(57)【要約】  （ａ）分子量が約６０ｋＤａであり、（ｂ）糖質とタンパク質との含有比率（糖質：タンパク質）が１６．４：１．０である、新規糖タンパク質を開示する。前記糖タンパク質は、（１）マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出し、（２）得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させ、（３）前記陰イオン交換樹脂から、溶離液により吸着画分を溶出させ、（４）ゲル濾過により、分子量５０〜７０ｋＤａの画分を取得することにより、調製することができる。  前記糖タンパク質は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤の有効成分として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有する糖タンパク質。
（ａ）分子量：約６０ｋＤａ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。
（ｂ）糖質とタンパク質との含有比率：（糖質：タンパク質）１６．４：１．０。
【請求項２】
（１）マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程、
（２）得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）前記陰イオン交換樹脂から、溶離液により吸着画分を溶出する工程、及び
（４）前記溶出工程で得られた溶出画分を、ゲル濾過により分画し、分子量５０〜７０ｋＤａの画分を取得する工程
を含む製造方法により調製することのできる、糖タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、免疫増強剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス負荷回復促進剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫増強方法。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復促進方法。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍を治療又は予防する方法。
【請求項１０】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、免疫増強剤又は免疫増強用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項１１】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、ストレス負荷回復促進剤又はストレス負荷回復促進用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、抗腫瘍剤又は抗腫瘍用医薬組成物を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規の糖タンパク質並びにそれを含有する医薬組成物、例えば、新規免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤に関する。本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、若しくは抗腫瘍剤、又は本発明の新規糖タンパク質は、医薬品として投与することができるだけでなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。なお、本明細書における免疫増強活性には、抗腫瘍活性が含まれる。
【背景技術】
【０００２】
マツタケ［Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａ  ｍａｔｓｕｔａｋｅ（Ｓ．Ｉｔｏ  ＆  Ｉｍａｉ）Ｓｉｎｇ．］には種々の生理活性物質が含まれていることが知られており、例えば、特許文献１及び特許文献２には、マツタケに含有される各種の抗腫瘍性物質が開示されている。前記特許文献１には、マツタケ菌糸体の液体培養物を熱水又は希アルカリ溶液で抽出して得られる抽出液から分離精製されたエミタニン−５−Ａ、エミタニン−５−Ｂ、エミタニン−５−Ｃ、及びエミタニン−５−Ｄに、サルコーマ１８０細胞の増殖阻止作用があることが開示されている。また、前記特許文献２には、マツタケ子実体の水抽出物から分離精製された分子量２０〜２１万のタンパク質（サブユニットの分子量＝１０〜１１万）が抗腫瘍活性を有することが開示されている。【０００３】
また、本発明者は、マツタケ熱水抽出液、マツタケのアルカリ溶液抽出液、あるいは、マツタケ熱水抽出液又はマツタケアルカリ溶液抽出液の陰イオン交換樹脂吸着画分が、免疫増強活性を有することを既に見出している（特許文献３）。
更に、本発明者らは、特定のマツタケ株を特定の培養方法により培養して得られた菌糸体由来の部分精製画分に、免疫増強作用及びストレス負荷回復促進作用があることも既に見出している（特許文献４）。なお、前記特許文献４に記載の前記部分精製画分は、理化学的性質の点で、公知の画分（例えば、前記特許文献３に記載の陰イオン交換樹脂吸着画分）とは異なる画分である。
【特許文献１】特公昭５７−１２３０号公報
【特許文献２】特許第２７６７５２１号明細書
【特許文献３】国際公開第ＷＯ０１／４９３０８号パンフレット
【特許文献４】国際公開第ＷＯ０３／０７０２６４号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明者は、免疫増強活性及び／又はストレス負荷回復促進活性を有するマツタケ由来の前記抽出液又は画分に含まれる活性本体の精製を試みたが、天然由来高分子物質の複雑きわまる特性（特に糖タンパク質）の点で、単一ピークとして単離することは容易なことではなかった。しかし、イオン交換分離の後、分子量分画操作を組み合わせたところ、免疫増強活性、ストレス負荷回復促進活性、及び抗腫瘍活性を有する化合物を単一ピークとして単離することに成功し、更に、それが新規の糖タンパク質であることを新たに見出した。本発明はこのような知見に基づくものである。【０００５】
従って、本発明の課題は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、及び／又は抗腫瘍剤の有効成分として有用な、新規の糖タンパク質を提供し、更に、それを含有する新規の医薬組成物、例えば、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記課題は、本発明による、下記の性質を有する糖タンパク質：
（ａ）分子量：約６０ｋＤａ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）
（ｂ）糖質とタンパク質との含有比率：（糖質：タンパク質）１６．４：１．０
により解決することができる。
また、本発明は、（１）マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程、
（２）得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）前記陰イオン交換樹脂から、適当な溶離液により吸着画分を溶出する工程、及び
（４）前記溶出工程で得られた溶出画分を、ゲル濾過により分画し、分子量５０〜７０ｋＤａの画分を取得する工程
を含む製造方法により調製することのできる、糖タンパク質に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質を、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することを含む、免疫増強方法に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質を、ストレス負荷回復促進が必要な対象に、有効量で投与することを含む、ストレス負荷回復促進方法に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質を、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することを含む、腫瘍の治療又は予防する方法に関する。
また、本発明は、前記糖タンパク質の、免疫増強剤若しくは免疫増強用医薬組成物、ストレス負荷回復促進剤若しくはストレス負荷回復促進用医薬組成物、又は抗腫瘍剤若しくは抗腫瘍用医薬組成物を製造するための使用に関する。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の免疫増強剤によれば、免疫増強が必要な対象の免疫能を増強することができる。また、本発明のストレス負荷回復促進剤によれば、ストレス負荷に対する回復を促進することができる。更に、本発明の抗腫瘍剤によれば、腫瘍を治療又は予防することができる。本発明の糖タンパク質は、前記免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤の有効成分として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
［１］本発明の糖タンパク質
本発明の糖タンパク質は、以下の性質を有する。
（１）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により決定される分子量が約６０ｋＤａ（５０〜７０ｋＤａ）である。
（２）タンパク質含量及び糖質含量：本発明の糖タンパク質の加水分解により得られるアミノ酸量を基に算出したところ、３８．４２μｇ／ｍｇである。また、本発明の糖タンパク質の加水分解により得られる単糖量を基に算出したところ、６２８．７２μｇ／ｍｇである。糖質とタンパク質との比率（糖質：タンパク質）は、１６．４：１．０である。
（３）脂肪酸含量：ステアリン酸（Ｃ１８：０）１．８６μｇ／ｍｇ、パルミチン酸（Ｃ１６：０）１．８４μｇ／ｍｇ、オレイン酸［Ｃ１８：１（９）］１．５２μｇ／ｍｇ、リノール酸［Ｃ１８：２（９，１２）］０．９４μｇ／ｍｇ、及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）０．５５μｇ／ｍｇである。
（４）アミノ酸組成：アスパラギン酸及びアスパラギン９．６５ｍｏｌ％、トレオニン６．１５ｍｏｌ％、セリン６．８３ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１０．１９ｍｏｌ％、グリシン８．７４ｍｏｌ％、アラニン９．８４ｍｏｌ％、バリン６．９４ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．１５ｍｏｌ％、メチオニン１．３１ｍｏｌ％、イソロイシン５．４７ｍｏｌ％、ロイシン９．５５ｍｏｌ％、チロシン２．６４ｍｏｌ％、フェニルアラニン４．０９ｍｏｌ％、リシン４．９９ｍｏｌ％、ヒスチジン１．９７ｍｏｌ％、アルギニン５．００ｍｏｌ％、トリプトファン１．１７ｍｏｌ％、及びプロリン５．３３ｍｏｌ％である。
