(57)【要約】  少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー宿主細胞を生成するために該細胞を使用する方法、並びにＡＡＶプロデューサー宿主細胞を使用してｒＡＡＶを生産、パッケージング、及び精製する方法。【選択図】  図８
2020507331.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、（ｉｉｉ）前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
４つのＲＴＳを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
６つのＲＴＳを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項５】
少なくとも１つのＲＴＳが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６】
少なくとも１つのＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが、単一の染色体座位に組み込まれている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
前記染色体座位が、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
第２のＡｄ遺伝子を更に含み、前記第２のＡｄ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記第２のＡｄ遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記第２のＡｄ遺伝子が、アデノウイルス５型由来である、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記第２のＡｄ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、前記ＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ＡＡＶ遺伝子が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む、請求項１４に記載の細胞。
【請求項１６】
前記ＡＡＶ遺伝子が、アデノ随伴ウイルス２型由来である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１７】
前記ＡＡＶ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１８】
ＡＡＶベクターカセットを更に含み、前記ＡＡＶベクターカセットが染色体に組み込まれている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記ＡＡＶベクターカセットが、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記ＡＡＶベクターカセットが、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項１８又は１９に記載の細胞。
【請求項２１】
ヘルパーウイルスを実質的に含まない、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせと、（ｉｉｉ）前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項２３】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項２２に記載の細胞。
【請求項２４】
４つのＲＴＳを含む、請求項２２又は２３に記載の細胞。
【請求項２５】
６つのＲＴＳを含む、請求項２２又は２３に記載の細胞。
【請求項２６】
少なくとも１つのＲＴＳが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが、単一の染色体座位に組み込まれている、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記染色体座位が、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を更に含む、請求項２２〜２７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
第２のＡｄ遺伝子を更に含み、前記第２のＡｄ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項２２〜３０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３２】
前記第２のＡｄ遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
前記第２のＡｄ遺伝子が、アデノウイルス５型由来である、請求項３２に記載の細胞。
【請求項３４】
前記第２のＡｄ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、前記ＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている、請求項２２〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３６】
前記ＡＡＶ遺伝子が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記ＡＡＶ遺伝子が、アデノ随伴ウイルス２型由来である、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記ＡＡＶ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３９】
ＡＡＶベクターカセットを更に含み、前記ＡＡＶベクターカセットが染色体に組み込まれている、請求項２２〜３８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４０】
前記ＡＡＶベクターカセットが、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む、請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
前記ＡＡＶベクターカセットが、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項３９又は４０に記載の細胞。
【請求項４２】
ヘルパーウイルスを実質的に含まない、請求項２０〜４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４３】
（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子とを含み、前記ＲＴＳ及び前記ＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている哺乳動物細胞。
【請求項４４】
前記ＡＡＶ遺伝子が、アデノ随伴ウイルス２型由来である、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である、請求項４３又は４４に記載の細胞。
【請求項４６】
４つのＲＴＳを含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４７】
６つのＲＴＳを含む、請求項４３〜４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４８】
少なくとも１つのＲＴＳが、配列番号１〜３０からなる群から選択される、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４９】
前記ＲＴＳ及び前記ＡＡＶ遺伝子が、単一の染色体座位に組み込まれている、請求項４３〜４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５０】
前記染色体座位が、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である、請求項４９に記載の細胞。
【請求項５１】
部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を更に含む、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５２】
前記部位特異的リコンビナーゼ遺伝子が、染色体に組み込まれている、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
Ａｄ遺伝子と、前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを更に含み、それにより、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれる、請求項４３〜５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５４】
前記Ａｄ遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む、請求項５３に記載の細胞。
【請求項５５】
前記Ａｄ遺伝子が、アデノウイルス５型由来である、請求項５４に記載の細胞。
【請求項５６】
前記ＡＡＶ遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項４３〜５５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５７】
ＡＡＶベクターカセットを更に含む、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５８】
前記ＡＡＶベクターカセットが、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む、請求項５７に記載の細胞。
【請求項５９】
前記目的遺伝子が、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、請求項５７又は５８に記載の細胞。
【請求項６０】
ヘルパーウイルスを実質的に含まない、請求項４３〜５９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項６１】
ａ．６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、
ｂ．Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、
ｃ．前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターであって、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている、前記プロモーターと、
ｄ．Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子であって、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、前記第２のＡｄ遺伝子と、
ｅ．Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子であって、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、前記ＡＡＶ遺伝子と、
ｆ．レポーター遺伝子、選択遺伝子又は治療目的遺伝子を含み、２つの前記ＲＴＳの間に位置する、ＡＡＶベクターカセットと
を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項６２】
Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子及び前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターと、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞。
【請求項６３】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー細胞を生産する方法であって、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、
ｂ．（ａ）で用意された前記細胞に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子、第２のＡｄ遺伝子、ＡＡＶベクターカセット又はそれらの組み合わせをコードする交換可能なカセットを含むベクターをトランスフェクトするステップと、
ｃ．染色体に前記交換可能なカセットを組み込むステップと、
ｄ．前記染色体に組み込まれた前記交換可能なカセットを有するｒＡＡＶプロデューサー細胞を選択するステップと
を含む方法。
【請求項６４】
前記トランスフェクション（ｂ）が、前記第２のＡｄ遺伝子及び前記ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、前記ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第２のベクターとの２つのベクターによりなされる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記トランスフェクション（ｂ）が、前記第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、前記ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターとの２つのベクターによりなされる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記トランスフェクション（ｂ）が、前記第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、前記ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、前記ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第３のベクターとの３つのベクターによりなされる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
各交換可能なカセットが、前記細胞の２つの前記ＲＴＳにマッチングする２つのＲＴＳを更に含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２のＡｄ遺伝子が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＡＡＶ遺伝子が、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＡＡＶベクターカセットが、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む、請求項６３〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生産する方法であって、（ｉ）宿主細胞にｒＡＡＶを感染させるステップと、（ｉｉ）ＡＡＶベクターカセットでパッケージングされたｒＡＡＶを生産するステップと、（ｉｉｉ）前記パッケージングされたｒＡＡＶを精製するステップとを含み、前記宿主細胞が、
ａ．少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、
ｂ．Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、
ｃ．前記Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターであって、前記ＲＴＳ、前記Ａｄ遺伝子及び前記プロモーターが染色体に組み込まれている、前記プロモーターと、
ｄ．Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む第２のＡｄ遺伝子と、
ｅ．Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、
ｆ．レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットと
を含む、方法。
【請求項７２】
生きている野生型ヘルパーウイルスが、ｒＡＡＶの生産及びパッケージングに必要とされない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
Ｅ１Ａの発現が、ｒＡＡＶの生産に必要とされない、請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
最小限で１．０×１０９ｖｇ／ｍｌの活性ｒＡＡＶが、精製後に得られる、請求項７１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞に関する。本開示はまた、細胞を使用して組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー細胞を生成する方法、並びに、ｒＡＡＶプロデューサー細胞を使用して、生きているヘルパーウイルスがない状態でｒＡＡＶを生産、パッケージング、及び精製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]遺伝子治療用製品の長期持続的、効率的な送達を可能にするため、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の使用が、臨床開発において積極的に追及されている。ｒＡＡＶ生産のためのバキュロウイルスベースのプラットフォームでは、可変的であり、かつ調製に時間を要する原料が通常必要とされる。ＨＥＫ２９３における３重のトランスフェクション及び一過性発現は、スケールアップ可能性が低いため、制限されたものとなる。既存のスケールアップ可能なヒーラ細胞ベースのプロデューサー細胞株を用いたプロセスでは、ヘルパーウイルスとして野生型（ｗｔ）アデノウイルス５（Ａｄ５）が必要となるが、安全性の観点から、最終産物からのヘルパーウイルスのクリアランスが重要である。ｒＡＡＶを生産する細胞株を構築する際、目的遺伝子及び補助的ヘルパー遺伝子は、一過性発現させてもよく、又は宿主染色体に組み込んでもよい。細胞ゲノムの修飾に使用される従来のＤＮＡトランスダクション経路では、予測不可能な改変が生じやすく、またウイルス血清型の違いに応じて随時変更することも容易ではない。
【０００３】
[0003]治療的な組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）構築物は、複製能が不完全であり、複製及び次のラウンドでの感染を行うためには、野生型のアデノウイルス（Ａｄ）の同時感染を必要とする。治療的な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの生成は一般に、（ｉ）複製及びパッケージングエレメントを提供するアデノ随伴ウイルス遺伝子のＲｅｐ／Ｃａｐ、（ｉｉ）ウイルスのパッケージングのための、Ａｄゲノム由来のヘルパーウイルス機能、及び（ｉｉｉ）ＡＡＶの３’及び５’の逆向き末端反復配列（ＩＴＲ）の間に位置する目的遺伝子（ＧＯＩ）、の３つの異なるコンポーネントを宿主に供給することが必要である。効率的な遺伝子発現、ＤＮＡ複製及びパッケージングに必要とされるＡｄ遺伝子としては、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ  ＲＮＡが挙げられると考えられる。Ｅ１Ａは、Ａｄ感染の際、最も初期に生産される遺伝子産物であるといわれている（Ｓｈｅｎｋ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ３ｒｄ  ｅｄ．，  ２２１１−２１４８（１９９６））。Ｅ１Ａは、ＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子プロモーターであるｐ５及びｐ１９からの転写の上方制御により、並びにＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４のためのアデノウイルス初期プロモーターの活性化により、ウイルス複製を開始させる足掛かりとして機能すると考えられている。また、ＡＡＶによりコードされるタンパク質（Ｒｅｐ及びＣａｐ）には、ウイルスＤＮＡ複製のために宿主細胞を細胞周期のＳ期に移行させる機能が存在しないため、Ｅ１Ａが本機能の発揮に用いられると考えられている。Ｅ１Ａの有害作用は、それがｐ５３を安定させ、さらにアポプトーシスに至らしめるということである（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．  ７：５３５−５４５（１９９３））。Ｅ１Ａのリークの発現は、Ａｄ遺伝子並びにＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子をオンにすることもある。後者は、細胞増殖抑制性及び細胞毒性を有することが報告されており、それにより、Ｅ１Ａを構成的に発現する細胞からの安定な細胞株の取得が困難となる。Ｅ１Ａ遺伝子発現の制御は、ヘルパーウイルスフリーのＡＡＶパッケージング細胞株の確立にきわめて重大であると考えられる。
【０００４】
[0004]これらのエレメントをまとめ、ｒＡＡＶを生産するための、様々な細胞株及び様々なアプローチが試みられてきた。これらの様々な細胞株の中には、ＨＥＫ２９３及びヒーラ細胞株も含まれる。様々なアプローチには、バキュロウイルス系の使用も含まれていた。しかしながら、各細胞株及びアプローチにはそれぞれ欠点があり、いずれも、スケールアップ可能な、強力なｒＡＡＶ生産プロセスのための理想的なプラットフォームではない。
【０００５】
[0005]ｒＡＡＶ生産プロセスの１つは、物理的にせん断されたＡｄ５  ＤＮＡを用いた一次胎生期腎臓細胞へのトランスフェクションにより生成したＨＥＫ２９３細胞を用いるものである（Ｇｒａｈａｍ  Ｆ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ３６：５９−７４（１９７７））。ゲノム解析の結果、ＨＥＫ２９３細胞が、Ｅ１領域及び更なる隣接配列を含む、アデノウイルスゲノムの左端の組み込まれた断片（塩基１−４３４４）を担持することをが解明されている（Ｌｏｕｉｓ  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２３３：４２３−９（１９９７））。いくつかの３重のトランスフェクションプロセスが、残りの必須エレメントを含むプラスミドによるトランスフェクションのために、付着ＨＥＫ２９３細胞に対して使用されている。ｒＡＡＶ生産においてはＨＥＫ２９３の使用が可能であるが、付着細胞ベースのプロセスはスケールアップが困難であり、様々な効能を有するベクターに対する高いニーズに応えることができず、ゆえに安定なプロデューサー細胞株ではなく、一過性のトランスフェクションに依存することとなる。
【０００６】
[0006]第２のｒＡＡＶ生産プロセスは、ＡＡＶ遺伝子Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＧＯＩの両方を含む、安定にトランスフェクトされたヒーラ細胞クローンの生成及び選択を特徴とする。これらの細胞株は次に野生型Ａｄ５を感染させ、ｒＡＡＶ粒子のパッケージングを行わせる。本方法はスケールアップ可能であるが、これらのクローンの生成は長期間の労働集約的なプロセスとなることがあり、また本プロセスの最終産物からの野生型Ａｄ５ウイルスの除去には複数のステップがプロセスに加わる。
【０００７】
[0007]第３のｒＡＡＶ生産プロセスは、ＡＡＶ遺伝子（Ｒｅｐ／Ｃａｐ）の導入のために組換えバキュロウイルスに依存するものであり、ＳＦ９昆虫細胞におけるｒＡＡＶ生産のために必要なヘルパーウイルス機能を直接行わせるものである。本方法は、懸濁培養においてスケールアップ可能であるが、それはプラーク精製された組換えバキュロウイルス構築物を生成することが必要であり、ゆえに製品開発のための期間が長期化する。
【０００８】
[0008]これらの欠点に対処し、所望のＡＡＶ血清型においても安定なプロデューサー細胞株を生成する迅速なプロセスを提供し、更には、生きているヘルパーウイルスを添加せずに高収率なスケールアップ生産を提供する、ｒＡＡＶ生産のための新規かつ効率的なプラットフォームが、前臨床及び臨床試験の両方で用いられる高品質のベクターを提供するために必要とされている。
【０００９】
[0009]Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、それらの強力なウイルス複製「妨害」能力が見出され、その旨名付けられた最初のサイトカインである。例えばプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を阻害するインフルエンザＮＳ１タンパク質及びワクシニアウイルスＥ３Ｌタンパク質、並びにワクシニアウイルスによりコードされる可溶性ＩＦＮ−α／β受容体おとりなど、多くのウイルス産物は、ＩＦＮ関連シグナルをブロックしうる。
【００１０】
[0010]チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｐｕｃｋ，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １０８：２５９−２６８（１９５８））は、多くの特徴づけがなされている細胞株であり、その高い生産能力、強靭な性質、工業上の安全記録及び使用記録における取扱性から、哺乳動物細胞からの組換えタンパク質の工業的製造のためにしばしば使用される（Ｂｉｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒａｃｈｅｒ，  Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，  ５８：６７１−６８５（２００６））。しかしながら、ＣＨＯ細胞はこれまでｒＡＡＶの生産において使用されていなかった。
【００１１】
[0011]各種の刊行物を本願明細書において引用し、それらの全開示内容を参照により本願明細書に組み込む。
【発明の概要】
【００１２】
［発明の簡単な説明］
[0012]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、（ｉｉｉ）Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞（Ｌｏｎｚａ，  Ｓｌｏｕｇｈ，  ＵＫ）、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞（Ｌｏｎｚａ，  Ｓｌｏｕｇｈ，  ＵＫ）、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎｓ）である（ＥＥＳＹＲ、例えば米国特許第７，７７１，９９７号明細書を参照）。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は第２のＡｄ遺伝子を含み、第２のＡｄ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、ＡＡＶ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス２型由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含み、ＡＡＶベクターカセットは染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。
【００１３】
