GaT_pp_10株で見られる増殖は、CO2の取り込み及び組み込みによるものであることが、この試験からさらに推測された。
【０２６０】
RuBisCO陽性GaT_pp_10株は、メタノールの最初のパルス後に明確な増殖を示し(図１の▲及び◆を参照)、メタノールがエネルギー生成のために添加される限り、増殖を続けた。
【０２６１】
表８は、グリセロールバッチ終了後、メタノールの全供給相中に観察されたバイオマス形成速度を示す。この例で培養したRuBisCO陽性株の２つの生物学的複製物は、観察された全培養期間にわたって、0.029 g*L-1*h-1(GaT_pp_10a)、及び0.016 g*L-1*h-1(GaT_pp_10b)のバイオマス形成速度を示した。予想通り、これらの条件下でのバイオマスの形成は、CBS7435 wt細胞(0.076 g*L-1*h-1)ではるかに顕著であった。CBS7435 wt細胞は依然として、機能的DAS1及びDAS2ならびにAOX1を有し、それらがメタノールを同化及び異化することを可能にする。
【０２６２】
コントロール株GaT_pp_12及びGaT_pp_13は、培養中にいかなるバイオマス形成も示さず、メタノール利用経路の異化分岐においてのみメタノールが利用され得ることを示した。これは、DAS1及びDAS2のノックアウトによるものである。
【０２６３】
RuBisCO陽性株(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)で観察されたバイオマス形成は、CO2の合成同化経路が機能的であることの明確な指標である。
【０２６４】
表８:同時供給(メタノール＋CO2)相全体にわたって計算されたバイオマス形成速度。GaT_pp_10(GaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)、コントロール株(GaT_pp_12及びGaT_pp_13)、ならびにCBS7435 wtのすべての生物学的複製物について、その形成速度を示す。
2020521476.tif 000010
【０２６５】
本実施例に記載のバイオリアクターにおいて、メタノール取り込みを培養６日目に測定した。
図２は、メタノール取り込みの研究の間に全てのバイオリアクターにおいて見られた増殖を示す。
【０２６６】
改変されたGaT_pp_10株(図２のGaT_pp_10a及びGaT_pp_10b)及びCBS7435 wt細胞のみが、増殖可能であった。これらの細胞はメタノール利用のための完全な遺伝的レパートリーを保持するので、wt細胞の増殖が期待された。GaT_pp_10a及びGaT_pp_10bの顕著な増殖は、CO2の合成同化のための提案された経路の機能性を明確に示した。合成コンパートメント化カルビン回路の導入は、Das1及びDas2活性の喪失を補償し、株がCO2からバイオマスを形成することを可能にする。
【０２６７】
RuBisCO陰性株(GaT_pp_12及びGaT_pp_13)は、観察された条件下で増殖することができなかった。これは、メタノールからもCO2からも、炭素を取り込むことができないためである。
【０２６８】
GaT_pp_10株及びCBS7435 wtにおけるバイオマスの形成はまた、観察されたメタノール取り込みと相関した(図３)。wt細胞はメタノールを急速に枯渇させることができ、最初の8.0 g*L-1メタノールを約３時間以内に完全に利用した。GaT_pp_10株における減少したバイオマス形成と同様に、メタノール取り込み速度は、wtについて観察されたものと比較して遅れていた。RuBisCO陽性株では、最初の8.0 g*L-1メタノールは７時間以内に〜5 g*L-1に減少し、培養の２４時間後に完全に枯渇した。
【０２６９】
RuBisCO陰性株(GaT_pp_12及びGaT_pp_13)については増殖は観察されなかったが、メタノールは依然として消費された。
【０２７０】
表９は、エネルギー源メタノールに対するバイオマス収率YX/S、及び比メタノール消費率を示す。YX/S[g (CDW)*g (MetOH)-1]値は、消費されたメタノールあたりのバイオマスの増加を、メタノール[g]あたりのCDW[g]で換算したエネルギーとして記述し、その計算は増殖を示す菌株に対してのみ適切であった。GaT_pp_10a及びGaT_pp_10bのメタノールでのバイオマス収率は、CBS7435 wt細胞で観察された値の約半分である。
【０２７１】
メタノール消費率を表現するために、比メタノール消費率qS (MetOH)[g*g(CDW)-1*h-1]を計算した。図３に、異なる株のメタノール取り込みを示す。メタノール濃度の減少は、以下の時間枠の間、ほぼ線形の挙動を示した：GaT_pp_10a,b, GaT_pp_12、GaT_pp_13ではT1〜7.2時間まで、CBS7435 wtではT1〜3.1時間。メタノール消費率は、上記時間枠における線形回帰の傾きから求めた。メタノール消費率を、T1/2に存在するバイオマス濃度で除して、比メタノール消費率(qs)を求めた。RuBisCO陰性株によってメタノールが依然として利用されているという所見はこれらの数値に反映され、このことは、基質は依然として酸化されうるが(qs (GaT_pp_12)＝0.027, qs (GaT_pp_13)＝0.024[g*g-1*h-1])、GaT_pp_10株で観察される率の約50％、CBS7435 wt株の率の約25％しかないことを示している。
【０２７２】
表９：比メタノール消費率(qs)、及びメタノールに対するバイオマス収率(YX/s)
値は、発酵１の間に(６日目)測定した(実施例４、図３)。
2020521476.tif 000011
【０２７３】
実施例５：GaT_pp_10の増殖は、電子供与体としてメタノールを使用する炭素源CO2に依存する
バイオリアクター中での培養のためのYPDプレ培養物を、以下に記載されるようにして調製した。
【０２７４】
YPDプレート上に、GaT_pp_10、GaT_pp_11及びGaT_pp_12の凍結ストック溶液からリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、100mLのYPD培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を50mLのファルコン管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁し、この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。500mlのBatchGly培地(初期OD＝1.0又は0.19 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０２７５】
バイオリアクター培養は、1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で、最大作業体積1.0Lで行った。培養温度は28℃に制御し、pHは12.5％水酸化アンモニウムの添加により5.0に制御し、攪拌速度を400〜1200rpmに制御することにより溶存酸素濃度を20％飽和以上に維持し、バッチ相の間、6〜45 sL*h-1の空気流量を維持した。正確なCO2濃度を確実にするために、入口の空気は、N2、O2、CO2の混合気体で合成的に構成した。
【０２７６】
上記のプレ培養物に由来する細胞を接種のために使用し、バイオリアクター中の初期体積を0.5L、初期光学濃度(600nm)を1.0又は0.19 g*L-1とした。グリセロールバッチは、約36時間後に(GaT_pp_12、技術的複製a及びbの両方について)及び40時間後に(GaT_pp_10、技術的複製a及びbの両方について)終了した。全株の蓄積バイオマスは、約10 g*L-1 CDWであった。
