(57)【要約】凝集形成能の低下した変異ヒトαシヌクレインが開示される。本発明の変異ヒトαシヌクレインは、野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制することができる。したがって、パーキンソン氏病病因の検討および治療、ならびに遺伝子治療法開発研究において有用である。さらに、本発明にしたがうアミノ酸変異部分を含むヒトαシヌクレイン部分構造ペプチドも開示される。
2004113535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
凝集形成能が低下している変異ヒトαシヌクレイン。
【請求項２】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、以下の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されている配列を有する、変異ヒトαシヌクレイン：
６８番目のグリシン；
６９番目のアラニン；
７０番目のバリン；
７１番目のバリン；
７２番目のトレオニン；
７４番目のバリン；
７７番目のバリン；および
８２番目のバリン。
【請求項３】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも１つを含有する、変異ヒトαシヌクレイン：
６８番目のグリシンをトレオニンまたはバリン；
６９番目のアラニンをトレオニンまたはバリンまたはリジン；
７０番目のバリンをトレオニンまたはプロリンまたはフェニルアラニン；
７１番目のバリンをトレオニンまたはリジン；
７２番目のトレオニンをバリンまたはグルタミン酸；
７４番目のバリンをトレオニン；
７７番目のバリンをトレオニン；および
８２番目のバリンをリジン。
【請求項４】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｌａ６９Ｌｙｓ／Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｌｙｓ／Ｔｈｒ７２Ｇｌｕの４箇所のアミノ酸残基の置換を有する変異ヒトαシヌクレイン。
【請求項５】
配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｌａ６９Ｌｙｓ／Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｌｙｓ／Ｔｈｒ７２ＧｌｕおよびＶａｌ８２Ｌｙｓの５箇所のアミノ酸残基の置換を有する変異ヒトαシヌクレイン。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の変異ヒトαシヌクレインをコードする遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の遺伝子を導入した組み換えプラスミド。
【請求項８】
請求項７に記載の組み換えプラスミドにより形質転換された形質転換体。
【請求項９】
変異型ヒトαシヌクレインの製造方法であって、
（ａ）請求項６に記載の遺伝子をプラスミドに導入して組み換えプラスミドを調製し、
（ｂ）（ａ）の組み換えプラスミドを用いて宿主を形質転換して形質転換体を調製し；そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換体を培養して変異型ヒトαシヌクレインを産生させる，
の各工程からなる方法。
【請求項１０】
野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制するための組成物であって、請求項１〜５のいずれかに記載の変異ヒトαシヌクレインを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１１】
細胞、組織または生物において、野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制する方法であって、細胞、組織または生物を、請求項１〜５のいずれかに記載の変異ヒトαシヌクレインと接触させることを含む方法。
【請求項１２】
以下のアミノ酸配列：
Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
のうち１０またはそれ以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項１３】
以下のアミノ酸配列：
Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ
を有するペプチド。
【請求項１４】
野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制するための組成物であって、請求項１２または１３に記載のペプチドを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１５】
細胞、組織または生物において、野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制する方法であって、細胞、組織または生物を、請求項１２または１３に記載のペプチドと接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、新規なヒトαシヌクレイン変異体に関する。
