(57)【要約】ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする心疾患を予防又は治療する医薬。この発明において、心疾患は心不全をきたす疾患、虚血性心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、不整脈、あるいは心肥大及び／又は頻脈を伴うものである。この発明において、発現ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターである。ＣＤ９遺伝子を心臓で発現させる心疾患を予防又は治療する方法。この発明において、予防又は治療がＣＤ９遺伝子を導入する遺伝子治療によるものである。また、遺伝子治療がＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする医薬を用いるものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項２】
心疾患が心不全をきたす疾患である請求の範囲第１項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項３】
心疾患が虚血性心疾患である請求の範囲第１項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項４】
虚血性心疾患が心筋梗塞である請求の範囲第３項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項５】
心疾患が心筋症、高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、心筋炎のいずれか１以上である請求の範囲第１項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項６】
心疾患が不整脈である請求の範囲第１項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項７】
不整脈が頻脈性不整脈である請求の範囲第６項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項８】
頻脈性不整脈が上室性不整脈及び／又は心室性不整脈である請求の範囲第７項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項９】
心疾患がＷＰＷ症候群、ＱＴ延長症候群、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈源性右室異形成症（ＡＲＶＤ、ＡＲＶＣ）のいずれか１以上である請求の範囲第６項〜請求の範囲第８項のいずれかに記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項１０】
心疾患が心肥大及び／又は頻脈を伴うものである請求の範囲第１項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項１１】
心肥大あるいは頻脈がＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）又はアンギオテンシン２の少なくとも１によるものである請求の範囲第１０項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項１２】
発現ベクターがウイルスベクター又は非ウイルスベクターである請求の範囲第１項〜請求の範囲第１１項のずれかに記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項１３】
ウイルスベクターがアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス又はワクシニアウイルスである請求の範囲第１２項に記載の心疾患を予防又は治療する医薬。
【請求項１４】
ＣＤ９遺伝子を心臓で発現させる心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１５】
心疾患が心不全をきたす疾患である請求の範囲第１４項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１６】
心疾患が虚血性心疾患である請求の範囲第１４項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１７】
虚血性心疾患が心筋梗塞である請求の範囲第１６項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１８】
心疾患が心筋症、高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、心筋炎のいずれか１以上である請求の範囲第１４項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項１９】
心疾患が不整脈である請求の範囲第１４項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２０】
不整脈が頻脈性不整脈である請求の範囲第１９項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２１】
頻脈性不整脈が上室性不整脈及び／又は心室性不整脈である請求の範囲第２０項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２２】
心疾患がＷＰＷ症候群、ＱＴ延長症候群、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈源性右室異形成症（ＡＲＶＤ、ＡＲＶＣ）のいずれか１以上である請求の範囲第１９項〜請求の範囲第２１のいずれかに記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２３】
心疾患が心肥大及び／又は頻脈を伴うものである請求の範囲第１４項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２４】
心肥大あるいは頻脈がＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）又はアンギオテンシン２の少なくとも１によるものである請求の範囲第２３項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２５】
予防又は治療がＣＤ９遺伝子を導入する遺伝子治療によるものである請求の範囲第１４項〜請求の範囲第２４項のいずれかに記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２６】
遺伝子治療がＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする医薬を用いるものである請求の範囲第２５項に記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【請求項２７】
予防又は治療が内因性のＣＤ９を発現させる発現誘導物質の投与によるものである請求の範囲第１４項〜請求の範囲第２４項のいずれかに記載の心疾患を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、心疾患を予防又は治療する医薬に関し、より詳細には、遺伝子治療に用い、ＣＤ９遺伝子を心臓に導入して心疾患を予防又は治療する医薬に関する。
【背景技術】  心筋梗塞、心筋症、不整脈、心不全など心疾患は、日本における三大死因の一つであり、医療上大きな問題となっている。従来、心疾患の治療には利尿薬、β遮断薬、ＡＣＥ阻害薬、カルシウム拮抗薬などの医薬が用いられているが、これらの医薬は心疾患を根治的に治療するものではない。
