(57)【要約】  ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）が、肝硬変を有する患者の細胞療法に使用される。凍結保存方法を確立し、これらの臨床プログラムのためのｈＢＴＳＣｓの供給を至適化した。それは、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、約３％組換えヒトアルブミンおよび０．１％ヒアルロナンを添加された無血清クボタ培地（ＫＭ）を含む。凍結保存されたｈＢＴＳＣｓと新たに単離されたｈＢＴＳＣｓとは、自己複製、幹性特性、および多分化能に関してインビトロで類似していた。それらは、機能的な肝細胞、胆管細胞または膵島に分化でき、類似するレベルのアルブミンまたはグルコース誘導レベルのインスリンの分泌物を産出する。凍結保存されたｈＢＴＳＣｓと新たに単離されたｈＢＴＳＣｓとは、免疫無防備状態マウスに等しく移植でき、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓよりも凍結保存されたｈＢＴＳＣｓでより高いヒト特異的遺伝子発現およびマウス血清中のヒトアルブミンレベルを有する細胞を産出した。ｈＢＴＳＣｓの凍結保存の成功により、肝疾患の治療のための臨床プログラムにロジスティックス上の利点を提供するｈＢＴＳＣｓ細胞バンクの確立が促進される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の凍結保存のための方法であって、
（ｉ）ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を採取すること；
（ｉｉ）（ａ）脂質を含む基礎培地、（ｂ）約０．０５％から０．１５％の間の濃度のヒアルロナン（ＨＡ）、（ｃ）凍結保護物質、（ｄ）抗酸化剤、および（ｅ）約１％から５％の間の濃度のアルブミンを含む凍結保存溶液を前記細胞に添加すること；ならびに
（ｉｉｉ）前記細胞を初期温度から前記細胞が凍結される最終温度に冷却することを含む方法。
【請求項２】
前記ヒアルロナンが、約０．１％の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凍結保護物質が、場合により約１％から２０％の間の濃度の、糖、グリセロール、およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記凍結保護物質が、約１０％の濃度のＤＭＳＯである、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
前記抗酸化剤は、セレン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、および還元グルタチオンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記アルブミンが、約３％の濃度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記アルブミンが、精製アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミンが、ヒトアルブミン、場合によりヒト血漿由来アルブミンまたは組換えヒトアルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結保存溶液が、クボタ培地、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥ／Ｆ１２、またはＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｉｉｉ）が、最終温度に達するまで毎分約１℃の割合で前記初期温度を低下させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｉｉｉ）が：
（ａ）細胞を前記初期温度から約−８０℃の前記最終温度にドライアイスを使用して冷却すること、または
（ｂ）細胞を前記初期温度から約−１９６℃の前記最終温度に液体窒素を使用して冷却することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞を解凍する方法であって：
（ｉ）請求項１に記載の方法に従って凍結保存された細胞を解凍すること；
（ｉｉ）血清または血清代用培地を含む第一の緩衝液を添加すること；
（ｉｉｉ）前記細胞を凍結保存培地および前記第一の緩衝液から分離すること；および
（ｉｖ）前記細胞を、血清または血清代用培地を含む第二の緩衝液に再懸濁することを含む方法。
【請求項１３】
前記血清がウシ胎児血清である、または前記血清代用培地がＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ、もしくはアルブミン、場合によりヒト血清由来アルブミン、を添加されたクボタ培地である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記血清が、約２％から２０％の間、場合により、約１０％から２０％の間、約１０％、または約２０％の濃度である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記血清代用培地は、約１％から５％の間の濃度でアルブミン、場合によりヒト血清由来アルブミン、を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
培養培地および／または緩衝液が、解凍緩衝剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｉｉ）が：
（ａ）前記細胞を遠心分離すること；
（ｂ）篩またはフィルターを通す、前記細胞の濾過；または
（ｃ）フレンチプレスタイプの濾過を使用することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
解凍された、凍結保存ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を培養する方法であって：
（ｉ）請求項１２に従って解凍された細胞をプレーティングすること；
（ｉｉ）前記細胞をインキュベーターで培養すること；
（ｉｉｉ）前記緩衝液を除去すること；および
（ｉｖ）前記緩衝液を、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された培養培地で置き換えることを含む方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉｉ）が、約６から７時間の間で行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された前記培養培地は、クボタ培地および／または細胞の分化のためのホルモン規定培地（ＨＤＭ）（例えば、肝細胞への系統に限定するためのもの、この場合ＨＤＭ−Ｈ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法によって産生された複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞を含む組成物。
【請求項２２】
前記複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞が、解凍される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞が、請求項１２に記載の方法に従って解凍される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞が、凍結される、請求項２１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で２０１７年４月６日に出願の米国特許出願第６２／４８２，６４４号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、一般に、細胞の凍結保存方法の分野に関する。
【０００３】
以前の研究で、出願人らは、肝臓外胆管の（周囲の）胆管における一群の内胚葉マーカーを発現する細胞の存在を実証した［１〜４］。これらのヒト組織中のインサイチューでの観察は、胆嚢上皮から単離された幹細胞の亜集団（ＳＯＸ９＋／Ｐｄｘ１＋／Ｓｏｘ１７＋／ＥｐＣＡＭ＋；ＳＯＸ９＋／ＰＤＸ１＋／ＳＯＸ１７＋／ＥｐＣＡＭ−）が、長期（インビトロ）維持され、自己複製され、異なる成熟した肝臓および膵臓系統のより限定的な子孫を生じる可能性があるとのインビトロでのデモンストレーションによって補足されている［１〜４］。これらの細胞（ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）と命名された）の発見により、肝臓、胆嚢上皮および膵臓の発生学、胆嚢系、肝胆道および膵臓発癌の病態生理学ならびに最終的に肝臓および膵臓の再生医学を含む異なる問題点に関連する示唆を伴う新しいシナリオが開かれる［１〜４］。この点において、ヒト胆嚢幹／前駆細胞（ｈＧＳＣｓ）と命名された［５］、胆嚢のクリプト内に見出されるｈＢＴＳＣｓの対応物（ｈＢＴＳＣｓの子孫であると推定される）の最近のデモンストレーションにより、これらの肝臓疾患の細胞療法のための多分化能および分化能力を有する内胚葉幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓおよびｈＧＳＣｓ）の集団の臨床使用の可能性が増加する。これらの細胞が、容易に単離可能および培養可能であり、低またはヌル免疫原性および発癌ポテンシャルを有することは重要である［６］。再生医学のため細胞を供給することにおける様々な障害を考慮すると［７］、胆嚢系が、再生医学の幹細胞および前駆細胞の理想的な供給源となる可能性がある。実際、出願人らは、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓを硬変患者に成功裏に移植し、肝臓機能の改善の点で利益があった。
【０００４】
ヒト組織は得るのが困難であり、現在、臨床プログラムで細胞が新たに単離されることが要求されるため、患者の治療のために細胞を供給することが阻まれている。凍結保存は、細胞療法の臨床プログラムにおける細胞産物の通常的な使用のための義務的なステップとなっている。凍結保存剤［８、９］、細胞コーティング技術［１０〜１２］、プリコンディショニング技術［１３］、および段階的凍結［１４、１５］の使用を含む、幾つかの異なる凍結保存技術が提案されている。残念なことに、肝臓細胞のような固形器官から単離された細胞型に関しては、解凍後の細胞生存率および移植効率の点で変動性が大きいことが報告されている［１３，１６，１７］。例えば、Ｔｅｒｒｙら［１８］は、高い生存率を保存し、規定の凍結保存条件を達成するために、血清を代替するものとして精製されたヒト血清アルブミンを使用することを提案した。より最近では、Ｔｕｒｎｅｒら［１９］は、２つの無血清で、ヒアルロナン（ＨＡ）を添加された完全に規定された緩衝剤である、Ｃｒｙｓｔｏｒ−１０（ＣＳ１０；  Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｂｏｔｈｅｌｌ、ＷＡ、ＵＳＡ）またはクボタ培地（ＰｈｏｅｎｉｘＳｏｎｇｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）のいずれかを使用する、ヒト肝臓幹細胞（ｈＨｐＳＣ）の凍結保存の間に接着分子発現を保存する効率的な戦略を開発した。
【発明の概要】
【０００５】
ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）の凍結保存のための方法に関する本開示の態様は、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を採取すること；（ａ）脂質を含む基礎培地、（ｂ）ヒアルロナン（ＨＡ）、（ｃ）凍結保護物質、（ｄ）抗酸化剤、および（ｅ）血清代用因子、場合によりアルブミンを含む凍結保存溶液を細胞に添加すること；ならびに（ｉｉｉ）細胞を初期温度から細胞が凍結される最終温度に冷却することを含む。
【０００６】
一部の実施形態では、ヒアルロナンは、約０．０５％から０．１５％の間の濃度、場合により約０．１％の濃度である。
【０００７】
一部の実施形態では、凍結保護物質は、１つまたは複数の糖、グリセロール、およびＤＭＳＯを含む。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約１％から２０％の間の濃度、場合により約１０％の濃度である。
【０００８】
一部の実施形態では、抗酸化剤は、１つまたは複数のセレン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、および還元グルタチオンを含む。
【０００９】
一部の実施形態では、アルブミンは、精製されたアルブミンおよび／またはヒトアルブミン、場合によりヒト血漿由来アルブミンまたは組換えヒトアルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、約１％から５％の間の濃度、場合により約３％の濃度である。
【００１０】
一部の実施形態では、凍結保存溶液は、１つまたは複数の市販されているまたは他の開示された緩衝剤であり、これは、１つまたは複数の構成要素（ａ）から（ｅ）を含み得る。非限定的な例は、クボタ培地、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ、Ｖｉａｓｐａｎ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥ／Ｆ１２、およびＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、緩徐なプログラム可能な凍結を使用して達成される。さらなる実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、最終温度に達するまで毎分約１℃の割合での初期温度の低下を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は：
（ａ）細胞を初期温度から約−８０℃の最終温度にドライアイス（ｓｏｌｉｄ  ｃａｒｂｏｎ  ｄｉｏｘｉｄｅ）を使用して冷却すること、または（ｂ）細胞を初期温度から約−１９６℃の最終温度に液体窒素を使用して冷却することを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）が、本明細書に開示された急速凍結方法を使用して達成され得ることが認識される。
