(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのシグナル伝達ドメインとＫ＋を結合できるカリウムセンサとを含むポリペプチドに関し、第１のシグナル伝達ドメインは、Ｋ＋がカリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる。本発明は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびＫ＋を検出するための多様な用途における上記ポリペプチドの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドであって、
ａ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｂ）カリウムセンサとを含み、前記カリウムセンサは、
ｂ１）配列番号１の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第１のドメインと、
ｂ２）配列番号２の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第２のドメインとを含み、
前記カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、前記第１のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンが前記カリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、
ａ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｂ）カリウムセンサとを含み、前記カリウムセンサは、
ｂ１）配列番号１の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第１のドメインと、
ｂ２）配列番号２の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、前記カリウムセンサの第２のドメインとを含み、
さらに、
ｃ）第２のシグナル伝達ドメインとを含み、
前記カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインとは、正電荷を帯びたカリウムイオンが前記カリウムセンサに結合すると、連携して、検出可能なシグナルを生成できる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記カリウムセンサは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第１のドメインのためのアミノ酸配列として、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ５１Ｎ、Ｄ５９Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｄ８３Ｎ、Ｄ８４Ｎ、Ｑ２６Ｒ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ７５Ｑ、またはＧ５２Ｄのアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第１のドメインのためのアミノ酸配列として、Ｑ２６Ｒ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ７５Ｑ、Ｇ５２Ｄの置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第２のドメインのためのアミノ酸配列として、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１２５Ｑ、Ｄ１３５Ｎ、Ｎ１１６Ｑ、Ｎ１１８Ｑ、Ｎ１２１Ｑ、またはＮ１２７Ｑのアミノ酸置換のうち少なくとも１つを有する配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記カリウムセンサは、前記カリウムセンサの第２のドメインのアミノ酸配列として、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１２５Ｑ、Ｄ１３５Ｎの置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、さらに、リンカーアミノ酸配列−ＧＧＧＧ−を少なくとも１つ、または式（Ｉ）のリンカー配列を少なくとも１つ含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド：
−（ＧＧＳ）ｘ（ＧＧＧＧＳ）ｙ（ＧＧ）ｚ−  （Ｉ）
式中、
ｘは整数０または１であり、
ｙは整数１〜６であり、
ｚは整数０または１である。
【請求項９】
ｙは２、３、または５である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記リンカーアミノ酸配列は、前記カリウムセンサの第１のドメインのアミノ酸配列の後ろで、かつ、前記カリウムセンサの第２のドメインの前に位置する、請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記第１のシグナル伝達ドメインと前記第２のシグナル伝達ドメインとのペアは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のドナーとアクセプターのペア、分割型酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）のペア、または分割型蛍光タンパク質（ｓｐｌｉｔ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のペアからなる群より選択され、前記第１のシグナル伝達ドメインおよび前記第２のシグナル伝達ドメインは１つのペアの各部分であり、好ましくは、前記第１のシグナル伝達ドメインおよび前記第２のシグナル伝達ドメインはＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアである、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアは、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）ドメイン、および、循環置換ｖｅｎｕｓ（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｖｅｎｕｓ）（ＣＰＶ）などの黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ドメインである、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアは、ＣｌｏｖｅｒおよびｍＲｕｂｙ２である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記第１のシグナル伝達ドメインは、蛍光タンパク質ドメインであり、好ましくはＣＦＰドメインである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２の配列との同一性が少なくとも８０％である配列を含む、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードし、真核生物または原核生物の遺伝子発現に好適な、ベクター。
【請求項１８】
請求項１５もしくは１６に記載のポリヌクレオチド、請求項１７に記載のベクター、および／または請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む細胞。
【請求項１９】
試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための方法であって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを提供する工程、
ｂ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドを前記試料と接触させる工程、
ｃ）前記第１のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに／または
ｄ）前記第１のシグナル伝達ドメインおよび前記第２のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
前記試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、前記試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法。
【請求項２０】
前記工程ｃ）および／またはｄ）において測定されるシグナルは、蛍光シグナル、発色シグナル、またはＦＲＥＴシグナルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
測定される前記シグナルはＦＲＥＴシグナルである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＦＲＥＴシグナルは、約４７０ｎｍ〜約４９０ｎｍの範囲の波長を有する光による励起ならびに／または約５１０ｎｍ〜５２０ｎｍおよび５９０ｎｍ〜約６１０ｎｍの範囲の光の発光の後に測定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程ａ）において、前記ポリペプチドの提供は、（ｉ）請求項１５もしくは１６に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項１７に記載のベクターを用いて、少なくとも１つの真核細胞をヒトもしくは動物の生体外でトランスフェクションすることもしくは原核細胞を形質転換すること、または（ｉｉ）請求項１８に係る細胞を提供することを含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２５】
正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するためのキットであって、
ａ）請求項１〜１４のいずれか１項に記載のポリペプチド、
ｂ）請求項１５もしくは１６に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１７に記載のベクター、および／または
ｃ）請求項１８に記載の細胞のうち少なくとも１つを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
カリウムイオン（Ｋ＋）は、あらゆる細胞型にとって、適切に機能するために必要である。細胞膜および細胞小器官の膜を介して電気化学的Ｋ＋勾配があることにより、Ｋ＋の流動が促進されて、多様な細胞機能が制御される。細胞外および細胞内のＫ＋濃度の変動によって、筋肉の収縮、神経伝達物質およびホルモンの放出、神経細胞の興奮性、細胞の体積、細胞の増殖、ならびに細胞死が制御されることが知られている。そのため、Ｋ＋ホメオスタシスの不均衡が細胞レベルおよび生命体レベルのいずれにおいても大きな意味をもち、神経疾患、心血管疾患、腎疾患、免疫疾患、筋肉疾患、および代謝疾患ならびにがんを含む多くの病態に関連しているということは、驚くにはあたらない。生体膜を介するＫ＋の流動および輸送は、非常に多くの選択的Ｋ＋チャネル、交換体、およびポンプによって行なわれており、これらは、多様な疾患の治療を目的とした治療薬の対象として期待されている。しかしながら、Ｋ＋動態を高空間分解能および高時間分解能にて研究するために使用できるプローブがないため、細胞外および細胞内のＫ＋の変動についての理解は、現時点では非常に限られている。
【０００２】
印象的であることには、細胞内Ｋ＋濃度が、膜電位に及ぼすその影響からも独立して、重要なシグナル伝達事象を制御しているということが明らかになりつつある。
【０００３】
最近の研究によって、細胞内Ｋ＋レベルの上昇によりＴ細胞におけるホスファターゼＰＰ２Ａの活性が増大することが示された（Ｅｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５３７，５３９−５４３（２０１６年９月２２日））。この結果として、Ａｋｔ−ｍＴＯＲ複合体が低リン酸化状態となり、Ｔ細胞のエフェクター機能が抑制される。この研究により、Ｋ＋イオンによる膜電位への寄与とは独立して生じるＫ＋イオンによる基本的細胞機能の制御がいかに厳しいものであるか、ということが明らかとなった。ここで、多様な細胞小器官におけるＫ＋の分布、ならびに、特定の生理的条件および病態において内部小器官Ｋ＋濃度が受け得る影響がどの程度動的かつ強力であるかについては、これまで、包括的な研究はなされていない。この点については、主として、個々の細胞および細胞小器官のレベルでのＫ＋流動をリアルタイムで定量できる好適な方法および手段がないために、ほとんど分かっていない。現在、Ｋ＋感受性を有する電極は、細胞外のＫ＋変動の測定にしばしば使用されているが、典型的には、少なくとも１ｍｌといった比較的多量の試料が必要となる。こうした電極は、Ｋ＋選択性は高いが、Ｋ＋変動の時空間的動態および細胞内のＫ＋シグナルを検出する目的ではほとんど使用できない。細胞外のＫ＋変動または細胞内のＫ＋変化のいずれかを画像化する目的で、いくつかの小さな化学蛍光性Ｋ＋センサが開発された。しかしながら、こうした蛍光性イオン指標は、Ｋ＋特異性が低いことが多い、ダイナミックレンジが小さい、非生理的レンジでＫ＋感受性を示す、細胞中および細胞小器官中への導入が困難である、入手困難な場合があるといったように、多くの制約がある。
【０００４】
蛍光性Ｋ＋プローブにはこのように多くの厳しい制約があるため、蛍光顕微鏡検査および／または蛍光光度計の使用による有効な定量的Ｋ＋イメージングは、事実上不可能である。
【０００５】
