(57)【要約】  操作された腫瘍溶解性ウイルス、それらをコードする関連融合タンパク質およびポリヌクレオチド、ならびに操作されたウイルスを使用して癌を治療する方法が開示されている。一態様において、本明細書に開示されるのは、操作された腫瘍溶解性ウイルスであり、当該腫瘍溶解性ウイルスは、非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する、操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
前記腫瘍溶解性ウイルスが融合性の腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
前記融合性の腫瘍溶解性ウイルスが改変または操作されたパラインフルエンザウイルス５型である、請求項２に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
前記融合性の腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞の融合を可能にする高融合性特性を可能にするペプチドをコードする遺伝子を含む、請求項２に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
前記非切断シグナルアンカーがノイラミニダーゼ膜貫通セグメントである、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドが操作された免疫グロブリンＦｃドメインを含み、
前記免疫グロブリンＦｃドメインは、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変されている、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、請求項６に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項８】
前記ＩｇＧ１ ＦｃドメインがＦｃＲ結合またはＡＤＣＣを増加させるための変更をさらに含む、請求項６に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項９】
前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄのタンパク質アゴニストを含む、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１０】
前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、抗ＣＤ１９に反応性のタンパク質エピトープ領域を含む、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１１】
前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドがＣＤ１９またはＣＤ２０である、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１２】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１またはＩＬ−１５のうちの１つまたは複数を発現するように操作されている、請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１３】
請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の操作された腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項１５】
前記対象に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドの１つもしくは複数を標的とする抗体、または、前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞の１つもしくは複数を標的とするように設計されたＣＡＲ Ｔ細胞を養子移入することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象に、操作された腫瘍溶解性ウイルスを投与することを含む、癌の治療方法であって、
前記腫瘍溶解性ウイルスが非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する、方法。
【請求項１７】
前記１つまたは複数の膜結合免疫細胞標的化リガンドは、操作された免疫グロブリンＦｃドメインを含み、
前記免疫グロブリンＦｃドメインが、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変されている、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つまたは複数の膜結合免疫細胞標的化リガンドは、ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄのタンパク質アゴニストを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が免疫細胞を養子移入することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記養子移入された免疫細胞がナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＫ細胞は、１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤で刺激および増殖される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤は、サイトカイン、成長因子、合成リガンド、ＮＫ細胞刺激粒子、ＮＫ細胞刺激エキソソーム、またはＮＫ細胞刺激フィーダー細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤は、ＮＫ細胞刺激粒子、ＮＫ細胞刺激エキソソーム、またはＮＫ細胞刺激フィーダー細胞であり、
前記１つまたは複数の剤は、ＩＬ−２１、４−１ＢＢＬ、またはその断片を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１５またはそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記ＮＫ細胞が、ＣＤ１９標的化抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体またはＣＤ２０標的化抗ＣＤ２０キメラ抗原受容体を発現するように操作される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫細胞が、操作されたＣＤ１９標的化抗ＣＤ１９ ＣＡＲ−Ｔ細胞または操作されたＣＤ２０標的化抗ＣＤ２０ ＣＡＲ−Ｔ細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記免疫細胞が、前記１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドに特異的な抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記癌は、白血病、リンパ腫、骨髄腫、黒色腫、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌、腎細胞癌、悪性黒色腫、悪性神経膠腫、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、メルケル細胞癌、皮膚癌、脳癌、膵臓腺癌、悪性中皮腫、肺腺癌、肺小細胞癌、肺扁平上皮癌、甲状腺未分化癌、または頭頸部扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＮＫ細胞が遺伝子改変されている、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
細胞質尾部領域、膜貫通領域、および細胞外ストーク領域；並びに前記細胞外ストーク領域のＣ末端に融合したＮ末端を含む免疫細胞標的化リガンド、を含む非切断シグナルアンカードメインを含む、融合タンパク質。
【請求項３１】
前記免疫細胞標的化リガンドは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＣＡＲ−Ｔ細胞からなる群から選択される免疫細胞に結合することができる、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
前記免疫細胞標的化リガンドが、アミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃドメインを含み、前記Ｆｃドメインの前記Ｎ末端が前記細胞外ストークドメインの前記Ｃ末端に融合する、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
前記免疫細胞標的化リガンドが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群より選択される免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記Ｆｃドメインが、２５６Ａ／Ｋ２９０Ａ／Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡまたはＬ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸修飾をさらに含む、請求項３３に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記非切断シグナルアンカードメインは、ノイラミニダーゼ、パラインフルエンザウイルス血球凝集素−ノイラミニダーゼ、トランスフェリン受容体、ＭＨＣクラスＩＩ不変鎖、Ｐ糖タンパク質、アシアロ糖タンパク質受容体、および中性エンドペプチダーゼのシグナルアンカードメインから選択されるシグナルアンカードメインを含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
前記非切断シグナルアンカードメインがノイラミニダーゼシグナルアンカードメインを含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
前記標的化リガンドが、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＮＫ２ＧＤリガンド、および抗リガンドドメインからなる群から選択される、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記標的化リガンドが、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、およびＭＩＣＢから選択されるＮＫ２ＧＤリガンドである、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記標的化リガンドが、ＣＤ１９およびＣＤ２０から選択される抗リガンドドメインである、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
請求項４０に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列。
【請求項４２】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む改変ウイルスゲノムを含む宿主ウイルス。
【請求項４３】
前記宿主ウイルスが腫瘍溶解性ウイルスである、請求項４２に記載の宿主ウイルス。
【請求項４４】
前記宿主ウイルスが、パラインフルエンザウイルス５型、ＣＰＩパラインフルエンザ、野生型パラインフルエンザ、ＣＰＩおよびＷＴパラインフルエンザ由来のＰ／Ｖをコードするウイルス骨格を有するＣＰＩ−ＷＴパラインフルエンザキメラウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、フラビウイルス、フィロウイルス、アレナウイルス、ブンヤウイルス、パラミクソウイルス、ラブドウイルス、ニューモウイルス、オルソミクソウイルス、デルタウイルス、レトロウイルス、ヘパドナウイルス、オルソヘペウイルス、ヒトパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、ＨＳＶ−１腫瘍溶解性ウイルスＨＳＶ１７１６、タリモジーン・ラハーパレプベック、アデノウイルス腫瘍溶解性ウイルスＨ１０１、ポリオウイルス腫瘍溶解性ウイルスＰＶＳＲＩＰＯ、レオウイルス腫瘍崩壊性ウイルスレオシリン、セネカバレーウイルスＳＶＶ−００１、コクサッキーウイルス腫瘍溶解性ウイルスコクサッキーウイルスＡ２１、エンテロウイルス腫瘍溶解性ウイルスリガウイルス、およびワクシニアウイルス腫瘍溶解性ウイルスＧＬ−ＯＮＣ１、またはＪＸ−５９４、から選択される、請求項４２に記載の宿主ウイルス。
【請求項４５】
前記宿主ウイルスが細胞融合性の腫瘍溶解性ウイルスである、請求項４２に記載の宿主ウイルス。
【請求項４６】
癌免疫療法のために免疫細胞を癌細胞に標的化する方法であって、請求項４１のポリヌクレオチドを含む改変腫瘍溶解性ウイルスを得て、前記細胞を前記改変腫瘍溶解性ウイルスと接触させることを含む、方法。
【請求項４７】
請求項４１のポリヌクレオチドをウイルスゲノムに挿入することにより前記腫瘍溶解性ウイルスを改変することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、癌治療として非常に有望である。ＯＶは癌細胞に選択的に広がり、大規模な細胞変性効果を引き起こす。これらのウイルスに感染した死にかけている癌細胞は、ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞をさらに動員して、ウイルス死滅を免れた感染癌細胞を「クリーンアップ」する。
【背景技術】
【０００２】
しかしながら、癌患者は、感染した標的癌細胞を死滅および／または除去する仕事をすることに失敗する免疫系に妥協している場合がある。したがって、必要なのは、新しい腫瘍溶解性ウイルスおよび改善された結果を提供できる当該細胞の使用方法である。
【発明の概要】
【０００３】