[0013]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ａｄ遺伝子のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせと、（ｉｉｉ）Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（グルタミン合成酵素ノックアウト）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である（ＥＥＳＹＲ）。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は第２のＡｄ遺伝子を更に含み、第２のＡｄ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、前記第２のＡｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、ＡＡＶ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス２型由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含み、ＡＡＶベクターカセットは染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。
【００１４】
[0014]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子とを含み、ＲＴＳ及びＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス２型由来である。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞 、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＴＳ及びＡＡＶは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である（ＥＥＳＹＲ）。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ａｄ遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを更に含み、それにより、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含み、ＡＡＶベクターカセットは染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。
【００１５】
[0015]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＲＴＳが配列番号１〜３０からなる群から選択される、６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは染色体に組み込まれ、また、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子であって、染色体に組み込まれ、２つのＲＴＳの間に位置する、第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子であって、染色体に組み込まれ、２つのＲＴＳの間に位置する、ＡＡＶ遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子又は治療目的遺伝子を含み、染色体に組み込まれ、２つのＲＴＳの間に位置する、ＡＡＶベクターカセットとを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供する。
【００１６】
[0016]いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子及びＡｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターと、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供する。
【００１７】
[0017]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、用意された細胞に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子、第２のＡｄ遺伝子、ＡＡＶベクターカセット又はそれらの組み合わせをコードする交換可能なカセットを含むベクターをトランスフェクトするステップと、染色体に交換可能なカセットを組み込むステップと、染色体に組み込まれた交換可能なカセットを有するｒＡＡＶプロデューサー細胞を選択するステップとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー細胞を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、第２のＡｄ遺伝子及びＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、の２つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、の２つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションが、第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第３のベクターと、の３つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、各交換可能なカセットは、細胞の２つのＲＴＳにマッチングする２つのＲＴＳを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
[0018]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）宿主細胞にｒＡＡＶを感染させるステップと、（ｉｉ）ＡＡＶベクターカセットでパッケージングされたｒＡＡＶを生産させるステップと、（ｉｉｉ）パッケージングされたｒＡＡＶを精製するステップとを含み、宿主細胞が、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターであって、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれているプロモーターと、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、生きている野生型ヘルパーウイルスが、ｒＡＡＶの生産及びパッケージングに必要とされない。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａの発現は、ｒＡＡＶ生産のために必要とされない。いくつかの実施形態では、最小限で１．０×１０９ｖｇ／ｍＬの活性ＡＡＶが、精製後に得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ａは実験計画の概略図を示す。
【図１Ｂ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ｂは、トランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（左）、及びトランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からのライセートを感染させたＨＥＫ２９３細胞（右）の、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）シグナルの検出を示す。
【図１Ｃ】図１は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞における組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の生産を示す。ＨＥＫ２９３細胞において、プラスミドによる３重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において、ヘルパーウイルスとの同時感染（ｗｔ  Ａｄ５）による２重トランスフェクション（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）及びｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））を完遂した。図１Ｃは、ウイルスゲノムＤＮＡのｑＰＣＲ解析による、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３（コントロール）細胞のｒＡＡＶ力価の定量を示す。
【図２】図２はｐＭＦ３０ベクターの図を示す。ＧＳ選択マーカーを担持するＴＥＴ誘導可能なベクターにＥ１Ａが存在する。
【図３】図３はｐＭＦ２３ベクターの図を示す。ＰＡＣ選択マーカーを担持する構成的ベクターにＥ１Ｂが存在する。
【図４】図４は、ｐＸＣ１７．４＿１７Ａｄ５ＰｅｒＰｒｏＫＺベクターの図を示す。Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７６：１９０４−１３（２００２）に記載のように、単一のプロモーターからＥ１Ａ及びＥ１Ｂを発現させた（２つの遺伝子の間のウイルス制御領域、並びにＥ１Ａ及びＥ１Ｂコーディング配列の間に位置するウイルスプロモーター領域（ヌクレオチド４９８〜３６３５）が保持されている）。アノテーションは、Ｑｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７６：１９０４−１３（２００２）に記載される座標と一致する。
【図５Ａ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ａは実験計画の概略図である。
【図５Ｂ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂ）プールにおける、Ｅ１Ａに関するゲノムＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｃ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ｂに関するゲノムＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｄ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｄは、ドキシサイクリンで処理したＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ａに関するＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｅ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。図５Ｅは、ドキシサイクリンで処理したＨＥＫ２９３Ｆ、ＨＥＫ２９３Ｌ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ｂに関するＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。
【図５Ｆ】図５は、ヘルパーウイルスなしに、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現してこれらの細胞におけるｒＡＡＶ生産を可能にするＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）プールの構築を示す。パネルＦは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールにおける、Ｅ１Ａ及びβ−アクチンに関する、タンパク質ライセートのウエスタンブロット解析を示す。
【図６】図６は、ｐＲＣ２−ｍｉＲＮＡ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（図６Ａ）、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（図６Ｂ）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）（図６Ｃ）のベクターの図を示す。
【図７】図７は、部位特異的組込み細胞株であるＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３における、３つの独立して指定可能な部位特異的組込み部位（ＳＳＩＳ）の概略図を示す。図７Ａは、１重又は２重機能レポート／マーカー遺伝子を含むランディングパッド１の配置を示す。レポーター遺伝子は、ＳＶ４０Ｅプロモーターの制御下であり、ＳＶ４０のポリＡ配列を有する。リコンビナーゼにより媒介されるカセット交換（ＲＭＣＥ）のため、不和合性のＦｒｔ部位が、ＳＶ４０プロモーターとｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子との間（Ｆｒｔ−Ａ）、及びＳＶ４０ポリＡ配列の５’側（Ｆｒｔ−Ｂ）に位置する。図７Ｂ及び図７Ｃは、ペイロード配列の独立したターゲッティングを可能にする、不和合性のＦｒｔ部位（Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ）及び異なるレポーターを含む下に続くランディングパッドの配置を示す。この場合、Ｆｒｔ部位Ａ〜Ｆは、表２に記載されるいずれかでありうる。
【図８】図８は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）−ＡＡＶプロデューサー細胞の調製方法の体系的概略図を示す。ＳＳＩＳを用いてアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子（ヘルパー遺伝子）、ＡＡＶ遺伝子（Ｒｅｐ／Ｃａｐ）及びＡＡＶベクターカセット（例えばＩＴＲ−ＧＯＩ−ＩＴＲ）を導入し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）には、更にＡｄ遺伝子（Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を誘導性プロモーターと共に他の部位に導入する。この場合、Ｆｒｔ部位Ａ〜Ｆは、表２に記載されるいずれかでありうる。図８Ａは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の単一部位の配置を示す。Ａｄヘルパー遺伝子はＳＳＩＳで組み込まれ、ＧＯＩ／Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子はプラスミドから一過性に発現される。図８Ｂは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の２重部位の配置を示す。Ａｄヘルパー及びＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子は２つの別々のＳＳＩＳで組み込まれ、ＧＯＩはプラスミドから一過性に発現される。図８Ｃは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３宿主の３重部位の配置を示す。ヘルパー、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＧＯＩ遺伝子は、３つの別々のＳＳＩＳで組み込まれる。いくつかの場合、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子はＳＳＩＳにおいて組み込まれ、発現を強化する。
【図９】図９は、異なる部位におけるＧＯＩ及びＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の部位特異的組込みを利用した、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）部位特異的組込み（ＳＳＩ）宿主におけるｒＡＡＶ生産の概略図を示す。ｒＡＡＶを生産するため、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主に野生型Ａｄ５を感染させ、ｒＡＡＶ複製のために必要とされるヘルパー遺伝子機能を提供した。
【図１０】図１０は、ＧＯＩベクターの概略図及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主の部位特異的組込みのためのＲｅｐ／Ｃａｐ遺伝子の４つのデザインを示す。全てのベクターには２つのＦｒｔ部位が側面に隣接し、それによりＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主細胞へのＳＳＩの導入が可能となる。図１０Ａは、ベクターｐＬＭＣ３１の構成（ＡＡＶカセットの両末端にＩＴＲが隣接するｅＧＦＰレポーター遺伝子を有するｒＡＡＶベクターをコード）を図式的に示す。本ベクターの選択マーカーはネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ遺伝子であり、Ｆｒｔ部位はＮＬ１のターゲッティングのために配置される。図１０Ｂは、ベクターｐＬＭＣ３２（ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコード）の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側に、２つのエンハンサーエレメントを含む、Ｒｅｐ発現を減少させｒＡＡＶ生産を抑制するための、最小ｐ５プロモーター（白い正方形）を含み、またＣａｐの３’側に、Ｃａｐの発現を強化する完全ｐ５プロモーター（白黒の正方形）を含む。図１０Ｃは、ベクターｐＬＭＣ３３（ＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコード）の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側に最小ｐ５プロモーター（白い正方形）を含み、またＣａｐの３’側に、ＴＡＴＡボックスをＧＧＧＧＧＧＧに変異させてプロモーター活性を減少させたｐ５ｍｕｔプロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。図１０Ｄは、ここでもＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコードするベクターｐＬＭＣ３４の構成を図式的に示す。ベクターは、Ｒｅｐの５’側に野生型ｐ５プロモーター（白及び黒の正方形）を含み、またＣａｐの３’側に変異ｐ５プロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。図１０Ｅは、ここでもＡＡＶ２  Ｒｅｐ／Ｃａｐ遺伝子をコードするベクターｐＬＭＣ３５の構成を図式的に示す。このベクターは、Ｒｅｐの５’側及びＣａｐの３’側に変異ｐ５プロモーター（黒及び灰色の正方形）を含む。ｐＬＭＣ３２からｐＬＭＣ３５の選択マーカーはＧＳ  ｃＤＮＡであり、Ｆｒｔ部位はＦｅｒ１Ｌ４へのターゲッティングのために配置される。
【図１１】図１１は、ウエスタンブロット解析によるＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞におけるＥ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐのタンパク質発現を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及び１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）でトランスフェクション、又はｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）で３重トランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に野生型Ａｄ５を感染させ、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及び１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）をトランスフェクト、又は野生型Ａｄ５を感染させ、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）をトランスフェクトした。トランスフェクションの３日後、タンパク質ライセートをウエスタンブロッティングで解析した。図１１Ａは、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒ、Ｅ１Ａ  ２４３Ｒ及びＥ１Ａ  １７１Ｒの、３つのＥ１Ａアイソフォームのレベルを示す（Ｒａｄｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  １０：ｅ０１４０１２４）。Ｅ１Ａタンパク質レベルは、マウス抗Ｅ１Ａ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３１８３）を１：１０００に希釈したものを使用して検出した。Ｅ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質アイソフォームの分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、Ｅ１Ａタンパク質レベルに変化がなかったが、各Ｅ１Ａアイソフォームのタンパク質レベルは、ＨＥＫ２９３とＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞との間で異なった。図１１Ｂは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質のレベルを示す。マウス抗Ｒｅｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０６９）を１：１０００に希釈したものを使用して、Ｒｅｐタンパク質レベルを検出した。分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、Ｒｅｐ５２タンパク質レベルに変化がなかったが、ｐＬＭＣ３４及びｐＬＭＣ３５によりトランスフェクトした細胞では、Ｒｅｐ７８タンパク質レベルは高かった。図１１Ｃは、マウス抗Ｃａｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０５８）を１：１０００で希釈したものを用いた、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の３つのＣａｐアイソフォームのレベルを示す。分子量を括弧内に示す。異なるベクターによりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において、ＶＰ３タンパク質レベルに変化がなく、ＶＰ１及びＶＰ２はＨＥＫ２９３細胞において検出できなかった。ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出できなかった。図１１Ｄは、マウス抗β−アクチン抗体（ＴＦＳ、ＭＡ５−１５７３）を１：１０００で希釈したものを用いた、β−アクチンローディングコントロールを示す。
【図１２】図１２は、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞により生産されるｒＡＡＶの感染性を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｒｅｐ／Ｃａｐ、ＧＯＩ及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によって３重トランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＧＯＩをトランスフェクトし、野生型Ａｄ５を感染させた。トランスフェクションの３日後、回収した粗製のｒＡＡＶを等量用い、ＨＥＫ２９３細胞に感染させた。トランスダクションの２日後、緑色蛍光及び明視野イメージを得た。緑色蛍光は、ＧＯＩパッケージングされたｒＡＡＶにより発せられる。図中のスケールバーは５０μｍを表す。３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞（ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社））（上パネル）により生産されるｒＡＡＶの感染性は、トランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（第３パネル）により生産されるｒＡＡＶより高かった。特に、ｐＬＭＣ３２〜３５によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により生産されるｒＡＡＶの感染性は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（上パネル）によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞より高かった。
【図１３】図１３は、ＧＯＩのＳＳＩ及び４つのＲｅｐ−Ｃａｐの構成のうちの１つを有する、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主由来のプールの構築物を示す。プールは、２つの段階で生成した。段階１のパート１において、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主を、ＦＬＰリコンビナーゼベクター（ｐＭＦ４）及び１Ｒｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）によりトランスフェクトし、次にグルタミンフリーの培地において選択した。段階１のパート２において、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主を、ＦＬＰリコンビナーゼベクター（ｐＭＦ４）、１つのＲｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）及びＧＯＩベクター（ｐＬＭＣ３１）によりトランスフェクトし、次にジェネテシン（５００μｇ／ｍＬ又は７５０μｇ／ｍＬ）を含むグルタミンフリーの培地において選択した。これらを「Ａ」プールとした。段階２において、「Ａ」プールの４〜７を、ＦＬＰリコンビナーゼ（ｐＭＦ４）及びＧＯＩベクター（ｐＬＭＣ３１）によりトランスフェクトし、次にジェネテシン（４００μｇ／ｍＬ）を含む培地において選択した。これらを「Ｂ」プールとした。
【図１４】図１４は、標的とされるＳＳＩ及び残りの（交換されない）ランディングパッドの検出のためのプライマー部位の概略図を示す。Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを検出するため、プライマーセットＰ５を設計した。予想される生成物のサイズは１５２４ｂｐである。残りのランディングパッドを検出するため、プライマーセットＰ６を設計した。予想される生成物のサイズは４８７ｂｐである。ＮＬ１座位に位置するランディングパッドへの特異的なＧＯＩ組込みを検出するため、プライマーセットＰ７を設計した。予想される生成物のサイズは１４４６ｂｐである。残りのＮＬ１ランディングパッドを検出するため、プライマーセットＰ８を設計した。予想される生成物のサイズは８０９ｂｐである。
【図１５】図１５は、Ｆｅｒ１Ｌ４ランディングパッドへのＲｅｐ／Ｃａｐ組込みについての、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。ゲノムＤＮＡを、「Ａ」プール、「Ｂ」プール、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主から回収し、次にＰＣＲによってプライマーセット５又は６を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離させた。図１５Ａは、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みについての、プライマーセットＰ５を用いたゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは１５２４ｂｐである。結果は、「Ａ」プールの４、５、６、７、９、１１、１７、１８、１９、２１及び解析した「Ｂ」プールの全てにおいて、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの特異的なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを示す。予想されるように、特異的なＲｅｐ／Ｃａｐの組込みは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主において検出されなかった。図１５Ｂは、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子の残りのランディングパッドについての、プライマーセットＰ６を用いた、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは４８７ｂｐである。結果は、１８を除く「Ａ」プールの全て、及び全ての「Ｂ」プールにおいて、いくつかの残りのランディングパッド、及びＦｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへの不完全なＲｅｐ／Ｃａｐ組込みを示す。より小型のＰＣＲ産物が「Ａ」プールの１９に存在し、すなわち配列の一部の損失を示す。予想されるように、Ｆｅｒ１Ｌ４のランディングパッドは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において増幅されたが、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主においては検出されなかった。
