(57)【要約】ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合阻害工程を含むインスリン遺伝子の転写促進方法：（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、（ｉｉ）ＰＨＦ１、及び（ｉｉｉ）ＤＬＸ４、並びにインスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、（ｉｉ）ＰＨＦ１、及び（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合阻害工程を含むインスリン遺伝子の転写促進方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項２】
ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４、
（ｉｖ）ＴＣＦ４、
及び
（Ｖ）ＴＭＰＯ。
【請求項３】
インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項４】
インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させることによりインスリン遺伝子の転写が促進するか否かを決定する工程を含む方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項５】
請求の範囲第２項ないし第４項のいずれか１項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングされた物質。
【請求項６】
インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項７】
糖尿病の予防及び／又は治療のための医薬であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項８】
請求の範囲第５項に記載の物質を有効成分として含有する請求の範囲第６項又は第７項に記載の医薬。
【請求項９】
インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療方法であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項１０】
糖尿病の予防及び／又は治療方法であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４。
【請求項１１】
請求の範囲第５項に記載の物質の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む請求の範囲第９項または第１０項に記載の方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項ないし第４項に記載のスクリーニング方法に用いる試薬キットであって、
（ａ）ＩＰＦ１及び／又はＩＰＦ１をコードするＤＮＡ、並びに
（ｂ）下記の群より選ばれる１又は２以上の蛋白質及び／又は該蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
を含有する試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、インスリン遺伝子の転写調節方法に関する。より具体的には、本発明は、ＩＰＦ１（インスリン・プロモーター・ファクター１：Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆａｃｔｏｒ−１、以下、本明細書で「ＩＰＦ１」と略す。）と該ＩＰＦ１と結合する蛋白質との結合を阻害する工程を含むインスリン遺伝子の転写調節方法に関するものである。
【背景技術】  ＩＰＦ１は、膵臓のβ細胞で発現している転写因子であり、インスリン、グルコキナーゼ（Ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ）、ＧＬＵＴ２など糖代謝に重要な遺伝子群の発現促進因子である（総説：Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４４，１２０３−１２１４，２００１；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４６，１２９−１４１，２００２；Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４５，３０９−３２６，２００２）。ＩＰＦ１の機能欠損は糖代謝の異常を招き、遺伝性２型糖尿病ＭＯＤＹ４（Ｍａｔｕｒｉｔｙ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｏｕｎｇ）を発症させることから（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０４，Ｒ４１−Ｒ４８，１９９９）、ＩＰＦ１はインスリン分泌等の糖代謝系や膵臓の機能維持において重要な因子であると考えられている。
ＩＰＦ１は、抗グルコース刺激によりフォスファチジルイノシトール３−キナーゼ及びストレス−アクティベーテッドプロテインキナーゼのシグナル伝達系を介してリン酸化を受けて核内へ移行し、インスリン遺伝子のプロモーター活性を促進することが報告されているが（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２０９３６−２０９４４，１９９７；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，１０１１−１０１６，１９９９）、これまでＩＰＦ１をリン酸化する酵素は同定されていない。また、ＩＰＦ１依存的なインスリン遺伝子プロモーター活性がヘパトサイト・ニュクリアー・ファクター−１α（ＨＮＦ−１α）により抑制されることが報告されており（Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｓ．２７，６３−７４，２００１）、インスリン遺伝子プロモーター領域へのＩＰＦ１の結合をＨＮＦ−１αが競合的に阻害するためであると考えられているが、ＩＰＦ１とＨＮＦ−１αが直接結合するかどうかについては従来知られていない。
一方、遺伝子の転写を制御する因子がいくつか知られている。例えば、ＨＮＦ３Ｇ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ３−ｇａｍｍａ）はＦｏｒｋｈｅａｄ  ｂｏｘを有する転写因子であり、肝臓特異的な遺伝子の転写制御因子であると考えられている（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０，３７７−３８５，１９９４；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３９，４１７−４１９，１９９７；Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８，４２４５−４２５１，１９９８）。ＤＬＸ４（Ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ  ４、ＢＰ１と呼ばれる場合もある）はホメオドメインを有する転写因子であり、β−ｇｌｏｂｉｎ遺伝子の転写を抑制することが知られている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２，２５０５−２５１４，２００２）。ＴＣＦ４（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４）はｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ構造を有する転写因子であり、ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩ遺伝子のイニシエーターエレメントや、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ遺伝子のエンハンサーエレメントに結合し、転写を活性化することが知られている（ＥＭＢＯ  Ｊ．