(57)【要約】本発明は、未成熟ＤＣを有効成分とする、温熱処置、好ましくは、磁性微粒子を用いる温熱処理、特に好ましくは、カチオン性リポソームで被覆されたマグネタイトを用いる温熱処理後の腫瘍の処置に用いるための免疫賦活剤、ヒトから取り出された骨髄細胞を、サイトカイン、好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地を用いて培養することを含む、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための未成熟ＤＣを有効成分とする免疫賦活剤の調製方法、及び温熱処置に続いて免疫処置を施す、腫瘍の治療方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟樹状細胞を有効成分とする、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための免疫賦活剤。
【請求項２】
温熱処置が、磁性微粒子を用いるものである、請求の範囲第１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
磁性微粒子が、カチオン性リポソームで被覆されたマグネタイトである、請求の範囲第２項に記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
ヒトから取り出された骨髄細胞をサイトカインを含む培地を用いて培養することを含む、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための未成熟樹状細胞を有効成分とする免疫賦活剤の調製方法。
【請求項５】
サイトカインが、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４である、請求の範囲第４項に記載の調製方法。
【請求項６】
温熱処置に続いて免疫処置を施す、腫瘍の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、未成熟樹状細胞を有効成分とする、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための免疫賦活剤に関する。
【背景技術】  これまで腫瘍を治療するために、外科療法、放射線療法、抗ガン剤による化学療法が主として用いられてきた。診断技術や臨床技術も大きく進歩し腫瘍の治療は不可能ではなくなってきている。
しかし、現在でも死亡原因に占める腫瘍の割合は３割を越えており、腫瘍に対する新しい治療法の開発が求められている。そのため新たな治療法として遺伝子療法、免疫療法、温熱療法などの方法の開発も始まっている。
上記した腫瘍の新たな治療法の中で、温熱療法は、古代ギリシャから行われてきた古い治療法で、腫瘍細胞が正常細胞に比べて熱に弱いという性質を利用した治療法である。温熱療法として広く用いられているのは、腫瘍の組織がある部位を全体的に加温し、熱に弱い腫瘍細胞を殺す方法である。
腫瘍の温熱療法として、内部発熱体として磁性微粒子を用い、この磁性微粒子を電磁波により加熱する方法が知られている。腫瘍組織の均一な加温による治療効果の向上のため、磁性微粒子としてマグネタイトを用いること、および、腫瘍細胞へのマグネタイトの取り込み効率を高めるため、腫瘍細胞の表面が負に帯電していることから、正の電荷をもった脂質膜（リポソーム）でマグネタイトを被覆することによりマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を作り、これを用いることが知られている（新海ら著、日本ハイパーサーミア学会誌（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）第１０巻、ｐ．１６８−１７７、１９９４年、及び、新海ら著、バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２１巻、ｐ．１２５−１３７、１９９４年）。
腫瘍の温熱療法は、それが非侵襲的な治療法であるために注目を集めているが、この温熱療法も、その単独使用では、種々の腫瘍を完全に治療するのは困難である場合が多い。
最近、サイトカインと磁性微粒子を含む悪性腫瘍の温熱治療剤が開発されている。
しかし、温熱療法のみでは、転移による影響を排除することはできず、温熱処置後の腫瘍において、免疫反応を活性化することができる治療剤の開発が待たれている。