【００１２】
さらなる態様は、本明細書に開示された凍結保存ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）の解凍の方法に関する。適切な解凍の非限定的な例は、例えば、（ｉ）本明細書に開示された方法に従って凍結保存された細胞を解凍すること、（ｉｉ）第一の緩衝液を添加すること；（ｉｉｉ）細胞を凍結保存培地および第一の緩衝液から分離すること；および（ｉｖ）細胞を第二の緩衝液に再懸濁することである。
【００１３】
一部の実施形態では、第一および／または第二の緩衝液は、血清または血清代用培地を含む。一部の実施形態では、血清は、ウシ胎児血清である。一部の実施形態では、血清代用培地は、１つまたは複数のＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍおよびクボタ培地であってもよく、場合によりアルブミンを添加され、同様に、場合によりヒト血清由来アルブミンを添加される。一部の実施形態では、血清は、約２％から２０％の間、場合により、約１０％から２０％の間、約１０％、または約２０％の濃度である。非等張性緩衝剤が使用される場合、この「高血清」解凍法が、氷晶形成を最小化するのに有利であり得ることが認識される。このプロセスに高脂質含量が要求されることが理由である。一部の実施形態では、血清は、約２％から５％の間の濃度である。等張性緩衝剤が使用される場合、この「低血清」解凍法が、使用されてもよいことが認識される。高脂質含量が要求されないことが理由である。一部の実施形態では、血清代用培地は、約１％から５％の間の濃度でアルブミンを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、第一および／または第二の緩衝液は、解凍緩衝剤を含む。一部の市販されている解凍緩衝剤が、血清または血清代用物を含むことが認識される。一部の実施形態が、上記の本明細書に定められたもの以外の手段による解凍を含み得ることも認識される。
【００１５】
培地、例えば、培養培地、緩衝液、および／または凍結保存溶液から細胞を分離するのに複数の様式が存在することがさらに認識される。非限定的な例は、細胞を遠心分離すること；篩またはフィルターを通す細胞の濾過；およびフレンチプレスタイプの濾過を含む。
【００１６】
追加の態様は、本明細書に開示された方法に従って解凍された細胞をプレーティングすること；細胞をインキュベーターで培養すること；緩衝液を除去すること；および緩衝液を、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された培養培地で置き換えることを含む、解凍された、凍結保存ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を培養する方法に関する。
【００１７】
一部の実施形態では、細胞は、インキュベーター中で約６から７時間の間インキュベートされる。
【００１８】
一部の実施形態では、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された培養培地は、クボタ培地および／または細胞の分化のための（例えば、肝細胞への系統の限定のための、この場合ＨＤＭ−Ｈ）ホルモン規定培地（ＨＤＭ）を含む。
【００１９】
さらなる態様は、本明細書に開示された方法に従う複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞を含む組成物に関する。一部の実施形態では、これらの細胞は、解凍または凍結され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】凍結保存／解凍後の生物学的な細胞の機能を図示する。Ａ）細胞生存率を、異なる溶液で凍結保存した細胞の解凍後のトリパンブルー排除試験により評価した（Ｎ＝９実験）。生存率は、Ｓｏｌ２Ａ、Ｓｏｌ２Ｂ、対照溶液（ＣＴＲＬ）、ならびに新たに単離された（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）に対し溶液１（Ｓｏｌ１）およびＳｏｌ３で有意に高かった。Ｓｏｌ１とＳｏｌ３の間に差はなかった。データは、９実験の平均±ＳＤとして表される；○＝ｐ＜０．００１  Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３対Ｓｏｌ２Ａ、Ｓｏｌ２Ｂ、およびＣＴＲＬ；○＝ｐ＜０．００１  Ｎｏ  Ｃｒｙｏ対全ての他の溶液。溶液組成：Ｓｏｌ１＝クボタ培地（ＫＭ）、ＤＭＳＯ（１０％）、組換えヒトアルブミン（１５％）、ヒアルロン酸  （０．１％  Ｗ／Ｖ）；Ｓｏｌ２Ａ＝ＫＭ、ヒアルロン酸（０．１％  Ｗ／Ｖ）、ＤＭＳＯ（１０％）；Ｓｏｌ２Ｂ＝ＫＭ、ヒアルロン酸（０．０５％  Ｗ／Ｖ）、ＤＭＳＯ（１０％）；Ｓｏｌ３＝ＫＭ、ＤＭＳＯ（１０％）、組換えヒトアルブミン（１５％）；ＣＴＲＬ＝ＫＭ、ＤＭＳＯ（１０％）、組換えヒトアルブミン（１．５％）。Ｂ）細胞老化を、凍結保存から得られた培養におけるまたは同じドナーから得られた新たに単離された細胞（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）におけるＸ−Ｇａｌ試験により評価した。グラフは、Ｘ−Ｇａｌ陰性細胞（非老化細胞）のパーセンテージを示す。Ｘ−Ｇａｌ陰性細胞は、凍結保存後９５％を超えた。Ｓｏｌ１とＳｏｌ３の間ならびに凍結保存された細胞と新鮮な対照細胞（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）との間に差は観察されなかった。Ｓｏｌ２Ａは、培養し、解凍した細胞のはなはだしい老化を実証した（δ＝ｐ＜０．０００１対他）。データは、３実験の平均±ＳＤとして表される。Ｃ）増殖率は、Ｓｏｌ１、Ｓｏｌ３で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓの培養および新たに単離された対照（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）における集団倍加（ＰＤ）週率（ｗｅｅｋ  ｒａｔｅ）として表される。凍結保存細胞（Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３）は、非凍結保存細胞（§＝ｐ＜０．０１）を基準に、より高いＰＤ週率を実証した。データは、８実験の平均±ＳＤとして表される。Ｄ）集団倍加時間（ＰＤＴ）は、Ｓｏｌ３（ＨＡなし）および新たに単離された対照（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）よりもＳｏｌ１（ヒアルロン酸／ＨＡ有り）において（○＝ｐ＜０．００１対他）ならびにＳｏｌ３対新たに単離された対照（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）において（δ＝ｐ＜０．０００１対Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）より低く見えた。データは、８実験の平均±ＳＤとして表される。Ｅ）コロニーの数を、培養の３日目に計数した。ＨＡコーティングｈＢＴＳＣｓおよび未コーティングｈＢＴＳＣｓを比較した。グラフは、Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３で凍結保存された細胞の解凍後に形成されたコロニーの数を説明する。より多数のコロニー（３１．５６±８．４３）が、Ｓｏｌ３よりもＳｏｌ１からの培養で発生した  （１０．１１±３．８５）  （＄＝ｐ＜０．０００００１）。データは、１８実験の平均±ＳＤとして表される。
【図２】溶液１（Ｓｏｌ１）、Ｓｏｌ３中の凍結保存細胞からの培養物、または新たに単離された、すなわち、凍結保存されていない（Ｎｏ  Ｃｒｙｏ）ヒト胆嚢系幹細胞（ｈＢＴＳＣｓ）における多能性および接着分子遺伝子の発現を示す。ＳＯＸ２の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、９実験の平均±標準誤差（ＳＥ）として表される；＊＝ｐ＜０．０５。ＰＤＸ１の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、９実験の平均±ＳＥとして表される；＊＝ｐ＜０．０５。ＮＡＮＯＧの相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、９実験の平均±ＳＥとして表される；§＝ｐ＜０．０１。ＳＯＸ１７の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、９実験の平均±ＳＥとして表される；＊＝ｐ＜０．０５。ＯＣＴ４の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、９実験の平均±ＳＥとして表される；§＝ｐ＜０．０１。ＣＤ４４の相対的な遺伝子発現。データは、６実験の平均±標準誤差（ＳＥ）として表される。ＩＴＧβ１の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の減少を示した。データは、６実験の平均±ＳＥとして表される；＊＝ｐ＜０．０５。ＩＴＧβ４の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の増加を示した。データは、６実験の平均±ＳＥとして表される；＊＝ｐ＜０．０５  Ｎｏ  Ｃｒｙｏ対他。ＣＤＨ１の相対的な遺伝子発現。Ｓｏｌ１および３の両方とも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、発現の減少を示した。データは、６実験の平均±ＳＥとして表される；§＝ｐ＜０．０１。
【図３】複数の内胚葉成熟運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に対する自己複製（ＫＭ）またはホルモン規定培地下で凍結保存されたまたは新たに単離されたｈＢＴＳＣｓの培養における多能性および多分化能性遺伝子の発現を示す。Ａ）異なる培養条件下、Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３中で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓにおけるＳＯＸ２、ＥｐＣＡＭ、ＯＣＴ４、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ２の相対的な遺伝子発現（示さず）。クボタ培地（ＫＭ）で自己複製条件下で培養された、以前に凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、特定の内胚葉成熟運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に対するホルモン規定培地に移した場合に、多能性および多分化能性遺伝子の発現を減少させた。データは、３実験の平均±ＳＤとして表される；＊＝ｐ＜０．０５；§＝ｐ＜０．０１；＊＊＝ｐ＜０．０５  ＨＭ対ＣＭおよびＰＭ；§§＝ｐ＜０．０５  ＰＭ対ＣＭおよびＨＭ。Ｂ）異なる規定条件で培養された新たに単離された（ＦＩ）ｈＢＴＳＣｓにおけるＮａｎｏｇ、ＳＯＸ２、ＥｐＣＡＭ、ＯＣＴ４、ＰＤＸ１、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ２の相対的な遺伝子発現。クボタ培地（ＫＭ）で自己複製条件下で培養された、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓは、特定の内胚葉成熟運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に対するホルモン規定培地に移した場合に、多能性および多分化能性遺伝子の発現を減少させた。データは、３実験の平均±ＳＤとして表される；＊＝ｐ＜０．０５；§＝ｐ＜０．０１＊＊＝ｐ＜０．０５  ＨＭ対ＣＭおよびＰＭ；§§＝ｐ＜０．０５  ＰＭ対ＣＭおよびＨＭ。
【図４】特定の内胚葉成熟運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に対する自己複製条件（クボタ培地−ＫＭ）またはホルモン規定培地で凍結保存されたまたは新たに単離されたｈＢＴＳＣｓの培養における特異的な成熟運命遺伝子の発現を示す。Ａ）異なる規定条件で培養された凍結保存ｈＢＴＳＣｓにおけるＣＹＰ３Ａ４、アルブミン（ＡＬＢ）、トランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン、セクレチン受容体（ＳＲ）、ＣＦＴＲ、ＡＳＢＴの相対的な遺伝子発現。クボタ培地（ＫＭ）で自己複製条件で培養された以前に凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、適切なホルモン規定培地に移した場合に、成体運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に関連する特異的な遺伝子の発現を増加させた。データは、３実験の平均±ＳＤとして表される；＊＝ｐ＜０．０５；§＝ｐ＜０．０１；○＝ｐ＜０．００１；δ＝ｐ＜０．０００１。Ｂ）異なる規定条件で培養された新たに単離されたｈＢＴＳＣｓにおけるＣＹＰ３Ａ４、アルブミン（ＡＬＢ）、トランスフェリン（ＴＲＡＮＳＦ）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン、セクレチン受容体（ＳＲ）、ＣＦＴＲ、ＡＳＢＴの相対的な遺伝子発現。クボタ培地（ＫＭ）で自己複製条件で培養された新たに単離されたｈＢＴＳＣｓは、関連するホルモン規定培地に移した場合に、成熟運命（肝細胞性／ＨＭ、胆管細胞性／ＣＭ、膵島／ＰＭ）に関連する特異的な遺伝子の発現を増加させた。データは、３実験の平均±ＳＤとして表される；＊＝ｐ＜０．０５；§＝ｐ＜０．０１；○＝ｐ＜０．００１；δ＝ｐ＜０．０００１。
