(57)【要約】  ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３からなる３つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる３つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、ＨＣＤＲ１の配列がＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ（配列番号４）であり、ＨＣＤＲ２の配列がＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ（配列番号５、Ｘは任意のアミノ酸である）であり、ＨＣＤＲ３の配列がＧＥＴＦＤＳ（配列番号６）であり、ＬＣＤＲ１の配列がＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ（配列番号７、Ｘ’はＦ、ＹまたはＷであり、ＺはＣ、Ｇ、ＳまたはＴである）であり、ＬＣＤＲ２の配列がＷＡＳＤＲＳＦ（配列番号８）であり、ＬＣＤＲ３の配列がＱＱＨＬＤＩＰＹＴ（配列番号９）である、ヒト化抗グロボＨ抗体、またはそのｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメント。
2020521752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３からなる３つの相補性決定領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる３つの相補性決定領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、ＨＣＤＲ１の配列がＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ（配列番号４）であり、ＨＣＤＲ２の配列がＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ（配列番号５、Ｘは任意のアミノ酸である）であり、ＨＣＤＲ３の配列がＧＥＴＦＤＳ（配列番号６）であり、ＬＣＤＲ１の配列がＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ（配列番号７、Ｘ’はＦ、ＹまたはＷであり、ＺはＣ、Ｇ、ＳまたはＴである）であり、ＬＣＤＲ２の配列がＷＡＳＤＲＳＦ（配列番号８）であり、ＬＣＤＲ３の配列がＱＱＨＬＤＩＰＹＴ（配列番号９）である、
ヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号５のＸがアスパラギンまたはグルタミンである、
請求項１に記載のヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号７のＸ’がトリプトファンである、
請求項１または２に記載のヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
配列番号７のＺがトレオニンまたはセリンである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記重鎖可変ドメインが配列番号２０の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号２２の配列を含む、
請求項１に記載のヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記重鎖可変ドメインが配列番号２１の配列を含み、前記軽鎖可変ドメインが配列番号２３の配列を含む、
請求項１に記載のヒト化抗グロボＨ抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、
癌を治療または予防するのに使用するための医薬組成物。
【請求項８】
前記癌が、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、または前立腺癌である、
請求項７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グロボＨに特異的に結合するヒト化抗体に関する。本発明はまた、これらの抗体を使用して癌を治療および／または診断するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グロボＨ（Ｆｕｃ−α１，２−Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃ−β１，３−Ｇａｌ−α１，４−Ｇａｌ−β１，４−Ｇｌｃ−β１，１−Ｃｅｒ）は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、および前立腺癌細胞を含む様々な上皮癌細胞の表面で過剰発現される多数の腫瘍関連炭水化物抗原に属する六糖である。グロボＨに加えて、他の公知の炭水化物抗原は、Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、シアリルＴｎ（Ｎｅｕ５Ａｃ−α２，６−ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、ＳＴｎ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＤ３Ｌ、フコシル−ＧＭｌ、ルイス抗原（Ｌｅｘ、Ｌｅｙ、Ｌｅａ、シアリルＬｅｘ、シアリルＬｅａ）、ＴＦ（Ｇａｌ−β１，３−ＧａｌＮＡｃ−α−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）を含み、癌免疫療法の標的抗原としても使用される（Ｓｕｓａｎ  Ｆ  Ｓｌｏｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｓ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００５）８３，４１８−４２８；Ｚｈｏｎｇｗｕ  Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｑｉａｎｌｉ  Ｗａｎｇ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００９  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；１３（５−６）：６０８−６１７；Ｔｈｅｒｅｓｅ  Ｂｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｂａｓｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（Ｃｏｍｂ）２００９  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２８；（３６）：５３３５−５３４９）。
