(57)【要約】本発明は、ＨＴＲＡ１の発現の調節に導く、ＨＴＲＡ１に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＨＴＲＡ１発現の調節は、広範な医学的障害、例えば黄斑変性症、例えば、加齢性黄斑変性症などのために有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドがＨＴＲＡ１核酸を標的とし、配列番号１１３に少なくとも９０%、例えば１００%相補性である１０〜２２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む、長さ１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
連続ヌクレオチド領域が、配列番号２３１、１８６、１９２、及び２０５からなる群より選択される配列に完全に相補的である、請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
連続ヌクレオチド領域が、配列番号１２４〜２３０からなる群より選択される配列に完全に相補的な少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含む、請求項１又は２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
連続ヌクレオチド領域が、配列番号１１３に完全に相補的である少なくとも１２の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
連続ヌクレオチド領域が、配列番号１１３に完全に相補的である少なくとも１４の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、配列番号６７、７３、及び８６のいずれか１つより選択される配列、又はその少なくとも１２の連続ヌクレオチドからなる、又はそれを含む、請求項１〜５のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結、例えば１つ又は複数のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、又は、例えば連続ヌクレオチド領域内の全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である、請求項１〜７のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列が、ギャップマー、例えば式５’−ＦＧ−Ｆ’−３’のギャップマーなどである、又はそれを含み、式中、領域Ｆ及びＦ’が独立して１〜７の糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇが、ＲＮａｓｅＨを動員することが可能である領域６〜１６のヌクレオシドであり、それにおいて領域Ｇに隣接する領域Ｆ及びＦ’のヌクレオシドが糖修飾ヌクレオシドである、請求項１〜８のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
領域Ｆ及びＦ’の少なくとも一方又は両方が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを各々含む、請求項９記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
連続ヌクレオチド領域を以下より選択される群より選択する、請求項１〜１０のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド：
【化１８】
2020521491.tif 000044
それにおいて大文字はＬＮＡヌクレオチドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、シトシン残基は場合により５−メチルシトシンである。
【請求項１２】
ＬＮＡヌクレオシドがベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである、請求項１０又は１１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
連続ヌクレオチド領域のヌクレオチド間のヌクレオシド間連結が全てホスホロチオエートヌクレオチド間連結である、請求項１〜１２のいずれか一項記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
以下からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む、又はそれからなるオリゴヌクレオチド：
【化１９】
2020521491.tif 000045
それにおいて大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【請求項１５】
請求項１〜１４記載のオリゴヌクレオチドのいずれか１つの医薬的に許容可能な塩。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１５記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲートならびに医薬的に許容可能な希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む、医薬的組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲート又は請求項１７記載の医薬的組成物を有効量で細胞に投与することを含む、ＨＴＲＡ１を発現している標的細胞においてＨＴＲＡ１発現を調節するためのインビボ又はインビトロの方法。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲート又は請求項１７記載の医薬的組成物の治療的又は予防的有効量を、疾患に罹患している又は感受性である被験者に投与することを含む、疾患を処置又は防止するための方法。
【請求項２０】
医薬における使用のための、請求項１〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲート又は請求項１７記載の医薬的組成物。
【請求項２１】
黄斑変性症（例えば湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、地図状萎縮、中間ｄＡＭＤ、糖尿病性網膜症など）、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症など、及び家族性虚血性脳小血管疾患からなる群より選択される疾患の処置又は防止における使用のための請求項１〜１５のいずれか一項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲート又は請求項１７記載の医薬的組成物。
【請求項２２】
黄斑変性症（例えば湿潤型ＡＭＤ、乾燥型ＡＭＤ、地図状萎縮、中間ｄＡＭＤ、糖尿病性網膜症など）、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症など、及び家族性虚血性脳小血管疾患からなる群より選択される疾患の処置又は防止のための医薬の調製のための、請求項１〜１５記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１６記載のコンジュゲート又は請求項１７記載の医薬的組成物の使用。
【請求項２３】
方法又は使用が黄斑変性症の処置のためである、請求項１９〜２２のいずれか一項記載の使用又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＨＴＲＡ１の発現の調節に導く、ＨＴＲＡ１に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＨＴＲＡ１発現の調節は、広範な医学的障害、例えば黄斑変性症など（例、加齢性黄斑変性症）のために有益である。
【０００２】
背景
セリンプロテアーゼのヒト高温要求Ａ（ＨＴＲＡ）ファミリーは、プロテアーゼ及びシャペロンの二重機能を組み合わせることにより、細胞外コンパートメントにおけるタンパク質恒常性の維持に含まれる遍在的に発現するＰＤＺプロテアーゼである。ＨＴＲＡプロテアーゼは、細胞外マトリックスの組織化、細胞増殖、及び老化に関係している。ＨＴＲＡ活性の調節は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141）、関節炎、例えば変形性関節症など（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）、癌、家族性虚血性脳小血管疾患、及び加齢黄斑変性症、ならびにパーキンソン病及びアルツハイマー病を含む重度疾患に関連する。ヒトＨＴＲＡ１はインスリン様成長因子（ＩＧＦ）結合ドメインを含む。それは、ＩＧＦの可用性及び細胞成長を調節し（Zumbrunn and Trueb, 1996, FEES Letters 398:189-192）、腫瘍抑制特性を示すことが提唱されている。ＨＴＲＡ１発現は転移性メラノーマにおいて下方調節されており、このように、メラノーマの進行の程度を示しうる。転移性メラノーマ細胞株におけるＨＴＲＡ１の過剰発現によって、インビトロでの増殖及び浸潤が低下し、異種移植マウスモデルにおいて腫瘍成長が低下した（Baldi et al., 2002, Oncogene 21:6684-6688）。ＨＴＲＡ１発現はまた、卵巣癌において下方調節される。卵巣癌細胞株では、ＨＴＲＡ１過剰発現によって細胞死が誘導され、アンチセンスＨＴＲＡ１発現によって足場非依存性成長が促進された（Chien et al., 2004, Oncogene 23:1636-1644）。
【０００３】
ＩＴＲＡ経路に対するその効果に加えて、ＨＴＲＡ１はまた、成長因子のＴＧＦβファミリーによるシグナル伝達を阻害する（Oka et al., 2004, Development 131:1041-1053）。ＨＴＲＡ１はアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を切断することができ、ＨＴＲＡ１阻害剤は培養細胞においてＡβペプチドの蓄積を起こす。このように、ＨＴＲＡ１はまた、アルツハイマー病に関係している（Grau et al.,2005, Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102:6021-6026）。
【０００４】
さらに、ＨＴＲＡ１の上方調節が観察されており、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Bakay et al. 2002, Neuromuscul. Disord. 12: 125-141）ならびに変形性関節症（Grau et al. 2006, JBC 281: 6124-6129）及びＡＭＤ（Fritsche, et al. Nat Gen 2013 45(4):433-9）に関連付けられると思われる。
【０００５】
ＨＴＲＡ１プロモーター領域（ｒｓ１１２００６３８）中の一塩基多型（ＳＮＰ）は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）を発症するリスクの１０倍増加に関連付けられる。さらに、ＨＴＲＡ１  ＳＮＰはＡＲＭＳ２  ＳＮＰ（ｒｓ１０４９０９２４）と連鎖不平衡にあり、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の発症リスク増加に関連付けられる。リスク対立遺伝子は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質発現の２〜３倍増加に関連付けられ、ＨＴＲＡ１はＡＭＤを伴う患者のドルーゼン中に存在する（Dewan et al., 2006, Science 314:989-992; Yang et al., 2006, Science 314:992-993）。ＨｔｒＡ１の過剰発現によって、マウスにおいてＡＭＤ様表現型が誘導される。ｈＨＴＲＡトランスジェニックマウス（Veierkottn, PlosOne 2011）では、ブルッフ膜の弾性板の分解が明らかになり、脈絡膜血管異常が決定され（Jones, PNAS 2011）、ポリープ状脈絡膜血管症（ＰＣＶ）病変が増加する（Kumar, IOVS 2014）。加えて、ｈＨＴＲＡ１  Ｔｇマウスにおけるブルッフ膜損傷が報告されており、そこではタバコ煙への曝露時でのＣＮＶの３倍増加が決定されている（Nakayama, IOVS 2014）。
【０００６】
加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、年齢６５歳を上回る人々における不可逆的な視力喪失の主な原因である。ＡＭＤの発症とともに、眼の裏側における光感受性の光受容体細胞、それらを代謝的に支持する基礎をなす色素上皮細胞、及びそれらが提供する鋭い中心視力が徐々に失われる。年齢は、ＡＭＤの発症の主要なリスク因子である：ＡＭＤを発症する可能性は５５歳以降に３倍になる。喫煙、薄い虹彩色、性別（女性の方が高リスク）、肥満、及びＵＶ照射への反復曝露もＡＭＤのリスクを増加させる。ＡＭＤ進行は３段階において定義することができる：１）早期、２）中期、及び３）進行性ＡＭＤ。２つの形態の進行性ＡＭＤがある：乾燥型ＡＭＤ（地図状萎縮、ＧＡとも呼ばれる）及び湿潤型ＡＭＤ（滲出型ＡＭＤとしても公知）。乾燥型ＡＭＤは、光受容体及び網膜色素上皮細胞の喪失により特徴付けられ、視力喪失に導く。湿潤型ＡＭＤは、病的脈絡膜（網膜下としても言及する）血管新生に関連付けられる。このプロセスにおいて形成される異常な血管からの漏出によって、黄斑が損傷され、視力が損なわれ、最終的には失明に導かれる。一部の場合では、患者は両方の型の進行性ＡＭＤに関連付けられる病態を提示することがある。湿潤型ＡＭＤのための処置戦略では、眼中への頻繁な注射が要求され、主に疾患進行を遅延させることに焦点を合わせている。現在、乾燥型ＡＭＤのための処置は利用可能ではない。従って、黄斑変性症状態（例えば湿潤型及び乾燥型ＡＭＤなど）を処置するための効果的な薬物の提供において、満たされていない医学的ニーズがある。ＷＯ２００８／０１３８９３には、ＨＴＲＡ１遺伝子又はｍＲＮＡにハイブリダイズするアンチセンス配列を含む核酸分子を含む加齢黄斑変性症に罹患した被験者を処置するための組成物が請求されている：アンチセンス分子は開示されていない。
【０００７】
ＷＯ２００９／００６４６０には、ＨＴＲＡ１を標的とするｓｉＲＮＡ及びＡＭＤを処置する際でのそれらの使用が提供されている。
【０００８】
発明の目的
本発明は、インビボ又はインビトロでＨＴＲＡ１を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明では、効果的なＨＴＲＡ１阻害を与えるためにアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化されうるヒトＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ（プレｍＲＮＡを含む）中に存在する潜在性の標的配列モチーフが同定された。本発明はまた、ＨＴＲＡ１を阻害することが可能である効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列及び化合物、ならびにＨＴＲＡ１が適応される疾患又は障害の処置におけるそれらの使用を提供する。
【０００９】
発明の概要
本発明は、哺乳動物ＨＴＲＡ１核酸を標的とする（即ち、ＨＴＲＡ１の発現を阻害すること可能である）、ＨＴＲＡ１の機能に関連する疾患を処置又は防止するためのオリゴヌクレオチドに関する。ＨＴＲＡ１を標的とするオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、即ち、それらのＨＴＲＡ１核酸標的に相補的である。
【００１０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、医薬的に許容可能な塩の形態（例えばナトリウム塩又はカリウム塩など）でありうる。
【００１１】
したがって、本発明は、少なくとも９０%の相補性を伴う（例えば哺乳動物ＨＴＲＡ１核酸に完全に相補的など）長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４など）を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドならびに医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬的組成物を提供する。
【００１３】
本発明は、少なくとも９０%の相補性を伴う（例えばＨＴＲＡ１核酸に完全に相補的など）長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列（例えば配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４からなる群より選択される配列など）を含むＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドなど）を提供する。
【００１４】
本発明は、１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１３に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補的である。
【００１５】
本発明は、長さが１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１３に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む：
【化１】
2020521491.tif 000002
【００１６】
配列番号１１３の逆相補体は配列番号１１９である：
【化２】
2020521491.tif 000003
【００１７】
本発明は、１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド領域は配列番号１１４に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である。
【００１８】
本発明は、長さ１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１４に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む：
【化３】
2020521491.tif 000004
【００１９】
配列番号１１４の逆相補体は配列番号１２０である：
【化４】
2020521491.tif 000005
【００２０】
本発明は、１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１５に少なくとも９０%（例えば１００%など）である。
【００２１】
本発明は、長さ１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１５に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む：
【化５】
2020521491.tif 000006
【００２２】
配列番号１１５の逆相補体は配列番号１２１である：
【化６】
2020521491.tif 000007
【００２３】
本発明は、１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１６に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である。
【００２４】
本発明は、長さ１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１６に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む：
【化７】
2020521491.tif 000008
【００２５】
配列番号１１６の逆相補体は配列番号１２２である：
【化８】
2020521491.tif 000009
【００２６】
本発明は、１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１７に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である。
【００２７】
本発明は、長さ１０〜３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１１７に少なくとも９０%（例えば１００%など）相補性である１０〜３０（例えば１２〜２２など）ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む：
【化９】
2020521491.tif 000010
【００２８】
配列番号１１７の逆相補体は配列番号１２３である：
【化１０】
2020521491.tif 000011
【００２９】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’ｇｃａａｔｇｔｇｔａａｇａａｇｔ３’（配列番号１１２）のものではない。一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’ｇｃａａｔｇｔｇｔａａｇａａｇｔ３’を含まない、又はそれからならない。一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’ｇｃａａｔｇｔｇｔａａｇａａｇｔ３’中に存在する１０又はそれ以上の連続ヌクレオチドを含まない、又はそれからならない。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは５’ＧＣＡａｔｇｔｇｔａａｇａＡＧＴ３’以外であり、それにおいて大文字はＬＮＡヌクレオシドを表し（ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを使用した）、全てのＬＮＡシトシンが５−メチルシトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、上付き文字ｍが前に付くＤＮＡシトシンは、５−メチルＣ−ＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【００３０】
本発明は、配列番号５〜１１１のいずれか１つにおいて存在する少なくとも１０の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号５〜１１１のいずれか１つにおいて存在する少なくとも１２の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号５〜１１１のいずれか１つにおいて存在する少なくとも１４の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、配列番号５〜１１１のいずれか１つにおいて存在する少なくとも１５又は１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明はアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいてオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５〜１１１のいずれか１つからなる群より選択される核酸塩基配列を含む、又はそれからなる。
