(57)【要約】  遺伝子構築物  本発明は、遺伝子構築物および該構築物を含む組換えベクターを提供する。構築物およびベクターは、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン病を含む神経変性障害の治療、予防、または改善のため、または脳卒中の治療のため、または神経の再生および／または生存の促進のための遺伝子治療法に使用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ受容体B（TrkB））をコードする第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、およびTrkB受容体アゴニストをコードする第２のコード配列を含む、神経変性障害または脳卒中の治療、予防、または改善に使用するための遺伝子構築物。
【請求項２】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WHPE）をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記WHPEは実質的に配列番号57または58に示される核酸配列、もしくはその断片または変異体を含む、請求項１に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３】
ポリA鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ポリA鎖は実質的に配列番号59に記載の核酸配列、もしくはその断片または変異体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項４】
プロモーターがヒトシナプシンI（SYN I）プロモーターであり、場合により前記プロモーターが実質的に配列番号1に記載のヌクレオチド配列、もしくはその断片または変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項５】
プロモーターがCAGプロモーターであり、場合により前記プロモーターが実質的に配列番号2、3または48に記載のヌクレオチド配列、もしくはその断片または変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項６】
第１および第２のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列は消化されてTrkB受容体とアゴニストを別々の分子として産生するように構成されるペプチドスペーサーをコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項７】
前記スペーサー配列が、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス2Aペプチドスペーサー配列を含み、コードする、請求項６に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項８】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号4に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６または請求項７のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項９】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号5に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１０】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号6に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項９に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１１】
前記スペーサー配列が、実質的に配列番号7に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１２】
前記ペプチドスペーサー配列が、実質的に配列番号8に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１１に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１３】
前記第１のコード配列が、TrkBのヒト正準アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記TrkBの正準アイソフォームは、実質的に配列番号9に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１４】
前記第１のコード配列が、実質的に配列番号10に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１３に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１５】
前記第１のコード配列が、TrkBのアイソフォーム4をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１６】
TrkBのアイソフォーム4が、実質的に配列番号11に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１５に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１７】
前記第１のコード配列が、実質的に配列番号12に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１５または請求項１６のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１８】
前記第１のコード配列が、TrkB受容体の変異体をコードするヌクレオチド配列を含み、配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の１つ以上のチロシン残基が改変もしくは変異されている、請求項１〜１７のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項１９】
配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基が改変されている、請求項１８に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２０】
配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の５つすべてのチロシン残基が改変されている、請求項１９に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２１】
前記または各チロシン残基が、グルタミン酸に改変されている、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２２】
前記TrkB受容体の改変型が、実質的に配列番号13に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２３】
前記第１のコード配列が、実質的に配列番号14に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２２に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２４】
前記第２のコード配列が、栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである、TrkB受容体アゴニストをコードし、場合により前記アゴニストが脳由来神経栄養因子（BDNF）；神経成長因子（NGF）；ニューロトロフィン-3（NT-3）；ニューロトロフィン-4（NT-4）；およびニューロトロフィン-5（NT-5）；またはそれらのその断片からなるアゴニストの群から選択される、請求項１〜２３のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２５】
前記第２のコード配列がニューロトロフィン-4（NT-4）をコードし、該NT-4が実質的に配列番号49または55に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含み、および／または前記第２のコード配列が、実質的に配列番号50または56に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２４に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２６】
前記TrkB受容体のアゴニストが、プレプロ脳由来神経栄養因子（プレ−プロ−BDNF）、プロ−BDNFまたは成熟BDNF（mBDNF）である、請求項１〜２５のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２７】
前記プロBDNFが正準プロBDNFであり、場合により正準プロBDNFが実質的に配列番号15に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含み、または前記第２のコード配列が、実質的に配列番号16に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２３に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２８】
前記プロBDNFが、プロBDNFのアイソフォーム2であり、場合によりプロBDNFのアイソフォーム2が本明細書で配列番号17と呼ばれるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２６に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項２９】
前記第２のコード配列が、成熟BDNFをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２６に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３０】
前記成熟BDNFが、実質的に配列番号18に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項２９に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３１】
前記第２のコード配列が、実質的に配列番号19に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３０に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３２】
前記第２のコード配列が、TrkB受容体アゴニストのシグナルペプチド、最も好ましくはBDNFのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列がBDNFの正準シグナルペプチドをコードする、請求項３２に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３４】
前記第２のコード配列が、実質的に配列番号20に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３５】
前記第２のコード配列が、実質的に配列番号21に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項３３に記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３６】
前記第２のコード配列が、実質的に配列番号23、25、27または29に記載のいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号22、24、26、または28に記載のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３７】
前記第２のコード配列が、実質的に配列番号31、33、35、37、39、41、43、45、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101または103に記載のいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；または前記シグナルペプチドが、実質的に配列番号30、32、34、36、38、40、42、44、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、または102に記載のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３８】
前記構築物が、実質的に配列番号107または108に記載されているヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３７のいずれかに記載の使用のための遺伝子構築物。
【請求項３９】
神経変性障害または脳卒中の治療、予防または改善に使用するための、請求項１〜３８のいずれかに記載の遺伝子構築物を含む組換えベクター。
【請求項４０】
前記ベクターが組換えAAV（rAAV）ベクターである、請求項３９に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項４１】
前記rAAVが、AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、またはAAV-11である、請求項４０に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項４２】
前記rAAVがrAAV血清型-2である、請求項４１に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項４３】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の遺伝子構築物、または請求項３９〜４２のいずれかに記載の組換えベクター、および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の遺伝子構築物または請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の組換えベクターを、医薬的に許容されるビヒクルと接触させることを含む、請求項４３に記載の医薬組成物を製造する方法。
【請求項４５】
前記神経変性障害が、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、毛細血管拡張性運動失調症、ニューロンセロイド脂褐素症、バッテン病、牛海綿状脳症（BSE）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭葉変性症、ゴーシェ病、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、リソソーム蓄積障害、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、運動ニューロン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、多種スルファターゼ欠損症、ムコリピド症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病C型、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、ピック病、ポンペ病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、スピルマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳変性症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、およびテイ・サックス病からなる群から選択される、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物またはベクター、または請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の使用のための遺伝子構築物またはベクター、または請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
ニューロンにおけるタウリン酸化を低減する、請求項４６に記載の使用のための遺伝子構築物またはベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子構築物、特にそのような構築物を含む組換えベクター、および神経変性障害の治療、予防または改善のための、または脳卒中の治療のための、もしくは神経の再生および／または生存を促進するための遺伝子学的治療法における構築物およびベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は、主としてニューロンに影響を与える疾患である。その変性プロセスには、神経構造の進行性の喪失、神経機能の進行性の喪失、または進行性のニューロン細胞死が含まれる場合がある。多くの特定の障害は、神経変性疾患として分類される。パーキンソン病は長期に渡る神経変性障害であり、約700万人が罹患していると推定されている。ハンチントン病もまた長期に渡る神経変性障害であるため、パーキンソン病とハンチントン病のための改善された治療が必要であり、神経の再生または生存の促進はそのような患者にとって有益であり得る。
【０００３】
運動ニューロン病には、運動ニューロンに神経変性効果がある障害が含まれる。これには、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、原発性側索硬化症（PLS）、進行性筋萎縮症（PMA）、進行性延髄麻痺（PBP）、偽球麻痺、または脊髄性筋萎縮症が含まれる。脳卒中は、脳への血流が遮られるかまたは減少した時に発生し、血流が不十分であると細胞死に至る可能性がある。
【０００４】
アルツハイマー病は、すべての認知症の約60％を占めており、推定では、世界中で2,600万人以上がアルツハイマー病にかかっていると報告されている[1]。認知症には、通常、記憶、言語、および認知プロセスの欠損を含む精神機能の進行性の低下が伴う。アルツハイマー病は患者自身に影響を及ぼすだけでなく、しばしば無給で、患者の世話をする必要がある多くの介護者にも大きな影響を与える。アルツハイマー病の最大の危険因子は年齢であるため、高齢者がより長く生きるにつれて有病率が劇的に増加する[1]。アルツハイマー病患者の増加は、すでに世界の医療システムに大きな影響を及ぼしている。アルツハイマー病に関連する典型的な病理学には、脳の肉眼的萎縮、大脳皮質における灰白質の薄化、ニューロン損失を示す脳室拡大、タンパク質を凝集し、凝集したタウタンパク質を含む細胞内神経原線維変化を集めるベータアミロイドペプチド[Aβ]を含む顕微鏡細胞外アミロイド斑、および脳血管アミロイド、すなわち血管を囲むアミロイドタンパク質が関与する。アルツハイマー病では、脳の多くの領域にアミロイドβペプチドの誤った折り畳みの細胞外沈着によって引き起こされるアミロイド斑、および過剰リン酸化タウタンパク質からなる神経原線維変化、特に前頭、側頭および頭頂皮質、海馬、および前脳基底部のコリン作動性核、がある。これらの脳領域は、短期記憶に不可欠な神経回路に関与する重要な領域を表している。アミロイド斑沈着は脳全体に無作為に現れるが、細胞内神経原線維変化の出現は、嗅周囲皮質で最初に検出されるという明確なパターン[2]に従うようである。神経原線維変化は、その後、嗅内皮質、海馬の領域、そして大脳皮質の外側に順次広がることが観察されている。多くの研究により、アルツハイマー病の最も初期の変化の一つはシナプスの喪失に関係していることが示されており、これは認知機能低下と相関し[3]、最終的に多くの脳領域で著しい細胞喪失につながる。したがって、病気の症状は、脳全体のゆっくりした破壊の進行に続き、新しい記憶を作ることができなくなることから始まり、これは海馬に依存するプロセスである。
【０００５】
脳由来神経栄養因子（BDNF）は、神経成長因子（NGF）、ニューロトロフィン-3（NT-3）、ニューロトロフィン-4／5（NT-4／5）とともに、栄養因子[4-5]のニューロトロフィンファミリーをのメンバーである。ニューロトロフィンは、末梢神経系および中枢神経系両方の広範なニューロンの発達、生存、および機能に不可欠な役割を果たす。ニューロトロフィンは、2つの細胞表面受容体、低親和性p75NTR受容体および高親和性チロシン受容体キナーゼ（Trk）ファミリー[4-5]と相互作用する。神経成長因子（NGF）はTrkAに優先的に結合し、脳由来神経栄養因子（BDNF）およびニューロトロフィン-4／5（NT-4／5）はトロポミオシン受容体キナーゼ-B（TrkB）に結合し、ニューロトロフィン-3（NT-3）はTrkC（およびそれほどではないがTrkA）[12-13]に結合する。
【０００６】
脳由来神経栄養因子（BDNF）は、中枢神経系全体、特に海馬と大脳皮質によく発現し、広く分布しているタンパク質である[6-7]。海馬、皮質、コリン作動性およびドーパミン作動性ニューロンの生存と機能において重要であることが示されている[8]。BDNFは、アルツハイマー病、ハンチントン病、うつ病、統合失調症、レット症候群など、多くの脳の障害に関連している。アルツハイマー病の海馬[9]および頭頂皮質[10]におけるBDNF mRNAレベルの大幅な低下、および嗅内皮質、海馬、側頭、前頭および頭頂皮質におけるBDNFのタンパク質レベルの低下の報告[11-16]があるため、アルツハイマー病で見られる早期記憶機能障害は海馬のBDNFのレベルに関連していると仮定されている。ただし、BDNFレベルの変化は、ある種のBDNF転写産物の特定のダウンレギュレーションによるものと思われる。メタアナリシスでも、健康な被験者と比較して、アルツハイマー病患者の血液中のニューロトロフィンレベルの有意な減少が示されている[17]。さらに、BDNFのより低い脳脊髄液濃度は、軽度認知障害（MCI）からアルツハイマー病への進行を予測することが示された[18]。
【０００７】
