(57)【要約】本開示は、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）のリスクのような、前立腺がん患者における種々の臨床エンドポイントの評価のための複数の遺伝子発現に基づいたゲノム前立腺スコア（商標）（ＧＰＳ（商標））アルゴリズムの使用に関する。一部の実施形態では、ＧＰＳ結果は、低および中リスクの前立腺がん患者の処置方針を決定するのに役立つように、これらの患者について判定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がん患者における有害臨床アウトカムの尤度を予測する方法であって、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を前記患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：  
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数３】
2020507320.tif 000014
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数４】
2020507320.tif 000015
、ステップと、
（ｄ）前記患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、ステップと、
（ｅ）前記患者のスコア群に基づいて、前記患者について有害臨床アウトカムの尤度を予測するステップであって、低いスコア群が、高スコア群よりも低い有害臨床アウトカムのリスクを示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２】
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者の定量的スコア群に基づいて前記患者のための処置を決定するステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有害臨床アウトカムが、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）または前立腺がん死（ＰＣＤ）の１つまたは複数である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
有害臨床アウトカムの相対リスクを低または中リスクの前立腺がん患者に割り当てる方法であって、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＥＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数５】
2020507320.tif 000016
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数６】
2020507320.tif 000017
、ステップと、
（ｄ）前記患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、ステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が、中リスク患者である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による中リスク患者である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者の定量的スコア群に基づいて前記患者のための処置を決定するステップをさらに含む、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、中リスク患者であり、前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者を高リスク患者として再分類し、必要に応じて、前記患者が前記低いスコア群にある場合、前記患者の分類を中リスク患者として維持する、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者を高リスク患者のためのマルチモード療法または標準的療法により処置するステップをさらに含む、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が前記低スコア群にある場合、前記患者を積極的監視により処置する、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って前記高スコア群の定量的スコアを有すると判定された中リスク前立腺がん患者を処置する方法であって、マルチモード療法を前記患者に施すステップを含む、方法。
【請求項３３】
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月１３日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４５８，４７４号、２０１７年３月１７日に出願された同第６２／４７３，２０４号、および２０１７年１０月３０日に出願された同第６２／５７８，６２２号の優先権の利益を主張している。
技術分野
本開示は、本明細書において転移とも呼ばれる臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）のリスクのような、前立腺がん患者における種々の臨床エンドポイントを評価するため、ならびに一部の実施形態では、臨床管理の選択肢を低および中リスクの前立腺がん患者について決定するための、複数の遺伝子発現に基づいたゲノム前立腺スコア（Genomic  Prostate  Score）（商標）（ＧＰＳ（商標））試験アルゴリズムの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）スクリーニングの１９８７年の導入は、決して臨床的に有意または死亡の原因とはならないであろう低悪性度前立腺がんの多くの症例の診断および積極的処置に至った。この理由は、前立腺がんの自然史が、ほとんどの場合、低悪性度であり、処置しなかったとしても、男性の生涯において進行せず、苦痛または死を引き起こさないためである。約半数の男性が、その生涯において侵襲性前立腺がんを発症するが（検死により認められるように）（B.  Halpertら、Cancer１６巻：７３７〜７４２頁（１９６３年）；B.  Holund、Scand  J  Urol  Nephrol１４巻：２９〜３５頁（１９８０年）；S.  Lundbergら、Scand  J  Urol  Nephrol４巻：９３〜９７頁（１９７０年）；M.  Yinら、J  Urol１７９巻：８９２〜８９５頁（２００８年））、１７％が前立腺がんと診断されるにとどまり、ほんの３％が前立腺がんの結果として死亡する。Cancer  Facts  and  Figures、Atlanta、GA：American  Cancer  Society（２０１０年）；JE  Damberら、Lancet３７１巻：１７１０〜１７２１頁（２００８年）。
【０００３】
しかし、現在、前立腺がんと診断される高いパーセンテージの男性は、低リスクの前立腺がんであるとしても、即時の前立腺全摘除術（ＲＰ）または根治的放射線療法により処置する。MR  Cooperbergら、J  Clin  Oncol２８巻：１１１７〜１１２３頁（２０１０年）；MR  Cooperbergら、J  Clin  Oncol２３巻：８１４６〜８１５１頁（２００５年）。外科手術および放射線療法は、前立腺がんによる再発および死亡のリスクを減少させる（AV  D'Amicoら、Jama２８０巻：９６９〜９７４頁（１９９８年）；M  Hanら、Urol  Clin  North  Am２８巻：５５５〜５６５頁（２００１年）；WU  Shipleyら、Jama２８１巻：１５９８〜１６０４頁（１９９９年）；AJ  Stephensonら、J  Clin  Oncol２７巻：４３００〜４３０５頁（２００９年））、しかし、処置して前立腺がんによる１個の死を予防しなければならない男性の数の推定は、１２〜１００人の範囲に及ぶ。A  Bill-Axelsonら、J  Natl  Cancer  Inst１００巻：１１４４〜１１５４頁（２００８年）；J  Hugossonら、Lancet  Oncol１１巻：７２５〜７３２頁（２０１０年）；LH  Klotzら、Can  J  Urol１３巻、補遺１号：４８〜５５頁（２００６年）；S  Loebら、J  Clin  Oncol２９巻：４６４〜４６７頁（２０１１年）；FH  Schroderら、N  Engl  J  Med３６０巻：１３２０〜１３２８頁（２００９年）。前立腺がんのこの過剰処置は、出費および毒性を伴う。例えば、前立腺全摘除術を受ける多数の男性が、手術の結果として失禁およびインポテンスに苦しみ（MS  Litwinら、Cancer１０９巻：２２３９〜２２４７頁（２００７年）；MG  Sandaら、N  Engl  J  Med３５８巻：１２５０〜１２６１頁（２００８年））、２５％もの男性が、前立腺がん処置のその選択を後悔している。FR  Schroeckら、Eur  Urol５４巻：７８５〜７９３頁（２００８年）。
【０００４】
前立腺がんの過剰処置の理由の１つは、即時療法を延期して代わりに積極的監視を受けるのに適切な候補である男性から、即時の根治療法を必要とする男性を識別するのに適切な予後ツールがないことである。例えば、臨床的病期分類、処置前ＰＳＡおよび生検グリーソンスコアの結果に基づいて低リスク疾患を有すると考えられ、プロトコールに基づいた積極的監視により処置されてきた男性の３０〜４０％は、経過観察のはじめの数年にわたって疾患進行を経験し（ＰＳＡの上昇、反復生検におけるグリーソンスコアの上昇、または臨床的進行により診断される）、この何人かは、根治療法の機会を失っていた可能性がある。HB  Carterら、J  Urol１７８巻：２３５９〜２３６４頁およびdiscussion２３６４〜２３５５頁（２００７年）；MA  Dall'Eraら、Cancer１１２巻：２６６４〜２６７０頁（２００８年）；L  Klotzら、J  Clin  Oncol２８巻：１２６〜１３１頁（２０１０年）。また、積極的監視の候補であると考えられるが、ともかく即時の前立腺摘除術を受ける男性の３０〜４０％は、高グレード（３＋４またはそれよりも高いグリーソンスコア）または非器官限局性疾患（被膜外進展（ＥＣＥ）または精嚢への浸潤（ＳＶＩ））を有することにより定義されるように、予想よりも高いリスクの疾患を有することが外科手術において見出される。SLら、J  Urol１８１巻：１６２８〜１６３３頁およびdiscussion１６３３〜１６２４頁（２００９年）；CR  Griffinら、J  Urol１７８巻：８６０〜８６３頁（２００７年）；PW  Mufarrijら、J  Urol１８１巻：６０７〜６０８頁（２００９年）。
前立腺がんにおける再発リスクおよび処置決定についての推定は現在、ＰＳＡレベルおよび／または臨床腫瘍悪性度のグレード分類および病期に主に基づいている。臨床腫瘍病期は、病理報告に含まれるのに十分な、アウトカムとの有意な関連性を有することを示しているが、米国病理医協会合意声明（College  of  American  Pathologists  Consensus  Statement）は、この情報の獲得、解釈、報告、および分析へのアプローチに変動が存在すると述べた。C.  Comptonら、Arch  Pathol  Lab  Med１２４巻：９７９〜９９２頁（２０００年）。結果として、現存する病理的病期分類法は、再現性に欠けており、したがって、個々の患者のリスクの不正確な推定を生じ得るものとして批評されている。
臨床アウトカムの尤度の判定に役立つ、さらなる情報を提供するために、臨床的再発の尤度を予測し得る遺伝子発現マーカーを探すための研究が行われており、例えば、複数の遺伝子の発現レベルを評価するアルゴリズムが、開発および商業化されている。E.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）；J.  Cullen,ら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）；国際特許公開ＷＯ２０１３／１１６１４４、このそれぞれは、参照により本明細書に組み込む。本開示は、いくつかの遺伝子サブセット由来の少なくとも１２種の種々の遺伝子の発現レベルを測定するアッセイを、例えば、他のパラメータに基づいて非常に低い、低、中、または高リスク群に分類される患者について、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）のような特定の長期的イベントのその患者の相対リスクを判定する手段として使用する方法に関する。一部の実施形態では、その臨床的および病理的特徴と組み合わせた患者のゲノム前立腺スコア（ＧＰＳ）結果により、その元の臨床リスク群と異なるリスクカテゴリーに患者が分類される。一部の実施形態では、これは、進行性疾患に対する患者の推定リスクをさらに精密化および個別化し、患者の処置計画の向上を可能とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１１６１４４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】B.  Halpertら、Cancer１６巻：７３７〜７４２頁（１９６３年
【非特許文献２】B.  Holund、Scand  J  Urol  Nephrol１４巻：２９〜３５頁（１９８０年）
【非特許文献３】S.  Lundbergら、Scand  J  Urol  Nephrol４巻：９３〜９７頁（１９７０年
【非特許文献４】M.  Yinら、J  Urol１７９巻：８９２〜８９５頁（２００８年）
【非特許文献５】Cancer  Facts  and  Figures、Atlanta、GA：American  Cancer  Society（２０１０年）
【非特許文献６】JE  Damberら、Lancet３７１巻：１７１０〜１７２１頁（２００８年）
【非特許文献７】MR  Cooperbergら、J  Clin  Oncol２８巻：１１１７〜１１２３頁（２０１０年）
【非特許文献８】MR  Cooperbergら、J  Clin  Oncol２３巻：８１４６〜８１５１頁（２００５年）
【非特許文献９】AV  D'Amicoら、Jama２８０巻：９６９〜９７４頁（１９９８年）
【非特許文献１０】M  Hanら、Urol  Clin  North  Am２８巻：５５５〜５６５頁（２００１年
【非特許文献１１】WU  Shipleyら、Jama２８１巻：１５９８〜１６０４頁（１９９９年）
【非特許文献１２】AJ  Stephensonら、J  Clin  Oncol２７巻：４３００〜４３０５頁（２００９年）
【非特許文献１３】A  Bill-Axelsonら、J  Natl  Cancer  Inst１００巻：１１４４〜１１５４頁（２００８年）
【非特許文献１４】J  Hugossonら、Lancet  Oncol１１巻：７２５〜７３２頁（２０１０年）
【非特許文献１５】LH  Klotzら、Can  J  Urol１３巻、補遺１号：４８〜５５頁（２００６年）
【非特許文献１６】S  Loebら、J  Clin  Oncol２９巻：４６４〜４６７頁（２０１１年）
【非特許文献１７】FH  Schroderら、N  Engl  J  Med３６０巻：１３２０〜１３２８頁（２００９年）
【非特許文献１８】MS  Litwinら、Cancer１０９巻：２２３９〜２２４７頁（２００７年）
【非特許文献１９】MG  Sandaら、N  Engl  J  Med３５８巻：１２５０〜１２６１頁（２００８年）
【非特許文献２０】FR  Schroeckら、Eur  Urol５４巻：７８５〜７９３頁（２００８年）
【非特許文献２１】HB  Carterら、J  Urol１７８巻：２３５９〜２３６４頁およびdiscussion２３６４〜２３５５頁（２００７年）
【非特許文献２２】MA  Dall'Eraら、Cancer１１２巻：２６６４〜２６７０頁（２００８年）
【非特許文献２３】L  Klotzら、J  Clin  Oncol２８巻：１２６〜１３１頁（２０１０年）
【非特許文献２４】SLら、J  Urol１８１巻：１６２８〜１６３３頁およびdiscussion１６３３〜１６２４頁（２００９年）
【非特許文献２５】CR  Griffinら、J  Urol１７８巻：８６０〜８６３頁（２００７年）
【非特許文献２６】PW  Mufarrijら、J  Urol１８１巻：６０７〜６０８頁（２００９年）
【非特許文献２７】C.  Comptonら、Arch  Pathol  Lab  Med１２４巻：９７９〜９９２頁（２０００年）
【非特許文献２８】E.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）
【非特許文献２９】J.  Cullen,ら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本開示は、一部の実施形態において、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような、前立腺がん患者における有害臨床アウトカムの尤度を予測する方法であって、（ａ）患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを正規化するステップと、（ｃ）本明細書に記載のＧＰＳ結果のような、定量的スコア（ＱＳ）を患者について算出するステップと、（ｄ）患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、患者が低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、患者が高スコア群に割り当てられる、ステップと、必要に応じて（ｅ）患者のスコア群に基づいて、患者についてＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような有害臨床アウトカムのリスクを予測するステップであって、低いスコア群が、高スコア群よりも低い有害臨床アウトカムのリスクを示す、ステップとを含む、方法を含む。一部の実施形態では、パート（ｄ）において、患者のＱＳが＜または≦４０である場合、患者は、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞または≧４０である場合、患者は、高スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）において、患者のＱＳが≦４０である場合、患者は、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞４０である場合、患者は、高スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、患者は、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および患者が高スコア群に入らない場合、患者は、中スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者のＱＳが＜または≦２０である場合、患者は、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞または≧２０である場合および患者が高スコア群に入らない場合、患者は、中スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者のＱＳが≦２０である場合、患者は、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞２０である場合および患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる。したがって、一部の実施形態では、患者は、次の３つの群：ＱＳ＜２０、ＱＳ＜２０であるが＜４０、およびＱＳ＞４０に分類される。任意の実施形態では、ＱＳは、本明細書に記載のＧＰＳであり得る。