【０００３】
しかし、ほとんどの炭水化物抗原はしばしば免疫系によって寛容され、その結果として、それらによって誘導される免疫原性は限られる。さらに、特定の免疫原に対する抗体の産生は、典型的には、２種類のリンパ球、すなわちＢ細胞とヘルパーＴ細胞との間の協調的相互作用を伴う。グロボＨ単独ではヘルパーＴ細胞を活性化することができず、これはグロボＨの低い免疫原性にも帰せられる。したがって、グロボＨ単独での免疫化は、しばしば低い力価の免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）へのクラススイッチができないこと、および効果的でない抗体の親和性成熟をもたらす。
【０００４】
最近、適切なアジュバントの添加により、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチを含む、グロボＨに対する抗体を誘導できることが実証された。したがって、グロボＨは癌ワクチン接種の有望な治療標的である。このアプローチは、乳癌、卵巣癌、前立腺癌および肺癌を含む様々な癌に対する様々な段階の臨床試験中である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
グロボＨに対する抗体は癌の診断および治療に有望であることが示されているが、より良い抗グロボＨ抗体が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、グロボＨに特異的に結合するヒト化グロボＨ抗体、ならびに癌の診断および／または治療においてそのような抗体を使用する方法に関する。グロボＨに特異的に結合することにより、本発明の抗体は、様々な上皮癌を含む、グロボＨを過剰発現する癌を診断および／または治療するために使用され得る。
【０００７】
本発明の一態様は、ヒト化抗グロボＨ抗体に関する。本発明の一実施形態によれば、ヒト化抗グロボＨ抗体、またはそのｓｃＦｖもしくはＦａｂフラグメントは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３からなる３つの相補性領域を有する重鎖可変ドメイン、ならびにＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３からなる３つの相補性領域を有する軽鎖可変ドメインを含み、ＨＣＤＲ１の配列はＧＹＩＳＳＤＱＩＬＮ（配列番号４）であり、ＨＣＤＲ２の配列はＲＩＹＰＶＴＧＶＴＱＹＸＨＫＦＶＧ（配列番号５、Ｘは任意のアミノ酸である）であり、ＨＣＤＲ３の配列はＧＥＴＦＤＳ（配列番号６）であり、ＬＣＤＲ１の配列はＫＳＮＱＮＬＬＸ’ＳＧＮＲＲＹＺＬＶ（配列番号７、Ｘ’はＦ、ＹまたはＷであり、ＺはＣ、Ｇ、ＳまたはＴである）であり、ＬＣＤＲ２の配列はＷＡＳＤＲＳＦ（配列番号８）であり、ＬＣＤＲ３の配列はＱＱＨＬＤＩＰＹＴ（配列番号９）である。
【０００８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号５のＸはアスパラギンまたはグルタミンである。本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号７のＸ’はトリプトファンである。本発明のいくつかの実施形態によれば、配列番号７のＺはセリンまたはトレオニンである。
【０００９】
本発明の一態様は、癌を診断、または予防、および／または治療するための方法に関する。本発明の一実施形態による方法は、有効量の抗グロボＨ抗体を、それを必要とする被験体に投与することを含む。有効量は、望ましい治療結果を達成することができる量である。当業者は、有効量が患者の年齢、性別、体重、状態などに基づいて異なり得ることを認識するであろう。そのような有効量は、患者および状態に基づいて常套的に決定される。当業者は、過度の実験なしに有効量を決定することができるであろう。癌は、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、または前立腺癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、グロボＨに対する抗体のクローンを得るための方法を説明するフローチャートを示す。
【００１１】
【図２】図２は、マウス抗グロボＨ抗体、キメラ抗グロボＨ抗体、およびヒト化抗グロボＨ抗体の模式図を示す。
【００１２】
【図３】図３は、キメラ抗グロボＨ抗体の結合曲線を示し、サブナノモルの結合定数を有する高い結合親和性を例証する。
【００１３】
【図４】図４は、コンピュータモデリングで使用される抗グロボＨ抗体の可変ドメインのモデルを示す。
【００１４】
【図５】図５は、フローサイトメトリを使用した、ＭＣＦ７に結合する様々な抗グロボＨ抗体の結果を示す。
【００１５】
【図６】図６は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＲ５０の様々なアミノ酸置換の結果を示す。この結果は、他の任意のアミノ酸によるこのＲ５０の置換が抗グロボＨ抗体の結合親和性を著しく低下させることを示しており、このＲ５０が抗原抗体相互作用に必須であることを示す。
【００１６】
【図７Ａ】図７Ａは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）におけるＷ２７の様々なアミノ酸置換の結果を示す。結果は、他の芳香族アミノ酸によるこのＷ２７の置換が抗体親和性のわずかな低下をもたらすことを示す。しかし、非芳香族アミノ酸による置換は、抗グロボＨ抗体の結合親和性を著しく低下させる。
【００１７】
【図７Ｂ】図７Ｂは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）におけるＮ５５の様々なアミノ酸置換の結果を示す。結果は、他の多くのアミノ酸によるこのＮ５５の置換がこの部位で許容されることを示す。様々なアミノ酸置換の中で、グルタミン（Ｑ）置換は実際により強固な抗体を産生した。
【００１８】
【図８Ａ】図８Ａは、様々な抗グロボＨ抗体（ＧＢＨ）：マウスＧＢＨ（Ｍ）、ヒト化ＧＢＨ（Ｈ）、復帰突然変異ヒト化ＧＢＨ（Ｂ１）、さらに精製されたＧＢＨ（Ｒｅ２）、およびＧＢＨ（Ｂ１１）のＶＨセグメントのフレームワーク領域の一次配列アライメントを示す。
【００１９】
【図８Ｂ】図８Ｂは、様々な抗グロボＨ抗体（ＧＢＨ）：マウスＧＢＨ（Ｍ）、ヒト化ＧＢＨ（Ｈ）、復帰突然変異ヒト化ＧＢＨ（Ｂ１）、さらに精製されたＧＢＨ（Ｒｅ２）、およびＧＢＨ（Ｂ１３）のＶＬセグメントのフレームワーク領域の一次配列アライメントを示す。