（５）中性糖組成：グルコース５６１．４５μｇ／ｍｇ、マンノース１６．６８μｇ／ｍｇ、ガラクト−ス４２．６５μｇ／ｍｇ、及びフコース９．５７μｇ／ｍｇである。なお、キシロースは検出限界以下である。
（６）アミノ糖組成：グルコサミン０．３６μｇ／ｍｇである。なお、マンノサミンは検出限界以下である。
（７）円偏光二色性分析（ＣＤ）：図７に示すスペクトルを示す。
（８）核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析
（ｉ）１Ｈ一次元ＮＭＲ分析：本発明の糖タンパク質は、図８に示すスペクトルを示す。
ヒドラジン処理により本発明のタンパク質からタンパク質を除いた場合には、図９に示すスペクトルを示す。
（ii）１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析：本発明の糖タンパク質は、図１０に示すスペクトルを示
す。ヒドラジン処理により本発明のタンパク質からタンパク質を除いた場合には、図１１に示すスペクトルを示す。
（９）糖質部の糖結合位置：本発明の糖タンパク質における糖質部は、表６に示す各結合様式を、表６に示す割合で含む。１→４結合のグルコースが主要な結合である。
（１０）赤外分光分析（ＩＲ）：図１２に示すスペクトルを示す。
（１１）紫外分光分析（ＵＶ）：図１３に示すスペクトルを示す。【０００９】
本発明の糖タンパク質は、前記性質を示す限り、その由来は特に限定されるものではないが、例えば、マツタケから分離することができる。
前記マツタケとしては、例えば、天然のマツタケの子実体若しくは菌糸体、又は培養により得られるマツタケの菌糸体若しくは培養物（Ｂｒｏｔｈ）を挙げることができる。培養に用いる前記マツタケとしては、例えば、国際公開第ＷＯ０２／３０４４０号パンフレットに記載のマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株を挙げることができる。前記マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター［（旧）工業技術院生命工学工業技術研究所（あて名：〒３０５−８５６６  日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６）］に平成１２年９月１４日より寄託しているものである。このマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株は、京都府亀岡市で採取したマツタケＣＭ６２７１株から子実体組織を切り出し、試験管内で培養することにより、菌糸体継代株を得たものであり、呉羽化学工業株式会社生物医学研究所で維持している。【００１０】
本発明の糖タンパク質は、以下の操作に限定されるものではないが、例えば、
マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程（以下、抽出工程と称する）、
得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程（以下、陰イオン交換樹脂吸着工程と称する）、
前記陰イオン交換樹脂から、適当な溶離液により吸着画分を溶出する工程（以下、溶出工程と称する）、
前記溶出工程において、以下に示す溶出条件で溶出された所定画分を、ゲル濾過により分画し、分子量５０〜７０ｋＤａの画分を取得する工程（以下、ゲル濾過分画工程と称する）
を含む製造方法により、調製することができる。なお、本発明の糖タンパク質には、前記製造方法により調製された糖タンパク質が含まれるだけでなく、前記製造方法により調製された糖タンパク質と同じ性質を示す糖タンパク質である限り、前記製造方法以外の製法で調製された糖タンパク質も含まれる。【００１１】
前記抽出工程において、マツタケとして子実体又は菌糸体を用いる場合には、抽出効率が向上するように、破砕物又は粉体の状態に加工することが好ましい。
抽出工程で熱水を用いる場合には、その熱水の温度は、６０〜１００℃であることが好ましく、８０〜９８℃であることがより好ましい。また、抽出の際には、抽出効率が向上するように、撹拌又は振盪しながら実施することが好ましい。抽出時間は、例えば、マツタケの状態（すなわち、子実体、菌糸体、又は培養物のいずれの状態であるか、あるいは、破砕物又は粉体の状態に加工した場合にはその加工状態）、熱水の温度、又は撹拌若しくは振盪の有無若しくは条件に応じて、適宜決定することができるが、通常、１〜６時間であり、２〜３時間であることが好ましい。【００１２】
抽出工程でアルカリ溶液を用いる場合には、前記アルカリ溶液としては、これに限定されるものではないが、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム又はカリウム）の水酸化物、特には水酸化ナトリウムの水溶液を用いることができる。前記アルカリ溶液のｐＨは、８〜１３であることが好ましく、９〜１２であることがより好ましい。アルカリ溶液抽出工程は、０〜２０℃で実施することが好ましく、０〜１５℃で実施することがより好ましい。アルカリ抽出工程で得られた抽出液は、中和処理を実施してから次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。【００１３】
抽出工程で得られた抽出液は、不溶物が混在する状態で、そのまま、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることもできるが、不溶物を除去してから、あるいは、不溶物を除去し、更に、抽出液中の低分子画分を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることが好ましい。例えば、不溶物が混在する抽出液を遠心分離することにより不溶物を除去し、得られる上清のみを、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。あるいは、不溶物が混在する抽出液を遠心分離して得られる前記上清を透析し、低分子画分（好ましくは分子量３５００以下の画分）を除去してから、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることができる。【００１４】
また、抽出工程で得られた抽出液は、次の陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる前に、脱脂工程を実施することもできる。なお、この脱脂工程と前記不溶物及び／又は低分子画分除去工程は、いずれか一方のみを実施することもできるし、両方を実施することもできる。
前記脱脂工程に用いる有機溶媒としては、例えば、脂溶性有機溶媒（例えば、クロロホルム、メタノール、エーテル、エタノール、酢酸エチル、又はヘキサン等）又はそれらの混合物（例えば、クロロホルムとメタノールとの混合液）を用いることができ、クロロホルムとメタノールとの混合液が好ましい。前記有機溶媒としてクロロホルムとメタノールとの混合液を使用する場合には、その混合比［クロロホルム：メタノール（ｖ／ｖ）］は、例えば、１０：１〜１：１０であることができる。脱脂工程は、１５〜３０℃の温度で実施することが好ましい。【００１５】
陰イオン交換樹脂吸着工程に用いることのできる陰イオン交換樹脂としては、公知の陰イオン交換樹脂を用いることができ、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルロース又はトリエチルアンモニオエチル（ＴＥＡＥ）セルロースを挙げることができる。【００１６】
溶出工程に用いる溶離液は、陰イオン交換樹脂吸着工程に用いる陰イオン交換樹脂の種類に応じて適宜決定することができ、例えば、塩化ナトリウム水溶液などを挙げることができる。溶出工程により溶出される画分の内、以下に示す溶出条件で溶出された画分（例えば、後述の実施例２におけるフラクションＢ）を、次のゲル濾過分画工程に使用することができる。
例えば、前記吸着工程において、陰イオン交換樹脂として、例えば、ＤＥＡＥ  ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＡＫ  ６５０Ｍ充填カラム（φ２２ｍｍ，ｈ２０ｃｍ）］を使用し、吸着させるサンプルを５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解させてアプライした場合、溶出工程において、溶出液Ａ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）及び溶出液Ｂ（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）のリニアグラジエント溶出を流速５ｍＬ／ｍｉｎで行い、１２分〜１５分（液量１５ｍＬ）に溶出される画分を、次のゲル濾過分画工程に使用することができる。【００１７】
ゲル濾過分画工程は、常法に従って実施することができ、分子量５０〜７０ｋＤａの画分（例えば、後述の実施例２におけるフラクションＢ−１−２）を取得することにより、本発明の糖タンパク質が単一ピークとして含まれる画分を取得することができる。ゲル濾過分画工程は、分画範囲の異なる複数（例えば、２種類）のゲル濾過カラムを用いて複数段階（例えば、２段階）で実施することができ、例えば、分画範囲が分子量１×１０３〜１×１０５Ｄａであるゲル濾過カラムを使用し、前記ゲル濾過カラムにより分画された分子量１０ｋＤａ以上の画分（例えば、後述の実施例２におけるフラクションＢ−１）を、続いて、分画範囲が分子量４×１０４〜２×１０７Ｄａであるゲル濾過カラムにアプライし、分子量５０〜７０ｋＤａの画分（例えば、後述の実施例２におけるフラクションＢ−１−２）を取得することができる。【００１８】
［２］本発明の医薬組成物
本発明の医薬組成物、特には、本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤は、有効成分として、本発明の糖タンパク質を含有する。
本発明の免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、又は抗腫瘍剤は、有効成分としての本発明の糖タンパク質を、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、動物、好ましくは哺乳動物（特にはヒト）に投与することができる。すなわち、本発明の組成物（好ましくは医薬組成物）、例えば、本発明の免疫増強組成物（好ましくは免疫増強医薬組成物）、ストレス負荷回復促進組成物（好ましくはストレス負荷回復促進医薬組成物）、又は抗腫瘍組成物（好ましくは抗腫瘍医薬組成物）は、有効成分としての本発明の糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する。【００１９】
