(57)【要約】  細胞ベースのアッセイは、生物活性の検出に必要とされ、それゆえ効力アッセイ、中和抗体の検出、治療用抗体のエフェクター細胞機能の検出と定量、又は遺伝子治療で使用されるＡＡＶベクターなどのウイルスベクターに対する効力又は中和抗体応答の定量として使用するために必要である。細胞ベースのアッセイは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を含む抗体媒介エフェクター機能の定量化にも必要である。細胞ベースのアッセイは、自動化イムノアッセイプラットフォームでの使用に適応するのが困難である。ルシフェラーゼ（ホタル、ウミシイタケ、ガウシア、ナノルシフェラーゼなど）などの蛍光又は発光、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｄｓＲＥＤなどの蛍光タンパク質、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）又はプロテアーゼなどの酵素を使用して定量化でき、薬物の作用機序に直接関連しているシグナル伝達に応答する容易に目に見えるタンパク質をコードするレポーター遺伝子を用いて、可溶性標的又は細胞表面標的（受容体又は他の細胞表面分子）への薬物の結合後の薬物の効力、抗薬物中和抗体、及び治療用抗体により誘発されるエフェクター細胞機能を定量化することができる。本発明の原理は、分泌タンパク質について、細胞ベースのアッセイの過程中又は細胞ベースのアッセイの終了時に産生されるレポーター遺伝子産物又は副産物が、細胞培地又は細胞上清のいずれかで、又は適切な受動的溶解バッファーで細胞の溶解の後、定量化されることである。ホタルルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子産物は、次いで、細胞培地又は細胞上清又は細胞ライセートで、ＥＬＩＳＡ、又はＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ電気化学発光（ＭＳＤ‐ＥＣＬ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＳＭＣ、Ａｌｐｃｏ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、Ｇｙｒｏｓなどの特定の自動化アッセイプラットフォーム、又はＢｉａｃｏｒｅプラットフォームなどのＳＰＲを使用した無標識検出に特異的な二重検出システムで標識されたホタルルシフェラーゼなどの遺伝子産物に特異的な抗体ペア（モノクローナル又はポリクローナル）を使用して検出される。ホタルルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子産物の発現は、構成的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼのような第二のレポーター遺伝子産物の発現に対して正規化することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は細胞株であって、該細胞が第一のレポーター遺伝子産物を発現し、さらに第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、上記細胞又は細胞株。
【請求項２】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する、請求項１に記載の細胞又は細胞株。
【請求項３】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、請求項１又は２に記載の細胞又は細胞株。
【請求項４】
前記細胞が薬物特異的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項５】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項６】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項７】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項８】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１から７のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項９】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１から８のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１０】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚目甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１２】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１３】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１４】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１５】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１６】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳動物又は鳥類の細胞である、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１８】
前記細胞がヒトのものである、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１９】
前記細胞が、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ‐１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ‐４０、ＰＩＬ‐５、又はＭＳＢ‐１のうちの一つ以上である、請求項１〜１８のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２０】
前記細胞が、配列番号１から配列番号４までの一つ以上から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも約７０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列をさらに含むベクター構築物を含む、請求項１から１９のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２１】
前記ベクター構築物が、共刺激分子ＣＤ２８、共刺激分子ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ）、共刺激分子ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）、共刺激分子ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）から選択される一つ以上をコードするポリヌクレオチドをさらに含むか、又は共刺激分子がＣＤ２８、ＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢ）、及びＩＣＯＳの一つ以上から選択される受容体である、請求項１から２０のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２２】
前記細胞がＣＤ１６ａに作用可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物は、ＣＤ１６に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の細胞はＡＤＣＣ活性が決定される治療用抗体によって認識される抗原を発現し、抗体と標的細胞上の特定の抗原との相互作用は、受容体の凝集及びエフェクター細胞上でのレポーター遺伝子の活性化をもたらす、請求項１から２１のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２３】
前記細胞がＣＤ３２に作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物がＣＤ３２に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の標的細胞は例えばプロテアーゼの放出に応答し、分泌されると定量化されＡＤＣＰ活性の評価を可能にするルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含有し、あるいは、プロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し得るものであり、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす、請求項１から２２のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２４】
前記細胞が、ＴＬＲ２又はＴＬＲ９に作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は遺伝子治療で使用する導入遺伝子を発現する組換えＡＡＶウイルスのいずれかによる細胞の感染に応答する、請求項１から２３のいずれかに記載の細胞。
【請求項２５】
例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の細胞又は細胞株の使用。
【請求項２６】
前記自動化アッセイが、例えばＧｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムなどの任意のＥＬＩＳＡタイプのアッセイ又はアッセイプラットフォーム、又は例えばＢｉａｃｏｒｅシステムなどのＳＰＲを使用する無標識検出である、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
以下を含むキット又はパーツのキット：
ｉ）請求項１〜２４のいずれかに記載の細胞；
ｉｉ）抗体に特異的な内因性標的が無効化された（変異された）細胞；及び
ｉｉｉ）抗体が特異的な標的の発現が増強されている細胞。
【請求項２８】
前記標的がＣＤ２０、ｍＴＮＦアルファ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記キットは、２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）における細胞が最適なＥ：Ｔ比で一つの同じバイアル中に存在している、請求項２７〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
ｉ）における細胞とｉｉｉ）における標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１〜約２:１の範囲、又は例えば約６:１、又は例えば約３：１、又は例えば約１．５：１である、請求項２７〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
ｉ）及びｉｉｉ）における細胞が、捕捉及び検出抗ルシフェラーゼ抗体の最適濃度とともに最適Ｅ：Ｔ比で一つの同じバイアル中に存在する、請求項２７〜３０のいずれかに記載のキット。
【請求項３２】
例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項３３】
前記自動化アッセイが、例えばＧｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムなどのＥＬＩＳＡタイプのアッセイ又はアッセイプラットフォーム、又は例えばＢｉａｃｏｒｅシステムなどのＳＰＲを使用する無標識検出である、請求項３２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自動化イムノアッセイプラットフォームを使用して、治療用抗体の効力を決定し、抗体反応を中和し、エフェクター細胞機能を決定する方法における新規システム及びその使用に関する。本発明によるシステムは、診断の状況で使用され得るキット又はパーツのキットで使用され得る。重要なことに、本発明によるシステムは、組換え又は天然の治療用タンパク質、又は治療用抗体、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって発現される導入遺伝子の使用に基づく治療の有効性、又は治療用タンパク質若しくは治療用抗体、組換えウイルス、又はエフェクター細胞機能の誘導の場合には有利であるか、若しくは免疫寛容の中断及び抗薬物抗体の産生の場合には不利となり得る養子療法で使用される細胞によって誘発される免疫応答を決定するために使用できる。
【背景技術】
【０００２】
組換えバイオ医薬品の繰り返し投与は、免疫寛容の破壊（１）及び抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生につながり得る。薬物動態、薬力学、バイオアベイラビリティ、及び有効性に悪影響を与えることに加えて、ＡＤＡは免疫複合疾患、アレルギー反応、場合によっては重度の自己免疫反応も引き起こす可能性がある。特定のタイプのＡＤＡは、タンパク質治療薬の活性を中和する場合がある。中和抗体（ＮＡｂ）は、タンパク質の活性部位内又はその近くのエピトープに直接結合するか、細胞表面受容体への薬物の結合を妨げるエピトープに結合することにより、バイオ医薬品の生物活性をブロックする。中和抗薬物抗体の開発は、特定の形態の癌、及び多発性硬化症や関節リウマチなどの自己免疫又は炎症性疾患を含む慢性疾患の治療において特に関心事である。ＡＤＡは、患者が治療に応答しないという結果をもたらし、ＥＰＯ又はトロンボポエチンなどの必須の豊富に存在するわけでもない内因性タンパク質と交差反応するＮＡＢの場合には、生命を脅かすことすらあるかもしれない（２、３）。薬物誘発性免疫グロブリンＩｇＥ抗体は、重篤なアナフィラキシー反応も引き起こす可能性がある（４）。ＡＤＡはまた、治療中止後も長期間持続する可能性があり、それにより同じ薬物によるその後の治療が制限される（５）。したがって、免疫原性の評価は、前臨床試験と臨床試験の両方における薬物安全性評価の重要な要素であり、免疫原性が低く、より安全なバイオ医薬品の開発の前提条件である。
【０００３】
規制当局は、最初のスクリーニングイムノアッセイとそれに続く確認直交イムノアッセイでの陽性サンプルの検査からなる免疫原性の評価に、段階的アプローチの使用を推奨している（６、７）。確認された陽性サンプルは、次いで、中和抗体の存在について分析される。規制当局は、中和抗薬物抗体を検出及び定量化するために、研究中の薬物の作用機序を可能な限り密接に反映する細胞ベースのアッセイの使用を推奨している。免疫原性の研究では、多くの場合、数百又は数千の個々のサンプルをテストする必要があり、自動化イムノアッセイプラットフォーム技術の使用が必要とする。ブリッジングＥＬＩＳＡベースのスクリーニングや確認アッセイなどのイムノアッセイは、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙの電気化学発光（ＭＳＤ‐ＥＣＬ）、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＳＭＣ、Ａｌｐｃｏ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ又はＧｙｒｏｓなどの自動化アッセイプラットフォーム、又はＢｉａｃｏｒｅを含むＳＰＲシステムなどの無標識（ラベルフリー）の検出システムでの実行に容易に適合できるが、細胞ベースのアッセイは、このようなプラットフォームテクノロジーへの適応が困難である。同様に、多数の治療用抗体の活性は、抗体の可変領域の標的細胞表面上の特定の抗原への結合及び抗体のＦｃ部分と免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体との相互作用に続く免疫媒介エフェクター細胞機能により部分的に媒介される。抗体媒介性エフェクター機能（８、９）には、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が含まれる。抗体媒介免疫エフェクター機能の評価には、自動化イムノアッセイプラットフォームでの分析に適応するのが難しい細胞ベースのアッセイの使用が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書では、バイオ医薬品の効力の定量化、中和抗薬物抗体の検出、又はＣＤＣ、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰなどの免疫介在性エフェクター細胞機能の定量化のための、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイを含むレポーター遺伝子アッセイがＥＬＩＳＡを用いて、又はＧｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムなどの自動化アッセイプラットフォーム上で、又はＢｉａｃｏｒｅシステムのようなとしてＳＰＲを使用する無標識検出により、レポーター遺伝子細胞株及び／又は機器のいずれも再設計することなしに可能にする発明を説明する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
