(57)【要約】本発明は、対象におけるTERTプロモーター突然変異に関連する癌に関する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、GA結合タンパク質転写因子βサブユニット1ロングアイソフォーム(GABPB1L)の発現または機能を特異的に低下させるかまたは阻害する剤の治療有効量を対象へ投与する工程を含む。2020521743.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるテロメラーゼ逆転写酵素(TERT)プロモーター突然変異に関連する癌を処置するための方法であって、GA結合タンパク質転写因子βサブユニット1ロングアイソフォーム（GA binding protein transcription factor beta subunit 1 long isoform）(GABPB1L)の発現または機能を特異的に低下させるかまたは阻害する剤の治療有効量を対象へ投与し、それによって、TERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置する工程を含む、前記方法。
【請求項２】
GABPB1Lの発現または機能を特異的に低下させるかまたは阻害する剤を投与する前に、対象のTERTプロモーター中の1つまたは複数の突然変異を同定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記剤が、GABPB1L mRNAの3’非翻訳領域(UTR)中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3に記載される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記剤が、GABPB1L mRNAの核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該ヌクレオチド配列が、GABPB1Lのエクソン9をコードする、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 6に記載される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ロックド核酸(LNA)アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項3〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約10〜約50ヌクレオチド長である、請求項3〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、約13〜約25ヌクレオチド長である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
前記癌が、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽腫、乏突起膠腫、卵巣癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、および肝臓癌からなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
別の癌療法を対象へ施す工程をさらに含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記癌療法が、放射線療法、化学療法および手術からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
約10〜約50ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5または6のいずれか1つに記載される配列に相補的である配列を含む、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド中の1つまたは複数のヌクレオチドが、天然ヌクレオチドの類似体である、請求項13記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
前記天然ヌクレオチドの類似体が、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、ペプチド核酸(PNA)、エチレン架橋核酸(ENA)、2’-O-メチル(2-OMe)修飾RNA、2’-O’-メトキシエチル(2-MOE)修飾RNA、ヘキシトール核酸、および／またはホスホロチオエートヌクレオチドである、請求項14記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記天然ヌクレオチドの類似体がLNA分子である、請求項15記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
約13〜約25ヌクレオチド長である、請求項13〜16のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ベクター中にある、請求項13〜17のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
細胞へコンジュゲートされている、請求項13〜18のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
細胞特異的リガンドまたは組織特異的リガンドへコンジュゲートされている、請求項13〜18のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記細胞特異的リガンドまたは組織特異的リガンドが、細胞表面受容体へ結合する抗体またはリガンドである、請求項20記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項13〜21のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項13〜18のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、ナノ粒子。
【請求項２４】
請求項23記載のナノ粒子を含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行関連出願
本出願は、2017年5月24日に出願された米国仮出願第62/510,613号の恩典を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
テロメアは、染色体の末端が複製されるのを可能にする、身体の染色体の2つの末端の各々で見られる反復DNA配列である。テロメラーゼは、同じテロメアDNA配列の複数のコピーを染色体の末端に付加する酵素である。テロメラーゼは、胎児組織、成人生殖細胞、および腫瘍細胞において発現される。体（身体）細胞はテロメラーゼを定期的に発現しないため、これらの細胞は、染色体のテロメアの短縮のために老齢化または老化する。癌細胞において、テロメラーゼはしばしば再活性化され、複製不死性がもたらされる。テロメラーゼ活性が癌細胞において低下すると、これらの細胞中のテロメアは短縮され、これは癌細胞が分裂するのを妨げるだろう。
【０００３】
テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)はテロメラーゼの触媒サブユニットである。TERTは、染色体のテロメアの末端への特定のDNA配列中のヌクレオチドの付加を触媒する。反復DNA配列のこの付加は、複数回の複製後の染色体末端の分解を防ぐ。テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)発現の再活性化は多くのヒト癌において生じる。TERT再活性化は、複製老化（老齢化）を克服してアポトーシス（細胞死）を防ぐために必要であり、これらは両方とも癌の開始における基本的な段階である。従って、TERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置するための組成物および方法が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、TERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置するための方法および組成物に関する。本発明者らは、GA結合タンパク質転写因子βサブユニット1のロングアイソフォーム（long isoform of GA binding protein transcription factor beta subunit 1）(GABPB1L)が、突然変異TERTプロモーターを活性化するために必要であることを発見した。さらに、本発明者らは、GABPB1Lの特異的阻害剤、例えば、GABPB1L mRNAのエクソン9または3’非翻訳領域(UTR)を特異的に標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)が、TERT発現を低下させ、従って、TERTプロモーター突然変異を保有する癌を処置するために使用され得ることを発見した。
【０００５】
いくつかの態様において、本発明は、対象におけるTERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置するための方法であって、GA結合タンパク質転写因子βサブユニット1ロングアイソフォーム(GABPB1L)の発現または機能を特異的に低下させるかまたは阻害する剤の治療有効量を対象へ投与し、それによって、TERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置する工程を含む、方法を提供する。
【０００６】
いくつかの例では、本方法は、GABPB1Lの発現または機能を特異的に阻害するかまたは低下させる剤を投与する前に、対象のTERTプロモーター中の1つまたは複数の突然変異を同定する工程をさらに含む。いくつかの例では、剤は、GABPB1L mRNAの3’ UTR中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの例では、GABPB1L mRNAの3’非翻訳領域(UTR)中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3に記載される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 1〜3に記載される配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の核酸類似体を組み込む。いくつかの態様において、核酸類似体はロックド核酸である。いくつかの例では、剤は、GABPB1L mRNAの核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該核酸配列はGABPB1Lのエクソン9をコードする。いくつかの例では、GABPB1L mRNAの核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列がGABPB1Lのエクソン9をコードする、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 6に記載される配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 4〜6に記載される配列に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の核酸類似体を組み込む。いくつかの態様において、核酸類似体はロックド核酸である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は1つまたは複数の核酸類似体を有する。
【０００７】
いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド中の核酸類似体は、ロックド核酸(LNA)である。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約50ヌクレオチド長である。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約13〜約25ヌクレオチド長である。
【０００８】
いくつかの例では、癌は、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽腫、卵巣癌、膀胱癌、甲状腺癌、腎癌、膀胱癌、および肝臓癌からなる群より選択される。
【０００９】
いくつかの例では、方法は、別の癌療法を対象へ施す工程をさらに含む。いくつかの例では、癌療法は、放射線療法、化学療法および手術からなる群より選択される。
【００１０】
