(57)【要約】  本発明の課題は微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する工業的に有利な方法を提供することにある。  リゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物よりレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する耐熱性の高い酵素を見出す。該酵素をコードする遺伝子で形質転換された形質転換微生物を取得する。該形質転換微生物により製造された当該酵素を炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する。  また、微生物又は該微生物の処理物を利用して炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造するに際して、有機溶媒を水性溶媒に添加する、レゾルシンの酸化を抑制する、或いは、レゾルシン、微生物又は該微生物の処理物の何れかを逐次添加することにより蓄積濃度を向上させる。その際上述の形質転換微生物を用いると更に良好な結果が得られる。上記製造方法はカテコールを用いた２，３−ジヒドロキシ安息香酸の製造に応用することが出来る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、有機溶媒を水性媒体に添加することを特徴とする製造方法。
【請求項２】
有機溶媒の添加によって反応の平衡が２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する側へ移動することを特徴とする請求項１に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項３】
添加する有機溶媒の１種類以上が水に対して相溶性を有することを特徴とする請求項１又は２に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項４】
添加する有機溶媒の１種類以上が非プロトン性溶媒であることを特徴とする請求項１〜３何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項５】
添加する有機溶媒が炭素数１から炭素数４のカルボニトリル、アルコール、エーテル、ケトン及びスルフィニルより成る群から選ばれた１種以上の溶媒であることを特徴とする請求項１又は２に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であって、反応系内のレゾルシンの酸化を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項７】
レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、反応系内のレゾルシンの酸化を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項８】
レゾルシンの酸化を抑制する手法として、反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気とすることを特徴とする請求項７に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項９】
レゾルシンの酸化を抑制する手法として、反応系内を減圧し脱気することを特徴とする請求項７に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
【請求項１０】
レゾルシンの酸化を抑制する手法として、水性媒体中へ酸化防止剤を添加することを特徴とする請求項７に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項１１】
反応の進行に応じて水性媒体中へレゾルシンを２回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とする、請求項1〜１０の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項１２】
レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物を２回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とする請求項１〜１１の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項１３】
下記の（ａ）〜（ｃ）の全ての理化学的性質を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）作用：２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）温度安定性：ｐＨ７.０の緩衝液中での活性半減期が５０℃において約１２０分、６０℃において約２５分。
（ｃ）至的温度：ｐＨ８で脱炭酸反応をさせる場合、温度７０℃付近において作用が至的である。
【請求項１４】
下記の全ての理化学的性質をさらに有する、請求項１３に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
（ｄ）炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。
【請求項１５】
配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１６】
配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られるアミノ酸配列を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
【請求項１７】
配列表の配列番号：２記載の塩基配列で表される２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１８】
配列表の配列番号：２記載の塩基配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列で表される２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項１９】
配列表の配列番号：２記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド。
【請求項２１】
請求項２０に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換微生物。
【請求項２２】
請求項１３〜１６いずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または請求項２１に記載の形質転換微生物を培養し、該微生物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの製造方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法により製造した２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを、炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法により製造した２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを、炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性媒体中でカテコールに作用させて２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，３-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項２５】
微生物が請求１３〜１６の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項２６】
微生物が請求項１７〜１９の何れか一項に記載の遺伝子を保持し、該遺伝子情報に基づく２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生物であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【請求項２７】
微生物が請求項２２に記載の形質転換微生物であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸、カテコールから２，３-ジヒドロキシ安息香酸に変換する耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼに関するものである。また、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子に関するものである。さらに、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換した形質転換微生物に関するものである。さらには耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または形質転換微生物を培養し、該微生物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの製造方法に関するものである。そして本発明は、この２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いた２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に関するものである。また、本発明は微生物又は該微生物の処理物を利用した２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法おいて、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高める方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
２，６-ジヒドロキシ安息香酸はレゾルシンを原料として、２，３-ジヒドロキシ安息香酸は、カテコールを原料としてコルベ-シュミット法による炭酸化反応により製造されている。すなわちレゾルシン、カテコールの金属塩に炭酸ガスを高温高圧下で反応させる方法により製造されているが、この方法によれば対応する多価アルコール芳香族カルボン酸の混合物が生成し、該混合物から目的化合物を分離精製するには非常な困難が伴う。そのため、選択的に目的化合物を製造する方法がいろいろ試みられているが、実用化するまでには至っていない。【０００３】
一方、レゾルシンの２位選択的にカルボキシル基を導入する方法、カテコールの３位選択的にカルボキシル基を導入する方法として、微生物菌体の触媒作用を利用した２，６-ジヒドロキシ安息香酸と２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製法が知られている（特開２００１-４６０９３号公報）。より具体的には、微生物菌体としてはプロピオニバクテリウム(Propionibacterium)属に属する微生物を使用し、炭酸緩衝液中においてレゾルシンと接触させることにより２，６-ジヒドロキシ安息香酸をカテコールと接触させることにより２，３-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法である。【０００４】
また、第１回「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発」（中間評価）分科会における事業原簿（作成者 新エネルギー・産業技術総合開発機構バイオテクノロジー開発室）によるとエンテロバクター（Enterobacter）属、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌が、レゾルシンを２，６-ジヒドロキシ安息香酸に変換する触媒作用を持つと記載されているが、それ以上の詳細な記載は無い。【０００５】
さらに、平成１５年度 日本生物工学会要旨集の桐村らの発表によると桐村らはRhizobium radiobacterに属する微生物に炭酸カリウム緩衝液中においてレゾルシンと接触させることにより２，６-ジヒドロキシ安息香酸を、カテコールと接触することにより２，３-ジヒドロキシ安息香酸を製造する微生物を見出している。また、その無細胞抽出液を用い最適反応条件を検討している。さらに、無細胞抽出液より本反応を触媒する酵素を精製することにより本反応が１種類の酵素によって触媒され、脱炭酸酵素の逆反応により進行することを推定している。しかしながら、その耐熱性については何ら言及しておらずその最
適温度は４０℃と低く、耐熱性に優れた安定性の高い酵素とは考えにくい。【０００６】
そして２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子はこれまでに明らかにされたことはない。したがって、その遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された形質転換微生物、さらにその遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された形質転換微生物が本酵素を発現し、活性を有する形質転換微生物が得られることも全く知られていない。【０００７】
以上のように本発明者が知る限り、レゾルシンを２，６-ジヒドロキシ安息香酸に、カテコールを２，３-ジヒドロキシ安息香酸に変換する触媒作用を有する微生物およびその触媒本体である酵素に関する報告は限られている。また、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子は全く知られていない。さらにその遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された形質転換微生物が本酵素を発現し、活性を有する形質転換微生物が得られることも全く知られていない。【０００８】
また、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法については、特開２００１-４６０９３号公報において反応は二酸化炭素雰囲気で行われているものの、二酸化炭素雰囲気により生成する２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることについては何ら記載されていない。反応は水性溶媒中で行われており、有機溶媒の添加による２，６-ジヒドロキシ安息香酸蓄積濃度向上の効果についても何ら言及されていない。反応は原料、微生物を反応開始時に一括添加しており、レゾルシン１０ｍＭから得られる２，６-ジヒドロキシ安息香酸は３．３ｍＭと蓄積濃度が低い。桐村らの報告では、反応は水性溶媒を用いて空気雰囲気で行われ、有機溶媒の添加に関しては何ら言及されていない。加えて、原料、微生物又は該微生物の処理物を反応開始時に一括添加しており、結果的にレゾルシン２５ｍＭから得られる２，６-ジヒドロキシ安息香酸は１０ｍＭであり、蓄積濃度は十分でない。【０００９】
以上のように、本発明者が知る限りは、微生物又は該微生物の処理物を利用した２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に関する報告は限られている。【００１０】
【特許文献１】特開２００１‐４６０９３公報
【非特許文献１】第1回「生物機能を活用した生産プロセスの基盤技術開発」（中間評価）分科会における事業原簿（作成者 新エネルギー・産業技術総合開発機構バイオテクノロジー開発室）：ＨＰアドレスhttp://www.nedo.go.jp/iinkai/hyouka/nittei/150512.html（平成１５年５月１２日公開）
【非特許文献２】平成１５年度 日本生物工学会要旨集日本生物工学会要旨集（２００３）（平成１５年８月２５日発行）