したがって、本発明は、例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける本発明による細胞株の使用に関する。
【０００６】
さらに、本発明は、例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける本発明によるキットの使用にも関する。
【０００７】
上記のように、使用は、例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイで使用できるようにするために、細胞株又はキットの修正又は適合を必要としない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、図の左側（ＬＨＳ）に抗ルシフェラーゼ抗体の対を用いる、ホタルルシフェラーゼの検出のためのブリッジングＥＬＩＳＡを，図の上部右側（ＲＨＳ）にｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイを、図の下のＲＨＳに、ストレプトアビジン被覆アッセイプレートに結合したビオチンで標識された一つの分子と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識された第二の抗ルシフェラーゼ抗体分子からなる特定の抗ルシフェラーゼ抗体ペアの使用に基づくルシフェラーゼ検出システムを示すものであり、ＨＲＰは細胞ベースのｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイによって検出される生物学的活性が、ＨＲＰ基質及び分光光度計を用いる光学濃度の定量の後、ブリッジングＥＬＩＳＡを用いて定量化されることを可能にする。
【０００９】
【図２】図２Ａは、試験した抗ルシフェラーゼ抗体のパネルの特性を示す。
【００１０】
図２Ｂは、捕捉抗体として使用した抗ルシフェラーゼ抗体Ａｂ‐１８５９２４（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）及びブリッジングＥＬＩＳＡにおける検出抗体として使用したＨＲＰ標識抗ルシフェラーゼ抗体Ａｂ‐６３５（Ａｂｃａｍ、ＵＫ）の性能を示す。
【００１１】
【図３】図３Ａは、２時間２５℃でインキュベートされた、社内ブロッキングバッファー（緩衝液）の相対的有効性と２つの市販のブロッキングバッファーのそれとを比較する、組換えホタルルシフェラーゼの検出のための、ＨＲＰ基質の添加及び分光光度計を使用して４５０ｎｍでの光学密度の定量化の前に、一対の抗ルシフェラーゼ抗体（コーティング抗体ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６４５６４；検出抗体ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）を使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出のための、ブリッジングＥＬＩＳＡの結果を示す。図３Ｂは、図３Ａのグラフに付随する測定値を含む表を示す。
【００１２】
【図４】図４Ａは、濃度を増加させたｂＦＧＦ（コーティング抗体ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２；検出抗体ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）で処理したＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出するための３，３’，５，５’‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びルミノールの相対的有効性を、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したホタルルシフェラーゼ活性の検出と比較したブリッジングＥＬＩＳＡの結果を示す。図４Ｂは、図４Ａのグラフに付随する測定値を含む表を示す。
【００１３】
【図５】図５Ａは、Ｏｎｅ  Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたホタルルシフェラーゼ活性の検出と比較した、Ｈｅｒ２を発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）標的細胞の存在下でＣＤ１６ａ応答性プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するｉＬｉｔｅ（登録商標）エフェクター細胞を使用するトラスツズマブのＡＤＣＣ活性の定量のためのアッセイから細胞抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出するための、ブリッジングＥＬＩＳＡ（コーティング抗体Ａｂｃａｍ社、英国、カタログ番号ＡＢ‐１８５９２４；ＨＲＰ標識検出抗体Ａｂｃａｍ社、英国、カタログ番号ＡＢ‐６３５）の結果を示す。図５Ｂは、図５Ａのグラフに付随する測定値を含む表を示す。
【００１４】
【図６】図６は、図の左側（ＬＨＳ）にＧｙｒｏｓＡＤＡ検出システムを、図の上部右側（ＲＨＳ）にｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイを、図の下のＲＨＳ上に、ストレプトアビジン被覆ビーズに結合したビオチンで標識された一つの分子と、Ａｌｅｘａ−６４７で標識された第二の抗ルシフェラーゼ抗体分子からなる特定の抗ルシフェラーゼ抗体ペアの使用に基づくルシフェラーゼ検出システムを示すものであり、Ａｌｅｘａ−６７はＧｙｒｏｓプラットフォームでの細胞ベースのｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイによって検出される生物学的活性の定量化を可能にする。あるいは、未標識の抗ルシフェラーゼアンカー及び検出抗体を、ビオチン又はＡｌｅｘａ‐６４７で標識した二次抗体と組み合わせて使用できる。
【００１５】
【図７】図７は、Ａｌｅｘａ‐６４７標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８１６４０）の、Ｇｙｒｏｓ検出システムにおける組換えホタルルシフェラーゼへの結合のプロファイル（図７Ａ）と、高容量の多孔性ビーズと標準スピン速度を使用したＧｙｒｏｓプラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出のための用量反応曲線（図７Ｂ）を示す。
【００１６】
【図８】図８は、Ｇｙｒｏｓ免疫検出系に対する組換えホタルルシフェラーゼの検出のための最適な条件を決定するための実験の結果を示す。図８Ａは、３．０又は３０μｇのいずれかの捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２）と１％に設定された光電子増倍管を使用したＧｙｒｏｓ検出システムでの組換えホタルルシフェラーゼへのＡｌｅｘａ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）の結合プロファイルを示す。図８Ｂは、２段階プロトコルで標準ビーズと１％光電子増倍管を使用した３．０、１０、又は３０μｇの捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２）を使用した高容量多孔性ビーズを備えたＧｙｒｏｓプラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出のための用量反応曲線を示す。
【００１７】
【図９】図９は、２段階プロトコルで高容量多孔質ビーズと２５％に設定した光電子増倍管を用いた３０μｇの捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２）及びＧｙｒｏｓ免疫検出プラットフォーム及びＡｌｅｘａ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８１６４０）を用いた濃度を増加させたｂＦＧＦで処理したＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物におけるホタルルシフェラーゼの検出を示す。結果は、図９Ａでは任意の単位として、図９ＢではｂＦＧＦ処理なしのＦＧＦ‐２１応答性細胞の対照サンプルと比較した誘導倍率として表される。
【００１８】
【図１０】図１０は、図１０ＡのＯｎｅ‐Ｇｌｏルシフェラーゼ検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して濃度を増加させたｂＦＧＦで処理したＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物におけるホタルルシフェラーゼ活性、並びに２段階プロトコルでの高容量多孔質ビーズ及び２５％に設定した光電子増倍管を用いた、Ｇｙｒｏｓ免疫検出プラットフォーム及びＡｌｅｘａ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８１６４０）及び３０μｇの捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２）を使用して検出したホタルルシフェラーゼの検出を示す（図１０Ｂ）。結果は、ｂＦＧＦ処理なしのＦＧＦ‐２１応答性細胞の対照サンプルに対する誘導倍率として表される。
【００１９】
【図１１】図１１は、図の左側（ＬＨＳ）にＭＳＤ  ＡＤＡ検出システムを、図の上部右側（ＲＨＳ）にｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイを、図の下のＲＨＳ上に、ストレプトアビジン被覆プレートに結合したビオチンで標識された一つの分子と、スルホ−タグ（Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ）でＦｃ部上で標識された第二の抗ルシフェラーゼ抗体分子からなる特定の抗ルシフェラーゼ抗体ペアの使用に基づくルシフェラーゼ検出システムを示すものであり、Ｓｕｌｆｏ−ＴａｇはＭＳＤプラットフォームでの細胞ベースのｉＬｉｔｅ（登録商標）ＮＡｂアッセイの定量化を可能にする。
【００２０】
【図１２】図１２は、同じ抗ルシフェラーゼ捕捉抗体ＡＢ‐２２２８６２（ＡｂＣａｍ  ＵＫ）及びＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識ヤギ抗マウス（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＣ‐５）又はロバ抗ヤギ（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＧ‐５）二次抗体をそれぞれ用いたＭＳＤ免疫アッセイプラットフォームにおける組換えホタルルシフェラーゼの検出について、モノクローナル抗ホタルルシフェラーゼ抗体ＭＡＩ１６８８０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ）とヤギポリクローナル抗ルシフェラーゼ抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ、英国）の有効性を比較するために設計された実験の結果を示す。
【００２１】
【図１３】図１３は、さまざまな濃度（０．１又は０．３μｇ／ｍｌ）の抗ルシフェラーゼモノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐２２２８６２）の、ポリクローナルヤギ抗ホタルルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８１６４０）及びＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識ロバ抗ヤギ二次抗体（ＭＳＤ、カタログ番号）と共に使用されるＭＳＤイムノアッセイプラットフォームの組換えホタルルシフェラーゼＲ３２ＡＧ‐５）とともに用いられる、ＭＳＤ免疫アッセイプラットフォームにおける組換えホタルルシフェラーゼの検出のための捕捉抗体としての有効性を比較する実験の結果を示す。
【００２２】
【図１４】図１４は、マイクロタイターアッセイプレートでＦＧＦ‐２１応答性細胞をｂＦＧＦの濃度を増加させて処理し、細胞の溶解及び細胞上清のＭＤＳプレートへの移動の前に、３７°Ｃで１８時間インキュベートする２段階手順の検出の有効性を、ＭＳＤプレートで直接実施したアッセイと比較する実験の結果を示す。抗ルシフェラーゼ捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ２２２８６２）を０．１μｇ／ｍｌの濃度で、ヤギ抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８１６４０）及びＳｕｌｆｏ‐タグ標識ロバ抗ヤギ二次抗体（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＧ‐５）とともに使用した。
【００２３】
【図１５】図１５は、図１５ＡのＭＳＤ検出プラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出の有効性を、図１５ＢのＧｙｒｏｓ免疫検出プラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼ活性の検出と比較する実験の結果を示す。結果は任意の単位で表される。
【００２４】
【図１６】図１６は、図１６ＡのＭＳＤ検出プラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出の有効性を、図１６ＢのＧｙｒｏｓ免疫検出プラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼ活性の検出と比較する実験の結果を示す。結果は、組換えホタルルシフェラーゼを含まない対照サンプルと比較した誘導倍率として表される。
【００２５】
【図１７】図１７Ａは、ストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００センサーチップに結合したシミアンウイルス５のＶ５タンパク質に対するビオチン化モノクローナル抗体を用いた組換えホタルルシフェラーゼの検出の特異性を決定する実験の結果を示す。
【００２６】
図１７Ｂは、ストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００センサーチップに結合したビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体（Ａｂ‐２２２８６２、ＡｂＣａｍ、英国）を使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出実験の結果を示す。
【００２７】
【図１８】図１８は、ストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００センサーチップに結合したビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体（Ａｂ‐２２２８６２、ＡｂＣａｍ、ＵＫ）を使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出実験の結果を示す。結果は、コントロールに対する相対単位のそれぞれの差として表される。
【００２８】
【図１９】図１９は、ストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００センサーチップに結合したビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体（Ａｂ‐２２２８６２、ＡｂＣａｍ、英国）を使用した組換えホタルルシフェラーゼの用量反応曲線を示す。
【００２９】
【図２０】図２０は、ストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００センサーチップに結合したビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体（Ａｂ‐２２２８６２、ＡｂＣａｍ、英国）を使用した組換えホタルルシフェラーゼの用量反応曲線とデータ分析を示す。
【００３０】