操作されたまたは改変された腫瘍溶解性ウイルスに関連する方法および組成物が開示されている。
【０００４】
一態様において、本明細書に開示されるのは、腫瘍溶解性ウイルスが非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する、操作された腫瘍溶解性ウイルスである。
【０００５】
本明細書には、細胞質尾部領域、膜貫通領域および細胞外ストーク（外茎）領域；細胞外ストーク領域のＣ末端に融合したＮ末端を含む免疫細胞標的化リガンドを含む非切断シグナルアンカードメインを含む融合タンパク質も開示される。
【０００６】
一態様において、本明細書に開示されるのは、前述のいずれかの態様の腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、操作された免疫グロブリンＦｃドメイン、ＮＫ細胞受容体ＮＫＧ２Ｄのタンパク質アゴニスト（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢなど）、抗ＣＤ１９（ＣＤ１９など）に反応するタンパク質エピトープ、および／または抗ＣＤ２０（ＣＤ２０など）に反応するタンパク質エピトープを含む。
【０００７】
腫瘍溶解性ウイルスおよび／または任意の前述の態様の融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質も開示され、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは免疫グロブリンＦｃドメインであり、免疫グロブリンＦｃドメイン（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインなど）は、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変されている（すなわち、Ｆｃは細胞表面の細胞外側で発現し、そのＮ末端側は細胞表面から最大距離にあるのではなく、細胞膜の表面近くの膜アンカーペプチドに付着している）。一態様において、本明細書に開示されるのは、前述のいずれかの態様の腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、ＦｃドメインのＮ末端は、非切断シグナルアンカーの細胞外ストーク領域のＣ末端に融合している。
【０００８】
一態様において、本明細書に開示されるのは、操作された腫瘍溶解性ウイルスであり、操作された腫瘍溶解性ウイルスは、融合性の腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの態様では、融合性の腫瘍溶解性ウイルスが改変または操作されたパラインフルエンザウイルス５型であり得る。融合性の腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞の融合を可能にする高融合性特性を可能にするペプチドをコードする遺伝子を含む、前述のいずれかの態様の融合性の腫瘍溶解性ウイルスも開示される。一態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、前述のいずれかの態様の融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むように改変または操作される。
【０００９】
腫瘍溶解性ウイルスがＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１つまたはＩＬ−１５のうちの１つまたは複数を発現するように操作されている、前述のいずれかの態様の腫瘍溶解性ウイルスも開示される。
【００１０】
一態様において、本明細書に開示されるのは、前述のいずれかの態様の、操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を対象に投与することを含む、癌の治療方法である。
【００１１】
抗体または免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、遺伝子改変ＮＫ細胞、および／またはＣＡＲ Ｔ細胞）を養子移入することをさらに含む、前述のいずれかの態様の癌を治療する方法も開示される。
【００１２】
一態様において、本明細書に開示されるのは、前述のいずれかの態様の癌を治療する方法であり、ここで、ＮＫ細胞は、１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤、例えば、サイトカイン、成長因子、合成リガンド、ＮＫ細胞刺激粒子、ＮＫ細胞刺激エキソソーム、またはＮＫ細胞刺激フィーダー細胞などで刺激および増殖される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付図面は、いくつかの実施形態を示しており、説明とともに開示された組成物および方法を示している。
【００１４】
【図１】図１は、標的化可能抗原を欠く腫瘍の治療の概略図であり、抗体の膜結合Ｆｃ領域（ＭＢ＿Ｆｃ）または膜結合標的化可能リガンド（ＭＢ＿ＴＬ）を送達するように操作された腫瘍標的化腫瘍溶解性ウイルスで処理されて感染される；（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＣＤ１９、および／またはＣＤ２０）。ＮＫ細胞受容体アゴニストではないＭＢ＿ＴＬを使用すると、ＴＬに対する治療抗体で腫瘍を治療できる（例えば、抗−ＣＤ２０−リツキシマブ、オファツムマブ、オブチヌツズマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブ、または抗ＣＤ１９ ＭＤＸ１３４２、ＭＥＤＩ−５５１、ＡＦＭ１１、ＸｍＡｂ ５８７１、ＭＯＲ−２０８、ＳＧＮ−１９Ａ、ＳＡＲ３４１９、ブリナツモマブ、またはタプリツモマブ）。次に、Ｆｃまたは抗ＴＬ抗体でマークされた腫瘍を、例えばＣＤ１６＋ＮＫ細胞などの抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が可能な養子移入細胞で治療することができる。
【００１５】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、非切断シグナルアンカーを含む膜結合免疫細胞標的化リガンドの構築を示す。図２Ａは、Ｉ型およびＩＩ型の内在性膜タンパク質の構造とそれぞれのシグナルアンカーを示す。図２Ｂは、膜結合免疫細胞標的化リガンドで使用される非切断シグナルアンカーの構造を示す。
【００１６】
【図３】図３Ａは、膜結合免疫細胞標的化リガンドの挿入点と融合性突然変異の部位を含む、操作された腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子の概略図を示す。
【００１７】
図３Ｂは、腫瘍溶解性ウイルスによる感染後のベロ細胞の顕微鏡写真を示す。
【００１８】
図３Ｃは、模擬（偽）治療された腫瘍標的と比較して、操作された腫瘍溶解性ウイルスを治療した場合、ＰＭ２１活性化ＮＫ細胞が腫瘍細胞をより効果的に認識して殺すことを示す。
【００１９】
図３Ｄは、ノイラミニダーゼシグナルアンカーを含むＦｃドメインを含み、ノイラミニダーゼのストーク長さを増加させる膜結合免疫細胞標的化リガンドの代替構造を示す。
【００２０】
【図４】図４は、膜結合免疫細胞標的化リガンド配列の例を示す。ここで、ノイラミニダーゼシグナルアンカーは、ＲＳリンカー（すなわち、制限部位リンカー）によってＩｇＧ Ｆｃドメインに融合されている。
【００２１】
【図５】図５は、ＮＡ−Ｆｃ構築物を運ぶプラスミドによってトランスフェクトされたときに感染細胞の表面に膜結合Ｆｃ標的化リガンドを正しく発現するＮＡ−Ｆｃ融合構築物の能力に関するフローサイトメトリー分析を示す。
【００２２】
【図６】図６は、Ｐ／Ｖ／ＦウイルスがＡ５４９細胞をＮＫ細胞殺傷に対して感作することを示す。Ａ５４９肺癌細胞株は偽感染またはＰ／Ｖ／Ｆウイルスに感染させた。感染後、ＮＫ細胞を示された比率で細胞に加え、４時間インキュベートした。細胞死は、Ｃｙｔｏｔｏｘ Ｇｌｏｗ Ａｓｓａｙを使用して測定された。ＮＫのみとターゲット（模擬感染（偽感染）またはＰ／Ｖ／Ｆに感染）のみのウェルを対照として含めた。
【００２３】
【図７】図７は、ゼオシン選択下でＮＡ１−Ｆｃ構築物をトランスフェクトしたＡ５４９肺癌細胞が細胞表面にＦｃを発現することを示す。Ａ５４９肺癌細胞株にＮＡ１−Ｆｃの発現をコードする構築物をトランスフェクトし、ゼオシンの存在下で培養した。細胞を抗ヒトＦｃ−ＡＰＣ抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。親細胞を対照として使用した。
【００２４】
【図８】図８は、腫瘍におけるＦｃの発現とＰ／Ｖ／Ｆの感染がＮＫ細胞によるＡ５４９細胞の殺傷を増加させることを示す。表面にＦｃを安定的に発現しているＡ５４９細胞またはＡ５４９細胞（Ａ５４９−Ｆｃ）にモックまたはＰ／Ｖ／Ｆを感染させ、ＮＫ細胞と標的が１：１つまたは１：３の割合でＮＫ細胞とインキュベートした。細胞死は、それぞれの標的のみの細胞を含む対照を参照して、標的ゲート内の生細胞イベントを測定するフローサイトメトリーによって決定された。
【００２５】
【図９】図９は、ＮＡ１−Ｆｃ−ＮＡ４−ＦｃコンストラクトをトランスフェクトしたＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞が、ＦＡＣＳソーティング後に細胞表面にＦｃを発現することを示す。ＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株に、ＮＡ１−Ｆｃ、ＮＡ２−Ｆｃ、ＮＡ３−ＦｃまたはＮＡ４−Ｆｃの発現をコードする構築物をトランスフェクトした。数日後、細胞を抗ヒトＦｃ−ＡＰＣ抗体で染色し、ＦＡＣＳで選別してＦｃ発現細胞集団サイトメトリーを濃縮した。選別された細胞は、テストされたすべての構築物について、安定であるが可変レベルのＦｃの発現を示す。親細胞を対照として使用した。
【００２６】
【図１０】図１０は、ＮＡストークの長さが増加すると、表面に発現したＦｃドメインの認識を介してＮＫ細胞の殺傷が改善されることを示す。（ＮＡ１−ＮＡ４）−Ｆｃの安定発現を伴うまたは伴わないＳＫＯＶ−３細胞を、ＮＫ：標的の３：１比でＮＫ細胞と混合した。細胞死は、それぞれの標的のみの細胞を含む対照を参照して、標的ゲート内の生細胞イベントを測定するフローサイトメトリーによって決定された。死滅は、ＳＫＯＶ−３の細胞表面のＦｃの密度ではなく、ＮＡストークの長さと相関する（図９）。
【００２７】
【図１１】図１１は、腫瘍でのＦｃの発現とＰ／Ｖ／Ｆの感染により、ＮＫ細胞によるＳＫＯＶ−３細胞の死滅が増加することを示す。表面にＮＡ１−Ｆｃを安定して発現するＳＫＯＶ−３細胞（ＳＫＯＶ−３−Ｆｃ）またはＳＫＯＶ−３細胞に模擬感染またはＰ／Ｖ／Ｆを感染させ、標的対ＮＫセル比が１：１つまたは１：３でＮＫ細胞とインキュベートした。細胞死は、それぞれの標的のみの細胞を含む対照を参照して、標的ゲート内の生細胞イベントを測定するフローサイトメトリーによって測定された。両方とも、表面でのＦｃの発現とＰ／Ｖ／Ｆの感染は、ＮＫ細胞によるＳＫＯＶ−３細胞の死滅の増加につながり、この効果は相加的である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法が開示および説明される前に、それらは、特に明記しない限り、特定の合成方法または特定の組換えバイオテクノロジー方法に限定されるものではなく、他に特定しない限り特定の試薬に限定されないため、当然、変化する可能性があることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００２９】
Ａ．定義
明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及には、２つ以上のそのような担体の混合物などが含まれる。
【００３０】
本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。さらに、各範囲のエンドポイントは、他のエンドポイントに関連して、および他のエンドポイントとは無関係に重要であることがさらに理解される。また、本明細書に開示されているいくつかの値があり、各値は、値自体に加えて「約」その特定の値としても本明細書に開示されていることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示されている。当業者によって適切に理解されるように、値が開示される場合、値以下、値以上、および値間の可能な範囲も開示されることも理解される。例えば、値「１０」が開示されている場合、「１０以下」および「１０以上」も開示されている。また、出願全体で、データはさまざまな形式で提供され、このデータはエンドポイントと開始点、およびデータポイントの任意の組み合わせの範囲を表すことも理解されている。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント１５が開示されている場合、１０および１５に等しい、より大きい、以上、より少ない、以下、とみなされ、同様に１０から１５とみなされることが理解される。また、２つの特定のユニットの間の各ユニットも開示されることが理解される。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３、１４も開示されている。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語を参照する。
【００３２】
「任意」または「任意に」とは、後に説明するイベントまたは状況が発生する場合と発生しない場合があり、説明にはそのイベントまたは状況が発生する場合と発生しない場合が含まれることを意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「Ｎ末端側」または「アミノ末端」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の方向性を指し、Ｎ末端を意味しない場合がある。いくつかの態様では、キメラまたは融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質が議論される場合、Ｎ末端側は、構造全体ではなく、キメラまたは融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の成分のみを指してもよい。例えば、非切断シグナルアンカーを含むＦｃドメインが議論されており、Ｆｃドメインが細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになると記載されている場合、本明細書で企図されるのは、シグナルアンカーがキメラまたは融合構築物のＮ末端にあり、実際に細胞膜に及ぶキメラまたは融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である。したがって、このようなキメラでは、アンカーはＦｃドメインよりもアミノ末端に近く、しかし、Ｆｃドメインの方向性は、細胞に面したＮ末端側を持っており、これは、典型的には細胞膜に及ぶカルボキシ末端および細胞外マトリックスに伸びるアミノ末端を有する典型的なＢ細胞のＦｃドメインの配向に対して反転している。
