(57)【要約】  骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて、該細胞を骨芽細胞に分化させる方法；骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて該細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに血小板第4因子を作用させて該骨芽細胞の分化・成熟を促進する方法；及び骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療剤であって、該治療剤が、骨形成誘導因子および血小板第4因子との組み合わせからなる前記骨疾患の予防および治療剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて、該細胞を骨芽細胞に分化させる方法。
【請求項２】
骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて該細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに血小板第4因子を作用させて該骨芽細胞の分化・成熟を促進する方法。
【請求項３】
骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療剤であって、該治療剤が、骨形成誘導因子および血小板第4因子との組み合わせからなる前記骨疾患の予防および治療剤。
【請求項４】
間葉系細胞に、骨形成誘導因子及び血小板第4因子を作用させて、該細胞を培養して得られる骨芽細胞を含む、骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療剤。
【請求項５】
間葉系細胞に、骨形成誘導因子及び血小板第4因子を作用させて、該細胞を培養して得られる、骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療用骨芽細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに該骨芽細胞の分化・成熟を促進することにより、骨量減少を伴い、骨形成促進が必要な骨粗しょう症や関節リウマチ或いは骨折などの骨疾患を予防および治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成を一生涯繰り返している動的な組織である。高齢化社会における大きな社会問題の一つは、骨粗しょう症などの骨疾患による寝たきり老人の増加であり、その治療薬の開発が望まれている。骨粗しょう症や慢性関節リウマチにおける関節破壊などの多くの骨疾患は破骨細胞による骨吸収と骨芽細胞による骨形成のバランスが崩れ、骨吸収が骨形成を上回ることによって発症する。したがって、これら骨疾患の治療薬として骨吸収を抑制する薬剤、例えばカルシトニンやビスホスフォネート系化合物が用いられており、また最近、破骨細胞の形成および活性化を抑制する新規なキーファクターとして破骨細胞形成抑制因子(OCIF/OPG) (Tsuda E. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 13-142, 1997; Yasuda H., et al.: Endocrinology 139: 1329-1337, 1998; Simonet WS., et al.: Cell 89: 309-319, 1997)が発見され、その新薬への開発が進められている。しかしながら、骨吸収が亢進して発症する骨疾患における骨量減少は、骨吸収抑制剤で治療しても元のレベルに回復しない（約10%程度の回復に留まる）ことが大きな問題である。したがって、骨吸収抑制剤のみによる治療では充分ではなく、積極的に骨形成を促進する治療薬の開発が望まれている。【０００３】
骨形成を担う骨芽細胞の分化・成熟を促進する骨形成誘導因子としてbone morphogenetic protein (BMP)がよく知られている。BMPは骨の中に存在する骨形成を誘導する活性因子として約40年前に見出され(Urist MR.: Science 150: 893-899, 1965)、Wozney らによってそのcDNAがクローニングされた(Wozney JM., et al.: Science 242: 1528-1534, 1988)。その後の多くの精力的な研究により、現在BMPは骨形成を促進する因子として発見当時よりもその重要性が高まっている。また、最近の研究によりSmadと呼ばれる転写因子群が関与するBMPの情報伝達系が明らかにされ、さらにBMPを直接あるいは間接的に修飾する分子が同定されている。【０００４】
