(57)【要約】本発明は、組換えタンパク質、特に抗体の産生中に細胞培養培地における制限された量のシステイン及びトリプトファンの使用に関する。このような制御された条件下で産生されるタンパク質及び抗体は不均質の減少、特にチャージ変異体不均質の減少を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、
で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【請求項２】
培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞／Ｌ）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養物中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、流加プロセスなどのバッチプロセスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンが、産生段階中の毎日の添加により提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）のレベルに減少させることによって、培養物中のシステイン又はシスチンを枯渇させ、ここで前記細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
産生の後期段階中に、すなわち、細胞が既に最大生存細胞密度に達したとき、トリプトファンが翌日添加される前に、培養物中のトリプトファンを枯渇させる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
産生段階が少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４日間、実施される方法。
【請求項１４】
産生段階の後半の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体又はその抗原結合断片が以下である、請求項１７に記載の方法：
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体；又は
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖と、配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体。
【請求項１９】
産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、又は２０，０００Ｌ以上の容量のバイオリアクター中で行われる、クレーム１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法は、組換えタンパク質を細胞培養培地から回収するステップ、及び組換えタンパク質を精製するさらなるステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
精製がプロテインＡクロマトグラフィーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
精製された組換えタンパク質を製剤化するステップをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
組換えタンパク質が、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
製剤がヒスチジン及び／又はプロリンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
製剤が５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６のｐＨで含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
製剤は、５．２〜６．０のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は産生される組換えタンパク質の不均質を減少させるものであり、ここで前記不均質の減少とは
ａ．電荷の不均質、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化；及び／又は
ｃ．例えば組換えタンパク質の異なるバッチ間の、色又は色の強度；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質不安定性、
を減少させることを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
組換えタンパク質を製造する方法であって、
ａ．培地中に組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質は細胞によって産生され、細胞培養培地はシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンで補充されており、ここで
・方法中に提供されたシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば、５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）である、ここで細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び／又は
・方法中に提供されたトリプトファンの総量は、２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）である、ここで、細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する、
を含む、上記方法。
【請求項３１】
方法が、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組換えタンパク質の産生段階中の細胞培養培地中に存在する
ａ．システイン又はシスチン及び／又は
ｂ．トリプトファン
の総量を制限することを含む、組換え宿主細胞により産生段階において産生されるバッチ中の組換えタンパク質の集団の不均質を減少させる方法。
【請求項３３】
前記方法は、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法により得られ得る又は得られる組換えタンパク質調製物。
【請求項３５】
抗体を含む医薬組成物であって、該組成物が請求項２３から２８のいずれか一項に記載のさらなる特徴の１つ以上を有し、好ましくは抗体が請求項１８に記載の抗体である、上記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質、特に抗体の製造の分野に属する。より具体的には、本発明は、商業規模の製造中に不均質を減少させたタンパク質を発現するための細胞培養法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用抗体などの治療用タンパク質としての組換えタンパク質の開発には、産業規模での組換えタンパク質の産生が必要である。これを達成するために、様々な発現系は、原核生物系及び真核生物系の両方を使用することができる。過去２０年間にわたって、治療薬として承認された大多数の治療用タンパク質が哺乳動物細胞培養物を介して製造され、そのような系は、ヒトに使用するための組換えポリペプチドを大量に生産するための好ましい発現系となっている。
【０００３】
しかし、哺乳動物の細胞培養には大きな課題がある。産生される組換えタンパク質の力価は、酵母及び昆虫細胞に基づく系のような他の真核生物産生系と比べて、一般的に非常に低い。
過去３０年にわたって、多くの努力が細胞培養と組換えポリペプチド発現の基本パラメータを確立するために捧げられ、細胞培養培地の組成の変化を通して最適な細胞増殖への到達（Ｈｅｃｋｌａｕ  Ｃ．、ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２１８（２０１６）５３−６３；Ｚａｎｇ  Ｌｉ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ  ８３（２０１１）５４２２−５４３０参照）及び操作条件、及び大型バイオリアクターの開発に多くの研究の焦点が絞られてきた。
【０００４】
収量はまだ哺乳動物細胞の非常に重要な側面であるが、近年では、開発と生産規模のすべての段階で、製品の品質と方法の一貫性を制御することに焦点がシフトしている。哺乳動物の細胞培養によって産生される治療用タンパク質は、さまざまなレベルの不均質を示す。そのような不均質は、限定されないが、異なるグリコシル化パターン、脱アミド化又は酸化、異なる電荷又はサイズ変異体から生じる差異を含む。組換えタンパク質の不均質は、例えば同じ製造方法で製造された同じタンパク質の異なるバッチ間で、製品の色の違いにもつながる可能性がある。そのような不均質、特に対象とする組換えタンパク質の色の違いは、治療用タンパク質が高濃度で製剤化されるとより明らかになる。近年、治療用タンパク質の皮下送達に向けた着実な傾向があり、治療用タンパク質を高濃度で製剤化する必要がある。高濃度は凝集体レベルの増加と関連している（Ｐｕｒｄｉｅ  Ｊ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、２０１６、３２、９９８〜１００８）。酸性種のレベルの増加のような荷電変異体の増加はタンパク質の安定性に影響を及ぼし得る（Ｂａｎｋｓ  Ｄ．Ｄ．ら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９、９８、４５０１-１０）が、その一方で濃縮治療用タンパク質の色がより強くなり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
培地の組成（Ｋｓｈｉｒｓａｇａｒ  Ｒ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０９：１０、２５２３−２５３２（２０１２）；ＵＳ２０１３／０２８１３５５；ＷＯ２０１３／１５８２７５）及び増殖条件などの細胞培養条件は、ｐＨと温度を含めて（ＵＳ８，７６５，４１３）、治療用タンパク質、特に不均質を最小限にした治療用抗体の製造のためのさらに改良された細胞培養法を提供することが依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組換えタンパク質の産生段階中に細胞培養培地におけるシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量を減少させることによって上記の必要性に応えるものである。
以下の特定の実施態様は、以下に番号付けされるように説明される：
【０００７】
実施態様１：組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、
で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【０００８】
実施態様２：培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される、実施態様１に記載の方法。
【０００９】
実施態様３：培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量のトリプトファンで補充される、実施態様１又は２に記載の方法。
【００１０】
実施態様４：方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１１】
実施態様５：方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞／Ｌ）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１２】
実施態様１ａ：組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
・産生される組換えタンパク質の総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【００１３】
実施態様２ａ：培養物が産生される組換えタンパク質の総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される、実施態様１に記載の方法。
【００１４】
実施態様３ａ：培養物が産生される組換えタンパク質の総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される、実施態様１又は２に記載の方法。
【００１５】
実施態様４ａ：方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終わりでの積分生細胞数を指す、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１６】
実施態様５ａ：方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞／Ｌ）であり、ここで細胞は産生段階の終わりでの積分生細胞数を指す、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
実施態様６：培養物中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１８】
実施態様７：前記方法が、流加（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）プロセスなどのバッチプロセスである、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
実施態様８：システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンが、産生段階中の毎日の添加により提供される、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００１９】
実施形態９：システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）のレベルに減少させることによって、培養物中のシステイン又はシスチンを枯渇させ、ここで前記細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、実施態様８に記載の方法。
【００２０】
実施態様９ａ：システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）のレベルに減少させることによって、培養物中のシステイン又はシスチンを枯渇させ、ここで前記細胞は産生段階の終了時での積分生細胞数を指す、実施態様８に記載の方法。
【００２１】