免疫には、Ｂリンパ球が生産する抗体が抗原と結合する液性免疫とＴリンパ球が活性物質を放出したり、直接抗原に働く細胞性免疫とがあることが知られている。細胞性免疫は、異物を貪食し，その抗原性物質を認識し，これをＭＨＣという蛋白質とともに細胞表面に提示した抗原提示細胞が、ヘルパーＴ細胞に接触することにより活性化され、インターロイキンを放出するというシステムである。
組織に常在している樹状細胞（ＤＣ）は、侵入した細菌やウイルス粒子、又はウイルス感染によって破壊された細胞の死骸・断片などを取り込み、リンパ液の流れに沿って所属リンパ節に移動する。この間にＤＣは、細胞外から取り込んだタンパク質を分解処理し、その結果生じたペプチドをＭＨＣ分子の上に提示する。そして、その所属リンパ器官に存在するリンパ球を抗原提示やサイトカインの放出によって刺激し、免疫系を活性化する。
このように、ＤＣは、初期段階の抗原認識を司り、抗原特異的な免疫の誘導、そして免疫系の活性化を行う。このＤＣを用いた免疫療法として、がん患者自身の単球を取り出し、未成熟ＤＣに分化させ、この未成熟ＤＣにがん抗原をパルスし、がん抗原を提示した成熟ＤＣとした後患者に戻す、ＤＣワクチンと呼ばれるがん免疫療法が開発されてきている。
しかし、ＤＣワクチンには、腫瘍関連抗原を過剰発現するＤＣを作製することが困難であること、多量の遺伝子導入樹状細胞の調製が困難であること、期待した程度の効果が認められないこと等の欠点があった。
したがって、本発明は、このような従来の技術の有する欠点のない、新規免疫賦活剤、その調製方法、それを用いる腫瘍の治療方法を提供することを目的としている。
【発明の開示】
本発明は、未成熟ＤＣを有効成分とする、温熱処置、好ましくは、磁性微粒子を用いる温熱処理、特に好ましくは、カチオン性リポソームで被覆されたマグネタイトを用いる温熱処理後の腫瘍の処置に用いるための免疫賦活剤である。
また、本発明は、ヒトから取り出された骨髄細胞を、サイトカイン、好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を含む培地を用いて培養することを含む、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための未成熟ＤＣを有効成分とする免疫賦活剤の調製方法である。
また、本発明は、温熱処置に続いて免疫処置を施す、腫瘍の治療方法である。
【図面の簡単な説明】  図１Ａは、無処置群（ｎ＝１０）の治療後の腫瘍サイズの経時変化である。Ｘ軸は、ＭＣＬ投与からの時間（ｄａｙ）を表し、Ｙ軸は、腫瘍径（ｍｍ）を表し、Ｘ印は、マウスが死亡した日を表す。
図１Ｂは、ＤＣ処置群（ｎ＝１０）の治療後の腫瘍サイズの経時変化である。Ｘ軸は、ＭＣＬ投与からの時間（ｄａｙ）を表し、Ｙ軸は、腫瘍径（ｍｍ）を表し、Ｘ印は、マウスが死亡した日を表す。
図１Ｃは、温熱処置群（ｎ＝１０）の治療後の腫瘍サイズの経時変化である。Ｘ軸は、ＭＣＬ投与からの時間（ｄａｙ）を表し、Ｙ軸は、腫瘍径（ｍｍ）を表し、Ｘ印は、マウスが死亡した日を表す。
図１Ｄは、温熱＋ＤＣ処置群（ｎ＝１０）の治療後の腫瘍サイズの経時変化である。Ｘ軸は、ＭＣＬ投与からの時間（ｄａｙ）を表し、Ｙ軸は、腫瘍径（ｍｍ）を表し、Ｘ印は、マウスが死亡した日を表す。
図２は、治療後のマウス生存率の経時変化である。Ｘ軸は、ＭＣＬ投与からの時間（ｄａｙ）を表し、Ｙ軸は、生存率（％）を表す。実線は無処置群を表し、長い破線は温熱処置群を表し、短い破線はＤＣ処置群を表し、点線は温熱＋ＤＣ処置群を表す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下に本発明を詳細に説明する。
がんに温熱処置を施すと、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ｇｐ９６等のヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）と呼ばれる一群のタンパク質の合成が誘導される。ＨＳＰ７０は、タンパク質の機能的高次構造の形成を助ける分子シャペロンとしての働きがある。ＨＳＰが抗原をシャペロンすることにより、専門的抗原提示細胞に対し抗原の輸送・供給を行うことが報告されている。専門的抗原提示細胞は、ＨＳＰ７０に対するレセプターを有しており、これを介してＨＳＰ７０とともに抗原が取り込まれると考えられている。また、そこで取り込まれた抗原は、ＨＳＰの効果によって、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩで提示されるといわれていることから、これによって、がん免疫に有効なＴｈ１の免疫反応が誘導されると考えられる。また、ＨＳＰ７０は、専門的抗原提示細胞の中でも、最も抗原提示作用の強いと思われるＤＣの成熟を誘導することも報告されている。