BMP活性を直接修飾する因子として、BMPの活性を阻害するアンタゴニストの存在が知られている。例えば、Noggin, Chordin, Follistatin, DANファミリーなど、数多くのBMPアンタゴニストが見出されている（Brunet LJ., et al.: Science 280: 1455-1457, 1998、 Francis-West PH., et al.: Cell Tissue Res. 296: 111-119, 1999、 Merino R., et al.: Development 126: 2161-2170, 1999、 Stanley E., et al.: Mech. Dev. 77: 173-184, 1998）。一方、最近BMP-2のプロモーター活性を高め、間接的にBMP活性を増強する化合物として、HMG-CoA還元酵素を阻害するLovastatinが見出された(Mundy G., et al.: Science 286: 1946-1949, 1999)。Lovastatinの類縁化合物であるSimvastatin, Mevastatin, FluvastatinなどもBMP-2のプロモーター活性を促進すること、またこれらの化合物は器官培養系やin vivoにおいて骨形成を促進することが明らかにされている（Mundy G., et al.: Science 286: 1946-1949, 1999）。しかし、高脂血症治療剤としてすでに開発されているStatin類投与患者における有意な骨形成促進に関する報告は見当たらない。さらに、最近Statin類と同様にBMP-2プロモーター活性を促進する化合物として種々のプロテアソーム阻害剤が見出されている（Garret IR., et al.: J. Clin. Invest. 111: 1771‐1782, 2003）。【０００５】
BMPは発見されてから約40年経過し、これまで骨疾患治療薬として大きな期待の下で開発が進められてきたが、未だに骨疾患治療薬として上市されるに至っていない。その医薬品化に向けての大きな障害の一つはin vivoでの薬効投与量が非常に多いことにあり、コスト面からも開発が困難視されている。BMP活性を直接増強する因子は、低投与量のBMPによる骨形成の促進が期待され、BMPの医薬品化を可能にするものと考えられる。しかしながら、前述したようにBMP活性を直接阻害するBMPアンタゴニストが数多く見出されているものの、BMP活性を直接増強するようなペプチド性因子、すなわちタンパク性のBMP活性増強因子の存在はこれまでに報告されていなかった。【０００６】
BMPは最も基本的な骨形成誘導因子であるが、in vivoでの薬効発現が弱く未だに骨疾患治療薬として開発されておらず、BMP活性を直接増強する安全なペプチド性因子が望まれていた。
【非特許文献１】Tsuda E. et al.: Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 13-142, 1997
【非特許文献２】Yasuda H., et al.: Endocrinology 139: 1329-1337, 1998
【非特許文献３】Simonet WS., et al.: Cell 89: 309-319, 1997
【非特許文献４】Urist MR.: Science 150: 893-899, 1965
【非特許文献５】Wozney JM., et al.: Science 242: 1528-1534, 1988
【非特許文献６】Brunet LJ., et al.: Science 280: 1455-1457, 1998
【非特許文献７】Francis-West PH., et al.: Cell Tissue Res. 296: 111-119, 1999
【非特許文献８】Merino R., et al.: Development 126: 2161-2170, 1999
【非特許文献９】Stanley E., et al.: Mech. Dev. 77: 173-184, 1998
【非特許文献１０】Mundy G., et al.: Science 286: 1946-1949, 1999
【非特許文献１１】Garret IR., et al.: J. Clin. Invest. 111: 1771‐1782, 2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、BMP活性を直接増強するようなペプチド性因子を見出し、当該因子によって、BMPによる間葉系細胞の骨芽細胞への分化、さらには該骨芽細胞の分化・成熟を促進することにより、骨量減少を伴い、骨形成促進が必要な骨粗しょう症や関節リウマチ或いは骨折などの骨疾患の予防および治療のための薬剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、後述の実施例に示したように、ウシ血清(calf serum, CS)中のBMP様因子の精製過程において、微量（10〜20 ng/ml）のBMP-4存在下で、筋芽細胞および骨芽細胞に分化し得る間葉系細胞株C2C12細胞の骨芽細胞への分化を強力に促進するペプチド性因子（以下において本因子ということもある）を見出し、当該因子が血小板第4因子（Platelet factor 4; PF4）であることを同定した。【０００９】