Ａｓｈｒａｆらは、カリウム結合タンパク質（Ｋｂｐ）が、高Ｋ＋濃度での大腸菌の正常増殖に必要な細胞質カリウムセンサとしてｉｎ  ｖｉｖｏにおいて働いている可能性を開示している（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２０１６，Ｍａｙ  ３；２４（５）７４１−９）。
【０００６】
ＷＯ０１／０４６２３Ａ１は、蛍光標識された環状ペプトリド（デプシペプチド）、および試料中のカリウムイオン濃度を光学的に求めるためのその使用を開示している。
【０００７】
ＵＳ２０１３／２４４８９１Ａ１は、活性化可能なアクセプターであるフルオロゲン（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎ）と、被検物質と相互作用する環境感受性のドナーとが、リンカーを介して連結したものを含む、バイオセンサを開示している。
【０００８】
ＷＯ２０１２／１１２４４０Ａ２は、カリウムイオンセンサとして機能し得る蛍光性のコポリマーを開示している。
【０００９】
ＵＳ２００３／１１９１９５Ａ１は、カリウムセンサとしての、蛍光性のアントラセン（ａｎｔｈｒａｚｅｎｅ）に基づくフルオロイオノフォアを開示している。
【００１０】
上述される先行技術に鑑みて、さらなるＫ＋センサの提供が依然として必要とされている。ただ、たとえば近接性に基づくプローブを構築することが困難であるために、このようなセンサの開発は困難である。今までのところ、遺伝学的にコードされたセンサにおいてリガンド結合が及ぼす立体効果が、蛍光消光またはフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）などにより検出可能な立体構造変化を誘導し得るか否かということを、確実には予測できない。したがって、遺伝学的にコードされたセンサが適切なものであるか否かは、ケースバイケースで、個々の結合ドメインと、リガンド結合時における個々の結合ドメインの立体構造変化の程度および安定性と、結合モジュールと検出ドメインとの間にリンカー配列がある場合はそのリンカー配列とに依存する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、本発明の目的は、Ｋ＋を検出するために好適な新規剤の提供である。
さらに、本発明の別の目的は、試料中のＫ＋を検出するための新規方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
概要
上述される本発明の目的は、以下のようなポリペプチドによって解決される。このポリペプチドは、
ａ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｂ）カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
ｂ１）配列番号１の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第１のドメインと、
ｂ２）配列番号２の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第２のドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第１のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる。
【００１３】
一態様において、本発明は、Ｋ＋を検出するために好適なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
一態様において、本発明は、真核生物または原核生物の遺伝子発現に好適な本発明に係るポリペプチドをコードするベクターに関する。
【００１５】
別の一態様において、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチド、ベクター、またはポリペプチドを含む細胞に関する。
【００１６】
さらなる一態様において、本発明は、試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための方法であって、
ａ）本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
ｂ）本発明に係るポリペプチドを試料と接触させる工程、
ｃ）第１のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに／または
ｄ）第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
【００１７】
さらなる一態様において、本発明は、試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための、本発明に係るポリペプチドの使用に関する。
【００１８】
さらに別の一態様において、本発明は、正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するためのキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｋ＋がＢＯＮドメインに結合すると生じるポリペプチドの立体構造変化を示す全体概略図である。この立体構造変化によって、検出可能なＦＲＥＴシグナルが増加する。
【図２】本発明に係るＦＲＥＴに基づくポリペプチドを示す。具体的には、以下の通りである。（ａ）ＧＥＰＩＩ  １．０およびＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０とよばれる２種のポリペプチドの全体概略図。（ｂ）Ｒ−ＧＥＰＩＩ  １．０の予測される三次元構造。（ｃ）ＧＥＰＩＩ  １．０（左の２つのパネル）またはＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０（右の２つのパネル）のいずれかを発現するＨｅＬａ細胞。スケールバーは１０μｍを表す。（ｄ）異なるＫ＋濃度を添加および除去すると生じる、ＧＥＰＩＩ  １．０の経時的なＥＣＦＰ、ＦＲＥＴシグナル（左パネル）、およびＦＲＥＴ比率シグナル（中央パネル）。右パネルは、透過処理（３μＭジギトニン＋２μＭバリノマイシン）したＨｅＬａ細胞におけるＧＥＰＩＩ  １．０の濃度応答曲線を示す。ＥＣ５０＝２．０４（１．７１６〜２．４１３）ｍＭ、Ｎ＝１０。（ｅ）バリノマイシン（１０μＭ）処理したＨｅＬａ細胞における、Ｒ−ＧＥＰＩＩ  １．０の、経時的な、代表的なＦＲＥＴ比率シグナル（左パネル）、Ｃｌｏｖｅｒシグナル（中央パネル）、およびＦＲＥＴシグナル（右パネル）。
【図３】Ｋ＋結合ＢＯＮドメインの予測される三次元構造（ａ、ｂ）である。図中、酸性アミノ酸が強調表示されている。図３（ｃ）は、互いに最も近接する２つの酸性アミノ酸の間の距離を示す。図３（ｄ）は、予測される孔直径とＫ＋イオンを示す。そして図３（ｅ）は、水和Ｋ＋イオンと非水和Ｋ＋イオンの半径を示す。
【図４】ＨｅＬａ細胞において発現された、異なる標的指向性配列を有するまたは有さないＧＥＰＩＩ１．０バリアントの共焦点画像である。パネルａ中のスケールバーは１０μｍを表す。（ａ）標的指向性配列を全く有さないＧＥＰＩＩ  １．０、（ｂ）核外輸送配列ＮＥＳを有するＧＥＰＩＩ  １．０、（ｃ）核先導配列ＮＬＳを有するＧＥＰＩＩ  １．０、（ｄ）ミトコンドリア標的指向性配列（ＣＯＸ８のタンデム二量体反復配列）を有するＧＥＰＩＩ  １．０、（ｅ）ＥＲ標的指向性配列（カルレティキュリン由来、Ｎ末端）とＣ末端にＫＤＥＬ残留配列を有するＧＥＰＩＩ、（ｆ）ＧＰＩアンカーを含むＧＥＰＩＩ  １．０、（ｇ）エメリンのＣ末端に融合させることにより、核周辺へ標的指向化したＧＥＰＩＩ  １．０、および（ｈ）形質膜下領域におけるＫ＋を監視するためのＣＡＡＸ−ＧＥＰＩＩ  １．０。これらの画像により、ポリペプチドが細胞の標的細胞小器官内または標的サブドメイン内に位置することが示される。
【図５】３ｍＭのＫ＋、Ｎａ＋、Ｃａ２＋、Ｒｂ＋、またはＣｓ＋それぞれに応答して生じる、精製ＧＥＰＩＩ  １．０の最大デルタＦＲＥＴ比率シグナルである。Ｋ＋について得られた比率が最も高い。Ｎａ＋およびＣａ２＋が示した比率が最も低い。実験は、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ蛍光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて行なった。０．０５％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００含有ＨＥＰＥＳバッファー溶液（ｐＨ：７．３）中における精製ＧＥＰＩＩ  ２００ｎＭについて、３ｍＭのＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＲｂＣｌ、またはＣｓＣｌの非存在下または存在下の両方において分析した。ＧＥＰＩＩ含有溶液８０μｌを、マルチウェルプレート（９６ウェル、蛍光分析用、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍuｎｓｔｅｒ、オーストリア）に移し、４３０ｎｍ±１０ｎｍにて照射した。４７５ｎｍ±１０ｎｍおよび５２５ｎｍ±１０ｎｍのそれぞれにおいて発光が収集された。ＦＲＥＴ比率の値（Ｆ５２５／Ｆ４７５）を計算し、それぞれ、１価イオンおよび２価イオンの非存在下におけるＧＥＰＩＩのＦＲＥＴ比率の値と対応づけた。
【図６】本発明に係るポリペプチドを適用し得る用途を示す。少量の生物試料（たとえば、ヒトまたはマウス試料）中のカリウム濃度をＫ＋非含有バッファーを用いて希釈してよく、次いで、本発明に係るポリペプチドを添加し、たとえばマルチウェルプレート中において、カリウムイオン濃度をＦＲＥＴによって検出する（Ａ）。精製ＧＥＰＩＩを用い、実験用マウスを犠牲死させることなくその顔面静脈または眼窩（Ｂ）のいずれかから採取した少量の血液試料（３０μｌ以下）中のＫ＋血清濃度を求めた。各ＧＥＰＩＩ  ＦＲＥＴ比率の値を用いて、パネルＣに示される直線較正フィッティングにより、Ｋ＋血清レベルを求めた。図示されるように、ＨＥＰＥＳバッファー溶液中にて６通りの規定Ｋ＋濃度を用いて、検量線を得た。マウス血清をＨＥＰＥＳバッファーで１：１２．５に希釈し、９６ウェル中においてＧＥＰＩＩ溶液と混合して、最終希釈倍率１：２５とした。これらの試料のＦＲＥＴ比率シグナルを、ＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ蛍光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて測定した。（Ｄ）４匹の異なるマウスの精製ＧＥＰＩＩ  １．０を用いて求めたＫ＋血清値（ｍＭ）。マウスの顔面静脈（赤色の丸）または眼窩（青色の四角）のいずれかから、血液を採取した。血液採取の方法はＫ＋値に影響を及ぼさなかった。（Ｅ）パネルＤに示される結果を、血液採取法別にプロットしたもの。（Ｆ）５匹の異なるマウスの血清の精製ＧＥＰＩＩ  １．０を用いて、血液採取後すぐ（０時間）、血液採取の２時間後、および血液採取の４時間後に求めたＫ＋値。このデータから、ＧＥＰＩＩ  １．０が長時間にわたりマウス血清中において機能を維持することが示される。（Ｇ）パネルＦに示される結果を、血液採取後にＦＲＥＴ測定を行なった時間別にプロットしたもの。
【図７】パネルＡは、精製ＧＥＰＩＩを用いて、（マルチウェル）細胞培養プレートにおける細胞外Ｋ＋濃度を動的かつ経時的に記録し、細胞生存力のエネルギー尺度としたものを、概略的に示す。グルコースなどの基質を与えた細胞は、生存していて、細胞外Ｋ＋５ｍＭ以下かつ細胞内Ｋ＋１３０ｍＭ以下にて生理的Ｋ＋勾配を維持している。こうした条件下において、細胞死およびＫ＋放出を呈した細胞はわずかであった。一方、２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）などの毒性代謝拮抗剤で処理した細胞は、細胞死およびＫ＋放出を呈し、その結果、上清中で増加している。（Ｂ）精製ＧＥＰＩＩ  １．０（ｃ＝５００ｎＭ）を用いて９６ウェル中で測定した、細胞外にある培地の経時的なＫ＋濃度。膵臓ベータ細胞クローン（ＩＮＳ−１）を、１０ｍＭグルコース（青色の曲線、コントロール）または１０ｍＭの２−ＤＧ（赤色の曲線）の存在下において維持した。図示されるように、１４時間の時点で、コントロール細胞を５０μＭジギトニンで処理した。この時点で、細胞のＫ＋放出が最大であった。上述されるＣＬＡＲＩＯｓｔａｒ蛍光マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて、ＧＥＰＩＩのＦＲＥＴ比率シグナルを求めた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
以下において本発明を詳細に記載するに先立ち、本発明が、本明細書中に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されず、これらは多様であるということが理解される。また、本明細書中において用いられる専門用語は、具体的な実施形態について説明する目的でのみ記載されており、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は付属の請求項によってのみ限定される、ということも理解される。特に定義がなければ、本明細書中において用いられるすべての科学技術用語は、当技術分野において通常の知識を有する者が共通して理解する意味と同じ意味を有する。
【００２１】
本明細書の記載全体を通していくつかの文献が引用されており、その全体が引用により本明細書に援用される。ただし、本明細書中に記載される内容は、本発明が先発明の効によってそれらの開示内容に先行する権利がないと認めるものとして解釈されない。
【００２２】