【００３４】
この出願全体で、さまざまな出版物が参照されている。これらが関連する最新技術をより完全に説明するために、これらの出版物の開示は、その全体が参照により本出願に組み込まれる。開示された参考文献は、参考文献が依拠する文で議論されている資料に含まれる資料について、個別におよび具体的に参照により本明細書に組み込まれる。
【００３５】
Ｂ．組成物
開示される組成物を調製するために使用される成分、ならびに本明細書に開示される方法内で使用される組成物自体が開示される。これらの資料およびその他の資料は、本書で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、グループなどが開示されている場合、これらの化合物のさまざまな個々のおよび集合的な組み合わせおよび順列の具体的な参照は明示的に開示されていない可能性があるが、それぞれが本明細書で特に企図され、説明されていることが理解される。例えば、特定の腫瘍溶解性ウイルスまたは融合タンパク質が開示および議論され、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合タンパク質を含む多数の分子に対して行うことができる多数の修飾が議論されている場合、特に意図されるのは、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合タンパク質のありとあらゆる組み合わせおよび順列、および特に反対の指示がない限り可能な修飾である。したがって、分子のクラスＡ、Ｂ、およびＣが開示されている場合、分子のクラスＤ、Ｅ、およびＦと組み合わせ分子の例が開示されている場合、Ａ−Ｄが開示され、その場合、それぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれが個々におよび集合的に意味の組み合わせを意図している場合でも、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆは開示されているとみなされる。同様に、これらのサブセットまたは組み合わせも開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブグループは開示されていると見なされる。この概念は、開示された組成物を作成および使用する方法のステップを含むがこれに限定されない、本出願のすべての態様に適用される。したがって、実行可能なさまざまな追加のステップがある場合、これらの追加のステップのそれぞれは、開示された方法の特定の実施形態または実施形態の組み合わせで実行できることが理解される。
【００３６】
癌細胞に優先的に感染して死滅させる腫瘍溶解性ウイルス（ＯＶ）は、癌治療として有望である。ＯＶは癌細胞に選択的に広がり、大規模な細胞変性効果を引き起こす。これらのウイルスに感染した死にかけている癌細胞は、ＮＫ細胞や細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫細胞をさらに動員して、ウイルスによる死を免れた感染癌細胞を「クリーンアップ」する。癌患者では、免疫系が頻繁に損なわれ、仕事をすることができないため、養子免疫細胞移植との併用により、結果が改善される可能性がある。
【００３７】
ＮＫ細胞などの免疫細胞は、感染細胞の破壊を直接標的にする。例えば、ＮＫ細胞は、さまざまな方法で腫瘍細胞、ストレスを受けた細胞、ウイルス感染した細胞を効率的に破壊する。１つ目は、標的細胞に直接関与し、膜に浸透し、次にいくつかのアポトーシスタンパク質を切断および活性化するタンパク質を注入することにより、標的細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）を開始することである。ＮＫ細胞の表面には、アポトーシスのプログラム細胞死についての内部信号をオンにする標的細胞上の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）の受容体などの受容体に結合して活性化できるタンパク質リガンドも含まれている。刺激されると、ＮＫ細胞はウイルスや腫瘍を阻害するだけでなく、他の免疫細胞への侵入を知らせるＩＮＦγやＴＮＦαなどのサイトカインも分泌する。
【００３８】
組換え核酸修飾の使用により、腫瘍細胞における融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現が、癌細胞を標的とするＮＫ細胞の動員を改善するように、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を操作または改変することができると理解されおよび本明細書で意図される。本明細書で互換的に使用される場合、「融合ペプチド」、「融合ポリペプチド」、および「融合タンパク質」という用語は、２つ以上の無関係のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質からのドメインを含むように設計された（遺伝子操作された）ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指す。いくつかの態様では、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、構成要素２つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のそれぞれのすべてまたは一部を含み、結合して融合物を形成する。
【００３９】
したがって、本発明の一態様は、本明細書に開示されるように、操作された融合タンパク質、すなわち、操作された腫瘍溶解性ウイルスによって発現される外因性膜結合標的化リガンドに関する。ここで使用されているように、「融合タンパク質」という用語は「キメラタンパク質」と同義語であり、以下でさらに詳細に説明するように、細胞質尾部領域、膜貫通領域および細胞外ストーク領域を含む第１の非切断シグナルアンカーポリペプチドを指し、第１のポリペプチドは、免疫細胞標的化リガンドポリペプチドに機能的に連結されている。「作動可能に連結された」という用語は、２つのポリペプチドの融合、すなわち、各領域の他方へのインフレームの融合を指す。融合は、２、３、４、５、６、７、８、９、２０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０以上のアミノ酸からなる短いポリペプチドリンカーを使用して、または使用せずに達成できる。例えば、標的化リガンドポリペプチドは、そのＮ末端で第１のポリペプチドのＣ末端に融合され得る。
【００４０】
一態様では、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、本明細書に開示される外因性膜結合標的化リガンドである。したがって、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、以下を含む非切断シグナルアンカードメインを含むことができる：細胞質尾部領域、膜貫通領域および細胞外ストーク領域；免疫細胞標的化リガンドであって、免疫細胞標的化リガンドのＮ末端が細胞外ストーク領域のＣ末端に融合している（例えば、図２Ｂを参照）。言い換えれば、融合タンパク質が細胞内で発現される場合、免疫細胞標的化リガンドは、免疫細胞標的化リガンドの自然発生の配向と比較して、細胞に対して逆向きで細胞膜に結合される。
【００４１】
一態様では、非切断シグナルアンカードメインは、図２Ａの下側パネルに概略的に示されているＩＩ型内在性膜タンパク質に由来する。ＩＩ型内在性膜タンパク質は一般に、細胞内のＮ末端、すなわち、細胞質尾部領域、膜貫通領域、細胞外ストーク領域、およびＣ末端を有する球状頭部領域を含む。本明細書に開示されるように、非切断シグナルアンカードメインは、細胞質尾部領域、膜貫通領域、および細胞外ストーク領域を含むが、球状頭部領域を欠いている。非切断シグナルアンカードメインは、例えば、ノイラミニダーゼ、パラインフルエンザウイルス血球凝集素−ノイラミニダーゼ、トランスフェリン受容体、ＭＨＣクラスＩＩ不変鎖、Ｐ糖タンパク質、アシアロ糖タンパク質受容体、または中性エンドペプチダーゼなどのＩＩ型内在性膜タンパク質の関連部分を含むことができる。例示的な態様において、図２Ｂに示すように、非切断シグナルアンカードメインはノイラミニダーゼシグナルアンカードメインを含む。
【００４２】
免疫細胞標的化リガンドは、例えば、結合することができ、例えば、免疫細胞に選択的に結合することができ、アミノ酸修飾を含むリガンドであって、リガンドのＮ末端は、非切断シグナルアンカードメインの細胞外ストークドメインのＣ末端に（ペプチドリンカーを介して）融合しまたは融合される。リガンドは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはＣＡＲ−Ｔ細胞などの免疫細胞に結合することができる既知のリガンドから選択することができる。そのようなリガンドには、例えば、ＩｇＧ１（図２Ｂに示す）、あるいはＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４などの免疫グロブリンＦｃドメインが含まれる。本明細書に記載の逆方向を達成するのに適したＦｃドメインへのアミノ酸修飾には、２５６Ａ／Ｋ２９０Ａ／Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡまたはＬ２３５Ｖ／Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌが含まれる。あるいは、標的化リガンドは、例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、およびＭＩＣＢなどのＮＫ２ＧＤリガンド、またはＣＤ１９やＣＤ２０などの抗リガンドドメインから選択される。
【００４３】
非限定的な例として、本明細書に開示される融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と十分に同一または由来するアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。本明細書に開示される融合タンパク質は、配列番号１の完全長配列よりも少ないかまたは多いアミノ酸を有するポリペプチドを包含し、配列番号１の配列を有する融合タンパク質によって示される標的化リガンドと同じ膜固定機能を示す。本開示による有用な融合タンパク質の例は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約４５％、好ましくは５５％、６５％、７５％、８５％、９５％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質を含み、配列番号１の融合タンパク質の機能的活性を保持する。より具体的には、本開示による融合タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００４４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性は、２つの配列を端から端まで並べて、２つの配列間のアミノ酸またはヌクレオチドの一致数を最適化することにより決定でき、例えば、ギャップを第１のアミノ酸または核酸配列の配列に導入して、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントを得ることができる。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。最初の配列の位置が、２番目の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント配列同一性は、配列が共有する同一の位置の数の関数である（すなわち、％配列同一性は、同一の位置の数／位置の総数×１００である）。
【００４５】
２つの配列間のパーセント配列同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。当該分野で公知であり、２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modified as in Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝ １００、ワード長＝１２で実施して、本発明のアドヘシン核酸分子に類似または相同のヌクレオチド配列を得ることができる。比較のためにギャップのあるアライメントを取得するには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に説明するように、ギャップのあるＢＬＡＳＴを利用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。
【００４６】
融合タンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で公知の標準的な組換えＤＮＡ技術により産生され得る。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術を適用してインフレームで連結される。適切な技術には、ライゲーションに平滑末端またはスタッガー末端を使用すること、適切な末端を提供する制限酵素消化、必要に応じて粘着末端の充填、望ましくない結合を避けるためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素ライゲーションが含まれる。あるいは、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、２つの連続した遺伝子断片間に相補的なオーバーハングを生じさせるアンカープライマーを使用して実行され、その後、アニールおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成することができる（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons: 1992を参照）。
