(57)【要約】  本明細書は、特に腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の抗原含有量および癌細胞の免疫原性を増強する方法、樹状細胞のクロスプレゼンテーションを強化する方法、単一の癌患者に由来するそのような操作された細胞を含む組成物、およびこれらの組成物を個人用免疫療法製品として使用して、ドナー患者の癌を治療する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じ癌患者からの癌細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む組成物であって、
前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の蓄積または免疫原性を改善するためにｅｘ  ｖｉｖｏで改変されている、
組成物。
【請求項２】
癌患者からのＤＣを含む組成物であって、
前記ＤＣには、前記癌患者から除去された腫瘍から単離された癌細胞からの抗原性物質が負荷され、前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現されるＴＡＡの蓄積または免疫原性を改善するために改変されている、
組成物。
【請求項３】
前記ＤＣは、増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変されている、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＣは、アミノグリコシド抗生物質への曝露により改変されている、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＣは、トール様受容体４アゴニストへの曝露により改変されている、請求項３〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記癌細胞は、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積するように改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１６】
前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、請求項１６または１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項２３】
前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記癌細胞は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の産生を増加させるように改変されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記癌細胞は、ゲンタマイシンへの曝露により改変されている、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記組成物は、生存癌細胞を含まない、請求項２〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項３０に記載の組成物を含む個人用免疫療法製品。
【請求項３２】
癌の治療における請求項３１に記載の個人用免疫療法製品の使用。
【請求項３３】
請求項３１に記載の個人用免疫療法製品を前記患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項３４】
個々の癌患者のための癌に対する個人用免疫療法製品の製造方法であって、
前記患者から腫瘍組織を採取することと、
前記患者から血液を採取することと、
前記腫瘍組織を操作して、ＴＡＡの蓄積を高めることと、
前記血液を操作して、単球を分離すると共にそれらを樹状細胞に分化させ、必要に応じて、前記樹状細胞の抗原提示能力を高めることと、
を含み、
操作された前記腫瘍組織からの前記樹状細胞および癌細胞物質を含む個人用免疫療法製品を作製する、
方法。
【請求項３５】
採取することは、前記患者から前記腫瘍組織および前記血液を物理的に除去することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記腫瘍組織および前記血液を、癌細胞を前記腫瘍組織から分離すると共にＤＣを前記血液中の単球と区別する能力を有する中央施設に送ることをさらに含み、前記中央施設は、１）前記ＤＣを改変して交差処理を増加させる、または２）前記癌細胞を改変してＴＡＡ含有量を増加させる、もしくは前記癌細胞の免疫原性を高める、または３）両方の能力をさらに有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
採取することは、前記腫瘍組織および前記血液の発送物を受け取ることを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍組織から癌細胞を分離することと、
単球を分化させることにより、前記血液からＤＣを得ることと、
前記癌細胞、前記ＤＣ、またはその両方を改変することと、
前記癌細胞またはその溶解物を含む癌細胞物質を、ＤＣ成熟因子の存在下で前記ＤＣと組み合わせることと、
をさらに含む、請求項３５または３７に記載の方法。
【請求項３９】
ＤＣ成熟因子の存在下で、前記腫瘍組織に由来する癌細胞またはその溶解物を含む癌細胞物質を、前記血液に由来する未熟ＤＣと組み合わせることをさらに含み、前記癌細胞、前記ＤＣ、または両方は改変されている、請求項３５または３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＤＣ成熟因子は、リポ多糖（ＬＰＳ）である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＤＣを増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変することをさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記癌細胞を改変してＤＡＭＰの産生を増加させることをさらに含む、請求項３８〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
改変することは、前記ＤＣまたは癌細胞のアミノグリコシド抗生物質への曝露を含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
改変することは、前記ＤＣのトール様受容体４アゴニストへの曝露を含む、請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記癌細胞を改変して、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積させることをさらに含む、請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、請求項３８〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、請求項３８〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、請求項３８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、請求項３８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記カスパーゼ阻害剤は、ｚＶＡＤ．ｆｍｋを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、請求項３８〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＤＣおよび癌細胞物質が組み合わされてから２４〜４８時間後に、ＤＣおよび癌細胞物質の組み合わせに凍結防止剤を添加すると共に組み合わせられた物質を凍結保存することをさらに含む、請求項３８〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
請求項３４〜６７のいずれか１項に記載の方法により製造された前記個人用免疫療法製品を前記個々の癌患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【請求項６９】
癌の治療における、請求項３４〜６７のいずれか１項に記載の方法により製造された前記個人用免疫療法製品の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
悪性細胞と免疫系との相互作用には、特に、特定の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による、自然免疫系および適応免疫系による癌細胞の排除、または免疫系と耐性癌細胞の間の平衡、または癌細胞の回避を可能にし、癌の最終的な臨床的検出につながる免疫制御の回避を含む。サイトカインインターロイキン−２などの特定の免疫療法は、既存の免疫応答を促進し、抗ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１などのチェックポイント阻害剤は、そのような阻害剤によって抑制されていた抗腫瘍応答を放出し得る。しかしながら、癌患者の多くは、悪性細胞の十分な免疫認識を欠いており、そのような方法では癌をうまく制御または排除することができない。すなわち、それらは、進行中の免疫応答の証拠としてのＣＴＬ腫瘍浸潤またはＰＤ−１の発現の増加の証拠、または鈍化した免疫応答の証拠としてのＰＤＬ−１発現の増加の証拠を有しない。したがって、癌患者において抗癌免疫応答を刺激する改善された方法の必要性が残っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００２】
開示された実施形態は、自己癌細胞からの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を負荷した自己樹状細胞（ＤＣ）を含む自己免疫療法製品を含む。そのような製品、およびそれらが含むｐＤＣはｅｘ  ｖｉｖｏで生成され、自然の過程を通じて、または本明細書に開示される薬剤のクラスへの身体の曝露時に体内で生じるＤＣを包含しない。それにもかかわらず、これらの製品および組成物は、ｅｘ  ｖｉｖｏで生成された後、対象、特に癌の治療を必要とする対象の身体に投与され得る。様々な実施形態では、ＤＣまたは癌細胞、あるいはその両方をｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作して、ＴＡＡを標的とする免疫原性を高める。治療される患者の腫瘍から得られた生癌細胞は、腫瘍細胞におけるＴＡＡの発現および／または蓄積を増加させ、それにより存在するＴＡＡの量を増加させる、または癌細胞の寛容原性を減少させる薬剤に曝露され得る。同様に、癌細胞を治療して免疫原性を改善し得る。ＤＣは、細胞内エンドソーム−リソソーム輸送を変化させるアミノグリコシドに曝露され得、それにより、外因性抗原のクロスプレゼンテーションを高める。ＤＣは、溶解された腫瘍細胞または全体ではあるが生存不能な腫瘍細胞に曝露されるため、ＤＣにＴＡＡが負荷され、処理される。次に、ＴＡＡを負荷したＤＣを免疫療法製品として元のドナーの癌患者に投与し得る。図１を参照。
【０００３】
開示された実施形態は、癌細胞を改変してそれらのＴＡＡ特異的、および一般的な免疫原性を改善する方法、およびＤＣを改変してそのクロスプレゼンテーションのレベルを増加させる方法を含む。さらなる実施形態は、改変ＤＣ、改変癌細胞またはその溶解物、またはその両方を含む組成物を含む。不活性化された癌細胞または細胞溶解物（癌細胞物質）の存在下でＤＣを培養することにより、ＤＣに抗原が負荷される。いくつかの実施形態では、抗原負荷後、ＤＣ培養物から残留癌細胞物質を除去するための手順は取られないため、抗原負荷ＤＣを含む組成物には、特に明記しない限りＤＣによってまだ取り込まれていない残留癌細胞物質が含まれる。自己抗原負荷ＤＣは、本明細書に記載の個人用抗癌免疫療法製品の主要な成分である。癌の治療におけるこれらの免疫療法製品の使用、およびこれらの免疫療法製品の投与を含む癌治療の方法も開示されている。最後に、ＤＣを改変し、癌細胞を改変して、それらが成分となる免疫療法製品の免疫原性および有効性を改善する特定の方法が開示されている。
【０００４】
ＤＣによるクロスプロセシングは、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質、またはリポ多糖（ＬＰＳ）などのトール様受容体４（ＴＬＲ−４）アゴニストへの曝露によって増加し得る。いくつかの実施形態では、交差処理増強剤は、単球を未熟ＤＣに分化させるプロセスの最初から追加される。これらの実施形態の一態様では、交差処理増強剤の濃度は比較的低い。いくつかの実施形態では、ＤＣ成熟および抗原負荷プロセスの開始から、交差処理増強剤が添加されるか、濃度が増加する。これらの実施形態の一態様では、交差処理増強剤の濃度は比較的高い。いくつかの実施形態では、ＬＰＳなどのＴＬＲ−４アゴニストが成熟剤として使用される。
【０００５】
癌細胞は、ＴＡＡの発現または蓄積を増加させるため（したがって、癌細胞物質のＴＡＡ特異的免疫原性を改善する）または癌細胞物質の全体的な免疫原性を増加させるための異なるメカニズムに依存する様々なアプローチによって改変され得る。いくつかの実施形態では、癌細胞改変の方法は単一のアプローチを使用する。他の実施形態では、癌細胞改変の方法は複数のアプローチを使用する。いくつかの実施形態では、複数のアプローチは単一のメカニズムに依存する。他の実施形態では、複数のアプローチはそれぞれ別個のメカニズムに依存する。さらに他の実施形態では、複数のアプローチのいくつかは共通のメカニズムを有するが、少なくとも１つは別個のメカニズムに依存する。ＴＡＡの蓄積を改善するためのアプローチは、エピジェネティック改変によるタンパク質発現の増加、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の活性化によるタンパク質発現の増加、プロテアソーム阻害によるタンパク質蓄積の増加、オートファジーの低減によるタンパク質の蓄積の増加、およびアポトーシスを阻害によるタンパク質の蓄積の増加を含む。ＴＡＡの免疫原性を改善するアプローチは、ＴＡＡの蓄積の改善、寛容原性分子の除去による一般的な免疫原性の増加、および損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の増加による一般的な免疫原性の増加を含む。
