(57)【要約】【課題】本発明は、改良された無細胞タンパク質合成用組成物に関し、より好ましい一形態としては適切なマグネシウムおよびクレアチンリン酸濃度下において、ＡＴＰをより至適濃度域で使用することにより、効率を向上させた無細胞タンパク質合成用組成物に関する。更には試薬、キットおよび本組成物を用いる無細胞タンパク質合成法にも関する。【解決手段】マグネシウムを２〜３．３ｍＭ、ＡＴＰを１．３〜３ｍＭで含有する無細胞タンパク質合成用組成物を用いることにより、無細胞タンパク質合成において従来組成では得られないタンパク質合成効率を得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たす無細胞タンパク質合成用組成物。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
【請求項２】
クレアチンリン酸を５〜２０ｍＭの濃度で含有することを特徴とする、請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項３】
無細胞タンパク質合成に用いる抽出液が、植物由来、動物由来、および微生物由来であることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項４】
無細胞タンパク質合成に用いる抽出液が植物由来であることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項５】
無細胞タンパク質合成に用いる抽出液がコムギ胚芽由来であることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項６】
無細胞タンパク質合成方法がバッチ法および連続法であることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項７】
連続法が、透析法および重層法であることを特徴とする請求項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の組成物を含有する試薬またはキット。
【請求項９】
請求項１〜７に記載の組成物、または、請求項８に記載の試薬またはキットを用いて無細胞タンパク質合成されたタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜７に記載の組成物、または、請求項８に記載の試薬またはキットを用いて無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たすことを特徴とする、無細胞タンパク質合成における、タンパク質合成の収率を増大させる方法。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
【請求項１２】
以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たすことを特徴とする、無細胞タンパク質合成におけるタンパク質合成の収率が増大した無細胞タンパク質合成用組成物を、製造する方法。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、改良された無細胞タンパク質合成用組成物に関し、より好ましい一形態としては適切なマグネシウムおよびクレアチンリン酸濃度下において、ＡＴＰをより至適濃度域で使用することにより、効率を向上させた無細胞タンパク質合成用組成物に関する。更には試薬、キット、および本組成物を用いる無細胞タンパク質合成法にも関する。
【背景技術】
【０００２】  近年の遺伝子工学や分子生物学分野の進歩並びに各種ゲノム配列解読の成果により、目的の遺伝子の産物であるタンパク質を発現させ、網羅的に、その機能および構造を解析することに研究の主眼が注がれるようになっている。その中でも、特に研究の進みの著しいタンパク質は、細胞内に存在するタンパク質であり、遺伝子配列を元に種々の方法で発現させ、研究が進められている。特に、ハイスループット化という観点から、近年、無細胞タンパク質合成法を用いた、網羅的な合成を用いることが一般化しつつある。【０００３】  無細胞タンパク質合成法とは、生細胞の代わりに、種々の細胞系の破砕物を準備し、基質やエネルギー源等を必要に応じて添加することで、細胞の成育とは無関係にタンパク質を合成・発現させる技術である。そのため、ほぼあらゆる種類のタンパク質を合成することが可能で、その応用範囲はきわめて広い。
無細胞タンパク質合成用組成物には、上記細胞系に、さらに合成に必要な各種の酵素や試薬等が添加されている。合成に必須な成分として、細胞系（抽出液など）、ｍＲＮＡ、クレアチンキナーゼ、バッファー成分（ＨＥＰＥＳ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’三リン酸（ＧＴＰ）、クレアチンリン酸（Ｃｒ−Ｐ）、スペルミジンが挙げられる。
