(57)【要約】  本開示は、遺伝子解析のための、対立遺伝子の割り当てにおける不明なリードのカバレッジの計算方法に関する。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
不明なリードのカバレッジ（ＣＵＲ）の計算方法であって、
ａ）関心のある遺伝子から配列リードを取得するステップと、
ｂ）前記配列リードを１つ以上の参照の対立遺伝子の配列にマッピングするステップと、
ｃ）全てのマッピングされたリードを２つのセットに分割するステップであって、第１のセットは、選択された参照配列にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含むステップと、
ｄ）選択された対立遺伝子にマッピングすることができない前記第２のセットのリードに基づいて、前記ＣＵＲをそれぞれの位置で計算するステップと
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ＣＵＲが標的のゲノム領域のノイズレベル内にあるか否かを決定するステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法において、実在の対立遺伝子が見落とされているか否か、および／または、誤った対立遺伝子が選択されているか否かを決定するため、バー、ライン、またはシンボルを用いて、前記ＣＵＲを、前記選択された対立遺伝子のカバレッジと共にカバレッジのプロットにおいてプロットするステップを更に具えることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法において、前記対象の遺伝子がＨＬＡ遺伝子であることを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法において、前記対象の遺伝子がＨＬＡ遺伝子ではないことを特徴とする方法。
【請求項６】
ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプを決定する方法であって、
ａ）１つ以上のＨＬＡ遺伝子から配列リードを取得するステップと、
ｂ）前記配列リードを、１つ以上の参照の対立遺伝子の配列にマッピングするステップと、
ｃ）全てのマッピングされたリードを２つのセットに分割するステップであって、第１のセットは、選択された前記参照の対立遺伝子の配列にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含むステップと、
ｄ）選択された対立遺伝子にマッピングすることができない前記第２のセットのリードに基づいて、ＣＵＲをそれぞれの位置で計算するステップと、
前記ＨＬＡ遺伝子のハプロタイプを決定するステップであって、前記ハプロタイプは、最も低いＣＵＲをもたらす対立遺伝子であるステップと
を具えることを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法において、前記ＣＵＲがノイズレベルまで低減されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は一般的に、２倍体ゲノムにおける対立遺伝子の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
２倍体サンプルについて、ゲノムの各遺伝子座には２つの対立遺伝子が存在する。両方の対立遺伝子が同じ場合、遺伝子座はホモ接合型である。そうでない場合、遺伝子座はヘテロ接合型である。遺伝子座がヘテロ接合型である場合、型決定のソフトウェアは、一方の対立遺伝子のみを検出し、他方を見落としている可能性がある。不明なリードのカバレッジは、この場合に存在する２番目の対立遺伝子を示す。
【０００３】
本開示は、この情報に基づいて正しい２番目の対立遺伝子を選択して、この遺伝子座で正確な遺伝子型を取得する手段を当業者に提供し、既存の技術に比べてデータ分析の精度を大いに向上させる。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の一態様は、不明なリードのカバレッジ（ＣＵＲ）の計算方法であって、ａ）全てのマッピングされたリードを２つのセットに分割するステップであって、第１のセットは、選択された対立遺伝子の参照にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含むステップと、ｂ）選択された対立遺伝子にマッピングすることができない第２のセットのリードに基づいて、カバレッジをそれぞれの位置で計算するステップと、ｃ）実在の対立遺伝子が見落とされているか否か、および／または、誤った対立遺伝子が選択されているか否かを決定するため、バー、ライン、またはシンボルを用いて、選択された対立遺伝子のカバレッジと共にＣＵＲをカバレッジのプロットにおいてプロットするステップとを具える方法に関する。