後述の実施例に示したように、本因子は、BMP非存在下ではC2C12細胞には何の効果も示さなかった。このC2C12細胞は、100 ng/ml 以下のBMP-2存在下ではほとんどアルカリホスファターゼ活性を発現しない（すなわち、骨芽細胞への分化が起こらない）が、100 ng/mlを超えるBMP-2存在下で急激にアルカリホスファターゼ活性を発現し骨芽細胞への分化が始まり、300 ng/ml以上のBMP-2存在下でほぼ100％骨芽細胞に分化する細胞である(Katagiri T., et al.: J Cell Biol. 127: 1755-1766, 1994)ことが知られている。これらのことから、本因子は、骨形成誘導因子自体ではなく、BMPの活性を増強する因子であると推測された。【００１０】
同様に脂肪細胞、骨芽細胞、軟骨細胞に分化し得る間葉系細胞株C3H/10T1/2細胞においても、C3H/10T1/2細胞から骨芽細胞への分化には、大量のBMPの存在が必要であることが知られている(Wang E.A.et al.:Growth Factors 9:57-71, 1993)が、本因子はこのC3H/10T1/2細胞の骨芽細胞への分化においても、C2C12細胞の場合と同様に微量(20〜50 ng/ml)のBMP-2またはBMP-4存在下で、骨芽細胞への分化を促進した。【００１１】
一方、骨芽細胞様細胞株ST2は、数ng/mlのBMP-2またはBMP-4存在下でアルカリホスファターゼ活性を発現することが知られているが、本因子はBMPによるST2細胞のアルカリホスファターゼ活性誘導を促進した。しかしながら、本因子はBMP非存在下ではST2細胞に対して何の効果も発揮しなかった。【００１２】
以上のように、本発明者らは、本因子が間葉系細胞を微量のBMP存在下で骨芽細胞に分化し得ることを初めて見出した。さらには、本因子は微量のBMP存在下で骨芽細胞を分化・成熟させ得ることから、BMPと血小板第4因子を組み合わせて使用することによって、間葉系細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに該骨芽細胞の分化・成熟を促進させることによって、骨形成促進が必要な骨粗しょう症や関節リウマチ或いは骨折などの骨疾患を予防および治療することが可能であることが判明した。【００１３】
血小板第４因子が、骨肉腫由来骨芽細胞様細胞株においてアルカリホスファターゼ活性を示すことが知られている（特開平７−１２６１８１）。しかしながら、血小板第４因子がBMP活性を増強させる作用を有すること、特に、間葉系細胞においてそれ単独ではアルカリホスファターゼ活性を示さないような低濃度のBMP存在下で、BMP活性を増強させ、骨芽細胞への分化を促進する作用を有することについては何ら記載されていないことから、間葉系細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに該骨芽細胞の分化・成熟を促進することにより、骨量減少を伴い、骨形成促進が必要な骨粗しょう症や関節リウマチ或いは骨折を伴う骨疾患の予防および治療に関する本発明を示唆するものではない。【００１４】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
（１）骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて、該細胞を骨芽細胞に分化させる方法；
（２）骨形成誘導因子の存在下に、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて該細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに血小板第4因子を作用させて該骨芽細胞の分化・成熟を促進する方法；
（３）骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療剤であって、該治療剤が、骨形成誘導因子および血小板第4因子との組み合わせからなる前記骨疾患の予防および治療剤；
（４）間葉系細胞に、骨形成誘導因子及び血小板第4因子を作用させて、該細胞を培養して得られる骨芽細胞を含む、骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療剤；
（５）間葉系細胞に、骨形成誘導因子及び血小板第4因子を作用させて、該細胞を培養して得られる、骨量減少を伴う骨疾患の予防および治療用骨芽細胞。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】陽イオン交換カラム（HiTrap-SP）クロマトグラフィーにおける本因子の溶出パターン及び各画分のアルカリホスファターゼ活性（ALP activity）を示す。
【図２】ヘパリンカラム（HiTrap-Heparin）クロマトグラフィーにおける本因子の溶出パターン及び各画分のアルカリホスファターゼ活性を示す。
