(57)【要約】  本発明は、切断可能なリンカーにより分離された2つ以上の治療的トランスジーン、例えばヘテロダイマーサイトカインの2つの構成要素を含む組み換えアデノウイルスに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列、第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列および第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間に配置される切断部位をコードする第3のヌクレオチド配列を含む、組み換えアデノウイルス。
【請求項２】
5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３】
連続して、5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列を含む、請求項１または２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４】
第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列が、単一のプロモーターに操作可能に連結され、該プロモーターが、任意に第1のヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに対して5'に位置する、請求項１〜３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５】
第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列が、単一のポリペプチド鎖として発現される、請求項１〜４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６】
5型アデノウイルス(Ad5)または2型アデノウイルス(Ad2)である、請求項１〜５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７】
5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８】
該切断部位がタンパク質分解性切断部位である、請求項１〜７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９】
タンパク質分解性切断部位が、真核生物の小胞体またはゴルジ体に存在するプロテアーゼにより切断される、請求項８記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１０】
タンパク質分解性切断部位がフューリン(furin)切断部位である、請求項８または９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１１】
フューリン切断部位がRX1X2R (配列番号：6) (式中、X1が任意のアミノ酸であり、X2がLysまたはArgである)を含む、請求項１０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１２】
フューリン切断部位がRAKR (配列番号：7)を含む、請求項１１記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１３】
第1、第2および第3のヌクレオチド配列が、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置されるE1b-19k挿入部位に挿入される、請求項１〜１２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１４】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位とE1b-55Kの開始部位の間に配置される、請求項１３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１５】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１３または１４記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１６】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する202ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１７】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する203ヌクレオチドの欠失を含む、請求項１５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１８】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1916に対応する欠失を含む、請求項１３〜１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項１９】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917に対応する欠失を含む、請求項１３〜１７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２０】
第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列がCTGACCTC (配列番号：2)とTCACCAGG (配列番号：3)の間に挿入される、請求項１３〜１９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２１】
5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：2)、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列およびTCACCAGG (配列番号：3)を含む、請求項１３〜２０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２２】
機能性Pea3結合部位の欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１〜２１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２３】
該欠失が、E1aの開始部位の上流約-300〜約-250に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２２記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２４】
該欠失が、E1aの開始部位の上流-304〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２２または２３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２５】
該欠失が、E1aの開始部位の上流-305〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２２または２３記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２６】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の195〜244に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２２〜２５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２７】
E1aプロモーターが配列GGTGTTTTGG (配列番号：4)を含む、請求項２２〜２６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２８】
機能性TATAボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１〜２７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項２９】
該欠失が、TATAボックス全体の欠失を含む、請求項２８記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３０】
該欠失が、E1aプロモーターの-27〜-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８または２９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３１】
該欠失が、E1aプロモーターの-31〜-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３２】
該欠失が、E1aプロモーターの-44〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３３】
該欠失が、E1aプロモーターの-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３４】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の472〜475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３５】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の468〜475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３６】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の455〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３７】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項２８〜３６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３８】
配列CTAGGACTG (配列番号：5)、AGTGCCCG (配列番号：16)および/またはTATTCCCG (配列番号：17)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、請求項２８〜３７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項３９】
配列CTAGGACTG (配列番号：5)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、請求項３８記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４０】
