(57)【要約】  患者における細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態を診断する方法は、患者から試料を得るステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数が、対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数より大きい場合、患者を細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態と診断するステップとを含む。
2020521117.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含む、患者における細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態を診断する方法。
前記患者から試料を得るステップ；
前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップ；及び
前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数が、対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数より大きい場合、前記患者を、細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態と診断するステップ；
【請求項２】
以下のステップを含む、患者の生物学的年齢を決定する方法。
患者から、細胞及び非細胞物質を含有する試料を得るステップ；
前記細胞と前記非細胞物質とを分離するステップ；
前記細胞を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、細胞表面ＡＧＥと前記抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップ； 
前記非細胞物質を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、非結合ＡＧＥと前記抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、前記試料中の非結合ＡＧＥの数を測定するステップ；及び
前記試料中の細胞表面ＡＧＥと非結合ＡＧＥの比を比較するステップ；
【請求項３】
以下のステップを含む、患者における細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害、又は病的状態を診断する方法。
患者から、細胞及び非細胞物質を含有する試料を得るステップ；
前記細胞と前記非細胞物質とを分離するステップ；
前記細胞を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、細胞表面ＡＧＥと前記抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップ；
前記非細胞物質を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、非結合ＡＧＥと前記抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、前記試料中の非結合ＡＧＥの数を測定するステップ；
前記試料中の細胞表面ＡＧＥと非結合ＡＧＥの比を比較して前記患者の生物学的年齢を決定するステップ；及び
前記患者の生物学的年齢が前記患者の暦年齢を上回る場合、前記患者を細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害、又は病的状態と診断するステップ；
【請求項４】
以下のステップを含む、患者における細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害、又は病的状態を診断する方法。
患者から試料を得るステップ；
前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップ；
前記試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を、年齢をマッチさせた対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数と比較することにより、前記患者の生物学的年齢を決定するステップ；及び
前記患者の生物学的年齢が前記患者の暦年齢より高い場合、前記患者を細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害、又は病的状態と診断するステップ；
【請求項５】
対象におけるＡＧＥ修飾細胞をインビボで検出する方法であって、
検出可能な標識で標識されている抗ＡＧＥ抗体を、前記対象に投与するステップ
を含む、前記方法。
【請求項６】
細胞表面終末糖化産物を発現する細胞を検出するためのキットであって、
抗ＡＧＥ抗体と、
対照試料とを含み、
任意で、前記抗ＡＧＥ抗体に結合する試薬を含む
前記キット。
【請求項７】
試料が、唾液試料、口腔スワブ、血液試料、皮膚試料、及び尿試料からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
細胞が、Ｔ細胞、赤血球、線維芽細胞、及び上皮細胞からなる群から選択される、請求項１〜５及び７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
測定するステップが、ＥＬＩＳＡ、セルソーティング、又はセルカウンティングを含む、請求項１〜５、７、及び８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
診断するステップが、試料中の細胞の少なくとも５％が細胞表面ＡＧＥを示す場合、患者を細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態と診断するステップを含む、請求項１〜５及び７〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
診断するステップが、試料中の細胞の少なくとも２５％が細胞表面ＡＧＥを示す場合、患者を細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態と診断するステップを含む、請求項１〜５及び７〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態が、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、慢性閉塞性肺疾患、ハンチントン舞踏病、特発性肺線維症、筋ジストロフィー、黄斑変性症、白内障、糖尿病性網膜症、パーキンソン病、早老症、白斑、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節炎、アテローム性動脈硬化症、がん及び転移性がん、がん療法関連身体障害又はがん療法副作用、高血圧、緑内障、骨粗しょう症、サルコペニア、悪液質、脳卒中、心筋梗塞、心房細動、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、放射線曝露、ＨＩＶ治療副作用、化学兵器曝露、中毒症、炎症、腎症、レビー小体病、プリオン病、脊柱湾曲、自己免疫障害、脂肪組織の喪失、乾癬、クローン病、喘息、加齢の生理学的影響、特発性ミオパチー、多発性硬化症、視神経脊髄炎、てんかん、及び副腎白質ジストロフィーからなる群から選択される少なくとも１つの疾患、障害、又は病的状態を含む、請求項１〜５及び７〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
抗ＡＧＥ抗体が、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリジン、カルボキシエチルリジン及びペントシジンからなる群から選択されるＡＧＥ修飾を示す細胞表面タンパク質又はペプチドに結合する、請求項１〜５及び７〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質又はペプチドに結合する、請求項１〜５及び７〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
抗ＡＧＥ抗体が、カルボキシエチルリジン修飾タンパク質又はペプチドに結合する、請求項１〜５及び７〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
抗ＡＧＥ抗体が、重鎖と軽鎖とを含み、
前記重鎖が、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖が、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１〜５及び７〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
患者が、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、イヌ、及びネコからなる群から選択される、請求項１〜５及び７〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
患者がヒトである、請求項１〜５及び７〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
対象を、標識を検出することができる装置に曝露させるステップをさらに含む、請求項１〜５及び７〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＡＧＥ修飾細胞が老化細胞である、請求項１〜５及び７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
ＡＧＥ修飾細胞が転移性がん細胞である、請求項１〜５及び７〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
標識が、放射標識、蛍光標識、金ナノ粒子、ガドリニウムナノ粒子、陽電子放出体、近赤外で放出する色素、量子ドット、超常磁性酸化鉄、カーボンナノチューブ、及び微小気泡からなる群から選択される少なくとも１つの標識を含む、請求項１〜５及び７〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
抗ＡＧＥ抗体に結合する試薬をさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項２４】
試薬が二次抗体を含む、請求項６又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
抗ＡＧＥ抗体、対照試料、及び試薬が滅菌されている、請求項６、２３及び２４のいずれかに記載のキット。
【請求項２６】
容器をさらに含む、請求項６及び２３〜２５のいずれかに記載のキットであって、抗ＡＧＥ抗体、対照試料、及び試薬が、前記容器中にある、前記キット。
【請求項２７】
抗ＡＧＥ抗体及び／又は試薬が標識されている、請求項６及び２３〜２６のいずれかに記載のキット。
【請求項２８】
標識が、蛍光標識、放射標識、及び金粒子からなる群から選択される少なくとも１つの標識を含む、請求項６及び２３〜２７のいずれかに記載のキット。
【請求項２９】
診断された患者に老化細胞除去剤の有効量を投与するステップをさらに含む、請求項１〜５及び７〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
老化細胞除去剤が、治療的抗ＡＧＥ抗体、毒素にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体、セノリティック剤、及びそれらの組み合わせを含む、請求項１〜５、７〜２２及び２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
患者における細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態の治療における使用のための老化細胞除去剤であって、前記患者の生物学的年齢が、前記患者の暦年齢を上回る、前記老化細胞除去剤。
【請求項３２】
患者の生物学的年齢が上記の方法を用いて決定される、請求項３１に記載の老化細胞除去剤。
【請求項３３】
患者における細胞老化と関連した疾患、障害、又は病的状態を治療する方法であって、
それを必要とする患者に老化細胞除去剤の治療有効量を投与するステップ
を含み、
前記患者の生物学的年齢が前記患者の暦年齢を上回る、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［背景技術］
老化細胞は、一部機能性又は非機能性の細胞であり、増殖停止の状態にある。老化は、細胞の特徴的な状態であり、バイオマーカーｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化、及びβ−ガラクトシダーゼの発現などのバイオマーカーと関連している。老化は、細胞の損傷又はストレス（増殖因子による過剰刺激など）で始まる。
【０００２】
