(57)【要約】  BCMA、NKG2D受容体、及びCD16と結合する多重特異性結合性タンパク質、ならびにがんの治療に有用な医薬組成物及び治療方法が記載される。【選択図】図１
2020507328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のもの：
(a)  NKG2Dに結合する第一の抗原結合部位；
(b)  BCMAに結合する第二の抗原結合部位；及び
(c)  CD16に結合するのに十分な抗体Fcドメインもしくはその部分、又はCD16に結合する第三の抗原結合部位
を含むタンパク質。
【請求項２】
前記第一の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、及びげっ歯類のNKG2Dに結合する、請求項1記載のタンパク質。
【請求項３】
前記第一の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項1又は2記載のタンパク質。
【請求項４】
前記重鎖可変ドメイン及び前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチドに存在する、請求項3記載のタンパク質。
【請求項５】
前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項3〜4のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチドに存在する、請求項5記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第一の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項5又は6記載のタンパク質。
【請求項８】
前記第一の抗原結合部位が、配列番号1と少なくとも90％同一の重鎖可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第一の抗原結合部位が、配列番号41と少なくとも90％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号42と少なくとも90％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記第一の抗原結合部位が、配列番号43と少なくとも90％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号44と少なくとも90％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第一の抗原結合部位が、配列番号45と少なくとも90％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号46と少なくとも90％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記第一の抗原結合部位が、配列番号47と少なくとも90％同一の重鎖可変ドメイン及び配列番号48と少なくとも90％同一の軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第一の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項1又は2記載のタンパク質。
【請求項１４】
前記単一ドメイン抗体が、VHHフラグメント又はVNARフラグメントである、請求項13記載のタンパク質。
【請求項１５】
前記第二の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを含む、請求項1〜2又は13〜14のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチドに存在する、請求項15記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号49と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号53又は配列番号54と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、
配列番号50のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR1配列；
配列番号51のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR2配列；及び
配列番号52のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜17のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、
配列番号55のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR1配列；
配列番号56のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR2配列；及び
配列番号57又は配列番号57のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項18記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号59と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号60と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、
配列番号79のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR1配列；
配列番号80のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR2配列；及び
配列番号81のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜16又は20のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、
配列番号82のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR1配列；
配列番号83のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR2配列；及び
配列番号84のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項21記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、配列番号61と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、配列番号62と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインが、
配列番号85のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR1配列；
配列番号86のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR2配列；及び
配列番号87のアミノ酸配列と同一の重鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項1〜16又は23のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインが、
配列番号88のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR1配列；
配列番号89のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR2配列；及び
配列番号90のアミノ酸配列と同一の軽鎖CDR3配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項24のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記第二の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項1〜4又は8〜14のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２７】
前記第二の抗原結合部位が、VHHフラグメント又はVNARフラグメントである、請求項26記載のタンパク質。
【請求項２８】
前記タンパク質が、CD16に結合するのに十分な抗体Fcドメインの部分を含み、前記抗体Fcドメインが、ヒンジ及びCH2ドメインを含む、請求項1〜27のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項２９】
前記抗体Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のヒンジ及びCH2ドメインを含む、請求項28記載のタンパク質。
【請求項３０】
前記Fcドメインが、ヒトIgG1抗体のアミノ酸234〜332と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む、請求項28又は29記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記Fcドメインが、ヒトIgG1のFcドメインと少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含み、Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439からなる群から選択される1以上の位置で相違する、請求項28〜30のいずれか1項記載のタンパク質。
【請求項３２】
請求項1〜31のいずれか1項記載のタンパク質及び医薬として許容し得る担体を含む、製剤。
【請求項３３】
請求項1〜31のいずれか1項記載のタンパク質を発現する1以上の核酸を含む、細胞。
【請求項３４】
直接的に及び／又は間接的に腫瘍細胞死を増強する方法であって、腫瘍及びナチュラルキラー細胞を、請求項1〜31のいずれか1項記載のタンパク質に曝露することを含む、方法。
【請求項３５】
がんを治療する方法であって、請求項1〜31のいずれか1項記載のタンパク質又は請求項32記載の製剤を患者に投与することを含む、方法。
【請求項３６】
前記がんが、多発性骨髄腫、急性骨髄単球性白血病、T細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及び濾胞性リンパ腫からなる群から選択される、請求項35記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
この出願は、2017年2月10日に出願された米国仮出願第62/457,780号の恩典及び優先権を主張するものであり、その内容の全体が、あらゆる目的のために本明細書中に参照により組み込まれる。
【０００２】
（配列表）
この出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されている、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる配列表を含有する。該ASCIIコピーは、2018年2月8日に作成され、DFY-003PC_SL.txtと名付けられ、かつ91,310バイトのサイズである。
【０００３】
（本発明の分野）
本発明は、B細胞成熟抗原(BCMA)、NKG2D受容体、及びCD16に結合する多重特異性結合性タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
（背景）
がんは、この疾患を治療するための文献に報告された多大な研究努力及び科学の前進にもかかわらず、重要な健康問題であり続けている。血液及び骨髄がんは、頻繁に診断されるがんタイプであり、多発性骨髄腫、白血病、及びリンパ腫を含む。これらのがんのための現在の治療選択肢は、全ての患者について有効ではなく、かつ／又は実質的な不利な副作用を有し得る。他のタイプのがんもまた、既存の治療選択肢を使用して治療するのが困難なままである。
【０００５】
がん免疫療法は、高度に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので、望ましい。二重特異性T細胞エンゲージャー（engagers）のような融合タンパク質は、腫瘍細胞及びT細胞に結合して腫瘍細胞の破壊を促進する、文献に記載されたがん免疫療法である。ある腫瘍関連抗原及びある免疫細胞に結合する抗体は、文献に記載されている。たとえば国際公開番号WO 2016/134371及びWO 2015/095412を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー(NK)細胞は、自然免疫系のコンポーネントであり、循環するリンパ球のおよそ15％を構成する。NK細胞は、事実上全ての組織に浸潤し、当初は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞を有効に殺す能力によって特徴付けされた。活性化されたNK細胞は、細胞傷害性T細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリン及びグランザイムを含有する細胞溶解性顆粒を介して、ならびにデス受容体経路を介して、標的細胞を殺す。活性化されたNK細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を増進するケモカイン及びIFN-γのような炎症性サイトカインを分泌する。
【０００７】
NK細胞は、その表面の多様な活性化及び阻害性受容体を通じたシグナルに応答する。たとえば、NK細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR)の活性化を通じて阻害される。あるいは、NK細胞が外来細胞又はがん細胞に遭遇すると、それらは、活性化受容体(たとえば、NKG2D、NCR、DNAM1)を通じて活性化される。NK細胞は、その表面のCD16受容体を通じていくつかの免疫グロブリンの定常領域によっても活性化される。活性化に対するNK細胞の全体的な感受性は、刺激性シグナル及び阻害性シグナルの総和に依存する。
【０００８】
BCMAは、TNF受容体スーパーファミリーに属する膜貫通タンパク質である。それは腫瘍壊死因子(リガンド)スーパーファミリー、メンバー13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)に特異的に結合し、NF-κB及びMAPK8/JNK活性化をもたらす。その発現は、B細胞分化系列に限定され、B細胞発生及び自己免疫応答に重要であることが示されている。BCMAはまた、種々のTRAFファミリーメンバーにも結合し、したがって、細胞生存及び増殖のためのシグナルを伝達する可能性がある。BCMAは、多発性骨髄腫、リンパ腫及び白血病のような多様ながんと結び付けられている。本発明は、BCMA発現がんのための治療を改良するためのある利点を提供する。
【発明の概要】
【０００９】
（概要）
本発明は、がん細胞上のBCMA、及びナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体に結合する多重特異性結合性タンパク質を提供する。このようなタンパク質は、2種類以上のNK活性化受容体をエンゲージすることができ、NKG2Dへの天然リガンドの結合を遮断し得る。ある実施態様において、このタンパク質は、ヒトにおいて、及びげっ歯類及びカニクイザルのような他の種において、NK細胞を刺激することができる。本発明の種々の態様及び実施態様は、以下においてさらに詳細に記載される。
【００１０】
したがって、本発明の一つの態様は、NKG2Dと結合する第一の抗原結合部位；BCMAに結合する第二の抗原結合部位；及び抗体Fcドメイン、CD16を結合するのに十分なその部分、又はCD16と結合する第三の抗原結合部位、を組み込んだタンパク質を提供する。これらの抗原結合部位は、各々、抗体重鎖可変ドメイン及び抗体軽鎖可変ドメイン(たとえば抗体内におけるとおりにアレンジされているか、又は一緒にscFvになるよう融合されている)を組み込んでいてもよく、又は、1以上の抗原結合部位は、ラクダ科の抗体のようなVHH抗体、もしくは軟骨魚類に見られるもののようなVNAR抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。
【００１１】