【０００８】
上記の方法の一部の実施形態では、患者は、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である。一部のこのような実施形態では、患者は、ＡＵＡ／ＥＡＵまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である。一部の実施形態では、この方法は、患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物のレベルは、ＧＵＳ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される。一部の実施形態では、生体試料は、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である。一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物のレベルは、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される。一部の実施形態では、この方法は、患者の定量的スコア群に基づいて患者のための処置を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、有害臨床アウトカムは、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）または前立腺がん死（ＰＣＤ）の１つまたは複数である。
【０００９】
本開示はまた、有害臨床アウトカムの相対リスクを低または中リスクの前立腺がん患者に割り当てる方法であって、（ａ）患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを正規化するステップと、（ｃ）本明細書に記載のＧＰＳ結果のような、定量的スコア（ＱＳ）を患者について算出するステップと、（ｄ）患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、患者が低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、患者が高スコア群に割り当てられる、ステップとを含む、方法を包含する。一部の実施形態では、パート（ｄ）において、患者のＱＳが＜または≦４０である場合、患者は、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞または≧４０である場合、患者は、高スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）において、患者のＱＳが≦４０である場合、患者は、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）患者のＱＳが＞４０である場合、患者は、高スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、患者は、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者のＱＳが＜または≦２０である場合、患者は、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞または≧２０である場合および患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、パート（ｄ）（ｉ）の低いスコア群の患者について、患者は、患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、患者のＱＳが＞２０である場合および患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる。一部の実施形態では、ＱＳは、本明細書に記載のＧＰＳである。
【００１０】
一部の実施形態では、患者は、中リスク患者である。一部のこのような実施形態では、患者は、ＡＵＡ／ＥＡＵまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による中リスク患者である。一部の実施形態では、この方法は、患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物のレベルは、ＧＵＳ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される。一部の実施形態では、生体試料は、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である。一部の実施形態では、ＲＮＡ転写物のレベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される。一部の実施形態では、この方法は、患者の定量的スコア群に基づいて患者のための処置を決定するステップをさらに含む。一部の実施形態では、患者は、中リスクの患者であり、患者が高スコア群にある場合、方法は、高リスク患者と同様に、リスク推定を患者について精密化するステップをさらに含み、必要に応じて、患者が低いスコア群にある場合、方法は、患者の分類を中リスク患者として維持するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、患者が高スコア群にある場合、高リスク患者のためのマルチモード療法または標準的療法により患者を処置するステップをさらに含む。このような一部の実施形態では、マルチモード療法は、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、および／または（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与、および／または（ｄ）外科手術、および／または（ｅ）放射線、すなわち、（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せを含む。一部の実施形態では、患者が低スコア群にある場合、方法は、積極的監視により患者を処置または管理するステップをさらに含む。
【００１１】
本開示はまた、上記の方法により高スコア群の定量的スコアを有すると判定された中リスク前立腺がん患者を処置する方法であって、マルチモード療法を患者に施すステップを含む、方法を包含する。一部の実施形態では、マルチモード療法は、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、および／または（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与、および／または（ｄ）外科手術、および／または（ｅ）放射線、および／または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】図１Ａは、４つのＮＣＣＮ（National  Clinical  Practice  Guidelines  in  Oncology）リスク群（非常に低い、低、中および高）のそれぞれのうち２０年間にわたって無転移のままであった前立腺がん対象の比率を示すグラフを提供する。合計２５９人の対象を分析した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、同様に２０年間にわたって前立腺がん死（ＰＣＤ）を経験していなかった４つの群の対象の比率を示す。
【００１３】
【図２Ａ】図２Ａは、ＮＣＣＮリスク群の２５９人の前立腺がん対象の分布を示し、非常に低い＋低リスク、中リスクおよび高リスク群のそれぞれの対象の数を提供し、各群の範囲および全体的前立腺スコア（Global  Prostate  Score）（ＧＰＳ）中央値を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、各ＮＣＣＮリスク群のアンドロゲン群スコアの分布を示す。
【００１４】
【図３】図３は、非常に低い＋低、中および高ＮＣＣＮリスク群のＧＰＳに対する転移の１０年リスクを示す。
【００１５】
【図４】図４は、非常に低い＋低、中および高ＮＣＣＮリスク群のＧＰＳに対する死亡の１０年リスクを示す。
【００１６】
【図５】図５は、転移（Ｍｅｔｓ、左パネル）および前立腺がん死（ＰＣＤ、右パネル）の予測と関連する、ＧＰＳおよび基礎的間質、細胞構成、アンドロゲンおよび増殖群スコアの標準化ハザード比を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
定義
他に定義しない限り、本明細書において使用する技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。Singletonら、Dictionary  of  Microbiology  and  Molecular  Biology第２版、J.  Wiley  &  Sons（New  York、NY１９９４年）およびMarch,  Advanced  Organic  Chemistry  Reactions,  Mechanisms  and  Structure第４版、John  Wiley  &  Sons（New  York、NY１９９２年）は、本出願において使用する用語の多くへの一般的指針を当業者に提供する。
【００１８】
当業者は、本明細書に記載のものと同様または等価である、多くの方法および材料を理解し、これらは、本発明の実行において使用され得る。実際、本発明は、本明細書に記載の方法および材料に決して制限しない。本発明のために、次の用語を以下に定義する。
【００１９】
用語「腫瘍」および「病変」は、本明細書において使用する場合、悪性か良性かにかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌および癌細胞および組織を指す。当業者は、腫瘍組織試料が、１つまたは複数のがん細胞、部分的または断片化した細胞、種々の病期の腫瘍、組織学的に正常に見える周囲組織、および／またはマクロもしくはマイクロ解剖による組織のような、複数の生物学的エレメントを含み得ることを理解するであろう。
【００２０】
用語「がん」および「癌性の」は、未制御の細胞増殖を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理的状態を指示または説明する。本開示のがんの例としては、前立腺がんのような、尿生殖路のがんが挙げられる。
【００２１】
本明細書において使用する場合、用語「前立腺がん」は、広い意味において使用し、前立腺の組織から生じるがんのすべての病期およびすべての形態を指す。
【００２２】
がんの病期分類は、医師が、疾患が進行した程度を評価して患者の処置を計画するのに役立つ。病期分類は、理学的検査、血液検査もしくは放射線療法に対する応答により臨床的に（臨床的病期分類）、および／または前立腺全摘除術のような外科手術に基づいて病理的に（病理的病期分類）行われ得る。対がん米国合同委員会（American  Joint  Committee  on  Cancer）（ＡＪＣＣ）によるAJCC  Cancer  Staging  Manual（第７版、２０１０年）の腫瘍、リンパ節、転移（ＴＮＭ）病期分類システムによれば、前立腺がんの種々の病期は、次のように定義される：腫瘍：Ｔ１：臨床的に明らかでない腫瘍が非触知またはイメージングにより不可視である、Ｔ１ａ：偶発腫が切除組織の５％またはそれ未満に組織学的に認められる、Ｔ１ｂ：偶発腫が切除組織の５％よりも多く組織学的に認められる、Ｔ１ｃ：腫瘍が針生検により確認される、Ｔ２：腫瘍が前立腺内に限局する、Ｔ２ａ：腫瘍が片葉の半分またはそれ未満に浸潤する、Ｔ２ｂ：腫瘍が片葉の半分よりも多く浸潤するが、両葉には及ばない、Ｔ２ｃ：腫瘍が両葉に浸潤する、Ｔ３：腫瘍が前立腺被膜まで進展する、Ｔ３ａ：被膜外進展（片葉または両葉）、Ｔ３ｂ：腫瘍が精嚢（単数または複数）に浸潤する、Ｔ４：腫瘍が精嚢以外の隣接組織（膀胱頸部、外括約筋、直腸、挙筋または骨盤壁）に固定または浸潤する。一般には、臨床的Ｔ（ｃＴ）病期は、Ｔ１またはＴ２であり、病理的Ｔ（ｐＴ）病期は、Ｔ２またはそれよりも高い。リンパ節：ＮＯ：非限局性のリンパ節転移、Ｎ１：限局性リンパ節転移。転移：Ｍ０：非遠隔転移、Ｍ１：遠隔転移が存在する。
【００２３】
グリーソングレード分類システムは、前立腺がんを有する男性の予後を評価することを助けるために使用する。他のパラメータとともに、これは、前立腺がん病期分類の方針に組み込まれ、予後を予測し、療法の指針となるのに役立つ。グリーソン「スコア」または「グレード」は、その顕微鏡像に基づいて前立腺がんに与えられる。グリーソンスコアが低い腫瘍は、典型的に、あまりにも緩徐に増殖するため、患者にその生涯において顕著な脅威を示さないことがある。このような患者は、「待機療法」または「積極的監視」により経時的にモニターされ得る。グリーソンスコアがより高いがんは、より侵襲性で、予後が悪化する可能性があり、このような患者は一般に、外科手術（例えば、前立腺全摘除術）、場合によっては、他の療法（例えば、放射線、ホルモン、超音波、化学療法）により処置する。グリーソンスコア（または和）は、２つの最も一般的な腫瘍パターンのグレードを含む。このようなパターンは、グリーソンパターン１〜５と呼ばれ、パターン１は、最も高分化型である。ほとんどは、パターンの混合を有する。グリーソンスコアまたはグレードを得るために、優勢のパターンを第２の最も多く見られるパターンに加えて２〜１０の数値を得る。グリーソングレードは、次の通りである：ＧＧＧ１（ＧＳ≦６）、ＧＧＧ２（ＧＳ３＋４＝７）、ＧＧＧ３（ＧＳ４＋３＝７）、ＧＧＧ４（ＧＳ４＋４＝８、ＧＳ３＋５＝８、ＧＳ５＋５＝８）およびＧＧＧ５（ＧＳ９または１０）。
【００２４】
病期分類：病期Ｉ：Ｔ１ａ  Ｎ０  Ｍ０  Ｇ１；病期ＩＩ：（Ｔ１ａ  Ｎ０  Ｍ０  Ｇ２〜４）または（Ｔ１ｂ、ｃ、Ｔ１、Ｔ２、Ｎ０  Ｍ０  任意のＧ）；病期ＩＩＩ：Ｔ３  Ｎ０  Ｍ０  任意のＧ；病期ＩＶ：（Ｔ４  Ｎ０  Ｍ０  任意のＧ）または（任意のＴ  Ｎ１  Ｍ０  任意のＧ）または（任意のＴ  任意のＮ  Ｍ１  任意のＧ）。
【００２５】
用語「アップグレーディング」は、本明細書において使用する場合、生検から判定されるグリーソングレードの、前立腺全摘除術（ＲＰ）から判定されるグリーソングレードに対する上昇を指す。例えば、アップグレーディングは、生検に関する３＋３または３＋４のグリーソングレードの、ＲＰに関する３＋４またはそれよりも高いグリーソングレードに対する変化を含む。「有意なアップグレーディング」または「アップグレード２」は、本明細書において使用する場合、生検から判定される３＋３または３＋４のグリーソングレードの、ＲＰから判定される４＋３またはそれよりも高いグリーソングレードに対する変化、または精嚢への浸潤（ＳＶＩ）、または被膜外浸潤（ＥＣＥ）を指す。
【００２６】
用語「高グレード」は、本明細書において使用する場合、ＲＰに関するグリーソンスコア＞＝３＋４または＞＝４＋３を指す。用語「低グレード」は、本明細書において使用する場合、ＲＰに関する３＋３のグリーソンスコアを指す。特定の実施形態では、「高グレード」の疾患は、少なくとも第１のパターン４、第２のパターン５または第３のパターン５のグリーソンスコアを指す。
【００２７】
用語「アップステージング」は、本明細書において使用する場合、生検の腫瘍病期の、ＲＰの腫瘍病期に対する上昇を指す。例えば、アップステージングは、生検の臨床的Ｔ１またはＴ２病期の腫瘍病期の、ＲＰの病理的Ｔ３病期に対する変化である。
【００２８】
用語「非器官限局性疾患」は、本明細書において使用する場合、ＲＰにおいて病理的病期Ｔ３疾患を有することを指す。用語「器官限局性」は、本明細書において使用する場合、ＲＰにおける病理的病期ｐＴ２を指す。用語「高グレードまたは非器官限局性疾患」は、少なくとも第１のパターン４、第２のパターン５もしくは第３のパターン５のグリーソンスコア、または病理的病期Ｔ３を有する前立腺がんを指す。
【００２９】
用語「有害病態」または「ＡＰ」は、本明細書において使用する場合、上記に定義する高グレード疾患、または上記に定義する非器官限局性疾患を指す。特定の実施形態では、「有害病態」は、グリーソンスコア＞＝３＋４もしくは＞＝４＋３もしくはＧＳ＞４＋３および／または病理的病期Ｔ３を有する前立腺がんを指す。
【００３０】
前立腺がん患者は、米国泌尿器科学会（American  Urological  Association）（ＡＵＡ）もしくはthe  National  Clinical  Practice  Guidelines  in  Oncology（ＮＣＣＮ）により提供された特定の認められたリスク分類システムに基づいて、またはＵＣＳＦにより策定されたCancer  of  the  Prostate  Risk  Assessment（ＣＡＰＲＡ）スコアシステムに応じて、特定の「リスク群」または「リスク分類」に分類され得る。したがって、一般には、用語「リスク分類」または「リスク群」は、ＰＳＡレベル、グリーソンスコアおよび臨床的病期等のような一連の予後因子に基づいた対象のグループ分類を意味し、これは、低、中または高のような負の臨床アウトカムと同様のリスクレベルを有するように分類されている。
【００３１】