無細胞タンパク質合成法を、どのような細胞系を用いるかという点でみると「植物」「動物」「微生物」のいずれに由来するものでも利用可能である。例えば現在、大腸菌の細胞破砕物、哺乳類の網状赤血球の抽出物、およびコムギなどの植物種子のエキストラクト等が、無細胞タンパク合成系として知られており、これらを用いることで、無細胞系においてタンパクの合成が可能である。【０００４】  特に近年、高効率コムギ胚芽無細胞タンパク質抽出液を用いる方法が注目を集めている（例えば、非特許文献１を参照。）。この方法は、コムギ胚芽抽出液中に含まれるとタンパク質合成を阻害する成分であるトリチンをはじめとするリボトキシンの含量を減らすことにより、タンパク質合成能を高めた方法である。真核生物由来のタンパク質合成方法としては、従来ウサギ網状赤血球を用いる方法が主に使用されてきたが、収量が低い、夾雑タンパク質が多い等の理由から、合成されたタンパク質の機能を解析するには、あまり向かない方法であると思われている。コムギ胚芽を用いる方法は、休眠期の胚芽を原料として抽出液を調製していることから、夾雑タンパク質も少なく、合成したタンパク質の機能を解析する場合有利であり、ヒトをはじめとする真核生物由来のタンパク質の解析に広く使われ始めている。
［非特許文献１］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２），５５９−５６４（２０００）【０００５】  一方、無細胞タンパク質合成法を、どのような形態で実施するかという点でみると「バッチ法」「連続法」に大別される。「バッチ法」は反応液中に必要な成分すべてを濃度勾配などを形成することなく均一化して反応させる方法であり、「連続法は」反応液中で枯渇してしまう成分を連続的に供給する反応方法である。
「連続法」の代表的な方法として、「重層法」「透析法」がある。「重層法」は反応液と枯渇する成分（ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、およびアミノ酸等）を含有するバッファーを、バリアーで隔てることなく隣接させることにより、拡散を利用して連続的に基質の供給、および副生成物濃度を減少させる。「透析法」は、反応液と枯渇する成分（ＡＴＰ、ＧＴＰ、クレアチンリン酸、およびアミノ酸等）を含有するバッファーを半透膜などのバリア−で隔て隣接させることにより、透析作用を利用して連続的に基質の供給、および副生成物の除去を行う方法である。
無細胞タンパク質合成法は「重層法」を併用することで、高収率でタンパク質を得ることができる（例えば、非特許文献２を参照。）。また、スピリン等によって開発された「透析法」を応用することによっても、高収量なタンパク質合成が可能である（例えば、非特許文献１を参照。）。すなわち、タンパク質合成に必要な、ＡＴＰ、ＧＴＰやアミノ酸などを連続的に供給することにより、タンパク質合成量を向上させる方法である。また、これらの方法は、反応によって生じた副精製物の濃度を下げる効果もある。これらの方法は、連続法と呼ばれる。ただ、透析法は透析膜等を用いる操作が煩雑であるため、より簡便な重層法やそれに準じる透析膜を使用しない方法が汎用的に使われ始めている。
［非特許文献２］ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１４，１０２−１０５（２００２）【０００６】  また、無細胞タンパク質合成法では、安定同位体や、セレノメチオニンなどをタンパク質に取りこませることが比較的容易であり、ＮＭＲやＸ線結晶解析などへの応用面でも大いに期待されている。【０００７】  その一方において、無細胞タンパク質合成に用いる成分や添加剤といった観点から、よりタンパク質合成効率を高めるような試みがなされてきた。例えば、コムギ胚芽抽出液中に含まれるＡＴＰをＡＤＰへ分解する活性を有するフォスファターゼに着目し、フォスファターゼ阻害剤やグルタチオン合成酵素などの阻害剤存在下でタンパク質合成を行い、収量を向上させることに成功している（例えば、特許文献１を参照。）。しかし、それらの阻害剤成分は、場合によっては合成する目的タンパク質に影響する可能性を否定できない。よって、網羅的にタンパク質合成を行い、それらの機能を解析するような場合には、適さない方法であるといえる。
［特許文献１］特開平７−１９４【０００８】  そこで可能な限り、従来の成分を変更することにより効率を向上させる試みが重要であると考えられる。さらに、重層法のような連続法を用いて至適化する検討は今まで行われてこなかった経緯があり、それも併せて検討することが重要である。この改良により、今までの実験結果と対応した性質を有したタンパク質を更に効率良く調製することができるようになると期待される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】［図１］ＡＴＰ：１．２ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１６ｍＭ（Ａ）とＡＴＰ：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭ（Ｂ）の条件下、重層法を用いて合成したＤＨＦＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＣＢＢ染色のバンド強度の比較を示す図。
［図２］ＡＴＰ：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭの条件下で、マグネシウム量を変化させた時のタンパク質合成量を示す図。