NKG2Dに結合する第一の抗原結合部位には、一つの実施態様において、たとえば、配列番号1と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有することによって、及び／又は配列番号1のCDR1(配列番号64)、CDR2(配列番号65)、及びCDR3(配列番号66)配列と同一であるアミノ酸配列を組み込むことによって、配列番号1に関連する重鎖可変ドメインを組み込むことができる。あるいは、第一の抗原結合部位には、配列番号41に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号42に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号41と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号41のCDR1(配列番号67)、CDR2(配列番号68)、及びCDR3(配列番号69)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号42と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号42のCDR1(配列番号70)、CDR2(配列番号71)、及びCDR3(配列番号72)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。他の実施態様において、第一の抗原結合部位には、配列番号43に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号44に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第一の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号43と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号43のCDR1(配列番号73)、CDR2(配列番号74)、及びCDR3(配列番号75)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号44と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号44のCDR1(配列番号76)、CDR2(配列番号77)、及びCDR3(配列番号78)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
【００１２】
あるいは、第一の抗原結合部位は、たとえば、配列番号45及び配列番号46とそれぞれ少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一のアミノ酸配列を有することによって、配列番号45に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号46に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。別の実施態様において、第一の抗原結合部位は、たとえば、配列番号47及び配列番号48とそれぞれ少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であるアミノ酸配列を有することによって、配列番号47に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号48に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。
【００１３】
第二の抗原結合部位には、場合によっては、配列番号49に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号53もしくは配列番号54に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号49と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号49のCDR1(配列番号50)、CDR2(配列番号51)、及びCDR3(配列番号52)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号53と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号53のCDR1(配列番号55)、CDR2(配列番号56)、及びCDR3(配列番号57)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。あるいは、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号54と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号54のCDR1(配列番号55)、CDR2(配列番号56)、及びCDR3(配列番号58)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
【００１４】
あるいは、第二の抗原結合部位には、配列番号59に関連する重鎖可変ドメイン及び配列番号60に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号59と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号59のCDR1(配列番号79)、CDR2(配列番号80)、及びCDR3(配列番号81)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号60と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号60のCDR1(配列番号82)、CDR2(配列番号83)、及びCDR3(配列番号84)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
【００１５】
別の実施態様において、第二の抗原結合部位には、配列番号61に関連する重鎖可変ドメイン、及び配列番号62に関連する軽鎖可変ドメインを組み込むことができる。たとえば、第二の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号61と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号61のCDR1(配列番号85)、CDR2(配列番号86)、及びCDR3(配列番号87)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。同様に、第二の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号62と少なくとも90％、少なくとも95％、又は100％同一であることができ、及び／又は配列番号62のCDR1(配列番号88)、CDR2(配列番号89)、及びCDR3(配列番号90)配列と同一のアミノ酸配列を組み込むことができる。
【００１６】
いくつかの実施態様において、第二の抗原結合部位には、第一の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込む。
【００１７】
いくつかの実施態様において、タンパク質は、CD16を結合するのに十分な抗体Fcドメインの部分を組み込まれ、ここで、この抗体Fcドメインは、ヒンジ及びCH2ドメイン、及び／又はヒトIgG抗体のアミノ酸配列234〜332と少なくとも90％同一のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
これらのタンパク質のうちの1つを含有する製剤；これらのタンパク質を発現する1以上の核酸を含有する細胞、及びこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法もまた提供される。
【００１９】
本発明の別の態様は、患者においてがんを治療する方法を提供する。この方法は、本明細書において記載される多重特異性結合性タンパク質の治療的有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む。多重特異性結合性タンパク質を使用する治療のための例示的ながんとしては、たとえば、多発性骨髄腫、急性骨髄単球性白血病、T細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及び濾胞性リンパ腫が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
（図面の簡単な説明）
【図１】図1は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の表現である。NKG2D結合ドメイン(右アーム):腫瘍抗原結合ドメイン(左アーム)。共通である軽鎖は、図面において同じシェード又はパターンで表される。
【００２１】
【図２】図2は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の表現である。NKG2D結合ドメインscFv(右アーム);腫瘍抗原結合ドメイン(左アーム)。
【００２２】
【図３】図3は、IgG様の形を維持する三官能性の二重特異性抗体である、Triomab形態のTriNKETの表現である。このキメラは、二つの親抗体から由来する、各々が一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する二つの半抗体からなる。Triomab形態は、ラット抗体の1/2及びマウス抗体の1/2を含有するヘテロ二量体の構築物であってもよい。
【００２３】
【図４】図4は、ノブ・イントゥー・ホール（knobs-into-holes）(KIH)技術を包含する、KiH共通軽鎖（Common Light Chain）(LC)形態のTriNKETの表現である。KiHは、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcを含有するヘテロ二量体である。KiHフォーマットのTriNKETは、二つの異なる重鎖及び両重鎖と対形成する共通の軽鎖を含有する、標的1及び標的2に結合する二つのfabを有するヘテロ二量体の構築物であってもよい。
【００２４】
【図５】図5は、可動性の天然リンカーを介して二つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価IgG様分子を生じる、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig（商標）)形態のTriNKETの表現である。DVD-Ig（商標）は、ホモ二量体の構築物であり、ここで、抗原2を標的とする可変ドメインが抗原1を標的とするFabの可変ドメインのN末端に融合されている。構築物は通常のFcを含有する。
【００２５】
【図６】図6は、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つのFabを含有するヘテロ二量体の構築物である、直交性Fabインターフェイス(Ortho-Fab)形態のTriNKETの表現である。LC-HC対形成は、直交性インターフェイスによって確保される。ヘテロ二量体化は、Fc内の突然変異によって確保される。
【００２６】
【図７】図7は、2-イン-1 IgフォーマットのTrinKETの表現である。
【００２７】
【図８】図8は、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つの異なるFabを含有するヘテロ二量体の構築物である、ES形態のTriNKETの表現である。ヘテロ二量体化は、Fc内の静電ステアリング突然変異によって確保される。
【００２８】
【図９】図9は、Fab Arm Exchange形態のTriNKET：重鎖及び付属する軽鎖(半分子)を別の分子由来の重鎖-軽鎖対と取り換えることによってFabアームを交換し、二重特異性抗体をもたらす抗体の表現である。Fab Arm Exchange形態(cFae)は、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcを含有するヘテロ二量体である。
【００２９】
【図１０】図10は、標的1及び2に結合する二つのFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcを含有するヘテロ二量体である、SEED Body形態のTriNKETの表現である。
【００３０】
【図１１】図11は、ロイシンジッパーが二つの異なるHCのヘテロ二量体化を誘導するために使用される、LuZ-Y形態のTriNKETの表現である。LuZ-Y形態は、Fcに融合された標的1及び2に結合する二つの異なるscFabを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、FcのC末端に融合されたロイシンジッパーモチーフを通じて確保される。
【００３１】
【図１２】図12は、Cov-X-Body形態のTriNKETの表現である。
【００３２】
【図１３】図13A〜13Bは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されるFcに融合された二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である、κλ-Body形態のTriNKETの表現である：抗原1を標的とするFab1はカッパLCを含有し、一方、抗原2を標的とする第二のFabはラムダLCを含有する。図13Aは、κλ-Bodyの一つの形態の例示的表現であり；図13Bは、別のκλ-Bodyの例示的表現である。
【００３３】
【図１４】図14は、ELISAアッセイにおけるヒト組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００３４】
【図１５】図15は、ELISAアッセイにおけるカニクイザル組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００３５】
【図１６】図16は、ELISAアッセイにおけるマウス組換えNKG2Dに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００３６】
【図１７】図17は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度(MFI)の倍数を示すフローサイトメトリーによる、ヒトNKG2Dを発現するEL4細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合を実証する棒グラフである。
【００３７】
【図１８】図18は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度(MFI)の倍数を示すフローサイトメトリーによる、マウスNKG2Dを発現するEL4細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の結合を実証する棒グラフである。
【００３８】
【図１９】図19は、天然リガンドULBP-6との競合による組換えヒトNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００３９】
【図２０】図20は、天然リガンドMICAとの競合による組換えヒトNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００４０】
【図２１】図21は、天然リガンドRae-1デルタとの競合による組換えマウスNKG2D-Fcに対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の特異的結合親和性を実証する折れ線グラフである。
【００４１】
【図２２】図22は、ヒトNKG2D-CD3ゼータ融合タンパク質を発現するTNF-α陽性細胞のパーセンテージを定量することによる、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNKG2Dの活性化を示す棒グラフである。
【００４２】
【図２３】図23は、マウスNKG2D-CD3ゼータ融合タンパク質を発現するTNF-α陽性細胞のパーセンテージを定量することによる、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNKG2Dの活性化を示す棒グラフである。
【００４３】
【図２４】図24は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４４】
【図２５】図25は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるヒトNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４５】
【図２６】図26は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４６】
【図２７】図27は、NKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)によるマウスNK細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００４７】
【図２８】図28は、腫瘍細胞に対するNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の細胞傷害性効果を示す棒グラフである。
【００４８】
【図２９】図29は、示差走査型蛍光定量法によって測定されたNKG2D結合ドメイン(クローンとして掲載されている)の融解温度を示す棒グラフである。
【００４９】
【図３０】図30は、EL4細胞で発現されたNKG2Dに対するBCMA標的化TriNKETの結合プロフィールを示す折れ線グラフである。
【００５０】
【図３１】図31は、MM.1Sヒト骨髄腫細胞で発現されたBCMAに対するBCMA標的化TriNKETの結合プロフィールを示す折れ線グラフである。
【００５１】
【図３２】図32は、BCMA陽性MM.1Sヒト骨髄腫細胞との培養におけるヒトNK活性化を示す棒グラフである。
【００５２】
【図３３】図33は、異なるNKG2D結合ドメインを有するBCMAを標的とするTriNKETがKMS12-PE骨髄腫細胞のヒトNK細胞による溶解を増強することを示す折れ線グラフである。
【００５３】
【図３４】図34A〜34Cは、CD16及びNKG2Dを使用するNK細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図34Aは、CD107aのレベルを実証する；図34Bは、IFNγのレベルを実証する；図34Cは、CD107a及びIFNγのレベルを実証する。グラフは、平均(n＝2)±SDを示す。データは、5人の異なる健常ドナーを使用する5回の独立した実験の代表である。
【００５４】
【図３５】図35は、標的1に結合するFab及びFcに融合された標的2に結合するscFabを含むOasc-Fabヘテロ二量体の構築物である。ヘテロ二量体化は、Fc内の突然変異によって確保される。