【０２７７】
発酵２の開始点で、サンプルを採取し、初期開始ODを３回測定した。OD測定値は、0.2〜0.5の吸光度範囲で、携帯型分光光度計(C8000 Cell Density Meter、WPA、Biowave)を用いて行った。出発点からのサンプリング材料も、HPLC分析のために採取した。HPLC分析の手順は、実施例４に記載されている。
【０２７８】
グリセロールバッチ相の後、培養の間、サンプルを少なくとも１日に１回採取した。HPLCサンプルを上記のように調製した。細胞密度は以下に記載するように、OD測定値及び細胞乾燥質量(CDW)の測定によって決定した。
【０２７９】
細胞乾燥重量の測定のために、2mLの細胞懸濁液からの細胞ペレットを水で１回洗浄し、遠心分離した(13,000rpm、3分)。洗浄工程の後、細胞ペレットを予め秤量したガラス管に移し、110℃で24時間乾燥させた。乾燥後、ガラス管を再び秤量し、細胞乾燥質量を以下の式で計算した:
CDW[g/L]＝(中身の入ったガラス管の重量[g]−空のガラス管の重量[g])*500
【０２８０】
各培養について、CDW測定を３回行った。
バッチ後、全てのバイオリアクターを、入口接続部に無菌的に接続されている、0.22μmフィルターユニットに接続された5mLの注射器を使用して、0.5％メタノール(v/v)の添加により誘導した。
【０２８１】
入口のガス中のCO2は、誘導相の間、1％に設定した。
上記のプロセス制御条件下で細胞を誘導した後、メタノールの酸化によって形成されたCO2を吹き飛ばすために、撹拌速度N及び入口ガス流量Fのプロセス制御値を増加させた。撹拌速度は1000rpmで一定に保ち、入口空気混合物のガス流量は35 sL*h-1に設定した。入口気体のCO2成分は、全てのバイオリアクターについて0％に設定した。この戦略は、メタノール酸化によって不可避的に形成される全てのCO2を即座に吹き飛ばすために追求された。
【０２８２】
高撹拌及びガス発生条件に切り替えた後、排出流中のCO2濃度を観察し、これがほぼ0％に達するとすぐに、メタノール供給を開始した。
誘導後の最初の供給工程は、全てのバイオリアクターに1％メタノール(v/v)を添加することによって行った。
第２の供給工程は、GaT_pp_10b及びGaT_pp_12bそれぞれの１つの技術的複製物を培養したバイオリアクター中で、CO2を5％に増加させることによって行った。
【０２８３】
GaT_pp_10a及びGaT_pp_12aが培養された他の２つのバイオリアクターでは、入口空気のCO2成分は0％に保たれた。
バイオリアクターのサンプリングは、上記のように少なくとも１日１回行った。
メタノール濃度を、at-line HPLC測定によって１日１回、1％(v/v)に調整した。
【０２８４】
誘導後３日目に、CO2の切り替えを行った。GaT_pp_10a及びGaT_pp_12aについて、入口空気のCO2組成を0％から5％に設定した。GaT_pp_10b及びGaT_pp_12bを含むリアクターでは、CO2供給を0％に変更した。
CO2供給の切り替え後、サンプル採取及び供給を、発酵２の終了まで状況に応じて行った。炭素源として5％CO2を用いて上述したのと同じ手順を行って、シャペロンフリー株GaT_pp_11を試験して、GaT_pp_10と比較した(表１０−*で印をつけた値)。
【０２８５】
結果  実施例５
以下の節では、上に概要を示した実施例の結果が記載され、それらは、改変されたGaT_pp_10株が、炭素の唯一の供給源としてCO2上で増殖できることを示す。
【０２８６】
本実施例の主な目的は、GaT_pp_10株の増殖が、発酵２の間の、外部からのCO2の供給によるものであることを実証することであった。CO2同化のための提案された経路の実現可能性及び機能性を、実施例３に示した。いずれにせよ、CO2も、メタノール利用経路の異化分岐の第１段階におけるメタノールの酸化によって細胞内で産生される。この実施例では、工程パラメーターを、製造されたCO2が細胞から即座に枯渇することを保証する条件に設定した。これは、撹拌速度を1000rpmに設定し、ガス流入口のガス流量を35 sL*h-1に設定することによって達成された。これらの条件下で、全ての産生されたCO2がバイオリアクターから吹き飛ばされることが保証された。
【０２８７】
誘導直後の遺伝子操作GaT_pp_10株における増殖は、0％CO2(図４の時点t2とt3の間の〇)と比較して、5％CO2を供給した場合(図４の時点t2とt3の間の◇)ではるかに顕著であることがはっきり分かった。また、この作用は可逆的であることが示され、GaT_pp_10bにおけるCO2供給の切り替え後(図４のt3後の◇)、細胞は速やかに増殖を停止した。逆に、CO2を0から5％CO2に設定すると、細胞は増殖を回復した(GaT_pp_10a、図４のt3後の〇)。
【０２８８】
予想されたように、RuBisCOを欠くコントロール株(GaT_pp_12a及びb)の技術的複製では、増殖は観察されなかった。
CO2供給切り替え発酵２中に観測されたバイオマス形成速度は、表１０に要約されており、(†)は、値が供給相の第１相(図４のt2〜t3；すなわち、GaT_pp_10aとGaT_pp_12aにおける0％CO2、GaT_pp_10bとGaT_pp_12bにおける5％CO2)から得られたことを示し、(‡)の印の付いた値は、第２相(図４におけるt3から培養の最後まで；すなわち、GaT_pp_10bとGaT_pp_12bにおける0％CO2、GaT_pp_10aとGaT_pp_12aにおける5％CO2)から得られたことを示している。
【０２８９】
バイオマス形成値は、バイオマスの形成が、CO2の外部供給と直接的に相関することを明確に示した。GaT_pp_10aは、CO2を供給しない場合には増殖をほとんど示さなかったが(0.002 g*L-1(CDW)*h-1)、入口空気のCO2成分を5％導入に設定すると、急速に増殖を開始した(0.029 g*L-1(CDW)*h-1)。
逆に、GaT_pp_10bは良好な増殖(0.036 g*L-1(CDW)*h-1)で始まり、CO2供給を0％に設定すると増殖を停止した(0.000 g*L-1(CDW)*h-1)。
【０２９０】
また、この実施例では、GroEL及びGroESの同時発現なしに、合成カルビン回路のペルオキシソームバージョンを発現する株でも、増殖が得られることが示された。これらの株を状況に応じて培養し(表１０における、*の付いた値を参照)、5％CO2で観察されたバイオマス形成速度（GaT_pp_11aでは0.008 g*L-1(CDW)、及びGaT_pp_11bでは0.004 g*L-1(CDW)）は、この経路が異種シャペロンを使用せずに機能し得ることを示す。
【０２９１】
表１０：入口気体流中の0％及び5％CO2でのバイオマス形成速度。発酵第１相(†)では、生物学的複製物GaT_pp_10a及びGaT_pp_12aにおけるのCO2供給は0％であり、発酵第２相(‡)の間は5％に設定された。逆に、発酵第１相(†)は、GaT_pp_10bとGaT_pp_12b IIでは5％CO 2で行われ、その後それぞれのバイオリアクターにおける第２相(‡)の間はCO 2を停止させた。GaT_pp_10株の増殖は、CO2の外部供給に依存する。5％CO2(*)での発酵相の独立複製において、GaT_pp_11(a及びb)の増殖を試験した。
【０２９２】
2020521476.tif 000012
【０２９３】