本発明の免疫増強剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、免疫増強活性を有する。前記免疫増強活性には、例えば、国際公開第ＷＯ０３／０７０２６４号パンフレットに記載の各種活性、例えば、抗腫瘍活性［例えば、担癌個体における生存期間の延長活性、抗原発腫瘍活性（特には、原発腫瘍の増殖抑制活性）、又は抗転移活性（特には、転移巣の増殖抑制活性）］、キラー活性誘導促進活性（特には、腸管リンパ球のキラー活性誘導促進活性）、腫瘍細胞認識増強活性、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）遺伝子発現増強活性、又は血清ＩＡＰ値上昇活性、あるいは、ＴＧＦ−β（免疫抑制物質の１つ）活性抑制活性などが含まれる。
本発明の免疫増強剤による治療又は予防の対象となる疾病としては、例えば、癌、感染症、自己免疫疾患、慢性疲労症候群、又は生活習慣症などを挙げることができる。【００２０】
本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、免疫増強が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、免疫増強組成物（好ましくは免疫増強医薬組成物）、免疫増強健康食品（好ましくは免疫増強機能性食品）、あるいは、免疫増強用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。【００２１】
本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、ストレス負荷に対する回復促進活性を有する。本発明のストレス負荷回復促進剤による治療又は予防の対象となる疾病としては、例えば、癌、感染症、自己免疫疾患、慢性疲労症候群、又は生活習慣症などを挙げることができる。
本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、ストレス負荷に対する回復促進が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、ストレス負荷に対する回復促進組成物（好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進医薬組成物）、ストレス負荷に対する回復促進健康食品（好ましくは、ストレス負荷に対する回復促進機能性食品）、あるいは、ストレス負荷に対する回復促進用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。【００２２】
一般に、動物に対して、単発的に、あるいは、或る期間に亘ってストレスを与えると、通常、その動物における免疫能は低下するが、前記ストレス負荷から解放されると、自発的な免疫力の回復が起こる。本明細書における「ストレス負荷に対する回復促進活性（ストレス負荷回復促進活性）」とは、ストレス負荷から開放した後、免疫力回復期における免疫力の回復を、自発的な回復よりも促進する活性を意味する。
本発明のストレス負荷回復促進剤の投与時期は、ストレス負荷により一時的に低下した免疫力を、その投与により回復促進可能である限り、特に限定されるものではなく、例えば、ストレス負荷の前、ストレス負荷中、及び／又はストレス負荷から開放した後の免疫力回復期に投与することができる。【００２３】
なお、本発明における前記「ストレス負荷回復促進活性」は、本発明者が見出した前記の単なる「免疫増強活性」とは異なる。すなわち、「免疫増強活性」とは、そのような活性を有する有効成分を投与した場合に、投与前の状態（ストレスの負荷がなく、免疫力が通常の状態であることもできるし、あるいは、ストレス負荷により、免疫力が低下している状態であることもできる）と比較して、免疫力の向上がみられる活性を一般に意味し、従って、免疫力それ自体を向上させる活性である。一方、本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、前述のように、免疫力回復期における免疫力の回復を促進する活性であって、従って、免疫力の回復速度を向上させる活性である。本発明のストレス負荷回復促進剤を投与すると、本発明のストレス負荷回復促進剤を投与しない場合と比較して、免疫力の回復速度が上昇する。【００２４】
更には、「免疫増強活性」においては、そのような活性を有する有効成分を投与すると、直接的に、免疫力の向上がみられるのに対して、本発明のストレス負荷回復促進剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質を、予め、ストレスを負荷する前に対象動物に投与しておくと、ストレス負荷中及び免疫力回復期中に、本発明の糖タンパク質を投与しなくても、免疫力回復期において免疫力の回復が促進される。この点においても、本発明における「免疫増強活性」と本発明における「ストレス負荷回復促進活性」とは、異なる活性である。【００２５】
本発明の抗腫瘍剤における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、抗腫瘍活性を有する。なお、前記抗腫瘍活性は免疫増強活性に含まれる。前記抗腫瘍活性には、例えば、担癌個体における生存期間の延長活性、抗原発腫瘍活性（特には、原発腫瘍の増殖抑制活性）、又は抗転移活性（特には、転移巣の増殖抑制活性）などが含まれる。本発明の抗腫瘍剤による治療又は予防の対象となる癌としては、例えば、肺癌、胃癌、肝臓癌、結腸・直腸癌、膵臓癌、食道癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、肉腫、メラノーマ、又は白血病などを挙げることができる。【００２６】
従って、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、それ単独で、あるいは、好ましくは薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる通常の担体又は希釈剤と共に、腫瘍の治療又は予防が必要な対象に、有効量で投与することができる。
また、本発明における有効成分である、本発明の糖タンパク質は、抗腫瘍組成物（好ましくは抗腫瘍医薬組成物）、抗腫瘍健康食品（好ましくは抗腫瘍機能性食品）、あるいは、抗腫瘍用のオーラル衛生用組成物を製造するために使用することができる。【００２７】
本発明の医薬組成物の投与剤型としては、特に限定がなく、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン剤、シロップ剤、エキス剤、若しくは丸剤等の経口剤、又は注射剤、外用液剤、軟膏剤、坐剤、局所投与のクリーム、若しくは点眼薬などの非経口剤を挙げることができる。【００２８】
これらの経口剤は、例えば、アルギン酸ナトリウム、澱粉、コーンスターチ、白糖、乳糖、ぶどう糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、デキストリン、ポリビニルピロリドン、結晶セルロース、大豆レシチン、ショ糖、脂肪酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ケイ酸マグネシウム、無水ケイ酸、又は合成ケイ酸アルミニウムなどの賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進剤、希釈剤、保存剤、着色剤、香料、矯味剤、安定化剤、保湿剤、防腐剤、又は酸化防止剤等を用いて、常法に従って製造することができる。【００２９】
非経口投与方法としては、注射（皮下、静脈内等）、又は直腸投与等が例示される。これらのなかで、注射剤が最も好適に用いられる。
例えば、注射剤の調製においては、有効成分の他に、例えば、生理食塩水若しくはリンゲル液等の水溶性溶剤、植物油若しくは脂肪酸エステル等の非水溶性溶剤、ブドウ糖若しくは塩化ナトリウム等の等張化剤、溶解補助剤、安定化剤、防腐剤、懸濁化剤、又は乳化剤などを任意に用いることができる。
また、本発明の医薬組成物は、徐放性ポリマーなどを用いた徐放性製剤の手法を用いて投与してもよい。例えば、本発明の医薬組成物をエチレンビニル酢酸ポリマーのペレットに取り込ませて、このペレットを治療又は予防すべき組織中に外科的に移植することができる。【００３０】
本発明の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、本発明の糖タンパク質を、０．０１〜９９重量％、好ましくは０．１〜８０重量％の量で含有することができる。
本発明の医薬組成物を用いる場合の投与量は、病気の種類、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができ、経口的に又は非経口的に投与することが可能である。【００３１】
また、投与形態も医薬品に限定されるものではなく、種々の形態、例えば、健康食品（好ましくは機能性食品）又は飼料として飲食物の形で与えることも可能である。なお、前記食品には飲料が含まれる。
食品には、（１）栄養素としての働き（第一次機能）、（２）人間の五感に訴える働き（第２次機能）の他に、（３）人間の健康、身体能力、又は心理状態に好ましい影響を与える働き（第３次機能）、例えば、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統を調節して、健康の維持や健康の回復に好ましい効果を及ぼす働きがあることが知られている。本明細書において「健康食品」とは、健康に何らかの効果を与えるか、あるいは、効果を期待することができる食品を意味し、「機能性食品」とは、前記「健康食品」の中でも、前記の種々の生体調節機能（すなわち、消化器系、循環器系、内分泌系、免疫系、又は神経系などの生理系統の調節機能）を充分に発現することができるように設計及び加工された食品を意味する。【００３２】
更には、オーラル衛生用組成物、例えば、口中に一時的に含むものの、そのほとんどを口中より吐き出す形態、例えば、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤の形で与えることも、あるいは、鼻から吸引させる吸入剤の形で与えることも可能である。例えば、本発明の糖タンパク質を、添加剤（例えば、食品添加剤）として、所望の食品（飲料を含む）、飼料、歯磨剤、洗口剤、チューインガム、又はうがい剤等に添加することができる。
【実施例】
【００３３】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。【００３４】
《実施例１：活性の評価方法》
後述の実施例２で実施したマツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株菌糸体及びそれに由来する各画分の活性の評価方法として、（１）ストレス負荷に対するナチュラルキラー［Natural Killer（以下、ＮＫと称する）］細胞の回復促進活性、及び（２）ヒト遺伝子組み替えトランスフォーミング増殖因子［Transforming