【００３１】
本発明は、配列番号１１８：５’ＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＧ３’に存在する少なくとも１０、又は少なくとも１２、少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は少なくとも１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。配列番号１１８の逆相補体は配列番号２３１：ＣＡＡＴＧＣＧＴＡＧＡＴＡＧＡＡＧＡＡＧである。
【００３２】
本発明は、配列番号２３１に相補的な少なくとも１０、又は少なくとも１２、少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は少なくとも１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３３】
本発明は、配列番号６７に存在する少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３４】
本発明は、配列番号８６に存在する少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３５】
本発明は、配列番号７３に存在する少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は少なくとも１６又は少なくとも１７又は１８の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３６】
本発明は、配列番号１８６に相補的な少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３７】
本発明は、配列番号２０５に相補的な少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３８】
本発明は、配列番号１９２に相補的な少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は少なくとも１６又は少なくとも１７又は１８の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３９】
本発明は、以下からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含む又はそれからなるオリゴヌクレオチドを提供する：
【化１１】
2020521491.tif 000012
それにおいて大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【００４０】
本発明は、式：
【化１２】
2020521491.tif 000013
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【００４１】
本発明は、式：
【化１３】
2020521491.tif 000014
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【００４２】
本発明は、式：
【化１４】
2020521491.tif 000015
のオリゴヌクレオチドを提供し、
それにおいて大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、下付き文字ｓはホスホロチオエートヌクレオシド間連結を表し、ｍＣは５メチルシトシンベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、ｍｃは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。
【００４３】
本発明は、実施例において提供するオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４４】
本発明は、本発明に従ったオリゴヌクレオチド、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合的に付着した少なくとも１つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲートを提供する。
【００４５】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートの医薬的に許容可能な塩を提供する。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は組成物を効果的な量で前記細胞に投与することにより、ＨＴＲＡ１を発現している細胞中でのＨＴＲＡ１発現のインビボ又はインビトロ調節方法を提供する。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、又はそのコンジュゲートの治療的又は予防的有効量を、疾患、障害、又は機能障害に罹患している又は罹患しやすい被験者に投与することを含む、ＨＴＲＡ１のインビボ活性に関連付けられる疾患、障害、又は機能障害を処置又は防止するための方法を提供する。
【００４８】
さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は組成物を、黄斑変性症、及びＨＴＲＡ１が関係している他の障害の処置又は防止のために使用する。
【００４９】
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎（例えば変形性関節症など）、家族性虚血性脳小血管疾患、アルツハイマー（Ａｌｚｈｉｅｍｅｒ’ｓ）病、及びパーキンソン病を含むリストより選択される疾患又は障害の処置における使用のための、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートを提供する。
【００５０】
本発明は、黄斑変性症、例えば湿潤型又は乾燥型加齢黄斑変性症（例、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地図状萎縮、早期ＡＭＤ、中間ＡＭＤ）、又は糖尿病性網膜症などの処置における使用のための、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートを提供する。
【００５１】
本発明は、黄斑変性症、例えば湿潤型又は乾燥型加齢黄斑変性症（例、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地図状萎縮、中間ｄＡＭＤなど）、又は糖尿病性網膜症の処置のための医薬の製造のための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は組成物の使用を提供する。
【００５２】
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎（例えば変形性関節症など）、家族性虚血性脳小血管疾患、アルツハイマー（Ａｌｚｈｉｅｍｅｒ’ｓ）病、及びパーキンソン病からなる群より選択される疾患又は障害の処置のための医薬の製造のための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は組成物の使用を提供する。
【００５３】
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎（例えば変形性関節症など）、家族性虚血性脳小血管疾患、アルツハイマー（Ａｌｚｈｉｅｍｅｒ’ｓ）病、及びパーキンソン病からなる群より選択される疾患又は障害に罹患している被験者の処置の方法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５４】
本発明は、眼疾患、例えば黄斑変性症など、例えば湿潤型又は乾燥型加齢黄斑変性症（例、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地図状萎縮、中間ｄＡＭＤ）など、又は糖尿病性網膜症に罹患している被験者の処置の方法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は組成物を被験者に投与する工程を含む。
【００５５】
本発明は、眼疾患、例えば黄斑変性症など、例えば湿潤型又は乾燥型加齢黄斑変性症（例、ｗＡＭＤ、ｄＡＭＤ、地図状萎縮、中間ＡＭＤ）など、又は糖尿病性網膜症に罹患している被験者の処置の方法を提供し、前記方法は、本発明のオリゴヌクレオチド又はその医薬的に許容可能な塩の少なくとも２つの投与量を、約１０μg〜２００μgの投与量において眼内注射で投与することを含み、それにおいて連続投与間の投与間隔は少なくとも４週間（即ち、投与間隔は≧４週間）、又は少なくとも毎月（即ち、投与間隔は≧１ヶ月）である。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１．ｎ＝２３１  ＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＵ２５１細胞株において５μMでスクリーニングした。残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲにより測定し、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として示す。位置５３１１３〜５３３８４の間にあるｎ＝１０のオリゴは比較的活性であった。
【図２】図２．ｎ＝２１０  ＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＵ２５１細胞株において５μMでスクリーニングした。残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲにより測定し、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として示す。位置５３１１３〜５３３８４の間にあるｎ＝３３のオリゴは比較的活性であった。
【図３】図３．ｎ＝３０５  ＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株においてそれぞれ５及び２５μMでスクリーニングした。残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルをｑＰＣＲにより測定し、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として示す。位置５３１１３〜５３３８４の間にあるｎ＝９５のオリゴは、残りと比較して比較的活性であった。
【図４】図４．ＬＮＡオリゴヌクレオチドを用いたヒト初代ＲＰＥ細胞の処理（１０日間の処理）時のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルの用量反応。組み換えたのは、Ｈｔｒａ１標的配列に関連しない組換え配列を伴う対照オリゴである。
【図５Ａ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｂ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｃ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｄ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｅ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｆ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図５Ｇ】図５．ＮＨＰ  ＰＫ／ＰＤ試験、ＩＶＴ投与、２５μg/眼。Ａ）ｑＰＣＲにより網膜において測定したＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｂ）オリゴＥＬＩＳＡにより測定した網膜におけるオリゴ含量。Ｃ）ＩＳＨにより例証するＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベル。Ｄ−Ｅ）ＩＰ−ＭＳによる網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルの定量。ドットは、個々の動物についてのデータを示す。エラーバーは、技術的な複製物についての標準誤差を示す（ｎ＝３）。Ｆ−Ｇ）ウェスタンブロットにより例証する網膜及び硝子体のそれぞれにおけるＨＴＲＡ１タンパク質レベルにおける低下。
【図６】図６．本発明の化合物（化合物番号６７、１）。化合物は、医薬的塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩など）の形態でありうる。
【図７】図７．本発明の化合物（化合物番号８６、１）。化合物は、医薬的塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩など）の形態でありうる。
【図８】図８．本発明の化合物（化合物番号７３、１）。化合物は、医薬的塩（例えばナトリウム塩又はカリウム塩など）の形態でありうる。
【図９】図９．化合物６７、１の医薬的塩の例：Ｍ＋は適切な陽イオン、典型的には正の金属イオン（例えばナトリウムイオン又はカリウムイオンなど）である。陽イオンとオリゴヌクレオチド陰イオンの化学量論比は、使用する陽イオンの電荷に依存する。適切には、１、２、又は３つの正電荷を伴う陽イオン（Ｍ＋、Ｍ＋＋、又はＭ＋＋＋を使用してもよい）。例証的な目的のために、二価陽イオン（例えばＣａ２＋など）と比較し、２倍多い単一＋電荷陽イオン（一価）（例えばＮａ＋又はＫ＋など）が必要とされる。
【図１０】図１０．化合物８６、１の医薬的塩の例：陽イオンＭ＋の記載については、図９についての図の説明を参照のこと。
【図１１】図１１．化合物７３、１の医薬的塩の例：陽イオンＭ＋の記載については、図９についての図の説明を参照のこと。
【図１２Ａ】図１２Ａ．化合物＃１５、３、及び＃１７をカニクイザルに硝子体内投与し、房水サンプルを注射後３、８、１５、及び２２日目に採取した。未希釈サンプルからのタンパク質は、Peggy Sue装置（Protein Simple）を使用したキャピラリー電気泳動により分析した。ＨＴＲＡ１は、カスタムメイドのポリコロナールウサギ抗血清を使用して検出した。動物＃Ｊ６０１５４（溶媒）、Ｊ６０１５８（Ｃ．  Ｉｄ＃１５，３）、Ｊ６０１６２（Ｃ．  Ｉｄ＃１７）からのデータを提示する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂ．シグナル強度を、精製した組換え（Ｓ３２８Ａ変異体）ＨＴＲＡ１タンパク質（Origene、＃ＴＰ７００２０８）との比較により定量化した。検量線をここに示す。
【図１２Ｃ−１】図１２Ｃ．上パネル：個々の動物から算出したＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での溶媒群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処置動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図１２Ｃ−２】図１２Ｃ．上パネル：個々の動物から算出したＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での溶媒群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処置動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図１２Ｃ−３】図１２Ｃ．上パネル：個々の動物から算出したＨＴＲＡ１房水濃度を、注射後の時間に対してプロットした。下パネル：各々の時間点での溶媒群についての平均ＨＴＲＡ１濃度を決定し、処置動物における対応する相対濃度を算出した。白丸：個々の値、黒丸：群平均。２２日目についてのＨＴＲＡ１低下（%）を示す。
【図１３】図１３．ＨＴＲＡ１転写産物を標的とする種々のＬＮＡ分子を用いて処置したカニクイザルにおける房水（青色菱形）中又は網膜（赤色四角）中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルに対してプロットしたＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ。値は、ＰＢＳ対照に対して標準化したパーセンテージとして表す。
【図１４】図１４．房水中のＨＴＲＡ１タンパク質と、（Ａ）網膜中のＨＴＲＡ１タンパク質及び（Ｂ）ＨＴＲＡ１転写産物を標的とする種々のＬＮＡ分子を用いて処置したカニクイザルにおける網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡとの相関。値は、ＰＢＳ対照に対して標準化したパーセンテージとして表す。
【００５７】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書中で使用する用語「オリゴヌクレオチド」は、２つ又はそれ以上の共有結合的に連結されたヌクレオシドを含む分子として当業者により一般的に理解されるように定義する。そのような共有結合的に結合されたヌクレオシドはまた、核酸分子又はオリゴマーとして言及されうる。オリゴヌクレオチドは一般に、実験室において固相化学合成、それに続く精製により作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合的に連結されたヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序、又はその修飾に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成し、典型的には精製又は単離する。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含みうる。
【００５８】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書中で使用する用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることにより標的遺伝子の発現を調節することが可能であるオリゴヌクレオチドとして定義する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、従ってｓｉＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。
【００５９】
連続ヌクレオチド領域
用語「連続ヌクレオチド領域」は、標的核酸に相補的であるオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中では、用語「連続ヌクレオチド配列」又は「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用してもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが連続ヌクレオチド領域中に存在する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは連続ヌクレオチド領域を含み、場合により、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に付着させるために使用されうるヌクレオチドリンカー領域を含みうる。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域のヌクレオチド間に存在するヌクレオシド間連結は、全てのホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００６０】
ヌクレオチド
ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然及び非天然ヌクレオチドの両方を含む。自然界では、ヌクレオチド（例えばＤＮＡヌクレオチド及びＲＮＡヌクレオチドなど）は、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び１つ又は複数のリン酸基（ヌクレオシド中には存在しない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「単量体」として互換的に言及してもよい。
【００６１】
修飾ヌクレオシド
本明細書中で使用する用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は（核酸）塩基部分の１つ又は複数の修飾の導入により、等価のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、本明細書中で、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「単量体」と互換的に使用してもよい。
【００６２】
修飾ヌクレオシド間連結
用語「修飾ヌクレオシド間連結」は、２つのヌクレオシドを共有結合的に共役させるホスホジエステル（ＰＯ）連結以外の連結として当業者により一般的に理解されているように定義する。修飾ヌクレオシド間連結を伴うヌクレオチドはまた、「修飾ヌクレオチド」と呼ぶ。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結によって、ホスホジエステル連結と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性が増加する。天然オリゴヌクレオチドについて、ヌクレオシド間連結は、隣接ヌクレオシド間にホスホジエステル結合を作製するリン酸基が含まれる。修飾ヌクレオシド間連結は、インビボでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化する際に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域で、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内の、ならびに修飾ヌクレオシドの領域中のヌクレアーゼ切断に対して保護するのに役立ちうる。
【００６３】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然ホスホジエステルから、例えばヌクレアーゼ攻撃により耐性のある連結へ修飾された１つ又は複数のヌクレオシド間連結を含む。ヌクレアーゼ耐性は、血清中でオリゴヌクレオチドをインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより決定してもよく、両方とも当技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することが可能であるヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結として言及する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結、又はその連続ヌクレオチド配列の全てを修飾する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基（例えばコンジュゲートなど）に連結するヌクレオシドがホスホジエステルでありうることが認識されるであろう。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結、又はその連続ヌクレオチド配列の全てがヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間連結である。