【００４７】
本明細書に開示される融合タンパク質をコードする融合遺伝子は、第１のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列から停止コドンを除去し、次にライゲーションまたはオーバーラップ伸長ＰＣＲによりフレーム内で第２のポリペプチドタンパク質をコードするｃＤＮＡを加えることにより作成できる。場合により、アミノ酸の短い配列（例えば、約２〜約２０アミノ酸の配列）を、第１のポリペプチドと第２のポリペプチド間のリンカーとして操作することができる。次いで、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む得られた融合遺伝子を、例えば、本明細書に開示されるように操作された腫瘍溶解性ウイルスを含む宿主ウイルスのゲノムに導入することができる。宿主ウイルスが宿主細胞に接触し、その改変された遺伝子パッケージを細胞の細胞質に送達すると、融合遺伝子は単一の融合タンパク質として宿主細胞によって発現される。
【００４８】
上記のように、開示されている腫瘍溶解性ウイルスは、標的癌部位の免疫細胞（ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、先天性リンパ系細胞、マクロファージ、Ｂ細胞（形質細胞を含む））の数を最大化するように改変または操作でき、したがって、免疫細胞活性（例えば、ＮＫ細胞活性、Ｔ細胞活性、ＣＡＲ Ｔ細胞活性、および／またはＢ細胞活性（形質細胞および抗体活性を含む）を増加させて、非修飾腫瘍溶解性ウイルスが行うよりも多くの癌を排除する。本明細書で使用される「腫瘍溶解性ウイルス」は、癌細胞に対して向性であり、癌細胞を死滅させるウイルスを指す。腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞を選択的に攻撃するように操作できる。したがって、一態様では、本明細書で開示されるのは、腫瘍溶解性ウイルスが非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する操作された腫瘍溶解性ウイルスである。いくつかの態様では、操作された腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書に開示される融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の１つまたは複数を発現する。
【００４９】
一態様では、開示された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、ＮＫ細胞に対する親和性を高めるために１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド（例えば、ＮＫ細胞標的化リガンドなど）を発現または含むように修飾されている。本明細書で使用される場合、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、免疫細胞活性の標的として役立ち得る任意の外因性ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を指し、ＮＫ細胞活性、Ｂ細胞活性、Ｔ細胞活性、ＣＡＲ Ｔ細胞活性などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、態様において、腫瘍溶解性ウイルスは、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む融合タンパク質を含む外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むことができる。開示された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の膜結合免疫細胞標的化リガンドは、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞、またはＣＡＲ Ｔ細胞によって結合され得る。一態様では、免疫細胞標的化リガンドは、シグナル伝達アンカーを含むように修飾を介して膜結合している。免疫細胞標的化リガンドは、例えば、ＮＫ細胞上のＣＤ１６のリガンドである免疫グロブリンＦｃドメイン、ＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド、または抗体またはＣＡＲ Ｔ細胞の標的を含むことができる。一態様では、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、例えばＦｃドメイン（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４）などのＮＫ細胞受容体によって直接結合できることが理解され、本明細書で企図され、ＮＫ２ＧＤリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）、または、抗リガンド抗体（例えば、抗ＣＤ１９または抗ＣＤ２０抗体が結合できるＣＤ１９またはＣＤ２０）を使用して、ＮＫ細胞が間接的に結合でき、または、抗リガンドＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞など）によって直接標的とすることができる。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、免疫細胞標的化リガンドを含む融合タンパク質および１つまたは複数の免疫細胞標的化リガンドを含む腫瘍溶解性ウイルスであり、免疫細胞標的化リガンドは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４からなる群より選択されるＦｃドメインである。
【００５０】
Ｆｃドメインは、ＮＫ細胞の表面にあるＣＤ１６（Ｆｃγ ＲＩＩＩ）が結合するリガンドである。ＣＤ１６はＮＫ細胞の主要な受容体の１つであり、ＣＤ１６が抗体のＦｃ部分（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインなど）に結合する場合、これにより、ＮＫ細胞の抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）が活性化される。ただし、抗体のＦｃ部分は通常、分泌された場合にのみ利用可能である。Ｂ細胞に見られる膜結合抗体受容体が存在する場合、Ｆｃ部分は通常、細胞のサイトゾルに向けられる。したがって、本明細書に開示される改変腫瘍溶解性ウイルスでは、Ｆｃドメインは、感染した腫瘍標的の膜上で発現されると細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変され、したがって細胞の表面に結合した細胞外抗体の向きを模倣する。一態様において、本明細書に開示されるのは、非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する改変または操作された腫瘍溶解性ウイルスであり、１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変された免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）である（すなわち、Ｆｃは細胞表面の細胞外側で発現し、そのＮ末端側は細胞表面から最大距離にあるのではなく、細胞膜の表面近くの膜アンカーペプチドに付着している）。
【００５１】
Ｆｃドメインは、単量体、二量体、または多量体の構築物として提示できることが理解され、本明細書で企図される。一態様において、Ｆｃドメインをさらに修飾して、抗体媒介性殺傷、ＮＫ細胞認識を強化し、活性化Ｆｃ受容体の拡大を制御することができる。例えば、Ｆｃドメインを変更して、ＣＤ１６の親和性を高めることができる。したがって、例えば、Ｆｃドメインは、例えばＴ２５６Ａ、Ｋ２９０Ａ、Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｌ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、および／またはＰ３９６Ｌなどの１つまたは複数の突然変異を含むこととしてもよい。同様に、Ｆｃドメインをさらに修飾して、活性化（ＩＩＩａ）受容体と阻害性Ｆｃ（ＩＩｂ）受容体の結合の選択性を高めることができる。したがって、例えば、Ｆｃドメインは、例えばＳ２３９Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｖ３０５Ｉ、および／またはＰ３９６Ｌなどの１つまたは複数の突然変異を含むこととしてもよい。
【００５２】
ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞上の受容体を活性化して、標的細胞のアクチン再編成（細胞分極）と脱顆粒を引き起こす。ＮＫＧ２Ｄは、通常は完全に存在しないか、正常細胞の表面に低レベルでしか存在しないが、感染、形質転換、老化、ストレスを受けた細胞によって過剰発現される誘導自己タンパク質を認識する。ＮＫＧ２Ｄのリガンドは、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列（ＭＩＣ）およびレテン酸初期転写物１（ＲＡＥＴ１）／ＵＬＢＰファミリーに由来し、ストレスを受けた悪性形質転換細胞および感染細胞の表面に現れる。ＭＩＣは表面糖タンパク質である。ＭＩＣファミリーのタンパク質（ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）は構造的にＭＨＣと類似しているが、β２−ミクログロブリンまたはＭＨＣのようなペプチドとは関連していない。ＭＩＣファミリータンパク質は、細胞外ドメイン（α１α２α３ドメイン）、膜貫通ドメイン、およびＣ末端細胞質尾部で構成されている。ＲＡＥＴ１ファミリーは、細胞外ドメイン（α１α２ドメイン）、膜貫通ドメイン、およびＣ末端細胞質尾部を含む表面糖タンパク質である。ＲＡＥＴ１ファミリーは、ＮＫＧ２Ｄのストレス誘発性リガンドとして機能し、ＭＨＣクラス１分子に関連している。一態様では、本明細書に開示されるのは、非切断シグナルアンカーを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であって、１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドはＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）である。
【００５３】
外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド、すなわち、本明細書に開示されるように操作された腫瘍溶解性ウイルスによってコードされる融合タンパク質は、感染した癌細胞の表面に存在するように改変される。一態様では、この膜結合提示は、非切断シグナルアンカーの使用により達成され得る。シグナルアンカーは、コードされたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を細胞表面膜に保持するシグナル配列を含むことができる。例えば、シグナルアンカーは、ノイラミニダーゼの膜貫通ドメイン、パラインフルエンザウイルス血球凝集素−ノイラミニダーゼからのシグナルアンカー、トランスフェリン受容体からのシグナルアンカー、ＭＨＣクラスＩＩ不変鎖からのシグナルアンカー、Ｐ糖タンパク質からのシグナルアンカー、アシアロ糖タンパク質受容体からのシグナルアンカー、または中性エンドペプチダーゼからのシグナルアンカーであり得る。あるいは、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、アミノ末端に追加の正荷電アミノ酸を含むアミノ酸置換をコードするように改変することができる。一態様では、外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドは、ＲＳリンカーなどのリンカーの使用によりシグナルアンカーが標的化リガンドに結合または融合された融合タンパク質であり得る。したがって、一態様では、１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む腫瘍溶解性ウイルス並びに／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、膜結合免疫細胞標的化リガンドは非切断シグナルアンカーを含む。一態様では、免疫細胞標的化リガンドは、アミノ酸修飾を含む免疫グロブリンＦｃドメインを含み、ＦｃドメインのＮ末端がシグナルアンカードメインの細胞外ストークドメインのＣ末端に融合する。一態様では、本明細書に開示されるのは、操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質であり、腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、または１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドおよび非切断シグナルアンカーを含むタンパク質であり、ここで、非切断シグナルアンカーは、ノイラミニダーゼ、パラインフルエンザウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、トランスフェリン受容体、ＭＨＣクラスＩＩ不変鎖、Ｐ糖タンパク質、アシアロ糖タンパク質受容体、または中性エンドペプチダーゼである。例えば、操作された腫瘍溶解性ウイルスは、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）およびノイラミニダーゼシグナルアンカードメインを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、ここで、Ｆｃドメインは、細胞に関してＦｃドメインの天然に生じる配向と比較して、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変されている。言い換えれば、免疫細胞標的化リガンドが免疫グロブリンＦｃドメインを含む本明細書に記載の融合ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質において、Ｆｃドメインは細胞表面の細胞外に発現し、そのＮ末端側は細胞表面から最大距離にあるのではなく、細胞膜の表面近くの膜アンカーペプチドに付着する。あるいは、本明細書に記載され、��作された腫瘍溶解性ウイルスにコードされる融合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）およびノイラミニダーゼシグナルアンカードメイン；またはＣＤ２０とノイラミニダーゼシグナルアンカードメイン；および／またはＣＤ１９およびノイラミニダーゼシグナルアンカードメインを含むことができる。