【図５】凍結保存されたｈＢＴＳＣｓの効果的な分化を実証する、クボタ培地／ＫＭ（基礎条件）と比較したホルモン規定培養培地によって誘導された形態、表現型および機能的な変化を図示する。Ａ）凍結保存されたｈＢＴＳＣｓを、解凍し、次いで、肝細胞（ＨＭ）、胆管細胞（ＣＭ）または膵臓細胞（ＰＭ）で分化を誘導するため特異的に適合させた培地で培養した。ＨＭで１５日後、アルブミン（肝細胞マーカー）を発現する立方形状細胞が、顕在化していた（Ｎ＝５）。ＣＭで１５日後、ＣＫ１９を発現する細胞のクラスターが、出現した（Ｎ＝５）。１４日後、コロニーの端部から出芽し、インスリンを発現する細胞を含有する、凝集性細胞の高密度球へのＰＭ遷移での単層（図１０）（Ｎ＝５）。図は、Ｓｏｌ１で凍結保存された細胞の培養物の代表である（Ｎ＝５）。Ｂ）解凍し、肝細胞培地（ＨＭ）で培養した凍結保存ｈＢＴＳＣｓの分化を、クボタ培地（ＫＭ）で自己複製条件で培養した対照細胞を基準にアルブミン分泌によって実証した（データは、６実験の平均±ＳＤとして表される；§＝ｐ＜０．０１  ＨＭ対ＫＭ）、これはＨｅｐＧ２を基準にして低いが（＊＝ｐ＜０．０５  ＨｅｐＧ２対ＫＭ）、新たに単離された細胞と類似する（示さず）。Ｃ）膵臓培地（ＰＭ）では、凍結保存および新たに単離されたｈＢＴＳＣｓの両方とも、グルコース濃度によって制御されるインスリン（Ｃペプチド）分泌特性を獲得した（データは、７実験の平均±ＳＤとして表される；§＝ｐ＜０．０１  低対高グルコース濃度、○＝ｐ＜０．００１  低対高グルコース濃度）。
【図６】ＳＣＩＤマウスに脾臓内移植後のｈＢＴＳＣｓ（凍結保存対新たに単離された）のインビボ肝臓移植および肝細胞分化を図示する。脾臓へのｈＢＴＳＣ注射の３０日後、肝臓および血清を分析した。Ａ）肝臓の切片を、抗ヒトミトコンドリアを利用する免疫組織化学によって分析した。新たに単離されたおよび凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、マウス肝実質への類似した移植効率を示した（Ｎ＝３）。ＳＣＩＤマウスの肝実質でのヒトミトコンドリアの発現は、２．６２６±１．５３０％および３．７２２±０．６３９％の宿主の実質細胞塊が、それぞれ、移植され、新たに単離されたおよび凍結保存されたｈＢＴＳＣｓに由来することを示した（データは、３実験の平均±ＳＤとして表される）。Ｂ）肝臓の切片を、ヒトアルブミン遺伝子発現に関してＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。ＳＣＩＤマウスの肝実質でのヒトアルブミンの遺伝子発現は、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓ（１．９０＊１０−１０±１．０９＊１０−１０）が移植された場合と比較して、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ  （５．１９＊１０−７±３．０６＊１０−７）が移植された場合に、より高かった（§＝ｐ＜０．０１）。（データは、３実験の平均±ＳＤとして表される）。Ｃ）ＳＣＩＤマウスでのヒト血清アルブミンのレベルは、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓ（２４．１３±１．４４ｎｇ／ｍＬ）を基準に、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ（７６．３９±１７．０４ｎｇ／ｍＬ）が移植された場合に、有意に高かった（δ＝ｐ＜０．０００１）。（データは、３実験の平均±ＳＤとして表される）。
【図７】異なる培養時間での単一コロニーの位相画像（倍率１０ｘ）により単一細胞クローン原性を図示する。Ａ）１日目、Ｂ）３日目、Ｃ）７日目、Ｄ）１０日目。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示に従う実施形態は、以下により完全に記載される。しかしながら、開示の態様は、異なる形態に具体化され得、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。どちらかといえば、これらの実施形態は、本開示が、徹底的かつ完全に、かつ本発明の範囲が当業者に完全に伝達されるように提供される。本明細書の記載で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定されることは意図されていない。本明細書および本出願を通して言及される全ての参照は、参照により組み込まれる。
【００２２】
他に規定されない限り、本明細書で使用された全ての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で規定されているもの等の用語が、本出願および関連性のある技術分野の文脈中のそれらの意味と一致する意味を有すると解されるべきこと、ならびに、本明細書に明示的にそのように規定されない限り、理想的または過度に公式な意味に解されるべきではないことがさらに理解される。以下で明確に規定されないが、そのような用語は、それらの一般的な意味に従って解されるべきである。
【００２３】
本明細書の記載で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、本発明が限定されることは意図されていない。本明細書で言及した全ての公開、特許出願、特許、および他の参考は、その全体が参照により組み込まれる。
【００２４】
本技術の実行は、他に示されない限り、技術分野の当業者の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えＤＮＡの従来技術を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ．  （２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；  ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  ＰＣＲ  １：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；  ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＰＣＲ  ２：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．  （１９９９）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （２００５）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：  Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ  ｅｄ．  （１９８４）  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第４，６８３，１９５号；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．  （１９８４）  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ  （１９８４）  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．  （１９８７）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｄ．  （２００３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄｓ．  （１９８７）  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ）；およびＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ  （１９９６）  Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照されたい。
【００２５】
文脈が他を示さない限り、本明細書に記載された本発明の様々な特徴が、任意の組合せで使用することができることが特異的に意図される。さらに、一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の特徴または特徴の組合せが、除外または省略され得ることも本開示は企図している。説明のために、複合体が構成要素Ａ、ＢおよびＣを含むことを明細書が述べている場合、任意のＡ、Ｂ  もしくはＣ、またはその組合せが、単独でまたは任意の組合せで、省略および放棄され得ることが特異的に意図される。
【００２６】
全ての数値指定、例えば、それぞれの範囲を含めて、ｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、近似であり、これは、必要に応じて、１．０もしくは０．１の増分によって、または代替的に＋／−１５％、もしくは代替的に１０％、もしくは代替的に５％、もしくは代替的に２％の変動によって、（＋）もしくは（−）に変動する。常に明確に述べられるわけではないが、全ての数値指定には、「約」という用語を先立たせていることが理解される。常に明確に述べられるわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、このような試薬の同等物が当技術分野で公知であることも理解される。
【００２７】
定義
本発明の記載および添付の特許請求の範囲に使用される、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が他に明らかに示さない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
【００２８】
本明細書で使用される、用語「約」は、量または濃度（例えば、バイオマトリックス足場における総タンパク質中のコラーゲンのパーセンテージ）などの測定可能な値を指す場合に、指定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
【００２９】
本明細書に開示された任意の構成要素、範囲、用量形態などの選択を記載するのに使用する場合に、用語「許容される」、「有効な」または「十分な」は、前記構成要素、範囲、用量形態などが、開示される目的に適切であることが意図される。
【００３０】
また、本明細書で使用される、「および／または」は、１つまたは複数の関連する列挙された項目の任意および全ての可能な組合せ、ならびに代替の（「または」）に解される場合に組合せの欠如を指しかつ包含する。
【００３１】
用語「緩衝剤」および／または「すすぎ洗い培地」は、バイオマトリックス足場の調製に使用される試薬を指すために本明細書で使用される。
【００３２】
本明細書で使用される、用語「細胞」は、真核生物細胞を指す。一部の実施形態では、この細胞は、動物起源であり、幹細胞または体細胞であり得る。用語「細胞の集団」は、同じまたは異なる起源の同じまたは異なる細胞型の１つまたは複数の細胞の群を指す。一部の実施形態では、この細胞の集団は、細胞株に由来してもよい；一部の実施形態では、この細胞の集団は、器官または組織のサンプルに由来してもよい。
【００３３】
本明細書で使用される、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものが除外されないことを意味することが意図される。本明細書で使用される、移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」（および文法上の変形）は、列挙した材料またはステップならびに列挙した実施形態の「基礎および新規特性に実質的に影響しないもの」を包含すると解される。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ、５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９、５５１〜５２、１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．  ４６１、４６３  （ＣＣＰＡ  １９７６）（原本で強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照されたい。したがって、本明細書で使用される、用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等と解されるべきではない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、本明細書に開示された組成物を投与するステップについて、他の成分および実質的な方法ステップの微量要素を超えるものを除外することを意味するものとする。これらの移行用語のそれぞれによって規定された態様は、本開示の範囲内である。
【００３４】
用語「培養」または「細胞培養」は、人工的な、インビトロまたはエクスビボの二次元（２Ｄ、単層）または三次元（３Ｄ）環境（マトリックスのある特定の形態にある場合または浮游の場合に、細胞の極性形状）での、一部の実施形態では、スフェロイドまたはオルガノイドの付着細胞（例えば、単層培養）としてまたは浮游凝集物培養としての細胞の維持を意味する。用語「スフェロイド」は、全てが同じ細胞型である細胞の浮游凝集物（例えば、細胞株からの凝集物）を示す；「オルガノイド」は、複数細胞型から構成される細胞の浮游凝集物である。一部の実施形態では、オルガノイドは、上皮ならびに内皮および／または間質または星状細胞を含む１つまたは複数の間葉細胞型の凝集物であってもよい。「細胞培養システム」は、細胞の集団が、生存または成長することができる培養条件を指すために本明細書で使用される。
【００３５】
「培養培地」は、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養液を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、培養培地は、１つまたは複数のアミノ酸、ビタミン、塩、脂質、ミネラル、微量元素を含み、間質液の化学成分を模倣する。培養培地は、限定されないが、細胞を特定の状態（例えば、多能性状態、静止状態など）に維持する、細胞を成熟させる、一部の例では、特異的に、幹／前駆細胞を特定系統の細胞への分化を促進する能力などの機能的な特性によって特徴づけられ得る。幹／前駆細胞に使用される培養培地の限定されることがない例は、クボタ培地であり、以下、本明細書にさらに規定される。一部の実施形態では、培地は、所与の環境に細胞を提示または導入するのに使用される「播種培地（ｓｅｅｄｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ）」であってもよい。
【００３６】