【０００６】
いくつかの実施形態では、エピジェネティック改変のメカニズムは、ＤＮＡの脱メチル化またはヒストンの脱アセチル化の阻害を含む。いくつかの実施形態では、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を活性化するメカニズムは、ＰＴＥＮの阻害または成長因子またはホルモンの添加を含む。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害のメカニズムは、プロテアソームプロテアーゼ活性の阻害またはユビキチンＥ３リガーゼの阻害を含む。いくつかの実施形態では、オートファジーを低減するメカニズムは、例えばアミノグリコシド抗生物質による治療によるリソソーム機能の阻害を含む。いくつかの実施形態では、アポトーシスを阻害するメカニズムは、カスパーゼ阻害を含む。いくつかの実施形態では、寛容原性シグナルを除去するメカニズムは、コレステロールおよびＷｎｔリガンドを枯渇させることを含む。いくつかの実施形態では、ＤＡＭＰを増加させるメカニズムは、例えばアミノグリコシド抗生物質での治療によるオートファジーの減少を含む。
【０００７】
癌細胞改変の各方法について、改変癌細胞、癌細胞の溶解物、または抗原負荷ＤＣを含む対応する組成物があり、ＤＣには改変癌細胞物質が負荷されている。いくつかの実施形態では、ＤＣは改変ＤＣである。いくつかの実施形態では、特定のアプローチ、メカニズム、または薬剤が具体的に含まれる。いくつかの実施形態では、特定のアプローチ、メカニズム、または薬剤が具体的に含まれない。
【０００８】
いくつかの実施形態では、癌細胞の別個の培養物は、異なるアプローチ、メカニズム、または薬剤によってそれぞれ改変され、次いでＤＣ抗原負荷のために一緒に組み合わされる。いくつかの実施形態では、癌細胞の別個の培養物は、異なるアプローチ、メカニズム、または薬剤によってそれぞれ改変され、次いで、別個のＤＣ培養物におけるＤＣ抗原負荷に使用され、その後、抗原負荷ＤＣは単一の免疫療法製品に組み合わされる。いくつかの実施形態では、癌細胞の別個の培養物は、異なるアプローチ、メカニズム、または薬剤によってそれぞれ改変され、次いで、患者に別々に投与される別個の免疫療法製品を作製するために使用される別個のＤＣ培養物におけるＤＣ抗原負荷に使用される。これらの実施形態のいくつかの態様では、別個の免疫療法製品がほぼ同時に（数分から４８時間以内に）投与されるが、他の態様では、別個の免疫療法製品が数週間または数ヶ月の間隔で投与される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】同じ患者に由来する癌細胞と樹状細胞を使用して、免疫原性が改善された自己免疫療法抗腫瘍製品を製造するプロセスの概要を示す。
【図２】ボルテゾミブ濃度に対する細胞生存反応を示す。約１μＭ〜５μＭの場合の応答の線形部分。
【図３】様々な濃度のボルテゾミブへの曝露から２日後の卵巣腫瘍細胞株培養の位相差顕微鏡写真である。
【図４】２０μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋと５ｎＭのボルテゾミブの連続投与後の形態変化を伴うサバイバルレスキューを示す位相差顕微鏡写真である。
【図５】ボルテゾミブとＺ−ＶＡｄ−ｆｍｋとの組み合わせが、培養形態または生存の明らかな変化を引き起こさなかったことを示す位相差顕微鏡写真である。
【図６】腫瘍細胞を様々な濃度のボルテゾミブに曝露した後の、異なる蛍光体で標識された２つの抗原の平均蛍光強度を示す。
【図７】腫瘍細胞を様々な濃度のボルテゾミブに曝露した後の、異なる蛍光体で標識された２つの抗原の画素の総和を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
免疫系は、腫瘍細胞を特異的に認識して排除し得る。癌の治療にこの能力を活用する可能性は長い間認識されてきたが、そうすることの成功はせいぜい限定的である。異種腫瘍細胞または個々の抗原またはエピトープの使用と比較して、免疫原として自己腫瘍細胞を使用すると、いくつかの利点がある。癌細胞には、ＴＡＡとして機能し得る変異タンパク質、新抗原が含まれるが、これらは各患者に固有であることが多いため、自己腫瘍のみが信頼できる供給源である。自己腫瘍には癌幹細胞と初期前駆細胞も含まれるため、その亜集団を表すＴＡＡは免疫原性組成物に含まれる。さらに、異種細胞または既製の免疫原を使用する場合のように、自己腫瘍の使用により、標的となる個々の抗原をそれぞれ同定および適合させる必要がなくなる。抗原の供給源として自己細胞を使用することにより、個々の患者の癌に対する抗原の完全な補体が免疫原性組成物に含まれるようになる。
【００１１】
しかしながら、腫瘍細胞調製物中に存在するＴＡＡの量は、腫瘍細胞中の抗原の定常状態レベルが低いため、または腫瘍細胞の一部のみが抗原を発現するため、またはその両方により制限される場合がある。特定の例は、癌幹細胞などのまれな亜集団のみに関連する抗原である。腫瘍細胞調製物中のＴＡＡの量が限られていると、調製物のＴＡＡ特異的免疫原性に悪影響を与え得る。さらに、癌細胞の一般的な免疫原性を改善し得る。癌細胞はまた、Ｗｎｔリガンドなどの寛容原性分子を含み得、その除去または枯渇は癌細胞の一般的な免疫原性を改善し得る。癌細胞は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）などの炎症誘発性分子を含み得、その増加は癌細胞の一般的な免疫原性を増加させ得る。ＤＡＭＰは、熱ショックタンパク質、ＨＭＧＢ−１（高移動度グループボックス１タンパク質）などの様々な核タンパク質および細胞質タンパク質、膜結合タンパク質、細胞傷害後の細胞外マトリックスに由来するタンパク質を含み得る。ＤＡＭＰは、ＤＮＡ、ＡＴＰ（アデノシン５’−三リン酸）、尿酸、ヘパリン硫酸などの非タンパク質分子も含む。ガンマインターフェロン、多くの化学療法剤、照射、特定のモノクローナル抗体、活性化ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、および抗体依存性細胞媒介傷害（ＡＤＣＣ）への癌細胞の曝露はまた、ＤＡＭＰ信号を増加させ得る。したがって、様々な実施形態では、腫瘍細胞は、タンパク質発現の増加を引き起こす、タンパク質分解の減少を引き起こす、腫瘍細胞におけるＴＡＡの蓄積を促進する、癌細胞から寛容原性分子を枯渇させる、またはＤＡＭＰの癌細胞産生を増加させる１つ以上薬剤に曝露される。いくつかの実施形態は、具体的には、薬剤のクラスの特定の薬剤への曝露を含む。他の実施形態は、具体的には、薬剤のクラスの特定の薬剤への曝露を含まない。
【００１２】
タンパク質の発現を増強または強化すると、個々の細胞のＴＡＡ発現レベルが増加するだけでなく、癌細胞集団全体で抗原が発現される均一性も向上する。腫瘍細胞調製物中のＴＡＡの量の増加は、どんなメカニズムによっても、免疫原性であるのに十分な物質がある可能性を向上させる。このようにして、体内で有効な免疫原になるには低すぎるレベルで自然に発現されるＴＡＡに対する免疫応答を得ることができる。しかしながら、体内の癌細胞による低レベルの抗原発現は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）および抗体によって認識されるのに十分であり得、そして、そのような免疫応答がそもそも誘発され得る場合、癌細胞の破壊につながる。
【００１３】
タンパク質抗原の抗原処理は、２つのパラダイム経路を介して進行する。１つは、外因性抗原がＤＣを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）に貪食され、エンドソーム区画で部分的に分解されてクラスＩＩ  ＭＨＣに関連付けられるペプチド（エピトープ）が生成されることである。ペプチド−ＭＨＣ  ＩＩ複合体はＡＰＣの表面に表示され、ここでは、他の可能性の中で、それらはＣＤ４＋Ｔ細胞によって認識され、Ｂ細胞にＴ細胞の助けを提供するために認可され、抗原に対する抗体応答の誘導と成熟をサポートする。他のパラダイム経路では、内因性タンパク質抗原は、典型的にはプロテオソームによって分解され、生成されたペプチド（エピトープ）はエンドソーム区画のクラスＩ  ＭＨＣに関連付けられる。ペプチド−ＭＨＣ  Ｉ複合体はＡＰＣの表面に表示され、ＣＴＬに成熟するＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される。
【００１４】
抗体は、ＴＡＡが腫瘍細胞表面に発現する程度まで、抗腫瘍応答の重要な部分となり得る。しかしながら、多くのＴＡＡは細胞内タンパク質であり、したがって一般的に抗体にアクセスせず、むしろＣＴＬによって標的化される必要がある。外因的に遭遇した抗原が内因性抗原処理経路に迂回され、クラスＩ  ＭＨＣと関連した抗原提示とＣＴＬ応答の誘導につながるパラダイム的抗原処理経路の改変例がある。このようなクロスプレゼンテーションは、エンドソームの輸送を変更することによって、特にファゴソームとリソソームの融合を遅らせて、より多くのファゴソーム物質がサイトゾルに放出されるようにすることで増加させ得る。ファゴソームとリソソームの融合のこのような遅延は、ＤＣをアミノグリコシド抗生物質に曝露する、またはＤＣをＬＰＳ（リポ多糖）、グルクロンオキシロマンナン、およびモルヒネ−３−グルクロニドなどのＴＬＲ４アゴニストに曝露することでＴＬＲ４を活性化することによって生じる。このようにして、ＤＣはより広範囲のＴＡＡに対するＣＴＬ応答をより効率的に刺激できる。治療はクラスＩＩ  ＭＨＣとの関連では提示を消失させないため、液性および細胞性免疫が刺激される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、生癌細胞とＤＣの両方を操作して、それぞれＴＡＡの発現とクロスプレゼンテーションを増強する。他の実施形態では、ＴＡＡ発現が増強した癌細胞を使用して、操作されていないＤＣに抗原を提供する。さらに他の実施形態では、ＴＡＡ発現を増強するために操作されていない生癌細胞を使用して、クロスプレゼンテーションを増強するために操作されたＤＣに抗原を提供する。しかしながら、ＤＣによる取り込みに対する抗原の可用性の向上とＤＣによるクロスプレゼンテーションの強化の組み合わせ効果は、細胞免疫療法製品としての操作された抗原負荷ＤＣの免疫原性を相乗的に改善すると予想される。したがって、様々な実施形態では、免疫療法製品は、改変された癌細胞（またはその溶解物）、改変されたＤＣ、またはその両方を使用して作製される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、患者はヒトである。他の実施形態では、患者は非ヒト哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、またはウマの患者である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物はげっ歯類ではない。
【００１７】
腫瘍からの生癌細胞の分離
腫瘍の除去またはバルキング除去手術中に、生腫瘍細胞が癌患者の体から除去される。場合によっては、手術は腫瘍（１つまたは複数）全体の除去を伴う。場合によっては、臓器全体またはその実質的な部分を除去する必要がある。除去された組織に病変組織と正常組織の両方が存在する場合、腫瘍組織は正常組織から切り離される。他の例では、手術はパンチまたは針生検を含むがこれらに限定されない生検を伴う。固形腫瘍の場合、酵素消化により組織が刻まれ、解離される。白血病の場合、生癌細胞は、例えば全血の密度勾配沈降または白血球除去によって血液から回収され得る。腹水腫瘍の場合、腹水液を排出してから沈殿させることにより、生腫瘍細胞を回収し得る。回収される生きた癌細胞の数は、腫瘍の大きさや特定の回収方法によって異なるが、一般的には、特に培養で十分に増殖し得ない腫瘍の場合には、より多くの数の細胞が好まれる。したがって、様々な実施形態では、１０５から１０７から１０９またはそれ以上のオーダーの生癌細胞が回収される。消化された細胞外マトリックスおよび他の破片から分離した後、生細胞は増殖のために豊富な細胞培地に移され、および／またはＴＡＡの発現および蓄積を増強するために１つ以上の薬剤に曝露される
【００１８】
いくつかの実施形態では、腫瘍または癌細胞は、任意の悪性新生物由来である。いくつかの実施形態は、癌の特定のクラス（１つまたは複数）またはタイプ（１つまたは複数）を具体的に含み、他の実施形態は具体的に除外する。それらは、固形腫瘍の形成または体液中に懸濁した細胞を含むものとして分類され得る。それらは、脳、頭頸部、食道、肺、肝臓、膵臓、腎臓、胃、結腸、前立腺、乳房、子宮、子宮頸部、卵巣、皮膚、骨、血液、眼、または網膜のような起源の組織に従って分類され得る。それらは、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、膠芽腫、腎細胞癌などの特定のタイプに分類され得る。トリプルネガティブ乳癌、ホルモン抵抗性前立腺癌、ＰＤ−Ｌ１陽性（または陰性）肺癌などのバイオマーカー発現に応じて、さらに細分化され得る。また、それらは、疾患の進行に応じて細分化され得る：非侵襲的、侵襲的、転移性；ステージ０、１、２、３、または４；特定の癌に関連する様々な尺度。癌はまた、それらによって運ばれる表現型的に重要な突然変異、例えばｐ５３またはＢ−Ｒａｆの突然変異に従って分類され得る。
【００１９】
分離された癌細胞の抗原発現と免疫原性の増強と強化
様々な薬剤が利用可能であり、いずれかのメカニズムによってＴＡＡの蓄積または曝露を増加させるか、腫瘍細胞の寛容原性を低下させ得る。これらは、タンパク質発現の増加、タンパク質分解の低減、アポトーシスの阻害、細胞膜からのコレステロールおよびＷｎｔリガンドの枯渇を含む。いくつかの実施形態では、単離された生癌細胞は２４時間から４週間まで培養される。他の実施形態では、培養期間は４〜６週間、４〜８週間、またはそれ以上に及ぶ。さらに他の実施形態では、培養期間は短く、数時間、例えば２、３、４、５、６時間またはそれ以上続くが、２４時間を超えない。いくつかの実施形態では、培養期間は、利用可能な癌細胞の数を増加させるための増殖期、続いて癌細胞が全体的な免疫原性を改善するために改変される増強期に分けられる。他の実施形態では、増殖期と増強期は一致するか、増殖期はないだろう。増強剤およびその作用メカニズムに応じて、いくつかの実施形態では、増強剤は増強期を通して存在するであろう。他の実施形態では、増強剤は、培養の最後の数時間または増強期の最後の日のみに存在する、または増強期全体に存在するが、この最終期間に薬剤の濃度が増加するだろう。さらに他の実施形態では、増強剤は、培養の最初の数時間、または増強期の最初の日にのみ存在する、または、薬剤の濃度はこの最初の期間の後に減少するが、増強期の残りの全体ではより低い濃度に維持される。いくつかの実施形態では、癌細胞は、本明細書で以下に記載される増強手順のちょうど１つの間に薬剤（１つまたは複数）に曝露されるであろう。他の実施形態では、癌細胞は、複数の増強手順、例えば、本明細書で以下に記載される増強手順の２、３、４、またはそれ以上の増強手順に曝露される。いくつかの実施形態では、これらの改変された癌細胞は、増強期の直後に自己ＤＣに曝露されるだろう。他の実施形態では、これらの改変された癌細胞は、後で自己ＤＣに曝露するために凍結保存される。