［図３］ＡＴＰ：１．２ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１６ｍＭ（Ａ）とＡＴＰ：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭ（Ｂ）の条件下、透析法を用いて合成したヒトＥＲＫ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるＣＢＢ染色のバンド強度の比較を示す図。Ｍ：分子量マーカー（上から９７ｋＤａ、６６ｋＤａ、４５ｋＤａ、４５ｋＤａ、２９ｋＤａ、２０ｋＤａ）、−（Ｂｌａｎｋ）。目的タンパク質のバンド（約４０ｋＤａ）を（←）で示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  すなわち、本発明の目的は、さらにタンパク質合成効率の向上した無細胞タンパク質合成用組成物を供給することにある。また、それらを含有する試薬・キットおよび、これらの組成物を用いてタンパク質を合成する方法を供給することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】  すなわち、本発明は以下の構成からなる。
項１．  以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たす無細胞タンパク質合成用組成物。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
項２．  クレアチンリン酸を５〜２０ｍＭの濃度で含有することを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項３．  無細胞タンパク質合成に用いる抽出液が、植物由来、動物由来、および微生物由来であることを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項４．  無細胞タンパク質合成に用いる抽出液が植物由来であることを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項５．  無細胞タンパク質合成に用いる抽出液がコムギ胚芽由来であることを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項６．  無細胞タンパク質合成方法がバッチ法および連続法であることを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項７．  連続法が、透析法および重層法であることを特徴とする、項１に記載の無細胞タンパク質合成用組成物。
項８．  項１〜７に記載の組成物を含有する試薬またはキット。
項９．  項１〜７に記載の組成物、または、項８に記載の試薬またはキットを用いて無細胞タンパク質合成されたタンパク質。
項１０．項１〜７に記載の組成物、または、項８に記載の試薬またはキットを用いて無細胞タンパク質合成を行うことを特徴とする無細胞タンパク質合成方法。
項１１．以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たすことを特徴とする、無細胞タンパク質合成における、タンパク質合成の収率を増大させる方法。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
項１２．
以下の（ａ）および（ｂ）の条件を満たすことを特徴とする、無細胞タンパク質合成におけるタンパク質合成の収率が増大した無細胞タンパク質合成用組成物を、製造する方法。（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有する、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有する
【発明の効果】
【００１２】  本発明により、新たな成分を加えることなく、従来の方法に比べ約１．３〜１．７倍、無細胞タンパク質合成の収量を増大することができるようになった。本発明は、特に有用なコムギ胚芽抽出液を用いた高効率無細胞タンパク質合成法に有用であり、従来法に比べ、高収量かつ確実な結果が得られる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明の検討には、主に東洋紡製のＰＲＯＴＥＩＯＳ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｔを用いた。このキットは、高効率コムギ胚芽抽出液を採用したコムギ胚芽無細胞タンパク質合成システムであり（例えば、非特許文献３を参照。）、重層法を基本とした合成法を推奨している。今回我々は、バッファーのみを文献に従って自家調製し、タンパク質合成に最も必須であると思われるアデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン５’三リン酸（ＧＴＰ）、およびＡＴＰの再生に関わるクレアチンリン酸（Ｃｒ−Ｐ）の至適濃度を中心に検証した。本キットで用いられている反応方法は、抽出液、ｍＲＮＡ、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、バッファー成分（ＨＥＰＥＳ、酢酸カリウム、酢酸マグネシウム、ＡＴＰ、ＧＴＰ、Ｃｒ−Ｐ、スペルミジンなどからなる）を含有する反応液の上層に、５倍量のバッファー成分を重層し、１６〜２４時間反応させる方法である。いわゆる上で説明したいわゆる重層法である。反応中に、上層と下層は拡散により混合されるが、そのときに低分子成分の供給および排除が行われ、無細胞タンパク質合成が連続的に持続し、従来のバッチ法に比べて５〜１０倍の高いタンパク質収量を達成することができる。この反応に使用される上層と下層の低分子成分（以下：バッファー成分）はほぼ同一のものである。この時に使用するバッファー成分に関しては、最初に報告されてから（例えば、非特許文献４を参照。）それほど改良が加えられていないのが現状である。
