(57)【要約】  酵母において植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログを生成するための方法及び細胞株。この方法は、ポリケチドシンターゼCDS及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼCDSで形質転換された酵母細胞を適用し、細胞株はこの細胞を含む。ポリケチドシンターゼ酵素は、オリベトール又はメチル-オリベトールの合成を触媒し、アサのオリベトール酸シンターゼ又はキイロタマホコリカビのポリケチドシンターゼ(「DiPKS」)を含んでもよい。酵母細胞は、DiPKSの活性を増加させるためのホスホパンテチエニルトランスフェラーゼを含むように改変することができる。酵母細胞は、オリベトール又はメチル-オリベトールを合成するのに適用可能なマロニル-CoAを増加させるために、ミトコンドリアのアセトアルデヒド異化を軽減するように改変することができる。プレニルトランスフェラーゼ酵素は、カンナビゲロール又はカンナビゲロールアナログの合成を触媒し、ストレプトマイセス種CL190由来のαββα細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素を含んでもよい。酵母細胞は、プレニル化に利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させるために、ゲラニルピロリン酸の枯渇を軽減するように改変することができる。
2020507351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成する方法であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程であって、
ポリケチドシンターゼ酵素が、マロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を生成するためのものであり、前駆化学物質が、構造I:
【化１】
2020507351.tif 000121
を有し、構造Iにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3が、H、カルボキシル、又はメチルであり、
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質をプレニル化するためのものであり、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を提供する、工程と、
酵母細胞培養物をもたらすために前記酵母細胞を増殖させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
酵母細胞が、ヘキサノイルシンターゼ酵素をコードする第3のポリヌクレオチドを含み、
ポリケチドシンターゼ酵素が、アサ由来のOAS酵素を含み;
酵母細胞を増殖させる工程が、ヘキサン酸を含む栄養調製物中で酵母細胞を増殖させる工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
酵母細胞が、アサのポリケチドシクラーゼ酵素を含まず、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号45の塩基3841から4995によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するアサ由来のOAS酵素のコード配列を含む、請求項2又は3に記載の方法。
【請求項５】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号45の塩基3841から4995と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、Hであり、R3が、Hである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、Hである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、メチルであり、R3が、Hである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、メチルである、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ポリケチドシンターゼ酵素が、キイロタマホコリカビ由来のDiPKSポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号46の塩基535から9978によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号46の塩基535から9978と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R2においてメチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、メチル化植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項10から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を軽減するためにC-Metドメインの活性部位に影響を及ぼす変異を含み、その結果、R2がメチルであり、R3がHである第1の前駆化学物質、及びR2がHであり、R3がHである第2の前駆化学物質を含む少なくとも1つの前駆化学物質を生じ、
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、メチル化植物性カンナビノイドアナログ及び非メチル化植物性カンナビノイドを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１５】
DiPKSポリケチドシンターゼが、DiPKSG1516D; G1518Aポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号37の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516D; G1518Aポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号37の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
DiPKSポリケチドシンターゼが、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１９】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号38の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号38の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を防止するために、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素のC-Metドメインの活性部位における活性を低減する変異を含み、その結果、水素R2基及び水素R3基を有する少なくとも1つの前駆化学物質を生じ、
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項10に記載の方法。
【請求項２２】
酵母細胞が、DiPKSの活性を増加させるために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第3のポリヌクレオチドを含む、請求項10から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、A.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
第3のポリヌクレオチドが、配列番号10の塩基1170から2201によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するA.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
第3のポリヌクレオチドが、配列番号10の塩基1170から2201と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
ポリケチドシンターゼ酵素が、より長鎖のケチル-CoAを用いずにマロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を合成するための活性部位を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1においてペンチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、ペンチル-植物性カンナビノイド又はメチル化ペンチル-植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つの前駆化学物質が、オリベトール、オリベトール酸、メチル-オリベトール、又はメチル-オリベトール酸のうちの少なくとも1つを含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、CBG、CBGa、meCBG、又はmeCBGaのうちの少なくとも1つを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、ストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素を含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号44の塩基987から1913によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号44の塩基987から1913と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、Hであり、R3が、Hである、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、Hである、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、メチルであり、R3が、Hである、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、メチルである、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
酵母細胞が、利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させる遺伝子改変を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子改変が、Erg20酵素の不活性化を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
酵母細胞が、配列番号3によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するErg20K197Eのコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
第3のポリヌクレオチドが、配列番号3と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
酵母細胞が、利用可能なマロニル-CoAを増加させる遺伝子改変を含む、請求項1から39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
遺伝子改変が、Maf1の発現の増加を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
酵母細胞が、配列番号8の塩基936から2123によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するMaf1のコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
第3のポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号8と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
遺伝子改変が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンターゼの細胞質発現を増加させるための改変を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
酵母細胞が、配列番号4の塩基3938から5893によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.エンテリカ由来のAcsL641Pのコード配列、及び配列番号4の塩基1494から2999によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のAld6のコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
第3のポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号4の塩基51から7114と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
遺伝子改変が、マロニル-CoAシンターゼの活性を増加させるための改変を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４８】
酵母細胞が、S.セレビシエ由来のAcc1S659A; S1167Aのコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
第3のポリヌクレオチドが、Acc1S659A; S1167A酵素のコード配列を含み、該酵素の一部が、配列番号7の塩基9から1716によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質部分Acc1S659A; S1167Aと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
第3のポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号7と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
酵母細胞が、構成的プロモーターの調節下にあるS.セレビシエ由来のAcc1のコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項47に記載の方法。
【請求項５２】
構成的プロモーターが、S.セレビシエ由来のPGK1プロモーターを含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
PGK1プロモーターが、配列番号6の塩基7から750と80%から100%の間のヌクレオチド相同性を有する、請求項52に記載の方法。
【請求項５４】
遺伝子改変が、ステロール生合成の活性化因子の発現の増加を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項５５】
酵母細胞が、配列番号9の塩基975から3701によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のUpc2E888Dのコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
第3のポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号9と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36のいずれか1つと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項1から28又は請求項31から56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
酵母細胞培養物から植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を抽出する工程を更に含む、請求項1から57のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成するための酵母細胞であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド、及び
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチド
を含む、酵母細胞。
【請求項６０】
方法の請求項1から57のいずれか一項において提供される酵母細胞に関連して規定される酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ以上についての特徴を更に含む、請求項59に記載の酵母細胞。
【請求項６１】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログの生成のために酵母細胞を形質転換する方法であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチドを酵母細胞株へと導入する工程、及び
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを前記酵母へと導入する工程
を含む、方法。
【請求項６２】
方法の請求項1から57のいずれか一項において提供される酵母細胞に関連して規定される、酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ以上についての特徴を更に含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
以下の構造II:
【化２】
2020507351.tif 000122
を有する植物性カンナビノイドアナログであって、
構造IIにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、
R2が、メチル基であり、
R3が、H、カルボキシル基、又はメチル基である、植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６４】
R1が、炭素数5の鎖長を有し、R3が、Hである、請求項63に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６５】
酵母における生合成によって生成される、請求項63に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６６】
以下の構造III:
【化３】
2020507351.tif 000123
を有する植物性カンナビノイドアナログであって、
構造IIIにおいて、R1が、ペンチル基であり、
R2が、メチル基であり、
R3が、Hである、植物性カンナビノイドアナログ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、参照によりその全体が本出願に組み込まれる、2017年2月17日に出願された、酵母における植物性カンナビノイドの生成のための方法及び細胞株と題される、米国仮特許出願第62/460,526号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本開示は、一般的に、酵母における植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドのアナログの生成に関する。
【背景技術】
【０００３】
植物性カンナビノイドは、アサ(Cannabis sativa)、他の植物、及び一部の真菌において天然に生成される。105種を超える植物性カンナビノイドが、アサにおいて生合成されるか、又はアサにおいて生合成された植物性カンナビノイドからの熱分解若しくは他の分解により生じることが知られている。アサ植物は、穀物、繊維、及び他の材料の貴重な供給源でもあるが、一方、特に、室内で、植物性カンナビノイドを生成するためにアサを生育させることは、エネルギー及び労力の点で高価である。次に、アサ植物から植物性カンナビノイドを抽出、精製、及び分画化することは、労力及びエネルギー集約的でもある。
【０００４】
植物性カンナビノイドは、アサの医学的作用及び向精神性作用に寄与する薬理学的に活性な分子である。アサにおける植物性カンナビノイドの生合成の規模は、他の農業プロジェクトと同様である。他の農業プロジェクトと同様に、アサを生育させることによる植物性カンナビノイドの大規模生成には、様々な投入(例えば、栄養、光、有害生物防除、CO2等)が必要とされる。アサを栽培するために必要とされる投入は、提供されなければならない。更に、許可される場合、アサの栽培は、現在、植物から調製される生成物が商業的使用を目的とする場合、重い規制、税、及び厳しい品質管理の対象であり、費用はますます増加している。植物性カンナビノイドアナログは、構造上、植物性カンナビノイドに類似する薬理学的に活性な分子である。植物性カンナビノイドアナログは、化学的に合成されることが多く、労力集約的であり高価である可能性がある。結果として、ロバスト且つスケーラブルな発酵性生物において植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログを生成することが経済的となり得る。サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)は、工業的規模の同様の分子を生成するために使用される発酵性生物の一例である。
【０００５】