より具体的には、基礎培地は、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素および細胞の周囲の間質液の化学成分を模倣する組成物中の様々な栄養分から構成される緩衝剤である。このような培地は、場合により、生物学的プロセス（例えば、増殖、分化）を駆動させるのに必要とされる必須のシグナル伝達分子（ホルモン、増殖因子）を提供するため、または細胞懸濁液の調製に典型的に使用される酵素に対する阻害剤の供給源として提供される、血清を添加され得る。血清は培養に使用される細胞型に対して自己であり得るが、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマなどの農業または食物上の目的で日常的に屠殺される動物の血清が最も一般的である。血清を添加された培地は、場合により血清補充培地（ＳＳＭ）と称されてもよい。
【００３７】
本明細書で使用される、「分化」は、特異的な条件が、成体特異的遺伝子産物を産生する成体細胞型に細胞を成熟させることを意味する。
【００３８】
用語「均等物」または「生物学的均等物」は、特定の分子、生物、または細胞材料を指す場合に、互換的に使用され、所望の構造または機能性を維持するうえに最低限の相同性を有するものを意図する。
【００３９】
本明細書で使用される、用語「発現」は、ポリヌクレオチドをｍＲＮＡへと転写するプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡをその後、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質へと翻訳するプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織サンプル中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定され得る；さらに、複数の遺伝子の発現レベルを決定して、特定のサンプルについての発現プロファイル確立することができる。
【００４０】
本明細書で使用される、用語「機能的」は、任意の分子、生物学的、または細胞材料を修飾するのに使用されてもよく、特定の指定される効果が達成されることが意図される。
【００４１】
本明細書で使用される、用語「遺伝子」は、ＲＮＡがコード（例えば、ｍＲＮＡ）であろうとまたは非コード（例えば、ｎｃＲＮＡ）であろうと、ＲＮＡ分子に転写される任意の核酸配列を含むことを広く意味する。
【００４２】
本明細書で使用される、用語「生成（ｇｅｎｅｒａｔｅ）」およびその均等な用語（例えば、生成する、生成される、など）は、特定のモデルのコロニー、器官、またはオルガノイドを産出する方法ステップを指す場合に、「産生」およびその均等な用語と互換的に使用される。
【００４３】
本明細書で使用される、用語「単離」は、他の材料から実質的に遊離している分子または生物または細胞材料を指す。
【００４４】
本明細書で使用される、クボタ培地は、内胚葉幹細胞のために設計され、それらを自己複製モードの分裂（特に、ヒアルロナン基層または３Ｄでの場合、ヒアルロナンが培地に添加される場合）クローン原性で増殖させるのを可能にする、無血清で、完全に規定された培地を指す。クボタ培地は、銅を含有しない、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンに結合した精製遊離脂肪酸の混合物を含有し、場合により高密度リポタンパク質も含有する任意の基礎培地を指してもよい。クボタ培地およびその均等物は、無血清で、特に内胚葉幹細胞に関する培養選択に使用され、精製されたシグナル（インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ）、脂質、および栄養分の規定された混合物のみを含有する。一部の実施形態では、それは、一過性に、細胞をマトリックス足場に導入する接種プロセスのために低（典型的に５％以下）レベルの血清を使用するＳＳＭとしておよび細胞懸濁液の調製に使用される酵素を不活化するために使用することができる；できるだけ急速（例えば、５〜６時間内）に無血清のクボタ培地に転換することが至適である。
【００４５】
ある特定の実施形態では、培地は、銅を含有せず、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）を含有し、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、トランスフェリン／Ｆｅ（５μｇ／ｍＬ）、高密度リポタンパク質（１０μｇ／ｍＬ）、セレン（１０−１０Ｍ）、亜鉛（１０−１２Ｍ）、ニコチンアミド（５μｇ／ｍＬ）、および精製アルブミンの形態に結合した精製遊離脂肪酸の混合物を添加された、無血清基礎培地（例えば、ＲＰＭＩ１６４０またはＤＭＥ／Ｆ１２）から構成される。この培地の調製のための非限定的な例示的な方法は、Ｋｕｂｏｔａ  Ｈ、Ｒｅｉｄ  ＬＭ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （ＵＳＡ）  ２０００；  ９７：１２１３２〜１２１３７、Ｙ．  Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｌ．  Ｙａｏ、Ｃ．Ｂ．  Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．  ２０１０；  ５２（４）：１４４３〜５４、Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．  ２０００；  ８２（１）：  ｐｐ．  １５６〜１６８；  Ｙ．  Ｗａｎｇ、Ｈ．Ｌ．  Ｙａｏ、Ｃ．Ｂ．  Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．  ２０１０  Ｏｃｔ  ５２（４）：１４４３〜５４など他で公開されており、その開示が参照により本明細書に組み込まれる。クボタ培地の変形は、無血清条件下での増殖を可能にする追加の因子および補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を提供することによってある特定の細胞型に使用することができる。例えば、クボタ培地を修飾して、細胞の移行的な増幅または幹細胞集団よりも遅れて、コミットした前駆体（例えば、肝芽細胞）および他の成熟系統段階を無血清条件下エクスビボでの生存および増殖を可能にし得る。この一例は、肝芽細胞ならびに肝芽細胞およびそれらの子孫、コミットした前駆体のエクスビボ増殖のために修飾したクボタ培地である：無血清のクボタ培地は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および時には血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）でさらに添加される。結果として起こる細胞増殖は、（たとえあったにしても）自己複製は最小限で発生する。培地は、細胞が、ＩＶ型コラーゲンおよびラミニンの基層上にあるまたは５０％より多くＩＶ型コラーゲンおよびラミニンを含有している３Ｄヒドロゲル中に包埋される場合に特に有効である。
【００４６】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはこれらの類似体のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、既知または未知の任意の機能を果たしうる。遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離ＤＮＡの任意の配列、単離ＲＮＡの任意の配列、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定例である。
【００４７】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチド、およびヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素により中断することができる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションなどにより、重合化の後でさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖および一本鎖分子の両方を指す。他に指定または要請されない限り、ポリヌクレオチドである、本技術の任意の態様は、二本鎖形態、および二本鎖形態を作り出すことが公知であるかまたは予測される２つの相補的な一本鎖形態の各々の両方とも包含する。
【００４８】
略語
以下の略語は、以下に開示される実施例に使用される。
【００４９】
ＡＬＢ、アルブミン；ＡＳＢＴ、アピカルナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター；ｂＦＧＦ、塩基性線維芽細胞増殖因子；ＣＤＨ１、カドヘリン１；ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子；ＣＫ、サイトケラチン；ＣＹＰ３Ａ４、チトクロムＰ４５０  ３Ａ４；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＰＢＳ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水；ＥＧＦ、上皮増殖因子；ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子；ＦＢＳ、ウシ胎仔血清；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＧＭＰ、Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｔｉｃｅ；ＨＡ、ヒアルロナン；ｈＢＴＳＣｓ、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞；ＨＧＦ、肝細胞増殖因子；ｈＧＳＣｓ、ヒト胆嚢幹／前駆細胞：ｈＨｐＳＣ、ヒト肝臓幹細胞；ＨＤＭ、無血清ホルモン規定培地；ＨＳＡ、ヒト血清アルブミン；ＩＮＳ、インスリン；ＩＴＧＢ１、インテグリンβ１；ＩＴＧＢ４、インテグリンβ４；ＫＭ、クボタ培地；ＭＫＭ、修飾クボタ培地；ＮＡＮＯＧ、Ｎａｎｏｇホメオボックス；ＯＣＴ４、Ｏｃｔａｍｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ４；ＯＳＭ、オンコスタチンＭ；ＰＢＧ、周胆嚢腺；ＰＤ、集団倍加；ＰＤＴ、集団倍加時間；ＰＤＸ１、膵臓十二指腸ホメオボックス１；ＲＴ−ｑＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＣＩＤ、重症複合免疫不全症；ＳＤ、標準偏差；ＳＯＸ、Ｓｒｙ関連ＨＭＧボックス；ＳＲ、セクレチン受容体；Ｔ３、トリヨードサイロニン３；ＴＲＡＮＳＦ、トランスフェリン；ＶＥＧＦ、血管内皮増殖因子。
【００５０】
開示の実施の形態
一般に、凍結保存の技術は、等張性緩衝剤の使用に頼っている。このような緩衝剤は、浸透圧効果に起因する水のシフトがないことから、氷晶形成を生成する性向が最も少ないことが公知である。
【００５１】
この例は、Ｃｒｙｏｓｔｏｒであり、Ｂｉｏｌｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって販売された凍結保存緩衝剤であり、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの器官保存緩衝剤の誘導体である。基礎緩衝剤は、等張性であり、不凍化タンパク質（例えば、極寒地に生存している動物で発見された）＋凍結保存剤（ＤＭＳＯ）＋糖（特定サイズのデキストラン）を添加される。
【００５２】
出願人らは、非等張性緩衝剤の使用が凍結保存にも適切であり得ることを発見した。例えば、クボタ培地は等張性ではないが、浸透圧効果はヒアルロナンによって軽減される。ヒアルロナンは、接着分子に関する表面受容体と複合体を形成し、それらの内部移行を遮断する。したがって、細胞が解凍される場合、それらは直ちに付着できる。さらに、出願人らは、幹細胞が、必ずしも１つのタイプから別のタイプの緩衝剤にスイッチされなければならないわけではない点において幹細胞にとって理想的であることを実証した。むしろ、それらは、任意の浸透圧効果を最小化する補助剤を使用するとともに同じ培地中に保持される。実際、細胞がクボタ培地中で凍結保存される場合、それらはその中で解凍され、プレーティングされてもよく、ユーザーが遠心分離ステップを回避するのを可能にする（例えば、付着の間の数時間の間に培地にＤＭＳＯを有していることについての懸念を排し、単純に細胞を付着させ、次いで、数時間に穏やかに培地を除去する。培地は、次いで、新鮮な無血清のクボタ培地で置き換えてもよい）。凍結保存中のクボタ培地の使用に関連する態様は、参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３５４９８に開示される。
【００５３】
一般に、全ての凍結保存緩衝剤は、ＤＭＳＯなどの凍結保存剤を使用する。天然の凍結保存剤は、糖（例えば、グルコース）またはグリセロールを含む；これらは、幾つかの動物種における天然の凍結保存剤である。グリセロールを使用してもよいが、グリセロールはかなり粘稠性である。過去、研究者は、ＤＭＳＯがより可溶性である傾向にあり、より簡便に使用されることを発見した。一部の凍結保存緩衝剤は、極寒地の気候で発見された動物に由来する不凍化タンパク質を添加される。これらのタンパク質は、特徴づけられ、クローニングされており、それらの商業上の利用が可能となっている。
【００５４】
多くの凍結保存緩衝剤は、抗酸化剤を使用する。非限定的な例は、セレン、ビタミンＥ、およびビタミンＣを含む。
【００５５】
緩徐凍結および急速凍結保存技術は、当技術分野において知られている。急速凍結保存に関して、典型的な方法は、細胞を凍結保存緩衝剤に添加し、アンプルまたは容器をコットンでパックし、それを−８０℃のフリーザーに置くことである。細胞の生存率は、緩徐凍結ほどに良好（例えば、およそ６０〜７０％）ではないが、一部の目的では、この粗雑な方法が許容される。至適な凍結に関して、解凍で８０〜９０％を超える細胞生存率を達成するために、緩徐凍結法を使用しなければならない。温度を−８０℃に達するまでの時間で、１度ずつ温度を低下させるコンピュータ化した凍結チャンバーの多くの形態が存在する；それらは、氷が形成し始める温度で若干長期にわたる細胞リンガー（ｃｅｌｌｓ  ｌｉｎｇｅｒ）を有する、コンピュータ化戦略を多くの場合に含み、細胞に対する氷晶ダメージが最小化される。