いくつかの態様において、本発明は、約10〜約50ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、SEQ ID NO: 1、2、3、4、5または6のいずれか1つに記載される配列に相補的である配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約13〜約25ヌクレオチド長である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本出願は図面を含む。図面は、組成物および方法のある態様および／または特徴を図示し、組成物および方法の任意の説明を補うことが意図される。記載された説明がそのようなことが当てはまることを明示的に示さない限り、図面は組成物および方法の範囲を限定しない。
【図１】GABPB1Lが突然変異TERTプロモーターの活性化のために必要とされたことを示す。(a、b) (a) TERTプロモーター突然変異または(b)TERTプロモーター野生型株中におけるGABPB1のsiRNA媒介ノックダウン後のTERT発現。GBM1およびT98Gは、TERTプロモーター突然変異初代GBM株であり、OG1は、患者由来TERTプロモーター突然変異再発性乏突起膠腫株である。*P<0.05、**P<0.01、各々それぞれの株中におけるsi対照(siCTRL)と比較しての両側スチューデントt検定。値は少なくとも3つの独立した実験（OG1およびHCT116株については2つの独立した実験）の平均値±S.D.である。(c) (a)からのTERTプロモーター突然変異株中におけるGABPB1のsiRNA媒介ノックダウン後のGABPB1L発現。*P<0.05、**P<0.01、各々それぞれの株中におけるsi対照(siCTRL)と比較しての両側スチューデントt検定。値は少なくとも3つの独立した実験（OG1株については2つの独立した実験）の平均値±S.D.である。
【図２】GABPB2ノックダウンが突然変異または野生型TERT発現に対する影響をほとんどまたは全く有しなかったことを示す。(a) GBM1およびT98Gまたは(b) HCT116およびHEK293T株中におけるGABPB2のsiRNA媒介ノックダウン後のTERT発現。*P<0.05、各々それぞれの株中におけるsi対照(siCTRL)と比較しての両側スチューデントt検定。値は少なくとも3つの独立した実験（HCT116株については2つの独立した実験）の平均値±S.D.である。
【図３ａ】GABP四量体形成アイソフォームGABPβ1Lの発現が、TERTプロモーター突然変異神経膠腫中におけるTERT発現と相関することを示す。(a〜d) (a、b) 109個のTERT発現GBMまたは(c、d) 49個のTERTプロモーター突然変異乏突起膠腫からのTERT発現(log2正規化カウント)に対するGABPB1LまたはGABPB1S発現(log2正規化カウント)の相関。灰色の線は傾向線を示す。
【図３ｂ】図３ａの説明を参照のこと。
【図３ｃ】図３ａの説明を参照のこと。
【図３ｄ】図３ａの説明を参照のこと。
【図３ｅ】GABP四量体形成アイソフォームGABPβ1Lの発現が、TERTプロモーター突然変異神経膠腫中におけるTERT発現と相関することを示す。(e〜h) (e) 109個のTERT発現GBM、(f) 49個のTERTプロモーター突然変異乏突起膠腫、または(g〜h) 262個のTERT発現結腸直腸癌からのTERT発現(log2正規化カウント)に対するGABPB1LまたはGABPB2発現(log2正規化カウント)の相関。灰色の線は傾向線を示す。
【図３ｆ】図３ｅの説明を参照のこと。
【図３ｇ】図３ｅの説明を参照のこと。
【図３ｈ】図３ｅの説明を参照のこと。
【図４】GABPB1Lのエクソン9またはUTRのいずれかを標的化するように設計されたLNA-ASOを示す。GABPB1SおよびGABPB1Lについてのエクソン構造。挿入図は、GABPB1Lの第9エクソンまたはUTRのいずれかへハイブリダイズするように設計された6つのLNA-ASOの場所を示す。
【図５】GABPB1L標的化LNA-ASOが様々な程度の急性細胞毒性を有したことを示す。患者由来膠芽腫細胞(GBM1)に、トランスフェクトしなかったか、トランスフェクション試薬のみ、スクランブル対照、または様々なGABPB1L標的化LNA-ASO配列をトランスフェクトし、細胞増殖をMTSアッセイによって48および72時間で測定した。図5(a)は、GABPB1Lのエクソン9に対して標的化された3つのLNA-ASOを示す。図5(b)は、GABP1LのUTR領域に対して標的化された3つのLNA-ASOを示す。
【図６】GABPB1L標的化LNA-ASOが、TERTプロモーター突然変異依存様式でTERT発現を低下させたことを示す。TERTプロモーター突然変異細胞(GBM1、U251)またはTERT野生型細胞(SK-MEL-28)中におけるLNA-ASO B1L-1またはB1L-2のいずれかを介してのGABPB1LのLNA-ASO媒介ノックダウン後のTERT発現。
【図７】GABPB1L標的化LNA-ASOが、全体的なGABPB1転写物レベルをインタクトのまま残しながら、GABPB1L転写を特異的にノックダウンしたことを示す。LNA-ASOトランスフェクション後の総GABPB1、GABPB1L、およびTERTの発現を示す。トランスフェクトされたLNA-ASOをx軸に列挙する。GAPDHおよびスクランブルLNA-ASOを陰性対照として使用し、TARTおよびGABPA標的化LNA-ASOを陽性対照として使用した。
【図８】LNA-ASO UTR1が、GABPB1Lのタンパク質発現を低下させ、GABPB1Sのタンパク質発現を低下させなかったことを示す。GABPB1LのLNA-ASO UTR1ノックダウン後のHCC細胞株SNU-423中のタンパク質発現を示す。タンパク質バンドを右の棒グラフに定量化する。
【図９】siRNAを介してのGABPB1のノックダウンは、TERTプロモーター突然変異患者由来神経膠腫培養物中のTERT発現を低下させるが、脳由来TERTプロモーター野生型培養物中のTERT発現を低下させないことを示す。TERTプロモーター突然変異神経膠腫培養物(a、c)または脳由来TERTプロモーター野生型培養物(b、d)中のGABPB1のsiRNAノックダウン後72時間でのqPCRによって測定されたTERT (a、b)またはGABPB1L (c、d)発現。NHAPC5 = 正常ヒト星状細胞ポストクライシスクローン5。LN18 = TERTプロモーター野生型膠芽腫。hNPC = iPSC由来ヒト神経前駆細胞。
【図１０】LNA-ASO UTR1を介してのGABPB1Lのノックダウンは、TERTプロモーター突然変異患者由来神経膠腫培養物中のTERT発現を低下させるが、脳由来TERTプロモーター野生型培養物中のTERT発現を低下させないことを示す。TERTプロモーター突然変異神経膠腫培養物(a、c)または脳由来TERTプロモーター野生型培養物(b、d)中の、UTR1 LNA-ASOを使用してのGABPB1Lのノックダウン後72時間でのqPCRによって測定されたTERT (a、b)またはGABPB1LおよびGABPB1S (c、d)発現。NHAPC5 = 正常ヒト星状細胞ポストクライシスクローン5。LN18 = TERTプロモーター野生型膠芽腫。hNPC = iPSC由来ヒト神経前駆細胞。
【図１１】LNA-ASO UTR1が、GBM異種移植インビボモデル中においてGABPB1Lを低下させたことを示す。LNA-ASO UTR1の注射後のマウス中における、頭蓋内で増殖させたDBTRG05-MG中のGABPB1LのmRNA発現を示す。マウスにビヒクル対照(n=3)またはLNA-ASO UTR1 (n=4)のいずれかを注射し、注射後3日で犠牲にした。RNAを腫瘍から単離し、GABPB1LをRT-qPCRによって測定した。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈でそうではないと明確に指示していない限り、複数形の参照物を含む。
【００１３】
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)および一本鎖もしくは二本鎖形態のいずれかのそのポリマーを指す。特に限定されない限り、この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含し、これらとしては、参照核酸と類似する結合特性を有しかつ天然のヌクレオチドと類似する様式で代謝される、ロックド核酸(LNA)、架橋核酸(BNA)、ペプチド核酸(PNA)、エチレン架橋核酸(ENA)、2’-O-メチル(2-OMe)修飾RNA、2’-O-メトキシエチル(2-MOE)修飾RNA、ヘキシトール核酸、およびホスホロチオエート化骨格を有するヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。特に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に修飾されたバリアント（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、一塩基多型(SNP)、および相補配列、ならびに明示的に示される配列を暗黙的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、1つまたは複数の選択された（または全ての）コドンの第3位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); およびRossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、および遺伝子によってコードされるmRNAと交換可能に使用される。チミン(T)およびウラシル(U)は、ポリヌクレオチドのタイプ（DNAまたはRNA）に従って核酸において交換可能に使用される。
【００１４】
「処置する」は、症状の軽減；寛解；減少もしくは疾患状態を患者により許容可能にすること；変性もしくは衰弱の速度を減速させること；または変性の最終点をあまり消耗性にしないことのような、任意の客観的または主観的パラメーターを含む、疾患、状態、または障害の処置もしくは改善または予防における成功の任意の証拠を指す。症状の処置または改善は、医師による検査の結果を含む、客観的または主観的パラメーターに基づき得る。従って、用語「処置する」は、本明細書に記載されるような疾患、状態または障害に関連する症状または状態の発症を、予防するかもしくは遅らせるため、緩和するため、または阻止もしくは阻害するための、本発明の化合物または剤の投与を含む。用語「治療効果」は、対象中における疾患、疾患の症状、または疾患の副作用の、軽減、除去、または予防を指す。本発明の方法を使用する「処置する」または「処置」は、本明細書に記載されるような疾患、状態または障害に関連する疾患または障害の増加した危険性を有し得るが、症状をまだ経験していないかまたは示していない対象中における症状の発症を予防すること、疾患または障害の症状を抑制すること（その発症を遅らせるもしくは阻止すること）、疾患の症状または副作用からの軽減を提供すること（待期療法を含む）、および疾患の症状を軽減させること（退縮をもたらす）を含む。処置は、予防的（疾患の発症を予防するかもしくは遅らせるため、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の発現を予防するため）であり得るか、または疾患もしくは状態の発現後の症状の治療的抑制もしくは緩和であり得る。用語「処置」は、本明細書において使用される場合、防止的（例えば、予防的）、治癒的または緩和的処置を含む。
【００１５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指示する1つまたは複数の核酸制御配列と定義される。本明細書において使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼII型プロモーターの場合、TATAエレメントを含む。プロモーターはまた、任意で、転写の開始部位から数千塩基対も離れたところに位置することができる遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。