【００２０】
エピジェネティック改変
タンパク質発現レベルは、癌細胞のエピジェネティック改変により増加され得る。生理学的に正常な細胞と比較して、癌細胞は様々なタンパク質の発現を低下させるエピジェネティック改変を有する。したがって、獲得された癌細胞のエピジェネティック改変を逆転させることにより、下方制御されたＴＡＡの発現を回復させ得る。
【００２１】
転写活性化は、ヒストン尾部のリジン残基のアセチル化に関連する。タンパク質発現をダウンレギュレートできるエピジェネティックメカニズムの１つは、ヒストン尾部のリジン残基の脱アセチル化である。ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＩ）への曝露は、タンパク質発現と癌細胞の抗原含有量の増加を伴うｍＲＮＡ転写の増加に使用され得る。ＨＤＩの例は、トリコスタチンＡなどのヒドロキサム酸（またはヒドロキサメート）、環状テトラペプチド（トラポキシンＢなど）、およびデプシペプチド、ベンズアミド、求電子ケトン、ならびにフェニルブチレートおよびバルプロ酸などの脂肪酸化合物を含む。第２世代ＨＤＩには、ヒドロキサム酸ボリノスタット（ＳＡＨＡ）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、ＬＡＱ８２４、およびパノビノスタット（ＬＢＨ５８９）；およびベンズアミド：エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＣＩ９９４、およびモセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）を含む。さらに、クラスＩＩＩヒストン脱アセチル化酵素はＮＡＤ＋に依存しているため、ニコチンアミドと、ジヒドロクマリン、ナフトピラノン、２−ヒドロキシナフトアルデヒドなどのＮＡＤの誘導体によって阻害される。したがって、これらの薬剤は、ＴＡＡの転写活性化と発現のレベルを増加させるために使用され得る。
【００２２】
タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターは通常、ＣＧジヌクレオチドの頻度が増加し、ＣｐＧアイランドと呼ばれる。これらのＣＧジヌクレオチドはメチル化され得、ＣｐＧアイランドでのこれらのジヌクレオチドの過剰メチル化は転写サイレンシングを引き起こし得る。このような過剰メチル化は、有糸分裂後の娘細胞に受け継がれ得る安定したエピジェネティック変化である。このようなサイレンシングは、例えば遺伝子量の調節など、通常の生理機能で役割を果たすが、癌では異常な高メチル化がよく見られる。脱メチル化剤を使用して、癌細胞によって発現され得る生殖細胞系または腫瘍特異的遺伝子を含む、サイレンシング化された遺伝子の発現を元に戻し得る。  
【００２３】
５−アザシチジン（アザシチジン、５−アザ−ＣＲ；Ｖｉｄａｚａ（登録商標）、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓｕｍｍｉｔ，  ＮＪ，  ＵＳＡ）および５−アザ−２’−デオキシシチジン（デシタビン、５−アザ−ＣｄＲ（Ｄａｃｏｇｅｎ（登録商標），  ＳｕｐｅｒＧｅｎ，  Ｉｎｃ．，  Ｄｕｂｌｉｎ，  ＣＡ，  ＵＳＡ））のような脱メチル化剤は、以前は抗癌剤として使用されていたが、別のメカニズムで動作する。高濃度では、これらの薬物は細胞毒性の程度まで正常なポリヌクレオチド生理機能を破壊する。ＲＮＡに優先的に取り込まれるアザシチジンはタンパク質合成を破壊するが、デシタビンはＤＮＡにのみ取り込まれ、低濃度ではＤＮＡメチルトランスフェラーゼを不活性化し、ＣｐＧメチル化パターンの遺伝性を破壊する。したがって、これらの脱メチル化剤は、ＴＡＡの発現を増加させるために使用でき、好ましい実施形態は、脱メチル化剤としてデシタビンを使用する。
【００２４】
プロテオーム分解の阻害
プロテアソーム阻害剤は、カスパーゼ活性化による細胞死を引き起こす腫瘍細胞タンパク質の代謝回転を破壊するために使用されるよく知られた治療薬である。正常細胞では、プロテアソームはユビキチン化タンパク質の分解によりタンパク質の発現と機能を調節し、さらに異常またはミスフォールドタンパク質の細胞を浄化する。
【００２５】
プロテオソームは細胞の主要な中性タンパク質分解装置であり、通常のタンパク質代謝回転、ならびにサイトゾルおよび核の損傷、ミスフォールド、および異常タンパク質、特にユビキチン化されたタンパク質の分解において主要な役割を果たす。タンパク質分解の長期的な閉塞は細胞死につながるが、最初はタンパク質の蓄積を引き起こし、それ以外の場合は分解するはずである。プロテアソームの阻害剤および非ビクチネーション経路の酵素、特にＥ３リガーゼを使用して、タンパク質分解をブロックし得る。  
【００２６】
転写および翻訳の失敗、ゲノムの突然変異、または酸化もしくは熱などの多様なストレス条件により、ミスフォールドされたタンパク質が細胞のあらゆる区画で生成される。ミスフォールドされたタンパク質は、タンパク質分解経路、最も顕著にユビキチン−プロテアソーム系およびオートファジー液胞（リソソーム）系を標的とする。したがって、プロテアソーム系であるユビキチンを阻害すると、抗原的価値を有する可能性のあるミスフォールドまたは変異（新生抗原）タンパク質の蓄積が生じる。二次的な結果として、リソソーム処理の増加は、免疫系へのＭＨＣ提示の増加につながり得る。
【００２７】
複数のメカニズムが関与する可能性が高いが、プロテアソーム阻害はプロアポトーシス因子の分解を防ぎ、それにより新生細胞のプログラム細胞死を引き起こすと考えられている。プロテアソーム阻害は、比較的高用量（５０〜５００ｎＭ）で短期間投与した後、細胞内ペプチドのバランスを変えることも示された。
【００２８】
哺乳類細胞に侵入し、ユビキチン−プロテアソーム経路によるタンパク質の分解を阻害し得る２０Ｓプロテアソームの様々な非ペプチドおよびペプチド、可逆的および不可逆的阻害剤が特定されている。最初に発見された非ペプチド性プロテアソーム阻害剤は、天然物のラクタシスチンであった。他のプロテアソーム阻害剤は、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ−０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、エポキソマイシン天然選択的阻害剤、ベータ−ヒドロキシベータ−メチルブチレート（ＨＭＢ）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブおよびイキサゾミブを含む。Ｅ３リガーゼ阻害剤は、ｎｕｔｌｉｎ−３、ＪＮＪ−２６８５４１６５（セルデメタン）、ＮＶＰ−ＣＧＭ０９７、ＮＳＣ２０７８９５、Ｎ−（４−ブチル−２−メチルフェニル）アセトアミド（ＳＫＰ２Ｅ３リガーゼ阻害剤ＩＩ）、５−（３−ジメチルアミノプロピルアミノ）−３，１０−ジメチル−１０Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］キノリン−２，４−ジオン（Ｈｄｍ２Ｅ３リガーゼ阻害剤ＩＩ）、および９Ｈ−インデノ［１，２−ｅ］［１，２，５］オキサジアゾロ［３，４−ｂ］ピラジン−９−オン（ＳＭＥＲ３）を含む。したがって、これらの薬剤を使用して、癌細胞にＴＡＡを蓄積させ得る。
【００２９】
ボルテゾミブのｉｎ  ｖｉｖｏ使用は、ＤＣワクチン接種とボルテゾミブ治療を組み合わせた治療戦略の設計に影響を与える先天性および適応性の抗腫瘍免疫を調節する天然のヒト血液ＤＣの能力を劇的に損なうことが示された。プロテアソーム阻害剤を使用すると、通常はプロテアソームによって分解されるカスパーゼカスケード成分が蓄積し、アポトーシスによる細胞死を引き起こす。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ボルテゾミブなどのプロテアソーム阻害剤による癌細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ治療は、ｉｎ  ｖｉｖｏ曝露から生じるＤＣの障害および死を回避するために利用される。ｅｘ  ｖｉｖｏ治療を利用することにより、ＤＣのプロテアソーム阻害剤への曝露を回避または低減し得る。さらに、パンカスパーゼ阻害剤（すなわち、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋ）によるカスパーゼの封鎖は、腫瘍細胞またはＤＣのどちらであれ、アポトーシスの開始を防ぎ、そのどちらも逆効果になる可能性がある。
【００３１】
カスパーゼ阻害剤（薬効範囲が広いカスパーゼのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋなど）とプロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブなど）の同時または連続使用により、腫瘍の新抗原を含む様々なペプチドやタンパク質の蓄積が期待でき、それにより抗原負荷が増加し、より良い免疫応答を引き起こす。さらに、プロテアソーム阻害剤の腫瘍細胞とのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用により、ＤＣをプロテアソーム阻害剤に曝露することが回避されるため、ＤＣの抗原提示および抗腫瘍免疫活性化機能が妨げられない。
【００３２】
オートファジーの削減
アミノグリコシド抗生物質は、リソソームにおける選択的蓄積とリソソーム酵素の阻害により、哺乳動物細胞に対して毒性を示す。鉄イオンの非存在下でのゲンタマイシンによる腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ治療は、リソソームプロセシングを減少させ、ＤＣによる食作用に有利な強化されたＤＡＭＰシグナル伝達とともにＴＡＡ蓄積を増加させる。この効果は、照射や飢えなどのオートファジーを増加させるストレスに続いてより顕著になる。したがって、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質を使用して、オートファジーを低減または遅延させ、それによって細胞内のタンパク質「ジャンク」を増加させて、ＤＡＭＰシグナル伝達を増加させ得る。いくつかの実施形態では、癌細胞はストレスを受け、その後５０〜１５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンに曝露される。ＤＡＭＰシグナル伝達の増加は、ＴＡＡを含むタンパク質の蓄積に加えて、癌細胞の一般的な免疫原性を高める。
【００３３】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路の活性化
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ経路は、細胞の増殖と生存、細胞の成長と分化、インスリン作用、タンパク質合成とオートファジーの制御などを含み、かつ多くの癌で悪性状態を維持する中心的な役割を有する多くの細胞プロセスに関与する複雑なシグナル伝達経路である。経路活性化のメカニズムは、腫瘍抑制因子ＰＴＥＮ機能の阻害、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスホスフェート３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の増幅、Ａｋｔの増幅または突然変異、および成長因子受容体の増幅を含む。経路活性化の下流効果の１つは、タンパク質翻訳の主調節因子であるｍＴＯＲの活性化である。ｍＴＯＲは、ＴＯＲＣ１複合体とＴＯＲＣ２複合体の２つの複合体に存在する。ＴＯＲＣ１複合体では、ｍＴＯＲはその下流エフェクターＳ６キナーゼ／リボソームタンパク質Ｓ６および４ＥＢＰ−１／ｅＩＦ−４Ｅにシグナルを送り、タンパク質の翻訳を制御する。ｍＴＯＲは一般にＡｋｔの下流基質と考えられているが、ｍＴＯＲはＴＯＲＣ２複合体を介して経路に正のフィードバックを提供し得る。
【００３４】
ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２は両方とも、ホルモンと成長因子に反応する。特に、ｍＴＯＲＣ１は、アミノ酸やグルコースなどの栄養素によって急激に調節されているようである。特に大量のロイシンとアルギニンの細胞培養培地中のアミノ酸の存在は、増加したリボソーム生合成とタンパク質生合成、およびオートファジーの抑制を通して細胞成長を増加させ得る。ヒト肝癌細胞株の増殖は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでロイシン濃度に依存することが示されており、０．０５ｍＭのロイシン含有培地での増殖速度は０．２ｍＭと比較して大幅に低下している。様々な実施形態では、ロイシンまたはアルギニン対アラニンのモル比は、少なくとも１０：１以上、例えば２５：１、５０：１、または１００：１である。したがって、培養培地中のロイシンおよび／またはアルギニンの標準レベルよりも高いと、培養癌細胞の増殖およびタンパク質発現（ＴＡＡ発現を含む）を増加させ得る。
【００３５】