終末糖化産物（ＡＧＥ，advanced glycation end-product；ＡＧＥ修飾タンパク質、又は最終糖化産物とも呼ばれる）は、糖とタンパク質側鎖との非酵素的反応から生じる（Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)）。このプロセスは、還元糖とアミノ基とが可逆反応してシッフ塩基を形成することに始まり、次に、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。アマドリ産物は形成されると、さらに転位を経てＡＧＥを産生する。高血糖及び酸化ストレスは、膜タンパク質のこの翻訳後修飾を促進する（Lindsey JB, et al., "Receptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications," Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)）。ＡＧＥはまた、他のプロセスからも形成され得る。例えば、終末糖化産物、Ｎε−（カルボキシメチル）リジンは、脂質過酸化反応及び糖酸化反応の両方の産物である。ＡＧＥは、炎症、網膜症、腎症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含む複数の病的状態と関連している（Bierhaus A, "AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept," Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)）。
【０００３】
ＡＧＥ修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。最終糖化産物と老化とのこの関連性は、当技術分野で周知である。例えば、Gruber, L.（国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット、２００９年１１月２６日）、Ando, K. et al. (Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999))、Ahmed, E.K. et al. ("Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblasts" Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010))、Vlassara, H. et al. (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987))及びVlassara et al. ("High-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules" Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985))参照。さらに、Ahmed, E.K. et al.は、最終糖化産物が「細胞タンパク質及び細胞外タンパク質の自然損傷の主要原因の１つ」であることを示している（Ahmed, E.K. et al.、上記、３５３頁参照）。したがって、最終糖化産物の蓄積は、老化及び機能不全と関連している。
【０００４】
細胞老化の原因となる損傷又はストレスはまた、細胞内のミトコンドリアＤＮＡに悪影響を及ぼしてフリーラジカルを生成させる。フリーラジカルは、細胞内の糖と反応してメチルグリオキサール（ＭＧ）を形成する。ＭＧは今度は、タンパク質又は脂質と反応して終末糖化産物を生成する。タンパク質成分リジンの場合、ＭＧは、ＡＧＥであるカルボキシエチルリジンを形成するように反応する（Al-Abed, Y. et al., “Nε-Carboxymethyllysine formation by direct addition of glyoxal to lysine during the Maillard reaction”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 18, pp. 2161-2162 (1995)）。
【０００５】
ミトコンドリアＤＮＡに対する損傷又はストレスはまた、細胞周期遮断タンパク質を産生するように細胞を誘導するＤＮＡ損傷応答も引き起こす。これらの遮断タンパク質は、細胞が分裂するのを阻止する。損傷又はストレスの継続はｍＴＯＲ産生の原因となり、これが今度は、タンパク質合成を活性化し、タンパク質分解を不活性化する。細胞のさらなる刺激は、プログラム細胞死（アポトーシス）につながる。
【０００６】
ｐ１６は、Ｓ期（合成期）を阻害することにより細胞周期の制御に関与するタンパク質である。ｐ１６は、老化時に、又はＤＮＡ損傷、酸化ストレス若しくは薬物への曝露などの様々なストレスに応答して活性化され得る。ｐ１６は典型的には、ＤＮＡ損傷に応答して細胞を老化させ、細胞が過剰増殖状態に入るのを不可逆的に阻止する腫瘍抑制因子タンパク質と見なされる。しかし、ｐ１６の過剰発現を示す腫瘍もあれば、一方で、下方制御された発現を示すものもあることから、この点に関していくらかの曖昧さがある。証拠は、いくつかの腫瘍におけるｐ１６の過剰発現が、網膜芽細胞腫タンパク質（「Ｒｂ」）欠損から生じることを示唆している。ｐ１６はＲｂに作用してＳ期を阻害し、Ｒｂはｐ１６を下方制御し、負のフィードバックを生じさせる。Ｒｂ欠損はＳ期を阻害することも、ｐ１６を下方制御することもできず、故に過剰増殖細胞におけるｐ１６の過剰発現をもたらす（Romagosa, C. et al., p16Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087-2097 (2011)）。
【０００７】
老化細胞は、炎症促進性因子を含む細胞間シグナル伝達に関与する多くの因子の分泌に関連しており、これらの因子の分泌は、細胞老化関連分泌現象（senescence-associated secretory phenotype）、又はＳＡＳＰと呼ばれている（Freund, A. "Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences" Trends Mol Med. 2010 May;16(5):238-46）。クローン病及び関節リウマチなどの自己免疫疾患は、慢性炎症と関連している（Ferraccioli, G. et al. "Interleukin-1βand Interleukin-6 in Arthritis Animal Models: Roles in the Early Phase of Transition from Acute to Chronic Inflammation and Relevance for Human Rheumatoid Arthritis" Mol Med. 2010 Nov-Dec; 16(11-12): 552-557）。慢性炎症は、ベースラインより高いが、急性炎症で見出されるものより低いレベルでの病変部位付近の炎症促進性因子の存在を特徴とし得る。これらの因子の例には、ＴＮＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｃ５補体タンパク質、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ、ＩｇＥ、α４β１インテグリン及びα４β７インテグリンが含まれる。老化細胞はまた、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＣＡＭ１、ＴＮＦＡＰ３、ＥＳＭ１及びＣＣＬ２を含む、炎症において役割を有する遺伝子を上方制御する（Burton, D.G.A. et al., "Microarray analysis of senescent vascular smooth muscle cells: a link to atherosclerosis and vascular calcification", Experimental Gerontology, Vol. 44, No. 10, pp. 659-665 (October 2009)）。老化細胞は、炎症促進性因子を生成するため、これらの細胞を除去するだけで、炎症並びに炎症促進性因子の量及び濃度の顕著な低減をもたらす。
【０００８】
老化細胞は、ＳＡＳＰの一部としての活性酸素種（「ＲＯＳ」，reactive oxygen species）を分泌する。ＲＯＳは、細胞の老化の維持において重要な役割を果たしていると考えられている。ＲＯＳの分泌は、老化細胞が隣接細胞に老化を誘導するバイスタンダー効果を生じさせる。すなわち、ＲＯＳは、ｐ１６発現を活性化し、老化につながることが知られている細胞損傷そのものを生じさせる（Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)）。ｐ１６／Ｒｂ経路はＲＯＳの誘導につながり、これが今度は、ＲＯＳをさらに増強する正のフィードバックループを生じさせ、不可逆的細胞周期停止の維持を助けるタンパク質キナーゼＣデルタを活性化する。さらに、がん細胞をＲＯＳに曝露させると、過剰増殖細胞において細胞期停止を誘導することによりがんを治療するのに有効である可能性があることが示唆されている（Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)）。
【０００９】
老化細胞の相対的レベルは、疾患と特異的に相関している。老化細胞は、がん及び転移性がんと長年関連付けられており、１０％老化線維芽細胞との細胞培養は増殖刺激を証明した（Krtolica, A. et al., “Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging”, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 98, No. 21, pp. 12072-12077 (2001)）。生物学的老化の尺度であるエアロビックフィットネスは、３７％少ない老化ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞と関連していた（Spielmann, G. et al., “Aerobic fitness is associated with lower proportions of senescent blood T-cells in man”, Brain, Behavior and Immunity, Vol. 25, No. 8, pp. 1521-1529 (2011)）。同様に、老化ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、アイアンマントライアスロンに向けた６カ月のトレーニングの２週間後のトライアスロン選手において１９２％増加した（Cosgrove, C. et al., “The impact of 6-month training preparation for an Ironman triathlon on the proportions of naive, memory and senescent T cells in resting blood”, European Journal of Applied Physiology, Vol. 112, No. 8, pp. 2989-2998 (2012)）。
【００１０】
老化細胞の表面で発現される終末糖化産物のレベルの増加は、様々な疾患、障害及び病的状態のマーカーとして認識されてきた。カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ，carboxymethyllysine）のレベルの増加は、線維筋痛症患者の血清及び筋肉組織で見出されている（Ruster, M. et al., “Detection of elevated Nε-carboxymethyllysine levels in muscular tissue and in serum of patients with fibromyalgia”, Scandinavian Journal of Rheumatology, Vol. 34, No. 6, pp. 460-463 (2005)）。皮膚の薄化又は小じわなどの皮膚の老化の加速は、糖尿病患者で容易に目立つ（Schmid, D. et al., “Collage glycation and skin aging”, Cosmetics and Toiletries Manufacture Worldwide, available online at mibellebiochemistry.com/app/uploads/2015/03/GSP-T-for-Skin_Collagen-glycation-and-skin-aging-CT-2002.pdf (accessed on April 27, 2017)）。同様に、糖尿病患者の皮膚自家蛍光値は、ペントシジン及びＣＭＬの組織レベルと相関し、冠状動脈性心疾患及び予測死亡率と強い関係がある（Meerwaldt, R. et al., “Skin autofluorescence is a strong predictor of cardiac mortality in diabetes”, Diabetes Care, Vol. 30, No. 1, pp. 107-112 (2007)）。故に、ＡＧＥレベルの上昇は、細胞老化と関連した疾患、障害及び病的状態の一般に認められているマーカーである。
【００１１】
試料中のＡＧＥの絶対値は、疾患と特異的に相関している。血漿ＣＭＬのレベルは、対照と比較して前立腺がん患者で３０μｇ／ｍＬ高かった（Yang, S. et al., “Impact of oxidative stress biomarkers and carboxymethyllysine (an advanced glycation end product) on prostate cancer: a prospective study”, Clinical Genitourinary Cancer, Vol. 13, No. 5, pp. e347-e351 (2015)）。
【００１２】