【非特許文献３】オーガニックシンセシス（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．）ＩＩ、Ｐ．５５７（１９７３）
【非特許文献４】ジャーナルオブケミカルソサイエティー（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）Ｐ．３５０３（１９５２）
【非特許文献５】第５５回日本生物工学会大会（平成１５年８月２５日発行）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
微生物菌体が有する酵素の触媒作用を利用して産業上の有用物質を工業的に製造するにおいて耐熱性の有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いると耐熱性に応じて酵素の耐久性が向上し、経済的に有利である。また、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現し活性を有する形質転換微生物を作製し、さらに該形質転換微生物を用い該酵素を製造することは概酵素の製造コストを下げることが可能になるため有用である。【００１２】
また、微生物又は該微生物の処理物を利用した２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造において、反応条件を調製することにより生成する２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高めることは、工業的に２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する際に有利である。【００１３】
本発明は、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを提供するものである。また、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子を提供するものである。さらに、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド及びこのプラスミドにより形質転換した形質転換微生物を提供するものである。さらには耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または形質転換微生物を培養し、該微生物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの製造方法を提供するものである。そして本発明は、この２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いた２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。さらには、工業的に実施するのに有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記の課題を解決すべく２，６-ジヒドロキシ安息香酸、２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法について鋭意研究を重ねた結果、新規にリゾビウム（Rhizobium）属する微生物が、レゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸に変換する活性を有することを見出した。当該活性が見出された微生物より種々の精製方法を組合わせることにより酵素を精製しその性質を調べたところ耐熱性を有する工業的に有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼであることを見出した。また、この耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列、それをコードする遺伝子を明らかにし、その遺伝子を含むプラスミドにより形質転換された形質転換微生物が本酵素を発現し、活性を有する形質転換微生物が得られることを明らかにした。さらには、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または上記形質転換微生物を培養し、該微生物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの製造方法を開発した。さらに、この２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いた２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を開発した。【００１５】
また、本発明者らは２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法について鋭意検討を行ったところ、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で、微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法においては、以下の（１）〜（３）の知見を見出した。
（１）水性媒体に有機溶媒を添加することにより、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることを見出した。
（２）レゾルシンの酸化を抑制しつつ反応を進行させることにより、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることを見出した。
（３）レゾルシン、又は、微生物又は該微生物の処理物を逐次添加することにより、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め得ることを見出した。【００１６】
そして更に（１）〜（３）の組み合わせ及び（１）〜（３）と上述の耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの組み合わせにより、その効果をさらに高め得ることを見出した。【００１７】
以上の知見から本発明を完成するに至った。【００１８】
すなわち、本発明は、耐熱性を有する工業的に有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼおよびその生産方法を提供し、もって、２，６-ジヒドロキシ安息香酸、２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造法を提供するものである。また、微生物又は該微生物の処理物を利用した２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法において、反応条件を調整することにより工業的に有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法を提供するものである。【００１９】
より具体的には、以下の通りである。
[１]  レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、有機溶媒を水性媒体に添加することを特徴とする製造方法。
[２]  有機溶媒の添加によって反応の平衡が２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する側へ移動することを特徴とする[１]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[３]  添加する有機溶媒の１種類以上が水に対して相溶性を有することを特徴とする請求項[１]又は[２]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[４]  添加する有機溶媒の１種類以上が非プロトン性溶媒であることを特徴とする[１]は[２]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[５]  添加する有機溶媒が炭素数１から炭素数４のカルボニトリル、アルコール、エーテル、ケトン及びスルフィニルより成る群から選ばれた１種以上の溶媒であることを特徴とする[１]又は[２]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[６]  添加する有機溶媒が、アセトニトリル、イソプロパノール、ブタノール、ジエチルエーテル、アセトン、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエタノール、グリセリン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン及びメタノールより成る群から選ばれた単一或いは複数の溶媒である[５]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[７]  [１]〜[６]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であって、反応系内のレゾルシンの酸化を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[８]  レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物とレゾルシンを炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中で接触させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を製造する方法であって、反応系内のレゾルシンの酸化を抑制しながら反応を進行させることを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[９]  レゾルシンの酸化を抑制する手法として、反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気とすることを特徴とする[７]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[１０]  不活性雰囲気が窒素雰囲気であることを特徴とする[９]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[１１]  レゾルシンの酸化を抑制する手法として、反応系内を減圧し脱気することを特徴とする[７]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[１２]  レゾルシンの酸化を抑制する手法として、水性媒体中へ酸化防止剤を添加することを特徴とする[７]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[１３]  添加する酸化防止剤として、水性媒体中へ２-メルカプトエタノールを添加することを特徴とする[１２]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸製造方法。
[１４]  反応の進行に応じて水性媒体中へレゾルシンを２回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とする、[１]〜[１３]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[１５]  レゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物又は該微生物の処理物を２回以上に分けて必要量を分割して添加することを特徴とする[１]〜[１４]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[１６]  下記の（ａ）〜（ｃ）の全ての理化学的性質を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
（ａ）作用：２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）温度安定性：ｐＨ７.０の緩衝液中での活性半減期が５０℃において約１２０分、６０℃において約２５分。
（ｃ）至的温度：ｐＨ８で脱炭酸反応をさせる場合、温度７０℃付近において作用が至的である。
[１７]  下記の全ての理化学的性質をさらに有する、[１６]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
（ｄ）炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。
[１８]  下記の理化学的性質をさらに有する、[１６]又は[１７]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
（ｅ）分子量：ゲルろ過クロマトグラフィーでの分子量は約１５１０００ダルトン。
（ｆ）サブユニット構造：ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分子量は約３７５００ダルトンからなるホモテトラマー。
（ｇ）基質特異性：２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、３，４-ジヒドロキシ安息香酸、３，５-ジヒドロキシ安息香酸には作用しない。
（ｈ）至的ｐＨ：３０℃で脱炭酸反応をさせる場合ｐＨ約８．０において作用が至的である。
（ｉ）金属イオンの影響：Mg2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Mo6+、Ca2+金属イオンのいずれも脱炭酸活性を活性化しない。
（ｊ）補酵素：TPP、PLP、NAD+、NADP+、補酵素にはなり得ず、また本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素はない。
[１９]  配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[２０]  配列表の配列番号：１記載のアミノ酸配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られるアミノ酸配列を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[２１]  Rhizobium属に属する微生物に由来する[１６]〜[２０]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[２２]  Rhizobium属に属し、１６ＳｒＤＮＡの５‘末端側の塩基配列が配列表の配列番号：８記載の塩基配列を含む微生物に由来する[１６]〜[２０]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[２３]  微生物がRhizobium.sp MTP-10005（FERM BP-10122）である、[２２]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ。
[２４]  配列表の配列番号：２記載の塩基配列で表される２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[２５]  配列表の配列番号：２記載の塩基配列の一部を置換、欠失、削除または挿入して得られる塩基配列で表される２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[２６]  配列表の配列番号：２記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[２７]  Rhizobium属に属する微生物に由来する[２４]〜[２６]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[２８]  Rhizobium属に属し、１６ＳｒＤＮＡの５‘末端側の塩基配列が配列表の配列番号：８記載の塩基配列を含む微生物に由来する[２４]〜[２６]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[２９]  微生物がRhizobium.sp MTP-10005（FERM BP-10122）である、[２８]に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子。
