(57)【要約】本発明によれば、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とから構成される核酸構築物であって、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とは少なくとも一部がアニーリングしており、第１の１本鎖核酸及び第２の１本鎖核酸はそれぞれ第３の１本鎖核酸と連結している核酸構築物の製造方法が提供される。本発明によれば、本発明は、１本鎖核酸の特定のヌクレオチドどうしを連結することができるため、様々な構造を有する核酸を構築することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とから構成される核酸構築物であって、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とは少なくとも一部がアニーリングしており、第１の１本鎖核酸及び第２の１本鎖核酸はそれぞれ第３の１本鎖核酸と連結している核酸構築物の製造方法であって、
（ｉ）第１の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドであって、上記１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するヌクレオチドをリンカーを介して化学結合させることにより、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とを連結する工程、
（ｉｉ）第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸をアニーリングさせる工程、及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉ）及び（ｉｉ）により得られた連結物をリガーゼ処理することにより第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とを連結する工程、
を含むことを特徴とする上記の方法。
【請求項２】
リンカーが架橋剤であり、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドに、上記架橋剤により認識される官能基を付加し、該官能基と架橋剤を化学結合することにより結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
リンカーが、第１の１本鎖核酸の片方の末端のヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸の同じ側の末端から０〜１０塩基内側のヌクレオチドとの結合を介するものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の１本鎖核酸または第１の１本鎖核酸のいずれか一方が、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するＲＮＡを含み、その３’末端側の塩基配列が、もう一方の１本鎖核酸とアニーリング可能な塩基配列であり、かつ、もう一方の１本鎖核酸は、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合しているものである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
核酸誘導体が、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
スペーサーが、高分子からなるものである、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
スペーサーが、主鎖の原子数で１０以上の長さである、請求項４から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第３の１本鎖核酸が、標識物質を含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物。
【請求項１０】
第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とから構成され、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とは少なくとも一部がアニーリングしており、第１の１本鎖核酸及び第２の１本鎖核酸はそれぞれ第３の１本鎖核酸と連結している核酸構築物であって、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するヌクレオチドがリンカーを介して化学結合しており、かつ第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の末端のヌクレオチドが化学結合している、上記の核酸構築物。
【請求項１１】
リンカーが架橋剤であり、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドに、上記架橋剤により認識される官能基を付加し、該官能基と架橋剤が化学結合することにより結合している、請求項１０に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
リンカーが、第１の１本鎖核酸の片方の末端のヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸の同じ側の末端から０〜１０塩基内側のヌクレオチドとの結合を介するものである、請求項１０または１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
第２の１本鎖核酸または第１の１本鎖核酸のいずれか一方が、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するＲＮＡを含み、その３’末端側の塩基配列が、もう一方の１本鎖核酸とアニーリング可能な塩基配列であり、かつ、もう一方の１本鎖核酸は、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合しているものである、請求項１０〜１２のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１４】
核酸誘導体が、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
スペーサーが、高分子からなるものである、請求項１３または１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
スペーサーが、主鎖の原子数で１０以上の長さである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１７】
第３の１本鎖核酸が標識物質を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１８】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物または１３〜１７のいずれかに記載の核酸構築物をタンパク質翻訳系により翻訳し、コーディング配列がコードするタンパク質と該核酸構築物とを核酸誘導体を介して結合させることを含む、タンパク質−核酸連結体の製造方法。
【請求項１９】
請求項４〜８のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物または１３〜１７のいずれかに記載の核酸構築物を６０〜９０℃で加熱した後に冷却してから、タンパク質翻訳系により翻訳する、請求項１８に記載のタンパク質−核酸連結体の製造方法。
【請求項２０】
請求項１３〜１７のいずれかに記載の核酸構築物の核酸誘導体に、コーディング配列がコードするタンパク質が結合している、タンパク質−核酸連結体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のタンパク質−核酸連結体のｍＲＮＡ鎖を逆転写することを含む、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体の製造方法。
【請求項２２】
請求項２０に記載のタンパク質−核酸連結体のｍＲＮＡ鎖にＤＮＡがアニーリングしている、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体。
【請求項２３】
請求項２２に記載のＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体のＲＮＡを分解し、ＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ反応をすることにより得られる２本鎖ＤＮＡ−タンパク質連結体。
【請求項２４】
請求項２０〜２３のいずれかに記載のタンパク質−核酸連結体を、第３の１本鎖核酸が有する標識物質により分離精製することを含む、タンパク質−核酸連結体の精製方法。
【請求項２５】
請求項２０〜２３のいずれかに記載のタンパク質−核酸連結体または請求項２４の精製方法により得られたタンパク質−核酸連結体の混合物の中から、タンパク質の機能を指標として所望のタンパク質−核酸連結体を選択することを含む、所望のタンパク質−核酸連結体、所望のタンパク質、所望のタンパク質をコードする塩基配列、または所望のタンパク質をコードするＲＮＡの取得方法。
【請求項２６】
請求項２５で選択されたタンパク質−核酸連結体のコーディング配列を含むＤＮＡを増幅することを含む、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
【請求項２７】
請求項２６で得られたＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡをコーディング配列として、請求項４〜８のいずれかに記載の方法、請求項１８又は１９に記載の方法、請求項２４に記載の方法、請求項２５に記載の方法、および請求項２６に記載の方法を繰り返すことを含む、所望のタンパク質−核酸連結体、所望のタンパク質、所望のタンパク質をコードする塩基配列、所望のタンパク質をコードするＲＮＡ、または所望のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
【請求項２８】
２本の核酸の同じ末端側をリンカーを介して結合する方法であって、該核酸の結合しようとする各ヌクレオチドに該架橋剤により認識される官能基を付加し、これらを該架橋剤で結合させることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法により結合された２本の核酸を含む核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、１本鎖核酸どうしを連結する方法において、１本鎖核酸中の特定のヌクレオチドと他方の１本鎖核酸中の特定のヌクレオチドとをリンカーを介した化学結合させることにより核酸構築物を製造する方法、および１本鎖核酸どうしを連結する方法において、１本鎖核酸中の特定のヌクレオチドと他方の特定のヌクレオチドとを、リンカーを介した化学結合およびリガーゼによる酵素結合により連結し、突出構造を有さない核酸構築物を製造する方法、並びに該方法により製造された核酸構築物を用いたタンパク質−核酸連結体の製造方法等に関する。
【背景技術】  遺伝子工学においてＤＮＡの切断および連結は最も重要な基本的手法の一つである。一方、ＲＮＡの連結は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いた、主に人工ｒＲＮＡの合成（Ｂｒｕｃｅ  ＡＧ，Ｕｈｌｅｎｂｅｃｈ  ＯＣ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（１９８２）２１（５）８５５−６）や、全長ｃＤＮＡ作製のためのｍＲＮＡの５’末端へのプライマー付加方法（Ｔｒｏｕｔｔ  ＡＢ，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９９２）８９（２０）：９８２３−５）等がある。最近になって進化分子工学の手法であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（ＷＯ９８／１６６３６号公報およびＮｅｍｏｔｏ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，４０５−４０８）が登場し、そこでｍＲＮＡと、その３’末端にピューロマイシン等の核酸誘導体を末端に有するＤＮＡ等からなるリンカーを連結した核酸構築物を製造する必要がでてきた。従来の方法ではその効率が悪く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法に必須の該核酸構築物を用いて製造されるタンパク質−核酸連結体の製造にあたって大きな課題となっている。
また、上記リンカーには、さらにポリＡ鎖やビオチン等の精製用のタグ、蛍光色素等の検出用プローブ、逆転写によるｍＲＮＡのｃＤＮＡ／ｍＲＮＡ化を可能にするプライマー配列等を付加する場合（ＷＯ０３／１４７３４号公報）もあり、そのような複雑な構造を有する核酸構築物を製造するために、さらに、核酸結合のためのより効率の良い加工技術が求められている。
２種類の核酸を連結させる方法としては、従来は制限酵素を用いた２本鎖核酸のライゲーションが主であり、ＤＮＡリガーゼを用いたものがほとんどであった。最近になり西垣らが（Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｄｉｖｅｒｓ  １９９８；４（３）：１８７−９）２つのＤＮＡ断片の一部をハイブリダイズすることにより効率よくＴ４  ＲＮＡリガーゼを用いてライゲーションする方法（Ｙ−ライゲーション法）を見出した。Ｙ−ライゲーション法は、２本の１本鎖ＤＮＡ（５’−ハーフおよび３’−ハーフ）の末端に互いに相補的配列（ステム部分）を含めておき、ハイブリダイゼーション後、一本鎖領域（ブランチ部分）の末端をＲＮＡリガーゼで連結する方法である（ＷＯ０３／１４７３４号公報を参照）。しかし、この方法では連結すべき二本の一本鎖ＤＮＡの末端に互いに相補的な配列（ステム部分）を含めておく必要があり、この方法で製造された核酸構築物（図３のＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ）は、図に記載のとおり突出構造を有しているため、例えばこれを用いてタンパク質−核酸連結体を製造する場合、該連結体の生成効率が低いという問題があった。
本発明者らは、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するｍＲＮＡ鎖（第２の１本鎖核酸）、該ＲＮＡの３’末端の塩基配列とアニーリング可能な塩基配列からなるＤＮＡで、かつ核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合しているＤＮＡ鎖（第１の１本鎖核酸）、およびｐｏｌｙＡ等を有するＤＮＡ鎖（第３の１本鎖核酸）を用いて、ＲＮＡ（第２の１本鎖核酸）の３’末端とｐｏｌｙＡ等を有するＤＮＡ鎖（第３の１本鎖核酸）の５’末端とを結合させる方法、および第１の１本鎖核酸の５’末端と第３のＤＮＡ鎖の５’末端側のヌクレオチドとを結合させる方法を検討し、該方法により得られた核酸構築物を翻訳することにより製造されるタンパク質−核酸連結物の生成における飛躍的な効率化を達成した。
さらに詳しくは、本発明者らは、５’末端のヌクレオチドにチオール基を有する化合物を付加した１本鎖ＤＮＡと、さらにアミノ基を有する化合物を５’末端付近のヌクレオチドに付加したＤＮＡを、ＥＭＣＳを用いて連結し、この連結物にｍＲＮＡ鎖をアニーリングさせた後にリガーゼ処理することにより連結して得られた核酸構築物を鋳型として、タンパク質−核酸連結物を製造すれば、該連結物の生成効率が飛躍的に向上することを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とから構成される核酸構築物であって、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とは少なくとも一部がアニーリングしており、第１の１本鎖核酸及び第２の１本鎖核酸はそれぞれ第３の１本鎖核酸と連結している核酸構築物の製造方法であって、
（ｉ）第１の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドであって、上記１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するヌクレオチドをリンカーを介して化学結合させることにより、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とを連結する工程、
（ｉｉ）第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸をアニーリングさせる工程、及び
（ｉｉｉ）前記工程（ｉ）及び（ｉｉ）により得られた連結物をリガーゼ処理することにより第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とを連結する工程、
を含むことを特徴とする上記の方法。
（２）  リンカーが架橋剤であり、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドに、上記架橋剤により認識される官能基を付加し、該官能基と架橋剤を化学結合することにより結合する、（１）に記載の方法。