同様に、老化細胞と加齢又は加齢関連障害との相関は、国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレットに記載されているように、診断標的になる加齢マーカーをもたらした。テロメアは、生物学的老化と長年関連付けられており、短いテロメア長は、糖尿病、心血管疾患及びがんなどの加齢関連疾患の早期発症の指標として使用されている（“Telomere Testing White Paper”, Titanovo, available online at titanovo.com/telomere-length-testing/ (accessed on April 20, 2017)）。テロメア長は、ＤＮＡ試料においてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，polymerase chain reaction）分析を用いて測定することができる。加齢及び加齢関連障害を検出するのにテロメア長を使用することの重大な制約は、全ての老化がテロメアに関わるわけではないことである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２００９／１４３４１１号パンフレット
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ando, K. et al., Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in the Circulation, Biochem Biophys Res Commun., Vol. 258, 123, 125 (1999)
【非特許文献２】Lindsey JB, et al., "Receptor For Advanced Glycation End-Products (RAGE) and soluble RAGE (sRAGE): Cardiovascular Implications," Diabetes Vascular Disease Research, Vol. 6(1), 7-14, (2009)
【非特許文献３】Bierhaus A, "AGEs and their interaction with AGE-receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I. The AGE concept," Cardiovasc Res, Vol. 37(3), 586-600 (1998)
【非特許文献４】Ahmed, E.K. et al. ("Protein Modification and Replicative Senescence of WI-38 Human Embryonic Fibroblasts" Aging Cells, vol. 9, 252, 260 (2010))
【非特許文献５】Vlassara, H. et al. (Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor-Mediated Phagocytosis by Macrophages, J. Exp. Med., Vol. 166, 539, 545 (1987))
【非特許文献６】Vlassara et al. ("High-affinity-receptor-mediated Uptake and Degradation of Glucose-modified Proteins: A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules" Proc. Natl. Acad. Sci. USAI, Vol. 82, 5588, 5591 (1985))
【非特許文献７】Al-Abed, Y. et al., “Nε-Carboxymethyllysine formation by direct addition of glyoxal to lysine during the Maillard reaction”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 5, No. 18, pp. 2161-2162 (1995)
【非特許文献８】Romagosa, C. et al., p16Ink4a overexpression in cancer: a tumor suppressor gene associated with senescence and high-grade tumors, Oncogene, Vol. 30, 2087-2097 (2011)
【非特許文献９】Freund, A. "Inflammatory networks during cellular senescence: causes and consequences" Trends Mol Med. 2010 May;16(5):238-46
【非特許文献１０】Ferraccioli, G. et al. "Interleukin-1β and Interleukin-6 in Arthritis Animal Models: Roles in the Early Phase of Transition from Acute to Chronic Inflammation and Relevance for Human Rheumatoid Arthritis" Mol Med. 2010 Nov-Dec; 16(11-12): 552-557
【非特許文献１１】Burton, D.G.A. et al., "Microarray analysis of senescent vascular smooth muscle cells: a link to atherosclerosis and vascular calcification", Experimental Gerontology, Vol. 44, No. 10, pp. 659-665 (October 2009)
【非特許文献１２】Nelson, G., A senescent cell bystander effect: senescence-induced senescence, Aging Cell, Vo. 11, 345-349 (2012)
【非特許文献１３】Rayess, H. et al., Cellular senescence and tumor suppressor gene p16, Int J Cancer, Vol. 130, 1715-1725 (2012)
【非特許文献１４】Krtolica, A. et al., “Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging”, Proceedings of the National Academy of Sciences, Vol. 98, No. 21, pp. 12072-12077 (2001)
【非特許文献１５】Spielmann, G. et al., “Aerobic fitness is associated with lower proportions of senescent blood T-cells in man”, Brain, Behavior and Immunity, Vol. 25, No. 8, pp. 1521-1529 (2011)
【非特許文献１６】Cosgrove, C. et al., “The impact of 6-month training preparation for an Ironman triathlon on the proportions of naive, memory and senescent T cells in resting blood”, European Journal of Applied Physiology, Vol. 112, No. 8, pp. 2989-2998 (2012)
【非特許文献１７】Ruster, M. et al., “Detection of elevated Nε-carboxymethyllysine levels in muscular tissue and in serum of patients with fibromyalgia”, Scandinavian Journal of Rheumatology, Vol. 34, No. 6, pp. 460-463 (2005)
【非特許文献１８】Schmid, D. et al., “Collage glycation and skin aging”, Cosmetics and Toiletries Manufacture Worldwide, available online at mibellebiochemistry.com/app/uploads/2015/03/GSP-T-for-Skin_Collagen-glycation-and-skin-aging-CT-2002.pdf (accessed on April 27, 2017)
【非特許文献１９】Meerwaldt, R. et al., “Skin autofluorescence is a strong predictor of cardiac mortality in diabetes”, Diabetes Care, Vol. 30, No. 1, pp. 107-112 (2007)
【非特許文献２０】Yang, S. et al., “Impact of oxidative stress biomarkers and carboxymethyllysine (an advanced glycation end product) on prostate cancer: a prospective study”, Clinical Genitourinary Cancer, Vol. 13, No. 5, pp. e347-e351 (2015)
【非特許文献２１】“Telomere Testing White Paper”, Titanovo, available online at titanovo.com/telomere-length-testing/ (accessed on April 20, 2017)
【発明の概要】
【００１５】
第１の態様において、本発明は、患者における細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態を診断する方法であって、患者から試料を得るステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数が、対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数より大きい場合、患者を細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態と診断するステップとを含む方法である。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、患者の生物学的年齢を決定する方法であって、患者から、細胞及び非細胞物質を含有する試料を得るステップと、細胞と非細胞物質とを分離するステップと、細胞を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、細胞表面ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップと、非細胞物質を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、非結合ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、試料中の非結合ＡＧＥの数を測定するステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥと非結合ＡＧＥの比を比較するステップとを含む方法である。
【００１７】
第３の態様において、本発明は、患者における細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態を診断する方法であって、患者から、細胞及び非細胞物質を含有する試料を得るステップと、細胞と非細胞物質とを分離するステップと、細胞を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、細胞表面ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップと、非細胞物質を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、非結合ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、試料中の非結合ＡＧＥの数を測定するステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥと非結合ＡＧＥの比を比較して患者の生物学的年齢を決定するステップと、患者の生物学的年齢が患者の暦年齢を上回る場合、患者を細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態と診断するステップとを含む方法である。
【００１８】
第４の態様において、本発明は、患者における細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態を診断する方法であって、患者から試料を得るステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を測定するステップと、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数を、年齢をマッチさせた対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数と比較することにより患者の生物学的年齢を決定するステップと、患者の生物学的年齢が患者の暦年齢より高い場合、患者を細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態と診断するステップとを含む方法である。