例えば、ＡＵＡの２００７年のガイドラインによれば、「低リスク」患者は、１０ｎｇ／ｍＬまたはそれ未満の前立腺抗原（ＰＳＡ）レベル、６またはそれ未満のグリーソンスコアおよびＴ１ｃまたはＴ２ａの臨床的病期を有する患者である。ＡＵＡによる「高リスク」患者は、ＰＳＡ＞２０ｎｇ／ｍＬ、または８〜１０のグリーソンスコア、またはＴ２ｃの臨床的病期を有する。ＡＵＡによる「中リスク」患者は、ＰＳＡ＞１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、または７のグリーソンスコア、またはＴ２ｂの臨床的病期を有するが、いかなる「高リスク」条件をも満たさない。前立腺がんのためのＮＣＣＮガイドライン（２０１７年第２版）によれば、「非常に低いリスク」の患者は、Ｔ１ｃの病期、６未満またはそれと等しいグリーソンスコア、１０ｎｇ／ｍＬ未満のＰＳＡ、０．１５ｎｇ／ｍＬ／ｇ未満のＰＳＡ濃度、および３未満の陽性の前立腺生検コアを有し、５０％未満またはそれと等しいがんを各コアに有する。ＮＣＣＮによる「低リスク」患者は、Ｔ１〜Ｔ２ａの臨床的病期、６未満またはそれと等しいグリーソンスコア、および１０ｎｇ／ｍＬ未満のＰＳＡを有する。ＮＣＣＮによる「高リスク」患者は、Ｔ３ａの臨床的病期、または８〜１０のグリーソンスコア、またはＰＳＡ＞２０ｎｇ／ｍＬを有する。ＮＣＣＮによる「中リスク」患者は、Ｔ２ｂ〜Ｔ２ｃの臨床グレード、または７のグリーソンスコア、または１０〜２０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡを有する。ＣＡＰＲＡスコアは、診断時の年齢、診断時のＰＳＡ、生検のグリーソンスコア、臨床的病期、およびがんに関与する生検コアの割合により算出し、得点を各変数に割り当てて結果としてのスコアを得る。０〜２のＣＡＰＲＡスコアは低リスクを示し、３〜５のスコアは中リスクを示し、６〜１０のスコアは高リスクを示す。例えば、評価システム（例えば、ＡＵＡ、ＮＣＣＮまたはＣＡＰＲＡ）を使用せずに「中リスク」の患者について本明細書において言及した場合、そのようなシステムの少なくとも１つの中リスク群に入る患者を意味する。同様に、特定のシステムについて言及せずに「低リスク」患者について言及した場合、そのようなシステムの少なくとも１つの低または非常に低いリスク群に入る患者を意味する。特定のシステムについて言及せずに「高リスク」患者について言及した場合、そのようなシステムの少なくとも１つの高リスク群に入る患者を意味する。
【００３２】
高リスク患者または低リスク患者のための標準的療法のような「標準的療法」は、本明細書において使用する場合、ＡＵＡまたはＮＣＣＮのような組織によりそのような患者に推奨される療法の１つまたは複数の種類を指す。
【００３３】
本明細書において使用する場合、用語「積極的監視」および「待機療法」はともに、症状が現れるか、または変化するまでいかなる処置も施すことなく患者の状態を入念にモニタリングすることを含む。用語「待機療法」は、原発前立腺腫瘍の根治的処置を見合わせること、ならびに発症した場合は、前立腺の経尿道的切除術、尿路閉塞の管理、ホルモン療法、および転移巣の緩和のための放射線療法のような、限局性または転移性の進行のための緩和処置のみを提供することを包含する。用語「積極的監視」は、外科的、放射線および／または薬物処置のような根治的処置の必要を示唆する任意の続発する変化について患者をモニタリングすることを目標とする、初期の外科的、放射線および薬物処置のいずれも含まない患者のための定期的な臨床的モニタリングプログラムを意味する。積極的監視は、例えば、定期的なＰＳＡ試験、定期的な生検、および腫瘍病期および腫瘍進行のリスクを評価するように計画された他の定期的な試験を包含する。
【００３４】
本明細書において使用する場合、用語「外科手術」は、骨盤リンパ節郭清術、前立腺全摘除術（ＲＰ）、前立腺の経尿道的切除術（ＴＵＲＰ）、切除術、解剖、および腫瘍生検／除去を含む、癌組織の除去のために行われる外科的方法に適用する。遺伝子発現分析に使用する腫瘍組織または切片は、このような任意の方法により得られている。
【００３５】
本明細書において使用する場合、用語「がん細胞を含む生体試料」または「腫瘍細胞を含む生体試料」は、がん患者から得られる腫瘍材料を含む試料を互換的に指す。用語は、腫瘍組織試料、例えば、前立腺全摘除術により得られた組織、および例えば、コア生検または細針生検のような生検により得られた組織を包含する。生体試料は、新鮮、凍結または固定、ワックスに包埋した組織試料、例えば、ホルマリン固定したパラフィン包埋組織試料であってもよい。生体試料はまた、がん細胞を含む体液、例えば、血液、血漿、血清、尿等を包含する。さらに、用語「がん細胞を含む生体試料」は、原発腫瘍、例えば、循環腫瘍細胞以外の部位から得られた腫瘍細胞を含む試料を包含する。用語はまた、患者の腫瘍細胞の子孫である細胞、例えば、原発腫瘍細胞または循環腫瘍細胞に由来する細胞培養試料を包含する。用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍細胞から排出されたタンパク質または核酸材料、例えば、骨髄、血液、血漿、血清等を含み得る試料をさらに包含する。用語はまた、腫瘍細胞を濃縮した、あるいは、その採取後に操作した試料、ならびに患者の腫瘍材料から得られたポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む試料を包含する。
【００３６】
用語「予後」は、がん患者が、前立腺がんのような新生物疾患の、再発、転移拡散および薬物耐性を含む、がんに起因し得る死または進行を有する尤度を指すために本明細書において使用する。例えば、「予後良好」は、再発のない長期生存を含み、「予後不良」は、がん再発を含む。
【００３７】
用語「再発」は、がんの限局または遠隔再発（すなわち、遠隔転移）を指すために本明細書において使用し、「臨床的再発」と「生化学的再発」の両方を包含する。
【００３８】
用語「臨床的再発」または「ＣＲ」は、例えば、経過観察生検または他の臨床的手順において検出された場合、限局性の再発または遠隔転移のような再発を指す。
【００３９】
用語「生化学的再発」または「ＢＣＲ」は、ＰＳＡのような生化学マーカーの変化に基づいて検出された場合、再発を指す。一部の実施形態では、術後のＰＳＡ初期レベルが≧０．２ｎｇ／ｍＬであり、その後、後続の試験における確認ＰＳＡレベルが≧０．２ｎｇ／ｍＬである場合は、ＢＣＲを示す。
【００４０】
用語「前立腺がん死」または「ＰＣＤ」は、患者において早期に発見された前立腺がんの再発を含む、前立腺がんに起因する患者の死を指す。
【００４１】
用語「遠隔転移」または「Ｍｅｔｓ」は、骨内、または１つもしくは複数の遠位のリンパ節内、または別の非前立腺器官もしくは組織内のような、元の前立腺腫瘍から遠い部位におけるがんの再発を指す。
【００４２】
用語「臨床的無再発期間（ｃＲＦＩ）」は、外科手術から最初の臨床的再発または前立腺がんの臨床的再発に起因する死までの時間として本明細書において使用する。臨床的再発、または臨床的再発の前に生じる他の原発がんもしくは死が生じることなく経過観察が終了する場合、ｃＲＦＩまでの時間は、打ち切りとみなされる；これが生じる場合、唯一理解できる情報は、打ち切り時間に至るまで、臨床的再発は、この対象において生じていないということである。生化学的再発は、ｃＲＦＩの算出のために無視する。
【００４３】
用語「生化学的無再発期間（ｂＲＦＩ）」は、外科手術から最初の前立腺がんの生化学的再発までの時間を意味するために本明細書において使用する。生化学的再発の前に臨床的再発が生じ、ｂＲＦＩまたは生化学的再発の前に生じる他の原発がんもしくは死が生じることなく経過観察が終了する場合、生化学的再発までの時間は、これらのはじめの時点で打ち切りとみなされる。
【００４４】
実際は、上記のイベントまでの時間基準の算出は、打ち切りとみなされるイベントの定義に応じて試験毎に変化し得る。
【００４５】
本明細書において使用する場合、遺伝子の「発現レベル」または「レベル」の用語は、遺伝子の、またはそのポリペプチド翻訳産物のＲＮＡ転写の発現のレベルを本明細書において指す。本明細書において使用する場合、遺伝子の「正規化レベル」または「正規化発現レベル」の用語は、本明細書における１つまたは複数の参照遺伝子の発現レベルに対する正規化後の、遺伝子の、またはそのポリペプチド翻訳産物のＲＮＡ転写の発現のレベルを本明細書において指す。
【００４６】
用語「遺伝子産物」または「発現産物」は、ｍＲＮＡおよび遺伝子のＲＮＡ転写物のポリペプチド翻訳産物を含む、遺伝子のＲＮＡ（リボ核酸）転写産物（転写物）を指すために本明細書において使用する。遺伝子産物は、例えば、スプライシングされていないＲＮＡ、ｍＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、断片化ＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後修飾ポリペプチド、スプライスバリアントポリペプチド等であり得る。
【００４７】
本明細書において使用する用語「ＲＮＡ転写物」は、例えば、ｍＲＮＡ、スプライシングされていないＲＮＡ、スプライスバリアントｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよび断片化ＲＮＡを含む、遺伝子のＲＮＡ転写産物を指す。
【００４８】
他に指示しない限り、本明細書において使用する各遺伝子名は、遺伝子に割り当てられ、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ（URL:  www  (dot)  ncbi  (dot)  nlm  (dot)  gov  (slash)  sites  (slash)  entrez）により提供されたＯｆｆｉｃｉａｌ  Ｓｙｍｂｏｌと本出願の出願日と現在一致する。
【００４９】
用語「マイクロアレイ」は、ハイブリダイズ可能な配列要素、例えば、基質上のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプローブの秩序配列を指す。
【００５０】
用語「ポリヌクレオチド」は一般に、任意のポリヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであってもよい。したがって、例として、本明細書において定義するポリヌクレオチドは、一本および二本鎖ＤＮＡ、一本および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本および二本鎖領域を含むＲＮＡ、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖であるか、または一本および二本鎖領域を含み得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を制限なく含む。さらに、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用する場合、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。このような領域の鎖は、同一分子由来または異なる分子由来であり得る。領域は、この分子の１つまたは複数のすべてを含み得るが、より典型的には、この分子の一部の領域のみを含む。三重らせん領域の分子の１つは、オリゴヌクレオチドであることが多い。用語「ポリヌクレオチド」は、特にはｃＤＮＡを含む。この用語は、１つまたは複数の修飾塩基を含む、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡを含む。したがって、安定性のため、または他の理由のために修飾した骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その用語が本明細書において意図される「ポリヌクレオチド」である。さらに、イノシンのような異常塩基、またはトリチウム化塩基のような修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書において定義する用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般には、用語「ポリヌクレオチド」は、すべての化学的、酵素的および／または代謝的に修飾した未修飾ポリヌクレオチドの形態と、ウイルスならびに単純型および複雑型細胞を含む細胞のＤＮＡおよびＲＮＡ特性の化学形態とを包含する。
【００５１】
用語「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本または二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡｒＤＮＡハイブリッドおよび二本鎖ＤＮＡを制限なく含む、比較的短いポリヌクレオチドを指す。一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドは、化学的方法により、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成されることが多い。しかし、オリゴヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡによる技術を含む種々の他の方法により、ならびに細胞および生物内のＤＮＡの発現により生成され得る。
【００５２】
用語「Ｃｔ」は、本明細書において使用する場合、閾値サイクルを指し、蛍光が反応ウェル中で生成される、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）におけるこのサイクル数は、既定の閾値、すなわち、十分な数の増幅産物が蓄積して既定の閾値を満たす、反応中のポイントを上回る。
【００５３】
用語「Ｃｐ」は、本明細書において使用する場合、「交差ポイント」を指す。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体とその最大値の二次導関数とを決定することにより算出される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最も高く、ＰＣＲの対数期が始まる時点のサイクルを表す。
【００５４】
用語「閾値化」は、遺伝子発現測定値と臨床応答との非線形関係を説明するのに、ならびに報告された患者のスコアの変動をさらに減少させるのに使用する手順を指す。閾値化を適用すると、閾値より低いかまたは高いすべての測定値が、その閾値に設定される。遺伝子発現とアウトカムとの非線形関係は、スムーサーまたは三次スプラインを使用して検討され、コックス比例ハザード回帰を使用して無再発期間について、またはロジスティック回帰を使用して有害病態について遺伝子発現をモデル化し得る。D.  Cox、Journal  of  the  Royal  Statistical  Society、Series  B３４巻：１８７〜２２０頁（１９７２年）。報告された患者のスコアの変動は、遺伝子発現の可変性の関数として特定の遺伝子の定量化および／または検出の限界において検討され得る。
【００５５】
本明細書において使用する場合、用語「増幅産物」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応のような増幅技術を使用して合成されたＤＮＡの断片を指す。
【００５６】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者により容易に決定することができ、一般に、プローブ長、洗浄温度および塩濃度に依存した実験的計算である。一般には、長いプローブでは、適切なアニーリングに高い温度が必要とされるが、短いプローブでは、低い温度が必要とされる。ハイブリダイゼーションは一般に、その融解温度未満の環境において相補鎖が存在する場合、変性ＤＮＡの再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との所望の相同性の程度が高ければ、使用し得る相対温度が高くなる。結果として、高い相対温度では、よりストリンジェントな反応条件を生じる傾向にあるが、低い温度では、それほどストリンジェントな反応条件を生じないということになる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明については、Ausubelら、Current  Protocols  in  Molecular  Biology（Wiley  Interscience  Publishers、１９９５年）を参照されたい。
【００５７】
「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書において定義する場合、典型的には（１）洗浄に低いイオン強度および高い温度、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用するか、（２）ハイブリダイゼーションにおいてホルムアミドのような変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファーをｐＨ６．５で、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを４２℃でともに使用するか、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を４２℃で使用して０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％のホルムアミド中４２℃で洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を５５℃で行う。
【００５８】
「中ストリンジェント条件」は、Sambrookら、Molecular  Cloning：A  Laboratory  Manual、New  York：Cold  Spring  Harbor  Press、１９８９年に記載のように確認することができ、洗浄液および上記の条件ほどストリンジェントでないハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ）の使用を含む。中ストリンジェント条件の例としては、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％のデキストラン硫酸、およびせん断した変性サケ精子ＤＮＡ２０ｍｇ／ｍｌを含む溶液中３７℃で一晩インキュベーションし、その後、フィルターを１×ＳＳＣ中約３７〜５００Ｃで洗浄する。当業者は、プローブ長等のような因子を適応させるのに必要な温度、イオン強度等の調整法を理解するであろう。
【００５９】
用語「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」は、互換的に使用し、イントロンを除去しエクソンを連結して、真核細胞の細胞質内に移動する持続的コード配列を有する成熟ｍＲＮＡを生成するＲＮＡプロセシングを指す。
【００６０】