【００２０】
【図９Ａ】図９Ａは、ＣＤＲ領域におけるアラニンスキャニングおよび様々なアミノ酸置換からの結果に基づくコンセンサスクローンＧＢＨ（Ｃ）のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤ３の配列を示す。ＨＣＤＲ２の重要でない残基Ｘにグルタミン（Ｑ）を含む例示的なクローンＧＢＨ（Ｂ１１）も示されている。
【００２１】
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＣＤＲ領域におけるアラニンスキャニングおよび様々なアミノ酸置換からの結果に基づくコンセンサスクローンＧＢＨ（Ｃ）のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３の配列を示す。ＬＣＤＲ１の芳香族残基Ｘにトリプトファン（Ｗ）および柔軟な残基Ｚにトレオニン（Ｔ）を含む例示的なクローンＧＢＨ（Ｂ１３）も示されている。
【００２２】
【図１０】図１０は、抗グロボＨ抗体による、グロボＨを発現する乳癌細胞の認識を示す。パネルＡ〜Ｃは、ＭＣＦ７細胞の抗体認識の免疫蛍光画像を示す。パネルＡ’〜Ｃ’は、光学顕微鏡で可視化した細胞の対応する画像を示す。
【００２３】
【図１１】図１１（Ａ）〜１１（Ｇ）はＦＡＣＳの結果を示しており、抗グロボＨ抗体によって検出された様々な癌細胞でのグロボＨの発現を示す。図１１（Ａ）は、ＭＣＦ７乳癌細胞がＨｅｒ２抗原（上のパネル）およびグロボＨ抗原（下のパネル）の両方を発現することを示す。図１１（Ｂ）は、ＨＣＣ１４２８肝細胞癌細胞がＨｅｒ２抗原（上のパネル）およびグロボＨ抗原（下のパネル）の両方を発現することを示す。図１１（Ｃ）は、ＢＴ４７４乳癌細胞がＨｅｒ２（上のパネル）を発現するが、グロボＨ（下のパネル）を発現しないことを示す。同様に、図１１（Ｄ）は、Ｃａｐａｎ−１膵臓癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｅ）は、Ａ−４３１扁平上皮癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｇ）は、ＨＴ−２９結腸直腸癌細胞が低レベルのグロボＨを発現することを示す。
【００２４】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、抗グロボＨ抗体によって媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の結果を示す。図１２Ａは、ＭＣＦ７細胞の結果を示す。図１２Ｂは、ＨＣＣ１４２８細胞の結果を示す。図１２Ｃは、ＢＴ４７４細胞の結果を示す。図１２Ｄは、Ｃａｐａｎ−１の結果を示す。図１２Ｅは、ＮＣＩ‐Ｎ８７の結果を示す。図１２Ｆは、Ａ４３１の結果を示す。これらの結果は、抗グロボＨ抗体によって媒介されるＡＤＣＣにはグロボＨの発現が必要であることを示す。
【００２５】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｅは、抗グロボＨ抗体によって媒介される補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の結果を示す。図１３Ａは、ＭＣＦ７細胞の結果を示す。図１３Ｂは、ＨＣＣ１４２８細胞の結果を示す。図１３Ｃは、ＢＴ４７４細胞の結果を示す。図１３Ｄは、Ｃａｐａｎ−１細胞の結果を示す。図１３Ｅは、ＮＣＩ‐Ｎ８７の結果を示す。これらの結果は、抗グロボＨ抗体によって媒介されるＣＤＣにはグロボＨの発現が必要であることを示す。
【００２６】
【図１４】図１４は、合成グリカンによる抗グロボＨ抗体媒介性細胞傷害の阻害の結果を示す。結果は、グロボＨが用量依存的に抗グロボＨ抗体と競合し、抗グロボＨ抗体媒介性細胞傷害を阻害することができるのに対し、ルイスｂ四糖は競合および阻害ができないことを示す。この特異的競合は、抗グロボＨ媒介性細胞傷害が、細胞表面に発現されたグロボＨへの結合によるものであることを示す。
【００２７】
【図１５】図１５は、ヒト化抗グロボＨ抗体が予言的モデルにおいて腫瘍成長を用量依存的に阻害できることを示す。
【００２８】
【図１６】図１６は、ヒト化抗グロボＨ抗体が治療モデルにおいて腫瘍成長を用量依存的に阻害できることを示す。
【００２９】
【図１７】図１７は、様々な抗グロボＨ抗体のＧＢＨ軽鎖可変ドメインの配列（配列番号１、配列番号２、および配列番号３）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上特に必要とされない限り、単数形の用語には複数形が含まれ、複数形の用語には単数形が含まれる。一般に、記載されている細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されている。
【００３１】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えばエレクトロポレーション、リポフェクション）には標準的な技術が使用される。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に行われるように、または本明細書に記載されているように実施される。上記の技術および手順は、一般に当技術分野で周知の従来の方法に従って、ならびに本明細書全体にわたって引用され、論じられる様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されているように実施される。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００１））参照。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗体」という用語は、複数の供給源（例えば種）からの配列を含む抗体を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト抗体の最小部分が、他の点ではヒト抗体である抗体に導入されている抗体を指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ヒト抗体」という用語は、タンパク質の実質的にすべての部分がヒトにおいて実質的に非免疫原性であり、わずかな配列変化または変異のみを有する抗体を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「抗原結合フラグメント」という用語は、抗原に結合する能力を保持する抗体の断片を指す。そのような抗原結合フラグメントには、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２などが含まれ得る。
