(57)【要約】  本発明の目的は、これまでの塩基部無保護法においては１２量体の合成が限界であったが、本発明により、塩基部位を全く保護しないで、少なくとも１０量体の核酸分子オリゴマー、例えば、２０量体程度のＤＮＡオリゴマーを固相法において極めて高純度で合成することができる、新たな核酸オリゴマーの合成方法を提供することである。  本発明は、ホスホロアミダイト法においてアルコール型活性化剤、又は、アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせを用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロアミダイト法においてアルコール型化合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。
【請求項２】
ホスホロアミダイト法において、アルコール型活化合物及び酸触媒の混合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法。
【請求項３】
アルコール型化合物がヒドロキシベンゾトリアゾール−１−オール（ＨＯＢｔ）、ＨＯＢｔ誘導体、及びフェノール類縁体からなる群から選択される、請求項１又は２記載の合成方法。
【請求項４】
ＨＯＢｔ誘導体が４及び／又は６位に置換基を有する、請求項１又は２記載の合成方法。
【請求項５】
ＨＯＢｔ誘導体が、６−トリフロメチルベンゾトリアゾール−１−オール、６−ニトロベンゾトリアゾール−１−オール、又は４−ニトロ−６−トリフロメチルベンゾトリアゾール−１−オールである、請求項４記載の合成方法。
【請求項６】
フェノール類縁体が２，４−ジニトロフェノール、３，４−ジシアノフェノール及び２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールから成る群から選択される、請求項３記載の合成方法。
【請求項７】
酸触媒が、イミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項２〜６のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項８】
酸触媒が、ベンズイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、４−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、又は４，５−ジシアノイミダゾールである、請求項７記載の合成方法。
【請求項９】
アルコール型活化合物及び酸触媒を等量含む混合物を活性化剤として使用する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１０】
固相担体を用いる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の合成方法によって調製された、少なくとも１０量体の核酸分子オリゴマー。
【請求項１２】
２０量体のＤＮＡオリゴマーである、請求項１１記載の核酸分子オリゴマー。
【請求項１３】
ＤＮＡチップ用の請求項１１又は１２に記載の核酸分子オリゴマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、塩基部無保護法による新規核酸合成方法、特に、ホスホロアミダイト法においてアルコール型化合物を活性化剤として用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法に関する。
関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、塩基部位を保護しないでＤＮＡを化学合成する方法としては、ホスホニウム型縮合剤BOMPを用いて水酸基選択的な縮合反応を行うH-ホスホネート法が知られている（非特許文献１）。この反応では、縮合反応中に生成する活性なホスファイト中間体が、塩基部のアミノ基よいも水酸基に対して優先的に反応することを利用している。【０００３】
【非特許文献１】Wada,T.; Sato, Y.; Honda, F.; Kawahara, S.; Sekine, M., Journal of the American Chemical Society 1997, 119, 12710-12821
【非特許文献２】Gryaznov, S. M.; Letsinger, R. L., Journal of the American Chemical Society 1991, 113, 5876-5877