多くの研究は、BDNFのプロドメインのVal66Met多型（バリンがメチオニンで置換されている）を示す被験者は、アルツハイマー病への進行の増加に関連していることを示しており[19]、他のBDNF多型も関係している可能性がある。BDNFのより大きな前駆体の型であるプロBDNFおよび成熟BDNF（mBDNF）の損失は、疾患の初期（プラーク沈着前）に発生し、記憶障害と相関する[20-21]。これらのデータは、アルツハイマー病の認知障害の根底にあるBDNF濃度の低下、シナプス喪失、および細胞機能障害の間の関連を強く示唆している。BDNFは、TrkB受容体との相互作用とそれに続くホスホイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）およびプロテインキナーゼ（Akt）シグナル伝達の増加により、神経細胞の急速なタウ脱リン酸化を誘導することも示されている[22-23]。したがって、BDNF濃度の低下は、ADの病理学的に顕著な特徴であるタウ過剰リン酸化にも寄与する可能性がある。また、マウスでのBDNF発現の減少を引き起こすタウの増加と逆の効果があるように見える[24]。最近のデータは、BDNFを含むニューロトロフィンのプロドメインの存在下でのAβ神経毒性の悪化の可能性も示している[25]。
【０００８】
mBDNF受容体TrkBを発現するニューロンの変化は、アルツハイマー病の死後脳でも見られる。例えば、アルツハイマー病患者の死後脳では、TrkB陽性ニューロンの47％の減少が報告されている[26]。これは、通常受容体を発現するニューロンの喪失、またはTrkB発現の生化学的ダウンレギュレーションのいずれかに起因する可能性がある。TrkBの減少は、神経細胞の生存に不可欠なキナーゼ活性を示さないアルツハイマー病の前頭皮質および側頭皮質の両方で、短縮型受容体アイソフォームTrkB-T1およびTrkB-Shcのアップレギュレーションによって悪化する可能性がある[27]。ニューロン培養におけるAβによるプロテアーゼ、カルパインの活性化は、受容体Shcドッキング部位付近での切断によりTrkB [28]の減少を誘導し、完全に機能する受容体を不完全なキナーゼ活性を有する短縮型アイソフォームに変換する。機能的TrkB受容体の短縮型アイソフォームへの変換の効果は、ニューロトロフィンシンク（sink）またはドミナントネガティブ受容体として作用する可能性がある。アルツハイマー病のマウスモデルでは、TrkB受容体のノックアウトが、Aβの沈着に影響を与えることなく、アルツハイマー病のようなシグナル異常および記憶障害を悪化させる[29]ことが観察された。これらのデータは、TrkB受容体の減少および／またはBDNFの産生と分泌の低下による活動の喪失が、アルツハイマー病のような症状と病態生理を引き起こす重要な要素であることを示唆している。
【０００９】
アルツハイマー病の脳におけるBDNF／TrkBシグナル伝達の欠乏に寄与する他の重要な仕組みには、TrkB-FLおよびホスホリパーゼ-γ（PLCγ）の活性化の干渉がなく[30]、亜致死濃度のAβによるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK／ERK）およびPI3K／Akt経路の抑制、およびBDNF誘発TrkBエンドサイトーシスの破壊が含まれる。Aβオリゴマーへの曝露は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ-3β（GSK3β）を介したダイナミン-1のリン酸化を介して、受容体エンドサイトーシスおよび下流のAkt活性化を損なう可能性がある[31]。さらに、Aβオリゴマーは、ユビキチン系の破壊[33]およびカルシウム恒常性の変化[34]によりBDNFを介したTrkBの逆行輸送を妨害することが示されている[34]。
【００１０】
その全体像は、アルツハイマー病、特にBDNFシステムにおける神経栄養シグナル伝達の著しい障害である。アルツハイマー病の動物モデルのいくつかで、BDNFシグナル伝達の補足または増強が試験されている。例えば、BDNFの注射は、Aβ[1-42] [35]によって誘発されるアルツハイマー病のラットモデルの学習障害を改善する。BDNFの活性ドメインを含む新規融合ペプチドと、脳にかなり浸透し得るHIVによってコードされた転写のトランス活性化因子（TAT）を含む注射は、TrkB／ERK1／2／Akt経路の活性化および動物モデルのいくつかの記憶関連タンパク質の回復により[36]、空間記憶を著しく改善した。さらに、レンチウイルスベースの遺伝子治療を使用したBDNFの発現は、アルツハイマー病のマウストランスジェニックモデルおよび認知機能低下を示している霊長類において神経保護効果があることが示された[37]。
【００１１】
BDNFは脳内で産生され、末梢に輸送される可能性があり、そこでニューロンをサポートし、生存を維持することができる[38-44]。N-メチル-D-アスパラギン酸などのグルタミン酸受容体アゴニストによる興奮毒性損傷時などの特定の条件では、比較的低いレベルではあるものの、BDNFも末梢ニューロンで産生される可能性がある[45-46]。BDNFは通常、短いシグナルペプチド配列を含むプレプロポリペプチド（すなわち、プレプロBDNF）として産生され、細胞外空間への放出のために小胞へのポリペプチド全体の輸送を促進する。シグナルペプチドの切断と除去により、プレプロBDNFがプロBDNFに変換される。次に、N末端プロBDNF配列が細胞内または細胞外で切断され、成熟型BDNF（mBDNF）が作成される[47]。pro-BDNFとmBDNFの両方は、p75NTR受容体を優先的に活性化するpro-BDNFとTrkB受容体を活性化するより短いmBDNFを有する生物学的活性を持つ[48-50]。例えば、網膜のp75NTRおよびTrkB受容体の活性化は、網膜神経節細胞（RGC）の生存に反対の効果を示す。前者は、直接RGC-細胞体-p75NTR-活性化[48-51]またはミュラー細胞でのp75NTRの間接的な活性化によりアポトーシスを招き、それにより腫瘍壊死因子アルファ（TNF-α）の放出を刺激し、RGC損失をさらに促進する[52]。
【００１２】
緑内障の動物モデルは、神経挫滅または眼内圧（IOP）の上昇に続いて、神経栄養性mBDNF／TrkBシグナル伝達からpro-BDNF／p75NTR経路へのシフトがあることを実証している。網膜におけるmBDNFおよびTrkB受容体のレベルの低下は、pro-BDNF[28]およびp75NTR受容体[55]の相対レベルの上昇の対立とともに実証されている[50、53-54]。実験的に眼内圧が上昇したラットへの組換えタンパク質の眼内注射によるmBDNFの補充は、未治療の目と比較してRGCの生存率を高め、それによりこのニューロトロフィンの重要な神経保護の役割を証明する[42-44]。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、上記を考慮して、神経変性障害または脳卒中の治療、予防、または改善のために、神経の再生または生存の促進のための改善された遺伝子治療が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、チロシンキナーゼ受容体B（TrkB）をコードする新規の遺伝子構築物、および単一のプロモーターの制御下でTrkB受容体のアゴニストを構築した。構築物のプロモーターを使用して、アゴニストと受容体が適切な神経細胞でのみ発現されるようにし、これらの細胞の生存を促進することができ得る。
【００１５】
したがって、本発明の第１の態様によれば、チロシンキナーゼ受容体B（TrkB））をコードする第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、およびTrkB受容体のアゴニストをコードする第２のコード配列を含む、神経変性障害または脳卒中の治療、予防、または改善に使用するための遺伝子構築物が提供される。
【００１６】
本発明者らは、実施例において、TrkB受容体とそのアゴニストの両方をコードする遺伝子を単一の遺伝子構築物に組み合わせることが可能であることを実証した。それらのサイズが大きいことを考えるとこれは特に困難であり、生理学的に有用な濃度でそれらを共発現させることが可能であったと予測することはできなかった。有利には、本発明の構築物では、先行技術［56］に記載されているように、組換えタンパク質を注入する必要はない。さらに、従来技術では、タンパク質の定期的な注射を行うことが依然として必要であるが、本発明の構築物は単一の遺伝子治療投与を必要とするのみである。
【００１７】
好ましくは、使用において、TrkB受容体はアゴニストにより活性化され、それにより神経細胞の生存を促進する。本発明の遺伝子構築物は、好ましくは、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、毛細血管拡張性運動失調症、ニューロンセロイド脂褐素症、バッテン病、牛海綿状脳症（BSE）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭葉変性症、ゴーシェ病、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、リソソーム蓄積障害、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、運動ニューロン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、多種スルファターゼ欠損症、ムコリピド症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病C型、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、ピック病、ポンペ病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、スピルマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳変性症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、およびテイ・サックス病からなる群から選択される神経変性障害の治療、予防または改善のために使用される。
【００１８】
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、アルツハイマー病の治療、予防または改善に使用される。
【００１９】
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、ハンチントン病の治療、予防または改善のためのものである。
【００２０】
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、パーキンソン病の治療、予防、または改善のためのものである。
【００２１】
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、運動ニューロン病の治療、予防、または改善のためのものである。
【００２２】
好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、脳卒中の治療、予防、または改善のためのものである。
【００２３】
本遺伝子治療構築物には、アルツハイマー病や脳卒中などの神経変性障害の治療に有益ないくつかの治療効果がある。その利点には、枯渇した脳のmBDNF濃度を治療的に補うこと、またはニューロトロフィンファミリーの他の栄養因子を補うことが含まれる。他の利点には、正常な脳組織のTrkB受容体密度レベルの回復が含まれる。プロ配列をコーディングしていない、例えばproBDNFをコーディングしていない遺伝子構築物にアゴニストを含める可能性は、mBDNF／TrkB型のシグナル伝達を支持し、pro-BDNF／p75NTR型の影響からバランスを回復する能力も有する。さらに、プロドメインニューロトロフィンを生成することなく、遺伝子治療を使用してmBDNFなどの成熟型アゴニストを生成することができるため、構築物がproBDNFなどのプロ形態のアゴニストを生成し放出すれば起こり得るAβ神経毒性を悪化させるリスクが大幅に低下する。好ましくは、本発明の構築物は、ニューロンにおけるタウリン酸化（アルツハイマー脳に関連する病態生理学的特徴の一つである）を低減するように構成される。
【００２４】
したがって、有利には、本発明の構築物は、これらの細胞におけるTrkBシグナル伝達を維持または増強するために神経細胞を標的化するのに使用され得る。したがって、構築物は、病態生理学的ストレッサーに対する保護を最大化し、神経の再生および／または生存を促進するために使用され得る。さらに、構築物は、１つ以上のプロモーターの制御下でのTrkB受容体および該受容体アゴニストの発現による神経変性障害または脳卒中の長期治療を提供するために、使用され得る。その結果、その構築物は、組み合わせても一時的な治療効果しかもたらさない複数の代替治療を使用する必要性を克服した。さらに、本発明の構築物は、TrkB受容体および該受容体アゴニストの両方の局所的増加によるTrkB受容体アゴニストに対する神経細胞の感受性を著しく高めるために使用でき得るので、有利である。
【００２５】
好ましくは、本発明の遺伝子構築物は発現カセットを含み、その一実施形態を図1に示す。図1に見られるように、構築物はプロモーター、TrkB受容体をコードする第１ヌクレオチド配列、およびTrkB受容体の好ましいアゴニストとして作用する成熟脳由来神経栄養性（mBDNF）をコードする第２ヌクレオチド配列を含む。しかしながら、本明細書で議論されるように、他のアゴニストが使用され得ることが認識されるであろう。また、図1に示すように、発現カセットは、2Aスペーサー配列、肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WHPE）をコードする配列、ポリA鎖をコードする配列、および左右の逆位末端反復配列（ITR）も含む。
【００２６】
したがって、好ましくは、遺伝子構築物は、第１および第２のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、スペーサー配列は、TrkB受容体とアゴニストを別々の分子として産生するために消化または切断されるように構成されるペプチドスペーサーをコードする。図１に示す実施形態では、TrkB受容体のコード配列は、スペーサー配列を間に挟んで受容体アゴニスト（BDNF）のコード配列の5'側に配置される。しかし、別の実施形態では、受容体アゴニストのコード配列は、スペーサー配列を間に挟んで受容体のコード配列の5'側に配置されてもよい。
【００２７】
好ましくは、遺伝子構築物は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WHPE）をコードするヌクレオチド配列を含み、２つの導入遺伝子、すなわちTrkB受容体およびそのアゴニスト（好ましくはBDNF）の発現を増強する。好ましくは、WHPEコード配列は、導入遺伝子コード配列の3'側に配置される。
【００２８】
ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節因子（WHPE）の一実施形態は、ガンマ−アルファ−ベータ因子を含む592bp長であり、本明細書では次のとおり配列番号57と呼ばれる：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG
[配列番号 57]
【００２９】
好ましくは、WHPEは、実質的に配列番号57に示される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３０】
しかしながら、好ましい実施形態では、ベータ要素の欠失のために247bp長であり、本明細書で次のとおり配列番号58と呼ばれる短縮型WHPEが使用される：
AATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTAGTTCTTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGT
[配列番号 58]
【００３１】
有利なことに、構築物で使用される短縮型WHPE配列は、導入遺伝子の発現に悪影響を与えることなく、全体で約300bpを節約した。好ましくは、WHPEは、実質的に配列番号58に示される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３２】
好ましくは、遺伝子構築物は、ポリA鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、ポリA鎖コード配列は、導入遺伝子コード配列の3'側に配置され、好ましくは、WHPEコード配列の3'側に配置される。
【００３３】
好ましくは、ポリA鎖は、シミアンウイルス40ポリ-A 224bp配列を含む。ポリA鎖の一実施形態は、本明細書では次のとおり配列番号59と呼ばれる：
AGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTA
[配列番号 59]
【００３４】
好ましくは、ポリA鎖は、実質的に配列番号59に示される核酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００３５】
好ましくは、遺伝子構築物は、左および／または右の逆位末端反復配列（ITR）を含む。好ましくは、各ITRは、構築物の5'および／または3'末端に配置される。
【００３６】
第１の態様の遺伝子構築物中のプロモーターは、RNAポリメラーゼが第１および第２のコード配列に結合して転写するように誘導することができる任意のヌクレオチド配列であり得る。一実施形態では、第１の態様の遺伝子構築物中のプロモーターは、サイトメガロウイルス（CMV）構成性プロモーターであり得る。これは、神経細胞とグリア細胞の両方に対して非選択的であると考えられている。
【００３７】
１つの好ましい実施形態では、プロモーターはヒトシナプシンI（SYN I）プロモーターであり、ヒトの脳で機能することが示されている。ヒトシナプシンI（SYN I）プロモーターをコードする469ヌクレオチド配列の一実施形態は、本明細書では次のとおり配列番号1と呼ばれる:
CTGCAGAGGGCCCTGCGTATGAGTGCAAGTGGGTTTTAGGACCAGGATGAGGCGGGGTGGGGGTGCCTACCTGACGACCGACCCCGACCCACTGGACAAGCACCCAACCCCCATTCCCCAAATTGCGCATCCCCTATCAGAGAGGGGGAGGGGAAACAGGATGCGGCGAGGCGCGTGCGCACTGCCAGCTTCAGCACCGCGGACAGTGCCTTCGCCCCCGCCTGGCGGCGCGCGCCACCGCCGCCTCAGCACTGAAGGCGCGCTGACGTCACTCGCCGGTCCCCCGCAAACTCCCCTTCCCGGCCACCTTGGTCGCGTCCGCGCCGCCGCCGGCCCAGCCGGACCGCACCACGCGAGGCGCGAGATAGGGGGGCACGGGCGCGACCATCTGCGCTGCGGCGCCGGCGACTCAGCGCTGCCTCAGTCTGCGGTGGGCAGCGGAGGAGTCGTGTCGTGCCTGAGAGCGCAG
[配列番号 1]
【００３８】
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号1に記載のヌクレオチド酸（nucleotide acid）配列、またはその断片もしくは変異体を含んでもよい。
【００３９】
別の好ましい実施形態では、プロモーターはCAGプロモーターであり、ヒトの脳で機能することも示されている。CAGプロモーターは、サイトメガロウイルス初期エンハンサー要素、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロン、およびウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプター含むことが好ましい。本明細書では、CAGプロモーターをコードする1733ヌクレオチド配列の一実施形態を、本明細書では次のとおり配列番号2と呼ぶ：
CTCGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGCCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGCGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGACGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTG
[配列番号 2]
【００４０】
別の好ましい実施形態では、プロモーターは、本明細書で次のとおり配列番号3と呼ばれるプロモーターの664ヌクレオチド形態のようなCAGプロモーターの短縮型である：
CTAGATCTGAATTCGGTACCCTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[配列番号 3]
【００４１】
さらに好ましい実施形態では、プロモーターは、本明細書で次のとおり配列番号48と呼ばれるプロモーターの584ヌクレオチド形態のようなCAGプロモーターの短縮型である：
GCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCG
[配列番号 48]
【００４２】
したがって、好ましくは、プロモーターは、実質的に配列番号2、3、または48に示されるヌクレオチド酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００４３】
科学文献に記載されている多くのバイシストロン性遺伝子構築物は、（i）２つの遺伝子の発現を個別に駆動するために組み込まれたデュアルプロモーターを有するか、または（ii）脳心筋炎ウイルス（EMCV）の配列内リボソーム進入部位（IRES）を使用して、組換えウイルスベクター内で単一プロモーターから転写される２つの遺伝子を連結する[45-46]。しかし、IRES依存性翻訳の効率は細胞や組織によって異なり、IRES依存性の第２の遺伝子発現は、バイシストロン性ベクターのキャップ依存性の第１の遺伝子発現よりかなり低くなる場合がある[47]。さらに、rAAVベクターのサイズ制限（一般的に5kb未満）は、デュアルプロモーターまたはIRESリンカーを使用したBDNFとTrkB受容体などの大きな遺伝子構築物の取り込みを妨げる。
【００４４】
したがって、好ましい実施形態では、遺伝子構築物は、第１および第２のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、スペーサー配列は消化されて、TrkB受容体とアゴニストを別々の分子として産生するように構成されるペプチドスペーサーをコードする。好ましくは、スペーサー配列は、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス2Aペプチドスペーサー配列を含み、コードする[47]。好ましくは、2Aペプチド配列は、第１のコード配列を第２のコード配列に接続する。これにより、構築物はさまざまなベクターでの発現に伴うサイズ制限を克服でき、単一のタンパク質として、単一のプロモーターの制御下で第１の態様の構築物によりコードされるすべてのペプチドの発現が可能になる。