（３）  リンカーが、第１の１本鎖核酸の片方の末端のヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸の同じ側の末端から０〜１０塩基内側のヌクレオチドとの結合を介するものである、（１）または（２）に記載の方法。
（４）  第２の１本鎖核酸または第１の１本鎖核酸のいずれか一方が、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するＲＮＡを含み、その３’末端側の塩基配列が、もう一方の１本鎖核酸とアニーリング可能な塩基配列であり、かつ、もう一方の１本鎖核酸は、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合しているものである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）  核酸誘導体が、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、（４）に記載の方法。
（６）  スペーサーが、高分子からなるものである、（４）または（５）に記載の方法。
（７）  スペーサーが、主鎖の原子数で１０以上の長さである、（４）から（６）のいずれかに記載の方法。
（８）  第３の１本鎖核酸が、標識物質を含む、（１）から（７）のいずれかに記載の方法。
（９）  （１）から（８）のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物。
（１０）  第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸とから構成され、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とは少なくとも一部がアニーリングしており、第１の１本鎖核酸及び第２の１本鎖核酸はそれぞれ第３の１本鎖核酸と連結している核酸構築物であって、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するヌクレオチドがリンカーを介して化学結合しており、かつ第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の末端のヌクレオチドが化学結合している、上記の核酸構築物。
（１１）  リンカーが架橋剤であり、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドに、上記架橋剤により認識される官能基を付加し、該官能基と架橋剤が化学結合することにより結合している、（１０）に記載の核酸構築物。
（１２）  リンカーが、第１の１本鎖核酸の片方の末端のヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸の同じ側の末端から０〜１０塩基内側のヌクレオチドとの結合を介するものである、（１０）または（１１）に記載の核酸構築物。
（１３）  第２の１本鎖核酸または第１の１本鎖核酸のいずれか一方が、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するＲＮＡを含み、その３’末端側の塩基配列が、もう一方の１本鎖核酸とアニーリング可能な塩基配列であり、かつ、もう一方の１本鎖核酸は、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合しているものである、（１０）〜（１２）のいずれかに記載の核酸構築物。
（１４）  核酸誘導体が、ピューロマイシン、３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド、３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシドの化学構造骨格を含む化合物又はそれらの類縁体である、（１３）に記載の核酸構築物。
（１５）  スペーサーが、高分子からなるものである、（１３）または（１４）に記載の核酸構築物。
（１６）  スペーサーが、主鎖の原子数で１０以上の長さである、（１３）〜（１５）のいずれかに記載の核酸構築物。
（１７）  第３の１本鎖核酸が標識物質を含む、（１３）〜（１６）のいずれかに記載の核酸構築物。
（１８）  （４）〜（８）のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物または（１３）〜（１７）のいずれかに記載の核酸構築物をタンパク質翻訳系により翻訳し、コーディング配列がコードするタンパク質と該核酸構築物とを核酸誘導体を介して結合させることを含む、タンパク質−核酸連結体の製造方法。
（１９）  （４）〜（８）のいずれかに記載の方法により製造される核酸構築物または（１３）〜（１７）のいずれかに記載の核酸構築物を６０〜９０℃で加熱した後に冷却してから、タンパク質翻訳系により翻訳する、（１８）に記載のタンパク質−核酸連結体の製造方法。
（２０）  （１３）〜（１７）のいずれかに記載の核酸構築物の核酸誘導体に、コーディング配列がコードするタンパク質が結合している、タンパク質−核酸連結体。
（２１）  （２０）に記載のタンパク質−核酸連結体のｍＲＮＡ鎖を逆転写することを含む、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体の製造方法。
（２２）  （２０）に記載のタンパク質−核酸連結体のｍＲＮＡ鎖にＤＮＡがアニーリングしている、ＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体。
（２３）  （２２）に記載のＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体のＲＮＡを分解し、ＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ反応をすることにより得られる２本鎖ＤＮＡ−タンパク質連結体。
（２４）  （２０）〜（２３）のいずれかに記載のタンパク質−核酸連結体を、第３の１本鎖核酸が有する標識物質により分離精製することを含む、タンパク質−核酸連結体の精製方法。
（２５）  （２０）〜（２３）のいずれかに記載のタンパク質−核酸連結体または（２４）の精製方法により得られたタンパク質−核酸連結体の混合物の中から、タンパク質の機能を指標として所望のタンパク質−核酸連結体を選択することを含む、所望のタンパク質−核酸連結体、所望のタンパク質、所望のタンパク質をコードする塩基配列、または所望のタンパク質をコードするＲＮＡの取得方法。
（２６）  （２５）で選択されたタンパク質−核酸連結体のコーディング配列を含むＤＮＡを増幅することを含む、所望のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
（２７）  （２６）で得られたＤＮＡを転写して得られたｍＲＮＡをコーディング配列として、（４）〜（８）のいずれかに記載の方法、（１８）又は（１９）に記載の方法、（２４）に記載の方法、（２５）に記載の方法、および（２６）に記載の方法を繰り返すことを含む、所望のタンパク質−核酸連結体、所望のタンパク質、所望のタンパク質をコードする塩基配列、所望のタンパク質をコードするＲＮＡ、または所望のタンパク質をコードするＤＮＡの取得方法。
（２８）  ２本の核酸の同じ末端側をリンカーを介して結合する方法であって、該核酸の結合しようとする各ヌクレオチドに該架橋剤により認識される官能基を付加し、これらを該架橋剤で結合させることを特徴とする方法。
（２９）  （２８）に記載の方法により結合された２本の核酸を含む核酸構築物。
【図面の簡単な説明】  図１は、架橋剤を介して１本鎖核酸中のヌクレオチドを結合する方法の模式図である。
図２は、スペーサー鎖、および標識鎖を結合する方法を示した模式図である。末端に核酸誘導体（図中Ｐで示される）および蛍光物質物等を有するオリゴ１とオリゴ２を連結（スペーサー鎖）し、さらにｐｏｌｙＡ（標識物）を有するオリゴ３（標識鎖）を架橋剤を介して連結することによりスペーサー鎖と標識鎖の連結物が得られる。
図３は、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、およびＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡの構造を示す模式図である。図中枠内には、架橋剤を介した結合方法の模式図が示される。また、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡで示したスペーサー鎖と標識鎖の連結物は、突出部を有し、本発明のものより、ＩＶＶ分子の合成効率が低い。
図４は、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ、またはＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡとｍＲＮＡ鎖とのライゲーションの結果を示す電気泳動の写真である。本発明のＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡは、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡに比べてｍＲＮＡとのライゲーション効率が高い。
レーン１：  ｍＲＮＡ
レーン２：  ｍＲＮＡ：Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ＝１：１．２
レーン３：  ｍＲＮＡ：Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ＝１：１．２
レーン４：  ｍＲＮＡ：Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ＝１：２
レーン５：  ｍＲＮＡ：Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ＝１：３
レーン６：  分子量マーカー
図５は、スペーサー鎖と標識鎖の連結物の構造の違いによるＩＶＶ分子形成効率への影響を示す電気泳動の写真である。本発明のＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡは、いずれもＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡに比べてＩＶＶ分子の形成効率が高く、特にＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡではＩＶＶ形成効率が高くなっている。
レーン１：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  翻訳前
レーン２：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  翻訳１時間
レーン３：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  翻訳３時間
レーン４：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  翻訳前
レーン５：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  翻訳１時間
レーン６：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  翻訳３時間
レーン７：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  翻訳前
レーン８：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  翻訳１時間
レーン９：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  翻訳３時間
レーン１０：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  翻訳前
レーン１１：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  翻訳１時間
レーン１２：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  翻訳３時間
図６は、スペーサー鎖と標識鎖の連結物の構造の違いによるＩＶＶ分子の逆転写効率への影響を示す電気泳動の写真である。Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡを除き、逆転写によるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ２本鎖化とそのＲＮａｓｅ  Ｈ処理によってｃＤＮＡ化が確認できた。Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡでは逆転写産物が４０−５０％程度確認された。
レーン１：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  ＲＮＡ−リンカー連結体
レーン２：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  逆転写反応後
レーン３：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ  ＲＮａｓｅＨ処理後
レーン４：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  ＲＮＡ−リンカー連結体
レーン５：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  逆転写反応後
レーン６：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ  ＲＮａｓｅＨ処理後
レーン７：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  ＲＮＡ−リンカー連結体
レーン８：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  逆転写反応後
レーン９：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ  ＲＮａｓｅＨ処理後
レーン１０：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  ＲＮＡ−リンカー連結体
レーン１１：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  逆転写反応後
レーン１２：  Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ  ＲＮａｓｅＨ処理後
図７は、翻訳前にｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を加熱、急冷することのＩＶＶ分子の形成効率への影響を示す電気泳動の写真である。翻訳前にｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を加熱、急冷した方がＩＶＶ分子の形成効率が高い。
レーン１：  未処理    翻訳前
レーン２：  未処理    翻訳１時間
レーン３：  未処理    翻訳３時間
レーン４：  加熱冷却  翻訳前
レーン５：  加熱冷却  翻訳１時間
レーン６：  加熱冷却  翻訳３時間
図８は、ＩＶＶ分子調製用ｃＤＮＡライブラリーの作製方法の概略図である。ｍＲＮＡからランダムプライミング法により逆転写でｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成し（Ｉ）、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ処理によりｄｓＤＮＡライブラリーを合成し（ＩＩ）、さらに翻訳エンハンサーなどを含むアダプターと結合して（ＩＩＩ）、ＰＣＲによりフォワード共通プライマー（配列番号７）、リバース共通プライマー（配列番号８）を用いて、５’、３’共通配列を導入し、ＩＶＶ分子調製用ｃＤＮＡライブラリーを作製した（ＩＶ）。
図９Ａは、ＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーを４％ウレア変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて泳動した結果を示す図である。調製されたＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーは、スメアな泳動像を示し、またＤＮＡ鎖の長さも十分であった。
図９Ｂは、ＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーとその元となっているｍＲＮＡ中に含まれる特定分子の存在量を定量ＰＣＲ法により測定した結果を示すグラフである。調製されたＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリー中に含まれる複数種の特定のｃＤＮＡ量は、もとのｍＲＮＡ中に含まれるものと差異がない。