ＰＴＥＮ（第１０染色体でホスファターゼとテンシンのホモログが削除された）は、ホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート３−ホスファターゼをホスファチジルイノシトール−４，５−ジホスフェートに変換し、ＰＩ３ＫによるＰＫＢ／Ａｋｔ活性化に対抗するホスファチジルイノシトール−３，４，５−トリホスフェート３−ホスファターゼである。ＰＴＥＮは、細胞膜と一時的に相互作用してその脂質基質を代謝する５０ｋＤのサイトゾル酵素である。多くの腫瘍タイプでは、いくつかの異なるメカニズムによる機能の喪失が高頻度で観察されている。ＰＴＥＮ活性抑制は、細胞の増殖、成長、生存、および関連する代謝の変化に多くの細胞系統で強力な影響を及ぼす。オルトバナジン酸ナトリウムなどのバナジウム化合物は、ホスファターゼ阻害剤として長い間認識されてきた。ビスペルオキソバナジウム１，１０フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ））およびビスペルオキソバナジウム５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ））などのペルオキソバナジウム化合物は、単純なバナデート化合物よりも増加した生物学的効力を示し、標的選択性が高い。Ｎ−（９，１０−ジオキソ−９，１０−ジヒドロフェナントレン−２−イル）ピバルアミド（ＳＦ１６７０）は、ＰＴＥＮの強力かつ特異的な阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＰＴＥＮ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ経路を介して作用する薬剤と組み合わせて使用される。そのような要因には、既知の成長因子（例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＶＧＦ神経成長因子誘導性（ＶＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）など）、ホルモン、インテグリン（ラミニン）、および他の受容体媒介シグナル伝達因子を含む。したがって、これらの因子を使用して、タンパク質合成を含む細胞活性化のレベルを増加し、培養癌細胞におけるＴＡＡ発現のレベルを増加し得る。細胞培養培地に添加される因子の好ましい組み合わせは、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦおよびＥＧＦである。したがって、ＰＴＥＮの阻害剤は、特に成長因子と組み合わせて使用すると、タンパク質合成の増加だけでなく、癌細胞の成長と増殖の加速を可能にする。
【００３６】
アポトーシスの阻害
アポトーシスは、様々なストレスや生化学的シグナルによって開始されるプログラムされた細胞死の制御されたプロセスである。これは、細胞の外傷による壊死とは対照的である。このプロセスは、カスパーゼと呼ばれる、サイトゾルのアスパルテート特異的システインプロテアーゼである酵素ファミリーによって制御されている。それらは、アポトーシスプログラムの開始と実行に関与する。カスパーゼは潜在的チモーゲンとして発現し、自己タンパク質分解メカニズムまたは他のプロテアーゼ（しばしば他のカスパーゼ）による処理によって活性化される。ヒトカスパーゼは、サイトカイン活性化（カスパーゼ−１、−４、−５、および−１３）、アポトーシス開始（カスパーゼ−２、−８、−９、および−１０）、アポトーシス実行（カスパーゼ−３、−６、および−７）の３つの機能群に細分類され得る。カスパーゼは、ＡＰＡＦ１、ＣＦＬＡＲ／ＦＬＩＰ、ＮＯＬ３／ＡＲＣ、およびＢＩＲＣ１／ＮＡＩＰ、ＢＩＲＣ２／ｃＩＡＰ−１、およびＢＩＲＣ３／ｃＩＡＰ−２、ＢＩＲＣ４／ＸＩＡＰ、ＢＩＲＣ５／Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＢＩＲＣ７／Ｌｉｖｉｎなどのアポトーシス阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバーを含む様々な刺激に反応する。ＩＡＰ活性は、ＤＩＡＢＬＯ／ＳＭＡＣまたはＰＲＳＳ２５／ＨＴＲＡ２／Ｏｍｉによって調節される。薬効範囲が広いカスパーゼ阻害剤へのｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露は、細胞死を防ぎ、ＴＡＡの蓄積による腫瘍細胞の急速な増殖を可能にする。
【００３７】
細胞透過性で可逆的または不可逆的な、天然または合成源由来のペプチドカスパーゼ阻害剤または非ペプチドカスパーゼ阻害剤の非限定的な例を表１に示す。これらの薬剤は、培養中の生癌細胞の数と割合を増加させ、ＴＡＡの蓄積を可能にするために使用され得る。
【表１】
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【００３８】
ＤＣ阻害性シグナル伝達分子の枯渇
細胞間コミュニケーションの共通のモードは、シグナル伝達分子の分泌であり、その分子は隣接する細胞によって受け取られる。そのようなシグナル伝達系の１つは、脂質改変された疎水性糖タンパク質の大きなファミリーであるＷｎｔリガンドによって媒介される。実際、一次配列が比較的親水性であるため、疎水性を提供するのは脂質改変である。細胞表面でのＷｎｔリガンドの受容は、遺伝子転写の変化につながる細胞内シグナル伝達カスケードを開始する。ＤＣでは、Ｗｎｔシグナル伝達はβ−カテニンの活性化につながり、これは、耐性を促進し、炎症を制限する重要な工程である。
【００３９】
Ｗｎｔシグナル伝達の異常な調節は、多くの腫瘍タイプで共通である。悪性状態に関連するエピジェネティック変化および遺伝的変化により、Ｗｎｔ経路活性が上昇する。さらに最近では、Ｗｎｔシグナル伝達レベルが、腫瘍成長の促進に関与する幹様腫瘍細胞を識別することが明らかになった。腫瘍では、Ｗｎｔシグナル伝達の蓄積は、過剰なＷｎｔシグナル伝達を伴う抗原提示細胞の調節による免疫回避に部分的に関与する。さらに、癌免疫療法の最も望ましい標的の１つである癌幹細胞は、特に寛容原性であると思われる。
【００４０】
Ｗｎｔリガンドは、脂質ラフト、コレステロール、ガングリオシド、およびスフィンゴ脂質が豊富な細胞の細胞膜の界面活性剤耐性部分に優先的に見られる。膜コレステロールの枯渇は脂質ラフトの完全性を破壊し、同時にＷｎｔを枯渇させる。利用可能な様々なコレステロール枯渇剤の中で、メチル−β−シクロデキストリン（ＭＣＤ）は、β−グルコピラノースユニットからなる高水溶性の環状七糖であり、細胞からのＷｎｔリガンドを含む他の脂質改変膜成分とともに、コレステロールの枯渇に最も効果的な薬剤である。Ｗｎｔ富化腫瘍の場合、ＤＣへの曝露前に腫瘍細胞からＷｎｔリガンドを捕捉および除去することにより、ＤＣの寛容原性状態へのプログラミングが妨げられるため、癌細胞製剤の免疫原性が向上する。したがって、ＭＣＤなどのコレステロール枯渇剤による治療はまた、Ｗｎｔリガンドを枯渇させ、腫瘍細胞、特に癌幹細胞の免疫原性の改善をもたらす。
【００４１】
抗原処理の増強
細胞溶解性免疫応答は、主にＣＤ８＋Ｔ細胞によって媒介される。そのような応答を刺激するために、ＤＣは、主に内因的に発現された抗原を負荷したクラスＩ  ＭＨＣと関連して抗原を提示する必要がある。食作用物質は主にクラスＩＩ  ＭＨＣと関連して提示されるが、クラスＩ  ＭＨＣと関連して食作用抗原の提示につながるクロスプレゼンテーションと呼ばれるプロセスがある。摂取後、ファゴソームは、最初にエンドソームのコンパートメント、次いでリソソームのコンパートメントの連続的な融合および分裂イベントを経て、ファゴソームの内容物の分解、「ファゴソーム成熟」と呼ばれるプロセスを引き起こす。ＤＣは、クロスプレゼンテーションに最適な条件を可能にする特殊な食作用経路を開発した。これらの専門分野には、軽度の分解性のファゴソーム環境、プロテアソームを介した分解のための細胞質ゾルへの抗原の輸送、および小胞体（ＥＲ）またはファゴソームでの生成ペプチドの効果的な負荷が含まれる。ファゴソームとリソソームの正常な融合により、ファゴソームの内容物が分解される。融合プロセスの遅延により、ファゴソームの内容物の細胞質への輸出が強化される。したがって、腫瘍細胞のファゴソーム処理の意図された遅延は、ＴＡＡのクロスプレゼンテーションの増加および細胞傷害性免疫応答の強化をもたらし得る。
【００４２】
アミノグリコシド抗生物質はリソソームに蓄積し、リソソーム酵素を阻害し、オートファジー物質の構築をもたらす。物質の蓄積は、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を含む細胞ストレス応答を引き起こす。ＲＯＳとリソソーム鉄の存在下で、リソソーム膜wo
浸透し、その内容物がサイトゾルに放出され、アポトーシスと細胞死を引き起こす。ただし、ＤＣの毒性は、培地に鉄が含まれていないため低減できる。したがって、ゲンタマイシンなどのアミノグリコシド抗生物質の低濃度は、クロスプレゼンテーションのレベルを高める。ＴＬＲ４アゴニストは、ファゴソームとリソソームの融合の遅延も媒介する。したがって、いくつかの実施形態では、アミノグリコシド抗生物質には、ＬＰＳ、グルクロンオキシロマンナン、またはモルヒネ−３−グルクロニドなどのＴＬＲ４アゴニストが補充される。
【００４３】
樹状細胞の分離
本明細書に記載の実施形態で使用するためのＤＣは、腫瘍細胞が単離される患者のと同じ患者の血液から単離された単球の分化によって得られ得る。単球からのＤＣの分化のための技術は、当技術分野で十分に確立されている。手短に言えば、典型的なプロトコルでは、密度勾配遠心分離によって全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が分離される。ＰＢＭＣが培養される。単球は付着性であり、非付着性細胞は１〜２４時間後に洗い流される。あるいは、免疫磁気ビーズを使用して、単球をＰＢＭＣから単離し得る。単球をＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で５〜８日間培養して、未熟ＤＣに分化させる。この時点で、未熟ＤＣはゆるく付着しており、穏やかなピペッティングにより収穫できる。次に、成熟因子、典型的にはＬＰＳなどのＴＬＲ−４アゴニストの存在下で、未熟ＤＣをさらに約２日間培養する。あるいは、例えば、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、およびＰＧＥ２を含む単球成熟カクテルを使用し得る。通常、成熟と抗原の負荷は同時に実行される。手順は、新たに分離または凍結保存されたＰＢＭＣで実行され得る。
【００４４】
ＴＡＡ増強後の癌細胞の収穫と不活性化
癌細胞培養は、ＴＡＡの発現もしくは蓄積を増強するため、または本明細書に記載のものを含むがこれらに限定されない免疫原性を高めるための１つ以上の手順を受けた後、酵素消化（例えば、トリプシンＴｒｙｐＬＥ、コラゲナーゼ、またはディスパーゼによる）または機械的スクレーピングによって収穫される。細胞を収集し、中性緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、生理食塩水、ハンクス平衡塩類溶液、リンガー液など）での沈降の繰り返しサイクルにより、培地および酵素溶液がなくなるまで洗浄する。総タンパク質は、ビウレット法または色素（ブラッドフォード、３’，３’’，５’，５’’−テトラブロモフェノールフタレインエチルエステル−ＴＢＰＥＥ、またはエリトロシン−Ｂ）を使用した分光光度法によって決定され得る。
【００４５】
これらの癌細胞は、患者／ドナーに投与される免疫療法製品の調製に使用されるため、生存している悪性細胞が患者に再投与されないようにすることを確実にするために、それらを不活性化する（細胞分裂できないようにする）ことが重要である。不活性化の１つの方法は、放射線源（Ｃｓ−１３７、Ｃｏ−６０など）に１０〜１００Ｇｙ（１，０００〜１０，０００Ｒａｄ）の合計累積線量まで曝露することによるガンマ線照射である。あるいは、同じ目的のためにＸ線またはＵＶ照射への曝露を使用し得る。照射された全細胞は、抗原負荷のためにＤＣと組み合わせ得る。
【００４６】
細胞溶解は、照射の代わりに、または照射に加えて、不活性化に使用され得る。溶解は、等張液または低張液で繰り返し凍結融解サイクルに曝露され、凍結防止剤を加えないことで得られる。機械的溶解は、超音波処理器を使用して高強度の超音波に曝露することによっても生成され得る。浴型またはプローブ型の超音波処理器はどちらも使用できるが、サンプルの相互汚染を避けるために、後者には特別な注意を払う必要がある。浸透圧溶解は、細胞を低張緩衝液に曝露することで得られる。現在の適正製造基準と一致する他の溶解方法も使用され得る。溶解物は、抗原負荷のためにＤＣと組み合わせられ得る。癌細胞溶解物および不活性化された全癌細胞は、まとめて癌細胞物質と呼ばれる。
【００４７】
不活性化が完了したかどうかを評価するための様々な品質管理方法が利用可能である。１つの方法は色素排除で、その方法においては、生細胞は色素を排除するが、不活性化された細胞は染色される。適切な染料は、光学顕微鏡による評価、または細胞計数機（Ｖｉ−ＣＥＬＬ（商標）；Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒなど）を使用した自動化された方法での評価に使用され得るトリパンブルー、および蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーによる評価に使用され得る、ヨウ化プロピジウムまたは７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を含む。生存率は、細胞計測器またはフローサイトメーターを使用した粒子サイズ分析に従って評価され得る。最後に、生細胞の検出に使用できる様々な増殖アッセイがある。これらは、ＤＮＡへの放射標識ヌクレオチドの取り込みに依存する増殖アッセイ、ならびにＭＴＴおよびＭＴＳアッセイのように対応するテトラゾリウム塩の還元により形成されるホルマザン色素などの発色産物に依存するアッセイを含む。
【００４８】
場合によっては、患者は免疫療法製品を受け取る準備ができていない場合があり得る。例えば、免疫療法レジメンは、特定のスケジュールで複数回の投与を要求するかもしれないが、次の投与の時間はまだ来ていない。そのような場合、不活性化された細胞または細胞溶解物は、将来の使用のために凍結されてもよい。不活性化された細胞全体の例では、ＤＭＳＯ、グリセロール、トレハロース、スクロースなどの凍結防止剤が使用され、細胞はＬＮ２フリーザーなどで約−１３５℃〜約−１９６℃で保存される。溶解物は−２０℃以下で保存され得る。いくつかの実施形態では、癌細胞は、治療期間またはそのかなりの部分を通して培養で維持され、複数のサイクルの増強期培養が可能になり、予定された投与ごとに新鮮な収穫が行われ得る。他の実施形態では、単一の増強期および収穫により、複数回、さらにはすべての投与のための癌細胞物質が提供される。
【００４９】
ＤＣの抗原負荷
不活性化された増強された癌細胞または細胞溶解物（癌細胞物質）は、ＬＰＳなどの成熟因子とともに未熟ＤＣの培養物に加えられる。ＤＣは、抗原の取り込みおよび抗原プロセシングが起こることを可能にするために、さらなる期間培養される。様々な実施形態では、この抗原処理期は４〜３６時間続く。好ましい実施形態では、ＤＣはアミノグリコシド抗生物質で処理されており、この場合、そのような処理は処理期の間継続される。抗原処理期の終わりに、ＤＣのアリコートは、必要になるまで凍結防止剤の存在下で液体窒素で凍結される。いくつかの実施形態では、抗原負荷ＤＣは、患者への投与の前に癌細胞または細胞溶解物から精製される。他の実施形態では、混合物は患者に投与される。溶解物からＤＣを精製するために、単一の沈降および再懸濁洗浄が使用され得る。免疫親和性法、例えば免疫磁気ビーズを使用して、抗原処理期後に残っている全癌細胞を除去し得る。他の実施形態では、抗原調製物とＤＣは分離されていない。混合物は免疫原性組成物に使用される。
