(57)【要約】  本発明は、５．９〜７．１好ましくは６．２〜６．８のｐＨを有し、かつ１〜１５重量％の総タンパク質濃度を有する、カゼインミセルとホエイタンパク質と植物タンパク質とを含む成分組成物を用意する工程であって、当該組成物はカゼインミセルのホエイタンパク質に対する比が９０／１０〜６０／４０であり、カゼインミセルとホエイタンパク質の植物タンパク質に対する比が８０／２０〜２０／８０である工程と、二価カチオンを添加して成分組成物に２．０〜１０ｍＭの遊離二価カチオンの濃度をもたらす工程と、成分組成物を熱処理してミセルカゼイン、ホエイタンパク質及び植物タンパク質を含む凝集タンパク質を形成する工程であって、凝集体はレーザー回折により測定したＤ（４，３）平均直径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する工程と、を含む、食品又は飲料製品の製造方法に関する。本発明はまた、この方法によって得られる製品にも関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食品又は飲料製品を製造する方法であって、
カゼインミセルと、ホエイタンパク質と、植物タンパク質とを含み、５．９〜７．１、好ましくは６．２〜６．８のｐＨを有し、１〜１５重量％の総タンパク質濃度を有する、成分組成物を用意する工程であって、
前記組成物は、カゼインミセルのホエイタンパク質に対する比が９０／１０〜６０／４０であり、カゼインミセルとホエイタンパク質の、植物タンパク質に対する比が８０／２０〜２０／８０である、工程と、
二価カチオンを添加して、前記成分組成物に２．０〜１０ｍＭの濃度の遊離二価カチオンをもたらす工程と、
続いて
前記成分組成物を熱処理して、カゼインミセルと、ホエイタンパク質と、植物タンパク質とを含む凝集タンパク質を形成する工程であって、前記凝集体は、レーザー回折により測定したＤ（４，３）平均直径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する、工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記成分組成物は、８０〜１２５℃の温度で３０〜９００秒間、又は１２６℃以上の温度で３〜４５秒間熱処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記植物タンパク質が、エンドウ豆タンパク質、大豆タンパク質、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記成分組成物が均質化に供され、前記均質化が、好ましくは前記成分組成物の前記熱処理の前である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記植物タンパク質の溶解度が、物理的処理により改善されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記凝集体が、Ｄ（４，３）平均直径によって測定したときに１０〜４０μｍ、好ましくは１０〜３０μｍである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記二価カチオンが、Ｃａカチオン若しくはＭｇカチオン又はこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記二価カチオンが、カルシウムカチオンである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
カルシウム塩が、前記遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜６．０ｍＭ、好ましくは２．０〜４．０ｍＭ、より好ましくは２．０〜３．０ｍＭになるまで添加される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記植物タンパク質がエンドウ豆タンパク質であり、カルシウム塩が、前記遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜３．０ｍＭ、好ましくは２．０〜２．５ｍＭになるまで添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記植物タンパク質が大豆タンパク質であり、カルシウム塩が、前記遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜３．０ｍＭ、好ましくは２．０〜３．０ｍＭになるまで添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記最終製品中の可溶性タンパク質の含有量が、前記総タンパク質含有量に対して３０％以下である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記成分組成物が、０〜３６重量％の脂肪、好ましくは１．０〜２０重量％、より好ましくは３．０〜１５重量％、最も好ましくは５〜１０重量％の脂肪を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記成分組成物中の前記カゼイン及びホエイタンパク質が、生乳、低温殺菌乳、低温濃縮乳、低温粉乳、乳タンパク質濃縮物、液体若しくは粉末フォーマットの乳タンパク質単離物、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される形態で提供され、
前記追加のホエイタンパク質が、スイートデイリーホエイ、ホエイタンパク質濃縮物、液体、濃縮物若しくは粉末フォーマットのホエイタンパク質単離物、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される形態で提供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法によって得られる食品又は飲料製品。
【請求項１６】
カゼインミセル、ホエイタンパク質及び植物タンパク質の凝集体を含む凝集タンパク質を含有する、食品又は飲料製品であって、
前記製品は、５．９〜７．１、好ましくは６．２〜６．８のｐＨを有し、かつ１〜１５重量％の総タンパク質濃度を有し、
前記組成物は、カゼインミセルのホエイタンパク質に対する比が９０／１０〜６０／４０であり、カゼインミセルとホエイタンパク質の、植物タンパク質に対する比が８０／２０〜２０／８０であり、前記成分組成物中の遊離二価カチオンの濃度が２．０〜１０ｍＭであり、
凝集タンパク質が、カゼインと、ホエイタンパク質と、植物タンパク質とを含み、前記凝集体が、レーザー回折により測定したＤ（４，３）平均直径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、食品又は飲料製品の製造方法に関し、特に、成分組成物中に凝集タンパク質を形成するための方法に関する。本発明はまた、カゼインミセル、ホエイタンパク質及び植物タンパク質凝集体を含む、凝集タンパク質を含有する食品又は飲料製品にも関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の凝集によって食品及び飲料製品に食感及び口当たりが提供されることが知られており、優れた味及び食感をもたらしながら主要栄養素の栄養バランスを示す食品及び飲料製品が引き続き必要とされている。
【０００３】
中国特許第１０４４８９０９７（Ａ）号は、乳酸菌又はプロバイオティクス用の熱対流乾燥保護剤を得る方法を記載している。該方法は、タンパク質凝集を誘導するため、カルシウムを富化した乳調製物を６０℃で熱処理する工程と、続いて該調製物を機械的均質化処理に供する工程と、を含む。
【０００４】
国際公開第０７０４０１１３（Ａ）号では、乳由来の複合脂質中に高含有量を示す成分の製造について記載されている。上記成分は、バター上清（ｂｕｔｔｅｒ  ｓｅｒｕｍ）のタンパク質画分を、ｐＨ４．０〜５．０において、カルシウムの存在下で沈殿させ、上清を濾過して複合脂質を濃縮することによって得られる。
【０００５】
国際公開第０６０６５１３５（Ａ２）号では、遊離二価カチオンの豊富な液体食品製品の製造が開示されており、この製造では、カルシウムの存在下での凝集に対する耐性を高めるために、タンパク質によって保持されるリジン残基の２０％がグリコシル化されている。したがって、国際公開第０６０６５１３５（Ａ２）号は、二価カチオン、とりわけカルシウムの存在下でのタンパク質凝集の防止に関する。
【０００６】
米国特許出願公開第２０１３００１１５１５（Ａ１）号では、ホエイタンパク質を富化した乳タンパク質濃縮物の製造方法が記載されている。脱脂乳は、ホエイタンパク質とカゼインとの凝集を促進するために、ｐＨ範囲６．５〜７．０で加熱される。続いて、加熱された製品を濾過して、タンパク質凝集体を濃縮し、ラクトースを除去する。
【０００７】
Ｄ．Ｌ．Ｖａｎ  Ｈｅｋｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｓｕｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  Ｗｈｏｌｅ  Ｃａｓｅｉｎ，１９９７，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８０  ２７４０−２７５０．］は、過リン酸化カゼインの粘度における遊離カルシウムの添加の影響を記載している。ｐＨ８．４で３０ｍＭのカルシウムを添加することにより、４重量％の過リン酸化カゼイン（１９０％リン酸化）の粘度が増加することが示された。この研究は、植物タンパク質と乳タンパク質との混合物に関するものではない。更に、植物タンパク質と乳タンパク質との混合物に関して、超リン酸化カゼインは、化学修飾された高価な原材料であることから望ましくない。
【０００８】
Ｃ．Ｈｏｌｔは、自身の論文［Ａｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｙ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｌｔｓ  ｉｎ  ｍｉｌｋ，２００４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．，３３，４２１−４３４］において、ウシ乳の遊離カルシウムイオンの量は、ｐＨ６．７０で１０．２ｍＭであり、この値は乳のｐＨが６．０に低下すると８ｍＭに低下することを報告した。上記論文は植物タンパク質に関するものではない。
【０００９】
Ｉ．Ｒ．ＭｃＫｉｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｄｉｆｆｕｓｉｎｇ−ｗａｖｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｔｅｄ  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｅｄ  ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ，２００９，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，１１２７−１１３３］は、ｐＨ範囲６．０〜７．２において１０重量％で再構成された脱脂乳への塩化カルシウム添加の影響、並びにその後、乳を６０、７５及び９０℃で１０分間加熱したときの粘度に対する影響を調査した。彼らは、最大１０ｍＭの塩化カルシウム含有量で、９０℃で加熱したときの乳について、臨界不安定性ｐＨが５．９であることを報告した。上記論文は植物タンパク質に関するものではない。