[３０]   [２４]〜[２９]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのサブユニットをコードする遺伝子を含んでいる組換えプラスミド。
[３１]  [３０]に記載のプラスミドによって形質転換された形質転換微生物。
[３２]  [１６]〜[２３]のいずれか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物または[３１]に記載の形質転換微生物を培養し、該微生物またはその培養上清およびこれらの処理物として提供される該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの製造方法。
[３３]  [３２]に記載の方法により製造した２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを、炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[３４]  [３２]に記載の方法により製造した２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを、炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性媒体中でカテコールに作用させて２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，３-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[３５]  微生物が[１６]〜[２３]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生する微生物であることを特徴とする[１]〜[１５]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[３６]  微生物が[２４]〜[３０]の何れか一項に記載の遺伝子を保持し、該遺伝子情報に基づく２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生物であることを特徴とする[１]〜[１５]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
[３７]  微生物が[３１]記載の形質転換微生物であることを特徴とする[１]〜[１５]の何れか一項に記載の２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２０】
本発明により提供される耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを用いることにより、その反応選択性も利用し、極めて単純な工程で工業的に実施するのに有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造法が提供される。【００２１】
また、微生物又は該微生物の処理物を触媒とした２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法において、反応時の溶媒種や原料の安定性などの反応条件を調整することにより生成する２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高め、安全かつ簡単な工程で工業的に実施するのに有利な２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】２，６−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す電気泳動写真である。レーン１は分子量マーカー、レーン２は実施例１記載２，６−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製酵素液、レーン３は実施例７の結果を、レーン４は比較例４の結果をそれぞれ示す。
【図２】反応液中の２，６-ジヒドロキシ安息香酸生成濃度の経時変化を示すグラフである。図中、ひし形は実施例２３の結果を、四角は比較例８をそれぞれ示す。
【図３】実施例２４に記載の反応液中の２，６-ジヒドロキシ安息香酸生成濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】反応液中のモル比（レゾルシンと２，６-ジヒドロキシ安息香酸のモル量の和に対する２，６-ジヒドロキシ安息香酸のモル量）の経時変化を示すグラフである。図中、レゾルシンをＲＳ、２，６−ジヒドロキシ安息香酸を２，６−ＤＨＢＡと略記する。ひし形は実施例３３の結果を、四角は実施例３４の結果をそれぞれ示す。横軸は反応時間（Ｈｒ）を表す。
【図５】反応液中のモル比（レゾルシンと２，６-ジヒドロキシ安息香酸のモル量の和に対する２，６-ジヒドロキシ安息香酸のモル量）の経時変化を示すグラフである。図中、レゾルシンをＲＳ、２，６−ジヒドロキシ安息香酸を２，６−ＤＨＢＡと略記する。ひし形は比較例９の結果を、四角は比較例１０の結果をそれぞれ示す。横軸は反応時間（Ｈｒ）を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明は、耐熱性を有する２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼに関する。本発明において２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼとは、２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシン、炭酸の生成を触媒する酵素を指す。本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは以下の（ａ）〜（ｃ）の全ての理化学的性質を有する。
（ａ）作用：２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用してレゾルシンを生成する反応を触媒する。
（ｂ）温度安定性：ｐＨ７.０の緩衝液中での活性半減期が５０℃において約１２０分、６０℃において約２５分。
（ｃ）至的温度：ｐＨ８で脱炭酸反応をさせる場合、温度７０℃付近において作用が至的である。なお本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは好ましくは以下の（ｄ）の理化学的性質をさらに有する。
（ｄ）炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する。本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼはさらに好ましくは以下の（ｅ）〜（ｉ）の全ての性質を持つ。
（ｅ）分子量：ゲルろ過クロマトグラフィーでの分子量は１５１０００ダルトン。
（ｆ）サブユニット構造：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分子量は約３７５００ダルトンからなるホモテトラマー。
（ｇ）基質特異性：２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、３，４-ジヒドロキシ安息香酸、３，５-ジヒドロキシ安息香酸には作用しない。
（ｈ）至的ｐＨ：３０℃で脱炭酸反応をさせる場合ｐＨ約８．０において作用が至的である。
（ｉ）金属イオンの影響：Mg2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Mo6+、Ca2+金属イオンのいずれも脱炭酸活性を活性化しない。
（ｊ）補酵素：TPP、PLP、NAD+、NADP+のいずれも補酵素にはなり得ず、また本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素はない。【００２４】
本発明において、上記の（ａ）記載の作用、つまりは２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性は次のようにして測定することにより確認できる。例えば１００μｌの酵素液と９ｍＭの基質（例えば２，６-ジヒドロキシ安息香酸）を含む１００ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）総量１ｍｌ中で、３０℃、５分間で反応させる。この反応によって生成する生成物（例えばレゾルシン）量をＨＰＬＣ法によって測定することにより酵素活性を測定できる。ＨＰＬＣ法としては、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、水とアセトニトリルの混合物に０．１％トリフルオロ酢酸を添加したものを移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィー、検出は紫外部分光検出器によって波長２８０ｎｍ付近で行う方法が例示できる。【００２５】
（ｂ）記載の本発明における酵素の温度安定性指標の１つである活性半減期とは、水性媒体中に溶解している酵素をある処理温度（例えば５０℃）で保持した際、未処理の酵素活性を１００％とした時に処理後の酵素活性が５０％になる時間のことである。本活性半減期を求めるには以下の条件にて熱処理を行うことにより求められる。熱処理において使用される水性媒体とは１ｍＭ以上1Ｍ以下の塩濃度の緩衝液、望ましくは１ｍＭ以上１００ｍＭ以下の塩濃度の緩衝液、より望ましくは５ｍＭ以上１５ｍＭ以下の塩濃度の緩衝液である。ここでいう緩衝液の種類は特に制限は無いがｐＨ７付近で緩衝能が高い燐酸カリウム緩衝液を例示できる。熱処理する方法としては水性媒体中に溶解している酵素を瞬時に指定の温度において処理できる方法であれば特に制限はない。例えば容量１５ｍＬの蓋付きガラス製試験管に１．０ｍＬの水性媒体に溶解している酵素を入れ、指定の温度に制御した水浴恒温槽に浸漬し、振とうしながら必要時間保持すれば良い。ここで述べるｐＨ７.０の緩衝液中での活性半減期が５０℃において約１２０分とは、２０分以上２２０分以下、望ましくは７０分以上１７０分以下、より望ましくは１１０分以上１３０分以下のことである。また、６０℃において約２５分とは１０分以上４０分以下、望ましくは１５分以上３５分以下、より望ましくは２０分以上３０分以下のことである。【００２６】
（ｃ）記載の至的温度については上記の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において温度のみを変化させることにより容易に求められる。７０℃付近とは４５℃以上９５℃以下、望ましくは５５℃以上８５℃以下、望ましくは６５℃以上７５℃以下のことを指す。【００２７】
（ｄ）記載の性質については、炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下に水性溶媒中でレゾルシンに本酵素を作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成の有無を測定すれば確認できる。
炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下とは、レゾルシンに付加されるカルボキシル基の供給源を水生溶媒中に共存させるためであり、より具体的には、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウムに代表される炭酸塩を上述の水生溶媒中に添加し、もしくは、気体・液体・固体の二酸化炭素を該水生溶媒中に吹き込み、または、添加することで調製することができる。２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成の有無はＨＰＬＣ法によって測定することが測定できる。ＨＰＬＣ法としては、オクタデシル基を有したシリカゲルパックドカラムなどを固定相に用い、水とアセトニトリルの混合物に０．１％トリフルオロ酢酸を添加したものを移動相とする一般的な逆相クロマトグラフィー、検出は紫外部分光検出器によって波長２８０ｎｍ付近で行う方法が例示できる。【００２８】
（ｅ）に記載しているように本酵素はゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量は約１５１０００ダルトンを示す。約１５１０００ダルトンとは、１４００００ダルトン〜１６００００ダルトン、好ましくは１４５０００ダルトン〜１５５０００ダルトンを指す。【００２９】
（ｆ）に記載しているように本酵素はＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分子量は約３７５００ダルトンを示す。約３７５００ダルトンとは３３０００ダルトン〜４３０００ダルトン好ましくは３５０００ダルトン〜４００００ダルトンを指す。（ｅ）に記載しているゲルろ過クロマトグラフィーにおける分子量とＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動におけるサブユニット分子量から本酵素はホモテトラマーであることが容易に推定できる。【００３０】
（ｇ）に記載している基質特異性については上記の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において基質のみを変えることにより容易に求められ、２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、３，４-ジヒドロキシ安息香酸、３，５-ジヒドロキシ安息香酸には作用しない。【００３１】
（ｈ）に記載している至的ｐＨについては上記の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法においてｐＨのみを変えることにより容易に求められ、３０℃で脱炭酸反応をさせる場合ｐＨ約８．０において作用が至的である。約ｐＨ８．０とはｐＨ６．０以上９．０以下、望ましくはｐＨ７．０以上８．５以下のことを指す。使用する緩衝液に特に制限は無いがピペラジン（ｐＨ５〜５．５）、MES（pH５．５〜６．５）、リン酸カリウム（pH
６．５〜８．０）、Tris（pH８．０〜９．０）、CHES（pH ９．０〜１０．０）濃度としては１００ｍＭを例示できる。【００３２】
（ｉ）に記載している金属の影響については上記の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において反応系に各種金属の終濃度が１ｍＭになるように添加し活性を測定することにより容易に求められ、Mg2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Mo6+、Ca2+金属イオンのいずれも脱炭酸活性を活性化しない。【００３３】