１５，６６８０−６６９０；Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７，４６７−４７０）。また、ＰＨＦ１（ＰＨＤ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）はＰＨＤ  ｆｉｎｇｅｒ  ｄｏｍａｉｎを有する蛋白質であり、転写調節因子ではないかと考えられているが、その機能は不明である（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４８，３８１−３８３，１９９８）。しかしながら、これらの転写因子がインスリン遺伝子転写の調節因子であることは従来全く知られていない。さらに、ＴＭＰＯ（Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）は核蛋白質であり、核構造の維持や細胞周期に関与している可能性が考えられているが、その機能の詳細は不明であり（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２８，１９８−２０５，１９９５；Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６，３６１−３７０，１９９６）、この蛋白質がインスリン遺伝子転写に関与しているとの報告はない。
【発明の開示】
上記のように、ＩＰＦ１はインスリン遺伝子転写における重要な転写促進因子であることから、ＩＰＦ１と結合する蛋白質を同定することは糖尿病の予防及び／又は治療のための手段を提供するために極めて重要である。また、ＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害することによりインスリン遺伝子の転写を調節する手段を提供できる可能性がある。従って、本発明の課題は、ＩＰＦ１と結合する蛋白質を提供し、さらにＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害することによりインスリン遺伝子転写を調節する手段を提供することにある。
本発明者らはＩＰＦ１と結合する蛋白質を同定してその機能を明らかにすべく、国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の予測方法に従って、ＩＰＦ１のアミノ酸配列をある長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、選抜された蛋白質とＩＰＦ１との間でローカルアライメントを行いローカルアライメントのスコアの高い蛋白質をＩＰＦ１と結合可能な蛋白質であると予測した。その結果、ＩＰＦ１由来のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドと相同性のあるオリゴペプチドを有する数種の蛋白質が見出された。そして、本発明者らは、これらの蛋白質がＩＰＦ１と結合すること、及びその結合に基づいてインスリン遺伝子の転写を調節する方法を見出した。さらに、これらの蛋白質がインスリンプロモーターの活性抑制作用を有することを見出した。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。
すなわち、本発明により、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合阻害工程を含むインスリン遺伝子の転写促進方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ３−ｇａｍｍａ）、
（ｉｉ）ＰＨＦ１（ＰＨＤ  ｆｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓ  ｈｏｍｅｏｂｏｘ４）
が提供される。
また、本発明により、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４、
（ｉｖ）ＴＣＦ４（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ４）
及び
（ｖ）ＴＭＰＯ（ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｔｉｎ）
も提供される。
さらに、本発明により、インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
も提供される。
また、本発明により、インスリン遺伝子の転写を促進する物質のスクリーニング方法であって、ＩＰＦ１及び以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させることによりインスリン遺伝子の転写が促進するか否かを決定する工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
も提供される。
別の観点からは、本発明により、上記のいずれかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた物質が提供される。
また、本発明により、インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４；並びに
糖尿病の予防及び／又は治療のための医薬であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する医薬：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
が提供される。これらの医薬の好ましい態様によれば、上記のいずれかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含有する医薬が提供される。
さらに、インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療方法であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４；並びに
糖尿病の予防及び／又は治療方法であって、ＩＰＦ１と以下の群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する工程を含む方法：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
が提供される。これらの方法の好ましい態様によれば、上記のいずれかのスクリーニング方法によりスクリーニングされた物質を投与する工程を含む方法が提供される。
さらに別の観点からは、上記のスクリーニング方法に用いる試薬キットであって、
（ａ）ＩＰＦ１及び／又はＩＰＦ１をコードするＤＮＡ、並びに
（ｂ）ＩＰＦ１と結合する蛋白質及び／又は該蛋白質をコードするＤＮＡ
を含有する試薬キット
が本発明により提供される。この発明の好ましい態様によれば、
（ａ）ＩＰＦ１及び／又はＩＰＦ１をコードするＤＮＡ、並びに
（ｂ）下記の群より選ばれる１又は２以上の蛋白質及び／又は該蛋白質をコードするＤＮＡ：
（ｉ）ＨＮＦ３Ｇ、
（ｉｉ）ＰＨＦ１、
及び
（ｉｉｉ）ＤＬＸ４
を含有する試薬キットが提供される。
【図面の簡単な説明】  第１図は、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＰＰＧＬＳＡＳＰＱＰＳ、ＥＧＡＥＰＧＶ、及びＰＦＰＧＡＬＧＡとＨＮＦ３Ｇ中の相同性のあるオリゴペプチドＰＧＧＬＰＡＳＰＬＰＳ、ＥＧＧＥＰＧＶ、及びＰＹＰＧＧＬＰＡとのローカルアライメントの結果を示す。
第２図は、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＰＰＤＩＳＰＹＥ及びＧＥＥＬＬとＰＨＦ１中の相同性のあるオリゴペプチドＰＰＤＲＳＰＬＥ及びＧＥＥＬＬとのローカルアライメントの結果を示す。
第３図は、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ、ＳＰＱＰＳ、及びＲＲＰＱＥＰとＤＬＸ４中の相同性のあるオリゴペプチドＶＫＩＷＦＱＮＫＲＳＫＹＫＫ、ＳＰＥＰＳ、及びＲＲＰＱＡＰとのローカルアライメントの結果を示す。