【００３６】
「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，ＮＩＨ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）およびそれ以降の版によって定義されるように、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の超可変領域を示すことが意図されている。抗体は、典型的には３つの重鎖ＣＤＲと３つの軽鎖ＣＤＲを含む。ＣＤＲ（１つまたは複数）という用語は、場合によって、それが認識する抗原またはエピトープへの結合に関与するアミノ酸残基の大部分を含むこれらの領域の１つまたいくつかまたはさらに全体を示すために本明細書で使用される。
【００３７】
本明細書で言及される「ＣＤＲのセット」という用語は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。したがって、ＨＣＤＲのセットはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指し（ＨＣＤＲは重鎖ＣＤＲを指す）、ＬＣＤＲのセットはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を指す（ＬＣＤＲは軽鎖ＣＤＲを指す）。特に明記されない限り、「ＣＤＲのセット」はＨＣＤＲおよび／またはＬＣＤＲを含み得る。
【００３８】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的または完全な同一性がある場合、「相同」である。例えば、８５％の相同性は、２つの配列を最大一致のために整列した場合、８５％のアミノ酸が同一であることを意味する。一致を最大化する際にギャップ（一致する２つの配列のいずれかにおける）が許容され、５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。２つのオーソロガス配列内に異なる相同性の領域が存在し得ることが認識されるべきである。例えば、マウスおよびヒトのオーソログの機能性領域は、非機能性領域よりも高度の相同性を有し得る。
【００３９】
抗原結合部位は一般に、可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）免疫グロブリンドメインによって形成され、抗原結合界面は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される６つの表面ポリペプチドループによって形成される。各ＶＨ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）および各ＶＬ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）には、フレームワーク領域（ＦＲ）と共に３つのＣＤＲが存在する。
【００４０】
ＶＨドメインとＶＬドメインからなる抗体抗原結合部位は、典型的にはポリペプチドの６つのループ：軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）からの３つと重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からの３つによって形成される。公知の原子構造の抗体の分析は、抗体結合部位の配列と三次元構造との関係を解明することができる。
【００４１】
配列と構造の関係の研究は、公知の配列を有するが三次元構造が不明である抗体の残基を予測するために使用でき、これらの残基はＣＤＲループの三次元構造を維持するのに重要であり、したがって結合特異性を維持する。構造的アプローチでは、ＷＡＭなどの自由に使用できるかまたは市販のパッケージを使用して抗体分子のモデルを作成することができる。次いで、Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）またはＤｅｅｐ  Ｖｉｅｗなどのタンパク質可視化および分析ソフトウェアパッケージを使用して、ＣＤＲの各位置で可能な置換を評価し得る。次に、この情報を使用して、活性に対して最小限の作用または有益な作用を及ぼす可能性が高い置換を行い得る。
【００４２】
ＣＤＲおよび抗体ＶＨまたはＶＬドメインの配列内でアミノ酸置換を行うための技術は当技術分野で利用可能である。
【００４３】
詳細な説明
本発明の実施形態は、抗グロボＨ抗体ならびに癌の診断および治療におけるそれらの使用に関する。本発明の実施は、細胞生物学、細胞培養、抗体技術、および遺伝子工学の従来の技術を含む技術を使用し、これらは当技術分野の通常の技術の範囲内である。
【００４４】
以下の例は、ヒト化抗グロボＨ抗体の開発ならびに癌の診断および治療におけるそれらの使用を説明する。当業者は、これらの例が説明のみのためであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを認識するであろう。
【００４５】
上記のように、グロボＨは六糖であり、乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、および前立腺癌細胞を含む上皮癌細胞の表面で過剰発現される。グロボＨに対する抗体は、そのような癌の治療と診断に有用であることが示されている。患者に使用するために、抗体は、望ましくない免疫学的応答がないなどの、副作用が最小限であるかまたは副作用を全く有さないべきである。本発明の実施形態は、ヒト化抗グロボＨ抗体に関する。これらのヒト化抗体は、良好な結合効率を有し、望ましくない免疫学的応答が全くないかまたは最小限である。
【００４６】
本発明の実施形態によれば、ヒト化抗グロボＨ抗体を生成するための一般的な方法は、グロボＨに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得ること、ハイブリドーマからＣＤＲ配列を得ること、およびＣＤＲ配列をヒトフレームワーク配列にクローニングしてヒト化抗体を作製することを含む。ヒト化抗体は、例えばフレームワーク領域の配列および／またはＣＤＲ配列を改善するためにさらに最適化し得る。図１は、ヒト化抗グロボＨ抗体を得るための本発明の一実施形態による方法を概説するフローチャートを示す。
【００４７】
様々な手順のための方法が当技術分野で公知である。以下の特定の例は、例示的な実施形態を説明する。しかしながら、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく修正または変形が可能であることを認識するであろう。