【００１０】
Ｌ．Ｒａｍａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｔｈｅ  ｒｈｅｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｉｌｋ  ｇｅｌｓ，２０１４，Ｊ．Ｆｏｏｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，４５−５１］は、７０℃で加熱したときの全脂肪乳（３．５％脂肪）への塩化カルシウムの添加の影響を明らかにした。１２．５ｍＭ未満の塩化カルシウムを添加すると、より粘稠な分散液がもたらされ、塩化カルシウム濃度を増加させると、より強度の高いゲルが形成されることが報告された。興味深いことに、塩化カルシウムを添加し、乳を９０℃で１０分間前処理してから７０℃で加熱すると、最も強度の高いゲルが生じた。ゲル形成は、多くの半固体の食品及び飲料製品において望ましくない。上記論文は植物タンパク質に関するものではない。
【００１１】
Ｔ．Ｐｈａｎ−Ｘｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｔｕｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  ｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｏｒ  ｓｏｄｉｕｍ  ｉｏｎｓ．２０１３，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１４，６，１９８０−１９８９］は、ｐＨ７．０で塩化カルシウムを□−ラクトグロブリンに添加して１００％ホエイタンパク質（□−ラクトグロブリン）を処理した場合、４重量％のタンパク質濃度に対してカルシウム含有量が５〜６ｍＭのときに、６８℃又は８５℃で加熱すると、マイクロゲル又はゲル形成をもたらしたことを報告している。この場合もゲル形成は、多くの半固体の食品及び飲料製品において望ましくない。
【００１２】
Ｎ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｔｈｅｒｍａｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｙ  ｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｔ  ｎｅｕｔｒａｌ  ｐＨ．２０１６，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，６１，７４０−７４６］は、大豆タンパク質単離物を、中性ｐＨで５０〜９０℃の範囲の温度に加熱すると、５〜９重量％の範囲のタンパク質濃度で、フラクタル凝集体を形成したことを報告している。カルシウムがタンパク質凝集に与える影響は記載されていない。
【００１３】
Ｊ．Ｍ．Ｆｒａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．［Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｈｅｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｐｅａ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ  ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ．２０００，ＪＡＯＣＳ，７７，９，９７５−９８４］は、６重量％のエンドウ豆タンパク質で安定化された濃縮６５重量％ヒマワリ油エマルションが、７０℃を超える温度で最大６０分間加熱すると粘度増加を示し、エンドウ豆タンパク質の等電点付近のｐＨ、すなわちｐＨ５．３で最も高い粘度増加が得られたことを報告している。
【００１４】
カゼインミセルとエンドウ豆タンパク質との間の相互作用は、Ｊ．−Ｌ．Ｍｅｓｓｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．［Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅ−ｐｅａ  ｓｙｓｔｅｍ（ｐａｒｔ  １）：ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．２０１７，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，６７，２２９−２４２］に記載されている。加熱すると、ミセルカゼイン及びエンドウ豆タンパク質の分散体は、４０〜８５℃、ｐＨ  ７．１で、１：１の重量混合比及び１．８重量％のタンパク質含量で分離する。カゼインはエンドウ豆タンパク質の凝集に関与しなかったが、エンドウ豆タンパク質サブユニットの解離に関係していたと結論付けられた。この文書は、遊離カルシウムの効果を開示していない。
【００１５】
Ｃ．Ｍ．Ｂｅｌｉｃｉｕ  ａｎｄ  Ｃ．Ｉ．Ｍｏｒａｒｕ［Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｍｉｃｅｌｌａｒ  ｃａｓｅｉｎ−ｓｏｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ．２０１１，Ｆｏｏｄ  Ｈｙｄｒｏｃｏｌｌｏｉｄｓ，２５，１４４８−１４６０］は、１：１のカゼインミセル及び大豆タンパク質単離物を、２〜１５重量％の範囲のタンパク質含有量で、４０〜９０℃の範囲、ｐＨ  ７．０で、１５分間加熱することの効果を研究した。彼らは、混合物の流動特性が、同じタンパク質濃度の大豆タンパク質単離物よりも低いことを見出した。加えて、著者は、カルシウムが溶液から沈殿し、凝集体の全体的な電荷に関係せず、食感／粘度に関係しなかったと主張した。
【００１６】
従来技術の教示は、乳製品へのカルシウム添加で粘度増加が得られる場合があることを示すが、乳／植物タンパク質の混合物の粘度増加が得られる場合があることは開示されていない。また、ゲル化効果が食品製造において望ましくない場合があることも、従来技術から周知である。更に、製品のｐＨは変動し、プロセスに影響を与える場合があるが、製品の不安定性につながる場合がある。従来技術では、望ましい味及び食感をもたらす食品及び飲料製品を提供する方法が示されていない。
【００１７】
したがって、優れた味及び食感をもたらしながら、主要栄養素の栄養バランスを示す食品及び飲料製品が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明の目的は、改善された食感及び口当たりを有する食品又は乳／植物タンパク質製品を提供することである。
（発明の概要）
【００１９】
本発明は、特定濃度の添加二価カチオンの存在下での特定の熱処理による、乳／植物タンパク質ベースの凝集体の使用による改善を提供する。
【００２０】
第１の態様では、本発明は、食品又は飲料製品の製造方法であって、
カゼインミセルと、ホエイタンパク質と、植物タンパク質とを含み、５．９〜７．１、好ましくは６．２〜６．８のｐＨを有し、１〜１５重量％の総タンパク質濃度を有する、成分組成物を用意する工程であって、
組成物は、カゼインミセルのホエイタンパク質に対する比が９０／１０〜６０／４０であり、
カゼインミセルとホエイタンパク質の、植物タンパク質に対する比が８０／２０〜２０／８０である、工程と、
二価カチオンを添加して、成分組成物に２．０〜１０ｍＭの濃度の遊離二価カチオンをもたらす工程と、
続いて
上記成分組成物を熱処理して、カゼインミセル、ホエイタンパク質及び植物タンパク質を含む凝集タンパク質を形成する工程であって、凝集体は、レーザー回折により測定したＤ（４，３）平均直径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する、工程と、
を含む、方法に関する。
【００２１】
本発明は、製品中の総脂肪含有量の低減を可能にしながら最適な感覚特性をもたらすことを目的として、添加遊離二価カチオンの存在下で熱処理すると生成する乳／植物タンパク質ベースの凝集体を使用する。更に、本発明により、追加の安定剤又はヒドロコロイドを使用せずとも、乳製品ベースの食感付与製品の配合が可能になる。
【００２２】
本発明の好ましい方法において熱処理では、成分組成物は、８０〜１２５℃の温度に３０〜９００秒間、又は１２６℃以上の温度に３〜４５秒間供される。本発明のより好ましい実施形態では、熱処理により、成分組成物は、８０〜１００℃の温度に０．５〜４分間、又は１３５℃を超えるＵＨＴ（超高温）熱処理に３〜４５秒間供される。
【００２３】
請求項１に記載の方法によると、成分組成物は、８０〜１２５℃の温度で、３０〜９００秒間、又は１２６℃以上の温度で３〜４５秒間熱処理される。
【００２４】
第２の態様では、本発明は、上記の方法によって得られる食品又は飲料製品に関する。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、カゼインミセル、ホエイタンパク質及び植物タンパク質の凝集体を含む凝集タンパク質を含有する食品又は飲料製品に関し、該製品は、５．９〜７．１、好ましくは６．２〜６．８のｐＨを有し、かつ１〜１５重量％の総タンパク質濃度を有し、組成物は、カゼインミセルのホエイタンパク質に対する比が９０／１０〜６０／４０であり、カゼインミセルとホエイタンパク質の植物タンパク質に対する比が８０／２０〜２０／８０であり、成分組成物中の遊離二価カチオンの濃度は２．０〜１０ｍＭであり、凝集タンパク質は、カゼインと、ホエイタンパク質と、植物タンパク質とを含み、凝集体は、レーザー回折により測定したＤ（４，３）平均直径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】総タンパク質含有量３重量％及び混合比７５／２５の乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）／大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）により安定化された高オレイン酸ヒマワリ油ベースのエマルションについて、ｐＨ７．０で５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下又は不在下で加熱（９５℃、１５分）及び剪断後の粒度分布を示す。（Ａ）２．５重量％ヒマワリ油、（Ｂ）５重量％ヒマワリ油、（Ｃ）１０重量％ヒマワリ油。実線：ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；破線：ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。