（ｊ）に記載している補酵素の影響については上記の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの脱炭酸活性の測定方法において反応系にＴＰＰ、ＰＬＰについては終濃度５０μＭ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+については終濃度が１ｍＭになるように添加し活性を測定することにより容易に求められ、ＴＰＰ、ＰＬＰ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+はいずれも補酵素にはなり得なかった。また本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素は無いと考えられる。【００３４】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの一態様は、配列表の配列番号：1に記載のアミノ酸配列、あるいは配列番号：1に記載のアミノ酸配列に１もしくは２以上、好ましくは数個のアミノ酸が２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性が維持し得る範囲内で置換、欠失、修飾または挿入または付加されたアミノ酸配列を有する。【００３５】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号：２に記載の塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、配列番号：１に示すタンパク質をコードする。ただし、配列番号：１に示すアミノ酸配列をコードする塩基配列には、配列番号：２に示す塩基配列のみならず、異なるコドンに基づくあらゆる塩基配列が含まれる。更に適宜置換、欠失、修飾または挿入または付加を導入する事によりポリヌクレオチドのホモログを得る事も可能である。本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは配列番号：２に示す塩基配列に対して、これによりコードされる２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの酵素活性を維持し得る範囲内で塩基の置換、欠失または付加を行って得られるものである。このホモログには、例えば、配列番号：１の塩基配列の相補配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできる塩基配列を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。【００３６】
このストリンジェントな条件でのハイブリダイゼ-ションは、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅに記載の方法によって行なう事ができ、市販のシステムとしては、ＧｅｎｅＩｍａｇｅシステム（アマシャム社製）を挙げる事ができる。【００３７】
具体的には以下の操作によってハイブリダイゼ-ションを行なう事ができる。試験すべきＤＮＡまたはＲＮＡ分子を転写した膜を製品プロトコールに従って、標識したプローブとプロトコール指定のハイブリダイゼ-ションバッファー中でハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼ-ションバッファーの組成は、０．１重量％ＳＤＳ、５重量％デキストラン硫酸、１／２０溶のキット添付のブロッキング試薬及び２〜７×ＳＳＣからなる。ブロッキング試薬としては例えば、１００×Ｄｅｎｈａｒｄｔ‘ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ、２％（重量／容量）Ｂｏｖｉｎｅ
ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ、２％（重量／容量）ＦｉｃｌｌTM４００、２％（重量／容量）ポリビニルピロリドンを５倍濃度で調整したものを１／２０に希釈して使用する事ができる。２０×ＳＳＣは、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸溶液であり、ＳＳＣは、より好ましくは３〜６×ＳＳＣ、更に好ましくは４〜５×ＳＳＣの濃度で使用する。ハイブリダイゼ-ションの温度は４０〜８０℃、より好ましくは５０〜７０℃、更に好ましくは５５〜６５℃の範囲であり、数時間から一晩のインキュベーションを行った後、洗浄バッファーで洗浄する。洗浄の温度は、好ましくは室温、より好ましくはハイブリダイゼーション時の温度である。洗浄バッファーの組成は６×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、より好ましくは４×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、更に好ましくは１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液、最も好ましくは０．１×ＳＳＣ＋０．１重量％ＳＤＳ溶液である。このような洗浄バッファーで膜を洗浄し、プローブがハイブリダイズしたＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子をプローブに用いた標識を利用して識別する事ができる。【００３８】
本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡは、例えば以下のような方法によって単離することができる。下記に述べる方法により例えばリゾビウム  スピーシズ（Rhizobium  sp）MTP-10005（FERM
BP-10122）を培養し、培養した菌体より下記に述べる精製操作により精製酵素を得る。得た精製酵素のＮ末端およびリジルエンドぺプチダーゼ、Ｖ８プロテアーゼなどの酵素により切断後ＨＰＬＣによって分取したペプチドをプロテインシーケンサーにより解析する。その結果、リゾビウム
スピーシズ（Rhizobium sp）MTP-10005（FERM BP-10122）においては配列表の配列番号３から７に示す部分アミノ酸配列を有することが判明した。【００３９】
尚、上記リゾビウム  スピーシズ（Rhizobium sp）MTP-10005（FERM BP-10122）は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、平成１５年７月８日から特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて上記受託番号にて寄託されている。【００４０】
なお、得られたアミノ酸配列情報を元にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、本プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡの一部を得ることができる。さらに得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡを制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどのベクターに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。また、TaKaRa-La  PCRTm
in vitro cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いることにより、本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを得ることが可能である。【００４１】
上記のようにして単離された本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡを、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣ１８やｐＫＫ２２３-３、ｐＢＲ３２２、ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII-ＳＫ（＋）、ｐＳＣ１０１、ｐＥＴ−３ｂ、ｐＥＴ−１１ｂなどに代表される発現用のプラスミドに組み込むことにより、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現プラスミドが提供される。尚、形質転換に使用する宿主生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律的に増殖可能で、さらに外来性ＤＮＡの形質が発現できるものであればよく、例として大腸菌が挙げられるが、特に大腸菌に限定されるものではない。そして、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現プラスミドで形質転換して得られた形質転換微生物を公知の情報に基づいて、培養することができ、培養した形質転換微生物が２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性を有することにより２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡが含まれているプラスミドであることが確認できる。さらにそのプラスミドの塩基配列を解析することによって、目的の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをコードするＤＮＡの塩基配列が判明し、ＤＮＡの塩基配列からコードされている２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼのアミノ酸配列を推定することができる。【００４２】
また、形質転換微生物を利用することによって、発現する２，６-ジヒドロキシ安息
香酸デカルボキシラーゼの酵素量を増加させることが可能となる。酵素量を増加させる手段としては、遺伝子の転写調整領域の改良、遺伝子のコピー数の増加、蛋白への翻訳の効率化、好適な宿主の選択などが挙げられる。転写調整領域の改良とは、遺伝子の転写量を増加させる改変を加えることをいう。例えば、プロモーターに変異を導入しプロモーターを強化し、下流にある遺伝子の転写量を増加させる方法が挙げられる。その他にも、宿主内で強力に発現するプロモーターを導入する方法が挙げられ、例えば宿主が大腸菌においては、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｐ、Ｔ７などのプロモーターが挙げられる。遺伝子のコピー数の上昇は、具体的には、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を多コピー型ベクターに挿入し、得られた組み換えＤＮＡを宿主細胞に保持させればよい。蛋白の翻訳効率を上昇させる方法としては、例えば原核生物ではＳＤ配列、真核生物ではコンセンサス配列を導入、改変することなどが挙げられる。ここでいうＳＤ配列、コンセンサス配列とは、各生物のリボソーム結合部位を言う。これら２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの酵素量を増加させる方法としては特に上述に限定されるものではない。【００４３】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの由来に特には制限はないが、好ましくは微生物に由来するものであり、さらに好ましくは好気下での培養ができる微生物に由来するものであり、さらに好ましくはリゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物に由来するものであり、さらに好ましくはリゾビウム（Rhizobium）属に属する微生物の１６ＳｒＤＮＡのうち５‘末端側の塩基配列が配列表の配列番号：８記載の塩基配列である微生物に由来するものである。より具体的には、リゾビウム
スピーシズ（Rhizobium sp）MTP-10005（FERM BP-10122）を好適な事例として挙げる事ができる。また、公知の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを遺伝子組換えによって改変したものであっても、本発明に包含される。【００４４】
なお、本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが由来するRhizobium属微生物の１６ＳｒＤＮＡの５’末端側の塩基配列はRhizobium属に属する微生物をLB
Broth(Becton Dickinson社製)寒天培地に塗抹後、３０℃、２日間培養して得られた菌体よりPrepMan Method(Applied  Biosystem社製)を用いてゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより１６ＳｒＤＮＡのうち５’末端側約５００ｂｐの領域を増幅し、増幅された塩基配列をシーケンシングすることにより決定できる。【００４５】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを得るために必要な微生物の培養物は、当該分野で一般的な微生物の培養方法に準拠した方法を採用することにより得ることができるが、より具体的には、以下のような条件である。【００４６】
培養用の培地は、当該微生物を通常この分野において用いる培地、例えば、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン、ＮＺアミン等の有機栄養源、グルコース、マルトース、しょ糖、でんぷん、有機酸等の炭素源、硫酸アンモニウム、尿素、塩化アンモニウム等の窒素源、リン酸塩、マグネシウム、カリウム、鉄等の無機栄養源、ビタミン類を適宜組み合わせて使用すればよい。【００４７】
培養温度は、２０〜４０℃、より好ましくは２５〜３５℃で、培養ｐＨは、ｐＨ５．０〜１０．０でより好ましくはｐＨ６．０〜９．０で行いうる。また、嫌気下、好気下でいずれの条件下でも行うことができるが、通常は増殖速度が速い好気下での振盪培養が好ましい。培養日数は、特に制限されるものではないが、好ましくは、１〜７日の範囲で目的の活性が最大になるまで培養すればよい。【００４８】
また、２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性を高めるためには、菌体を増殖させるための培地に２，６-ジヒドロキシ安息香酸の添加が有効である。添加量は、培地中に１〜１００ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭとなるように添加することが好ましい。【００４９】
そして、本発明においては該プラスミドで形質転換して得られた形質転換微生物をそれ自体公知の方法により培養することができ、本発明の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生させることもできる。この場合使用される培地としては炭素源、窒素源、無機物及びその他の栄養素を適量含有する培地ならば合成培地または天然培地のいずれでも使用可能である。培養は前記培養成分を含有する液体培地中で振とう培養、通気攪拌培養、連続培養、流加培養などの通常の培養方法を用いて行う事が出来る。培養条件は、培養の種類、培養方法により適宜選択すればよく、菌株が生育し２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを産生できる条件であれば特に制限はない。【００５０】
尚、以上の培養条件は、用いる微生物や培地組成などに応じて変更することは可能であるが、レゾルシンを２，６-ジヒドロキシ安息香酸にカテコールを２，３-ジヒドロキシ安息香酸に変換する活性が最大になるように設定することが重要であることは当然である。【００５１】
