(57)【要約】  ロイヤラクチン（ＲＡ）に特異的な抗体は、未変性ロイヤラクチンを含むロイヤラクチンの精製方法において使用することができる。これらの方法は、未変性ロイヤラクチンが濃縮された組成物を製造することができる。精製されたロイヤラクチンは、未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用することができる。単離された核酸は、ロイヤラクチンに特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする。ロイヤラクチン（ＲＡ）に特異的な抗体は、未変性ロイヤラクチンを含むロイヤラクチンの精製方法において使用することができる。これらの方法は、未変性ロイヤラクチンが濃縮された組成物を製造することができる。精製されたロイヤラクチンは、未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用することができる。単離された核酸は、ロイヤラクチンに特異的に結合するモノクローナル抗体をコードする。【選択図】図４Ａ
2020516592.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
未変性ロイヤラクチンの精製方法であって、
未変性ロイヤラクチンを含む生物質を水溶液の中に可溶化する工程と、
可溶化された前記生物質を含む前記水溶液を、基質上に固定化されたモノクローナル抗体と接触させる工程であって、前記モノクローナル抗体が配列番号２のアミノ酸配列に特異的に結合し、これにより前記モノクローナル抗体を前記未変性ロイヤラクチンに結合する工程と、
未変性ロイヤラクチンに結合した前記モノクローナル抗体を、前記水溶液から分離する工程と、
結合した前記未変性ロイヤラクチンを、例えば溶出により、前記モノクローナル抗体から取り外し、これにより未変性ロイヤラクチンを精製する工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が、
配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、
配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び
配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメイン
を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに
配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、
配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び
配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメイン
を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記モノクローナル抗体が、
配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ、及び
配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲ
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記モノクローナル抗体が、
（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、
（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、
（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、
（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、又は
（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体が、
（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び抗体４Ｇ６Ｃ５の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、
（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＨＣＶＲ、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＬＣＶＲ、
（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＨＣＶＲ、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＬＣＶＲ、
（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＨＣＶＲ、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＬＣＶＲ、又は
（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＨＣＶＲ、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＬＣＶＲ
を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記モノクローナル抗体が、結合について、
（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む他のモノクローナル抗体、
（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲを含む他のモノクローナル抗体、
（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲを含む他のモノクローナル抗体、
（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲを含む他のモノクローナル抗体、又は
（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲを含む他のモノクローナル抗体
のうちの少なくとも１つと競合する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記モノクローナル抗体が、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、若しくは抗体９Ｇ６Ａ２、又は抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、若しくは抗体９Ｇ６Ａ２のうちの少なくとも１つとロイヤラクチンへの結合について競合する抗体からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項８】
精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物を調製する工程をさらに含み、前記組成物が、凍結乾燥された未変性ロイヤラクチンを含むか、又は前記組成物が、前記精製された未変性ロイヤラクチンを含む局所化粧品によって含まれる請求項１から請求項７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物質が昆虫ロイヤルゼリーを含む請求項１から請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物質が、未変性ロイヤラクチンを産生するように遺伝子改変された細胞のエキスを含む請求項１から請求項９いずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記昆虫がミツバチ属に属する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基質がアガロースを含む請求項１から請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触させること、分離すること、及び取り外すことが、免疫沈降を含む請求項１から請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させること、分離すること、及び取り外すことが、アフィニティカラムを使用して実施される請求項１から請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、凍結乾燥された未変性ロイヤラクチンを含む請求項８から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、少なくとも３０％（重量／重量）の凍結乾燥された未変性ロイヤラクチンを含む請求項８から請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記局所化粧品が、局所ローション剤、クリーム、ペースト、ゲル、スプレー、粉末、又は薬筆を含む請求項８から請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記局所化粧品が、少なくとも１０％のロイヤラクチン（重量／重量）を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体であって、
（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、
（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、
（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、
（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、又は
（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ
を含む単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２０】
配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、
配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び
配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメイン
を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに
配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、
配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び
配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメイン
を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む請求項１９に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２１】
配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ、及び
配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲ
を含む請求項１９に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体が、
（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、及び抗体４Ｇ６Ｃ５の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、
（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＨＣＶＲ、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＬＣＶＲ、
（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＨＣＶＲ、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＬＣＶＲ、
（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＨＣＶＲ、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＬＣＶＲ、又は
（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＨＣＶＲ、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＬＣＶＲ
を含む請求項１９に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体が、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、又は抗体９Ｇ６Ａ２を含む請求項１９に記載の単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ロイヤラクチンへの結合について、請求項１９から請求項２３のいずれか一項に記載の抗体（ａ）〜（ｅ）のうちの少なくとも１つと競合し、前記ロイヤラクチンが配列番号２のアミノ酸配列を有する単離されたモノクローナル抗体。
【請求項２５】
ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体をコードする単離された核酸であって、前記抗体が、
配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む（ＨＣＶＲ）、並びに
配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む単離された核酸。
【請求項２６】
前記ＨＣＶＲが配列番号６のＨＣＶＲを含み、前記ＬＣＶＲが配列番号８のＬＣＶＲを含む請求項２５に記載の単離された核酸。
【請求項２７】
前記単離された核酸が、配列番号３及び配列番号５を含み、配列番号３及び配列番号５が、同じポリヌクレオチドによって含まれるか、又は異なるポリヌクレオチドによって含まれる請求項２５又は請求項２６に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
あらゆる優先権主張出願の参照による援用
外国又は国内の優先権主張が本願の出願時の出願データシートの中で特定されているいずれの及びすべての出願は、米国特許施行規則（３７  ＣＦＲ）１．５７に基づき、参照により本明細書に援用する。本願は、２０１７年４月１３日出願の米国仮出願第６２／４８５，２６３号の利益を主張し、米国仮出願第６２／４８５，２６３号は参照によりその全体を本明細書に援用する。
【０００２】
配列表、表、又はコンピュータープログラムリストへの参照
本願は、電子フォーマットの配列表とともに出願されている。この配列表は、ファイル名ＷＹＬＳ００１ＷＯ．ＴＸＴで、２０１８年４月５日に作成され最後に修正されたファイルとして提供され、このファイルは、サイズが１４，２６７バイトである。この配列表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体を本明細書に援用したものとする。
【０００３】
分野
本発明のいくつかの実施形態は、全体として、ロイヤラクチン（ＲＡ）に特異的な抗体、及び、例えば、未変性ロイヤラクチンを精製するためのこのような抗体の使用方法に関する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの態様は、未変性ロイヤラクチンの精製方法を含む。当該方法は、未変性ロイヤラクチンを含む生物質を、例えば水溶液の中に可溶化する工程を含むことができる。当該方法は、上記可溶化された生物質を含む溶液（これは、例として、上記のとおり水溶液であることができる）を、基質上に固定化されたモノクローナル抗体と接触させる工程であって、このモノクローナル抗体は配列番号２のアミノ酸配列に特異的に結合し、かつ上記モノクローナル抗体は上記未変性ロイヤラクチンに結合する工程を含むことができる。当該方法は、未変性ロイヤラクチンに結合した上記モノクローナル抗体を、例えば洗浄することにより上記溶液から分離する工程を含むことができる。当該方法は、上記結合した未変性ロイヤラクチンを、例えば溶出により上記モノクローナル抗体から取り外し、これにより未変性ロイヤラクチンを精製する工程をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、当該方法は、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物を調製する工程をさらに含む。この組成物は、凍結乾燥された未変性ロイヤラクチンを含むことができるし、又は未変性ロイヤラクチンを含む化粧品、例えば局所化粧品の一部であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、当該方法は、未変性ロイヤラクチンが濃縮された組成物を製造する。この組成物は、少なくとも１％（重量／重量）の未変性ロイヤラクチン、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の未変性ロイヤラクチン、及び列挙された値のいずれか２つの間の範囲、例えば１％〜９０％、１％〜５０％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、５％〜９０％、５％〜５０％、５％〜３０％、５％〜２０％、５％〜１０％、１０％〜９０％、１０％〜５０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜９０％、２０％〜５０％、又は２０％〜３０％の未変性ロイヤラクチンを含むことができる。いくつかの実施形態では、上記抗体は、マウス抗体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの未変性ロイヤラクチンの精製方法の抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるいずれかの未変性ロイヤラクチンの精製方法の抗体は、配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ、及び配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲを含む。いくつかの実施形態では、上記抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、又は抗体９Ｇ６Ａ２、又はそれらの結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、この抗体は、（ａ）抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｃ５のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）、又は（ｂ）抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｃ９のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、又は（ｃ）抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体８Ｃ５Ｄ３のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、又は（ｄ）抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体４Ｇ６Ｅ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲ、又は（ｅ）抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＨＣＶＲ、並びに抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び抗体９Ｇ６Ａ２のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを有するＬＣＶＲを含む。いくつかの実施形態では、上記抗体は、ロイヤラクチンへの結合について上に列挙された抗体のうちの少なくとも１つと競合する。いくつかの実施形態では、上記生物質は、昆虫ロイヤルゼリーを含む。いくつかの実施形態では、この生物質は、未変性ロイヤラクチンを産生するように遺伝子改変された細胞のエキスを含む。いくつかの実施形態では、上記昆虫はミツバチ属に属する。いくつかの実施形態では、上記基質は、アガロースを含む。いくつかの実施形態では、分離すること、及び取り外すことは、免疫沈降を含む。いくつかの実施形態では、上記接触させること、分離すること、及び取り外すことは、アフィニティカラムを使用して実施される。いくつかの実施形態では、精製された未変性ロイヤラクチンを含む（かつ未変性ロイヤラクチンが濃縮されている）上記組成物は、少なくとも３０％（重量／重量）の凍結乾燥された未変性ロイヤラクチンを含む。いくつかの実施形態では、未変性ロイヤラクチンを含む上記局所化粧品は、局所ローション剤、クリーム、ペースト、ゲル、スプレー、粉末、又は薬筆を含む。いくつかの実施形態では、局所化粧品は、少なくとも１０％のロイヤラクチン（重量／重量）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物を含むキットが提供される。従って、いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載される未変性ロイヤラクチンが濃縮された組成物を含む。
