(57)【要約】  この書面は、腫瘍壊死因子(TNF)に関連するアポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートに対する抗体を提供し、より具体的には、TRAILショートを中和することができるヒト化TRAILショート抗体を提供する。例えば、1つ以上のヒト化TRAILショート抗体を使用してアポトーシスを(例えば、TRAILが媒介する細胞死、ナチュラルキラー(NK)細胞毒性、及び/又はCD8+ T細胞死滅を介して)誘導するための材料及び方法が提供される。【選択図】図１
2020507580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートに結合する抗体であって、
配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載される相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域(VH)ドメイン;並びに
配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含む軽鎖可変領域(VL)ドメイン
を含む前記抗体。
【請求項２】
前記VHドメインが、配列番号6に対して少なくとも75パーセントの配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、配列番号6に記載されるVHドメイン配列を含むヒト化抗体である、請求項2に記載の抗体。
【請求項４】
前記重鎖が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、及び配列番号13からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項５】
前記VLドメインが、配列番号20に対して少なくとも75パーセントの配列同一性を有する配列を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号20に記載されるVLドメイン配列を含むヒト化抗体である、請求項5に記載の抗体。
【請求項７】
前記軽鎖が、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がキメラ抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項９】
前記キメラ抗体がヒト化抗体である、請求項8に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が抗体の抗原結合断片である、請求項1に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体がTRAILショートを中和する、請求項1に記載の抗体。
【請求項１３】
哺乳動物において腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートを中和する方法であって、
請求項1に記載の抗体を前記哺乳動物に投与すること
を含む前記方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する方法であって、
請求項1に記載の抗体を哺乳動物に投与することを含み、前記抗体が前記哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効である、前記方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記アポトーシスが、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)によって誘導されるアポトーシスを含む、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物細胞におけるナチュラルキラー(NK)細胞の細胞毒性を増加させる方法であって、
請求項1に記載の抗体を哺乳動物に投与することを含み、前記抗体が前記哺乳動物細胞におけるNK細胞毒性を増加させるのに有効である、前記方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
感染症を治療する方法であって、
前記感染症を有する哺乳動物に、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートに結合する抗体を投与することを含み、前記抗体は、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載される相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域(VH)ドメイン、並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含む軽鎖可変領域(VL)ドメインを含み;
前記抗体はナチュラルキラー(NK)細胞毒性を増加させる、前記方法。
【請求項２４】
前記感染症が慢性感染症である、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染症が、ヒト免疫不全ウイルス感染症、B型肝炎ウイルス感染症、及びC型肝炎ウイルス感染症からなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物にTRAILアゴニストを投与することをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
前記TRAILアゴニストが、組換えTRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体、及びTRAILオリゴマーからなる群から選択される、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物に抗レトロウイルス療法を施すことをさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗レトロウイルス療法が、アバカビル、ジダノシン、エムトリシタビン、エンテカビル、ラミブジン、スタブジン、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ザルシタビン、ジドブジン、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ネビラピン、リルピビリン、アデフォビル、テノホビル、エンフビルチド、マラビロク、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ベビリマト、アンプレナビル、フォサンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、チプラナビル、TRIM5アルファ、tatアンタゴニスト、トリコサンチン、ペグ化インターフェロンアルファ(PEG-IFN-a)、ダクラタスビル、エルバスビル、グラゾプレビル、グレカプレビル、ピブレンタスビル、レジパスビル、ソフォスブビル、オンビタスビル、パリタプレビル、リトナビル、ダサブビル、シメプレビル、ベルパタスビル、及びボキシラプレビルからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
癌を治療する方法であって、
前記癌を有する哺乳動物に、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートに結合する抗体を投与することを含み、前記抗体は、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載される相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域(VH)ドメイン、並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含む軽鎖可変領域(VL)ドメインを含み;
前記抗体は、前記癌由来の癌細胞においてアポトーシスを誘導する、前記方法。
【請求項３３】
前記癌が、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、T細胞悪性腫瘍、B細胞悪性腫瘍、膀胱癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌、非扁平上皮非小細胞肺癌、大腸癌、黒色腫、ホルモン受容体陽性乳癌、HER2陽性乳癌、トリプルネガティブ乳癌、子宮頸癌、食道癌、頭頸部癌、腎乳頭細胞癌、腎明細胞癌、腎移行上皮癌、嫌色素性腎細胞癌、肝細胞癌、骨髄腫、及び子宮癌からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
前述の抗体がヒト化抗体である、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物にTRAILアゴニストを投与することをさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３７】
前記TRAILアゴニストが、組換えTRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体、及びTRAILオリゴマーからなる群から選択される、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記哺乳動物に癌治療を施すことをさらに含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌治療が、化学療法剤、放射線療法、近接照射療法、及び外科手術からなる群から選択される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記化学療法剤が、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサラプラチン、テモゾロミド、チオテパ、5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メルカプトプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、及びペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、マイトマイシン-C、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、エチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、L-アスパラギナーゼ、ボルテゾミブ、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、三酸化ヒ素、CHOP(シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロン)、R-CHOP(リツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロン)、トラスツズマブ、ペルツズマブ、イピリムマブ、ジヌツキシマブ、シルツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、ラムシルマブ、ベバシズマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、オララツマブ、デノスマブ、ブリナツモマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブ、エムタンシン、アパチニブ、カボザンチニブ、アレクチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、コビメチニブ、トラメチニブ、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、ラクタシスチン、タモキシフェン、オバトクラックス、ナビトクラックス、ゴシポール、イニパリブ、オラパリブ、ペリフォシン、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、フルベストラント、テムシロリムス、エベロリムス、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ダブラフェニブ、及びビンタフォリドからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
sk-TRAILが媒介する細胞死を妨げる抗体であって、
TRAILショートの細胞外ドメイン;及び
免疫グロブリンFcドメイン
を含む前記抗体。
【請求項４２】
前記免疫グロブリンFcドメインがIgG Fcドメインである、請求項41に記載の抗体。
【請求項４３】
アポトーシスに関連する疾患及び/又は状態を治療する方法であって、
望ましくないアポトーシスに関連する前記疾患及び/又は状態を有する哺乳動物に、sk-TRAILが媒介する細胞死を妨げる抗体を投与することを含み、前記抗体は、TRAILショートの細胞外ドメイン及び免疫グロブリンFcドメインを含み、
前記抗体は、望ましくないアポトーシスに関連する前記疾患及び/又は状態からの細胞におけるアポトーシスを減少させる、前記方法。
【請求項４４】
前記免疫グロブリンFcドメインがIgG Fcドメインである、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
望ましくないアポトーシスに関連する前記疾患及び/又は状態が、心筋梗塞、虚血再灌流傷害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、アルコール消費後の肝傷害、アセトアミノフェン摂取後の肝傷害、及び非アルコール性脂肪性肝炎からなる群より選択される、請求項43に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項43に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年2月10日に出願された米国特許出願第62/457,614号、及び2017年5月30日に出願された米国特許出願第62/512,627号の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる(及び参照により本出願の開示に組み込まれる)。
【０００２】
連邦資金に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたAI120698の下での政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
1. 技術分野
この書面は、腫瘍壊死因子(TNF)関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)ショートに対する抗体、より具体的にはTRAILショートを中和することができるヒト化TRAILショート抗体に関する。例えば、この書面は、アポトーシスを誘導するために1つ以上のヒト化TRAILショート抗体を使用するための材料及び方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
2. 背景情報
TRAILは、免疫細胞及びその他の細胞によって発現される免疫調節タンパク質であり、標的細胞上のTRAIL受容体1(TRAIL-R1)又はTRAIL-R2への結合を介してウイルス感染した細胞又は悪性細胞を死滅させることができる。TRAILショートは、TRAILが媒介する細胞死を遮断することができるTRAILのスプライシング変異体である。TRAILは、5つの同種の受容体、TRAIL-R1、R2、R3、R4、又はオステオプロテゲリンのうちの1つに結合することができるが、TRAIL-R1又はR2への結合のみが、受容体を有する細胞のアポトーシスによる死を誘導する(Wang及びEl-Deiry、2003年 Oncogene 22巻:8628-8633頁)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wang及びEl-Deiry、2003年 Oncogene 22巻:8628-8633頁
【発明の概要】
【０００６】
TRAILショートは、TRAILの新規なスプライス変異体であり、TRAIL-R1(「R1」)及び/又はTRAIL-R2(「R2」)に結合することができる。R1及び/又はR2に結合した場合、TRAILショートは、完全長のTRAILが細胞死を誘導するのを防ぐ(Schneppleら、2011年、J Biol Chem 286巻、35742-35754頁)。
【０００７】
この書面は、TRAILショートに対する抗体(例えば、抗TRAILショート抗体)、より具体的には、TRAILショートを中和することができるが、完全長のTRAILには結合しないヒト化TRAILショート抗体に対するを提供する。この書面はまた、TRAILショートに対する抗体を作製及び使用するための材料及び方法を提供する。例えば、1つ以上のヒト化TRAILショート抗体を使用して、アポトーシスを(例えば、TRAILが媒介する細胞死、ナチュラルキラー(NK)細胞毒性、CD8+ T細胞死滅、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞死、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法を介して)調節する(例えば、増加又は減少させる)ことができる。いくつかの場合において、1つ以上のヒト化TRAILショート抗体を使用して、癌(膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌、肝細胞癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、子宮癌、及び血液癌、例えば、B細胞悪性腫瘍)、及び/又は慢性ウイルス感染症(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染症)を治療することができる。
【０００８】