実施態様１０：産生の後期段階中に、すなわち、細胞が既に最大生存細胞密度に達したとき、トリプトファンが翌日添加される前に、培養物中のトリプトファンを枯渇させる、実施態様８又は９に記載の方法。
【００２２】
実施態様１１：細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、産生段階中の任意の時点で細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が０．３ｇ／Ｌを超えない、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２３】
実施態様１２：細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２４】
実施態様１３：産生段階が少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４日間、実施される方法。
【００２５】
実施態様１４：産生段階の後半の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２６】
実施態様１５：産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
実施態様１４ａ：産生段階の後半の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の量の８重量％〜３５％である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２８】
実施態様１５ａ：産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の量の８重量％〜３５％である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２９】
実施態様１６：前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３０】
実施態様１７：組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３１】
実施態様１８：抗体又はその抗原結合断片が以下である、実施態様１７に記載の方法：
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体；又は
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖と、配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体。
【００３２】
実施態様１９：産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、又は２０，０００Ｌ以上の容量のバイオリアクター中で行われる、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３３】
実施態様２０：方法は、組換えタンパク質を細胞培養培地から回収するステップ、及び組換えタンパク質を精製するさらなるステップを含む、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３４】
実施態様２１：精製がプロテインＡクロマトグラフィーを含む、実施態様２０に記載の方法。
【００３５】
実施態様２２：精製された組換えタンパク質を製剤化するステップをさらに含む、実施態様２０又は２１に記載の方法。
【００３６】
実施態様２３：組換えタンパク質が、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される、実施態様２２に記載の方法。
【００３７】
実施態様２４：製剤がヒスチジン及び／又はプロリンを含む、実施態様２３に記載の方法。
【００３８】
実施態様２５：製剤が５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６のｐＨで含む、実施態様２４に記載の方法。
【００３９】
実施態様２６：製剤は、５．２〜６．０、好ましくは約５．６のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む、実施態様２５に記載の方法。
【００４０】
実施態様２７：界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、例えば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である、実施態様２３〜２６のいずれか一項記載の方法。
【００４１】
実施態様２８：組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される、実施態様２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【００４２】
実施態様２９：前記方法は産生される組換えタンパク質の不均質を減少させるものであり、ここで前記不均質の減少とは
ａ．電荷の不均質、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）を減少させること；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化を減少させること；及び／又は
ｃ．例えば組換えタンパク質の異なるバッチ間で、色又は色の強度を減少させること；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）を減少させること；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質不安定性を減少させること、
を含む、先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法。
【００４３】
実施態様３０：組換えタンパク質を製造する方法であって、
ａ．培地中に組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質は細胞によって産生され、細胞培養培地はシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンで補充されており、ここで
・方法中に提供されたシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば、５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）である、ここで細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び／又は
・方法中に提供されたトリプトファンの総量は、２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）である、ここで、細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する、
を含む、上記方法。
【００４４】
実施態様３０ａ:組換えタンパク質を製造する方法であって、
ａ．培地中に組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養するステップ；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させるステップ、ここで組換えタンパク質は細胞によって産生され、細胞培養培地はシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンで補充されており、ここで
・方法中に提供されたシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば、５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）である、ここで細胞は、産生段階の終了時での積分生細胞数である、及び／又は
・方法中に提供されたトリプトファンの総量は、２．５〜３．５ｇ／（１０個の１２細胞）である、ここで、細胞は、産生段階の終了時での積分生細胞数である、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収するステップ、
を含む、上記方法。
【００４５】
実施態様３１：方法が、実施態様２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、実施態様３０に記載の方法。
【００４６】
実施態様３２：組換えタンパク質の産生段階中の細胞培養培地中に存在する
ａ．システイン又はシスチン及び／又は
ｂ．トリプトファン
の総量を制限することを含む、組換え宿主細胞により産生段階において産生されるバッチ中の組換えタンパク質の集団の不均質を減少させる方法。
【００４７】
実施態様３３：前記方法は、実施態様２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、実施態様３２に記載の方法。
【００４８】
実施態様３４：先行する実施態様のいずれか一項に記載の方法により得られ得る又は得られる組換えタンパク質調製物。
【００４９】
実施態様３５：抗体を含む医薬組成物であって、該組成物が実施態様２３から２８のいずれか一項に記載のさらなる特徴の１つ以上を有し、好ましくは抗体が実施態様１８に記載の抗体である、上記医薬組成物。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】産生される組換えタンパク質の重量パーセントあたりのバイオリアクターで行われた産生段階全体で添加されたアミノ酸システイン又はシスチン及びトリプトファンの総量を測定するための計算分析の説明。
【００５１】
【図２】それぞれ、４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値（ａ）及び酸性ピーク群（ＡＰＧ）変異体（ｂ）に対する産生された総ｍＡｂ１のトリプトファン及びシステイン又はシスチンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の影響。
【００５２】
【図３】それぞれ、４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値（ａ）及び酸性ピーク群（ＡＰＧ）変異体（ｂ）に対する産生された総ｍＡｂ１重量（ｇ／ｇ）のトリプトファンとシステイン又はシスチンの添加総量重量％の影響、並びにＡＰＧ上のシステイン又はシスチン（ｃ）及びトリプトファン（ｄ）の最大濃度の相関の欠如。
【００５３】
【図４】産生された総ｍＡｂ１のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の関数としての組換えモノクローナル抗体ｍＡｂ１の酸性ピーク群（ＡＰＧ）変異体の多重線形回帰モデル。
【００５４】
【図５】産生された総組換えｍＡｂ１のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の関数としての組換えモノクローナル抗体ｍＡｂ１のメインピーク群変異体の多重線形回帰モデル。
【００５５】
【図６】産生された総組換えｍＡｂ１のシステイン又はシスチンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の関数としての組換えモノクローナル抗体ｍＡｂ１の高分子量種（ＨＭＷＳ）変異体の多重線形回帰モデル。
【００５６】
【図７】産生された総組換えｍＡｂ１のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の関数としての組換えモノクローナル抗体ｍＡｂ１の４０ｍｇ／ｍＬ変異体に正規化されたｂ＊値の多重線形回帰モデル。
【００５７】
【図８】（ａ）高分子量種（ＨＭＷＳ）及び（ｂ）４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値（ｃ）酸性ピーク群（ＡＰＧ）及び（ｄ）主ピーク群変異体に対する産生された総組換えｍＡｂ１のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の影響の等高線プロット。黒い破線の四角形は、産生された総組換えｍＡｂ１の理想のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）に対応し、その目的はＡＰＧ、ＨＭＷＳ、４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値を減少させ、メインピーク群変異体を増加させるためであり、これは、システイン又はシスチンについては産生される総ｍＡｂ１の１２．０６〜２８．０３重量％（ｇ／ｇ）の添加量に相当し、トリプトファンについては産生される総ｍＡｂ１の８．８４〜３２．０６重量％（ｇ／ｇ）の添加量に相当する。
【００５８】
【図９】細胞培養体積（ＣＳＶ）に正規化された積分生細胞数（ＩＶＣＣ）に対する細胞培養体積（ＣＳＶ）重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の影響。ＣＳＶ重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の関数としてＣＳＶに正規化された累積ＩＶＣＣの多重線形回帰モデルを（ａ）に示す。ＣＳＶに正規化された累積ＩＶＣＣに対する、ＣＳＶ重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の影響の等高線図を（ｂ）に示す。
【００５９】
【図１０】ＣＳＶ重量の産生段階中に細胞培養培地に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の、ＨＰＬＣ法で測定した最終ｍＡｂ１力価（ｍＡｂＨＰＬＣ）に及ぼす影響。ＣＳＶ重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の関数としての最終ｍＡｂ１ＨＰＬＣ力価の多重線形回帰モデルを（ａ）に示す。最終ｍＡｂＨＰＬＣ力価に対する、ＣＳＶ重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の影響の等高線図を（ｂ）に示す。
【００６０】
【図１１】１４日間の産生の間のＩＶＣＣの産生段階の終了時のＩＶＣＣ＊１０−１２あたりの、産生段階中の細胞培養培地に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の影響の等高線図が（ａ）に示されている。最終ｍＡｂＨＰＬＣ力価での産生段階の終了時のＩＶＣＣ＊１０−１２あたりの、産生段階中の細胞培養培地に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の影響を示す等高線図を（ｂ）に示す。産生段階の終了時にＩＶＣＣ＊１０−１２あたりのバイオリアクターで行われた産生段階を通して添加されたアミノ酸システイン又はシスチン及びトリプトファンの量を測定するための計算分析の説明は、（ｃ）に示されている。