【００５５】
【図３６】図36は、DuetMabであり、これは抗原1及び2に結合する二つの異なるFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcを含有するヘテロ二量体の構築物である。Fab1及び2は、正しい軽鎖(LC)及び重鎖(HC)対形成を確保する差次的S-S架橋を含有する。
【００５６】
【図３７】図37は、CrossmAbであり、これはヘテロ二量体化によって安定化されたFcに融合された標的1及び2に結合する二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である。CL及びCH1ドメイン、及びVH及びVLドメインが切り替えられる、たとえばCH1が一線でVLと融合され、一方、CLが一線でVHと融合される。
【００５７】
【図３８】図38は、Fit-Igであり、これは抗原2に結合するFabが抗原1に結合するFabのHCのN末端に融合されているホモ二量体の構築物である。この構築物は、野生型Fcを含有する。
【００５８】
【図３９】図39は、TriNKETがKMS12-PE骨髄腫細胞のヒトNK細胞による溶解を増強することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
（詳細な説明）
本発明は、がん細胞上のBCMAとナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体とに結合してナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合性タンパク質、そのような多重特異性結合性タンパク質を含む医薬組成物、及び、がんの治療のためのものを含む、そのような多重特異性タンパク質及び医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の種々の態様は、以下において節に分けて説明される；しかし、一つの特定の節において記載される本発明の態様は、いかなる特定の節にも限定されるべきではない。
【００６０】
本発明の理解を促進するために、多数の用語及び語句を以下において定義する。
【００６１】
本明細書において使用される「一つの」（「a」及び「an」）という用語は、「1以上」（「one or more」）を意味し、文脈上不適切でない限り複数を含む。
【００６２】
本明細書において使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、免疫グロブリン分子の抗原結合に参加する部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重(「H」)鎖及び軽(「L」)鎖のN末端可変(「V」)領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖及び軽鎖のV領域内の三つの高度に多岐にわたるストレッチは、「超可変領域」と呼ばれ、「フレームワーク領域」又は「FR」として知られる、より保存された隣接ストレッチ間に挟まれている。そのため、「FR」という用語は、免疫グロブリンにおいて超可変領域の間及び隣に天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の三つの超可変領域及び重鎖の三つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間で互いに関して配置される。この抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖及び軽鎖の各々の三つの超可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」と呼ばれる。ラクダ及び軟骨魚類のような、ある動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクト抗体、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合フラグメント、又は、単一ポリペプチドにおいて軽鎖可変ドメインに重鎖可変ドメインを接続するためのペプチドリンカーを使用する、scFvのような組換えポリペプチドの中に存在することができる。
【００６３】
本明細書において使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、タンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、がんと関連する任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞上で、あるいは腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、又は免疫浸潤のような腫瘍微小環境において、発現されることができる。
【００６４】
本明細書において使用される場合、「被験者」及び「患者」という用語は、本明細書において記載される方法及び組成物によって治療されるべき生物を指す。このような生物は、好ましくは哺乳類(たとえばマウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、など)を含み、より好ましくはヒトを含むが、これらに限定されない。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「有効量」という用語は、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な、化合物(たとえば本発明の化合物)の量を指す。有効量は、1回以上の投与、適用、又は投薬で投与することができ、特定の製剤又は投与経路に限定されることを意図しない。本明細書において使用される場合、「治療する」（treating）という用語は、状態、疾患、障害などの改善、又はその症状の寛解をもたらす、たとえば緩和、低減、調節、寛解、又は排除のような、任意の効果を含む。
【００６６】
本明細書において使用される場合、「医薬組成物」という用語は、インビボ又はエクスビボでの診断又は治療用途のためにその組成物を特に好適にする不活性又は活性の担体と、活性剤との組み合わせを指す。
【００６７】
本明細書において使用される場合、「医薬として許容し得る担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、乳濁液(たとえば油／水、又は水／油乳濁液など)、及び種々のタイプの湿潤剤のような、任意の標準的製薬担体を指す。この組成物はまた、安定剤及び保存料をも含むことができる。担体、安定剤及びアジュバントの例については、たとえばMartinの「レミントンの製剤科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences）、15版、Mack Publ. Co., Easton, PA  (1975)を参照されたい。
【００６８】
本明細書において使用される場合、「医薬として許容し得る塩」という用語は、被験者への投与の際、本発明の化合物、又はその活性代謝産物もしくは残基を提供することができる、本発明の化合物の任意の医薬として許容し得る塩(たとえば酸又は塩基)を指す。当業者には公知のように、本発明の化合物の「塩」は、無機又は有機酸、及び塩基から誘導されてもよい。例示的な酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン-p-スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。シュウ酸のような他の酸は、それら自体は医薬として許容し得るものではないものの、本発明の化合物及びその医薬として許容し得る酸付加塩を入手することにおける中間体として有用な塩の調製において利用してもよい。
【００６９】
例示的な塩基としては、アルカリ金属(たとえばナトリウム)水酸化物、アルカリ土類金属(たとえばマグネシウム)水酸化物、アンモニア、及び式NW4+(式中、WはC1〜4アルキルである)の化合物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
例示的な塩としては、以下のもの：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、樟脳スルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸（flucoheptanoate）、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩（hydroiodide）、2-ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩（palmoate）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバレート、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、ウンデカン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。塩の他の例としては、Na+、NH4+、及びNW4+(式中、WはC1〜4アルキル基である)のような好適なカチオンと複合した本発明の化合物のアニオンなどが挙げられる。
【００７１】
治療用途のためには、本発明の化合物の塩は、医薬として許容し得るように企図される。しかし、医薬として許容し得ない酸及び塩基の塩もまた、たとえば、医薬として許容し得る化合物の調製又は精製において、用途を見出し得る。
【００７２】
記載全体を通じて、組成物が具体的コンポーネントを有する、含有する、又は含むとして記載されている場合、又はプロセス及び方法が具体的工程を有する、含有する、又は含むとして記載されている場合、付加的に、指定されたそのコンポーネントから本質的になる、又は指定されたそのコンポーネントからなる、本発明の組成物があること、及び指定されたそのプロセス工程から本質的になる、又は指定されたそのプロセス工程からなる、本発明のプロセス又は方法があることが企図される。
【００７３】
一般的な問題として、パーセンテージを特定する組成物は、別途特記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴っていない場合は、その変数の先の定義が支配する。
【００７４】
I.  タンパク質
本発明は、がん細胞上のBCMAと、ナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体とに結合して、ナチュラルキラー細胞を活性化する多重特異性結合性タンパク質を提供する。この多重特異性結合性タンパク質は、本明細書において記載される医薬組成物及び治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞上のNKG2D受容体及びCD16受容体に対する多重特異性結合性タンパク質の結合は、がん細胞の破壊に向けてナチュラルキラー細胞の活性を増強する。がん細胞上のBCMAに対する多重特異性結合性タンパク質の結合は、がん細胞をナチュラルキラー細胞の近傍に運び、それがナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接又は間接の破壊を促進する。さらに、例示的な多重特異性結合性タンパク質の説明を以下に提供する。
【００７５】
多重特異性結合性タンパク質の第一のコンポーネントは、NK細胞、γδT細胞及びCD8+αβT細胞を含むことができるがこれらに限定されない、NKG2D受容体を発現する細胞に結合する。NKG2D結合に際して、多重特異性結合性タンパク質は、ULBP6及びMICAのような天然リガンドを、NKG2Dへの結合から遮断し得る。
【００７６】
多重特異性結合性タンパク質の第二のコンポーネントは、多発性骨髄腫、急性骨髄単球性白血病、T細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及び濾胞性リンパ腫を含むことができるがこれらに限定されない、BCMAを発現する細胞に結合する。
【００７７】
多重特異性結合性タンパク質の第三のコンポーネントは、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、及び濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面上のFc受容体であるCD16を発現する細胞に結合する。
【００７８】
多重特異性結合性タンパク質は、以下の実施例に示されているがそれらに限定されないいくつかのフォーマットをとることができる。一つのフォーマットは、第一の免疫グロブリン重鎖、第二の免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体である。第一の免疫グロブリン重鎖は、第一のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメイン、第一の可変重鎖ドメイン、及び場合によっては第一のCH1重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む；第一の免疫グロブリン重鎖と共に、免疫グロブリン軽鎖は、NKG2Dと結合する抗原結合部位を形成する。第二の免疫グロブリン重鎖は、第二のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメイン、第二の可変重鎖ドメイン、及び第一の免疫グロブリン重鎖と対形成するものと同一の免疫グロブリン軽鎖と対を形成し得る、第二のCH1重鎖ドメインを含み、但し、免疫グロブリン軽鎖が第二の免疫グロブリン重鎖と対形成する場合には、生じる抗原結合部位はBCMAに結合する。第一のFcドメイン及び第二のFcドメインは、一緒にCD16に結合することができる(図1)。
【００７９】
別の例示的フォーマットは、第一の免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖、及び第二の免疫グロブリン重鎖を含むヘテロ二量体の多重特異性抗体を包含する。第一の免疫グロブリン重鎖は、リンカー又は抗体ヒンジを介してNKG2Dと結合する単鎖Fv(scFv)に融合された第一のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメインを含む。多種多様なリンカーを、scFvを第一のFcドメインに又はscFv自身の内部で連結するために使用し得る。それに加えて、scFvは、ジスルフィド結合の形成を可能にし、scFv構造全体を安定化する突然変異を組み込むことができる。scFvはまた、第一の免疫グロブリン重鎖全体の等電点を変化させる、及び／又は下流の精製をよりたやすくすることができる、突然変異をも組み込むことができる。第二の免疫グロブリン重鎖は、第二のFc(ヒンジ-CH2-CH3)ドメイン、及び第二の可変重鎖ドメイン、及び場合によって含まれる第二のCH1重鎖ドメインを含む。免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン及び定常軽鎖ドメインを含む。第二の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対形成し、BCMAに結合する。第一のFcドメイン及び第二のFcドメインは、一緒にCD16に結合することができる(図2)。
【００８０】
一つ以上の付加的な結合モチーフは、場合によってはリンカー配列を介して、定常領域CH3ドメインのC末端に融合されてもよい。ある実施態様において、抗原結合部位は、単鎖又はジスルフィド安定化可変領域(scFv)であり得、又は四価もしくは三価分子を形成し得る。
【００８１】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Triomab形態であり、これはIgG様の形を維持する三官能性の二重特異性抗体である。このキメラは、二つの親抗体から由来する、各々が一つの軽鎖及び一つの重鎖を有する二つの半抗体からなる。
【００８２】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、KiH共通軽鎖（Common Light Chain）(LC)形態であり、これはノブ・イントゥー・ホール（knobs-into-holes）(KIH)技術を包含する。KIHは、ヘテロ二量体化を増進するためにCH3ドメインを改造して「ノブ」又は「ホール」のいずれかを各重鎖に創出することを包含する。「ノブ・イントゥー・ホール(KiH)」Fc技術の背景コンセプトは、小さい残基を嵩高い残基で置換することにより(すなわち、EU付番におけるT366WCH3A)、一つのCH3ドメイン(CH3A)中に「ノブ」を導入することであった。この「ノブ」を収容するために、ノブの最も近くに隣接する残基をより小さい残基で置き換えることにより(すなわち、T366S/L368A/Y407VCH3B)、他のCH3ドメイン(CH3B)上に相補的な「ホール」表面が創出された。「ホール」突然変異は、構造先導型（structured-guided）ファージライブラリースクリーニング(Atwell S, Ridgway JB,Wells JA, Carter Pの文献、「ファージディスプレイライブラリーを使用するホモ二量体のドメインインターフェイスのリモデリングからの安定なヘテロ二量体」(Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library)、J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35))によって最適化された。KiH Fc変異体のX線結晶構造（Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess Cらの文献、「ノブ・アンド・ホールアグリコシル化半抗体ホモ二量体の逆平行コンフォメーションはCH2-CH3疎水性相互作用によって媒介される」（Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction）、J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57； Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori Kの文献、「FcγRsに対して改良された親和性を有する非対称に改造された新規なFc変異体の結晶構造」（Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs)、Mol Immunol (2014) 58(1):132-8)）により、ヘテロ二量体化がCH3ドメイン間のコアインターフェイスでの立体的相補性によって駆動された疎水性相互作用によって熱力学的に好まれるのに対し、ノブ−ノブ及びホール−ホールのインターフェースはそれぞれ立体障害及び好ましい相互作用の崩壊のためにホモ二量体化を好まないことが、実証された。
