(57)【要約】  生体組織モデル装置は、液体組成物を貯蔵する第１の液体区画；液体組成物を貯蔵する第２の液体区画；及び両区画の間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される細胞積層体を含む。血管壁モデルは、ハニカム構造を有する多孔性膜；多孔性膜の一方の面に配置された血管内皮細胞層；及び多孔性膜の他方の面に配置された平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層を含む。血管壁モデル装置は、液体組成物を貯蔵する第１の液体区画；液体組成物を貯蔵する第２の液体区画；及び両区画の間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される血管壁モデルを含む。これらのモデル又はモデル装置の適用がさらに提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される細胞積層体、を含み、
細胞積層体は、ハニカム構造を有する多孔性膜、第１のタイプの細胞を含み、多孔性膜の一方の面に配置される細胞層、及び第１のタイプとは異なる第２のタイプの細胞を含み、多孔性膜の他方の面に配置される細胞層を含む生体組織モデル装置。
【請求項２】
第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞は、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群から選択された２つのタイプの細胞である請求項１に記載の生体組織モデル装置。
【請求項３】
多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項１に記載の生体組織モデル装置。
【請求項４】
多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される請求項１に記載の生体組織モデル装置。
【請求項５】
多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である請求項１に記載の生体組織モデル装置。
【請求項６】
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む、請求項１に記載の生体組織モデル装置を使用する被検物質の評価方法。
【請求項７】
工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む請求項６に記載の被検物質の評価方法。
【請求項８】
被検物質が添加された液体区画にトレーサーを添加することをさらに含み、トレーサーが添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たトレーサーの量を測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する請求項６に記載の被検物質の評価方法。
【請求項９】
ハニカム構造を有する多孔性膜；
多孔性膜の一方の面に配置された血管内皮細胞層；及び
多孔性膜の他方の面に配置された平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層
を含む血管壁モデル。
【請求項１０】
血管壁モデルにおける血管内皮細胞層側から平滑筋細胞層側又は間葉系幹細胞層側へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性が、多孔性膜の一方の面から多孔性膜の他方の面へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜１０％である請求項９に記載の血管壁モデル。
【請求項１１】
多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項９に記載の血管壁モデル。
【請求項１２】
多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される請求項９に記載の血管壁モデル。
【請求項１３】
多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である請求項９に記載の血管壁モデル。
【請求項１４】
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される請求項９に記載の血管壁モデルを含む血管壁モデル装置。
【請求項１５】
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む請求項１４に記載の血管壁モデル装置を用いた被検物質の評価方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む請求項１５に記載の被検物質の評価方法。
【請求項１７】
第１の液体区画又は第２の液体区画の１つは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画であり、第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加することは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画に被検物質を添加することを含み、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出た赤血球の量、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、又は被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する請求項１５に記載の被検物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体組織モデル装置、血管壁モデル、血管壁モデル装置、及び被検物質の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
日本特許第５１１３３３２号には、血管脳関門インヴィトロ・モデル、及び前記モデルを用いた薬物の評価方法が開示されている。血管脳関門インヴィトロ・モデルは「細胞培養インサート」と呼ばれるフィルター装置が培養プレートに挿入された構造であり、脳毛細血管内皮細胞層が細胞培養インサートのフィルターの上面に配置され、脳周皮細胞層が細胞培養インサートのフィルターの下面に配置され、アストロサイト層が培養プレートの底面に配置された構造である。
【０００３】
血管脳関門インヴィトロ・モデルにおいて、細胞培養インサートのフィルター部は、脳毛細血管内皮細胞層、トラック−エッチド（ＴＥ）メンブレン及び脳周皮細胞層の積層体である。前記積層体は、脳周皮細胞をＴＥ膜の一方の面に培養した後、脳毛細血管内皮細胞をＴＥ膜の他方の面に培養することにより得られる。
【０００４】
前記血管脳関門インヴィトロ・モデルは、培養プレート内側の空間が細胞培養インサートにより２つの液体区画に分割された構造となっている。日本特許第５１１３３３２号には、細胞培養インサートの内側（脳毛細血管内皮細胞層が配置される側の液体区画）に薬物を添加し、細胞培養インサートの外側（脳周皮細胞層が配置される側の液体区画）に漏れ出た薬物の量を測定し、薬物の血管脳関門の通過能を評価することを含む、血管脳関門インヴィトロ・モデルを用いる方法が開示されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
動物実験に替わる薬物又は病態評価用の生体組織モデル装置を得るためには、生体内の組織に類似した構造と機能を有する細胞組織の構築が必要である。生体内の組織に類似した構造と機能を有する細胞組織を構築する観点から、細胞培養のための足場として作用する、ＴＥ膜（一般的に約２％〜約２０％の開口率を有するＴＥフィルム）よりも高い開口率を有する多孔性膜の両面で細胞を培養して細胞積層体を得て、その細胞積層体を生体組織モデル装置に適用することが望ましい。
【０００６】
細胞培養のための足場として、日本特開２００２−３３５９４９号公報に開示されたハニカム構造フィルム、及び日本特開第２００７−００６９８７号に開示されたハニカム薄膜が知られている。日本特開第２００２−３３５９４９号公報には、ハニカム構造フィルムの両面に同種の細胞（肝細胞又は心筋細胞）を培養することで得られた細胞積層体が開示されている。日本特開第２００７−００６９８７号公報には、ハニカム薄膜の一方の面に線維芽細胞を培養した後、ハニカム薄膜の他方の面に上皮ケラチン生成細胞を培養することで得られた皮膚再生用移植のための細胞シートが開示されている。これらの２つの特許文献において、例えば薬物評価に使用できる装置の構築は達成されていない。
【０００７】
本開示に係る実施態様は、上述の状況を考慮して工夫された。
【０００８】
本開示は、本開示が解決しようとする課題である、新規な生体組織モデル装置、新規な血管壁モデル、新規な血管壁モデル装置、及びこれらの適用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
課題を解決するための具体的な手段は下記の態様を含む。
【００１０】
［Ａ１］
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される細胞積層体、を含み、
細胞積層体は、ハニカム構造を有する多孔性膜、第１のタイプの細胞を含み、多孔性膜の一方の面に配置される細胞層、及び第１のタイプとは異なる第２のタイプの細胞を含み、多孔性膜の他方の面に配置される細胞層を含む生体組織モデル装置。
［Ａ２］
［Ａ１］において、第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞は、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群から選択された２つのタイプの細胞である生体組織モデル装置。
［Ａ３］
［Ａ１］又は［Ａ２］において、多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む生体組織モデル装置。
［Ａ４］
［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれか１つにおいて、多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される生体組織モデル装置。
［Ａ５］
［Ａ１］〜［Ａ４］のいずれか１つにおいて、多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である生体組織モデル装置。
［Ａ６］
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む、［Ａ１］〜［Ａ５］のいずれか１つに記載の生体組織モデル装置を使用する被検物質の評価方法。
［Ａ７］
［Ａ６］において、工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む被検物質の評価方法。
［Ａ８］
［Ａ６］において、被検物質が添加された液体区画にトレーサーを添加することをさらに含み、トレーサーが添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たトレーサーの量を測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する被検物質の評価方法。
【００１１】
［Ｂ１］
ハニカム構造を有する多孔性膜；
多孔性膜の一方の面に配置された血管内皮細胞層；及び
多孔性膜の他方の面に配置された平滑筋細胞層
を含む血管壁モデル。
［Ｂ２］
［Ｂ１］において、血管壁モデルにおける血管内皮細胞層側から平滑筋細胞層側へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性が、多孔性膜の一方の面から多孔性膜の他方の面へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜１０％である血管壁モデル。
［Ｂ３］
ハニカム構造を有する多孔性膜；
多孔性膜の一方の面に配置された血管内皮細胞層；及び
多孔性膜の他方の面に配置された間葉系幹細胞層
を含む血管壁モデル。
［Ｂ４］
［Ｂ３］において、血管壁モデルにおける血管内皮細胞層側から間葉系幹細胞層側へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性が多孔性膜の一方の面から多孔性膜の他方の面へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜１０％である血管壁モデル。