【０００５】
一部の実施形態において、本発明は、不明なリードのカバレッジ（ＣＵＲ）の計算方法を提供する。典型的に、そのような方法は、関心のある遺伝子から配列リードを取得し、配列リードを１つ以上の参照の対立遺伝子の配列にマッピングするステップを具える。リードをマッピングした後で、それらは２つのセットに分割され、第１のセットは、選択された参照配列にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含む。この情報は、選択された対立遺伝子にマッピングすることができない第２のセットのリードに基づいて、不明なリードのカバレッジ（ＣＵＲ）をそれぞれの位置で計算するのに用いられる。そのような方法は、ＣＵＲが標的のゲノム領域のノイズレベル内にあるか否かを決定するステップを含むことができる。一部の実施形態において、本発明の方法は図解で表すことができ、例えば、実在の対立遺伝子が見落とされているか否か、および／または、誤った対立遺伝子が選択されているか否かを決定するため、ＣＵＲは、バー、ライン、またはシンボルを用いて、選択された対立遺伝子のカバレッジと共にカバレッジのプロットにおいてプロットすることができる。一部の実施形態において、対象の遺伝子はＨＬＡ遺伝子である。他の実施形態において、対象の遺伝子はＨＬＡ遺伝子ではない。
【０００６】
一部の実施形態において、本発明は、ＨＬＡ遺伝子座のハプロタイプを決定する方法を提供する。そのような方法は典型的に、１つ以上のＨＬＡ遺伝子から配列リードを取得して、配列リードを１つ以上の参照の対立遺伝子の配列にマッピングするステップを具える。その後、マッピングされたリードは２つのセットに分割され、第１のセットは、選択された参照の対立遺伝子の配列にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含む。その後、ＣＵＲは、選択された対立遺伝子にマッピングすることができない第２のセットのリードに基づいて、それぞれの位置で計算することができる。ＨＬＡ遺伝子のハプロタイプは、最も低いＣＵＲをもたらす参照の対立遺伝子のハプロタイプであると決定される。一部の実施形態において、ＣＵＲはノイズレベルまで低減される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１において、左のパネルはｃＤＮＡの参照配列に沿ったカバレッジを示し、右のパネルは、ゲノムの参照配列に沿ったカバレッジを示す。
【図２】図２は、２つの正しい対立遺伝子のカバレッジのプロットを表す。
【図３】図３は、例を示す。
【図４】図４は、例を示す。
【図５】図５は、選択された対立遺伝子のカバレッジのプロットを示す。
【図６】図６は、遺伝子型決定の精度、および一致を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
説明することを目的として、本開示の完全な理解のために特定の命名法が記載される。しかしながら、これらの具体的な詳細が本開示の態様を実施するのに必要とされないことは当業者には明らかである。特定の用途の説明は、代表例としてのみ提供される。本開示の態様は、示された実施形態に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と矛盾しない可能な限り広い範囲に一致させることを意図している。
【０００９】
配列決定のリードは、ヌクレオチドの断片であり、それは特定の領域で１つの対立遺伝子の配列を表す。次世代シークエンシング技術により、ゲノム上の対象領域を網羅するため、数百万の重複リードを生成することができる。マッピング解析中、それぞれのリードを参照配列と比較し、最良のマッチング配列および位置に整列させることができる。ゲノム上の任意の位置にある「リードカバレッジ」（本明細書では単に「カバレッジ」とも称される）は、マッピング後の位置を網羅する重複リードの数として定義される。通常、選択された対立遺伝子のカバレッジは、選択された対立遺伝子の参照配列にマッピングされたリードから計算することができる。ここで我々は、不明なリードのカバレッジ（ＣＵＲ、ＵＲＣと称されることもある）を、遺伝子座に対するあらゆる可能な対立遺伝子のカバレッジから選択された対立遺伝子のカバレッジを差し引いたものとして定義する。
