(57)【要約】  本発明は、キメラ抗原受容体を含む細胞を提供すること；及び前記ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する試薬の存在下で前記細胞を培養してＣＡＲ細胞を得ることを含むＣＡＲ−Ｔ細胞を調製する方法と共に、その生成物を提供する。
2020521479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を提供することと、
前記ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する試薬の存在下で前記細胞を培養して、ＣＡＲ細胞を得ることと、
を含む、方法。
【請求項２】
ＣＡＲをコードする核酸配列と、ｈＴＥＲＴ若しくはＳＶ４０ＬＴ又はその組合せをコードする核酸配列と、を前記細胞に導入することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬が前記ＣＡＲの前記細胞外ドメインに結合して前記ＣＡＲを含む前記細胞の応答を媒介するか、或いは、前記試薬が前記ＣＡＲの前記細胞外ドメインが結合する抗原の細胞外ドメインである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原が、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、又はＣＤ４である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬で培養した後、前記試薬の量と前記CAR細胞の数量との比が１：５０００〜１：５（μｇ／１０４細胞）である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項６】
培地における前記試薬の濃度が２〜１０４ｎｇ／ｍｌである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＡＲを含む前記Ｔ細胞を提供することは、前記ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを前記Ｔ細胞に導入した後、前記試薬の不存在下で前記Ｔ細胞を少なくとも８日間培養することを含み、前記試薬の存在下で前記Ｔ細胞を培養することは、前記少なくとも８日間後、前記Ｔ細胞を培養することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＡＲを発現する前記ＣＡＲ細胞と前記ＣＡＲを発現しない前記細胞との数量比が、前記試薬の不存在下で前記細胞を培養する場合の比より大きい、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項９】
ｈＴＥＲＴをコードする前記核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの組込みが、ｈＴＥＲＴをコードする前記核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せのゲノム組込み、及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの構成的発現を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１０】
ｈＴＥＲＴ若しくはＳＶ４０ＬＴ又はその組合せをコードする前記核酸配列の発現が、誘導性発現系により調節される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１１】
自殺遺伝子をコードする核酸配列を前記細胞に導入し、前記自殺遺伝子の発現が許容されるようにヌクレオシド類似体で前記細胞を培養し、前記ヌクレオシド類似体に前記ＣＡＲ細胞に対する細胞毒性を持たせることを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＡＲが、細胞外ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＡＲの前記スペーサードメインが、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含むか、あるいは、前記ＣＡＲの前記膜貫通ドメインが、配列番号７２又は７５のアミノ酸配列を含み、前記ＣＡＲの前記スペーサードメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４の少なくとも一種の細胞外ドメイン、もしくは、配列番号１８〜２７のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬が、ＧＣＣ、Ｂ７−Ｈ４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍａｒｔ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈ  ＴＥＲＩ、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、エストロゲン、プロゲステロン、ＲＯＮ、又はＵＬＢＰ／ＲＡＥＴｌファミリーの１又は複数のメンバーの細胞外ドメインの少なくとも一種を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の方法で得られる前記ＣＡＲ細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列又はＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せを含む修飾されたＴ細胞であって、ｈＴＥＲＴをコードする前記核酸配列又はＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せを前記修飾されたＴ細胞のゲノムに組み込み、前記修飾されたＴ細胞が、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せを構成的に発現する、修飾されたＴ細胞。
【請求項１９】
前記修飾されたＴ細胞が、ＣＡＲをコードする核酸配列をさらに含み、
前記修飾されたＴ細胞が、前記ＣＡＲが結合する抗原を発現する細胞を抑制でき、
前記ＣＡＲ及びｈＴＥＲＴ又はＳＶ４０ＬＴをコードする前記核酸配列又はその組合せが、別々のポリペプチドの遺伝子生成物として発現される、
請求項１８に記載の修飾されたＴ細胞。
【請求項２０】
ｈＴＥＲＴをコードする前記核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せの発現が、誘導性発現系によって調節される、及び／又は、前記修飾されたＴ細胞が、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む、請求項１８に記載の修飾されたＴ細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交差引用
本出願は、２０１８年３月８日に提出された米国仮出願番号６２／６４０，５２３、発明の名称「リンパ球系及びその使用」、２０１７年１２月１３日に提出された米国仮出願番号６２／５９８，０２４、発明の名称「キメラ抗原受容体細胞の作製及びその使用」、２０１７年６月３０日に提出された米国仮出願番号６２／５２７，６４９、発明の名称「キメラ抗原受容体細胞の作製及びその使用」、２０１７年６月３０日に提出された米国仮出願番号６２／５２７，１４０、発明の名称「修飾されたリンパ球系及びその使用」、及び２０１７年６月１日に提出された米国仮出願番号６２／５１３，７８１、発明の名称「リンパ球系及びその使用」の権益を要求し、それらの仮出願が引用により全体としてここに組み込まれる。
【０００２】
配列リスト情報
２０１８年５月３日ごろ作成されたキメラ抗原受容体細胞の作製及びその使用という名称で約２４．５ＫＢのファイルサイズのコンピュータ可読テキストファイル「Ｉ０７１−００２９ＵＳ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」は、本出願の配列リストを含み、引用により全体としてここに組み込まれる。
【０００３】
本開示は、修飾細胞に関し、具体的には、修飾細胞を含む組成物、並びにその疾患及び病状の治療への使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２５年以上前、科学者は、Ｔ細胞で発現するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開発した。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）技術により、特定の抗体の抗原認識ドメインとＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内ドメインとを結合させる。ある悪性腫瘍を標的とするためにＣＡＲ遺伝子で修飾されたＴ細胞は、良好な臨床的効果を示した。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法において、医師は、患者の血液を抽出し、その細胞障害性Ｔ細胞を回収する。その後、実験室で細胞を再設計することで、どのように患者ごとに特定の癌を攻撃するかが知られる。既存の若干の免疫細胞を除去するために、通常、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の前又はＣＡＲ  Ｔ細胞療法中に患者に化学療法を実施する。しかし、化学療法により、患者のＴ細胞が著しく減少する。多くの患者は、９ヶ月内で回復し、その免疫細胞も化学療法を受ける前のレベルに戻れるが、一部の患者は、持続的なＣＡＲ  Ｔ細胞療法に十分なＴ細胞を生じることができない可能性があるので、危険な状況になる。また、ＣＡＲ  Ｔ療法において、患者体内のＣＡＲ  Ｔ細胞の長時間維持は、腫瘍治療における患者の予後にとって非常に重要である。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞の長時間存在を維持できれば、この技術により腫瘍の再発を効果的に低減できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本明細書に記載される実施形態は、遺伝子修飾されたＣＡＲ細胞を含む組成物、並びにその疾患及び病状の治療への使用に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示に係るいくつかの実施形態は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列と、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ又はその組合せをコードする核酸配列と、を細胞に導入することと、ＣＡＲの細胞外ドメインに認識される試薬の存在下で細胞を培養することで、修飾されたＣＡＲ細胞を生じさせることと、を含む方法に関する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せの組込みは、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せのゲノム組込み、及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ又はその組合せの構成的発現を含む。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ又はその組合せの発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、前記方法は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を細胞に導入し、自殺遺伝子の発現が許容されるように、自殺遺伝子を含むＣＡＲ細胞及びＣＡＲをコードする核酸をヌクレオシド類似体と一緒に培養することにより、ヌクレオシド類似体に細胞毒性を持たせることをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外成分と結合して細胞応答を媒介する調節化合物、ＣＡＲの細胞外ドメインと結合するリガンド、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原、又はＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、又はＣＤ４である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体であり、及び／又はヒトＩｇＧのＦａｂ断片と結合する。いくつかの実施形態において、調節化合物は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、調節化合物は、配列番号４１〜４７のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、調節化合物は、配列番号２１及び４８〜５３のアミノ酸配列の少なくとも一種と結合する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、配列番号３８、３５、３９、及び４０の少なくとも一種を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞と比べ、試薬の存在下で培養されるＣＡＲ細胞は、細胞成長が約１．５〜２倍増加したことを示す。いくつかの実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞と比べ、試薬の存在下で培養されるＣＡＲ細胞は、細胞成長が約１．５〜３倍増加したことを示す。いくつかの実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞と比べ、試薬の存在下で培養されるＣＡＲ細胞は、細胞成長が約２倍増加したことを示す。いくつかの実施形態において、培地におけるＣＡＲ細胞の細胞密度は、少なくとも約２５×１０４細胞／ｍＬ培地である。いくつかの実施形態において、培地におけるＣＡＲ細胞の細胞密度は、約２００×１０４細胞／ｍＬ培地より小さい。いくつかの実施形態において、培地におけるＣＡＲ細胞の細胞密度は、約５０×１０４〜約２００×１０４細胞／ｍＬ培地にある。いくつかの実施形態において、培地におけるＣＡＲ細胞の細胞密度は、約５０×１０４〜約１００×１０４細胞／ｍＬ培地にある。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、細胞培地に由来するテトラサイクリンに敏感である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、リバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）をコードする第３の核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴ又はＳＶ４０ＬＴの発現は、ｒｔＴＡによって調節されることで、ｈＴＥＲＴ又はＳＶ４０ＬＴをテトラサイクリンの存在下で発現させる。いくつかの実施形態において、細胞培地におけるテトラサイクリンの濃度は、約２μｇ／ｍｌ以上である。いくつかの実施形態において、テトラサイクリンは、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、メクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン及びクロルテトラサイクリンからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、テトラサイクリンは、ドキシサイクリンである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、自殺遺伝子をコードする第４の核酸配列を含むことで、ヌクレオシド類似体の存在下で自殺遺伝子の発現が許容されるようにＣＡＲ細胞を培養している時、ＣＡＲ細胞に対してヌクレオシド類似体が細胞毒性を有するようになる。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ、水痘・帯状疱疹ウィルスのチミジンキナーゼ及び細菌由来シトシンデアミナーゼからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼである。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド類似体は、ガンシクロビル、アシクロビル、ブシクロビル、ファムシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、トリフルオロチミジン、１−［２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノフラノシル］−５−ヨードウラシル、ビダラビン（ａｒａ−Ａ）、チミジンアラビノシド（ａｒａＴ）１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、及びＡｒａＣからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、ヌクレオシド類似体は、ガンシクロビルである。
【００１４】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法を用いて得られた単離細胞に関する。いくつかの実施形態は、単離細胞集団を含有する組成物に関する。いくつかの実施形態は、本明細書に記載される組成物の有効量を投与することを含む、被験体においてＴ細胞応答を増強させる、及び／又は被験体の腫瘍を治療する方法に関する。
【００１５】
いくつかの実施形態は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せを含む修飾細胞に関し、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの組込みは、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せのゲノム組込み、及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せの構成的発現を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、Ｔ細胞であり、ＣＡＲをコードする核酸配列をさらに含み、且つ細胞がＣＡＲによって認識される抗原を発現することを抑制できる。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸及びｈＴＥＲＴをコードする核酸、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せは、別々のポリペプチドの遺伝子生成物として発現される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、誘導性発現系は、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、又はその組合せの発現を増加又は活性化するｒｔＴＡ−ＴＲＥ系である。いくつかの実施形態において、修飾細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、修飾細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子はＨＳＶ−ＴＫ系である。いくつかの実施形態において、修飾細胞は増殖性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原と結合する。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、又はＴＥＭ８を含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子が破壊され、内在性ＴＣＲの発現が低下する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ遺伝子に関連する標的ベクターがＴ細胞のゲノムに組み込まれることにより、内在性ＴＣＲの発現が消去される。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子が破壊され、内在性ＣＤ４の発現が低下する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＨＩＶ表面上の分子に結合する。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴが配列番号６の配列を有し、かつＳＶ４０ＬＴが配列番号７の配列を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態は、増殖性Ｔ細胞を得るように１又は複数の核酸配列をＴ細胞に転移させてＴ細胞を増殖させることと、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸配列を、増殖されたＴ細胞に導入することでＣＡＲ  Ｔ細胞を得ることを含む、ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法に関する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、増殖されたＴ細胞は、本明細書に記載されるいずれかの修飾されたＴ細胞である。いくつかの実施形態において、１又は複数の核酸配列は、Ｔｅｔ誘導性ＨＰＶ１６−Ｅ６／Ｅ７発現系を含む。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、被験体から抽出された初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞注入に応答する対応野生型Ｔ細胞に比べて低下した免疫原性を有するＴ細胞である。いくつかの実施形態は、ヒト患者に本明細書に記載される修飾細胞を含む医薬組成物を投与することを含む、疾患又は病状を治療する方法に関する。いくつかの実施形態において、疾患又は病状は、ＡＩＤＳであり、医薬組成物は、ＨＩＶ表面上の分子に結合する抗原結合ドメインを有するＣＡＲを含む細胞を包含する。いくつかの実施形態において、疾患又は病状は癌であり、医薬組成物は、ＣＡＲを含む修飾細胞を包含し、ＣＡＲの抗原結合ドメインが癌細胞上の分子に結合し、細胞上の内在性ＴＣＲ数が減少する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸がＴ細胞のゲノムに組み込まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン，及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸配列を包含する、ＣＡＲ  Ｔ細胞に関し、前記細胞内ドメインがＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子が破壊され、ＴＣＲの発現が低下又は消去する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸配列を包含する、ＣＡＲ  Ｔ細胞に関し、前記細胞内ドメインがＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子が破壊され、内在性ＣＤ４の発現が低下する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＨＩＶ表面上の分子に結合する。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、本明細書に記載される修飾されたＴ細胞を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態は、増殖性Ｔ細胞を得るように１又は複数の核酸配列をＴ細胞に転移することを含む、制限増殖性Ｔ細胞を生成する方法に関し、１又は複数の核酸配列がペプチドをコードし、ペプチドの発現によりＴ細胞を増殖性Ｔ細胞に転化させ、前記ペプチドが誘導性発現系、誘導性自殺系又はその組合せにより調節される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せである。いくつかの実施形態において、誘導性発現系は、ｒｔＴＡ−ＴＲＥ系である。いくつかの実施形態において、誘導性自殺系は、ＨＳＶ−ＴＫ系又は誘導性カスパーゼ−９系である。
【００２３】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される方法を用いて制限増殖性Ｔ細胞を作製することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含有する培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンのいずれかも含まない培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、そのＳＶ４０ＬＴ遺伝子又はｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が低下したＴ細胞を得ることと、それを必要とする被験体に前記Ｔ細胞を含む医薬組成物を投与することとを含む、疾患又は病状を治療する方法に関する。
【００２４】
いくつかの実施形態は、疾患又は病状を治療するための、本明細書に記載される方法を用いて得られた増殖性Ｔ細胞を含む医薬組成物に関し、前記医薬組成物の疾患又は病状を治療するための方法は、本明細書に記載される方法を用いて制限増殖性Ｔ細胞を作製することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含有する培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含まない培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、そのＳＶ４０ＬＴ遺伝子又はｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が低下したＴ細胞を得ることと、被験体に前記Ｔ細胞を含む医薬組成物を投与することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、ある所定の条件に応答する被験体にガンシクロビルを投与することをさらに含んでもよい。
【００２５】
いくつかの実施形態は、修飾細胞を含むＴ細胞集団に関し、修飾細胞のＴＣＲ遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する内在性遺伝子が破壊され、内在性ＴＣＲの発現が低下する。
【００２６】
いくつかの実施形態は、修飾細胞を含むＴ細胞集団に関し、修飾細胞のＰＤ−１遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する内在性遺伝子が破壊され、ＰＤ−１遺伝子の発現が低下する。いくつかの実施形態において、修飾細胞が、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）のヒトＴ細胞に対する阻害作用を低減した短縮ＰＤ−１をコードする核酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲを含む細胞を提供し、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下で細胞を培養することでＣＡＲ細胞を得ることを含む方法に関する。
【００２８】
いくつかの実施形態は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することでＣＡＲ細胞を得ることとを含む、インビトロでＣＡＲ細胞を作製するための方法に関する。
【００２９】
いくつかの実施形態は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲを発現する細胞（ＣＡＲ細胞）と発現しない細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することでＣＡＲを発現する細胞を濃縮することとを含む、ＣＡＲを発現する細胞を濃縮するための方法に関する。
【００３０】