【０００５】
いくつかの態様は、ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を含む。いくつかの実施形態では、当該抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、若しくは抗体９Ｇ６Ａ２、又はこれらの抗体のうちの１つの抗体のＬＣＶＲ及びＨＣＤＲ、又はこれらの抗体のうちの１つの抗体のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＤＣＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、当該単離されたモノクローナル抗体は、ロイヤラクチンへの結合について上に列挙された抗体のうちの１つと競合する。いくつかの実施形態では、当該抗体は、マウス抗体を含む。いくつかの態様は、ロイヤラクチンに特異的な当該抗体を含むキットを含む。いくつかの実施形態では、当該単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、当該単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ、及び配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲを含む。
【０００６】
いくつかの態様は、ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体をコードする核酸配列を含むか、実質的にこの核酸配列からなるか、又はこの核酸配列からなる単離された核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、当該単離された核酸は、配列番号２を含むか、実質的に配列番号２からなるか、又は配列番号２からなるロイヤラクチンに特異的に結合する抗体をコードする。いくつかの実施形態では、上記ＨＣＶＲをコードする上記核酸及び上記ＬＣＶＲをコードする上記核酸は、同じポリヌクレオチドによって含まれる。いくつかの実施形態では、上記ＨＣＶＲをコードする上記核酸及び上記ＬＣＶＲをコードする上記核酸は、異なるポリヌクレオチド（例えば、別個のベクター、又は別個の染色体）によって含まれる。いくつかの実施形態では、当該核酸は、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸を含むか、実質的に配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸からなるか、又は配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸からなる。配列番号５の核酸は重鎖可変領域をコードすることができ、配列番号７の核酸は軽鎖可変領域をコードすることができる。いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸は、同じ核酸分子、例えば１つのベクターによって含まれ、かつ別個のプロモーターの制御下にあるか、又は１つのプロモーターの制御下にあり、ＩＲＥＳ又は２Ａ配列によって分離されている。いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸は、異なる核酸分子によって含まれる。いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸は、同じ組成物の中に存在する異なる核酸分子によって含まれる。いくつかの実施形態では、当該単離された核酸は、配列番号２のポリペプチドを含むか、実質的に配列番号２のポリペプチドからなるか、又は配列番号２のポリペプチドからなるロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体をコードする。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体を発現するためのハイブリドーマ細胞は、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】図１Ａは、ミツバチロイヤラクチンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１）（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ０００６３３．１）の図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ロイヤラクチンのアミノ酸配列（配列番号２）の図である。
【図２Ａ】図２Ａは、ロイヤラクチン融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号３）の図であり、このヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態でロイヤラクチンに特異的な抗体を生成するために使用することができる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、上記ロイヤラクチン融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号４）の図である。未変性タンパク質と共通の同一性の領域、ＦＬＡＧタグ、及びポリＨｉｓタグを含めたこの融合タンパク質の特定の要素が注目される。
【図３Ａ】図３Ａは、本発明のいくつかの実施形態に係るＲＡに特異的なモノクローナル抗体の親和性を測定するドットイムノブロットアッセイの画像である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に係るＲＡに特異的なモノクローナル抗体の親和性を測定するドットイムノブロットアッセイの画像である。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に係るロイヤラクチンに結合する５つのモノクローナル抗体の各々によるロイヤラクチンの免疫沈降についてのクマシー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ）染色後のゲルの画像である。この５つの抗体（抗体１９、２０、２１、２２、及び２３）は、免疫ブロットによって、ロイヤラクチンに対して最も高い親和性を有すると特定されていた。図４Ａは、モノクローナル抗体１９及び２０を用いた５００ｎｇのＲＡ出発物質の免疫沈降の結果を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、本発明のいくつかの実施形態に係るロイヤラクチンに結合する５つのモノクローナル抗体の各々によるロイヤラクチンの免疫沈降についてのクマシー染色後のゲルの画像である。この５つの抗体（抗体１９、２０、２１、２２、及び２３）は、免疫ブロットによって、ロイヤラクチンに対して最も高い親和性を有すると特定されていた。図４Ｂは、モノクローナル抗体２１、２２、及び２３を用いた５００ｎｇのＲＡ出発物質の免疫沈降の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明のいくつかの実施形態に係るロイヤラクチンに結合するモノクローナル抗体を使用する、ロイヤルゼリー由来の未変性ロイヤラクチンの免疫沈降のクマシー染色後のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの画像である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、免疫沈降のインプット、ＮＢ、洗浄、及び溶出のＲＡに対するウエスタンブロットの画像である。
【図６Ａ】図６Ａ〜図６Ｄは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す一連の図である。図６Ａは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域をコードする核酸（配列番号５）を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｄは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す一連の図である。図６Ｂは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域を含むポリペプチド（配列番号６）を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜図６Ｄは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す一連の図である。図６Ｃは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の軽鎖可変領域をコードする核酸（配列番号７）を示す。
【図６Ｄ】図６Ａ〜図６Ｄは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を示す一連の図である。図６Ｄは、いくつかの実施形態の抗体４Ｇ６Ｃ５の軽鎖可変領域を含むポリペプチド（配列番号８）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本明細書に記載されるのは、ロイヤラクチン（ＲＡ）タンパク質を精製するための方法及び組成物、並びに精製されたロイヤラクチンを含む組成物である。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンは、未変性ロイヤラクチンに結合するロイヤラクチンに特異的な抗体、例えば本明細書に記載されるモノクローナル抗体を使用して生成され、その結果、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物が製造される。未変性ロイヤラクチンを含む生物質は水溶液中で可溶化でき、ロイヤラクチンに特異的な抗体と接触させることができる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンはその未変性の立体構造で精製され、これにより未変性の立体構造の精製されたロイヤラクチンを含む組成物が製造される。いくつかの実施形態では、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物の製造方法が記載される。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的で、かつ未変性ロイヤラクチンに結合する１以上のモノクローナル抗体が提供される。