天然に存在する植物性カンナビノイドの生成のためにアサを生育させるのに関わる時間、エネルギー、及び労力によって、酵母において植物性カンナビノイドを生成するためにトランスジェニック細胞株を生成する動機付けが与えられる。このような試みの一例が、Poulos及びFarniaの米国特許出願公開第2016/0010126号に提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第2016/0010126号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gietz、R. D.及びSchiestl、R. H.、「High-efficiency yeast transformation using LiAc/SS carrier DNA/PEG method.」 Nat. Protoc. 2、31〜34(2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
酵母において植物性カンナビノイドを生成するための以前の手法、及び植物性カンナビノイドアナログを生成するための以前の手法のうちの少なくとも1つの不利益を取り除くか又は軽減することが、本開示の目的である。アサにおいて発見された105種の植物性カンナビノイドの多くは、酵母で合成することができ、酵母に基づく生成を改良することが望ましい場合がある。同様に、労力集約的合成の必要のない植物性カンナビノイドアナログの生成を可能にする手法が望ましい場合がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明において提供される方法及び細胞株は、ストレプトマイセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)(「CL190」)由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素(「AltPT」)をコードする遺伝子で形質転換されたトランスジェニックサッカロマイセス・セレビシエを適用してもよく、含んでもよい。AltPTは、αββα(「ABBA」)タイプのプレニルトランスフェラーゼ酵素である。AltPTは、オリベトール酸及びゲラニルピロリン酸(「GPP」)からのカンナビゲロール酸(「CBGa」)の合成を触媒する。AltPTはまた、オリベトール及びGPPからのカンナビゲロール(「CBG」)の合成を触媒する。アサでは、プレニルトランスフェラーゼ酵素は、オリベトール酸及びGPPからのCBGaの合成を触媒する。アサのプレニルトランスフェラーゼは、膜結合性であり、S.セレビシエにおける発現を複雑化する。対照的に、AltPTは、細胞質性であり、アサのプレニルトランスフェラーゼよりも高いレベルで、S.セレビシエにおいて発現する。AltPTは、S.セレビシエにおいて発現される場合、膜結合性のアサのプレニルトランスフェラーゼに対して有利性をもたらし、オリベトール酸及びGPPからのCBGa、又はオリベトール及びGPPからのCBGの合成を触媒することができる。S.セレビシエは、Erg20、Maf1若しくはUPC2、又はGPPを消耗する代謝経路をサポートする酵素又は他のタンパク質に対する他の遺伝子において1つ又は複数の変異を有する場合があり、1つ又は複数の変異は、利用可能なGPPを増加させるためのものである。或いは、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、クルイウェロマイセス・マルキシアヌス(Kluyveromyces marxianus)、クルイウェロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ロドスポリジウム・トルロイデス(Rhodosporidium toruloides)、クリプトコッカス・カルバタス(Cryptococcus curvatus)、トリコスポロン・プルランス(Trichosporon pullulan)及びリポマイセス・リポフェラス(Lipomyces lipoferetc)を含む他の種の酵母を適用してもよい。
【００１０】
本発明において提供される一部の方法及び細胞株では、トランスジェニックS.セレビシエは、アサのポリケチドシンターゼ(オリベトール酸シンターゼ又は「OAS」とも称される)の遺伝子を含む。OASは、マロニル-CoA及びヘキサノイル-CoAからのオリベトールの合成を触媒する。この反応は、マロニル-CoA対ヘキサノイル-CoA対オリベトール酸の2:1:1の化学量論比を有する。アサでは、オリベトールは、オリベトール酸シクラーゼ(「OAC」)又は別のポリケチドシクラーゼの存在下でカルボキシル化されてオリベトール酸となり、AltPT及び膜結合性プレニルトランスフェラーゼによってアサにおいて触媒される他の細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素に関連して上述したCBGa合成代謝経路へと送り込まれる。アサ由来のOAC酵素は、トランスジェニックS.セレビシエから除外され、AltPTによってCBGaよりもむしろCBGの合成を駆動してもよい。
【００１１】
本発明において提供される一部の方法及び細胞株では、トランスジェニックS.セレビシエは、キイロタマホコリカビ(Dictyostelium discoideum)のポリケチドシンターゼ(「DiPKS」)の遺伝子を含む。DiPKSは、I型脂肪酸シンターゼ(「FAS」)とポリケチドシンターゼの両方からなる融合タンパク質であり、ハイブリッド「FAS-PKS」タンパク質と称される。DiPKSは、マロニル-CoAからのメチル-オリベトールの合成を触媒する。この反応は、マロニル-CoA対メチル-オリベトールの6:1の化学量論比を有する。AltPTは、上述のオリベトールからのCBGの合成と同様に、メチル-オリベトールからのメチルカンナビゲロール(「meCBG」)の合成を触媒する。ヘキサン酸は、S.セレビシエに対して毒性である。OASを適用する場合、ヘキサノイル-CoAは、オリベトールの合成に必要な前駆体である。オリベトール又はオリベトール酸を生成するためのOASよりもむしろメチル-オリベトールを生成するためのDiPKSを使用する場合、ヘキサン酸を増殖培地に添加する必要はない。増殖培地におけるヘキサン酸の非存在により、S.セレビシエ培養物の増殖の増加及びOASを使用する場合のCBGの収率と比較したmeCBGの収率の増大が、もたらされ得る。
【００１２】
一部の適用では、meCBG及びmeCBGから合成され得るメチル化された下流の植物性カンナビノイドアナログ(アサにおいてCBGaから合成される下流の植物性カンナビノイドと同様に)は、貴重であり得る。他の場合では、天然に存在する植物性カンナビノイドの脱炭酸形態と構造上同一である植物性カンナビノイドがより望ましい場合がある。天然に存在する植物性カンナビノイドの脱炭酸形態と構造上同一である植物性カンナビノイドの生成のために、DiPKSが、野生型DiPKSに対して改変され、オリベトールのメチル化を低減し、その結果、meCBGよりもむしろCBGの合成がもたらされる。S.セレビシエは、DiPKSの活性を増加させるために補因子担持酵素を含んでもよい。
【００１３】
オリベトール及びメチルオリベトールの合成は、細胞質におけるマロニル-CoAのレベルを増加させることによって促進されてもよい。S.セレビシエは、ネイティブアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼの過剰発現及び変異体アセチル-CoAシンターゼ又はその変異がミトコンドリアのアセトアルデヒド異化を低下させる他の遺伝子の発現を有してもよい。アセトアルデヒドをアセチル-CoA生成へと転換することによってミトコンドリアのアセトアルデヒド異化を低下させることにより、オリベトールを合成するのに利用可能なマロニル-CoAが増加する。Acc1は、ネイティブ酵母マロニルCoAシンターゼである。S.セレビシエは、Acc1の過剰発現又は活性が増加し且つ利用可能なマロニル-CoAが増加したAcc1の改変を有してもよい。S.セレビシエは、Maf1又はtRNA生合成の他の調節因子の改変された発現を含んでもよい。ネイティブMaf1を過剰発現することにより、tRNA生合成に対するイソペンチルピロリン酸(「IPP」)の損失が低減し、それによって、酵母におけるモノテルペン収率が改善されることが示された。IPPは、メバロン酸経路における中間体である。Upc2は、S.セレビシエにおけるステロール生合成の活性化因子であり、Upc2のGlu888Asp変異は、酵母におけるモノテルペン生成を増加させる場合がある。
【００１４】
第1の態様では、本明細書において、酵母において植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログを生成するための方法及び細胞株が提供される。方法は、ポリケチドシンターゼCDS及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素CDSを形質転換した酵母細胞を適用し、細胞株は、これらを含む。ポリケチドシンターゼ酵素は、オリベトール又はメチル-オリベトールの合成を触媒し、アサのオリベトール酸シンターゼ又はキイロタマホコリカビのポリケチドシンターゼ(「DiPKS」)を含んでもよい。酵母細胞は、DiPKSの活性を増加させるために、ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼを含むように改変することができる。酵母細胞は、オリベトール又はメチル-オリベトールを合成するために利用可能なマロニル-CoAを増加させるために、ミトコンドリアのアセトアルデヒド異化を軽減するように改変することができる。プレニルトランスフェラーゼ酵素は、カンナビゲロール又はカンナビゲロールアナログの合成を触媒し、ストレプトマイセス種CL190由来のαββα細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素を含んでもよい。酵母細胞は、プレニル化に利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させるために、ゲラニルピロリン酸の消耗を軽減するように改変することができる。
【００１５】
さらなる態様では、本明細書において、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成する方法であって、ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程と、酵母細胞培養物をもたらすために酵母細胞を増殖させる工程とを含む、方法が提供される。ポリケチドシンターゼ酵素は、マロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を生成するためのものであり、前駆化学物質は、構造I:
【００１６】
【化１】
2020507351.tif 000003
【００１７】
を有する。構造Iにおいて、R1は、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3は、H、カルボキシル、又はメチルである。細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも1つの前駆化学物質をプレニル化するためのものであり、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、酵母細胞は、ヘキサノイルシンターゼ酵素をコードする第3のヌクレオチドを含み;ポリケチドシンターゼ酵素は、アサ由来のOAS酵素を含み;酵母細胞を増殖させる工程は、ヘキサン酸を含む栄養調製物中で酵母細胞を増殖させる工程を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、アサのポリケチドシクラーゼ酵素を含まず、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するアサ由来のOAS酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【００１９】
一部の実施形態では、R1は、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、Hであり、R3は、Hである。
【００２０】
一部の実施形態では、R1は、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、カルボキシルであり、R3は、Hである。
【００２１】
一部の実施形態では、R1は、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、メチルであり、R3は、Hである。
【００２２】
一部の実施形態では、R1は、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、カルボキシルであり、R3は、メチルである。
【００２３】
一部の実施形態では、ポリケチドシンターゼ酵素は、キイロタマホコリカビ由来のDiPKSポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号46の塩基535から9978によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号46の塩基535から9978と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、少なくとも1つの前駆化学物質は、R2においてメチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、メチル化植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素は、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を軽減するためにC-Metドメインの活性部位に影響を及ぼす変異を含み、その結果、R2がメチルであり、R3がHである第1の前駆化学物質、及びR2がHであり、R3がHである第2の前駆化学物質を含む少なくとも1つの前駆化学物質を生じ;植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、メチル化植物性カンナビノイドアナログ及び非メチル化植物性カンナビノイドを含む。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼは、DiPKSG1516D; G1518Aポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号37の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するG1518Aポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号37の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼは、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号38の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号38の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素は、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を防止するために、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素のC-Metドメインの活性部位における活性を低減する変異を含み、その結果、水素R2基及び水素R3基を有する少なくとも1つの前駆化学物質を生じ;植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、DiPKSの活性を増加させるために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、A.ニデュランス(A. nidulans)由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を含む。一部の実���形態では、第3のポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基1170から2201によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するA.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基1170から2201と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【００２４】
一部の実施形態では、ポリケチドシンターゼ酵素は、より長鎖のケチル-CoAを用いずにマロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を合成するための活性部位を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの前駆化学物質は、R1においてペンチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、ペンチル-植物性カンナビノイド又はメチル化ペンチル-植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、少なくとも1つの前駆化学物質は、オリベトール、オリベトール酸、メチル-オリベトール、又はメチル-オリベトール酸のうちの少なくとも1つを含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、CBG、CBGa、meCBG、又はmeCBGaのうちの少なくとも1つを含む。
【００２５】
一部の実施形態では、細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素は、ストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、配列番号44の塩基987から1913によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、配列番号44の塩基987から1913と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【００２６】
一部の実施形態では、R1は、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、Hであり、R3は、Hである。
【００２７】
一部の実施形態では、R1は、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、カルボキシルであり、R3は、Hである。
【００２８】
一部の実施形態では、R1は、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、メチルであり、R3は、Hである。
【００２９】
一部の実施形態では、R1は、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2は、カルボキシルであり、R3は、メチルである。
【００３０】
一部の実施形態では、酵母細胞は、利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させる遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変は、Erg20酵素の不活性化を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号3によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するErg20K197Eに関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、配列番号3と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【００３１】
一部の実施形態では、酵母細胞は、利用可能なマロニル-CoAを増加させる遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変は、Maf1の発現の増加を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号8の塩基936から2123によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するMaf1に関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号8と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンターゼの細胞質発現を増加させるための改変を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号4の塩基3938から5893によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.エンテリカ(S. enterica)由来のAcsL641Pに関するコード配列、及び配列番号4の塩基1494から2999によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のAld6に関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号4の塩基51から7114と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、マロニル-CoAシンターゼの活性を増加させるための改変を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、S.セレビシエ由来のAcc1S659A; S1167Aに関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、Acc1S659A; S1167A酵素に関するコード配列を含み、該酵素の一部が、配列番号7の塩基9から1716によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質部分Acc1S659A; S1167Aと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号7と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、酵母細胞は、構成的プロモーターの調節下にあるS.セレビシエ由来のAcc1に関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、S.セレビシエ由来のPGK1プロモーターを含む。一部の実施形態では、PGK1プロモーターは、配列番号6の塩基7から750と80%から100%の間のヌクレオチド相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、ステロール生合成の活性化因子の発現の増加を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号9の塩基975から3701によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のUpc2E888Dに関するコード配列を含む第3のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、第3のポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を含み、配列番号9と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【００３２】
