(57)【要約】複雑な不均一コミュニティの微生物株の解析、その機能的関連性及び相互作用の決定、ならびにそれに基づく診断及び生物学的状態の管理、のための方法、装置、及びシステムが開示される。治療（生物反応性の改変剤（合成微生物アンサンブルを含む生物反応性の改変剤など）など）を含めて、状態及び状態異常／状態逸脱の診断、解析、及び治療のための方法も開示される。【選択図】図１
2020507308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの試料セットを取得すること（各試料セットは、複数の生物学的試料を含み、前記少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットは、第１の状態にあると定義され、前記少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットは、第２の状態にあると定義され、前記第１の状態は、前記第２の状態とは異なる）、
各試料における複数の微生物型を検出すること、
前記複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、前記試料における前記検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数と、前記試料における前記特有の第１のマーカーの数及びその相対量と、に基づいて決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、
前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してベースライン状態を定義すること（前記ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在もしくは不在または特定の存在量もしくは活性を含む）、
状態が不明な少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記少なくとも１つの追加の試料は、生物学的試料源に由来する生物学的試料である）、
前記少なくとも１つの追加の試料について、
１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、
検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の数及び前記特有の第１のマーカーの量からそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態とを比較することで、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する状態を決定すること、
前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態を出力／表示すること、
前記決定された状態が前記ベースライン状態と実質的に異なるのであれば、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態に基づいて前記生物学的試料源に対する治療を決定すること、ならびに
前記生物学的試料源に前記治療を施すこと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記治療が、生物反応性の改変剤であり、前記生物反応性の改変剤が、合成微生物アンサンブルを含み、前記方法が、
前記ベースライン状態と、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態と、に基づいて１つまたは複数の活性微生物株を選択すること、ならびに
前記１つまたは複数の活性微生物株を担体媒体と組み合わせて前記合成微生物アンサンブルを形成させること（前記合成微生物アンサンブルは、前記生物学的試料源に投与されると、前記ベースライン状態に向かって前記生物学的試料源の状態を変化させるように構成される）、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
少なくとも１つの共通パラメータを共有する少なくとも２つの試料を取得すること（前記少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つは、第１の状態にあると定義され、前記少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つは、第２の状態にあると定義され、前記第２の状態は、前記第１の状態とは異なる）、
各試料について、前記試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、
前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の総数を決定すること、
各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の総数及び前記特有の第１のマーカーの相対数から、各試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記第１の状態に由来する前記少なくとも１つの試料についての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記第２の状態に由来する前記少なくとも１つの試料についての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、を比較することで、ベースライン状態を定義／決定すること（前記ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在もしくは不在または特定の存在量もしくは活性によって定義される）、
少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記追加の試料の状態は不明である）、
前記少なくとも１つの追加の試料について、
１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、
前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、
特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の数及び前記特有の第１のマーカーの数から、それぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態とを比較することで、前記少なくとも１つの追加の試料の状態を決定すること、
前記少なくとも１つの追加の試料の前記決定された状態を出力／表示すること、
を含む、方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの追加の試料の前記決定された状態が、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する環境の状態に対応する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記環境に対する治療を決定することをさらに含み、前記治療が、前記ベースラインに向かって前記環境の前記状態を変化させるように構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記環境に対する治療を決定することをさらに含み、前記治療が、現在の状態から遠ざかるように前記環境の前記状態を変化させるように構成される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
治療が、管理またはライフスタイルを変更すること含む、請求項５または請求項６の１項に記載の方法。
【請求項８】
治療が、飼料成分または給餌レジメンを変えることを含む請求項５または請求項６の１項に記載の方法。
【請求項９】
治療が、薬物の投与または治療法の実施を含む、請求項５または請求項６の１項に記載の方法。
【請求項１０】
治療が、医学的介入を含む、請求項５または請求項６の１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの追加の試料に基づいて前記ベースライン状態を更新することをさらに含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、または請求項１０の１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ベースライン状態を定義することが、特定の微生物株の閾値を定義することを含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、または請求項１１の１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ベースライン状態を定義することが、一群の微生物株の閾値を定義することを含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、または請求項１１の１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ベースライン状態を定義することが、教師あり機械学習を含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、または請求項１３の１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ベースライン状態を定義することが、教師なし機械学習を含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、または請求項１３の１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態との比較が、特定の微生物株の相対量を決定することを含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、または請求項１５の１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態との比較が、微生物株の特定の群の相対量を決定することを含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、または請求項１５の１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態との比較が、次元削減マトリックス、非類似度マトリックス、距離マトリックス、または共分散マトリックスのうちの少なくとも１つを利用することを含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、または請求項１７の１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態との比較が、教師あり機械学習を含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、または請求項１８の１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態との比較が、教師なし機械学習を含む、請求項３、請求項４、請求項５、請求項６、請求項７、請求項８、請求項９、請求項１０、請求項１１、請求項１２、請求項１３、請求項１４、請求項１５、請求項１６、請求項１７、または請求項１８の１項に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも２つの試料セットを取得すること（各試料セットは、複数の試料を含み、前記少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットは、第１の状態にあると定義され、前記少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットは、第２の状態にあると定義され、前記第１の状態は、前記第２の状態とは異なる）、
各試料における複数の微生物型を検出すること、
前記複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、前記試料における前記検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数と、前記試料における前記特有の第１のマーカーの数及びその相対量と、に基づいて決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、
前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも２つの試料セットの各試料についての前記活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してベースライン状態を定義すること（前記ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在もしくは不在または特定の存在量もしくは活性を含む）、
状態が不明な少なくとも１つの追加の試料を取得すること、
前記少なくとも１つの追加の試料について、
１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、
検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、
特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、
前記それぞれの微生物型の数及び前記特有の第１のマーカーの量からそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態とを比較することで、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する状態を決定すること、ならびに
前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態を出力／表示すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記ベースライン状態と、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態と、に基づいて複数の活性微生物株を選択すること、ならびに
前記選択された複数の活性微生物株を担体媒体と組み合わせて活性微生物の合成アンサンブルを形成させること（前記合成アンサンブルは、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する環境に導入されると、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記環境の状態を改変するように構成される）、
をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
特有の第１のマーカー及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
特有の第１のマーカー及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すことを含む、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含む、請求項２１、請求項２２、請求項２３、または請求項２４の１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含む、請求項２１、請求項２２、請求項２３、または請求項２４の１項に記載の方法。
【請求項２７】
特有の第１のマーカーの測定が、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーを測定することを含む、請求項２１、請求項２２、請求項２３、または請求項２４の１項に記載の方法。
【請求項２８】
特有の第１のマーカーの測定が、各試料における特有のＲＮＡマーカーを測定することを含む、請求項２１、請求項２２、請求項２３、または請求項２４の１項に記載の方法。
【請求項２９】
特有の第１のマーカーの測定が、各試料における特有のタンパク質マーカーを測定することを含む、請求項２１、請求項２２、請求項２３、または請求項２４の１項に記載の方法。
【請求項３０】
それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定が、前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む、請求項２１〜２９の１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、試料ｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供すことを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
プロセッサによって実施される方法であって、前記方法が、
複数の試料の試料データを受け取るること（前記試料データは、検出された微生物型のリスト及び各試料における検出されたそれぞれの微生物型の対応する絶対細胞数と、特有の第１のマーカーデータ（前記特有の第１のマーカーデータは、各試料における検出されたそれぞれの微生物型の微生物株の相対量を含む）と、特有の第２のマーカーデータ（前記特有の第２のマーカーデータは、各試料におけるそれぞれの微生物株の活性情報を含む）と、を含む）、
前記試料データに基づいて各試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を、１つまたは複数のプロセッサを使用して得ること、
前記活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を、前記１つまたは複数のプロセッサを使用して処理することで、ベースライン状態を特定すること（前記ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在もしくは不在または特定の存在量もしくは活性と関連する）、
状態が不明な少なくとも１つの追加の試料の追加のデータを受け取ること（前記少なくとも１つの追加の試料の前記追加のデータは、検出された微生物型のリスト及び前記少なくとも１つの追加の試料における検出されたそれぞれの微生物型の対応する絶対細胞数と、特有の第１のマーカーデータ（前記特有の第１のマーカーデータは、前記少なくとも１つの追加の試料における検出されたそれぞれの微生物型の微生物株の相対量を含む）と、特有の第２のマーカーデータ（前記特有の第２のマーカーデータは、前記少なくとも１つの追加の試料におけるそれぞれの微生物株の活性情報を含む）と、を含む）、
前記少なくとも１つの追加の試料の前記追加のデータに基づいて前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株の追加のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を、前記１つまたは複数のプロセッサを使用して得ること、
前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株の追加のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数と前記ベースライン状態とを比較する解析に基づいて前記少なくとも１つの追加の試料の状態を、前記１つまたは複数のプロセッサを使用して決定すること、ならびに
前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態を、前記１つまたは複数のプロセッサを使用して表示すること、
を含む、前記方法。
【請求項３５】
前記決定された状態が前記ベースライン状態と実質的に異なるのであれば、前記少なくとも１つの追加の試料と関連する前記決定された状態に基づいて、少なくとも１つの処置を、前記１つまたは複数のプロセッサを使用して表示することをさらに含み、前記少なくとも１つの処置が、前記少なくとも１つの追加の試料の前記状態を調節するための処置である、請求項３４に記載の、プロセッサによって実施される方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月２８日出願の米国仮特許出願第６２／４３９，８０４号の優先権及び利益を主張すると共に、本出願は、２０１７年９月１８日出願の米国仮特許出願第６２／５６０，１７４号の優先権及び利益も主張し、前述の出願（複数可）は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、著作権、マスクワーク、及び／または他の知的財産保護の対象となる材料を含み得る。そのような知的財産のそれぞれの所有者は、本開示が特許庁のファイル／記録に公開される通りに任意の者が本開示を複製する分には意義は唱えないが、その他の場合は、すべての権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
微生物は、コミュニティとして天然に共存しており、さまざまな相互作用に関与する結果、個々のコミュニティメンバーの間では協働も競合も生じる。微生物生態学が進歩したことで、ほとんどのコミュニティには種の多様性及び複雑性が高いレベルで存在することが明らかとなっている。微生物は、環境中の至る所に存在し、生物圏内の多様な生態系に生息している。個々の微生物及びそのそれぞれのコミュニティは、海洋部（深海と海洋表層との両方）、土壌、ならびに動物組織（ヒト組織を含む）などの環境において特有の役割を担っている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、複雑な不均一コミュニティの微生物株の解析、その機能的関連性及び相互作用の決定、ならびにそれに基づく診断及び生物学的状態の管理、のための方法、装置、及びシステムを対象とする。合成微生物アンサンブルを含む治療を含めて、状態ならびに状態異常及び状態逸脱の診断、解析、及び治療のための方法も開示される。
【０００５】
本開示の１つの態様では、診断方法が開示される。方法は、少なくとも１つの共通環境パラメータ（試料型、試料位置、試料時期など）を共有する少なくとも２つの試料を取得することを含み得る。少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つを第１の状態にあると定義することができ、少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つを第２の状態にあると定義することができ、第２の状態は、第１の状態とは異なる。例えば、１つの実施形態では、少なくとも２つの状態のうちの１つは、健康な状態であるか、または健康な試料源（例えば、１つもしくは複数の望ましい特徴もしくはメタデータを有する試料源）と関連する状態であり、その他の状態は、不健康／病的な状態であるか、または不健康／病的な試料源（例えば、１つもしくは複数の望ましくない特徴もしくはメタデータを有する試料源であり、場合によっては、特に、健康な試料源の対応する特徴（複数可）もしくはメタデータと比較すると望ましくない特徴もしくはメタデータを１つもしくは複数有する試料源）と関連する状態である。各試料について、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数が決定される。
【０００６】
各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数／それぞれの数に基づいて、各試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数が決定される。次に、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが測定され、その微生物株の活性レベルが決定される（例えば、特定の活性閾値を上回る特有の第２のマーカーに基づいて決定される）。実施態様に応じて、活性レベルは、数的、相対的、及び／または二項的（例えば、活性／不活性）であり得る。決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。第１の状態に由来する少なくとも１つの試料についての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、第２の状態に由来する少なくとも１つの試料についての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、を比較または処理することで、ベースライン状態（例えば、健康な状態または正常な状態）を定義または決定することができる。ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在または不在によって定義または特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の試料を取得することを、含むか、またはさらに含み、追加の試料の状態は不明である。次に、少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数が決定される。特有の第１のマーカー及びその量が決定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から、それぞれの微生物株の絶対細胞数が決定される。少なくとも１つの特有の第２のマーカーが、特定した閾値に基づいてそれぞれの微生物株に使用されることで、その微生物株の活性レベルが決定される。決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。次に、少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数とベースライン状態とが比較されることで、少なくとも１つの追加の試料の状態（例えば、健康または不健康、正常または異常など）が決定される。次に、少なくとも１つの追加の試料の決定された状態が出力及び／または表示される（例えば、表示画面またはグラフィカルインターフェースに出力及び／または表示される）。
【０００７】
いくつかの別の実施形態によれば、少なくとも１つの追加の試料の決定された状態は、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境の状態に対応する。実施態様に応じて、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境には、地理空間環境が含まれ得、こうした地理空間環境は、野原または牧草地、飼料の環境または源（例えば、穀物サイロ）、標的とする動物及び／または群れなどである。少なくとも１つの追加の試料と関連する環境に対する治療を解明または決定することができる。ベースラインが健康または同様のものである実施形態では、ベースラインに向かって環境の状態を変化させるように治療を構成することができる。いくつかの実施形態では、所望の目標または有利な結果と関連する状態に向かって環境の状態を変化させるように治療を構成することができる。治療は、合成アンサンブル（特に、本開示の方法に従って形成される合成アンサンブル）、化学的／生物学的な治療もしくは薬剤、治療レジメン、これらの治療の２つ以上の組み合わせ、及び／または同様のものを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の試料に基づいてベースライン状態を更新することができる。
【０００８】
本開示の別の態様では、分析方法が開示される。そのような方法は、少なくとも２つの試料セットを取得することを含み得、各試料セットは、複数の試料を含む。いくつかの実施態様では、少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットを第１の状態にあると定義することができ、少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットを第２の状態にあると定義することができ、第１の状態は、第２の状態とは異なり、試料セットにおける試料の範囲は、試料セットに対応する状態の範囲に対応する。他の実施態様では、試料セット内の試料は、それぞれの状態にあると定義されるか、または状態の決定もしくは定義は、分析後に行われる。方法は、次に、各試料における複数の微生物型を検出すること、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、ならびに各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、を含む。方法は、次に、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、ならびにそれぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、を含む。次に、少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。方法は、少なくとも２つの試料セットの各試料及び／またはそれぞれの試料についての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してベースライン状態を定義することを含む。ベースライン状態は、いくつかの実施形態では、特定した分類群及び／または株の存在または不在によって定義及び／または特徴付けることができる。
【０００９】
次に、状態が不明な少なくとも１つの追加の試料が取得される。少なくとも１つの追加の試料について、方法は、（１）１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、（２）検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、（３）特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、（４）それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から、それぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、（５）それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定してその微生物株の活性レベルを決定すること、ならびに（６）決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む。少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数とベースライン状態とを比較することで、少なくとも１つの追加の試料と関連する状態が決定され、少なくとも１つの追加の試料と関連する決定された状態が表示または出力される。
【００１０】
方法は、ベースライン状態と、少なくとも１つの追加の試料と関連する決定された状態と、に基づいて複数の活性微生物株を選択すること、ならびに選択された複数の活性微生物株を担体媒体と組み合わせて活性微生物の合成アンサンブルを形成させること、をさらに含み得、この合成アンサンブルは、この合成アンサンブルが、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境に導入されると、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境の状態を改変するように構成される。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、複数の試料から活性微生物を同定し、同定された微生物を少なくとも１つのメタデータと共に解析し、解析に基づいて微生物のアンサンブルを創出するための方法が開示される。障害もしくは望ましくない状態に対する治療において、及び／または生物学的状態の変化（例えば、疾患状態から健康な状態もしくはベースライン状態への変化、またはベースラインもしくは正常な状態から生産的な状態または増進した状態への変化）のために、アンサンブルを使用することができる。方法の実施形態は、試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定することを含み、１つまたは複数の活性微生物株は、試料における微生物コミュニティに存在する。１つまたは複数の微生物株は、微生物型の亜分類群（ｓｕｂｔａｘｏｎ）であり得る。本明細書で提供される方法において使用される試料は、任意の環境起源のものであり得る。例えば、１つの実施形態では、試料は、動物、土壌（例えば、バルク土壌もしくは根圏）、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、植物、食品もしくは飲料（例えば、チーズ、ビール、ワイン、パン、もしくは他の発酵食品）、または極限環境に由来する。別の実施形態では、動物試料は、血液、組織、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、消化管、ルーメン、筋肉、脳、組織、または器官の試料である。１つの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法が提供される。方法は、状態／生物学的状態の定義、及び／または試料（及び対応する試料源）の状態を決定するための解析、のために使用することもできる。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、標的生物学的環境の特性及び／または生物学的状態を変えるように構成された活性微生物株のバイオアンサンブルの形成方法が提供される。そのような方法は、少なくとも１つの共通環境パラメータ（試料型、試料時期、試料位置、試料源型など）を共有する少なくとも２つの試料（または試料セット）を取得すること、及び各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、を含み得る。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が決定され（例えば、非限定的な例として、本明細書で議論される染色手順、細胞選別／ＦＡＣＳなど）、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定される。少なくとも１つの特有の第２のマーカーは、活性（例えば、代謝活性）の指標であり、それぞれの微生物株について測定されることで各試料における活性微生物株が決定され、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数が解析されることで、それぞれの活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータ、各試料の測定メタデータ、及び／または試料セット（複数可）の測定メタデータと、の関連性が明らかにされる。解析に基づいて複数の活性微生物株が選択され、担体媒体と組み合わせられることで、活性微生物のバイオアンサンブルが形成され、この活性微生物のバイオアンサンブルは、このバイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると、その標的生物学的環境の少なくとも１つの特性（少なくとも１つのメタデータに対応するもの）を変えるように構成されている。実施形態に応じて、メタデータは、唯一の環境パラメータまたは任意の１つの環境パラメータであり得、試料または試料セットにわたって同一または比較的類似したものであり、異なる試料または試料セットにわたって異なる値を有し得る。例えば、乳牛のメタデータは、摂食及び乳産生量を含み得、摂食メタデータ値は同一であり得る（すなわち、乳牛には、同一の飼料が与えられる）一方で、乳産生量／乳組成は異なり得る（すなわち、１頭の乳牛に由来する試料または特定の乳牛群に由来する試料セットは、第２の乳牛に由来する試料または別の乳牛群の試料セットに対応する乳産生量／乳組成とは異なる平均乳産生量／平均乳組成を有する）。いくつかの実施形態では、１つの試料セットを利用して生物学的状態（ベースライン状態など）を定義することができる。
【００１３】
本開示のいくつかの実施形態によれば、微生物コミュニティを解析するための診断方法及び方法が提供される。そのような方法は、少なくとも２つの試料（または少なくとも２つの試料のデータ）を取得すること（各試料は、不均一微生物コミュニティを含む）、及び各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、を含み得る。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が決定される（例えば、本明細書で議論されるＦＡＣＳまたは他の方法を介して決定される）。各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値（活性、濃度、発現など）が測定され（特有の第２のマーカーは、被検出微生物型の特定の微生物株の活性（例えば、代謝活性）の指標である）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値に基づいて（例えば、特定のセット閾値を上回る値に基づいて）それぞれの検出微生物株の活性が決定される。各試料におけるそれぞれの活性な検出微生物株のそれぞれの比率が決定される（例えば、それぞれの絶対細胞数、値などに基づいて決定される）。次に、少なくとも２つの試料の活性な検出微生物株（またはそのサブセット）のそれぞれが解析されることで、それぞれの活性な検出微生物株とその他の活性な検出微生物株との間、ならびにそれぞれの活性な検出微生物株と少なくとも１つの測定メタデータとの間、の関連性及びその強度が明らかにされる。次に、明らかにされた関連性は、表示またはその他の形で出力され、生物学的状態の定義及び／またはバイオアンサンブルの生成に利用することができる。いくつかの実施形態では、ある特定の強度または重みを上回る関連性のみが表示される。本開示を通じて詳細に示されるように、開示の解析に基づく生物学的状態または状態は、解析及び治療の目的のために定義することができ、バイオアンサンブルは、標的環境に導入されると、バイオアンサンブルが標的環境の生物学的状態または特性（具体的には、測定メタデータと関連する特性）を変更または変えることができるように構成することができる。
【００１４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、方法は、複数の試料における複数の微生物型の存在を検出すること、及び各試料における検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、を含む。各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定することができ、特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値またはレベルが測定され、特有の第２のマーカーは、特定の微生物株の代謝活性の指標である。測定値または測定レベルに基づいて、各試料について検出された微生物株のそれぞれの活性が決定または定義される（例えば、特定した閾値を上回る測定値または測定レベルに基づいて決定または定義される）。試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の加重値または細胞補正値が決定される（この加重値または細胞補正値は、相対存在量ではない）。いくつかの実施態様では、加重値または細胞補正値は、すべての株のすべての絶対細胞数の総和に対する１つの株の絶対細胞数である。
【００１５】
各試料（または試料セット）の活性な検出微生物株のそれぞれが解析される。解析は、加重値を有するそれぞれの活性な検出微生物株と加重値を有する他のあらゆる活性微生物株との間、ならびに加重値を有するそれぞれの活性微生物株と１つまたは複数の測定メタデータとの間、の関連性及びその強度を明らかにすることを含み得る。
【００１６】
明らかにされた関連性（ならびにいくつかの実施形態では、加重値及び強度などの関連データ）は、生物学的状態（ベースライン状態など）を定義するために使用することができ、及び／または次に、表示またはその他の形で出力することができ、合成アンサンブルの生成及び／または生物学的状態の管理に利用することができる。いくつかの実施形態では、それぞれのメタデータについて明らかにされた関連性が表示または出力される。いくつかの実施形態では、表示または出力された関連性によって、疾患またはベースライン状態からの逸脱の原因となる状態（複数可）及び／または１つもしくは複数の微生物株が同定されるか、あるいはその同定が容易になるように当該関連性が構成される。いくつかの実施形態では、表示または出力された関連性によって、生物学的状態の改変及び／または疾患もしくは障害の治療のために１つまたは複数の微生物株が同定されるか、あるいはその同定が容易になるように当該関連性が構成される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ある特定の強度または重みを上回る関連性（例えば、特定した閾値または基準値を上回るもの）のみが表示または出力される。本開示を通じて詳細に示されるように、合成アンサンブルは、標的環境に導入されると、合成アンサンブルが生物学的状態を改変し、及び／または標的環境の特性（具体的には、測定メタデータと関連する特性）を変更もしくは変えることができるように構成することができる。いくつかの実施態様では、上記の方法を使用することで、生物学的状態を改変するか、または生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを形成させることができ、当該方法は、複数の環境パラメータをそれぞれが有する２つ以上の試料セットに基づいており、複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータは、２つ以上の試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータは、２つ以上の試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータである。いくつかの実施態様では、各試料セットは、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含む。いくつかの実施態様では、活性微生物株の少なくとも１つは、１つまたは複数の微生物型の亜分類群である。
【００１８】
本開示のいくつかの実施形態では、１つまたは複数の微生物型は、１つまたは複数の細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせである。１つの実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせである。別の実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の真菌種または真菌亜種である。別の実施形態では、１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の細菌種または細菌亜種である。さらに別の実施形態では、試料は、ルーメン試料である。いくつかの実施形態では、ルーメン試料は、ウシに由来する。いくつかの実施形態では、試料は、消化管試料である。いくつかの実施形態では、消化管試料は、ブタまたはニワトリに由来する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、方法は、試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定することを含み、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、試料における１つまたは複数の微生物型のそれぞれの絶対数が決定される。そのような実施形態を使用することで、生物学的状態、または事前に定義されたベースライン状態からの逸脱を決定することができる。特有の第１のマーカーの数が、特有の第１のマーカーのそれぞれの相対量と共に測定される。本明細書に記載のように、特有の第１のマーカーは、特有の微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現のレベルを測定することによって、例えばタンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで、活性を評価することができる。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なり得、生物株の活性のマーカーである。特有の第２のマーカーの１つまたは複数の発現レベルに基づいて、（存在するのであれば）どの１つまたは複数の微生物株が活性であるかが決定される。１つの実施形態では、微生物株は、特有の第２のマーカーを、閾値レベルで発現するか、または閾値レベルを上回る割合で発現するのであれば、活性であると見なされる。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の活性微生物株の１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の微生物型の絶対数と、に基づいて決定される。
【００２０】
１つの実施形態では、試料における１つまたは複数の生物型のそれぞれの数の決定は、核酸シークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、またはフローサイトメトリーに、試料またはその一部を供すことを含む。
【００２１】
１つの実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のＲＮＡマーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有のタンパク質マーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、特有の代謝物マーカーの数の測定を含む。別の実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の糖質マーカー、特有の脂質マーカー、またはそれらの組み合わせ、の数の測定を含む。
【００２２】
別の実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む。特有の第１のマーカーの測定は、１つの実施形態では、マーカーに特異的な反応を含み、この反応は、例えば、特有の第１のマーカーに特異的なプライマーを用いて実施される。別の実施形態では、メタゲノム手法が採られる。
【００２３】
１つの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、試料におけるＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡ）を発現解析に供すことを含む。別の実施形態では、遺伝子発現解析は、シークエンシング反応を含む。さらに別の実施形態では、ＲＮＡ発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、試料における特有の第２のマーカーの数の測定は、特有のタンパク質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の第２のマーカーの数の測定は、特有の代謝物マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の糖質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、試料における特有の代謝物マーカーの数の測定は、特有の脂質マーカーの数の測定を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数は、複数の試料において測定される。複数の試料の絶対細胞数を使用することで、状態もしくは生物学的状態（ベースライン状態など）を定義することができ、及び／または事前に定義された生物学的状態（ベースライン状態など）から試料源が逸脱しているかどうかの決定に使用することができる。別の実施形態では、複数の試料は、同一の環境または同様の環境から取得される。いくつかの実施形態では、複数の試料は、複数の時点で取得される。例えば、生物学的状態の管理では、特定の環境または標的（動物など）を対象として複数の試料を経時的に取得することで、動物の生物学的状態を監視及び管理し、治療、サプリメントなどを与えて、ベースライン状態もしくは他の所望の生物学的状態に向かうように標的を誘導するか、またはそれを標的が保持するようにすることができる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーのレベルの測定は、試料またはその一部を質量分析に供すことを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供すことを含む。
【００２６】
本開示の別の態様では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法では、複数の試料で決定がなされ、絶対細胞数レベルは、１つまたは複数のメタデータ（例えば、環境）パラメータに関連付けられる。１つまたは複数のメタデータパラメータに絶対細胞数レベルを関連付けることは、１つの実施形態では、共出現測定、相互情報量測定、連鎖解析、及び／または同様のものを含む。１つの実施形態では、１つまたは複数のメタデータパラメータは、第２の活性微生物株の存在である。したがって、この方法の実施形態の１つでは、微生物コミュニティにおける１つまたは複数の活性微生物株と環境パラメータとの共出現を決定するために絶対細胞数値が使用される。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数レベルは、微生物コミュニティの取得源である環境の環境パラメータ（摂食条件、ｐＨ、栄養素、または温度など）に関連付けられる。
【００２７】
この態様では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の環境パラメータに関連付けられる。環境パラメータは、試料自体のパラメータであり得、例えば、ｐＨ、温度、試料におけるタンパク質量、コミュニティにおける他の微生物の存在である。１つの実施形態では、パラメータは、試料の取得源である宿主の特定のゲノム配列（例えば、特定の遺伝子変異）である。あるいは、環境パラメータは、微生物コミュニティの独自性の変化に影響を与えるパラメータであるか（すなわち、微生物コミュニティの「独自性」は、コミュニティにおける微生物株の型及び／または特定の微生物株の数によって特徴付けられる）、あるいは微生物コミュニティの独自性の変化によって影響を受けるパラメータである。例えば、１つの実施形態では、環境パラメータは、動物の食物摂取量であるか、あるいは泌乳反芻動物によって産生する乳汁の量（または乳汁のタンパク質もしくは脂肪の含量）である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、環境パラメータは、メタデータパラメータと称される。
【００２８】
１つの実施形態では、試料における１つまたは複数の活性微生物株の共出現の決定は、１つまたは複数の環境パラメータと活性微生物株との関連性を示すリンケージがまとまったマトリックスを創出することを含む。
【００２９】
１つの実施形態では、１つまたは複数の活性生物株とメタデータパラメータとの共出現の決定は、ネットワーク内の株の連結度を測定するためのネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法を含み、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析及び／またはネットワーク解析方法は、グラフ理論、種コミュニティルール、固有ベクトル／モジュラリティマトリックス、ガンビット・オブ・ザ・グループ（Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ）、及び／またはネットワーク測定、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施態様では、ネットワーク測定は、観測マトリックス、時間集合（ｔｉｍｅ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）ネットワーク、階層的クラスター解析、ノード−レベル特徴量、及び／またはネットワークレベル特徴量、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、ノード−レベル特徴量は、次数、強度、媒介中心性、固有ベクトル中心性、ページランク、及び／または到達性（ｒｅａｃｈ）、のうちの１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、ネットワークレベル特徴量は、密度、同類性／次数相関、及び／または推移性、のうちの１つまたは複数を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、クラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【００３１】
解析に基づいて、株関連性を表示もしくはその他の形で出力することができ、及び／または微生物アンサンブルに含めるための１つもしくは複数の活性な関連株が同定される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】いくつかの実施形態による、状態の決定及び診断の高レベル処理フローの例を示す。
【図１Ａ】複雑な不均一コミュニティに由来する微生物株をスクリーニング及び解析し、その機能的関連性及び相互作用を予測し、それに基づいて微生物アンサンブルを選択及び合成するための高レベル処理フローの、いくつかの実施形態による例を示す。
【図１Ｂ】１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための、いくつかの実施形態による一般的な処理フローを示す。
【図１Ｃ】微生物コミュニティを解析し、型／株−メタデータの関連性を決定し、表示し、バイオアンサンブルを生成するための、いくつかの実施形態による処理フローを示す。
【図１Ｄ】解析された株及び関連性を視覚的に出力した、いくつかの実施形態による例を示す。
【図１Ｅ】いくつかの実施形態による、ルーメン細菌及び乳脂肪効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図１Ｆ】いくつかの実施形態による、ルーメン真菌及び乳脂肪効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図１Ｇ】いくつかの実施形態による、ルーメン細菌及び乳効率（Ｄａｉｒｙ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）に対するＭＩＣスsコアの分布を示す。
【図１Ｈ】いくつかの実施形態による、ルーメン真菌及び乳効率に対するＭＩＣスコアの分布を示す。
【図２】試料（複数可）における１つまたは複数の活性微生物株と、１つまたは複数のメタデータ（環境）パラメータと、の共出現を決定する、いくつかの実施形態による一般的な処理フローを示す。
【図３Ａ】微生物の相互作用解析及び選択を行うシステム３００の、いくつかの実施形態による例を示す模式図である。図３Ｂは、そのようなシステムで使用するための処理フローの例である。天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択することで、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連指標を変えることになる微生物のアンサンブル、集合物、または他の合成集団を形成するためのシステム及び処理が、図３Ａ及び図３Ｂと関連して記載される。
【図３Ｂ】図３Ａのようなシステムで使用するための処理フローの例である。天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定し、活性微生物を同定し、複数の活性微生物を選択することで、特定のパラメータ（複数可）及び／または関連指標を変えることになる微生物のアンサンブル、集合物、または他の合成集団を形成するためのシステム及び処理が、図３Ａ及び図３Ｂと関連して記載される。
【図３Ｃ】本開示のいくつかの態様を示すデータの例を示す。
【図３Ｄ】本開示のいくつかの態様を示すデータの例を示す。
【図４】乳牛における乳脂肪の産生に影響を与えるルーメン微生物コミュニティ構成要素を決定するための実験の過程にわたって産生した乳脂肪のポンドが非線形性を有することを示す。