【０００９】
メスのミツバチ幼虫は、働きバチ又は女王バチのずれかへと変態することができる。ロイヤルゼリーは、働きバチによって分泌される物質である。ロイヤルゼリーは、種々のビタミン、炭水化物、脂肪酸、及びタンパク質の複雑な混合物である。ロイヤルゼリーを供給されたメスの幼虫だけが女王バチへと変態することになる。ロイヤラクチン（例えば、配列番号２に示される）は、公知のファミリーのメンバーがない（すなわち、パラログ）、単量体の５７ｋＤａタンパク質であり、ロイヤルゼリーの一成分である。ロイヤラクチン自体がメスの幼虫を女王バチへと分化するように誘導することができるということが示されている。ロイヤラクチンは、成長速度の向上及び長寿命を伴いロイヤルゼリーの効果を複製（再現）する。ロイヤラクチンは、別の昆虫、キイロショウジョウバエ、すなわちｃｏｍｍｏｎ  ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙにおいて、成長の向上及び長寿命という同じ効果を有することも明らかになっている。ロイヤラクチンは、非昆虫線形動物、エレガンス線虫において寿命を延ばす効果を有するということも明らかになっている。昆虫及び蠕虫の両方において、ロイヤラクチンは、主に上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のメンバーを介して作用することが明らかになっている。これは、ショウジョウバエ及びエレガンス線虫の両方において、ノックアウト変異体の使用を通して明らかにされた。最後に、ロイヤラクチンは、哺乳類細胞に対して細胞分裂促進作用を有することも明らかにされている。ミツバチの間にロイヤラクチンが高度に保存されていることを考えると、ミツバチの属のロイヤラクチン、より正確に言えばミツバチ属の昆虫のロイヤラクチンは、本明細書に記載される生物活性（例えば、哺乳類細胞に対する細胞分裂活性及び癒傷における活性）を有し、本明細書に記載される抗体及び方法を使用して精製することができるということが想定される。従って、本明細書で使用する場合、「ロイヤラクチン」は、ミツバチ属のロイヤラクチンを指す。このようなロイヤラクチンは、ミツバチ属の昆虫のロイヤルゼリーの中で見つけることができる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンは、配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を含むか、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質からなる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンは、配列番号１の核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンは、ミツバチ属のロイヤラクチンを含む。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンは、セイヨウミツバチのロイヤラクチンを含む。いくつかの実施形態では、ミツバチ属のロイヤラクチンは、親和性タグ、例えばｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、及び／又はＨＡタグをさらに含む。
【００１０】
未変性の立体構造のロイヤラクチンは本明細書中に記載する生物活性を有するが、ロイヤラクチンのポリペプチド配列を含む他のタンパク質（例えば、変性ロイヤラクチン、又は合成ロイヤラクチンポリペプチド若しくはフラグメント）は、必ずしもこれらの活性を有しないか、又はより低い活性しか有しないということが想定される。従って、いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的に結合する抗体が提供される。ロイヤラクチンに特異的な抗体は、未変性ロイヤラクチンに結合することができる。本明細書で使用する場合、「未変性（の）」ロイヤラクチンは、ロイヤルゼリーの中に見つけることができるミツバチ属の変性されていないロイヤラクチンタンパク質、例えば、配列番号２のタンパク質を指す。この抗体は、未変性ロイヤラクチンを精製するために使用することができ、その結果、本明細書に記載される精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物が製造される。
【００１１】
抗体
抗体は、免疫グロブリン分子のクラスのメンバーである。全長抗体は、約１５０ｋＤａの分子量を有するヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｊａｎｅｗａｙら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第５版、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１を参照。この文献は、参照によりその全体を本明細書に援用する。典型的な抗体は２つの軽鎖及び２つの重鎖を含み、２つの軽鎖の各々は可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び軽鎖定常領域を含み、２つの重鎖の各々は、可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び重鎖定常領域を含む。抗体のこれらの鎖は、ジスルフィド結合によって一緒に結合されている。Ｎ末端からＣ末端へ、各重鎖可変領域は、以下を含む重鎖可変領域を含む：第１重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ１）、第１重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１）、第２重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ２）、第２重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ２）、第３重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ３）、第３重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ３）、及び第４重鎖フレームワーク領域（ＨＦＲ４）。上記重鎖可変領域の（Ｃ末端の方向に向かって）下流にあるのは重鎖定常領域であり、この重鎖定常領域は、（Ｎ末端からＣ末端へ）定常重鎖１（ＣＨ１）、定常重鎖２（ＣＨ２）及び定常重鎖３（ＣＨ３）のドメインを含む。ヒト抗体では、上記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のタイプであってもよい。Ｎ末端からＣ末端へ、各軽鎖は、以下を含む軽鎖可変領域を含む：第１軽鎖フレームワーク領域（ＬＦＲ１）、第１軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ１）、第２軽鎖フレームワーク領域（ＬＦＲ２）、第２軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ２）、第３軽鎖フレームワーク領域（ＬＦＲ３）、第３軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ３）、及び第４軽鎖フレームワーク領域（ＬＦＲ４）。上記軽鎖可変領域の（Ｃ末端の方向に向かって）下流には、軽鎖定常領域がある。ヒト抗体では、上記軽鎖定常領域は、κ型又はλ型のいずれかであってもよい。上記ＣＤＲは、超可変ループを表し、上記６つのＣＤＲ又はそれらのサブセットは、抗体によるエピトープ認識及び結合に関与する。ＣＤＲは、当該技術分野で認識されているいずれかの定義、例えばＫａｂａｔの定義（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド州（１９９１）を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａの定義（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１−９１７（１９８７）を参照）、及びＡｂＭ定義（Ｍａｒｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：９２６８−９２７２（１９８９））に従ってナンバリングすることができる。これらの文献の各々は、参照によりその全体を本明細書に援用する。いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＡｂＭ定義、接触定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）及びＩＭＧＴ定義から選択される群に従って定義される。本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、全長モノクローナル抗体及び全長ポリクローナル抗体、並びにそれらの機能結合フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体などを包含する。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに対する抗体は全長抗体である。タンパク質、高分子、又は抗体の他の結合標的となりうるものの不均一な集団の中で、抗体の結合が特定の抗原の存在を決定する場合に、抗体は、「特異的に結合する」（又は…に「特異的に結合する」、又は「…に特異的」である、及びこれらの基本語の派生語を含む）と理解される。従って、ロイヤラクチンに特異的である抗体は、バックグラウンドよりも高いレベルでロイヤラクチンを含む物質に結合すると理解され、好ましくは、物質中の他の潜在的な抗原に実質的に結合することなくロイヤラクチンに結合すると理解される。ロイヤラクチンに特異的な抗体は未変性ロイヤラクチンに結合することができ、他の形態のロイヤラクチンにも結合してよいが、未変性ロイヤラクチンへの結合活性は未変性ロイヤラクチンを精製することにとって有用であるということに留意されたい。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態に係るモノクローナル抗体は、ロイヤラクチンを含む抗原の１以上の投与物に宿主生物を曝露することにより構築することができる。このロイヤラクチンを含む抗原は、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体タンパク質をさらに含む。