GaT_pp_10株の増殖が、CO2の外部供給に依存することが、この実施例(表１０)に示される増殖データによって実証される。ペルオキシソームにおいて機能的カルビン回路を発現する改変GaT_pp_10株に、CO2及びメタノールを供給した場合にのみ、増殖が観察可能であり、これは、CO2の機能的取り込み及び組み込みを実証する。
【０２９４】
実施例６ ペルオキシソームに局在する機能的合成カルビン回路を発現する株を用いた乳酸の産生
以下の実施例は、炭素源としてCO2を使用する大量化学物質の製造のための宿主株としての改変GaT_pp_10株の可能性を実証するために行われた。開示されたGaT_pp_10株を使用して、化学物質の産生に至る広範囲の経路が可能であり、乳酸(LA)の産生が工業的に関連する例として示されている。
【０２９５】
P.パストリスCBS7435変異体であってRuBisCO陽性株(GaT_pp_10株として示す)を宿主株として使用した。発現ベクターpPM2D_pGAPは、pPuzzle_ZeoRベクター骨格(WO2008/128701A2に記載される)及びBB3rN_14(GoldenPiCS: a Golden Gate-derived modular cloning system for applied synthetic biology in the yeast Pichia pastoris. Prielhofer R, Barrero JJ, Steuer S, Gassler T, Zahrl R, Baumann K, Sauer M, Mattanovich D, Gasser B, Marx H.BMC Syst Biol. 2017 Dec 8;11(1):123. doi: 10.1186/s12918-017-0492-3.10.1186/s12918-017-0492-3 PubMed 29221460)(pUC19細菌複製起点及びゼオシン又はNourseothricin(NTC)抗生物質耐性カセットからなる)の誘導体である。細菌乳酸脱水素酵素(LDH)遺伝子の発現は、P.パストリス・グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素(GAP)プロモーター又はアルコール酸化酵素(AOX)プロモーターそれぞれ、及びS.セレビシエCYC1転写ターミネーターによって媒介された。LDH遺伝子をサブクローニングし、実施例３に記載されるように、それぞれのP.パストリスへのエレクトロポレーションの前に、ベクターpPM2d_pGAP及びBB3rN_14にそれぞれ連結した。陽性形質転換体の選択は、それぞれ、50μg*mL-1のゼオシン又は100μg*mL-1のNTCを含むYPDプレート(１リットルあたり:酵母抽出物10g、ペプトン20g、グルコース20g、アガー-アガー20g)上で行った。コロニーPCRを用いて、形質転換されたプラスミドの存在を確実にした。それゆえ、実施例３に記載のようにゲノムDNAを得、適切なプライマーを用いたPCRを行った。
【０２９６】
最終的に得られた株は、GaT_pp_28(Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PGAPLDH)(PGAP下で、LDH 遺伝子を有する)、及びGaT_pp_39(Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PAOX1LDH)(AOX1プロモーター(PAOX1)の制御下でLDH遺伝子を有する)として表される。
【０２９７】
次いで、LDH産生株を、LA産生振盪フラスコ実験(GaT_pp_28)及びバイオリアクター培養(GaT_pp_28及びGaT_pp_39)について試験した。発酵研究は、実施例４及び５に従って設計した。これらの培養の間の乳酸の産生を、実施例３に記載されるサンプル調製物と同様にHPLC分析(Blumhoff, et al 2013. Metabolic Engineering 19. 26-32. doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.; Steiger, et al. 2016. Metabolic Engineering 35. 95-104. doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003)によってモニターした。
【０２９８】
LDHを過剰発現する振盪フラスコ培養株のために、YPプレ培養物を以下のように調製した。
GaT_pp_28又はGaT_pp_39の凍結ストック溶液からYPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、100mLのYPG培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を50mLのファルコン管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、5mLの滅菌dH2Oに再懸濁した。この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。0.5％メタノールを補充した20mlのBatchGly培地(初期OD＝15.0又は2.85 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０２９９】
次いで、主培養物を、振盪デバイス(180回転/分)上のCO2インキュベーター(5％CO2を使用)中でインキュベートした。接種後１日１回サンプリングを行い、培養１日目からメタノール濃度を1％(v/v)に調整した。細胞増殖(OD測定値)及び代謝産物プロファイル(HPLC分析)を、実施例４及び５に記載のようにモニターした。
【０３００】
GaT_pp_28又はGaT_pp_39株のバイオリアクター培養のために、YPプレ培養物を以下のように調製した。
GaT_pp_28又はGaT_pp_39の凍結ストック溶液から、YPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、400mLのYPG培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を500mLの滅菌遠心分離管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁し、この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。0.5％メタノールを補充した500mlのYNB培地(初期OD＝15.0又は2.85 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０３０１】
接種後、バイオリアクター培養を、実施例４に記載のように1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で行った(5M NaOHを用いてpHを調整する変更を加えた)。サンプリング手順及びリアクター中のメタノール濃度の維持も、実施例４に従って行った。
【０３０２】
結果  実施例６
３つの生物学的複製物を、それぞれ２つの技術的複製で培養した。振盪フラスコ培養物を、接種後5％の増加CO2雰囲気下で維持した。培養期間の間、LDHを有する改変株は、乳酸(LA)を分泌した(表１１)。
【０３０３】
表１１:振盪フラスコにおいてCO2でGaT_pp_28を培養した間に測定された乳酸力価。各生物学的複製物(GaT_pp_28_C1〜C3)及び親株(GaT_pp_10)についての２つの技術的複製(I及びII)に関し、異なる時点でのLA力価を示す。時点0で、細胞を、0.5％メタノール(v/v)を含有するBatchGly培地に接種した。改変されたGaT_pp_28株は、炭素源としてのCO2上で、乳酸(LA)を産生する。