【００５４】
膜結合免疫細胞標的化リガンドおよび非切断シグナルアンカーを含む融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の一実施形態は、配列番号１：MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKに示され、図４に示されている。
【００５５】
本明細書で議論されるように、融合ペプチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質；外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド；および／または既知であり本明細書で企図されるシグナルアンカードメインの多数の変異体がある。タンパク質変異体および誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列の改変を伴い得る。例えば、アミノ酸配列の改変は、通常、置換、挿入、または欠失の３つのクラスの１つ以上に分類される。挿入には、アミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。通常、挿入は、アミノまたはカルボキシル末端融合の挿入よりも小さな挿入であり、例えば、１〜４残基のオーダーである。実施例に記載されているような免疫原性融合タンパク質誘導体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの架橋または融合をコードするＤＮＡで形質転換された組換え細胞培養により、標的配列に免疫原性を付与するのに十分な大きさのポリペプチドを融合することにより作製される。欠失は、タンパク質配列からの１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。典型的には、タンパク質分子内のいずれか１つの部位で約２〜６個以下の残基が削除される。これらの変異体は通常、タンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的変異誘発により調製され、それにより変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養でＤＮＡを発現する。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位で置換突然変異を行う技術、例えばＭ１３プライマー突然変異誘発およびＰＣＲ突然変異誘発はよく知られており；アミノ酸置換は、通常、単一の残基からなるが、一度に多くの異なる場所で発生する可能性があり；挿入は通常、約１〜１０アミノ酸残基のオーダーであり；削除は約１〜３０残基の範囲である。削除または挿入は、隣接するペアで行われることが好ましい。すなわち、２残基の削除または２残基の挿入である。置換、削除、挿入、またはそれらの任意の組み合わせを組み合わせて、最終的な構造に到達することができる。突然変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、できれば二次ｍＲＮＡ構造を生成する可能性のある相補的領域を作成しないことが望ましい。置換バリアントとは、少なくとも１つの残基が削除され、その場所に別の残基が挿入されているバリアントである。そのような置換は一般に、以下の表１および２に従って行われ、保存的置換と呼ばれる。
【表１】
2020521447.tif 000003
【表２】
2020521447.tif 000004
【００５６】
機能または免疫学的同一性の大幅な変更は、表２にあるものよりも保守的ではない置換を選択することによって行われ、すなわち、（ａ）例えばシートまたはらせん構造としての置換領域のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大部分、を維持することへの影響がより大きく異なる残基を選択する。一般にタンパク質の特性に最大の変化をもたらすと予想される置換は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルは、疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルと置換される（すなわち、それらによって置換される）；（ｂ）システインまたはプロリンは、他の残基と置換される（すなわち、それらによって置換される）；（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、またはヒスチジルは、電気的に陰性の残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルと置換される（すなわち、それらによって置換される）；または（ｄ）かさ高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンは、側鎖を持たないもの、例えば、この場合グリシン、と置換される（すなわち、それによって置換される）；（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化の部位の数を増やすことによる、ものである。
【００５７】
例えば、生物学的および／または化学的に類似する別のアミノ酸残基による１つのアミノ酸残基の置換は、保存的置換として当業者に知られている。例えば、保存的置換は、１つの疎水性残基を別の疎水性残基に、または１つの極性残基を別の極性残基に置き換えることである。置換には、例えば、Ｇｌｙ，Ａｌａ；Ｖａｌ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ；Ａｓｐ，Ｇｌｕ；Ａｓｎ，Ｇｌｎ；Ｓｅｒ，Ｔｈｒ；Ｌｙｓ，Ａｒｇ；およびＰｈｅ，Ｔｙｒ、などの組み合わせが含まれる。明示的に開示された各配列のそのような保存的に置換されたバリエーションは、本明細書で提供されるモザイクポリペプチド内に含まれる。
【００５８】
Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）の部位を挿入するために、置換または欠失変異誘発を使用できる。システインまたは他の不安定な残基の削除も望ましい場合がある。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの欠失または置換は、例えば、塩基性残基の１つを削除するか、グルタミニルまたはヒスチジル残基で１つを置換することにより達成される。
【００５９】
特定の翻訳後誘導体化は、発現したポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、翻訳後、対応するグルタミルおよびアスパリル残基にしばしば脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。他の翻訳後修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（T.E. Creighton、Proteins：Structure and Molecular Properties、W.H. Freeman＆Co.、San Francisco pp 79-86 [1983]）、Ｎ末端アミンのアセチル化、場合によってはＣ末端カルボキシルのアミド化が含まれる。
【００６０】
本明細書で開示されるタンパク質の変異体および誘導体を定義するための１つの方法は、特定の既知の配列に対する相同性／同一性に関して変異体および誘導体を定義することによると理解される。例えば、配列番号１は、融合タンパク質の特定の配列を示す。具体的に開示されているのは、記載された配列に対して少なくとも、７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するこれらおよび本明細書に開示された他のタンパク質の変異体である。当業者は、２つのタンパク質の配列同一性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性が最高レベルになるように、２つの配列を並べた後に配列同一性を計算できる。
【００６１】
本明細書は様々なタンパク質およびタンパク質配列について議論するので、それらのタンパク質配列、すなわちポリヌクレオチドをコードできる核酸も開示されていることが理解される。これには、特定のタンパク質配列に関連するすべての縮重配列、すなわち、特定のタンパク質配列をコードする配列を有するすべての核酸、ならびにタンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含むすべての核酸が含まれる。したがって、各特定の核酸配列は本明細書に記載されていない可能性があるが、各配列はすべて、開示されたタンパク質配列を通じて実際に本明細書に開示および記載されていることが理解される。したがって、開示された融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質のアミノ酸配列を有する当業者は、前述の融合ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質をコードするポリヌクレオチドを構想および構築できることが理解され、本明細書で企図される。一態様において、本明細書に開示される融合タンパク質（例えば、配列番号１に記載される融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド配列が本明細書に開示される。
【００６２】
一態様では、本明細書に開示される操作された操作された腫瘍溶解細胞および／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質により誘導されるＮＫ細胞活性は、ＮＫ細胞とＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１つまたはＩＬ−１５などの活性化サイトカインとの接触によりＮＫ細胞を活性化することにより増加し得ることが本明細書で企図される。一態様において、活性化サイトカインは腫瘍溶解性ウイルスにより発現され得ることが認識されている。したがって、一態様では、腫瘍溶解性ウイルスは、非切断シグナルアンカードメインを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する、操作された腫瘍溶解性ウイルスであり、ここで、腫瘍溶解性ウイルスは、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、またはＩＬ−１５のうちの１つまたは複数を発現するようにさらに操作されている。
【００６３】
本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスは、任意のウイルス骨格から構築され得る。一態様では、ウイルスは、改変または操作された、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイルス−２、水痘帯状疱疹ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス、および／またはヒトヘルペスウイルス−６）、ポックスウイルス（例えば、痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、および／またはオルフウイルス）、レオウイルス（ロタウイルスなど）、ピコルナウイルス（例えば、エンテロウイルス、セネカウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、および／または口蹄疫ウイルス）、トガウイルス（アルファウイルス、セムリキフォレストウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、シンドビスウイルス、風疹ウイルスなど）、コロナウイルス、フラビウイルス（Ｃ型肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、マレーバレー熱ウイルス、黄熱ウイルス、西ナイルウイルス、ジカウイルス、デング熱ウイルスなど）、フィロウイルス（例えば、エボラウイルスやマールブルグウイルス）、アレナウイルス（例えば、ラッサ熱ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ピチネウイルス、フニンウイルス、および／またはマチュポウイルス）、ブニャウイルス（例えば、ハンタンウイルス、および／またはリフトバレー熱ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、ヒトパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、サルウイルス５、および／または麻疹ウイルス）、ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルスおよび／または狂犬病ウイルス）、ニューモウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス）、オルソミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルスＡ、インフルエンザウイルスＢ、および／またはインフルエンザＣウイルス）、デルタウイルス（Ｄ型肝炎ウイルスなど）、レトロウイルス（例えば、サル免疫不全ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、およびヒト免疫不全ウイルス２型、ラウス肉腫ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型および／またはサル泡沫状ウイルス）、ヘパドナウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）、オルソヘペウイルス（Ｅ型肝炎ウイルスなど）、ヒトパピローマウイルス、またはポリオーマウイルスである。例えば、腫瘍崩壊性ウイルスは、ＨＳＶ−１腫瘍崩壊性ウイルスＨＳＶ１７１６またはタリモジーン・ラハーパレプベック（Talimogene laherparepvec）、改変アデノウイルス腫瘍崩壊性ウイルスＨ１０１、ポリオウイルス腫瘍崩壊性ウイルスＰＶＳＲＩＰＯ、レオウイルス腫瘍崩壊性ウイルス レオシリン、セネカバレーウイルス ＳＶＶ−００１、コクサッキーウイルス腫瘍溶解性ウイルスコクサッキーウイルスＡ２１、エンテロウイルス 腫瘍溶解性ウイルスリガウイルス、またはワクシニアウイルス腫瘍溶解性ウイルス ＧＬ−ＯＮＣ1、またはＪＸ−５９４であり得る。一態様において、本明細書に開示されるのは、改変または操作された腫瘍溶解性ウイルスであって、ここで、腫瘍溶解性ウイルスは、非切断シグナルアンカードメインを含む外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現し；ここで、改変または操���された腫瘍溶解性ウイルスは、例えば改変または操作されたパラインフルエンザウイルス５型などのパラインフルエンザウイルス、例えばＣＰＩパラインフルエンザ、野生型パラインフルエンザ、またはＣＰＩからＰ／ＶをコードするＣＰＩ−ＷＴパラインフルエンザキメラウイルスであり、ウイルス骨格の残りはＷＴパラインフルエンザである）。