いくつかの実施形態は、（ａ）ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得る工程と、（ｂ）第１の培地を使用してＣＡＲ細胞を所定の時間培養する工程と、（ｃ）第２の培地を使用してＣＡＲ細胞を培養する工程と、を順に含み、第１の培地が試薬を含まず、第２の培地が試薬を含み、前記試薬がＣＡＲの細胞外ドメインに結合する、インビトロでＣＡＲ細胞を作製するための方法に関する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合して細胞応答を媒介する調節化合物である。いくつかの実施形態において、調節化合物は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンド又はＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、又はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、調節化合物は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体であり、及び／又はヒトＩｇＧのＦａｂ断片と結合する。いくつかの実施形態において、調節化合物は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、調節化合物は、配列番号４１〜４７及び６１〜６３のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、調節化合物は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０、５１〜５３及び５６〜６０のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。いくつかの実施形態において、調節化合物は、ＧＣＣ、Ｂ７−Ｈ４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍａｒｔ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈ  ＴＥＲＩ、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、エストロゲン、プロゲステロン、ＲＯＮ、又はＵＬＢＰ／ＲＡＥＴｌファミリーの１又は複数のメンバーの少なくとも一種を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ  ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−Ｉ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７−Ｈ３の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はその組合せである。いくつかの実施形態において、調節化合物は、真核細胞系又は細菌発現系から生成される可溶性抗原である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、試薬を用いてＣＡＲ細胞を培養した後、試薬の量とＣＡＲ細胞の数量との比が１：５０〜１：５（μｇ／１０４細胞）、１：５００〜１：５（μｇ／１０４細胞）、又は１：５０００〜１０：５（μｇ／１０４細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞の培養は、抗ＣＤ３ビーズ、抗ＣＤ２８ビーズ、及びＩＬ２の少なくとも一種を含む培地を用いて細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態において、試薬を用いてＣＡＲ細胞を培養した後、試薬の量とＣＡＲ細胞の数量との比が１：５０〜１：５（μｇ／１０４細胞）である。いくつかの実施形態において、試薬の存在下で培養したＣＡＲ細胞においてＣＡＲのコピー数は、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合の数より大きい。いくつかの実施形態において、試薬の存在下で培養する場合のＣＡＲを発現する細胞数とＣＡＲを発現しない細胞数との比が試薬の不存在下で細胞を培養する場合の比より大きい。いくつかの実施形態において、試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することは、試薬の存在下でＣＡＲ細胞を所定の期間培養すること、或いは、試薬の存在下でＣＡＲ細胞を少なくとも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０日間培養することを含む。いくつかの実施形態において、所定の期間は、７〜１００日間である。いくつかの実施形態において、試薬の存在下で培養する場合に記憶Ｔ細胞表現型を生じるＣＡＲ細胞数は、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合の数より大きい。いくつかの実施形態において、試薬の存在下で培養する場合にＣＡＲ細胞より産生されるサイトカインの量は、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合にＣＡＲ細胞より産生されるサイトカインの量より多い。
【００３４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は健常ドナーに由来し、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの発現低下がある。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は健常ドナーに由来し、同一のヒトドナーから単離される初代ヒトＴ細胞により引き起こされるＧＶＨＤ応答に比べ、ヒトレセプターにおいて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を引き起こせず、或いは、低下したＧＶＨＤ応答を引き起こし、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの発現が低下しておらず、或いは、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの発現が破壊されておらず、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉが正常に発現されている。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せを含むＴ細胞である。
【００３５】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列とＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴの発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、誘導性発現系は、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、又はその組合せの発現を増加又は活性化するｒｔＴＡ−ＴＲＥである。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、自殺遺伝子はＨＳＶ−ＴＫ系である。
【００３６】
いくつかの実施形態は、前記方法で得られる単離細胞に関する。
【００３７】
いくつかの実施形態は、前記方法で得られる単離細胞を含む医薬組成物に関する。
【００３８】
いくつかの実施形態は、それを必要とする被験体に医薬組成物の有効量を投与することを含む、被験体において抗腫瘍免疫応答を刺激するための方法に関する。いくつかの実施形態は、癌を治療するための医薬組成物に関し、前記医薬組成物の癌を治療するための方法は、それを必要とする被験体に医薬組成物の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号７２又は７５のアミノ酸配列を含み、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態は、それを必要とする被験体にＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することでＴ細胞応答を提供することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる可溶性試薬を発現する提示細胞の有効量を投与することと、を含む方法に関する。
【００４０】
いくつかの実施形態は、被験体にＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することでＴ細胞応答を提供することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる可溶性試薬を発現する提示細胞の有効量を投与することで被験体におけるＴ細胞応答を増強させることと、を含む被験体におけるＴ細胞応答を増強させる方法に関する。いくつかの実施形態において、被験体におけるＴ細胞応答を増強させることは、ＣＡＲを含むＴ細胞の増殖を選択的に増強させることを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲ細胞を用いて被験体病状に対する治療を増強させる方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、被験体に試薬を発現する細胞集団及びＣＡＲ細胞集団を投与することを含む。別の実施形態において、前記方法は、被験体に試薬から誘導されるワクチン及びＣＡＲ細胞集団を投与することを含む。ＣＡＲ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲの細胞外ドメインは、前記試薬を認識する。
【００４２】
いくつかの実施形態は、疾患に罹患した被験体におけるＣＡＲ細胞増殖を増強させる方法に関する。前記方法は、ＣＡＲを含む細胞を作製することと、被験体にＣＡＲ細胞の有効量を投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる試薬をコードする核酸配列を細胞に導入することで修飾細胞を得、被験体に修飾細胞の有効量を投与することと、を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンドである。いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、配列番号４１〜４７及び６１〜６３のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０、５１〜５３及び５６〜６0のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。いくつかの実施形態において、試薬は、ＧＣＣ、Ｂ７−Ｈ４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍａｒｔ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈ  ＴＥＲＩ、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、エストロゲン、プロゲステロン、ＲＯＮ、又はＵＬＢＰ／ＲＡＥＴｌファミリーの１又は複数のメンバーの少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ  ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−Ｉ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７−Ｈ３の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、試薬は細胞により発現され、試薬の発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞と試薬を発現する細胞とを一緒に培養し、試薬は、前記細胞により発現され、試薬の発現は、誘導性自殺遺伝子発現系により調節される。いくつかの実施形態において、前記細胞は、野生型細胞に比べて同種異系ＣＡＲ療法に対して低下した免疫原性を有する修飾細胞である。いくつかの実施形態において、試薬は、可溶性抗原であるので、抗原は試薬を発現する細胞から放出される。いくつかの実施形態において、試薬を発現する細胞は、生弱毒化されて複製不全である。いくつかの実施形態において、γ線照射又は化学的不活性化により、試薬を発現する細胞は、生弱毒化されて複製不全である。いくつかの実施形態において、試薬を発現��る細胞又は単離される修飾細胞は、被験体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得される。いくつかの実施形態において、試薬を発現する細胞は、被験体のＴ細胞である。いくつかの実施形態において、試薬を発現する細胞は、ワクチンとして作製されるＴ細胞である。いくつかの実施形態において、試薬を発現する細胞は、弱毒化された腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、配列番号７２又は７５のアミノ酸配列を含み、ＣＡＲのスペーサードメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態は、細胞外ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする単離核酸配列に関する。ＣＡＲの細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合し、スペーサードメインは、配列番号６７又は６８のアミノ酸配列を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態は、細胞外ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする単離核酸配列に関する。ＣＡＲの細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合し、スペーサードメインは、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメインは、配列番号７３又は７４のアミノ酸配列を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインは抗体、リガンド又はその抗原結合断片を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合断片はＦａｂ又はｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、又はＴＥＭ８を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態は、前記単離核酸配列を含むベクターに関する。
【００４８】
いくつかの実施形態は、前記単離核酸配列を含む細胞に関する。
【００４９】
いくつかの実施形態は、前記単離核酸配列を含むＴ細胞集団を含有する組成物に関する。
【００５０】
いくつかの実施形態は、被験体において抗腫瘍免疫応答を刺激する、又は病状を治療するための方法に関する。前記方法は、前記単離核酸配列を含むヒトＴ細胞集団を含有する医薬組成物の有効量を被験体に投与することを含む。
【００５１】
いくつかの実施形態は、前記単離核酸配列を含む細胞を提供することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下で細胞を培養することとを含む方法に関する。
【００５２】
いくつかの実施形態は、インビトロでＣＡＲ細胞を作製するための方法に関する。前記方法は、細胞を提供することと、いずれかの前記単離核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することと、を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲを発現する細胞を濃縮するための方法に関する。前記方法は、細胞を提供することと、いずれかの前記単離核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲを発現する細胞（ＣＡＲ細胞）及びＣＡＲを発現しない細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することでＣＡＲを発現する細胞を濃縮することと、を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンドである。いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。いくつかの実施形態において、試薬は、抗原の細胞外ドメインである。いくつかの実施形態において、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４である。いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧのＦａｂ断片と結合する。いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、試薬は、配列番号２２及び３４のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。いくつかの実施形態において、試薬は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０及び５０〜６０のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲを活性化する、及び／又は細胞の共刺激応答を引き起こす。いくつかの実施形態において、抗原を発現する細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はその組合せである。
【００５５】
本発明の内容は、保護を要求する主旨の重要な特徴や必要な特徴を標識することも、保護を要求する主旨の範囲を制限することも意図していない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
図面を参照して具体的な実施形態を説明する。異なる図面において、類似又は同じ項目に同じ符号を付する。
【００５７】
【図１】抗原の存在又は不存在下でＴ細胞を培養する模式図を示し、本開示の実施形態に係る試薬の不存在下での培地を用いる非形質導入Ｔ細胞及びＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞増幅結果を表すヒストグラムを示す。
【図２】抗原の存在又は不存在下で培養されるＴ細胞の各種パラメーター付の表を示す。
【図３】ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ  １９細胞活性の維持を表すフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図４】ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ細胞の記憶細胞表現型の産生の刺激及び／又は誘導を表すフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図５】ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ細胞の記憶細胞表現型の産生の刺激及び／又は誘導を表すフローサイトメトリー解析の結果を示す。解析結果から、ＣＤ１９により細胞の状態を安定化することができることが分かる。図４の４０２及び４０６はそれぞれ、ＣＤ１９の存在及び不存在下で培養される細胞の細胞片のレベルを示す。図４の４０４及び４０８はそれぞれ、ＣＤ１９の存在及び不存在下で培養される細胞について細胞片の割合を示す。
【図６】ＣＤ１９によりＩＦＮγの放出能を増強できることを表すヒストグラムを示す。
【図７】ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ細胞存在の維持を表すフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図８】ＴＳＨＲによるＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞活性の維持を表すフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図９】ＣＡＲＴ−ＴＳＨＲ細胞のΔＭＦＩ（平均蛍光強度）を示す。ＭＦＩは、細胞集団の平均蛍光をいい、数値として算出する。
【図１０】ＴＳＨＲによるＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞活性の維持を表す他のフローサイトメトリー解析の結果を示す。
【図１１】ＴＳＨＲの存在及び不存在下で培養されるＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞の細胞形態を示す。
【図１２】例としてＣＡＲ分子及び細胞膜の一部構造の模式図を示す。
【図１３】ＣＡＲの各種構築物及びＣＡＲを有するＴ細胞の増幅結果を示す。ＣＡＲの各種構築物を有するＴ細胞をそれぞれ所定の時間培養する。１日目及び１５日目に培養されるＴ細胞に対してフローサイトメトリー解析を行い、細胞増幅率を測定する。ヒストグラムではＣＤ１９細胞外ドメインのある又はない場合に培養されるＣＡＲ  Ｔ細胞の増幅倍数を示す。
【図１４】図１３に示す４つのグループにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞増幅のフローサイトメトリー解析を示す。前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９細胞外ドメインのない場合に１５日間培養される。
【図１５】図１３に示す４つのグループにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞増幅のフローサイトメトリー解析を示す。前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９細胞外ドメインのある場合に１５日間培養される。
【図１６】図１３に示す４つのグループにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞でのＣＡＲ発現レベルのフローサイトメトリー解析を示す。前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９細胞外ドメインのない場合に１５日間培養される。
【図１７】図１３に示す４つのグループにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞でのＣＡＲ発現レベルのフローサイトメトリー解析を示す。前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９細胞外ドメインのある場合に２０日間培養される。
【図１８】ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８表現型変化のフローサイトメトリー解析を示す。
【図１９】ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８表現型変化のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２０】図１３に示す２つのグループにおいてＣＡＲ  Ｔ細胞でのＣＡＲ発現レベルのフローサイトメトリー解析を示す。前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＤ１９細胞外ドメインのある場合に１７日間培養される。
【図２１】ＣＡＲ  Ｔ細胞傷害試験のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２２】ＣＡＲ  Ｔ細胞のＩＦＮ−ｇ放出のフローサイトメトリー解析を示す。
【図２３】複数のＤＮＡ構築物の模式図を示す。
【図２４】Ｔ細胞傷害作用の蛍光写真を示す。
【図２５】Ｔ細胞傷害作用の蛍光写真を示す。
【図２６】Ｔ細胞傷害作用の蛍光写真を示す。
【図２７】複数の不死化単一細胞シーケンシング解析のグラフを示す。
【図２８】複数の不死化単一細胞シーケンシング解析のグラフを示す。
【図２９】複数の不死化単一細胞シーケンシング解析のグラフを示す。
【図３０】複数の不死化単一細胞シーケンシング解析のグラフを示す。
【図３１】複数の不死化単一細胞シーケンシング解析のグラフを示す。
【図３２】不死化Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のフローサイトメトリー結果を示す。上の図中の二つの縦座標は、ＣＡＲの発現を示す。横座標は、ＣＤ２７９（ＰＤ１）の発現を示す。左はアイソタイプコントロールであり、右はＣＡＲ抗体である。ｅｆ１ａ−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｒｔＴａ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴのＤＮＡを含むベクター及びｈＣＤ１９  ＣＡＲをコードするＤＮＡを含むベクターを使用してＴ細胞を感染させる。培養中、Ｔ細胞の成長を刺激するためにＣＤ１９ペプチドを加える。細胞ＣＡＲの発現が８２．８７％であると認めた。それは、定性的＋定量的な結果である。下表にＣＡＲのコピー数実験を示す。ＣＡＲ  Ｔ細胞においてｇＤＮＡの１μｇごとに２２４，１１５１個のＣＡＲコピーが存在することが認められ、それにより発現系におけるｈＣＤ１９の発現が誘導され、それは定量的な結果である。「ｄt混合物」とは、ｅｆ１ａ−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｒｔＴＡ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴのみで形質導入された、抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするＤＮＡを有さない細胞を含むコントロールのことを指す。
【図３３】細胞がデュアルスイッチＴ細胞ＣＤ８＋モノクローナル細胞（Ｄｏｘ濃度が２μｇ／ｍＬである）を表すグラフを示す。ｒＴｅｔＲは抗ＣＤ１９  ＣＡＲ増殖性Ｔ細胞の構築に用いられる。そのため、ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を培養物に加えたとき、ｈＴＥＲＴが発現される。Ｄｏｘを加えないとき、ｈＴＥＲＴが発現されず、細胞が徐々に死亡する。
【図３４】二重安全Ｔ／ＣＡＲ  Ｔ細胞１＋／−ＴＫ（ガンシクロビル）を表すグラフを示す。
【図３５】二重安全Ｔ／ＣＡＲ  Ｔ細胞１＋／−ＴＫ（ガンシクロビル）を表すフローサイトメトリー解析結果を示す。
【図３６】二重安全Ｔ／ＣＡＲ  Ｔ細胞１＋／−ＴＫ（ガンシクロビル）を表すフローサイトメトリー解析結果を示す。実験細胞：ＣＤ８＋ＣＺＹ−１  ＳＤＳ−Ｔ及びＮＴ細胞。ＴＫ用法：２4時間ごとに一回注射し、成人体内濃度が７１．４５ｎｇ／ｍｌ／５０００ｎｇ／ｋｇである。インビトロ実験濃度勾配：３５７．２ｎｇ／ｍｌ、１４２．９ｎｇ／ｍｌ、７１．４５ｎｇ／ｍｌ、３５．７２５ｎｇ／ｍｌ、１４．２８ｎｇ／ｍｌ、３．６ｎｇ／ｍｌ。例として、図３６には、コントロール及び実験では３５．７２５ｎｇ／ｍｌを使用することが示される。２００ｗの５０ｗ／ｍｌの細胞密度で出発細胞を培養する。
【図３７】濃度勾配での培養機能の測定を示し、前記測定にＣＤ８＋デュアルスイッチＣＡＲ  Ｔ細胞を示す。
【図３８】最適培養濃度：５０ｗ／ｍｌ〜１００ｗ／ｍｌを示し、低濃度又は高濃度でデュアルスイッチＴ細胞の成長を抑制できる。ｗ／ｍｌとはミリリットルごとに１万である。
【図３９】デュアルスイッチＣＡＲＴ細胞傷害試験結果を示す。
【図４０】細胞傷害分析の結果を示す。
【図４１】細胞傷害分析の結果を示す。図２６及び２７は傷害分析の結果（初代ｔ細胞ｃｄ３をノックアウトした結果）である。ノックアウトしてＣＡＲ及びｈＴＥＲＴをトランスフェクトした後、汎用ＣＡＲＴとする。フローチャート：左の３２．１７％がｃｄ３ノックアウトｃｄ３細胞であり、左の７９．１６％も同様である。顕著な１つのピークからシーケンシングピークの図が認められ、ノックアウトされたことが証明される。
【図４２】ＺＦＮを使用して得られたＣＤ３マイクロビーズで精製されたＣＤ３陰性細胞を示す。精製された後、ＡＰＣ−ＣＤ３抗体をＣＤ３陰性細胞に接種し、フローサイトメトリーの結果からノックアウトしたことが分かり、そのうちの９９．７％の細胞がＣＤ３−である。そして、デュアルスイッチｈＴＥＲT及びＣＡＲのレンチウィルスコピーによりこれらのＣＤ３陰性細胞をこれらの細胞のゲノムにトランスフェクトさせる。
【図４３】各種ＣＡＲ  Ｔ細胞の生存及び成長を示す。第１グループ（ｈＴｅｒｔ  ＣＤ１９  ＣＡＲ）において、ＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列及びｈＴＥＲＴをコードする核酸配列で健常ドナーからの初代Ｔ細胞を形質導入する。第２グループ（ＣＤ１９  ＣＡＲ）において、ＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸配列で初代Ｔ細胞を形質導入する。ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列を含むＣＡＲ  Ｔ細胞は長時間生存を示した。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞において、ＣＤ１９  ＥＣＤを含む細胞培地で培養された細胞は、ＣＤ１９  ＥＣＤを含まない細胞培地で培養された細胞よりも細胞成長速度が高い。ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列を含まないＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列で形質導入された後の約２０日間後に死亡し始める。