【図２】総タンパク質含有量３重量％及び混合比５０／５０の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物により安定化された高オレイン酸ヒマワリ油ベースのエマルションの、ｐＨ７．０で１０ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下又は不在下で加熱（９５℃、１５分）及び剪断後の粒度分布を示す。（Ａ）２．５重量％ヒマワリ油、（Ｂ）５重量％ヒマワリ油、（Ｃ）１０重量％ヒマワリ油。実線：ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；破線：ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。
【図３】３重量％乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比７５／２５）で安定化された５重量％の高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、９５℃で１５分間の熱処理及び剪断後の、共焦点走査レーザー顕微鏡写真を示す。（Ａ）ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；（Ｂ）ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。スケールバーは、１０μｍである。矢印の隣のｍｃはカゼインミセル、ｓｐは大豆タンパク質、ｏは油滴を表す。
【図４】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比５０／５０）で安定化された５重量％の高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、９５℃で１５分間の熱処理及び剪断後の、共焦点走査レーザー顕微鏡写真を示す。（Ａ）ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；（Ｂ）ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。スケールバーは、１０μｍである。矢印の隣のｍｃはカゼインミセル、ｓｐは大豆タンパク質、ｏは油滴を表す。
【図５】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比７５／２５）で安定化された高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、ｐＨ７．０で５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下又は不在下、９５℃で１５分間の熱処理及び剪断後の、２０℃における流動曲線を示す。（Ａ）２．５重量％ヒマワリ油、（Ｂ）５重量％ヒマワリ油、（Ｃ）１０重量％ヒマワリ油。〇：ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；×：ｐＨ７．０、５ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。
【図６】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比７５／２５）で安定化された高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、ｐＨ７．０で５ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下又は不在下、９５℃で１５分間の熱処理及び剪断後の、２０℃における流動曲線を示す。（Ａ）２．５重量％ヒマワリ油、（Ｂ）５重量％ヒマワリ油、（Ｃ）１０重量％ヒマワリ油。〇：ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；×：ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。
【図７】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物混合物で安定化された高オレイン酸ヒマワリ油エマルションについて、ｐＨ７．０でＣａＣｌ２の存在下又は不在下、９５℃で１５分間の熱処理及び剪断後の、剪断速度１０  １／ｓにおける粘度を示す。（Ａ）ＭＰＣ／ＳＰＩ混合比７５／２５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２添加、（Ｂ）ＭＰＣ／ＳＰＩ混合比５０／５０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。
【図８】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比７５／２５）で安定化された５重量％の高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、パイロットプラントにおいて９５℃で３分間の熱処理及び剪断後の、共焦点走査レーザー顕微鏡写真を示す。（Ａ）ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；（Ｂ）ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。スケールバーは、１０μｍである。矢印の隣のｐはタンパク質、ｏは油滴を表す。
【図９】３重量％の乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物（混合比５０／５０）で安定化された５重量％の高オレイン酸ヒマワリ油エマルションの、パイロットプラントにおいて９５℃で３分間の熱処理及び剪断後の、共焦点走査レーザー顕微鏡写真を示す。（Ａ）ｐＨ７．０、ＣａＣｌ２添加なし；（Ｂ）ｐＨ７．０、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２添加。スケールバーは、１０μｍである。矢印の隣のｐはタンパク質、ｏは油滴を表す。
【図１０】乳−エンドウ豆系又は乳−大豆系を配合するために使用された方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
乳／植物タンパク質の混合物への二価カチオン添加、特にカルシウム添加が、タンパク質凝集及び粘度増加に及ぼす効果に関する実験を実施したとき、驚くべきことに、加熱時に形成された凝集体の沈殿又はゲル化を伴わずに、最適なタンパク質凝集をもたらす二価カチオン添加には臨界範囲が存在することが見出された。この最適なカルシウム濃度を上回ると、系は沈降を伴う過剰凝集又は凝集体サイズの低下を示した。
【００２８】
理論に束縛されるものではないが、タンパク質へ塩化カルシウムを添加することで、タンパク質の表面に吸着されたプロトンと、より高い親和性を有するカルシウムイオンとの交換がもたらされると考えられる。この現象により、分散体のｐＨが低下し、それによってタンパク質間の静電反発力が減少した。これらの条件では、乳／植物タンパク質ベースの分散体及びエマルションを後で熱処理することで、タンパク質の制御された凝集がもたらされ、これは最終製品の食感特性及び感覚特性にプラスの影響を与えることが示された。
【００２９】
本発明の主な利点は、低脂肪乳／植物タンパク質ベースの系に食感を付与することができ、追加のヒドロコロイドの使用削減を可能にすることである。
【００３０】
本文脈において、本発明による方法で形成され、本発明の製品中に存在する凝集体は、Ｄ（４，３）平均径によって測定したときに５〜５０μｍのサイズを有する。凝集体の粒度分布は、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）又は同等の測定システムを使用して測定する（ＰＳＤ）。測定のために、試料は、例えば、９〜１０％の遮蔽率（ｏｂｓｃｕｒａｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）が得られ、次いでＭａｓｔｅｒｓｉｚｅｒで分析するまで、Ｈｙｄｒｏ  ＳＭ測定セルに分散させる場合がある。
【００３１】
更に、本文書では、遊離二価カチオンは、選択電極によって測定され得る。例えば、遊離カルシウム（イオン）濃度は、６９２ｐＨ／イオンメーター（Ｍｅｔｒｏｈｍ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に接続されたＢＮＣコネクターＰ／Ｎ５１３４４７０３を備えたメトラー・トレドカルシウム選択電極ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ（商標）ＤＸシリーズ半電池で測定される。
【００３２】
更に、本文書では、特に指示がない限り、成分の％は、組成物の重量に基づく重量％、すなわち重量／重量％を意味する。
【００３３】
好ましくは、成分組成物中のタンパク質濃度は、１〜１０重量％、より好ましくは２〜９重量％である。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、凝集体は、Ｄ（４，３）平均直径によって測定したときに１０〜４０μｍ、好ましくは１０〜３０μｍである。これにより、凝集体がざらつきを与えることなく、製品に望ましい口当たりを与える。
【００３５】
本文脈において、植物タンパク質は、大豆、エンドウ豆、オート麦、ジャガイモ、キャノーラ、ピーナッツ、又は米からなる群から選択され得る。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、植物タンパク質は、エンドウ豆タンパク質、大豆タンパク質、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。これらの植物タンパク質は、本発明の製品に良好な食感を提供することが見出されている。
【００３７】
有利には、本発明による方法では、植物タンパク質の溶解度は、物理的処理（例えば、加熱、均質化）により改善されている。
【００３８】
本発明による方法では、成分組成物が均質化されることが好ましい。しかしながら、本発明による方法で形成された凝集体は、凝集体が高すぎる剪断を受けた場合に破壊され得ることが見出されている。有利には、均質化は、成分組成物の熱処理の前である。
【００３９】
本発明によれば、二価カチオンは、Ｃａカチオン若しくはＭｇカチオン又はこれらの組み合わせからなる群から選択されることが好ましい。これらの二価カチオンは食品グレードであり、油又は脂肪の酸化し易さに関係しない。
【００４０】
本発明の好ましい実施形態では、二価カチオンはカルシウムカチオンである。
【００４１】
有利には、二価カチオン、好ましくはカルシウム塩は、遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜６．０ｍＭ、好ましくは２．０〜４．０ｍＭ、より好ましくは２．０〜３．０ｍＭになるまで添加される。
【００４２】
本発明の好ましい実施形態では、植物タンパク質はエンドウ豆タンパク質であり、カルシウム塩は、遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜３．０ｍＭ、好ましくは２．０〜２．５ｍＭになるまで添加される。本発明のこの実施形態は、添加された塩起因するいくつかの感覚的欠陥（金属味、石鹸っぽさ）がもたらされないという利点を有する。
【００４３】
植物タンパク質はエンドウ豆タンパク質であり、カルシウム塩は、遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜３．０ｍＭ、好ましくは２．０〜２．５ｍＭになるまで添加される。