上述されるＫ＋結合タンパク質（Ｋｂｐ）は、ＹｇａＵとしても知られ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）に由来する１６ｋＤａの可溶性細胞質タンパク質である。特異性の高いＫ＋結合タンパク質であり、高レベルの外部Ｋ＋存在下における正常な増殖に必要とされる。カリウムイオンはＢＯＮドメイン（配列番号１）にのみ結合し、結合すると立体構造変化が生じる。ＫｂｐはさらにＬｙｓＭドメイン（配列番号２）を含み、ＬｙｓＭドメインはＢＯＮドメインと相互作用し得る。
【００２３】
ＢＯＮドメイン、ＬｙｓＭドメイン、および全長Ｋｂｐのアミノ酸配列が、以下の表１に示される。
【００２４】
表１．ＫｂｐのＢＯＮドメインおよびＬｙｓＭドメインの配列
【００２５】
【表１】
2020521118.tif 000002
【００２６】
驚くべきことに、以下のような融合タンパク質によってＫ＋検出が可能であることが見いだされた。その融合タンパク質は、
ａ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｂ）カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
ｂ１）配列番号１の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第１のドメインと、
ｂ２）配列番号２の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第２のドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第１のシグナル伝達ドメインは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、検出可能なシグナルを生成できる。
【００２７】
Ｋ＋がカリウムセンサに結合することにより、このカリウムセンサの立体構造変化がトリガされてよく、この立体構造変化は、次いで、シグナル伝達ドメインを介して検出されてよい。この原理が、本発明に係るポリペプチドの１つを例にとって、図１中に例示される。本明細書中において、本発明に係るポリペプチドは、遺伝学的にコードされたカリウムイオン指標（Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｅｎｃｏｄｅｄ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒ；ＧＥＰＩＩ）ともよばれる。
【００２８】
好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインは、蛍光タンパク質ドメインである。さらにより好ましいことには、第１のシグナル伝達ドメインは、シアン蛍光タンパク質であり、好ましくは、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６の配列との同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるアミノ酸配列を含んでよいシアン蛍光タンパク質である。
【００２９】
好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインは、蛍光タンパク質ドメインである。理論に拘束されるものではないが、第１のシグナル伝達により生成される検出可能なシグナルは、蛍光タンパク質ドメインの蛍光シグナルの消光であってよい。好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端までにおいて、
ｉ）カリウムセンサの第１のドメインと
ｉｉ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｉｉｉ）カリウムセンサの第２のドメインとを含む。
【００３０】
第１のシグナル伝達ドメインは、任意に、リンカー配列の後ろおよび／または前に位置してよい。
【００３１】
さらに別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端までにおいて、ｉ）カリウムセンサの第１のドメインと、
ｉ）カリウムセンサの第２のドメインと、
ｉｉ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｉｉｉ）カリウムセンサの第１のドメインとを含む。
【００３２】
第１のシグナル伝達ドメインは、任意に、リンカー配列の後ろおよび／または前に位置してよい。
【００３３】
カリウムセンサの第１のドメインは、ＫｂｐのＢＯＮドメインに基づく。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む。別の好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、配列番号１の配列との同一性が少なくとも１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００３４】
別の好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第１のドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号１のアミノ酸配列を含む。好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列は、置換を約１〜約１１個含む。好ましい一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｄ４１Ｎ、Ｄ４３Ｎ、Ｄ５１Ｎ、Ｄ５９Ｎ、Ｅ６４Ｑ、Ｄ８３Ｎ、Ｄ８４Ｎ、Ｑ２６Ｒ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ７５Ｑ、またはＧ５２Ｄからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、カリウムセンサの第１のドメインのためのアミノ酸配列として、Ｑ２６Ｒ、Ｎ３５Ｑ、Ｎ７５Ｑ、Ｇ５２Ｄの置換を有する配列番号０１のアミノ酸配列（配列番号５）を含む。
【００３５】
カリウムセンサの第２のドメインは、ＫｂｐのＬｙｓＭドメインに基づく。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む。別の好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、配列番号２の配列との同一性が少なくとも１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００３６】
別の好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、少なくとも１つのアミノ酸置換を有する配列番号２のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサの第２のドメインは、置換を約１〜約１１個含む配列番号２のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１２５Ｑ、Ｄ１３５Ｎ、Ｎ１１６Ｑ、Ｎ１１８Ｑ、Ｎ１２１Ｑ、およびＮ１２７Ｑからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、カリウムセンサの第２のドメインのアミノ酸配列として、Ｄ１０４Ｎ、Ｅ１２５Ｑ、Ｄ１３５Ｎの置換を有する配列番号２のアミノ酸配列（配列番号４）を含む。配列中におけるアミノ酸の番号付けは、Ｋｂｐの野生型配列（配列番号３）を基準とする。
【００３７】
表２は、ＫｂｐならびにＢＯＮおよびＬｙｓドメインのバリアントの各々のアミノ酸配列の概要を示す。
【００３８】
表２：ＫｂｐならびにＢＯＮおよびＬｙｓドメインのバリアント
【００３９】
【表２】
2020521118.tif 000003
【００４０】
本発明は、さらに、ポリペプチドであって、
ａ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｂ）カリウムセンサとを含み、カリウムセンサは、
ｂ１）配列番号１の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第１のドメインと、
ｂ２）配列番号２の配列との同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を含む、カリウムセンサの第２のドメインとを含み、
さらに、
ｃ）第２のシグナル伝達ドメインとを含み、
カリウムセンサは、正電荷を帯びたカリウムイオンを結合でき、第１のシグナル伝達ドメインと第２のシグナル伝達ドメインとは、正電荷を帯びたカリウムイオンがカリウムセンサに結合すると、連携して、検出可能なシグナルを生成できる、ポリペプチドにも関する。好ましくは、検出可能なシグナルは、Ｋ＋がカリウムセンサに結合すると生成されてよい。Ｋ＋の結合は、たとえば、カリウムセンサにおける立体構造のシフトを誘導してよく、次いで、第１のシグナル伝達ドメインと第２のシグナル伝達ドメインとを互いに近づけるまたは互いから引き離すことにより、検出可能なシグナルの生成に少なくとも寄与してよい。好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインと第２のシグナル伝達ドメインとのペアは、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペア、分割型酵素（ｓｐｌｉｔ−ｅｎｚｙｍｅ）のペア、または分割型蛍光タンパク質（ｓｐｌｉｔ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のペアからなる群より選択され、第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインは１つのペアの各部分（たとえば、分割型酵素の半分ずつまたは分割型蛍光タンパク質の半分ずつ）である。好ましくは、Ｋ＋がカリウムセンサに結合することにより、ポリペプチドにおける立体構造のシフトが誘導されてよく、次いで、第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインが、検出可能なシグナルを生成できてよい。たとえば、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアが、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生成してよい、または、分割型酵素の半分ずつが機能可能となり、検出可能なシグナルを生成できる反応を触媒してよい、または、分割型蛍光タンパク質の半分ずつが、適切な範囲の波長を有する光によって励起された場合に、検出可能なシグナルとして、特定波長の光を放射できてよい。
【００４１】
好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインは、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアである。好ましくは、ドナーはシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）ドメインであってよく、アクセプターは、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）ドメインであってよい。より好ましくは、第１のシグナル伝達ドメインはドナーであってよく、第２のシグナル伝達ドメインはアクセプターであってよい。さらにより好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインはドナーでＣＦＰドメインであり、第２のシグナル伝達ドメインはアクセプターでＹＦＰドメインである。また、好ましくは、ＣＦＰドメインは、配列番号６のアミノ酸配列または配列番号６の配列との同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるアミノ酸配列を含んでよく、励起波長および蛍光発光波長は、配列番号６のＣＦＰドメインについてのものと同一または実質的に同一である、すなわち、励起ピークの波長が約４３６ｎｍであり、発光ピークの波長が約４７７ｎｍである。好ましくは、ＹＦＰドメインは、循環置換ｖｅｎｕｓ（ｃｉｒｃｕｌａｒｌｙ  ｐｅｒｍｕｔｅｄ  ｖｅｎｕｓ）（ＣＰＶ）タンパク質であってよく、この、循環置換ｖｅｎｕｓ（ＣＰＶ）タンパク質は、さらにより好ましくは、配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７の配列との同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるアミノ酸配列を含み、励起波長および蛍光発光波長は、配列番号７のＹＦＰドメインについてのものと同一または実質的に同一である、すなわち、励起ピークの波長が約５１４ｎｍであり、発光ピークが約５２７ｎｍである。
【００４２】
別の好ましい一実施形態において、ドナーはＣｌｏｖｅｒドメインであってよく、アクセプターはｍＲｕｂｙ２ドメインであってよい。より好ましくは、第１のシグナル伝達ドメインはドナーであってよく、第２のシグナル伝達ドメインはアクセプターであってよい。また、好ましくは、Ｃｌｏｖｅｒドメインは、配列番号８のアミノ酸配列または配列番号８の配列との同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるアミノ酸配列を含んでよく、励起波長および蛍光発光波長は、配列番号８のＣｌｏｖｅｒドメインについてのものと同一または実質的に同一である、すなわち、励起ピークの波長が約５０５ｎｍであり、発光ピークの波長が約５１５ｎｍである。好ましくは、ｍＲｕｂｙ２ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列または配列番号９の配列との同一性が少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％であるアミノ酸配列を含み、励起波長および蛍光発光波長は、配列番号９のｍＲｕｂｙ２ドメインについてのものと同一または実質的に同一である、すなわち、励起ピークの波長が約５５９ｎｍであり、発光ピークが約６００ｎｍである。