【００６１】
【図１２】ＣＳＶに正規化されたＩＶＣＣ上に対する、産生段階を通じて細胞培養培地で到達したシステイン又はシスチン及びトリプトファンの最大濃度の影響の等高線図。
【００６２】
【図１３】表６に記載される条件について添加したシステイン又はシステインの総量及びＩＶＣＣごとに添加されたシステイン又はシステインの総量。
【００６３】
【図１４】細胞増殖及びｍＡｂ力価に対するシステイン又はシスチン枯渇の影響。生細胞濃度（ＶＣＣ）プロファイル（ａ）、ｍＡｂ力価（ｂ）、及びフィード添加前のＣｙｓ濃度（ｃ）は、３つの実験条件の関数として示されている：産生段階を通してのシステイン又はシスチンの枯渇なし［枯渇なし‐（フィード中の３４．３５ｇ／Ｌ  Ｃｙｓ）］並びに６日目から流加産生の終了まで毎日のシステイン又はシスチン枯渇、及び飼料中のＣｙｓ濃度１７．１７ｇ／Ｌ及び６．８７ｇ／Ｌの２つの条件。
【００６４】
【図１５】（ａ）ｍＡｂ２の４０ｍｇ／ｍＬ変異体に正規化されたＡＰＧ及びｂ＊値に対する、（ｂ）ｍＡｂ３のＡＰＧ変異体に対する、及び（ｃ）ＡＰＧ、ＢＰＧ（塩基性ピークグループ）及びｍＡｂ４のメイングループ変異体に対する、産生された総組換え抗体重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の影響。
【００６５】
【図１６】総組換えｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３及びｍＡｂ４産生重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％のＡＰＧに対する影響。（ａ）では、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、及びｍＡｂ４のＡＰＧ変異体を、産生された総組換えｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３、及びｍＡｂ４重量のシステイン又はシスチン添加総量重量％に対してプロットした。（ｂ）では、組換えモノクローナル抗体ｍＡｂ１、ｍＡｂ２及びｍＡｂ３のＡＰＧ変異体並びに組換え多重特異性抗体、ｍＡｂ４の多重線形回帰モデルを、産生された総組換えｍＡｂ重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量重量％の関数としてプロットした。
【００６６】
【図１７】ｍＡｂ１抗体を発現するＤＧ４４  ＣＨＯ細胞株のデータに基づいて、酸性ピークグループ（ＡＰＧ）レベルを予測するために方程式を作成した（表３）。
【００６７】
【図１８】ｍＡｂ１抗体を発現するＤＧ４４  ＣＨＯ細胞株の実験的酸性ピークグループ（ＡＰＧ）レベル（ＡＰＧｅｘｐ）と予測ＡＰＧレベル（ＡＰＧｐｒｅｄ）の比較。２Ｌバイオリアクターで交互接線流（ＡＴＦ）技術を使用して、灌流産生プロセスでデータを生成した。ＡＰＧの予測は、図１７の式に基づく。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
発明の詳細な説明
本発明は、組換えタンパク質製造方法における産生段階中の細胞培養培地中で使用されるシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量使用を制限することにより、産生される組み換えタンパク質の不均質を減少させるという知見に基づいている。従って、本発明は培地中で発現される抗体又はその抗原結合断片の不均質を減少させるための細胞培養培地における限られた量のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの使用を開示する。
【００６９】
不均質を減少させることは、好ましくは以下に関するものである：
ａ．電荷、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）不均質；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化；及び／又は
ｃ．色又は色の強度（４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値）；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）の形成；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質での安定性，及び／又は
ｆ．それらの組み合わせ。
【００７０】
本明細書で使用される「不均質」という用語は、個々の分子間の差、例えば同じ製造プロセスによって、又は同じ製造バッチ内で生成された分子の集団における組換えタンパク質間の違いを指す。不均質は、例えば発現タンパク質の翻訳後修飾のために、組換えタンパク質の不完全な又は不均質な修飾から生じる可能性がある。そのような修飾は、脱アミノ化反応及び／又は酸化反応及び／又は糖化反応などの小分子の共有結合付加及び／又は異性化反応及び／又は断片化反応及び／又は他の反応の結果であり得、糖化パターンの変動も含む。そのような不均質の化学物理的発現は、電荷変異体プロファイル、色又は色強度、及び分子量プロファイルを含むがこれらに限定されない、得られる組換えタンパク質調製物に様々な特性をもたらす。
【００７１】
本発明に係る用語「産生段階」とは、細胞が組換えタンパク質を発現する（すなわち産生する）場合、組換えタンパク質を製造する方法の間の細胞培養の段階を含む。産生段階は、所望の生成物の力価が増加するときに開始し、細胞又は細胞培養液又は上清の収穫で終わる。通常、産生段階の開始時に、細胞培養物はバイオリアクターに移される。収穫は、組換えタンパク質、例えば組換え抗体をその後の工程で回収し精製するために、例えば産生容器から細胞培養液をから除去する工程である。本明細書で使用する場合の「初期細胞培養重量」という用語は、産生段階の開始時の培養物の重量、典型的にはバイオリアクターの接種時の重量を指す。
【００７２】
第１の態様において、本発明は組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．前記産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
ａ．産生される組換えタンパク質の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
ｂ．産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、
で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【００７３】
それは本発明の以下の説明から明らかなように、培養は、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンで補充される；そのような補充は以下とともにで実行できる：
１．システイン；又は
２．シスチン；又は
３．システイン及びシスチン；又は
４．システイン及びトリプトファン；又は
５．シスチン及びトリプトファン；又は
６．システイン、シスチン、及びトリプトファン；又は
７．トリプトファン。
【００７４】
本明細書で使用される場合、表現「システイン又はシスチンの総量」又は「総量〜までのシステイン又はシスチン」とは、ａ）シスチンが方法のために使用されない場合はシステイン単独の総量、ｂ）システインが方法のために使用されない場合はシスチン単独の総量、又はｃ）両方の化合物が方法に使用されている場合はシステイン＋シスチンの総量を指す。細胞培養培地中のシステイン及びシスチンは一定の平衡にあり、そこではシステインの２分子が酸化するとシスチンの１分子となり、還元するとシステインの２分子に戻る。
【００７５】
本明細書では、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量は、産生される組換えタンパク質の総量の割合として表され得る。本明細書で使用される「重量％」という用語は、重量の割合を指す。「総」（「合計」）とは、産生段階の終了時に決定される総量、すなわち産生段階の過程で添加されるシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量、及び産生段階の過程で産生される組換えタンパク質の総量を指し、産生される組換えタンパク質の総量は産生段階の終了時に測定される。
【００７６】
図１は、産生される組換えタンパク質の重量％あたりのシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量の計算方法を示す。添加されるシステイン又はシスチン又はトリプトファンの総量は、フィード速度（又はフィード体積）及びそのフィード中のシステイン又はシスチン又はトリプトファンの濃度と、培地中のシステイン又はシスチン又はトリプトファンの濃度の関数として計算され、添加されたフィードの体積ごとにフィードが添加される（図１、Ａ）。産生される組換えタンパク質の量は、細胞培養培地の最終体積と最終組換えタンパク質力価の関数として計算される（図１、Ｂ）。これらの２つの計算されたパラメーターの比率は、産生される組換えタンパク質の量あたりのシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの合計量である（図１、Ｃ）。
【００７７】
宿主細胞は、システイン又はシスチン及びトリプトファンをすでに含んでいてもいなくてもよい細胞培養培地中で初期は（工程ａにおいて）増殖させることができる。細胞培養培地にすでにシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの初期量が含まれている場合、総量にはこの初期量が含まれる。
【００７８】
本発明の方法の一つの実施態様では、培養物が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２．０６重量％〜２８．０３重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される。
【００７９】
本発明の方法の別の実施態様において、培養物が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の８．８４重量％〜３２．０６重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜３０重量％、例えば８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される。
【００８０】
あるいは、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量は、産生段階の終了時の積分生細胞数に対する方法中に添加される総量として表されてもよい。
【００８１】
一つの実施態様では、方法中に提供されるシステイン及び／又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す。別の実施態様では、方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す。
【００８２】
当業者は、産生段階などの特定の段階で細胞培養物に添加される及び／又は存在するシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの量を測定する方法を知っていることを理解されたい。例えば、これは本明細書の実施例に記載されているように行うことができる。同様に、当業者は、細胞培養によって産生される組換えタンパク質の総量を測定し、したがって、本発明の教示を適用して所望の技術的効果を達成する方法を知っているであろう。たとえば、これは、分析前に−８０°Ｃで保存した細胞培養上清サンプルにＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔモデルアナライザー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）又はプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用するような、本明細書の実施例に記載されているように行うことができる。
【００８３】
産生される組換えタンパク質の予想される総量あたりのシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの量が特定の範囲内に保たれる本発明による方法を設計するために、１つ又は複数の初期実験を行って特定の培養条件下で特定の宿主細胞によって産生される組換えタンパク質のおおよそのレベルを決定することが必要とされ得る。産生される組換えタンパク質のおおよその総レベルがわかれば、産生される組換えタンパク質の予想される総量あたりのシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの量が特定の範囲内に保たれる本発明による方法を設計することができる。
【００８４】
産生段階で細胞培養培地中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量に到達するために、さまざまな戦略を採用することができる。一つの実施態様では、総量は、産生段階の開始直後にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを添加することにより、例えば一度だけ、又は既に産生細胞培養培地に含まれるようにして到達することができる。別の実施態様では、総量は、産生段階中、添加、例えば毎日の添加又は連続添加の和によって到達することができる。さらに別の実施態様では、総量は、産生段階の開始時に細胞培養液中で初期システイン／システイン及び／又はトリプトファン濃度の組み合わせにより、及び添加により到達することができる。
【００８５】
したがって、本発明の方法の一つの実施態様では、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される。
【００８６】
好ましい実施態様では、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを産生段階の開始時に添加し、産生段階中毎日のボーラス添加を介して添加される。好ましくは、産生段階は少なくとも７日間、より好ましくは、７日間より長く、例えば１０日間、より好ましくは１４日間以上持続する。
【００８７】
好ましい実施態様では、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない。
【００８８】
さらに、好ましい実施態様では、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない。
【００８９】