本明細書において実証されるように、TRAILショートの抗TRAIL効果は、TRAILショート特異的抗体を使用して効果的に中和することができる。TRAILショートの中和は、TRAILが媒介する細胞死、NK細胞毒性、CD8+ T細胞死滅、CAR T細胞死滅、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法によるアポトーシスの誘導に効果的である。
【０００９】
一般的に、この書面の1つの態様は、TRAILショートに結合する抗体を特徴とする。TRAILショート抗体は、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載される相補性決定領域(CDR)を含む重鎖可変領域(VH)ドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含む軽鎖可変領域(VL)ドメインを含み得る。VHドメインは、配列番号6に対して少なくとも75パーセントの配列同一性を有する配列を含み得る。抗体は、配列番号6に記載されるVHドメイン配列を含むヒト化抗体であり得る。重鎖は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、又は配列番号13を含む配列を含み得る。VLドメインは、配列番号20に対して少なくとも75パーセントの配列同一性を有する配列を含み得る。抗体は、配列番号20に記載されるVLドメイン配列を含むヒト化抗体であり得る。VLドメインは、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、及び配列番号26からなる群から選択される配列を含み得る。抗体は、キメラ抗体(例えば、ヒト化抗体)であり得る。抗体は、抗体の抗原結合断片であり得る。抗体は、モノクローナル抗体であり得る。抗体は、TRAILショートに結合し得る。抗体は、TRAILショートを中和し得る。いくつかの場合において、抗体は、二重特異性であり得る(例えば、TRAILショートに結合する抗原結合断片、及び細胞表面抗原(細胞表面マーカーとも呼ばれる)等の別の抗原に結合する抗原結合断片を含み得る)。
【００１０】
別の態様では、この書面は、哺乳動物におけるTRAILショートを中和する方法を特徴とする。本方法は、哺乳動物に、本明細書に記載されるTRAILショートに結合する抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)を投与することを含むか又はそれから本質的になる。哺乳動物は、ヒトであり得る。抗体は、ヒト化抗体であり得る。
【００１１】
別の態様では、この書面は、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導する方法を特徴とする。本方法は、哺乳動物に、本明細書に記載されるTRAILショートに結合する抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)を、抗体が、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な条件下で投与することを含むか又はそれから本質的になる。哺乳動物は、ヒトであり得る。抗体は、ヒト化抗体であり得る。アポトーシスには、TRAIL誘導アポトーシスが含まれる。
【００１２】
別の態様では、この書面は、哺乳動物細胞におけるNK細胞の細胞毒性、CD8+ T細胞死滅、CAR T細胞死滅、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法を増加させる方法を特徴とする。本方法は、哺乳動物に、本明細書に記載されるTRAILショートに結合する抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)を、抗体が、哺乳動物細胞においてNK細胞毒性、CD8+ T細胞死滅、CAR T細胞死滅、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法を増加させるのに有効な条件下で投与することを含むか又はそれから本質的になる。哺乳動物は、ヒトであり得る。抗体は、ヒト化抗体であり得る。
【００１３】
別の態様では、この書面は、感染症の治療する方法を特徴とする。本方法は、感染症を有する哺乳動物に、TRAILショートに結合する抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)を、抗体がNK細胞毒性、CD8+ T細胞死滅、CAR T細胞死滅、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法を増加させる条件下で投与することを含むか又はそれから本質的になる。感染症は、慢性感染症(例えば、HIV感染症)であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。抗体は、ヒト化抗体であり得る。本方法はまた、哺乳動物にTRAILアゴニスト(例えば、組換えTRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体、又はTRAILオリゴマー)を投与することを含み得る。本方法はまた、哺乳動物に抗レトロウイルス療法(例えば、アバカビル、ジダノシン、エムトリシタビン、エンテカビル、ラミブジン、スタブジン、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ザルシタビン、ジドブジン、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ネビラピン、リルピビリン、アデフォビル、テノホビル、エンフビルチド、マラビロク、ドルテグラビル、エルビテグラビル、ラルテグラビル、ベビリマト、アンプレナビル、フォサンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、チプラナビル、TRIM5アルファ、tatアンタゴニスト、又はトリコサンチン)を施すことを含み得る。
【００１４】
別の態様では、この書面は、癌を治療する方法を特徴とする。本方法は、癌を有する哺乳動物に、TRAILショートに結合する抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン;並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)を、抗体が癌からの癌細胞においてアポトーシスを誘導する条件下で投与することを含むか又はそれから本質的になる。癌は、例えば、子宮頸癌、頭頸部癌、リンパ腫、白血病、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、又はB細胞悪性腫瘍であり得る。哺乳動物は、ヒトであり得る。抗体は、ヒト化抗体であり得る。本方法はまた、哺乳動物にTRAILアゴニスト(例えば、組換えTRAIL、抗TRAIL-R1抗体、抗TRAIL-R2抗体、又はTRAILオリゴマー)を投与することを含み得る。本方法はまた、哺乳動物に癌治療(例えば、化学療法剤、放射線療法、近接照射療法(brachytherapy)、又は外科手術)を施すことを含み得る。癌治療が化学療法剤である場合、化学療法剤は、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサラプラチン、テモゾロミド、チオテパ、5-フルオロウラシル(5-FU)、6-メルカプトプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、及びペメトレキセド、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、マイトマイシン-C、ミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、テニポシド、ミトキサントロン、ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、プレドニゾン、エチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、L-アスパラギナーゼ、ボルテゾミブ、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、三酸化ヒ素、CHOP、R-CHOP、トラスツズマブ、ペルツズマブ、イピリムマブ、ジヌツキシマブ、シルツキシマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ネシツムマブ、ラムシルマブ、ベバシズマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、オララツマブ、デノスマブ、ブリナツモマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、オビヌツズマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、エロツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブ、エムタンシン、アパチニブ、カボザンチニブ、アレクチニブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トファシチニブ、コビメチニブ、トラメチニブ、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、ラクタシスチン、タモキシフェン、オバトクラックス、ナビトクラックス、ゴシポール、イニパリブ、オラパリブ、ペリフォシン、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、トラメチニブ、アベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、トリラシクリブ、フルベストラント、テムシロリムス、エベロリムス、ベムラフェニブ、トラメチニブ、ダブラフェニブ、及びビンタフォリドからなる群から選択され得る。
【００１５】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が関する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似又は同等の方法及び材料を使用して本発明を実施することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載されているすべての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、及び実施例は例示のみであり、限定することを意図しない。
【００１６】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図1は、TRAILショートが非感染細胞とHIV感染細胞の両方で産生されることを示す。HIV陽性患者(HIV+;N=6)及びHIV陰性対照(HIV-;N=3)からの初代CD4 T細胞における単一の細胞遺伝子発現をFluidigm技術により評価した。A)単一のHIV陽性患者の単一細胞におけるTRAIL、TRAILショート、mRNAレベル、及び細胞表面マーカーのmRNA転写産物の発現の代表的なヒートマップ。B)HIV+及びHIV-患者(Pts)の細胞におけるHIV mRNA遺伝子発現。C)HIV+及びHIV-Ptsの細胞におけるHLA-DR遺伝子発現。D)HIV+及びHIV-Ptsの細胞におけるTRAILショートメッセージの発現。E)HIV遺伝子の細胞発現により決定される、HIV+及びHIV-細胞におけるTRAILショート発現。F)TRAILを発現するか又はTRAILを発現しない単一細胞におけるTRAILショート発現。G)休止期(CD25-、CD38-及びHLA-DR-)又は活性化(CD25、CD38、及び/又はHLA-DRのいずれか発現)におけるTRAILショート発現。H)T細胞サブセットにおけるTRAILショート発現-RTE:最近の胸腺移出;TCM:中央記憶T細胞;TEM:エフェクター記憶T細胞;TTM:移行記憶T細胞。
【図２】図2は、I型インターフェロンがTRAILショートの産生を駆動することを示す。A、B、及びCについて、一次非感染の休止期(CD25-、CD69-、HLA-DR-)CD4 T細胞は刺激されていないか、又はインターフェロン(A)、インターロイキン(B)、若しくは他の生物活性タンパク質(C)のいずれかで刺激され、TRAILショートmRNAはqRT-PCRで測定された。D)付随するTRAIL及びTRAILショートmRNAの発現を試料間で比較した。E)休止期CD4 T細胞を図示されるように刺激し、TRAILショートタンパク質発現をウエスタンブロットにより評価した。F)PBMCは、ビヒクル対照、TLR7、8若しくは9アゴニスト又はTL9不活性対照で24時間処理され、TRAILショートmRNA発現を測定した。G)(F)におけるPBMC及びTRAILショートmRNAを測定した場合と同様に、休止期の単離されたCD4 T細胞を処理した。H)PBMCを(F)のように処理し、24時間後、CD4 T細胞を分離し、TRAILショートmRNAをCD4サブセットにおいて測定した。データは、処置あたり5回の独立した実験の平均(SEM)を表す。P<0.05は、統計的に有意とみなされた。
【図３】図3は、TRAILショートのC末端が細胞外にあり、TRAIL「死」受容体と相互作用するが、TRAIL「デコイ」受容体とは相互作用しないことを示す。A)TRAILFL及びTRAILショートのエクソン、サイトゾル、膜貫通、細胞外、及び3'非翻訳領域(UTR)の概略アライメント。B)ECドメインにクローン化されたc-mycでTRAILショートを一過的に発現する293T細胞を抗c-myc抗体又はアイソタイプ対照で染色した。キー:グレー塗り潰し(eGFP+アイソタイプ対照を伴うTRAILショートmyc);破線(eGFP、抗myc);実線(eGFP+TRAILショート、抗myc)。C)C末端FLAGタグ付きTRAIL R1又はR2を一過的に発現する293T細胞の溶解物は、N末端HAタグ付きTRAILFL又はN末端HAタグ付きTRAILショート(パネル上部に表示される)を発現する細胞からの溶解物と組み合わせ、次に、抗HA抗体で免疫沈降した。複合体化されたタンパク質は分離され、FLAG又はHAについて免疫ブロットされた。総インプット溶解物は、下の2つのパネルに表示される。D)デコイTRAIL受容体R3及びR4を発現する293T細胞の溶解物は、N末端HAタグ付きTRAILFL又はN末端HAタグ付きTRAILショート(パネル上部に表示される)を発現する細胞からの溶解物と組み合わせ、次に、抗HA抗体で免疫沈降した。複合体化されたタンパク質は分離され、FLAG又はHAについて免疫ブロットされた。総インプット溶解物は、下の2つのパネルに表示される。E)TRAIL受容体R1、R2、R3及びR4へのTRAILショートの結合は、ELISAにより決定された。F)共焦点顕微鏡により可視化されたTRAIL受容体R1、R2、R3及びR4へのTRAILショートの結合。示されているデータは、4つの独立した実験の代表的なものである。
【図４】図4は、TRAILショートが細胞外小胞に含まれていることを示す。A)GFP-TRAILショートを一過的に発現するJurkat T細胞を共焦点顕微鏡で分析し、細胞をDAPIで対比染色した。B)HIV感染及び非感染(NI)のJurkat T細胞の膜又は細胞質画分をHSP 70(サイトゾル選択性タンパク質)又はTRAILショートについて分析した。C)HIV感染及び非感染(NI)のJurkat T細胞から細胞質、膜、及び上清画分を調製し、抗TRAILショート抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析した。D)PHA刺激したCD4+細胞の細胞外小胞を固定し、リンタングステン酸で染色し、次に、電子顕微鏡で分析した。スケールバー、2μm。E)PHA刺激及び非刺激のCD4+細胞からの細胞外小胞をTRAILショートのウエスタンブロッティングにより分析した。F)HA-TRAILFL及びHA-TRAILショートを一過的に発現する293T細胞から精製した細胞外小胞調製物のウエスタンブロット分析。G)eGFP-TRAILショート単独、Ruby-TRAILFL単独をトランスフェクトした293T細胞の上清からの細胞外小胞調製物のフローサイトメトリー分析。H)HA-TRAILFL単独、HA-TRAILショート単独でトランスフェクトした、又は1:1又は1:2の比率のHA-TRAILFL/HA-TRAILショートで同時トランスフェクトした293T細胞の上清からの細胞外小胞を使用して、標的Jurkat T-細胞を処置した。アポトーシス活性は、切断されたカスパーゼ3についてJurkat細胞を染色することにより決定された。I)(H)からの293T細胞の細胞外小胞におけるHA-TRAILFL及びHA-TRAILショート発現のウエスタンブロット確認。J)培養中の対照、HIV感染、及び模擬感染した初代CD4 T細胞からの上清は、示されているように微小胞又はエキソソーム画分に分離され、TRAILショート特異的モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで分析された。