【００１０】
従来のカバレッジは、選択された対立遺伝子の参照にマッピングされたリードの数を測定する。不明のリードのカバレッジは、選択された対立遺伝子の参照にマッピングすることができないリードの数を測定する。従来のカバレッジは、レビューを経て決定され、一定に保つことができる。しかし、ＣＵＲは、特定の遺伝子座のサンプルで選択された対立遺伝子に関連して定義されるため、対立遺伝子の選択に伴い変化する。正しい対立遺伝子が選択された場合、ＣＵＲがノイズレベルまで低減され、そこでは、遺伝子型コールについて品質尺度が規定される。
【００１１】
遺伝子座にマッピングされた配列リードの全体と、現在の予測される対立遺伝子の固有のカバレッジとを比較することにより、新規の対立遺伝子と、潜在的な対立遺伝子の型決定のミスとを検出することができ、型決定のミスには、誤った対立遺伝子および対立遺伝子のドロップアウトが含まれる。加えて、この方法は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子型に対してＮＧＳショットガンシークエンシング技術を適用するにあたり、クロスコンタミネーション、不十分な配列ラン等の問題を検出することができる。
【００１２】
大半のリードが、選択された対立遺伝子にマッピングすることができる場合、不明なリードのカバレッジは非常に低い。
【００１３】
我々は、本開示の方法が、精度において１％の改善、それを換算すると、驚くことに、リードの誤りが８３％減少することを見出した。このことは、現行方法が大幅に改善されることを表し、より正確に対立遺伝子を一致できることにより、大きな臨床的影響がもたらされる。
【００１４】
本明細書で用いられるように、「ノイズ」という用語は、特定の遺伝子座に与えられるがサンプルの遺伝子型とは一致しないリードに関する。ノイズリードは、シークエンシングのエラー、サンプルのコンタミネーション、及び実験からの他のアーチファクトが原因となり得る。サンプルの特定の遺伝子座における全てのリードのカバレッジは通常、２００倍または２００Ｘを超える。ノイズリードのカバレッジは、０乃至２０Ｘの正常範囲を有する。ｃＤＮＡ、および対立遺伝子のゲノム領域の最小カバレッジは、遺伝子型コールの品質を測定する。ｃＤＮＡ、またはゲノム領域の最小カバレッジが２０Ｘの閾値未満の場合、遺伝子型のコールの信頼度は低い。
【００１５】
図１において、左のパネルはｃＤＮＡの参照配列に沿ったカバレッジを示す。ラインは、遺伝子座ＨＬＡ−Ａについて選択された対立遺伝子のカバレッジを表し、陰影の領域はバープロットを示し、そこでは、それぞれのバーが、１つの位置における不明なリードのカバレッジを表す。右のパネルは、ゲノムの参照配列に沿ったカバレッジを示す。カバレッジ曲線の上にある赤い縦のバーは、選択された対立遺伝子間で多型の位置を示す。陰影領域は、選択された対立遺伝子のカバレッジと比較して、ＣＵＲが非常に低いことを示す。
【００１６】
図２は、２つの正しい対立遺伝子のカバレッジのプロットを表す。陰影領域は、遺伝子座にマッピングされた配列リード全体と、選択された対立遺伝子の固有のカバレッジとの差異を示し、この場合は正しいものである。左のパネルは、ｃＤＮＡの参照配列に対するプロットを示す。右のパネルは、ゲノムの参照配列に対するプロットを示す。
【００１７】
しかし、実在の対立遺伝子が見落とされている場合、カバレッジのプロットからＣＵＲの上昇が見られる。図３及び４は、例を示す。本開示の方法を用いて、ユーザは、他の品質測定法に基づき、見落とされた対立遺伝子を選択して、ＣＵＲを最小レベルに減らすことができる。
【００１８】
図３に示すように、実在する対立遺伝子が遺伝子型の選択で見落とされた場合、カバレッジのプロットは、上昇した陰影領域を示す。これは、多くのデータ量が、選択された対立遺伝子によっては解明できないことを示す。
【００１９】