温熱処置の腫瘍では、ＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＴＬ）やＤＣのような専門的抗原提示細胞が浸潤集積する。また、温熱後の腫瘍組織には、ＨＳＰ７０が大量に発現していることも知られている。
上記より、下記のストラテジーを導き出すことができる。本発明は、このストラテジーに基づくものである。まず、腫瘍にマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を用いた温熱療法を行う。そうすると腫瘍細胞は壊死し、温熱によって発現したヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）と抗原ペプチドの複合体が細胞外に放出される。次に、抗原に暴露されていない未成熟な段階のＤＣを温熱処置後の腫瘍組織に接種する。それによって、この未成熟なＤＣがＨＳＰと抗原の複合体を貪食し、ＨＳＰの効果によってＤＣが成熟し、ＭＨＣクラスＩでの抗原提示を行う。次に、成熟したＤＣがリンパ節に移動し、リンパ球を教育することでがん特異的な免疫が誘導され、活性化される。この活性化された免疫によって、温熱処置で殺されきれずに残存しているがん細胞や、転移がんを攻撃させて、がんを治療する。
この治療においては、インビトロでＤＣに抗原をパルスすることによってＤＣを成熟誘導した後に患者に戻すという、従来のＤＣ療法とは異なり、温熱処置を活用するために、患者の生体内でＤＣに対する抗原のパルス及びＤＣの成熟を行うことを特徴とする。この方法を採用することによって、驚くべきことに、腫瘍の治癒率が向上し、転移が原因と思われる早期の死亡が減少し、さらに、免疫による転移の抑制効果みとめられるという、予想外の格別の効果が認められた。
本発明は、未成熟ＤＣを有効成分とする、温熱処置、好ましくは、磁性微粒子を用いる温熱処理、特に好ましくは、カチオン性リポソームで被覆されたマグネタイトを用いる温熱処理後の腫瘍の処置に用いるための免疫賦活剤に関する。
本発明に用いる磁性微粒子としては、電磁波を吸収して発熱し、人体に無害なものであれば、使用することができるが、特に人体に吸収されにくい周波数の電磁波を吸収して発熱するものが有利であり、なかでも強磁性微粒子は、電磁波の吸収効率が良好であることから好ましく使用でき、例えば、マグネタイト、フェライトなどのセラミックあるいはパーマロイなどの強磁性金属等を例示できる。なお、前記磁性微粒子は、１００μｍ以下、特に１μｍ以下の粒径であることが望ましい。
本発明に用いる磁性微粒子として好ましいものは、正の電荷をもった脂質膜（リポソーム）を利用して、これでマグネタイトを被覆することにより調製したマグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）である。腫瘍細胞の表面が負に帯電していることから、ＭＣＬは、腫瘍細胞に選択的に集中する。ＭＣＬは、これを腫瘍に直接注入すると、エンドサイトーシスによって腫瘍細胞内に取り込まれることが確認された。
また、本発明に用いる磁性微粒子として好ましいのは、Ｓｈｉｎｋａｉらによって記載されるような、磁性微粒子を押出成型して、針状に成型した磁性微粒子である（Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１８（４），１９１−１９８（２００２））。
また、本発明に用いる磁性微粒子として好ましいのは、表面に腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した磁性微粒子である。抗体を結合した磁性微粒子は、腫瘍細胞の付近に選択的に集中するので、腫瘍細胞以外を加熱することなく温熱療法を行うことができる。
本発明における腫瘍には、あらゆる種類の腫瘍が含まれ得るが、例えば、悪性黒色腫等の皮膚ガン、肺ガン、大腸ガン、乳ガン、脳腫瘍、悪性組織球腫、骨肉腫、肝ガン、前立腺ガン、膵臓ガン、食道ガン、膀胱ガン、肺ガン、卵巣ガン、子宮ガン、胃ガン、舌ガン等があげられ、悪性黒色腫、肺ガン、脳腫瘍、前立腺ガン、大腸ガン、舌ガンに適用することが好ましく、悪性黒色腫に適用することが特に好ましい。
また、本発明は、ヒトから取り出された骨髄細胞をサイトカインを含む培地を用いて培養することを含む、温熱処置後の腫瘍の処置に用いるための未成熟ＤＣを有効成分とする免疫賦活剤の調製方法にも関する。