【図５】標的株Ａｓｃｕｓ＿７１３の、活性でフィルタリングした絶対細胞数と、産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、の相関を示す。
【図６】標的株Ａｓｃｕｓ＿７の、活性でフィルタリングした絶対細胞数と、実験過程にわたって産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、を示す。
【図７】標的株Ａｓｃｕｓ＿３０３８の、活性でフィルタリングしていない相対的な量または存在量と、産生した乳脂肪のポンド（ｌｂ）と、の相関を示す。
【図８】開示の方法に従って調製した微生物アンサンブルを乳牛に投与した実地試験の結果を示す。図８Ａは、産生した乳脂肪の平均ポンド数を経時的に示す。図８Ｂは、産生した乳タンパク質の平均ポンド数を経時的に示す。図８Ｃは、産生したエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）の平均ポンド数を経時的に示す。
【図９】本開示の実施形態に基づくトリ試験の結果を示す。
【図１０】本開示の実施形態に基づくウマ試験の結果を示す。
【図１１】本開示のいくつかの実施形態による診断プラットフォームワークフロー例の概観を示す。
【図１２−１】Ａ〜Ｄはウマの状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態を示す。
【図１２−２】Ａ〜Ｄはウマの状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態を示す。
【図１２−３】Ａ〜Ｄはウマの状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態を示す。
【図１３】Ａ〜Ｂは乳牛の状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態の例を示す。
【図１４Ａ】乳牛の状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態の例を示す。
【図１４Ｂ】乳牛の状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態の例を示す。
【図１４Ｃ】乳牛の状態の同定及び微生物に対する洞察に関する本開示の実施形態の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
多くの異なる型の生態系ならびに地球の生物地球化学における環境プロセス（例えば、栄養素の循環及び炭素の固定によるもの）にとって微生物コミュニティは中心をなすものである（Ｆａｌｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１，ｐｐ．２３７−２４０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、コミュニティが複雑であり、いずれの所与の微生物コミュニティも、そのメンバーのほとんどが培養不可能であるという理由で、こうしたプロセスの分子的及び生態学的な詳細ならびに影響因子に関する理解は依然として不十分なままである。
【００３４】
微生物コミュニティは、定性的及び定量的に組成が異なることから、それぞれの微生物コミュニティは特有のものであり、その組成は、それが存在する所与の生態系及び／または環境に依存する。微生物コミュニティメンバーの絶対細胞数は、コミュニティが存在する環境の変化、ならびに微生物によって引き起こされる生理学的及び代謝的な変化（例えば、細胞分裂、タンパク質発現など）によって影響を受ける。環境パラメータ及び／またはコミュニティ内の１つの活性微生物の量が変化すると、コミュニティのその他の微生物、ならびにコミュニティが見られる生態系及び／または環境に対して広範囲に影響が及び得る。こうした微生物コミュニティにおける変化を理解し、予測し、それに対処するには、試料における活性微生物及びそれぞれのコミュニティにおける活性微生物の数を同定することが必要である。しかしながら、これまでのところ、微生物コミュニティメンバーの試験は、絶対細胞数ではなく、特定の微生物コミュニティにおける微生物の比率に焦点を当てているものが圧倒的多数を占めている（Ｓｅｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，ｐ．６６６（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００３５】
例えばハイスループットシークエンシング手法を使用すれば、微生物コミュニティの組成を容易に決定できるものの、それぞれのコミュニティがどのように構築されて維持されるかということの理解を深めることが必要である。
【００３６】
微生物コミュニティは、生物地球化学的な必須要素の循環（例えば、炭素、酸素、窒素、硫黄、リン、及びさまざまな金属の循環）などの非常に重要なプロセスに関与しており、それぞれのコミュニティの構造、相互作用、及び動態は、生物圏の存在にとって非常に重要である（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．ｍＢｉｏ  ６（１）：ｅ０２２８８−１４．Ｄｏｉ：１０．１１２８／ｍＢｉｏ．０２２８８−１４（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。そのようなコミュニティは、高度に不均一であり、細菌、ウイルス、古細菌、及び他のマイクロ真核生物（真菌など）の複雑な混合物を含むことがほとんど常である。ヒト環境（腸及び膣など）における微生物コミュニティの不均一性レベルは、疾患（炎症性腸疾患及び細菌性膣炎など）と関連している（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。しかしながら、注目すべきことに、健康な個体でさえ、そのような環境において組織を占める微生物が顕著に異なるのである（Ｎａｔｕｒｅ（２０１２）．Ｖｏ．４８６，ｐ．２０７）。
【００３７】
微生物の多くが、培養不可能であるか、あるいは培養に困難／費用が伴い得るものであるため、培養に依存しない手法（核酸シークエンシングなど）によって、さまざまな微生物コミュニティの多様性に関する理解が進んできた。コミュニティの微生物多様性の研究に対する基礎的な手法といえば、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ  ｒＲＮＡまたは１６ｓ  ｒＲＮＡ）遺伝子を増幅及びシークエンシングするものであった。こうした手法は、この遺伝子が普遍的に存在し、進化速度が比較的一定であることに部分的には基づくものである。ハイスループット法が進歩したことで、メタゲノミクス解析がもたらされており、この解析では、微生物の全ゲノムがシークエンシングされる。そのような方法では、コミュニティの事前知識は必要なく、新たな微生物株を発見することが可能となる。メタゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、メタプロテオミクス、及びメタボロミクスはすべて、コミュニティを探索して構造及び機能を識別することを可能にするものである。
【００３８】
コミュニティにおける微生物を分類するだけでなく、どのメンバーが活性であるかということ、そうした生物の数、ならびに微生物コミュニティメンバー（複数可）が互いに共出現すること、及び微生物コミュニティメンバー（複数可）と環境パラメータ（複数可）とが共出現すること（例えば、コミュニティの環境のある特定の変化に応じてコミュニティに２つの微生物が共出現すること）も読み解く能力があれば、微生物コミュニティ内の微生物の独自性（及びそのそれぞれの数）に対するそれぞれの環境因子（例えば、気候、栄養素の存在、環境ｐＨ）の重要性、ならびにコミュニティが存在する環境に対するある特定のコミュニティメンバーの重要性を理解することが可能になると想定される。本開示は、こうしたもの及び他のニーズに対処するものである。
【００３９】
本明細書で使用される「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という単数形は、別に文脈上明確に示されない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「生物型」という用語は、単一の生物型または複数の生物型を意味することが意図される。別の例では、「環境パラメータ」という用語は、単一の環境パラメータまたは複数の環境パラメータを意味し得、その結果、「ａ」または「ａｎ」という不定冠詞は、存在する環境パラメータが１つまたは１つのみであるという解釈が文脈上必要にならない限り、複数の環境パラメータが存在する可能性を除外するものではない。
【００４０】
本明細書を通じて、「１つの実施形態」、「実施形態」、「１つの態様」、または「態様」、「１つの実施態様」、または「実施態様」に対する言及は、その実施形態と関連して記載される特定の特性、構造、または特徴が本開示の実施形態の少なくとも１つに含まれることを意味する。したがって、「１つの実施形態では」または「実施形態では」という語句が本明細書を通じてさまざまな箇所で登場するが、こうしたもののうちの必ずしもすべてが、同一の実施形態に言及しているというわけではない。さらに、特定の特性、構造、または特徴は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な様式で組み合わせることができる。
【００４１】
特定の実施形態では、本明細書で使用される「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、それが数値を修飾するとき、その値±１０％の範囲を意味する。値の範囲が与えられる場合、別に文脈上明確に示されない限り、その範囲の上限値と下限値との間に存在する、下限値の１０分の１の単位までの各介在値と、その記載範囲の任意の他の記載値または介在値と、が本開示に包含されると理解される。こうしたより小さな範囲の上限値及び下限値は、そのより小さな範囲に独立して含まれ得るものであり、こうした上限値及び下限値もまた、本開示に包含され、記載範囲において具体的に除外される任意の限界値の対象にもなる。記載範囲が限界値の一方または両方を含む場合、そうした含まれる限界値のどちらか一方または両方を除外した範囲もまた、本開示に含まれる。
【００４２】
本明細書で使用される「単離する」、「単離された」、「単離された微生物」、及び同様の用語は、１つまたは複数の微生物が、特定の環境（例えば、土壌、水、動物組織）においてそれと関連する材料の少なくとも１つから分離されていることを意味することが意図される。したがって、「単離された微生物」は、それが天然に生じる環境に存在するのではなく、本明細書に記載のさまざまな手法が適用されることで、その微生物がその天然の環境から取り出されており、天然には生じない存在状態とされている。したがって、単離された株は、例えば、生物学的に純粋な培養物として存在するか、または許容可能な担体と結び付いた胞子（もしくはその株の他の形態）として存在し得る。
【００４３】
本明細書で使用される「生物反応性の改変剤（ｂｉｏｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｏｒ）」は、本開示の方法、システム、及び／または装置によって明らかにされる組成物（１つまたは複数の活性微生物を含む微生物アンサンブルなど）であって、天然に生じる環境には天然に存在せず、及び／または天然には一貫して見られず、及び／または天然物には存在しない比率、割合、及び／または量を有する組成物を指す。例えば、生物反応性の改変剤（微生物アンサンブル（合成アンサンブルもしくはバイオアンサンブルとも称される）など）または生物反応性の改変剤の集合物は、同定もしくは生成された化合物／組成物、及び／または１つもしくは複数の単離された微生物株から、適切な媒体または担体と共に形成させることが可能である。生物反応性の改変剤は、標的に適用または投与することができ、こうした標的は、標的環境、標的集団、標的個体、標的動物、及び／または同様のものなどである。
【００４４】
いくつかの実施形態では、本開示による生物反応性の改変剤（微生物アンサンブルなど）は、相互に関連する個々の活性微生物種または種の活性株、のセット、サブセット、及び／または群から選択され、及び／またはそれに基づいて選択される。関連性及びネットワークは、本開示の方法によって明らかにされ、１つまたは複数の共通機能の実施に基づいて群化、関連付け、及び／または関係付けられるものであるか、あるいは認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、またはそれを導くか、及び／またはそれと関連するものであると説明できる。いくつかの実施態様では、微生物アンサンブルの選択元の群、及び／または生物反応性の改変剤の選択元の群、及び／または生物反応性の改変剤（微生物アンサンブル自体など）は、微生物の種、微生物の種の株、または微生物の異なる種の株を２つ以上含み得る。場合によっては、微生物は、群、生物反応性の改変剤、及び／または微生物アンサンブルの中で共生的に共存することができる。
【００４５】
本開示のある特定の態様では、生物反応性の改変剤及び／または微生物アンサンブルは、単離された生物学的に純粋な培養物として存在する１つもしくは複数の単離された微生物であるか、またはそれに基づくものである。特定の微生物の単離された生物学的に純粋な培養物は、当該培養物が（科学的に理にかなうように）他の生物を実質的に含まず、問題の個々の微生物のみを含むことを意味することを理解されよう。培養物は、異なる濃度の当該微生物を含み得る。本開示では、単離された生物学的に純粋な微生物は、「必然的に、低純度または不純な材料とは異なる」ことが多いことに留意されたい。例えば、Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，４２７  Ｆ．２ｄ  １３９４，（ＣＣＰＡ１９７０）（精製プロスタグランジンについて議論されている）を参照のこと。Ｉｎ  ｒｅ  Ｂｅｒｇｙ，５９６  Ｆ．２ｄ  ９５２（ＣＣＰＡ１９７９）（精製微生物について議論されている）も併せて参照のこと。Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｈ．Ｋ．Ｍｕｌｆｏｒｄ  ＆  Ｃｏ．，１８９  Ｆ．９５（Ｓ．Ｄ．Ｎ．Ｙ．１９１１）（Ｌｅａｒｎｅｄ  Ｈａｎｄにより精製アドレナリンについて議論されている），ａｆｆ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，ｒｅｖ’ｄ  ｉｎ  ｐａｒｔ，１９６  Ｆ．４９６（２ｄ  Ｃｉｒ．１９１２）も併せて参照のこと。これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、いくつかの態様では、開示の微生物アンサンブルにおいて使用されるべき単離された生物学的に純粋な微生物培養物で達成されなくてはならないある特定の定量的な濃度指標または純度限界が本開示の実施の際に必要となり得る。こうした純度値の存在は、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法によって同定される微生物が、天然の状態で存在するそうした微生物と区別される追加属性である。例えば、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．ｖ．Ｏｌｉｎ  Ｍａｔｈｉｅｓｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，２５３  Ｆ．２ｄ  １５６（４ｔｈ  Ｃｉｒ．１９５８）（微生物によって産生するビタミンＢ１２の純度限界値について議論されている）を参照のこと。当該文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書で使用される「担体」、「許容可能な担体」、または「医薬担体」は、微生物アンサンブルと共に使用されるか、または微生物アンサンブルにおいて使用される希釈剤、補助剤、賦形剤、または媒体を指す。そのような担体は、水及び油（石油起源、動物起源、植物起源、または合成起源のものを含む）などの無菌の液体であり得、こうしたものは、ピーナッツ油、ダイズ油、ミネラル油、ゴマ油、及び同様のものなどである。好ましくは、水または水溶液、生理食塩水、ならびにデキストロース水溶液及びグリセロール水溶液が担体として利用され、いくつかの実施形態では、注射用液として利用される。あるいは、担体は、固体の剤形担体であり得、こうした固体の剤形担体には、限定はされないが、結合剤（圧縮丸剤用）、流動促進剤、封入剤、風味剤、及び着色剤のうちの１つまたは複数が含まれる。担体の選択は、意図される投与経路及び標準的な薬務に照らして実施することができる。Ｈａｒｄｅｅ  ａｎｄ  Ｂａｇｇｏ（１９９８．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ．５０４  ｐｇ．）、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（１９７０．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．１７ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、及びＢｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（米国公開ＵＳ２０１１０２８０８４０Ａ１）を参照のこと。これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる。
【００４７】
「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」及び「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」という用語は、本明細書で互換的に使用され、真正細菌ドメイン、真核生物ドメイン、または古細菌ドメインのものである任意の微生物を指す。微生物型には、限定はされないが、細菌（例えば、マイコプラズマ、球菌、桿菌、リケッチア、スピリルム）、真菌（例えば、糸状菌、酵母）、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス（例えば、バクテリオファージ）、ウイロイド、及び／またはそれらの組み合わせが含まれる。生物株は、生物型の亜分類群であり、例えば、特定の微生物の種、亜種、亜型、遺伝子変異体、病原型、または血清型であり得る。
【００４８】
本明細書で使用される「マーカー」または「特有のマーカー」という用語は、特有の微生物型、微生物株、または微生物株の活性の指標である。生物学的な試料においてマーカーを測定することができ、こうしたマーカーには、限定はされないが、核酸に基づくマーカー（リボソームＲＮＡ遺伝子など）、ペプチドもしくはタンパク質に基づくマーカー、及び／または代謝物もしくは他の小分子マーカーが含まれる。
【００４９】
本明細書で使用される「代謝物」という用語は、代謝中間体または代謝産物である。１つの実施形態では、代謝物は、小分子である。代謝物は、さまざまな機能を有しており、こうした機能には、燃料機能、構造機能、シグナル伝達機能、酵素に刺激作用及び阻害作用を及ぼす機能、酵素に対する補因子としての機能、防御機能、ならびに他の生物との相互作用機能（色素、匂い物質、及びフェロモンなど）が含まれる。一次代謝物は、正常な発育、発生、及び生殖に直接的に関与する。二次代謝物は、こうしたプロセスに直接的には関与しないが、通常、重要な生態学的機能を有する。代謝物の例には、限定はされないが、抗生物質及び色素（樹脂及びテルペンなど）などが含まれる。いくつかの抗生物質では、前駆物質として一次代謝物が使用され、例えば、アクチノマイシンは、一次代謝物であるトリプトファンから創出される。本明細書で使用される代謝物には、小さな親水性糖質、大きな疎水性脂質、及び複雑な天然化合物が含まれる。
【００５０】
本開示の実施形態には、診断方法が含まれる。図１に示されるように、そのような方法は、少なくとも２つの試料またはそれについてのデータを取得することを含み得（０１１）、少なくとも２つの試料は、少なくとも１つの共通環境パラメータ（試料型、試料位置、試料時期など）を共有する。少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つを第１の状態にあると定義することができ（０１３）、少なくとも２つの試料のうちの少なくとも１つを第２の状態にあると定義することができ（０１５）、第２の状態は、第１の状態とは異なる。例えば、１つの実施形態では、少なくとも２つの状態のうちの１つは、健康な状態であるか、または健康な試料源（例えば、１つもしくは複数の望ましい特徴もしくはメタデータを有する試料源）と関連する状態であり、その他の状態は、不健康／病的な状態であるか、または不健康／病的な試料源（例えば、１つもしくは複数の望ましくない特徴もしくはメタデータを有する試料源であり、場合によっては、特に、健康な試料源の対応する特徴（複数可）もしくはメタデータと比較すると望ましくない特徴もしくはメタデータを１つもしくは複数有する試料源）と関連する状態である。各試料について、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出され（０１７）、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数が決定される（０１９）。
【００５１】
次に、各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され（０２１）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数／それぞれの数に基づいて、各試料におけるそれぞれの微生物株の絶対細胞数が決定される（０２３）。次に、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが測定され（０２５）、その微生物株の活性レベルが決定される（０２７）（例えば、特定の活性閾値を上回る特有の第２のマーカーに基づいて決定される）。実施態様に応じて、活性レベルは、数的、相対的、及び／または二項的（例えば、活性／不活性）であり得る。決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで（０２９）、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。第１の状態に由来する少なくとも１つの試料についての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、第２の状態に由来する少なくとも１つの試料についての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、を比較または処理することで、ベースライン状態（例えば、健康な状態または正常な状態）を定義または決定することができる（０３１）。ベースライン状態は、特定した分類群及び／または株の存在または不在によって定義または特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの追加の試料を取得することを、含むか、またはさらに含み（０３３）、少なくとも１つの追加の試料の状態は不明である。次に、少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され（０３５）、１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数が決定される（０３７）。特有の第１のマーカー及びその量が決定され（０３９）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から、それぞれの微生物株の絶対細胞数が決定される（０４１）。少なくとも１つの特有の第２のマーカーが、特定した閾値に基づいてそれぞれの微生物株に使用されることで、その微生物株の活性レベルが決定される（０４３）。決定された活性レベルによってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで（０４５）、活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる（０４７）。次に、少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数とベースライン状態とが比較されることで、少なくとも１つの追加の試料の状態（例えば、健康または不健康、正常または異常など）が決定される（０４９）。次に、少なくとも１つの追加の試料の決定された状態が出力及び／または表示される（０５１）（例えば、表示画面またはグラフィカルインターフェースに出力及び／または表示される）。
【００５２】
いくかの別の実施形態によれば、少なくとも１つの追加の試料の決定された状態は、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境の状態に対応する。実施態様に応じて、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境には、地理空間環境が含まれ得、こうした地理空間環境は、野原または牧草地、飼料の環境または源（例えば、穀物サイロ）、標的とする動物及び／または群れなどである。少なくとも１つの追加の試料と関連する環境に対する治療を解明または決定することができる。ベースラインが健康または同様のものである実施形態では、ベースラインに向かって環境の状態を変化させるように治療を構成することができる。いくつかの実施形態では、所望の目標または有利な結果と関連する状態に向かって環境の状態を変化させるように治療を構成することができる。治療は、合成アンサンブル（特に、本開示の方法に従って形成される合成アンサンブル）、化学的／生物学的な治療もしくは薬剤、治療レジメン、これらの治療の２つ以上の組み合わせ、及び／または同様のものを含み得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の試料に基づいてベースライン状態を更新することができる。
【００５３】
本開示の別の態様では、分析方法が開示される。そのような方法は、少なくとも２つの試料セットを取得することを含み得、各試料セットは、複数の試料を含む。いくつかの実施態様では、少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットを第１の状態にあると定義することができ、少なくとも２つの試料セットのうちの少なくとも１つの試料セットを第２の状態にあると定義することができ、第１の状態は、第２の状態とは異なり、試料セットにおける試料の範囲は、試料セットに対応する状態の範囲に対応する。他の実施態様では、試料セット内の試料は、それぞれの状態にあると定義されるか、または状態の決定もしくは定義は、分析後に行われる。方法は、次に、各試料における複数の微生物型を検出すること、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数を決定すること、ならびに各試料における特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、を含む。いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカー及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、のうちの少なくとも１つを含む。特有の第１のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、リボソームＲＮＡマーカー、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの測定は、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーを測定すること、各試料における特有のＲＮＡマーカーを測定すること、及び／または各試料における特有のタンパク質マーカーを測定すること、のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの測定は、各試料における特有の代謝物マーカーの測定を含み、この測定は、各試料における特有の脂質マーカーを測定すること、及び／または各試料における特有の糖質マーカーを測定すること、のうちの少なくとも１つを含み得る。
【００５４】
方法は、次に、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を、その試料における検出されたそれぞれの微生物型の数と、その試料における特有の第１のマーカーの数及びその量と、に基づいて決定すること、ならびにそれぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して各試料における活性微生物株を決定すること、を含む。いくつかの実施形態では、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定は、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、試料ｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すこと、各試料もしくはその一部を質量分析に供すこと、及び／または各試料もしくはその一部をメタリボソームプロファイリングもしくはリボソームプロファイリングに供すこと、のうちの少なくとも１つを含む。
【００５５】
次に、少なくとも２つの試料セットの各試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。方法は、少なくとも２つの試料セットの各試料及び／またはそれぞれの試料についての活性微生物株及びそれぞれの絶対細胞数を解析してベースライン状態を定義することを含む。ベースライン状態は、いくつかの実施形態では、特定した分類群及び／または株の存在または不在によって定義及び／または特徴付けることができる。
【００５６】
次に、状態が不明な少なくとも１つの追加の試料が取得される。少なくとも１つの追加の試料について、方法は、（ａ）１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、（ｂ）検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、（ｃ）特有の第１のマーカー及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、（ｄ）それぞれの微生物型の数及び特有の第１のマーカーの数から、それぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、（ｅ）それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定してその微生物株の活性レベルを決定すること、ならびに（ｆ）決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む。少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のセット及びそのそれぞれの絶対細胞数とベースライン状態とを比較することで、少なくとも１つの追加の試料と関連する状態が決定され、少なくとも１つの追加の試料と関連する決定された状態が表示または出力される。一般に、単一の状態として議論されるが、いくつかの実施形態及び用途については、ベースライン状態または生物学的状態は、特定のマイクロバイオームと関連する複数の状態及び／または生物学的状態を指し得、特定の徴候の特徴付け、同定、及び／または治療（個体レベルまたは群れレベルに対するものかは問われない）において複数の状態も利用できることを理解されよう。
【００５７】
方法は、ベースライン状態と、少なくとも１つの追加の試料と関連する決定された状態と、に基づいて複数の活性微生物株を選択すること、ならびに選択された複数の活性微生物株を担体媒体と組み合わせて活性微生物の合成アンサンブルを形成させること、をさらに含み得、この合成アンサンブルは、この合成アンサンブルが、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境に導入されると、少なくとも１つの追加の試料と関連する環境の状態を改変するように構成される。
【００５８】
本開示の１つの態様では、複数の微生物株と、１つまたは複数のメタデータ及び／またはパラメータと、の間の関連性を明らかにするための方法が開示される。図１Ａに示されるように、試料及び／または少なくとも２つの試料の試料データが少なくとも２つの試料源から受け取られ（１０１）、各試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が決定され（１０３）、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数（細胞数）が決定され（１０５）、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が決定され（１０７）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである。それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ（１０９）、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルが決定され（１１１）、微生物株は、その株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると見なされる。次に、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる（１１３）。少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数のセットまたはリストのネットワーク解析が実施され（１１５）、ネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアの決定、ならびにそれぞれの活性微生物株と少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株との間の最大情報係数スコアの決定、を含む。次に、機能、予測される機能、及び／または化学に基づいて活性微生物株を分類することができ（１１７）、分類に基づいて複数の活性微生物株が同定及び出力される（１１９）。いくつかの実施形態では、方法は、同定された複数の微生物株から活性微生物アンサンブルを構築することをさらに含み（１２１）、微生物アンサンブルは、標的に適用されると、少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成される。方法は、出力された複数の同定活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含み得る（追加詳細については実施例４を参照のこと）。いくつかの実施形態では、複数の活性微生物株を利用することで、それが標的に適用されると、少なくとも１つの同定病原体に対処し、及び／または少なくとも１つの同定病原体と関連する症状を治療するように構成された活性微生物アンサンブルを構築することができる。
【００５９】
本開示の１つの態様では、１つまたは複数の試料における１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数を決定するための方法が提供され、１つまたは複数の活性微生物株は、試料における微生物コミュニティに存在する。１つまたは複数の微生物株は、１つまたは複数の生物型の亜分類群である（図１Ｂの方法１０００を参照のこと）。各試料について、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出される（１００１）。試料における１つまたは複数の生物型のそれぞれの絶対数が決定される（１００２）。特有の第１のマーカーの数が、特有の第１のマーカーのそれぞれの量と共に測定される（１００３）。本明細書に記載のように、特有の第１のマーカーは、特有の微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することによってタンパク質レベル及び／またはＲＮＡレベルで活性が評価される（１００４）。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なり得るものであり、生物株の活性のマーカーである。特有の第２のマーカーの１つまたは複数の発現レベルに基づいて、（存在するのであれば）どの微生物株が活性であるかが決定される（１００５）。微生物株は、特有の第２のマーカーを特定のレベルで発現するか、または閾値レベルを上回って（例えば、閾値レベルを少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、もしくは少なくとも約４０％上回って）発現するのであれば、活性であると見なされる（１００５）（特定の用途及び／または実施態様に基づいてさまざまな閾値を決定することができ、例えば、試料源（複数可）（特定の種など）、試料起源の位置、目的メタデータ、環境などによって閾値は異なり得ることを理解されよう）。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、１つまたは複数の活性微生物株の１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の生物型の絶対数と、に基づいて決定することができる。
【００６０】
本開示のいくつかの実施形態は、微生物コミュニティの解析向けに構成することができる。図１Ｃによって示されるように、２つ以上の試料（及び／または試料セット）のデータが取得され（１０５１）（各試料は、不均一微生物コミュニティを含む）、各試料における複数の微生物型が検出される（１０５３）。次に、複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の絶対細胞数が、例えば本明細書で議論されるＦＡＣＳまたは他の方法を介して、決定される（１０５５）。各試料における特有の第１のマーカー及びその量が測定され（１０５７）、特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである。１つまたは複数の特有の第２のマーカーの値（活性、濃度、発現など）が測定され（１０５９）（特有の第２のマーカーは、被検出微生物型の特定の微生物株の活性（例えば、代謝活性）の指標である）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値に基づいて（例えば、特定のセット閾値を上回る値に基づいて）それぞれの検出微生物株の活性が決定される（１０６１）。各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株のそれぞれの比率が、例えばそれぞれの絶対細胞数、値などに基づいて、決定される（１０６３）。次に、少なくとも２つの試料の活性な検出微生物株（またはそのサブセット）のそれぞれが解析されることで、それぞれの活性な検出微生物株とその他の活性な検出微生物株との間、ならびにそれぞれの活性な検出微生物株と少なくとも１つの測定メタデータとの間、の生物学的状態（ベースライン状態など）及び／または関連性及びその強度が明らかにされる（１０６５）。次に、明らかにされた生物学的状態及び／または関連性は、表示またはその他の形で出力され（１０６７）（例えば、グラフィカルディスプレイ／グラフィカルインターフェースで行われる）（例えば、図１Ｄ）、生物学的状態の管理及び／またはバイオアンサンブルの生成に利用することができる（１０６９）。いくつかの実施形態では、関連性の表示／出力は、ある特定の強度または重みを上回る関連性のみが表示されるように限定することができる（１０６６ａ、１０６６ｂ）。
【００６１】
本開示による微生物アンサンブルは、相互に関連する個々の活性微生物種または種の活性株、のセット、サブセット、及び／または群から選択することができる。関連性及びネットワークは、本開示の方法によって明らかにされ、１つまたは複数の共通機能の実施に基づいて群化及び／または関連付けられるものであるか、あるいは認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、またはそれを導くか、またはそれと関連するものであると説明できる。図１Ｄでは、Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出法を使用することで、乳牛関連のメタデータパラメータと関連する群を同定した。それぞれのノードは、特定のルーメン微生物株またはメタデータパラメータを示す。ノード間のリンクは、有意な関連性を示す。連結されていないノードは、関連しない微生物である。着色された「バブル」はそれぞれ、Ｌｏｕｖａｉｎ解析によって検出された群を示す。この群化によって、株の分類先である群に基づいて株の機能性を予測することが可能になる。
【００６２】
本開示のいくつかの実施形態は、相互情報量を活用することで、動物の消化管に生息する天然の微生物株の、特定の動物形質に対する重要性を順位付けするように構成される。すべての微生物及び所望の動物形質について最大情報係数（ＭＩＣ）が計算される。０〜１の段階で関連性がスコア付けされ、１は、微生物株と動物形質との間に強い関連性があることを示し、０は、関連性がないことを示す。このスコアに基づくカットオフを使用することで、特定の形質の改善に関して有用な微生物及び有用ではない微生物が定義される。図１Ｅ及び図１Ｆは、乳脂肪効率との関連性を共有するルーメン微生物株のＭＩＣスコア分布の例を示す。ここでは、指数関数から直線へと曲線がシフトする点（細菌については約０．４５〜０．５、真菌については約０．３）が、有用な微生物株と有用ではない微生物株との間のカットオフとなる。図１Ｇ及び図１Ｈは、乳効率との関連性を共有するルーメン微生物株のＭＩＣスコア分布の例を示す。指数関数から直線へと曲線がシフトする点（細菌については約０．４５〜０．５、真菌については約０．２５）が、有用な微生物株と有用ではない微生物株との間のカットオフとなる。
【００６３】
図２に示されるように、本開示の別の態様では、１つまたは複数の活性微生物の絶対細胞数が複数の試料において決定され、絶対細胞数は、メタデータ（環境パラメータ）に関連付けられる（２００１〜２００８）。１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数の解析に複数の試料が供され、１つまたは複数の活性微生物株は、複数の試料の少なくとも１つにおいて活性測定値が閾値レベルであるか、または閾値レベルを上回るのであれば、活性であると見なされる（２００１〜２００６）。次に、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数は、特定の実施態様及び／または用途のメタデータパラメータに関連付けられる（２００８）。
【００６４】
１つの実施形態では、複数の試料は、同一の環境源から経時的に取得される（例えば、同一の動物から経時的に取得される）。別の実施形態では、複数の試料は、複数の環境源（例えば、異なる動物）に由来する。１つの実施形態では、環境パラメータは、第２の活性微生物株の絶対細胞数である。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数値を使用することで、１つまたは複数の活性微生物株と微生物コミュニティの第２の活性微生物株との共出現が決定される。別の実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数及び／または第２の環境株の絶対細胞数に対して第２の環境パラメータが関連付けられる。
【００６５】
開示の実施形態の態様は、本開示を通じて議論される。
【００６６】
重要なことであるが、本明細書で提供される方法で使用するための試料は、微生物コミュニティを含む任意の型のものであり得る。例えば、本明細書で提供される方法で使用するための試料には、限定はされないが、動物試料（例えば、哺乳類、爬虫類、トリ）、土壌、空気、水（例えば、海洋、淡水、廃水汚泥）、堆積物、油、植物、農産物、植物、土壌（例えば、根圏）、食品（例えば、チーズ、ビール、ワイン、パン）、及び極限環境試料（例えば、酸性鉱山排水、熱水系）が含まれる。海洋試料または淡水試料の場合、試料は、水体の表面または水体の任意の深度に由来し得る（例えば、深海試料）。水試料は、１つの実施形態では、海洋、河川、または湖の試料である。
【００６７】
１つの実施形態は、動物試料は、体液である。別の実施形態では、動物試料は、組織試料である。動物試料には、限定はされないが、歯、汗、爪、皮膚、毛髪、糞便、尿、精液、粘液、唾液、消化管が含まれる。動物試料は、例えば、ヒト、霊長類、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類（例えば、マウスもしくはラット）、またはトリの試料であり得る。１つの実施形態では、トリ試料は、１羽または複数羽のニワトリに由来する試料を含む。別の実施形態では、試料は、ヒト試料である。ヒトマイクロバイオームは、皮膚の表面及び深層、乳腺、唾液、口腔粘膜、結膜、ならびに消化管に見られる微生物の集合体を含む。マイクロバイオームに見られる微生物には、細菌、真菌、原生動物、ウイルス、及び古細菌が含まれる。体の部分が異なると、微生物の多様性が異なる。微生物の量及び型は、個体の健康状態または病的状態を知らせ得るものである。細菌分類群の数は数千に上り、ウイルスも同じくらい大量に存在し得る。体表の所与の部位の細菌組成は、人によって異なるものであり、型だけでなく、存在量または量も異なる。
【００６８】
別の実施形態では、試料は、ルーメン試料である。ウシなどの反芻動物は、その飼料を消化する上で多様な微生物コミュニティに依存している。こうした動物は、変化した上部消化管（反芻胃またはルーメン）を有することによって栄養価の乏しい飼料を使用するように進化を遂げており、飼料は、それが嫌気性微生物のコミュニティによって発酵を受ける間、当該上部消化管に保持される。ルーメン微生物コミュニティは、非常に高密度なものであり、ミリリットル当たり約３×１０１０個の微生物細胞を含む。ルーメンでは嫌気発酵微生物が大半を占めている。ルーメン微生物コミュニティは、生命の３つすべてのドメイン（細菌、古細菌、及び真核生物）のメンバーを含む。ルーメン発酵産物は、体の維持、成長、ならびに乳産生のためにそのそれぞれの宿主によって必要とされるものである（ｖａｎ  Ｈｏｕｔｅｒｔ（１９９３）．Ａｎｉｍ．Ｆｅｅｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．４３，ｐｐ．１８９−２２５、Ｂａｕｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｕｔｒ．３１，ｐｐ．２９９−３１９（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。さらに、乳汁の収量及び組成は、ルーメン微生物コミュニティと関連することが報告されている（Ｓａｎｄｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｎｉｍａｌ  ８，ｐｐ．５７２−５７９、Ｐａｌｍｏｎａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．９３，ｐｐ．２７９−２８７（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。１つの実施形態では、Ｊｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１，ｐｐ．４６９７−４７１０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に記載の処理を介してルーメン試料が取得される。
【００６９】
別の実施形態では、試料は、土壌試料（例えば、バルク土壌または根圏の試料）である。１グラムの土壌は、数万の細菌分類群、及び最大で１０億個の細菌細胞、ならびに約２億の菌糸体を含むと推定されている（Ｗａｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１，ｐｐ．５２６６−５２７０（あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。細菌、放線菌、真菌、藻類、原生動物、及びウイルスはすべて、土壌に見られるものである。土壌微生物コミュニティの多様性は、土壌微小環境の構造及び肥沃度、植物による栄養素獲得、植物の多様性及び成長、ならびに地上コミュニティと地下コミュニティとの間の資源の循環と関連付けられている。したがって、土壌試料の微生物含量の経時変化ならびに活性微生物の共出現（及び活性微生物の数）を評価することで、環境メタデータパラメータ（栄養素獲得及び／または植物多様性など）と関連する微生物への洞察が得られる。
【００７０】
１つの実施形態では、土壌試料は、根圏試料であり、根圏は、すなわち、根の分泌物及び関連土壌微生物によって直接的に影響を受ける狭い土壌領域である。根圏は、微生物活性の上昇が観測され、栄養素及び成長因子の交換を介して植物の根が土壌微生物と相互作用する、生息密度の高い領域である（Ｓａｎ  Ｍｉｇｕｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００２５３−０１４−５５４５−６（あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる））。植物は、多くの化合物を根圏に分泌するため、根圏における生物型の解析は、そこで成長する植物の特徴を決定する上で有用であり得る。
【００７１】
別の実施形態では、試料は、海洋試料または淡水試料である。海洋水は、ミリリットル当たり最大で１００万の微生物及び数千の微生物型を含む。こうした数は、沿岸水では有機物及び栄養素の生産性も取り込み量も高まることから桁違いに大きくなり得る。海洋微生物は、海洋生態系の機能、二酸化炭素の生産と固定とのバランス維持、海洋光合成微生物（シアノバクテリア、珪藻、ならびにピコ植物プランクトン及びナノ植物プランクトンなど）を介する地球上の酸素の５０％超の生産、新規の生理活性化合物及び代謝経路の提供、海洋食物網において非常に重要な最下位栄養レベルを占めることによる持続可能な海産物供給の確保、にとって極めて重要である。海洋環境に見られる生物には、ウイルス、細菌、古細菌、及びいくつかの真核生物が含まれる。海洋ウイルスは、ウイルスによる溶解を介して海洋細菌集団を制御する上で重要な役割を担い得る。海洋細菌は、他の小微生物にとっての食物源としても、有機物の生産者としても重要である。海洋において水柱を通じて見られる古細菌は遠洋古細菌であり、その存在量は海洋細菌の存在量に匹敵する。
【００７２】
別の実施形態では、試料は、極限環境に由来する試料を含み、極限環境は、すなわち、地球上のほとんどの生命に有害な条件を伴う環境である。極限環境で増殖する生物は、極限環境微生物と呼ばれる。古細菌ドメインは、極限環境微生物のよく知られる例を含むが、真正細菌ドメインもまた、こうした微生物の代表的なものを有し得る。極限環境微生物には、３以下のｐＨレベルで増殖する好酸性微生物、９以上のｐＨレベルで増殖する好アルカリ微生物、増殖に酸素を必要としない嫌気性生物（Ｓｐｉｎｏｌｏｒｉｃｕｓ  Ｃｉｎｚｉａなど）、深部地下において地下水で満たされた岩石、亀裂、帯水層、及び断層の中の微小空間に生息する岩石内生物（ｃｒｙｐｔｏｅｎｄｏｌｉｔｈ）、少なくとも約０．２Ｍの塩濃度で増殖する好塩性生物、高温（約８０〜１２２℃）で生息する超好熱性生物（熱水系に見られるものなど）、寒冷砂漠において岩石下に生息する岩石下生物（ｈｙｐｏｌｉｔｈ）、黄鉄鉱のような還元ミネラル化合物からエネルギーを引き出し、地球化学的な循環において活性な独立栄養生物（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ  ｅｕｒｏｐａｅａなど）、高レベルの溶解重金属（銅、カドミウム、ヒ素、及び亜鉛など）に耐性を示す金属耐性生物、栄養的に限られた環境で増殖する低栄養生物、糖濃度が高い環境で増殖する高濃性生物（ｏｓｍｏｐｈｉｌｅ）、高圧で生息する好圧性生物（ｐｉｅｚｏｐｈｉｌｅ）（または好圧性生物（ｂａｒｏｐｈｉｌｅ））（海洋または地下の深い位置に見られるものなど）、約−１５℃以下の温度で生存、増殖、及び／または繁殖する好冷性生物（ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌｅ）／好冷性生物（ｃｒｙｏｐｈｉｌｅ）、高レベルの電離放射線に抵抗性を示す放射線抵抗性生物、４５〜１２２℃の温度で生息する好熱性生物、極度に乾燥した条件で増殖することができる好乾性生物が含まれる。多重極限環境微生物は、複数のカテゴリーに入る極限環境微生物であると見なされる生物であり、多重極限環境微生物には、好熱好酸性微生物（７０〜８０℃の温度及びｐＨ２〜３を好む）が含まれる。古細菌のクレン古細菌門群は、好熱好酸性微生物を含む。
【００７３】
試料は、１つまたは複数のドメインに由来する微生物を含み得る。例えば、１つの実施形態では、試料は、細菌及び／または真菌（本明細書では細菌株または真菌株とも称される）の不均一集団を含む。本開示の教示内容の追加の用途には、食品、特に発酵食品及び微生物食品（例えば、パン、チーズ、ワイン、ビール、キムチ、コンブチャ、チョコレートなど）における使用が含まれる。
【００７４】
試料における１つまたは複数の微生物の存在及び絶対細胞数（例えば、同一または異なる環境から、及び／または複数の時点にわたって取得された複数の試料における１つまたは複数の微生物の絶対細胞数）を決定するための、本明細書で提供される方法では、１つまたは複数の微生物は、任意の型のものであり得る。例えば、１つまたは複数の微生物は、真正細菌ドメイン、古細菌ドメイン、真核生物ドメイン、またはそれらの組み合わせに由来し得る。細菌及び古細菌は、原核生物であり、内部オルガネラを有さない非常に単純な細胞構造を有する。細菌は、グラム陽性／外膜なし、グラム陰性／外膜あり、及び未分類の門に分類することができる。古細菌は、単細胞微生物のドメインまたは界を構成している。視覚的には細菌と同様ではあるものの、古細菌は、真核生物のもの（注目すべきは、転写及び翻訳に関与する酵素）とより密接に関連する遺伝子及びいくつかの代謝経路を有している。古細菌生化学の他の側面は、その細胞膜にエーテル脂質が存在するなど、特有のものである。古細菌は、タウム古細菌門、アイグ古細菌門、クレン古細菌門、及びコル古細菌門という４つの認知された門に分けられる。
【００７５】
真核生物のドメインは、真核生物を含んでおり、真核生物は、膜結合型オルガネラ（核など）によって定義される。原生動物は、単細胞真核生物である。動物、植物、及び真菌を含めて、多細胞生物はすべて真核生物である。真核生物は、原生生物界、植物界、菌界、及び動物界という４つの界に分類されている。しかしながら、いくつかの代替分類が存在する。別の分類では、真核生物は、エクスカバータ界（さまざまな鞭毛原生動物）、アメーバ動物界（葉状アメーバ類（ｌｏｂｏｓｅ  ａｍｏｅｂｏｉｄ）及び粘液糸状菌）、オピストコンタ界（動物、真菌、襟鞭毛虫）、リザリア界（有孔虫、放散虫、及びさまざまな他のアメーバ様原生動物）、クロムアルベオラータ界（黄色植物（褐藻、珪藻）、ハプト植物、クリプト植物（またはクリプト藻類）、及びアルベオラータ）、アーケプラスチダ界／一次植物（陸上植物、緑藻、紅藻、及び灰色藻）という６つの界に分けられる。
【００７６】
真核生物のドメイン内では、真菌が微生物コミュニティにおける主たる微生物である。真菌には、微生物（酵母及び糸状菌など）ならびによく知られたキノコが含まれる。真菌細胞は、グルカン及びキチンを含む細胞壁を有しており、このことは、こうした生物に特有の特徴である。真菌は、共通の祖先を共有する関連生物の単一群を形成しており、この群は、真菌類（Ｅｕｍｙｃｏｔａ）と呼ばれる。真菌界は、１５０万種〜５００万種と推定されており、これらのうちで正式に分類されているものは約５％である。ほとんどの真菌の細胞は、複数の核を含み得る菌糸と呼ばれる管状の伸長した糸状構造として増殖する。いくつかの種は、出芽または二分裂によって繁殖する単細胞酵母として増殖する。真菌の主要な門（ｐｈｙｌａ）（門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と呼ばれることもある）は、その有性生殖構造の特徴に主に基づいて分類されている。現在、微胞子虫門、ツボカビ門、コウマクキン門、ネオカリマスティクス門、グロムス門、子嚢菌門、及び担子菌門という７つの門が提唱されている。
【００７７】