【００１６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。本明細書において使用される場合、これらの用語は、アミノ酸残基が共有ペプチド結合によって連結されている、完全長タンパク質を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含する。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、メッセンジャーRNA（mRNA）に相補的であり、mRNA配列へハイブリダイズしそしてmRNA配列を不活性化し、例えば、mRNA配列を翻訳について利用不可能にし、または破壊のためにmRNAを標的化する、核酸配列（DNA、RNA、またはヌクレオチド類似体）である。いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1LをコードするmRNAの非コードまたはコード領域へ特異的に結合するかまたはハイブリダイズする。GABPB1LをコードするmRNAへ特異的に結合するかまたはハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1のショートアイソフォーム（GABPB1S）をコードするmRNA、またはGA結合タンパク質転写因子βサブユニット2（GABPB2）をコードするmRNAへハイブリダイズも結合もしない。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約10〜約50ヌクレオチド長である。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50ヌクレオチド長であり得る。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約40ヌクレオチド長、約10〜30ヌクレオチド長、約10〜25ヌクレオチド長、約12〜約50ヌクレオチド長、約12〜約40ヌクレオチド長、約12〜約30ヌクレオチド長、約12〜25ヌクレオチド長、約13〜約40ヌクレオチド長、約13〜約30ヌクレオチド長、または約13〜約25ヌクレオチド長であり得る。
【００１８】
本明細書に提供されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、TERTプロモーター突然変異細胞中におけるTERT発現を減少させ、従って、TERTプロモーター突然変異細胞中におけるテロメラーゼ活性を減少させる。この発現の減少は、対照細胞または対照値と比較した場合、約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%またはその間の任意のパーセンテージであり得る。一般に、GABPB1LをコードするmRNAの非コードまたはコード領域へ特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、GABPB1L mRNA中の核酸配列、例えば、GABPB1L mRNA（例えばヒトGABPB1L mRNA）のエクソン9をコードする核酸配列または3’UTR中の核酸配列に相補的である（例えば、完全に相補的である）かまたは実質的に相補的である（例えば、1〜4個のミスマッチを有する）ように設計される。いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、二次構造形成を回避するかまたは減らすために型通りの方法を使用して変更または設計することができる。いくつかの場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、G-C含有量を最適化するように設計することができる。いくつかの場合、G-C含有量は、好ましくは約40%〜約60%（例えば、40%、45%、50%、55%、60%）である。
【００１９】
本明細書において使用される場合、用語「相補的な」または「相補性」は、ヌクレオチドまたは核酸間の特異的な塩基対形成を指す。いくつかの態様において、例えば、限定されるものではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドとGABPB1L mRNA中の標的核酸配列との塩基対形成が記載される。相補的ヌクレオチドは、一般に、アデニン(A)およびチミン(T)（またはAおよびウラシル(U)）、ならびにグアニン(G)およびシトシン(C)である。上記に記載されるように、本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1L mRNA中の核酸配列に完全に相補的であり得るかまたは実質的に相補的であり得る（例えば、1〜4個のミスマッチを有する）。
【００２０】
全体にわたって使用されるように、対象とは個体を意味する。例えば、対象は、哺乳動物、例えば霊長動物、より具体的にはヒトである。非ヒト霊長動物も同様に対象である。対象という用語は、飼育動物、例えば、ネコ、イヌなど、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）および実験動物（例えば、フェレット、チンチラ、マウス、ウサギ、ラット、アレチネズミ、モルモットなど）を含む。従って、獣医学的使用ならびに医学的使用および製剤が本明細書において意図される。この用語は特定の年齢または性別を意味しない。従って、成人および新生児対象が、男性または女性にかかわらず、包含されるように意図される。本明細書において使用される場合、患者または対象は、交換可能に使用され得、疾患または障害に罹患している対象を指すことができる。
【００２１】
本明細書において使用される場合、1つまたは複数のTERTプロモーター突然変異に関連する癌は、皮膚癌（例えば、基底細胞癌、扁平上皮癌、メルケル細胞癌、多形性皮膚肉腫、非定型的線維黄色腫および黒色腫）、頭頸部癌（例えば、喉頭癌および頭頸部扁平上皮癌）、軟部組織および胸膜腫瘍（例えば、粘液性脂肪肉腫、孤在性線維性腫瘍、軟骨肉腫、線維肉腫、および悪性胸膜中皮腫）、脳癌（例えば、膠芽腫、乏突起膠腫、神経膠肉腫、髄膜腫または髄芽腫）、婦人科癌（例えば、卵巣癌、子宮内膜癌および子宮頸部扁平上皮癌）、泌尿器科癌（例えば、腎細胞癌、膀胱癌、尿管癌、腎盂癌、内分泌癌（例えば、甲状腺癌および副腎皮質癌）、肺癌、消化器系癌（例えば、肝細胞癌および胃癌）、髄様癌、パラガングリオーマ、褐色細胞腫、葉状腫瘍ならびにマントル細胞リンパ腫であり得るが、これらに限定されない。
【００２２】
任意で、本明細書に提供される方法は、例えば、化学療法、免疫療法、放射線および／または手術のような、別の癌療法（単数または複数）を対象へ施す工程をさらに含むことができる。
【００２３】
全体にわたって使用されるように、化学療法剤は、癌細胞または腫瘍の増殖を阻害することができる化合物である。1つまたは複数の化学療法剤が本明細書に記載される方法のいずれにおいても使用され得ることが理解される。例えば、2つ以上の化学療法剤、3つ以上の化学療法剤、4つ以上の化学療法剤などを、本明細書に提供される方法において使用することができる。化学療法剤としては、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシラート、ビセレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジコン、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンII（組換えインターロイキンII、またはrIL2を含む）、インターフェロンアルファ-2a、インターフェロンアルファ-2b、インターフェロンアルファ-nl、インターフェロンアルファ-n3、インターフェロンベータ-la、インターフェロンガンマ-1b、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、マイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、プロマイシン、塩酸プロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシンが挙げられる。
【００２４】
本明細書において使用される場合、「安全かつ有効な量」は、本発明の方法で使用される場合に合理的なベネフィット／リスク比と見合う、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー反応）の無い所望の治療反応をもたらすために十分である剤の量を指す。「治療有効量」によって、所望の治療反応をもたらすために有効な剤の量、例えば、癌の増殖を遅らせるため、または癌のサイズを減少させるため、または癌を転移させないために有効な量が意味される。具体的な安全かつ有効な量または治療有効量は、処置される特定の状態、患者の身体状態、処置される対象のタイプ、処置の期間、併用療法（存在する場合）の性質、ならびに用いられる具体的な製剤および化合物またはその誘導体の構造のような因子で変動するだろう。
【００２５】
発明の詳細な説明
下記の説明は本組成物および方法の様々な局面および態様を記載する。特定の態様は、組成物および方法の範囲を定義するように意図されない。むしろ、態様は、開示される組成物および方法の範囲内に少なくとも含まれる様々な組成物および方法の非限定的な例を単に提供する。説明は当業者の視点から読まれるものであり；従って、当業者に周知の情報は必ずしも含まれない。
【００２６】
多くの癌細胞のTERTプロモーター領域中において、非コード突然変異を含む、突然変異が見つかった。いかなる機構によっても束縛されないが、様々な癌中におけるTERTプロモーター突然変異の高率発生、ならびに原発腫瘍中におけるTERT転写、テロメア長およびテロメラーゼ活性の増加とのTERTプロモーター突然変異の直接相関は、TERTプロモーター突然変異がヒト癌においてテロメラーゼ再活性化の基本的機構を示すことを示唆している。
【００２７】
本明細書に提供されるのは、1つまたは複数のTERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置するための組成物および方法である。本発明者らは、驚くべきことに、GABPB1Lが突然変異TERTプロモーターを活性化するために必要であることを発見した。さらに、本発明者らは、GABPB1Lの発現または機能の特異的阻害剤または低下剤、例えば、GABPB1L mRNAのエクソン9または3’非翻訳領域(UTR)を特異的に標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を、TERT発現を低下させ、従ってTERTプロモーター突然変異を保有する癌を処置するために使用することができることを発見した。GABPB1Lの発現または機能を特異的に標的化しそして低下させることによって、TERT発現を減少させ、従って、1つまたは複数のTERTプロモーター突然変異に関連する癌におけるTERT再活性化を低下させる。
【００２８】
方法
対象におけるTERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置するための方法であって、GA結合タンパク質転写因子βサブユニット1ロングアイソフォーム(GABPB1L)の発現または機能を特異的に低下させるかまたは阻害する剤の治療有効量を対象へ投与し、それによって、TERTプロモーター突然変異に関連する癌を処置する工程を含む、方法を本明細書に記載する。いくつかの例では、癌は、TERTプロモーター中の1つまたは複数の突然変異に関連する。これらとしては、C228T（染色体5上（hg19ゲノム座標1295228））、C228A（染色体5上（hg19ゲノム座標1295228））、C250T（染色体5上（hg19ゲノム座標1295250））、A161C（hg19ゲノム座標1295161）、C228T突然変異（染色体5上（hg19ゲノム座標1295228））およびC229T突然変異（染色体5上（hg19ゲノム座標1295229））を含むタンデム突然変異）、ならびにC242T突然変異（染色体5上（hg19ゲノム座標1295242））およびC243T突然変異（染色体5上（hg19ゲノム座標1295243））を含むタンデム突然変異が挙げられるが、これらに限定されない。任意で、方法は、GABPB1Lの発現または機能を特異的に阻害するかまたは低下させる剤の治療有効量を投与する前に、対象のTERTプロモーター中の1つまたは複数の突然変異を同定する工程をさらに含む。TERTプロモーター中の1つまたは複数の突然変異を同定するための方法は、当業者に公知である。これらとしては、例えば、核酸シーケンシング、逆転写および／またはポリメラーゼ連鎖反応による核酸増幅、一本鎖高次構造多型(SSCP)解析、制限酵素断片長多型(RFLP)解析、サザンハイブリダイゼーション、ノザンブロットハイブリダイゼーション、インサイチュハイブリダイゼーションならびに電気泳動移動度シフト解析(EMSA)のような技術が挙げられる。
【００２９】
いくつかの例では、GABPB1L機能を特異的に阻害するかまたは低下させる剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、モルホリノ、ロックド核酸(LNA)、miRNA、架橋核酸(BNA)、ペプチド核酸(PNA)、エチレン架橋核酸(ENA)、2’-O-メチル(2-OMe)修飾RNA、2’-O-メトキシエチル(2-MOE)修飾RNA、ヘキシトール核酸、および／またはホスホロチオエート化骨格を有するオリゴヌクレオチドである。いくつかの例では、GABPB1Lを特異的に阻害する1つまたは複数の剤を投与する。いくつかの例では、GABPB1Lの発現または機能を特異的に阻害するかまたは低下させる1つまたは複数の剤を投与する。
【００３０】
いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNAまたはsiRNAは、GABPB1L mRNAの3’ UTR中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズする配列を含む。本明細書に提供される方法および組成物を使用して標的化され得るGABPB1Lヌクレオチド配列の例は、SEQ ID NO: 13に示される。この配列は、GABPB1Lのエクソン9および3'UTRを含む。GABPB1Lの3’ UTRの配列は、SEQ ID NO: 14として本明細書に提供される。SEQ ID NO: 14中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、型通りの方法を使用して設計することができる。例えば、SEQ ID NO: 14中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的である約14ヌクレオチド長〜約25ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、SEQ ID NO: 14に基づいて設計することができる。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
2020521743.tif 000003
を含むGABPB1L mRNAの3’ UTR中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的である。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 1〜3中のヌクレオチドのうちの1つまたは複数は核酸類似体である。いくつかの態様において、SEQ ID NO:1〜3中のヌクレオチドのうちの1つまたは複数はロックド核酸である。GABPB1L mRNAの3’ UTR中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、
2020521743.tif 000004
が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、SEQ ID NO: 7〜9中のヌクレオチドのうちの1つまたは複数は核酸類似体である。いくつかの態様において、SEQ ID NO:7〜9中のヌクレオチドのうちの1つまたは複数はロックド核酸である。
【００３１】
他の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、LNAまたはsiRNAは、GABPB1L mRNAの核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的である配列を含み、該ヌクレオチド配列はGABPB1Lのエクソン9をコードする。GABPB1Lのエクソン9の配列は、SEQ ID NO: 15として本明細書に提供される。SEQ ID NO: 15中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを、型通りの方法を使用して設計することができる。例えば、SEQ ID NO: 15中の核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的である約13ヌクレオチド長〜約25ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、SEQ ID NO: 15に基づいて設計することができる。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、
2020521743.tif 000005
を含む核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的である。GABPB1L mRNAの核酸配列へ特異的にハイブリダイズするかまたはこれに相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該ヌクレオチド配列がGABPB1Lのエクソン9をコードする、アンチセンスオリゴヌクレオチドの例としては、
2020521743.tif 000006
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシング機構の成分とプレ-mrNAとの間で生じるRNA-RNA塩基対形成またはタンパク質-RNA結合相互作用を遮断することによってGABPB1L転写物の正常なスプライシングを妨害する、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、スプライススイッチングLNAである。いくつかの例では、スプライススイッチングアンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1プレ-mRNA上の1つまたは複数のスプライス認識部位を塞ぎ、強力なRNアーゼH応答を誘発することなくGABPB1L mRNAの成熟を防ぐ。RNアーゼH活性化を防ぐために、ssLNAは、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド骨格の全体に沿ってLNA修飾リボヌクレオチドおよび未修飾デオキシリボヌクレオチドを互い違いにする。例えば、Havens and Hastings “Splice-switching antisense oligonucleotides as therapeutic drugs,” Nucleic Acids Res. 44(14): 6549-6563 (2016))を参照されたい。
【００３３】
本明細書に提供される1つまたは複数の剤は、薬学的に許容される担体中にあり得る。担体という用語は、化合物または組成物と組み合わせられると、その意図される使用または目的について化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性、または任意の他の特徴を助けるかまたは容易にする、化合物、組成物、物質、または構造体を意味する。例えば、担体を、有効成分の分解を最小限にし、対象における有害な副作用を最小限にするように、選択することができる。そのような薬学的に許容される担体としては、食塩水、緩衝食塩水、人工脳脊髄液、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない、無菌生体適合性薬学的担体が挙げられる。
【００３４】
本発明において使用される組成物の投与様式を下記に例示する。本明細書に記載されるGABPB1L阻害剤はいずれも、以下を含む様々な経路のいずれによっても送達され得る：注射によって（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内）、持続点滴静注によって、皮膚に（cutaneously）、経皮的に（dermally）、経皮的に（transdermally）、経口的に（例えば、錠剤、丸剤、液剤、可食フィルムストリップ）、埋め込み型浸透圧ポンプによって、坐剤によって、またはエアゾールスプレーによって。投与経路としては、局所、皮内、髄腔内、病巣内、腫瘍内、膀胱内、膣内、眼内、直腸内、肺内、頭蓋内、心室内、脳室内、脊髄内、皮膚、皮膚下、関節内、体腔内配置、鼻腔吸入、肺吸入、皮膚へのインプレッション、およびエレクトロポレーションが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
アンチセンス、モルホリノ、siRNA分子、またはロックド核酸のような、核酸が用いられる例において、核酸は、細胞内に（例えば、核酸ベクターからの発現によって、もしくは受容体媒介機構によって）、または、投与されると細胞内になる適切な核酸発現ベクターによって、例えばレトロウイルスベクターの使用によって（米国特許第4,980,286号を参照されたい）、または直接注入によって、または微粒子衝撃の使用によって（例えば、遺伝子銃；Biolistic, Dupont）、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングして、または、核に入ることが公知であるホメオボックス様ペプチドへ連結された状態で投与することによって（例えば、Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88:1864-8）、送達され得る。核酸担体はまた、ポリエチレングリコール(PEG)、PEG-リポソーム、ヒスチジンおよびリジンから構成される分岐担体(HKポリマー)、キトサン-チアミンピロリン酸担体、界面活性剤、ナノキトサン担体、およびD5W溶液を含む。本開示は、ゲノム中へ組み込まれるまかまたは組み込まれない、合成オリゴ、裸のDNA、裸のアンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミドおよびウイルス送達を含む、全ての形態の核酸送達を含む。核酸はまたジムノシスによって（gymnotically）送達され得る。例えば、この参照によりその全体が本明細書に組み入れられる、Soifer et al. “Silencing of gene expression by gymnotic delivery of antisense oligonucleotides,” Methods Mol. Biol. 815: 333-46 (2012)を参照されたい。
【００３６】
上述したように、ベクター送達は、組換えレトロウイルスゲノムをパッケージすることができるレトロウイルスベクター系のような、ウイルス系を介して行うことができる（例えば、Pastan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:4486, 1988; Miller et al., Mol. Cell. Biol. 6:2895, 1986を参照されたい）。哺乳動物細胞中へ変更された核酸を導入する厳密な方法は、当然ながら、レトロウイルスベクターの使用に限定されない。アデノウイルスベクター（Mitani et al., Hum. Gene Ther. 5:941-948, 1994）、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター（Goodman et al., Blood 84:1492-1500, 1994）、レンチウイルスベクター（Naidini et al., Science 272:263-267, 1996）、および偽型レトロウイルスベクター（Agrawal et al., Exper. Hematol. 24:738-747, 1996）の使用を含む他の技術が、この手順のために広く利用可能である。
【００３７】
核酸はまた、ナノ粒子中に封入され得、または担体へ化学的にコンジュゲートされ得る。例えば、核酸は、特定の細胞タイプまたは腫瘍環境へ核酸を標的化するために、細胞表面受容体についての抗体またはリガンドのような、細胞または組織ターゲッティングリガンドへ化学的にコンジュゲートされ得る。
【００３８】
ほんの数例を挙げると、リポソーム送達ならびに受容体媒介および他のエンドサイトーシス機構のような、物理的な形質導入技術も使用され得る（例えば、Schwartzenberger et al., Blood 87:472-478, 1996を参照のこと）。本発明は、これらのまたは他の一般的に使用される遺伝子導入方法のいずれかと共に使用され得る。
【００３９】
剤の有効量、例えば、安全かつ有効な量または治療有効量は、疾患の性質に依存し得、標準的な臨床技術によって決定され得る。従って、これらの量は変動するだろう。複数の投薬量を、疾患、および対象の状態に依存して投与することもできる。さらに、インビトロアッセイを、最適な投薬量範囲を同定するために用いることができる。製剤中に用いられる正確な用量はまた、投与経路、および疾患または障害の重症度に依存し、実施者の判断および各対象の状況に応じて決定されるべきである。有効用量を、インビトロまたは動物モデル試験系から誘導される用量反応曲線から推定することができる。意図される投与様式に依存して、本明細書に記載される1つまたは複数の剤を含む薬学的組成物は、好ましくは、正確な投薬量の単回投与に適した単位投薬形態の、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、エアロゾル剤、または懸濁剤のような、固体、半固体、または液体投薬形態の形態であり得る。組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、本明細書に記載される剤またはその誘導体の治療有効量を含み、さらに、他の医学的薬剤、薬剤、担体、または希釈剤を含むことができる。薬学的に許容されるとは、許容されない生物学的効果を引き起こすことなく、またはそれが含有される薬学的組成物の他の成分と有害な方法で相互作用することなく、選択された化合物と共に個体へ投与され得る、生物学的にまたは他の点で望ましくないものではない材料を意味する。
【００４０】
組成物