【００８３】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、デュアル可変ドメイン免疫グロブリン(DVD-Ig（商標）)形態にあり、これは、可動性の天然リンカーを介して二つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせて、四価のIgG様分子を生じるものである。
【００８４】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、直交性Fabインターフェイス(Ortho-Fab)形態にある。ortho-Fab IgGアプローチ(Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HLらの文献、「直交性Fabインターフェイスの構造ベースの設計による二重特異性IgG抗体の生成」（Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface）、Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8)において、構造ベースの領域設計は、一方のFabのみのLC及びHCVH-CH1インターフェイスで、他方のFabに何らの変化も起こさずに相補的突然変異を導入する。
【００８５】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、2-イン-1 Igフォーマットにある。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、ES形態にあり、これは、Fcに融合された標的1及び標的2に結合する二つの異なるFabを含有するヘテロ二量体の構築物である。ヘテロ二量体化は、Fcにおける静電ステアリング突然変異によって確保される。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、κλ-Body形態にあり、これは、ヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcに融合された二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である：抗原1を標的とするFab1はカッパLCを含有し、一方、抗原2を標的とする第二のFabはラムダLCを含有する。図13Aは、κλ-Bodyの一形態の例示的表現であり；図13Bは別のκλ-Bodyの例示的表現である。
【００８６】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fabアーム交換(Fab Arm Exchange)形態(重鎖及び付属する軽鎖(半分子)を別の分子由来の重鎖-軽鎖対と取り換えることによってFabアームを交換し、それが二重特異性抗体をもたらす抗体)にある。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、SEED Body形態にある。ストランド交換改造ドメイン(SEED)プラットフォームは、非対称の二重特異性抗体様分子、自然抗体の治療的適用を拡張する能力を生成するために設計された。このタンパク質改造プラットフォームは、保存されたCH3ドメイン内で免疫グロブリンの構造的に関連する配列を交換することに基づいている。SEED設計は、AG/GAヘテロ二量体の効率的生成を可能にし、一方、AG及びGA SEED CH3ドメインのホモ二量体化を避ける(Muda M.らの文献、Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54))。いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、LuZ-Y形態にあり、この中では、二つの異なるHCのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーが使用される(Wranik, BJ.らの文献、J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9)。
【００８７】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Cov-X-Body形態にある。二重特異性CovX-Bodyにおいて、二つの異なるペプチドは、分岐型アゼチジノンリンカーを使用して一緒にされ、穏やかな条件下で部位特異的な方式で足場抗体に融合される。ファルマコフォアは機能的活性の原因であり、一方、抗体足場は、長い半減期及びIg様分布を授ける。ファルマコフォアは、化学的に最適化することができ、又は他のファルマコフォアと置き換えて、最適化された又は独自の二重特異性抗体を生成することができる(Doppalapudi VRらの文献、PNAS (2010), 107(52);22611-22616)。
【００８８】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fcに融合された標的1に結合するFab及び標的2に結合するscFabを含有するOasc-Fabヘテロ二量体の形態にある。ヘテロ二量体化は、Fcにおける突然変異によって確保される。
【００８９】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、DuetMab形態にあり、これは抗原1及び2に結合する二つの異なるFab、及びヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたFcを含有するヘテロ二量体の構築物である。Fab 1及び2は、正しいLC及びHCの対形成を確保する差次的S-S架橋を含有する。
【００９０】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、CrossmAb形態にあり、これは、ヘテロ二量体化によって安定化されるFcに融合された、標的1及び2に結合する二つの異なるFabを有するヘテロ二量体の構築物である。CL及びCH1ドメイン、及びVH及びVLドメインは、切り替えられ、たとえばCH1は一線でVLと融合される一方、CLは一線でVHと融合される。
【００９１】
いくつかの実施態様において、多重特異性結合性タンパク質は、Fit-Ig形態にあり、これは、抗原2に結合するFabが抗原1に結合するFabのHCのN末端に融合されたホモ二量体の構築物である。この構築物は、野生型Fcを含有する。
【００９２】
表1は、組み合わせでNKG2Dに結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を掲載する。
【表１】
2020507328.tif 000003
2020507328.tif 000004
2020507328.tif 000005
2020507328.tif 000006
2020507328.tif 000007
2020507328.tif 000008
2020507328.tif 000009
【００９３】
あるいは、米国第9,273,136号に説明されているように、配列番号45によって定義される重鎖可変ドメインは、配列番号46によって定義される軽鎖可変ドメインと対形成させ、NKG2Dに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
【化１】
2020507328.tif 000010
【００９４】
あるいは、米国第7,879,985号に説明されているように、配列番号47によって定義される重鎖可変ドメインは、配列番号48によって定義される軽鎖可変ドメインと対形成させ、NKG2Dに結合することができる抗原結合部位を形成することができる。
【化２】
2020507328.tif 000011
【００９５】
表2は、組み合わせでBCMAに結合することができる重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのペプチド配列を掲載する。
【表２】
2020507328.tif 000012
2020507328.tif 000013
2020507328.tif 000014
【００９６】
あるいは、BCMAに結合することができる新規な抗原結合部位は、配列番号63によって定義されるアミノ酸配列に対する結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化３】
2020507328.tif 000015
【００９７】
Fcドメイン内において、CD16結合は、ヒンジ領域及びCH2ドメインによって媒介される。たとえば、ヒトIgG1内において、CD16との相互作用は、CH2ドメイン中のアミノ酸残基Asp 265 -  Glu 269、Asn 297 - Thr 299、Ala 327 - Ile 332、Leu 234 - Ser 239、及び炭水化物残基N-アセチル-D-グルコサミンに第一義的にフォーカスされる(Sondermannらの文献、Nature, 406 (6793):267-273を参照されたい)。公知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリー又は酵母表面ディスプレイcDNAライブラリーを使用することなどによって、CD16に対する結合親和性を増強又は低減するように選択することができ、又は、相互作用の公知の三次元構造に基づいて設計することができる。
【００９８】
ヘテロ二量体の抗体重鎖のアセンブリーは、同じ細胞において二つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、それは各抗体重鎖のホモ二量体のアセンブリーを、ヘテロ二量体のアセンブリーと同様にもたらし得る。ヘテロ二量体の優先的なアセンブリーを増進することは、米国第13/494870号、米国第16/028850号、米国第11/533709号、米国第12/875015号、米国第13/289934号、米国第14/773418号、米国第12/811207号、米国第13/866756号、米国第14/647480号、及び米国第14/830336号に示されるように、各抗体重鎖定常領域のCH3ドメインに異なる突然変異を組み込むことによって達成することができる。たとえば、突然変異は、ヒトIgG1に基づいて、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチド内にこれらの二つの鎖が相互に選択的にヘテロ二量体化することを可能にする別個の対のアミノ酸置換を組み込むことによってCH3ドメインに作製することができる。以下において説明されるアミノ酸置換の位置は、全てKabatにおけるようにEUインデックスに従って付番されている。
【００９９】
一つのシナリオにおいて、第一のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン(R)、フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)又はトリプトファン(W)から選択される、より大きいアミノ酸で置き換え、かつ、第二のポリペプチドにおける少なくとも一つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)、又はバリン(V)から選ばれる、より小さいアミノ酸で置き換え、このより大きいアミノ酸置換(突起物)がこのより小さいアミノ酸置換の表面(空洞)の中にフィットするようにする。たとえば、一つのポリペプチドにはT366W置換を組み込むことができ、他方にはT366S、L368A、及びY407Vを含む三つの置換を組み込むことができる。
【０１００】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、場合によっては、ヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含む、CH1ドメインを有する又は有さないIgG定常領域のような、抗体定常領域と少なくとも90％同一のアミノ酸配列にカップリングすることができる。いくつかの実施態様において、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトIgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域、又はIgG4定常領域のような、ヒト抗体定常領域と少なくとも90％同一である。いくつかの他の実施態様において、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、又はウマのような別の哺乳類由来の抗体定常領域と少なくとも90％同一である。１以上の突然変異は、ヒトIgG1定常領域と比較して定常領域の中に、たとえばQ347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及び／又はK439に、組み込むことができる。例示的な置換としては、たとえば、Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D、及びK439Eが挙げられる。
【０１０１】
ある実施態様において、ヒトIgG1定常領域のCH1に組み込むことができる突然変異は、アミノ酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171、及び／又はV173にあってもよい。ある実施態様において、ヒトIgG1定常領域のCκに組み込むことができる突然変異は、アミノ酸E123、F116、S176、V163、S174、及び／又はT164にあってもよい。
【０１０２】
アミノ酸置換は、表3に示される以下の置換のセットから選択し得る。
【表３】
2020507328.tif 000016
【０１０３】
あるいは、アミノ酸置換は、表4に示される以下の置換のセットから選択し得る。
【表４】
2020507328.tif 000017
【０１０４】
あるいは、アミノ酸置換は、表5に示される以下の置換のセットから選択し得る。
【表５】
2020507328.tif 000018
【０１０５】
あるいは、各ポリペプチド鎖における少なくとも一つのアミノ酸置換は、表6から選択し得る。
【表６】
2020507328.tif 000019
【０１０６】
あるいは、少なくとも一つのアミノ酸置換は、表7における以下の置換のセットから選択し得、ここで、第一のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の負に荷電したアミノ酸で置き換えられ、第二のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の正に荷電したアミノ酸で置き換えられる。
【表７】
2020507328.tif 000020
【０１０７】
あるいは、少なくとも一つのアミノ酸置換は、表8における以下のセットから選択し得、ここで、第一のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の正に荷電したアミノ酸で置き換えられ、第二のポリペプチドの縦列に示される位置は、任意の公知の負に荷電したアミノ酸で置き換えられる。
【表８】
2020507328.tif 000021
【０１０８】
あるいは、又はそれに加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第一の又は第二のポリペプチド鎖のいずれかにS354Cを、かつ、反対側のポリペプチド鎖にY349Cを、導入することによって増大してもよく、これは二つのポリペプチドのインターフェイス内に人為的なジスルフィド架橋を形成する。
【０１０９】
上で記載した多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えDNA技術を使用して作製することができる。たとえば、第一の免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸配列は、第一の発現ベクター中にクローニングすることができる；第二の免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列は、第二の発現ベクター中にクローニングすることができる；免疫グロブリン軽鎖をコードする第三の核酸配列は、第三の発現ベクター中にクローニングすることができる；第一、第二、及び第三の発現ベクターは、宿主細胞中に一緒に安定にトランスフェクトして、多量体タンパク質を産生させることができる。
【０１１０】
多重特異性タンパク質の最大の収率を達成するために、第一、第二、及び第三の発現ベクターの異なる比を探求して、宿主細胞中へのトランスフェクションのための最適比を決定することができる。トランスフェクション後、単一のクローンは、限界希釈法、ELISA、FACS、顕微鏡法、又はClonepixのような、当該分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単離することができる。
【０１１１】
クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養し、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、デプスろ過、細胞溶解、ホモジナイゼーション、凍結融解、親和性精製、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用交換クロマトグラフィ、及び混合モードクロマトグラフィを含む、当該分野において公知の方法を使用して、単離及び精製することができる。
【０１１２】
II．  TriNKETの特徴
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原のための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKETは、ヒトNKG2Dを発現する細胞に結合する。ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原のための結合ドメインを含むTriNKETは、同じ腫瘍関連抗原結合ドメインを有するモノクローナル抗体のレベルと匹敵するレベルで腫瘍関連抗原に結合する。
【０１１３】
本明細書において記載されるTriNKETは、腫瘍成長の低減及びがん細胞の殺傷により有効である。
【０１１４】
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原のための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKETは、その抗原を発現する腫瘍細胞と共に培養する場合、初代ヒトNK細胞を活性化する。NK細胞活性化は、CD107a脱顆粒及びIFNγサイトカイン産生の増大を特徴とする。さらに、腫瘍関連抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体と比較して、TriNKETは、その抗原を発現する腫瘍細胞の存在下でヒトNK細胞の優れた活性化を示す。たとえば、抗BCMAモノクローナル抗体と比較して、BCMA結合ドメインを有する本開示のTriNKETは、BCMA発現がん細胞の存在下でヒトNK細胞の優れた活性化を有する。
【０１１５】
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原のための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKETは、その抗原を発現する腫瘍細胞の存在下で休止及びIL-2活性化されたヒトNK細胞の活性を増強する。休止NK細胞は、IL-2活性化されたNK細胞よりも低いバックグラウンドIFNγ産生及びCD107a脱顆粒を示した。ある実施態様において、休止NK細胞は、IL-2活性化されたNK細胞と比較して、IFNγ産生及びCD107a脱顆粒のより大きい変化を示す。ある実施態様において、IL-2活性化されたNK細胞は、TriNKETでの刺激後に、より大きいパーセンテージのIFNγ+；CD107a+になる細胞を示す。
【０１１６】
ある実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍関連抗原BCMAのための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKETは、この抗原を発現する腫瘍細胞の存在下で、休止及びIL-2活性化されたヒトNK細胞の細胞傷害活性を増強する。さらに、腫瘍関連抗原BCMAのための結合ドメインを含むTriNKET(たとえばA40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET、及びF63-TriNKET)は、同じ腫瘍関連抗原結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、腫瘍細胞に対する活性化された及び休止NK細胞応答をより強力に方向付けする。ある実施態様において、TriNKETは、BCMA結合部位を含むモノクローナル抗体と比較して、中程度及び低度のBCMAを発現する腫瘍細胞に対して利点を与える。したがって、TriNKETを含む療法は、抗BCMAモノクローナル抗体療法よりも優れていることができる。
【０１１７】
ある実施態様において、モノクローナル抗体と比較して、腫瘍関連抗原BCMAのための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKET(たとえばA40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET、及びF63-TriNKET)は、高発現のFc受容体(FcR)を有するがん、又は高レベルのFcRを有する腫瘍微小環境にあるがんを治療することにおいて、有利である。モノクローナル抗体は、腫瘍成長に対するその効果を、中でも特にADCC、CDC、食作用、及びシグナル遮断を含む複数のメカニズムを通して発揮する。FcγRの中で、CD16は、IgG Fcに対して最も低い親和性を有する；FcγRI(CD64)は、高親和性FcRであり、これはCD16よりも約1000倍より強くIgG Fcと結合する。CD64は、通常、骨髄性分化系列のような多くの造血分化系列で発現され、急性骨髄性白血病(AML)のようなこれらの細胞タイプに由来する腫瘍上で発現されることができる。MDSC及び単球のような、腫瘍に浸潤する免疫細胞もまた、CD64を発現し、腫瘍微小環境に浸潤することが知られている。腫瘍による又は腫瘍微小環境におけるCD64の発現は、モノクローナル抗体療法に対して不利な影響を有することができる。抗体は高親和性受容体に好んで結合するので、腫瘍微小環境におけるCD64の発現は、これらの抗体がNK細胞の表面上のCD16にエンゲージすることを困難にする。TriNKETは、NK細胞の表面の二つの活性化受容体を標的とすることを通じて、モノクローナル抗体療法に対する(腫瘍上又は腫瘍微小環境における)CD64発現の不利な影響を克服することができる。腫瘍細胞上でのCD64発現にかかわらず、NK細胞上の二つの活性化受容体をデュアル標的化することはNK細胞へのより強い特異的結合を提供するので、TriNKETは、全ての腫瘍細胞に対するヒトNK細胞応答を媒介することができる。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、腫瘍関連抗原BCMAのための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKET(たとえばA40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET、及びF63-TriNKET)は、低減されたオン標的オフ腫瘍副作用を通じてより良い安全性プロフィールを提供する。ナチュラルキラー細胞及びCD8 T細胞は、共に腫瘍細胞を直接的に溶解することができるが、NK細胞及びCD8 T細胞が腫瘍細胞から正常自己を認識するメカニズムは相違する。NK細胞の活性は、活性化(NCR、NKG2D、CD16、など)受容体及び阻害性(KIR、NKG2A、など)受容体からのシグナルのバランスによって調節される。これらの活性化シグナル及び阻害性シグナルのバランスは、NK細胞が、ストレスを受けた、ウイルス感染した又はトランスフォームした自己細胞から健康な自己細胞を決定することを可能にする。この自己寛容性の「ビルトイン」メカニズムは、正常健康組織をNK細胞応答から保護することを助けることになる。この原理を拡張するために、NK細胞の自己寛容性は、TriNKETが、オフ腫瘍副作用なしに、又はより増大した治療的ウィンドウを有して、自己及び腫瘍の両方に発現される抗原を標的とすることを可能にすることになる。ナチュラルキラー細胞とは異なって、T細胞は、活性化及びエフェクター機能のためにMHC分子によって提示される特異的ペプチドの認識を必要とする。T細胞は、免疫療法の一次標的であり、腫瘍に対してT細胞応答を再方向付けするために多くの戦略が開発されてきた。T細胞二重特異性体（bispecifics）、チェックポイント阻害剤、及びCAR-T細胞は、全てFDAによって承認されているが、しばしば用量規制毒性が問題となる。T細胞二重特異性体及びCAR-T細胞は、腫瘍細胞の表面上の抗原を標的とするために結合ドメインを使用することにより、及びエフェクター細胞に活性化シグナルを伝達するために改造されたシグナリングドメインを使用することにより、TCR-MHC認識系の周辺で作用する。抗腫瘍免疫応答を誘起するのに有効であるが、これらの療法は、しばしばサイトカイン放出症候群(CRS)、及びオン標的オフ腫瘍副作用と結びつけられる。TriNKETは、NK細胞活性化及び阻害の天然系を「無視する」ことがないので、この文脈において独特である。その代わりに、TriNKETは、バランスを左右し、健康な自己に対するNKの寛容性を維持しながら、NK細胞に対する付加的な活性化シグナルを提供するように設計されている。
【０１１９】
いくつかの実施態様において、NKG2D結合ドメイン、及び腫瘍関連抗原BCMAのための結合ドメインを含む、本明細書において記載されるTriNKET(たとえばA40-TriNKET、A44-TriNKET、A49-TriNKET、C26-TriNKET、F04-TriNKET、F43-TriNKET、F47-TriNKET、及びF63-TriNKET)は、同じ腫瘍抗原結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりも有効に、腫瘍の進行を遅延させる。いくつかの実施態様において、NKG2D結合ドメイン及び腫瘍抗原BCMA結合ドメインを含むTriNKETは、がん転移に対して、抗BCMA結合ドメインを含むモノクローナル抗体よりも有効である。
【０１２０】
III.  治療的適用
本発明は、本明細書に記載される多重特異性結合性タンパク質及び／又は本明細書に記載される医薬組成物を使用してがんを治療する方法を提供する。この方法は、治療的有効量の本明細書に記載される多重特異性結合性タンパク質を、それを必要とする患者に投与することにより、BCMAを発現する多種多様ながんを治療するために使用し得る。
【０１２１】
この治療方法は、治療されるべきがんに従って特徴付けすることができる。たとえば、ある実施態様においては、がんは、血液又は骨髄由来である。例示的なものとしては、多発性骨髄腫、急性骨髄単球性白血病、T細胞リンパ腫、急性単球性白血病、及び濾胞性リンパ腫が挙げられる。T細胞リンパ腫は、前駆Tリンパ芽球性リンパ腫、末梢T細胞リンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、血管免疫芽球性T細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／T細胞リンパ腫、腸症タイプT細胞リンパ腫、皮下脂肪組織炎様T細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、又は末梢T細胞リンパ腫を含むことができる。
【０１２２】
ある実施態様において、がんは、B細胞リンパ腫であり、たとえば、びまん性大B細胞リンパ腫、一次縦隔B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯B細胞リンパ腫、節外性辺縁帯B細胞リンパ腫、結節性辺縁帯B細胞リンパ腫、脾臓辺縁帯B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、又は一次中枢神経系(CNS)リンパ腫などである。
【０１２３】
ある他の実施態様において、がんは固形腫瘍であり、たとえば、脳がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、白血病、肺がん、肝臓がん、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、胃がん、精巣がん、又は子宮がんなどである。さらに別の実施態様において、がんは血管新生腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽腫、肉腫（たとえば血管肉腫又は軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道系がん、甲状腺がん、末端部黒質黒色腫、光線角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、アデノイド嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆道がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管細胞癌、軟骨肉腫、脈絡叢乳頭腫／癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器がん、十二指腸がん、内分泌系がん、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼窩がん、女性生殖器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃幽門がん、胃底がん、胃腺腫、膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽腫、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物、上皮内扁平上皮新生物、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移がん、口がん、粘膜表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻道がん、神経系がん、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、オリゴデンドログリア癌、口腔癌、骨肉腫、乳頭漿液性腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在性悪性黒色腫、T細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸がん、子宮体がん、ブドウ膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰がん、高分化癌、又はウィルムス腫瘍である。
【０１２４】
治療すべきがんは、がん細胞の表面上に発現される特定の抗原の存在に従って特徴付けすることができる。ある実施態様において、がん細胞は、BCMAに加えて、以下のもの：CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4、及びPD1の一つ以上を発現することができる。
【０１２５】
IV.  組み合わせ療法
本発明の別の態様は、組み合わせ療法を提供する。本明細書において記載される多重特異性結合性タンパク質は、がんを治療するために付加的な治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０１２６】
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよい例示的な治療剤としては、たとえば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルキトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、サイマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン-α、インターフェロン-2α、インターフェロン-β、インターフェロン-γ、コロニー刺激因子-1、コロニー刺激因子-2、デニロイキンジフチトクス、インターロイキン-2、黄体ホルモン放出因子、及びその同族受容体への差次的結合及び増大したもしくは低減した血清半減期を呈し得る前述の剤のバリエーションが挙げられる。
【０１２７】
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよいさらなるクラスの剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、(i)細胞傷害性T‐リンパ球関連抗原(CTLA4)、(ii)プログラム細胞死タンパク質1(PD1)、(iii)PDL1、(iv)LAG3、(v)B7-H3、(vi)B7-H4、及び(vii)TIM3の、一つ以上を阻害する剤が挙げられる。CTLA4阻害剤イピリムマブは、黒色腫を治療するために米国食品医薬品局によって承認されている。
【０１２８】
がんの治療において組み合わせ療法の一部として使用してもよいさらに他の剤としては、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体剤(たとえばハーセプチン)及び非細胞傷害性剤(たとえばチロシンキナーゼ阻害剤)が挙げられる。
【０１２９】
さらに他の抗がん剤のカテゴリーとしては、たとえば：(i)ALK阻害剤、ATR阻害剤、A2Aアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトンチロシンキナーゼ阻害剤、CDC7阻害剤、CHK1阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、DNA-PK阻害剤、DNA-PK及びmTORの両方の阻害剤、DNMT1阻害剤、DNMT1阻害剤プラス2-クロロデオキシアデノシン、HDAC阻害剤、Hedgehogシグナル伝達経路阻害剤、IDO阻害剤、JAK阻害剤、mTOR阻害剤、MEK阻害剤、MELK阻害剤、MTH1阻害剤、PARP阻害剤、ホスホイノシチド3キナーゼ阻害剤、PARP1及びDHODHの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼII阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、VEGFR阻害剤、及びWEE1阻害剤から選択される阻害剤；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25、又はICOSのアゴニスト；及び(iii)IL-12、IL-15、GM-CSF、及びG-CSFから選択されるサイトカインが挙げられる。