第４図は、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＨＨＨＬＰＡＱ、ＰＰＧＬＳＡＳ、及びＧＰＡＰＥＦＳＡとＴＣＦ４中の相同性のあるオリゴペプチドＨＳＬＬＰＮＱ、ＰＰＧＬＰＳＳ、及びＧＳＰＰＳＬＳＡとのローカルアライメントの結果を示す。
第５図は、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなるオリゴペプチドＦＱＲＧＰＡＰＥＦＳＡＳＰＰとＴＭＰＯ中の相同性のあるオリゴペプチドＦＱＧＩＳＦＰＥＩＳＴＲＰＰとのローカルアライメントの結果を示す。
第６図は、ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、ＤＬＸ４、ＴＣＦ４、又はＴＭＰＯとの結合試験の結果を示す。
第７図は、ＨｅＬａ細胞系でのＩＰＦ１依存的ヒトインスリンプロモーター活性の検出結果を示す。
第８図は、ＨｅＬａ細胞系でのＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４過剰発現のＩＰＦ１依存的ヒトインスリンプロモーター活性への影響を示す。
第９図は、ＭＩＮ６細胞系でのＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４過剰発現のヒトインスリンプロモーター活性への影響を示す。
第１０図は、ヒト膵臓におけるヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、及びヒトＤＬＸ４の発現を確認した結果（ＲＴ−ＰＣＲ法）を示す。
第１１図は、ＭＩＮ６細胞におけるマウスＨＮＦ３Ｇ、マウスＰＨＦ１、及びマウスＤＬＸ４の発現を確認した結果（ＲＴ−ＰＣＲ法）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に用いられる（ｉ）ないし（ｖ）の蛋白質（これらを野生型の相互作用蛋白質と呼ぶ場合がある）は、それぞれ配列表の配列番号４、６、８、１０および１２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。本発明に用いられるＩＰＦ１（これを野生型のＩＰＦ１と呼ぶ場合がある）は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列で表される蛋白質である。よって、当業者はこれらの記載から、野生型の相互作用蛋白質及び野生型のＩＰＦ１を容易に入手可能である。例えば、これらの蛋白質の産生が認められる試料（例えばヒト膵臓由来の細胞）から、自体公知の精製方法（それぞれの蛋白質を抗原とするモノクローナル抗体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法）を用いて、回収し精製すればよい。
また、本明細書において、（ｉ）ないし（ｖ）の蛋白質には、上記の野生型の相互作用蛋白質のアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、挿入または欠失したアミノ酸配列を含み、ヒトを含む哺乳動物生体において上記の野生型の相互作用蛋白質と実質的に同一のインスリン遺伝子転写調節作用を有する蛋白質、または実質的に同一のインスリンプロモーター活性抑制作用を有する蛋白質（これらの蛋白質を変異型の相互作用蛋白質と呼ぶ場合がある）も含まれる。
さらに、本明細書において、ＩＰＦ１には、上記の野生型のＩＰＦ１のアミノ酸配列において１個ないし数個のアミノ酸が置換、挿入または欠失したアミノ酸配列を含み、ヒトを含む哺乳動物生体において上記の野生型のＩＰＦ１と実質的に同一のインスリンプロモーター活性化作用を有する蛋白質、または実質的に同一のインスリン遺伝子転写促進作用を有する蛋白質（これらの蛋白質を変異型のＩＰＦ１と呼ぶ場合がある）も含まれる。
一般的には、変異型の相互作用蛋白質は、野生型の相互作用蛋白質のアミノ酸配列と一定上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有していることが好ましい。同様に、変異型のＩＰＦ１は、野生型のＩＰＦ１のアミノ酸配列と一定上（例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上）の相同性を有するアミノ酸配列を有していることが好ましい。
これらの変異蛋白質をコードする遺伝子の取得方法は公知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールドスプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年）等に記載された方法またはそれに準じる方法により適宜入手することができ、所望の変異蛋白質を容易に入手することができる。得られた変異蛋白質が、野生型の相互作用蛋白質と実質的に同一のインスリン遺伝子転写調節作用を有するか否かは、本明細書の実施例３に具体的に示されたインスリンプロモーター活性の抑制作用検出方法を用いて、当業者が容易に確認できる。また、得られた変異蛋白質が、野生型のＩＰＦ１同一のインスリンプロモーター活性化作用を有するか否かは、本明細書の実施例３に具体的に示されたインスリンプロモーター活性測定方法を用いて、当業者が容易に確認できる。
本発明により提供されるインスリン遺伝子の転写促進方法は、ＩＰＦ１と上記の蛋白質（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）からなる群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合阻害工程を含むことを特徴としている。いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、ＩＰＦ１と結合する上記の（ｉ）、（ｉｉ）、又は（ｉｉｉ）の蛋白質は、一般的にはＩＰＦ１のインスリンプロモーター活性を抑制することが期待される。従って、この結合を阻害する物質は該蛋白質のインスリンプロモーター活性抑制作用を阻害することにより、インスリンプロモーターを活性化し、インスリン遺伝子の転写を促進することができる。上記の結合を阻害する物質の種類は特に限定されず、例えば、有機化合物、無機化合物、糖化合物などの低分子化合物のほか、抗体などの蛋白質類、アンチセンス核酸などの核酸類、多糖類、脂質類などの高分子化合物であってもよい。また、天然物質又は非天然物質のいずれであってもよい。
本明細書において、ＩＰＦ１とある蛋白質の結合とはＩＰＦ１と該蛋白質が複合体を形成するように、水素結合、疎水結合および静電的相互作用などの非共有結合により、ＩＰＦ１と該蛋白質が相互作用することを意味する。ここでの結合とは、ＩＰＦ１と該蛋白質が全体として結合すれば足りる。例えば、ＩＰＦ１または該蛋白質を構成するアミノ酸の中に、ＩＰＦ１と該蛋白質の結合に関与しないアミノ酸が含まれていてもよい。
ＩＰＦ１と該蛋白質の結合は、免疫沈降法による共沈物の確認、ツーハイブリッド法、プルダウン法、ウエスタンブロット法および蛍光共鳴エネルギー転移法などの自体公知の方法またはこれらの方法を組合せることにより検出され得る。
上記の阻害作用を有する物質は、例えば、本発明により提供される以下の方法によってスクリーニングすることができる。該方法は、ＩＰＦ１と上記の（ｉ）ないし（ｖ）からなる群より選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する物質をスクリーニングするための方法であり、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合を可能にする条件下で、被験物質とＩＰＦ１及び／又は該蛋白質を接触させ、次いで、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において、該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出することにより、該被験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害するか否かを決定する工程を含むことを特徴としている。この方法の好ましい態様によれば、上記の（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）からなる群から選ばれるいずれか１つの蛋白質との結合を阻害する物質をスクリーニングすることができる。