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、上記のH-ホスホネート法では、鎖長が長くなるにつれて、DNA合成において分子内環化反応のような塩基部位での副反応が指数関数的に増えるため、１２量体を過ぎると主生成物として目的のＤＮＡオリゴマーを得ることは極めて困難であった。また、シトシン塩基を含むＤＮＡは副反応が多く、これを防ぐよい方法は知られていなかった。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
そこで、本発明者は、長鎖オリゴマーの合成が容易なホスホロアミダイト法（非特許文献２）において、活性なホスファイト中間体を形成することによって、水酸基選択的なリン酸化を利用したＤＮＡ合成法が可能になるのでないかと考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成した。【０００６】
即ち、本発明は、ホスホロアミダイト法においてアルコール型活性化剤、好ましくは、アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせを用いることを特徴とする、核酸オリゴマーの合成方法に係る。
【発明の効果】
【０００７】
これまでの塩基部無保護法においては１２量体の合成が限界であったが、本発明により、塩基部位を全く保護しないで、少なくとも１０量体の核酸分子オリゴマー、例えば、２０量体程度のＤＮＡオリゴマーを固相法において極めて高純度で合成することが可能となる。かかるＤＮＡオリゴマーはＤＮＡチップ用に有利に使用することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本明細書において、「アルコール型活性化剤」とは、ホスホロアミダイト法において活性なホスファイト中間体の形成を可能にする化合物であり、脂肪族炭化水素んいおける水素原子が水酸基に置換された化合物を意味するものではない。アルコール型活性化剤としては当業者に公知の任意の化合物を使用することができるが、高い縮合効率（例えば、９５％以上）を得る為には、特に、ヒドロキシベンゾトリアゾール−１−オール（ＨＯＢｔ）、ＨＯＢｔ誘導体、及びフェノール類縁体からなる群から選択される化合物が好ましい。ＨＯＢｔ誘導体としては、ニトロ、ブロモ、ヨード、トリフロメチル基等の置換基が１〜４個導入されたもの、例えば、６−トリフロメチルベンゾトリアゾール−１−オール、６−ニトロベンゾトリアゾール−１−オール、又は４−ニトロ−６−トリフロメチルベンゾトリアゾール−１−オールのようなＨＯＢｔ誘導体が好ましく、４及び／又は６位にトリフロメチル及びニトロ基のような各種置換基を有するＨＯＢｔ誘導体が特に好ましい。【０００９】
フェノール類縁体としても当業者に公知の任意の化合物を使用することが出来るが、同様に高い縮合効率を得る為には、２，４−ジニトロフェノール、３，４−ジシアノフェノール及び２−ニトロ−４−トリフルオロメチルフェノールが好適である。【００１０】
一方、酸触媒としては当業者に公知の任意の化合物を使用することが出来るが、特に、イミダゾール、テトラゾール、及びそれらの誘導体が好ましい。これらの好適な具体例として、ベンズイミダゾールトリフラート（ＢＩＴ）、４−エチルチオテトラゾール、イミダゾリウムトリフラート、及び４，５−ジシアノイミダゾール等を挙げることが出来る。【００１１】
アルコール型活性化剤及び酸触媒の組み合わせにおいて、その量比は、各化合物の種類、反応溶媒等の諸条件に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、１：１０〜１０：１の当量比である。【００１２】
本発明の合成反応は固相又は液相等の任意の系で実施することが出来るが、工業的にオリゴマーを合成するような場合には固相担体を用いる合成方法が好ましい。固相担体は当業者に公知の任意の物質、例えば、ＣＰＧ又はＨＣＰを使用することが出来る。【００１３】
本発明において、核酸はＤＮＡ又はＲＮＡであり、それを構成する塩基は天然構造以外に、糖部位にシクロヌクレオシド骨格を有するもの、その２’及び／又は４’に各種置換基を有するもの等の各種修飾体及び変異体も含まれる。更に、リン酸基に関しても、例えば、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのような骨格を有するものも含まれる。【００１４】
ホスホロアミダイト法において、本明細書中に特記されていない各種反応条件は、本発明の実施に際して、当業者が適宜選択することが出来るものである。
【実施例】
【００１５】
以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。【００１６】