図１０は、ＩＶＶスクリーニングの概略を示す図である。  ＩＶＶ分子のスクリーニングは、（ｉ）タンパク質−逆転写核酸連結体（以下、これを「ＩＶＶｃＤＮＡ分子」と称することがある）形成工程、（ｉｉ）ベイト（被検物質）に対する相互作用分子の選抜工程、（ｉｉｉ）選択されたＩＶＶ分子からなるタンパク質−逆転写核酸連結体再作製工程、（ｉｖ）シークエンス解析による選択されたＩＶＶ分子の同定工程の４つの工程からなる。
図１１は、ＦＫ５０６をベイトとしたＩＶＶスクリーニングにより得られたＩＶＶｃＤＮＡライブラリーをウレア変性ＰＡＧＥにて泳動し、スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した結果を示す図である。ラウンド７および８で単一のバンドが確認された。
図１２は、ＦＫ５０６をベイトとしたＩＶＶスクリーニングの各ラウンドにおけるＦＫＢＰ１２を含むＩＶＶ分子数を示すグラフである。図中、四角のグラフはＦＫＢＰを含むＩＶＶ分子数を示し、三角はｂ−Ａｃｔｉｎを含むものを示す。ラウンドが重なるごとに、ＦＫＢＰ１２を含むＩＶＶ分子数が増加しており、本実施例のスクリーニングにより、ＦＫ５０６と相互作用するタンパク質を含むＩＶＶ分子が濃縮されていることが確認された。
図１３は、ＩＶＶ調製用翻訳鋳型分子のＤＮＡ２本鎖化を行った反応液を変性、および非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、Ｔ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡのフルオレセインに由来する蛍光およびＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ染色で検出した結果を示す図である。図中、レーン１は、ＦＫＢＰ１２のｍＲＮＡ、レーン２はｍＲＮＡとＴ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡの結合体、レーン３はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体、レーン４はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体をＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＨで処理したもの、レーン５から７は２本鎖ＤＮＡ化したＰＣＲ反応液であり、レーン５は変性を７２℃で行ない、プライマー濃度が鋳型の５等量のもの、レーン６は変性を７２℃で行い、プライマー濃度が鋳型の１．２５等量のもの、またレーン７は変性を８４℃で行ない、プライマー濃度が鋳型の１．２５等量であるものを示す。ｍＲＮＡ−Ｔ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡの連結物のｍＲＮＡ部が２本鎖ＤＮＡとなっていることが確認された。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を実施するための最良の形態について詳細に説明する。
（１）核酸構築物およびその製造方法
本発明の「核酸構築物」は、少なくともその一部がアニーリングしている第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸が、各々第３の１本鎖核酸と連結している構造を有する核酸構築物であり、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するヌクレオチドがリンカーを介して化学結合しており、第２の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々異なる末端側のヌクレオチドが化学結合しているものである。
ここで、同じ末端側とは、例えば第１の１本鎖核酸の３’末端側のヌクレオチドと結合するのは、第３の１本鎖核酸の３’末端側に存在するいずれかのヌクレオチドであることを意味する。具体的には、第１の１本鎖核酸の３’末端側に存在するヌクレオチドと第３の１本鎖核酸の３’末端側に存在するヌクレオチドがリンカーを介して化学結合する場合、又は第１の１本鎖核酸の５’末端側に存在するヌクレオチドと第３の１本鎖核酸の５’末端側に存在するヌクレオチドがリンカーを介して化学結合する場合の２通りが考えられる。
第１の１本鎖核酸、第２の１本鎖核酸、及び第３の１本鎖核酸の種類は本発明の核酸構築物を構成し得る限り特に制限されず、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。また、これらの１本鎖核酸は、それを構成するヌクレオチドが修飾を受けていてもよく、さらにヌクレオチド以外の物質、例えばペプチド、糖、ポリエチレングリコール等の高分子化合物等を含んでいてもよい。ヌクレオチドの修飾は、例えば、標識物質等によるものが挙げられる。標識物質としては、蛍光物質等が挙げられる。蛍光物質は、具体的には、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８等が挙げられる。これらの標識物質は、それ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手できる。
本発明で用いられるＤＮＡ鎖は、天然由来のＤＮＡから作製した１本鎖ＤＮＡでもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した１本鎖ＤＮＡでもよいし、化学合成により作製した１本鎖ＤＮＡでもよい。また、本発明で用いるＲＮＡの種類も特に限定されず、天然の組織又は細胞由来のＲＮＡでも、ＤＮＡからインビトロで発現させたＲＮＡでもよい。
第１の１本鎖核酸、第２の１本鎖核酸、及び第３の１本鎖核酸の長さは本発明の核酸構築物を構成し得る限り特に制限はない。一般的には、いずれの１本鎖核酸も、各数十塩基から数十キロ塩基程度であり、例えば、１０塩基から５０，０００塩基程度であり、より好ましくは１２塩基から１０，０００塩基程度である。また、第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸はその一部がアニーリングしているが、アニーリングする位置は、本発明の核酸構築物が形成され得る場所であれば特に制限はない。具体的には、第２の１本鎖核酸の、第３の１本鎖核酸とリガーゼ処理により酵素結合する末端付近で第１の１本鎖核酸第２の１本鎖核酸とがアニーリングしていることが好ましい。アニーリングにより２本鎖となっている長さは特に限定されないが、具体的には１２塩基対から５０塩基対程度が好ましい。
第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の連結は、リンカーを介して行う。リンカーとは、第１の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドと第３の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドであって、第１の１本鎖核酸と同じ末端側に存在するヌクレオチドを連結し得るものであれば如何なるものでもよい。例えば、架橋剤が好ましく用いられ、この場合、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドの末端に、上記架橋剤により認識される官能基を付加することによれば、該官能基と架橋剤を化学結合することにより、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸の各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドを結合することができる。さらに、上記官能基を末端に有する化合物を第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸各々同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドの末端に結合させることにより該官能基を付加する方法が好ましく用いられる。
また、リンカーを介して第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸を結合する方法としては、ホスホアミダイド法によりそれらをリンカーを介してＤＮＡ合成機により連結する方法なども用いられる。この場合、リンカーは、ヌクレオチドのみで形成されるループ構造により立体的に小さなものが好ましく、炭素数２〜１８のメチレン鎖あるいは主鎖の原子数が８〜１２０のポリオキシエチレングリコールを含む構造、およびそれらがリン酸化ジエステル結合で２〜４０ユニット連結したものなどが好ましく用いられる。これらの市販品としては、スペーサーホスホアミダイドＣ３（グレンリサーチ社製）、スペーサーホスホアミダイド９（グレンリサーチ社製）、スペーサーホスホアミダイド１８（グレンリサーチ社製）等が挙げられる。
上記で、架橋剤により認識される官能基を導入するヌクレオチドとしては、例えばＤＮＡの場合、ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴのいずれでもよいが、ｄＴが、官能基の導入を行う上で簡便であるので好ましい。官能基を導入するヌクレオチドの各１本鎖核酸中の位置は、上記した連結が可能であれば特に制限はないが、連結する末端から０〜５０塩基内側のヌクレオチドが好ましく、１〜１０塩基内側のヌクレオチドがさらに好ましい。官能基を末端に有する化合物としては、架橋剤との反応が可能であれば特に制限はないが、該化合物が末端に有する官能基が、第１の１本鎖核酸および第２の１本鎖核酸の他の構成要素に含まれる官能基より、架橋剤と反応しやすくする構造を有することが好ましい。例えば、アミノ基やチオール基などの官能基が炭素数２から１８のメチレン鎖、あるい主鎖の原子数が８から１２０のポリオキシエチレングリコールを介してヌクレオチドの塩基部分やデオキシリボースあるいはリン酸ジエステル部分に連結している構造が挙げられる。
これらの構造は、それ自体既知の市販されている試薬を用いて化学反応させることにより構築することができる。市販品としては、例えば、５’−チオール修飾Ｃ６（グレンリサーチ社製）、５’アミノ修飾Ｃ６（グレンリサーチ社製）、５’アミノ修飾Ｃ１２（グレンリサーチ社製）、５’アミノ修飾５（グレンリサーチ社製）、アミノ修飾Ｃ２ｄＴ（グレンリサーチ社製）、アミノ修飾Ｃ６ｄＴ（グレンリサーチ社製）等が挙げられる。このうち、アミノ基を有する化合物をＮ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｎａｔｅ（同人化学社製）等でチオール基に変換して用いることもできる。また、該化合物中の官能基は目的の反応を行うまで保護基により保護されていることが要求される場合があり、その場合に用いられる保護基としては、官能基がチオール基の場合は、トリチル基、アセトアミドメチル基、ｔ−ブチル基等が挙げられ、アミノ基の場合にはｔ−ブトキシカルボニル基や特願２００３−０４２４２８号明細書に記載のＮα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニル）フェニルアラニル基などのアミノ酸誘導体等が挙げられる。中性付近の水溶液中、３７度以下の穏やかな条件でプロテアーゼやペプチダーゼで遊離されるアミノ酸誘導体はヌクレオチドに導入されるアミノ基の保護基として特に優れている。
ここで、架橋剤により認識される官能基が、架橋すべき部位以外に、第１の１本鎖核酸または第２の１本鎖核酸に存在する場合には、その官能基を上記の保護基を用いて保護しておき、架橋すべき部位の官能基のみが選択的に反応するようにしておくことが好ましい。具体的には、例えば、架橋すべき部位に導入した官能基以外に第１又は第２の１本鎖核酸に存在する同じ官能基を上記保護基で保護して、架橋すべき部位に導入した官能基は保護しないで、架橋反応を行うか、または、架橋すべき部位に導入した官能基と、架橋すべき部位に導入した官能基以外に第１又は第２の１本鎖核酸に存在する同じ官能基を異なる保護基で保護した後、架橋すべき部位に導入した官能基のみを脱保護して架橋反応を行う方法などが挙げられる。
このような官能基を末端に有する化合物の合成方法は、それ自体既知の通常用いられる方法が用いられ、また上記のような市販の化合物（試薬）を用いることもできる。上記化合物を、第１の１本鎖核酸または第２の１本鎖核酸を構成するいずれかのヌクレオチドに結合する方法としては、官能基をその保護基とともに導入したヌクレオシド誘導体あるいはアルコール誘導体の水酸基をホスホアミダイトに変換し、それをＤＮＡ合成機上で連結する方法等が挙げられる。また、上記した保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。
架橋剤としては、ヘテロ２価性、ホモ２価性試薬の何れでもよい。具体的には、例えば、アミノ基とチオール基を架橋するヘテロ２価性試薬としては、Ｎ−（４−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＧＭＣＳ：同人化学社製等）、Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＥＭＣＳ：同人化学社製等）、Ｎ−（８−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＨＭＣＳ：同人化学社製等）、Ｎ−（１１−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｕｎｄｅｃａｎｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＫＭＣＳ：同人化学社製等）、Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＩＡ：ＰＩＥＲＣＥ社製等）、Ｎ−（ｐ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｈｅｎｙｌ）ｉｓｏｃｙａｎａｔｅ（ＰＭＰＩ：ＰＩＥＲＣＥ社製等）等が好ましく用いられる。これらの架橋剤を用いる場合、アミノ基とチオール基を認識して架橋するため、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸のいずれかの末端付近に存在するヌクレオチドにアミノ基を導入し、もう一方の１本鎖核酸の同じ末端側に存在するいずれかのヌクレオチドにチオール基を導入して両者を結合させる。
アミノ基どうしを架橋するホモ２価性試薬としては、４，４’−Ｄｉｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎｏ−２，２’−ｓｔｉｌｂｅｎｅｄｉｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ，ｄｉｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ（ＤＩＤＳ：同人化学社製等）、Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ（ＤＳＧ：ＰＩＥＲＣＥ社製等）、Ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ（ＤＳＳ：ＰＩＥＲＣＥ社製等）、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ−０，０’−ｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｓｕｃｃｉｎａｔｅ）（ＥＧＳ：同人化学社製等）等が挙げられる。また、チオール基どうしを架橋するホモ２価性試薬としては、１，４−Ｂｉｓ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｕｔａｎｅ（ＢＭＢ：ＰＩＥＲＣＥ社製等）、１，４−Ｂｉｓ−Ｍａｌｅｉｍｉｄｙｌ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔａｎｅ（ＢＭＤＢ：ＰＩＥＲＣＥ社製）等が挙げられる。
上記の官能基、又は上記の官能基を末端に有する化合物が結合している第１の１本鎖核酸および第３の１本鎖核酸を上記架橋剤を介して結合させる方法としては、それ自体既知の通常用いられる方法で、架橋剤や１本鎖核酸の種類等によって適宜選択して行うことができる。例えば、架橋剤としてＥＭＣＳを用いる場合を例に、以下に詳細に説明する。また、その結合の模式図を図１に示す。まず、第１の１本鎖核酸として、チオール基を導入したものを用いる場合で、該チオール基が、トリチル基等によって保護されている場合、該保護基を外す反応を行う。まず、該１本鎖核酸を適当な緩衝液、例えば、０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン水溶液に溶解し、これに最終濃度６ｍＭとなるように硝酸銀水溶液を添加し、さらに適当時間攪拌した後、最終濃度１２ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加してさらに適当時間攪拌する。この反応溶液から不溶物を遠心濾過フィルターによって濾去した後、逆相高速液体クロマトグラフィ等でトリチル基が外れ、チオール基が反応可能な第１の１本鎖核酸を分離取得する。次に、第３の１本鎖核酸としてアミノ基を導入したものを用いて、これを適当な緩衝液、例えば０．１Ｍリン酸水素２ナトリウム水溶液に溶解する。この溶液に、第３の１本鎖核酸に対して１０等量以上となるようにＥＭＣＳを２０ｍＭ  ＤＭＦ溶液に溶解したものを添加して一定時間攪拌する。この反応液から逆相高速液体クロマトグラフィ等でＥＭＣＳと結合した第３の１本鎖核酸を分離取得する。この連結物を上記で保護基を外した第１の１本鎖核酸と混合し、該混合溶液を必要であれば濃縮して、さらに必要であれば遠心エバポレーター等でほぼ乾固するまで濃縮し、これを適当な緩衝液、例えば、２５％のジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）に再溶解した後に、逆相高速液体クロマトグラフィー等で分離して、第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸がＥＭＣＳを介して結合した分子を分離取得することができる。