一部の実施形態では、第2のポリヌクレオチドは、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36のいずれか1つと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素に関するコード配列を含む。
【００３３】
一部の実施形態では、方法は、酵母細胞培養物から植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を抽出する工程を含む。
【００３４】
さらなる態様では、本明細書において、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成するための酵母細胞であって、ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド;及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを含む、酵母細胞が提供される。
【００３５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ又は複数についての特徴が、酵母細胞中に含まれる。
【００３６】
さらなる態様では、本明細書において、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログの生成のために酵母細胞を形質転換する方法が提供される。この方法は、ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチドを酵母細胞株へと導入する工程、及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを酵母へと導入する工程を含む。
【００３７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ又は複数についての特徴は、酵母細胞を形質転換する際に適用される。
【００３８】
さらなる態様では、本明細書において、以下の構造II:
【００３９】
【化２】
2020507351.tif 000004
【００４０】
を有する植物性カンナビノイドアナログが提供される。構造IIにおいて、R1は、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基である。R2は、メチル基である。R3は、H、カルボキシル基、又はメチル基である。
【００４１】
一部の実施形態では、R1は、炭素数5の鎖長を有し、R3は、Hである。
【００４２】
一部の実施形態では、植物性カンナビノイドアナログは、酵母における生合成によって生成される。
【００４３】
さらなる態様では、本明細書において、以下の構造III:
【００４４】
【化３】
2020507351.tif 000005
【００４５】
を有する植物性カンナビノイドアナログが提供される。構造IIIにおいて、R1は、ペンチル基であり;R2は、メチル基であり;R3は、Hである。
【００４６】
本開示の他の態様及び特徴は、添付の図面と併せて、具体的実施形態についての以下の説明を鑑みて、当業者にとって明らかとなるであろう。
【００４７】
本開示の実施形態を、ここで、ほんの一例として、添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】アサにおけるオリベトール酸と異なるアルキル鎖長を有する関連化合物との生合成の概略図である。
【図２】アサにおけるヘキサン酸、マロニル-CoA、及びゲラニルピロリン酸からのCBGaの生合成の概略図である。
【図３】アサにおけるCBGaからの酸性形態の下流の植物性カンナビノイドの生合成の概略図である。
【図４】OAS及びAltPTによる形質転換酵母細胞におけるCBGの生合成の概略図である。
【図５】CBGからの形質転換酵母細胞における下流の植物性カンナビノイドの生合成の概略図である。
【図６】DiPKS及びAltPTによる形質転換酵母細胞におけるmeCBGの生合成の概略図である。
【図７】meCBGからの形質転換酵母細胞における下流のメチル化植物性カンナビノイドアナログの生合成の概略図である。
【図８】meCBGからの形質転換酵母細胞における下流のメチル化植物性カンナビノイドアナログの生合成の概略図である。
【図９】オリベトールのメチル化を低下させるための、C-メチルトランスフェラーゼに対する変異を有するDiPKSにおける機能的ドメインの概略図である。
【図１０】DiPKSG1516D; G1518A及びAltPTによる形質転換酵母細胞におけるmeCBG及びCBGの生合成の概略図である。
【図１１】DiPKSG1516R及びAltPTによる形質転換酵母細胞におけるCBGの生合成の概略図である。
【図１２】ヘキサン酸の様々な濃度におけるS.セレビシエの増殖を示すグラフである。
【図１３】ヘキサン酸が導入される前後のS.セレビシエの増殖及びオリベトール生成を示すグラフである。
【図１４】ヘキサン酸が導入される前後の酵母の増殖及びCBG生成を示すグラフである。
【図１５】ヘキサン酸が導入される前後の酵母の増殖及びヘキサン酸消費を示すグラフである。
【図１６】S.セレビシエにおける、アサの膜結合性プレニルトランスフェラーゼ及びAltPTの細胞質発現を示すグラフである。
【図１７】S.セレビシエにおける、アサのOAS及びAltPTによるCBGの生成及びDiPKS及びAltPTによるmeCBGの生成を示すグラフである。
【図１８】DiPKSによるメチル-オリベトールの生成及びDiPKSG1516D; G1518Aによるメチル-オリベトールとオリベトールの両方の生成を示すグラフである。
【図１９】S.セレビシエの2つの別々の株における、DiPKSによるメチル-オリベトールの生成を示すグラフである。
【図２０】S.セレビシエの2つの別々の株における、DiPKSによるメチル-オリベトールの生成を示すグラフである。
【図２１】S.セレビシエの2つの別々の株における、AltPTによるmeCBGの生成を示すグラフである。
【図２２】S.セレビシエの2つの別々の株における、DiPKSによるメチル-オリベトールの生成、及びDiPKSG1516Rによるメチル-オリベトールとオリベトールの両方の生成を示すグラフである。
【図２３】S.セレビシエの3つの別々の株における、DiPKSG1516Rによるオリベトールの生成を示すグラフである。
【図２４】S.セレビシエの3つの株における、アサのOAS及びAltPTによるCBGの生成、DiPKS及びAltPTによるmeCBGの生成、並びにDiPKSG1516R及びAltPTによるCBGの生成を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
一般的に、本開示は、アサ植物において天然に生合成される植物性カンナビノイド及びメチル-オリベトールから生合成されるメチル化植物性カンナビノイドアナログを生成するための方法及び酵母細胞株を提供する。植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログは、トランスジェニック酵母において生成される。本発明において提供される方法及び細胞株は、アサ植物に存在しない酵素に対する遺伝子の適用を含む。植物性カンナビノイドを生じる生合成経路における酵素をコードするアサ植物における遺伝子一式以外の遺伝子の適用により、脱炭酸植物性カンナビノイドの生合成、メチル化植物性カンナビノイドアナログの生合成、及びサッカロマイセス・セレビシエ及び他の種の酵母にとって毒性であるヘキサン酸を投入しない、植物性カンナビノイドの生合成による生成を含む1つ又は複数の利益をもたらすことができる。
【００５０】
修飾語「脱炭酸」は、本明細書で使用される場合、例えば、Δ9-テトラヒドロカンナビノール(「THC」)の2若しくは4位において、又はアサにおけるカンナビゲロール酸(「CBGa」)の生合成に対する前駆体であるオリベトール酸の4位に対応する、他の植物性カンナビノイド若しくは植物性カンナビノイドアナログにおける同等の位置において、酸性基を欠く植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログの形態を指す。植物性カンナビノイドの酸性形態は、アサにおいて、オリベトール酸から生合成される。植物性カンナビノイドの酸形態が加熱されると、植物性カンナビノイドの芳香環とカルボキシル基の間の結合が切断される。脱炭酸は、アサにおいて生成されたカルボキシル化植物性カンナビノイドを加熱することに起因し、一般的に、約110℃を超える温度まで燃焼又は加熱する間に急速に起こる。簡単化のため、本明細書で使用される場合、「脱炭酸」は、植物性カンナビノイドが、真の脱炭酸の間に失われた酸性基を含んでいたか、又はカルボキシル基を有さずに生合成された否かにかかわらず、酸性基を欠く植物性カンナビノイドを指す。
【００５１】
図1は、アサにおいて起こる、マロニル-CoAとヘキサノイル-CoAのポリケチド縮合産物からのオリベトール酸の生合成を示す。オリベトール酸は、CBGaに対する代謝前駆体である。CBGaは、以下に更に詳細に記載する多数の下流の植物性カンナビノイドに対する前駆体である。ほとんどの種類のアサでは、植物性カンナビノイドの大多数が、オリベトール酸から生合成され、次に、2:1の化学量論比のマロニル-CoAとヘキサノイル-CoAから合成される、ペンチル-カンナビノイドである。プロピル-カンナビノイドが観察される場合もあり、広く使用される三文字略記における「v」という添え字により特定されることが多い(例えば、テトラヒドロカンナビバリンは、通常、「THCv」と称され、カンナビジバリンは、通常、「CBDv」と称される等)。図1はまた、下流のプロピル-植物性カンナビノイドをもたらすこととなる、マロニル-CoAとn-ブチル-CoAとの縮合からのジバリノール酸の生合成を示す。
【００５２】
図1はまた、下流のメチル-植物性カンナビノイドをもたらすこととなる、マロニル-CoAとアセチル-CoAとの縮合からのオルセリン酸の生合成を示す。「メチル-植物性カンナビノイド」という用語は、この文脈において、それらのアルキル側鎖がメチル基であることを意味し、ほとんどの植物性カンナビノイドが、アルキル側鎖にペンチル基を有し、varinnic植物性カンナビノイドが、アルキル側鎖にプロピル基を有する。meCBG及び他のメチル化植物性カンナビノイドアナログが「メチル化」と称される文脈は、「メチル-植物性カンナビノイド」及び図1における接頭辞としての「メチル」の使用と異なり、それに類似する。同様に、オリベトールは規定の長さの側鎖を有するため(そうでなければ、図1に示される他の3つのポリケチドのうちの1つであるか、「オリベトール」ではない)、メチル-オリベトールは、環におけるメチル化への言及であり、より短い側鎖に対する言及ではない。
【００５３】
図1はまた、下流のブチル-植物性カンナビノイドをもたらすこととなる、マロニル-CoAとバレリル-CoAとの縮合からの2,4-ジオール-6-プロピル安息香酸(2,4-diol-6-propylbenzenoic acid)の生合成を示す。
【００５４】
図2は、図1に示されるオリベトール酸生合成工程を含む、アサにおけるヘキサン酸、マロニル-CoA、及びゲラニルピロリン酸(「GPP」)からのCBGaの生合成を示す。ヘキサン酸は、補酵素Aと共にヘキサノイル-CoAシンターゼによって活性化される(「Hex1」;図2の反応1)。OAS(オリベトールを合成し、オリベトール酸を合成しないにもかかわらず、オリベトール酸シンターゼとも称される)及びOACは、一緒になって、ヘキサノイルCoA及びマロニル-CoAからのオリベトール酸の生成を触媒する(図2の反応2)。プレニルトランスフェラーゼは、オリベトール酸をGPPと結び付け、図2のCBGa工程3をもたらす。
【００５５】
図3は、CBGaからの、アサにおける下流の酸形態の植物性カンナビノイドの生合成を示す。CBGaは、THCaシンターゼによって、Δ9-テトラヒドロカンナビノール酸(「THCa」)へと酸化的に環化される。CBGaは、CBDaシンターゼによって、カンナビジオール酸(「CBDa」)へと酸化的に環化される。カンナビクロメン酸(「CBCa」)、カンナビエルソン酸(「CBEa」)、イソ-テトラヒドロカンナビノール酸(「iso-THCa」)、カンナビシクロール酸(「CBLa」)、又はカンナビシトラン酸(「CBTa」)等の他の植物性カンナビノイドも、他のシンターゼ酵素によって、又は得られる植物性カンナビノイド構造に関して酵素活性に影響を及ぼすように植物細胞内の条件を変えることによって、アサにおいて合成される。これらの一般的な植物性カンナビノイドタイプのそれぞれの酸形態を、オリベトール酸がヘキサノイル-CoA及びマロニル-CoAから合成される5位炭素鎖となるアルキル側鎖を示す一般的「R」基を用いて図3に示す。一部の場合では、カルボキシル基は、図3に示される位置とR基に対して反対側の環上の位置に、代わりに見出される(例えば、図3に示される2位よりもむしろTHCの4位等)。図3に示される植物性カンナビノイドの脱炭酸形態は、それぞれ、THC、カンナビジオール(「CBD」)、カンナビクロメン(「CBC」)、カンナビエルソイン(「CBE」)、イソ-テトラヒドロカンナビノール(「iso-THC」)、カンナビシクロール(「CBL」)、又はカンナビシトラン(「CBT」)である。
【００５６】
Poulosらの米国特許出願公開第2016/0010126号には、S.セレビシエ及びK. マルキシアヌス(K. marxianus)における5つのネイティブアサ遺伝子の発現について記載されている。植物性カンナビノイド生成のための酵母におけるネイティブアサ経路由来の遺伝子の発現は、欠点を有する場合がある。アサのOASは、ポリケチド基質として、ヘキサノイル-CoAを使用する。ヘキサン酸は、S.セレビシエ及び酵母のいくつかの他の株に対して毒性である。更に、オリベトール酸からのCBGaの合成には、真菌では十分に発現されない場合のある、膜結合性のアサのプレニルトランスフェラーゼ酵素が必要とされる。
【００５７】
植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログの生成のために本発明において提供される方法及び酵母細胞は、ストレプトマイセス種CL 190由来のプレニルトランスフェラーゼNphBの遺伝子を形質転換したS.セレビシエを適用し、含んでもよい。ストレプトマイセス種CL 190のNphBプレニルトランスフェラーゼは、アサのプレニルトランスフェラーゼ酵素の代わりを提供し、以下で「AltPT」と称される。AltPTは、αββα(「ABBA」)タイプのプレニルトランスフェラーゼ酵素である。AltPTは、非常に無差別であり、ほとんどのポリケチドをプレニル化に対する基質として許容する。AltPTは、テルペノイドドナーとしてGPPに特異的である。AltPTは、植物であるアサで発現される膜結合性プレニルトランスフェラーゼと対照的に、グラム陽性細菌であるストレプトマイセス種CL 190で発現される細胞質性酵素である。細菌の細胞質性酵素は、酵母において、植物の膜結合性酵素よりも高いレベルで発現する。AltPTは、アサにおける膜結合性プレニルトランスフェラーゼによって触媒される反応と同様に、オリベトール酸をCBGaにプレニル化する。AltPTはまた、オリベトールをカンナビゲロール(「CBG」)に、又はメチル-オリベトールをメチルカンナビゲロール(「meCBG」)にプレニル化することとなる。酵母に対してコドン最適化されるAltPTの合成配列は、本明細書において、配列番号1に含まれる。AltPTを完全にコードするDNA配列(「CDS」)は、NCBI GenBankのオンラインデータベースにおいて、受託番号NCBI-AB187169で利用可能である。
【００５８】
図4は、ヘキサン酸、マロニル-CoA、及びGPPからCBGを生成するための、トランスジェニック酵母における生合成経路を示す。図4に示されるCBGを生成するための本発明において提供される酵母株は、ストレプトマイセス種CL190のAltPT、アサのHex1、及びアサのOASをコードする遺伝子を含んでもよい。このような酵母株の例は、「HB37」及び「HB88」として提供され、これらはそれぞれTable 7(表7)に記載されている。
【００５９】
図5は、CBGからの下流の植物性カンナビノイドの生合成を示す。CBGは、THC、CBD、CBC、CBE、iso-THC、CBL、又はCBTへと酸化的に環化される。これらの一般的な植物性カンナビノイドタイプのそれぞれの脱炭酸形態は、オリベトールから生合成される植物性カンナビノイドの5位炭素鎖となるアルキル側鎖を示す一般的「R」基を用いて図5に示される。
【００６０】
図4は、Hex1による、ヘキサン酸からのヘキサノイル-CoAの生成を示す。ヘキサン酸は、補酵素Aと共にHex1によって活性化される(図4の反応1)。OASは、ヘキサノイルCoA及びマロニル-CoAからのオリベトールの生成を触媒する(図4の反応2)。AltPTによって、オリベトール酸はGPPと縮合し、CBGが得られる(図4の反応3)。
【００６１】
図4に示される経路は、アサのHEx1及びアサのOASを含む。図4に示される経路は、アサのOACを含まない。それに対応して、図4の経路を実行するためのトランスジェニック酵母細胞は、OASに対する遺伝子を含むが、アサのOACに対する遺伝子を含まない。アサのOACは、オリベトール酸の生合成の間に、オリベトールをオリベトール酸へとカルボキシル化する。OASを用い、OAC又は別のポリケチドシクラーゼを用いない場合、オリベトール酸よりもオリベトールが生成され、これはアサにおいて生成される。結果として、AltPTによって触媒される反応は、CBGaよりもむしろCBGを生じる。次いで、植物性カンナビノイドを生成する下流の反応は、それと対応して、図5の植物性カンナビノイドを含む植物性カンナビノイドの脱炭酸種を生成し、一方、図3の植物性カンナビノイドを含む酸形態は、アサにおけるように、OAC又は別のポリケチドシクラーゼも存在する場合に生成されることとなる。
【００６２】
図4の反応2におけるOASによって触媒されたヘキサノイル-CoAのオリベトールへの変換は、図4の経路において、代謝の傷害として特定された。図4の反応2における収率を増加させるために、複数の酵素が機能的にスクリーニングされ、1つの酵素、すなわち、マロニル-CoAから直接メチル-オリベトールを生成することができる、「DiPKS」と称されるキイロタマホコリカビ由来のポリケチドシンターゼが特定された。酵母に対してコドン最適化されるDiPKSの合成配列は、本明細書において、配列番号2に含まれる。DiPKS のCDSは、NCBI GenBankのオンラインデータベースにおいて、受託番号NC_007087.3で利用可能である。
【００６３】
図6は、マロニル-CoA及びGPPからのmeCBGを生成するためのトランスジェニック酵母における生合成経路を示す。図6に示されるCBGを生成するための、本発明において提供される酵母株は、AltPTに対する遺伝子及び培地中にヘキサン酸を必要とすることなく、マロニル-CoAのみからのポリケチドの生成をサポートするDiPKSに対する遺伝子を含んでもよい。DiPKSは、脂肪酸シンターゼに見られるドメイン、メチルトランスフェラーゼドメイン、及びPks IIIドメインに類似する機能的ドメインを含む(図9を参照のこと)。野生型DiPKS遺伝子をコードするコドン最適化合成配列を含む酵母株の例は、「HB84」、「HB90」、及び「HB105」として提供され、そのそれぞれはTable 7(表7)に記載されている。
【００６４】
図6は、DiPKSによって触媒される、マロニル-CoAからのメチル-オリベトールの生成(図6の反応1)を示す。AltPTは、プレニル基のドナーとして、GPPと共にメチル-オリベトールをプレニル化し、meCBGをもたらす(図6の反応2)。OASよりもむしろDiPKSを適用することによって、ヘキサン酸を補充せずに、植物性カンナビノイド及び植物性カンナビノイドアナログの生成が促進される。ヘキサン酸は、S.セレビシエに対して毒性であるため、CBG又はmeCBGのための生合成経路においてヘキサン酸に対する要求を除去することによって、OAS及びHex1を発現する酵母細胞におけるCBGの収率よりも高いCBG又はmeCBGの収率を得ることができる。
【００６５】