ところで、ＣＤ９は膜４回貫通型蛋白スーパーファミリー（ＴＭ４ＳＦ）の一つに分類される分子量２７ｋＤａの膜蛋白質である。ＣＤ９の生体での作用については、ｐｒｅ  Ｂ由来の細胞の特異マーカーであること（Ｍａｓｅｌｌｉｓ−Ｓｍｉｔｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，１６０７−１６１３，１９９０）、造血系細胞、非造血系細胞を問わず、様々な細胞に発現していること（Ｍａｅｃｋｅｒ  Ｈ．Ｔ  ｅｔ  ａｌ；ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１，４２８−４４２，１９９７、Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ  Ｆ；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４，４１４３−４１５１，２００１）、ｐｒｅ  Ｂ細胞の凝集分化に関わること（Ｍａｓｅｌｌｉｓ−Ｓｍｉｔｈ  Ａ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，１６０７−１６１３，１９９０）、血小板の活性化に関わること（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ  ＬＫ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６５，３８１５−３８２２，１９９０）、癌細胞をはじめとする様々な細胞の接着や生存性に関わること（Ｈａｓｈｉｄａ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ：Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．，８９：１５８−６７，２００３）、受精に必須の膜蛋白であること（Ｍｉｙａｄｏ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７，３２１−３２４，２０００）、細胞膜中で複数の蛋白質を会合させ、蛋白質間の相互作用を協調し促進する分子として作用し、細胞接着、増殖、分化、免疫、止血など創傷治癒の現象に関わること（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ  Ｆ；Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４，４１４３−４１５１，２００１、Ｋｌｅｉｎ−Ｓｏｙｅｒ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０，３６０−３）の報告がある。
一方、ＣＤ９とＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮増殖因子、ｈｅｐａｒｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）との関係についての報告もある。例えば、ＨＢ−ＥＧＦやインテグリンα３β１との複合体の形成（Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４９：４３９−４４４，２００１）、ＨＢ−ＥＧＦの前駆体であるｐｒｏＨＢ−ＥＧＦのｊｕｘｔａｃｒｉｎｅ  ｆａｃｔｏｒとしての活性の調節（Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ，：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８，９２９−９３８．１９９５、Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｒ，Ｍｅｋａｄａ  Ｅ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．１１：３３５−３４４，２０００）、ＨＢ−ＥＧＦのｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇの過程に関わることでＨＢ−ＥＧＦの活性の多様性を演出している可能性（Ｎａｋａｇａｗａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７１，３０８５８−３０８６３，１９９６、Ｎａｋａｍｕｒａ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７５，１８２８４−１８２９０，２０００）の報告がある。また、腎臓上皮細胞も虚血障害モデルにおいて、ＨＢ−ＥＧＦとＣＤ９が共発現されることで生存性が改善されること（Ｔａｋｅｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ；Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．５５，７１−８１，１９９９）、動脈硬化の過程において、ＨＢ−ＥＧＦは正常大動脈（Ｍｉｙａｇａｗａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．９５，４０４−４１１，１９９５）や冠動脈（Ｎａｋａｔａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４，２７７８−２７８６，１９９６）に発現されている一方、動脈硬化病変やいくつかの内膜平滑筋細胞にＣＤ９が発現し、ＣＤ９とｐｒｏＨＢ−ＥＧＦの共発現がｐｒｏＨＢ−ＥＧＦによる平滑筋細胞の増殖を促進すること（Ｎｉｓｈｉｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ；Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２０，１２３６−１２４３，２０００）からＣＤ９は動脈硬化や組織修復の過程に纎維芽細胞の増殖や形質転換のバランスを担うＨＢ−ＧＦの活性を調節する重要な分子である可能性（Ｋｉｒｋｌａｎｄ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ；Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．９，１４６４−７３，１９９８）の報告がある。更に、本発明者らは、心筋梗塞モデル動物におけるＨＢ−ＥＧＦの過剰発現は、代償性の心筋肥大を促進する一方で、筋繊維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の増殖を促進し、繊維化を亢進することにより心機能低下を助長して、ＨＢ−ＥＧＦが病態の進行に重要な役割を担う中心的な因子であるとの知見を得ている。
このようにＣＤ９の作用やＣＤ９とＨＢ−ＥＧＦの関係に関し多くの報告があるが、これまでにＣＤ９が心肥大を抑制すること、あるいは頻脈を抑制することについての報告はない。
【発明の開示】
本発明は、心疾患を根治的に予防又は治療する医薬を提供することを課題とする。また、心疾患を根治的に予防又は治療する方法を提供することを課題とする。
本発明は、ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする心疾患を予防又は治療する医薬を要旨とする。この発明において、心疾患が心不全をきたす疾患、虚血性心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、不整脈、あるいは心肥大及び／又は頻脈を伴うものである。また、心肥大あるいは頻脈はＨＢ−ＥＧＦ（ヘパリン結合性上皮増殖因子）、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子）又はアンギオテンシン２の少なくとも１によるものである。
また、上記の発明において、発現ベクターはウイルスベクター又は非ウイルスベクターである。
また、ＣＤ９遺伝子を心臓で発現させる心疾患を予防又は治療する方法を要旨とする。この発明において、心疾患は心不全をきたす疾患、虚血性心疾患、心筋症、高血圧性心疾患、弁膜症、先天性心疾患、心筋炎、不整脈、あるいは心肥大及び／又は頻脈を伴うものである。
この発明において、予防、治療はＣＤ９遺伝子を導入する遺伝子治療によっても、あるいは内因性のＣＤ９を発現させる発現誘導物質の投与によっても良い。また、遺伝子治療は、ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターを有効成分とする医薬を用いても良い。