２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼは次のような方法で精製することが可能である。２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが培養上清中に分泌される場合は遠心分離等を用い微生物菌体を除いたものを粗酵素液とすることができる。２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが菌体内に蓄積される場合には、培養終了後、微生物をろ過、遠心分離等の方法で集め、緩衝液、生理食塩水等で菌体を洗浄後、凍結融解処理、超音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理などの物理処理や、リゾチームなどの細胞溶解酵素処理のような生化学的処理もしくは界面活性剤との化学的処理を組み合わせて行うことにより微生物を破砕し、破砕した菌体液を緩衝液等に懸濁し、不溶物を遠心分離等で除去したものを粗酵素液とすることができる。また植物や動物組織に２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼが含まれる場合も上に述べたような菌体内に蓄積される場合と同様に粗酵素液を調製することが可能である。こうして得られた粗酵素液を、塩析、有機溶媒などによる分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィーによる分離および等電点電気泳動、ｎａｔｉｖｅ-電気泳動などの電気泳動法による分離等の手段を単独もしくは組合わせることにより精製し電気泳動的に単一のバンドに精製することができる。【００５２】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸および２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法とは炭酸イオン及び／または二酸化炭素存在下において水性溶媒中にて該２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼをレゾルシンまたはカテコールに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法であれば特に制限はない。したがって、上記のように微生物を培養して得た培養液自体、もしくは、該培養液から遠心分離・濾過等の操作により分離される該微生物菌体、上記の微生物菌体の洗浄物、破砕物、または、抽出物等、菌体を生理食塩水などで洗浄して得られる洗浄菌体、菌体や洗浄菌体を凍結乾燥、アセトン乾燥処理することなどにより得られる乾燥菌体、種々の物理化学的方法、例えば超音波破砕、フレンチプレス、浸透圧、凍結融解、溶菌酵素、界面活性剤及び有機溶媒処理等により得られる菌体破砕物、例えば菌体破砕物や培養上清等から、硫安分画、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、疎水クロマトグラフィー、アフィニイティークロマトグラフィー等の常法（これらの組み合わせを含む）により、２，６-ジヒドロキシ安息香酸をレゾルシンに変換する活性画分を特定・分離して得た粗精製酵素および精製酵素、上述の微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、精製酵素をポリアクリルアミド法、アルギン酸法、カラギーナン法、または適当な坦体に共有結合法、吸着法等公知の方法で固定化することにより得た固定化物を、炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下にて水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸をまたはカテコールに作用させて２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成させ、反応により生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を該水性溶媒中より採取することを特徴とする２，６-ジヒドロキシ安息香酸２，３-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法は本製造法に含まれる。【００５３】
これら微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、精製酵素および、固定化物は、その製造直後に反応して用いることはもちろん、たとえば低温条件下等にて製造後一旦保管し、必要に応じて必要量を使用することもできる。【００５４】
このように調製された微生物の培養物、処理物、粗精製酵素、精製酵素および固定化物を炭酸イオン及び／または二酸化炭素の存在下にて水性溶媒中でレゾルシンに作用させて２，６-ジヒドロキシ安息香酸またはカテコールに作用させて２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成させるが、その際の培養物、処理物や固定化物の使用量は、通常、目的とする効果を発揮する量（有効量）であれば良く、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められる。【００５５】
本発明において、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体は、レゾルシンまたはカテコールに付加されるカルボキシル基の供給源となるのであれば特に制限はない。すなわち、炭酸イオン及び／または二酸化炭素を含む水性媒体とは、具体的には、重炭酸塩、炭酸塩を上述の水性溶媒中に添加し、もしくは、気体・液体・固体の二酸化炭素を該水性溶媒中に吹き込み、又は添加することで調製することができる。重炭酸塩、炭酸塩のカチオン種としては、各種金属イオン、有機化合物のカチオン、アンモニアイオンなどが挙げられる。尚、炭酸イオン及び／または二酸化炭素の水性媒体中での濃度は特に制限はないが、５０〜５０００ｍＭの濃度が例示できる。また、ＣＯ２超臨界条件下での反応も可能である。尚、水性媒は特に制限がなく、２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の生成に影響を及ぼさない限りは、均一混合系でも二相系でもよい。【００５６】
本発明における水性溶媒中より２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を採取する方法とは、生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を反応液から分離・精製する方法であれば特に制限はないが、たとえば、反応液を濾過や遠心分離等により前処理した後、得られた上清液に塩酸や硫酸等の酸溶液を加えて酸性化することにより、２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸の粗結晶を回収する方法を好適な例として挙げることができる。また、溶剤抽出等の方法により回収することも可能であり、クロマトグラフィー等公知の精製方法を適宜併用することもできる。【００５７】
本発明において２，６-ジヒドロキシ安息香酸の製造方法に使用される微生物は、上述の耐熱性を有する２，６−ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを発現する微生物が好ましい。しかしながら、このような微生物に限定されることなく、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物であればよい。詳しくは、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する酵素を発現する微生物であればよい。以後、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する能力を有する微生物を単に微生物と呼ぶことがある。微生物の帰属分類群としては、細菌、放線菌、酵母、かび等に属する微生物が挙げられる。より具体的には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する微生物、好ましくは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属やＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属に属する微生物が挙げられ、特にＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（代表例
ＭＴ-１０８８３）、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ.（代表例 ＭＴＰ-１０００５）が例示できる。ＭＴ-１０８８３は受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０１２１として日本国茨城県つくば市東１丁目１番号中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成１１年６月８日から特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づいて寄託されている。【００５８】
使用される微生物は、炭酸イオン及び/又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する酵素を発現する微生物であれば、自然界に存在する天然の微生物でも人為的に作製された組換え微生物でもよい。ここで述べる組換え微生物とは、２，６-ジヒドロキシ安息香酸生産に関与する酵素をコードするＤＮＡ配列により宿主細胞を形質転換したものであり、この組換え微生物により、構成的或いは誘導的に該酵素を効率的に生産し得るものである。また、天然の微生物又は組換え微生物にニトロソグアニジンのような変異導入剤と接触させる手法やＵＶ照射法などの変異導入処理を施すことにより得られる何らかの有用な形質を保持した突然変異微生物でもよい。このような突然変異微生物が取得した形質としては、例えば、レゾルシンや炭酸塩、二酸化炭素、２，６-ジヒドロキシ安息香酸に対する耐性の向上した変異株、２，６-ジヒドロキシ安息香酸を分解しなくなった変異株、２，６-ジヒドロキシ安息香酸に関与する酵素の生産性の高い変異株等が挙げられる。【００５９】
本発明で使用する微生物又は該微生物の処理物とは、芳香族化合物から芳香族カルボン酸を生成する能力を有するものであれば、特に制限はない。したがって、微生物又は該微生物の処理物は、菌体培養液、培養菌体、破砕菌体、菌体抽出物、乾燥菌体、有機溶媒処理菌体、粗酵素、精製酵素、固定化物等である。これら微生物又は該微生物の処理物は、製造直後に反応に用いることは勿論、製造後に保管し、必要に応じて使用することもできる。【００６０】
本発明において、有機溶媒は通常の有機合成に使用されるものであればよい。好ましくは炭酸イオン及び／又は二酸化炭素を含む水性媒体中でレゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成させる反応の平衡を２，６−ジヒドロキシ安息香酸側へ移動させる有機溶媒である。ここでいう平衡とは、炭酸イオン及び／又は二酸化炭素とレゾルシンから２，６−ジヒドロキシ安息香酸を生成する反応とその逆反応である２，６−ジヒドロキシ安息香酸から炭酸イオン及び／又は二酸化炭素とレゾルシンを生成するの化学親和力がつり合った状態のことをいう。ここでいう反応の平衡が２，６−ジヒドロキシ安息香酸側へ移動するとは、有機溶媒の添加し反応を行うことによって、有機溶媒を添加しない場合の反応と比較して異なる平衡状態へと達し、その結果、反応液中のレゾルシンと２，６−ジヒドロキシ安息香酸のモル比が、有機溶媒を添加しない場合の反応平衡と比較して２，６−ジヒドロキシ安息香酸側へ傾くことをいう。【００６１】
添加する有機溶媒として、具体的には炭素数１から炭素数４のカルボニトリル、アルコール、エーテル、ケトン、スルフィニルのうちから選ばれた有機溶媒などである。より具体的にはアセトニトリル、イソプロパノール、ブタノール、ジエチルエーテル、アセトン、エタノール、エチレングリコール、エチレングリコールモノメチルエタノール、グリセリン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、メタノールなどが挙げられる。またこれら具体例だけに限定されることなく、反応平衡を２，６−ジヒドロキシ安息香酸側へ移動させる有機溶媒として、好ましくは水に対して相溶性の有機溶媒や及び/又は非プロトン性有機溶媒などが挙げられる。ここでいう水に対して相溶性の有機溶媒とは、水と自由に混合する有機溶媒をいう。具体例としては、アセトニトリル、イソプロパノール、アセトン、エタノール、エチレングリコール、モノメチルエタノール、グリセリン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、メタノールなどが挙げられる。【００６２】
また、非プロトン性有機溶媒とは、プロトンを供与する能力が著しく低い有機溶媒であり、具体例としては、アセトニトリル、ジエチルエーテル、アセトン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフランなどが挙げられる。これら有機溶媒は、単一でも２種以上の混合使用でも構わない。また、反応開始時に添加しても、反応途中に添加しても構わない。添加量は１〜８０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）％、好ましくは１０〜６０％である。【００６３】
本発明において、レゾルシンの酸化を抑制するのは、レゾルシンの酸化により生成するレゾルシンラジカルがオリゴマーとなり、これらが２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成を阻害することを抑制するためである。酸化を抑制されたレゾルシンは、反応液中でレゾルシンとして安定して存在するため、２，６−ジヒドロキシ安息香酸の選択率は９７〜１００％と著しく向上する。ここでいう２，６−ジヒドロキシ安息香酸の選択率とは、反応液中の減少したレゾルシンのモル量に対する生成した２，６−ジヒドロキシ安息香酸のモル量の割合をいう。レゾルシンの酸化抑制方法としては、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成に影響を及ぼさない限りは特に制限はない。代表例として、反応系内の酸素濃度の低下による酸化抑制方法が挙げられる。反応系内の酸素濃度はレゾルシンの酸化を抑制し得る濃度であれば特に制限はないが、好ましくは反応液の溶存酸素濃度１０ｐｐｍ以下である。より好ましくは８ｐｐｍ以下、さらに好ましくは４ｐｐｍ以下である。【００６４】
反応系内の酸素濃度を上述の範囲内に調整する方法については特に制限はないが、具体的には、反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気にする方法や、反応系内を減圧する方法、酸化防止剤の添加などが挙げられる。【００６５】
反応系内気相部を不活性雰囲気又は二酸化炭素雰囲気にする方法において不活性雰囲気とは、反応容器の気相をアルゴンなどの希ガス又は系の物質と反応しない窒素などの不活性ガスで置換し、酸素ガスなどによる有害な影響を与えないようにした気相の状態を指す。使用する希ガスや不活性ガスは単独でも複数を混合して使用しても良い。これに準じて、二酸化炭素雰囲気とは、反応系内気相部を二酸化炭素で置換した状態を指す。また、二酸化炭素と単独又は複数の希ガス又は不活性ガスを混合した状態でもよい。気相部の容量が小さく気相部の置換だけでは反応液の溶存酸素濃度を上述範囲内に調整できない場合は、気体・液体・固体の希ガス、又は不活性ガス、又は二酸化炭素を水性溶媒中に吹き込むことや添加することにより溶存酸素を低下させる方法でも良い。【００６６】
反応系内を減圧にする方法とは、減圧により反応系内を脱気することによって反応系内の酸素濃度を低下させる方法である。反応系内の圧力は酸素濃度が上述範囲内となれば特に制限はないが、具体的には常圧未満、好ましくは０．５１×１０５Ｐａ未満である。【００６７】
酸化防止剤の添加は、上述の反応系内酸素濃度を低減する効果の他に、酸化したレゾルシンを還元する効果もある。添加する酸化防止剤は、レゾルシンの酸化抑制する効果があれば特に制限はないが、具体的には、２-メルカプトエタノール、硫化水素、チオ硫酸ナトリウム、過酸化水素、ハイドロキノン、トコフェロール、ノルジヒドログアイアレチン酸、没食子酸エステル、ｔ-ブチルヒドロキシアニソール、２，６-ジ-ｔ-メチルフェノール、Ｌ-アスコルビン酸、イソアスコルビン酸、クエン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ジフェニルアミン、フェニレンジアミン誘導体、ホスホン酸エステルなどが挙げられる。好ましくは、２-メルカプトエタノールである。【００６８】
