【手続補正書】
【提出日】平成30年10月31日(2018.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインのインフルエンザウイルス株又は亜型とは異なるインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものであり、ここで、
(a) 該HAステムドメインが、(i) HA1のN末端ステムセグメントであって、HA1N-termからApのアミノ酸残基からなる該HA1のN末端ステムセグメント；(ii) HA1のC末端ステムセグメントであって、AqからHA1C-termのアミノ酸残基からなる該HA1のC末端ステムセグメント；及び(iii) HA2ステムドメインを含み；かつ
(b) 該HA球状ヘッドドメインが、HA1ドメインの(i) Apと(ii) Aqの間のアミノ酸残基を含み、
ここで、HA1N-termが、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸であり；HA1C-termが、HA1ドメインのC末端アミノ酸であり；かつApが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置52に対応するCysであり；Aqが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置277に対応するCysである、前記キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
【請求項２】
HAステムドメイン及びHA球状ヘッドドメインを含むキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドであって、該HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインのインフルエンザウイルス株又は亜型とは異なるインフルエンザウイルス株又は亜型由来のものであり、ここで、
(a) 該HAステムドメインが、(i) HA1のN末端ステムセグメントであって、HA1N-termからAp-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、又はAp+10のアミノ酸残基からなる該HA1のN末端ステムセグメント；(ii) HA1のC末端ステムセグメントであって、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10、Aq、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、又はAq+10からHA1C-termのアミノ酸残基からなる該HA1のC末端ステムセグメント；及び(iii) HA2ステムドメインを含み；かつ
(b) 該HA球状ヘッドドメインが、HA1ドメインの(i) Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、又はAp+10と(ii) Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq-5、Aq-6、Aq-7、Aq-8、Aq-9、Aq-10、Aq、Aq+1、Aq+2、Aq+3、Aq+4、Aq+5、Aq+6、Aq+7、Aq+8、Aq+9、又はAq+10の間のアミノ酸残基を含み、
ここで、HA1N-termが、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸であり；HA1C-termが、HA1ドメインのC末端アミノ酸であり；かつApが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置52に対応するCysであり；Aqが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置277に対応するCysである、前記キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
【請求項３】
(a) 前記HAステムドメインが、(i) HA1のN末端ステムセグメントであって、HA1N-termからAp-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、又はAp+10のアミノ酸残基からなる該HA1のN末端ステムセグメント；(ii) HA1のC末端ステムセグメントであって、Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq、Aq+1、Aq+2、又はAq+3からHA1C-termのアミノ酸残基からなる該HA1のC末端ステムセグメント；及び(iii) HA2ステムドメインを含み；かつ
(b) 前記HA球状ヘッドドメインが、HA1ドメインの(i) Ap-1、Ap-2、Ap-3、Ap-4、Ap-5、Ap-6、Ap-7、Ap-8、Ap-9、Ap-10、Ap、Ap+1、Ap+2、Ap+3、Ap+4、Ap+5、Ap+6、Ap+7、Ap+8、Ap+9、又はAp+10と(ii) Aq-1、Aq-2、Aq-3、Aq-4、Aq、Aq+1、Aq+2、又はAq+3の間のアミノ酸残基を含み、
ここで、HA1N-termが、シグナルペプチドが除去されている成熟したHA0タンパク質のN末端アミノ酸であり；HA1C-termが、HA1ドメインのC末端アミノ酸であり；かつApが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置52に対応するCysであり；Aqが、H3付番を用いてHA1ドメインのアミノ酸位置277に対応するCysである、請求項２記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド。
【請求項４】
前記HA球状ヘッドドメインが、該HAステムドメインのインフルエンザウイルス亜型とは異なるA型インフルエンザウイルス亜型由来のものである、請求項１〜３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項５】
前記HAステムドメインが、季節性インフルエンザウイルス株由来である、請求項１〜３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項６】
前記HAステムドメインが、亜型H1のインフルエンザウイルスのHAステムドメインである、請求項１〜４のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項７】
前記HAステムドメインが、亜型H3のインフルエンザウイルスのHAステムドメインである、請求項１〜４のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項８】