［Ｂ５］
［Ｂ１］〜［Ｂ４］のいずれか１つにおいて、多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む血管壁モデル。
［Ｂ６］
［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれか１つにおいて、多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される血管壁モデル。
［Ｂ７］
［Ｂ１］〜［Ｂ６］のいずれか１つにおいて、多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である血管壁モデル。
【００１２】
［Ｃ１］
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれか１つの血管壁モデルを含む血管壁モデル装置。
［Ｃ２］
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む［Ｃ１］の血管壁モデル装置を用いた被検物質の評価方法。
［Ｃ３］
［Ｃ２］において、工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む被検物質の評価方法。
［Ｃ４］
［Ｃ２］において、第１の液体区画又は第２の液体区画の１つは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画であり、第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加することは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画に被検物質を添加することを含み、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出た赤血球の量、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、又は被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する被検物質の評価方法。
【００１３】
［Ｄ１］
底部及び底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、多孔性膜と、多孔性膜が容器の内底面に対向し、その内底面と接触しない位置に多孔性膜を保持するように構成された保持部材とを用いる、多孔性膜の両面に細胞層を含む細胞積層体の製造方法において、
第１の細胞を、容器の内底面及び多孔性膜の表面と接触する液体培養培地において、多孔性膜が内底面に対向するように容器の内底面と接触しない位置で保持部材により保持され、かつ多孔性膜が重力方向に下部側に位置し、容器の底部が上部側に位置する状態で培養すること；及び
第１の細胞を多孔性膜の下部面で培養し、第２の細胞を多孔性膜の上部面で、多孔性膜が内底面に対向するように容器の内底面と接触しない位置で保持部材により保持され、かつ多孔性膜が重力方向に上部側に位置し、容器の底部が下部側に位置する状態で培養すること；を含む方法。
【発明の効果】
【００１４】
本開示によれば、新規な生体組織モデル装置、新規な血管壁モデル、新規な血管壁モデル装置、及びこれらの適用が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】生体組織モデル装置の一例を示す概略的な断面図である。
【図２】生体組織モデル装置内の細胞積層体の一例を示す概略的な部分断面図である。
【図３Ａ】ハニカム構造を有する多孔性膜の一例を示す斜視図である。
【図３Ｂ】図３Ａにおける多孔性膜を上部側から見た平面図である。
【図３Ｃ】図３Ｂにおけるｃ−ｃ線に沿った多孔性膜の断面図である。
【図４Ａ】保持部材の一例を示す斜視図である。
【図４Ｂ】図４Ａに示した保持部材が培養容器に配置される状態を示す斜視図である。
【図５】細胞積層体の製造方法の一例を示す概路図である。
【図６】細胞積層体の製造方法の一例を示す概路図である。
【図７】実施例１において使用された多孔性膜の顕微鏡写真である。
【図８】実施例１における多孔性膜の片面に形成された各細胞層の免疫蛍光画像である。
【図９】ＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対蛍光強度を示すグラフである。
【図１０】ＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対蛍光強度を示すグラフである。
【図１１】実施例２における多孔性膜の片面に形成された各細胞層の免疫蛍光画像である。
【図１２】実施例２における細胞積層体の免疫蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明の実施態様を記載する。以下の記載と実施例は例示的な実施態様を説明するものであり、発明の範囲を制限するものではない。本開示に記載された作用メカニズムは推定を含み、その推定が正しいか否かは発明の範囲を制限するものではない。
【００１７】
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。
【００１８】
組成物中の特定成分にそれぞれ相応する２つ以上の物質が存在する場合、特に断らない限り、本開示に記載した組成物中の特定成分の量は、組成物に存在する２つ以上の物質の総量を意味する。
【００１９】
＜生体組織モデル装置及び血管壁モデル装置＞
本開示に係る生体組織モデル装置は、
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される細胞積層体を含む。
【００２０】
本開示に係る生体組織モデル装置における細胞積層体は、
ハニカム構造を有する多孔性膜；
第１のタイプの細胞を含み、ハニカム構造を有する多孔性膜の一方の面に配置される細胞層；及び
第１のタイプとは異なる第２のタイプの細胞を含み、ハニカム構造を有する多孔性膜の他方の面に配置される細胞層を含む。
ハニカム構造を有する多孔性膜は、以下「ハニカム膜」という。
【００２１】
本開示に係る生体組織モデル装置において、細胞積層体は一方の細胞層が第１の液体区画に対向し、他方の細胞層が第２の液体区画に対向するように配置される。
【００２２】
本開示に係る生体組織モデル装置において、第１の液体区画に貯蔵された液体組成物及び第２の液体区画に貯蔵された液体組成物は同じ組成であってもよく、互いに異なっていてもよい。これらの液体組成物のそれぞれは、細胞を細胞積層体内の細胞層に生きた状態で維持するように構成された組成を有することが好ましい。液体組成物の例は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、哺乳動物細胞用の基本培地、及び血液を含む。
【００２３】
図１に、本開示に係る生体組織モデル装置の一例である生体組織モデル装置５００が示されている。図１は、生体組織モデル装置５００の概略的な断面図である。この図において、各部材のサイズは概念的なサイズであり、部材サイズ間の相対的な関係はこれに限定されない。生体組織モデル装置５００は、第１の液体区画４１０、第２の液体区画４２０、及び細胞積層体３００を含む。第１の液体区画４１０及び第２の液体区画４２０のそれぞれは液体組成物を貯蔵する。第１の液体区画４１０に貯蔵された液体組成物と第２の液体区画４２０に貯蔵された液体組成物は、同じ組成であってもよく、互いに異なっていてもよい。細胞積層体３００は、第１の液体区画４１０と第２の液体区画４２０との間の隔壁の部分である。
【００２４】
図１に示された生体組織モデル装置５００の構成の一例は、細胞培養インサートが培養容器に配置される構成である。この構成の生体組織モデル装置は、底部及び底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、容器に配置される細胞培養インサートとを含み、細胞培養インサートは細胞積層体を含む。この構成は、培養容器と細胞培養インサートとが一体化されている培養装置を用いた後述する製造方法により細胞積層体が製造された後に得られた細胞培養インサートと培養容器とで構成される（例えば、図４Ｂに示されている後述する構成）。この構成は、以下「細胞培養インサートタイプ装置」という。細胞培養インサートタイプ装置の構成の一例として図４Ｂを参照して記載した場合、保持部材４０の中空円筒部４２及びハニカム膜２０により規定された空間は、図１に示された第１の液体区画４１０に対応し、培養容器６０の底部６２、培養容器６０の側壁部６４、保持部材４０の中空円筒部４２、及びハニカム膜２０により規定された空間は、図１に示された第２の液体区画４２０に対応する。
【００２５】
本開示に係る生体組織モデル装置の一例は血管壁モデル装置である。本開示に係る血管壁モデル装置は、
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画及び第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される血管壁モデルを含む。
【００２６】
本開示に係る血管壁モデル装置における血管壁モデルは、ハニカム膜、ハニカム膜の一方の面に配置される血管内皮細胞層、及びハニカム膜の他方の面に配置される平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層を含む。本開示に係る血管壁モデル装置において、血管壁モデルにおける血管内皮細胞層及び平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層は、血管内皮細胞層及び平滑筋細胞層／間葉系幹細胞層のそれぞれが対応する液体区画に対向するように配置される。
【００２７】
本開示に係る血管壁モデル装置において、第１の液体区画に貯蔵された液体組成物及び第２の液体区画に貯蔵された液体組成物は、同じ組成であってもよく、互いに異なっていてもよい。液体組成物は、血管内皮細胞及び平滑筋細胞／間葉系幹細胞を生きた状態で維持するように構成された組成を有することが好ましい。液体組成物の例は、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、哺乳動物細胞用の基本培地、血液、赤血球を含む液体組成物、及び血液を模倣してデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物を含む。本開示において、血液の範囲は、生理食塩水に希釈した血液；血液にグルコース及び抗凝固剤などの添加剤を添加して得られた保存可能な血液；及びこれらの画分などの血液サンプルを含む。
【００２８】
本開示に係る生体組織モデル装置の構成の一例は、細胞積層体３００が図１に示した生体組織モデル装置５００における血管壁モデルの構成である。本開示に係る生体組織モデル装置の構成の例は、前述の細胞培養インサートタイプ装置を含む。
【００２９】
本開示に係る生体組織モデル装置における細胞積層体、及び本開示に係る血管壁モデル装置における血管壁モデルについて以下に記載する。
【００３０】
［細胞積層体及び血管壁モデル］
本開示に係る生体組織モデル装置における細胞積層体は、ハニカム膜と、第１のタイプの細胞を含み、ハニカム膜の一方の面に配置される細胞層と、第１のタイプとは異なる第２のタイプの細胞を含み、ハニカム膜の他方の面に配置される細胞層とを含む。ハニカム膜の各面に配置される細胞層の数は１つ又は２つ以上であってもよい。
【００３１】
図２に、本開示に係る生体組織モデル装置における細胞積層体の一例である細胞積層体３００を示す。図２は細胞積層体３００の概略的な部分断面図である。この図において、各部材の寸法は概念的な寸法であり、部材の寸法間の相対的な関係はこれに限定されない。
【００３２】
細胞積層体３００は、ハニカム膜２００、第１のタイプの細胞を含む細胞層１１０、及び第２のタイプの細胞を含む細胞層１２０を含む。第１のタイプの細胞を含む細胞層１１０がハニカム膜２００の一方の主面に配置され、第２のタイプの細胞を含む細胞層１２０がハニカム膜２００の他方の主面に配置される。
【００３３】
［ハニカム膜］
本開示に係る細胞積層体におけるハニカム膜は、細胞積層体の製造時に細胞が接着して増殖する足場として作用する。より具体的には、細胞はハニカム膜の両面で増殖して両面に細胞層を形成し、それにより本開示に係る細胞積層体が提供される。
【００３４】