本明細書に記載の方法による検出及び定量化の対象となる微生物は、ウイルスでもあり得る。ウイルスは、他の生物の生細胞の内部でのみ複製する小さな感染性病原体である。ウイルスは、真核生物、細菌、及び古細菌のドメインにおけるすべての型の生命体に感染することができる。ウイルス粒子（ビリオンとして知られる）は、（ｉ）ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る遺伝物質、（ｉｉ）こうした遺伝子を保護するタンパク質コート、ならびに場合によっては（ｉｉｉ）それが細胞外に存在するときにタンパク質コートを囲む脂質外被、という２つまたは３つの部分からなる。ウイルスについては、カウドウイルス目、ヘルペスウイルス目、リガメンウイルス目（Ｌｉｇａｍｅｎｖｉｒａｌｅ）、モノネガウイルス目、ニドウイルス目、ピコルナウイルス目、及びティモウイルス目という７つの目が確立されている。ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）または二本鎖（ｄｓ）、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得、ウイルスゲノムにおいては、逆転写酵素（ＲＴ）が使用されることも使用されないこともあり得る。さらに、ｓｓＲＮＡウイルスは、センス（＋）またはアンチセンス（−）であり得る。この分類では、ウイルスは、Ｉ：ｄｓＤＮＡウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスなど）、ＩＩ：（＋）ｓｓＤＮＡウイルス（パルボウイルスなど）、ＩＩＩ：ｄｓＲＮＡウイルス（レオウイルスなど）、ＩＶ：（＋）ｓｓＲＮＡウイルス（ピコルナウイルス、トガウイルスなど）、Ｖ：（−）ｓｓＲＮＡウイルス（オルソミクソウイルス、ラブドウイルスなど）、ＶＩ：生活環においてＤＮＡ中間体を伴う（＋）ｓｓＲＮＡ−ＲＴウイルス（レトロウイルスなど）、ＶＩＩ：ｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス（ヘパドナウイルスなど）という７つの群に分けられる。
【００７８】
本明細書に記載の方法による検出及び定量化の対象となる微生物は、ウイロイドでもあり得る。ウイロイドは、知られる中で最小の感染性病原体であり、タンパク質コートなしの一本鎖ＲＮＡである環状短鎖のみからなる。ウイロイドは、ほとんどが植物病原体であり、そのいくつかは、経済観点から重要なものである。ウイロイドゲノムは、サイズが極端に小さく、約２４６〜約４６７の範囲の核酸塩基を有する。
【００７９】
本明細書で提供される方法によれば、試料は、試料における１つまたは複数の微生物型の存在が検出されるように処理される（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。試料における１つまたは複数の微生物生物型の絶対数が決定される（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）。１つまたは複数の生物型の存在の決定と、少なくとも１つの生物型の絶対数の決定と、は平行して実施するか、または連続して実施することができる。例えば、細菌（すなわち、１つの微生物型）及び真菌（すなわち、第２の微生物型）を含む微生物コミュニティを含む試料の場合、１つの実施形態では、試料におけるこれらの生物型のうちの一方または両方の存在がユーザーによって検出される（図１Ｂ、１００１；図２、２００１）。別の実施形態では、試料における少なくとも１つの生物型の絶対数（この例の場合、試料における細菌、真菌、またはそれらの組み合わせの数）がユーザーによって決定される（図１Ｂ、１００２；図２、２００２）。
【００８０】
１つの実施形態では、試料またはその一部がフローサイトメトリー（ＦＣ）分析に供されることで、１つまたは複数の微生物型の存在及び／または数が検出される（図１Ｂ、１００１、１００２；図２、２００１、２００２）。フローサイトメーターによる１つの実施形態では、個々の微生物細胞は、少なくとも約３００個／秒、または少なくとも約５００個／秒、または少なくとも約１０００個／秒の速度でイルミネーションゾーンを通過する。しかしながら、この速度は、利用機器の型に応じて異なり得ることを認識されよう。電子的にゲートされる検出器によって、散乱光の程度を示すパルスの大きさが測定される。こうしたパルスの大きさが「ビン」または「チャネル」へと電子的に選別されることで、ある特定の定量的な特性（例えば、細胞の染色特性、直径、細胞膜）を有する細胞の数を、チャネル番号に対してヒストグラム表示することが可能になる。そのような分析によって、それぞれの「ビン」における細胞数を決定することが可能になり、こうした「ビン」は、本明細書に記載の実施形態では、「微生物型」ビン（例えば、細菌、真菌、線形動物、原生動物、古細菌、藻類、渦鞭毛藻類、ウイルス、ウイロイドなど）である。
【００８１】
１つの実施形態では、試料は、１つまたは複数の蛍光色素で染色され（蛍光色素は、特定の微生物型に特異的である）、この染色によって、フローサイトメーターまたは蛍光を利用する何らかの他の検出方法及び定量化方法（蛍光顕微鏡法など）を介して検出することが可能になる。この方法によって、試料における所与の生物型の細胞数及び／または細胞体積を定量化することができる。別の実施形態では、本明細書に記載のように、フローサイトメトリーを利用することで、生物型の特有の第１のマーカー及び／または特有の第２のマーカー（酵素の発現、細胞表面タンパク質の発現など）の存在及び量が決定される。変数が２つまたは３つのヒストグラムまたは等高線図（例えば、光散乱と細胞膜染色に由来する蛍光と（タンパク質染色またはＤＮＡ染色に由来する蛍光と）を対比したもの）を生成することもできるため、集団全体における細胞間のさまざまな目的特性の分布の印象を得ることができる。そのような多パラメータのフローサイトメトリーデータを多く表示することは、一般的に行われることであり、本明細書に記載の方法での使用に適している。
【００８２】
１つまたは複数の微生物型の存在及び数を検出するために試料を処理する実施形態の１つでは、顕微鏡法が利用される（図１Ｂ、１００１、１００２）。１つの実施形態では、顕微鏡法は、光学顕微鏡法であり、小さな試料の画像を拡大するために可視光及びレンズ系が使用される。デジタル画像は、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって記録することができる。他の顕微鏡手法には、限定はされないが、走査型電子顕微鏡法及び透過型電子顕微鏡法が含まれる。微生物型は、本明細書で提供される態様に従って可視化及び定量化される。
【００８３】
本開示の別の実施形態では、１つまたは複数の微生物型の存在及び数を検出するために、各試料またはその一部が蛍光顕微鏡法に供される。異なる蛍光色素を使用することで、試料における細胞を直接的に染色し、落射蛍光顕微鏡ならびに上記のフローサイトメトリーを使用して細胞総数を定量化することができる。微生物の定量化に有用な色素には、限定はされないが、アクリジンオレンジ（ＡＯ）、４，６−ジ−アミノ−２フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、及び５−シアノ−２，３ジトリルテトラゾリウムクロリド（ＣＴＣ）が含まれる。生細胞は、生死判定染色方法によって推定することができ、こうした生死判定染色方法は、緑色蛍光のＳＹＴＯ９（商標）色素（すべての膜を透過する）及び赤色蛍光のヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素（損傷膜を有する細胞を透過する）という２つの核酸染色剤を含むＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）細菌生死判定キット（Ｂａｃ−Ｌｉｇｈｔ（商標））などである。したがって、膜に損傷がある細胞は赤色に染まることになり、一方、膜に損傷のない細胞は緑色に染まることになる。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）は、落射蛍光顕微鏡法を進展させたものであり、特定生物の迅速な検出及び計数を可能にするものである。ＦＩＳＨでは、試料における生物ＤＮＡに特異的に結合する蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブ（通常１５〜２５塩基対）が使用され、落射蛍光顕微鏡または共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）を使用して細胞を可視化することが可能になる。レポーター沈着触媒蛍光インサイチュハイブリダイゼーション法（Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）（ＣＡＲＤ−ＦＩＳＨ）では、試験対象微生物から得られるシグナルの強度を増幅するために西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用することによってＦＩＳＨ法が改良されている。ＦＩＳＨを他の手法と組み合わせることで微生物コミュニティを特徴付けることができる。１つの複合手法は、高親和性ペプチド核酸（ＰＮＡ）−ＦＩＳＨであり、この手法では、プローブが細胞外高分子物質（ＥＰＳ）マトリックスを透過する能力が増強されている。別の例は、細胞生死判定キットとＦＩＳＨとが組み合わさったＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ−ＦＩＳＨであり、この手法は、飲料水配水系における消毒効率の評価に使用されている。
【００８４】
別の実施形態では、各試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の絶対数を決定するために顕微ラマン分光法に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。顕微ラマン分光法は、単一細胞ラマンスペクトル（ＳＣＲＳ）を検出及び測定することを可能にする非破壊かつ無標識の技術である。典型的なＳＣＲＳでは、単一細胞の固有の生化学的「フィンガープリント」が得られる。ＳＣＲＳは、その中に生体分子（核酸、タンパク質、糖質、及び脂質を含む）の情報を豊富に含んでおり、これによって、異なる細胞種、生理学的変化、及び細胞表現型を特徴付けることが可能になる。ラマン顕微鏡法では、異なる細胞バイオマーカーの化学結合によるレーザー光の散乱が調べられる。ＳＣＲＳは、１つの単一細胞におけるすべての生体分子のスペクトルの総和であり、細胞の表現型プロファイルを示す。細胞表現型は、遺伝子発現の結果としてのものであり、通常は遺伝子型を反映する。したがって、同一の増殖条件の下では、異なる微生物型からは、その遺伝子型の差異に対応する明確に異なるＳＣＲＳが得られるため、異なる微生物型をそのラマンスペクトルによって同定することができる。
【００８５】
さらに別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために遠心分離に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。この処理は、遠心分離機によって創出される遠心力を使用することによって不均一混合物を沈降させるものである。混合物の高密度成分は遠心分離機の軸から遠ざかって移動する一方で、混合物の低密度成分は軸に向かって移動する。遠心分離によって、細胞質部分、膜部分、及び細胞外部分へと試料を分画することが可能になる。目的の生物学的分子の局在情報を決定するためにも遠心分離を使用できる。さらに、全微生物コミュニティＤＮＡの分画にも遠心分離を使用することができる。異なる原核生物群は、ＤＮＡにおけるそのグアニン＋シトシン（Ｇ＋Ｃ）含量が異なるため、Ｇ＋Ｃ含量に基づく密度勾配遠心分離は、生物型、及びそれぞれの型と関連する細胞の数を識別するための方法である。この手法では、全コミュニティＤＮＡの分画プロファイルが得られ、Ｇ＋Ｃ含量の関数としてＤＮＡの存在量が示される。全コミュニティＤＮＡは、高度に精製された画分へと物理的に分離され、それぞれの画分は、Ｇ＋Ｃ含量が異なることを示しており、当該画分を、追加の分子手法（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）／増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）（ＡＲＤＲＡ）（本明細書の議論を参照のこと）など）によって分析することで、全微生物コミュニティの多様性及び１つまたは複数の微生物型の存在／量を評価することができる。
【００８６】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために染色に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。染色剤及び色素を使用することで、生物学的組織、細胞、または細胞内オルガネラを可視化することができる。染色を顕微鏡法、フローサイトメトリー、またはゲル電気泳動と併用することで、異なる微生物型に特有の細胞または生物学的分子を可視化またはマークすることができる。インビボ染色は、生存組織の染色処理である一方で、インビトロ染色では、その生物学的状況から取り出された細胞または構造が染色される。本明細書に記載の方法で使用するための特定の染色手法の例には、限定はされないが、細菌のグラム状態を決定するためのグラム染色、内生胞子の存在を同定するための内生胞子染色、チール・ネールゼン染色、組織の薄切片を調べるためのヘマトキシリン及びエオシン染色、体のさまざまな分泌液に由来する細胞試料を調べるためのパパニコロウ染色、糖質の過ヨウ素酸・シッフ染色、細胞を周囲結合組織と区別するために三色染色プロトコールを利用するマッソントリクローム、血液または骨髄試料を調べるためのロマノフスキー染色（またはライト染色、ジェンナー染色、メイ・グリュンワルド溶液、リーシュマン染色、及びギムザ染色を含む一般的な変法）、タンパク質及びＤＮＡを明らかにするための銀染色、脂質のためのズダン染色、ならびに真の内生胞子を検出するためのコンクリン染色（Ｃｏｎｋｌｉｎ’ｓ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）が含まれる。一般的な生物学的染色剤には、細胞周期を決定するためのアクリジンオレンジ、酸性ムチンのためのビスマルクブラウン、グリコーゲンのためのカルミン、核のためのカルミンアルミニウム、タンパク質のためのクマシーブルー、神経細胞質の酸性成分のためのクレシルバイオレット、細胞壁のためのクリスタルバイオレット、核のためのＤＡＰＩ、細胞質物質、細胞膜、いくつかの細胞外構造、及び赤血球のためのエオシン、ＤＮＡのための臭化エチジウム、コラーゲン、平滑筋、またはミトコンドリアのための酸性フクシン、核のためのヘマトキシリン、ＤＮＡのためのヘキスト染色剤、デンプンのためのヨウ素、細菌（ヒメネス染色手法の場合）及び胞子のためのマラカイトグリーン、クロマチンのためのメチルグリーン、動物細胞のためのメチレンブルー、ニッスル物質のためのニュートラルレッド、核のためのナイルブルー、親油性物質のためのナイルレッド、脂質のための四酸化オスミウム、蛍光顕微鏡法において使用されるローダミン、核のためのサフラニンが含まれる。染色剤は、コントラストを強調するために透過型電子顕微鏡法においても使用され、こうした染色剤には、リンタングステン酸、四酸化オスミウム、四酸化ルテニウム、モリブデン酸アンモニウム、ヨウ化カドミウム、カルボヒドラジド、塩化第二鉄、ヘキサミン、三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛、クエン酸鉛、硝酸鉛（ＩＩ）、過ヨウ素酸、リンモリブデン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、タンパク銀、塩化金酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、及び硫���バナジルが含まれる。
【００８７】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために質量分析（ＭＳ）に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。ＭＳは、以下に議論されるように、試料における１つまたは複数の特有のマーカーの存在及び発現を検出するためにも使用することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＭＳを使用することで、例えば、微生物型に特有のタンパク質及び／またはペプチドマーカーの存在及び量が検出されるため、試料におけるそれぞれの微生物型の数が評価される。定量化は、安定同位体標識を用いて実施するか、または標識を用いずに実施することができる。ペプチドのデノボシークエンシングは、ＭＳ／ＭＳスペクトルから直接的に実施するか、または配列タグ付け（データベースに対して一致し得る短いタグを得る）を行っても実施することができる。ＭＳは、タンパク質の翻訳後修飾を明らかにし、代謝物を同定することもできる。ＭＳをクロマトグラフィー手法及び他の分離手法（ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、イオン移動度など）と併用することで、質量の分解能及び決定能を高めることができる。
【００８８】
別の実施形態では、試料またはその一部は、微生物型の存在及び少なくとも１つの微生物型の数を決定するために脂質分析に供される（図１Ｂ、１００１〜１００２；図２、２００１〜２００２）。脂肪酸は、細胞バイオマスに比較的一定の比率で存在しており、コミュニティ内の微生物型を区別することができるシグネチャー脂肪酸が微生物細胞には存在する。１つの実施形態では、脂肪酸は、鹸化した後、誘導体化してそれぞれの脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を得ることによって抽出され、その後、ＦＡＭＥは、ガスクロマトグラフィーによって分析される。次に、１つの実施形態では、ＦＡＭＥプロファイルが参照ＦＡＭＥデータベースと比較されることで、多変量統計解析によって脂肪酸及びその対応微生物シグネチャーが同定される。
【００８９】
本明細書で提供される方法の態様では、試料またはその一部（例えば、試料の一定分量）における特有の第１のマーカーの数、ならびに特有の第１のマーカーのそれぞれの量が測定される（図１Ｂ、１００３；図２、２００３）。特有のマーカーは、微生物株のマーカーである。探索及び測定の対象となる特有のマーカーによっては試料全体を分析する必要はないことを理解されよう。例えば、特有のマーカーが細菌株に特有のものであれば、試料の真菌部分を分析する必要はない。上記のように、いくつかの実施形態では、試料における１つまたは複数の生物型の絶対細胞数の測定は、生物型によって試料を分離すること（例えば、フローサイトメトリーを介して実施される）を含む。
【００９０】
本明細書では、生物株に特有の任意のマーカーを利用することができる。例えば、マーカーには、限定はされないが、小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（１６Ｓ／１８Ｓ  ｒＤＮＡ）、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２３Ｓ／２５Ｓ／２８Ｓ  ｒＤＮＡ）、介在５．８Ｓ遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素、ベータ−チューブリン、伸長因子、ＲＮＡポリメラーゼ、及び内部転写スペーサー（ＩＴＳ）が含まれ得る。
【００９１】
リボソームＲＮＡ遺伝子（ｒＤＮＡ）、特に小サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（すなわち、真核生物の場合は１８Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子（１８Ｓ  ｒＤＮＡ）であり、原核生物の場合は、１６Ｓ  ｒＲＮＡ（１６Ｓ  ｒＤＮＡ）である）は、微生物コミュニティにおける生物型及び株を評価する上で主たる標的となっている。しかしながら、大サブユニットリボソームＲＮＡ遺伝子（２８Ｓ  ｒＤＮＡ）もまた、標的とされている。ｒＤＮＡは、分類学的な同定に適したものであり、この理由は、（ｉ）既知生物のすべてにｒＤＮＡが普遍的に存在すること、（ｉｉ）保存領域と可変領域との両方をｒＤＮＡが有すること、（ｉｉｉ）比較に利用可能なｒＤＮＡ配列のデータベースが指数関数的に充実してきていること、によるものである。試料のコミュニティ解析では、保存領域は、対応するユニバーサルＰＣＲプライマー及び／またはシークエンシングプライマーのためのアニーリング部位として役立ち、一方、可変領域は、系統発生学的な差異を明らかにするために使用することができる。さらに、細胞におけるｒＤＮＡのコピー数が多いことも、環境試料からの検出を容易にしている。
【００９２】
内部転写スペーサー（ＩＴＳ）は、１８Ｓ  ｒＤＮＡと２８Ｓ  ｒＤＮＡとの間に位置するものであり、ＩＴＳもまた、標的とされている。ＩＴＳは、転写はされるものの、リボソームの構築前にスプライシングを受けて除去される。ＩＴＳ領域は、ＩＴＳ１及びＩＴＳ２という２つの高度に可変なスペーサーと、介在５．８Ｓ遺伝子と、から構成される。ゲノムには、このｒＤＮＡオペロンのコピーが複数存在する。ＩＴＳ領域は、リボソームの構成要素をコードしないため、高度に可変である。
【００９３】
１つの実施形態では、特有のＲＮＡマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーであり得る。
【００９４】
タンパク質をコードする機能遺伝子もまた、特有の第１のマーカーとして本明細書で使用することができる。そのようなマーカーには、限定はされないが、リコンビナーゼＡ遺伝子ファミリー（細菌のＲｅｃＡ、古細菌のＲａｄＡ及びＲａｄＢ、真核生物のＲａｄ５１及びＲａｄ５７、ファージのＵｖｓＸ）、ＲＮＡポリメラーゼβサブユニット（ＲｐｏＢ）遺伝子（転写の開始及び伸長を担う）、シャペロニンが含まれる。候補マーカー遺伝子もまた、細菌＋古細菌に対するものが同定されている：リボソームタンパク質Ｓ２（ｒｐｓＢ）、リボソームタンパク質Ｓ１０（ｒｐｓＪ）、リボソームタンパク質Ｌ１（ｒｐｌＡ）、翻訳伸長因子ＥＦ−２、翻訳開始因子ＩＦ−２、メタロエンドペプチダーゼ、リボソームタンパク質Ｌ２２、ｆｆｈ  シグナル認識粒子タンパク質、リボソームタンパク質Ｌ４／Ｌ１ｅ（ｒｐｌＤ）、リボソームタンパク質Ｌ２（ｒｐｌＢ）、リボソームタンパク質Ｓ９（ｒｐｓＩ）、リボソームタンパク質Ｌ３（ｒｐｌＣ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼベータサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１４ｂ／Ｌ２３ｅ（ｒｐｌＮ）、リボソームタンパク質Ｓ５、リボソームタンパク質Ｓ１９（ｒｐｓＳ）、リボソームタンパク質Ｓ７、リボソームタンパク質Ｌ１６／Ｌ１０Ｅ（ｒｐｌＰ）、リボソームタンパク質Ｓ１３（ｒｐｓＭ）、フェニルアラニルｔＲＮＡシンテターゼαサブユニット、リボソームタンパク質Ｌ１５、リボソームタンパク質Ｌ２５／Ｌ２３、リボソームタンパク質Ｌ６（ｒｐｌＦ）、リボソームタンパク質Ｌ１１（ｒｐｌＫ）、リボソームタンパク質Ｌ５（ｒｐｌＥ）、リボソームタンパク質Ｓ１２／Ｓ２３、リボソームタンパク質Ｌ２９、リボソームタンパク質Ｓ３（ｒｐｓＣ）、リボソームタンパク質Ｓ１１（ｒｐｓＫ）、リボソームタンパク質Ｌ１０、リボソームタンパク質Ｓ８、ｔＲＮＡプソイドウリジンシンターゼＢ、リボソームタンパク質Ｌ１８Ｐ／Ｌ５Ｅ、リボソームタンパク質Ｓ１５Ｐ／Ｓ１３ｅ、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、リボソームタンパク質Ｓ１７、リボソームタンパク質Ｌ１３（ｒｐｌＭ）、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシクロ−リガーゼ（ｒｐｓＥ）、リボヌクレアーゼＨＩＩ、及びリボソームタンパク質Ｌ２４。細菌に対する他の候補マーカー遺伝子には、転写伸長タンパク質ＮｕｓＡ（ｎｕｓＡ）、ｒｐｏＢ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ（ｒｐｏＢ）、ＧＴＰ結合タンパク質ＥｎｇＡ、ｒｐｏＣ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットベータ’、ｐｒｉＡ  プライモソーム集合タンパク質、転写共役修復因子、ＣＴＰシンターゼ（ｐｙｒＧ）、ｓｅｃＹ  タンパク質前駆体トランスロカーゼサブユニットＳｅｃＹ、ＧＴＰ結合タンパク質Ｏｂｇ／ＣｇｔＡ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ｒｐｓＦ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ６、ｐｏＡ  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼサブユニットアルファ、ペプチド鎖終結因子１、ｒｐｌＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ９、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔｓｆ  伸長因子Ｔｓ（ｔｓｆ）、ｒｐｌＱ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１７、ｔＲＮＡ（グアニン−Ｎ（１）−）−メチルトランスフェラーゼ（ｒｐｌＳ）、ｒｐｌＹ  推定５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２５、ＤＮＡ修復タンパク質ＲａｄＡ、グルコース阻害分裂タンパク質Ａ、リボソーム結合因子Ａ、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＬ、ｓｍｐＢ  ＳｓｒＡ−結合タンパク質（ｓｍｐＢ）、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、Ｓ−アデノシル−メチルトランスフェラーゼＭｒａＷ、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラモイルアラニン−−Ｄ−グルタミン酸リガーゼ、ｒｐｌＳ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１９、ｒｐｌＴ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２０（ｒｐｌＴ）、ｒｕｖＡ  ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼ、ｒｕｖＢ  ホリデイジャンクションＤＮＡヘリカーゼＢ、ｓｅｒＳ  セリルｔＲＮＡシンテターゼ、ｒｐｌＵ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２１、ｒｐｓＲ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１８、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質ＭｕｔＳ、ｒｐｓＴ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２０、ＤＮＡ修復タンパク質ＲｅｃＮ、ｆｒｒ  リボソームリサイクリング因子（ｆｒｒ）、組換えタンパク質ＲｅｃＲ、機能未知タンパク質ＵＰＦ００５４、ｍｉａＡ  ｔＲＮＡイソペンテニルトランスフェラーゼ、ＧＴＰ結合タンパク質ＹｃｈＦ、染色体複製開始タンパク質ＤｎａＡ、デホスホＣｏＡキナーゼ、１６Ｓ  ｒＲＮＡプロセシングタンパク質ＲｉｍＭ、ＡＴＰ−コーン（ｃｏｎｅ）ドメインタンパク質、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ、２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ、脂肪酸／リン脂質合成タンパク質ＰｌｓＸ、ｔＲＮＡ（Ｉｌｅ）−ライシジンシンテターゼ、ｄｎａＧ  ＤＮＡプライマーゼ（ｄｎａＧ）、ｒｕｖＣ  ホリデイジャンクションリゾルバーゼ、ｒｐｓＰ  ３０Ｓリボソームタンパク質Ｓ１６、リコンビナーゼＡ  ｒｅｃＡ、リボフラビン生合成タンパク質ＲｉｂＦ、グリシルｔＲＮＡシンテターゼベータサブユニット、ｔｒｍＵ  ｔＲＮＡ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジレート）−メチルトランスフェラーゼ、ｒｐｍＩ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３５、ｈｅｍＥウロポルフィリノーゲン脱炭酸酵素、桿状決定タンパク質、ｒｐｍＡ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７（ｒｐｍＡ）、ペプチジルｔＲＮＡヒドロラーゼ、翻訳開始因子ＩＦ−３（ｉｎｆＣ）、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミル−トリペプチドシンテターゼ、ｒｐｍＦ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３２、ｒｐＩＬ  ５０Ｓリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２（ｒｐＩＬ）、ｌｅｕＳ  ロイシルｔＲＮＡシンテターゼ、ｌｉｇＡ  ＮＡＤ依存性ＤＮＡリガーゼ、細胞分裂タンパク質ＦｔｓＡ、ＧＴＰ結合タンパク質ＴｙｐＡ、ＡＴＰ依存性Ｃｌｐプロテアーゼ、ＡＴＰ結合サブユニットＣｌｐＸ、ＤＮＡ複製及び修復タンパク質ＲｅｃＦ、ならびにＵＤＰ−Ｎ−アセチルエノールピルボイルグルコサミンレダクターゼが含まれる。
【００９５】
リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ）もまた、本明細書に記載の方法による特有の第１のマーカーとして使用することができる。ＰＬＦＡは、微生物が増殖する間に急速に合成され、貯蔵分子には見られず、細胞死の間に急速に分解されるため、現在の生存コミュニティの構成メンバー数をＰＬＦＡによって正確に調べることができる。すべての細胞は、抽出及びエステル化して脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）を形成させることができる脂肪酸（ＦＡ）を含んでいる。ガスクロマトグラフィー−質量分析を使用してＦＡＭＥが分析されると、得られるプロファイルは、試料における微生物の「フィンガープリント」となる。真正細菌ドメイン及び真核生物ドメインにおける生物の膜の化学組成物は、エステル型結合によってグリセロールに連結された脂肪酸（リン脂質脂肪酸（ＰＬＦＡ））から構成される。一方、古細菌の膜脂質は、エーテル型結合によってグリセロールに連結された長鎖の分岐炭化水素（リン脂質エーテル脂質（ＰＬＥＬ））から構成される。これは、これら３つのドメインを区別するために最も広く使用される非遺伝子的な基準の１つである。この意味においては、微生物細胞膜に由来するリン脂質（異なるアシル鎖によって特徴付けられる）は優れたシグネチャー分子であり、この理由は、そのような脂質構造多様性を特定の微生物分類群と関連付けできることによるものである。
【００９６】
本明細書に示されるように、生物株が活性であるかを決定するために、１つまたは複数の特有の第２のマーカー（第１のマーカーと同一または異なり得る）の発現レベルが測定される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。特有の第１のマーカーは、上記のものである。特有の第２のマーカーは、微生物活性のマーカーである。例えば、１つの実施形態では、上記の第１のマーカーのいずれかのｍＲＮＡまたはタンパク質の発現は、本開示の目的のための特有の第２のマーカーであると見なされる。
【００９７】
１つの実施形態では、第２のマーカーの発現レベルが閾値レベル（例えば、対照レベル）以上であるならば、微生物は、活性であると見なされる（図１Ｂ、１００５；図２、２００５）。１つの実施形態では、第２のマーカーの発現レベルが、閾値レベル（いくつかの実施形態では対照レベル）と比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、または少なくとも約３０％変化するのであれば、活性であると判定される。
【００９８】
特有の第２のマーカーは、１つの実施形態では、タンパク質レベル、ＲＮＡレベル、または代謝物レベルで測定される。特有の第２のマーカーは、特有の第１のマーカーと同一または異なる。
【００９９】
上に示されるように、本明細書に記載の方法に従って、複数の特有の第１のマーカー及び特有の第２のマーカーを検出することができる。さらに、特有の第１のマーカーの検出及び定量化は、本開示を踏まえて当業者に知られる方法に従って実施することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。
【０１００】
１つの実施形態では、核酸シークエンシング（例えば、ｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）を使用することで、特有の第１のマーカー及び／または特有の第２のマーカーの絶対細胞数が決定される。シークエンシングプラットフォームには、限定はされないが、Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、及びＮａｎｏｐｏｒｅから利用可能なサンガーシークエンシング法及びハイスループットシークエンシング法が含まれる。シークエンシングは、特定のＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列のアンプリコンシークエンシング、または全メタゲノム／トランスクリプトームのショットガンシークエンシングであり得る。
【０１０１】
従来のサンガーシークエンシング（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，ｐｐ．５４６３−５４６７（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））は、インビトロのＤＮＡ複製の間に、鎖伸長を停止するジデオキシヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼによって選択的に取り込まれることに依存するものであり、本明細書に記載の方法での使用に適している。
【０１０２】
別の実施形態では、試料またはその一部は、核酸の抽出、適切なプライマーを用いた目的ＤＮＡ（ｒＲＮＡ遺伝子など）の増幅、及びシークエンシングベクターを使用するクローンライブラリーの構築に供される。次に、選択されたクローンがサンガーシークエンシングによってシークエンシングされ、目的ＤＮＡのヌクレオチド配列が検索されることで、試料における特有の微生物株の数を計算することが可能になる。
【０１０３】
Ｒｏｃｈｅ／４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓの４５４パイロシークエンシングは、長いリードを生成するものであり、本明細書に記載の方法において利用することができる（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ，４３７，ｐｐ．３７６−３８０、米国特許第６，２７４，３２０号、同６，２５８，５６８号、同６，２１０，８９１号（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のためにその全体が本明細書に組み込まれる））。シークエンシング対象の核酸（例えば、アンプリコンまたはネブライザーによって断片化したゲノムＤＮＡ／メタゲノムＤＮＡ）は、ＰＣＲまたはライゲーションによって特異的なアダプターが両末端に付加される。アダプターを有するＤＮＡは、小さなビーズに固定化され（理想的には、１つのビーズが１つのＤＮＡ断片を有することになる）、このビーズは、油中水型エマルションに懸濁される。次に、エマルションＰＣＲ段階が実施されることで、それぞれのＤＮＡ断片の複数のコピーが調製され、その結果、同一のＤＮＡ断片がクローン化された多くのコピーをそれぞれのビーズが含むビーズのセットが得られる。次に、ビーズはそれぞれ、光ファイバーチップのウェルに入れられ、当該ウェルは、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）反応に必要な酵素も含む。塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）が付加されるとピロリン酸が放出され、この放出によって閃光が生じ、この閃光が記録されることで各ウェルにおけるＤＮＡ断片の配列判定が行われる。最大１，０００塩基のリード長でラン当たり約１００万のリード数を達成することができる。ペアエンドシークエンシングを行うことができ、これによってリードのペアが得られ、得られたリードはそれぞれ、所与のＤＮＡ断片の一方の末端から始まるものである。マルチプレックス反応では、分子バーコードを創出し、アダプター配列と目的配列との間に設置することができ、これによって、それぞれの配列を生物情報学的に試料に割り当てることが可能になる。
【０１０４】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａシークエンシングでは、約２５塩基対（ｂｐ）〜約３００ｂｐの平均リード長が得られる（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ，６：３７３−３８２、Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５，ｐ．６３、Ｆａｄｒｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ２，ｐ．６、Ｃａｐｏｒａｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＩＳＭＥ  Ｊ，６，ｐ．１６２１−１６２４、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｗｈｏｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９）。このシークエンシング技術もまた、合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）であるが、このシークエンシング技術では、可逆的色素ターミネーターと、オリゴが付加された領域を有するフローセルと、が利用される。シークエンシング対象のＤＮＡ断片は、特異的なアダプターを両末端に有しており、断片の末端にハイブリダイズする特異的なオリゴヌクレオチドが多数配置されたフローセル上に流される。次に、断片はそれぞれ、複製されて同一断片のクラスターが調製される。次に、可逆的色素−ターミネーターヌクレオチドがフローセル上に流され、結合する時間が取られる。過剰のヌクレオチドは洗浄除去され、フローセルが画像化される。可逆的ターミネーターは除去することができ、その結果、処理を繰り返すことができ、その後のサイクルにおいてヌクレオチドを続けて添加することができる。それぞれの長さが３００塩基のペアエンドリードを達成することができる。Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでは、それぞれのリードにつき１２５塩基を有するペアエンド様式で４０億の断片を１回のランで生成することができる。試料のマルチプレックス解析については、バーコードを使用することもできるが、インデックスプライマーが使用される。
【０１０５】
ＳＯＬｉＤ（オリゴヌクレオチドのライゲーション及び検出によるシークエンシング（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））処理は、「ライゲーションによるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）」手法であり、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するために本明細書に記載の方法で使用することができる（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）（Ｐｅｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＳＯＬｉＤ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ２−Ｂａｓｅ  Ｅｎｃｏｄｉｎｇ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００７、Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｕｓｉｎｇ  ＳＯＬｉＤ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  ＳＯＬｉＤ  ｓｈｏｔｇｕｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１４（Ｓｕｐｐｌ５）：Ｓ１６、Ｍａｒｄｉｓ（２００８）Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，９：３８７−４０２（これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。ＤＮＡ断片のライブラリーは、シークエンシング対象の試料から調製され、クローンビーズ集団を調製するために使用され、この場合、それぞれの磁気ビーズの表面に１種類のみの断片が存在することになる。磁気ビーズに結合した断片は、ユニバーサルＰ１アダプター配列を有することになり、その結果、あらゆる断片の開始配列が既知かつ同一のものとなる。プライマーは、ライブラリーテンプレート内のＰ１アダプター配列にハイブリダイズする。４種類の蛍光で標識された二塩基プローブのセットがシークエンシングプライマーへのライゲーションにおいて競合する。１つ目の塩基及び２つ目の塩基がすべて、各ライゲーション反応において確実に確かめられることによって二塩基プローブの特異性が達成される。ライゲーション、検出、及び切断のサイクルが複数回実施され、サイクル数によって最終的なリード長が決定される。ＳＯＬｉＤプラットフォームでは、長さが７５塩基のリードをラン当たり最大で３０億リード生成することができる。ペアエンドシークエンシングが利用可能であり、本明細書で使用することができるが、ペアにおける第２のリードの長さは３５塩基にすぎない。別々のインデックスを付けたランを行えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって使用されるものと類似のシステムを介して試料のマルチプレックス解析を行うことが可能である。
【０１０６】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、４５４シークエンシングと同様のものであり、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための本明細書に記載の方法での使用に適している（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムでは、ＤＮＡ断片が結合したビーズを含むマイクロウェルのプレートが使用される。しかしながら、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシステムは、塩基の取り込みが検出される様式がその他のシステムのすべてと異なる。伸長中のＤＮＡ鎖に塩基が付加されるとプロトンが放出され、このプロトンによって周辺のｐＨが僅かに変化する。ｐＨを検知する微量測定器がプレート上のウェルと結び付いており、こうした変化が生じると当該微量測定器によって記録される。異なる塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）がウェルを通って順次流れることで、各ウェルに由来する配列を推定することが可能になる。Ｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎプラットフォームは、２００塩基のリード長を有するリードをラン当たり最大で５０００万リード生成することができる。Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅプラットフォームでは、４００塩基という、より長いリードが生成される。双方向シークエンシングが利用可能である。マルチプレックス解析は、標準的なインライン分子バーコードシークエンシングを介して行うことが可能である。
【０１０７】
Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＰａｃＢｉｏ）ＳＭＲＴシークエンシングは、一分子リアルタイムシークエンシング手法を使用するものであり、１つの実施形態では、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための本明細書に記載の方法で使用される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰａｃＢｉｏシークエンシングシステムは、増幅段階を必要としないことから、他の主要な次世代シークエンシングシステムとは一線を画するものとなっている。１つの実施形態では、このシークエンシングは、多くのゼロモード導波路（ＺＭＷ）検出器を含むチップ上で実施される。ＺＭＷ検出器にはＤＮＡポリメラーゼが結合されており、リン酸を介して連結された色素で標識されたヌクレオチドの取り込みがＤＮＡ鎖の合成と並行してリアルタイムで画像化される。ＰａｃＢｉｏシステムでは、非常に長いリード長（平均約４，６００塩基）が得られ、ラン当たりに得られるリード数も非常に多い（約４７，０００）。リードは、典型的には、両末端からの独立したシークエンシングを必要とすることなくＣＣＳを介して断片を複数回カバーできるほど十分な長さを有するため、典型的な「ペアエンド」手法はＰａｃＢｉｏでは使用されない。ＰａｃＢｉｏでのマルチプレックス解析は、独立したリードを必要とするものではなく、標準的な「インライン」バーコード付加モデルに従って行われる。
【０１０８】
１つの実施形態では、特有の第１のマーカーがＩＴＳゲノム領域の場合、試料における微生物株の数及び独自性を決定するために、１つの実施形態では、リボソーム遺伝子間スペーサー自動解析（ＡＲＩＳＡ）が使用される（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（Ｒａｎｊａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５，ｐｐ．１１１１−１１２０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。ＩＴＳ領域は、長さとヌクレオチド配列との両方において顕著な不均一性を有する。蛍光標識されたフォワードプライマー及び自動ＤＮＡシークエンサーを使用することで、高い分離分解能及びハイスループットを得ることが可能である。各試料に内部標準を含めることで、包括的断片のサイズ分類における精度が得られる。
【０１０９】
別の実施形態では、試料における特有の第１のマーカー及びその量を特徴付けるために、ＰＣＲによって増幅されたｒＤＮＡ断片の断片長多型（ＲＦＬＰ）（増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ＡＲＤＲＡ）としても知られる）が使用される（図１Ｂ、１００３、図２、２００３）（追加詳細については、Ｍａｓｓｏｌ−Ｄｅｙａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｅｃｏｌ．Ｍａｎｕａｌ．３．３．２，ｐｐ．１−１８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。共通プライマーを使用するＰＣＲによってｒＤＮＡ断片が生成され、生成したｒＤＮＡ断片は、制限酵素で消化され、アガロースゲルまたはアクリルアミドゲルにおいて電気泳動され、臭化エチジウムまたは硝酸銀で染色される。
【０１１０】
特有の第１のマーカーの存在及び相対量の検出において使用されるフィンガープリンティング手法の１つは、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）である（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６２，ｐｐ．３１１２−３１２０、Ｓｃｈｅｉｎｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６，ｐｐ．１０３−１１７、Ｓｃｈｗｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｔｅｂｂｅ（１９９８）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，ｐｐ．４８７０−４８７６（これらの文献はそれぞれ、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。この手法では、ＤＮＡ断片（１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーを用いて得られたＰＣＲ産物など）が変性され、非変性ゲルで直接的に電気泳動される。分離は、サイズ差異と、一本鎖ＤＮＡの折り畳まれた高次構造と、に基づいており、こうしたものによって電気泳動移動度が影響を受ける。電気泳動の間にＤＮＡ鎖が再アニーリングすることは、いくつかの方針によって阻止することができ、こうした方針には、ＰＣＲにおいて１つのリン酸化プライマーを使用した後、ラムダエキソヌクレアーゼでリン酸化鎖を特異的に消化すること、及び１つのビオチン化プライマーを使用して変性後の１つの一本鎖を磁気で分離すること、が含まれる。所与の微生物コミュニティにおける主たる集団の独自性を評価するために、１つの実施形態では、バンドが切り出され、シークエンシングされるか、または特異的なプローブがＳＳＣＰパターンにハイブリダイズされ得る。電気泳動条件（ゲルマトリックス、温度、及びゲルへのグリセロールの添加など）によって、分離に影響が及び得る。
【０１１１】
シークエンシングに基づく方法に加えて、第２のマーカーの発現（例えば、遺伝子発現、タンパク質発現）を定量化するための他の方法もまた、１つまたは複数の第２のマーカーの発現レベルを決定するための本明細書で提供される方法での使用に適している（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ解析、線形増幅手法（核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）など）はすべて、本明細書に記載の方法での使用に適しており、本開示を踏まえて当業者に知られる方法に従って実施することができる。
【０１１２】
別の実施形態では、試料またはその一部は、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。転写されたリボソームＲＮＡ及び／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びｍＲＮＡ）を相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）へと逆転写した後、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を実施することによって、特定の微生物株の活性が測定される。
【０１１３】
別の実施形態では、試料またはその一部は、第１のマーカー及び／または第２のマーカーの存在及び量を検出するために、ＰＣＲに基づくフィンガープリンティング手法に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４；図２、２００３〜２００４）。ＰＣＲ産物は、ヌクレオチド組成に基づいて電気泳動によって分離することができる。異なるＤＮＡ分子の間の配列差異は、融解挙動に影響を与えるため、異なる配列を有する分子は、ゲル中の異なる位置で移動を停止することになる。したがって、異なるバンドまたはピークの位置及び相対強度によって電気泳動プロファイルを定義することができ、この電気泳動プロファイルを、多様性インデックスを計算するための数値データに変換することができる。ゲルからバンドを切り出した後、シークエンシングすることで、コミュニティメンバーの系統発生学的な所属を明らかにすることもできる。電気泳動方法には、限定はされないが、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）、制限酵素断片長多型分析（ＲＦＬＰ）または増幅リボソームＤＮＡ制限酵素分析（ＡＲＤＲＡ）、末端標識制限酵素断片多型分析（Ｔ−ＲＦＬＰ）、リボソーム遺伝子間スペーサー自動解析（ＡＲＩＳＡ）、無作為増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、ＤＮＡ増幅フィンガープリンティング（ＤＡＦ）、及びＢｂ−ＰＥＧ電気泳動が含まれ得る。
【０１１４】
別の実施形態では、試料またはその一部は、特有の第１のマーカーの量及び／または特有の第２のマーカーの存在／量を決定するために、チップに基づくプラットフォーム（マイクロアレイまたはマイクロフルイディクスなど）に供される（図１Ｂ、１００３〜１００４、図２、２００３〜２００４）。試料における全ＤＮＡからＰＣＲ産物が増幅され、マイクロアレイに固定された既知の分子プローブに対して当該ＰＣＲ産物が直接的にハイブリダイズされる。この蛍光標識ＰＣＲアンプリコンが当該プローブにハイブリダイズした後、共焦点レーザー走査型顕微鏡法を使用することによって陽性シグナルがスコア付けされる。マイクロアレイ手法では、複製に関して試料を迅速に評価することが可能になり、このことは、微生物コミュニティの分析においては重要な利点である。マイクロアレイ上でのハイブリダイゼーションシグナル強度は、標的生物の量に直接的に比例し得る。ユニバーサル高密度１６Ｓマイクロアレイ（例えば、ＰＨＹＬＯＣＨＩＰ）は、いくつかの培養微生物種及び「候補の門（ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ）」を標的とする１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のプローブを約３０，０００個含む。こうしたプローブによって、１２１の区分された原核生物目のすべてが標的となり、８，７４１の細菌分類群及び古細菌分類群を同時に検出することが可能になる。微生物コミュニティのプロファイリングのために使用される別のマイクロアレイは、機能遺伝子アレイ（ＦＧＡ）である。ＰＨＹＬＯＣＨＰとは異なり、ＦＧＡは、細菌の特定の代謝群を検出することを第一に設計される。したがって、ＦＧＡは、コミュニティ構造を明らかにするだけでなく、インサイチュのコミュニティ代謝能も解明するものである。ＦＧＡは、生物学的機能が既知の遺伝子に由来するプローブを含んでいるため、微生物コミュニティ組成を生態系機能と関連付ける上で有用である。ＧＥＯＣＨＩＰと呼ばれるＦＧＡは、さまざまな生物地球化学的プロセス、生態学的プロセス、及び環境プロセス（アンモニア酸化、メタン酸化、及び窒素固定など）に関与するすべての既知代謝遺伝子に由来する＞２４，０００個のプローブを含む。
【０１１５】
１つの実施形態では、１つまたは複数の第２のマーカーの発現レベルを決定するための本明細書に記載の方法でタンパク質発現アッセイが使用される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。例えば、１つの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを定量化するために、質量分析または免疫アッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）が利用され、１つまたは複数の特有の第２のマーカーは、タンパク質である。
【０１１６】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取り込みに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＢｒｄＵは、チミジンの合成ヌクレオシド類似体であり、複製中の細胞において新たに合成されるＤＮＡに取り込ませることができる。次に、ＢＲｄＵを検出するために、この塩基類似体に特異的な抗体を使用することができる。したがって、ＢｒｄＵが取り込まれることで同定される細胞は、そのＤＮＡを活発に複製している細胞であり、このことは、本明細書に記載の方法の１つの実施形態による微生物の活性の尺度である。ＢｒｄＵ取り込みをＦＩＳＨと併用することで、標的細胞の独自性及び活性を把握することができる。