【図２１】図２１は、図の左側（ＬＨＳ）にＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＡＤＡ検出システムを、図の右上（ＲＨＳ）にｉＬｉｔｅ（商標）ＮＡｂアッセイを、図の下部ＲＨＳに、ビオチンでＦｃ部分で標識され、ストレプトアビジン被覆ドナービーズに結合した一つの分子と、そのＦｃ部分を介してジゴキシゲニンで標識されたアクセプタービーズに結合した２番目の抗ルシフェラーゼ抗体分子からなる特異的な抗ルシフェラーゼ抗体ペアの使用に基づくルシフェラーゼ検出システムを示し、ジゴキシゲニンはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームでの細胞ベースのｉＬｉｔｅ（商標）ＮＡｂアッセイの検出を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
発明の概要
治療剤の伝統的な細胞ベースの効力アッセイ又は薬物又は治療薬に対する中和抗体の定量のためのアッセイは、細胞増殖への効果（シミュレーション又は阻害）、その活性を容易に測定できるサイトカイン又は他の可溶性因子の産生、又はアポトーシス、細胞毒性等の誘導のような特定の薬物の活性（又は活性の阻害）の定量に基づいている。別のアプローチは、シグナル伝達を定量化することであり、これは可溶性標的又は細胞表面標的（受容体又は他の細胞表面結合分子）への薬物の結合に続くレポーター遺伝子を使用した薬物の作用メカニズムに直接関連する。レポーター遺伝子は、薬物の治療作用を媒介するために貢献するのと同じシグナル伝達経路によって活性化される。レポーター遺伝子は通常、ルシフェラーゼ（ホタル、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）、ガウシア（Ｇａｕｓｓｉａ）、ナノルシフェラーゼなど）などの蛍光又は発光、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又はｄｓＲＥＤなどの蛍光タンパク質、又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）若しくはプロテアーゼなどの酵素を使用して定量化できる、すぐに見えるタンパク質をエンコードする。本発明の原理は、細胞ベースのアッセイの過程中又はアッセイの終了時に産生されるレポーター遺伝子産物又は副産物が、分泌タンパク質について細胞培地又は細胞の上清のいずれかで、あるいはＰｒｏｍｅｇａ（カタログ番号Ｅ１９４１）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（カタログ番号Ｂ３３２１Ｓ）、又はＢｉｏｔｉｕｍ（カタログ番号９９９１２）で市販されているようなＮＰ４０又はＳＤＳなどの界面活性剤を含む受動溶解バッファーによる細胞の溶解の後に定量化されるということである。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）などのレポーター遺伝子産物は、次いで、実施例に示されるように各アッセイプラットフォームに特異的なデュアル検出系で標識されたホタルルシフェラーゼペアなどの遺伝子産物に特異的な一対の抗体（モノクローナル又はポリクローナル）を使用して、細胞上清又は細胞溶解物で検出される。適切な抗ルシフェラーゼ抗体は、原則として任意のタイプの抗ルシフェラーゼ抗体であってもよく、例えば以下を含んでもよい：抗Ｌｕｃ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）マウスモノクローナル抗体（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ（Ｂｉｏｒａｄ）カタログ番号ＭＣＡ２０７６）、抗Ｌｕｃ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）マウスモノクローナル（Ｇｅｎｗａｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈカタログ番号ＧＷＢ‐Ａ１８Ｄ６７）、ウサギ抗Ｌｕｃ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）モノクローナル抗体ＥＰＲ１７７９０（ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ１８５９２４）及びＡｌｅｘａ４８８標識ウサギ抗Ｌｕｃモノクローナル抗体（ＡｂＣａｍカタログ番号ａｂ２１４９５０）、抗‐Ｌｕｃ（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）マウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＮＢ６００‐３０７）、ウサギポリクローナル抗ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号ＮＢＰ２‐４２９１４）、ウサギモノクローナル抗ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）抗体（ＡｂＣａｍカタログ番号１８５９２５）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８標識ウサギ抗ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）モノクローナル抗体（ＡｂＣａｍ  カタログ番号ａｂ２１６１１３）、ビオチン標識ウサギポリクローナル抗ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）抗体（Ｂｉｏｒｂｙｔ、カタログ番号ｏｒｂ１９６９４５）、及び抗Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓルシフェラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＰＡ１１８１）。例えばホタルルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子産物の発現は、構成的プロモーターの制御下で例えばウミシイタケルシフェラーゼ又はナノルシフェラーゼのような第二のレポーター遺伝子産物の発現に対して正規化することができる。
【００３２】
したがって、本発明は、ＥＬＩＳＡにより定量される細胞ベースのアッセイを使用して、又はＭＳＤ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＳＭＣ、Ａｌｐｃｏ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、若しくはＧｙｒｏｓなどの免疫検出プラットフォーム又はＢｉａｃｏｒｅを含むＳＰＲシステムのような無標識検出システムを使用して検出される生物活性を初めて可能にする。
【００３３】
さらに、本発明は、効力アッセイ、ウイルス感染性の定量化、又は遺伝子治療に使用されるＡＡＶ導入遺伝子などのウイルスベクター又はウイルス導入遺伝子の効力の定量化などの複雑な細胞ベースのアッセイ、あるいはウイルスベクター又はウイルスベクターにより担持される導入遺伝子に対する抗薬物中和抗体又は中和抗体の検出のための、又はＥＬＩＳＡにより若しくはハイスループット免疫検出プラットフォームで分析されるＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣなどのエフェクター細胞機能のためのアッセイを、レポーター遺伝子細胞株及び／又はアッセイプラットフォームのいずれかも変更する必要性なく、初めて可能にする。また、同一の抗体、例えば、デュアル検出システムを用いて標識された抗ホタルルシフェラーゼモノクローナル抗体は、特定のプラットフォーム上で使用されるすべての異なる治療剤のために使用することができるが、現在は特定のアッセイプラットフォームを使用して分析される各薬物について異なる抗体ペアが必要とされているのである。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態では、治療用抗体のＡＤＣＣ活性の検出及び定量化を容易にするために、ＡＤＣＣエフェクターレポーター遺伝子細胞株及び薬物特異的標的細胞を、分析すべき薬物の適切な希釈液と混合する。エフェクター細胞（Ｅ）及び標的細胞（Ｔ）は、実験室で連続的に培養するか、個別に凍結して使用直前に解凍し、次いで適切な標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）で分析すべき薬物の適切な希釈液ととともに混合し、適切な時間インキュベートした後に、細胞を溶解し、ＦＬ特異抗体（モノクローナル又はポリクローナル）ペアを追加し、ＡＤＣＣ活性の定量化のためのアッセイプラットフォームに細胞溶解物上清のサンプルを追加する。あるいは、ＡＤＣＣエフェクターレポーター遺伝子細胞株と薬物特異的標的細胞は、細胞を凍結する前に最適なエフェクター（Ｅ）：標的細胞（Ｔ）比で、単独で又は適切な濃度の一対の抗ルシフェラーゼ抗体とともに、事前に混合することができる（「Ｃｏｍｂｏ」）。したがって、ＡＤＣＣエフェクターの「コンボ」バイアルを解凍し、最適なＥ：Ｔ比で凍結した薬物特異的標的細胞を、ＡＤＣＣ活性を定量すべき薬物の適切な希釈液と直接混合し、適切な時間インキュベートした後、細胞を溶解し、ＦＬ特異抗体（モノクローナル又はポリクローナル）ペアを追加（凍結前に抗体が細胞のバイアルに含まれていない場合）及び細胞溶解物上清のサンプルをＡＤＣＣ活性の定量化のためのアッセイプラットフォームに追加する。治療用抗体のＡＤＣＰ及び／又はＣＤＣ活性が標的細胞を用いて同様に定量化することでき、標的細胞は、プロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、ＡＤＣＰ又はＣＤＣ活性の評価を可能にするルシフェラーゼのようなプロテアーゼで切断可能なレポーター遺伝子産物を含有する。あるいは、プロテアーゼは、レポーター遺伝子タンパク質産物に立体構造変化を誘発し、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠されたエピトープの出現をもたらす可能性がある。本発明は、自動化アッセイプラットフォームを使用するＣＡＲ‐Ｔ細胞などの養子療法で使用される細胞の活性の定量化にも適用可能である。ＣＡＲ‐Ｔ活性は、ＡＤＣＰ又はＣＤＣアッセイについて前述したものと同じタイプの標的細胞を使用して定量化される。
【００３５】
本発明による使用に適した細胞株は、例えば、ＷＯ２００４／０３９９９０、ＷＯ２００８／０５５１５３、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７５０５３、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７５０５５、及びＥＰ１８１６２４８５．９に見出すことができ、これらは参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【００３６】
定義
本明細書で互換的に使用される「無効化」又は「ミュート」という用語は、特定の遺伝子をノックアウトして最終的に細胞の表現型を変化させることを意味する。事実上、この用語は、遺伝子を非機能的にすることを包含することを意味する。例として、表面細胞受容体の発現を除去するための特定の遺伝子の無効化がある。
【００３７】
「＋＋細胞」に関連する「＋＋」という用語は、抗原／受容体が過剰発現している標的細胞を意味することを意図している。この用語は、本明細書では「Ｔ＋」と交換可能に使用される。さらに、例えばＣＤ２０＋＋などの受容体又は抗原とともにこの表現が使用される場合、ＣＤ２０が問題の細胞で過剰発現されることを意味することを意図している。本発明の範囲を制限することを意図しない例として、ＣＤ２０の場合発現レベルは野生型ＣＤ２０＋Ｒａｊｉ細胞と比較してＣＤ２０＋＋標的細胞で約１６倍増加する。
【００３８】
「−／−細胞」に関連する「−／−」という用語は、抗原／受容体が発現されていない、すなわち関連遺伝子がノックアウト（無効化）され、問題の抗原／受容体の発現をミュートする標的細胞を意味するものとする。この用語は、本明細書では「Ｔ−」と交換可能に使用される。その結果、特定の抗原をコードする遺伝子が機能しなくなったため、細胞は抗体によって認識される検出可能なレベルの特定の抗原をもはや発現しない。本発明の文脈において、これは対照標的細胞とみなされ得る。
【００３９】
「Ｅ」という用語は、「エフェクター細胞」、特に本発明によるエフェクター細胞を意味することを意図している。「エフェクター細胞」という用語は、刺激に積極的に反応し、何らかの変化をもたらす（それをもたらす）あらゆるタイプの細胞を意味することを意図している。そのような例の一つは、サイトカイン誘導性キラー細胞であり、腫瘍細胞を溶解できる強力な細胞毒性エフェクター細胞である。さらなる例であり、本発明の文脈において、エフェクター細胞は、抗体のＦｃ領域に結合する細胞の表面上にＦｃガンマ受容体（ＦＣγＲ又はＦＣＧＲ）を有する任意の細胞を意味することが意図され、ここで前記抗体自体は標的細胞に特異的に結合できるものである。
【００４０】
用語「Ｔ」は、「標的細胞」、すなわち特定のホルモン、抗原、抗体、抗生物質、感作Ｔ細胞、又は他の物質と反応する特定の受容体／抗原を有する細胞を意味することを意図している。それに関連して、用語「（Ｔ＋）」は、抗原陽性標的細胞、したがってその表面に抗原を発現し、抗体の結合を可能にする細胞を意味することを意図している。対照的に、「（Ｔ−）」という用語は、抗原陰性標的細胞（対照標的細胞）、したがってその表面に抗原を発現せず、したがって抗体と反応することができない細胞を意味することを意図している。言い換えると、特定の抗原をコードする遺伝子が機能しなくなったため、抗原−／−細胞（又はＴ−細胞）は、ＡＤＣＣ活性について試験されている抗体によって認識される検出可能なレベルの特定の抗原を発現しない。具体的には、本発明に従って使用される標的細胞は同じタイプの細胞であり、これは通常Ｔ＋細胞として一つの細胞型を使用し、Ｔ−細胞として別の細胞型を使用する既知の方法とは対照的である。言い換えると、相同対照標的細胞は、アッセイされる抗体によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いて、抗原陽性標的（Ｔ＋）細胞とすべての点で全く同じ細胞である。前述のように、これは、Ｔ細胞（Ｔリンパ球）の使用とは対照的であり、例えば、ＣＤ２０発現Ｂ細胞標的細胞を使用したリチキシマブ活性の定量化の対照標的細胞としてしばしば使用される。
【００４１】
「ＮＨＳ」という用語は、例えば生体試料中の正常なヒト血清を意味することを意図している。
【００４２】
用語「自動化アッセイ」は、自動化された又は少なくとも部分的に自動化された設定、例えばロボット処理及び／又はアッセイの実行の使用に使用されるように設計された任意のアッセイプラットフォームを意味するように意図される。プラットフォームは、原則として、例えばマイクロタイタープレートなどのマルチウェルシステムの使用などの任意の形式、又は任意のタイプの容器を含む他の形式であり得る。通常、自動化アッセイは、完全ないわゆるハンズフリー（すなわち、アッセイ手順の手動処理を必要としない）又はアッセイ手順の少なくとも一部の手動監視を必要としないウォークアウェイアッセイとして使用できる。自動化は、各容器内のさまざまな量の液体の測定及び分配、及び／又はさらなる処理及び分析のためのアッセイの出力の測定を含むことができる。
【００４３】
さらに、用語「自動化アッセイ」は、複数のサンプルが分析物の存在について同時に又は並行して、分析物に対する抗体を用いて、ここで抗体は溶液中にあるか又は表面に直接付着しており、又はビオチンとストレプタビジンとの相互作用を介して、又は二次抗体を間接的に使用して、そして自動プラットフォームを使用して検出できるように直接的に又は間接的に標識された二次抗体を使用する分析物の検出、又は質量や回折などの物理的属性の変化の定量化による分析物の検出により分析されるシステムを含んでもよい。
【００４４】
用語「イムノアッセイ」は、抗体又は抗原の使用を介して溶液中のマクロ分子又は小分子の存在又は濃度を測定する生化学試験を意味することが意図されている。
【００４５】
「ベクター」又は「ベクター構築物」という用語は、組換え遺伝物質を宿主細胞に移すための媒体として使用されるＤＮＡ分子を指す。ベクターの４つの主要なタイプは、プラスミド、バクテリオファージ及びその他のウイルス、コスミド、及び人工染色体である。ベクター自体は一般に、挿入物（異種核酸配列、導入遺伝子）と、ベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。遺伝情報を宿主に伝達するベクターの目的は、通常、標的細胞で挿入物を単離、増殖、又は発現させることである。発現ベクター（発現構築物）と呼ばれるベクターは、標的細胞での異種配列の発現に特に適合しており、一般に異種配列の発現を促進するプロモーター配列を持っている。本発明の実施形態で使用されるベクターの選択は、ポリペプチド又はポリヌクレオチドをコードするベクターの特定の用途に依存する。