【０３０４】
【表１１】
2020521476.tif 000013
【０３０５】
GaT_pp_28細胞は、唯一の炭素源としてCO2で培養した際に、最大で36mg/Lの力価で乳酸を産生する。これらの結果は、ペルオキシソームに局在化した合成カルビン回路を備えた改変酵母細胞が、LAの生産プラットフォームとして使用できることを示す。
【０３０６】
表１２：バイオリアクターにおいて、CO2でGaT_pp_28及びGaT_pp_39を培養する間に測定された乳酸力価。改変されたGaT_pp_39株及びGaT_pp_28株は、唯一の炭素源としてCO2を使用して乳酸(LA)を産生する; LA力価が、対応する細胞乾燥重量(CDW)値とともに、異なる時点について示される。
【表１２】
2020521476.tif 000014
【０３０７】
実施例６の過程において、合成カルビン回路のペルオキシソームバージョンを有する改変された酵母細胞を、２つの異なるプロモーターの制御下でLA産生について試験した。GaT_pp_39株では、LDH遺伝子はPAOX1によって制御され、GaT_pp_28株ではPGAPの制御下にある。両方の株において、検出可能なレベルのLAが、バイオリアクター培養の間に得られた(表１２参照)。
【０３０８】
実施例６では、合成カルビン回路のペルオキシソームバージョンを発現する改変された細胞が、LAのための産生プラットフォームとして使用できるというエビデンスが提供される。これは、広範囲の化学物質の生産プラットフォームとしてのGaT_pp_10株の可能性を示す。
【０３０９】
実施例７  ペルオキシソームに局在する機能的合成カルビン回路を発現する株を用いたブタカルボキシペプチダーゼB(CpB)又はヒト血清アルブミン(HSA)の産生
カルビン回路のペルオキシソームバージョンを有する株(GaT_pp_10)に基づいて、CpBを過剰発現するように株を改変した(GaT_pp_31)及び(GaT_pp_35)。CpB及びHSAを発現する形質転換体を、バイオリアクター中で、唯一の炭素源としてCO2を用いて培養した。これらの研究のセットアップは、実施例４及び５に記載されるセットアップに従って設計される。
【０３１０】
株の構築
P.パストリス CBS7435変異体であってRuBisCO陽性株(GaT_pp_10株として示す)を宿主株として使用した。pPM2d_pAOX発現ベクターは、pUC19細菌複製起点及びゼオシン抗生物質耐性カセットからなる、WO2008/128701A2に記載されるpPuzzle ZeoRベクター骨格の誘導体である。異種遺伝子の発現は、それぞれ、P.パストリス・アルコール酸化酵素(AOX1)プロモーター(PAOX1)、及びS.セレビシエCYC1転写ターミネーターによって媒介された。ブタカルボキシペプチダーゼ(45.7kDaの、GeneBank CAB46991.1のアミノ酸16〜416)をコードする遺伝子を、P.パストリスのためにコドン最適化し、N末端S.セレビシエα接合因子シグナルリーダー配列を用いて合成した。天然の分泌リーダー(66.4kDaの、GenBank NP_000468のアミノ酸1〜609)を有するヒト血清アルブミンをコードする遺伝子を、P.パストリスのためにコドン最適化し、合成した。分子量は、Expasyオンラインツール(https://web.expasy.org/compute_pi/)を用いて計算した。N末端分泌リーダー配列を伴う目的の遺伝子を有する得られたベクターを、SbfI及びSfiIで消化し、遺伝子をそれぞれ、SbfI及びSfiIで消化されたベクターpPM2d_pAOXに連結する。プラスミドを、実施例３に記載したように、各P.パストリス株(GaT_pp_10)へのエレクトロポレーションの前に直線化した。陽性形質転換体の選択は、ゼオシン50μg*mL-1を含むYPDプレート(1リットルあたり:酵母抽出物10g、ペプトン20g、グルコース20g、寒天20g)上で行った。コロニーPCRを用いて、形質転換されたプラスミドの存在を確実にした。実施例３に記載のようにゲノムDNAを得、適切なプライマーを用いてPCRを行った。
【０３１１】
最終的に改変された株(遺伝子型 Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PAOX1CpBを有する)は、GaT_pp_31として表され、Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PAOX1HSAを有するものは、GaT_pp_35と表される。両方の株において、モデルタンパク質(GaT_pp_31ではCpB；GaT_pp_35ではHSA)は、PAOX1によって制御される。
【０３１２】
GaT_pp_31及びGaT_pp_35プレ培養物のバイオリアクター培養のために、以下のように準備を行った：
GaT_pp_31及びGaT_pp_35の凍結ストック溶液から、YPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、400mLのYPG培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を500mLの滅菌遠心分離管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁し、この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。0.5％メタノールを補充した500mlのYNB培地(初期OD＝18.0又は3.45 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０３１３】
接種後、バイオリアクター培養を、実施例４に記載のように1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で行った(5M NaOHを用いてpHを調整する変更を加えた)。サンプリング手順及びリアクター中のメタノール濃度の維持も、実施例４に従って行った。
【０３１４】
培養上清サンプル中のHSA及びCpBを、SDS-PAGE分析、続いて銀イオン染色によって検出した。簡単に述べると、15μLの上清を、5μLの4×サンプル緩衝液(NuPAGE LDSサンプル緩衝液(4×)(ThermoFischer Scientific, US))と混合し、70℃で10分間加熱した後、MOPS泳動バッファー中の10％Bis-Tris Protein Gels(ThermoFischer Scientific, US)上にロードした。分離は、電源を30mAの定電流に設定して行った。ゲルを約３時間泳動し、次いで固定液(エタノール50％(v/v)、酢酸10％(v/v))中で4℃にて一晩固定した。固定工程後、ゲルを室温で、インキュベート溶液(エタノール30％(v/v)、0.89M酢酸ナトリウム、13mMチオ硫酸ナトリウム、0.25％グルタルアルデヒド)中にて30分間インキュベートし、３回洗浄した(それぞれ10分間、RO-H2O中で)。その後、ゲルを、硝酸銀溶液(6mM硝酸銀、0.02％ホルムアルデヒド)中でインキュベートし、短時間洗浄し、次いでバンドが現れるまで展開液(0.25M炭酸ナトリウム、0.01％ホルムアルデヒド)中で展開した。50mM EDTAナトリウム溶液を１時間適用することによって反応を停止させた。
【０３１５】
結果  実施例７