【０１３０】
本発明のタンパク質は、一次病変の外科的除去の補助としても使用することができる。
【０１３１】
多重特異性結合性タンパク質及び付加的な治療剤の量、及び投与の相対的なタイミングは、所望の組み合わされた治療効果を達成するために選択してもよい。たとえば、そのような投与を必要とする患者に組み合わせ療法を施す場合、組み合わせの治療剤、又はこれらの治療剤を含む医薬組成物もしくは組成物は、たとえば、順次、同時期に、一緒に、同時に、などの任意の順序で投与してもよい。さらに、たとえば、多重特異性結合性タンパク質は、付加的な治療剤がその予防的又は治療的効果を発揮する間に投与してもよく、又はその逆であってもよい。
【０１３２】
V.  医薬組成物
本開示は、治療的有効量の本明細書において記載されるタンパク質を含有する医薬組成物をも特徴とする。この組成物は、多様な薬物送達系における使用のために製剤化することができる。一つ以上の生理学的に許容し得る賦形剤又は担体もまた、適正な製剤化のために組成物に含ませることができる。本開示における使用のために好適な製剤は、「レミントンの製剤科学」（Remington's Pharmaceutical Sciences）、Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版, 1985に見い出される。薬物送達の方法の手短な総説については、たとえば Langerの文献(Science 249:1527-1533, 1990)を参照されたい。
【０１３３】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、又はシリンジに含有させてもよい。ある実施態様において、このバッグは、チューブ及び／又は針を含むチャンネルに繋げてもよい。ある実施態様において、製剤は、凍結乾燥製剤又は液体製剤であってもよい。ある実施態様において、製剤は、フリーズドライ（凍結乾燥）し、約12〜60本のバイアルに封入してもよい。ある実施態様において、製剤は、フリーズドライしてもよく、45 mgのフリーズドライ製剤を１本のバイアルに封入してもよい。ある実施態様において、約40 mg〜約100 mgのフリーズドライ製剤を、１本のバイアルに封入してもよい。ある実施態様において、12、27、又は45本のバイアルからのフリーズドライ製剤を一緒にして、静脈内薬物製剤における治療的用量のタンパク質を得る。ある実施態様において、製剤は、液体製剤であってもよく、約250 mg/バイアル〜約1000 mg/バイアルとして貯蔵してもよい。ある実施態様において、製剤は、液体製剤であってもよく、約600 mg/バイアルとして貯蔵してもよい。ある実施態様において、製剤は、液体製剤であってもよく、約250 mg/バイアルとして貯蔵してもよい。
【０１３４】
この本開示は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療的有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤で存在し得る。
【０１３５】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよく、又は滅菌ろ過してもよい。得られる水性溶液は、そのまま使用するために包装してもよく、又は凍結乾燥してもよく、凍結乾燥された調製物は、投与に先立って滅菌水性担体と一緒にする。調製物のpHは、典型的には3〜11になり、より好ましくは5〜9又は6〜8であり、最も好ましくは7〜8であり、たとえば7〜7.5である。得られる固体形態の組成物は、各々が固定された量の上記の剤（単数又は複数）を含有する複数の単回用量単位に包装してもよい。固体形態の組成物は、可動的な量のために容器中に包装することもできる。
【０１３６】
ある実施態様において、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート80、水、及び水酸化ナトリウムとの組み合わせで本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
【０１３７】
ある実施態様において、水性製剤は、pH緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含めて調製される。本発明の緩衝液は、約4〜約8、たとえば約4.5〜約6.0、又は約4.8〜約5.5の範囲のpHを有していてもよく、又は約5.0〜約5.2のpHを有していてもよい。上記のpHの中間の範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。たとえば、上限及び／又は下限として上記される値の任意の組み合わせを使用する値の範囲は、含まれることが意図されている。この範囲内にpHをコントロールする緩衝液の例としては、酢酸塩（たとえば酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及びその他の有機酸緩衝液が挙げられる。
【０１３８】
ある実施態様において、製剤は、pHを約4〜約8の範囲に維持するためのクエン酸塩及びリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある実施態様において、pH範囲は、約4.5〜約6.0、又は約pH4.8〜約5.5であってもよく、又は約5.0〜約5.2のpH範囲にあってもよい。ある実施態様において、緩衝系は、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、及び／又はリン酸二水素ナトリウム二水和物を含む。ある実施態様において、緩衝系は、約1.3 mg/mlのクエン酸(たとえば1.305 mg/ml)、約0.3 mg/mlのクエン酸ナトリウム(たとえば0.305 mg/ml)、約1.5 mg/mlのリン酸二ナトリウム二水和物(たとえば1.53 mg/ml)、約0.9 mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物(たとえば0.86)、及び約6.2 mg/mlの塩化ナトリウム(たとえば6.165 mg/ml)を含む。ある実施態様において、緩衝系は、1〜1.5 mg/mlのクエン酸、0.25〜0.5 mg/mlのクエン酸ナトリウム、1.25〜1.75 mg/mlのリン酸二ナトリウム二水和物、0.7〜1.1 mg/mlのリン酸二水素ナトリウム二水和物、及び6.0〜6.4 mg/mlの塩化ナトリウムを含む。ある実施態様において、製剤のpHは、水酸化ナトリウムで調整される。
【０１３９】
等張剤として作用し、抗体を安定化し得るポリオールも、製剤に含まれていてもよい。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化させてもよい量で製剤に添加される。ある実施態様において、水性製剤は等張であってもよい。添加されるポリオールの量は、ポリオールの分子量に関して変えてもよい。たとえば、(トレハロースのような)二糖と比較してより少ない量の単糖(たとえばマンニトール)を添加してもよい。ある実施態様において、等張化剤として製剤において使用してもよいポリオールは、マンニトールである。ある実施態様において、マンニトール濃度は、約5〜約20 mg/mlであってもよい。ある実施態様において、マンニトールの濃度は、約7.5〜15 mg/mlであってもよい。ある実施態様において、マンニトールの濃度は、約10〜14 mg/mlであってもよい。ある実施態様において、マンニトールの濃度は、約12 mg/mlであってもよい。ある実施態様において、ポリオールであるソルビトールを製剤に含ませてもよい。
【０１４０】
洗剤又は界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート類(たとえばポリソルベート20、80など)又はポロキサマー類(たとえばポロキサマー188)のような非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減する、及び／又は製剤中の粒子の形成を最小限にする、及び／又は吸着を低減するような量である。ある実施態様において、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含んでいてもよい。ある実施態様において、製剤は、洗剤であるポリソルベート80又はTween 80を含有してもよい。Tween 80は、ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノオレエートを記載するために使用される用語である(Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorfの文献、第4版、1996を参照されたい)。ある実施態様において、製剤は、約0.1 mg/mL及び約10 mg/mLの間、又は約0.5 mg/mL及び約5 mg/mLの間のポリソルベート80を含有してもよい。ある実施態様において、約0.1％ポリソルベート80を製剤に添加してもよい。
【０１４１】
（複数の）実施態様において、本開示のタンパク質生成物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミ製のクリンプシールクロージャーで密閉されたUSP / Ph Eur type I 50R バイアル中の10 mg/mL濃度で提示してもよい。この栓は、USP及びPh Eurに準拠したエラストマーで製造してもよい。ある実施態様において、バイアルには、抽出可能容量を60 mLとするために、61.2 mLのタンパク質生成物溶液を充填してもよい。ある実施態様において、液体製剤は、0.9％生理食塩水溶液で希釈してもよい。
【０１４２】
ある実施態様において、本開示の液体製剤は、安定化レベルの糖との組み合わせで10 mg/mL濃度の溶液として調製してもよい。ある実施態様において、液体製剤は、水性担体中に調製してもよい。ある実施態様において、静脈内投与に望ましくない又は適さない粘度をもたらし得る量を超えない量で安定剤を添加してもよい。ある実施態様において、糖は、二糖類、たとえばスクロースであってもよい。ある実施態様において、液体製剤は、一つ以上の緩衝剤、界面活性剤、及び保存料をも含んでいてもよい。
【０１４３】
ある実施態様において、液体製剤のpHは、医薬として許容し得る酸及び／又は塩基の添加によって設定してもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る酸は、塩酸であってもよい。ある実施態様において、塩基は、水酸化ナトリウムであってもよい。
【０１４４】
凝集に加えて、脱アミド化は、発酵、収穫/細胞清澄化、精製、薬物質/薬物生成物貯蔵の間、及びサンプル分析の間に起こり得るペプチド及びタンパク質の一般的な生成物変異体である。脱アミド化は、加水分解を行うことができるコハク酸イミド中間体を形成するタンパク質からのNH3の喪失である。コハク酸イミド中間体は、親ペプチドの17 uの質量低減をもたらす。後続する加水分解は、18 uの質量増大をもたらす。コハク酸イミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性のために困難である。それ自体、脱アミド化は、典型的には1 uの質量増大として検出可能である。アスパラギンの脱アミド化は、アスパラギン酸又はイソアスパラギン酸のいずれかをもたらす。脱アミド化の速度に影響するパラメーターとしては、pH、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチドコンフォメーション及び三次構造が挙げられる。ペプチド鎖においてAsnに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響する。タンパク質配列においてAsnに続くGly及びSerは、脱アミド化に対してより高い感受性をもたらす。
【０１４５】
ある実施態様において、本開示の液体製剤は、タンパク質生成物の脱アミノ化を防ぐためのpH及び湿度条件下で保存されてもよい。
【０１４６】
本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与について安全かつ非毒性の)ものであり、液体製剤の調製に有用なものである。実例となる担体としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(たとえばリン酸緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。
【０１４７】
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得る。
【０１４８】
静脈内(IV)製剤は、患者が移植後に病院にいてIV経路を介して全ての薬剤を受けている場合のように、特定の場合において好ましい投与経路であり得る。ある実施態様において、液体製剤は、投与前に0.9％塩化ナトリウム溶液で希釈される。ある実施態様において、注射用の希釈された薬剤生成物は等張であり、静脈内注入による投与に好適である。
【０１４９】
ある実施態様において、塩又は緩衝剤コンポーネントは、10 mM〜200 mMの量で添加してもよい。塩類及び／又は緩衝剤は、医薬として許容し得るものであり、「塩基形成性」金属又はアミンを用いて種々の公知の酸(無機及び有機)から誘導される。ある実施態様において、緩衝剤は、リン酸緩衝剤であってもよい。ある実施態様において、緩衝剤は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立つ。
【０１５０】
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得る。
【０１５１】
本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与について安全かつ非毒性の)ものであり、液体製剤の調製に有用なものである。実例となる担体としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(たとえばリン酸緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。
【０１５２】
この本開示は、タンパク質及び凍結乾燥保護剤を含む凍結乾燥製剤で存在し得る。凍結乾燥保護剤は、糖、たとえば二糖類であってもよい。ある実施態様において、凍結乾燥保護剤は、スクロース又はマルトースであってもよい。凍結乾燥製剤は、緩衝剤、界面活性剤、増量剤、及び／又は保存料の一つ以上をも含んでいてもよい。
【０１５３】
凍結乾燥薬剤製品の安定化に有用なスクロース又はマルトースの量は、少なくとも1:2のタンパク質対スクロース又はマルトースの重量比であってもよい。ある実施態様において、タンパク質対スクロース又はマルトース重量比は、1:2〜1:5であってもよい。
【０１５４】
ある実施態様において、製剤のpHは、凍結乾燥前に、医薬として許容し得る酸及び／又は塩基の添加によって設定してもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る酸は塩酸であってもよい。ある実施態様において、医薬として許容し得る塩基は水酸化ナトリウムであってもよい。
【０１５５】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のpHは、6〜8に調整してもよい。ある実施態様において、凍結乾燥薬剤製品のpH範囲は、7〜8であってもよい。
【０１５６】
ある実施態様において、塩又は緩衝剤コンポーネントは、10 mM〜200 mMの量で添加してもよい。塩類及び／又は緩衝剤は、医薬として許容し得るものであり、「塩基形成性」金属又はアミンを用いて種々の公知の酸(無機及び有機)から誘導される。ある実施態様において、緩衝剤は、リン酸緩衝剤であってもよい。ある実施態様において、緩衝剤は、グリシン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩緩衝剤であってもよく、その場合、ナトリウム、カリウム又はアンモニウムイオンは、対イオンとして役立つ。
【０１５７】
ある実施態様において、「増量剤」を添加してもよい。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を加え、凍結乾燥ケーキの物理的構造に貢献する(たとえば開放孔（open pore）構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの産生を促進する)化合物である。実例となる増量剤としては、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコール及びソルビトールが挙げられる。本発明の凍結乾燥製剤は、このような増量剤を含有してもよい。
【０１５８】
保存料は、細菌の作用を低減するために、場合によっては、本明細書における製剤に添加してもよい。保存料の添加は、たとえば、多回使用(複数回投与)製剤の製造を促進し得る。
【０１５９】
ある実施態様において、凍結乾燥薬剤生成物は、水性担体を用いて構成されていてもよい。本明細書における目的の水性担体は、医薬として許容し得る(ヒトに対する投与について安全かつ非毒性の)ものであり、凍結乾燥後に、液体製剤の調製に有用なものである。実例となる希釈剤としては、注射用の滅菌水(SWFI)、注射用の静菌水(BWFI)、pH緩衝溶液(たとえばリン酸緩衝生理食塩水)、滅菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液、又はデキストロース溶液が挙げられる。
【０１６０】