【００４５】
よって、TrkB、2Aペプチド、およびアゴニスト（好ましくはBDNF）の配列を含む単一タンパク質の翻訳に続いて、末端グリシン−プロリン結合でウイルス2Aペプチド配列の切断が起こり、それにより２つのタンパク質、すなわちTrkBおよびアゴニスト（例えばmBDNF）が遊離する。遺伝子構築物は、ウイルス2Aペプチドの残っている短いN末端アミノ酸配列がTrkB受容体の細胞内部分に付着したままになるように設計されているため、免疫原性リスクが除去され、成熟受容体の細胞内シグナル伝達能力を妨げない。C末端ウイルス2A配列の残留プロリンアミノ酸は、N末端アゴニストシグナルペプチドに付着したままであり、成熟タンパク質からのシグナル配列の切断後にアゴニストタンパク質から最終的に除去される。
【００４６】
本発明者らは、スペーサー配列の2つの実施形態を生成した。本明細書に記載の両方の実施形態に共通するペプチドスペーサー配列の１つの重要な部分は、C末端である。したがって、好ましくは、ペプチドスペーサー配列は、本明細書では配列番号4と呼ばれる以下のようなアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
QAGDVEENPGP
[配列番号 4]
【００４７】
好ましくは、ペプチドスペーサー配列の消化または切断部位は、配列番号4の末端部グリシンと終端プロリンの間に位置する。
【００４８】
第１の好ましい実施形態では、スペーサー配列は、本明細書では配列番号5と呼ばれる以下のようなヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
[配列番号 5]
【００４９】
この第１の実施形態では、ペプチドスペーサー配列は、本明細書で配列番号6と呼ばれる以下のようなアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GSGATNFSLLQAGDVEENPGP
[配列番号 6]
【００５０】
第２の好ましい実施形態では、スペーサー配列は、本明細書で配列番号7と呼ばれる以下のようなヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT
[配列番号 7]
【００５１】
この第２の実施形態では、ペプチドスペーサー配列は、本明細書で配列番号8と呼ばれる以下のようなアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
SGATNFSLLKQAGDVEENPGP
[配列番号 8]
【００５２】
本発明者らは、TrkB受容体の配列を慎重に検討し、第１の態様の遺伝子構築物中の第１のコード配列によりコードされる受容体のいくつかの好ましい実施形態を生み出した。
【００５３】
好ましい一実施形態では、第１のコード配列は、TrkBのヒト正準アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、TrkBの正準アイソフォームは、本明細書で配列番号9と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列（822残基）、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[配列番号 9]
【００５４】
好ましくは、この実施形態では、第１のコード配列は、本明細書で配列番号10と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[配列番号 10]
【００５５】
別の好ましい実施形態では、第１のコード配列は、TrkBのアイソフォーム4をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、TrkBのアイソフォーム4は、本明細書で配列番号11と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKDFSWFGFGKVKSRQGVGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVYLDILG
[配列番号 11]
【００５６】
好ましくは、第１のコード配列のこの実施形態は、本明細書で配列番号12と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGATTTCTCATGGTTTGGATTTGGGAAAGTAAAATCAAGACAAGGTGTTGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGTACTTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGTACAGCACTGACTACTACAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCTACCTGGACATTCTAGGC
[配列番号 12]
【００５７】
本発明者らは、TrkB受容体の配列の研究にかなりの発明的努力を費やし、TrkBが５つのチロシン残基を（配列番号9の位置516、701、705、706および816に）含み、これら残基は、通常BDNF二量体の存在下で二量化および自己リン酸化後にリン酸化されることを認識した。これらの5つのチロシン残基のリン酸化に伴う問題は、受容体がShp-2ホスファターゼなどのホスファターゼによって容易に失活する可能性があることである。したがって、in vivoでの受容体のリン酸化および結果として生じる不活化を防ぐために、好ましくは、これらの重要なチロシンの１つ以上を（より好ましくはグルタミン酸に）変異させて、結果として生じるホスホチロシンを模倣し、BDNFの存在下で活性を維持し、Shp-2ホスファターゼなどのホスファターゼによって不活化することができない受容体を生成する。TrkBのそのような変異体形態は、より長い期間、または受容体が内在化されるまで活性を維持するTrkB受容体活性を生成することを目的としている。
【００５８】
以下に示すDNAおよびアミノ酸配列は、5つのグルタミン酸（E）残基に変異したこれら5つのチロシン（Y）残基の位置を示している。本発明の実施形態では、これらの残基のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたは５つがグルタミン酸に変異され得ることが理解されよう。これらの変異の様々な組み合わせ、例えば位置516および701のみ、または位置705、706および816のみなども想定されている。
【００５９】
したがって、別の好ましい実施形態では、第１のコード配列は、配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の１つ以上のチロシン残基が改変もしくは変異されているTrkB受容体の変異体をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基が改変されている。最も好ましくは、配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の５つすべてのチロシン残基が改変されている。
【００６０】
好ましくは、そのまたは各チロシン残基は、異なるアミノ酸残基、より好ましくはグルタミン酸に改変される。したがって、好ましくは、TrkB受容体の変異型は、Y516E、Y701E、Y705E、Y706Eおよび／またはY816Eを含む。
【００６１】
好ましくは、TrkB受容体の改変型は、本明細書で配列番号13と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
MSSWIRWHGPAMARLWGFCWLVVGFWRAAFACPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREHLSVYAVVVIASVVGFCLLVMLFLLKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQEFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVESTDEERVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHMRKNIKGIHTLLQNLAKASPVELDILG
[配列番号 13]
【００６２】
好ましくは、この実施形態では、第１のコード配列は、本明細書で配列番号14と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGTCGTCCTGGATAAGGTGGCATGGACCCGCCATGGCGCGGCTCTGGGGCTTCTGCTGGCTGGTTGTGGGCTTCTGGAGGGCCGCTTTCGCCTGTCCCACGTCCTGCAAATGCAGTGCCTCTCGGATCTGGTGCAGCGACCCTTCTCCTGGCATCGTGGCATTTCCGAGATTGGAGCCTAACAGTGTAGATCCTGAGAACATCACCGAAATTTTCATCGCAAACCAGAAAAGGTTAGAAATCATCAACGAAGATGATGTTGAAGCTTATGTGGGACTGAGAAATCTGACAATTGTGGATTCTGGATTAAAATTTGTGGCTCATAAAGCATTTCTGAAAAACAGCAACCTGCAGCACATCAATTTTACCCGAAACAAACTGACGAGTTTGTCTAGGAAACATTTCCGTCACCTTGACTTGTCTGAACTGATCCTGGTGGGCAATCCATTTACATGCTCCTGTGACATTATGTGGATCAAGACTCTCCAAGAGGCTAAATCCAGTCCAGACACTCAGGATTTGTACTGCCTGAATGAAAGCAGCAAGAATATTCCCCTGGCAAACCTGCAGATACCCAATTGTGGTTTGCCATCTGCAAATCTGGCCGCACCTAACCTCACTGTGGAGGAAGGAAAGTCTATCACATTATCCTGTAGTGTGGCAGGTGATCCGGTTCCTAATATGTATTGGGATGTTGGTAACCTGGTTTCCAAACATATGAATGAAACAAGCCACACACAGGGCTCCTTAAGGATAACTAACATTTCATCCGATGACAGTGGGAAGCAGATCTCTTGTGTGGCGGAAAATCTTGTAGGAGAAGATCAAGATTCTGTCAACCTCACTGTGCATTTTGCACCAACTATCACATTTCTCGAATCTCCAACCTCAGACCACCACTGGTGCATTCCATTCACTGTGAAAGGCAACCCCAAACCAGCGCTTCAGTGGTTCTATAACGGGGCAATATTGAATGAGTCCAAATACATCTGTACTAAAATACATGTTACCAATCACACGGAGTACCACGGCTGCCTCCAGCTGGATAATCCCACTCACATGAACAATGGGGACTACACTCTAATAGCCAAGAATGAGTATGGGAAGGATGAGAAACAGATTTCTGCTCACTTCATGGGCTGGCCTGGAATTGACGATGGTGCAAACCCAAATTATCCTGATGTAATTTATGAAGATTATGGAACTGCAGCGAATGACATCGGGGACACCACGAACAGAAGTAATGAAATCCCTTCCACAGACGTCACTGATAAAACCGGTCGGGAACATCTCTCGGTCTATGCTGTGGTGGTGATTGCGTCTGTGGTGGGATTTTGCCTTTTGGTAATGCTGTTTCTGCTTAAGTTGGCAAGACACTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCCTCCGTTATCAGCAATGATGATGACTCTGCCAGCCCACTCCATCACATCTCCAATGGGAGTAACACTCCATCTTCTTCGGAAGGTGGCCCAGATGCTGTCATTATTGGAATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAATCCCCAGGAATTTGGCATCACCAACAGTCAGCTCAAGCCAGACACATTTGTTCAGCACATCAAGCGACATAACATTGTTCTGAAAAGGGAGCTAGGCGAAGGAGCCTTTGGAAAAGTGTTCCTAGCTGAATGCTATAACCTCTGTCCTGAGCAGGACAAGATCTTGGTGGCAGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGTGACAATGCACGCAAGGACTTCCACCGTGAGGCCGAGCTCCTGACCAACCTCCAGCATGAGCACATCGTCAAGTTCTATGGCGTCTGCGTGGAGGGCGACCCCCTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCATGGGGACCTCAACAAGTTCCTCAGGGCACACGGCCCTGATGCCGTGCTGATGGCTGAGGGCAACCCGCCCACGGAACTGACGCAGTCGCAGATGCTGCATATAGCCCAGCAGATCGCCGCGGGCATGGTCTACCTGGCGTCCCAGCACTTCGTGCACCGCGATTTGGCCACCAGGAACTGCCTGGTCGGGGAGAACTTGCTGGTGAAAATCGGGGACTTTGGGATGTCCCGGGACGTGGAAAGCACTGACGAAGAAAGGGTCGGTGGCCACACAATGCTGCCCATTCGCTGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACGACGGAAAGCGACGTCTGGAGCCTGGGGGTCGTGTTGTGGGAGATTTTCACCTATGGCAAACAGCCCTGGTACCAGCTGTCAAACAATGAGGTGATAGAGTGTATCACTCAGGGCCGAGTCCTGCAGCGACCCCGCACGTGCCCCCAGGAGGTGTATGAGCTGATGCTGGGGTGCTGGCAGCGAGAGCCCCACATGAGGAAGAACATCAAGGGCATCCATACCCTCCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCTCCGGTCGAACTGGACATTCTAGGC
[配列番号 14]
【００６３】
第２のコード配列は、好ましくは栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである、TrkB受容体アゴニストをコードすることが理解されよう。TrkB受容体アゴニストは、プロ配列を欠く栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーであり得る。TrkB受容体アゴニストは、成熟型の栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーであり得る。したがって、TrkB受容体の好ましいアゴニストは、脳由来神経栄養因子（BDNF）；神経成長因子（NGF）；ニューロトロフィン-3（NT-3）；ニューロトロフィン-4（NT-4）；およびニューロトロフィン-5（NT-5）；またはそれらの断片からなるアゴニストの群から選択され得る。TrkB受容体の好ましいアゴニストは、プロ配列を欠く脳由来神経栄養因子（BDNF）；プロ配列を欠く神経成長因子（NGF）；プロ配列を欠くニューロトロフィン-3（NT-3）；プロ配列を欠くニューロトロフィン-4（NT-4）；およびプロ配列を欠くニューロトロフィン-5（NT-5）；またはそれらの断片からなるアゴニストの群から選択され得る。TrkB受容体の好ましいアゴニストは、成熟脳由来神経栄養因子（BDNF）；成熟神経成長因子（NGF）；成熟ニューロトロフィン-3（NT-3）；成熟ニューロトロフィン-4（NT-4）；および成熟ニューロトロフィン-5（NT-5）；またはそれらの断片からなるアゴニストの群から選択され得る。
【００６４】
これらのアゴニストのそれぞれのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、当業者に知られているであろう。しかし、例として、ニューロトロフィン-4（NT-4）の一実施形態のアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号49に記載されている通りである。
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIESQPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRRGVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[配列番号 49]
【００６５】
ニューロトロフィン-4（NT-4）のこの実施形態の核酸コード配列は、実質的に以下の配列番号50に記載されている通りである。
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCCCAACCCCCACCCTCAACATTGCCCCCTTTTCTGGCCCCTGAGTGGGACCTTCTCTCCCCCCGAGTAGTCCTGTCTAGGGGTGCCCCTGCTGGGCCCCCTCTGCTCTTCCTGCTGGAGGCTGGGGCCTTTCGGGAGTCAGCAGGTGCCCCGGCCAACCGCAGCCGGCGTGGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[配列番号 50]
【００６６】
NT-4配列のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号51に記載されている通りである。
MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES
[配列番号 51]
【００６７】
このシグナルペプチドの核酸配列は、実質的に以下の配列番号52に記載されている通りである。
ATGCTCCCTCTCCCCTCATGCTCCCTCCCCATCCTCCTCCTTTTCCTCCTCCCCAGTGTGCCAATTGAGTCC
[配列番号 52]
【００６８】
このNT-4配列のプロペプチドのアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号53に記載されている通りである。
QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR
[配列番号 53]
【００６９】
このプロペプチドの核酸配列は、実質的に以下の配列番号54に記載されている通りである。
caacccccaccctcaacattgcccccttttctggcccctgagtgggaccttctctccccccgagtagtcctgtctaggggtgcccctgctgggccccctctgctcttcctgctggaggctggggcctttcgggagtcagcaggtgccccggccaaccgcagccggcgt
[配列番号 54]
【００７０】
このNT-4配列の成熟タンパク質配列のアミノ酸配列は、実質的に以下の配列番号55に記載されている通りである。
GVSETAPASRRGELAVCDAVSGWVTDRRTAVDLRGREVEVLGEVPAAGGSPLRQYFFETRCKADNAEEGGPGAGGGGCRGVDRRHWVSECKAKQSYVRALTADAQGRVGWRWIRIDTACVCTLLSRTGRA
[配列番号 55]
【００７１】
この成熟NT-4タンパク質の核酸コード配列は、実質的に以下の配列番号56に記載されている通りである。
GGGGTGAGCGAAACTGCACCAGCGAGTCGTCGGGGTGAGCTGGCTGTGTGCGATGCAGTCAGTGGCTGGGTGACAGACCGCCGGACCGCTGTGGACTTGCGTGGGCGCGAGGTGGAGGTGTTGGGCGAGGTGCCTGCAGCTGGCGGCAGTCCCCTCCGCCAGTACTTCTTTGAAACCCGCTGCAAGGCTGATAACGCTGAGGAAGGTGGCCCGGGGGCAGGTGGAGGGGGCTGCCGGGGAGTGGACAGGAGGCACTGGGTATCTGAGTGCAAGGCCAAGCAGTCCTATGTGCGGGCATTGACCGCTGATGCCCAGGGCCGTGTGGGCTGGCGATGGATTCGAATTGACACTGCCTGCGTCTGCACACTCCTCAGCCGGACTGGCCGGGCC
[配列番号 56]
【００７２】
したがって、一つの好ましい実施形態では、第２のコード配列はニューロトロフィン-4（NT-4）をコードし、これは実質的に配列番号49または55に示されるアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含み得る。したがって、第２のコード配列は、実質的に配列番号50または56に示されるヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含み得る。
【００７３】
しかしながら、最も好ましいTrkB受容体のアゴニストには、プレプロ脳由来神経栄養因子（プレ−プロ−BDNF）、プロ−BDNFまたは成熟BDNF（mBDNF）が含まれる。BDNFは、最初に前駆体タンパク質のプレプロBDNFとして、小胞体にあるリボソームによって合成される。ヒトプレプロBDNF遺伝子（ENSG00000176697）によってコードされる少なくとも17の既知のスプライス変異体がある。プレプロBDNFが粗面小胞体に入ると、プレプロBDNFはシグナルペプチド（すなわち「プレ」配列）の切断によってプロBDNFに変換される。プロBDNFは、プロBDNF上に存在する追加のN末端ペプチド配列の切断によってmBDNFに変換される。
【００７４】
プロBDNFとmBDNFは両方とも細胞外空間に分泌され、そこで様々な細胞の受容体に結合し活性化する。
【００７５】
プロBDNFは、受容体p75NTRに優先的に結合し活性化する。この受容体は活性化されると、一部の細胞型でアポトーシスを誘発する可能性がある。したがって、好ましい一実施形態では、プロBDNFはp75NTR受容体アゴニストである。一実施形態では、プロBDNFは正準プロBDNFである。好ましくは、正準プロBDNFは、本明細書で配列番号14と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[配列番号 15]