GaT_pp_31株を、上記のようにバイオリアクター培養で培養し、0.5％メタノールを補充したYNB培地中で培養を行った。１日目から開始して、メタノールを１日１回、1％メタノール(v/v)に調整し、入口ガス流中にCO2(5％)を供給した(これは、改変された細胞にとって唯一の炭素源に相当する)。培養期間中、細胞は、0.019g CDW L-1 h-1のバイオマス形成速度で増殖した。さらに、上清サンプルのSDS-PAGE及び銀イオン染色による分析は、GaT_pp_31株によるCpBの発現を明らかにした(図７)。バイオリアクター培養の接種(0時間)後、バンドは見られなかったが(図７のレーン１)、72時間後、約45kDaに相当するサイズでバンドを検出することができた(図７のレーン２)。これは、CO2のみが炭素源として利用可能である条件下で、CpBが生成されることを示す。
【０３１６】
HSAを過剰発現する株(GaT_pp_35)を、GaT_pp_31株に準じて培養した。２回目の発酵では(バイオマス形成速度は0.013 g CDW L-1h-1)、HSAが検出可能なレベルで生成され、この方法の再現性が強調された。図８は、バイオリアクター培養の過程の間に、HSAが、0日目(d0)の検出不可能なレベルから出発して、１日目〜３日目(d1〜3)の検出可能なレベルにまで蓄積されることを示す。HSAのコンパクトで球状の形態のために、銀染色によって検出される見かけの分子量(ここでは約55kDa)は、66.4kDaの実際の分子量より小さい(未公開の以前のデータと一致する)。
【０３１７】
この実施例を用いて、合成カルビン回路のペルオキシソームバージョンを備えた細胞の、タンパク質産生プラットフォームとしての有用性が実証される。モデル技術的酵素としてのCpBの、及び医薬関連産物のモデルタンパク質としてのHSAの、十分に検出可能なレベルでの発現は、種々の産物クラスが、RuBisCO陽性(GaT_pp_10)バックグラウンドで産生できることを裏付ける。
【０３１８】
実施例８  機能的カルビン回路を発現するP.パストリスに対するAox1、Das1及びDas2の影響
AOX1のCDSは、次のようにGat_pp_10に再統合される:
AOX1のCDSを、P.パストリスCBS7435のゲノムから増幅し、実施例２に記載の手順に従って、それぞれのBB1プラスミドにクローニングする。天然PAOX1、AOX1のCDS、及び適切なターミネーターを有する発現カセットを、実施例２に概説するように、ゴールデンゲートクローニングによってBB2レベルで構築する。機能性AOX1カセットを、ゴールデンゲートクローニング及びCRISPR/Cas9を使用して、実施例２及び３で記載したのと同様のワークフローを使用して、GaT_pp_10株に組み込む。
【０３１９】
Aox1活性の再構築のための上記ワークフローと同様に、DAS1及びDAS2のCDSを、改変株のそれぞれのターミネーター領域に再統合する。
株を、実施例４、５及び６に記載されるように、CO2及びメタノールでの増殖について試験する。
【０３２０】
実施例９  機能的カルビン回路を発現するP.パストリス株におけるCO2取り込みを検証するための13C標識
気体CO2の取り込みを介したバイオマスへの無機炭素の取り込みを分析するために、13Cに基づく標識化研究を実施した。実験のセットアップ(実施例４に従って採用した)は、13C標識グリセロールによるバッチ相に続いて、標識12C CO2及び非標識13Cメタノールによる供給相を含む(シナリオI)。第２の設定では、13C標識グリセロールでバッチを実施し、12C非標識メタノール及び非標識(12C)CO2で供給相を実施する(シナリオII)。
【０３２１】
培養は、GaT_pp_10株及びGaT_pp_12株を用いて、実施例５に記載の手順に従ってバイオリアクター中で行う。実施例５に反して、完全に標識された13Cグリセロールを炭素源として含む標識培地(LM)を使用した。全部で４つのバイオリアクターが接種された。３つのバイオリアクターにおいて、シナリオIを適用した(GaT_pp_10で２つ、GaT_pp_12で１つのリアクター)。一方、シナリオIIは、GaT_pp_10を接種したリアクターについて適用した。両方の実験から、バイオマスを回収し、同位体比質量分析計(EA-IRMS)に連結した元素分析器を用いて、12Cの13Cに対するバイオマス中の同位体比を決定した。この分析手順は、第三者(IMPRINT ANALYTICS, Neutal, Austria)による商業サービスによって実施した。
【０３２２】
簡単に述べると、GaT_pp_10及びGaT_pp_12の凍結ストック溶液から、YPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、100mLのYPD培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を50mLのファルコン管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁し、この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。500mlのLM(初期OD＝1.0又は0.19 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０３２３】
バイオリアクター培養は、1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で、最大作業体積1.0Lで行った。培養温度は28℃に制御し、pHは12.5％水酸化アンモニウムの添加により5.0に制御し、攪拌速度を400〜1200rpmに制御することにより溶存酸素濃度を20％飽和以上に維持し、バッチ相の間6〜45 sL*h-1の空気流量を維持した。正確なCO2濃度を確実にするために、入口の空気は、N2、O2、CO2の混合気体で合成した。
【０３２４】
上記のプレ培養物に由来する細胞を使用して、バイオリアクター中の出発体積0.5Lに接種し、初期光学濃度(600nm)を1.0又は0.19g*L-1とした。グリセロールバッチは、約36時間後(GaT_pp_12)及び40時間後(GaT_pp_10；３つの技術的複製I〜IIIすべてについて)に終了した。全菌株の蓄積バイオマスは約5.0 g*L-1 CDWであった。
【０３２５】
標識発酵の開始点で、サンプルを採取し、最初の初期ODを３回測定した。OD測定値は、0.2〜0.5の吸光度範囲で、携帯型分光光度計(C8000 Cell Density Meter, WPA, Biowave)を用いて行った。出発点からのサンプリング材料も、HPLC分析のために採取した。HPLC分析の手順は、実施例４に記載されている。さらに、全13C含有量をEA-IRMSによって決定するためにサンプルを採取した。この目的のために、約0.5mgの乾燥バイオマスに対応する細胞懸濁液の容量を、最初に0.1MのHClで洗浄し、次にRO-H2Oで２回洗浄した。解析まで、13Cバイオマスサンプルを-20℃で保存した。
【０３２６】
グリセロールバッチ相の後、培養の間、サンプルを少なくとも１日に１回採取した。OD測定、HPLC及び13C含量サンプル調製を上記のように行った。
バッチ後、全てのバイオリアクターを、入口接続部に無菌的に接続されている、0.22μmフィルターユニットに接続された5mLの注射器を使用して、0.5％メタノール(v/v)の添加によって誘導した。
吸入ガス中のCO2は、誘導相の間1％に設定した。
【０３２７】
上記のプロセス制御条件下で細胞を誘導した後、メタノールの酸化によって形成されたCO2を吹き飛ばすために、撹拌速度N及び入口ガス流量Fのプロセス制御値を増加させた。撹拌速度は1000rpmで一定に保ち、入口空気混合物のガス流量は35 sL*h-1に設定した。
誘導後、CO2を5％に上昇させ、全てのバイオリアクターに1％メタノール(v/v)を加えることにより、供給相を開始した。
【０３２８】
バイオリアクターのサンプリングは、上記のように少なくとも１日１回行った。