【００５０】
免疫
ＴＡＡを負荷したＤＣ（癌細胞物質とＤＣを組み合わせたもの）が患者／ドナーに投与される。投与は、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、皮内、リンパ内（すなわち、求心性リンパ管へ）、結節内（例えば、鼠径リンパ節または軸リンパ節へ）を含む、医学的に適切な注射経路による注射または注入により得る。ＴＡＡ負荷ＤＣは、単独での免疫療法で使用するか、ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ）、ＰＤ−１（例えば、ペンブロリズマブまたはニボルマブ）、および／またはＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ）に対する抗体などの免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、用量は、最初の月については１週間間隔で投与され、その後、合計８回の用量については毎月投与される。他の実施形態は、単回投与のみを含む。他の実施形態は、疾患が検出されなくなるか、疾患の明らかな進行があるまで定期的な投与を継続する。さらに他の実施形態では、免疫療法製品は、例えば、数時間、数日、数週間、または数ヶ月にわたる連続注入として投与される。いくつかの実施形態では、製品の新しいバッチは、新しい転移が出現するなら、および出現するとき、新しい転移から生成される。投与されるＤＣの数は、投与ごとに約１〜約２０００万ＤＣ、例えば１０００万ＤＣなど、大きく異なり得る。しかしながら、使用する細胞の数を増やしたり減らしたりすることもし得る。例えば、複数のボーラス注射を使用するいくつかの実施形態では、注射あたりのＤＣの数は、上記範囲の下端またはさらにそれ未満であり得る。例えば、長期間にわたって注入を使用するいくつかの実施形態では、投与されるＤＣの総数は、上記範囲の上限に近づくか、それを超える場合がある。いくつかの実施形態では、投与されるＤＣの数は、患者から得られ得る腫瘍組織またはＤＣの量によって制限される。
【００５２】
ロジスティクス
ここで説明する手順を実行するための専門知識とインフラは、癌患者が治療を受けるすべての病院、診療所、外来手術センターなど（総称して、患者治療施設）で利用できるとは限らない。いくつかの実施形態では、必要なインフラおよび訓練された人員を備えた中央施設は、患者の治療部位から治療を必要とする患者の腫瘍組織および血液を受け取る。中央施設は、本明細書に記載されるように癌細胞および／またはＤＣを改変する手順を実行して、自己ＴＡＡを負荷した自己ＤＣを含む個人用抗癌免疫療法製品を生成し、免疫療法製品を患者治療施設に送り、そこで免疫療法製品を患者に投与し得る。いくつかの実施形態では、中央施設は、医師の判断において患者にとって特に有益である患者の医師からの指示に従って、癌細胞および／またはＤＣの特定の改変を実行する。いくつかの実施形態では、中央施設が提供するガイダンス（投与が行われる時間枠、投与量、投与頻度、注入の場合の注入速度、または受領から投与までの免疫療法製品の保管方法など）およびそれによる患者の利益（ならびに医師および／または患者治療施設は、患者を治療できるという利益を受ける）に従って、免疫療法製品が患者に投与される。腫瘍組織が患者から除去される患者治療施設と、免疫療法製品が投与される患者治療施設は、同じでも異なっていてもよい。「中央施設」とは、施設が複数の患者治療施設にサービスを提供することを意味する。中央施設は、患者治療施設の１つと同じ建物またはキャンパスに同所配置することも、すべての患者治療施設とは別所配置することもできる。
【００５３】
場合によっては、患者は、癌の改善という形態で利益を得る（つまり、癌の進行が止まるか、退行するか、寛解するか、二次症状が改善するか、または他の治療の有害な副作用を回避する）。これらの実施形態の態様では、医師、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設は、患者の要請で活動している。他の態様では、患者の利益は、組織の寄付に同意し、かつ医師、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設の命令と指示に従った免疫療法製品の投与を受けること、または実行する方法の様々な必要な工程の支払いを手配することを条件とする。その他の場合、医師、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設は、患者の前向きな結果を得るか、方法の１つ以上の必要な工程を実行するために支払われることにより、評判またはビジネス的利益を得、医師の残りのチェーンの患者もしくはその他の関係者、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設は彼らの要請で活動している。他の態様では、医師、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設の利益は、医師の残りのチェーンの患者もしくはその他の関係者、他の医療従事者、医療施設（患者治療施設など）、健康維持組織、および／または中央施設の命令または支持を条件とする。
【００５４】
凍結保存された免疫療法製品（すなわち、凍結保存された抗原負荷ＤＣ）は、患者が投与の準備ができるまで中央施設に保管される。その後、単回投与は患者治療施設に出荷され、そこで解凍されて、さらに処理または操作することなく患者に投与される。患者治療施設と中央施設が同じ場所にあり、抗原処理期が終了するときに患者が免疫療法製品を受け取る準備ができている場合、免疫療法製品を凍結保存する必要はないが、代わりに患者に迅速に投与され得る。
【００５５】
特定の実施形態のリスト
以下の実施形態のリストは、本明細書で説明される幅、組み合わせおよびサブコンビネーション、発明のクラスなどに関する様々な実施形態の例示であるが、本明細書で支持を見つけるすべての実施形態の網羅的な列挙を意図するものではない。
実施形態１．同じ癌患者からの癌細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む組成物であって、
前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の蓄積または免疫原性を改善するためにｅｘ  ｖｉｖｏで改変されている、組成物。
実施形態２．癌患者からのＤＣを含む組成物であって、前記ＤＣには、前記癌患者から除去された腫瘍から単離された癌細胞からの抗原性物質が負荷され、前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現されるＴＡＡの蓄積または免疫原性を改善するために改変されている、組成物。
実施形態３．ＴＡＡの蓄積を改善するための前記改変は、エピジェネティック改変によるタンパク質発現の増加を含む、実施形態１または２に記載の組成物。
実施形態４．ＴＡＡの蓄積を改善するための前記改変は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を活性化することによりタンパク質発現を増加させることを含む、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態５．ＴＡＡの蓄積を改善するための前記改変は、プロテアソーム阻害によるタンパク質蓄積の増加を含む、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態６．ＴＡＡの蓄積を改善するための前記改変は、オートファジーを減少させることによりタンパク質蓄積を増加させることを含む、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態７．ＴＡＡの蓄積を改善するための前記改変は、アポトーシスを阻害することによりタンパク質蓄積を増加させることを含む、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態８．ＴＡＡの免疫原性を改善するための前記改変は、寛容原性分子の除去を含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態９．ＴＡＡの免疫原性を改善するための前記改変は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）を増加させることにより一般的な免疫原性を増加させることを含む、実施形態１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１０．前記ＤＣは、増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変されている、実施形態１〜９のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１１．前記ＤＣは、アミノグリコシド抗生物質への曝露により改変されている、実施形態１０に記載の組成物。
実施形態１２．前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、実施形態１１に記載の組成物。
実施形態１３．前記ＤＣは、トール様受容体４アゴニストへの曝露により改変されている、実施形態１０〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１４．前記癌細胞は、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積するように改変されている、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態１５．前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態１６．前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、実施形態１５の組成物。
実施形態１７．前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態１８．前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、実施形態１７に記載の組成物。
実施形態１９．前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、請求項１８に記載に記載の組成物。
実施形態２０．前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態２１．前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態２０に記載の組成物。
実施形態２２．前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態２３．前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態２４．前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、実施形態２３に記載の組成物。
実施形態２５．前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、実施形態２３または２４に記載の組成物。
実施形態２６．前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、実施形態２５に記載の組成物。
実施形態２７．前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、実施形態２５または２６に記載の組成物。
実施形態２８．前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２７に記載の組成物。
実施形態２９．前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、実施形態１４に記載の組成物。
実施形態３０．前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、実施形態２９に記載の組成物。
実施形態３１．前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを含む、実施形態３０に記載の組成物。
実施形態３２．前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３３．前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、実施形態３２に記載の組成物。
実施形態３４．前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、実施形態３２または３３に記載の組成物。
実施形態３５．前記癌細胞は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の産生を増加させるように改変されている、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３６．前記癌細胞は、ゲンタマイシンへの曝露により改変されている、実施形態３５に記載の組成物。
実施形態３７．前記組成物は、生存癌細胞を含まない、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の組成物。
実施形態３８．患者の癌の治療に使用するための実施形態３７に記載の組成物。
実施形態３９．実施形態３７に記載の組成物を含む個人用免疫療法製品。
実施形態４０．前記患者の癌の治療における実施形態３７に記載の組成物または実施形態３９に記載の個人用免疫療法製品の使用。
実施形態４１．実施形態３７に記載の組成物または実施形態３９に記載の個人用免疫療法製品を前記患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
実施形態４２．個々の癌患者のための癌に対する個人用免疫療法製品の製造方法であって、
前記患者から腫瘍組織を採取することと、