Growth Factor-β1（以下、ＴＧＦ−β１と称する）］結合活性を用いた。【００３５】
（１）ストレス負荷に対するＮＫ細胞活性回復促進活性の評価
ストレス負荷に対するＮＫ細胞活性回復促進活性は、評価用サンプルをマウスに１０日間経口投与した後、拘束ストレスを１８時間負荷し、ストレス解放後のＮＫ細胞活性を測定することにより、評価した。
具体的には、日本チャールズリバーから購入した８週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（各群＝５匹）に、評価用サンプルの水溶液を１０日間に亘って、通常の飼育ケージ中で経口投与（マツタケ菌糸体の３００ｍｇ／ｋｇ／日相当量）した。続いて、マウスを前記飼育ケージから取り出し、空気抜けの穴を開けた５０ｍＬ容のキャップ付きポリプロピレン製遠心用チューブ（カタログ番号2341-050；テクノグラス社）にマウスを１匹ずつ閉じ込めた。このチューブ中に閉じ込められたマウスは、身動きができない状態となった。次に、それらのチューブを飼育用ケージに戻し、１８時間その状態で放置することにより、拘束ストレスを与えた。１８時間のストレスの後、チューブからマウスを取り出し、飼育用ケージに戻し、普通の環境下で飼育した。【００３６】
前記拘束ストレスを解放してから、７日後にマウスを屠殺し、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇらの方法により（Greenberg AHら, J Exp Psychol, 12, 25-31, 1986）、以下の手順に従って、試験管内でＮＫ感受性の腫瘍細胞株ＹＡＣ−１に対するリンパ節細胞の細胞傷害活性を測定することにより、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を評価した。
すなわち、マウスから脾臓を無菌的に取り出し、ハンクス平衡塩類溶液（Hanks
Balanced Salt Solution）を入れた無菌シャーレに移した。はさみとピンセットとでリンパ節をほぐした後、メッシュを通してリンパ球の単細胞液を調製した。１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理を実施）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で細胞を３回洗浄した後、２０ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸、及び２０μｇ／ｍＬゲンタマイシンをそれぞれ添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、細胞濃度を５ｘ１０６個／ｍＬに調整して得た細胞懸濁液をエフェクター細胞として用いた。【００３７】
一方、標的細胞として用いたＹＡＣ−１細胞は、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地中で、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所で継代維持したものである。前記ＹＡＣ−１細胞にクロム酸ナトリウム（アマ−シャムジャパン）を加え、３７℃で２０分間反応させた。未結合の放射性クロム酸ナトリウムを、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄することにより除去し、放射性クロム標識腫瘍細胞を５ｘ１０４個／ｍＬに調整した。【００３８】
先に調整した前記エフェクター細胞懸濁液又はその２倍希釈系列と、前記放射性クロム標識腫瘍細胞とを、試験管に０．１ｍＬずつ加え、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。なお、この際、後述する特異的傷害率を算出するために、放射性クロム標識腫瘍細胞と培地とを試験管に加えた懸濁液、そして、放射性クロム標識腫瘍細胞と界面活性剤（トリトン；最終濃度＝０．０５％）とを試験管に加えた懸濁液についても、３７℃の５％炭酸ガス培養器中で４時間反応させた。反応終了後、１０％牛胎児血清（５６℃で３０分間の熱処理済み）添加ＲＰＭＩ１６４０培地をそれぞれの試験管に１．５ｍＬずつ加え、ミキサーでよく混合した後、遠心分離（１２００ｒｐｍ，５分間，４℃）して、上清を分離し、放射活性をガンマカウンターを用いて測定した。【００３９】
特異的傷害率［Specific Lysis；Ｓ．Ｌ．（単位＝％）］は、式：
［Ｓ．Ｌ．］＝｛（Ｂ−Ｂｆ）／（Ｂｍａｘ−Ｂｆ）｝ｘ１００
［式中、Ｂは実験群上清の放射活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｆは自然遊離群上清の放射活性（単位＝Ｂｑ）であり、Ｂｍａｘは最大遊離群の放射活性（単位＝Ｂｑ）である］
から算出し、エフェクター細胞１０７個当り３０％の腫瘍細胞を傷害する細胞数、すなわち、「３０％傷害単位（Lytic Units 30%；ＬＵ３０）」でＮＫ細胞活性を算出した。そして、評価用サンプルのＮＫ細胞活性値が、対照の蒸留水投与群のＮＫ細胞活性値に対し、有意に促進されている場合（ｐ＜０．０５）に「促進活性あり」、有意差がない場合（ｐ＞０．０５）に「促進活性なし」と表示した。【００４０】
（２）ＴＧＦ−β１結合活性の評価
ＴＧＦ−β１結合活性は、ＴＧＦ−β１標品と評価用サンプルとを試験管内で２時間反応させた後、酵素免疫測定法により、結合ＴＧＦ−β１を定量することにより、評価した。
具体的には、タンパク質吸着の少ないポリプロピレンチューブ（マルチシリコナイズチューブ，Safe Seal Microcentrifuge Tube；フナコシ）中で、ＴＧＦ−β１標品（フナコシ）を２％アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）に溶解し、１００ｎｇ／ｍＬ溶液に調整した。一方、評価用サンプルを２％アルブミン含有リン酸緩衝液に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬ濃度に調整した。前記ＴＧＦ−β１溶液と評価用サンプル溶液の段階希釈溶液とを０．５ｍＬずつ、タンパク質吸着の少ないチューブに入れ、２２℃で３時間反応させた。反応終了後、反応液中のＴＧＦ−β１含量を市販の測定キット（Quantikine
human TGF-β1 ELISA kit；フナコシ）を用いて測定した。【００４１】
結合率（単位＝％）は、式：
［結合率（％）］＝｛（Ｔｃ−Ｔ）／Ｔｃ｝ｘ１００
［式中、Ｔは評価用サンプル添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）であり、Ｔｃは２％アルブミン含有リン酸緩衝液添加群のＴＧＦ−β１実測値（単位＝ｎｇ／ｍＬ）である］により算出した。そして、評価用サンプルのＴＧＦ−β１結合率が、３０％以上の場合に「結合活性あり」、３０％以下の場合に「結合活性なし」と表示した。【００４２】
《実施例２：マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株菌糸体の乾燥粉末からの活性画分の単離》
マツタケＦＥＲＭ  ＢＰ−７３０４株菌糸体の乾燥粉末（ロット番号：Ｍ６５Ｔ１Ｙ１）２．０ｇを、５００ｍＬ容の三角フラスコに入れ、これに０．２ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム１００ｍＬを添加し、２３℃でスターラー攪拌下、１時間抽出した。遠心分離（１２０００ｒｐｍ，３０分間，４℃）の後、１．０ｍｏｌ／Ｌの塩酸でｐＨを７．０に調整し、上清（アルカリ抽出液）と沈殿（アルカリ抽出残渣）を回収した。アルカリ抽出液を、５００ｍＬ容の分液ロートに入れ、次いでクロロホルムとメタノールとの混合液［１：１（ｖ／ｖ）；以下、ＣｈＭｅと称する］を１００ｍＬ加え、２３℃で抽出した。水層部とＣｈＭｅ層部をそれぞれ回収し、凍結乾燥を実施し、それぞれの粉末０．５ｇと０．０５ｇを得た。生物活性は水層部にみられた（表１）。【００４３】
【表１】
2005035571.tif 000002
N.D.；未試験【００４４】
次に、水層部粉末０．５ｇを０．０５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ７．２）５ｍＬに溶解し、前以て０．０５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液で平衡化させたジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＰＡＫ  ６５０Ｍ充填カラム（φ２２ｍｍ，ｈ２０ｃｍ）にアプライし、溶出液Ａ（５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）及び溶出液Ｂ（１ｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム含有５０ｍｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）のリニアグラジエント溶出を流速５ｍＬ／ｍｉｎで行い、２８０ｎｍの吸収度を指標に分画した。
その結果、図１に示すようなパターンを示した。得られたピークを５つに分け、各画分を分画分子量１３０００の透析膜中（外液は蒸留水）で２０時間以上透析した後、各透析膜内画分について、それぞれの生物活性を測定したところ、活性はフラクションＢにみられた（表２）。【００４５】
【表２】
2005035571.tif 000003
N.D.；未試験【００４６】
更に、Ｂ画分の前記透析膜内画分を、０．０５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液で前以て平衡化させたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−１００（ファルマシア社）充填カラム（φ１６ｍｍ，ｈ３００ｍｍ）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、２８０ｎｍの吸収度を指標に分画した。その結果、図２に示すようなパターンを示し、得られたフラクションを３つに分け、生物活性を測定したところ、活性はフラクションＢ−１にみられた（図３及び表３）。【００４７】
【表３】
2005035571.tif 000004
【００４８】
フラクションＢ−１を、０．０５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液で前以て平衡化させたセファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−５００（ファルマシア社）充填カラム（φ１６ｍｍ，ｈ６００ｍｍ）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、２８０ｎｍの吸収度を指標に分画した。その結果、図４に示すようなパターンを示し、得られたフラクションを３つに分け、生物活性を測定したところ、活性はフラクションＢ−１−２にみられた（表４）。【００４９】