図7及び図8は、それぞれ、THC、CBD、CBC、CBE、iso-THC、CBL、及びCBTのメチル化アナログであり、オリベトール酸又はオリベトールの代わりにメチル-オリベトールが前駆化学物質として提供される場合に調製され得る、メチル-テトラヒドロカンナビノール(「meTHC」)、メチル-カンナビジオール(「meCBD」)、メチル-カンナビクロメン(「meCBC」)、メチル-カンナビエルソイン(「meCBE」)、イソ-メチル-テトラヒドロカンナビノール(「iso-meTHC」)、メチル-カンナビシクロール(「meCBL」)、又はメチル-カンナビシトラン(「meCBT」)に対応する下流のメチル化植物性カンナビノイドアナログを示す。これらのメチル化植物性カンナビノイドアナログのそれぞれの脱炭酸形態を、合成がヘキサノイル-CoA及びマロニル-CoA、又はマロニル-CoAのみに起因する5位炭素鎖となるアルキル側鎖を示す一般的「R」基を用いて図7及び図8に示す。
【００６６】
meCBD以外にも、図7及び図8に示される下流の植物性カンナビノイドアナログのそれぞれの構造の一部は、芳香環に結合した回転が制約された基を含む。結果として、meCBD以外の図7及び図8に示される各下流の植物性カンナビノイドアナログは、2つの回転異性体のうちの1つのmeCBGから合成され得る。合成の間のmeCBGの回転異性体によって、得られる環化されたメチル化植物性カンナビノイドアナログのメチル基は、図7のmeTHC、meCBC、meCBE、iso-meTHC、meCBL、若しくはmeCBTの異性体について示される位置、又は図8のmeTHC、meCBC、meCBE、iso-meTHC、meCBL、若しくはmeCBTの異性体について示される位置に存在し得る。本明細書におけるmeTHC、meCBC、meCBE、iso-meTHC、meCBL、又はmeCBTへの言及は、図7及び図8に示される異性体のいずれか又は両方を含む。
【００６７】
DiPKSは、オリベトールを芳香環の4位においてメチル化するC-メチルトランスフェラーゼドメインを含む。結果として、AltPTはメチル-オリベトールをプレニル化して、アサにおいて合成されることが知られているCBGaではなく、植物性カンナビノイドアナログであるmeCBGを生じる。インプットとしてCBGa又はCBGを使用する場合に植物性カンナビノイドを生成することができる任意の下流の反応は、図7及び図8に示すメチル化植物性カンナビノイドアナログの脱炭酸種を対応して生成することになるが、一方、植物性カンナビノイドの非メチル化酸形態がアサにおいて生成されることになる(図3を参照のこと)。メチル化及びカルボキシル化の炭素は異なる位置に存在し得るため、OAC又は別のポリケチドシクラーゼが含まれる場合、メチル-オリベトールは、OAC又は他のポリケチドシクラーゼによってmeCBGaへと変換されてもよい。例えば、meCBGから合成されるmeTHCは、炭素4においてメチル化されてもよく、2位に存在し得るTHCaのカルボキシ基により、メチル-テトラヒドロカンナビノール酸(「meTHCa」)へとカルボキシル化され得る。或いは、meCBGから合成されるmeTHCは、炭素2においてメチル化されてもよく、この場合、THCaのカルボキシル基は、4位にあってもよい。THCaは、2位、又は4位にカルボキシル基を有するアサにおいて観察される。
【００６８】
図9は、β-ケトアシル-シンターゼ(「KS」)、アシルトランスアセチラーゼ(「AT」)、デヒドラターゼ(「DH」)、C-メチルトランスフェラーゼ(「C-Met」)、エノイルレダクターゼ(「ER」)、ケトレダクターゼ(「KR」)、及びアシルキャリアタンパク質(「ACP」)を示すDiPKSの機能的ドメインの概略図である。「タイプIII」のドメインは、3型ポリケチドシンターゼである。FAS-PKSタンパク質であるDiPKSについて言えば、KS、AT、DH、ER、KR、及びACP部分は、典型的には、脂肪酸シンターゼと関連する機能をもたらす。C-Metドメインは、炭素4においてオリベトールをメチル化するための触媒活性をもたらす。C-Metドメインは、図9において線で削除されており、C-Metドメインを不活性化し、メチル化の機能性を軽減するか又は消失させるDiPKSタンパク質に対する改変を模式的に例証する。タイプIIIのドメインは、反復型ポリケチド伸長及びACPからタイプIIIドメインへと導入されたヘキサン酸チオエーテルの環化を触媒する。
【００６９】
図10は、マロニル-CoA及びGPPからのmeCBGとCBGの両方の生成のためのトランスジェニック酵母における生合成経路を示す。図10に示されるCBGとmeCBGの両方を生成するための本発明において提供される酵母株は、AltPTに対する遺伝子及び図9で模式的に示されるように、C-Metドメインにおいて活性の低下した変異体DiPKSに対する遺伝子を含んでもよい。DiPKSタンパク質のC-Metドメインは、DiPKSのアミノ酸残基1510から1633を含む。C-Metドメインは、3つのモチーフを含む。第1のモチーフは、残基1510から1518を含む。第2のモチーフは、残基1596から1603を含む。第3のモチーフは、残基1623から1633を含む。これら3つのモチーフのうちの1つ又は複数が破壊されると、C-Metドメインにおける活性の低下を生じる場合がある。
【００７０】
C-Metドメインにおいて活性の低下した改変DiPKSを発現する酵母株の例は、以下の実施例Vにおいて「HB80A」として提供される。HB80Aは、野生型DiPKSタンパク質をコードする酵母のコドン最適化遺伝子において改変を含む。HB80Aは、DiPKSタンパク質がC-Metドメインの第1のモチーフにおいて改変されるようなDiPKS遺伝子における改変を含む。DiPKS遺伝子に対するこれらの改変の結果として、DiPKSタンパク質は、Gly1516Asp及びGly1518Alaの置換を有する。HB80Aは、DiPKSG1516D; G1518Aのみを含み、AltPTを含まず、結果として、図10の工程1A及び1Bのみを触媒し、反応2Aも2Bも触媒しない。HB80Aは、メチル-オリベトール及びオリベトールを生成する。HB80A株は、例えば、HB80AをpAltPTプラスミドで形質転換することによって、AltPTを含むように改変されてもよい(Table 6(表6)を参照のこと)。
【００７１】
図10は、マロニル-CoAからのメチル-オリベトール(図10の反応1A)とマロニル-CoAからのオリベトール(図10の反応1B)の両方の生成を示す。反応1A及び反応1Bは、それぞれ、DiPKSG1516D; G1518Aによって触媒される。Gly1516Asp及びGly1518Alaの置換は、C-Metドメインの活性部位におけるものであり、オリベトール環の4位におけるメチル化のDiPKSG1516D; G1518Aによる触媒を減少させ、インプットマロニル-CoAの一部が、反応1Aよりも反応1Bに従って触媒されるのを可能とする。無差別なABBAプレニルトランスフェラーゼであるAltPTは、GPPとメチル-オリベトール及びGPPとオリベトールの両方のプレニル化を触媒する。結果として、meCBG(図10の反応2A)及びCBG(図10の反応2B)が生成される。次いで、他の植物性カンナビノイドを生成するための任意の下流の反応は、CBGの芳香環における4位(又は下流の植物性カンナビノイドにおける対応する位置)において官能基を有さないメチル化植物性カンナビノイドアナログ及びメチル化植物性カンナビノイド種の混合物を対応して生成し、一方、酸形態はアサにおいて生成されることになる。
【００７２】
図11は、マロニル-CoA及びGPPのみからのCBGの生成のためのトランスジェニック酵母における生合成経路を示す。図11に示されるCBGのみを生成するための本発明において提供される酵母株は、AltPTに対する遺伝子及び図9で模式的に示されるように、C-Metドメインにおいて活性の低下した変異体DiPKSに対する遺伝子を含んでもよい。
【００７３】
C-Metドメインにおいて基本的に活性を有さない改変DiPKSを発現する酵母株の例は、以下の実施例VIII、IX及びXにおいて「HB135」、「HB137」、「HB138」及び「HB139」として提供される。HB135、HB137、HB138及びHB139のそれぞれは、野生型DiPKSタンパク質をコードする酵母のコドン最適化遺伝子において改変を含む。HB135、HB137、HB138及びHB139はそれぞれ、DiPKSタンパク質がC-Metドメインの第1のモチーフにおいて改変されるようなDiPKS遺伝子の改変を含む。DiPKS遺伝子に対するこれらの改変の結果として、DiPKSタンパク質は、Gly1516Argの置換を有する。
【００７４】
DiPKSG1516Rは、図11の反応1を触媒する。Gly1516Argの置換は、C-Metドメインの活性部位におけるものであり、オリベトール環の4位におけるメチル化のDiPKSG1516Rによる触媒を減少させる。マロニル-CoAのインプットは、図11の反応1に従って触媒される。HB139はAltPTも含み、結果として、オリベトール及びCBG(図11の反応2)が生成される。次いで、他の植物性カンナビノイドを生成するための任意の下流の反応は、CBGの芳香環における4位、又は下流の植物性カンナビノイドにおける対応する位置において官能基を有さない植物性カンナビノイド種を対応して生成し、一方、酸形態はアサにおいて生成されることになる。
【００７５】
生合成前駆体の利用可能性の増加
図4、図6、図10及び図11において示される各生合成経路は、それぞれ、CBGa、CBG、又はmeCBGを生成するために、マロニル-CoA及びGPPを必要とする。酵母細胞は変異してもよく、他の種に由来する遺伝子が導入されてもよく、遺伝子が上方調節又は下方調節されてもよく、又はそうでなければ、酵母細胞は、マロニル-CoA、GPP、又は図4、図6、図10及び図11のいずれかの生合成経路をサポートするために必要とされる他のインプット代謝物の利用可能性を増加させるために、OAS又はDiPKS等のポリケチドシンターゼの導入以外、及びAltPT等の細胞質性プレニルトランスフェラーゼの導入以外に、遺伝子改変されてもよい。
【００７６】
酵母細胞は、利用可能なGPPを増加させるために改変されてもよい。S.セレビシエは、Erg20又はGPPを枯渇させる代謝経路をサポートする酵素に関する他の遺伝子に、1つ又は複数の他の変異を有してもよい。Erg20は、酵母細胞におけるGPP生成を触媒する。Erg20はまた、GPPに3-イソペンチルピロリン酸(「IPP」)の1つのサブユニットを付加し、下流のセスキテルペン及びステロールの生合成に使用される代謝物である、ファルネシルピロリン酸(「FPP」)を生じる。Erg20におけるいくつかの変異は、GPPのFPPへの変換を低減させ、細胞において利用可能なGPPを増加させることが実証されている。Erg20における置換変異Lys197Gluは、Erg20によるGPPのFPPへの変換を低下させる。Table 4(表4)に示されるように、すべての改変基本株は、Erg20K197E変異体タンパク質(「HB42」、「HB82」、「HB100」、「HB106」、及び「HB110」)を発現する。同様に、HB42、HB82、HB100、HB106、又はHB110のいずれかに基づく各改変酵母株は、酵母ゲノムに組み込まれるErg20K197E変異体をコードする完全ポリヌクレオチドを含む。配列番号3は、Erg20K197Eタンパク質及び相同組換えに関するフランキング配列をコードするCDSである。
【００７７】
酵母株は、利用可能なマロニル-CoAを増加させるために改変されてもよい。ミトコンドリアのアセトアルデヒド異化の低下により、エタノール異化からのアセトアルデヒドのアセチル-CoA生成への転換が生じ、次いで、マロニル-CoA及び下流のポリケチド及びテルペノイドの生成が駆動される。S.セレビシエは、残基641におけるロイシンのプロリンへの置換による改変(「AcsL641P」)、及びS.セレビシエ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(「Ald6」)を有するサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)由来のアセチル-CoAを発現するように改変することができる。Leu641Pro変異は、Acsの下流調節を除去し、AcsL641P変異体に関して、野生型Acsよりも高い活性をもたらす。まとめると、これら2つの酵素の細胞質発現により、細胞質におけるアセチル-CoAの濃度が増加する。細胞質におけるアセチル-CoAの濃度が高くなるほど、ミトコンドリア異化は低下し、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ(「PDH」)を回避して、PDHバイパスをもたらす。結果として、より多くのアセチル-CoAがマロニル-CoA生成に利用可能となる。配列番号4は、pGREGプラスミドをベースとするプラスミドであり、及びAld6及びSeAcsL641Pに対する遺伝子、プロモーター、ターミネーター、及びクラスター化規則的間隔短鎖回文反復配列(「CRISPR」)を適用する組換えによって、Flagfeldt-部位19におけるS.セレビシエゲノムへの組み込みのための組み込み部位相同配列をコードするDNA配列を含む。以下のTable 4(表4)に示されるように(「PDHバイパス」という用語によって)、基本株HB82、HB100、HB106、及びHB110は、TDH3プロモーターの下でAld6をコードする塩基1494から2999に由来する配列番号4の一部、及びTef1Pプロモーターの下でSeAcsL641Pをコードする塩基3948から5893に由来する配列番号4の一部を有する。同様に、HB82、HB100、HB106、又はHB110のいずれかに基づく各改変酵母は、Ald6及びSeAcsL641Pをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００７８】
細胞質性マロニル-CoAを増加させることに対する別のアプローチは、ネイティブ酵母マロニル-CoAシンターゼであるAcc1を上方調節することである。Acc1遺伝子のプロモーター配列は、PGK1遺伝子に対する構成的酵母プロモーターによって置き替えられた。PGK1遺伝子由来のプロモーターは、Acc1の複数の複製が細胞内に存在することを可能とする。ネイティブAcc1プロモーターは、タンパク質の単一の複製のみが同時に細胞内に存在することを可能とする。ネイティブプロモーター領域は、配列番号5に示されている。改変プロモーター領域は、配列番号6に示されている。
【００７９】
Acc1の発現を上方調節することに加えて、S.セレビシエは、Acc1活性及び細胞質性アセチル-CoA濃度を増加させるために、1つ又は複数のAcc1の改変を含んでもよい。Acc1の抑制を取り除き、より高いAcc1発現及びより多いマロニル-CoA生成をもたらす調節配列における2つの変異は、文献において特定された。配列番号7は、S.セレビシエゲノムを相同組換えによってネイティブAcc1遺伝子において改変するために使用され得るポリヌクレオチドである。配列番号7は、Ser659Ala及びSer1167Ala改変を有するAcc1遺伝子に関するコード配列の一部を含む。結果として、この配列により形質転換されたS.セレビシエは、Acc1S659A; S1167Aを発現することになる。同様の結果は、例えば、任意の適切な部位に、Tef1プロモーター、Ser659Ala及びSer1167Ala改変を有するAcc1、及びPrm9ターミネーターを有する配列を組み込むことによって達成されてもよい。最終結果は、Tef1、Acc1S659A; S1167A、及びPrm9が、S.セレビシエゲノムへの組み込みを促進するためのゲノムDNA配列に隣接することであろう。これは、Flagfeldtの部位18で試みられたが、構築物のサイズによって、代わりに、上述の配列番号7を用いるアプローチが続いて行われた。
【００８０】
S.セレビシエは、Maf1又はtRNA生合成の他の調節因子の改変された発現を含んでもよい。ネイティブMaf1の過剰発現は、tRNA生合成に対するIPPの損失を低減させ、それによって、酵母におけるモノテルペンの収率を改善することが示されている。IPPは、メバロン酸経路における中間体である。配列番号8は、Tef1プロモーターの下でのMaf1ゲノム組み込みのために、Maf1-部位5においてS.セレビシエのゲノムへと組み込まれたポリヌクレオチドである。配列番号8は、Tef1プロモーター、ネイティブMaf1遺伝子、及びPrm9ターミネーターを含む。まとめると、Tef1、Maf1、及びPrm9は、S.セレビシエゲノムへの組み込みを促進するためのゲノムDNA配列によって隣接する。以下のTable 4(表4)に示されるように、基本株HB100、HB106、及びHB110は、Tef1プロモーターの下でMaf1を発現する。同様に、HB100、HB106、又はHB110のいずれかに基づく各改変酵母は、Tef1プロモーターの下でMaf1に関するコード配列を含むポリヌクレオチドを含む。
【００８１】
Upc2は、S.セレビシエにおけるステロール生合成の活性化因子である。Upc2のGlu888Asp変異によって、酵母におけるモノテルペン生成が増加する。配列番号9は、Tef1プロモーターの下でUpc2E888Dの発現をもたらすためにゲノムへと組み込まれ得るポリヌクレオチドである。配列番号9は、Tef1プロモーター、Upc2E888D遺伝子、及びPrm9ターミネーターを含む。まとめると、Tef1、Upc2E888D、及びPrm9は、S.セレビシエゲノムへの組み込みを促進するためにゲノムDNA配列に隣接する。
【００８２】
上記遺伝子、Erg20K197E、AcsL641P、Ald6、Maf1、Acc1S659A; S1167A又はUpc2E888Dは、プラスミドから発現されるか又はS.セレビシエのゲノムへと組み込まれてもよい。ゲノムへの組み込みは、CRISPR組換えを含む相同組換え、又は任意の適切なアプローチによるものであってもよい。Acc1のプロモーターは、組換えによって同様に改変されてもよい。配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9のそれぞれにおけるコード配列及び調節配列は、発現のためのプラスミド(例えば、pYES等)又はS.セレビシエゲノムへの組み込みのための直鎖状ポリヌクレオチドに含まれてもよい。基本株HB42、HB82、HB100、HB106、又はHB110のそれぞれは、1つ又は複数の組み込まれた配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号8、又は配列番号10を含む(以下を参照のこと)。配列番号7、又は配列番号9の組み込みは、同様のアプローチによって適用されてもよい。
【００８３】
DiPKS機能の増加
図9に示されるように、DiPKSは、ACPドメインを含む。DiPKSのACPドメインは、補因子としてホスホパンテテイン基を必要とする。NpgAは、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)由来の4'-ホスホパンテチエニルトランスフェラーゼである。S.セレビシエに対してコドン最適化されたNpgAの複製は、S.セレビシエへと導入され、例えば、相同組換えによって、S.セレビシエに形質転換されてもよい。NpgA遺伝子カセットは、Flagfeldtの部位14でサッカロマイセス・セレビシエのゲノムへと組み込まれ、株HB100を作出する。組み込まれたDNAの配列は、配列番号10に示され、Tef1プロモーター、NpgAコード配列及びPrm9ターミネーターを含む。まとめると、Tef1p、NpgA、及びPrm9tは、S.セレビシエゲノムのFlagfeldtの部位14への組み込みを促進するゲノムDNA配列に隣接する。以下のTable 4(表4)に示されるように、基本株HB100、HB106、及びHB110は、この組み込みカセットを含む。或いは、配列番号10の塩基636から2782が、株HB98におけるように、発現プラスミドに含まれてもよい。
【００８４】
NpgAの発現によって、DiPKSのACPドメインへとホスホパンテテイン基を負荷するという、より強い触媒作用のためのA.ニデュランスのホスホパンテテイニルトランスフェラーゼがもたらされる。結果として、DiPKSによって触媒される反応(図6の反応1)は、より早い速度で起こり、meCBGへのプレニル化のためのメチル-オリベトールをより多量にもたらし得る。
【００８５】
他のプレニルトランスフェラーゼ酵素
NphBバリアントは、ABBAプレニルトランスフェラーゼ構造に関するDELTA BLAST検索に基づいて定義された。このリストは、GPPに対して適当であり、IPP、ジメチルアリルピロリン酸、又は他のプレニル基に対しては適当でない結合ポケットを探すことによって改良された。配列番号12から配列番号33は、DELTA BLAST検索で位置を決定した真菌及び細菌由来の細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素に関する一次構造アミノ酸残基配列を提供する。アサゲノムのDELTA BLAST検索も行われ、膜結合性プレニルトランスフェラーゼ酵素は、これらの検索で位置を決定された。一部のアサの膜結合性プレニルトランスフェラーゼ酵素は、酵母の一部の種ではほとんど発現せず、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを調製するために本発明において提供される酵母株へと導入されない。
【００８６】
配列番号33から配列番号36は、手作業による文献検索で位置を決定された真菌及び細菌由来の細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素に関する一次構造アミノ酸残基配列を提供する。配列番号33から配列番号36は、それぞれ、FNQ26、FNQ28、FUR7、及びNAPT9という名称の細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素に関する一次構造アミノ酸残基配列である。
【００８７】
配列番号11から配列番号36のいずれかは、細胞質性プレニルトランスフェラーゼとして本発明において提供される酵母株に適用され得る。これらのプレニルトランスフェラーゼのそれぞれをTable 1(表1)にまとめる。
【００８８】
【表１Ａ】
2020507351.tif 000006
【００８９】
【表１Ｂ】
2020507351.tif 000007
【００９０】
DiPKSの改変
DiPKSは、C-Metの活性を低減又は消失させるために改変されてもよい。