【００６４】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結はホスホロチオエートヌクレオシド間連結でありうる。一部の実施形態では、修飾ヌクレオシド間連結は、本発明のオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエートのＲＮａｓｅＨ動員と適合性がある。
【００６５】
一部の実施形態では、ヌクレオシド間連結は硫黄（Ｓ）（例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結など）を含む。
【００６６】
ホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、及び製造の容易さのために特に有用である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間連結、又はその連続ヌクレオチド配列の全てがホスホロチオエートである。
【００６７】
核酸塩基
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチド中に存在するプリン（例、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例、ウラシル、チミン、及びシトシン）部分を含む。本発明の文脈において、用語「核酸塩基」はまた、天然核酸塩基とは異なりうるが、しかし、核酸ハイブリダイゼーションの間に機能的である修飾核酸塩基を包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然核酸塩基（例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、及びヒポキサンチンなど）、ならびに非天然バリアントの両方を指す。そのようなバリアントは、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1において記載されている。
【００６８】
一部の実施形態では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジンなど、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオチミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、及び２−クロロ−６−アミノプリンより選択される核酸塩基などに変化させることにより修飾する。
【００６９】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基についての文字コード（例、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵ）により示してもよく、それにおいて各々の文字は、場合により、等価の機能の修飾核酸塩基を含みうる。例えば、例示するオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチルシトシンより選択する。場合により、ＬＮＡギャップマーのために、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドを使用してもよい。一部の実施形態では、５’ｃｇ３’モチーフ中のシトシン核酸塩基は５−メチルシトシンである。
【００７０】
修飾オリゴヌクレオチド
用語「修飾オリゴヌクレオチド」によって、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間連結を含むオリゴヌクレオチドを記載する。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを伴うオリゴヌクレオチドを記載するために文献において使用されてきた用語である。
【００７１】
相補性
用語「相補性」によって、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソンクリック塩基対形成のための能力を記載する。ワトソン−クリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を伴うヌクレオシドを含みうるが、例えば、５−メチルシトシンがシトシンの代わりにしばしば使用され、そのようなものとして、用語「相補性」は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基の間のワトソンクリック塩基対形成を包含することが理解されるであろう（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照のこと）。
【００７２】
本明細書中で使用する用語「%相補的」は、所与の位置で、別々の核酸分子（例、標的核酸）の所与の位置で連続ヌクレオチド配列と相補的である（即ち、それとワトソンクリック塩基対を形成する）核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド領域又は配列のパーセントでのヌクレオチド数を指す。パーセンテージは、２つの配列間で対を形成する、整列された塩基の数をカウントし、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数により除し、１００により乗じることにより算出する。そのような比較では、整列しない（塩基対を形成しない）核酸塩基／ヌクレオチドをミスマッチと呼ぶ。
【００７３】
２つの配列間の相補性に言及する場合、相補性の決定は、２つの配列のより短い方の長さ（例えば連続ヌクレオチド領域又は配列の長さなど）にわたって測定されることが理解されるであろう。
【００７４】
用語「完全に相補的」は１００%の相補性を指す。ミスマッチの%項値又は表示の非存在において、相補的は完全に相補的を意味する。
【００７５】
同一性
本明細書中で使用する用語「同一性」は、所与の位置で、別々の核酸分子（例、標的核酸）の所与の位置で連続ヌクレオチド配列と（即ち、相補的ヌクレオシドとワトソンクリック塩基対を形成するそれらの能力において）同一である核酸分子（例、オリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のパーセントでのヌクレオチド数を指す。パーセンテージは、２つの配列（ギャップを含む）間で同一である、整列された塩基の数をカウントし、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数により除し、１００により乗じることにより算出する。同一性パーセント＝（マッチ数×１００）／整列領域の長さ（ギャップを伴う）。
【００７６】
オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域の同一性を決定する場合、同一性を連続ヌクレオチド領域の長さにわたって算出する。オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列全体が連続ヌクレオチド領域である実施形態では、同一性は従って、オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の長さにわたって算出する。これに関して、連続ヌクレオチド領域は、参照核酸配列の領域と同一であってもよく、又は一部の実施形態では、参照核酸全体と同一であってもよい。他に示さない場合、参照配列と１００%の同一性を有する配列は同一であるとして言及する。
【００７７】
例えば、参照配列は、配列番号５〜１１１のいずれか１つからなる群より選択してもよい。
【００７８】
しかし、オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド領域、例えば領域Ｄ’又はＤ’’に隣接する追加のヌクレオチドを含む場合、これらの追加の隣接ヌクレオチドは、同一性を決定する場合に無視してもよい。一部の実施形態では、同一性をオリゴヌクレオチド配列全体にわたって算出してもよい。
【００７９】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一である少なくとも１０の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８０】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同であるの少なくとも１２の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８１】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一である少なくとも１３の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一である少なくとも１４の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一である少なくとも１５の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８４】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一である少なくとも１６の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１３〜１１８、又は配列番号５〜１１１・・からなる群より選択される配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２の連続ヌクレオチドなど、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列全体は、配列番号の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２の連続ヌクレオチドなど、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００８６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列は、配列番号１１９の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００８７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列は、配列番号１２０の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００８８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列は、配列番号１２１の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００８９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列は、配列番号１２２の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００９０】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列は、配列番号１２３の少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２など、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどからなる、又はそれで構成される。
【００９１】
本発明は、少なくとも１０、又は少なくとも１２、又は少なくとも１３、又は少なくとも１４又は少なくとも１５又は少なくとも１６又は少なくとも１７又は少なくとも１８の連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。配列番号１１８：５’ＣＴＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＧ３’。
【００９２】
一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は、配列番号６７と同一の１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続ヌクレオチドを含む。
【００９３】
一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は、配列番号７３と同一の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８の連続ヌクレオチドを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、連続ヌクレオチド領域は、配列番号８６と同一の１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６の連続ヌクレオチドを含む。
【００９５】
本発明は、長さ１１〜３０ヌクレオチド（例えば長さ１２〜２０ヌクレオチドなど）のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいてオリゴヌクレオチドは配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列と同一の連続ヌクレオチド配列を含む。
【００９６】
本発明は、連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド配列は、参照配列の少なくとも１０の連続ヌクレオチドにわたって配列番号５〜１１１からなる群より選択される参照配列と同一である。
【００９７】
本発明は、連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド配列は、参照配列の少なくとも１２の連続ヌクレオチドにわたって配列番号５〜１１１からなる群より選択される参照配列と同一である。
【００９８】
本発明は、連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド配列は、参照配列の少なくとも１４の連続ヌクレオチドにわたって配列番号５〜１１１からなる群より選択される参照配列と同一である。
【００９９】
本発明は、連続ヌクレオチド配列を含む又はそれからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、それにおいて連続ヌクレオチド配列は、参照配列の長さにわたって配列番号５〜１１１からなる群より選択される参照配列と同一である。
【０１００】
ハイブリダイゼーション
本明細書中で使用する用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例、オリゴヌクレオチド及び標的核酸）が反対鎖の塩基対間に水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成すると理解すべきである。２つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。それはしばしば、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖化される温度として定義される融解温度（Ｔｍ）の観点から記載される。生理学的条件Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）により反応の解離定数（Ｋｄ）に関連し、式中、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。従って、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水溶液の濃度が１Mであり、ｐＨが７であり、温度が３７℃である反応に関連付けられるエネルギーである。標的核酸へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは自発的な反応であり、自発的な反応について、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにおいて記載されている等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）方法の使用により実験的に測定することができる。当業者は、市販の機器をΔＧ°測定のために利用可能であることを知っているであろう。ΔＧ°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405により記載されている適宜導出された熱力学的パラメーターを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465により記載されているように、最近傍モデルを使用することにより数値的に推定することができる。  ハイブリダイゼーションによりその意図する核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、長さ１０〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の推定ΔＧ°値を伴い標的核酸にハイブリダイズする。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブス自由エネルギーΔＧ°により測定する。オリゴヌクレオチドは、長さ８〜３０ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満など、例えば−２０ｋｃａｌ未満など、例えば−２５ｋｃａｌ未満などの推定ΔＧ°値を伴い標的核酸にハイブリダイズしうる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０など、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ又は−１６〜−２７ｋｃａｌなど、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌなどの推定ΔＧ°値を伴い標的核酸にハイブリダイズする。
【０１０１】
標的配列
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子の部分配列に相補的である又はハイブリダイズする連続ヌクレオチド領域を含む。本明細書中で使用する用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に相補的である核酸塩基配列を含む標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。一部の実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域又は配列に相補的である標的核酸上の領域からなる。一部の実施形態では、標的配列は単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的化されうる標的核酸の好ましい領域を表す。
【０１０２】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸（例えば標的配列など）に相補的である連続ヌクレオチド領域を含む。
【０１０３】
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子中に存在する標的配列に相補的である又はハイブリダイズする少なくとも１０のヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含む。連続ヌクレオチド領域（従って、標的配列）は、少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２の連続ヌクレオチドなど、例えば１２〜２２からなど、例えば１４〜１８の連続ヌクレオチドからなどを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、及び１１８からなる群より選択される配列内に存在する。
【０１０５】
標的細胞
本明細書中で使用する用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。一部の実施形態では、標的細胞はインビボ又はインビトロでありうる。一部の実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば霊長類細胞など、例えばサル細胞又はヒト細胞などである。一部の実施形態では、標的細胞は、網膜細胞、例えば網膜色素上皮（ＰＲＥ）細胞などでありうる。一部の実施形態では、細胞は、ＲＰＥ細胞、双極細胞、アマクリン細胞、内皮細胞、神経節細胞、及びミクログリア細胞からなる群より選択する。インビトロ評価について、標的細胞は初代細胞又は樹立細胞株、例えばＵ２５１、ＡＲＰＥ１９・・・などである。
【０１０６】
標的核酸
本発明に従い、標的核酸は、哺乳動物ＨＴＲＡ１をコードする核酸であり、例えば、遺伝子、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及びプレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列でありうる。標的は従って、ＨＴＲＡ１標的核酸として言及されうる。
【０１０７】
適切には、標的核酸は、ＨＴＲＡ１タンパク質、特に哺乳動物ＨＴＲＡ１、例えばヒトＨＴＲＡ１などをコードする（例えば、ヒト及びラットＨＴＲＡ１についてのｍＲＮＡ及びプレｍＲＮＡ配列を提供する表１及び２を参照のこと）。
【０１０８】
一部の実施形態では、標的核酸は、配列番号１、２、３、及び４からなる群、又はその天然バリアント（例、哺乳動物ＨＴＲＡ１タンパク質をコードする配列）より選択する。
【０１０９】
標的細胞は、ＨＴＲＡ１標的核酸を発現している細胞である。好ましい実施形態では、標的核酸は、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ、例えばＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡ又はＨＴＲＡ１成熟ｍＲＮＡなどである。ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡのポリＡテールは典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化については無視する。
【０１１０】
研究又は診断において本発明のオリゴヌクレオチドを用いる場合、標的核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡから由来するｃＤＮＡ又は合成核酸でありうる。
【０１１１】