【表４】
2005035571.tif 000005
【００５０】
フラクションＢ−１−２を、０．０５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ塩酸緩衝液で前以て平衡化させたＣ１８逆相カラムであるＩｎｔｅｓｉｌ  ＥＰ３００（ＧＬサイエンス社）充填カラム（φ４．５ｍｍ，ｈ１５０ｍｍ）にアプライし、Ａ溶液（０．０５％ギ酸）及びＢ溶液［アセトニトリル／水（９０／１０）＋０．０５％ギ酸］のリニアグラジエントで溶出させ、２８０ｎｍの吸収度を記録した。その結果、図５に示すような単一ピーク（以下、ＰＧと称することがある）を示した。生物活性も確認された（表５）。初発物質に比べ、比活性は、ＴＧＦ−β１結合活性で約３３倍、ＮＫ細胞回復促進活性で約６０倍に増加した。【００５１】
【表５】
2005035571.tif 000006
【００５２】
《実施例３：活性構造の解析》
（１）ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析
実施例２で得られたＰＧの５μｇを水１０μＬに溶解した後、泳動バッファー（０．２５ｍｏｌ／Ｌ−Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２％ＳＤＳ，１０％メルカプトエタノール，３０％グリセロール，０．０１％ブロモフェノールブルー）１０μＬを加え、６５℃で１５分間熱変性させ、電気泳動を実施した。条件は以下のとおりである。
・ゲル：ＰＡＧミニ「第一」１５／２５（第一化学）
・泳動用緩衝液：トリスグリシン・ランニングバッファー（第一化学）
・泳動条件：３５ｍＡで６０分間泳動を行った。
・ＭＷマーカー：各バンド（ＭＷ＝９７４００，６６３００，４２４００）（第一化学）
・染色：銀染色
その結果、図６に示すように、分子量が約６０ｋＤａ付近に１本のスポットが検出された。【００５３】
（２）アミノ酸組成分析
酸加水分解は、以下の手順で実施した。すなわち、ＰＧ６．３０ｍｇを秤量し、純水３．１５ｍＬに溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、２ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。この溶液２００μＬをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸２００μＬを添加し、１１０℃で２２時間加水分解の後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水１００μＬに溶解し、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。【００５４】
また、アルカリ加水分解（トリプトファン分析用）は、以下の手順で実施した。すなわち、前記ＰＧ溶液（２ｍｇ／ｍＬ）１ｍＬをエッペンドルフチューブに入れて減圧乾固した後、可溶性デンプン（Starch Soluble）５ｍｇを含む４．２ｍｏｌ／Ｌ水酸化ナトリウム溶液１００μＬを加えた。このチューブをガラス試験管に入れ、真空封管下、１１０℃で１６時間加水分解した。空冷後、開封し、チューブを氷中で冷却し、６ｍｏｌ／Ｌ塩酸３０μＬを添加し、中和した。更に、精製水４２０μＬを添加して総量を５００μＬとし、その５０μＬをアミノ酸分析に用いた。
アミノ酸分析の装置として日立Ｌ−８５００型アミノ酸分析計（日立製作所）を使用し、ニンヒドリン発色により定量した。【００５５】
分析の結果、アミノ酸組成は、アスパラギン酸及びアスパラギン９．６５ｍｏｌ％、トレオニン６．１５ｍｏｌ％、セリン６．８３ｍｏｌ％、グルタミン酸及びグルタミン１０．１９ｍｏｌ％、グリシン８．７４ｍｏｌ％、アラニン９．８４ｍｏｌ％、バリン６．９４ｍｏｌ％、１／２−シスチン０．１５ｍｏｌ％、メチオニン１．３１ｍｏｌ％、イソロイシン５．４７ｍｏｌ％、ロイシン９．５５ｍｏｌ％、チロシン２．６４ｍｏｌ％、フェニルアラニン４．０９ｍｏｌ％、リシン４．９９ｍｏｌ％、ヒスチジン１．９７ｍｏｌ％、アルギニン５．００ｍｏｌ％、トリプトファン１．１７ｍｏｌ％、及びプロリン５．３３ｍｏｌ％であった。【００５６】
（３）タンパク質部Ｎ末端の分析
ＰＧをＰＶＤＦ（polyvinylidene difluoride）膜にブロッティング後、電気泳動後のゲルをＰＶＤＦ膜に載せ、５０ｍＡで２時間、ブロッティングした。なお、ブロッティングバッファーには、電気泳動バッファーに１０％容量のメタノールを加えた溶液を用いた。ブロッティング後、クーマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色液［２．５％（ｗ／ｖ）ＣＢＢ  Ｒ−２５０，２５％（ｗ／ｖ）エタノール，１０％（ｗ／ｖ）酢酸］中で１５分間振盪後、脱色液［２５％（ｗ／ｖ）エタノール，１０％（ｗ／ｖ）酢酸］で余分な染色が取れるまで脱色を行った。そして、目的のバンドを切り出し、アミノ酸シーケンス分析に用いた。【００５７】
気相シーケンサーによるＮ末端のアミノ酸分析は下記条件で行った。すなわち、試料を５０％メタノール／０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、メタノールで洗浄後、乾燥し、下記の機器を用いてエドマン分解を実施し、Ｎ末端より８残基までアミノ酸配列検出を試みた。
・プロテインシーケンサー：Procise cLC 492cLC（アプライドバイオシステムズ）
・ＰＴＨアナライザー：140D（アプライドバイオシステムズ）
・ＵＶ検出器：S200（アプライドバイオシステムズ）
・分析プログラム：Pulsed-liquid ProSorb cLC【００５８】
その結果、エドマン分解の各サイクルで複数のフェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）標識アミノ酸が検出され、且つ各サイクル前後で増減あるＰＴＨ標識アミノ酸は見られず、配列を決定することはできなかった。【００５９】
（４）円偏光二色性分析（ＣＤ）
検体（ＰＧ約３ｍｇ）に精製水を添加して２ｍｇ／ｍＬとし、測定に使用した。
測定装置として、ＪＡＳＣＯＪ−５００Ａを使用し、溶媒として水を使用した。波長範囲２００〜２５０ｎｍ、セル長１ｍｍ、温度は室温（２３℃）であり、積算回数は８回である条件で測定した。
得られたＣＤスペクトルを図７に示す。２次構造解析の結果、αへリックス２１％、βシート３４％であり、残りは不規則構造と推定された。【００６０】
（５）中性糖及びアミノ糖分析
ＰＧ６．３０ｍｇを秤量し、純水３．１５ｍＬに溶解した後、０．２２μｍのフィルターで濾過し、２ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。この溶液５００μＬをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、２ｍｏｌ／Ｌのトリフルオロ酢酸２００μＬを添加し、１００℃で６時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水２００μＬに溶解し、更に、純水で２０倍又は２００倍希釈した。この溶液５０μＬに内部標準物質ヘプトース５００ｎｇを添加し、カラムＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｓｕｇａｒ  ＡＸＧ  １５ｃｍｘ４．６ｍｍ  ＩＤ（東ソー）と検出器分光光度計ＲＦ−５３５（島津製作所）とを装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は７０℃であり、移動相及びその流速は０．５ｍｏｌ／Ｌホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）及び０．４ｍＬ／分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として１％アルギニン／３％ホウ酸を用い、流速は０．５ｍＬ／分であり、反応温度は１５０℃であり、検出波長はＥｘ３２０ｎｍ及びＥＭ４３０ｎｍであった。
ＰＧの中性糖組成は、多い方から順に、グルコース５６１．４５μｇ／ｍｇ、マンノース１６．６８μｇ／ｍｇ、ガラクト−ス４２．６５μｇ／ｍｇ、及びフコース９．５７μｇ／ｍｇであった。なお、キシロースは検出限界以下であった。【００６１】
一方、前記ＰＧ溶液５００μＬをガラス試験管に採取し、エバポレーターで減圧乾固した。次いで、４ｍｏｌ／Ｌの塩酸２００μＬを添加し、１００℃で６時間加水分解した後、エバポレーターで減圧乾固して残渣を得た。残渣を純水２００μＬに溶解し、そのうち５０μＬを、カラムＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｓｕｇａｒ  ＳＧＸ  １５ｃｍｘ４．６ｍｍ  ＩＤ（東ソー）と検出器分光光度計ＲＦ−１０ＡＸＬ（島津製作所）とを装着した高速液体クロマト装置ＬＣ−９Ａ（島津製作所）にアプライした。カラム温度は６０℃であり、移動相及びその流速は０．０４ｍｏｌ／Ｌホウ酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）及び０．３ｍＬ／分であった。ポストカラム標識の条件は、反応試薬として１％アルギニン／３％ホウ酸を用い、流速は０．５ｍＬ／分であり、反応温度は１５０℃であり、検出波長はＥｘ３２０ｎｍ及びＥＭ４３０ｎｍであった。
ＰＧのアミノ糖組成は、グルコサミン０．３６μｇ／ｍｇであった。なお、マンノサミンは検出限界（０．２μｇ／ｍｇ）以下であった。【００６２】
（６）タンパク質の定量
前記実施例３（２）のＰＧ加水分解により得られたアミノ酸量を基に、タンパク質含有量を算出すると、３８．４２μｇ／ｍｇの値になった。【００６３】
（７）糖質の定量
前記実施例３（５）のＰＧの加水分解により得られた単糖量を基に、糖質含有量を算出すると、６２８．７２μｇ／ｍｇの値になった。【００６４】
（８）核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析
（ｉ）ＰＧの１Ｈ一次元ＮＭＲ分析
ＰＧ１１．６ｍｇにＤ２Ｏ２．５ｍＬを加え、超音波で約５分間処理した。サンプル溶液には少し濁りがあった。１Ｈ  ＮＭＲの測定条件は以下のとおりとした。すなわち、測定装置としては、Ｕｎｉｔｙ  ｐｌｕｓ  ５００型（Ｖａｒｉａｎ社）を使用し、観測周波数は５００．２ＭＨｚ（１Ｈ核）である。溶媒としてＤ２Ｏ溶液を使用し、濃度は飽和溶液である。標準としてアセトン２．２２５ｐｐｍを用い、温度は２５℃と４５℃、観測幅８ｋＨｚ、データ点６４Ｋ、パルス幅約４５°、パルス繰り返し時間５．５秒、積算回数を１２８回とした。【００６５】