【背景技術】  αシヌクレインは１４０残基からなる熱に安定な蛋白質である。パーキンソン病患者脳のＬｅｗｙ小体にαシヌクレイン凝集物の蓄積がみられる事から、多くの神経変性疾患と同様、異常蛋白質の蓄積と神経細胞死との関連性が注目されている。αシヌクレインは生体内では特定の立体構造をとらず、ｎａｔｉｖｅｌｙ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｙに属するとされている。
αシヌクレインは一次構造上３つの領域に分けられ、その内中央領域を構成する３５アミノ酸残基が、アルツハイマー病患者脳に見られる老人斑の第二の構成成分ＮＡＣ（Ｎｏｎ−ａｍｙｌｏｉｄβｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｍｙｌｏｉｄ）であり、βシート形成能が高く、凝集に特に深く関わる領域である事実が示されてきた（Ｕｅｄａ  Ｋ，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｈ，Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ，Ｘｉａ  Ｙ，Ｉｗａｉ  Ａ，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｏｔｅｒｏ  ＤＡ，Ｋｏｎｄｏ  Ｊ，Ｉｈａｒａ  Ｙ，Ｓａｉｔｏｈ  Ｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９３；９０（２３）：１１２８２−６．，Ｉｗａｉ  Ａ，Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｍ，Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ，Ｓａｉｔｏｈ  Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９５；３４（３２）：１０１３９−４５．，Ｈａｎ  Ｈ，Ｗｅｉｎｒｅｂ  ＰＨ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  ＰＴ  Ｊｒ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１９９５（３）：１６３−９．）。
また、ＮＡＣ領域よりも上流の位置において、家族性パーキンソン氏病にみられる遺伝性点変異、Ａｌａ５０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒによりシヌクレインの凝集が促進される事が示唆されている（Ｌｉｎｄａ  Ｎａｒｈｉ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｊ．Ｗｏｏｄ，Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ｓｔｅａｖｅｎｓｏｎ，Ｙｉｊｉａ  Ｊｉａｎｇ，Ｇａｙ  Ｍａｙ  Ｗｕ，Ｄａｎ  Ａｎａｆｉ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ａ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｋａｒｅｎ  Ｓｉｔｎｅｙ，Ｐａｕｌ  Ｄｅｎｉｓ，Ｊｅａｎ−Ｃｌａｕｄｅ  Ｌｏｕｉｓ，Ｊｅｔｔｅ  Ｗｙｐｙｃｈ，Ａｎｊａ  Ｌｅｏｎａ  Ｂｉｅｒｅ，ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｉｔｒｏｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９９；２７４：９８４３−９８４６．，Ｒｏｃｈｅｔ  Ｊ−Ｃ，Ｃｏｎｗａｙ  Ｋ．Ａ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  Ｐ．Ｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９，１０６１９−６２６．，Ｃｏｎｗａｙ  Ｋ．Ａ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｊ．Ｄ，Ｌａｎｓｂｕｒｙ  Ｐ．Ｔ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９８）４，１３１８−１３２０．，Ｌｉ．Ｊ．，Ｕｖｅｒｓｋｙ  Ｖ．Ｎ，Ｆｉｎｋ  Ａ．Ｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）４０，１１６０４−６１３）。しかし、これまで系統的な変異αシヌクレイン構築に基づく蛋白質化学的解析による同分子の凝集・線維化機構の解明は行われていない。
本発明は、野生型ヒトαシヌクレインの凝集を抑制する作用を有する変異ヒトαシヌクレインを提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者は、αシヌクレインの凝集に関与する可能性のあるアミノ酸残基を種々検討した結果、凝集形成能の低下したヒトαシヌクレイン変異体を発見することに成功して本発明を完成した。