上記の工程において、ＩＰＦ１及びある蛋白質の結合を可能にする条件とは、例えば、ＩＰＦ１及び該蛋白質を細胞内において共発現させた条件である。ＩＰＦ１及び該蛋白質をそれぞれコードするポリヌクレオチドを組み込んだ適当なベクターを慣用の遺伝子工学的手法により、細胞にトランスフェクションすることにより、該条件を満たすことが可能である。
さらに、上記の工程において、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナルとはＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるものであってそのもの自体がその物理的または化学的性質により直接検出され得るものを意味し、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるマーカーとはＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるものであってそのものの物理的または生物学的性質を指標として間接的に検出され得るものを意味する。シグナルとしては、ルシフェラーゼ、放射性同位体等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子等、または検出のエピトープタグ、例えば６×Ｈｉｓ−ｔａｇ等が例示される。これらシグナルまたはマーカーの検出方法は当業者に周知のものである。
また、上記の工程においてＩＰＦ１と該蛋白質の結合を可能にする条件下において、それらと該披験物質を共存させた場合に、該披験物質を共存させない場合と比較して、ＩＰＦ１と該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／またはマーカーが低減または消失した場合に、該披験物質がＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害すると決定することができる。
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質の種類は特に限定されず、任意の化合物を被験物質として使用することができる。被験物質は有機化合物、無機化合物、糖化合物などの低分子化合物のほか、蛋白質、核酸、多糖類、脂質類などの高分子化合物であってもよい。また、天然物質又は非天然物質のいずれであってもよい。スクリーニングに供されるライブラリーとしては、例えば、低分子化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
また、上記の方法において、ＩＰＦ１及び該蛋白質の結合により生じるシグナル及び／又はマーカーを検出可能な系において該シグナル及び／又はマーカーの存在若しくは不存在又は変化を検出する工程はインスリン遺伝子の転写が促進するか否かを決定する工程として行われるものでもよく、その結果、上記の方法に従ってインスリン遺伝子の転写を促進する物質をスクリーニングすることができる。
また、本発明により上記のスクリーニングを行うためのキットが提供されるが、該キットは（ａ）ＩＰＦ１及び／又はＩＰＦ１をコードするＤＮＡ、並びに（ｂ）ＩＰＦ１と相互作用する蛋白質及び／又は該蛋白質をコードするＤＮＡを含有することを特徴としている。キットの要素は、蛋白質として提供されてもよく、あるいは該蛋白質を発現可能な遺伝子、好ましくは該遺伝子を含む組換えベクターなどの形態で提供されてもよい。
本発明の方法によりスクリーニングされた物質を有効成分として含む医薬は、インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療のための医薬として、ヒトを含む哺乳類動物に投与することができる。インスリン遺伝子の遺伝子産物量の低減に起因する疾患としては、例えば、糖尿病（糖尿病の合併症を含む）を挙げることができる。本発明の医薬の投与形態は特に制限されず、経口的又は非経口的に投与することができる。本発明の医薬としては、有効成分である物質をそのまま用いてもよいが、有効成分である物質とともに薬理学的及び製剤学的に許容される製剤用添加物とを含む医薬組成物を調製して投与することが望ましい。
例えば、蛋白質を有効成分として含む本発明の医薬は、通常の蛋白質製剤の調製方法に従って製剤化することができ、核酸を有効成分として含む本発明の医薬も、当業界で利用可能な手段で製剤化して用いることができる。本明細書において「核酸」の用語はＤＮＡ又はＲＮＡを包含する。核酸を含む本発明の医薬は、例えば有効成分である核酸を含む組換えベクターの形態で用いることができる。上記の組換えベクターには、有効成分である該核酸から生体内で効率的に遺伝子産物を発現されるように、遺伝子発現のために必要な、あるいは遺伝子発現を促進する各種の配列を適宜の順番で組み込んでおいてもよい。本発明の医薬がアンチセンス核酸を含む場合、該核酸はＤＮＡ又はＲＮＡのいずれでもよく、全長も特に制限されることはない。アンチセンス核酸は、例えば、相補的結合が可能になるように１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のオリゴヌクレオチドであってもよい。また、本発明の医薬の有効成分として上記の蛋白質に結合可能な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を用いる場合には、抗体は通常の方法で製造することができ、上記の蛋白質に特異的に結合可能なモノクローナル抗体も当業者に汎用の方法で製造することができる。
薬理学的及び製剤学的に許容しうる製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を用いることができる。経口投与に適する医薬組成物の例としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、又はシロップ剤等を挙げることができる。非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、経皮吸収剤、点眼剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、又は貼付剤等を挙げることができる。本発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分である物質の種類、治療又は予防の目的、患者の年齢や症状、投与経路などの種々の条件に応じて適宜の投与量を選択することが可能であるが、一般的には、成人１日あたり０．００１ｍｇ〜１０００ｍｇ程度の投与量範囲から選択することができる。
また、本発明は、インスリン遺伝子の遺伝子産物の低減に起因する疾患の予防及び／又は治療方法を提供する。該方法は、ＩＰＦ１と該ＩＰＦ１と結合する蛋白質（好ましくは、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１またはＤＬＸ４）との結合を阻害することを特徴とする。インスリン遺伝子の遺伝子産物の低減に起因する疾患とは、例えば、糖尿病を挙げることができる。上記の医薬を用いて、該方法を実施することが可能である。
【実施例】  以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
例１：ＩＰＦ１と相互作用する蛋白質の抽出
ＩＰＦ１と相互作用する蛋白質を、国際公開第ＷＯ  １／６７２９９号公報に記載の予測方法に従って予測した。ＩＰＦ１のアミノ酸配列を適宜の長さのオリゴペプチドに分解し、各オリゴペプチドのアミノ酸配列あるいはそのアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を持った蛋白質をデータベース中で検索し、得られた蛋白質とＩＰＦ１との間でローカルアライメントを行い、ローカルアライメントのスコアの高いものをＩＰＦ１と相互作用すると予測した。ローカルアライメントのスコアは国際公開第ＷＯ０１／６７２９９号公報に記載の方法と同様に２５．０以上とした。