本発明に用いるサイトカインは、主に免疫担当細胞から作られ、免疫反応と造血反応を制御する多機能性の細胞増殖・分化誘導因子である。これら一連の因子群は主として活性化Ｔ細胞やマクロファージあるいはストローマ細胞から産生され、リンパ球及び造血系細胞間をネットワーク的に連絡して、その増殖、分化、機能を調節している。このようなサイトカインとしては、本発明の効果を奏するものであれば特に限定されないが、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒系前駆細胞の増殖・分化の刺激作用をもつサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α等が挙げられ、特に好ましくは、ＩＬ−４及びＧＭ−ＣＳＦである。
また、本発明に用いるサイトカインの製造法は特に限定されず、該サイトカインは、天然由来のもの、遺伝子組換えによるもの、化学合成によるものなどを含む。
本発明は、さらに、温熱処置に続いて免疫処置を施す、腫瘍の治療方法に関する。すなわち、腫瘍に温熱処置をした後、樹状細胞を投与することことを含む腫瘍の温熱治療法、特に、本発明は、磁性微粒子を該腫瘍に投与した後、該腫瘍を電磁場におくことを含む腫瘍の温熱処置後に、未成熟樹状細胞を投与することを特徴とするがんの治療方法である。
本発明の治療法で使用する電磁場としては、高周波磁場を用いることが好ましく、特に、周波数が１ＫＨｚ〜１０ＭＨｚの電磁波による高周波磁場であることが好ましい。１ＫＨｚより高い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、磁気ヒステリシス加熱の効率が高いからであり、１０ＭＨｚより低い周波数の高周波磁場が好ましい理由は、誘導電流による生体の発熱を抑制したまま磁性微粒子を加熱することができるからである。
本発明で使用する、表面に腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を結合した磁性微粒子は、たとえば、特開平３−１２８３３１号公報に記載されている方法、すなわち、磁性微粒子に二官能性架橋剤を結合させた後、これに腫瘍細胞に選択的に結合する抗体を反応させることにより製造できる。
前記腫瘍細胞に選択的に結合する抗体としては、例えば、肺癌に対するモノクロナール抗体（ＨＢ４Ｃ５）、大腸癌に対するモノクロナール抗体（１７−１Ａ）、乳癌に対するモノクロナール抗体（Ｈ１５Ｆ２）、悪性黒色腫に対するモノクローナル抗体（ＣＨ１４９）等を使用することができる。
前記磁性微粒子が、強磁性金属である場合には、前記強磁性金属に酸化処理を施して表面に酸化被膜を形成した後、二官能性架橋剤を結合させることが有利である。
前記二官能性架橋剤を結合させる方法としては、例えば、磁性微粒子にγ−アミノプロピルトリエトキシシランおよびグルタルアルデヒドを順に結合させる方法、ビニルアルデヒドおよびアクリルアルデヒドを順に結合させる方法、あるいはアミノシランおよびポリエチレングリコールを順に結合させる方法等を使用することが有利である。
【実施例】  次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。
実施例１
以下において、本発明を実施例に基づき説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１  実験材料
１−１  担がんマウスの作製
モデル癌細胞はマウスＢ１６メラノーマ細胞を用いた。
樹状細胞を採取するマウスと同種であるＣ５７ＢＬ／６マウスの皮下に、Ｂ１６メラノーマ細胞を移植し、担がんマウスを作製した。
１−２  マグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）の作製方法
試薬として以下のものを使用した。
磁性微粒子：１０ｎｍマグネタイト（戸田工業）
ＴＭＡＧ：Ｎ−（α−トリメチルアンモニオアセチル）−ジドデシル−Ｄ−グルタメートクロライド（相互薬工）
ＤＬＰＣ：ジラウロイルフォスファチジルコリン（ＳＩＧＭＡ）
ＤＯＰＥ：ジオレオイルフォスファチジルエタノールアミン（ＳＩＧＭＡ）
磁性微粒子であるマグネタイトは粒径１０ｎｍのものを用いた。マグネタイトを、脱イオン水を用いて十分に洗浄し、余剰のイオン成分を取り除いた。超音波処理によって、水に分散させた。ＴＭＡＧ（５．５６ｍｇ）、ＤＬＰＣ（１１．１７ｍｇ）、ＤＯＰＥ（１３．２７ｍｇ）の組成でナス型フラスコ内壁上にリン脂質膜を形成した。このリン脂質膜に上記の方法で作製したマグネタイト溶液（２０ｍｇ−マグネタイト／ｍｌ）を２ｍｌ加え、ボルテックス撹拌しながら膜を膨潤させた。膨潤させた膜及び磁性微粒子を超音波（２８Ｗ）で１５分間処理し、ＰＢＳ（１０倍濃度）２００μｌを加え、分散させた。さらに超音波（２８Ｗ）で１５分間処理し、マグネタイトカチオニックリポソーム（ＭＣＬ）を得た。