【図４４】異なる条件での各グループのＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞成長を示す。Ａ：第１グループ（ｈＴＥＲＴ＋ＤＯＸ＋ＣＤ１９）：ＥＣＤ  ＣＤ１９及びＤｏｘを含む培地で増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈＴＥＲＴ）を培養する。第２グループ（ｈＴＥＲＴ＋ＤＯＸ）：Ｄｏxを含むがＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地で増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈＴＥＲＴ）を培養する。第３グループ（ｈＴＥＲＴ  ＣＤ１９ＣＡＲ−Ｔなし）：Ｄｏｘ及びＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地でＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養する。Ｂ：第１グループ：ＥＣＤ  ＣＤ１９及びＤｏｘを含まない培地でＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈ１９ＣＡＲ）を培養する。第２グループ：Ｄｏｘを含むがＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地でデュアルスイッチ（デュアルスイッチｈ１９ＣＡＲ＋ｄｏｘ）を有する増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養する。第３グループ：Ｄｏｘ及びＥＣＤ  ＣＤ１９を含む培地でデュアルスイッチ（デュアルスイッチｈ１９ＣＡＲ＋ｄｏｘ＋ｃｄ１９）を有する増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養する。これらの結果から、試薬及び／又は増殖的修飾はインビトロＣＡＲ  Ｔ細胞の長時間維持に寄与することが分かる。
【図４５】抗ＴＳＨＲ  ＣＡＲ分子のＴ細胞での発現を表すフローサイトメトリー解析（単一生細胞でゲートされる）を示す。抗ＴＳＨＲ  ＣＡＲ  Ｔ細胞を構築し、フローサイトメトリーによりＣＡＲ分子の発現を検出する。非形質導入Ｔ細胞に比べ、ＣＡＲ分子の発現が観察された。
【図４６】ＴＳＨＲのＴ細胞での過剰発現を表すフローサイトメトリー解析（単一生細胞でゲートされる）を示す。レンチウィルスベクターは抗原過剰発現Ｔ細胞（ＴＳＨＲ）の構築に用いられる。ＴＳＨＲ分子のＴ細胞表面での発現（左はＩｇＧ、右は抗ＴＳＨＲ  ＦＩＴＣ）が観察された。
【図４７】マウス末梢血中のサイトカイン放出（ＩＬ−２）を示す。
【図４８】マウス末梢血中のサイトカイン放出（ＩＦＮ−γ）を示す。
【図４９】マウス末梢血中のサイトカイン放出（ＩＬ−４）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
他に定義されない限り、本明細書において使用する全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は等価な任意の方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。本開示の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００５９】
冠詞「１つの（ａ／ａｎ）」は、本明細書では、１又は複数の（即ち、少なくとも１つの）該冠詞の文法的目的語を指すために使用される。例として、「ある要素」は、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００６０】
「約」とは、基準分量、レベル、値、数値、頻度、百分率、寸法、サイズ、総量、重量、又は長さに対して２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％ほど変動した分量、レベル、値、数値、頻度、百分率、寸法、サイズ、総量、重量又は長さを意味する。
【００６１】
本明細書で使用する「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激された細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生及び検出可能なエフェクター機能に関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を受けているＴ細胞を指す。
【００６２】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）及び所望の生物学的活性又は機能を示す限り抗体断片を含む。本開示における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２、並びに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含むさまざまな形態で存在し得る（Harlowら、1999年、Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlowら、1989年、Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houstonら、1988年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85：5879-5883；Birdら、1988年、Science 242：423-426頁）。
【００６３】
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域を指す。抗体断片の他の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重抗体；線形抗体；一本鎖抗体分子；並びに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれる。
【００６４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、緊密で非共有結合的な、１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインの折りたたみから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗原結合特異性を抗体に与える６つの超可変ループ（それぞれＨ鎖及びＬ鎖から３ループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含むＦｖの半分）であっても抗原を認識して結合する能力を有するが、結合部位全体（二量体）よりも親和性は低い。
【００６５】
本明細書において使用する「抗体重鎖」は、天然に存在する立体配座の全抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうち大きい方を指す。本明細書において使用する「抗体軽鎖」は、天然に存在する立体配座の全抗体分子中に存在する２つの型のポリペプチド鎖のうち小さい方を指す。κ及びλ軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００６６】
「合成抗体」という用語は、例えば、バクテリオファージによって発現される抗体のような、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子を合成して発現することで得られる抗体、又は抗体をコードするアミノ酸を得て作製される抗体を含む。利用可能であって本分野において周知である技術を用いて合成ＤＮＡを得る。
【００６７】
「抗原」という用語は、抗体産生若しくは特異的な免疫学的コンピテント細胞の活性化、又はその両方に関与できる、免疫応答を誘発する分子として定義される。抗原は、すべてのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子、或いは、組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来する分子を含む。例えば、免疫応答を誘発するタンパク質又はペプチドをコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含むＤＮＡが、それ故に、本明細書において使用する用語「抗原」をコードする。抗原は、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要はない。抗原は、組織試料、腫瘍試料、細胞又は生物学的液体を含む生体試料から生成、合成又は誘導することができる。
【００６８】
本明細書において使用する「抗腫瘍作用」という用語は、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、転移の数の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存の減少、腫瘍細胞を有する被験体の期待余命の延長又は癌状態に関連する様々な生理学的症状の改善に関連する生物学的作用を指す。「抗腫瘍作用」はまず、腫瘍発生の予防において本開示のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞及び抗体の能力によっても明らかにされ得る。
【００６９】
用語「自己抗原」は、免疫系によって誤って外来であると認識された抗原を指す。自己抗原には、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）が含まれる。
【００７０】
「自己」という用語は、後に被験体に再導入される、同じ被験体に由来する材料を説明するために用いられる。
【００７１】
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる被験体に由来する移植片を表すために使用される。例として、ドナー被験体は、相関でも非相関でも、レセプター被験体でもよいが、レセプター被験体と類似する免疫系マーカーを有する。
【００７２】
「異種性」という用語は、異なる種の被験体由来の移植片を説明するために用いられる。例として、ドナー被験体とレセプター被験体は、異なる種に由来し、遺伝学的及び免疫学的不和合であってもよい。
【００７３】
「癌」という用語は、異常細胞の迅速且つ制御されない増殖によって特徴付けられる疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、又は血流及びリンパ系を通じて体の他の部分に広がることができる。様々な癌の例としては、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌等が含まれる。
【００７４】
本明細書を通じて、文脈が他の意味を要求しない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、記載された工程もしくは要素、又は工程もしくは要素の群を含むが、任意の他の工程もしくは要素又は工程もしくは要素の群を排除しないことを意味すると理解されるものとする。
【００７５】
「・・からなる」という用語は、「・・からなる」という語句に続く全てのものを含み、これに限定されることを意味する。従って、「・・からなる」という用語は、列挙された要素が必要又は必須であり、他の要素が存在してはいけないことを示す。
【００７６】
「実質的に・・からなる」という用語は、その語句の後に列挙される任意の要素を含み、列挙された要素に関して本開示において特定された活性若しくは作用に干渉しないか、又は寄与する他の要素を含んでもよいことを意味する。従って、「実質的に・・からなる」という用語は、列挙された要素が必要又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、列挙された要素の活性若しくは作用に影響を及ぼすか否かに依存して存在しても、又は存在しなくてもよいことを表す。
【００７７】
「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関連するポリヌクレオチド（即ち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「A-G-T」は、配列「T-C-A」に相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対形成規則に従って一致する「部分的」なものであってもよい。あるいは、核酸間に「完全な」又は「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を有する。
【００７８】
「に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ）」又は「に対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ  ｔｏ）」という用語は、（ａ）参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部と実質的に同一若しくは相補的であるヌクレオチド配列を有するか、又はペプチド若しくはタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、あるいは（ｂ）参照ペプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するペプチド又はポリペプチドを意味する。
【００７９】
「共刺激リガンド」という用語は、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合によって提供される一次シグナルに加えて、増殖、活性化、分化及び他の細胞応答の少なくとも一種を含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上の分子を指す。共刺激リガンドとしては、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、ＣＤ７のリガンド、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体、及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれてもよい。共刺激リガンドは、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドと特異的に結合するアゴニスト又は抗体も包含する。
【００８０】
「共刺激分子」という用語は、共刺激リガンドと特異的に結合して、それによって増殖等のＴ細胞による共刺激応答を媒介するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌ様受容体が含まれる。
【００８１】
「共刺激シグナル」という用語は、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーション等の一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖及び／又は主要分子の上方制御又は下方制御を導くシグナルを指す。「疾患」及び「状態」という用語は互換的に使用することができ、又は特定の病症若しくは状態が既知の原因物質を有さず（よって、病因が未だ解明されておらず）、従って、未だ疾患として認識されていないが、望ましくない状態又は症候群としてのみ認識され、多かれ少なかれ特異的な症状のセットが臨床医によって同定されているという点で異なっていてもよい。「疾患」という用語は、被験体が恒常性を維持できず、疾患が改善されない場合、被験体の健康が悪化し続ける被験体の健康状態である。対照的に、被験体における「障害」は、動物が恒常性を維持できるが、その動物の健康状態は、障害のない場合よりも好ましくない健康状態である。未治療のまま放置しても、障害が必ずしも動物の健康状態を更に低下させるとは限らない。
【００８２】
「有効な」という用語は、所望の、期待された、又は意図された結果を達成するのに適切であることを意味する。例えば、治療背景における「有効量」は、治療的又は予防的な利益を生じるのに十分な化合物の量であり得る。
【００８３】
「コードする」という用語は、所定のヌクレオチド配列（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）又は所定のアミノ酸配列のいずれかを有する、生物学的プロセス中の他のポリマー及び巨大分子の合成のための鋳型として機能するポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列、例えば、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの固有な特性並びにそれから生じる生物学的特性を指す。従って、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的系においてタンパク質を産生する場合、前記遺伝子は前記タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同じであり（「Ｔ」の代わりに「Ｕ」を使用することを除く）、通常は配列リストに提供されるコード鎖及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質又はその遺伝子もしくはｃＤＮＡの他の産物をコードすると言うことができる。
【００８４】
「外因性」という用語は、野生型細胞又は生物において天然に存在しないが、通常分子生物学的技術によって細胞に導入される分子を指す。外因性ポリヌクレオチドの例には、所望のタンパク質をコードするベクター、プラスミド及び／又は人工核酸構築物が含まれる。ポリヌクレオチド及びタンパク質に関して、「内因性」又は「天然」という用語は、所与の野生型細胞又は生物に見出すことができる天然に存在するポリヌクレオチド又はアミノ酸配列を指す。また、第１の生物から単離され、分子生物学的技術によって第２の生物に移入される特定のポリヌクレオチド配列は、通常、第２の生物に対して「外因性」ポリヌクレオチド又はアミノ酸配列とみなされる。具体的な実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、分子生物学的技術によって、そのようなポリヌクレオチド配列を既に含む微生物に「導入」することができ、例えば、もともと天然に存在するポリヌクレオチド配列の１又は複数の別のコピーを作製し、それによってコードされたポリペプチドの過剰発現を促進することができる。
【００８５】
「発現」という用語は、そのプロモータによって駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳を指す。
【００８６】
「発現ベクター」という用語は、発現されるヌクレオチド配列に動作可能に連結された発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用性要素を含み、発現のための他の要素は、宿主細胞によって、又はインビトロ発現系において供給され得る。発現ベクターには、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の又はリポソームに含まれる）、及びウィルス（例えば、レンチウィルス、レトロウィルス、アデノウィルス、及びアデノ随伴ウィルス）等、本分野で知られているもの全てが含まれる。
【００８７】
「相同の」（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）という用語は、２つのポリペプチド間又は２つのポリヌクレオチド間の配列類似性又は配列同一性を指す。２つの比較される配列の両方のある位置が同じ塩基又はアミノ酸モノマーサブユニットによって占有される場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占有される場合）、この分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同性パーセンテージは、２つの配列によって共有される一致数又は相同位置数を、比較した位置の数で割って１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列中の１０の位置のうち６が一致又は相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣ及びＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性を共有する。２つの配列が最大の相同性を与えるように整列された場合に比較が行われる。
【００８８】
「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能するタンパク質のクラスを指す。このクラスのタンパク質に含まれる５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙、母乳、胃腸分泌物等の身体分泌物並びに呼吸器及び泌尿生殖路の粘液分泌物に存在する一次抗体である。ＩｇＧは最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、ほとんどの被験体において、一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。それは、凝集、補体固定、及び他の抗体応答において最も効率的な免疫グロブリンであり、細菌及びウィルスに対する防御において重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能を有さないが、抗原受容体として機能し得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンへの暴露時に肥満細胞及び好塩基球からメディエーターを放出させることにより、即時過敏症を媒介する免疫グロブリンである。
【００８９】
「単離」という用語は、天然の状態で通常それに付随する成分を実質的に又は本質的に含まない材料を意味する。前記材料は、タンパク質又は核酸のような細胞又は高分子であってもよい。例えば、本明細書において使用する「単離ポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば、通常は断片に隣接する配列から取り外されたＤＮＡ断片を指す。あるいは、本明細書において使用する「単離ペプチド」又は「単離ポリペプチド」等は、その天然の細胞環境及び細胞の他の関連要素からのペプチド又はポリペプチド分子のインビトロ単離及び／又は精製を指す。
【００９０】
「実質的に精製される」という用語は、天然状態で通常それと会合している成分を実質的に含まない材料を意味する。例えば、実質的に精製された細胞は、天然に存在する状態又は天然状態で通常会合している他の細胞型から単離された細胞である。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団とは、均質な細胞集団を意味する。別の場合には、この用語は、それらが天然状態で自然に会合している細胞から単離された細胞を単に指す。いくつかの実施形態において、細胞はインビトロで培養される。他の実施形態において、細胞はインビトロで培養されない。
【００９１】
本開示の文脈において、一般的に存在する核酸塩基に関して以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを示し、「Ｃ」はシトシンを示し、「Ｇ」はグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示し、「Ｕ」はウリジンを示す。
【００９２】
他に特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が同じバージョンで１又は複数のイントロンを含み得る範囲でイントロンを含むことができる。
【００９３】
「レンチウィルス」という用語は、レトロウィルス科の属を指す。レンチウィルスは、非分裂細胞を感染することができるレトロウィルス間で独特であり、宿主細胞のＤＮＡに相当量の遺伝情報を送達することができるので、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、全てレンチウィルスの例である。レンチウィルス由来のベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成する手段を提供する。
【００９４】
「調節する」という用語は、治療又は化合物が存在しない被験体における応答のレベルと比較した、及び／又は他の点では同一であるが治療されていない被験体における応答のレベルと比較した、被験体における応答のレベルの検出可能な増加又は減少を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナル又は応答を混乱させ、及び／又は影響を及ぼし、それにより、被験体、好ましくはヒトにおいて有益な治療応答を媒介することを包含する。
【００９５】
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれた場合、「動作可能に連結される」。例えば、プレ配列又は分泌リーダー配列のためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結され、プロモータ又はエンハンサーは、その配列の転写に影響を及ぼす場合にはコード配列に動作可能に連結され、或いは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コード配列に動作可能に連結される。
【００９６】
「転写制御下」という用語は、プロモータが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の開始及びポリヌクレオチドの発現を制御するためにポリヌクレオチドに動作可能に連結され、ポリヌクレオチドに対して正しい位置及び方向にあることを意味する。
【００９７】
「過剰発現」腫瘍抗原又は腫瘍抗原の「過剰発現」という用語は、患者の特定の組織又は器官内の疾患領域（例えば固形腫瘍）由来の細胞における、その組織又は器官からの正常細胞における発現レベルと比較して、異常な発現レベルの腫瘍抗原の発現を示すことを意図している。腫瘍抗原の過剰発現を特徴とする固形腫瘍又は血液悪性腫瘍に罹患した患者は、本分野で公知の標準的なアッセイによって決定することができる。
【００９８】
免疫原性組成物の「非経口」投与には、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は胸骨内の注射若しくは注入技術が含まれる。
【００９９】
「患者」、「被験体」及び「個体」等の用語は本明細書において互換的に使用され、本明細書に記載の方法を受けることができる任意のヒト、動物又は生体を指す。特定の非限定的な実施形態において、患者、被験体又は個体はヒト又は動物である。いくつかの実施形態において、用語「被験体」は、免疫応答が誘発され得る生体（例えば、哺乳動物）を含むことが意図される。被験体の例には、ヒトや動物、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらのトランスジェニック種が含まれる。
【０１００】
治療の必要がある、又はそれを必要とする被験体は、治療の必要がある疾患、病状又は障害に罹患した被験体を含む。それを必要とする被験体は、疾患、病状又は障害を予防するために治療を必要とする被験体をさらに含む。
【０１０１】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｃＤＮＡ、又はＤＮＡを指す。この用語は、通常、少なくとも１０塩基長のポリマー型ヌクレオチドの、リボヌクレオチド若しくはデオキシヌクレオチドのいずれか、又はいずれかのタイプのヌクレオチドの改変型のいずれかを指す。この用語は、あらゆる形態の核酸を含み、一本鎖及び二本鎖形態の核酸を含む。
【０１０２】
「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」等という用語は、参照ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、又は以下に定義される厳格な条件で参照配列とハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失又は置換によって参照ポリヌクレオチドと区別されるポリヌクレオチドを包含する。従って、用語「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」には、１又は複数のヌクレオチドが付加又は欠失しているか、又は異なるヌクレオチドで置換されているポリヌクレオチドが含まれる。これに関して、変異、付加、欠失及び置換を含む特定の改変を参照ポリヌクレオチドに対して行い、改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物学的機能又は活性を保持するか、又は参照ポリヌクレオチドと比較して活性を増加（即ち、最適化）させることが可能であることは当該分野において周知のことである。ポリヌクレオチド変異体には、例えば、本明細書に記載の参照ポリヌクレオチド配列と、少なくとも５０％（及び少なくとも５１％〜少なくとも９９％及びその間の全ての整数百分率、例えば９０％、９５％又は９８％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。「ポリヌクレオチド変異体」及び「変異体」という用語はまた、天然の対立遺伝子変異体及びオルソログも含む。