機能性CAATボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１〜３９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４１】
該欠失がCAATボックス全体の欠失を含む、請求項４０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４２】
該欠失が、E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４０または４１記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４３】
該欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)の423〜431に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４０〜４２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４４】
E1aプロモーターが配列TTCCGTGGCG (配列番号：18)を含む、請求項４０〜４３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４５】
組み換えアデノウイルスがE3欠失をさらに含み、E3欠失が、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される、請求項１〜４４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４６】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項４５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４７】
E3欠失が、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４５または４６記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４８】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４５〜４７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項４９】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４５〜４８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５０】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４５〜４９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５１】
E3欠失が、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1064ヌクレオチドの欠失を含む、請求項４５〜４９いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５２】
E3欠失が、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む、請求項４５〜５１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５３】
E3欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む、請求項４５〜５２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５４】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される、請求項４５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５５】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５４記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５６】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５４または５５記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５７】
E3欠失が、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５４〜５６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５８】
E3欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む、請求項５４〜５８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項５９】
組み換えアデノウイルスがE4欠失をさらに含み、E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位と右逆方向末端反復(right inverted terminal repeat) (ITR)の間に配置される、請求項１〜５８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６０】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間に配置される、請求項５９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６１】
E4欠失が、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９または６０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６２】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500、約1000〜約1250または約1250〜約1500ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９〜６１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６３】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９〜６２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６４】
E4欠失が、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する1449ヌクレオチドの欠失を含む、請求項５９〜６３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６５】
E4欠失が、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む、請求項５９〜６４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６６】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、アセチルコリン、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、ICAM、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-24、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、IL-35、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、p53、TGF-β、TGF-βトラップおよびチミジンキナーゼから選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜６５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６７】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、アセチルコリン、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、ICAM、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-23A/p19、p40、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、p53、TGF-β、TGF-βトラップおよびチミジンキナーゼから選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜６５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６８】
第1および第2の治療的トランスジーンが、ヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする、請求項１〜６７いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項６９】
第1および/または第2の治療的トランスジーンがIL-23A/p19およびp40から選択される、請求項６８記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７０】
第1の治療的トランスジーンがp40をコードする、請求項６９記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７１】
第2の治療的トランスジーンがIL-23A/p19をコードする、請求項６９または７０記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７２】
配列番号：9のヌクレオチド17〜1000によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６９〜７１いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７３】
配列番号：9のヌクレオチド1013〜1582によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６９〜７２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７４】
配列番号：9のヌクレオチド17〜1582によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項６９〜７３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７５】