【０１１７】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＦＩＳＨと組み合わさったマイクロオートラジオグラフィー（ＭＡＲ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＭＡＲ−ＦＩＳＨは、放射性基質が細胞に取り込まれることに基づいており、活性細胞の検出にはオートラジオグラフィーが使用され、細胞の同定にはＦＩＳＨが使用される。単一細胞の解像度での活性細胞の検出及び同定が、顕微鏡を用いて実施される。ＭＡＲ−ＦＩＳＨでは、全細胞、プローブの標的となる細胞、及び所与の放射標識物質を取り込む細胞の割合に関する情報が得られる。この方法は、標的微生物のインサイチュ機能の評価を与えるものであり、微生物のインビボ生理学を試験する上で有効な手法である。細胞特異的な基質取り込みをＭＡＲ−ＦＩＳＨと組み合わせて定量化するために開発された手法は、定量的ＭＡＲ（ＱＭＡＲ）として知られる。
【０１１８】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＦＩＳＨと組み合わさった安定同位体ラマン分光法（ラマン−ＦＩＳＨ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。この手法では、安定同位体プロービング、ラマン分光法、及びＦＩＳＨが組み合わせられることで、代謝プロセスが特定の生物と関連付けられる。細胞による安定同位体の取り込み比率が光散乱に影響を与える結果、標識された細胞成分（タンパク質成分及びｍＲＮＡ成分を含む）についてのピークシフトが測定可能となる。ラマン分光法を使用することで、細胞が化合物を合成するかどうかを明らかにすることができ、こうした化合物には、限定はされないが、油（アルカンなど）、脂質（トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）など）、特定のタンパク質（ヘムタンパク質、金属タンパク質など）、チトクロム（Ｐ４５０、チトクロムｃなど）、クロロフィル、発色団（集光性カロテノイド及びロドプシンのための色素など）、有機ポリマー（ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）など）、ホパノイド、ステロイド、デンプン、硫化物、サルフェート、及び二次代謝物（ビタミンＢ１２など）が含まれる。
【０１１９】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、ＤＮＡ／ＲＮＡ安定同位体プロービング（ＳＩＰ）に供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。ＳＩＰは、特定の代謝経路と関連する微生物多様性を決定することを可能にするものであり、一般に、炭素化合物及び窒素化合物の利用に関与する微生物を試験するために適用されている。目的基質は、安定同位体（１３Ｃまたは１５Ｎなど）で標識され、試料に添加される。当該基質を代謝することができる微生物のみがその細胞に当該基質を取り込むことになる。その後、密度勾配遠心分離によって１３Ｃ−ＤＮＡ及び１５Ｎ−ＤＮＡを単離し、メタゲノム解析に使用することができる。ＲＮＡに基づくＳＩＰは、ＲＮＡ自体が細胞活性を反映するものであるため、ＳＩＰ試験において使用するための応答性バイオマーカーとなり得る。
【０１２０】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、同位体アレイに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。同位体アレイでは、活性微生物コミュニティを機能的及び系統発生学的にハイスループット様式でスクリーニングすることが可能になる。この手法では、基質の取り込みプロファイルを監視するためのＳＩＰと、活性微生物コミュニティの分類学的独自性を決定するためのマイクロアレイ技術と、が併用される。１４Ｃで標識された基質と共に試料がインキュベートされ、この基質は、増殖過程の間に微生物バイオマスに取り込まれる。１４Ｃで標識されたｒＲＮＡは、非標識ｒＲＮＡと分離された後、蛍光色素で標識される。蛍光標識されたｒＲＮＡは、系統発生学的マイクロアレイにハイブリダイズされた後、放射シグナル及び蛍光シグナルが走査される。したがって、この手法では、微生物コミュニティの組成と、複雑な微生物コミュニティの代謝的に活性な微生物による特定基質の消費と、を同時に試験することが可能になる。
【０１２１】
１つの実施形態では、試料またはその一部は、特有の第２のマーカーのレベルを決定するために、メタボロミクスアッセイに供される（図１Ｂ、１００４；図２、２００４）。メタボロミクスでは、生物学的な細胞、組織、器官、または生物におけるすべての代謝物（細胞プロセスの最終代謝産物）の収集物に相当するメタボロームが試験される。この方法論を使用することで、特定の代謝物プロファイルを異なる微生物と関連付けることが可能になるため、微生物の存在及び／または微生物介在性のプロセスを監視することができる。微生物活性と関連する細胞内代謝物及び細胞外代謝物のプロファイルは、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）などの手法を使用して得ることができる。メタボローム試料の複雑な混合物は、ガスクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、及びキャピラリー電気泳動などの手法によって分離することができる。代謝物の検出は、質量分析、核磁気共鳴分（ＮＭＲ）分光法、イオンモビリティ質量分析、電気化学検出（ＨＰＬＣと組み合わせたもの）、及び放射標識（薄層クロマトグラフィーと組み合わせたときのもの）によって実施することができる。
【０１２２】
本明細書に記載の実施形態によれば、試料における１つまたは複数の活性微生物株の存在及びそれぞれの数が決定される（図１Ｂ、１００６；図２、２００６）。例えば、第１のマーカーの数及び存在をアッセイすることで得られる株独自性情報が解析されることで、特有の第１のマーカーがどのくらい多く出現するかが決定され、それによって特有の微生物株が示される（例えば、シークエンシングアッセイにおける配列リードの数を数えることによって行われる）。この値は、１つの実施形態では、第１のマーカーの全配列リードに占める割合として示すことで、特定の微生物型に占める特有の微生物株の割合を得ることができる。別の実施形態では、この割合に対して微生物型の数（段階１００２または段階２００２で得られるもの。図１Ｂ及び図２を参照のこと）が乗じられることで、試料及び所与の体積における１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数が得られる。
【０１２３】
１つまたは複数の微生物株は、特有の第２のマーカーの発現レベルが、閾値レベルであるか、閾値より高い（例えば、対照レベルと比較して少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％高い）のであれば、上記のように、活性であると見なされる。
【０１２４】
本開示の別の態様では、１つまたは複数の微生物株の絶対細胞数を決定するための方法は、複数の試料において決定が実施される（図２、具体的には２００７を参照のこと）。活性であると分類されるべき微生物株については、試料のうちの１つにおいて活性であるだけでよい。試料は、同一の取得源から複数の時点にわたって取得され得るか、または異なる環境源（例えば、異なる動物）から取得され得る。
【０１２５】
１つの実施形態では、試料にまたがる絶対細胞数値が使用されることで、１つまたは複数の活性微生物株が環境パラメータと関連付けられる（図２、２００８）。１つの実施形態では、環境パラメータは、第２の活性微生物株の存在である。環境パラメータに対する１つまたは複数の活性微生物株の関連付けは、１つの実施形態では、ネットワーク解析及び／またはグラフ理論によって株とパラメータとの共出現を決定することによって実施される。
【０１２６】
１つの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株と環境パラメータとの共出現の決定は、ネットワーク内の株（複数可）と環境パラメータとの連結度を測定するためのネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法を含み、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。独立性の測定例は、本明細書で提供及び議論されており、追加詳細については、Ｂｌｏｍｑｖｉｓｔ“Ｏｎ  ａ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｏｆ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｗｏ  ｒａｎｄｏｍ  ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（１９５０）：５９３−６００、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ−Ｗｉｌｅｙ  ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｔｅｘｔｓ  ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｓｅｃｔｉｏｎ”（１９９９）、及び／またはＢｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｒｅｅ  ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（１９６１）：４８５−４９８の教示内容及び方法を調整利用することによって理解できる（前述の刊行物はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）。
【０１２７】
別の実施形態では、変数間の連結度を確立するために、相関解析方法（ピアソン相関、スピアマン相関、ケンドール相関、正準相関解析、尤度比検定（例えば、Ｗｉｌｋｓ，Ｓ．Ｓ．“Ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｋ  Ｓｅｔｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｅｃｏｎｏｍｅｔｒｉｃａ，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．３，Ｊｕｌｙ  １９３５，ｐｐ３０９−３２６（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）を含む）及び正準相関解析が使用される。こうした方法の多変数拡張、最大相関（例えば、Ａｌｆｒｅｄ  Ｒｅｎｙｉ“Ｏｎ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｏｆ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ”Ａｃｔａ  ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａ  ｈｕｎｇａｒｉｃａ  １０．３−４（１９５９）：４４１−４５１（参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）、または両方（ＭＡＣ）を、比較対象の変数の数に応じて、適切なときに使用することができる。いくつかの実施形態では、多次元パターンを発見するように構成される最大相関解析及び／または他の多変量相関測定（例えば、“Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，”Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３１ｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ，２０１４（当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の方法及び教示内容を適用することによるもの）が利用される。いくつかの実施形態では、ネットワークの特徴量及び解析（Ｆａｒｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ，Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｏｃｉａｌ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，２０１５，８４，ｐｐ．１１４４−１１６３．ｄｏｉ：１０．１１１１／１３６５−２６５６．１２４１８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）によって議論されるものなど）を本開示のために利用及び調整することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、ノンパラメトリック手法（例えば、Ｔａｓｋｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｓｔｓ  ｏｆ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  １００．４７１（２００５）：９１６−９２５、及びＧｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｔｅｓｔ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｔｗｏ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．９２，Ｎｏ．４３８，Ｊｕｎｅ，１９７７，ｐｐ５６１−５６７（あらゆる目的のために参照によってそれぞれの全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）を含み、こうしたノンパラメトリック手法には、相互情報量最大情報係数、最大情報エントロピー（ＭＩＥ；例えば、Ｚｈａｎｇ  Ｙａ−ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｂｌｅ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｅｎｔｒｏｐｙ［Ｊ］”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＆  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５−０１（３７（１）：１２３−１２９）（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の教示内容及び方法を適用することによるもの）、カーネル正準相関解析（ＫＣＣＡ；例えば、Ｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｋｅｒｎｅｌ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３（２００２）１−４８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、交替条件付き期待値またはバックフィッティングアルゴリズム（ＡＣＥ；例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ：  Ｒｅｊｏｉｎｄｅｒ．”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ８０，ｎｏ．３９１（１９８５）：６１４−１９，ｄｏｉ：１０．２３０７／２２８８４７７（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、相関距離測定（ｄｃｏｒ；例えば、Ｓｚｅｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｂｙ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｔａｎｃｅｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００７，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．６，２７６９−２７９４，ｄｏｉ：１０．１２１４／００９０５３６０７００００００５０５（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、ブラウン距離共分散（Ｂｒｏｗｎｉａｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ）（ｄｃｏｖ；例えば、Ｓｚｅｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｂｒｏｗｎｉａｎ  Ｄｉｓｔａｎｃｅ  Ｃｏｖａｒｉａｎｃｅ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２００９，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，１２３６−１２６５，Ｄｏｉ：１０．１２１４／０９−ＡＯＡＳ３１２（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、ヒルベルト・シュミット独立性基準（ＨＳＣＩ／ＣＨＳＩ；例えば、Ｇｒｅｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａ  Ｋｅｒｎａｌ  Ｔｗｏ−Ｓａｍｐｌｅ  Ｔｅｓｔ”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３（２０１２）７２３−７７３、及びＰｏｃｚｏｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｐｕｌａ−ｂａｓｅｄ  Ｋｅｒｎｅｌ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  Ｍｅａｓｕｒｅｓ”Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｍｅｌｌｏｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｈｏｗｃａｓｅ＠ＣＭＵ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２９ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のため参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）、乱択従属係数（ＲＤＣ；例えば、Ｌｏｐｅｚ−Ｐａｚ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ”Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２０１３）（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）が含まれ、こうした手法によって変数の連結度が確立される。いくつかの実施形態では、こうした方法の１つまたは複数を、バギング法もしくはブースティング法またはｋ最近傍推定法（例えば、Ｂｒｅｉｍａｎ，“Ａｒｃｉｎｇ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒｓ”Ｔｈｅ  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，１９９８，Ｖｏｌ．２６，Ｎｏ．３，８０１−８４９、Ｌｉｕ，“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｂａｇｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｍａｘｉｍａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，２０１６，ｐｐ．２２９−２５７、及び／またはＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔｕａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｏｎｇｌｙ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｖａｒｉａｂｌｅｓ”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（ＡＩＳＴＡＴＳ），２０１５，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＪＭＬＲ：Ｗ＆ＣＰ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３８（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによるもの）と組み合わせることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、ノードレベル解析を含み、こうしたノードレベル解析には、次数、強度、媒介中心性、固有ベクトル中心性、ページランク、及び到達性（ｒｅａｃｈ）が含まれる。別の実施形態では、ネットワーク解析は、ネットワークレベル特徴量を含み、こうしたネットワークレベル特徴量には、密度、同類性または次数相関、推移性、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせが含まれる。他の実施形態では、種コミュニティルール（例えば、Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ：Ｃｈａｎｃｅ  ｏｒ  Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ？”Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．６（Ｄｅｃ．，１９７９），ｐｐ．１１３２−１１４０（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）がネットワークに適用され、これは、ガンビット・オブ・ザ・グループ（Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ）仮定（例えば、Ｆｒａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ａｎｉｍａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｇａｍｂｉｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｒｏｕｐ”Ｂｅｈａｖ  Ｅｃｏｌ  Ｓｏｃｉｏｂｉｏｌ（２０１０）６４：４９３，ｄｏｉ：１０．１００７／ｘ００２６５−００９８−０８６５−８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）の方法及び教示内容を適用することによるもの）を活用することを含み得る。いくつかの実施形態では、固有ベクトル／モジュラリティマトリックス解析方法は、例えば、Ｍａｒｋ  ＥＪ  Ｎｅｗｍａｎ  ｉｎ“Ｆｉｎｄｉｎｇ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｃｅｓ”Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｅ  ７４．３（２００６）：０３６１０４（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）によって議論される教示内容及び方法を調整利用することによって使用することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、時間集合ネットワークまたは時間順序ネットワークが利用される。別の実施形態では、クラスター解析方法は、グラフにおけるコミュニティ検出の使用、及び／またはコミュニティ検出アルゴリズム（非限定的な例として、Ｌｏｕｖａｉｎアルゴリズム、Ｂｒｏｎ−Ｋｅｒｂｏｓｃｈアルゴリズム、Ｇｉｒｖａｎ−Ｎｅｗｍａｎアルゴリズム、Ｃｌａｕｓｅｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｍｏｏｒｅアルゴリズム、Ｐｏｎｓ−Ｌａｔａｐｙアルゴリズム、及びＷａｋｉｔａ−Ｔｓｕｒｕｍｉアルゴリズムなど）の使用による、観測マトリックス、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルの構築（ｂｕｉｌｄｉｎｇ）または構築（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ）を含む。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、クラスター解析方法は、モジュラリティの最適化に基づくヒューリスティックな方法である。別の実施形態では、クラスター解析方法は、Ｌｏｕｖａｉｎ法（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｆａｓｔ  ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２００８，Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２００８（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）によって記載される方法を参照のこと。この方法を、本明細書に開示の方法における使用に適用することができる）である。
【０１３２】
他の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、階層的クラスター解析、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、試料における環境パラメータに対する１つまたは複数の活性微生物株の関連付け（例えば、共出現の決定）は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンケージがまとまったマトリックスを創出することを含む。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、段階２００７で得られる複数の試料データ（例えば、２つ以上の時点で取得され得る２つ以上の試料にわたって得られるものであり、それぞれの時点は、個々の試料に対応する）が集計される。別の実施形態では、各試料における１つまたは複数の微生物株のそれぞれの細胞の数が関連性マトリックス（いくつかの実施形態では、量マトリックスであり得る）に蓄積される。１つの実施形態では、関連性マトリックスは、関連性（例えば、量）データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して特定時点試料における活性微生物株間の関連性を明らかにするために使用される。１つの実施形態では、有意ではないルールを除外するためにフィルターが適用される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、１つもしくは複数の活性微生物株または２つ以上の活性微生物株の絶対細胞数が、例えば共出現の決定を介して、１つまたは複数の環境パラメータに関連付けられる（図２、２００８）。環境パラメータは、解析対象の試料（複数可）に応じて選択することができ、本明細書に記載の方法による制限を受けない。環境パラメータは、試料自体のパラメータであり得、例えば、試料におけるｐＨ、温度、タンパク質量である。あるいは、環境パラメータは、微生物コミュニティの独自性の変化に影響を与えるパラメータであるか（すなわち、微生物コミュニティの「独自性」は、コミュニティにおける微生物株の型及び／または特定の微生物株の数によって特徴付けられる）、あるいは微生物コミュニティの独自性の変化によって影響を受けるパラメータである。例えば、１つの実施形態では、環境パラメータは、動物の食物摂取量であるか、あるいは泌乳反芻動物によって産生する乳汁の量（または乳汁のタンパク質もしくは脂肪の含量）である。１つの実施形態では、環境パラメータは、同一の試料に存在する、微生物コミュニティの第２の微生物株の存在、活性、及び／または量である。本明細書に記載の実施形態のいくつかでは、環境パラメータは、メタデータパラメータと称され、逆もまた同様である。
【０１３６】
メタデータパラメータの他の例には、限定はされないが、試料の取得元である宿主に由来する遺伝情報（例えば、ＤＮＡ変異情報）、試料ｐＨ、試料温度、特定のタンパク質またはｍＲＮＡの発現、周辺環境／生態系の栄養素条件（例えば、１つまたは複数の栄養素のレベル及び／または独自性）、疾患に対する感受性または抵抗性、疾患の発症または進行、毒素に対する試料の感受性または抵抗性、生体異物化合物の有効性（医薬的な薬物）、天然物の生合成、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
【０１３７】
例えば、１つの実施形態によれば、図２の方法（すなわち、２００１〜２００７）に従って、複数の試料にまたがって微生物株数変化が計算される。１つまたは複数の活性株（例えば、段階２００６に従って活性であると最初に同定された１つまたは複数の株）の経時的な株数変化が集計されると共に、変化の方向性が加味される（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）。経時的な細胞数はネットワークとして示され、微生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用することで、ノード間の連結度が決定され、クラスターが定義される。１つの実施形態では、クラスターは、所望のメタデータと関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してフィルタリングされる（図２、２００８）。
【０１３８】
別の実施形態では、経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによる重要度に従って微生物株が順位付けされ、細胞数変化が最も大きいものが最上位に順位付けされる。
【０１３９】
１つの実施形態では、ネットワーク解析方法及び／またはクラスター解析方法は、ネットワーク内の１つまたは複数の株の連結度を測定するために使用され、ネットワークは、共通または同様の環境パラメータを共有する２つ以上の試料がまとまったものである。１つの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、社会的ネットワーク理論、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。さらに別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１４０】
クラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。
【０１４１】
ネットワーク及びクラスターに基づく解析（例えば、図２の方法段階２００８を実施するためのもの）は、プロセッサ、コンポーネント、及び／またはモジュールを介して実施することができる。本明細書で使用されるコンポーネント及び／またはモジュールは、例えば、任意の組立物、命令、及び／または動作可能なように連結された電気コンポーネントのセットとなり得るものであり、こうしたコンポーネント及び／またはモジュールには、例えば、メモリ、プロセッサ、電気トレース、光コネクタ、ソフトウェア（ハードウェアで実行されるもの）及び／または同様のものが含まれ得る。
【０１４２】
図３Ａは、１つの実施形態による、微生物の解析、スクリーニング、及び選択を行うプラットフォーム及びシステム３００を示す模式図である。本開示によるプラットフォームは、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度を決定するためのシステム及び処理を含み得るものであり、図３Ａと関連して一例が示される。図３Ａは、構造的な図であるため、説明の明瞭性を向上させるために、ある特定の態様は割愛されているが、こうした態様は、本開示の文脈に鑑みれば、当業者には明らかであろう。
【０１４３】
図３Ａに示されるように、微生物のスクリーニング及び選択を行うプラットフォーム及びシステム３００は、１つまたは複数のプロセッサ３１０、データベース３１９、メモリ３２０、通信インターフェース３９０、ユーザー入力デバイス３９６及び周辺デバイス３９７（限定はされないが、データの収集及び解析を行うデバイス（ＦＡＣｓなど）、選択／インキュベート／製剤化デバイス、及び／または追加のデータベース／データソース、遠隔データ収集デバイス（例えば、メタデータ環境データ（試料特徴、温度、天候など）を収集することができるデバイス（そのような情報を収集するためのアプリを実行するモバイルスマートフォンならびに他のモバイルデバイスまたは固定式デバイスを含む））を含む）と相互通信するように構成された入力／出力インターフェース、クライアント３９３ｂ（ユーザーインターフェース及び／またはディスプレイ（グラフィカルディスプレイなど）を含み得る）ならびにユーザー３９３ａに対して通信ネットワーク３９２（例えば、ＬＡＮ、ＷＡＮ、及び／またはインターネット）を介してデータを送受信するように構成されたネットワークインターフェース、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、ならびに株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５、及び生物学的状態／診断コンポーネント３６０を含み得る。いくつかの実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、単一の物理的デバイスであり得る。他の実施形態では、微生物スクリーニングシステム３００は、複数の物理的デバイス（例えば、動作可能なようにネットワークによって結ばれたもの）を含み得、こうした物理的デバイスはそれぞれ、図３Ａに示されるコンポーネント及び／またはモジュールを１つまたは複数含み得る。いくつかの実施形態では、スクリーニングシステムは、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１１０５１５号、同第２０１６／０２３０２１７号、及び同第２０１６／０２２４７４９号（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）に詳細が記載される教示内容及び方法を適用することによって診断及び治療に利用することができる。
【０１４４】
微生物スクリーニングシステム３００におけるコンポーネントまたはモジュールはそれぞれ、残りのコンポーネント及び／またはモジュールのそれぞれに動作可能なように連結することができる。微生物スクリーニングシステム３００におけるコンポーネント及び／またはモジュールはそれぞれ、そのコンポーネント及び／またはモジュールと関連する１つまたは複数の特定の機能を実行することが可能なハードウェア及び／またはソフトウェア（ハードウェアに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）との任意の組み合わせで使用することができる。
【０１４５】
メモリ３２０は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）（例えば、ダイナミックＲＡＭ、スタティックＲＡＭ）、フラッシュメモリ、着脱式メモリ、ハードドライブ、データベース、及び／または同様のものであり得る。いくつかの実施形態では、メモリ３２０は、例えば、データベース（例えば、３１９に示されるようなもの）、処理、アプリケーション、仮想マシン、及び／または他の何らかのソフトウェアコンポーネント、ソフトウェアプログラム、及び／またはソフトウェアモジュール（ハードウェアに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）、あるいはハードウェアコンポーネント／ハードウェアモジュールを含み得るものであり、こうしたものは、微生物スクリーニング処理及び／または微生物スクリーニング及びアンサンブル生成のための１つもしくは複数の関連方法を実行するように構成される（例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、株選択／微生物アンサンブル生成コンポーネント３５５、（及び／または同様のモジュール）を介して実行するように構成される）。そのような実施形態では、微生物スクリーニング及び／またはアンサンブル生成処理及び／または関連方法を実行する命令は、メモリ３２０内に保存し、プロセッサ３１０で実行することができる。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０を介して収集されたデータは、データベース３１９及び／またはメモリ３２０に保存することができる。
【０１４６】
プロセッサ３１０は、例えば、通信インターフェース３９０の操作の制御と、メモリ３２０へのデータの書き込み及びメモリ３２０からのデータの読み込みと、メモリ３２０内に保存された命令の実行と、を行うよう構成することができる。プロセッサ３１０は、例えば、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント、及びネットワーク解析コンポーネント３５０（本明細書にさらに詳細に記載される）の操作を実行及び／または制御するように構成することもできる。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５は、プロセッサ（複数可）３１０の制御下で、メモリ３２０内に保存された方法または処理に基づいて微生物スクリーニング、選択、及び合成アンサンブル生成処理（本明細書にさらに詳細に記載される）を実行するように構成することができる。
【０１４７】
通信インターフェース３９０は、微生物スクリーニングシステム３００の１つまたは複数のポートを含み、及び／またはそれを管理（例えば、入出力インターフェース（複数可）３９５を介して管理）するように構成することができる。場合によっては、例えば、通信インターフェース３９０（例えば、ネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ））は、１つまたは複数のラインカード（ｌｉｎｅ  ｃａｒｄ）を含み得、こうしたラインカードはそれぞれ、デバイス（例えば、周辺デバイス３９７及び／またはユーザー入力デバイス３９６）に（動作可能なように）連結された１つまたは複数のポートを含み得る。通信インターフェース３９０に含められるポートは、連結されたデバイスとの活発な通信またはネットワーク３９２を介した活発な通信（例えば、エンドユーザーデバイス３９３ｂ、ホストデバイス、サーバーなどとの通信）を行うことができる任意の実体であり得る。いくつかの実施形態では、そのようなポートは、必ずしもハードウェアポートである必要はなく、仮想ポートまたはソフトウェアによって定義されるポートでもあり得る。通信ネットワーク３９２は、情報（例えば、データ及び／または信号）を送信することが可能な任意のネットワークまたはネットワークの組み合わせであり得、通信ネットワーク３９２には、例えば、電話ネットワーク、イーサネット（登録商標）ネットワーク、光ファイバーネットワーク、無線ネットワーク、及び／またはセルラーネットワークが含まれ得る。通信は、ネットワークを介するものであり得、こうしたネットワークは、例えば、Ｗｉ−Ｆｉまたは無線ローカルエリアネットワーク（「ＷＬＡＮ」）接続、無線ワイドエリアネットワーク（「ＷＷＡＮ」）接続、及び／またはセルラー接続などである。ネットワーク接続は、有線接続であり得、こうした有線接続は、例えば、イーサネット（登録商標）接続、デジタル加入回線（「ＤＳＬ」）接続、広帯域同軸接続、及び／または光ファイバー接続などである。例えば、微生物スクリーニングシステム３００は、ネットワーク３９２を介して１つまたは複数の計算デバイス３９３ｂによってアクセスされるように構成されたホストデバイスであり得る。そのような様式では、計算デバイスは、ネットワーク３９２を介して、微生物スクリーニングシステム３００に情報を送信し、及び／または微生物スクリーニングシステム３００から情報を受信することができる。そのような情報は、例えば、微生物スクリーニングシステム３００が収集し、関連付け、決定し、解析し、及び／またはネットワーク解析された微生物のうちで活性なもののアンサンブルを生成する情報であり得え、このことは、本明細書にさらに詳細に記載される。同様に、計算デバイスは、微生物スクリーニングシステム３００からの決定情報を検索及び／または要求するように構成することができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、通信インターフェース３９０は、入力／出力インターフェース３９５を含み、及び／またはそれを含むように構成することができる。入力／出力インターフェースは、ユーザー入力デバイス、周辺デバイス、暗号プロセッサデバイス、及び／または同様のものを受容、それと通信、及び／またはそれに接続することができる。場合によっては、１つの出力デバイスは、ビデオディスプレイであり得、こうしたビデオディスプレイには、例えば、ビデオインターフェースからの信号を受信するインターフェース（例えば、デジタルビジュアルインターフェース（ＤＶＩ）の電気回路及びケーブル）を備えた陰極線管（ＣＲＴ）もしくは液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）、ＬＥＤ、またはプラズマを基礎とするモニタが含まれ得る。そのような実施形態では、通信インターフェース３９０は、他の機能の中でも特に、データ及び／または情報を受信し、微生物スクリーニングの修正、指令、及び／または命令を送信するように構成することができる。
【０１４９】
データ収集コンポーネント３３０は、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度に関する解析のためのデータを収集、処理、及び／または正規化するように構成された任意のハードウェア及び／またはソフトウェアのコンポーネント及び／またはモジュール（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得、上記の解析は、絶対数計数コンポーネント３３５、試料関連付けコンポーネント３４０、活性コンポーネント３４５、ネットワーク解析コンポーネント３５０、及び／または株選択／アンサンブル生成コンポーネント３５５によって実施される。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０は、試料の所与の体積における１つまたは複数の活性生物株の絶対細胞数を決定するように構成することができる。データ収集コンポーネント３３０は、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数に基づき、マーカー配列を使用して絶対細胞数データセット内の活性株を同定することができる。データ収集コンポーネント３３０は、試料中の微生物集団の動態を示すために、ある一定期間、継続的にデータを収集することができる。データ収集コンポーネント３３０は、時間的なデータを集計し、メモリ（メモリ３２０など）に存在する量マトリックスにそれぞれの活性生物株の細胞数を蓄積することができる。
【０１５０】
試料関連付けコンポーネント３４０及びネットワーク解析コンポーネント３５０は、天然の微生物コミュニティ内の多次元の種間相互作用及び依存度をまとめて決定するように構成することができる。試料関連付けコンポーネント３４０は、メタデータパラメータを（環境パラメータを、例えば、共出現したことをもって）１つまたは複数の活性微生物株の存在に関連付けるように構成された任意のハードウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得る。いくつかの実施形態では、試料関連付けコンポーネント３４０は、１つまたは複数の活性生物株を１つまたは複数の環境パラメータに関連付けることができる。
【０１５１】
ネットワーク解析コンポーネント３５０は、環境（メタデータ）パラメータに対して試料における１つまたは複数の活性微生物株が共出現することを決定するように構成された任意のハードウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアコンポーネント（メモリ（メモリ３２０など）に保存されたもの及び／またはハードウェア（プロセッサ３１０など）で実行されるもの）であり得る。いくつかの実施形態では、データ収集コンポーネント３３０によって収集されたデータと、試料関連付けコンポーネント３４０によって決定された１つまたは複数の活性微生物株と１つまたは複数の環境パラメータとの間の関連性と、に基づいて、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、環境パラメータと微生物株との関連性を示すリンケージ、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルがまとまったマトリックスを創出することで、微生物株の不均一集団の１つまたは複数のネットワークを示すことができる。例えば、ネットワーク解析では、量データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して試料における活性微生物株とメタデータパラメータとの間の関連性（例えば、２つ以上の活性微生物株の関連性）を明らかにするために関連性（量及び／または存在量）マトリックスを使用することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、ルールを選択及び／または除外するためのフィルターを適用することができる。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、変化の方向性を加味した上で（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）、活性株の経時的な細胞数変化を計算することができる。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、ネットワークとしてマトリックスを示すことができ、微生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。ネットワーク解析コンポーネント３５０は、マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用して、ノード間の連結度を決定し、クラスターを定義することができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、所望のメタデータと関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してクラスターをフィルタリングすることができる。いくつかの実施形態では、ネットワーク解析コンポーネント３５０は、経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによって標的微生物株を順位付けすることができ、細胞数変化が最も大きいものが最上位に順位付けされる。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ネットワーク解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む。別の実施形態では、クラスター解析方法を使用することができ、このクラスター解析方法は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築することを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、連結度を確立するための、変数間の相互情報量、最大情報係数計算、または他のノンパラメトリック法を含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む。別の実施形態では、ネットワーク解析は、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む。
【０１５３】
図３Ｂは、本開示の実施形態の１つによる論理フローの例を示す。最初に、複数の試料及び／または試料セットが取得及び／または入手される（３００１）。本明細書で使用される「試料」は、１つまたは複数の試料、試料セット、複数の試料（例えば、特定の集団に由来するもの）を指し得るが、これは理解を容易にするためのものであり、結果的に、２つ以上の異なる試料について議論されるとき、各試料は、複数の副試料を含み得ることを理解されよう（例えば、第１の試料及び第２の試料について議論されるとき、第１の試料は、第１の集団から取得された副試料を２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る数含み得、第２の試料は、第２の集団から取得された副試料、あるいは、第１の集団から取得されるが、異なる時点（第１の副試料の取得から１週間後または１ヶ月後の時点など）で取得された副試料を２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回る数含み得る）。副試料が取得されると、それぞれの副試料についての個々の取得識別指標及びパラメータを管理し、蓄積することができ、こうしたものには、環境パラメータ、定性的及び／または定量的な知見、集団メンバー独自性が含まれる（したがって、例えば、２つ以上の異なる時点で同一の集団から試料が取得されるとき、こうした副試料は独自性によって対にされるため、時間１の時点で動物１から取得される副試料は、時間２の時点で同一の動物から取得される副試料と結び付けられるなどする）。
【０１５４】
各試料、試料セット、及び／または副試料について、標的生物型に基づいて細胞が染色され（３００２）、各試料／副試料またはその一部が重量測定され、段階希釈され（３００３）、処理される（３００４）ことで、各試料／副試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数が決定される。１つの例示の実施態様では、細胞選別機を使用することで、試料に由来する個々の細菌細胞及び真菌細胞（環境試料に由来するものなど）を数えることができる。本開示の一環として、特異的な色素を開発したことで、従来の方法では以前は数えることができなかった微生物を数えることが可能になった。本開示の方法に従って特異的な色素を使用すると、細胞壁（例えば、細菌及び／または真菌のもの）が染色されることで、レーザーを使用して細胞特徴に基づいて、より大きな集団から標的細胞の個別集団を数えることができる。１つの特定の例では、環境試料が調製され、等張緩衝液で希釈され、下記の色素で染色される：（ａ）細菌については、下記の色素を染色に使用することができる−ＤＮＡ：Ｓｙｂｒグリーン、呼吸：５−シアノ−２，３−ジトリルテトラゾリウムクロリド及び／またはＣＴＣ、細胞壁：マラカイトグリーン及び／またはクリスタルバイオレット、（ｂ）真菌については、下記の色素を染色に使用することができる−細胞壁：カルコフロールホワイト、コンゴーレッド、トリパンブルー、ダイレクトイエロー９６、ダイレクトイエロー１１、ダイレクトブラック１９、ダイレクトオレンジ１０、ダイレクトレッド２３、ダイレクトレッド８１、ダイレクトグリーン１、ダイレクトバイオレット５１、コムギ胚芽凝集素−ＷＧＡ、リアクティブイエロー２、リアクティブイエロー４２、リアクティブブラック５、リアクティブオレンジ１６、リアクティブレッド２３、リアクティブグリーン１９、及び／またはリアクティブバイオレット５。
【０１５５】
直接的色素及び反応性色素は、典型的には、セルロースに基づく材料（すなわち、綿、亜麻、及びビスコースレーヨン）の染色を連想させるものであるが、本開示の開発においては、こうした色素をキチン及びキトサンの染色にも使用できることが有利に発見された。当該色素をキチン及びキトサンの染色に利用できる理由は、キチン及びキトサンには、それぞれアセチルグルコサミンがβ−（１→４）結合で連結された鎖、ならびにＤ−グルコサミン及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがβ−（１→４）結合で連結された鎖が存在することによるものである。こうしたサブユニットから鎖が構築されると、セルロース鎖と非常に類似した平らな繊維様構造が形成される。キチン分子及び／またはキトサン分子への直接的な色素の付着は、色素と当該繊維分子と間のファンデルワールス力を介して生じる。これら２つ分子の間の接触表面積が広ければ広いほど、相互作用が強くなる。一方、反応性色素は、キチン及び／またはキトサンに対して共有結合を形成する。
【０１５６】
染色された試料はそれぞれ、計数のためにＦＡＣｓにロードされる（３００４）。個々の液滴（例えば、マイクロリットルの約１／１０のもの（０．１μＬ））の流れを生じさせる特定サイズのノズル（例えば、１００μｍ（実施態様及び用途に応じて選択される））を備えたマイクロ流体チップを介して試料を分析にかけることができる。こうした変数（ノズルサイズ、液滴形成）は、それぞれの標的微生物型に最適化することができる。理想的には、それぞれの液滴には１つの細胞、すなわち「事象（ｅｖｅｎｔ）」が封入され、それぞれの液滴にレーザーが当たると、染色物はすべて励起され、異なる波長の光を放出する。ＦＡＣｓは、それぞれの放出を光学的に検出し、それを事象としてプロットすることができる（例えば、２Ｄグラフにプロットすることができる）。典型的なグラフは、事象のサイズ（「前方散乱」によって決定される）に対応する１つの軸と、蛍光の強度に対応するもう１つの軸と、からなるものである。こうしたグラフ上の個別の集団の周りに「ゲート」をかけることができ、こうしたゲート内の事象を数えることができる。
【０１５７】
図３Ｃは、ダイレクトイエローで染色された真菌に由来するデータの例を示しており、酵母の単培養物（３００５ａ）（正の対照、左）、Ｅ．ｃｏｌｉ（３００５ｂ）（負の対照、中央）、及び環境試料（３００５ｃ）（実験、右）を含む。この図では、「後方散乱」（ＢＳＣ−Ａ）によって事象の複雑性が測定されており、ＦＩＴＣによってダイレクトイエローからの蛍光放出強度が測定されている。ドットはそれぞれ、１つの事象を示しており、事象の密度は、緑色から赤色への色変化によって示される。ゲートＢは、標的となる事象（この場合は、ダイレクトイエローで染色された真菌）が見られることが予測される通常領域を示す。
【０１５８】
図３Ｂに説明を戻すと、１つまたは複数の取得源から２つ以上の試料（個々の動物もしくは単一の地理的位置から経時的に取得される試料、地理的位置、品種、能力、食物、疾患などが異なる２つ以上の群から取得される試料、生理学的な撹乱もしくは事象を経験する１つもしくは複数の群から取得される試料、及び／または同様のものを含む）を取得すること（３００１）から始まり、フローサイトメトリー（上記の染色（３００２）を含む）を使用して試料が解析されることで絶対数が確立され得る。試料は、重量測定され、段階希釈され（３００３）、ＦＡＣｓを使用して処理される（３００４）。次に、ＦＡＣｓの結果が処理されることで、各試料における所望の生物型の絶対数が決定される（３００５）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数１】
2020507308.tif 000003
【数２】
2020507308.tif 000004
【０１５９】
各試料から全核酸が単離される（３００６）。核酸試料溶出液は、２つの部分に分割され（典型的には２等分される）、それぞれの部分が酵素的に精製されることで、精製ＤＮＡが得られるか（３００６ａ）、または精製ＲＮＡが得られる（３００６ｂ）。精製ＲＮＡは、酵素的にｃＤＮＡに変換されることによって安定化される（３００６ｃ）。ＰＣＲを使用して精製ＤＮＡと精製ｃＤＮＡとの両方についてシークエンシングライブラリー（例えば、ＩＬＬＵＭＩＮＡシークエンシングライブラリー）が調製されることで、適切なバーコード及びアダプター領域が付加され、所望の生物型の測定に適したマーカー領域が増幅される（３００７）。ライブラリーのクオリティを評価及び定量化することができ、次に、すべてのライブラリーをプールしてシークエンシングすることができる。