【００４４】
本発明の別の好ましい実施形態では、植物タンパク質は大豆タンパク質であり、カルシウム塩は、遊離二価カルシウムカチオン濃度が２．０〜３．０ｍＭ、好ましくは２．０〜３．０ｍＭになるまで添加される。本発明のこの実施形態は、添加された塩に起因するいくつかの感覚的欠陥（金属味、石鹸っぽさ）がもたらされないという利点を有する。
【００４５】
成分組成物のｐＨは、カチオンを添加した後に５．９〜６．８に調整され得る。
【００４６】
更に、二価カチオンは、ミネラル塩の形態で添加されることが好ましい。好ましくは、ミネラル塩は、塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、リン酸カルシウム、ステアレートマレエート、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、及びグルコン酸カルシウムからなる群から選択される。本発明の特に好ましい実施形態では、カルシウム塩は、塩化カルシウム又は乳酸カルシウムである。本発明の全ての自然な実施形態では、カルシウムは、例えば膜分画によってタンパク質、脂肪、及びラクトースを分離した後の乳由来の濃縮ミネラルから得られる。
【００４７】
成分組成物のｐＨは、カルシウムカチオンを添加する前に好ましくは６．２〜７．１である。
【００４８】
凝集反応後の成分組成物中の可溶性タンパク質の含有量は、総タンパク質含有量に対して好ましくは３０％以下、好ましくは２０％以下であり、タンパク質のほとんどが凝集構造に埋め込まれていることを示す。
【００４９】
本発明の一実施形態では、成分組成物は、０〜３６重量％の脂肪、好ましくは１．０〜２０重量％、より好ましくは３．０〜１５重量％、最も好ましくは５〜１０重量％の脂肪を含む。少量の脂肪であっても、製品内に形成された凝集により、製品の食感がクリーミーであることが判明している。
【００５０】
成分組成物中のカゼイン及びホエイタンパク質は、好ましくは、生乳、低温殺菌乳、低温濃縮乳、低温粉乳、乳タンパク質濃縮物、液体若しくは粉末フォーマットの乳タンパク質単離物、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される形態で提供され、追加のホエイタンパク質は、スイートデイリーホエイ、ホエイタンパク質濃縮物、液体、濃縮物若しくは粉末フォーマットのホエイタンパク質単離物、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される形態で提供される。
【００５１】
好ましくは、ホエイタンパク質源は非変性である。
【００５２】
植物タンパク質は、好ましくは粉末植物タンパク質濃縮物又は単離物から選択される。
【００５３】
カゼインミセルは、液体若しくは粉末形態又はこれらの組み合わせで、乳、乳タンパク質濃縮物、及び乳タンパク質単離物からなる群から得ることができる。
【００５４】
本発明はまた、上記の方法によって得られる乳製品濃縮物に関する。
【００５５】
本発明の特に好ましい実施形態では、濃縮物は、凍結乾燥、噴霧乾燥、又はロール乾燥の手段によって粉末に乾燥される。
【００５６】
本発明による製品は、アイスクリーム又は冷凍菓子、乳製品濃縮物又はデザート、ソースなどの乳製品であってもよい。製品フォーマットとしては、凍結、常温、チルド、液体及び粉末が挙げられる。
【実施例１】
【００５７】
以下の実施例は、限定するものではなく例として、本発明の様々な実施形態を例示する。
【００５８】
実施例１：
還元全脂肪乳及びエンドウ豆タンパク質単離物に乳酸カルシウムを添加することよって得られる、乳タンパク質とエンドウ豆タンパク質との凝集体（全タンパク質含有量の７５％が乳タンパク質であり、２５％がエンドウ豆タンパク質である）。
【００５９】
材料及び方法
脱脂粉乳（ＭＳＫ）（低熱）は、Ｈｏｃｈｄｏｒｆ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、エンドウ豆タンパク質単離物Ｎｕｔｒａｌｙｓ  ＸＦはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された。
【００６０】
エンドウ豆タンパク質単離物のタンパク質濃度は脱脂粉乳よりも高いことから、マルトデキストリンＤＥ  ３８−４１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加することによって総固形分（ＴＳ）を調整し、平均全脂肪乳として１３％ＴＳを達成するようにした。高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、乳脂肪の代わりに使用されている。
【００６１】
１３％ＴＳでは、系は、３．３％の総タンパク質（２．５％乳タンパク質、０．８％エンドウ豆タンパク質）と、３．５％の油で配合されている。
【００６２】
表１は、乳−エンドウ豆系の組成を示す。
【００６３】
【表１】
2020521487.tif 000002
【００６４】
カルシウム添加のために、乳酸カルシウム（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を乾燥混合し、本方法の間にマルトデキストリンと共に添加した。
【００６５】
図１０は、乳−豆系を配合するために使用された方法を示す。
【００６６】
エンドウ豆タンパク質の溶解度を高めるために、エンドウ豆タンパク質を５５℃の逆浸透水に添加し、３０分間撹拌した。このタンパク質分散体を、１１０℃の油浴（ＨＢＲ４  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に浸漬されたコイル管（内半径４ｍｍ、７回巻、直径９４ｍｍ、長さ２１００ｃｍ）を用いて９５℃で加熱した。コイル出口で確実に標的温度に到達させるため、流速は４２５ｍＬ／分とした。加熱した分散体を、９５℃の水浴（ＨＢＲ４  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に置いた、電磁攪拌器を備えたＳｃｈｏｔｔボトルに回収した。エンドウ豆タンパク質分散体を９５℃で１０分間撹拌した後、冷水浴中で５０℃まで冷却し、続いて卓上ホモジナイザーＰａｎｄａ  ＰＬＵＳ（ＧＥＡ  Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ，Ｉｔａｌｙ）で、２００＋５０バールで均質化した。
【００６７】
他の成分（ＭＳＫ、油（存在する場合）、マルトデキストリン及びカルシウム塩）を５０℃で均質化したエンドウ豆タンパク質分散体に添加し、混合物を５０℃で４０分間撹拌した。プレエマルションは、１４０００ｒｐｍで１分間のＵｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ（Ｔ２５  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）処理によって得られる。
【００６８】
続いて、事前に均質化した混合物を、５０℃、２００＋５０バールで均質化し、次いで氷浴中で４℃まで冷却した。混合物を異なるアリコートに分割し、１０℃未満に維持しながら、アリコートの各々のｐＨを、５％ｗ／ｗ水酸化カリウム溶液（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又は１０％ｗ／ｗクエン酸溶液（Ｊｕｎｇｂｕｎｚｌａｕｅｒ，Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて目標値に調整した。
【００６９】
ｐＨ平衡化後、各エマルションを、プレートヒーター（ｒｔｃ  ｂａｓｉｃ  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上のＳｃｈｏｔｔボトル内で、連続撹拌下で予熱した。コイル出口で確実に標的温度に到達させるため、予熱したエマルションを、１１０℃の油浴（ＨＢＲ４  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に浸漬した加熱コイル（内半径４ｍｍ、７回巻、直径９４ｍｍ、長さ２１０ｃｍ）を通して１１５ｍＬ／分でポンプ圧送した。コイルを保持管（内半径７ｍｍ、長さ３４００ｍｍ）に接続し、これを９６℃の水浴（ＨＢＲ４  ＩＫＡ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に浸漬した。コイルと水浴との間の接続は、保持管と合わせて、９６℃で６０秒の合計加熱時間を提供した。
【００７０】
加熱後、追加のコイル管（内半径４ｍｍ、４回巻、直径９４ｍｍ、長さ１２０ｃｍ）を通して試料をポンプ圧送し、氷水に浸漬して、３０秒未満で＜５０℃に冷却した。
【００７１】
流動特性
非加熱のエマルションと加熱したエマルションとを用いて、プレート／プレート形状（直径６０ｍｍ）及び間隙１ｍｍを備えたＵＭＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と結合された制御応力レオメーターＨａａｋｅ  Ｒｈｅｏｓｔｒｅｓｓ  ６０００を使用して流動実験を実施した。
【００７２】
定常剪断流曲線を、２５℃＋／−０．１の一定温度において、０〜３００  １／ｓ（線形増加）の範囲の剪断速度で求めた。見かけ粘度を剪断速度に応じて記録した。
【００７３】
粒度分布
粒度分布を評価するために、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ  ２０００粒度計（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｌｔｄ．，ＵＫ）を使用した動的光散乱によって、非加熱のエマルションと加熱したエマルションとを分析した。液体試料を分散させるために使用した、ガスを含まない超純水は、Ｈｏｎｙｗｅｌｌ水圧減圧器（最大脱イオン水圧力：１バール）及びＥＲＭＡ水脱気器（脱イオン水中の溶存空気を低減するため）を使用して用意した。
【００７４】
使用された測定設定として、０．０１の吸収における屈折率は、脂肪液滴については１．４６、水については１．３３である。全ての試料は、２．０〜２．５％の遮蔽率で測定された。測定結果は、Ｍｉｅ理論に基づいてＭａｌｖｅｒｎソフトウェアで計算される。体積ベースの平均直径値Ｄ（４，３）が報告される。
【００７５】
イオン（遊離カルシウム）定量
カルシウムイオン濃度は、Ｏｒｉｏｎ  Ｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｅｒ  ＥＡ９４０カルシウムイオン選択電極と、ｐＨ／ｍＶメータ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｉｏｎ，ＵＳＡ）をｍＶモードで使用して測定した。イオン強度を標準化するために、８０ｍＭ  ＫＣｌを含有する１、５、及び１０ｍＭのカルシウム標準溶液のｍＶ読み取り値の標準曲線からの回帰方程式に基づいて、ミリボルト読み取り値からカルシウムイオン濃度を計算した。これらの標準物質は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）から供給された０．１Ｍ塩化カルシウム標準溶液、及び４Ｍ塩化カリウム溶液（Ｉｏｎｉｃ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ  Ａｄｊｕｓｔｏｒ  Ｃａｌｃｉｕｍ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｏｒｉｏｎ，ＵＳＡ）から調製した。