［非特許文献３］Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２），５５９−５６４（２０００）
［非特許文献４］Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７，２４７−２５６（１９７６）【００１４】  本発明者らは、これらの課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、クレアチンリン酸（Ｃｒ−Ｐ）がクレアチンキナーゼの作用によりＡＤＰにリン酸基を渡しＡＴＰを生じさせる、いわゆるＡＴＰの再生系におけるリン酸基の給源として添加されていること、および、ＡＴＰがマグネシウムイオンをキレートし無効化する作用を持つことに着目し、ＡＴＰ、マグネシウム、およびクレアチンリン酸（Ｃｒ−Ｐ）の濃度を至適化することにより、さらにタンパク質合成効率の向上した無細胞タンパク質合成用組成物を供給できること、また、それらを含有する試薬・キットおよび、これらの組成物を用いてタンパク質を合成する方法を供給できることを見出し、本発明を完成するに至った。
無細胞タンパク質合成の反応組成はこれまでに種々検討されてきたにもかかわらず、このような観点から組成を最適化した事例はなかった。【００１５】  アデノシン５’三リン酸（ＡＴＰ）の濃度は、マグネシウムの添加濃度によって規定される。何故ならばＡＴＰおよびＧＴＰは、マグネシウムイオンをキレートし、無効化してしまうからである。【００１６】  従来、コムギ胚芽等の無細胞タンパク質合成系では、酢酸マグネシウムを２．５ｍＭ前後で添加するのが一般的であった。そのような条件では、ＡＴＰは１．２ｍＭ前後添加されるのが一般的であった。【００１７】  Ｃｒ−Ｐは、ＡＴＰよりも高濃度で添加しても無細胞タンパク質合成反応を阻害しないので、リン酸基の給源として好ましく添加されている。【００１８】  従来、一般的にＣｒ−Ｐは、８〜１６ｍＭ前後で用いられてきた。【００１９】  エネルギー供給源であるグアノシン５’三リン酸（ＧＴＰ）の濃度もやはり、マグネシウムの添加濃度によって規定される。従来、コムギ胚芽等の無細胞タンパク質合成系では、通常、酢酸マグネシウムを２．５ｍＭ前後で添加するのが一般的であった。そのような条件では、ＧＴＰは０．１〜０．２５ｍＭで添加されるのが一般的であった。【００２０】  真核生物において、ＡＴＰは主にｔＲＮＡのアミノアシル化反応およびタンパク質の合成に、ＧＴＰは主にタンパク質の合成に使われることが分かっている。原核生物においては、ＡＴＰは主にｔＲＮＡのアミノアシル化反応のみに使われていることが分かっている。【００２１】  無細胞タンパク質合成の歴史は古く、今まで様々な反応組成が報告されてきた。しかし、エネルギー供給物質に関する組成は、どれも類似している。コムギ胚芽無細胞タンパク質合成系での事例を列挙すると、以下の表１のようになる。【００２２】
2005075660.tif 000002
【００２３】  表１には、過去に報告された論文、特許に記載されている無細胞タンパク質合成のマグネシウム濃度、ＡＴＰ、およびＣｒ−Ｐ濃度の比較を示す。
［非特許文献５］Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９６，３８−５０（１９８３）
［特許文献２］特公平７−１１０２３６【００２４】  いくつかの報告においては、マグネシウム濃度を１．９ｍＭとして、ＡＴＰ、ＧＴＰ、およびＣｒ−Ｐ濃度を至適化しているものもある（例えば、特許文献２を参照）。【００２５】  本発明者らは、まず、エネルギー供給源となるＡＴＰ、およびＧＴＰに着目し、その添加濃度について重層法を用いて検討を実施した。その時のマグネシウム濃度は、２．６ｍＭとした。検討では、上層と下層のバッファー成分の濃度はほぼ同一になるように調製した。また、胚芽抽出液には若干、塩やアミノ酸の成分が含有されているが、エネルギー成分は含有されておらず、今回の実験では無視できるものとした。活性の検出は、反応液下層に１４Ｃラベルしたロイシンを添加しておき、標準タンパク質として使用した大腸菌ジヒドロ葉酸還元酵素への１４Ｃロイシンの取り込み量を、液体シンチレーションカウンターにより測定する方法を用いた。その結果、ＧＴＰ濃度は幅広い濃度域で至適を示すが、ＡＴＰ濃度は従来報告されている１．２ｍＭよりも高い領域でより高い活性を示すことが明らかとなった。また、ＡＴＰ濃度とＧＴＰ濃度に相関性は無かった。【００２６】  次に、ＡＴＰと密接に関わっているＣｒ−Ｐの濃度とＡＴＰ濃度の相関性について検討を実施した。その時のマグネシウム濃度も２．６ｍＭとした。その結果、クレアチンリン酸濃度とＡＴＰ濃度の間に、ＧＴＰとの間には見られなかった相関性を見出すことができた。Ｃｒ−Ｐ濃度が８〜１６ｍＭの間で、ＡＴＰ濃度は従来から報告されている１．２ｍＭよりも高い濃度で至適であった。８ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では２．４ｍＭ  ＡＴＰが、１２ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．８ｍＭ  ＡＴＰが、また、１８ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．８ｍＭ  ＡＴＰが至適であるという結果であった。【００２７】  結論として、ＡＴＰについては、２．６ｍＭマグネシウム存在下において、従来至適とされてきた１〜１．２ｍＭを超える高濃度域であり、かつ３ｍＭよりも低い濃度で至適であった。