この第１の１本鎖核酸と第３の１本鎖核酸のリンカーを介した結合工程の前後のいずれかで、第１の１本鎖核酸部分に第２の１本鎖核酸をアニーリングさせる。アニーリングの方法は、それ自体既知の通常用いられる方法でよいが、例えば、上記連結物と第２の１本鎖核酸をモル比で１：１．２〜１：３となるように混合して、該混合溶液を７２℃で１〜３分加熱した後に、これを１５〜２５℃まで３分以上かけて冷却する方法等が挙げられる。この時の緩衝液としては、生化学上用いられ得るものであれば特に制限はないが、例えば、この後行うリガーゼ処理のための緩衝液を用いると緩衝液の交換が必要なく便利である。
上記の工程で得られた第１の核酸と第３の核酸がリンカーを介して結合しており、さらに第１の核酸に第２の核酸がアニーリングした連結物について、次に、第３の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸をリガーゼ処理により酵素結合する。このとき、第３の１本鎖核酸は、第１の１本鎖核酸と上記のようにリンカーを介して結合しており、第２の１本鎖核酸は第１の１本鎖核酸とアニーリングすることにより結合しているため、第２の１本鎖核酸のいずれかの末端に存在するヌクレオチドと、第３の１本鎖核酸のそれと反対側の末端のヌクレオチドが、溶液中で互いに接近して存在しており、リガーゼ処理により効率よく結合される。リガーゼ処理による結合に有利な末端どうしの距離は、例えば、リンカーの長さやリンカーが結合するヌクレオチドの位置により適宜調整することができる。リガーゼは、１本鎖核酸どうしを結合し得るものであればいずれのものでもよいが、具体的には、ＲＮＡリガーゼ等が挙げられ、好ましくはＴ４ＲＮＡリガーゼが用いられる。
リガーゼ処理の条件は、使用する酵素の活性が発揮される条件であればよく、例えば、好適な緩衝液（例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼバッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＡＴＰ）中で、１５〜２５℃の温度で一定時間反応させたり、あるいは２５℃で３０分間と４５℃で２分間のサイクルを反復した後に２５℃で３０分間反応させたりすることができる。ここに示した温度及び反応時間は一例に過ぎず、反応効率が高くなるように適宜選択して変更することができる。
上記リガーゼ反応後、該反応液をフェノール抽出及びエタノール沈殿等の定法により反応生成物を精製することにより、本発明の核酸構築物を取得することができる。このようにして得られる核酸構築物自体も本発明の範囲内である。
（２）タンパク質−核酸連結体の鋳型としての核酸構築物およびその製造法
本発明の核酸構築物は、ＷＯ９８／１６６３６号公報に記載のタンパク質−核酸連結体（以下、これを「タンパク質−核酸連結体」、または「ＩＶＶ分子」と称することがある）の鋳型として特に好ましく用いられる。タンパク質−核酸連結体とは、タンパク質とそれをコードするＲＮＡがピューロマイシン等の核酸誘導体を介して結合した分子であり、タンパク質の相互作用解析等の強力なツールとなり得る分子である。
本発明の核酸構築物をタンパク質−核酸連結体の鋳型として製造する場合には、基本的には（１）に記載の核酸構築物と同様の構造であるが、特にタンパク質−核酸連結体の鋳型として好ましい構造を以下に説明する。
第２の１本鎖核酸または第１の１本鎖核酸のいずれか一方は、タンパク質の発現制御配列およびコーディング配列を有するＲＮＡ（以下、これを「ｍＲＮＡ鎖」と称することがある）で、これとアニーリングする他方の１本鎖核酸が核酸誘導体を末端に有するスペーサーが枝分かれした状態で結合している核酸（以下、これを「スペーサー鎖」と称することがある）であることが好ましい。また、第３の１本鎖核酸は、ＤＮＡ及びその誘導体であることが好ましく、作製された核酸構築物を翻訳してタンパク質−核酸連結体を製造した場合、翻訳反応液中から該分子のみを精製すること、該分子をラベルすること、及び該分子を固相（支持体）に結合させること等を目的として親和性物質や蛍光物質等の標識物質等を有することが好ましい（以下、これを「標識鎖」と称することがある）。
ここで、ｍＲＮＡ鎖のタンパク質の発現制御配列とは、（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識される配列が挙げられる。プロモーター配列の種類は、適用する発現系に適したものを適宜選択すればよく特に限定されない。例えば、大腸菌ウイルスＴ７のＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＴ７プロモーター配列、ＳＰ６プロモーター配列などが挙げられる。翻訳の際にリボソームによって認識される配列としては、翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＲＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）に対応するＤＮＡ配列や原核細胞のリボソームによって認識されるシャイン・ダルガノ配列（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）、５’キャップ構造（Ｓｈａｔｋｉｎ，Ｃｅｌｌ，９，６４５−（１９７６））、オメガ配列等のｔａｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓのリボソームによって認識される配列、ＷＯ０３／５６００９号公報に記載の配列、ｒａｂｂｉｔβ−ｇｌｏｂｌｉｎ、Ｘｅｎｏｐｕｓβ−ｇｌｏｂｌｉｎ  あるいはｂｒｏｍｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓのリボゾーム認識領域などが挙げられる。
コーディング配列とは、タンパク質−核酸連結体を作製する目的タンパク質をコードする配列であり、この種類は特に限定されず、目的に応じて適宜選択できる。また、コーディング配列としては、目的タンパク質に融合するようにＦＬＡＧ、Ｈｉｓタグなどをコードする配列を含んだり、さらにはポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）のプライマーがハイブリダイズするための共通配列などを含むこともできる。
スペーサー鎖は、核酸誘導体を末端に有するスペーサーが、枝分かれした状態で結合している１本鎖核酸であるが、これを使用して無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳を行った場合、ｍＲＮＡの末端付近まで翻訳が進んだ後、核酸誘導体（例えば、ピューロマイシンなど）がリボソームのＡサイトに入ることによりタンパク質と結合させることができる。また、そのｍＲＮＡと２本鎖を形成している核酸部分は、最終的に本発明の核酸構築物として構築され、翻訳され、タンパク質−核酸連結体となった時に、ｍＲＮＡ鎖を逆転写するプライマーとしても機能する。
核酸誘導体としては、無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞中でタンパク質の翻訳が行われた時に、合成されたタンパク質のＣ末端に結合する能力を有する化合物である限り限定されないが、その３’末端がアミノアシルｔＲＮＡに化学構造骨格が類似しているものを選択することができる。代表的な化合物として、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）と３’−Ｎ−アミノアシルピューロマイシンアミノヌクレオシド（３’−Ｎ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌｐｕｒｏｍｙｃｉｎ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ、ＰＡＮＳ−アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＰＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＰＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＰＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全ての各アミノ酸に対応するＰＡＮＳ−アミノ酸化合物が挙げられる。
また、３’−アミノアデノシンのアミノ基とアミノ酸のカルボキシル基が脱水縮合して連結した３’−Ｎ−アミノアシルアデノシンアミノヌクレオシド（３’−Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ａｍｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ，ＡＡＮＳ−アミノ酸）、すなわち、アミノ酸部がグリシンのＡＡＮＳ−Ｇｌｙ、アミノ酸部がバリンのＡＡＮＳ−Ｖａｌ、アミノ酸部がアラニンのＡＡＮＳ−Ａｌａ、その他、アミノ酸部が全アミノ酸の各アミノ酸に対応するＡＡＮＳ−アミノ酸化合物を使用できる。また、核酸あるいは核酸とアミノ酸のエステル結合したものなども使用できる。さらにまた、核酸あるいは核酸に類似した化学構造骨格及び塩基を有する物質と、アミノ酸に類似した化学構造骨格を有する物質とを化学的に結合した化合物は、すべて本発明で用いられる核酸誘導体に含まれる。核酸誘導体としては、ピューロマイシン、ＰＡＮＳ−アミノ酸もしくはＡＡＮＳ−アミノ酸がリン酸基を介してヌクレオシドと結合している化合物がより好ましい。これらの化合物の中でピューロマイシン、リボシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルピューロマイシン、デオキシシチジルデオキシシチジルピューロマイシン、デオキシウリジルピューロマイシンなどのピューロマイシン誘導体が特に好ましい。
上記したような核酸誘導体は、それ自体既知の化学結合方法によって製造することができる。具体的には、リン酸ジエステル結合で合成ユニットを結合させる場合は、ＤＮＡ合成機に一般的に用いられているホスホアミダイド法などにより固相合成で合成することが可能である。ペプチド結合を導入する場合は、活性エステル法などにより合成ユニットを結合させるが、ＤＮＡとの複合体を合成する場合は、両方の合成法に対応が可能な保護基が必要になる。
また、（１）に記載したとおり核酸誘導体を含むスペーサー鎖は、架橋反応により他の１本鎖核酸と連結させる。この架橋反応に用いられる架橋剤が認識する官能基が核酸誘導体に含まれる場合には、これを適当な保護基により保護することが好ましい。具体的に、例えば核酸誘導体にピューロマイシンが含まれる場合は、そのαアミノ基をＮα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）基などで保護しておくことが好ましい。
上記した保護基の導入法及び脱保護法は当業者に公知であり、例えば、Ｔｅｏｄｏｒａ，Ｗ．Ｇｒｅｅｎ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  ＆  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９８１）などに記載されている。ピューロマイシンのαアミノ基をＮα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）基で保護したものの製造方法としては、まず、ピューロマイシン２塩酸塩を適当な溶媒（例えば、水）に溶解した後、ジメトキシエタン（ＤＭＥ）と１０％炭酸ナトリウム水溶液を加える。この溶液にベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）で保護されたフェニルアラニル−ＯＳｕをＤＭＥに溶かした溶液を加え、さらに１０％炭酸ナトリウム水溶液を加えて反応させる。得られたＮα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）ピューロマイシンは、常法により固相担体に結合させ、ＤＮＡ合成機などで使用することができる。Ｎα−（Ｎα−ベンジルオキシカルボニルフェニルアラニル）基の脱保護は核酸誘導体をリン酸緩衝液に溶解し、キモトリプシンで酵素消化することで行われる。
上記核酸誘導体はスペーサーを介してスペーサー鎖の核酸部分に結合している。スペーサーとしては、ポリエチレン又はポリエチレングリコールあるいはその誘導体などの高分子物質や、オリゴヌクレオチドやペプチドあるいはその誘導体などの生体高分子物質等が用いられ、好ましくはポリエチレングリコールが用いられる。スペーサーの長さは特に限定されないが、好ましくは、分子量１５０〜６０００であるか、または主鎖の原子数は１０原子から４００原子であり、さらに好ましくは、分子量６００〜３０００であるか、または主鎖の原子数が４０原子から２００原子である。スペーサーが結合するヌクレオチドは、スペーサー鎖の核酸部分の何れでもよいが、スペーサー鎖の３’末端から０〜２０塩基内側のヌクレオチドが好ましく、０〜８塩基内側の末端がさらに好ましい。スペーサー鎖のスペーサーとヌクレオチドの結合は、（１）に記載のリンカーを介した結合が好ましく用いられる。
スペーサー鎖の核酸部分は、ｍＲＮＡの３’末端とアニーリングする塩基配列を有する１２〜５０塩基程度のものが好ましい。スペーサー鎖の核酸部分がＤＮＡであると、ｍＲＮＡ鎖とアニーリングさせて２本鎖とした後これを翻訳反応に供する際、ＲＮａｓｅＨの分解を受けやすいため、ＤＮＡとＲＮＡ誘導体のキメラ鎖であることが好ましい。ＲＮＡ誘導体は、具体的には、２’−ＯＭｅＲＮＡや２‘−Ｆ  ＲＮＡが好ましく用いられる。ただしこの場合キメラ鎖が逆転写酵素の基質として認識される必要があり、特に逆転写反応の開始点となる３’末端部分はＤＮＡであることが逆転写効率上好ましく、そのＤＮＡ鎖は１〜６塩基程度が好ましい。スペーサー鎖と相補性を有するｍＲＮＡの３’末端の配列は、コーディング配列の３’末端側にアニーリングのための配列として付加した共通配列を用いることが好ましい。スペーサー鎖の好ましい配列として、例えば実施例１のオリゴ２に記載のもの等が挙げられる。スペーサー鎖の核酸部分のうち、（１）に記載のリンカーの一部となる架橋剤に認識される官能基を末端に有する化合物が結合するヌクレオチドは、５’末端のヌクレオチドであることが好ましい。
標識鎖の長さは適宜選択することができ、一般的には１塩基から数百塩基であり、好ましくは１〜１００塩基程度である。標識鎖が有する標識物質としては、親和性物質、共有結合性物質、蛍光物質、分解性物質等が挙げられる。親和性物質としては、ポリＡ配列、ポリＴ配列、ビオチン、ＦＬＡＧ等の各種抗原又は抗体、Ｈｉｓタグ、ＮＴＡ等の配位子、受容体リガンド等が挙げられる。また、共有結合性物質としては、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド等の核酸末端部分、ヒドラジド、ケトン、チオエステル等の官能基、ソラレン等の架橋性物質が挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセイン、オレゴングリーン、ローダミン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ａｌｅｘａ４８８等が挙げられる。分解性物質としては、光反応で分解する１−（２−ニトロフェニル）−エチル基を有する誘導体や、プロテアーゼやペプチダーゼに認識されるアミノ酸配列等が挙げられる。これらの標識物質は、それ自体既知の通常用いられるものであり、容易に入手可能であり、また常法により核酸等に結合して標識することができる。
標識鎖の核酸部分には、（１）に記載のリンカーの一部となる架橋剤に認識される官能基を末端に有する化合物が結合しているが、その位置は、標識鎖のリガーゼ処理によって連結させる末端から０〜１０塩基、好ましくは１〜１０塩基内側に存在するいずれかのヌクレオチドであることが好ましい。標識物質が結合する位置は、標識鎖の核酸部分のうちリガーゼ処理によって連結させる末端と逆側の末端が好ましい。また、該標識物質は、ヌクレオチドに上記したようなスペーサーを介して結合していてもよい。