【０１６０】
生のシークエンシングリードに対してクオリティトリミング及びマージが実施される（３００８）。処理されたリードが重複除去され、クラスター化されることで、複数の試料に存在する特有の株のすべてのセットまたはリストが得られる（３００９）。このセットまたはリストは、複数の試料に存在するそれぞれの株を分類学的に同定するために使用することができる（３０１０）。ＤＮＡ試料に由来するシークエンシングライブラリーを同定することができ、同定されたＤＮＡライブラリーに由来するシークエンシングリードは、各試料にどの株が存在するかを同定し、各試料におけるそれぞれの株のリード数を定量化するために、重複除去された株のセットまたはリストにマッピングし戻される（３０１１）。次に、定量化されたリードリストは、それぞれの株の絶対数または細胞数を決定するために、標的微生物型の絶対細胞数と統合される（３０１３）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数３】
2020507308.tif 000005
【０１６１】
ｃＤＮＡ試料から得られたシークエンシングライブラリーが同定される（３０１４）。次に、同定されたｃＤＮＡライブラリーに由来するシークエンシングリードは、各試料においてどの株が活性であるかを決定するために、重複除去された株のリストにマッピングし戻される。リード数が特定または指定の閾値を下回るのであれば（３０１５）、その株は、不活性であると見なされるか、または同定され、その後の解析から除外される（３０１５ａ）。リード数が閾値を上回るのであれば（３０１５）、その株は、活性であると見なされるか、または同定され、解析に残される（３０１５ｂ）。次に、不活性株は、結果からフィルタリングされることで（３０１３）、各試料についての活性株のセットまたはリスト及びそれぞれの絶対数／細胞数が得られる（３０１６）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような処理の方法論の例を示すものである：
【数４】
2020507308.tif 000006
【０１６２】
各試料（試料のセット、副試料など）についての定性的メタデータ及び定量的メタデータ（例えば、環境パラメータなど）が同定、検索、及び／または取得され（３０１７）、データベース（例えば、３１９）に保存される（３０１８）。適切なメタデータを特定することができ、用途／実施態様に応じてデータベースにクエリーが投げられることで、解析対象の各試料についての特定メタデータ及び／または関連メタデータが引き出される（３０１９）。次に、メタデータのサブセットが活性株のセットまたはリスト及びその対応する絶対数／細胞数とマージされることで、試料マトリックスによって１つの大きな種及びメタデータが創出される（３０２０）。
【０１６３】
次に、最大情報係数（ＭＩＣ）が株とメタデータとの間（３０２１ａ）ならびに株間（３０２１ｂ）で計算される。結果がプールされることで、すべての関連性のセットまたはリスト及びその対応するＭＩＣスコアが創出される（３０２２）。関連性が所与の閾値を下回るのであれば（３０２３）、関連性がないものと見なされる／特定される（３０２３ｂ）。関連性が所与の閾値を上回るのであれば（３０２３）、関連性があるものと見なされ／特定され（３０２３ａ）、ネットワーク解析にさらに供される（３０２４）。下記のコード断片は、１つの実施形態による、そのような解析の方法論の例を示すものである：
【数５】
2020507308.tif 000007
【０１６４】
ネットワーク解析の結果に基づいて生物学的状態が定義され、及び／または活性株が選択され（３０２５）、この選択は、選択された株を含む製造物（例えば、アンサンブル、集合物、及び／または他の合成集団）を調製するために実施される。ネットワーク解析の結果を使用することで、追加の製造物組成試験を行うための株の診断及び／または選択の情報を得ることもできる。
【０１６５】
閾値の使用については、解析及び決定に関して上に議論されている。閾値は、統計学な閾値（すなわち、有意性検定）に加えて、実施態様及び用途に応じて、（１）経験的に決定されるものであり（例えば、リードレベルが低い特定の部分または有意な部分を除去する数となるようにカットオフ値が設定され、分布レベルに基づいて決定される）、（２）任意の非ゼロ値であり、（３）割合／パーセンタイルに基づくものであり、（４）第２のマーカー（すなわち、活性）の正規化リード数が第１のマーカー（細胞数）の正規化リード数を上回る株のみとするものであり、（５）活性と量または細胞数との間のｌｏｇ２倍率変化であり、（６）第２のマーカー（活性）の正規化リード数が、試料（及び／または試料セット）全体についての第２のマーカー（活性）の平均リード数を上回るものとするものであり、及び／または任意の大きさの上記の閾値であり得る。以下には、１つの実施形態に従って、ＤＮＡに基づく第１のマーカーの測定値と関連してＲＮＡに基づく第２のマーカーの測定値の分布に対して閾値を設定する例が詳細に示される。
【０１６６】
１羽の雄性Ｃｏｂｂ５００の小腸内容物を取得し、本開示による分析に供した。簡潔に記載すると、試料における細菌細胞の総数を、ＦＡＣｓを使用して決定した（例えば、３００４）。固定した小腸試料から全核酸を単離した（例えば、３００６）。ＤＮＡ（第１のマーカー）シークエンシングライブラリー及びｃＤＮＡ（第２のマーカー）シークエンシングライブラリーを調製し（例えば、３００７）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ  ＭＩＳＥＱにロードした。それぞれのライブラリーに由来する生のシークエンシングリードに対して、クオリティフィルタリング、重複除去、クラスター化、及び定量化を実施した（例えば、３００８）。ＤＮＡに基づくライブラリーとｃＤＮＡに基づくライブラリーとの両方に由来する定量化株のリストを細胞数データと統合することで、試料中のそれぞれの株の絶対細胞数を確立した（例えば、３０１３）。ｃＤＮＡは、必ずしも株量の直接的な測定値を与えるものではないものの（すなわち、高度に活性な株は、同一のＲＮＡ分子のコピーを多く有し得る）、この例では、ｃＤＮＡに基づくライブラリーを細胞計数データと統合することで、ＤＮＡライブラリーに使用したものと同一の正規化手順を維持した。
【０１６７】
分析の後、ｃＤＮＡに基づくライブラリーでは７０２株（４６株は特有のもの）を同定し、ＤＮＡに基づくライブラリーでは１１４０株を同定した。活性閾値として０を使用すると（すなわち、任意の非ゼロ値を残すと）、この試料中でＤＮＡに基づく第１のマーカーを有していた株の５７％が、ｃＤＮＡに基づく第２のマーカーとも関連していた。こうした株は、微生物コミュニティのうちの活性部分であると同定／見なされ、こうした株のみ、その後の解析が継続される。閾値の厳密性を上げ、その第２のマーカー値が第１のマーカー値を上回る株のみを活性であると見なすのであれば、２８９株（２５％）のみが閾値を満たす。この閾値を満たす株は、図３ＤのＤＮＡ（第１のマーカー）線を上回るものに対応する。
【０１６８】
本開示は、互いに影響し合う複数の活性微生物株ならびに１つまたは複数のパラメータまたはメタデータを同定し、同定された微生物を微生物アンサンブルにおいて使用するために選択するさまざまな方法を含み、当該微生物アンサンブルは、共通機能の実施と関連するか、もしくは共通機能に影響を与えるか、または認識可能なパラメータ（目的の表現型形質（例えば、反芻動物における乳産生の増加）など）に関与するか、もしくはそれを導くか、もしくはそれと関連するものであると説明できる、個々の微生物種または種の株の微生物コミュニティの選択サブセットを含む。本開示は、こうした方法を実施及び／または促進するさまざまなシステム及び装置も含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、方法は、少なくとも１つの共通の特徴（試料地理的位置、試料型、試料源、試料源個体、試料標的動物、試料時期、品種、食物、温度など）を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴（共通の特徴とは異なる試料地理的位置／時間的位置、試料型、試料源、試料源個体、試料標的動物、試料時期、品種、食物、温度など）を有する少なくとも２つの試料を取得することを含む。各試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数が決定され、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである。この後、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが特定した閾値に基づいて測定されることで各試料におけるその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によって絶対細胞数がフィルタリングされることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られ、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数が互いに比較されるか、または少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと比較され、予測される機能及び／または化学に基づいて、少なくとも２つの群、少なくとも３つの群、少なくとも４つの群、少なくとも５つの群、少なくとも６つの群、少なくとも７つの群、少なくとも８つの群、少なくとも９つの群、少なくとも１０の群、少なくとも１５の群、少なくとも２０の群、少なくとも２５の群、少なくとも５０の群、少なくとも７５の群、または少なくとも１００の群のうちの１つへと活性微生物株が分類される。例えば、比較は、それぞれの微生物株の間の結び付き、それぞれの微生物株とメタデータとの間の結び付き、及び／またはメタデータと微生物株との間の結び付き、を明らかにするネットワーク解析であり得る。少なくとも１つの微生物を、少なくとも２つの群から選択し、組み合わせることで、少なくとも１つのメタデータに対応する特性（例えば、標的の特性（乳牛または乳牛集団の乳産生など））を変えるように構成された微生物のアンサンブルを形成させることができる。アンサンブルの形成は、微生物株またはそれぞれの微生物株を単離すること、あらかじめ単離された微生物株を解析に基づいて選択すること、及び／または解析に基づいて特定の微生物株をインキュベート／増殖させること、ならびに用途に基づいて特定の量／数及び／または比率及び／または媒体／担体（複数可）で株を含むように株を組み合わせて微生物アンサンブルを形成させること、を含み得る。アンサンブルは、それがレシピエントに影響を与える（例えば、乳産生を増加させる）ことができるような方法でそのアンサンブル中の微生物を送達することが可能になる適切な媒体、担体、及び／または医薬担体を含み得る。
【０１７０】
特有の第１のマーカーの数の測定は、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定すること、各試料における特有のＲＮＡマーカーの数を測定すること、各試料における特有のタンパク質マーカーの数を測定すること、及び／または各試料における特有の代謝物マーカーの数を測定すること（各試料における特有の脂質マーカーの数を測定すること、及び／または各試料における特有の糖質マーカーの数を測定することを含む）を含み得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、を含む。特有の第１のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含み得る。特有の第１のマーカーは、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを付加的または代替的に含み得る。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定は、各試料における少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含むと共に、試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含み得る。遺伝子発現解析は、シークエンシング反応、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含み得る。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料またはその一部を質量分析に供すこと、及び／または各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングもしくはリボソームプロファイリングに供すこと、を含む。１つまたは複数の微生物型には、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせが含まれ、１つまたは複数の微生物株には、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせが含まれる。１つまたは複数の微生物株は、１つもしくは複数の真菌種もしくは真菌亜種であり得、及び／または１つもしくは複数の微生物株は、１つもしくは複数の細菌種もしくは細菌亜種であり得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、各試料における１つまたは複数の微生物型のそれぞれの数の決定は、各試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む。
【０１７５】
特有の第１のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、β−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含み得る。特有のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、ゲノムＤＮＡをゲノムシークエンシングに供すこと、及び／またはゲノムＤＮＡをアンプリコンシークエンシングに供すこと、を含み得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの異なる特徴は、第１の試料の取得時間と第２の試料の取得時間とが異なるように少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得時間と、第１の試料の取得位置と第２の試料の取得位置とが異なるように少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得位置（地理的な位置差異及び／または個々の試料標的／動物取得差異）と、を含む。少なくとも１つの共通の特徴は、第１の試料の試料源型と第２の試料の試料源型とが同一である試料源型を含み得る。試料源型は、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、植物部分型、及び／または同様のもの、のうちの１つであり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通の特徴は、少なくとも２つの試料のそれぞれが消化管試料であることを含み、こうした消化管試料は、いくつかの実施態様では、ルーメン試料であり得る。いくつかの実施態様では、本明細書で提供される共通／異なる特徴は、代替として、ある特定の試料の間の異なる／共通の特徴であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通の特徴は、動物試料源型を含むと共に、各試料は、追加の共通の特徴を含み、その結果、各試料は、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料である。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、上記の方法は、少なくとも１つの測定メタデータに基づいて標的から少なくとも１つの追加の試料を取得することをさらに含み得、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料は、少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通の特徴を共有する。次に、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在が検出され、１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数が決定され、特有の第１のマーカーの数及びその量が測定され、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とが統合されることで、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数が得られ、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーが測定されることでその微生物株の活性レベルが決定され、決定された活性によって絶対細胞数がフィルタリングされることで、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料ついての活性微生物株のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数が得られる。そのような実施形態では、少なくとも２つの群からの少なくとも１つの微生物株の選択は、標的に由来する少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株（複数可）のセットまたはリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に基づくものであり、その結果、形成されるアンサンブルは、少なくとも１つのメタデータに対応する標的の特性を変えるように構成される。例えば、そのような実施態様が使用されるのであれば、ホルスタイン乳牛から取得された試料と、ジャージー乳牛または水牛から取得された標的試料と、から微生物アンサンブルを明らかにすることができ、元の試料及び標的試料（複数可）に由来する同一または同様の微生物株の間の同一、実質的に同様、または同様のネットワーク関連性が解析によって明らかにされる。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の比較は、各試料における１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定することを含む。少なくとも１つの測定メタデータは、１つまたは複数のパラメータを含み得、１つまたは複数のパラメータは、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、試料源の体重、試料源の飼料摂取量、試料源の体重増加、試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせ、のうちの少なくとも１つである。パラメータは、試料源によって産生する乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量も含み得る。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、各試料における、１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現の決定は、２つ以上の試料セットにおけるメタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して不均一微生物コミュニティ（複数可）の１つまたは複数のネットワークを示すことを含み得る。１つまたは複数の活性微生物株と、少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定し、活性微生物株を分類することは、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するためのネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み得、ネットワークは、共通の特徴、測定メタデータ、及び／または関連環境パラメータを共有する少なくとも２つの試料がまとまったものを示す。ネットワーク解析及び／またはクラスター解析は、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含み得る。クラスター解析は、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、及び／または重心モデルを構築することを含み得る。ネットワーク解析は、いくつかの実施態様では、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、それらの組み合わせ、及び／または同様のものを介するネットワーク（複数可）の予測モデリングを含み得る。ネットワーク解析は、微分方程式に基づく集団のモデリング及び／またはＬｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含み得る。解析は、ヒューリスティックな方法であり得る。いくつかの実施形態では、解析は、Ｌｏｕｖａｉｎ法であり得る。ネットワーク解析は、変数間の連結度を確立するためのノンパラメトリック法、及び／または連結度を確立するための、変数間の相互情報量及び／または最大情報係数の計算を含み得る。
【０１８０】
いくつかの実施形態については、環境の特性または特徴を変えるように構築された活性微生物株のアンサンブルを２つ以上の試料セットに基づいて形成するための方法であって、当該２つ以上の試料セットが、当該２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有し、かつ当該２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの異なる環境パラメータを有するものであり、各試料セットが、不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の生物型の亜分類群である方法は、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、及び各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、を含み、特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである。次に、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルがタンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで測定され、特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーであり、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回る発現レベルに基づいて各試料について検出された微生物株の活性が決定され、１つまたは複数の第１のマーカーの量と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数が計算され、１つまたは複数の活性微生物株は、特定した閾値を上回って特有の第２のマーカーを発現する。次に、試料における活性微生物株と少なくとも１つの環境パラメータとの共出現が、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づいて決定され、ネットワークは、少なくとも２つ以上の試料セットが少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータと共にまとまったものである。ネットワーク解析に基づいて１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株が選択され、選択された複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルが形成され、活性微生物株のアンサンブルは、その活性微生物株のアンサンブルが環境に導入されたときにその環境の特性または特徴を選択的に変えるように構成される。いくつかの実施態様については、第１の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定識別指標は、第２の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標とは異なる。例えば、試料／試料セットが乳牛に由来するのであれば、第１の試料セットは、牧草食が与えられた乳牛に由来し得、一方、第２の試料セットは、トウモロコシ食が与えられた乳牛に由来し得る。１つの試料セットは、単一の試料であり得るが、代替的に、複数の試料でもあり得、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標は、実質的に同様であり（例えば、１つのセット中の試料はすべて、牧草飼料を摂取する群れから取得されたものである）、１つの試料セットについての平均測定識別指標は、別の試料セットに由来する平均測定識別指標と異なる（第１の試料セットは、牧草飼料を摂取する群れに由来し、第２の試料セットは、トウモロコシ飼料を摂取する群れに由来する試料である）。解析において考慮される差異及び類似性が追加で存在し得、こうした差異及び類似性は、品種の差異、食物の差異、能力の差異、年齢の差異、飼料添加物の差異、成長段階の差異、生理学的特徴の差異、健康状態の差異、標高（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）の差異、環境温度の差異、季節の差異、抗生物質の差異などである。いくつかの実施形態では、各試料セットは、複数の試料を含み、第１の試料セットは、第１の集団から取得され、第２の試料セットは、第２の集団から取得され、一方、追加または代替の実施形態では、各試料セットは、複数の試料を含み、第１の試料セットは、第１の時点で第１の集団から取得され、第２の試料セットは、第１の時点とは異なる第２の時点で第１の集団から取得される。例えば、第１の試料セットは、牧草飼料を摂取中のウシの群れから第１の時点で取得することができ、第２の試料セットは、第１の試料セットが取得された直後から群れの飼料がトウモロコシに切り替わっている第２の時点（例えば、２ヶ月後）に取得することができる。そのような実施形態では、試料を取得し、集団に対する解析を実施することができ、及び／または個々の動物に対する固有の照会情報を試料に含めることができ、その結果、ある一定期間にわたって個々の動物に生じた変化を特定できるようになり、粒度レベルが高まったデータが得られる。いくつかの実施形態では、生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを２つ以上の試料（または試料セット（それぞれのセットは、少なくとも１つの試料を含む））に基づいて形成するための方法であって、それぞれが複数の環境パラメータ（及び／またはメタデータ）を有し、複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータが、２つ以上の試料または試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータが、２つ以上の試料または試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータであり、各試料セットが、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、活性微生物株の少なくとも１つが、１つまたは複数の生物型の亜分類群である方法は、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーのレベル（例えば、発現レベル）を測定すること（特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回るレベル（例えば、発現レベル）に基づいて、各試料について検出された微生物株のそれぞれの活性を決定して１つまたは複数の活性微生物株を同定すること、１つまたは複数の特有の第１のマーカーのそれぞれの量（相対量、比例量、割合量など）と、１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元のそれぞれまたは対応する微生物型の絶対細胞数と、から、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（計算は、乗算、ドット演算子、及び／または他の操作などの数値演算である）（１つまたは複数の活性微生物株は、特定した閾値を上回って１つまたは複数の特有の第２のマーカーを有するか、または発現する）、２つ以上の試料セットの活性微生物株を解析すること（解析は、２つ以上の試料セットのそれぞれの活性微生物株のそれぞれと、少なくとも１つの共通環境パラメータと、少なくとも１つの異なる環境パラメータと、のノンパラメトリックネットワーク解析を実施することを含み、ノンパラメトリックネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、及びそれぞれの活性微生物株と少なくとも１つの異なる環境パラメータとの間の最大情報係数スコアを決定すること、を含む）、ノンパラメトリックネットワーク解析に基づいて１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに選択された複数の活性微生物株及び微生物担体媒体を含む活性微生物株の合成アンサンブルを形成させること（活性微生物株のアンサンブルは、その活性微生物株の合成アンサンブルが生物学的環境に導入されると、その生物学的環境の特性を選択的に変えるように構成される）、を含む。実施形態または実施態様に応じて、少なくとも２つの試料または試料セットは、３つの試料、４つの試料、５つの試料、６つの試料、７つの試料、８つの試料、９つの試料、１０の試料、１１の試料、１２の試料、１３の試料、１４の試料、１５の試料、１６の試料、１７の試料、１８の試料、１９の試料、２０の試料、２１の試料、２２の試料、２３の試料、２４の試料、２５の試料、２６の試料、２７の試料、２８の試料、２９の試料、３０の試料、３５の試料、４０の試料、４５の試料、５０の試料、６０の試料、７０の試料、８０の試料、９０の試料、１００の試料、１５０の試料、２００の試料、３００の試料、４００の試料、５００の試料、６００の試料、及び／または同様のものを含み得る。試料の総数は、実施形態／実施態様に応じ得るものであり、５未満、５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００未満、１００超、２００未満、２００超、３００未満、３００超、４００未満、４００超、５００未満、５００超、１０００未満、１０００超、５０００未満、１００００未満、２００００未満などであり得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの共通または関連する環境因子には、栄養素情報、食物情報、動物特徴、感染情報、健康状態、及び／または同様のものを含む。
【０１８２】
少なくとも１つの測定識別指標は、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、試料源の体重、試料源の飼料摂取量、試料源の体重増加、試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、試料源の産生特徴、試料源によって産生する乳汁における乳清タンパク質の存在量、試料源によって産生するカゼインタンパク質の存在量、及び／または試料源によって産生する乳汁における脂肪の存在量、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１８３】
各試料における特有の第１のマーカーの数の測定は、実施形態に応じて、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定すること、特有のＲＮＡマーカーの数を測定すること、及び／または特有のタンパク質マーカーの数を測定すること、を含み得る。複数の微生物型は、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、各試料における微生物型のそれぞれの絶対数の決定は、シークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動及び／またはフローサイトメトリーに、試料またはその一部を供すことを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の微生物型の亜分類群である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の細菌種または細菌亜種である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の真菌種または真菌亜種である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの特有の第１のマーカーは、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、ベータ−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、特有の第１のマーカーの数及びその量の測定は、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すこと、及び／または各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すこと、を含む。いくつかの実施態様では、特有の第１のマーカーは、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカーを含み得る。いくつかの実施態様では、特有の第１のマーカーは、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組み合わせを含み得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含み、いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は、シークエンシング反応を含む。いくつかの実施態様では、遺伝子発現解析は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、質量分析、メタリボソームプロファイリング、及び／またはリボソームプロファイリングに、各試料またはその一部を供すことを含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定は、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリング（Ｒｉｂｏ−Ｓｅｑ）に供すことを含む（例えば、Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，Ｓ．Ｇｈａｅｍｍａｇｈａｍｉ，Ｊ．Ｒ．Ｎｅｗｍａｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ，２００９，“Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４：２１８−２２３、Ｉｎｇｏｌｉａ，Ｎ．Ｔ．，２０１４，“Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：ｎｅｗ  ｖｉｅｗｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｏｄｏｎｓ  ｔｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｃａｌｅ”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１５：２０５−２１３を参照のこと（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のための参照によってその全体が組み込まれる））。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは、ゲノムスケールでインビボのタンパク質合成を決定するために使用することができる分子手法である。この方法では、フットプリントリボソームによるｍＲＮＡとの結合及び相互作用に伴ってそれを介してどの転写物が活発に転写中であるかが直接的に測定される。次に、ｍＲＮＡの被結合領域が処理され、ハイスループットシークエンシング反応に供される。Ｒｉｂｏ−ｓｅｑは、定量的プロテオミクスと強い相関を有することが示されている（例えば、Ｌｉ，Ｇ．Ｗ．，Ｄ．Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，Ｃ．Ｇｒｏｓｓ，ａｎｄ  Ｊ．Ｓ．Ｗｅｉｓｓｍａｎ．２０１４“Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒａｔｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ  ａｌｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ”Ｃｅｌｌ  １５７：６２４−６３５を参照のこと（参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる））。
【０１９０】
試料の取得源の型は、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つであり得る。いくつかの実施態様では、各試料は、消化管試料及び／またはルーメン試料である。いくつかの実施態様では、試料は、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、組織試料、及び／または器官試料であり得る。
【０１９１】
実施態様に応じて、本開示の微生物アンサンブルは、２つ以上の実質的に純粋な微生物または微生物株（所望の微生物／微生物株の混合物）を含み得、標的に投与（例えば、マイクロバイオータを回復させるために動物に投与）することができる任意の追加の成分も含み得る。本開示に従って調製される微生物アンサンブルは、微生物が標的環境（例えば、動物の消化管であり、この場合、アンサンブルは、低ｐＨに抵抗性であり、消化管環境において増殖するように構成される）で生き延びることを可能にする物質と共に投与することができる。いくつかの実施形態では、微生物アンサンブルは、１つまたは複数の所望の微生物または微生物株の数及び／または活性を増加させる１つまたは複数の物質を含み得、当該株は、アンサンブルに含められる微生物／株の中に存在する株であるか、またはそこに存在しない株である。そのような物質の例には、限定はされないが、フルクトオリゴ糖（例えば、オリゴフルクトース、イヌリン、イヌリン型フルクタン）、ガラクトオリゴ糖、アミノ酸、アルコール、及びそれらの混合物が含まれる（Ｒａｍｉｒｅｚ−Ｆａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．４：１−１０、及びＰｏｏｌ−Ｚｏｂｅｌ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  ２００７．Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３７：２５８０−２５８４  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌを参照のこと（これらの文献はそれぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる））。
【０１９２】
本開示の方法によって同定される微生物株は、培養／増殖させてからアンサンブルに含めることができる。そのような増殖のために培地を使用することができ、こうした培地には、微生物の増殖を支援する上で適した任意の培地が含まれ得、その例には、限定はされないが、ガストリン添加寒天、ＬＢ培地、血清、及び／または組織培養ゲルを含めて、天然または人工のものが含まれる。培地は、単独で使用するか、または１つもしくは複数の他の培地と併用できることを理解されよう。培地は、外来栄養素を添加して使用するか、または外来栄養素を添加せずに使用することもできる。培地は、追加の化合物または成分で改変するか、または濃度を高めることができ、こうした化合物または成分は、例えば、微生物及び／またはその株の特定の群の相互作用及び／または選択を支援し得る成分である。例えば、抗生物質（ペニシリンなど）または滅菌剤（例えば、第四級アンモニウム塩及び酸化剤）が含められ得、及び／または物理的条件（塩分、栄養素（例えば、有機ミネラル及び無機ミネラル（リン、窒素塩、アンモニア、カリウム、及び微量栄養素（コバルト及びマグネシウムなど）など）、ｐＨ、及び／または温度など）が改変され得る。
【０１９３】
上で議論されるように、本開示に従ってシステム及び装置を構成することができ、いくつかの実施形態では、こうしたシステム及び装置は、プロセッサ及びメモリを含み得、このメモリにプロセッサ可読命令／発行可能命令を保存することで方法（複数可）が実施される。１つの実施形態では、システム及び／または装置は、方法を実施するように構成される。方法のプロセッサの実施態様もまた開示され、このことは、図３Ａを参照して議論される。例えば、プロセッサによって実施される方法は、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料から試料データを受け取ること、各試料について各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を決定すること、１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を決定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、それぞれの微生物型の数と第１のマーカーの数とを、１つまたは複数のプロセッサを介して統合して各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルを決定すること（微生物株は、その株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると同定する）、決定された活性によってそれぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のフィルタリングされた絶対数を１つまたは複数のプロセッサを介して解析し、機能、予測機能、及び／または化学に基づいて活性微生物株を分類すること、分類に基づいて複数の活性微生物株を同定すること、ならびに同定された複数の活性微生物株を出力すること（当該同定された複数の活性微生物株は、標的に適用されると少なくとも１つの測定メタデータに対応する標的の特性を変えるように構成された活性微生物を構築するためのものである）、を含み得る。いくつかの実施形態では、出力は、合成及び／またはトランスジェニックの微生物及び微生物株の生成、合成、評価、及び／または試験において利用することができる。いくつかの実施形態は、方法（複数可）の実行を実現及び／または促進するための命令が保存されたプロセッサ可読かつ非一過性のコンピュータ可読媒体を含み得る。いくつかの実施形態では、本開示による解析方法及びスクリーニング方法、装置、及びシステムは、問題の微生物及び株（病原体など）の同定に使用することができ、このことは、後述の実施例４において議論される。そのような状況では、試料のネットワーク解析において既知の症状メタデータ（病変スコアなど）が使用されることが想定される。
【０１９４】
宿主の状態及び表現型は、宿主中に存在するマイクロバイオームの組成と本質的に関連し得る。こうした組成の測定値を宿主データと関連付けて学習することで、患者の転帰及び状態変化を正確に予測するためのバイオマーカーを同定することができる。状態を決定するために使用される診断ツールでは、取得が容易な試料を利用することができ、こうした診断ツールの適用及び解析に要する時間は短いことから、いくつかの実施形態では、こうした診断ツールは、培養を利用する方法を代替するための候補となる。
【０１９５】
マイクロバイオームの遺伝子型／表現型の測定に利用できる方法にはさまざまなものが存在し、こうした方法には、限定はされないが、メタボロミクス、アンプリコンメタゲノミクス、メタゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、及び／またはプロテオミクスが含まれる。一方で、それぞれの測定値は、横列が試料を示し、縦列が測定項目を示す表に分解される。例えば、アンプリコンメタゲノミクスは、横列が試料、縦列がＯＴＵ（すなわち、微生物）の表に分解され、この表には、その試料の測定値がまとめられる。場合によっては、測定変数は、特徴と呼ばれ、表は、特徴ごとに試料の次元を有する。測定値の表は、標的データと称すことができ、各試料に関する外部データは、ラベルと称される。ラベルデータは、標的横列に対応するように並べることができ、少なくとも１つの縦列（複数可）を含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態によれば、いくつかの診断方法における最初の段階は、標的データセットを前処理することを含む。測定特異的な場合、及び測定／モデル特異的な場合はさらにいっそう、さまざまな正規化方法を使用することが可能であり得る。そのような場合、表は、著しい異常値を含み得、他の試料には見られない高存在量の特徴によって１つの試料が外れる。著しい異常値を含む試料が存在すると、モデルの能力が不十分なものになり得る。本明細書では、異常値に対処するためのさまざまな方法が開示され、こうした方法は、データセットを補正して異常値の影響を最小化するもの、または異常値を完全に除外するものなどである（例えば、Ｉｇｌｅｗｉｃｚ  １９８３、Ａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．１９８２、Ｊａｎｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９５、Ｇｉｒｍａｎ  １９９４、ＭｃＬａｃｈｌａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｅｌ  ２００４（それぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）。多くの値が欠損している疎データからも異常値は生じ得、こうしたことは、生物学的な測定では一般的なことであり得る。これは、マトリックス補完、マトリックス分解、及び／または欠損値の近似を可能にする他の方法論を介して補正することができる（例えば、Ｋｅｓｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９、Ｋａｐｕｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６、Ｍａｚｕｍｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０（それぞれ、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）。絶対量が不明な場合、組成に補正を実施することができ、この補正は、例えば、有心対数比変換及び逆対数比変換を使用して実施される（例えば、Ｍｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１７を参照のこと）。場合によっては、ラベルの特定のセットに関するシグナルから、関連性を有さない特徴を、特徴選択を介して大幅に低減することができる（例えば、Ｂａｒａｎｉｕｋ  ２００７を参照のこと）。特徴選択では、関連性の尺度（ＭＩＣ及びＨｏｆｆｄｉｎｇなど）が活用される。一方で、関連性を有さないと見なされる特徴を除外するか、またはその重みを低く付け、重要度が高い特徴の重みを高く付ける特徴抽出方法が多く存在する。
【０１９７】
いくつかの実施形態によれば、開示の方法の一部として機械学習を利用することができ、具体的には、ラベルと関連する標的データにおける機構の決定においても、ラベルと関連する標的データにおけるバイオマーカーの発見においても、機械学習を使用することができる。機械学習は、教師あり機械学習方法及び教師なし機械学習方法へと下位分類することができる。教師あり機械学習では、モデルの開発と検証との両方を行うためのモデリング処理へとラベルが直接的に統合される。教師なし機械学習は、ラベルが不明であるか、または組み込まれないクラスの機械学習を言い表すものであり、純粋に標的データ特徴に基づいてデータが解析される。
【０１９８】
教師なし機械学習は、試料間または特徴間で標的データの固有構造を測定するための方法を多く含む。ほとんどの教師なし機械学習方法（多様体学習（Ｃｒｉｍｉｎｉｓｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）、クラスタリング（Ｋｌｕｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、及び分解（Ｂｏｕｗｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）など）の主な目標は、データにおける固有ラベルの数を決定することである。こうした方法は、診断ツールでは、次元削減において使用されることが最も一般的であり、次元削減では、視覚化可能な低次元（すなわち、１〜３次元）で標的データにおける試料を見ることができる。マイクロバイオームでは、使用される最も一般的な次元方法は、異なる距離マトリックスに対する主座標分析（ＰＣｏＡ）（Ｌｏｚｕｐｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、主成分分析（Ｊｏｌｌｉｆｆｅ  １９８６）、及び線形判別分析（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．２００５）である。さらに、ＰＣｏＡ次元削減手法の場合を除くすべての手法を、教師あり機械学習に対する前処理段階として使用することができる。
【０１９９】
教師あり機械学習は、広い方法分類であるが、本明細書に開示される特定の方法（限定はされないが、下記のものを含む）は、本開示のマイクロバイオーム関連解析に特に有用である。教師あり機械学習のクラス及び予測モデルのカテゴリーの中には、回帰と分類という２つのサブカテゴリーが存在する。回帰は、ラベルが連続的である場合を表す。分類は、あり得るラベル数が２つの場合は二項的であり得、または存在し得るラベル数がいくつかある場合は多クラスであり得る。いずれの所見分類においても、ラベルはそれぞれ、任意の所与の縦列に２回以上出現しなくてはならない。
【０２００】
いくつかの実施形態では、標的データが必要に応じて前処理されることでモデル最適化が最大化され、欠損エントリーを含まないようにラベルデータが処理される。次に、ラベルデータにおけるそれぞれの縦列が分離され、連続回帰、二項分類、または多クラス分類のいずれかとして評価される。サブクラスに応じて方法が決定され、この決定は、限定はされないが、一般に、ランダムフォレスト（Ｂｒｅｉｍａｎ  ２００１）、最近傍（Ｉｎｄｙｋ  ａｎｄ  Ｍｏｔｗａｎｉ  １９９８）、ニューラルネットワーク（教師あり）（Ｍφｌｌｅｒ  １９９３）、サポートベクターマシン（Ｓｍｏｌａ  ａｎｄ  Ｓｃｈｏｌｋｏｐｆ  ２００４）、またはガウス過程（Ｎｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）を使用して実施される。標的及びラベルのデータをトレーニングデータセット（例えば、８０％）及び試験データセット（例えば、２０％）に分割することによってモデルが交差検証される。この交差検証は、反復して実施され、それぞれの反復実施時に特徴及び試料を（分割）シャッフルして実施される。それぞれの反復実施時に、トレーニングデータから標的データへの予測の間でモデル能力の評価基準が計算される（Ｔａｙｌｏｒ  ２００１）。能力評価基準は、モデルのパラメータの調整（ハイパーパラメータ調整とも呼ばれる）と、モデルの予測力の検証と、の両方に使用される。
【０２０１】
予測力の高いモデルが得られた後に、ハイスループットバイオマーカープローブに加えて、自動化予測プラットフォームが開発される。いくつかの実施形態では、測定値の全コミュニティが利用されることで、正確な結果が得られ、この場合、入力測定値が予測の生成に使用される。開発された予測モデルは、既知のデータセット全体でのトレーニング後に、新たなデータからラベルを予測するために使用される。関連する信頼性及び確率分布と共に予測を得ることができる。このことは、入力試料から予測を視覚化する自動機能において実施することができる。いくつかの実施形態では、特徴選択またはモデルによって、高い予測力を有する小さな亜群または単一の特徴が明らかになる。そのような実施形態では、ハイスループットプローブを開発することで、予測と関連する特徴を迅速に同定することができる。例えば、アンプリコンメタゲノミクスの場合、単一の微生物または微生物の小コミュニティによって状態を直接的に決定し、患者の転帰を予測することができる。ハイスループットプローブは、特定の特徴の存在量または存在を明らかにすることができるリアルタイムＰＣＲプライマーであり得る。
【０２０２】
本明細書に記載のシステム及び方法は、ソフトウェア（メモリに保存されたもの及び／またはハードウェアで実行されるもの）、ハードウェア、あるいはそれらの組み合わせによって実施できることが意図される。ハードウェアコンポーネント及び／またはハードウェアモジュールには、例えば、汎用プロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、及び／または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が含まれ得る。ソフトウェアコンポーネント及び／またはソフトウェアモジュール（ハードウェアで実行されるもの）は、さまざまなソフトウェア言語（例えば、コンピュータコード）において表すことができ、こうしたソフトウェア言語には、Ｕｎｉｘ（登録商標）ユーティリティ、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｊａｖａ（登録商標）、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）（例えば、ＥＣＭＡＳｃｒｉｐｔ６）、Ｒｕｂｙ、ＳＱＬ、ＳＡＳ（登録商標）、Ｒプログラミング言語／ソフトウェア環境、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（商標）、ならびに他のオブジェクト指向型、手続き型、または他の型のプログラミング言語及び開発ツールが含まれる。コンピュータコードの例には、限定はされないが、マイクロコードまたはマイクロ命令、マシン命令（コンパイラによって生成されるものなど）、ウェブサービスを生成するために使用されるコード、及びインタプリタを使用するコンピュータによって実行される高レベルの命令を含むファイルが含まれる。コンピュータコードの追加の例には、限定はされないが、制御信号、暗号化コード、及び圧縮コードが含まれる。
【０２０３】