すなわち、本発明は、凝集形成能が低下している変異ヒトαシヌクレインを提供する。特に、本発明は、野生型ヒトαシヌクレインのアミノ酸配列（配列番号１）において、以下の少なくとも１つのアミノ酸残基が置換されている配列を有する、変異ヒトαシヌクレインを提供する：６８番目のグリシン；６９番目のアラニン；７０番目のバリン；７１番目のバリン；７２番目のトレオニン；７４番目のバリン；７７番目のバリン；および８２番目のバリン。
好ましくは、本発明の変異ヒトαシヌクレインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、以下に挙げるアミノ酸置換の少なくとも１つを含有する：６８番目のグリシンをトレオニンまたはバリン；６９番目のアラニンをトレオニンまたはバリンまたはリジン；７０番目のバリンをトレオニンまたはプロリンまたはフェニルアラニン；７１番目のバリンをトレオニンまたはリジン；７２番目のトレオニンをバリンまたはグルタミン酸；７４番目のバリンをトレオニン；７７番目のバリンをトレオニン；および８２番目のバリンをリジン。また好ましくは、本発明の変異ヒトαシヌクレインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｌａ６９Ｌｙｓ／Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｌｙｓ／Ｔｈｒ７２Ｇｌｕの４箇所のアミノ酸残基の置換を有する。また好ましくは、本発明の変異ヒトαシヌクレインは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、Ａｌａ６９Ｌｙｓ／Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｌｙｓ／Ｔｈｒ７２ＧｌｕおよびＶａｌ８２Ｌｙｓの５箇所のアミノ酸残基の置換を有する。
別の観点においては、本発明は、上述の本発明の変異ヒトαシヌクレインをコードする遺伝子、該遺伝子を導入した組み換えプラスミド、および該組み換えプラスミドにより形質転換された形質転換体を提供する。
本発明はまた、変異型ヒトαシヌクレインの製造方法であって、
（ａ）請求項６に記載の遺伝子をプラスミドに導入して組み換えプラスミドを調製し、
（ｂ）（ａ）の組み換えプラスミドを用いて宿主を形質転換して形質転換体を調製し；そして
（ｃ）（ｂ）の形質転換体を培養して変異型ヒトαシヌクレインを産生させる，
の各工程からなる方法を提供する。
さらに別の観点においては、本発明は、以下のアミノ酸配列：
2004113535.tif 000003
のうち１０またはそれ以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。
好ましくは、本発明のペプチドは、以下のアミノ酸配列：
2004113535.tif 000004
を有する。
また別の観点においては、本発明は、野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制するための組成物であって、上述の本発明の変異ヒトαシヌクレインまたは本発明のペプチドを含むことを特徴とする組成物を提供する。本発明はまた、細胞、組織または生物において、野生型ヒトαシヌクレイン、Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異ヒトαシヌクレインまたはＡｌａ５０Ｐｒｏ変異ヒトαシヌクレインの凝集を抑制する方法であって、細胞、組織または生物を、上述の本発明の変異ヒトαシヌクレインまたは本発明のペプチドと接触させることを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】  図１は、野生型およびＡ５３Ｔ変異型αシヌクレインの線維形成の時間変化を示す（ＷＴ；野性型αシヌクレイン、Ａ５３Ｔ；Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異αシヌクレイン、Ａ３０Ｐ；Ａｌａ３０Ｐｒｏ変異αシヌクレイン）。
図２は、野生型および本発明の変異型αシヌクレインの線維形成の時間変化を示す（ＷＴ；野性型αシヌクレイン、Ｖ７０Ｔ；Ｖａｌ７０Ｔｈｒ変異αシヌクレイン、Ｖ７０Ｐ；Ｖａｌ３０Ｐｒｏ変異αシヌクレイン、Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ；Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異αシヌクレイン）。
図３は、野生型および変異型αシヌクレイン、ならびに野生型またはＡ５３Ｔ変異型αシヌクレインと本発明の変異型αシヌクレインとの混合試料について、凝集塊形成を評価したグラフである（ｂｅｆｏｒｅ：初期値，ａｆｔｅｒ  １４５ｈｒ後、ＷＴ；野性型、Ｖ７０Ｐ；Ｖａｌ７０Ｐｒｏ変異型、Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ；Ｖａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異、Ａ５３Ｔ；Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異、ＷＴ  ｘ  Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ；野性型とＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異との混合試料、Ａ５３Ｔ  ｘ  Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ；Ａｌａ５３ＴｈｒとＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異との混合試料）。