標的配列は、標的核酸の部分配列であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、ＨＴＲＡ１部分配列、例えば配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、又は２３１からなる群より選択される配列などに完全に相補的であるか、又は１つもしくは２つのミスマッチだけを含む。
【０１１２】
標的配列は、標的核酸の部分配列であってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、ＨＴＲＡ１部分配列、例えば配列番号１２４〜２３０からなる群より選択される配列などに完全に相補的であるか、又は１つもしくは２つのミスマッチだけを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド領域は、ＨＴＲＡ１部分配列配列番号２３１に完全に相補的であるか、又は１つもしくは２つのミスマッチだけを含む。
【０１１３】
標的又はその部分配列への相補性は、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域の長さにわたって測定する。
【０１１４】
インビボ又はインビトロでの適用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは典型的には、ＨＴＲＡ１標的核酸を発現している細胞においてＨＴＲＡ１標的核酸の発現を阻害することが可能である。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は典型的には、場合により、１つ又は２つのミスマッチの例外を伴い、及び場合により、オリゴヌクレオチドを任意の官能基、例えばコンジュゲート又は他の非相補的末端ヌクレオチドなどに連結しうるヌクレオチドベースのリンカー領域（例、領域Ｄ）を除くオリゴヌクレオチドの長さ全体にわたって測定した場合、ＨＴＲＡ１標的核酸に相補的である。標的核酸は、一部の実施形態では、ＲＮＡ又はＤＮＡ、例えばメッセンジャーＲＮＡなど、例えば成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡなどでありうる。一部の実施形態では、標的核酸は、哺乳動物ＨＴＲＡ１タンパク質（例えばヒトＨＴＲＡ１など）をコードするＲＮＡ又はＤＮＡ、例えば、配列番号１（ＮＭ＿００２７７５．４、ＧＩ：１９００１４５７５）として開示されているようなヒトＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ配列である。例示的な標的核酸に関するさらなる情報を表１＆２中に提供する。
【表１】
2020521491.tif 000016
【表２】
2020521491.tif 000017
【０１１５】
天然バリアント
用語「天然バリアント」は、標的核酸と同じ遺伝子座から由来するＨＴＲＡ１遺伝子又は転写物のバリアントを指すが、しかし、例えば、同じアミノ酸をコードするコドンの多様性を起こす遺伝コードの縮重のため、又はプレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は多型（例えば一塩基多型など）、及び対立遺伝子変異体の存在に起因して異なりうる。オリゴヌクレオチドに完全に相補的な配列の存在に基づき、本発明のオリゴヌクレオチドは従って、標的核酸及びその天然バリアントを標的としうる。一部の実施形態では、天然バリアントは、哺乳動物ＨＴＲＡ１標的核酸（例えば配列番号１、２、３、又は４からなる群より選択され標的核酸など）への少なくとも９５%、例えば少なくとも９８%又は少なくとも９９%などの相同性を有する。
【０１１６】
発現の調節
本明細書中で使用する用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＨＴＲＡ１の量と比較した場合にＨＴＲＡ１の量を変えるオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解される。あるいは、発現の調節は、本発明のオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験の参照により決定されうる。調節の１つの型は、例えば、ｍＲＮＡの分解又は転写の遮断によりＨＴＲＡ１の発現を阻害、下方調節、低下、抑制、除去、停止、遮断、防止、軽減、低減、回避、又は終結させるオリゴヌクレオチドの能力である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１の発現を阻害、下方調節、低下、抑制、除去、停止、遮断、防止、軽減、低減、回避、又は終結させることが可能である。
【０１１７】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、例えば融解温度（Ｔｍ）により測定されるように、オリゴヌクレオチド中に組み入れられた場合、その相補的標的についてのオリゴヌクレオチドの親和性を増強する修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシド当たり＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の間の融解温度における増加をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドならびにロックド核酸（ＬＮＡ）を含む（例、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照のこと）。
【０１１８】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾糖部分、即ち、ＤＮＡ及びＲＮＡ中に見出されるリボース糖部分と比較した場合での糖部分の修飾を有する１つ又は複数のヌクレオシドを含んでもよい。
【０１１９】
リボース糖部分の修飾を伴う多数のヌクレオシドが、主に、オリゴヌクレオチドの特定の特性、例えば親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などを改善する目的で作製されてきた。
【０１２０】
そのような修飾は、リボソーム環構造が、典型的にはリボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素の間にビラジクル架橋を有するヘキソース環（ＨＮＡ）、もしくは二環式環、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素の間の結合を欠く非連結リボース環（例、ＵＮＡ）を用いた置換により修飾されるものを含む。他の糖修飾ヌクレオシドは、例えば、ビシクロヘキソース核酸（ＷＯ２０１１／０１７５２１）又は三環式核酸（ＷＯ２０１３／１５４７９８）を含む。修飾ヌクレオシドはまた、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）、又はモルホリノ核酸の場合において糖部分が非糖部分で置換されているヌクレオシドを含む。
【０１２１】
糖修飾はまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドにおいて自然に見出される２’−ＯＨ基に変えることを介して作製される修飾を含む。置換基は、例えば、２’、３’、４’、又は５’の位置に導入してもよい。修飾糖部分を伴うヌクレオシドはまた、２’修飾ヌクレオシド（例えば２’置換ヌクレオシドなど）を含む。実際に、多くの焦点が２’置換ヌクレオシドの開発に当てられており、多数の２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に組み入れられた場合に有益な特性（例えば増強されたヌクレオシド耐性及び増強された親和性など）を有することが見出されている。
【０１２２】
２’修飾ヌクレオシド。
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位置にＨ又は−ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）、又は２’連結ビラジクルを含むヌクレオシドであり、２’置換ヌクレオシド及びＬＮＡ（２’−４’ビラジクル架橋）ヌクレオシドを含む。例えば、２’修飾糖は、オリゴヌクレオチドへの増強した結合親和性及び／又は増加したヌクレアーゼ耐性を提供しうる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えば  Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を是非参照のこと。以下は、２’置換修飾ヌクレオシドの例証である。
【化１５】
2020521491.tif 000018
【０１２３】
ロックド核酸ヌクレオシド（ＬＮＡ）
ＬＮＡヌクレオシドは、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’の間にリンカー基（ビラジクル又は架橋として言及する）を含む修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドはまた、文献において架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）と呼ぶ。
【０１２４】
一部の実施形態では、本発明のオリゴマーの修飾ヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドは、式Ｉ又はＩＩの一般構造を有する：
【化１６】
2020521491.tif 000019
式中、Ｗは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｒａ）−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−より選択し、例えば一部の実施形態では−Ｏ−などである；
Ｂは核酸塩基部分を指定する；
Ｚは、隣接ヌクレオシド又は５’末端基へのヌクレオシド間連結を指定する；
Ｚ＊は、隣接ヌクレオシド又は３’末端基へのヌクレオシド間連結を指定する；
Ｘは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなるリストより選択される群を指定する。
【０１２５】
一部の実施形態では、Ｘは、−Ｏ−、−Ｓ−、ＮＨ−、ＮＲａＲｂ、−ＣＨ２−、ＣＲａＲｂ、−Ｃ（＝ＣＨ２）−、及び−Ｃ（＝ＣＲａＲｂ）−からなる群より選択する。
【０１２６】
一部の実施形態では、Ｘは−Ｏ−である
Ｙは、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択された基を指定する。
【０１２７】
一部の実施形態では、Ｙは、−ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、−Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、及び−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−からなる群より選択する。
【０１２８】
一部の実施形態では、Ｙは、−ＣＨ２−、−ＣＨＲａ−、−ＣＨＣＨ３−、ＣＲａＲｂ−からなる群より選択する、
又は−Ｘ−Ｙ−は二価リンカー基（ラジクルとしても言及する）を一緒に指定し、−Ｃ（ＲａＲｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｃ（Ｒｂ）−、−Ｃ（Ｒａ）＝Ｎ−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒａ）２−、  −Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｎ（Ｒａ）−、及び＞Ｃ＝Ｚからなる群より選択される１、２、又は３の基／原子からなる二価リンカー基を一緒に指定する。
【０１２９】
一部の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は、−Ｘ−ＣＨ２−、−Ｘ−ＣＲａＲｂ−、−Ｘ−ＣＨＲａ−、−Ｘ−Ｃ（ＨＣＨ３）−、−Ｏ−Ｙ−、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨＣＨ３−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３ＣＨ３）−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、ＯＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−，−Ｏ−ＣＨ２ＯＣＨ２−、−Ｏ−ＮＣＨ２−、−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−、−ＮＲａ−ＣＨ２−、Ｎ−Ｏ−ＣＨ２、−Ｓ−ＣＲａＲｂ−、及び−Ｓ−ＣＨＲａ−からなる群より選択されるビラジクルを指定する。
【０１３０】
一部の実施形態では、−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を指定する。
式中、Ｚは−Ｏ−、−Ｓ−、及び−Ｎ（Ｒａ）−より選択し、
Ｒａ、及び存在する場合にはＲｂは、各々が、水素、場合により置換Ｃ１−６−アルキル、場合により置換Ｃ２−６−アルケニル、場合により置換Ｃ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、場合により置換Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲンより独立して選択され、ここでアリール及びヘテロアリールを場合により置換してもよく、ここで２つのジェミナル置換基Ｒａ及びＲｂは一緒に、場合により置換メチレン（＝ＣＨ２）を指定しうるが、それにおいて全てのキラル中心について、不斉基はＲ又はＳのいずれかの方向において見出されうる。
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、水素、場合により置換Ｃ１−６−アルキル、場合により置換Ｃ２−６−アルケニル、場合により置換Ｃ２−６−アルキニル、ヒドロキシ、Ｃ１−６−アルコキシ、Ｃ２−６−アルコキシアルキル、Ｃ２−６−アルケニルオキシ、カルボキシ、Ｃ１−６−アルコキシカルボニル、Ｃ１−６−アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、アリールオキシ−カルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ−カルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、  アミノ、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ、カルバモイル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）−アミノ−カルボニル、アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、モノ及びジ（Ｃ１−６−アルキル）アミノ−Ｃ１−６−アルキル−アミノカルボニル、Ｃ１−６−アルキル−カルボニルアミノ、カルバミド、Ｃ１−６−アルカノイルオキシ、スルホノ、Ｃ１−６−アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、Ｃ１−６−アルキルチオ、ハロゲンからなる群より独立して選択し、ここでアリール及びヘテロアリールは場合により置換されてもよく、ここで２つのジェミナル置換基は一緒にオキソ、チオキソ、イミノ、又は場合により置換メチレンを指定しうる。
【０１３１】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は、Ｃ１−６アルキル（例えばメチルなど）及び水素より独立して選択する。
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊は全て水素である。
【０１３３】
一部の実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て水素であり、Ｒ５及びＲ５＊のいずれかも水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方は水素以外、例えばＣ１−６アルキルなど（例えばメチルなど）である。
【０１３４】
一部の実施形態では、Ｒａは水素又はメチルのいずれかである。一部の実施形態では、存在する場合、Ｒｂは水素又はメチルのいずれかである。
【０１３５】
一部の実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が水素である。
【０１３６】
一部の実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方は水素であり、他方は水素以外である。
【０１３７】
一部の実施形態では、Ｒａ及びＲｂの一方はメチルであり、他方は水素である。
【０１３８】
一部の実施形態では、Ｒａ及びＲｂの両方がメチルである。
【０１３９】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ９８／０３９３５２、及びＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、それらを全て参照により本明細書により組み入れ、一般にベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ及びアルファ−Ｌ−オキシＬＮＡヌクレオシドとして公知であるものを含む  。
【０１４０】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなチオＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、それらを参照により本明細書により組み入れる。
【０１４１】
一部の実施形態では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−ＮＨ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなアミノＬＮＡヌクレオシドは、ＷＯ９９／０１４２２６及びＷＯ２００４／０４６１６０に開示されており、それらを参照により本明細書により組み入れる。
【０１４２】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−又は−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはＷＯ００／０４７５９９及びMorita et al, Bioorganic & Med. Chem. Lett. 12 73-76に開示されており、それらを参照により本明細書により組み入れ、一般に２’−Ｏ−４’Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）として公知であるものを含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の全て、ならびにＲ５及びＲ５＊の一方は水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方は水素以外、例えばＣ１−６アルキルなど（例えばメチルなど）である。そのような５’置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００７／１３４１８１に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。
【０１４４】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、Ｒａ及びＲｂの一方又は両方が水素以外、例えばメチルなどであり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３の全て、及びＲ５及びＲ５＊の一方は水素であり、Ｒ５及びＲ５＊の他方は水素以外、例えばＣ１−６アルキルなど（例えばメチルなど）である。そのようなビス修飾ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２０１０／０７７５７８に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。
【０１４５】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−（２’Ｏ−メトキシエチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を指定する。一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は、二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＣＨ３）−（２’Ｏ−エチル二環式核酸−Seth at al., 2010, J. Org. Chem. Vol 75(5) pp. 1569-81）を指定する。一部の実施形態では、ビラジカル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのような６’置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１００３６６９８及びＷＯ０７０９７００７１に開示されており、それらの両方を参照により本明細書により組み入れる。
【０１４６】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、当技術分野において環状ＭＯＥ（ｃＭＯＥ）として公知であり、ＷＯ０７０９７００７１に開示されている。
【０１４７】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は、Ｒ−又はＳ−配置のいずれかにおける二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−を提示する。一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は一緒に二価リンカー基−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−を指定する（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ（ＣＨ３）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのような６’メチルＬＮＡヌクレオシドはまた、当技術分野においてｃＥＴヌクレオシドとして公知であり、ＷＯ０７０９００７１（ベータ−Ｄ）及びＷＯ２０１０／０３６６９８（アルファ−Ｌ）に開示されているように、（Ｓ）ｃＥＴ又は（Ｒ）ｃＥＴ立体異性体のいずれかでありうるが、それらの両方を参照により本明細書により組み入れる。