【００４８】
抗グロボＨ抗体のＶ領域の分子クローニング
最初に、抗グロボＨのハイブリドーマ（例えばマウスＧＢＨハイブリドーマ）を生成した。そのようなハイブリドーマは、モノクローナル抗体の作製のための標準的なプロトコルで生成され得る。次いで、例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を使用して、ハイブリドーマの全ＲＮＡを単離した。次に、例えば一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）とオリゴ（ｄＴ２０）プライマーまたはＩｇ−３’定常領域プライマーを使用して、ｃＤＮＡを全ＲＮＡから合成した。
【００４９】
次いで、免疫グロブリン遺伝子の重鎖および軽鎖可変領域をｃＤＮＡからクローニングした。例えば、抗グロボＨ  ｍＡｂのＶＨおよびＶＬ可変領域を、マウスＩｇ−５’プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、ＰＣＲによってマウスＧＢＨハイブリドーマｃＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ産物は、ＣｌｏｎｅＪｅｔ（商標）ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔｓ）を使用して適切なベクター（例えばｐＪＥＴ１．２ベクター）に直接クローニングし得る。ｐＪＥＴ１．２ベクターには致死的な挿入が含まれており、所望の遺伝子がこの致死領域にクローニングされた場合にのみ選択条件を生き残る。これは、組換えコロニーの選択を容易にする。最後に、組換えコロニーを所望のクローンについてスクリーニングし、それらのクローンのＤＮＡを単離して配列決定した。免疫グロブリン（ＩＧ）ヌクレオチド配列は、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（ＩＧＭＴ）ウェブサイトで分析し得る。
【００５０】
抗体の発現および精製
抗体作製のために、単離したクローンを任意の適切な細胞で発現させ得る。一例として、Ｆ２９３細胞（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に抗グロボＨ  ｍＡｂ発現プラスミドをトランスフェクトし、７日間培養した。プロテインＡアフィニティカラム（ＧＥ）を使用して抗グロボＨ抗体を培地から精製した。タンパク質濃度は、当技術分野で公知の手順を使用して、または製造者の指示に従って、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイキットで測定し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し得る。
【００５１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
抗体親和性は、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅなどの当技術分野で公知の任意の適切な方法で評価し得る。例えば、炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．５）で希釈したグロボＨ−ＮＨ２（Ｏｌｉｇｏｔｅｃｈ）を９６ウェルプレートに４℃で一晩被覆した。ブロッキング（例えばＢＳＡを用いて）後、２倍連続希釈した抗グロボＨ抗体をウェルに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。結合後、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（１：１５０００）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用して発色させ、１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４の添加によって反応を停止させた。抗原抗体結合の程度は、プレートを読み取ることによって、すなわちＥＬＩＳＡリーダ（ＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｄｅｌ６８０）を使用して４５０〜６５５ｎｍでの吸光度を測定することによって決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアなどの適切なソフトウェアを使用してデータを分析し得る。
【００５２】
抗グロボＨ抗体のヒト化
本発明の実施形態は、抗グロボＨ抗体のヒト化に関する。図２は、キメラ抗体およびヒト化抗体の概略図を示す。キメラ抗体は、異なる供給源（例えば異なる種）からの可変領域と定常領域を有するものである。例えば、上記の手順からクローニングしたマウス抗グロボＨ抗体の可変領域をヒト抗体の定常領域に移植して、キメラ抗体を生成し得る。
【００５３】
図３は、本発明の一実施形態によるキメラ抗体の結合アッセイを示す。結合アッセイは、上記のようにＥＬＩＳＡで実施した。この結合曲線から、このキメラ抗体の結合定数は１．０ｎＭより良好であると推定でき、予想されるように抗体の可変ドメインをヒト抗体の定常ドメインに移植しても結合を損なわないことを示す。
【００５４】
図２を参照すると、ヒト化抗体は、１つの種からのＣＤＲと、ヒト免疫グロブリンからのフレームワーク領域および定常領域とを含む。ヒト化抗体を生成するための例示的な工程は以下の通りであり得る。
【００５５】
１）ヒトＶ領域フレームワークの選択。
マウスからの上記のクローニングした可変領域のフレームワーク領域と最も高い相同性を有するヒト免疫グロブリンからのフレームワークをＩＭＧＴデータベースから選択した。相同性比較に基づき、ＶＨ３サブグループの重鎖のフレームワークおよびＶｋ１サブグループの軽鎖のフレームワークを、それぞれ、ヒト化抗グロボＨ  ｍＡｂ（ＧＢＨ）のために選択した。
【００５６】
２）ＣＤＲ移植した抗グロボＨ抗体の構築。
６つの完全なマウスＣＤＲ配列を有するヒトフレームワーク（ＶＬκサブグループＩおよびＶＨサブグループＩＩＩ）をＰＣＲによって構築し、次いで抗体発現ベクターにサブクローニングした。当技術分野で公知の任意の適切なベクターを使用し得る。これによってハイブリッド可変領域（ＶＨおよびＶＬ）が生成される。
【００５７】
３）復帰突然変異。
フレームワークへのＣＤＲの移植は、異なる供給源からの可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）をもたらす。そのような異種ドメインは、最適な配列を有さない場合がある。したがって、抗体の親和性は最良でない場合がある。結合親和性を改善するために、一部のアミノ酸を他の種に復帰突然変異させ得る。