【００６４】
一態様では、癌細胞などの標的細胞へのウイルスの膜融合を促進すると、腫瘍溶解性ウイルスから標的細胞への遺伝物質の送達の速度および効率を高めることができると認識されている。腫瘍溶解性ウイルスの標的細胞への融合を促進できる１つの方法は、融合性のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質の使用によるものである。融合性のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質には、ウイルス融合性のペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質、例えば、インフルエンザ血球凝集素ペプチド（ＨＡ）、デング熱融合ペプチド、ＨＩＶエンベロープ（Ｅｎｖ）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルスとＳＶ５）融合タンパク質（Ｆ）およびパラミクソウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）などが含まれるが、これらに限定されない。したがって、一態様において、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドおよび非切断シグナルアンカードメインを含む腫瘍溶解性ウイルスであり、操作された腫瘍溶解性ウイルスは融合性の腫瘍溶解性ウイルスである。一態様において、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、腫瘍溶解性ウイルスにとって内因性であり得るか、またはウイルスは、外因性融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現するように操作され得る。言い換えれば、腫瘍溶解性ウイルスは、天然のものでも、融合性になるように操作／改変されたものでもよい。例えば、骨格腫瘍溶解性ウイルスはレオウイルス、ポリオウイルス、またはアデノウイルスであり得、これらは、融合性ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むように改変／操作され得、したがって融合性である。したがって、一態様において、本明細書に開示されるのは、非切断シグナルアンカードメインを含む外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを発現する改変または操作された腫瘍溶解性ウイルスであり、改変または操作された腫瘍溶解性ウイルスは、例えば改変または操作されたパラインフルエンザウイルス５型などのパラインフルエンザウイルスであり、腫瘍溶解性ウイルスはパラミクソウイルスＦおよび／またはＨＮを発現する。一態様では、天然の融合性の腫瘍溶解性ウイルスは、さらなる融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むように操作することもできる。そのような操作された融合性の腫瘍溶解性ウイルスは、高融合性である。したがって、一態様において、本明細書に開示されるのは、腫瘍細胞の融合を可能にする高融合性を可能にするペプチドをコードする遺伝子を含む融合性の腫瘍溶解性ウイルスである。
【００６５】
上記のように、開示された融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質および／または修飾された腫瘍溶解性ウイルスは、標的癌部位での免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＣＡＲ Ｔ細胞、先天性リンパ系細胞、マクロファージ、Ｂ細胞（形質細胞を含む））の数を最大にし、したがって免疫細胞活性（例えば、ＮＫ細胞活性、Ｔ細胞活性、ＣＡＲ Ｔ細胞活性、および／またはＢ細胞活性（形質細胞および抗体活性を含む）を高めるように設計されている。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、癌免疫療法のために免疫細胞を癌細胞に標的化する方法であって、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質；外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド、および／または腫瘍溶解性ウイルスゲノムへ本明細書に開示されるシグナルアンカードメインを挿入することにより腫瘍溶解性ウイルスを改変することと、細胞を改変腫瘍溶解性ウイルスと接触させることと、を含む方法である。
【００６６】
１．薬学的担体／医薬品の送達
上述のように、組成物は、薬学的に許容される担体とともにｉｎ ｖｉｖｏで投与することもできる。「薬学的に許容される」とは、望ましくない生物学的効果を引き起こすことがなく、有害な態様でそれが含まれる医薬組成物の他の成分と相互作用することのない、生物学的ではなく、またはその他の点で望ましくない点はない材料を意味する。すなわち、材料は、核酸またはベクターとともに対象に投与されてもよい。担体は、当業者によく知られているように、当然のことながら、活性成分の分解を最小限に抑え、対象における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
【００６７】
組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所など、局所鼻腔内投与または吸入による投与を含めて投与することができる。本明細書で使用される「局所鼻腔内投与」は、鼻孔の一方または両方を介した鼻および鼻道への組成物の送達を意味し、噴霧機構または液滴機構による送達、または核酸またはベクターのエアロゾル化による送達を含むことができる。吸入剤による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口を通して行うことができる。挿管を介して呼吸器系の任意の領域（肺など）に直接送達することもできる。必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般的な状態、治療されるアレルギー性疾患の重症度、使用される特定の核酸またはベクター、その投与方法などに応じて、対象ごとに異なる。したがって、すべての成分に対して正確な量を指定することはできない。しかしながら、適切な量は、本明細書の教示が与えられた通常の実験のみを使用して、当業者によって決定され得る。
【００６８】
組成物の非経口投与は、使用される場合、一般的に注射によって特徴付けられる。注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射前の液体の懸濁液の溶液に適した固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製することができる。非経口投与のより最近改訂されたアプローチは、一定の投与量が維持されるように、徐放または持続放出システムの使用を伴う。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３，６１０，７９５号を参照されたい。
【００６９】
材料は、溶液、懸濁液（例えば、微粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた）であってもよい。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型を標的とする場合がある。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するこの技術の使用例ある（Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992);およびRoffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。「ステルス」および他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌を標的とする脂質媒介薬物を含む）、細胞特異的リガンドを介したＤＮＡの受容体媒介標的、リンパ球指向腫瘍標的、およびｉｎ ｖｉｖｏでのマウス神経膠腫細胞の高度に特異的な治療レトロウイルス標的などの媒体（ビヒクル）。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するこの技術の使用例である（Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); and Litzinger および Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)）。概して、受容体は、構成的またはリガンド誘導性のエンドサイトーシスの経路に関与している。これらの受容体はクラスリンでコーティングされたピットに集まり、クラスリンでコーティングされた小胞を介して細胞に入り、受容体が分類された酸性化エンドソームを通過してから、細胞表面にリサイクルされ、細胞内に保存されるか、リソソームで分解される。内在化経路は、栄養素の取り込み、活性化タンパク質の除去、高分子の除去、ウイルスと毒素の日和見侵入、リガンドの解離と分解、受容体レベルの調節など、さまざまな機能を果たす。多くの受容体は、細胞の種類、受容体の濃度、リガンドの種類、リガンドの価数、およびリガンドの濃度に応じて、複数の細胞内経路をたどる。受容体を介したエンドサイトーシスの分子および細胞メカニズムがレビューされている（Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。
【００７０】
ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に使用することができる。したがって、一態様において、本明細書に開示されるのは、１つまたは複数の操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり、腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、細胞内に面するアミノ末端に対して逆向きになるように改変された免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）；から選択される外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド；非切断シグナルアンカードメイン（例えば、ノイラミニダーゼ膜貫通セグメント）を含むＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）および／またはＣＤ１９）を発現する。
【００７１】
適切な担体とその製剤は、Remington：The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載される。典型的には、製剤を等張にするために、製剤に適切な量の薬学的に許容される塩が使用される。薬学的に許容される担体の例には、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは、好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性調製物が含まれ、このマトリックスは、成形品、例えばフィルム、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスベクターのタイプ（すなわち、腫瘍溶解性ウイルスのウイルス骨格）、投与経路および投与される組成物の濃度に応じて、特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明らかであろう。
【００７２】
薬学的担体は当業者に知られている。これらは、典型的には、滅菌水、生理食塩水、生理的ｐＨの緩衝液などの溶液を含む、薬物をヒトに投与するための標準的な担体である。組成物は筋肉内または皮下に投与することができる。他の化合物は、当業者によって使用される標準的な手順に従って投与されるであろう。
【００７３】
医薬組成物は、選択された分子に加えて、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝液、防腐剤、界面活性剤などを含んでもよい。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬などの１つまたは複数の活性成分を含んでもよい。
【００７４】