【図５】図5は、TRAILからのTRAILショート保護が隣接する細胞に移行することができることを示す。A)TRAILFL、TRAILショート、又はそれらの両方のいずれかを発現するエフェクター293T細胞をCTO標識した標的Jurkat T細胞と混合した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリーで分析し、Cell Tracker Orange(CTO)陽性(Jurkat)集団をゲーティングし、生細胞/死細胞について染色した。B)293T細胞を1、2、5、10、又は20μgのN末端HAタグ付きTRAILFL単独でトランスフェクトし、抗HA抗体を用いたウエスタンで分析した。C)293T細胞を1、2、5、又は10μgのTRAILショート及び一定の10μgのTRAILFLで同時トランスフェクトし、ウエスタンブロットで分析した。D)293Tエフェクター細胞を(B)からTRAILFLの増加量でトランスフェクトし、CTO+標的Jurkat細胞と共培養し、CTO+Jurkat細胞の死滅パーセンテージを決定した。E)一定のTRAILFLで増加量のTRAILショートを同時トランスフェクトした(D)からの293Tエフェクター細胞を標的細胞と共培養し、(C)のように分析した。F)N末端Ruby-タグ付け-TRAILショート(Ruby-TRAILショート)、膜貫通ドメインを欠損している構築物(Ruby-TRAILショートΔTM)、及びRubyタグ単独(下部パネル)をコードするプラスミドの概略図。これらの構築物でトランスフェクトした293T細胞からの溶解物の抗TRAILショート抗体及び抗アクチン対照を使用したウエスタン分析(上部パネル)。G)293T細胞を(F)の構築物でトランスフェクトし、代表的な顕微鏡写真を示す(上部パネル)。293Tをトランスフェクトした細胞からの上清を回収し、標的HeLa細胞を処理するために使用し、次に、共焦点顕微鏡で分析した。DAPIで染色したHeLa核及びruby-TRAILショート又はRuby-TRAILショートΔTMフィルターチャネルを重ね合わせた代表的な顕微鏡写真を示す(下部パネル)。Ruby TRAILショートを発現する293T細胞からの上清で処理されたHeLa細胞のみが、原形質膜上に点状の表面局在化Ruby TRAILショートを有する。H)Ruby、Ruby-TRAILショート、又はRuby-TRAILショートΔTMをトランスフェクトした293Tの上清で前処理された(G)のHeLa細胞をスーパーキラー(sk)-TRAILで処理した。細胞死滅は、経時的な活性カスパーゼ3染色によって定量化された。一番右の時間点で、4つのトレースは、上部から下部に、sk-TRAIL+Ruby、sk-TRAIL+Ruby-TRAILショートΔTM、sk-TRAIL+培地、sk-TRAIL+Ruby-TRAILショートΔTMである。4つの独立した実験の代表的なデータ。P<0.05は、線形回帰により統計的に有意とみなされた。
【図６】図6は、TRAILショートがPESTドメインを含み、プロテアソームによってユビキチン化され、及び分解されることを示す。A)293T細胞をN末端HAタグ付きTRAILショートでトランスフェクトし、シクロヘキシミド(100μg/mL)で処理し、抗HA抗体によるウエスタン分析によって、示された時間で分析した。B)TRAILショートの推定PESTドメインは、TRAILショートのペプチド配列の下に「+」で示される。C)プロリン76からアラニン(P76A)への突然変異は、TRAILショートのPESTドメインに操作され、細胞を(A)のようにシクロヘキシミドの存在下でトランスフェクト及び分析した。D)HAタグ付きTRAILショートを293T細胞にトランスフェクトし、抗HA抗体で免疫沈降し、次に、免疫沈降物をLys48とLys63の間のユビキチン連結(OTUB1、AMSH、OOTUD3、TRABID、OTUD7B、YOD1、Otulin、又はUP2)を区別する様々な脱ユビキチン化酵素(DUB)で処理した。処理した試料をSDS-PAGEで分離し、ユビキチンについて免疫ブロットした。E)TRAILショートでトランスフェクトされた293T細胞をMG132の存在下で示された時間、インキュベートし、次に、回収し、抗TRAILショートを用いてウエスタンにより分析した。F)P76A突然変異体においてTRAILショート発現が増加する。TRAILショート及びP76A TRAILショートを293T細胞にトランスフェクトし、TRAILショートについてフローサイトメトリーにより(下部パネル)又はアイソタイプ対照抗体(上部パネル)を用いて分析した。すべてのデータは、少なくとも3つの独立した実験の代表的なものである。
【図７】図7は、TRAILショートがTRAIL耐性を引き起こすのに必要及び十分であることを示す。A)TRAILショートを恒常的に発現するJurkat T細胞は、増加量の抗TRAILショート抗体の存在下又は非存在下で、sk-TRAILの添加により死滅するように誘導された。細胞死は、活性カスパーゼ3染色によって測定された。対照細胞は、増加する抗TRAILショート抗体単独で処理された。右端の時間点で、上部の4つのトレースは、上から下に、5μg/mL抗TRAILショート、2.5μg/mL抗TRAILショート、1μg/mL抗TRAILショート、及び0μg/mL抗TRAILショートである。B)TRAILショートを発現しないHeLa細胞は、Fcに融合したTRAILショートの細胞外ドメインからなる増加量の融合タンパク質(Ts-ECD:Fc)の非存在下若しくは存在下でsk-TRAILの添加により死滅するように刺激され、又はウシ血清アルブミン(BSA)対照を用いて刺激され、(A)のように分析された。追加の対照細胞は、増加するTRAILショート-ECD:Fc単独で処理された。右端の時間点で、上部の5つのトレースは、上から下に、0μg/mL抗TRAILショートECD:Fc、10μg/mL BSA、5μg/mL抗TRAILショートECD:Fc、2.5μg/mL抗TRAILショート-ECD:Fc、及び10μg/mL抗TRAILショート-ECD:Fcである。データは、6つの独立した実験の代表的なものである。
【図８】図8は、TRAILショートの過剰発現がNK細胞の細胞毒性を低下させることを示す。A)ウエスタンブロットは、Jurkat細胞におけるTRAILショート-EGFP-C1の過剰発現を示す。B)NK細胞は、CTOで標識されたJurkat細胞と共培養され、活性化されたカスパーゼ-3について染色された。C)細胞毒性アッセイは、E:Tt比を増加させたTRAILショート又は対照プラスミドの存在下で、Jurkat細胞を用いて行われた。EGFP-C1は左側にあり、TRAILショート-EGFP-C1はすべての場合において右側にある。
【図９】図9は、HIV IIIBがNK細胞のTRAILショートの表面発現を誘導することを示すフローサイトメトリーを含む。NK細胞は、HIV IIBウイルス又はGp120組換えタンパク質を含む培養上清とともにインキュベートされ、TRAILショート及びTRAILFLの表面発現について染色された。
【図１０】図10は、TRAILショートが、NK活性化に影響を与えないことを示すグラフを含む。NK細胞は、TRAILショートを過剰発現するJurkat細胞とともに共培養され(灰色のバー)、単離され、CD16、パーフォリン、CD107、及びCD69について染色された。
【図１１】図11は、A) どのようにTRAILショートが標的細胞上のTRAIL受容体1及び/又は2を占有し、したがって、TRAILが媒介する細胞死を防ぐか;B)どのようにTRAILショート抗体がTRAILショートに結合及びブロックし得、TRAILがR1又はR2に結合してアポトーシスを誘導することを可能にするか、を示す模式図を含む。
【図１２】図12は、代表的な抗TRAILショート抗体の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)のアミノ酸配列を含む。A.4つのヒト化VH変異体:VH1(配列番号5)、VH2(配列番号6)、VH3(配列番号7)、及びVH4(配列番号8)とともにアライメントしたマウスVH(VH0)配列(配列番号4)を含むアミノ酸配列アラインメント。CDRに下線を引く。B.4つのヒト化VL変異体:VL1(配列番号18)、VL2(配列番号19)、VL3(配列番号20)、及びVL4(配列番号21)とともにアライメントしたマウスVL(VL0)配列(配列番号17)を含むアミノ酸配列アラインメント。CDRに下線を引く。
【図１３−１】図13は、ヒト化抗TRAILショート抗体のアミノ酸配列を含む。A.ヒト化重鎖HC0(配列番号9)、HC1(配列番号10)、HC2(配列番号11)、HC3(配列番号12)、及びHC4(配列番号13)のアミノ酸配列。B.ヒト化重鎖LC0(配列番号22)、LC1(配列番号23)、LC2(配列番号24)、LC3(配列番号25)、及びLC4(配列番号26)のアミノ酸配列。
【図１３−２】図13-1の続きである。
【図１４−１】図14は、抗TRAILショート抗体(2.2)のインビボ投与が、白血病細胞の数を減少し、マウスの生存期間を延長できることを示す。A)抗TRAILショート抗体(左パネル)又はアイソタイプ対照(IC;右パネル)で27日目に、及び抗TRAIL受容体2(抗DR5)抗体で翌日(例えば、28日目)に処置されたマウスにおける52日目での代表的なルシフェラーゼ発現を示す写真。B)抗TRAILショート抗体(左パネル)又はアイソタイプ対照(IC;右パネル)で27日目に、及び抗TRAIL受容体2(抗DR5)抗体で翌日(例えば、28日目)に処理されたマウスにおける45日目でのルシフェラーゼ発現を示すグレースケール表示に最適化された写真。C)点線で示される27日目にIC又は抗TRAILショート抗体で処理され、破線で示される28日目に抗TRAIL受容体2(抗DR5)抗体で処理されたマウスにおけるルシフェラーゼ発現を示すグラフ。D)点線で示される27日目にIC又は抗TRAILショート抗体で処理され、破線で示される28日目に抗TRAIL受容体2(抗DR5)抗体で処理されたマウスにおける生存パーセントを示すグラフ。E)点線で示される20、27、及び34日目にIC又は抗TRAILショート抗体で処理されたマウスのルシフェラーゼ発現を示すグラフ。F)点線で示される20、27、及び34日目にIC又は抗TRAILショート抗体で処理されたマウスの生存パーセントを示すグラフ。
【図１４−２】図14-1の続きである。
【図１５−１】図15は、異なる癌細胞株におけるsk-TRAIL細胞毒性における抗TRAILショート抗体の効果を示すグラフを含む。癌細胞を抗TRAILショート抗体2.2(Ts 2.2)又はIgG3対照とともにプレインキュベートし、次に、sk-TRAILを細胞に添加した。細胞死(カスパーゼ3/7+)は、経時的に、A)Jeko及びHBL1リンパ腫白血病細胞、B)L3.6、BxPc3、及びMiapaca膵臓癌細胞、C)MeLa 15、sk-mel-28、C32TG、及びA375黒色腫細胞、及びD)TYKNU、Kuramochi、hOvtax2、CaOv3、COV362、PEO1、OVCAR5、及びOvcar8卵巣癌細胞において測定された。示されている場合、p値は、抗TRAILショート抗体2.2を添加したsk-TRAIL対sk-TRAIL単独を基準とする。
【図１５−２】図15-1の続きである。
【図１５−３】図15-1の続きである。
【図１６】図16は、様々な癌細胞におけるTRAILショート(TRAIL-s)mRNAの定量化を示すグラフを含む。qRTPCRを使用して、TRAIL-s標準を使用してTRAIL-sのコピー数を計算した。
【図１７】図17は、TRAILショート2.2抗体を使用して染色した組織を示す免疫組織化学画像を含む。正常、及びTRAILショートについて陽性に染色された対応する癌組織の例が示される(上部パネル)。悪性試料の40倍の倍率もまた示される(下部パネル)。膵臓、胃、及び前立腺癌組織は、非悪性組織と比較して、TRAILショートの発現が有意に上昇している。
【図１８】図18は、TRAILショート発現が組織マイクロアレイの免疫組織化学で観察されることを示す。図は、1:400希釈の抗TRAIL-ショート抗体2.2を使用して行われた8つの組織マイクロアレイ(TMA)の概要である。内側の円は、TRAIL-ショート染色が陽性であるそのアレイにおけるケースのパーセントを表す。外側の円は、次のように計算される免疫反応スコアを表す。組織陽性パーセント(0〜25%=1、26〜50%=2.51〜75%=3及び76〜100%=4)×染色の強度(ネガティブ=0、弱い=1、中程度=2、及び強い=3)。
【図１９】図19は、TRAILショートが多数のヒト腫瘍で見られることを示す。100万キロベースあたりの読み取り(RPKM)として定量化されたTRAILショートレベルは、様々なヒト腫瘍で示される。データは、Cancer Genome Atlas(TCGA)から決定された。
【図２０−１】図20は、TRAILショートのレベルの増加が一部のヒト腫瘍の生存率の低下と関連していることを示す。生存率は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(A)、結腸及び直腸腺癌(B)、嫌色素性腎細胞癌(C)、膵臓腺癌(D)、及び胸腺腫(E)を有する患者のカプランマイヤー分析によって評価された。P値は示される通りである。
【図２０−２】図20-1の続きである。
【図２１】図21は、抗TRAILショート抗体がTRAILショート抗原と相互作用することを検証する。HEK293T細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)(上段)、GFP-TRAILショート(中段)、又はGFP-TRAILFL(下段)をコードするプラスミドでトランスフェクトされた。細胞は、抗TRAILショート抗体、二次ヤギ抗マウスフィコエリトリン(PE)(中段の左列)、及び4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(中段の右列)で染色された。細胞は、共焦点顕微鏡によって、PEラベル(赤色;左端の列)、GFP(緑色;中段の左列)、及びDAPI染色核(青色;中段の右列)について分析された。3色すべての重ね合わせた複合画像もまた示される(重ね合わせ、右端の列)。
【図２２】図22は、抗TRAILショート抗体クローンHC2LC3が3.8pMの親和性を示し、sk-TRAIL(1ng/ml)の存在下で有意な相乗的死滅を示したことを示す。
【図２３−１】図23は、一部の患者由来細胞が抗TRAILショート抗体+sk-TRAILに応答性であったことを示す。血液悪性腫瘍の疑いで脾臓摘出術を受けた患者の脾臓由来の細胞を新たに単離し、何もしない(対照)、スーパーキラーTRAIL(sk-TRAIL、オリゴマー化TRAILアゴニスト)、ヒト化抗TRAILショート抗体(クローンHC2LC3)、又はアイソタイプ対照抗体(IgG4)で示された濃度(及び単独又は示された組み合わせ)により処理した。Incucyte生細胞イメージングプラットフォームを使用して、経時的な活性カスパーゼ3/7活性を分析することにより、経時的に細胞死を監視した。A)血管免疫芽球性T細胞リンパ腫を有する患者からの結果(下部パネルは、同じ診断で異なる症例のTRAILショートのIHCを示し、TRAILショートの有意な発現を示す)。B)ホジキンスリンパ腫を有する患者からの結果(下部パネルは、同じ診断で異なる症例のTRAILショートのIHCを示し、TRAILショートの最小発現を示す)。C)再発性B細胞リンパ腫を有する患者からの結果(下部パネルは、同細胞のTRAILショート、TRAIL、DR4、DR5のフローサイトメトリーを示す)。D)マントル細胞リンパ腫を有する患者由来の結果(下部パネルは、同細胞のTRAILショート、TRAIL、DR4、DR5のフローサイトメトリーを示す)。E)非ホジキンリンパ腫B細胞系統/サイクリンD陽性の患者からの結果。
【図２３−２】図23-1の続きである。
【図２３−３】図23-1の続きである。
【図２３−４】図23-1の続きである。
【図２４−１】図24は、異なるヒト患者由来の癌細胞株におけるsk-TRAIL細胞毒性に対する抗TRAILショート抗体の効果を示すグラフを含む。患者脾臓由来の細胞は、RPMIで新鮮な状態で受け取り、抗TRAIL-ショートクローンHC2LC3の増加用量(1.25、2.5、又は5μg)の存在下又は非存在下で、1ng/mL用量のsk-TRAILの存在下で細胞毒性に対する感受性について試験された。対照を同用量のヒトIgG4で処理した。細胞死は、切断されたカスパーゼ3/7陽性の細胞数によって、72時間にわたって2時間ごとにモニターされた。パネルA〜Iに示される癌の種類は、ラベル通りである。
【図２４−２】図24-1の続きである。
【図２４−３】図24-1の続きである。
【図２５】図25は、多数のヒト患者由来の癌細胞株におけるsk-TRAIL単独の応答性よりも高い、抗TRAILショートプラスsk-TRAILに対する応答性を示す。1ng/mL用量のsk-TRAIL単独又はsk-TRAIL(同じ用量)+5μg/mL用量の抗TRAILショートクローンHC2LC3の処理48時間後の死細胞数が示される。応答性は、抗TRAILショート抗体の添加後の死細胞数の統計的に有意な増加として定義された。ペアt検定の統計が示される。
【図２６】図26は、単独及びsk-TRAILとの組み合わせの両方で、抗TRAILショートに対するヒト患者由来細胞株の応答性の概要結果を示す。応答性は、sk-TRAIL単独による処置と比較して、死細胞数の統計的に有意な増加として定義された。
【図２７】図27は、抗TRAILショートに応答する細胞株におけるTRAILショート発現の増加を示す。A)様々な応答性及び非応答性の細胞株におけるリアルタイムqPCRを使用したTRAILショートmRNAのコピー数の定量。B)CF555又はアイソタイプにコンジュゲートされた抗TRAIL-ショート2.2又はアイソタイプをフローサイトメトリーを使用して3つの細胞株を染色することにより測定されたTRAILショート陽性のパーセント。
【図２８−１】図28は、293T細胞及び患者由来の腫瘍組織におけるTRAILショート発現を示す。1:400希釈の抗TRAILショート抗体を使用して、TRAILショートについて染色した免疫組織化学スライドを示す図である。A)左の列は、EGFPでトランスフェクトされた293T細胞(20×倍率)を示し、右の列は、TRAILショートEGFPでトランスフェクトされた293T細胞(20×倍率)を示し、TRAILショートに特異的な抗体(茶色に見える)で染色された。上段は複合画像であり、中段は青色に染色された画像のコンポーネントであり、下段は茶色に染色された画像のコンポーネントである(TRAILショートについて染色された)。B)20×(左)及び40×(右)倍率での膵臓腺癌患者の組織。上段は複合画像であり、中段は青色に染色された画像のコンポーネントであり、下段は茶色に染色された画像のコンポーネントである(TRAILショートについて染色された)。C)20×(左)及び40×(右)倍率での扁平上皮癌扁桃腺患者の組織。上段は複合画像であり、中段は青色に染色された画像のコンポーネントであり、下段は茶色に染色された画像のコンポーネントである(TRAILショートについて染色された)。
【図２８−２】図28-1の続きである。
【図２８−３】図28-1の続きである。