【００１９】
第５の態様において、本発明は、対象におけるＡＧＥ修飾細胞をインビボで検出する方法であって、対象に検出可能な標識で標識されている抗ＡＧＥ抗体を投与するステップを含む方法である。
【００２０】
第６の態様において、本発明は、細胞表面終末糖化産物を発現する細胞を検出するためのキットであって、抗ＡＧＥ抗体と、対照試料と、任意で、抗ＡＧＥ抗体に結合する試薬とを含むキットである。
【００２１】
第７の態様において、本発明は、患者における細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に老化細胞除去剤の治療有効量を投与するステップを含む方法である。患者の生物学的年齢は、患者の暦年齢を上回る。
【００２２】
定義
用語「ペプチド」は、２〜５０個のアミノ酸からなる分子を意味する。
【００２３】
用語「タンパク質」は、５０個を超えるアミノ酸からなる分子を意味する。
【００２４】
用語「終末糖化産物」、「ＡＧＥ」、「ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチド」及び「最終糖化産物」は、糖とタンパク質側鎖との反応の結果として形成され、さらに転位し、不可逆的架橋を形成する修飾タンパク質又はペプチドを指す。このプロセスは、還元糖とアミノ基とが可逆反応してシッフ塩基を形成することに始まり、次に、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。アマドリ産物は形成されると、さらに転位を経てＡＧＥを産生する。ＡＧＥ修飾タンパク質及びＡＧＥ修飾タンパク質に対する抗体は、Bucalaの米国特許第５，７０２，７０４号明細書（「Ｂｕｃａｌａ」）及びAl-Abed et al.の米国特許第６，３８０，１６５号明細書（「Ａｌ−Ａｂｅｄ」）に記載されている。ＡＧＥを形成するのに必要な転位を経ていない、糖化アルブミンで見出されるＮ−デオキシフルクトシルリジンなどの糖化タンパク質又はペプチドは、ＡＧＥではない。ＡＧＥは、２−（２−フロイル）−４（５）−（２−フラニル）−１Ｈ−イミダゾール（「ＦＦＩ」）；５−ヒドロキシメチル−１−アルキルピロール−２−カルバルデヒド（「ピラリン」）；１−アルキル−２−ホルミル−３，４−ジグリコシルピロール（「ＡＦＧＰ」）、非蛍光モデルＡＧＥ；カルボキシメチルリジン；カルボキシエチルリジン；及びペントシジンなどのＡＧＥ修飾（ＡＧＥエピトープ又はＡＧＥ部分とも呼ばれる）の存在によって同定することができる。別のＡＧＥであるＡＬＩはＡｌ−Ａｂｅｄに記載されている。
【００２５】
「抗ＡＧＥ抗体」又は「ＡＧＥ抗体」は、ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドに結合し、好ましくは抗体の定常領域を含む抗体、抗体断片又は他のタンパク質若しくはペプチドを意味する。ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドは、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ科動物（例えば、ラクダ又はアルパカ）、ウシ、ヒツジ、又はヤギ細胞の表面に結合した状態で通常見出されるタンパク質又はペプチドであってもよい。或いは、ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドは、細胞の表面に結合していないタンパク質又はペプチド（遊離、非結合又は循環タンパク質又はペプチドとも呼ばれる）であってもよい。「抗ＡＧＥ抗体」又は「ＡＧＥ抗体」は、ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチド、及び同じ非ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドの両方に同じ特異性及び選択性で結合する抗体又は他のタンパク質を含まない（すなわち、ＡＧＥ修飾の存在は結合を増加させない）。「抗ＡＧＥ抗体」又は「ＡＧＥ抗体」は、例えば毒素、薬物、又は他の化学物質若しくは粒子にコンジュゲートされる抗体を含む。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまたあり得る。
【００２６】
用語「老化細胞」は、増殖停止の状態にあり、ｐ１６Ｉｎｋ４ａの活性化又は老化関連β−ガラクトシダーゼの発現などの、１又は２以上の老化のバイオマーカーを発現する細胞を意味する。また、含まれるのは、老化の１又は２以上のバイオマーカーを発現し、インビボでは増殖しないが、特定の条件下でインビトロで増殖し得る、ＡＬＳ患者の筋肉で見出されるいくつかのサテライト細胞などの細胞である。
【００２７】
用語「セノリティック剤（senolytic agent）」は、老化細胞を破壊する分子量９００ダルトン未満の小分子を意味する。用語「セノリティック剤」には、抗体、抗体コンジュゲート、タンパク質、ペプチド又は生物学的療法が含まれない。
【００２８】
用語「老化細胞除去剤（senescent cell removal agent）」は、老化細胞を破壊する物質を意味する。老化細胞除去剤には、米国特許第９，１６１，８１０号明細書に記載されたものなどの治療的抗ＡＧＥ抗体、及びセノリティック剤が含まれる。
【００２９】
用語「バリアント」は、１個又は２個以上のヌクレオチド、タンパク質又はアミノ酸残基が欠失、置換又は付加されている、具体的に同定された配列とは異なるヌクレオチド、タンパク質又はアミノ酸配列を意味する。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアント、又は天然に存在しないバリアントであってもよい。同定された配列のバリアントは、同定された配列の機能的特徴のいくつか又は全てを保持してもよい。
【００３０】
用語「配列同一性パーセント（％）」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して配列同一性最大パーセントを得た後の、及びいかなる保存的置換も配列同一性の一部として見なさない、参照ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（DNASTAR社）ソフトウェアなどの公開されているコンピュータソフトウェアを用いて、様々な方法で得ることができる。好ましくは、配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を用いて生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムは、Genentech, Inc.社（サウスサンフランシスコ、ＣＡ）から公開されており、又は米国著作権局にユーザー文書と共に提出された、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下に登録されているソースコードからコンパイルすることができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸオペレーションシステムで使用するためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定されており、変動しない。
【００３１】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列比較に使用される状況において、任意のアミノ酸配列Ｂへの、任意のアミノ酸配列Ｂとの、又は任意のアミノ酸配列Ｂに対する、任意のアミノ酸配列Ａの配列同一性％（或いは、任意のアミノ酸配列Ｂに、任意のアミノ酸配列Ｂと、又は任意のアミノ酸配列Ｂに対して、特定のアミノ酸配列同一性％を有する又は含む任意のアミノ酸配列Ａと表現され得る）は、次のように計算される：分数Ｘ／Ｙの１００倍（式中、Ｘは、配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって、Ａ及びＢのそのプログラムのアライメントにおいて同一マッチとして採点されるアミノ酸残基の数であり、Ｙは、Ｂにおけるアミノ酸残基の総数である）。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さに等しくない場合、ＢへのＡのアミノ酸配列同一性％は、ＡへのＢのアミノ酸配列同一性％に等しくならない。特に具体的な記載のない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性％値は、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】細胞表面終末糖化産物を発現する細胞を検出するためのキットを例示する図である。
【図２】抗体結合実験における応答対時間のグラフである。
【図３Ａ】赤色に染色されたカルボキシメチルリジン（ダークグレー）及び緑色に染色されたリン酸化タウ（ライトグレー）を示すアルツハイマー病試料の細胞の写真である。
【図３Ｂ】赤色に染色されたカルボキシメチルリジン（ダークグレー）及び緑色に染色されたアミロイド前駆体タンパク質（ライトグレー）を示すアルツハイマー病試料の細胞の写真である。
【図３Ｃ】赤色に染色されたカルボキシメチルリジン（ダークグレー）及び緑色に染色されたαシヌクレイン（ライトグレー）を示す、黒質由来のパーキンソン病試料の細胞の写真である。
【図３Ｄ】赤色に染色されたカルボキシメチルリジン（ダークグレー）及び緑色に染色されたαシヌクレイン（ライトグレー）を示す腹側被蓋野由来のパーキンソン病試料の細胞の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
細胞老化と様々な疾患、障害及び病的状態との定量可能な関連性を認識することは、診断標的になる老化細胞をもたらした。例えば、ＣＤ５７は、ナチュラルキラー（ＮＫ，natural killer）細胞及びＴ細胞などの免疫細胞を含む老化細胞の既知のマーカーである（Kared, H. et al., “CD57 in human natural killer cells and T-lymphocytes”, Cancer Immunology, Immunotherapy, Vol. 65, No. 4, pp. 441-452 (2016)）。Miltenyi Biotec社（ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）製のＣＤ８＋ＣＤ５７＋  Ｔ細胞単離キットなどのＣＤ５７単離キットが市販されているが、これらの定量的測定ツールは、研究用途のみが対象となる。Miltenyi Biotec社製Ｔ細胞単離キットのデータシートは、キットが診断用途又は治療用途向けではないことを明記している。
【００３４】
終末糖化産物の検出及び定量化は、質量分析及び高速液体クロマトグラフィーなどのタンパク質を検出することができる分析法で実施されてきた。しかし、これらの手法は扱いにくく、複雑な実験室機器にしばしば依存する。抗ＡＧＥ抗体を用いる終末糖化産物の測定のための免疫アッセイなどのウェットラボ手法は、著しく使用しやすい。Kamiya Biomedical Company社（シアトル、ＷＡ、ＵＳＡ）製のＣａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｌｙｓｉｎｅ（ＣＭＬ）ＥＬＩＳＡカタログ番号ＫＴ−３２４２８などの抗ＡＧＥアッセイが市販されている。老化細胞検出ツールとまさに同じように、これらの定量的測定ツールは、研究用途のみが対象となる。Kamiya Biomedical Company社ＣＭＬ  ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＫＴ−３２４２８）のデータシートは、製品が診断手順における用途のためではないことを明記している。したがって、診断目的での抗ＡＧＥ抗体の使用は、日常的でも従来的でもない。
【００３５】
本発明は、老化関連疾患、障害又は病的状態を診断及び監視するために終末糖化産物修飾タンパク質及びペプチドに結合する抗体を使用する。ＡＧＥ修飾タンパク質及びペプチド、特に、一部機能性及び非機能性細胞の表面のＡＧＥ修飾タンパク質及びペプチドは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ，enzyme-linked immunosorbent assay）、セルソーティング及びセルカウンティングを含む抗体ベースの診断方法のための固有の標的である。例えば、周知の終末糖化産物である、細胞結合カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）の検出が、試料中の老化細胞の総数、濃度又は比を決定するのに使用されてもよい。患者は、対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数と比較した試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数に基づき、又は試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数が臨床閾値を上回る場合、治療を必要とすると同定され得る。或いは、又はさらに、細胞結合ＡＧＥと遊離（非結合）ＡＧＥの比の比較は、試料中の老化細胞の数を標準化し、及び疾患進行又は生物学的老化を監視するのに使用されてもよい。細胞結合ＡＧＥのより大きな比は、内部源及び細胞機能障害によるより大量の細胞老化を示している。抗ＡＧＥ抗体ベースの診断方法は、低侵襲及び実施しやすいという利点を提供し、そのような検査が診察室又は診療所で実施されることを可能にする。
【００３６】