本発明のいくつかの実施形態によれば、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター、ロバ、ヤギ、ウマなど様々な宿主が好適である。従って、いくつかの実施形態では所望の宿主種のいずれのものの抗体も産生することができると理解される。いくつかの実施形態では、宿主は、非ヒトの哺乳動物を含む。いくつかの実施形態では、宿主は、マウス又はラット等の齧歯動物である。抗体産生細胞、典型的にはＢ細胞、は、その宿主から単離することができる。いくつかの実施形態では、宿主へのロイヤラクチンを含む抗原の最初の投与のあとに、１以上の追加が続く。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマが抗体産生細胞から構築され、ハイブリドーマは、未変性ロイヤラクチンに対する親和性等の所望の特徴を有する抗体の産生についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、抗体又はそれらの結合フラグメントをコードする核酸を含むファージディスプレイライブラリーが作製される（Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１２：１７３−１８４（１９９４）を参照）。このファージディスプレイライブラリーは、所望の標的、例えば未変性ロイヤラクチンに対する親和性を有する抗体又は結合フラグメントについてスクリーニングすることができる。従って、ファージディスプレイライブラリーは、好適な親和性を有する抗体についての初期スクリーニングのために使用することができ、未変性ロイヤラクチンに対する好適な親和性を有する変異体についてスクリーニングするため、例えばリードモノクローナル抗体のより高い親和性変異体についてスクリーニングするためも使用することができる。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、未変性ロイヤラクチンに対する好適な結合特性を有する抗体をコードする核酸を特定するためにスクリーニングされる。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイライブラリーは、未変性ロイヤラクチンに結合するモノクローナル抗体の高親和性変異体についてスクリーニングするために使用される。このファージディスプレイライブラリーは、可溶化した未変性ロイヤラクチン、例えば未変性ロイヤラクチンを含む水溶液に対してスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体を生成するための技術は、例えば、Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ（２０１４）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋで論じられており、この文献を、参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００１３】
いくつかの実施形態では、２以上のモノクローナル抗体が、ロイヤラクチン、例えば未変性ロイヤラクチン上のエピトープへの結合について競合する。本明細書で使用する場合、第２抗体がロイヤラクチンの共通のエピトープに結合するのを第１抗体が阻害するとき、ロイヤラクチンへの結合について２つの抗体が「競合する」。競合は、いくつかの好適なアッセイ、例えば競合ＥＬＩＳＡ、又は競合ラジオイムノアッセイを使用して確認することができる。例えば、ロイヤラクチンに特異的な標識第１抗体の結合は、ロイヤラクチンに特異的な標識されていない（又は別の標識がされている）第２抗体の存在下及び不存在下で判定することができ、標識第１抗体の結合が第２抗体の存在下で減少するか否かが判定される。この第１抗体は、直接又は間接的に標識されてよい。いくつかのエピトープは、一次構造エピトープ（ｌｉｎｅａｒ  ｅｐｉｔｏｐｅ）であってよく、この一次構造エピトープは、ロイヤラクチン上の特定の組の残基を表し、例えば、ロイヤラクチンペプチド及び／又は欠失ペプチドへの抗体結合のマッピングにより確認することができる。例えば、いくつかの実施形態に係るロイヤラクチンの一次構造エピトープは、配列番号２の残基１〜１０、１１〜２０、２１〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜６０、６１〜７０、７１〜８０、８１〜９０、９１〜１００、１０１〜１１０、１１１〜１２０、１２１〜１３０、１３１〜１４０、１４１〜１５０、１５１〜１６０、１６１〜１７０、１７１〜１８０、１８１〜１９０、１９１〜２００、２０１〜２１０、２１１〜２２０、２２１〜２３０、２３１〜２４０、２４１〜２５０、２５１〜２６０、２６１〜２７０、２７１〜２８０、２８１〜２９０、２９１〜３００、３０１〜３１０、３１１〜３２０、３２１〜３３０、３３１〜３４０、３４１〜３５０、３５１〜３６０、３６１〜３７０、３７１〜３８０、３８１〜３９０、３９１〜４００、４０１〜４１０、４１１〜４２０、又は４２１〜４３２のエピトープを含むことができる。いくつかのエピトープは、立体構造的であることができ、従ってその三次元構造の結果として未変性ロイヤラクチン上に存在することができるが、ロイヤラクチンの一次アミノ酸配列中の連続する残基を必ずしも含まない。従って、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるロイヤラクチンに特異的なモノクローナル抗体は、未変性ロイヤラクチン上の立体構造エピトープに特異的に結合するが、変性ロイヤラクチンには、より低い親和性で結合するか、又は認め得るほどには結合しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるロイヤラクチンに特異的なモノクローナル抗体は、ロイヤラクチン上の一次構造エピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、若しくは抗体９Ｇ６Ａ２のうちの少なくとも１つ、又は上述の抗体のうちのいずれかの抗体の６つのＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む抗体とロイヤラクチンへの結合について競合する。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに対する抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５���３、抗体４Ｇ６Ｅ２、又は抗体９Ｇ６Ａ２のうちの２以上とロイヤラクチンへの結合について競合する。抗体４Ｇ６Ｃ５のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲ配列が、それぞれ図６Ｂ及び図６Ｄに示されている。上述のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸が、それぞれ図６Ａ及び図６Ｃに示されている。抗体「４Ｇ６Ｃ５」（又は、「ｍＡｂ  ４Ｇ６Ｃ５」、「クローン４Ｇ６Ｃ５」等のこの基本語の派生語）が本明細書中で言及されるところではいつも、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含むＨＣＶＲ、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含むＬＣＶＲを含む抗体が明示的に想定されているということは分かるであろう。抗体「４Ｇ６Ｃ５」（又は、この基本語の派生語）が本明細書中で言及されるところではいつも、配列番号６のＨＣＶＲであるＨＣＶＲ及び配列番号８のＬＣＶＲであるＬＣＶＲを含む抗体も明示的に想定されているということは分かるであろう。
【００１４】
いくつかの実施形態では、（本明細書に記載される未変性ロイヤラクチンのいずれかの精製方法の抗体として使用することができる）単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む。いくつかの実施形態では、（本明細書に記載される未変性ロイヤラクチンのいずれかの精製方法の抗体として使用することができる）単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、上記ＨＣＶＲは、配列番号６に少なくとも８５％同一のポリペプチドを含み、上記ＬＣＶＲは、配列番号８に少なくとも８５％同一のポリペプチドを含む。例えば、上記ＨＣＶＲは、配列番号６に少なくとも９０％同一のポリペプチドを含むことができ、上記ＬＣＶＲは、配列番号８に少なくとも９０％同一のポリペプチドを含むことができる。例えば、上記ＨＣＶＲは、配列番号６に少なくとも９５％同一のポリペプチドを含むことができ、上記ＬＣＶＲは、配列番号８に少なくとも９５％同一のポリペプチドを含むことができる。例えば、上記ＨＣＶＲは、配列番号６に少なくとも９７％同一のポリペプチドを含むことができ、上記ＬＣＶＲは、配列番号８に少なくとも９７％同一のポリペプチドを含むことができる。例えば、上記ＨＣＶＲは、配列番号６に少なくとも９９％同一のポリペプチドを含むことができ、上記ＬＣＶＲは、配列番号８に少なくとも９９％同一のポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、（本明細書に記載される未変性ロイヤラクチンのいずれかの精製方法の抗体として使用することができる）単離されたモノクローナル抗体は、配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ及び配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態は、ロイヤラクチンに特異的に結合する単離されたモノクローナル抗体をコードする核酸を含む。いくつかの実施形態では、上記核酸は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体をコードすることができる。いくつかの実施形態では、上記核酸は、配列番号５の核酸配列及び配列番号７の核酸配列を含むか、実質的に配列番号５の核酸配列及び配列番号７の核酸配列からなるか、又は配列番号５の核酸配列及び配列番号７の核酸配列からなる。配列番号５の核酸は、ロイヤラクチンに特異的に結合する抗体のＨＣＶＲをコードすることができ、配列番号７の核酸は、ロイヤラクチンに特異的に結合する抗体のＬＣＶＲをコードすることができる。いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸は、同じポリヌクレオチドの一部分である（例えば、同じベクター上又は同じ染色体上に存在する）。いくつかの実施形態では、配列番号５の核酸及び配列番号７の核酸は、異なるポリヌクレオチドの一部分である（例えば、異なるベクター上又は異なる染色体上に存在する）。