【図２９】図29は、ヒトJurkat T細胞リンパ腫細胞を移植したNSGマウスが、抗DR5抗体と抗TRAILショート抗体の組み合わせで効果的に処置されることを示す。確立された腫瘍は、14日ごとに10mg/kgの(i)TRAILショートのアイソタイプ対照とDR5抗体のアイソタイプ(アイソタイプと称する)、(ii)抗TRAILショート抗体クローン2.2+抗DR5(抗TRAILショートと称する)、(iii)抗TRAILショート抗体+抗DR5抗体のアイソタイプ対照(アイソタイプ対照+抗DR5と称する)、又は(iv)抗TRAILショート(2.2)+抗DR5のいずれかで、示した通りに2週間ごとに処理された。A)経時的に、マウスを全身イメージングによりルシフェラーゼ発現について分析した。B)カプランマイヤー分析によって評価された生存。
【図３０】図30は、抗TRAILショート抗体+アイソタイプ対照、又は抗TRAILショート抗体+抗DR5抗体が、ヒト癌のマウス異種移植モデルにおける腫瘍成長の抑制をもたらすことを示す。NSGマウスにヒトびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(HBL-1)細胞株を皮下に移植し、腫瘍サイズを毎日測定した。腫瘍が100立方mmを超えるか又はそれに等しいサイズに達した場合、マウスは、14日ごとに10mg/kgの(i)TRAILショート及びDR5抗体のアイソタイプ対照(IC+IC)、(ii)抗TRAILショート抗体クローン2.2+抗DR5のアイソタイプ対照(2.2+IC)、(iii)抗TRAILショート抗体+抗DR5抗体のアイソタイプ対照(IC+DR5)、又は(iv)抗TRAILショート(2.2)+抗DR5抗体(2.2+DR5)のいずれかによって示される通りに毎週IP注射によって、示された処置を受けた。A)経時的に、マウスは、ベースラインから計算された腫瘍サイズ及び倍率変化について分析された。B)カプランマイヤー分析によって評価された生存。
【図３１−１】図31は、TRAILショートがインサイチュハイブリダイゼーション(ISH)により組織内で検出することができることを示す。サル免疫不全ウイルス(SIV)に感染したマカクの組織は、TRAIL全長特異的プローブ又はTRAILショート特異的プローブのいずれかで染色され、以下の倍率で視覚化された。A〜Dにおいて、左の列は10×倍率であり、中央の列は20×倍率、右の列は40×倍率である。A〜Dにおいて、最上行は複合画像であり、真ん中の行は赤色で表される複合画像のコンポーネント((A)と(C)のTRAIL、及び(B)と(D)のTRAILショート)であり、最下行は青色で表されるそれらの複合画像のコンポーネントである。A)TRAIL特異的プローブで染色されたSIV感染マカク腋窩リンパ節組織。B)TRAILショート特異的プローブで染色したSIV感染マカク腋窩リンパ節組織。C)TRAIL特異的プローブで染色されたSIV感染マカク脾臓組織。D)TRAILショート特異的プローブで染色したSIV感染マカク脾臓組織。
【図３１−２】図31-1の続きである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
この書面は、TRAILショートを中和することができるTRAILショート抗体(例えば、ヒト化TRAILショート抗体)、並びにTRAILショート抗体を作製及び使用するための材料及び方法を提供する。いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を使用して、疾患(例えば、癌及び/又は肝臓の状態)及び/又は感染症(例えば、慢性感染症)を治療することができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体は、疾患細胞(例えば、癌細胞)及び/又は感染細胞の数を減少させる条件下で、疾患及び/又は感染を有する哺乳動物に投与することができる。いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を用いて、アポトーシス(例えば、TRAILが媒介する細胞死、NK細胞毒性、CD8+T細胞死滅、CAR T細胞死滅、及び/又は腫瘍溶解性ウイルス療法)を調節(例えば、増加又は減少)できる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体は、疾患細胞(例えば、癌細胞)の1つ以上において、及び/又は感染細胞の1つ以上においてアポトーシスを誘導する条件下で、疾患細胞(例えば、癌細胞)及び/又は感染細胞(例えば、ウイルス感染細胞)を有する哺乳動物に投与することができる。この書面はまた、本明細書に記載されるTRAILショート抗体をコードする核酸、並びに本明細書に記載されるTRAILショート抗体をコードする核酸を発現する構築物を提供する。
【００１９】
本明細書に記載される疾患を治療する場合、疾患は、例えば、癌(例えば、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、及び転移)又は肝臓の状態であり得る。本明細書に記載される、治療され得る癌の例には、限定されないが、卵巣癌、黒色腫、膵臓癌、血液悪性腫瘍(例えば、T細胞悪性腫瘍及びB細胞悪性腫瘍)、膀胱癌、肺癌(例えば、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌、及び非扁平上皮非小細胞肺癌)、大腸癌、黒色腫、乳癌(例えば、ホルモン受容体陽性乳癌、HER2陽性乳癌、及びトリプルネガティブ乳癌)、子宮頸癌、食道癌、頭頸部癌、腎臓癌(例えば、腎乳頭細胞癌、腎明細胞癌、腎移行上皮癌、及び嫌色素性腎細胞癌)、肝細胞癌、骨髄腫、及び子宮癌が含まれる。
【００２０】
本明細書に記載される感染症を治療する場合、感染症は、例えば、慢性感染症及び/又はウイルス感染症であり得る。本明細書に記載される、治療することができる感染症の例には、限定されないが、HIV、SIV、内因性レトロウイルス、アネロウイルス、サーコウイルス、ヒトヘルペスウイルス、水痘帯状ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、ポリオーマウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、D型肝炎ウイルス、GBウイルスC、パピローマウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、異種向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス、ポリオーマウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、麻疹ウイルス、及びコクサッキーウイルス感染症が含まれる。いくつかの場合において、本明細書に記載される治療される感染症はHIV感染症であり得る。
【００２１】
本明細書に記載される望ましくないアポトーシスを治療する場合、望ましくないアポトーシスは、例えば、任意の適切な疾患及び/又は状態に関連し得る。本明細書に記載される治療することができる望ましくないアポトーシスに関連する疾患及び/又は状態の例には、限定されないが、心筋梗塞、虚血再灌流傷害、神経変性疾患(例えば、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病)、肝障害(例えば、アルコール消費後、薬物(例えば、アセトアミノフェン)摂取後、及び非アルコール性脂肪性肝炎)が含まれる。
【００２２】
疾患及び/若しくは感染症を有するか又は疾患及び/若しくは感染症を発症するリスクのある任意のタイプの哺乳動物は、本明細書に記載されるように治療することができる。例えば、疾患及び/又は感染症を有するヒト及び他の霊長類、例えばサルは、1つ以上のTRAILショート抗体で治療することができる。いくつかの場合において、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、マウス、及びラットは、本明細書に記載される1つ以上のTRAILショート抗体で治療することができる。
【００２３】
任意の適切な方法を使用して、疾患及び/若しくは感染症を有するか、又は疾患(例えば、癌)及び/若しくは感染症を発症するリスクがある哺乳動物を同定することができる。例えば、イメージング技術(造影剤あり又はなし;例えば、コンピュータ断層撮影(CT)スキャン又は磁気共鳴イメージング(MRI))、生検技術、骨髄吸引、結腸鏡検査、S状結腸鏡検査、直腸指診、血液検査、血小板検査、糞便検査、尿検査、内視鏡技術、ELISA技術、PCRベースの技術、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、及び組織学的技術を使用して、癌を有する哺乳動物(例えば、ヒト)を同定することができる。例えば、イメージング技術(造影剤あり又はなし;例えば、CTスキャン又はMRI)、生検技術(例えば、肝臓組織検査)、及び血液試験を使用して、肝臓の状態を有する哺乳動物(例えば、ヒト)を同定することができる。例えば、抗体技術、ウイルス抗原検出試験、培養技術、ELISA技術、PCRベースの技術(例えば、ウイルス負荷試験)、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、ハイブリダイゼーション技術(例えば、ISH)、及び組織学的技術(例えば、免疫組織化学(IHC))を使用して、感染症を有する哺乳動物(例えば、ヒト)を同定することができる。
【００２４】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を使用して、TRAILベースの療法に十分に応答する可能性が高い哺乳動物を同定することができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体を疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物に投与して、TRAILショートベースの療法に十分に応答する可能性が高い哺乳動物を同定することができる。いくつかの場合において、疾患及び/若しくは感染症を有するか、又は疾患及び/若しくは感染症を発症するリスクがある哺乳動物は、TRAILショート及び/又はTRAILの有無について評価することができる。例えば、疾患及び/又は感染症を有するヒトから得られた試料中のTRAILショート及び/又はTRAILの存在、非存在、又はレベルを使用して、ヒトがTRAILベースの療法に応答する可能性が高いかどうかを判断することができる。任意の適切な試料が、TRAILショート及び/又はTRAILの存在について評価することができる。例えば、生物学的試料、例えば、組織試料及び体液試料(例えば、血液、血清、血漿、又は尿)を哺乳類から得、TRAILショート及び/又はTRAILの存在、非存在、又はレベルを評価することができる。任意の適切な方法を使用して、TRAILショート及び/又はTRAILの存在、非存在、又はレベルを検出することができる。例えば、抗体技術、ウイルス抗原検出テスト、培養技術、ELISA技術、PCRベースの技術(例えば、ウイルス負荷テスト)、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、ハイブリダイゼーション技術(例えば、ISH)、及び組織学的技術(例えば、IHC)を使用して、哺乳動物から得られた試料中のTRAILショート及び/又はTRAILの存在、非存在、又はレベルを決定することができる。いくつかの場合において、本明細書に記載されるTRAILショート抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン、並びに配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む)を(例えば、PET又はSPECTイメージングを可能にするために放射性核種で)ラベル付けして、哺乳動物から得られた試料中のTRAILショート及び/又はTRAILの存在、非存在、又はレベルを決定することができる。哺乳動物は、哺乳動物から得られた試料が検出可能なレベルのTRAILショート及び/又はTRAILを有する場合、TRAILベースの療法に反応する可能性が高いものとして同定することができる。いくつかの場合において、TRAILベースの療法に応答する可能性が高いものとして同定された哺乳動物は、本明細書に記載されるように治療することができる。例えば、IL-6、IL-8、及びEGFを阻害する1つ以上の抗癌剤は、トリプルネガティブ乳癌(例えば、TNBC)を有するものとして同定されたヒトに投与され、ヒトを治療することができる。
【００２５】
疾患及び/若しくは感染症を有するか、疾患及び/若しくは感染症を発症するリスクがある、又はTRAILベースの療法に十分に応答する可能性が高いものとして同定されると、哺乳動物は、1つ以上のTRAILショート抗体(例えば、TRAILショートを中和する1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物)を投与するか又は自己投与するよう指示され得る。いくつかの場合において、哺乳動物(例えば、ヒト)はTRAILショートを有するものとして同定され得る。例えば、哺乳動物は、任意の適切な方法を使用してTRAILショートの存在又は非存在について評価され得る。例えば、TRAILショートのレベルを検出する技術には、ELISA技術、PCRベースの技術、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、ハイブリダイゼーション技術(例えば、ISH)、及び/又は組織学的技術(例えば、IHC)が含まれる。TRAILショートの存在又は非存在は、例えば、哺乳動物がTRAILショート抗体療法に応答する可能性が高いことを判断するために使用することができる。
【００２６】
任意の適切な方法を使用して、1つ以上のTRAILショート抗体を哺乳動物に投与することができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体を哺乳動物に投与することができ、及び/又は1つ以上のTRAILショート抗体をコードする核酸を哺乳動物に投与することができる。1つ以上のTRAILショート抗体をコードする核酸が哺乳動物に投与される場合、核酸はベクター(例えば、ベクター媒介抗体遺伝子導入用)に含まれ得る。
【００２７】
本明細書で提供されるTRAILショート抗体は、TRAILショート上のエピトープに特異的に結合する。本明細書で使用される「抗体」という用語は、TRAILショートに結合する何らかの能力を保持するインタクトな抗体並びに抗体断片(例えば、抗原結合断片)を指す。いくつかの場合において、本明細書で提供されるTRAILショート抗体は全長TRAILに結合しない。TRAILショート抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。TRAILショート抗体は、キメラ(例えば、部分的にヒト化又は完全にヒト化された)抗体であり得る。TRAILショート抗体は、非免疫原性抗体であり得る。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、中和抗体であり得る。本明細書で使用されるとき、TRAILショート「中和」抗体は、TRAILショートに結合してTRAILショートの生物学的効果を中和する抗体である。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、アポトーシスを誘導(例えば、増加)させることができる。例えば、TRAILショート中和抗体は、TRAILショートに結合し、TRAILショートがR1及び/又はR2に結合するのを防ぎ、したがって、R1及びR2をTRAIL結合及びアポトーシスの誘導に利用できるようにする。例えば、TRAILショート中和抗体は、TRAILショートに結合し、結合したTRAILショートをR1及び/又はR2から放出し、したがって、R1及びR2をTRAILの結合及びアポトーシスの誘導に利用することができる。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、TRAILショート機能を再現することができる。本明細書で使用されるとき、「TRAILショート機能」には、TRAILが媒介する細胞死を低減及び/又は排除する能力が含まれる。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、アポトーシスを阻害する(例えば、減少させる)ことができる。例えば、本明細書で提供されるTRAILショート抗体は、Fcドメイン(例えばIgG Fcドメイン)に融合したTRAILショートの細胞外ドメインを含むことができる。例えば、IgG Fcドメインに融合したTRAILショートの細胞外ドメインを使用して、アポトーシス(例えば、望ましくないアポトーシス)を低減及び/又は排除させることができる。
【００２８】
本明細書で提供されるTRAILショート抗体は、任意の適切な方法(例えば、Greenら、Production of Polyclonal Antisera, in Immunochemical Protocols (Manson編)、1-5頁(Humana Press 1992年);Coliganら、Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats, Mice and Hamsters, in Current Protocols In Immunology、セクション2.4.1 (1992年);Coliganら、ユニット9、Current Protocols in Immunology、Wiley Interscience、1994年;Kohler & Milstein、Nature 256巻:495頁(1975年);Coliganら、セクション2.5.1 2.6.7;及びHarlowら、Antibodies: A Laboratory Manual、726頁(Cold Spring Harbor Pub. 1988年)を参照されたい)を使用して調製することができる。例えば、TRAILショートを含む試料を免疫原として使用して、特定の抗体が産生されるように動物における免疫応答を誘発することができる。
【００２９】