本発明の医薬に用いるＣＤ９遺伝子は、ＣＤ９を発現し得る遺伝子をいう。また、ＣＤ９遺伝子は、発現されるポリペプチドがＣＤ９と実質的に同効である限りその遺伝子配列の一部の欠失、置換、挿入、あるいは他の塩基の付加された遺伝子でも良い。ＣＤ９遺伝子としては、Ｓｔｒａｕｓｂｅｒｇ  Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，（２６）１６８９９−１６９０３，２００２に記載されるヒトＣＤ９遺伝子が例示される（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＡＡＨ１１９８８、ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ番号はＢＣ０１１９８８である）。
ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターは、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミドなどが挙げられる。ウイルベクターは、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ワクシニアウイルスなどが挙げられる。非ウイルスベクターは、例えばカチオン性リポソーム、膜融合性リポソーム、カチオン性高分子などが挙げられる。リポソームは、リン脂質からなる数１０〜数１００ｎｍの粒径のカプセルで、その内部にＣＤ９遺伝子を含むプラスミドを封入できる。
ＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターの作製は、従来の遺伝子工学技術、細胞培養技術、ウイルス技術を利用して行うことができる（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．」、［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｖｏｌｕｍｅ  １−３．Ｊｏｓｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌ編集、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社出版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）２００１」、「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、第２版（１９８７），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ」、「Ｆｒａｎｋ  Ｌ．Ｇｒａｈａｍ著、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｈａｐａｔｅｒ  １１．ｐ１０９−ｐ１２８」、「Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９１）」、「Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５）９２，２４７７−２５８１．」等）。
本発明の医薬は、有効成分のＣＤ９遺伝子を含む発現ベクターと薬学的に許容される賦形剤、担体、溶剤などの助剤とを混合し、注射剤などの種々の製剤形態で用いることができる。また、本発明の医薬の投与態様は特に限定されず、例えば注射、カテーテル、バルーンカテーテルなどにより投与できる。内因性のＣＤ９を発現させる発現誘導物質の場合、全身静脈投与、あるいは経口投与などで投与できる。
本発明の医薬により投与されるＣＤ９遺伝子の量は、投与を受ける者の病態、年齢、体重などを考慮して適宜増減できるが、従来の心疾患への遺伝子治療の臨床試験でウイルスベクターとしてアデノウイルスを用いた場合、ウイルス感染力価ｐｆｕ（ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ）で２×１０１０を用いて安全性が確認されているため、同量が投与量の目安となる。また、非ウイルスベクターとしてリポソームを用いた場合、ＤＮＡ量２ｍｇで安全に心疾患の遺伝子治療の臨床試験が行われているため、同量が投与量の目安となる。
本発明の医薬は、遺伝子治療に用い、心不全をきたす疾患に広く適用できる。
心不全の代表的な病理は、心臓の肥大と拡張であり、心臓の肥大は各種の負荷に対する形態的適応とみられるが、これには限界があり適応不全（代償不全）の状態に陥り、心筋肥大そのものが直接的に心不全やその他の心疾患の病態を悪化させることが知られている（心臓病学、石川恭三  総編集、１９９５年  医学書院参照）。従って、本発明の医薬が適用できる心疾患を更に例示すれば、虚血性心疾患（例えば、心筋梗塞）、心筋症（例えば、拡張型心筋症、肥大型心筋症、拘束型心筋症）、高血圧性心疾患、弁膜症（例えば、大動脈弁、僧房弁などの閉鎖不全、あるいは狭窄）、先天性心疾患、心筋炎などが挙げられる。また、不整脈には、徐脈性不整脈と頻脈性不整脈があり、頻脈性不整脈には上室性不整脈（例えば、洞性頻脈、上室性期外収縮、心房細動、心房粗動、上室性頻拍症）、心室性不整脈（例えば、心室性期外収縮、心室頻拍、心室細動、ｔｏｒｓａｄｅ  ｄｅ  ｐｏｉｎｔｅｓ）が例示できる。また、頻脈性不整脈の発生を主な病態とする疾患として、ＷＰＷ症候群、ＱＴ延長症候群、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、不整脈源性右室異形成症（ＡＲＶＤ、ＡＲＶＣ）が挙げられる（以上、不整脈に関し、「不整脈」（改訂版  目で見る循環器病シリーズ１、笠貫  宏  編集、２０００年  メジカルビュー社）参照）。また、心肥大や頻脈を伴う心疾患に好適に用いることができる。心疾患は、ＨＢ−ＥＧＦの発現による病的心筋細胞肥大や病的心筋細胞の頻拍（頻脈）、さらにはＨＧＦ（肝細胞増殖因子、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）の発現やアンギオテンシン２による病的心筋細胞肥大や病的心筋細胞の頻拍（頻脈）を阻止し、心筋細胞の機能を正常化させることで根治的な治療ができる。また、本発明の医薬は、投与から数時間で効果を奏するので、急性の心疾患に用いることができ、また、遺伝子治療は長期の遺伝子発現で長期の治療効果を期待できるため、高血圧症、慢性心筋梗塞など慢性的な疾患に伴う心肥大や頻脈を防止するために予防的に用いることもできる。
また、ＣＤ９を生体内で発現させることにより心疾患の予防又は治療ができ、心この心疾患の予防、治療は、本発明の医薬を用いる遺伝子治療により行うこともできるが、内因性のＣＤ９の発現を誘導する物質を投与し、生体内で内因性のＣＤ９を発現誘導させることによっても行うことができる。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＣＤ９、ＨＢ−ＥＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦ受容体の発現を示すアガロース電気泳動の結果である。Ｈ：全心臓、ＣＭ：心筋細胞、ＣＦ：心繊維芽細胞、Ｃ１：マウス肺、Ｃ２：ＨｅｐＧ２細胞、ＮＣ：ネガテイブコントロール、ＨＰＲＴ：インターナルコントロールである。第２図は、Ａｄ．ＬａｃＺの新生マウスの心筋細胞に対する遺伝子導入効率を示すグラフ及びＸ−ｇａｌ染色した培養心筋細胞の顕微鏡写真像である。第３図は、新生マウスの心筋細胞にＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９及びＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ＋Ａｄ．ＣＤ９を各々遺伝子導入し、免疫組織化学染色を行った心筋細胞の顕微鏡写真像である。第４図は、新生マウスの心筋細胞にＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９及びＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ＋Ａｄ．ＣＤ９を各々遺伝子導入後の心筋細胞面積を示すグラフである。第５図は、新生マウスの心筋細胞にＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９及びＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ＋Ａｄ．ＣＤ９を各々遺伝子導入後の心筋細胞の拍動数を示すグラフである。第６図は、Ａｄ．ＣＤ９を遺伝子導入して発現させた新生マウスの心筋細胞にヒト組換えＨＢ−ＥＧＦ（ｒＨＢ）、アンギオテンシン２（Ａｎｇ２）及びヒト組換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）をそれぞれ作用させた場合の心筋細胞の顕微鏡写真像である。