ある実施態様において、現開示の凍結乾燥薬剤生成物は、注射用の滅菌水、USP(SWFI)、又は0.9％塩化ナトリウム注射、USPのいずれかを用いて再構成される。再構成の間に、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
【０１６１】
ある実施態様において、本開示の凍結乾燥タンパク質生成物は、約4.5 mLの注射用水に構成され、0.9％生理食塩水溶液(塩化ナトリウム溶液)で希釈される。
【０１６２】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、及び投与モードについて所望の治療応答を患者に毒性なしに達成するのに有効な活性成分の量を得るように、変化させてもよい。
【０１６３】
具体的用量は、各患者について均一な用量、たとえば、50〜5000 mgのタンパク質であることができる。あるいは、患者の用量は、その患者のおよその体重又は表面積に適合させることができる。適切な投薬を決定することにおける他の要因は、治療又は防止すべき疾患又は状態、疾患の重症度、投与の経路、及び患者の年齢、性別及び医学的状態を含むことができる。さらに、治療のための適切な投薬を決定するために必要な計算の改善は、特に本明細書において開示される投薬情報及びアッセイに照らして、当業者によってルーチンに行われる。投薬は、適切な用量反応データと一緒に使用される投薬を決定するための公知のアッセイの使用を通じて決定することもできる。個別の患者の投薬は、疾患の進行の監視につれて調整することができる。患者における標的可能な構築物又は複合体の血液レベルは、有効濃度に到達する又はそれを維持するために投薬を調整する必要があるかどうかを調べるために測定することができる。ファーマコゲノミクスは、所定の個体についてどのような標的可能な構築物及び／又は複合体、及びその投薬が、最も有効である可能性が高いかを決定するために使用してもよい(Schmitzらの文献、Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimerらの文献、Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。
【０１６４】
一般に、体重に基づく投薬は、体重1kg当たり約0.01 μg〜約100 mgであり、たとえば、約0.01 μg〜約100 mg/kg体重、約0.01 μg〜約50 mg/kg体重、約0.01 μg〜約10 mg/kg体重、約0.01 μg〜約1 mg/kg体重、約0.01 μg〜約100 μg/kg体重、約0.01 μg〜約50 μg/kg体重、約0.01 μg〜約10 μg/kg体重、約0.01 μg〜約1 μg/kg体重、約0.01 μg〜約0.1 μg/kg体重、約0.1 μg〜約100 mg/kg体重、約0.1 μg〜約50 mg/kg体重、約0.1 μg〜約10 mg/kg体重、約0.1 μg〜約1 mg/kg体重、約0.1 μg〜約100 μg/kg体重、約0.1 μg〜約10 μg/kg体重、約0.1 μg〜約1 μg/kg体重、約1 μg〜約100 mg/kg体重、約1 μg〜約50 mg/kg体重、約1 μg〜約10 mg/kg体重、約1 μg〜約1 mg/kg体重、約1 μg〜約100 μg/kg体重、約1 μg〜約50 μg/kg体重、約1 μg〜約10 μg/kg体重、約10 μg〜約100 mg/kg体重、約10 μg〜約50 mg/kg体重、約10 μg〜約10 mg/kg体重、約10 μg〜約1 mg/kg体重、約10 μg〜約100 μg/kg体重、約10 μg〜約50 μg/kg体重、約50 μg〜約100 mg/kg体重、約50μg〜約50 mg/kg体重、約50 μg〜約10 mg/kg体重、約50 μg〜約1 mg/kg体重、約50 μg〜約100 μg/kg体重、約100 μg〜約100 mg/kg体重、約100 μg〜約50 mg/kg体重、約100 μg〜約10 mg/kg体重、約100 μg〜約1 mg/kg体重、約1 mg〜約100 mg/kg体重、約1 mg〜約50 mg/kg体重、約1 mg〜約10 mg/kg体重、約10 mg〜約100 mg/kg体重、約10 mg〜約50 mg/kg体重、約50 mg〜約100 mg/kg体重である。
【０１６５】
用量は、1回以上を、毎日、毎週、毎月、又は毎年、あるいは2〜20年ごとに1回、与えられてもよい。当業者は、測定された体液又は組織における標的可能な構築物又は複合体の滞留時間及び濃度に基づいて投薬の反復率を容易に見積もることができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内、カテーテルを介した灌流によるもの、又は直接病巣内注射によるものであり得る。これは、毎日1回以上、毎週1回以上、毎月1回以上、及び毎年1回以上、投与してもよい。
【実施例】
【０１６６】
(実施例)
ここで一般的に記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによりさらに容易に理解されるであろう。以下の実施例は、本発明のある態様及び実施態様の実例の目的のみのために含まれており、本発明を限定することを意図していない。
【実施例１】
【０１６７】
実施例1：  NKG2D結合ドメインはNKG2Dに結合する
NKG2D結合ドメインは精製された組換えNKG2Dに結合する
ヒト、マウス又はカニクイザルNKG2D外部ドメインの核酸配列を、ヒトIgG1 Fcドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現されるべき哺乳類細胞中に導入した。精製後、NKG2D-Fc融合タンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンを用いてウェルをブロッキングした後、NKG2D結合ドメインを滴定し、NKG2D-Fc 融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼとコンジュゲート化されヒトカッパ軽鎖を特異的に認識してFc交差反応性を回避する二次抗体を使用して検出した。ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質である3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)をウェルに添加して、結合シグナルを可視化し、その吸光度を、450 nMで測定し、540 nMで修正した。NKG2D結合ドメインクローン、アイソタイプコントロール又は陽性コントロール(配列番号45〜48、又はeBioscienceで入手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)を各ウェルに添加した。
【０１６８】
アイソタイプコントロールは、組換えNKG2D-Fcタンパク質に最小限の結合を示したが、一方、陽性コントロールは、組換え抗原に最も強力に結合した。全てのクローンによって産生されたNKG2D結合ドメインは、ヒト(図14)、マウス(図16)、及びカニクイザル(図15)組換えNKG2D-Fcタンパク質を横断的に結合することを実証したが、クローンごとの親和性の変化を伴っていた。一般に、各抗NKG2Dクローンは、ヒト(図14)及びカニクイザル(図15)組換えNKG2D-Fcに同様の親和性で結合したが、マウス(図16)組換えNKG2D-Fcに対してはより低い親和性で結合した。
【０１６９】
NKG2D結合ドメインはNKG2Dを発現する細胞に結合する
EL4マウスリンパ腫細胞株を、ヒト又はマウスNKG2D-CD3ゼータシグナリングドメインキメラ抗原受容体を発現するように改造した。NKG2D結合クローン、アイソタイプコントロール又は陽性コントロールを100 nM濃度で使用して、EL4細胞上で発現された細胞外NKG2Dを染色した。抗体結合は、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出した。細胞は、フローサイトメトリーで解析し、バックグラウンドに対する倍数(FOB)を、親EL4細胞と比較してのNKG2D発現細胞の平均蛍光強度(MFI)を使用して算出した。
【０１７０】
全てのクローンによって産生されたNKG2D結合ドメインは、ヒト及びマウスNKG2Dを発現するEL4細胞に結合した。陽性コントロール抗体(配列番号45〜48、又はeBioscienceで入手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)は、最良のFOB結合シグナルを与えた。各クローンについてのNKG2D結合親和性は、ヒトNKG2D(図17)及びマウスNKG2D(図18)を発現する細胞間で同様であった。
【実施例２】
【０１７１】
実施例2：  NKG2D結合ドメインはNKG2Dへの天然リガンド結合を遮断する
ULBP-6との競合
組換えヒトNKG2D-Fcタンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させ、これらのウェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特異的結合を低減させた。飽和濃度のULBP-6-His-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合ドメインクローンを添加した。2時間のインキュベーションの後、ウェルを洗浄し、NKG2D-Fcでコーティングしたウェルに結合した残存するULBP-6-His-ビオチンを、ストレプトアビジンをコンジュゲート化したホースラディッシュペルオキシダーゼ及びTMB基質によって検出した。吸光度を、450 nMで測定し、540 nMで修正した。バックグラウンドを差し引いた後、NKG2D-Fcタンパク質に対するNKG2D結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のNKG2D-Fcタンパク質への結合から遮断されたULBP-6-His-ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性コントロール抗体(配列番号45〜48から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインは、NKG2DへのULBP-6結合を遮断したが、一方、アイソタイプコントロールは、ULBP-6との競合をほとんど示さなかった(図19)。
【０１７２】
MICAとの競合
組換えヒトMICA-Fcタンパク質を、マイクロプレートのウェルに吸着させ、これらのウェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特異的結合を低減させた。NKG2D-Fc-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄後、MICA-Fcでコーティングしたウェルに結合した残存するNKG2D-Fc-ビオチンを、ストレプトアビジン-HRP及びTMB基質を使用して検出した。吸光度は、450 nMで測定し、540 nMで修正した。バックグラウンドを差し引いた後、NKG2D-Fcタンパク質へのNKG2D結合ドメインの特異的結合を、MICA-Fcでコーティングされたウェルへの結合から遮断されたNKG2D-Fc-ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性コントロール抗体(配列番号45〜48から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインは、NKG2DへのMICA結合を遮断したが、一方、アイソタイプコントロールは、MICAとの競合をほとんど示さなかった(図20)。
【０１７３】
Rae-1デルタとの競合
組換えマウスRae-1デルタ-Fc(R&D Systemsから購入した)を、マイクロプレートのウェルに吸着させ、これらのウェルを、ウシ血清アルブミンを用いてブロッキングして、非特異的結合を低減させた。マウスNKG2D-Fc-ビオチンをウェルに添加し、続いて、NKG2D結合ドメインを添加した。インキュベーション及び洗浄後、Rae-1デルタ-Fcでコーティングしたウェルに結合した残存するNKG2D-Fc-ビオチンを、ストレプトアビジン-HRP及びTMB基質を使用して検出した。吸光度は、450 nM で測定し、540 nMで修正した。バックグラウンドを差し引いた後、NKG2D-Fcタンパク質へのNKG2D結合ドメインの特異的結合を、Rae-1デルタ-Fcでコーティングしたウェルへの結合から遮断されたNKG2D-Fc-ビオチンのパーセンテージから算出した。陽性コントロール(配列番号45〜48、又はeBioscienceで入手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)及び種々のNKG2D結合ドメインクローンは、マウスNKG2DへのRae-1デルタ結合を遮断したが、一方、アイソタイプコントロール抗体は、Rae-1デルタとの競合をほとんど示さなかった(図21)。
【実施例３】
【０１７４】
実施例3：  NKG2D結合ドメインクローンはNKG2Dを活性化する
ヒト及びマウスNKG2Dの核酸配列を、CD3ゼータシグナリングドメインをコードする核酸配列に融合して、キメラ抗原受容体(CAR)構築物を得た。NKG2D-CAR構築物を、次に、Gibsonアセンブリーを使用してレトロウイルスベクター中にクローニングし、レトロウイルス産生のためにexpi293細胞にトランスフェクトした。EL4細胞は、8μg/mLポリブレンと一緒にNKG2D-CARを含有するウイルスで感染させた。感染24時間後、EL4細胞中のNKG2D-CARの発現レベルをフローサイトメトリーで解析し、細胞表面上に高レベルのNKG2D-CARを発現するクローンを選択した。
【０１７５】
NKG2D結合ドメインがNKG2Dを活性化するか否かを決定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、NKG2D-CAR EL4細胞を、ブレフェルジン-A及びモネンシンの存在下で、抗体フラグメントでコーティングしたウェルで4時間、培養した。細胞内TNF-α産生、NKG2D活性化についてのインジケーターを、フローサイトメトリーによってアッセイした。TNF-α陽性細胞のパーセンテージを、陽性コントロールで処理した細胞に対して正規化した。全てのNKG2D結合ドメインは、ヒトNKG2D(図22)及びマウスNKG2D(図23)の両方を活性化した。
【実施例４】
【０１７６】
実施例4：  NKG2D結合ドメインはNK細胞を活性化する
初代ヒトNK細胞
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。NK細胞(CD3- CD56+)は、磁性ビーズを用いる陰性選択を使用してPBMCから単離し、単離されたNK細胞の純度は、典型的には＞95％であった。単離されたNK細胞を、次に、100 ng/mL IL-2を含有する培地中で24〜48時間培養し、その後、NKG2D結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移して、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗CD107a抗体、ブレフェルジン-A、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。培養に続いて、NK細胞を、フルオロフォアをコンジュゲート化したCD3、CD56及びIFN-γに対する抗体を使用して、フローサイトメトリーによってアッセイした。CD107a及びIFN-γ染色を、CD3- CD56+細胞において解析し、NK細胞活性化を評価した。CD107a/IFN-γ二重陽性細胞の増大は、一つの受容体よりも二つの活性化受容体のエンゲージメントを通じた、より良いNK細胞活性化の指標である。NKG2D結合ドメイン及び陽性コントロール(配列番号45〜48から選択される)は、アイソタイプコントロールよりも、より高いパーセンテージのNK細胞がCD107a+及びIFN-γ+になることを示した(図24及び図25は、それぞれがNK細胞調製のために異なるドナーのPBMCを使用した、2回の独立した実験からのデータを表す)。
【０１７７】
初代マウスNK細胞
脾臓は、C57Bl/6マウスから入手し、70μm細胞ストレーナーを通して壊して、単一細胞懸濁液を得た。細胞は、ペレット化し、ACK溶解緩衝液(Thermo Fisher Scientific ＃A1049201から購入した；155mM塩化アンモニウム、10mM炭酸水素カリウム、0.01mM EDTA)中に再懸濁して、赤血球を除去した。残りの細胞は、100 ng/mL hIL-2と共に72時間培養してから回収し、NK細胞単離のために調製した。NK細胞(CD3-NK1.1+)は、次に、磁性ビーズを用いる陰性除去技術を使用して脾臓細胞から単離し、典型的には＞90％の純度であった。精製されたNK細胞を、100 ng/mL mIL-15を含有する培地中で48時間培養してから、NKG2D結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移して、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗CD107a抗体、ブレフェルジン-A、及びモネンシンを含有する培地中で培養した。NKG2D結合ドメインでコーティングしたウェル中での培養の後、NK細胞を、フルオロフォアをコンジュゲート化したCD3、NK1.1及びIFN-γに対する抗体を使用して、フローサイトメトリーによりアッセイした。CD107a及びIFN-γ染色を、CD3- NK1.1+細胞において解析し、NK細胞活性化を評価した。CD107a/IFN-γ二重陽性細胞の増大は、一つの受容体よりも二つの活性化受容体のエンゲージメントを通じた、より良いNK細胞活性化の指標である。NKG2D結合ドメイン及び陽性コントロール(eBioscienceで入手可能な抗マウスNKG2DクローンMI-6及びCX-5から選択される)は、アイソタイプコントロールよりも、より高いパーセンテージのNK細胞がCD107a+及びIFN-γ+になることを示した(図26及び図27は、それぞれがNK細胞調製のために異なるマウスを使用した、2回の独立した実験からのデータを表す)。