【００１６】
いくつかの実施形態では、未変性ロイヤラクチンに対するポリクローナル抗体が提供される。ポリクローナル抗体は、必ずしも未変性ロイヤラクチン上の同じエピトープに結合せず、従って、必ずしも結合について互いに競合しない。ポリクローナル抗体（「抗血清」と呼ばれることもある）は、宿主を、本明細書に記載されるロイヤラクチンを含む抗原で免疫化することにより得ることができる。宿主由来の免疫血清を得ることができ、ロイヤラクチンに対する親和性を有するポリクローナル抗体は、アフィニティ精製、例えばアフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降を通して得ることができる。例えば、未変性の立体構造のロイヤラクチン等のロイヤラクチンを固相上に固定化して、ポリクローナル血清と接触させることができ、これにより、ロイヤラクチンに特異的なポリクローナル抗体は、固相上に固定化された未変性ロイヤラクチンに結合する。次いで、この固相は、ロイヤラクチンに特異的でない抗体及び任意の望まれない物質を除去するために洗浄されてもよい。次いで、ロイヤラクチンに特異的な抗体を、例えば溶出によりこの固相から回収することができる。
【００１７】
ロイヤラクチンの精製方法
いくつかの実施形態は、ロイヤラクチンの精製方法を含む。本明細書で使用する場合、未変性ロイヤラクチン等の所望の物質を「精製すること」は、不均一組成物中の他の物質からその物質を分離することを指し、この分離は、例えばその所望の物質をその不均一組成物から除去して保持することにより、及び／又はその他の物質をその不均一組成物から認め得るほどに除去することにより行えるということに留意されたい。従って、「精製された」ロイヤラクチン（この基本語の派生語を含む）は、全体がロイヤラクチンからなる必要はなく、出発の不均一組成物と比べてロイヤラクチンが認め得るほどに濃縮されている組成物も包含する。従って、本発明のいくつかの実施形態に従って論じられるロイヤラクチンの精製方法は、ロイヤラクチンが濃縮された組成物、例えば未変性ロイヤラクチン等のロイヤラクチンを含むか、実質的に未変性ロイヤラクチン等のロイヤラクチンからなるか、又は未変性ロイヤラクチン等のロイヤラクチンからなる組成物を生成すると理解される。ロイヤラクチンが認め得るほどに濃縮されているこのような組成物のような生成物も、精製されたロイヤラクチンを含むと理解される。同様の理由により、（ロイヤラクチン及び他の物質を含む）粗製の生物学的エキスは、本明細書で使用する「精製された」ロイヤラクチンを含まないと理解されるであろう。当該方法は、未変性ロイヤラクチンを含む生物質を水溶液の中に可溶化する工程を含むことができる。当該方法は、上記可溶化された生物質を含む水溶液を基質上に固定化された抗体と接触させる工程を含むことができ、この接触で、上記モノクローナル抗体がロイヤラクチンに特異的に結合する。上記抗体は、未変性ロイヤラクチンに結合することができる。当該方法は、上記抗体に結合した未変性ロイヤラクチンを、この水溶液から（例えば、この水溶液を除去することにより、その抗体及び基質を洗浄することにより、及び／又はその基質をその水溶液から除去することにより）分離する工程を含むことができる。この結合した未変性ロイヤラクチンは、次に例えば  溶出により、上記基質から取り外すことができる。このようにして得られた未変性ロイヤラクチンは、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物を代表する。いくつかの実施形態では、精製されたロイヤラクチンを含む上記組成物は、少なくとも１％（重量／重量）の未変性ロイヤラクチン、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の未変性ロイヤラクチン、及び列挙された値のいずれか２つの間の範囲、例えば１％〜９０％、１％〜５０％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、５％〜９０％、５％〜５０％、５％〜３０％、５％〜２０％、５％〜１０％、１０％〜９０％、１０％〜５０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜９０％、２０％〜５０％、又は２０％〜３０％の未変性ロイヤラクチンを含む。いくつかの実施形態では、この精製されたロイヤラクチンは、さらなる精製、例えば濾過、遠心分離、サイズ排���クロマトグラフィー、又は１以上の追加のラウンドの、ロイヤラクチンに特異的な抗体を使用するアフィニティ精製にかけられる。いくつかの実施形態では、上記精製された未変性ロイヤラクチンは、本明細書に記載される未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用される。いくつかの実施形態では、上記精製された未変性ロイヤラクチンは、本明細書に記載される化粧品を製造するためのキットに含まれる。さらには、ロイヤラクチンの精製方法が本明細書に開示され、その方法が抗体を含むところではいつも、ロイヤラクチンの精製において使用するための抗体も明示的に想定されていると理解されたい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに向けられる抗体は、その抗体を基質上に固定化し、水溶液中の未変性ロイヤラクチンをその抗体に結合し、結合したロイヤラクチンを（例えば洗浄すること及び／又はその基質をその水溶液から物理的に分離することにより）残りの水溶液から分離し、この結合した未変性ロイヤラクチンを溶出する（又は別のやり方で取り外す）ことにより、未変性ロイヤラクチンを濃縮又は精製するために使用することができる。いくつかの実施形態では、上記抗体は、配列番号６のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号６のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号６のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメイン、並びに配列番号８のＣＤＲ３ドメインのＣＤＲ３ドメイン、配列番号８のＣＤＲ２ドメインのＣＤＲ２ドメイン、及び配列番号８のＣＤＲ１ドメインのＣＤＲ１ドメインを含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む抗体を含むか、これらの抗体から実質的になるか、又はこれらの抗体からなる。いくつかの実施形態では、上記抗体は、配列番号６のＨＣＶＲのＨＣＶＲ及び配列番号８のＬＣＶＲのＬＣＶＲを含む抗体を含むか、この抗体から実質的になるか、又はこの抗体からなる。いくつかの実施形態では、上記抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、又は抗体９Ｇ６Ａ２のうちの１以上を含む。いくつかの実施形態では、上記抗体は、抗体４Ｇ６Ｃ５、抗体８Ｃ５Ｃ９、抗体８Ｃ５Ｄ３、抗体４Ｇ６Ｅ２、又は抗体９Ｇ６Ａ２のうちの１以上とロイヤラクチンへの結合について競合する。いくつかの好適な技術が、本発明のいくつかの実施形態に従い抗体を基質上に固定化するために使用することができる。例えば、抗体は、活性化ビーズ（例としてはＡｆｆｉ−ｇｅｌ  １０、バイオラッドラボラトリーズ（Ｂｉｏｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、リッチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）、カルフォルニア州が挙げられる）との共有結合を介して、又は抗体を、ＩｇＧに対して高い親和性を有するタンパク質、例えばプロテインＡにすでに結合されているビーズ（例としてはＰｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州が挙げられる）と接触させることにより、基質上に固定化することができる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体は、免疫沈降により未変性ロイヤラクチンを精製するために使用される。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体は、アフィニティークロマトグラフィーによって未変性ロイヤラクチンを精製するために使用される。いくつかの実施形態では、未変性ロイヤラクチンが基質上の抗体に結合した後、１以上の洗浄が実施され、その結果、結合した未変性ロイヤラクチンを溶出するか又は別のやり方で取り外すのに先立って、ロイヤラクチンを含んでいた最初の溶液から基質及び抗体が分離される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体は、例えば架橋等の共有結合により直接基質上に固定化される。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体は、例えばロイヤラクチンに特異的な上記抗体を基質に固定化された二次抗体と接触させることにより、間接的に基質上に固定化される。この場合、上記二次抗体は、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体の宿主に特異的である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、親和性タグ、例えばｈｉｓタグ又はＦＬＡＧタグ、又はヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含むロイヤラクチンがアフィニティ精製される。このような親和性タグ化ロイヤラクチンタンパク質は、細胞培養液中、例えばその親和性タグ化ロイヤラクチンをコードする核酸を含む昆虫細胞又はバクテリア細胞の中で産生することができる。このロイヤラクチンは、上記親和性タグに対する親和性を有する固相と接触させられてもよい。例えば、固相中のＮｉ又はＣｏ等の重金属イオンは、ｈｉｓタグに対する親和性を有することができる。例えば、固相上に固定化された抗体は、ＦＬＡＧタグ又はＨＡタグに対する親和性を有することができる。例として、ｈｉｓタグ及びＦＬＡＧタグを含むロイヤラクチンタンパク質は、配列番号４に示される。実施例１で示すように、この親和性タグ化ロイヤラクチンタンパク質は、アフィニティ精製され、生物活性を有することが示された。
【００２１】