【００４３】
表３は、配列番号６〜９のアミノ酸配列を示す。
表３：シグナル伝達ドメインのアミノ酸配列
【００４４】
【表３】
2020521118.tif 000004
【００４５】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ＧＥＰＩＩ  １．０（配列番号１３）またはＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０（配列番号２１）のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
別の好ましい一実施形態において、第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインは、標識フルオレセイン分子、または他の小分子フルオロフォア、または検出可能な部位などの、翻訳後修飾を含む。Ｋ＋がカリウムセンサに結合すると第１のシグナル伝達ドメインが第２のシグナル伝達と連携して検出可能なシグナルを生成することに、これらが寄与してよい。
【００４７】
別の好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、Ｋｂｐのアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも７５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも８５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも９０％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態において、カリウムセンサは、配列番号３の配列との同一性が少なくとも１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端までにおいて、
ｉ）第１のシグナル伝達ドメインと、
ｉｉ）カリウムセンサであって、好ましくはカリウムセンサの第１のドメインがカリウムセンサの第２のドメインの前に位置する、カリウムセンサと、
ｉｉｉ）第２のシグナル伝達ドメインとを含む。
【００４９】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含んでよい。リンカーは、その構造が好ましくはフレキシブルであってリジッドではなく、検出可能なシグナルの感受性を改変してよい。リンカーアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列において、第１のシグナル伝達グループ、カリウムセンサの第１のドメイン、カリウムセンサの第２のドメイン、および第２のシグナル伝達ドメインのうちいずれか２つの間に位置してよい。好ましい一実施形態において、リンカーアミノ酸配列は、カリウムセンサの第１のドメインのアミノ酸配列の後ろで、かつ、カリウムセンサの第２のドメインの前に位置する。しかしながら、説明するまでもないが、リンカードメインは、カリウムセンサと第１のシグナル伝達ドメインとの間、またはカリウムセンサと第２のシグナル伝達ドメインとの間に位置してもよい。
【００５０】
一実施形態において、リンカーは、アミノ酸配列−ＧＧＧＧ−を含有する。
好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、さらに、式（Ｉ）のリンカーアミノ酸配列を少なくとも１つ含む。
【００５１】
−（ＧＧＳ）ｘ（ＧＧＧＧＳ）ｙ（ＧＧ）ｚ−  （Ｉ）
式中、
ｘは整数０または１であり、
ｙは整数１〜６であり、
ｚは整数０または１である。
【００５２】
好ましい一実施形態において、ｙは４ではない。
好ましい一実施形態において、ｙは２、３、または５である。
【００５３】
好ましい一実施形態において、ｘは０、ｙは１、かつｚは１である。この実施形態において、さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【００５４】
別の好ましい一実施形態において、ｘは０、ｙは２または３、かつｚは０である。この実施形態において、さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１５または配列番号１６のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
さらに別の好ましい一実施形態において、ｘは０、ｙは４、かつｚは１である。この実施形態において、さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【００５６】
別の好ましい一実施形態において、ｘは１、ｙは５、かつｚは０である。この実施形態において、さらに好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１８、配列番号１９、または配列番号２０のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
生体系において細胞外Ｋ＋レベルの典型的な範囲は約１ｍＭ〜約１０ｍＭであることが知られている。その一方、細胞内のサイトゾルおよび小器官のＫ＋濃度の典型的な範囲は約１００ｍＭ〜３００ｍＭである。例示から明らかとなるが、本発明に係るポリペプチドは、異なるＫ＋感受性を提供してよく、これは、上述されるとおり、配列番号１および／または配列番号２におけるリンカー配列またはアミノ酸置換の存在に依存してよい。したがって、ここで理解される必要があるのは、熟練した人であれば用途に応じた好適な感受性を有する本発明に係るポリペプチドを使用するであろうということである。たとえば、熟練した人であれば、細胞外Ｋ＋レベルを測定する際には、ＥＣ５０値が比較的低い、すなわち２０ｍＭ以下、好ましくは１０ｍＭ以下、より好ましくは約５ｍＭであるポリペプチドを使用し、細胞内Ｋ＋濃度を測定する際には、ＥＣ５０値がこれより高い、すなわち、約１０〜約３００ｍＭ、好ましくは約５０〜約１５０ｍＭである、本発明に係るポリペプチドを使用するであろう。本明細書中におけるＥＣ５０値は、例４中に記載される方法によって得られるＥＣ５０値を指す。
【００５８】
したがって、好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、約１０〜約３００ｍＭのＥＣ５０値を提供する。このポリペプチドは、細胞内Ｋ＋を検出するために特に好適であってよい。
【００５９】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、細胞外Ｋ＋の測定にあたり、約２０ｍＭ以下、好ましくは約５ｍＭのＥＣ５０値を提供する。
【００６０】
別の好ましい一実施形態において、ポリペプチドは、標的指向性配列をさらに含む。標的指向性配列は、ポリペプチドを、細胞の標的小器官もしくは標的サブドメインまたは細胞外分泌物へと指向させるアミノ酸配列である。標的小器官および標的サブドメインには、たとえば、核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、細胞表面、核膜、および形質膜下領域が含まれてよい。標的指向性配列は、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置してよい。たとえばアミノ酸配列ＬＰＰＬＥＲＬＴＬをポリペプチドのＣ末端に付加するなどのように、核外輸送配列を付加することによって、その結果、ポリペプチドがサイトゾル内にのみ局在化してよい。Ｃ末端に核先導配列（ＫＲＳＷＳＭＡＦＣ）を付加することによって、その結果、核が標的とされてよい。ミトコンドリアは、ＣＯＸ８のタンデム二量体反復配列などの、ミトコンドリア標的指向性配列によって、標的とされてよい。ＥＲ標的指向性配列の例には、Ｎ末端のカルレティキュリンのＥＲ標的指向性配列と本発明に係るポリペプチドのＣ末端のＫＤＥＬ残留配列とが含まれる。たとえば、ＧＰＩアンカー配列により、ポリペプチドが細胞表面へと指向されてよい。核周辺標的配列の例にはエメリンが含まれ、この場合、本発明に係るポリペプチドの配列はエメリンのＣ末端に融合される。形質膜下領域標的指向性配列の例は、ＧＴＰアーゼ  ＫｒａｓアイソフォームｂのＣＡＡＸドメインであり、これは、たとえば、配列ＭＳＫＤＶＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭが本発明に係るポリペプチドのＣ末端に融合されたものを有する。
【００６１】
好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、単離されたポリペプチドである。
【００６２】
別の一態様において、本発明は、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００６３】
遺伝暗号に縮重があるため、本発明に係る任意のポリペプチドが異なるヌクレオチド配列によってコードされてよいことが、当業者には明らかであろう。
【００６４】
好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの長さは、ヌクレオチド９０００個未満、ヌクレオチド８０００個未満、ヌクレオチド７０００個未満、ヌクレオチド６０００個未満、ヌクレオチド５０００個未満、ヌクレオチド４０００個未満、ヌクレオチド３０００個未満、ヌクレオチド２０００個未満、ヌクレオチド１０００個未満、またはヌクレオチド５００個未満である。
【００６５】
さらに好ましい一実施形態において、本発明に係る単離されたポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド２４〜９０００個、好ましくは少なくともヌクレオチド２４〜８０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド２４〜７０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド２４〜６０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド２４〜５０００個、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド２４〜４０００個である。別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド６０〜９０００個、好ましくは少なくともヌクレオチド６０〜８０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド６０〜７０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド６０〜６０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド６０〜５０００個、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド６０〜４０００個である。さらに好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド９０〜９０００個、好ましくは少なくともヌクレオチド９０〜８０００個、より好ましくは少なくとも９０〜７０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド９０〜６０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド９０〜５０００個、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド９０〜４０００個である。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド１２０〜９０００個、好ましくは少なくともヌクレオチド１２０〜８０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド１２０〜７０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド１２０〜６０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド１２０〜５０００個、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド１２０〜４０００個である。さらに別の好ましい一実施形態において、本発明に係る単離されたポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド３００〜９０００個、好ましくは少なくともヌクレオチド３００〜８０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド３００〜７０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド３００〜６０００個、より好ましくは少なくともヌクレオチド３００〜５０００個、さらにより好ましくは少なくともヌクレオチド３００〜４０００個である。
【００６６】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドの長さは、少なくともヌクレオチド３００個、少なくともヌクレオチド４００個、少なくともヌクレオチド１０００個、少なくともヌクレオチド２０００個、または少なくともヌクレオチド２５００個である。
【００６７】