実施例１：２量体の固相合成
末端にチミジンを導入したＨＣＰ固相担体を使用して、本発明方法における水酸基選択性を検討した。ＨＣＰ固相担体上の末端水酸基に対して各塩基（Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ）を含むアミダイトユニット２０当量と各種活性化剤４０当量を用いて、１分間リン酸化反応を行った後、０．１Ｍヨウ素溶液（ピリジン：水＝９：１）で酸化した（室温で２分間）。次に、３％トリクロロ酢酸―ＣＨ２Ｃｌ２溶液によりＤＭＴｒ基を脱保護し（室温、１分間）、続いてアンモニアによるリン酸保護基（２−シアノエチル基）の切り出し・脱保護（室温、１２時間）を行った。
活性化剤として従来のＩＭＴを活性化剤として使用した場合には、ｄ［ＡｐＴ］及びｄ［ＣｐＴ］が夫々、７７％及び８３％の水酸基選択性で得られた。これに対して、活性化剤として、ＨＯＢｔ活性化剤としてを使用した場合には、ｄ［ＡｐＴ］及びｄ［ＣｐＴ］が夫々、９９．７％及び９９．９％の水酸基選択性で得られた。ここで、水酸基選択性は、ＨＰＬＣチャートに現れる目的化合物のピークとＮ−リン酸体のピークの面積比から産出した値である。【００１７】
実施例２：３量体の固相合成
更に、塩基部無保護ＤＮＡ合成におけるＨＯＢｔの有用性を確認する為に、各種の３量体を合成した。まず、実施例１の方法においてＨＯＢｔを活性化剤として使用して、各種２量体を合成し、その後、さらに縮合反応を行い、各種３量体を合成した。ｄ［ＴｐＡｐＴ］及びｄ［ＴｐＣｐＴ］の合成において、ＩＭＴを使用したときにはかなりの量の副反応生成物が観察された。
以上の結果を表１に示す。尚、表１には、ＣＨ３ＣＮ−ＮＭＰ混合溶媒系でプロトンブロック法の活性化剤であるＮＢＴを使用した場合の結果も併せて記載されている。【００１８】
【表１】
2005082923.tif 000002
【００１９】
実施例３：ＤＮＡ合成機を用いる長鎖オリゴマーの合成
d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT]と[TTAAAAATTATTAAATTATT]それぞれの合成はApplied Biosystem Inc.(ABI) のDNA/RNA Synthesizer 392を使用した。DNAオリゴマーの自動合成機による合成は、末端にチミジンを導入したHCP固相担体 (1 μmol, 28 μmo/g, サクシニルリンカー)、また活性化剤として0.2M HOtfBt (6-トリフルオロメチルベンゾトリアゾール-1-オール：アルコール型活性化剤)及び0.2M BIT (ベンズイミダゾールトリフラート：酸触媒)の混合物のCH3CN - N-メチル2-ピロリドン (15:1, v/v)溶媒を用いて行った。合成各鎖伸長サイクルは、以下の表２に示すとおりである。【００２０】
【表２】
2005082923.tif 000003
【００２１】
続いて、DMTr基を1分間のCH2Cl2 (2 mL)中の3%トリクロロ酢酸で除去し、CH2Cl2 (1 mL x 3),  CH3CN (1 mL x 3)で固相担体を洗浄した。最後に、固相担体を40分間の濃アンモニア水(500 μL)処理で切り出し、脱保護を行って目的物を得た。
d[CCCCCTTTTCTCTCTCTCT], Mass (M+H) calcd 5868.23, found 5869.92; Enzyme Assay dC:T = 1.00:0.99, isolated yield 79%.
[TTAAAAATTATTAAATTATT], Mass (M+Na) calcd 6130.31, found 6132.69; Enzyme Assay dA:T =1.00:0.94, isolated yield 31%.
【産業上の利用可能性】
【００２２】
２０量体程度のＤＮＡフラグメントは遺伝子診断で汎用されているアフィメトリック社型のＤＮＡチップで必要とされている鎖長であり、この長さのＤＮＡが塩基部位無保護で合成が可能になったことは，きわめてコストパホーマンスのよいＤＮＡチップのハイスループト調製への糸口を切り開くもので、バイオ分野に与える影響は大きい。本発明は、塩基部無保護法で初めての実用的レベルに達した合成法であり、本発明方法で合成された核酸オリゴマーのSNP解析などの遺伝子診断への応用が期待される。
【配列表】
2005082923000001.app
【国際調査報告】
2005082923.tif 000004
2005082923.tif 000005
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