TERTプロモーター突然変異細胞またはTERTプロモーター突然変異癌中におけるTERT発現を低下させるための組成物を提供する。本明細書に記載されるのは、約10〜約50ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、GABPB1L mRNAの3’UTR中の配列またはエクソン9をコードするGABPB1L mRNA中のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1L mRNAの3’UTR中のSEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2またはSEQ ID NO: 3を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。これらとしては、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8またはSEQ ID NO: 9を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。他の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、GABPB1Lのエクソン9をコードするGABPB1L mRNA配列中のSEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5またはSEQ ID NO: 6を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。これらとしては、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11またはSEQ ID NO: 12を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約40ヌクレオチド長、約10〜約30ヌクレオチド長または約10〜約25ヌクレオチド長である。いくつかの例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約13〜約40ヌクレオチド長、約13〜約30ヌクレオチド長または約13〜約25ヌクレオチド長である。他の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約14〜約40ヌクレオチド長、約14〜約30ヌクレオチド長または約14〜約25ヌクレオチド長である。他の例では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約15〜約40ヌクレオチド長、約15〜約30ヌクレオチド長または約15〜約25ヌクレオチド長である。
【００４２】
任意で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、上述したように、ベクター、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター中にあり得る。任意で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、担体、例えば、細胞、細胞特異的リガンドまたは組織ターゲッティングリガンド（例えば、細胞表面受容体についての抗体もしくはリガンド）、ポリエチレングリコール(PEG)、PEG-リポソーム、ヒスチジンおよびリジンから構成される分岐担体(HKポリマー)、キトサン-チアミンピロリン酸担体、界面活性剤、ナノキトサン担体、およびD5W溶液と組み合され得るかまたはこれらへコンジュゲートされ得る。任意で、担体は、薬学的に許容される担体であり得る。任意で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子中に封入され得る。本明細書に記載されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む複数のナノ粒子も提供する。
【００４３】
任意で、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むナノ粒子、または担体と組み合わされたかまたは担体へコンジュゲートされたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される組成物中にある。
【００４４】
開示される方法および組成物のために使用され得る、これらと組み合わせて使用され得る、これらの調製において使用され得る、またはこれらのプロダクトである、材料、組成物、および成分を開示する。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示される場合、これらの化合物の各々の様々な個々のならびに集合的な組み合わせおよび順列の具体的な参照は明示的に開示されていない場合があるが、各々が本明細書において具体的に意図されかつ記載されることが理解される。例えば、方法が開示および議論され、方法に含まれる1つまたは複数の分子に対して成され得る多数の修飾が議論される場合、方法のあらゆる組み合わせおよび順列、ならびに可能である修飾が、特にそれとは反対の指示がない限り、具体的に意図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも、具体的に意図されかつ開示される。この概念は、開示される組成物を使用する方法中の工程を含むが、これらに限定されない、本開示の全ての局面に適用される。従って、行われ得る様々な追加の工程が存在する場合、これらの追加の工程の各々は、開示される方法の任意の特定の方法工程または方法工程の組み合わせで行われ得ること、ならびに各々のそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットは、具体的に意図され、開示されているとみなされるべきであることが理解される。
【実施例】
【００４５】
下記の実施例は、例示のためにのみ提供され、限定のためではない。当業者は、本質的に同じかまたは同様の結果をもたらすように変更または改変され得る様々な重要でないパラメーターを容易に認識するだろう。
【００４６】
テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)発現の再活性化は、複製老化（老齢化）を克服して細胞アポトーシスを防ぐために必要である。50種を超える癌がTERTプロモーター突然変異を獲得する。これらの単一点突発変異がテロメラーゼを再活性化し、テロメア長の無限の維持を可能にし、細胞不死化を可能にする（Horn et al. TERT Promoter Mutations in Familial and Sporadic Melanoma. Sci. (New York, NY) (2013); Huang et al. Highly Recurrent TERT Promoter Mutations in Human Melanoma. Sci. (New York, NY) (2013); Arita et al. Upregulating mutations in the TERT promoter commonly occur in adult malignant gliomas and are strongly associated with total 1p19q loss. Acta Neuropathol. 126, 267-276 (2013); Killela et al. TERT promoter mutations occur frequently in gliomas and a subset of tumors derived from cells with low rates of self-renewal. Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 6021-6026 (2013)）。点突発変異によって形成される転写因子結合部位は、E26形質転換特異的(ETS)因子GA結合タンパク質(GABP)を特異的に動員し、これは、GABPαおよびGABPβサブユニットから構成される多量体転写因子である（Bell et al. Cancer. The transcription factor GABP selectively binds and activates the mutant TERT promoter in cancer. Sci. (New York, NY) 348, 1036-1039 (2015); Stern et al. Mutation of the TERTpromoter, switch to active chromatin, and monoallelic TERTexpression in multiple cancers. Genome Res. (2015)）。
【００４７】
GABPは、構造的に異なるGABPβアイソフォームのどれが複合体に組み込まれるかに応じて、2つの機能的に独立した転写因子種である二量体または四量体を形成することができる（Bell et al.; およびStern et al.）。本明細書に示されるように、GABPB1L四量体形成アイソフォームが、突然変異TERTプロモーターを活性化するために必要であった。さらに、総GABP機能を除去することなくTERTプロモーター突然変異細胞中におけるTERT発現を低下させるために、GABPB1Lを標的化するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)を操作する実行可能性が実証された。最後に、本明細書に示されるように、GABPB1L標的化ASO候補は、インビボで送達剤の助けなしにGABPB1Lレベルを低下させることができ、これは、TERTプロモーター突然変異を保有する癌を処置するこのアプローチの能力を示している。
【００４８】
テロメアは染色体の末端で「TTAGGG」リピートから構成され、テロメア長は、癌を含む複数のヒト疾患において重要な役割を果たしている（Moyzis et al. A highly conserved repetitive DNA sequence, (TTAGGG)n, present at the telomeres of human chromosomes. 85, 6622-6626 (1988); Blasco, Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond. Nat. Rev. Genet. 6, 611-622 (2005)）。
【００４９】
テロメア長は、テロメア末端を認識し、これに結合し、そして固有のRNAテンプレートを使用してこれを伸長する逆転写酵素複合体である、テロメラーゼによって調節される（Bryan & Cech, Telomerase and the maintenance of chromosome ends. Curr. Opin. Cell Biol. 11, 318-324 (1999); Greider & Blackburn, E. H. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts. Cell 43, 405-413 (1985)）。TERT遺伝子は、テロメラーゼの触媒サブユニットをコードし、その転写調節は、通常、テロメラーゼ活性における律速段階である（Weinrich S.L. et al. Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTR and the catalytic protein subunit hTRT. Nat. Genet. 17, 498-502 (1997); Nakamura et al. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. Sci. (New York, NY) 277, 955-959 (1997); およびMeyerson et al. hEST2, the putative human telomerase catalytic subunit gene, is up-regulated in tumor cells and during immortalization. Cell 90, 785-795 (1997)）。
【００５０】