本明細書で提供されるTRAILショート抗体は、任意の適切な方法を使用して、ヒト化及び/又は脱免疫化(例えば、非免疫原性化)することができる。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重及び軽可変鎖由来のマウスCDRをヒト可変ドメインに移し、次に、マウスの対応物のフレームワーク領域にヒト残基を置換することにより生成することができる。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することにより、ヒトを治療する場合に、マウス定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題を未然に防ぐことができる。マウス免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的な技術は、例えば、Orlandiら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86巻:3833頁(1989年)に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、例えば、Jonesら、Nature 321巻:522頁(1986年);Riechmannら、Nature 332巻:323頁(1988年);Verhoeyenら、Science 239巻:1534頁(1988年);Carterら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 89巻:4285頁(1992年);及びSandhu、Crit. Rev. Biotech. 12巻:437頁(1992年);Singerら、J. Immunol. 150巻:2844頁(1993年)に記載されている。いくつかの場合において、ヒト化、例えば、スーパーヒト化は、他の場所(Hwangら、Methods、36巻:35-42頁(2005年))で記載されているように使用することができる。いくつかの場合において、SDSグラフティング(Kashmiriら、Methods、36巻:25-34頁(2005年))、ヒトストリングコンテント最適化(Lazarら、Mol. Immunol.、44巻:1986-1998頁(2007年))、フレームワークシャッフリング(Dall'Acquaら、Methods、36巻:43-60頁(2005年);及びDamschroderら、Mol. Immunol.、44巻:3049-3060頁(2007年))、及びファージディスプレイアプローチ(Rosokら、J. Biol. Chem.、271巻:22611-22618頁(1996巻);Radarら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、95巻:8910-8915頁(1998年);及びHuseら、Science、246巻:1275-1281頁(1989年))を用いて、TRAILショート抗体調製物を得ることができる。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、実施例3及び4に記載されているようにヒト化することができる。TRAILショート抗体は、抗体Ab866であり得る。
【００３０】
TRAILショート抗体重鎖は、免疫グロブリンFcドメイン(例えば、ヒト化免疫グロブリンFcドメイン)を含むことができる。Fcドメインは、アイソタイプ(例えば、IgG、IgA、IgD、IgE、又はIgM)のいずれに由来し得る。Fcドメインは、任意のアイソタイプサブクラスに由来し得る。例えば、FcドメインがIgGアイソタイプである場合、Fcドメインは、IgG1、IgG2、IgG3、又はIgG4 Fcドメインであり得る。
【００３１】
TRAILショート抗体(例えば、抗体Ab866)VHドメインには、以下に記載される相補性決定領域(CDR)を含むことができる:
2020507580.tif 000003
【００３２】
VH CDR1、VH CDR2R、及びVH CDR3を含むTRAILショート抗体VHドメインの例には、限定されないが、以下に記載されるVHドメインが含まれる:
2020507580.tif 000004
【００３３】
いくつかの場合において、TRAILショート抗体VHドメインは、配列番号4〜8のいずれか1つに記載される配列に対して少なくとも75パーセント(例えば、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、TRAILショート抗体重鎖VHドメインは、配列番号4に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、TRAILショート抗体重鎖VHドメインは、配列番号6に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００３４】
TRAILショート抗体重鎖の例は、以下に記載される:
2020507580.tif 000005
2020507580.tif 000006
【００３５】
TRAILショート抗体(例えば、抗体Ab866)VLドメインは、以下に記載されるCDRを含むことができる:
2020507580.tif 000007
【００３６】
VL CDR1、VL CDR2R、及びVL CDR3を含むTRAILショート抗体VLドメインの例には、限定されないが、以下に記載されるVLドメインが含まれる:
2020507580.tif 000008
【００３７】
いくつかの場合において、TRAILショート抗体VLドメインは、配列番号17〜21のいずれか1つに記載される配列に対して少なくとも75パーセント(例えば、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、又は100%)同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、TRAILショート抗体重鎖VLドメインは、配列番号17に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有し得る。例えば、TRAILショート抗体重鎖VLドメインは、配列番号20に対して少なくとも75%同一であるアミノ酸配列を有し得る。
【００３８】
TRAILショート抗体軽鎖の例は、以下に記載される:
2020507580.tif 000009
2020507580.tif 000010
【００３９】
本明細書に記載されるTRAILショート抗体は、本明細書に記載される重鎖及び本明細書に記載される軽鎖の任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの場合において、TRAILショート抗体は、HC2及びLC3を含むことができる。
【００４０】
いくつかの場合において、本明細書に記載されるTRAILショート抗体は、1つ以上の標識(例えば、検出可能な標識)を含む(例えば、融合又はコンジュゲートする)ことができる。標識は、限定されないが、蛍光標識(例えば、フルオロフォア)、放射性標識、又は酵素であり得る。検出可能な標識の例には、限定されないが、R-フィコエリトリン(PE)、CTO、GFP、蛍光発生活性化タンパク質(FAP)、ガウシアルシフェラーゼ(GLuc)、ウミホタルルシフェラーゼ(Cluc)、放射性核種、ビオチンが含まれる。
【００４１】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又はそれを超えるTRAILショート抗体)は、疾患及び/又は感染症を治療するために哺乳動物に投与することができる。例えば、2つ以上のTRAILショート抗体は、疾患及び/又は感染症を治療するために哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することができる。
【００４２】
いくつか場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物は、単独の活性成分として疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物に投与することができる。
【００４３】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物は、疾患及び/又は感染症を治療するために使用される1つ以上の追加の薬剤/療法との併用療法として、疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物に投与することができる。例えば、疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物を治療するために使用される併用療法は、1つ以上の細胞ベースの療法及び/又は1つ以上のTRAILベースの療法を組み合わせた1つ以上のTRAILショート抗体を哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することを含むことができる。TRAILベースの療法には、例えば、TRAILモジュレーター、例えば、限定されないが、組換えTRAIL(例えば、デュラネルミン)、抗TRAIL-R1抗体(例えば、マパツムマブ)、抗TRAIL-R2抗体(例えば、コナツムマブ、レクサツムマブ、チガツズマブ、ドロジツマブ、LBY-135)、TRAILオリゴマー(例えば、ABBV-621)、及び/又はTRAILショート細胞外ドメイン:Fc融合体が含まれ得る。いくつかの場合において、TRAILモジュレーターはTRAILアゴニストであり得る。いくつかの場合において、TRAILモジュレーターは、1つ以上の追加のドメイン(例えば、安定性及び/又は機能を強化するドメイン、例えば、ポリヒスチジン、FLAGエピトープ、イソロイシンジッパーモチーフ(LZ)、ヒト免疫グロブリンのFc部分、アルブミン、及び/又はナノ粒子)を含み得る(例えば、それに融合又はコンジュゲートし得る)。2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、又はそれを超える)のTRAILモジュレーターが哺乳動物に投与される場合、TRAILモジュレーターは、単独で又は任意の組み合わせで投与することができる。細胞ベースの療法には、例えば、養子細胞移入療法(例えば、養子T細胞療法)、例えば、限定されないが、自己TIL、アルファ-ベータT細胞受容体で遺伝子操作されたTIL、キメラ抗原受容体で遺伝子操作されたTIL(CAR T細胞療法)及び/又は遺伝子操作されたNK若しくはNK/T細胞を含むc腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移入が含まれ得る。
【００４４】
癌を有する哺乳動物を治療するために使用される併用療法には、哺乳動物(例えば、ヒト)に、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物及び1つ以上の癌治療、例えば、化学療法剤、例えば、限定されないが、アルキル化剤(例えば、アルトレタミン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ロムスチン、メルファラン、オキサラプラチン、テモゾロミド、及びチオテパ)、代謝拮抗剤(例えば、5-FU)、6-メルカプトプリン、カペシタビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、及びペメトレキセド)、アントラサイクリン系抗生物質(例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、及びイダルビシン)、非アントラサイクリン系抗生物質(例えば、アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、マイトマイシン-C、及びミトキサントロン)、トポイソメラーゼI阻害剤(例えば、トポテカン及びイリノテカン(例えば、CPT-11))、トポイソメラーゼII阻害剤(例えば、エトポシド(例えば、VP-16)、テニポシド、及びミトキサントロン)、有糸分裂阻害剤(例えば、ドセタキセル、エストラムスチン、イクサベピロン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン)、コルチコステロイド(例えば、プレドニゾン、エチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾン)、酵素(例えば、L-アスパラギナーゼ)、及び/又はプロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ);分化誘導剤、限定されないが、例えば、レチノイド、トレチノイン、ベキサロテン、及び三酸化ヒ素;カクテル療法(例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの組み合わせ(CHOP)、又はリツキシマブ、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニゾロンの組み合わせ(R-CHOP));モノクローナル抗体、例えば、限定されないが、抗HER2抗体(例えば、トラスツズマブ及びペルツズマブ)、抗CTLA-4抗体(例えば、イピリムマブ)、抗GD2抗体(例えば、ジヌツキシマブ)、抗IL-6抗体(例えば、シルツキシマブ)、抗EGFR抗体(例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、及びネシツムマブ)、抗VEGF抗体(例えば、ラムシルマブ及びベバシズマブ)、抗PD-1抗体(例えば、ペンブロリズマブ及びニボルマブ)、抗PD-L1抗体(例えば、アテゾリズマブ)、抗PDGF抗体(例えば、オララツマブ)、抗RANK抗体(例えば、デノスマブ)、抗CD3抗体(例えば、ブリナツモマブ)、抗CD19抗体(例えば、ブリナツモマブ)、抗CD20抗体(リツキシマブ、オファツムマブ、及びオビヌツズマブ)、抗CD38抗体(例えば、ダラツムマブ)、抗CD52抗体(例えば、アレムツズマブ)、及び抗SLAMF7抗体(例えば、エロツズマブ);抗体-薬物コンジュゲート、例えば、限定されないが、ゲムツズマブオゾガマイシン、ブレンツキシマブベドチン、トラスツズマブ、及びエムタンシン;標的化小分子、例えば、限定されないが、チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、VEGF阻害剤(例えば、アパチニブ)、c-Met阻害剤(例えば、カボザンチニブ)、ALK阻害剤(例えば、アレクチニブ及びクリゾチニブ)、Brc-Abl阻害剤(例えば、ダサチニブ、イマチニブ、及びニロチニブ)、EGFR阻害剤(例えば、エルロチニブ及びゲフィチニブ)、HER2阻害剤(例えば、ラパチニブ)、マルチ標的化チロシンキナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ及びスニチニブ)、JAK1阻害剤(例えば、トファシチニブ)、MEK阻害剤(例えば、コビメチニブ及びトラメチニブ)、プロテアソーム阻害剤(例えば、イキサゾミブ、カルフィルゾミブ、ボルテゾミブ、ジスルフィラム、及びラクタシスチン)、エストロゲン受容体モジュレーター(例えば、タモキシフェン)、Bcl-2阻害剤(例えば、オバトクラクス、ナビトクラクス、及びゴシポール)、PARP阻害剤(例えば、イニパリブ及びオラパリブ)、PI3K阻害剤(例えば、ペリフォシン)、BRAF阻害剤(例えば、ダブラフェニブ及びベムラフェニブ)、MEK阻害剤(例えば、トラメチニブ)、CDK阻害剤(例えば、アベマシクリブ、パルボシクリブ、リボシクリブ、及びトリラシクリブ)、選択的エストロゲン受容体分解剤(例えば、フルベストラント)、BET阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼ阻害剤(例えば、テムシロリムス、エベロリムス、ベムラフェニブ、トラメチニブ、及びダブラフェニブ);小分子薬物コンジュゲート、例えば、限定されないが、ビンタフォリド;放射線療法(例えば、外部ビーム療法、強度変調放射線療法、画像誘導放射線療法、陽子線療法);近接照射療法;及び/又は外科手術(例えば、腫瘍、腫瘍の一部、又は転移の外科的切除)を投与することを含み得る。
【００４５】
肝状態を有する哺乳動物を治療するために使用される併用療法には、1つ以上のTRAILショート抗体含む組成物、及び1つ以上の肝疾患治療、例えば、限定されないが、体重減少、肝疾患(例えば、A型肝炎、B型肝炎、及びC型肝炎)に対するワクチン接種、ビタミンE、及び/又はコーヒーを哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することを含むことができる。
【００４６】
感染症(例えば、ウイルス感染症)を有する哺乳動物を治療するために使用される併用療法には、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物、及び1つ以上の感染治療薬、例えば、抗レトロウイルス療法、例えば、限定されないが、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(例えば、アバカビル、ジダノシン、エムトリシタビン、エンテカビル、ラミブジン、スタブジン、テノホビルジソプロキシルフマル酸塩、ザルシタビン、及びジドブジン);非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤(例えば、デラビルジン、エファビレンツ、エトラビリン、ネビラピン、及びリルピビリン);ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤(例えば、アデフォビル及びテノホビル);融合阻害剤(例えば、エンフビルタイド);侵入阻害剤(例えば、マラビロック);インテグラーゼ阻害剤(例えば、ドルテグラビル、エルビテグラビル(リトノバイル及び/又はコビジスタットの有無にかかわらず)、及びラルテグラビル);成熟阻害剤(例えば、ビビリマト);プロテアーゼ阻害剤(例えば、アンプレナビル、フォサンプレナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、リトナビル、サキナビル、アタザナビル、ダルナビル、及びチプラナビル);脱コーティング阻害剤(例えば、TRIM5アルファ);転写阻害剤(例えば、tatアンタゴニスト);及び/又は翻訳阻害剤(例えば、トリコサンチン);ペグ化インターフェロンアルファ(PEG-IFN-a);ダクラタスビル;エルバスビル;グラゾプレビル;グレカプレビル;ピブレンタスビル;レジパスビル;ソフォスブビル;オンビタスビル;パリタプレビル;リトナビル;ダサブビル;シメプレビル;ベルパタスビル;及びボキシラプレビルを哺乳動物(例えば、ヒト)に投与することを含むことができる。