前記H1亜型が、A/カリフォルニア/04/09である、請求項６記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項９】
前記H3亜型が、A/パース/16/2009である、請求項７記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１０】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、又はH17のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項１〜９のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１１】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、又はH16のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項６又は８記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１２】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H5、H8、H11、又はH12のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項６又は８記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１３】
前記HA球状ヘッドドメインが、亜型H4、H7、H10、H14、又はH15のインフルエンザウイルスのHA球状ヘッドドメインである、請求項７又は９記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１４】
前記HA球状ヘッドドメインが、A/ベトナム/1203/04(H5)のHA球状ヘッドドメインである、請求項９記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１５】
前記HA球状ヘッドドメインが、A/アルバータ/24/01(H7)のHA球状ヘッドドメインである、請求項９記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１６】
(a) 前記HAステムドメインが、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位を含み、該修飾されたグリコシル化部位が、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、該修飾が、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊し、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である；及び/又は
(b) 前記HA球状ヘッドドメインが、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天然のグリコシル化部位を含み、ここで、Xaaが任意のアミノ酸である、
請求項１５記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１７】
（a）前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置20-22、21-23、33-35、46-48、289-291、290-292、296-298、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、及びH16のインフルエンザウイルス由来のHAステムドメインであるか；
（b）前記修飾されたグリコシル化部位が、H3付番体系に従って、アミノ酸位置8-10、22-24、38-40、46-48、296-298、410-412、及び481-483からなる群から選択されるアミノ酸位置に位置しており、前記HAステムドメインが、亜型H3、H4、H7、H10、H14、又はH15のインフルエンザウイルス由来のHAステムドメインであるか；又は
（c）前記修飾が、前記天然のグリコシル化部位の1以上のアミノ酸置換を含む、
請求項１６記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１８】
（a）前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH1亜型のHA球状ヘッドドメインであり、かつ前記非天然のグリコシル化部位が、Sa、Sb、Ca、もしくはCb抗原性部位に位置しているか；
（b）前記HA球状ヘッドドメインが、インフルエンザウイルスH3亜型であり、かつ前記非天然のグリコシル化部位が、A、B、C、もしくはD抗原性部位に位置しているか；又は
（c）前記非天然のグリコシル化部位が、H3付番に従って、血球凝集素アミノ酸位置59-61、129-131、158-160、又は165-167にある、
請求項１６又は１７記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項１９】
前記HAステムドメインが、HA1とHA2との間の接合部でのプロテアーゼ切断に対して抵抗性である、請求項１〜１８のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、可溶性である、請求項１〜１９のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、フォルドンドメイン又は三量体化ドメインを含む、請求項２０記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２２】
前記キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドが、前記HAステムドメインのインフルエンザウイルス株又は亜型の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを更に含む、請求項１〜１９のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２３】
前記キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドが、インフルエンザウイルスHAの融合活性を有する、請求項１〜２２のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞において発現され、かつ該細胞から単離される、請求項１〜２３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜２３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルスHAをコードする、核酸。