【００７６】
好ましくは、この実施形態では、第２のコード配列は、本明細書で配列番号16と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
GCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[配列番号 16]
【００７７】
別の実施形態では、プロBDNFは、プロBDNFのアイソフォーム2であり、好ましくはバリンからメチオニンへの突然変異（下線を付したアミノ酸）を含む。好ましくは、プロBDNFのアイソフォーム2は、本明細書で配列番号17と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHMIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRRHSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[配列番号 17]
【００７８】
しかし、一実施形態では、アゴニストはプロBDNFまたはその断片もしくは変異体ではなく、代わりに第２のコード配列は好ましくは成熟BDNFをコードするヌクレオチド配列を含む。成熟BDNF（mBDNF）は、TrkBに優先的に結合し活性化する。そのTrkBは、活性化されると神経細胞の生存を促進する。したがって、成熟BDNFはTrkBの最も好ましいアゴニストである。他の既知の遺伝子構築物とは異なり、ミスフォールディングされていない成熟BDNFタンパク質を産生することができるため、第１の態様による構築物は有利である。
【００７９】
したがって、１つの好ましい実施形態では、第２のコード配列は、成熟BDNFをコードするヌクレオチド配列を含む。mBDNFは、その遺伝子によってコードされる１７のアイソフォームすべてに共通である。７つのタンパク質の異なる配列があり、そのうちの５つは正準型に対して延長されたシグナル配列を有し、１つは正準シグナル配列を有するが、バリンからメチオニンへの変異は有しない（アイソフォーム2、4、7、8、9、10、11、12、13、14、16に共通）。バリンからメチオニンへの変異は、細胞からのBDNFの放出を減少させると考えられている。
【００８０】
好ましくは、成熟BDNFは、本明細書で配列番号18と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
HSDPARRGELSVCDSISEWVTAADKKTAVDMSGGTVTVLEKVPVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEGCRGIDKRHWNSQCRTTQSYVRALTMDSKKRIGWRFIRIDTSCVCTLTIKRGR
[配列番号 18]
【００８１】
好ましくは、第２のコード配列のこの実施形態は、本明細書で配列番号19と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTTGGTTGCATGAAGGCTGCCCCCATGAAAGAAGCAAACATCCGAGGACAAGGTGGCTTGGCCTACCCAGGTGTGCGGACCCATGGGACTCTGGAGAGCGTGAATGGGCCCAAGGCAGGTTCAAGAGGCTTGACATCATTGGCTGACACTTTCGAACACGTGATAGAAGAGCTGTTGGATGAGGACCAGAAAGTTCGGCCCAATGAAGAAAACAATAAGGACGCAGACTTGTACACGTCCAGGGTGATGCTCAGTAGTCAAGTGCCTTTGGAGCCTCCTCTTCTCTTTCTGCTGGAGGAATACAAAAATTACCTAGATGCTGCAAACATGTCCATGAGGGTCCGGCGCCACTCTGACCCTGCCCGCCGAGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGTGAGTGGGTAACGGCGGCAGACAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCGGGCGGGACGGTCACAGTCCTTGAAAAGGTCCCTGTATCAAAAGGCCAACTGAAGCAATACTTCTACGAGACCAAGTGCAATCCCATGGGTTACACAAAAGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCATTGGAACTCCCAGTGCCGAACTACCCAGTCGTACGTGCGGGCCCTTACCATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCTTGTGTATGTACATTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[配列番号 19]
【００８２】
別の実施形態では、アゴニストは、プロ配列を欠いているがN末端に結合したシグナルペプチドを有する栄養因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーである。アゴニストは、栄養因子ニューロトロフィンファミリーの成熟型メンバーおよびN末端に結合したシグナルペプチドを有するメンバーであってよい。シグナルペプチドは、アゴニストの適切なフォールディングまたは産生を促進する任意のシグナルペプチドであり得る。好ましい実施形態において、シグナルペプチドは、本明細書に開示される任意のシグナルペプチドであり得る。
【００８３】
さらに別の好ましい実施形態では、アゴニストは、そのN末端にシグナルペプチドが結合したmBDNFである。以下で議論するように、シグナルペプチドは、プレプロBDNFの正準シグナルペプチド、IL-2のシグナルペプチド、または本発明者らによって新たに作成された新規シグナル配列であり得る。
【００８４】
好ましくは、第２のコード配列は、TrkB受容体のアゴニストのシグナルペプチド、最も好ましくはBDNFのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい一実施形態では、ヌクレオチド配列は、BDNFの正準シグナルペプチドをコードする。好ましくは、第２のコード配列のこの実施形態は、本明細書で配列番号20と呼ばれる以下に記載のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
MTILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 20]
【００８５】
好ましくは、第２のコード配列のこの実施形態は、本明細書で配列番号21と呼ばれる以下に記載のヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む：
ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 21]
【００８６】
本発明者らは、一連の延長シグナルペプチドを作成した。好ましい実施形態では、BDNFのアイソフォームシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、アイソフォーム2、3、6、5、および4からなる群から選択される。これらの延長シグナルペプチドのそれぞれの核酸およびアミノ酸配列が以下に示されている。
アイソフォーム2
MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 22]
ATGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 23]
アイソフォーム3および6
MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 24]
ATGCAGAGCCGGGAAGAGGAATGGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTT ACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 25]
アイソフォーム5
MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 26]
ATGCTCTGTGCGATTTCATTGTGTGCTCGCGTTCGCAAGCTCCGTAGTGCAGGAAGGTGCGGGAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 27]
アイソフォーム4
MCGATSFLHECTRLILVTTQNAEFLQKGLQVHTCFGVYPHASVWHDCASQKKGCAVYLHVSVEFNKLIPENGFIKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 28]
ATGTGTGGAGCCACCAGTTTTCTCCATGAGTGCACAAGGTTAATCCTTGTTACTACTCAGAATGCTGAGTTTCTACAGAAAGGGTTGCAGGTCCACACATGTTTTGGCGTCTACCCACACGCTTCTGTATGGCATGACTGTGCATCCCAGAAGAAGGGCTGTGCTGTGTACCTCCACGTTTCAGTGGAATTTAACAAACTGATCCCTGAAAATGGTTTCATAAAGTTCCACCAGGTGAGAAGAGTGATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 29]
【００８７】
したがって、好ましい実施形態では、第２のコード配列は、本明細書で配列番号23、25、27、29と呼ばれるいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、シグナルペプチドは、本明細書で配列番号22、24、26、または28と呼ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明者らは、アゴニスト、好ましくはBDNFの新規シグナルペプチドの様々な実施形態も作成した。これらのシグナルペプチドは、N末端部分の塩基性レベルを高め（リジン（K）およびアルギニン（R）残基の付加）、疎水性領域を伸ばして（ロイシン（L）残基を付加）野生型正準シグナル配列で観察されるレベルと比較してBDNFの分泌を増加させる。
a) QTA003P（IL-2シグナル）
MYRMQLLSCIALSLALVTNS
[配列番号 30]
ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[配列番号 31]
b) QTA004P
MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK
[配列番号 32]
ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGAGCG
[配列番号 33]
c) QTA009P (改変 IL-2)
MRRMQLLLLIALSLALVTNS
[配列番号 34]
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT
[配列番号 35]
d) QTA010P
MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA
[配列番号 36]
ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 37]
e) QTA0012P
MRILLLTMVISYFGCMKA
[配列番号 38]
ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 39]
f) QTA0013P
MRRILFLTMVISYFGCMKA
[配列番号 40]
ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 41]
g) QTA0014P
MRRFLFLLVISYFGCMKA
[配列番号 42]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 43]
i) QTA0015P
MRRFLFLLYFGCMKA
[配列番号 44]
ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG
[配列番号 45]
【００８９】
図６は、アゴニスト、好ましくはBDNFの分泌を促進するために、本発明の構築物で使用されるシグナルペプチドのさらなる好ましい実施形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドの２番目の残基はトレオニン（T）であり、リジン（K）またはアルギニン（R）などの1つ以上の塩基性残基で置換されていることが好ましい。シグナルペプチドの次の残基区間（イソロイシン（I）、ロイシン（L）、フェニルアラニン（F）およびロイシン（L）を含む）は、１つ以上の疎水性残基で置換されることが好ましい。
【００９０】
したがって、好ましい実施形態では、第２のコード配列は、本明細書で配列番号31、33、35、37、39、41、43、45、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101または103と呼ばれるいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、シグナルペプチドは、本明細書で配列番号30、32、34、36、38、40、42、44、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、または102と呼ばれるいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００９１】
したがって、本発明者らは、プロ配列の除去（このこともこれまで達成されたことがない）によってBDNF遺伝子配列を改変して、適切にフォールディングされた成熟BDNFを生成するという結果がもたらされ、完全に新規なシグナルペプチドの導入と組み合わせて、内因性配列でこれまでに達成された以上に、BDNFの生産と放出を大幅に高めることを理解されたい。
【００９２】
好ましくは、遺伝子構築物は、左および／または右の逆位末端反復配列（ITR）を含む。好ましくは、各ITRは、構築物の5'および／または3'端に配置される。ITRは、ウイルス（AAVやレンチウイルスなど）の血清型に特異的であり、二次構造にヘアピンループを形成する限り、どのような配列でもあり得る。
【００９３】
ITRの一実施形態のDNA配列（市販のAAVプラスミドからの左ITR）は、本明細書で以下の記載のように配列番号46と表される：
CCTGCAGGCAGCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT
[配列番号 46]
【００９４】
ITRの別の実施形態のDNA配列（市販のAAVプラスミドからの右ITR）は、本明細書で以下の記載のように配列番号47と表される：
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGCTGCCTGCAGG
[配列番号 47]
【００９５】
上記から、当業者は、第１の態様の構築物の実施形態のヌクレオチド配列、ならびにコードされた導入遺伝子のアミノ酸配列を理解するであろう。ただし、誤解を避けるため、プラスミドQTA020P（およびベクターQTA020V）中に含まれるマウスTrkB受容体−ウイルス−2Aペプチド−mBDNFのコドン最適化された2940 bp配列のコード配列は、本明細書では次のとおり配列番号107と呼ばれる：
ATGAGCCCATGGCTGAAGTGGCACGGACCAGCAATGGCAAGACTGTGGGGCCTGTGCCTGCTGGTGCTGGGCTTCTGGAGAGCCAGCCTGGCCTGTCCAACCTCCTGCAAGTGTAGCTCCGCCAGGATCTGGTGCACAGAGCCTTCTCCAGGCATCGTGGCCTTTCCCCGCCTGGAGCCTAACAGCGTGGATCCCGAGAATATCACCGAGATCCTGATCGCCAACCAGAAGCGGCTGGAGATCATCAATGAGGACGATGTGGAGGCCTACGTGGGCCTGAGAAACCTGACAATCGTGGACTCCGGCCTGAAGTTCGTGGCCTATAAGGCCTTTCTGAAGAACTCTAATCTGAGGCACATCAACTTCACCCGCAATAAGCTGACATCTCTGAGCCGGAGACACTTTCGGCACCTGGATCTGTCCGACCTGATCCTGACCGGCAATCCATTCACATGCTCTTGTGACATCATGTGGCTGAAGACCCTGCAGGAGACAAAGTCTAGCCCCGATACCCAGGACCTGTACTGTCTGAACGAGTCCTCTAAGAATATGCCTCTGGCCAACCTGCAGATCCCTAATTGTGGACTGCCAAGCGCCCGGCTGGCCGCACCTAACCTGACAGTGGAGGAGGGCAAGTCCGTGACACTGTCCTGTTCTGTGGGCGGCGATCCCCTGCCTACCCTGTATTGGGACGTGGGCAACCTGGTGTCTAAGCACATGAATGAGACCTCCCACACACAGGGCTCTCTGAGAATCACAAATATCAGCTCCGACGATAGCGGCAAGCAGATCTCTTGCGTGGCAGAGAACCTGGTGGGAGAGGATCAGGACAGCGTGAATCTGACCGTGCACTTCGCCCCCACCATCACATTTCTGGAGTCTCCTACCAGCGATCACCACTGGTGCATCCCCTTCACAGTGCGGGGAAACCCAAAGCCCGCCCTGCAGTGGTTTTACAACGGCGCCATCCTGAATGAGTCCAAGTATATCTGTACCAAGATCCACGTGACCAACCACACAGAGTACCACGGCTGCCTGCAGCTGGATAATCCCACCCACATGAACAATGGCGACTACACACTGATGGCCAAGAACGAGTATGGCAAGGACGAGAGGCAGATCAGCGCCCACTTCATGGGCCGCCCTGGAGTGGATTATGAGACCAACCCTAATTACCCAGAGGTGCTGTATGAGGACTGGACCACACCTACCGATATCGGCGACACCACAAACAAGTCTAATGAGATCCCAAGCACAGATGTGGCCGACCAGTCTAACAGGGAGCACCTGAGCGTGTACGCAGTGGTGGTCATCGCCTCCGTGGTGGGCTTCTGCCTGCTGGTCATGCTGCTGCTGCTGAAGCTGGCCCGCCACTCTAAGTTTGGCATGAAGGGCCCAGCCTCCGTGATCTCTAATGACGATGACAGCGCCAGCCCCCTGCACCACATCAGCAACGGCTCCAATACCCCTTCTAGCTCCGAGGGCGGCCCAGATGCCGTGATCATCGGCATGACAAAGATCCCCGTGATCGAGAACCCTCAGTACTTCGGCATCACCAATTCCCAGCTGAAGCCTGACACATTTGTGCAGCACATCAAGCGGCACAACATCGTGCTGAAGAGGGAACTGGGAGAGGGAGCCTTCGGCAAGGTGTTTCTGGCCGAGTGCTATAACCTGTGCCCAGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACCCTGAAGGATGCCAGCGACAACGCCCGGAAGGACTTCCACAGAGAGGCCGAGCTGCTGACAAATCTGCAGCACGAGCACATCGTGAAGTTTTACGGCGTGTGCGTGGAGGGCGACCCTCTGATCATGGTGTTCGAGTATATGAAGCACGGCGATCTGAACAAGTTTCTGAGAGCACACGGACCAGATGCCGTGCTGATGGCAGAGGGAAATCCCCCTACCGAGCTGACACAGTCTCAGATGCTGCACATTGCACAGCAGATTGCAGCAGGAATGGTGTACCTGGCCAGCCAGCACTTCGTGCACAGGGATCTGGCAACCAGAAACTGCCTGGTGGGAGAGAATCTGCTGGTGAAGATCGGCGACTTTGGCATGTCCCGGGACGTGTACTCTACCGACTACTATAGAGTGGGCGGCCACACAATGCTGCCCATCAGGTGGATGCCACCCGAGAGCATCATGTATCGCAAGTTCACCACAGAGTCTGACGTGTGGAGCCTGGGCGTGGTGCTGTGGGAGATCTTTACCTACGGCAAGCAGCCTTGGTATCAGCTGTCCAACAATGAAGTGATCGAGTGTATTACACAGGGACGCGTGCTGCAGAGGCCACGCACATGCCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGCTGTTGGCAGCGGGAGCCACACACCAGAAAGAACATCAAGAGCATCCACACACTGCTGCAGAATCTGGCCAAGGCCTCCCCCGTGTATCTGGACATCCTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[配列番号 107]
【００９６】
プラスミドQTA029P（およびベクターQTA029V）中に含まれるヒトTrkB受容体−ウイルス−2Aペプチド−mBDNFのコドン最適化された2943 bp配列のコード配列は、本明細書では次のとおり配列番号108と呼ばれる：