得られたスペクトルを図８に示す。ＰＧ中性糖の主成分であるグルコースについて解析した。すなわち、２５℃の１Ｈ  ＮＭＲでは、グルコースの１位のプロトンに特徴的な４．５ｐｐｍ〜５．５ｐｐｍに着目すると、５．４ｐｐｍと５．２ｐｐｍ付近がグルコースのα１位と考えられる。また、４．６５ｐｐｍ付近のマイナーピーク（ダブレットピーク）はβ１位と考えられる。４．７５ｐｐｍ〜５．１５ｐｐｍ付近のピーク（４５℃測定での４．７９ｐｐｍのピークも含む）はグルコース以外の糖やタンパク質のαプロトン由来と推定される。【００６６】
（ii）ヒドラジン処理ＰＧの１Ｈ一次元ＮＭＲ分析
ＰＧ糖質部の構造解析のため、タンパク質部をヒドラジン処理により除いたサンプル（以下、ヒドラジン処理ＰＧと称する）を調製した。すなわち、ＰＧを試験管（φ５ｍｍｘｈ５０ｍｍ）に入れ、ヒドラグラフ（生化学工業）内にセットし、５０℃で５時間真空乾燥した。次いで、無水ヒドラジン２ｍＬを添加して１００℃で２時間加熱することにより、気相ヒドラジン分解を行った。ヒドラジンを留去し、残渣を純水０．５ｍＬに溶解し、純水を外液にして一晩透析した。透析内液をエバポレーターにて減圧乾固し、ＮＭＲ測定用試料とした。サンプル濃度が７．７ｍｇ／２．５ｍＬであること以外は、測定条件は実施例３（８）（ｉ）と同じである。【００６７】
得られたスペクトルを図９に示す。２５℃の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、実施例３（８）（ｉ）のそれよりもブロードであった。これは、ヒドラジン処理によりタンパク質がなくなり、多糖の濃度が増加したためと考えられる。また、実施例３（８）（ｉ）でみられた３．６６ｐｐｍの大きなピークはなくなっていた。
グルコースの１位のプロトンに特徴的な４．５ｐｐｍ〜５．５ｐｐｍに着目すると、５．４ｐｐｍ付近がグルコースのα１位と考えられる。また、４．７ｐｐｍ〜５．２ｐｐｍ付近のピーク（４５℃での４．７８ｐｐｍのピークも含む）はβ１位またはグルコース以外の糖由来と推定される。【００６８】
（iii）ＰＧの１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析
ＰＧを、約１１．６ｍｇ／２．５ｍＬになるように、Ｄ２Ｏに溶解した。サンプル溶液には少し濁りがあった。１３Ｃ  ＮＭＲの測定条件は以下のとおりである。すなわち、観測周波数は１２５．８ＭＨｚであり、基準はアセトン（３０．５ｐｐｍ）、温度は２５℃、観測幅は３１．４ＫＨｚ、データ点は１２８Ｋ、パルス幅は約４５°、パルス繰り返し時間は４．０秒、積算回数４００００、１Ｈ完全デカップリングである条件で測定を実施した。【００６９】
得られたスペクトルを図１０に示す。１３Ｃ  ＮＭＲについては、感度が上がらないため、Ｓ／Ｎ比が不充分で解析は難しかった。６０．７ｐｐｍの大きなピークは糖質以外の成分由来と推定された。６５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークが均一でないことから、構成糖は不均一であると推定された。
１００．１ｐｐｍのピークは、グルコースの１位の炭素で、α型でグルシド結合したものと考えられ、１Ｈ  ＮＭＲの結果を支持している。
１位以外については、６０〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。グルコース単糖又は２糖の化学シフトを解析すると、グルコースのα２位及び４位の炭素がグルシド結合していると考えられ、結合様式は、α１−２又はα１−４と推定された。【００７０】
（iv）ヒドラジン処理ＰＧの１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析
得られたスペクトルを図１１に示す。１３Ｃ  ＮＭＲについては、実施例３（８）（iii）よりもＳ／Ｎ比がやや改善したスペクトルが観測され、化学シフト値はほぼ同様であった。実施例３（８）（iii）にあった６０．７ｐｐｍの大きなピークはなくなった。
６５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークは均一でないことから、糖の結合様式は不均一であると推定された。１００．０ｐｐｍのピークは、グルコースの１位の炭素で、α型でグルシド結合したものと考えられ、１Ｈ  ＮＭＲの結果を支持している。
１位以外については、６０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。グルコース単糖又は２糖の化学シフトと比較すると、グルコースのα２位及び４位の炭素がグルシド結合している可能性が実施例３（８）（iii）と同様考えられ、結合様式はα１−２又はα１−４と推定された。【００７１】
（９）メチル化による糖結合位置の分析
ＰＧ糖質部を、粉末水酸化ナトリウム存在下、ヨウ化メチルで完全メチル化し、生成したメチル化多糖を単糖に分解し、得られたメチル化単糖を還元アセチル化し、部分メチル化糖アルコールのアセチル誘導体（部分メチル化アルジトールアセテート）の形にしてガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及びガスクロマトグラフ質量分析（ＧＣ／ＭＳ）測定により誘導体の同定を行い、組成比を求めた。【００７２】
すなわち、バイアル瓶にＰＧ２．４ｍｇを秤量し、５酸化リン存在下で一晩乾燥させた。これに、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）０．８ｍＬを添加して５時間攪拌後、粉末の水酸化ナトリウム８０ｍｇを加えて４時間攪拌した。次に、ヨウ化メチル０．６ｍＬを添加して１時間攪拌後、クロロホルム１ｍＬで３回抽出した。純水にて３回洗浄の後、クロロホルム層を回収し、無水硫酸ナトリウム１．８ｇを加えて脱水し、室温で１時間放置した。この溶液を濾過し、得られた濾液を濃縮した後、その少量をサンプリングして、薄層クロマト板にスポットし、薄層クロマトグラフィーを行い、オルシノール硫酸で発色させてメチル化糖の存在を確認した。この溶液をエバポレーターにて乾固し、得られた残渣に少量の純水を加えて洗浄した。この洗浄操作を３回繰り返した後、純水０．５ｍＬを加えて残渣を溶解し、ＮａＢＨ４２０ｍｇ／純水２ｍＬを０．５ｍＬ加えて攪拌し、室温にて４時間放置した。酢酸で過剰のＮａＢＨ４を分解し、エバポレーターにて減圧乾固した。得られた残渣をメタノール２ｍＬで５回洗浄し、次いで無水酢酸・ピリジン混液（１／１）１ｍＬを添加して１００℃にて４時間加熱した後、エバポレーターにて減圧乾固した。得られた残渣にクロロホルム２ｍＬを加えて抽出し、更に、純水２ｍＬを添加して混和させた。クロロホルム層に無水硫酸ナトリウム１．５ｇを加えて脱水し、室温で３０分間放置後、濾過し、濾液を得た。この濾液をエバポレーターにて減圧乾固した後、クロロホルムに溶解し、ＧＣ及びＭＳ分析を行なった。【００７３】
ＧＣ−ＭＳ測定条件は以下の通りとした。すなわち、ＧＣ分析装置はＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋｅｒｄ  ＨＰ５８９０  ＳＥＲＩＥＳで、カラム液相はＳＰＢ−５（スペルコジャパン）、カラムタイプはｆｕｓｅｄ  ｓｉｌｉｃａ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ３０ｍｘ０．２５ｍｍ  ＩＤを用い、キャリヤーガスはＨｅ、カラム温度は６０℃（１分保持）→２８０℃（＋８℃／分で昇温）、注入口温度は２８０℃、検出モードはＦＩＤ、注入量は０．５μＬで、注入モードはｓｐｌｉｔｌｅｓｓであった。ＭＳは、装置ＪＭＳ  ＤＸ−３０３質量分析計（日本電子）とデータ処理システムＪＭＡ  ＤＡ５０００データ処理システム（日本電子）とを用い、ＭＳ部のイオン化方式はＥＩ、電子加速電圧は７０Ｖ、イオン化電流は３００μＡ、イオン源温度は２５０℃、イオン加速電圧は３．０ＫＶ、走査速度は１ｓｅｃ／ｓｃａｎ（ｍ／ｚ＝１０〜５００）、走査間隔は１ｓｅｃであった。【００７４】
部分メチル化アルジトールアセテートの標準マススペクトルと照合することにより、試料のクロマトグラム上の各ピークを同定した結果を表６に示した。更に、ガスクロマトグラムで得られた各ピークの面積から、部分メチル化アルジトールアセテートの組成比を求めた結果も表６に示した。これらの結果から、ＰＧの糖鎖は１→４結合のグルコースが主要な結合であることが示唆された。【００７５】
【表６】
2005035571.tif 000007
Glc；グルコース、→4 Glc 1→；1→4結合のグルコース、→2 Glc 1→；1→2結合のグルコース、→6
Glc 1 →；1→6結合のグルコース、→4,6 Glc 1→; 1→4結合と→6結合のグルコース、→2,4 Glc1→；1→2結合と→4結合のグルコース【００７６】
（１０）ＰＧ中の脂肪酸分析
ＰＧ６．６５ｍｇを１．５ｍＬ容ポリチューブに秤量後、メタノール０．２ｍＬを加えた。Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃを用い、これを減圧乾燥し、乾燥物試料６．２２ｍｇをガラス製ネジ付き試験管内に移した。これに、５％塩酸・メタノール溶液１ｍＬを加え、オーブン内で９０℃、１６時間加熱反応させることにより、ＰＧ中に存在する脂肪酸のトリグリセライドを脂肪酸メチルエステルに変換した。メタノリシス終了後、ヘキサン１ｍＬを加えて激しく振り混ぜ、静置した後にヘキサン層を回収し、窒素パージで乾固後、クロロホルム（内部標準としてペンタデカン酸メチルを約０．０１％含む）１．０ｍＬに再溶解した。この溶液を、以下に記載する通り、ＧＣ法により測定した。【００７７】
次に、定量用標準品としてオレイン酸メチル（ジーエルサイエンス株式会社）２５．３７ｍｇを１０ｍＬメスフラスコに秤量し、内部標準を含むクロロホルムを標線まで加えて２５３７μｇ／ｍＬ標準溶液とした。更に、この溶液を、内部標準を含むクロロホルムで２５倍希釈して１０１．５μｇ／ｍＬ溶液を調製した。更に、これを、内部標準を含むクロロホルムで順次５倍希釈して２０．３μｇ／ｍＬ溶液、４．０６μｇ／ｍＬ溶液、及び０．８１μｇ／ｍＬ溶液を調製した。以下に記載する通り、これらを、試料溶液と同様に、ＧＣ分析を行い、得られたピーク面積と標準溶液の濃度より検量線を作成し、これより試料溶液中の各脂肪酸の定量分析を行った。
一方、定性用標準品として、以下の２種類の標準溶液（溶媒：クロロホルム）を用いた。（１）Ｃ１４〜Ｃ１８の飽和脂肪酸、及び１〜３価不飽和脂肪酸のメチルエステル混合溶液。（２）Ｃ２０〜Ｃ２６の飽和脂肪酸、及び１価不飽和脂肪酸のメチルエステル混合溶液。【００７８】
ＧＣ分析は下記の通リに実施した。すなわち、装置としてガスクロマトグラフＨＰ５８９０型（Hewlett Packard社）、検出器として水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、カラムとしてＳＰ２３８０（ｈ３０ｍｘφ０．２５ｍｍ，膜厚０．２μｍ）を用い、カラム温度５０℃（１分保持）→２５０℃（＋８℃／分で昇温）、注入口温度２５０℃、注入量１μＬ（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ注入）の条件であった。なお、ＧＣ分析は脂肪酸メチルとして行っているので、以下の式に従って、試料中の脂肪酸量（遊離脂肪酸として）を算出した。