【０１４８】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＲａＲｂ−であり、それにおいてＲａ又はＲｂはいずれも水素ではなく、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。一部の実施形態では、Ｒａ及びＲｂは両方ともメチルである。そのような６’二置換ＬＮＡヌクレオシドはＷＯ２００９００６４７８に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。
【０１４９】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｓ−ＣＨＲａ−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのような６’置換チオＬＮＡヌクレオシドはＷＯ１１１５６２０２に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。一部の６’置換チオＬＮＡの実施形態では、Ｒａはメチルである。
【０１５０】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｃ（＝ＣＨ２）−Ｃ（ＲａＲｂ）−、例えば-Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ２−、又は−Ｃ（＝ＣＨ２）−ＣＨ（ＣＨ３）−などであり、Ｗは  Ｏであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。そのようなビニルカルボＬＮＡヌクレオシドはＷＯ０８１５４４０１及びＷＯ０９０６７６４７に開示されており、それらの両方を参照により本明細書により組み入れる。
【０１５１】
一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（−ＯＲａ）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。一部の実施形態では、ＲａはＣ１−６アルキル（例えばメチルなど）である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、Ｎ置換ＬＮＡとして公知であり、ＷＯ２００８／１５０７２９に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は一緒に、二価リンカー基−Ｏ−ＮＲａ−ＣＨ３−を指定する（Seth at al., 2010, J. Org. Chem）。一部の実施形態では、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｎ（Ｒａ）−であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。一部の実施形態では、ＲａはＣ１−６アルキル（例えばメチルなど）である。
【０１５２】
一部の実施形態では、Ｒ５及びＲ５＊の一方又は両方が水素であり、置換される場合、Ｒ５及びＲ５＊の他方はＣ１−６アルキル（例えばメチルなど）である。そのような実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は全て水素であってもよく、ビラジクル−Ｘ−Ｙ−は−Ｏ−ＣＨ２−又は−Ｏ−Ｃ（ＨＣＲａ）−（例えば−Ｏ−Ｃ（ＨＣＨ３）−など）より選択してもよい。
【０１５３】
一部の実施形態では、ビラジクルは-ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−（例えばＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−など）であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。一部の実施形態では、ＲａはＣ１−６アルキル（例えばメチルなど）である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、立体構造的に制限されたヌクレオチド（ＣＲＮ）として公知であり、ＷＯ２０１３０３６６８６８に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。
【０１５４】
一部の実施形態では、ビラジクルは−Ｏ−ＣＲａＲｂ−Ｏ−ＣＲａＲｂ−（例えばＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−など）であり、ＷはＯであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、及びＲ５＊の全てが全て水素である。一部の実施形態では、ＲａはＣ１−６アルキル（例えばメチルなど）である。そのようなＬＮＡヌクレオシドはまた、ＣＯＣヌクレオチドとして公知であり、Mitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009 37(4), 1225-1238に開示されており、それを参照により本明細書により組み入れる。
【０１５５】
特定しない場合、ＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄ又はアルファ−Ｌ立体アイソフォームでありうることが認識されるであろう。
【０１５６】
ＬＮＡヌクレオシドの例をスキーム１において提示する。
【化１７】
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【０１５７】
実施例において例証するように、本発明の一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド中のＬＮＡヌクレオシドはベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドである。
【０１５８】
ヌクレアーゼ媒介性分解
ヌクレアーゼ媒介性分解は、相補的ヌクレオチド配列の分解を、そのような配列と二本鎖を形成する場合に媒介することが可能であるオリゴヌクレオチドを指す。
【０１５９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸のヌクレアーゼ媒介性分解を介して機能しうるが、ここで本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼ、特にエンドヌクレアーゼ、好ましくはエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、例えばＲＮａｓｅ  Ｈなどを動員することが可能である。ヌクレアーゼ媒介性機構を介して作動するオリゴヌクレオチド設計の例は、オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも５又は６のＤＮＡヌクレオシドの領域を含み、親和性増強ヌクレオシド、例えばギャップマー、ヘッドマー、及びテールマーにより片側又は両側に隣接するオリゴヌクレオチドである。
【０１６０】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子との二本鎖における場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員するためのその能力を指す。ＷＯ０１／２３６１３には、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのインビトロ方法が提供されており、それは、ＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するために使用されうる。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列を伴い提供された場合、テスト中の修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、しかし、ＤＮＡ単量体だけを含み、オリゴヌクレオチド中の全ての単量体間のホスホロチオエート連結を伴うオリゴヌクレオチドを使用し、ＷＯ０１／２３６１３の実施例９１〜９５（参照により本明細書により組み入れる）により提供される方法論を使用した場合に決定された初期速度（pmol/l/分で測定される）の少なくとも５%、例えば少なくとも１０%又は２０%超などを有する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能であると見なす。
【０１６１】
ギャップマー
本明細書中で使用する用語「ギャップマー」は、１つ又は複数の親和性増強修飾ヌクレオシド（隣接又はウィング）を含む領域により５’及び３’が隣接されたＲＮａｓｅ  Ｈ動員オリゴヌクレオチド（ギャップ）の領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す。種々のギャップマー設計を本明細書中に記載する。ヘッドマー及びテールマーは、隣接部の１つが欠落している、即ち、オリゴヌクレオチドの末端の１つだけが親和性増強修飾ヌクレオシドを含むＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能なオリゴヌクレオチドである。ヘッドマーについて、３’隣接部が欠落している（即ち、５’隣接部は親和性増強修飾ヌクレオシドを含む）。
【０１６２】
ＬＮＡギャップマー
用語「ＬＮＡギャップマー」は、親和性増強修飾ヌクレオシドの少なくとも１つがＬＮＡヌクレオシドであるギャップマーオリゴヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＬＮＡギャップマー中のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド及び／又は６’メチルベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド（例えば（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドなど）である。
【０１６３】
混合ウィングギャップマー
用語「混合ウィングギャップマー」は、隣接領域が少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド及び少なくとも１つの非ヌクレオシド修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも１つのＤＮＡヌクレオシド又は少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドなどを含むＬＮＡギャップマーを指す。一部の実施形態では、混合ウィングギャップマーは、ＬＮＡヌクレオシドを含む１つの隣接部（例、５’又は３’）を有し、他の隣接部（それぞれ３’又は５’）は２’置換修飾ヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、混合ウィングギャップマー中のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド及び／又は６’メチルベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド（例えば（Ｓ）ｃＥＴヌクレオシドなど）である。
【０１６４】
コンジュゲート
本明細書中で使用する用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃもしくは第３の領域）に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドを指す。
【０１６５】
本明細書中で使用する用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃもしくは第３の領域）に共有結合的に連結されたオリゴヌクレオチドを指す。
【０１６６】
一部の実施形態では、タンパク質（例えば酵素、抗体もしくは抗体断片又はペプチドなど）；親油性部分（例えば脂質、リン脂質、ステロールなど）；ポリマー（例えばポリエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなど）；受容体リガンド；小分子；レポーター分子；及び非ヌクレオシド糖からなる群より選択される非ヌクレオチド部分。
【０１６７】
リンカー
連結又はリンカーは、１つの化学基又は目的のセグメントを、１つ又は複数の共有結合を介して別の化学基又は目的のセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドに直接的に又は連結部分（例、リンカー又はテザー）を通じて付着させることができる。リンカーは、３番目の領域を共有的に接続するのに役立つ（例、オリゴヌクレオチドへのコンジュゲート部分（例、領域Ａ又はＣの末端））。
【０１６８】
本発明の一部の実施形態では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは場合により、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分の間に位置付けられるリンカー領域を含んでもよい。一部の実施形態では、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドの間のリンカーは生体切断可能である。
【０１６９】
哺乳動物の体内で通常遭遇する又は遭遇するものと類似の条件下で開裂可能である生理学的に不安定な結合を含む又はそれからなる生物分解性リンカー。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例、切断）を受ける条件は、化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件又は薬剤など、及び哺乳動物細胞中で見出される又は遭遇するものと類似の塩濃度を含む。哺乳動物の細胞内条件はまた、哺乳類細胞中に通常存在する酵素活性（例えばタンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどから）の存在を含む。一実施形態では、生物分解性リンカーはＳ１ヌクレアーゼ切断に感受性である。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、１と１０の間のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０のヌクレオシドなど、より好ましくは２と６の間のヌクレオシド、最も好ましくは少なくとも２つの連続ホスホジエステル連結、例えば少なくとも３つ又は４つ又は５つの連続ホスホジエステル連結などを含む２と４の間の連結ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。生物分解性リンカーを含むホスホジエステルは、ＷＯ２０１４／０７６１９５（参照により本明細書により組み入れる）により詳細に記載されており、本明細書中で領域Ｄとして言及してもよい。
【０１７０】
コンジュゲートはまた、非生物分解性リンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結してもよく、又は一部の実施形態では、コンジュゲートは、生物分解性リンカーに共有結合的に付着された非切断性リンカーを含んでもよい。必ずしも生物分解性ではないが、しかし、主にコンジュゲート部分をオリゴヌクレオチド又は生物分解性リンカーに共有結合的に接続するのに役立つリンカー。そのようなリンカーは、反復単位（例えばエチレングリコール、アミノ酸単位、又はアミノアルキル基など）の鎖構造又はオリゴマーを含んでもよい。一部の実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、アミノアルキル、例えばＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基など（例えば、Ｃ６からＣ１２アミノアルキル基を含む）である。一部の実施形態では、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基はルーチン的には、コンジュゲート基上のアミノ修飾オリゴヌクレオチド及び活性化エステル基の使用を介してオリゴヌクレオチドに付着されうる。
【０１７１】
処置
本明細書中で使用する用語「処置」は、既存の疾患（例、本明細書中で言及する疾患又は障害）の処置、又は疾患の防止（即ち、予防）の両方を指す。従って、本明細書中で言及する処置は、一部の実施形態では予防的でありうることが認識されるであろう。
【０１７２】
発明の詳細な説明
本発明のオリゴヌクレオチド
本発明は、ＨＴＲＡ１の発現を阻害することが可能なオリゴヌクレオチドに関する。調節は、ＨＴＲＡ１をコードする、又はＨＴＲＡ１の調節において含まれる標的核酸にハイブリダイズすることにより達成されうる。標的核酸は、哺乳動物ＨＴＲＡ  １配列、例えば配列番号１、２、３、又は４からなる群より選択される配列などでありうる。
【０１７３】
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＨＴＲＡ１を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば哺乳動物ＨＴＲＡ１などである。
【０１７４】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、それを阻害又は下方調節することにより標的の発現を調節することが可能である。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも２０%（例えば標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、又は９０%の阻害など）の発現の阻害を産生する。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ＡＲＰＥ−１９細胞を使用してインビトロで、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０%又は７０%だけ阻害することが可能でありうる。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ＡＲＰＥ−１９細胞を使用してインビトロで、ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡの発現レベルを少なくとも６０%又は７０%だけ阻害することが可能でありうる。一部の実施形態では、本発明の化合物は、ＡＲＰＥ−１９細胞を使用してインビトロで、ＨＴＲＡ１タンパク質の発現レベルを少なくとも５０%だけ阻害することが可能でありうる。適切には、実施例は、ＨＴＲＡ１  ＲＮＡ又はタンパク質阻害を測定するために使用されうるアッセイを提供する。標的調節は、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列と標的核酸の間でのハイブリダイゼーションにより引き起こされる。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間でのミスマッチを含む。ミスマッチにもかかわらず、標的核酸へのハイブリダイゼーションは、ＨＴＲＡ１発現の所望の調節を示すのに依然として十分でありうる。ミスマッチに起因する結合親和性の低下は、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチド数の増加及び／又はオリゴヌクレオチド配列内に存在する標的への結合親和性を増加させることが可能な修飾ヌクレオシド（例えばＬＮＡを含む２’修飾ヌクレオシドなど）数の増加により有利に代償されうる。
【０１７５】
本発明の一態様は、ＨＴＲＡ１標的配列に対して少なくとも９０%の相補性を伴う（例えばＨＴＲＡ１標的配列に完全に相補的であるなど）長さ１０〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド（例、配列番号１、２、３＆４からなる群より選択される核酸）に関する。
【０１７６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の領域と少なくとも９０%相補的である、例えば少なくとも９１%など、例えば少なくとも９２%など、例えば少なくとも９３%など、例えば少なくとも９４%など、例えば少なくとも９５%など、例えば少なくとも９６%など、少なくとも９７%など、例えば少なくとも９８%など、又は１００%相補的である連続配列を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００%相補的）であり、又は一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間に１つ又は２つのミスマッチを含みうる。
【０１７８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１１９、１２０、１２１、１２２、又は１２３からなる群より選択される配列の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１７９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１２４−２３０からなる群より選択される配列の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８０】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８６の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８１】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９２の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８２】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２０５の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８６の領域に少なくとも９０%相補的であり、完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９２の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１３ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２０５の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、及び２３１からなる群より選択される配列に完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８６の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１８８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９２の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全（又は１００%）相補的である。