【００４６】
「作動可能に連結された」（operatively linked）又は「作動可能に連結された」（operably linked）という用語は、遺伝子又はオープンリーディングフレームなどの機能単位の一部である要素の連結を指す。したがって、ポリペプチド（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）をコードする核酸配列にプロモーターを機能的に連結することにより、２つの要素は機能ユニットの一部、つまり遺伝子になる。発現制御配列（プロモーター）の核酸配列への連結により、プロモーターによって指示される核酸配列の転写が可能になる。ポリペプチドをコードする２つの異種核酸配列を機能的に連結することにより、配列は機能ユニットの一部‐異種核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームになる。２つのアミノ酸配列を機能的に連結することにより、配列は同じ機能単位（ポリペプチド）の一部になる。２つの異種アミノ酸配列を作動可能に連結すると、ハイブリッド（融合）ポリペプチドが生成される。
【００４７】
発明の詳細な説明
本発明は一つ以上の細胞株に関する。細胞は原則として、哺乳動物又は非哺乳動物細胞、真核細胞又は原核細胞などの任意の細胞であり得る。一つの態様では、細胞は、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞である。さらに別の態様では、細胞は鳥類細胞であってもよい。その他の非制限的な例は、脊椎動物細胞、植物プロトプラスト、真菌及び酵母細胞、及び細菌細胞である。さらなる非限定的な例は、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ‐１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ‐４０、ＰＩＬ‐５、又はＭＳＢ‐１である。
【００４８】
一つの態様では、本発明は、下流プロモーターに作動可能に連結されたシス作用性調節配列を含むポリヌクレオチドに関し、ＮＦ‐ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５の一つ以上は前記シス作用性調節配列に結合することができる。一つの態様では、発明はポリヌクレオチドに関し、前記ＮＦ‐ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５はすべて、前記シス作用性調節配列に結合することができる。
【００４９】
本発明によるポリヌクレオチドは、第一のレポータータンパク質をコードするオープンリードフレーム配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。一つの態様では、レポーターは、例えばルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質などの酵素である。
【００５０】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号１と同一のＤＮＡ配列に対して、少なくとも約７０％配列同一性、例えば少なくとも約７５％配列同一性、例えば少なくとも約８０％配列同一性、例えば少なくとも約８５％配列同一性、例えば少なくとも約９０％の配列同一性、例えば少なくとも約９５％の配列同一性、例えば少なくとも約９８％の配列同一性、例えば少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。ここで配列番号１は
【化１】
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である。
【００５１】
本発明はまた、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクター構築物に関する。ベクターはプラスミド又はウイルスベクターであり得る。
【００５２】
本発明はまた、上記ベクターを含む細胞に関し、ここで、前記ベクターはエピソームであるか、又は前記細胞のゲノムに組み込まれている。本発明による細胞は、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質をさらに発現し得る。
本発明はまた、以下を含むキットに関する：
ｉ）抗体のＦｃ領域に結合することができる、配列番号１を有するポリヌクレオチドを更に含むベクターを含む、本発明によるエフェクター細胞（Ｅ）；
ｉｉ）前記抗体に特異的な内因性標的／抗原が、標的／抗原が細胞によって発現されないように無効化（変異）された細胞（Ｔ−）；及び
ｉｉｉ）前記抗体に特異的な標的の発現が増強又は過剰発現されている標的細胞（Ｔ＋）。
【００５３】
本発明によるキットは、ｉｉ）における細胞及びｉｉｉ）における細胞が、ｉｉ）における細胞がアッセイされる抗体又は薬物によって認識される特異的抗原を発現しないことを除いては、すべての点で全く同一の細胞である。本発明によるキットは、標的／抗原がＣＤ２０、ｍＴＮＦα、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲの一つ以上であるものであってもよい。
【００５４】
さらに、本発明によるキットは、２つのバイアルを含むことができ、ｉ）及びｉｉｉ）の細胞は、最適なＥ：Ｔ比で一つの同一のバイアルに存在する。ｉ）におけるエフェクター細胞とｉｉｉ）における標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）は約２４：１〜約２：１、又は約６：１、又は約３：１、又は約１．５：１の範囲である。
【００５５】
本発明はまた、治療用抗体で治療された患者からの臨床サンプルにおけるエクスビボでの抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を定量化する方法に関し、該方法は以下を含む；
ａ）抗体の投与を含む治療を受けている患者から得られたサンプルを、本発明による標的細胞ｉｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ）薬物標的が無効化された本発明による細胞ｉｉ）の存在下で得られたシグナルを、本発明によるエフェクター細胞ｉ）及び本発明による標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから差し引くステップ、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定されたシグナル関係に基づいてＡＤＣＣ活性を決定し、エフェクター細胞ｉ）＆ターゲット＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）≧１の場合、血清サンプルの陽性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）が存在するとし、エフェクター細胞ｉ）＆標的＋＋細胞ｉｉｉ）の値／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）の値≦１の場合、血清サンプルの陰性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性がない）が存在するとし、以下の式を使用する。
［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋  ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、ここで（Ｅ）は項目８‐１０のいずれかのエフェクター細胞である。（Ｔ＋）細胞は項目１１  ｉｉｉ）に記載の細胞であり、（Ｔ−）はパラグラフｉｉ）に記載の細胞であり、ＮＨＳ＝正常ヒト血清試料である。
【００５６】
さらなる態様において、本発明はまた、ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補償する方法に関し、この方法は、細胞ｉ）、すなわち本発明による細胞の存在下で得られたシグナルを、本発明による標的細胞ｉｉｉ）及びエフェクター細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルから減算することを含む。本発明による標的細胞ｉｉｉ）及びエフェクター細胞ｉ）は、検討している抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す薬物標的又は血清試料を発現するものであり、この時エフェクター細胞ｉ）＆標的陰性細胞ｉｉ）＞１であり、使用する式は［（Ｅ＋Ｔ＋＋薬物＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋、又は［（Ｅ＋Ｔ＋＋ＮＨＳ）−（Ｅ＋Ｔ−＋ＮＨＳ）＋（Ｅ＋Ｔ＋）］／Ｅ＋Ｔ＋であり、ここで（Ｅ）は本発明のエフェクター細胞であり、（Ｔ＋）細胞は本発明による細胞であり、（Ｔ−）は段落ｉｉ）による細胞であり、ＮＨＳ＝正常ヒト血清サンプルである。
【００５７】
別の態様では、本発明は以下のいずれかを過剰発現するように操作されたエフェクター細胞に関する。低親和性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６Ａ）Ｖ若しくはＦ変異体、又はＦｃγ応答ＲＩＩａ（ＣＤ３２）Ｈ若しくはＲ変異体、これらはＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子の活性化、又は上記のホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）リポーター遺伝子に操作可能に連結したＮＦ‐ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ５の結合部位を含む合成キメラプロモーターの活性化による、標的細胞に発現した特定の抗原に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答する。
【００５８】
本発明の別の態様では、エフェクター細胞は以下のいずれかを過剰発現するように操作されている。例えば、高親和性Ｆｃ受容体、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、又は例えば低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ１（ＣＤ３２）、又は低親和性Ｆｃ阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢ２（ＣＤ３２）、又は低親和性Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６Ｂ）、これらはＮＦＡＴ応答性レポーター遺伝子の活性化によって、又は本明細書に開示されるホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）レポーター遺伝子に操作可能に連結されたＮＦ‐ＡＴ、ＡＰ１、ＮＦｋＢ、及びＳＴＡＴ５の結合部位を含む新規合成キメラプロモーターの活性化によって、標的細胞上に発現した特定の抗原に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答する。
【００５９】
一つの態様では、本発明は、ベクター構築物が、共刺激分子ＣＤ２８、共刺激分子ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ）、共刺激分子ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）、共刺激分子ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）から選択される一つ以上をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、又は共刺激分子がＣＤ２８、ＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢ）、及びＩＣＯＳの一つ以上から選択される受容体である、細胞に関する。
【００６０】
一つの態様において、本発明による細胞は、一つ以上の共刺激分子が細胞上で構成的に発現されるか又は過剰発現されるようなものである。細胞はさらにＣＤ１６Ａ又はＣＤ３２を発現し得る。
一つの態様では、本発明による細胞は、ＣＴＬＡ‐４（ＣＤ１５２）が特異的に無効化されるようなものである。
【００６１】
上述のように、本発明による細胞は、第一のレポータータンパク質を発現する構築物を含んでもよい。第一のレポータータンパク質は、例えばルシフェラーゼ又は蛍光タンパク質などの酵素であり得る。
細胞は、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現するようにさらに操作されてもよい。
【００６２】
さらに、本発明による細胞は、抗体又はＦｃ融合タンパク質によって認識される抗原をさらに発現又は過剰発現してもよい。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、治療用抗体の抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）活性を定量化する方法に関し、以下のステップを含む：
ａ）抗体、エフェクター細胞ｉ）及びを含む得られたサンプルを本発明による標的細胞ｉｉｉ）と接触させる、
ｂ）エフェクター細胞ｉ）及び本発明による細胞ｉｉ）の存在下で得られたシグナル（ここで薬物標的は無効化されている）を、本発明によるエフェクター細胞ｉ）及び本発明によるターゲット細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから減算する、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定されたシグナル関係に基づいてＡＤＣＰ活性を決定する。
【００６４】
一実施形態では、レポーター遺伝子（第一のレポーター遺伝子）は酵素をコードする。好ましい実施形態では、レポーター（第一のレポーター）は、ホタルルシフェラーゼ又はウミシイタケルシフェラーゼなどのルシフェラーゼである。
【００６５】
別の実施形態において、レポーター遺伝子（第一のレポーター遺伝子）は蛍光タンパク質をコードし、第一のレポータータンパク質は蛍光タンパク質である。有用な蛍光タンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及び関連蛍光タンパク質が含まれ、たとえば、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及び異なる励起／発光スペクトルを表示する変種が含まれる。
【００６６】
有用な構成的活性プロモーターには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＵＢＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ヒトβ‐アクチン（ｈＡＣＴＢ）、ヒト伸長因子‐１α（ｈＥＦ‐１α）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター及びサイトメガロウイルス初期エンハンサー／ニワトリβ‐アクチン（ＣＡＧ）プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
好ましい実施形態では、第一のレポータータンパク質はルシフェラーゼであり、第二のレポーター（構成的に発現される）もルシフェラーゼであるが、ルシフェラーゼは同じではない。このように、両方のルシフェラーゼの活性は容易に検出可能であり、アッセイプレートの同じウェルで連続して読み取ることができる。例えば、レポーター遺伝子構築物がホタルルシフェラーゼ（第一のレポータータンパク質）を産生する場合、構成的産生は、第二のルシフェラーゼ（第二のレポータータンパク質）、例えばウミシイタケルシフェラーゼであってもよい。第二のルシフェラーゼの活性に対して正規化された第一のルシフェラーゼの活性は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１１／０１８９６５８号に記載されている。アッセイを実施する場合、最初のレポーター遺伝子ルシフェラーゼが測定された後、試薬を加えて特定のルシフェラーゼをクエンチし、その後の読み取りで構成的コンストラクトからルシフェラーゼを読み取って、標準化の目的に使用できるようにする。
【００６８】
本発明の別の態様では、哺乳動物細胞であり得る細胞は、（ｉ）下流プロモーター配列に作動可能に連結された異種シス作用性調節配列を含む第一の異種ポリヌクレオチド、ここで前記プロモーターは第一のレポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている、
（ｉｉ）キメラ転写因子をコードする第二の異種ポリヌクレオチド、ここで前記キメラ転写因子は、前記シス作用性調節配列に結合することができる異種ＤＮＡ結合ドメインに融合したＥｌｋ‐１のトランス活性化ドメインを含み、及び