予測の結果、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなる配列番号４７に記載のオリゴペプチド、配列番号４８に記載のオリゴペプチド、及び配列番号４９に記載のオリゴペプチドと相同性のある配列番号５０に記載のオリゴペプチド、配列番号５１に記載のオリゴペプチド、及び配列番号５２に記載のオリゴペプチドがＨＮＦ３Ｇのアミノ酸配列中に存在することが分かった。第１図にＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇとのローカルアライメントの結果を示す。また、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなる配列番号５３に記載のオリゴペプチド及び配列番号５４に記載のオリゴペプチドと相同性のある配列番号５５に記載のオリゴペプチド、配列番号５６に記載のオリゴペプチドがＰＨＦ１のアミノ酸配列中に存在しており（第２図）、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなる配列番号５７に記載のオリゴペプチド、配列番号５８に記載のオリゴペプチド、及び配列番号５９に記載のオリゴペプチドと相同性のある配列番号６０に記載のオリゴペプチド、配列番号６１に記載のオリゴペプチド、及び配列番号６２に記載のオリゴペプチドがＤＬＸ４のアミノ酸配列中に存在しており（第３図）、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなる配列番号６３に記載のオリゴペプチド、配列番号６４に記載のオリゴペプチド、及び配列番号６５に記載のオリゴペプチドと相同性のある配列番号６６に記載のオリゴペプチド、配列番号６７に記載のオリゴペプチド、及び配列番号６８に記載のオリゴペプチドがＴＣＦ４のアミノ酸配列中に存在しており（第４図）、ＩＰＦ１由来のアミノ酸残基からなる配列番号６９に記載のオリゴペプチドと相同性のある配列番号７０に記載のオリゴペプチドがＴＭＰＯのアミノ酸配列中に存在することが分かった（第５図）。
例２：ヒトＩＰＦ１との結合試験
ヒトＩＰＦ１とヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４、ヒトＴＣＦ４、又はヒトＴＭＰＯと結合するか否かをＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法により検討した。
＜材料＞
（１）各ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＩＰＦ１  ｃＤＮＡはヒト肝臓由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒトＨＮＦ３Ｇ  ｃＤＮＡはヒト肝臓由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒトＰＨＦ１  ｃＤＮＡ、ヒトＴＣＦ４  ｃＤＮＡ及びヒトＴＭＰＯ  ｃＤＮＡはヒト脳由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）から、ヒトＤＬＸ４  ｃＤＮＡはヒト胎盤由来ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からそれぞれＰＣＲによりクローニングした。
（２）各種発現プラスミド
ヒトＩＰＦ１  ｃＤＮＡをＧＳＴ融合蛋白質発現用ベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に組み込み、Ｎ末ＧＳＴ融合ＩＰＦ１発現プラスミド、ｐＧＥＸ−４Ｔ／ＩＰＦ１を構築した。また、ヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４、ヒトＴＣＦ４及びヒトＴＭＰＯの各ｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ蛋白質合成及び動物細胞用発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込み、各発現プラスミドを構築した（ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＨＮＦ３Ｇ、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＨＦ１、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＤＬＸ４、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＴＣＦ４及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＴＭＰＯ）。なお、その際、各蛋白質がＮ末ＨＡタグ付加型蛋白質として発現されるよう、ＨＡタグコード配列を各ｃＤＮＡの５’末に挿入した。陰性コントロールとして用いるＬａｃＺの発現プラスミドは、ｐＣｒｕｚＨＡ−ＬａｃＺ（Ｎ末ＨＡクグ付加型ＬａｃＺ発現プラスミド）（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）を用いた。
（３）Ｎ末ＧＳＴ融合ＩＰＦ１（ＧＳＴ−ＩＰＦ１）の精製
ＧＳＴ−ＩＰＦ１は、ｐＧＥＸ−４Ｔ／ＩＰＦ１を保持する大腸菌にて誘導発現後、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて精製した。
＜方法＞
（１）ＧＳＴ−ｐｕｌｌ  ｄｏｗｎ法による結合試験
ヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４、ヒトＴＣＦ４、ヒトＴＭＰＯ及びＬａｃＺは、ＴＮＴ  ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにて３５Ｓ−メチオニン標識した蛋白質として合成した。２０μｌの合成反応液と５μｇのＧＳＴ−ＩＰＦ１又はＧＳＴを、５００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．５／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＤＴＴ／０．５％  ＮＰ−４０）中にて、氷上、１時間静置した。その後、２０μｌ（ｂｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）のＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂを添加し、４°Ｃにて一晩、転倒混和した後、遠心によりビーズを回収した。ビーズを５００μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで４回洗浄した後、２０μｌの２×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８／４％  ＳＤＳ／２０％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ／０．０１％  Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  ｂｌｕｅ）を加え、３分間煮沸後、上清を５−２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、ＢＡＳ２０００（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ社）により結合した蛋白質を検出した。
＜結果＞
ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、ＤＬＸ４、ＴＣＦ４、及びＴＭＰＯとの結合が認められた（第６図）。なお、ＬａｃＺとＩＰＦ１との結合は認められなかったことから、検出されたＩＰＦ１と各蛋白質との結合は非特異的なものではないと言える（第６図）。第６図中、ＧＳＴ（ＧＳＴのレーン）あるいはＧＳＴ−ＩＰＦ１（ＧＳＴ−ＩＰＦ１のレーン）とｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系にて３２Ｓ−メチオニン標識蛋白質として合成した各蛋白質（ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、ＤＬＸ４、ＴＣＦ４、ＴＭＰＯ及びＬａｃＺ）（ｉｎｐｕｔのレーン）を混合後、グルタチオンセファロースによりＧＳＴあるいはＧＳＴ−ＩＰＦ１を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。その後、結合蛋白質をオートラジオグラフィーにより検出した。矢頭は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系にて合成した各蛋白質（ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、ＤＬＸ４、ＴＣＦ４、ＴＭＰＯ及びＬａｃＺ）の位置を示す。
例３：ヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４によるヒトインスリン遺伝子プロモーター活性の抑制
ＩＰＦ１との結合が認められたヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４、ヒトＴＣＦ４、及びヒトＴＭＰＯのうち、ヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、ヒトＤＬＸ４を用いてヒトインスリン遺伝子プロモーター活性の抑制作用をレポーターアッセイ系を用いて検討した。
＜材料＞
（１）ヒトインスリン遺伝子プロモーター領域のクローニング及びルシフェラーゼレポータープラスミドの構築
ヒトインスリン遺伝子プロモーター領域（−３９２／＋２３７、転写開始点を＋１とする）は、Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）からＰＣＲによりクローニングした。クローニングしたプロモーター領域をルシフェラーゼレポーターベクターであるｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）に組み込み、ヒトインスリン遺伝子プロモーター活性測定用レポータープラスミドであるｐＩｎｓＰｒｏ（−３９２／＋２３７）−ＧＬ３を構築した。
（２）各種発現プラスミド
ヒトＩＰＦ１のｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に組み込みＩＰＦ１発現プラスミドを構築した（ｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＰＦ１）。その際、Ｎ末ＦＬＡＧタグ付加型蛋白質として発現されるよう、ＦＬＡＧタグコード配列をＩＰＦ１ｃＤＮＡの５’末に挿入した。ヒトＨＮＦ３Ｇ、ヒトＰＨＦ１、及びヒトＤＬＸ４の各発現プラスミドは、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＨＮＦ３Ｇ、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＨＦ１、及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＤＬＸ４をそれぞれ使用した。
＜方法＞
（１）トランスフェクション及びレポーターアッセイ
前日に２×１０５個のＨｅＬａ細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに散種し、一晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてトランスフェクションを行った。プラスミドは、２００ｎｇのｐＩｎｓＰｒｏ（−３９２／＋２３７）−ＧＬ３、４００ｎｇのｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＰＦ１、１μｇの各発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＨＮＦ３Ｇ、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＨＦ１、及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＤＬＸ４）及びｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌとして０．５ｎｇのｐＲＬ−ＳＶ４０（Ｐｒｏｍｅｇａ社）をそれぞれ用いた。また、ＤＮＡの総量は１．６μｇとなるようにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて調整した。４８時間培養後、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。なお、測定値は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性により補正した。マウスインスリノーマ由来β細胞株であるＭＩＮ６細胞を用いる場合は、前日に、５×１０５個のＭＩＮ６細胞を６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに散種し、一晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてトランスフェクションを行った。プラスミドは、２００ｎｇのｐＩｎｓＰｒｏ（−３９２／＋２３７）−ＧＬ３、１μｇの各発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＨＮＦ３Ｇ、ｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＰＨＦ１、及びｐｃＤＮＡ−ＨＡ−ＤＬＸ４）及びｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌとして５ｎｇのｐＲＬ−ＳＶ４０をそれぞれ用いた。また、ＤＮＡの総量は１．２μｇとなるようにｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にて調整した。４８時間培養後、上記と同様の方法にてルシフェラーゼ活性を測定した。
＜結果＞
まず、ＩＰＦ１を発現していないＨｅＬａ細胞でのルシフェラーゼレポーター系を用いたＩＰＦ１依存的なヒトインスリンプロモーター活性検出系の構築を行った。その結果、第７図に示すように、ＩＰＦ１発現プラスミド量依存的なヒトインスリンプロモーター活性の増大が認められた。第７図中、縦軸はｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＰＦ１未導入の時のルシフェラーゼ活性を１とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を、横軸は導入したｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＰＦ１量を表す。そこで、この系を用いて各蛋白質の影響について検討した。その結果、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１及びＤＬＸ４の過剰発現によりＩＰＦ１依存的なヒトインスリンプロモーター活性がそれぞれ約４５％、約２５％及び約６０％抑制されることが明らかとなった（第８図）。第８図中、縦軸はｐｃＤＮＡ−ＦＬＡＧ−ＩＰＦ１のみ導入時のルシフェラーゼ活性を１００とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を表す。−は発現プラスミド未導入、＋は発現プラスミドを導入したことを示す。また、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４はそれぞれ対応する発現プラスミドを導入したことを示す。