【０１８９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２０５の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９０】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１５ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８６の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９１】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１５ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９２の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９２】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１５ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２０５の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、及び２３１からなる群より選択される配列に完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８６の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６、例えば１６、１７、もしくは１８ヌクレオチドなどの連続ヌクレオチド配列は、配列番号１９２の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号２０５の領域に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、及び２３１からなる群より選択される配列からなる群より選択される配列に完全に（又は１００%）相補的であり。
【０１９８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１２４〜２３０からなる群より選択される配列からなる群より選択される配列に完全に（又は１００%）相補的である。
【０１９９】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１８６に完全に（又は１００%）相補的である。
【０２００】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号１９２に完全に（又は１００%）相補的である。
【０２０１】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号２０５に完全に（又は１００%）相補的である。
【０２０２】
オリゴヌクレオチドモチーフ配列は、例えば、ヌクレアーゼ耐性及び／又は標的核酸への結合親和性を増加させるために修飾することができることが理解される。修飾は、定義において及び「オリゴヌクレオチド設計」のセクションにおいて記載している。
【０２０３】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、標的核酸の領域に完全に相補的（１００%相補的）である、又は一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間に１つ又は２つのミスマッチを含みうる  。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、標的核酸配列に少なくとも９０%相補的であり、例えば完全に（又は１００%）相補的である。
【０２０４】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列に対して１００%の同一性を有する。
【０２０５】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１４ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列に対して１００%の同一性を有する。
【０２０６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその少なくとも１６ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、配列番号５〜１１１からなる群より選択される配列に対して１００%の同一性を有する。
【０２０７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、配列番号５〜１１１より選択される配列を含む、又はそれからなる。
【０２０８】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは以下の群より選択する（標的部分配列はオリゴヌクレオチドモチーフの逆相補体であることに注意すること）：
【表３】
2020521491.tif 000021
2020521491.tif 000022
2020521491.tif 000023
2020521491.tif 000024
又はそのコンジュゲート；化合物の設計と題された欄について、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、シトシンヌクレオシドは場合により５メチルシトシンであり、ヌクレオシド間連結は少なくとも８０%、例えば少なくとも９０%又は１００%修飾ヌクレオシド間連結など、例えばホスホロチオエートヌクレオシド間連結などである。一部の実施形態では、上の表中の化合物設計欄中の化合物の全てのヌクレオシド間連結が、ホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。モチーフ及び標的部分配列は核酸塩基配列である。
【０２０９】
本発明は、以下のオリゴヌクレオチドを提供する：
【表４】
2020521491.tif 000025
2020521491.tif 000026
2020521491.tif 000027
2020521491.tif 000028
又はそのコンジュゲート；それにおいて上の表の化合物において、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、全てのＬＮＡシトシンは５−メチルシトシン（上付き文字ｍにより示す）であり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、小文字ｃの前の上付き文字ｍは５メチルシトシンＤＮＡヌクレオシドを表す。全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエートヌクレオシド間連結である。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド設計
オリゴヌクレオチド設計は、オリゴヌクレオチド配列におけるヌクレオシド糖修飾のパターンを指す。本発明のオリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシドを含み、ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドも含みうる。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡヌクレオシドを含む。本発明のオリゴヌクレオチド中への修飾ヌクレオシドの組み入れによって、標的核酸についてのオリゴヌクレオチドの親和性が増強しうる。その場合において、修飾ヌクレオシドは、親和性増強修飾ヌクレオチドとして言及することができる。
【０２１１】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、又は少なくとも１６の修飾ヌクレオシドなどを含む。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１〜１０の修飾ヌクレオシド、例えば２〜９の修飾ヌクレオシドなど、例えば３〜８の修飾ヌクレオシドなど、例えば４〜７の修飾ヌクレオシドなど、例えば６又は７の修飾ヌクレオシドなどを含む。一実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは、これら３種類の修飾（修飾糖、修飾核酸塩基、及び修飾ヌクレオシド間連結）又はそれらの組み合わせより独立して選択される修飾を含みうる。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の糖修飾ヌクレオシド、例えば２’糖修飾ヌクレオシドなどを含む。好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ、及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される１つ又は複数の２’糖修飾ヌクレオシドを含む。さらにより好ましくは、１つ又は複数の修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
【０２１２】
一部の実施形態では、修飾ヌクレオシドの少なくとも１つはロックド核酸（ＬＮＡ）であり、修飾ヌクレオシドの例えば少なくとも２など、例えば少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、又は少なくとも８つはＬＮＡである。さらなる実施形態では、全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡである。
【０２１３】
さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾ヌクレオシド間連結を含む。好ましい実施形態では、連続ヌクレオチド配列内のヌクレオシド間連結は、ホスホロチオエート又はボラノホスフェートのヌクレオシド間連結である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの連続配列中の全てのヌクレオチド間連結は、ホスホロチオエート連結である。
【０２１４】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２’−ＭＯＥ−ＲＮＡである少なくとも１つの修飾ヌクレオシド、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の２’−ＭＯＥ−ＲＮＡヌクレオシド単位などを含む。一部の実施形態では、前記修飾ヌクレオシドの少なくとも１つが２’−フルオロＤＮＡ、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０の２’−フルオロ−ＤＮＡヌクレオシド単位などである。
【０２１５】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ単位、例えば１、２、３、４、５、６、７、又は８のＬＮＡ単位など、例えば２〜６のＬＮＡ単位など、例えば３〜７のＬＮＡ単位など、４〜８のＬＮＡ単位、又は３、４、５、６、もしくは７のＬＮＡ単位を含む。一部の実施形態では、全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。一部の実施形態では、全てのＬＮＡシトシン単位は５−メチル−シトシンである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域は、ヌクレオチド配列の５’末端に少なくとも１つのＬＮＡ単位及び３’末端に少なくとも２つのＬＮＡユニットを有する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド中に存在する全てのシトシン核酸塩基は、５−メチル−シトシンである。
【０２１６】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは少なくとも１つのＬＮＡ単位及び少なくとも１つの２’置換修飾ヌクレオシドを含む。
【０２１７】
本発明の一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは２’糖修飾ヌクレオシド及びＤＮＡ単位の両方を含む。
【０２１８】
本発明の一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能である。
【０２１９】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド領域はギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０２２０】
ギャップマー設計
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド領域は、本明細書中で単に「ギャップマー」としても言及されるギャップマー設計又は構造を有する。ギャップマー構造では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも３つの異なる構造領域、５’−隣接部、ギャップ、及び３’−隣接部、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を「５−＞３」方向に含む。この設計において、隣接領域Ｆ及びＦ’（ウィング領域とも呼ぶ）は、領域Ｇに隣接する少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシドを含み、一部の実施形態では、２〜７の糖修飾ヌクレオシドの連続ストレッチ、又は糖修飾及びＤＮＡヌクレオシドの連続ストレッチ（糖修飾及びＤＮＡヌクレオシドの両方を含む混合ウィング）を含みうる。結果的に、ギャップ領域に隣接する５’隣接領域及び３’隣接領域のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド（例えば２’修飾ヌクレオシドなど）である。ギャップ領域Ｇは、オリゴヌクレオチドがＨＴＲＡ１標的核酸との二本鎖中にある場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することが可能である連続ヌクレオチドのストレッチを含む。一部の実施形態では、領域Ｇは、５〜１６のＤＮＡヌクレオシドの連続ストレッチを含む。ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’はＨＴＲＡ１標的核酸に相補的であり、従って、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域でありうる。
【０２２１】
領域Ｆ及びＦ’は、領域Ｇの５’及び３’末端に隣接し、１つ又は複数の親和性増強修飾ヌクレオシドを含みうる。一部の実施形態では、３’隣接部は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシド、好ましくは少なくとも２つのＬＮＡヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、５’隣接部は、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、５’及び３’隣接領域の両方がＬＮＡヌクレオシドを含む。一部の実施形態では、隣接領域中の全てのヌクレオシドがＬＮＡヌクレオシドである。他の実施形態では、隣接領域は、ＬＮＡヌクレオシド及び他のヌクレオシド（混合隣接部）の両方、例えばＤＮＡヌクレオシド及び／又は非ＬＮＡ修飾ヌクレオシドなど、例えば２’置換ヌクレオシドなどを含みうる。この場合では、ギャップは、親和性増強修飾ヌクレオシド、例えばＬＮＡなど（例えばベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡなど）により５’及び３’末端で隣接する少なくとも５つのＲＮａｓｅ  Ｈ動員ヌクレオシド（例えば５〜１６のＤＮＡヌクレオシドなど）の連続配列として定義する。
【０２２２】
領域Ｆ
領域Ｇの’５末端に付着した領域Ｆ（５’隣接部又は５’ウィング）は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７の修飾ヌクレオシドなどを含む、含有する、又はそれからなる。一部の実施形態では、領域Ｆは、１〜７の修飾ヌクレオシド、例えば２〜６の修飾ヌクレオシドなど、例えば２〜５の修飾ヌクレオシドなど、例えば２〜４の修飾ヌクレオシドなど、例えば１〜３の修飾ヌクレオシドなど、例えば１、２、３、又は４の修飾ヌクレオシドなどを含む、又はそれらからなる。
【０２２３】
一実施形態では、領域Ｆ中の修飾ヌクレオシドの１つ又は複数あるいは全てが、２’修飾ヌクレオシドである。
【０２２４】
さらなる実施形態では、領域Ｆ中の２’修飾ヌクレオシドの１つ又は複数は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位より選択する。
【０２２５】
本発明の一実施形態では、領域Ｆ中の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施形態では、領域Ｆ中のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ配置のいずれか又はそれらの組み合わせにおいて、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群より独立して選択する。好ましい実施形態では、領域Ｆは、連続配列の５’末端に少なくとも１つのベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ単位を有する。
【０２２６】
領域Ｇ
領域Ｇ（ギャップ領域）は、ＲＮａｓｅＨを動員することが可能な５〜１６の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、含有する、又はそれからなる。さらなる実施形態では、領域Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することが可能である５〜１２、又は６〜１０、又は７〜９、例えば８つなどの連続ヌクレオチド単位を含む、含有する、又はそれらからなる。
【０２２７】
さらなる実施形態では、領域Ｇ中の少なくとも１つのヌクレオシド単位は、ＤＮＡヌクレオシド単位、例えば４〜２０又は６〜１８のＤＮＡ単位、例えば５〜１６などである。一部の実施形態では、領域Ｇのヌクレオシドの全てが  ＤＮＡ単位である。
【０２２８】
さらなる実施形態では、領域Ｇは、ＤＮＡと、ＲＮａｓｅ  Ｈ切断を媒介することが可能な他のヌクレオシドとの混合物からなりうる。一部の実施形態では、領域Ｇのヌクレオシドの少なくとも５０%がＤＮＡ、例えば少なくとも６０%、少なくとも７０%、又は少なくとも８０%、又は少なくとも９０%のＤＮＡなどである。
【０２２９】
領域Ｆ’
領域Ｇの’３末端に付着した領域Ｆ’（３’隣接部又は３’ウィング）は、少なくとも１つの糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７の修飾ヌクレオシドなどを含む、含有する、又はそれからなる。一部の実施形態では、領域Ｆ’は、１〜７の修飾ヌクレオシド、例えば２〜６の修飾ヌクレオシドなど、例えば２〜５の修飾ヌクレオシドなど、例えば２〜４の修飾ヌクレオシドなど、例えば１〜３の修飾ヌクレオシドなど、例えば１、２、３、又は４の修飾ヌクレオシドなどを含む、又はそれらからなる。
【０２３０】
一実施形態では、領域Ｆ’中の修飾ヌクレオシドの１つ又は複数あるいは全てが、２’修飾ヌクレオシドである。
【０２３１】
さらなる実施形態では、領域Ｆ’中の２’修飾ヌクレオシドの１つ又は複数は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロＤＮＡ単位、２’−アルコキシＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位、及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位より選択する。
【０２３２】
本発明の一実施形態では、領域Ｆ’中の全ての修飾ヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。さらなる実施形態では、領域Ｆ’中のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄもしくはアルファ−Ｌ配置のいずれか又はそれらの組み合わせにおいて、オキシ−ＬＮＡ、チオ−ＬＮＡ、アミノ−ＬＮＡ、ｃＥＴ、及び／又はＥＮＡからなる群より独立して選択する。好ましい実施形態では、領域Ｆ’は、連続配列の５’末端に少なくとも１つのベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ単位を有する。
【０２３３】
領域Ｄ、Ｄ’、及びＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的である連続ヌクレオチド領域を含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、本明細書において領域Ｄとして言及する連続ヌクレオチド領域の５’及び／又は３’に位置付けられる追加のヌクレオチドをさらに含みうる。領域Ｄ’及びＤ’’は、それぞれ領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に付着させることができる。Ｄ領域（領域Ｄ’又はＤ’’）は、一部の実施形態では、標的核酸に相補的である連続ヌクレオチド配列の部分を形成しうる、又は他の実施形態では、Ｄ領域は標的核酸に非相補的でありうる。
【０２３４】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域、及び場合により１〜５の追加の５’ヌクレオチド（領域Ｄ’）からなる、又はそれを含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域、及び場合により１〜５の追加の３’ヌクレオチド（領域Ｄ’’）からなる、又はそれを含む。
【０２３６】
領域Ｄ’又はＤ’’は、標的核酸に相補的又は非相補的でありうる１、２、３、４、又は５の追加のヌクレオチドを独立して含みうる。この点において、本発明のオリゴヌクレオチドは、一部の実施形態では、追加のヌクレオチドにより５’及び／又は３’末端で隣接される標的を調節することが可能である連続ヌクレオチド配列を含みうる。そのような追加のヌクレオチドは、ヌクレアーゼ感受性の生物分解性リンカーとしての役割を果たしうるが、従って、官能基（例えばコンジュゲート部分など）を本発明のオリゴヌクレオチドに付着させるために使用されうる。一部の実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドを、ホスホジエステル連結を用いて連結し、ＤＮＡ又はＲＮＡでありうる。別の実施形態では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ安定性を増強するため、又は合成の容易さのために含まれうる修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド領域に加えて領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式により表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１−３−Ｆ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７−Ｄ’’１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’１−３−Ｆ１−７−Ｇ４−１２−Ｆ’１−７−Ｄ’’１−３