図４は、野生型および変異型αシヌクレイン、ならびに野生型またはＡ５３Ｔ変異型αシヌクレインと本発明の変異型αシヌクレインとの混合試料について、線維形成の時間変化を示すグラフである（ＷＴ  ｘ  Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ：野性型αシヌクレインとＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異αシヌクレインとの混合試料、Ａ５３Ｔ  ｘ  Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｔ：Ａｌａ５３Ｔｈｒ変異αシヌクレインとＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ二重変異αシヌクレインとの混合試料）。
発明の詳細な説明
本発明の変異型ヒトαシヌクレインは、野生型ヒトαシヌクレインをコードする遺伝子から遺伝子工学的手法を用いて製造することができる。野生型ヒトαシヌクレインのアミノ酸配列およびこれをコードする遺伝子の配列を、それぞれ配列番号１および２に示す。
これにはまず部位特異的変異法をもちいて野生型ヒトαシヌクレインをコードする遺伝子の変異目的部位の塩基配列を、目的とするアミノ酸残基に対応する塩基配列に変更して、変異型のヒトαシヌクレイン遺伝子を調製する。この部位特異的変異法は、野生型の遺伝子ＤＮＡが組み込まれたプラスミドの一本鎖ＤＮＡを鋳型にして、変異させようとする塩基配列を含む合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして変異型の遺伝子を合成するものであり、各種市販キットを用いて合成することができる（ＴＡＫＡＲＡ  Ｍｕｔａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍなど）。
本発明においては、野生型のヒトαシヌクレイン遺伝子の一本鎖とアニーリング可能であるが置換しようとする目的部位に対応する塩基配列が相違するオリゴヌクレオチドを化学合成し、この合成オリゴヌクレオチドをプライマーとし、かつ該野生型のヒトαシヌクレイン遺伝子が組み込まれたプラスミドの一本鎖ＤＮＡを鋳型として、変異型のヒトαシヌクレイン遺伝子を合成することができる。
次いで、変異型ヒトαシヌクレインをコードする遺伝子を発現ベクター系に挿入して、発現用宿主ベクター系を構築する。本発明において用いられる宿主としては、例えば大腸菌、酵母、枯草菌などが挙げられるが、特にこれらに限定されるものではない。
また、本発明のペプチドは、慣用の固相または液相のペプチド合成技術により製造することができる。
本発明の変異型ヒトαシヌクレインの凝集形成能は、アミロイドをはじめとする蛋白質凝集にもとづく線維形成観測において一般的に用いられている方法により測定することができる。例えば、αシヌクレインを約２ｍｇ／ｍｌになるように調製して、３７℃でインキュベーションし、一定時間ごとにアリコートを採取する。この採取した試料に対して、線維構造に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｆＴ）を終濃度２５μＭで含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．４の緩衝液溶液に加え１００μｌとして、直ちに蛍光スペクトルを観測する（Ｅｘ  ４４０ｎｍ，Ｅｍ  ４５０−５５０ｎｍ）。ＴｆＴの蛍光強度の増加を追跡することにより、線維形成速度を測定することができる。
また、本発明の変異型ヒトαシヌクレインならびに本発明のペプチドが野生型αシヌクレインまたは家族性パーキンソン氏病患者で見出された２種の変異αシヌクレイン、Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒの凝集形成を抑制する能力は、これらのヒトαシヌクレインと本発明の変異型ヒトαシヌクレインを混合した試料を用いて、上述のように線維形成速度を測定し、その変動を定量することにより測定することができる。
このようにして開発した変異ヒトαシヌクレインおよびペプチドを用いて、パーキンソン氏病に代表されるレビー小体が沈積する神経変性疾患であるシヌクレオパシーの進行の抑制が期待される。具体的には、本発明の変異ヒトαシヌクレインあるいはペプチドを直接患部に投与する方法、これらの構造遺伝子を含む発現ベクターにより恒常的あるいは一過性として患部で発現させる方法、さらにこれらの変異ヒトαシヌクレインあるいはペプチドにＰｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ（ＰＴＤ）とよばれる細胞透過性を付与するペプチド残基を遺伝子的あるいは化学的に結合させることにより、患部近傍に投与・吸収させる方法によりその治療効果が期待される。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また，本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願２００３−２０２６９９号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