ATGTCATCTTGGATCCGCTGGCACGGGCCAGCGATGGCCCGATTGTGGGGCTTCTGCTGGCTTGTTGTAGGCTTCTGGCGCGCGGCGTTCGCGTGTCCGACCTCTTGCAAATGCTCAGCAAGCCGAATTTGGTGCTCAGACCCTAGTCCAGGAATTGTTGCATTCCCCCGACTGGAACCAAACTCCGTCGACCCGGAGAATATAACTGAGATATTTATTGCAAATCAAAAACGCCTTGAAATCATTAACGAGGATGACGTGGAGGCCTACGTTGGTTTGAGAAATCTTACTATTGTCGACTCCGGACTTAAATTTGTAGCTCATAAAGCCTTCCTGAAGAACTCTAATCTGCAGCACATTAATTTCACGAGAAATAAGCTGACCAGCTTGTCCCGGAAGCATTTCCGCCATCTCGACCTGAGCGAGCTCATACTGGTCGGAAACCCATTTACGTGCTCCTGTGACATCATGTGGATCAAAACTCTGCAAGAGGCGAAAAGTAGTCCGGATACCCAAGACCTTTACTGTCTTAATGAAAGCTCAAAAAATATCCCGCTGGCCAACCTGCAGATACCGAACTGCGGACTTCCTAGTGCGAATTTGGCTGCCCCAAATCTTACCGTCGAAGAAGGCAAATCAATCACGCTTTCTTGTTCTGTAGCTGGAGATCCAGTGCCTAATATGTATTGGGACGTGGGTAACCTCGTCTCAAAACATATGAACGAAACGAGCCACACCCAGGGCTCTTTGCGGATAACAAACATCTCCTCTGATGATTCTGGAAAGCAAATCAGTTGCGTAGCTGAAAATCTGGTTGGCGAAGATCAAGATTCAGTCAATCTGACAGTCCATTTCGCCCCAACGATCACCTTTCTGGAGAGCCCAACTAGCGATCACCACTGGTGTATTCCGTTTACGGTAAAAGGAAATCCAAAACCTGCACTCCAATGGTTTTATAATGGAGCCATCTTGAATGAAAGCAAATATATCTGTACTAAAATCCATGTGACGAATCACACCGAGTATCACGGGTGTCTTCAATTGGATAATCCAACCCATATGAATAATGGTGATTATACTTTGATAGCGAAGAACGAATACGGCAAAGACGAAAAGCAAATATCCGCACATTTCATGGGTTGGCCTGGCATCGACGACGGTGCGAACCCGAACTACCCAGATGTTATTTACGAGGATTATGGGACTGCGGCAAACGACATTGGCGACACCACAAACCGAAGCAACGAGATACCAAGTACTGACGTCACTGACAAAACGGGTCGAGAGCATTTGTCTGTTTACGCCGTTGTTGTTATCGCCTCAGTTGTCGGATTTTGCCTGTTGGTCATGCTTTTCCTCCTGAAGCTCGCGCGACATTCCAAGTTTGGCATGAAGGGGCCAGCAAGTGTTATATCCAATGATGATGATAGCGCTTCTCCATTGCACCACATAAGTAACGGCTCAAACACGCCGTCATCTAGTGAAGGTGGACCAGACGCGGTCATTATAGGGATGACTAAAATTCCCGTAATCGAAAACCCTCAGTACTTCGGCATAACCAACAGTCAGCTTAAACCCGATACTTTCGTGCAGCACATCAAAAGGCACAACATAGTCCTCAAGCGCGAACTCGGGGAGGGAGCCTTCGGAAAGGTCTTTCTTGCTGAGTGCTATAATTTGTGTCCTGAGCAGGATAAAATTCTTGTGGCTGTAAAAACTCTCAAAGATGCTTCCGACAACGCACGGAAGGATTTTCATCGGGAGGCCGAACTGTTGACGAATTTGCAGCACGAGCATATAGTAAAGTTCTACGGGGTATGTGTTGAGGGGGACCCGTTGATTATGGTCTTCGAGTATATGAAGCACGGGGACCTGAACAAATTTTTGCGCGCCCATGGGCCTGATGCCGTCCTTATGGCAGAAGGGAACCCTCCAACAGAACTCACCCAGAGTCAGATGTTGCACATAGCGCAACAGATCGCGGCCGGCATGGTTTACCTGGCCAGTCAACACTTCGTGCATAGAGATCTTGCCACTCGCAACTGTTTGGTCGGGGAGAACCTTCTGGTTAAGATTGGTGACTTTGGTATGTCACGAGATGTGTATTCCACTGACTATTACAGAGTTGGGGGTCATACAATGCTTCCTATTCGGTGGATGCCCCCCGAATCCATCATGTACAGAAAGTTCACGACAGAGAGTGATGTTTGGAGTCTCGGCGTGGTGCTCTGGGAAATTTTCACATACGGAAAGCAGCCGTGGTATCAACTTAGCAACAATGAGGTGATAGAGTGTATTACACAGGGTCGGGTGTTGCAGCGCCCTCGAACGTGCCCACAAGAAGTATATGAACTTATGCTCGGGTGCTGGCAAAGAGAACCACATATGAGAAAAAATATCAAGGGGATACATACATTGCTTCAGAACTTGGCCAAGGCATCACCCGTCTACCTCGATATACTGGGCAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[配列番号 108]
【００９７】
したがって、最も好ましい実施形態では、構築物は、実質的に配列番号107または108に記載されているヌクレオチド配列、またはその断片もしくは変異体を含む。
【００９８】
本発明者らは、本発明の構築物を含む一連の組換え発現ベクターを作成した。
【００９９】
したがって、第２の態様によれば、神経変性障害または脳卒中の治療、予防または改善に使用するための、第１の態様による遺伝子構築物を含む組換えベクターが提供される。
【０１００】
本明細書に記載の構築物および発現ベクターを使用して、神経の再生および生存を促進することができる。いくつかの実施形態では、組換えベクターは、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、運動ニューロン病、または脳卒中の治療、予防、または改善のためのものである。本明細書に記載される組換えベクターは、本明細書に記載される任意の治療または使用のためのものであり得る。
【０１０１】
組換えベクターは、組換えAAV（rAAV）ベクターであり得る。そのrAAVは、天然に存在するベクターまたはハイブリッドAAV血清型を有するベクターであり得る。rAAVは、AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、およびAAV-11であってもよい。好ましくは、rAAVはrAAV血清型-2である。
【０１０２】
有利なことに、組換えAAV2は、宿主生物において最小限の免疫応答を引き起こし、ベクター投与後少なくとも１年間持続できる長期導入遺伝子発現を媒介する。
【０１０３】
本明細書で使用される「組換えAAV（rAAV）ベクター」という用語は、少なくとも１つの末端反復配列を含む組換えAAV由来核酸を意味する。
【０１０４】
ベクターの好ましい実施形態を図２〜５に示す。
【０１０５】
第３の態様によれば、対象の神経変性障害または脳卒中を治療、予防または改善する方法、または対象の神経の再生および／または生存を促進する方法が提供され、その方法は、そのような治療、第１の態様による治療的有効量の遺伝子構築物、または第２の態様による組換えベクターを必要とする対象に投与することを含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態で、その方法は、アルツハイマー病、パーキンソン病、運動ニューロン病、ハンチントン病、または本明細書に開示される他の神経変性の治療、予防、または改善のためのものであり得る。
【０１０７】
好ましくは、本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、遺伝子治療技術で使用される。構築物またはベクターによってコードされるアゴニストは、構築物／ベクターによってもコードされるTrkBを活性化し、それにより神経細胞の生存を促進する。
【０１０８】
別の実施形態では、構築物およびベクターを使用して、神経の再生および／または生存を促進することができ得る。
【０１０９】
第１の態様による遺伝子構築物、または第２の態様による組換えベクターは、神経変性障害または脳卒中を治療、改善、または予防するため、または神経の再生および／または生存を促進するために、単剤治療（すなわち、第１の態様による遺伝子構築物の使用、または本発明の第２の態様によるベクター）として使用される薬剤に用いられ得ることが理解されるであろう。あるいは、本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、神経変性障害または脳卒中を治療、改善、または予防するため、または神経の再生および／または生存を促進するために、既知の治療の補助として、または組み合わせて使用することができ得る。
【０１１０】
本発明による遺伝子構築物または本発明による組換えベクターは、特に組成物が使用される方法に応じて、多くの異なる形態を有する組成物に組み合わせることができる。したがって、組成物は、例えば、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ゲル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮吸収パッチ、リポソーム懸濁液または他のいずれかの、治療を必要とする人または動物に投与される適切な形態である得る。本発明による薬剤のビヒクルは、それが与えられる対象によって十分に許容されるものであるべきであることは理解されるであろう。
【０１１１】
本発明による遺伝子構築物または組換えベクターはまた、徐放または遅延放出装置内に組み込まれてもよい。そのような装置は、例えば、皮膚の上または皮下に挿入されてもよく、薬剤は数週間または数ヶ月にわたって放出されてもよい。その装置は、少なくとも治療部位に隣接して配置されてもよい。遺伝子構築物または組換えベクターによる長期治療が必要で、通常頻繁な投与（例えば、少なくとも毎日の注射）を必要とする場合、そのような装置は特に有利かもしれない。
【０１１２】
好ましい実施形態では、本発明による薬剤は、血流、神経への注射によって、または治療を必要とする部位へ直接注射することにより、対象に投与することができる。例えば、薬剤は血液脳関門を通過するように構成される。注射は、静脈内（ボーラスまたは注入）または皮下（ボーラスまたは注入）、または皮内（ボーラスまたは注入）であり得る。
【０１１３】
必要とされる遺伝子構築物または組換えベクターの量は、その生物学的活性および生物学的利用能によって決定され、その結果、投与形式、遺伝子構築物または組換えベクターの物理化学的特性、および単剤治療または併用治療として使用されるのかどうか次第であることが理解されるであろう。投与の頻度は、治療される対象内での環状ポリペプチドの半減期にも影響されるだろう。投与される最適な投与量は、当業者によって決定され得、使用中の特定の遺伝子構築物または組換えベクター、医薬組成物の強度、投与形式、および障害の進行または段階によって異なる。対象の年齢、体重、性別、食事、および投与時間を含む治療される特定の対象に依存する追加の要因により、投与量を調整する必要が生じる。
【０１１４】
一般に、0.001μg／kg体重から10mg／kg体重、または0.01μg／kg体重から1mg／kg体重の本発明の構築物またはベクターの本発明による日用量は、使用する遺伝子構築物または組換えベクターに応じて、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、運動ニューロン病、または脳卒中の治療、改善、または予防に使用できる。
【０１１５】
遺伝子構築物または組換えベクターは、障害の発症前、発症中または発症後に投与され得る。日用量は、単回投与として与えられてもよい（例えば、１日１回の注射または鼻スプレーの吸入）。あるいは、遺伝子構築物または組換えベクターは、１日の内に２回以上の投与を必要とし得る。例として、遺伝子構築物または組換えベクターは、0.07μgから700 mg（つまり、体重70 kgを想定）の間の１日２回（または治療中の障害の重症度に応じて）投与することができる。治療を受けている患者は、起床時に最初の服用を行い、次に夕方（２回服用の場合）またはその後３〜４時間間隔で２回目の服用を行うことがある。あるいは、反復用量を投与する必要なく、本発明による遺伝子構築物または組換えベクターの最適用量を徐放装置を使用して、患者に提供することができる。
【０１１６】
製薬業で従来使用されているような既知の手順（例えば、in vivo実験、臨床試験など）を使用して、本発明による遺伝子構築物または組換えベクターの特定の製剤および正確な治療計画（例えば、薬剤の毎日の投与量および投与頻度として）を作り得る。本発明者らは、それらはTrkB受容体およびTrkB受容体アゴニストのコード配列に作動可能に連結されたプロモーターをコードする遺伝子構築物を提案した最初のものであると考えている。
【０１１７】
第４の態様によれば、第１の態様による遺伝子構築物、または第２の態様による組換えベクター、および薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物が提供される。
【０１１８】
第５の態様によれば、第５の態様による医薬組成物を調製する方法が提供され、（その方法は）第１の態様による遺伝子構築物、または第２の態様による組換えベクターを医薬的に許容されるビヒクルと接触させることを含む。
【０１１９】
「対象」は、脊椎動物、哺乳動物、または家畜であり得る。したがって、本発明による組成物および薬剤は、任意の哺乳動物、例えば家畜（例えば、馬）、ペットを治療するために使用することができ、または他の獣医学用途で使用することができる。しかし、被験者が人間であるのが最も好ましい。
【０１２０】
遺伝子構築物、組換えベクターまたは医薬組成物の「治療有効量」は、対象に投与される場合、神経変性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、、運動ニューロン病、脳卒中を治療するために必要な前述の量である任意の量であり、または神経の再生および／または生存の促進のような望ましい効果をもたらす。
【０１２１】
例えば、使用される遺伝子構築物、組換えベクターまたは医薬組成物の治療的有効量は、約0.01mgから約800mg、好ましくは約0.01mgから約500mgであり得る。遺伝子構築物、組換えベクターまたは医薬組成物の量は、約0.1mgから約250mg、最も好ましくは約0.1mgから約20mgの量である。
【０１２２】
本明細書で言及される「薬学的に許容されるビヒクル」は、医薬組成物の製剤化に有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物、または既知の化合物の組み合わせである。
【０１２３】
一実施形態では、薬学的に許容されるビヒクルは固体であってもよく、組成物は粉末または錠剤の形態であってもよい。薬学的に許容される固体のビヒクルには、香味剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁剤、染料、充填剤、流動促進剤、圧縮助剤、不活性バインダー、甘味料、防腐剤、染料、コーティング材、または錠剤崩壊剤としても作用する１つ以上の物質が含まれ得る。ビヒクルはカプセル化材であってもよい。粉末の場合、ビヒクルは、本発明による微粉化された有効物質と混合されている微粉化された固体である。錠剤の場合、有効物質（例えば、本発明による遺伝子構築物または組換えベクター）は、適切な割合で必要な圧縮特性を有するビヒクルと混合され、所望の形状およびサイズに成形され得る。粉末および錠剤は、好ましくは最大99％の有効物質を含む。適切な固体ビヒクルには、例えば、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリジン、低融点ワックスおよびイオン交換樹脂が含まれる。別の実施形態では、医薬のビヒクルはゲルであってもよく、組成物はクリームなどの形態であってもよい。
【０１２４】
しかしながら、医薬ビヒクルは液体であってもよく、医薬組成物は溶液の形態である。液体ビヒクルは、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤、および加圧組成物の調製に使用される。本発明による遺伝子構築物または組換えベクターは、水、有機溶媒、両方の混合物または薬学的に許容される油もしくは脂肪などの薬学的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁されてもよい。液体ビヒクルは、可溶化剤、乳化剤、緩衝剤、防腐剤、甘味料、香味料、懸濁化剤、増粘剤、色素、粘度調整剤、安定剤または浸透圧調整剤などの他の適切な医薬添加物を含むことができる。経口および非経口投与用の液体ビヒクルの適切な例には、水（上記の添加剤を部分的に含む、例えばセルロース誘導体、好ましくはカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価アルコールおよび多価アルコール、例えばグリコールを含む）およびそれらの誘導体、および油（例えばヤシ油（fractionated coconut oil）と落花生油）が含まれる。非経口投与の場合、ビヒクルはオレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルなどの油性エステルであってもよい。滅菌液体ビヒクルは、非経口投与用の滅菌液体形態の組成物に有用である。加圧組成物用の液体ビヒクルは、ハロゲン化炭化水素または他の薬学的に許容される推進剤であり得る。
【０１２５】
滅菌溶液または懸濁液である液体医薬組成物は、例えば、筋肉内、くも膜下腔内、硬膜外、腹腔内、静脈内、および特に皮下注射により利用することができる。遺伝子構築物または組換えベクターは、滅菌水、食塩水、または他の適切な滅菌注射用媒体を使用して、投与時に溶解または懸濁できる滅菌固体組成物として調製され得る。
【０１２６】
本発明の遺伝子構築物、組換えベクターおよび医薬組成物は、他の溶質または懸濁剤（例えば、溶液を等張性にするのに十分な生理食塩水またはグルコース）、胆汁酸塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート80（エチレンオキシドと共重合したソルビトールおよびその無水物のオレイン酸エステル）などを含む滅菌溶液または懸濁液の形態で経口投与することができる。本発明による遺伝子構築物、組換えベクターまたは医薬組成物は、液体または固体組成物の形態で経口投与することもできる。経口投与に適した組成物には、丸薬、カプセル、顆粒、錠剤、および粉末などの固体形態、ならびに溶液、シロップ、エリキシル剤、および懸濁液などの液体形態が含まれる。非経口投与に有用な形態には、滅菌溶液、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。
【０１２７】
さらなる態様によれば、視神経障害または蝸牛障害の治療、予防または改善に使用するため、または神経の再生および／または生存を促進するための、第１の態様による遺伝子構築物、または第２の態様による組換えベクターが提供される；ここで、第２のコード配列は、ニューロトロフィンファミリー由来の栄養因子の成熟形態を含む。第２のコード配列は、シグナルペプチドを含み得る。その構築物またはベクターは、アゴニストがプロ配列を欠くが、シグナルペプチドを有するようなものであり得る。シグナルペプチドはN末端に結合し、アゴニストの分泌、発現、またはフォールディングを高める。第２のコード配列は、成熟神経成長因子（NGF）、成熟ニューロトロフィン-3（NT-3）、成熟ニューロトロフィン-5（NT-5）、またはそれらの断片もしくは変異体のいずれかを含み得る。
【０１２８】
本発明は、本明細書で言及される配列のいずれかのアミノ酸配列または核酸配列（その変異体または断片を含む）を実質的に含む、任意の核酸もしくはペプチドまたはその変異体、誘導体もしくは類似体に及ぶことが理解されよう。用語「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「変異体」および「断片」は、本明細書で言及された配列のいずれか１つのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも40％の配列同一性を有する配列であり得る。例えば、配列番号1〜108として識別される配列と40％の同一性などである。
【０１２９】
言及される配列のいずれかと65％を超える、より好ましくは70％を超える、さらにより好ましくは75％を超える、さらにより好ましくは80％を超える配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列が想定されている。好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は、言及される配列のいずれかと少なくとも85％の同一性、より好ましくは少なくとも90％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも92％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも95％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも97％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも98％の同一性、そして最も好ましくは本明細書で言及される配列のいずれかと少なくとも99％の同一性を有する。
【０１３０】
熟練した技術者は、２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセントを計算する方法を理解するだろう。２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセントを計算するには、２つの配列のアラインメントをまず準備し、その後配列同一性値を計算する必要がある。２つの配列の同一性パーセントは：（i）配列のアラインメントまたは三次元比較からの構造アラインメントなどに使用される方法、例えばClustalW、BLAST、FASTA、Smith-Waterman（異なるプログラムで実行）；および（ii）アラインメント方法で使用されるパラメーター、例えば、ローカル対グローバルアライメント、使用されるペアスコアマトリックス（BLOSUM62、PAM250、Gonnetなど）、およびギャップペナルティー、例えば関数形式および定数、によって異なる値を取り得る。
【０１３１】
アラインメントを行った後、２つの配列間の同一性パーセントを計算する多くの異なる方法がある。例えば、同一残基の数を（i）最短配列の長さ；（ii）アラインメントの長さ；（iii）配列の平均長；（iv）ギャップのない位置数；または（v）オーバーハングを除く同等の位置の数で割ることができる。さらに、同一性パーセントも長さに強く依存することが理解されよう。したがって、配列のペアが短いほど、偶然に発生すると予想される配列の同一性は高くなる。
【０１３２】