【図１６】図１６は、ＮＬ１ランディングパッドへのＧＯＩ組込みについての、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。ゲノムＤＮＡを、「Ａ」プール、「Ｂ」プール、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主から回収し、次にＰＣＲによってプライマーセット７又は８を使用して増幅した。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分離させた。図１６Ａは、ＮＬ１ランディングパッドへのＧＯＩ組込みについての、プライマーセットＰ７を用いた、ゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは１４４６ｂｐである。結果は、「Ａ」プールでなく、「Ｂ」プールの全てのＮＬ１座位に位置するランディングパッドへの特異的なＧＯＩ組込みを示す。予想されるように、特異的なＧＯＩ組込みは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主において検出されなかった。図１６Ｂは、残りのＮＬ１ランディングパッドについての、Ｐ８プライマーセットを用いたゲノムＤＮＡ産物のアガロースゲル解析を示す。予想される生成物のサイズは８０９ｂｐである。結果は、１１を除く「Ａ」プールの全て、及び全ての「Ｂ」プールにおいて、いくつかの残りのランディングパッド、及びＮＬ１遺伝子に位置するランディングパッドへの不完全なＧＯＩ組込みを示す。結果によれば、ＮＬ１ランディングパッドは、「Ａ」プール１１において完全でなく、ＧＯＩはランディングパッドに組み込まれなかった。予想されるように、ＮＬ１のランディングパッドは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において増幅されたが、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主においては検出されなかった。
【図１７】図１７は、ウエスタンブロット解析による、野生型Ａｄ５を感染させたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞におけるＥ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐのタンパク質発現を示す。「Ａ」プール及び「Ｂ」プールに３日間野生型Ａｄ５を感染させ、次にＥ１Ａ、Ｒｅｐ、Ｃａｐ及びβ−アクチンタンパク質発現解析のために回収した。図１７Ａは、Ｅ１Ａ  ２８９Ｒ、Ｅ１Ａ  ２４３Ｒ及びＥ１Ａ  １７１Ｒの、３つのアイソフォームのレベルを示す。Ｅ１Ａタンパク質レベルは、マウス抗Ｅ１Ａ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３１８３）を１：１０００に希釈したものを使用して検出した。Ｅ１Ａ、Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質アイソフォームの分子量を括弧内に示す。３つ全てのＥ１Ａアイソフォームのレベルは、すべてのプールで同等であり、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞においてわずかに高かった。図１７Ｂは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２タンパク質のレベルを示す。マウス抗Ｒｅｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０６９）を１：１０００に希釈したものを使用して、Ｒｅｐタンパク質レベルを検出した。分子量を括弧内に示す。Ｒｅｐ７８は検出できなかった。Ｒｅｐ５２は「Ａ」プール１３及び「Ｂ」プール６、７、８及び１０において検出された（＊で示す）。図１１Ｃは、マウス抗Ｃａｐ抗体（ＡＲＰ、０３−６１０５８）を１：１０００で希釈したものを用いた、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の３つのＣａｐアイソフォームのレベルを示す。分子量を括弧内に示す。ＶＰ１、Ｖｐ２及びＶＰ３は検出されなかった。図１７Ｄは、マウス抗β−アクチン抗体（ＴＦＳ、ＭＡ５−１５７３）を１：１０００で希釈したものを用いた、β−アクチンローディングコントロールを示す。
【図１８】図１８は、ＡＡＶ２  Ｒｅｐ及びＣａｐ  ｍＲＮＡの検出のためのプライマー部位の概略図を示す。プライマーセットＰ１はＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８用である。プライマーセットＰ２はＲｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０用である。プライマーセットＰ３はＲｅｐ７８及びＲｅｐ５２用である。プライマーセットＰ４は、全Ｒｅｐ及びＣａｐ用である。＊は、ＶＰ３を生産するために用いた代替ＡＣＧコドンを示す。ＡＡＶ２ゲノム構造は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ａｎｄ  Ｍｕｚｙｃｚｋａ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｖｉｒｏｌ．  １：４２７−４５１（２０１４）を参考に調整した。
【図１９】図１９は、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からの、Ｒｅｐ−Ｃａｐ遺伝子及びＡｄ５ヘルパー遺伝子についてのｍＲＮＡ発現解析を示す。ＨＥＫ２９３細胞は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクター）により３重トランスフェクトした（黒いバー）。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞は、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２及びｐＡＡＶ−ＧＦＰをトランスフェクトし、野生型Ａｄ５を感染させた（白いバー）。コントロールには、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２によりトランスフェクトしたＨＥＫ２９３又はＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞を含めた（左上のバー）。ｃＤＮＡを調製し、Ｒｅｐ／Ｃａｐ及びＡｄヘルパー遺伝子についてのＲＴ−ｑＰＣＲ解析に供した。発現データをβ−アクチンにより内部正規化し、次にＨＥＫ２９３コントロールサンプルと比較した。プライマー配列を図２１に示す。図１９Ａは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ６８のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜６倍及び〜５倍の誘導が観察された。図１９Ｂは、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜１１倍及び〜５倍の誘導が観察された。図１９Ｃは、Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２のｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜１７倍及び〜４倍の誘導が観察された。図１９Ｄは、全Ｒｅｐ及びＣａｐのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において、（それぞれ）〜２０倍及び〜７倍の誘導が観察された。図１９Ｅは、Ｅ１ＡのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１ＡのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｆは、Ｅ１Ｂ−１９ＫのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１Ｂ−１９ＫのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｇは、Ｅ１Ｂ−５５ＫのｍＲＮＡレベルを示す。３重トランスフェクション後、ＨＥＫ２９３において、〜１倍の誘導が観察された。Ｅ１Ｂ−５５ＫのｍＲＮＡは、コントロールＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出されず、トランスフェクション及び野生型Ａｄ５による感染の後、検出された。図１９Ｈは、Ｅ２ＡのｍＲＮＡレベルを示す。Ｅ２ＡのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｉは、Ｅ４のｍＲＮＡレベルを示す。Ｅ４のｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｊは、ＶＡＩのｍＲＮＡレベルを示す。ＶＡＩのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。図１９Ｋは、ＶＡＩＩのｍＲＮＡレベルを示す。ＶＡＩＩのｍＲＮＡは、コントロールサンプルにおいては検出できず、３重トランスフェクションの後に存在した。観察された全てのｍＲＮＡレベルは、Ｅ４を除き、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において低かった（図１９Ａ〜Ｋ）。これらのデータは、Ｒｅｐ−ＣａｐのｍＲＮＡ誘導及び発現が、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において低かったことを示す。
【図２０】図２０は、３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞からのｒＡＡＶの力価を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、及びｐＬＭＣ３２〜３５又はｐＲＣ−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の１つ、及びｐＬＭＣ３１又はｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクターをトランスフェクトした。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に、野生型Ａｄ５、ｐＬＭＣ３２〜３５又はｐＲＣ−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）の１つ、及びｐＬＭＣ３１又はｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）ベクターを感染させた。トランスフェクションの３日後にＤＮＡを抽出し、ＡＡＶ発現についてのＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲ解析に供した。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞により生産されるＡＡＶの力価は、ＨＥＫ２９３細胞におけるよりも低く、ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＬＭＣ３１及びｐＬＭＣ３２〜３５を使用して３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞により生産される力価は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈベクター（ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社））、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を使用して３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞において顕著に高かった。
【図２１】図２１は、ＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲ及びゲノムＤＮＡ  ＰＣＲ分析に使用したプライマー配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
[0040]単語「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」の使用は、特許請求の範囲及び／又は明細書中の「含む」という用語との関係で用いられるときは、「１つ」を意味する場合もあるが、また「１つ又は複数」、「少なくとも１つ」及び「１つ又は複数以上」を意味することとも整合する。
【００２１】
[0041]本願において「約」という用語は、ある値が、その値を測定するために使用される方法／装置において固有の誤差変動を有するか、又は試験対象物中にかかる変動が存在することを示すために用いられる。典型的には、用語は、状況に応じて、およそ１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％の、又はそれ未満の変動性を含むことを意味する。
【００２２】
[0042]特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、それが単なる代替物であるか、又は該代替物を排他的に含まないことを意図することが明確に示されない限り、「及び／又は」を意味するものとするが、本開示では、かかる代替物及び「及び／又は」に関連する定義に関するサポートは設けている。
【００２３】
[0043]本明細書及び請求項（複数含む）において用いられる単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（また例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などのあらゆる同義語）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（また例えば「ｈａｖｅ」及び「ｈａｓ」などのあらゆる同義語）、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（また例えば「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」及び「ｉｎｃｌｕｄｅ」などのあらゆる同義語）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（また例えば「ｃｏｎｔａｉｎｓ」及び「ｃｏｎｔａｉｎ」などのあらゆる同義語）は、包括的であるか又はオープンエンドであり、更なる、記載されていないエレメント又は方法ステップを排除するものではない。本明細書で述べられるいかなる実施形態も、本発明のいかなる方法、システム、宿主細胞、発現ベクター及び／又は組成物に関して実施されることができると考えられる。さらにまた、本発明の組成物、システム、細胞及び／又はベクターは、本願明細書に記載される方法のいずれかを実施するために用いることができる。
【００２４】
[0044]用語「例えば」及びその対応する省略形「ｅ．ｇ．」（イタリック体か否かを問わない）の使用は、記載される具体的な用語が開示の代表的な例及び実施形態であって、特に断りのない限り、参照される又は引用される具体例に限定されるものではないことを意味する。
【００２５】
[0045]本開示は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、（ｉｉｉ）Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。
【００２６】
[0046]「核酸」、「核酸分子」又は「オリゴヌクレオチド」は、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。用語「核酸」には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）及びポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が包含され、そのいずれも、一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡには、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミド若しくはベクターＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが包含されるが、これらに限定されない。ＲＮＡには、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＭＩＲＮＡが包含されるが、これらに限定されない。
【００２７】
[0047]用語「組換え」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質に関して用いるときは、天然に存在することが公知でない遺伝的物質の新規な組み合わせ、又はそれらの結果物を意味する。組換え分子は、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子切断（例えば制限エンドヌクレアーゼを使用）及び核酸分子、ペプチド又はタンパク質の固相合成などの、組換技術の分野において利用可能な周知技術のいずれかにより調製することができる。いくつかの実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが公知でないウイルスベクター又はウイルスを指し、例えば、ウイルスベクター又はウイルス中に１つ又は複数の変異、核酸挿入又は異種遺伝子を有するウイルスベクター又はウイルスを指す。いくつかの実施形態では、「組換え」は、天然に存在することが公知でない細胞又は宿主細胞を指し、例えば細胞又は宿主細胞中に１つ又は複数の変異、核酸挿入又は異種遺伝子を有する細胞又は宿主細胞を指す。
【００２８】
[0048]「単離された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、その天然の環境から取り出された分子である。「単離された」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド又は核酸は、賦形剤（例えば希釈剤又はアジュバント）と共に調製されてもよく、それによっても、未だ単離されたと考えられる。
【００２９】
[0049]核酸配列又はアミノ酸配列の文脈における用語「配列同一性」又は「％同一性」とは、ある複数の配列が指定された比較ウインドウで整列配置されたときの、比較された配列中の同一である残基のパーセンテージを意味する。比較ウインドウは、配列が整列配置されることができる及び比較されることができる、少なくとも１０〜１０００以上の残基のセグメントでありうる。配列同一性の決定のためのアラインメント方法は、従来技術において周知であり、一般公開されているデータベース（例えばＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ．））を使用して実施できる。
【００３０】
[0050]いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、それぞれ、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。本開示の特定の実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と、それぞれ、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチド又は核酸分子は、参照ポリペプチド又は核酸分子と、それぞれ、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％の配列同一性を有する。
【００３１】
[0051]本明細書において、「プロモーター」、「プロモーター配列」又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合させることができ、下流のコード配列又は非コード配列の転写開始に関与するＤＮＡ制御領域／配列を指す。本開示のいくつかの例において、プロモーター配列は、転写開始点を含み、上流側に向かって、バックグラウンドよりも高い検出可能なレベルで転写開始するのに必要最小限の塩基又はエレメントを含む。いくつかの実施形態では、プロモーター配列は、転写開始点、並びにＲＮＡポリメラーゼを結合させる役割を果たすタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、常にではないがしばしば、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターなどの各種のプロモーターを、例えば本開示の宿主細胞又はベクターにおいて用いて、遺伝子発現を駆動させうる。いくつかの実施形態では、プロモーターはリーク発現をもたらすプロモーターではなく、すなわち、該プロモーターは、本願明細書に記載される遺伝子産物のいずれか１つを構成的に発現しない。
【００３２】
[0052]本願明細書の用語「哺乳動物細胞」には、哺乳動物綱に属するあらゆるメンバーに由来する細胞（例えばヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞、ハムスター細胞及びその他）が包含される。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアント（例えばＣＨＯＫ１ＳＶ  ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）を含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（ＸＣｅｅｄ（登録商標）、Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。
【００３３】
[0053]本願明細書の用語「染色体に組み込まれた」又は「染色体への組込み」は、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）の染色体への核酸配列の安定な取り込み、すなわち、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）の染色体のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に核酸配列が組み込まれることを指す。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれる核酸配列は安定である。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれる核酸配列は、プラスミド又はベクターに配置されない。いくつかの実施形態では、染色体に組み込まれる核酸配列は切除されない。いくつかの実施形態では、染色体への組込みは、クラスター形成され一定の間隔をあけられた短いパリンドロームリピート（ＣＲＩＳＰＲ）、及びＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）遺伝子編集システム（ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ）により媒介される。
【００３４】
[0054]本明細書で用いられる「組換え標的部位特異的組込み」又は「部位特異的組込み」という用語は、交換可能であり、また１つ又は複数の遺伝子を宿主細胞染色体に導入するために用いることができる。参照により本願明細書に組み込む、Ｂｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３８１：８０１−８１３（２０００），  Ｋｏｌｂ，  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ４：３８１−３９２（２００２）及びＣｏａｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ２３：４０７−４１９（２００５）を参照。いくつかの実施形態では、「組換え標的部位特異的組込み」又は「部位特異的組込み」は、ある核酸配列を染色体の特異的な部位に組み込むことを指す。いくつかの実施形態では、部位特異的組込みは、部位特異的組換えによってなされる。いくつかの実施形態では、「部位特異的組換え」は、配列又は標的部位のそれらの同族対での組換えを触媒する特異的な酵素による、２つのＤＮＡパートナー分子の再編成を指す。部位特異的組換え及び部位特異的組込みは、相同組換えとは対照的に、パートナーＤＮＡ分子の間にごくわずかなＤＮＡ相同性しか必要とせず、ＲｅｃＡとは独立しており、またいかなる段階においてもＤＮＡ複製が関与しない。いくつかの実施形態では、部位特異的組換えは、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）における核酸の部位特異的組込みを触媒する部位特異的リコンビナーゼシステムを使用する。リコンビナーゼシステムは、典型的には、２つの特異的なＤＮＡ配列（組換え標的部位）、及び特異的な酵素（リコンビナーゼ）の３つのエレメントからなる。リコンビナーゼは、複数の特異的な組換え標的部位間での組換え反応を触媒する。
【００３５】
[0055]当業者に公知の他の手段を用いて、所望の核酸配列（例えば遺伝子）の１つ又は複数を挿入してもよい。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の核酸配列（例えば遺伝子）を、相同組換えを用いて染色体に挿入する。「相同組換え」とは、ヌクレオチド配列が、２つの類似又は同一のＤＮＡ分子間で交換される遺伝的組換えを指す。いくつかの実施形態では、削除／挿入の標的とされる領域（例えば遺伝子）が、相同組換えにより削除／挿入される。例えば、削除／挿入の標的とされる領域に相同性を有する配列が両側に隣接する選択マーカーを有するインカミング（ｉｎｃｏｍｉｎｇ）配列を含むＤＮＡ構築物が用いられる。ＤＮＡ構築物は、宿主染色体の相同配列と整列配置され、二重交差イベントにおいて、標的とされる領域が、（ｉ）宿主の染色体から切除されるか、又は（ｉｉ）染色体に挿入される。いくつかの実施形態では、相同組換えは、組換え標的部位、アデノウイルス（Ａｄ）遺伝子（例えばＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせ）、及び／又はＡｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターの挿入には用いられない。
【００３６】
[0056]リコンビナーゼ酵素又はリコンビナーゼは、部位特異的組換えにおいて、組換えを触媒する特異的な酵素である。本開示のいくつかの実施形態では、部位特異的組換えに使用するリコンビナーゼは、非哺乳動物の系に由来する。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、細菌、バクテリオファージ又は酵母に由来する。
【００３７】