本開示におけるハニカム構造は、隔壁による区画化により多数の貫通孔が形成される構造をいう。本開示に係る細胞積層体におけるハニカム膜において、ハニカム構造の貫通孔はハニカム膜の主面に開口を形成する。本開示に係る細胞積層体におけるハニカム膜は、複数のハニカム構造が層状に積層されている構造を有する膜であってもよい。
【００３５】
本開示に係る細胞積層体におけるハニカム膜において、ハニカム構造の貫通孔の形状は制限されない。貫通孔の形状は、例えば、球体の一部が欠けた球欠形状、バレル状、円柱形状、又は多角柱状であり、複数種の形状の貫通孔が混在していてもよい。貫通孔の開口の形状は、例えば、円形、楕円形又は多角形状であり、複数種の形状の開口が混在していてもよい。ハニカム構造において、隣接する貫通孔は部分的に互いに連通していてもよい。
【００３６】
ハニカム膜では、ハニカム膜に配置された細胞層の均質性を高める観点から、貫通孔は、規則的に配列されていることが好ましい。規則的な配列は途切れたりずれたりしてもよい。しかしながら、規則的配列は、すべての方向に途切れることなく連続して繰り返されることが好ましい。
【００３７】
以下、図面を参照して、ハニカム膜の一例を説明する。各図において、同一又は等価な要素又は部分には同一の参照符号が付与される。以下の記載において、「長径」とは輪郭線上の任意の２点間の最長距離を意味し、又は方向が特定されている場合は、特定された方向における任意の２点間の最長距離を意味する。
【００３８】
図３Ａ〜３Ｃに、ハニカム膜の一例であるハニカム膜２０が示されている。図３Ａはハニカム膜２０の斜視図であり、図３Ｂは、図３Ａにおけるハニカム膜２０を上部側から見た平面図であり、図３Ｃは、図３Ｂにおけるｃ−ｃ線に沿ったハニカム膜２０の断面図である。
【００３９】
貫通孔２２は、ハニカム膜２０の主面上の全域に亘って配列される。しかしながら、細胞が接触することができないハニカム膜２０上の領域が存在する場合、その領域には貫通孔２２を設ける必要がない。ハニカム膜２０において、隣接する貫通孔２２は隔壁２４により互いに分離されている。
【００４０】
貫通孔２２の配列は、反対側面が平行な六角形（好ましくは、正六角形）又は類似した形状が単位として作用し、開口の中心が形状の頂点及び対角線の交差点に位置する配列である。「開口の中心」とは、主面の平面における開口の２次元形状の重心を意味する。
【００４１】
貫通孔２２の形状は、例えば、球体の一部が欠けた球欠形状、バレル形状、円柱形状、又は多角柱状である。貫通孔２２の開口の形状は、例えば、円形、楕円形又は多角形状である。ハニカム構造において、隣接する貫通孔２２は、ハニカム膜２０の内部の連通孔により互いに連通していてもよい。
【００４２】
以下に、ハニカム膜２０のサイズについて記載する。
【００４３】
貫通孔２２のピッチＰ１は、隣接する開口の中心間の距離である。ピッチＰ１は、ハニカム膜２０に配置された細胞層に含まれた細胞のサイズにより調整されることが好ましい。ピッチＰ１は、例えば、１μｍ〜５０μｍである。
【００４４】
開口直径Ｄａは、貫通孔２２の開口の長径である。開口直径Ｄａは、細胞層に含まれた細胞がハニカム膜２０に残留する大きさであることが好ましい。開口直径Ｄａは、例えば、細胞層に含まれた細胞の長径の１０％〜１５０％（例えば、１０μｍ〜５０μｍ）である。血管壁モデルが赤血球漏出試験を行うために構築される場合、開口直径Ｄａは、赤血球が通過できる大きさであることが好ましい。一方の面の細胞と他方の面の細胞間の細胞間接触を可能にする観点から、開口直径Ｄａは、小さ過ぎないことが好ましい。一方、細胞層に含まれた細胞がハニカム膜２０に残留するようにする観点から、開口直径Ｄａは、大き過ぎないことが好ましい。これらの観点から、開口直径Ｄａは、１μｍ〜２０μｍが好ましく、２μｍ〜１０μｍがより好ましく、３μｍ〜５μｍがさらに好ましい。同様に、開口の開口直径Ｄａの平均値は、１μｍ〜２０μｍが好ましく、２μｍ〜１０μｍがより好ましく、３μｍ〜５μｍがさらに好ましい。
【００４５】
開口直径Ｄａの変動係数は、２０％以下が好ましく、変動係数が小さいほどより好ましい。開口直径Ｄａの変動係数が小さいほど、ハニカム層２０に配置された細胞層の均質性が高くなる。変動係数は、グループの標準偏差をグループの算術平均値で除することで求められる値であり、変動係数は、グループ内の変動の度合いの指標である。本開示では、変動係数は百分率で示す。
【００４６】
隔壁２４の幅Ｗは、隣接する開口間の最小距離として測定される隔壁２４の幅を指す。幅Ｗは、細胞層に含まれた細胞がハニカム膜２０に残留する幅であることが好ましい。
【００４７】
ハニカム膜の物質透過性及び強度の観点から、ハニカム膜２０の開口率は、３０％〜７０％が好ましく、３５％〜６５％がより好ましく、４０％〜６０％がさらに好ましい。ハニカム膜２０の開口率は、平面視における主面の面積（開口を含む面積）に対する開口の総面積の比である。開口率は、一方の面と他方の面に対して個別に算定される。
【００４８】
一方の面の細胞と他方の面の細胞との間の細胞間接触を可能にする観点から、ハニカム膜２０の厚さは、厚過ぎないことが好ましい。ハニカム膜２０の強度の観点から、ハニカム膜２０の厚さは、薄過ぎないことが好ましい。これらの観点から、ハニカム膜２０の厚さは、０．５μｍ〜４０μｍが好ましく、１μｍ〜２０μｍがより好ましく、２μｍ〜８μｍがさらに好ましい。
【００４９】
ハニカム膜の製造に使用される方法は制限されない。ハニカム膜の製造方法の例は、日本特許第４７３４１５７号公報、第４９４５２８１号公報、第５４０５３７４号公報、第５４２２２３０号公報、及び日本特開第２０１１−０７４１４０号公報に開示されている、重合体溶媒を含むコーティングフィルムにおいて水滴を成長させることにより貫通孔を形成する製造方法；及び樹脂材質の膜にエッチング処理又はパンチング処理を行って貫通孔を形成することによりハニカム膜を形成する製造方法を含む。
【００５０】
ハニカム膜の材料の例としては、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、及びポリ−３−ヒドロキシブチレート）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリビニルアセテート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリウレア、多環芳香族化合物、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、及びセルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、及びセルロースアセテートブチレート）、ポリ（グリセロールセバケート）及びポリアクリルアミンなどの重合体を含む。例えば、日本特許第４７３４１５７号公報に開示された製造方法を用いてハニカム膜を製造する観点から、疎水性有機溶媒に溶解される重合体が好ましい。例えば、溶媒に対する溶解度、光学特性、電気的特性、膜強度、及び弾性の観点から、これらの重合体は、必要に応じて単独重合体、共重合体、重合体ブレンド又は重合体アロイの形態を取り得る。これらの重合体は、単独で使用してもよく、２つ以上を組み合わせて使用してもよい。
【００５１】
ハニカム膜の材料として、自立性の観点から、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリカーボネート又はポリ乳酸が好ましく、細胞層の生着を維持する観点から、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体又はポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体が好ましい。
【００５２】
ハニカム膜の各面は、細胞接着性の観点から、好ましくはフィブロネクチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、又はＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つに被覆され、少なくとも細胞層が配置される領域上に被覆される。基底膜マトリックスについては、市販品（例えば、マトリゲル（ＭＡＴＲＩＧＥＬ）（登録商標）、ゲルトレックス（ＧＥＬＴＲＥＸ）（登録商標））が利用可能である。組み換えペプチドについては、市販品（例えば、セルネスト（ＣＥＬＬＮＥＳＴ）（登録商標））が利用可能である。ハニカム膜において、孔の内部も、これらの物質の少なくとも１つで被覆されることが好ましい。
【００５３】
［第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞］
本開示に係る生体組織モデル装置における細胞積層体において、第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞は、異なる種類の細胞である。第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞の２つのタイプの細胞は、例えば、実質細胞（例えば、肝実質細胞又は膵実質細胞）、間質細胞（例えば、周皮細胞）、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、心筋細胞、又は骨格筋細胞）、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞）、上皮細胞（例えば、肺胞上皮細胞、口腔上皮細胞、胆管上皮細胞、腸上皮細胞、膵管上皮細胞、腎上皮細胞、腎尿細管上皮細胞又は胎盤上皮細胞）及び幹細胞（例えば、間葉系幹細胞）からなる群から選択された２つのタイプの細胞である。
【００５４】
本開示に係る細胞積層体において、複数種の細胞が１つの細胞層に含まれてもよい。本開示に係る細胞積層体において、第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞以外の１種以上の細胞（第３タイプの細胞という）が一方の細胞層に含まれてもよく、両方の細胞層に含まれてもよい。一例として、第１のタイプの細胞は実質細胞であり、第２のタイプの細胞は間質細胞であり、第３タイプの細胞は神経細胞であり、神経細胞は細胞層の一方又は両方に含まれ得る。
【００５５】
第１のタイプの細胞を含む一方の細胞層が他方の細胞層に含まれたものと同種の細胞である第２のタイプの細胞をさらに含む場合でも、その構成は、一方の細胞層に含まれた細胞及び他方の細胞層に含まれた細胞が、例えば細胞タイプ間の含有割合に基づいて区別できる限り、依然として本開示の範囲内である。例えば、本開示は一方の細胞層に含まれた細胞が実質細胞及び間質細胞（９：１の含有割合）であり、他方の細胞層に含まれた細胞が実質細胞及び間質細胞（１：９の含有割合）である構成を含む。
【００５６】
本開示に係る細胞積層体は、生体内の組織を模倣し、本開示に係る生体組織モデル装置に含まれる組織モデルである。そのため、模倣しようとする生体内の組織により、第１のタイプの細胞と第２のタイプの細胞が選択され、必要に応じて第３タイプの細胞が選択される。動物組織では、基底膜は一般的に１つの細胞層と別の細胞層との間に存在する。（組織モデルとして作用する）本開示に係る細胞積層体では、ハニカム膜は基底膜に対応する。
【００５７】
生体内の組織を模倣する組織モデルの一例は、血管壁モデルである。本開示に係る血管壁モデルは、ハニカム膜、ハニカム膜の一方の面に配置される血管内皮細胞層、及びハニカム膜の他方の面に配置される平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層を含む。
【００５８】
血管壁モデルは、化学物質が血管内皮細胞層の細胞間を自由に通過することを防止することが好ましく、つまり、バリア機能を有することが好ましい。血管壁モデルのバリア機能は、フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン７０（ＦＩＴＣ−デキストラン７０）の透過性を指標として用いて表現することができる。本開示に係る血管壁モデルは、好ましくは、血管内皮細胞層側から平滑筋細胞層側又は間葉系幹細胞層側へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性が、ハニカム膜自体のＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜１０％、より好ましくは、ハニカム膜自体のＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜５％、さらに好ましくは、ハニカム膜自体のＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜２％となるように構成される。このような構成を有する血管壁モデルにおいて、血管内皮細胞間の細胞間接着は、おそらく生体内の血管壁に近い状態に発達した。血管壁モデルを利用して薬物を正確に評価するために、血管壁モデルは、生体内の血管壁に類似した構造と機能を有することが好ましい。したがって、前記構成を有する血管壁モデルは、優れた薬物評価手段として作用することができる。