一つの実施態様では、システイン又はシスチンを細胞培養培地に毎日添加し、及び６日目に細胞培養培地中のシステイン又はシスチンを０．３ｇ／Ｌの最大濃度に増加し、そして７日目から１４日目に細胞培養培地中のシステイン又はシスチンを最大濃度０．９ｇ／Ｌに増加する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの量は、産生段階の終了時に全産生段階にわたって計算する場合の特定の範囲内だけでなく、産生段階の部分中の任意の時点で、又は全産生段階のどの時点であってもよい。したがって、一つの実施態様において、産生段階の後半の任意の時点で（例えば１４日間の産生段階の７〜１４日目）：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【００９１】
別の実施態様では、産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【００９２】
システイン又はシスチンを毎日の添加により細胞に提供する場合、翌日の添加が提供される前にシステイン又はシスチンを培地中で枯渇させてもよい。一つの実施態様では、システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えばシステイン又はシスチン添加を５．６〜７ｇ／［１０１２細胞］のレベルに減少させることによって、システイン又はシスチンを培養物中で枯渇させる。第二の実施態様では、トリプトファンは、産生の後期段階中、細胞培養の間、すなわち、細胞がすでに最大生存細胞密度に達したとき、例えば１４日間の産生段階で８日目以降に枯渇し始めながら、培養物中で枯渇させる。
【００９３】
理論に束縛されるものではないが、システイン又はシスチンが枯渇しているにもかかわらず、産生段階における細胞はシステイン又はシスチンが奪われたままではなく、一旦枯渇が生じるとシステイン又はシスチンに変換され得る不活性代謝産物として、添加を介して、細胞培養培地中で利用可能なシステイン又はシスチンを保存することを目的とした内部メカニズムを持っていると仮定される。
【００９４】
さらなる独立した態様において、本発明は、組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法に関する：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記細胞培養培地がシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンで補充され、ここで
・方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び／又は
・方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【００９５】
この方法の一つの実施態様において、細胞培養培地が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される。
【００９６】
この方法の別の実施態様において、細胞培養培地が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される。
【００９７】
この方法の別の実施態様では、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される。
【００９８】
この方法の別の実施態様では、方法は、流加プロセスなどのバッチプロセスである。この方法の別の実施態様では、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンが、産生段階中の毎日の添加により提供される。
【００９９】
この方法の別の実施態様では、システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／［１０１２細胞］のレベルに減少させることによって細胞培養培地中のシステイン又はシスチンを枯渇させる。
【０１００】
この方法の別の実施態様では、産生の後期段階で、すなわち、細胞が既に最大生存細胞密度に達したとき、トリプトファンが翌日添加される前に、細胞培養培地中のトリプトファンを枯渇させる。
【０１０１】
この方法の別の実施態様において、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、産生段階中の任意の時点で細胞培養中のシステイン又はシスチン濃度が０．３ｇ／Ｌを超えない。
【０１０２】
この方法の別の実施態様では、細胞培養中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、産生段階中の任意の時点で細胞培養中のトリプトファン濃度が０．３ｇ／Ｌを超えない。
【０１０３】
この方法の別の実施態様では、産生段階は少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４日間実施される。
【０１０４】
この方法の一つの実施態様では、産生段階の後半の任意の時点で：
ａ．細胞培養培地中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
ｂ．細胞培養培地中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【０１０５】
この方法の別の実施態様では、産生段階中の任意の時点で：
ａ．システイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
ｂ．トリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【０１０６】
この方法の別の実施態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である。
【０１０７】
この方法の別の実施態様では、組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である。
【０１０８】
この方法の別の実施態様では、産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、又は２００００Ｌ以上の容量のバイオリアクター中で行われる。
【０１０９】
この方法の一つの実施態様では、方法は、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収するステップと、組換えタンパク質を精製するさらなるステップとを含む。
【０１１０】
この方法のさらなる実施態様では、精製はプロテインＡクロマトグラフィーを含む。
【０１１１】
この方法のさらなる実施態様において、方法は、精製された組換えタンパク質を処方するステップをさらに含む。
【０１１２】
この方法の一つの実施態様では、組換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される。
【０１１３】
この方法のさらなる実施態様では、製剤はヒスチジン及び／又はプロリンを含む。
【０１１４】
この方法のさらに別の実施態様では、製剤が５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６、例えば５．５〜６のｐＨで含む。
【０１１５】
この方法のさらに別の実施態様では、製剤は、５．２〜６．０、例えば約５．６のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジン及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む。
【０１１６】
この方法のさらなる実施態様において、界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である。
【０１１７】
この方法のさらなる別の実施態様では、組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されている
【０１１８】
この方法の別の実施態様では、方法は産生される組換えタンパク質の不均質を減少させるものであり、ここで前記不均質の減少とは
ａ．電荷の不均質、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）を減少させること；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化を減少させること；及び／又は
ｃ．例えば組換えタンパク質の異なるバッチ間で、色又は色の強度を減少させること；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）を減少させること；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質不安定性を減少させること、
を含む。
【０１１９】
さらに独立した態様において、本発明は、組換えタンパク質の産生段階中の細胞培養培地中に存在する
ａ．システイン又はシスチン及び／又は
ｂ．トリプトファン
の総量を制限することを含む、組換え宿主細胞により産生段階において産生されるバッチ中の組換えタンパク質の集団の不均質を減少させる方法に関する。
【０１２０】
一つの実施態様では、本方法は以下を含む：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、
で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【０１２１】
本方法の一つの実施態様において、培養物が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される。
【０１２２】
本方法の別の実施態様では、培養物が、産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される。
【０１２３】
本方法の別の実施態様では、方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す。
【０１２４】
本方法の別の実施態様では、方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す。
【０１２５】
本方法の別の実施態様では、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される。
【０１２６】
本方法の別の実施態様では、方法は、流加プロセスなどのバッチプロセスである。
【０１２７】
本方法の別の実施態様において、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンは、産生段階中の毎日の添加により提供される。
【０１２８】
本方法の別の実施態様において、システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／［１０１２細胞］のレベルに減少させることによって細胞培養培地中のシステイン又はシスチンを枯渇させる。
【０１２９】
本方法の別の実施態様では、産生の後期段階中に、すなわち、細胞が既に最大生存細胞密度に達したとき、トリプトファンが翌日添加される前に、細胞培養培地中のトリプトファンを枯渇させる。
【０１３０】
本方法の別の実施態様では、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない。
【０１３１】
本方法の別の実施態様では、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない。
【０１３２】
本方法の別の実施態様では、産生段階は少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４日間実施される。
【０１３３】
本方法の別の実施態様では、産生段階の後半の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【０１３４】
本方法の別の実施態様では、産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び／又は
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である。
【０１３５】
本方法の別の実施態様では、宿主細胞は哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である。
【０１３６】
本方法の別の実施態様では、組換えタンパク質は抗体又はその抗原結合断片である。
【０１３７】
本方法の別の実施態様では、産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、又は２００００Ｌ以上の容量のバイオリアクター中で行われる。
【０１３８】
この方法の一つの実施態様では、方法は、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収するステップと、組換えタンパク質を精製するさらなるステップとを含む。
【０１３９】
この方法のさらなる実施態様では、精製はプロテインＡクロマトグラフィーを含む。
【０１４０】
この方法のさらなる実施態様において、方法は、精製された組換えタンパク質を製剤化するさらなるステップを含む。
【０１４１】
この方法の一つの実施態様では、組換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される。
【０１４２】
この方法のさらなる実施態様では、製剤はヒスチジン及び／又はプロリンを含む。
【０１４３】
この方法のさらに別の実施態様では、製剤は５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６、例えば５．５〜６のｐＨで含む。
【０１４４】
この方法のさらに別の実施態様では、製剤は、５．２〜６．０、例えば約５．６のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む。
【０１４５】
この方法のさらなる実施態様では、界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である。
【０１４６】
この方法のさらに別の実施態様では、組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されている。
【０１４７】
この方法の別の実施態様において、方法は産生される組換えタンパク質の不均質を減少させるものであり、ここで前記不均質の減少とは：
ａ．電荷の不均質、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化；及び／又は
ｃ．例えば組換えタンパク質の異なるバッチ間の、色又は色の強度；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質不安定性、
を減少させることを含む。
【０１４８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の方法により得られ得る又は得られる組換えタンパク質調製物（製剤）に関する。一つの実施態様では、その製剤はバルク製剤である。他の実施態様では、例えば、方法がタンパク質産物を製剤化するさらなるステップを含む場合、得られる製剤は製剤化されたタンパク質製剤、例えば患者への投与に適した製剤である。