【００７６】
結果
表２は、乳−エンドウ豆タンパク質（７５：２５−表１のレシピ）に２．５ｍＭ乳酸カルシウムを添加して調製され、異なるｐＨに調整された試料の分析から得られた結果を示す。
【００７７】
【表２】
2020521487.tif 000003
【００７８】
表２は、ｐＨを低下させることによって、系中のカルシウムは、ｐＨ６．０６において２．８ｍＭまで徐々に放出されていることを示す。乳酸カルシウムの存在下でエマルションを加熱した後に、粒径と粘度の両方が増加したことを観察することができる。粘度増加に対する効果は、ｐＨが低い方が大きい。
【００７９】
ｐＨが５．８４まで更に低下したとき、遊離カルシウムは３．６まで増加し、非常に大きな凝集体（２３９．５４１μｍ）の形成をもたらし、粘度効果（１００  １／ｓで３ｍＰａ・ｓ）を失う。しかしながら、系はゲル化しなかった。
【００８０】
実施例２：
二倍濃縮された還元全脂肪乳に乳酸カルシウムを添加することによって得られた乳タンパク質とエンドウ豆タンパク質との凝集体（乳タンパク質の２５％がエンドウ豆タンパク質によって置換されている）。
【００８１】
脱脂粉乳（ＭＳＫ）（低熱）は、Ｈｏｃｈｄｏｒｆ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、エンドウ豆タンパク質単離物Ｎｕｔｒａｌｙｓ  ＸＦはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された。
【００８２】
エンドウ豆タンパク質単離物のタンパク質濃度は脱脂粉乳よりも高いことから、マルトデキストリンＤＥ  ３８−４１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加することによって総固形分（ＴＳ）を調整し、平均全脂肪乳として１３％ＴＳを達成するようにした。高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、乳脂肪の代わりに使用されている。
【００８３】
２６％ＴＳでは、系は、６．６％の総タンパク質（４．９５％乳タンパク質、１．６５％エンドウ豆タンパク質）と、７％油で配合されている。
【００８４】
表１は、乳−エンドウ豆系の組成を示す。
【００８５】
【表３】
2020521487.tif 000004
【００８６】
カルシウム添加のために、乳酸カルシウム（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を乾燥混合し、本方法の間にマルトデキストリンと共に添加した。
【００８７】
図１０は、乳−エンドウ豆系を配合するために使用された方法を示す。
【００８８】
エンドウ豆タンパク質を前処理し、実施例１に示すように、乳−エンドウ豆系を配合及び加工した。
【００８９】
流動特性
非加熱のエマルションと加熱したエマルションとを用いて、実施例１と同様に流動実験を行った。
【００９０】
粒度分布
粒度分布を、実施例１と同様に分析した。
【００９１】
イオン（遊離カルシウム）判定
カルシウムイオン濃度を、実施例１に示すように測定した。
結果
【００９２】
【表４】
2020521487.tif 000005
【００９３】
表４は、２．５ｍＭの乳酸カルシウム（ｃａｌｃｉｕｍ  ｌａｃｔａｔｅｄ）を添加したエマルションは、ｐＨ６．７で１．４ｍＭの遊離カルシウム値を特徴とすることを示し、これは熱処理中に有意なタンパク質凝集を誘導しない。ｐＨが低下すると、系内のカルシウムは、ｐＨ６．１１で３．０ｍＭまで徐々に放出されている。乳酸カルシウムの存在下、及び２．０ｍＭ以上の遊離カルシウム濃度でエマルションを加熱した後に、粒径及び粘度の両方が増加することを観察することができる。粘度増加に対する効果は、ｐＨが低い方が大きく、したがって遊離カルシウム濃度が高い方が大きい。
【００９４】
実施例３：
二倍濃縮された還元低脂肪乳に乳酸カルシウムを添加することによって得られた乳タンパク質とエンドウ豆タンパク質との凝集体（乳タンパク質の２５％がエンドウ豆タンパク質によって置換されている）。
【００９５】
脱脂粉乳（ＭＳＫ）（低熱）は、Ｈｏｃｈｄｏｒｆ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、エンドウ豆タンパク質単離物Ｎｕｔｒａｌｙｓ  ＸＦはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された。
【００９６】
エンドウ豆タンパク質単離物のタンパク質濃度は脱脂粉乳よりも高いことから、マルトデキストリンＤＥ  ３８−４１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加することによって総固形分（ＴＳ）を調整し、平均全脂肪乳として１３％ＴＳを達成するようにした。高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、乳脂肪の代わりに使用されている。２６％ＴＳでは、系は、６．６％の総タンパク質（４．９５％乳タンパク質、１．６５％エンドウ豆タンパク質）と、１％の油で配合されている。
【００９７】
表５は、乳−エンドウ豆系の組成を示す。
【００９８】
【表５】
2020521487.tif 000006
【００９９】
カルシウム添加のために、乳酸カルシウム（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を乾燥混合し、本方法の間にマルトデキストリンと共に添加した。
【０１００】
図１０は、乳−エンドウ豆系を配合するために使用された方法を示す。
【０１０１】
エンドウ豆タンパク質を前処理し、実施例１に示すように、乳−エンドウ豆系を配合及び加工した。
【０１０２】
流動特性
非加熱のエマルションと加熱したエマルションとを用いて、実施例１と同様に流動実験を行った。
【０１０３】
粒度分布
粒度分布を、実施例１と同様に分析した。
【０１０４】
イオン（遊離カルシウム）判定
カルシウムイオン濃度を、実施例１に示すように測定した。
結果
【０１０５】
【表６】
2020521487.tif 000007
【０１０６】
表６は、乳酸カルシウムを含むエマルションが、ｐＨ６．５９で１．５ｍＭの遊離カルシウムイオン値を有したことを示し、この値は全脂肪系で観察された値と同程度である。これらの条件下（ｐＨ６．５９、遊離カルシウム濃度１．５ｍＭ）では、熱処理中に有意なタンパク質凝集は誘導されなかった。ｐＨが低下すると、遊離カルシウムはｐＨ６．２０で最大２．４ｍＭまで増加し、エマルションを加熱した後に粒径及び粘度の両方が増加した。粘度増加に対する効果は、ｐＨが低い方が大きい。乳酸カルシウムを添加し、ｐＨを低下させることにより、低脂肪系では、カルシウム非添加の全脂肪系の粘度（１００  １／ｓで１６ｍＰａ・ｓ）と同様の粘度又はより高い粘度さえも達成することが可能であった。
【０１０７】
実施例４：
二倍濃縮された還元スキムミルクに乳酸カルシウムを添加することによって得られた乳タンパク質とエンドウ豆タンパク質との凝集体（乳タンパク質の２５％がエンドウ豆タンパク質によって置換されている）。
【０１０８】
脱脂粉乳（ＭＳＫ）（低熱）は、Ｈｏｃｈｄｏｒｆ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、エンドウ豆タンパク質単離物Ｎｕｔｒａｌｙｓ  ＸＦはＲｏｑｕｅｔｔｅ（Ｆｒａｎｃｅ）によって提供された。エンドウ豆タンパク質単離物のタンパク質濃度は脱脂粉乳よりも高いことから、マルトデキストリンＤＥ  ３８−４１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加することによって総固形分（ＴＳ）を調整し、平均全脂肪乳として１３％ＴＳを達成するようにした。高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、乳脂肪の代わりに使用されている。２６％  ＴＳでは、系は、６．６％の総タンパク質（４．９５％の乳タンパク質、１．６５％エンドウ豆タンパク質）で配合され、脂肪添加を全く行わない。
【０１０９】
表５は、乳−エンドウ豆系の組成を示す。
【０１１０】
【表７】
2020521487.tif 000008
【０１１１】
カルシウム添加のために、乳酸カルシウム（Ｐｕｒａｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を乾燥混合し、本方法の間にマルトデキストリンと共に添加した。
【０１１２】
図１０は、乳−エンドウ豆系を配合するために使用された方法を示す。
【０１１３】
エンドウ豆タンパク質を前処理し、実施例１に示すように、乳−エンドウ豆系を配合及び加工した。
【０１１４】
流動特性
非加熱のエマルションと加熱したエマルションとを用いて、実施例１と同様に流動実験を行った。
【０１１５】
粒度分布
粒度分布を実施例１と同様に分析したが、使用した測定設定では、タンパク質の屈折率は１．５２であった。
【０１１６】
イオン（遊離カルシウム）判定
カルシウムイオン濃度を、実施例１に示すように測定した。
結果
【０１１７】
【表８】
2020521487.tif 000009
【０１１８】
表８は、乳酸カルシウムを含むタンパク質分散体が、ｐＨ６．６９で１．５の遊離カルシウムイオン値を有したことを示し、この値は全脂肪及び低脂肪系で観察された値と同程度である。これらの条件下（ｐＨ６．６９、遊離カルシウム濃度１．５ｍＭ）では、熱処理中に有意なタンパク質凝集は誘導されなかった。ｐＨが低下すると、タンパク質分散体では、遊離カルシウムがｐＨ６．０３で２．８ｍＭまで増加し、タンパク質分散体を加熱した後には粒径及び粘度の両方が増加した。粘度増加に対する効果は、ｐＨが低い方が大きい。乳酸カルシウムを添加し、ｐＨを低下させることにより、脂肪を含まない系では、カルシウム非添加の全脂肪系の粘度（１００  １／ｓで１６ｍＰａ・ｓ）と同様の粘度又はより高い粘度さえも達成することが可能であった。
【０１１９】
実施例５：
試験室規模での、乳タンパク質濃縮物（ＭＰＣ）／大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）への塩化カルシウム添加によるエマルション安定化
材料及び方法
ＭＰＣ分散体の調製
カゼインミセル分散体の原液を、１０重量％のタンパク質濃度で調製した。カゼインミセル富化乳タンパク質濃縮物Ｐｒｏｍｉｌｋ８５２Ｂを、Ｉｎｇｒｅｄｉａ（Ａｒｒａｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。粉末の組成は（ｇ／１００ｇ湿潤粉末）：タンパク質（Ｎ×６．３８）８２．３、Ｃａ２．６、Ｍｇ０．１、Ｎａ０．０７、Ｋ０．２９、Ｃｌ０．０５、Ｐ１．５６であった。分散体を調製するのに必要な粉末の質量を、粉末中のタンパク質含有量に応じて計算した。
【０１２０】
ＭＰＣ粉末を、室温で撹拌しながら、ＭｉｌｌｉＱ水で３時間水和した。３時間後、タンパク質分散体を、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ−５高圧一段式ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ（登録商標），Ｃａｎａｄａ）で均質化した。この処理は、カゼインミセルの平均粒径を低下させた。これは分散体を安定化させ、ＭＰＣの沈殿を回避することができる。