前記患者から血液を採取することと、
個人用免疫療法製品を作製するために、前記腫瘍組織と前記血液を操作することと、を含み、
操作することは、前記患者の癌によって発現されるＴＡＡの蓄積または免疫原性を改善するために、前記患者から得られた癌細胞またはＤＣ、またはその両方のｅｘ  ｖｉｖｏ改変を含む、
方法。
実施形態４３．個々の癌患者のための癌に対する個人用免疫療法製品の製造方法であって、
前記患者から腫瘍組織を採取することと、
前記患者から血液を採取することと、
前記腫瘍組織を操作して、ＴＡＡの蓄積を高めることと、
前記血液を操作して、単球を分離すると共にそれらを樹状細胞に分化させ、必要に応じて、前記樹状細胞の抗原提示能力を高めることと、
を含み、
操作された前記腫瘍組織からの前記樹状細胞および癌細胞物質を含む個人用免疫療法製品を作製する、
方法。
実施形態４４．ＴＡＡの蓄積または免疫原性を改善するための改変は、実施形態１〜３６のいずれか１つに記載の改変を実施することを含む、実施形態４２または４３の方法。
実施形態４５．操作することは、癌細胞を不活性化することを含む、実施形態４２〜４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６．不活性化することは、ガンマ線照射への曝露を含む、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４７．不活性化することは、ＵＶ照射への曝露を含む、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４８．不活性化することは、Ｘ線照射への曝露を含む、実施形態４５に記載の方法。
実施形態４９．不活性化することは細胞溶解を含む、実施形態４５〜４８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５０．採取することは、前記患者から前記腫瘍組織および前記血液を物理的に除去することを含む、実施形態４２〜４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５１．前記腫瘍組織および前記血液を、癌細胞を前記腫瘍組織から分離すると共にＤＣを前記血液中の単球と区別する能力を有する中央施設に送ることをさらに含み、前記中央施設は、１）前記ＤＣを改変して交差処理を増加させる、または２）前記癌細胞を改変してＴＡＡ含有量を増加させる、もしくは前記癌細胞の免疫原性を高める、または３）両方の能力をさらに有する、請求項５０に記載の方法。
実施形態５２．前記採取することは、前記腫瘍組織および前記血液の発送物を受け取ることを含む、実施形態４２〜４９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５３．前記腫瘍組織から癌細胞を分離することをさらに含む、実施形態４２〜５２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５４．単球を分化させることにより、前記血液からＤＣを得ることをさらに含む、実施形態４２〜５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５．前記癌細胞またはその溶解物を含む癌細胞物質を、ＤＣ成熟因子の存在下で前記ＤＣと組み合わせることと、をさらに含む、実施形態４２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６．前記ＤＣは組み合わせ時には未熟ＤＣである、実施形態５５に記載の方法。
実施形態５７．前記ＤＣ成熟因子は、リポ多糖（ＬＰＳ）である、実施形態５５または５６に記載の方法。
実施形態５８．前記ＤＣを増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変することをさらに含む、実施形態４２〜５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９．前記癌細胞を改変してＤＡＭＰの産生を増加させることをさらに含む、請求項４２〜５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０．改変することは、前記ＤＣまたは癌細胞のアミノグリコシド抗生物質への曝露を含む、実施形態５８または５９記載に記載の方法。
実施形態６１．前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、実施形態６０の方法。
実施形態６２．改変することは、前記ＤＣのトール様受容体４アゴニストへの曝露を含む、実施形態４２〜６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６３．前記癌細胞を改変して、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積させることをさらに含む、実施形態４２〜６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４．前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、実施形態６３に記載の方法。
実施形態６５．前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、実施形態６４に記載の方法。
実施形態６６．前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、実施形態４２〜６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、実施形態６６に記載の方法。
実施形態６８．前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、実施形態６７に記載の方法。
実施形態６９．前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、実施形態４２〜６８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７０．前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、実施形態６９に記載の方法。
実施形態７１．前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、実施形態４２〜７０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７２．前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、実施形態４２〜７１のいずれか１つの方法。
実施形態７３．前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、実施形態７２に記載の方法。
実施形態７４．前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、実施形態７２または７３に記載の方法。
実施形態７５．前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、実施形態７４に記載の方法。
実施形態７６．前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、実施形態７４または７５に記載の方法。
実施形態７７．前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態７６に記載の方法。
実施形態７８．前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、実施形態４２〜７７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態７９．前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、実施形態７８に記載の方法。
実施形態８０．前記カスパーゼ阻害剤は、ｚＶＡＤ．ｆｍｋを含む、実施形態７９に記載の方法。
実施形態８１．前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、実施形態４２〜８０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８２．前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、実施形態８１に記載の方法。
実施形態８３．前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、実施形態８１または８２に記載の方法。
実施形態８４．ＤＣおよび癌細胞物質が組み合わされてから２４〜４８時間後に、ＤＣおよび癌細胞物質の組み合わせに凍結防止剤を添加すると共に組み合わせられた物質を凍結保存することをさらに含む、実施形態４２〜８３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態８５．実施形態４２〜８４のいずれか１つの方法により製造された前記個人用免疫療法製品を前記個々の癌患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
実施形態８６．癌の治療における、実施形態４２〜８４のいずれか１つに記載の方法により製造された前記個人用免疫療法製品の使用。
実施形態８７．前記患者の癌の治療のための薬剤の製造における実施形態１〜３７のいずれか１つに記載の組成物の使用。
実施形態８８．前記患者がヒトである、実施形態３９に記載の個人用免疫療法製品。
実施形態８９．用量あたり１〜２０ｘ１０６ＤＣを含む、実施形態８８に記載の個人用免疫療法製品。
実施形態９０．注射による投与を含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９１．注入による投与を含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９２．免疫チェックポイント阻害剤の投与をさらに含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９３．前記免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＩＣＯＳ、またはＯＸ４０に特異的な抗体である、請求項９２に記載の方法。
実施形態９４．単回用量の投与を含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９５．毎週間隔での投与を含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９６．毎月間隔での投与を含む、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９７．前記癌は癌腫である、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９８．前記癌は肉腫である、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態９９．前記癌は白血病またはリンパ腫である、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態１００．前記癌は、脳、頭頸部、食道、肺、肝臓、膵臓、腎臓、胃、結腸、前立腺、乳房、子宮、子宮頸部、卵巣、皮膚、骨、血液、眼、または網膜の癌である、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９もしくは８６に記載の使用。
実施形態１０１．前記癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、膠芽腫、腎細胞癌、または結腸直腸癌である、実施形態４１もしくは８５に記載の治療方法、または実施形態３９または８６に記載の使用。
【００５６】
（実施例）
以下の非限定的な例は、現在企図されている代表的な実施形態のより完全な理解を促進するために、例示のみを目的として提供されている。これらの例は、本明細書に記載されている実施形態のいずれかを制限するものと解釈されるべきではないが、特許請求の範囲に見られる特定の制限をサポートすることができる。
【００５７】
（実施例１）
腫瘍からの生癌細胞の分離
典型的な準備では、外科的切除により得られた腫瘍片を正常組織から切開し、直径２〜３ｍｍの断片に機械的に切り刻み、細胞培養液中の酵素で解離させる。刻んだ腫瘍片を、コラゲナーゼのトリプシンの存在下で、３７℃で０．５〜３時間連続撹拌する。あるいは、ディパーゼは、一晩または最大７２時間冷蔵（約４℃）、室温（約２５℃）、または３７℃で低濃度で使用される。消化された細胞外マトリックスおよびその他の破片は、遠心分離と再懸濁のサイクルを繰り返すことにより除去される。生癌細胞は細胞培養容器に移され、栄養豊富な培地で増殖される。
【００５８】
（実施例２）
ヒストン脱アセチル化酵素の阻害によるタンパク質発現の増加
分離された生癌細胞は組織培養に配置される。増強期では、組織培養培地にバルプロ酸もしくはフェニルブチレート、またはその両方を、それぞれ０．０１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度で補充する。ヒストンのアセチル化、ｍＲＮＡ転写、およびＴＡＡの発現を含むタンパク質発現のレベルはすべて増加する。
【００５９】
（実施例３）
阻害ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるタンパク質発現の増加
分離された生癌細胞は組織培養に配置される。組織培養培地には、濃度に応じて、増強期の開始から１時間以上、増強期全体までデシタビンが補充される。１００〜５００ｎＭの濃度は、培養の増強期を通して使用され得る。あるいは、増強期の開始時に１μＭ〜１０μＭのより高い濃度を使用し、その後除去するか、より低い濃度に下げ得る。過剰メチル化が逆転し、サイレンシングされた生殖細胞系および腫瘍特異的抗原の発現が増加し、癌細胞集団全体でより均一になる。
【００６０】
（実施例４）
プロテアソーム阻害によるタンパク質含有量の増加
分離された生癌細胞は組織培養に配置される。組織培養培地には、０．１〜１μＭの濃度のラクタシスチン、１〜２μＭの濃度のエポキソマイシン、および／または１０〜１５０μｇ／ｍＬの濃度のＨＭＢが補充される。阻害剤は、培養の増強期全体またはその一部に存在し得るが、少なくとも収穫前の最後の２４時間に存在する。記載されている範囲の下限の用量は、長期曝露に適している。記載されている範囲の上限での用量は、培養の残り２４時間で使用され得る。癌細胞のタンパク質（正常タンパク質、変異タンパク質、ミスフォールドタンパク質を含む）の含有量が増加する。