【実施例】  以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが，これらの実施例は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】変異ヒトαシヌクレイン遺伝子の作成
ヒトαシヌクレイン遺伝子のクローニング
大腸菌発現ベクターとしてｐＴＹＢ１を利用した。ＮｄｅＩサイトをデザインしたプライマーと、ＫｐｎＩサイトとインテインの構造遺伝子の塩基配列を一部含むようにデザインしたプライマーを用いて、ヒト骨髄ｃＤＮＡライブラリー（Ｈｕｍａｎ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ）に対してＰＣＲを行い、ヒト由来αシヌクレインの構造遺伝子を増幅した。
ＰＣＲ  ｆｏｒｗａｒｄプライマー：
2004113535.tif 000005
ＰＣＲ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：
2004113535.tif 000006
ＰＣＲの反応条件は変性：９５℃（１分間）、アニーリング：５５℃（１分間）、伸長：７２℃（１分間）で３５サイクル行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動にかけた後、ジーンクリーンＩＩキット（Ｂｉｏ  １０１社）を用いてＤＮＡを精製した。これをｐＧＥＭ−Ｔにサブクローニングした。このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α−ＭＣＲに形質転換し、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）／ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）／Ｘ−Ｇａｌ（８０μｇ／ｍｌ）のプレートにてカラーセレクションを行った。得られたホワイトコロニーを培養後、プラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンスの解析を行った。αシヌクレインの構造遺伝子の挿入が確認できたプラスミドを持つコロニーを再び培養し、抽出したプラスミドをＮｄｅＩ、ＫｐｎＩで制限酵素消化した。得られたＤＮＡ断片を上記同様に精製した。これを同様の制限酵素で調製した発現ベクターｐＴＹＢ１にクローニングし、αシヌクレインのＣ末端にインテイン〜キチン結合ドメインが連結された融合蛋白質を発現させるためのベクター、ｐＴＹＢ１／α−ｓｙｎを構築した。
このプラスミドを大腸菌ＤＨ５α−ＭＣＲに形質転換、培養後、プラスミドを抽出し、ＤＮＡシークエンスの解析を行い変異の入っていないことを確認した。
部位特異的変異導入
クローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔにαシヌクレイン遺伝子を挿入したプラスミドに対し、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩサイトをデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行い、αシヌクレイン遺伝子断片を増幅した。
ＰＣＲ  ｆｏｒｗａｒｄプライマー１：ＮｃｏＩサイトをデザインしたプライマー
2004113535.tif 000007
ＰＣＲ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー２：ＰｓｔＩサイトをデザインしたプライマー
2004113535.tif 000008
増幅断片をＴＡクローニングした後、ＮｃｏＩおよびＰｓｔＩによる制限酵素消化により切り出し、同様に処理した発現用ベクターｐＴｒｃ９９ＡにライゲーションさせｐＴｒｃ９９Ａ／αｓｙｎを作成した。このプラスミドに対し、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩおよびＫｐｎＩサイトをデザインしたプライマーを用いてＰＣＲを行いαシヌクレイン遺伝子断片を増幅した。
ＰＣＲ  ｆｏｒｗａｒｄプライマー３：ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｄｅＩサイトをデザインしたプライマー
2004113535.tif 000009
ＰＣＲ  ｒｅｖｅｒｓｅプライマー４：ＫｐｎＩサイトをデザインしたプライマー
2004113535.tif 000010
増幅断片をＴＡクローニングした後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＫｐｎＩによる制限酵素消化により切り出し、同様に処理した変異導入用ベクターｐＫＦ１９ｋとライゲーションさせてｐＫＦ１９ｋ／αｓｙｎを得た。これを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した後にプラスミドを抽出し、遺伝子配列を確認した。以下に示す変異導入用オリゴヌクレオチドを用いて、ＴＡＫＡＲＡ  Ｍｕｔａｎ  Ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍキットによりαシヌクレイン遺伝子に変異導入をおこなって、それぞれの変異体遺伝子配列を含むプラスミド（以下、ｐＫＦ１９ｋ／変異αｓｙｎと総称する）を得た。また、２以上の変異を導入する場合には、これらのオリゴヌクレオチドを適宜組み合わせた。これを大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換し、変異導入をシークエンス解析により確認した。