【００５８】
図４に示すように、抗体結合に影響を及ぼし得る重要なアミノ酸残基をコンピュータモデリングによって分析し得る。モデリングは、上部コア領域と界面領域を（例えば５Å領域内で）検討し得る。モデリングでは、成功事例に基づいて事前の知識も適用し得る。モデリングに基づき、例えばアミノ酸残基を元の種の対応するアミノ酸残基で置き換えるために、アミノ酸置換を実施し得る（すなわち復帰突然変異）。次に、改善された抗体を選択するために変異抗体を結合について評価し得る。
【００５９】
したがって、クローンＧＢＨ（Ｂ１）は初回の復帰突然変異から選択した。クローンＧＢＨ（Ｒｅ１）およびＧＢＨ（Ｒｅ２）は、Ｂ１クローンに基づいて、以下の追加の考慮事項を伴うさらなる突然変異から生成した：（ｉ）Ｆｖ  βバレルのほとんどの構造的に保存された鎖を回避する；（ｉｉ）比較的高い表面アクセス可能性（例えば３０％を超える）によってリサーフェシング部位（マウスアミノ酸）をランク付けする；および（ｉｉｉ）一般的に報告されている危険部位のフレームワークを分類する。
【００６０】
図５に示すように、キメラ抗体（ｃＧＢＨ）はＭＣＦ７細胞に良好に結合する。しかし、ヒト化はこの結合を有意に低下させる（ＧＢＨ（ＨＨ）を参照）。初回の復帰突然変異後、ＧＢＨ（Ｂ１）は抗体のほとんどの結合活性を回復した。さらなる変異、ＧＢＨ（Ｒｅ１Ｒｅ２）およびＧＢＨ（ｒｅ２Ｒｅ２）は、結合親和性を有意に改善した。これらの変異体の軽鎖および重鎖可変ドメインの配列を図８Ａおよび８Ｂに示す。
【００６１】
４）重要なアミノ酸残基のＣＤＲ親和性の最適化およびアラニンスキャニング。
フレームワーク領域における上記の復帰突然変異に加えて、ＣＤＲ配列を最適化することによって抗体親和性をさらに改善し得る。グロボＨ抗原とＧＢＨ（Ｒｅ２Ｒｅ２）抗体のコンピュータモデリングおよびコンピュータドッキングに基づき、部位特異的突然変異誘発によって選択的ＣＤＲ変異クローンを生成した。変異クローンの結合親和性は、ＥＬＩＳＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ、またはＦｏｒｔｅＢｉｏなどの任意の適切な方法で分析し得る。
【００６２】
表１は、ＧＢＨ（Ｒｅ２Ｒｅ２）を出発抗体として使用したアラニンスキャニング結果の例を示す。これらの結果は、４つの部位（ＣＤＲＨ１のＩ３３、ＣＤＲＨ２のＲ５０、ＣＤＲＨ３のＥ９６、およびＣＤＲＬ１のＷ２７）でのアラニン置換が抗体親和性の著しい低下をもたらすことを示しており、これら４つの残基が抗体結合に重要であることを示す。一方で、他の部位（例えばＣＤＲＨ２のＮ５８、ＣＤＲＬ１のＮ２８、ＣＤＲＬ１のＤ９３、およびＣＤＲＬ３のＩ９４）でのアラニン置換は抗体結合に有意の影響を及ぼさず、これらの残基が抗原抗体相互作用に重要ではないことを示す。
【表１】
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【００６３】
上記のアラニンスキャニングからの重要な残基をさらに試験して、これらの重要な残基の重要性を確認することができる。図６に示すように、ＣＤＲＨ２のＲ５０は重要な残基であり、他のアミノ酸による置換は結合を本質的に無効にした。
【００６４】
一方で、アラニンスキャニングによるいくつかの明らかに重要な残基は、類似のアミノ酸を許容し得る。例えば、図７Ａに示すように、ＬＣＤＲ１のＷ２７（図９Ｂ参照）は結合に重要であるが、他の芳香族アミノ酸残基（ＹおよびＦ）による置換は十分に許容され、しかし、この部位の他のアミノ酸置換は抗体結合を本質的に無効にした。これらの結果は、芳香族側鎖を有するアミノ酸残基がこの位置にある限り、抗体結合活性が実質的に保持されることを示す。
【００６５】
一方、アラニンスキャニング結果から重要ではないアミノ酸は、さらに最適化され得る。例えば、残基５８（図９ＡにおけるＧＢＨ（Ｃ）のＨＣＤＲ２のＸ’として示される）は重要ではなく、多くのアミノ酸がこの位置で十分に許容される（図７Ｂ）。中でも、グルタミン（Ｑ）は最も高い結合活性を与える。同様に、ＬＣＤＲ１のＺとして示される残基３２（図９Ｂ）は、類似の極性を有するいくつかのアミノ酸を許容できる。例示的な抗体ＧＢＨ（Ｂ１３）では、このＺはトレオニンである（図９Ｂ）。
【００６６】
他のアミノ酸（すなわちアラニン以外）での置換が結合の改善をもたらすかどうかを調べるために、ＣＤＲの他の残基も検討した。表２に示すように、ＱによるＮ５８の置換（クローン名：ＶＨＢ１１）だけが結合のわずかな改善をもたらした。重要な残基の他のすべてのアミノ酸置換は、結合の喪失または減少をもたらした。
【表２】
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【００６７】
図８Ａは、マウスクローン（Ｍ）（配列番号１０）、ヒト化クローン（Ｈ）（配列番号１１）、復帰突然変異クローン（Ｂ１）（配列番号１２）、反復復帰突然変異クローン（Ｒｅ２）（配列番号１３）、およびＶＨＢ１１クローン（Ｂ１１）（配列番号１４）の重鎖可変ドメインのフレームワーク領域の配列アラインメントを示す。図８Ｂは、マウスクローン（Ｍ）（配列番号１５）、ヒト化クローン（Ｈ）（配列番号１６）、復帰突然変異クローン（Ｂ１）（配列番号１７）、反復復帰突然変異クローン（Ｒｅ２）（配列番号１８）、およびＶＨＢ１１クローン（Ｂ１１）（配列番号１９）の軽鎖可変ドメインのフレームワーク領域の配列アラインメントを示す。
【００６８】
ＣＤＲＬ１では、残基３２は結合に重要ではない。いくつかの残基、Ｃ、Ｓ、Ｇ、およびＴは許容される。一例として、この位置にＴを有するクローンＢ１３を図９Ｂに示す。
【００６９】
図９Ａは、コンセンサスクローンＧＢＨ（Ｃ）（配列番号２０）および例示的なクローンＧＢＨ（Ｂ１３）（配列番号２１）の重鎖可変ドメインの配列を示す。図９Ｂは、コンセンサスクローンＧＢＨ（Ｃ）（配列番号２２）および例示的なクローンＧＢＨ（Ｂ１３）（配列番号２３）の軽鎖可変ドメインの配列を示す。
【００７０】
親和性測定アッセイ−ＦｏｒｔｅＢｉｏ
抗グロボＨ抗体の親和性を評価するために、グロボＨ−アミンを製造者の指示に従ってアミン反応性バイオセンサに固定化した。すべての測定は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ９６を使用して３０°Ｃで実施した。親和性結合曲線の適合は、Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアが提供する所定のモデル（１：１結合）を使用して実施した。
【００７１】
表３は、いくつかの例のＦｏｒｔｅＢｉｏアッセイの結果を示す。
【表３】