【００６１】
（実施例５）
ＰＴＥＮの阻害による細胞増殖とタンパク質産生の増加
単離された生癌細胞は、７０：１のアルギニン：アラニンの比率と２５：１のロイシン：アラニンの比率でロイシンとアルギニンを補充した培地の組織培養に置かれる。組織培養培地には、５〜２０μＭの濃度のｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、またはｂｐＶ（ｂｉｐｙ）がさらに補充される。それは、細胞培養開始時に少なくとも２４時間適用され、場合により、細胞培養期間全体にわたってより低い濃度で継続される。ＰＴＥＮ阻害の期間中を通して、培地にはさらにインスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦおよびＥＧＦが補充される。
【００６２】
（実施例６）
アポトーシスの抑制による急速な癌細胞の増殖とＴＡＡの蓄積
分離された生癌細胞は組織培養に配置される。組織培養培地には、５〜５０μＭの濃度の薬効範囲が広いカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋが補充される。カスパーゼ阻害剤は、細胞培養の開始時に添加され、培養の増殖期および増強期を通して維持される。培養された癌細胞は増殖し、高い生存率を維持しながら、ＴＡＡを含むタンパク質は未処理の培養よりも高いレベルで蓄積する。
【００６３】
（実施例７）
Ｗｎｔシグナル伝達リガンドの枯渇による免疫原性の増加
分離された生癌細胞は組織培養に配置される。増強期およびＤＣ負荷の準備の終了の３０分から３時間前に、組織培養培地に０．５〜２０ｍＭの濃度のベータ−メチル−シクロデキストリンを補充する。コレステロールとＷｎｔリガンドは、癌細胞の原形質膜から枯渇する。
【００６４】
（実施例８）
増強培養後の癌細胞の収穫と不活性化
培養の増強段階が完了すると、癌細胞はトリプシン処理によって分離される。回収された細胞は、リン酸緩衝生理食塩水中で３サイクルの遠心分離により、培地およびトリプシン溶液がなくなるまで洗浄される。次いで、細胞に総線量１００Ｇｙで照射し、凍結防止剤を含まない培地で３〜５回の凍結／解凍サイクルを使用して溶解する。総タンパク質は、ビウレット法によって決定される。
【００６５】
（実施例９）
アミノグリコシド抗生物質による治療によるＤＣでの交差処理の促進
ＰＢＭＣを培地に播種し、単球を付着させた後、非付着細胞を洗い流す。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４および５−１０μ／ｍｌのゲンタマイシンを補充した新鮮な培地を加え、細胞を３〜５日間インキュベートする。不活性化された癌細胞または細胞溶解物、およびＬＰＳが添加され、ゲンタマイシン濃度が５０〜１５０μ／ｍｌに増加され、ＤＣがさらに２４〜４８時間インキュベートされる。
【００６６】
（実施例１０）
腫瘍細胞のタンパク質蓄積を増加させるためのプロテアソーム阻害剤とカスパーゼ阻害剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用
プロテアソーム阻害剤の使用により得られる抗原量の増加から利益を得るが、アポトーシスの誘発を回避するために、プロテアソーム阻害剤はカスパーゼ阻害剤と併せて使用され得る。最初に、最小限の細胞死を引き起こすプロテアソーム阻害剤の濃度を見つけるために、様々なボルテゾミブ希釈液を、７０〜９０％のコンフルエンスに達した後、確立された卵巣腫瘍株でｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。培養物は、５％ＦＢＳを含む標準ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地で維持された。ボルテゾミブは、ＤＭＳＯで再構成され、０．１〜１００ｎＭの濃度で培養物に直接添加された。
【００６７】
５ｎＭのボルテゾミブを超える濃度では、すべての細胞が２４時間以内に死んだ。５ｎＭから１ｎＭのボルテゾミブでは、細胞は濃度の減少に比例して生存した。１ｎＭ濃度未満では、ボルテゾミブは生存率に影響しなかった（図２および３）。
【００６８】
次に、カスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを同じ細胞培養系で１０〜１００μＭの濃度範囲で試験したところ、アポトーシス曝露（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）なしではカスパーゼ阻害剤が細胞生存に影響を与えないことが分かった。さらなる実験のために、２０μＭの濃度を選択した。
【００６９】
次に、カスパーゼ阻害剤とプロテアソーム阻害剤の連続適用を試験した。腫瘍細胞を２０μＭカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋの存在下で２４時間培養し、次に培地をボルテゾミブを含む培地と交換し、細胞をさらに４８時間培養した。ボルテゾミブは、誘導された細胞死の最低濃度である５ｎＭで使用された。図４に例示されているように、多核で拡大した細胞体で構成されている、特徴的な細胞形態を持つ約７５％の細胞生存率が観察された。
【００７０】
ボルテゾミブとＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋの同時適用も、１または２０μＭのＺ−ＶＡＤ−ｆｍｋとともに１ｎＭのボルテゾミブを使用して試験された。これらの治療は、細胞の形態や生存に明らかな変化を引き起こさない（図５を参照）。
【００７１】
タンパク質含有量を評価するために、我々は癌で一般的に見られる２つの標的を検索した：通常は卵巣癌に特異的なＣＡ１２５、および多くの種類の癌（例えば、結腸、乳房、卵巣、肺、膵臓）で一般的なＭＵＣ１。タンパク質は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（緑；抗ＭＵＣ１）または５９４（赤；抗ＣＡ１２５）と結合した抗体を使用して標識された。細胞は、露出および拡大のための事前設定パラメータを備えた落射蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ）で画像化された。Ｎｉｋｏｎ  ＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して、各チャネルは、最大画素強度（同様の画像化パラメータを示す）、標的タンパク質の量の増加または減少を示す平均強度、および標識された標的タンパク質含有量に比例する標識された画素の合計について分析された。図６および図７に見られるように、０．１ｎＭ〜１．０ｎＭ（カスパーゼ阻害剤なし）の濃度のボルテゾミブは、処理された腫瘍細胞のこれらの抗原の数と含有量を増加させる。
【００７２】
さらに、Ｋｉ６７標識化を使用して、様々な条件下での腫瘍細胞の増殖状態の違いを分析した。Ｋｉ６７標識化は、増殖状態の違いを示さなかった。
【００７３】
これらのデータは、細胞の生存率や増殖能力に影響を与えることなく、任意でカスパーゼ阻害剤と組み合わされた、低濃度のプロテアソーム阻害剤に細胞を曝露することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞のタンパク質含有量を増加させることができることを示す。この治療により、タンパク質含有量が増加し、その後、抗原提示細胞の新抗原が利用可能になる。同時に、樹状細胞への曝露前の腫瘍細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、抗原提示細胞のプロテアソーム阻害剤へのｉｎ  ｖｉｖｏでの有害な曝露を回避する。これらの発見は、樹状細胞に基づく免疫療法への即時の適用性にとって重要である。
【００７４】
最後に、本明細書の態様は特定の実施形態を参照することにより強調されているが、当業者はこれらの開示された実施形態が本明細書に開示された主題の原理の単なる例示であることを容易に理解するであろうことを理解されたい。したがって、開示される主題は、本明細書で説明される特定の方法論、プロトコル、および／または試薬などに決して限定されないことを理解されたい。したがって、本明細書の教示に従って、本明細書の趣旨から逸脱することなく、開示された主題の様々な修正、変更、または代替構成を行い得る。最後に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、示され説明された通りのものに限定されない。
【００７５】
本発明を実施するために本発明者らが知っている最良の形態を含む本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。もちろん、これらの記載された実施形態の変形は、前述の説明を読めば当業者には明らかであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外にも本発明を実施することを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変物および均等物を含む。さらに、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、すべての可能な変形例における上記実施形態の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【００７６】
本発明の代替実施形態、要素、または工程の群化は、限定として解釈されるべきではない。各群メンバーは、個別に、または本明細書に開示されている他の群メンバーとの任意の組み合わせで参照および特許請求され得る。群の１つ以上のメンバーが、利便性および／または特許性の理由で群に含まれたり、群から削除されたりすることが予想される。そのような包含または削除が生じた場合、明細書は改変されたグループを含むとみなされ、したがって、添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュグループの記述を満たすものとみなされる。  
【００７７】
他に指示がない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特徴、項目、量、パラメータ、特性、用語などを表すすべての数字は、すべての場合に用語「約」によって改変されるものと理解されたい。本明細書で使用される「約」という用語は、そのように制限された特性、アイテム、数量、パラメータ、特性、または用語が、指定された特性、アイテム、数量、パラメータ、特性、または用語の値の上下１０パーセントの範囲を包含することを意味する。したがって、そうでないと示さない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、変わり得る近似値である。少なくとも、および均等論の適用を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値表示は、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を説明する数値範囲および値は近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載されている数値範囲および値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、数値の範囲または値には、それぞれのテスト測定で見つかった標準偏差から必然的に生じる特定の誤差が本質的に含まれている。本明細書における値の数値範囲の列挙は、その範囲内に入る個々の数値を個別に参照する簡単な方法として役立つことのみを意図している。本明細書で特に明記しない限り、数値範囲の個々の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【００７８】
本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに否定されない限り、本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および類似の指示対象は、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。本明細書中に記載されるすべての方法は、本明細書中で他に指示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく照らすことを意図しており、特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言語は、本発明の実施に不可欠な非請求要素を示すと解釈されるべきではない。
【００７９】
本明細書に開示される特定の実施形態は、言語からなる、または本質的に言語からなるを使用して、請求項でさらに限定され得る。請求項で使用される場合、補正ごとに提出または追加されたかどうかにかかわらず、「からなる」という移行用語は、請求項で指定されていない要素、工程、または成分を除外する。「本質的に〜からなる」という移行用語は、特定の物質または工程、および基本的および新規の特性（１つまたは複数）に実質的に影響を与えないものに請求項の範囲を限定する。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書において本質的または明示的に説明され、可能化される。
【００８０】
本明細書で参照および特定されるすべての特許、特許公報、およびその他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される組成物および方法論を説明および開示する目的で、その全体が参照により本明細書に個別に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日前の開示のみのために提供されている。この点に関して、発明者が、先行発明のおかげで、またはその他の理由により、そのような開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が利用できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確性に関する承認を構成するものではない。
【００８１】
（付記）
（付記１）
同じ癌患者からの癌細胞および樹状細胞（ＤＣ）を含む組成物であって、