変異導入用オリゴヌクレオチド：
2004113535.tif 000011
変異αシヌクレイン生産用ベクターの構築
各ｐＫＦ１９ｋ／変異αｓｙｎプラスミドをＮｄｅＩおよびＫｐｎＩにて制限酵素消化し、同様に処理したインテイン融合発現ベクターｐＴＹＢ１とライゲーションさせて、それぞれの変異αシヌクレイン生産用ベクター（以下、ｐＴＹＢ１／変異αｓｙｎと総称する）を構築し、野生型と同様に大腸菌ＤＨ５α−ＭＣＲに形質転換した。
【実施例２】変異シヌクレインの製造
坂口フラスコを用い、４５０ｍｌのＬＢ培地（アンピシリン終濃度１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、一晩振とう培養したｐＴＹＢ１／変異α−ｓｙｎをもつ大腸菌ＥＲ２５６６をファーメンター中のＬＢ培地（７Ｌ、エイノール（消泡剤）１ｍｌ、を含む）に植菌した。エアレーション７Ｌ／ｍｉｎで、３７℃で培養を開始し、ＯＤ６００が０．５〜０．８に達した段階で終濃度０．３ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加して、インテイン〜キチン結合ドメイン融合αシヌクレインの発現を誘導した。誘導開始後、温度を１５℃に下げ、さらに１６時間培養を行った。培養した菌体を遠心分離（５０００ｇ、４℃、１０分）で集菌し、さらに得られた菌体を０．８５％ＮａＣｌ溶液で２回洗浄した。
精製方法
培養後、集菌、洗浄して得られた菌体を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５０ｍＭ  ＮａＣｌに懸濁後、フレンチプレス（１１０ＭＰａ）で破砕し遠心分離（２０，０００×ｇ，４℃，３０分）を行った。あらかじめ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化しておいたキチンカラム（ｖｏｌｕｍｅ；約１０ｍｌ）に、遠心後得られた上清を流した。その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０をカラムの１０倍量使い、未吸着蛋白質を洗い流した。続いて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を３０ｍｌ流しカラムの塩濃度を下げ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍＭ  ＤＴＴを３０ｍｌ流した状態で、４℃下に１６時間放置してインテインの自己分解反応をさせた。その後、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）を３０ｍｌ流し、得られたサンプルを２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に対して三回透析を行い、最後に非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより精製の確認を行った。
【実施例３】ＣＤスペクトルによるαシヌクレインの構造変化の観測
精製されたαシヌクレインを約１００μｇ／ｍｌになるように調製して、温度変化におけるαシヌクレインの構造変化をＣＤスペクル測定により観察した。温度変化は３−９０℃で、低い温度から順に３℃、１５℃、２５℃、４０℃、６０℃、９０℃にてスペクトルの測定を行った。また各温度において任意の時間に複数回スペクトラムを測定し、その温度における熱が十分αシヌクレインに伝わり、構造状態が一定となっていることを確認した。そののちに、蛋白質溶液由来のＣＤスペクトラムとして決定した。この蛋白質溶液由来のＣＤスペクトルから、蛋白質が溶解している緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）由来のＣＤスペクトルを差し引き、コンピュータープログラムによりスムージングを行った。その結果、変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインと比較して凝集形成能が低下していた。
【実施例４】蛍光プローブによる構造変化の観測