【０１０３】
「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、アミノ酸残基のポリマー並びにそれらの変異体及び合成類似体を指す。従って、これらの用語は、１又は複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸、例えば、対応する天然アミノ酸の化学的類似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、通常様々な化学反応を触媒する（即ち、その速度を増加させる）酵素ポリペプチド又は「酵素」を含み得る。
【０１０４】
「ポリペプチド変異体」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失又は置換によって参照ポリペプチド配列と区別されるポリペプチドを指す。特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は、保存的又は非保存的であり得る１又は複数の置換によって参照ポリペプチドと区別される。特定の実施形態において、ポリペプチド変異体は保存的置換を含み、この点で、ポリペプチドの活性の性質を変化させることなく、いくつかのアミノ酸を広く類似の性質を有する他のものに変更できることが本分野において周知のことである。ポリペプチド変異体はまた、１又は複数のアミノ酸が付加若しくは欠失しているか、又は異なるアミノ酸残基で置換されたポリペプチドを包含する。
【０１０５】
「プロモータ」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写の開始に必要とされる、細胞の合成機構又は導入された合成機構によって認識されるＤＮＡ配列を指す。「発現制御配列」という用語は、特定の宿主生物において動作可能に連結されたコード配列の発現に必要なDNA配列を指す。原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモータ、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【０１０６】
「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合する（ｂｉｎｄｓ）」、又は「・・・と相互作用する」という用語は、１つの分子が、試料又は生物中の特定の第２分子を認識するして付着するが、試料中の他の構造的に無関係の分子は実質的に認識又は付着しないことを意味する。抗体に関して本明細書において使用する「特異的に結合する」という用語は、特異的抗原を認識するが試料中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種由来の抗原に特異的に結合する抗体はまた、１又は複数の種由来のその抗原に結合してもよい。しかし、そのような異種間反応性は、それ自体は特異的な抗体の分類を変更するものではない。別の例において、抗原に特異的に結合する抗体は、異なる対立遺伝子型の抗原に結合してもよい。しかし、そのような交差反応性は、それ自体は特異的な抗体の分類を変更するものではない。場合によっては、「特異的な結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」又は「特異的に結合（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、抗体、タンパク質又はペプチドと、第２の化学種との相互作用に関して使用され、この相互作用が前記化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存すること、例えば、抗体が特定のタンパク質構造を他の任意のタンパク質より認識し、結合することを意味する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含む反応においてエピトープＡ（又は遊離の非標識Ａ）を含む分子の存在は、抗体に結合される標識されたAの量を減少させる。
【０１０７】
「統計的に有意な」とは、結果が偶然に発生した可能性が低いことを意味する。統計学的有意性は、本分野で公知の任意の方法によって決定することができる。有意性の一般的に使用される尺度には、帰無仮説が当てはまる場合、観察される事象が起こる頻度又は確率であるｐ値が含まれる。得られたｐ値が有意水準よりも小さい場合、帰無仮説は棄却される。単純な場合、有意水準はｐ値０．０５以下で定義される。「低減した」又は「減少した」又は「より少ない」量は、通常「統計的に有意な」又は生理的に有意な量であり、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０若しくは５０倍又はそれ以上（例えば、１００、５００、１０００倍）（１より大きい全ての整数及びその間の小数点、例えば１．５、１．６、１．７、１．８等を含む）の本明細書に記載された量又はレベルの減少量を含み得る。
【０１０８】
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドとの結合、その結果のＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達等のシグナル伝達事象の媒介によって誘導される一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御及び／又は細胞骨格構造の再編成等の、特定の分子の発現変化を媒介することができる。
【０１０９】
「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。例えば、刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞受容体複合体と結合するζ鎖である。
【０１１０】
「刺激リガンド」という用語は、抗原提示細胞（例えば、ＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞等）に存在する場合、Ｔ細胞の同族結合パートナー（本明細書において、「刺激分子」と称される）と特異的に結合し、それにより活性化、免疫応答の開始、増殖及び類似過程を含むＴ細胞による一次応答を媒介することができるリガンドを指す。刺激リガンドは、本分野において周知であり、とりわけ、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１１１】
「治療用」という用語は、治療及び／又は予防を意味する。治療効果は、疾患状態の抑制、寛解又は根絶、或いは疾患状態の症状の軽減によって得られる。
【０１１２】
「治療有効量」という用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医が求める組織、系又は被験体の生物学的又は医学的応答を誘発する本発明の化合物の量を指す。「治療有効量」という用語は、投与されると、治療される障害又は疾患の１又は複数の徴候又は症状の発症を予防するか、或いはある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療有効量は、化合物、疾患及びその重症度並びに治療される被験体の年齢、体重等に応じて変化する。
【０１１３】
「疾患を治療する」という用語は、被験体が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの徴候又は症状の頻度又は重症度を低減させることを意味する。
【０１１４】
「トランスフェクトされた」又は「形質転換された」又は「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入又は導入されるプロセスを指す。「トランスフェクトされた」、「形質転換された」又は「形質導入された」細胞は、外因性核酸によりトランスフェクト、形質転換又は形質導入された細胞である。前記細胞は、初代被験体細胞及びその子孫を含む。
【０１１５】
「ベクター」は、単離核酸を含み、単離核酸を細胞の内部に送達するために使用できるポリヌクレオチドである。線形ポリヌクレオチド、イオン性又は両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミド及びウィルスを含む多くのベクターが本分野において公知である。従って、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミド又はウィルスを含む。この用語はまた、細胞への核酸の移入を促進する非プラスミド性及び非ウィルス性化合物、例えばポリリジン化合物、リポソーム等を含む。ウィルスベクターの例としては、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウィルスベクター等が含まれる。例えば、レンチウィルスは複雑なレトロウィルスであり、一般的なレトロウィルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能又は構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウィルスベクターは、本分野において周知である。レンチウィルスのいくつかの例には、ヒト免疫不全ウィルス：ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、及びシミアン免疫不全ウィルス：ＳＩＶが含まれる。レンチウィルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆが欠失しており、ベクターを生物学的に安全にしている。
【０１１６】
範囲：本開示を通じて、この開示のさまざまな態様を範囲形式で提示することができる。範囲の形式での記述は、単に便宜上及び簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は、その範囲内の全ての可能な部分範囲及び個々の数値を具体的に開示したものとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、具体的に開示した部分範囲、例えば、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６など、ならびにその範囲内の個々の数値、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有するとみなすべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１１７】
本開示は、単離核酸配列、当該単離核酸配列を含むベクター、修飾細胞及びこれらの細胞を用いて癌を治療する方法に関する。
【０１１８】
本開示はいくつかの側面において、試薬を用いてインビトロでＣＡＲ細胞を培養することで、ＣＡＲ細胞の効果及び／又はＣＡＲ細胞の作製効率を増強し、ＣＡＲ細胞の長時間インビトロ保持を実現することができる、及び／又はＣＡＲ  Ｔ細胞が記憶Ｔ細胞表現型を生じることを誘導することができるという驚くべき発見に関する。これらの場合、ＣＡＲ細胞により発現されたＣＡＲは、試薬を認識及び／又は結合する。いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外成分と結合する、及び／又はＣＡＲのシグナル伝達経路を活性化させることによりＣＡＲを発現するＴ細胞を刺激する調節化合物である。例えば、調節化合物は、Ｔ細胞のＣＡＲと結合し、活性化、免疫応答の開始及び／又は増殖を含むＴ細胞応答を媒介することができる。
【０１１９】
本開示はいくつかの側面において、数回増殖可能な修飾されたＴ細胞／ＣＡＲ  Ｔ細胞（即ち、増殖性細胞又は長寿細胞）に関する。このような増殖性細胞は、細胞治療機能のような、正常Ｔ細胞／ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を保持している。いくつかの実施形態において、デュアルスイッチを設計することで増殖性Ｔ細胞／ＣＡＲ  Ｔ細胞の成長を調節することができる。本明細書に係る実施形態は、一つ又は二つの制御スイッチを含む機構を設計する。第１のスイッチは、ｒｔＴＡ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴ／ＳＶ４０ＬＴを含む。ｒｔＴＡ−ＴＲＥは、真核細胞により誘導される調節遺伝子の発現である。テトラサイクリンを加えてｈＴＥＲＴ（ヒトテロメラーゼ逆転写酵素）又はＳＶ４０ＬＴ（ＳＶ４０大型Ｔ抗原）の発現を誘導することで、不死化表現型を生じさせることができる。第２の調節スイッチは、ＥＦ１ａ−ＴＫである。ＴＫ遺伝子は自殺遺伝子である。ガンシクロビルを加えた場合、当該試薬により自殺遺伝子を機能させて細胞自体を死亡させるように調節する。いくつかの実施形態において、一つ又は二つの制御スイッチを有するＣＡＲ  Ｔ細胞により、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、より長時間生存し関連する生物学的機能を保持するとともに、有効性と安全性を維持することができるようになる。そして、レンチウィルス以外に、本発明に含まれる様々な他の方法、例えば、ゲノムを別のゲノムに挿入するノックイン方法及び他のベクター（例えば、レトロウィルスベクター）の使用によりＴ細胞を生じることができる。
【０１２０】
本開示の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）細胞を用いて病状を治療するための組成物及び方法に関する。「キメラ抗原受容体」、又は、代替的に、「ＣＡＲ」という用語は、少なくとも細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、細胞質ドメイン）を含む組換えポリペプチド構築物を指す。いくつかの実施形態において、ＣＡＲポリペプチド構築物におけるドメインは、同一のポリペプチド鎖に存在し（例えば、キメラ融合タンパク質を含む）、又はそれら同士が連続していない（例えば、異なるポリペプチド鎖に存在する）。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、上述した刺激分子及び／又は共刺激分子に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含んでもよい。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３−ζの一次シグナル伝達ドメイン）に由来する機能的シグナル伝達ドメインを含む。別の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも一種の共刺激分子に由来する１又は複数の機能的シグナル伝達ドメインをさらに含む。共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの一部を指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要とされる抗原受容体又はそのリガンド以外の細胞表面分子である。
【０１２２】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサードメイン（即ち、ヒンジドメイン）が組み込まれていてもよい。本明細書において使用する場合、用語「スペーサードメイン」は、膜貫通ドメインを、ポリペプチド鎖中の細胞外ドメイン又は細胞質ドメインのいずれかに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドを意味する。スペーサードメインは、３００アミノ酸まで、好ましくは１０〜１００アミノ酸、最も好ましくは２５〜５０アミノ酸を含むことができる。
【０１２３】
ＣＡＲの細胞外ドメインは、特定の腫瘍マーカー（例えば、腫瘍抗原）を標的とする抗原結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体又はＴＣＲ（例えば、ＴＣＲα結合ドメイン又はＴＣＲβ結合ドメイン））を含んでもよい。腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。腫瘍抗原は本分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡ  ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸管カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１ａ、ｐ５３、プロステイン（ｐｒｏｓｔｅｉｎ）、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、サバイビン及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、並びにメソテリンを含む。例えば、腫瘍抗原がＣＤ１９である場合、そのＣＡＲがＣＤ１９  ＣＡＲと称され、対応するＣＡＲ細胞がＣＤ１９  ＣＡＲ細胞（例えば、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞）と称される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、細胞外リガンド結合ドメインは、フレキシブルリンカーによって接続された標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域及び重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを包含する。短リンカーペプチドを用いて軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を連結することで一本鎖可変領域断片を作製する（Birdら、Science 242：423-426，1988）。リンカーペプチドの例として、１つの可変領域のカルボキシル末端ともう１つの可変領域のアミノ末端との間を約３．５ｎｍブリッジする、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号７６）を有するＧＳリンカーがある。他の配列のリンカーが既に設計されて使用されている（Birdら、1988、上記と同様）。通常、リンカーは、短いフレキシブルポリペプチドであってもよく、好ましくは約２０以下のアミノ酸残基を含む。逆に、リンカーに対しては、修飾を実施することにより別の機能、例えば、薬物の付着や固体支持体への付着を実現することができる。一本鎖変異体は、組換え又は合成により産生される。ｓｃＦｖの合成産生には、自動合成機を用いてもよい。ｓｃＦｖの組換え産生には、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む適切なプラスミドを適切な宿主細胞に導入してもよく、前記宿主細胞は、酵母、植物、昆虫又は哺乳動物細胞などの真核生物でも、大腸菌などの原核生物でもよい。目的とするｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、通常の操作、例えばポリヌクレオチドの連結により作製される。得られたｓｃＦｖは、本分野において既知の標準タンパク質精製技術により単離される。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、又は腫瘍により発現されるウィルス関連抗原を含む。いくつかの実施形態において、ＣＡＲの結合要素は、その相同抗原と結合するときに、成長できなくなるように、若しくは、死亡又は減少が促進されるように、腫瘍細胞に影響を及ぼす、任意の抗原結合部分を含んでもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態は、遺伝子修飾された細胞に関する。いくつかの実施形態において、修飾細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せを含んでもよい。特定の実施形態において、修飾細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする第１の核酸配列及び／又はＳＶ４０ＬＴをコードする第２の核酸配列を含んでもよい。例えば、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列が配列番号６の配列を有し、かつＳＶ４０ＬＴをコードする核酸配列が配列番号７の配列を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞である。特定の実施形態において、修飾細胞は増殖性Ｔ細胞である。増殖性細胞は、野生型細胞よりも高い増殖能力を有する遺伝子修飾された細胞を指す。以下の技術により増殖性細胞が得られる。例えば、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、及び／又は他の遺伝子を細胞に移入して増殖性細胞が得られる。いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡコード構築物（例えば、ｈＴＥＲＴ及び／又はＳＶ４０ＬＴ）を細胞に注入してこれらの細胞において一過性遺伝子発現を実現してもよい。別の実施形態において、構築物（例えば、ｈＴＥＲＴ及び／又はＳＶ４０ＬＴ）をコードするベクターを細胞に導入して増殖性細胞が得られる。例えば、ベクターの少なくとも一部が細胞のゲノムに組み込まれてもよい。これらの場合、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せの組込みは、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せのゲノム組込み、及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せの構成的発現を含む。
【０１２８】
以上のように、いくつかの実施形態は増殖能力の多段階制御に関する。例えば、真核細胞により誘導される発現系は、Ｔ細胞の増殖能力を調節するために用いられる。「テトラサイクリン」をこれらの細胞に持続的に加えることで、ｈＴＥＲＴ及び／又はＳＶ４０ＬＴを発現できるが、テトラサイクリンの供給を停止させると、ｈＴＥＲＴ及び／又はＳＶ４０ＬＴを発現しない場合がある。そのため、この増幅を停止させてもよい。いくつかの実施形態において、Ｅｆ１αとＴＫ自殺遺伝子は、増殖能力の調節に用いられる。ＴＫ自殺遺伝子の機能は、試薬に敏感な遺伝子であるため、この系を用いて転移される細胞は、試薬の存在下で死になる場合がある。よって、安全で有効な方式でＴ細胞の増殖能力を調節できる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの発現は、誘導性発現系により調節される。例えば、誘導性発現系は、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子又はその組合せの発現を増加又は活性化するｒＴＴＡ−ＴＲＥである。誘導性発現系において、遺伝子の時間空間的制御による活性化及び／又は発現が許容される。例えば、テトラサイクリンにより制御される転写活性化は、誘導型遺伝子の発現方法であり、そのうち転写が、抗生物質テトラサイクリン又はその誘導体（例えばドキシサイクリン）の存在下で可逆的に開始又は停止される。例えば、誘導性自殺遺伝子発現系において時間空間的制御による自殺遺伝子の活性化及び／又は発現が許容され、それによりアポトーシスで細胞自体が殺される。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含んでもよい。例えば、自殺遺伝子はＨＳＶ−ＴＫ系である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含んでもよい。例えば、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、かつ細胞外ドメインが腫瘍抗原と結合してもよい。特定の実施形態において、腫瘍抗原には、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、又はＴＥＭ８が含まれる。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びそのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含んでもよい、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。例えば、細胞内ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含んでもよい。特定の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸、ｈＴＥＲＴをコードする核酸、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸又はその組合せは別々のポリペプチドの遺伝子生成物として発現される。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子が破壊され、内在性ＴＣＲの発現が低下する。特定の実施形態において、ＴＣＲ遺伝子に関連する標的ベクターがＴ細胞のゲノムに組み込まれることにより、内在性ＴＣＲの発現が消去される。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子が破壊され、内在性ＣＤ４の発現が低下する。特定の実施形態において、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＨＩＶ表面上の分子に結合する。
【０１３４】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲを有する修飾細胞（ＣＡＲ細胞）を作製するための方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せをコードする核酸配列を細胞に導入することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せの組込みは、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せのゲノム組込み、及びｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せの構成的発現を含む。いくつかの実施形態において、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せをコードする核酸配列の発現は、誘導性発現系により調節される。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することをさらに含んでもよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を細胞に導入することをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外成分に結合して細胞応答を媒介する調節化合物である。例えば、調節化合物は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンド又はＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原の細胞外ドメインである。例えば、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、又はＣＤ４である。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。例えば、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体であり、及び／又はヒトＩｇＧのＦａｂ断片と結合する。特定の実施形態において、調節化合物は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。場合によっては、調節化合物は、配列番号４１〜４７のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。場合によっては、調節化合物は、配列番号２１及び４８〜５３のアミノ酸配列の少なくとも一種と結合する。場合によっては、ＣＡＲ細胞は、配列番号３８、３５、３９及び４０のアミノ酸配列の少なくとも一種の配列を含んでもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞に比べ、前記ＣＡＲ細胞は、細胞成長が約１．５〜２倍増加したことを示す。特定の実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞に比べ、前記ＣＡＲ細胞は、細胞成長が約１．５〜３倍増加したことを示す。特定の実施形態において、試薬の不存在下で培養されるＣＡＲ細胞に比べ、前記ＣＡＲ細胞は、細胞成長が約２倍増加したことを示す。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、培地におけるＣＡＲ細胞の細胞密度は、少なくとも２５細胞／ｍｌ細胞培地である。特定の実施形態において、ＣＡＲ細胞の細胞密度は、２００×１０４細胞／ｍｌ細胞培地より小さい。特定の実施形態において、ＣＡＲ細胞の細胞密度は、５０×１０４〜２００細胞／ｍｌ細胞培地にある。特定の実施形態において、ＣＡＲ細胞の細胞密度は、５０×１０４〜１００×１０４細胞／ｍｌ細胞培地にある。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、細胞培地におけるテトラサイクリンに敏感である。例えば、ＣＡＲ細胞は、リバーステトラサイクリントランス活性化因子（ｒｔＴＡ）をコードする第３の核酸配列を含む。特定の実施形態において、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴの発現は、ｒｔＴＡによって調節されることで、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴをテトラサイクリンの存在下で発現させる。例えば、テトラサイクリンは、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、メクロサイクリン、ドキシサイクリン、リメサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ロリテトラサイクリン及びクロルテトラサイクリンからなる群より選択される。具体的な実施形態において、テトラサイクリンは、ドキシサイクリンである。特定の実施形態において、細胞培地におけるテトラサイクリンの濃度は、２μｇ／ｍｌ以上である。