ｍＲＮＡ鎖、スペーサー鎖、及び標識鎖の連結は、（１）に記載の方法により行うことができる。  かくして構築された本発明の核酸構築物をタンパク質翻訳系に導入することによりタンパク質−核酸連結体を製造することができる。核酸からそれがコードするタンパク質を人工的に生成させるための翻訳系は当業者に公知である。具体的には、適当な細胞よりタンパク質合成能を有する成分を抽出し、その抽出液を用いて目的のタンパク質を合成させる無細胞タンパク質合成系が挙げられる。このような無細胞タンパク質合成系には、リボゾーム、開始因子、伸長因子及びｔＲＮＡ等の翻訳に必要な要素が含まれている。このような無細胞タンパク質合成系としては、例えば、真核生物の無細胞タンパク質合成系が用いられ、より具体的には、ウサギ網状赤血球抽出液やコムギ胚芽抽出液などが挙げられるが、これらに限られるものではない。無細胞タンパク質合成系は、キットとして市販されているものを使用することができる。例えば、ウサギ網状赤血球抽出液のキットとしては、Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔｒｅａｔｅｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等が用いられ、またコムギ胚芽抽出液としては、ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。タンパク質翻訳系としては、生細胞を使用してもよく、具体的には、原核又は真核生物、例えば大腸菌の細胞等を用いることができる。無細胞タンパク質翻訳系又は生細胞などは、その中にタンパク質をコードする核酸を添加するか又は導入することによってタンパク質合成が行われるものである限り特に制限はない。本発明の核酸構築物を無細胞タンパク質合成系に導入する直前に、６０〜９０℃で加熱した後急冷する工程を行うと、タンパク質−核酸連結体の合成効率が高くなるため好ましい。
上記翻訳反応液から、タンパク質−核酸連結体を精製する場合、標識鎖に親和性物質あるいは共有結合物質が結合している場合には、該親和性物質あるいは共有結合物質を介して精製を行うことができる。精製の方法は、用いる親和性物質および共有結合物質に応じて適宜選択してそれ自体既知の定法を用いることができる。このようにして製造したタンパク質−核酸連結体も本発明に含まれるものである。
本発明は、さらに所望のタンパク質−核酸連結体をタンパク質の機能を指標として選択することを特徴とするタンパク質、該タンパク質のコーディング配列、該コーディング配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡの選択方法も含まれる。
この選択方法は、タンパク質−核酸連結体（ＩＶＶ分子）中のタンパク質が有する機能（生物活性）を用いて所望の機能を有するタンパク質をＩＶＶ分子として選択することを意味する。即ち、製造されたＩＶＶ分子と相互作用をし得る被験物質、例えばタンパク質、ペプチド、核酸、糖質、脂質、低分子化合物等との相互作用の有無や強弱に基づいて、ＩＶＶ分子を選択することができる。このような相互作用の解析方法としては、例えばＷＯ９８／１６６３６号公報に記載の方法を用いることができる。
また、本発明のタンパク質−核酸連結体および被験物質は、固相（支持体）に結合させて用いることもできる。タンパク質−核酸連結体の固相への結合は、上記標識鎖に親和性物質や共有結合性物質が結合している場合には、これらを用いて行うことができる。具体的には、親和性物質又は共有結合性物質が親和性を有するまたは結合する物質を予め固定化した固相に、上記タンパク質−核酸連結体を接触させることにより、当該タンパク質−核酸連結体を固相に容易に固定化することができる。固相への被験物質の結合は、例えば、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．＆  Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｐ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，４０４−４０６；Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｌ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９０２２−９０２６等に記載されている方法等により行うことができる。
固相（支持体）としては、通常の核酸、タンパク質、糖質、脂質、低分子化合物等の固定化に用いることができる支持体であれば特に限定されない。支持体としては、親和性物質や共有結合性物質どうしの結合形成、あるいは上記被験物質の結合に悪影響を及ぼさないものであればその形状は特に限定されず、例えば、平板、マイクロウェル、ビーズ等の任意の形態をとることができる。支持体の材質としては、例えば、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ビスフェノールＡのポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート等のポリマー類、シリコン、活性炭、多孔質ガラス、多孔質セラミックス、多孔質シリコン、多孔質活性炭、織編物、不織布、濾紙、短繊維、メンブランフィルター等の多孔質物質を挙げることができる。
上記選択方法に付するＩＶＶ分子は、上記タンパク質−核酸連結体でもよいし、ｍＲＮＡ鎖をＤＮＡに逆転写したタンパク質−逆転写核酸連結体でもよい。即ち、ＲＮＡ部分を含む核酸を逆転写酵素で処理することにより、ＲＮＡからＤＮＡへの逆転写が起こり、ＲＮＡ部分の塩基配列をＤＮＡに転換することができる。逆転写反応に必要な試薬及び反応条件は当業者に周知であり、必要に応じて適宜選択することができる。さらに得られたＤＮＡ−ＲＮＡ−タンパク質連結体のＲＮＡをＲＮＡ分解酵素などを用いて分解し、ＤＮＡを鋳型にポリメラーゼ反応をすることにより２本鎖ＤＮＡ−タンパク質連結体を作製して用いることもできる。本明細書では、上記ＲＮＡ−ＤＮＡ−タンパク質連結体および２本鎖ＤＮＡ−タンパク質連結体を合わせてタンパク質−逆転写核酸連結体と言う。このような、タンパク質−逆転写核酸連結体を用いれば、核酸部分の安定性がよいこと、また１本鎖ＲＮＡの非特異的吸着がないため好ましい。本明細書では、上記タンパク質−核酸連結体とタンパク質−逆転写核酸連結体を、単に「タンパク質−核酸連結体」と称することがある。
上記選択方法で選択されたＩＶＶ分子は、これを再度被験物質との相互作用に基づいて選択することにより、該相互作用がより適当なタンパク質を選択および取得することができる。一度選択されたＩＶＶ分子を、再度被験物質と接触させるためには、（ｉ）選択されたＩＶＶ分子の１本鎖ＲＮＡ部分を必要に応じて分解する等した後に、これをＰＣＲなどで増幅し（増幅工程）、（ｉｉ）増幅されたＤＮＡ鎖をもとにｍＲＮＡ鎖を製造し、さらに上記の核酸構築物を製造してＩＶＶ分子を製造し（構築工程）、（ｉｉｉ）選択方法を行うことにより可能となる。これら（ｉ）増幅工程、（ｉｉ）構築工程、（ｉｉｉ）選択工程を必要に応じて繰り返すことにより、被験物質との相互作用がより適当なタンパク質を選択および取得することができる。
（ｉ）増幅工程は、ＰＣＲを用いて例えば以下のように行うことも好ましい。ＩＶＶ分子の核酸中、増幅するのは少なくともタンパク質をコーディングする部分（以下、これを「ＯＲＦ」と称することがある）を含む領域である。このように増幅されたＤＮＡについて、塩基配列をそれ自体既知の定法により解析することにより、上記選択方法で選択されたタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡも選択することができる。該領域を増幅するのに用いられるＰＣＲプライマーとしては、特に制限はないが、全てのＩＶＶ分子に共通に用いられる配列として、５’側のプライマーは、ＯＲＦの５’上流側に連結されている配列が好ましく用いられる。具体的には、上記したタンパク質−核酸連結体の場合、５’側のプライマーは、翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列などが好ましく用いられ、３’側のプライマーは、タグ配列や共通配列が好ましく用いられる。かくして増幅されて得られたＤＮＡは、ＯＲＦのみを含むものであるので、上記に記載の（１）プロモーター配列、（２）翻訳の際にリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（以下、これらを「５’付加配列」と称することがある）。タグ配列、共通配列等（以下、これらを「３’付加配列」と称することがある）を結合する。これらの配列の結合は、ＤＮＡリガーゼ、下述するオーバーラップエクステンション法、ＰＣＲ法を用いて行うことができる。ＰＣＲのプライマーとしては、増幅されたＤＮＡの５’末端と共通の配列を３’末端に有する５’末端付加配列からなるものと、増幅されたＤＮＡの３’末端と共通の配列を５’末端に有する３’付加配列からなるものが用いられる。
オーバーラップエクステンション法による結合方法は、まず増幅されたＤＮＡの５’末端と共通の配列を３’末端に有する５’付加配列を等モル数程度用意し、これをアニーリングさせた後に、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いて２本鎖ＤＮＡに合成し、さらに増幅されたＤＮＡの３’末端と共通の配列を５’末端に有する３’付加配列を等モル数程度用意し、これをアニーリングさせた後に、ＤＮＡポリメラーゼなどを用いて２本鎖ＤＮＡを合成する方法である。上記５’側付加配列および３’付加配列の結合は、片方ずつ行っても、両方同時に行ってもよい。かくして合成された２本鎖ＤＮＡは、これを両末端の塩基配列を有するプライマーなどを用いてさらにＰＣＲで増幅してもよい。
上記（ｉ）の増幅工程で得られたＤＮＡに（ｉｖ）変異を導入（変異導入工程）し、さらにこれを上記の方法で増幅し、（ｉｉ）構築工程、（ｉｉｉ）選択工程を行うことにより、タンパク質の機能（生物活性）の改変および新たな機能の創製が可能となる。これら（ｉ）〜（ｉｖ）の工程は必要に応じ繰り返すこともできる。変異導入工程は、ＩＶＶ分子の核酸部がＲＮＡの場合には、上記した方法によりＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した後に変異の導入を行えばよく、核酸部の増幅は変異導入しながら行ってもよい。
変異導入はすでに確立しているＥｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ，Ｄ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１，１１−１５）やＳｅｘｕａｌ  ＰＣＲＳｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．Ｃ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，１０７７−１０７５１）を用いて容易に行うことができる。また、変異導入ライブラリーの作製方法としては、変異を導入したい配列をランダムＤＮＡ合成法などにより作製し、オーバーラップエクステンション法により、共通配列などと連結する方法もある。
なお、本明細書における、上記した核酸の単離、調製、核酸の連結、核酸の合成、ＰＣＲ、プラスミドの構築、無細胞系の遺伝子操作技術は、市販のキットなどを用いた場合にはその取扱説明書に準じ、それ以外で特に明記しない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｍｇ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載の方法またはそれに準じた方法により行うことができる。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、下記の実施例は本発明を単に例示するものに過ぎず、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものではない。本発明の精神から離れることなく、いかなる変更、改良または改変を加えることができることは当業者には自明である。
［実施例１］  スペーサー鎖と標識鎖の連結
先ず、スペーサー鎖の合成工程を図２に模式的に示す。スペーサー鎖および標識鎖の原料として以下のような修飾オリゴヌクレオチドをＤＮＡ合成機で合成した。配列の中の（ｔｈｉｏｌ）は５’−Ｔｈｉｏｌ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６、（Ｓｐｃ）はＳｐａｃｅｒ１８、（Ｆｔ）はＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ−ｄＴ、（Ｐｕｒｏ）はＰｕｒｏｍｙｃｉｎ  ＣＰＧ、（Ａｔ）はＡｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ６  ｄＴ、Ｕ’は２’−ＯＭｅ−Ｕ、Ｃ’は２’−ＯＭｅ−Ｃ、Ｇ’は２’−ＯＭｅ−Ｇ、ｐ−はＣｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（以上すべてグレンリサーチ）をそれぞれ示す。オリゴ１、オリゴ２、オリゴ４、オリゴ５は５’末端チオールの保護基であるトリチル基を残した状態で準備した。
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オリゴ１（１２．５ｎｍｏｌ；図２）を０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン水溶液４５μｌに溶かした溶液に０．２Ｍ硝酸銀水溶液を１．８μｌ加えて３０分撹拌し、さらに０．２Ｍジチオスレイトール水溶液を３．６μｌ加えて３０分撹拌した。不溶物を濾去したのち逆相高速液体クロマトグラフィ（逆相ＨＰＬＣ）でトリチル基が外れたオリゴ１のフラクション溶液を得た。オリゴ２（１２．５ｎｍｏｌ；図２）を０．１Ｍリン酸水素２ナトリウム水溶液１５μｌに溶かした溶液にＥＭＣＳ（架橋剤；同仁化学）の２０ｍＭ  ＤＭＦ溶液５μｌを３回に分けて加えて合計３０分室温で撹拌した。逆相ＨＰＬＣでオリゴ２がＥＭＣＳと結合した目的物のフラクション溶液を得て、オリゴ１のフラクション溶液と混合した。この溶液を遠心エバポレーターで濃縮し、ほぼ乾固したあと２５％のジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）４０μｌに再溶解して室温で１時間撹拌した。逆相ＨＰＬＣでオリゴ１とオリゴ２がＥＭＣＳを介して連結した目的物オリゴ１−２（図２）を精製した（９ｎｍｏｌ）。
オリゴ１−２（９ｎｍｏｌ）を０．１Ｍ酢酸トリエチルアミン水溶液４５μｌに溶かした溶液に０．２Ｍ硝酸銀水溶液を１．８μｌ加えて３０分撹拌し、さらに０．２Ｍジチオスレイトール水溶液を３．６μｌ加えて３０分撹拌した。不溶物を濾去したのち逆相ＨＰＬＣでトリチル基が外れたオリゴ１−２のフラクション溶液を得た。オリゴ３（９ｎｍｏｌ；図２）を０．１Ｍリン酸水素２ナトリウム水溶液１５μｌに溶かした溶液にＥＭＣＳの２０ｍＭ  ＤＭＦ溶液５μｌを３回に分けて加えて合計３０分室温で撹拌した。逆相ＨＰＬＣでオリゴ３がＥＭＣＳと結合した目的物のフラクション溶液を得て、オリゴ１−２のフラクション溶液と混合した。この溶液を遠心エバポレーターで濃縮し、ほぼ乾固したあと２５％のジメチルホルムアミドを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．１）４０μｌに再溶解して室温で１時間撹拌した。逆相ＨＰＬＣでオリゴ１−２とオリゴ３がＥＭＣＳを介して連結した目的物Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ（図２）を精製した（約４．５ｎｍｏｌ）。
同様にオリゴ２と３をＥＭＣＳで連結して得られたオリゴ２−３をオリゴ１と連結させる方法によってもＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡが得られた。
オリゴ２の代わりにオリゴ４からオリゴ１０を用い、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ（オリゴ４）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ（オリゴ５）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡ（オリゴ６）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡ（オリゴ７）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡ（オリゴ８）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡ（オリゴ９）、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．８ＦＡ（オリゴ１０）、を同様の方法で合成した。
［実施例２］  転写用ＤＮＡの構築とｍＲＮＡ鎖の作製
転写効率の高い大腸菌ウィルスＴ７のＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって認識されるＤＮＡ配列（Ｔ７プロモーター配列）と翻訳の際に真核細胞のリボソームによって認識されるＤＮＡ配列（Ｋｏｚａｋ配列）と原核細胞のリボソームによって認識される（シャイン・ダルガノ配列：Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）を有し、その下流にＯｃｔ−１の一部（ＰＯＵ；配列番号１）とＦＬＡＧ配列、スペーサー鎖と連結するための共通配列（Ｙ−ｔａｇ）をコードしたＤＮＡを構築した。
配列番号１のＤＮＡを原料として、その３’末端の共通配列としての１１塩基ＧＣＧＧＣＧＧＧＡＡＡをＧＧＡＡＡの５塩基に改変したＤＮＡを合成し、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡ用とした。