第７図は、Ａｄ．ＣＤ９を遺伝子導入して発現させた新生マウスの心筋細胞にヒト組換えＨＢ−ＥＧＦ（ｒＨＢ）、アンギオテンシン２（Ａｎｇ２）及びヒト組換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）をそれぞれ作用させた場合の心筋細胞の細胞面積を示すグラフである。グラフ中、黒塗りはＣＤ９が遺伝子導入されたものである。第８図は、Ａｄ．ＣＤ９を遺伝子導入して発現させた新生マウスの心筋細胞にヒト組換えＨＢ−ＥＧＦ（ｒＨＢ）、アンギオテンシン２（Ａｎｇ２）及びヒト組換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ）をそれぞれ作用させた場合の心筋細胞の拍動数を示すグラフである。グラフ中、黒塗りはＣＤ９が遺伝子導入されたものである。
第９図は、ＣＤ９の発現の有無によるシグナル伝達におけるリン酸化の程度をウエスタンブロテイングにより解析した写真像である。第１０図は、心筋梗塞後８週間の成体マウスの慢性心不全モデルにおける生存曲線である。第１１図は、心筋梗塞後８週間の成体マウスの慢性心不全モデルにおける心筋細胞のボーダーゾーンの顕微鏡写真像である。第１２図は、心筋梗塞後８週間の成体マウスの慢性心不全モデルにおけるボーダーゾーンとリモートゾーンの心筋細胞径を示すグラフである。第１３図は、心筋梗塞後１週間の成体マウスにおける心エコーのＬＶＥＦを示すグラフである。図中、ｓｈａｍは心筋梗塞を起こしていない正常マウスを、ＭＩは心筋梗塞（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）を示す。（以下、第１４図〜第２３図においても同様）。第１４図は、心筋梗塞後１週間の成体マウスにおける心エコーのＬＶＤｄを示すグラフである。第１５図は、心筋梗塞後１週間の成体マウスにおけるカテーテルによる＋ｄｐ／ｄｔを示すグラフである。第１６図は、心筋梗塞後１週間の成体マウスにおけるカテーテルによるＬＶＳＰを示すグラフである。第１７図は、心筋梗塞後１週間の成体マウスにおけるカテーテルによるＬＶＥＤＰを示すグラフである。
図１８は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの体重補正後の心臓重量を示すグラフである。図１９は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの体重補正後の肺重量である。図２０は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの心筋梗塞領域面積を示すグラフである。図２１は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの線維化面積を示すグラフである。図２２は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの心筋の増殖細胞を示すグラフである。図２３は、心筋梗塞後１週間の成体マウスの心筋の筋線維芽細胞を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施例を挙げて説明する。なお、実施例中のプラスミド、ＤＮＡ、各種酵素、大腸菌、培養細胞などを取り扱う遺伝子工学技術や細胞培養技術は、特に断らない限り上記の「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、（１９９４），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．」及び「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ；Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、第２版（１９８７），Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ」に記載の方法に準じて行った。また、特に断りがない限り、アデノウイルスの一般的な取り扱いに関しては、上記の「Ｆｒａｎｋ  Ｌ．Ｇｒａｈａｍ著、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｈａｐａｔｅｒ  １１．ｐ１０９−ｐ１２８」及び「Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９１）」、アデノウイルスの作製については、上記の「Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９９５）９２，２４７７−２５８１．」に記載の方法に準じて行った。また、治療効果や現象に関しては、いずれかの群間での有意差を先ずＡｎｏｖａ検定で解析し、続いて各二群間の個々の有意差の検定はＳｔｕｄｅｎｔ  ｔ−ｔｅｓｔ（二群間非対称ｔ検定）で解析した。また、生存率の有意差の解析には、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ検定を用いて解析した。
実施例で用いるアデノウイルスベクターは、以下のように作製した。
プラスミドｐＡＤＬ．１／ＲＳＶ（Ｂ．Ｆａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４），１，２４７−２５４）は、上流よりヒト５型アデノウイルスの３’側から０−４５５塩基部分、Ｒｏｕｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｒｅｐｅａｔ（ＲＳＶ）ｐｒｏｍｏｔｅｒ、マルチクローニングサイト、Ｂｏｖｉｎｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅのｐｏｌｙ  Ａ  ｓｉｇｎａｌ配列、ヒト５型アデノウイルスの３’側から３３２８−５７８８塩基部分をｐＢＲ３２２プラスミドに組み込んで作製されたプラスミドでＳｈｕ−Ｈｓｉａ  Ｃｈｅｎ氏（Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ大）より供与を受けた。ｐＡＤＬ．１／ＲＳＶプラスミドを制限酵素のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔ  Ｉで消化し、精製したものをｌｉｇａｔｉｏｎに用いるベクターとした。一方、プラスミドｐＲｃ／ＣＭＶ（インビトロジェン社）にヒトＨＢ−ＥＧＦのｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ全長のｃＤＮＡ、サルＣＤ９のｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ全長のｃＤＮＡを含むそれぞれのプラスミドｐＲｃＨＢＥＧＦ、ｐＲｃＣＤ９は、目加田英輔氏（大阪大学）より供与を受けた。ｐＲｃＨＢＥＧＦ、ｐＲｃＣＤ９の両プラスミドから制限酵素のＨｉｎｄ  ＩＩＩとＮｏｔ  Ｉにより、それぞれＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡ、ＣＤ９  ｃＤＮＡの全長を切り出し、これをアガロースゲル電気泳動して、目的のＤＮＡ断片を切り出し、精製したものをｌｉｇａｔｉｏｎに用いるインサートとした。