医薬組成物は、局所または全身治療が望ましいかどうか、および治療される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（眼科的、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口的、吸入による、または非経口的、例えば静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射であり得る。開示された抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。
【００７５】
非経口投与用の製剤には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳液または懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が含まれる。非経口ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンガーのデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの防腐剤および他の添加物も存在し得る。
【００７６】
局所投与用の製剤には、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液体、および粉末が含まれてもよい。従来の医薬担体、水性、粉末または油性基剤、増粘剤などが必要または望ましい場合がある。
【００７７】
経口投与用の組成物には、粉末または顆粒、水または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香料、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。
【００７８】
一部の組成物は、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸などの無機酸、および、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸などの有機酸との反応によって、または、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、モノ−、ジ−、トリアルキル、アリールアミン、置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって、形成される、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与される可能性がある。
【００７９】
ｂ）治療的使用
組成物を投与するための有効な投与量およびスケジュールは経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の範囲内である。
一態様では、本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルス（または当該ウイルスを含む組成物）は、養子移入されたＮＫ細胞の投与の前に投与することができる。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、ＮＫ細胞の養子移入の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８時間前、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、または３０日前に投与し得、ＮＫ細胞が投与される前に、宿主免疫系が本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスに応答することを可能にする。別の態様では、腫瘍溶解性ウイルスおよび養子移入されたＮＫ細胞は、同じまたは異なる部位に同時に、または同時に投与することができる。別の態様では、ＮＫ細胞は、本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスまたは当該ウイルスを含む任意の組成物の投与の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８時間、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２１、２８、または３０日前に投与され得る。腫瘍溶解性ウイルスの前または後に投与する場合、ＮＫ細胞は同じ部位または異なる部位に投与することができる。
【００８０】
組成物の投与のための用量範囲は、障害の症状が影響を受ける所望の効果を生み出すのに十分な範囲である。用量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などの有害な副作用を引き起こすほど大きくすべきではない。概して、投与量は、患者の年齢、状態、性別および疾患の程度、投与経路、またはレジメンに他の薬物が含まれるかどうかによって異なり、当業者が決定できる。投与量は、対抗適応症が発生した場合に個々の医師が調整できる。投与量は様々であり、１日または数日間、毎日１回または複数回の投与により投与することができる。医薬品の特定のクラスの適切な投与量に関するガイダンスは、文献に記載されている。例えば、抗体の適切な用量を選択する際のガイダンスは、抗体の治療的使用に関する文献、例えば、Handbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357; Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389に記載されている。単独で使用される抗体の典型的な１日投与量は、上記の要因に応じて、１日あたり約１μｇ／ｋｇから最大１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲である。
【００８１】
Ｃ．癌の治療方法
腫瘍溶解性ウイルスは、癌の治療のための効果的な治療薬であることが当技術分野で示されている。ウイルスは、出口で感染した癌細胞を溶解し、癌細胞の感染も宿主の免疫応答を刺激して感染細胞を殺す。開示された操作されたウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は同様に癌の治療に有用であり、そのような腫瘍溶解性ウイルスの効力を改善してＮＫ細胞を感染癌細胞に補充することが理解され、本明細書で企図される。したがって、一態様では、膜結合免疫細胞標的化リガンド（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、細胞内に面したアミノ末端に対して逆方向を有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）を含む１つまたは複数のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現する開示された腫瘍溶解性ウイルス；ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）、および／またはＣＤ１９）および非切断シグナルアンカードメインおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、または膜結合免疫細胞標的化リガンドと非切断シグナルアンカードメインを含むタンパク質が、癌の治療に使用できる。一態様において、操作された腫瘍溶解性ウイルスは、融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を含むように改変され得る。１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドが免疫グロブリンＦｃドメインである場合、Ｆｃドメインは、そのＮ末端側が細胞膜の表面近くの膜アンカーペプチドに付着した状態で、細胞表面の細胞外側に発現するように改変できることが理解される。
【００８２】
本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスの１つを対象に投与することにより治療することができる異なるタイプの癌の非限定的なリストは以下の通りである：リンパ腫（ホジキンおよび非ホジキン）、白血病、癌腫、固形組織の癌、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、神経膠腫、高悪性度神経膠腫、芽細胞腫、神経芽細胞腫、形質細胞腫、組織球腫、黒色腫、腺腫、低酸素腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫または肉腫、転移癌、または一般的な癌。開示された腫瘍溶解性ウイルスおよびそれを含む組成物が治療に使用できる癌の代表的だが非限定的なリストは次のとおりである：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部扁平上皮癌、腎臓癌、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、神経芽細胞腫／膠芽腫、メルケル細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、黒色腫、口、喉、喉頭、肺の扁平上皮癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮頸癌、乳癌、上皮癌腎癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器癌；精巣癌；結腸癌および直腸癌、前立腺癌、または膵臓癌。
【００８３】
したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、癌を治療する方法であって、１つまたは複数の操作された腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質（開示された融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現する腫瘍溶解性ウイルスを含む）を含む組成物を対象に投与することを含み、ここで、１つまたは複数の腫瘍溶解性ウイルスは、外因性の膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む１つまたは複数の融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質を発現する。一態様では、外因性の膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む、本明細書に開示される融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、細胞質尾部領域、膜貫通領域および細胞外ストーク領域；および細胞外ストーク領域のＣ末端に融合したＮ末端を含む免疫細胞標的化リガンドを含む非切断シグナルアンカードメインを含む。したがって、融合ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、膜結合免疫細胞標的化リガンドを提供する（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）は、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）；および／または別の標的化可能なリガンド（例えば、ＣＤ１９またはＣＤ２０）の自然な向きのリガンドと比較して、細胞に対して逆向きに配向し、アミノ末端は細胞外ではなく細胞内に面するように改変される。）。
【００８４】
治療方法は、標的癌細胞に対するＮＫ細胞活性を増加させるために改変および／または融合されたペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である腫瘍溶解性ウイルスを使用することが理解され、本明細書で企図される。したがって、本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスおよび／または融合ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の治療活性は、本明細書に開示される腫瘍溶解性ウイルスのいずれかによる腫瘍溶解性ウイルス治療中の対象への免疫細胞（例えば、これには、遺伝子組み換えナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれるが、これに限定されない、ＮＫ細胞。）またはその任意の組み合わせの養子移入を通じて増強することができる。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、例えばＮＫ細胞（例えば、遺伝子改変ＮＫ細胞を含む）および／またはＣＤ１９標的化抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞を対象に養子免疫伝達することをさらに含む、癌を治療する方法である。一態様では、ＮＫ細胞は、ＣＤ１９標的化抗ＣＤ１９キメラ抗原受容体を発現するように改変され得る。
【００８５】
一態様では、開示された腫瘍溶解性ウイルスで使用されるいくつかの標的化リガンドは、ＮＫ細胞上の受容体に対する直接リガンドではないことが理解され、本明細書で企図される。一態様は、本明細書に開示されるのは、非切断シグナルアンカードメインを含む１つまたは複数の膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む腫瘍溶解性ウイルスを対象に投与することを含む、癌を治療する方法であって、当該方法は、標的化リガンド（例えば、抗ＣＤ１９抗体（例えば、ＭＤＸ１３４２、ＭＥＤＩ−５５１、ＡＦＭ１１、ＸｍＡｂ ５８７１、ＭＯＲ−２０８、ＳＧＮ−１９Ａ、ＳＡＲ３４１９、ブリナツモマブ、またはタプリツモマブ））または抗ＣＤ−２０抗体（例えば、リツキシマブ、オファツムマブ、オブチヌツズマブ、ベルツズマブ、またはオクレリズマブ）を認識する１つまたは複数の抗体を対象に投与することをさらに含む。癌を治療する開示された方法は、非切断シグナルアンカードメインを含む１つまたは複数の膜結合免疫細胞標的化リガンドを含む腫瘍溶解性ウイルスおよび標的リガンドを認識する抗体を対象に投与することを含み、当該方法は、上記に開示された免疫細胞のいずれかの投与をさらに含むことができることが理解される。加えて、開示された方法は、当業者に知られている抗癌治療薬の投与をさらに含むことができる。
【００８６】