メタノール濃度を、アットラインHPLC測定によって１日１回、1％(v/v)に調整した。コントロール株GaT_pp_12を含むリアクター、及びGaT_pp_10株を含む２台のリアクター(I及びII)では、13C標識メタノールを適用したが(シナリオI)、株GaT_pp_10を含む３台目のリアクター(III)では、非標識12Cメタノールを用いた(シナリオII)。
【０３２９】
結果  実施例９
以下の節では、上記で概説した実施例の結果を記載し、改変されたGaT_pp_10株が唯一の炭素源としてCO2上で増殖することができ、バイオマスの形成が気体CO2の取り込みに起因することを示す。
【０３３０】
唯一の炭素源としてCO2を使用し、還元当量の生成のための供与体基質としてメタノールを使用した標識培地での標識試験中の増殖性能は、BatchGly培地を使用した実施例４及び５と同様であった。これは、CO2及びメタノールで増殖中の同様のバイオマス形成速度に反映される(表１０と表１３を比較)。さらに、13C標識メタノール(GaT_pp_I及びII)又は非標識メタノール(III)の利用は、増殖性能を有意に変化させない。
【０３３１】
表１３：GaT_pp_10株とGaT_pp_12株の13C標識発酵時のバイオマス形成速度
12C CO2の存在下の13Cメタノール(GaT_pp_12及びGaT_pp_10 I_II)で、又は12C CO2の存在下の12Cメタノール(GaT_pp_10 III)でのいずれかで、培養を行った(13Cグリセロールでのバッチ相後)
【表１３】
2020521476.tif 000015
【０３３２】
表１４：GaT_pp_12株とGaT_pp_10株の同位体比質量分析(EA-IRMS)によるバイオマスサンプルの総13C含量解析。すべての株を13Cグリセロール上で増殖させ(バッチ)、続いて12CO2／13CH3OH(シナリオI  GaT_pp_12、GaT_pp_10 I〜II)又は12CO2／12CH3OH(シナリオII  GaT_pp_10 III)を共供給した。EA-IRMSによって、得られたバイオマスサンプル中の13C含量(％)(13Cm)を測定。13Cmの標準偏差は、同一サンプルの技術的に再現された３回の測定値の誤差を示す。測定されたバイオマス形成を用いて計算された、理論的な13C含量(％)(13 Ccal)の予測値。
【０３３３】
【表１４】
2020521476.tif 000016
【０３３４】
実施例９は、EA-IRMSにより総13C含量を測定することによって、12CO2で増殖時のCO2のバイオマスへの取り込みを直接的に検証する。バイオマス中の13C含量は、13Cグリセロールでのバッチ相中に95％まで濃縮され(表１４の45時間時点のバッチ終了値を参照)、その後、炭素源として12COを適用してウォッシュアウトされた。GaT_pp_12株は機能的なカルビン回路を持たないコントロール株であり、その結果、12C CO2を取り込むことによってその13C含量を変化させることはできない。すべての生育株(GaT_pp_10 I〜III)は、同時供給相中に13C含量の低下を示し(表１４の85〜158時間後の13Cm値参照)、蓄積バイオマスに従って算出した値(各時点での13Ccal値)と同等であった。エネルギー供給のために13Cメタノールを供給した２つの株については(GaT_pp_10 I及びII)、理論値に従い13C含量が減少した。これは、メタノール酸化自体に由来する有意な量の炭素が、取り込まれていないことを示す。シナリオII(GaT_pp_10 III)では、12Cメタノールをエネルギー供給に使用した。この手法では、最終バイオマスにおける総13C含量減少の程度が、シナリオI(GaT_pp_10 I及びII)と有意に異ならない。このことは、同化された炭素が、入口ガス流に供給される12CO2に由来し、メタノール酸化そのものには由来しないことを示している。
【０３３５】
実施例１０：P.パストリスにおけるカルビン回路のサイトゾル発現のためのプラスミド及び株構築
この実施例では、サイトゾルに局在する機能的カルビン回路を含む株の構築が開示される。ゴールデンゲートクローニングを用いて、DNAをプラスミドに十分にサブクローニングするための全ての工程を、実施例２に記載のように実施する。表１５に記載の遺伝子のコード配列(CDS)を、ピキア・パストリス CBS7435 wt由来のメタノール誘導性プロモーター及びターミネーター配列と組み合わせた(表１６)。
【０３３６】
表１５：ピキア・パストリスのサイトゾルに局在する合成カルビン回路の創造に必要な遺伝子（遺伝子源、酵素命名法に従う、EC番号も示す）
【表１５】
2020521476.tif 000017
【０３３７】
表１６：提唱された合成カルビン回路における遺伝子調節エレメント(プロモーターPXXX及びターミネーターTXXX)。全ての遺伝子(表９も参照)は、P.パストリス CBS7435に由来する強力なメタノール誘導性プロモーターによって制御される。GroEL及びGroESは、中等強度の構成的プロモーターによって調節される。
【表１６】
2020521476.tif 000018
【０３３８】
表１６に列挙した発現カセットを、ゴールデンゲートクローニングを用いて組み立て、実施例３に記載した手順に従ってP.パストリス CBS7435の形質転換に使用した。
GaT_pp_22株は、表１７に示されるスキームに従って構築された。この株は、P.パストリスにおいてサイトゾルカルビン回路を可能にするために必要な全ての遺伝子を含む。
【０３３９】
表１７：株構築の概要；ピキア・パストリス(Centraalbureau voor Schimmelcultures, NL, genome sequenced by Kuberl et al., 2011; Valli et al., 2016)から出発して得られた遺伝子型とともに、各形質転換体の名称及び親を示す。カルビン回路のサイトゾルバージョンによるCO2同化に必須のすべての遺伝子を含む株をGaT_pp_22と命名する。
【表１７】
2020521476.tif 000019
【０３４０】
実施例１１：サイトゾルに局在する機能的カルビン回路を含む株は、二酸化炭素及びメタノールの存在下で増殖することができる
バイオリアクター培養は、実施例４に記載のように行った。バッチ相を15g/Lグリセロールで実施した。実施例４に記載したように、CO2及びメタノールの供給を行った。
改変したGaT_pp_22株は、メタノール/CO2供給相の間、エネルギー源としてのメタノール及び唯一の炭素源としてのCO2の存在下で増殖を示した。
【０３４１】
図６は、改変されたGaT_pp_22株が、エネルギー源としてのメタノール、及び唯一の炭素源としてのCO2の存在下で増殖できることを示す。この実験から、GaT_pp_22株で見られる増殖は、CO2の取り込み及び組み込みによるものであると結論付けることができる。表１８は、GaT_pp_22株(I及びII)のグリセロールバッチ終了後、メタノールを用いた全供給相の間に観察されたバイオマス形成速度を、ペルオキシソームに局在化した経路を有する株(GaT_pp_10 I及びII)と比較して示す。
【０３４２】
RuBisCO陽性株(GaT_pp_22 I及びGaT_pp_22 II)で観察されたバイオマス形成は、CO2の合成同化経路が機能的であることを示す(表１８)。
表１８：同時供給(メタノール＋CO2)相全体にわたって計算されたバイオマス形成速度。形成速度を、GaT_pp_22の２つの生物学的複製(I及びII)について示し、サイトゾル経路バージョンを発現するGaT_pp_10の２つの生物学的複製(I及びII)と比較する。
【表１８】