【００５９】
血管壁モデルにおけるＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の検定に使用される方法については後述する。
【００６０】
生体内の組織を模倣する組織モデルの別の例は、病態再現モデルである。このモデルでは、遺伝子変異を有する細胞又は患者からの細胞が第１のタイプの細胞又は第２のタイプの細胞の少なくとも１つとして使用される。
【００６１】
前述の細胞積層体を含む生体組織モデル装置は、薬物評価又は病態評価用の装置として、又は動物実験に代替できるテスト用の装置として有用である。次に、生体組織モデル装置を利用した被検物質の評価方法を本開示に係る生体組織モデル装置の適用として説明する。
【００６２】
＜被検物質の評価方法＞
本開示に係る生体組織モデル装置は、被検物質が細胞組織に及ぼす影響を評価する手段として使用されてもよい。具体的に、被検物質が細胞組織に及ぼす影響は、
被検物質を第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程により、
本開示に係る生体組織モデル装置を使用して評価される。
例えば、被検物質は下記モード（ａ）及び（ｂ）に従って評価される。
【００６３】
（ａ）細胞積層体の細胞から分泌された化学物質を定量化するモード
被検物質が添加された液体区画に対向する側に位置する細胞層の細胞は、被検物質に反応して化学物質を分泌する（細胞の損傷による細胞内成分の漏出を含む）。結果として、被検物質が添加された液体区画は、細胞から分泌された物質を含むようになる。さらに、被検物質が添加された液体区画に対向する細胞層とは反対側の細胞層にある細胞は、一方の面の細胞層と他方の面の細胞層との間の細胞間相互作用（すなわち、可溶性因子による信号伝達）、又は一方の面の細胞層と他方の面の細胞層との間の細胞間接触の少なくとも１つによって化学物質を分泌する。被検物質が添加された液体区画に含まれる細胞から分泌された物質、又は他の液体区画に含まれる細胞から分泌された物質の少なくとも１つを定量化し、得られた量を利用して、被検物質が細胞組織に影響を与えたか否か、及びその影響の程度を測定する。細胞から分泌された物質の例は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、タンパク質及び転写因子を含む。
【００６４】
（ｂ）細胞積層体の一側から細胞積層体の他側に漏れ出る化学物質、又は細胞が定量化されるモード
被検物質が添加された液体区画に対向する側に位置する細胞層の細胞は、被検物質に反応してそれらの形態を変化させて（細胞の損傷を含む）、細胞層にギャップが生じる。結果として、被検物質が添加された液体区画に貯蔵された液体組成物に含まれた化学物質、又は細胞が他の液体区画に漏れ出る。他の液体区画に漏れ出た化学物質、又は細胞を定量化し、得られた量を利用して、被検物質が細胞組織に影響を与えたか否か、及びその影響の程度を測定する。
【００６５】
モード（ｂ）の一例は、トレーサーが使用されるモードである。具体的には、被検物質を１つの液体区画に添加した後、被検物質が添加された液体区画にトレーサーを添加して、他の液体区画に漏れ出たトレーサーの量を定量化する。このモードでは、被検物質を１つの液体区画に添加した後、例えば、３７℃で３０分〜２４時間の持続期間インキュベーションを行い、トレーサーを添加する。このモードでは、トレーサーの例は、蛍光票職化学物質、放射性同位元素を含む化学物質、及び着色剤化合物を含む。トレーサーは、トレーサーのタイプにより蛍光強度、放射線又は色度を測定することにより定量化される。他の液体区画に漏れ出たトレーサーの量に基づいて被検物質が細胞組織に影響を与えたか否か、及びその影響の程度を測定する。
【００６６】
モード（ａ）及び（ｂ）において、本開示に係る生体組織モデル装置は、次のような点で従来の生体組織モデル装置に比べて有利である。
【００６７】
従来の生体組織モデル装置は、ＴＥ膜の両面に細胞層を有する細胞積層体を含む。ＴＥ膜は、一般的に開口率が約２％〜約２０％と低い。ＴＥ膜の両面に細胞層を有する細胞積層体では、一方の面の細胞層と他方の面の細胞層との間の細胞間相互作用は相対的に不活性である。そのため、被検物質が添加された液体区画に対向する側に位置する細胞層とは反対側にある細胞層が期待反応を行わず、目的とする化学物質を分泌しない可能性がある。また、ＴＥ膜の両面に細胞層を有する細胞積層体では、細胞層の細胞の形態が変化して細胞層にギャップを生成する場合でも、細胞層により閉鎖されたＴＥ膜の孔が貫通する可能性は低い。細胞層のバリア機能が被検物質により消去される場合でも、ＴＥ膜自体のバリア機能は作動することができ、トレーサーの漏出を防止することができる。したがって、従来の生体組織モデル装置は、被検物質が細胞組織に及ぼす影響を正確に評価することができない場合がある。特に、被検物質が及ぼす影響が弱い場合、又は被検物質の濃度が低い場合、被検物質が細胞組織に及ぼす影響を評価することは困難である。
【００６８】
本開示に係る生体組織モデル装置は、ハニカム膜の両面に細胞層を含む細胞積層体を含む。ハニカム膜は高い開口率を有する。ハニカム膜の両面に細胞層を含む細胞積層体では、一方の面の細胞層と他方の面の細胞層との間の細胞間相互作用は相対的に活性である。活性細胞間相互作用により、被検物質が添加された液体区画に対向する側に位置する細胞層とは反対側にある細胞層が期待反応を行って目的とする化学物質を分泌することが推定される。また、ハニカム膜の両面に細胞層を含む細胞積層体では、細胞層の細胞の形態が変化して細胞層にギャップを生成する場合に、細胞層により閉鎖されたハニカム膜の孔が高い確率で貫通するようになる。したがって、細胞層のバリア機能が被検物質により消去されると、トレーサーの漏出が高い確率で生じる。したがって、被検物質が細胞組織に及ぼす影響を本開示に係る生体組織モデル装置を利用して高感度で評価することができる。
【００６９】
本開示に係る血管壁モデル装置は、被検物質が血管壁に及ぼす影響を評価する手段として使用することができる。具体的には、被検物質が血管壁に及ぼす影響は、
被検物質を第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞の少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞の少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
により、本開示に係る血管壁モデル装置を使用して評価される。被検物質の評価は、例えば、下記モード（ａ−１）又は（ｂ−１）により行われる。
【００７０】
（ａ−１）血管壁モデルの細胞から分泌された化学物質が定量化されるモード
このモードは、前述のモード（ａ）と同様の方法で行われる。
【００７１】
（ｂ−１）血管壁モデル装置の一側から血管壁モデル装置の他側に漏れ出る化学物質、又は細胞が定量化されるモード
このモードは、前述のモード（ｂ）と同様の方法で行われる。一例は、トレーサーが使用される前述のモードである。下記のモードも考えられる。
【００７２】
モード（ｂ−１）の一例では、血液、赤血球を含む液体組成物、又はデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含み、血液を模倣する液体組成物が第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに貯蔵される血管壁モデル装置を使用する。このモードでは、血液、赤血球を含む液体組成物、又はデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含み、血液を模倣する液体組成物が貯蔵される液体区画に被検物質を添加し、他の液体区画に漏れ出た赤血球の量、他の液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、又は他の液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを定量化する。
【００７３】
前記モードの一例では、血液、赤血球を含む液体組成物、又はデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含み、血液を模倣する液体組成物が血管内皮細胞層に対向する側に位置する液体区画に貯蔵される血管壁モデル装置を使用し、血管内皮細胞層に対向する側に位置する液体区画に被検物質を添加し、平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出た赤血球の量、平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、或いは平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを定量化する。より具体的には、被検物質の評価は下記の方法によって行われる。
【００７４】
血管壁において、血管内皮細胞の発達した細胞間接着は、化学物質の血管壁通過を制限する。被検物質が血管内皮細胞に影響を与える場合、血管内皮細胞は被検物質に反応して（血管内皮細胞の損傷を含む）、化学物質に対する血管壁の透過性が増加する。結果として、血管内皮細胞層に対向する側に位置する液体区画の液体組成物に含まれた赤血球、又はデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つが平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出る。被検物質にさらに溶血毒性がある場合、ヘモグロビンが赤血球から出てきて、そのヘモグロビンが平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出る。平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出た赤血球の量、平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、又は平滑筋細胞層又は間葉系幹細胞層に対向する側に位置する液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを測定して、得られた量に基づいて被検物質が血管壁及び赤血球に影響を与えたか否か、及びその影響の程度を測定する。
【００７５】
本開示に係る血管壁モデル装置は、血管壁モデルのバリア機能を評価する手段として使用することができる。例えば、血管壁モデルのバリア機能は、例えば、フィルター部が血管壁モデルである細胞培養インサート型装置を使用して、ＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性を下記の方法で検定することにより評価される。
【００７６】
フィルター部が血管壁モデル（すなわち、血管内皮細胞層がハニカム膜の一方の面に配置され、平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層がハニカム膜の他方の面に配置される細胞積層体）であり、血管内皮細胞層が細胞培養インサートの内側に対向する細胞培養インサート型装置を用意する。ＦＩＴＣ−デキストラン７０を細胞培養インサートの内側に添加して３７℃でインキュベーションし、１０分以内に細胞培養インサートの外側に漏れ出たＦＩＴＣ−デキストラン７０の量を測定する（すなわち、細胞培養インサートの外側におけるＦＩＴＣの蛍光強度を測定する）。これとは別に、フィルター部がハニカム膜自体である細胞培養インサート型装置を使用して、前述と同様の手順により細胞培養インサートの外側に漏れ出るＦＩＴＣ−デキストラン７０の量を測定する（すなわち、細胞培養インサートの外側におけるＦＩＴＣの蛍光強度を測定する）。相対的蛍光強度（ＲＦＩ）の、百分率で示す後者の測定で得られた蛍光強度に対する前者の測定で得られた蛍光強度の割合を算定する。ＲＦＩ値が小さいほど、血管壁モデルはより高いバリア機能を示すものと見なされる。ＲＦＩは、０％〜１０％が好ましく、０％〜５％がより好ましく、０％〜２％がさらに好ましい。
【００７７】
＜細胞積層体及び生体組織モデル装置の製造方法＞