【０１３９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、自殺遺伝子をコードする第４の核酸配列を含むことで、自殺遺伝子の発現が許容されるようにＣＡＲ細胞とヌクレオシド類似体とが培養され、ヌクレオシド類似体に細胞毒性を持たせてもよい。例えば、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ、水痘・帯状疱疹ウィルスのチミジンキナーゼ及び細菌由来シトシンデアミナーゼからなる群より選択される。具体的な実施形態において、自殺遺伝子は、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼである。特定の実施形態において、ヌクレオシド類似体は、ガンシクロビル、アシクロビル、ブシクロビル、ファムシクロビル、ペンシクロビル、バラシクロビル、トリフルオロチミジン、１−〔２−デオキシ，２−フルオロ，β−Ｄ−アラビノフラノシル〕−５−ヨードウラシル、ビダラビン（ａｒａ−Ａ）、チミジンアラビノシド（ａｒａＴ）１−β−Ｄ−アラビノフラノシルチミン、５−エチル−２’−デオキシウリジン、５−ヨード−５’−アミノ−２，５’−ジデオキシウリジン、イドクスウリジン、ＡＺＴ、ＡＩＵ、ジデオキシシチジン、及びＡｒａＣからなる群より選択される。具体的な実施形態において、ヌクレオシド類似体は、ガンシクロビルである。
【０１４０】
いくつかの実施形態は、前記方法で得られた単離細胞に関する。いくつかの実施形態において、単離細胞集団を含有する組成物を提供する。いくつかの実施形態において、被験体においてＴ細胞応答を増強させる、及び／又は被験体の腫瘍を治療する方法は、組成物の有効量を投与することを含んでもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を生成する方法に関する。前記方法は、増殖性Ｔ細胞を得るように１又は複数の核酸配列をＴ細胞に転移させてＴ細胞を増殖させることと、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含むＣＡＲをコードする核酸配列を、増殖されたＴ細胞に導入することでＣＡＲ  Ｔ細胞を得ることと、を含んでもよい。例えば、前記１又は複数の核酸配列は、Ｔｅｔ誘導性ＨＰＶ１６−Ｅ６／Ｅ７発現系を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、被験体から抽出された初代Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、Ｔ細胞注入に応答する対応野生型Ｔ細胞に比べて低下した免疫原性を有するＴ細胞である。
【０１４３】
いくつかの実施形態は、疾患又は病状を治療する方法に関する。前記方法は、ヒト患者に本明細書に記載される医薬組成物（例えば、修飾されたＴ細胞集団）を投与することを含んでもよい。特定の実施形態において、疾患又は病状は、ＡＩＤＳであり、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＨＩＶ表面上の分子に結合する。特定の実施形態において、疾患又は病状は癌であり、ＣＡＲの抗原結合ドメインが癌細胞上の分子に結合し、内在性ＴＣＲ数が減少する。
【０１４４】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲ  Ｔ細胞に関し、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞のＴＣＲ遺伝子が破壊され、ＴＣＲの発現が消去される。
【０１４５】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲ  Ｔ細胞に関し、前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み、前記ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含み、Ｔ細胞のＣＤ４遺伝子が破壊され、内在性ＣＤ４の発現が低下する。例えば、ＣＡＲの抗原結合ドメインがＨＩＶ及び／又は腫瘍細胞表面上の分子に結合する。
【０１４６】
いくつかの実施形態は、制限増殖性Ｔ細胞を生成する方法に関する。前記方法は、増殖性Ｔ細胞を得るように１又は複数の核酸配列をＴ細胞に転移することを含み、１又は複数の核酸配列がペプチドをコードし、ペプチドの発現によりＴ細胞を増殖性Ｔ細胞に転化させ、前記ペプチドが誘導性発現系、誘導性自殺系又はその組合せにより調節される。いくつかの実施形態において、ペプチドは、ｈＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ、又はその組合せである。特定の実施形態において、誘導性発現系はｒｔＴＡ−ＴＲＥである。特定の実施形態において、誘導性自殺系は、ＨＳＶ−ＴＫ系又は誘導性カスパーゼ−９系である。
【０１４７】
いくつかの実施形態は、疾患又は病状を治療する方法に関する。前記方法は、本明細書に記載される方法を用いて制限増殖性Ｔ細胞を作製することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含有する培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンのいずれも含まない培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養し、そのＳＶ４０ＬＴ遺伝子又はｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が低下したＴ細胞を得ることと、被験体に得られたＴ細胞を含む医薬組成物を投与することとを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態は、疾患又は病状を治療するための、本明細書に記載される方法を用いて得られた医薬組成物に関し、前記医薬組成物が疾患又は病状を治療するための方法は、前記方法を用いて制限増殖性Ｔ細胞を作製することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含有する培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養することと、テトラサイクリン又はドキシサイクリンを含まない培地を使用して制限増殖性Ｔ細胞を培養し、そのＳＶ４０ＬＴ遺伝子又はｈＴＥＲＴ遺伝子の発現が低下したＴ細胞を得ることと、被験体に得られたＴ細胞を含む医薬組成物を投与することと、を含む。特定の実施形態において、前記方法は、ある所定の条件に応答して被験体にガンシクロビルを投与することをさらに含んでもよい。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、修飾細胞のＴＣＲ遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する内在性遺伝子が破壊され、内在性ＴＣＲの発現が低下する。
【０１５０】
いくつかの実施形態は、本明細書に記載される修飾細胞を含むＴ細胞集団に関する。いくつかの実施形態において、修飾細胞のＰＤ−１遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する内在性遺伝子が破壊され、内在性ＰＤ−１の発現が低下する。特定の実施形態において、修飾細胞が、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）のヒトＴ細胞に対する阻害作用を低減した短縮ＰＤ−１をコードする核酸配列を含む。
【０１５１】
いくつかの実施形態は、修飾細胞を作製するための方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下で前記細胞を培養することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロでのＣＡＲ細胞の作製のために実施されてもよい。前記方法は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＡＲを発現する細胞を濃縮するために実施されてもよい。前記方法は、細胞を提供することと、ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲを発現する細胞（ＣＡＲ細胞）と発現しない細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することでＣＡＲを発現する細胞を濃縮することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロでのＣＡＲ細胞の作製のために実施されてもよい。前記方法は、（ａ）ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得る工程と、（ｂ）第１の培地を使用してＣＡＲ細胞を所定の時間培養する工程と、（ｃ）第２の培地を使用してＣＡＲ細胞を培養する工程とを順に含んでもよく、第１の培地が試薬を含まず、第２の培地が試薬を含み、前記試薬がＣＡＲの細胞外ドメインに結合する。
【０１５２】
いくつかの実施形態は、前記方法で得られる単離細胞及び単離細胞を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態は、被験体において抗腫瘍免疫応答を刺激するための方法に関する。前記方法は、被験体に医薬組成物の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態は、癌を治療するための医薬組成物に関し、前記医薬組成物が癌を治療するための方法は、被験体に医薬組成物の有効量を投与することを含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外成分に結合して細胞応答を媒介する調節化合物である。特定の実施形態において、調節化合物は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンド又はＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。特定の実施形態において、調節化合物は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。場合によっては、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体であり、及び／又はヒトＩｇＧのＦａｂ断片と結合する。特定の実施形態において、調節化合物は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含んでもよい。特定の実施形態において、調節化合物は、配列番号４１〜４７及び６１〜６３のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。特定の実施形態において、調節化合物は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０、５１〜５３及び５６〜６０のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。特定の実施形態において、調節化合物は、ＧＣＣ、Ｂ７−Ｈ４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍａｒｔ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈ  ＴＥＲＩ、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、エストロゲン、プロゲステロン、ＲＯＮ、又はＵＬＢＰ／ＲＡＥＴｌファミリーの１又は複数のメンバーの少なくとも一種を含む。特定の実施形態において、調節化合物は、真核細胞系又は細菌発現系から生成される可溶性抗原である。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、「可溶性抗原」は細胞膜に結合しないポリペプチドである。可溶性抗原は、最も一般的には、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを欠くリガンド結合ポリペプチド（例えば受容体）である。可溶性抗原は、他のアミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製のために提供する、或いは、ポリペプチドを基質又は免疫グロブリンの定常領域配列に付着させる部位を提供するアフィニティータグを含んでもよい。可溶性抗原ポリペプチドが、膜アンカリング又はシグナル伝達をそれぞれ提供するための、十分な膜貫通及び細胞内ポリペプチドセグメント部を欠いている場合、可溶性抗原ポリペプチドがこれらのセグメント部を実質的に含まないと言われる。例えば、多くの細胞表面受容体が天然に存在しているが、可溶性対応物がタンパク質加水分解によって生成される。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、前記試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原の細胞外ドメインである。特定の実施形態において、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、又はＣＤ４である。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ  ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−Ｉ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７−Ｈ３の少なくとも一種を含む。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞又はその組合せである。例えば、細胞は、健常ドナー又は被験体から得られる初代Ｔ細胞から誘導されるＴ細胞である。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、試薬を用いてＣＡＲ細胞を培養した後、試薬の量とＣＡＲ細胞の数量との比が１：５０〜１：５（μg／１０４細胞）、１：５００〜１：５（μｇ／１０４細胞）、又は１：５０００〜１０：５（μg／１０４細胞）である。特定の実施形態において、試薬の量とＣＡＲ細胞の数量との比が１：５０〜１：５（μg／１０４細胞）である。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、培地は、抗ＣＤ３ビーズ、抗ＣＤ２８ビーズ、及びＩＬ２の少なくとも一種を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞においてＣＡＲのコピー数は、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合の数より大きい。特定の実施形態において、ＣＡＲを発現する細胞とＣＡＲを発現しない細胞との数量比が試薬の不存在下で細胞を培養する場合の比より大きい。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、試薬の存在下でＣＡＲ細胞を所定の期間培養し、或いは、試薬の存在下でＣＡＲ細胞を少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０日間培養してもよい。例えば、所定の期間は７〜１００日間である。別の実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを細胞に導入した後、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を少なくとも８、９、１０、１１、１２又は１３日間培養した後、試薬で培養してもよい。具体的な実施形態において、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターを細胞に導入した後、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を約１０日間培養した後、試薬で培養してもよい。特定の実施形態において、試薬の存在下でＴ細胞を培養することは、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターをＴ細胞に導入した後、試薬の存在又は不存在下でＴ細胞を少なくとも８日間培養し、その後、前記少なくとも８日間後、試薬でＴ細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、試薬の存在下でＴ細胞を培養することは、ＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクターをＴ細胞に導入した後、試薬の存在又は不存在下でＴ細胞を少なくとも１０日間培養し、その後、前記少なくとも１０日間後、試薬でＴ細胞を培養することを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、試薬の存在下で培養する場合に記憶Ｔ細胞表現型を生じるＣＡＲ細胞数は、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合の数より大きい。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、試薬の不存在下でＣＡＲ細胞を培養する場合に、ＣＡＲ細胞より産生されるサイトカインの量は、ＣＡＲ細胞より産生されるサイトカインの量より大きい。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、健常ドナーに由来し、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの低下した発現がある。特定の実施形態において、ＣＡＲ細胞は、健常ドナーに由来し、同一のヒトドナーから単離される初代ヒトＴ細胞により引き起こされるＧＶＨＤ応答に比べ、ヒトレセプターにおいて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）応答を引き起こせず、或いは、低下したＧＶＨＤ応答を引き起こし、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの発現が低下しておらず、或いは、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉの発現が破壊されておらず、内在性ＴＣＲ遺伝子及び／又はＨＬＡ  Ｉが正常に発現されている。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列、ＳＶ４０ＬＴをコードする核酸、又はその組合せを含むＴ細胞である。特定の実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ｈＴＥＲＴをコードする核酸配列とＳＶ４０ＬＴをコードする核酸を含んでもよい。特定の実施形態において、ｈＴＥＲＴの発現は、誘導性発現系により調節される。特定の実施形態において、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子の発現は、誘導性発現系により調節される。特定の実施形態において、誘導性発現系は、ＳＶ４０ＬＴ遺伝子、ｈＴＥＲＴ遺伝子、又はその組合せの発現を増加又は活性化するｒｔＴＡ−ＴＲＥである。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ細胞は、自殺遺伝子をコードする核酸配列を含んでもよい。特定の実施形態において、自殺遺伝子はＨＳＶ−ＴＫ系である。
【０１６７】
いくつかの実施形態は、インビボでの細胞の増幅方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、被験体にＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することでＴ細胞応答を提供することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる可溶性試薬を発現する提示細胞の有効量を投与することとを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、被験体におけるＴ細胞応答を増強させるために実施されてもよい。前記方法は、被験体にＣＡＲを含むＴ細胞の有効量を投与することでＴ細胞応答を提供することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる可溶性試薬を発現する提示細胞の有効量を投与することで被験体におけるＴ細胞応答を増強させることとを含んでもよい。特定の実施形態において、提示細胞はＴ細胞、樹状細胞及び／又は抗原提示細胞である。特定の実施形態において、被験体におけるＴ細胞応答を増強させることは、ＣＡＲを含むＴ細胞の増殖を選択的に増強させることを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＡＲ細胞を用いて被験体病状に対する治療を増強させるために用いられてもよい。前記方法は、試薬を発現する細胞集団又はワクチンとして作製される試薬を投与することを含んでもよい。これらの場合、ＣＡＲ細胞はＣＡＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲの細胞外ドメインが前記試薬を認識できる。いくつかの実施形態において、前記方法は、疾患に罹患した被験体においてＣＡＲ細胞の増殖を増強させるために実施されてもよい。前記方法は、ＣＡＲを含む細胞を作製することと、被験体にＣＡＲ細胞の有効量を投与することと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識できる試薬をコードする核酸配列を細胞に導入し、被験体に細胞の有効量を投与することとを含んでもよい。
【０１６８】
被験体におけるＴ細胞応答は、ヘルパーＴ細胞、キラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞及び他のタイプのＴ細胞に関連する細胞媒介免疫である。例えば、Ｔ細胞応答は、例えば、免疫過程において他の白血球を補助する、ウィルス感染細胞及び腫瘍細胞を同定して破壊する活動を含んでもよい。被験体におけるＴ細胞応答は、様々な指標、例えば、Ｔ細胞により傷害された多くのウィルス感染細胞及び／又は腫瘍細胞、ウィルス感染細胞及び／又は腫瘍細胞と共に培養される場合にＴ細胞から放出されるサイトカインの量、被験体におけるＴ細胞の増殖レベル、Ｔ細胞の表現型変化（例えば、記憶Ｔ細胞への変化）及び被験体におけるＴ細胞の長寿又は寿命レベルにより測定することができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ  Ｔ細胞と抗原陽性細胞とを共培養してＣＡＲ  Ｔ細胞の傷害効果を測定することでインビトロ傷害試験を行うことができる。対応抗原を発現しないコントロール細胞に比べ、ＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養される対応抗原陽性細胞の数量減少及びＩＦＮγ、ＴＮＦα等の放出増加が示されることで、ＣＡＲ  Ｔ細胞が対応抗原陽性細胞に対して傷害作用を有すると言える。また、ＣＡＲ  ｔ細胞の体内抗腫瘍活性を測定してもよい。例えば、本明細書に記載される抗原を用いて免疫不全マウスで異種移植モデルを構築してもよい。過去二十年では、ヒト癌細胞又は腫瘍生検組織を免疫不全の齧歯動物（異種移植モデル）に異種移植し、新規な癌治療剤を開発するための主な前臨床スクリーニングを構成する（Songら、Cancer Res. PMC 2014 Aug 21及びMortonら、Nature Protocols，2，-247-250（2007））。ＣＡＲ  Ｔ細胞の体内抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍異種移植片を保有する免疫不全マウスをＣＡＲ  Ｔの抗腫瘍活性の評価に用いられる（例えば、マウス腫瘍及びマウス血液ＩＦＮγ、ＴＮＦα等の減少、及び／又はマウスの骨髄／末梢血／脾におけるＣＡＲ  Ｔ滞留時間の減少）。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンドである。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。特定の実施形態において、試薬は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン１（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。特定の実施形態において、試薬は、配列番号４１〜４７及び６１〜６３のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。特定の実施形態において、試薬は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０、５１〜５３及び５６〜６０のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。特定の実施形態において、試薬は、ＧＣＣ、Ｂ７−Ｈ４、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＩＬ１３Ｒα、ｈｅｒ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＩＶ−Ｉ  Ｇａｇ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍａｒｔ−Ｉ、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＷＴ−Ｉ、ｈ  ＴＥＲＩ、ＭＵＣ１６、メソテリン、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、エストロゲン、プロゲステロン、ＲＯＮ、又はＵＬＢＰ／ＲＡＥＴｌファミリーの１又は複数のメンバーの少なくとも一種を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、前記細胞内ドメインは、ＣＤ３−ζシグナル伝達ドメイン及び共刺激分子のシグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの共刺激分子は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ  ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−Ｉ（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、又はＢ７−Ｈ３の少なくとも一種を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態において、細胞又は単離細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、又はその組合せである。特定の実施形態において、細胞は、生弱毒化されて複製不全である。特定の実施形態において、γ線照射又は化学的不活性化により、細胞は、生弱毒化されて複製不全である。特定の実施形態において、細胞又は単離された修飾細胞は、被験体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得される。特定の実施形態において、細胞は、被験体又は健常ドナーのＴ細胞である。特定の実施形態において、細胞は、ワクチンとして作製されるＴ細胞である。特定の実施形態において、細胞は、弱毒化された腫瘍細胞である。特定の実施形態において、細胞は、野生型細胞に比べて同種異系ＣＡＲ療法に対して低下した免疫原性を有する修飾細胞である。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、試薬は細胞により発現され、試薬の発現は、誘導性発現系により調節される。特定の実施形態において、試薬は細胞により発現され、試薬の発現は、誘導性自殺遺伝子発現系により調節される。特定の実施形態において、試薬は、可溶性抗原であるので、抗原は細胞から放出される。