【０１４９】
組換えタンパク質、好ましくはそのようにして得られる前記製剤における抗体又はその抗原結合断片は、同じ方法で得られる同じ組換えタンパク質に関して減少した不均質を示すが、ここで産生段階中のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンの総量は、本発明で説明されるように限定されない。
【０１５０】
さらに別の態様では、本発明は、抗体を含む医薬組成物に関し、組成物は、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤の液体製剤組成物である。
【０１５１】
一つの実施態様では、医薬組成物はヒスチジン及び／又はプロリンを含む。
【０１５２】
さらなる実施態様では、医薬組成物はヒスチジン及び／又はプロリンを含む。
【０１５３】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６、例えば５．５〜６のｐＨで含む。
【０１５４】
さらなる実施態様において、医薬組成物は、５．２〜６．０、例えば約５．６のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む。
【０１５５】
医薬組成物のさらなる実施態様において、界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である。
【０１５６】
医薬組成物のさらなる実施態様において、抗体は、１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される。
【０１５７】
医薬組成物のさらなる実施態様では、抗体は以下である：
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体；又は
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖と、配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体。
【０１５８】
宿主細胞と培養条件
組換えタンパク質、抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは哺乳動物宿主細胞、最も好ましくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を培養することにより産生され得る。
【０１５９】
用語「細胞培養」（「細胞培養物」）又はその文法的変形は、特定の期間、例えば産生段階での細胞培養培地で維持又は増殖される１つ以上の組換えタンパク質を発現（すなわち産生）するように適切に改変された及び／又は操作された、複数の宿主細胞、好ましくは哺乳動物宿主細胞を含むが、それらに限定されるものではない。
【０１６０】
哺乳動物細胞は、特にＣＨＯ細胞において、その増殖及び組換えタンパク質の発現をサポートする任意の培地で培養することができる。好ましくは、培地は、動物血清とペプトンなどの動物由来産物を含まない培地である。当業者が入手可能な様々な細胞培養培地が存在するが、各培地は、細胞増殖とタンパク質産生を可能にする適切な濃度で存在する、ビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長因子、イオン、緩衝剤、ヌクレオシド、グルコース又は同等のエネルギー源の異なる組み合わせを含む。適切な媒体は、例えば、ＷＯ９８／０８９３４及びＵＳ２００６／０１４８０７４（両方ともその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明において使用することができ、又はシステイン／システイン及び／又はトリプトファン要件を満たすように修飾することができる、さらに好適な市販の培地としては、ＡｍｐｌｉＣＨＯ  ＣＤ媒体、Ｄｙｎａｍｉｓ（商標）培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ（商標）ＣＨＯ流加システム、ＣＤ  ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地、ＣＰ  ＯｐｔｉＣＨＯ（商標）、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＢａｌａｎＣＤ（商標）ＣＨＯ増殖Ａ培地、ＡｃｔｉＰｒｏ（商標）、ＤＭＥＭ−ダルベッコ改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。
【０１６１】
細胞培養物は、必要な生産の規模に応じて流加モードで操作してもしなくてもよい振盪フラスコ又はバイオリアクターなどの任意の適切な容器内で行うことができる。
【０１６２】
これらのバイオリアクターは、攪拌タンクリアクター又はエアリフトリアクターのいずれかであり得る。１，０００Ｌを超えて５０，０００Ｌまで、好ましくは５，０００Ｌ〜２０，０００Ｌ、又は１０，０００Ｌの容量のさまざまな大規模バイオリアクターが利用可能である。あるいは、２Ｌ〜１００Ｌなどのより小さい規模のバイオリアクターも抗体又は抗体断片を製造するために使用できる。
【０１６３】
本発明の好ましい実施態様では、前の段階（すなわち、拡張段階）がどこで実行されるかに関係なく、産生段階は、バイオリアクター又は振盪フラスコ又はスピナーフラスコなどの他の懸濁培養容器で実行される。産生段階は流加モードで好ましくは動作させるが、任意の他のモード、例えばバッチ、灌流又はケモスタットモードを代替として使用することができる。灌流又はケモスタットの場合、使用されるシステイン又はシステイン及び／又はトリプトファンの総量の比率は、灌流流量対産生容器から産生される組換えタンパク質の除去速度に従って計算される。
【０１６４】
一つの実施態様では、方法は、組換えタンパク質を細胞培養培地から回収するステップ、及び組換えタンパク質を精製するさらなるステップを含む。
【０１６５】
さらなる態様において、精製はプロテインＡクロマトグラフィーを含む。
【０１６６】
さらなる実施態様において、方法は精製された組換えタンパク質を製剤化するさらなるステップを含む。
【０１６７】
一つの実施態様において、組換えタンパク質は、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される。
【０１６８】
さらなる実施態様において、製剤はヒスチジン及び／又はプロリンを含む。
【０１６９】
さらに別の実施態様において、製剤が５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６、例えば５．５〜６のｐＨで含む。
【０１７０】
さらに別の実施態様では、製剤は、約５．６などの５．２から６．０の間のｐＨで、３０ｍＭの濃度のヒスチジン及び２５０ｍＭの濃度のプロリンを含む。
【０１７１】
さらなる実施態様では、界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である。
【０１７２】
さらに別の実施態様では、組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ミリｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化されている。
【０１７３】
組換えタンパク質、例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、哺乳動物細胞培養物、典型的にはＣＨＯ細胞培養物の上清中に典型的には見出される。ＣＨＯ宿主細胞については、抗体又はその抗原結合断片は上清中に分泌され、当該上清が当技術分野で公知の方法により、典型的には遠心分離により回収され得る。
【０１７４】
本発明の方法を使用して産生することができる組換えタンパク質
本発明の方法は、例えば、糖タンパク質及び多量体タンパク質だけでなく、重要な三次構造を有するペプチド又はより大きなタンパク質を例えば含む、あらゆる種類の組換えポリペプチド又はタンパク質を産生するために使用できる。しかし、好ましくは、本発明の方法で産生される組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である。本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語は、例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の両方、並びに単一特異性抗体、及び二重特異性抗体などの多重特異性抗体の両方を含む。
【０１７５】
「抗体」（単数又は複数）には、任意の種の、特に哺乳動物種の抗体、典型的には２つの重鎖及び２つの軽鎖を有する抗体、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、及びＩｇＭ及びその改変変異体を含む任意のアイソタイプのヒト抗体、非ヒト霊長類抗体、例えばチンパンジー、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザル由来の抗体、げっ歯類抗体、例えばマウス、ラット又はウサギ由来の抗体；ヤギ又はウマの抗体、及びそれらの誘導体、又はニワトリ抗体などの鳥類種の、又はサメ抗体などの魚種のものが含まれる。用語「抗体」（単数又は複数）はまた、少なくとも１つの重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第１部分が第１の種由来であり、重鎖及び／又は軽鎖抗体配列の第２部分が第２の種由来である「キメラ」抗体も指す。本明細書で関心のあるキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界ザル）由来の可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体に由来する配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、目的の特異性、親和性、及び活性を有する、非ヒト種（ドナー抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、又は非ヒト霊長類の超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基で置換されたヒト抗体（レシピエント抗体）である。ほとんどの場合、ＣＤＲの外側のヒト（レシピエント）抗体の残基は；すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）では、対応する非ヒト残基によってさらに置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの変更は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。ヒト化は、ヒトにおける非ヒト抗体の免疫原性を低下させ、したがって、ヒト疾患の治療への抗体の適用を促進する。ヒト化抗体及びそれらを生成するいくつかの異なる技術は当技術分野で周知である。用語「抗体」（単数又は複数）は、ヒト化の代替として生成され得るヒト抗体も指す。例えば、免疫時に内因性ネズミ抗体の産生なしにヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を製造することが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失により、内因性抗体産生が完全に阻害されることが報告されている。そのような生殖細胞系変異マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、特定の抗原に対するヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子を運ぶトランスジェニック動物の免疫化により、特定の抗原に対して特異性を有するヒト抗体の産生をもたらすであろう。そのようなトランスジェニック動物を製造するための技術及びそのようなトランスジェニック動物からヒト抗体を単離及び製造するための技術は、当技術分野で知られている。あるいは、トランスジェニック動物では；例えばマウスの場合、マウス抗体の可変領域をコードする免疫グロブリン遺伝子のみが、対応するヒト可変免疫グロブリン遺伝子配列に置き換えられる。抗体定常領域をコードするマウス生殖系列免疫グロブリン遺伝子は変化しないままである。このようにして、抗体エフェクターはトランスジェニックマウスの免疫系で機能し、その結果、Ｂ細胞の発達は本質的に変化せず、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原攻撃に対する抗体応答の改善につながる可能性がある。関心のある特定の抗体をコードする遺伝子がそのようなトランスジェニック動物から単離されると、定常領域をコードする遺伝子を完全なヒト抗体を得るためにヒト定常領域遺伝子で置き換えることができる。本明細書で使用される「抗体」（単数又は複数）という用語は、非グリコシル化抗体も指す。
【０１７６】
本明細書で使用される「その抗原結合断片」という用語又はその文法的変形は、抗体断片を指す。抗体の断片は、当技術分野で知られている少なくとも１つの重鎖又は軽鎖免疫グロブリンドメインを含み、１つ又は複数の抗原に結合する。本発明による抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ及びｓｃＦｖ断片；並びにダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、例えばｓｄＡｂ、ＶＨＨ、又はラクダ抗体（例えば、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）などのラクダ又はラマ）及びＶＮＡＲ断片、単鎖抗体、Ｆａｂ−Ｆｖ又はＦａｂ−Ｆｖ−Ｆｖ構築物を含むがこれらに限定されない抗体断片又は抗体から形成された二重特異性、三重特異性、四重特異性又は多重特異性抗体を含む。上記で定義される抗体断片は当業界で公知である。
【０１７７】
特に好ましい実施態様では、本発明の方法により産生される抗体又はその抗原結合断片は以下である（表１）：
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体；又は
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖と、配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体。
【０１７８】