【請求項２６】
請求項２５の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２７】
請求項２５記載の核酸を発現している単離された細胞であって、該単離された細胞が、任意に哺乳動物細胞である、前記細胞。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含むウイルスであって、該ウイルスが、任意にインフルエンザウイルス、ニューカッスル病ウイルス(NDV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、又はレトロウイルスである、前記ウイルス。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む、不活化A型インフルエンザウイルス。
【請求項３０】
スプリットウイルスである、請求項２９記載の不活化A型インフルエンザウイルス。
【請求項３１】
請求項１〜２３のいずれか一項記載のキメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチドを含む、免疫原性組成物。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか一項記載のウイルスを含む、免疫原性組成物。
【請求項３３】
請求項２５記載の核酸、又は請求項２６記載のベクターを含む、免疫原性組成物。
【請求項３４】
アジュバントを更に含む、請求項３１〜３３のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項３５】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、3デ-O-アシル化モノホスホリル脂質A(MPL)、MF59、AS03、AS04、ポリソルベート80、イミダゾピリジン化合物、イミダゾキノキサリン化合物、サポニン、フロイントアジュバント、水中油エマルジョン、又はCpGである、請求項３４記載の免疫原性組成物。
【請求項３６】
前記免疫原性組成物が、鼻腔内又は筋肉内投与用に製剤化される、請求項３１〜３５のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項３７】
インフルエンザウイルス疾患又はインフルエンザウイルス感染に対して対象を免疫化するための、請求項３１〜３６のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項３８】
対象においてインフルエンザウイルス疾患を予防するのに使用するための、請求項３１〜３６のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【請求項３９】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患に対して対象を免疫化するための請求項３２〜３６のいずれか一項記載の免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物が、第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチド、該第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドを含む第2のウイルス、又は該第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドをコードする第2の核酸を含む第2の免疫原性組成物と組み合わせて該対象に投与されるように使用され、該第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドが、第2のHAステムドメインとは異種の第2のHA球状ヘッドドメインを含み、かつ該第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドが、該キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドと同じHAステムドメインを含む、前記免疫原性組成物。
【請求項４０】
インフルエンザウイルス感染又はインフルエンザウイルス疾患に対して対象を免疫化するための請求項３２〜３６のいずれか一項記載の免疫原性組成物であって、該免疫原性組成物が、インフルエンザウイルスと組み合わせて該対象に投与されるように使用され、該キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドが、該インフルエンザウイルスのHAポリペプチドと同じHAステムドメインを含む、前記免疫原性組成物。
【請求項４１】
前記キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドのHA球状ヘッドドメインと前記第2のキメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドとが、異種である、請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４２】
前記インフルエンザウイルスのHAポリペプチドのHA球状ヘッドドメインと前記キメラインフルエンザウイルスHAポリペプチドとが、異種である、請求項３８記載の免疫原性組成物。
【請求項４３】
前記対象が、ヒトである、請求項３７〜４２のいずれか一項記載の免疫原性組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
【図１６】図16A〜16Fは、キメラH6血球凝集素をトランスフェクトした細胞の免疫蛍光解析を示す。293T細胞に、キメラH6血球凝集素を発現する1μgのpCAGGSプラスミドをトランスフェクトした。DNA(図16A)、Cal/09感染(図16B)、DNA及びCal/09感染(図16C)、又はCal/09スプリットワクチン(図16D)を受容した動物由来の血清をトランスフェクト細胞に添加し、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可視化した。対照として、交差反応性H1ステム抗体C179(図16E)、又はPR8の球状ヘッドに対する抗体であるPY102(図16F)をトランスフェクト細胞に添加し、Alexa Fluor 594コンジュゲート抗マウスIgGとともにインキュベートした後、蛍光顕微鏡法で可視化した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