【図３】逆相液体クロマトグラフィーにおける本因子の溶出パターン及び各画分のアルカリホスファターゼ活性を示す。
【図４】高速液体クロマトグラフィーによりペプチドマッピングした結果を示す。
【図５】PF4のBMP活性増強活性におけるBMPの種類(BMP-2, BMP-4)の影響を示すグラフである。
【図６】PF4のBMP活性増強におよぼすPF4存在時期の影響を示すグラフである。
【図７】間葉系細胞株C2C12の骨芽細胞への分化に及ぼすPF4の効果を示すグラフである。
【図８】間葉系細胞株C3H10T1/2の骨芽細胞への分化に及ぼすPF4の効果を示すグラフである。
【図９】骨芽細胞様細胞株ST2の分化・成熟におよぼすPF4の効果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の骨形成誘導因子としては、公知の種々のbone morphogenetic protein (BMP)を使用することができる。BMPは、どのようなBMPでも用いることができるが、好ましくは高度に精製されたBMPであり、より具体的には、哺乳動物BMP、特にヒトBMPと実質的に同じ生物学的活性を有するものである。ヒト由来のBMPが好ましい。BMPの由来は特に限定されず、天然由来のBMP、遺伝子組換え法により得られたBMPなどを用いることができるが、好ましくは遺伝子組換え法により得られたBMPである。遺伝子組換え法により得られるBMPには、天然由来のBMPとアミノ酸配列が同じであるもの、あるいは該アミノ酸配列中の１または複数のアミノ酸を欠失、置換、付加等したもので、天然由来のBMPと同様の生物学的活性を有するもの等であってもよい。具体的BMPには、BMP-2、BMP-4、BMP-7などが挙げられる。なお、BMP-2、BMP-4の配列は前記Wozney JM., et al.: Science 242: 1528-1534, 1988に記載されており、またBMP-7の配列は、Anthony JC. et al.: Proc. Natl. Acid. Sci. USA 87: 9843-9847, 1990に記載されている。【００１７】
本発明の血小板第4因子（PF4）としては、公知の種々のものを使用することができる。血小板第4因子は、巨核球や血小板のα-顆粒に存在する因子であることから、天然原料である血小板から精製することにより得ることができる。また、公知のPF4遺伝子（Poncz M., et al.: Blood 69: 219-223, 1987）をクローニングし、遺伝子工学を利用して遺伝子組み換えPF4を生産することができる。具体的には、ヒト血小板第4因子（Ilermodson M., et al.: J. Biol. Chem. 252: 6276-6278, 1977）、ウシ血小板第4因子（Ciaglowski RE., et al.: Arch. Biochem. Biophys. 250: 249-256, 1986）、マウス血小板第4因子（Watanabe O., et al.: J. Hum. Genet. 44: 173-176, 1999）などが挙げられる。あるいは、その活性を保持している限り、その一部のアミノ酸を欠失、置換、付加等の改変を行ったものであってもよい。ヒト血小板第4因子が好ましい。【００１８】
間葉系細胞は、間葉系幹細胞とも呼ばれ、軟骨細胞、筋肉、骨芽細胞、骨髄間質細胞、脂肪細胞、線維芽細胞などへ分化し得る未分化の細胞を意味する。【００１９】
本発明においては、骨形成誘導因子の存在下、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて、該細胞を骨芽細胞に分化させる。あるいは、骨形成誘導因子の存在下、間葉系細胞に血小板第4因子を作用させて該細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに血小板第4因子を作用させて該骨芽細胞の分化・成熟を促進する。【００２０】
間葉系細胞をin vitroで分化させる場合、間葉系細胞を適当な濃度のウシ胎児血清（FBS）を含むDMEMやαMEMなどの水溶液に懸濁し、コンフルエントになるまで培養後、通常、100 ng/ml 以下、好ましくは、1〜50 ng/ml、特に好ましくは、10〜20 ng/mlの濃度範囲の骨形成誘導因子存在下、通常、5〜20μｇ/mlの範囲の血小板第4因子を添加し、37℃、5％CO2、2〜3日間の条件で反応させ、骨芽細胞に分化させる。さらに、該骨芽細胞を分化・成熟させる場合、新たに骨形成誘導因子や血小板第4因子を追加してもよいが、そのまま反応を継続してもよい。通常、2〜3日間培養を継続することによって該骨芽細胞を分化・成熟させることができる。【００２１】
かくして得られるこれら骨芽細胞を、骨折個所等の患部に移植して骨を形成させることによって骨疾患を治療することが考えられる。【００２２】