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、非一過性のコンピュータ可読媒体（非一過性のプロセッサ可読媒体またはプロセッサ可読メモリとも称され得る）を備えたデバイスに関し、こうした非一過性のコンピュータ可読媒体は、コンピュータによって実行されるさまざまな操作を実施するための命令またはコンピュータコードがそこに存在するものである。コンピュータ可読媒体（またはプロセッサ可読媒体）は、一過性に伝搬する信号（例えば、送信媒体（空間またはケーブルなど）上で情報を運ぶ伝搬性の電磁波）自体をそれが含まないという意味において非一過性である。媒体及びコンピュータコード（コードとも称され得る）は、特定の目的（複数可）のために設計及び構築されるものであり得る。非一過性のコンピュータ可読媒体の例には、限定はされないが、磁気記憶媒体（ハードディスク、フロッピー（登録商標）ディスク、及び磁気テープなど）、光記憶媒体（コンパクトディスク／デジタルビデオディスク（ＣＤ／ＤＶＤ）、コンパクトディスク−読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、及びホログラフィックデバイスなど）、磁気光学記憶媒体（光ディスクなど）、搬送波信号処理コンポーネント及び／または搬送波信号処理モジュール、ならびにプログラムコードを保存及び実行するように特別に構成されたハードウェアデバイス（特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、プログラマブル論理デバイス（ＰＬＤ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、及びランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）デバイスなど）が含まれる。本明細書に記載の他の実施形態は、コンピュータプログラム製品に関し、こうしたコンピュータプログラム製品は、例えば、本明細書で議論される命令及び／またはコンピュータコードを含み得る。
【０２０４】
図３Ａのさまざまな実施形態が上に説明されているが、こうした実施形態は、例として示されているものにすぎず、限定ではないことを理解されよう。上記の方法及び段階が、ある特定の順序で生じるある特定の事象を示す場合、ある特定の段階の順序を改変することができる。さらに、ある特定の段階を、可能なときは並行処理で同時に実施することも、上記のように連続的に実施することもできる。特定の特徴及び／または構成要素の組み合わせを有するものとしてさまざまな実施形態が記載されているが、本明細書に記載の実施形態のいずれかに由来する任意の特徴及び／または構成要素の任意の組み合わせまたは部分的組み合わせを有する他の実施形態も可能である。さらに、特定の計算デバイスと関連する特定の実体を有するものとしてさまざまな実施形態が記載されるが、他の実施形態では、他の計算デバイス及び／または異なる計算デバイスと関連する実体は異なり得る。
【実施例】
【０２０５】
実験データ及び実施例
本開示は、下記の実験データ及び実施例を参照することによってさらに示される。しかしながら、こうした実験データ及び実施例は、上記の実施形態のように、例示的なものであり、いかなる様式においても本開示の範囲の限定であると解釈してはならないことに留意されたい。
【０２０６】
実施例１
図２に示される段階を参照する。
【０２０７】
２０００：乳牛のルーメン試料に由来する細胞をマトリックスから剥離する。この処理は、超音波処理またはボルテックス処理を介して試料を激しくブレンドまたは混合した後、細胞からマトリックスを除去するために分画遠心分離法に供すことによって実施できる。遠心分離は、ＮｙｃｏｄｅｎｚまたはＰｅｒｃｏｌｌを使用する勾配遠心分離段階を含み得る。
【０２０８】
２００１：特定の生物型を標的とする蛍光色素を使用して生物を染色する。フローサイトメトリーを使用することによって、染色特性及びサイズに基づいて異なる集団を判別する。
【０２０９】
２００２：試料における生物の絶対数を、例えばフローサイトメトリーによって、決定する。この段階では、所与の体積中にどのくらい多くの生物型（細菌、古細菌、真菌、ウイルス、または原生生物など）が存在するかについての情報が得られる。
【０２１０】
２００３：乳牛のルーメン試料を取得し、マトリックスに接着した細胞を、ビーズ破砕を介して直接的に溶解させる。全核酸を精製する。全精製核酸をＲＮＡｓｅで処理して精製ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を得る。ｑＰＣＲを使用することで、バルクのｇＤＮＡから特定のマーカーを増幅すると同時に、それぞれのマーカーにシークエンシングアダプター及びバーコードを付加する。指数関数的な増幅の初期にｑＰＣＲ反応を停止することで、ＰＣＲと関連する偏りを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑを使用してマルチプレックスシークエンシングを実施する。
【０２１１】
２００４：マトリックスに接着した乳牛ルーメン試料から、ビーズ破砕を介して細胞を直接的に溶解させる。カラムに基づく手法を使用して全核酸を精製する。全精製核酸をＤＮＡｓｅで処理して精製ＲＮＡを得る。逆転写酵素を使用して全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換する。ｑＰＣＲを使用することで、バルクのｃＤＮＡから特定のマーカーを増幅すると同時に、それぞれのマーカーにシークエンシングアダプター及びバーコードを付加する。指数関数的な増幅の初期にｑＰＣＲ反応を停止することで、ＰＣＲと関連する偏りを最小化する。試料をプールし、プールした試料に対してＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑを使用してマルチプレックスシークエンシングを実施する。
【０２１２】
２００５：クオリティの低い塩基対及び切断型リードを除外することによってシークエンシング結果（ｆａｓｔｑファイル）を処理する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを使用してＤＮＡに基づくデータセットを解析し、現存データベースエントリーに対するシークエンシングリードのマッチングを行うことで、集団内の株を同定する。特有の配列は、データベースに追加する。カスタマイズしたＵＰＡＲＳＥパイプラインを使用してＲＮＡに基づくデータセットを解析する。最新データベースを使用して活性株を同定する。
【０２１３】
２００６：前の段階（２００５）で得た株独自性データを使用して、それぞれの株を示すリードの数を決定し、全リードに占める割合として示す。この割合に対して細胞数（２００２）を乗じることで、試料及び所与の体積におけるそれぞれの生物型の絶対細胞数を決定する。ＲＮＡに基づくデータセットに存在するマーカー配列を適切な閾値と共に使用して絶対細胞数データセット内において活性株を同定する。閾値を満たさない株は、解析から除外する。
【０２１４】
２００７：２００３〜２００６を繰り返すことで、複数の乳牛ルーメン内の微生物集団の動態を示す経時変化を確立する。時間的なデータを集計し、各試料についてのそれぞれの活性生物株の細胞数及びメタデータを量マトリックスまたは存在量マトリックスに保存する。量マトリックスを使用することで、量データで重み付けされるルールマイニング手法を使用して特定時点の試料における活性株間の関連性を明らかにする。フィルターを適用して、有意ではないルールを除外する。
【０２１５】
２００８：変化の方向性を加味した上で（すなわち、負の値は減少を示し、正の値は増加を示す）、活性株の経時的な細胞数変化を計算する。マトリックスをネットワークとして示し、ネットワーク中、生物株はノードを示し、量で重み付けされたルールはエッジを示す。マルコフ連鎖及びランダムウォークを活用して、ノード間の連結度を決定し、クラスターを定義する。所望のメタデータ（環境パラメータ（複数可））と関連するクラスターを同定するために、メタデータを使用してクラスターをフィルタリングする。経時的な細胞数変化と標的クラスターに存在する株とを統合することによって標的生物株を順位付けし、細胞数変化が最も大きいものを最上位に順位付けする。
【０２１６】
実施例２
実験の設計及び材料及び方法
目的：乳牛における乳脂肪の産生に影響を与えるルーメン微生物コミュニティの構成要素を決定すること。
【０２１７】
動物：ルーメンにカニューレを挿入した泌乳ホルスタイン乳牛８頭を、実験で使用するための個別のタイストールに収容した。乳牛には、１日に２回の給餌及び１日に２回搾乳を実施し、乳牛が新鮮な水を自由に摂取できる状態を保った。１頭の乳牛（乳牛１）については、実験前の流産に起因して合併症が生じたため、食物起因性の乳脂肪量低下を最初に誘導した後に試験から除外した。
【０２１８】
実験の設計及び処理：実験では、２群及び１実験期間とするクロスオーバー設計を使用した。実験期間は３８日間に及ぶものとし、１０日間は共変動期間／ウォッシュアウト期間とし、２８日間はデータ収集及び試料取得のためのものとした。データ収集期間は、食物起因性の乳脂肪量低下（ＭＦＤ）の誘導期間が１０日間、回復期間が１８日間となる構成とした。第１の実験期間の後に、１０日間のウォッシュアウト期間をすべての乳牛に取らせてから期間２を開始した。
【０２１９】
デンプン分解性が高く（７０％が分解可能）、多価不飽和脂肪酸のレベルが高い（ＰＵＦＡ、３．７％）、低繊維含量（ＮＤＦ２９％）の完全混合飼料（ＴＭＲ）を用いて食物起因性のＭＦＤを誘導した。回復期間には、デンプン分解性が異なる２つの食物を使用した。繊維含量が高く（ＮＤＦ３７％）、ＰＵＦＡ含量が低く（２．６％）、デンプン分解性が高い（７０％が分解可能）回復用食物に対して４頭の乳牛を無作為に割り付けた。残りの４頭の乳牛には、繊維含量が高く（ＮＤＦ３７％）、ＰＵＦＡ含量が低い（２．６％）が、デンプン分解性が低い（３５％）回復用食物を与えた。
【０２２０】
１０日間の共変動期間中及び１０日間のウォッシュアウト期間中は、繊維含量が高く、ＰＵＦＡ含量が低く、デンプン分解性が低い食物を乳牛に与えた。
【０２２１】
試料及び測定：共変動期間、ウォッシュアウト期間、及び試料取得期間を通じて、乳産生量、乾物摂取量、及び飼料効率をそれぞれの動物について毎日測定した。ＴＭＲ試料については、栄養素組成の測定を実施した。取得期間中は、乳試料を取得し、３日ごとに分析した。試料の分析は、乳成分濃度（乳脂肪、乳タンパク質、ラクトース、乳中尿素窒素、体細胞数、及び固形分）ならびに脂肪酸組成について実施した。
【０２２２】
取得期間中は、ルーメン試料を取得し、微生物コミュニティの組成及び活性について３日ごとに分析した。食物起因性のＭＦＤから０日目、７日目、及び１０日目には、その日の給餌から０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、及び２２時間後に、ルーメンから集中的に試料を取得した。同様に、回復期間中は、１６日目及び２８日目に、その日の給餌から０時間後、２時間後、４時間後、６時間後、８時間後、１０時間後、１２時間後、１４時間後、１６時間後、１８時間後、２０時間後、及び２２時間後に、ルーメンから集中的に試料を取得した。ルーメン内容物の分析は、ｐＨ、酢酸濃度、酪酸濃度、プロピオン酸濃度、イソ酸濃度、ならびに長鎖及びＣＬＡ異性体の濃度について実施した。
【０２２３】
ルーメン試料の調製及びシークエンシング：ルーメン試料を取得後、スイングバケット型の遠心分離機においてルーメン試料の遠心分離（４，０００ｒｐｍ）を４℃で２０分間実施した。上清をデカントし、０．１ｍｍのガラスビーズを事前に充填した１．７ｍＬ滅菌チューブに一定分量のルーメン内容物試料（１〜２ｍｇ）をそれぞれ添加した。第２の一定分量を取得し、細胞計数用として空の１．７ｍＬ滅菌チューブに入れて保管した。
【０２２４】
ガラスビーズを含めたルーメン試料（第１の一定分量）を、ビーズ破砕を用いてホモジナイズして微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。空のチューブに入れたルーメン試料（第２の一定分量）を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。
【０２２５】
シークエンシングリードの処理及びデータ解析：シークエンシングリードのクオリティトリミング及び処理を実施することで、ルーメンに存在する細菌種をマーカー遺伝子に基づいて同定した。計数データセット及び活性データセットをシークエンシングリードと統合することで、ルーメン微生物コミュニティ内の活性微生物種の絶対細胞数を決定した。相互情報量を使用することによって、乳牛の産生特徴（産生した乳汁のポンドを含む）の経時変化を、実験過程にわたって各試料内の活性微生物の分布に関連付けた。産生した乳脂肪のポンドとそれぞれの活性微生物の絶対細胞数との間で最大情報係数（ＭＩＣ）スコアを計算した。ＭＩＣスコアによって微生物を順位付けし、ＭＩＣスコアが最も高い微生物を、産生した乳汁のポンドとの関連性が最も高い標的種として選択した。
【０２２６】
計数データ、活性データ、ならびに数及び活性が最終結果に与える影響を決定するための試験ケースを、シークエンシング解析から適切なデータセットを除外することによって実施した。ＭＩＣではなく線形相関を使用することが標的の選択に与える影響を評価するために、すべての微生物の相対存在量及び活性微生物の絶対細胞数に対する産生した乳脂肪のポンドのピアソン係数も計算した。
【０２２７】
結果及び考察
相対存在量と絶対細胞数との対比
【０２２８】
細胞数データを含めたデータセットについての上位１５の標的種（絶対細胞数、表２）及び細胞数データを含めないデータセットについての上位１５の標的種（相対存在量、表１）をＭＩＣスコアに基づいて同定した。標的の最終的な選択に対する細胞数データの影響を浮き彫りにするため、この解析では活性データは使用しなかった。最終的に、上位８つの標的は、２つのデータセットの間で同一であった。残りの７つのうちの５つの株は両方のリストに存在したが、その順序は異なった。これら５つの株は順位に差異が存在したにもかかわらず、それぞれの株に対して計算されたＭＩＣスコアは、２つのリストの間で同一であった。絶対細胞数リストには存在するが、相対存在量リストには存在しない２つの株（ａｓｃｕｓ＿１１１及びａｓｃｕｓ＿２８８）は、相対存在量リストではそれぞれ９１位及び１６位であった。相対存在量リストには存在するが、絶対細胞数リストには存在しない２つの株（ａｓｃｕｓ＿１０２及びａｓｃｕｓ＿２５２）は、絶対細胞数リストではそれぞれ５０位及び１９位であった。これら４つの株は、それぞれのリストでのＭＩＣスコアが実際に異なっており、したがってこのことは、それらの順位がシフトし、それに伴ってリスト中のその他の株に影響が及んだことの説明を与えるものである。
【０２２９】
【表１−１】
2020507308.tif 000008
【表１−２】
2020507308.tif 000009
【表１−３】
2020507308.tif 000010
【０２３０】
【表２−１】
2020507308.tif 000011
【表２−２】
2020507308.tif 000012
【０２３１】
細胞数データを統合することは、それぞれの株に割り当てられる最終的なＭＩＣスコアに常に影響を与えるものではなかった。このことは、微生物集団は、実際に、ルーメン内で毎日変化し、３８日間の実験期間にわたって変化してはいたものの、その変化は常に１０７〜１０８個細胞／ミリリットルの範囲内であったという事実に起因するものであり得る。集団の数の変化が増大すれば、最終的なＭＩＣスコアに影響が及ぶ範囲が拡大することは明らかであると想定される。
【０２３２】
不活性種と活性種との対比
【０２３３】
活性データに基づいて株をフィルタリングすることの影響を評価するために、活性データと共に相対存在量を活用したデータセット（表３）、及び活性データなしで相対存在量を活用したデータセット（表１）、ならびに活性データと共に絶対細胞数を活用したデータセット（表４）、及び活性データなしで絶対細胞数を活用したデータセット（表２）、から標的種を同定した。
【０２３４】
相対存在量の場合については、ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、ａｓｃｕｓ＿３４１、及びａｓｃｕｓ＿２５２は、活性データの適用前は、標的株であると見なされていた。これら８つの株（最初の上位１５の標的のうちの５３％）は、活性データの統合後は、上位１５から外れて下位に落ちた。同様の傾向が絶対細胞数の場合についても観測された。Ａｓｃｕｓ＿１２６、ａｓｃｕｓ＿１３６６、ａｓｃｕｓ＿１７８０、ａｓｃｕｓ＿２９９、ａｓｃｕｓ＿１１３９、ａｓｃｕｓ＿１２７、及びａｓｃｕｓ＿３４１（最初の上位１５の標的うちの４６％）は、活性データセットの統合後は、上位１５から外れて下位に落ちた。
【０２３５】
細胞数データセットと比較すると、活性データセットは、標的の順位及び選択に対してはるかに重大な影響を有していた。こうしたデータセットを共に統合するとき、試料が不活性であることが明らかになれば、その試料は本質的に「０」に変えられ、解析の一部とは見なされなくなる。この理由から、試料内の点の分布は、統合後に重度に改変または歪められた状態となり得、このことは、次に、最終的なＭＩＣスコア、ひいては標的微生物の順序に大きな影響を与える。
【０２３６】
【表３−１】
2020507308.tif 000013
【表３−２】
2020507308.tif 000014
【０２３７】
【表４−１】
2020507308.tif 000015
【表４−２】
2020507308.tif 000016
【０２３８】
相対存在量かつ活性なしと、絶対細胞数かつ活性ありとの対比
【０２３９】
最終的には、本明細書で定義される方法は、細胞数データと活性データとの両方を活用することで、関連するメタデータ特徴に高度に関連付けられる微生物を同定するものである。両方の方法（表４、表１）を使用して選択した上位１５の標的のうちで、両方のリストに見られたものは７株にすぎなかった。８つの株（５３％）は、絶対細胞数及び活性を含むリストに特有のものであった。両方のリストに存在する上位３つの標的は、株と順位との両方において一致した。しかしながら、３つのうちの２つは、両方のリストでＭＩＣスコアが異なっており、このことは、それらが活性データセットの統合によって影響を受けたものの、その影響は、それらの順位を覆すには十分ではなかったことを示唆している。
【０２４０】
線形相関手法とノンパラメトリック手法との対比
【０２４１】
産生した乳脂肪のポンドと各試料内の活性微生物の絶対細胞数との間でピアソン係数及びＭＩＣスコアを計算した（表５）。ＭＩＣ（表５ａ）またはピアソン係数（表５ｂ）のいずれかによって株を順位付けすることで、乳脂肪産生との関連性が最も高い標的株を選択した。ＭＩＣスコアとピアソン係数との両方が、それぞれの場合において報告される。両方のリストに見られた株は６つであり、このことは、ＭＩＣ手法を使用することで特有の株が９つ（６０％）同定されたことを意味する。リスト間での株の順序は異なっており、それぞれの方法によって同定された上位３つの標的株もまた特有のものであった。
【０２４２】
ピアソン係数と同様に、ＭＩＣスコアは、０〜１の範囲にわたって報告されるものであり、１は、２つの変数の間で関連性が非常に強いことを示唆する。ここでは、上位１５の標的は、０．９７〜０．７４の範囲のＭＩＣスコアを示した。一方、この相関試験ケースに対するピアソン係数は、０．５３〜０．４５の範囲となり、相互情報量の試験ケースと比較すると実質的に低かった。この相違は、それぞれの解析方法に固有の差異に起因するものであり得る。相関は、直線の周りの点の分散を測定する線形推定である一方で、相互情報量では、確率分布が活用され、２つの分布の間の類似性が測定される。実験過程にわたって、産生した乳脂肪のポンドは、非線形的に変化した（図４）。この特定の関数については、相互情報量によって示され、近似が取られる方が、相関と比較して適している可能性がある。このことについて調べるために、相関及び相互情報量を使用して同定した上位の標的株（それぞれＡｓｃｕｓ＿７１３（図５）及びＡｓｃｕｓ＿７（図６））をプロットすることで、株と乳脂肪量との関連性をそれぞれの方法がどのくらい精度よく予測したかを決定した。２つの変数が強い相関を示すのであれば、互いに対してプロットすると点の分散がほとんどないか、または全くない１つの線によってそれら２つの変数が示される。図５では、Ａｓｃｕｓ＿７１３と乳脂肪量との相関は弱く、このことは、点が広範に拡散していることによって示される。重ねて記載すると、相互情報量は、２つの点分布がどのくらい類似するかを測定するものである。Ａｓｃｕｓ＿７を乳脂肪量と共にプロットすると（図６）、これら２つの点の分布が非常に類似していることが明らかである。
【０２４３】
全体としての本発明の方法と従来の手法との対比
【０２４４】
微生物コミュニティを解析する従来の手法は、活性情報を取り込むことなく相対存在量データを使用することに依存しており、最終的に、メタデータに対する微生物種の単純な相関を得て終わるものである（例えば、米国特許第９，２０６，６８０号（当該文献は、あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。本明細書では、我々は、それぞれのデータセットを取り込むことが標的の最終リストにどの程度の影響を付加的に及ぼすかを示している。本明細書に記載の方法が、その全体として適用されると、従来の方法と比較して完全に異なる標的セットが本明細書に記載の方法によって選択された（表５ａ及び表５ｃ）。従来の手法を使用すると標的株として最上位に選択されたＡｓｃｕｓ＿３０３８を、乳脂肪量に対してプロットして相関の強度を可視化した（図７）。前述の例のように、乳脂肪量に対してＡｓｃｕｓ＿３０３８が示した相関もまた弱いものであった。
【０２４５】
表５：相互情報量または相関を使用したときの上位１５の標的株
【０２４６】
【表５ａ−１】
2020507308.tif 000017
【表５ａ−２】
2020507308.tif 000018
【０２４７】
【表５ｂ−１】
2020507308.tif 000019
【表５ｂ−２】
2020507308.tif 000020
【表５ｂ−３】
2020507308.tif 000021
【０２４８】
【表５ｃ−１】
2020507308.tif 000022
【表５ｃ−２】
2020507308.tif 000023
【表５ｃ−３】
2020507308.tif 000024
【０２４９】
実施例３
乳牛における総乳脂肪量、総乳タンパク質量、及びエネルギー補正乳量（ＥＣＭ）の増加
実施例３では、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算ＥＣＭを増加させることを目的とする特定の実施態様が示される。本明細書で使用されるように、ＥＣＭは、乳体積、乳脂肪、及び乳タンパク質に基づく乳汁中のエネルギー量を示す。ＥＣＭでは、乳成分が脂肪３．５％及びタンパク質３．２％に補正されることによって動物の能力が等しくなり、個々の動物及び群れのレベルで経時的に産生を比較することが可能になる。本開示と関連してＥＣＭの計算に使用される式は、以下のものである。
ＥＣＭ＝（０．３２７ｘ乳汁のポンド）＋（１２．９５ｘ脂肪のポンド）＋（７．２ｘタンパク質のポンド）
【０２５０】
開示の方法を利用して活性な相互関連微生物／微生物株を同定し、そこから微生物アンサンブルを生成して本明細書に示される方法論を適用すると、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することが実証されている。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【０２５１】
この実施例では、上記の開示に従って同定及び生成された２つの単離された微生物（Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙ）を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、Ａｓｃｕｓｂ＿Ｘ及びＡｓｃｕｓｆ＿Ｙを含む微生物アンサンブルを１日に１回、５週間投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、１日の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【０２５２】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【０２５３】
対照群への投与は、２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水を用いるものとし、実験群への投与は、２０ｍＬの中性緩衝生理食塩水に約１０９個の細胞を懸濁したもの用いるものとした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【０２５４】
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にあらゆる乳牛のルーメンから試料を取得し、ここでは微生物投与の前日を０日目とした。実験投与及び対照投与は、その日にルーメンから試料を取得した後に実施したことに留意されたい。ルーメンからの毎日の試料取得は０日目に開始し、取得したルーメン液にＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを挿入して記録を取った。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの中心領域、背側領域、腹側領域、前側領域、及び後側領域からカニューレを介して微粒子と液体との両方を取得するようにし、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止液（エタノール９５％、フェノール５％）を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールした。それぞれの試料取得日に糞便試料も取得し、糞便は、触診用スリーブを使用して直腸から取得した。それぞれの試料取得時に乳牛の体重を測定した。
【０２５５】
糞便試料を２オンスバイアルに入れ、凍結保管し、分析することで、見かけの中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）消化性の値、見かけのデンプン消化性の値、及び見かけのタンパク質消化性の値を決定した。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの液体部分と微粒子部分との両方を取得するようにし、それらのそれぞれを１５ｍｌのコニカルチューブに保管した。１０％の停止液（フェノール５％／エタノール９５％の混合物）で細胞を固定し、４℃に保ち、氷上に留めてＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送付した。
【０２５６】
乳産生量を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。乳組成（脂肪％及びタンパク質％など）を１日に２回（朝に１回及び夜に１回）測定した。タンパク質脂肪、固形分については近赤外線分光法で分析し、乳中尿素窒素（ＭＵＮ）及び体細胞数（ＳＣＣ）についてはＴｕｌａｒｅ  Ｄａｉｒｙ  Ｈｅｒｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＤＨＩＡ）（Ｔｕｌａｒｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で分析して、乳試料をさらに分析した。個々の乳牛の飼料摂取量及びルーメンのｐＨを１日に１回決定した。
【０２５７】
完全混合飼料（ＴＭＲ）の試料を適用期間の最終日に取得し、その後は１週間に１回の取得を続けた。試料取得は四分法を用いて実施し、試料は真空密封バッグに保管し、この真空密封バッグをＣｕｍｂｅｒｌａｎｄ  Ｖａｌｌｅｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（Ｈａｇｅｒｓｔｏｗｎ，ＭＤ）に送付し、ＮＩＲ１パッケージによる分析を実施した。緩衝液及び／または微生物バイオアンサンブルの最終投与日は３５日目としたが、他の測定及び試料取得はすべて、４６日目まで記載のように継続した。
【０２５８】
図８Ａは、開示の方法に基づいて微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳脂肪産生量が２０．９％増加したことを示す。図８Ｂは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、緩衝液単独物を投与した乳牛と比較して平均乳タンパク質産生量が２０．７％増加したことを示す。図８Ｃは、微生物アンサンブルを投与した乳牛では、平均エネルギー補正乳産生量が１９．４％増加したことを示す。図８Ａ〜Ｃに見られる増加は、アンサンブルの投与を停止（データ点を横切る垂直線によって示される）した後は、顕著さが低下した。
【０２５９】
実施例４
ブロイラーにおける病変形成の原因病原体としてのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの検出
さまざまなレベルのＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを１６０羽の雄性Ｃｏｂｂ５００に投与した（表６ａ）。これらの雄性Ｃｏｂｂ５００を２１日間飼育し、屠殺し、病変スコアを付けることで、壊死性腸炎の進行及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの影響を定量化した。
【０２６０】
【表６ａ−１】
2020507308.tif 000025
【表６ａ−２】
2020507308.tif 000026
【０２６１】
実験設計
【０２６２】
環境的に制御された施設内にトリを収容し、木の床の飼育領域（約４フィート×４フィートからフィーダースペース用の２．２５平方フィートを引いた領域）にトリを入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を［約０．６９平方フィート／トリ］とし、温度、照明、フィーダー、及び水を供給した。木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れ、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。試験中に、試験用のトリにとっての快適な条件としては木くずが湿気を帯びすぎた状態となった場合は、追加の木くずを飼育領域に加えた。照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを下記のように使用した。
【０２６３】
【表６ｂ】
2020507308.tif 000027
【０２６４】
トリに対する環境条件（すなわち、トリ密度、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの頑丈な（プラスチックの）仕切りを各飼育領域に設けた。
【０２６５】
ワクチン接種及び治療薬投与：
【０２６６】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０２６７】
水：
【０２６８】
飼育領域当たりに１つのＰｌａｓｓｏｎ給水器を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄することで、清潔な水が一定して確実にトリに供給されるようにした。
【０２６９】
給餌：
【０２７０】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０２７１】
毎日の観察：
【０２７２】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを文書化し、それを試験記録の付属文書とした。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０２７３】
飼育領域のカード：
【０２７４】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードによって処理番号を示した。
【０２７５】
動物の取り扱い：
【０２７６】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０２７７】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０２７８】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、試験責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場のＳＯＰに従って安楽死させた。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させた。いずれの除外理由も文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させたのであれば、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。
【０２７９】
試験責任者によって安楽死が必要であると判断されれば、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。
【０２８０】
死亡率及び選別：
【０２８１】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも、体重を測定し、剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、体重を測定し、文書化した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０２８２】
体重及び飼料摂取量：
【０２８３】
およそ１４日目及び２１日目にトリの体重を飼育領域別かつ個別に測定した。各飼育領域に残った飼料は、試験の１４日目及び２１日目に重量を測定し、記録した。１４〜２１日目の間の飼料摂取量を計算した。
【０２８４】
体重増加及び飼料要求率：
【０２８５】
飼育領域かつ個体ベースのトリの平均体重を各体重測定日にまとめた。生存するトリの総体重によって飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して、試験の２１日目に平均飼料要求率を計算した（すなわち、０〜２１日目のもの）。生存するトリの総体重に死亡または飼育領域から除外したトリの体重を加えたものによってその飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して補正飼料要求率を計算した。
【０２８６】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳの投与
【０２８７】
投与方法：
【０２８８】
この試験では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を、試験設計に基づく固定量で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合した。投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出した。
【０２８９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
【０２９０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、それぞれの日に使用した。トリの各飼育領域について、一晩培養したブロス培養物を固定量で、固定量の処理飼料とフィーダートレイ中で混合した（投与の項を参照のこと）。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入した。飼育領域はすべて、同一に処理するようにする。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施した。
【０２９１】
収集データ：
−本開示によるＡｓｃｕｓプラットフォーム法で解析するための腸内容物。
−飼育領域別かつ個別のトリの体重及び飼育領域別の飼料効率（およそ１４日目及び２１日目）。
−各飼育領域に追加した飼料量及び各飼育領域から除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
−死亡率：性別、体重、及び推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
−除外したトリ：選別理由、性別、及び体重（０日目〜試験終了）。
−施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
−トリ５羽／飼育領域の病変スコア（およそ２１日目）。
【０２９２】
病変のスコア付け：
【０２９３】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物の最後の投与から４日後、最初に捕獲されたトリを選択することによって、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けした。病変は、下記のようにスコア付けした：
−０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
−１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰である。
−２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
−３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
−４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ。
【０２９４】
結果
【０２９５】
上に開示される方法（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、及び図２を参照して議論されるもの、ならびに本明細書を通じて議論されるもの）ならびに従来の相関手法（上に議論されるもの）を使用して結果を解析した。各トリの小腸内容物について株レベルの微生物の存在量及び活性を決定し、こうしたプロファイルを、２つの異なるトリ特徴（個々の病変スコア及び飼育領域の平均病変スコア）に関して解析した。
【０２９６】
個々の病変スコアの解析では、３７羽のトリを使用した。この解析に関しては、４０羽のトリのスコア付けを実施したものの、解析に十分な腸材料が存在したのは３７羽のみであった。本開示のＡｓｃｕｓ手法と従来の手法との両方について、同一のシークエンシングリード及び同一のシークエンシング解析パイプラインを使用した。しかしながら、Ａｓｃｕｓ手法では、詳細を前述したように、各試料の細胞数情報に加えて、活性情報も統合した。
【０２９７】
Ａｓｃｕｓ相互情報量手法を使用することで、活性株の存在量と３７羽のブロイラーの個々の病変スコアとの間の関連性をスコア付けした。従来の手法については、３７羽のブロイラーの株と個々の病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。次に、この特定の株の順位を、それぞれの解析方法の結果で確認した。Ａｓｃｕｓ手法では、実験において投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが、個々の病変スコアと関連する最上位の株として同定された。この株は、従来の方法では、個々の病変スコアと関連する上位２６番目の株として同定された。開示の方法／手法を使用することでＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを原因病原体として同定することに成功したため、この病原株を示す第１のマーカー及び／または第２のマーカーを、今後の試料における発病状態及び／または望ましくない状態の指標として使用することができる。マーカーの存在量を、発病状態の重症度の指標として使用することもできる。
【０２９８】
平均病変スコアの解析では、１０２羽のトリを使用した。前述の場合と同様に、Ａｓｃｕｓ手法と従来の手法との両方について、同一のシークエンシングリード及び同一のシークエンシング解析パイプラインを使用した。この場合もまた、Ａｓｃｕｓ手法では、各試料の細胞数情報に加えて、活性情報も統合した。
【０２９９】
Ａｓｃｕｓ相互情報量手法を使用することで、活性株の存在量と各飼育領域の平均病変スコアとの間の関連性をスコア付けした。従来の手法については、各飼育領域の株と平均病変スコアとの間でピアソン相関を計算した。原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。次に、この特定の株の順位を、それぞれの解析方法の結果で確認した。Ａｓｃｕｓ手法では、実験において投与したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが、飼育領域の平均病変スコアと関連する上位４番目の株として同定された。従来の手法では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓは、飼育領域の平均病変スコアと関連する上位１５番目の株として同定された。バルク／平均を測定することによってＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの感染レベルの変動が隠れてしまうため、飼育領域の平均病変スコアの測定精度は、個々の病変スコアと比較して低いものとなる。個々の病変スコアの解析を平均飼育領域病変スコア解析と比較すると、こうして順位が下がることは、予測したとおりのことであった。以下には、収集したメタデータが示される。
【０３００】
【表７】
2020507308.tif 000028
【０３０１】
実施例５
ブロイラーの消化管マイクロバイオームの組成を、より生産的な状態に向かって変化させるための活性微生物株のアンサンブルの選択
９６羽の雄性Ｃｏｂｂ５００を２１日間飼育した。個々のトリについて体重及び飼料摂取量を決定し、屠殺後に、盲腸剥離物を取得した。この盲腸試料を、本開示の方法を使用して処理することで、生産状況においてブロイラーに投与すると飼料効率を高めることになる微生物のアンサンブルを明らかにした。
【０３０２】
実験設計
【０３０３】
１２０羽のＣｏｂｂ５００のヒヨコを分け、食物処理に基づいて飼育領域に入れた。０〜１４日目の処理別にトリを床の飼育領域に入れた。２つの飼育領域を含む１つのブロックと、２つの個別のケージをそれぞれが含む４８のブロックと、に試験施設を分けた。完全乱塊法を使用して処理を飼育領域／ケージに割り付け、試験を通じて飼育領域／ケージの処理はそのままとした。処理は、数字コードによって識別した。トリは、ケージ／飼育領域に無作為に割り付けた。特定の処理群は、表９に以下に示されるとおりである。
【０３０４】
【表９】
2020507308.tif 000029
【０３０５】
収容：
【０３０６】
ケージ／飼育領域に対する処理の割り付けは、コンピュータプログラムを使用して実施した。コンピュータによって生成した割り付けは、下記のとおりである：
【０３０７】
環境的に制御された施設にトリを収容し、頑丈なプラスチック（高さ４フィート）から構成される広いコンクリート床の飼育領域（４フィートｘ８フィート）に、清潔な藁くずと共にトリを入れた。１４日目に、環境的に制御された同一施設内のケージに９６羽のトリを移した。各ケージは、２４インチｘ１８インチｘ２４インチとした。
【０３０８】
照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを使用した。２４時間ごとの連続光の時間は、表１０に以下に示されるとおりである。
【０３０９】
【表１０−１】
2020507308.tif 000030
【表１０−２】
2020507308.tif 000031
【０３１０】
トリに対する環境条件（すなわち、０．５３平方フィート）、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。
【０３１１】
トリの移動を防ぐために、各飼育領域を点検して、飼育領域間の高さ約１４インチの仕切りに１インチを超える開口が存在しないことを確かめた。
【０３１２】
ワクチン接種：
【０３１３】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０３１４】
水：
【０３１５】
試験を通じて水を不断供給した。床の飼育領域では、自動のベル型給水器を介して水を供給した。バタリーケージでは、１つのニップル式給水器を介して水を供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄して、清潔な水が確実にトリに常に供給されるようにした。
【０３１６】
給餌：
【０３１７】
試験を通じて飼料を不断供給した。床の飼育領域では、直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して飼料を供給した。バタリーケージでは、１つのフィーダートラフ（９インチｘ４インチ）を介して供給した。最初の約４日間は、床の各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。
【０３１８】
毎日の観察：
【０３１９】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０３２０】
死亡率及び選別：
【０３２１】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、剖検した。推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０３２２】
体重及び飼料摂取量：
【０３２３】
約９６羽のトリの体重測定を個別に毎日実施した。各ケージに残った飼料は、１４〜２１日目に、重量を毎日測定し、記録した。各ケージの飼料摂取量を毎日決定した。
【０３２４】
体重増加及び飼料要求率：
【０３２５】
１４〜２１日目のケージベースの体重増加及び処理ベースの平均体重増加を決定した。トリの体重によってケージの総飼料消費量を割ったものを使用して、１４〜２１日目の期間の日々及び全期間の飼料要求率を計算した。１４〜２１日目の期間の平均処理飼料要求率を、その処理を行った各ケージに由来する個々の飼料要求率を平均化することによって決定した。
【０３２６】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０３２７】
顕著な併発疾患を発症しており、損傷し、その状態が試験の結果に影響を与え得る動物は、試験から除外し、決定が下った時点で安楽死させた。投与から６日後、ケージにいるすべてのトリを取り出し、病変のスコア付けを実施した。
【０３２８】
収集データ：
【０３２９】
トリの体重及び飼料要求率（１４〜２１日目の間、個別に毎日実施）。
【０３３０】
床の飼育領域及びケージに追加した飼料量ならびに床の飼育領域及びケージから除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
【０３３１】
死亡率：推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
【０３３２】
除外したトリ：選別理由（０日目〜試験終了）。
【０３３３】
施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
【０３３４】
各トリに由来する盲腸内容物（２１日目）。
【０３３５】
結果
【０３３６】
上に開示される方法（例えば、図１Ａ、図１Ｂ、及び図２を参照して議論されるもの、ならびに本明細書を通じて議論されるもの）を使用して結果を解析した。各トリの盲腸内容物について株レベルの微生物の存在量及び活性を決定した。９６のブロイラー盲腸試料のすべてにまたがって、特有の株が全部で２２，４６１株検出された。活性閾値によってそれぞれの株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を創出した。上記の株のうち、屠殺の時点のそれぞれのブロイラーにおいて活性であると見なされた株は、平均で４８．３％にすぎなかった。フィルタリングの後、各トリの活性微生物のプロファイルを、さまざまなトリメタデータ（飼料効率、最終的な体重、及び食物におけるサリノマイシンの存在／不在を含む）と統合することで、こうした形質のすべての能力を改善するアンサンブルを選択した。
【０３３７】
本開示の相互情報量手法を使用することで、活性株の絶対細胞数と能力測定値との間の関連性、ならびに２つの異なる活性株の間の関連性を、９６羽すべてのトリについてスコア付けした。閾値の適用後、４０３９のメタデータ−株関連性が有意であると見なされ、８８４２の株−株関連性が有意であると見なされた。次に、こうしたリンク（ＭＩＣスコアによって重み付けされたもの）をエッジとして使用する（メタデータ及び株はノードとする）ことで、その後のコミュニティ検出解析のためのネットワークを創出した。このネットワークに対してＬｏｕｖａｉｎ法によるコミュニティ検出アルゴリズムを適用して、ノードを亜群に分類した。
【０３３８】
Ｌｏｕｖａｉｎ法では、ノードをその現在の亜群から最初に除外し、隣接する亜群へと移入することによってネットワークモジュラリティが最適化される。そのノードの隣接ノードのモジュラリティが改善するのであれば、その新たな亜群へのそのノードの再割り付けが行われる。複数の群のモジュラリティが改善するのであれば、最も有効な変化を伴う亜群が選択される。この段階が、新たな割り付けが行われなくなるまで、ネットワークにおけるあらゆるノードに対して繰り返される。次の段階では、あらたな粗視化ネットワークが創出され、すなわち、発見された亜群が新たなノードとなる。ノード間のエッジは、それぞれの亜群内の低レベルのノードのすべての総和によって定義される。ここから、モジュラリティが最適化する変化がもはや生じ得なくなくなるまで、第１の段階及び第２の段階が繰り返される。極大値（すなわち、反復段階で生じる群）と最大値（すなわち、最終的な群化）との両方を調べることで、全微生物コミュニティ内に生じる亜群を分離すると共に、存在し得る可能性のある階層を明らかにすることができる。
【０３３９】
モジュラリティ：
【数６】
2020507308.tif 000032
【０３４０】
式中、Ａは、メタデータ−株関連性及び株−株関連性のマトリックスであり、ｋｉ＝ΣｊＡｉｊは、ノードｉに付加される総リンク重であり、ｍ＝１／２ΣｉｊＡｉｊである。ノードｉ及びノードｊが同一のコミュニティに割り付けられると、クロネッカーのデルタδ（ｃｉ，ｃｊ）は１となり、その他の場合は０となる。
【０３４１】
ノードの移動時におけるモジュラリティの変化の算出：
【数７】
2020507308.tif 000033
【０３４２】
ΔＱは、亜群Ｃのモジュラリティの増分である。Σｉｎは、Ｃにおけるリンクの重みの総和であり、Σｔｏｔは、Ｃにおけるノードに付随するリンクの重みの総和であり、ｋｉは、ノードｉに付随するリンクの重みの総和であり、ｋｉ，ｉｎは、ＣにおけるノードにＩから繋がるリンクの重みの総和であり、ｍは、ネットワークにおけるすべてのリンクの重みの総和である。
【０３４３】
Ｌｏｕｖａｉｎコミュニティ検出法を使用することで、ニワトリ微生物コミュニティにおいて５つの異なる亜群を検出した。天然には膨大な量の微生物多様性が存在するものの、存在する機能的多様性ははるかに少ない。代謝能力には類似性及び重複性が存在することにより、冗長性が生じる。同一の環境刺激または栄養素に応答する微生物株は、類似傾向を有する可能性があり（このことが本開示の方法によって捕捉される）、こうした微生物は、最終的に一緒に群化されることになる。得られる分類及び階層によって株の機能性予測を明らかにし、この機能性予測は、コミュニティ検出解析後にこうした株が分類される先の群に基づいて行う。この分類は、より良好／生産的な状態を定義するためにも使用することができる。この状態が確立されると、この状態を使用して今後の試料の状態を定義及び表すことができる。
【０３４４】
株の分類が完了した後、試料に由来する微生物株を培養する。不均一微生物コミュニティから純粋培養物を単離し、増殖させることには技術的な困難が伴うため、実験室においては、本開示の方法の活性閾値と関連性閾値との両方を通過する株のごく一部のみが純粋に増殖することになる。培養が完了した後、純粋培養物が存在するか否かということ、及び株がどの亜群に分類されるかということ、に基づいて微生物株のアンサンブルを選択する。可能な限り機能的多様性に富むものとなるようにアンサンブルを創出し、すなわち、アンサンブルにおいて多様な亜群となるように株を選択する。次に、こうしたアンサンブルを有効性試験及び実地試験において試験することで、製品としての株のアンサンブルの有効性を決定し、株のアンサンブルが生産に寄与することが実証されれば、株のアンサンブルを製造し、製品として流通させることができる。
【０３４５】
実施例６
サイズの小さな試料を使用することによる活性微生物株の同定
以下に詳細に示されるように、活性微生物株の同定に有効な試料の数は、僅か２つであり得る。具体的には、２つの試料の比較を含めて、すべての比較について、腸の病変及び壊死性腸炎の活性微生物株かつ原因病原体としてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが本開示の方法によって正しく同定されることが以下の実験によって示される。
【０３４６】
実験設計
【０３４７】
環境的に制御された施設内にトリを収容し、コンクリート床の飼育領域（約４フィート×４フィートからフィーダースペース用の２．２５平方フィートを引いた領域）に入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を［約０．５５平方フィート／トリ（０日目）、約０．６９平方フィート／トリ（２１日目（病変のスコア付け後））］とし、温度、湿度、照明、フィーダー、及び水のスペースをすべての試験群で同様となるように供給した。清潔な木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れることで、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。トリを快適な状態で維持するために、追加の木くずを飼育領域に加えた。白色光を介する照明及び市販の照明プログラムは、以下のように使用した。
【０３４８】
【表１１】
2020507308.tif 000034
【０３４９】
トリに対する環境条件（すなわち、トリ密度、温度、照明、フィーダー、及び水のスペース）は、すべての処理群で同様となるようにした。飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの頑丈な（プラスチックの）仕切りを各飼育領域に設けた。
【０３５０】
ワクチン接種及び治療薬投与：
【０３５１】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。受け入れ時（試験の０日目）に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。ワクチン製造業者、ロット番号、及び有効期限を文書化し、最終報告書と共に提出した。
【０３５２】
水：
【０３５３】
飼育領域当たりに１つのＰｌａｓｓｏｎ給水器を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄することで、清潔な水が一定して確実にトリに供給されるようにした。
【０３５４】
給餌：
【０３５５】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０３５６】
毎日の観察：
【０３５７】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを文書化し、文書化したものを試験記録と共に含めた。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０３５８】
飼育領域のカード：
【０３５９】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードによって処理番号を示した。
【０３６０】
動物の取り扱い：
【０３６１】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０３６２】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死：
【０３６３】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、試験責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場のＳＯＰに従って安楽死させてよい。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させてよい。除外理由は、文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させたのであれば、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。
【０３６４】
試験責任者によって安楽死が必要であると判断されれば、頸椎脱臼によって動物を安楽死させた。
【０３６５】
死亡率及び選別：
【０３６６】
死亡が明らかになったトリまたは除外及び屠殺したトリはいずれも、体重を測定し、剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができなくなった選別トリは、屠殺し、体重を測定し、文書化した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０３６７】