【０１２１】
Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ  ＺＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（登録商標），ＵＫ）を使用して均質化した後、カゼインミセルのｚ平均流体力学半径を求めた。半径は約２００〜２５０ｎｍであった。対応する多分散指数は、０．２未満であり、試料が単分散の粒度分布を呈することを示した。
【０１２２】
ＳＰＩ分散体の調製
大豆タンパク質の溶解度を改善するべく、大豆タンパク質を、タンパク質変性を最小限に抑えるために軽度の等電点沈殿処理を使用して、非ＧＭＯ大豆粉（Ｓｏｙ  Ｆｌｏｕｒ  ７Ｂ  ＩＰ（ＡＤＭ，Ｄｅｃａｔｕｒ，Ｉｌ，ＵＳＡ；バッチ４１３９３６））から抽出した。この目的のために、大豆粉を、室温で撹拌しながらＭｉｌｌｉＱ水に９０分間分散させた。粉対水の比は、１：８（ｐＨ：６．７で８００ｇの水に対して１００ｇの粉）とした。分散後、１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを７．５に調整し、分散体を１リットルのボトルに入れ、室温において、９，０００ｇで３０分間遠心分離した。その後、上清を回収し、タンパク質を沈殿させるために、１Ｍ  ＨＣｌを用いてｐＨを４．８に調整した。次いで、分散体を、前と同じ条件で再度遠心分離した。遠心分離後、沈殿物を抽出し、粒径を小さくして水和容量を向上させるために、乳鉢で粉砕した。その後、沈殿物を、できるだけ少量の水（質量比１：４、沈殿／水）に少なくとも１０分間撹拌して可溶化し、１Ｍ  ＮａＯＨの添加によってｐＨを７．０に調整した。完全可溶化後、大豆タンパク質単離物分散体を凍結し、凍結乾燥して粉末を得た。粉末の組成は（ｇ／１００ｇ湿潤粉末）：タンパク質（Ｎｘ６．２５）９１．３、Ｃａ０．０５７、Ｍｇ０．０７３、Ｎａ１．５９、Ｋ０．３７、Ｃｌ０．６２、Ｐ０．６３であった。タンパク質抽出に必要とされるｐＨ調整工程により、ミネラルＮａ及びＣｌの量がかなり高くなったことに気付くことができる。大豆タンパク質の異なる画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により同定したところ、大豆タンパク質の主要分画７Ｓ及び１１Ｓの両方の存在が明らかとなった。
【０１２３】
ＳＰＩの原液分散体を、１０重量％のタンパク質濃度で調製した。ＳＰＩを、撹拌しながら室温で４時間、ＭｉｌｌｉＱ水に分散させた。次いで、分散体を４℃で一晩保存して完全に水和させ、撹拌中に形成される発泡体層を減少させた。
【０１２４】
ＭＣＩ／ＳＰＩ混合物の調製
以下に記載のように調製したＭＣＩとＳＰＩの分散体を、ＭＰＣ：ＳＰＩの重量比７５：２５及び５０：５０で混合し、磁気攪拌器を用いて室温で少なくとも１０分間撹拌した。
【０１２５】
エマルションの調製
高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｍａｎｎｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をタンパク質分散体に添加することによってＯ／Ｗエマルションを調製し、全試料について、１０重量％で調製された原液分散体を希釈することによって、２．５、５及び１０重量％の油含有量及び３重量％の一定のタンパク質含有量を得た。続いて、油／水系を、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５  ｂａｓｉｃ（ＩＫＡ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、５００ｍＬの体積に対して１１，０００ｒｐｍ／分で１分間、事前に均質化した。事前に均質化したエマルションを、第１のバルブについては５０バール、第２のバルブについては２５０バールに調整したＰａｎｄａＰＬＵＳ  ＨｏｍｏＧｅｎｉｕｓ  ２０００（ＧＥＡ（登録商標），Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて高圧で均質化し、合計３００バールの圧力を得た。
【０１２６】
エマルションをこの方法によって２回均質化した。均質化後、１Ｍ  ＮａＯＨを添加することによってｐＨを７．０に調整した。カルシウム含有試料について、必要量のＣａＣｌ２２（Ｈ２Ｏ）をｐＨ７．０の試料に添加し、エマルションを室温で１時間撹拌した。次いで、試料を、９７℃に調整した温水浴中で、９５℃で１５分間加熱した。エマルションを氷水で２０分間冷却した後、４℃で１時間保管した。
【０１２７】
冷却後、体積６０ｍＬのビーカー内で、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘ  Ｔ２５  ｂａｓｉｃ（ＩＫＡ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、１６，０００ｒｐｍで２分間加熱処理した。その後分析が完了するまで、エマルションを４℃で保存した。
【０１２８】
粒度分布
粒度分布を評価するために、ＭａｓｔｅｒＳｉｚｅｒ  ３０００（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ（登録商標），ＵＫ）を使用した動的光散乱によって、剪断後のエマルションを分析した。エマルションの試料を、９〜１０％の遮蔽率が得られるまでＨｙｄｒｏ  ＳＭ測定セルに分散させた。非加熱の試料及び加熱した試料を分析した。測定を３回行い、３回の反復の平均を報告した。
【０１２９】
タンパク質凝集体の微細構造
試料の凍結切片法
ＣＬＳＭにより試料を分析するために、凍結切削を行った。凍結切削のため、スクロース及びホルムアルデヒドを試料に添加して、試料を保存した。割合は、スクロースは総体積の３０重量％、ホルムアルデヒドは３．７重量％である。ボルテックスを用いて試料を均質化し、分析を開始する前に４℃で一晩保管した。その後、試料を固定した。このステップは、凍結切片法用の最適切削温度（ＯＣＴ）化合物、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）１ｇ中に０．５ｇの試料を添加することで構成された。組成物を均質化し、凍結切片法用のＯＣＴ化合物、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）が予め入っている凍結試料ホルダに０．１ｇを添加した。
【０１３０】
凍結試料ホルダを、８０ｍＬの２−メチルブタン（９９％、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標），ＵＳより）が入ったプラスチックバイアルに浸漬し、それ自体を液体窒素が入った絶縁ボックスに浸漬した。２−メチルブタンの溶液は、試料の良好な凍結を確実にし、乾燥から保護する。
【０１３１】
次いで、試料をＣｒｙｏｓｔａｔ  ＣＭ  ３０５０（Ｌｅｉｃａ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に入れた。その後−２１℃で、ミクロトームでのカットを、７μｍの厚さで行った。分析が実施されるまで、顕微鏡スライドを−２０℃の冷凍庫で保存した。
【０１３２】
顕微鏡スライドガラスは、組織をガラススライドに接着させ、過酷な工程の間に組織が除去されることを避けるために、ＨｉｓｔｏＧｒｉｐ（５０倍濃縮物、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標），ＵＳ製）で前処理した。
【０１３３】
共焦点走査レーザー顕微鏡
乳タンパク質と大豆タンパク質とを区別するための特定のタンパク質免疫標識を用い、混合タンパク質エマルションを分析した。Ａｕｔｙ（２０１３）によれば、免疫標識は、タンパク質に対してより一般的に使用され、対象とするタンパク質、すなわちＭＰＣ及びＳＰＩを標的とする特異的な抗体を必要とする。免疫標識の結果は、一次抗体の標的エピトープに対する特異性に大きく依存する。特にタンパク質は我々の実験において過酷な熱処理を受けることから、熱変性は、標的タンパク質の免疫反応性に影響を与え得る。この処理は、抗体特異性に影響を及ぼし、標識の有効性を低下させ得る。
【０１３４】
シグナル対ノイズ比が増加することから、一次抗体に結合する蛍光標識された二次抗体を使用して、２ステップ免疫標識を行った。
【０１３５】
抗体を使用してタンパク質を検出する前に、抗体の非特異的結合を防ぐために残りの結合表面を遮断しなければならない。正常ヤギ血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰＣＮ  ５０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（登録商標），ＵＳ）を遮断剤として使用した。２５μＬの正常ヤギ血清を、１ｍＬの抗体希釈緩衝液｛トリス５０ｍＭ−ＮａＣｌ  １５０ｍＭ−ＰＥＧ０．１％−ＢＳＡ２．５％  ｐＨ８．６｝に添加した。調製物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）遠心分離器５７０２（Ｖａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、４，０００ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離の間に、ｍｉｌｌｉＱ水を用いて顕微鏡スライドをすすぎ、Ｔｉｓｓｕｓ  Ｔｅｋ（登録商標）を除去した。正常ヤギ血清を顕微鏡スライドに２０分間塗布し、３つの染色皿（そのうちの２つにはｍｉｌｌｉＱを満たし、最後の１つにはすすぎ緩衝液｛トリス５０ｍＭ−ＮａＣｌ  １．５０Ｍ−ＰＥＧ１％  ｐＨ８．６｝を満たした）の中ですすいだ。大豆抗体は１：２００希釈、カゼインκ抗体は１：５０希釈とし一次抗体を調製した。より効率的な希釈率を選択するために、異なる希釈率を事前に実施していた。２０μＬのウサギ抗カゼインκ（Ａｎｔｉｂｏｄｙｅｓ．Ｏｎｌｉｎｅ，ＵＳ）を、抗体希釈液用溶液１ｍＬに添加し、ボルテックスを用いて均質化した。同様の作業により、ニワトリ抗大豆タンパク質（Ａｎｔｉｂｏｄｙｅｓ．Ｏｎｌｉｎｅ，ＵＳ）を使用して、選択された希釈率に調整して、大豆タンパク質抗体を調製した。上記２種類の抗体を合わせて混合し、各１ｍＬをＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブに入れた。その後、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）チューブを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）遠心分離器５７０２（Ｖａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して４，０００ｇで１０分間遠心分離した。次いで、一次抗体を、顕微鏡スライド上に乗せ、湿潤条件下で４℃で一晩置いた。インキュベーション後、顕微鏡スライドを、すすぎ緩衝液を満たした３つの染色皿の中ですすぎ、最後の１皿の中に試料を１０分間放置した。この間に、二次抗体を、一次抗体と同じ操作に従って調製した。ヤギ抗ニワトリＩｇｙ（Ｈ＆Ｌ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８（Ａｇｒｉｓｅｒａ（登録商標），Ｓｗｅｄｅｎ）、及びヤギ抗ウサギＩｇＹ（Ｈ＆Ｌ）、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４０５（Ａｇｒｉｓｅｒｓ（登録商標），Ｓｗｅｄｅｎ）を二次抗体として使用した。二次抗体を顕微鏡スライド上に１時間置き、ＭｉｌｌｉＱ水を満たした３つの染色皿の中ですすいだ。