【００５６】
幹細胞を凍結保存する場合、緩衝剤中の脂質が高レベルである必要がある。出願人らは、これを精製アルブミンと複合化された遊離脂肪酸で満たされたクボタ培地を使用して達成した。別の培地（ＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍ）は、同様に多くの脂質を使用し、ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を凍結保存するために採用されることが知られている。
【００５７】
出願人らは、凍結保存の間に、より高レベル（インビボでのレベルに近いレベル）の高度に精製された組換えヒトアルブミンを使用することが、予想外に優れた結果を産み出すことをさらに発見した。
【００５８】
ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）の凍結保存のための方法に関する本開示の態様は、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を採取すること；（ａ）脂質を含有する基礎培地、（ｂ）ヒアルロナン（ＨＡ）、（ｃ）凍結保護物質、（ｄ）抗酸化剤、および（ｅ）血清代用因子、場合によりアルブミンを含む凍結保存溶液を細胞に添加すること；ならびに（ｉｉｉ）細胞を初期温度から細胞が凍結される最終温度に冷却することを含む。
【００５９】
一部の実施形態では、ヒアルロナンは、約０．０５％から０．１５％の間の濃度、場合により約０．１％の濃度である。
【００６０】
一部の実施形態では、凍結保護物質は、１つまたは複数の糖、グリセロール、およびＤＭＳＯを含む。一部の実施形態では、凍結保護物質は、約１％から２０％の間の濃度、場合により約１０％の濃度である。
【００６１】
一部の実施形態では、抗酸化剤は、１つまたは複数のセレン、ビタミンＥ、ビタミンＣ、および還元グルタチオンを含む。
【００６２】
一部の実施形態では、アルブミンは、精製されたアルブミンおよび／またはヒトアルブミン、場合によりヒト血漿由来アルブミンまたは組換えヒトアルブミンである。一部の実施形態では、アルブミンは、約１％から５％の間の濃度、場合により約３％の濃度であり、血清中のアルブミンの既知濃度（３〜５％）を模倣する。
【００６３】
一部の実施形態では、凍結保存溶液は、１つまたは複数の市販されているまたは他の開示された緩衝剤であり、これは、１つまたは複数の構成要素（ａ）から（ｅ）を含み得る。非限定的な例は、クボタ培地、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥ／Ｆ１２、およびＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｏｎｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍを含む。
【００６４】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、緩徐なプログラム可能な凍結を使用して達成される。さらなる実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、最終温度に達するまで毎分約１℃の割合での初期温度の低下を含む。一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は：（ａ）細胞を初期温度から約−８０℃の最終温度にドライアイスを使用して冷却すること、または（ｂ）細胞を初期温度から約−１９６℃の最終温度に液体窒素を使用して冷却することを含む。ある特定の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）が、本明細書に開示された急速凍結方法を使用して達成され得ることが認識される。
【００６５】
さらなる態様は、本明細書に開示された凍結保存ヒト胆嚢系幹／前駆細胞（ｈＢＴＳＣｓ）の解凍の方法に関する。適切な解凍の非限定的な例は、例えば、（ｉ）本明細書に開示された方法に従って凍結保存された細胞を解凍すること、（ｉｉ）第一の緩衝液を添加すること；（ｉｉｉ）細胞を凍結保存培地および第一の緩衝液から分離すること；および（ｉｖ）細胞を第二の緩衝液に再懸濁することである。
【００６６】
一部の実施形態では、第一および／または第二の緩衝液は、血清または血清代用培地を含む。一部の実施形態では、血清は、ウシ胎児血清である。一部の実施形態では、血清代用培地は、１つまたは複数のＧＩＢＣＯ’ｓ  Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｄｉｕｍおよびクボタ培地であってもよく、場合によりアルブミンを添加され、同様に、場合によりヒト血清由来アルブミンを添加される。一部の実施形態では、血清は、約２％から２０％の間、場合により、約１０％から２０％の間、約１０％、または約２０％の濃度である。非等張性緩衝剤が使用される場合、この「高血清」解凍法が、氷晶形成を最小化するのに有利であり得ることが認識される。このプロセスに高脂質含量が要求されることが理由である。一部の実施形態では、血清は、約２％から５％の間の濃度である。等張性緩衝剤が使用される場合、この「低血清」解凍法が、使用されてもよいことが認識される。高脂質含量が要求されないことが理由である。一部の実施形態では、血清代用培地は、約１％から５％の間の濃度でアルブミンを含む。
【００６７】
一部の実施形態では、第一および／または第二の緩衝液は、解凍緩衝剤を含む。一部の市販されている解凍緩衝剤が、血清または血清代用物を含むことが認識される。一部の実施形態が、上記の本明細書に定められたもの以外の手段による解凍を含み得ることも認識される。
【００６８】
上清、例えば、培養培地、緩衝液、および／または凍結保存溶液から細胞を分離するのに複数の様式が存在することがさらに認識される。非限定的な例には、細胞を遠心分離すること；篩またはフィルターを通す、細胞の濾過；およびフレンチプレスタイプの濾過が含まれる。
【００６９】
追加の態様は、本明細書に開示された方法に従って解凍された細胞をプレーティングすること；細胞をインキュベーターで培養すること；緩衝液を除去すること；および緩衝液を、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された培養培地で置き換えることを含む、解凍された、凍結保存ヒト胆嚢系幹／前駆細胞を培養する方法に関する。
【００７０】
一部の実施形態では、細胞は、インキュベーター中で約６から７時間の間インキュベートされる。
【００７１】
一部の実施形態では、ヒト胆嚢系幹／前駆細胞の成長および／または分化のために設計された培養培地は、クボタ培地および／または細胞の分化のためのホルモン規定培地（ＨＤＭ）（例えば、肝細胞への系統に限定するためのもの、この場合ＨＤＭ−Ｈ）を含む。
【００７２】
さらなる態様は、本明細書に開示された方法に従う複数の凍結保存されたヒト胆嚢系幹／前駆細胞を含む組成物に関する。一部の実施形態では、これらの細胞は、解凍または凍結され得る。
【実施例】
【００７３】
以下の実施例は、非限定的であり、開示を実施する様々な例に使用することができる手順の例示である。加えて、以下に本明細書に開示された全ての参照は、その全体が参照によって組み込まれる。
【００７４】
実施例１  凍結保存研究
Ｉ．材料および方法
ヒト組織の供給。
インビトロ実験に関して、総肝管、胆管、胆嚢管、胆嚢、および胆膵管膨大部を含むヒト肝臓外胆嚢系を、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、Ｓａｐｉｅｎｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅ、Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙの「Ｐａｒｉｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｉｎｉ」部門の臓器提供者から得た。研究目的のために組織を使用するとのインフォームドコンセントを、発明者らの移植プログラムから得た。全てのサンプルは、１９から７３歳の間の成人に由来した。インビボ実験に関して、胎児肝臓から単離されたｈＢＴＳＣｓが、利用された。ヒト胎児（１６〜２２週の在胎月齢）を、婦人科学部門（Ｓａｐｉｅｎｚａ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅ、Ｉｔａｌｙ）の選択的な妊娠終結によって得た。インフォームドコンセントを、中絶前に母親から得た。研究は、Ｓａｐｉｅｎｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの地域倫理委員会によって承認された。プロトコールは本発明者らの治験審査委員会の承認を受け、処理手続きは現行のＧｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｃＧＭＰ）に準拠した。研究プロトコールは、Ｅｔｈｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｕｍｂｅｒｔｏ  Ｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｒｏｍｅの倫理委員会によって審査および承認された。
【００７５】
組織処理。
組織検体を、以前に記載されているように処理した１、５、６、２８〜３０。簡潔に述べると、組織を、０．１％  Ｏｃｔａｌｂｉｎ  ２０％（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＃５４００４５４）、１ｎＭセレン、抗生物質、３００Ｕ／ｍｌコラゲナーゼＮＢ１  ＧＭＰ（Ｓｅｒｖａ  ＃１７４５２．０１）、１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（Ｒｏｃｈｅ  ＃１８４５０．０２）を添加されたＧＭＰ  Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣｅｌｌＧｒｏ  ＃２０８０１〜０５００）で、３７℃で３０〜４５分間頻繁に撹拌して消化した。懸濁液を、８００ミクロンの金属性メッシュフィルター（ＩＤＥＡＬＥ  ＡＣＬＲＩ９  ｉｎｏｘステンレススチール）を通して濾過し、再懸濁前に２７０ｇで１０分間回転させた。その後、細胞懸濁液を、１００および３０ミクロン（μ）メッシュフィルターを通して続けて通過させた；次いで、細胞計数をＦａｓｔ−Ｒｅａｄ  １０２  （ＢｉｏｓｉｇｍａＳｒｌ、Ｖｅｎｉｃｅ、Ｉｔａｌｙ）によって行い、細胞生存率をトリパンブルーアッセイ測定による細胞生存率を測定した（全細胞に対する生存細胞の％として表される）。細胞生存率（トリパンブルー排除）は、一貫して９５％超であった。
【００７６】
ＥｐＣＡＭソーティング手順。
細胞を、製造者（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって示された通り磁気ビーズを使用することによって上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）の発現に関してソートした。簡単に説明すると、ＥｐＣＡＭ＋細胞を、ＥｐＣＡＭマイクロビーズ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カタログ＃１３０−０６１−１０１）で磁気的に標識した。次いで、細胞懸濁液を、ＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場に配置したＭＡＣＳ  ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．、カタログ＃１３０−０４２−４０１）にロードした。ＥｐＣＡＭ＋細胞を、１ｍＬ当たり３００，０００個細胞の濃度で基礎培地に懸濁し、最終的な細胞懸濁液として使用した。
【００７７】
ＧＭＰ条件および無菌試験での細胞単離。
将来的な臨床応用に関してｃＧＭＰ条件でｈＢＴＳＣｓを産生するために、胆嚢を「欧州連合の医薬品管理規則」およびヒト使用に関する医薬品のためのｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅｓの欧州ガイドライン（ＥｕｄｒａＬｅｘ  −  ４巻Ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅガイドライン）に従って処理した。
【００７８】
培地および溶液。
全ての培地を、滅菌濾過（０．２２μｍフィルター）し、使用前に暗所で４℃に保持した。ＲＰＭＩ−１６４０（全ての細胞培養に使用される基礎培地）およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  （Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から得た。全ての試薬は、他に指定されない限り、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。増殖因子（注記されるもの以外）は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から購入した。
【００７９】
クボタ培地（ＫＭ）は、内胚葉幹／前駆細胞３１の生存および増殖のために開発された無血清培地であり、その後、ヒト肝臓幹細胞２８、２９、ヒト胆嚢系幹細胞１、３、４、ヒト膵臓幹／前駆細胞２５およびげっ歯類肝臓幹細胞３２で成功したことが示されている。クボタ培地は、銅を含有せず、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１０−９Ｍセレン、４．５ｍＭニコチンアミド、０．１ｎＭ硫酸亜鉛七水和物、１０−８Ｍヒドロコルチゾン（またはデキサメサゾン）、５μｇ／ｍＬトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍＬインスリン、１０μｇ／ｍＬ高密度リポタンパク質、０．１％ヒト（またはウシ）血清アルブミン（ＨＳＡまたはＢＳＡ）、および精製ＨＳＡに添加され結合した精製遊離脂肪酸の混合物を有する、任意の基礎培地（ここでは、ＲＰＭＩ１６４０）からなる。その調製の詳細なプロトコールは、クボタおよびＲｅｉｄ３１によって最初に報告され、その後、様々な総説２８に要約された。その培地は、現在ＰｈｏｅｎｉｘＳｏｎｇｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）を通して市販されている。