好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０の配列との同一性が少なくとも８０％である配列を含む、またはこうした配列からなる。さらに好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である配列を含む、またはこうした配列からなる。特に好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１０の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％である配列を含む、またはこうした配列からなる。
【００６８】
好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列との同一性が少なくとも８０％である配列を含む、またはこうした配列からなる。さらに好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である配列を含む、またはこうした配列からなる。特に好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１１の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％である配列を含む、またはこうした配列からなる。
【００６９】
好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列との同一性が少なくとも８０％である配列を含む、またはこうした配列からなる。さらに好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、さらにより好ましくは少なくとも９２％、さらにより好ましくは少なくとも９３％、さらにより好ましくは少なくとも９４％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９６％、さらにより好ましくは少なくとも９７％、さらにより好ましくは少なくとも９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％である配列を含む、またはこうした配列からなる。特に好ましい一実施形態において、本発明に係るポリヌクレオチドは、配列番号１２の配列との同一性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９８％である配列を含む、またはこうした配列からなる。
【００７０】
配列番号１０〜１２の配列が、以下の表４に示される。
表４：ＢＯＮドメイン、ＬｙｓＭドメイン、およびＫｂｐをコードするヌクレオチド配列
【００７１】
【表４】
2020521118.tif 000005
【００７２】
本発明に係るポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ分子であってよい。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本発明に係る単離されたポリヌクレオチドは、発現ベクターなどのベクター中に挿入されてよい。発現ベクターは、たとえば、単離されたプラスミド、ミニ染色体、コスミド、バクテリアファージ、レトロウイルスベクター、または当業者に既知の任意の他のベクターといった、原核生物または真核細胞発現ベクターなどであってよい。当業者であれば、具体的なニーズに合う適切なベクターをどのように選択するかということに精通しているであろう。好ましい一実施形態において、発現ベクターは、単離されたプラスミドである。
【００７４】
したがって、本発明は、本発明に係るポリヌクレオチドを含む発現ベクターにも関する。
【００７５】
一態様において、本発明は、上記ポリペプチド、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクター、および／またはプラスミドを含む細胞に関する。上記細胞は、ヒト胚性幹細胞ではない。細胞の例には、細胞のトランスフェクションまたは形質転換など当業者に広く周知される方法によって遺伝子改変されていてよい、哺乳類細胞、ヒト細胞、もしくは植物細胞などの真核細胞または原核細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養細胞または細胞溶解物が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
一態様において、本発明は、試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための方法であって、
ａ）本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
ｂ）本発明に係るポリペプチドを接触させる工程、
ｃ）第１のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化によって、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
【００７７】
一態様において、本発明は、試料中における正電荷を帯びたカリウムイオンを検出するための方法であって、
ａ）本発明に係るポリペプチドを提供する工程、
ｂ）本発明に係るポリペプチドを接触させる工程、
ｃ）第１のシグナル伝達ドメインが生成したシグナルを測定する工程、ならびに／または
ｄ）第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインが連携して生成したシグナルを測定する工程を含み、
試料との接触後に生じるシグナル強度の変化によって、試料中にカリウムイオンが存在することが示される、方法に関する。
【００７８】
ポリペプチドを提供する工程ａ）は、人体の外で行なわれる。
上記方法の一実施形態において、試料の非存在下でのポリペプチドのシグナルと比較した、試料との接触後に生じるシグナル強度の変化により、試料中にＫ＋が存在することが示される。
【００７９】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係る方法は、（定量的な）ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング法である。
【００８０】
好ましい一実施形態において、測定されるシグナルは、蛍光シグナル、発色シグナル、またはＦＲＥＴシグナルである。好ましくは、シグナルは、本発明に係るポリペプチドのカリウムセンサにＫ＋が結合すると生成されてよい。好ましい一実施形態において、シグナルは、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペア、分割型酵素のペア、または分割型蛍光タンパク質のペアによって生成されてよい。検出は、当業者に広く周知される方法によって行なわれてよい。
【００８１】
一実施形態において、測定されるシグナルは、蛍光シグナルである。好ましい一実施形態において、蛍光シグナルは、Ｋ＋がカリウムセンサドメインに結合することによって消光される。
【００８２】
より好ましい一実施形態において、測定される検出可能なシグナルは、ＦＲＥＴシグナルである。好ましくは、ＦＲＥＴシグナルは、第１のシグナル伝達ドメインおよび第２のシグナル伝達ドメインによって生成される。より好ましくは、ＦＲＥＴシグナルは、ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペア、好ましくは、ＣＰＶなどのＹＦＰとＣＦＰとによって生成される。当業者であれば、ＦＲＥＴシグナルをどのように測定するかについて認識している。好ましくは、ＹＦＰとＣＦＰとの間のＦＲＥＴは、約４２０ｎｍ〜約４５０ｎｍの範囲の波長を有する光による励起の後に測定される。より好ましくは、測定は、約４４０ｎｍの光による励起の後に行なわれる。また、好ましくは、光の発光は、約５２５ｎｍ〜約５４５ｎｍの範囲、より好ましくは約５３５ｎｍの波長において測定される。
【００８３】
別の好ましい一実施形態において、ＦＲＥＴのペアは、ＹＦＰおよびＣＦＰの代わりに、ＣｌｏｖｅｒおよびｍＲｕｂｙ２である。この場合、ＦＲＥＴシグナルは、４７０ｎｍ〜約４９０ｎｍでの励起ならびに／または約５１０ｎｍ〜５２０ｎｍ（発光１）および５９０ｎｍ〜約６１０ｎｍ（発光２）の範囲の光の発光の後に測定される。
【００８４】
好ましい一実施形態において、Ｋ＋を検出するための方法の工程ａ）、すなわち、本発明に係るポリペプチドの提供は、少なくとも１つの細胞をヒトもしくは動物の生体外でトランスフェクションすること、または、本発明に係るポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、プラスミド、および／もしくは発現ベクターを用いて原核細胞を形質転換することを含んでよい。したがって、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞のタンパク質合成によって提供されてよい。したがって、本発明に係るポリペプチドは、上記細胞から単離されてもよい、または、上記細胞によって分泌されてよい、または、上記細胞の内部に留まってもよい。別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、本発明に係る方法の工程ａ）において本発明に係る細胞を提供することによって、提供されてよい。
【００８５】
好ましい一実施形態において、本発明に係る方法は、任意の種類の試料中におけるカリウムイオンの存在を検出してよい。より好ましくは、試料は、生物試料または液体試料またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらにより好ましくは、試料は、細胞培養、細胞ペレット、細胞溶解物、ヒトもしくは動物由来の組織試料、血液、またはＫ＋を含有する液体である。一実施形態において、試料は、細胞単層培養または三次元細胞培養を含む細胞培養、細胞懸濁液、細胞ペレット、細胞溶解物、ヒトまたは動物由来の組織試料、およびＫ＋を含有する液体試料などの生物試料も含んでよい。したがって、本発明に係る方法は、好ましくは、Ｋ＋の存在および／または分布を検出することによって、そして任意に、細胞アポトーシス、細胞シグナル伝達、または細胞遺伝子発現などの、生物試料についての上記以外の関連パラメータを求めることとの組み合わせによって、Ｋ＋が生物試料に及ぼす影響を特徴づけるために使用されてよい。
【００８６】
したがって、一態様において、本発明に係るポリペプチドは、上述されるように試料中におけるＫ＋を検出するために使用されてよい。好ましい一実施形態において、本発明に係る使用は、（定量的）ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングにおける本発明に係るポリペプチドの使用を含む。「ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養した生細胞を単離したものについての顕微鏡観察などの、人体外における生細胞内のイメージングを指す。たとえば、本発明に係る細胞内ポリペプチドは、たとえば定義された刺激またはストレスに対する応答として、サイトゾル、形質膜下領域、核、小胞体、核膜、およびミトコンドリア中におけるＫ＋レベルの変化を呈してよい。
【００８７】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係る単離されたポリペプチドを、たとえばマルチウェルプレートなどの、好適な容器中において、生物試料と接触させてよく、カリウム濃度は、たとえばプレート蛍光リーダーを用いて、直接測定されてよい。本発明に係るポリペプチドを使用する１つの利点として、このようなアッセイに必要な試料の量が、電極を使用するカリウム濃度測定に必要な生物試料の量と比較して、少量（わずか約５〜１０μｌ）であろうということがある。電極を使用するカリウム濃度の測定では、Ｋ＋電極を十分に浸漬するために要する量が、典型的には、約１００〜１０００μｌ、またはそれより多い。したがって、このようなＫ＋電極を使用し、血液総量が１．５〜２．５ｍｌ（体重の６〜８％）である、マウスなどの実験用小動物を用いて、血清Ｋ＋濃度を求めるには、通常、最高血中濃度のために動物を犠牲死させる必要がある。
【００８８】
別の好ましい一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞死アッセイにおいて使用してよい。事実上すべての細胞型、特に興奮性細胞において、細胞膜を介するＮａ＋およびＫ＋勾配をＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼによって維持するには、非常に大きなエネルギーが必要となる。ストレス条件下においては、細胞は十分なエネルギーを得られるわけではないため、細胞の生存力が低下して、最終的には細胞死を生じるであろう。本発明のこの実施形態において、本発明に係る単離されたポリペプチドは、培養細胞の培養基に添加されて、培養基中のＫ＋濃度を経時的に監視するために使用されてよい。細胞の生存力が低下した場合、または細胞死の出現が増加した場合、培地中のＫ＋濃度は上昇するであろう。したがって、これが次いで、本発明に係るポリペプチドを使用して検出されてよい。このアッセイにおいて本発明に係るポリペプチドを使用することによって、現時点における最高技術水準の他の細胞死／生存力アッセイ（たとえば、ＭＴＴアッセイ、またはＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙなどのレサズリンに基づくアッセイ）のように細胞にさらに損傷を与えたりさらに影響を及ぼしたりせずに、リアルタイム測定が可能となるという利点が提供される。
【００８９】
別の一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、細胞増殖アッセイにおいて使用される。細胞の増殖中はＫ＋濃度が減少することが知られている。本発明に係る単離されたポリペプチドを培養細胞の培養基に添加することによって、細胞増殖の程度を監視することも可能である。たとえば、このアッセイは、増殖中の細菌細胞培養と、成長も増殖もしない死細胞が大半を占める細菌細胞培養とを区別するために使用されてよい。この判定を、たとえば細菌細胞培養の光学濃度（ＯＤ６００）測定などによる、現行の標準的な細菌増殖監視法によって行なうことは、不可能である。