【００４７】
1つ以上のTRAILショート抗体が、疾患及び/又は感染症を治療するために使用される1つ以上の追加の薬剤と組み合わせて使用される場合、1つ以上の追加の薬剤を同時に又は独立して投与することができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物を最初に投与し、1つ以上の追加の薬剤を2番目に投与することができ、逆もまた同様である。1つ以上のTRAILショート抗体が、疾患及び/又は感染症を治療するために使用される1つ以上の追加の療法と組み合わせて使用される実施形態では、1つ以上の追加の療法は、1つ以上のTRAILショート抗体と同時に又はそれと独立して行うことができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物は、1つ以上の追加の療法が行われる前、その最中、又はその後に投与することができる。
【００４８】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体は、疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物に投与するための薬学的に許容される組成物に製剤化することができる。例えば、治療有効量のTRAILショート抗体は、1つ以上の薬学的に許容される担体(添加剤)及び/又は希釈剤とともに製剤化することができる。医薬組成物は、限定されないが、滅菌溶液、懸濁液、徐放性製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、及び顆粒を含む、固体又は液体形態で投与するために製剤化することができる。本明細書に記載される医薬組成物に使用され得る薬学的に許容される担体、充填剤、及びビヒクルには、限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂肪が含まれる。
【００４９】
1つ以上のTRAILショート抗体を含む医薬組成物は、経口、非経口(皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、くも膜下腔内、及び皮内を含む)、又は吸入投与用に設計され得る。経口投与される場合、1つ以上のTRAILショート抗体を含む医薬組成物は、丸剤、錠剤、又はカプセル剤の形態であり得る。非経口投与に適した組成物には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を意図されたレシピエントの血液と等張状態にする溶質を含むことができる水性及び非水性の滅菌注射液;懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。吸入用組成物は、例えば、吸入器、ネブライザー、及び/又は乾燥粉末吸入器を使用して送達させることができる。製剤は、単位用量又は複数用量の容器、例えば、密閉アンプル及びバイアルで提供することができ、使用する直前に、滅菌液体担体、例えば、注射用水を添加することだけが要求されるフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存され得る。即時の注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。
【００５０】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む薬学的に許容される組成物を局所的に又は全身的に投与することができる。例えば、TRAILショート抗体を含む組成物は、哺乳動物(例えば、ヒト)への経口投与又は吸入により全身投与することができる。
【００５１】
有効用量は、疾患及び/又は感染症の重症度、投与経路、対象の年齢及び一般的な健康状態、賦形剤の使用、他の治療薬との併用、例えば、他の薬剤の使用の可能性、及び治療する医師の判断に応じて変化し得る。
【００５２】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物の有効量は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、治療される疾患及び/又は感染症の症状の重症度若しくは発生を軽減する任意の量であり得る。いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物の有効量は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、疾患細胞(例えば、癌細胞)及び/又は感染細胞の数を減少させる任意の量であり得る。有効量は、一定であり得、又は哺乳動物の治療に対する応答に応じて、スライド制若しくは変動用量として調整され得る。様々な要因が、特定の用途で使用される実際の有効量に影響を及ぼし得る。例えば、投与頻度、治療期間、複数の治療薬の使用、投与経路、並びに疾患及び/又は感染症の重症度は、投与される実際の有効量の増加又は減少を必要とする場合がある。
【００５３】
いくつかの場合において、投与頻度は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、治療される疾患及び/又は感染症の症状の重症度若しくは発生を軽減する任意の頻度であり得る。いくつかの場合において、投与頻度は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、疾患細胞(例えば、癌細胞)及び/又は感染細胞の数を減少させる任意の頻度であり得る。例えば、投与頻度は、月に約1回から2週間に1回、週に約1回から日に約3回、月に約2回から日に約6回、又は週に約2回から日に1回であり得る。いくつかの場合において、投与頻度は週に1回であり得る。いくつかの場合において、投与頻度は2週間ごとであり得る。投与頻度は治療期間中に一定であり得、又は変更され得る。1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物による治療過程には、休薬期間を含み得る。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物は、2週間にわたって毎日投与され、その後2週間の休薬期間があり得、このようなレジメンを複数回繰り返すことができる。有効量と同様に、様々な要因が、特定の用途に使用される実際の投与頻度に影響を及ぼし得る。例えば、有効量、治療期間、複数の治療薬の使用、投与経路、並びに疾患及び/又は感染症の重症度は、投与頻度の増加又は減少を必要とする場合がある。
【００５４】
いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物を投与するための有効期間は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、治療される疾患及び/又は感染症の症状の重症度若しくは発生を軽減する任意の期間であり得る。いくつかの場合において、1つ以上のTRAILショート抗体を含む組成物を投与するための有効期間は、哺乳動物に重大な毒性を生じることなく、疾患細胞(例えば、癌細胞)及び/又は感染細胞の数を減少させる任意の期間であり得る。例えば、有効期間は、数日から数週間、数ヶ月、又は数年まで変化し得る。いくつかの場合において、疾患及び/又は感染症を治療するための有効期間は、約1ヶ月から約10年までの期間の範囲であり得る。複数の要因が、特定の治療に使用される実際の有効期間に影響を及ぼし得る。例えば、有効期間は、投与頻度、有効量、複数の治療薬の使用、投与経路、及び治療される状態の重症度によって変化し得る。
【００５５】
特定の例において、治療の経過、並びに治療される疾患及び/又は感染症の重症度を監視することができる。任意の適切な方法を使用して、疾患及び/又は感染症の重症度が軽減されているかどうかを決定することができる。例えば、疾患(例えば、癌)の重症度は、異なる時間点での、イメージング技術(造影剤あり又はなし)、生検技術、骨髄吸引、大腸内視鏡検査、S状結腸鏡検査、直腸指診、血液検査、血小板検査、糞便検査、尿検査、内視鏡技術、ELISA技術、PCRベースの技術、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、フローサイトメトリー、遺伝子分析(例えば、遺伝子再配列用)、及び/又は組織学的技術を用いて評価することができる。例えば、感染症の重症度は、異なる時間点での、抗体技術、ウイルス抗原検出試験、培養技術、ELISA技術、PCRベースの技術(例えば、ウイルス負荷試験)、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、及び/又は組織学的技術を用いて評価することができる。任意の適切な方法を使用して、TRAILショート抗体療法又はTRAILショート抗体を含む併用療法に対する応答を監視することができる。例えば、TRAIL及び/又はTRAILショートのレベルを検出する技術には、ELISA技術、PCRベースの技術、ブロッティング技術(例えば、ウエスタンブロット)、ハイブリダイゼーション技術(例えば、ISH)及び/又は組織学的技術(例えば、IHC)が含まれる。
【００５６】
いくつかの場合において、TRAILショート抗体療法又はTRAILショート抗体を含む併用療法に対する応答の監視にセラノスティックスを含めることができる。例えば、1つ以上のTRAILショート抗体は、疾患及び/又は感染症を有する哺乳動物に投与することができ、疾患及び/又は感染症を同時に監視することができる。例えば、本明細書に記載される1つ以上のTRAILショート抗体(例えば、配列番号1、配列番号2、及び配列番号3に記載されるCDRを含むVHドメイン、及び配列番号14、配列番号15、及び配列番号16に記載されるCDRを含むVLドメインを含む抗体)は、PET又はSPECTイメージングによる監視を可能にするために放射性核種で標識することができる。
【００５７】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【００５８】
実施例1：TRAILに対する耐性は微小胞関連TRAILショートにより付与され、抗体中和により逆転される
概要
TRAILは、TRAIL-R1又はTRAIL-R2に結合し、正常細胞に危害を加えずに腫瘍細胞及び/又はウイルス感染細胞にアポトーシスを誘導することができる。残念なことに、TRAIL受容体を標的とする療法の臨床的な成功は限られている。以下のデータは、I型インターフェロンシグナル伝達がTRAILショートの発現を誘導し、TRAILショートが微小胞内で細胞微小環境に放出され、バイスタンダー細胞に取り込まれ得ることを示す。TRAILショートは、TRAIL-R1とR2に結合するが、TRAILデコイ受容体R3及びR4には結合せず、完全長TRAILが細胞死を誘導するのを妨げる。TRAILショートを産生しない細胞はTRAILショートに結合した後、TRAILに対して保護されるため、TRAIL死滅に対するTRAILショートが媒介する保護はトランスで起こる。組換えTRAILショートは、TRAILにより誘導される死滅に対して細胞を保護するのに十分であるが、特定の抗体によるTRAILショートの枯渇がTRAIL感受性を回復する。これらの結果は、TRAIL耐性を理解し、克服するためのパラダイムを確立する。
【００５９】
結果
TRAILショートは非感染細胞とHIV感染細胞の両方によって産生される
HIV感染細胞対非感染細胞のTRAILショート産生は、単一細胞のmRNA分析を用いて評価された。これらの実験では、HIV感染又は非感染ドナー由来の単一のCD4 T細胞を統合された流体回路で分離し、個々の細胞分析は、HIV特異的標的、TRAILショート及びTRAIL受容体/リガンド、並びに細胞系統及び活性化状態のマーカーのPCRを使用して実施された(図1A)。
【００６０】
アッセイの特異性は、HIV非感染ドナーにHIV転写産物を含む細胞がなく、HIV感染ドナー由来のCD4 T細胞のほとんどがHIV転写産物を含まないことを観察することによって確認された(図1B)。HIV感染した患者において観察される不適切で過剰な免疫活性化もまた観察された。すなわち、HIV感染ドナー由来のより多くの細胞は、HIV非感染ドナー由来の細胞よりも活性化マーカーHLA-DRを発現した(図1C)。HIV感染したドナーと非感染ドナーの両方からの細胞はTRAILショートの転写産物を含み(図1D)、HIV感染ドナー由来のHIV感染細胞(HIV mRNA+)とHIV非感染(HIV mRNA-)細胞の両方はTRAILショートを発現した(図1E)。これはHIV感染がTRAILショートの産生には必要とされないことを示す。個々の細胞の大部分は、TRAILFL又はTRAILショートのいずれかを発現するか、又はTRAILFLとTRAILショートのいずれも発現しなかった。これは、TRAILショートがTRAILFLのスプライス変異体であることと一貫性がある(図1F)。どんな刺激がTRAILショート発現を誘導するかについての洞察を得るために、このような発現が細胞活性化と相関するかどうかを評価し、TRAILショートメッセージがCD25、CD38、又はHLA-DRの転写産物の存在によって決定される免疫活性化と関連していないことを見出した(図1G)。この分析において表されるCD4 T細胞サブセット内では、最近の胸腺移出(RTE)、エフェクター記憶CD4 T細胞(TEM)、又は移行記憶CD4 T細胞(TTM)よりも多くの中心記憶CD4 T細胞(TCM)がTRAILショート転写産物を含んでいた(図1H)。したがって、データは、HIVに感染していない個々の細胞においてTRAILショートを発現できることを示す。
【００６１】
I型インターフェロンがTRAILショートの産生を駆動する
HIV非感染細胞はTRAILショートを作製することができるため、どの刺激がTRAILショートの産生を駆動するのかを理解することが妥当となった。HIVタンパク質、HIV誘導サイトカイン、及び/又はIFNがTRAILショート発現の誘導に関与するかもしれない。HIV感染は、宿主細胞に多面的効果を有する多数の生理活性HIVコードタンパク質を産生する。個々の細胞のHIV感染は、TLR及びRIGを含む一連のパターン認識受容体(PRR)によって認識され得、これらは、I型IFNの産生とそれに続くIFN刺激遺伝子(ISG)の誘導に至る(Zitvogelら、2015年 Nat Rev Immunol 15巻:405-414頁)。これらの刺激のいずれがTRAILショート産生を駆動するかを決定するために、感染患者の血漿中に存在するサイトカイン、IFN、及びHIVタンパク質のパネルをスクリーニングして、これらの刺激のいずれかが休止期(CD25-、CD69-、HLA-DR-)CD4 T細胞を誘導して、TRAILショートを産生することができるかを評価した。IFNα14とIFNβは、TRAILショートメッセージを約50倍まで有意に誘導し(図2A及びE)、炎症性サイトカインを含むサイトカインのパネルは、TRAILショートメッセージの発現を、多少、ただし有意ではない程度に数倍だけ増加させた(図2B)。同様に、TNFα、LPS、及びgp120は、TRAILショート発現に最小限に影響を与えた(図2C)。他の刺激と比較したI型インターフェロンの同様の効果は、処理された試料のTRAILショートタンパク質レベルを分析した場合に見出された(図2E)。同じ試料において、TRAILFLメッセージが測定され、TRAILFLの発現とTRAILショートの発現の密接な線形相関が見出され(図2D)、これは図1Fと一致した。まとめると、これらのデータは、TRAILショートが事実上のインターフェロン刺激遺伝子であるという結論をサポートする。したがって、I型インターフェロンシグナル伝達によって特徴付けられる多様な条件で発現する可能性が高い。
【００６２】
TRAILショートのカルボキシル末端は原形質膜上で外部化され、TRAIL受容体R3及びR4ではなく、TRAIL受容体R1及びR2と相互作用する
TRAILFLは、細胞外C末端ドメインを有するシングルパスII型膜貫通タンパク質として発現される。アミノ酸約95-281を含むTRAILFLのC末端領域は、アポトーシス促進機能に関与し、中央の亜鉛イオンの周りに配位したホモ三量体を形成する(Chaら、1999年 Immunity 11巻:253-261頁)。TRAILショートは、エクソン3と4が削除され、エクソン5にフレームシフトが導入され、早熟終止コドン及び新規11アミノ酸C末端が生じるスプライシングイベントの結果として生じる(図3A)。
【００６３】
TRAILショートが原形質膜に輸送され細胞の外表面に存在するかどうかを評価した。そうするために、mycタグをTRAILショートの新規C末端内に挿入し、フローサイトメトリーを使用して、非透過性又は透過性のトランスフェクトされた細胞でエピトープのアクセス可能性を分析した。透過性対照のトランスフェクトされた細胞は検出可能なmycを含んでいたが(内因性mycを反映している可能性が高い)、TRAILショート-mycをトランスフェクトされた細胞はトランスフェクトされたタンパク質発現と一致する追加のmyc染色を示した(図3B、左パネル)。同じ細胞の非透過性試料は、対照のトランスフェクトされた細胞の表面myc染色を示さなかったが、表面myc陽性細胞の明確な集団は、TRAILショート-myc発現後に検出することができ(図3B、右パネル)、TRAILショートのカルボキシル末端が細胞外環境でアクセス可能であるという解釈を支持する。
【００６４】
TRAILFLは、4つの異なるメンバータンパク質が存在する、TRAIL受容体ファミリーのメンバーに結合することにより、そのアポトーシス促進効果を発揮する。TRAIL-R1及びR2にはデスドメインが含まれ、これはリガンド結合に続いて、デスドメイン(FADD)とFas関連タンパク質を動員し、カスパーゼ-8活性化をもたらす。TRAIL-R3及びR4は機能的なデスドメインを含まず、カスパーゼ-8活性化をもたらさず、しばしば「デコイ」受容体と考えられている。TRAIL受容体ファミリーのメンバーはまた、TRAILFLに結合する、それらの様々な能力によって互いに区別される。1つの等温滴定熱量測定研究は、TRAIL-R2へのTRAILFL結合親和性がTRAIL-R1よりも少なくとも35倍高く、TRAIL-R3よりも100倍高いことを示したが(TRAIL-R4は評価されなかった)(Trunehら、2000年、J Biol Chem 275巻:23319-23325頁)、別のものはTRAIL R4>R2>R3>R1を示し、解離定数は0.869〜4.08nMの範囲であった(Langら、2016年、J Biol Chem 291巻:5022-5037頁)。これらの研究は、TRAIL-R2がTRAILFLに対して最高の親和性を有するアポトーシス誘導受容体であることを強調している。