本開示に係る生体組織モデル装置は、例えば、生体組織モデル装置に隔壁としてハニカム膜の各面に異なる種類の細胞を培養して得られた細胞積層体を設けることを含む方法；又はハニカム膜になる生体組織モデル装置に隔壁の一部を構成し、ハニカム膜の各面に異なる種類の細胞を培養して細胞積層体を形成することを含む方法により製造される。ハニカム膜の各面に異なる種類の細胞を培養して細胞積層体を得る方法としては、後述する細胞積層体の製造方法であってもよい。細胞積層体の製造方法の後述するモードも、本開示に係る血管壁モデルの製造方法である。細胞積層体の製造方法の後述するモードも、本開示に係る生体組織モデル装置の一例である細胞培養インサート型装置の製造方法である。
【００７８】
本開示に係る製造方法において、底部及び底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、ハニカム膜と、ハニカム膜が容器の内底面に対向し、その内底面と接触しない位置に保持されるようにハニカム膜を保持するように構成された保持部材。以下、容器は「培養容器」という。
【００７９】
本開示に係る製造方法は、培養容器と、ハニカム膜と、保持部材とを用いてハニカム膜の両面に細胞を培養し、それによりハニカム膜の両面に細胞層を有する細胞積層体を製造することを含む。
【００８０】
まず、本開示に係る製造方法で用いられる培養容器、ハニカム膜及び保持部材を説明する。培養容器、ハニカム膜及び保持部材の後述する例は、細胞培養インサート型装置における好ましい例に対応する。
【００８１】
培養容器は、例えば、ディッシュ、マルチディッシュ、又はマルチウェルプレートである。培養容器の底部の形状は、例えば、円形、長方形、又は正方形である。培養容器の材料は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、又はガラスである。培養容器は、透明度が高いことが好ましい。
【００８２】
培養容器の内底面は、偏平であることが好ましい。培養容器の内底面は、細胞がその内底面に接着しないようにする性質を有することが好ましい。したがって、培養容器の内底面は、コロナ放電処理又はタンパク質コーティング処理を施さないことが好ましい。細胞の接着を減らすために、培養容器の内底面は、例えば、ホスホリルコリン基又はポリエチレングリコールを有する重合体で被覆されてもよい。内底面と同様に、培養容器の内側面は、細胞がその内側面に接着しないようにする性質を有することが好ましい。
【００８３】
本開示に係る製造方法に用いられるハニカム膜には、細胞積層体に含まれるハニカム膜と同じ定義が与えられ、その好ましい例も同じである。本開示に係る製造方法において、ハニカム膜は、細胞が接着して増殖する足場である。
【００８４】
本開示に係る製造方法において、ハニカム膜は、細胞が接着して増殖する足場であるところ、ハニカム膜の開口率が高いほど、またハニカム膜の厚さが薄いほど、一方の面の細胞と他方の面の細胞との間のより活性な細胞間相互作用（すなわち、可溶性因子による信号伝達）又は一方の面の細胞と他方の面の細胞との間のより活性な細胞間接触の少なくとも１つを提供する。細胞培養中のより活性な細胞間相互作用は、生体内の組織により近接した機能を有する細胞積層体の製造を可能とする。本開示に係る製造方法は、例えば、血管内皮細胞の細胞間接着が生体内の血管壁に近接した状態に発達した血管壁モデルの製造を可能とする。
【００８５】
保持部材は、ハニカム膜が培養容器の内底面に対向してその内底面と接触しない位置に保持されるようにハニカム膜を保持するように構成された部材である。
【００８６】
高い透明度、液体培養培地における化学的安全性及び軽量性を考慮すると、保持部材の材料としては、ポリカーボネート、ポリスチレン及びポリエステルなどの樹脂が好ましい。
【００８７】
保持部材の形状は制限されない。保持部材は、例えば、ハニカム膜を保持するように構成された部分、及び培養容器と接触するように構成された部分を含む。保持部材は、例えば、培養容器の側壁部のエッジにかかる突出部を有するワイヤ状部材、棒状部材、又は中空円筒状部材である。
【００８８】
保持部材の形態に関連して、保持部材は、例えば、
中空円筒部の一方の軸方向端部に多孔性膜を保持するように構成された中空円筒部（円筒部は、培養容器の内径より小さい外径を有し、軸方向に中空円筒部の長さは培養容器の側壁部の高さより低い）；及び
中空円筒部の他方の軸方向端部から半径方向に外向きに突出する突出部（突出部は、培養容器の側壁部のエッジにかかるように構成される）を含む部材である。このような形態については、図面を参照しながら以下で説明する。
【００８９】
図４Ａにおいて、保持部材の一例である保持部材４０をハニカム膜２０（ハニカム膜の一例）と組み合わせた状態で示している。図４Ａは、保持部材４０の斜視図である。図４Ｂは、ハニカム膜２０と組み合わせた保持部材４０が培養容器６０（培養容器の一例）に設置される状態を示す斜視図である。
【００９０】
保持部材４０は、中空円筒部４２及び突出部４４を含む。ハニカム膜２０は、中空円筒部４２の軸方向の一端に配置される。ハニカム膜２０は、中空円筒部４２の一端に位置した開口を少なくとも閉鎖するサイズを有する。ハニカム膜２０は、熱圧着、超音波溶着、レーザー溶着、接着剤又は両面接着テープによって中空円筒部４２の一端に接着される。これとは異なり、ハニカム膜２０は、中空円筒部４２の外面に取り付けられたリング状の固定部材により中空円筒部４２の一端に固定させてもよい。
【００９１】
中空円筒部４２は、培養容器６０の内径よりも小さい外径を有し、培養容器６０の内側（すなわち、底部６２及び側壁部６４により規定される空間）に挿入可能である。中空円筒部４２の軸方向の長さは、培養容器６０の側壁部６４の高さよりも低い。したがって、ハニカム膜２０は培養容器６０の底部６２と接触しない。
【００９２】
中空円筒部４２は、円周方向及び軸方向に連続的な壁を有する。このような構成は、ハニカム膜２０及び中空円筒部４２により規定された空間に液体を保存するようにする。しかしながら、突出部４４の付近の位置にある中空円筒部４２の壁にはスリットが備えられてもよい。中空円筒部４２の内面形状は、例えば、円柱形状、多角柱状、円錐台形状又は角錐台形状である。
【００９３】
突出部４４は、ハニカム膜２０が配置される端部とは反対側の中空円筒部４２の軸方向の端部において、中空円筒部４２の半径方向に外向きに突出する。例えば、中空円筒部４２の円周方向に約１２０゜間隔で３つの突出部４４が設けられてもよい。しかしながら、突出部４４の個数及び形状はこれに限定されない。突出部４４は、中空円筒部４２の円周方向に連続したリング状であってもよい。
【００９４】
突出部４４は、保持部材４０が培養容器６０の内側に挿入されるとき、突出部４４が培養容器６０の側壁部６４のエッジにかかるようにする突出長さを有する。保持部材４０は、突出部４４によって、培養容器６０の側壁部６４のエッジに固定される。
【００９５】
図４Ａに示されたような形状を有する培養装置は、一般的に細胞培養インサートと呼ばれる。
【００９６】
次に、本開示に係る製造方法における工程について説明する。本開示において、「工程」の語の範囲は、独立した工程、及び他の工程と明確に区別できないが該当工程の所望の目的を達成する工程を含む。
【００９７】
本開示に係る製造方法において、培養容器、ハニカム膜及び保持部材が用いられ、製造工程は下記の工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む。図５は、本開示に係る製造方法の一例を示す概略図であり、工程（Ａ）及び（Ｂ）を説明するための概略図である。図５において、矢印Ｇは重力方向を示す。
【００９８】
工程（Ａ）：培養容器６の内底面及びハニカム膜２の表面と接触する液体培養培地において、内底面に対向するように培養容器６の内底面と接触しない位置に保持部材４によってハニカム膜２は保持され、ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて下部側に位置し、培養容器６の底部が上部側に位置する状態で第１の細胞１１を培養する。
【００９９】
工程（Ｂ）：内底面に対向するように培養容器６の内底面と接触しない位置に保持部材４によってハニカム膜２が保持され、ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて上部側に位置し、培養容器６の底部が下部側に位置する状態で、第１の細胞１１をハニカム膜２の下面で培養し、第２の細胞１２をハニカム膜２の上面で培養する。
【０１００】
本開示において、「培養」とは、必ずしも細胞の増殖を伴うものではなく、増殖の有無にかかわらず、細胞を生きた状態で維持することがこの用語の範囲に含まれる。
【０１０１】
工程（Ａ）で採用される状態では、ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて下部側に位置し、培養容器６の底部が上部側に位置する。工程（Ａ）において、細胞懸濁液が培養容器６の内底面及びハニカム膜２の表面と接触するように、培養容器６とハニカム膜２との間に第１の細胞１１を含む細胞懸濁液を提供し、第１の細胞１１をこの状態で培養する。培養容器６の内底面と細胞懸濁液に含まれた液体培養培地との間に作用する表面張力により、液体培養培地はハニカム膜２に残留し、ハニカム膜２の孔を通じた液体培地の落下が減少する。したがって、高い開口率を有するハニカム膜は細胞積層体の製造に用いることができる。ハニカム膜２は、培養容器６の内底面付近の位置において、ハニカム膜２が培養容器６の内底面に対向して培養容器６の内底面に平行に又は実質的に平行に配向される状態に、保持部材４により保持されることが好ましい。ハニカム膜２と培養容器６の内底面との間の距離は、例えば、０．５ｍｍ〜１０ｍｍである。
【０１０２】
工程（Ａ）において、液体培養培地の第１の細胞１１は、自重によって重力方向Ｇに移動し、ハニカム膜２に接着する。工程（Ａ）は、ハニカム膜２に第１の細胞１１を接着培養する工程である。
【０１０３】
工程（Ａ）における細胞培養の条件は、一般的な細胞培養条件であってもよい。例えば、インキュベーターで３７℃の温度及び５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度の培養（例えば、ＣＯ２インキュベーター、パナソニック製）が利用されてもよい。培養期間は、ハニカム膜２への第１の細胞１１の接着が安定するまでの期間であることが好ましい。
【０１０４】
工程（Ｂ）に採用される状態では、ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて上部側に位置し、培養容器６の底部が下部側に位置する。工程（Ｂ）において、第１の細胞１１はハニカム膜２の下面で培養され、第２の細胞１２はハニカム膜２の上面で培養される。ハニカム膜２の下面で培養される第１の細胞１１は、培養容器６の内底面に対向する側に位置するハニカム膜２の面で培養した第１の細胞１１であり、その細胞は工程（Ｂ）で引き続き培養される。
【０１０５】
工程（Ｂ）における細胞培養の条件は、一般的な細胞培養条件であってもよい。例えば、インキュベーターで３７℃の温度及び５％（ｖ／ｖ）のＣＯ２濃度の培養が利用されてもよい。培養期間は、ハニカム膜２の両面で細胞が飽和（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）に到逹するまでの期間であることが好ましい。細胞が飽和に到逹したことは、例えば、光学顕微鏡下の観察により検出されてもよい。培養培地は、培養期間中に他の培養培地に交換されてもよい。
【０１０６】
工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む製造方法の一例を、図６を参照して説明する。図６に示された例示方法は、図４Ｂに示された形状を有する培養装置を利用した製造方法である。図６における（１）〜（５）はそれぞれ下記工程（１）〜（５）に対応する。図６において、矢印Ｇは重力方向を示す。工程（１）〜（５）を含む例示方法によると、工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む製造方法を容易に実現することができる。工程（１）〜（５）を含む例示方法は、細胞積層体の製造方法であり、同時に生体組織モデル装置の一例である細胞培養インサートタイプ装置の製造方法である。
【０１０７】
工程（１）：培養容器６の内底面に第１の細胞１１を含む細胞懸濁液を提供する。
【０１０８】
工程（１）において、細胞懸濁液は、培養容器６の内側面と接触しないように、内底面に提供されることが好ましい。工程（３）において、培養容器６の内側壁に沿って細胞懸濁液が落下することを防止するためである。培養容器６の内側壁に沿って細胞懸濁液が落下することを防止するための別の手段は、例えば、ハニカム膜２の主面における大きさを、培養容器６の内側面と全外周にかけて接触する大きさに設定することである。