【００９０】
さらに別の一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、動物の生体内での細胞外Ｋ＋変動を生体顕微鏡検査により、たとえば脳または筋肉の生体顕微鏡検査により、リアルタイムで可視化するためのセンサとして使用してよい。本発明に係るポリペプチドは、本願において、たとえば、動物に局所的に適用されてよい。この文脈において、本発明に係るポリペプチドは、たとえば、動物モデルの研究において、がんまたは癲癇、片頭痛、もしくは頭蓋脳外傷などの神経障害を調べるための研究手段として使用されてよい。
【００９１】
一態様において、本発明は、さらに、試料中におけるＫ＋を検出するためのキットであって、
ａ）本発明に係るポリペプチド、
ｂ）本発明に係るポリヌクレオチドもしくは本発明に係るベクター、および／または
ｃ）本発明に係る細胞のうち少なくとも１つを含む、キットにも関する。
【００９２】
このようなキットの例には、上述されるように細胞死または細胞生存力を判定するためのキットが含まれる。このようなキットは、本発明に係るポリペプチドに加えて、たとえば、
ａ）試料を希釈するための好適なＫ＋非含有バッファー、
ｂ）ポジティブコントロールとして、Ｋ＋濃度が既知である少なくとも１種の標準溶液、
ｃ）キットが複数種類の溶液を有する場合には、任意に、Ｋ＋濃度の異なる標準溶液（これら標準溶液を用いて検量線を得てよい）、または
ｄ）本発明に係るポリペプチドを希釈するための好適なバッファーのうち少なくとも１つを含んでよい。
【００９３】
本発明に係るポリヌクレオチドまたはベクターを含むキットは、コントロール試料を生成するために、シグナル伝達ドメインの一方のみまたはシグナル伝達ドメインの両方またはカリウムセンサのみをコードするプラスミドをさらに含んでよい。キットは、ポリヌクレオチドまたはベクターを希釈するための好適なバッファーをさらに含んでよい。
【００９４】
本発明に係る細胞を含むキットは、細胞のための好適な培養基および／または凍結保存培地をさらに含んでよい。
【００９５】
さらに別の一実施形態において、本発明に係るポリペプチドは、携帯式のＫ＋クイック試験キットにも使用されてよい。このような試験において、本発明に係るポリペプチドは、溶液中、好ましくはカリウム非含有溶液中に含まれてよい、または、固相もしくはビーズ上に固定されていてもよい。
【００９６】
定義
以下の定義が導入される。本明細書中および意図される請求項中において用いられる単数形「ａ」および「ａｎ」は、特記されない限り、それぞれの複数形をも含む。
【００９７】
「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」（含む）という用語ならびに「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの活用形は、限定的でないということが理解される。本発明の目的のために、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ」（からなる）という用語は、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という用語の好ましい形態であると考えられる。
【００９８】
以下の記載において、少なくともいくつかの実施形態を含むグループが定義される場合、このグループは、好ましくはこれらの実施形態のみからなるグループをも包含することが意味される。
【００９９】
本発明の文脈において、「約」および「およそ」または「実質的に同一の」という用語は、議論対象である特徴による技術的な効果が確保されると当業者が理解できる程度の、精度の間隔を指す。上記用語は、典型的には、示されている数値からの±１０％、好ましくは±５％のずれを包含する。
【０１００】
本明細書中において用いられる「ドメイン」という用語は、ポリペプチドまたは融合タンパク質を構築する構成要素を指す。したがって、用語「ドメイン」は、このドメインを除いたポリペプチド鎖または構造とは独立して折り畳みできる、および／または機能できる、および／または存在できるポリペプチドの部分を含む。たとえば、シアン蛍光タンパク質は、これが融合タンパク質の一部である場合に、ドメインであるとみなされる。本明細書中において用いられる用語「ドメイン」は、分割型酵素または分割型蛍光タンパク質の各部分をさらに含み、たとえ分割型酵素または分割型蛍光タンパク質の２つのドメインが一緒になった場合にのみ折り畳みおよび機能可能となるものであっても、各部分はドメインであるとみなされる。
【０１０１】
本明細書中において用いられる「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書中において、交換可能に用いられて、部分長または完全長タンパク質を含み得るタンパク質分子を指す。この用語は「融合タンパク質」を含み、「融合タンパク質」は、２つ以上のタンパク質に由来するアミノ酸配列を有するタンパク質またはポリペプチドを含む。融合タンパク質は、別個のタンパク質に由来するアミノ酸部分同士の間のアミノ酸連結領域をさらに含んでよい。
【０１０２】
本明細書中において用いられる「検出可能なシグナル」という用語は、生化学、化学、医学、または診断技術の技術分野において広く用いられるシグナルの増加または減少を指す。検出可能なシグナルの例には、電気的シグナル（たとえば、静電容量）、力学的シグナル、光学的シグナル、聴覚的シグナル、または熱的シグナルが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、光学的シグナルは、蛍光シグナル、ＦＲＥＴシグナル、発色シグナル、または電気化学発光シグナルであってよい。また、好ましくは、シグナルは検出可能であってよい。すなわち、シグナルおよびシグナルの各変化は、適切な技術的機器を用いて監視されてよい。好ましくは、検出可能なシグナルは、たとえばポリペプチドの立体構造変化によって誘導されるといったように、近接性依存的に生成または変化するシグナルであってよい。
【０１０３】
本明細書で用いられる「ＦＲＥＴ」という用語は、分子間または分子内における蛍光共鳴エネルギー移動を指す。ＦＲＥＴ法において、１つのフルオロフォアがエネルギードナーとして作用し、他の１つのフルオロフォアがエネルギーアクセプターとして作用できる。場合によっては、これらはそれぞれ、レポーターおよびクエンチャーとして知られる。ドナーは、光の特定の波長によって励起されてよく、これにより、ドナーは通常、蛍光発光波長を呈してよい。アクセプターもまた、ある波長において励起されてよく、これにより、アクセプターは、多様な距離依存的エネルギー伝達機構によって、ドナー分子の発光エネルギーを受け取ってよい。一般的に、アクセプターは、ドナーと近接している場合に、ドナーの発光エネルギーを受け取る。ドナーとアクセプターとは、別々の分子であってもよいし、または、たとえば１つのポリペプチドの２つの異なるドメインといったように、１つの分子における別々の部分であってもよい。ＦＲＥＴ測定技術は、当技術分野において周知である。
【０１０４】
本明細書中において用いられる「ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペア」という用語は、上述されるＦＲＥＴを行なうことのできるエネルギードナーとエネルギーアクセプターとにそれぞれ相当するフルオロフォアを指す。この文脈において、「フルオロフォア」という用語は、分子に蛍光を生じさせる分子の構成要素を指す。特定の波長の光を吸収して、異なる（しかし同じ様に特定の）波長の光を再放射できるのは、分子内の官能基である。放射される光の量および波長は、フルオロフォアと、フルオロフォアの化学的環境との両方に依存する。フルオロフォアは、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインの反応性誘導体、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、クマリン、シアニン３、シアニン５、もしくはシアニン７などのシアニン色素（Ｃｙ）、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  Ｖｉｃｔｏｒｉａ）もしくはウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはそのタンパク質バリアントである、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、およびＹｐｅｔを含む黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａ１などの青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔなどのシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ならびにＵｎａＧ、ｄｓＲｅｄ、ｍＲｕｂｙ２、Ｃｌｏｖｅｒ、ｅｑＦＰ６１１、Ｄｒｏｎｐａ、ＴａｇＲＦＰ、ＫＦＰ、ＥｏｓＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ、ＩｒｉｓＦＰ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＲｕｂｂｙ、ｍＫＯｋ、およびｍＫＯ２などの他の蛍光タンパク質といった蛍光タンパク質を含むが、これらに限定されない。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインの反応性誘導体、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、クマリン、シアニン（ｃｙａｎｉｎ）（Ｃｙ）などの小分子フルオロフォアは、タンパク質に結合してフルオロフォアとして作用してよい。ＦＲＥＴのドナーとアクセプターのペアとして使用してよいフルオロフォアの例には、ドナーとしてのＣＦＰおよびアクセプターとしてのＹＦＰ、ドナーとしてのＥＧＦＰおよびアクセプターとしてのＣｙ３、またはドナーとしてのＥＧＦＰおよびアクセプターとしてのＹＦＰ、またはドナーとしてのＣｌｏｖｅｒおよびアクセプターとしてのｍＲｕｂｙ２、またはドナーとしてのｃｐＥＧＦＰおよびアクセプターとしてのｍＫＯ２が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本明細書中において用いられる「分割型酵素（ｓｐｌｉｔ  ｅｎｚｙｍｅ）」という用語は、分割することにより、生物学的活性が少なくとも低減されたまたは生物学的活性を有さない少なくとも２つの部分になる、生理活性を有する酵素を指す。この文脈において、「分割型酵素のペア」という用語は、少なくとも部分的に不活性である少なくとも２つの酵素部分を指す。こうした酵素部分は、互いに近づくと相互作用して、生理活性を有する酵素を形成し、この酵素が、従来の酵素検出技術によって検出されてよい。分割型酵素技術についても、さらに、ＷＯ２００５／０９４４４１Ａ２に記載される。分割型酵素の例として、生物発光により再構成および監視できるウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）、比色、化学発光、または蛍光検出によって活性を監視できる補完分割型β−ガラクトシダーゼ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｓｐｌｉｔ  β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）、加水分解によるニトロセフィンの色変化またはＣＣＦ−２／ＡＭによる蛍光によって相補性をアッセイできる分割型β−ラクタマーゼ（ｓｐｌｉｔ  β−ｌａｃｔａｍａｓｅ）、ＧＴＰアーゼ（荷電の変化）、ペルオキシダーゼ（比色）、ヌクレアーゼ（エンドおよびエキソ開裂）、制限エンドヌクレアーゼ（配列特異的エンド開裂）、プロテアーゼ（タンパク質開裂）、リガーゼ（核酸オリゴのライゲーション）、およびチオール−ジスルフィド酸化還元酵素（ジスルフィド結合による立体構造変化）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
本明細書中において用いられる「分割型蛍光タンパク質（ＳＦＰ）のペア（ｓｐｌｉｔ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＳＦＰ）  ｐａｉｒｓ）」という用語は、蛍光タンパク質の少なくとも２つの部分を指す。ＳＦＰは、各々は非蛍光性であるが補完されると機能性蛍光分子を形成する複数のペプチドまたはポリペプチド断片から構成される。たとえば、分割型緑色蛍光タンパク質（分割型ＧＦＰ）はＳＦＰである。遺伝子工学により作製された分割型ＧＦＰ分子のいくつかは、自己集合する（たとえば、米国特許出願公報第２００５／０２２１３４３号およびＰＣＴ公報第ＷＯ／２００５／０７４４３６号；Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：１０２−１０７，２００５；Ｃａｂａｎｔｏｕｓ  ａｎｄ  Ｗａｌｄｏ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：８４５−８５４，２００６．を参照のこと）。また、ＵＳ２０１２２８２６４３が、分割型黄色蛍光タンパク質バリアントおよび分割型シアン蛍光タンパク質バリアントについて記載する。
【０１０７】