用語「相関する」および「関連する」は、２つの測定または算出したエンティティ間、あるいは測定または算出したエンティティ（例えば、グリーソンスコア、ＰＳＡレベル、ＧＰＳ結果）とイベント（例えば、ＣＲ、ＰＣＤ）との間の関連性を指すために本明細書において互換的に使用する。
【００６１】
「カートリッジ」は、ＲＮＡ転写レベルを試料から検出するための試薬のような、試料を処理するための試薬を含む物理的構造を指す。一部の実施形態では、熱循環のような反応およびＲＮＡ抽出のような試料の処理は、カートリッジ内で生じ得る。カートリッジ内に含まれる「ウェル」は、チャンバー、くぼみ、特定の表面または他の種類の特定の領域であり得、これはＰＣＲまたは他の化学反応を行うための、プライマーおよび／またはプローブのような特定の試薬を保持し得る。
【００６２】
「コンピュータベースシステム」は、情報を分析するために使用する、ハードウェア、ソフトウェアおよびデータ記憶媒体のシステムを指す。患者のコンピュータベースシステムの最小限のハードウェアは、中央処理装置（ＣＰＵ）ならびにデータ入力、データ出力（例えば、ディスプレイ）およびデータ記憶のためのハードウェアを含む。当業者は、いずれの現在利用可能なコンピュータベースシステムおよび／またはその構成要素が、本開示の方法と関連した使用に適することを容易に理解し得る。データ記憶媒体は、上記の本発明の情報の記録、またはそのような製品にアクセス可能なメモリアクセスデバイスを含む任意の製品を含むことができる。
【００６３】
データを「記録」するための、プログラミングまたはコンピュータ可読媒体上の他の情報は、当分野で公知の任意の方法を使用した、情報を記憶するためのプロセスを指す。好都合な任意のデータ記憶構造を、記憶した情報にアクセスするために使用する手段に基づいて選択することができる。多様なデータプロセッサプログラムおよびフォーマットは、記憶、例えば、文書作成テキストファイル、データベースフォーマット等に使用することができる。
【００６４】
「プロセッサ」または「演算手段」は、それに要求される機能を実行する、ハードウェアおよび／またはソフトウェアの任意の組合せを言及する。例えば、適したプロセッサは、電子制御装置、メインフレーム、サーバまたはパーソナルコンピュータ（デスクトップまたはポータブル）の形態で利用可能なようなプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであり得る。プロセッサがプログラム可能である場合、適したプログラミングは、遠隔地からプロセッサへ伝達されるか、またはコンピュータプログラム製品（磁気、光学もしくは固体デバイスに基づいたいずれかの、ポータブルまたは固定のコンピュータ可読記憶媒体等）にあらかじめ保存され得る。例えば、磁気媒体または光学ディスクは、プログラミングを保持可能であり、各プロセッサとその対応する基地で通信する、適したリーダーにより読取り可能である。
【００６５】
アルゴリズムに基づいた方法、ＧＰＳアルゴリズム、および遺伝子サブセット
本発明は、特定の臨床アウトカムの相対リスクを、前立腺がんを有する患者について判定するため、およびアッセイから得られるスコアに基づいて患者を特定の処置群に割り当てるためのアルゴリズムに基づいた分子診断アッセイを提供する。
【００６６】
一部の実施形態では、本開示は、次の各遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２、ＴＰＸ２、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２およびＳＲＤ５Ａ２ならびに１つまたは複数の参照遺伝子の発現レベルに基づいて定量的スコアを得る方法に関する。一部の実施形態では、定量的スコアは、０〜１００の範囲にスケール化して全体的前立腺スコア（ＧＰＳ）を得る。一部の実施形態では、定量的スコアは、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような臨床エンドポイントの相対リスクを患者について予測するために使用する。一部の実施形態では、臨床エンドポイントは、３年、５年または１０年のような特定の期間の臨床エンドポイントであるとみなされる。
【００６７】
一部の実施形態では、方法は、患者のＧＰＳが、有害臨床アウトカムまたはＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような種々の臨床エンドポイントのリスクの特定のレベルを示唆する、特定の閾値よりも高いかまたは低いかどうかを判定するステップを含む。一部の実施形態では、閾値は、１８〜２２、例えば１８、１９、２０、２１または２２であり、一部の実施形態では、３８〜４２、例えば、３８、３９、４０、４１または４２であり、一部の実施形態では、このような閾値の両方が考えられる。一部の実施形態では、閾値は２０であり、一部の実施形態では、閾値は４０であり、一部の実施形態では、２０と４０の両方の値が考えられる。
【００６８】
本明細書において使用する場合、「定量的スコア」は一般に、より複雑な定量的情報分析の単純化または開示または報告を助けるための算術的または数学的に算出した数値、例えば、前立腺がん患者における、本開示の遺伝子または遺伝子サブセットの特定の発現レベルの、特定の臨床アウトカムパラメータの尤度に対する相関性を指す。定量的スコアは、特定のアルゴリズムの適用により定めることができる。本明細書における一部の実施形態では、定量的スコアは、遺伝子または遺伝子群の特定のサブセットについて定めることができる（すなわち、「遺伝子群スコア」）。さらに、群の形成により、遺伝子または遺伝子サブセットの種々の発現レベルの寄与の数学的重み付けを、定量的スコアに対して容易にすることができる。生理的プロセスまたは構成要素の細胞特性を表す遺伝子または遺伝子群の重み付けは、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような、がんの病態および臨床アウトカムに対するそのプロセスまたは特性の寄与を反映し得る。
【００６９】
ＧＰＳは、次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２、ＴＰＭ２、ＴＰＸ２、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２およびＳＲＤ５Ａ２のそれぞれを含む一連の遺伝子、ならびにＧＵＳ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１の１つまたは複数のような少なくとも１つの参照遺伝子の発現レベルデータから算出される。
【００７０】
分析された遺伝子は、アルゴリズムの一部として特定の遺伝子サブセットに分類され得る。本開示の遺伝子サブセットは、例えば、間質応答遺伝子群、増殖遺伝子群、アンドロゲンシグナル伝達遺伝子群、および細胞構成遺伝子群を含む。間質応答および増殖遺伝子群は、過剰発現した場合にアウトカムの悪化と関連する遺伝子を含むが、アンドロゲンシグナル伝達および細胞構成遺伝子群は、過小発現した場合にアウトカムの悪化と関連する遺伝子を含む。
【００７１】
本明細書において「間質応答遺伝子群」と呼ばれる（「ＥＣＭ遺伝子群」または「間質系遺伝子群」とも呼ばれる）遺伝子サブセットは、ＢＧＮ、ＣＯＬＩＡ１およびＳＦＲＰ４遺伝子を含む。この群の遺伝子は、主に間質細胞により合成することができ、間質応答に関与し得るか、またはＥＣＭ遺伝子群の遺伝子を同時発現し得る。「間質細胞」は本明細書において、生体組織の支持構造を構成する結合組織細胞と呼ばれる。間質細胞は、線維芽細胞、免疫細胞、周皮細胞、内皮細胞および炎症細胞を含む。
【００７２】
「細胞構成遺伝子群」（「遊走遺伝子群」または「遊走制御遺伝子群」または「細胞骨格遺伝子群」とも呼ばれる）は、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２およびＴＰＭ２遺伝子を含む。このような遺伝子は、アクチンおよび付属タンパク質の動的微小繊維網の一部であり、細胞内で細胞を支持する、遺伝子および同時発現した遺伝子を含み、細胞運動および細胞分裂のための物理的な力を生成し、ならびに小胞および細胞小器官の細胞内輸送を容易にし得る。
【００７３】
「アンドロゲン遺伝子群」（「ＰＳＡ遺伝子群」および「ＰＳＡ制御遺伝子群」とも呼ばれる）は、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＲ、ＥＲＧおよびＳＲＤ５Ａ２遺伝子を含む。このような遺伝子は、セリンプロテアーゼのカリクレインファミリーのメンバーである遺伝子（例えば、カリクレイン３［ＰＳＡ］）、およびアンドロゲン遺伝子群の遺伝子を同時発現する遺伝子を含み得る。
【００７４】
「増殖遺伝子群」（「細胞周期遺伝子群」とも呼ばれる）は、ＴＰＸ２遺伝子を含む。この遺伝子群は、細胞増殖および細胞周期調節のような細胞周期機能、例えば、チェックポイント／Ｇ１からＳ期への移行に関与し得る遺伝子、ならびにこのような遺伝子を同時発現する遺伝子を含む。
【００７５】
一部の実施形態では、ＷＯ２０１３／１１６１４４の表５ＢのＲＳ０〜ＲＳ２７アルゴリズムから選択されるアルゴリズムを選択し、必要に応じて、０〜１００にスケール化して、患者を評価する定量的スコアを得て、例として、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓまたはＰＣＤのような臨床エンドポイントの相対リスクを判定することができる。一部の実施形態では、遺伝子のセットは、それぞれ間質応答群、細胞構成群、アンドロゲン群および増殖群由来の少なくとも１つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、アルゴリズムは、修飾することができ、例えば、１つもしくは複数の上記の遺伝子群由来の１つもしくは複数の遺伝子を追加もしくは除去するか、またはさらなる遺伝子群を追加することができる。一部の実施形態では、臨床エンドポイントは、３年、５年または１０年のような特定の期間の臨床エンドポイントであるとみなされる。
【００７６】
ＧＰＳの算出
一部の実施形態では、定量的結果は、ＧＰＳである。ＧＰＳ結果は、０〜１００のスケールで算出することができ、対照により正規化した遺伝子発現測定値から次のように導き出すことができる。
【００７７】
未スケール化ＧＰＳ（ＧＰＳｕ）は、次のように算出することができる：
ＧＰＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数１】
2020507320.tif 000002
【００７８】
次いで、ＧＰＳｕは、０〜１００であるように次のようにスケール化することができる。
【００７９】
【数２】
2020507320.tif 000003
【００８０】
ＧＰＳ（スケール化）は、ＧＰＳ値である。
【００８１】
患者についてＧＰＳ値または結果が得られると、スコアは、事前に規定されたカットポイントまたは閾値、例えば、１８〜２２の範囲、例えば、１８、１９、２０、２１もしくは２２、および／または３８〜４２の範囲、例えば、３８、３９、４０、４１または４２のカットポイントを使用して特定のＧＰＳ群に分類される。このようなカットポイントは、以下の実施例に記載のように、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのリスク対ＧＰＳ結果の統計分析に基づいて定義され得る。
【００８２】
一部の実施形態では、患者は、１８〜２２の範囲、例えば、１８、１９、２０、２１または２２のカットポイントに基づいて２つの群に分類することができ、ここで、一方の群は、ＧＰＳ結果がカットポイント未満あるいはカットポイント未満またはそれと等しい場合、カットポイント未満であるとみなされ、他方の群は、ＧＰＳ結果がカットポイントよりも高いか、あるいはカットポイントよりも高いかまたはそれと等しい場合、カットポイントよりも高いとみなされる。したがって、例えば、低ＧＰＳ群は、ＧＰＳ＜２０（または、カットポイントが設定される場合に応じて＜１８、＜１９、＜２１、＜２２）を有するものであり得、高ＧＰＳ群は、ＧＰＳ≧２０（または、カットポイントが設定される場合に応じて≧１８、≧１９、≧２１、≧２２）を有するものであり得る。あるいは、低ＧＰＳ群は、ＧＰＳ≦２０を有するものであり得、高ＧＰＳ群は、ＧＰＳ＞２０を有するものであり得る（または、カットポイントが設定される場合に応じて≦１８、≦１９、≦２１、≦２２および＞１８、＞１９、＞２１、＞２２）。一部の実施形態では、２０のカットポイントは、低ＧＰＳ群および高ＧＰＳ群を定義し、したがって、ＧＰＳ結果≦２０を有するものは、低ＧＰＳ群に入り、ＧＰＳ結果＞２０を有するものは、高いＧＰＳ群に入る。
【００８３】
一部の実施形態では、３８〜４２の範囲のカットポイントは、低ＧＰＳおよび高ＧＰＳ群を示すために使用される。したがって、例えば、低ＧＰＳ群は、ＧＰＳ＜４０（または、カットポイントが設定される場合に応じて＜３８、＜３９、＜４１、＜４２）を有するものであり得、高ＧＰＳ群は、ＧＰＳ≧４０（カットポイントが設定される場合に応じて≧４１、≧４２）を有するものであり得る。あるいは、低ＧＰＳ群は、ＧＰＳ≦４０を有するものであり得、高ＧＰＳ群は、ＧＰＳ＞４０を有するものであり得る（または、カットポイントが設定される場合に応じて≦４１、≦４２および＞３８、＞３９、＞４１、＞４２）。一部の実施形態では、４０のカットポイントは、低ＧＰＳ群および高いＧＰＳ群を定義し、したがって、ＧＰＳ結果≦４０を有するものは、低ＧＰＳ群に入り、ＧＰＳ結果＞４０を有するものは、高いＧＰＳ群に入る。
【００８４】
ＧＰＳアルゴリズムの特定の前立腺がんリスク群への適用
前立腺がん患者の処置は、場合によっては、ＡＵＡ、ＮＣＣＮまたはＣＡＰＲＡ基準の１つまたは複数に従って、非常に低い、低、中または高リスクとして負の臨床アウトカムについて患者が分類されているかどうかに、少なくともある程度は基づいている。上述のように、このような分類は、腫瘍病期またはグレード、ＰＳＡレベルおよびグリーソンスコアのような複数の因子を考慮に入れる。
【００８５】
例えば、前立腺がん患者のために利用可能な処置は、前立腺全摘除術（ＲＰ）、前立腺の経尿道的切除術（ＴＵＲＰ）、切除術、解剖および腫瘍生検／除去のような外科手術を含む。骨盤リンパ節の解剖（ＰＬＮＤ）はまた、将来の転移を防ぐのに懸念があるような一部の場合では、ＲＰと同時に行われ得る。一部の場合では、外照射療法（ＥＢＲＴ）、一次小線源療法、または他の種類の小線源療法のような放射線療法（ＲＴ）が行われ得る。一部の場合では、患者は、アンドロゲン遮断剤（アンドロゲン遮断療法またはＡＤＴ）のような薬物により処置することができ、これは一般にＬＨＲＨアンタゴニストを含む。ＡＤＴは、一部の場合、例えば、ＲＴの前、中および／または後に投与され得る。高リスク患者においては、例えば、ＡＤＴは、ＲＴ後１、２、３年またはそれを超える等の長期間投与され得る。一部の場合では、ドセタキセル、カバジタキセルまたはシプロイセルＴのような免疫療法剤および化学療法剤がまた、処方され得る。低リスク患者はまた、積極的監視により単独で処置することができ、例えば、その腫瘍病期の変化のエビデンスがない限り、またはその腫瘍病期の変化のエビデンスがあるまで、積極的監視を続けることができる。高齢患者あるいはその平均余命が短い患者はまた、必要に応じて緩和的介入による待機療法によって単独で処置することができる。
【００８６】
種々の処置選択は、患者のリスクレベル、および例えば、ＡＵＡまたはＮＣＣＮガイドラインによる関連の推奨に従ってなされ得る。例えば、非常に低いリスクの患者は、積極的監視により、またはその平均余命が短い場合は待機療法により処置され得る。低リスク患者は、例えば、積極的監視によるだけでなく、限局性腫瘍が完全に除去され得る場合は特に、必要に応じてＰＬＮＤを併用するＲＰにより、またはＥＢＲＴもしくは小線源療法のようなＲＴにより、または他の一部の「単独」処置の形態（すなわち、２つの組合せとは対照的な外科手術または放射線のような処置の１つの形態）により処置され得る。中リスクの患者は、例えば、ＲＰおよび必要に応じたＰＬＮＤにより、必要に応じてＡＤＴを併用するＲＴにより、または外科手術、放射線療法、および必要に応じた薬物処置の組合せにより処置され得る。このような患者は、「集学的」療法、すなわち、ＲＴおよびＡＤＴのような種々の処置形態の組合せにより処置され得る。高リスク患者は、例えば、ＥＢＲＴ、およびＲＴ後１、２または３年間等の長期ＡＤＴ処置のようなマルチモード療法により、ならびに時には、患者が処置に対処するのに十分に適合する場合に、さらに化学療法とともに処置され得る。高リスク患者はまた、状態が保証する場合には、外科的に処置され得る。
【００８７】
したがって、本発明の方法の一部の実施形態では、患者はこれまでに、ＡＵＡまたはＮＣＣＮまたはＣＡＰＲＡ基準に従って非常に低い、低、中または高リスク群に分類されている。一部の実施形態では、ＧＰＳ結果または他の定量的スコアを本明細書に記載の方法から得ることは、患者のための適切な処置方針の決定において有用であり得る。
【００８８】
例えば、一部の実施形態では、ＧＰＳ結果は、非常に低いまたは低リスクの患者について得られ、方法は、１８〜２２のカットオフポイントもしくは３８〜４２のカットオフポイント、またはこのようなカットオフポイントの両方を使用して、どのＧＰＳ結果群、例えば、低または高群に患者が入るかを判定するステップを含む。一部の実施形態では、ＧＰＳ結果は、高リスク患者について得られ、方法は、１８〜２２のカットオフポイントもしくは３８〜４２のカットオフポイント、またはこのようなカットオフポイントの両方を使用して、どのＧＰＳ結果群、例えば、低または高群に患者が入るかを判定するステップを含む。一部の実施形態では、ＧＰＳ結果は、中リスクの患者について得られ、方法は、１８〜２２のカットオフポイントもしくは３８〜４２のカットオフポイント、またはこのようなカットオフポイントの両方を使用して、どのＧＰＳ結果群、例えば、低または高群に患者が入るかを判定するステップを含む。
【００８９】