開示された癌治療方法では、有効な治療用量に達するある程度のＮＫ細胞の活性化および／または増殖を達成することが望ましい場合がある。サイトカイン（ＩＬ−１５やＩＬ−２１など）と、刺激細胞の表面に発現した受容体を活性化するリガンド（４−ｌＢＢＬなど）で刺激されると、ＮＫ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の混合物内で指数関数的かつ優先的に増殖する。膜結合ＩＬ−２１による刺激は、培養に新鮮な刺激細胞が定期的に補充されることを条件として、無数の世代にわたってＮＫ細胞の連続増殖を刺激し、ＮＫ細胞の連続的な拡大を可能にすることがわかった。これらの方法は効率的なｉｎ ｖｉｔｒｏ ＮＫ細胞の増殖を可能にするが、生きたフィーダー細胞の必要性は、大きなＧＭＰ施設と能力を持たない臨床設定への移行を困難にする。また、患者に注入されたＮＫ細胞は、フィーダーによる継続的な刺激の欠如のために分裂を停止する場合がある。原形質膜（ＰＭ）粒子、エキソソーム（ＥＸ）、または１つ以上の活性化剤、刺激ペプチド、サイトカイン、および／または接着分子を含むフィーダー細胞を使用して、ＮＫ細胞と接触、活性化、および／または増殖することにより、これらのハードルが克服される。ＮＫ細胞活性化剤および刺激ペプチドの例には、４１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７および／または他のホーミング受容体が含まれるが、これらに限定されない。サイトカインの例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、およびＩＬ−１８が含まれるが、これらに限定されない。接着分子の例には、ＬＦＡ−１、ＭＩＣＡ、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２が含まれるが、これらに限定されない。例えば、フィーダー細胞または原形質膜粒子（ＰＭ粒子）またはエキソソーム（ＥＸ）は、膜結合ＩＬ−２１（それぞれＦＣ２１フィーダー細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソーム）を発現するフィーダー細胞から調製される。膜結合ＩＬ２１発現ＦＣ２１細胞、ＰＭ２１粒子、およびＥＸ２１エキソソームは、追加の１つまたは複数の活性化剤、刺激ペプチド、サイトカイン、および／または４１ＢＢＬ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＩＣＡ、ＬＦＡ−１、２Ｂ４、ＢＣＭ／ＳＬＡＭＦ２、ＣＣＲ７を含むがこれらに限定されない接着分子をさらに含むことができる（例えば、４１ＢＢＬおよび膜結合インターロイキン２１を発現するＰＭ２１粒子、ＥＸ２１エキソソーム、またはＦＣ２１フィーダー細胞）。したがって、一態様では、本明細書に開示されるのは、非切断シグナルアンカードメインを含む１つまたは複数の外因性膜結合免疫細胞標的化リガンド（例えば、細胞に対して逆向きを有するように改変された免疫グロブリンＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／またはＩｇＧ４ Ｆｃドメイン）であり、リガンド、ＮＫＧ２Ｄリガンド（例えば、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢ）および／またはＣＤ１９）の自然に生じる向きと比較して、アミノ末端が細胞外ではなく細胞内に面している、を発現する１つまたは複数の��作された腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物を対象に投与することを含む、癌を治療する方法であり；さらに、例えば、ＮＫ細胞（例えば、遺伝子組み換えＮＫ細胞など）またはＣＤ１９標的化抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞などの免疫細胞を対象に養子的に移入することを含み、ここで、免疫細胞はＮＫ細胞であり、ＮＫ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、およびそれらの任意の組み合わせ、例えば、ＩＬ−１２とＩＬ−１５；ＩＬ−１２とＩＬ−１８；ＩＬ−１５とＩＬ−１８；およびＩＬ−１２とＩＬ−１５とＩＬ１８を含む。）、成長因子、合成リガンド、ＮＫ細胞刺激粒子、ＮＫ細胞刺激エキソソーム、および／またはＮＫ細胞刺激粒子、エキソソーム、および／またはＩＬ−２１、４−１ＢＢＬ、ＩＬ−２１と４−１ＢＢＬを含むＮＫ細胞刺激フィーダー細胞；またはサイトカインまたはＮＫ細胞刺激粒子、エキソソーム、またはそれらのフィーダー細胞の任意の組み合わせなどの１つまたは複数のＮＫ細胞刺激剤で刺激および増殖される。
【００８７】
一態様では、原形質膜粒子またはエキソソームは、ＮＫ細胞フィーダー細胞から精製することができる。クレームされた発明で使用され、本明細書で開示される原形質膜粒子およびエキソソームの作製で使用されるＮＫ細胞フィーダー細胞は、照射された自己または同種末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または非照射自己または同種ＰＢＭＣ、ＲＰＭＩ８８６６、ＨＦＷＴ、Ｋ５６２、膜結合ＩＬ−１５および４１ＢＢＬをトランスフェクトしたＫ５６２細胞、膜結合ＩＬ−２１および４１ＢＢＬをトランスフェクトしたＫ５６２細胞、またはＥＢＶ−ＬＣＬのいずれかであり得る。いくつかの態様において、ＮＫ細胞フィーダー細胞は、膜結合ＩＬ−２１および４１ＢＢＬでトランスフェクトされたＫ５６２細胞または膜結合ＩＬ−１５および４１ＢＢＬでトランスフェクトされたＫ５６２細胞であり得る。
【００８８】
Ｄ．実施例
以下の実施例は、本明細書で特許請求される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示されるものであり、また、純粋に例示的なものであり、本開示を限定するものではありません。数値（例えば、量、温度など）に関して正確性を確保するための努力がなされてきたが、いくつかの誤差と偏差は考慮されるべきである。特に指定のない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧力は大気圧または大気圧に近い。
【００８９】
ここで、腫瘍溶解性ウイルスは、強化された免疫刺激のためにさらに改善され、免疫標的化可能リガンド、特に抗体の膜結合Ｆｃドメイン（ＭＢ＿Ｆｃ）などの外因性膜結合免疫細胞標的化リガンドを送達するために使用され、養子移入されたＮＫ細胞の効力を強化する（図１）。抗体のＦｃドメインは、ＮＫ細胞上のＣＤ１６（ＦｃγＩＩＩ受容体）によって認識され、それが抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘発する。ＡＤＣＣを介したＮＫ細胞の標的細胞の殺傷は、腫瘍によって展開される免疫抑制メカニズムの影響を受けにくいため、抗体由来のＦｃで腫瘍表面をマークすると、ＡＤＣＣを介したより効果的な殺傷が得られ、効率的な腫瘍除去が可能になる。膜結合免疫細胞標的化リガンドを構築するために、ＩＩ型内在性膜タンパク質からの非切断シグナルアンカーを標的化リガンドに融合させることができる。事実上、タイプＩＩ内在性膜タンパク質に通常存在する球状頭部は、標的化リガンドに置き換えられる（図２）。
【００９０】
標的化可能な抗原または治療抗体の非存在下で、ＡＤＣＣの癌細胞を「マーク」する腫瘍標的化腫瘍溶解性ウイルスを使用して、人工Ｆｃ含有タンパク質を腫瘍に送達できる。キメラタンパク質は表面結合抗体を模倣できる：タイプＩＩ膜配向は、Ｆｃドメインのアミノ末端が単量体、二量体または多量体の形で細胞膜に（すなわち細胞内で）面するように、リガンドの自然に生じる向きに対して逆向きにあるＣ末端で細胞外に露出したＦｃドメインと融合する。または、他の標的化可能なリガンド（例えば、ＣＤ１９、ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、および／またはＣＤ２０）を、腫瘍溶解性ウイルスを介して直接送達することができ、ここで、標的化リガンド（ＲＡＥＴ１、ＲＡＥＴ１Ｅ、ＲＡＥＴ１Ｇ、ＲＡＥＴ１Ｈ、ＲＡＥＴ１Ｌ、ＲＡＥＴ１Ｎ、ＭＩＣＡ、および／またはＭＩＣＢなど）がＮＫ細胞上のＮＫＧ２Ｄ受容体によって、表面膜、またはＡＤＣＣ（例えば、抗ＣＤ２０−リツキサン、オファツムマブ、オブチヌツズマブ、ベルツズマブ、オクレリズマブなど、または抗ＣＤ１９ ＭＤＸ１３４２、ＭＥＤＩ−５５１、ＡＦＭ１１、ＸｍＡｂ ５８７１、ＭＯＲ−２０８、ＳＧＮ−１９Ａ、ＳＡＲ３４１９、ブリナツモマブ、またはタプリツモマブなど）と結合できる標的化可能なリガンド（ＣＤ２０またはＣＤ１９など）に対する治療抗体および／または標的化リガンドを標的とするＣＡＲ Ｔ細胞（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞）とともに直接認識できる。膜結合（ＭＢ＿Ｆｃ）または膜結合（ＭＢ＿ＴＬ）の送達に適した腫瘍溶解性ウイルスの例は、パラインフルエンザウイルス５のＰ／Ｖ／Ｆ変異体である。この操作されたＰ／Ｖ／Ｆ変異体には、１）ポリメラーゼ機能（Ｐ）と免疫応答の阻害（Ｖ）の両方に関与するタンパク質をコードするＰ／Ｖ遺伝子（図３Ａ）、２）ウイルスの侵入と合胞体の生成に関与する融合タンパク質をコードする、ウイルスＦ遺伝子（図３Ｂ）に変異がある。Ｐ／Ｖ変異は、腫瘍細胞でのウイルスの増殖を制限し、ウイルスは細胞死と抗ウイルス応答を誘導する（１４−１６）。Ｆ変異の結果、ウイルスが腫瘍を介して拡散し、壊死を介して死滅する望ましい特性である、大規模な細胞間融合（合胞体）を生成する。これは、図３Ｂの顕微鏡写真で明らかであり、Ｐ／Ｖ／Ｆ感染後のＶｅｒｏ細胞の大規模なシンシチウムを示している。Ｐ／Ｖ／Ｆに感染した癌細胞も、ヒトＰＭ２１−ＮＫ細胞により効率的に認識され、死滅させられる（図３Ｃ）。この実験では、ヒト卵巣ＳＫＯＶ３−Ｌｕｃ細胞を模擬感染させるか、ＭＯＩ＝１０でＰ／Ｖ／Ｆウイルスに感染させ、２０時間後にＰＭ２１粒子アプローチによって生成されたヒトＮＫ細胞とさまざまな比率でインキュベートした。ＮＫ細胞の非存在下でのＰ／Ｖ／Ｆ細胞変性効果が明らかではなかった２４時間後に、生存細胞の割合を決定した（細胞生存率＞９０％）。図３Ｃに示されるように、ＰＭ２１−ＮＫ細胞は、模擬感染に比べてＰＶ／Ｆ感染細胞を死滅させるのにはるかに効果的であり、標的細胞の５０％を死滅させるのに必要なＮＫ細胞は、少なくとも５倍少なかった。したがって、Ｐ／Ｖ／Ｆは、養子ＮＫ細胞治療での���図された用途に使用するのに適したウイルスである。配信ベクターとして、このウイルスには次のような（１）複数の外来遺伝子を追加するための既知のパッケージング制約のない小さなゲノム；（２）非力価細胞の効率的な感染により、高力価（＞１０10ｐｆｕ／ｍｌ）での生産が可能になる；（３）宿主ＤＮＡへの統合がなく、組換えが観察されない細胞質複製；（４）ヒトに感染するが、感染は病気や病原性とは関係ない；といった強力な有効化特性がある。細胞膜のＦｃドメインを取得するには、Ｎ末端細胞質尾部、膜貫通ドメインとして機能する非切断シグナルアンカー、および原形質膜から伸びるストーク領域からなる、十分に特徴付けられたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼタンパク質（ＮＡ）からの膜標的化ドメインを使用できる。図３Ｄに示すように、ＦｃドメインがＮＡストーク領域の長さの増加にリンクしているＮＡ−Ｆｃキメラで構成されている。ＮＡ−Ｆｃを組換えＰ／Ｖ／Ｆウイルスに挿入して、腫瘍細胞と正常細胞（Ｐ／Ｖ変異による）に特異的であり、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣを増強できる新規の腫瘍溶解性ウイルス（図３Ａ）を生成できる（Ａ）。ＮＡ−Ｆｃ構築物の１つのアミノ酸配列の例を図４に示し、図５にトランスフェクトした腫瘍細胞の表面にＦｃを提示する性能を示す。この実験では、Ａ５４９肺癌細胞にモック対照、空のベクター、またはＮＡ１＿Ｆｃをコードするベクターをトランスフェクトし、翌日、表面発現のために抗ヒトＦｃ抗体（ＡＰＣ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＰ６０１７−Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色して細胞表面のＦｃの存在を検出した。ＮＡ１＿Ｆｃで切断された細胞のみが、Ｆｃ発現細胞の表面に結合した抗Ｆｃ抗体を反映するＡＰＣチャネルで高い平均蛍光強度を有していた。したがって、ＮＡは適切な配向でＦｃを発現するのに適した膜アンカーである。ＮＨ2末端細胞質ドメインおよびＣＯＯＨ末端エクトドメイン（Ｎcytトポロジー）を備えた適切な膜貫通ドメインのその他の例には、トランスフェリン受容体、アシアゴ糖タンパク質、ゴルジ常駐糖転移酵素ファミリーおよびパラミクソウイルスＨＮタンパク質が含まれるが、これに限定されない。
【００９１】
２つのＮＫ細胞耐性細胞株−Ａ５４９非小肺癌およびＳＫＯＶ−３卵巣癌細胞株を使用して、概念実証研究を収集し、その腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍標的をＮＫ細胞殺傷に感作させることができ（図６、８、１１）、したがって、「ユニバーサル標的化可能リガンド」を腫瘍細胞に送達する送達媒体としても使用できることを示した。Ｐ／Ｖ／Ｆを含む多くのウイルスは、感染した細胞にＤＮＡを送達し、宿主細胞でウイルスによってコードされたタンパク質の発現をもたらすことが知られている。ＮＫ細胞上のＣＤ１６受容体に関与する抗体のＦｃドメインは、上記の「ユニバーサルターゲティング可能なリガンド」の一例である。Ｆｃドメインのノイラミダーゼ（ＮＡ）ストークへの付着により、細胞表面でのＦｃの発現が可能になります（図７および９）。予想通り、ＳＫＯＶ−３細胞またはＡ５４９細胞のいずれかでのＮＡ１−Ｆｃの安定した発現は、ＮＫ細胞による殺傷の増加をもたらし、この効果はＰ／Ｖ／Ｆ感染と相加的であった（図３および６）。さらに、ノイラミダーゼのストークドメインの長さを増やすことにより、Ｆｃ認識を介した殺傷がさらに強化された（図１０）。したがって、ＯＶを使用の使用を組み合わせて、殺傷性を強化し、「ユニバーサルリガンド」を送達すると、最もＮＫ細胞耐性の癌細胞株でさえＮＫ細胞感受性に感作させることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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