また、その至適はＣｒ−Ｐの濃度と密接に関連しており、８ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では２．４ｍＭ  ＡＴＰが、１２ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．８ｍＭ  ＡＴＰが、また、１８ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．８ｍＭ  ＡＴＰが至適であった。また、Ｃｒ−Ｐ濃度が２４ｍＭを越えるとＡＴＰ濃度とは関係なく、一律に合成能が低くなる傾向にあった（表２）。【００２８】  また、最も至適であったＡＴＰ：１．８ｍＭ，Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭの条件下で至適マグネシウム濃度を検討をしたところ、２〜３．３ｍＭで至適であり、２．６ｍＭ付近が最も至適であることが明らかとなった（図２）。また、表２において好成績が得られた他のケースについても同様に検討した結果、それぞれ２．６ｍＭ付近が至適であることが確認できた。なお、上記検討において、Ｃｒ−Ｐの濃度５〜２０ｍＭの範囲内でマグネシウム濃度の至適濃度はほとんど差がなかった。【００２９】  よって本発明は、ＡＴＰが１．３〜３ｍＭの濃度、マグネシウムが２〜３．３ｍＭで含有されることを特徴とする無細胞タンパク質合成組成物である。【００３０】  本発明における最終ＡＴＰ濃度は、好ましくは１．５〜２．８、さらに好ましくは、１．８���２．４ｍＭである。また、ＡＴＰは種々の塩の化合物として、供給されて良い。一価の塩が好ましく、最も好ましくはナトリウム塩もしくはカリウム塩である。【００３１】  本発明における最終マグネシウム濃度は、好ましくは２〜３．３ｍＭ、さらに好ましくは２．５〜３ｍＭである。マグネシウムは、好ましくは酸との塩で供給され、さらにこのましくは、酢酸マグネシウム、硫酸ナトリウムとして供給される。塩化物、すなわち塩化マグネシウムも考えられるが、塩素イオンが無細胞タンパク質合成を阻害することが知られていることから避ける方が好ましいといえる。【００３２】  また本発明においては、Ｃｒ−Ｐは、５〜２０ｍＭの濃度で用いる。好ましくは８〜１６ｍＭ、で用いる。Ｃｒ−Ｐの供給形態としては、塩の化合物が考えられ、一価の塩が好ましい。最も好ましくは、ナトリウム塩もしくはカリウム塩が用いられる。【００３３】  本願発明の無細胞タンパク質合成用組成物は、より好ましくは、（ａ）ＡＴＰを１．３〜３ｍＭの濃度で含有し、（ｂ）マグネシウムを２〜３．３ｍＭの濃度で含有し、（ｃ）クレアチン酸を５〜２０ｍＭで含有し、かつ、（ｄ）高効率コムギ無細胞タンパク質合成法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２），５５９−５６４（２０００）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５１４，１０２−１０５（２００２））を用いる場合、反応組成物中に含まれるＡＴＰ、Ｍｇ、およびＣｒ−Ｐを以下の濃度、すなわち、ＡＴＰ：１．２ｍＭ、Ｍｇ：２．６ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：８ｍＭとなるように含有する条件（他の成分は文献どおり）と比較して、合成されるタンパク質の収量が１．１倍以上であるような組成物である。【００３４】  リン酸の給源としてクレアチンリン酸の変わりにグルコース六リン酸を用いる無細胞タンパク質合成法もある（例えば、非特許文献６を参照。）が、その場合において、ＡＴＰ濃度は１ｍＭが通常使われていたことから、本発明の請求項１に記載される発明を適用した場合の有効性は容易に予想できる。その場合、グルコース六リン酸は０．５ｍＭ程度で用いられることが報告されているが、ＡＴＰ濃度を１．３〜３ｍＭへ変更する場合、若干の至適化が必要であると考えられる。また、方法によっては、ピルビン酸とピルビン酸キナーゼを用いるＡＴＰ再生化法を採用する無細胞タンパク質合成法もあるが、本発明の請求項１は、その方法にも有効であることは容易に推察可能である。
［非特許文献６］Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５４，８０５−８１０（１９８８）【００３５】  ＡＴＰ濃度は、添加されるＣｒ−Ｐ濃度によって変化させることが好ましい。５〜１０ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．８〜３．０ｍＭ、１０〜２０ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．３〜２．４ｍＭで用いる。更に好ましくは、５〜１０ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では２．０〜２．６ｍＭ、１０〜２０ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下では１．６〜２．０ｍＭで用いる。最も好ましくは、１０〜１４ｍＭ  Ｃｒ−Ｐ存在下で、１．６〜２．０ｍＭ用いる。最も至適化された条件では、従来法に比べ、１．２倍〜１．７倍程度の合成量の増大が見られる。【００３６】  上記条件において、クレアチンキナーゼの濃度はとくに限定されないが、好ましくは０．１〜２ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．