また本発明においては、骨形成誘導因子と血小板第4因子とを組み合わせて使用することにより、骨形成を促進し、骨量減少を伴う骨疾患を予防および治療することができる。【００２３】
骨形成を促進するには、骨組織における(1)骨芽細胞の分化・成熟だけでなく、(2)骨芽細胞に分化し得る間葉系細胞からの多数の骨芽細胞前駆細胞の分化動員（リクルートメント）が必要と考えられる。前述したように、骨芽細胞はBMPに感受性であり、少量のBMPでアルカリホスファターゼを発現し分化・成熟するが、未分化間葉系細胞からの骨芽細胞への分化の過程はBMPに極めて非感受性であり、BMPによる骨芽細胞の分化動員が容易に進まないことを示唆している。これに対し、血小板第4因子自身は、BMP非存在下では間葉系細胞からの骨芽細胞への分化および骨芽細胞の分化・成熟には何の効果も発現しないが、微量のBMP存在下でBMPによる間葉系細胞から骨芽細胞への分化を強力に促進し、さらにBMPによる骨芽細胞のアルカリホスファターゼ活性誘導を促進する。【００２４】
例えば、骨折治療には、骨形成誘導因子はコラーゲン、ヒアルロン酸スポンジ、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリエチレングリコール共重合体などのゲル状の担体に担持して、患部に塗布あるいは注入などによって投与する。【００２５】
血小板第4因子は、骨形成誘導因子と混合して上記担体に担持して投与してもよい。また、血小板第4因子を単独で上記担体に担持したもの、或いは、水溶性注射剤としたものを、上記担体に担持された骨形成誘導因子と同時に、あるいは、逐次的に患部に投与してもよい。【００２６】
本発明の治療剤は、局所投与するのが好ましく、その場合、投与量は、骨形成誘導因子は1〜10 mg／投与部位／人／日の範囲、また、血小板第4因子は0.1〜10 mg／投与部位／人／日の範囲から選ばれる。【００２７】
本発明に従い、骨形成誘導因子と血小板第4因子を組み合わせて使用すれば、間葉系細胞を骨芽細胞に分化させ、さらに該骨芽細胞の分化・成熟を促進することにより、骨量減少を伴い、骨形成促進が必要な骨粗しょう症や関節リウマチ或いは骨折などの骨疾患の予防および治療を行うことができる。
【実施例】
【００２８】
実施例1：ウシ血清からの本因子の精製
１）ヘパリンカラム（HeparinCL-6B）クロマトグラフィーによる精製
ウシ血清 (Hyclone社より購入) 10 リットルについて、蛋白量および粘度が高いため、1リットルずつ0.1% CHAPS を含む20 mM トリス塩酸緩衝液、pH 7.0で４倍に希釈し、同緩衝液で平衡化したHeparin CL-6Bカラム（径2.5 cm x 20 cm, ゲル容量100 ml）に流速4 ml/分で負荷した。カラムを0.1% CHAPSを含む20 mMトリス塩酸緩衝液、pH 7.0で充分に洗浄した後、カラムに吸着した蛋白質を流速 7 ml/分、60分間で０から２M NaClの直線濃度勾配（食塩は0.1% CHAPSを含む20 mM トリス塩酸緩衝液、pH 7.0に溶解）で溶出した。溶出液中の蛋白質を280 nmの吸光度によりモニターしながら、溶出液を７mlずつ分画した。本因子の溶出画分を同定するため、各画分についてC2C12細胞を用いてBMPによる筋芽細胞から骨芽細胞への分化誘導を促進する活性、即ちBMPによるアルカリホスファターゼ活性誘導を促進する活性を下記の測定法で測定した。
本因子の活性測定法
1-1）C2C12細胞を付着細胞用75T-フラスコ（住友ベークライト）を用い、15% ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEMで約90%コンフルエントになるまで培養した。1 mM EDTAを含む0.25％ トリプシン溶液で細胞を剥がし、1% FBSを含むDMEMで細胞数が4 x 105/mlになるように懸濁した。
1-2）得られた細胞懸濁液を、タイプ１コラーゲンをコートした96ウエルプレート（IWAKI）の各ウエルに50μLずつ添加し、37℃のCO2インキュベーターで一夜培養した。
1-3）カラムクロマトグラフィーで得られた各溶出画分を1% FBSを含むDMEMで適当に希釈し、滅菌濾過後、50μLずつ上記のC2C12細胞を培養した96ウエルプレートの各ウエルに加え、次いで60 ng/ml BMP-4および1% FBSを含むDMEMを各ウエルに50μLずつ添加した（BMP-4の最終濃度は20 ng/ml）。また、BMP-4無添加群は1% FBSを含むDMEMを50μLずつ各ウエルに添加した。このようにして調製した96-ウエルプレートをさらにCO2インキュベーター中で、5〜6日間培養した。
1-4）培養後、培養液を除き、細胞をＰＢＳ（−）（タカラバイオ社より購入）で洗浄後、エタノール・アセトン溶液（エタノール：アセトン＝１：１）100μLずつ各ウエルに添加し室温で1分間放置後直ちに除去した。風乾後1 mg/mlのｐ-ニトロフェノールフォスフェート(p-nitrophenyl phosphate)を含む溶液（0.1 M ジエタノールアミン、1 mM MgCl2、pH10）100μLを各ウエルに添加し室温で20分間反応させた。50μLの3N NaOHを各ウエルに添加し反応を止めた後、各ウエルの405nmの吸光度を測定することによりアルカリホスファターゼ活性を測定した。【００２９】