【図３８】図38A〜38Bは、ストーク特異的モノクローナル抗体がcHA発現ウイルス及びシュードタイプ粒子を中和することを示す。cHA発現ウイルス又はシュードタイプ粒子を中和するmAb(KB2)の能力をプラーク減少アッセイ又はシュードタイプ粒子阻害アッセイにより評価した。MDCK細胞を、表示された量(ug/mL)のmAbの存在下で、又は抗体なしで、cHA発現ウイルスもしくはシュードタイプ粒子に感染させるか、又はこれらで形質導入した。プラーク形成又はルシフェラーゼ活性を読出しとして用いて、mAbによる阻害の程度を決定した。(図38A)該mAbは、cH1/1(黒い四角)及びcH5/1(黒い三角)ウイルス複製を用量依存的な形で中和し、100ug/mLを超える濃度で100％阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。(図38B)該mAbは、cH1/1(黒い四角)シュードタイプ粒子の侵入も用量依存的な形で阻害し、4ug/mL超で完全に阻害する。データ点は、実験複製の平均値及び標準偏差を表す。シュードタイプ阻害アッセイは独立に処理された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
別の態様において、本明細書に提供されるのは、1以上の修飾されたグリコシル化部位及び/又は1以上の非天然のグリコシル化部位を含むflu血球凝集素(HA)ポリペプチド(例えば、キメラインフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素(HA)ステムドメインポリペプチド)である。図19Bに示すように、野生型血球凝集素のグリコシル化は、球状ヘッドドメインとステムドメインの両方で生じる。これらのドメインで内のグリコシル化は抗原性領域をマスクし、それにより、インフルエンザウイルスが宿主免疫系応答を回避するのを可能にすることができると考えられる。例えば、季節性インフルエンザウイルス株(例えば、H1N1及びH3N2)は、時間とともに球状ヘッドドメインの免疫優性抗原性領域中にさらなるグリコシル化部位を獲得することが知られている。しかしながら、本明細書に記載のインフルエンザウイルスHAポリペプチドとの関連において、ポリペプチドのステムドメイン内でのグリコシル化は、このドメインに見出される保存された抗原性領域に対する所望の免疫応答を妨害又は防止することができる。図19Cを参照されたい。一実施態様において、本明細書に提供されるのは、少なくとも1つの修飾されたグリコシル化部位を有するステムドメインを含むflu HAポリペプチドであり、ここで、該修飾されたグリコシル化部位、ここで、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する。別の実施態様において、本明細書に提供されるのは、HA球状ヘッドドメインを含むflu HAポリペプチドであり、ここで、該HA球状ヘッドドメインは、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する少なくとも1つの非天然のグリコシル化部位を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。別の実施態様において、該flu HAポリペプチドは、(1)1以上の修飾されたグリコシル化部位を含むステムドメイン(ここで、該修飾されたグリコシル化部位は、天然のグリコシル化部位の修飾を含み、該修飾は、該修飾されたグリコシル化部位に結合するグリカンの能力を破壊する);及び(2)アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する1以上の非天然のグリコシル化部位を含むHA球状ヘッドドメイン(ここで、Xaaは任意のアミノ酸である)を含む。具体的な実施態様において、該flu HAポリペプチドのステムドメイン中の修飾されたグリコシル化部位は、アミノ酸配列Asn-Xaa-Ser/Thr/Cysを有する天然のグリコシル化部位の修飾を含み、ここで、Xaaは任意のアミノ酸である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０７７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０７７０】
中和ストーク抗体を検出する目的で、キメラ分子を発現する組換えウイルスもレスキューした。過去1世紀にわたるヒトインフルエンザウイルスは全て、N1又はN2亜型のNAをコードしているので、cH9/1N3再集合体ウイルスのレスキューにより、どの(N1又はN2)ノイラミニダーゼ抗体活性も測定することなく、ストーク特異的抗体の中和能力の評価が可能になると推論された。cH9/1N3ウイルス(H9球状ヘッドHAと、N3亜型ノイラミニダーゼとともに、H1ストークを発現する)を、リバースジェネティックスを用いてレスキューし、高力価になるまで発育鶏卵中で成長させた。このウイルスのプラークアッセイ表現型は、PR8野生型ウイルスのプラークアッセイ表現型と同様であった(図29C)。ウイルス継代後のH9ヘッドの存在を確認するために、細胞をcH9/1N3ウイルスに感染させた。その後、感染細胞を、H9亜型血球凝集素タンパク質に特異的な抗体であるマウスmAb G1-26でプロービングした。汎H1ストーク特異的抗体6F12を用いて、野生型PR8ウイルス感染細胞とcH9/1N3ウイルス感染細胞の両方を検出した(図26B)。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０８０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０８０２】
レスキューされたウイルスにおけるcHAの存在を感染細胞のウェスタンブロット及び間接免疫蛍光によりさらに確認した(図35及び36)。MDCK細胞を、rWT PR8、野生型パース/09、cH1/1、cH5/1、cH7/3、及びcH5/3ウイルスに感染させた(図35及び36)。cH1/1及びcH5/1キメラHAタンパク質を、それぞれ、Cal/09(H1) HAのヘッドドメインに対して反応する抗体(29E3)(Medinaらの文献(2010, Nature Communications 1:28))又はVN/04(H5) HAのヘッドドメインに対して反応する抗体(mAb #8)(Steelらの文献(2009, J Virol 83:1742-53))を用いて、対応する試料中で検出した(図35)。汎H3抗ストークmAbである12D1を用いて、cH7/3とcH5/3と野生型パースHAの間で同程度の発現レベル(Wangらの文献(2010, PLoS Pathog 6:e1000796)参照)。野生型パースHAは、ゲル上でのより遅い移動を示し、これは、球状ヘッドドメイン中のグリコシル化部位の数がより多いためである可能性が高い。cH7/3又はcH5/3感染試料に対して、それぞれ、抗H7ポリクローナル抗体(NR-3152)又は抗H5モノクローナル抗体(mAb #8)を使用することにより、正確なHAヘッドドメインがH3ストークの上に発現することが確認された。陽性バンドは、どちらの場合にも検出された。