【００９１】
配列番号37は、DiPKSが、C-metドメインの活性を一緒に破壊するGly1516Asp置換及びGly1518Ala置換を含む酵母に対してコドン最適化されるDIPKSに対する合成配列の改変形態である。S.セレビシエ培養におけるDiPKSG1516D, G1518A発現の結果は、株HB80Aを含む実施例IVに関連して以下に提供される。他の改変は、C-Metの活性部位全体又はC-Metのすべてを破壊するか又は消失させるために、DiPKSへと導入されてもよい。これらの改変DiPKS酵素のそれぞれは、野生型DiPKSについて説明したように、S.セレビシエへと導入されてもよい。
【００９２】
配列番号38は、DiPKSが、C-metドメインの活性を破壊するGly1516Arg置換を含む酵母に対してコドン最適化されるDIPKSに対する合成配列の改変形態である。S.セレビシエ培養におけるDiPKSG1516R発現の結果は、株HB135を含む実施例VIII及び株HB135、HB137及びHB138を含む実施例IXに関連して以下に提供される。
【００９３】
具体的には、DiPKSG1516D, G1518A及びDiPKSG1516Rに加えて、以下の他の改変が、C-Metの活性部位全体又はC-Metのすべてを破壊するか又は消失させるために、DiPKSへと導入されてもよい:(a)GGGSGGGSGを有するモチーフ1の置換、(b)モチーフ1におけるGly1516Arg 置換及びGGGSGGGSを有するモチーフ2の置換、(c)モチーフ3のちょうど外側にあり、C-Metドメインの活性部位における三次構造を破壊するGlu1634Ala、並びに(d)His1608Gln置換によるC-Metドメインの活性部位の破壊。(a)から(d)のそれぞれについてコドン最適化された配列が、発現プラスミド上で酵母へと導入され、DiPKSG1516D, G1518A及びDiPKSG1516Rの発現に対しても同様に、基本株HB100へと導入された。それぞれの場合に、オリベトールは観察されなかった。GGGSGGGSを有するモチーフ1又はモチーフ2のいずれの置換によっても、同様に、メチル-オリベトールの生成は消失した。DiPKSG1634A変異体を発現する酵母の培養によって、一例のバッチで培養物1l当たり2.67mgのメチル-オリベトールが得られた。DiPKSH1608N変異体を発現する酵母の培養では、一例のバッチで培養物1l当たり3.19mgのメチル-オリベトールが得られた。
【００９４】
酵母細胞の形質転換及び増殖
実行された方法の具体例及びこの記載に従って生成された酵母細胞の詳細を以下の実施例IからXとして提供する。これら10個の具体例のそれぞれでは、プラスミドの構築、酵母の形質転換、株増殖の定量、及び細胞内代謝物の定量に対して同様のアプローチを適用した。10個の例に共通の特徴、続いて、10個の例のうちの1つ又は複数に関連する結果及び他の詳細を以下に記載する。
【００９５】
プラスミドの構築
本発明において提供される方法及び酵母細胞の例を適用及び調製するためにアセンブルしたプラスミドをTable 2(表2)に示す。Table 2(表2)では、発現プラスミドpYES、及びpYES2について、配列番号39及び40は、それぞれ、発現カセットを有さないプラスミド全体を提供する。配列番号10、37、38、及び41から47の発現カセットは、Table 2(表2)に示されるプラスミドを調製するために含まれ得る。配列番号4は、PDHバイパス遺伝子に対するカセットを含むpGREGプラスミドである。
【００９６】
【表２Ａ】
2020507351.tif 000008
【００９７】
【表２Ｂ】
2020507351.tif 000009
【００９８】
S.セレビシエへと導入するためのプラスミドを、Operon Eurofins and Phusion HF polymerase(ThermoFisher F-530S)からのプライマーを用い、Eppendorf Mastercycler ep Gradient 5341を使用して、製造業者の推奨するプロトコールに従って、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)によって増幅させた。
【００９９】
すべてのプラスミドは、重複するDNA部分とS.セレビシエにおける形質転換支援組換え(transformation assisted recombination)を使用してアセンブルした。プラスミドを、Gietz、R. D.及びSchiestl、R. H.、「High-efficiency yeast transformation using LiAc/SS carrier DNA/PEG method.」 Nat. Protoc. 2、31〜34(2007)に記載される酢酸リチウムヒートショック方法を使用してS.セレビシエへと形質転換した。プラスミドをアセンブルするために使用した基本酵母株をTable 3(表3)に示す。
【０１００】
【表３】
2020507351.tif 000010
【０１０１】
pAltPTプラスミドをHB24ロイシン栄養要求株においてアセンブルした。pNPGA、pDiPKSm1、pDiPKSm2、pGFP、pPTGFP、pAPTGFP、pH1OAS、pDiPKS、pCRISPR、及びpPDH プラスミドをHB25ウラシル栄養要求株においてアセンブルした。形質転換S.セレビシエ細胞を、寒天ペトリ皿における栄養要求性選択によって選択した。ペトリ皿から回収したコロニーを、250RPMで振盪させながら、30℃で16時間、液体選択培地中で増殖させた。
【０１０２】
液体選択培地中で増殖させた後、形質転換S.セレビシエ細胞を採取し、プラスミドDNAを抽出した。抽出したプラスミドDNAを大腸菌(Escherichia coli)へと形質転換した。形質転換大腸菌は、アンピシリンを含む寒天ペトリ皿で増殖させることによって選択した。大腸菌を、プラスミドを増幅させるために培養した。大腸菌中で増殖したプラスミドを抽出し、正確な構成を確認するためにサンガーのジデオキシシークエンシングを用いてシークエンシングした。次いで、シークエンスを確認したプラスミドを、S.セレビシエのゲノム改変又は安定した形質転換のために使用した。
【０１０３】
S.セレビシエのゲノム改変
本明細書に記載のS.セレビシエ株は、プラスミドの安定した形質転換又はゲノム改変によって調製されてもよい。ゲノム改変は、例えば、CRISPRを活用する方法によって、相同性組換えを介して遂行されてもよい。
【０１０４】
CRISPRを適用する方法を、S.セレビシエゲノムからDNAを欠失させ、異種DNAをS.セレビシエゲノムへと導入するために適用した。Cas9エンドヌクレアーゼをS.セレビシエゲノムの所望の位置へと標的化するためのガイドRNA(「gRNA」)配列は、BenchlingオンラインDNA編集ソフトウェアを用いて設計した。オーバーラップエクステンション(「SOEing」)及びPCRによるDNAスプライシングを適用して、gRNA配列をアセンブルし、機能的gRNAカセットを含むDNA配列を増幅させた。
【０１０５】
機能的gRNAカセット、Cas9-発現遺伝子カセット、及びpYes2(URA)プラスミドをpCRISPRプラスミドへとアセンブルして、標的化DNA二本鎖切断を容易にするためにS.セレビシエへと形質転換した。生じたDNA切断を、標的DNAの直鎖状断片の付加によって修復した。
【０１０６】
配列番号3に示されるErg20K197Eタンパク質に関するCDSを、相同性組換えによってHB13のゲノムへと組み込み、HB42基本株を得た。
【０１０７】
配列番号4の塩基51から7114を、CRISPRによってHB42株へと組み込み、S.セレビシエのPDHバイパス遺伝子を有するHB82基本株を得た。pPDHプラスミドは、S.セレビシエにおけるアセンブリー後に確認した配列であった。シークエンスを確認したpPDHプラスミドを、大腸菌内で増殖させ、精製して、BciV1制限酵素で消化した。Table 2(表2)におけるように、BciV1による消化によって、Ald6及びSeAcsL641Pに対する遺伝子、プロモーター、ターミネーター、及びCas9によるPDH-部位19におけるS.セレビシエゲノムへの組み込みのための組み込み部位相同配列を含むポリヌクレオチドが得られた。得られた直鎖状PDHバイパスドナーポリヌクレオチドを、配列番号4の塩基51から7114に示されるように、ゲル分離によって精製した。
【０１０８】
単一のPDHバイパスポリヌクレオチドに関する両方のPDHバイパス遺伝子(Ald6及びAcsL641P)と共に、PDHバイパスドナーポリヌクレオチドを、pCRISPRにより、S.セレビシエへと同時形質転換した。形質転換は、Gietzに記載されている酢酸リチウムヒートショック方法によるものであった。pCRISPRプラスミドはCas9を発現し、gRNA分子によって、S.セレビシエゲノムの選択された位置へと標的化される。この位置において、Cas9タンパク質によって、DNAの二重鎖切断が生じる。PDHバイパスドナーポリヌクレオチドを、CRISPR反応におけるドナーポリヌクレオチドとして使用した。Ald6、AcsL641P、プロモーター、及びターミネーターを含むPDHバイパスドナーポリヌクレオチドを、相同性組換えによって、切断部位である部位19においてゲノムへと組み込み、株HB82を得た。
【０１０９】
配列番号10に示されるNpgAドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNA SOEingを使用して、NpgA組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、NpgA遺伝子カセットをコードしていた。NpgA遺伝子カセットは、Tef1プロモーター、NpgAコード配列及びPrm9ターミネーターを含む。第3のポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【０１１０】
NpgAドナーポリヌクレオチドを、pCRISPRプラスミドを用いて、株HB82へと同時形質転換した。pCRISPRプラスミドが発現し、エンドヌクレアーゼCas9を、gRNA分子によって、S.セレビシエゲノムのある位置へと標的化した。この位置で、Cas9タンパク質によって、DNAの二重鎖切断が生じ、NpgAドナーポリヌクレオチドを、相同性組換えによって、切断したゲノムへと組み込み、HB100基本株を得た。
【０１１１】
配列番号8に示されるMaf1ドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNAのSOEingを使用して、Maf1組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、Maf1遺伝子カセットをコードしていた。Maf1遺伝子カセットは、Tef1プロモーター、Maf1コード配列及びPrm9ターミネーターを含む。第3のポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【０１１２】
Maf1ドナーポリヌクレオチドを、pCRISPRプラスミドを用いて、HB100株へと同時形質転換した。pCRISPRプラスミドが発現し、エンドヌクレアーゼCas9を、gRNA分子によって、S.セレビシエゲノムのある位置へと標的化した。この位置で、Cas9タンパク質によって、DNAの二重鎖切断が生じ、Maf1ドナーポリヌクレオチドを、相同性組換えによって、切断したゲノムへと組み込むことができる。Maf1ドナーポリヌクレオチドのHB100株への安定した形質転換により、HB106基本株が得られる。
【０１１３】
配列番号6に示されるAcc1-PGK1pドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNAのSOEingを使用して、Acc1-PGK1p組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、PGK1プロモーター領域をコードしていた。第3のポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【０１１４】
Acc1-PGK1ドナーポリヌクレオチドを、pCRISPRプラスミドを用いて同時形質転換した。pCRISPRプラスミドが発現し、エンドヌクレアーゼCas9を、gRNA分子によって、S.セレビシエゲノムのある位置へと標的化した。この位置で、Cas9タンパク質によって、DNAの二重鎖切断が生じ、Acc1-PGK1ドナーポリヌクレオチドを、相同性組換えによって、切断したゲノムへと組み込んだ。HB100株へのドナーポリヌクレオチドの安定した形質転換によって、PGK1プロモーターの調節下にあるAcc1を有するHB110基本株が得られる。
【０１１５】
Table 4(表4)は、S.セレビシエの遺伝子改変によって調製された基本株についてのまとめを提供する。Table 4(表4)に示される各基本株は、ロイシン及びウラシル栄養要求株であり、これらはいずれもプラスミドを含まない。
【０１１６】
【表４】
2020507351.tif 000011
【０１１７】
株の構築のための安定した形質転換
Gietzによって記載されている酢酸リチウムヒートショック方法を使用して、プラスミドをS.セレビシエへと形質転換した。
【０１１８】
トランスジェニックS.セレビシエ株HB1、HB6、及びHB7を、Table 2(表2)からのプラスミドをTable 5(表5)において以下に示すHB25へと導入することによって、HB25基本株から調製した。株HB1、HB6、及びHB7を、S.セレビシエにおけるアサのプレニルトランスフェラーゼ及びAltPTのタンパク質発現レベルを比較するために使用した。
【０１１９】
【表５】
2020507351.tif 000012
【０１２０】
Table 6(表6)において以下に示すように、トランスジェニックS.セレビシエHB80、HB80A、HB98、HB102、HB135、HB137及びHB138を発現プラスミドによるHB42の形質転換によって、HB42、HB100、HB106及びHB110基本株から調製し、HB80AをHB80の形質転換によって調製した。HB80、HB98及びHB102はそれぞれ、DiPKSを含み、発現する。HB80Aは、DiPKSG1516D;G1518Aを含み、発現する。HB135、HB137及びHB138はそれぞれ、DiPKSG1516Rを含み、発現する。HB98は、プラスミド由来のDiPKS及びNPGaを含み、発現する。
【０１２１】
【表６】
2020507351.tif 000013
【０１２２】
トランスジェニックS.セレビシエHB37、HB84、HB88、HB90、HB105及びHB130をTable 7(表7)において以下に示す発現プラスミドによる基本株の形質転換によって、Table 7(表7)に示す基本株から調製した。HB37及びHB88はそれぞれ、AltPT及びOASを含み、発現する。HB80、HB90及びHB105はそれぞれ、AltPT及びDiPKSを含み、発現する。HB139は、AltPT及びDiPKSG1516Rを含み、発現する。
【０１２３】
【表７】
2020507351.tif 000014
【０１２４】
酵母の増殖及び栄養摂取条件
酵母培養物を選択培地による終夜の培養で増殖させ、種菌を得た。次いで、得られた種菌を使用して、三連で50mlの培養物を接種し、600nmで0.1の吸光度(「A600」)を有する光学密度とした。Table 8(表8)は、各株を増殖させるために使用した培地の詳細を示す。
【０１２５】
【表８】
2020507351.tif 000015
【０１２６】
Table 8(表8)では、「4DO*」は、ロイシン及びウラシルを欠く、酵母の合成ドロップアウト培地補充物を指す。株HB13に関して、「HB13-HA」は、0.5mMのヘキサン酸の存在下で増殖したHB13を指し、「HB13-No」は、ヘキサン酸の非存在下で増殖したHB13を指す。Table 8(表8)では、「YNB」は、Table 9(表9)の最初の2列側に列挙した化学物質を含む栄養ブロスである。Table 9(表9)の3及び4番目の列に列挙した化学物質は、4DO*補充物に含まれる。
【０１２７】
【表９】
2020507351.tif 000016
【０１２８】
代謝物の定量
細胞内代謝物を、メタノール抽出を使用して、S.セレビシエ細胞から抽出した。1mLの液体培養物を12,000×gで3分間スピンダウンした。250μLの得られた上清を細胞内代謝物の定量に使用した。得られた細胞ペレットを、200μlの80%メタノール(-40℃)中に懸濁させた。混合物をボルテックスし、氷上で10分間冷やした。氷上で10分間冷やした後、混合物を、4℃にて、15,000×gで14分間スピンダウンした。得られた上清を採取した。更に200μlの80%メタノール(-40℃)を細胞デブリペレットに添加し、混合物を氷上で10分間冷やした。氷上で10分間冷やした後、混合物を、4℃にて、15,000×gで14分間スピンダウンした。得られた200μlの上清を、前もって採取した200μlの上清に添加し、合計400μlの、細胞内代謝物を含む80%メタノールを得た。
【０１２９】
細胞内代謝物は、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)及び質量分析(「MS」)方法を使用して定量した。Agilent 1260オートサンプラー及びThermoFinnigan LTQ質量分析計に接続したHPLCシステムを使用した。HPLCシステムは、Zorbax Eclipse C18 2.1μm×5.6mm×100mmのカラムを備えていた。
【０１３０】
代謝物を、オートサンプラーを使用して、10μlのサンプル中に注入し、1ml/分の流速で使用するHPLCにおいて分離した。HPLC分離プロトコールは、(a)98%の溶媒A及び2%の溶媒Bの0〜2分;(b)98%の溶媒Bとなるまでの2〜15分;(c)98%の溶媒Bで15〜16.5分;(d)98%の溶媒Aとなるまでの16.5〜17.5分;及び(e)98%の溶媒Aで最終の2.5分の平衡の合計20分であった。溶媒Aは、MS水中アセトニトリル+0.1%のギ酸であり、溶媒Bは、MS水中0.1%のギ酸であった。
【０１３１】
HPLCによる分離後、エレクトロスプレーイオン化によってサンプルを質量分析計へと注入し、ポジティブモードで分析した。キャピラリー温度は380℃に保った。チューブレンズ電圧は30Vであり、キャピラリー電圧は0Vであり、スプレー電圧は5kVであった。HPLC-MS/MS後、CBGを、317.2を親イオンとして、193.1を娘イオンとして分析し、一方、meCBGを、331.2を親イオンとして分析した。同様に、HPLC-MS/MS後、オリベトールを、181.2を親イオンとして、111を娘イオンとして分析し、一方、メチル-オリベトールを、193.2を親イオンとして、125を娘イオンとして分析した。
【０１３２】
様々な濃度の公知の標準物質を注入して、線形標準曲線を作成した。CBG及びmeCBGの標準物質は、Toronto Research Chemicalsから購入した。meCBGは、Toronto Research Chemicalsが標準物質を注文される前にその化学物質を合成したことがなかったため、リクエストして特注で調製された。オリベトール及びメチル-オリベトールの標準物質は、Sigma Aldrichから購入した。
【０１３３】
S.セレビシエの増殖に関するヘキサン酸の作用
ヘキサン酸の生合成に必要とされる酵素をコードする遺伝子は、S.セレビシエへと導入されなかった。代わりに、HB37等のOAS遺伝子を含む酵母細胞において、ヘキサン酸が増殖培地中に含まれた。
【０１３４】
図12は、S.セレビシエの増殖に関するヘキサン酸補充の作用を示す。HB13を、YNB+2%のグルコース+1.6g/Lの4DO*+0.5mMのヘキサン酸中で培養した。ヘキサン酸を、培養の36時間目に添加した。ヘキサン酸を添加して、0、0.5、1.0及び3.0mMの濃度の培養サンプルを分離した。ヘキサン酸は、S.セレビシエに対して毒性である。ヘキサン酸の存在下では、増殖の減少が観察された。S.セレビシエ増殖の減少の大きさは、増殖培地におけるヘキサン酸の濃度に対応する。培養懸濁物のA600値によって増殖速度が定量され、図12において0、0.5、1.0及び3.0mMのヘキサン酸濃度において示されている。
【０１３５】
0.5mMのヘキサン酸の存在下では、HB13及びHB37は96時間増殖し、24時間、36時間、48時間、60、72時間、84時間及び96時間の時点で試料を採取した。ヘキサン酸の非存在下では、HB13及びHB84が増殖し、72時間目の単一の時点に採取した。HB13を両方の実験の対照として使用した。増殖培地は、Table 8(表8)及びTable 9(表9)に関連して上述されている。
【０１３６】
【表１０】
2020507351.tif 000017
【０１３７】
Table 10(表10)に示されるように、HB84はHB37よりも増殖した。更に、HB84は、meCBGを生成するのにヘキサン酸を必要とせず、一方、HB37は、CBGを生成するのにヘキサン酸を必要とする。同様に、HB13は、0.5mMのヘキサン酸の存在と比較して、ヘキサン酸の非存在下で、72時間目により良好な増殖を示し、図12に示されるデータと一致した。
【０１３８】
図13から図15はそれぞれ、Table 10(表10)に列挙したHB37培養物のA600値を示す(三角形のデータ点を有する破線)。更に、図13から図15はそれぞれ、円のデータ点を有する実線で、別のデータ系列を示す。
【０１３９】
図13は、円のデータ点を有する実線で、オリベトール生成(培養培地1L当たりのオリベトールのμg)を示す。
【０１４０】
図14は、円のデータ点を有する実線で、CBG生成(培養培地1L当たりのCBGのμg)を示す。
【０１４１】
図15は、円のデータ点を有する実線で、培養物中に存在するヘキサン酸(培養培地1L当たりのヘキサン酸のmg)を示す。
【０１４２】
まとめると、図13から図15は、50から60時間の間に起こるジオキシックシフト(dioxic shift)と一致する。ジオキシックシフトは、グルコース異化から酢酸及びエタノール異化までの代謝シフトを含む。ジオキシックシフトに関して、多くの二次的代謝経路がより活性となり、AltPT及びOASの活性も同様に増加する。