【００６５】
TRAILショートもまた任意の他のTRAIL受容体ファミリーメンバーと相互作用するかどうかに対処するために、C末端FLAGタグ付きTRAIL-R1、R2、R3、又はR4を発現する293T細胞からの細胞溶解物は、N末端HAタグ付きTRAILFL又はN末端HAタグ付きTRAILショートを発現する細胞からの細胞溶解物と組み合わせた。混合物を抗HAで免疫沈降させ、FLAG含有タンパク質について分析した。FLAG-TRAIL-R1とR2の両方がHA-TRAILFLにより免疫沈降された(図3C)。FLAG-TRAIL-R1及びR2はまた、HA-TRAILショートを同程度に共免疫沈降した(図3C)。しかしながら、TRAILFLはTRAIL-R3とR4の両方に関連付けられているが、TRAILショートは特にそうではなかった(図3D)。したがって、TRAILショートは、デコイ受容体R3とR4を温存しながら、死を誘導するTRAIL-R1とR2に優先的に結合する。これは、選択的受容体結合がTRAILショートの生物学的効果の中心であり得ることを示唆する。
【００６６】
TRAILショートは細胞外小胞内に含まれる
TRAILショートがそのコンパートメントにどのように放出されるかは不明な状態である。このプロセスを調べるために、GFP又はGFP-TRAILショートをトランスフェクトしたJurkat T細胞を共焦点顕微鏡で分析した。TRAILショートは原形質膜に局在化することが観察され(図4A)、HIV感染細胞又は対照細胞の重膜画分を免疫ブロットすることで確認した(図4B)。画分の純度は、サイトゾル特異的HSP70によって確認された。TRAILショートは、感染した培養物の上清画分で見出された。さらに、上清関連TRAILショートは、細胞関連TRAILショートと同様に移動した。これは、上清関連TRAILショートが、切断イベントによって生成された可能性が低いことを示唆する(図4C)。
【００６７】
TRAILショートが細胞外小胞内に組み込まれ得るかどうかを調べるため、PHA刺激及び非刺激のCD4+細胞からの細胞外小胞を超遠心分離によって回収し、固定し、電子顕微鏡によってサイズを分析し、直径中央値136nmで50nm〜約400nmの範囲を明らかにした(図4D)。これらの結果は、微小胞(>100nm)とエキソソーム(<100nm)の両方の存在を示唆する。同じ細胞外小胞のウエスタンブロット分析は、抗TRAILショート抗体を用いて行われた。これは、TRAILショートを含む細胞外小胞と一致する約15kDaのバンド(図4E)を明らかにした。HA-TRAILFL及びHA-TRAILショートをトランスフェクトした293T細胞からの全細胞溶解物及び精製された細胞外小胞調製物は、ウエスタンブロットにより同様のパターンを生成した(図4F)。TRAILショートに関連する細胞外小胞の存在は、293T細胞をeGFP-TRAILFL及び/又はRuby-TRAILショートでトランスフェクトし、上清をフローサイトメトリーで分析することによりさらに検証された。トランスフェクトされていない細胞上清には、GFP又はRubyシグナルが実質的に含まれていなかったが、eGFP-TRAILFL又はRuby-TRAILショートのみでトランスフェクトされた細胞は、各タンパク質の検出可能な発現を個別に示した。細胞をeGFP-TRAILFL及びRuby-TRAILショートで同時トランスフェクトした場合、eGFP-TRAILFLのみ、Ruby-TRAILショートのみ、eGFP-TRAILFLとRuby-TRAILショートの両方で小胞が検出された(図4G)。
【００６８】
微小胞局在化TRAILFLは、生物活性があることが示されており(Huberら、2005年 Gastroenterology 128巻:1796-1804頁)、したがって、細胞外小胞におけるTRAILショートは同様に生物活性であるかどうかについて調べられた。293T細胞をHA-TRAILFL単独、HA-TRAILショート単独、1:1の比率の両方、又は1:2 HA-TRAILFL:HA-TRAILショート比率の両方でトランスフェクトし、TRAILショート微小胞を含む濃縮上清を回収した。Jurkat細胞は、新鮮な培地、トランスフェクトされていない293T細胞から馴化された培地、又はトランスフェクトされた293T細胞の4つの品種のうちの1つから馴化された培地のいずれかでインキュベートされ、アポトーシスによる細胞死のマーカーとして切断されたカスパーゼ-3についてフローサイトメトリーによって分析された。新鮮な培地又はトランスフェクトされていない293T細胞からの培地でインキュベートされたJurkat細胞は、低レベルの基底アポトーシスを有していた(約5%)。対照的に、TRAILFLでトランスフェクトされた293T細胞からの培地でインキュベートされたJurkat細胞は、アポトーシスが20%を超え、TRAILFLが微小胞画分で活性であることと一致した。重要なことは、293T細胞をTRAILFL及びTRAILショートで同時トランスフェクトした場合、微小胞調製物によるJurkat T細胞の死滅の程度は減少し、TRAILショートの存在量が多くなった場合に最低になった(約3%〜13%;図4H及びI)。
【００６９】
TRAILショートは膜貫通ドメインを有する膜関連タンパク質であるため、TRAILショートがエキソソームではなく微小胞と同様に関連しているかどうかを試験した。HIVに感染した初代CD4 T細胞培養物からの上清は、超遠心分離により微小胞に、又は他の場所で記載されている樹脂ベースの抽出によりエキソソームに分画された(例えば、Taylorら、2011年 Methods Mol Biol 728巻:235-246頁を参照されたい)。微小胞調製物及びエキソソームは、本発明者らのTRAILショート特異的抗体を使用したイムノブロットで分析され、微小胞調製物においてのみTRAILショートを同定した(図4J)。
【００７０】
TRAILからのTRAILショート保護は隣接する細胞に移行し得る
TRAILショート発現の生物学的影響を評価するために、TRAILFL、TRAILショート、又はその両方をエフェクター細胞として使用される293T細胞に発現させた。TRAIL-R2を発現する標的Jurkat T細胞をCell Tracker Orange(CTO)で標識し、エフェクター293T細胞を標的CTO+ Jurkat細胞と混合し、CTO陽性集団でゲーティングするフローサイトメトリーにより分析を行った(図5A)。標的Jurkat細胞は、1μg〜20μgのHA-TRAILFLのトランスフェクションにより、7.1%〜32.8%の範囲で増加する量のトランスフェクトされたHA-TRAILFLプラスミドと正に相関した(図5B及びC)。エフェクター293T細胞を10μgのHA-TRAILFL及び増加する量のHA-TRAILショートでトランスフェクトし、CTO標識Jurkat T細胞と共培養し、同様の方法で分析した。増加量のTRAILショートプラスミドは、TRAILショート発現の増加に導いた(図5D)。これは、順番にJurkat標的細胞の死滅量の減少をもたらした(図5E)。したがって、TRAILFLとのTRAILショートの同時発現は、用量依存的にTRAILFLのアポトーシス誘導活性に拮抗する。
【００７１】
TRAIL死滅に対するTRAILショートが媒介する耐性が、TRAILショート産生細胞から、TRAILショートを産生しない微小環境中に存在するバイスタンダー細胞に移行できるかどうかを調べるために、rubyタグ付きTRAILショート(ruby-TRAILショート)及び膜貫通ドメインを欠損したrubyタグ付きTRAILショート(ruby-TRAILショートΔTM)の構築物が生成され、各構築物の強固な発現が確認された(図5F)。ruby-TRAILショートでトランスフェクトされた293T細胞は、rubyの膜周囲発現を示したが、一方、ruby-TRAILショートΔTM発現細胞はびまん性の細胞質発現を示した(図5G、上段パネル)。トランスフェクトされた細胞からの上清を回収し、HeLa細胞を処置するために使用された。処理されたHeLa細胞は、ruby-TRAILショートの取り込みを示したが、ruby-TRAILショートΔTMの取り込みは示さなかった(図5G、下段パネル)。これは、膜貫通ドメインがTRAILショートの膜局在化に必要であり、さらに、TRAILショートを含む微小胞が、TRAILショートを産生しない隣接細胞によって取り込まれていることを示すという理解と一致する。これらの微小胞処理されたHeLa細胞がTRAILが媒介する死滅に対する耐性を獲得したかどうかを試験した。未処理のHeLa細胞は、sk-TRAILで処理された後、時間依存的に死滅した。rubyでトランスフェクトされた又はruby-TRAILショートΔTMでトランスフェクトされた293T細胞からの上清の添加は、sk-TRAILの死滅を感知できるほどには変更しなかったが、一方、ruby-TRAILショートでトランスフェクトされた細胞からの上清の添加は、sk-TRAILによって誘発される死滅を約20%減少させた(図5H)。したがって、1つの細胞によるTRAILショートの発現は、TRAILショートの微小胞移行によって媒介される別の細胞にTRAIL耐性を付与することができる。
【００７２】
TRAILショートはPESTドメインを含み、プロテアソームによってユビキチン化及び分解される
TRAILショートの細胞内局在化を調べる研究中に(図1A)、表面上短いTRAILショートの半減期に気づいた。この観察結果を調べるために、293T細胞は、HA-TRAILショートでトランスフェクトされ、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミドの非存在下及び存在下でタンパク質の半減期を評価している(図6A)。タンパク質の約50%が最初の約60分以内に失われ、これは、急速なタンパク質代謝回転を示した。TRAILショートにおける推定PESTドメインは、アミノ酸59と81の間で同定された(図6B)。プロリン76のアラニンへの置換は、TRAILショートの半減期を著しく延長し(図6C)、これは機能的なPESTドメインを確認し、その後のユビキチン化及びプロテアソームが媒介する分解を示唆している。
【００７３】
TRAILショートがユビキチン化されることを確認するために、HAタグ付きTRAILショートを293T細胞で発現させ、抗HAプルダウン及びユビキチンのイムノブロッティングが行われた。これらの分析は、ポリユビキチン化されたHA-TRAILショートに対応するサイズで移動する豊富なユビキチン化タンパク質を明らかにした(図4D)。Lys48連結でのユビキチンによるタンパク質の修飾はプロテアソームの分解を駆動することができるが、Lys63連結でのユビキチン化はタンパク質:タンパク質相互作用の修飾、及びシグナル伝達経路の変化をもたらす(Dengら、2000年 Cell 103巻:351-361頁)。ユビキチン化されたTRAILショートがLys48を介した分解の標的であるかどうかを評価するために、Lys48とLys63のユビキチン連結間を区別する特定の脱ユビキチン化酵素(DUB)を使用した(例えば、Komanderら、2009年 Nat Rev Mol Cell Biol 10巻:550-563頁を参照されたい)。HA-TRAILショートのユビキチン化は、Lys48特異的DUB USP2によって逆転され(図6D)、これは、TRAILショートが分解のためにプロテアソームに標的されることと一致するようにユビキチン化されることを示す。これは、プロテアソーム阻害剤MG132と共に又はそれなしで処理された細胞のTRAILショートレベルを測定することで確認され、プロテアソーム阻害がTRAILショート発現レベルを大幅に増加させることを明らかにした(図6E)。これらの観察、及びユビキチンプロテアソーム経路がTRAILショートの発現レベルを支配しているという仮説と一致して、PEST突然変異体P76A TRAILショートの発現は、個々の細胞におけるTRAILショートのレベルの増加をもたらした。TRAILショートを含む細胞の総数はそれほど増加しなかった(図6F)。
【００７４】
TRAILショートは、TRAIL耐性を引き起こすのに十分かつ必要の両方である
これらのデータは、TRAILショートが、TRAILショートを産生する細胞と、微小胞が媒介する移行からTRAILショートを取り込むバイスタンダー細胞の両方の細胞死/生存に基本的に影響を与えることを示す。TRAILショート単独がこれらの効果に関与するかどうかを評価するために、TRAILショートの組換え構築物が、免疫グロブリンGのFcドメインに融合したTRAILショートの細胞外ドメインをクローニングすることによって生成された。精製後、組換えTRAILショート細胞外ドメイン:Fc融合(TRAILショートECD:Fc)は、Jurkat T細胞単独、又はsk-TRAILで前処理されたJurkat T細胞に加えられた。TRAILショートECD:Fcは毒性ではなかったが、用量依存的にsk-TRAILが媒介するJurkat T細胞の死滅を妨げた(図7A)。
【００７５】
TRAILショートの枯渇がTRAIL耐性を軽減するのに十分かどうかを評価した。TRAILショートに固有である11個のC末端アミノ酸に特異的なTRAILショート抗体の生成については、他の場所に記載されている(例えば、Schneppleら、2011年 J Biol Chem 286巻:35742-35754頁を参照)。TRAILショートを恒常的に発現するJurkat T細胞をIFNα14で刺激して、TRAILショートの最大発現を誘導し、次にsk-TRAILによる死を誘導した。本発明者らの以前の観察と一致して、sk-TRAIL処理は、Jurkat T細胞の強力な死滅をもたらした(図7B)。TRAILショートがTRAILのアンタゴニストであることと合致して、増加する用量のTRAILショート抗体の存在下でのsk-TRAIL処理は、Jurkat死滅の用量依存的増加を誘導した。これは、試験した抗体の最高用量5μg/mlでは、TRAILショート抗体単独が固有の細胞毒性を持たないにもかかわらず、死細胞の数を効果的に2倍にした。したがって、このモデルシステムにおいて、TRAILショートの存在はTRAIL耐性に必要かつ十分であり、本発明者らのデータは、TRAILショートの抗TRAIL効果がTRAILショート特異的抗体によって効果的に阻害され得ることを示す。
【００７６】
[実施例2：TRAILショートはNK細胞の細胞傷害能を減少させる
NK細胞は、HIV感染に対する抗ウイルス応答において重要な役割を果たす。NK細胞は、腫瘍細胞を死滅させるためのエフェクター分子としてTRAILを産生することができるが、抗ウイルス防御におけるその役割はまさに明らかになりつつある。HIV感染細胞によって産生されるTRAILショートは、これらの細胞がウイルスに対する重要な自然免疫応答を開始する能力を減少させる主な要因であり得る。NK機能に対するTRAILショートの効果を決定するために、HIV感染中のNK細胞の細胞毒性機能の減少におけるTRAILショートの役割を評価した。
【００７７】
方法
Jurkat細胞を対照又はTRAILショート発現プラスミドでトランスフェクトし、様々なエフェクター:標的比(1:1〜20:1)で非感染ドナー(N=10)由来の初代NK細胞とインキュベートした。フローサイトメトリーベースのアッセイを用いて、標的Jurkat細胞に対するNK細胞の細胞毒性効果を決定した。NK細胞の活性及び機能に対するTRAILショートの過剰発現の効果は、CD69、パーフォリン、CD16及びCD107aを染色することにより決定された。さらに、TRAIL及びTRAILショートのNK発現に対するgp120又はHIV-1 IIIB株を含む上清の効果は、表面染色によって測定された。
【００７８】
結果
標的細胞におけるTRAILショートの過剰発現は、対照細胞と比較して、E:T比の範囲全体でこれらの細胞に対するNKの細胞毒性機能を有意に減少させた(図8;20:1のE:T比でp=0.006)。これらの結果は、TRAILショート発現が、NKが媒介する細胞毒性を有意に減少させることを実証した。
【００７９】
HIV IIIBウイルスを含む培養上清でのNK細胞の前処理は、TRAILショートの表面発現を大幅に増加させたが、TRAIL発現には影響がなかったのに対し、gp120単独では影響しなかった(図9)。これらの結果は、HIVを含む上清単独がNK細胞におけるTRAILショートの表面発現を増加させることを実証した。
【００８０】
TRAILショートは、NK細胞におけるCD69、CD16、パーフォリン又はCD107aの発現を変化させなかった(図10)。これらの結果は、TRAILショートがNK機能に影響を及ぼし、HIV感染に対する自然免疫応答に重要な役割を果たすことができることを実証した。
【００８１】
実施例3：抗TRAILショート抗体のヒト化
マウスモノクローナル抗体TRAILs 2.2をヒト化して抗体Ab866を作製した。
【００８２】
重鎖
マウスTRAILs 2.2のVHドメインの配列を以下に記載する。CDRは太字で示されている:
2020507580.tif 000011
【００８３】
マウスVHのCDRをヒトアクセプターフレームワークに移して、ヒト化変異体VH1-VH4を作製した:
2020507580.tif 000012
【００８４】
ヒト化変異体VH1-4のVH0マウス配列のアラインメントを図12Aに示す。VH0マウス配列に対するヒト化変異体VH1-4の相同性を以下の表1に示す。
【００８５】
【表１】
2020507580.tif 000013
【００８６】
軽鎖
マウスTRAILs 2.2のVLドメインの配列を以下に記載する。CDRは太字で示されている:
2020507580.tif 000014
【００８７】
マウスVLのCDRをヒトアクセプターフレームワークに移して、ヒト化変異体VL1-VL4を作製した:
2020507580.tif 000015
2020507580.tif 000016
【００８８】
ヒト化変異体VL1-4のVL0マウス配列のアラインメントを図12Bに示す。VL0マウス配列に対するヒト化変異体VL1-4の相同性を以下の表2に示す。
【００８９】
【表２】
2020507580.tif 000017