この明細書全体を通して、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）はＫａｂａｔの定義に従って定義される。Ｋａｂａｔの定義は、抗体の残基に番号を付けるための標準であり、ＣＤＲ領域を識別するために通常使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９１）、第５版、ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２）。
【０１７９】
【表１Ａ】
2020521490.tif 000002
【表１Ｂ】
2020521490.tif 000003
【０１８０】
組換えタンパク質又は好ましい抗体又はその抗原結合断片は、典型的には、タンパク質又は抗体ヌクレオチド配列をコードするベクターを含む宿主細胞によって産生され得る。
【０１８１】
抗体又はその抗原結合断片は、重鎖又は軽鎖タンパク質のみを含んでもよく、その場合、重鎖又は軽鎖タンパク質コード配列のみを使用して細胞をトランスフェクトする必要がある。重鎖と軽鎖の両方を含む産物の産生のために、細胞に２つのベクター、軽鎖タンパク質をコードする第１ベクターと重鎖タンパク質をコードする第２ベクターをトランスフェクトしてもよい。あるいは、軽鎖及び重鎖タンパク質をコードする配列を含む単一のベクターを使用してもよい。
【０１８２】
好ましい実施態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片タンパク質を産生するための方法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ．培地で抗体又はその抗原結合断片を産生できるＣＨＯ細胞を培養する；
ｂ．抗体又はその抗原結合断片が細胞によって産生される産生段階を通じて培養を進行させる、ここで、前記産生段階の間に、培養物は、産生される抗体又はその抗体結合断片の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までシステイン又はシスチンで補充される、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から抗体又はその抗原結合断片を回収する、
ここで、方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）である、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を意味する、
ここで、システイン又はシスチンは、産生段階で毎日添加することにより提供される、
ここで、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度は、産生段階のいずれの時点でも０．９ｇ／Ｌを超えず、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度は、産生段階のいずれの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えない、
ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは：
１）配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む；又は
２）配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む。
【０１８３】
さらなる好ましい実施態様では、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を製造する方法であって、以下を含む方法を提供する：
ａ．培地で抗体又はその抗原結合断片を産生できるＣＨＯ細胞を培養する；
ｂ．抗体又はその抗原結合断片が細胞によって産生される産生段階を通じて培養を進行させる、ここで、前記産生段階の間に、細胞培養培地が
・産生される抗体又はその抗原結合断片の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び／又は
・産生される抗体又はその抗原結合断片の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン
で補充される、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から抗体又はその抗原結合断片を回収する、
ここで、方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を意味し、
ここで、方法中に提供されるトリプトファンの総量は、２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２個／Ｌ）であり、ここで、細胞は産生段階の終了で予想される積分生細胞数を意味し、
ここで、システイン又はシスチン及び／又はトリプトファンは、産生段階での毎日の添加により提供され、
ここで、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度は、産生段階中のいずれの時点でも０．９ｇ／Ｌを超えず、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度は、産生段階中のいずれの時点でも０．３ｇ／Ｌを超えない、
ここで、細胞培養中のトリプトファン濃度は、産生段階のどの時点でも０．６ｇ／Ｌ  培地を超えない、好ましくは、細胞培養培地のトリプトファン濃度は、産生中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない段階、及び 
ここで、前記抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは：
１）配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３；又は
２）配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む。
【０１８４】
以下、添付の図面に示される実施態様を参照して、例により本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０１８５】
略語
ｍＡｂ：モノクローナル抗体；ＭＦＣＳ：マルチ発酵制御システム；Ｃｙｓ：システイン又はシスチン；Ｔｒｐ：トリプトファン
【０１８６】
材料及び方法
細胞株、細胞培養及び実験手順
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞株を使用した。マルチ発酵制御システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって制御される供給塔（Ｃ‐ＤＣＵＩＩ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を備えた２Ｌ攪拌タンクガラス製バイオリアクター中で、シスチン（０．０５ｇ／Ｌ）及びトリプトファン（０．２ｇ／Ｌ）を含有する化学的に定義される動物フリーの接種培地で、標準的な操作条件（ｐＨ７、温度３６．８°Ｃ）の下、細胞を培養した。それぞれがｍＡｂ１、ｍＡｂ２、ｍＡｂ３及びｍＡｂ４と呼ばれるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を産生する４つの異なる産生細胞株を使用した。ｍＡｂ１は、配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖を含む抗ＦｃＲｎ抗体である。
【０１８７】
産生は１４日間、流加実験モードで行われた。この段階の間、モノクローナル抗体が培地中に分泌される。サンプルを毎日採取して、生存細胞密度（ＶＣＤ）、生存率、オフラインｐＨ、ｐＣＯ２、浸透圧、グルコース‐乳酸濃度、アミノ酸濃度及びｍＡｂ濃度（−８０°Ｃでストック）を決定した。消泡剤は、泡の蓄積を制御するために、必要に応じて毎日手動で添加した。接種から７２時間後、所定の割合で連続栄養補給を開始した。連続栄養補給培地は、システイン／シスチン又はトリプトファンを含まない。この時点で、システイン／シスチン及びトリプトファンを、以下の実施例に記載されている量を有するボーラスフィードとして１０日間毎日添加した。実施例に記載のシステイン／シスチン及びトリプトファンの量は、接種媒体に既に存在するこれらのアミノ酸の初期の量を考慮して、接種から７２時間後に開始するボーラス添加の総量である。グルコース濃度が６ｇ／Ｌを下回った場合（６日目以降）にグルコースボーラスフィードを培養液に添加し、グルコース濃度を毎日測定した。アミノ酸分析のサンプルは、フィード添加前に採取した。フィード後の濃度は、フィード組成に基づいて計算し、フィード添加前の栄養素濃度を測定した。
【０１８８】
分析方法
細胞は、トリパンブルー排除に基づいて作動するＶＩ‐ＣＥＬＬ（登録商標）ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ‐Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｂｒｅａ，ＣＡ）自動細胞計数装置を使用して計数した。
ＮＯＶＡ４００ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ自動分析装置（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、培養培地中のグルコース及び乳酸レベルを測定した。
【０１８９】
モデル２０２０凝固点浸透圧計（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｗｏｏｄ、ＭＡ）を浸透圧測定に使用した。モデルＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅｐＨＯｘ（登録商標）血液ガス分析装置（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、オフラインのガス及びｐＨ測定を実行した。
【０１９０】
代謝物濃度は、ＣｅｄｅｘＢｉｏＨＴシステム（Ｒｏｃｈｅ）を使用して毎日決定した。
製品力価分析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔモデルアナライザー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）又はプロテインＡ高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、分析前に−８０°Ｃで保存した細胞培養上清サンプルで行った。
【０１９１】
アミノ酸は、Ａｍｉｃｏｎ‐Ｕｌｔｒａ‐０．５ｍＬ遠心フィルター（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて限外濾過した後、逆相ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ・Ｔａｇｕｌｔｒａ法）によって分析した。
【０１９２】
プロテインＡ精製（ＡＫＴＡ  Ｘｐｒｅｓｓシステム）を使用して、細胞培養上清サンプルのｍＡｂを精製した。精製ｍＡｂのメイン、酸性（酸性ピーク群ＡＰＧ）及び塩基性（塩基性ピーク群ＢＰＧ）アイソフォームの相対的割合をイメージキャピラリー電気泳動（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ  ｉＣＥ３）によって決定した。精製されたｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）、モノマー及び低分子量種（ＬＭＷＳ）レベルを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ‐ＵＰＬＣ）によって決定した。
【０１９３】
濃縮したｍＡｂ１とｍＡｂ２の製剤の色強度は、透過分光光度計（ＵｌｔｒａｓｃａｎＰｒｏ）を用いて濃縮したタンパク質Ａ溶出液中で測定し、Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｌ’ｅｃｌａｉｒａｇｅ（ＣＩＬ）スケールと比較した。数値結果は、４０ｍｇ／ｍＬの濃度に正規化した。
【０１９４】
エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ‐ＭＳ）を精製されたｍＡｂ１について行った。ペプチドマッピングを抗体への翻訳後修飾を識別するために行った。ＳＡＳソフトウェアＪＭＰ１１を使用して統計分析を行った。
【０１９５】
例１
２リットルのバイオリアクターに、０．３５×１０６細胞／ｍＬの播種密度でｍＡｂ１を産生するＣＨＯ細胞を接種した。細胞培養を通して到達されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンのさまざまな最大濃度、及び産生された総ｍＡｂ１重量のシステイン又はシスチン（Ｃｙｓ）及びトリプトファン（Ｔｒｐ）重量％のさまざまな総量で、材料と方法のセクションに記載されているように８つの実験条件を流加プロセスでテストした（表２ａ）。第一の目的は、システイン又はシスチン及びトリプトファンの組換えｍＡｂ１の不均質への影響を評価することであった。第二の目的は、細胞培養を通じて到達された高濃度のシステイン又はシスチン及び／又はトリプトファンによる、及び／又は産生された総ｍＡｂ重量の総添加量重量％による影響があったかどうかを識別することであった。
【０１９６】
【表２Ａ】
2020521490.tif 000004
【０１９７】
材料と方法のセクションで説明したように、組換えタンパク質の電荷変異体と色強度を測定した。データは一方向Ａｎｏｖａ統計分析により分析され、線形適合とｐ値＜０．０５は許容可能とみなされた。
【０１９８】
図２ｂに示すように、ｍＡｂ１における酸性ピーク群電荷変異体（ＡＰＧ％）の増加と産生された総ｍＡｂ１あたり添加されたシステイン又はシスチンの総量重量％（ｇ／ｇ）の増加との間に相関関係があった。
ｍＡｂ１の色強度に対して、ｍＡｂ１色強度（４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値）の増加と産生された総ｍＡｂ１あたり添加されたトリプトファンの総量重量％（ｇ／ｇ）の増加との間に相関があった（図２ａ）。
【０１９９】
しかし、データをトリプトファン又はシステイン又はシスチンの最大濃度に関して分析した場合、色又はＡＰＧには影響がなかった（図２ｃ及び２ｄ）。
【０２００】