上記のような測定法により、BMP非存在下では何の効果も示さないが、少量（20 ng/ml）のBMP共存下でC2C12細胞の筋芽細胞から骨芽細胞への分化を強力に促進する画分、すなわちアルカリホスファターゼ活性を強力に誘導する活性画分を約 90  ml(血清１リットル当り)採取した。【００３０】
２）陽イオン交換カラム（HiTrap-SP）クロマトグラフィーによる精製
Heparin CL-6Bカラムからの本因子活性画分180 ml（ウシ血清２リットル中の活性画分に相当）を0.1% CHAPSを含む20 mM トリス塩酸緩衝液、pH 7.5で10倍希釈し、同緩衝液で平衡化したHiTrap-SP陽イオン交換カラム（5 mlゲル、充填カラム）に4 ml/分で負荷した。カラムを同緩衝液で充分洗浄後、カラムに吸着した蛋白質を流速2 ml/分、50分間で0.2から0.6 M NaCl (食塩は同緩衝液に溶解した)の直線濃度勾配で溶出した。溶出液の蛋白質を280 nmの吸光度でモニターし、2 mlずつ分画した。各画分について、1)記載の測定法により少量のBMP存在下でのみC2C12細胞の筋芽細胞から骨芽細胞への分化を強力に促進する活性画分約32 ml採取した。本因子の溶出パターンを図１に示す。【００３１】
３）ヘパリンカラム（HiTrap-Heparin）クロマトグラフィーによる精製
HiTrap-SPカラムクロマトグラフィーからの本因子活性画分約15 ml (ウシ血清１リットルからの本因子活性画分に相当)を0.1% CHAPSを含む20mMトリス塩酸緩衝液、pH 7.5で5倍に希釈した後、同緩衝液で平衡化したHiTrap-Heparinカラム（1 ml ゲル、充填カラム）に流速1 ml/分で負荷した。カラムを充分洗浄後、カラムに吸着した蛋白質を流速0.5 ml/分、50分間で食塩濃度（食塩は同緩衝液に溶解した）が0から1.4 Mになるような直線濃度勾配で溶出した。溶出液中の蛋白質を280 nmの吸光度でモニターし、溶出液を0.5 mlずつ分画した。各画分について同様に活性を測定し、本因子活性画分として約3.5mlを採取した。本因子の溶出パターンを図2に示す。【００３２】
４）逆相液体クロマトグラフィーによる精製
HiTrap-Heparinカラムクロマトグラフィーからの本因子活性画分約50μL(ウシ血清約0.2 リットルからの本因子活性画分に相当)を10.8% アセトニトリルおよび0.1% トリフルオロ酢酸を含む水溶液で平衡化したバイダック社製C4-カラム（径1 mm x 15 cm）に流速50 μL/分で負荷し、カラムに吸着した蛋白質を流速50μL/分、50分間でアセトニトリル濃度が10.8から54.8%になるような直線濃度勾配により溶出した。溶出液中の蛋白質を280 nmの吸光度でモニターし、溶出液を50 μLずつ分画した。各画分の一部を直ちに1%のウシ胎児血清を含む活性測定培地（DMEM）で中和後、同培地で適当に希釈し、本因子の活性を測定した。本因子のC4カラムからの溶出パターンを図3に示す。【００３３】
実施例2：本因子の物理化学的性質の測定
1) アミノ酸配列分析による同定
実施例１の4)の逆相液体クロマトグラフィーで活性が確認された画分(図3)の蛋白質のN末端配列をプロテインシークエンサー、モデル491ｃＬＣ(アプライドバイオシステムズ社)により決定を試みたところ、N末アミノ酸配列は検出されなかった。このことから本因子のN末端はブロックされていることが示唆された。そこで、図3の活性画分をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）に供し、銀染色法により蛋白バンドを染色した。ゲル上のメインバンドを切り出し、10 mMジチオスレイトールで還元後、55 mMヨードアセトアミド処理して還元カルボキシメチルアミド化した。得られたゲル片を10μg/mlのトリプシンを含む25 mM重炭酸アンモニウム溶液中で37℃16時間処理することによりトリプシンによるin-gel digestionを行った。遊離したペプチド断片を5 ％トリフルオロ酢酸を含む50％アセトニトリル溶液で抽出して得られたペプチド抽出液を遠心濃縮機で濃縮後、バイダック社製C18カラムに負荷し、高速液体クロマトグラフィーによりペプチドマッピングをおこなった。ペプチドマッピングの結果を図4に示す。図4のペプチド画分について、それぞれプロテインシークエンサーによりアミノ酸配列を決定した。図４の＊印のペプチド画分のアミノ酸配列が決定された。このアミノ酸配列を用いて蛋白質データベースによりホモロジー検索を実施したところ、ウシPF4であることが確認された。得られたアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。【００３４】