[0057]いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをコードする核酸配列は、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）に組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼをコードする核酸配列は、分子生物学において公知の他の方法により宿主細胞に送達される。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼのポリペプチド配列を直接細胞に送達してもよい。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼは、Ｃｒｅリコンビナーゼ、Ｄｒｅリコンビナーゼ、ＫＤリコンビナーゼ、Ｂ２Ｂ３リコンビナーゼ、Ｈｉｎリコンビナーゼ、Ｔｒｅコンビナーゼ、λインテグラーゼ、ＨＫ０２２インテグラーゼ、ＨＰ１インテグラーゼ、γδレゾルバーゼ／インベルターゼ、ＰａｒＡレゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｔｎ３レゾルバーゼ／インベルターゼ、Ｇｉｎレゾルバーゼ／インベルターゼ、φＣ３１インテグラーゼ、ＢｘＢ１インテグラーゼ、Ｒ４インテグラーゼ又は他の機能性リコンビナーゼ酵素である。例えば、Ｔｈｏｒｐｅ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：  ５５０５−５５１０（１９９８）、Ｋｕｈｓｔｏｓｓ  ＆  Ｒａｏ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：８９７−８９０（１９９１）、米国特許第５，１９０，８７１号明細書、Ｏｗ  ＆  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １５５：７０４−７１３（１９８３）、Ｍａｔｓｕｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７８：３３７４−３３７６（１９９６）、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７２：１０９２−１０９８（１９９０）、Ｓｔｒａｇｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：５０７−５１２（１９８９）、Ｃａｒｒａｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：  ７４−８３（１９９４）、Ｂａｎｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６：５３５−５５１（１９９５）、Ｃｒｅｌｉｎ  ＆  Ｒｏｏｄ，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７９：５１４８−５１５６（１９９７）を参照。
【００３８】
[0058]いくつかの実施形態では、本願明細書に記載されるリコンビナーゼはＦＬＰリコンビナーゼである。ＦＬＰリコンビナーゼは、ＤＮＡ複製の間、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の２μｍプラスミドのコピー数の増幅に関係する部位特異的組換え反応を触媒するタンパク質である。いくつかの実施形態では、本開示のＦＬＰリコンビナーゼはサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の種に由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼはサッカロマイセス・セレビシエに由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼでサッカロマイセス・セレビシエの株に由来する。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼは耐熱性の変異型ＦＬＰリコンビナーゼである。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼはＦＬＰ１又はＦＬＰｅである。いくつかの実施形態では、ＦＬＰリコンビナーゼをコードする核酸配列は、ヒトにおいて最適化されたコドンを含む。
【００３９】
[0059]いくつかの実施形態では、リコンビナーゼはＣｒｅリコンビナーゼである。Ｃｒｅ（ｃａｕｓｅｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）は、リコンビナーゼのＩｎｔファミリーのメンバーであり（Ａｒｇｏｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  ５：４３３）、細菌のみならず真核細胞においても、ｌｏｘ部位（ｌｏｃｕｓ  ｏｆ  Ｘ−ｉｎｇ  ｏｖｅｒ）の効率的な組換えを行うことが示されている（Ｓａｕｅｒ（１９８７）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ７：２０８７、Ｓａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８５：５１６６）。いくつかの実施形態では、本願明細書に記載され、使用されるＣｒｅリコンビナーゼは、バクテリオファージに由来する。いくつかの実施形態では、ＣｒｅリコンビナーゼはＰ１バクテリオファージに由来する。
【００４０】
[0060]本明細書に記載される用語「組換え標的部位」、「ＲＴＳ」及び「部位特異的リコンビナーゼ標的部位」は、短い（例えば６０未満の塩基対の）核酸部位又は配列を指し、それは部位特異的リコンビナーゼにより認識され、部位特異的組換えイベントの間の交差領域となる。頭字語「ＲＴＳ」は、単一の組換え標的部位又は複数の組換え標的部位のいずれかを指す。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、約６０未満の塩基対、約５５未満の塩基対、約５０未満の塩基対、約４５未満の塩基対、約４０未満の塩基対、約３５未満の塩基対又は約３０未満の塩基対である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、約３０〜約６０の塩基対、約３０〜約５５の塩基対、約３２〜約５２の塩基対、約３４〜約４４の塩基対、約３２の塩基対、約３４の塩基対又は約５２の塩基対である。ＲＴＳの例には、ｌｏｘ部位、ｒｏｘ部位、Ｆｒｔ部位、ａｔｔ部位及びｄｉｆ部位が包含されるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＲＴＳは、表１、２、３又は４のいずれかに示される配列と実質的に同じ配列を有する核酸である。
【００４１】
[0061]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表１から選択されるｌｏｘ部位である。本願明細書に記載の用語「ｌｏｘ部位」は、Ｃｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないｌｏｘ部位が当技術分野で公知である。各種のｌｏｘ部位の配列は、組換えが起こる８塩基の対非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対の逆向き反復配列をそれら全てが含むという点で類似している。部位の方向性、及び各種のｌｏｘ部位の変動性の原因となるのは、非対称コア領域である。これらの（非限定的な）例としては、天然のｌｏｘＰ（Ｐ１ゲノムに存在する配列）、ｌｏｘＢ、ｌｏｘＬ及びｌｏｘＲ（これらは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）染色体に存在）、並びにいくつかの変異型又は改変型ｌｏｘ部位（例えばｌｏｘＰ５１１、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ１１７、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ２、ｌｏｘＰ３、ｌｏｘＰ２３、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ２及びｌｏｘＰ３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、ｌｏｘΔ８６、ｌｏｘΔ１１７、ｌｏｘＣ２、ｌｏｘＰ２、ｌｏｘＰ３及びｌｏｘＰ２３から選択されるｌｏｘ部位である。いくつかの実施形態では、ｌｏｘのＲＴＳは、表１に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００４２】
【表１】
2020507331.tif 000003
【００４３】
[0062]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表２から選択されるＦｒｔ部位である。本願明細書に記載の用語「Ｆｒｔ部位」は、酵母の２μｍプラスミドのＦＬＰ遺伝子の産物（ＦＬＰリコンビナーゼ）が部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないＦｒｔ部位が当技術分野で公知である。各種のＦｒｔ部位の配列は、組換えが起こる８塩基の対非対称コア領域に隣接する同一の１３塩基対の逆向き反復配列をそれら全てが含むという点で類似している。部位の方向性、及び各種のＦｒｔ部位の変動性の原因となるのは、非対称コア領域である。これらの（非限定的な）例には、天然のＦｒｔ及びいくつかの変異型又は改変型Ｆｒｔ部位（例えばＦｒｔ１、Ｆｒｔ２）が包含される。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、Ｆｒｔ（Ｆ）、Ｆｒｔ  Ｆ１（Ｆ１）、Ｆｒｔ  Ｆ２（Ｆ２）、Ｆｒｔ  Ｆ３（Ｆ３）、Ｆｒｔ  Ｆ４（Ｆ４）又はＦｒｔ  Ｆ５（Ｆ５）から選択されるＦｒｔ部位である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、Ｆｒｔ  Ｆ６（Ｆ６）、Ｆｒｔ  Ｆ７（Ｆ７）、Ｆｒｔ  Ｆ１４（Ｆ１４）、Ｆｒｔ  Ｆ１５（Ｆ１５）又はＦｆ６１から選択されるＦｒｔ部位である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、Ｆ２１５１、Ｆｗ２、Ｆ２１６１及びＦ２２６２から選択されるＦｒｔ部位である。いくつかの実施形態では、Ｆｒｔ組換え標的部位は、表２に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００４４】
【表２】
2020507331.tif 000004
【００４５】
[0063]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表３から選択されるｒｏｘ部位である。本願明細書に記載の用語「ｒｏｘ部位」は、Ｄｒｅリコンビナーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないｒｏｘ部位が当技術分野で公知である。これらの（非限定的な）例としては、ｒｏｘＲ及びｒｏｘＦが包含される。いくつかの実施形態では、ｒｏｘ組換え標的部位は、表３に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００４６】
【表３】
2020507331.tif 000005
【００４７】
[0064]いくつかの実施形態では、ＲＴＳは、表４から選択されるａｔｔ部位である。本願明細書に記載の用語「ａｔｔ部位」は、λインテグラーゼ又はφＣ３１インテグラーゼが部位特異的組換えを触媒できるヌクレオチド配列を指す。様々な同一でないａｔｔ部位が当技術分野で公知である。これらの（非限定的な）例としては、ａｔｔＰ、ａｔｔＢ、ｐｒｏＢ、ｔｒｐＣ、ｇａｌＴ、ｔｈｒＡ及びｒｒｎＢが包含される。いくつかの実施形態では、ａｔｔ組換え標的部位は、表４に示す配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸である。
【００４８】
【表４】
2020507331.tif 000006
【００４９】
[0065]本願明細書に記載される用語「別個の組換え標的部位」は、同一でない、又は異種特異的な組換え標的部位を指す。例えば、いくつかのバリアントＦｒｔ部位が存在するが、組換えは通常、同一の２つのＦｒｔ部位の間でのみ起こりうる。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換え系（例えばＬｏｘＰ及びＬｏｘＲ）に由来する同一でない組換え標的部位を指す。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、異なる組換え系（例えばＬｏｘＰ及びＦｒｔ）に由来する同一でない組換え標的部位を指す。いくつかの実施形態では、別個の組換え標的部位は、同じ組換え系に由来する組換え標的部位と、異なる組換え系に由来する組換え標的部位との組み合わせ（例えばＬｏｘＰ、ＬｏｘＲ、Ｆｒｔ及びＦｒｔ１）を指す。
【００５０】
[0066]各種のＲＴＳの組み合わせが使用できる。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜６から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２８〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号７〜２１から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２２〜２３から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２４〜２７から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号２８〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：ＬｏｘＰ＿５１１、Ｆｒｔ＿Ｆ５、Ｆｒｔ及びＬｏｘＰ。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：Ｆｒｔ＿Ｆ１４及びＦｒｔ＿Ｆ１５。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：ＬｏｘＰ＿５１１、Ｆｒｔ＿Ｆ５、Ｆｒｔ、ＬｏｘＰ、Ｆｒｔ＿Ｆ１４及びＦｒｔ＿Ｆ１５。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含んでもよい：Ｆｒｔ＿１、Ｆｒｔ＿２、Ｆｒｔ＿３、Ｆｒｔ＿４。いくつかの実施形態では、少なくとも４つの別個のＲＴＳを含む細胞は、以下のＲＴＳを含む：Ｆｒｔ＿ｍ５、Ｆｒｔ＿ｗｔ、Ｆｒｔ＿ｍ１４、Ｆｒｔ＿ｍ１５、Ｆｒｔ＿ｍ７及びＦｒｔ＿ｍ６。
【００５１】
[0067]本願明細書に記載される用語「ランディングパッド」は、宿主細胞において染色体に組み込まれる第１の組換え標的部位を含む核酸配列を指す。いくつかの実施形態では、ランディング部位は、宿主細胞において染色体に組み込まれる２つ以上の組換え標的部位を含む。いくつかの実施形態では、細胞は１、２、３、４、５、６、７又は８つのランディングパッドを含む。いくつかの実施形態では、ランディングパッドは、最大１、２、３、４、５、６、７又は８つの別個の染色体座位に組み込まれる。
【００５２】
[0068]本願明細書に記載される用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス科のファミリーの、二本鎖ＤＮＡを含む二十面体ヌクレオカプシドを有する非エンベロープ型ウイルスを指す。５０超のアデノウイルスのサブタイプがヒトから単離され、多くの更なるサブタイプが他の哺乳動物及び鳥類から単離されている。鳥類。例えば、Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌｓ，”  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  ｅｄ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．  ４９７−５６２（１９８４）、Ｓｔｒａｕｓｓ，  “Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ，”  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  ｅｄ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．Ｙ．，  ｐｐ．４５１−５９６（１９８４）を参照。これらのサブタイプは、アデノウイルス科のファミリーに属し、それは現在では２つの属（すなわちマストアデノウイルス属及びアビアデノウイルス属）に分類される。すべてのアデノウイルスは、形態学的及び構造的に類似している。しかしながら、ヒトにおいて、アデノウイルスは、異なる免疫学的特性を示し、すなわち血清型に分類される。アデノウイルスの２つのヒト血清型（すなわちＡｄ２及びＡｄ５）が重点的に研究されており、アデノウイルスに関する多数の全般的情報が提供されている。
【００５３】
[0069]「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡである核酸分子が包含される。「遺伝子」はまた、コーディング配列に先行する（５’非コード配列）及び続く（３’非コード配列）制御配列として作用することができる核酸断片を指すこともある。いくつかの実施形態では、遺伝子は、複数のコピーで組み込まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子は、所定のコピー数で組み込まれる。
【００５４】
[0070]本願明細書に記載される用語「アデノウイルス遺伝子」又は「ＡＶ遺伝子」は、１つ又は複数のアデノウイルスサブタイプ又は血清型に由来する１つ又は複数の核酸配列から構成される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングに関与する遺伝子である。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２、又はそれらの組み合わせ、又は他のいずれかのＡｄ遺伝子である。いくつかの実施形態では、本開示は、Ａｄ遺伝子の１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２の１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ及びＥ１Ｂを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ及びＥ２Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ及びＥ２Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ２Ａ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、前記Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ａ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ及びＥ２Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ１Ｂ及びＭＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ及びＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ２Ａ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ４を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ４及びＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＥ４及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＶＡを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＭＩＲ３４２を含む。いくつかの実施形態では、本発明者らは、Ａｄ遺伝子がＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含むとき、Ａｄ遺伝子が染色体に組み込まれ、より一貫したＡｄ遺伝子発現が観察されることを見出している。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２から選択される１つ又は複数を含む。
【００５５】
[0071]本願明細書に記載される用語「制御エレメント」は、核酸配列の発現のいくつかの態様を制御する遺伝的エレメントを指す。本明細書において用いられる「プロモーター」は、作動可能に連結されたコード領域の転写開始を促進する制御エレメントである。いくつかの実施形態では、プロモーターはＡｄプロモーターである。本明細書において用いられる「ＡＶプロモーター」という用語は、アデノウイルス系に由来するかかる制御エレメントを指す。いくつかの実施形態では、プロモーターはＡＡＶプロモーターである。本明細書において用いられる「ＡＡＶプロモーター」という用語は、アデノ随伴ウイルスの系に由来するかかる制御エレメントを意味する。いくつかの実施形態では、本開示は、ＡＡＶプロモーターの１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。本明細書において用いられる「非ＡＶプロモーター」という用語は、非アデノウイルス系に由来するかかる制御エレメントを指す。いくつかの実施形態では、非ＡＶプロモーターは原核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、非ＡＶプロモーターは真核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、本開示は、プロモーターの１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、非Ａｄプロモーターの１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、Ａｄプロモーターの１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。いくつかの実施形態では、プロモーターは非ＡＡＶプロモーターである。本明細書において用いられる「非ＡＡＶプロモーター」という用語は、アデノ随伴ウイルスの系に由来しないかかる制御エレメントを意味する。いくつかの実施形態では、非ＡＡＶプロモーターは原核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、非ＡＡＶプロモーターは真核生物の系に由来する。いくつかの実施形態では、本開示は、非ＡＡＶプロモーターの１つ又は複数が細胞において染色体に組み込まれた細胞を提供する。
【００５６】
[0072]本願明細書に記載される用語「作動可能な組み合わせにおいて」、「作動可能な順序で」及び「作動可能に連結される」は、所定の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を誘導できる核酸分子が生産される態様での核酸配列の結合を指す。用語はまた、機能性タンパク質が得られる態様でのアミノ酸配列の結合を指す場合もある。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、Ａｄ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は非Ａｄプロモーターに作動可能に連結され、Ａｄ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はＡｄプロモーターに作動可能に連結され、Ａｄ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、ＡＡＶ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は非ＡＡＶプロモーターに作動可能に連結され、ＡＡＶ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子はＡＡＶプロモーターに作動可能に連結され、ＡＡＶ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧＯＩ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、ＧＯＩ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧＯＩ遺伝子は非ＧＯＩプロモーターに作動可能に連結され、ＧＯＩ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれない。
【００５７】
[0073]いくつかの実施形態では、制御エレメントは、遺伝子発現を、外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、Ａｄ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、ＡＡＶ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧＯＩはプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、ＧＯＩは宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、リコンビナーゼ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、リコンビナーゼ遺伝子は宿主細胞の染色体のゲノムに組み込まれない。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａ発現はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現をｒＡＡＶの生産に作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａ発現はプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは遺伝子発現を外因的に供給されたリガンドの存在に作動可能に連結し、遺伝子発現は、外因的に供給されたリガンドの存在をｒＡＡＶの生産に作動可能に連結する。
【００５８】
[0074]いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、２つの異なる座位にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、同じ座位にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、同じ座位にあり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子は異なる座位にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、同じ座位にあり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子及びＡＡＶベクターカセットは異なる座位にある。
【００５９】