【００８０】
分化研究に関して、無血清クボタ培地は、カルシウム（最終濃度０．６ｍＭ）、銅（１０−１２Ｍ）および２０ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加され、修飾クボタ培地（ＭＫＭ）と称される。３つの異なるＨＤＭが、ｈＢＴＳＣｓの選択的な分化を誘導するために調製された：
・肝細胞分化（ＨＭ）に関するＨＤＭは、ＭＫＭに７μｇ／Ｌグルカゴン、２ｇ／Ｌガラクトース、１ｎＭトリヨードサイロニン３（Ｔ３）、１０ｎｇ／ｍＬオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）；１０ｎｇ／ｍＬ上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、２０ｎｇ／ｍＬ肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、および１μＭデキサメタゾンを補充することによって調製された４、６。
・胆管細胞分化（ＣＭ）に関するＨＤＭ：ＭＫＭに２０ｎｇ／ｍＬ血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）１６５および１０ｎｇ／ｍＬ  ＨＧＦを補充４、６。
・膵島細胞分化（ＰＭ）に関するＨＤＭ：ＭＫＭにヒドロコルチゾンなしで２％  Ｂ２７、０．１ｍＭアスコルビン酸、０．２５μＭシクロパミン、１μＭレチノイン酸を補充；ｂＦＧＦを、最初の４日間添加しておき、次いで、５０ｎｇ／ｍＬエキセンジン−４および２０ｎｇ／ｍＬのＨＧＦで置き換えた４、５。
【００８１】
凍結保存のための方法および緩衝剤
細胞を、様々なプラスチック基層から解離させて採取し、凍結保存した。解離させた細胞培養を２７０ｇで１０分間遠心分離し、凍結保存の溶液の１ｍＬを細胞ペレットに添加した。最終的に細胞を含有する緩衝液を、Ｎｕｎｃバイアル（Ｕｎｉｍｅｄ  ＃６３０２５９８）に移した。これらを、Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｃｒｙｏ  １℃  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｎａｌｇｅｎｅ、ＣＡＴ  Ｎｏ．  ５１００−０００１）に配置した。使用した凍結保存の方法は、温度を毎分１℃で−８０℃に低下させることによってであり；２４時間後、細胞を、−１９６℃で液体窒素に配置した。
【００８２】
凍結保存緩衝剤の異なる候補を、試験した。それらを、使用日に、それぞれ１０ｍＬの量で調製した。緩衝剤は、Ｔｕｒｎｅｒら１９によって確立されたものの誘導体である。それらは全て内胚葉幹／前駆細胞に関して開発されたクボタ培地からなり、１０％  ＤＭＳＯを添加された；加えて、ＫＭは、精製遊離脂肪酸の混合物を結合する、精製アルブミンを含有する。緩衝剤の一部では、追加の、より高レベルのアルブミンを、添加した。アルブミンは、組換えヒトアルブミン溶液（Ｏｃｔａｌｂｉｎ  ２０％；Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ＃５４００４５４）から調製される。したがって、１５％溶液は、１５％の２０％  Ｏｃｔａｌｂｉｎ調製物または３％の最終パーセンテージであり；１．５％は、したがって０．３％である。緩衝剤の間の区別は、以下の通りである：
＊Ｓｏｌ１：組換えヒトアルブミン（１５％）、ＨＡ（０．１％）
＊Ｓｏｌ２Ａ：ＨＡ（０．１％）
＊Ｓｏｌ２Ｂ：ＨＡ（０．０５％）、
＊Ｓｏｌ３：組換えヒトアルブミン（１５％）、
＊ＣＴＲＬ：組換えヒトアルブミン（１．５％）、
ＨＡを、３０ｍＬのＫＭ中に懸濁した２００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウムを使用して調製した。
【００８３】
細胞の解凍。
Ｎｕｎｃ（Ｕｎｉｍｅｄ  ＃６３０２５９８）中で凍結した細胞を解凍し、２０％ヒト血清由来アルブミンを有する１ｍＬの培養培地を徐々（一滴ずつ）に添加した。次いで、内容物を１５ｍＬファルコンチューブに移し；容量をＫＭで徐々に５ｍＬにし、次いで、２７０ｇで１０分間の遠心分離に供した２。遠心分離後、上清を除去し、凍結保存に使用されたＤＭＳＯを排除した。細胞ペレットを、１０％血清を補充したＫＭでのプレーティングに必要な容量まで再懸濁した１。分析研究には、異なる凍結保存溶液で凍結されていた解凍した細胞の細胞生存率、ならびに多能性幹細胞のマーカーである接着分子（ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＢ４、ＣＤ４４、ＣＤＨ１）および内胚葉幹細胞のマーカー（ＰＤＸ１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ）の両方のＲＴ−ｑＰＣＲの使用による遺伝子発現を評価するものが含まれる。
【００８４】
細胞培養およびクローン増殖。
胆嚢組織検体から得られた、未ソートおよびソートされたＥｐＣＡＭ＋細胞（およそ３Ｘ１０５）を、３ｃｍ直径プラスチック培養皿に播種し、１０％ＦＢＳを有するＫＭ中に一晩（約１２時間）保持した。その後、細胞培養を無血清ＫＭ中に維持し、少なくとも２カ月観察した。ｈＢＴＳＣｓのクローン増殖の試験に関して、単一細胞の懸濁液を得て、細胞を、無期限に約３６〜４０時間毎に自己複製する条件（特に低（２％）酸素条件での場合）で、ＫＭ中でクローン接種密度（５００／ｃｍ２）３３で培養プラスチックにプレーティングした。肝芽細胞は、これらの条件下で約５〜７日間のみ継続する（それらは、より長期の生存および増殖のために追加の因子を必要とする）。肝臓、胆嚢系および膵臓の成熟上皮細胞は、無血清ＫＭ中で一週を超えて生存しない。
【００８５】
細胞生存率。
細胞生存度を、トリパンブルー排除アッセイ（Ｓｉｇｍａ  ＃３０２  ６４３−２５Ｇ）により決定した。青色に染色された細胞が死細胞であった；生存細胞は染色されなかった。この色素は、細胞溶液と１：１  ｖ／ｖで使用された。細胞計数を、ＦＡＳＴ−ＲＥＡＤ  １０２（Ｂｉｏｓｉｇｍａ＃ＢＳＶ１００）の使用により実施した。細胞生存率を、細胞の解凍後に直ちに計算した。
【００８６】
老化。
解凍した細胞の老化を、Ｘ−Ｇａｌ試験（Ｓｉｇｍａ  ＃ＣＳ００３０）３４によって決定した。本発明者らは２．６Ｘ１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度を使用し、細胞を試験前に三日間成長させた。解凍において最高の生存率であることが実証されたものである、Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３中に凍結保存させた細胞を、Ｘ−Ｇａｌ試験でさらに分析した。結果を、凍結保存されていなかった細胞である対照と比較した。対照は、新たに単離された細胞を生成するプロセスを模倣するアッセイのために、培養され、解離させられ、および、次いで、プレーティングさせられた細胞から構成された。
【００８７】
集団倍加。
増殖率を、１×１０４細胞／ｃｍ２の密度で６マルチウェルプレートに播種し、７日間培養した、同じｈＢＴＳＣ集団で分析した。細胞計数は、以下の培養条件下で実施された：
・Ｓｏｌ１中で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ
・Ｓｏｌ３中で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ
・新たに単離されたｈＢＴＳＣｓ（凍結保存されなかった）
【００８８】
培地を、無血清ＫＭを使用して、三日毎に交換した。細胞数の平均を、各条件について３つの実験サンプルで計算し、細胞密度を、細胞／ｃｍ２±標準偏差（ＳＤ）の平均として表した。細胞を、支持体から解離し、トリパンブルーアッセイで計数した。これらの実験に関して、本発明者らは、生存細胞のみを使用した。
【００８９】
ＰＤＴを、以下の式（１）３５によって指数成長期に計算した：
（２４）ＰＤＴ＝ｌｏｇ１０ｘΔＴ／ｌｏｇ１０（Ｎ７ｄ）−ｌｏｇ１０（Ｎ１ｄ）
Ｎ７ｄは７日目での細胞数であり、Ｎ１ｄは１日目での細胞数である。
【００９０】
ＰＤ率を決定するために、ｈＢＴＳＣｓを、培養培地中で１×１０４細胞／ｃｍ２の密度で最初に播種した。各条件について３つのサンプルを使用した。以下の式（２）３５を適用した：
（２）ＰＤ＝ｌｏｇ１０（Ｎ）−ｌｏｇ１０（Ｎｓ）／ｌｏｇ１０（２）
Ｎは採取された細胞数であり、Ｎｓは初期のプレーティングした細胞数である。
【００９１】
コロニー計数
ｈＢＴＳＣコロニーは、プレーティング後の１から２週の間に出現し始め、光学顕微鏡で１０Ｘで検査することによって容易に同定した。任意のサイズのコロニーを、大きいもので＞３，０００細胞または小さいもので＜２００細胞として計数した。８ウェルチャンバースライドの各ウェルを、コロニーについて１０Ｘ拡大率を使用して評価し、培養の２〜３週間後に計数した。コロニー数、サイズ、および形態学の観察を注記した。解凍における最高の生存率が、緩衝剤Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３中で凍結保存された細胞によって与えられることを考慮して、これらの細胞をさらなるアッセイに供して凍結に対するそれらの応答を評価した１９。
【００９２】
定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）分析。
ＲＮＡ抽出を、マウス肝臓またはｈＢＴＳＣ培養物からの組織で実施した。肝内および肝臓外胆嚢系由来細胞培養からの全ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉＩ３６の手順によって抽出した。本発明者らは、それぞれインビトロおよびインビボデータの参照遺伝子としてＧＡＰＤＨおよびβアクチンを使用した。
【００９３】
ＲＮＡの質および量を、以前に記載されている通り、ＲＮＡ  ＳｔＳｅｎｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｈｉｐ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えた、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＲＮＡで評価した。遺伝子の発現を、細胞および組織から抽出された全ＲＮＡサンプルにおいて閉鎖チューブ（ＯｎｅＳｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ｂｙ  Ｑｉａｇｅｎ、Ｈａｍｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で実施された逆転写およびｑＰＣＲ増幅によって行った。これらの遺伝子を、参照として使用されるＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子と共増殖（ｃｏ−ａｍｐｌｉｆｉｅｄ）した。遺伝子発現を、Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＫ）で実施されるオンチップキャピラリー微量電気泳動で単位複製配列を定量することによって測定した。目的の遺伝子の発現を、目的の遺伝子と参照遺伝子ＧＡＰＤＨ（インビトロ）およびβアクチン（インビボ）との濃度の比によって計算した（機器によってｎｍｏｌ／Ｌで報告）。
【００９４】
以下の目的の遺伝子（ＧＯＩ）を、それらのそれぞれについて報告されたプライマー対を使用して増幅した。ＧＯＩと参照遺伝子（すなわち、ＣＤＨ１、ＣＤ４４、ＩＴＧＢ１／４、ＳＯＸ２／１７、ＰＤＸ１、ＥｐＣＡＭ、ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ、ＣＹＰ３Ａ４、トランスフェリン、ＳＲ、ＡＳＢＴ、ＣＦＴＲ、ＩＮＳ、グルカゴンに関してＧＡＰＤＨ、ならびにヒトおよびマウスアルブミンに関してベータアクチン）との濃度の比を、ＧＯＩ相対発現であると仮定した。
【００９５】
【表１】
2020516257.tif 000003
2020516257.tif 000004
【００９６】
ｈＢＴＳＣｓでのアルブミン分泌の測定
ｈＢＴＳＣｓは、培養プラスチックにプレーティング後に無血清クボタ培地（ＫＭ）で自己複製期間を経験した。細胞を、ＫＭ中に３．８×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地を、３日毎に交換した。ＫＭで１週間培養した後、培養物を、ＫＭ（対照）または肝細胞に適合させたＨＤＭのいずれかに供した。アルブミン分泌実験を、培養のさらに２週間後に実施した。アッセイの全期間、細胞は継代されなかった。
【００９７】
２４時間にわたって採取された細胞培養培地を、ヒトアルブミン特異的ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ、カタログ＃ａｂ１０８７８８）によって三連で分析した。培地を、採取し、−２０℃で保存した。値は、２８ミリリットルの培養培地当たり百万個細胞当たりのマイクログラムとして表される。培地上清中のヒトアルブミン分泌の評価を、陽性対照として利用された、高分化型ヒト肝臓癌細胞株であり、Ｌｏｎｚａ（Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入したＨｅｐＧ２細胞でも実施した。
【００９８】
ｈＢＴＳＣｓでのＣペプチド分泌の測定
ｈＢＴＳＣｓは、培養プラスチックにプレーティング後に無血清ＫＭで自己複製期間を経験した。細胞を、ＫＭ中に５．２×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種した。培地を、３日毎に交換した。ＫＭで１週間培養した後、培養物を、ＫＭ（対照）または膵島に対する幹細胞の分化に適合させたＨＤＭのいずれかに供した。グルコースチャレンジ実験を、培養のさらに２週間後に実施した。アッセイの全期間について、細胞は継代されなかった。
【００９９】