このように処理されたｐＡＤＬ．１／ＲＳＶベクターとＨＢ−ＥＧＦ  ｃＤＮＡ、ＣＤ９  ｃＤＮＡインサートをそれぞれＴ４  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅでｌｉｇａｔｉｏｎ反応を行い、ｐＡＤＬ．１／ＲＳＶ−ＨＢ−ＥＧＦ、ｐＡＤＬ．１／ＲＳＶ−ＣＤ９をそれぞれ得た。さらに、ヒト５型アデノウイルスのＥ１領域以外の遺伝子を含むプラスミドのｐＪＭ１７（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）と共にｐＡＤＬ．１／ＲＳＶ−ＨＢ−ＥＧＦとｐＡＤＬ．１／ＲＳＶ−ＣＤ９をそれぞれ２９３細胞にリン酸カルシウム法で共感染した。これにより、相同組み替えを起こして正しい目的のアデノウイウルスが出来たプラークが共感染１０−１４日後に出現した。このプラークを拾い、目的のＨＢ−ＥＧＦ、あるいはＣＤ９を発現する正しい非増殖型組み替えアデノウイルスＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９であることを抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体（Ｍ−１８：ｓｃ−１４１４、ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ社）、抗ＣＤ９抗体（ＡＬＢ６、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨ社）を用いた免疫染色などで確認した後、２９３細胞でウイルス増幅し、塩化セシウムの密度勾配遠心法により濃縮、精製して得た。
また、遺伝子導入に用いる大腸菌のＬａｃＺ遺伝子を発現する組み替えアデノウイルスのＡｄ．ＬａｃＺは上記と同じような方法で作製したが、Ａｄ．ＬａｃＺの作製法の詳細はＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９５）９２，２５７７−２５８１に記載されている。また、Ａｄ．ｄＥ１．３は、ＣＤ９やＨＢ−ＥＧＦが組み込まれていないためにこれらの遺伝子を何ら発現しないコントロールの組み替えアデノウイルスである。Ａｄ．ｄＥ１．３は、ＣＤ９やＨＢ−ＥＧＦが挿入されていないｐＡＤＬ．１／ＲＳＶとｐＪＭ１７を前述のように２９３細胞に共感染して同様の方法と過程で作製した。なお、ヒトＨＢ−ＥＧＦは、Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１，９３６−９３９（１９９１）に記載があり、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＮ６０２７８である。また、ＣＤ９はサルＣＤ９を用いたが、サルＣＤ９はＤＲＡＰ２７（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）として報告されたもので（Ｍｉｔａｍｕｒａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１８（６）：１３８９−１３９９，１９９２、Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋのａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号はＢＡＡ０１５６９である）、ヒトＣＤ９と遺伝子配列がほとんど同じで機能も同じと考えられているものである。また、以下の実験系で行った心筋細胞の細胞面積の評価及び心筋細胞の拍動数の評価は、心肥大が心筋細胞の肥大と定義され、頻脈が心筋細胞の拍動数の増大と定義されること（世界的に最も有名且つ権威のあるテキストの「Ｂｒａｕｎｗａｌｄ’ｓ  ＨＥＡＲＴ  ＤＩＳＥＡＳＥ  Ａ  ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１」参照）に基づくものである。
【実施例１】（ラット、マウスの全心臓及び心筋細胞におけるＣＤ９等の発現）
全心臓と心筋細胞におけるＣＤ９、ＨＢ−ＥＧＦ及びＨＢ−ＥＧＦの受容体群（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４）の内因性の発現をＲＴ−ＰＣＲ法を用いて調べた。８週令の成体ＳＤラットと１日令の新生ＢＡＬＢ／Ｃマウスからそれぞれ心筋細胞と全心臓をコラゲナーゼ  タイプ２（ＷＯＲ：ＣＬＳ  ２，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉカタログ番号４５００４１７７）で酵素的に処理し、単離した。次いで、セパゾールＲＮＡ  Ｉ  Ｓｕｐｅｒ（ナカライテスク  カタログ番号３０４−８６）１ｍｌを加えてホモジナイズし、クロロホルムにて水相とフェノール相に分離し、水相をイソプロパノールにて沈殿させた。遠心後、７０％エタノールを用いて懸濁し、更に遠心してＲＮＡを抽出した。１μｇのトータルＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）にて逆転写し、ｃＤＮＡをＰＣＲ法にて増幅した。
ＨＢ−ＥＧＦのセンスプライマー（５‘−ＣＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＣＴＴＴ−３’、配列番号１）とアンチセンスプライマー（５‘−ＣＣＡＡＧＡＣＴＧＴＡＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴ−３’、配列番号２）（Ｙｏｓｈｉｚｕｍｉ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ，：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，９４６７−９４６９，１９９２）、ＣＤ９のセンスプライマー（５‘−ＡＧＣＡＡＧＴＧＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＣ−３’、配列番号３）とアンチセンスプライマー（５‘−ＡＡＴＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＧＧ−３’、配列番号４）は北海道システム・サイエンス社に依頼して合成したものを用いた。また、ＨＢ−ＥＧＦの受容体群は、Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ：Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３９：４７５６−４７６４，１９９８を参照し、ＥＧＦＲのセンスプライマー（５‘−ＡＣＡＡＣＴＧＴＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴ−３’、配列番号５）とアンチセンスプライマー（５‘−ＴＴＣＣＴＧＴＡＡＧＴＴＣＣＧＣＡＴ−３’、配列番号６）、ＥｒｂＢ２のセンスプライマー（５‘−ＡＧＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＡＧＣＴＴＡ−３’、配列番号７）とアンチセンスプライマー（５‘−ＴＧＧＴＴＧＧＧＡＣＴＣＴＴＧＡＣ−３’配列番号８）、ＥｒｂＢ３のセンスプライマー（５‘−ＧＡＣＣＴＡＧＡＣＣＴＡＧＡＣＴＴ−３’、配列番号９）とアンチセンスプライマー（５‘−ＴＣＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＣ−３’、配列番号１０）、ＥｒｂＢ４のセンスプライマー（５‘−ＣＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡ−３’、配列番号１１）とアンチセンスプライマー（５‘−ＡＡＡＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＴＴＧＣＡ−３’、配列番号１２）は北海道システム・サイエンス社に依頼して合成したものを用いた。インターナルコントロールにヒポキサンチンフォスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）を用いた。