前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の蓄積または免疫原性を改善するためにｅｘ  ｖｉｖｏで改変されている、
組成物。
【００８２】
（付記２）
癌患者からのＤＣを含む組成物であって、
前記ＤＣには、前記癌患者から除去された腫瘍から単離された癌細胞からの抗原性物質が負荷され、前記癌細胞もしくは前記ＤＣ、またはその両方は、前記患者の癌によって発現されるＴＡＡの蓄積または免疫原性を改善するために改変されている、
組成物。
【００８３】
（付記３）
前記ＤＣは、増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変されている、付記１または２に記載の組成物。
【００８４】
（付記４）
前記ＤＣは、アミノグリコシド抗生物質への曝露により改変されている、付記３に記載の組成物。
【００８５】
（付記５）
前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、付記４に記載の組成物。
【００８６】
（付記６）
前記ＤＣは、トール様受容体４アゴニストへの曝露により改変されている、付記３〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【００８７】
（付記７）
前記癌細胞は、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積するように改変されている、付記１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【００８８】
（付記８）
前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【００８９】
（付記９）
前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、付記８に記載の組成物。
【００９０】
（付記１０）
前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【００９１】
（付記１１）
前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、付記１０に記載の組成物。
【００９２】
（付記１２）
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、付記１１に記載の組成物。
【００９３】
（付記１３）
前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【００９４】
（付記１４）
前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、付記１３に記載の組成物。
【００９５】
（付記１５）
前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【００９６】
（付記１６）
前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【００９７】
（付記１７）
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、付記１６に記載の組成物。
【００９８】
（付記１８）
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、付記１６または１７に記載の組成物。
【００９９】
（付記１９）
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、付記１８に記載の組成物。
【０１００】
（付記２０）
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、付記１８または１９に記載の組成物。
【０１０１】
（付記２１）
前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、付記２０に記載の組成物。
【０１０２】
（付記２２）
前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、付記７に記載の組成物。
【０１０３】
（付記２３）
前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、付記２２に記載の組成物。
【０１０４】
（付記２４）
前記カスパーゼ阻害剤は、Ｚ−ＶＡＤ−ｆｍｋを含む、付記２３に記載の組成物。
【０１０５】
（付記２５）
前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、付記１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【０１０６】
（付記２６）
前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、付記２５に記載の組成物。
【０１０７】
（付記２７）
前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、付記２５または２６に記載の組成物。
【０１０８】
（付記２８）
前記癌細胞は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）の産生を増加させるように改変されている、付記１〜６のいずれか１つに記載の組成物。
【０１０９】
（付記２９）
前記癌細胞は、ゲンタマイシンへの曝露により改変されている、付記２８に記載の組成物。
【０１１０】
（付記３０）
前記組成物は、生存癌細胞を含まない、付記２〜２９のいずれか１つに記載の組成物。
【０１１１】
（付記３１）
付記３０に記載の組成物を含む個人用免疫療法製品。
【０１１２】
（付記３２）
癌の治療における付記３１に記載の個人用免疫療法製品の使用。
【０１１３】
（付記３３）
付記３１に記載の個人用免疫療法製品を前記患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【０１１４】
（付記３４）
個々の癌患者のための癌に対する個人用免疫療法製品の製造方法であって、
前記患者から腫瘍組織を採取することと、
前記患者から血液を採取することと、
前記腫瘍組織を操作して、ＴＡＡの蓄積を高めることと、
前記血液を操作して、単球を分離すると共にそれらを樹状細胞に分化させ、必要に応じて、前記樹状細胞の抗原提示能力を高めることと、
を含み、
操作された前記腫瘍組織からの前記樹状細胞および癌細胞物質を含む個人用免疫療法製品を作製する、
方法。
【０１１５】
（付記３５）
採取することは、前記患者から前記腫瘍組織および前記血液を物理的に除去することを含む、付記３４に記載の方法。
【０１１６】
（付記３６）
前記腫瘍組織および前記血液を、癌細胞を前記腫瘍組織から分離すると共にＤＣを前記血液中の単球と区別する能力を有する中央施設に送ることをさらに含み、前記中央施設は、１）前記ＤＣを改変して交差処理を増加させる、または２）前記癌細胞を改変してＴＡＡ含有量を増加させる、もしくは前記癌細胞の免疫原性を高める、または３）両方の能力をさらに有する、付記３５に記載の方法。
【０１１７】
（付記３７）
採取することは、前記腫瘍組織および前記血液の発送物を受け取ることを含む、付記３４に記載の方法。
【０１１８】
（付記３８）
前記腫瘍組織から癌細胞を分離することと、
単球を分化させることにより、前記血液からＤＣを得ることと、
前記癌細胞、前記ＤＣ、またはその両方を改変することと、
前記癌細胞またはその溶解物を含む癌細胞物質を、ＤＣ成熟因子の存在下で前記ＤＣと組み合わせることと、
をさらに含む、付記３５または３７に記載の方法。
【０１１９】
（付記３９）
ＤＣ成熟因子の存在下で、前記腫瘍組織に由来する癌細胞またはその溶解物を含む癌細胞物質を、前記血液に由来する未熟ＤＣと組み合わせることをさらに含み、前記癌細胞、前記ＤＣ、または両方は改変されている、付記３５または３７に記載の方法。
【０１２０】
（付記４０）
前記ＤＣ成熟因子は、リポ多糖（ＬＰＳ）である、付記３８または３９に記載の方法。
【０１２１】
（付記４１）
前記ＤＣを増加したレベルのクロスプレゼンテーションを有するように改変することをさらに含む、付記３８〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１２２】
（付記４２）
前記癌細胞を改変してＤＡＭＰの産生を増加させることをさらに含む、付記３８〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
（付記４３）
改変することは、前記ＤＣまたは癌細胞のアミノグリコシド抗生物質への曝露を含む、付記４１または４２に記載の方法。
【０１２４】
（付記４４）
前記アミノグリコシド抗生物質は、ゲンタマイシンを含む、付記４３に記載の方法。
【０１２５】
（付記４５）
改変することは、前記ＤＣのトール様受容体４アゴニストへの曝露を含む、付記３８〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
（付記４６）
前記癌細胞を改変して、増加した量のＴＡＡを発現または蓄積させることをさらに含む、付記３８〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１２７】
（付記４７）
前記癌細胞は、ゲノム脱メチル化剤への曝露により改変されている、付記４６に記載の方法。
【０１２８】
（付記４８）
前記ゲノム脱メチル化剤は、デシタビンを含む、付記４７に記載の方法。
【０１２９】
（付記４９）
前記癌細胞は、ヒストンアセチル化促進剤への曝露により改変されている、付記３８〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
（付記５０）
前記ヒストンアセチル化促進剤は、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤を含む、付記４９に記載の方法。
【０１３１】
（付記５１）
前記ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤は、バルプロ酸を含む、付記５０に記載の方法。
【０１３２】
（付記５２）
前記癌細胞は、プロテアソーム阻害剤への曝露により改変されている、付記３８〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０１３３】
（付記５３）
前記プロテアソーム阻害剤は、ラクタシスチン、エポキソマイシン、ベータ−ヒドロキシ−ベータ−メチルブチレート、またはそれらの任意の組み合わせを含む、付記５２に記載の方法。
【０１３４】
（付記５４）
前記癌細胞は、Ｅ３リガーゼ阻害剤への曝露により改変されている、付記３８〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
（付記５５）
前記癌細胞は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤への曝露により改変されている、付記３８〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
（付記５６）
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、細胞培養培地中のロイシンもしくはアルギニン、またはその両方の超標準濃度を含む、付記５５に記載の方法。
【０１３７】
（付記５７）
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路活性化剤は、ＰＴＥＮ阻害剤を含む、付記５５または５６に記載の方法。
【０１３８】
（付記５８）
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、ビスペルオキソバナジウム−１，１０−フェナントロリン（ｂｐＶ（ｐｈｅｎ）、ビスペルオキソバナジウム−５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシル（ｂｐＶ（ＨＯｐｉｃ）、ビスペルオキソ−（ビピリジン）−オキソバナデートｂｐＶ（ｂｉｐｙ）、またはその任意の組み合わせ、を含む、付記５７に記載の方法。
【０１３９】
（付記５９）
前記ＰＴＥＮ阻害剤は、１つ以上のホルモンまたは成長因子と併せて使用される、付記５７または５８に記載の方法。
【０１４０】
（付記６０）
前記１つ以上のホルモンまたは成長因子は、インスリン、甲状腺ホルモン、塩基性ＦＧＦ、ＥＧＦ、またはそれらの組み合わせを含む、付記５９に記載の方法。
【０１４１】
（付記６１）
前記癌細胞は、アポトーシスの阻害剤への曝露により改変されている、付記３８〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０１４２】
（付記６２）
前記アポトーシスの阻害剤は、カスパーゼ阻害剤である、付記６１に記載の方法。
【０１４３】
（付記６３）
前記カスパーゼ阻害剤は、ｚＶＡＤ．ｆｍｋを含む、付記６２に記載の方法。
【０１４４】
（付記６４）
前記癌細胞は、寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、付記３８〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０１４５】
（付記６５）
前記寛容原性化合物がＷｎｔリガンドを含む、付記６４に記載の方法。
【０１４６】
（付記６６）
前記癌細胞は、ベータ−メチル−シクロデキストリンへの曝露による寛容原性化合物の枯渇によって改変されている、付記６４または６５に記載の方法。
【０１４７】
（付記６７）
ＤＣおよび癌細胞物質が組み合わされてから２４〜４８時間後に、ＤＣおよび癌細胞物質の組み合わせに凍結防止剤を添加すると共に組み合わせられた物質を凍結保存することをさらに含む、付記３８〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０１４８】
（付記６８）
付記３４〜６７のいずれか１つに記載の方法により製造された前記個人用免疫療法製品を前記個々の癌患者に投与することを含む、癌を治療する方法。
【０１４９】
（付記６９）
癌の治療における、付記３４〜６７のいずれか１つに記載の方法により製造された前記個人用免疫療法製品の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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