細胞を、Ｄｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、ＧＩＢＣＯ、カタログ＃１４１９０１４４）で三回洗浄した。その後、細胞を、５．５ｍＭグルコースおよび抗生物質を有するＣｏｎｎａｕｇｈｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ培地（ＣＭＲＬ）で２時間インキュベートした；ＣＭＲＬは、より高レベルのヌクレオシドおよびビタミンを有し、ヒトおよび霊長類細胞に有用であることが発見された、化学的に規定された無タンパク質培地である。インキュベーション培地を、採取し、−２０℃で保存した。細胞を、ＤＢＰＳで三回再び穏やかに洗浄し、次いで、２８ｍＭグルコースおよび抗生物質を補充した無グルコースＣＭＲＬで２時間インキュベートした。再び、各ウェルから培地を、採取し、−２０℃で保存した。細胞を、トリパンブルーアッセイを使用して計数した。５．５ｍＭ対２８ｍＭグルコースでの培養からのサンプルを、Ｃペプチド合成のアッセイに関して使用した。培地中のヒトＣペプチド含量を、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ、Ｒｅｆ  ＤＩＣＰ００）によって測定し、各サンプルの細胞数に対して標準化した。高グルコースチャレンジに応答して生成されるＣペプチドの量を、低グルコースチャレンジによって生成される量で割り、平均Ｃペプチド分泌指数を算出した。Ｃペプチド分泌の刺激指数は、高グルコース濃度下の培地で分泌されたＣペプチドと基礎（低）グルコース濃度下で分泌されたＣペプチドとの間の比として計算される；培地中のＣペプチド濃度を、同じ細胞サンプルでおよび固定期間（２時間）の間、ＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１００】
ＳＣＩＤマウスにおける細胞移植。
全ての動物実験は、動物実験に関するＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵおよびＳａｐｉｅｎｚａ施設ガイドラインに基づき実施された。動物実験プロトコールは、Ｓａｐｉｅｎｚａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｍｅ  ａｎｄ  Ｕｍｂｅｒｔｏ  Ｉ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｒｏｍｅ  （Ｐｒｏｔ．  ５４１）の倫理委員会によって審査および承認された。ＳＣＩＤマウス（Ｔ／ＳＯＰＦ  ＮＯＤ．ＣＢ１７  ＰＲＫＤＣ／Ｊ）（Ｎ＝４）は、雄性４週齡動物であり、ヒト細胞の移植に関する宿主として使用された。動物を、麻酔薬（２，２，２−トリブロモエタノール）で鎮静化した。その後、新たに単離されたまたは凍結保存および解凍された２×１０６個のｈＢＴＳＣｓを、１００μｌ食塩水で懸濁し、脾臓を介して肝臓に注射した。シャム対照は、１００μｌ食塩水のみを注入された。全ての動物を、回復するまで厳重にモニターし、食物および水を自由に与えた。全ての動物プロトコールは、本発明者らの施設ガイドラインを順守した。死亡は発生しなかった。細胞移植の３０日後、マウスを屠殺し、さらなる分析のために肝臓を除去した。肝臓サンプルを、遺伝子分析のためにＴｒｉｚｏｌ試薬または病理および免疫組織化学分析のために４％ホルマリンに配置した。血液サンプルを、心臓から採取し、遠心分離し、血清サンプルをＥＬＩＳＡ（ＡＢＣＡＭ  ＃ａｄ１０８７８８）によるヒトアルブミンの定量のために−２０℃で保存した。
【０１０１】
光学顕微鏡（ＬＭ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）および免疫蛍光（ＩＦ）
検体を、１０％緩衝ホルマリンに２〜４時間固定し、低温度融解パラフィン（５５〜５７℃）に包埋し、３〜４μｍ切片を、標準的なプロトコールに従って、ヘマトキシリンエオシンおよびＳｉｒｉｕｓレッド／Ｆａｓｔグリーンで染色した。ＩＨＣに関して、内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール性過酸化水素（２．５％）中で３０分間インキュベーションすることによってブロックした。販売会社によって示された通り、抗原を、プロテイナーゼＫ（Ｄａｋｏ、コードＳｏｌ３０２０）で１０分間室温で適用することによって回復させた。切片を、次いで、一晩４℃、一次抗体でインキュベートした。
【０１０２】
一次抗体
【０１０３】
【表２】
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【０１０４】
サンプルを、ＰＢＳで５分間で二回すすぎ洗いし、二次ビオチン化抗体（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、Ｄａｋｏ、コードＫ０６９０；Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）、次いで、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＬＳＡＢ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、Ｄａｋｏ、コードＫ０６９０）で室温で２０分間インキュベートした。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ）を基質として使用し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。細胞培養の免疫蛍光に関して、スライドチャンバーをアセトンで１０分間室温で固定し、次いで、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０ですすぎ洗いした。非特異的なタンパク質結合を、５％正常ヤギ血清によりブロックした。固定された細胞を、一次抗体でインキュベートした。次いで、細胞を、洗浄し、標識アイソタイプ特異的二次抗体（抗マウス  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５４６、抗マウス  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８、抗ウサギ  Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ−４８８、抗ヤギ  ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５４６、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）で１時間インキュベートし、細胞核の可視化については４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で対比染色した。全ての免疫反応に関して、陰性対照（一次抗体を免疫前血清で置き換えた）も、含めた。切片／培養を、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＭ  ４５００  Ｂ  ＬｉｇｈｔおよびＪｅｎｏｐｔｉｋＰｒｏｇ  Ｒｅｓ  Ｃ１０  Ｐｌｕｓ  Ｖｉｄｅｏｃａｍ（Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた蛍光顕微鏡（Ｗｅｌｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、コード様式（ｃｏｄｅｄ  ｆａｓｈｉｏｎ）で検査した。ＩＦ染色も、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２）によって分析した。ＬＭ、ＩＨＣおよびＩＦ観察を、イメージ分析システム（ＩＡＳ  −  Ｄｅｌｔａ  Ｓｉｓｔｅｍｉ、Ｒｏｍａ−  Ｉｔａｌｙ）で処理し、二名の病理学者が盲検様式で独立に実施した。
【０１０５】
陽性および陰性対照
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
全ての計数を、各スライドについて６つのオーバーラップしない視野（拡大率ｘ２０）で実施し；少なくとも３つの異なるスライドを各検体から取得した。ＩＨＣ／ＩＦ染色に関して、陽性細胞の数を、各スライド／培養について６つのオーバーラップしない視野（拡大率ｘ２０）でランダムな盲検様式で計数し、データを、％陽性細胞として表した。
【０１０８】
統計解析
データを、平均±ＳＤとして表した。統計学的分析を、ＳＰＳＳ統計ソフトウェア（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．  Ｃｈｉｃａｇｏ  ＩＬ、ＵＳＡ）によって実施した。非正規分布パラメータに関する群間の差を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって検定した。統計学的な有意性を、ｐ値＜０．０５に設定した。
【０１０９】
ＩＩ．結果
凍結保存されたｈＢＴＳＣｓによる生存率、老化およびコロニー形成。
ｈＢＴＳＣｓを、基礎対照溶液（ＫＭ中の１０％  ＤＭＳＯ、１．５％ヒトアルブミン）で４〜１２週間凍結保存し、次いで、解凍し、プラスチックに１０，０００細胞／ｍＬの密度で播種した。図１および７は、基礎対照溶液での凍結保存の４週間後のｈＢＴＳＣ培養物の細胞生存率および形態を示す。解凍後、細胞を、クボタ培地（ＫＭ）で３０日の期間成長させた。ｈＢＴＳＣｓは、新たに単離された細胞によって生成されたものに形態学的に類似する細胞コロニーを形成できる（図７）。本発明者らは、様々な凍結保存緩衝剤を試験した。それらの全ては、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加された無血清ＫＭから構成され、異なる濃度のヒトアルブミンおよびＨＡ含有することで区別された。生存細胞のパーセントを、凍結保存の４週間後および解凍直後に評価した（Ｎ＝９）。溶液１（Ｓｏｌ１：０．１％  ＨＡ＋１５％組換えヒトアルブミンをさらに補充した）中の細胞は、７２．７８±５．６５％の平均生存率を有していた。溶液３（Ｓｏｌ３：１５％組換えヒトアルブミンをさらに補充した）中の細胞は、７８．８９±６．５１％の平均生存率を有していた。Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３は、他の緩衝剤中の細胞よりも有意に高い（ｐ＜０．００１）解凍後の生存率をもたらした。溶液２Ａ（Ｓｏｌ２Ａ：０．１％  ＨＡを補充した）の平均生存率は、５３．３３±１３．２３％であり；溶液２Ｂ（Ｓｏｌ２Ｂ：０．０５％  ＨＡを補充した）の細胞は、５０．５６±５．２７％であり、および対照溶液（ＣＴＲＬ：１．５％組換えヒトアルブミンを補充した）の細胞は、５０．００±６．６１％である。Ｓｏｌ１とＳｏｌ３の間に細胞生存率の有意差は認められなかった（図１Ａ）。
【０１１０】
出願人らは、次に、凍結保存から得られた培養または同じドナーから新たに単離された細胞における細胞老化（Ｘ−Ｇａｌ）を評価した。Ｘ−Ｇａｌ陰性細胞（老化ではない）の数は、凍結保存後９５％を超えた（図１Ｂ）。Ｓｏｌ１（ＨＡ有；９８．５７±０．３６；Ｎ＝９）とＳｏｌ３（ＨＡ無；  ９６．７２±０．６６；Ｎ＝９；ｐ＞０．０５）との間、および凍結保存と新たに単離された細胞（９８．００±０．５３；Ｎ＝９；ｐ＞０．０５）との間に差は観察されなかった。老化陰性細胞は、他の条件よりもＳｏｌ２Ａで著明に低かった（４．８５±０．８０；Ｎ＝９；ｐ＜０．０００１）。培養の細胞集団倍加（ＰＤ）により、Ｓｏｌ１およびＳｏｌ３で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓのインビトロでの機能的な特性が至適に維持されることが確認された。実際に、ＰＤは、新たに単離されたもの（０．８１±０．０１）と比較して、Ｓｏｌ１（１．１１±０．０１）およびＳｏｌ３  （０．９８±０．０１）で有意に高かった（Ｎ＝８；ｐ＜０．０１）（図１Ｃ）。ＰＤ時間（ＰＤＴ）は、新たに単離された細胞（８．６７±０．０３日）と比較して、Ｓｏｌ３で、およびＳｏｌ３（ＨＡ無）よりもＳｏｌ１（ＨＡ有）（６．３２±０．０２対７．１４±０．０２日；Ｎ＝８；ｐ＜０．００１）で有意に低かった（Ｎ＝８；ｐ＜０．０００１）（図１Ｄ）。
【０１１１】
コロニー形成は、接種および移植能力の代用マーカーである。２００〜３，０００個の細胞によって形成されるコロニーの数は、Ｓｏｌ３での凍結保存された細胞（ＨＡ無、１０．１１±３．８５、Ｎ＝１８；ｐ＜０．０００００１）と比較して、Ｓｏｌ１での細胞（ＨＡ有、３１．５６±８．４３、Ｎ＝１８）で劇的に増加した（図１Ｅ）。
【０１１２】
凍結保存されたｈＢＴＳＣｓでの幹細胞マーカーおよび接着分子の発現。
凍結保存が幹細胞表現型に影響するかどうかを評価するために、内胚葉幹細胞によって一般的に発現される中心的な遺伝子の発現を評価した。これらには、多能性遺伝子（ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２）および内胚葉転写因子（ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１）が含まれる。これらを、凍結保存の前後１カ月で評価した。興味深いことに、幹細胞遺伝子は、新たに単離された細胞よりもＳｏｌ１およびＳｏｌ３で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓで、より高度に発現した［ＳＯＸ２（ｐ＜０．０５）、ＰＤＸ１（ｐ＜０．０５）、ＮＡＮＯＧ（ｐ＜０．０１）、ＳＯＸ１７（ｐ＜０．０５）、およびＯＣＴ４（ｐ＜０．０１）；Ｎ＝５］（図２）。
【０１１３】
Ｔｕｒｎｅｒら２０によって示される通り、細胞移植後の移植は、接着分子の発現のレベルとよく相関する。したがって、出願人らは、ＣＤ４４（ヒアルロナン受容体）、ＩＴＧＢ１（インテグリンベータ１）、ＩＴＧＢ４（インテグリンベータ４）、およびＣＤＨ１（カドヘリン１）を含む、接着分子をコードする異なる遺伝子の遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲによって分析した。新たに単離された細胞に対し、異なる凍結保存緩衝剤に供した細胞において、ＣＤ４４の発現に関して有意差は認められない（図２）、他方でＩＴＧＢ１およびＣＤＨ１の発現は、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓと比較して、凍結保存された細胞で減少し（ＩＴＧＢ１、ｐ＜０．０５；ＣＤＨ１Ｎ＝５；ｐ＜０．０１）（図６Ｂおよび６Ｃ）；ＩＴＧＢ４発現は、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓで増加した（ｐ＜０．０５）（図２）。