テロメラーゼ活性は、大部分の正常組織においてサイレンシングされており、細胞分裂の各連続回でテロメアを短縮させる（Hayflick & Moorhead, The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 25, 585-621 (1961)）。最終的に、臨界的なテロメア長に達し（Hayflick & Moorhead; Cong, et al. Human telomerase and its regulation. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66, 407-25-table of contents (2002); Nandakumar & Cech. Finding the end: recruitment of telomerase to telomeres. Nat. Rev. Mol. cell Biol. 14, 69-82 (2013)）、細胞は、複製老化に入るかまたはプログラム細胞死を受けるかのいずれかとなる（Huschtscha & Holliday.  Limited and unlimited growth of SV40-transformed cells from human diploid MRC-5 fibroblasts. J. Cell Sci. 63, 77-99 (1983); Wright et al. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. 9, 3088-3092 (1989); およびCounter et al. Telomere shortening associated with chromosome instability is arrested in immortal cells which express telomerase activity. 11, 1921-1929 (1992)）。ヒト癌の90%超がテロメラーゼを発現して複製不死性を達成するため、テロメラーゼの再活性化または再発現は、腫瘍形成の特徴と見なされている（Kim et al. Specific Association of Human Telomerase Activity with Immortal Cells and Cancer. Sci. (New York, NY) 266, 2011-2015 (1994); Phd, P. C.-B. et al. Methylation of the TERT promoter and risk stratification of childhood brain tumours: an integrative genomic and molecular study. Lancet Oncol. 14, 534-542 (2013); およびShay, J. W. & Bacchetti, S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer 33, 787-791 (1997)）。
【００５１】
2つのホットスポット点突発変異が、黒色腫の71%においてTERTプロモーター中に同定された（Horn et al. およびHuang et al.）。これらの突然変異は、翻訳開始部位の124および146塩基対上流に位置し、それらのhg19ゲノム座標に基づいて、それぞれ、C228TおよびC250Tと呼ばれる。突然変異は、典型的にヘテロ接合であり、互いに排他的な様式で生じ、両方とも、同一の11塩基対配列
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を形成する。両方の突然変異がTERTプロモーター活性およびTERT遺伝子転写を活性化する。それらの最初の発見の直後に、TERTプロモーター突然変異が、膠芽腫の83%（Killela et al.）、黒色腫の71%（Horn et al. およびHuang et al.）、膀胱癌の66%、および肝細胞癌(HCC)の47%（Killela et al; and Quaas et al. Frequency of TERT promoter mutations in primary tumors of the liver. Virchows Arch. (2014)）を含む、いくつかの腫瘍タイプにおいて最も一般的な点突発変異であることがわかった。現在まで、ホットスポット突然変異が、50を超える異なる癌タイプにおいて同定された（Bell et al. Understanding TERT Promoter Mutations: A Common Path to Immortality. Mol. Cancer Res. 14, 315-323 (2016)）。
【００５２】
TERTプロモーター突然変異によって形成される同一の11bp DNA配列モチーフに基づいて、プロモーター活性化の機構が、ETSファミリーTFの動員を伴うと仮定された。しかし、27個のETS因子があり、大部分は、非常に類似しているDNA配列にインビトロで結合し、これは広範囲な冗長性を示唆している（Wei et al. Genome-wide analysis of ETS-family DNA-binding in vitro and in vivo. EMBO J. 29, 2147-2160 (2010)）。従って、他のETS因子ではなくGABPAが突然変異TERT活性化を担うTFであると同定されたことは、驚くべきことであった5。GABPαは、野生型プロモーター活性に影響を与えることなく突然変異TERTプロモーターを選択的に調節するための唯一のETS因子であり、突然変異TERTプロモーターへのその結合は、GBM、黒色腫、HCC、および神経芽腫を含む複数の癌タイプ由来の細胞株にわたって保存された。これは、TERTプロモーター突然変異を保有する癌細胞中におけるテロメラーゼを阻害するための治療標的としての転写因子GABPを開示する。
【００５３】
GABP転写因子は、DNA結合GABPαサブユニットおよびトランス活性化GABPβサブユニットからなる偏性多量体である。GABPは、1つのGABPαおよび1つのGABPβサブユニットから構成されるヘテロ二量体（GABPαβ）、または2つのGABPαおよび2つのGABPβサブユニットから構成されるヘテロ四量体（GABPα2β2）として作用し得る（Rosmarin et al. GA-binding protein transcription factor: a review of GABP as an integrator of intracellular signaling and protein-protein interactions. Blood Cells. Mol. Dis. 32, 143-154 (2004)）。GABPβサブユニットは、2つの異なる遺伝子によってコードされる：GABPβ1をコードするGABPB1遺伝子、およびGABPβ2をコードするGABPB2遺伝子。GABPβ1サブユニットは、2つの異なるアイソフォーム、短いGABPβ1Sアイソフォームおよびより長いGABPβ1Lアイソフォームを有し、一方、GABPβ2サブユニットは単一のアイソフォームを有する（Rosmarin et al.; およびDe La Brousse et al. Molecular and genetic characterization of GABP beta. Genes Dev. 8, 1853-1865 (1994)）。GABPβ1SアイソフォームはGABPαと二量体化することができるのみであるが、GABPβ1LおよびGABPβ2は両方とも、GABPヘテロ四量体の形成を媒介するC末端ロイシンジッパードメイン(LZD)を有する（Rosmarin et al.およびDe La Brousse et al.）。GABPβ1LまたはGABPβ2はGABP四量体を形成するが、GABPβ1Lアイソフォームを含有するGABP四量体は、GABPβ2含有四量体とは機能的に異なり、別の転写プログラムを制御し得る（Jing et al. GABPbeta2 is dispensible for normal lymphocyte development but moderately affects B cell responses. J. Biol. Chem. 283, 24326-24333 (2008); およびYu et al. Targeting Tetramer-Forming GABPβ Isoforms Impairs Self-Renewal of Hematopoietic and Leukemic Stem Cells. Cell Stem Cell 11, 207-219 (2012)）。さらに、完全なGABP機能の無効化はマウスにおいて初期胚致死をもたらすが、四量体特異的転写プログラムのノックアウトは最小限の表現型結果を有する（Jing et al.; Yu et al.; およびXue et al. Targeting the GA binding protein beta1L isoform does not perturb lymphocyte development and function. Mol. Cell. Biol. 28, 4300-4309 (2008)）。従って、突然変異TERTプロモーターがGABP二量体、GABP四量体、または両方によって調節されるかどうかを決定することは、治療標的としてGABPを評価するために重要であった。突然変異TERTプロモーターを活性化するためにGABP四量体が必要である場合、GABPβ1LおよびGABPβ2が機能的に冗長である程度もまた、GABP四量体標的化療法に影響を与える。
【００５４】
方法
細胞培養
GBM1、T98G、およびU251細胞を、DMEM/Ham’s F-12 1:1培地、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン中に培養した。GBM1初代培養はBell et al. (2015)に以前記載された。HEK293T細胞を、10% FBS、1%非必須アミノ酸、1%グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンが補われたDMEM H-21培地中に培養した。HCT116細胞を、10% FBSおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンが補われたMcCoy’s 5A培地中に培養した。OG1は、TERTプロモーター突然変異、IDH1突然変異患者由来再発性高悪性度乏突起膠腫培養物である。OG1細胞を、2mM L-グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、B-27 w/oビタミンA (Invitrogen)、N2サプリメント、20 ng/mL EGF、および20 ng/mL bFGF、および1%ピルビン酸ナトリウムが補われたNeurocult NS-A (stem Cell Technologies)中に培養した。細胞を1.6 ug/cm2ラミニンコーティング上で増殖させ、StemPro Accutase (Gibco)で解離した。SK-MEL-28およびSNU-423細胞を、RPMI-1640、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%ピルビン酸ナトリウム中に培養した。全ての細胞を摂氏37度、5% CO2で維持した。
【００５５】
siRNA / LNA-ASOノックダウン
ノンターゲティング、GABPB1、およびGABPB2-指向siRNAプールをDharmaconから得た。ノンターゲティング、GABPA、TERT、およびGABPB1-指向（B1L-1、B1L-2、B1L-3、UTR1、UTR2、UTR3）LNA-ASOを設計し、Exiqonに注文した。100μLの細胞を96ウェルプレート中において30,000細胞/mLの密度で播種し、24時間後、最終濃度50 nMのsiRNA/LNA-ASOおよび0.1 uLのDharmafect 1試薬(Dharmacon)でトランスフェクトした。トランスフェクション後48時間および72時間で、細胞を溶解し、POWER SYBR Green Cells-to-Ctキット(Ambion)を使用して、cDNAを生成した。下記のように、定量的PCRを行い、GUSB、TERT、GABPB1L、およびGABPB2の発現レベルを測定した。全てのsiRNAを、全ての細胞株中の標的転写物の>50%ノックダウンについてトランスフェクション後48時間および72時間で独立して確認した。
【００５６】
RT-qPCR
定量的PCRをPOWER SYBR Greenコンプリートマスターミックス(Life Technologies)で行い、GUSB、TERT、GABPB1、GABPB1L、およびGABPB2の発現レベルを測定した。各サンプルをApplied Biosystems 7900HT Fast Real-Time Systemにおいてトリプリケートで測定した。融解曲線を手動で検査し、PCR特異性を確認した。相対的発現レベルをGUSBに対するデルタCTによって計算した。
【００５７】
細胞生存アッセイ
細胞株を96ウェルプレート中において5000細胞/mLの密度で播種した。播種後t = 24、48および96時間で、MTS (Cell titer 96 aqueous MTS, Promega)を、製造業者の説明書に従って、培地中において1:5の比率で37℃にて2時間インキュベートした。プレートを490 nmでBioplate Synergy 2マイクロプレートリーダーにおいて読み取った。個々のサンプルの細胞増殖を、t = 24時間でのそれらの対応の吸光度に対して吸光度を正規化することによって計算した。各時点をトリプリケートで分析した。
【００５８】
イムノブロッティング