2020521476.tif 000020
【０３４３】
実施例１２：サイトゾルに局在する機能的合成カルビン回路を発現する株(GaT_pp_22)を用いた乳酸の産生
以下の実施例は、炭素源としてCO2を使用して大量化学物質を製造する宿主株としての改変GaT_pp_22株の可能性を実証するために行われた。開示されたGaT_pp_22株を使用して、化学物質の産生につながる広範囲の経路が可能であり、乳酸(LA)の産生が工業的に関連する例として示される。
【０３４４】
PAOX1の制御下でLDHを有する実施例６で構築したプラスミドを、GaT_pp_22株に形質転換し、GaT_pp_41を得た。この完全な遺伝子型は、以下の通りである：Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(cTDH3, cPRK, cPGK1)1(cRuBisCO, GroEL, GroES)2(cTKL1, cTPI1)3PAOX1LDH
【０３４５】
次いで、LDH産生株を、実施例４、５及び６に従って設計された発酵研究において、乳酸(LA)産生のために試験した。これらの培養の間の乳酸産生を、HPLC分析(Blumhoff, et al 2013. Metabolic Engineering 19. 26-32. doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.; Steiger, et al. 2016. Metabolic Engineering 35. 95-104. doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003)によってモニターした(実施例３に記載されるサンプル調製物に類似)。
【０３４６】
簡単に述べると、LDHを過剰発現するGaT_pp_41株のバイオリアクター培養を以下のように行った。
GaT_pp_41の凍結ストック溶液からYPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、400mLのYPG培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を500mLの滅菌遠心分離管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁した。この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。0.5％メタノールを補充した500mlのYNB培地(初期OD＝15.0又は2.85 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０３４７】
接種後、バイオリアクター培養を、実施例４に記載のように1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で行った(5M NaOHを用いてpHを調整する変更を加えた)。サンプリング手順及び反応器中のメタノール濃度の維持も、実施例４に従って行った。
【０３４８】
結果  実施例１２
実施例６では、GaT_pp_10株(ペルオキシソームバージョンの経路)をLAの生産プラットフォームとして使用できることが示された。この実施例１２では、サイトゾル中で合成カルビン回路を発現する株も、LA産生に使用できることを示すデータが提供される。
バイオリアクター培養において、改変されたGaT_pp_41細胞は増殖し、上清中に乳酸を分泌することができた(表１９)。培養42時間後に最大で35mg/Lの乳酸が検出された。
【０３４９】
表１９：改変されたGaT_pp_41株は、唯一の炭素源としてCO2を使用して乳酸(LA)を産生する; LA力価が、対応する細胞乾燥重量(CDW)値とともに、異なる時点について示される。
【表１９】
2020521476.tif 000021
【０３５０】
ここで提供するデータは、CO2を唯一の炭素源として使用して乳酸を蓄積する可能性を実証し、エネルギーはGaT_pp_22のバックグラウンドにおけるメタノール酸化によって供給される。
【０３５１】
実施例１３：サイトゾル(GaT_pp_22)及びペルオキシソーム(GaT_pp_10)に局在する機能的合成カルビン回路を発現する株を用いたイタコン酸の産生
以下の実施例は、炭素源としてCO2を使用してイタコン酸を産生する宿主株としての、さらに改変されたGaT_pp_22株及びGaT_pp_10株の可能性を実証するために行われる。
【０３５２】
先に記載されたGaT_pp_22及びGaT_pp_10株は、レシピエント株として使用され、そしてpAOX又はpGAPプロモーターの制御下で、シス-アコニット酸デカルボキシラーゼ(Uniprot ID: B3IUN8)をコードするcadAのコード配列を転写する機能的発現カセットを含むプラスミドで形質転換される(Steiger, et al. 2016. Metabolic Engineering 35. 95-104. doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003)(例えば、実施例６に記載のプラスミドpPM2d_pGAP及びpPM2d_pAOXを、レシピエントプラスミドとして使用する)。cadAを含む機能的発現カセットを含むプラスミドを、実施例６に従って、GaT_pp_22及びGaT_pp_10株に形質転換し、GaT_pp_22+pGAP::CAD及びGaT_pp_10+CADを生じさせる。
【０３５３】
次いで、CAD産生株(GaT_pp_22+CAD及びGaT_pp_10+CAD)を、実施例４及び５に従って設計される発酵研究において、イタコン酸産生について試験する。これらの培養の間のイタコン酸の産生を、HPLC分析(Blumhoff, et al 2013. Metabolic Engineering 19. 26-32. doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.; Steiger, et al. 2016. Metabolic Engineering 35. 95-104. doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003)によってモニターする(実施例３に記載されるサンプル調製物に類似)。
【０３５４】
実施例１４：ブタのカルボキシペプチダーゼB(CpB)又はヒト血清アルブミン(HSA)を分泌するGaT_pp_22誘導体の構築
P.パストリスCBS7435変異体であってRuBisCO陽性株(GaT_pp_22株として示される)を、レシピエント株として使用した。GaT_pp_22のバックグラウンドにおいてCpB及びHSAを発現する株を、GaT_pp_10株について記載した手順に従って、実施例７に記載したように構築する。
【０３５５】
最終的な株は、それぞれ、遺伝子型 Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PAOX1CpBを有するGaT_pp_37 (CpB)、及び、遺伝子型 Δ(aox1)1(das1)2(das2)3::(TDH3, PRK, PGK1)1(RuBisCO, GroEL, GroES)2(TKL1, TPI1)3PAOX1HSAを有するGaT_pp_38 (HSA)と表示される。
【０３５６】
バイオマス形成のための炭素がCO2によってのみ提供される場合に、HSAを過剰発現する改変GaT_pp_38株が、異種タンパク質を産生することができるかどうかを試験するために、バイオリアクター培養を行った。これらの研究のセットアップは、実施例４、５及び６に記載されたセットアップに従って設計された。