本明細書中において２つの配列の「同一性割合」を求めるためには、好ましくは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７による数学的アルゴリズムを使用する。このアルゴリズムは、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０による、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）から入手可能なＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムに組み込まれている。
【０１０８】
同一性割合を求めるためには、好ましくは、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準パラメータを用いる。
【０１０９】
ＢＬＡＳＴによるポリヌクレオチドの検索は、好ましくは、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて行なわれる。
【０１１０】
ｇｅｎｅｒａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓに関して、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスは１００に設定してよく、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスはチェックしてよく、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスは１０に設定してよく、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスは２８に設定してよい。ｓｃｏｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓに関して、「Ｍａｔｃｈ／ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ」は１，−２に設定してよく、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスはｌｉｎｅａｒに設定してよい。Ｆｉｌｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｎｇのパラメータに関して、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスはチェックしなくてよく、「Ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ」ボックスはチェックしなくてよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスはチェックしてよく、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスはチェックしなくてよい。
【０１１１】
ＢＬＡＳＴによるタンパク質の検索は、好ましくは、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて行なわれる。
【０１１２】
ｇｅｎｅｒａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓに関して、「Ｍａｘ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ボックスは１００に設定してよく、「Ｓｈｏｒｔ  ｑｕｅｒｉｅｓ」ボックスはチェックしてよく、「Ｅｘｐｅｃｔ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ」ボックスは１０に設定してよく、「Ｗｏｒｄ  Ｓｉｚｅ」ボックスは「３」に設定してよい。ｓｃｏｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓに関して、「Ｍａｔｒｉｘ」ボックスは「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定してよく、「Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ」ボックスは「Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１」に設定してよく、「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ」ボックスは「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ」に設定してよい。Ｆｉｌｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍａｓｋｉｎｇのパラメータに関して、「Ｌｏｗ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ」ボックスはチェックしなくてよく、「Ｍａｓｋ  ｆｏｒ  ｌｏｏｋｕｐ  ｔａｂｌｅ  ｏｎｌｙ」ボックスはチェックしなくてよく、「Ｍａｓｋ  ｌｏｗｅｒ  ｃａｓｅ  ｌｅｔｔｅｒｓ」ボックスはチェックしなくてよい。
【０１１３】
同一性割合は、各参照配列の全長、すなわち、各文脈で列挙される配列番号の配列の全長との比較で求められる。たとえば、配列番号１の配列との同一性が少なくとも８０％であるアミノ酸配列は、配列番号１の全長との比較で配列番号１との同一性が少なくとも８０％である。別の一例において、配列番号３の配列との同一性が少なくとも８０％である配列は、配列番号３の全長との比較で配列番号３との同一性が少なくとも８０％である。
【０１１４】
本発明の文脈において、「単離された」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがその天然環境から除去されたということ、および／または天然に存在しない形態であることを示す。また、「単離された」ポリペプチドまたは「単離された」ポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて生成されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドであってよい。
【０１１５】
本明細書中において用いられる「アミノ酸置換」という用語は、保存的または非保存的置換による、好ましくは保存的置換による、アミノ酸配列中における置換を指す。いくつかの実施形態において、置換は、天然アミノ酸を非天然アミノ酸で交換することも含む。保存的置換は、アミノ酸を、化学的特性の類似する別のアミノ酸で置換することを含む。好ましくは、保存的置換は、
（ｉ）塩基性アミノ酸を別の異なる塩基性アミノ酸で置換すること、
（ｉｉ）酸性アミノ酸を別の異なる酸性アミノ酸で置換すること、
（ｉｉｉ）芳香族アミノ酸を別の異なる芳香族アミノ酸で置換すること、
（ｉｖ）非極性脂肪族アミノ酸を別の異なる非極性脂肪族アミノ酸で置換すること、および
（ｖ）極性非荷電アミノ酸を別の異なる極性非荷電アミノ酸で置換することからなる群より選択される置換である。
【０１１６】
塩基性アミノ酸は、好ましくは、アルギニン、ヒスチジン、およびリシンからなる群より選択される。酸性アミノ酸は、好ましくは、アスパラギン酸またはグルタミン酸である。
【０１１７】
芳香族アミノ酸は、好ましくは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群より選択される。非極性脂肪族アミノ酸は、好ましくは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、メチオニン、およびイソロイシンからなる群より選択される。極性非荷電アミノ酸は、好ましくは、セリン、トレオニン、システイン、プロリン、アスパラギン、およびグルタミンからなる群より選択される。保存的アミノ酸置換とは異なり、非保存的アミノ酸置換は、アミノ酸を、上記に概要が示される保存的置換（ｉ）〜（ｖ）に該当しない任意のアミノ酸で交換することである。
【０１１８】
本明細書中において用いられる「生物試料」という用語は、ヒトまたは動物の体外におかれた組織（たとえば、組織生検）、臓器、細胞、細胞溶解物、または体液（血液、尿、唾液、胆汁、血清、および脳脊髄液など）の試料を指す。さらに、「生物試料」という用語は、トランスフェクション法および形質転換法を含む当業者に広く周知される方法によって任意に遺伝子改変されていてよい、哺乳類細胞、ヒト細胞、もしくは植物細胞などの真核細胞または原核細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養細胞または細胞溶解物も含む。
【０１１９】
本明細書中において用いられる「結合」という用語は、２つの分子が引き付け合って相互作用する結果として安定な関係が形成され、この関係において、これらの分子が互いに近接していることを指す。結合した結果、分子複合体が形成される場合があり、その際、構成要素同士を引き付け合わせて一緒に保持している力は、一般的に、非共有結合性の力であり、したがって通常は、共有結合よりもエネルギー的に弱い。
【実施例】
【０１２０】
１．細胞培養、細胞トランスフェクション、化学物質、およびバッファー
１０％ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン含有のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中において、ＨｅＬａ細胞を増殖させた。６０〜８０％コンフルエントにおいて、３０ｍｍイメージングシャーレ中の細胞を、適切なプラスミドＤＮＡ１．５μｇおよびＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）３μｇと混合した血清非含有抗生物質非含有培地１ｍｌを用いて、トランスフェクションした。加湿インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ２、９５％空気）中において細胞を１６〜２０時間維持した後、各培養基に再度交換した。すべての実験は、トランスフェクションして２４時間後に行なった。バリノマイシンは、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、最終濃度７μＭにて使用した。使用した実験用バッファーは、８．０または７．６ＮａＣｌ、１．４４Ｎａ２ＨＰＯ４、０．１２ＮａＨ２ＰＯ４から構成され（ｇ／Ｌ）、ＮａＯＨを使用し、０．４ＫＣｌ有りまたはＫＣｌ無しのいずれかにおいて、ｐＨ７．４０としたものである。
【０１２１】
２．生細胞イメージング
デジタル広視野蛍光イメージングシステムであるＴｉＬＬ  ｉＭＩＣ（Ｔｉｌｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，Ｇｒａｅｆｅｌｆｉｎｇ、ドイツ）を使用して、蛍光イメージングを行なった。レッドシフトしたＦＲＥＴに基づくＲ−ＧＥＰＩＩが４８０ｎｍにおいて励起され、５１０〜５４０ｎｍ（Ｃｌｏｖｅｒ、すなわちＦＲＥＴドナー）および５６０〜６１０ｎｍ（ＣｌｏｖｅｒからｍＲｕｂｙ２へのＦＲＥＴ）のそれぞれにおける発光を取り込んだ。ＣＦＰ／ＹＦＰに基づくＧＥＰＩＩ  １．０が４３０ｎｍにおいて励起され、４８０ｎｍおよび５３５ｎｍのそれぞれにおける発光を記録した。データ収集およびデジタル蛍光顕微鏡の制御を、ライブ収集ソフトウェア  バージョン２．０．０．１２（Ｔｉｌｌ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を使用して行なった。
【０１２２】
３．ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング
ＢＯＮドメインおよび全長Ｋｂｐのモデルを、オンラインツールＰｈｙｒｅ２（タンパク質相同性／類似性認識エンジンＶ２．０；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｐｈｙｒｅ２／ｈｔｍｌ／ｐａｇｅ．ｃｇｉ？ｉｄ＝ｉｎｄｅｘ）を使用して予測した。キメラの予測三次元構造のさらなる分析を、ソフトウェアＰｙＭｏｌ  ｖｉｅｗｅｒを使用して行なった。トンネル予測（ｔｕｎｎｅｌ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ）を、オンラインツールＰｏｒｅＷａｌｋｅｒ  １．０（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｈｏｒｎｔｏｎｓｒｖ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＰｏｒｅＷａｌｋｅｒ／）を使用して行なった。
【０１２３】
４．ＦＲＥＴによるＫ＋の検出
ＧＥＰＩＩ  １．０およびＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０ポリペプチドをコードするプラスミドＤＮＡ（図２ａおよび図２ｂ）を、伝統的なクローニング法によって作製した。ＧＥＰＩＩ  １．０は、最適化されたＣＦＰ／ＹＦＰ（ＦＲＥＴドナーとしてｓＥＣＦＰ、およびＦＲＥＴアクセプターとしてｃｐＶ）のＦＲＥＴペアを含む（図２ａの上パネル）。レッドシフトしたＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０は、ＣｌｏｖｅｒおよびｍＲｕｂｙ２（図２ａの下パネル、および図２ｂ）を含み、これらはそれぞれ、明るい緑色および赤色のＦＰバリアントである。ＣｌｏｖｅｒおよびｍＲｕｂｙ２は、動態が改善された深色性ＦＲＥＴプローブを作製するために、最適化されている。これら２つのプローブを、ＨｅＬａ細胞において試験した。ＨｅＬａ細胞は、各プラスミドＤＮＡをトランスフェクションした後、ＣＦＰ／ＹＦＰに基づくＧＥＰＩＩ  １．０（図２ｃの左パネル）またはレッドシフトしたＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０（図２ｃの右パネル）のいずれかを発現した。サイトゾルＫ＋濃度（［Ｋ＋］ｃｙｔｏ）を制御するために、ジギトニンとＫ＋イオノフォアであるバリノマイシンとの混合物（図２ｄ）またはバリノマイシン単独（図２ｅ）を用いて、細胞を透過処理した。実際、ＧＥＰＩＩのＦＲＥＴ比率シグナルは、Ｋ＋添加に応答して濃度依存的に増加したが（図２ｄ）、Ｋ＋を除去するとＦＲＥＴ蛍光は速やかに減少した（図２ｄおよび図２ｅ）。この実験から、ＦＰおよびｋｂｐに基づくキメラのコンストラクトをこのように設計および作製すれば、Ｋ＋変化をリアルタイムで読み出せる機能性ＦＲＥＴプローブを作製できることが確認された。