次に、ＩＰＦ１を内在的に発現しているマウスインスリノーマ由来β細胞株であるＭＩＮ６細胞を用いて、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４のヒトインスリンプロモーター活性への影響をレポーターアッセイにより検討した。その結果、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１及びＤＬＸ４の過剰発現によりヒトインスリンプロモーター活性が約６０％、約３０％及び約４５％抑制されることが明らかとなった（第９図）。第９図中、縦軸は各発現プラスミド未導入時のルシフェラーゼ活性を１００とした場合の相対的ルシフェラーゼ活性を表す。−は発現プラスミド未導入、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４はそれぞれ対応する発現プラスミドを導入したことを示す。以上の結果より、ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４が、ＨｅＬａ細胞系でのＩＰＦ１依存的なヒトインスリン遺伝子プロモーター活性及びＭＩＮ６細胞系でのヒトインスリンプロモーター活性の両活性を抑制することが明らかとなった。
例４：ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４のヒト膵臓及びＭＩＮ６細胞での発現確認（ＲＴ−ＰＣＲ法）
インスリン分泌組織であるヒト膵臓及びマウスインスリノーマ由来β細胞株であるＭＩＮ６細胞においてＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４が発現しているか否かについてをＲＴ−ＰＣＲ法により検討した。
＜方法＞
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による各ｍＲＮＡの確認
ヒト膵臓、ヒト脳及びヒト胎盤由来ｃＤＮＡはそれぞれＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。マウスＭＩＮ６細胞の場合は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製後、ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．２．１（Ｔａｋａｒａ社）を用いてＭＩＮ６細胞由来ｃＤＮＡを合成した。各ｃＤＮＡを鋳型として、ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔｏｙｏｂｏ社）及び各遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを実施した。反応液を２％アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロマイド染色により目的のＰＣＲ産物を検出した。
プライマーとしては、
ヒトＨＮＦ３Ｇの場合は、
配列番号３５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号３６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
ヒトＰＨＦ１の場合は
配列番号３７に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号３８に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
ヒトＤＬＸ４の場合は
配列番号３９に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号４０に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ使用した。
また、マウスＨＮＦ３Ｇの場合には
配列番号４１に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号４２に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
マウスＰＨＦ１の場合には
配列番号４３に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号４４に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
マウスＤＬＸ４の場合には
配列番号４５に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、及び
配列番号４６に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
をそれぞれ使用した。
＜結果＞
ＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１、及びＤＬＸ４のインスリン分泌組織であるヒト膵臓における発現をＲＴ−ＰＣＲ法により検討した結果、各遺伝子のｍＲＮＡの存在が確認された。第１０図は、ヒト膵臓（Ｐａｎｃｒｅａｓのレーン）、ヒト脳（Ｂｒａｉｎのレーン）又はヒト胎盤（Ｐｌａｃｅｎｔａのレーン）由来の各ｃＤＮＡを鋳型とし、各遺伝子特異的プライマーを用いてＰＣＲを実施した結果を示しており（それぞれＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１及びＤＬＸ４のパネル）。反応液を２％アガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイド染色により目的のＰＣＲ産物を検出した。左の数字はサイズマーカーの値（ｂｐ）を、矢頭は各ｍＲＮＡ由来の増幅産物の位置を表す。また、Ｂｒａｉｎ、Ｐａｎｃｒｅａｓ及びＰｌａｃｅｎｔａはそれぞれ各臓器由来のｃＤＮＡを鋳型としたことを示す。
また、インスリンは膵臓に存在するβ細胞により分泌されることから、マウスインスリノーマ由来のβ細胞株であるＭＩＮ６細胞での各マウス遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより検討した結果、各マウス遺伝子のｍＲＮＡの存在が確認された。第１１図は、マウスＭＩＮ６細胞由来ｃＤＮＡを鋳型とし、各遺伝子特異的プライマー（それぞれＨＮＦ３Ｇ、ＰＨＦ１及びＤＬＸ４のレーン）を用いてＰＣＲを実施した結果を示した図である。反応液を２％アガロースゲル電気泳動により分離後、エチジウムブロマイド染色により目的のＰＣＲ産物を検出した。左の数字はサイズマーカーの値（ｂｐ）を、矢頭は各ｍＲＮＡ由来の増幅産物の位置を表す。なお、各遺伝子検出用のプライマーは、イントロンをはさむように設計してあるため、増幅されたＰＣＲ産物はゲノミックＤＮＡ由来のものではない。
【配列表フリーテキスト】配列番号１３：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１４：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１５：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号１６：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号１７：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号１８：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号１９：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいで高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２０：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２１：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＨＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２２：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＨＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２３：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２４：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２５：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＤＬＸ４の部分オリゴペプチド。