2) ゲル濾過およびSDS-PAGEによる分子量の測定
図3の活性画分を遠心濃縮機で濃縮乾固後、0.1% CHAPSと0.2 M NaClを含む50 mMトリス塩酸緩衝液（pH 7.5）50μLに溶解し、SMARTシステムに装備したSuperdex 200カラム(径0.32cm x 30 cm)に負荷した。カラムを同緩衝液で展開した結果、見かけの分子量が約50 〜60 kDaの蛋白ピークに活性が検出された。さらに図3の活性画分を同様に濃縮乾固後、10μLのSDS-PAGE用緩衝液（50mMトリス塩酸緩衝液pH6.8、2%SDS、6%βメルカプトエタノール、10%グリセロール、0.002%BPB）に溶解し、12%のポリアクリルアミドゲルを用いて非還元下でSDS-PAGEを実施した。ゲルを銀染色することにより蛋白バンドを検出した。見かけ上の分子量約14 kDaの蛋白質が検出された。この分子量は報告されているウシPF4の分子量と一致した（Ciaglowski RE., et al: Arch. Biochem. Biophys. 250: 249-256, 1986）。ゲル濾過での分子量とSDS-PAGEの分子量の比較から明らかなように、PF4は約14 kDaの蛋白質の単量体が会合して4量体を形成していることが確認された。ゲル中の過剰のSDSを0.01% Triton X-100で抽出除去し、14 kDaの蛋白質を含むゲルスライスを細かく砕いて蛋白質を抽出し、その抽出液の活性を測定したところ、活性は検出されなかった。このことから、PF4の分子量14 kDaの単量体には活性がなく、分子量約50〜60 kDaの4量体に活性があることが明らかになった。【００３５】
実施例3：PF4のBMP活性増強活性におけるBMPの種類(BMP-2, BMP-4)の影響
実施例１で得られたPF4を、BCA Protein Assay Reagent Kit（PIERCE社）用いて定量し、１％FBSを含むDMEMで150μg/mlになるように希釈した後、濾過滅菌した。実施例１で示した活性測定法と同様にC2C12細胞を１夜培養した96ウエルプレートのウエルに、90, 75, 60, 45, 30, 15, 6, 3μg/ml （最終濃度は30, 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1μg/ml）になるように１％FBSを含むDMEMで希釈したPF4と60ng/ml（最終濃度は20 ng/ml）のBMP-2またはBMP-4を50μlずつ添加し、CO2インキュベーター中で5〜6日間培養した。培養後、実施例１と同様の方法でアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図５に示す。図５に示すように、PF4はBMP-4だけでなくBMP-2によるC2C12細胞のアルカリホスファターゼ活性も濃度依存的に増強した。【００３６】
実施例 4： PF4のBMP活性増強におよぼすPF4存在時期の影響
実施例３で得られた、１％FBSを含むDMEMで150μg/mlになるように希釈した滅菌PF4を、60, 30, 15μg/ml（最終濃度は20, 10, 5μg/ml）になるように１％FBSを含むDMEMで希釈したPF4溶液を作製した。C2C12細胞を、実施例１で示した方法と同様にして１夜培養した96ウエルプレートのウエルを2グループ（A B）に分け、グループAには上記のように調製したPF4溶液50μlと60 ng/ml（最終濃度は20 ng/ml）のBMP-4を50μlずつ添加した。グループBには１％FBSを含むDMEM と60 ng/ml（最終濃度は20 ng/ml）のBMP-4を50μlずつ添加した。以上のようにした96ウエルプレートをCO2インキュベーター中で3日間培養した。培養後、培養液を廃棄し、100μlのPBSで洗浄後50μlの１％FBSを含むDMEMを添加した。さらに、グループBには作製したPF4溶液50μlと60 ng/ml（最終濃度は20 ng/ml）のBMP-4を50μlずつ添加した。グループAには１％FBSを含むDMEM と60 ng/ml（最終濃度は20 ng/ml）のBMP-4を50μlずつ添加した。さらに、CO2インキュベーター中で3日間培養した。培養後、実施例１と同様の方法でアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図６に示す。PF4の添加時期が前半であるグループAの方が後半であるグループBよりBMP活性増強活性が強いことから、PF4は骨形成因子による間葉系細胞から骨芽細胞への分化を増強することを示唆している。【００３７】
実施例 5：BMPによる各種間葉系細胞株の骨芽細胞への分化および骨芽細胞株の分化・成熟に及ぼすPF4の促進効果
１）間葉系細胞株C2C12の骨芽細胞への分化に及ぼすPF4の効果