【０１２４】
ｉｎ  ｓｉｔｕにおいて、ＣＦＰ／ＹＦＰに基づくＧＥＰＩＩ  １．０およびＲ−ＧＥＰＩＩ  １．０それぞれの半最大有効濃度（ＥＣ５０）は、個々に、２．０４（１．７２〜２．４１）ｍＭ（図２ｄの右パネル）および４．１１（３．２５〜５．１９）ｍＭ（ｎ＝８）であった。ｉｎ  ｓｉｔｕ（ＨｅＬａ細胞単独培養）においてＥＣ５０値を求めるために、ＧＥＰＩＩを発現する細胞を、Ｋ＋非含有溶液中５μＭジギトニンで１０分間、透過処理した。半自動灌流系を用い、顕微鏡下、細胞にジギトニンを添加した。経時的連続ＦＲＥＴ比率イメージングを用いて、プローブのＫ＋感受性を調べた。ＦＲＥＴ比率シグナルが増加して安定するまで、灌流系により、０．０１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲で異なるＫ＋濃度を添加した。Ｋ＋濃度の対数の各々に対して最大デルタＦＲＥＴ比率の値をプロットし、シグモイド曲線の濃度応答式を用いてフィットさせた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを用いて、データ分析を行なった。
【０１２５】
５．ポリペプチドバリアントの合理的設計
ＧＥＰＩＩのＫ＋感受性を操作するために、Ｐｈｙｒｅ−２およびＰｙＭｏｌソフトウェアを用いた配列分析および相同性三次元モデリングに基づいて、野生型ｋｂｐの合理的再設計を行なった。我々の予測および事前データが示したところによると、ＢＯＮおよびＬｙｓＭドメインにおける荷電極性アミノ酸をコードする突然変異によって、ＦＲＥＴに基づく各ＧＥＰＩＩのＫ＋感受性が有意に減少した。
【０１２６】
ｋｂｐの野生型Ｋ＋結合ＢＯＮドメイン中、酸性アミノ酸がＤ４１、Ｄ４３、Ｄ５１、Ｄ５９、Ｅ６４、Ｅ６７、Ｄ８３、およびＤ８４の８つの位置にあることを特定できる（図３ａおよび図３ｂ中の赤色の領域）。興味深いことに、Ｐｈｙｒｅ２およびＰｙＭｏｌを用いたＢＯＮドメインの三次元モデリングにより、孔またはトンネルのような構造が予測された（図３ａ）。この孔における２つの酸性アミノ酸の間の最短距離は、約６８０〜８００ｐｍである（図３ｃ）。孔の最小直径は約６６０ｐｍ（図３ｄ）であると考えられる。孔に近接する酸性アミノ酸および孔内の酸性アミノ酸は、水和したＫ＋イオンを良好に妨害して結合している可能性がある（図３ｅ）。
【０１２７】
また、ＢＯＮドメインの配列分析と三次元モデリング（図３）による予測から、すべての酸性アミノ酸に加えて、２７位のＱ（グルタミン）、３５位のＮ（アスパラギン）、７５位のＮ（アスパラギン）、および５３位のＧ（グリシン）がＫ＋感知にとって重要であると考えられた。
【０１２８】
ＬｙｓＭドメインの１０５位（Ｄ）、１２６位（Ｅ）、および４０８位（Ｄ）に位置する、負電荷を帯びた３つのアミノ酸は、Ｋ＋結合ＢＯＮドメインと相互作用することが想定されるが、これらもまた、Ｋ＋結合によるタンパク質の立体構造変化にとって重要であると考えられる。
【０１２９】
６．ポリペプチドバリアントを用いたＦＲＥＴ検出
ＧＥＰＩＩ  １．０の突然変異体をコードするプラスミドＤＮＡを、部位特異的突然変異誘発によって作製した。ここで、設計された一塩基多型を有するプライマーを用い、ヘラクレス（ｈｅｒｃｕｌａｓｅ）ＩＩポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、米国）を用いて、ＰＣＲをそれぞれ行なった。次いで、各ＰＣＲ産物を、ｐｃＤＮＡ３．１（−）哺乳類発現ベクター中に、制限酵素をそれぞれ用いてサブクローニングした。次いで、各プラスミドＤＮＡによりＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、上記例４中に説明されるとおりにＥＣ５０を求めた。各ポリペプチドバリアントについての結果を表５中にまとめる。
【０１３０】
表５：アミノ酸置換を有するＧＥＰＩＩ  １．０バリアントの感受性
【０１３１】
【表５】
2020521118.tif 000006
【０１３２】
７．カリウムセンサの第１のドメインとカリウムセンサの第２のドメインとの間に異なるリンカー分子を使用したポリペプチドバリアントのＦＲＥＴ検出
グリシン残基およびセリン残基を含むリンカー配列を含む本発明に係るポリペプチドをコードするプラスミドを、各リンカーを構成するアミノ酸をコードするよう設計したフォワードプライマーとリバースプライマーの対を用いて作製した。フォワードプライマーは、オーバーハング伸長ＰＣＲを行なうことによって野生型ＬｙｓＭドメインを５’オーバーハングにより伸長してリンカーを形成するよう設計した。リバースプライマーは、野生型ＢＯＮドメインを結合して、同じリンカーを３’末端に形成するよう設計した。次いで、さらにＰＣＲを行なうことによってこれら２つのＰＣＲ産物を融合し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター中の、ｍｓｅＣＦＰをコードするヌクレオチド配列とｃｐＶをコードするヌクレオチド配列との間にサブクローニングした。最終的に得たコンストラクトは、ＫｂｐのＢＯＮドメインとＬｙｓＭドメインとの間にフレキシブルなリンカーを有する、ＣＦＰ／ＹＦＰのＦＲＥＴに基づく新規のＧＥＰＩＩバリアントをコードする。
【０１３３】
次いで、このプラスミドＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクションし、上記例４中に説明されるとおりにＥＣ５０を求めた。各ポリペプチドバリアントについての結果を表６中にまとめる。
【０１３４】
表６：異なるリンカー配列によりＢＯＮおよびＬｙｓＭが連結したＧＥＰＩＩ  １．０バリアントの感受性
【０１３５】
【表６】
2020521118.tif 000007
【０１３６】
リンカー分子を含むポリペプチドは、ＧＥＰＩＩ  １．０よりもＥＣ５０が増加した。
８．ＢＯＮドメインとＬｙｓＭドメインとの間にリンカーを含むポリペプチドバリアントのＦＲＥＴ検出
アミノ酸置換およびリンカー配列を含む本発明に係るポリペプチドをコードするプラスミドを、各リンカーを構成するアミノ酸をコードするよう設計したフォワードプライマーとリバースプライマーの対を用いて作製した。フォワードプライマーは、オーバーハング伸長ＰＣＲを行なうことによってΔＬｙｓＭドメイン（ΔＬｙｓＭ  ＧＥＰＩＩ  １．０を参照）を５’オーバーハングにより伸長してリンカーを形成するよう設計した。リバースプライマーは、野生型ＢＯＮドメインを結合して、同じリンカーを３’末端に形成するよう設計した。次いで、さらにＰＣＲを行なうことによってこれら２つのＰＣＲ産物を融合し、ｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクター中の、ｍｓｅＣＦＰをコードするヌクレオチド配列とｃｐＶをコードするヌクレオチド配列との間にサブクローニングした。最終的に得たコンストラクトは、ＢＯＮドメインとΔＬｙｓＭドメインとの間にフレキシブルなリンカーを有する、ＣＦＰ／ＹＦＰのＦＲＥＴに基づく新規のＧＥＰＩＩバリアントをコードする。
【０１３７】
次いで、このプラスミドＤＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、上記例４中に説明されるとおりにＥＣ５０を求めた。各ポリペプチドバリアントについての結果を表７中にまとめる。
【０１３８】
表７：アミノ酸置換およびリンカー配列を含むＧＥＰＩＩ  １．０バリアントの感受性
【０１３９】
【表７】
2020521118.tif 000008
【０１４０】
９．本発明に係るポリペプチドを発現する細胞の小器官およびサブドメインへの標的指向化
遺伝学的にコードされたプローブの大きな利点として、こうしたプローブを細胞の小器官およびサブドメインへ正確に標的指向化できるという点がある。したがって、ＧＥＰＩＩの標的指向化により、Ｋ＋レベルおよび動態の定量化を、高い空間および時間分解能にて実施可能となる。標的指向化できるＫ＋プローブがないために、細胞内Ｋ＋流動についての現時点での我々の理解は、具体性を欠いている。
【０１４１】
ＧＥＰＩＩ  １．０をコードしＮ末端またはＣ末端のいずれかに標的配列を有するＤＮＡプラスミドを、それぞれ、当業者に知られる一般的な分子生物学的方法によってクローニングした。ＧＥＰＩＩ  １．０ポリペプチド（図２を参照）を核（図４ｃ）、ミトコンドリア（図４ｄ）、小胞体（ＥＲ、図４ｅ）、細胞表面（図４ｆ）、核膜（図４ｇ）、および形質膜下領域（図４ｈ）へ標的指向化した実験について、蛍光顕微鏡検査により分析した。結果を図４中に示す。標的指向性配列を全く含まないＧＥＰＩＩ  １．０は、サイトゾルおよび核の中に局在している（図４ａ）。核外輸送配列（ＮＥＳ；ＬＰＰＬＥＲＬＴＬ）をＧＥＰＩＩ  １．０のＣ末端に付加したことによって、その結果、Ｋ＋プローブがサイトゾル中のみに局在化した（図４ｂ）。標的指向化したプローブによって、細胞内Ｋ＋流動のタイムラプス蛍光イメージングが可能となるであろう。
【０１４２】
１０．単離されたポリペプチドの特徴づけ
上述される異なるＧＥＰＩＩバリアントを、ｐｅｔＭ１１細菌発現ベクター中にクローニングした。ＧＥＰＩＩをコードする細菌発現プラスミドをケミカルコンピテントＤＨ５α細菌中に形質転換した後、細胞をＬＢ寒天プレート上で培養して、単一コロニーを得た。単一コロニーを含む前培養を一晩培養し、次いで、３７℃の新しいＬＢ培地１Ｌ中に接種した。光学濃度０．７が観察されたら、ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）を添加して最終濃度０．５ｍＭとすることによってタンパク質発現を誘導し、細胞を室温でさらに培養した。次いで、発現したＧＥＰＩＩを細菌細胞から細胞溶解によって抽出し、アフィニティクロマトグラフィーによってさらに精製した。カラムからの溶出には、イミダゾールを用いた。ＧＥＰＩＩを含有する溶出液を、ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００（０．０５％）含有のＨＥＰＥＳバッファー溶液で希釈した。さらに、サイズ排除クロマトグラフィーにより、組換えＧＥＰＩＩの抽出を確認した。蛍光プレートリーダーを用いたＦＲＥＴ測定によって、組換えポリペプチドのＦＲＥＴ比率シグナルがＮａ＋およびＣａ２＋の影響を受けないことが示された。一方、各イオン３ｍＭ添加に応答した精製ＧＥＰＩＩのＦＲＥＴ比率シグナルの増加幅は、Ｋ＋添加時の方が、Ｒｂ＋およびＣｓ＋添加時よりも大きかった（図５を参照）。
【０１４３】
１１．生物試料中におけるＫ＋濃度を求める
予備実験において、図６Ａ中に記載される実験構成により、上述される精製ＧＥＰＩＩ  １．０を用いてマウス血清中のＫ＋を求めた。求めた血清Ｋ＋濃度は６．６３±０．３４ｍＭ（ＳＤ、ｎ＝５、図６）であったが、この濃度は、発表されているデータとよく合致する。重要なことには、血液採取法（顔面静脈または眼窩）およびマウス血清中におけるＧＥＰＩＩの安定性とは独立して、再現性および反復性が極めて高く（図６）、このことから、生物学的プローブ中のＫ＋をＧＥＰＩＩを用いて求める方法は、非常にしっかりとした正確な方法であることが示された。
【０１４４】
１２．生存力／細胞死アッセイ
また、精製ＧＥＰＩＩ  １．０を用いて、（マルチウェル）細胞培養プレートにおける細胞外Ｋ＋濃度を動的に記録し、細胞生存力および細胞死の尺度とした。細胞をグルコースまたは２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）のいずれかを含有する培養基中に維持しながら、細胞外にある組換えＧＥＰＩＩ  １．０のＦＲＥＴ比率シグナルを１時間毎に測定した。図７中に示すように、１０ｍＭグルコース存在下におけるコントロール細胞の上清中の細胞外Ｋ＋濃度は、細胞を５０μＭジギトニンで透過処理するまで、経時的に一定のままであった。一方、精製ＧＥＰＩＩ  １．０のＦＲＥＴ比率シグナルは、細胞を２−ＤＧで処理した場合に経時的に大きく増加したが、このことから、代謝が危機的状態にあることが示された。代謝が危機的状態になると、細胞内Ｋ＋の急速な減少につながる。こうした知見から、培養中の細胞によるＫ＋放出の測定が細胞生存力のリアルタイムでの読み出しに相当するということが、さらに強調される。
【図１】
2020521118.tif 000009
【図２】
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【図３】
2020521118.tif 000011
【図４ａ】
2020521118.tif 000012
【図４ｂ】
2020521118.tif 000013
【図４ｃ】
2020521118.tif 000014
【図４ｄ】
2020521118.tif 000015
【図４ｅ】
2020521118.tif 000016
【図４ｆ】
2020521118.tif 000017
【図４ｇ】
2020521118.tif 000018
【図４ｈ】
2020521118.tif 000019
【図５】
2020521118.tif 000020
【図６】
2020521118.tif 000021
【図７】
2020521118.tif 000022
【配列表】
2020521118000001.app
【国際調査報告】
2020521118.tif 000023
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