【０１１４】
多分化能は、凍結保存で保存される。
多分化能遺伝子は、自己複製条件下でｈＢＴＳＣｓで発現され、次いで、成熟細胞に分化した際に消失する。出願人らは、Ｓｏｌ１（図３Ａ、４Ａ）、Ｓｏｌ３（データ示さず）対新たに単離された細胞（図３Ｂ、４Ｂ）での凍結保存後のｈＢＴＳＣｓの培養を試験した。分化条件に関して、出願人らは、成熟肝細胞（ＨＭ）、胆管細胞（ＣＭ）または膵島（ＰＭ）へのｈＢＴＳＣｓの分化を誘導するため特異的に適合させた、異なるホルモン規定培地（ＨＤＭ）を使用した。ヒドロコルチゾンなしのＫＭを対照として使用した、というのも、この培地が細胞増殖を許容し、肝臓および膵臓の両方に向かう分化に関して中立的であるからである（糖質コルチコイドは、膵臓分化については回避しなければならない）。凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ（図３Ａ）ならびに新たに単離された細胞（図３Ｂ）は、肝細胞（ＨＭ）、膵臓（ＰＭ）または胆嚢（ＣＭ）運命への幹細胞の分化に適合させたＨＤＭでの培養の二週間後に、多能性遺伝子（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ４、およびＳＯＸ２）および内胚葉幹細胞遺伝子（ＥｐＣＡＭ、ＰＤＸ１、およびＳＯＸ１７）の発現の減少を示した（ｐ＜０．０５）。ｈＢＴＳＣｓ（Ｓｏｌ１および新たに単離された）がＫＭからＨＭに２週間移された場合に、成熟肝細胞特異的遺伝子の発現の有意な増加が観察された（例えば、アルブミン（Ａｌｂ）；Ｎ＝５；ｐ＜０．０１対ＫＭ；トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆ）；Ｎ＝５；ｐ＜０．０５対ＫＭおよびチトクロムＰ４５０  ３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４）；Ｎ＝５；ｐ＜０．０１対ＫＭを含む）（図４）。同様に、ｈＢＴＳＣｓ（Ｓｏｌ１および新たに単離された）がＰＭまたはＣＭに２週間移された場合に、膵島特異的遺伝子発現（インスリン（Ｉｎｓ）、Ｎ＝５、ｐ＜０．０５；グルカゴンＮ＝５、ｐ＜０．０１  ＰＭ対ＫＭ）、および大胆管細胞特異的遺伝子発現（セクレチン受容体（ＳＲ）、Ｎ＝５、ｐ＜０．０１；嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ），Ｎ＝５、ｐ＜０．０１；アピカルナトリウム依存性胆汁酸トランスポーター（ＡＳＢＴ）、Ｎ＝５、ｐ＜０．０５  ＣＭ対ＫＭ）（図４）の有意な増加が観察された。ＨＤＭ中のｈＢＴＳＣｓは、形態および表現型特性の特徴的な変化を発生させた。具体的には、ＨＭで１５日後、アルブミン（肝細胞マーカー）を発現する立方状細胞を観察し（図５Ａ）（Ｎ＝５）；ＣＭで１５日後、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）を発現する細胞のクラスターが出現した（図５Ａ）（Ｎ＝５）；他方で、１４日後、ＰＭでのｈＢＴＳＣｓは、コロニーの端部から出芽し、インスリンを発現する細胞を含有する、凝集性細胞の高密度球を産生した（図５Ａ）（Ｎ＝５）。Ｓｏｌ１、Ｓｏｌ３および新たに単離された細胞の間に有意差は観察されなかった（Ｎ＝５）。
【０１１５】
出願人らは、次いで、どのようにして、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓが、インビトロで肝細胞様細胞または膵島様細胞に効果的に分化することができるかを機能的なレベルで評価した。ＨＭで培養された凍結保存ｈＢＴＳＣｓは、アルブミンを産生および分泌する能力を獲得したが（Ｎ＝７；ｐ＜０．０１  ＨＭ対ＫＭ）、ＨｅｐＧ２を基準にして若干程度は低かった（ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。ＰＭで培養された場合に、ｈＢＴＳＣｓは、グルコース濃度によって制御されるインスリン分泌を獲得した（低対高グルコース濃度；Ｎ＝７；ｐ＜０．０１  対低グルコース）（図５Ｃ）。
【０１１６】
凍結保存されたｈＢＴＳＣｓの効果的なインビボ移植。
凍結保存されたｈＢＴＳＣｓが免疫無防備状態マウス（ｉｍｍｕｎｅ−ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ  ｍｉｃｅ）の肝臓に効果的に移植され、増殖することができるかどうかを決定するために、細胞をＳＣＩＤマウスの脾臓に移植した。次いで、肝臓を、以前５に記載されている通り細胞移植の３０日後、ヒトミトコンドリアに対する抗体での免疫組織化学によって分析した。図６Ａに示される通り、凍結保存された（Ｓｏｌ１）ｈＢＴＳＣｓは、新たに単離された細胞と同じ効率で肝実質に移植された（Ｎ＝３；ｐ＞０．０５）。実際、ＳＣＩＤマウスの肝実質でのヒトミトコンドリアの発現は、２．６２６±１．５３０％および３．７２２±０．６３９の宿主の実質細胞塊が、それぞれ、新たなまたは凍結保存されたｈＢＴＳＣｓに由来するヒト細胞を含んでいたことを示した（図６Ａ）。移植された凍結保存ｈＢＴＳＣｓのマウス肝臓への効果的な移植および分化を確認するために、本発明者らは、肝臓中のヒトアルブミンｍＲＮＡおよび血清中のヒトアルブミン（タンパク質）を測定した。肝臓でのヒトアルブミンｍＲＮＡの発現は、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓ（１．９０＊１０−１０±１．０９＊１０−１０）で移植されたマウスよりも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ（５．１９＊１０−７±３．０６＊１０−７）で移植されたマウスで有意に高かった（Ｎ＝３；ｐ＜０．０１）（図６Ｂ）。したがって、同じ動物での、ヒト血清アルブミンレベルは、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓ（２４．１３±１．４４ｎｇ／ｍＬ）で移植されたマウスよりも、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓ（７６．３９±１７．０４ｎｇ／ｍＬ）で移植されたマウスで、有意に高かった（Ｎ＝３；ｐ＜０．０００１）（図６Ｃ）。
【０１１７】
ＩＩＩ．考察
出願人らは、ＤＭＳＯ（１０％）、ＨＡ（０．１％）および高濃度の組換えヒトアルブミン（１５％）を補充した無血清クボタ培地（ＫＭ）から構成される、ｈＢＴＳＣｓのための、成功を収めた凍結保存プロトコールを確立した。この結論が導かれる鍵となる所見は、以下である：１）ｈＢＴＳＣｓは、この凍結保存緩衝剤に供した場合、１２０日間の凍結保存後の解凍時に、生存し、高い生存率（約８０％）を有し得る；２）インビトロでの増殖率（集団倍加時間）およびコロニー形成能力は、ＨＡ（０．１％）を有する凍結保存緩衝剤の補充によって改善された；３）高アルブミン濃度±ＨＡを含有する緩衝剤で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、インビトロで成熟運命（肝細胞、胆管細胞、または機能的な膵臓β細胞）に効率的に分化した；４）高アルブミン濃度＋ＨＡを含有する緩衝剤で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓは、ＳＣＩＤマウスに効果的に移植され、移植後にインビボで分化した。
【０１１８】
出願人らは、ＧＭＰ条件下で細胞単離および凍結保存／解凍プロセスを行ったこと；インビトロ実験のみが、ＧＭＰグレード戦略の細胞凍結保存ではなかったことを注記している。出願人らは、細胞生存率および増殖能力の機構を防御することを目的とし、等張性緩衝剤、不凍化タンパク質（極寒地の動物からの）、抗酸化剤および凍結試薬、例えば、ＤＭＳＯまたはグリセロールの使用に基づいた。現存する方法は、造血性細胞亜集団に対して良好に働く、というのも、造血性細胞亜集団が細胞結合ドメインを欠損する細胞外マトリックス構成要素を本来的に有しており、そのため細胞が浮遊できるからである。したがって、それらの接着および他のマトリックス依存的な機能は、インタクトであり、凍結保存によって有害な影響を及ぼされない。対照的に、固形器官からの細胞の単離には、マトリックスを溶解する酵素活性が要求され、これにより細胞が細胞懸濁液に分散されるのを可能にし、これらの細胞をマトリックス依存性活性での凍結保存の有害作用に脆弱にする２０。肝細胞を含む肝臓細胞は、固形器官からの細胞の代表であり、凍結保存が遭遇する多大の困難が実証されている１４。加えて、幹／前駆細胞の凍結保存は、成熟細胞の凍結保存に比べ、追加の障害がある、というのも、血清などの凍結保存緩衝剤の多くの添加物が、幹性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の特性を排除するのと並行して分化を誘発することができるからである２０。出願人らは、これらの障害が、等張性培地、例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（Ｃｒｙｓｔｏｒ−１０）または完全に規定され、無血清の幹細胞培地、ＫＭにヒアルロナン（幹細胞ニッチのマトリックス化学の主要な成分）を補充したものを使用することによって克服することができることを以前に実証した２１。この研究で、本発明者らは、高レベルの組換えヒトアルブミン（最終濃度：約３％）を添加することによってさらに条件を改善できた。出願人らは、凍結保存後、生存率、接種、増殖率および分化潜在能力などの鍵となる細胞の表現型特性の維持を評価した１、１９。最初に、出願人らは、高レベルの組換えヒトアルブミン（約３％）を含有するいずれかの無血清緩衝剤（Ｓｏｌ１またはＳｏｌ３）での凍結保存が、他の緩衝剤で試験した細胞と比較して解凍後に有意に良好な細胞生存率をもたらすことを観察した。したがって、高濃度のヒトアルブミン（０．３％と比較して約３％）での補充は、解凍後の細胞生存率の維持を促進する。以前に、Ｔｅｒｒｙら１４は、ヒト血清アルブミンが胎児血清の代替物となることができ、血清中に含有される高レベルのアルブミンが血清凍結保護作用の主要な決定要因であると仮定することを提案した；本発明者らの結果は、凍結保護剤としてのアルブミンの役割を確認した。
【０１１９】
出願人らは、高アルブミン濃度±ＨＡを含有する溶液での凍結保存がｈＢＴＳＣｓを細胞老化から防御することをさらに実証した。細胞老化は、細胞分裂の間のテロメア短縮と相関しているが、幹細胞は高テロメラーゼ活性により老化に対抗しており２２、２３、このことは肝臓幹細胞でＲｅｉｄらによって実証された２２、２３。本発明者らは、インビトロでの増殖率を集団倍加アッセイによって分析し、新たに単離された細胞を基準にして、凍結保存されたｈＢＴＳＣｓによる増殖能力の保存を実証した。接種および増殖は、両方ともコロニー形成能力と相関している２０。出願人らは、コロニー形成特性が何らかの凍結保存緩衝剤によって影響されるかどうかを試験した。一部の接着分子（例えば、ＩＴＧＢ４）の発現は改善され、ＣＤ４４の発現は影響されないが、一方、他は減少した（ＩＴＧＢ１、ＣＤＨ１）。さらにＳｏｌ３に対しＳｏｌ１で凍結保存された細胞での増殖は類似していたが、高いアルブミンレベルとＨＡとを両方とも含有するＳｏｌ１での細胞でのコロニー形成を劇的に増加させる。肝臓での幹細胞および前駆体の全ての亜集団がＨＡに対する受容体であるＣＤ４４を発現すること、ならびにアポトーシスが解凍後に急速に接着タンパク質を回復することができない細胞で増加することに注目すべきである２０。ＨＡは、肝臓幹細胞ニッチの主な成分を代表する２４。Ｔｕｒｎｅｒら２０は、ヒアルロナン補充の使用により、ヒト肝臓幹／前駆細胞（ｈＨｐＳＣ）の至適な凍結保存に成功する選択肢が構成されることを観察した。ここで、出願人らは、凍結保存後の細胞の移植に有利であり得るプリコンディショニング剤としてのＨＡの積極的な役割を実証した。実際、ＲＴ−ｑＰＣＲによって得られたデータは、Ｓｏｌ１で凍結保存されたｈＢＴＳＣｓでは、新たに単離された細胞での発現と比較して、接着分子の発現は部分的に保存されるが、多能性および内胚葉幹細胞の遺伝子は全体的に保存されることを実証した。これらのデータは、Ｔｕｒｎｅｒら２０による以前の結果と一致する。最後に、最も重要なこととして、ｈＢＴＳＣｓの分化ポテンシャルは、高アルブミン濃度±ＨＡを含有するＳｏｌ１または３で凍結保存された場合に影響されず、新たに単離された細胞のものに類似する１〜４、２５。実際、出願人らは、インビトロで、肝細胞、胆管細胞または膵臓細胞へのｈＢＴＳＣｓの選択的な分化を誘導するため特異的に適合させた培地では、分化能力も、本発明者らの凍結保存のプロトコールによって良好に保存されることを示した。それらは、ＨＡによって影響されない。これは、肝細胞に分化する細胞のアルブミン合成／分泌能力ならびに膵臓細胞に分化する細胞での、基礎状態およびグルコースチャレンジ後の両方ともでインスリン産生を評価することにより機能的なレベルでも実証された。
【０１２０】
最後に、最も重要なこととして、出願人らは、高アルブミン＋ＨＡを含有する緩衝剤（Ｓｏｌ１）で凍結保存され、ＳＣＩＤマウスに移植されたｈＢＴＳＣｓが、新たに単離された細胞よりも良好な移植および分化効率を提示することを実証した。マウス肝臓にホストするヒト細胞ならびにヒトアルブミンの合成および分泌のパーセントは、実際に凍結保存で、新たに単離されたｈＢＴＳＣｓよりも良好であった（Ｓｏｌ１対新たに単離された）。この驚くべき結果は、新たに単離された細胞よりも、ＨＡが細胞移植を改善するとのインビトロでの観察およびＨＡでコーティングした細胞が、移植後、より高率の肝臓移植を示したとのインビボでの観察に沿うものである２６。
【０１２１】
ｈＢＴＳＣｓは、任意の年齢のドナーのヒト組織からＧＭＰ条件下で容易に単離され、進行性肝硬変を有する患者の細胞療法のため既に使用されている２７。胆嚢系組織の単離の非常に広範囲の利用可能性およびそれらの生物学的特性を考慮すると、ｈＢＴＳＣｓは糖尿病を含む肝臓および膵臓の再生医学に多大な応用潜在力を有している。この研究では、ｈＢＴＳＣｓは、重大な細胞機能を失うことなく、成功裏に凍結保存された；これにより、保存され、迅速に使用することができ、肝臓疾患の細胞療法にロジスティックス上の利点を提供するｈＢＴＳＣｓの細胞バンクの確立が促進される。
【０１２２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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