１−３  未成熟樹状細胞の調製
治療を施すマウスと同じ種類のマウスから、大腿骨を取り出し、その大腿骨から骨髄細胞を抜き出した。密度勾配遠心によって、単球層を分離した。得られた単球をサイトカインであるＧＭ−ＣＳＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃ）及びＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃ）を含有する培地で７日間培養し、樹状細胞（未成熟樹状細胞）に分化させ、得られた未成熟樹状細胞を実験に用いた。
２  実験方法
担がんマウスの腫瘍径が７ｍｍになった時点で、ＭＣＬを腫瘍局所に投与し、温熱処置及びＤＣ処置を行った。ＭＣＬを投与してから２時間後に、１２０ＫＨｚの高周波磁場を担がんマウスに印可することで４３℃、３０分の温熱処置を行い、その直後に樹状細胞（１×１０６）を腫瘍に投与した。対象群として無処置群、樹状細胞を投与せず温熱処置のみを行った温熱処置群及び温熱処置を行わず樹状細胞を投与したＤＣ処置群を設けた。
３  Ｂ１６メラノーマ細胞に対する効果
３−１  治癒効果（図１および図２）
無処置群、温熱処置群、ＤＣ処置群のいずれにおいても腫瘍は完治せず、腫瘍は増大しつづけた。それに対して、温熱＋ＤＣ処置群では、１０匹中の６匹において、腫瘍の完全退縮が認められた。また、温熱＋ＤＣ処置群以外の処置群では、原発がんがまだ小さい段階での、転移が原因と思われる死亡例が認められるのに対し、温熱＋ＤＣ処置群では、死亡例は認められず、転移の抑制効果が示唆された。さらに、生存率については、温熱＋ＤＣ処置群以外の処置群では、４０日程度で死亡してしまうが、温熱＋ＤＣ処置群では、５０日を経過しても高い生存率が認められた。
３−２  リチャレンジ
抗腫瘍免疫が賦活化され、その免疫による腫瘍に対する効果を確認するために、リチャレンジによる免疫実験を行った。
この実験では、温熱＋ＤＣ療法によって、腫瘍が完全に治癒したマウスであるキュアード・マウスを用い、これに再度Ｂ１６メラノーマ細胞を移植した。そして、腫瘍が拒絶されるか、それとも腫瘍が付くかを観察した。対照群として何ら処置をしていないマウスに腫瘍を移植した群を設けた（ナイーブ・マウス）。
その結果、ナイーブ・マウスでは、１０日以内にすべてのマウスに腫瘍が付き、そして腫瘍は経時的に大きくなっていった。しかし、キュアード・マウスでは、全部のマウスで、腫瘍が拒絶され、腫瘍が付かなかった。
この結果から、温熱＋ＤＣ処置を受けたマウスでは、抗腫瘍免疫が獲得されていることが理解される。
３−３  細胞障害性試験
免疫の効果を確かめるために、細胞障害性試験を行った。
温熱＋ＤＣ処置を行い、腫瘍が完治したキュアード・マウスとナイーブ・マウスの脾臓細胞を用い、それに含まれるリンパ球の細胞障害性を調べた。まず、処置の対象としたＢ１６に特異的な免疫の細胞障害性を調べるために、脾臓細胞とＢ１６細胞とを共培養し、特異的溶解を調べたところ、キュアード・マウスでは、細胞障害性の向上が認められた。
また、非特異的なＮＫ細胞による細胞障害性を調べるために、ＮＫ細胞に反応性である、すなわちＮＫ細胞に殺されやすいＹＡＣ１細胞と脾臓細胞とを共培養し細胞溶解を調べたところ、この場合においても、キュアード・マウスについて、細胞障害性の向上が認められた。
この結果から、温熱＋ＤＣ処置によって、特異的な細胞障害性のみならず、非特異的なＮＫ細胞による細胞障害性も高まることが確認された。
４  考察
温熱処置後の腫瘍に未成熟な樹状細胞を接触させることで、腫瘍の治癒率の向上が認められた。また、温熱処置と樹状細胞処置とによって、転移が原因と思われる早期の死亡が減少した。これらの結果から、温熱処置及び樹状細胞処置が、免疫による転移の抑制効果を有することが示唆される。また、温熱処置及び樹状細胞処置により、抗腫瘍免疫効果も高められることも明らかとなった。そして、この抗腫瘍免疫においては、腫瘍特異的免疫と自然免疫（非特異的免疫）の双方の活性化効果あるものと思われる。
【産業上の利用可能性】  本発明の免疫賦活剤は、腫瘍を完全退縮させることができ、転移を防止することができ、そして、特異的及び非特異的細胞障害性を高めることができる。
したがって、本発明の免疫賦活剤は、腫瘍の治療において有用である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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