【０１７４】
いくつかの実施形態は、スペーサードメインを有するＣＡＲをコードする単離核酸配列に関する。いくつかの実施形態において、単離核酸配列は、細胞外ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するＣＡＲをコードでき、細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合し、スペーサードメインは、配列番号６８又は６９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、単離核酸配列は、細胞外ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを有するＣＡＲをコードでき、細胞外ドメインは、腫瘍抗原に結合し、スペーサードメインは、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、膜貫通ドメインは、配列番号７２又は７５のアミノ酸配列を含む。
【０１７５】
いくつかの実施形態は、単離核酸配列を含むベクター、単離核酸配列を含む細胞に関する。例えば、細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞又はその組合せであってもよい。いくつかの実施形態は、単離核酸配列を有するＴ細胞集団を含有する組成物に関する。
【０１７６】
いくつかの実施形態は、ＣＡＲを有する細胞を作製するための方法及びその使用に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、被験体において抗腫瘍免疫応答を刺激する、又は病状を治療するために実施されてもよい。前記方法は、単離核酸配列を含むヒトＴ細胞集団を含有する医薬組成物の有効量を被験体に投与することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、単離核酸配列を含む細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下で前記細胞を培養することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、インビトロでのＣＡＲ細胞の作製のために実施されてもよい。前記方法は、細胞を提供することと、単離核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインが認識する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することとを含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＣＡＲを発現する細胞を濃縮するために実施されてもよい。前記方法は、細胞を提供することと、単離核酸配列を細胞に導入することでＣＡＲを発現する細胞（ＣＡＲ細胞）とＣＡＲを発現しない細胞を得ることと、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する試薬の存在下でＣＡＲ細胞を培養することでＣＡＲを発現する細胞を濃縮することとを含んでもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは抗体、リガンド又はその抗原結合断片を含む。特定の実施形態において、抗原結合断片はＦａｂ又はｓｃＦｖを含む。特定の実施形態において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ又は軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＲＯＲ１、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、癌胎児性抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７−Ｈ６、ＩＬ−１３受容体α２、ＩＬ−１１受容体α、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＣＤ１７１、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２  ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＣ１、葉酸受容体−α、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児性ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＣＤ４４ｖ６、ＴＥＭ１、又はＴＥＭ８を含む。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態において、細胞内ドメインはＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインのリガンドである。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインが結合する抗原である。特定の実施形態において、試薬は、抗原の細胞外ドメインである。特定の実施形態において、抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮成長因子受容体の変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ジシアロガングリオシド２（ＧＤ２）、インターロイキン−１３Ｒａ２（ＩＬ１３Ｒα２）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１−ＣＡＭ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、分化クラスター１３３（ＣＤ１３３）、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、癌・精巣抗原１Ｂ（ＣＴＡＧ１Ｂ）、ムチン1（ＭＵＣ１）、葉酸受容体α（ＦＲ−α）、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４である。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲの細胞外ドメインに結合する抗体である。特定の実施形態において、抗体は、ヒトＩｇＧ抗体である。例えば、抗体は、ヒトＩｇＧのＦａb断片と結合する。特定の実施形態において、試薬は、ＣＤ１９、ＦＺＤ１０、ＴＳＨＲ、ＰＲＬＲ、Ｍｕｃ  １７、ＧＵＣＹ２Ｃ、ＣＤ２０７、ＣＤ３、ＣＤ５、又はＣＤ４からの少なくとも一種の細胞外ドメインを含む。特定の実施形態において、試薬は、配列番号２２及び３４のアミノ酸配列の少なくとも一種を含む。特定の実施形態において、試薬は、配列番号５５、２１、４８、４９、４０及び５０〜６０のアミノ酸配列の少なくとも一種に結合する。特定の実施形態において、試薬は、ＣＡＲを活性化し、及び／又は細胞の共刺激応答を引き起こす。
【０１７９】
例えば、遺伝子を発現する細胞からライブラリーをスクリーニングする方法、遺伝子を含むことが知られているベクターから前記遺伝子を誘導する方法、又は標準技術を使用してそれらを含む細胞及び組織から直接単離する方法など、本分野で既知の組換え方法を用いて所望の分子をコードする核酸配列を得ることができる。或いは、目的とする遺伝子は、クローンの代わりに、合成によって産生されることができる。
【０１８０】
本開示の実施形態はさらに、本開示に係るＤＮＡを挿入したベクターに関する。レトロウィルス（例えば、レンチウィルス）から誘導されるベクターは、導入遺伝子の長時間の安定した組込み及びその娘細胞への繁殖が許容されるため、長時間の遺伝子転移を達成するのに適切なツールである。レンチウィルスベクターは、肝細胞などの非増殖細胞を形質導入できるため、マウス白血病ウィルスなどの発がん性レトロウィルスから誘導されるベクターに比べてより多くの利点がある。さらに、免疫原性が低いという付加的利点がある。
【０１８１】
ＣＡＲをコードする天然又は合成核酸の発現は通常、ＣＡＲポリペプチド又はその一部をコードする核酸を、１又は複数のプロモータに動作可能に連結し、その構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、真核生物の複製及び組み込みに適用される。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現を調節するための転写及び翻訳ターミネーター、開始配列及びプロモータを含む。
【０１８２】
ＣＡＲをコードする合成核酸の発現及び哺乳動物細胞への遺伝子移入に関連する更なる情報は、引用によりその全体が組み込まれる米国特許番号ＵＳ８，９０６，６８２に提供されている。
【０１８３】
実施形態はさらに、患者に本開示に係る遺伝子改変細胞の有効量を投与することを含む、患者の疾患を治療するための方法に関する。本発明に係る方法によれば、卵巣癌、乳癌、結腸癌、多形膠芽細胞腫、前立腺癌及び白血病などの癌を含む各種の疾患を治療することができる。いくつかの実施形態において、前記方法は、ヒト患者に抗腫瘍有効量のヒトＴ細胞集団を含む医薬組成物を投与することを含み、前記細胞集団におけるヒトＴ細胞は、本開示に記載の核酸配列を含むヒトＴ細胞を包含する。
【０１８４】
いくつかの実施形態は、Ｔ細胞白血病を治療するための組成物及び方法に関する。修飾細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列、及び分化クラスター（ＣＤ）に関連する遺伝子の１又は複数のエキソンの破壊を含んでもよい。これらの場合、ＣＡＲの細胞外ドメインがＣＤ分子を認識する。特定の実施形態において、ＣＤ分子は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、又はＣＤ５２を含む。別の実施形態において、修飾細胞は、ＣＡＲ  ＮＫ細胞又はＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１８５】
Ｔ細胞白血病には、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫、Ｔ細胞性前リンパ球性白血病など、Ｔ細胞に影響する異なるタイプのリンパ性白血病が含まれる。例えば、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫は通常、侵襲性（急速に成長する）Ｔ細胞リンパ腫であり、血液（白血病）、リンパ節（リンパ腫）、皮膚又は体の多くの領域で発見される。キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ  Ｔ）細胞療法は、新しく開発された養子抗腫瘍療法であり、いくつかの白血病（例えば、Ｂ細胞リンパ腫及びＢ細胞慢性リンパ球白血病）を効率的に治療できることが証明された。しかし、同胞殺し（ｆｒａｔｒｉｃｉｄｅ）という問題で、ＣＡＲ  Ｔ標的の通常技術は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を含むＴ細胞を損傷する。いくつかの実施形態においては、遺伝子編集技術を用いてＴ／ＮＫ細胞のある遺伝子を修飾する。例えば、ある分化（ＣＤ）遺伝子クラスター又は関連遺伝子を修飾することにより、修飾細胞がＴ細胞腫瘍を殺傷してＣＡＲ  Ｔ／ＮＫ細胞の同胞攻撃を避ける。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインが抗原に結合する。特定の実施形態において、細胞内ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む、共刺激シグナル伝達ドメインを包含する。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、又はＣＤ５２遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する内在性遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態において、ＣＤ分子に関連する遺伝子はＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３ζサブユニットなど、減量されたＴＣＲサブユニット又はＣＤ３サブユニットの少なくとも一種を有する。ＣＤ３に関する他の情報及びＣＤ３サブユニット発現の破壊は、「A PCR-Based Method to Genotype Mice Knocked Out for All Four CD3 Subunits，the Standard Recipient Strain for Retrogenic TCR/CD3 Bone Marrow Reconstitution Technology」，Alejandro Ferrer，Adam G. Schrum及びDiana Gil，BioResearch Open Access 2013 2：3，222-226から発見され、この参考文献はその全体が引用により組み込まれる。特定の実施形態において、ＣＤ分子に関連する遺伝子はＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞は、減量されたＴＲＡＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、又はＣＤ３εサブユニットの少なくとも一種を有する。特定の実施形態において、ＣＤ分子に関連する遺伝子はＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞は、低下したＴＲＡＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３εサブユニットの発現を有する。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ３又はＴＣＲに結合し、ＣＡＲを含む細胞によるＴ細胞応答に比べ、修飾細胞は被験体において減量を引き起こすか、或いは、別の修飾された細胞によるＴ細胞応答を引き起こさず、前記ＣＡＲの細胞外ドメインがＣＤ３又はＴＣＲに結合し、内在性ＣＤ３／ＴＣＲを破壊しない。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号８８及び／又は８９のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態において、ＣＤ分子はＣＤ３であり、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号５７、８８、又は８９のアミノ酸配列を含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、実施形態１〜１６のいずれかの修飾細胞であって、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）遺伝子（又は核酸配列）上の第１の標的部位と結合する、三つ以上の亜鉛フィンガードメインを含む第１の亜鉛フィンガータンパク（ＺＦＰ）と、ＴＲＡＣ遺伝子における第２の標的部位と結合する、三つ以上の亜鉛フィンガードメインを含む第２のＺＦＰと、切断ドメインと、を含む、単離された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む修飾細胞である。場合によっては、第１のＺＦＰは、第１のＺＦＰのＮ端から第１のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号７８、７７、８０、７９、７８、及び８７のアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＰは、第２のＺＦＰのＮ端から第２のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号８２、８３、８６、及び８４のアミノ酸配列を含む。他の場合には、第１のＺＦＰは、第１のＺＦＰのＮ端から第１のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号２６、２５、２６、２７、及び２８のアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＰは、第２のＺＦＰのＮ端から第２のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号３０、３１、２６、３２のアミノ酸配列を含む。場合によっては、第１の標的部位は配列番号８１のアミノ酸配列を含み、第２の標的部位は配列番号８５のアミノ酸配列を含む。他の場合には、第１の標的部位は配列番号２９のアミノ酸配列を含み、第２の標的部位は配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、ＣＤ分子はＣＤ４であり、ＣＡＲの細胞外ドメインは配列番号５８、９０、又は９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ分子はＣＤ４であり、ＣＡＲの細胞外ドメインは配列番号５９、９２、又は９３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ分子はＣＤ５であり、ＣＡＲの細胞外ドメインは配列番号９４、９５、又は９６のアミノ酸配列を含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、修飾細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体の１又は複数のサブユニットに結合するＣＡＲをコードする核酸配列及びＣＤ３／ＴＣＲ複合体に関連する１又は複数の遺伝子の破壊を含んでもよい。例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＴＣＲα、及びＴＣＲβなどの複数のサブユニット又は鎖を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞外ドメインは、ＣＤ３サブユニット（例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ及びＣＤ３εサブユニット）に結合し、修飾細胞は、減量されたＴＲＡＣ発現又は非発現を含む。場合によっては、ＣＡＲの細胞外ドメインは、配列番号５７、５８、５９、又は９５のアミノ酸配列を含む。場合によっては、修飾細胞は、ＴＲＡＣを標的とする亜鉛フィンガーヌクレアーゼを含み、減量されたＴＲＡＣ発現又は非発現を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、前記修飾細胞を作製する方法は、ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することで修飾細胞を得ることと、細胞又は修飾細胞の遺伝子の１又は複数のエキソンを破壊することとを含んでもよい。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、前記修飾細胞の集団を包含する。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞白血病を治療する方法は、被験体に前記修飾細胞の治療有効量を投与することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞白血病は、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫又はＴ細胞性前リンパ球性白血病の少なくとも一種を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、ＣＤ分子を発現する癌を治療する方法は、被験体に前記修飾細胞の治療有効量を投与することを含んでもよい。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、ＣＤ分子を発現する細胞数の減少方法は、ＣＡＲを含む細胞のＣＤ分子に関連する遺伝子の１又は複数のエキソンを破壊することで破壊されたＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＤ分子を含む細胞を破壊されたＣＡＲ細胞の有効量と接触させることとを含んでもよく、ＣＡＲ細胞に比べ、破壊されたＣＡＲ細胞は、増殖及び／又は生存レベルが増加した。いくつかの実施形態において、破壊されたＣＡＲ細胞は、前記修飾細胞である。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、ＣＤ分子を発現する細胞数の減少方法は、細胞を前記修飾細胞の有効量と接触させることを含んでもよい。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ＣＤ分子を発現する細胞の増殖又は活性の抑制方法は、細胞を前記修飾細胞の有効量と接触させることを含んでもよい。
【０１９８】
治療可能な癌は、血管新生されていないか、又は未だ実質的に血管新生されていない腫瘍、並びに血管新生腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（例えば、血液学的腫瘍、例えば、白血病及びリンパ腫）又は固形腫瘍を含み得る。本開示のＣＡＲで治療される癌のタイプには、癌腫、芽腫及び肉腫並びに特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍並びに肉腫、癌腫及び黒色腫等の悪性腫瘍が含まれるが、これらに限定されない。成人の腫瘍／癌及び小児の腫瘍／癌も含まれる。
【０１９９】
血液学的癌は、血液又は骨髄の癌である。血液学的（又は造血性）癌の例には、急性白血病（急性リンパ球白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病及び骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病及び赤血白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病及び慢性リンパ球性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性及び高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病及び脊髄形成異常症を含む、白血病が含まれる。
【０２００】
固形腫瘍は、通常嚢胞又は液体領域を含まない、組織の異常な腫瘤である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。異なるタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプに関して命名される（肉腫、癌腫及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例には、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ様悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫及びＣＮＳ（中枢神経系）腫瘍（例えば、神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫など）、神経膠芽腫（多形性神経膠芽腫とも言う）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移）が含まれる。
【０２０１】
例えば、腎細胞癌は、よく見られる悪性腫瘍の１つである。早期腎細胞癌に罹患した患者に対する治療について、外科切除で５年生存率が９０％に達する。しかし、末期拡散や転移した末期患者の５年生存率はただ約１０％である（参考としてNational Cancer Institute：SEER Stat Fact Sheets：Kidney and Renal Pelvis Cancer. Bethesda，MD：National Cancer Institute.からオンラインで得られる。前回アクセス時間：２０１７年１１月２日）。膵臓癌は、消化管悪性腫瘍であり、非常に悪性で診断も治療も困難である。過去２０年では医療技術は大幅改善されたが、膵臓癌の診断や治療ではまだ多くの問題がある。膵臓癌は、初診率が低いので、発見されたときに通常はもう転移した。そのため、２０％よりも少ない患者は、外科切除で５年生存率が平均１０％より小さい。（American Cancer Society：Cancer Facts and Figures 2018. Atlanta，Ga：American Cancer Society，2018.からオンラインで得られる。前回アクセス時間：２０１８年１月５日）。尿管癌は、泌尿系における尿路上皮細胞から発展されてきた癌であり、相対的に稀に見える悪性腫瘍である。尿路上皮癌は、早期診断率が高く早期治療が有効であるが、再発率が高い、進展しやすい及び予後が劣る悪性腫瘍である。子宮内膜癌は、子宮内膜に由来する上皮悪性腫瘍である。子宮内膜癌は女性生殖器における三つの悪性腫瘍の1つである。早期患者は５年生存率が６２％〜８４％であるが、末期患者の治療効果が悪い。乳癌はよく見られる悪性腫瘍であり、女性患者が多く、発症率が非常に高く、医療技術が絶えず改善しているので、乳癌からの生存機会が既に著しく向上し、５年生存率が９０％に達することができる。しかし、トリブルネガティブ乳癌に対しては、治療が依然として困難であり、腫瘍細胞の侵襲能が強く、予後が悪い。前立腺癌は、男性生殖系において最もよく見られる癌であり、多数は男性老年患者であり、米国で第２の致命的な癌であり、統計によると、早期前立腺癌の５年生存率が９０％達するが、末期前立腺癌患者の５年生存率がただ３０％である。食道癌は、食道による癌であり、最近数十年、食道癌の発症率が向上した。予後が悪い主原因は、大部分の患者は通常、診断された時に既に一部末期又は遠隔転移にある。卵巣癌患者の多数（６０％）は、末期疾患に罹患したと診断され、その５年生存率が２９％である。卵巣癌は全体として５年相対生存率が低い（４７％）。結腸直腸癌は、よく見られる悪性腫瘍である。遺伝原因の以外、結腸直腸癌は、高脂肪、高タンパク質及び低繊維の飲食習慣に緊密に相関する。米国などの国では、結腸直腸癌の発症率が非常に高く、５年相対生存率が約６０％である。これらの癌の現状をまとめると、癌の治療は未だ先が長く、これらの癌の新規な治療方法の開発が急務である。
【０２０２】
本明細書に記載されるように、活性化及び増幅細胞は免疫不全の個体で発生した疾患の治療及び予防のために用いられる。具体的には、本開示に係る遺伝子改変細胞は癌の治療に用いられる。特定の実施形態において、本開示に係る細胞は、発がんリスクがある患者を治療するために用いられる。従って、本開示は、本開示に係る修飾Ｔ細胞の治療有効量を投与することを含む、癌の治療又は予防方法を提供する。
【０２０３】
本開示に係る修飾Ｔ細胞は、単独で、又は希釈剤及び／若しくはＩＬ−２若しくは他のサイトカイン若しくは細胞集団等の他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与することができる。簡潔には、本開示に係る医薬組成物は、本明細書に記載の修飾Ｔ細胞集団を、１又は複数の薬学的又は生理学的に許容されるベクター、希釈剤又は賦形剤と組み合わせる含むことができる。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸塩緩衝食塩水などの緩衝剤；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシンなどのアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ又はグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；並びに防腐剤を含むことができる。本開示における組成物は、静脈内投与のために作製されることが好ましい。
【０２０４】
本開示に係る医薬組成物は、治療（又は予防）される疾患に適する方式で投与される。臨床試験により適切な用量を決定できるが、投与量及び頻度は、患者の病状及び患者の疾患のタイプと重症度などの因子により決定される。
【０２０５】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」又は「治療量」が示される場合、投与される本開示の組成物の正確な量は、患者の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染又は転移の程度及び患者（被験体）の病状の個人差を考慮して、医師によって決定される。本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、概して１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、好ましくは１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の投与量で投与することができ、これらの範囲内のすべての整数値を含むといえる。Ｔ細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる。細胞は、免疫療法において一般に知られている注入技術を用いて投与することができる（例えば、Rosenbergら、New Eng. J. of Med. 319：1676，1988を参照）。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて治療を調整することで、医学分野の当業者にとって容易に決定され得る。