２〜１ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは０．３〜０．７ｍｇ／ｍｌである。【００３７】  上記ＡＴＰ、マグネシウム（塩）、クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼなどは、市販のものを適宜入手するか、あるいは必要により、それらを公知の手段により精製して用いることができる。【００３８】  今回の検討では、代表的な無細胞合成方法として、コムギ無細胞タンパク質合成系を用いたが、本発明の範囲は、これに規定されるものではなく、植物由来、動物由来、および微生物由来のいずれであっても差し支えない。これは、バッファー組成に関しては、様々な無細胞タンパク質合成においてもほとんど変わらないことを根拠としている。しかし、種々の理由から本発明は、コムギ胚芽無細胞法に応用するのが好ましい。その理由は、従来技術の項に示した、様々なコムギ無細胞タンパク質合成法の利点から来るものである。さらには、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６（２），５５９−５６４（２０００）（非特許文献１）で報告された高効率コムギ胚芽抽出液を用いる無細胞タンパク質合成法が好ましいといえる。【００３９】  本発明の無細胞タンパク質合成用組成物を用いる無細胞タンパク質合成方法としては、特に限定されないが、一般的にバッチ法および連続法を用いる。
バッチ法は、最初に、無細胞タンパク質合成用組成物に反応に必要な全ての成分を含有させて、一液で反応を行うものである。
一方、連続法とは、上にも説明した、タンパク質合成に必要なエネルギー物質や、低分子物質、すなわち、ＡＴＰや、ＧＴＰ、Ｃｒ−Ｐ、アミノ酸などを断続的に供給することで無細胞タンパク質合成反応を断続的に継続させ、目的タンパク質収量を向上させる方法である。具体的には、スピリン等によって報告された透析法（例えば、非特許文献７を参照。）や、重層法（例えば、非特許文献２を参照。）がある。
透析法や重層法などの連続法は、いずれも、無細胞タンパク質合成用組成物を、細胞系を含む「反応液」と反応に必要な低分子物質を含有する「バッファー」に二分して、両者を直接または透析膜などを介して接触させ、その境界面において「バッファー」から「反応液」への低分子物質の供給と、「反応液」から「バッファー」への副生成物の除去を行う方法である。
透析法は、透析膜を介して、低分子物質の供給と副生成物の除去を行う方法であり、重層法は、反応液の上にバッファーの層を形成させ、拡散によりそれらが徐々に交わることによる同様の効果をねらうものである。効率の面では透析法が有効であり、簡便性やスループットの面からは重層法が有効である。本発明においては、主に重層法を用いて検討を行ったが、それは、条件を簡便に設定でき、結果の再現性に優れるからであり、発明としては特に限定されるものではない。
［非特許文献７］Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２（４８８２），１１６２−１１６４（１９８８）【００４０】  本発明でいう無細胞タンパク質合成用組成物とは、いわゆる反応液（バッファー成分、ｍＲＮＡ、エキストラクト、クレアチンキナーゼなどを含む）および／または重層法や透析法に使用される低分子物質供給用のバッファーを意味する。よって、連続法を使用する場合、反応液とバッファーのどちらか、または、両方が本発明の組成になっていることが好ましい。好ましくは、低分子供給用のバッファーが、さらに好ましくは、バッファーおよび反応液が本発明の組成になっていることが望まれる。【００４１】  また、無細胞タンパク質合成の方法によっては、ｍＲＮＡの合成（転写）とタンパク質合成（翻訳）を一度に行う方法も存在し、その場合は、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、およびＵＴＰを同一濃度で供給することが報告されている（例えば、特許文献３を参照。）。本発明においても同様の目的でこれらを含有してもよく、それぞれの終濃度は０．４〜１ｍＭ程度である。このような系においても、連続法とのカップルさせる場合においては、バッファー成分を本発明の組成にすれば良い。
［特許文献３］特許第２９０４５８３号【００４２】  本発明は、さらに、本発明の組成物を含有する試薬やキットにも及ぶ。それは、本発明を幅広いユーザーへ供給することにより、タンパク質の機能・構造解析の効率やスピードが向上することが期待されるからである。【００４３】  また、本発明は、本組成物を使用して合成したタンパク質にも及ぶ。【００４４】  さらに本発明は、本発明の無細胞タンパク質合成用組成物を用いての、無細胞タンパク質合成法にも及ぶ。【００４５】  本発明の実施の一態様としては、無細胞タンパク質合成用試薬・キットを挙げることができ、コムギ胚芽抽出液、クレアチンキナーゼ、無細胞タンパク質合成用バッファー類（いくつかのパーツに分かれていても良く、最終濃度として、本発明のＡＴＰ、Ｃｒ−Ｐ濃度になるように調製されている）を含む。【００４６】  本発明のさらに具体的な実施の一態様としては、無細胞タンパク質合成用試薬・キットをあげることができ、コムギ胚芽抽出液、クレアチンキナーゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、無細胞タンパク質合成用バッファー成分（終濃度で次のような濃度になるように調製してあるもの：３０〜６０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、８０〜１００ｍＭ  酢酸カリウム、２．