上記の作製したＤＮＡを反応液１００μｌあたり１０μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ａｎａｌｏｇ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。キャップアナログおよび過剰のＮＴＰ（ヌクレオチド３リン酸）を除去するために、プライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒ；Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使ってエタノール沈澱を行った。
［実施例３］  スペーサー鎖と標識鎖（スペーサー鎖と標識鎖の連結物）の連結物とｍＲＮＡ鎖のライゲーション
上記で作製したｍＲＮＡ鎖とスペーサー鎖と標識鎖の連結物（Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ）を割合（モル比）が１：１．２から１：３．０となるようにＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）に溶解し、ジメチルスルホキシドを最終濃度（Ｔａｋａｒａ製）を至適量加えて２５℃で１時間反応させた。ライゲーション産物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使って精製した。
ライゲーションの効率を確認するために、４％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２５０Ｖ、１００ｍＡ、６０分の条件でサンプルを泳動し、Ｖｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ製）で染色し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。結果を図４に示す。レーン１はライゲーション前のｍＲＮＡ、レーン２は比較としてｍＲＮＡ鎖と標識鎖の結合部が突出しているＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ（図３）をｍＲＮＡとモル比で１．２倍量用いてライゲーションしたもの、レーン３から５はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡをｍＲＮＡとモル比でそれぞれ１．２倍、２．０倍、３．０倍量用いてライゲーションしたもの、レーン６は分子量マーカーに相当する。また、ライゲーション後の主生成物に相当するバンドは、特異的にフルオレセイン蛍光を発することを確認し、フルオレセインを有するスペーサー鎖と標識鎖の連結物とｍＲＮＡの連結物に由来するものと判断した。
Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．８ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡなど、実施例１で調製したスペーサー鎖と標識鎖の連結物のいずれを使ってもＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡとほぼ同効率のライゲーション結果が得られた。
［実施例４］  無細胞翻訳系によるｍＲＮＡ−タンパク質連結体の調製
実施例３の方法により得られたｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を無細胞翻訳系に加えてｍＲＮＡ−タンパク質連結体を形成させた。無細胞翻訳系としてはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）小麦胚芽無細胞翻訳系を用い、バッチ法で小麦胚芽抽出液６μｌに対しｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物４ｐｍｏｌ、全量２５μｌとして２６℃で１時間ないし３時間反応させた。
ＩＶＶ分子の形成効率を確認するために、５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、２０ｍＡの条件でサンプルを泳動した結果を図５に示す。レーン１はＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡのｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を無細胞翻訳系に加えてすぐに反応を止めたもの、レーン２は翻訳を１時間行なわせたもの、レーン３は翻訳を３時間行なわせたものをそれぞれ泳動したものに相当する。同様にレーン４からレーン６はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ、レーン７からレーン９はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、レーン１０からレーン１２はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを用いて行なった場合の泳動結果を示す。Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡを用いた場合には、ＩＶＶ分子がほとんど生成していないのに対し、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを用いた場合には１４％から２４％のＩＶＶ分子形成効率が確認された。特願２００２−０１２８２０号明細書にあるように、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡを用いた場合にはＩＶＶ分子形成効率をあげるために翻訳後に高塩濃度下におくことが必要であったが、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５ＦＡシリーズでは、そのような操作をする必要なく、同等以上の効率でＩＶＶ分子を得ることができた。
実施例１で調製した他のスペーサー鎖と標識鎖の連結物を同様に用いた場合、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡはＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡと、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡはＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡとそれぞれ同程度のＩＶＶ分子形成効率を示し、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．８ＦＡは、ほぼ同程度のＩＶＶ分子形成効率を示した。さらに、その中で安定性はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡがもっとも高いと判断された。
［実施例５］  Ｔ−ｓｐａｃｅｒによる逆転写の確認
実施例３の方法で得られたｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を用いて、逆転写反応によりスペーサー鎖の核酸部分をプライマーとしてｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ２本鎖化された産物が得られるか確認した。４  ｐｍｏｌのｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を溶かした溶液にＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を加えて至適条件で反応させ、さらにこのうちの３ｐｍｏｌ相当の溶液にＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｔａｋａｒａ）２ｕｎｉｔｓを加えた。
４％アクリルアミド８Ｍ尿素変性ゲル電気泳動、６５℃、２５０Ｖ、１００ｍＡ、６０分の条件でサンプル１ｐｍｏｌ相当を泳動し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）でフルオレセインの蛍光を検出した。結果を図６に示す。レーン１はＴ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡのｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物、レーン２はその逆転写反応混合物、レーン３はそれをさらにＲＮａｓｅ  Ｈ処理した混合物をそれぞれ泳動したものに相当する。同様にレーン４からレーン６はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡ、レーン７からレーン９はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡ、レーン１０からレーン１２はＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡをそれぞれスペーサー鎖と標識鎖の連結物として用いた場合のｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物、逆転写反応混合物、ＲＮａｓｅ  Ｈ処理混合物を泳動した結果である。Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡを除き、逆転写によるｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ２本鎖化とそのＲＮａｓｅ  Ｈ処理によってｃＤＮＡ化が確認できた。
実施例１で調製した他のスペーサー鎖と標識鎖の連結物を用いて同様に行なった場合、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡとＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．８  ＦＡではＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡやＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡと同程度の逆転写産物が検出され、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡはＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡと同様に逆転写が進行しなかった。Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡとＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡでは逆転写産物が４０−５０％程度確認された。
Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．１ＦＡは逆転写のプライマーとなる配列が全て２’Ｏｍｅ−ＲＮＡであるため、逆転写は起こらないと考えられる。しかし、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性を受けにくくするためＲＮＡと２本鎖を形成する配列は、できるだけ非ＤＮＡ型であることが好ましい。そこで、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡあるいはＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡのように、スペーサーが枝分かれして結合しているアミノｄＴ基から３‘末端方向の塩基をＤＮＡにし５’末端方向の塩基を全て２’Ｏｍｅ−ＲＮＡにした。その結果、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡでは、逆転写が進行せず、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡとＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．７ＦＡでは、逆転写産物が４０−５０％程度確認された。このことから、逆転写酵素は、３’側の２ｍｅｒないし３ｍｅｒだけを認識しているのではないことがわかった。また、このうち２’Ｏｍｅ−ｍＲＮＡ鎖が１１ｍｅｒで、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．５ＦＡより２本鎖部分が短いＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．６ＦＡの方が、逆転写が進行するということから、逆転写酵素は、プライマーとして、３’末端と１０数ｍｅｒ程度５’側上流側のＤＮＡ鎖を認識するのではないかと考えた。そこで、３’末端から４ｍｅｒがＤＮＡ鎖、１１ｍｅｒが２’Ｏｍｅ−ｍＲＮＡ鎖、６ｍｅｒがＤＮＡ鎖であるＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．８ＦＡを作製し検討したところ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ、あるいは、全てがＤＮＡ鎖であるＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡやＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡと同程度の逆転写産物が検出された。さらに、逆転写酵素のプライマーの認識部位として、５’方向の配列が厳密にＤＮＡである必要が無いと考えられたことから、３’末端から４ｍｅｒがＤＮＡ鎖、その後の１６ｍｅｒがＤＮＡと２’Ｏｍｅ−ＲＮＡ  の繰り返し配列であるＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを作製し検討したところ、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ３ＦＡ、あるいは、全てがＤＮＡ鎖であるＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．２ＦＡやＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．３ＦＡ、上記のＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．８ＦＡと同程度の逆転写産物が検出された。実施例４及び５の結果から、Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを主に用いることとした。
［実施例６］  ＩＶＶ分子形成効率向上のための操作
Ｓｐ６プロモーター配列とｏｍｅｇａ配列の下流にＲＸＲαのＣ末端側の２６０塩基、ＦＬＡＧ配列、共通配列をそれぞれコードしたＤＮＡ（配列番号２）を構築した。実施例２と同様の方法で対応するｍＲＮＡ鎖を作製した。
このｍＲＮＡ鎖とＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを割合（モル比）が１：３となるようにＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）に溶解し、ジメチルスルホキシドを最終濃度５％になるように加えた。この溶液をＰＣＲ装置上７２℃で２分加熱し、１５℃まで５分かけて冷却することでアニーリングした。Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ製）を至適量加えて１５℃で２時間反応させた。生成したｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使って精製し、−８０℃で保存した。
上記ｍＲＮＡ−スペーサー鎖−標識鎖の連結物の一部を無細胞翻訳系で用いる緩衝液（ＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭキットに添付）中に溶かし、ＰＣＲ装置上７２℃で２分加熱したのち氷浴に移して急冷した。この溶液にＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｃｒｅａｔｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ、ｔＲＮＡを加えたのち小麦胚芽抽出液と混合して実施例４と同じ最終組成とした。続いて、２６℃で１時間ないし３時間反応させた。
実施例４と同様に、ＩＶＶ分子を５Ｍ尿素変性５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、２０ｍＡの条件で泳動した結果を図７に示す。レーン１からレーン３は、実施例４の方法にあるように、翻訳に付する前に処理をせずｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を無細胞翻訳系に加えたもの、レーン４からレーン６は翻訳に付する前に加熱冷却後ｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を無細胞翻訳系に加えたものを泳動した結果である。レーン１及び４は無細胞翻訳系に加えた後すぐに反応を停止したもの、レーン２及び５は翻訳を１時間行なわせたもの、レーン３及び６は翻訳を３時間行なわせたものをそれぞれ泳動したものに相当する。翻訳前にｍＲＮＡ鎖−スペーサー鎖−標識鎖の連結物を加熱、急冷した方がＩＶＶ分子の形成効率が高いことが明らかとなった。
［実施例７］  ＩＶＶ分子ライブラリーの作製