精製されたαシヌクレインを約１００μｇ／ｍｌになるように調製して、温度変化におけるαシヌクレインの構造変化を２０μＭチオフラビンＴ，または５０μＭ８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）を加えチオフラビンＴの場合はＥｘ  ４４０ｎｍ，Ｅｍ  ４５０−５５０ｎｍ、ＡＮＳの場合はＥｘ  ３８０ｎｍ，Ｅｍ  ４００−６００ｎｍでの蛍光スペクル測定により観察した。温度変化は３−９０℃で、低い温度から順に３℃、１５℃、２５℃、４０℃、６０℃、９０℃にてスペクトルの測定を行った。また各温度において任意の時間に複数回スペクトラムを測定し、その温度における熱が十分αシヌクレインに伝わり、構造状態が一定となっていることを確認した。そののちに、蛋白質溶液由来の蛍光スペクトラムとして決定した。この蛋白質溶液由来の蛍光スペクトルから、蛋白質が溶解している緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）由来の蛍光スペクトルを差し引き、コンピュータープログラムによりスムージングを行った。その結果、変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインと比較して凝集形成能が低下されていた。
【実施例５】変異αシヌクレインの凝集塊ならびに線維形成の解析
精製された野性型ならびに本発明にて構築した変異αシヌクレイン、および家族性パーキンソン氏病患者で見出された２種の変異αシヌクレイン、Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒを約２ｍｇ／ｍｌになるように調製して、３７℃でインキュベーションした。一定時間ごとにそれぞれ１０μｌずつ採取した。この採取した試料に対して、線維構造に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｆＴ）を終濃度２５μＭで含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．４の緩衝液溶液に加え１００μｌとして、直ちに蛍光スペクトルを観測した（Ｅｘ  ４４０ｎｍ，Ｅｍ  ４５０−５５０ｎｍ）。線維形成速度ならびにその量はＴｆＴの蛍光強度の増加を指標に観測した。この方法はアミロイドをはじめとする蛋白質凝集にもとづく線維形成観測において一般的に用いられている方法である。
家族性パーキンソン氏病患者で見出された２種の変異αシヌクレイン、Ａｌａ３０ＰｒｏおよびＡｌａ５３Ｔｈｒは試料インキュベーション直後から、また野性型αシヌクレインでは約１２時間後から蛍光強度が顕著に増加し、線維形成が観測された。その後、この３種のαシヌクレインの線維形成は進み、蛍光強度５０を超える多量の線維形成が観測された。その結果を図１に示す。これに対し、本発明により構築された変異αシヌクレインであるＶａｌ７０Ｔｈｒ，Ｖａｌ７０Ｐｒｏおよび同時に２箇所にアミノ酸置換が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒは線維形成能力が低下していた。すなわち図２に示すように、Ｖａｌ７０Ｔｈｒ，およびＶａｌ７０Ｐｒｏ変異αシヌクレインの線維形成速度は野性型の約５０％以下であった。また最終的な線維形成量はＶａｌ７０Ｔｈｒでは野性型の約５０％、Ｖａｌ７０Ｐｒｏでは約２０％であった。
また、Ｖ７４Ｔ、Ｖ７７Ｔ、Ｖ８２Ｋ、ならびにＡ６９Ｋ／Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｋ／Ｔ７２Ｅの４箇所が置換されたαシヌクレインおよびＡ６９Ｋ／Ｖ７０Ｔ／Ｖ７１Ｋ／Ｔ７２Ｅ／Ｖ８２Ｋの５箇所が置換されたαシヌクレインは、いずれもＶａｌ７１Ｔｈｒの線維形成能力と同程度の線維形成能力を示した。その線維形成能力は野生型αシヌクレインの線維形成能力と比べ、速度、最終到達量は約５０％程度であった。
さらに驚くべきことに２箇所の変異が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒの線維形成はほとんど観測されなかった。１００時間後の線維形成量は野性型の１０％以下であった。このように、これらの変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインと比較して線維形成能が低下していた。
またこの実験において溶液に形成されているαシヌクレイン凝集塊の総量（線維および非線維成分の和）を溶液の濁度を３３０ｎｍの散乱により計測することで評価した。その結果を図３に示す。野性型ではインキュベーション前に比較して凝集塊が顕著に形成されていることが観測される。さらに家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒでは野性型よりも多くの凝集塊が形成されていることが観測された。これに対して、本発明により構築された変異αシヌクレインであるＶａｌ７０Ｐｒｏおよび同時に２箇所にアミノ酸置換が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒは凝集塊形成能力が低下していた。すわわち、Ｖａｌ７０Ｐｒｏ変異αシヌクレインの凝集塊の量は野性型の約８０％以下であった。さらに驚くべきことに二箇所の変異が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒの凝集塊の量は野性型の約１５％であった。このように、これらの変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインと比較して凝集形成能が低下していた。
【実施例６】変異αシヌクレインによる野性型ならびに家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒの凝集塊および線維形成の抑制