中リスクの患者が関わるこのような一部の実施形態では、本発明の方法に基づいた定量的スコアの判定が、患者の負の臨床アウトカムの相対リスクをさらに分類するために使用され得る。例えば、一部の実施形態では、３８、３９、４０、４１もしくは４２よりも高い、または３８、３９、４０、４１もしくは４２よりも高いかもしくは等しいＧＰＳ結果を有する中リスクの患者は、患者のＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントの相対リスクが、中リスクの患者と比較して、概して高いことを示す。一部の実施形態では、３８、３９、４０、４１もしくは４２よりも高い、または３８、３９、４０、４１もしくは４２よりも高いかもしくはそれに等しいＧＰＳ結果を有する中リスクの患者は、患者がＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントのリスクを有し、これは高リスク患者のリスクと概して同様であることを示す。例えば、４０よりも高い、または４０よりも高いかもしくはそれと等しいＧＰＳ結果を有する中リスクの患者は、患者がＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントのリスクを有し、これは高リスク患者のリスクと概して同様であることを示し得る。一部の実施形態では、この情報は、どのようにその中リスク患者を処置するかに影響し得る。例えば、このような患者は、高リスク患者のための処置の推奨に従って処置することができ、例えば、ＡＤＴおよび必要に応じて化学療法または免疫療法を併用したＲＴのような集学的治療を施すことができる。一方、中リスクの患者において、３８、３９、４０、４１もしくは４２未満、または３８、３９、４０、４１もしくは４２未満もしくはそれと等しいＧＰＳ結果は、患者のＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントの相対リスクが、中リスクの患者と比較して、概して低いことを示し得る。一部の実施形態では、中リスクの患者において、４０未満、または４０未満もしくはそれと等しいＧＰＳ結果は、患者のＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントの相対リスクが、中リスクの患者と比較して、概して低いことを示し得る。このような場合では、患者は、外科手術によるよりもむしろ積極的監視により、少なくとも初期は処置することができ、または外科手術または放射線単独のような単独処置により処置することができる。例えば、中リスクの患者が関わる一部の実施形態では、１８、１９、２０、２１もしくは２２未満、または１８、１９、２０、２１もしくは２２未満もしくはそれと等しいＧＰＳ結果は、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントの相対リスクが低いことを示す。例えば、中リスクの患者が関わる一部の実施形態では、２０未満、または２０未満もしくはそれと等しいＧＰＳ結果は、ＣＲ、ＢＣＲ、ＭｅｔｓおよびＰＣＤのような負の臨床エンドポイントの相対リスクが低いことを示す。このような場合では、例えば、患者は、外科手術または放射線によるよりもむしろ積極的監視により、少なくとも初期は治療することができる。一部の実施形態では、中リスクの患者は、このような上位と下位のカットポイントの間のＧＰＳ結果を有し得る。このような場合では、患者は、外科手術によるよりもむしろ積極的監視により、少なくとも初期は処置することができ、または外科手術または放射線単独のような単独処置により処置することができる。したがって、ＧＰＳにより、中リスクの患者を、負の臨床エンドポイントについて高いおよび低いリスクの２つまたは３つの亜群に分類することが可能となり得る。その結果、一部の実施形態では、ＧＰＳ結果の判定および患者の分類についての分析後、それに伴って処置方針を変化させてもよい。他の実施形態では、初期の処置方針は、リスク群（例えば、ＡＵＡ、ＮＣＣＮまたはＣＡＰＲＡ）とＧＰＳ結果の組合せに少なくともある程度基づいてもよい。
【００９０】
遺伝子産物の発現レベルをアッセイする方法
本開示の遺伝子の発現レベルを決定するための種々の技術的アプローチは、本明細書に記載し、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ハイスループット配列決定、遺伝子発現の連続分析（serial  analysis  of  gene  expression）（ＳＡＧＥ）およびデジタル遺伝子発現（Digital  Gene  Expression）（ＤＧＥ）をこれらに制限なく含み、以下に詳細に考察する。特定の態様では、各遺伝子の発現レベルは、エクソン、イントロン、タンパク質エピトープおよびタンパク質活性を含む、遺伝子発現産物の種々の特徴に関連して決定され得る。
【００９１】
アッセイする発現産物は、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドであり得る。発現産物は、断片化していてもよい。例えば、アッセイでは、発現産物の標的配列に相補的なプライマーを使用することができ、したがって、標的配列を含む完全転写物ならびに発現産物を断片化したものを測定することができる。さらなる情報は、国際特許公開ＷＯ２０１３／１１６１４４の表Ａに提示されている。
【００９２】
ＲＮＡ発現産物は、直接、またはＰＣＲに基づいた増幅法、例えば、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって得られるｃＤＮＡ産物を検出することによりアッセイすることができる（米国特許第７，５８７，２７９号を参照）。ポリペプチド発現産物は、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を使用して、プロテオミクス技術によりアッセイすることができる。さらに、ＲＮＡとポリペプチド発現産物の両方はまた、マイクロアレイを使用してアッセイすることができる。
【００９３】
遺伝子発現プロファイリングの方法は、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づいた方法、ポリヌクレオチドの配列決定に基づいた方法、およびプロテオミクスに基づいた方法を含む。試料中のＲＮＡ発現の定量のための、当分野において公知の例示的方法は、ノーザンブロット法およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ParkerおよびBarnes、Methods  in  Molecular  Biology１０６巻：２４７〜２８３頁（１９９９年））；ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ（Hod、Biotechniques１３巻：８５２〜８５４頁（１９９２年））；ならびに逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Weisら、Trends  in  Genetics８巻：２６３〜２６４頁（１９９２年））のようなＰＣＲに基づいた方法を含む。ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖またはＤＮＡ−タンパク質二本鎖を含む、配列特異的二本鎖を認識し得る抗体を利用してもよい。配列決定に基づいた遺伝子発現分析のための代表的方法は、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列特性配列決定法（massively  parallel  signature  sequencing）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析を含む。当分野において公知の他の方法を使用してもよい。
【００９４】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）
典型的には、ｍＲＮＡは、試験試料から単離する。出発物質は典型的に、ヒト腫瘍から、通常は、原発腫瘍から単離した全ＲＮＡである。必要に応じて、同一の患者由来の正常組織を内部対照として使用し得る。このような正常組織は、腫瘍に隣接する組織学的に正常に見える組織であってもよい。ｍＲＮＡは、組織試料から、例えば、新鮮、凍結（例えば、新鮮凍結）、またはパラフィン包埋し固定（例えば、ホルマリン固定）した試料から抽出することができる。
【００９５】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的方法は、当分野において公知であり、Ausubelら、Current  Protocols  of  Molecular  Biology、John  Wiley  and  Sons（１９９７年）を含む分子生物学の標準的教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのＲＮＡ抽出のための方法は、例えば、RuppおよびLocker、Lab  Invest.５６巻：Ａ６７（１９８７年）およびDe  Andresら、BioTechniques１８巻：４２０４４頁（１９９５年）に開示されている。特には、ＲＮＡ単離は、Ｑｉａｇｅｎのような商業的製造者による精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを使用して、製造者の説明書に従って行うことができる。例えば、培地中の細胞からの全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ（登録商標）ミニカラムを使用して単離することができる。他の市販のＲＮＡ単離キットは、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＰａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を含む。組織試料由来の全ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離することができる。腫瘍から調製したＲＮＡは、例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離法により単離することができる。
【００９６】
次いで、ＲＮＡを含む試料は、逆転写に供して、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを生成し、その後、ＰＣＲ反応において指数関数的に増幅させる。２つの最も一般的に使用される逆転写酵素は、トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写ステップは、発現プロファイリングの状況および目標に応じて、特定のプライマー、ランダムヘキサマー、またはオリゴｄＴプライマーを使用して典型的に刺激する。例えば、抽出したＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、製造者の説明書に従って逆転写することができる。次いで、得られたｃＤＮＡは、後続のＰＣＲ反応において鋳型として使用することができる。
【００９７】
ＰＣＲに基づいた方法では、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼのような耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用する。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲでは、ＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を典型的に利用して、その標的増幅産物に結合するハイブリダイゼーションプローブを加水分解するが、等価な５’ヌクレアーゼ活性を有するいかなる酵素も使用することができる。２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、ＰＣＲ反応産物に典型的な増幅産物の生成に使用する。第３のオリゴヌクレオチド、またはプローブは、２つのＰＣＲプライマーのハイブリダイゼーション部位間に位置する増幅産物のヌクレオチド配列の検出を促進するように設計することができる。プローブは、例えば、レポーター色素により検出可能に標識化することができ、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブ構成のように、蛍光色素と消光蛍光色素の両方がさらに提供され得る。Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブを使用する場合、増幅反応において、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により、プローブが鋳型依存的方法で切断される。得られたプローブ断片は、溶液中で分離し、放出されたレポーター色素からのシグナルは、第２のフルオロフォアの消光効果から免れる。レポーター色素の１つの分子は、遊離して新たな各分子が合成され、消光しなかったレポーター色素を検出することにより、データの定量的解釈の基礎がもたらされる。
【００９８】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲは、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）またはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）等のハイスループットプラットフォームのような市販の装置を使用して行うことができる。好ましい実施形態では、手順は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）リアルタイムＰＣＲシステム上で実行され、これはマイクロウェルプレートに基づいたサイクラープラットフォームである。
【００９９】
５’ヌクレアーゼアッセイのデータは一般に、閾値サイクル（「Ｃｔ」）として最初に表される。蛍光値は、すべてのサイクルにおいて記録され、増幅反応におけるその時点までの増幅された産物の量を表す。閾値サイクル（Ｃｔ）は一般に、蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録されるポイントであると説明される。あるいは、データは、交差ポイント（「Ｃｐ」）として表され得る。Ｃｐ値は、ｑＰＣＲ増幅曲線全体とその最大値の二次導関数を割り出すことにより算出される。Ｃｐ値は、蛍光の増加が最も高く、ＰＣＲの対数期が始まる時点のサイクルを表す。
【０１００】
誤差および試料間の変動効果を最少化するために、ＲＴ−ＰＣＲは通常、内部標準を使用して行われる。理想的な内部標準遺伝子（参照遺伝子とも呼ばれる）は、同一起源のがんおよび非がん組織において、ほとんど一定のレベル（すなわち、正常およびがん組織において有意差を有しないレベル）で発現し、実験的処置により有意には影響されず（すなわち、化学療法への曝露の結果として、適切な組織の発現レベルにおいて有意差を示さない）、異なる患者から採取した同一組織において、ほとんど一定のレベルで発現する。例えば、本明細書に開示されている方法において有用な参照遺伝子は、正常前立腺組織と比較して、がん性前立腺において有意差を有する発現レベルを示すべきではない。正規化に使用する例示的参照遺伝子としては、次の遺伝子：ＧＵＳ、ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１の１つまたは複数が挙げられる。遺伝子発現測定値は、１つまたは複数の（例えば、２、３、４、５つまたはそれよりも多い）参照遺伝子の平均に対して正規化され得る。対照により正規化した発現測定値は、２〜１５の範囲であってもよく、ここで、１単位の増加は通常、ＲＮＡ量の２倍の増加を示す。
【０１０１】
リアルタイムＰＣＲは、各標的配列の内部競合配列を正規化に使用する場合の定量的競合ＰＣＲと、試料に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的競合ＰＣＲの両方との互換性を有する。さらなる詳細については、例えば、Heldら、Genome  Research６巻：９８６〜９９４頁（１９９６年）を参照されたい。
【０１０２】
本開示の方法における使用のための代表的プロトコールのステップでは、固定したパラフィン包埋組織をＲＮＡソースとして使用する。例えば、ｍＲＮＡの単離、精製、プライマー伸長および増幅は、当分野において利用可能な方法に従って行うことができる（例えば、Godfreyら、J.  Molec.  Diagnostics２巻：８４〜９１頁（２０００年）；Spechtら、Am.  J.  Pathol.１５８巻：４１９〜２９頁（２００１年）を参照）。簡潔には、代表的プロセスは、約１０μｍ厚のパラフィン包埋腫瘍組織試料の切片に切断することにより開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを、ＲＮＡを含む試料から枯渇させる。ＲＮＡ濃度の分析の後、遺伝子特異的プライマーを使用してＲＮＡを逆転写し、その後、ＲＴ−ＰＣＲを行ってｃＤＮＡ増幅産物を得る。
【０１０３】
イントロンに基づいたＰＣＲプライマーおよびプローブの設計
ＰＣＲプライマーおよびプローブは、目的の遺伝子のｍＲＮＡ転写物に存在する、エクソンまたはイントロン配列に基づいて設計することができる。プライマー／プローブの設計は、Kent,  W.J.、Genome  Res.１２巻（４号）：６５６〜６４頁（２００２年）により開発されたＤＮＡ  ＢＬＡＴソフトウェアのような公的に入手可能なソフトウェアを使用して、またはその変形を含むＢＬＡＳＴソフトウェアにより行うことができる。
【０１０４】
必要または望ましい場合、標的配列の反復配列は、マスクして非特異的シグナルを軽減することができる。これを達成するための例示的ツールとしては、Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅよりオンラインで利用可能なＲｅｐｅａｒｔ  Ｍａｓｋｅｒプログラムが挙げられ、これはＤＮＡ配列を反復エレメントのライブラリーに対してスクリーニングし、反復エレメントがマスクされたクエリー配列を返す。次いで、マスク化イントロン配列は、商業的に、あるいは公的に利用可能な任意のプライマー／プローブ設計パッケージ、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＭＧＢ  ａｓｓａｙ−ｂｙ−ｄｅｓｉｇｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｐｒｉｍｅｒ３（Steve  RozenおよびHelen  J.  Skaletsky（２０００年）Primer3  on  the  WWW  for  general  users  and  for  biologist  programmers）を使用してプライマーおよびプローブ配列を設計するために使用することができる。S.  Rrawetz、S.  Misener、Bioinformatics  Methods  and  Protocols：Methods  in  Molecular  Biology、３６５〜３８６頁（Humana  Press）を参照されたい。
【０１０５】
ＰＣＲプライマー設計に影響し得る他の因子は、プライマー長、融解温度（Ｔｍ）、およびＧ／Ｃ含量、特異性、相補的プライマー配列、ならびに３’末端配列を含む。一般には、最適なＰＣＲプライマーは通常、１７〜３０塩基の長さであり、約２０〜８０％、例えば、約５０〜６０％のＧ＋Ｃ塩基を含み、５０〜８０  ０Ｃ、例えば、約５０〜７０  ０ＣのＴｍの値を示す。
【０１０６】