【０１４３】
図12から図15及びTable 10(表10)は、ヘキサン酸レベルが、50から60時間の間に下降し、次いで下降し続けるまでの、植物性カンナビノイドを生成するためのヘキサン酸の消費によって、いかなる程度にも軽減されたと考えられないヘキサン酸の毒性と一致したデータを示す。図12及び図13に示されるように、オリベトール及びCBGは、ヘキサン酸の導入から始まって、生成されていた。しかし、CBGが生成され、ヘキサン酸がオリベトールに変換された一方で、培養物のA600は、オリベトール及びCBGが生成されたように急激には増加しなかった。A600は、図15に示されるように、ヘキサン酸が、50から60時間の間に枯渇され始めた後にのみ増加した。枯渇は、オリベトール生成の少なくとも部分的な結果である。しかし、培養物のA600における有意な増加は、オリベトール及びCBGの生成中及びその後の36時間目におけるヘキサン酸の導入においても、ヘキサン酸濃度が枯渇するまで観察されなかった。
【０１４４】
細胞質性及び膜結合性プレニルトランスフェラーゼの発現
アサのプレニルトランスフェラーゼは、膜結合性の植物タンパク質であり、一方、AltPTは、細胞質性の細菌タンパク質である。アサのプレニルトランスフェラーゼよりもS.セレビシエのAltPTの適用によって、酵母細胞におけるよりレベルの高いタンパク質発現がもたらされる。Table 5(表5)に示されるようにHB1、HB6、HB7、及びHB13のそれぞれを、YNB、2%のグルコース、及び1.6g/Lの4DO*中で終夜増殖させた。終夜増殖させた後、得られた培養物を1.0のA600に正規化し、次いで、YNB、2%のグルコース、及び1.6g/Lの4DO*中で4時間増殖させた。BD Acuri C6フローサイトメーターを使用して、各培養懸濁物から蛍光度を測定した。
【０１４５】
HB1は緑色蛍光タンパク質(「GFP」)を発現する。HB6及びHB7のそれぞれは、GFP-プレニルトランスフェラーゼ融合タンパク質を発現する。HB6もHB7もpDiPKS又はpH1OASプラスミド由来の遺伝子を含まない。それと対応して、HB6もHB7もポリケチドシンターゼ遺伝子を発現しないか又は図4、図6、又は図9のいずれかの生合成経路を完成させるための酵素のすべては含んでいない。
【０１４６】
図16は、HB13(「ネガティブ」)、HB1(「ポジティブ」)、HB6(「プレニルトランスフェラーゼ_アサ」)、及びHB7(「プレニルトランスフェラーゼ_Alt」)の細胞培養物サンプルからの平均蛍光レベルを示す。蛍光レベルはタンパク質発現レベルに対応し、HB6によるアサのプレニルトランスフェラーゼの相対的発現レベルとHB7によるAltPTの相対的発現レベルを示す。通常の膜結合性のアサのプレニルトランスフェラーゼは、S.セレビシエの細胞質における発現が低レベルである。細胞質のAltPTは、通常の膜結合性のアサのプレニルトランスフェラーゼよりも高いレベルで、S.セレビシエの細胞質で発現される。
【実施例】
【０１４７】
(実施例I)
Table 7(表7)において上述されている酵母株HB37を、YNB+2%のグルコース+1.6g/Lの4DO*+0.5mMのヘキサン酸培地中で培養した。グルコース及びヘキサン酸からのCBGの生成が観察され、酵母におけるCBGの直接的生成を実証した。
【０１４８】
CBGを0.85mMのヘキサン酸を含む10μg/Lの濃度で生成した。ヘキサン酸の供給及び増殖条件を最適化した後、50μg/LのCBGを0.5mMのヘキサン酸を用いて生成した。
【０１４９】
(実施例II)
Table 7(表7)において上述されている酵母株HB84を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのmeCBGの生成が観察され、ヘキサン酸を用いない、酵母におけるmeCBGの直接的生成を実証した。meCBGを42.63mg/Lで生成した。HB84によって生成されたmeCBGの収率は、HB37からのCBGの収率と比較して、ほぼ1,000倍の増加を表す。
【０１５０】
図17は、実施例IのHB37からのCBG(「CBG_C_sativa」)の収率と比較した実施例IIのHB84からのmeCBG(「HB_CBG_me」)の収率を示す。
【０１５１】
(実施例III)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB80を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのメチル-オリベトールの生成を観察し、HB80がAltPTを欠いているため、meCBGへの変換なしでの、酵母におけるメチル-オリベトールの直接的生成を実証した。メチル-オリベトールを3.259mg/Lの濃度で生成した。meCBGへの変換は、HB80及びAltPT又はHB139等の別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含む株において続くことが期待される。
【０１５２】
(実施例IV)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB80Aを、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。DiPKSG1516D; G1518Aによって触媒されるラフィノース及びガラクトースからのオリベトールとメチル-オリベトール両方の生成が観察された。このデータは、ヘキサン酸を含まない場合の、酵母におけるオリベトールとメチル-オリベトール両方の直接的生成を実証する。HB80AはAltPTを欠くため、CBG及びmeCBGへの変換は続かなかった。CBG及びmeCBGへの変換は、pAltPTによってHB80Aを形質転換すること等によって、HB80A及びAltPT又は別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含んだ株で続くことが期待される。
【０１５３】
図18は、実施例IIIからのHB80によって生成されたメチル-オリベトール(「メチル_オリベトール HB80」)、並びにHB80Aによって生成されたオリベトール及びメチル-オリベトール(それぞれ、「メチル_オリベトール HB80A」及び「オリベトール HB80A」)の濃度を示す。培養物のサンプルを72時間目に採取した。HB80Aは、メチル-オリベトールの大半を生成し(培養物1L当たり0.010mgのオリベトールと比較して培養物1L当たり1.4mgのメチル-オリベトール)、組み合わせても、HB80により生成されるメチル-オリベトール(3.26mg/L)より少ないメチル-オリベトールとオリベトールしか生成されない。
【０１５４】
(実施例V)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB98を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。DiPKSによって触媒されるラフィノース及びガラクトースからのメチル-オリベトールの生成が確認された。このデータは、ヘキサン酸を含まない場合にも、実施例IIIに記載されているHB80と比較したメチル-オリベトール生成の増加を実証する。HB80AはAltPTを欠くため、meCBGへの変換は続かなかった。meCBGへの変換は、pAltPTによってHB98を形質転換すること又はpNPGaによってHB84を形質転換すること等によって、HB98及びAltPT又は別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含んだ株で続くことが期待される。
【０１５５】
図19は、実施例IIIからのHB80によって生成されたメチル-オリベトール(「メチル_オリベトール HB80」)、及び実施例VからのHB98によって生成されたメチル-オリベトール(「メチル_オリベトール HB98」)の濃度を示す。培養物のサンプルを72時間目に採取した。HB80は、培養物1L当たり3.26mgのメチル-オリベトールしか生成しなかったが、HB98は、29.85mg/Lのメチル-オリベトールを生成した。HB98は、HB80のほぼ10倍のメチル-オリベトールを生成した。
【０１５６】
(実施例VI)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB102を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのメチル-オリベトールの生成が観察され、29.85mg/Lのメチル-オリベトールしか生成しなかった株HB98と比較して、酵母において、42.44mg/Lのメチル-オリベトールの増加した生成が実証された。このことは、NpgAの遺伝子組み込みバージョンが機能的であることを実証した。HB102はAltPTを欠くため、meCBGへの変換は続かなかった。meCBGへの変換は、HB102及びAltPT又はHB105等の別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含んだ株で続くことが期待される。
【０１５７】
図20は、実施例Vにおける株HB98からのメチル-オリベトール(「メチル_オリベトール HB98」)の生成と比較した、実施例VIからのHB102によって生成されたメチル-オリベトール(「メチル_オリベトール HB102」)の濃度を示す。
【０１５８】
(実施例VII)
Table 7(表7)において上述されている酵母株HB105を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのmeCBGの生成が、66.3mg/Lの力価で観察され、HB84由来のCBGの収率と比較した、meCBGの生成の増加が実証された。このことは、meCBG力価に関するPDHバイパス及び組み込みNpgAのポジティブな効果を実証する。
【０１５９】
図21は、実施例IIにおける株HB84からのmeCBG(「メチル_CBG HB84」)の生成と比較した、実施例VIIからのHB105によって生成されるmeCBG(「メチル_CBG HB105」)の力価を示す。
【０１６０】
(実施例VIII)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB135を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのオリベトールの生成が観察され、いずれのヘキサン酸も用いない、49.24mg/Lの高力価における、メチル-オリベトールの生成なしの、酵母におけるオリベトールの生成を実証する。これは、株HB102によるメチル-オリベトールの生成に匹敵し、DIPKSの変異が、メチル-オリベトールに対してオリベトールの生成に有効であることを実証する。HB135はAltPTを欠くため、CBG及びmeCBGへの変換は続かなかった。CBG及びmeCBGへの変換は、HB135及びAltPT又は別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含む株で続くことが期待される。
【０１６１】
図22は、実施例VIにおける株HB102からのメチル-オリベトールの生成と比較した、実施例VIIIからのHB135によって生成されるオリベトール及びメチル-オリベトール(それぞれ、「メチル_オリベトール HB135」及び「オリベトール HB135」)の濃度を示す。
【０１６２】
(実施例IX)
Table 6(表6)において上述されている酵母株HB137及びHB138を、YNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのオリベトールの生成は、両方の株で観察された。株HB137が生成した61.26mg/Lのオリベトール及び株HB138が生成した74.26mg/Lのオリベトールによって、オリベトール力価に関するMaf1組み込み及びAcc1-プロモータースワップのポジティブな効果を実証した。HB137及びHB138はAltPTを欠くため、CBGへの変換は続かなかった。CBGへの変換は、HB137及びHB138及びAltPT又は別のプレニルトランスフェラーゼの特徴を含んだ株で続くことが期待される。
【０１６３】
図23は、実施例VIIIにおけるHB135によって生成されるオリベトールと比較した、実施例IXからのHB137(「オリベトール HB137」)及びHB138(「オリベトール HB138」)によって生成されるオリベトール)の濃度を示す。
【０１６４】
(実施例X)
Table 7(表7)において上述されている酵母株HB139をYNB+2%のラフィノース+2%のガラクトース+1.6g/Lの4DO*培地中で培養した。ラフィノース及びガラクトースからのCBGの生成が、0.03mg/Lの力価で、直接的に観察された。これは、株HB105によって生成されたmeCBGの力価よりはるかに低い。
【０１６５】
図24は、実施例VIIからのHB105によるmeCBGの生成(「meCBG HB105」)及び実施例IにおけるHB37によるCBGの生成(「CBG HB37」)と比較した、実施例Xから、HB139によって、ガラクトース及びラフィノースから直接的に生成されるCBG(「CBG HB139」)の濃度を示す。
【０１６６】
(参照文献)
・M. B. Austin, T. Saito, M.E. Bowman, S. Haydock, A. Kato, B.S. Moore, R.R. Kay and Noel, J. P. (2006) “Biosynthesis of Dictyostelium discoideum differentiation-inducing factor by a hybrid type I fatty acid-type III polyketide synthase” Nature chemical biology, 2(9), 494.
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【０１６７】
配列
以下の配列は、この出願と共に電子的に提出されるが、本発明にも含まれる。
【表１１−１】
2020507351.tif 000018
【表１１−２】
2020507351.tif 000019
【表１１−３】
2020507351.tif 000020
【表１１−４】
2020507351.tif 000021
【表１１−５】
2020507351.tif 000022
【表１１−６】
2020507351.tif 000023
【表１１−７】
2020507351.tif 000024
【表１１−８】
2020507351.tif 000025
【表１１−９】
2020507351.tif 000026
【表１１−１０】
2020507351.tif 000027
【表１１−１１】
2020507351.tif 000028
【表１１−１２】
2020507351.tif 000029
【表１１−１３】
2020507351.tif 000030
【表１１−１４】
2020507351.tif 000031
【表１１−１５】
2020507351.tif 000032
【表１１−１６】
2020507351.tif 000033
【０１６８】
【表１１−１７】
2020507351.tif 000034
【表１１−１８】
2020507351.tif 000035
【０１６９】
【表１１−１９】
2020507351.tif 000036
【表１１−２０】
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【表１１−２１】
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【表１１−２２】
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【表１１−２３】
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【表１１−２４】
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【表１１−２５】
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【表１１−２６】
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【表１１−２７】
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【表１１−２８】
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【表１１−２９】
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【表１１−３０】
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【表１１−３１】
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【表１１−３２】
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【表１１−３３】
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【表１１−３４】
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【表１１−３５】
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【表１１−３６】
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【表１１−３７】
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【表１１−３８】
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【表１１−３９】
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【表１１−４０】
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【表１１−４１】
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【表１１−４２】
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【表１１−４３】
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【表１１−４４】
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【表１１−４５】
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【表１１−４６】
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【表１１−４７】
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【表１１−４８】
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【表１１−４９】
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【表１１−５０】
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【表１１−５１】
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【表１１−５２】
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【表１１−５３】
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【表１１−５４】
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【表１１−５５】
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【表１１−５６】
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【表１１−５７】
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【表１１−５８】
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【表１１−５９】
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【表１１−６０】
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【表１１−６１】
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【表１１−６２】
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【表１１−６３】
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【表１１−６４】
2020507351.tif 000081
【表１１−６５】
2020507351.tif 000082
【表１１−６６】
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【表１１−６７】
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【表１１−６８】
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【表１１−６９】
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【表１１−７０】
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【表１１−７１】