老化細胞が細胞表面終末糖化産物を発現することから、抗ＡＧＥ抗体は、試料中の老化細胞の存在を検出するのに使用されてもよい。１つの実施形態では、試料が提供される。試料は、ヒト患者から得られ得る。次に、試料を抗ＡＧＥ抗体と接触させ、細胞表面ＡＧＥと抗ＡＧＥ抗体との結合を検出することにより、試料中の細胞表面ＡＧＥの存在が決定又は測定される。対照試料は、比較のためのベースラインとして、患者から又は健康な対象から得てもよい。比較のためのベースラインはまた、健康な対照群からＡＧＥ修飾を示す細胞の平均数として得ることもできる。好ましくは、対照試料は、試料が得られる患者と同じ暦年齢の健康な対象（「年齢をマッチさせた」又は「年齢順」対照としても知られる）から得られる。
【００３７】
細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数は、定性的又は定量的測定を用いて決定することができる。測定は、健康な対照との比較に有用な情報を提供することが意図される。定量的測定の例には、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の総数、平均数、濃度、比又は割合を測定することが含まれる。定性的測定の例には、免疫組織化学又は免疫細胞化学的手法で組織試料を分析することが含まれる。例えば、試料内の糖化の位置は、細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態を示し得る。
【００３８】
試料中の老化細胞の測定は、細胞老化と関連した疾患、障害若しくは病的状態を有する患者を診断し、又は治療を必要としていると患者を同定するのに使用することができる。細胞機能障害のレベルの上昇は、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の総数、平均数、濃度、比又は割合が、対照における細胞表面ＡＧＥを示す細胞の総数、平均数、濃度、比又は割合を上回る場合に示され得る。例えば、５％を超える老化細胞を含有する試料は、細胞機能障害のレベルの上昇を示す。患者は、症状を示す前又は医療専門家から臨床診断を受ける前に、細胞老化と関連した疾患、障害若しくは病的状態と診断され、又は治療を必要としていると同定され得る。好ましくは、患者は、細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態の同定に役立つ検査の前に、細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態の少なくとも１つの症状を既に示す。試料中の老化細胞の測定はまた、重複又は類似する症状と疾患、障害又は病的状態を区別するための鑑別診断において使用することもできる。
【００３９】
細胞機能障害のレベルの上昇はまた、試料中の細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数が臨床閾値を上回る場合にも示され得る。例えば、試料が、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、３０％、３５％、４０％及び４５％の老化細胞を含む、５％〜５０％の老化細胞を含有するならば、患者は、細胞老化と関連した疾患、障害若しくは病的状態と診断され、又は治療を必要としていると同定され得る。臨床閾値は、健康な患者から得られる試料のコレクションにおいて見出されるＡＧＥ修飾細胞の最高数又は平均数に基づいてもよい。
【００４０】
試料中の老化細胞の測定はまた、患者の生物学的年齢を決定するのに使用することもできる。老化細胞は年齢と共に蓄積することから、年齢をマッチさせた対照と比較して試料中のより大量の老化細胞は、生物学的年齢の進行を示す。患者の生物学的年齢が患者の暦年齢より高い場合、患者は治療を必要としていると同定され得る。例えば、患者は、彼女の生物学的年齢が、彼女の暦年齢より少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％及び４５％高い場合を含む、彼女の暦年齢より１０％〜５０％高い場合、生物学的年齢が進行していると診断され得る。同様に、患者は、彼女の生物学的年齢が、彼女の暦年齢より少なくとも１０歳、１５歳、２０歳、２５歳、３０歳、３５歳、４０歳及び４５歳高い場合を含む、彼女の暦年齢より５〜５０歳高い場合、生物学的年齢が進行していると診断され得る。
【００４１】
抗ＡＧＥ抗体は、試料中の遊離（非結合）ＡＧＥ及びＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドを検出するのに使用することもできる。遊離ＡＧＥは、細胞老化と関連がない終末糖化産物の尺度となり得る。試料中の細胞表面ＡＧＥの数は、試料中の老化細胞の数を標準化するために遊離ＡＧＥの数と比較することができる。例えば、細胞表面ＡＧＥと遊離ＡＧＥの比は、細胞表面に蓄積しているＡＧＥ割合を決定するのに使用することができ、高い比率は細胞老化の増加を示す。試料中の老化細胞の割合もまた、患者の生物学的年齢の尺度として使用することができる。
【００４２】
試料は、老化している可能性がある細胞を含有する患者から得られる任意の物質であってもよい。適切な試料の例には、唾液、口腔スワブ、血液試料、尿試料、皮膚試料及び生検が含まれる。試料は、遠心分離などにより物理的に処理されていてもよく、又はトリプシン処理などにより化学的に処理されていてもよい。試料処理は、血液試料の血清及び血漿への分離など、試料の特定の部分を分離するのに使用することができる。
【００４３】
細胞表面終末糖化産物の存在について検査される試料内の細胞は、細胞老化を起こすことができる任意の細胞であってもよい。検査される適切な細胞の例には、Ｔ細胞、赤血球、線維芽細胞及び上皮細胞が含まれる。Ｔ細胞は、検査に好ましい細胞である。
【００４４】
試料中のＡＧＥ修飾ペプチド又はタンパク質の存在は、任意の抗体ベースの同定法によって決定することができる。適切な抗体同定法の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ，radioimmunoassay）及びリアルタイム免疫定量ＰＣＲ（ｉｑＰＣＲ，real-time immunoquantitative PCR）、セルソーティング、例えば蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ，fluorescent activated cell sorting）、フローサイトメトリー及び磁気セルソーティング、セルカウンティング、ウエスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ，immunohistochemistry）、免疫細胞化学（ＩＣＣ，immunocytochemistry）、免疫沈降並びに酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ，enzyme linked immunospot）などの免疫アッセイが含まれる。好ましくは、抗体同定法は免疫アッセイである。
【００４５】
組織試料中の老化細胞を検出するための好ましい手法は、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色である。組織試料の組織学的分析は、組織試料中の特定のタンパク質を同定するための十分に確立された手法である。例えば、ＡＧＥは、アテローム硬化病変及び膵臓がんの組織試料で検出されている（Wendel, U. et al., “A novel monoclonal antibody targeting carboxymethyllysine, an advanced glycation end product in atherosclerosis and pancreatic cancer”, PLoS One, Vol. 13, No. 2, e0191872 (2018)）。免疫組織化学染色は、糖化の特定の部位の検出を可能にする。
【００４６】
診断法は、試料が得られた現場で実施することができる。或いは、試料は、研究所などの現場を離れた検査施設へ送られてもよい。
【００４７】
抗ＡＧＥ抗体は、老化細胞の表面で発現されるＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドを含むＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドに結合する任意の抗体であってもよい。抗ＡＧＥ抗体は当技術分野で公知であり、市販されている。例には、米国特許第５，７０２，７０４号明細書（Bucala）及び米国特許第６，３８０，１６５号明細書（Al-Abed et al.）に記載されたものが含まれる。抗体は、ＦＦＩ、ピラリン、ＡＦＧＰ、ＡＬＩ、カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、カルボキシエチルリジン（ＣＥＬ，carboxyethyllysine）及びペントシジンなどのＡＧＥ修飾を有する１又は２以上のＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチド、並びにそのような抗体の混合物に結合することができる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナルであってもよい。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。
【００４８】
好ましい抗ＡＧＥ抗体には、カルボキシメチルリジン又はカルボキシエチルリジンＡＧＥ修飾を示すタンパク質又はペプチドに結合するものが含まれる。カルボキシメチルリジン（Ｎ（イプシロン）−（カルボキシメチル）リジン、Ｎ（６）−カルボキシメチルリジン、又は２−アミノ−６−（カルボキシメチルアミノ）ヘキサン酸としても知られる）及びカルボキシエチルリジン（Ｎ−イプシロン−（カルボキシエチル）リジンとしても知られる）は、酸化ストレス及び化学的糖化の結果としてタンパク質又はペプチド及び脂質で見出される。ＣＭＬ及びＣＥＬ修飾タンパク質又はペプチドは、様々な細胞で発現される受容体ＲＡＧＥによって認識される。ＣＭＬ及びＣＥＬは十分に試験されており、ＣＭＬ及びＣＥＬ関連製品が市販されている。例えば、Cell Biolabs, Inc.社は、ＣＭＬ−ＢＳＡ抗原、ＣＭＬポリクローナル抗体、ＣＭＬ免疫ブロットキット、及びＣＭＬ競合的ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cml-assays）並びにＣＥＬ−ＢＳＡ抗原及びＣＥＬ競合的ＥＬＩＳＡキット（www.cellbiolabs.com/cel-n-epsilon-carboxyethyl-lysine-assays-and-reagents）を販売している。好ましい市販の抗ＡＧＥ抗体は、R&D Systems, Inc.社（ミネアポリス、ＭＮ；カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能な、キーホールリンペットヘモシニアンとコンジュゲートされたカルボキシメチルリジンに対して産生されるマウス抗最終糖化産物抗体（Ｃｌｏｎｅ  ３１８００３）である。
【００４９】
抗ＡＧＥ抗体は、配列番号１のタンパク質配列を有する重鎖、及び配列番号３のタンパク質配列を有する軽鎖を有してもよく又は含んでもよい。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ配列番号２及び配列番号４に示されている。さらなる抗ＡＧＥ抗体のＤＮＡ及びタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット、国際特許出願公開第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１８１８５号に見出すことができる。
【００５０】
抗ＡＧＥ抗体は、２つの異なるエピトープを対象にする抗体である二重特異性抗体であってもよい。そのような抗体は、１つの抗ＡＧＥ抗体由来の可変領域（又は相補性決定領域）、及び異なる抗体由来の可変領域（又は相補性決定領域）を含む。
【００５１】
抗体断片が、抗体全体の代わりに使用されてもよい。例えば、免疫グロブリンＧは、酵素による消化によってより小さな断片に分解され得る。パパイン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋のＮ末端側を切断してＦａｂ断片を生成する。Ｆａｂ断片は、軽鎖、及び重鎖の２つのＮ末端ドメイン（Ｆｄ断片としても知られる）のうちの１つを含む。ペプシン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋のＣ末端側を切断してＦ（ａｂ’）２断片を生成する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、軽鎖、及びジスルフィド架橋によって連結された２つのＮ末端ドメインの両方を含む。ペプシン消化はまた、Ｆｖ（可変断片（fragment variable））及びＦｃ（結晶性断片（fragment crystallizable））断片を形成することもできる。Ｆｖ断片は、２つのＮ末端可変ドメインを含有する。Ｆｃ断片は、細胞上の免疫グロブリン受容体、及び補体カスケードの最初のエレメントと相互作用するドメインを含有する。ペプシンはまた、重鎖（ＣＨ３）の第３定常ドメインの前で免疫グロブリンＧを切断して、大きな断片Ｆ（ａｂｃ）及び小さな断片ｐＦｃ’を生成することもできる。抗体断片は、或いは組換え的に生成することができる。
【００５２】