したがって、タンパク質またはDNA配列の正確なアライメントは複雑な工程であることが理解されよう。一般的な多重アライメントプログラムClustalW（Thompsonら、1994、Nucleic Acids Research、22、4673-4680; Thompsonら、1997、Nucleic Acids Research、24、4876-4882）は、本発明と一致して複数のタンパク質またはDNAのアライメントを生成するのに好ましい方法である。ClustalWの適切なパラメーターは以下の通りである：DNAアライメントの場合：ギャップオープンペナルティ= 15.0、ギャップ伸長ペナルティ= 6.66、およびマトリックス = 一致率（Identity）。タンパク質アラインメントの場合：ギャップオープンペナルティ= 10.0、ギャップ伸長ペナルティ= 0.2、およびマトリックス= Gonnet。DNAおよびタンパク質アラインメントの場合：ENDCAP = -1、およびGAPDIST = 4。当業者は、最適な配列アラインメントのために、これらおよび他のパラメーターを変える必要があるかもしれないことに気付くであろう。
【０１３３】
２つのアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列間の同一性パーセントの計算は、好ましくは、（N／T）* 100などのアラインメントから計算し得る。ここで、Nは配列が同一残基を共有する位置の数、およびTはギャップを含むがオーバーハングを除く、比較される位置の総数である。したがって、２つの配列間の同一性パーセントを計算する最も好ましい方法には、（i）例えば上記のような適切なパラメーターのセットを使用してClustalWプログラムを使用して配列アラインメントを準備する；および（ii）NとTの値を次の式に挿入する：−配列同一性 =（N／T）* 100が含まれる。
【０１３４】
類似の配列を同定する代替方法は、当業者に知られているであろう。例えば、実質的に類似したヌクレオチド配列は、ストリンジェント条件下でDNA配列またはそれらの相補体にハイブリダイズする配列によりコードされるだろう。ストリンジェント条件とは、約45oCの3x塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）でフィルター結合DNAまたはRNAにヌクレオチドがハイブリダイズし、次いで約20−65oCの0.2x SSC／0.1％SDSで少なくとも１回洗浄されることを意味する。あるいは、実質的に類似のポリペプチドは、例えば、配列番号3および5に示される配列と少なくとも１個、しかし５、１０、２０、５０または１００個未満のアミノ酸が異なり得る。
【０１３５】
遺伝コードの縮重により、本明細書に記載の任意の核酸配列は、その機能的変異体を提供するために、それによりコードされるタンパク質の配列に実質的に影響を与えることなく変わる（vary）または変える（change）ことができることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、配列内の同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更された配列を有するものであり、したがってサイレント変化を生じる。他の適切な変異体は、相同ヌクレオチド配列を有するが、それを置換するアミノ酸と類似の生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更される配列の全部または一部を含むものであり、保存的変化を生じる。例えば、小さな非極性の疎水性アミノ酸には、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、およびメチオニンが含まれる。大きな非極性の疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。極性中性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、リシン、アルギニン、およびヒスチジンが含まれる。負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸とグルタミン酸が含まれる。したがって、どのアミノ酸が類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えられてもよいことが理解されるであろうし、熟練した技術者はこれらのアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０１３６】
本明細書（添付の請求項、要約および図面のいずれも含む）に記載されているすべての特徴、および／またはそのように開示されているいずれかの方法または工程のすべてのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除き、任意の組み合わせで上記の態様のいずれかと組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
本発明のより良い理解のために、およびその実施形態がどのように実施され得るかを示すために、例示として、添付の図面に言及する：
【図１】図１は、本発明による遺伝子構築物の一実施形態の概略図である。
【図２】図２は、正準シグナル配列（青）に加えてプロBDNF（赤）およびmBDNF（黒）を含む「プラスミドQTA001PA」として知られる、本発明による組換えベクターの第１の実施形態の概略図である。また、−IRES−GFP−配列（シアンと紫）も含んでいる；
【図３】図３は、プロBDNFを含まず（しかしmBDNFのみを生成する）「Qsa001PA」と同じシグナル配列（青）を有する「プラスミドQTA002P」として知られる、本発明による組換えベクターの第２の実施形態の概略図である。また、−IRES−GFP−配列（シアンと紫）も含んでいる；
【図４】図４は、プロBDNFを含まず（しかしmBDNFのみを生成する）IL-2シグナル配列（青）を有する「プラスミドQTA003PA」として知られる、本発明による組換えベクターの第３の実施形態の概略図である。また、−IRES−GFP−配列（シアンと紫）も含んでいる；
【図５】図５は、プロBDNFを含まず（しかしmBDNFのみを生成する）新規シグナル配列（青）を有する「シグナルQTA004PA」として知られる、本発明による組換えベクターの第４の実施形態の概略図である。また、−IRES−GFP−配列（シアンと紫）も含んでいる；
【図６】図６は、本発明の構築物で使用されるシグナルペプチドの異なる実施形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。２番目の残基はリシン（K）やアルギニン（R）などの１つ以上の塩基性残基で置き換えることができるトレオニン（t）である。イソロイシン（I）、ロイシン（L）、フェニルアラニン（F）およびロイシン（L）を含む次の残基区間は、１つ以上の疎水性残基で置き換えることができる；
【図７】図７は、異なるシグナルペプチド配列を持ち、延長プロBDNF成分のコード配列を持たないmBDNFをコードする遺伝子を含むプラスミド（4μgDNA／ウェル）の、形質導入後24時間での特定のELISA法を使用したHEK293細胞からのBDNFの放出を示している（データはn = 4の平均値±SEMとして表示）；
【図８】図８は、プラスミド形質導入の24時間後のHEK293細胞溶解物中のBDNF免疫反応性物質の細胞濃度（任意単位）のウエスタン・ブロッティングの結果を示している（データはn = 4の平均±SEMとして表示）；
【図９】図９は、細胞にQTA001PAを形質導入した場合の2つの分子量バンド（32kDaおよび14kDa）と、それに対してQTA002P、QTA003PおよびQTA004P形質導入の単一の14kDaバンドを示す細胞溶解物のウエスタン・ブロットにおけるBDNF免疫反応性を示している。
【図１０】図１０は、選択的プロBDNF ELISA法を使用したプラスミド形質導入の24時間後に、特定のELISA法を使用して測定したHEK293インキュベーション培地のプロBDNF濃度を示している（データはn = 4の平均±SEMとして表示）。
【図１１】図１１は、プラスミドQTA002P（内因性正準シグナルペプチド配列）、およびQTA009PからQTA013PによるHEK293細胞溶解物中のBDNF発現を示している。データは平均+ S.E.M.として表示される。** QTA002Pと比較してP <0.01；
【図１２】図１２は、プラスミドQTA002P（内因性正準シグナルペプチド配列）、およびQTA009PからQTA013PによるHEK293細胞インキュベーション培地でのBDNF発現を示している。データは平均+ S.E.M.として表示される。** QTA002Pと比較してP <0.01；
【図１３】図１３は、HEK293細胞の、プラスミドQTA015P（IRESスペーサーで分離されたBDNFとeGFPを発現）、QTA021P（BDNFを発現し、続いて機能的ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたeGFPを発現）、QTA022P（BDNFを発現し、続いて非機能性ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたeGFPを発現）およびQTA023P（eGFPを発現し、続いて機能性ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたBDNFをコードする）を形質導入された２４時間後のウエスタン・ブロットを示している。データは、BDNF免疫反応性（A）、eGFP免疫反応性（B）、およびHEK293細胞からインキュベーション培地に放出されたBDNFの量（C）として示される。データは、バンドにおける密度の平均+ S.E.Mとして表示される。
【図１４】図１４Aは、QTA020Vベクターによるトランスフェクションの４８時間後のHEK293細胞ホモジネートのウエスタン・ブロットを示し、ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたTrkB受容体およびBDNFを含む大きな前駆体コード領域の効率的なプロセシングを示す。図１４Bおよび１４Cは、プロセシング後、ウイルス−2Aペプチド切断後に生成された導入遺伝子タンパク質が、プロセシングの後、HEK293細胞の正しい細胞内区画に輸送されたこと（TrkB受容体は細胞表面へ、およびBDNFは放出前に貯蔵小胞へ）を示している；
【図１５】図１５Aは、TrkB受容体発現を示し、図１５Bは、rAAV2ベクター、QTA020Vのマウス網膜ホモジネートにおけるBDNF発現を示す。データは、マウス網膜ホモジネートのウエスタン・ブロットの密度の平均+ S.E.Mとして表示される。**未処理（naive）（注射していない動物）と比較してP <0.01；
【図１６】図１６は、ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたTrkB受容体とBDNFのコーディングを含むrAAV2ベクターであるQTA020V注入後の、免疫細胞化学によって示されるマウス網膜神経節細胞層におけるTrkB（A）およびBDNF（B）導入遺伝子の発現を示す;
【図１７】図１７は、rAAV2-CAG-eGFPベクターで処理したマウスおよび対照動物での視神経圧迫（ONC）後の網膜神経節細胞（RGC）の生存率を示す。データは、網膜フラットマウントのBrn3A陽性細胞でカウントされた、動物あたりの網膜全体の網膜神経節細胞の平均数を平均+ S.E.M.として表示されている。***対照と比較して、P <0.001、*P <0.05；
【図１８】図１８は、導入遺伝子を発現しないrAAV2ウイルスベクター（Nullウイルス）、BDNFのみ（QTA027V）、TrkBのみ（QTA025V）およびBDNFとTrkB両方（QTA020V）によるトランスフェクション後のウエスタン・ブロットによる、未分化ヒトSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞のホモジネートにおけるBDNF（図１８A）およびTrkB（図１８B）導入遺伝子の発現を示す。図１８Cは、ウイルスベクターNull、QTA020V、QTA025VまたはQTA027Vによるトランスフェクション後のウエスタン・ブロットにおけるSH-SY5Y細胞の活性化リン酸化TrkB受容体のレベルを示す。BDNFとTrkBの両方を発現するQTA020Vベクターのみが、トランスフェクトされていない細胞と比較して、TrkB受容体の活性化を大幅に増加させることがわかった（**P <0.01；多重比較のためのボンフェローニ補正t検定後の分散分析（ANOVA））。データは、n = 4の実験の場合の平均+ S.E.M.として表示される；
【図１９】図１９は、TUNEL染色による過酸化水素（0.1mMまたは1.0mMのいずれかのH2O2）の添加によって生じる酸化ストレスへの曝露後の、培養中の未分化SH-SY5Y細胞のアポトーシス細胞死のレベルを示す。過酸化水素の添加前にBDNFおよびTrkB受容体の両方を発現するrAAV2ベクターQTA020Vをトランスフェクトした細胞は、未処理の細胞に対してアポトーシスに対して有意に保護されていることがわかった（**P <0.01；多重比較のためのボンフェローニ補正t検定後の分散分析）。データは、n = 6〜10の実験の場合の平均+ S.E.M.として表示される；そして
【図２０】図２０は、P301S変異ヒトTau遺伝子導入したマウスから得られ、セリン396／セリン404（PHF-1）またはセリン202／セリン205（AT8）の位置でリン酸化Tauを認識する抗体で染色された視神経の代表的な免疫細胞化学的画像を示す。マウスに3ヶ月齢でrAAV2ベクターQTA020V（mBDNFおよびTrkB受容体の両方を発現する）を硝子体内に注射し、免疫細胞化学のために視神経の除去３週間後に終了した。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１３８】
以下の実施例は、神経再生および／または生存を促進するための本発明の実施形態の使用を実証する。実施例により開示される使用、方法、および治療から導き出せる教示は、本明細書に開示されるように、神経変性障害および脳卒中の治療にも適用可能である。
【０１３９】
方法と材料
分子クローニングおよびプラスミド構築物
オンラインツール（http://www.idtdna.com/CodonOpt）を使用してDNA配列のコドン最適化を行い、Integrated DNA Technologies, Inc.（IDT；9180 N. McCormick Boulevard、Skokie、IL 60076-2920、米国）またはGenScript（860 Centennial Ave、Piscataway、NJ 08854、米国）によってDNAブロックを合成した。マスタープラスミドQTA001PAおよび後続のプラスミドを作成するためのクローニングは、標準的な分子生物学およびクローニング技術を使用して実行された。
【０１４０】
プラスミドのスケールアップと精製
DNAプラスミドをSUREコンピテントセル（Agilent Technologies；部品番号200238）で一晩スケールアップして、マキシプレップ精製後に2.29μg／μlのプラスミドを提供した。残りのプラスミドは、最大500μgのスケールにスケールアップされ、エンドトキシンの存在を最小限に抑えた形質導入品質とされた。
【０１４１】
HEK293培養およびプラスミドDNAによる細胞形質導入
HEK293細胞（400,000細胞）を、ポリ-L-リジン（10ug／mL、Sigma-Aldrich、カタログ番号P1274）被覆6ウェルプレートの10％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリンおよび1％ストレプトマイシン（1％Pen／Strep）を含む1.5mLダルベッコの最小必須培地（DMEM）で、80％コンフルエントになるまで培養した。次に、培地を2mLのDMEM（添加剤なし）に交換した。２〜３時間後、4μgのプラスミドDNAと10μLのリポフェクタミン（4μL／mL；Thermo Fisher Scientific；カタログ番号12566014）を含む追加の0.5mlのトランスフェクション培地を上清収集用として各ウェルに添加し、結果トランスフェクション期間を通じて2.5mlの全体体積になった。
【０１４２】
SH-SY5Y培養およびrAAV2ウイルスベクターによる細胞トランスフェクション
SH-SY5Y細胞は、ポリ-L-リジン（10μg／mL、Sigma製品番号P1274）でコーティングされた6ウェルプレート（300,000細胞）、96ウェルプレート（10,000細胞）、または13mmガラスカバースリップ（100,000細胞）で培養した。10％ウシ胎児血清（FBS）、1％ペニシリン、および1％ストレプトマイシン（1％Pen／Strep）を含むダルベッコの最小必須培地（DMEM）を使用して細胞を80％コンフルエントになるまで37℃で培養した後、添加物なしのDMEMに交換し、その後にトランスフェクションした。使用したDMEMの体積は、6ウェルプレート（2mL）、96ウェルプレート（100μL）、カバースリップ（500μL）であった。PBSで希釈したベクターを、1.0x1010（VP）／mLの最終濃度で培地に直接添加し、37℃で48時間インキュベートした。
【０１４３】
過酸化水素によるSH-SY5Y細胞死とTUNEL染色
SH-SY5Y細胞のトランスフェクションの48時間後、培地を新鮮なDMEM（添加物なし）と交換した。過酸化水素（H2O2）（Thermo Fisher Scientific；製品番号BP2633500、ロット番号1378087）をろ過水で希釈し（0.1または1.0mMの濃度まで）、さらに24時間、ウェルまたはプレートに等量を加えた。ろ過された水は、ビヒクル対照として機能した。カバースリップをPBSで2回洗浄し、室温で1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。PBSでさらに３回洗浄した後、5％正常ヤギ血清（NGS）、3％ウシ血清アルブミン（BSA）、および0.3％Triton X-100を含むPBSで室温にて60分間インキュベートすることにより、細胞をブロッキングおよび透過化処理した。次に、細胞をTrkBの市販ウサギポリクローナル抗体（Abcam；製品番号ab33655、ロット番号GR232306-1 1：500希釈）、ウサギポリクローナル抗BDNF抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc；製品番号sc-546；1：300希釈のロット番号CO915）またはブロッキング溶液で希釈したp-Tyr515-TrkB（Abcam製品番号ab109684ロット番号GR92849-4、1：750）で、一晩4℃でインキュベートした。alexa fluor 488（Life Technologies；製品番号A11034、1：1000）に結合させた二次抗ウサギ抗体を使用して、室温で2時間染色を行った。TUNEL染色（Promega；製品番号G3250；ロット番号0000215719）では、細胞をPBSで3回洗浄し、TUNEL平衡化バッファーに１０分間浸した。TUNEL反応混合物は製造業者のプロトコルに従って作成され、100μL／カバースリップが37℃で1時間細胞に添加された。1X標準クエン酸塩溶液（SCS）で15分間インキュベートすることにより、反応を停止した。細胞核を1μg／mLのDAPI（Thermo Scientific；製品番号D1306、1：8000）で対比染色した。細胞をさらに３回洗浄した後、イメージングの前にfluorSaveTM試薬（Calbiochem／EMD Chemicals Inc.、Gibbstown, NJ, USA）でマウントした。20X対物レンズとLeica DM6000落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）を使用してイメージングを実施した。
【０１４４】
ELISA法によるBDNF測定
HEK293細胞から分泌されたBDNFの量は、トランスフェクションの２４時間後に細胞培養培地で測定された。培地を遠心分離して破片を除去し、市販のヒトBDNF ELISAキット（Sigma-Aldrich、製品番号RAB0026）を使用して測定した。BDNF濃度は、サンプルを新たに作成したBDNF標準と比較することにより決定した。
【０１４５】
BDNFおよびTrkB受容体のウエスタン・ブロッティング
HEK293細胞内のBDNFおよびTrkB免疫反応性の量は、DMEMインキュベーション培地を除去し、冷リン酸緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、新しく調製した溶解バッファー350μLをウェルに加えて測定した（10mlのLysis-M試薬 +完全なミニプロテアーゼ阻害剤カクテル1錠、Roche；カタログ番号04719964001、+ 100μlのHaltホスファターゼ阻害剤カクテル（100X）、Thermo Scientific; カタログ番号78428）。細胞の均質化後、BCAアッセイ（Pierce BCAプロテインアッセイキット、Thermo Scientific；カタログ番号23227）を使用してタンパク質懸濁液を定量した。6μg〜15μgのHEK293細胞溶解物タンパク質／レーンをBis-Trisゲル（12％NuPAGE Novex；カタログ番号NP0342BOX、Thermo Scientific）で泳動させ、一晩インキュベートした一次ウサギポリクローナル抗BDNF抗体（Santa Cruz Biotechnology Inc；商品番号sc-546；1：500希釈）、ウサギポリクローナル抗TrkB抗体（Abcam；カタログ番号ab33655、1：2000希釈で使用）またはeGFP抗体（Abcam product、番号ab-290、1： 500希釈で使用）を使用したウエスタン・ブロッティングで検査した。一次抗体は、HRP結合抗ウサギ抗体（Vector Laboratories；カタログ番号PI-1000、1：8000）およびECL Prime（Amersham、GE Healthcare、UK）およびAlliance ウエスタン・ブロットイメージングシステム（UVItec Ltd、Cambridge、UK）を使用したシグナル検出で可視化された。マウス網膜のウエスタン・ブロットでは、ベクター処理した動物の目を新たに調製した500μLの溶解バッファー（10mlのLysis-M試薬 + cOmplete ミニプロテアーゼ阻害剤カクテル1錠、Roche製品番号04719964001 + 100μlのHaltホスファターゼ阻害剤カクテル（100X）、Thermo Scientific製品番号78428）で均質化した。組織を1分間破壊し（Qiagen、TissueRuptor製品番号9001273）、その後さらに１５分間氷上で保持した。次いで、タンパク質を上記のようにウエスタン・ブロッティングにより分析した。