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【表１１−７２】
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【表１１−７３】
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【表１１−７４】
2020507351.tif 000091
【表１１−７５】
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【表１１−７６】
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【表１１−７７】
2020507351.tif 000094
【表１１−７８】
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【表１１−７９】
2020507351.tif 000096
【表１１−８０】
2020507351.tif 000097
【表１１−８１】
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【表１１−８２】
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【表１１−８３】
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【表１１−８４】
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【表１１−８５】
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【表１１−８６】
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【表１１−８７】
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【表１１−８８】
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【表１１−８９】
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【表１１−９０】
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【表１１−９１】
2020507351.tif 000108
【表１１−９２】
2020507351.tif 000109
【表１１−９３】
2020507351.tif 000110
【表１１−９４】
2020507351.tif 000111
【表１１−９５】
2020507351.tif 000112
【表１１−９６】
2020507351.tif 000113
【表１１−９７】
2020507351.tif 000114
【表１１−９８】
2020507351.tif 000115
【表１１−９９】
2020507351.tif 000116
【表１１−１００】
2020507351.tif 000117
【表１１−１０１】
2020507351.tif 000118
【表１１−１０２】
2020507351.tif 000119
【表１１−１０３】
2020507351.tif 000120
【０１７０】
単なる例
先行する記載において、説明を目的として、実施形態の全体的理解をもたらすために多数の詳細が示されている。しかし、これらの具体的詳細が必要とされないことは当業者にとって明らかであろう。
【０１７１】
上述の実施形態は、単なる例であることを意図する。本明細書に添付された特許請求の範囲によってのみ定義される範囲を逸脱することなく、当業者によって、特定の実施形態に対する変更、修正及びバリエーションが実行され得る。
【図１】
2020507351.tif 000124
【図２】
2020507351.tif 000125
【図３】
2020507351.tif 000126
【図４】
2020507351.tif 000127
【図５】
2020507351.tif 000128
【図６】
2020507351.tif 000129
【図７】
2020507351.tif 000130
【図８】
2020507351.tif 000131
【図９】
2020507351.tif 000132
【図１０】
2020507351.tif 000133
【図１１】
2020507351.tif 000134
【図１２】
2020507351.tif 000135
【図１３】
2020507351.tif 000136
【図１４】
2020507351.tif 000137
【図１５】
2020507351.tif 000138
【図１６】
2020507351.tif 000139
【図１７】
2020507351.tif 000140
【図１８】
2020507351.tif 000141
【図１９】
2020507351.tif 000142
【図２０】
2020507351.tif 000143
【図２１】
2020507351.tif 000144
【図２２】
2020507351.tif 000145
【図２３】
2020507351.tif 000146
【図２４】
2020507351.tif 000147
【配列表】
2020507351000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月17日(2019.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成する方法であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド及び細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを含む酵母細胞を提供する工程であって、
ポリケチドシンターゼ酵素が、マロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を生成するためのものであり、前駆化学物質が、構造I:
【化１】
2020507351.tif 000148
を有し、構造Iにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3が、H、カルボキシル、又はメチルであり、
ポリケチドシンターゼ酵素が、アサに対してネイティブではなく、
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質をプレニル化するためのものであり、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を提供する、工程と、
酵母細胞培養物をもたらすために前記酵母細胞を増殖させる工程と
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、Hであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、メチルであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数3の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、メチルである前駆化学物質を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
ポリケチドシンターゼ酵素が、キイロタマホコリカビ由来のDiPKSポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号46の塩基535から9978によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号46の塩基535から9978と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R2が、メチル基である前駆化学物質を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、メチル化植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項6から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を軽減するためにC-Metドメインの活性部位に影響を及ぼす変異を含み、その結果、R2がメチルであり、R3がHである第1の前駆化学物質、及びR2がHであり、R3がHである第2の前駆化学物質を含む少なくとも1つの前駆化学物質を生じ、
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、メチル化植物性カンナビノイドアナログ及び非メチル化植物性カンナビノイドを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１１】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、DiPKSG1516D;G1518Aポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号37の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516D;G1518Aポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号37の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を防止するために、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素のC-Metドメインの活性部位における活性を低減する変異を含み、その結果、水素R2基及び水素R3基を有する少なくとも1つの前駆化学物質を生じ、
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１５】
DiPKSポリケチドシンターゼ酵素が、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素を含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号38の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素のコード配列を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
第1のポリヌクレオチドが、配列番号38の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
酵母細胞が、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素の活性を増加させるために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素をコードするホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドを含む、請求項6から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼが、A.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドが、配列番号10の塩基1170から2201によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するA.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドが、配列番号10の塩基1170から2201と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
ポリケチドシンターゼ酵素が、より長鎖のケチル-CoAを用いずにマロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を合成するための活性部位を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1においてペンチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、ペンチル-植物性カンナビノイド又はメチル化ペンチル-植物性カンナビノイドアナログを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つの前駆化学物質が、オリベトール、オリベトール酸、メチル-オリベトール、又はメチル-オリベトール酸のうちの少なくとも1つを含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種が、CBG、CBGa、meCBG、又はmeCBGaのうちの少なくとも1つを含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、ストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号44の塩基987から1913によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するストレプトマイセス種CL190由来のNphBプレニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号44の塩基987から1913と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、Hであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、メチルであり、R3が、Hである前駆化学物質を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも1つの前駆化学物質が、R1が、炭素数5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、カルボキシルであり、R3が、メチルである前駆化学物質を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
酵母細胞が、利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させる遺伝子改変を含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
遺伝子改変が、Erg20酵素の不活性化を含む、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
酵母細胞が、配列番号3によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するErg20K197Eのコード配列を含むErg20ポリヌクレオチドを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
Erg20ポリヌクレオチドが、配列番号3と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項34に記載の方法。
【請求項３６】
酵母細胞が、利用可能なマロニル-CoAを増加させる遺伝子改変を含む、請求項1から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
遺伝子改変が、Maf1の発現の増加を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
酵母細胞が、配列番号8の塩基936から2123によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するMaf1のコード配列を含むMaf1ポリヌクレオチドを含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
Maf1ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号8と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
遺伝子改変が、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンターゼの細胞質発現を増加させるための改変を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項４１】
酵母細胞が、配列番号4の塩基3938から5893によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.エンテリカ由来のAcsL641Pのコード配列、及び配列番号4の塩基1494から2999によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のAld6のコード配列を含むAcsポリヌクレオチドを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
Acsポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号4の塩基51から7114と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝子改変が、マロニル-CoAシンターゼの活性を増加させるための改変を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項４４】
酵母細胞が、S.セレビシエ由来のAcc1S659A;S1157Aのコード配列を含むAcc1ポリヌクレオチドを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
Acc1ポリヌクレオチドが、Acc1S659A;S1157A酵素のコード配列を含み、該酵素の一部が、配列番号7の塩基9から1716によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質部分Acc1S659A;S1157Aと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する、請求項44に記載の方法。
【請求項４６】
Acc1ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号7と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項45に記載の方法。
【請求項４７】
酵母細胞が、構成的プロモーターの調節下にあるS.セレビシエ由来のAcc1のコード配列を含むAcc1ポリヌクレオチドを含む、請求項43に記載の方法。
【請求項４８】
構成的プロモーターが、S.セレビシエ由来のPGK1プロモーターを含む、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
PGK1プロモーターが、配列番号6の塩基7から750と80%から100%の間のヌクレオチド相同性を有する、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
遺伝子改変が、ステロール生合成の活性化因子の発現の増加を含む、請求項36に記載の方法。
【請求項５１】
酵母細胞が、配列番号9の塩基975から3701によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のUpc2E888Dのコード配列を含むUpc2ポリヌクレオチドを含む、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
Upc2ポリヌクレオチドが、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号9と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
第2のポリヌクレオチドが、配列番号11、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35又は配列番号36のいずれか1つと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素のコード配列を含む、請求項1から24又は請求項28から52のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
酵母細胞培養物から植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を抽出する工程を更に含む、請求項1から53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを生成するための酵母細胞であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチド、及び
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチド
を含み、
ポリケチドシンターゼ酵素が、マロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を生成するためのものであり、前駆化学物質が、構造I:
【化２】
2020507351.tif 000149
を有し、構造Iにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3が、H、カルボキシル、又はメチルであり、
ポリケチドシンターゼ酵素が、アサに対してネイティブではなく、
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質をプレニル化するためのものであり、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を提供する、酵母細胞。