【０３５７】
GaT_pp_38株のバイオリアクター培養のために、プレ培養物を以下のように調製した。
GaT_pp_31及びGaT_pp_35の凍結ストック溶液からYPDプレート上にリストリークを行い、28℃で48時間インキュベートした。単一コロニーを採取し、400mLのYPG培地の接種に使用した。プレ培養物を28℃及び180rpmで一晩増殖させた。光学密度を測定し、次いで、細胞懸濁液を500mLの滅菌遠心分離管に移し、遠心分離した(1500g、6分間)。ペレットを滅菌dH2Oで２回洗浄した後、20mLの滅菌dH2Oに再懸濁した。この懸濁液からサンプルを採取し、ODを測定した。0.5％メタノールを補充した500mlのYNB培地(初期OD＝18.0又は 3.45 g*L-1 CDW)の接種に必要な容量を計算した。
【０３５８】
接種後、バイオリアクター培養を、実施例４に記載のように1.4LのDASGIPリアクター(Eppendorf、Germany)中で行った(5M NaOHを用いてpHを調整する変更を加えた)。サンプリング手順及びリアクター中のメタノール濃度の維持も、実施例４に従って行った。
SDS-PAGEによるHSA検出と銀イオン染色の解析手順は実施例７で記載しており、それに従って行った。
【０３５９】
結果  実施例１４
HSAを過剰発現するサイトゾル株(GaT_pp_38)を、２つの生物学的複製において上記のように培養した。これらの培養において、細胞はなお、それぞれ、0.012及び0.008g CDW L-1h-1のバイオマス形成速度で成長した。両方の場合において、HSAは、十分に検出可能なレベルで産生された。図８(レーン６〜１３)は、HSAが、GaT_pp_38の両方の生物学的複製において、バイオリアクター培養の過程の間に、0日目(d0)の検出不可能なレベルから始まって、１日目から３日目(d1〜3)の十分に検出可能なレベルまで蓄積されることを示す。HSAのコンパクトで球状の形態のために、銀染色によって検出される見かけの分子量(ここでは約55kDa)は、66.4kDaの実際の分子量より小さい(未公開の以前のデータと一致する)。
【０３６０】
この実施例を用いて、モデル医薬タンパク質を代表するHSAが、合成カルビン回路のサイトゾルバージョンを保有するGaT_pp_38株を用いて産生できることが示される。
【０３６１】
実施例の項に記載した参照文献:
Blumhoff, Marzena L., Matthias G. Steiger, Diethard Mattanovich, and Michael Sauer. 2013. “Targeting Enzymes to the Right Compartment: Metabolic Engineering for Itaconic Acid Production by Aspergillus Niger.” Metabolic Engineering 19 (September). Elsevier: 26-32. doi:10.1016/j.ymben.2013.05.003.
Engler, Carola, Ramona Gruetzner, Romy Kandzia, and Sylvestre Marillonnet. 2009. “Golden Gate Shuffling: A One-Pot DNA Shuffling Method Based on Type IIs Restriction Enzymes.” PloS One 4 (5): e5553. doi:10.1371/journal.pone.0005553.
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Kuberl, Andreas, Jessica Schneider, Gerhard G. Thallinger, Ingund Anderl, Daniel Wibberg, Tanja Hajek, Sebastian Jaenicke, et al. 2011. “High-Quality Genome Sequence of Pichia Pastoris CBS7435.” Journal of Biotechnology 154 (4): 312-20. doi:10.1016/j.jbiotec.2011.04.014.
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Steiger, Matthias G., Peter J. Punt, Arthur F.J. Ram, Diethard Mattanovich, and Michael Sauer. 2016. “Characterizing MttA as a Mitochondrial Cis-Aconitic Acid Transporter by Metabolic Engineering.” Metabolic Engineering 35 (May). Elsevier: 95-104. doi:10.1016/j.ymben.2016.02.003.
Valli, Minoska, Nadine E. Tatto, Armin Peymann, Clemens Gruber, Nils Landes, Heinz Ekker, Gerhard G. Thallinger, Diethard Mattanovich, Brigitte Gasser, and Alexandra B. Graf. 2016. “Curation of the Genome Annotation of Pichia Pastoris (Komagataella Phaffii) CBS7435 from Gene Level to Protein Function.” FEMS Yeast Research 16 (6): 1-12. doi:10.1093/femsyr/fow051.
Weninger, Astrid, Anna-Maria Hatzl, Christian Schmid, Thomas Vogl, and Anton Glieder. 2016. “Combinatorial Optimization of CRISPR/Cas9 Expression Enables Precision Genome Engineering in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris.” Journal of Biotechnology 235: 139-49. doi:10.1016/j.jbiotec.2016.03.027.
【図１】
2020521476.tif 000022
【図２】
2020521476.tif 000023
【図３】
2020521476.tif 000024
【図４】
2020521476.tif 000025
【図５−１】
2020521476.tif 000026
【図５−２】
2020521476.tif 000027
【図５−３】
2020521476.tif 000028
【図５−４】
2020521476.tif 000029
【図５−５】
2020521476.tif 000030
【図５−６】
2020521476.tif 000031
【図５−７】
2020521476.tif 000032
【図６】
2020521476.tif 000033
【図７】
2020521476.tif 000034
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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