［脂肪酸量］＝［脂肪酸メチルとして得られた定量結果］ｘ［遊離脂肪酸分子量／脂肪酸
メチル分子量］
その結果、ＰＧの脂肪酸組成は、多い方から順に、ステアリン酸（Ｃ１８：０）１．８６μｇ／ｍｇ、パルミチン酸（Ｃ１６：０）１．８４μｇ／ｍｇ、オレイン酸［Ｃ１８：１（９）］１．５２μｇ／ｍｇ、リノール酸［Ｃ１８：２（９，１２）］０．９４μｇ／ｍｇ、及びミリスチン酸（Ｃ１４：０）０．５５μｇ／ｍｇであった。【００７９】
（９）赤外分光分析（ＩＲ）
赤外分光分析は、ＫＢｒ法により実施した。より具体的には、ＰＧ１ｍｇとＫＢｒ粉末１０ｍｇとを均質に混合した後、プレスして円盤状に成型し、ＦＴＩＲ  ＶＡＫＯＲ−ＩＩＩ型［日本分光（株）］を用いて測定を実施した。得られたＩＲスペクトルを図１２に示す。【００８０】
（１０）紫外分光分析（ＵＶ）
ＰＧを純水に溶解し、５０ｍｇ／ｍＬ濃度で測定した。装置として、Ｂｉｏ  Ｓｐｅｃ  １６００（島津製作所）を使用した。得られたＵＶスペクトルを図１３に示す。【００８１】
《実施例４：抗腫瘍活性の評価》【００８２】
（１）メラノーマＢ１６
日本チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腋窩部皮下に、メラノーマＢ１６を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、メラノーマＢ１６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株（An NY Acad. Sci 100: 762-790, 1963）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0144）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腋窩部皮下で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に１０回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、毎日生死を観察した。結果を図１４に示す。平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値±ＳＥ）：１５．５±１．２日に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、１９．０±２．６日及び２０．５±１．９日であり、検体投与により生存期間は延長された。【００８３】
（２）形質細胞腫Ｘ５５６３
チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢の雌性Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの腋窩部皮下に、形質細胞腫Ｘ５５６３を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、形質細胞腫Ｘ５５６３は、Ｃ３Ｈ／Ｈｅマウス回盲部に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株（JNCI 24: 1153-1165, 1960）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0174）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウスの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に１０回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、６０日間毎日生死を観察したところ、対照群の６０日生存率５０％（３／６）に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、１００％（６／６）及び６７％（４／６）であり、検体投与により生存率の向上がみられた。更に、生存個体においても、図１５に示すとおり、腫瘍サイズは、検体投与により明らかに抑制された。【００８４】
（３）サルコーマ１８０
日本クレア（東京）から購入した５週齢の雌性ＩＣＲマウスの腋窩部皮下に、サルコーマ１８０［Sarcoma 180 (S180)］を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群１０匹）。なお、サルコーマ１８０は、アルビノマウス由来の肉腫に由来する腫瘍細胞株（Cancer
Res 20: 930-939, 1969）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0173）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、ＩＣＲマウスの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に１０回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後２５日目に、マウスをと殺し、腫瘍結節を取り出して重量を測定したところ、対照群の腫瘍結節重量［平均値±標準誤差（ＳＥ）］：１．０５±０．２２ｇに対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、０．０１±０．０１ｇ及び０．００±０．００ｇであり、検体投与により、腫瘍増殖は明らかに抑制された。【００８５】
（４）エールリッヒ癌
日本クレア（東京）から購入した５週齢の雌性ＩＣＲマウスの腋窩部皮下に、エールリッヒ癌（Ehrlich）を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群１０匹）。なお、エールリッヒ癌は、ｄｄＹマウスに発生した乳腺腫瘍に由来する腫瘍細胞株（JNCI
13: 1299-1377, 1953）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0147）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、ＩＣＲマウスの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に１０回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後２５日目に、マウスをと殺し、腫瘍結節を取り出して重量を測定したところ、対照群の腫瘍結節重量（平均値±ＳＥ）：１．９６±０．５０ｇに対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、０．０１±０．０１ｇ及び０．４８±０．３３ｇであり、検体投与により、腫瘍増殖は明らかに抑制された。【００８６】
（５）吉田肉腫
日本チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢の雄性Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔内に、吉田肉腫（ＹＳ）を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、吉田肉腫は、ｏ−アミノアゾトルエンを３箇月間与え、亜ヒ素酸アルコールを塗布することにより発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株（Proc Imp Acad Tokyo 20: 611-618, 1944）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0088）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に４回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値±ＳＥ）：８．３±０．３日に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、９．０±０．４日及び７．５±１．１日であり、検体１２５ｍｇ／ｋｇ投与により、生存期間は延長される傾向にあった。【００８７】
（６）白血病Ｐ３８８
日本チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢のＣＤＦ１マウスの腋窩部皮下に、白血病Ｐ３８８を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、白血病Ｐ３８８は、ＤＢＡ／２マウスをメチルコランスレン処置することにより発生した白血病に由来する腫瘍細胞株（Am J Pathol 33: 603, 1957）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0326）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、ＣＤＦ１マウスの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に４回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値±ＳＥ）：１７．３±２．２日に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、１８．３±２．４日及び１９．６±１．７日であり、検体投与により、生存期間は延長傾向にあった。【００８８】
（７）白血病ＥＬ４
日本チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎ雄マウスの腋窩部皮下に、白血病ＥＬ４を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、白血病ＥＬ４は、マウスをジメチルベンズアントラセン（ＤＭＢＡ）処置することにより膵臓に発生したリンホーマに由来する腫瘍細胞株（Cancer Res 16: 338-343, 1956）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0150）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウスの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に４回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、毎日生死を観察し、平均生存期間を求めたところ、対照群の平均生存日数（平均値±ＳＥ）：１２．０±０．４日に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、それぞれ、１３．０±０．０日及び１１．８±０．３日であり、検体１２５ｍｇ／ｋｇ投与により、生存期間は延長傾向にあった。【００８９】