いくつかの実施形態では、上記基質は、濃縮又は精製のプロセスに役立つように常磁性であるビーズ（例としては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｅａｄｓ、サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ）、マサチューセッツ州が挙げられる）を含む。このプロセスは、ビーズが遠心分離ではなく磁石を用いて集められることを除いて上述のバッチ精製アプローチと同様である。いくつかの実施形態では、上記基質は、アガロース、例えばアガロースビーズ又はアガロース樹脂を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンを含む生物由来物質（例えば、ロイヤルゼリー、細胞培養液、又は細胞培養液エキス）の粗製溶液が、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体と接触させられる。いくつかの実施形態では、この溶液は水溶液である。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンを含む上記生物由来物質は、ロイヤルゼリーを含むか、ロイヤルゼリーからなるか、又は実質的にロイヤルゼリーからなる。いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンを含む上記生物由来物質は、細胞培養液又はそのエキス、例えばロイヤラクチンを発現する遺伝子導入細胞の培養液を含むか、それからなるか、又は実質的にそれからなる。いくつかの実施形態では、この細胞は、バクテリア細胞又は昆虫細胞を含む。いくつかの実施形態では、未変性ロイヤラクチンを含む生物由来物質の溶液が、１以上の初期精製工程を経た後で、ロイヤラクチンに特異的な上記抗体と接触させられる。例えば、いくつかの実施形態では、ロイヤラクチンを含む生物由来物質の上記溶液は、それをロイヤラクチンについて濃縮するため、及び／又は望まれない物質を除去するために、初期ラウンドの濾過、遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー等を経ることができる。初期精製を経た溶液は、次に、本明細書に記載されるロイヤラクチンに対する抗体を使用するロイヤラクチンの精製方法にさらにかけられてもよい。
【００２３】
いくつかの実施形態では、基質（例えば、ビーズ）上に固定化された上記ロイヤラクチンに特異的な抗体がカラムの中に置かれ、未変性ロイヤラクチンを含有する生物質を含有する溶液がそのカラムに通される。何回かの洗浄の後、未変性ロイヤラクチンは、抗体から抗原を解離させる特定の緩衝液を使用して溶出され、カラムからの素通り画分に集められる。精製された未変性ロイヤラクチンは、このようにして得ることができ、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物が得られる。いくつかの実施形態では、精製はバッチ法で行うこともできる。カラムを使用する代わりに、上記ビーズが粗製溶液に添加される。遠心分離が、ビーズをペレットにするために使用することができ、このビーズは、同じアプローチを使用して洗浄される。最終の溶出は、ビーズが遠心沈降された後に最終溶離液がビーズから吸引されることを除いて、カラムを用いる場合と同じであってもよい。精製された未変性ロイヤラクチンは、このようにして得ることができ、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物が得られる。
【００２４】
精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるロイヤラクチンの精製方法は、精製された未変性ロイヤラクチンが濃縮されているか、精製された未変性ロイヤラクチンからなるか、又は実質的に精製された未変性ロイヤラクチンからなる組成物を生成する。いくつかの実施形態では、この組成物は、未変性ロイヤラクチンを溶媒中に、例えば水溶液の中に含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、精製された未変性ロイヤラクチンを乾燥形態で、例えば凍結乾燥された又は噴霧乾燥された形態で含む。精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、「化粧品」（本明細書中で「化粧料用組成物」及びいずれかの基本語の派生語で呼ばれることもある）のために有用であることができるということが想定される。いくつかの実施形態では、この化粧品は、局所ローション剤、クリーム、ペースト、ゲル、スプレー、粉末、薬筆等の局所化粧品を含む。従って、いくつかの実施形態では、化粧品は、本明細書に記載される精製された未変性ロイヤラクチンを含む。いくつかの実施形態では、この精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用される。いくつかの実施形態では、この精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、本明細書に記載される精製方法を使用して生成され、次いで介在する工程なしに未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用される。いくつかの実施形態では、上記精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、例えば凍結乾燥又は噴霧乾燥することにより乾燥され、その後、未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するために使用することができる。いくつかの実施形態では、この精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、未変性ロイヤラクチンを含む化粧品を製造するためのキットの中に含まれる。いくつかの実施形態では、このキットは、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物をどのようにして化粧品に組み込むことができるかについて使用者を導く使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、このキットは、精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物を再構成する方法について使用者を導く使用説明書をさらに含む。いくつかの実施形態では、この精製された未変性ロイヤラクチンを含む組成物は、少なくとも１％（重量／重量）の未変性ロイヤラクチン、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％の未変性ロイヤラクチン、及び列挙された値のいずれか２つの間の範囲、例えば１％〜９０％、１％〜５０％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、５％〜９０％、５％〜５０％、５％〜３０％、５％〜２０％、５％〜１０％、１０％〜９０％、１０％〜５０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜９０％、２０％〜５０％、又は２０％〜３０％の未変性ロイヤラクチンを含む。
【００２５】
いくつかの実施形態では、上記未変性ロイヤラクチンを含む化粧品は、少なくとも１％（重量／重量）の未変性ロイヤラクチン、例えば少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、又は８０％のロイヤラクチン、及び列挙された値のいずれか２つの間の範囲、例えば１％〜８０％、１％〜５０％、１％〜３０％、１％〜２０％、１％〜１０％、５％〜８０％、５％〜５０％、５％〜３０％、５％〜２０％、５％〜１０％、１０％〜８０％、１０％〜５０％、１０％〜３０％、１０％〜２０％、２０％〜８０％、２０％〜５０％、又は２０％〜３０％の未変性ロイヤラクチンを含む。本明細書に記載される精製されたロイヤラクチンを含むこのような化粧品は、本明細書に記載される局所化粧品であってもよい。本発明のいくつかの実施形態に係る精製された未変性ロイヤラクチンを含むこのような化粧品は、本明細書に記載されるようにコロニー形成を刺激する、及び／又は癒傷を刺激するなどの生物活性を有することができるということが想定される。
【実施例】
【００２６】
実施例１：癒傷活性を有するＨｉｓタグ化ロイヤラクチンタンパク質の生成
（ミツバチ属の）ハナバチのロイヤルゼリーは、いくつかの哺乳類細胞の増殖を高め、癒傷を高めると過去に報告された。ロイヤラクチンは、主要なロイヤルゼリータンパク質のうちの豊富なもののうちの１つであり、本発明者らは、それが担っているのではないかと仮説を立てた。ロイヤラクチンタンパク質の配列は公知であり、ヒスチジンタグを有する全長ロイヤラクチンタンパク質（配列番号４）を含む細菌性融合タンパク質を作製した。粗製可溶化液を、精製を可能にするように重金属イオンが連結されたカラムにかけることにより、このタンパク質を精製し、次いで培養液中で細胞を処理するために使用した。
【００２７】
コロニー形成単位を見るためのインビトロ  実験をＵ９３７（ヒト骨髄系）及びＨＥＫ２９３（ヒト胚性腎臓）細胞株で実施し、精製したタンパク質の存在下でコロニー形成が増加することを明らかにした。この結果を胚性幹細胞にも拡張して、同様の結果を確認した。最後に、精製した上記タンパク質を、癒傷遅延の動物モデル、糖尿病（ｄｂ／ｄｂ）マウスに対して使用した。これは、上記タンパク質の施用が癒傷のおよそ５０％改善を生じることを示した。このように、Ｈｉｓタグ化ロイヤラクチンタンパク質（配列番号２）は、複数種のヒト細胞において、及び癒傷遅延のマウスモデルにおいてコロニー形成を刺激するための生物活性を持っていた。
【００２８】
実施例２：ロイヤラクチンに向けられた抗体の生成
実施例１において生物活性を有することを確認した、ヒスチジンタグを有する全長ロイヤラクチン（配列番号２）を含有する融合タンパク質を細菌中で生成し、精製した。このタンパク質を使用して、マウスへの注射によってモノクローナル抗体を産生し、その後、複数のハイブリドーマの生成について脾臓を回収した。個々のハイブリドーマを単離し、産生した抗体をドットイムノブロットアッセイを使用してスクリーニングした。種々の濃度のロイヤラクチンを、対照としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）とともにブロット上にドットとして加えた。全部で３０の別個のハイブリドーマを、ドットイムノブロットアッセイを使用して試験し（図３Ａ及び図３Ｂ）、ロイヤラクチンに対して最も高い親和性を有する５つをさらなる分析のために選択した（ハイブリドーマ番号１９、２０、２１、２２、及び２３）。
【００２９】
このウエスタンドットブロットの結果を下記の表１に要約する。
【表１】
2020516592.tif 000003
【００３０】
実施例３：抗体によるタンパク質の免疫沈降