ＰＣＲプライマーおよびプローブ設計のためのさらなるガイドラインについては、例えば、これによりその全開示を参照により明示的に組み込む、Dieffenbach,  CW.ら、PCR  Primer,  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、New  York、１９９５年、１３３〜１５５頁の「General  Concepts  for  PCR  Primer  Design」；InnisおよびGelfand、PCR  Protocols,  A  Guide  to  Methods  and  Applications、CRC  Press、London、１９９４年、５〜１１頁の「Optimization  of  PCRs」；およびPlasterer,  T.N.  Primerselect:  Primer  and  probe  design.  Methods  Mol.  Biol.７０巻：５２０〜５２７頁（１９９７年）を参照されたい。
【０１０７】
国際特許公開ＷＯ２０１３／１１６１４４の表Ａは、プライマー、プローブおよび増幅産物配列に関するさらなる情報を提供し、これらは、本明細書に開示されている遺伝子とともに使用することができる。
【０１０８】
ＭａｓｓＡＲＲＡＹ（登録商標）システム
ＭａｓｓＡＲＲＡＹに基づいた方法、例えば、ＲＮＡの単離および逆転写の後にＳｅｑｕｅｎｏｍ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により開発された例示的方法では、得られたｃＤＮＡに合成ＤＮＡ分子（競合分子）を添加し、これは、単一塩基以外のすべての位置の標的ｃＤＮＡ領域に適合し、内部標準として作用する。ｃＤＮＡ／競合分子混合物は、ＰＣＲで増幅し、ＰＣＲ後エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）酵素処理に供し、これにより残留ヌクレオチドが脱リン酸化される。アルカリホスファターゼの不活化の後、競合分子およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物は、プライマー伸長に供し、これにより競合分子およびｃＤＮＡ由来のＰＣＲ産物の明瞭なマスシグナルが生成される。精製の後、このような産物は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）法による分析に必要とされる構成要素があらかじめ充填されているチップアレイ上に分注する。次いで、反応中に存在するｃＤＮＡは、生成されたマススペクトルのピーク領域の比率を分析することにより定量する。さらなる詳細については、例えば、DingおよびCantor、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA１００巻：３０５９〜３０６４頁（２００３年）を参照されたい。
【０１０９】
他のＰＣＲに基づいた方法
本明細書に開示されている方法における使用を見出すことが可能な、さらなるＰＣＲに基づいた技術は、例えば、ＢｅａｄＡｒｒａｙ（登録商標）技術（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Oliphantら、Discovery  of  Markers  for  Disease（Supplement  to  Biotechniques）、２００２年６月；Fergusonら、Analytical  Chemistry７２巻：５６１８頁（２０００年））；市販のＬｕｍｉｎｅｘ１００  ＬａｂＭＡＰ（登録商標）システムおよび多色コードミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を遺伝子発現の迅速アッセイにおいて使用したＢｅａｄｓＡｒｒａｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（登録商標）（ＢＡＤＧＥ）（Yangら、Genome  Res.１１巻：１８８８〜１８９８頁（２００１年））；ならびにｈｉｇｈ  ｃｏｖｅｒａｇｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（ＨｉＣＥＰ）分析（Fukumuraら、Nucl.  Acids.  Res.３１巻（１６号）ｅ９４頁（２００３年））を含む。
【０１１０】
マイクロアレイ
目的の遺伝子またはマイクロアレイの発現レベルはまた、マイクロアレイ技術を使用して評価することができる。この方法では、目的のポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む）を基質上に整列させる。次いで、整列した配列は、特定のハイブリダイゼーションに適した条件下で、試験試料のＲＮＡから生成した検出可能な標識化ｃＤＮＡと接触させる。ＲＴ−ＰＣＲ方法のように、ＲＮＡのソースは典型的には、腫瘍試料から、および必要に応じて、内部対照として同一患者の正常組織または細胞株から単離した全ＲＮＡである。ＲＮＡは、例えば、パラフィン包埋し固定（例えば、ホルマリン固定）して凍結または保存された組織試料から抽出することができる。
【０１１１】
例えば、ＰＣＲにより増幅した、アッセイする遺伝子ｃＤＮＡクローンの挿入断片は、高密度の配列の基質に適用される。通常、少なくとも１０，０００のヌクレオチド配列が、基質に適用される。例えば、マイクロチップ上に各１０，０００エレメントで固定化したマイクロアレイ遺伝子は、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションに適する。蛍光で標識したｃＤＮＡプローブは、目的の組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドを組み込むことにより生成することができる。チップに適用した標識化ｃＤＮＡプローブは、配列上のＤＮＡの各スポットに対する特異性によりハイブリダイズさせる。ストリンジェント条件下で洗浄して非特異的に結合したプローブを除去した後、共焦点レーザー顕微鏡により、またはＣＣＤカメラのような別の検出方法によりチップをスキャンする。整列させた各エレメントのハイブリダイゼーションの定量により、対応するＲＮＡ存在量の評価が可能となる。
【０１１２】
二色蛍光により、別々に標識した、２つのＲＮＡソースから生成したｃＤＮＡプローブは、対で配列とハイブリダイズさせる。したがって、特定の各遺伝子に対応する２つのソース由来の転写物の相対存在量は、同時に決定する。ハイブリダイゼーションのスケールの小型化は、簡便性および多数の遺伝子について発現パターンの迅速な評価をもたらす。このような方法は、１細胞あたり少数のコピーを発現する希少な転写物を検出するのに、および発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現性よく検出するのに必要とされる感度を有することが示されている（Schenaら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA９３巻（２号）：１０６〜１４９頁（１９９６年））。マイクロアレイ分析は、市販の装置により、製造者のプロトコールに従って、例えば、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎＣｈｉｐ（登録商標）技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を使用することにより行うことができる。
【０１１３】
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写についてそれぞれのハイブリダイゼーションプローブを用意する必要なく、多数の遺伝子転写物の同時および定量的分析を可能とする方法である。はじめに、各転写物における唯一の位置からタグが得られるという条件で、転写物を一意的に同定するのに十分な情報を含む、短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を生成する。次いで、多くの転写物をともに連結させて長い連続分子を形成し、これを配列決定して複数のタグの同一性を同時に明らかとすることができる。転写物の任意の集団の発現パターンは、タグそれぞれの存在量を決定し、各タグに対応する遺伝子を同定することにより定量的に評価することができる。さらなる詳細については、例えば、Velculescuら、Science２７０巻：４８４〜４８７頁（１９９５年）；およびVelculescuら、Cell８８巻：２４３〜５１頁（１９９７年）を参照されたい。
【０１１４】
核酸配列決定による遺伝子発現分析
核酸配列決定技術は、遺伝子発現の分析に適した方法である。このような方法の根底にある原理は、ｃＤＮＡ配列が試料中に検出される回数が、その配列に対応するＲＮＡの相対発現に直接関連することである。このような方法は、デジタル遺伝子発現（ＤＧＥ）の用語で言及され、得られるデータの別々の数値的特性を示すこともある。この原理を適用する初期の方法は、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）および超並列特性配列決定法（ＭＰＳＳ）であった。例えば、S.  Brennerら、Nature  Biotechnology１８巻（６号）：６３０〜６３４頁（２０００年）を参照されたい。より最近では、「次世代」配列決定技術の出現により、ＤＧＥがより簡便、よりハイスループットで、より入手可能となった。結果として、これまでに可能なものよりも、より多くの実験室で、より多くの各患者試料における、より多くの遺伝子の発現をスクリーニングするためにＤＧＥを利用することが可能となる。例えば、J.  Marioni,  Genome  Research１８巻（９号）：１５０９〜１５１７頁（２００８年）；R.  Morin,  Genome  Research１８巻（４号）：６１０〜６２１頁（２００８年）；A.  Mortazavi,  Nature  Methods５巻（７号）：６２１〜６２８頁（２００８年）；N.  Cloonan,  Nature  Methods５巻（７号）：６１３〜６１９頁（２００８年）を参照されたい。
【０１１５】
ＲＮＡの体液からの単離
発現分析においてＲＮＡを血液、血漿および血清から（例えば、K.  Endersら、Clin  Chem４８巻、１６４７〜５３頁（２００２年）およびそこに引用される参考文献を参照）ならびに尿から（例えば、R.  Boomら、J  Clin  Microbiol.２８巻、４９５〜５０３頁（１９９０年）およびそこに引用される参考文献を参照）単離する方法は、記載されている。
【０１１６】
免疫組織化学的検査
免疫組織化学的検査法はまた、遺伝子の発現レベルの検出に適し、本明細書に開示されている方法に適用する。目的の遺伝子の遺伝子産物に特異的に結合する抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、このような方法において使用することができる。抗体は、抗体それ自体を直接標識することにより、例えば、放射性標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、または西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼのような酵素を用いて、検出することができる。あるいは、非標識一次抗体は、一次抗体に特異的な標識化二次抗体と組み合わせて使用することができる。免疫組織化学的検査プロトコールおよびキットは、当分野において周知であり、市販されている。
【０１１７】
プロテオミクス
用語「プロテオーム」は、試料（例えば、組織、生物または細胞培養物）中に特定の時点で存在するタンパク質全体として定義される。プロテオミクスはとりわけ、試料中のタンパク質発現の全体的変化の研究を含む（「発現プロテオミクス」とも呼ばれる）。プロテオミクスは典型的に、次のステップ：（１）試料中の各タンパク質の二次元ゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）による分離、（２）ゲルから回収された各タンパク質の同定、例えば、質量分析またはＮ末端配列決定、および（３）バイオインフォマティクスを使用したデータの分析を含む。
【０１１８】
ｍＲＮＡの単離、精製および増幅の概要
ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む、固定したパラフィン包埋組織をＲＮＡソースとして使用して遺伝子発現をプロファイリングするための代表的プロトコールのステップが、種々の公開学術論文に提供されている（例えば、T.E.  Godfreyら、J.  Molec.  Diagnostics２巻：８４〜９１頁（２０００年）；K.  Spechtら、Am.  J.  Pathol.１５８巻：４１９〜２９頁（２００１年）、M.  Croninら、Am  J  Pathol１６４巻：３５〜４２頁（２００４年）を参照）。簡潔には、代表的プロセスは、組織試料切片（例えば、パラフィン包埋腫瘍組織試料の約１０μｍ厚の切片）を切断することから開始する。次いで、ＲＮＡを抽出し、タンパク質およびＤＮＡを除去する。ＲＮＡ濃度の分析の後、必要に応じてＲＮＡ修復を行う。次いで、例えば、遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写により試料を分析に供し、その後ＲＴ−ＰＣＲを行うことができる。
【０１１９】
統計分析
当業者は、目的の臨床アウトカム（例えば、再発）とＧＰＳまたは別の診断試験スコアとの間に有意な関連性が存在するかどうかの判定に使用され得る、多くの統計的方法が存在することを理解するであろう。
【０１２０】
例えば、仮説検定は、両側ｐ値を使用して報告され得る。アウトカム（例えば、ＣＲ、ＢＣＲ、Ｍｅｔｓ、ＰＣＤ）の特定の測定または算出したエンティティとの有意な関連性が存在するかどうかを検討するために、最大重み疑似部分尤度推定量を使用したコックス比例ハザード（ＰＨ）モデルを使用することができ、ハザード比（ＨＲ）が１である帰無仮説のワルド検定のｐ値が、報告され得る。
【０１２１】
発現レベルの正規化
本明細書に開示されている方法において使用する発現データは、正規化され得る。正規化は、例えば、ＲＮＡの量の差および試料から得たＲＮＡの質の可変性を補正して、ＣｔまたはＣｐ測定値等における不必要な体系的変化の原因を除去する（すなわち、正規化して切り捨てる）プロセスを指す。保存した固定化パラフィン包埋組織試料を使用するＲＴ−ＰＣＲ実験に関しては、例えば、体系的変化の原因は、患者試料の年齢および試料の保管に使用する固定液の種類に応じたＲＮＡ分解度を含み得る。他の体系的変化の原因は、実験室処理条件に起因し得る。
【０１２２】
アッセイは、適切な条件下での発現レベルにおいて有意差を有しない、特定の参照遺伝子の発現を組み込むことにより正規化を行うことができる。本明細書に開示されている参照遺伝子の例としては、ハウスキーピング遺伝子が挙げられる（例えば、E.  Eisenbergら、Trends  in  Genetics１９巻（７号）：３６２〜３６５頁（２００３年）を参照）。一般には、参照遺伝子は典型的に、非癌性前立腺組織と比較して有意味に異なる前立腺がんの発現を示さないこと、ならびに種々の試料およびプロセス条件に追従しないことで知られている遺伝子であり、したがって、外部影響を正規化して切り捨てることができる。例示的実施形態では、次の遺伝子の１つまたは複数を、ｍＲＮＡ発現データを正規化する参照遺伝子として使用する：ＧＵＳ、ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１。各試験遺伝子、例えば、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＴＰＸ２、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＳＲＤ５Ａ２、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２およびＴＰＭ２についての較正重み付け平均ＣｔまたはＣｐ測定値は、５つまたはそれよりも多い参照遺伝子の平均値に対して正規化され得る。他の実施形態では、正規化は、あるいは、すべてのアッセイした遺伝子またはその大きなサブセットのシグナル（ＣｔまたはＣｐ）の平均値または中央値に基づき得る（国際的な正規化のアプローチ）。
【０１２３】
当業者は、正規化は、多くの方法で達成することができ、上記の技術は、網羅的なものではなく、例示的なものであることのみを意図することを理解するであろう。
【０１２４】
発現レベルの標準化
本明細書に開示されている方法において使用する発現データは、標準化され得る。標準化は、すべての遺伝子を効率的に比較可能なスケールにおくプロセスを指す。これは、一部の遺伝子が、他よりも変動（広範な発現）を示すために行われる。標準化は、各発現値を、その遺伝子の全試料にわたる標準偏差で割ることにより行われる。次いで、ハザード比は、ハザードの、臨床エンドポイント（臨床的再発、生物学的再発、前立腺がんによる死、または任意の原因による死）に対する、発現において標準偏差が１増加する毎の比例変化として解釈される。
【０１２５】
本発明のキット
本発明の方法における使用のための材料は、周知の手順に従って生成されるキットの調製に適する。したがって、本開示は、予後のアウトカムまたは処置に対する応答を予測することを目的として本開示の遺伝子の発現を定量するための、遺伝子特異的または遺伝子選択的プローブおよび／またはプライマーを含み得る薬剤を含むキットを提供する。このようなキットは必要に応じて、腫瘍試料、特に、固定したパラフィン包埋組織試料からのＲＮＡの抽出のための試薬、および／またはＲＮＡ増幅のための試薬を含むことができる。さらに、キットは必要に応じて、識別の記述もしくは表示または本発明の方法におけるその使用に関する説明書を有する試薬（単数または複数）含むことができる。キットは、容器（方法の自動的実施における使用に適したマイクロリットルプレートを含む）を含むことができ、それぞれが方法において利用される種々の材料または試薬（典型的には濃縮形態）の１つまたは複数を有し、例えば、クロマトグラフカラム、既製のマイクロアレイ、バッファー、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、またはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ならびに１つまたは複数の本発明のプローブおよびプライマー（例えば、ＲＮＡポリメラーゼと反応するプロモーターに結合する適切な長さのポリ（Ｔ）またはランダムプライマー）を含む。予後または予測情報を推定または定量するのに使用する数学的アルゴリズムはまた、キットの正しく有望な構成要素である。
【０１２６】