ＩＶＶ分子ライブラリーを作製する工程において、（ｉ）スペーサー鎖と標識鎖の連結物の作製効率、（ｉｉ）ｍＲＮＡとスペーサー鎖と標識鎖の連結体との連結効率、（ｉｉｉ）翻訳反応によるＩＶＶ分子の形成効率、（ｉｖ）スペーサー鎖のｐｏｌｙ−Ａなどを用いたＩＶＶの精製効率、（ｖ）ＩＶＶ分子の逆転写の効率、および（ｖｉ）特願２００２−０１２８２０号明細書に記載のＩＶＶライブラリー分子の精製効率が、最終的に調製されるＩＶＶライブラリー中に含まれるＩＶＶ分子数に影響を及ぼす。
上記実施例における、各工程の効率とその際に得られる分子数の例を表１に示した。表１は、ＩＶＶ分子ライブラリーを作製する各工程における効率と、各工程におけるライブラリー中に含まれるＩＶＶ分子数を示した表である。
2005024018.tif 000005
（ｉ）スペーサー鎖と標識鎖の連結物の作製効率は約３６％、（ｉｉ）ｍＲＮＡとスペーサー鎖と標識鎖の連結体との連結効率は８０％以上、（ｉｉｉ）翻訳反応によるＩＶＶ分子の形成効率は１４〜２４％、（ｉｖ）スペーサー鎖のｐｏｌｙ−Ａなどを用いたＩＶＶの精製効率は約８０％、（ｖ）ＩＶＶ分子の逆転写の効率はほぼ１００％、さらに（ｖｉ）ＩＶＶライブラリー分子の精製効率は２０〜４０％であった。また、工程（ｉｉ）で調製される５００ｐｍｏｌ（３×１０１５分子）のＩＶＶライブラリーを使用した場合、ベイトとの相互作用反応を行う際のＩＶＶライブラリー（工程（ｖ）または（ｖｉ））は１１．２〜９６ｐｍｏｌ（０．６７〜５．７６×１０１３分子）のＩＶＶ分子が含まれる。実際のスクリーニングには、上記工程（ｖ）または（ｖｉ）まで経たものを使用する。また、工程（ｉｉｉ）〜（ｖｉ）は分子の安定性の面から、一連で行われることが望ましい。
これらの効率から、最終的に本実施例において調製されるＩＶＶ分子ライブラリーに含まれるＩＶＶ分子の数は、例えば、工程（ｉｉ）で調製される５００ｐｍｏｌ（３×１０１５分子）のＩＶＶライブラリーを使用した場合、ベイトとの相互作用反応を行う際のＩＶＶライブラリー（工程（ｖ）または（ｖｉ））は１１．２〜９６ｐｍｏｌ（０．６７〜５．７６×１０１３分子）のＩＶＶ分子が含まれる。ＩＶＶライブラリー分子の作製は全てｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うため、その特徴として、ＩＶＶライブラリーのダイバーシティー（分子の多様性）を維持することが挙げられる。このことから、ベイトとの相互作用反応を行う際のＩＶＶライブラリーサイズが約１０１３分子と非常に大きいことは、この特徴を有効に活用できるという点でスクリーニングに有用である。
［実施例８］  ＦＫ５０６をベイトとしたＩＶＶライブラリースクリーニング
（１）ＩＶＶ調製用ｃＤＮＡライブラリーの作製
常法にしたがって、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｄｏｕｂｌｅ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、ｃＤＮＡライブラリを作製した。作製の概略を図８に示した。まず、ヒト脳から抽出し、ｏｌｉｇｏ  ｄＴカラムで精製したｍＲＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）０．５μｇを鋳型として、９塩基からなるランダム配列と特定配列を含むランダムプライマー（配列番号４）０．２あるいは０．４ｐｍｏｌ、または、２あるいは４ｐｍｏｌを用いて、ランダムプライミング法により逆転写でｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡライブラリーを合成した（Ｉ）。ＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社製）によりｃＤＮＡと二本鎖化しているＲＮＡを切断するのと同時に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）によりｃＤＮＡに相補的なＤＮＡを合成し、さらに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩにより合成されたＤＮＡ間にあるニックを修正してｄｓＤＮＡライブラリーを合成した（ＩＩ）。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼＩは合成した側のＤＮＡの５’末端にのみリン酸基を導入することから、次に、合成したｄｓＤＮＡをエタノール沈殿し、４μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水に溶解し、翻訳エンハンサーなどを含む１００μＭアダプター（配列番号５および６）を１μｌとＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ、ＴＯＹＯＢＯ社製）を５μｌ加えて、１６℃で一晩反応させ両者を結合した（ＩＩＩ）。アダプターは、エンハンサーや特定配列をコードする一本鎖ＤＮＡ（配列番号５）とその３’末端に相補な短いＤＮＡ（配列番号６）を、常法に従ってアニーリングすることで作製した。この反応液を精製（ＤＮＡ  ｐｕｒｉｆｕｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）した後、５０μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水で溶出した。
次に、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いたＰＣＲによりフォワード共通プライマー（配列番号７）、リバース共通プライマー（配列番号８）を用いて、５’、３’共通配列を導入し、ＩＶＶ分子調製用ｃＤＮＡライブラリーを作製した（ＩＶ）。ＰＣＲは、ｔｅｍｐｌａｔｅ量及びサイクル数を検討した後、最適条件として、０．２あるいは０．４ｐｍｏｌのランダムプライマーを用いた際には、５０μｌの反応系で、溶出液１μｌをテンプレートとし、９４℃で２分、１８サイクル（９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で５分を１サイクルとする）、６８℃で３分の反応を行った。２あるいは４ｐｍｏｌのランダムプライマーを用いた際には、同条件で１６サイクルの反応を行った。
（２）ＩＶＶ調製用ＲＮＡライブラリーの作製およびＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡとの連結
上記（１）で作製したＩＶＶ調製用ｃＤＮＡライブラリーを反応液５０μｌあたり１μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ａｎａｌｏｇ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。
さらに、上記で作製したｍＲＮＡとスペーサー鎖と標識鎖（ピューロマイシンリンカー：Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ）を割合（モル比）が１：１．２から１：３．０となるようにＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）に溶解し、ジメチルスルホキシドを最終濃度５％になるように加えた。この溶液をＰＣＲ装置上９４℃で加熱し２５℃まで１０分かけて冷却することでアニーリングした。Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を至適量加えて２５℃で約１時間反応させた。ライゲーション産物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ製）を使って精製し、ＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーとした。
このＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーの質は、（ａ）ライブラリーをゲル電気泳動により分画した際の大きさやスメアな泳動像示すこと、（ｂ）ｍＲＮＡとの特定分子の存在量の比較、あるいは（ｃ）配列解析により評価することができる。
（ａ）ゲル電気泳動による評価
上記で作製したＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリー２００ｎｇ（Ａ：上記で０．２あるいは０．４ｐｍｏｌのランダムプライマーから作製したもの、Ｂ：２あるいは４ｐｍｏｌのランダムプライマーから作製したものをそれぞれ等モルずつあわせた）を４％ウレア変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にて泳動し、標識鎖のＦｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎを使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。結果を図９Ａに示す。レーン１はＩＶＶ  ｃＤＮＡライブラリＡ、レーン２はＩＶＶ  ｃＤＮＡライブラリＢである。図から明らかなように、上記で調製されたＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーは、スメアな泳動像を示し、またＤＮＡ鎖の長さも十分であることを確認した。
（ｂ）ｍＲＮＡとの特定分子の存在量の比較による評価
常法に従って、サイバーグリーンをもちいた定量ＰＣＲ法（ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉＸ：ＡＢＩ社製）によって、数種の分子の存在量を定量した。元のｍＲＮＡの鋳型としては、元のｍＲＮＡをＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＴ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＢＩ社）によって、ランダムプライマーによって作製したｃＤＮＡを使用した。ＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーは、スペーサーに導入してある逆転写プライマー配列を利用して、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写し、その後、ＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社製）処理したものを精製し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ水に溶解したものを使用した。
これらのＤＮＡを鋳型として、ＦＫＢＰ１２（配列番号９、１０）、ＦＫＢＰ５（配列番号１１、１２）、Ｓａｒａ（配列１３、１４）、ＳＴＣＨ（配列番号１５、１６）、Ｓｍａｄ４（配列番号１７、１８）、ＣＤＨ１（配列番号１９、２０）、ＲＸＲα（配列番号２１、２２）、ＳＤＰ１（配列番号２３、２４）、ｂ−Ａｃｔｉｎ（配列番号２５、２６）量を上記定量ＰＣＲにより測定した。
いずれも、鋳型１０ｎｇ中の存在量をもとめ、図９Ｂに示した。白カラムは元のｍＲＮＡ、黒カラムはＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリーを示す。図から明らかなように、調製されたＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリー中に含まれる複数種の特定のｃＤＮＡ量は、もとのｍＲＮＡ中に含まれるものと差異がないことを確認した。
（ｃ）配列解析
上記で作製したＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリー２００ｎｇ（Ａ：上記で０．２あるいは０．４ｐｍｏｌのランダムプライマーから作製したもの、Ｂ：２あるいは４ｐｍｏｌのランダムプライマーから作製したものをそれぞれ等モルずつあわせた））を、スペーサー鎖に導入してある逆転写プライマー配列を利用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写し、その後、ＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社製）処理したものを精製し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ水に溶解した。これを鋳型としてＰＣＲによってクローニングするＤＮＡを作製した。反応条件は、ＥＸ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて、フォワードプライマーとして配列番号２７、リバースプライマーとして配列番号２８を使用し、最適な鋳型の量、ＰＣＲサイクル数でそれぞれ行った。ＰＣＲは、９４℃で２分、最適サイクル（９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で５分を１サイクルとする）、７２℃で３分の条件とした。以下常法に従って、上記のＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にライゲーションし、クローニングした。インサートを含んでいるコロニーからプラスミドを抽出し、シークエンス解析を行った。Ａ、Ｂそれぞれ約１００個のＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリークローンの配列解析により、ＩＶＶフォームからなることを確認した。
（３）スクリーニング
ＩＶＶ分子のスクリーニングは、（ｉ）タンパク質−逆転写核酸連結体（以下、これを「ＩＶＶｃＤＮＡ分子」と称することがある）形成工程、（ｉｉ）ベイト（被検物質）に対する相互作用分子の選抜工程、（ｉｉｉ）選択されたＩＶＶ分子からなるタンパク質−逆転写核酸連結体再作製工程、（ｉｖ）シークエンス解析による選択されたＩＶＶ分子の同定工程の４つの工程からなる。（ｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）はＩＶＶ分子のスクリーニング（以下、これを「ＩＶＶスクリーニング」と称することがある）において共通の工程であり、（ｉｉ）はベイト特異的な工程である。また、ベイトは、その特性に従って、できるだけ高い濃度で調製されることが望ましい。ＩＶＶスクリーニングは、ベイトごとに相互作用分子が選択されているかを確認しつつ、上記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を繰り返し、特定のＩＶＶ分子の選択がなされた際には（ｉｖ）の工程で選択されたＩＶＶ分子のＤＮＡ配列を解析し、いずれの分子が選択されたか確認する。選択がされたかどうかの決定は、（ｉｉｉ）の工程で、選択分子の量の増加、あるいは、再ライブラリー化時にライブラリーをゲル電気泳動により分画した際にいくつかの単一なバンドを形成することを指標とする。ＩＶＶスクリーニングの概略を図１０に示した。
（３）−（ｉ）ＩＶＶｃＤＮＡ分子ライブラリー調製
上記（２）で作製したＩＶＶ調製用翻訳鋳型ライブラリー６４μｇを小麦胚芽無細胞翻訳系ＰＲＯＴＥＩＯＳ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、２６℃で１時間反応し翻訳させることでピューロマイシンに翻訳されたペプチドを結合させてＩＶＶ分子を形成させた。
この分子を、１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００になるように調整し、９．６ｎｍｏｌのＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）Ｐｒｏｂｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を結合させたＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ（Ｔａｋａｒａ社製）３６０μｌと４℃、約１時間結合させた。その後、上清をとり、洗浄ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で３回洗い、ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で１回洗い、ｂｕｆｆｅｒ  Ｃ（２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）で１回洗い、次いで、ＭｉｌｌｉＱ水９０μｌで３回溶出して元のＩＶＶ分子ライブラリー及びＩＶＶ分子ライブラリー分子を得た。
次いで、上記の元のＩＶＶ分子ライブラリー及びＩＶＶ分子ライブラリー分子を、スペーサーに導入してある逆転写プライマー配列を利用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写した。溶出画分２７０μｌに５×ＲＴ  Ｂｕｆｆｅｒ：１０８μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ：５４μｌ、０．１Ｍ  ＤＴＴ：２７μｌ、４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＷＡＫＯ社製）：２１．６μｌ、２００Ｕ／μｌ  ＲＴａｓｅ：２７μｌ、ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水：３２．４μｌを加え、５０度で２分、２６℃まで１秒間に０．４℃ずつ下げて反応させた。