初期スクリーニングを通過した上述の抗体を、ロイヤラクチンに結合するその能力について、免疫沈降実験を用いてさらに試験した。５００ｎｇの精製されたロイヤラクチンを、様々な量の試験するモノクローナル抗体でインキュベーションした。結合後、プロテインＡが連結されたアガロースビーズを加え、上記抗体及び結合したタンパク質を免疫沈降させた。この沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動にかけ、特定したタンパク質が適切なサイズであることを明らかにし、そして結合されたタンパク質の量を部分的に定量した。すべての抗体が上記タンパク質に適切に結合することが判明したが、抗体番号１９及び抗体番号２０は、わずかにより良好なタンパク質沈殿を有していた。結果として、ロイヤルゼリーから濃縮されたエキスを製造する際のさらなる使用のためにモノクローナル抗体番号１９を選んだ。
【００３１】
実施例４：結合抗体がロイヤラクチンに結合する能力
まず、上記精製したタンパク質を使用して、上記モノクローナル抗体がロイヤラクチンを濃縮する能力を明らかにした。５つのモノクローナル抗体、抗体１９（４Ｇ６Ｃ５）、２０（８Ｃ５Ｃ９）、２１（８Ｃ５Ｄ３）、２２（４Ｇ６Ｅ２）及び２３（９Ｇ６Ａ２）を試験した。異なる量の上記モノクローナル抗体を、ビーズ支持体に結合した。結合後、少量の精製されたロイヤラクチンを上記ビーズとともにインキュベーションし、結合させた。次に、このビーズを単離し、洗浄し、結合したタンパク質をクマシー染色によって分析した。クマシー染色後のゲルを図４Ａ及び図４Ｂに示す。ＮＢはＩＰの素通り画分である。「溶出」はＩＰ後画分である（回収した試料）。ロイヤラクチンについてのバンドを矢印で示す（図４Ａ中の白矢印、図４Ｂ中の黒矢印）。
【００３２】
強いバンドが「溶出」には存在したのに対して、「洗浄」には検出可能なバンドが存在しないことによって明示されるとおり、この実験は、上記結合抗体は上記ロイヤラクチンタンパク質のほとんどすべてを結合することができるということを明らかにした。
【００３３】
実施例５
ロイヤラクチンの試料濃縮スキーム。ロイヤルゼリーからのロイヤラクチンの濃縮のための手順を明らかにするための小スケールの実験を実施した。１ｇのロイヤルゼリーを３４ｍＬのＴｒｉｓ  ｐＨ７緩衝液に溶解させた。この混合物のタンパク質アッセイ（ＢＣＡ）は、全タンパク質のタンパク質濃度が３．２２ｍｇ／ｍＬであることを明らかにした。モノクローナル抗体番号１９（４Ｇ６Ｃ５）をＤｙｎａｂｅａｄ（商標）支持体に結合した。結合後、１ｍｇの全ロイヤルゼリータンパク質を上記結合抗体に加え、結合させた。次に、このビーズを単離し、洗浄し、結合したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。次に、このフィルターをロイヤラクチンに特異的な抗体を用いて免疫ブロットにかけ、上記モノクローナル抗体が適切なサイズのバンドを有意に濃縮することができることを明らかにした。結果を図５Ａ（クマシー染色後のＳＧＳ−ＰＡＧＥ）及び図５Ｂ（ＲＡに対するポリクローナル抗体を使用した抗ＲＡウエスタンブロット）に示すが、この結果は、ロイヤラクチンに対応するサイズのバンドのタンパク質が濃縮されたことを確認する。
【００３４】
実施例６
いくつかの実施形態に係るモノクローナル抗体番号１９（４Ｇ６Ｃ５）のＨＣＶＲ及びＬＣＶＲをコードする核酸を配列決定した。ＨＣＶＲをコードする核酸（配列番号５）を図６Ａに示し、対応する翻訳後のＨＣＶＲポリペプチド（配列番号６）を図６Ｂに示す。ＬＣＶＲをコードする核酸（配列番号７）を図６Ｃに示し、対応する翻訳後のＬＣＶＲポリペプチド（配列番号８）を図６Ｄに示す。
【００３５】
種々の態様及び実施形態が本明細書に開示されたが、他の態様及び実施形態は当業者には明らかであろう。本明細書に開示された種々の態様及び実施形態は、説明のためのものであり、限定するものであることは意図されておらず、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。当業者は、本明細書に開示されるこのプロセス及び方法並びに他のプロセス及び方法のために、上記プロセス及び方法において実施される機能は、異なる順序で実行できるということはわかるであろう。さらには、説明した工程及び操作は、例として提供されているにすぎず、上記工程及び操作のいくつかは、開示された実施形態の本質から逸脱することがなければ、任意であってもよいし、より少ない工程及び操作へと組み合わされてもよいし、又は追加の工程及び操作へと拡張されてもよい。
【００３６】
種々の態様及び実施形態が本明細書に開示されたが、他の態様及び実施形態は当業者には明らかであろう。本明細書に開示された種々の態様及び実施形態は、説明のためのものであり、限定するものであることは意図されておらず、真の範囲及び趣旨は以下の特許請求の範囲によって示される。
【００３７】
本明細書中の実質的にすべての複数形及び／又は単数形の用語の使用に関しては、当業者は、文脈及び／又は適用例に応じて適宜、複数形から単数形へ、及び／又は単数形から複数形へと翻訳することができる。種々の単数形／複数形の置き換えは、明確性のために、本明細書中で明示的に示されることがある。
【００３８】
全般に、本明細書で使用される用語、とりわけ添付の特許請求の範囲（例えば、添付の請求項の本体部）で使用される用語は、全般に「非限定」用語として意図されている（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は「含むが、それらに限定されない」と解釈されるべきであり、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は「少なくとも…を有する」と解釈されるべきであり、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は「含むが、それらに限定されない」と解釈されるべきである、など）ということを当業者は理解するであろう。導入された請求項の構成要素の特定数が意図されている場合、このような意図は請求項中に明示的に記載されることになり、そのような記載がなければそのような意図はないということを当業者はさらに理解するであろう。例えば、理解の助けとして、以下の添付の請求項は、請求項の構成要素を導入するための導入句「少なくとも１つの」及び「１以上の」の使用を含むことがある。しかしながら、そのような句の使用は、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による請求項の構成要素の導入が、そのような導入された請求項の構成要素を含有するいずれか特定の請求項を、ただ１つのそのような構成要素を含有する実施形態に限定するということを含意すると解釈されるべきではない。これは、同じ請求項が上記導入句「１以上の」又は「少なくとも１つの」並びに「ａ」又は「ａｎ」等の不定冠詞を含む場合であってもである（例えば、「ａ」及び／又は「ａｎ」は、「少なくとも１つの」又は「１以上の」を意味すると解釈されるべきである）。同じことは、請求項の構成要素を導入するために使用される定冠詞の使用についても当てはまる。加えて、導入された請求項の構成要素の特定数が明示的に記載されている場合であっても、当業者は、そのような構成要素は少なくとも記載された数を意味する（例えば、他の修飾語句なしの「２つの構成要素」のそのままの記載は、少なくとも２つの構成要素、又は２以上の構成要素を意味する）と解釈されるべきであると認識するであろう。さらには、「Ａ、Ｂ、及びＣ等のうちの少なくとも１つ」に類似の常套句が使用される場合には、一般に、そのような解釈は、当業者ならその常套句を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つを有する抗体」はＡ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に等、有する抗体を含むであろうが、これに限定されない）。「Ａ、Ｂ、又はＣなどのうちの少なくとも１つ」に類似の常套句が使用される場合には、全般に、そのような解釈は、当業者ならその常套句を理解するであろうという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、又はＣのうちの少なくとも１つを有する抗体」は、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、及び／又はＡ、Ｂ、及びＣを一緒に等、有する系を含むであろうが、これに限定されない）。２以上の択一的な用語を提示する実質的にすべての離接的な語及び／又は句は、明細書においてであれ、請求項においてであれ、又は図面においてであれ、用語のうちの１つ、用語のうちのいずれか、又は両方の用語を含む可能性を想定していると理解されるべきであるということを当業者はさらに理解するであろう。例えば、句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解される。
【００３９】
加えて、本開示の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合には、当業者は、その開示は、それにより、そのマーカッシュ群のいずれかの個々のメンバー又はメンバーの部分群に関しても記載されていると認識するであろう。
【００４０】
当業者が理解するように、いずれか及びすべての目的のために、例えば記載を提供することに関して、本明細書に開示されるすべての範囲は、いずれかの及びすべての可能な部分範囲並びにそれらの部分範囲の組み合わせをも包含する。あらゆる記載された範囲は、少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などへ分解される同じ範囲を十分に記載し実施可能にしていると簡単に認識することができる。限定を意図しない例として、本明細書で論じられる各範囲は、下限側の３分の１、真ん中の３分の１及び上限側の３分の１などへ容易に分解することができる。同じく当業者が理解するように、「…まで（以下）」、「少なくとも」などのすべての語句は、記載された数を含み、かつ範囲を指し、この範囲は、上で論じたようにその後部分範囲へと分解されてもよい。最後に、当業者が理解するように、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。従って、例えば、１〜３個の細胞を有する群は、１つの細胞、２つの細胞、又は３つの細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１つの細胞、２つの細胞、３つの細胞、４つの細胞、又は５つの細胞を有する群を指す、などである。
【００４１】
上述の記載から、本開示の種々の実施形態は、説明のために本明細書に記載されたこと、及び本開示の範囲及び趣旨から逸脱せずに種々の改変が加えられてもよいということは分かるであろう。従って、本明細書に開示される種々の実施形態は限定することを意図されておらず、真の範囲及び趣旨は添付の特許請求の範囲によって示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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