【０１３６】
油滴を可視化するために、顕微鏡スライドを、エタノールに溶解したナイルレッドで１０分間染色し、ＭｉｌｌｉＱ水中ですすいだ。次いで、スライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｈａｒｄ  Ｓｅｔ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（登録商標），ＵＳ）装着セットを用いて装着した。
【０１３７】
その後、顕微鏡スライドを、Ｚｅｉｓｓ（登録商標）ＬＳＭ７１０共焦点走査顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ（登録商標），Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して分析した。１０×／０．４５  ∞／０．１７／ＰＬ  ＡＰＯ及び６３×／１．４油／ＤＩＣ  ４２０７８２−９９００／ＰＬ  ＡＰＯを全ての画像に使用した。
【０１３８】
飽和コントロールにより、タンパク質に対する一次抗体の特異性を確認することができ、二次抗体が第１の抗体に特異的であることを確実にする。そのために、タンパク質を２．５μＬ／ｍＬの量で一次抗体の調製に添加した。一次抗体及び二次抗体が特異的である場合、ＣＬＳＭにおいてシグナル及びバックグラウンドがないはずである。また、重ね合わせを避けるため、各スペクトル発光を確実に十分に離れさせるために、ナイルレッドスペクトル発光の制御も行った。
【０１３９】
流動特性
剪断の１日後、同心円筒形状ＣＣ２７−ＳＳ／Ｓ（直径＝２７ｍｍ、ギャップ＝１．１４ｍｍ、Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ（登録商標），Ａｕｓｔｒｉａによる）を有する応力制御されたレオメーターＰｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ５０１（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ（登録商標），Ａｕｓｔｒｉａ）を用いて流動実験を行った。
【０１４０】
２５℃の一定温度で、定常状態の流量測定を行い、１００  １／ｓの剪断応力を試料に５分間適用し、続いて４つの剪断速度（１つは０．１〜５００  １／ｓ、もう一方は５００〜０．１  １／ｓで、これらを２回実施した）を適用し、各３０秒で１５回の測定を行った。見かけ粘度を剪断速度に応じて記録した。
【０１４１】
各測定について、エマルション試料のアリコート（１９ｍＬ）をカップに注いだ。測定を３回行い、３回の反復の平均を報告した。
【０１４２】
可溶性タンパク質含有量
本発明からの製品中の可溶性タンパク質の含有量を評価するために、製造の１日後に、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）遠心分離機５４１８（Ｖａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてエマルションを、室温で２０分間１６，０００ｇで遠心分離した。逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＵＰＬＣ）により分析するために、上清を慎重に回収し、４℃で保存した。
【０１４３】
ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ  Ｍｉｌｆｏｒｄ  Ｍａ，ＵＳＡ）は、バイナリポンプ、温度制御オートサンプラー（サンプルマネージャ−ＵＰＳＭＰＭ６Ｒ）及びフォトダイオードアレイ検出器（ＵＰＰＤＡ−Ｅ）で構成された。装置は、Ｅｍｐｏｗｅｒ（登録商標）３ソフトウェア、Ｐｒｏバージョンによって制御された。
【０１４４】
逆相分析カラムＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ３００  Ｃ４  １．７μｍ  ２．１×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ  Ｍｉｌｆｏｒｄ  Ｍａ，ＵＳＡ）及びＶＡＮＧＵＡＲＤＴＭ  Ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ  ＢＥＨ３００  Ｃ４  １．７μｍ  ２．１×５ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ  Ｍｉｌｆｏｒｄ  Ｍａ，ＵＳＡ）で分離を行った。ＵＰＬＣバイアルを８℃±２℃の一定温度に保ち、サンプルマネージャシステムによって注入した。５００μＬの注入器及び２５０μＬのインジェクションループを使用した。
【０１４５】
カゼイン及び大豆タンパク質の標準を、１０重量％の参照溶液から、ｍｉｌｌｉＱ水で希釈することによって、０．１、０．３、１、３、及び５重量％の濃度で調製した。１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）マイクロチューブに、２００μＬの試料及び８００μＬの緩衝液｛グアニジン−ＨＣｌ７．５Ｍ；クエン酸三ナトリウム６．２５ｍＭ；ＤＴＴ２３ｍＭ｝を添加した。試料の質量及び緩衝液の質量を正確に秤量した。次いで、ボルテックスを用いて組成物を均質化し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ  Ｃｏｍｐａｃｔ（Ｖａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で、６０℃で１０分間、６５０ｒｐｍでインキュベートした。
【０１４６】
インキュベーション後、試料を均質化し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）遠心分離機５４１８（Ｖａｕｄａｕｘ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＡＧ（登録商標），Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で、１６，０００ｇで１０分間、室温で遠心分離した。次いで、上清を慎重に回収し、脂肪層に注意しながら、また、存在する場合はペレットを懸濁させないようにして、ＵＰＬＣバイアルに入れた。注入量は３０μＬ〜１５０μＬで可変であり、試料のタンパク質含有量（ケルダール法、Ｎｘ６．３８により決定）に合わせて、十分なシグナルを有するようにした。変動性を考慮するために、標準物質にも調整された量を注入した。
【０１４７】
溶出中に２つの溶媒を混合して用い勾配溶出を行った。溶媒Ａは水中０．１％ＴＦＡからなり、溶媒Ｂはアセトニトリル／水（９０／１０）（ｖ：ｖ）中０．１％ＴＦＡであった。分離は、１５〜３５％Ｂで４分間（５％Ｂ．分−１）、３５〜４７％Ｂで２４分（０．５％Ｂ．分−１）及び４７％Ｂ〜８０％Ｂで４分間（８．２５％Ｂ．分−１）の直線勾配で実施した。これに続いて、８０％Ｂでの定組成溶離を１分間行った。次いで、２分で直線的に開始条件に戻し、続いて５分間カラムを再平衡化した。
【０１４８】
流速は０．６ｍＬ／分−１とし、カラム温度は４０±１℃で一定に保った。取得はλ＝２１４ｎｍ（解像度２．４ｎｍ−２０ポイント／秒−露光時間自動）で達成された。
【０１４９】
各クロマトグラムを手動で積分した。検量線については、注入されたタンパク質量に応じて総面積をプロットした。可溶性タンパク質含有量は、遠心分離後の上清中に存在するタンパク質量と、遠心分離せずにエマルション中に存在するタンパク質の総量との比から計算し、百分率で表した。
結果
粒度分布
【０１５０】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、７５：２５のＭＰＣ：ＳＰＩ比で熱処理及び剪断を実施すると、ｐＨ７．０におけるエマルションの粒度分布は、試験した３種類のヒマワリ油含有量（２．５、５及び１０重量％）について約４００〜６００ｎｍのピークを示すことを示す。対照的に、５ｍＭの添加遊離カルシウムの存在下で熱処理が実施されたとき、より大きな粒子が形成される。したがって、粒度分布のピークの約１０〜２５μｍへの明確なシフトの存在により、初期油滴が凝集して、より大きいタンパク質ベースの粒子になったことを示す。
【０１５１】
図２Ａ、２Ｂ及び２Ｃは、５０：５０のＭＰＣ：ＳＰＩ比で熱処理及び剪断を実施すると、ｐＨ７．０におけるエマルションの粒度分布は、試験した３種類のヒマワリ油含有量（２．５、５及び１０重量％）について約４００〜６００ｎｍのピークを示すことを示す。対照的に、１０ｍＭの添加遊離カルシウムの存在下で達成される熱処理の際に、より大きな粒子が形成される。したがって、粒度分布のピークの約１０〜２５μｍへの明確なシフトの存在により、初期油滴が凝集して、より大きいタンパク質ベースの粒子になったことを示す。
【０１５２】
微細構造及び可溶性タンパク質含有量
本発明のタンパク質ベースの凝集体の微細構造は、５重量％の高オレイン酸ヒマワリ油を含有するエマルションについて、図３（７５：２５比）及び図４（５０：５０）に明確に示されている。図３Ａは、７５／２５のＭＰＣ／ＳＰＩ比で、十分に画定された油滴の周囲に小さい接続した凝集体が得られたことを示す。ＭＰＣ及びＳＰＩの両方の標識は、両方の特異的な標識が容易に区別できることから、タンパク質が凝集体の近くに位置していないことを示す。可溶性タンパク質の量は約９７％であり、両方のタンパク質源のごくわずかな画分のみが凝集体形成に関与していたことを示した。対照的に、５ｍＭカルシウムの存在下では、より大きい粒子と、より小さい粒子が得られた（図３Ｂ）。油滴は、目に見えにくく、凝集構造に強く埋め込まれていた。ＭＰＣ及びＳＰＩ標識は、粒子内部に位置し、それらが空間的に非常に近いことを示した。この試料中の可溶性タンパク質の量は４％未満であり、ＭＰＣ及びＳＰＩのほとんどが凝集構造に関与したことを示した。図４は、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下での重量比５０／５０のＭＰＣ／ＳＰＩ混合物の顕微鏡写真を示す。添加遊離カルシウムがない場合（図４Ａ）、多数の分離した油滴が埋め込まれた小さな凝集体が見られた。ＣａＣｌ２を添加した場合、２つのタンパク質源の同時標識で見ることができるように、油滴は、ＭＰＣ及びＳＰＩの両方が関与した、より大きなタンパク質凝集体に、はるかに多く埋め込まれた（図４Ｂ）。ｐＨ７．０における可溶性タンパク質の量は、ＵＰＬＣにより測定したときに約８５．９％であった。これは、タンパク質のほとんどが凝集構造に関与しなかったことを示す。塩化カルシウムの存在下で、可溶性タンパク質の量は１３．４％に達するまで劇的に低下したことから、タンパク質のほとんどが凝集体の一部となっており、したがってより大きな粒子の形成に関係することを示す。
【０１５３】
流動特性及び剪断粘度