[0075]本願明細書に記載される用語「染色体座位」は、少なくとも１つの遺伝子を含みうる、細胞の染色体上の核酸の、所定の位置を指す。いくつかの実施形態では、染色体座位は、約５００塩基対〜約１００，０００塩基対、約５，０００塩基対〜約７５，０００塩基対、約５，０００塩基対〜約６０，０００塩基対、約２０，０００塩基対〜約５０，０００塩基対、約３０，０００塩基対〜約５０，０００塩基対又は約４５，０００塩基対〜約４９，０００塩基対である。いくつかの実施形態では、染色体座位は、所定の核酸配列の５’又は３’末端から最大約１００塩基対、約２５０塩基対、約５００塩基対、約７５０塩基対又は約１０００塩基対伸長する。いくつかの実施形態では、染色体座位は内因性の核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、分子生物学の当業者に公知の方法を使用して染色体に組み込まれた外因性のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内に、染色体座位内に組み込まれる遺伝子によりコードされるタンパク質を強力かつ安定に生産させるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内に、ウイルス遺伝子を強力かつ安定に発現させるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、宿主細胞のゲノム内にて、効率的に部位特異的な組換えを生じさせるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４（例えば米国特許出願第１４／４０９，２８３号を参照）、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨＡ又はＭＧＡＴ１を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位はＮＬ１又はＮＬ２を含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロンを含む。いくつかの実施形態では、染色体座位は、発現増強及び安定性領域（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社、タリータウン、ＮＹ、ＥＥＳＹＲ、例えば米国特許第７，７７１，９９７号明細書を参照）である。いくつかの実施形態では、染色体座位の少なくとも一部の核酸は欠失している。
【００６０】
[0076]いくつかの実施形態では、染色体座位は、表Ａに記載されるＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞に関し、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、２つの異なる座位にあり、そのうちの１つは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内にある。いくつかの実施形態では、第１のＡｄ遺伝子Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ、並びにＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子は、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内にある。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも３つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞に関し、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞に関し、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも５つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞に関し、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む哺乳動物細胞に関し、少なくとも１つのＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、ＮＬ１座位、ＮＬ２座位、ＮＬ３座位、ＮＬ４座位、ＮＬ５座位又はＮＬ６座位内に組み込まれる。
【００６１】
【表５】
2020507331.tif 000007
2020507331.tif 000008
【００６２】
[0077]当業者は「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語が、座内のいかなる部分への組込みも包含し、それが示されるゲノム座標にのみ限定されないことを理解するであろう。当業者は「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語が、対応する生物における対応する座も包含するものと理解するであろう。したがって、いくつかの実施形態では、「ＮＬ１座位内で組み込まれる」又は「ＮＬ２座位内で組み込まれる」という用語は、示されるゲノム座標の約５０，０００ｂｐ以内、約４０，０００ｂｐ以内、約３０，０００ｂｐ以内、２０，０００ｂｐ以内又は１０，０００ｂｐ以内への組込みを包含するであろう。
【００６３】
[0078]いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。
【００６４】
[0079]本願明細書に記載される用語「２つのＲＴＳの間に位置する」とは、２つのＲＴＳの間に位置する遺伝子を指し、すなわち、ＲＴＳの１つが遺伝子の５’に位置し、別のＲＴＳが遺伝子の３’に位置することを指す。いくつかの実施形態において、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子に直接隣接して位置する。いくつかの実施形態において、ＲＴＳは、それらの間に位置する遺伝子から所定の距離を置いて位置する。いくつかの実施形態において、ＲＴＳは方向性を有する配列である。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの間に位置する遺伝子の５’及び３’は、順方向に配向される（すなわち、それらは同じ方向に配向する）。いくつかの実施形態では、ＲＴＳの間に位置する遺伝子の５’及び３’は、逆方向に配向される（すなわち、それらは異なる方向に配向する）。
【００６５】
[0080]いくつかの実施形態では、細胞はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、前記ＡＡＶ遺伝子は染色体に組み込まれる。ＡＡＶ遺伝子は、いずれかのＡＡＶ血清型由来のいずれかの遺伝子を備える。いくつかの実施形態において、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｃａｐ、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス２型由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルスＡｎｃ８０由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、ＡＮＣ８０  Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００６６】
[0081]本願明細書に記載される用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」は、パルボウイルス科及びディペンドパルボウイルス属のファミリーの、一本鎖ＤＮＡを含む、小型の、複製能の不完全な、非エンベロープ型ウイルスを指す。１０超のアデノ随伴ウイルス血清型がこれまでに同定され、なかでも血清型ＡＡＶ２が最も良く特徴づけられている。ＡＡＶ血清型の他の（非限定的な）例は、ＡＮＣ８０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１である。これらの血清型に加え、ＡＡＶ偽型が開発されている。ＡＡＶ偽型は、第１の血清型のカプシドと、第２の血清型のゲノムを含む（例えば、偽型ＡＡＶ２／５は、血清型ＡＡＶ２のゲノムと、ＡＡＶ５のカプシドを有するＡＡＶに対応する）。
【００６７】
[0082]本明細書で用いられる「組換えＡＡＶ」又は「ｒＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ  ＩＴＲが５’及び３’側に隣接する異種遺伝子をカプシド化する（すなわち、コートタンパク質で囲む）ＡＡＶタンパク質シェルを含む、感染性の、複製能が不完全なウイルスを指す。
【００６８】
[0083]本明細書で使用する「複製コンピテントアデノウイルス（ＲＣＡ）」という用語は、組換えアデノウイルスベクターとプロデューサー細胞ゲノムに存在するアデノウイルス遺伝子との間の相同組換えにより生じるｒＡＡＶ生産の間にしばしば生産される、活性アデノウイルス粒子の望ましくない混入物を意味する。
【００６９】
[0084]本願明細書に記載される用語「アデノ随伴ウイルス遺伝子」は、１つ又は複数のアデノ随伴ウイルスの血清型に由来する１つ又は複数の核酸配列から構成される遺伝子を指す。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、ＡＡＶの複製及びパッケージングに関与する遺伝子である。
【００７０】
[0085]本願明細書に記載される用語「Ｒｅｐ」遺伝子は、当業者に公知の、ウイルスゲノムの複製に集合的に必要とされるウイルスの複製タンパク質、又は、例えばヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）ｒｅｐ遺伝子など（ＡＡＶ−２  ＤＮＡ複製を媒介することが公知）の、その機能的ホモログをコードするＡＡＶゲノムの領域を意味する。したがって、ｒｅｐのコード領域は少なくとも、ＡＡＶのＲｅｐ７８及びＲｅｐ６８（「長い形態の形Ｒｅｐ」）並びにＲｅｐ５２及びＲｅｐ４０（「短い形態のＲｅｐ」）をコードする遺伝子又はその機能的ホモログを含む。ＡＡＶのｒｅｐのコード領域の更なる説明のために。本発明で用いられるｒｅｐのコード領域は、いかなるウイルス血清型（例えば上記のＡＡＶ血清型）に由来してもよい。適切な標的細胞において発現されるときに、存在するｒｅｐ遺伝子が充分な組込み機能を示す限り、領域はすべての野生型遺伝子を含む必要があるわけではなく、（例えばヌクレオチドの挿入、削除又は置換により）改変されたものであってもよい。例えば、Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｎ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５８：９７−１２９（１９９２）及びＫｏｔｉｎ，  Ｒ．  Ｍ．，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１（１９９４）を参照。
【００７１】
[0086]本願明細書に記載される用語「Ｃａｐ」遺伝子は、当業者に公知の、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするＡＡＶゲノム中の領域を指す。これらのカプシドタンパク質の（非限定的な）例は、ＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３である。本開示において使用するＣａｐ遺伝子は、いかなるＡＡＶ血清型又はＡＡＶ血清型の組み合わせに由来してもよい。
【００７２】
[0087]いくつかの実施形態では、細胞は第２のＡｄ遺伝子を含み、第２のＡｄ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００７３】
[0088]いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含み、ＡＡＶベクターカセットは染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、２つのＲＴＳの間に位置する。
【００７４】
[0089]「ベクター」又は「発現ベクター」は、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス又はコスミドなどのレプリコンであり、それに対して他のＤＮＡ断片が連結され、細胞内において当該連結されたＤＮＡ断片の複製及び／又は発現がなされる。「ベクター」には、エピソーム性（例えばプラスミド）及び非エピソーム性のベクターが含まれる。本開示のいくつかの実施形態では、ベクターはエピソーム性のベクターであり、それは、例えば非対称的な分離により、度重なる細胞世代を経た後で細胞集団から除去され／失われる。用語「ベクター」は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボで核酸分子を細胞に導入するためのウイルス性及び非ウイルス性の手段を包含する。用語ベクターには、合成ベクターが包含されうる。ベクターは、トランスフェクション、トランスダクション、細胞融合及びリポフェクションを含むがこれに限定されない周知の方法により、所望の宿主細胞に導入できる。ベクターは、プロモーターを含む各種の制御エレメントを含んでもよい。
【００７５】
[0090]本発明で用いられる「トランスフェクション」は、ベクターを含む外因性の核酸分子を細胞に導入することを意味する。「トランスフェクトされた」細胞は、細胞内に外因性の核酸分子を含み、また「変換された」細胞は、細胞内の外因性の核酸分子により細胞の表現型の変化が誘導されたものである。トランスフェクトされた核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる場合も、及び／又は、細胞により、染色体外において一時的に維持されるか若しくは長期間維持される場合もある。外因性の核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、「組換え」、「形質転換」又は「トランスジェニック」生物と呼ばれる。多くのトランスフェクション技術が従来技術において一般に公知である。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６（１９７３）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９８６）及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  １３：１９７（１９８１）を参照。かかる技術を用いて、１つ又は複数の外来性ＤＮＡ部分（例えばＡＡＶベクターカセット、ＡＡＶヘルパー構築物及び他の核酸分子）を適切な宿主細胞に導入することができる。
【００７６】
[0091]本明細書において、「交換可能なカセット」又は「カセット」という用語は、遺伝子及び組換え部位を含む一種の可動的な遺伝的エレメントである。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットは少なくとも２つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットはレポーター遺伝子又は選択遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、カセットは、リコンビナーゼにより媒介されるカセット交換（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃａｓｓｅｔｔｅ−ｅｘｃｈａｎｇｅ：ＲＭＣＥ）により交換される。
【００７７】
[0092]本願明細書に記載される用語「ＡＡＶベクターカセット」は、アデノ随伴ウイルス血清型ベクターに由来するカセットを指す。ＡＡＶベクターカセットは、ＡＡＶ野生型遺伝子の１つ又は複数、例えばＲｅｐ及び／又はＣａｐ遺伝子を全部又は部分的に欠失してもよいが、機能的に隣接する逆向き末端リピート（ＩＴＲ）配列を保持する。
【００７８】
[0093]本願明細書に記載される用語「機能的に隣接する逆向き末端リポート」又は「機能的に隣接するＩＴＲ」という用語は、ＡＡＶベクターカセットに対する関心（ＧＯＩ）の遺伝子の５’及び３’末端に配置される、最初の１２５塩基対がＹ字又はＴ字形のデュプレックス構造を形成できる１４５塩基対のＩＴＲ配列を指す。ＩＴＲ配列は、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケージング及び組込みのために必要とされる最小限の配列を表す。
【００７９】
[0094]本願明細書に記載される用語「補助的遺伝子」、「ヘルパー遺伝子」及び「補助的ヘルパー遺伝子」は、ｒＡＡＶの複製又はパッケージングを補助する第１の遺伝子を指すものとして交換可能に用いられる。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子はウイルス遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子はＡｄ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子はＡＡＶ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ＡＡＶ遺伝子、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は原核細胞遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は真核細胞遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ＲＮＡをコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子はインターフェロン（ＩＦＮ）アンタゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）阻害剤であるタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、インフルエンザＮＳ１タンパク質をコードする遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ワクチニアウイルスＥ３Ｌタンパク質をコードする遺伝子を含む（例えばｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １５：５４５−５２，（２００８）を参照）。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、感染細胞におけるＩＦＮ反応に対して逆作用する、ウイルスによりコードされる可溶性ＩＦＮ−α／β受容体おとりをコードする。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ＮＳ１、Ｅ３Ｌ又は類似のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ヘルパー遺伝子は、ＮＳ１、Ｅ３Ｌ又は相同な配列若しくはモチーフを有するタンパク質をコードする。
【００８０】
[0095]本願明細書に記載される「目的遺伝子」又は「ＧＯＩ」という用語は、異種遺伝子を記載するために用いる。本願明細書に記載される「異種遺伝子」又は「ＨＧ」という用語は、コーディング配列又は制御配列などの核酸配列に関連する場合には、通常では結合されず、及び／又は通常では特定の細胞との関連がない、核酸配列（例えば遺伝子）を意味する。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、コーディング配列自体が天然で見つからない構築物（例えば天然遺伝子と異なるコドンを有する合成配列）である。アレルの変動又は天然に生じる変異イベントは、本発明で用いられるような異種ＤＮＡを生じさせない。
【００８１】
[0096]いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。
【００８２】
[0097]本願明細書に記載される「レポーター遺伝子」は、その発現が、細胞に対して容易に同定でき及び測定できる表現型を付与する遺伝子のことである。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は蛍光タンパク質遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子は選択遺伝子を含む。
【００８３】
[0098]本願明細書に記載される用語「選択遺伝子」は、通常の必須栄養素が欠損する培地において増殖する能力を付与するための酵素活性をコードする遺伝子の使用を指し、加えて、選択遺伝子は、該選択遺伝子が発現される細胞に抗生物質又は薬剤に対する耐性を付与できるものであってもよい。選択遺伝子を用いて、宿主細胞に特定の表現型を与えてもよい。宿主細胞が、選択培地において増殖しようとするときに選択遺伝子を発現しなければならない場合、該遺伝子はポジティブセレクション遺伝子と呼ばれる。また選択遺伝子は、特定の遺伝子を含む宿主細胞に対する選択に用いることもでき、このように用いられる選択遺伝子はネガティブセレクション遺伝子と呼ばれる。
【００８４】
[0099]本願明細書に記載される用語「治療目的遺伝子」は、何らかの機能的関連性のあるヌクレオチド配列を指す。すなわち、本開示の治療目的遺伝子は、標的細胞のゲノムにおいては不完全であるか又は失われている、何らかのタンパク質をコードする必要な遺伝子、又は、所望の生物学的又は治療的効果（例えば抗ウイルス機能）を有する非天然タンパク質をコードする遺伝子、を含んでもよく、又は、その配列はアンチセンス又はリボザイム機能を有する分子に対応するものであってもよい。適切な治療目的遺伝子の（非限定的な）代表例としては、炎症性疾患、自己免疫、慢性及び伝染性疾患（ＡＩＤＳ、癌、神経系疾患、心血管疾患、過剰コレスタ血症などの障害を含む）、各種の貧血、地中海貧血症及び血友病などの各種の血液疾患、遺伝子欠損（例えば嚢胞性線維形成、ゴーシェ疾患、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損、気腫など）の治療のために使用される遺伝子が挙げられる。癌に対する、及びウイルス疾患に対するアンチセンス療法において有用であるいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばｍＲＮＡの翻訳開始部位（ＡＵＧコドン）周辺の配列に対する相補的短鎖オリゴヌクレオチド）は従来技術文献において記載され、また適切な治療目的遺伝子の例でもある。
【００８５】
[00100]いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。本願明細書に記載される「ヘルパーウイルス」は、アデノ随伴ウイルスの複製及びパッケージングを可能にするために添加される何らかの非ＡＡＶウイルスである。ヘルパーウイルスの（非限定的な）代表例は、アデノウイルス及びヘルペスウイルスである。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを実質的に含まないという用語は、細胞当たり１００未満、１０未満又は１未満のヘルパーウイルスを有する細胞を指す。いくつかの実施形態では、ヘルパーウイルスを実質的に含まないという用語は、ヘルパーウイルスが存在しない細胞、又はヘルパーウイルスが周知の検出方法を用いても検出されない細胞の集団のことを指す。いくつかの実施形態では、野生型ヘルパーウイルスが細胞に存在しない。いくつかの実施形態では、用語「野生型ウイルス」は、他のいかなるウイルスとも独立して細胞において複製できる、あらゆる完全な非ＡＡＶウイルスを指す。
【００８６】
[00101]いくつかの実施形態では、本発明は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）アデノウイルス（Ａｄ）遺伝子のＥ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせと、（ｉｉｉ）Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞（例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標））、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（例えばＸＣＥＥＤ（商標））、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。
【００８７】
[00102]いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、ＮＬ３、ＮＬ４、ＮＬ５、ＮＬ６、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である（ＥＥＳＹＲ）。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は第２のＡｄ遺伝子を更に含み、第２のＡｄ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子を更に含み、ＡＡＶ遺伝子は染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、アデノ随伴ウイルス２型由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含み、ＡＡＶベクターカセットは染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。
【００８８】
[00103]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、（ｉｉ）Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子とを含み、ＲＴＳ及びＡＡＶ遺伝子が染色体に組み込まれている哺乳動物細胞を提供する。いくつかの実施形態では、細胞は、マウス細胞、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞（例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）ＰＯＴＥＬＬＩＧＥＮＴ（登録商標））、すべてのバリアントを含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞、付着適応及び懸濁適応バリアントを含むＨＥＫ２９３細胞、ヒーラ細胞又はＨＴ１０８０細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は４つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、細胞は６つのＲＴＳを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＴＳは、配列番号１〜３０から選択される。いくつかの実施形態では、ＲＴＳ及びＡＡＶは、単一の染色体座位に組み込まれている。いくつかの実施形態では、染色体座位は、Ｆｅｒ１Ｌ４、ＲＯＳＡ２６、ＨＧＰＲＴ、ＤＨＦＲ、ＣＯＳＭＣ、ＬＤＨａ、ＭＧＡＴ１、ＧＲＩＫ１、ＮＬ１、ＮＬ２、Ｘ染色体上のＭＩＤ１の第１イントロン、又は発現増強及び安定性領域である（ＥＥＳＹＲ）。いくつかの実施形態では、細胞は、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、部位特異的リコンビナーゼ遺伝子は、染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、Ａｄ遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを更に含み、それにより、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれる。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、Ａｄ遺伝子は、Ａｄ５由来である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞はＡＡＶベクターカセットを更に含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、目的遺伝子は、２つのＲＴＳの間に位置する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、細胞は、ヘルパーウイルスを完全に含まない。
【００８９】
[00104]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも１つのＲＴＳが配列番号１〜３０からなる群から選択される、６つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターは染色体に組み込まれ、また、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子であって、２つのＲＴＳの間に位置する第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子であって、２つのＲＴＳの間に位置するＡＡＶ遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子又は治療目的遺伝子を含み、２つのＲＴＳの間に位置する、ＡＡＶベクターカセットとを含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供する。