次いで、抗ＦＬＡＧ抗体（シグマ社製）を用いてＩＶＶｃＤＮＡ分子ライブラリを精製した。上記で逆転写反応したもの５４０μｌを、ｆｉｎａｌ  ２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｎｐ４０、１０％  グリセロール、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡになるように調製した。これを、４０μｌの抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ社製）に４℃で一晩結合させ、１００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  Ｎｐ４０、１０％  グリセロール、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、０．５μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ）で３回洗いＩＶＶｃＤＮＡ分子ライブラリーを得た。
（３）−（ｉｉ）ベイトに対する相互作用分子の選抜工程
（Ｉ）ビオチン化ＦＫ５０６およびＦＫ５０６ビーズの調製
ＦＫ５０６はペプチジルプロリルイソメラーゼである蛋白質ＦＫＢＰと複合体を形成してカルシニューリンに結合し、ＮＦＡＴの脱リン酸化とその核内移行によるＴ細胞の活性化を阻害する天然から単離された免疫抑制剤である。ＦＫＢＰの中でも１２ｋＤａのＦＫＢＰ１２がＦＫ５０６の主な標的であるとされている。
ベイト用ＦＫ５０６（Ｓｅｑｕｏｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製）はまず１等量のジメチルアミノピリジン存在下で５等量の無水コハク酸とジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中、室温で２日間室温で反応させ、カルボン酸誘導体として逆相ＨＰＬＣで精製した。これをＤＭＦに溶解し、それぞれ１等量のＰｙＢＯＰ（Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ−ｏｘｙ−ｔｒｉｓ−ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ−ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ  ｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＨＯＢｔ（１−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒａｔｅ）、トリエチルアミンを加えて室温で５分反応させたのちＢｉｏｔｉｎ−ＰＯＥ３−ａｍｉｎｅ（モレキュラーバイオサイエンス社製）を３等量加えて１時間反応させた。生成したビオチン化ＦＫ５０６を逆相ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで確認した。
濃度１ｍＭのビオチン化ＦＫ５０６の５０％エタノール水溶液１６μｌをＴＢＫＴ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２％  Ｔｗｅｅｎ２０）３８４μｌに加えて撹拌し、ＭＡＧＮＯＴＥＸ−ＳＡ（Ｔａｋａｒａ社製）１００μｌ相当に加えて室温で３０分混合した。ビーズをＴＢＫＴ１５０μｌで５回、ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）３００μｌで３回洗ってＦＫ５０６ビーズを調製した。ビオチン化ＦＫ５０６の代わりにＢｉｏｔｉｎ−ＰＯＥ３−ａｍｉｎｅを使って同様にビオチンビーズを調製した。
（ＩＩ）ＩＶＶｃＤＮＡ分子とベイトとの接触および結合体の取得
上記（３）−（ｉ）で得たＩＶＶｃＤＮＡライブラリー３０μｇを、３×ＦＬＡＧ  ｐｅｐｔｉｄｅをＴＢＫ溶液（１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））４０μｌで３回溶出した。この溶液に各種原液を加え、最終量４００μｌ、最終濃度１５０ｍＭ  ＫＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５μｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、５０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡとした。これを上記（Ｉ）で得たビオチンビーズと合わせて室温で１時間静かに混合したのち、上清を上記（Ｉ）で得たＦＫ５０６ビーズと合わせて室温で２時間静かに混合した。
この溶液中のビーズを２００μｌの上記ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５回、２００μｌの上記ＦＫ５０６  Ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒにエタノールを１％加えたもの）で５回洗浄し、１００μＭのＦＫ５０６溶液（ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに溶かしたもの）を５０μｌ加えて室温で１時間懸濁させた。上清にＲＮａｓｅ  Ｈ溶液（ＴＯＹＯＢＯ社製）を２μｌ、１０μｇ／ｍｌ  ＲＮａｓｅ  Ａ溶液を１０μｌ加えて室温で３０分反応させ、残ったＤＮＡ鎖から成る分子をエタノール沈殿で回収し、２０μｌのＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ水に懸濁して再ライブラリー化のためのＰＣＲの鋳型として調製した。
（３）−（ｉｉｉ）選択されたＩＶＶ分子からなるＩＶＶｃＤＮＡ分子ライブラリー作製
上記（３）−（ｉｉ）で得られたＦＫ５０６と相互作用するタンパク質を含むＩＶＶｃＤＮＡ分子ライブラリーから、該タンパク質をコードするＤＮＡ部分の増幅を行った。ＰＣＲは、１０μｌの反応系で、プライマー（配列番号２７、および２８）を用いて、上記で得られたＩＶＶｃＤＮＡ分子を含む溶出液１μｌを鋳型とし、９４℃で２分、１８サイクル（９８℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃で５分を１サイクルとする）、６８℃で３分の反応を行った（１ｓｔ  ＰＣＲ）。次に、このＰＣＲ産物を鋳型とし、転写プロモーターやスペーサー鎖とのアニーリング配列を含むプライマー（配列番号７、および８）を用いて同様にＰＣＲを行った（２ｎｄ  ＰＣＲ）。スクリーニング初回あるいは、回収量が増加するまでは、溶出画分全て、またはダイバーシティを維持しつつ再ライブラリ化することが望ましい。
上記で作製したＩＶＶｃＤＮＡライブラリーのタンパク質部分をコードするＤＮＡを反応液５０μｌあたり１〜２μｇ加え、ＲＮＡ合成キットＲｉｂｏｍａｘ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使ってｍＲＮＡに転写した。翻訳効率をあげるためにキャップアナログ（ＲＮＡ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ａｎａｌｏｇ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を最終濃度が７．２ｍＭになるように加え、ｍＲＮＡの５’側を修飾した。
さらに、上記で作製したｍＲＮＡ鎖とＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡを割合（モル比）が１：１．２から１：３．０となるようにＴ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＡＴＰ）に溶解し、ジメチルスルホキシドを最終濃度５％になるように加えた。この溶液をＰＣＲ装置上９４℃で加熱し２５℃まで１０分かけて冷却することでアニーリングした。Ｔ４  ＲＮＡ  ｌｉｇａｓｅ（Ｔａｋａｒａ社製）を至適量加えて２５℃で約１時間反応させた。ライゲーション産物をＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使って精製し、ＩＶＶｃＤＮＡライブラリー（以下、これを「濃縮ＩＶＶｃＤＮＡライブラリー」と称することがある）とした。
（３）−（ｉｖ）シークエンス解析による選択されたＩＶＶ分子の同定
上記（３）−（ｉｉｉ）の工程を何回か繰り返し、得られたＩＶＶｃＤＮＡライブラリーをゲル電気泳動により分画した際に、いくつかの単一なバンドを形成した場合、これをクローニングしシークエンス解析することによりベイトと相互作用するタンパク質が同定される。本実施例では、上記（ｉｉｉ）の工程を７回および８回繰り返した後、ＩＶＶｃＤＮＡライブラリーのタンパク質部分をコードするＤＮＡを、ウレア変性ＰＡＧＥにて泳動し、スペーサーに導入してある蛍光（Ｆｌｕｏｒｏｓｃｅｉｎ）を使って、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ社製）で画像化した。このスクリーニングの１ラウンドから８ラウンドまでの結果を図１１に示す。ここで、濃縮されているラウンド７および８のバンドとその周辺を、分画して精製したものをクローニングした。クローニングは、ＤＮＡを精製し、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター（プロメガ社製）にライゲーションして行った。
次に、インサートを含んでいるコロニーからプラスミドを抽出し、シークエンス解析を行った。約１５０クローンをシークエンス解析し、得られた塩基配列Ｂｌａｓｔ検索によって同定した。この結果、ＦＫＢＰ１２のほぼ全長に相当する配列がラウンド７で４０．３％（６４／１５９）、ラウンド８で８０．７％（１２１／１５０）得られた。他にＦＫＢＰ１２のホモログ由来と推測されるシークエンスがラウンド７とラウンド８で１つずつ確認された。
（４）各ラウンドにおけるＦＫＢＰ１２を含むＩＶＶ分子数の測定
常法に従って、サイバーグリーンをもちいた定量ＰＣＲ法（ＳＹＢＥＲ  ＧＲＥＥＮ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉＸ：ＡＢＩ社製）によって、各ラウンドのＦＫＢＰ１２を含むＩＶＶ分子の存在量を定量した。ベイトに対して、内因性のネガティブコントロールとして、βＡｃｔｉｎを指標とした。定量ＰＣＲ法のテンプレートしては、１ラウンド以降は、再ライブラリー化した際の１ｓｔ  ＰＣＲ産物あるいは２ｎｄ  ＰＣＲ産物を用い、最初のＩＶＶｃＤＮＡライブラリーとしては、最初のＩＶＶｃＤＮＡライブラリーを、スペーサーに導入してある逆転写プライマー配列を利用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写し、その後、ＲＮａｓｅＨ（ＴＯＹＯＢＯ社製）処理したものをプライマー除去剤（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｒｅｍｏｖｅｒ、Ｅｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を使って精製し、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ水に溶解したものを鋳型として、再ライブラリー化と同様にＰＣＲしたものを鋳型とした。また、同定された遺伝子の定量は、ＦＫＢＰ１２は配列番号９および１０のプライマー、ｂ−Ａｃｔｉｎは配列番号２５および２６の配列を有するプライマーを用いて行った。この結果を図１２に示す。図中、四角のグラフはＦＫＢＰを含むＩＶＶ分子数を示し、三角はｂ−Ａｃｔｉｎを含むものを示し、いずれもライブラリー１０ｎｇ中の存在量を示した。図から明らかなように、ラウンドが重なるごとに、ＦＫＢＰ１２を含むＩＶＶ分子数が増加しており、本実施例のスクリーニングにより、ＦＫ５０６と相互作用するタンパク質を含むＩＶＶ分子が濃縮されていることがわかった。
［実施例９］  ＩＶＶ調製用翻訳鋳型分子のＤＮＡ２本鎖化
上記実施例８で得られたＦＫＢＰ１２をコードするＤＮＡを含むシークエンス解析用ベクターを鋳型として、配列番号２９および３０に記載のプライマーを用いたＰＣＲを行った。このＤＮＡを実施例８（２）に記載の方法と同様にｍＲＮＡとＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡの結合体を作製し、さらにＴ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡに導入してある逆転写プライマー配列を利用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて逆転写した。
得られたｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体２ｐｍｏｌを実施例５のｍＲＮＡ分解の方法により処理し、ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体を得た。これを５‘プライマー（配列番号２９）とともにＥＸ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ社製）の反応液１０μｌに溶解した。ＰＣＲ装置中で７２℃または８４℃で１分間加熱変性し、さらに７２℃で２分間伸張反応を行った。生成物を尿素変性下および非変性下でポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、Ｔ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡのフルオレセインに由来する蛍光およびＶｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎ染色で検出した。この結果を図１３に示す。図中、レーン１は、ＦＫＢＰ１２のｍＲＮＡ、レーン２はｍＲＮＡとＴ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡの結合体、レーン３はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体、レーン４はｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−Ｔ−ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ結合体をＲＮａｓｅＡとＲＮａｓｅＨで処理したもの、レーン５から７は２本鎖ＤＮＡ化したＰＣＲ反応液であり、レーン５は変性を７２℃で行ない、プライマー濃度が鋳型の５等量のもの、レーン６は変性を７２℃で行い、プライマー濃度が鋳型の１．２５等量のもの、またレーン７は変性を８４℃で行ない、プライマー濃度が鋳型の１．２５等量であるものを示す。図１３から明らかなように、変性ＰＡＧＥでは、Ｔ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡ由来の蛍光で検出したＤＮＡ鎖はレーン５〜７でいずれも主に１本であるのに対し、Ｖｉｓｔｒａ  Ｇｒｅｅｎで検出するとやや分子量の小さいものに由来するバンドを加えて主に２本になっていることから、上記の反応でｃＤＮＡ−Ｔ−Ｓｐｌｉｎｔ５．９ＦＡの連結物のｃＤＮＡ部分が２本鎖ＤＮＡとなっていることがわかった。
【産業上の利用可能性】  本発明は、１本鎖核酸の特定のヌクレオチドどうしを連結することができるため、様々な構造を有する核酸を構築することができる。このことは、例えば、複雑な構造を有するｃＤＮＡライブラリーの構築等に有用である。また、本発明の核酸構築物は、タンパク質−核酸連結物の鋳型として構築することができる。タンパク質−核酸連結体は、タンパク質−物質間の相互作用解析等の強力なツールであるが、タンパク質（−核酸連結体）ライブラリーの分子の多様性が重要であるため、該連結体の形成効率が高い製造方法が必要とされている。本発明の核酸構築物を鋳型とすると、連結部分に突出部がないため、タンパク質−核酸連結体の形成効率が著しく高くなり、多様性の高いライブラリーが構築される。
本発明による１本鎖核酸の連結方法は、１本鎖核酸中の特定のヌクレオチドと他方の１本鎖核酸中の特定のヌクレオチドを結合し、その一方を化学結合していない他の１本鎖核酸とアニーリングし、アニーリングされていない他方の１本鎖核酸を近傍効果により化学結合していない１本鎖核酸と連結することを可能にする。本発明の方法で形成された核酸構築物は、通常の２本鎖核酸より立体的に大きな部分を有さず、ステムループ構造やソラレン架橋部位のような突出構造を有さない。この効果により、得られた核酸構築物を翻訳すると、翻訳後の高塩濃度化の操作を行わずに、タンパク質−核酸連結物を高効率で製造することができる利点を有する。
また、本発明の方法は上記の核酸構築物以外にも１本鎖核酸どうしを連結することができ、例えば、様々な複雑な構造を有する核酸ライブラリーを作製すること等も可能である。これは、タンパク質工学や進化分子工学において極めて有用な技術となる。
本出願は、２００３年９月８日付の日本特許出願（特願２００３−３１５３８５）に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取り込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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