（ｉｉｉ）チロシンキナーゼＦＧＦＲ１ｃ及びβ‐Ｋｌｏｔｈｏタンパク質を含む細胞表面結合ヘテロ二量体受容体タンパク質、を含む。
【００６９】
一つの態様において、ＤＮＡ結合ドメインは哺乳動物細胞には存在しない。
【００７０】
さらなる態様において、異種ＤＮＡ結合ドメイン及びその同系のシス作用性調節配列は、酵母又は細菌起源のものであり得る。
【００７１】
シス作用性調節配列は上流活性化配列（ＵＡＳ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインは、前記上流活性化配列と結合することが可能なＤＮＡ結合ドメインである。
【００７２】
一つの態様では、シス作用性調節配列はガラクトース応答性上流活性化配列（ＵＡＳＧ）であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインはＤＮＡ結合ドメインガラクトース応答性転写因子ＧＡＬ４（ＧＡＬ４ＤＢ）である。
【００７３】
別の態様では、シス作用性調節配列はＬｅｘＡのＤＮＡ結合部位であり、前記異種ＤＮＡ結合ドメインはリプレッサーＬｅｘＡタンパク質のＤＮＡ結合ドメインである。
【００７４】
本発明による細胞は、β‐Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする下流のオープンリーディングフレームに操作可能に連結され、前記β−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質が発現されるプロモーターを含み、ここでβ−Ｋｌｏｔｈｏタンパク質をコードする前記オープンリーディングフレームは前記細胞での発現のためにコドン最適化されている。
【００７５】
一つの態様では、本発明は、哺乳動物細胞であり得る細胞に関し、前記オープンリーディングフレームは、配列番号２に記載の配列、又は配列番号２と少なくとも７５％の配列同一性、例えば配列番号２と７９％の配列同一性、例えば配列番号２と８５％の配列同一性、例えば配列番号２と９０％の配列同一性、例えば配列番号２と９５％の配列同一性、例えば配列番号２と９７％の配列同一性、例えば配列番号２と９８％の配列同一性、例えば配列番号２と９９％の配列同一性を有する配列を含むか又はからなる。
【００７６】
第一のレポータータンパク質は酵素であってもよく、前記第一のレポータータンパク質はルシフェラーゼであってもよい。
【００７７】
上述のように、本発明による細胞は、第二のレポータータンパク質をさらに発現することができ、ここで、前記第二のレポータータンパク質は構成的プロモーターから発現される。
【００７８】
一の態様では、本発明による細胞は、ＨＥＫ２９３、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ６５２及びＵ９３７を含む群から選択される細胞株とすることができる。
さらなる態様において、本発明による細胞はＨＥＫ２９３から選択された細胞株とすることができる。
【００７９】
本発明はまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０３９９９０及び／又はＷＯ２００８／０５５１５３に開示されているような細胞に関する。
【００８０】
結果として、本発明はまた、細胞外シグナルに応答した細胞表面タンパク質のシグナル伝達活性により調節される一つ以上の転写制御エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子構築物で形質転換された細胞に関し、前記細胞は、前記シグナル伝達活性を失う前に凍結より高い温度で少なくとも約１時間、約３０日以下の間、前記シグナル伝達活性を維持するように処理されている。
【００８１】
細胞は凍結状態であってもよく、上記の前記処理は細胞が凍結される実質的に直前に前に生じている。
【００８２】
細胞は抗有糸分裂及びアポトーシス促進剤で処理し、次いで凍結保存剤を含有する溶液に再懸濁し、前記細胞が少なくとも約１時間、ただし約３０日以下の間、前記シグナル伝達活性を喪失する前に凍結より上の温度で前記シグナル伝達活性を維持するようにしておいてもよい。
【００８３】
処理された細胞は、処理された後、実質的に直後に約８０℃で凍結され、次いで凍結保存剤を含有する溶液に再懸濁されてもよい。
【００８４】
凍結保存剤は、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又は例えばグリセロールのような当技術分野で公知の任意の他の凍結保存剤であってもよい。
【００８５】
一つの態様において、凍結保存剤は溶液中例えば約１０％の量のＤＭＳＯであってもよい。
【００８６】
さらに、凍結保存剤は、約２．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と１０％のグリセロールの組み合わせであってもよい。
【００８７】
一つの態様では、抗有糸分裂剤及びアポトーシス促進剤はビンブラスチンであり得る。
別の態様では、抗有糸分裂剤及びアポトーシス促進剤は５‐フルオロウラシルであり得る。
【００８８】
本発明による細胞は、前記細胞が少なくとも約１時間、ただし約３０日以下の間、前記シグナル伝達活性を喪失する前に凍結より上の温度で前記シグナル伝達活性を維持するような強度で、十分な時間で、γ放射線を照射されていてもよい。
【００８９】
γ放射線の強度及び時間は、例えば約６から例えば約１２（Ｇｙ）であり得る。
【００９０】
凍結より上の温度は室温でもよい。
表面タンパク質は細胞表面受容体であることができ、該細胞表面受容体は、サイトカイン受容体、成長因子受容体、ホルモン受容体、神経受容体、Ｔ細胞受容体、抗原受容体、及び補体受容体から選択される。
【００９１】
一つの態様では、細胞表面受容体はＩ型インターフェロン受容体であってもよく、前記細胞外シグナルはＩ型インターフェロンによって提供される。
【００９２】
さらなる態様では、一つ以上の転写制御エレメントがインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）を含むことができ、該ＩＳＲＥは配列番号３のヌクレオチド配列を含む。
【００９３】
一方では、細胞表面受容体はＩＩ型インターフェロン受容体であってもよく、前記細胞外シグナルはＩＩ型インターフェロンによって提供される。
【００９４】
一つの態様では、一つ以上の転写制御エレメントは、ガンマ活性化配列（ＧＡＳ）を含み得る。
【００９５】
本発明の一つの態様では、細胞表面受容体はインターフェロン受容体であり、細胞外シグナルは、Ｉ型インターフェロン及び／又はＩＩ型インターフェロンによって提供され得る。
【００９６】
さらなる態様では、一つ以上の転写制御エレメントはインターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）及びガンマ活性化配列（ＧＡＳ）を含み得る。
【００９７】
本発明によれば、レポーター遺伝子産物は、例えばホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、クラゲエクオリン、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ｄｓＲＥＤ、ｓｓ‐ガラクトシダーゼ、及びアルカリホスファターゼを含む群から選択され得る。
【００９８】
一つの態様では、レポーター遺伝子産物はホタルルシフェラーゼである。
別の態様では、レポーター遺伝子産物は強化された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である。
【００９９】
さらなる態様では、レポーター遺伝子産物はクラゲのエクオリンである。
一つの態様では、細胞はＰＩＬ５細胞であり得る。
【０１００】
さらなる態様では、本発明はまた、第一の細胞外シグナルに応答する第一の細胞表面分子又は複合体によって開始されるシグナル伝達経路の一部として活性化される転写制御エレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子構築物で形質転換された細胞株に関するものであり、ここでシグナル伝達経路は、転写制御エレメントに結合して該転写制御エレメントを活性化し、それによりレポーター遺伝子の転写を調節する転写因子を含むものであり、改良により細胞外シグナルに対する細胞株の反応の感度及び／又は特異性が改善され、ここで：
ａ）前記転写制御エレメントは、前記第一の細胞外シグナルに応答して前記第一の細胞表面分子又は複合体により開始されるシグナル伝達経路の一部として活性化される天然の転写制御エレメントの修飾であるか、又は前記第一の細胞表面分子又は複合体によって活性化されるが、他の転写因子に対する応答エレメントを欠く前記転写因子に特異的な最適数の応答エレメントを含む合成プロモーターであり、転写制御エレメントの感度及び／又は特異性が天然の転写制御エレメントに比べて改善される；及び／又は
ｂ）前記細胞株の細胞は、第二の細胞外シグナルに応答する第二の細胞表面分子、又は応答する複合体の一部を欠いており、その第二の細胞外シグナルは、もし前記第二の細胞表面分子が存在していれば、前記レポーター遺伝子の転写を調節するシグナル伝達経路の開始を引き起こすだろう。
【０１０１】
天然の転写制御エレメントの修飾は、該天然転写制御エレメントの部位特異的突然変異誘発及び天然転写制御エレメントの感度及び／又は特異性を改善する修飾の選択により得ることができる。
【０１０２】
また、天然転写制御エレメントの修飾は、他の転写因子のための結合部位を欠く一方で、前記転写因子の結合部位の天然又はコンセンサス配列のタンデムリピートを含む合成ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０３】
一つの態様において、転写因子はＮＦＫβである。
一つの態様において、転写因子ＮＦＫＢの結合部位のタンデムリピートは、配列番号４の配列からなる。
【０１０４】
一つの態様において、細胞株は前記第二の細胞表面分子なしで天然に存在する。
【０１０５】
さらなる態様では、第一の細胞外シグナルは腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）であってもよく、第二の細胞外シグナルは、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及び／又はインターロイキン２（ＩＬ２）であってもよい。
【０１０６】
本発明による細胞株の細胞は、前記第二の細胞表面分子をノックアウトするように遺伝的に操作されていてもよい。
【０１０７】
さらなる態様では、第一の細胞外シグナルはインターフェロン‐γ（ＩＦＮγ）であってもよく、前記第二の細胞外シグナルはインターフェロン‐α（ＩＦＮα）及び／又はインターフェロン‐β（ＩＦＮβ）である。
【０１０８】
さらなる態様において、前記第一の細胞表面分子又は複合体の少なくとも細胞外部分は、第一の種の細胞表面分子又は複合体のものであり、前記細胞株の細胞は前記第一の細胞表面分子又は複合体においてノックするように遺伝子操作された第二の種の細胞である。
【０１０９】
一つの態様では、第一の及び／又は第二の細胞表面分子又は複合体は細胞表面受容体であり得、前記第一の及び／又は第二の細胞表面分子又は複合体はパターン認識受容体である。
【０１１０】
したがって、本発明は、自動化アッセイ又はアッセイプラットフォームにおける本発明による細胞又は細胞株の使用にも関する。自動化アッセイは、部分的又は完全に自動化されたアッセイ又は任意の形式でアッセイを実行する手順に使用される任意のプラットフォームを含み得ることを理解されたい。非限定的な例は、任意の文脈でのＥＬＩＳＡのような任意のアッセイ、Ｇｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムのような自動化アッセイプラットフォーム、又は、ＢｉａｃｏｒｅシステムのようなＳＰＲを使用ｓｕｒｕ無標識検出によるものである。
【０１１１】
本発明の利点は、本明細書に開示される細胞を修飾する必要がなく、及び／又は本発明による細胞の使用のためにアッセイプラットフォームを改変又は適合させる必要がなく、それでもなお信頼性が高く、堅牢で安定なアッセイ及びその結果を提供できることである。
【実施例】
【０１１２】
例１
ブリッジングＥＬＩＳＡでは、薬物（小分子、ペプチド、又はバイオ医薬品）が、該薬物と、固体表面（通常は９６又は３８４ウェルのマイクロタイタープレート）に直接結合した薬物の一つのエピトープに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、又はビオチン（それが今度はストレプトアビジン被覆表面、通常は９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート又はストレプトアビジン被覆ビーズに結合する）で標識された薬物の一つのエピトープに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の一つの分子、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又は薬物のレベルの定量に広く使用される別の適切なマーカーで標識された薬物の第二のエピトープに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の別の分子との間のブリッジの形成によって検出される（図１）。同様に、サンプル中の抗薬物抗体の存在は、薬物の二つの分子と、固体表面（通常は９６又は３８４ウェルのマイクロタイタープレート）に直接結合した薬物の一つのエピトープに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）、又はビオチン（それが今度はストレプトアビジン被覆表面、通常は９６又は３８４ウェルマイクロタイタープレート又はストレプトアビジン被覆ビーズに結合する）で標識された薬物に対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の一つの分子、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又は抗薬物抗体の定量に広く使用される別の適切なマーカーで標識された薬物の第二のエピトープに対する抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の別の分子との間のブリッジの形成によって検出される（図１）。同様に、一次アンカー及び検出抗ルシフェラーゼ抗体の両方を、一次アンカー及び検出抗ルシフェラーゼ抗体に対する二次検出抗体（モノクローナル又はポリクローナル）と組み合わせて使用してもよい。
【０１１３】
ホタルルシフェラーゼに対する一連の６種類の市販の抗体（図２Ａ）を組換えホタルルシフェラーゼに結合する能力について試験した（図２Ｂ）。結果は、ルシフェラーゼを使用しない場合のバックグラウンド測定値に対するシグナルの増加倍率として表され、この時、市販の基質（Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ、Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用したホタルルシフェラーゼ活性の定量化で得られた値（図２Ｂ）と比較した捕捉又は検出抗体として使用した。組換えホタルルシフェラーゼの検出に最適な組み合わせは、１００ｎｇ／ウェルの濃度で被覆抗体として使用される抗体Ａｂ‐１８５９２４（ＡｂＣａｍ、英国）と、検出抗体として１／２０，０００の希釈で使用されるＨＲＰ（ＡｂＣａｍ、英国）で標識された抗体Ａｂ‐６３５であることが見出された（図２Ｂ）。社内ブロッキングバッファーの使用と２つの市販のブロッキングバッファーの使用との間に大きな違いは観察されなかった（図３）。ＨＲＰは、３，３’，５，５’‐テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質及びルミノメーターを使用するシグナルの定量を使用して、又はＯｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質によるルシフェラーゼ活性の測定で得られるレベルに匹敵する検出レベルが得られるルミノール基質を使用して化学発光によって定量化できた（図４）。