【０１４６】
免疫細胞化学
HEK293細胞（70,000）を4ウェルプレート内の13mmのポリ-L-リジン被覆カバースリップに播種し、0.5ml培地中に10％FBSおよび1％Pen／Strepを含むDMEMでインキュベートした。細胞が80％コンフルエンスまで増殖したら、培地を0.4mlのDMEM（添加剤なし）と２〜３時間交換し、さらに0.1mLのトランスフェクション培地（0.8μgプラスミドDNA + 2μlリポフェクタミン）を加えて、最終容量0.5mlに達した。カバースリップをPBSで２回洗浄し、室温で1Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の4％パラホルムアルデヒドで30分間固定した。PBSでさらに3回洗浄した後、5％正常ヤギ血清（NGS）、3％ウシ血清アルブミン（BSA）、および0.3％Triton X-100を含むPBSで室温にて60分間インキュベートすることにより、細胞をブロッキングおよび透過化処理した。次に、ブロッキング溶液で希釈したBDNF（Santa Cruz Biotechnology Inc；製品番号sc-546；1：300希釈）またはTrkB（Abcam製品番号ab33655、1：500希釈）用の市販のウサギポリクローナル抗体とともに、細胞を4℃で一晩インキュベートした。alexa fluor 647（Invitrogen、製品番号A21248、1：1000）に結合させた二次抗ウサギ抗体を使用して、室温で２時間染色を行った。細胞核も1μg／mlのDAPI（Thermo Scientific、製品番号D1306、1：8000）で対比染色した。細胞をさらに３回洗浄した後、イメージングの前にfluorSaveTM試薬（Calbiochem／EMD Chemicals Inc.、Gibbstown, NJ, USA）でマウントした。20X対物レンズとLeica DM6000落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）または3倍デジタルズームと0.5−0.8シーケンシャルスキャンzステップ間隔を使用する６３倍油浸対物レンズを装備したLeica SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）を使用して、イメージングを実施した。
【０１４７】
対照またはベクター処理動物の網膜構造および視神経の免疫細胞化学（注射後３週間または４週間）のため、慎重に解剖した眼を4％パラホルムアルデヒド／0.1% PBS（pH 7.4）で一晩固定し、4℃にて30％ショ糖／0.1％PBSで脱水した（24時間）。次に、OCTコンパウンド（Sakura Finetek、Zoeterwoude、Netherland）を含むシリコン型に眼を埋め込み、ドライアイスで凍結した。Bright OTF 5000クリオスタット（Bright Instruments, Huntingdon, UK）を使用して、P301Sマウスの網膜の背腹軸／上下軸の13μm切片または視神経の縦断切片をスーパーフロスト・プラススライド（VWR製品番号631-0108）に収集した。スライドをPBSで3回洗浄し、5％の正常ヤギ血清（NGS）、3％のウシ血清アルブミン（BSA）およびPBS中0.3％のTriton X-100で室温にて６０分間透過化処理した。次に、スライドをブロッキング溶液で希釈したBDNF（Santa Cruz Biotechnology Inc；製品番号sc-546、1：300）、TrkB（Abcam；製品番号ab33655、1：500）、Tau Ser396/404（PHF-1；Cambridgeにて生成、1：500）、またはTau Ser202/205（AT8；Invitrogen製品番号MN1020、1：500）に対する市販ウサギポリクローナル抗体とともに4℃で一晩インキュベートした。alexa fluor 647（Invitrogen、製品番号A21248、1：1000）に結合させた二次抗ウサギ抗体を使用して、室温で２時間染色を行った。細胞核も1μg／mlのDAPI（Thermo Scientific、製品番号D1306、1：8000）で対比染色した。スライドをさらに３回洗浄した後、イメージングの前にfluorSaveTM試薬（Calbiochem／EMD Chemicals Inc.、Gibbstown, NJ, USA）でマウントした。20X対物レンズとLeica DM6000落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）または3倍デジタルズームと0.5〜0.8シーケンシャルスキャンzステップ間隔を使用する６３倍油浸対物レンズを装備したLeica SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）を使用して、イメージングを実施した。
【０１４８】
硝子体内注射
７〜１０日間の順化期間の後、１２週齢のC57／BL.6または１６週齢のP301S（Harlan labs、Bicester、U.K.）マウスをさまざまな研究グループに無作為に分けた。その後、ケタミン（50mg／kg）とキシラジン（5g／kg）の腹腔内注射で麻酔した。局所1％テトラカイン点眼液を研究の１日目に投与した。1％トロピカミド点眼液を使用して、瞳孔拡張が達成された。手術用顕微鏡を使用して、部分的な深さの強膜パイロット孔を30ゲージの針で作成し、チップ直径30μmでチップ長2.5 mmの微細な金属マイクロピペットによるその下の強膜、脈絡膜、および網膜の貫通を容易にした。次に、そのマイクロピペットを10μLのガラスシリンジ（Hamilton Co.、Reno、NV）に接続した後、グループに応じて2μLのベクター懸濁液をピペットに吸い上げた。硝子体内注射中の水晶体の貫通または渦静脈への損傷を避けるために、注意が払われた。注射部位は、上外側縁の約3mm後方に向けられた。ベクター懸濁液の拡散を可能にするために、注射は１分以上かけてゆっくりと行われた。右目は手付かずのままで、内部の対側の対照として機能した。
【０１４９】
視神経圧迫（ONC）
ベクター投与の３週間後（２１日）、マウスはONC手順に供されるか、または未処理もしくは模擬圧迫状態で放置された。双眼手術用スコープの下で、眼球の下側からバネ式ハサミで小さな切開を始め、眼の側方の周りを切開した。これにより、眼球の後面が露出し、視神経の可視化が可能になった。露出した視神経を、クロスアクションピンセット（Dumont番号N7、カタログ番号RS-5027；Roboz）を使用して、眼球から約1〜3mmで10秒間把持し、自己クランプ作用の圧力のみで視神経を圧迫した。10秒後、視神経が解放され、ピンセットが取り除かれ、眼が回転して元の位置に戻る。ONCの７日後、動物は殺処分された。4％パラホルムアルデヒド／0.1%のPBS（pH 7.4）に一晩臓器を配置することにより、各グループの両眼を固定した。次に、角膜から眼後部構造を切除し水晶体を除去した後、網膜フラットマウントを準備した。網膜フラットマウントは、4％パラホルムアルデヒド／0.1%のPBSで３０分間固定し、PBS中0.5％Triton X-100で洗浄した。網膜を−80℃で１０分間凍結して、核膜を浸透化、抗体の浸透性を改善した後、PBS中10％の正常ロバ血清（NDS）、2％ウシ血清アルブミン（BSA）および2％Triton X-100で室温にて６０分間ブロッキングした。RGCをBrn3Aに対する抗体（1：200、Santa Cruz、番号sc-31984）で対比染色し、20X対物レンズとLeica DM6000落射蛍光顕微鏡（Leica Microsystems、Wetzlar、Germany）を使用して蛍光顕微鏡下で可視化した。1.5倍デジタルズームと0.5〜0.8シーケンシャルスキャンzステップ間隔を使用する４０倍油浸対物レンズを装備したLeica SP5共焦点顕微鏡（Leica Microsystems）を使用して、より高い解像度の画像が得られた。RGC細胞数は、ImageJで核プラグイン（ITCN）をカウントするための画像ベースのツールを使用して測定され、RGC／mm2の密度として表された。
【０１５０】
構築物とベクター
本発明者らは、図１に示すように、緑内障や蝸牛の病的状態などの視神経の病的状態に苦しむ対象を治療するため、または神経再生および／または生存を促進するために使用できる遺伝子構築物を生成した。構築物は、RGCの細胞表面上のTrkB受容体の密度を維持または増加させ、mBDNFの同時生産と局所放出によりTrkB受容体経路を介したシグナル伝達を維持または増加させるように設計されている。
【０１５１】
構築物は、TrkB受容体およびそのアゴニストである成熟脳由来神経栄養因子をコードする導入遺伝子を含む。これらの導入遺伝子は、ヒトシナプシンI（SYN I）プロモーターまたはCAGプロモーターのいずれかである単一のプロモーターに作動可能に連結されている。有利なことに、図１の構築物は、それがコードする導入遺伝子のサイズに邪魔されることなくrAAV2ベクターに配置することができる。これは、最初の導入遺伝子であるTrkBがウイルス2Aペプチド配列に連結され、続いてBDNFシグナルペプチド、次に成熟タンパク質が続くように、構築物が配向されているためである。ウイルス2Aペプチドの短いN末端アミノ酸配列がTrkB受容体の細胞内部分に付着したままであり、C末端ウイルス2A配列からの残留プロリンアミノ酸がN末端BDNFシグナルペプチドに付着したままであり、最終的に切断後にmBDNFタンパク質から除去されるので、この配向はまた免疫原性リスクを最小限にとどめる。ベクターは、薬理学的に許容される緩衝液に入れられ、対象に投与され得る。
【０１５２】
図２〜５は、発現ベクターのさまざまな実施形態を示している。図２は、正準シグナル配列（青）（つまり、MTILFLTMVISYFGCMKA [配列番号 20]）とプロBDNF（赤）およびmBDNF（黒）を含む「プラスミドQTA001PA」として知られるベクターを示している。図３は、「プラスミドQTA002P」として知られるベクターを示している。それはプロBDNFをコードせず、mBDNFのみを生成し、QTA001PAと同じシグナル配列（青）をコードする。図４は、「プラスミドQTA003P」として知られるベクターを示している。これもプロBDNFをコードせず、mBDNFのみを生成する。mBDNFの正準シグナル配列の代わりに、IL-2シグナル配列（青）を含んでいる。最後に、図５は「プラスミドQTA004P」として知られるベクターを示している。プロBDNFをコードせず、代わりにmBDNFのみを生成する。また、新規シグナル配列（青）[配列番号 32]もコードする。
【０１５３】
本発明者らは、成熟BDNF（mBDNF）の要素から始まる緑内障遺伝子治療の概念に関連する構築物およびベクターを作成および調査した。それらは、プロBDNFコード領域を含まないBDNF配列を含むプラスミド（QTA002P、図3を参照）によるリポフェクタミン形質導入後のHEK293細胞からのmBDNFの産生と放出を明確に実証した（図７を参照）。細胞から放出されたmBDNFは、予測される14kDaのモノマーであり（ウエスタン・ブロッティングおよびBDNFに対する市販の抗体を使用して測定）、酵母および他の細胞ベースの製造アプローチ1を使用して、商業量のmBDNFを生成しようとしているいくつかのグループによって報告されているような、タンパク質凝集の証拠はない。したがって、mBDNFは、TrkB受容体を活性化するために、タンパク質分子が非共有結合二量体を形成できるような形で放出される。
【０１５４】
BDNFのELISA法（mBDNFとより大きな延張プロBDNFタンパク質を区別しない）を使用して、本発明者らはまた、内因性の正準18アミノ酸シグナルペプチド配列（MTILFLTMVISYFGCMKA）をコードするDNA配列を新規ペプチド配列（QTA004P−図5を参照）で置換し、BDNF遺伝子を含むプラスミドによる細胞のリポフェクタミン形質導入後、同等レベルのBDNFをHEK293インキュベーション培地に放出できることを実証した（図７を参照）。
【０１５５】
インターロイキン2シグナルペプチドをコードする配列（QTA003P-図４を参照）による内因性シグナルペプチドの置換は、BDNFを培地から放出するのにあまり効果的ではない。培地に放出されるBDNFのレベルは現在約1〜2nMであり、このアゴニストの濃度は特定のTrkB受容体を最大限に活性化するのに十分である（約0.9nMのIC50）。BDNFの放出レベルは、プロBDNFとmBDNFの組み合わせ配列を含み、１８アミノ酸の正準シグナルペプチドも含むプラスミドQTA001PA（図２を参照）で、プラスミドQTA002P（図３を参照）およびQTA004P（図５を参照）と比較して約３５倍（876±87 ng／mL BDNF）である。
【０１５６】
リポフェクタミンプラスミド形質導入の２４時間後に定量的ウエスタン・ブロットにより細胞内に残っているBDNFを測定すると、QTA002PおよびQTA004Pを使用した場合よりもQTA001PAを使用した方がBDNFの残存濃度が低かった（図８を参照）。
【０１５７】
さらに、QTA001PAによって形質導入された細胞溶解物のBDNF免疫反応性の約半分はプロBDNF（32kDaの分子量バンド）の形であったが、プロBDNFバンドはQTA002P、QTA003PおよびQTA004Pで形質導入された細胞の溶解物にはなかった（図９を参照）。おそらくこれらのプラスミドがプロBDNF拡張コード配列を含まないためである。
【０１５８】
プロBDNFに特異的なELISA法を使用して、発明者らは、QTA001PAによって形質導入された細胞から放出されたBDNF免疫反応性の約70ng／mL（2.2nMまたは3.5％）がプロBDNFの形であり、大部分（96.5％または876ng／mL／63nM）はmBDNFとして放出される（図１０を参照）ことを実証できた。延張されたプロBDNFのコード配列を含まないQTA002P、QTA003PまたはQTA004Pによって形質導入された細胞から検出されたプロBDNF免疫反応性は、なかった。
【０１５９】
したがって、すべてのプラスミドが14kDaのmBDNFタンパク質を産生できることは明らかであるが、HEK293細胞から放出されるmBDNFの量は、タンパク質の分泌小胞への貯蔵およびパッケージングの効率に大きく依存している。したがって、プラスミドQTA001PAで生成されたプロBDNFとmBDNFの組み合わせ配列を含むタンパク質の延張型（図２）は、細胞内部に蓄積していると思われるより小さなmBDNF配列よりもはるかに効率的に分泌小胞にパッケージされ、インキュベーション培地に放出される。
【０１６０】
図１１を参照すると、プラスミドQTA002Pで表される内因性正準シグナルペプチド配列のコーディングを、プラスミドQTA009PからQTA013Pに含まれる新規配列で置換することで、プラスミド導入後２４時間にHEK293細胞のBDNF濃度が増加することがわかる。図１２は、プラスミドQTA002Pに含まれる内因性正準シグナルペプチドコード配列を新規配列（プラスミドQTA009PからQTA013Pへ）で置換すると、プラスミドによる形質導入の２４時間後に測定されているように、HEK293細胞からのBDNFの放出（ELISA法で測定）が増加することを実証している。
【０１６１】
図１３に示すように、ウイルス−2Aペプチド配列を付加すると、大きな前駆体タンパク質のコード配列が２つの導入遺伝子であるeGFPとBDNFに効率的にプロセシングされる結果となる。ウエスタン・ブロットは、プラスミドを形質導入してから２４時間後のHEK293細胞を示している：（i）QTA015P（IRESスペーサーで分離されたBDNFおよびeGFPを発現）、（ii）QTA021P（BDNFを発現）は後に、機能的ウイルス−2Aペプチド配列により分離されたeGFPが続くBDNF、（iii）QTA022P（BDNFを発現）は後に、非機能性ウイルス−2Aペプチド配列により分離されたeGFPが続くBDNF、および（iv）QTA023P（eGFPを発現）は後に、機能性ウイルス−2Aペプチド配列により分離されたBDNFが続くeGFP。
【０１６２】
QTA021P（mBDNF−ウイルス−2Aペプチド−eGFPのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書では次のとおり配列番号104と呼ばれる：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCCGTGAAGCAGACCCTGAACTTTGATTTGCTCAAGTTGGCGGGGGATGTGGAAAGCAATCCCGGGCCAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[配列番号 104]
【０１６３】
QTA022P（mBDNF−非機能性ウイルス−2Aペプチド−eGFPのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書では次のとおり配列番号105と呼ばれる：
ATGACTATCCTGTTTCTGACAATGGTTATTAGCTATTTCGGTTGCATGAAGGCTCACAGTGATCCCGCACGCCGCGGAGAACTTAGCGTGTGCGACAGCATCAGCGAGTGGGTCACCGCCGCCGATAAGAAGACCGCTGTGGATATGTCCGGCGGGACCGTCACTGTACTCGAAAAAGTTCCAGTGAGCAAAGGCCAACTGAAACAATATTTCTATGAAACTAAGTGCAACCCCATGGGGTACACCAAGGAGGGCTGCCGGGGAATCGACAAGAGACACTGGAATTCCCAGTGCCGGACCACTCAGAGCTACGTCCGCGCCTTGACGATGGATTCAAAGAAGCGCATCGGATGGCGGTTCATAAGAATCGACACCAGTTGTGTGTGCACGCTGACGATAAAACGGGGGCGGGCCCCTGTCAAACAAACCCTCAATTTTGACTTGCTGAAGCTTGCTGGGGATGTCGAGTCCGCTGCCGCGGCTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGCGTTGTGCCAATACTGGTTGAGTTGGATGGCGATGTCAACGGACACAAATTTAGCGTAAGCGGGGAGGGAGAGGGCGACGCCACATATGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATTTGCACGACCGGCAAATTGCCCGTCCCTTGGCCCACACTTGTGACGACCCTGACTTATGGCGTACAGTGCTTCAGCAGGTACCCTGATCATATGAAGCAACACGACTTCTTTAAGAGTGCCATGCCAGAGGGATACGTCCAGGAAAGAACCATATTCTTCAAAGATGATGGAAATTACAAAACCCGGGCAGAGGTCAAGTTTGAAGGCGACACCCTGGTGAACAGGATCGAACTCAAAGGCATCGATTTCAAAGAGGACGGAAACATCCTCGGACACAAACTGGAATACAATTACAACAGCCACAACGTCTACATCATGGCAGATAAACAAAAGAACGGTATTAAAGTGAACTTCAAGATCCGGCACAACATCGAAGACGGCTCCGTCCAGCTTGCCGACCACTACCAGCAAAATACCCCGATCGGCGACGGCCCCGTTCTCCTCCCCGATAATCACTACCTGAGTACACAGTCAGCCTTGAGCAAAGACCCTAATGAAAAGCGGGACCACATGGTTTTGCTGGAGTTCGTTACCGCAGCGGGTATTACGCTGGGTATGGACGAGCTTTACAAGTAA
[配列番号 105]
【０１６４】
QTA023P（eGFP−ウイルス−2Aペプチド−mBDNFのコドン最適化配列を含むプラスミド）のコード配列は、本明細書で次のとおり配列番号106と呼ばれる：
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAGGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGCTCCCGTTAAACAAACTCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCTGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCGCACTCCGACCCTGCCCGCCGTGGGGAGCTGAGCGTGTGTGACAGTATTAGCGAGTGGGTCACAGCGGCAGATAAAAAGACTGCAGTGGACATGTCTGGCGGGACGGTCACAGTCCTAGAGAAAGTCCCGGTATCCAAAGGCCAACTGAAGCAGTATTTCTACGAGACCAAGTGTAATCCCATGGGTTACACCAAGGAAGGCTGCAGGGGCATAGACAAAAGGCACTGGAACTCGCAATGCCGAACTACCCAATCGTATGTTCGGGCCCTTACTATGGATAGCAAAAAGAGAATTGGCTGGCGATTCATAAGGATAGACACTTCCTGTGTATGTACACTGACCATTAAAAGGGGAAGATAG
[配列番号 106]
【０１６５】
図１４Aを参照すると、QTA020Vベクターでのトランスフェクションの４８時間後のHEK293細胞ホモジネートのウエスタン・ブロットが示されている。これは、ウイルス−2Aペプチド配列によって分離されたTrkB受容体とBDNFを含む大きな前駆体コード領域の効率的なプロセシングを示している。２つのTrkBおよびmBDNF免疫反応性導入遺伝子は、予測される正しい分子量の範囲内にある。TrkB受容体バンドを超える大きな前駆体タンパク質の染色がないことに注目する必要がある。これは、５回の反復で前駆体タンパク質がほぼ完全にまたは完全にプロセシングされていることを示している。図１４Bおよび１４Cは、プロセシング後、ウイルス−2Aペプチド切断後に生成された導入遺伝子タンパク質が、HEK293細胞の正しい細胞内区画に輸送されたことを示している（TrkB受容体は細胞表面へ、およびBDNFは放出前に貯蔵小胞へ）。
【０１６６】
図１５は、TrkB受容体とBDNFの2つのコード領域を分離するウイルス−2Aペプチド配列の追加により、rAAV2ベクター、QTA020Vの硝子体内注射後のマウス網膜の２つの導入遺伝子への効率的なプロセシングという結果になることを示している。
【０１６７】
図１６は、ウイルス−2Aペプチド配列によって分離された、TrkB受容体およびBDNFのコーディングを含むrAAV2ベクターであるQTA020Vの注射後の免疫細胞化学によって示されるマウス網膜神経節細胞層における導入遺伝子の発現を示している。標的網膜神経節細胞体は、抗Brn3A抗体で赤く染色され、網膜層を区別するために細胞核はDAPIで青く対比染色される。