配列番号：9のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号：9に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む、請求項６９〜７４いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７６】
第1および/または第2の治療的トランスジーンが、外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない、請求項１〜７５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７７】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜７６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７８】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜７６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項７９】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜７８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８０】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜７８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８１】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む、請求項１〜８０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８２】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000ヌクレオチド、約6000または約7000ヌクレオチドを含む、請求項１〜８０いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８３】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが約1600ヌクレオチドを含む、請求項１〜８２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８４】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが約1650ヌクレオチドを含む、請求項１〜８３いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８５】
第1および第2の治療的トランスジーンの合わせたサイズが約3100ヌクレオチドを含む、請求項１〜８２いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８６】
過増殖性細胞において選択的に複製する、請求項１〜８５いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８７】
過増殖性細胞において第1および/または第2の治療的トランスジーンを選択的に発現する、請求項１〜８６いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８８】
過増殖性細胞が癌細胞である、請求項８６または８７記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項８９】
腫瘍崩壊性ウイルスである、請求項１〜８８いずれか一項記載の組み換えアデノウイルス。
【請求項９０】
請求項１〜８９いずれか一項に規定される組み換えアデノウイルスおよび少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項９１】
標的細胞を、請求項１〜８９いずれか一項に規定される組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、2つの治療的トランスジーンを発現させる工程を含む、標的細胞において2つの治療的トランスジーンを発現させる方法。
【請求項９２】
発現された場合、2つの治療的トランスジーンが単一のポリペプチド鎖を生じる、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
単一のポリペプチド鎖が、翻訳後に2つのポリペプチド鎖に切断される、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
腫瘍細胞を、請求項１〜８９いずれか一項に規定される組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項９５】
腫瘍増殖の阻害を必要とする被験体に、請求項１〜８９いずれか一項に規定される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍の増殖を阻害する工程を含む、腫瘍増殖の阻害を必要とする被験体において腫瘍増殖を阻害する方法。
【請求項９６】
癌の治療を必要とする被験体に、請求項１〜８９いずれか一項に規定される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、該被験体において癌を治療する工程を含む、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法。
【請求項９７】
癌が、肛門癌、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、癌腫、胆管癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃食道癌、胃腸(GI)癌、消化管間質腫瘍、肝細胞癌、婦人科癌、頭頸部癌、血液癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、小児癌、前立腺癌、腎細胞癌、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、皮膚の扁平上皮癌、胃癌、精巣癌および甲状腺癌から選択される、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
癌が、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、頭頸部癌、乳癌、肛門癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、胃食道癌、結腸直腸癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、胆管癌、脳癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫および膵臓癌から選択される、請求項９６記載の方法。
【請求項９９】
組み換えアデノウイルスが、手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法およびウイルス療法から選択される1つ以上の治療と組み合わせて投与される、請求項９５〜９８いずれか記載の方法。
【請求項１００】
組み換えアデノウイルスの有効量が、102〜1015プラーク形成単位(pfu)である、請求項９４〜９９いずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
被験体がヒトである、請求項９５〜１００いずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
被験体が小児のヒトである、請求項１０１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、その全体において本明細書中の参照により本明細書に援用される、2017年4月12日に出願された米国仮特許出願第62/484,841号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、分子生物学およびウイルス学、特に2つ以上の治療的トランスジーンを発現する組み換えウイルスである。
【背景技術】
【０００３】
背景
癌を引き起こす基礎になる分子機構の広い知識に関わらず、ほとんどの進行した癌は、現在の化学療法および放射線プロトコルでは不治のままである。腫瘍崩壊性ウイルスは、種々の悪性疾患についての現在の標準的な治療を有意に増強させる可能性を有する基盤技術として明らかになっている(Kumar, S. et al. (2008) CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS 10(4):371-379; Kim, D. (2001) EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY 1(3):525-538; Kim D. (2000) ONCOGENE 19(56):6660-6669)。これらのウイルスは、感染-再生-溶解の一続きの反応により悪性細胞を直接的に破壊するだけでなく、抗腫瘍免疫を間接的に誘導もする腫瘍崩壊性剤としての将来性を示している。これらの免疫刺激特性は、ウイルスが複製するごとにコピーされて発現される治療的トランスジーンの挿入により高められる。
【０００４】
以前に開発された腫瘍崩壊性ウイルスとしては、正常細胞においては転写的に弱められるが癌細胞においては転写的に活性であるTAV-255と称される腫瘍崩壊性血清型5アデノウイルス(Ad5)が挙げられる(PCT公開公報WO2010101921参照)。TAV-255ベクターがこの腫瘍選択性を達成する機構は、特異的なDNA配列への結合を介した、ウイルスが宿主細胞に侵入した後に転写される最初期遺伝子であるE1aのアデノウイルス発現を制御するタンパク質である転写因子Pea3およびE2Fについての3つの転写因子(TF)結合部位の標的化された欠失を介すると考えられる。
【０００５】
今日までの努力にかかわらず、ヒト患者において癌および過増殖性障害を治療するための改善された組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性ウイルスの必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は、部分的に、2つの治療的トランスジーンを発現する特定の組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスについて、それぞれの治療的トランスジーンの発現は、2つの治療的トランスジーンが、介在(intervening)切断部位、例えばタンパク質分解性切断部位を有する単一のポリペプチド鎖として発現される場合に大きく高められ得るという発見に基づく。次いで、該切断部位は、1つ以上の切断因子、例えば内発性または外来性切断因子により翻訳後に切断され得、それぞれの治療的トランスジーンによりコードされる成熟タンパク質産物を生じ得る。かかるアプローチは、それぞれの治療的トランスジーンの化学量論的発現および同時送達を確実にするさらなる利益を有する。