精製された野性型ならびに本発明にて構築した２箇所の変異が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒ変異αシヌクレイン１ｍｇ／ｍｌと、野性型あるいは家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒを１ｍｇ／ｍｌになるように混合し、総蛋白質濃度２ｍｇ／ｍｌに調製して、３７℃でインキュベーションした。一定時間ごとにそれぞれ１０μｌずつ採取した。この採取した試料に対して、線維構造に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｆＴ）を終濃度２５μＭで含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．４の緩衝液溶液に加え１００μｌとして、直ちに蛍光スペクトルを観測した（Ｅｘ  ４４０ｎｍ，Ｅｍ  ４５０−５５０ｎｍ）。線維形成速度ならびにその量はＴｆＴの蛍光強度の増加を指標に観測した。
その結果、野生型αシヌクレインおよび家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒが含まれているにもかかわらず、ＴｆＴを指標とする線維形成はほとんど観測されなかった。野性型単独でインキュベーションした場合には約４８時間後に最大線維形成量に到達するのに対して、野性型αシヌクレインとＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒを混合した試料においては、同時間ではまったく線維は形成されていなかった。１００時間のインキュベーション後においても野性型単独でインキュベーションした場合の約１５％以下であった（図４）。さらに家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒ単独でインキュベーションした場合にはインキュベーション直後から急激に線維が形成され、同じく４８時間後には最大線維形成量に到達するにもかかわらず、家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒと本発明にて構築した二箇所の変異が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒとを混合した試料においては、１２５時間インキュベーション後もまったく線維は形成されていなかった。
このように、本発明にて構築した変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインおよび家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインの線維形成を抑制することが示された。またこの実験において溶液に形成されているαシヌクレイン凝集塊の総量（線維および非線維成分の和）を溶液の濁度を３３０ｎｍの散乱により計測することで評価した（図３）。その結果、野性型単独あるいは家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインＡｌａ５３Ｔｈｒ単独では多くの凝集塊が形成されていることが観測されるのに対して、本発明にて構築した二箇所の変異が施されたＶａｌ７０Ｔｈｒ／Ｖａｌ７１Ｔｈｒと混合した試料においては、野性型およびＡｌａ５３Ｔｈｒのいずれと混合した系において、凝集塊の形成が大幅に減少していた。このように、本発明にて構築した変異αシヌクレインは野生型αシヌクレインおよび家族性パーキンソン氏病患者で見出された変異αシヌクレインの凝集塊形成能力を抑制することが示された。
これは本発明によって構築された変異αシヌクレインが、αシヌクレインの線維および凝集塊形成によって引き起こされるパーキンソン氏病に代表される各種シヌクレオパシー神経変性疾患の有効な治療薬であること、ならびに新たな治療薬の開発のための重要な分子であることを示している。
【実施例７】部分構造ペプチドによる野性型αシヌクレインの線維形成の抑制
精製された野生型のαシヌクレイン２ｍｇ／ｍｌの溶液に、ＮＨ２−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−ＣＯＯＨである１０残基からなる合成αシヌクレイン部分構造ペプチドを０．２ｍｇ／ｍｌ溶解し、３７℃でインキュベーションした。一定時間ごとにそれぞれ１０μｌずつ採取した。この採取した試料に対して、線維構造に特異的に結合する蛍光色素チオフラビンＴ（ＴｆＴ）を終濃度２５μＭで含む１０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈｃｌ、ｐＨ７．４の緩衝液溶液に加え１００μｌとして、直ちに蛍光スペクトルを観測した（Ｅｘ  ４４０ｎｍ，Ｅｍ  ４５０−５５０ｎｍ）。線維形成速度ならびにその量はＴｆＴの蛍光強度の増加を指標に観測した。
その結果、αシヌクレイン部分構造ペプチドは野生型αシヌクレインの線維形成能力を約２０％低下させることができ、このペプチドが抗線維形成能力を有することが示された。
産業上の利用性
凝集形成能が低下した本発明の変異ヒトαシヌクレインは、パーキンソン氏病病因の検討および治療、ならびに遺伝子治療法開発研究において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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