サイクロフィリンB（ローディング対照）およびGABPB1についてのイムノブロッティングを、供給業者の説明書に従って、NuPAGEシステム(Thermofisher)を用い、ウサギ抗-サイクロフィリンB抗体PA1-027A (Pierce antibodies; 1:1000希釈)およびウサギ抗-GABPB1抗体12597-1-AP (Proteintech; 1:500希釈)を使用して行った。主要バンドの検出を、Li-Cor Odyssey FcイメージングシステムにおいてLi-Corヤギ抗-ウサギ680RD二次抗体(1:15000希釈)を使用して行った。
【００５９】
TCGAデータ解析
The Cancer Genome Atlas (TCGA) (Network, C. G. A. R. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature 455, 1061-1068 (2008))からのデータの収集は、ヒト対象の保護についての全ての適用法令、規則、および政策に準拠しており、必要な倫理的な承認が得られた。全てのデータの解析をRプロジェクトバージョン3.3.2 (http://www.r-project.org/)において行った。GABPおよびTERTについての正規化RNA-seq発現データを、143個の膠芽腫（109個のTERT-発現および34個のTERT-欠損）サンプル、49個の乏突起膠腫（49個のTERTプロモーター-突然変異）サンプル、ならびに249個の結腸直腸癌（249個のTERT-発現）サンプルについてTCGAから臨床情報と共にダウンロードした（レベル3正規化データ、2015年12月、http://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm）。TERT突然変異状態を全ての神経膠腫サンプルについてCeccarelliらから得た（Ceccarelli et al. Molecular Profiling Reveals Biologically Discrete Subsets and Pathways of Progression in Diffuse Glioma. Cell 164, 550-563 (2016)。GABPアイソフォームを、スピアマンの相関を使用してTERTとの関連について分析した。PCA直交回帰直線を使用して、線形傾向線を作成した。
【００６０】
インビボ試験
免疫不全ヌードマウスに、ハミルトン注射器法を使用して頭蓋内に3 x 105 DBTRG05-MG膠芽腫細胞（C228T TERTp突然変異）を注射し、同所性腫瘍を、ライブ・バイオルミネセンス・イメージング(BLI)によって可視になるまで増殖させた。腫瘍がBLIによる1 x 108光子/秒サイズを達成したら、マウスに、CEDを介して直接腫瘤へ、ビヒクル対照(PBS)またはLNA-ASO UTR1のいずれかを注射した。全てのマウスをLNA注射後3日で犠牲にし、新鮮な腫瘍組織をRNA解析のために収集した。
【００６１】
結果
GABP二量体形成アイソフォーム(GABPβ1S)または四量体形成アイソフォーム(GABPβ1LおよびGABPβ2)が突然変異TERTプロモーターを調節するかどうかを決定するために、GABPβ1およびGABPβ2のsiRNA媒介ノックダウンを、3つのTERTプロモーター突然変異細胞株（GBM1 [C228T]、T98G [C250T]、OG1 [C228T]）ならびに2つのTERT発現性、プロモーター野生型細胞株（HCT116およびHEK293T）において使用した。GBM1およびT98Gは、TERTプロモーター突然変異初代GBM株であり、OG1は、患者由来TERTプロモーター突然変異再発性乏突起膠腫株である。GABPβ1のノックダウンは、全ての3つのTERTプロモーター突然変異細胞株においてTERT発現を有意に低下させたが、TERTプロモーター野生型株においては限定的な効果を有した（図1に示される通り）。対照的に、GABPβ2のsiRNA媒介ノックダウンは、TERTプロモーター状態に関係なく、TERT発現に対して大きな効果を有さなかった（図2に示される通り）。突然変異TERTプロモーターへのGABP四量体結合の可能性のために、四量体形成GABPB1Lアイソフォームの発現をこのノックダウン試験において特異的に探し、全ての3つのTERTプロモーター突然変異細胞株中におけるsiRNA媒介ノックダウン後のこのアイソフォームの有意な枯渇を確認した（図1）。
【００６２】
GABPB1Lのこの有意なノックダウンは、TERTの発現がTERTプロモーター突然変異GBMおよび乏突起膠腫中におけるGABPB1L発現と相関するかどうかの試験に至った。この分析によって、両方の癌タイプ中におけるTERTおよびGABPB1L mRNAの間の有意なポジティブな関連が明らかとなったが、TERTおよびGABPB1SまたはGABPB2 mRNAレベルの間の有意な相関はないことが明らかとなった（図3）。さらに、優勢TERTプロモーター野生型結腸直腸癌中におけるGABPアイソフォームおよびTERT発現データの解析によって、TERT発現およびGABPB1LまたはGABPB2発現との間でポジティブな相関はないことが明らかとなった（図3）。まとめると、これらのデータは、GABP四量体形成アイソフォームGABPβ1Lが突然変異TERTプロモーターの活性化のために必要であったこと、およびGABPβ2およびGABPβ1Sは突然変異TERT活性化において役割を果たさなかったことを支持した。
【００６３】
次に、GABPB1S mRNA発現をインタクトのまま残しながらGABPB1Lを特異的に標的化するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)の設計を行った。加えて、ロックド核酸-ASO(LNA-ASO)を研究等級siRNAの代わりに設計し、何故ならば、LNA-ASOは、治療薬として投与され得るASOに非常によく似ているためである。LNA-ASOは、それらのロックド核酸修飾リボース環のために、エンドヌクレアーゼに耐性であり、従って、血清中のそれらの安定性を増加させる（Braasch & Corey, Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem. Biol. 8, 1-7 (2001)）。それらは、ジムノシス（gymnnosis）と呼ばれるプロセスを通して、送達剤からの助け無しで細胞膜を横断することができる（Stein et al. Efficient gene silencing by delivery of locked nucleic acid antisense oligonucleotides, unassisted by transfection reagents. Nucleic Acids Res. 38, e3-e3 (2009); およびZhang et al. Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection. Gene Ther. 18, 326-333 (2010)）。これらの進歩により、化学的に修飾されたASOは、癌を含む複数のヒト疾患についての第三相臨床試験にある（Rigo et al. Pharmacology of a Central Nervous System Delivered 2’-O-Methoxyethyl-Modified Survival of Motor Neuron Splicing Oligonucleotide in Mice and Nonhuman Primates. J. Pharmacol. Exp. Ther. 350, 46-55 (2014); Miller et al. An antisense oligonucleotide against SOD1 delivered intrathecally for patients with SOD1 familial amyotrophic lateral sclerosis: A phase 1, randomised, first-in-man study. Lancet Neurol. 12, 435-442 (2013)）。
【００６４】
エクソン9またはその3’ UTRを通じてGABPB1Lを特異的に標的化する6つのLNA-ASO（図4）を設計し、Exiqonに注文した（LNA-ASO B1L-1、B1L-2、B1L-3、UTR1、UTR2、UTR3 − 下記表1に示される通り）。
（表１）
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【００６５】
LNA-ASOは細胞に対して非特異的に有毒であり得るため、それらの急性細胞毒性を先ずMTSアッセイによって試験した（図5に示される通り）。LNA-ASO B1L-1およびUTR3は急性毒性を有することが分かり、一方、LNA-ASO UTR1およびUTR2は軽度毒性を有することが分かった。次に、GABPB1L標的化LNA-ASOが、TERTプロモーター突然変異依存様式でTERT発現を低下させることができるかどうかを試験した。LNA-ASO B1L-1およびB1L-2を、2つのTERTp突然変異細胞株(GBM1およびU251)、ならびに1つのTERTp野生型細胞株(SK-MEL-28)中へトランスフェクトした。興味深いことには、LNA-ASO B1L-2は、両方のTERTp突然変異株においてTERT発現を有意に低下させることができ、一方、野生型株においては有意な効果を有さなかった（図6）。最後に、GABPB1Sアイソフォームをインタクトのまま残しながら、LNA-ASOがGABPB1Lアイソフォームを特異的にサイレンシングするかどうかを確認した。図7は、LNA-ASO B1L-1およびUTR1が、総GABPB1レベルを20%未満変化させたまま、GABPB1Lレベルを50%超低下させることができたことを示す。加えて、LNA-ASO UTR1はまたTERT発現を約50%低下させた。LNA-ASO B1L-1で以前観察された急性毒性のために、さらなる研究についてはLNA-ASO UTR1に注目することにした。GABPB1Lタンパク質を特異的にサイレンシングするLNA-ASO UTR1の能力をウエスタンブロットによってさらに測定した。図8は、HCC細胞株SNU-423中へのLNA-ASO UTR1のトランスフェクションが、GABPB1L発現の50%低下をもたらし、一方、GABPB1Sは実際に20%増加することを示す。これらのデータは、インビトロでGABPB1Lを特異的にサイレンシングしそして突然変異TERTプロモーターからのTERT発現を付随的に低下させるためのASOの設計を支持する。
【００６６】
神経膠腫の臨床的に関連するモデル中のTERT発現に対するGABPB1Lノックダウンの効果をさらに確認するために、TERTプロモーター突然変異退形成乏突起膠腫(SF10471)または膠芽腫(SF7996、SF8249、SF8279、SF9030、およびSF11411)を有する患者に由来する6つの初代細胞培養物を利用した。これらの患者由来培養物に加えて、3つの新たなTERTプロモーター野生型株を、GABPB1LノックダウンのTERTプロモーター突然変異特異性についての対照として含めた。これらのTERTプロモーター野生型株は、ヒト星状細胞由来株NHAPC5、iPSC由来ヒト神経前駆細胞株hNPC、および膠芽腫由来株LN18である。GABPB1を標的化するsiRNAプールおよびGABPB1Lを標的化するLNA-ASO UTR1 (SEQ ID NO: 7)は両方とも、一団のTERTプロモーター突然変異患者由来培養物にわたってTERT発現を有意に低下させ（図9aおよび10a）、一方、TERTプロモーター野生型培養物に対しては効果を有さなかった（図9bおよび10b）。
【００６７】
GABPB1ターゲティングsiRNAプールおよびGABPB1LターゲティングUTR1 LNA-ASOは両方とも、GABPB1L mRNAレベルを有意に枯渇させた（図9c、9d、10c、および10d）。加えて、UTR1 LNA-ASOは、アッセイしたいずれの培養物においてもGABPB1Sレベルを低下させなかった（図10d）。これらのデータは、GABPB1Lを阻害しTERTプロモーター突然変異神経膠腫中のTERT発現を低下させる特異性をさらに確認し、何故ならば、TERT低下が、臨床的に関連するTERTプロモーター突然変異患者由来神経膠腫株だけに限定され、脳由来TERTプロモーター野生型株においては観察されなかったためである。
【００６８】