【請求項５６】
方法の請求項1から53のいずれか一項において提供される酵母細胞に関連して規定される酵母細胞、第1のポリヌクレオチド、又は第2のポリヌクレオチドのうちの1つ以上についての特徴を更に含む、請求項55に記載の酵母細胞。
【請求項５７】
植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログの生成のために酵母細胞を形質転換する方法であって、
ポリケチドシンターゼ酵素をコードする第1のポリヌクレオチドを酵母細胞株へと導入する工程、及び
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素をコードする第2のポリヌクレオチドを前記酵母へと導入する工程
を含み、
ポリケチドシンターゼ酵素が、マロニル-CoAから少なくとも1つの前駆化学物質を生成するためのものであり、前駆化学物質が、構造I:
【化３】
2020507351.tif 000150
を有し、構造Iにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、R2が、H、カルボキシル、又はメチルであり、R3が、H、カルボキシル、又はメチルであり、
ポリケチドシンターゼ酵素が、アサに対してネイティブではなく、
細胞質性プレニルトランスフェラーゼ酵素が、少なくとも1つの前駆化学物質をプレニル化するためのものであり、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種を提供する、方法。
【請求項５８】
ポリヌクレオチドを、第1のポリヌクレオチド若しくは第2のポリヌクレオチドの特徴を共有するか、又は方法の請求項1から53のいずれか一項において提供される酵母細胞の特徴のうちの1つ以上を共有する酵母細胞を生じる酵母細胞へと導入する工程を更に含む、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
以下の構造II:
【化４】
2020507351.tif 000151
を有する植物性カンナビノイドアナログであって、
構造IIにおいて、R1が、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり、
R2が、メチル基であり、
R3が、H、カルボキシル基、又はメチル基であり、
R4が、ゲラニル基であり、
R5が、H又はR4のゲラニル基であり、
R6が、H又はR4のゲラニル基である、植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６０】
R1が、炭素数5の鎖長を有し、R3が、Hである、請求項59に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６１】
ゲラニル基が、環化ゲラニル基を含む、請求項59又は60に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６２】
R5が、環化ゲラニル基である、請求項61に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６３】
R6が、環化ゲラニル基である、請求項62に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６４】
R6が、環化ゲラニル基である、請求項61に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６５】
酵母における生合成によって生成される、請求項59から64のいずれか一項に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６６】
以下の構造III:
【化５】
2020507351.tif 000152
を有する植物性カンナビノイドアナログであって、
構造IIIにおいて、R1が、ペンチル基であり、
R2が、メチル基であり、
R3が、Hであり、
R4が、ゲラニル基であり、
R5が、H又はR4のゲラニル基であり、
R6が、H又はR4のゲラニル基である、植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６７】
ゲラニル基が、環化ゲラニル基を含む、請求項66に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６８】
R5が、環化ゲラニル基である、請求項67に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項６９】
R6が、環化ゲラニル基である、請求項68に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【請求項７０】
R6が、環化ゲラニル基である、請求項67に記載の植物性カンナビノイドアナログ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
一部の実施形態では、酵母細胞は、ヘキサノイルシンターゼ酵素をコードするヘキサノイルシンターゼヌクレオチドを含み;ポリケチドシンターゼ酵素は、アサ由来のOAS酵素を含み;酵母細胞を増殖させる工程は、ヘキサン酸を含む栄養調製物中で酵母細胞を増殖させる工程を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、アサのポリケチドシクラーゼ酵素を含まず、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するアサ由来のOAS酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号45の塩基3841から4995と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
一部の実施形態では、ポリケチドシンターゼ酵素は、キイロタマホコリカビ由来のDiPKSポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号46の塩基535から9978によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号46の塩基535から9978と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、少なくとも1つの前駆化学物質は、R2においてメチル基を含み、植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、メチル化植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素は、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を軽減するためにC-Metドメインの活性部位に影響を及ぼす変異を含み、その結果、R2がメチルであり、R3がHである第1の前駆化学物質、及びR2がHであり、R3がHである第2の前駆化学物質を含む少なくとも1つの前駆化学物質を生じ;植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、メチル化植物性カンナビノイドアナログ及び非メチル化植物性カンナビノイドを含む。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼは、DiPKSG1516D; G1518Aポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号37の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するG1518Aポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号37の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼは、DiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号38の塩基523から9966によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するDiPKSG1516Rポリケチドシンターゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、第1のポリヌクレオチドは、配列番号38の塩基523から9966と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素は、少なくとも1つの前駆化学物質のメチル化を防止するために、DiPKSポリケチドシンターゼ酵素のC-Metドメインの活性部位における活性を低減する変異を含み、その結果、水素R2基及び水素R3基を有する少なくとも1つの前駆化学物質を生じ;植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログのうちの少なくとも1つの種は、脱炭酸植物性カンナビノイド又は植物性カンナビノイドアナログを含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、DiPKSの活性を増加させるために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素をコードするホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼは、A.ニデュランス(A. nidulans)由来のNpgAホスホパンテテイニルトラ��スフェラーゼ酵素を含む。一部の実施形態では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基1170から2201によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するA.ニデュランス由来のNpgAホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ酵素に関するコード配列を含む。一部の実施形態では、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドは、配列番号10の塩基1170から2201と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
一部の実施形態では、酵母細胞は、利用可能なゲラニルピロリン酸を増加させる遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変は、Erg20酵素の不活性化を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号3によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するErg20K197Eに関するコード配列を含むErg20ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Erg20ポリヌクレオチドは、配列番号3と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
一部の実施形態では、酵母細胞は、利用可能なマロニル-CoAを増加させる遺伝子改変を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変は、Maf1の発現の増加を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号8の塩基936から2123によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するMaf1に関するコード配列を含むMaf1ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Maf1ポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号8と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ及びアセチル-CoAシンターゼの細胞質発現を増加させるための改変を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号4の塩基3938から5893によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.エンテリカ(S. enterica)由来のAcsL641Pに関するコード配列、及び配列番号4の塩基1494から2999によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のAld6に関するコード配列を含むAcsポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Acsポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号4の塩基51から7114と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、マロニル-CoAシンターゼの活性を増加させるための改変を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、S.セレビシエ由来のAcc1S659A; S1157Aに関するコード配列を含むAcc1ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Acc1ポリヌクレオチドは、Acc1S659A; S1157A酵素に関するコード配列を含み、該酵素の一部が、配列番号7の塩基9から1716によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質部分Acc1S659A; S1157Aと80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有する。一部の実施形態では、Acc1ポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を更に含み、配列番号7と80%から100%の間の塩基配列相同性を有する。一部の実施形態では、酵母細胞は、構成的プロモーターの調節下にあるS.セレビシエ由来のAcc1に関するコード配列を含むAcc1ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、構成的プロモーターは、S.セレビシエ由来のPGK1プロモーターを含む。一部の実施形態では、PGK1プロモーターは、配列番号6の塩基7から750と80%から100%の間のヌクレオチド相同性を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変は、ステロール生合成の活性化因子の発現の増加を含む。一部の実施形態では、酵母細胞は、配列番号9の塩基975から3701によって定義されるリーディングフレームによってコードされるタンパク質と80%から100%の間のアミノ酸残基配列相同性を有する一次構造を有するS.セレビシエ由来のUpc2E888Dに関するコード配列を含むUpc2ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、Upc2ポリヌクレオチドは、プロモーター配列、ターミネーター配列及び組み込み配列を含み、配列番号9と80%から100%の間の塩基配列相同��を有する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４０】
を有する植物性カンナビノイドアナログが提供される。構造IIにおいて、R1は、炭素数1、2、3、4、又は5の鎖長を有するアルキル基であり;R2は、メチル基であり;R3は、H、カルボキシル基、又はメチル基であり;R4は、ゲラニル基であり;R5は、H、又はR4におけるゲラニル基であり;R6は、H、又はR4におけるゲラニル基である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４２】
一部の実施形態では、ゲラニル基は、環化ゲラニル基を含む。一部の実施形態では、R5は、環化ゲラニル基である。一部の実施形態では、R5及びR6は、各々環化ゲラニル基である。一部の実施形態では、R6は、環化ゲラニル基である。一部の実施形態では、植物性カンナビノイドアナログは、酵母における生合成によって生成される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
を有する植物性カンナビノイドアナログが提供される。構造IIIにおいて、R1は、ペンチル基であり;R2は、メチル基であり;R3は、Hであり;R4は、ゲラニル基であり;R5は、H、又はR4におけるゲラニル基であり;R6は、H、又はR4におけるゲラニル基である。
一部の実施形態では、ゲラニル基は、環化ゲラニル基を含む。一部の実施形態では、R5は、環化ゲラニル基である。一部の実施形態では、R5及びR6は、各々環化ゲラニル基である。一部の実施形態では、R6は、環化ゲラニル基である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
Acc1の発現を上方調節することに加えて、S.セレビシエは、Acc1活性及び細胞質性アセチル-CoA濃度を増加させるために、1つ又は複数のAcc1の改変を含んでもよい。Acc1の抑制を取り除き、より高いAcc1発現及びより多いマロニル-CoA生成をもたらす調節配列における2つの変異は、文献において特定された。配列番号7は、S.セレビシエゲノムを相同組換えによってネイティブAcc1遺伝子において改変するために使用され得るポリヌクレオチドである。配列番号7は、Ser659Ala及びSer1157Ala改変を有するAcc1遺伝子に関するコード配列の一部を含む。結果として、この配列により形質転換されたS.セレビシエは、Acc1S659A; S1157Aを発現することになる。同様の結果は、例えば、任意の適切な部位に、Tef1プロモーター、Ser659Ala及びSer1157Ala改変を有するAcc1、及びPrm9ターミネーターを有する配列を組み込むことによって達成されてもよい。最終結果は、Tef1、Acc1S659A; S1157A、及びPrm9が、S.セレビシエゲノムへの組み込みを促進するためのゲノムDNA配列に隣接することであろう。これは、Flagfeldtの部位18で試みられたが、構築物のサイズによって、代わりに、上述の配列番号7を用いるアプローチが続いて行われた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
上記遺伝子、Erg20K197E、AcsL641P、Ald6、Maf1、Acc1S659A; S1157A又はUpc2E888Dは、プラスミドから発現されるか又はS.セレビシエのゲノムへと組み込まれてもよい。ゲノムへの組み込みは、CRISPR組換えを含む相同組換え、又は任意の適切なアプローチによるものであってもよい。Acc1のプロモーターは、組換えによって同様に改変されてもよい。配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号8、又は配列番号9のそれぞれにおけるコード配列及び調節配列は、発現のためのプラスミド(例えば、pYES等)又はS.セレビシエゲノムへの組み込みのための直鎖状ポリヌクレオチドに含まれてもよい。基本株HB42、HB82、HB100、HB106、又はHB110のそれぞれは、1つ又は複数の組み込まれた配列番号3、配列番号4、配列番号6、配列番号8、又は配列番号10を含む(以下を参照のこと)。配列番号7、又は配列番号9の組み込みは、同様のアプローチによって適用されてもよい。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
配列番号10に示されるNpgAドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNA SOEingを使用して、NpgA組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、NpgA遺伝子カセットをコードしていた。NpgA遺伝子カセットは、Tef1プロモーター、NpgAコード配列及びPrm9ターミネーターを含む。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
配列番号8に示されるMaf1ドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNAのSOEingを使用して、Maf1組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、Maf1遺伝子カセットをコードしていた。Maf1遺伝子カセットは、Tef1プロモーター、Maf1コード配列及びPrm9ターミネーターを含む。Maf1ポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
配列番号6に示されるAcc1-PGK1pドナーポリヌクレオチドを調製し、増幅させた。DNAのSOEingを使用して、Acc1-PGK1p組み込みのために、3つのポリヌクレオチドから単一のドナーDNA断片を作出した。第1のポリヌクレオチドは、ドナーの特定位置におけるゲノムへの組み込みを可能とするゲノム相同性の5'領域であった。第2のポリヌクレオチドは、PGK1プロモーター領域をコードしていた。Acc1ポリヌクレオチドは、S.セレビシエゲノムへの標的化組み込みを容易にするゲノム相同性に対する3'領域を含んだ。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表１１−１７】
2020507351.tif 000153
【表１１−１８】
2020507351.tif 000154
【国際調査報告】
2020507351.tif 000155
2020507351.tif 000156
2020507351.tif 000157
2020507351.tif 000158