（８）肝癌ＡＨ１３
日本チャールズリバー（神奈川）から購入した６週齢の雄性Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔内に、肝癌ＡＨ１３を１×１０６個／０．２ｍＬハンクス平衡塩溶液／匹移植した（１群６匹）。なお、肝癌ＡＨ１３は、ラットをジメチルアミノアゾベンゼン（ＤＡＢ）処置することにより肝臓に発生した腫瘍に由来する腫瘍細胞株（病理学会誌 11: 147-168, 1967）であり、本実施例では、東北大学・加齢医学研究所付属医用細胞資源センター（保管番号：TKG0011）から入手し、呉羽化学工業株式会社・生物医学研究所において、Ｄｏｎｒｙｕラットの腹腔内で継代・維持している細胞を使用した。
移植２４時間後から、実施例２で得られたＰＧ（生理食塩水に溶解）を１２５ｍｇ／ｋｇ又は２５０ｍｇ／ｋｇ量、隔日に４回、腹腔内注射した。対照として、検体溶液の代わりに、生理食塩水０．２ｍＬを用いた。
移植後、毎日生死を観察したところ、対照群の１２日生存率１７％（１／６）に対し、検体１２５ｍｇ／ｋｇ及び２５０ｍｇ／ｋｇ投与群のそれは、いずれも６７％（４／６）であり、検体投与により生存期間は延長された。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明の糖タンパク質は、免疫増強剤、ストレス負荷回復促進剤、及び／又は抗腫瘍剤の用途に適用することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】アルカリ抽出液のＣｈＭｅ処理により得られた水層部について、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。
【図２】陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたフラクションＢについて、ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−１００）を実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。
【図３】陰イオン交換クロマトグラフィーにより得られたフラクションＢについて、ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−１００）を実施して得られた各画分におけるＴＧＦ−β１の結合活性を示すグラフである。
【図４】ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−１００）により得られたフラクションＢ−１について、更にゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−５００）を実施して得られた溶出パターン及び各画分におけるＴＧＦ−β１の結合活性を示すグラフである。
【図５】ゲル濾過クロマトグラフィー（セファクリルＳ−５００）により得られたフラクションＢ−１−２について、逆相クロマトグラフィーを実施して得られた溶出パターンを示すクロマトグラフである。
【図６】逆相クロマトグラフィーにより得られた本発明の糖タンパク質について、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した結果を示す、クロマトグラフである図面に代わる写真である。
【図７】本発明の糖タンパク質の円偏光二色性分析により得られたＣＤスペクトルである。
【図８】本発明の糖タンパク質の１Ｈ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図９】ヒドラジン処理糖タンパク質の１Ｈ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図１０】本発明の糖タンパク質の１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図１１】ヒドラジン処理糖タンパク質の１３Ｃ一次元ＮＭＲ測定により得られたスペクトルである。
【図１２】本発明の糖タンパク質の赤外分光分析により得られたスペクトルである。
【図１３】本発明の糖タンパク質の紫外分光分析により得られたスペクトルである。
【図１４】本発明の糖タンパク質を投与したメラノーマＢ１６移植マウスの生存率を示すグラフである。
【図１５】本発明の糖タンパク質を投与した形質細胞腫Ｘ５５６３移植マウスにおける腫瘍体積の経時変化を示すグラフである。
【図１】
2005035571.tif 000008
【図２】
2005035571.tif 000009
【図３】
2005035571.tif 000010
【図４】
2005035571.tif 000011
【図５】
2005035571.tif 000012
【図６】
2005035571.tif 000013
【図７】
2005035571.tif 000014
【図８】
2005035571.tif 000015
【図９】
2005035571.tif 000016
【図１０】
2005035571.tif 000017
【図１１】
2005035571.tif 000018
【図１２】
2005035571.tif 000019
【図１３】
2005035571.tif 000020
【図１４】
2005035571.tif 000021
【図１５】
2005035571.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月28日(2007.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の性質を有する糖タンパク質。
（ａ）分子量：約６０ｋＤａ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による）。
（ｂ）糖質とタンパク質との含有比率：（糖質：タンパク質）１６．４：１．０。
【請求項２】
（１）マツタケをアルカリ溶液又は熱水で抽出する工程、
（２）得られた抽出液を陰イオン交換樹脂に吸着させる工程、
（３）前記陰イオン交換樹脂から、溶離液により吸着画分を溶出する工程、及び
（４）前記溶出工程で得られた溶出画分を、ゲル濾過により分画し、分子量５０〜７０ｋＤａの画分を取得する工程
を含む製造方法により調製することのできる、糖タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質と、薬剤学的又は獣医学的に許容することのできる担体又は希釈剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、免疫増強剤。
【請求項５】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、ストレス負荷回復促進剤。
【請求項６】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質を有効成分として含有することを特徴とする、抗腫瘍剤。
【請求項７】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、免疫増強剤又は免疫増強用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項８】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、ストレス負荷回復促進剤又はストレス負荷回復促進用医薬組成物を製造するための使用。
【請求項９】
請求項１又は２に記載の糖タンパク質の、抗腫瘍剤又は抗腫瘍用医薬組成物を製造するための使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
（ii）ヒドラジン処理ＰＧの１Ｈ一次元ＮＭＲ分析
ＰＧ糖質部の構造解析のため、タンパク質部をヒドラジン処理により除いたサンプル（以下、ヒドラジン処理ＰＧと称する）を調製した。すなわち、ＰＧを試験管（φ５ｍｍｘｈ５０ｍｍ）に入れ、ヒドラクラブ（生化学工業）内にセットし、５０℃で５時間真空乾燥した。次いで、無水ヒドラジン２ｍＬを添加して１００℃で２時間加熱することにより、気相ヒドラジン分解を行った。ヒドラジンを留去し、残渣を純水０．５ｍＬに溶解し、純水を外液にして一晩透析した。透析内液をエバポレーターにて減圧乾固し、ＮＭＲ測定用試料とした。サンプル濃度が７．７ｍｇ／２．５ｍＬであること以外は、測定条件は実施例３（８）（ｉ）と同じである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
得られたスペクトルを図１０に示す。１３Ｃ  ＮＭＲについては、感度が上がらないため、Ｓ／Ｎ比が不充分で解析は難しかった。６０．７ｐｐｍの大きなピークは糖質以外の成分由来と推定された。６５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークが均一でないことから、構成糖は不均一であると推定された。
１００．１ｐｐｍのピークは、グルコースの１位の炭素で、α型でグルコシド結合したものと考えられ、１Ｈ  ＮＭＲの結果を支持している。
１位以外については、６０〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。グルコース単糖又は２糖の化学シフトを解析すると、グルコースのα２位及び４位の炭素がグルコシド結合していると考えられ、結合様式は、α１−２又はα１−４と推定された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
（iv）ヒドラジン処理ＰＧの１３Ｃ一次元ＮＭＲ分析
得られたスペクトルを図１１に示す。１３Ｃ  ＮＭＲについては、実施例３（８）（iii）よりもＳ／Ｎ比がやや改善したスペクトルが観測され、化学シフト値はほぼ同様であった。実施例３（８）（iii）にあった６０．７ｐｐｍの大きなピークはなくなった。
６５ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークは均一でないことから、糖の結合様式は不均一であると推定された。１００．０ｐｐｍのピークは、グルコースの１位の炭素で、α型でグルコシド結合したものと考えられ、１Ｈ  ＮＭＲの結果を支持している。
１位以外については、６０ｐｐｍ〜８０ｐｐｍのピークの化学シフトを解析した。グルコース単糖又は２糖の化学シフトと比較すると、グルコースのα２位及び４位の炭素がグルコシド結合している可能性が実施例３（８）（iii）と同様考えられ、結合様式はα１−２又はα１−４と推定された。
【国際調査報告】
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