ＦＧＦ‐２１及びｂＦＧＦ応答性プロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＦＧＦ‐２１応答性細胞を、マイクロタイターアッセイプレートでｂＦＧＦ濃度を増加させて処理し、３７℃で１８時間インキュベートした後、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）を使用したホタルルシフェラーゼ活性の定量、及び細胞の溶解、及びビオチン標識抗ルシフェラーゼ捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８５９２４）及びＨＲＰ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）を使用したホタルルシフェラーゼの定量を行った（図４に示すように）。結果は、左パネルにｂＦＧＦ処理なしのＦＧＦ‐２１応答性細胞の対照サンプルに対する誘導倍率として、右パネルに任意の単位として表される（図５）。抗ホタルルシフェラーゼ抗体を使用して、ｂＦＧＦの濃度を増加させて処理したＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出すると、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質でルシフェラーゼ活性を測定した場合と同等の検出レベルが得られた（図４）。
【０１１４】
多数の治療用抗体の活性は、抗体の可変領域が標的細胞の表面の特定の抗原に結合し、抗体のＦｃ部分と免疫エフェクター細胞上のＦｃ受容体との相互作用（１、２）した後、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）や抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）などの免疫媒介エフェクター細胞機能によって部分的に媒介される。ＡＤＣＣ活性の定量化は、エフェクター細胞上での、抗体のＦｃ部分のＦｃγＲＩＩＩＡ受容体（ＣＤ１６ａ）に対する結合、及び標的細胞での抗体の特定の抗原への結合後、標的細胞傷害性又はエフェクター細胞のレポーター遺伝子活性を評価するための細胞ベースのアッセイの使用を必要とする（１，２）。ＣＤ１６応答性プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現する操作されたＪｕｒｋａｔ  ＡＤＣＣエフェクター細胞（３）及び標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が３：１のＨＥＲ２陽性標的細胞（３）の抽出物を３７°Ｃで４時間、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））の濃度を増加させながらインキュベートした後、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）を使用したホタルルシフェラーゼ活性の定量、及び細胞の溶解、及び抗ルシフェラーゼ捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐１８５９２４）及びＨＲＰ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）を使用したホタルルシフェラーゼの定量を行った。
【０１１５】
ＨＥＲ２陽性標的細胞の存在下でＣＤ１６応答性プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼを発現するＪｕｒｋａｔ  ＡＤＣＣエフェクター細胞の抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出するための抗ホタルルシフェラーゼ抗体の使用により、トラスツズマブのＡＤＣＣ活性を、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質でルシフェラーゼ活性を測定して得られたものと同等の結果で決定することができた（図５）。これらの結果は、単純な免疫検出手順を使用して、ＡＤＣＣやＡＤＣＰなどの免疫媒介エフェクター細胞機能などの複雑な生物学的プロセスをどのように定量化できるかを初めて示す。
【０１１６】
例２
Ｇｙｒｏｓプラットフォームテクノロジーは、ナノリットルのマイクロフルイディクスとレーザー活性化蛍光に基づく検出システムを組み込むように設計されたＣＤを使用した、毛管作用の遠心制御の使用に基づいている。
Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用した免疫原性アッセイは、ビオチンで標識された薬物の２つの分子とＡｌｅｘａ‐６４７などの蛍光マーカーで標識された薬物の別の分子との間のブリッジの形成によって抗薬物抗体が検出されるブリッジングＥＬＩＳＡに基づいている（図６）。
サンプル中の抗薬物抗体の存在は、Ａｌｅｘａ標識薬物分子をビオチン標識薬物分子（それが今度はストレプトアビジン被覆ビーズに結合する）に結合させるブリッジを形成する。Ａｌｅｘａ標識結合薬物から放出される蛍光は、次いでレーザーによる活性化後に定量化される。あるいは、治療用抗体の効力は、２つの抗薬物抗体分子（モノクローナル又はポリクローナル）の間にブリッジを形成する薬物を検出するＡｌｅｘａとビオチンで標識された、治療用抗体に特異的な、抗薬物抗体ペアを使用して定量化することができる。同様に、一次アンカー抗体と検出抗ルシフェラーゼ抗体の両方を、二次アンカー抗体と検出抗体（モノクローナル又はポリクローナル）とともに使用できる。各Ｇｙｒｏｓ  ＡＤＡアッセイには、異なる二重標識薬物ペアが必要である。対照的に、単一の二重標識抗ルシフェラーゼ抗体ペアを使用して、Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用して細胞ベースのアッセイを定量化できる本発明を使用して試験したすべての薬物の効力、ＮＡｂ応答、及びエフェクター細胞応答を定量化できる。ビオチン標識抗ルシフェラーゼアンカー抗体Ａｂ‐２２２８６２（ＡｂＣａｍ、英国）を、Ａｌｅｘｉａ６４７標識抗ルシフェラーゼ検出抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ、英国）とともに使用して、Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用して組換えホタルルシフェラーゼの濃度を増加させながら検出した。蛍光の検出プロファイルにより、使用したＡｌｅｘｉａ‐６４７標識抗ルシフェラーゼ検出抗体は中程度の親和性しかないことが明らかになった（図７Ａ）。使用した検出抗体の親和性が制限されているにもかかわらず、ホタルルシフェラーゼ活性のモニタリングで得られたものに匹敵する用量反応曲線を得て、Ｇｙｒｏｓ免疫検出プラットフォームと一対の抗ルシフェラーゼ抗体を使用して生物活性を定量化できた（図７Ｂ）。異なる濃度のビオチン標識抗ルシフェラーゼアンカー抗体Ａｂ‐２２２８６２（ＡｂＣａｍ、英国）をＡｌｅｘｉａ‐６４７標識抗ルシフェラーゼ検出抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ、英国）とともに使用して、光電子増倍管を１％に設定したＧｙｒｏｓプラットフォームにより組換えホタルルシフェラーゼの検出に最適な条件を決定した（図８）。
【０１１７】
３７℃で１８時間ｂＦＧＦの濃度を増加させながら細胞を処理した後、Ｇｙｒｏｓ免疫検出プラットフォームを使用して、ＦＧＦ‐２１及びｂＦＧＦ応答性プロモーターの制御下にあるホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含むＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出し、その後にＯｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１１０）を使用したホタルルシフェラーゼ活性の定量及び細胞の溶解及び抗ルシフェラーゼ捕捉抗体Ａｂ‐２２２８６２（ＡｂＣａｍ、英国）及びＡｌｅｘｉａ‐６４７標識抗ルシフェラーゼ検出抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ、英国）を使用したホタルルシフェラーゼの定量を行った。図９Ａでは結果を任意単位として、図９ＢではｂＦＧＦ処理なしのＦＧＦ‐２１応答性細胞の対照サンプルに対する誘導倍率として示す。増加する濃度のｂＦＧＦで処理されたＦＧＦ‐２１応答性細胞の抽出物中のホタルルシフェラーゼを検出するための抗ホタルルシフェラーゼ抗体の使用により、Ｇｙｒｏｓプラットフォーム（図１０Ａ）で１対の抗ルシフェラーゼ抗体を使用して、Ｏｎｅ‐Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）基質（図１０Ｂ）でルシフェラーゼ活性を測定して得られたものに匹敵する検出レベルを得ることができた。
【０１１８】
例３
ＭＳＤプラットフォームテクノロジーは、電気化学発光と、捕捉抗体（これは次に、電極が埋め込まれた炭素又は金被覆９６ウェルプレートに結合する）に結合した分析物を検出するＳｕｌｆｏ−Ｔａｇ標識抗体に基づく検出システムの使用に基づいている。ＭＳＤプラットフォームを使用した免疫原性アッセイはブリッジングＥＬＩＳＡに基づいており、このブリッジングＥＬＩＳＡでは、ストレプトアビジン被覆金プレートに結合したビオチンで標識された一つの分子と、Ｓｕｌｆｏ‐Ｔａｇを有する薬物（モノクローナル又はポリクローナル治療用抗体）の別の分子からなる薬物の２つの分子間のブリッジの形成によって抗薬物抗体が検出される（図１１）。サンプル中の抗薬物抗体の存在は、Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ標識薬物分子をビオチン標識薬物分子に結合させるブリッジを形成し、それはストレプトアビジン被覆プレートに結合する。次に、Ｓｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識結合薬物から放出される光シグナルが定量化される。あるいは、治療用抗体の効力は、２つの抗薬物抗体分子（モノクローナル又はポリクローナル）間でブリッジを形成する薬物を検出するＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇとビオチンで標識された、治療用抗体に特異的な、抗薬物抗体ペアを使用して定量化できる。同様に、一次アンカー抗体と検出抗ルシフェラーゼ抗体の両方を、二次アンカー抗体と検出抗体（モノクローナル又はポリクローナル）とともに使用できる。各ＭＳＤ  ＡＤＡアッセイには、異なる二重標識薬物ペア又は一次抗体ペアが必要である。対照的に、単一の二重標識抗ルシフェラーゼ抗体ペアを使用して、ＭＳＤプラットフォームにより細胞ベースのアッセイを定量化できる本発明を使用して試験したすべての薬物について効力、ＮＡｂ応答、及びエフェクター細胞応答の定量化が可能である。
【０１１９】
ヤギ抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５）及びＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識ロバ抗ヤギ二次抗体（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＧ‐５）と併用した場合、ＭＳＤイムノアッセイプラットフォームで組換えルシフェラーゼを捕捉するために使用した場合、２つの異なる抗ルシフェラーゼ抗体（モノクローナル又はポリクローナル）の相対的効力をテストした。結果は、両方の抗体を０．３μｇ／ｍｌの濃度で使用した場合、抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ、英国）が優れた結果を与えたことを明確に示す（図１２）。抗ホタルルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ‐６３５及びＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識ロバ抗ヤギ二次抗体（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＧ‐５）と共に使用されるＭＳＤイムノアッセイプラットフォームで組換えホタルルシフェラーゼを捕捉するための０．１又は０．３μｇ／ｍｌのいずれかの濃度の抗体Ａｂ‐１８１６４０の使用は、ホタルルシフェラーゼ活性の定量化で得られた曲線と同様の用量反応曲線（図１３）をもたらした。
ＦＧＦ‐２１応答性細胞をｂＦＧＦの濃度を増加させて処理し、細胞の溶解と細胞上清のＭＤＳプレートへの移動の前にマイクロタイターアッセイプレートで３７°Ｃで１８時間インキュベートした２段階手順の検出の有効性を、２種類の濃度（０．１又は０．３μｇ／ｍｌ）の抗ルシフェラーゼ捕捉抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ１８１６４０）及びＳｕｌｆｏ‐Ｔａｇ標識抗ルシフェラーゼ検出抗体（ＡｂＣａｍ  ＵＫ、カタログ番号Ａｂ３６５）を使用して、ＭＳＤプレートでアッセイを直接実施した場合に得られるものと比較した。結果は、ＭＳＤ検出プレートでＦＧＦ‐２１応答性細胞をｂＦＧＦの濃度を増加させて直接処理する１ステップ手順が、細胞をアッセイプレートで最初に処理し、次に、細胞溶解物をＭＳＤアッセイプレートに移す２ステム手順と同等であることを明確に示す（図１４）。
ＭＳＤ検出プラットフォームを使用した組換えホタルルシフェラーゼの検出の有効性を、Ｇｙｒｏｓ免疫検出プラットフォームを使用したものと比較した。ＭＳＤシステムを使用して得られた結果（図１５Ａ）は、結果が任意の単位で表された場合（図１５）でも、又はホタルルシフェラーゼを含まない対照サンプルに対する誘導倍率として表された場合（図１６）でも、Ｇｙｒｏｓプラットフォームを使用して得られたもの（図１５Ｂ）と同等であった。
【０１２０】
例４
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、偏光が２つの材料間の界面で導電性表面に当たると発生する。これにより、プラズモンと呼ばれる電荷密度波が生成され、これがセンサー表面の質量に比例して、共鳴角と呼ばれる特定の角度で反射光の強度が低下する。この角度は、分子が結合及び解離するにつれて変化し、センサーグラムに相互作用プロファイルがリアルタイムで記録される。ＳＰＲは、抗体とタンパク質抗原間の相互作用などのタンパク質‐タンパク質相互作用を含む、生体分子相互作用のリアルタイムの無標識検出を可能にする。相互作用の特異性を決定するために設計された最初の実験では、シミアンウイルス５のＶ５タンパク質に対するビオチン標識抗体（Ａｂ‐１８６１７、ＡｂＣａｍ、英国）をストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ３０００センサーチップに結合した。組換えホタルルシフェラーゼが抗Ｖ５抗体でコーティングされたセンサーチップに適用された場合、バックグラウンドの読み取りと比較してシグナルの有意な増加は観察されなかった（図１７Ａ）。対照的に、組換えホタルルシフェラーゼは、ストレプトアビジンコーティングされたＢｉａｃｏｒｅ３０００センサーチップに結合したビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ  ＵＫ）を使用してセンサーチップに適用すると、容易に検出された（図１７Ｂ及び１８）。ビオチン標識モノクローナル抗ルシフェラーゼ抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ  ＵＫ）がストレプトアビジン被覆Ｂｉａｃｏｒｅ３０００センサーチップに結合されたセンサーチップに、組換えホタルルシフェラーゼの濃度を増加させて適用すると、シグナルの明確な用量関連の増加がまた観察された（図１９及び２０）。ＳＰＲでは、２つの分子の相互作用の結合親和性と解離定数（Ｋｄ）を決定することができる。Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を使用した組換えホタルルシフェラーゼの捕捉抗体Ａｂ‐１８１６４０（ＡｂＣａｍ  ＵＫ）のＫｄは３．４．１０−７であった（図２０）。
【０１２１】
例５
ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＡｌｐｈａＬＩＳＡソリューションＥＬＩＳＡプラットフォームテクノロジーは、ストレプトアビジン被覆ドナービーズの使用と、ストレプトアビジン被覆ドナービーズに付着したビオチン標識薬物とジゴキシゲニン標識アクセプタービーズとの間にＡＤＡがブリッジを形成するジゴキシゲニン標識アクセプタービーズに基づく検出システムに基づいている。標識薬物ＡＤＡ複合体は、抗ジゴキシゲニン‐ＨＲＰコンジュゲートと発光シグナルの定量を使用して検出される（図３）。ＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ＡＤＡアッセイごとに、異なる二重標識薬物ペアが必要である。対照的に、抗ルシフェラーゼ抗体アクセプタービーズとビオチン標識ドナービーズの単一のペアを使用して、ＡｌｐｈａＬＩＳＡプラットフォームを用いて細胞ベースのアッセイを定量することを可能にする本発明を使用して試験したすべての薬物の効力、ＮＡｂ応答、及びエフェクター細胞応答を定量化できる。
【０１２２】
一つの態様では、本発明は以下の項目に関する。
１．細胞、細胞を溶解するのに適した界面活性剤又は受動溶解バッファーを含むバッファー、一部分が蛍光タグで標識され、他の部分がビオチンなどの第二のタグで標識された抗ルシフェラーゼ抗体を含むキットであって、該抗ルシフェラーゼ抗体が以下の特徴の一つ以上を任意の組み合わせで含む、上記キット；