【０１０９】
工程（１）において、培養容器６の内底面に提供された細胞懸濁液の量は、培養容器６の内底面とハニカム膜２とで挟まれた空間の体積と同等の量である。第１の細胞１１の播種密度は、例えば、ハニカム膜２の面積を基準に１．０×１０３〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２である。
【０１１０】
工程（２）：ハニカム膜２を備えた保持部材４を培養容器６に配置して、ハニカム膜２を培養容器６の内底面に提供された細胞懸濁液と接触させる。
【０１１１】
工程（２）の実施結果、第１の細胞１１を含む細胞懸濁液は、培養容器６の内底面及びハニカム膜２の表面と接触することになる（つまり、細胞懸濁液は培養容器６の内底面とハニカム膜２の表面とで挟まれる）。以下の製造方法の説明において、ハニカム膜２を備えた保持部材４と培養容器６とが一体化されている装置を「培養装置」という。
【０１１２】
工程（３）：ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて下部側に位置し、培養容器６の底部が上部側に位置する状態で、培養容器６の内底面とハニカム膜２との間で第１の細胞１１を培養する。
【０１１３】
工程（３）は、ハニカム膜２を備えた保持部材４が培養容器６に取り付けられたまま培養装置を上下反転させた後、培養装置をインキュベーターに静置することで実現される。細胞懸濁液に含まれた第１の細胞１１は、自重によって重力方向Ｇに移動して、ハニカム膜２に接着する。
【０１１４】
工程（４）：ハニカム膜２が重力方向Ｇにおいて上部側に位置し、培養容器６の底部が下部側に位置する状態で、第２の細胞１２をハニカム膜２の上面に播種する。
【０１１５】
工程（４）は、培養装置をインキュベーターから取り出して培養装置を上下反転させた後、第２の細胞１２を含む細胞懸濁液をハニカム膜２に播種することで実現される。第２の細胞１２の播種密度は、例えば、１．０×１０３〜１．０×１０６細胞／ｃｍ２である。液体培養培地は、第２の細胞１２を播種する前又は後に、第１の細胞１１側に添加されることが好ましい。
【０１１６】
工程（５）：培養容器６の底部が重力方向Ｇにおいて下部側に位置し、ハニカム膜２が上部側に位置する状態で、第１の細胞１１をハニカム膜２の下面に培養し、第２の細胞１２をハニカム膜２の上面に培養する。
【０１１７】
工程（５）は、工程（４）に続いて、培養装置をインキュベーターに静置することで実現される。培養培地は、工程（５）の期間中に他の培養培地に交換してもよい。第１の細胞１１又は第２の細胞１２の少なくとも１つが幹細胞である場合、目的とする体細胞への分化を誘導する分化誘導因子を培養培地に添加する。
【０１１８】
工程（１）〜（５）を通じて、ハニカム膜２、第１の細胞１１を含みハニカム膜２の一方の面に配置される細胞層、及び第２の細胞１２を含みハニカム膜２の他方の面に配置される細胞層を含む細胞積層体が得られる。
【０１１９】
以下に、本開示に係る製造方法に用いる細胞について説明する。
【０１２０】
本開示に係る製造方法において、第１の細胞及び第２の細胞は、異なる種類の細胞であり、細胞の種類の組み合わせは、本開示に係る細胞積層体が模倣しようとする生体組織により選択される。第１の細胞及び第２の細胞の２種の細胞は、例えば、実質細胞（例えば、肝実質細胞又は膵実質細胞）、間質細胞（例えば、周皮細胞）、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、心筋細胞、又は骨格筋細胞）、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞又はリンパ管内皮細胞）、及び上皮細胞（例えば、肺胞上皮細胞、口腔上皮細胞、胆管上皮細胞、腸上皮細胞、膵管上皮細胞、腎上皮細胞、腎尿細管上皮細胞又は胎盤上皮細胞）、及び任意のこれらの細胞に分化できる細胞（例えば、前駆細胞、間葉系幹細胞、又は多能性幹細胞）からなる群から選択された２種の細胞である。
【０１２１】
第１の細胞又は第２の細胞として用いることができる多能性幹細胞の例は、胚性幹細胞（ＥＳ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）、胚性生殖細胞（ＥＧ）、胚性癌細胞（ＥＣ）、多能性成体前駆細胞（ＭＡＰ）、成体多能性幹細胞（ＡＰＳ）、及びミューズ細胞（Ｍｕｓｅ細胞）；を含む。本開示に係る製造方法の工程（Ｂ）において、目的とする体細胞へと分化を誘導する分化誘導因子が培地に添加され、それにより多能性幹細胞が体細胞に分化される。
【０１２２】
本開示に係る製造方法において、第１の細胞及び第２の細胞とは異なる種類の細胞（「第３細胞」といい、１種でも、複数種でもよい）が、第１の細胞又は第２の細胞の少なくとも１つと共培養されてもよい。共培養の結果、第１の細胞又は第２の細胞だけでなく、第３細胞を含む細胞層がハニカム膜の一方の面又は両面に形成される。例示的な組み合わせにおいて、第１の細胞は実質細胞であり、第２の細胞は間質細胞であり、第３細胞は神経細胞である。
【０１２３】
本開示に係る製造方法において、模倣しようとする生体内の組織によって第１の細胞と第２の細胞の組み合わせを選択でき、必要に応じて第３細胞が選択され、これにより、生体内の組織を模倣する組織モデルが得られる。本開示に係る製造方法の一例において、第１の細胞は平滑筋細胞又は平滑筋細胞に分化する細胞であり、第２の細胞は血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞である。本開示に係る製造方法の別の例において、第１の細胞は間葉系幹細胞であり、第２の細胞は血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞である。本開示に係る製造方法は、血管内皮細胞層がハニカム膜の一方の面に配置され、平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層がハニカム膜の他方の面に配置される細胞積層体を提供、すなわち血管壁モデルを提供する。
【０１２４】
病態再現の目的で、遺伝子変異がある細胞又は患者由来の細胞を、第１の細胞又は第２の細胞の少なくとも１つとして用いる。
【０１２５】
細胞懸濁液の調製又は細胞培養に用いる液体培養培地は、対象となる細胞腫によって選択される。特定培養培地の例は、哺乳動物細胞用の基本培地に細胞成長因子を添加して細胞腫に最適化した培養培地、例えば、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ダルベッコ変性イーグル培地：栄養素混合物Ｆ−１２（ＤＭＥＭ：Ｆ−１２）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、最小必須培地アルファ（ＭＥＭα）、又は基本培地イーグル（ＢＭＥ）を含む。これらの培養培地は、市販されている。液体培養培地は、共培養しようとする細胞腫によって２種以上の培養培地を混合して得られた培養培地であってもよい。液体培養培地のｐＨは、例えば７．０〜８．０である。液体培養培地は、細胞を自重によって重力方向に移動させるようにする比重及び粘度を有する。
実施例
【０１２６】
以下に、本開示の実施態様について実施例を参照して説明する。しかしながら、本開示の実施態様は、これらの実施例に限定されない。
【０１２７】
下記の説明において、物質の濃度に関連して使用される「Ｍ」はモル濃度を意味し、１Ｍは１ｍｏｌ／Ｌである。
【０１２８】
下記実施例で使用される化学物質の略語は、次のとおりである。
ＥＧＭ：内皮細胞成長培地
ＦＩＴＣ：フルオレセインイソチオシアネート
ＨＢＳＳ：ハンク緩衝塩溶液
ＨＣＭ：ハニカム膜
ＨＵＡＳＭＣ：ヒト臍帯動脈平滑筋細胞
ＨＵＶＥＣ：ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＴＥＭ：トラック−エッチドメンブレン
【０１２９】
実施例１
［材料］
・２４ウェルプレート：懸濁培養品質（＃６６２−１０２、グライナー）
・ＴＥＭインサート：２４ウェル・ハンギング・インサート、トラック−エッチドメンブレン（ポアサイズ：５．７μｍ、厚さ：１０．６μｍ、及び開口率：１２．４％、ポリエチレンテレフタレート、図７）（＃ＭＣＭＰ２４Ｈ４８、ミリポア）
・ＨＣＭインサート：２４ウェル・ハンギング・インサート、ハニカム膜（ポアサイズ：５．０μｍ、厚さ：２．２μｍ、及び開口率：５５％、ポリブタジエン、図７）
・コーティングタンパク質：フィブロネクチン（＃３３０１６−０１５、インビトロゼン）
【０１３０】
［細胞］
・血管内皮細胞：ＨＵＶＥＣ（＃Ｃ２５１７ＡＳ、Ｌｏｎｚａ）
・平滑筋細胞：ＨＵＡＳＭＣ（＃Ｃ−１２５００、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）
【０１３１】
［細胞培養培地及び剥離試薬］
・ＨＵＶＥＣ用ＥＧＭ−２（＃ＣＣ−３１６２、Ｌｏｎｚａ）
・ＨＵＡＳＭＣ用平滑筋細胞成長培地２キット（＃Ｃ−２２１６２、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）
・アキュターゼ（ＡＴ１０４−５００、  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
【０１３２】
［ＨＣＭの滅菌］
（１）７０％（ｖ／ｖ）エタノールを１枚の２４ウェルプレートのウェルに５００μｌ／ウェルの量で添加し、ＰＢＳを２枚の他の２４ウェルプレートのウェルに５００μｌ／ウェルの量で添加した。これとは別に、７０％（ｖ／ｖ）を添加したカップを準備した。
（２）ＨＣＭインサートをカップ内のエタノールに浸漬させた後、ＨＣＭインサートをＨＣＭがエタノールに浸漬されるようにエタノールを含むウェルに入れ、ＨＣＭインサートを５分間静置した。
（３）ＨＣＭインサートをエタノールから取り出し、吸引器を用いてそれぞれのＨＣＭインサートの内側からエタノールを除去した。ＨＣＭインサートをすぐにＰＢＳを含むウェルに移送してＨＣＭがＰＢＳに浸漬されるように置いた。これに１ｍｌのＰＢＳを添加した。
（４）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、吸引器を用いてそれぞれのＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去した。ＨＣＭインサートをすぐにＰＢＳを含むウェルに移送してこれらのＨＣＭがＰＢＳに浸漬されるように置いた。これに１ｍｌのＰＢＳを添加した。
（５）ＰＢＳに浸漬されるＨＣＭインサートを真空乾燥器に入れて、ＨＣＭを脱気した。
（６）ＨＣＭインサートを顕微鏡で観察して、ＨＣＭインサートに破損、付着物及びＨＣＭしわがないことを確認した。
【０１３３】
［ＨＣＭのフィブロネクチンコーティング］
（１）フィブロネクチンをＰＢＳに溶解して３０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン溶液を調製した。
（２）７０μｌのフィブロネクチン溶液を２４ウェルプレートのウェルの中心部にスポットした。
（３）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、吸引器を用いてそれぞれのＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去し、ＨＣＭインサートをすぐにウェルのフィブロネクチン溶液スポットに載せてＨＣＭをフィブロネクチン溶液に浸漬した。
（４）１００μｌのフィブロネクチン溶液をそれぞれのＨＣＭインサートの内側に添加して、室温で１時間静置した（又は４℃で一晩静置した）。
【０１３４】
［ＨＣＭインサートを用いた細胞培養］
（１）ＨＵＡＳＭＣの細胞懸濁液８０μｌを２４ウェルプレートのウェルの中心部にドーム状に置いた。
（２）コーティングされたＨＣＭインサートをそれぞれＨＵＡＳＭＣの細胞懸濁液の上に置いて、細胞懸濁液をウェルの底面とＨＣＭとにより挟み込んだ。
（３）細胞懸濁液をウェルの底面とＨＣＭとにより挟み込んだ状態で、プレートとＨＣＭインサートの上下を反転させた。反転させた状態のプレートとＨＣＭインサートとをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、１６時間培養した。