【実施例５】
【０１７８】
実施例5：  NKG2D結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
ヒト及びマウス初代NK細胞活性化アッセイは、NKG2D結合ドメインとのインキュベーション後のNK細胞上の増大した細胞傷害性マーカーを実証する。このことが、増大した腫瘍細胞溶解につながる(translates into)か否かを調べるために、各NKG2D結合ドメインが単一特異性抗体に開発された細胞ベースのアッセイを利用した。Fc領域は、一つの標的化アームとして使用され、一方、Fab領域(NKG2D結合ドメイン)は、NK細胞を活性化するための別の標的化アームとして作用した。ヒト起源であり、高レベルのFc受容体を発現するTHP-1細胞を腫瘍標的として使用し、Perkin Elmer DELFIA Cytotoxicity Kitを使用した。THP-1細胞は、BATDA試薬で標識し、培地中に105/mLで再懸濁した。標識されたTHP-1細胞を、次に、マイクロタイタープレートのウェル中で、37℃で3時間、NKG2D抗体及び単離されたマウスNK細胞と一緒にした。インキュベーション後、20μlの培養上清を採取し、200μlのユウロピウム溶液と混合し、振とうしながら15分間、遮光してインキュベートした。蛍光を、時間分解蛍光モジュールを備えたPheraStarプレートリーダーリーダー（励起337nm、発光620nm）によって経時的に測定し、キットの指示書に従って特異的溶解を算出した。
【０１７９】
陽性コントロール、NKG2Dの天然リガンドULBP-6は、マウスNK細胞によるTHP-1標的細胞の増大した特異的溶解を示した。NKG2D抗体は、THP-1標的細胞の特異的溶解も増大したが、一方、アイソタイプコントロール抗体は、低減した特異的溶解を示した。点線は、添加した抗体なしでのマウスNK細胞によるTHP-1細胞の特異的溶解を示す(図28)。
【実施例６】
【０１８０】
実施例6：  NKG2D抗体は高い熱安定性を示す
NKG2D結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿された見かけの融解温度は、典型的なIgG1抗体に関して相対的に高い(図29)。
【実施例７】
【０１８１】
実施例7：  多重特異性結合性タンパク質はNKG2Dに結合する
EL4マウスリンパ腫細胞株を、ヒトNKG2Dを発現するように改造した。各々がNKG2D結合ドメイン、腫瘍関連抗原結合ドメイン(BCMA結合ドメイン)、及び図1に示すようにCD16に結合するFcドメインを含有する三重特異性結合性タンパク質(TriNKET)を、EL4細胞上に発現された細胞外NKG2Dに対するそれらの親和性について試験した。NKG2Dへの多重特異性結合性タンパク質の結合は、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出した。細胞をフローサイトメトリーによって解析し、バックグラウンドに対する倍数(FOB)を、親EL4細胞と比較したNKG2D発現細胞の平均蛍光強度(MFI)を使用して算出した。
【０１８２】
試験したTriNKETは、BCMA-TriNKET-C26(ADI-28226及びBCMA結合ドメイン)、BCMA-TriNKET-F04(ADI-29404及びBCMA結合ドメイン)、BCMA-TriNKET-F43(ADI-29443及びBCMA結合ドメイン)、及びBCMA-TriNKET-F47(ADI-29447及びBCMA結合ドメイン)を含んでいた。
【０１８３】
試験した分子において使用されたBCMA結合ドメインは、以下に掲載するとおりの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインから構成されていた。
【０１８４】
EM-801重鎖可変ドメイン(配列番号91)：
【化４】
2020507328.tif 000022
【０１８５】
EM-801軽鎖可変ドメイン(配列番号92)：
【化５】
2020507328.tif 000023
【０１８６】
EM-901重鎖可変ドメイン(配列番号93)
【化６】
2020507328.tif 000024
【０１８７】
EM-901軽鎖可変ドメイン(配列番号94)
【化７】
2020507328.tif 000025
【実施例８】
【０１８８】
実施例8：  多重特異性結合性タンパク質はヒト腫瘍抗原に結合する
三重特異性結合性タンパク質はBCMAに結合する
BCMAを発現するMM.1Sヒト骨髄腫細胞を使用して、腫瘍関連抗原BCMAに対するTriNKETの結合をアッセイした。TriNKETは、希釈し、それぞれの細胞と共にインキュベートした。TriNKET、及び場合によってはその親の抗BCMAモノクローナル抗体(EM-801)を、細胞と共にインキュベートし、結合を、フルオロフォアをコンジュゲート化した抗ヒトIgG二次抗体を使用して検出した。細胞を、フローサイトメトリーによって解析し、バックグラウンドに対する倍数(FOB)を、二次抗体コントロールに対して正規化したTriNKET及びEM-801からの平均蛍光強度(MFI)を使用して算出した。C26-TriNKET-BCMA、F04-TriNKET-BCMA、F43-TriNKET-BCMA、及びF47-TriNKET-BCMAは、EM-801と比較して匹敵するレベルの、MM.1S細胞上に発現されたBCMAへの結合を示す(図31)。
【実施例９】
【０１８９】
実施例9：  多重特異性結合性タンパク質はNK細胞を活性化する
初代ヒトNK細胞は、標的を発現するヒトがん細胞株との共培養においてTriNKETによって活性化される
初代ヒトNK細胞をBCMA陽性MM.1S骨髄腫細胞と共培養することにより、初代ヒトNK細胞のTriNKET媒介性活性化がもたらされた。BCMAを標的とするTriNKET(たとえばC26-TriNKET-BMCA及びF04-TriNKET-BMCA)は、CD107a脱顆粒及びIFNγサイトカイン産生の増大によって示されるように、MM.1S骨髄腫細胞と共培養されたヒトNK細胞の活性化を媒介した(図32)。アイソタイプTriNKETと比較して、BCMAを標的とするTriNKET(たとえばA44-TriNKET-BMCA、A49-TriNKET-BMCA、C26-TriNKET-BMCA、F04-TriNKET-BMCA、F43-TriNKET-BMCA、F43-TriNKET-BMCA、F47-TriNKET-BMCA、及びF63-TriNKET-BMCA)は、増大したNK細胞活性を示した(図32)。
【実施例１０】
【０１９０】
実施例10：  三重特異性結合性タンパク質は標的がん細胞の細胞傷害性を可能にする
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。NK細胞(CD3- CD56+)は、磁性ビーズを用いる陰性選択を使用してPBMCから単離し、単離されたNK細胞の純度は、典型的には＞90％であった。単離されたNK細胞を、活性化のために100ng/mL IL-2を含有する培地中で培養するか、又はサイトカインなしで一晩休止させた。IL-2活性化された又は休止させたNK細胞を、次の日に細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０１９１】
DELFIA細胞傷害性アッセイ：
目的の標的を発現するヒトがん細胞株は、培養から収穫し、細胞をPBSで洗浄し、BATDA試薬(Perkin Elmer AD0116)で標識するために106/mLで成長培地に再懸濁した。標的細胞の標識については、製造業者の指示に従った。標識した後、細胞をPBSで3回洗浄し、0.5〜1.0x105/mLで培地中に再懸濁した。バックグラウンドウェルを調製するために、標識細胞のアリコートを取り分け、細胞を培地から遠心分離した。100 μlの培地を、ペレット化した細胞を崩さないように注意深く3連のウェルに添加した。100 μlのBATDA標識細胞を、96ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルは、標的細胞からの自発的放出のために保存し、ウェルは、1％ Triton-Xの添加により、標的細胞の最大溶解のために調製した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体又はTriNKETを培地で希釈して、50 μlの希釈されたmAb又はTriNKETを各ウェルに添加した。休止させた及び／又は活性化したNK細胞を、培養から収穫し、細胞を洗浄し、所望のE:T比に応じて培地中に105〜2.0×106/mLで再懸濁した。50 μlのNK細胞をプレートの各ウェルに添加し、培地容量を合計で200 μlとした。プレートは、37℃で5％CO2と共に2〜3時間インキュベートしてから、アッセイを発色させた。
【０１９２】
2〜3時間の培養の後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を、200gで5分間の遠心分離によりペレット化した。20 μlの培養上清を製造業者から提供された清潔なマイクロプレートに移し、200 μlの室温のユウロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートは、遮光して、250rpmのプレートシェーカー上で15分間インキュベートした。プレートを、Victor 3又はSpectraMax i3X機器のいずれかを使用して読み取った。％特異的溶解は、以下のようにして算出した：％特異的溶解＝((実験的放出−自発的放出)／(最大放出−自発的放出)) ＊ 100％。
【０１９３】
BCMA陽性骨髄腫細胞のTriNKET媒介性溶解をアッセイした。図39は、休止させたヒトNKエフェクター細胞によるBCMA陽性KMS12-PE骨髄腫細胞のTriNKET媒介性溶解を示す。同じNKG2D結合ドメイン(A49)と、異なるBCMA標的化ドメインを使用する二つのTriNKET(cFAE-A49.801及びcFAE-A49.901)を、インビトロでの効率について試験した。両TriNKETは、同様の程度でKMS12-PE細胞のNK細胞溶解を増強したが、EM-901標的化ドメインを使用するTriNKETは増大した効力を提供した(図39)。
【０１９４】
図33は、異なるNKG2D結合ドメイン(A40、A44、A49、C26、及びF47)を使用するが、同じBCMA標的化ドメインを使用する、いくつかのTriNKETの細胞傷害性活性を示す。BCMA標的化TriNKETのNKG2D結合ドメインの変更は、TriNKETの最大殺傷ならびに効力の変動を生み出した。全てのTriNKETは、EM-901モノクローナル抗体と比較して増大したKMS12-PE標的細胞の殺傷を実証した(図33)。
【実施例１１】
【０１９５】
実施例11：
NKG2D及びCD16を架橋することによるヒトNK細胞の相乗的活性化を調べた。
【０１９６】
初代ヒトNK細胞活性化アッセイ
末梢血単核細胞(PBMC)は、密度勾配遠心分離を使用してヒト末梢血バフィーコートから単離した。NK細胞は、陰性磁性ビーズ(StemCell ＃ 17955)を使用してPBMCから精製した。NK細胞は、フローサイトメトリーにより決定したところ、＞90％ CD3-CD56+であった。細胞を、次に100 ng/mL hIL-2(Peprotech ＃200-02)を含有する培地中で48時間拡大させた後、活性化アッセイに使用した。抗体を、100 μl滅菌PBS中、2 μg/ml(抗CD16、Biolegend ＃ 302013)及び5 μg/mL(抗NKG2D、R&D ＃MAB139)の濃度で、4℃で一晩、96ウェル平底プレート上にコーティングし、続いて、過剰な抗体を除去するためにウェルを十分に洗浄した。脱顆粒の評価のために、IL-2活性化されたNK細胞を、5×105細胞/mlで、100 ng/mL hIL2及び1 μg/mL APCコンジュゲート化抗CD107a mAb(Biolegend ＃ 328619)を補充した培地中に再懸濁した。1×105細胞/ウェルを、次に、抗体でコーティングしたプレートに添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンA(BFA, Biolegend ＃ 420601)及びモネンシン(Biolegend ＃ 420701)を、それぞれ最終希釈1:1000及び1:270で添加した。プレーティングした細胞は、5％ CO2中、37℃で4時間、インキュベートした。IFN-γの細胞内染色のために、NK細胞を、抗CD3(Biolegend ＃300452)及び抗CD56 mAb(Biolegend ＃ 318328)で標識し、その後、固定し、透過性にし、抗IFN-γ mAb(Biolegend ＃ 506507)で標識した。NK細胞を、生CD56+CD3-細胞上でゲーティングした後、フローサイトメトリーによって、CD107a及びIFN-γの発現について解析した。
【０１９７】
受容体組み合わせの相対的効力を調べるために、プレート結合刺激によるNKG2D又はCD16の架橋、及び両受容体の共架橋を実施した。図34(図34A〜3C)に示すように、CD16及びNKG2Dの組み合わせた刺激は、高く上昇したレベルのCD107a(脱顆粒)(図3A)及び／又はIFN-γ産生(図34B)をもたらした。点線は、各受容体の個別の刺激の相加的効果を表す。
【０１９８】
IL-2活性化されたNK細胞のCD107aレベル及び細胞内IFN-γ産生は、抗CD16、抗NKG2D、又は両モノクローナル抗体の組み合わせを用いる4時間のプレート結合刺激の後に解析した。グラフは、平均(n＝2)±SDを示す。図34Aは、CD107aのレベルを実証する；図34Bは、IFNγのレベルを実証する；図34Cは、CD107aのレベルを実証する。図34A〜34Cに示されるデータは、5人の異なる健常ドナーを使用する5回の独立した実験の代表である。
【０１９９】
参照による組み込み
本明細書において引用される特許書類及び科学的記事の各々の開示全体は、あらゆる目的のために参照により組み込まれる。
【０２００】
等価物
本発明は、その精神又は本質的な特徴から逸脱することなしに、他の具体的な形態に具体化されてもよい。前述の実施態様は、それゆえ全ての観点において本明細書において記載される本発明を限定するものではなく実例となるものとして考慮されるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってよりもむしろ添付の請求項によって示されるのであり、請求項の等価物の意味及び範囲内にある全ての変更は、その中に含まれることが意図されている。
【図１】
2020507328.tif 000026
【図２】
2020507328.tif 000027
【図３】
2020507328.tif 000028
【図４】
2020507328.tif 000029
【図５】
2020507328.tif 000030
【図６】
2020507328.tif 000031
【図７】
2020507328.tif 000032
【図８】
2020507328.tif 000033
【図９】
2020507328.tif 000034
【図１０】
2020507328.tif 000035
【図１１】
2020507328.tif 000036
【図１２】
2020507328.tif 000037
【図１３Ａ】
2020507328.tif 000038
【図１３Ｂ】
2020507328.tif 000039
【図１４】
2020507328.tif 000040
【図１５】
2020507328.tif 000041
【図１６】
2020507328.tif 000042
【図１７】
2020507328.tif 000043
【図１８】
2020507328.tif 000044
【図１９】
2020507328.tif 000045
【図２０】
2020507328.tif 000046
【図２１】
2020507328.tif 000047
【図２２】
2020507328.tif 000048
【図２３】
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【図２４】
2020507328.tif 000050
【図２５】
2020507328.tif 000051
【図２６】
2020507328.tif 000052
【図２７】
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【図２８】
2020507328.tif 000054
【図２９】
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【図３０】
2020507328.tif 000056
【図３１】
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【図３２】
2020507328.tif 000058
【図３３】
2020507328.tif 000059
【図３４Ａ】
2020507328.tif 000060
【図３４Ｂ】
2020507328.tif 000061
【図３４Ｃ】
2020507328.tif 000062
【図３５】
2020507328.tif 000063
【図３６】
2020507328.tif 000064
【図３７】
2020507328.tif 000065
【図３８】
2020507328.tif 000066
【図３９】
2020507328.tif 000067
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月12日(2019.12.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020507328000001.app
【国際調査報告】
2020507328.tif 000068
2020507328.tif 000069