ＣＬＯＳＴＲＩＤＩＵＭ  ＰＥＲＦＲＩＮＧＥＮＳの投与
【０３６８】
投与方法：
【０３６９】
この試験では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を、試験設計に基づく固定量で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合した。投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出した。
【０３７０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与：
【０３７１】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、それぞれの日に使用した。トリの各飼育領域について、一晩培養したブロス培養物を固定量で、固定量の処理飼料とフィーダートレイ中で混合した。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入した。飼育領域はすべて、同一に処理するようにする。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施するようにする。
【０３７２】
収集データ
【０３７３】
本出願の方法で解析するための腸内容物。
【０３７４】
飼育領域別かつ個別のトリの体重及び飼育領域別の飼料効率（およそ１４日目及び２１日目）。
【０３７５】
各飼育領域に追加した飼料量及び各飼育領域から除去した飼料量（０日目〜試験終了）。
【０３７６】
死亡率：性別、体重、及び推定死亡原因（０日目〜試験終了）。
【０３７７】
除外したトリ：選別理由、性別、及び体重（０日目〜試験終了）。
【０３７８】
施設及びトリの毎日の観察、毎日の施設温度。
【０３７９】
トリ５羽／飼育領域の病変スコア（およそ２１日目）。
【０３８０】
病変のスコア付けをした４８羽のトリから取得した試料。
【０３８１】
病変のスコア付け：
【０３８２】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物の最後の投与から４日後、最初に捕獲されたトリを選択することによって、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けした。病変は、下記のようにスコア付けした：
【０３８３】
０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
【０３８４】
１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰である。
【０３８５】
２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
【０３８６】
３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
【０３８７】
４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ。
【０３８８】
結果
【０３８９】
本出願の方法を使用して結果を解析した。４８羽のトリすべての小腸内容物について株レベルの微生物の絶対細胞数及び活性を決定した。本出願の方法によって、各試料の絶対細胞数情報だけでなく、活性情報も統合した。
【０３９０】
本出願の相互情報量手法を使用することで、活性株の絶対細胞数と、無作為に選択した１０羽のブロイラーの個々の病変スコアと、の間の関連性をスコア付けした。データセットから１つの試料を無作為に除外し、解析を繰り返した。これを、比較するブロイラー試料が２つのみとなるまで繰り返した。
【０３９１】
原因株であるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの確認は、試料のプールから同定した生物のリストに対する網羅的アライメント検索を介して実施した。表１２には、解析したすべての株に対するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの順位（順位が１位であることは、その株が病変スコアの誘起に最も関与しているということである）が示される：
【表１２−１】
2020507308.tif 000035
【表１２−２】
2020507308.tif 000036
【０３９２】
表１２は、開示の方法を使用することで、２つの試料の比較を含めて、すべての比較について、病変スコアの活性微生物株かつ原因病原体としてＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが正しく同定されたことを示す。試料数を減らすにつれて、偽陽性（すなわち、他の株もまた、原因病原体として同定される）の数が増加し、この増加は、７つの試料を比較した時点で始まった。この７つの試料の比較時点では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを含む２つの株が１位タイとなった。この傾向は、比較試料の数を２つに減らすまで続き、２つの試料の比較では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを含む３１の株が最上位タイとなった。
【０３９３】
一般に、追加の試料を使用するとノイズ／偽陽性数を減らすことができる一方で、合計３１の同定株に由来するものを含めて、残りの株をさらに分析及び処理することでもＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを原因株として同定するができる。本開示の方法は、実施形態、構成、及び用途に応じて、少数の試料で実施することができ、試料源、試料型、メタデータ、標的マイクロバイオームの複雑性などに応じて、利用する試料の数を変えることができる。
【０３９４】
実施例７
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに感染したブロイラーを診断するためのプラットフォーム
この試験では、診断を提供するために本開示を使用する例が示される。この試験の目的は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓをさまざまなレベルで投与したときに壊死性腸炎の期間中のブロイラーにおける微生物組成に生じる差異を決定することとした。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓに関する追加詳細については、Ａｌ−Ｓｈｅｉｋｈｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ”Ａｖｉａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９７７）：２５６−２６３（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）において見つけることができる。
【０３９５】
この試験では、２１日の試験期間にわたって１６０羽のＣｏｂｂ５００ブロイラーを利用した。Ｃｏｂｂ５００商業生産ブロイラーは、すべて雄性かつ受け入れ時（０日目）の年齢が生後約１日のものを使用した。Ｃｏｂｂ５００ニワトリは、Ｓｉｌｏａｍ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｎｏｒｔｈから入手した。ニワトリを４つの処理に分け、飼育領域当たりのトリ数を２０とし、処理当たりの飼育領域数を２とした。
【０３９６】
この試験では、飼料添加物であるフィターゼ２５００（Ｎｕｔｒａ  Ｂｌｅｎｄ，ＬＬＣから入手）（ロット番号０６１１５Ａ０７）を利用した。使用したフィターゼ２５００は市販のものであり、その濃度は２，５００ＦＴＵ／ｇであり、その含有レベルは０．０２％であり、安全かつ温度監視された乾燥区域で保管されるものである。投与方法は、飼料を介するものとし、２１日間にわたって実施した。
【０３９７】
基本飼料及び処理食物の試料を重複取得した（試料サイズ約３００ｇ）。基本食物及びそれぞれの処理食物について１つの試料をアッセイのスポンサーに提出した。
【０３９８】
実験設計
【０３９９】
試験群
【０４００】
４つの飼育領域を含むブロック２つに試験施設を分けた。完全乱塊法を使用して処理を飼育領域／ケージに割り付けた。特定の処理群を表１３に示されるように設計した。
【０４０１】
【表１３】
2020507308.tif 000037
【０４０２】
収容
【０４０３】
ケージ／飼育領域に対する処理の割り付けは、コンピュータプログラムを使用して実施した。コンピュータによって生成した割り付けは、表１４に以下に示されるとおりである：
【０４０４】
【表１４】
2020507308.tif 000038
【０４０５】
環境的に制御された施設にトリを収容し、木の床の飼育領域（約４フィート×４フィートからフィーダースペース用の２．２５平方フィートを引いた領域）にトリを入れ、この飼育領域では、床スペース及びトリの密度を約０．６９平方フィート／トリとし、温度、照明、フィーダー、及び水のスペースをすべての試験群で同様となるように供給した。木くずを適切な深さで含めた清潔な飼育領域にトリを入れ、当該ヒヨコにとって快適な環境を与えた。試験中に、試験用のトリにとっての快適な条件としては木くずが湿気を帯びすぎた状態となった場合は、追加の木くずを飼育領域に加えた。照明は、白色光を介するものとし、市販の照明プログラムを表１５に示されるように使用した。
【０４０６】
【表１５】
2020507308.tif 000039
【０４０７】
飼育領域間のトリの移動及び細菌拡散を防ぐために、飼育領域の間に約２４インチの高さの頑丈な（プラスチックの）仕切りを各飼育領域に設けた。
【０４０８】
ワクチン接種
【０４０９】
マレック病を防ぐために、孵化場でトリにワクチン接種を行った。試験の０日目に、ニューカッスル病及び感染性気管支炎を防ぐために、噴霧適用によってトリにワクチン接種を行った。試験中、実験設計にあるものを除き、他のワクチン接種は一切実施しなかった。ワクチン接種の記録（ワクチンの起源、型、ロット番号、及び有効期限）を試験記録と共に維持した。本明細書に開示のもの以外のワクチン接種または投薬は一切利用しなかった。
【０４１０】
水
【０４１１】
飼育領域当たりに１つのＰｌａｓｓｏｎ給水器を介して、試験を通じて水を不断供給した。給水器は、１日に２回点検し、必要に応じて洗浄して、清潔な水が確実にトリに常に供給されるようにした。
【０４１２】
飼料
【０４１３】
飼育領域当たりに１つの直径約１７インチの吊り下げ式チューブフィーダーを介して、試験を通じて不断給餌を行った。最初の約４日間は、床の各飼育領域にヒヨコ用のフィーダートレイを置いた。受け入れ時（０日目）に、実験設計に従ってトリをそのそれぞれの処理食物の摂取過程下に置いた。０日目から試験終了までの間に飼育領域に追加した飼料及び飼育領域から除去した飼料については、重量を測定し、記録した。
【０４１４】
毎日の観察
【０４１５】
全体的な群れの状態、照明、水、飼料、換気、及び不測の事象について、試験施設、飼育領域、及びトリを少なくとも１日に２回観察した。１日に２回の観察のいずれかにおいて異常な状態また異常な挙動が確認されれば、それを試験記録に記入した。試験施設の最低温度及び最高温度を１日に１回記録した。
【０４１６】
飼育領域カード
【０４１７】
各飼育領域に２つのカードを取り付けた。一方のカードによって飼育領域番号を識別し、第２のカードでは処理番号を示すようにする。
【０４１８】
動物の取り扱い
【０４１９】
動物は、理想的な飼育適合条件の下で保持した。損傷及び不要なストレスを低減するような様式で動物を取り扱った。人道的な手段を厳格に実行した。
【０４２０】
獣医学的な管理、介入、及び安楽死
【０４２１】
試験手順とは無関係な臨床的に顕著な併発疾患を発症したトリは、責任者または被任命者の裁量で試験から除外し、現場の標準操作手順に従って安楽死させた。さらに、瀕死または損傷したトリもまた、現場の獣医師または有資格技術者の権限で安楽死させてよい。除外理由はいずれも、文書化した。動物が死亡するか、または除外し、人道的理由で安楽死させた場合は、そのことを飼育領域の死亡率シートに記録し、剖検を実施し、提出して除外理由を文書化した。安楽死が必要であると判断したのであれば、頸椎脱臼を介して動物を安楽死させた。
【０４２２】
死亡率及び選別
【０４２３】
死亡が明らかになったトリはいずれも除外し、体重を測定し、剖検した。このことは、試験の０日目から開始した。飼料または水を得ることができないトリは、屠殺し、剖検した。体重及び推定死亡原因及び剖検知見を飼育領域の死亡率記録に記録した。
【０４２４】
体重及び飼料摂取量
【０４２５】
およそ１４日目及び２１日目にトリの体重を飼育領域別かつ個別に測定した。各飼育領域に残った飼料は、試験の１４日目及び２１日目に重量を測定し、記録した。１４〜２１日目の間の飼料摂取量を計算した。
【０４２６】
体重増加及び飼料要求率
【０４２７】
飼育領域かつ個体ベースのトリの平均体重を各体重測定日にまとめた。生存するトリの総体重によって飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して、試験の２１日目に平均飼料要求率を計算した。生存するトリの総体重に死亡または飼育領域から除外したトリの体重を加えたものによってその飼育領域の総飼料消費量を割ったものを使用して補正飼料要求率を計算した。
【０４２８】
消化管内容物の取得
【０４２９】
２１日目に、頸椎脱臼によって各トリを安楽死させて、記載の手順を使用して下記のものを取得し、手袋は、各トリ間で交換した。
【０４３０】
１５０μｌの停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに１つの盲腸の内容物を直ちに入れる。
【０４３１】
１５０μｌの停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに小腸の内容物を直ちに入れる。
【０４３２】
ＧＩ管から砂嚢を切除し、内容物を鉗子で取り出し、１５０μｌの停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに入れる。
【０４３３】
ＧＩ管から素嚢を切除し、鉗子／スクレーパーで内容物を粘膜内層から剥がし取り、１５０μｌの停止液を事前に充填した１．５ｍｌチューブに入れる。
【０４３４】
送付するまで、すべての試料を４℃で保管する。
【０４３５】
秤
【０４３６】
飼料及び飼料添加物の重量測定に使用した秤は、コロラド州によって認可及び／または認証を受けたものである。秤を使用するたびに、ＣＱＲ標準操作手順に従って基準分銅を使用して秤を点検した。
【０４３７】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの投与
【０４３８】
投与方法
【０４３９】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃから入手した。この試験では、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５、Ａ型、α毒素及びβ２毒素）の培養物を、飼料を介して投与した。培養物との混合には、各飼育領域のフィーダー由来の飼料を使用した。飼育領域に培養物を置く前に、約４〜８時間、処理飼料を取り出し、トリから遠ざけた。トリの各飼育領域について、約２．０〜９．０Ｘ１０８ｃｆｕ／ｍｌの濃度のブロス培養物を、試験設計に基づく固定量で、固定量の飼料（約２５ｇ／トリ）とフィーダートレイ中で混合し、投与を行う飼育領域はすべて、同一に処理した。培養物−飼料のほとんどが１〜２時間以内に消費された。すべての処理においてトリが同様に処理されるように、非投与群もまた、投与群と同一の時間、飼料を取り出した。
【０４４０】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの投与
【０４４１】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ（ＣＬ−１５）の培養増殖は、デンプンを含む液体チオグリコール酸培地において約３７℃で約５時間実施した。ＣＬ−１５は、コロラド州においてブロイラーの間で大流行したものに由来するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの野外株である。新鮮なブロス培養物を調製し、それぞれの日に使用した。トリの各飼育領域について、一晩培養したブロス培養物を固定量で、固定量の処理飼料とフィーダートレイ中で混合した（投与の項を参照のこと）。飼料の量、接種培養物の体積及び定量化、ならびに投与日数を最終報告書に記入した。飼育領域はすべて、同一に処理した。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの培養物のトリへの投与は、１日間（試験の１７日目）実施した。培養物に対する定量化は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃによって実施し、結果を最終報告書に記入した。この試験については標的死亡率を定めることはしなかった。
【０４４２】
病変のスコア付け
【０４４３】
Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ培養物の最後の投与から４日後、最初に捕獲されたトリを選択することによって、各飼育領域から５羽のトリを無作為に選択し、屠殺し、壊死性腸炎について腸の病変をスコア付けした。病変は、下記のようにスコア付けした：
【０４４４】
０＝正常：ＮＥ病変がなく、小腸は、正常な弾性を有する（開いた後に、丸まって正常位置に戻る）。
【０４４５】
１＝軽度：小腸壁が薄く、弛緩性であり（開いたときに平らなままであり、開いた後に、丸まって正常な位置に戻らない）、粘膜を覆う粘液が過剰である。
【０４４６】
２＝中等度：腸壁が顕著に発赤し、膨化しており、腸膜に少数の潰瘍及び壊死が存在し、粘液が過剰である。
【０４４７】
３＝重度：小腸膜の壊死及び潰瘍が多発する領域（複数可）が存在し、顕著な出血が見られ、フィブリン及び壊死片の層が粘膜上に存在する（トルコタオルの外観を有する）。
【０４４８】
４＝死亡または瀕死：２４時間以内に死亡し得る可能性があり、かつ２以上のＮＥ病変スコアを有するトリ。
【０４４９】
処分
【０４５０】
過剰な試験物品
【０４５１】
この試験のために入手及び使用した試験物品について報告を継続的に実施した。過剰な試験物品は、処分するか、またはスポンサーに返却した。文書化したものを試験記録と共に提出した。
【０４５２】
飼料
【０４５３】
すべての食物について報告を継続的に実施した。混合、使用、及び廃棄した量を文書化した。未使用の飼料は、不用品回収販売に出し、及び／または現地の埋め立て処理場への商用輸送のための大型ごみ容器に入れることによって処分した。処分については、試験報告書に記入した。
【０４５４】
試験動物
【０４５５】
試験のために入手したトリについて報告を継続的に実施した。試験中及び試験終了時点の死体及び屠殺したトリは、試験終了時点で処理場に送り、廃棄処分した。処分について文書化したものを試験報告書と共に提出した。この試験に用いた動物に由来する食品がヒトの食物連鎖に入ることのないようにした。
【０４５６】
試料の分析
【０４５７】
それぞれの消化管内容物試料の一部を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。同一の消化管内容物試料の別の部分をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。シークエンシングリードを使用することで、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎによる感染後の各トリに存在するそれぞれの活性微生物メンバーの細胞数を定量化した。
【０４５８】
壊死性腸炎は、腸管粘膜の重度の壊死であり、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによって生成する毒素によって引き起こされる。したがって、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの疾患、存在、及び活性を診断するものとしてのプラットフォームの能力を評価するために、試料を取得した各トリの病変スコアとの関連でプラットフォームの能力を分析した。すべての器官を分析し、この結果によって、どう判断しても小腸がＣ．ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓ感染の最良の予測判断材料であることが示された。小腸は、病原体確立の原発位置であるため、上記のことは予測どおりのことであった。
【０４５９】
この結果は、図９及び表１６に示される。病変のスコア付けの期間中にスコアが１以上とされたトリは、１羽を除くすべてのトリでＣ．ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓが検出された。Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓの存在量は、各トリについて測定された病変スコアと相関する傾向を有しており、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｇｅｎｓの存在量が多くなればなるほど、トリのスコアが「４」となる可能性が高くなった。病変スコアが「０」とスコア付けされた複数のトリのＧＩ管には、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが実際に存在した。こうして存在するにもかかわらず、活性を分析すると、こうしたトリではＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓが活性ではないことが明らかとなった。こうした結果は、開示の方法及びシステムが、壊死性腸炎を有するトリにおけるＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの量及び活性を検出できることを示している。この情報は、病気を有する個々のトリにおける疾患の重症度に加えて、ブロイラーにおける壊死性腸炎大流行の原因病原体を予測するための診断として使用することができる。
【０４６０】
【表１６−１】
2020507308.tif 000040
【表１６−２】
2020507308.tif 000041
【０４６１】
実施例８
【０４６２】
微生物組成物の投与後のルーメン微生物組成の変化
泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量、ならびに計算ＥＣＭを増加させるために本開示の方法を適用した。
【０４６３】
本明細書に示される本開示の方法論は、開示の単離された微生物、アンサンブル、及びそれを含む組成物を利用することに基づいており、泌乳反芻動物によって産生する乳脂肪及び乳タンパク質の総量が増加することを実証している。こうした増加は、ホルモンを別に与えることを必要とせずに実現した。
【０４６４】
この例では、本開示の方法によって同定及び合成された、２つの単離微生物（１つの細菌及び１つの真菌）を含む微生物アンサンブルを、授乳の中期のホルスタイン乳牛に５週間にわたって投与した。
【０４６５】
８頭の群２つに乳牛を無作為に割り付け、これらの群の一方は、微生物アンサンブルを含まない緩衝液を投与する対照群とした。第２の群（実験群）には、微生物アンサンブルを５週間、１日に１回投与した。乳牛はそれぞれ、個別の飼育領域に収容し、飼料及び水を自由に摂取できるようにした。食物は、乳量が多くなる食物とした。乳牛には自由に摂食させ、日々の終わりに飼料の重量を測定し、前日の拒食分は、重量を測定し、廃棄した。体重測定は、Ｓａｌｔｅｒ  Ｂｒｅｃｋｎｅｌｌ（Ｆａｉｒｍｏｎｔ，ＭＮ）のＰＳ−２０００スケールで実施した。
【０４６６】
乳牛のルーメンにカニューレが到達するように乳牛にカニューレを装着した。乳牛には、カニューレ挿入の後、少なくとも１０日間の回復期間をさらに与えてから、対照用量または実験用量を投与した。
【０４６７】
２０ｍｌの中性緩衝生理食塩水でそれぞれの投与を行うものと、当該生理食塩水に約１０９個細胞を懸濁したものでそれぞれの投与を行うものと、にした。対照群には、２０ｍｌの当該生理食塩水を１日に１回投与し、実験群には、１０９個の微生物細胞の記載の微生物アンサンブルをさらに含む２０ｍｌの当該生理食塩水を投与した。
【０４６８】
０日目、７日目、１４日目、２１日目、及び３５日目にあらゆる乳牛のルーメンから試料を取得し、ここでは微生物投与の前日を０日目とした。実験投与及び対照投与は、その日にルーメンから試料を取得した後に実施したことに留意されたい。ルーメンからの毎日の試料取得は０日目に開始し、取得したルーメン液にＨａｎｎａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｗｏｏｎｓｏｃｋｅｔ，ＲＩ）のｐＨメーターを挿入して記録を取った。ルーメン試料の取得においては、ルーメンの中心領域、背側領域、腹側領域、前側領域、及び後側領域からカニューレを介して微粒子と液体との両方を取得するようにし、５つの試料すべてを、１．５ｍｌの停止液（エタノール９５％、フェノール５％）を含む１５ｍｌのコニカルバイアルにプールし、４℃で保管し、氷上に留めてＡｓｃｕｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｖｉｓｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に送付した。
【０４６９】
それぞれのルーメン試料の一部を染色し、フローサイトメーターにかけることで、各試料におけるそれぞれの微生物型の細胞数を定量化した。同一のルーメン試料の別の部分をビーズ破砕でホモジナイズすることで微生物を溶解させた。各試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出及び精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでのシークエンシング用として調製した。ペアエンド化学を使用して試料をシークエンシングし、ライブラリーの両末端に対して３００塩基対のシークエンシングを実施した。シークエンシングリードを使用することで、対照群及び実験群の動物ルーメンのそれぞれに存在するそれぞれの活性微生物メンバーの細胞数を実験過程にわたって定量化した。
【０４７０】
細菌と真菌との両方がルーメンにコロニーを形成し、動物によっては、連日投与の約３〜５日後にルーメンにおいて細菌と真菌との両方が活性であった。このコロニー形成は、実験群では観測されたが、対照群では観測されなかった。ルーメンは、累積的なルーメン微生物集団の化学が高度に絡み合う動的な環境である。微生物アンサンブルを人工的に添加すれば、コミュニティの全体構造に影響が及び得る。この有望な効果を評価するために、全微生物コミュニティを実験過程にわたって解析することで、微生物コミュニティ集団における高レベルの分類学的変化を明らかにした。
【０４７１】
実験動物において投与した真菌の細胞数が上昇したことを除き、真菌集団では特徴的な傾向が経時的に観測されることはなかった。一方で、細菌集団は、より予想どおりに実際に変化した。個々の動物にまたがる高レベルの傾向を経時的に評価するために、微生物集団の組成パーセントを計算し、比較した。コミュニティの構成率が１％を超える属のみを解析した。既知の繊維分解性細菌を含む属（ルミノコッカス属を含む）の組成パーセントが、対照動物と比較して実験動物で増加したことが明らかとなった。クロストリジウムクラスターＸＩＶａ、クロストリジウム属、シュードブチルビブリオ属（Ｐｓｅｕｄｏｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）、ブチリシモナス属、及びラクノスピラ属（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）を含めて、揮発性脂肪酸産生性の属もまた、その存在量が実験動物で上昇したことが明らかとなった。プレボテラ属で観測された変化が最も大きいものであった。この属のメンバーは、ルーメン内でのセロビオース、ペクチン、及びさまざまな他の構造糖質の分解に関与することが示されている。プレボテラ属の１種は、植物リグニンを有利な抗酸化物質（プレボテラ属起源）に変換することにも関与している。
【０４７２】
ルーメンの定量的な経時変化を、より直接的に測定するために、細胞数データをシークエンシングデータと統合することで、集団のバルク変化を細胞レベルで明らかにした。実験群のぞれぞれの属の平均細胞数を、対照群のそれぞれの属の平均細胞数で割ることによって細胞数の倍率変化を決定した。これまでの解析では閾値に満たずに外れていた多くの属が細胞数解析によって捕捉された。プロミクロモノスポラ属、ロドピレルーラ属（Ｒｈｏｄｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ）、オリビバクター属（Ｏｌｉｖｉｂａｃｔｅｒ）、ウィクティウァルリス属（Ｖｉｃｔｉｖａｌｌｉｓ）、ノカルジア属、レンティスファエラ属、ユーバクテリウム属、ペドバクター属、ブチリシモナス属、モギバクテリウム属（Ｍｏｇｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、及びデスルホビブリオ属はすべて、実験動物において平均で少なくとも１０倍に増えたことが明らかとなった。プレボテラ属、ラクノスピラ属、ブチリシコッカス属、クロストリジウムＸＩＶａ、ロゼブリア属、狭義のクロストリジウム属、及びシュードブチルビブリオ属は、実験動物において約１．５倍に増えたことが明らかとなった。
【０４７３】
【表１７】
2020507308.tif 000042
【０４７４】
【表１８−１】
2020507308.tif 000043
【表１８−２】
2020507308.tif 000044
【０４７５】
【表１９】
2020507308.tif 000045
【０４７６】
実施例９
疝痛を有するウマ及び同一飼育領域の健康な対照のウマのウマ糞便マイクロバイオータの決定
【０４７７】
ウマは、疝痛、及び当該動物に重度の腹痛を引き起こす好発腸管障害を有すると診断されることが多い。疝痛の原因は、高度に可変である。疝痛は、難消化性物体の摂取、ガス、または消化管の捻転に起因する閉塞によって生じ得る。疝痛によっては、動物の消化管に存在する微生物集団の異常と関連する。ほとんどの症例で、疝痛、特に、慢性症例の正確な原因を診断することは非常に困難である。ここでは、微生物に基づく疝痛を有する動物を診断するために、２０頭のウマの糞便を開示の方法で解析した。
【０４７８】
２ヶ月にわたって、２０頭のウマ（対照１０頭、実験１０頭）をアッセイした。動物から試料を取得し、試料が２つ１組となるようにした。疝痛を有するウマのそれぞれについて、同一の飼育場で飼育されている対照のウマの試料を取得した。疝痛を有するウマと同様の移動歴を有し、過去６ヶ月に、抗微生物剤の投与も受けず、疝痛のエピソードも有さなかったウマを対照とした。
【０４７９】
それぞれのウマの所有者から、同意書に署名をもらい、調査協力を得た。心拍数、呼吸数、体温、粘膜色、毛細血管再充満時間、及び消化管の腹鳴を測定する身体検査をそれぞれのウマに実施した。検査で見つかった他の異常はいずれも報告した。全血球計算及び化学パネル用に血液を取得し、動物の直腸にスワブを４〜６ｃｍ挿入することによって糞便試料を取得した。直腸の内壁にスワブを穏やか擦り付けることで、細胞及び糞便材料を取得した。次に、このスワブを、停止液を事前に充填したチューブに完全に浸した後、新たな滅菌１．７ｍＬチューブに直ちに移した。余分なスワブ棒は除去してからチューブを閉じた。この操作を繰り返して重複試料を得た。疝痛を有するウマについては、直腸検査の間に糞便も取得した。糞便は、１５ｍＬの停止液を事前に充填した５０ｍＬコニカルに保管した。可能な場合は胃液及び胃内容物を取得した。
【０４８０】
輸送中、試料はすべて、４℃／氷上で保管した。スワブは、実験室に戻る間、−２０℃で保管し、発送まで−２０℃で維持した。
【０４８１】
取得データには、以下のものが含まれる：
・年齢、品種、主な用途
・血液試験の結果
・食物／給餌／サプリメントのレジメン
・収容の型
・移動歴
・駆虫歴
・治療
・投薬歴及び病歴（特に、疝痛を再発しているかどうか）（結果的に任意の麻酔エピソードを含むもの）
・ウマの症状／挙動、病原体試験（サルモネラ、クロストリジウム）に関する任意の追加情報
・最終診断
【０４８２】
本開示の方法を使用してすべての糞便試料を解析した。
【０４８３】
雌性ウマは、疝痛を有さない対照のウマと比較してその糞便におけるプロテオバクテリアの相対存在量が多いとき、大結腸捻転に起因する疝痛エピソードを発症する傾向を有することが、Ｗｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆａｅｃａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｔａ  ｏｆ  ｍａｒｅｓ  ｐｒｅｃｅｄｅ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｏｓｔ  ｐａｒｔｕｍ  ｃｏｌｉｃ”Ｅｑｕｉｎｅ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｊｏｕｒｎａｌ  ４７．６  ２０１５：６４１−６４９（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）によって明らかにされた。大結腸捻転は、疝痛の最も重篤な形態の１つであり、疝痛が進行してより重篤な状態となる前に動物の食物及び管理が変更されるのであれば、防ぎ得るものである。多くの症例で、早期検出は不可能であり、大結腸捻転を有するウマは、侵襲的手術を受けるか、または疝痛が再発すると安楽死させられる。
【０４８４】
解析によって、１０頭のウマのうちごく少数のみが微生物起因性の疝痛を有していたことが明らかとなり、このことは、獣医学的な診断によって裏付けられた。具体的には、１頭のウマが大結腸捻転に起因する疝痛を有すると診断された。図１０で確認できるように、疝痛を有するウマ３では、他のウマのすべてと比較して高度に活性なプロテオバクテリア（ピンクの棒）のレベルが実際に上昇していた。さらに解析したところ、このプロテオバクテリアは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｅｑｕｏｒｕｍの遠い類縁種であることが示された。これまでの研究では、この種を病原性と関連付けることはできていなかったが（例えば、Ｍｏｙａｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．“Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｅｑｕｏｒｕｍ：ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｏｒｓｅｓ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ”ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ５７．１（２００９）：１４−１６（あらゆる目的のために参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれる）を参照のこと）、ここでの結果は、この種が大結腸捻転による疝痛の発症において役割を担うことを示している。したがって、ウマは、多種多様な疝痛を患うものの、開示の方法によって、微生物に基づく疝痛を有する動物を診断することができる。図１０は、ウマの糞便における活性微生物の相対存在量を門レベルで示す。プロテオバクテリアは、薄いピンク色によって示される。疝痛を有するウマ３（大結腸捻転による疝痛を有すると診断されたウマ）は、赤の長方形によって示される。
【０４８５】
図１１は、いくつかの実施形態による診断プラットフォームワークフロー例の概観を示す。
【０４８６】
実施例１０
ウマの状態の同定及び微生物に対する洞察
この試験の目的は、バイオマーカー及び考え得る生物学的機構を把握し、疝痛の複数の状態を区別（すなわち、細菌性のウマ疝痛と非細菌性のウマ疝痛とを区別）することとした。全部で６０の患者から試料を複数回取得し、これらの患者のうち３０が疝痛の一形態を有することを明らかにした。残りの３０の患者は、他の診断症状を全く有さず、健康であることを明らかにした。
【０４８７】
試料の処理：
それぞれの試料取得時点で糞便試料を取得し、安定化溶液を事前に充填した１５ｍｌのコニカルチューブに直ちに添加し、４℃で保管した。数回反転させることによって溶液を混合した後、直ちに４℃で保管した。糞便試料を４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をデカントし、０．５ｍＬを取り分け、ＰｏｗｅｒＶｉｒａｌ（登録商標）環境ＲＮＡ／ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用する全ＲＮＡ及び全ＤＮＡの抽出用とした。デカントした上清を液体窒素中で急速凍結させ、下流のメタボロミクス処理用とした。
【０４８８】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ．
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変した２７Ｆ及び５３４Ｒを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅すると共に、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変したＩＴＳ５及びＩＴＳ４を使用してＩＴＳ領域を増幅した。これらの増幅は、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの標準プロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）に従って実施した。増幅後、標準的なアガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ産物を検証し、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。精製したアンプリコンライブラリーを、標準プロトコール（例えば、Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）に従ってＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で定量化及びシークエンシングした。ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で生のｆａｓｔｑリードを脱マルチプレックス化した。総細胞の計数はすべて、ＳＨ８００Ｓ細胞選別機（Ｓｏｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施した。生のシークエンシングデータはすべて、アダプター配列のトリミングを実施し、カットオフ値を２０としてｐｈｒｅｄ３３でクオリティフィルタリングを実施し、これらの処理は、Ｔｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅを使用して実施した（例えば、Ｋｒｕｅｇｅｒ  ２０１５を参照のこと）。次に、残っている配列はすべて、ＰｈｉＸ、複雑性の低いリード、及びクロストークについてフィルタリングを実施した（例えば、Ｅｄｇａｒ  ２０１６を参照のこと）。ＤＹ２０及びＤＹ２１に対する標的配列と併せてＲＤＰ  １６Ｓ  ｒＲＮＡデータベース（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）を用いてＵＳＥＡＲＣＨのＵＮＯＩＳＥ及びＳＩＮＴＡＸ（ｖ１０．０．２４０）（例えば、Ｅｄｇａｒ  ａｎｄ  Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ  ２０１５、Ｅｄｇａｒ  ２０１６を参照のこと）で、１６Ｓによる分類学的な配列クラスタリング及び分類を実施した。
【０４８９】
活性測定．
ＤＮａｓｅ  Ｉ処理（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を実施した後のＲＮＡ試料でｃＤＮＡ合成を実施した。製造業者のプロトコールに従ってランダムプライマー混合物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及びＲｎａｓｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）をｃＤＮＡ合成に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変した２７Ｆ及び５３４Ｒを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅すると共に、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変したＩＴＳ５及びＩＴＳ４を使用してＩＴＳ領域を増幅した。これらの増幅は、標準プロトコールに従って実施した。増幅後、ＰＣＲ産物を検証し、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。精製したアンプリコンライブラリーをＱｕｂｉｔ（登録商標）ＤＮＡ  ＨＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で定量化し、標準プロトコールに従ってＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシークエンシングした。ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で生のｆａｓｔｑリードを脱マルチプレックス化した。
【０４９０】
細胞の染色及び計数．
各試料の少分量を、新しい１．７ｍＬチューブに取り分け、その重量を測定した。１ｍＬの滅菌ＰＢＳを各試料に添加し、ビーズなしでビーズ破砕を実施することで線維性のルーメン内容物から細胞を分離した。次に、試料を遠心分離して大きなデブリを除去した。一定分量の上清をＰＢＳで希釈した後、染色した。それぞれのチューブに計数用ビーズを添加した（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ＡＣＦＰ−７０−１０）。次に、染色した試料をＳｏｎｙ  ＳＨ８００細胞選別機（Ｓｏｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、元の試料のグラム当たりの真菌細胞及び細菌細胞の数を決定した。
【０４９１】
バイオマーカーの同定．
絶対細胞数を使用して絶対細胞数を把握し、ｃＤＮＡシークエンシングによる正規化を介して不活性ＯＴＵをフィルタリングした。試料出力結果をＯＴＵ表で処理し、マトリックス補完を介して前処理した。補完の後、健康状態に関してデータでの学習を実施し（細菌性疝痛と非細菌性疝痛または健康な状態との対比）、１０分割検証におけるＲＯＣは、０．９超であった。データをＰＣｏＡ次元削減で可視化した。さらに、ＯＴＵ表から一般的な病原バイオマーカーをスクリーニングした。最終的に、組成がまとまったものを健康状態間で比較した。
【０４９２】
事例研究．
スクリーニングのための新たな試料を提示し、本開示の方法を使用してプラットフォームにかけた。ランダムフォレスト機械学習モデルからは、予測される健康状態に基づく分布が得られた（図１２ａ）。一般的な病原バイオマーカーからは、存在量が非常に多いマーカーは存在しないことが明らかとなった（図１２ｂ）。ＰＣｏＡからは、試料が疝痛の分布に含まれるものであることが明らかとなった（図１２ｃ）。最終的に、試料状態間で組成がまとまったものを提示試料と比較すると、提示試料は疝痛の組成と一致するものであることが明らかとなった（図１２ｄ）。試料及びその後の解析は、この試料の取得源であるウマが試料取得時に疝痛状態にあったことを示唆している。
【０４９３】
実施例１１
乳牛の状態の同定及び微生物に対する洞察
この試験の目的は、生産及び他の重要な外部因子と関連する、乳牛ルーメンのバイオマーカー及び考え得る生物学的機構を得ることとした。異なる気候、地理、品種、飼料系、及び健康状態から全部で５，０００の試料を取得した。さらに、食物型（すなわち、ＴＭＲ、ｐＴＭＲ、牧草）によって主に誘導された健康な状態をいくつか試料取得し、いくつかの一般的な不健康状態（すなわち、乳脂肪量低下）と比較した。
【０４９４】
試料の処理．
それぞれの試料取得時点で糞便試料を取得し、安定化溶液を事前に充填した１５ｍｌのコニカルチューブに直ちに添加し、４℃で保管した。数回反転させることによって溶液を混合した後、直ちに４℃で保管した。糞便試料を４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清をデカントし、０．５ｍＬを取り分け、ＰｏｗｅｒＶｉｒａｌ（登録商標）環境ＲＮＡ／ＤＮＡ単離キット（Ｍｏ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用する全ＲＮＡ及び全ＤＮＡの抽出用とした。デカントした上清を液体窒素中で急速凍結させ、下流のメタボロミクス処理用とした。
【０４９５】
１６Ｓ  ｒＲＮＡ．
Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変した２７Ｆ及び５３４Ｒを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅すると共に、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変したＩＴＳ５及びＩＴＳ４を使用してＩＴＳ領域を増幅した。これらの増幅は、Ｑ５（登録商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼの標準プロトコール（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）に従って実施した。増幅後、標準的なアガロースゲル電気泳動を用いてＰＣＲ産物を検証し、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。精製したアンプリコンライブラリーを、標準プロトコール（例えば、Ｆｌｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）に従ってＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で定量化及びシークエンシングした。ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で生のｆａｓｔｑリードを脱マルチプレックス化した。総細胞の計数はすべて、ＳＨ８００Ｓ細胞選別機（Ｓｏｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で実施した。生のシークエンシングデータはすべて、アダプター配列のトリミングを実施し、カットオフ値を２０としてｐｈｒｅｄ３３でクオリティフィルタリングを実施し、これらの処理は、Ｔｒｉｍ  Ｇａｌｏｒｅを使用して実施した（例えば、Ｋｒｕｅｇｅｒ  ２０１５を参照のこと）。次に、残っている配列はすべて、ＰｈｉＸ、複雑性の低いリード、及びクロストークについてフィルタリングを実施した（例えば、Ｅｄｇａｒ  ２０１６を参照のこと）。ＤＹ２０及びＤＹ２１に対する標的配列と併せてＲＤＰ  １６Ｓ  ｒＲＮＡデータベース（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）を用いてＵＳＥＡＲＣＨのＵＮＯＩＳＥ及びＳＩＮＴＡＸ（ｖ１０．０．２４０）（例えば、Ｅｄｇａｒ  ａｎｄ  Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ  ２０１５、Ｅｄｇａｒ  ２０１６を参照のこと）で、１６Ｓによる分類学的な配列クラスタリング及び分類を実施した。
【０４９６】
活性測定．
ＤＮａｓｅ  Ｉ処理（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）を実施した後のＲＮＡ試料でｃＤＮＡ合成を実施した。製造業者のプロトコールに従ってランダムプライマー混合物（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＶ逆転写酵素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）、及びＲｎａｓｉｎ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）をｃＤＮＡ合成に使用した。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変した２７Ｆ及び５３４Ｒを使用して１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を増幅すると共に、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用に改変したＩＴＳ５及びＩＴＳ４を使用してＩＴＳ領域を増幅した。これらの増幅は、標準プロトコールに従って実施した。増幅後、ＰＣＲ産物を検証し、ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して精製した。精製したアンプリコンライブラリーをＱｕｂｉｔ（登録商標）ＤＮＡ  ＨＳキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で定量化し、標準プロトコールに従ってＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）でシークエンシングした。ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で生のｆａｓｔｑリードを脱マルチプレックス化した。
【０４９７】
細胞の染色及び計数．
各試料の少分量を、新しい１．７ｍＬチューブに取り分け、その重量を測定した。１ｍＬの滅菌ＰＢＳを各試料に添加し、ビーズなしでビーズ破砕を実施することで線維性のルーメン内容物から細胞を分離した。次に、試料を遠心分離して大きなデブリを除去した。一定分量の上清をＰＢＳで希釈した後、染色した。それぞれのチューブに計数用ビーズを添加した（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ  ＡＣＦＰ−７０−１０）。次に、染色した試料をＳｏｎｙ  ＳＨ８００細胞選別機（Ｓｏｎｙ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理し、元の試料のグラム当たりの真菌細胞及び細菌細胞の数を決定した。
【０４９８】
バイオマーカー及び予測モデルの構築．
絶対細胞数を使用して絶対細胞数を把握し、ｃＤＮＡシークエンシングによる正規化を介して不活性ＯＴＵをフィルタリングした。次に、マトリックス補完を介してデータを補完した。データをＰＣｏＡ次元削減で可視化した。これによって、いくつかの健康な状態が、ＴＭＲに基づく食物では左側に、ｐＴＭＲに基づく食物では右側に、密接にクラスター化し、不健康状態の群は下側に広く分散して存在することが明らかとなった（図１３ｂ）。部分的最小二乗回帰を介して微生物組成に関して動物のデータでの学習を最初に実施した。得られたモデルの精度は高く、Ｒ二乗値は０．９超であり、平均二乗誤差は１未満であった。これによって、栄養的、地理的、及び気候的な入力に基づいて組成を予測することが可能となった。こうしたデータの操作を介すれば、微生物組成の予測を得ることができる。ランダムフォレスト機械学習を使用することで、微生物組成から栄養的、地理的、及び気候的なデータを予測し、１０分割検証におけるＲＯＣは、０．９超であった。これらの方法の両方を相前後して使用することができ、試料メタデータまたは試料微生物組成のいずれを学習及び予測することもできる。これは、多くの健康な状態及び不健康状態に適するものであり、それによって任意の状態を予測的に最適化することができる。
【０４９９】
事例研究．
ｐＴＭＲ食物を摂取している健康な乳牛のルーメン試料から試料を提示した。記載の方法を使用してルーメン試料を分析し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑでシークエンシングした。この試料は、ＰＣｏＡ次元削減を行ったところ、健康な分布に入るものとされた（図１３ａ）。さらに、ルーメンのＮＤＦ及びｐＨをインシリコで最適化したところ、当該ルーメン組成は、ｐＴＭＲ食物を摂取している状態の中でも、より生産的な状態にあるものとされた（図１３ｂ）。このことは、これら２つの変数に対して飼料変更または飼料添加物を介して改変を加えると、試料取得源の動物の微生物組成が、最も近い最も生産的な状態のものと一致するようになることを示唆している。微生物組成を学習することで、健康（図１４Ａ）、食物（図１４Ｂ）、及び気候（図１４Ｃ）において考え得る誤った管理を明らかにするための非測定外部因子を予測することも可能であった。
【０５００】
一般に、単一の状態として議論されるが、いくつかの実施形態及び用途については、状態（例えば、ベースライン状態）または生物学的状態は、特定のマイクロバイオームと関連する複数の状態及び／または生物学的状態を指し得、ベースラインの定義、特定の状態の定義、試料の特徴付け、潜在的な問題の同定、及び／または特定の徴候の治療（個体レベルまたは群（例えば、群れ）レベルに対するものかは問われない）において複数の状態も利用できることを理解されよう。例えば、上記の疝痛の例では、疝痛の原因は複数存在し得、そのようなものはマイクロバイオームに反映される。いくつかの実施形態では、本開示による比較では、下記の状態を利用することができる：対照（健康）、微生物性の疝痛、及び非微生物性の疝痛（ならびにいくつかの実施形態では、複数の異なる状態／下位状態）。
【０５０１】
追加の実施形態例
【０５０２】
実施形態Ａ１
少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、を比較し、前記活性微生物株を、予測される機能及び／または化学に基づいて少なくとも２つの群に分類すること、前記少なくとも２つの群から、少なくとも１つの微生物株を選択すること、ならびに前記少なくとも２つの群に由来する前記選択された少なくとも１つの微生物株を組み合わせることで、前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成された微生物のアンサンブルを形成させること、を含む、方法。
【０５０３】
実施形態Ａ２
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ３
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ４
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有のタンパク質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ５
前記特有の第１のマーカーの数の測定が、各試料における特有の代謝物マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ６
前記特有の代謝物マーカーの数の測定が、各試料における特有の脂質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ５に記載の方法。
実施形態Ａ７
前記特有の代謝物マーカーの数の測定が、各試料における特有の糖質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ５に記載の方法。
実施形態Ａ８
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ９
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ１０
前記特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、及び／またはリボソームＲＮＡマーカー、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ１１
前記特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、及び／または代謝酵素、のうちの少なくとも１つを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５０４】