【００９０】
すべてのヒト化変異体は、世界保健機関(WHO)のヒト化抗体の定義に準拠していた。
【００９１】
実施例4：抗TRAILショート抗体
VHドメインの各々は、ヒトIgG1アイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成される。重鎖配列全体をコドン最適化(DNA2.0、USA)し、DNA配列を検証することができる。IgG1定常ドメイン(アロタイプG1m17,1)のアミノ酸配列は、以下である：
2020507580.tif 000018
【００９２】
VLドメインの各々は、ヒトIgKアイソタイプ定常ドメイン配列とインフレームで合成される。軽鎖配列全体をコドン最適化(DNA2.0、USA)し、DNA配列を検証することができる。IgK定常ドメイン(アロタイプKm3)のアミノ酸配列は、以下である：
2020507580.tif 000019
【００９３】
変異体鎖の各々は、DNA配列決定分析によって検証される。16個のヒト化抗体には、表3に示されるヒト化可変ドメインの任意の組み合わせを含むことができる。
【００９４】
【表３】
2020507580.tif 000020
【００９５】
重鎖及び軽鎖の各々の完全なアミノ酸配列を図13に示す。
【００９６】
実施例5：癌を治療するための抗TRAILショート抗体
インビボで抗TRAILショート抗体の効果を調べるために、NSGマウスは、ルシフェラーゼを恒常的に発現するJurkat T細胞白血病細胞を注射され、ルシフェラーゼ発現を週2回測定した。図14A〜Cに示される実験について、マウスは、27日目に10mg/kgのIC抗体又は抗TRAILショート抗体クローン2.2(例えば、実施例4に記載されるマウスTRAILs 2.2)のいずれかを注射された。マウスは、24時間後(例えば、28日目)、抗TRAIL受容体2(抗DR5)抗体(10mg/kg)で注射された。代表的なルシフェラーゼ発現は、アイソタイプ対照で処理されたマウスと比較して、抗TRAILショート抗体で処理されたマウスにおいて減少した(図14A及び14B)。ルシフェラーゼ発現は、抗TRAILショート抗体及び抗DR5で処理されたマウスにおいて有意に減少した(図14C)。抗TRAILショート抗体及び抗DR5で処理されたマウスのすべてが生存し、一方、対照マウスは生存しなかったが、この差は統計的に有意ではなかった(図14D)。これらの結果は、TRAILアゴニスト(抗DR5)の存在下でのTRAILショート阻害が、アイソタイプ対照+抗DR5と比較して腫瘍制御の改善、及び生存率の改善をもたらすことを示している。図14D〜Eに示される実験について、マウスは、20、27、及び34日目に10mg/kgのIC抗体又は抗TRAILショート抗体クローン2.2のいずれかを注射された。ルシフェラーゼ発現は、抗TRAILショート抗体で処理されたマウスにおいて有意に減少し(図14E)、アイソタイプ対照抗体で処理されたマウスと比較して、生存率は、抗TRAILショート抗体で処理されたマウスにおいて有意に増加した(図14F)。これらの結果は、抗TRAILショート抗体を単独又は抗DR5の存在下でインビボ投与すると、マウスにおける白血病細胞の数を減少させ、マウスの生存期間を延長できることを示している。
【００９７】
抗TRAILショート抗体sk-TRAIL細胞毒性の効果は、様々な癌細胞株において調べられた。細胞を96ウェルプレートに1ウェルあたり1×104細胞の密度で播種した。次に、細胞は、37℃で1時間示されるように可変濃度(1〜20μg/mL)で、中和抗TRAIL短抗体クローン2.2又はIgG3対照とともにプレインキュベートされた。次に、sk-TRAILは、示されるように、1〜10ng/mLの用量で細胞に添加された。細胞死を測定するために、カスパーゼ3/7アポトーシスアッセイ試薬を1:1000の希釈で細胞に添加した。細胞死のライブタイム分析について、IncuCyte(登録商標)システムを用いて、2時間ごとに細胞のリアルタイム画像を捕捉した。リンパ腫白血病細胞(図15A)、膵臓癌細胞(図15B)、黒色腫細胞(図15C)、及び卵巣癌細胞(図15D)を調べた。各処置を3重にして行った。これらの結果は、一部の細胞株において、抗TRAILショート抗体が、組換えTRAILと協調して作用し、癌細胞におけるアポトーシスを誘発することを実証した。
【００９８】
【表４】
2020507580.tif 000021
【００９９】
異なる癌細胞におけるTRAIL発現を調べるために、TRAIL mRNAは、qRTPCRによって異なる癌細胞において定量された。RNAは、QiagenのRNeasyミニキットを用いて単離された。高容量のcDNA逆転写キットを用いて、1μgのRNAをcDNAに逆転写した。cDNAを希釈し、TRAILショート及びTRAILFLについて標準を使用して、各遺伝子のコピー数をリンパ腫白血病細胞、膵臓癌細胞、黒色腫細胞、及び卵巣癌細胞において計算した(図16)。
【０１００】
異なる癌細胞におけるTRAILの発現をさらに調べるために、組織マイクロアレイの組織を1:400濃度のTRAILショート2.2抗体を用いた免疫組織化学により染色した。図17に示されるように、膵臓、胃、及び前立腺の正常組織並びに対応する癌組織の例は、TRAILショートについて陽性に染色された。これらの結果は、癌組織が非悪性組織と比較してTRAILショートの有意に高められた発現を有することを示した。
【０１０１】
実施例6：癌を治療するための抗TRAILショート抗体
様々な癌種におけるTRAILショート発現は、組織マイクロアレイの免疫組織化学を用いて観察された。1:400の希釈で抗TRAIL-ショート抗体2.2を使用して行われた8つの組織マイクロアレイ(TMA)を図18及び以下の表5にまとめる。
【０１０２】
【表５】
2020507580.tif 000022
2020507580.tif 000023
【０１０３】
TRAILショートは多数のヒト腫瘍において見出された(図19)。TRAILショートレベルは、100万キロベースあたりの読み取り(RPKM)として定量化された。データは、Cancer Genome Atlas(TCGA)から決定された。
【０１０４】
TRAILショートのレベルの増加は、一部のヒト腫瘍の生存率の不良と関連していた(図20)。生存は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(図20A)、結腸及び直腸腺癌(図20B)、色素性腎細胞癌(図20C)、膵臓腺癌(図20D)、及び胸腺腫(図20E)を有する患者のカプランマイヤー分析により評価され、100万キロベースあたりの転写産物(TPM)として表されるTRAILショートレベルによって層別化された。生存曲線は、Cancer Genome Atlas(TCGA)から決定された。
【０１０５】
抗TRAILショート抗体は、TRAILショート抗原と相互作用した。HEK293T細胞は、緑色蛍光タンパク質(GFP)、GFP-TRAILショート、又はGFP-TRAILFLをコードするプラスミドでトランスフェクトされ、共焦点顕微鏡で分析された(図21)。
【０１０６】
コドン最適化により、16個の抗TRAILショート抗体変異体が得られた。抗TRAILショート抗体の変異体は、スーパーキラー(sk)-TRAIL及び様々な親和性と組み合わせて、Jurkat細胞に対するTRAIL誘導細胞毒性に様々な影響を及ぼした(表6)。表面プラズモン共鳴を使用して親和性を分析した。クローンHC2LC3は、3.8pMの親和性、及びsk-TRAILの存在下で有意な相乗的な死滅を示した(1ng/ml;図22)。
【０１０７】
【表６】
2020507580.tif 000024
【０１０８】
患者由来の細胞の一部は、抗TRAILショート抗体+sk-TRAILに応答性であったが、他はそうではなかった。血液悪性腫瘍の疑いで脾臓摘出術を受けた患者の脾臓由来の細胞を新たに単離し、何もなし(対照)、スーパーキラーTRAIL(sk-TRAIL、オリゴマー化TRAILアゴニスト)、ヒト化抗TRAILショート抗体(クローンHC2LC3)、又はアイソタイプ対照抗体で処理した(IgG4)。Incucyte生細胞イメージングプラットフォームを使用して、経時的に活性なカスパーゼ3/7活性を分析することによって、経時的な細胞死を監視した(図23)。
【０１０９】
異なるヒト患者由来の癌細胞株におけるsk-TRAIL細胞毒性に対する抗TRAILショート抗体の効果を評価した。患者の脾臓由来の細胞は、RPMI中に新たに受け入れられ、増加用量の抗TRAIL-ショートクローンHC2LC3(1.25、2.5、又は5μg)の存在下又は非存在下、1ng/mLの用量のsk-TRAILの存在下で細胞毒性に対する感受性について試験された。対照は、同じ用量のヒトIgG4で処理された。Incucyteを使用して、72時間にわたって、切断されたカスパーゼ3/7陽性である細胞数により、2時間ごとに細胞死を監視した(図24)。
【０１１０】
抗TRAILショート+sk-TRAILに対する応答性は、多数のヒト患者由来の癌細胞株におけるsk-TRAIL単独よりも大きかった。1ng/mLの用量でのsk-TRAIL単独、又はsk-TRAIL(同用量)+5μg/mLの用量での抗TRAILショートクローンHC2LC3の処理後の48時間での死細胞数を図25に示す。応答性は、抗TRAILショート抗体の添加後の死細胞数の統計的に有意な増加として定義された。ペアt検定の統計が示される。
【０１１１】
単独及びsk-TRAILと組み合わせた抗TRAILショートに対するヒト患者由来の細胞株の応答性を図26及び表7に示す。応答性は、sk-TRAILによる治療に対する死細胞数の統計的に有意な増加として定義された。
【０１１２】
【表７】
2020507580.tif 000025
【０１１３】
抗TRAILショートに応答性である細胞株におけるTRAILショート発現の増加は、様々な応答性及び非応答性の細胞株でリアルタイムqPCRを使用したTRAILショートmRNAのコピー数の定量(図27A)、及びフローサイトメトリーによるCF555にコンジュゲートさせた抗TRAIL-ショート2.2又はアイソタイプを使用した3つの細胞株の染色によって測定されたTRAILショート陽性の割合(図27B)により観察された。
【０１１４】
293T細胞及び患者由来の腫瘍組織におけるTRAILショート発現を調べた。1:400の希釈で抗TRAILショート抗体を使用してTRAILショートに関して染色した免疫組織化学スライドを図28に示す。
【０１１５】
ヒトJurkat T細胞リンパ腫細胞を移植したNSGマウスは、抗DR5+抗TRAILショート抗体の組み合わせで効果的に治療された。IV注射によりルシフェラーゼを発現するJurkat T細胞をNSGマウスに移植した。腫瘍を確立させ、2週間ごとに、以下のいずれかの10mg/kgで14日ごとに示される通りに処置した:(i)TRAILショートのアイソタイプ対照及びDR5抗体のアイソタイプ(アイソタイプと呼ばれる)、(ii)抗TRAILショート抗体クローン2.2+抗DR5のアイソタイプ対照(抗TRAILショートと呼ばれる)、(iii)抗TRAILショート抗体のアイソタイプ対照+抗DR5抗体(アイソタイプ対照+抗DR5と呼ばれる)、又は(iv)抗TRAILショート(2.2)+抗DR5。経時的に、マウスを全身画像化によりルシフェラーゼ発現について分析した(図29A)。生存率をカプランマイヤー分析で評価した(図29B)。
【０１１６】
抗TRAILショート抗体+アイソタイプ対照、又は抗TRAILショート抗体+抗DR5抗体は、ヒト癌のマウス異種移植モデルにおいて腫瘍成長の抑制をもたらした(図30)。NSGマウスにヒトびまん性大細胞型B細胞リンパ腫(HBL-1)細胞株を皮下移植し、腫瘍サイズを毎日測定した。腫瘍が100立方mmを超える又はそれに等しいサイズに達した場合、マウスは、毎週、以下のいずれかの10mg/kgでIP注射によって14日ごとに示された処置を示される通りに受けた:(i)TRAILショート及びDR5抗体のアイソタイプ対照(IC+IC)、(ii)抗TRAILショート抗体クローン2.2+抗DR5のアイソタイプ対照(2.2+IC)、(iii)抗TRAILショート抗体のアイソタイプ対照+抗DR5抗体(IC+DR5)、又は(iv)抗TRAILショート(2.2)+抗DR5抗体(2.2+DR5)。経時的に、マウスを腫瘍のサイズ及びベースラインから計算される倍数変化について分析した(図30A)。生存率をカプランマイヤー分析で評価した(図30B)。
【０１１７】
抗TRAILショート抗体クローン2.2の毒性、及び任意の毒性効果の可逆性を調べた。10匹のC57BL/6マウス(5匹の雄及び5匹の雌)を使用した。動物は、1日目に10mg/kgの用量及び5ml/kgの用量で静脈内ボーラスにより抗TRAILショート抗体クローン2.2を投与された。研究中に評価されたパラメータには、皮膚、毛皮、目及び粘膜、呼吸器系、循環器系、自律神経中枢系、体性運動活動、自発運動及び行動パターンの変化、体重変化、並びに死亡率への影響が含まれた。生存期間の終わりに、すべての動物を計量し、人道的に安楽死させ、臨床化学及び血液分析のために血液を回収し、肉眼的剖検を行った。動物の体調、活動、又は行動に異常若しくは変化はなかった。すべての研究動物の臨床観察は毎日行われた。すべての研究動物は、7日間、1日2回観察された。すべての動物は研究期間中、生存した。すべての動物は研究中に体重が減少したが、しかしながら、絶食後、屠殺前の最終体重を回収したため、体重の減少が絶食処置、抗TRAILショート抗体クローン2.2、又はそれらの組み合わせによるものかどうかは不明である。血液学及び臨床化学に関する臨床病理学調査は、8日目に生存した研究動物のすべてに対して行われた。最終血液試料は、大静脈又は心臓穿刺から回収された。10匹の健康なC57 BL/6マウスのコホートにおいて、雄又は雌の動物のいずれかの1日目に抗TRAILショート抗体をIV注射した後の7日間の観察期間にわたって、有害な毒性は観察されなかった。
【０１１８】
TRAILショートは、インサイチュハイブリダイゼーションにより組織内で検出することができる(ISH;図31)。SIV感染させたマカク組織は、Advanced Cell DiagnosticsからのTRAIL完全長特異的プローブ又はTRAILショート特異的プローブ(配列383bp 5'-tcgttaga aagactccaa gaatgaaaag gctctgggcc gca -3' 423bp(配列番号31)を有する)のいずれかで染色され、10倍、20倍、40倍の倍率で視覚化された(図31)。SIV感染させたマカク腋窩リンパ節組織は、TRAIL特異的プローブとTRAILショート特異的プローブの両方で染色された。同様に、SIV感染させたマカク脾臓組織は、TRAIL特異的プローブとTRAILショート特異的プローブの両方で染色された。
【０１１９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて記載したが、前述の記載は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示し、限定するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び修飾は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2020507580.tif 000026
【図２】
2020507580.tif 000027
【図３】
2020507580.tif 000028
【図４】
2020507580.tif 000029
【図５】
2020507580.tif 000030
【図６】
2020507580.tif 000031
【図７】
2020507580.tif 000032
【図８】
2020507580.tif 000033
【図９】
2020507580.tif 000034
【図１０】
2020507580.tif 000035
【図１１】
2020507580.tif 000036
【図１２】
2020507580.tif 000037
【図１３−１】
2020507580.tif 000038
【図１３−２】
2020507580.tif 000039
【図１４−１】
2020507580.tif 000040
【図１４−２】
2020507580.tif 000041
【図１５−１】
2020507580.tif 000042
【図１５−２】
2020507580.tif 000043
【図１５−３】
2020507580.tif 000044
【図１６】
2020507580.tif 000045
【図１７】
2020507580.tif 000046
【図１８】
2020507580.tif 000047
【図１９】
2020507580.tif 000048
【図２０−１】
2020507580.tif 000049
【図２０−２】
2020507580.tif 000050
【図２１】
2020507580.tif 000051
【図２２】
2020507580.tif 000052
【図２３−１】
2020507580.tif 000053
【図２３−２】
2020507580.tif 000054
【図２３−３】
2020507580.tif 000055
【図２３−４】
2020507580.tif 000056
【図２４−１】
2020507580.tif 000057
【図２４−２】
2020507580.tif 000058
【図２４−３】
2020507580.tif 000059
【図２５】
2020507580.tif 000060
【図２６】
2020507580.tif 000061
【図２７】
2020507580.tif 000062
【図２８−１】
2020507580.tif 000063
【図２８−２】
2020507580.tif 000064
【図２８−３】
2020507580.tif 000065
【図２９】
2020507580.tif 000066
【図３０】
2020507580.tif 000067
【図３１−１】
2020507580.tif 000068
【図３１−２】
2020507580.tif 000069
【配列表】
2020507580000001.app
【国際調査報告】
2020507580.tif 000070
2020507580.tif 000071
2020507580.tif 000072