【０００７】
一局面において、本発明は、第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列、第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列および第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間に配置される切断部位をコードする第3のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノウイルスを提供する。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、連続的に、5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む、例えば第1のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列および/または第3のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間に配置される介在ヌクレオチド配列(例えば別のトランスジーンまたは制御配列を含む配列)がない、組み換えポリヌクレオチド配列を含む。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、単一のプロモーター(任意に、第1のヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに対して5'に配置される)に操作可能に連結され、単一のポリペプチド鎖として発現される。
【０００８】
切断部位は、タンパク質分解性切断部位、例えば真核細胞の小胞体またはゴルジ体内に存在するプロテアーゼにより切断されるタンパク質分解性切断部位であり得る。ある態様において、タンパク質分解性切断部位は、フューリン(furin)切断部位、例えば配列RX1X2R (配列番号：6)を含むフューリン切断部位(式中、X1は任意のアミノ酸であり、X2はLysまたはArgである)、例えば配列RAKR (配列番号：7)を含むフューリン切断部位である。
【０００９】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは5型アデノウイルス(Ad5)または2型アデノウイルス(Ad2)である。
【００１０】
ある態様において、第1、第2および第3のヌクレオチド配列は、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置されるE1b-19k挿入部位に挿入される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-55Kの開始部位の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1、第2および第3のヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1、第2および第3のヌクレオチド配列は、CTGACCTC (配列番号：2)とTCACCAGG (配列番号：3)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：2)、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列およびTCACCAGG (配列番号：3)を含む。
【００１１】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性Pea3結合部位の欠失を有するE1aプロモーターを含む。例えば、ウイルスは、E1aの開始部位の上流約-300〜約-250に対応するヌクレオチドの欠失、例えばE1aの開始部位の上流-305〜-255または-304〜-255に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。ある態様において、該欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の195〜244に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/またはE1aプロモーターは、配列GGTGTTTTGG (配列番号：4)を含む。
【００１２】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性TATAボックスの欠失、例えばTATAボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。例えば、ある態様において、ウイルスは、それぞれAd5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド472〜475、468〜475、455〜552および353〜552に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-27〜-24、-31〜-24、-44〜+54または-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列CTAGGACTG (配列番号：5)、AGTGCCCG (配列番号：16)またはTATTCCCG (配列番号：17)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失されるポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００１３】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、アデノウイルス5型E1aプロモーターの-29〜-26、-33〜-26、-44〜+52または-148〜+52に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、ウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列CTAGGACTG (配列番号：5)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失されるポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００１４】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性CAATボックスの欠失、例えばCAATボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。例えば、ある態様において、ウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド423〜431に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列TTCCGTGGCG (配列番号：18)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失されるポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００１５】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはE3欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失部位は、pVIIIの停止部位とFiberの開始部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失部位は、E3-10.5Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。
【００１６】
ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位とE3-14.7Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。
【００１７】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはさらにE4欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位と右逆方向末端反復(right inverted terminal repeat) (ITR)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500または約1000〜約1250ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1449ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む。
【００１８】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、アセチルコリン、抗CTLA-4抗体重鎖または軽鎖、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD40L、CD70、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、GITRL、GM-CSF、ICAM、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10トラップ、IL-15、IL-15 IL-15受容体融合タンパク質、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、IL-12B/p40、IL-24、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、IL-35、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、Ox40L、p53、分泌フラジェリン、TGF-β、TGF-βトラップ、チミジンキナーゼおよびTNF-αから選択されるポリペプチドをコードする。
【００１９】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、アセチルコリン、抗CTLA-4抗体重鎖または軽鎖、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD40L、CD70、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、GITRL、GM-CSF、ICAM、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10トラップ、IL-12、IL-12A/p35、IL-12B/p40、IL-15、IL-15 IL-15受容体融合タンパク質、IL-23A/p19、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、Ox40L、p53、分泌フラジェリン、TGF-β、TGF-βトラップ、チミジンキナーゼおよびTNF-αから選択されるポリペプチドをコードする。