【０２０６】
特定の実施形態において、必要に応じて、活性化Ｔ細胞を被験体に投与し、続いて採血し（又はアフェレーシスを行い）、活性化及び増幅Ｔ細胞を回収し、それらを患者に再注入してもよい。このプロセスは数週間ごとに複数回行うことができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、又は１００ｃｃの採血から活性化される。理論に束縛されるものではないが、この複数の血液採取／複数の再注入プロトコルを使用して、Ｔ細胞の特定の集団を選択することができる。
【０２０７】
本明細書に記載される医薬組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、注入、インプランテーション又はトランスプランテーションを含む任意の好都合な方式で行うことができる。本明細書に記載の組成物は、患者に皮下、皮内、腫瘍内、節内、髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、又は腹腔内投与することができる。いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞組成物は、皮内又は皮下注射によって患者に投与される。別の実施形態において、本開示のＴ細胞組成物は、好ましくは静脈内投与される。Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接注射できる。
【０２０８】
本開示の特定の実施形態において、本明細書に記載の方法、又はＴ細胞を治療レベルに増幅させる本分野で公知のほかの方法を用いて活性化及び増幅させた細胞は、限定するものではないが、抗ウィルス療法、ＭＳ患者に対するシドフォビル及びインターロイキン−２、シタラビン（ＡＲＡ−Ｃともいう）又はナタリズマブ治療、若しくは乾癬患者に対するエファリズマブ治療若しくはＰＭＬ患者に対する他の治療などの薬剤による治療を含む、任意の数の関連する治療方法と（例えば、その前、同時又は後に）併せて患者に投与される。更なる実施形態において、本開示のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノレート及びＦＫ５０６）、抗体又は他の免疫除去剤（例えば、ＣＡＭ  ＰＡＴＨ）、抗ＣＤ３抗体又は他の抗体療法、シトキシン、フルダリビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン及び放射線照射と組み合わせて使用することができる。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか（シクロスポリン及びＦＫ５０６）、又は成長因子誘発シグナル伝達に重要なｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）。（Liuら、Cell 66：807-815，1991；Hendersonら、Immun 73：316-321，1991；Biererら、Curr. Opin. Immun 5：763-773，1993；Isoniemi（上記と同様））。いくつかの実施形態において、本開示の細胞組成物は、骨髄移植、Ｔ細胞除去療法（フルダラビンなどの化学治療剤を使用する）、体外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド又は抗体（例えば、ＯＫＴ３又はＣＡＭＰＡＴＨ）と（例えばその前、同時又はその後に）併せて患者に投与される。別の実施形態において、本開示の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法（例えば、リツキサンなどのＣＤ２０と反応する試薬）の後に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、被験体に対しては、高用量の化学療法及びその後の末梢血幹細胞移植による標準的な治療を受けることができる。特定の実施形態において、移植に続いて、被験体は、本開示の増幅された免疫細胞の注入を受ける。別の実施形態において、増幅された細胞は、外科手術の前又は後に投与される。
【０２０９】
患者に投与される上記治療の投与量は、治療される病状の正確な性質及び治療のレシピエントによって変化する。ヒト投与のための投与量のスケーリングは、各種の因子に応じて当業界で受け入れられている実践に従って医師によって行うことができる。
【０２１０】
遺伝子改変又は修飾されたＴ細胞を用いた癌治療の方法の他の情報は、米国特許番号ＵＳ８，９０６，６８２に記載されており、前記米国特許は、その全体が引用により組み込まれる。
【０２１１】
いくつかの実施形態は、修飾細胞のインビトロでの作製方法に関する。前記方法は、被験体から細胞サンプルを得ることを含んでもよい。例えば、サンプルは、Ｔ細胞又はＴ細胞の前駆細胞を含んでもよい。前記方法は、少なくとも一種のＣＡＲをコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトし、ＣＡＲ発現を選択的に増強させるＴ細胞が増殖した培地でＣＡＲ細胞集団をエキソビボで培養することを含んでもよい。いくつかの実施形態において、サンプルは、凍結保存したサンプルである。いくつかの実施形態において、細胞サンプルは、臍帯血に由来する。いくつかの実施形態において、細胞サンプルは、被験体の末梢血サンプルに由来する。いくつかの実施形態において、細胞サンプルは、アフェレーシスで得られる。いくつかの実施形態において、細胞サンプルは、静脈穿刺で得られる。いくつかの実施形態において、細胞サンプルはＴ細胞亜集団である。いくつかの実施形態において、内因性Ｔ細胞受容体及び／又は内因性ＨＬＡに関するＣＡＲ細胞の遺伝子が破壊され、ＣＡＲ細胞の免疫原性が低下する。
【０２１２】
例示的実施形態
以下、例示的実施形態を示す。
１．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列及び分化クラスター（ＣＤ）に関連する遺伝子の１又は複数のエキソンの破壊を含み、ＣＡＲの細胞外ドメインがＣＤ分子を認識する、修飾細胞。
２．ＣＤ分子に関連する遺伝子が、ＣＤ２、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、又はＣＤ５２遺伝子を含む、実施形態１に記載の修飾細胞。
３．ＣＡＲ  ＮＫ細胞又はＣＡＲ  Ｔ細胞である、実施形態１又は２に記載の修飾細胞。
４．ＣＡＲは、抗原に結合する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の修飾細胞。
５．細胞内ドメインが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びそれらのいずれかの組合せからなる群より選択される共刺激分子の細胞内ドメインを含む共刺激シグナル伝達ドメインを包含する、実施形態１〜４のいずれかに記載の修飾細胞。
６．修飾細胞が、ＣＤ２、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、又はＣＤ５２遺伝子の生合成又は輸送経路に関連する破壊された内在性遺伝子を有する、実施形態１〜５のいずれかに記載の修飾細胞。
７．ＣＤ分子に関連する遺伝子がＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞が減量されたＴＣＲサブユニットの少なくとも一種、或いはＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、又はＣＤ３ζサブユニットの少なくとも一種を有する、実施形態１〜６のいずれかに記載の修飾細胞。
８．ＣＤ分子に関連する遺伝子がＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞が減量されたＴＲＡＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、又はＣＤ３εサブユニットの少なくとも一種を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載の修飾細胞。
９．ＣＤ分子に関連する遺伝子がＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、修飾細胞が低下したＴＲＡＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、及びＣＤ３εサブユニットの発現を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載の修飾細胞。
１０．細胞外ドメインがＣＤ３又はＴＣＲに結合し、ＣＡＲを含む細胞によるＴ細胞応答に比べ、修飾細胞が、被験体において減量を引き起こすか、或いは、別の修飾細胞によるＴ細胞応答を引き起こさず、前記ＣＡＲの細胞外ドメインがＣＤ３又はＴＣＲに結合し、ＣＤ３／ＴＣＲに関連する遺伝子の１又は複数のエキソンの破壊を有さない、実施形態１〜９のいずれかに記載の修飾細胞。
１１．ＣＡＲの細胞外ドメインが、配列番号５７のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１０のいずれかに記載の修飾細胞。
１２．ＣＡＲの細胞外ドメインが、配列番号８８及び／又は８９のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１１のいずれかに記載の修飾細胞。
１３．ＣＤ分子に関連する遺伝子がＣＤ３／ＴＣＲ遺伝子であり、ＣＡＲの細胞外ドメインが配列番号５７、８８又は８９のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載の修飾細胞。
１４．ＣＤ分子がＣＤ４であり、ＣＡＲの細胞外ドメインが配列番号５８、９０又は９１のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１３のいずれかに記載の修飾細胞。
１５．ＣＤ分子がＣＤ４であり、ＣＡＲの細胞外ドメインが配列番号５９、９２又は９３のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の修飾細胞。
１６．ＣＤ分子がＣＤ５であり、ＣＡＲの細胞外ドメインが配列番号９４、９５又は９６のアミノ酸配列を含む、実施形態1〜15のいずれかに記載の修飾細胞。
１７．修飾細胞が、Ｔ細胞受容体α定常（ＴＲＡＣ）分子における第１の標的部位と結合する、三つ以上の亜鉛フィンガードメインを含む第１の亜鉛フィンガータンパク（ＺＦＰ）と、ＴＲＡＣ遺伝子における第２の標的部位と結合する、三つ以上の亜鉛フィンガードメインを含む第２のＺＦＰと、切断ドメインとを含む単離された亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を包含し、第１のＺＦＰが、第１のＺＦＰのＮ端から第１のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号７８、７７、８０、７９、７８及び８７のアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＰが、第２のＺＦＰのＮ端から第２のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号８２、８３、８６及び８４のアミノ酸配列を含むか、或いは、第１のＺＦＰが、第１のＺＦＰのＮ端から第１のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号２６、２５、２６、２７及び２８のアミノ酸配列を含み、第２のＺＦＰが、第２のＺＦＰのＮ端から第２のＺＦＰのＣ端まで順に配列番号３０、３１、２６、３２のアミノ酸配列を含み、第１の標的部位が配列番号８１のアミノ酸配列を含み、第２の標的部位が配列番号８５のアミノ酸配列を含むか、或いは、第１の標的部位が配列番号２９のアミノ酸配列を含み、第２の標的部位が配列番号３３のアミノ酸配列を含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の修飾細胞。
１８．ＣＡＲをコードする核酸配列を細胞に導入することで修飾細胞を得ることと、細胞又は修飾細胞の遺伝子の1又は複数のエキソンを破壊することとを含む、実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞の作製方法。
１９．実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞集団を含む医薬組成物。
２０．被験体に実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞の治療有効量を投与することを含む方法であって、Ｔ細胞白血病が、大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫又はＴ細胞性前リンパ球性白血病の少なくとも一種を含む、Ｔ細胞白血病を治療する方法。
２１．被験体に実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞の治療有効量を投与することを含む、ＣＤ分子を発現する癌を治療する方法。
２２．ＣＡＲを含む細胞のＣＤ分子に関連する遺伝子の１又は複数のエキソンを破壊することで破壊されたＣＡＲ細胞を得ることと、ＣＤ分子を含む細胞を破壊されたＣＡＲ細胞の有効量と接触させることとを含む方法であって、ＣＡＲ細胞に比べ、破壊されたＣＡＲ細胞は、増殖及び／又は生存レベルが増加した、ＣＤ分子を発現する細胞数の減少方法。
２３．破壊されたＣＡＲ細胞が実施形態２〜１７のいずれかに記載の修飾細胞である、実施形態２２に記載の方法。
２４．細胞を実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞の有効量と接触させることを含む、ＣＤ分子を発現する細胞数の減少方法。
２５．細胞を実施形態１〜１７のいずれかに記載の修飾細胞の有効量と接触させることを含む、ＣＤ分子を発現する細胞の増殖又は活性の抑制方法。
【実施例】
【０２１３】
以下の実施例を参考して本開示をさらに説明する。また、これらの実施例は説明のみを目的として提供しており、他に特定されない限り、制限することを意図するものではない。従って、本開示は、以下の実施例に限定されると決して解釈すべきではなく、本明細書で提供される教示により明らかになる任意のすべての変形を包含すると解釈すべきである。
【０２１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ及びＫ５６２細胞におけるＣＡＲの発現
ＣＤ１９  ＣＡＲ又はＴＳＨＲ  ＣＡＲをコードするレンチウィルスベクターを作製した（Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy，In Vivo Molecular Therapy、第17巻第8期、1453-1464、2009年8月を参照されたい。前記参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる）。
【０２１５】
初代Ｔ細胞は患者から得られた。レンチウィルスベクターを用いて得られた初代Ｔ細胞を形質導入して修飾されたＴ細胞が得られた。フローサイトメトリーを行って分析することで、初代Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を決定した。細胞培養、レンチウィルスベクター構築及びフローサイトメトリーに関連する技術は、Control of large，established tumor xenograftswith genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains，PNAS 2009年3月3日、第106巻第9期、3360-3365から発見され、前記参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを含むがＣＤ１９  ＥＣＤがない培地を用いてＴ細胞を培養した。形質導入されていないＴ細胞及びＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞増幅速度を観察し、図１に示した。
【０２１７】
ＣＤ１９細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激及び増幅
１日目に、ＣＤ１９  ＣＡＲをコードするレンチウィルスベクターを用いて初代Ｔ細胞を形質導入して修飾されたＴ細胞が得られ、上記修飾されたＴ細胞は、抗ＣＤ１９を発現するＣＡＲ  Ｔ細胞（以下、「ＣＡＲ  Ｔ１９細胞」と称する）を含む。修飾されたＴ細胞を二つのグループに分けてそれぞれ培養した。第１グループのＣＡＲ  Ｔ１９細胞は、抗ＣＤ３とＣＤ２８ビーズ及びＩＬ２で、第２グループのＣＡＲ  Ｔ１９細胞は、可溶性ＣＤ１９（例えば、ＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、配列番号４１）、抗ＣＤ３とＣＤ２８ビーズ及びＩＬ２でそれぞれ培養された。第２グループに対しては、最初に可溶性ＣＤ１９を２マイクログラム用いてＣＡＲ  Ｔ１９細胞を５００，０００個培養し、ＣＡＲ  Ｔ１９細胞が成長した後可溶性ＣＤ１９を４マイクログラム用いた。細胞数を計測し、フローサイトメトリーによりＣＡＲ＋細胞と修飾されたＴ細胞集団との比率を観察した。細胞集団におけるＣＡＲコピー数を計測した。
【０２１８】
例えば、２２日目に、ＣＡＲ  Ｔ細胞とＣＡＲを発現しないＴ細胞とは、異なる程度に成長した。図２の第５列に示すように、第２グループにおけるＣＡＲ  Ｔ１９細胞コピー数が第２グループにおけるｑＰＣＲ分析によるものより高かった。図２の第６列に示すように、第２グループにおけるＣＡＲ  Ｔ１９細胞とＴ細胞との比率が、第１グループにおけるフローサイトメトリー分析を用いた比率より高かった。図３に示すように、縦軸は抗ｓｃＦｖ  ＰＥを示し、フレーム領域はＣＡＲ  Ｔ１９細胞を表す。驚いたことに、培地にＣＤ１９  ＥＣＤを加えた結果、初期（この初期は約３日目から１０日目）のＣＤ１９ＥＣＤ不存在の培養に比べ、形質導入されていないＴ細胞もＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞も明らかな細胞増幅の増加が示されなかった。この時期の後、ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞増幅速度がＣＤ１９  ＥＣＤの不存在下で培養された細胞の増幅速度より高かった。これらの結果から、ＣＤ１９は、インビトロでＣＡＲ  Ｔ１９細胞の長時間維持を刺激又は増強したが、短時間維持（例えば、１０日間以下）に対しては明らかな増強を示さなかったことが分かった。
【０２１９】
ＴＳＨＲ  ＥＣＤの存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞の刺激及び増幅
ＴＳＨＲ  ＣＡＲをコードするレンチウィルスベクターを用いて初代Ｔ細胞を形質導入して修飾されたＴ細胞が得られ、上記修飾されたＴ細胞は抗ＴＳＨＲを発現するＣＡＲ  Ｔ細胞（以下、「ＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞」と称する）を含む。修飾されたＴ細胞を凍結して３０日間保存した。Ｔ細胞の凍結及び凍結Ｔ細胞の解凍に関連する技術は、Levineら、Molecular Therapy - Methods & Clinical Development，Molecular Therapy、第4巻、2017年3月17日から発見される。
【０２２０】
修飾されたＴ細胞を解凍して二つのグループに分け、それぞれ培養した。第１グループのＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞は、抗ＣＤ３とＣＤ２８ビーズ及びＩＬ２で１０日間培養し、第２グループのＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞は、様々な濃度の可溶性ＴＳＨＲ（例えば、ＴＳＨＲの細胞外ドメイン、配列番号３４）、抗ＣＤ３とＣＤ２８ビーズ及びＩＬ２で培養した。第２グループに対しては、ＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞５００，０００個と１０、１２５、５００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＴＳＨＲ  ＥＣＤとをそれぞれ１４日間培養した。フローサイトメトリーによりＴ細胞集団（図８及び図９）を観察し、顕微鏡でＴ細胞集団の細胞形態を観察した（図１０）。
【０２２１】
図８に示すように、ＴＳＨＲ  ＥＣＤ濃度の増加につれ、低ＳＳＣ−Ａ分散性ＦＳＣ群が減少した。図８に示すように、第２グループの細胞に５００ｎｇ／ｍｌの可溶性ＴＳＨＲ  ＥＣＤを添加したとき、ＣＡＲ＋細胞とＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞との比率（Ｐ１）が明らかに増加した。図９及び図１０に示すように、添加した抗原（ＴＳＨＲ−ＥＣＤ）の割合の増加につれ、細胞片が減少し、ＴＳＨＲ  ＥＣＤの不存在下で培養する場合に比べ、細胞がより良好な状態に保持されたことを示す。ＭＦＩ（平均蛍光強度）は、細胞集団の平均蛍光位置を指し、数値として算出した。図１０に示すように、５００ｎｇの抗原の刺激で、ＣＡＲ蛍光（下の水平軸）が細胞集団の右に移動した。ＣＡＲ陽性細胞の割合が増加し、強度が増加し、ＭＦＩ値も向上した。これらの結果から、ＴＳＨＲは、インビトロでＣＡＲ  Ｔ−ＴＳＨＲ細胞の長時間維持を刺激又は増強したことを示した。
【０２２２】
Ｔ細胞表現型の観察
Ｔ細胞表現型をさらに観察した。開始から３０日目に、第２グループ中のＣＡＲ  Ｔ１９細胞とＴ細胞との比率が上昇し続けた（図４におけるＰ４フレームを参照）。ＣＡＲ＋及びＣＡＲ−細胞における記憶細胞マーカーＣＤ６２Ｌを分析し、培養されたＴ細胞集団の表現型を決定した。第２グループのＣＡＲ  Ｔ１９細胞において、Ｔ細胞集団の全部又は多数の細胞が記憶細胞の表現型を示した（例えば、ＣＤ６２Ｌ  ｈｉ）。図５の上の図にはＣＡＲ＋細胞分析を示し、下の図にはＣＡＲ−細胞分析を示した。これらのデータから、ＣＤ１９がＣＡＲ  Ｔ細胞を誘導して記憶Ｔ細胞の表現型を生じさせたことを示した。
【０２２３】
第１グループ及び第２グループにおけるＣＡＲ  Ｔ１９の機能分析
上述した実施形態を使用して第１グループ及び第２グループのＣＡＲ  Ｔ１９細胞を約１〜３週間培養した。その後、ＣＡＲ  Ｔ１９細胞を洗浄し、ＣＤ１９を含まない培養物に投入した。これらのＣＡＲ  Ｔ１９細胞をＫ５６２−ＣＤ１９（Ｅ：Ｔ  １：１又は１：１０）と共培養した。２４時間、４８時間、及び７２時間後、培養物の上清を回収し、細胞から放出されたＩＦＮ−γを測定してＣＡＲ  Ｔ１９細胞の機能を決定した。
【０２２４】
第１グループにも第２グループにもＩＦＮ−γが観察された。図６に示すように、２４時間後、第２グループにおけるＩＦＮ−γが第１グループよりも明らかに高かった。第１グループにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞が低いエネルギー消費状態（例えば、記憶Ｔ細胞状態）にあり、細胞を活性化するのに一定の時間がかかる（図６を参照）。これらのデータから、ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ細胞の培養がＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γの放出能を増強したことを示した。
【０２２５】
ＣＤ１９の除去によるＣＡＲ  Ｔ１９細胞に対する影響
ＣＡＲ  Ｔ１９細胞をＣＤ１９と１５日間以上培養した後、第３グループと第４グループに分けた。第３グループ中のＣＡＲ  Ｔ１９細胞を可溶性ＣＤ１９で連続して培養したのに対して、第４グループ中のＣＡＲ  Ｔ１９細胞をＣＤ１９の不存在下で培養した。図７に示すように（例えば、２７日目）、第４グループにおけるＣＡＲ＋細胞数が第３グループよりも比較的低かった。これらのデータから、ＣＤ１９がＣＡＲ  Ｔ１９細胞の存在の維持に寄与することを示した。
【０２２６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞増幅を促進するＣＡＲ及びヒンジドメインの付加アミノ酸の構築
それぞれ、シグナルペプチド（配列番号３８）、抗原特異的一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（配列番号５５又は２１）、ヒンジドメイン（配列番号６８、６９、７０又は７１）、膜貫通ドメイン（配列番号７２、７３、７４又は７５）、１又は複数の共刺激ドメイン（配列番号３）、ＣＤ３−ζ（配列番号４０）及びＥＧＦＰを連結することにより、各種のＣＡＲ（Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ）を構築した（図１２及び１３を参照）。
【０２２７】
初代Ｔ細胞は、ボランティアの末梢血から得られた。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社からのＰａｎ−Ｔキットを用いて磁気ビーズによるネガティブ選択を行うことにより、末梢血からＴ細胞を回収した。初代Ｔ細胞が単離された翌日、回収されたＴ細胞を、Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤ  ＣＡＲを含むレンチウィルス（即ち、Ｌｅｎｔｉ−ＣＡＲｓ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）により感染させ、ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製した。
【０２２８】
感染させてから１４日目、各グループ１５，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞を回収し、１０００ｎｇ／ｍｌのＣＤ１９抗原（即ち、組換えヒトＣＤ１９タンパク質）を用いて培養した。１５日間刺激した後、ＣＤ１９の濃度が４００ｎｇ／ｍｌとなった。２0日間刺激した後、ＣＤ１９の濃度が２００ｎｇ／ｍｌとなり約１３０日間まで維持した。
【０２２９】
刺激開始時の２日目、１５日目（図１４〜１７）、１７日目（図２０）、６５日目及び１３０日目、フローサイトメトリーによりＣＡＲの発現及び細胞形態を観察した。抗Ｆ（ａｂ２）’−ビオチンとＰＥ−ストレプトアビジン抗体との組合せをＣＡＲ発現の検出に用いた。ＦＩＴＣチャンネルをＥＧＦＰ発現の検出に用い、細胞片及び細胞生存率の検出パラメーターがＳＳＣ／ＦＳＣであった。
【０２３０】
１３０日目に、Ｋ５６２−ＲＦＰ−ＣＤ１９、Ｋ５６２−ＲＦＰ、及びＮａｌｍ６細胞を用いて上述した実施形態で維持されたＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を調べた。そのうち、Ｋ５６２−ＲＦＰ−ＣＤ１９及びＮａｌｍ６がＣＤ１９陽性細胞であり、Ｋ５６２−ＲＦＰがＣＤ１9陰性細胞である。傷害作用（例えば赤色蛍光）及びサイトカイン放出（例えばＩＦＮ−ｇ）を測定することでＣＡＲ  Ｔ細胞の機能を評価した。そして、ＣＡＲ分子のコピー数を調べた。
【０２３１】
図１４及び図１５には、ＣＤ１９の存在又は不存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養の前又は後のフローサイトメトリー結果を示した。ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ発現の変化を観察した。ＣＡＲ分子はＥＧＦ付きのＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰであった。そのため、ＣＡＲを刺激した後、刺激されていないＣＡＲに比べ、緑色蛍光がより強かった。図１４及び図１５に示すように、ＥＧＦＰ−ＦＩＴＣの水平軸にＰ８フレームにおけるＥＧＦＰ発現の強度が見出された。図１４には、刺激前（第Ｂ／Ｄグループ）及び並行刺激なしのグループ（第Ａ／Ｃグループ）を示し、図１５には、刺激後（第Ｂ／Ｄグループ）及び並行刺激ありのグループ（第Ａ／Ｃグループ）を示した。
【０２３２】