酸化防止剤の添加量はレゾルシンの酸化を抑制し得る濃度であれば特に制限はない。好ましくは、２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成に影響を及ぼさない適当な所要量であり、この適当な所要量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められる。例えば、２-メルカプトエタノールの添加量は、予備実験より１ｐｐｍ〜２０００ｐｐｍが好ましい。より好ましくは、２０ｐｐｍから２００ｐｐｍである。【００６９】
また、反応の間レゾルシンの酸化を抑制し続けるには、低下させた酸素濃度を維持することが重要である。その方法として、密閉性の高い反応器を使用するなど、外部からの酸素の侵入を防げばよい。ＤＯ計などを使用すれば、より厳密に反応系内の酸素濃度を制御できる。【００７０】
本発明において、反応時のレゾルシン濃度は特に制限されないが、１〜２０００ｍＭが望ましい。レゾルシンは、固体のまま、あるいは、溶媒に溶解または分散させ添加すればよく、反応開始当初に一括添加、又は、反応の進行に応じて所要量を逐次添加する。好ましくは逐次添加である。逐次添加するレゾルシン量に特に制限はないが、より望ましくは反応時のレゾルシン濃度が最大反応速度の維持を阻害しない程度の濃度となるようなレゾルシン量を逐次添加する。【００７１】
本発明において、微生物又は該微生物の処理物は、反応開始当初に一括添加、又は、反応の進行に応じて適当な所要量を２回以上に分けて必要量を分割して添加する。好ましくは反応の進行に応じて適当な所要量を逐次添加する。適当な所要量とは、目的とする効果を発揮する量（有効量）であり、この有効量は当業者であれば簡単な予備実験により容易に求められる。【００７２】
本発明における２，６-ジヒドロキシ安息香酸または２，３-ジヒドロキシ安息香酸を生成（以後、単に反応と呼ぶ）させる条件は、反応ｐＨとしては、ｐＨ３〜１２、好ましくはｐＨ６〜９である。また、反応の進行により反応液のｐＨが変化する場合はｐＨを至適ｐＨに調節するのが好ましい。反応温度は、氷点〜６０℃、好ましくは２０〜４０℃の範囲である。反応時間については、特に制限されるものではないが、より具体的には、１分間から１２０時間程度である。反応時の圧力も特に制限されるものではないが、通常、常圧〜１００ｋｇ／ｃｍ２の範囲が好適である。反応は攪拌下あるいは静置下いずれでもよく、また、バッチ式または適当なバイオリアクターを用いた連続式のいずれでも可能である。【００７３】
本発明において、反応系内の酸素濃度の低下、有機溶媒の添加、反応時のレゾルシンの逐次添加、微生物又は該微生物の処理物の逐次添加は、いずれも２，６-ジヒドロキシ安息香酸の蓄積濃度を高める効果があり、これらの手法は単独でも複数を組み合わせてもその効果を発揮する。好ましくは、複数を組み合わせる。【００７４】
次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００７５】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの精製
ＬＢ培地（イーストエキス：5ｇ/ｌ、ポリペプトン：10ｇ/ｌ、ＮａＣｌ：10ｇ/ｌ ｐＨ７．０）を所定濃度に調整したものを、口径２１ｍｍの試験管に５ｍｌ入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。これにＬＢ培地に１．５％の寒天を加えたスラント培地で継代培養している菌体（リゾビウムスピーシス  ＭＴＰ-１０００５）を１白金耳接種した。２５℃の恒温室にて１日間振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。その０．５ｍｌを、終濃度２０ｍＭの２，６-ジヒドロキシ安息香酸を含む、表１に示す組成（ｐＨ８．５に、５Ｎ  ＫＯＨにて調整）でオートクレーブ殺菌済みの培地５０ｍｌが入った５００ｍｌバッフル付き三角フラスコに接種した。２５℃で２日間振盪培養し菌体を遠心分離（３０００ｒｐｍで１０分間）によって回収した（乾物重換算で約５０ｍｇ）。【００７６】
【表１】
2005054462.tif 000002
【００７７】
回収した菌体は生理食塩水（ＮａＣｌ ９ｇ／ｌ）で洗浄後、培養液の１／２０量の０．０２％ ２-メルカプトエタノール入りの１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、遠心分離後（１５０００ｒｐｍ、１０分間）上澄みを回収し酵素液とした。本酵素溶液をＤＥＡＥ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、Ｂｕｔｙｌ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、ＳｕｐｅｒＱ-ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＨＷ-５５の順に通すことによりポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ  ＰＡＧＥ）的に単一に精製することができた。なお活性画分の同定には次に記載する脱炭酸活性を測定する反応方法を用い行った。表２の反応組成の反応液１ｍｌを１０ｍｌ容のネジ口式遠沈管にて３０℃、５分間振とうしながら反応した。反応停止は5Ｎ塩酸２００μｌを加えることにより行った。【００７８】
【表２】
2005054462.tif 000003
【００７９】
遠心分離（１５０００ｒｐｍ 、１０分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。【００８０】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-２（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．製）
移動相：水：アセトニトリル（８５：１５）、０.１％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸
送液：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
カラム温度：４０℃
検出方法：ＵＶ吸収波長２８０ｎｍ【００８１】
また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動的に単一に精製した酵素を用い表３の反応組成の反応液１ｍｌを１０ｍｌ容のネジ口式遠沈管にて３０℃、５分間振とうしながら反応した。反応停止は５Ｎ塩酸２００μｌを加えることにより行った。【００８２】
【表３】
2005054462.tif 000004
【００８３】
遠心分離（１５０００ｒｐｍ 、１０分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。この反応液を分析した結果、原料に用いたレゾルシンのピーク以外は標品の２，６-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出された。このピークをＬＣ／ＭＳで分析した結果、確かに２，６-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。【００８４】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-２（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．製）
移動相：水：アセトニトリル（８５：１５）、０.１％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸
送液：０．６ｍｌ／ｍｉｎ.
カラム温度：４０℃
検出方法：ＵＶ吸収波長２８０ｎｍ【００８５】
また同様に表４の反応組成の反応液１ｍｌを用い反応を行ったところ、原料に用いたカテコールのピーク以外は標品の２，３-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出された。このピークをＬＣ／ＭＳで分析した結果、確かに２，３-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。【００８６】
【表４】
2005054462.tif 000005
【実施例２】
【００８７】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼの性質
１．サブユニット分子量とタンパク質全体の分子量の測定 
実施例１で取得した精製酵素を用い、ゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果、本酵素の全体の分子量は約１５１０００であった。また、ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果よりサブユニットの分子量は約３７５００であった。これらの結果より、本酵素はホモテトラマーの構造を持つと判断される。【００８８】
２．Ｎ末端配列および部分アミノ酸配列
実施例１で取得した精製酵素のＮ末端配列と精製酵素をリジルエンドぺプチダーゼにより消化し、ＨＰＬＣによって分取したペプチドの配列をプロテインシーケンサーにより解析した。解析により得られた配列は配列表の配列番号３から７に示す。なお配列番号３がＮ末端配列を示す。【００８９】
３．基質特異性
本酵素の基質特異性を実施例１で得た精製酵素を用い実施例１に示した脱炭酸活性を測定することにより確認した。基質としては、２，６-ジヒドロキシ安息香酸、３，４-ジヒドロキシ安息香酸、３，５-ジヒドロキシ安息香酸を用いた。その結果、２，６-ジヒドロキシ安息香酸に作用し、３，４-ジヒドロキシ安息香酸、３，５-ジヒドロキシ安息香酸には作用しなかった。【００９０】
４．酵素の熱安定性
実施例１で得た精製酵素を１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１．０ｍＬに溶解し容量１５ｍＬの蓋付きガラス製試験管に入れ、指定の温度（５０℃・７０℃）に制御した水浴恒温槽に浸漬し振とうしながら熱処理を行い、所定時間ごとに１００μｌずつサンプリングし、その後、実施例１に記載した方法によって脱炭酸活性を測定した。取得した結果より活性半減期を計算した。その結果、本酵素の活性半減期は５０℃において１２２分。６０℃において２５．５分であった。【００９１】
５．至的反応温度
実施例１で得た精製酵素を用い実施例１に記載した脱炭酸活性を測定する方法にて温度のみを２０℃〜９０℃の範囲で変えて、測定したところ、本酵素の至的温度は７０℃付近であると推定された。【００９２】
６．至的反応ｐＨ
実施例１で得た精製酵素を用い実施例１に記載した脱炭酸活性を測定する方法にてｐＨのみ５〜１０の範囲で変えて、測定したところ、本酵素の至的ｐＨは約８付近であると推定された。使用した緩衝液はピペラジン（ｐＨ５〜５．５）、MES（pH５．５〜６．５）、リン酸カリウム（ｐＨ６．５〜８．０）、Tris（ｐＨ８．０〜９．０）、CHES（ｐＨ９．０〜１０．０）であり反応中の最終濃度としては１００ｍＭになるように調製した。【００９３】
７．各種金属塩の影響
実施例１で得た精製酵素を用い、Mg2+、Ni2+、Co2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Mo6+、Ca2+の塩化物塩を実施例１に記載した脱炭酸活性を測定する反応系に終濃度１ｍＭになるように添加し、その影響を調べたところ供試した全ての金属塩はいずれも脱炭酸活性を活性化しなかった。【００９４】
８．補酵素の影響
実施例１で得た精製酵素を用い、TPP、PLP、NAD+、NADP+を実施例１に記載した脱炭酸活性を測定する反応系に終濃度１０μＭになるように添加し、その影響を調べたところ供試した全ての化合物はほとんど影響を及ぼさなく補酵素にはなり得なかった。また、本酵素の吸収スペクトルは単純タンパク質の吸収スペクトルを示すことより補酵素は無いと考えられる。
【実施例３】
【００９５】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子取得
実施例１で精製した精製酵素のＮ末端配列と精製酵素をリジルエンドぺプチダーゼにより消化した。
１．部分アミノ酸配列の取得
ＨＰＬＣによって分取したペプチドの配列をプロテインシーケンサーにより解析した。その結果、リゾビウム スピーシズ（Rhizobium sp）MTP-10005（FERM  BP-10122）においては配列表の配列番号３から７に示す部分アミノ酸配列を取得した。【００９６】
２．ゲノミックＤＮＡの調製
培養後遠心分離により取得したRhizobium.sp MTP-10005菌体を燐酸緩衝液で洗浄後、遠心分離により回収した。回収した洗浄菌体より「基礎生化学実験法２抽出・分離・精製
阿南功一他著 丸善株式会社出版」記載によるバクテリアゲノムＤＮＡの分離方法に従い、ゲノムＤＮＡを調製した。【００９７】
３．TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いるための部分遺伝子配列の取得
上記で調製したゲノミックDNAとアミノ酸部分配列により設計した配列表の配列番号：９，１０記載のプライマーを用いて増幅したところ増幅断片(約250bp)を得た。【００９８】
次に、pT７Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子をTAクローニングし、その挿入断片の塩基配列についてAmersham Pharmacia
Biotech社製 Vistra Thermo SequenaseTM Pre-mixed Cycle Sequencing KitとHitachi
Electronics Engineering社製、Hitachi DNA sequencer SQ5500Eを用いたプライマ-エクステンション法によって決定した。【００９９】
４．TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitによる遺伝子配列の取得
上記で調製したゲノミックDNAを制限酵素（EcoRＩ,SalＩ）で完全消化した。
TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitのプロトコールに従い、完全消化したゲノミックDNAにEcoRＩカセット連結したものをテンプレートとして用い、1st  PCRには配列表の配列番号：１１記載のプライマ-、２nd  PCRには配列表の配列番号：１２記載のプライマ-を用いて増幅したところ増幅断片(約3000bp)を得た。【０１００】
次に、pT７Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子をTAクローニングし、その挿入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。【０１０１】
次に、TaKaRa La PCRTm in vitro cloning Kitのプロトコールに従い、完全消化したゲノミックDNAにSalＩカセット連結したものをテンプレートとして用い、1st  PCRには配列表の配列番号：１３記載のプライマ-、２nd  PCRには配列表の配列番号：１４記載の配列
のプライマーを用いて増幅したところ増幅断片(約1200bp)を得た。【０１０２】
次に、pT７Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子をTAクローニングし、その挿入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。【０１０３】
５．全遺伝子配列の取得
全配列の決定については、５末端側についてのgene walkingの結果と上記の結果より設計した、配列表の配列番号：１５、１６記載の配列のプライマーを用いて増幅したところ増幅断片を得た。【０１０４】
次に、pT７Blue T-Vectorを利用して上記増幅遺伝子をTAクローニングし、その挿入断片の塩基配列は上記の方法によって決定した。その結果、配列表の配列番号：２に示した目的遺伝子を取得した。