抗体は、周知の方法を用いて生成することができる。例えば、ポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、免疫原、及び所望であればアジュバントの１回又は２回以上の注射によって哺乳動物宿主において産生され得る。典型的には、免疫原（及びアジュバント）は、皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射される。免疫原は、ＡＧＥ−アンチトロンビンIII、ＡＧＥ−カルモジュリン、ＡＧＥ−インスリン、ＡＧＥ−セルロプラスミン、ＡＧＥ−コラーゲン、ＡＧＥ−カテプシンＢ、ＡＧＥ−アルブミン、例えばＡＧＥ−ウシ血清アルブミン（ＡＧＥ−ＢＳＡ）、ＡＧＥ−ヒト血清アルブミン及びオボアルブミンなど、ＡＧＥ−クリスタリン、ＡＧＥ−プラスミノーゲン活性化因子、ＡＧＥ−内皮血漿膜タンパク質、ＡＧＥ−アルデヒドレダクターゼ、ＡＧＥ−トランスフェリン、ＡＧＥ−フィブリン、ＡＧＥ−銅／亜鉛ＳＯＤ、ＡＧＥ−アポＢ、ＡＧＥ−フィブロネクチン、ＡＧＥ−膵臓リボース、ＡＧＥ−アポＡ−Ｉ及びII、ＡＧＥ−ヘモグロビン、ＡＧＥ−Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰアーゼ、ＡＧＥ−プラスミノーゲン、ＡＧＥ−ミエリン、ＡＧＥ−リゾチーム、ＡＧＥ−免疫グロブリン、ＡＧＥ−赤血球グルタミン酸輸送タンパク質、ＡＧＥ−β−Ｎ−アセチルヘキソミナーゼ、ＡＧＥ−アポＥ、ＡＧＥ−赤血球膜タンパク質、ＡＧＥ−アルドースレダクターゼ、ＡＧＥ−フェリチン、ＡＧＥ−赤血球スペクトリン、ＡＧＥ−アルコールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ−ハプトグロビン、ＡＧＥ−チューブリン、ＡＧＥ−甲状腺ホルモン、ＡＧＥ−フィブリノーゲン、ＡＧＥ−β２−ミクログロブリン、ＡＧＥ−ソルビトールデヒドロゲナーゼ、ＡＧＥ−α１−アンチトリプシン、ＡＧＥ−炭酸脱水酵素、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼ、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質、ＡＧＥ−ヘキソキナーゼ、ＡＧＥ−アポＣ−Ｉ、ＡＧＥ−リボヌクレアーゼ、ＡＧＥ−ヘモグロビン、例えばＡＧＥ−ヒトヘモグロビンなど、ＡＧＥ−低密度リポタンパク質（ＡＧＥ−ＬＤＬ）並びにＡＧＥ−コラーゲンIVなどの細胞のＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドであってもよい。完全な、溶解された、又は部分的に消化されたＡＧＥ修飾赤血球などのＡＧＥ修飾細胞はまた、ＡＧＥ抗原として使用することもできる。アジュバントの例には、フロイント完全アジュバント、モノホスホリルリピドＡ合成−トレハロースジコリノミコレート、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、熱ショックタンパク質ＨＳＰ７０又はＨＳＰ９６、モノホスホリルリピドＡを含有するスクアレンエマルジョン、α２−マクログロブリン、並びに油エマルジョン、プルロニックポリオール、ポリアニオン及びジニトロフェノールを含む界面活性物質が含まれる。免疫応答を改善するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ，keyhole limpet hemocyanin）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、コレラ毒素、不安定性エンテロトキシン、シリカ粒子又は大豆トリプシンインヒビターなどの、宿主における免疫原性であるポリペプチドにコンジュゲートされてもよい。好ましい免疫原コンジュゲートは、ＡＧＥ−ＫＬＨである。或いは、ｐＡｂは、ＩｇＹ分子を産生するニワトリで作製され得る。
【００５３】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、宿主又は宿主由来のリンパ球を免疫し、ｍＡｂ分泌（又は分泌する可能性がある）リンパ球を採取し、それらのリンパ球を不死化細胞（例えば、骨髄腫細胞）に融合し、所望のｍＡｂを分泌する細胞を選択することによって作製され得る。ＥＢＶハイブリドーマ法などの他の手法が使用されてもよい。所望であれば、ｍＡｂは、タンパク質Ａセファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫安塩析又は親和性クロマトグラフィーなどの従来の手順によって、培養培地又は腹水液から精製されてもよい。
【００５４】
抗ＡＧＥ抗体は、細胞老化を特徴とする任意の疾患、障害若しくは病的状態の発症を診断する、又は細胞老化を特徴とする任意の疾患、障害若しくは病的状態の進行を測定するのに使用することができる。細胞老化と関連している疾患、障害及び病的状態の例には、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ，amyotrophic lateral sclerosis又はルーゲーリック病）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ，chronic obstructive pulmonary disease）、ハンチントン舞踏病、特発性肺線維症、筋ジストロフィー（ベッカー型、デュシェンヌ型、肢帯及びヤマモト型（Yamamoto's muscular dystrophy）筋ジストロフィーを含む）、黄斑変性症、白内障、糖尿病性網膜症、パーキンソン病、早老症（ウェルナー症候群及びハッチンソンギルフォード早老症を含む）、白斑、嚢胞性線維症、アトピー性皮膚炎、湿疹、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ及び若年性関節リウマチを含む）、アテローム性動脈硬化症、がん及び転移性がん（例えば、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、肺がん、黒色腫、結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん、子宮頸がん、膀胱がん、直腸がん、食道がん、肝臓がん、口腔及び咽頭がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、胃がん、膵臓がん及び網膜芽細胞腫がんを含む）、がん療法関連身体障害又はがん療法副作用、高血圧、緑内障、骨粗しょう症、サルコペニア、悪液質、脳卒中、心筋梗塞、心房細動、移植拒絶、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、放射線曝露、ＨＩＶ治療副作用、化学兵器曝露、中毒症、炎症、腎症、レビー小体病、プリオン病（牛海綿状脳症、クロイツフェルトヤコブ病、スクレイピー、慢性消耗病、クールー病及び致死性家族性不眠症を含む）、脊柱湾曲（lordokyphosis）、自己免疫障害、脂肪組織の喪失、乾癬、クローン病、喘息、加齢の生理学的影響（しわ、老人性色素斑、脱毛、皮下脂肪組織の減少及び皮膚の薄化をなどの「美容的」影響を含む）、特発性ミオパチー（idiopathic myopathy）（例えば、特発性炎症性ミオパチー、特発性炎症性筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、孤発性封入体筋炎及び若年性筋炎を含む）、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ，neuromyelitis optica、デビック病又はデビック症候群）、てんかん並びに副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ，adrenoleukodystrophy、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、Ｘ−ＡＬＤ、脳ＡＬＤ又はｃＡＬＤ）が含まれる。
【００５５】
細胞老化と関連した疾患、障害又は病的状態を発症し得るいずれの対象も、本明細書に記載された方法によって診断され得る。対象は、哺乳動物であってもよい。ヒトは、診断に好ましい対象である。診断され得る他の対象には、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ及びイヌ又はネコなどのコンパニオンアニマルが含まれる。
【００５６】
細胞老化と関連した疾患、障害若しくは病的状態と診断された、又は治療を必要としていると同定された患者は、老化細胞を標的にし、破壊するための老化細胞除去剤を投与され得る。老化細胞除去剤の例には、治療的抗ＡＧＥ抗体、毒素にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体、ダサチニブ及び／又はケルセチンなどのセノリティック剤、並びにそれらの組み合わせが含まれる。老化細胞はまた、治療用超音波の適用によって破壊することもできる。老化細胞破壊法は、所望の治療成績を達成するように組み合わせることができる。例えば、患者は、機能性細胞を残しながら老化細胞を選択的に破壊するために、ダサチニブ及びケルセチン並びに高密度焦点式超音波の組み合わせを投与されてもよい。老化細胞除去剤の治療有効量は、使用される特定の老化細胞除去剤に応じて異なるであろう。例えば、抗ＡＧＥ抗体の適当な投与量レベルは、一般に、約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、及び約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇを含む、約０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ患者体重となるであろう。同様に、併用療法ダサチニブ及びケルセチンの適当な投与量レベルは、一般に、約５ｍｇ／ｋｇ患者体重ダサチニブ及び約５０ｍｇ／ｋｇ患者体重ケルセチンとなるであろう。治療有効性は、細胞表面ＡＧＥを示す細胞の数の反復測定によって監視され得る。
【００５７】
老化細胞除去剤の投与は、サルコペニア、アテローム性動脈硬化症及び転移性がんの治療において有効であると証明されている。老化細胞除去剤の投与による治療に特に適切である、細胞老化と関連した他の疾患、障害及び病的状態には、炎症、自己免疫病、骨関節炎、アルツハイマー病及びパーキンソン病が含まれる。
【００５８】
上記に記載されたインビトロ診断方法に加えて、抗ＡＧＥ抗体はまた、インビボ診断方法において使用することもできる。インビボ診断検査は、ＡＧＥ修飾タンパク質及びペプチドを検出する非侵襲的方法を提供する。インビボ診断検査は、転移性がん細胞などの、細胞表面終末糖化産物を発現する老化細胞を検出するために特に有用である（例えば、国際公開第２０１７／１４３０７３号パンフレット参照）。抗ＡＧＥ抗体は、検出可能な標識又はトレーサーで標識し、次いで対象に投与されてもよい。標識された抗ＡＧＥ抗体は、ＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドに特異的に結合し、標識を検出することができる任意の適切な装置でＡＧＥ修飾タンパク質又はペプチドを検出できるようにする。インビボ診断方法の例には、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ，positron emission tomography）及び免疫ＰＥＴ、磁気共鳴画像（ＭＲＩ，magnetic resonance imaging）、単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ，single photon emission computed tomography）、光学イメージング、超音波、放射免疫シンチグラフィ及びそれらの組み合わせが含まれる。抗体にコンジュゲートされている放射標識、蛍光標識、陽電子放出体、近赤外（ＮＩＲ，near infrared）で放出する色素、金及びガドリニウムなどのナノ粒子、量子ドット、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ，superparamagnetic iron oxide）、カーボンナノチューブ又は微小気泡などの、任意の診断法に適当であるいずれの標識も使用され得る。
【００５９】
図１は、細胞表面終末糖化産物を発現する細胞を検出するためのキット１００を例示する。キットは、抗ＡＧＥ抗体１１０、対照１２０及び、任意で、抗ＡＧＥ抗体を検出するための試薬１３０を含み得る。抗ＡＧＥ抗体、対照及び任意の試薬は、ボトル、アンプル、エンベロープ、試験管、バイアル、フラスコ又はシリンジなどの任意の適切な容器で供給され得る。抗ＡＧＥ抗体及び／又は試薬は、蛍光標識、放射標識又は金粒子などで標識されていてもよい。対照は、既知量のＡＧＥ修飾タンパク質若しくはペプチド、又はＡＧＥ修飾を示す固定若しくは保存細胞を含有する溶液である、二次抗体が作製された動物由来の正常な血清であってもよい。抗ＡＧＥ抗体を検出するための試薬の例には、ロバで作製され、ローダミンで標識された抗ヒトポリクローナル抗体などの二次抗体が含まれる。キットは、容器１４０に収容されていてもよい。キットは、印刷された説明書１５０を含んでいてもよい。好ましくは、キットの内容物は滅菌であり、使用できる状態である。
【００６０】
キットは、キット成分を収容するための容器を含んでいてもよい。容器は、プラスチックなどの強固な耐久性のある材料で形成されてもよく、又は袋若しくは側面が柔らかい箱などのように柔軟であってもよい。
【００６１】
キットは、使用説明書を含んでいてもよい。説明書は、印刷された説明書として、若しくはユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ，universal serial bus）ドライブ、セキュアデジタル（ＳＤ，secure digital）カードなどでの電子フォーマットで提供されてもよく、又はインターネット上で提供され、クイックレスポンス（ＱＲ，quick response）コードを通じてアクセスできてもよい。
【００６２】