ｍＡｂ１の不均質に影響を及ぼすのは、産生される総ｍＡｂ１重量当たりのシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量であって、流加設定（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｓｅｔｔｉｎｇ）における産生段階を通して到達されるシステイン又はシスチン及びトリプトファンの最大濃度ではないことを確認するために、高濃度の２つのアミノ酸に到達するために３日目にシステイン又はシスチン及びトリプトファンをさまざまにボーラス添加して８つの実験条件をテストした（表２ｂ）。産生された総ｍＡｂ１重量の同じ添加量重量％（ｇ／ｇ）のシステイン又はシスチン及びトリプトファンを得るために、フィード戦略を適合させた。流加条件で示されているように、ｍＡｂ１の酸性ピーク群電荷変異体の増加（ＡＰＧ％）と、産生された総ｍＡｂ１あたりのシステイン又はシスチンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）の増加との間に相関関係があり（図３ｂ）、及びｍＡｂ１色強度（４０ｍｇ／ｍＬに正規化されたｂ＊値）と、産生された総ｍＡｂ１あたりのトリプトファンの添加総量重量％（ｇ／ｇ）との増加の間に相関関係がある（図３ａ）。しかし、ＡＰＧ電荷変異体及びシステイン又はシスチン及びトリプトファンの最大濃度（ｇ／Ｌ）には相関がなかった（それぞれ図３ｃ及び３ｄ）。これらの結果は、産生された総ｍＡｂ１重量の重量％（ｇ／ｇ）あたり細胞培養中に添加されたシステイン及びトリプトファンの総量が、ＡＰＧ電荷変異体及び色強度に影響することを確認するものである。システイン又はシスチン及びトリプトファンの最大濃度は、ＡＰＧ電荷変異体及び色強度に影響がない。
【０２０１】
【表２Ｂ】
2020521490.tif 000005
【０２０２】
結論
産生された総組み換えｍＡｂ１のＣｙｓ及びＴｒｐの添加総量重量％（ｇ／ｇ）は、ｍＡｂ１電荷変異体との色強度に影響を与える。これに反して、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの最大濃度は、ｍＡｂ１の質に影響しなかった。
【０２０３】
例２
細胞培養中の、産生される総ｍＡｂのシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％（ｇ／ｇ）の影響をさらに調べるために、２Ｌバイオリアクター実行で４８の実験条件（表３）を方法のセクションで記載するように準備した。ｍＡｂ１電荷変異体、凝集体（ＨＭＷＳ）、色強度、力価、及び生細胞増殖を分析した。
【０２０４】
【表３Ａ】
2020521490.tif 000006
【表３Ｂ】
2020521490.tif 000007
【表３Ｃ】
2020521490.tif 000008
【０２０５】
図４に示すように、産生される総ｍＡｂ１の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％（ｇ／ｇ）は酸性電荷変異体群（ＡＰＧ％）に影響する。産生された総ｍＡｂ１あたり１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチンの総量の約５０重量％（ｇ／ｇ）の飽和効果がある。システイン又はシスチン及びトリプトファンの影響は相互作用なしで累積的である。産生された総ｍＡｂ１の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合重量％（ｇ／ｇ）を減らすと、産生されるｍＡｂ１の酸性ピークの割合が減少する。
【０２０６】
図５は、産生された総ｍＡｂ１重量のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量（１４日間の細胞培養中に添加）重量％のメインピーク群への影響を示す。ＡＰＧ％で見られるように、システイン又はシスチン及びトリプトファンの影響は累積し、相互作用はない。産生される総ｍＡｂ１重量の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％を減らすと、産生される組換えｍＡｂのメインピークの割合が増加する。
【０２０７】
図６は、高分子量種（ＨＭＷＳ）で産生される総ｍＡｂ１の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチンの総量重量％（ｇ／ｇ）の影響を示す。産生される総ｍＡｂ１の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチンの総量重量％（ｇ／ｇ）の約５０％の飽和効果がある。システイン又はシスチンの総量を減らすと、産生される組換えｍＡｂのＨＭＷＳの割合が減少する。添加されたＴｒｐの総量の影響は、ＨＭＷＳで観察されない。
【０２０８】
図７に示す結果は、産生される総ｍＡｂ１の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％（ｇ／ｇ）の、組換えｍＡｂ１の色強度（４０ｍＧ／ｍＬに正規化されたｂ値）に対する影響を説明する。１４日の産生段階を通して添加されるシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量を減らすと、産生される組換えｍＡｂ１の色強度が低下する。産生された総ｍＡｂ１の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％（ｇ／ｇ）との間に相互作用効果がある。
【０２０９】
図８は、ＡＰＧの最低値、ＨＭＷＳ、色強度、及びメインピーク群の最高値を達成するために産生される総ｍＡｂ‐１の１４日の産生段階を通じて添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合重量％（ｇ／ｇ）の最適範囲を示す等高線図を示す。添加されるシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量はシステイン又はシスチンについては産生される総ｍＡｂ１の１２．０６〜２８．０３重量％（ｇ／ｇ）で加え、トリプトファンについては総ｍＡｂ１の８．８４〜３２．０６重量％（ｇ／ｇ）で加える。
【０２１０】
１４日の産生段階を通して累積積分生細胞数（ＩＶＣＣ）が計算され、細胞培養体積（ＣＳＶ）によって正規化された。図９に示す結果は、ＣＳＶの初期重量ごとに細胞培養液に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合がＩＶＣＣに及ぼす影響を示す。初期ＣＳＶ重量当たり細胞培養培地に添加されるシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合の最適範囲があり、それはシステイン又はシスチンについては０．０８％〜０．２４％であり、トリプトファンについては０．０７％〜０．１５％の。相乗効果はなく、累積効果のみが観察されました（図９ａ及び９ｂ）。
【０２１１】
図の１０ａ及び１０ｂは、初期ＣＳＶ重量当たり細胞培養培地に添加するシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合の、ｍＡｂ１力価に対する影響を示す。ＣＳＶ重量当たり細胞培養培地に添加するシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の割合の最適範囲があり、それはＣＳＶ重量のシステイン又はシスチンについて０．０８％〜０．２４％であり、トリプトファンについて０．０７％〜０．１５％重量％。相互作用効果はない。
【０２１２】
図１１ａ及び１１ｂに示す等高線プロットは、産生段階の終了時にＩＶＣＣ＊１０−１２当たり細胞培養培地に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量の最適範囲を示し、それはＣｙｓについては２．９〜１２ｇであり、Ｔｒｐについては２．５〜７ｇである。
【０２１３】
例３
組換えモノクローナル抗体は、材料及び方法で説明されているように、産生された総組換えｍＡｂ１のさまざまなシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総添加量重量％での３回の流加実験条件で特徴付けられる（表４）。
【０２１４】
【表４】
2020521490.tif 000009
【０２１５】
質量分光分析は、システイン又はシスチン及びトリプトファンの濃度増加の結果として、非変性及び変性条件における、グリコシル化ｍＡｂ１についての質量スペクトルで観察された最も強いピークの質量シフトを示した。これらの観察は、修飾がグリコシル化パターンの変化にリンクされていないという結論につながる。マニュアルデコンボリューション後の質量スペクトルの軽鎖、重鎖及びハーフマー（ｈａｌｆｍｅｒ）（一つの重鎖プラス一つの軽鎖）の分析は、ｍＡｂ１の可能な糖化が、産生された総ｍＡｂ重量の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの高い総量重量％で起こることを示唆している。おそらくより多くの付加物、すなわちｍＡｂ１への小分子の添加を観察することができる。システイン又はシスチン及びトリプトファンの添加総量が増加すると、軽鎖のシステイン付加も増加する。表５は、ペプチドマッピングで得られた、テストされた３つの実験条件に対するｍＡｂ１の特性の概要を示す。結果は、産生される総ｍＡｂ重量の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％を増やすと、重鎖のスレオニン１９でメチオニン酸化が増加し、重鎖のスレオニン３３で脱アミド化が起こることを示す。さらに、ｍＡｂ１のＡＰＧ％及びＢＰＧ％変異体は、産生される総ｍＡｂ重量の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の増加とともに劇的に増加するが、メインピークは、産生された総ｍＡｂ重量の１４日の産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の減少とともに増加する。
【０２１６】
【表５】
2020521490.tif 000010
【０２１７】
例４
ｍＡｂ１を発現するＤＧ４４  ＣＨＯ細胞株の増殖に対するシステイン又はシスチン及びトリプトファンの阻害濃度を識別するために、３日目にシステイン又はシスチン及びトリプトファンの種々のボーラス添加を、これらのアミノ酸の高濃度に到達する目的で試験した（表２ｂ）。産生される総ｍＡｂ１重量の同じ添加量重量％のシステイン又はシスチン及びトリプトファンを得るために、フィード戦略を適合させた。図１２は、それぞれ０．３ｇ／Ｌから０．９ｇ／Ｌまで及び０．６ｇ／Ｌの高濃度のシステイン又はシスチン及びトリプトファンが著しく細胞増殖を減少させることを示す（ＣＳＶにより正規化された１４日の産生段階を通しての累積ＩＶＣＣ）。
【０２１８】
例５
システイン又はシスチンの枯渇は、ｍＡｂ１を発現するＣＨＯ細胞株の増殖と産生性に影響を与える可能性があるという仮説が立てた。２Ｌバイオリアクター中の９の実験条件を分析した（表６ａ）：産生段階プロセスを通じてシステイン又はシスチンの枯渇のない３つの対照条件、６日目に毎日の枯渇を開始し、流加産生プロセスの終了まで６．８７ｇ／Ｌのフィードでシステイン又はシスチン濃度を継続する２つの実験条件、及び６日目にシステイン又はシスチンを枯渇させ、フィード中１７．１７ｇ／Ｌのシステイン又はシスチン濃度を有する４つの実験条件である。システイン又はシスチンが毎日添加されるため、枯渇は周期的である。フィード戦略は表６ｂに記載されている。システイン又はシステインの添加総量及びＩＶＣＣごとのシステイン又はシステインの添加総量図１３に示す。フィード添加前のＣｙｓ濃度を図１４ｃに示す。図１４ａに示すように、フィード中のシステイン又はシスチン濃度が約１７．１７ｇ／Ｌである場合、６日目のシステイン又はシスチンの枯渇は細胞増殖に影響を与えない。理論に縛られることを望まないが、システイン又はシスチン関連の代謝物は細胞内に蓄積及び保存され、システイン又はシスチンが枯渇すると利用可能になると考えられる。ただし、ｍＡｂ１の細胞株の産生性は、システイン又はシステインの枯渇の影響を受ける（図１４ｂ）。
【０２１９】
【表６Ａ】
2020521490.tif 000011
【０２２０】
【表６Ｂ】
2020521490.tif 000012
【０２２１】
例６
総組換えｍＡｂの産生段階を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％を制御することによって引き起こされる不均質の減少の影響は、ｍＡｂ１を排除するものではない。システイン又はシスチン及びトリプトファンの総量についての実験は、組換え抗体も産生する他の三つのＣＨＯ細胞株でテストした（表７）。図１５ａに示すように、ＡＰＧ電荷変異体と色強度の増加は、総ｍＡｂ２の添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の増加と相関している。ｍＡｂ３のＡＰＧ電荷変異体を分析すると、同様の結果が得られた（１５ｂ）。最後に、ＡＰＧ及びＢＰＧ電荷変異体の増加とメインピークの減少は、総ｍＡｂ４のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の増加と相関した（１５ｃ）。これらの結果はｍＡｂ１について得られた結果を確認するものである。
【０２２２】
【表７】
2020521490.tif 000013
【０２２３】
例７
産生された総組換えｍＡｂ重量の１４日の産生を通して添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の影響を、ここでテストした４つの異なるモノクローナル抗体のデータに基づいて分析した（表３及び７）。図１６（ａ及びｂ）に示すように、ＡＰＧ電荷変異体増加は、分析したすべての４つの抗体について、産生された組換え抗体総重量の添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファン総量重量％の増加に相関している。この結果は、産生された組換え抗体総重量の添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファン総量重量％と抗体の不均質との間の関係が、特異的な抗体に限定されず、任意の抗体に適用されることを確認するものである。
【０２２４】
例８
液体医薬製剤
モノクローナル抗体ｍＡｂ１の医薬製剤を流加モードで大規模に、すなわち２０００Ｌステンレススチールのバイオリアクター中で、材料及び方法に記載の標準操作条件下で、表９で特定されているように添加した、種々のシステイン又はシスチン及びトリプトファン総量を用いて製造した。抗体サンプルの緩衝液を透析濾過緩衝液（３３ｍＭ  Ｈｉｓ及び２５０ｍＭ  Ｐｒｏ、ｐＨ５．６）と少なくとも７回（７透析体積）交換し、続いて、３０ｋＤａの分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を使用して限外濾過を行った。抗体の濃度（１４０ｍｇ／ｍｌ＋／−１４ｍｇ／ｍｌ）が達成されたら、必要な濃度（最終濃度に基づいて０．０３％ｗ／ｖ）でポリソルベート８０を添加した。ＵＶＡ２８０を使用して、抗体の濃度を測定した。
【０２２５】
表８に、製剤化されたｍＡｂ１の電荷変異体の外観を示す。表８及び９で「より高いＣｙｓ添加」と定義される２つの産生では、表８及び９で「より低いＣｙｓ添加」として定義される他の３つの産生よりも、産生された総組換えｍＡｂ１のシステイン又はシスチンの総添加量重量％がより多い。ＡＰＧ電荷変異体の増加は産生された総組換えｍＡｂ１の添加されたシステイン又はシスチンの総量重量％の増加に相関している。
【０２２６】
【表８Ａ】