C2C12細胞を付着細胞用75T-フラスコ（住友ベークライト）を用い、15% ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEMで約90%コンフルエントになるまで培養した。 1 mM EDTAを含む0.25％ トリプシン溶液で細胞を剥がし、1% FBSを含むDMEMで細胞数が4 x 105/mlになるように懸濁した。タイプ１コラーゲンをコートした96ウエルプレート（IWAKI）の各ウエルに50μLずつ添加し、37℃のCO2インキュベーターで1日間培養した。培養後培養液を除き、1％ FBSを含むDMEMで30μg/mlになるように希釈したPF4（最終濃度15μg/ml）または1％ FBSを含むDMEMを50μLずつ添加した。さらに、1% FBSを含むDMEMで200 ng/mlから２分の1ずつ9段階に希釈したBMP-4を96ウエルプレートの各ウエルに50μLずつ添加した。BMP-4無添加群は1% FBSを含むDMEMを50μLずつ各ウエルに添加した。このように調製した96-ウエルプレートをさらにCO2インキュベーター中で、4〜6日間培養した。培養後、培養液を除き、0.6 ｍM MgCl2、0.1％TritonX-100、5.4 ｍM 4-アミノアンチピリン、5.4ｍMフェニルリン酸を含む600 ｍMジエタノールアミン溶液を各ウエルに50μLずつ添加した。5分後、36 ｍMのフェリシアン化カリウム溶液を50μLずつ添加し、各ウエルの495 nmの吸光度を測定することによりアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図７に示す。PF4はBMP-4によるC2C12細胞のアルカリホスファターゼ誘導活性を4倍以上増強し、BMP-4によるC2C12細胞の骨芽細胞への分化を強力に促進することを示している。【００３８】
２）間葉系細胞株C3H10T1/2の骨芽細胞への分化に及ぼすPF4の効果
C3H10T1/2細胞を付着細胞用75T-フラスコ（住友ベークライト）を用い、10% ウシ胎児血清（FBS）を含むαMEMで約90%コンフルエントになるまで培養した。1mM EDTAを含む0.25％ トリプシン溶液で細胞を剥がし、10% FBSを含むαMEMで細胞数が1 x 104/mlになるように懸濁した。タイプ１コラーゲンをコートした96ウエルプレート（IWAKI）の各ウエルに50μLずつ添加し、37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。培養後培養液を除き、1％ FBSを含むOpti-MEMで30μｇ/mlになるように希釈したPF4（最終濃度15μg/ml）または1％ FBSを含むOpti-MEMを50μLずつ添加した。さらに、1% FBSを含むOpti-MEMで200 ng/mlから２分の1ずつ9段階に希釈したBMP-4を96ウエルプレートの各ウエルに50μLずつ添加した。BMP-4無添加群は1% FBSを含むOpti-MEMを50μLずつ各ウエルに添加した。このように調製した96-ウエルプレートをさらにCO2インキュベーター中で、4〜6日間培養した。培養後、培養液を除き、実施例5の1）と同様にアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図８に示す。PF4は最も未分化段階にあるC3H10T1/2のBMP-4による骨芽細胞への分化を促進した。【００３９】
３）骨芽細胞様細胞株ST2の分化・成熟におよぼすPF4の効果
ST2細胞を付着細胞用75T-フラスコ（住友ベークライト）を用い、10 % ウシ胎児血清（FBS）を含むαMEMで約90%コンフルエントになるまで培養した。1 mM EDTAを含む0.25％ トリプシン溶液で細胞を剥がし、10% FBSを含むαMEMで細胞数が1 x 104/mlになるように懸濁した。96ウエルプレート（NUNC）の各ウエルに50μLずつ添加し、37℃のCO2インキュベーターで2日間培養した。培養後培養液を除き、1％ FBSを含むOpti-MEMで26μg/mlになるように希釈したPF4（最終濃度13μg/ml）または1％ FBSを含むOpti-MEMを50μLずつ添加した。さらに、1% FBSを含むOpti-MEMで200 ng/mlから２分の1ずつ9段階に希釈したBMP-4を96ウエルプレートの各ウエルに50μLずつ添加した。BMP-4無添加群は1% FBSを含むOpti-MEMを50μLずつ各ウエルに添加した。このように調製した96-ウエルプレートをさらにCO2インキュベーター中で、4〜6日間培養した。培養後、培養液を除き、実施例5の1）と同様にアルカリホスファターゼ活性を測定した。結果を図９に示す。PF4はBMP-4によるST2細胞のアルカリホスファターゼ誘導活性を2倍以上に増強し、骨芽細胞葉細胞に対しても、BMP-4による分化・成熟を促進することが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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