キットは、緩衝液、固定液、遮断溶液、プロテアーゼ阻害剤、分析用基材、例えば顕微鏡スライド及び／又はカバースリップ、マイクロタイタープレートなど、並びに界面活性剤及び清浄液などの細胞抽出試薬などの、さらなる診断用材料又は機器を含有していてもよい。
［実施例］
【実施例１】
【００６３】
口腔上皮細胞の収集
患者は生理食塩水を３０秒間口の中でグチュグチュする。患者は次いで、溶液をコップに吐き出す。コップからの生理食塩水１．５ｍＬを次いで、マイクロピペットを用いて遠心分離管に移す。遠心分離管をバランス遠心分離機に入れ、１０，０００〜１４，０００ＲＰＭで２分間遠心分離した。遠心分離は、遠心分離管の底にペレットが見えるまで繰り返してもよい。上清を次いで、デカントして及び／又はマイクロピペットで除去して捨てた。ペレットは、上皮細胞のいずれかが老化しているかを決定するために、細胞表面ＡＧＥの存在について検査され得る単離口腔上皮細胞を含有する。
【実施例２】
【００６４】
皮膚細胞に基づく診断及び治療
表皮細胞は、テープ採取プロセスを用いて収集する。粘着テープ（Adhesives Research社、グレンロック、ＰＡ）を直径約１７ｍｍの円板に加工する。テープを患者の皮膚に適用し、次いで除去して角質層から表皮細胞を採取する。テープ採取をさらに３回繰り返して、合計４つの表皮試料を得る。表皮細胞を次いで細胞表面ＡＧＥの存在について検査して、表皮細胞のいずれかが老化しているかを決定する。
【００６５】
真皮細胞は薄片生検を用いて収集する。外科用メスの刃を使用して、表皮を通り真皮にアクセスして試料を得るのに十分な皮膚を除去する。試料内の線維芽細胞を次いで、細胞表面ＡＧＥの存在について検査して、線維芽細胞のいずれかが老化しているかを決定する。薄片生検における少なくとも５％の老化細胞の存在は、皮膚損傷、及び老化した皮膚細胞の数を低減する治療の必要性を示す。患者は、老化した皮膚細胞を標的にし、除去するための老化細胞除去剤を投与される。
【実施例３】
【００６６】
抗ＡＧＥ抗体を用いた直接結合ＥＬＩＳＡ
マウス及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合を、直接結合ＥＬＩＳＡによって調査した。抗カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）抗体（R&D Systems社、ＭＡＢ３２４７）を対照として使用した。ＣＭＬをＫＬＨ（ＣＭＬ−ＫＬＨ）にコンジュゲートし、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方をＥＬＩＳＡプレートに一晩コーティングした。ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＦｃを使用して、対照及びマウス抗ＡＧＥ抗体を検出した。ＨＲＰ−ヤギ抗ヒトＦｃを使用して、キメラ抗ＡＧＥ抗体を検出した。
【００６７】
抗原を、ｐＨ６．５の１×リン酸緩衝液で１μｇ／ｍＬに希釈した。９６ウェルマイクロタイターＥＬＩＳＡプレートを１００μＬ／ウェルの希釈抗原でコーティングし、４℃で一晩寝かせた。プレートを１×ＰＢＳ、２．５％ＢＳＡでブロックし、翌日室温で１〜２時間静置した。抗体試料を、５０μｇ／ｍＬの開始濃度で１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡによる連続希釈で調製した。二次抗体を１：５，０００希釈した。抗体希釈物１００μＬを各ウェルに適用した。プレートをマイクロプレートシェーカーで０．５〜１時間、室温でインキュベートした。プレートを１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ／ウェル希釈ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ二次抗体をウェルに適用した。プレートをマイクロプレートシェーカーで１時間インキュベートした。プレートを次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬ  ＨＲＰ基質ＴＭＢを各ウェルに添加して、プレートを展開した。３〜５分が経過した後、１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを添加して反応を停止した。２回目の直接結合ＥＬＩＳＡはＣＭＬコーティングのみで行なった。ＯＤ４５０での吸光度を、マイクロプレートリーダーを用いて読み取った。
【００６８】
ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨ  ＥＬＩＳＡのＯＤ４５０吸光度生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレートの９６ウェルのうちの４８ウェルを使用した。プレートマップのブランクウェルは未使用ウェルを示す。
【００６９】
ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨ  ＥＬＩＳＡのプレートマップ：
【００７０】
【表１】
2020521117.tif 000003
【００７１】
ＣＭＬのみのＥＬＩＳＡに関するＯＤ４５０吸光度生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレートの９６ウェルのうちの２４ウェルを使用した。プレートマップのブランクウェルは未使用ウェルを示す。
【００７２】
ＣＭＬのみＥＬＩＳＡのプレートマップ
【００７３】
【表２】
2020521117.tif 000004
【００７４】
対照及びキメラ抗ＡＧＥ抗体は、ＣＭＬ及びＣＭＬ−ＫＬＨの両方への結合を示した。マウス（親）抗ＡＧＥ抗体は、ＣＭＬ又はＣＭＬ−ＫＬＨのどちらかへの極めて弱い結合〜結合無しを示した。反復ＥＬＩＳＡからのデータは、ＣＭＬへの対照及びキメラ抗ＡＧＥ抗体の結合を裏付けている。全ての緩衝液対照は、陰性シグナルを示した。
【００７５】
このデータは、ＡＧＥ及びＡＧＥ−免疫原コンジュゲートに結合する抗ＡＧＥ抗体の能力を裏付けている。周知のＡＧＥカルボキシメチルリジンへの結合の証拠は、診断適用における抗ＡＧＥ抗体の適合性を支持するものである。
【実施例４】
【００７６】
血液試料に基づく診断及び治療
血液試料を患者から採血する。血液試料を遠心分離して血清を単離する。ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を、Miltenyi Biotec社製ＣＤ８＋ＣＤ５７＋  Ｔ細胞単離キット（ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）を用いて単離する。ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を血球計算盤を用いて計数する。血清及び単離ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を次いで、抗ＣＭＬ抗体への結合について検査する。標識抗ＣＭＬ抗体に結合する単離ＣＤ５７＋  Ｔ細胞５０％以上と組み合わされた血清ＣＭＬ  １５２μｇ／ｍＬ以下は、患者が老化細胞除去剤による治療を必要としていることを示す。老化細胞を標的にし、除去する抗ＡＧＥ抗体を患者に投与する。
【実施例５】
【００７７】
口腔スワブに基づく診断及び治療
試料を口腔スワブによって患者から得る。スワブからの口腔上皮細胞及び唾液を分離する。口腔細胞をトリプシン処理し、抗ＣＭＬモノクローナル抗体と混合する。混合物を次いで血球計算盤に通して、老化した口腔細胞を計数する。遊離ＣＭＬを唾液のＥＬＩＳＡによって測定する。抗ＣＭＬ抗体に結合する口腔細胞５０％以上と組み合わされた唾液ＣＭＬ  ３μｇ／ｍＬ以下は、患者が老化細胞除去剤による治療を必要としていることを示す。老化細胞を標的にし、除去する毒素にコンジュゲートされた抗ＡＧＥ抗体を患者に投与する。
【実施例６】
【００７８】
生物学的年齢の決定
試料を口腔スワブによって５０歳患者から得る。スワブからの口腔上皮細胞及び唾液を分離する。口腔細胞をトリプシン処理し、抗ＣＭＬモノクローナル抗体と混合する。混合物を次いで血球計算盤に通して、老化した口腔細胞を計数する。遊離ＣＭＬを唾液のＥＬＩＳＡによって測定する。唾液中の細胞表面ＣＭＬを発現する口腔細胞と遊離ＣＭＬの比は、５：１である。この比は、健康な５０歳に対して予測される比より大きく、患者が、彼女の暦年齢より高い生物学的年齢を有することを証明するものである。結果は、患者が、細胞老化による加齢及び加齢関連疾患、障害又は病的状態の早期発症を経験していることを示している。これらの結果はまた、患者が老化細胞除去剤による治療を必要としていることも示している。
【実施例７】
【００７９】
細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態の診断及び治療
血液試料を４５歳患者から得る。血液試料を遠心分離して血清を単離する。ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を、Miltenyi Biotec社製ＣＤ８＋ＣＤ５７＋  Ｔ細胞単離キット（ベルギッシュグラッドバッハ、ドイツ）を用いて単離する。ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を血球計算盤を用いて計数する。血清及び単離ＣＤ５７＋  Ｔ細胞を次いで、抗ＣＭＬ抗体への結合について検査する。血清中の細胞表面ＣＭＬを発現する細胞と遊離ＣＭＬの比は、１０：１である。この比は、患者が生物学的年齢６５を有することを示している。患者の生物学的年齢が患者の暦年齢を上回ることから、患者は、細胞老化による進行した生物学的老化と関連した疾患、障害又は病的状態と診断される。老化細胞を標的にし、除去する抗ＡＧＥ抗体を患者に投与する。
【実施例８】
【００８０】
抗最終糖化産物抗体の投与のインビボ試験
抗最終糖化産物抗体の効果を調べるために、抗体を３週間にわたり週１回（１、８及び１５日目）、１日２回静脈内注射によって高齢ＣＤ１（ＩＣＲ）マウス（Charles River Laboratories社）に投与し、その後に１０週間の無治療期間が続いた。検査抗体は、キーホールリンペットヘモシニアンとコンジュゲートされたカルボキシメチルリジンに対して産生される市販のマウス抗最終糖化産物抗体であり、R&D Systems, Inc.社（ミネアポリス、ＭＮ：カタログ番号ＭＡＢ３２４７）から入手可能なカルボキシメチルリジンＭＡｂ（Ｃｌｏｎｅ  ３１８００３）であった。対照動物では生理食塩水の対照参照を使用した。
【００８１】
「若齢」と呼ばれるマウスは８週齢であり、一方、「老齢」と呼ばれるマウスは８８週（±２日）齢であった。抗体の投与からの有害事象は見られなかった。試験に使用された動物の種々の群を表１に示す。
【００８２】
【表３】
2020521117.tif 000005
【００８３】
老化細胞のマーカーであるＰ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡを、リアルタイムｑＰＣＲによって群の脂肪組織で定量化した。結果を表２に示す。表中、ΔΔＣｔ＝ΔＣｔ平均対照群（２）−ΔＣｔ平均実験群（１又は３又は５）；倍数発現（fold expression）＝２−ΔΔＣｔ。
【００８４】
【表４】
2020521117.tif 000006
【００８５】
上記の表は、予測通り、未治療老齢マウス（対照群２）が、未治療若齢マウス（対照群１）より２．５５倍多くのＰ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡを発現することを示している。これは、８５日目の回復終了時点で安楽死させた群２未治療老齢マウスを、２２日目の治療終了時点で安楽死させた群１未治療若齢マウスと比較した場合に観察された。群２未治療老齢マウスからの結果を、８５日目に安楽死させた群３治療老齢マウスからの結果と比較した場合、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡは群３より群２で１．２３倍高いことが観察された。したがって、老齢マウスを２．５μｇ／グラム／１日２回／週の抗体で治療した場合、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡ発現のレベルはより低かった。
【００８６】
群２（対照）未治療老齢マウスからの結果を、２２日目に安楽死させた群５（５μｇ／グラム）治療老齢マウスからの結果と比較した場合、Ｐ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡは、群５（５μｇ／グラム）より群２（対照）で３．０３倍高いことが観察された。この比較は、５．０μｇ／グラム／１日２回／週で治療した場合、群５動物はより低レベルのＰ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡ発現を有し、若齢未治療マウス（すなわち群１）に匹敵するｐ１６ＩＮＫ４ａ  ｍＲＮＡ発現レベルを示すことを示した。８５日目の回復終了時点で安楽死させた群３（２．５μｇ／グラム）マウスとは異なり、群５マウスは２２日目の治療終了時点で安楽死させた。
【００８７】
これらの結果は、抗ＡＧＥ抗体の投与が老化細胞の死滅をもたらしたことを証明するものである。
【００８８】
サルコペニアに対する抗体投与の効果を決定するために、腓腹筋量も測定した。結果を表３に示す。結果は、対照と比較して抗体の投与は筋肉量を増加させたが、５．０μｇ／ｇｍ／１日２回／週のより高い投与量でのみ増加させたことを示している。
【００８９】
【表５】
2020521117.tif 000007
【００９０】
これらの結果は、細胞のＡＧＥに結合する抗体の投与が、老化のバイオマーカーであるｐ１６ＩＮＫ４ａを発現する細胞の低減をもたらしたことを証明するものである。データは、老化細胞の低減が老齢マウスにおける筋肉量の増加に直接つながることを示している。これらの結果は、サルコペニアの古典的な徴候である筋肉量の喪失が、細胞のＡＧＥに結合する抗体などの老化細胞除去剤の投与によって治療され得ることを示している。