（４）１２００μｌの平滑筋細胞成長培地２キットを各ＨＣＭインサートの外側に添加した。プレートとＨＣＭインサートをインキュベーターから取り出し、プレートとＨＣＭインサートの配向を初期配向に戻し、ＨＣＭインサートを培養培地を含むウェルへ移送した。その後、ＨＵＶＥＣの細胞懸濁液３００μｌを各ＨＣＭインサートの内側に播種した。
（５）プレートとＨＣＭインサートをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、８０時間培養した。
【０１３５】
各タイプの細胞に対する播種条件は次のとおりであった。
ＨＵＡＳＭＣ：培養面積は０．７８５ｃｍ２であり、播種密度は１．０×１０４細胞／ｃｍ２であり、細胞懸濁液の体積は８０μｌであった。
ＨＵＶＥＣ：培養面積は０．３２ｃｍ２であり、播種密度は５．０×１０４細胞／ｃｍ２であり、細胞懸濁液の体積は３００μｌであった。
【０１３６】
前記培養の結果、血管内皮細胞層がフィルターの上面に提供され、平滑筋細胞層がフィルターの下面に提供されたＨＣＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」ともいう）が得られた。ＣＤ３１に対して免疫蛍光染色した上面の細胞層、及びα−平滑筋アクチンに対して免疫蛍光染色した下面の細胞層を図８に示した。
【０１３７】
前記手順と同様の方式で、血管内皮細胞層がフィルターの上面に提供され、細胞層がフィルターの下面には提供されていないＨＣＭインサート（「ＶＥＣ−ＨＣＭインサート」ともいう）、及び平滑筋細胞層がフィルターの下面に提供され、細胞層がフィルターの上面には提供されていないＨＣＭインサート（「ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」ともいう）が調製された。
【０１３８】
［ＴＥＭインサートを用いた細胞培養］
ＴＥＭインサートを上下反転して置いた状態で、ＨＵＡＳＭＣをそれらのフィルターに播種し、ＴＥＭインサートをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、１６時間培養した。次に、ＴＥＭインサートを２４ウェルプレートのウェルに入れ、ＨＵＶＥＣを各ＴＥＭインサートの内側に播種し、１２００μｌの平滑筋細胞成長培地２キットを各ＴＥＭインサートの外側に添加した。次に、ＴＥＭインサートをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、８０時間培養した。
【０１３９】
ＴＥＭインサートへの細胞の播種条件は、ＨＣＭインサートへの細胞の播種条件と同一である。
【０１４０】
前記培養の結果、血管内皮細胞層がフィルターの上面に提供され、平滑筋細胞層がフィルターの下面に提供されたＴＥＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＴＥＭインサートともいう）が得られた。
【０１４１】
前記手順と同様の方式で、血管内皮細胞層がフィルターの上面に提供され、細胞層がフィルターの下面には提供されていないＴＥＭインサート（「ＶＥＣ−ＴＥＭインサート」ともいう）、及び平滑筋細胞層がフィルターの下面に提供され、細胞層がフィルターの上面には提供されていないＴＥＭインサート（「ＳＭＣ−ＴＥＭインサート」ともいう）が調製された。
【０１４２】
［透過性検定］
（１）２ｍｇのＦＩＴＣ−デキストラン７０（７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を８ｍｌのＨＢＳＳ（＋）（０８４−０８９６５、和光純薬）に溶解し、２５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を製造した。ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を遮光条件下で保管した。
（２）９００μｌ／ウェルのＨＢＳＳ（＋）を２４ウェルプレートの第１の〜第３カラムの各ウェルに添加した。
（３）細胞積層体を有するインサートを培養培地から取り出し、吸引器を用いて各インサートの内側から培養培地を除去した。インサートを第１のカラムのウェルに入れた。
（４）２００μｌのＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を第１のカラムのウェルにある各インサートの内側に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（５）インサートを第２のカラムのウェルに移送し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（６）インサートを第３のカラムのウェルに移送し、プレートにアルミニウムシートを被せて遮光した。
（７）第１の及び第２のカラムのウェルのサンプル液をそれぞれピペットで混合し、１００μｌのサンプル液をそれぞれのウェルからとって９６ウェルブラックプレートに移送した。９６ウェルブラックプレートにアルミニウムシートを被せて遮光した。
（８）各サンプル液におけるＦＩＴＣの蛍光強度をプレートリーダー（ＥＮＳＰＩＲＥ、パーキンエルマー）を用いて励起波長（Ｅｘ）：４８５ｎｍ、放出波長（Ｅｍ）：５３０ｎｍ及び閃光回数：６０回にして測定した。
【０１４３】
第１のカラムのウェルのサンプル液におけるＦＩＴＣの相対蛍光強度（すなわち、ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液の添加から１０分以内に漏れ出たＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対量）を図９に示した。図９におけるグラフは、フィルターのいずれかの片面に細胞層がないインサートにおける蛍光強度を標準とした相対蛍光強度を示す。
【０１４４】
ＴＥＭインサートの場合、ＶＥＣ−ＴＥＭインサートは３．０±０．５％（ｎ＝５）の相対強度を示し、ＳＭＣ−ＴＥＭインサートは８．２±２．９％（ｎ＝５）の相対強度を示し、ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＴＥＭインサートは０．４±０．２％（ｎ＝５）の相対強度を示した。平滑筋細胞層は一般的に、あまりタイトな細胞間結合を有さないにもかかわらず、ＳＭＣ−ＴＥＭインサートの相対蛍光強度は前記の値であった。したがって、その結果は、ＴＥＭ自体がＴＥＭインサートでＦＩＴＣ−デキストラン７０に対してバリア機能を行うことを示していると推測される。
【０１４５】
ＨＣＭインサートの場合、ＶＥＣ−ＨＣＭインサートは１９．３±１０．２％（ｎ＝５）の相対強度を示し、ＳＭＣ−ＨＣＭインサートは６７．４±６．１％（ｎ＝５）の相対強度を示し、ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサートは０．４±０．３％（ｎ＝５）の相対強度を示した。ＦＩＴＣ−デキストラン７０に対するバリア機能は、ＨＣＭの一方の面に血管内皮細胞層を形成し、ＨＣＭの他方の面に平滑筋細胞層を形成することで得られた。
【０１４６】
［ヒスタミンによる透過性検定］
（１）２ｍｇのＦＩＴＣ−デキストラン７０（７０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ）を８ｍｌのＨＢＳＳ（＋）（０８４−０８９６５、和光純薬）に溶解し、２５０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を調製した。ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を遮光条件下で保存した。ヒスタミンをＨＢＳＳ（＋）に溶解してヒスタミン溶液を調製した。
（２）９００μｌ／ウェルのＨＢＳＳ（＋）を２４ウェルプレートの第１の〜第３カラムの各ウェルに添加した。
（３）細胞積層体を有するインサートを培養培地から取り出し、吸引器を用いて各インサートの内側から培養培地を除去した。インサートを第１のカラムのウェルに入れた。
（４）ヒスタミン溶液を１０μＭ又は１００μＭの最終濃度でウェルに添加して、１２０分間インキュベートした。
（５）２００μｌのＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を第１のカラムのウェルにある各インサートの内側に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（６）インサートを第２のカラムのウェルに移送し、３７℃で１０分間インキュベートした。
（７）インサートを第３カラムのウェルに移送し、プレートにアルミニウムシートを被せて遮光した。
（８）第１の及び第２のカラムのウェルのサンプル液をそれぞれピペットで混合し、１００μｌのサンプル液をそれぞれのウェルから取り９６ウェルブラックプレートに移送した。９６ウェルブラックプレートにアルミニウムシートを被せて遮光した。
（９）各サンプル液におけるＦＩＴＣの蛍光強度を、プレートリーダー（ＥＮＳＰＩＲＥ、パーキンエルマー）を用いて励起波長（Ｅｘ）：４８５ｎｍ、及び放出波長（Ｅｍ）：５３０ｎｍにして測定した。
【０１４７】
第１のカラムのウェルのサンプル液におけるＦＩＴＣの相対蛍光強度（すなわち、ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液の添加から１０分以内に漏れ出たＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対量）を図１０に示した。図１０におけるグラフは、フィルターのいずれかの面に細胞層がないインサートにおける蛍光強度を標準とした相対蛍光強度を示す。
【０１４８】
ヒスタミンは、血管内皮細胞の物質透過性を増進させる活性を有する。ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサートは、ヒスタミンの濃度に依存するＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の増加を示した。また、結果はＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサートが生体内の血管壁と類似した機能を有することを証明した。また、結果は被検物質が血管壁に及ぼす影響をＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサートを用いて高感度で評価することができることを証明した。
【０１４９】
実施例２
［材料］
・２４ウェルプレート：懸濁培養品質（＃６６２−１０２、グライナー）
・ＨＣＭインサート：ハニカム構造を有する多孔性膜がフィルター部に提供される２４ウェル・ハンギング・インサート（多孔性膜はポアサイズ：３．０μｍ、厚さ：１．２μｍ、及び開口率：５５％であり、ハンギング・インサートはポリカーボネート材質である）。
・ＨＣＭ用コーティング物質：ラット尾由来のコラーゲンＩ（＃３５４２３６、コーニング）
【０１５０】
［細胞］
・血管内皮細胞：ラット血管内皮細胞（＃ｃＡＰ−ｒ０００１、Ａｎｇｉｏｐｒｏｔｅｏｍｉｅ）
・平滑筋細胞：ラット平滑筋細胞（＃Ｒ−ＡＳＭ−５８０、Ｌｏｎｚａ）
【０１５１】
［液体培養培地及び細胞剥離試薬］
・ラット血管内皮細胞用のラット内皮細胞成長培地（＃ｃＡＰ−０３、ｃＡＰ−０４、Ａｎｇｉｏｐｒｏｔｅｏｍｉｅ）
・ＤＥＭＥＭ：ラット平滑筋細胞用Ｆ−１２（１：１）培養培地（＃ＢＥ０４−６８７Ｑ、Ｌｏｎｚａ）
・アキュターゼ（ＡＴ１０４−５００、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
【０１５２】
［ＨＣＭの滅菌］
ＨＣＭの滅菌は、実施例１と同様の方法で行った。
【０１５３】
［ＨＣＭのコラーゲンコーティング］
（１）コラーゲンＩを０．２Ｎの酢酸溶液に溶解して５０μｇ／ｍｌのコラーゲンＩ溶液を調製した。
（２）７０μｌのコラーゲンＩ溶液を、２４ウェルプレートのウェルの中心部にスポットした。
（３）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、吸引器を用いてそれぞれのＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去し、ＨＣＭインサートをすぐにウェルのコラーゲンＩ溶液スポットに載せてＨＣＭをコラーゲンＩ溶液に浸漬した。
（４）１００μｌのコラーゲンＩ溶液をそれぞれのＨＣＭインサートの内側に添加して、室温で４時間静置した（又は４℃で一晩静置した）。
（５）５００μｌのＰＢＳを添加してＨＣＭを中和した。
【０１５４】
［ＨＣＭインサートを利用した細胞培養（細胞積層体の調製）］
（１）ラット平滑筋細胞の細胞懸濁液８０μｌを２４ウェルプレートのウェルの中心部にドーム状に置いた。