【００９０】
[00105]いくつかの実施形態では、本開示は、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子及び該Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターと、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ及びＭＩＲ３４２を含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ及びＣａｐを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を提供する。
【００９１】
[00106]いくつかの実施形態では、本開示は、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが染色体に組み込まれている細胞を用意するステップと、用意された細胞に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子、第２のＡｄ遺伝子、ＡＡＶベクターカセット又はそれらの組み合わせをコードする交換可能なカセットを含むベクターをトランスフェクトするステップと、染色体に交換可能なカセットを組み込むステップと、染色体に組み込まれた交換可能なカセットを有するｒＡＡＶプロデューサー細胞を選択するステップとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）プロデューサー細胞を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、第２のＡｄ遺伝子及びＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、の２つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションは、第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、の２つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクションが、第２のＡｄ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第１のベクターと、ＡＡＶ遺伝子を含む交換可能なカセットを含む第２のベクターと、ＡＡＶベクターカセットを含む交換可能なカセットを含む第３のベクターと、の３つのベクターによりなされる。いくつかの実施形態では、各交換可能なカセットは、細胞の２つのＲＴＳにマッチングする２つのＲＴＳを更に含む。いくつかの実施形態では、本発明者らは、細胞がそれらの遺伝的構成において相同であるため、ＳＳＩの使用が、トランスフェクトした細胞からのクローニングの必要性を排除することを見出している。
【００９２】
[00107]２つのＲＴＳ配列に関する用語「マッチング」は、リコンビナーゼと結合して、２つの配列間での部位特異的組換えに影響を及ぼしうる能力を有する２つの配列を意味する。いくつかの実施形態では、細胞のＲＴＳにマッチングする交換可能なカセット上のＲＴＳは、細胞のＲＴＳと実質的に同一の配列を有する該カセット上のＲＴＳを指す。いくつかの実施形態では、交換可能なカセットは、細胞において染色体に組み込まれた１つ又は２つのＲＴＳと実質的に同一の配列を含む。
【００９３】
[00108]いくつかの実施形態において、「組み込む」という用語は、交換可能なカセットの染色体への組込み（例えば挿入）を指す。いくつかの実施形態では、組込みは、部位特異的リコンビナーゼにより媒介される。
【００９４】
[00109]いくつかの実施形態では、用語「選択」は、染色体に組み込まれたマーカーを含む細胞を同定することを指す。いくつかの実施形態では、選択は、周知の方法を用いたマーカーの存在の検出により行う。いくつかの実施形態では、選択は、周知の方法を用いたマーカーの不存在の検出により行う。
【００９５】
[00110]いくつかの実施形態では、第２のＡｄ遺伝子は、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ遺伝子は、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターカセットは、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含む。
【００９６】
[00111]いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）宿主細胞にｒＡＡＶを感染させるステップと、（ｉｉ）ＡＡＶベクターカセットでパッケージングされたＡＡＶを生産させるステップと、（ｉｉｉ）パッケージングされたｒＡＡＶを精製するステップとを含み、宿主細胞が、少なくとも４つの別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）と、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ又はそれらの組み合わせを含むアデノウイルス（Ａｄ）遺伝子と、Ａｄ遺伝子に作動可能に連結されるプロモーターとを含み、ＲＴＳ、Ａｄ遺伝子及びプロモーターが、染色体に組み込まれ、また宿主細胞が、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４、ＶＡ、ＭＩＲ３４２又はそれらの組み合わせを含む第２のＡｄ遺伝子と、Ｒｅｐ、Ｃａｐ又はそれらの組み合わせを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子と、レポーター遺伝子、選択遺伝子、治療目的遺伝子又はそれらの組み合わせを含むＡＡＶベクターカセットとを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を生産する方法を提供する。いくつかの実施形態では、生きている野生型ヘルパーウイルスが、ｒＡＡＶの生産及びパッケージングに必要とされない。いくつかの実施形態では、Ｅ１Ａの発現は、ｒＡＡＶ生産のために必要とされない。いくつかの実施形態では、最小限で１．０×１０９ｖｇ／ｍＬの活性ｒＡＡＶが、精製後に得られる。本開示のいくつかの実施形態では、ｒＡＡＶは、複製コンピテントアデノウイルス（ＲＣＡ）を実質的に含まずに生産される。例えば、本開示のいくつかの実施形態では、ＲＣＡは精製前には検出限界以下である。ウイルス粒子の定量化方法は、当業者に公知であり、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析、感染滴定アッセイ、エンドポイント希釈アッセイ及びウイルスプラークアッセイなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＡＡＶプロデューサー細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、プロデューサー細胞のプールの遺伝的構造を相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＡＡＶプロデューサー細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、プロデューサー細胞のプールを効率的に相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＡＡＶプロデューサー細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、プロデューサー細胞のプールを、第２のヘルパー遺伝子に対する第１のヘルパー遺伝子の比率において相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＡＡＶプロデューサー細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、プロデューサー細胞のプールを、治療目的遺伝子に対するヘルパー遺伝子の比率において相同なものとすることを見出した。いくつかの実施形態では、本発明者らは、ｒＡＡＶプロデューサー細胞の調製におけるＳＳＩの使用が、より一貫したｒＡＡＶ産物の品質保持が可能となることを見出した。
【００９７】
[00112]本発明で使用する「アミノ酸」とは、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）及びアミノ（−ＮＨ２）基を含む化合物を意味する。「アミノ酸」は、天然の、及び非天然の、すなわち合成された、アミノ酸を指す。天然アミノ酸（その３文字及び１文字標記と併記する）には、アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（システイン；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が含まれる。
【００９８】
[00113]用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本願明細書においては交換可能に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態のことを指し、それには、変性ペプチド主鎖を有するコード化及び非コード化アミノ酸、化学的又は生化学的に修飾された又は誘導体化されたアミノ酸及びポリペプチドが包含される。
【００９９】
[00114]原核及び／又は真核細胞株などの望ましい細胞株を、本願明細書に記載されるいかなる好適な装置、施設及び方法を使用して培養することができる。さらに、いくつかの実施形態では、装置、施設及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（付着）細胞の培養に適しており、例えばポリペプチド製品、核酸製品（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は、例えば細胞及び／若しくはウイルス及び微生物治療に使用される哺乳動物若しくは微生物の細胞、及び／又は、ウイルスなどの、薬学的及び生物薬学的製品、の製造用に構成された製造操作に適する。
【０１００】
[00115]いくつかの実施形態では、細胞は、例えば治療用又は診断用の組換え製品などの製品を発現するか又は生産する。以下に詳細に説明するように、細胞により生産される製品の例としては、限定されないが、抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティック（抗原と特異的に結合するが、抗体とは構造的な関連性がないポリペプチド分子（例えばＤＡＲＰｉｎ、ａｆｆｉｂｏｄｙ、ａｄｎｅｃｔｉｎ又はＩｇＮＡＲ）、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えばグリコシル化タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療薬（例えば抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子治療及びウイルス免疫療用のウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成人幹細胞）、ワクチン又は脂質封入粒子（例えばエキソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ）、又はＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡなど）（抗生物質）又はアミノ酸が挙げられる。実施形態では、装置、施設及び方法は、バイオシミラーの製造に用いられうる。
【０１０１】
[00116]上記のように、実施形態では、装置、施設及び方法は、真核細胞（例えば哺乳動物細胞）又は下等真核細胞（例えば酵母細胞若しくは糸状菌細胞）、又は原核細胞（例えばグラム陽性若しくはグラム陰性細胞）、及び／又は真核細胞により合成される、真核若しくは原核細胞の産物（例えばタンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡ）の、大規模スケールにて製造することを可能にする。いくつかの実施形態では、微生物叢治療において利用される微生物及びその胞子の使用も開示される。本願明細書において特に明記しない限り、装置、施設及び方法には、限定されないが、ベンチスケール、パイロットスケール及び最大生産スケールなど、あらゆる望ましい容量又は生成能力のものが包含されうる。
【０１０２】
[00117]さらに、本願明細書において特に明記しない限り、装置、施設及び方法は、あらゆる適切な反応器を備えてもよく、限定されないが、撹拌槽、エアーリフト、線維、マイクロファイバー、中空糸、セラミックマトリックス、流動床、固定床及び／又はスパウテッドベッドバイオリアクターが挙げられる。本明細書において、「反応器」は、培養槽又は培養ユニット、又は他のいかなる反応容器を備えてもよく、用語「反応器」は「培養槽」と交換可能に用いられる。「培養槽」又は「培養」という用語は、微生物及び哺乳動物組織のいずれの培養をも指す。例えば、いくつかの態様において、一例としてのバイオリアクターユニットは、栄養分及び／又は炭素源のフィード、適切なガス（例えば酸素）注入、発酵培地又は細胞培地の吸排気、気液相の分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、撹拌（例えば回転）及び／又は洗浄／殺菌、のうちの１つ又は複数又は全てを行うことができる。例示的な反応器ユニット（例えば培養ユニット）は、ユニット内に複数の反応器を備えてもよく、例えば、当該ユニットは１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０又は１００又はそれ超のユニットのバイオリアクターを有してもよく、及び／又は、施設には、施設内に単一の又は複数の反応器を有する複数のユニットを設置してもよい。各種実施形態では、バイオリアクターは、バッチ、セミフェドバッチ、フェドバッチ、潅流及び／又は連続発酵プロセスに適したものとしうる。反応器の直径を適宜調節しうる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの容量としうる。非限定的な例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１Ｌ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、５Ｌ、６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌ、１０Ｌ、１５Ｌ、２０Ｌ、２５Ｌ、３０Ｌ、４０Ｌ、５０Ｌ、６０Ｌ、７０Ｌ、８０Ｌ、９０Ｌ、１００Ｌ、１５０Ｌ、２００Ｌ、２５０Ｌ、３００Ｌ、３５０Ｌ、４００Ｌ、４５０Ｌ、５００Ｌ、５５０Ｌ、６００Ｌ、６５０Ｌ、７００Ｌ、７５０Ｌ、８００Ｌ、８５０Ｌ、９００Ｌ、９５０Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、２５００Ｌ、３０００Ｌ、３５００Ｌ、４０００Ｌ、４５００Ｌ、５０００Ｌ、６０００Ｌ、７０００Ｌ、８０００Ｌ、９０００Ｌ、１０，０００Ｌ、１５，０００Ｌ、２０，０００Ｌ及び／又は５０，０００Ｌの容量が挙げられる。さらに、適切な反応器は、複数回使用用、一回使用用、使い捨て可能、又は非使い捨て可能であってもよく、合金製（例えばステンレス鋼（例えば、３１６Ｌ又は他のいかなる適切なステンレス鋼）及びインコネル）、プラスチック製及び／又はガラス製など、いかなる適切な材料により形成されてもよい。
【０１０３】
[00118]実施形態では、本願明細書において特に明記しない限り、本願明細書に記載される装置、施設及び方法は、その他の記載されていないいずれの適切な操作ユニット及び／又は器材、例えば分離、精製及びかかる製品の単離のための操作ユニット及び／又は器材を備えてもよい。いかなる適切な施設及び環境を使用してもよく、例えば従来の現場組立施設、モジュール式、移動式及び仮設式の施設、又は他のいかなる適切な建設物、施設及び／又はレイアウトを使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態ではモジュール式のクリーンルームを使用してもよい。さらに、特に明記しない限り、本願明細書に記載される装置、システム及び方法は、単一の場所又は施設の中において格納され、及び／又は実施してもよく、或いは別々の又は複数の場所及び／又は施設の中において格納され、及び／又は実施してもよい。
【０１０４】
[00119]適切でありうる施設、器材及び／又はシステムの非限定的な例としては、限定されないが、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、第２０１２／００７７４２９号、第２０１１／０２８０７９７号、第２００９／０３０５６２６号、並びに米国特許第８，２９８，０５４号、第７，６２９，１６７号及び第５，６５６，４９１号に記載のものが挙げられ、それらの全開示内容を参照により本願明細書に組み込む。
【０１０５】
[00120]実施形態では、細胞は真核細胞（例えば哺乳動物細胞）である。例えば、哺乳動物細胞は、ヒト又は齧歯目又はウシの細胞系又は細胞株でありうる。例えば、かかる細胞、細胞系又は細胞株の例としては、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（乳児ハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７）、ＱＣ１−３、ＨＥＫ２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬａ、ＥＢｌ、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解性又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来の細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（Ｌｏｎｚａ社のＸｃｅｅｄ（登録商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎシステム（Ｌｏｎｚａ社、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）の一部）である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ社、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）である。真核細胞は、鳥類の細胞、細胞株又は細胞系統（例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖｌ３）であってもよい。
【０１０６】
[00121]いくつかの実施形態では、真核細胞は幹細胞である。幹細胞は、例えば多能性幹細胞であってもよく、例えば胚幹細胞（ＥＳＣ）、成人幹細胞、誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が挙げられる。
【０１０７】
[00122]一実施形態では、細胞は、本願明細書に記載される細胞のいずれかの分化形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中のいずれかの初代細胞から誘導された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞から誘導されたものではない。例えば、いくつかの実施形態では、細胞は、個体の患者から抽出され単離された、又は確立された細胞バンクから得た細胞（例えばリンパ球）として免疫療法において用いられる。いくつかの実施形態では、細胞には、遺伝的に操作された細胞（すなわちＣＡＲ−Ｔなど）が包含されうる。
【０１０８】
[00123]実施形態では、細胞は肝細胞（例えばヒト肝細胞、動物の肝細胞又は非実質細胞）である。例えば、細胞は、プレート培養可能な代謝試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能な誘導試験用ヒト肝細胞、プレート培養可能なＱｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁培養用ヒト肝細胞（１０ドナー及び２０ドナーをプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星状細胞、イヌ肝細胞（単一及びプールされたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（スピローグ−ドーリー、ウィスターハム及びウィスター肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（イエ・短毛ネコ肝細胞を含む）、及びウサギ肝細胞（ニュージランドホワイト肝細胞を含む）であってもよい。肝細胞は、例えばＴｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ＬＬＣ（６  デイビスドライブリサーチトライアングルパーク、ノースカロライナ、米国２７７０９）から市販されている。
【０１０９】
[00124]一実施形態では、真核細胞は下等真核細胞であり、例えば酵母細胞（例えばピキア属（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、及びピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ属（例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガタエラ・ファフィイ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロマイセス属（例えばサッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クリベロマイセス属（例えばクリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、カンジダ属（例えばカンジダ・ウチリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、カンジダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、カンジダ・ボイディニイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム属（例えば（ゲオトリクム・ファーメンタンスＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はシゾサッカロマイセス・ポンペ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））が挙げられる。ピキア・パストリスの種が好ましい。ピキア・パストリスの株の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５である。
【０１１０】
[00125]一実施形態では、真核細胞は菌類の細胞であり、例えばアスペルギルス（例えばＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ）、Ａ．ニドゥラ（Ａ．ｎｉｄｕｌａ））、アクレモニウム（例えばＡ．サーモフィラム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、カエトモニウム（例えばＣ．サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、クリソスポリウム（例えばＣ．サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ））、コルジセプス（例えばＣ．ミリタリス（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ））、コリナスクス（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クテノマイセス（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ）、フザリウム（例えばＦ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ））、グロメレラ（例えばＧ．グラミニコラ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ））、ヒポクレア（例えばＨ．ジェコリナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ））、マグナポルテ（例えばＭ．オリザエ（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ））、ミセリオフトラ（例えばＭ．サーモフィレ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、ネクトリア（例えばＮ．ヘマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ））、ニューロスポラ（例えばＮ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、ペニシリウム、スポロトリクム（例えばＳ．サーモフィレ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ））、チエラビア（例えばＴ．テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、Ｔ．ヘテロサリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ））、トリコデルマ（例えばＴ．リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））又はバーティシリウム（例えばＶ．ダーリア（Ｖ．ｄａｈｌｉａ））が挙げられる。
【０１１１】
[00126]一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９、Ｍｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えばアンフォラ（Ａｍｐｈｏｒａ）、珪藻、ドゥナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、クロレラ、クラミドモナス、シアノフィタ（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ）（シアノバクテリア）、ナノクロロピス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、スピルリナ又はオクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ））、又は植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、米、小麦又はエノコログサ）由来の細胞、又は双子葉植物（例えばカッサバ、ジャガイモ、大豆、トマト、タバコ、アルファルファ、ヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）又はアラビドプシス）由来の細胞である。
【０１１２】