異なる高オレイン酸ヒマワリ油含有量を有するＭＰＣ／ＳＰＩ混合物の流動曲線を図５及び図６に示す。図５は、７５／２５の混合比の場合、塩化カルシウムの添加が擬塑性流動挙動（ｓｈｅａｒ  ｔｈｉｎｎｉｎｇ  ｂｅｈａｖｉｏｕｒ）を促進し、この効果が初期混合物中の油の含有量と共に増加したことを示す（図５Ａ、５Ｂ及び５Ｃ）。興味深いことに、系は、塩化カルシウム不在下、ｐＨ７．０において、常により低い擬塑性流動挙動を示し、脂肪含有量（ｆａｃｔ  ｃｏｎｔｅｎｔ）の影響がはるかに少なく、形成されたタンパク質構造が系のバルク粘度に強く影響することはできないことを示した。これは、明らかに塩化カルシウム添加がタンパク質凝集を促進し、粒子が粘度に大きく影響を及ぼし、したがって脂肪の減少を可能にする、本発明の試料の場合とは大きく異なる。
【０１５４】
重量混合比５０／５０のＭＰＣ／ＳＰＩ混合物に関連する流量データを図６に示す。７５／２５の比では、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２の存在下で、曲線は、高オレイン酸ヒマワリ油中の含有量が増加することによって増強された強力な擬塑性流動挙動を示したことがわかる（図６Ａ、６Ｂ及び６Ｃ）。これにより、本発明のタンパク質凝集体は、より多くの空間を占有することができ、バルク粘度に影響した。これは、カルシウム不在下でｐＨ７．０における対照系では該当しない。ｐＨ７．０で生成されたエマルションは、剪断速度に応じて、粘度とは独立してニュートン流動挙動を示した。これは、粘度が主に油の体積分率によって決まること、及び油滴が相互作用しないことによって説明される。
【０１５５】
図７は、生理学的口内条件に関連する１０  １／ｓの剪断速度で流動曲線から抽出された剪断粘度をまとめている。両方のＭＰＣ／ＳＰＩ系について、油の添加は剪断粘度を増加させるが、興味深いことに、本発明の試料で得られた値は、両方のＭＰＣ／ＳＰＩ比について、ＣａＣｌ２が添加されていないｐＨ７．０におけるそれぞれの対照よりも高いことが明らかである。これは、本発明が、粘度及び口当たりを維持しながら、脂肪含有量を減少させる可能性があることを再び示す。
【０１５６】
実施例６：
パイロットスケールでの、乳タンパク質濃縮物／大豆タンパク質単離物への塩化カルシウム添加によるエマルション安定化
実施例６で試験した系をパイロットスケールで再現し、本発明の感度が工業条件に及ぼす影響を試験した。使用したＭＰＣは、実施例５と同様であり、すなわち、Ｐｒｏｍｉｌｋ８５２Ｂは、Ｉｎｇｒｅｄｉａ（Ａｒｒａｓ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入した。大豆タンパク質単離物は、ＡＤＭ（Ｄｅｃａｔｕｒ，ＩＬ，ＵＳＡ）から市販のＰｒｏｆａｍ  ９７４−ＩＰであった。これは、脱脂大豆粉からタンパク質を等電点沈殿することによって得られる。乾燥粉末中のタンパク質含有量は９５．４重量％であり、脂肪含有量は０．６重量％であった。
【０１５７】
試料の調製
ＭＣＰ分散体及びＳＰＩ分散体を、タンパク質含有量３重量％で、逆浸透（ＲＯ）水で調製した。ステンレス鋼タンク内で、５０℃のＲＯ水１７３．４ｋｇに６．６ｋｇのＭＰＣ粉末を機械的撹拌下で３０分間分散させることによって、１８０ｋｇのＭＰＣのバッチを調製した。ＳＰＩについては、２．１ｋｇのＳＰＩ粉末を、２０℃のＲＯ水５７．９ｋｇに分散させた。３０分後、高圧ホモジナイザーを使用して、ＭＰＣ分散体を２５０／５０バールで均質化した。ＭＰＣ及びＳＰＩのｐＨを、１０％塩酸を使用して、２０℃でｐＨ７．０に調整した。ｐＨ７．０に調整したＭＰＣ分散体とＳＰＩ分散体とを、４０ｋｇバッチ中で混合して、７５／２５及び５０／５０のＭＰＣ／ＳＰＩ混合比（重量）を達成し、２０℃で３０分間撹拌した。次に、高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）をタンパク質分散体に添加し、高剪断下で５重量％のエマルションを生成した。次いで、高圧ホモジナイザーを使用して、プレエマルションを２５０／５０バールで均質化し、試料を１０℃まで冷却した。ｐＨを再度確認した。本発明の試料では、必要量のＣａＣｌ２，２（Ｈ２Ｏ）を添加して、７５ＭＰＣ／２５ＳＰＩの比については１０ｍＭ、５０ＭＰＣ／５０ＳＰＩの比については２０ｍＭに遊離カルシウム含有量を増加させた。次いで、１８０Ｌ／ｈで動作する直接蒸気注入ラインを用いて、９５℃で３分間加熱処理した。試料をＤＳＩ処理のために６０℃で予熱し、次いで、多管式熱交換器を使用して１０℃まで冷却した。次いで、試料を５００ｍＬポリプロピレンボトルに充填し、分析のために４℃で保管した。
【０１５８】
粒度分布
試料の粒度分布を、実施例１に記載のように求めた。Ｄ（４，３）平均直径は、異なる試料について報告されている。
【０１５９】
流動特性
試料の流動曲線は、実施例１に記載のように求めた。１０ｓ−１における剪断粘度が、試料について報告されている。
【０１６０】
共焦点レーザー走査型顕微鏡
試料を、凍結切片ではなく、液体フォーマットで撮像したこと、及びＭＰＣとＳＰＩとを区別するために特異的な免疫標識を使用しなかったことを除いて、実施例５に記載のように試料を調製し、特性評価した。そのため、試料を、アーチファクトの圧縮及び乾燥を防止するためにガラススライドカバースリップで閉鎖した、深さ１ｍｍのプラスチックチャンバ内に置いた。標識するために、ファストグリーン染料（１重量％水溶液、使用時に１００倍希釈）をタンパク質に使用したが、油滴には、ナイルレッド（０．２５重量％エタノール溶液、使用時に１００倍希釈）を使用した。
【０１６１】
可溶性タンパク質
試料中に存在する可溶性タンパク質を、実施例５に記載のように、ＵＰＬＣによって求めた。
結果
粒径、粘度、及び可溶性タンパク質
【０１６２】
本発明の試料の粒径は、両方のＭＰＣ／ＳＰＩ混合比について、添加ＣａＣｌ２を含有しない試料と比較して増加した（表９）。これは、初期油滴がタンパク質と一緒に凝集して、より大きい凝集体を形成することを示す。１０  １／ｓにおける粘度は、対応する対照試料と同様又はそれよりも大きく、タンパク質凝集体が、試料中の油含有量が同程度の試料のバルク粘度に影響を与えていたことを示した。本発明の試料の流動曲線は擬塑性流動挙動を示したが、対照は、実施例５に記載のようにニュートン流体であったことに留意されたい。可溶性タンパク質含有量は、本発明の試料では非常に低く（３％未満）、対照の方が大きかった（５０／５０比については最大６２．２％）。これは、先の実施例に記載されているように、本発明は、ほとんどのタンパク質と油滴との凝集を促進し、バルク粘度に影響を及ぼす、より大きな凝集体を形成することを示す。
【０１６３】
【表９】
2020521487.tif 000010
【０１６４】
凝集体の微細構造
試料の構造をＣＳＬＭによって調べた（図８及び図９）。対照試料は、両方のＭＰＣ／ＳＰＩ混合比について、凝集の顕著な兆候なく、油滴の均質な分布を示した（図８Ａ及び図９Ａ）。これは、タンパク質のほとんどが可溶性のままである理由を、油滴の界面の安定化に限られた画分しか関与しなかったためとして説明する。本発明の試料は、いずれの比率でも、添加ＣａＣｌ２の存在下で、油滴が凝集して、油滴を埋め込んだ、より大きい凝集体を形成した（図８Ｂ及び図９Ｂ）。
【０１６５】
実施例７：
二倍濃縮された還元全脂肪乳に乳酸カルシウムを添加することによって得られた乳タンパク質と大豆ンパク質との凝集体（乳タンパク質の５０％が大豆タンパク質によって置換されている）。
【０１６６】
脱脂粉乳（ＭＳＫ）（低熱）は、Ｈｏｃｈｄｏｒｆ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって提供され、大豆タンパク質単離物Ｃｌａｒｉｓｏｙ  １７０はＡＤＭ（Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）によって提供された。
【０１６７】
大豆タンパク質単離物のタンパク質濃度は脱脂粉乳よりも高いことから、マルトデキストリンＤＥ  ３８−４１（Ｒｏｑｕｅｔｔｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を添加することによって総固形分（ＴＳ）を調整し、２６％ＴＳを達成するようにした。高オレイン酸ヒマワリ油（Ｏｌｅｉｆｉｃｉｏ  Ｓａｂｏ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）は、乳脂肪の代わりに使用されている。
【０１６８】
２６％ＴＳでは、系は、６．６％の総タンパク質（３％乳タンパク質、３％大豆タンパク質）と、７％の油で配合されている。
【０１６９】
表１０は、乳−大豆系の組成を示す。
【０１７０】
【表１０】
2020521487.tif 000011
【０１７１】
カルシウム添加のために、乳酸カルシウム（Ｍｅｒｃｋ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を乾燥混合し、本方法の間にマルトデキストリンと共に添加した。
【０１７２】
図１０は、乳−エンドウ豆系を配合するために使用された方法を示す。
【０１７３】
大豆タンパク質は、可溶性を改善するために処理し、実施例１に示すように、乳−大豆系を配合及び加工した。
結果
【０１７４】
【表１１】
2020521487.tif 000012
【０１７５】
表１１は、乳酸カルシウムの添加なしのエマルションは、可溶性カルシウムの形態の遊離イオンカルシウムを１．８ｍＭ含有していたことを示し、これは、熱処理中に有意なタンパク質凝集を誘導するのに十分ではない。乳酸カルシウムを系に添加することにより、遊離イオン性カルシウムの増加がもたらされた。ｐＨが低下すると、系内のカルシウムはｐＨ６．３９で最大２．９ｍＭまで徐々に増加し、エマルションを加熱した後に粒径及び粘度の両方が増加した。粘度増加に対する効果は、ｐＨが低い方が大きい。
【０１７６】
ｐＨが６．２５まで更に低下したとき、遊離カルシウムは３．１まで増加し、中程度のサイズの凝集体（４９．７３３μｍ）の形成をもたらしたが、ｐＨ６．３９と比較して粘度効果をいくらか失った。これは、この特定の系では、ｐＨ６．２５で３．１の遊離カルシウムが既に高すぎることを示す。粘度増加を最大化するために、より少ない遊離カルシウム及び／又はより高いｐＨを使用する必要がある（例えば、ｐＨ６．３９及び３．１ｍＭの遊離カルシウム）。
【図１】
2020521487.tif 000013
【図２】
2020521487.tif 000014
【図３（Ａ）】
2020521487.tif 000015
【図３（Ｂ）】
2020521487.tif 000016
【図４（Ａ）】
2020521487.tif 000017
【図４（Ｂ）】
2020521487.tif 000018
【図５】
2020521487.tif 000019
【図６】
2020521487.tif 000020
【図７】
2020521487.tif 000021
【図８（Ａ）】
2020521487.tif 000022
【図８（Ｂ）】
2020521487.tif 000023
【図９（Ａ）】
2020521487.tif 000024
【図９（Ｂ）】
2020521487.tif 000025
【図１０】
2020521487.tif 000026
【国際調査報告】
2020521487.tif 000027
2020521487.tif 000028
2020521487.tif 000029