図１６及び図１７には、ＣＤ１９の存在又は不存在下でのＣＡＲ  Ｔ細胞の共培養の前又は後の更なるフローサイトメトリー結果を示した。ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＥＧＦＰ発現の変化を観察した。ＣＡＲ分子はＥＧＦ付きのＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰであった。そのため、ＣＡＲを刺激した後、刺激されていないＣＡＲに比べ、緑色蛍光がより強かった。図１６及び図１７に示すように、垂直軸はＣＡＲ−ＰＥを示し、水平軸はＥＧＦＰ−ＦＩＴＣを示し、ＣＡＲ分子にはＥＧＦＰが付けられていた（例えば、ＣＡＲ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）。また、Ｑ３−ＵＲ（左上隅）フレームには、ＣＡＲ＋ＥＧＦＰ＋発現の強度を示した。図１６には、ＣＤ１９刺激を受けた後の表現型（第Ｂ／Ｄグループ）及び刺激なしの並行培養での表現型（第Ａ／Ｃグループ）を示した。図２０（図１６及び図１７に類似）には、１７日目の第Ａ及びＤグループのフローサイトメトリー結果を示した。これらの結果から、ＣＡＲ＋ＥＧＦＰ＋細胞の割合が増加し、これらの細胞が成長し続けたことが分かった。
【０２３３】
これらの結果から、ＣＤ１９刺激が抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の成長維持に用いられ（図１２及び図１３を参照）、ＣＤ１９刺激がＣＡＲ＋のＴ細胞を濃縮又は特異的に刺激することができ（図１４〜１６を参照）、そしてインビトロでＣＤ１９タンパク質がＴ細胞を活性化させてＣＡＲ陽性細胞を連続して成長させて濃縮するために用いられた。
【０２３４】
図１８及び図１９には、ＣＡＲ  Ｔ細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８表現型の変化を示した。この二つの図面には、同じ実験、即ち、ＣＤ１９による刺激の前又は後の、異なるヒンジのある又はないＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＤ８とＣＤ４の比率の変化を示した。従来、抗原の持続的存在下で培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞が主にＣＤ４細胞に徐々に転化したことを観察した。図１８には、第Ａ及びＣグループにおける並行未処理のＣＡＲ  Ｔ細胞表現型のフローサイトメトリー結果を示した。垂直軸はＣＤ８であり、水平軸はＣＤ４であった。左上領域はＣＤ８＋Ｔ細胞で、右下領域はＣＤ４＋Ｔ細胞であった。図１９は、ＣＤ１９刺激による細胞のフローサイトメトリー結果であり、ＣＤ４細胞の百分率が増加したことを示した。これらの結果から、抗ＣＤ１９及び他の抗原刺激によりＴ細胞の組成を変更できることを示した。
【０２３５】
図２１には、ＣＤ１９タンパク質で１３０日間培養された第ＤグループのＣＡＲ  Ｔ細胞の傷害試験を示した。Ｋ５６２−ＲＦＰ／ｋ５６２  ＣＤ１９−ＲＦＰ細胞をそれぞれＣＡＲ  Ｔ細胞と共培養し、１３０日目にその傷害作用を調べた。図２１に示すように、右の３列には、１：１及び１０：１でＫ５６２  ＣＤ１９−ＲＦＰ細胞の明らかな傷害が示され、フレームに示すとおりであった。ＣＤ１９によるＣＡＲ  Ｔ細胞に対するバックグラウンド刺激を考慮し、実験を開始する前、ＣＤ１９タンパク質を除去し、その代りにＣＤ１９を含まないブイヨンを用いた。図２１におけるこれらの結果から、ＣＤ１９と共培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞は傷害機能を維持したことが分かった。また、第ＤグループにおけるこれらのＣＡＲ  Ｔ細胞からのインターフェロンγ（ＩＦＮ−ｇ）の放出を調べた。図２２には、第ＤグループにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞からのＩＦＮ−ｇの放出のフローサイトメトリー結果を示し、コピー数を算出した。第ＤグループのＣＡＲ  Ｔ細胞をＣＤ１９陽性細胞（Ｋ５６２−ＲＦＰ−ＣＤ１９、ｎａｌｍ−６）と共培養し、サイトカイン放出を測定した。図２２示すように、ＣＤ１９を用いて１３０日間共培養されたＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ１９＋細胞に対するＩＦＮ−ｇを放出した（図２２の左図を参照）。右上の図では、フローサイトメトリー結果よりこれらのＣＡＲ  Ｔ細胞のＣＡＲ発現を示した。横軸はＥＧＦＰを検出するためのＦＩＴＣであり、縦軸はＣＡＲ分子を検出するためのＰＥであり、Ｑ３−ＵＲによりＣＡＲ＋ＥＧＦＰ＋細胞比率を示した。右下の図には、ｑＰＣＲにより測定したＣＡＲ  Ｔ細胞のコピー数を示した。これらの結果から、ＣＤ１９刺激によるＣＡＲ  Ｔ細胞がＣＤ１９＋細胞に対するＩＦＮ−ｇを放出したことが分かった。また、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞は、１３０日目にＣＡＲ陽性細胞表現型が維持された。同様に、ＣＤ１９は１３０日目にＣＡＲ  Ｔ細胞の成長を刺激し続けた。ＣＡＲ＋が完全陽性に近くと、コピー数が４より小さくなった。
【０２３６】
ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞傷害試験
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞にＣＤ１９−ＣＡＲをコードする核酸配列を導入した。傷害試験を行い、傷害機能がない又は弱いと観察した。Ｔ細胞マーカーの更なる発現を分析した。ＣＤ３を発現したとき、ＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞がＣＤ４の低発現及びＣＤ８の不発現を示した。これらの結果から、腫瘍細胞の成長抑制では、ｈＴＥＲＴ及び／又はＳＶ４０ＬＴをコードする核酸配列を包含する増殖性Ｔ細胞がＣＡＲ−Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞より優れていることが分かった。
【０２３７】
修飾細胞の作製
最初の健常ヒトＴ細胞（0日目）の単離から、１日目にｈＴＥＲＴ単独（「単独」とはこの一種だけを意味する）、ＳＶ４０ＬＴ単独、ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ＬＴ、ｈＴＥＲＴ＋マウスＣＤ１９ＣＡＲ、ＳＶ４０ＬＴ＋マウスＣＤ１９ＣＡＲ、ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ＬＴ＋マウスＣＤ１９ＣＡＲでヒトＴ細胞を感染させた（図２３を参照）。計６つのグループを測定した。
【０２３８】
ＦＡＣＳによりＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７９、ｍＣＡＲの発現を複数回検出した。そして、細胞を培養し、９２日目に細胞を分析してｍＣＡＲ（マウスＣＡＲ）を検出した。９２日目にｍＣＡＲを再度転移した。９５日目にＥ：Ｔ：１：１、３：１、１０：１、３０：１の比率で共培養（腫瘍とエフェクターとの共培養）を行った（単位：百万細胞）。
【０２３９】
蛍光シグナルを集めることで４時間及び２４時間の傷害作用を測定した。２４時間後、上清（共培養物）を回収し、ＩＦＮ−ｇの放出を測定した。ｍ１９ＣＡＲ（有）とは、感染開始の時に既にｍ１９ＣＡＲが感染された場合を指す。
【０２４０】
図２４、図２５、及び図２６は、複数のＴ細胞の傷害作用を示す蛍光写真である。Ｋ５６２−ＣＤ１９は、Ｋ５６２細胞の表面にＣＤ１９タンパク質（Ｅ：Ｔ：３０：１及び１０：１の比率）を過剰発現することで構築された細胞系であった。結果として、２４時間の傷害作用を示した。不死化Ｔ細胞は、３日間の前にレンチウィルスに感染されたことで、ラット由来のＣＡＲと一緒に転移し、不死化Ｔ細胞のＣＡＲ発現が許容された。その後、死亡させてＩＦＮ−ｇ放出を測定するために、これらの転移した細胞を腫瘍細胞と共培養した。
【０２４１】
図２４では、Ｋ５６２−ＣＤ１９単独は、ｋ５６２−ＣＤ１９自体の細胞状態（腫瘍自体だけで他の細胞を添加しない）を示す。陰性コントロール１０：１では、野生型Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がない（Ｅ：Ｔ：１０：１の比率）ことを示した。陰性コントロール３０：１では、野生型Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がない（Ｅ：Ｔ：３０：１の比率）ことを示した。陽性コントロールｍ１９ＣＡＲ（１１０１）：３０：１では、ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｍＣＡＲに感染したＴ細胞）を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、有意な割合の傷害作用を示した（Ｅ：Ｔ：３０：１の比率）。
【０２４２】
図２５には、不死化細胞に対する有効性検証を示した。Ｓｖ４０ＬＴ単独＋ｍ１９ＣＡＲ（有）１０：１について、不死化Ｔ細胞をマウスｍＣＡＲウィルスに感染させて（ｓｖ４０ＬＴと共に転移して）腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、一定の傷害作用を示した（Ｅ：Ｔ：Ｓｖ４０ｌｔ単独＋ｍ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞１０部と腫瘍細胞１部の比率）。Ｓｖ４０ＬＴ単独＋ｍ１９ＣＡＲ（有）３０：１について、不死化Ｔ細胞をｍＣＡＲウィルスに感染させて（ｓｖ４０ＬＴと共に転移して）腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、良好な傷害作用を示した（Ｅ：Ｔ：３０：１：Ｓｖ４０ｌｔ＋ｍ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞３０部と腫瘍細胞１部の比率）。Ｓｖ４０ＬＴ＋ｈＴＥＲＴ＋ｍ１９ＣＡＲ（有）１０：１について、不死化Ｔ細胞をマウスｍＣＡＲウィルスに感染させて（ｓｖ４０ＬＴ及びｈＴＥＲＴと共に転移して）腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、非常に少ない傷害作用を示した（Ｅ：Ｔ：１０：１：Ｓｖ４０ＬＴ＋ｈＴＥＲＴ＋ｍ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞１０部と腫瘍１部の比率）。Ｓｖ４０ｌｔ＋ｈＴＥＲＴ＋ｍ１  ９ＣＡＲ（有）３０：１について、不死化Ｔ細胞をｍＣＡＲウィルスに感染させて（ｓｖ４０ＬＴ及びｈＴＥＲＴと共に転移して）腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用を示した（Ｅ：Ｔ：Ｓｖ４０ＬＴ＋ｈＴＥＲＴ＋ｍ１９ＣＡＲ  Ｔ細胞３０部と腫瘍細胞１部の比率）。
【０２４３】
図２６には、不死化細胞に対する安全性検証を示した。Ｓｖ４０ＬＴ単独１０：１について、ＣＡＲウィルスに感染していない（ｓｖ４０ＬＴと共に転移した）不死化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：Ｓｖ４０ＬＴ  Ｔ細胞単独１０部と腫瘍細胞１部の比率）。Ｓｖ４０ＬＴ単独３０：１について、ＣＡＲウィルスに感染していない（ｓｖ４０ＬＴと共に転移した）不死化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：Ｓｖ４０ｌｔ  Ｔ細胞単独３０部と腫瘍細胞１部の比率）。ｈＴＥＲＴ単独１０：１について、不死化Ｔ細胞を（ｈＴＥＲＴと共に転移して）腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：ｈＴＥＲＴ  Ｔ細胞単独１０部と腫瘍細胞１部の比率）。ｈＴＥＲＴ単独３０：１について、ＣＡＲウィルスに感染していない（ｓｖ４０ＬＴと共に転移した）不死化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：ｈＴＥＲＴ  Ｔ細胞単独３０部と腫瘍細胞１部の比率）。ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ＬＴ  １０：１について、ＣＡＲウィルスに感染していない（ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ＬＴと共に転移した）不死化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ＬＴ  Ｔ細胞１０部と腫瘍細胞１部の比率）。ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ｌｔ  ３０：１について、ＣＡＲウィルスに感染していない（ｈＴＥＲＴ及びＳＶ４０ＬＴと共に転移した）不死化Ｔ細胞を腫瘍細胞（ＲＫ５６２−ＣＤ１９）と共培養し、傷害作用がないことを示した（Ｅ：Ｔ：ｈＴＥＲＴ＋ＳＶ４０ＬＴ  Ｔ細胞３０部と腫瘍細胞１部の比率）。
【０２４４】
図２７〜３１は、複数の不死化単一細胞のシーケンシング解析を示す図である。分析から、Ｔ細胞傷害機能に関連する特定の遺伝子の発現が増加したので、これらのＴ細胞の細胞毒性が改善されたことが分かった。例えば、野生型Ｔ細胞に比べ、不死化Ｔ細胞においてＧＡＭＡの発現が有意に増加した。
【０２４５】
表１には、上記実験に係るＤＮＡ及び／又はタンパク質ポリペプチド配列をまとめた。
【表１】
2020521479.tif 000003
【０２４６】
図１に示すように、ＣＤ１９  ＣＡＲ（配列番号２１）をコードするレンチウィルスベクター及び配列１又は６を含むレンチウィルスベクター（ｅｆ１ａ−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｒｔＴＡ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴ：５’から３’まで順に、配列番号：１、２、３、４、５、６、又はｅｆ１ａ−ｒｔＴＡ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴ：５’から３’まで順に、配列番号１、４、５、及び６）で、健常ドナーからの初代Ｔ細胞を形質導入して形質導入Ｔ細胞が得られ、前記Ｔ細胞は１日目に抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現した不死化Ｔ細胞（以下、「抗ＣＤ１９  ＣＡＲ増殖性Ｔ細胞」と称する）を含む。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ増殖性Ｔ細胞を各々のグループに分け、様々な濃度のドキシサイクリン（Ｄｏx）、ＣＤ１９細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、及び／又はガンシクロビル（ＧＣＶ）の存在下で異なる培地で培養した。若干のグループにおいて、ＣＤ１９  ＥＣＤ（配列番号２２）を培地（１ｍｇ／２５０，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞）に添加し、ＣＤ１９  ＣＡＲを発現する細胞の百分率が増加した。
【０２４７】
第１グループでは、１日目から、形質導入細胞をＤｏｘ（２μｇ／ｍｌ）含有培地で培養した。４２日目に、ＣＤ１９  ＥＣＤを培地に添加した（ＣＡＲ  Ｔ細胞５００，０００個／可溶性ＣＤ１９  ２マイクログラム）。９０日目に、形質導入細胞に対してフローサイトメトリー分析を行った。図３２は不死化Ｔ細胞におけるＣＡＲ発現のフローサイトメトリー結果を示す。
【０２４８】
第２グループでは、Ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌ）含有培地で形質導入細胞を約９２日間培養し、２つのサブグループに分けた。９２日目に、Ｄｏｘを第１サブグループから除去し、第２サブグループではＤｏｘを維持した。この２つのサブグループでの細胞成長を観察し、その結果を図３３に示した。
【０２４９】
第３グループでは、Ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌ）及びＣＤ１９  ＥＣＤ（１ｍｇ／２５０，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞）を含有する培地で形質導入細胞（ｅｆ１ａ−ＴＫ−ＩＲＥＳ−ｒｔＴＡ−ＴＲＥ−ｈＴＥＲＴ）を培養した。９０日目に、様々な濃度のＧＣＶを形質導入細胞に添加した。この２つのサブグループでの細胞成長を観察し、その結果を図３４〜３６に示した。ＮＴは非形質導入Ｔ細胞を表し、ＧＣＶの存在下で成長し続けた。ＤＴＴ細胞は形質導入Ｔ細胞を表し、ＧＣＶの存在下で成長が悪かった。
【０２５０】
第４グループでは、Ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌ）及びＣＤ１９  ＥＣＤ（１ｍｇ／２５０，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞）を含有する培地で、異なる細胞濃度で形質導入細胞を培養した。９０日目に細胞成長を測定し、その結果を図３７、図３８、及び図４４に示した。
【０２５１】
第５グループでは、Ｄｏｘ（２μｇ／ｍｌ）及びＣＤ１９  ＥＣＤ（１ｍｇ／２５０，０００個のＣＡＲ  Ｔ細胞）を含有する培地で形質導入細胞を培養した。９０日目にこれらの細胞に対して傷害試験を行い、その結果を図３９に示した。
【０２５２】
第６グループでは、形質導入細胞に、ＴＲＡＣ遺伝子での部位特異的変異導入を実現するように構築されたＴＲＡＣ特異的ＺＦＮを導入した。実質的にはUrnovら（2005） Nature 435（7042）：646-651、Lombardoら（2007年11月） Nat Biotechnol. 25（11）：1298-306及び米国特許公開番号２００８／０１３１９６２の書類に開示されるように、各種のＺＦＮを設計してプラスミドベクターに組み込んだ。ＺＦＮは、亜鉛フィンガー結合ドメイン（例えばＺＦＮ左及びＺＦＮ右結合ドメイン）の各種の組合せを含み、これらの組合せは、表１、表２、及び表３に示された。ＺＦＮの切断ドメインは、遺伝子改変ＦｏｋＩ切断ドメイン（配列番号２３又は２４）を含む。一対のＺＦＮをコードするｍＲＮＡ（表２を参照）を形質導入細胞に導入し、ＴＣＲのα鎖に関連する標的ゲノム遺伝子座を修飾した。ＣＤ３の発現を測定し、その結果を図４０〜４２に示した。
【０２５３】
試薬（例えば、ＥＣＤ  ＣＤ１９）及び／又は増殖的修飾（例えば、ｈＴＥＲＴ）の貢献を調べた。図４４には、異なる条件で各グループのＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞成長を示した。Ａ：第１グループ：ＥＣＤ  ＣＤ１９及びＤｏｘを含む培地で増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈＴＥＲＴ）を培養した。第２グループ：Ｄｏｘを含むがＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地で増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈＴＥＲＴ）を培養した。第３グループ：Ｄｏｘ及びＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地でＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養した。Ｂ：第１グループ：ＥＣＤ  ＣＤ１９及びＤｏｘを含まない培地でＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞（ｈ１９ＣＡＲ）を培養した。第２グループ：Ｄｏｘを含むがＥＣＤ  ＣＤ１９を含まない培地でデュアルスイッチ（デュアルスイッチｈ１９ＣＡＲ＋ｄｏｘ）を有する増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養した。第２グループ：Ｄｏｘ及びＥＣＤ  ＣＤ１９を含む培地でデュアルスイッチ（デュアルスイッチｈ１９ＣＡＲ＋ｄｏｘ＋ｃｄ１９）を有する増殖性ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を培養した。これらの結果から、試薬及び／又は増殖的修飾がインビトロでのＣＡＲ  Ｔ細胞の長時間維持に寄与することを示した。
【０２５４】
【表２】
2020521479.tif 000004
【０２５５】
【表３】
2020521479.tif 000005
【０２５６】
抗原発現Ｋ５６２細胞系の構築
各種の抗原をコードする核酸配列を含むレンチウィルスを用いてＫ５６２細胞を形質導入して（図３９）、標的腫瘍細胞系（ｋ５６２−ＣＤ１９腫瘍細胞）を構築した。レンチウィルスはＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（赤色）構築物を含み、前記構築物が抗原の発現を確認するために赤色蛍光をコードする。これらの細胞系から赤色蛍光シグナルが観察され、標的固形腫瘍細胞系を構築することに成功したことを示した（図３９）。細胞系の構築技術は、「Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains Mediate Enhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy」 In Vivo Molecular Therapy、第１７巻第８期、1453-1464、２００９年８月から発見され、前記参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。Ｋ５６２細胞は、米国タイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手した。
【０２５７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の構築
各種のＣＡＲを含むレンチウィルスを用いて初代Ｔ細胞を形質導入し、表１に示す異なる抗原を標的とする異なるＣＡＲ  Ｔ細胞系を構築した。若干の実験において、レンチウィルスは、図２３に示す核酸配列１〜４又は６を含んでもよい。これらの細胞は健常なヒトドナーから得られた。レンチウィルスはそれぞれ、ＣＡＲ分子をコードする核酸配列を含み、さらにＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（緑色）構築物を含み、前記構築物がＣＡＲの発現を確認するために緑色蛍光をコードする。ＣＡＲの発現を測定してＣＡＲ  Ｔ細胞系が特異的抗原分子を発現したことを確認した。細胞培養、レンチウィルスベクター構築及びフローサイトメトリーに関連する技術は、「Treatment of Advanced Leukemia in Micewith mRNA-Engineered T Cells」Human Gene Therapy，22：1575-1586（2011年12月）から発見され、前記参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２５８】
Ｔ細胞傷害試験
ＣＡＲ  Ｔ細胞傷害試験を行ってＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性を測定した。健常ヒトドナーの血液サンプルから初代Ｔ細胞を得た。図２３（図２４〜２６及び図３９）に示すように、ＣＡＲをコードする核酸配列及び核酸配列１〜４又は６を用いてこれらのＴ細胞を形質導入し、フローサイトメトリーによりＴ細胞でのＣＡＲ発現を測定した。
【０２５９】
対応するヒト抗原をコードする核酸配列でＫ５６２細胞をそれぞれ形質導入し、フローサイトメトリーにより抗原発現を測定した。蛍光タンパク質（ＲＦＰ）をコードする核酸配列で別の抗原発現Ｋ５６２細胞を形質導入して傷害試験分析に用いた。各種のＣＡＲ  Ｔ細胞及び対応するＫ５６２細胞を様々なＥ：Ｔ比率（３０：１、１０：１、３：１、１：１）で２４時間インキュベートし、共培養細胞からの赤色蛍光シグナルが観察された。
【０２６０】
インビボ抗腫瘍活性
過去二十年では、ヒト癌細胞又は腫瘍生検組織を免疫不全の齧歯動物（異種移植モデル）に異種移植し、新規な癌の治療剤を開発するための主な前臨床スクリーニングを構成する（Songら、Cancer Res. PMC 2014年8月21日、2159-2169及びMortonら、Nature Protocols，2，247-250 （2007））。ＣＡＲ  Ｔ細胞の体内抗腫瘍活性を評価するために、腫瘍異種移植片を保有する免疫不全マウスをＣＡＲ  Ｔの抗腫瘍活性の評価に用いた。
【０２６１】
Ｋ５６２−ＣＤ１９−ＲＦＰ細胞は、ＣＤ１９腫瘍異種移植片を保有する免疫不全マウスを構築するために用いられた。１２０日目に、Ｋ５６２−ＰＲＬＲ−ＲＦＰ細胞を免疫不全マウスに尾静脈注射した。１２２日目又は１２３日目に、２Ｇｙで免疫不全マウスを放射線照射した。３日目に、免疫不全マウスでは腫瘍細胞の形成が観察された。
【０２６２】
１２３日目に、抗ＣＤ１９ヒトＣＡＲ  Ｔ細胞（即ち、抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ）を免疫不全マウスに注入し、免疫不全マウスでは抗腫瘍活性が観察された。本開示に記載の実施形態で抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製した。注入後から三週間又は四週間後、フローサイトメトリーにより、免疫不全マウスの末梢血を使用してｋ５６２−ＣＤ１９−ＲＦＰ細胞の存在を評価した。コントロールでは、緩衝液を免疫不全マウスに注入し、免疫不全マウスが四週間から六週間で死亡した。抗ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔを注入した免疫不全マウスについては、ｋ５６２−ＣＤ１９−ＲＦＰ細胞が観察されておらず、免疫不全マウスが正常に動いた。免疫不全マウスでは、ヒトＣＤ３細胞がさらに観察された（図４３）。結論として、ＣＡＲ増殖性Ｔ細胞は、マウスで抗腫瘍活性を有する。以下の表４には前記実施形態に関する他の情報を示した。
【０２６３】
【表４】
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【０２６４】
初代Ｔ細胞でのＣＡＲ／抗原の発現
初代Ｔ細胞は患者から得られた。得られた初代Ｔ細胞を２つのグループに分けた。抗ＴＳＨＲ  ＣＡＲをコードする核酸配列（配列番号４９）を含むレンチウィルスベクターで第１グループにおける初代Ｔ細胞を形質導入した。ＴＳＨＲをコードする核酸配列（配列番号４３）を含むレンチウィルスベクターで第２グループにおける初代Ｔ細胞を形質導入した。フローサイトメトリーを行って分析することで、初代Ｔ細胞でのＣＡＲ及びＴＳＨＲの発現をそれぞれ決定した（図４５及び図４６）。細胞培養、レンチウィルスベクター構築及びフローサイトメトリーに関連する技術は、「Control of large，established tumor xenograftswith genetically retargeted human T cells containing CD28 and CD137 domains」 3360-3365 PNAS 2009年3月3日、第106巻第9期に発見され、前記参考文献は、引用により本明細書に組み込まれる。
【０２６５】
インビボでのサイトカイン放出の測定
第１グループ及び第２グループの初代Ｔ細胞をマウスに注入した（実験群）。コントロールとして、第１グループの初代Ｔ細胞単独又は緩衝液をマウスに注入した（第１コントロール及び第２コントロール）。以下の表５には、細胞注入に関するいくつかのパラメーターを示した。ＮＰＧマウスを放射線照射し、所定量のＣＡＲ  Ｔ細胞及び対応するコントロール剤をマウスに注入した。第２コントロールについては、緩衝液をマウスに３回連続して戻した。第１コントロールについては、抗原を発現しないＴ細胞を３回連続して戻した。実験群については、抗原を発現したＴ細胞を３回連続して注入した。注入が完了した後、角膜縁静脈からの血液を回収してマウス末梢血におけるＴ細胞及び因子放出を分析した。その後、マウスを殺し、各臓器におけるＴ比率／ＣＡＲ  Ｔ細胞比率／ＣＡＲ  Ｔコピー及び他のデータを集めた。そして、サイトカイン放出の測定を行った。実験群及びコントロールについて、マウス末梢血における各種のサイトカイン（例えば、ＩＦＮｇ、ＩＬ４、ＩＬ２）を測定した。図４７〜４９に示すように、実験群で放出されたサイトカインは、コントロールよりも量が大きかった。これらの結果から、抗原を発現する細胞の注入により、対応するＣＡＲ  Ｔ細胞のＴ細胞応答を増強したことを示した。以下の表６には、体内分析のスケジュールを示した。
【０２６６】
【表５】
2020521479.tif 000007
【０２６７】
【表６】
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【０２６８】
以上のように、本明細書に記載される治療方法は、他の種又は被験体、例えばヒトに容易に適用される。
【０２６９】
本明細書に引用される全ての出版物、特許、及び特許出願はいずれも、それぞれ個々の出版物、特許、又は特許出願が引用により組み込まれると明らかで個々に指示されるように、引用により全体として本明細書に組み込まれる。各種の実施形態により上述した内容を記載したが、本分野の当業者であれば、その精神を逸脱しない範囲で様々な補正、置換、省略及び変更を行うことができると理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020521479.tif 000023
【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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