2020521490.tif 000014
【０２２７】
【表８Ｂ】
2020521490.tif 000015
【０２２８】
例９
酸性ピーク群（ＡＰＧ）レベルを予測するモデルは、ｍＡｂ１抗体を発現するＤＧ４４ＣＨＯ細胞株のデータ（表３）に基づいて開発された（図１７）。ＡＰＧは、Ｍｉｃｈｅａｌｉｓ  Ｍｅｎｔｅｎ速度論を用いて産生された総組換えｍＡｂ重量の１４日の産生を通して重量％に添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量重量％の関数として表される。
【０２２９】
モデルを灌流製造に適用するために、各灌流製造日は新しい製造バッチとして定義された。したがって、使用されるシステイン又はシステイン及び／又はトリプトファンの総量の比率は、製造容器から産生される組換えタンパク質の除去率に対する灌流流量に従って計算される。交互タンジェンシャルフロー（ＡＴＦ）技術を使用して、２Ｌバイオリアクターで灌流製造を行った。図１８に示すように、ＡＰＧ電荷変異体の予測は実験データとよく適合している。この結果は、産生された組換え抗体総重量の添加されたシステイン又はシスチン及びトリプトファン総量重量％と抗体の不均質との間の関係が、他の産生モード、例えば灌流、バッチ又はケモスタットモード製造に拡張できることを確認するものである。
【配列表フリーテキスト】
【０２３０】
配列番号１〜１１  ＜２２３＞ヒト化
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
2020521490.tif 000023
【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月4日(2019.12.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質の製造方法であって、以下を含む方法：
ａ．培地で組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質が前記細胞によって産生され、前記産生段階中に、培養物が
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の１０重量％〜３０重量％の総量までのシステイン又はシスチン；及び
・産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３５重量％の総量までのトリプトファン、
で補充される；及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する。
【請求項２】
培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の１２重量％〜２８重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、１２重量％〜２５重量％、例えば１２重量％〜２０重量％の総量までのシステイン又はシスチンで補充される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
培養物が産生される組換えタンパク質の予想される総量の８重量％〜３０重量％の総量まで、例えば産生される組換えタンパク質の予想される総量の、８重量％〜２５重量％、例えば８重量％〜２０重量％の総量までのトリプトファンで補充される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
方法中に提供されるシステイン又はシスチンの総量が２．９〜１２ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
方法中に提供されるトリプトファンの総量が２．５〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞／Ｌ）であり、ここで細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養物中のシステイン又はシスチン及びトリプトファンの総量が、細胞培養培地にシステイン又はシスチン及びトリプトファンを：
ａ．産生段階の開始時に、
ｂ．産生段階中の任意の時点で１回又は複数回、
ｃ．産生段階中の継続的な添加を通して、又は
ｄ．ａ．、ｂ．及びｃ．の任意の組み合わせで
添加することにより達成される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記方法が、流加プロセスなどのバッチプロセスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
システイン又はシスチン及びトリプトファンが、産生段階中の毎日の添加により提供される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
システイン又はシスチンを翌日に添加する前に、例えば、システイン又はシスチンの添加を５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）のレベルに減少させることによって、培養物中のシステイン又はシスチンを枯渇させ、ここで前記細胞は産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
産生の後期段階中に、すなわち、細胞が既に最大生存細胞密度に達したとき、トリプトファンが翌日添加される前に、培養物中のトリプトファンを枯渇させる、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．９ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のシステイン又はシスチン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．６ｇ／Ｌを超えない、好ましくは、細胞培養培地中のトリプトファン濃度が産生段階中の任意の時点で０．３ｇ／Ｌを超えない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
産生段階が少なくとも７日間、好ましくは少なくとも１４日間、実施される方法。
【請求項１４】
産生段階の後半の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
産生段階中の任意の時点で：
・培養物中のシステイン又はシスチンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の１０重量％〜３０％である；及び
・培養物中のトリプトファンの量が、産生される組換えタンパク質の予想される量の８重量％〜３５％である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記宿主細胞は、哺乳動物細胞、好ましくはＣＨＯ細胞である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
組換えタンパク質は、抗体又はその抗原結合断片である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
抗体又はその抗原結合断片が以下である、請求項１７に記載の方法：
１）ａ．配列番号１で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ１；配列番号２で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ２；配列番号３で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｈ３；配列番号４で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ１；配列番号５で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ２及び配列番号６で定義される配列を有するＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｂ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｃ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号８で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重可変領域とを含む抗体又はその抗原結合断片；
ｄ．配列番号７で定義される配列を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
ｅ．配列番号７で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽可変領域と、配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体又はその抗原結合断片；又は
２）配列番号９で定義される配列を有する軽鎖と配列番号１０で定義される配列を有する重鎖とを含む抗体；又は
３）配列番号９で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する軽鎖と、配列番号１０で定義される配列に対して少なくとも８０％の同一性又は類似性、好ましくは９０％の同一性又は類似性を有する重鎖とを含む抗体。
【請求項１９】
産生段階が、好ましくは５０Ｌ以上、１００Ｌ以上、５００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、２０００Ｌ以上、５０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、又は２０，０００Ｌ以上の容量のバイオリアクター中で行われる、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
方法は、組換えタンパク質を細胞培養培地から回収するステップ、及び組換えタンパク質を精製するさらなるステップを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
精製がプロテインＡクロマトグラフィーを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
精製された組換えタンパク質を製剤化するステップをさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
組換えタンパク質が、１つ以上のアミノ酸及び界面活性剤を含む液体製剤に製剤化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
製剤がヒスチジン及び／又はプロリンを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
製剤が５ｍＭ〜１００ｍＭの濃度で、例えば１０ｍＭ〜５０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び／又は１００ｍＭ〜５００ｍＭの濃度でプロリンを、５〜７．４、例えば５〜６．５、例えば５〜６のｐＨで含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
製剤は、５．２〜６．０のｐＨで、３０ｍＭの濃度でヒスチジンを、及び２５０ｍＭの濃度でプロリンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
界面活性剤は、好ましくは、０．００１％〜０．１％（ｗ／ｖ）、例えば、０．００５％〜０．１％、例えば、０．０１％〜０．１％、たとえば０．０１％〜０．０５％、例えば０．０３％の濃度の、ポリソルベート８０である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
組換えタンパク質が抗体であり、抗体が１０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば２０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば５０ｍｇ／ｍｌ〜２５０ｍｇ／ｍｌ、例えば、１２０ｍｇ／ｍｌ〜１６０ｍｇ／ｍｌ、例えば１４０ｍｇ／ｍｌの濃度で製剤化される、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法は産生される組換えタンパク質の不均質を減少させるものであり、ここで前記不均質の減少とは
ａ．電荷の不均質、好ましくは酸性ピーク群（ＡＰＧ）；及び／又は
ｂ．アミノ酸酸化、異性化、断片化、他の共有結合付加物糖化、脱アミド、システイニル化；及び／又は
ｃ．例えば組換えタンパク質の異なるバッチ間の、色又は色の強度；及び／又は
ｄ．高分子量種（ＨＭＷＳ）；及び／又は
ｅ．組換えタンパク質不安定性、
を減少させることを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
組換えタンパク質を製造する方法であって、
ａ．培地中に組換えタンパク質を産生できる宿主細胞を培養する；
ｂ．産生段階を通じて培養を進行させる、ここで組換えタンパク質は細胞によって産生され、細胞培養培地はシステイン又はシスチン及びトリプトファンで補充されており、ここで
・方法中に提供されたシステイン又はシスチンの総量は、２．９〜７ｇ／（１０１２細胞）、例えば、５．６〜７ｇ／（１０１２細胞）である、ここで細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び
・方法中に提供されたトリプトファンの総量は、２．５〜３．５ｇ／（１０１２細胞）である、ここで、細胞は、産生段階の終了時に予想される積分生細胞数を指す、及び
ｃ．任意に、細胞培養培地から組換えタンパク質を回収する、
を含む、上記方法。
【請求項３１】
方法が、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
組換えタンパク質の産生段階中の細胞培養培地中に存在する
ａ．システイン又はシスチン及び
ｂ．トリプトファン
の総量を制限することを含む、組換え宿主細胞により産生段階において産生されるバッチ中の組換えタンパク質の集団の不均質を減少させる方法。
【請求項３３】
前記方法は、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のさらなる特徴の一つ以上を有する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法により得られ得る又は得られる組換えタンパク質調製物。
【請求項３５】
抗体を含む医薬組成物であって、該組成物が請求項２３から２８のいずれか一項に記載のさらなる特徴の１つ以上を有し、好ましくは抗体が請求項１８に記載の抗体である、上記医薬組成物。
【国際調査報告】
2020521490.tif 000035
2020521490.tif 000036
2020521490.tif 000037