図４は、２つの選択された対立遺伝子のカバレッジのプロットを示し、そこでは、一方が正しく、もう一方が誤っている。左のパネルの７３乃至３５６、および右のパネルの９８６辺りを中心とする陰影領域は、Ｃ＊０７：０４：０２が、このサンプルで正しい対立遺伝子ではないことを示唆する。
【００２０】
図５は、選択された対立遺伝子のカバレッジのプロットを示し、そこでは、一方が見落とされている。両方のパネルの陰影領域は、このサンプルで一方の対立遺伝子が見落とされていることを示唆する。
【００２１】
本開示の一態様は、ＣＵＲの計算方法であって、ａ）全てのマッピングされたリードを２つのセットに分割するステップであって、第１のセットは、選択された対立遺伝子の参照にマッピングすることができる全てのリードを含み、第２のセットは、残りのリードを含むステップと、ｂ）選択された対立遺伝子にマッピングすることができない第２のセットのリードに基づいて、カバレッジをそれぞれの位置で計算するステップと、ｃ）ＣＵＲが標的のゲノム領域のノイズレベル内にあるか否かを決定するステップとを具える方法に関する。
【００２２】
一部の実施形態において、方法は、実在する対立遺伝子が見落とされているか否か、および／または、誤った対立遺伝子が選択されているか否かを決定するため、バー、ライン、またはシンボルを用いて、ＣＵＲを、選択された対立遺伝子のカバレッジと共にカバレッジのプロットにおいてプロットするステップを更に具える。
【００２３】
一部の実施形態において、方法は、ＮＧＳ  ＨＬＡの型決定に用いられる。
【００２４】
別の実施形態において、方法は、任意の他の２倍体の遺伝子または標的に関する対立遺伝子の遺伝子型決定に用いられる。
【００２５】
実施例１
例えば、ＨＬＡ遺伝子を含むゲノムＤＮＡ等、１つ以上の対象の遺伝子を含むＤＮＡのサンプルは、例えば、米国特許公開第２０１４／０２０６５４７号に見られる標準的な技術を用いて配列決定を行うことができる。要するに、ＰＣＲプライマーは、最も多型であるエクソンおよび介在配列を単一の産物として増幅できるよう、それぞれの遺伝子用に設計することができる。複数の遺伝子を同時に配列決定しようとする場合、増幅断片の末端の表示におけるバイアスを最小限にするために、等モル量のＰＣＲ産物をプールしてライゲーションさせることができる。これらのライゲーションされた産物は、３００乃至３５０ｂｐの平均の断片サイズにランダムに切断され、例えば、製造業者の指示に従ってＩｌｌｕｍｉｎａ社のシーケンサ（ＧＡＩＩＸ、ＨｉＳｅｑ２０００、ＭｉＳｅｑ等）を用いるシークエンシングに備えることができる。
【００２６】
そのようにして得られた配列を、ゲノムの参照配列に対してアラインメントすることができる。ＨＬＡ配列に関して、このように得られた配列を、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴＮプログラムを有するＩＭＧＴ−ＨＬＡデータベースからの配列に対してアラインメントすることができる。２００００を超えるサンプルについて、ＣＵＲと共に分析およびレビューを行った。遺伝子型決定の結果の精度は、ＵＲＣ情報を導入しないソフトウェアによる自動コール、および表１に示したＣＵＲ情報に基づいてユーザが訂正したレビュー済コールの両方について評価される。エラー率は、レビューを経たＵＲＣ情報では８３％減少した。
【００２７】
上記の説明は、当業者に開示の請求項に係る態様およびその実施形態を実施する方法を教示することを目的としており、当業者が記載を読んだ際に明らかとなるであろう全ての明白な修正および変形を詳述することを意図するものではない。しかしながら、そのような明白な修正および変形はすべて本開示の範囲内に含まれることが意図されている。本開示は、文脈が明確に反対を示さない限り、意図される目的を達成するのに有効である任意の順序で成分および工程を網羅することを意図する。本明細書で引用した全ての発明および刊行物は、参照により完全に本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月15日(2019.8.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2020507145.tif 000012
【図６】
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【国際調査報告】
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