TERTプロモーター突然変異神経膠腫中のGABPB1Lを阻害するスプライススイッチングLNA-ASO（ssLNA）についてのスクリーンも行った。標的領域は、GABPB1エクソン9（GABPB1L特異的）の全体ならびに隣接する上流イントロン領域および下流3’ UTRを包含した。GABPB1LターゲティングLNA-ASO UTR1は、RNアーゼH依存性分解機構によってGABPB1Lレベルを低下させる。RNアーゼH活性化LNA-ASOに関連するオフターゲット効果を最小限にするために、非分解性スプライススイッチングLNA-ASO（ssLNA）のライブラリーを、GABPB1Lスプライシングの阻害についてスクリーニングした。簡潔には、これらのssLNAは、GABPB1プレ-mRNA上のスプライス認識部位を塞ぎ、RNアーゼH応答を誘発することなくGABPB1L mRNAの成熟を防ぐ。RNアーゼH活性化を防ぐために、ssLNAは、ホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチド骨格の全体に沿ってLNA修飾リボヌクレオチドおよび未修飾デオキシリボヌクレオチドを互い違いにする。GABPB1Lのスプライシングを阻害するためにssLNAを使用することは、従って、TERTプロモーター突然変異神経膠腫中においてTERTを枯渇させるための新規かつ独特のアプローチである。
【００６９】
本開示はまた、トランスフェクション試薬の非存在下で、GABPB1L標的化ASOのインビボ投与を通して同様のレベルのGABPB1L阻害を達成することを記載する。DBTRG05-MG GBM細胞の頭蓋内異種移植片を保有する6匹のマウスを使用するパイロット実験を行った。腫瘍サイズがライブ・バイオルミネセンス・イメージングによって検出可能となったら、同所性腫瘍にLNA-ASO UTR1 (n=4)またはビヒクル対照(n=3)のいずれかを注射した。マウスをLNA-ASO注射後3日で犠牲にし、腫瘍をRNA単離およびRT-qPCR解析のために採取した。図11は、処置群中の腫瘍が、対照群と比較して有意に低下したGABPB1L mRNA発現を有したことを示す。従って、これは、TERTプロモーター突然変異腫瘍中のGABPB1Lアイソフォームを特異的に標的化するためにインビボで送達試薬無しで送達することができるLNA-ASOを示す。
【００７０】
本明細書に提供される研究は、GABPB1Lが、突然変異TERTプロモーターを活性化するために必要とされる唯一のGABPBアイソフォームであること、および、GABPB1Lをサイレンシングし、TERT発現を低下させ、そしてGABP二量体機能をインタクトのまま残すために、化学的に修飾されたASOを設計することが可能であることを示す。これらのデータは、TERTプロモーター突然変異癌中のテロメラーゼを低下させるためにGABPB1Lを標的化する方法を支持している。GABPAまたは総GABPB1（GABPB1SおよびGABPB1L）のいずれかの遺伝子ノックアウトはマウスにおいて胚致死をもたらし、これは、総GABP機能が健康な細胞機能にとって不可欠であることを示している(31,37)。この致死表現型は、突然変異TERT活性化に治療的に介入するための戦略として総GABP機能を遮断する可能性を著しく限定する。さらに、GABPB1LおよびGABPB2は両方ともGABPヘテロ四量体を形成することができ、これは、それらが調節する標的遺伝子における機能的な冗長性についての可能性を強調する(28)。しかし、本明細書に示されるように、GABPB1Lアイソフォームが突然変異TERT発現を調節することについて、顕著な特異性があり、GABPB2アイソフォームにはない。従って、GABPB1L標的化治療薬は、本発明者らが総GABP機能阻害から予想する重篤な患者毒性を生じさせること無く、強力なTERT低下を達成するだろう。
【００７１】
小分子によるGABPB1Lの特異的阻害は可能であるが、これは困難であると判明し得、何故ならば、GABPB1SとGABPB1Lとの唯一の差異が、エクソン9によってコードされるLZDであるためである。対照的に、ASOはこのタイプの標的によく適しており、何故ならば、それらを、一方のアイソフォームを阻害するが他方を阻害しないように特異的に設計することができるためである。LNA-ASOを試験し、これらの次世代ASOを、インビボでGABPB1Lを標的化するために使用できることが判明した。ロックド核酸修飾（ここで、リボース環は、2’-Oおよび4’-C原子間のメチレン架橋によって連結されている）は、より小さな配列が、生理的温度およびpHでそれらの標的へハイブリダイズするために必要な結合親和性を達成することを可能にする。それはまた、ASOを血清中のエンドヌクレアーゼ分解に対してより耐性にする（Braasch & Corey）。助けのない細胞取り込み（ジムノシス（gymnosis）と呼ばれる）もまた、厳密な機構はまだ解明されていないが、LNA-ASOで文書化された（Stein et al.; およびZhang et al.）。従って、LNA-ASOのような化学的に修飾されたASOは、癌患者中においてGABPB1L機能を有効に遮断することができる実行可能な治療手段を提供する。LNAと同様のまたはLNAよりも優れた効果をASOに対して有する他の修飾オリゴヌクレオチド化学も存在する。これらとしては、架橋核酸(BNA)、ペプチド核酸(PNA)、エチレン架橋核酸(ENA)、2’-O-メチル(2-OMe)修飾RNA、2’-O-メトキシエチル(2-MOE)修飾RNA、ヘキシトール核酸、およびホスホロチオエート化骨格を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる（Thomas et al. Antitumor Effects of EGFR Antisense Guanidine-Based Peptide Nucleic Acids in Cancer Models. 8, 345-352 (2013); Topics, C. Biological and Pharmaceutical Aspects of Nucleic Acids Chemistry 2 -O , 4 -C-Ethylene-Bridged Nucleic Acids ( ENA TM ) as Next-Generation Antisense and Antigene Agents. 27, 453-456 (2004); Kang et al. Inhibition of MDR1 gene expression by chimeric HNA antisense oligonucleotides. 32, 46-51 (2004); Rahman et al. EXCELLENT HYBRIDIZING AND NUCLEASE RESISTANCE PROFILES. 1625-1628 (2007). doi:10.1080/15257770701548980; Technology, A. Development of Bridged Nucleic Acid Analogues for Antigene Technology. 52, 1399-1404 (2004); およびImanishi & Obika. BNAs: novel nucleic acid analogs with a bridged sugar moiety. 1653-1659 (2002)）。これらの化学修飾のうちの1つまたは複数を用いてASOを形成することは、非特異的毒性を最小限にしながら患者中における安定したGABPB1L阻害を達成するために使用され得る。
【００７２】
いくつかの態様において、安定させる骨格化学修飾に加えて、GABPB1L標的化ASOは、その効能をさらに増加させるため、組織分布を改善するため、および毒性を低下させるために、送達技術と合わせられる。腫瘍組織中への直接送達を通してインビボでGABPB1Lノックダウンを達成する能力が本明細書において実証されたが、ナノ粒子(NP)中にASOを封入する、多くのグループが、それらの有効性を増加させることができる（Zatsepin & Koteliansky, Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery - going from bench to bedside. Int J Nanomedicine. 11, 3077-3086 (2016)）。NPの代替法は、ASOを、細胞ターゲッティングリガンドまたは組織ターゲッティングリガンド、例えば、細胞表面受容体についての抗体またはリガンドへ化学的にコンジュゲートすることである（Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 44, 6518-6548 (2016); およびLayek & Singh, J. Cell penetrating peptide conjugated chitosan for enhanced delivery of nucleic acid. International Journal of Molecular Sciences 16, 28912-28930 (2015)）。そのようにすることは、留まっている腫瘍を保有する組織タイプでの有効なASO濃度を増加させることができる。いくつかの態様において、これは、ASOに基づくGABPB1L標的化療法のコンポーネントである。
【００７３】
GABPB1LのmRNAを特異的に阻害するように設計された6つのLNA-ASOを合成した。減少したTERT mRNA発現がいくつかのLNA-ASOで達成されたが、これら6つのうちの1つ（UTR1）が、有意なGABPB1Lノックダウンを達成することができ、付随的にTERT mRNA発現を低下させた。GABPB1のエクソン8および9の間のイントロン、エクソン9の任意の部分、またはGABPB1L特異的3’ UTRを標的化する任意のASOを、GABPB1S翻訳をインタクトのまま残しながらGABPB1Lをサイレンシングするために使用することができた。最適なGABPB1L標的化ASOは、型通りの実験に基づいて決定され得る、使用される化学修飾ならびにASO配列中のそれらの位置に依存するだろう。
【００７４】
最後に、本明細書に開示されるように、GABPB1L標的化ASOの治療用途は、TERTプロモーター突然変異を保有する任意の癌適応症に適用される。これは、膠芽腫の83%、黒色腫の71%、膀胱癌の66%、および肝細胞癌の47%を含む。これらの突然変異は、現在、50を超える異なる癌タイプに存在することが分かっており、これは、開示される療法についての著しい必要性を強調する。本明細書に提供されるデータは、GABP二量体機能をインタクトのまま残しながら、突然変異TERT活性化を遮断するためにGABPB1L翻訳を阻害し、従ってTERTプロモーター突然変異癌を処置することについての能力を証明する。
【００７５】
本明細書において引用される刊行物およびそれらが引用される材料は、参照によりそれらの全体が本明細書に具体的に組み入れられる。多数の態様を記載した。それにもかかわらず、様々な改変が成され得ることが理解されるだろう。従って、他の態様も添付の特許請求の範囲内にある。
【００７６】
GABPB1L mRNA配列
GABPB1Lのエクソン9および3’ UTRを含むmRNA配列（SEQ ID NO: 13）
2020521743.tif 000009
【００７７】
GABPB1Lの3’ UTRのmRNA配列（SEQ ID NO: 14）
2020521743.tif 000010
【００７８】
GABPB1Lのエクソン9のmRNA配列（SEQ ID NO: 15）
2020521743.tif 000011
【図１】
2020521743.tif 000013
【図２】
2020521743.tif 000014
【図３ａ】
2020521743.tif 000015
【図３ｂ】
2020521743.tif 000016
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図３ｅ】
2020521743.tif 000019
【図３ｆ】
2020521743.tif 000020
【図３ｇ】
2020521743.tif 000021
【図３ｈ】
2020521743.tif 000022
【図４】
2020521743.tif 000023
【図５】
2020521743.tif 000024
【図６】
2020521743.tif 000025
【図７】
2020521743.tif 000026
【図８】
2020521743.tif 000027
【図９】
2020521743.tif 000028
【図１０】
2020521743.tif 000029
【図１１】
2020521743.tif 000030
【配列表】
2020521743000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月29日(2020.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2020521743.tif 000034
【図３ｃ】
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【図３ｄ】
2020521743.tif 000036
【図３ｅ】
2020521743.tif 000037
【図３ｆ】
2020521743.tif 000038
【図３ｇ】
2020521743.tif 000039
【図３ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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