【００９１】
このデータは、抗ＡＧＥ抗体が、細胞表面ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドを発現する細胞に選択的に結合することができることを裏付けている。選択的結合の証拠は、診断適用における抗ＡＧＥ抗体の適合性を支持するものである。データはまた、抗ＡＧＥ抗体がインビボでの使用に安全であることも証明している。
【実施例９】
【００９２】
検査抗体の親和性及び動態
実施例８で使用した検査抗体の親和性及び動態を、細胞のＡＧＥ修飾タンパク質のモデル基質としてＮα，Ｎα−ビス（カルボキシメチル）−Ｌ−リジントリフルオロ酢酸塩（Sigma-Aldrich社、セントルイス、ＭＯ）を用いて解析した。ラベルフリー相互作用解析をBIACORE（商標）T200（GE Healthcare社、ピッツバーグ、ＰＡ）で、Ｆｃ１をブランクとして設定し、Ｆｃ２を検査抗体（１５０，０００Ｄａの分子量）で固定化したＳｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＣＭ５（GE Healthcare社、ピッツバーグ、ＰＡ）を用いて実施した。ランニング緩衝液は、２５℃の温度のＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．０５％Ｐ−２０、ｐＨ７．４）であった。ソフトウェアは、BIACORE（商標）T200評価ソフトウェア、バージョン２．０であった。解析では二重参照（Ｆｃ２−１及び緩衝液注射のみ）を使用し、データをラングミュア１：１結合モデルにフィットさせた。
【００９３】
【表６】
2020521117.tif 000008
【００９４】
応答対時間のグラフを図２に例示する。以下の値は解析から決定した：ｋａ（１／Ｍｓ）＝１．８５７×１０３；ｋｄ（１／ｓ）＝６．７８１×１０−３；ＫＤ（Ｍ）＝３．６５１×１０−６；Ｒｍａｘ（ＲＵ）＝１９．５２；及びＣｈｉ２＝０．１１４。フィッティングのＣｈｉ２値はＲｍａｘの１０％未満であるため、フィットは信頼性がある。
【実施例１０】
【００９５】
カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投与のインビボ試験
腫瘍増殖、転移の可能性及び悪液質に対するカルボキシメチルリジン抗体の効果を調査した。インビボ試験をマウス乳がん腫瘍モデルを用いてマウスで実施した。メスＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ、Charles River社）は、試験１日目に１１週齢であった。
【００９６】
４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２５３９）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、２５μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１００単位／ｍＬペニシリンＧナトリウム及び１００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。腫瘍細胞を、５％ＣＯ２及び９５％空気の雰囲気中、３７℃で加湿インキュベーターの組織培養フラスコで維持した。
【００９７】
培養乳がん細胞を次いでマウスに移植した。４Ｔ１細胞を対数期増殖中に採取し、移植当日に１×１０６細胞／ｍＬの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。１×１０５  ４Ｔ１細胞（０．１ｍＬ懸濁液）を各検査動物の右側腹部に皮下移植して、腫瘍を惹起した。腫瘍を、その体積が８０〜１２０ｍｍ３の標的範囲に近づいたときに監視した。腫瘍体積を、式：腫瘍体積＝（腫瘍幅）２（腫瘍長さ）／２を用いて決定した。腫瘍体積１ｍｍ３が重量１ｍｇを有するという仮定を用いて、腫瘍重量を概算した。試験１日目として指定した移植１３日後、マウスを、１０８〜１２６ｍｍ３の個々の腫瘍体積及び１１２ｍｍ３の群平均腫瘍体積を有する４群（ｎ＝１５／群）に選別した。４つの治療群を以下の表５に示す。
【００９８】
【表７】
2020521117.tif 000009
【００９９】
抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体を、治療剤として使用した。２５０ｍｇのカルボキシメチルリジンモノクローナル抗体は、R&D Systems社（ミネアポリス、ＭＮ）から入手した。カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投薬溶液を媒体（ＰＢＳ）中１及び０．５ｍｇ／ｍＬで調製して、１０ｍＬ／ｋｇの投薬容量中、それぞれ１０及び５μｇ／ｇの活性投与量を得た。投薬溶液を光から保護して、４℃で保管した。
【０１００】
全ての治療は、マウスに１回投与した試験１日目を除いて、２１日間、１日２回、静脈内（ｉ．ｖ．）投与された。尾静脈劣化のためにｉ．ｖ．投与することができない動物については、試験１９日目にｉ．ｖ．投薬を腹腔内（ｉ．ｐ．）投薬に変更した。投薬容量は、体重（１０ｍＬ／ｋｇ）２０グラムあたり０．２００ｍＬであり、個々の動物の体重に合わせて調整した。
【０１０１】
試験は２３日間継続した。腫瘍を１週間に２回、キャリパーを用いて測定した。動物の体重を１〜５日目は毎日、次いで試験の終了までは１週間に２回測定した。任意の副作用についてもマウスを観察した。許容可能な毒性は、試験期間中の２０％未満の群平均体重減少、及び１０％以下の治療関連死として定義した。治療有効性は、試験の最終日（２３日目）からのデータを用いて決定した。
【０１０２】
腫瘍増殖を阻害する抗カルボキシメチルリジン抗体の能力を、群１〜３の腫瘍体積中央値（ＭＴＶ，median tumor volume）を比較して決定した。腫瘍体積は、上記に記載したように測定した。腫瘍増殖阻害パーセント（ＴＧＩ％）は、対照群のＭＴＶの割合として表される、対照群（群１）のＭＴＶと薬物治療群のＭＴＶとの差として定義した。ＴＧＩ％は、式：ＴＧＩ％＝（１−ＭＴＶ治療／ＭＴＶ対照）×１００に従って計算することができる。
【０１０３】
がん転移を阻害する抗カルボキシメチルリジン抗体の能力を、群１〜３の肺がん病巣を比較して決定した。阻害パーセント（阻害％）は、対照群の転移病巣の平均カウントの割合として表される、対照群の転移病巣の平均カウントと、薬物治療群の転移病巣の平均カウントとの差として定義した。阻害％は、以下の式：阻害％＝（１−病巣治療の平均カウント／病巣対照の平均カウント）×１００に従って計算することができる。
【０１０４】
悪液質を阻害する抗カルボキシメチルリジン抗体の能力を、群１〜３の肺及び腓腹筋の重量を比較して決定した。組織重量はまた、１００ｇ体重に標準化した。
【０１０５】
治療有効性もまた、試験期間中に観察された退縮応答の発生率及び程度によって評価した。治療は、動物における腫瘍の部分的退縮（ＰＲ，partial regression）又は完全退縮（ＣＲ，complete regression）をもたらし得る。ＰＲ応答では、腫瘍体積は、試験の経過中の３回連続測定に関して１日目の体積の５０％以下であり、これらの３回測定のうちの１又は２回以上に関して１３．５ｍｍ３以上であった。ＣＲ応答では、腫瘍体積は、試験の経過中の３回連続測定に関して１３．５ｍｍ３未満であった。
【０１０６】
統計分析を、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ６．０７用Ｐｒｉｓｍ（GraphPad社）を用いて実施した。２群間の２３日目の平均腫瘍体積（ＭＴＶ，mean tumor volume）の差の統計分析を、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定を用いて達成した。転移病巣の比較を、ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔによって評価した。標準化した組織重量をＡＮＯＶＡによって比較した。両側統計分析を有意水準Ｐ＝０．０５で行った。結果を、統計的に有意又は統計的に有意ではないとして分類した。
【０１０７】
試験の結果を以下の表６に示す。
【０１０８】
【表８】
2020521117.tif 000010
【０１０９】
全ての治療レジメンは許容される耐容性を示し、治療関連死はなかった。唯一の動物死は、転移による非治療関連死であった。ＴＧＩ％は、５μｇ／ｇ（群２）及び１０μｇ／ｇ治療群（群３）で有意傾向であった（Ｐ＞０．０５、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）。阻害％は、５μｇ／ｇ治療群で有意傾向であった（Ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔ）。阻害％は、１０μｇ／ｇ治療群で統計的に有意であった（Ｐ≦０．０１、ＡＮＯＶＡ−Ｄｕｎｎｅｔｔ）。悪液質を治療するカルボキシメチルリジン抗体の能力は、治療群と対照群との肺及び腓腹筋の臓器重量の比較に基づき、有意傾向であった（Ｐ＞０．０５、ＡＮＯＶＡ）。結果は、抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投与が、がん転移を低減できることを示している。
【０１１０】
このデータは、抗ＡＧＥ抗体が、細胞表面ＡＧＥ修飾タンパク質又はＡＧＥ修飾ペプチドを発現する細胞に選択的に結合することができることを裏付けている。選択的結合の証拠は、診断適用における抗ＡＧＥ抗体の適合性を支持するものである。データはまた、抗ＡＧＥ抗体がインビボでの使用に安全であることも証明している。
【実施例１１】
【０１１１】
老化した軟骨細胞にインビトロで結合する抗ＡＧＥ抗体
老化した軟骨細胞は、骨関節炎関節から得た。抗ＡＧＥ抗体は、老化した軟骨細胞にインビトロで結合した。これらの結果は、抗ＡＧＥ抗体が、老化細胞に結合することができることを裏付けている。結果はまた、診断適用における抗ＡＧＥ抗体の適合性も裏付けている。
【実施例１２】
【０１１２】
免疫組織化学的試験
組織試料は、アルツハイマー病及びパーキンソン病患者から得た。２つのアルツハイマー病試料は、海馬から採取した。１つのパーキンソン病試料は黒質から採取し、第２のパーキンソン病試料は腹側被蓋野から採取した。全ての細胞を、上記に記載したように抗ＡＧＥ抗体を用いてカルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）に対して染色した。アルツハイマー病細胞は、リン酸化タウ（ホスホタウ）又は別個にアミロイド前駆体タンパク質に対して染色した。パーキンソン病細胞は、アルファシヌクレインに対して染色した。細胞の核染色を、ＤＡＰＩ対比染色を用いて同定した（実験は、アリゾナ州立大学のDiego Mastroeni博士によって実施され、画像が作成された）。
【０１１３】
図３Ａは、赤色に染色されたカルボキシメチルリジン及び緑色に染色されたリン酸化タウを示すアルツハイマー病試料の細胞の写真である。
【０１１４】
図３Ｂは、赤色に染色されたカルボキシメチルリジン及び緑色に染色されたアミロイド前駆体タンパク質を示すアルツハイマー病試料の細胞の写真である。
【０１１５】
図３Ｃは、赤色に染色されたカルボキシメチルリジン及び緑色に染色されたアルファシヌクレインを示す黒質由来のパーキンソン病試料の細胞の写真である。
【０１１６】
図３Ｄは、赤色に染色されたカルボキシメチルリジン及び緑色に染色されたアルファシヌクレインを示す腹側被蓋野由来のパーキンソン病試料の細胞の写真である。
【０１１７】
周知のＡＧＥであるＣＭＬは、アルツハイマー病及びパーキンソン病における確立された病態と共存しなかった。代わりに、ＣＭＬはグリア細胞で見つかった。アルツハイマー病試料におけるＣＭＬ免疫反応性はミクログリアによるものであり、パーキンソン病試料におけるＣＭＬ免疫反応性は星状膠細胞によるものであることが疑われた。結果は、アルツハイマー病及びパーキンソン病における老化したグリア細胞の存在を証明する。抗ＡＧＥ抗体を用いる老化したグリア細胞の除去は、神経幹／前駆細胞によるグリア細胞の再生をもたらすことが予測される（例えば、Leonard, B.W. et al., "Subventricular zone neural progenitors from rapid brain autopsies of elderly subjects with and without neurodegenerative disease", The Journal of Comparative Neurology, Vol. 515, pp. 269-294 (2009)参照）。
【０１１８】
このデータは、様々な神経変性疾患を有する患者から得られた組織試料中の細胞に存在するＡＧＥに結合する抗ＡＧＥ抗体の能力を裏付けている。この証拠は、診断適用における抗ＡＧＥ抗体の適合性をさらに裏付けるものである。
【０１１９】
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【図１】
2020521117.tif 000011
【図２】
2020521117.tif 000012
【図３Ａ】
2020521117.tif 000013
【図３Ｂ】
2020521117.tif 000014
【図３Ｃ】
2020521117.tif 000015
【図３Ｄ】
2020521117.tif 000016
【配列表】
2020521117000001.app
【国際調査報告】
2020521117.tif 000017
2020521117.tif 000018
2020521117.tif 000019
2020521117.tif 000020
2020521117.tif 000021
2020521117.tif 000022