‐抗ルシフェラーゼ抗体はモノクローナル抗体である
‐抗ルシフェラーゼ抗体はポリクローナル抗体である
‐抗ルシフェラーゼ抗体はホタルルシフェラーゼに特異的である
‐抗ルシフェラーゼ抗体はウミシイタケルシフェラーゼに特異的である
‐抗ルシフェラーゼ抗体はナノルシフェラーゼに特異的である
‐抗ルシフェラーゼ抗体はガウシアルシフェラーゼに特異的である、
‐抗ルシフェラーゼ抗体は例えばＡｌｅｘａなどの蛍光タグで標識されている
‐抗ルシフェラーゼ抗体はＳｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識されている
‐抗ルシフェラーゼ抗体はビオチンで標識されている、
‐抗ルシフェラーゼ抗体はホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されている、
‐抗ルシフェラーゼ抗体はジゴキシゲニン（ＤＩＧ）で標識されている、
‐抗ルシフェラーゼ抗体は二次抗体によって認識される、
‐抗ルシフェラーゼ抗体はストレプトアビジン被覆ドナービーズに結合している、
‐抗ルシフェラーゼ抗体はジゴキシゲニン標識アクセプタービーズに結合している。
【０１２３】
２．第一のレポーター遺伝子産物を発現し、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質をさらに発現し、以下の特徴の一つ以上を任意の組み合わせで含む、項目１に記載の細胞；
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下で、花虫綱ルシフェラーゼタンパク質又は十脚甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下で、花虫綱ルシフェラーゼタンパク質又は十脚甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、
‐細胞は構成的プロモーターの制御下ガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。
【０１２４】
３．細胞が操作可能にＣＤ１６ａ又はＣＤ３２に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物は、ＣＤ１６に結合した抗体のＦｃ部分と第二の細胞のライゲーションに応答し、該第二の細胞はＡＤＣＣ活性が決定される治療用抗体によって認識される抗原を発現するものであり、その標的細胞上の特定の抗原と抗体の相互作用が受容体の凝集とエフェクター細胞上のレポーター遺伝子の活性化をもたらすものである、項目１〜２のいずれかに記載の細胞。
【０１２５】
４．細胞が操作可能にＣＤ１６ａ又はＣＤ３２に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物はＣＤ１６ａ又はＣＤ３２に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の標的細胞はルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含有し、これはプロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、ＡＤＣＰ活性の評価を可能にする、あるいはプロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物においてコンフォメーション変化を誘導することができ、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠されたエピトープの出現をもたらす、項目１〜３のいずれかに記載の細胞。
【０１２６】
５．細胞がルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含む標的細胞を構成し、その活性はプロテアーゼの放出により増加されるか又は阻害され、一旦分泌されるか又は自発的に放出されるか又は細胞の溶解によって放出されると定量化することができ、ＣＤＣ活性の評価を可能にする、あるいはプロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす、項目１〜４のいずれかに記載の細胞。
【０１２７】
６．ＣＡＲ‐Ｔ細胞などの養子療法で使用される細胞の効力の定量化に使用するための項目１〜５のいずれかに記載の細胞であって、細胞は、ルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含む標的細胞を構成し、該プロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物はプロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、細胞毒性の評価を可能にする、あるいはプロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす、上記細胞。
【０１２８】
７．以下を含むキット又はパーツのキット：
ｉ）項目１〜６のいずれかに記載の細胞；
ｉｉ）抗体が特異的な内因性標的が無効化／変異している細胞；
ｉｉｉ）抗体が特異的な標的の発現が増加する細胞。
【０１２９】
８．標的がＣＤ１９、ＣＤ２０、ｍＴＮＦアルファ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲである、項目７に記載のキット。
【０１３０】
９．キットが２つのバイアルを含み、前記ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が一つの同じバイアルに最適Ｅ：Ｔ比で存在する、項目７〜８のいずれかに記載のキット。
【０１３１】
１０．ｉ）の細胞とｉｉ）の標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）は約２４：１〜約２：１の範囲、又は例えば約６：１、又は例えば約３：１、又は例えば約１．５：１である、項目９に記載のキット。
【０１３２】
１１．治療用抗体で治療された患者からの臨床サンプル中のｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣ活性を定量化する方法であって、
ａ）抗体の投与を含む治療を受けている患者から得たサンプルを項目７の標的細胞ｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ）エフェクター細胞ｉ）及び標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから、薬物標的が無効化された細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルを差し引くステップ、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定されたシグナル関係に基づいてＡＤＣＣ活性を決定するステップ、ここでエフェクター細胞ｉ）＆標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）≧１のシグナル関係のとき血清サンプルの陽性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）が存在し、エフェクター細胞ｉ）＆標的＋＋細胞ｉｉｉ）の値／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）の値≦１のとき血清サンプルの陰性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性がない）が存在する、
を含む、上記方法。
【０１３３】
１２．ヒト血清の存在下でのレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補償する方法であって、エフェクター細胞ｉ）及び標的陰性細胞ｉｉ）＞１のとき試験中の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関係しない活性を示す薬物標的又は血清サンプルを発現する項目７の標的細胞ｉｉｉ）及びエフェクター細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルから、細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルを差し引くことを含む、上記方法。
【０１３４】
１３．細胞ベースのアッセイを実施する方法であって、以下のステップを含む方法：
ｉ）アッセイの終了時に細胞の溶解によりルシフェラーゼ活性が分泌又は放出されることを除いて通常の方法で、例えば、界面活性剤又は受動溶解バッファーの添加などの適切な手段で、細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを実施する、
ｉｉ）その後、レポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体を添加する、その一部はＥＬＩＳＡ又は特定の自動化イムノアッセイプラットフォームに特異的な二つのタグの一つで標識されており、他の一部はＥＬＩＳＡ又は同じ自動化イムノアッセイプラットフォームに特異的な第二のタグで標識されている、
ｉｉｉ）適切な量の細胞ライセートの上清を特定の自動化イムノアッセイプラットフォームに追加し、通常の方法で定量化するか、又は薬物特異的効果は第一のものとは異なる第二のレポーター遺伝子産物に特異的な第二の抗体の追加によって正規化することもでき、構成的プロモーターの制御下で転写される。
【０１３５】
さらなる態様では、本発明は以下の項目にも関する：
１．細胞、細胞を溶解するのに適した界面活性剤又は受動溶解バッファーを含むバッファー、一部が蛍光タグで標識され、他の部分がビオチンで標識された抗ルシフェラーゼ抗体を含むキットであって、ただし以下のオプションの一つ以上を有する上記キット：
‐抗ルシフェラーゼ抗体はモノクローナル抗体である、又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はポリクローナル抗体である、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はホタルルシフェラーゼに特異的である、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はウミシイタケルシフェラーゼに特異的である、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はナノルシフェラーゼに特異的である、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はガウシアルシフェラーゼに特異的である、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体はＡｌｅｘａなどの蛍光タグで標識されている、及び／又は
‐前記抗ルシフェラーゼ抗体はＳｕｌｆｏ−Ｔａｇで標識されている、及び／又は
‐前記抗ルシフェラーゼ抗体はビオチンで標識されている、及び／又は
‐前記抗ルシフェラーゼ抗体はストレプトアビジン被覆ドナービーズに結合している、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体は、ジゴキシゲニン標識アクセプタービーズに結合している、及び／又は
‐抗ルシフェラーゼ抗体は、ビオチン、Ａｌｅｘａ、Ｓｕｌｆｏ−Ｔａｇ、ジゴキシゲニン又は抗体の結合又は検出のいずれかを可能にする他の標識で標識された第二の抗体を用いて検出される。
【０１３６】
２．先行する項目のいずれかによる細胞であって、細胞は第一のレポーター遺伝子産物を発現し、さらに第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現し、ただし以下のオプションの一つ以上を有する上記細胞：
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、及び／又は
‐細胞は、薬物特異的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚目甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は、薬物特異的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は薬物特異的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、及び／又は
‐細胞は、構成的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚目甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は、構成的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、及び／又は
‐細胞は構成的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する。
【０１３７】
３．細胞がＣＤ１６ａに作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物がＣＤ１６に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の細胞はＡＤＣＣ活性が測定される治療用抗体によって認識される抗原を発現する、先行する項目のいずれかに記載の細胞。抗体と、標的細胞上の特定の抗原との相互作用により、受容体が凝集し、エフェクター細胞上のレポーター遺伝子が活性化される。
【０１３８】
４．細胞がＣＤ３２に作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物がＣＤ３２に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の標的細胞はルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含み、該プロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物はプロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、ＡＤＣＰ活性の評価を可能にする、先行する項目のいずれかに記載の細胞。あるいはプロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす。
【０１３９】
５．細胞がルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含む標的細胞を構成し、該プロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物はプロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、ＣＤＣＰ活性の評価を可能にする、先行する項目のいずれかに記載の細胞。あるいは、プロテアーゼは、レポーター遺伝子タンパク質産物にコンフォメーション変化を誘発し、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす可能性がある。
【０１４０】
６．ＣＡＲ‐Ｔ細胞などの養子療法で使用される細胞の効力の定量化のための先行する項目のいずれかに記載の細胞であって、細胞が、ルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含む標的細胞を構成し、該プロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物はプロテアーゼの放出に応答し、一旦分泌されると定量化することができ、細胞毒性の評価を可能にするか、あるいは、プロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し、その結果、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす可能性がある。
【０１４１】
７．先行する項目のいずれかに記載の細胞であって、細胞が作動可能にＴＬＲ２又はＴＬＲ９に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物は、遺伝子治療で使用する導入遺伝子を発現するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は組換えＡＡＶウイルスのいずれかで細胞の感染に応答する、上記細胞。そのような細胞は、ＡＡＶと接触する抗ＡＡＶ中和抗体の存在がＴＬＲ２又はＴＬＲ９応答性レポーター遺伝子産物を活性化する能力を阻害するため、野生型ＡＡＶ又は組換えＡＡＶベクターに対するＡＡＶベクター又は中和抗ＡＡＶ抗体応答の効力を定量化するために使用できる。