配列番号２６：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＤＬＸ４の部分オリゴペプチド。
配列番号２７：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２８：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号２９：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号３０：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号３１：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号３２：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号３３：ＩＰＦ１とＴＭＰＯのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号３４：ＩＰＦ１とＴＭＰＯのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＭＰＯの部分オリゴペプチド。
配列番号３５：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号３６：配列番号３に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号３７：配列番号５に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号３８：配列番号５に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号３９：配列番号７に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４０：配列番号７に記載の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４１：マウスＨＮＦ３Ｇ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４２：マウスＨＮＦ３Ｇ遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４３：マウスＰＨＦ１遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４４：マウスＰＨＦ１遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４５：マウスＤＬＸ４遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４６：マウスＤＬＸ４遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマー用オリゴヌクレオチド。
配列番号４７：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号４８：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号４９：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５０：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号５１：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号５２：ＩＰＦ１とＨＮＦ３Ｇのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＨＮＦ３Ｇの部分オリゴペプチド。
配列番号５３：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５４：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５５：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＨＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５６：ＩＰＦ１とＰＨＦ１のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＰＨＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５７：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５８：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号５９：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号６０：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＤＬＸ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６１：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＤＬＸ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６２：ＩＰＦ１とＤＬＸ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＤＬＸ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６３：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号６４：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号６５：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号６６：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６７：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６８：ＩＰＦ１とＴＣＦ４のローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＣＦ４の部分オリゴペプチド。
配列番号６９：ＩＰＦ１とＴＭＰＯのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＩＰＦ１の部分オリゴペプチド。
配列番号７０：ＩＰＦ１とＴＭＰＯのローカルアライメントにおいて高いスコアを示したＴＭＰＯの部分オリゴペプチド。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ＩＰＦ１と結合する蛋白質（ｉ）ないし（ｖ）が提供され、ＩＰＦ１と該蛋白質との結合を阻害することによりインスリン遺伝子転写を調節する手段が提供された。この手段を用いた本発明のスクリーニング方法により、例えば、インスリン遺伝子転写を促進する物質を容易にスクリーニングすることができ、該物質は、糖尿病などの疾患の予防及び／又は治療のための医薬の有効成分として用いることできる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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