【実施例４】
【０１０５】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌（BL21
StarTM）の２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性の確認
１．pET 発現システムを利用した発現用ベクターの構築
上記塩基配列決定により取得した配列をもとにpET発現システムのベクター（pET-３ｂ、pET-１１ｂ）（Novegen）に繋ぎ込むために配列表の配列番号：１７、１８記載のプライマ-によりゲノミックをテンプレートとして用い、増幅した遺伝子を上記ベクターの制限酵素サイト（NdeＩ、BamHＩ）に繋ぎ込み発現ベクターを構築した。
このベクターによりキットに含まれるコンピテントセルBL21 StarTM  (Invitrogen)を形質転換し形質転換大腸菌を取得した。【０１０６】
２．上記形質転換体の２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ活性の確認
５００ｍｌのバッフル付き三角フラスコに１００ｍｌのＬＢ液体培地を調製し、１２１℃、２０分間のオートクレーブにより滅菌した。上記形質転換体を一白菌耳植菌し、３７℃、１３０ｒｐｍにて培養OD600＝０．６になるまで培養し、試験管に１ｍＭになるようにIPTGを加えさらに３０℃で１５時間培養した。遠心分離（５０００Ｇ×１５分間）により菌体のみを培養液より回収し、続いて、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後に、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。その後、培養液の１／２０量の０．０２％
２-メルカプトエタノール入りの１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、遠心分離後（１５０００ｒｐｍ 、１０分間）上澄みを回収し酵素液とした。【０１０７】
その後、次に記載する脱炭酸活性を測定する反応方法を用い酵素活性に確認行った。表５の反応組成の反応液１ｍｌを１０ｍｌ容のネジ口式遠沈管にて３０℃、５分間振とうしながら反応した。反応停止は５Ｎ塩酸２００μｌを加えることにより行った。【０１０８】
【表５】
2005054462.tif 000006
【０１０９】
遠心分離（１５０００ｒｐｍ 、１０分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。
その結果、確かに２，６-ジヒドロキシ安息香酸を脱炭酸しレゾルシンを生成する活性を確認した。レゾルシンの生成量は１μｇであった。【０１１０】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-２（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．製）
移動相：水：アセトニトリル（８５：１５）、０.１％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸
送液：０．６ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
検出方法：ＵＶ吸収波長２８０ｎｍ【０１１１】
[比較例１]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いた２，６-ジヒドロキシ安息香酸の脱炭酸
２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET-３ｂ、pET-１１ｂ）によって形質転換した大腸菌を実施例４と同様に培養し、酵素液を取得しそれを用いて２，６-ジヒドロキシ安息香酸の脱炭酸を試み、反応液の分析を行ったが、２，６-ジヒドロキシ安息香酸を脱炭酸しレゾルシンを生成する活性は認められなかった。
【実施例５】
【０１１２】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたレゾルシンからの２，６-ジヒドロキシ安息香酸への変換
また、実施例４と同様に取得した酵素液を用い表６の反応組成の反応液１ｍｌを１０ｍｌ容のネジ口式遠沈管にて３０℃、５分間振とうしながら反応した。反応停止は５Ｎ塩酸２００μｌを加えることにより行った。【０１１３】
【表６】
2005054462.tif 000007
【０１１４】
遠心分離（１５０００ｒｐｍ 、１０分間）により除蛋白後、上清を下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。この反応液を分析した結果、原料に用いたレゾルシンのピーク以外は標品の２，６-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出された。このピークをＬＣ／ＭＳで分析した結果、確かに２，６-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。【０１１５】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-２（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．製）
移動相：水：アセトニトリル（８５：１５）、０.１％（ｖ/ｖ）トリフルオロ酢酸
送液：０．６ｍｌ／ｍｉｎ．
カラム温度：４０℃
検出方法：ＵＶ吸収波長２８０ｎｍ【０１１６】
本方法で２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成量を定量した結果、４μｇが生成していると計算された。【０１１７】
[比較例２]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたレゾルシンからの２，６-ジヒドロキシ安息香酸への変換
２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET-３ｂ、pET-１１ｂ）によって形質転換した大腸菌を実施例５と同様に培養し、酵素液を取得しそれを用いてレゾルシンの２，６-ジヒドロキシ安息香酸の変換を試み、反応液の分析を行ったが、レゾルシン酸より２，６-ジヒドロキシ安息香酸への変換は認められなかった。
【実施例６】
【０１１８】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたカテコールからの２，３-ジヒドロキシ安息香酸への変換
また実施例５と同様に表７の反応組成の反応液１ｍｌを用い反応を行ったところ、原料に用いたカテコールのピーク以外は標品の２，３-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出された。このピークをＬＣ／ＭＳで分析した結果、確かに２，３-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。【０１１９】
【表７】
2005054462.tif 000008
【０１２０】
本方法で２，３-ジヒドロキシ安息香酸の生成量を定量した結果、６μｇが生成していると計算された。【０１２１】
[比較例３]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡによって形質転換した大腸菌を用いたカテコールからの２，３-ジヒドロキシ安息香酸への変換
２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET-３ｂ、pET-１１ｂ）によって形質転換した大腸菌を実施例６と同様に培養し、酵素液を取得しそれを用いてカテコールの２，３-ジヒドロキシ安息香酸の変換を試み、反応液の分析を行ったが、カテコールより２，３-ジヒドロキシ安息香酸への変換は認められなかった。
【実施例７】
【０１２２】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））の２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現の確認
実施例４においてpET-３ｂを用いて構築した発現ベクターにより、コンピテントセルＢＬ２１（ＤＥ３）（Novagen）を形質転換し、形質転換大腸菌を取得した。試験管に５ｍｌのＬＢ液体培地を、２Ｌ坂口フラスコに１ＬのＬＢ液体培地をそれぞれ調製し、１２１℃、２０分間のオートクレーブ滅菌後、それぞれにアンピシリンを１００μｇ／ｍｌとなるよう添加し培養に使用した。試験管に上記形質転換体を一白菌耳植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．６になるまで培養した。培養液全量を坂口フラスコに移液し、３７℃、１１０ｒｐｍでＯＤ６００＝０．４になるまで培養した。０．４ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、さらに２５℃で３時間培養した。遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１時間）により菌体のみを培養液より回収し、５０ｍｌの生理食塩水に該菌体を再懸濁した後、再度遠心分離を行って湿菌体を得た。この湿菌体を培養液の１／２０量の０．０２％２−メルカプトエタノール入り１０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁した。この懸濁液を超音波処理により菌体破砕し、遠心分離（１５０００ｒｐｍ、１０分）後、上清を回収し、透析処理したものを粗酵素液とした。これを用いてＬａｅｍｍｌｉ法によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行った。分子量マーカーとしてはPrecision
plus proteinTM standards all blueを、ゲル染色液としてはCoomassie brilliant blue
R-250を使用した。結果を図１に示す。【０１２３】
[比較例４]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡにより形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））を用いた２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ発現
２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないベクター（pET-３ｂ）によって形質転換した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を実施例７と同様に培養し、酵素液を取得した。それを用いてＬａｅｍｍｌｉ法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図１に示す。レーン３のRhizobium.sp  MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））より取得した粗酵素液は、レーン２の２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製酵素液と同じ位置に濃いバンドが見られた。また、レーン４のRhizobium.sp  MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡにより形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））より取得した粗酵素液はレーン２の２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ精製酵素液と同じ位置にほとんどバンドが見られなかった。これより、Rhizobium.sp  MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））は２,６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼを大量に発現していることが確認された。
【実施例８】
【０１２４】
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含むＤＮＡによって形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））を用いたレゾルシンからの２,６-ジヒドロキシ安息香酸への変換
実施例７において取得した酵素溶液を用いて、実施例５と同様にレゾルシンの炭酸化を試み、反応液の分析を行った。その結果、確かにレゾルシンから２，６-ジヒドロキシ安息香酸を生成する活性を確認した。２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成量は１４μｇであった。【０１２５】
[比較例５]
Rhizobium.sp MTP-10005由来の２，６-ジヒドロキシ安息香酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含まないＤＮＡによって形質転換した大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））を用いたレゾルシンからの２,６-ジヒドロキシ安息香酸への変換
比較例４により取得した酵素液を用いて、実施例５と同様にレゾルシンの炭酸化を試み、反応液の分析を行ったが、レゾルシンから２,６-ジヒドロキシ安息香酸への変換は認められなかった。
【実施例９】
【０１２６】
普通ブイヨン培地（栄研）（栄研化学株式会社製）を所定濃度に調製したものを、口径２１ｍｍの試験管に５ｍｌ入れ、１２１℃、１５分間オートクレーブ殺菌を行った。これにＬＢ培地に１．５％の寒天を加えたスラント培地で継代培養している菌体（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ
ｓｐ. ＭＴ-１０００５）を１白金耳接種した。２５℃の恒温室にて１日間振盪培養を行い、種菌体を増殖させた。その０．５ｍｌを終濃度２０ｍＭの２，６-ジヒドロキシ安息香酸を含む、表１に示す組成（ｐＨ７．０に、５ＮのＫＯＨにて調整）でオートクレーブ殺菌済みの培地５００ｍｌが入った２ｌバッフル付き三角フラスコに接種した。２５℃で２日間振盪培養し菌体を遠心分離（８０００ｇ、２０分間）によって回収した（乾物重換算で約３．２ｇ）。【０１２７】
回収した菌体は生理食塩水（ＮａＣｌ ９ｇ／ｌ）で洗浄後、凍結保管した。以上のようにして得られた凍結菌体の一部を用いて、表８に示す反応液を１０ｍｌ容のネジ口試験管に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃、２４時間振とうしながら反応した。反応終了時は５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液１２００μｌを加え反応を停止した。【０１２８】
【表８】
2005054462.tif 000009
【０１２９】
遠心分離（１３０００ｒｐｍ 、１０分間）により除菌体後、上清を下記の条件で高速液体クロマトグラフィーにより分析した。【０１３０】
その結果、原料に用いたレゾルシンのピ-ク以外は標品の２，６-ジヒドロキシ安息香酸と一致するピークのみが検出された。このピークをＬＣ／ＭＳで分析した結果、確かに２，６-ジヒドロキシ安息香酸であることが確認された。本方法で２，６-ジヒドロキシ安息香酸の生成量を定量した結果を表９に示す。【０１３１】
カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ ＯＤＳ-２（ＧＬＳｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．製）
移動相：水：アセトニトリル（８５：１５）、０．１（ｖ／ｖ）％トリフルオロ酢酸
送液：０．８ｍｌ／ｍｉｎ.