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【００７２】
本発明の抗体は、例えばグロボＨを発現する癌の診断において、グロボＨを発現する細胞を可視化するために使用し得る。例として、細胞表面（例えばＭＣＦ７細胞）で発現されるグロボＨに結合した抗グロボＨ抗体を可視化するために、ＭＣＦ７細胞をスライドガラス（ＮＵＮＣ）上で培養し、次に４％パラホルムアルデヒドで固定した。ＰＢＳで洗浄した後、細胞を抗グロボＨ抗体で染色し、続いてヤギ抗ヒトＦＩＴＣ抗体（１：１０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。一次抗体を含まない細胞を対照として含めた。試料を載せたスライドガラスを蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ）によるＦＩＴＣ蛍光画像および明視野画像によって検査した。
【００７３】
図１０は、抗グロボＨ抗体によるＭＣＦ７細胞の免疫染色の結果を示す。パネルＡ〜Ｃは、抗グロボＨ  Ａｂを用いたＭＣＦ７細胞の蛍光イメージングを示し、パネルＡ’〜Ｃ’は同じ細胞の暗視野（ＢＦ）イメージングを示す。これらの結果は、本発明の抗体が実際に細胞表面のグロボＨに結合できることを示す。
【００７４】
親和性測定アッセイ−Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）
抗体親和性は、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａＣｏｒｅ（商標）を用いて評価し得る。ＢｉａＣｏｒｅ（商標）アッセイでは、製造者の指示に従って標準的なアミン化学を使用して、グロボＨ−アミンをＢｉａｃｏｒｅ（商標）ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）に固定化した。抗グロボＨ抗体の独立した連続希釈液をマイクロプレート上で調製した。各試料を、例えば２つのフローセル：１つは対照細胞および他の１つはグロボＨを固定化した細胞に５０μＬ／分の流量で、２．５分間注入した。注入の終了時に結合速度を測定した。各試料の後に、１０ｍＭグリシンｐＨ  ２．５／１．５（ｖ／ｖ＝１）を３０μＬ／分の流量で４５秒間注入することによってチップを再生した。すべての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００機器を使用して２５．０°Ｃの一定温度で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ（商標））中で行った。親和性結合曲線の適合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェア２．０が提供する所定のモデル（１：１結合）を使用して実施した。
【００７５】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
抗グロボＨ抗体は、例えばＦＡＣＳを用いて、細胞表面でグロボＨを発現する細胞を検出するために、またはグロボＨを発現する細胞を選別するために使用し得る。グロボＨを発現する細胞、ＭＣＦ７またはＨＣＣ１４２８を採取し、５％ＰＢＳ／ＦＢＳ緩衝液に再懸濁した。細胞（１ｘ１０５）を抗グロボＨ抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはハーセプチン（１０μｇ／ｍｌ、陰性対照）と共に４℃で１時間インキュベートし、次にヤギ抗ヒトＩｇＧ  ＦＩＴＣコンジュゲート（１／１０００）を用いて４℃で１時間染色した。各アッセイについて、２つの追加対照を調製した；１つは一次抗体なしおよび他の１つは全く抗体なしの対照であった。処理したすべての試料をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析し、結果をＦＡＣＳｕｉｔｅソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって処理した。
【００７６】
ＦＡＣＳに基づき、様々な癌細胞を、それらがグロボＨを発現するかどうかを調べるために評価し得る。図１１（Ａ）〜１１（Ｇ）は、抗グロボＨ抗体とＦＡＣＳを使用した様々な細胞株からのグロボＨ検出の結果を示す。図１１（Ａ）は、ＭＣＦ７乳癌細胞がＨｅｒ２抗原（上のパネル）およびグロボＨ抗原（下のパネル）の両方を発現することを示す。図１１（Ｂ）は、ＨＣＣ１４２８肝細胞癌細胞がＨｅｒ２抗原（上のパネル）およびグロボＨ抗原（下のパネル）の両方を発現することを示す。図１１（Ｃ）は、ＢＴ４７４乳癌細胞がＨｅｒ２（上のパネル）を発現するが、グロボＨ（下のパネル）を発現しないことを示す。同様に、図１１（Ｄ）は、Ｃａｐａｎ−１膵臓癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｅ）は、Ａ−４３１扁平上皮癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｆ）は、ＮＣＩ−Ｎ８７胃癌細胞がグロボＨを発現することを示す。図１１（Ｇ）は、ＨＴ−２９結腸直腸癌細胞が低レベルのグロボＨを発現することを示す。これらの結果は、様々な癌の診断における抗グロボＨ抗体の有用性を実証する。
【００７７】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。本発明のヒト化抗グロボＨ抗体は、グロボＨを発現する癌を治療するための有望な治療薬である。抗グロボＨ抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、精製ヒトＮＫ細胞を抗体処理したヒト乳癌細胞（例えばＨＣＣ１４２８、ＭＣＦ７、Ｃａｐａｎ−１、ＮＣＩ−Ｎ８７、Ａ４３１、またはＢＴ４７４細胞）と共に５：１のＥ／Ｔ比で３時間インキュベートした。ＡＤＣＣアッセイのために、抗ＩＬ２０抗体を陰性対照として使用し、ハーセプチン（Ｒｏｃｈｅ）を陽性対照として使用した。ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＴＤＡ放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計（ＣＬＡＲＩＯ、ＢＧＭ）で測定した。
【００７８】
図１２Ａ〜１２Ｆは、抗グロボＨ抗体がＭＣＦ７（図１２Ａ）、ＨＣＣ１４２８（図１２Ｂ）、Ｃａｐａｎ−１（図１２Ｄ）、ＮＣＩ−Ｎ８７（図１２Ｅ）、およびＡ４３１（図１２Ｆ）癌細胞を含む様々な癌細胞でＡＤＣＣを誘導できることを示す。しかし、抗グロボＨ抗体は、ＢＴ４７４細胞（図１２Ｃ）が表面にグロボＨを発現しないという観察と一致して、ＢＴ４７４細胞ではＡＤＣＣを誘導することができなかった。これらの結果は、抗グロボＨ抗体によって誘導されるＡＤＣＣが細胞表面でのグロボＨの発現に依存することを裏付け、抗グロボＨ抗体がグロボＨを発現する癌細胞の死滅を誘導するのに有効であることを確認する。