一部の実施形態では、キットは、患者試料における特定のＲＮＡ転写物のレベルをＲＴ−ＰＣＲにより決定するのに必要な試薬を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、キットは、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＴＰＸ２、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＳＲＤ５Ａ２、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２およびＴＰＭ２遺伝子の１つまたは複数のＲＮＡ転写物のレベルを決定するための１つまたは複数のプライマーを含む、少なくとも１つのウェル（チャネル、チャンバー、領域または表面を構成し得る）を含む、カートリッジまたは他の同様の物理的構造を含むことができる。一部の実施形態では、プライマーは、カートリッジ内の１つまたは複数のウェルに付着している。一部の実施形態では、各ウェルは、例えば、種々の色の標識で標識したプライマーを使用することにより、２、３、４、５または６つの種々の遺伝子のためのプライマーを含むことができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのウェルは、１つまたは複数の参照遺伝子のＲＮＡ転写レベルを決定するための少なくとも１つのプライマーを含む。一部の実施形態では、参照遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子を含む。他の実施形態では、参照遺伝子は、ＧＵＳ、ＡＡＭＰ、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、カートリッジ内に含まれるプライマーは、ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＴＰＸ２、ＡＺＧＰ１、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＳＲＤ５Ａ２、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＧＳＴＭ２およびＴＰＭ２、ならびに１つまたは複数の参照遺伝子からなる一連の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを決定するためのプライマーを含む。一部の実施形態では、カートリッジは、バッファー、ヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰまたはｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、および／またはＲＮＡポリメラーゼのような増幅試薬をさらに含む。一部の実施形態では、カートリッジは、このような試薬をカートリッジのウェル内に導入する１つまたは複数の構成要素を含むシステムの一部である。一部の実施形態では、ＲＮＡは、試料から抽出され、抽出されたＲＮＡは、カートリッジに適用される。他の実施形態では、抽出ステップは必要とせず、試料は、カートリッジに直接適用される。本明細書においてＲＮＡ転写レベルを定量するのに利用可能なカートリッジおよび関連システムの実例は、国際公開ＷＯ２００６／１３６９９０およびその関連の米国特許第９，５６８，４２４号に記載されている。
【０１２７】
一部の実施形態では、カートリッジは、そこで熱循環が発生する、プライマーを含む少なくとも１つのウェル、ならびに試料を導入、溶解および／または洗浄するための１つまたは複数のウェルを含む。一部の実施形態では、カートリッジ構造の全体はまた、ポンプ、バルブ、プロセスウェル、ならびに液体および廃棄リザーバーを含み、これらはカートリッジ内において、試料の処理およびＲＴ−ＰＣＲ反応ならびにそれに関連した、特定の遺伝子のＲＮＡ転写レベルの検出を行うことを可能とする。
【０１２８】
カートリッジシステムを利用する一部の実施形態では、システムでは、試料由来のＲＮＡならびにカートリッジ内に含まれるプライマーおよび試薬を使用してＲＮＡ転写レベルを決定することが可能であり、システムはまた、関連する正規化ＲＮＡ転写レベルを決定し、ＧＰＳスコアのような関連する任意の定量的スコアを算出することが可能なソフトウェアを含む。一部の実施形態では、システムは、患者の定量的スコア（例えば、ＧＰＳスコア）を本明細書に記載のように、適切な低、中または高リスク範囲に分類することにより、患者が低、中または高リスクの有害臨床アウトカム、例えば、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）のリスクにあるかどうかを判定することが、さらに可能である。一部の実施形態では、システムはまた、患者の定量的スコアを提供する報告を作成することが可能である。
【０１２９】
報告
本発明の方法は、商業的診断目的のために実行される場合、本明細書に記載の方法から得た情報の報告または要約を一般に作成する。例えば、報告は、１つまたは複数の遺伝子の発現レベル、ＧＰＳ結果、ＧＰＳ結果と、特定の閾値またはカットオフポイントとの、および／または平均スコアとの比較に関する前立腺患者の情報、ならびに患者についての他の情報、例えば、ＡＵＡまたはＮＣＣＮまたは他の認められるリスク群、ならびに患者をこのようなリスク群、例えば、ＰＳＡレベル、グリーソンスコア等に分類するために使用した情報を含み得る。本発明の方法および報告は、報告をデータベースに記憶することをさらに含み得る。方法では、データベースに対象の記録を作成し、記録にデータを追加することができる。報告は、書面の報告、音声による報告、または電子記録であってもよい。報告は、演算デバイス（例えば、携帯用デバイス、デスクトップコンピュータ、スマートデバイス、ウェブサイト等）上で表示および／または記憶することができる。報告が、医師および／または患者に提供されることが考慮される。報告の受信には、データおよび報告を含むサーバコンピュータへのネットワーク接続を確立すること、ならびにサーバコンピュータからのデータおよび報告を要求することをさらに含み得る。
【０１３０】
コンピュータプログラム
上記のアッセイから得た値、例えば、発現データは、手動で算出し記憶することができる。あるいは、上記のステップは、コンピュータプログラム製品により完全または部分的に行うことができる。したがって、本発明は、そこに記憶されたコンピュータプログラムを有するコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品を提供する。プログラムは、コンピュータにより読み取る場合、１つまたは複数の個体由来の生体試料の分析から得られた値（例えば、遺伝子発現レベル、正規化、標準化、閾値化、ならびにアッセイから得た値のスコアおよび／もしくはテキストへの変換または腫瘍病期および関連情報のグラフィック描写）に基づいて適切な計算を実行することができる。コンピュータプログラム製品は、そこに計算を行うためのコンピュータプログラムを記憶している。
【０１３１】
本開示は、上記のプログラムを実行するためのシステムを提供し、このシステムは一般に、ａ）中央演算環境と、ｂ）演算環境に動作可能に接続されて患者のデータを受信する入力デバイスであって、この患者のデータが、例えば、詳細に上記のように、患者由来の生体試料を使用したアッセイから得た発現レベルもしくは他の値、またはマイクロアレイデータを含み得る、入力デバイスと、ｃ）演算環境に接続されて情報をユーザ（例えば、医療関係者）に提供する出力デバイスと、ｄ）中央演算環境（例えば、プロセッサ）により実行されるアルゴリズムとを含み、このアルゴリズムは、入力デバイスにより受信したデータに基づいて実行され、このアルゴリズムが、本明細書に記載の、発現スコア、閾値、または他の機能を算出する。本発明により提供する方法はまた、全体的または部分的に自動化してもよい。
【０１３２】
本発明を説明してきたところで、次の実施例を参照することによって、本発明は、より容易に理解することができる。この実施例は、例示目的で提供し、本発明を制限することを決して意図しない。
【実施例】
【０１３３】
（実施例１）
ＧＰＳ結果＜２０と関連する臨床的再発（ＣＲ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）のリスク
２つの大規模な長期的前立腺がんコホートを分析して、ＣＲおよびＰＣＤのリスクをＧＰＳ＜または＞２０単位について０〜１００のスケールで推定した。E.  Kleinら、Eur  Urol  ６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）およびJ.  Cullenら、Eur  Urol  ６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）から得た患者のデータを分析して、あらかじめ設定した２０のＧＰＳカットオフポイントと関連するＣＲおよびＰＣＤのリスクを設定した。本試験における患者のベースライン特性に関する、さらなる詳細についてはE.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）、表１、およびJ.  Cullenら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）、表１を参照されたい。
【０１３４】
ＧＰＳの値（≦２０または＞２０）に基づいて患者を分けた。コックス回帰分析は、コホートのサンプリング重み付けを考慮した。ＧＰＳおよびＣＲおよびＰＣＤについてＫｌｅｉｎの標準化ハザード比（ｓｔｄ  ＨＲ、共変量における１標準偏差（ＳＤ）の変化についてのＨＲ）を使用してＧＰＳを展開したため、平均への回帰（ＲＭ）を補正して２群の生存曲線を推定した。
【０１３５】
Ｃｕｌｌｅｎの４０２人の患者（追跡期間中央値５．２年）のうち、５人の患者のみが転移を起こし、５人すべてがＧＰＳ＞２０を有した。６．６年の追跡期間中央値を有するＫｌｅｉｎの４２６人の患者のうち、１０９人のＣＲ患者（遠隔転移と限局性の再発の両方を含む）および３９人のＰＣＤ患者が存在したが、このような患者の１人のみが、ＧＰＳ＜２０を有した。対照的に、Ｋｌｅｉｎの患者の２８％が、ＧＰＳ＜２０を有した。ＧＰＳは、ＡＵＡリスク群を調整した後のＣＲ（ｓｔｄ  ＨＲ２．５０（９５％ＣＩ  １．９９、３．１５、ｐ＜０．００１、ＲＭ補正ｓｔｄＨＲ２．１６、ＦＤＲ＜０．１％））とＰＣＤ（ｓｔｄＨＲ  ２．９０（９５％ＣＩ  ２．０６、４．０６、ｐ＜０．００１、ＲＭ補正ｓｔｄＨＲ１．９６、ＦＤＲ＜０．１％））の両方にとって有意な予測因子であった。下記の表に示すように、中リスクの前立腺がん（ＡＵＡ）およびＧＰＳ結果≦２０を有する男性は、ＣＲおよびＰＣＤの１０年ＲＭ補正リスクがそれぞれ２．６％および０．７％であった。中リスクの前立腺がん（ＡＵＡ）およびＧＰＳ結果＞２０を有する男性は、ＣＲおよびＰＣＤの推定１０年ＲＭ補正リスクがより大きい。このような結果は、非常に低い、低または中程度のＮＣＣＮリスク群およびＧＰＳ結果≦２０の男性が、即時の根治的処置よりもむしろ積極的監視に適した候補であり得ることを示唆する。
【表１】
2020507320.tif 000004
【０１３６】
（実施例２）
前立腺がん患者におけるＧＰＳ結果≦４０および＞４０ならびに遠隔転移および前立腺がん死のリスク
２５９人の患者の最初の選択は、１９９５〜２０１０年の大規模な地域参画型の米国統合医療制度（U.S.  Integrated  health  care  system）のＮＣＣＮリスクが非常に低いから高である６１８４人の前立腺がん患者から選択された。特には、６，１８４人の適格な患者の中でも、あらかじめ規定したコホートサンプリング計画に基づいて４０４人が選択され、そのうちの３３４人の患者が利用可能な生検組織を有していた。１４人（４％）が、臨床的不適格であったため、４１人（１２％）が、腫瘍が不十分であったか、または腫瘍型が誤っていたため除外された。残りの２７９人のうち、有効なＧＰＳ結果を、最終的に評価可能な集団を代表する２５９人の患者（９３％）について得た。２５９人の患者には、５人の非常に低いリスク群、３５人の低リスク群、１６０人の中リスク群、および５７人の高リスク群が含まれた。以下の表では、２５９人の評価可能な患者の特性を提供する。
【表２】
2020507320.tif 000005
【０１３７】
２５９人の評価可能な患者には、７９人（加重比率＝８．８％）の遠隔転移、および１８０人の非転移患者が含まれた。２５９人の評価可能な患者には、６４人のＰＣＤ（加重比率＝１．８％）および１９５人の非ＰＣＤ患者が含まれた。
【０１３８】
遠隔転移（Ｍｅｔｓ）および前立腺がん死（ＰＣＤ）の１０年推定は、各患者リスク群について判定し、ＧＰＳ結果を得た（詳細については図１Ａ〜１Ｂおよび２Ａ〜２Ｂを参照）。以下の表に示すように、２５９人の患者すべてについての平均ＧＰＳは、３１であり、スコア中央値は、２８であった。
【表３】
2020507320.tif 000006
【０１３９】
４０人の患者の非常に低いおよび低リスク群では、スコア中央値は２２であり、１６０人の患者の中リスク群では、中央値は２９であり、５７人の患者の高リスク群では、中央値は４３であった。
【０１４０】
グリーソンスコアに対してＧＰＳを考慮する多変量分析（ＭＶＡ）では、ＮＣＣＮリスク群、ＡＵＡリスク群またはＣａｐｒａスコア、ＧＰＳは、ｐ値＜０．００１〜０．００７によりＭｅｔｓおよびＰＣＤの１０年リスクと有意に関連していることが見出された。詳細については、以下の表を参照されたい。また、図３を参照されたい。
【表４】
2020507320.tif 000007
【表５】
2020507320.tif 000008
【０１４１】
ＧＰＳ結果はまた、診断時の年齢、グリーソンスコア、診断時のＰＳＡレベル、および陽性生検コアの割合のような臨床的因子により調整する多変量モデルにおいてＰＣＤと有意に関連し続けた（ｐ値＝０．００４）。詳細については、以下の表を参照されたい。
【表６】
2020507320.tif 000009
【０１４２】
さらに、１６０人のＮＣＣＮ中リスク患者から得たデータの分析は、高リスク患者のリスクと同様に、ＧＰＳ結果＞４０を有する患者（２４％）が転移の５年リスクを有することを示した。特には、このような患者の８４％が、５年無転移であり、高リスク患者の８５％が、ＧＰＳ結果にかかわらず５年無転移であり、ＧＰＳ結果≦４０を有する中リスク患者の９７％が、５年無転移であった。さらに、ＧＰＳ≦４０を有するＮＣＣＮ高リスク患者（試験した高リスク群の４１％）は、臨床的中リスク患者のリスクと同様に、遠隔転移の５年リスクを有した。特には、そのような患者は、９６％が５年無転移であるが、中リスク患者のすべては、９４％が５年無転移であると推定された。対照的に、ＧＰＳ＞４０を有する高リスク患者は、５９％が５年無転移にとどまった。
【０１４３】
それぞれの遺伝子群スコア（間質応答、細胞構成、アンドロゲンシグナル伝達、および増殖）をまた、ＭｅｔｓおよびＰＣＤの発生に対して判定および分析する。図５を参照されたい。ＭｅｔｓとＰＣＤの遺伝子群スコアはともに、遺伝子群スコアの、ＣＲのような他の変数との関連性に基づいて予想通りのままである。
【０１４４】
概して、結果は、ＧＰＳが、前立腺全摘除術後の、臨床的に低、中および高リスク前立腺がん患者についての転移およびＰＣＤのリスクの有意な予測因子であること、ＮＣＣＮ、ＡＵＡおよびＣＡＰＲＡ臨床リスク群を含む臨床的および病理的共変量による調整後の、ＧＰＳと転移およびＰＣＤまでの時間との関連性が有意なままであること、ＧＰＳにより、従来の臨床病理的予後因子を超えた予後情報が加えられ、診断時のリスク層別化が向上することを実証する。その上、ＮＣＣＮ中リスク群において、ＧＰＳは、アウトカムの有意な予測因子であった。特には、４０よりも高いＧＰＳ結果を有する患者は、臨床的高リスク患者のリスクと同様に、遠隔転移の５年リスクを有した。結果として、ＧＰＳ＞４０を有するこのような中リスク群の患者は、マルチモード処置のような、より強力な処置の適した候補であり得る。
【０１４５】
ＧＰＳと生化学的再発（ＢＣＲ）との相関性をまた、この患者群において試験した。試験のために、術後のＢＣＲイベントを２００７年のＡＵＡガイドラインに従って、（１）術後ＰＳＡレベル≧０．２ｎｇ／ｍＬであり、その上、連続確証的ＰＳＡレベル≧０．２ｎｇ／ｍＬであり、ここで、ＢＣＲ日は最初のＰＳＡ日であるか、または（２）ＰＳＡレベル≧０．１ｎｇ／ｍＬの上昇後にサルベージ放射線またはホルモン療法を開始し、ここで、ＢＣＲ日は、サルベージ療法日であるとして定義した。試験により、単変量モデルの２５９人の試験した患者において、２０単位あたりのＧＰＳ値とＢＣＲとの有意な関連性が見出された（ＨＲ２．５０、ＨＲ９５％ＣＩ  １．６２、３．８５、ワルドＣｈｉｓｑ１７．００、ワルドｐ値＜０．０００１）。
【表７−１】
2020507320.tif 000010
【表７−２】
2020507320.tif 000011
【表８】
2020507320.tif 000012
【表９】
2020507320.tif 000013
【０１４６】
ＮＣＣＮ、ＡＵＡおよびＣａｐｒａスコアならびにＧＰＳ結果を考慮する多変量モデルにおいて、関連性は、有意なままであった（ｐ＜０．００１）。詳細については、表４を参照されたい。ｃＴ病期、グリーソンスコア、および診断時のＰＳＡのような因子により調整した後の関連性はまた、有意なままであった。詳細については、表５を参照されたい。
【０１４７】
（実施例３）
前立腺がん患者におけるＧＰＳ結果≦４０および＞４０ならびに臨床的再発（ＣＲ）および生化学的再発（ＢＣＲ）のリスク
２つのさらなる試験では、E.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）およびJ.  Cullenら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）から得た患者のデータを分析して、４０より高いかまたは低いＧＰＡ結果が、ＢＣＲおよびＣＲとどのように相関するかを中リスク患者において検討した。このような試験における患者のベースライン特性に関する、さらなる詳細についてはE.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）、表１、およびJ.  Cullenら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）、表１をまた参照されたい。
【０１４８】
E.  Kleinら、Eur  Urol６６巻：５５０〜５６０頁（２０１４年）に記載のクリーブランドクリニック（ＣＣ）のデータベースから得られる前立腺がん患者の試験では、ＧＰＳ≦４０を有するＡＵＡ中リスク群患者は、１０年で４．７％の臨床的再発（ＣＲ）のＲＭ補正推定リスクを有するが、ＧＰＳ＞４０を有するＡＵＡ中リスク患者は、１０年で１６．９％のＣＲのＲＭ補正推定リスクを有することを示した。ＡＵＡ高リスク群の患者は、ＧＰＳ結果にかかわらず、１０年で１８．２％のＣＲのＲＭ補正推定リスクを有した。したがって、ＧＰＳ中および高リスク群は、１０年で同様のＣＲリスクを有した。