【０２３８】
製造の方法
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによりオリゴヌクレオチド中に含まれる共有結合的に連結された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドの製造のための方法を提供する。好ましくは、この方法ではホスホラミダイト化学を使用する（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照のこと）。さらなる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを医薬的に許容可能な希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法を提供する。
【０２３９】
医薬的塩
治療薬としての使用のために、本発明のオリゴヌクレオチドは、適切な医薬的塩（例えばナトリウム又はカリウム塩など）として提供してもよい。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドはナトリウム塩である。
【０２４０】
医薬的組成物
さらなる態様では、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートのいずれか、ならびに医薬的に許容可能な希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを含む医薬的組成物を提供する。医薬的に許容可能な希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、医薬的に許容可能な塩は、ナトリウム塩及びカリウム塩を含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、医薬的に許容可能な希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μM溶液の濃度で医薬的に許容可能な希釈剤中で使用する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜１０００μgの用量で投与する。
【０２４１】
ＷＯ  ２００７／０３１０９１では、医薬的に許容可能な希釈剤、担体、及びアジュバントの適切で好ましい例が提供されている（参照により本明細書により組み入れる）。適切な投与量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤もＷＯ２００７／０３１０９１において提供されている。
【０２４２】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬的組成物又は製剤の調製のために医薬的に許容可能な活性又は不活性物質と混合してもよい。医薬的組成物の製剤化のための組成及び方法は、多くの基準（投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含むがこれらに限定しない）に依存的である。
【０２４３】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特に、オリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、コンジュゲート部分は、一度プロドラッグが作用部位（例、標的細胞）に送達されると、オリゴヌクレオチドが切断される。
【０２４４】
適用
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療、及び予防のための研究試薬として利用されうる。
【０２４５】
研究では、そのようなオリゴヌクレオチドを使用し、細胞（例、インビトロ細胞培養）及び実験動物においてＨＴＲＡ１タンパク質の合成を特異的に調節し、それにより標的の機能分析又は治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を促進しうる。典型的には、標的調節は、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解又は阻害することにより達成し、それによりタンパク質形成を防止する、タンパク質を産生する遺伝子又はｍＲＮＡのモジュレーターを分解又は阻害する。
【０２４６】
診断では、オリゴヌクレオチドを使用し、ノーザンブロッティング、インサイチュハイブリダイゼーション、又は同様の技術により、細胞及び組織中でのＨＴＲＡ１発現を検出及び定量化しうる。
【０２４７】
治療のために、ＨＴＲＡ１の発現を調節することにより処置することができる疾患又は障害を有する疑いのある動物又はヒト。
【０２４８】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物の治療的又は予防的有効量を疾患に罹患している又は感受性である被験者に投与することを含む、疾患を処置又は防止するための方法を提供する。
【０２４９】
本発明はまた、医薬としての使用のための本明細書中で定義するオリゴヌクレオチド、組成物、又はコンジュゲートに関する。
【０２５０】
本発明に従ったオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物は、典型的には有効量で投与する。
【０２５１】
本発明はまた、本明細書中で言及する障害の処置のための医薬の製造について、又は本明細書中で言及する障害としての処置の方法について記載する本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用を提供する。
【０２５２】
疾患又は障害は、本明細書中で言及するように、ＨＴＲＡ１の発現に関連付けられる。一部の実施形態では、疾患又は障害は、ＨＴＲＡ１遺伝子、又はそのタンパク質産物がＨＴＲＡ１に関連付けられる、もしくは相互作用する遺伝子における変異に関連付けられうる。従って、一部の実施形態では、標的核酸はＨＴＲＡ１配列の変異形態であり、他の実施形態では、標的核酸はＨＴＲＡ１配列の調節因子である。
【０２５３】
本発明の方法は、好ましくは、ＨＴＲＡ１の異常なレベル及び／又は活性により起こされる疾患に対する処置又は予防のために用いる。
【０２５４】
本発明はさらに、ＨＴＲＡ１の異常なレベル及び／又は活性の処置のための医薬の製造のための、本明細書中で定義するオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物の使用に関する。
【０２５５】
一実施形態では、本発明は、眼障害、例えば黄斑変性症（加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、例えば乾燥型ＡＭＤ又は湿潤型ＡＭＤなどを含む）など、及び糖尿病性網膜症より選択される疾患又は障害の処置における使用のためのオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物に関する。一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬的組成物は、地図状萎縮又は中間ｄＡＭＤの処置における使用のためでありうる。ＨＴＲＡ１はまた、アルツハイマー病及びパーキンソン病において適応されており、従って、一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬的組成物は、アルツハイマー病又はパーキンソン病の処置における使用のためでありうる。ＨＴＲＡ１はまた、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎（例えば変形性関節症など）、家族性虚血性脳小血管疾患において適応されており、従って、一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬的組成物は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎（例えば変形性関節症など）、又は家族性虚血性脳小血管疾患の処置における使用のためでありうる。
【０２５６】
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は医薬的組成物は、局所（例えば皮膚、吸入、眼、又は耳など）又は経腸（例えば経口又は胃腸管を通じてなど）又は非経口（例えば静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、又は髄腔内など）投与しうる。
【０２５７】
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、又は医薬的組成物は、非経口経路（静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内注射もしくは注入、くも膜下腔内又は頭蓋内（例、脳内又は脳室内）投与を含む）により投与する。一部の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは静脈内投与する。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは皮下投与する。
【０２５８】
眼障害、例えば黄斑変性症など（例、ＡＭＤ（湿潤型又は乾燥型））を処置する際での使用のために、眼内注射を使用してもよい。
【０２５９】
一部の実施形態では、本発明の化合物、又はその医薬的に許容可能な塩は、眼内注射を介して、眼当たり約１０μg〜約２００μg、例えば眼当たり約５０μg〜約１５０μgなど、例えば眼当たり約１００μgなどの用量で投与する。一部の実施形態では、投与間隔、即ち、連続投与間の期間は、少なくとも１ヶ月１回、例えば少なくとも２ヶ月に１回、又は少なくとも３ヶ月に１回である。
【０２６０】
併用療法
一部の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬的組成物は、別の治療薬剤との併用処置における使用のためである。治療薬剤は、例えば、上に記載する疾患又は障害のための標準治療でありうる。
【０２６１】
実施例
材料及び方法
オリゴヌクレオチド合成
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野において一般的に公知である。以下は適用されうるプロトコールである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用される装置、支持体、及び濃度に関してわずかに変動する方法により製造されていたであろう。
【０２６２】
オリゴヌクレオチドは、１μmｏｌスケールのＯｌｉｇｏｍａｋｅｒ  ４８でのホスホルアミダイトアプローチを使用し、ウリジンユニバーサル支持体上で合成する。合成の終了時、オリゴヌクレオチドを、６０℃で５〜１６時間にわたりアンモニア水を使用して固体支持体から切断する。オリゴヌクレオチドを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により又は固相抽出により精製し、ＵＰＬＣにより特徴付けし、分子量をＥＳＩ−ＭＳによりさらに確認する。
【０２６３】
オリゴヌクレオチドの伸長：
β−シアノエチル−ホスホラミダイト（ＤＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｇ（ｉｂｕ）、ＤＮＡ−Ｃ（Ｂｚ）、ＤＮＡ−Ｔ、ＬＮＡ−５−メチル−Ｃ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）、ＬＮＡ−Ｇ（ｄｍｆ）、ＬＮＡ−Ｔ）の共役を、アセトニトリル中の０．１Mの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイト及びアセトニトリル（０．２５M）中のＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）（アクティベーターとして）の溶液を使用して実施する。最終サイクルについては、所望の修飾を伴うホスホルアミダイトを使用することができる（例、コンジュゲート基又はコンジュゲート基自体を付着させるいためのＣ６リンカー）。ホスホロチオエート連結の導入のためのチオール化は、キサンタン水素化物（アセトニトリル／ピリジン９：１中０．０１M）を使用して行う。ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｒｄｉｅｓｔｅｒ）連結を、ＴＨＦ／ピリジン／水７：２：１中の０．０２Mヨウ素を使用して導入することができる。試薬の残りは、オリゴヌクレオチド合成のために典型的に使用されるものである。
【０２６４】
固相合成後のコンジュゲーションについては、市販のＣ６アミノリンカーホルホラミダイト（ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を固相合成の最後のサイクルにおいて使用することができ、脱保護及び固体支持体からの切断後、アミノ連結された脱保護オリゴヌクレオチドを単離する。コンジュゲートを、標準的な合成方法を使用して官能基の活性化を介して導入する。
【０２６５】
ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：
粗化合物を、Phenomenex Jupiter C18 10μ  １５０×１０mmカラムでの分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ  ８）及びアセトニトリルを、５mL/分の流速で緩衝液として使用する。収集した画分を凍結乾燥し、典型的には白色固体として精製化合物を与える。
【０２６６】
略語：
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＴ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
Ｂｚ：ベンゾイル
イブ：イソブチリル
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
【０２６７】
Ｔｍアッセイ：
オリゴヌクレオチド及びＲＮＡ標的（リン酸連結、ＰＯ）二本鎖を５００mlのＲＮａｓｅフリー水中で３mMに希釈し、５００mlの２×Ｔｍ緩衝液（２００mM  ＮａＣｌ、０．２mM  ＥＤＴＡ、２０mM  Ｎａリン酸、ｐＨ  ７．０）と混合する。溶液を３分間にわたり９５℃に加熱し、次に室温で３０分間にわたりアニールする。二重融解温度（Ｔｍ）を、PE Templabソフトウェア（Perkin Elmer）を使用し、ペルチェ温度プログラマーＰＴＰ６を備えたLambda 40 UV/VIS分光光度計で測定する。温度を２０℃から９５℃に上昇させ、次に２５℃に下落させ、２６０nmでの吸収を記録する。融解及びアニーリングの両方の１次導関数及び局所最大値を使用して二本鎖Ｔｍを評価する。
【０２６８】
使用するオリゴヌクレオチド：
【表５】
2020521491.tif 000029
2020521491.tif 000030
2020521491.tif 000031
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【０２６９】
実施例１．単一濃度でのＵ２５１細胞株におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ効力の試験。
ＨＴＲＡ１についての有望な「ホットスポット」領域の同定。ｎ＝２３１のＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドのライブラリーをＵ２５１細胞株において５μM、６日間の処理でスクリーニングした。このライブラリーから、本発明者らは、図１（配列番号１１６又は１１７）に示すように、位置５３１１３〜５３３８４の間のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡを標的とする一連の活性オリゴヌクレオチドを同定した。
【０２７０】
ヒト膠芽腫Ｕ２５１細胞株をＥＣＡＣＣから購入し、供給者により推奨されるように５%ＣＯ２を伴う３７℃で、加湿インキュベーター中で維持した。アッセイのために、９６マルチウェルプレートにおいて、１５０００個のＵ２５１細胞／ウェルを飢餓培地（１０%の代わりの１%ＦＢＳを除く、供給者により推奨される培地）中に播種した。細胞を、ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、２４時間にわたりインキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度：５μM。オリゴヌクレオチドの添加後３〜４日に、培地を除去し、新しい培地（オリゴヌクレオチドを伴わない）を加えた。オリゴヌクレオチドの添加後６日に、細胞を回収した。ＲＮＡを、PureLink Pro 96 RNA精製キット（Ambion、製造者の指示に従う）を使用して抽出した。ｃＤＮＡを次に、Ｍ−ＭＬＴ逆転写酵素、ランダム１０量体RETROscript、ＲＮａｓｅ阻害剤（Ambion、製造者の指示に従う）と１００mM  ｄＮＴＰセットＰＣＲグレード（Invitrogen）及びＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ不含水（Gibco）を使用して合成した。遺伝子発現分析のために、ｑＰＣＲを、TagMan Fast Advanced Master Mix（２×）（Ambion）を使用し、二重設定において実施した。以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲのために使用した：Life TechnologiesからのＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１（ＦＡＭ−ＭＧＢ）、及びハウスキーピング遺伝子、ＴＢＰ、Ｈｓ４３２６３２２Ｅ（ＶＩＣ−ＭＧＢ）。ｎ＝２つの非依存的な生物学的複製物。表中の残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として示す。
【表６】
2020521491.tif 000033
【０２７１】
実施例２．単一濃度でのＵ２５１細胞株におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ効力の試験。
実施例１において記載する「ホットスポット」領域５３１１３〜５３３８４を、５μMでＵ２５１細胞株においてスクリーニングされたｎ＝２１０のＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドの新たなライブラリー中でさらに検証した。ｎ＝３３のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、位置５３１１３〜５３３８４の間でヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡを標的としたが、これらのオリゴは、図２に示すように、残りとの比較において、比較的活性であった。
【０２７２】
アッセイを、実施例１に記載するように実施した。ｎ＝２つの非依存的な生物学的複製物。残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として表中に示す。
【表７】
2020521491.tif 000034
【０２７３】
実施例３．単一濃度でのＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株におけるＬＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ効力の試験。
実施例１及び２に記載する「ホットスポット」領域５３１１３〜５３３８４を、それぞれ５μM及び２５μMでＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株でスクリーニングされたｎ＝３０５のＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドの新たなライブラリーにおいてさらに検証した。ｎ＝９５のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、位置５３１１３〜５３３８４の間でヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡを標的としたが、これらのオリゴは、図３に示すように、残りとの比較において、比較的活性であった。
【０２７４】
ヒト網膜色素上皮ＡＲＰＥ１９細胞株をＡＴＣＣから購入し、３７℃、５%ＣＯ２の加湿インキュベーターにおいてＤＭＥＭ−Ｆ１２（Sigma、Ｄ８４３７）、１０%ＦＢＳ、１%ペニシリン／ストレプトマイシン中で維持した。Ｕ２５１細胞株を実施例１において記載する。アッセイのために、２０００個のＵ２５１又はＡＲＰＥ１９細胞／ウェルを、９６マルチウェルプレートにおいて、供給者により推奨される培地中に播種した。細胞を、ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、２時間にわたりインキュベートした。オリゴの濃度は、Ｕ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞中でそれぞれ５及び２５μMであった。オリゴヌクレオチドの添加後４日に細胞を回収した。ＲＮＡ抽出を、実施例１に記載するように実施し、ｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲを、qScript XLTワンステップRT-qPCR Toughmix Low ROX、９５１３４−１００（Quanta Biosciences）を使用して実施した。以下のTaqManプライマーアッセイを、二重設定においてＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞のために使用した：ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１（ＦＡＭ−ＭＧＢ）、及びハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ４３１０８８４Ｅ（ＶＩＣ−ＭＧＢ）。全てのプライマーセットをLife Technologiesから購入した。ｎ＝１の生物学的複製物。表中の相対的なＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを、対照（ＰＢＳ処理細胞）の%として示す。
【表８】
2020521491.tif 000035
2020521491.tif 000036
2020521491.tif 000037
【０２７５】
実施例４．用量反応曲線におけるＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株中での選択化合物のインビトロ効力及び有効性の試験。