（２）コーティングされたＨＣＭインサートをそれぞれラット平滑筋細胞の細胞懸濁液の上に置いて、細胞懸濁液をウェルの底面とＨＣＭとにより挟み込んだ。
（３）細胞懸濁液をウェルの底面とＨＣＭとにより挟み込んだ状態で、プレートとＨＣＭインサートの上下を反転させた。反転させた状態のプレートとＨＣＭインサートとをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、１６時間培養した。
（４）１２００μｌのラット内皮細胞成長培地を各ＨＣＭインサートの外側に添加した。プレートとＨＣＭインサートをインキュベーターから取り出し、プレートとＨＣＭインサートの配向を初期配向に戻し、ＨＣＭインサートを培養培地を含むウェルへ移送した。その後、ラット血管内皮細胞の細胞懸濁液３００μｌを各ＨＣＭインサートの内側に播種した。
（５）プレートとＨＣＭインサートをインキュベーターに入れて（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２）、８０時間培養した。
【０１５５】
各タイプの細胞に対する播種条件は、次のとおりであった。
ラット平滑筋細胞：培養面積は０．７８５ｃｍ２であり、播種密度は１．０×１０４細胞／ｃｍ２であり、細胞懸濁液の体積は８０μｌであった。
ラット血管内皮細胞：培養面積は０．３２ｃｍ２であり、播種密度は５．０×１０４細胞／ｃｍ２であり、細胞懸濁液の体積は３００μｌであった。
【０１５６】
前記培養の結果、血管内皮細胞層がフィルターの上面に提供され、平滑筋細胞層がフィルターの下面に提供されたＨＣＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」ともいう）が得られた。図１１に、ＶＥ−カドヘリンに対して免疫蛍光染色した上面の細胞層、及びカルポニンに対して免疫蛍光染色した下面の細胞層を示した。
【０１５７】
図１１に示したように、融合性（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）細胞層の形成及び血管内皮カドヘリンの局所化が明確に観察された。血管内皮カドヘリンの局所化は、血管内皮細胞間の強力な接着力（細胞間結合の形成）を示し、実際の血管の特徴である。したがって、ＨＣＭの一側に血管内皮細胞層を形成しＨＣＭの他側に平滑筋細胞層を形成することで、生体組織と類似した構造を有する細胞積層体が調製された。
【０１５８】
［生理活性物質に対する反応の評価］
（１）０．１ｍｇ（１００単位）のトロンビン（＃Ｔ７００９−１００ＵＮ、Ｓｉｇｍａ）を１００μｌの生理食塩水に溶解してトロンビン溶液を１０００Ｕ／ｍＬの濃度で調製した。トロンビン溶液をＨＢＳＳ（＋）で希釈して２５Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液及び１００Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液を調製した。
（２）９００μｌのＨＢＳＳ（＋）を２４ウェルプレートの各ウェルに添加した。
（３）細胞積層体が提供されたインサートを培養培地から取り出し、吸引器を用いてそれぞれのインサートの内側から培養培地を除去し、インサートをウェルに配置した。
（４）ＨＢＳＳ（＋）（対照群）、２５Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液、又は１００Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液を２００μＬの量で、ウェルに配置した各インサートの内側に添加し、インサートを３７℃で３０分間インキュベートした。
（５）細胞積層体を顕微鏡で観察した。細胞積層体の顕微鏡写真を図１２に示し、これはＶＥ−カドヘリンからの赤色蛍光とα−平滑筋アクチンからの緑色蛍光の重畳画像である。
【０１５９】
図１２に示したように、トロンビンの添加によるアクチンストレスファイバーの活性化に起因した細胞収縮が観察された。図１２の上段の矢印で示す方向に細胞収縮が生じたことが観察された。トロンビン濃度が高いほど、細胞収縮の度合いも強かった。したがって、ＨＣＭの一側に血管内皮細胞層及びＨＣＭの他側に平滑筋細胞層を有する細胞積層体は、生体組織と同様に生理活性物質に反応することが確認された。
【０１６０】
２０１７年６月９日に出願された米国特許出願第１５／６１８１５０号の開示内容がすべて参照により本願に組み込まれる。
本明細書で言及されたすべての刊行物、特許出願、及び技術規格は、個々の刊行物、特許出願、又は技術規格が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に記載された場合と同程度に、本願に参照により組み込まれる。
【図１】
2020521461.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020521461.tif 000012
【図８】
2020521461.tif 000013
【図９】
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【図１０】
2020521461.tif 000015
【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月25日(2019.11.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；
液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び
第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される細胞積層体、を含み、
細胞積層体は、ハニカム構造を有する多孔性膜、第１のタイプの細胞を含み、多孔性膜の一方の面に配置される細胞層、及び第１のタイプとは異なる第２のタイプの細胞を含み、多孔性膜の他方の面に配置される細胞層を含む生体組織モデル装置。
【請求項２】
第１のタイプの細胞及び第２のタイプの細胞は、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、グリア細胞、内皮細胞及び上皮細胞からなる群から選択された２つのタイプの細胞である請求項１に記載の生体組織モデル装置。
【請求項３】
多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項１または請求項２に記載の生体組織モデル装置。
【請求項４】
多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の生体組織モデル装置。
【請求項５】
多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の生体組織モデル装置。
【請求項６】
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の生体組織モデル装置を使用する被検物質の評価方法。
【請求項７】
工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む請求項６に記載の被検物質の評価方法。
【請求項８】
被検物質が添加された液体区画にトレーサーを添加することをさらに含み、トレーサーが添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たトレーサーの量を測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する請求項６に記載の被検物質の評価方法。
【請求項９】
ハニカム構造を有する多孔性膜；
多孔性膜の一方の面に配置された血管内皮細胞層；及び
多孔性膜の他方の面に配置された平滑筋細胞層或いは間葉系幹細胞層
を含む血管壁モデル。
【請求項１０】
血管壁モデルにおける血管内皮細胞層側から平滑筋細胞層側又は間葉系幹細胞層側へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性が、多孔性膜の一方の面から多孔性膜の他方の面へのＦＩＴＣ−デキストラン７０の透過性の０％〜１０％である請求項９に記載の血管壁モデル。
【請求項１１】
多孔性膜の材料は、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリ（セバシン酸グリセロール）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミン、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリシロキサン誘導体及びトリアセチルセルロースからなる群から選択された少なくとも１つを含む請求項９または請求項１０に記載の血管壁モデル。
【請求項１２】
多孔性膜の各表面は、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テナシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス、組み換えペプチド及びポリリジンからなる群から選択された少なくとも１つにより被覆される請求項９〜請求項１１のいずれか１項に記載の血管壁モデル。
【請求項１３】
多孔性膜における貫通孔の開口の平均直径は１μｍ〜２０μｍであり、多孔性膜の開口率は３０％〜７０％である請求項９〜請求項１２のいずれか１項に記載の血管壁モデル。
【請求項１４】
液体組成物が貯蔵される第１の液体区画；液体組成物が貯蔵される第２の液体区画；及び第１の液体区画と第２の液体区画との間の隔壁として、第１の液体区画と第２の液体区画との間に配置される請求項９〜請求項１３のいずれか１項に記載の血管壁モデルを含む血管壁モデル装置。
【請求項１５】
第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加すること；及び
（ｉ）第１の液体区画に含まれる化学物質、又は第１の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量すること、又は（ｉｉ）第２の液体区画に含まれる化学物質、又は第２の液体区画に含まれる細胞のうち少なくとも１つを定量することのうち少なくとも１つの工程
を含む請求項１４に記載の血管壁モデル装置を用いた被検物質の評価方法。
【請求項１６】
工程（ｉ）は、第１の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第１の液体区画に含まれるタンパク質、又は第１の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含み、工程（ｉｉ）は、第２の液体区画に含まれるｍｉＲＮＡ、第２の液体区画に含まれるタンパク質、又は第２の液体区画に含まれる転写因子の少なくとも１つを定量することを含む請求項１５に記載の被検物質の評価方法。
【請求項１７】
第１の液体区画又は第２の液体区画の１つは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画であり、第１の液体区画又は第２の液体区画の少なくとも１つに被検物質を添加することは、血液、赤血球を含む液体組成物、又は血液を模倣し、デキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つを含む液体組成物が貯蔵される液体区画に被検物質を添加することを含み、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出た赤血球の量、被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たヘモグロビンの量、又は被検物質が添加された液体区画から他の液体区画に漏れ出たデキストラン、エバンスブルー、フルオレセインナトリウム塩及びＦＩＴＣ−マイクロビーズからなる群から選択された少なくとも１つの量の少なくとも１つを測定することが、工程（ｉ）又は（ｉｉ）を構成する請求項１５に記載の被検物質の評価方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
開口直径Ｄａの変動係数は、２０％以下が好ましく、変動係数が小さいほどより好ましい。開口直径Ｄａの変動係数が小さいほど、ハニカム膜２０に配置された細胞層の均質性が高くなる。変動係数は、グループの標準偏差をグループの算術平均値で除することで求められる値であり、変動係数は、グループ内の変動の度合いの指標である。本開示では、変動係数は百分率で示す。
【国際調査報告】
2020521461.tif 000018