【０１４９】
ＧＰＳ≦４０を有するＡＵＡ中リスク群の患者はまた、３年で１５．７％および５年で２３．６％の生化学的再発（ＢＣＲ）のＲＭ補正推定リスクを有することが見出された（ＰＳＡ閾値０．２）が、ＧＰＳ＞４０を有するＡＵＡ中リスク患者は、３年で３３．５％および５年で４７．１％のＢＣＲのＲＭ補正推定リスクを有することが見出された。ＡＵＡ高リスク群の患者は、ＧＰＳ結果にかかわらず、３年で３２．９％および５年で４５．４％のＢＣＲのＲＭ補正推定リスクを有した。やはり、ＧＰＳ中および高リスク群は、３および５年で同様のＢＣＲリスクを有した。
【０１５０】
J.  Cullenら、Eur  Urol６８巻：１２３〜１３１頁（２０１５年）に記載のＣｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＰＤＲ）データベースの試験から得た患者の同様の分析では、１３９人のＮＣＣＮ中リスク患者の群を評価して、ＧＰＳ結果対ＢＣＲの３年または５年リスクを検討した。ＧＰＳ≦４０を有する中リスク患者（患者の６１％）は、８．０％のＢＣＲの３年リスクおよび１６．１％のＢＣＲの５年リスクを有した（ＰＳＡ閾値０．２）。対照的に、ＧＰＳ＞４０を有する中リスク患者は、２７．４％のＢＣＲの３年リスクおよび３６．０％のＢＣＲの５年リスクを有した。このような結果は、ＣＣ／Ｋｌｅｉｎ試験における患者の結果と同様である。
【図１Ａ】
2020507320.tif 000018
【図１Ｂ】
2020507320.tif 000019
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020507320.tif 000021
【図３】
2020507320.tif 000022
【図４】
2020507320.tif 000023
【図５】
2020507320.tif 000024
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月9日(2019.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺がん患者の定量的スコア（ＱＳ）群を前記患者における有害臨床アウトカムの尤度の指標とする方法であって、該方法は、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を前記患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：  
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数３】
2020507320.tif 000025
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数４】
2020507320.tif 000026
、ステップと、
を含み、
（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられ、
前記患者のスコア群は、前記患者について有害臨床アウトカムの尤度を示し、低いスコア群は、高スコア群よりも低い有害臨床アウトカムのリスクを示す、方法。
【請求項２】
（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉ）前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者の定量的スコア群は、前記患者のための処置を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記有害臨床アウトカムが、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）または前立腺がん死（ＰＣＤ）の１つまたは複数である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前立腺がん患者の定量的スコア（ＱＳ）を、低または中リスクの前立腺がん患者に対する有害臨床アウトカムの相対リスクの指標とする方法であって、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＥＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数５】
2020507320.tif 000027
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数６】
2020507320.tif 000028
、ステップと
を含み、
（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、方法。
【請求項１６】
（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ｉ）前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が、中リスク患者である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による中リスク患者である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、請求項１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者の定量的スコア群は、前記患者のための処置を示す、請求項１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、中リスク患者であり、前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者の前記高スコア群は、前記患者が高リスク患者として再分類され得ることを示し、必要に応じて、前記患者が前記低いスコア群にある場合、前記患者の前記低いスコア群は、前記患者の分類が中リスク患者として維持され得ることを示す、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者の前記高スコア群は、前記患者が高リスク患者のためのマルチモード療法または標準的療法により処置され得ることを示す、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者が前記低スコア群にある場合、前記患者の前記低いスコア群は、前記患者が積極的監視により処置され得ることを示す、請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って前記高スコア群の定量的スコアを有すると判定された中リスク前立腺がん患者を処置するための医薬または医療デバイスであって、マルチモード療法を前記患者に行うための手段を含む、医薬または医療デバイス。
【請求項３３】
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、請求項３２に記載の医薬または医療デバイス。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本開示はまた、上記の方法により高スコア群の定量的スコアを有すると判定された中リスク前立腺がん患者を処置する方法であって、マルチモード療法を患者に施すステップを含む、方法を包含する。一部の実施形態では、マルチモード療法は、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、および／または（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与、および／または（ｄ）外科手術、および／または（ｅ）放射線、および／または（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せを含む。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
前立腺がん患者における有害臨床アウトカムの尤度を予測する方法であって、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＦＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を前記患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：  
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数３】
2020507320.tif 000029
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数４】
2020507320.tif 000030
、ステップと、
（ｄ）前記患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、ステップと、
（ｅ）前記患者のスコア群に基づいて、前記患者について有害臨床アウトカムの尤度を予測するステップであって、低いスコア群が、高スコア群よりも低い有害臨床アウトカムのリスクを示す、ステップと
を含む、方法。
（項目２）
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低
いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、項目１に記載の方法。
（項目３）
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、項目２に記載の方法。
（項目４）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目１〜３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目４に記載の方法。
（項目６）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目５に記載の方法。
（項目７）
前記患者が、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、項目１〜６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による、非常に低い、もしくは低、中または高リスク患者である、項目７に記載の方法。
（項目９）
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、項目１〜８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、項目１〜９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、項目１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、項目１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記患者の定量的スコア群に基づいて前記患者のための処置を決定するステップをさらに含む、項目１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記有害臨床アウトカムが、臨床的再発（ＣＲ）、生化学的再発（ＢＣＲ）、遠隔転移（Ｍｅｔｓ）または前立腺がん死（ＰＣＤ）の１つまたは複数である、項目１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
有害臨床アウトカムの相対リスクを低または中リスクの前立腺がん患者に割り当てる方
法であって、
（ａ）前記患者から得たがん細胞を含む生体試料において次の遺伝子：ＢＧＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＳＥＲＰ４、ＦＬＮＣ、ＧＳＮ、ＴＰＭ２、ＧＳＴＭ２、ＦＡＭ１３Ｃ、ＫＬＫ２、ＡＺＧＰ１、ＳＲＤ５Ａ２およびＴＰＸ２のＲＮＡ転写物のレベルを測定するステップと、
（ｂ）正規化遺伝子発現レベルを得るために、前記遺伝子の前記ＲＮＡ転写物の前記レベルを正規化するステップと、
（ｃ）定量的スコア（ＱＳ）を患者について算出するステップであって、前記定量的スコアが、次のように算出され、ここで以下の遺伝子記号は、各遺伝子それぞれの前記正規化遺伝子発現レベルを表す：
（ｉ）未スケール化定量的スコア（ＱＳｕ）を次のように算出する：
ＱＳｕ＝０．７３５×間質応答群スコア−０．３６８×細胞構成群スコア−０．３５２×アンドロゲン群スコア＋０．０９５×増殖群スコア
ここで：
間質応答群スコア＝０．５２７×ＢＧＮ＋０．４５７×ＣＯＬ１Ａ１＋０．１５６×ＳＦＲＰ４
細胞構成群スコア＝０．１６３×ＦＬＮＣ＋０．５０４×ＧＳＮ＋０．４２１×ＴＰＭ２＋０．３９４×ＧＳＴＭ２
アンドロゲン群スコア＝０．６３４×ＦＡＭ１３Ｃ＋１．０７９×ＫＬＫ２＋０．６４２×ＡＺＧＰ１＋０．９９７×ＳＲＤ５Ａ２閾値
増殖群スコア＝ＴＰＸ２閾値、
ここで、ＳＲＤ５Ａ２閾値およびＴＰＸ２閾値は、閾値化により次のように算出される：
【数５】
2020507320.tif 000031
（ｉｉ）スケール化定量的スコア（ＱＳ）を次のように算出する：
【数６】
2020507320.tif 000032
、ステップと、
（ｄ）前記患者を定量的スコア群に割り当てるステップであって、（ｉ）前記患者のＱＳが＜または≦３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧３８、３９、４０、４１または４２の閾値である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、ステップと
を含む、方法。
（項目１６）
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが＜または≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞または≧４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
パート（ｄ）において、前記患者のＱＳが≦４０である場合、前記患者が、低いスコア群に割り当てられ、（ｉｉ）前記患者のＱＳが＞４０である場合、前記患者が、高スコア群に割り当てられる、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦１８、１９、２０、２１または２２のさらなる閾値である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧１８、１９、２０、２１または２２の閾値である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが＜または≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞または≧２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
パート（ｄ）（ｉ）の前記低いスコア群の患者について、前記患者は、前記患者のＱＳが≦２０である場合、低スコア群に割り当てられ、前記患者のＱＳが＞２０である場合および前記患者が前記高スコア群に入らない場合、中スコア群に割り当てられる、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記患者が、中リスク患者である、項目１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２２）
前記患者が、ＡＵＡまたはＮＣＣＮ分類の一方または両方による中リスク患者である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記患者の定量的スコアおよびスコア群を提供する報告を提供するステップをさらに含む、項目１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、ＡＲＦ１、ＡＴＰ５Ｅ、ＣＬＴＣ、ＧＰＳ１およびＰＧＫ１から選択される少なくとも１つの参照遺伝子に対して正規化される、項目１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記生体試料が、新鮮、凍結または固定したパラフィン包埋試料である、項目１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記ＲＮＡ転写物の前記レベルが、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して決定される、項目１５〜２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記患者の定量的スコア群に基づいて前記患者のための処置を決定するステップをさらに含む、項目１５〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記患者が、中リスク患者であり、前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者を高リスク患者として再分類し、必要に応じて、前記患者が前記低いスコア群にある場合、前記患者の分類を中リスク患者として維持する、項目１５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目２９）
前記患者が前記高スコア群にある場合、前記患者を高リスク患者のためのマルチモード療法または標準的療法により処置するステップをさらに含む、項目１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１）
前記患者が前記低スコア群にある場合、前記患者を積極的監視により処置する、項目１８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
項目１５〜１７のいずれか一項に記載の方法に従って前記高スコア群の定量的スコアを有すると判定された中リスク前立腺がん患者を処置する方法であって、マルチモード療法を前記患者に施すステップを含む、方法。
（項目３３）
前記マルチモード療法が、（ａ）少なくとも１つのホルモン療法剤の投与、（ｂ）少なくとも１つの免疫療法剤の投与、および／または（ｃ）少なくとも１つの化学療法剤の投与を含む、項目３２に記載の方法。
【国際調査報告】
2020507320.tif 000033
2020507320.tif 000034
2020507320.tif 000035