【０１６８】
図１７を参照すると、硝子体内注射（2μlの9x1012ベクター粒子／ml）を介したQTA02oV（TrkB受容体とBDNFのコーディング領域を含み、ウイルス−2Aペプチド配列で分離されている）の前処理が、rAAV2−CAG−eGFPベクターで処理した対照動物に対して視神経圧迫後のマウス網膜神経節細胞の生存に、有意な神経保護効果を与えることが示されている。QTA020Vベクターによる神経保護レベルは、BDNFのみを発現するベクターによって提供されるレベルよりも大きかった。３つの動物グループすべてに視神経圧迫処置を施し、傷害の７日後に網膜神経節細胞の数を測定した。網膜神経節細胞は、模擬圧迫の対象動物（データは示さず）に対して、対照（黒いバー）では71％減少した。
【０１６９】
構築物の神経保護効果
図１８を参照すると、導入遺伝子を発現しないrAAV2ウイルスベクター（Nullウイルス）、BDNFのみ（QTA027V）、TrkBのみ（QTA025V）、およびBDNFとTrkBの両方（QTA020V）でのトランスフェクション後のウエスタン・ブロッティングによる未分化ヒトSH-SY5Y神経芽腫細胞ホモジネートにおけるBDNF導入遺伝子（図１８Aを参照）およびTrkB導入遺伝子（図１８Bを参照）の発現が示されている。良いレベルの発現が達成されていることは明らかである。
【０１７０】
図１８Cを参照すると、ウイルスベクターNull、QTA020V、QTA025VまたはQTA027Vによるトランスフェクション後のウエスタン・ブロットにおけるSH-SY5Y細胞の活性化リン酸化TrkB受容体のレベルが示されている。BDNFとTrkBの両方を発現するQTA020Vベクターのみが、トランスフェクトされていない細胞と比較して、TrkB受容体の活性化を著しく増加させることがわかった。したがって、本発明の構築物は両方の導入遺伝子を効果的に発現し、神経芽腫SH-SY5Y細胞で活性化リン酸化TrkB受容体をもたらすことが示されており、アルツハイマー病または脳卒中などの神経変性障害を治療できることが示されている。
【０１７１】
図１９を参照すると、TUNEL染色による過酸化水素（0.1mMまたは1.0mMのいずれかのH2O2）の添加によって生じる酸化ストレスへの曝露後の、培養中の未分化神経芽腫SH-SY5Y細胞のアポトーシス細胞死のレベルが示されている。過酸化水素の添加前にBDNFとTrkB受容体の両方を発現するrAAV2ベクターQTA020Vをトランスフェクトした細胞は、驚くべきことに、未処理の細胞と対比してアポトーシスに対して有意に保護されることがわかった。これらのデータは、本発明の構築物が神経変性障害または脳卒中の治療、予防または改善に使用できるという概念を、ここでもサポートしている。
【０１７２】
ここで図２０を参照すると、P301S変異ヒトTau形質転換マウスから得られ、セリン396／セリン404（PHF-1）またはセリン202／セリン205（AT8）の位置でリン酸化Tauを認識する抗体で染色された、視神経の代表的な免疫細胞化学画像が示されている。
【０１７３】
P301Sトランスジェニックマウスは、主に海馬で８ヶ月までにニューロンの損失と脳萎縮を発症するが、新皮質や嗅内皮質を含む他の脳領域にまで広がる。それらは、新皮質、扁桃体、海馬、脳幹、および脊髄に散在性の神経原線維もつれのような封入体を発現する。もつれの病理には、小膠細胞症および星状膠細胞症が伴うが、アミロイド斑は伴わない[56、57、58]。
【０１７４】
マウスは、標的網膜神経節細胞とその軸索にTrkB受容体とBDNFの両方を発現するQTA020Vの硝子体内注射により治療された。図２０の画像は、PHF-1およびAT-8を使用したタウの過剰リン酸化の程度が、視神経を構成する軸索で著しく減少していることを示している。これらのin vivoデータは、本発明の構築物を使用したTrkBおよびBDNFの増加した発現が、アルツハイマー脳に関連する病態生理学的特徴の１つであるニューロンのタウリン酸化を有意に低減できることを示している。
【０１７５】
結論
アルツハイマー病については、この疾患の代用と一般的にみなされ、臨床結果に対するある程度の予測可能性をもって遺伝子治療を試験できる単一の前臨床モデルは存在しないことが理解されよう。しかし、利用可能なものは、そのゲノムの改変により、この疾患を有するヒトで特定された定義的な遺伝子的／神経化学的または生化学的変化の１つがげっ歯類へ導入された動物モデルである。これらの変化には、Aβの過剰な産生およびプラークの形成[59]、軸索輸送を媒介すると考えられるタウタンパク質の神経細胞体および軸索内での過剰リン酸化の発生[60]およびBDNFとその同族受容体であるTrkBの両方の減少[11-14、27]が含まれる。
【０１７６】
ヒトの死後組織と、その生成に関与するBACE-1酵素の遮断（ベルベセスタット；Merck）または抗体中和（たとえばソラネズマブ；Eli Lillyおよびバピネオズマブ；Pfizer／J＆J）による両方の実験動物からベータアミロイドを除去することに成功し得るさまざまな薬剤の能力に基づき、これらのアプローチはどちらも、第III相臨床試験で有意な臨床的利益を生むことができていない。したがって、アルツハイマー病と診断されたヒトの脳で広く説明されている死後変化のうち、BDNFシグナル伝達の喪失および過剰リン酸化タウに関連する神経原線維もつれの存在は、この神経学的状態に関連する病態生理学的変化を回復または遅延させる唯一の未検証のアプローチである。
【０１７７】
本発明者らは、重要な発明的努力を用いて、この疾患において両方が減少すると報告されたTrkB受容体とBDNF（上記引用文献を参照）を同時に発現し、アップレギュレートさせることができる新規構築物を使用して、BDNFシグナル伝達の損失を克服する問題に取り組んだ。
【０１７８】
BDNFの半減期は短いため、脳への１日あたり数回の脳への注射または持続的注入を必要とする可能性のある組換えBDNFの定期的な投与は、臨床的に実行不可能であり、おそらくTrkB受容体のダウンレギュレーションに関連する。さらに、発明者らは、SHSY-5Y細胞では、TrkB受容体を単独で発現するrAAV2は、活性p-Y515-TrkB染色のレベルによって測定されるこの受容体の活性を有意に増加させるのに十分でないことも、図１８Cで実証した。本発明の構築物は、（i）プロBDBFコーディングの喪失、（ii）重要なプロBDNF配列の省略によるBDNFの細胞内輸送および正常なタンパク質フォールディングに関連する問題を克服するための、新規シグナルペプチドの導入、（iii）リボソームによるTrkB配列産生とリボソームによるBDNF配列産生との間での翻訳「スキップ」を促進するウイルス−2Aペプチド配列を含む単一の導入遺伝子の構築、および（iv）最後に、短縮されたWPREおよびpolyA配列を含むいくつかの進歩性を通じて、TrkB受容体およびBDNFの両方の大きなコード配列を収容するように特に設計されている。したがって、本発明者らは、2つの導入遺伝子、BDNF、およびその同族受容体であるBDNFを発現する新規構築物が、TrkB受容体のみをアップレギュレートすることよりもはるかに優れているという証拠を提供した。本発明者らはまた、以前に実証されたように[56]、新規遺伝子治療構築物が最適な活性を提供できることを実証したが、BDNFの追加の（定期的な）注射を必要としない。
【０１７９】
本発明者の主な目的は、提供された実施例が明瞭に実証している低レベルのBDNF／TrkBシグナル伝達に対処できる遺伝子治療を開発することであった。予想外であったのは、図２０に示すように、新規遺伝子治療構築物が過剰リン酸化タウタンパク質の密度（タウタンパク質の長さに沿っていくつかのリン酸化セリン残基を認識する２つの抗体を使用して測定）を大幅に低減できることであった。タウは、脳や視神経などの他の神経組織に見られる遍在性タンパク質である。視神経をモデルシステムとして使用して、眼のBDNFシグナル伝達の増加は、このタンパク質アイソフォームの提案された病理学的レベルを低下させることがわかった。したがって、P301S形質転換マウス系統におけるBDNF／TrkBシグナル伝達をアップレギュレートし、リン酸化タウの密度のこのような大幅な減少を観察する能力は予期されていなかった。
【０１８０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成30年9月26日(2018.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ受容体B（TrkB））をコードする第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、およびTrkB受容体アゴニストをコードする第２のコード配列を含む遺伝子構築物であって、
前記アゴニストが成熟BDNFまたは成熟NT-4であり、第２のコード配列がTrkB受容体アゴニストの分泌を促進するシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、また前記遺伝子構築物が第１および第２のコード配列の間に配置されたスペーサー配列を含み、前記スペーサー配列は消化されてTrkB受容体とアゴニストを別々の分子として産生するように構成されるペプチドスペーサーをコードする遺伝子構築物を含む、神経変性障害の治療、予防、または改善に使用するための組換えベクター。
【請求項２】
前記遺伝子構築物がウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WHPE）をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記WHPEは実質的に配列番号57または58に示される核酸配列、もしくは配列番号57または58と少なくとも65％の配列同一性を有する断片または変異体を含む、請求項１に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３】
ポリA鎖をコードするヌクレオチド配列を含み、場合により前記ポリA鎖は実質的に配列番号59に記載の核酸配列、もしくは配列番号59と少なくとも65％の配列同一性を有する断片または変異体を含む、請求項１または請求項２のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項４】
プロモーターがヒトシナプシンI（SYN I）プロモーターであり、場合により前記プロモーターが実質的に配列番号1に記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号1と少なくとも65％の配列同一性を有する断片または変異体を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項５】
プロモーターがCAGプロモーターであり、場合により前記プロモーターが実質的に配列番号2、3または48に記載のヌクレオチド配列、もしくは配列番号2、3または48と少なくとも65％の配列同一性を有する断片または変異体を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項６】
前記スペーサー配列が、ウイルスペプチドスペーサー配列、より好ましくはウイルス2Aペプチドスペーサー配列を含み、コードする、請求項１〜５のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項７】
前記ペプチドスペーサー配列が、配列番号4に示されるアミノ酸配列、または配列番号4と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項８】
前記スペーサー配列が、配列番号5に示されるヌクレオチド配列、または配列番号5と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項９】
前記ペプチドスペーサー配列が、配列番号6に示されるアミノ酸配列、または配列番号6と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１０】
前記スペーサー配列が、配列番号7に示されるヌクレオチド配列、または配列番号7と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１１】
前記ペプチドスペーサー配列が、配列番号8に示されるアミノ酸配列、または配列番号8と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１２】
前記第１のコード配列が、TrkBのヒト正準アイソフォームをコードするヌクレオチド配列を含み、前記TrkBの正準アイソフォームは、配列番号9に示されるアミノ酸配列、または配列番号9と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１３】
前記第１のコード配列が、配列番号10に示されるヌクレオチド配列、または配列番号10と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１４】
前記第１のコード配列が、TrkBのアイソフォーム4をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１５】
TrkBのアイソフォーム4が、配列番号11に示されるアミノ酸配列、または配列番号11と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１４に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１６】
前記第１のコード配列が、配列番号12に示されるヌクレオチド配列、または配列番号12と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１４または請求項１５のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１７】
前記第１のコード配列が、配列番号9に従ったヌクレオチド配列を含み、配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の１つ以上のチロシン残基が異なるアミノ酸残基に改変されている、請求項１〜１６のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１８】
配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の少なくとも２つ、３つまたは４つのチロシン残基が異なるアミノ酸残基に改変されている、請求項１７に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項１９】
配列番号9の位置516、701、705、706および／または816の５つすべてのチロシン残基が異なるアミノ酸残基に改変されている、請求項１８に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２０】
前記または各チロシン残基が、グルタミン酸に改変されている、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２１】
前記TrkB受容体の改変型が、配列番号13に示されるアミノ酸配列、または配列番号13と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２２】
前記第１のコード配列が、配列番号14に示されるヌクレオチド配列、または配列番号14と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２１に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２３】
前記第２のコード配列がニューロトロフィン-4（NT-4）をコードし、該NT-4が配列番号49または55に示されるアミノ酸配列、または配列番号49または55と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含み、および／または前記第２のコード配列が、配列番号50または56に示されるヌクレオチド配列、または配列番号50または56と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２４】
前記第２のコード配列が、成熟BDNFをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２３に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２５】
前記成熟BDNFが、配列番号18に記載のアミノ酸配列、または配列番号18と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２４に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２６】
前記第２のコード配列が、配列番号19に記載のヌクレオチド配列、または配列番号19と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２５に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２７】
前記第２のコード配列が、TrkB受容体アゴニストのシグナルペプチド、最も好ましくはBDNFのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２８】
前記ヌクレオチド配列がBDNFの正準シグナルペプチドをコードし、
前記第２のコード配列が、配列番号20に記載のアミノ酸配列、または配列番号20と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含むシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２７に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項２９】
前記第２のコード配列が、配列番号21に記載のヌクレオチド配列、または配列番号21と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項２７に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３０】
前記第２のコード配列が、配列番号23、25、27または29に記載のいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、または前記シグナルペプチドが、配列番号22、24、26、または28に記載のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜２９のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３１】
前記第２のコード配列が、配列番号31、33、35、37、39、41、43、45、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101または103に記載のいずれか１つのシグナル配列ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み；または前記シグナルペプチドが、配列番号30、32、34、36、38、40、42、44、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、または102に記載のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３２】
前記構築物が、配列番号107または108に記載されているヌクレオチド配列、または配列番号107または108と少なくとも65％の配列同一性を有する断片もしくは変異体を含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３３】
前記ベクターが組換えAAV（rAAV）ベクターである、請求項１〜３２のいずれかに記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３４】
前記rAAVが、AAV-1、AAV-2、AAV-3A、AAV-3B、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、またはAAV-11である、請求項４０に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３５】
前記rAAVがrAAV血清型-2である、請求項３４に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３６】
前記神経変性障害が、アレキサンダー病、アルパーズ病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、毛細血管拡張性運動失調症、ニューロンセロイド脂褐素症、バッテン病、牛海綿状脳症（BSE）、カナバン病、脳性麻痺、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭葉変性症、ゴーシェ病、ハンチントン病、HIV関連認知症、ケネディ病、クラッベ病、レビー小体型認知症、リソソーム蓄積障害、神経ボレリア症、マシャド・ジョセフ病、運動ニューロン病、多系統萎縮症、多発性硬化症、多種スルファターゼ欠損症、ムコリピド症、ナルコレプシー、ニーマン・ピック病C型、ニーマン・ピック病、パーキンソン病、ペリツェウス・メルツバッハ病、ピック病、ポンペ病、原発性側索硬化症、プリオン病、進行性核上性麻痺、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、悪性貧血に続発する亜急性連合性脊髄変性症、スピルマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病、脊髄小脳変性症、脊髄性筋萎縮症、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー病、脊髄癆、およびテイ・サックス病からなる群から選択される、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３７】
前記神経変性障害がアルツハイマー病である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の使用のための組換えベクター。
【請求項３８】
ニューロンにおけるタウリン酸化を低減する、請求項３７に記載の使用のための組換えベクター。
【国際調査報告】
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