また、陽性コントロールとして上記の新生マウス肺とヒト肝癌細胞のＨｅｐＧ２細胞（東北大学加齡医学研究所付属医用細胞資源センターより供与）を用いた。ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＤ９のＰＣＲ法は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔａｑ（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号  Ｍ１８６５）を使用し、熱変性９４℃、３０ｓ、アニーリング５６℃、１ｍｉｎ、伸長反応７２℃、１ｍｉｎにて３８サイクル行い、ＨＢ−ＥＧＦの受容体群、ＨＰＲＴはＴＡＫＡＲＡ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡカタログ番号  ＲＲ００１Ａ）を使用し、アニーリング温度を５５℃として同様に行った。ＰＣＲサーマルサイクラーは、ＴＡＫＡＲＡのＴＰ−４００を使用した。結果は、図１に示した。
図１で示されるように、ＨＢ−ＥＧＦは成体ラット、新生マウスとも心臓で発現がみられ、特に培養心筋細胞でより発現が強いことから、心臓中の心筋細胞自体でＨＢ−ＥＧＦは高発現していることが認められた。また、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４は、成体ラット、新生マウスとも培養心筋細胞で強く発現していることが確認されたが、ＥＧＦＲは成体ラットでは発現が明らかでなく、新生マウスでは強い発現が認められた。ＥｒｂＢ３は、成体ラット、新生マウスとも発現が認められなかった。一方、ＣＤ９は成体ラットの全心臓では発現が認められたが、その培養心筋細胞では発現が明らかでなく、新生マウスの全心臓、培養心筋細胞とも発現が認められなかった。このように、ＨＢ−ＥＧＦの受容体群であるＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ４は心筋細胞では比較的高発現している一方、ＣＤ９は心筋細胞にはほとんど発現していないことが明らかとなった。
【実施例２】（アデノウイルスベクターの遺伝子導入効率の確認）
マウスラミニン（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．カタログ番号  ＢＴ−２７６）をコーテイングした４ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ（Ｎｕｎｃ：Ｌａｂ−Ｔｅｋ，Ｐｅｒｍａｎｏｘ，カタログ番号１７７４３７）に１日令の新生ＢＡＬＢ／Ｃマウスよりコラゲナーゼ  タイプ２（ＷＯＲ：ＣＬＳ  ２，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉカタログ番号４５００４１７７）で単離した心筋細胞（Ａｏｙａｍａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ：Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．，５５：７８７−７９８，２００２）を５ｘ１０５／５００μｌ／Ｗｅｌｌの濃度で播き、ペニシリン（１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、５％非働化オーストラリア産ウシ胎児血清を含有する低グルコースＤＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号  Ｄ６０４６）で維持し、３７℃、９５％空気−５％二酸化炭素の加湿培養器内で培養を行った。得られた初代培養心筋細胞へのアデノウイルスベクターの遺伝子導入効率、発現の確認を行った。すなわち、初代培養心筋細胞にＡｄ．ＬａｃＺをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（多重感染度：１ＭＯＩ＝１  ｐｌａｑｕｅ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ／ｃｅｌｌ）を３００、１００、３０、１０、３、０と希釈して感染させ、４８時間後にＸ−ｇａｌ染色を行った。図２に示すように、ＭＯＩ  ３０で９６％、ＭＯＩ  １０においても８０％以上の良好な遺伝子導入効率であった。この結果より、以下の実験ではＭＯＩ  １０−３０でアデノウイルスを感染させ、２４時間十分に発現させた後、培地を交換し、さらに無血清培養液で洗浄し使用した。ＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２あるいはＨＧＦを作用させる場合はさらに２４時間無血清培養液にて培養した。
【実施例３】（心筋細胞の免疫組織化学染色）
上記で得た新生マウスの培養心筋細胞を４％パラホルムアルデヒドにて１０分間固定し、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ１００にて細胞膜を穿孔し、１０％スキムミルク（雪印）にて６０分ブロッキングした。その後、一次抗体（マウスモノクローナル抗体ＣＤ９（クローンＡＬＢ６）、ＩＭＭＵＮＯＴＥＣＨカタログ番号０１１７）５０倍希釈（２ｕｇ／ｍｌ）、ヤギポリクローナル抗体ＨＢ−ＥＧＦ（Ｍ−１８）（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ  カタログ番号ｓｃ−１４１４）１００倍希釈を１時間反応させ、ＨＢ−ＥＧＦの可視化は抗ヤギＡｌｅｘａ５６８（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  カタログ番号Ａ−１１０５７）、ＣＤ９の可視化は抗マウスＡｌｅｘａ４８８（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  カタログ番号Ａ−１１０２９）で標識して行った。核染色は、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳカタログ番号Ｈ−３５７０）１０００倍希釈にて５分間行なった。Ｆ−ａｃｔｉｎは、ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＢＥＳ  カタログ番号Ｒ−４１５）５００倍希釈にて標識確認した。観察画像記録は、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ製品番号  ＬＳＭ  ５１０）により行った。ＭＯＩ  １０での十分な導入効率を確認した後、Ａｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９、Ａｄ．ＨＢ−ＥＧＦ＋Ａｄ．ＣＤ９による心筋細胞への遺伝子導入後の発現及び局在を蛍光免疫組織染色にて確認した。結果は、図３に示した。
図３より、ＨＢ−ＥＧＦのみを単独で遺伝子導入した場合の発現パターンは、細胞内に顆粒状に染色され、ＣＤ９のみを単独で遺伝子導入した場合は細胞膜表面が染色された。しかし、ＨＢ−ＥＧＦとＣＤ９を共発現させると、それぞれの蛋白の局在パターンが変化することが確認された。つまり、ＣＤ９は単独で遺伝子導入された場合、その導入ＣＤ９遺伝子の発現蛋白は内因性ＣＤ９の元来の発現場所である膜上に局在するが、ＨＢ−ＥＧＦとＣＤ９を共に強発現させた場合、ＣＤ９蛋白はＨＢ−ＥＧＦ蛋白と共に細胞内へ移動することが分かった。
【実施例４】（心筋細胞の細胞面積と拍動数）
上記で得た新生マウスの心筋初代培養細胞にＡｄ．ＣＤ９、Ａｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ＣＤ９＋Ａｄ．ＨＧ−ＥＧＦを用いてＣＤ９、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＤ９＋ＨＢ−ＥＧＦ（それぞれＭＯＩ  １０）を強発現させておき、２４時間後の心筋細胞の変化を形態的、生理学的に検討した。細胞面積は、４％パラホルムアルデヒドにて心筋細胞を１０分固定後、ＰＩＸＥＬカウント（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ）を用いて計測した。