【００７９】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
ＡＤＣＣと同様に、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、抗体に基づく癌治療において重要な役割を果たす。ＣＤＣの誘導における本発明の抗グロボＨ抗体の能力を評価するために、以下の実験を実施した。これらの試験では、ＨＣＣ１４２８、ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、Ｃａｐａｎ−１、またはＮＣＩ−Ｎ８７細胞を含む抗体処理したヒト癌細胞に４０％の正常ヒト血清（ＮＨＳ）（ｖ：ｖ）を３時間添加した。抗ＩＬ２０抗体とハーセプチンの両方をＣＤＣアッセイの陰性対照として使用した。ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＴＤＡ放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計（ＣＬＡＲＩＯ、ＢＧＭ）で測定した。
【００８０】
図１３Ａ〜１３Ｅは、抗グロボＨ抗体がＭＣＦ７細胞（図１３Ａ）、ＨＣＣ１４２８細胞（図１３Ｂ）、Ｃａｐａｎ−１細胞（図１３Ｄ）、およびＮＣＩ−Ｎ８７（図１３Ｅ）細胞においてＣＤＣを誘導できることを示す。しかし、抗グロボＨ抗体は、ＢＴ４７４細胞ではＣＤＣを誘導することができなかった。これらの結果は、ＭＣＦ７、Ｃａｐａｎ−１、ＮＣＩ−Ｎ８７、およびＨＣＣ１４２８細胞が表面にグロボＨを発現するのに対し、ＢＴ４７４７細胞は発現しないという事実と一致する。これらの結果は、抗グロボＨ抗体がＣＤＣを誘導できること、および抗グロボＨ抗体によって誘導されるＣＤＣが細胞表面でのグロボＨの発現に依存することを確認する。
【００８１】
グロボＨ競合アッセイ
抗グロボＨ抗体によって誘導される細胞傷害がグロボＨ依存性であることを確認するために、グロボＨ競合を実施することができる。１μＭの抗グロボＨ抗体を、様々な濃度の合成グロボＨまたはルイスｂ四糖（Ｓｉｇｍａ）のいずれかと共に３７℃で１時間プレインキュベートした。ルイスｂ四糖を陰性対照として使用した。４０％のＮＨＳ（ｖ：ｖ）を抗グロボＨ抗体−グリカン混合物に添加し、次いでヒト乳癌細胞株ＭＣＦ７と共に３時間インキュベートした。ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でＴＤＡ放出を用いて細胞死の割合を測定した。蛍光は、時間分解蛍光計（ＣＬＡＲＩＯ、ＢＧＭ）で測定した。
【００８２】
図１４は、抗グロボＨによって誘導される細胞傷害が用量依存的にグロボＨ（フコース−ガラクトース−Ｎ−Ａｃ−ガラクトサミン−ガラクトース−ガラクトース−グルコース）と競合することができるが、ルイスｂ四糖（フコース−ガラクトース−Ｎ−Ａｃ−グルコサミン−フコース）とは競合できないことを示す。これらの結果は、抗グロボＨ抗体によって誘導される細胞傷害がグロボＨ依存性であることをさらに確認する。
【００８３】
異種移植動物モデル
抗グロボＨがグロボＨ発現細胞のＡＤＣＣおよびＣＤＣを誘導できるという事実は、これらの抗体が表面にグロボＨを発現する癌を予防および／または治療するのに有用であることを示す。
【００８４】
癌の予防および／または治療における抗グロボＨ抗体の能力を評価するために、体重２０〜２４ｇ（６〜７週齢）の５匹の雌性（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの群を使用する。生存可能なヒト乳癌ＨＣＣ１４２８細胞（主催者によって提供された、マトリゲル０．２ｍｌ中１ｘ１０７）をヌードマウスの背側に皮下注射する。Ｅｓｔｏｌ−Ｄｅｐｏｔ（１００μｇ／マウス）を、細胞移植の１週間前から開始して週２回、７週間にわたってサプリメントとして皮下注射する。試験試薬（抗グロボＨ抗体、タキソール、またはビヒクル）を、細胞移植の２時間後（予防モデル）または７日後（治療モデル）から静脈内投与する。体重と腫瘍サイズを週２回、最大６０日間記録する。腫瘍重量（ｍｍ３）は、長楕円体の式：長さ（ｍｍ）ｘ［幅（ｍｍ）］２ｘ０．５に従って推定する。試験化合物で処置した動物の腫瘍成長は、Ｔ／Ｃ（治療／対照）ｘ１００％として計算する；Ｔ／Ｃ  ４２％の値は、抗腫瘍活性を示すうえで有意と見なされる。
【００８５】
図１５は、予防モデルにおいて、抗グロボＨ抗体が用量依存的に腫瘍の成長を防ぐことができたことを示す。１０ｍｇ／Ｋｇ（ｍｐｋ）の用量では、抗体はタキソールと同程度に有効であり、３０ｍｐｋでは、抗体は癌の成長を防ぐうえでタキソールよりも有効であった。
【００８６】
図１６は、治療モデルにおいて、抗グロボＨ抗体が用量依存的に腫瘍成長を抑制することができたことを示す。１０ｍｇ／Ｋｇ（ｍｐｋ）の用量では、抗体はタキソールと同程度に有効であり、２０ｍｐｋおよび３０ｍｐｋでは、抗体は癌の成長を防ぐうえでタキソールよりも有効であった。
【００８７】
これらのインビボモデルからの結果は、ヒト化抗グロボＨ抗体がグロボＨを発現する癌、例えば乳癌、大腸癌、卵巣癌、膵臓癌、肺癌、肝臓癌、および前立腺癌を含む様々な上皮癌の予防および治療に使用できることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020521752.tif 000012
【図８Ａ】
2020521752.tif 000013
【図８Ｂ】
2020521752.tif 000014
【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
2020521752.tif 000028
【図１３−２】
2020521752.tif 000029
【図１３−３】
2020521752.tif 000030
【図１４】
2020521752.tif 000031
【図１５】
2020521752.tif 000032
【図１６】
2020521752.tif 000033
【図１７】
2020521752.tif 000034
【配列表】
2020521752000001.app
【国際調査報告】
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2020521752.tif 000036
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