【０１４２】
８．以下を含むキット：
ｉ）上記の項目のいずれかに記載の細胞；
ｉｉ）抗体が特異的な内因性標的が無効化（変異）された細胞；及び
ｉｉｉ）抗体が特異的な標的の発現が増強される細胞。
【０１４３】
９．標的がＣＤ２０、ｍＴＮＦａｌｐｈａ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲである、項目８に記載のキット。
【０１４４】
１０．キットが２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が最適なＥ：Ｔ比で一つの同じバイアルに存在する、先行する項目のいずれかに記載のキット。
【０１４５】
１１．ｉ）の細胞とｉｉｉ）の標的細胞との比（Ｅ：Ｔ比）が約２４：１から約２：１の範囲、例えば約６：１、又は例えば約３：１、又は例えば約１．５：１である、先行する項目いずれかに記載のキット。
【０１４６】
１２．ｉ）及びｉｉｉ）の細胞が、捕捉及び検出抗ルシフェラーゼ抗体の最適濃度とともに最適Ｅ：Ｔ比で一つの同じバイアル中に存在する、先行する項目のいずれかに記載のキット。
【０１４７】
１３．治療用抗体で治療された患者からの臨床サンプルにおいてｅｘ  ｖｉｖｏでＡＤＣＣ活性を定量するための方法であって、
ａ）抗体の投与を含む治療を受けている患者から得たサンプルを先行する項目の標的細胞ｉｉ）と接触させるステップ、
ｂ）エフェクター細胞ｉ）及び標的細胞ｉｉｉ）の存在下で得られたシグナルから、薬物標的が無効化された細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルを差し引くステップ、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定されたシグナル関係に基づいてＡＤＣＣ活性を決定するステップ、ここでエフェクター細胞ｉ）＆標的＋＋細胞ｉｉｉ）／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）≧１のシグナル関係のとき血清サンプルの陽性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性）が存在し、エフェクター細胞ｉ）＆標的＋＋細胞ｉｉｉ）の値／エフェクター細胞ｉ）＆標的−／−細胞ｉｉ）の値≦１のとき血清サンプルの陰性結果（すなわち、検出可能なＡＤＣＣ活性がない）が存在する、
を含む、上記方法。
【０１４８】
１４．異なるＡＡＶ血清型に対する中和抗体力価を決定するための組換えＡＡＶベクターでの治療前、又はウイルスベクター及び／又はウイルスベクターによって運ばれる導入遺伝子に対する中和抗体力価を決定するための組換えＡＡＶベクターでの治療中に、患者の臨床サンプルの中和活性をｅｘ  ｖｉｖｏ（エクスビボ）で定量する方法であって、以下のステップを含む上記方法：
ａ）治療前の患者又は抗体の投与を含む治療を受けている患者から得られたサンプルを、先行する項目のレポーター細胞及びＡＡＶ又はＡＡＶベクターｉｉ）と接触させる、
ｂ）同じレポーター遺伝子を含むがＡＡＶｉ）を含まない細胞の存在下で得られたシグナルを差し引く、
ｃ）ａ）及びｂ）で測定されたシグナル関係に基づいて中和活性を決定する、ここでシグナル関係が≧１の場合に血清サンプルの陽性結果（すなわち、検出可能な中和活性）が存在し、値が≦１の場合、血清サンプルの陰性結果（すなわち、検出可能な中和活性がない）が存在する。
【０１４９】
１５．ヒト血清の存在下でレポーター遺伝子シグナルの非特異的増加を補償する方法であって、エフェクター細胞ｉ）＆標的陰性細胞ｉｉ）＞１の場合試験中の抗体に特異的なＡＤＣＣ活性に関連しない活性を示す薬物標的又は血清サンプルを発現する、先行する項目の標的細胞ｉｉｉ）及びエフェクター細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルから、細胞ｉ）の存在下で得られたシグナルを差し引くことを含む、上記方法。
【０１５０】
１６．細胞ベースのアッセイを実施する方法であって、アッセイの終了時に界面活性剤又は受動的溶解バッファーの添加などの適切な手段を使用して細胞を溶解することことを除いて、通常の方法で細胞ベースのレポーター遺伝子アッセイを実施し、その後、レポーター遺伝子産物を特異的に認識する抗体を添加し、その一部は特定の自動化イムノアッセイプラットフォームに特異的な二つのタグの一つで標識されており、他の一部は同じ自動化イムノアッセイプラットフォームに特異的な第二のタグで標識されており、適切な量の細胞ライセートの上清を特定の自動化イムノアッセイプラットフォームに追加し、通常の方法で定量化し、任意選択で、薬物特異的効果は第一のものとは異なる第二のレポーター遺伝子産物に特異的な第二の抗体の追加によって正規化することもでき、構成的プロモーターの制御下で転写される。
【０１５１】
参考文献
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７．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  Ａｇｅｎｃｙ  （ＥＭＡ）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（欧州医薬品庁（ＥＭＡ）バイオテクノロジー由来の治療用タンパク質の免疫原性評価。）ｗｗｗ．ｅｍａ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ／１４３２７０６ＥＮ．２００７
８．Ｆ．Ｍａｒｃｕｃｃｉ，Ｍ．Ｂｅｌｌｏｎｅ，Ｃ．Ｒｕｍｉｏ，及びＡ．Ｃｏｒｔｉ，”Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ．”（「モノクローナル抗体と免疫細胞間の腫瘍蓄積及び相互作用を改善するアプローチ」），ＭＡｂｓ，ｖｏｌ．５，ｐｐ．３４‐４６，２０１３．
９．Ｎ．Ｒａｊａｓｅｋａｒａｎ，Ｃ．Ｃｈｅｓｔｅｒ，Ａ．Ｙｏｎｅｚａｗａ，Ｘ．Ｚｈａｏ，及びＨ．Ｅ．Ｋｏｈｒｔ，“Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：  ａ  ｎｅｗ  ｅｒａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ”（「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の増強：癌治療の新時代」），Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｓ  Ｔｈｅｒ，ｖｏｌ．４，ｐｐ．９１‐１００，２０１５．
【配列表フリーテキスト】
【０１５２】
配列番号１：＜２２３＞人工
配列番号２：＜２２３＞ｂｅｔａＫｌｏｔｈｏ  ＣＤＳ-最適化コドン
配列番号３：＜２２３＞合成
配列番号４：＜２２３＞合成
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月27日(2019.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞又は細胞株であって、該細胞が第一のレポーター遺伝子産物を発現し、さらに第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現し、該細胞が配列番号１から配列番号４までの一つ以上から選択されるヌクレオチド配列をさらに含むベクター構築物を含む、上記細胞又は細胞株。
【請求項２】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でレポーター遺伝子を発現する、請求項１に記載の細胞又は細胞株。
【請求項３】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、請求項１又は２に記載の細胞又は細胞株。
【請求項４】
前記細胞が薬物特異的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜３のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項５】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項６】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜５のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項７】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜６のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項８】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１から７のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項９】
前記細胞が、薬物特異的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１から８のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１０】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、第一のレポータータンパク質とは異なる第二のレポータータンパク質を発現する、請求項１〜９のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１１】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下で、花虫類ルシフェラーゼタンパク質又は十脚目甲殻類ルシフェラーゼタンパク質をコードするルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１０のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１２】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１１のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１３】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１２のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１４】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１５】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でナノルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１４のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１６】
前記細胞が、構成的プロモーターの制御下でガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現する、請求項１〜１５のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１７】
前記細胞が哺乳動物又は鳥類の細胞である、請求項１〜１６のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１８】
前記細胞がヒトのものである、請求項１〜１７のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項１９】
前記細胞が、Ｊｕｒｋａｔ、Ｍｏｌｔ４、Ｒａｊｉ、ＳＫＢＲ３、ＮＫ９２、ＫＨＹＧ‐１、ＨＥＫ２９３細胞ＤＴ‐４０、ＰＩＬ‐５、又はＭＳＢ‐１のうちの一つ以上である、請求項１〜１８のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２０】
前記ベクター構築物が、共刺激分子ＣＤ２８、共刺激分子ＣＤ１３７（４‐１ＢＢ）、共刺激分子ＣＤ２４７（Ｔ３ゼータ鎖）、共刺激分子ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）から選択される一つ以上をコードするポリヌクレオチドをさらに含むか、又は共刺激分子がＣＤ２８、ＣＤ１３７Ｌ（４‐１ＢＢ）、及びＩＣＯＳの一つ以上から選択される受容体である、請求項１から１９のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２１】
前記細胞がＣＤ１６ａに作用可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物は、ＣＤ１６に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の細胞はＡＤＣＣ活性が決定される治療用抗体によって認識される抗原を発現し、抗体と標的細胞上の特定の抗原との相互作用は、受容体の凝集及びエフェクター細胞上でのレポーター遺伝子の活性化をもたらす、請求項１から２０のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２２】
前記細胞がＣＤ３２に作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物がＣＤ３２に結合した抗体のＦｃ部分のライゲーションに応答し、第二の標的細胞は例えばプロテアーゼの放出に応答し、分泌されると定量化されＡＤＣＰ活性の評価を可能にするルシフェラーゼなどのプロテアーゼ切断可能なレポーター遺伝子産物を含有し、あるいは、プロテアーゼはレポーター遺伝子タンパク質産物のコンフォメーション変化を誘発し得るものであり、プラットフォーム検出システムで使用される抗体ペアによって検出できる隠れたエピトープの出現をもたらす、請求項１から２１のいずれかに記載の細胞又は細胞株。
【請求項２３】
前記細胞が、ＴＬＲ２又はＴＬＲ９に作動可能に連結されたレポーター遺伝子産物を発現し、レポーター遺伝子産物が、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又は遺伝子治療で使用する導入遺伝子を発現する組換えＡＡＶウイルスのいずれかによる細胞の感染に応答する、請求項１から２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項２４】
例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞又は細胞株の使用。
【請求項２５】
前記自動化アッセイが、例えばＧｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムなどの任意のＥＬＩＳＡタイプのアッセイ又はアッセイプラットフォーム、又は例えばＢｉａｃｏｒｅシステムなどのＳＰＲを使用する無標識検出である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
以下を含むキット又はパーツのキット：
ｉ）請求項１〜２３のいずれかに記載の細胞；
ｉｉ）抗体に特異的な内因性標的が無効化された（変異された）細胞；及び
ｉｉｉ）抗体が特異的な標的の発現が増強されている細胞。
【請求項２７】
前記標的がＣＤ２０、ｍＴＮＦアルファ、ｅｒｂＢ２、ＥＧＦＲである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記キットは、２つのバイアルを含み、ｉ）及びｉｉｉ）における細胞が最適なＥ：Ｔ比で一つの同じバイアル中に存在している、請求項２６〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
ｉ）における細胞とｉｉｉ）における標的細胞の比（Ｅ：Ｔ比）が、約２４：１〜約２:１の範囲、又は例えば約６:１、又は例えば約３：１、又は例えば約１．５：１である、請求項２６〜２８のいずれかに記載のキット。
【請求項３０】
ｉ）及びｉｉｉ）における細胞が、捕捉及び検出抗ルシフェラーゼ抗体の最適濃度とともに最適Ｅ：Ｔ比で一つの同じバイアル中に存在する、請求項２６〜２９のいずれかに記載のキット。
【請求項３１】
例えば自動化イムノアッセイなどの自動化アッセイにおける請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のキットの使用。
【請求項３２】
前記自動化アッセイが、例えばＧｙｒｏｓ、ＭＳＤ、又はＡｌｐｈａＬＩＳＡシステムなどのＥＬＩＳＡタイプのアッセイ又はアッセイプラットフォーム、又は例えばＢｉａｃｏｒｅシステムなどのＳＰＲを使用する無標識検出である、請求項３１に記載の使用。
【国際調査報告】
2020516246.tif 000028
2020516246.tif 000029
2020516246.tif 000030