５〜３．０ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．１〜０．３ｍＭアミノ酸（２０種もしくは１９種）、２〜５ｍＭ  ジチオスイトール、０．１〜０．５ｍＭスペルミジン、０．１〜０．２５ｍＭＧＴＰと、１０〜１４ｍＭＣｒ−Ｐ、１．６〜２．０ｍＭ）。バッファー成分は、別途連続法用として添付しても良い。ｍＲＮＡは、ユーザーが別途合成、精製し添加する。【００４７】  本願発明において、ＡＴＰ、マグネシウム、クレアチンリン酸は種々の公知の方法で測定することが出来る。例えば、ＡＴＰはルシフェラーゼによるルシフェリン及び酸素との生物発光反応、およびＨＰＬＣ法を用いて測定することができる。マグネシウムはＩＤ−ＭＳや原子吸光法のほか、酵素法による測定試薬などを用いて測定できる。クレアチンリン酸はＨＰＬＣ法などで測定できる。ＡＴＰ、クレアチンリン酸についてさらに詳しく調べたい場合は、ＬＣ−ＭＳなどを併用すると良い。
【実施例】
【００４８】  以下に本発明の実施例をあげることにより、本発明による効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。【００４９】［実施例１］ＡＴＰおよびクレアチンリン酸濃度の無細胞タンパク質合成に及ぼす影響
重層法によるタンパク質合成活性測定は、以下のような反応条件にて反応を行った。すなわち、反応液（下層）として、容量の２０％のＷｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ（キット添付；２００ＯＤ）、８００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）、バッファー成分（終濃度として；３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチン（ホスホ）キナーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）、０．３８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ（ＰＲＯＴＥＩＯＳの取扱い説明書に従いｐＥＵ−ＤＨＦＲから転写し、精製したもの）、４μＣｉ／ｍｌ［Ｕ−１４Ｃ］ロイシン（５０μＣｉ／ｍｌ；アマシャムバイオサイエンス社製）、任意の濃度のＡＴＰ、Ｃｒ−Ｐを含有する）からなる反応液をそれぞれ５０μｌ調製した。上層（バッファー層）としては、終濃度として；３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．３８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、下層と同濃度のＡＴＰ、Ｃｒ−Ｐとなるように、それぞれ２５０μｌ調製した。ＡＴＰの濃度は終濃度で、１、１．２、１．８、２．４、３．６ｍＭの４水準、Ｃｒ−Ｐ濃度は終濃度で、８、１２、１６、２４ｍＭの４水準で交差実験を行った。反応は、まず、バッファー層を、ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートに２５０μｌ添加し、その下に反応層（下層）を静かにピペットにて添加し形成した（ＰＲＯＴＥＩＯＳの取扱い説明書参照）。反応は２６℃にて行ない、１６時間後その２０μｌを１ｃｍ×２ｃｍ角の濾紙にスポットした。［Ｕ−１４Ｃ］ロイシンの取り込みの測定法は遠藤等の論文（例えば、非特許文献８を参照。）に従い実施した。すなわち、濾紙を冷１０％トリクロロ酢酸溶液中で３０分間タンパク質を固定した後、５％トリクロロ酢酸中で１０分間煮沸、同液で２回リンスした。更に、ジエチルエーテル／エタノール（１：１）、ジエチルエーテルで５分づつ処理し、乾燥させた後、３ｍｌのクリアゾールＩ（ナカライテスク社製）を加えて液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）にて放射活性を測定した。
結果、表２に示すような傾向を得ることができた。表２は、様々なＡＴＰ濃度、Ｃｒ−Ｐ濃度の条件下での、タンパク質合成量の比較を示す表である。表２には、１．２ｍＭ  ＡＴＰ、８ｍＭ  Ｃｒ−Ｐでのカウントをコントロールとした時の相対合成量の値を示している。Ｃｒ−Ｐ濃度が１２〜１６ｍＭでＡＴＰ濃度が１．８ｍＭの時と、Ｃｒ−Ｐ濃度が８ｍＭでＡＴＰが２．４ｍＭの時に、コントロールに比べ２０％以上タンパク質の合成量の増大が見られた。特に、Ｃｒ−Ｐ濃度が１２ｍＭでかつＡＴＰ濃度が１．８ｍＭの時に最大であり、約３０％の増大が見られることが分かった。
［非特許文献８］Ｙ．Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０【００５０】
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【００５１】  本実験では、放射活性の取り込みによる比較であるが、実際、合成されたタンパク質をＣＢＢ染色にても検出した結果、同様な傾向を確認している。図１にＡＴＰ：１．２ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１６ｍＭ（Ａ）とＡＴＰ：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭ（Ｂ）のＣＢＢ染色におけるＤＨＦＲバンド強度の比較を示す。図から分かるように約１．７倍の合成量の違いを確認している。