図４に示すように、ＨＢ−ＥＧＦが遺伝子導入された心筋細胞の細胞面積は、コントロール（ＨＢ−ＥＧＦとＣＤ９の遺伝子が未導入）に対し有意な増大がみられ（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）、ＣＤ９を単独で遺伝子導入した心筋細胞の細胞面積は有意な変化がみられなかった。一方、ＣＤ９＋ＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入群の心筋細胞の細胞面積は、ＨＢ−ＥＧＦによる増大を有意に抑制していた。
次いで、上記のＣＤ９、ＨＢ−ＥＧＦ、ＣＤ９＋ＨＢ−ＥＧＦが各々遺伝子導入された心筋細胞の拍動をビデオ顕微鏡観測システム（ＯＬＹＭＰＵＳ顕微鏡ＩＸ  ７０＋ＣＣＤカメラＣＳ  ９００）を用いて記録した。その結果、図５に示すように、ＨＢ−ＥＧＦが遺伝子導入された心筋細胞の拍動数は、有意な増加（コントロール７０±８／ｍｉｎに対して１３０±１０／ｍｉｎ）がみられたが、ＣＤ９＋ＨＢ−ＥＧＦが遺伝子導入された心筋細胞の拍動数はコントロールとほぼ同様で（７６±１０／ｍｉｎ）、ＣＤ９がＨＢ−ＥＧＦの作用を阻害していることが示された（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
新生マウスの心筋初代培養細胞にＭＯＩ  ３０でＡｄ．ＣＤ９を感染させて遺伝子導入し、ＣＤ９を強発現させ、２４時間後、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ（ｒＨＢ−ＥＧＦ、Ｒ＆Ｄシステム  カタログ番号２５９−ＨＥ）（濃度１０ｎｇ／ｍｌ）、アンギオテンシン２（ＳＩＧＭＡ  カタログ番号  Ａ−９５２５）（濃度１００ｎＭ）、ヒト組み換えＨＧＦ（ｒＨＧＦ、Ｒ＆Ｄシステム  カタログ番号  ２９４−ＨＧ）（濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を各々培養液中に加えて心筋細胞に２４時間作用させた。その後、４％パラホルムアルデヒドにて心筋細胞を固定し、免疫染色にてＣＤ９の導入の有無を確認し、Ｆ−ａｃｔｉｎ染色により筋繊維形成の程度を調べた。図６のＣＤ９が遺伝子導入された心筋細胞（Ａｎｔｉ−ＣＤ９の写真像参照）は、ＣＤ９免疫染色像とＦ−ａｃｔｉｎ染色像を重合した写真像から分かるようにヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦによる心筋細胞肥大作用が抑制されていた。
また、上記のようにＣＤ９を強発現させてヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦを各々培養液中に加えた心筋細胞についてＣＤ９を遺伝子導入していないコントロールの心筋細胞の面積を１として各群の心筋細胞の面積の比を解析した。また、心筋細胞の拍動数変化は、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦを加える２４時間前より、Ａｄ．ＣＤ９、あるいはＡｄ．ｄＥ１．３（コントロール）をＭＯＩ  ３０にて十分に作用させた。拍動細胞の存在を確認後、無血清培養液にて３回洗浄、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦの各々を肥大定量時と同量加え、３時間後、培養細胞ビデオ観察システム（ＯＬＹＭＰＵＳ顕微鏡  製品番号ＩＸ  ７０およびＣＣＤカメラ  製品番号ＣＳ  ９００）を用い、２０個以上の心筋細胞を各５分以上観察し１分間の拍動数を計測した。
図６に示すように、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦのいずれかを添加した場合、すべてにおいて筋繊維の形成、肥大が確認できたが、予めＣＤ９を強発現させその発現が確認されている心筋細胞においては、叙述のように肥大及び筋繊維形成が抑制されていた。また、細胞面積は、図７に示すように、統計学的に有意であった。例えば、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ単独：２．８±０．５倍対コントロール、ＣＤ９＋ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ：０．７±０．１倍対コントロールであり、アンギオテンシン２、ｒＨＧＦの場合も同様にＣＤ９は心筋細胞の肥大を抑制していた（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ、＊＊Ｐ＜０．００１ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。また、心筋細胞の拍動数は、図８に示すように、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ヒト組み換えＨＧＦの作用により、有意に拍動数の増加がみられ、ＣＤ９によりその作用が打ち消されることが確認された（＊ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ、＊＊ｐ＜０．００１ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。このことより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてもＣＤ９が心筋肥大作用及び心陽性変力作用を抑制することが明らかとなった。
【実施例５】（シグナル伝達におけるリン酸化の阻害）
次にＣＤ９のメカニズムを検討するため、細胞内情報伝達のＭＡＰＫ（ＭＡＰキナーゼ）のリン酸化を調べた。拍動の観察を終了した心筋細胞より、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法にてプロテインアッセイキット（バイオラッド  カタログ番号５００−０００２ＪＡ）を用いて蛋白を抽出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに３μｇずつ泳動し、ウエスタンブロッテイングにて確認した。その結果、図９に示すように、ｐＥＲＫ（Ｅ−４）（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺカタログ番号ｓｃ−７３８３），ｐ−ｐ７０  Ｓ６Ｋ（Ａ−６）（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺカタログ番号  ｓｃ−８４１６）、ｐ−ｐ３８（Ｄ−８）（ＳＡＮＴＡＣＲＵＺカタログ番号ｓｃ−７９７３）を用いることにより、ＣＤ９の作用でａｃｔｉｖｅ−ＥＲＫ、ａｃｔｉｖｅ−ｐ７０  Ｓ６Ｋ及びａｃｔｉｖｅ−ｐ３８のリン酸化が抑制され（ａｃｔｉｖｅ−ｐ３８は軽度に抑制）、シグナル伝達を阻害していることが推測された。シグナル伝達の阻害は、ヒト組み換えＨＢ−ＥＧＦのみならず、アンギオテンシン２やヒト組み換えＨＧＦの添加でも同様にみられ、ＨＢ−ＥＧＦ、アンギオテンシン２、ＨＧＦのシグナル伝達経路に関与していることが示唆された。なお、発色は、ＨＲＰの二次抗体にて標識し、スーパーシグナルＷｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学蛍光発色物（ＰＩＥＲＣＥ  カタログ番号  ３４０７７）にて発光させた。インターナルコントロールの蛋白質としてα−ｔｕｂｌｉｎ（ＤＭ１Ａ）（ＳＩＧＭＡカタログ番号  Ｔ−９０２６）を同様にウエスタンブロッティングで検出した。
【実施例６】（心筋梗塞動物モデルにおける心機能の改善）