実施形態Ａ１２
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定が、各試料における前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルを測定することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１３
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
実施形態Ａ１４
前記遺伝子発現解析が、シークエンシング反応を含む、実施形態Ａ１３に記載の方法。
実施形態Ａ１５
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む、実施形態Ａ１３に記載の方法。
実施形態Ａ１６
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
実施形態Ａ１７
前記少なくとも１つの特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部をメタリボソームプロファイリングまたはリボソームプロファイリングに供すことを含む、実施形態Ａ１２に記載の方法。
【０５０５】
実施形態Ａ１８
前記１つまたは複数の微生物型が、細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ１〜Ａ１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ１９
前記１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ１〜Ａ１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２０
前記１つもしくは複数の微生物株が、１つもしくは複数の真菌種もしくは真菌亜種であり、及び／または前記１つもしくは複数の微生物株が、１つもしくは複数の細菌種もしくは細菌亜種である、実施形態Ａ１９に記載の方法。
【０５０６】
実施形態Ａ２１
各試料における前記１つまたは複数の微生物型のそれぞれの数の決定が、各試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２０のいずれか１つに記載の方法。
【０５０７】
実施形態Ａ２２
前記特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、β−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５０８】
実施形態Ａ２２ａ
前記特有の第１のマーカーが、系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｂ
前記特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｃ
前記特有の第１のマーカーが、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｄ
前記特有の第１のマーカーが、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｅ
前記特有の第１のマーカーが、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｆ
前記特有の第１のマーカーが、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｇ
前記特有の第１のマーカーが、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｈ
前記特有の第１のマーカーが、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｉ
前記特有の第１のマーカーが、β−チューブリン遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｊ
前記特有の第１のマーカーが、伸長因子遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｋ
前記特有の第１のマーカーが、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
実施形態Ａ２２ｌ
前記特有の第１のマーカーが、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）を含む系統発生学的マーカーを含まない、実施形態Ａ１に記載の方法。
【０５０９】
実施形態Ａ２３
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２４
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、ゲノムＤＮＡをゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
実施形態Ａ２５
前記特有のマーカーの数及びその量の測定が、ゲノムＤＮＡをアンプリコンシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ２２に記載の方法。
【０５１０】
実施形態Ａ２６
前記少なくとも１つの異なる特徴が、第１の試料の取得時間と第２の試料の取得時間とが異なるように前記少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得時間を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０５１１】
実施形態Ａ２７
前記少なくとも１つの異なる特徴が、第１の試料の取得位置と第２の試料の取得位置とが異なるように前記少なくとも２つの試料のそれぞれが取得された取得位置を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
【０５１２】
実施形態Ａ２８
前記少なくとも１つの共通の特徴が、第１の試料の試料源型と第２の試料の試料源型とが同一である試料源型を含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ２９
前記試料源型が、動物型、器官型、土壌型、水型、堆積物型、油型、植物型、農産物型、バルク土壌型、土壌根圏型、または植物部分型のうちの１つである、実施形態Ａ２８に記載の方法。
【０５１３】
実施形態Ａ３０
前記少なくとも１つの共通の特徴が、前記少なくとも２つの試料のそれぞれが消化管  試料であることを含む、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５１４】
実施形態Ａ３１
前記少なくとも１つの共通の特徴が、動物試料源型を含むと共に、各試料が、追加の共通の特徴を有し、その結果、各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料である、実施形態Ａ１〜Ａ２７のいずれか１つに記載の方法。
【０５１５】
実施形態Ａ３２
前記少なくとも１つの測定メタデータに基づいて標的から少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料は、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの共通の特徴を共有する）、ならびに前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む、実施形態Ａ１〜Ａ３１のいずれか１つに記載の方法であって、前記少なくとも２つの群のそれぞれからの前記少なくとも１つの微生物株の選択が、前記標的に由来する前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に基づくものであり、その結果、前記形成されるアンサンブルが、前記少なくとも１つのメタデータに対応する前記標的の特性を変えるように構成される、前記方法。
【０５１６】
実施形態Ａ３３
前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の比較が、各試料における前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を決定することを含む、実施形態Ａ１〜Ａ３２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３４
前記少なくとも１つの測定メタデータが、１つまたは複数のパラメータを含み、前記１つまたは複数のパラメータが、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、前記試料源の体重、前記試料源の飼料摂取量、前記試料源の体重増加、前記試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、前記試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、前記試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせ、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ３３に記載の方法。
実施形態Ａ３５
前記１つまたは複数のパラメータが、乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ３４に記載の方法。
【０５１７】
実施形態Ａ３６
各試料における、前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定が、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記１つまたは複数の活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して不均一微生物コミュニティ（複数可）の１つまたは複数のネットワークを示すことを含む、実施形態Ａ３３〜Ａ３５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３７
前記少なくとも１つの測定メタデータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ３６に記載の方法。
【０５１８】
実施形態Ａ３８
前記１つまたは複数の活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定し、前記活性微生物株を分類することが、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するためのネットワーク解析及び／またはクラスター解析を含み、前記ネットワークが、共通の特徴、測定メタデータ、及び／または関連環境パラメータを共有する前記少なくとも２つの試料がまとまったものを示す、実施形態Ａ３３〜Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ３９
前記少なくとも１つの測定メタデータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ３８に記載の方法。
実施形態Ａ４０
前記ネットワーク解析及び／またはクラスター解析が、連鎖解析、モジュラリティ解析、頑健性測定、媒介性測定、連結度測定、推移性測定、中心性測定、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４１
前記クラスター解析が、連結度モデル、部分空間モデル、分布モデル、密度モデル、または重心モデルを構築するものを含む、実施形態Ａ３８〜Ａ４０のいずれか１つに記載の方法。
【０５１９】
実施形態Ａ４２
前記ネットワーク解析が、リンクのマイニング及び予測、集団分類、リンクに基づくクラスタリング、関連類似度、またはそれらの組み合わせを介するネットワークの予測モデリングを含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４３
前記ネットワーク解析が、微分方程式に基づく集団のモデリングを含む、実施形態Ａ３８または実施形態３Ａ９に記載の方法。
実施形態Ａ４４
前記ネットワーク解析が、Ｌｏｔｋａ−Ｖｏｌｔｅｒｒａモデリングを含む、実施形態Ａ４３に記載の方法。
実施形態Ａ４５
前記クラスター解析が、ヒューリスティックな方法である、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４６
前記ヒューリスティックな方法が、Ｌｏｕｖａｉｎ法である、実施形態Ａ４５に記載の方法。
【０５２０】
実施形態Ａ４７
前記ネットワーク解析が、変数間の連結度を確立するためのノンパラメトリック法を含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
実施形態Ａ４８
前記ネットワーク解析が、連結度を確立するための、変数間の相互情報量及び／または最大情報係数の計算を含む、実施形態Ａ３８または実施形態Ａ３９に記載の方法。
【０５２１】
実施形態Ａ４９
環境の特性または特徴を変えるように構成された活性微生物株のアンサンブルを２つ以上の試料セットに基づいて形成するための方法であって、前記２つ以上の試料セットが、前記２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータを共有し、かつ前記２つ以上の試料セットの間で少なくとも１つの異なる環境パラメータを有するものであり、各試料セットが、不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、前記１つまたは複数の微生物株が、１つまたは複数の生物型の亜分類群であり、前記方法が、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、タンパク質レベルまたはＲＮＡレベルで１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルを測定すること（特有の第２のマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回る発現レベルに基づいて、各試料について前記検出された微生物株の活性を決定すること、前記１つまたは複数の第１のマーカーの量と、前記１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の前記微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（前記１つまたは複数の活性微生物株は、前記特有の第２のマーカーを、前記特定した閾値を上回って発現する）、前記試料における前記活性微生物株と、少なくとも１つの環境パラメータまたは追加の活性微生物株と、の共出現を、ネットワーク内のそれぞれの微生物株の連結度を測定するための最大情報係数ネットワーク解析に基づいて決定すること（前記ネットワークは、前記少なくとも２つ以上の試料セットが少なくとも１つの共通または関連する環境パラメータと共にまとまったものである）、前記ネットワーク解析に基づいて前記１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに前記選択された複数の活性微生物株から活性微生物株のアンサンブルを形成させること（前記活性微生物株のアンサンブルは、前記活性微生物株のアンサンブルが環境に導入されたときに前記環境の特性または特徴を選択的に変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５２２】
実施形態Ａ５０
前記少なくとも１つの環境パラメータが、第２の微生物株の存在、活性、及び／または量を含む、実施形態Ａ４９に記載の方法。
実施形態Ａ５１
第１の試料セットについての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の少なくとも１つの測定識別指標が、第２の試料セットについての前記少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標とは異なる、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
【０５２３】
実施形態Ａ５２
各試料セットが、複数の試料を含み、試料セット内の各試料についての少なくとも１つの共通または関連する環境因子の測定識別指標が、実質的に同様であり、１つの試料セットについての平均測定識別指標が、別の試料セットに由来する前記平均測定識別指標と異なる、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５３
各試料セットが、複数の試料を含み、第１の試料セットが、第１の集団から取得され、第２の試料セットが、第２の集団から取得される、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５４
各試料セットが、複数の試料を含み、第１の試料セットが、第１の時点で第１の集団から取得され、第２の試料セットが、前記第１の時点とは異なる第２の時点で前記第１の集団から取得される、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ５５
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、栄養素情報を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
【０５２４】
実施形態Ａ５６
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、食物情報を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５７
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、動物特徴を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ５８
少なくとも１つの共通または関連する環境因子が、感染情報または健康状態を含む、実施形態Ａ４９〜Ａ５４のいずれか１つに記載の方法。
【０５２５】
実施形態Ａ５９
少なくとも１つの測定識別指標が、試料ｐＨ、試料温度、脂肪の存在量、タンパク質の存在量、糖質の存在量、ミネラルの存在量、ビタミンの存在量、天然物の存在量、特定の化合物の存在量、前記試料源の体重、前記試料源の飼料摂取量、前記試料源の体重増加、前記試料源の飼料効率、１つもしくは複数の病原体の存在もしくは不在、前記試料源の物理的な特徴（複数可）もしくは測定値（複数可）、前記試料源の産生特徴、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ５１に記載の方法。
【０５２６】
実施形態Ａ６０
前記少なくとも１つのパラメータが、乳汁における乳清タンパク質の存在量、カゼインタンパク質の存在量、及び／または脂肪の存在量、のうちの少なくとも１つである、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ６１
各試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のゲノムＤＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６２
前記試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のＲＮＡマーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６３
前記試料における前記特有の第１のマーカーの数の測定が、特有のタンパク質マーカーの数を測定することを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６０のいずれか１つに記載の方法。
【０５２７】
実施形態Ａ６４
前記複数の微生物型が、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６５
各試料における前記微生物型のそれぞれの絶対細胞数の決定が、前記試料またはその一部をシークエンシング、遠心分離、光学顕微鏡法、蛍光顕微鏡法、染色、質量分析、マイクロフルイディクス、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ゲル電気泳動、及び／またはフローサイトメトリーに供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６６
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の細菌、古細菌、真菌、原生動物、植物、他の真核生物、ウイルス、ウイロイド、またはそれらの組み合わせから選択される１つまたは複数の微生物型の亜分類群である、実施形態Ａ４９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の方法。
【０５２８】
実施形態Ａ６７
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の細菌株、古細菌株、真菌株、原生動物株、植物株、他の真核生物株、ウイルス株、ウイロイド株、またはそれらの組み合わせである、実施形態Ａ４９〜Ａ６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６８
１つまたは複数の活性微生物株が、１つまたは複数の真菌種、真菌亜種、細菌種、及び／または細菌亜種である、実施形態Ａ４９〜Ａ６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ６９
少なくとも１つの特有の第１のマーカーが、５Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１６Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２３Ｓリボソームサブユニット遺伝子、５．８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、１８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、２８Ｓリボソームサブユニット遺伝子、チトクロムｃ酸化酵素サブユニット遺伝子、ベータ−チューブリン遺伝子、伸長因子遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼサブユニット遺伝子、内部転写スペーサー（ＩＴＳ）、またはそれらの組み合わせを含む系統発生学的マーカーを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８のいずれか１つに記載の方法。
【０５２９】
実施形態Ａ７０
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをハイスループットシークエンシング反応に供すことを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７１
前記特有の第１のマーカーの数及びその量の測定が、各試料に由来するゲノムＤＮＡをメタゲノムシークエンシングに供すことを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７２
特有の第１のマーカーが、ｍＲＮＡマーカー、ｓｉＲＮＡマーカー、またはリボソームＲＮＡマーカーを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
実施形態Ａ７３
特有の第１のマーカーが、シグマ因子、転写因子、ヌクレオシド関連タンパク質、代謝酵素、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４９または実施形態Ａ５０に記載の方法。
【０５３０】
実施形態Ａ７４
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料におけるｍＲＮＡを遺伝子発現解析に供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ７３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ７５
前記遺伝子発現解析が、シークエンシング反応を含む、実施形態Ａ７４に記載の方法。
実施形態Ａ７６
前記遺伝子発現解析が、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、メタトランスクリプトームシークエンシング、及び／またはトランスクリプトームシークエンシングを含む、実施形態Ａ７４に記載の方法。
【０５３１】
実施形態Ａ７７
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、各試料またはその一部を質量分析に供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８及び実施形態Ａ７４〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ７８
前記１つまたは複数の特有の第２のマーカーの発現レベルの測定が、前記試料またはその一部をメタリボソームプロファイリング及び／またはリボソームプロファイリングに供すことを含む、実施形態Ａ４９〜Ａ６８及び実施形態Ａ７４〜Ａ７６のいずれか１つに記載の方法。
【０５３２】
実施形態Ａ７９
前記試料の取得源の型が、動物、土壌、空気、塩水、淡水、廃水汚泥、堆積物、油、植物、農産物、バルク土壌、土壌根圏、植物部分、野菜、極限環境、またはそれらの組み合わせ、のうちの１つである、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０５３３】
実施形態Ａ８０
各試料が、消化管試料である、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態Ａ８１
各試料が、組織試料、血液試料、歯試料、汗試料、爪試料、皮膚試料、毛髪試料、糞便試料、尿試料、精液試料、粘液試料、唾液試料、筋肉試料、脳試料、または器官試料のうちの１つである、実施形態Ａ４９〜Ａ７８のいずれか１つに記載の方法。
【０５３４】
実施形態Ａ８２
プロセッサによって実施される方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料から試料データを受け取ること、各試料について各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を決定すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を決定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを、プロセッサを介して統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの特定した閾値を上回る測定値に基づいて各試料におけるそれぞれの微生物株の活性レベルを決定すること（微生物株は、前記株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーの測定値が対応閾値を上回るであれば、活性であると同定する）、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株と共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数のネットワーク解析を、少なくとも１つのプロセッサを介して実施すること（前記ネットワーク解析は、それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、及びそれぞれの活性微生物株とそれぞれの少なくとも１つの測定メタデータまたは追加の活性微生物株の間の最大情報係数スコアを決定することを含む）、予測される機能及び／または化学に基づいて前記活性微生物株を分類すること、前記分類に基づいて複数の活性微生物株を同定すること、ならびに前記同定された複数の活性微生物株を出力すること、を含む、前記方法。
【０５３５】
実施形態Ａ８３
標的に適用されると、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成された活性微生物アンサンブルを構築することをさらに含む、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８４
前記出力された複数の活性微生物株が、活性微生物アンサンブルの構築に使用され、前記活性微生物アンサンブルが、標的に適用されると、前記少なくとも１つの測定メタデータに対応する特性を変えるように構成される、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８５
前記出力された複数の同定活性微生物株に基づいて少なくとも１つの病原体を同定することをさらに含む、実施形態Ａ８２に記載の、プロセッサによって実施される方法。
実施形態Ａ８６
前記出力された複数の活性微生物株が、活性微生物アンサンブルの構築にさらに使用され、前記活性微生物アンサンブルが、標的に適用されると、前記少なくとも１つの同定病原体を標的とし、前記少なくとも１つの同定病原体と関連する症状を治療及び／または予防するように構成される、実施形態Ａ８２〜Ａ８５のいずれか１つに記載の、プロセッサによって実施される方法。
【０５３６】
実施形態Ａ８７
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通の特徴を共有し、かつ少なくとも１つの異なる特徴を有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、微生物株のマーカーである）、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること（前記比較は、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含み、各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定は、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む）、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づいて予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株を選択すること、ならびに前記選択された微生物株を組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物のバイオアンサンブルを形成させること（前記バイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルが標的生物学的環境に導入されると前記標的生物学的環境の前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５３７】
実施形態Ａ８８
前記少なくとも１つの測定メタデータに基づいて少なくとも１つの追加の試料を取得すること（前記少なくとも１つの追加の試料は、前記少なくとも２つの試料と少なくとも１つの特徴を共有する）、ならびに前記少なくとも１つの追加の試料について、１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること、前記それぞれの微生物型の数と前記第１のマーカーの数とを統合して、存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を得ること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを測定して前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも１つの追加の試料についての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、をさらに含む、実施形態Ａ８７に記載の方法であって、前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数の比較が、前記少なくとも１つの測定メタデータと共に、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、を比較することを含み、その結果、前記活性微生物株の選択が、前記少なくとも１つの追加の試料についての前記活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数に少なくとも部分的に基づくものとなる、前記方法。
【０５３８】
実施形態Ａ８９
生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物株の合成アンサンブルを形成するための方法であって、前記方法が、複数の環境パラメータをそれぞれが有する２つ以上の試料セットに基づいており、前記複数の環境パラメータの少なくとも１つのパラメータが、前記２つ以上の試料セットの間で同様の共通環境パラメータであり、少なくとも１つの環境パラメータが、前記２つ以上の試料セットのそれぞれの間で異なる別の環境パラメータであり、各試料セットが、生物学的試料源から取得された不均一微生物コミュニティを含む少なくとも１つの試料を含み、前記活性微生物株の少なくとも１つが、１つまたは複数の生物型の亜分類群であり、前記方法が、各試料における複数の微生物型の存在を検出すること、各試料において検出された微生物型のそれぞれの絶対細胞数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーは、微生物株のマーカーである）、１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーの発現レベルを測定すること（特有のＲＮＡマーカーは、微生物株の活性のマーカーである）、前記１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーの特定した閾値を上回る発現レベルに基づいて、各試料について前記検出された微生物株のそれぞれの活性を決定すること、前記１つまたは複数の第１のマーカーの量と、前記１つまたは複数の微生物株が亜分類群となる由来元の前記微生物型の絶対細胞数と、に基づいて、各試料における検出されたそれぞれの活性微生物株の絶対細胞数を計算すること（前記１つまたは複数の活性微生物株は、１つまたは複数の特有のＲＮＡマーカーを、前記特定した閾値を上回って発現する）、前記２つ以上の試料セットの前記活性微生物株を解析すること（前記解析は、前記２つ以上の試料セットのそれぞれの前記活性微生物株のそれぞれと、前記少なくとも１つの共通環境パラメータと、前記少なくとも１つの異なる環境パラメータと、のノンパラメトリックネットワーク解析を実施することを含み、前記ノンパラメトリックネットワーク解析は、（１）それぞれの活性微生物株と他のあらゆる活性微生物株との間の最大情報係数スコアを決定すること、ならびに（２）それぞれの活性微生物株と前記少なくとも１つの異なる環境パラメータとの間の最大情報係数スコアを決定することを含む）、前記ノンパラメトリックネットワーク解析に基づいて前記１つまたは複数の活性微生物株から複数の活性微生物株を選択すること、ならびに前記選択された複数の活性微生物株及び微生物担体媒体を含む活性微生物株の合成アンサンブルを形成させること（前記活性微生物株のアンサンブルは、前記活性微生物株の合成アンサンブルが生物学的環境に導入されると、前記生物学的環境の特性を選択的に変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５３９】
実施形態Ａ９０
標的生物学的環境の特性を変えるように構成された活性微生物バイオアンサンブルの形成方法であって、前記方法が、少なくとも１つの共通環境パラメータを共有し、かつ少なくとも１つの異なる環境パラメータを有する少なくとも２つの試料を取得すること、各試料について、各試料における１つまたは複数の微生物型の存在を検出すること、前記１つまたは複数の微生物型のうちで各試料において検出されたそれぞれの微生物型の数を決定すること、各試料における特有の第１のマーカーの数及びその量を測定すること（特有の第１のマーカーはそれぞれ、被検出微生物型の微生物株のマーカーである）、前記検出されたそれぞれの微生物型の数と、前記微生物型に対応または関連する特有の第１のマーカーの比例数／相対数と、に基づいて、各試料に存在するそれぞれの微生物株の絶対細胞数を決定すること、それぞれの微生物株に対する少なくとも１つの特有の第２のマーカーを、特定した閾値に基づいて測定して各試料における前記微生物株の活性レベルを決定すること、前記決定された活性によって前記それぞれの微生物株の絶対細胞数をフィルタリングすることで、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての活性微生物株のリスト及びそのそれぞれの絶対細胞数を得ること、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての前記活性微生物株のフィルタリングされた絶対細胞数と、前記少なくとも２つの試料のそれぞれについての少なくとも１つの測定メタデータと、を比較すること（前記比較は、各試料における前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現を決定することを含み、各試料における、前記活性微生物株と、前記少なくとも１つの測定メタデータと、の共出現の決定は、メタデータと微生物株との関連性を示すリンケージ、前記活性微生物株の絶対細胞数、ならびに前記特有の第２のマーカーの測定値、がまとまったマトリックスを創出して１つまたは複数の不均一微生物コミュニティネットワークを示すことを含む）、活性な不均一微生物コミュニティネットワーク内のそれぞれの活性微生物株と測定メタデータとの連結度を明らかにするノンパラメトリックネットワーク解析及びクラスター解析のうちの少なくとも１つに基づいて予測される機能及び／または化学に従って前記活性微生物株を少なくとも２つの群に群化すること、前記少なくとも２つの群のそれぞれから少なくとも１つの微生物株を選択すること、前記選択された微生物株を組み合わせ、担体媒体と一緒にして活性微生物の合成バイオアンサンブルを形成させること（前記合成バイオアンサンブルは、前記バイオアンサンブルを標的生物学的環境に導入すると、前記標的生物学的環境の前記少なくとも１つのメタデータに対応する特性を変えるように構成される）、を含む、前記方法。
【０５４０】
本開示は、その特定の実施形態を参照して明らかにされているが、本開示の真の趣旨及び範囲を逸脱することなく、さまざまな変更を実施できると共に、同等形態での置き換えもできることを当業者なら理解するであろう。さらに、記載の実施形態及び開示の目的の趣旨及び範囲に特定の状況、材料、組成物、プロセス、またはプロセス段階（複数可）が適合するように、多くの改変を実施することができる。そのような改変はすべて、本開示の範囲に含まれることが意図される。本明細書で参照される特許、特許出願、特許出願刊行物、学術論文、及びプロトコールは、あらゆる目的のために参照によってその全体が組み込まれる。こうした文献には、下記のＰＣＴ出願刊行物が含まれる：ＷＯ／２０１６／２１０２５１、ＷＯ／２０１７／１２０４９５、及びＷＯ／２０１７／１８１２０３。
【０５４１】
さまざまな実施形態が本明細書に記載及び例示されているが、本明細書に記載の機能の実施、及び／または本明細書に記載の結果の獲得、及び／または本明細書に記載の利点の１つもしくは複数、を達成するためのさまざまな他の方法及び／または構造を当業者なら容易に思い付くであろう。そのような変形形態及び／または改変形態はそれぞれ、本開示の範囲に含まれるものと見なされる。より一般的には、本明細書に記載のパラメータ、寸法、材料、及び構成は、例示のものとして提供されており、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／または構成は、開示の教示内容が使用される特定の用途（複数可）または実施態様（複数可）に依存することになることを当業者なら容易に理解するであろう。当業者なら日常的な実験手法を使用するだけで、本明細書に記載の特定の実施形態に対する同等形態を認識するか、または確認可能であろう。したがって、前述の実施形態は、例として示されるものにすぎず、添付の特許請求の範囲及びそこに記載のものの同等形態の範囲内で、具体的に記載及び請求されるもの以外の形で実施形態を実施できると理解されたい。本開示の実施形態は、本明細書に記載のそれぞれの個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を対象とする。さらに、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法を２つ以上組み合わせたものはいずれも、そのような特徴、システム、物品、材料、キット、及び／または方法が相互に矛盾しないのであれば、本開示の範囲に含まれる。
【０５４２】
上記の実施形態は、多数の方法のいずれでも実施することができる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、またはそれらの組み合わせを使用して実施することができる。ソフトウェアにおいて実施されるとき、ソフトウェアコードは、任意の適切なプロセッサまたはプロセッサの集合物で実行することができ、こうしたプロセッサまたはプロセッサの集合物が、単一のコンピュータにおいて提供されるか、または複数のコンピュータにまたがって分散しているものであるかは問われない。
【０５４３】
さらに、開示の方法をコンピュータと組み合わせて使用できることを理解されよう。こうしたコンピュータは、ラックマウント型コンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、またはタブレットコンピュータなどの、いくつかの形態のいずれにおいても具体化することができる。さらに、コンピュータとは一般に見なされないが、適切な処理能力を有するデバイスにコンピュータを組み込むことができ、こうしたデバイスには、タブレット、携帯情報端末（ＰＤＡ）、スマートフォン、または任意の他の適切な携帯式または固定式の電子デバイスが含まれる。
【０５４４】
また、コンピュータは、１つまたは複数のディスプレイを含めて、１つまたは複数の入力デバイス及び出力デバイスを有し得る。こうしたデバイスは、数ある中でも特に、ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる。ユーザーインターフェースを提供するために使用することができる出力デバイスの例には、出力結果を視覚的に表示するためのプリンターまたは表示画面、及び出力結果を音で示すためのスピーカーまたは他の音発生デバイスが含まれる。ユーザーインターフェースのために使用することができる入力デバイスの例には、キーボード、ならびにポインティングデバイス（マウス、タッチパッド、及びデジタイズタブレットなど）が含まれる。別の例として、コンピュータは、音声認識を介すか、または他の音形式で、入力情報を受信することができる。
【０５４５】
そのようなコンピュータは、任意の適切な形式で１つまたは複数のネットワークによって相互接続することができ、こうしたネットワークには、ローカルエリアネットワークまたはワイドエリアネットワーク（企業ネットワークなど）、及びインテリジェントネットワーク（ＩＮ）またはインターネットが含まれる。そのようなネットワークは、任意の適切な技術に基づくものであり得、任意の適切なプロトコールに従って運用することができ、無線ネットワーク、有線ネットワーク、または光ファイバーネットワークを含み得る。
【０５４６】
本明細書に概要が記載されるさまざまな方法及びプロセス（及び／またはその一部）は、さまざまなオペレーティングシステムまたはプラットフォームのいずれか１つを利用する１つまたは複数のプロセッサで実行可能なソフトウェアとしてコード化することができる。さらに、そのようなソフトウェアは、いくつかの適切なプログラミング言語及び／またはプログラミングツールもしくはスクリプト作成ツールのいずれかを使用して記述することができると共に、実行可能なマシン語コードまたはフレームワークもしくは仮想マシンで実行される中間コードとしてコンパイルすることもできる。
【０５４７】
この点において、１つまたは複数のプログラムがコード化されたコンピュータ可読記憶媒体（または複数のコンピュータ可読記憶媒体）（例えば、コンピュータメモリ、１つもしくは複数のフロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク、光ディスク、磁気テープ、フラッシュメモリ、フィールドプログラマブルゲートアレイの回路構成もしくは他の半導体デバイス、または他の非一過性の媒体もしくは有形のコンピュータ記憶媒体）として開示のさまざまな概念を具体化することができ、こうした１つまたは複数のプログラムは、１つまたは複数のコンピュータまたは他のプロセッサで実行されると、上記の本開示のさまざまな実施形態を実施する方法を実行することができる。コンピュータ可読媒体（複数可）は、可搬型のものであり得、その結果、そこに保存されたプログラム（複数可）を１つまたは複数の異なるコンピュータまたは他のプロセッサにロードして、上に議論される本開示のさまざまな態様を実施することができる。
【０５４８】
「プログラム」または「ソフトウェア」という用語は、コンピュータまたは他のプロセッサをプログラムして上に議論される実施形態のさまざまな態様を実施するために利用することができる、コンピュータによって実行可能な命令の任意の型のコンピュータコードまたはセットを指すために包括的な意味において本明細書で使用される。さらに、１つの態様によれば、実行時に本開示の方法を実施する１つまたは複数のコンピュータプログラムは、単一のコンピュータまたはプロセッサに存在する必要はなく、本開示のさまざまな態様を実施するためのいくつかの異なるコンピュータまたはプロセッサにまたがってモジュラー様式で分散して存在し得ることを理解されよう。
【０５４９】
コンピュータによって実行可能な命令は、１つまたは複数のコンピュータまたは他のデバイスによって実行される多くの形態（プログラムモジュールなど）をとり得る。一般に、プログラムモジュールは、特定のタスクを実施するか、または特定の抽象データ型を実施するルーチン、プログラム、オブジェクト、コンポーネント、データ構造などを含む。典型的には、プログラムモジュールの機能性を、必要に応じて、さまざまな実施形態において統合または分配することができる。
【０５５０】
また、データ構造は、任意の適切な形式でコンピュータ可読媒体に保存することができる。説明を簡単にするために、データ構造は、そのデータ構造における位置で関連付けられたフィールドを有するように示すことができる。同様に、そのような関連性は、コンピュータ可読媒体における位置がフィールド間の関連性を示すようにフィールドの保存割り当てを行うことによっても達成できる。しかしながら、データ構造のフィールドにおける情報の間の関連性を確立するために任意の適切な機構を使用することができ、こうした機構には、ポインター、タグ、またはデータ要素間の関連性を確立する他の機構を使用するものが含まれる。
【０５５１】
また、開示のさまざまな概念を１つまたは複数の方法として具体化することができ、こうした方法の例は示されている。方法の一部として実施される行為は、任意の適切な方法で順序付けすることができる。したがって、実施形態は、例示のものとは異なる順序で行為を実施するものとして構成され得るものであり、こうした順序には、実施形態の例において行為が連続的なものとして示されていたとしても、いくつかの行為を同時に実施するものが含まれ得る。
【０５５２】
本明細書で定義及び使用される定義はすべて、辞書の定義、参照によって組み込まれる文書の定義、及び／または定義される用語の通常の意味より優先されることを理解されよう。
【０５５３】
本明細書ではフロー図が使用されている。フロー図の使用は、実施される操作の順序に関する限定を意図するものではない。本明細書に記載される対象物では、異なるコンポーネントが他の異なるコンポーネントに含められたもの、または異なるコンポーネントが他の異なるコンポーネントと連結されたものが示されることがある。そのような記載の構築様式は単に例示にすぎず、実際は、同一の機能性を達成する他の多くの構築様式を利用できることを理解されよう。概念的な意味では、同一の機能性を達成するための任意の配置のコンポーネントが、所望の機能性を達成するように効率的に「結合」される。したがって、特定の機能性を達成するために組み合わせられた本明細書の任意の２つのコンポーネントは、構築様式または中間コンポーネントとは無関係に、所望の機能性を達成するように互いに「結合」されたものと見なすことができる。同様に、そのように結合した任意の２つのコンポーネントは、所望の機能性を達成するために互いに「機能可能なように連結」または「機能可能ように結合」したものと見なすこともでき、そのように結合することが可能な任意の２つのコンポーネントは、所望の機能性を達成するために互いに「機能可能なように結合可能」なものと見なすこともできる。機能可能なように結合可能なものの特定の例には、限定はされないが、物理的に対形成することが可能であり、及び／または物理的に相互作用するコンポーネント、及び／または無線で相互作用することが可能であり、及び／または無線で相互作用するコンポーネント、及び／または論理的に相互作用し、及び／または論理的に相互作用することが可能なコンポーネントが含まれる。
【０５５４】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「ａ」及び「ａｎ」という不定冠詞は、異なる定義が明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味することを理解されよう。
【０５５５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／または」という語句は、まとまった要素、すなわち、離接的に存在する場合もあり、連接的に存在する場合もある要素の「いずれかまたは両方」を意味することを理解されよう。「及び／または」を用いて列挙される複数の要素もまた、同一の様式、すなわち、そのようにまとまった当該要素の「１つまたは複数」であると解釈されるべきである。「及び／または」節によって具体的に特定される要素以外にも、具体的に特定されるそうした要素と関連するか否かとは無関係に、他の要素が任意選択で存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／またはＢ」に対する参照は、非限定型の言葉（「含む」など）と併用されるとき、１つの実施形態では、Ａのみ（Ｂ以外の要素を任意選択で含む）を指し、別の実施形態では、Ｂのみ（Ａ以外の要素を任意選択で含む）を指し、さらに別の実施形態では、ＡとＢとの両方（他の要素を任意選択で含む）を指すなどし得る。
【０５５６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「または」は、上に定義される「及び／または」と同一の意味を有することを理解されよう。例えば、「または」あるいは「及び／または」によってリスト中の項目が分かれているとき、「または」あるいは「及び／または」は、包含的であり、すなわち、いくつかの要素または一連の要素のうちの少なくとも１つを含むだけなく、そのうちの複数も含むことに加えて、任意選択で、リストにない項目も追加で含むと解釈されるものとする。これと異なることが明確に示される用語（「のうちの１つのみ」もしくは「のうちの厳密に１つ」、または特許請求の範囲で使用されるときは、「からなる」など）のみが、いくつかの要素または一連の要素のうちの厳密に１つの要素を含むことを指すことになる。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他性の用語（「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」、または「のうちの厳密に１つ」など）が先行するとき、排他的選択肢を指すもの（すなわち、「一方またはもう一方であるが、両方ではない」）としてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０５５７】
１つまたは複数の要素のリストに関して本明細書及び特許請求の範囲で使用される「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストに存在する要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されるありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ず含むというわけではなく、要素のリストに存在する要素の任意の組み合わせを除外しないことを理解されよう。この定義では、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定される要素と関連するか否かとは無関係に、任意選択で存在し得ることも許容される。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（あるいは同等の「ＡまたはＢのうちの少なくとも１つ」、あるいは同等の「Ａ及び／またはＢのうちの少なくとも１つ」）は、１つの実施形態では、Ｂが存在しない少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）（加えて任意選択でＢ以外の要素を含む）を指し、別の実施形態では、Ａが存在しない少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）（加えて任意選択でＡ以外の要素を含む）を指し、さらに別の実施形態では、少なくとも１つのＡ（任意選択で複数のＡを含む）及び少なくとも１つのＢ（任意選択で複数のＢを含む）（加えて任意選択で他の要素を含む）を指すなどし得る。
【０５５８】
特許請求の範囲ならびに上記の本明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」、及び同様のものなどの移行句はすべて、非限定的であり、すなわち、含むが、限定はされないという意味を有することを理解されよう。「からなる」及び「から本質的になる」という移行句のみが、それぞれ限定的または半限定的な移行句となるものとし、このことは、米国特許庁特許審査便覧のセクション２１１１．０３に記載される。
【図１】
2020507308.tif 000046
【図１Ａ】
2020507308.tif 000047
【図１Ｂ】
2020507308.tif 000048
【図１Ｃ】
2020507308.tif 000049
【図１Ｄ】
2020507308.tif 000050
【図１Ｅ】
2020507308.tif 000051
【図１Ｆ】
2020507308.tif 000052
【図１Ｇ】
2020507308.tif 000053
【図１Ｈ】
2020507308.tif 000054
【図２】
2020507308.tif 000055
【図３Ａ】
2020507308.tif 000056
【図３Ｂ】
2020507308.tif 000057
【図３Ｃ】
2020507308.tif 000058
【図３Ｄ】
2020507308.tif 000059
【図４】
2020507308.tif 000060
【図５】
2020507308.tif 000061
【図６】
2020507308.tif 000062
【図７】
2020507308.tif 000063
【図８】
2020507308.tif 000064
【図９】
2020507308.tif 000065
【図１０】
2020507308.tif 000066
【図１１】
2020507308.tif 000067
【図１２−１】
2020507308.tif 000068
【図１２−２】
2020507308.tif 000069
【図１２−３】
2020507308.tif 000070
【図１３】
2020507308.tif 000071
【図１４Ａ】
2020507308.tif 000072
【図１４Ｂ】
2020507308.tif 000073
【図１４Ｃ】
2020507308.tif 000074
【国際調査報告】
2020507308.tif 000075
2020507308.tif 000076
2020507308.tif 000077