Ｕ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株をそれぞれ実施例１及び３に記載した。Ｕ２５１アッセイを、実施例１に記載するとおりに実施した。ＡＲＰＥ１９アッセイを以下のように実施した：５０００個のＡＲＰＥ１９細胞／ウェルを、９６マルチウェルプレートにおいて、供給者により推奨される培地（１０%の代わりの１%ＦＢＳを除く）中に播種した。細胞を、ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、２時間にわたりインキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μMから、半対数希釈、８ポイント。オリゴヌクレオチドの添加後４日に細胞を回収した。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及びｑＰＣＲを、実施例１に記載するように実施した。ｎ＝２の非依存的な生物学的複製物。５０μMでのＥＣ５０値及び残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、対照の%（ＰＢＳ）として表中に示す。
【表９】
2020521491.tif 000038
【０２７６】
実施例５．用量応答曲線におけるＵ２５１及びＡＲＰＥ１９細胞株中での選択化合物のインビトロ効力及び有効性の試験。
アッセイを、実施例３に記載するように実施した。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μMから、半対数希釈、８ポイント。それぞれＵ２５１及びＡＲＰＥ１９についてのｎ＝２及びｎ＝１の非依存的な生物学的複製物。５０μMでのＥＣ５０値及び残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、対照の%（ＰＢＳ）として表中に示す。
【表１０】
2020521491.tif 000039
【０２７７】
実施例６．用量応答曲線におけるＵ２５１細胞株中での選択化合物のインビトロ効力及び有効性の試験。
アッセイを、実施例３に記載するように実施した。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μMから、半対数希釈、８ポイント。ｎ＝２の非依存的な生物学的複製物。５０μMでのＥＣ５０値及び残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、対照の%（ＰＢＳ）として表中に示す。
【表１１】
2020521491.tif 000040
【０２７８】
実施例７．用量反応曲線におけるＵ２５１細胞株中での選択化合物のインビトロ効力及び有効性の試験。
ＡＲＰＥ１９細胞株を実施例３において記載した。アッセイのために、ＡＲＰＥ１９細胞、２４０００個細胞／ウェルを、９６マルチウェルプレートにおいて、１００μLの飢餓培地（１０%の代わりの１%ＦＢＳを除く、供給者により推奨される培養培地）中に播種した。細胞を、ＰＢＳ中に溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、２時間にわたりインキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μMから、半対数希釈、８ポイント。オリゴヌクレオチド化合物の添加後４及び７日目に、オリゴヌクレオチドを伴わない７５μLの新鮮な飢餓培地を細胞に加えた（古い培地の除去を伴わない）。ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及びｑＰＣＲを、実施例３に記載するように実施した。ｎ＝２の非依存的な生物学的複製物。５０μMでのＥＣ５０値及び残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡレベルを、対照の%（ＰＢＳ）として表中に示す。
【表１２】
2020521491.tif 000041
【０２７９】
実施例８
ヒト初代ＲＰＥ細胞中でのインビトロ有効性の試験。
ヒト初代網膜色素上皮（ｈｐＲＰＥ）細胞をSciencell（カタログ番号６５４０）から購入した。アッセイのために、５０００個のｈｐＲＰＥ細胞／ウェルを、ラミニン（ラミニン５２１、BioLamina  カタログ番号ＬＮ５２１−０３）でコーティングした９６マルチウェルプレートにおいて培養培地（EpiCM、Sciencell  カタログ番号４１０１）中に播種した。それらをこの培地で１週間にわたり増殖させ、以下の培地を２週間にわたり使用して分化させた：Ｎ１サプリメント（Sigma  カタログ番号Ｎ−６５３０）、グルタミン−ペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma  カタログ番号Ｇ−１１４６）、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ、Sigma  カタログ番号Ｍ−７１４５）、タウリン（Sigma  カタログ番号Ｔ−０６２５）、ヒドロコルチゾン（Sigma  カタログ番号Ｈ−０３９６６）、トリヨードサイロニン（Sigma  カタログ番号Ｔ−５５１６）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Sigma  カタログ番号Ａ−９６４７）を添加したＭＥアルファ培地（Sigma  カタログ番号Ｍ−４５２６）。細胞を加湿したインキュベーター中で３７℃、５%ＣＯ２で培養した。
【０２８０】
実験日に、細胞を、オリゴヌクレオチドの添加前に、新鮮な分化培地と１時間にわたりインキュベートした。これらをＰＢＳ中に溶解し、０日目及び４日目に細胞に適用した。７日目に培地を交換し、１０日目に細胞をβ−メルカプトエタノールを伴う５０μlのＲＬＴ緩衝液（Qiagen  カタログ番号７９２１６）で回収した。ＲＮＡの抽出は、ＤＮａｓｅ  Ｉ処理（カタログ番号７９２５４；ロット１５１０４２６７４）を含むQiagen RNeasy Mini Kit（カタログ番号７４１０４；ロット１５１０４８０７３）のユーザーマニュアルに従って実施した。ＲＮＡの品質管理は、Agilent Bioanalyzer Nano Kit（Agilent；カタログ番号５０６７−１５１１；ロット１４４６）を用いて実施した。ｃＤＮＡへのトータルＲＮＡの逆転写（ｃＤＮＡ合成）を、製造者の指示（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号４３６８８１４；ロット００３１４１５８）に従って、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ランダムヘキサマーオリゴヌクレオチドに基づく）を使用して実施した。ｃＤＮＡサンプルの測定を、７９００ＨＴリアルタイムＰＣＲ装置（Thermo Fisher Scientific）で、３８４ウェルプレートフォーマットにおいて３通りに行った。以下のTaqManプライマーアッセイをｑＰＣＲのために使用した：ＨＴＲＡ１、Ｈｓ０１０１６１５１＿ｍ１及びＨｓ００１７０１９７＿ｍ１、ハウスキーピング遺伝子、ＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１及びＰＰＩＡ、Ｈｓ９９９９９９０４＿ｍ１（Life Technologiesから）。ｎ＝３の生物学的複製物。残留ＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ発現レベルを図４及び次の表中に対照（ＰＢＳ）の%として示す。
【表１３】
2020521491.tif 000042
【０２８１】
実施例９．カニクイザルのインビボ薬物動態学及び薬力学試験、２１日間の処置、硝子体内（ＩＶＴ）注射、単回投与。
ノックダウンを、網膜中のｍＲＮＡならびに網膜中及び硝子体中のタンパク質レベルの両方で、位置５３１１３〜５３３８４の間のヒトＨＴＲＡ１プレｍＲＮＡにおいて「ホットスポット」を標的とする３つのＨＴＲＡ１  ＬＮＡオリゴヌクレオチドについて観察した（図５を参照のこと）。
【０２８２】
動物
全ての実験をカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）において実施した。
【０２８３】
４匹の動物を試験の各々の群中に含め、合計２０匹であった。
【０２８４】
化合物及び投与手順
ブプレノルフィン鎮痛剤を、試験化合物注射の前及び２日後に投与した。動物を、ケタミン及びキシラジンの筋肉内注射を用いて麻酔した。試験項目及び陰性対照（ＰＢＳ）を、テトラカイン麻酔薬の局所適用後の試験１日目に、麻酔動物の両眼において硝子体内投与（投与当たり５０μＬ）した。
【０２８５】
安楽死
生存期の終了時（２２日目）に、全てのサルを、ペントバルビタールの腹腔内及び過剰投与注射により安楽死させた。
【０２８６】
ｑＰＣＲによるＨｔｒａ１  ＲＮＡ発現のオリゴ含量測定及び定量化
安楽死の直後に、眼組織を氷上で素早く慎重に切開し、出荷まで−８０℃で保存した。網膜サンプルを７００μLのMagNa Pure 96 LC RNA Isolation Tissue緩衝液中で溶解し、Precellys Evolutionホモジナイザーを使用して２mlチューブ２×１．５分当たり１つのステンレススチールビーズを加え、それに続く室温での３０分間のインキュベートによりホモジナイズした。サンプルを１３０００rpm、５分間遠心分離した。半分を生物分析用に取っておき、残りの半分については、ＲＮＡ抽出を直接続けた。
【０２８７】
生物分析のために、サンプルを、ハイブリダイゼーションＥＬＩＳＡ方法を用いたオリゴ含量測定のために１０〜５０倍に希釈した。ビオチニル化ＬＮＡ捕捉プローブ及びジゴキシゲニン結合ＬＮＡ検出プローブ（両方とも５×ＳＳＣＴ中で３５nM、各々が検出されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの一端に相補的である）を希釈ホモジネート又は関連標準と混合し、ＲＴで３０分間にわたりインキュベートし、次にストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート（Nuncカタログ番号４３６０１４）に加えた。
【０２８８】
プレートを室温で１時間にわたりインキュベートし、２×ＳＳＣＴ（３００mM塩化ナトリウム、３０mMクエン酸ナトリウム、０．０５%ｖ／ｖ  Tween-20、ｐＨ  ７．０）中で洗浄した。捕捉されたＬＮＡ二本鎖を、アルカリホスファターゼ（Roche Applied Scienceカタログ番号１１０９３２７４９１０）及びアルカリホスファターゼ基質システム（Ｂｌｕｅ  Ｐｈｏｓ基質、KPL製品コード５０−８８−００）を結合させた抗ＤＩＧ抗体を使用して検出した。オリゴ複合体の量を、Biotekリーダーで６１５nmでの吸光度として測定した。
【０２８９】
ＲＮＡ抽出のために、細胞ＲＮＡ大容量キット（０５４６７５３５００１、Roche）を、ＤＮＡｓｅ処理を含む製造者の指示に従って、プログラム組織ＦＦ標準ＬＶ３．１を伴うMagNA Pure 96システムにおいて使用した。ＲＮＡの品質管理及び濃度を、Ｅｏｎリーダー（Biotek）を用いて測定した。ＲＮＡ濃度をサンプル全体で標準化し、その後のｃＤＮＡ合成及びｑＰＣＲを、qScript XLTワンステップRT-qPCR ToughMix Low ROX、９５１３４−１００（Quanta Biosciences）を使用し、ワンステップ反応において実施した。以下のTaqManプライマーアッセイをｓｉｎｇｐｌｅｘ反応において使用した：Ｈｔｒａ１、Ｍｆ０１０１６１５０＿、Ｍｆ０１０１６１５２＿ｍ１及びＲｈ０２７９９５２７＿ｍ１、ならびにハウスキーピング遺伝子、ＡＲＦＧＡＰ２、Ｍｆ０１０５８４８８＿ｇ１及びＲｈ０１０５８４８５＿ｍ１、及びＡＲＬ１、Ｍｆ０２７９５４３１＿ｍ１（Life Technologiesから）。ｑＰＣＲ分析をViiA7機器（Life Technologies）で実行した。眼／群：ｎ＝３眼。各々の眼を個別のサンプルとして処理した。相対的なＨｔｒａ１  ｍＲＮＡ発現レベルを対照（ＰＢＳ）の%として示す。
【０２９０】
組織学
眼球を取り出し、１０%中性緩衝ホルマリン中で２４時間にわたり固定し、トリミングしてパラフィン中に包埋した。
【０２９１】
ＩＳＨ分析のために、ホルマリン固定パラフィン包埋された厚さ４μMのカニクイザル網膜組織の切片を、RNAscope 2.5 VS Probe-Mmu-HTRA1、REF 486979(Advanced Cell Diagnostics, Inc.）を使用し、完全自動化Ventana Dicovery ULTRA染色モジュール（手順：mRNA Discovery Ultra Red 4.0 - v0.00.0152）を使用して処理した。使用する色素原はFastred、ヘマトキシリンＩＩ対比染色剤である。
【０２９２】
プレートベースの免疫沈降質量分析（ＩＰ−ＭＳ）アプローチを使用したＨＴＲＡ１タンパク質の定量化
サンプル調製、網膜
【０２９３】
網膜を、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用し、プロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free、Roche）を伴う４容量（ｗ／ｖ）のＲＩＰＡ緩衝液（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１mM  ＥＤＴＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中で均質化した。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を測定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０２９４】
サンプル調製、硝子体
硝子体液（３００μl）を、プロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free、Roche）を伴う５×ＲＩＰＡ緩衝液（最終濃度：５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２５%デオキシコール酸、１%ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて希釈し、Precellys 24（５５００、１５秒、２サイクル）を使用して均質化した。ホモジネートを遠心分離し（１３，０００rpm、３分）、上清のタンパク質含量を測定した（Pierce BCAタンパク質アッセイ）。
【０２９５】
プレートベースのＨＴＲＡ１免疫沈降及びトリプシン消化
９６ウェルプレート（Nunc MaxiSorp）を抗ＨＴＲＡ１マウスモノクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ＭＡＢ２９１６、５００μg/ウェル、ＰＢＳ  ５０μl）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳ（２００μl）で２回洗浄し、２０℃で３０分間にわたり、ＰＢＳ中の３%（ｗ／ｖ）ＢＳＡでブロックし、続いてＰＢＳで２回洗浄した。サンプル（７５μg網膜、５０μｌＰＢＳ中の１００μg硝子体）を無作為化し、プレートに加え、続いてシェーカー（１５０rpm）で４℃で一晩インキュベートした。プレートを次に、ＰＢＳで２回、水で１回洗浄した。５０mM  ＴＥＡＢ中の１０mM  ＤＴＴ（３０μl）を次に各々のウェルに加え、続いて２０℃で１時間にわたりインキュベートしてシステインスルフヒドリルを還元した。５０mM  ＴＥＡＢ（５μl）中の１５０mMヨードアセトアミドを次に各々のウェルに加え、システインスルフヒドリルをブロックするために、暗所で２０℃で３０分間にわたりインキュベートした。１０μlの消化液を各々のウェルに加え（最終濃度：１．２４ng/μlトリプシン、２０fmol/μlＢＳＡペプチド、２６fmol/μl同位体標識ＨＴＲＡ１ペプチド、１fmol/μlｉＲＴペプチド、Biognosys）、続いて２０℃で一晩インキュベートした。
【０２９６】
標的質量分析によるＨＴＲＡ１ペプチドの定量化（選択された反応モニタリング、ＳＲＭ）。
【０２９７】
質量分析を、TSQ Quantivaトリプル四重極質量分析計（Thermo Scientific）に共役されたUltimate RSLCnano LCで実施した。サンプル（２０μL）を、ＩＰのために使用する９６ウェルプレートから直接的に注入し、添加緩衝液（０．５%ｖ／ｖギ酸、２%ｖ／ｖ  ＡＣＮ）中のAcclaim Pepmap 100トラップカラム（１００μM×２cm、Ｃ１８、５μM、１００A、Thermo Scientific）に５μL/分で６分間にわたり添加した。ペプチドを次に、４０℃に加熱した統合エレクトロスプレーエミッターを伴うPepMap Easy-SPRAY分析カラム（７５μM×１５cm、３μM、１００A、Thermo Scientific）で、２５０nL/分の流量で以下の勾配を使用して分離した：６分、９８%緩衝液Ａ（２%ＡＣＮ、０．１%ギ酸）、２%緩衝液Ｂ（ＡＣＮ＋０．１%ギ酸）；３６分、３０%緩衝液Ｂ；４１分、６０%緩衝液Ｂ；４３分、８０%緩衝液Ｂ；４９分、８０%緩衝液Ｂ；５０分、２%緩衝液Ｂ。ＴＳＱＱｕａｎｔｉｖａを、以下のパラメーターを用いてＳＲＭモードで操作した：サイクル時間、１．５秒；スプレー電圧、１８００V；衝突ガス圧、２ｍＴｏｒｒ。Ｑ１及びＱ３分解能、０．７ＦＷＨＭ；イオン移動管温度３００℃。ＳＲＭ移行を、ＨＴＲＡ１ペプチド「ＬＨＲＰＰＶＩＶＬＱＲ」及び同位体標識（Ｌ−［Ｕ−１３Ｃ、Ｕ−１５Ｎ］Ｒ）合成バージョンで取得し、内部標準として使用した。
【０２９８】
データ分析は、Skylineバージョン３．６を使用して実施した。
【０２９９】
ウェスタンブロット
0.5 Precellysesチューブ（ＣＫ１４＿０．５ｍｌ、Bertin Technologies）中の切開した網膜サンプルを、プロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free Proteases-Inhibitor Mini、１１  ８３６  １７０  ００１、Roche）を伴うＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０−１８８、Milipore）中で溶解及びホモジナイズした。
【０３００】
硝子体サンプルを0.5 Precellysesチューブ（ＣＫ１４＿０．５ｍｌ、Bertin Technologies）に加え、プロテアーゼ阻害剤（Complete EDTA-free Proteases-Inhibitor Mini、１１  ８３６  １７０  ００１、Roche）を伴う１／４×ＲＩＰＡ溶解緩衝液（２０−１８８、Milipore）中でホモジナイズした。
【０３０１】
サンプル（網膜２０μgタンパク質、硝子体４０μgタンパク質）を還元条件下で、４〜１５%勾配ゲル（＃５６７−８０８４  Bio-Rad）で分析し、Trans-Blot Turbo Device（Bio-Radから）を使用してニトロセルロース（＃１７０−４１５９  Bio-Rad）にブロットした。
【０３０２】
一次抗体：ウサギ抗ヒトＨＴＲＡ１（ＳＦ１）はSascha Fauser（University of Cologne）からのご厚意である（マウス抗ヒトＧａｐｄｈ（＃９８７９５  Sigma-Aldrich））。二次抗体：ヤギ抗ウサギ８００ＣＷ及びヤギ抗マウス６８０ＲＤはＬｉ−Ｃｏｒからであった。
【０３０３】
ブロットをOdyssee CLX（Li-Corから）で画像化し、分析した。
【０３０４】
実施例１０‐カニクイザルのインビボ評価：房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質の測定ならびに網膜中でのＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ及びタンパク質阻害との比較。
実験方法：上の実施例を参照のこと。実施例９の硝子体液サンプルに従って、房水サンプルを採取し、サンプルを調製した。カニクイザルの房水サンプル（ＡＨ）を分析方法論：キャピラリー電気泳動システム（Peggy Sue（商標）、Proteinsimple）のサイズベースアッセイで分析した。
【０３０５】
サンプルを氷上で解凍し、希釈せずに使用した。定量化のために、組換えＨＴＲＡ１−  Ｓ３２８Ａ変異体（Origene＃ＴＰ７００２０８）。調製は供給者により記載される通りであった。
一次ウサギ抗ヒトＨＴＲＡ抗体ＳＦ１は、Sascha Fauser教授により提供され、１：３００希釈で使用した。全ての他の試薬はProteinsimpleからであった。
【０３０６】
サンプルを、１２〜２３０kDa分離モジュールを使用し、技術的に３通りに、検量線を２通りに処理した。ピーク下面積を、Xlfit（IDBSソフトウェア）を使用して計算及び分析した。
【表１４】
2020521491.tif 000043
【０３０７】
注意−図１２〜１４に示す化合物ＩＤでは、実施例の残りとして異なる番号付けシステムを利用する。上の表は、以前の実施例及び本明細書中の他の箇所において使用するものと比較した、図１２〜１４で使用する番号付けのキーを提供する。
【０３０８】
図１２Ａは、化合物Ｂ及び＃７３，１を用いて投与したサルの房水中でのＨＴＲＡ１タンパク質レベルの視覚化を示し、サンプルを注射後３、８、１５、及び２２日目に採取した。図１２Ｂには、ＨＴＲＡ１タンパク質レベルの算出において使用する検量線を提供する。図１２Ｃには、注射後の時間に対してプロットした個々の動物からの房水から算出したＨＴＲＡ１レベルを提供する。
【０３０９】
図１３は、房水中のＨＴＲＡ１タンパク質のレベルと網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡのレベルの間での直接的な相関関係を例証する。房水ＨＴＲＡ１タンパク質レベルは、従って、ＨＴＲＡ１網膜ｍＲＮＡレベル又はＨＴＲＡ１網膜ｍＲＮＡ阻害についてのバイオマーカーとして使用してもよい。
【０３１０】
図１４は、網膜中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルと房水中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルの間にも相関があることを例証しているが、相関は、この実験では、網膜中のＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡ阻害と房水中のＨＴＲＡ１タンパク質レベルの相関ほど強くはなく、房水ＨＴＲＡ１タンパク質レベルがＨＴＲＡ１  ｍＲＮＡアンタゴニストについてのバイオマーカーとして特に適していることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ−１】
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【図１２Ｃ−２】
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【図１２Ｃ−３】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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