[00127]一実施形態では、細胞は細菌又は原核細胞である。いくつかの実施形態では、原核細胞はグラム陽性細胞（例えばバシラス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス又はラクトバシラス）である。使用できるバシラスは、例えばＢ．サブティルス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．アミノリクエファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．ナットー（Ｂ．ｎａｔｔｏ）又はＢ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。実施形態では、細胞はＢ．サブティルス（例えばＢ．サブティルス３ＮＡ及びＢ．サブティルス１６８）である。例えば、バシラスは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６，  ４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ，  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４）から入手できる。
【０１１３】
[00128]一実施形態では、原核細胞はグラム陰性細胞、例えばサルモネラ菌ｓｐｐ．又は大腸菌（例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ  １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉ）、並びに、大腸菌Ｂ−株に由来する細胞（例えばＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３））であり、それらの全ては市販されている。適切な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの微生物収集機関から市販されている。いくつかの実施形態では、細胞には、治療薬として利用される他の微生物叢が包含される。これらは、ファーミキューテス、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ）、プロテオバクテリア（Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）、ベラムミクロビア（Ｖｅｒｒｕｍｉｃｒｏｂｉａ）、アクチノバクテリア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）、フゾバクテリア及びシアノバクテリアに属するヒトマイクロバイオームに存在する微生物叢を包含する。微生物叢には、好気性、絶対嫌気性又は通性嫌気性のいずれも包含され、また細胞又は胞子が包含される。治療的な微生物叢には、遺伝的に操作された生物及びそれらの操作において利用されるベクターも包含される。他のマイクロバイオーム関連の治療的な生物としては、アルケー、菌類及びウイルスが挙げられる。例えば、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４８６，  ２０７−２１４  （１４  Ｊｕｎｅ  ２０１２）、Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４８９（７４１５）：  ２５０−２５６（２０１２）、Ｌｌｏｙｄ−Ｐｒｉｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ８：５１（２０１６）を参照。
【０１１４】
[00129]いくつかの実施形態では、培養細胞を用いて、治療的使用のためのタンパク質、例えば抗体（例えばモノクローナル抗体）及び／又は組換えタンパク質を生産させる。実施形態では、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学的中間体又は代謝産物を生産する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトンから、約１４０，０００ダルトン超の分子量を有する分子を生産させることができる。実施形態では、これらの分子は、一定の範囲の複雑さを有する場合があり、グリコシル化などの翻訳後修飾を含む場合がある。
【０１１５】
[00130]実施形態において、タンパク質は、例えば、ボトックス、ミオブロック、ニューロブロック、ディスポート（又はボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼα、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、コリオゴナドトロピンα、フィルグラスチム、セトロレキシル、インターロイキン−２、アルデスロイキン、セテロイキン（ｃｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンディフィトックス、インターフェロンα−ｎ３（注入）、インターフェロンα−ｎｌ、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（γ−１ａ）、インターフェロンγ、サイモシンα１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ビペラタブ、エチタブ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ、エプトテルミンα、テリパラチド（骨粗鬆症）、カルシトニン注射可能剤（骨疾患）、カルシトニン（鼻、骨粗鬆症）、エタナーセプト、ヘモグロビングルタマー  ２５０（ウシ）、ドロトレコギンα、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子（局所ゲル、創傷癒合）、ＤＷＰ４０１、ダーベポエチンα、エポエチンω、エポエチンβ、エポエチンα、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグα、モノナイン、エプタコグα（活性化）、組換え因子ＶＩＩＩ＋ＶＷＦ、リコンビネート、組換え因子ＶＩＩＩ、因子ＶＩＩＩ（組換え）、アルフマート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグα、因子ＶＩＩＩ、パリフェルミン、インディキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、卵胞刺激ホルモンα、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イニグルセラーゼ、ガルスルファーゼ、ロイコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム、トリプトレリン酢酸塩、ヒステレリン（皮下インプラント、ハイドロン）、デスロレリン、ヒステレリン、ナファレリン、ロイプロリド持続的放出デポー（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリドインプラント（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、ユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ＫＰ−１０２プログラム、ソマトロピン、メカセルミン（成長不全）、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（頬、ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシチド注入、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、ベタセロン、酢酸ガラティラメル、ゲポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト白血球由来のαインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン−Ａ、インターフェロン−α２、アルファフェロン、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンα、アボネックス組換えヒト黄体化ホルモン、ドルナーゼα、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンα、アトシバン���ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、ＨＰＶワクチン（四価）、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼβ、アガルシダーゼα、ラロニダーゼ、酢酸プレザチド銅（局所ゲル）、ラスブリケース、ラニビズマブ、アクチミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、ＰＥＧ−イントロン、トリコミン、組換え型ダニアレルギー減感作注入剤、組換えヒト上皮小体ホルモン（副甲状腺ホルモン）１−８４（ｓｃ、骨粗鬆症）、エポエチンデルタ、トランスジェニック抗トロンビンＩＩＩ、グランジトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロン−α（経口トローチ剤）、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼインヒビター（血管性浮腫）、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフュービルタイド（ニードルフリー注射液、バイオジェクター（Ｂｉｏｊｅｃｔｏｒ）  ２０００）、ＶＧＶ−１、インターフェロン（α）、ルシナクタント、アビプタジル（吸入、肺疾患）、イカチバント、エカランチド、オミガナン、アウログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、ペキシガナンアセテート、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎ  ｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド（骨粗鬆症）、ティファコギン（ｔｉｆａｃｏｇｉｎ）、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション剤、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンα、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ダイアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン（持続的放出注入）、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン（吸入、ＡＩＲ）、インスリン（吸入、テクノスフィア（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ））、インスリン（吸入、ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンβ（Ｃ型肝炎ウイルス感染（ＨＣＶ））、インターフェロンα−ｎ３（経口）、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、キセレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、リンホスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド、ＭＰ５２（β−リン酸三カルシウム担体、骨再生）、黒色腫ワクチン、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテスペン（ｖｉｔｅｓｐｅｎ）、ヒトトロンビン（冷凍、外科手術出血）、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン（静脈、肝腎症候群）、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ（注射可能剤、血管疾患）、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン（吸入、嚢胞性線維形成）、ＳＣＶ−０７、��ＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボウマンビルク阻害剤濃縮物、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−ハイニック−アネキシンＶ、カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）（持続放出）、オザレリクス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン（ｉｂｏｃｔａｄｅｋｉｎ）、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、バイファシックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、ωインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、卵巣癌免疫療法ワクチン、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス（Ｏｎｃｏｖａｘ）−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、マルチエピトープペプチド黒色腫ワクチン（ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ）、ネミフィチド、ｒＡＡＴ（吸入）、ｒＡＡＴ（皮膚病学的）、ＣＧＲＰ（吸入、喘息）、ペグスネルセプト、チモシンβ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サーモンカルシトニン（経口薬、ｅｌｉｇｅｎ）、カルシトニン（経口薬、骨粗鬆症）、エキサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン、カルデバ（Ｃａｒｄｅｖａ）、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット、ヘマチド、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）（局所）、ｒＮＡＰｃ２、組換え因子Ｖ１１１（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ソノリシス  プロリーゼ、ニューロバックス（ＮｅｕｒｏＶａｘ）、ＣＺＥＮ−００２、膵島細胞新生治療薬、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（放出制御、メディソルブ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ−９６０４、ｌｉｎａｃｌｏｔｉｄ  ｅａｃｅｔａｔｅ、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン（Ｈｅｍｏｓｐａｎ）、ＶＡＬ（注射可能）、速効性インスリン（注射可能剤、ビアデル（Ｖｉａｄｅｌ））、鼻腔内インスリン、インスリン（吸入）、インスリン（経口、エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ（皮下注入、湿疹）、ピトラキンラ（吸入用乾燥粉末、喘息）、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０（自己免疫疾患／炎症）、タラクトフェリン（局所）、ｒＥＶ−１３１（眼）、ｒＥＶ−１３１（呼吸器疾患）、経口組換えヒトインスリン（糖尿病）、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン（経口）、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンα−ｎ３（局所）、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン、胆汁酸塩刺激されたリパーゼ、メリスパーゼ、アルカリホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン−��Ｉ、ブリメラノチド、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、マラリアワクチン（バイロソーム（ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ）、ＰｅｖｉＰＲＯ）、ＡＬＴＵ−１３５、パルボウイルスＢ１９ワクチン、インフルエンザワクチン（組換えノイラミニダーゼ）、マラリア／ＨＢＶワクチン、炭疽菌ワクチン、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、ＨＩＶワクチン（経口）、ＨＰＶワクチン、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）リポソームクリーム（ノバソーム（Ｎｏｖａｓｏｍｅ））、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨ類似体（局所、乾癬）、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆワクチン（結核）、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａワクチン（結核）、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換え疫病ＦＩＶワクチン、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７アレルゲンターゲッティングワクチン（ダニアレルギー）、ＰＲ１ペプチド抗原（白血病）、変異型ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）ワクチン（腺癌）、ＣＭＬワクチン、ＷＴ１−ペプチドワクチン（癌）、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン（皮膚病、糖尿病性足潰瘍）、ルピントリビル、レチクロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、αガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン治療ワクチン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７（経口薬、結核）、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素（抗癌）、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コムボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズマブ−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２（組換え）、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７（
局所）、Ｌ−１９ベースの放射性免疫治療剤（癌）、Ｒｅ−１８８  Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨワクチン（癌）、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１ワクチン（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、黒色腫ワクチン（治療的なパルス化抗原）、前立腺癌ワクチン、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン（ドライアイ）、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ（注射可能）、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］（肥満、鼻腔）、ＦＧＬＬ、アタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ）、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト上皮小体ホルモン１−３４（鼻、骨粗鬆症）、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００（セリアック病／糖尿病）、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）リポソームクリーム（ノバソーム）、デュラマイシン（眼、ドライアイ）、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポイエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、因子ＸＩＩＩ、アミノカンジン（ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（即時放出）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ（放出制御、バイオスフィア）、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン（肺疾患）、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト（血小板減少障害）、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト（痛み）、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、経口テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合ワクチン（テラポア（Ｔｈｅｒａｐｏｒｅ））、ＥＰ−１０４３、小児Ｓ肺炎ワクチン、マラリアワクチン、髄膜炎菌グループＢワクチン、新生児のグループＢ溶連菌ワクチン、炭疽菌ワクチン、ＨＣＶワクチン（ｇｐＥ１＋ｇｐＥ２＋ＭＦ−５９）、中耳炎治療、ＨＣＶワクチン（コア抗原＋イスコマトリックス（ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ））、ｈＰＴＨ（１−３４）（経皮、ＶｉａＤｅｒｍ）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン、ＢＩＭ−２３１９０、結核ワクチン、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、癌ワクチン、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ（固形腫瘍）（デスモプレシン）（頬、徐放性）、オネルセプト及びＴＰ−９２０１が挙げられる。
【０１１６】
[00131]いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢＴＨＥＲＡ（商標））エタナーセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））又は、バイオシミラー及びバイオベターを含む他のあらゆる適切なポリペプチドである。
【０１１７】
[00132]他の適切なポリペプチドは、下記の表６、及び米国特許出願公開第２０１６／００９７０７４号の表１に記載のものである。当業者であれば、本発明の開示が更に、本願明細書において記載されている製品及び／又はコンジュゲートの組み合わせ（すなわち、マルチプロテイン、修飾タンパク質（ＰＥＧ、毒素、他の活性成分へのコンジュゲート）を包含することを認識できるであろう。
【０１１８】
【表６】
2020507331.tif 000009
2020507331.tif 000010
2020507331.tif 000011
2020507331.tif 000012
【０１１９】
[00133]いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、表７に示すホルモン、血液凝固／凝固因子、サイトカイン／成長因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。
【０１２０】
【表７】
2020507331.tif 000013
2020507331.tif 000014
【０１２１】
[00134]いくつかの実施形態では、タンパク質は多重特異的なタンパク質（例えば表８で示す二重特異性抗体）である。
【０１２２】
【表８】
2020507331.tif 000015
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2020507331.tif 000017
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2020507331.tif 000020
【０１２３】
[00135]治療的タンパク質のためのシステムの利点を実現するため、表１０で概説されるように、複数のＲＴＳ部位を含むＣＨＯＫ１ＳＶ  ＳＳＩを、治療的タンパク質の発現を試験することができる。実験は、３つのフェーズに分けることができる；フェーズ１：多部位ＳＳＩの用途を試験し、ｑＰを増加させる；フェーズ２：多部位ＳＳＩの能力を試験し、２つのＳＳＩＳにわたる３遺伝子二重特異性ｍＡｂを発現させる；フェーズ３：１つの部位において補助的遺伝子を発現させ、他の部位においてコードされるＤｔＥタンパク質の発現を補助する。
【０１２４】
[00136]フェーズ１：単一のＲＴＳ部位を含むいくつかの細胞株の限定は、必要な転写単位の単一コピーが、臨床的製造のための適切な力価を発生させるのに十分でないということである。したがって、我々は、複数のＲＴＳを使用し、ｍＡｂ遺伝子の組み込まれたコピー数を増加させるオプションを評価することができる。かかる方法において、ｍＡｂ遺伝子を、ランディングパッドＡ及びＢの標的とすることができる。プールの均一性は、プロテインＡ  ＨＰＬＣによって上清のＦＡＣＳソーティング及び分析によって決定することができる。
【０１２５】
[00137]フェーズ２：大多数の次世代抗体（例えば四価の二重特異性抗体）の場合、複数の重鎖又は軽鎖の会合は繰り返し起こる課題である。極めて少ない不必要な副産物量の最適な生成物の品質を得るため、安定的及び高い再現性で、４つの抗体鎖を発現する適切なＣＨＯクローンの選択が有効である。その結果、クローン選択の間、ＥＬＩＳＡ、ＲＰ−ＨＰＬＣ又はＣＤ−ＳＤＳを利用する多くの生成物の解析がしばしば必要とされる。しかしながら、複数のＲＴＳを含む細胞株では、複数鎖のタンパク質をコードする遺伝子は、空間的に個々のプロモーターを有する形で２つの部位に切り離される。これにより、個々の鎖のコピー数及び相対的な発現がトランスフェクタントプールと早い時期に整合することが確実となり、コード化される転写単位のプロモーター強度又はコピー数の操作による個々のポリペプチド鎖の取得可能性の効果的な経験的微調整が可能となる。この利点としては、生成物の品質がより均一となり、ＳＳＩ生成プール及び細胞株から生産されるミスフォールディングされた複数鎖組換えタンパク質の比率が減少し、初期段階での評価の必要性が劇的に減少することが挙げられる。試験分子：セルグツマブ  アムナロイキン（ｃｅｒｇｕｔｕｍａｂ  ａｍｕｎａｌｅｕｋｉｎ）。
【０１２６】
[00138]フェーズ３：ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞株の分泌能力の増加をもたらす内因性タンパク質の発現は、生成物の力価を増加させる確立された方法である。候補は国際公開第２０１５／０１８７０３Ａ１号パンフレットから同定することができ、複数の別個の組換え標的部位（ＲＴＳ）を含む細胞株に対して、表９及び１０のそれらを評価することができる。生成物の力価はプロテインＡ  ＨＰＬＣによって測定することができ、抗体会合体はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＩＥＦによって評価することができる。試験分子：リツキシマブ、ｃＢ７２．３、インフリキシマブ及びエタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）。
【０１２７】
【表９】
2020507331.tif 000021