また、同様な効果は、バッチ法、透析法によっても確認されており、更に、種々のタンパク質（ヒトＭＡＰキナーゼ、サルコシンオキシダーゼ）などについても確認されている。【００５２】［実施例２］ＡＴＰおよびクレアチンリン酸濃度の無細胞タンパク質合成に及ぼす影響
実施例１での方法を用いて、マグネシウム濃度の至適範囲を測定した。具体的には、ＡＴＰ濃度：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ濃度：１．２ｍＭとし、その他の濃度を固定し、酢酸マグネシウムの濃度のみを、１．８〜３．４ｍＭの間で変化させ、それぞれにおけるタンパク質合成量を１４Ｃ−ロイシンの取り込み量測定にて測定した。その結果、２．６ｍＭを中心として、２〜３．３ｍＭ付近で至適であることが明らかとなった（図２）。【００５３】［実施例３］透析法を用いたタンパク質合成例
透析法を用いたタンパク質合成実験は、以下のような反応条件にて反応を行った。
すなわち、反応液として、容量の２０％のＷｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔ（キット添付；２００ＯＤ）、８００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（東洋紡製）、バッファー成分（終濃度として；３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６５ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．５ｍｇ／ｍｌクレアチン（ホスホ）キナーゼ（Ｒｏｃｈｅ製）、０．３８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、０．５ｍｇ／ｍｌ  ｍＲＮＡ（ＰＲＯＴＥＩＯＳの取扱い説明書に従いｐＥＵ−ｈｕｍａｎ  ＥＲＫ２から転写し、精製したもの）、任意の濃度のＡＴＰ、Ｃｒ−Ｐを含有する）からなる反応液をそれぞれの条件で５０μｌづつ調製し、洗浄・平衡化した透析カップ（ＭＷＣＯ：１２０００）（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ社製）に移した。ｐＥＵ−ｈｕｍａｎ  ＥＲＫ２は、ｐＥＵ３−ＮＩＩベクターのＭＣＳにヒトＭＡＰキナーゼ２（ＥＲＫ２）のオープンリーリングフレーム（ＯＲＦ）をクローニングしたものである。
透析液（バッファー層）としては、終濃度として；３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．６）、９５ｍＭ  酢酸カリウム、２．６ｍＭ  酢酸マグネシウム、０．２５ｍＭ  ＧＴＰ、２．８５ｍＭ  ジチオスレイトール、０．３８ｍＭ  スペルミジン、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、反応液と同濃度のＡＴＰ、Ｃｒ−Ｐとなるように、それぞれ２５０μｌ調製した。ＡＴＰとＣｒ−Ｐの濃度は、ＡＴＰ：１．２ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１６ｍＭ（Ａ）とＡＴＰ：１．８ｍＭ、Ｃｒ−Ｐ：１２ｍＭ（Ｂ）に設定し、比較した。
反応は、透析液２ｍｌをプラスチック容器に入れ、透析カップ（反応液入り）の透析膜部分が透析液にまんべんなく浸るようにし、透析液をマグネチックスターラーにて攪拌しつつ行なった（反応液の攪拌はなし）。反応温度は２６℃に設定した。反応は４８時間行なったが、２４時間で一度透析液を新しいものと交換した。また、ブランクとして、ｍＲＮＡを添加しないものについても実施した。
目的タンパク質の合成量は、反応終了液１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分析し、測定した。その結果、（Ｂ）の条件を用いた場合、飛躍的に目的タンパク質の合成量が増大することが示された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】  本発明の改良された無細胞タンパク質合成用組成物は、無細胞タンパク質合成反応全般に広く応用することが可能である。列挙すると、一般的な無細胞タンパク質合成反応（バッチ法、連続法含む）、タンパク質ラベリング反応（蛍光、ラジオアイソトープ、安定同位体、セレノメチオニンなど）、リボゾームディスプレイ法、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｖｉｒｕｓ法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４１４，４０５−４０８（１９９７））、ＳＴＡＢＬＥ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４５７（２），２２７−２３０（１９９９））などに応用することができ、例えば医薬や診断薬などに用いる種々のタンパク質の製造や、種々のタンパク質の構造・機能解析において、産業界に大きく寄与することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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