カラム温度：４０℃
検出方法：ＵＶ吸収波長２８０ｎｍ
【実施例１０】
【０１３２】
実施例９に記載の凍結保管菌体を用いて、窒素雰囲気下で実施例９と同様に反応を行った。結果を表９に示す。
【実施例１１】
【０１３３】
実施例９記載の凍結保管菌体を用いて、表２に示す組成液に２-メルカプトエタノール（２-ＭＥ）を２０ｐｐｍの濃度となるよう添加し、空気雰囲気で、実施例９と同様にして反応を行った。結果を表９に示す。【０１３４】
[比較例６]
実施例９に記載の凍結保管菌体を用いて、空気雰囲気下で実施例９と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表９に示す。【０１３５】
【表９】
2005054462.tif 000010
【実施例１２】
【０１３６】
実施例９記載の凍結保管菌体を用いて、表１０に示す反応液を１０ｍｌ容のネジ口試験管に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃、２４時間振とうしながら反応した。反応終了時は５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液１２００μｌを加え反応を停止した。【０１３７】
【表１０】
2005054462.tif 000011
【０１３８】
反応停止後、実施例９と同様に分析したところ、生成した２，６-ジヒドロキシ安息香酸は、３１．２ｍＭであった。
【実施例１３】
【０１３９】
実施例９と同様の手順で増殖させ凍結保管された凍結菌体（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ＭＴ-１０８８３）を用いて、表１１に示す反応液を１０ｍｌ容のネジ口試験管に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃、２４時間振とうしながら反応した。反応終了時は５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液４００μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を表１２に示す。【０１４０】
【表１１】
2005054462.tif 000012
【実施例１４】
【０１４１】
表１１記載のエチレングリコールに代えてエタノール１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例１５】
【０１４２】
表１１記載のエチレングリコールに代えてテトラヒドロフラン１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例１６】
【０１４３】
表１１記載のエチレングリコールに代えてジオキサン１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例１７】
【０１４４】
表１１記載のエチレングリコールに代えてメタノール１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例１８】
【０１４５】
表１１記載のエチレングリコールに代えてジメチルホルムアミド１００μｌを加えた反応液を実施例５と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例１９】
【０１４６】
表１１記載のエチレングリコールに代えてジメチルスルホキシド１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例２０】
【０１４７】
表１１記載のエチレングリコールに代えてアセトン１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例２１】
【０１４８】
表１１記載のエチレングリコールに代えてエチレングリコールモノエチルエーテル１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。
【実施例２２】
【０１４９】
表１１記載のエチレングリコールに代えてグリセリン１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。【０１５０】
[比較例７]
表１１記載のエチレングリコールに代えて脱イオン水１００μｌを加えた反応液を実施例１３と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１２に示す。【０１５１】
【表１２】
2005054462.tif 000013
【実施例２３】
【０１５２】
実施例９記載の凍結保管菌体を用いて、表１３に示す反応液を５０ｍｌ容のネジ口バイヤル瓶に移液し、４０℃で反応した。表１４に示したとおりにレゾルシン、菌体を分割添加した。各時間に反応液２００μｌを採取し、５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液８０μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を図２に示す。【０１５３】
【表１３】
2005054462.tif 000014
【０１５４】
【表１４】
2005054462.tif 000015
【０１５５】
[比較例８]
表１５に示す反応液を用いて、実施例２３と同様に反応を行った。結果を図２に示す。【０１５６】
【表１５】
2005054462.tif 000016
【実施例２４】
【０１５７】
実施例1記載の凍結菌体を用いて、表１６に示す反応液を５０ｍｌ容のネジ口バイヤル瓶に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃で反応した。各時間に反応液２００μｌを採取し、５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液８０μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を図３に示す。【０１５８】
【表１６】
2005054462.tif 000017
【実施例２５】
【０１５９】
実施例９記載の凍結菌体を用いて、表１７に示す反応液を１０ｍｌ容のネジ口試験管に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃、２４時間振とうしながら反応した。反応終了時は５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液４００μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を表１８に示す。表１８に示すレゾルシン転化率（％）とは、レゾルシンという限定した反応基質に着目し、反応開始時に反応器内に存在したレゾルシンの単位物質量（ｍｏｌ）当たりの反応したレゾルシンの物質量の割合を％表示で示したものである。【０１６０】
【表１７】
2005054462.tif 000018
【実施例２６】
【０１６１】
表１７記載のアセトニトリルに代えてイソプロパノール１００μｌを加えた反応液を実施例２５と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１８に示す。
【実施例２７】
【０１６２】
表１７記載のアセトニトリルに代えてブタノール１００μｌを加えた反応液を実施例２５と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１８に示す。
【実施例２８】
【０１６３】
表１７記載のアセトニトリルに代えてジエチルエーテル１００μｌを加えた反応液を実施例２５と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表１８に示す。【０１６４】
【表１８】
2005054462.tif 000019
【実施例２９】
【０１６５】
実施例９記載の凍結菌体を用いて、表１９に示す反応液を１０ｍｌ容のネジ口試験管に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃、２４時間振とうしながら脱炭酸化反応を行った。反応終了時は５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液４００μｌを加え反応を停止した。【０１６６】
反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を表２０に示す。表２０に示す２，６−ジヒドロキシ安息香酸転化率（％）とは、２，６−ジヒドロキシ安息香酸という限定した反応基質に着目し、反応開始時に反応器内に存在した２，６−ジヒドロキシ安息香酸の単位物質量（ｍｏｌ）あたりの反応した２，６−ジヒドロキシ安息香酸の物質量の割合を％表示で示したものである。【０１６７】
【表１９】
2005054462.tif 000020
【実施例３０】
【０１６８】
表１９記載のアセトニトリルに代えてイソプロパノール１００μｌを加えた反応液を実施例２９と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表２０に示す。
【実施例３１】
【０１６９】
表１９記載のアセトニトリルに代えてブタノール１００μｌを加えた反応液を実施例２９と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表２０に示す。
【実施例３２】
【０１７０】
表１９記載のアセトニトリルに代えてジエチルエーテル１００μｌを加えた反応液を実施例２９と同様に反応を行い、目的物を得た。結果を表２０に示す。表１８，１９を比較すると、各反応とも反応平衡点に達していることが分かる。【０１７１】
【表２０】
2005054462.tif 000021
【実施例３３】
【０１７２】
実施例９記載の凍結菌体を用いて、表２１に示す反応液を５０ｍｌ容のネジ口バイヤル瓶に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃で反応した。各時間に反応液１００μｌを採取し、５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液４０μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を図４に示す。【０１７３】
【表２１】
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【０１７４】
[比較例９]
表２２に示す反応液を用いて、実施例３３と同様に反応を行なった。結果を図５に示す。【０１７５】
【表２２】
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【実施例３４】
【０１７６】
実施例９記載の凍結菌体を用いて、表２３に示す反応液を５０ｍｌ容のネジ口バイヤル瓶に移液し、気相部を１００％ＣＯ２で置換した後、２５℃で反応した。各時間に反応液１００μｌを採取し、５Ｎ塩酸／エタノール等量混合液４０μｌを加え反応を停止した。反応停止後、実施例９と同様に分析した。結果を図４に示す。【０１７７】
【表２３】
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【０１７８】
図４より、アセトンを添加した場合、反応液中のレゾルシンと２，６−ジヒドロキシ安息香酸のモル比はレゾルシン：２，６−ジヒドロキシ安息香酸=６：４に収束することがわかる。【０１７９】
[比較例１０]
表２４に示す反応液を用いて、実施例３４と同様に反応を行なった。結果を図５に示す。【０１８０】
図５より、アセトン無添加の場合、反応液中のレゾルシンと２，６−ジヒドロキシ安息香酸のモル比はレゾルシン：２，６−ジヒドロキシ安息香酸=３：７に収束することがわかる。【０１８１】
【表２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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