【０１２８】
【表１０】
2020507331.tif 000022
【実施例】
【０１２９】
実施例１：アデノウイルス５ウイルスとの同時感染による、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）の一過性のＡＡＶ生産
[00139]ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）（Ｌｏｎｚａ社、Ｓｌｏｕｇｈ、英国）細胞が、生物学的にｒＡＡＶベクタータンパク質を生産し、組立てることができるか否かを決定するため、野生型Ａｄ５ウイルス（カタログ番号：ＡＴＣＣ（登録商標）ＶＲ−１５１６（商標）、ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、米国）の存在下で、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞を、２つのプラスミド、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）コントロールベクター（カタログ番号：ＡＡＶ−４００  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、サンディエゴ、米国）（図６）によってトランスフェクトした。天然条件では、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞は、それがウイルス受容体を欠いているため、アデノウイルスを受容しないが、カチオン性トランスフェクション試薬（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ又はＰＥＩ）の存在下では、負に荷電するアデノウイルス５が、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞に入ることが可能となるため、すべてのヘルパーエレメントが提供される。このコンセプトは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞がすべてのエレメント（トランスフェクションによるＲｅｐ−Ｃａｐ及びＧＯＩ、及び感染によるＡｄ５エレメント）を提供される本評価実験を設計する際に用いられた。細胞をトランスフェクション／感染後７２時間において回収し、４回の凍結／解凍サイクルを繰り返して溶解させ、続いてベンゾナーゼ処置を行う、あらゆるプラスミドＤＮＡを消化させた。ライセートを用い、ＡＡＶ力価についてｑＰＣＲによって試験し、また導入遺伝子（緑色蛍光タンパク質：ＧＦＰ）の発現についてＨＥＫ２９３へのトランスダクション効率によって試験した。本実験のコントロールとして、付着ＨＥＫ２９３細胞を用い、３重トランスフェクション（ｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）、ｐＡＡＶ−ＧＦＰ（ＡＡＶ−４００、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）（図６））したＨＥＫ２９３からの細胞ライセートを、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）（ｐＡＡＶ−ＧＦＰ）をトランスフェクトし、野生型Ａｄ５を感染させたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞と同様に解析した。実験の概略及び本実験の結果を図１に示す。トランスフェクション後、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において緑色の蛍光が検出され、トランスフェクションが成功したことを示す（図１Ｂ、左パネル）。トランスフェクション後のＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞のライセートを用い、ＨＥＫ２９３細胞の形質導入を行ったが、低い緑色の蛍光がＨＥＫ２９３細胞において検出されるのみであり（図１Ｂ、右パネル）、ＡＡＶの低レベルの生産を示唆するものであった。ｑＰＣＲデータは、６．８Ｅ＋０９ｖｇ／ｍＬのＡＡＶ力価を示す（図１Ｃ）。ポジティブコントロールである、３重トランスフェクトしたＨＥＫ２９３では、予想どおり、１．８ｅ＋１２の高いＡＡＶ力価を生産し、一方陰性対照（ＨＥＫ２９３  ＧＦＰトランスフェクション）においてはＡＡＶは生産されなかった。要約すると、これは、ＡＡＶのパッケージングに必要とされるすべての公知のゲノムエレメントを提供されるとき、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞がＡＡＶを生産することができることを初めて示す実験である。
【０１３０】
実施例２：ウイルス同時感染のないＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）の一過性のｒＡＡＶ生産
[00140]ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞が、野生型Ａｄ５ウイルスがない場合にｒＡＡＶを生産できるか否か決定するため、Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５に類似のアプローチにより、Ａｄ５  Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂを発現する細胞を作製した。ＴＥＴオンプロモーター（ｐＭＦ３０、図２）の制御下でＥ１Ａを、構成的ヒトＣＭＶプロモーター（ｐＭＦ２３、図３）及びＡｄ５  Ｅ１Ａ−Ｅ１Ｂのオープンリーディングフレーム（ｐＸＣ１７．４＿１７ＡＶ５ＰｅｒＰｒｏＫＺ、図４）の制御下でＥ１Ｂを発現するプラスミド構築物を構築した。ｐＭＦ３０をトランスフェクトし、５０μＭのＬ−ＭＳＸを補充したグルタミンフリー培地において生存可能である細胞を選択することによって、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）由来のプールを構築した（図５Ａ）。次に、このＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１ＡをｐＭＦ２３によってトランスフェクトし、５０μＭのＬ−ＭＳＸ及び１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを補充したグルタミンフリー培地において生存可能である細胞を選択した（図５Ａ）。水コントロールをゲノムＤＮＡ  ＰＣＲの全てにおいて混在させたが、Ｅ１ＡのＰＣＲ産物がＨＥＫ２９３Ｆ及びＨＥＫ２９３Ｌ細胞及びｐＸＣ１７．４＿１７ＡＶ５ＰｅｒＰｒｏＫＺにおいて増幅されたことは明白である（図１Ｂ）。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ（ＭＯＣＫ）及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ  Ｅ１Ｂ（Ｅ１Ａ  Ｅ１Ｂ）プールをドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）で０（未処理）、２、３、４及び７日間処理し、ＴＥＴプロモーター及びＥ１Ａ転写を活性化し、次に、Ｅ１Ａ（図１Ｄ）及びＥ１Ｂ（図１Ｅ）のためのプライマーを使用した逆転写ＰＣＲのために、ｍＲＮＡを単離した。その結果、ドキシサイクリンによって処理したＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ  Ｅ１Ｂプール及びＨＥＫ２９３Ｌ細胞において、Ｅ１Ａ  ２４３Ｒ及びＥ１Ａ  １７１Ｒのレベルが高いことが示された。Ｅ１Ｂ  ｍＲＮＡ産物の量は、ドキシサイクリン処理の後で変化しなかったが、ＨＥＫ２９３Ｌ細胞では顕著に高かった。Ｅ１Ａタンパク質は、７日間ドキシサイクリンで処理したＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ  Ｅ１Ｂプールにおいて検出された（Ｅ１Ａ  Ｅ１Ｂ）が、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＭＯＣＫ（ＭＯＣＫ）タンパク質ライセートにおいては検出できなかった（図５Ｆ）。次に、このＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）Ｅ１Ａ＿Ｅ１Ｂプールを用いて、ドキシサイクリン（２μｇ／ｍｌ）の有無におけるｒＡＡＶの生産能力を試験した。Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂタンパク質の高発現を確実にするため、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞へのＥ１Ａ−Ｅ１Ｂプラスミド（ｐＸＣ１７．４＿１７ＡＶ５ＰｅｒＰｒｏＫＺ、図４）の一過性トランスフェクションも行った。これらのデータは、Ｅ１Ａタンパク質発現が、野生型Ａｄ感染の必要なくＣＨＯにおいて達成できることを示す。Ｅ１Ｂの組込み及び発現を確認することはより困難であった。
【０１３１】
実施例３：ウイルス同時感染のないＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３における永続的なｒＡＡＶ生産
[00141]組換えＣＨＯＫ１ＳＶ（商標）細胞株から同定される座位として、次のＲＭＣＥに適するランディングパッドを、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３ゲノムに組込みした（Ｆｅｒ１Ｌ４、ＮＬ１、２、３、４、５及び６、国際公開第２０１３／１９００３２Ａ１号パンフレット及び欧州特許出願公開第２７１１４２８Ａ１号明細書参照）。これらのランディングパッド内のエレメントの配置の概略図を図７Ａ、Ｂ及びＣに示す。ＳＶ４０Ｅプロモーターと選択マーカーとの間のＦｒｔ部位の配置により、次のＲＭＣＥのラウンドにおけるその使用が可能となる。適合しないＦｒｔ部位（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ）及び異なるレポーター／選択マーカーの使用により、これらの部位の独立した同定を確実にする。図８は、ＲＭＣＥ後の、ＣＨＯ及びＨＥＫ２９３由来のＳＳＩ細胞株におけるＡＡＶ、Ａｄ５及びＧＯＩ遺伝子の各種の配置を示し、１（図８Ａ）、２（図８Ｂ）及び３（図８Ｃ）の配置が存在する。
【０１３２】
[00142]ＨＥＫ２９３  ＳＳＩ宿主を生成するため、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  （ＵＣＳＣ）ヒトゲノムデータベースのスタンドアロンコピー（バージョン：２００６年３月（ＮＣＢＩ３６／ｈｇ１８））を使用し、ＣＨＯＫ１ＳＶ由来のベクター組込み部位、及びランディングパッド位置を、ヒトゲノムに対してＢＬＡＴ検索した。ＣＨＯＫ１ＳＶ配列の少なくとも２５塩基対において、９５％（以上）の配列類似性が同定された。類似の領域を、ＩＧＶビューア（Ｂｒｏａｄ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．４）で視覚化した。社内のＣｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９デザインツールを使用して、Ｃｒｉｓｐｒ−Ｃａｓ９  ｇＲＮＡをデザインした。ＣＨＯＫ１ＳＶ及びＨＥＫ２９３の座位を表Ａにまとめる。
【０１３３】
実施例４：補助的遺伝子発現は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）におけるｒＡＡＶ生産を強化する
[00143]哺乳類の生来の免疫系は、ウイルスのシグネーチャーを認識することによってウイルス感染を感知し、抗ウイルス反応（例えばＲＩＧ−１  ＩＦＮα反応）を活性化する。ＲＮＡサイレンシング又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が哺乳動物細胞の抗ウイルス機構として有用であるという証拠が多く存在する。哺乳動物のウイルスは、ＩＦＮアンタゴニスト（例えばインフルエンザＮＳ１タンパク質及びワクチニアウイルスＥ３Ｌタンパク質）をコードし（例えばｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １５：５４５−５２（２００８）を参照）、それらはＰＫＲを阻害し、またワクチニアウイルスによりコードされる可溶性のＩＦＮ−α／β受容体おとりは、感染細胞のＩＦＮ反応に逆作用する。ＩＦＮアンタゴニストの同時発現は、実施例２及び３において観察される低いＡｄ５及びＡＡＶ遺伝子発現を克服する、考えられるアプローチとして検討することができる。
【０１３４】
実施例５：部位特異的な組込みを用いたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）におけるｒＡＡＶ生産
セクション１：二重ランディングパッドＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主の構築
[00144]２つのランディングパッドをＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）宿主のゲノムに挿入することによって、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主を作製した（図９）。ランディングパッドＡは、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置し（表１０を参照）、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０Ｅ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ−ｅＧＦＰ融合遺伝子（Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ）及びＳＶ４０ポリアデニル化配列（ｐＡ）から構成される。Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ遺伝子及びＳＶ４０  ｐＡに対し、適合しないＦｒｔ部位（それぞれＦｒｔ＿５及びＦｒｔ＿ｗｔ）を隣接させ、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ゲノムへの組換え遺伝子のＲＭＣＥを促進にする。ランディングパッドＢは、ＮＬ１座位（表Ａを参照）に位置し、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０Ｅ）、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ−ＤｓＲｅｄ融合遺伝子（ＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ）及びＳＶ４０ポリアデニル化配列（ｐＡ）から構成される。ＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ遺伝子及びＳＶ４０  ｐＡには、適合しないＦｒｔ部位（それぞれＦｒｔ１４及びＦｒｔ１５）が隣接する。両方のランディングパッドにおいて、ＳＶ４０Ｅプロモーター及び選択マーカーの間にＦｒｔ部位を配置することにより、次のＲＭＣＥのラウンドにおけるその使用が可能となる。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のＲＭＣＥのために設計されたターゲッティングベクターは、目的のランディングパッドと互換性を有するＦｒｔ部位の３’のすぐ横に配置される陽性選択マーカー（例えばＧＳ）を含む（図９）。ベクターの残りの部分は、ランディングパッドの第２のＦｒｔ部位と互換性を有するＦｒｔ部位が続くＧＯＩのための転写単位を含む。ターゲッティングベクターＤＮＡ（図１０）を、Ｆｌｐリコンビナーゼを発現するベクターとコトランスフェクトする。トランスフェクション細胞を２４時間インキュベートし、次に選択圧を適用する（例えば培地からのグルタミンの除去）。ＲＭＣＥの成功は、Ｈｐｔ−ｅＧＦＰ又はＰＡＣ−ＤｓＲｅｄ遺伝子の喪失及び陽性選択マーカー遺伝子による置換によって示される。細胞は、蛍光顕微鏡下又はフローサイトメーター分析によると暗くみえる。陽性選択において復帰した非交換細胞は、ＦＡＣＳにより容易に除去される。
【０１３５】
セクション２：ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主と互換性を有するＲｅｐ−Ｃａｐ及びＧＯＩ発現ベクターの構築
[00145]Ｒｅｐ−Ｃａｐ及びＧＯＩ遺伝子を発現するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主由来のプールを生成するため（図９）、５つのベクターを設計した（ｐＬＭＣ３１〜３５、図１０Ａ〜Ｅ）。ｐＬＭＣ３１（図１０Ａ）は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主のＧＯＩ（ｅＧＦＰ）生産細胞株を作製するための標的ベクターである。ｅＧＦＰの転写は、ｈＣＭＶ主要中間体初期遺伝子１（ｈＣＭＶ）のプロモーターにより活性化され、β−グロビンポリアデニル化（ｐＡ）配列を使用する。全ての転写カセットは、ウイルスの複製及びパッケージングのために必要な唯一のシス活性エレメントである逆向き末端リピート（ＩＴＲ）が隣接する。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩ（ｎｐｔＩ）遺伝子は、Ｆｒｔ１４のすぐ３’側に配置され、ＮＬ１座位のランディングパッドに位置するＳＶ４０ＥプロモーターによりＲＭＣＥの転写が良好に活性化される。ｐＬＭＣ３２〜３５（図１０Ｂ〜Ｅ）は、ＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐを生産するＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主（図１０Ｂ〜Ｅ）細胞株を作製するための、ＡＡＶ  ｐ５プロモーターの高次構造が異なり、Ｒｅｐ−Ｃａｐ発現カセットを含む標的ベクターである。野生型ｐ５プロモーターにより生じる通常のＲｅｐ７８発現は、ＡＡＶ生産を阻害することが示されている。異なる高次構造を採用する目的は、Ｒｅｐ７８発現を低減させる一方で、Ｃａｐ発現を維持してＡＡＶ生産を最大にすることである。グルタミン合成酵素（ＧＳ）ｃＤＮＡをＦｒｔ５の３’側に隣接して配置し、Ｆｅｒ１Ｌ４座位のランディングパッドに位置するＳＶ４０Ｅプロモーターにより、好適なＲＭＣＥ転写を行わせた。ｐＬＭＣ３２（図１０Ｂ）は、２つのエンハンサーエレメントを除かれた最小のｐ５（白い四角）を含む。Ｃａｐ遺伝子の３’に位置する完全なｐ５（白黒の四角）は、Ｃａｐ発現を強化する。ｐＬＭＣ３３（図１０Ｃ）もまた、最小のｐ５プロモーター（白い四角）（ｐＬＭＣ３２と同様）を有するが、Ｃａｐ遺伝子の３’のｐ５ｍｕｔプロモーター（黒及び灰色の四角）は変異（ＧＧＧＧＧＧＧ）ＴＡＴＡボックスを含む。ｐＬＭＣ３４（図１０Ｄ）は、Ｒｅｐの５’にｐ５プロモーター（白黒の四角）を含み、ＧＧＧＧＧＧＧに変異したＴＡＴＡボックスを有するｐ５ｍｕｔプロモーター（黒及び灰色の四角）は、Ｃａｐの３’末端に位置する。ｐＬＭＣ３５（図１０Ｅ）は、両方のｐ５プロモーター（黒及び灰色の四角）にＴＡＴＡ変異を有する。ｐＬＭＣ３２〜３５は、ＧＳ  ｃＤＮＡ選択マーカーを使用する。
【０１３６】
セクション３：４つのＲｅｐ−Ｃａｐ構成を有する３重トランスフェクションによる、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）及びＨＥＫ２９３細胞におけるｒＡＡＶの生産
[00146]ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及びＲｅｐ−Ｃａｐ（ｐＬＭＣ３２〜３５）発現ベクターの、野生型Ａｄ５ウイルスと共感染したＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）又はｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）ベクターと共トランスフェクトしたＨＥＫ２９３における、ｒＡＡＶ生産を維持する能力を検討した。ウエスタンブロット解析において、Ｅ１Ａタンパク質発現（図１１Ａ）によってＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞への野生型Ａｄ５のトランスダクションを確認し、またＨＥＫ２９３細胞におけるｐＬＭＣ３１〜３５ベクターによる高レベルのＲｅｐ及びＣａｐタンパク質の発現、Ｒｅｐタンパク質の低レベルの発現、またＣａｐタンパク質がＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞（図１１Ｂ及び１１Ｃ）において検出できないことを確認した。ＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲ分析では、ＨＥＫ２９３細胞においては、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製のオリジナルのプラスミド（５＃、ｐＲＣ２−ｍｉ３４２（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）及びｐＡＡＶ−ＧＦＰ）と比較し、これらのｐＬＭＣ３２〜３５ベクターでは３〜５倍ＡＡＶ力価が増加した一方で、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞においては、生産レベルは低かった（図２０）。感染性アッセイによりｑＰＣＲ力価を確認し、ＨＥＫ２９３サンプルへの高レベルでのウイルストランスダクション及びＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）サンプルへの低レベルでの感染が示された（図１２）。要約すると、これらのデータはＨＥＫ２９３及びＣＨＯ細胞におけるＡＡＶ生産のための、ｐＬＭＣ３２〜３５ベクターの機能性を確認するものであり、それらが安定に発現される場合にはＣＨＯ細胞においてｒＡＡＶ生産が可能となることを示唆するものである。
【０１３７】
セクション４：部位特異的組込み（ＳＳＩ）による、Ｒｅｐ−Ｃａｐ及びＧＯＩを安定発現するＣＨＯ細胞の生成
[00147]ＧＯＩ及びＲｅｐ／Ｃａｐが安定的に組み込まれたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主がｒＡＡＶ生産を維持できるか否かを決定するため、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及び各Ｒｅｐ−Ｃａｐベクター（ｐＬＭＣ３２〜３５）を、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）ＳＳＩ宿主に、ＦＬＰリコンビナーゼ発現ベクター（ｐＭＦ４）と共にトランスフェクトした。Ｒｅｐ−Ｃａｐ及びＧＯＩの同時又は順次の組込みによって、２セットのプールを生成した（図１３）。Ｒｅｐ−Ｃａｐ、Ｆｅｒ１Ｌランディングパッド、ＧＯＩ又はＮＬ１ランディングパッドのいずれにもアニーリングするよう設計したプライマーを用いたＰＣＲ分析により（図１４）、大多数のプールにおいて、Ｆｅｒ１Ｌ４遺伝子に位置するランディングパッドへのＲｅｐ／Ｃａｐの良好な組込みが示された（図１５Ａ）。プール中の２つ（「Ａ」プールの１８及び１９）を除いて、残余のＦｅｒ１Ｌ４ランディングパッドのＰＣＲ産物を全部において検出した結果、これらのプールにおける完全なＳＳＩが示された（図１５Ｂ）。しかしながら、ＧＯＩは、順次ターゲッティングによって生成したプール（「Ｂ」プール）のＮＬ１座位にあるランディングパッドにのみ組み込まれ（図１６Ａ）、残りのランディングパッドはプールの全てにおいて検出された（図１６Ｂ）。ウエスタンブロット解析はＲｅｐを安定発現する５つのプールを同定した一方で、Ｃａｐタンパク質発現は検出できなかった（図１７）。ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞におけるＲｅｐ−Ｃａｐ発現を実証するため、Ｒｅｐ及びＣａｐの異なるアイソフォームを検出するためのプライマーを使用して、これらの遺伝子のｍＲＮＡ発現を、ＴａｑＭａｎ−ｑＰＣＲアッセイにより解析した（図１８及び図２１）。Ｒｅｐ−Ｃａｐ２、ＧＯＩ及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）ベクターでトランスフェクトしたＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞は、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及びＲｅｐ−Ｃａｐ（ｐＬＭＣ３２〜３５）ベクター（図１９Ａ〜Ｃ）と比較し、〜５倍高いＲｅｐのｍＲＮＡレベル（図１９Ａ〜Ｃ）、並びに〜７倍のＲｅｐ及びＣａｐのｍＲＮＡレベル（図１９Ｄ）を誘導した。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ  Ｉ  ｍＲＮＡレベルは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞をＲｅｐ−Ｃａｐ２、ＧＯＩ及びｐＨｅｌｐｅｒ（６２３４、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）によってトランスフェクトしたときにのみ検出可能であり、ＧＯＩ（ｐＬＭＣ３１）及びＲｅｐ−Ｃａｐ（ｐＬＭＣ３２〜３５）によってトランスフェクトしたときでは不可能であった（図１９Ｅ〜Ｊ）。ＶＡ  ＩＩのｍＲＮＡレベルは、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において検出できなかった（図１９Ｋ）。観察された全てのｍＲＮＡレベルは、Ｅ４を除き、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）において低かった（図１９Ａ〜Ｋ）。これらのデータは、Ｒｅｐ−ＣａｐのｍＲＮＡ誘導及び発現が、ＨＥＫ２９３細胞と比較し、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞において低かったことを示す。要約すると、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ（商標）細胞はＡｄ５ヘルパー遺伝子及びＲｅｐ−Ｃａｐを発現することができる��、これらの遺伝子の発現レベルは更に最適化される必要がある。
【図１Ａ】
2020507331.tif 000023
【図１Ｂ】
2020507331.tif 000024
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
2020507331.tif 000029
【図５Ｂ】
2020507331.tif 000030
【図５Ｃ】
2020507331.tif 000031
【図５Ｄ】
2020507331.tif 000032
【図５Ｅ】
2020507331.tif 000033
【図５Ｆ】
2020507331.tif 000034
【図６】
2020507331.tif 000035
【図７】
2020507331.tif 000036
【図８】
2020507331.tif 000037
【図９】
2020507331.tif 000038
【図１０】
2020507331.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020507331.tif 000042
【図１４】
2020507331.tif 000043
【図１５】
2020507331.tif 000044
【図１６】
2020507331.tif 000045
【図１７】
2020507331.tif 000046
【図１８】
2020507331.tif 000047
【図１９】
2020507331.tif 000048
【図２０】
2020507331.tif 000049
【図２１】
2020507331.tif 000050
【配列表】
2020507331000001.app
【国際調査報告】
2020507331.tif 000051
2020507331.tif 000052
2020507331.tif 000053
2020507331.tif 000054