８−１２週齢の成体雄マウスＣ５７／ＢＬ６を気管切開し、麻酔器（木村医科器械  製品番号  コンパクト−１５）にて全身麻酔（ＧＯＨ笑気／酸素／ハロセン）した後、開胸した。冠動脈を２−０ナイロン糸にて永久的結紮し心筋梗塞動物モデルを作製した。１００ｕｌのＰＢＳに溶解したＡｄ．ＨＢ−ＥＧＦ、Ａｄ．ｄＥ１．３、Ａｄ．ＨＢ−ＥＧＦ＋Ａｄ．ＣＤ９の各ウイルス１ｘ１０１１粒子を含むＰＢＳ液を心筋の心外膜側に直接散布投与し、閉胸した。４日後に血清を採血し、１週間後（心筋梗塞後１週間モデル）及び８週間後に各々屠殺して評価した。心筋梗塞１週間モデルは、心エコー（アロカ、プローブ：７．５ＭＨＺ  製品番号ＳＳＤ−２０００）にて左室駆出率（ＬＶＥＦ）、左室拡張期径（ＬＶＤｄ）、左室収縮期径（ＬＶＤｓ）、左室中隔厚（ＩＶＳｔ）、後壁厚（ＰＷｔ）を計測した。また、右頸動脈より観血的に動脈圧モニターカテーテル（Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓカタログ番号ＳＰＲ  ４０７）を大動脈及び左心室内に挿入して左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）、左室拡張末期圧（ＬＶＥＤＰ）、左室最大陽性ｄＰ／ｄｔ，左室最大陰性ｄＰ／ｄｔを測定（ＰｏｗｅｒＬａｂ  ｓｙｓｔｅｍ  ｖｅｒ  ４．２  ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）した。採血後に臓器（心臓、肺、肝臓、腎臟、脾臓）を採取した。
図１０に慢性期８週間までの生存曲線を示した。ＨＢ−ＥＧＦのみ遺伝子導入したマウス（ＨＢ−ＥＧＦ＋ｄｅ１．３）は急性期（ほぼ２週間以内）に死亡し、ＣＤ９を同時に遺伝子導入することにより（ＨＢ−ＥＧＦ＋ＣＤ９）生存し得た（Ｐ＜０．０５）。
次に組織学的な検討をした。慢性期８週間のマウスの心臓をスライスし、１０％ホルマリンにて固定した。パラフィン包埋後、カットした後、ＨＥ染色した。図１１に示すように、ＨＢ−ＥＧＦを遺伝子導入したマウスに比べ、ＣＤ９を同時に遣伝子導入したものは、代償性肥大が抑制されていた。また、各切片をＬＵＺＥＸ  Ｆシステム（ニレコ社製）を用い、心筋細胞径をボーダーゾーン（Ｂｏｒｄｅｒ：心筋梗塞部と正常部の境界領域）とリモートゾーン（Ｒｅｍｏｔｅ：心筋梗塞部から離れた正常の心筋部）で計測（各サンプル各ｚｏｎｅ２０個以上）した。図１２に示すように、ボーダーゾーンにおいてコントロール群でもみられる代償性肥大がＨＢ−ＥＧＦ群でもみられたが、ＣＤ９を同時に遺伝子導入することにより、その肥大作用が抑制されていた（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ、＊＊ｐ＜０．００１ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
また、２週間以内の急性期にＨＢ−ＥＧＦ＋ｄＥ１．３群の８０％が死亡した原因について検討するため作製した心筋梗塞後１週間モデルの心エコー及びカテーテルによる心機能の測定の結果は以下の通りであった。心エコーによる心機能評価では、左室駆出率（ＬＶＥＦ）（図１３参照）において、カテーテルによる観血的血行動態評価では、左室最大陽性ｄＰ／ｄｔ及び左室収縮期圧（ＬＶＳＰ）（図１５及び図１６）において、ＣＤ９の遺伝子導入群がコントロール及びＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入群に比し、心機能が有意に良好であった（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。なお、心筋梗塞後１週間の短い期間では左室の大きさに変化がないと言われているようにＬＶＤｄのＣＤ９遺伝子導入群とコントロール並びにＨＢ−ＥＧＦ遺伝子導入群の間に差がみられなかった（図１４参照）。同様に左室の壁の厚さの指標となるＩＶＳｔ、ＰＷｔについても心筋梗塞１週間の短い期間では有意な差がなかった（図面省略）。また、ＬＶＥＤＰは有意差がなかったが、ＣＤ９遺伝子導入群では低い傾向にあった（図１７参照、＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
これらの結果は、ＣＤ９を心臓に遺伝子導入することにより心肥大と頻脈を抑制し、心疾患の予防や改善に効果的であることを示すものであり、本発明の医薬は他の心不全モデルなどにおいても応用し得るものである。
【実施例７】（心筋梗塞動物モデルにおける臓器重量の測定）
心筋梗塞作製後１週間が経過したマウスのそれぞれの群についてすべてを屠殺した。屠殺後のマウスの体重を各々測定し、心臓の重量、肺の重量をその体重で除して補正し、補正後の心臓及び肺の重量を算出した。心臓の重量増加は、心臓の過剰な肥大及び拡大を示し、心不全など心機能の悪化の指標となる。また、肺の重量増加は、肺のうっ血を示し、このことは肺水腫、つまりは心不全を示す指標となる。結果は、図１８及び図１９に示したように、ＣＤ９導入群は有意に臓器重量が抑制され、心不全状態になっていない（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ、＊＊Ｐ＜０．００１ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
【実施例８】（心筋梗塞動物モデルにおける心筋梗塞領域面積及び線維化面積の測定）
心筋梗塞作製後１週間が経過したマウスのそれぞれの群についてすべてを屠殺した。屠殺後、心臓を取り出し、スライスした切片をホルマリン処理にて固定後、該切片に線維化指標のマッソン  トリクローム染色を行った。心筋梗塞領域面積（ＭＩ  ａｒｅａ）は、心筋壊死部分の左心室全体における比率を計算した。また、線維化面積は、特にマッソン  トリクローム染色にて陽性部分の左心室切片全体の面積に対する比率で計算した。結果は、図２０及び図２１に示したように、ＣＤ９導入群は心筋梗塞領域面積（ＭＩ  ａｒｅａ）及び線維化面積のいずれにおいても、有意な減少を認め、治療効果が現れている（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
【実施例９】（心筋梗塞動物モデルにおける心筋梗塞領域の免疫組織学的検討）
心筋梗塞作製後１週間が経過したマウスのそれぞれの群についてすべてを屠殺した。屠殺後、心臓を取り出し、ホルマリン処理にて固定後、パラフィン包理し、スライス処理した。増殖細胞の指標として、Ｋｉ−６７抗原に対するモノクローナル抗体（クローン：ＭＩＢ−１、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、カタログ番号Ｍ７２４０、抗体希釈２５倍）、筋線維芽細胞の指標として、抗平滑筋線維アクチン（α−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（ＳＭＡ））に対するモノクローナル抗体によるＤＡＫＯ  ＥＰＯＳ／ＨＲＰ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ／ペルオキシダーゼ）キット（クローン：１Ａ４、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ社、カタログ番号  Ｕ７０３３）を用いて心臓のスライスを染色した。染色陽性細胞を顕微鏡にて観察を行い、高倍率（Ｈｉｇｈ  Ｐｏｗｅｒ  Ｆｉｅｌｄ（ＨＰＦ））の２００倍観察によりそれぞれのグループにつき、１検体１０視野の単位視野当たりの陽性細胞をカウントし平均化後、グラフ化した。結果は、図２２及び図２３に示したように、ＣＤ９導入群は増殖細胞及び筋線維芽細胞のいずれにおいても、有意な減少が認められ、ＣＤ９が増殖細胞の不整かつ過剰な修復、肉芽の抑制や筋線維芽細胞の増殖を抑制することが明らかとなった（＊Ｐ＜０．０５ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ、＊＊Ｐ＜０．００１ＶＳＣｏｎｔｒｏｌ）。
産業上の利用性
本発明の医薬は、遺伝子治療に用い、ＣＤ９遺伝子を心臓に導入することにより、心疾患、特に心肥大や頻脈を伴う心疾患を根治的に予防又は治療できる。また、本発明の予防又は治療の方法は、ＣＤ９遺伝子を心臓で発現させることにより心疾患を根治的に予防又は治療できる。
本発明は、発明の実質的範囲に包含される限り、上記の実施例に限定されるものではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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