【００２０】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマータンパク質、例えばヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする。例えば、ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、IL-12A/p35およびIL-12B/p40から選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはIL-12B/p40をコードし、第2の治療的トランスジーンはIL-12A/p35をコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：8のヌクレオチド17〜1000、配列番号：8のヌクレオチド1013〜1606および/または配列番号：8のヌクレオチド17〜1606によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：8のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号：8に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００２１】
ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンはIL-23A/p19およびIL-12B/p40から選択され、例えば第1の治療的トランスジーンはIL-12B/p40をコードし、第2の治療的トランスジーンはIL-23A/p19をコードする。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：9のヌクレオチド17〜1000、配列番号：9のヌクレオチド1013〜1582および/または配列番号：9のヌクレオチド17〜1582によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：9のヌクレオチド配列を含むかまたは配列番号：9に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００２２】
ある態様において、前述の組み換えウイルスのいずれかは、過増殖性細胞において選択的に複製し得る。ある態様において、前述の組み換えウイルスのいずれかは、過増殖性細胞において2つ以上の治療的トランスジーンを選択的に発現し得る。過増殖性細胞は、癌細胞、例えば肺癌細胞、結腸癌細胞および膵臓癌細胞であり得る。ある態様において、前述の組み換えウイルスのいずれかは、腫瘍崩壊性ウイルスであり得る。
【００２３】
ある態様において、前述の組み換えアデノウイルスのいずれかにおいて、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００２４】
ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００２５】
ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000ヌクレオチド、約6000または約7000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約1600ヌクレオチド、約1650ヌクレオチドまたは約3100ヌクレオチドを含む。
【００２６】
別の局面において、本発明は、前述の組み換えアデノウイルスのそれぞれおよび少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
別の局面において、本発明は、被験体において癌を治療する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、被験体において癌疾患を治療する工程を含む。ある態様において、癌は、肛門癌、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、癌腫、胆管癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃食道癌、胃腸(GI)癌、消化管間質腫瘍、肝細胞癌、婦人科癌、頭頸部癌、血液癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、小児癌、前立腺癌、腎細胞癌、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、皮膚の扁平上皮癌、胃癌、精巣癌および甲状腺癌から選択される。
【００２８】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む。
【００２９】
別の局面において、本発明は、被験体において腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。該方法は、被験体に、本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を投与して、腫瘍細胞の増殖を阻害する工程を含む。
【００３０】
前述の方法のそれぞれにおいて、組み換えアデノウイルスは、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法およびウイルス療法から選択される1つ以上の治療と組み合わせて投与され得る。前述の方法のそれぞれにおいて、組み換えアデノウイルスの有効量は、例えば102〜1015プラーク形成単位(pfu)であり得る。前述の方法のいずれかのある態様において、被験体は、例えばヒト、小児のヒトであり得る。
【００３１】
別の局面において、本発明は、標的細胞において2つ以上の治療的トランスジーンを発現させる方法を提供する。該方法は、細胞に本明細書に記載される組み換えアデノウイルスの有効量を送達、例えば該細胞を該組み換えアデノウイルスの有効量に暴露して、標的トランスジーンを発現させる工程を含む。ある態様において、2つの治療的トランスジーンは、発現された場合、翻訳後に2つのポリペプチド鎖に切断され得る単一のポリペプチド鎖を産生する。
【００３２】
本発明のこれらおよび他の局面および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図１】図1は、ELISAにより測定された場合の、異なるリンカーを有するIL-12をコードするプラスミドを一過的にトランスフェクトされたHEK-293細胞によるIL-12発現を示すグラフである。ドットは3重に測定された濃度を示し、太線は平均を示し、エラーバーは標準偏差を示す。
【図２】図2は、TAV-hIL-12-フューリンアデノウイルス(「フューリン」と示す)、TAV-hIL-12-分離アデノウイルス(「分離」と示す)および対照dl309アデノウイルス由来のDNAのPCR産物を示すゲルであり、予想されるサイズの産物を示す。
【図３】図3は、示されるウイルスでの感染後の示される時点でのADS-12細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。クリスタルバイオレットは生細胞を紫色に染色する。
【図４】図4は、ELISAにより測定された場合のTAV-Δ19kおよびTAV-mIL12-IRESを感染させたADS-12細胞からのIL-12発現を示す棒グラフである。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】図5は、ADS-12細胞におけるTAV-Δ19kおよびTAV-mIL-12-IRESのウイルス複製を示す棒グラフである。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】図6は、ELISAにより測定された場合の、TAV-Δ19k、TAV-hIL-12-IRES、TAV-hIL-12-フューリンを感染させたか、またはウイルスなしのA549細胞からのIL-12発現を示す棒グラフである。
【図７】図7は、示されるウイルスでの感染後の示される時点でのA549細胞のクリスタルバイオレット染色を示す。クリスタルバイオレットは生細胞を紫色に染色する。
【図８】図8は、A549細胞におけるTAV-Δ19k、TAV-hIL-12-IRESおよびTAV-hIL-12-フューリンのウイルス複製を示す棒グラフである。
【図９】図9は、ウイルスTAV-mIL-12-フューリンからのIL-12の発現を示す折れ線グラフである。A549細胞は示されるMOIで感染させ、条件づけ培地中のIL-12濃度は、ELISAにより、示される時点で測定した。CTは対照非感染細胞を示す。
【図１０】図10は、ウイルスTAV-mIL-23-フューリンからのIL-23の発現およびウイルスTAV-mIL-27-フューリンからのIL-27の発現を示す棒グラフである。A549細胞は、5のMOIで感染させ、条件づけ培地中のそれぞれのウイルスについての対応するサイトカインの濃度は、ELISAにより感染の4日後に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本発明は、部分的に、2つの治療的トランスジーンを発現する特定の組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスについて、2つの治療的トランスジーンが、介在切断部位、例えばタンパク質分解性切断部位を有する単一のポリペプチドとして発現される場合に、それぞれの治療的トランスジーンの発現が大きく高められ得るという発見に基づく。次いで該切断部位は、1つ以上の切断因子、例えば内発性または外来性の切断因子により翻訳後に切断されて、それぞれの治療的トランスジーンによりコードされる成熟タンパク質産物を産生し得る。かかるアプローチは、それぞれの治療的トランスジーンの化学量論的発現および同時送達を確実にするというさらなる利益を有する。
【００３５】
従って、一局面において、本発明は、第1の治療的トランスジーンをコードする第1のヌクレオチド配列、第2の治療的トランスジーンをコードする第2のヌクレオチド配列および第1のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間に配置される切断部位をコードする第3のヌクレオチド配列を含む組み換えアデノウイルスを提供する。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、連続的に、5'〜3'の方向で、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含む、例えば第1のヌクレオチド配列と第3のヌクレオチド配列の間および/または第3のヌクレオチド配列と第2のヌクレオチド配列の間に配置される介在ヌクレオチド配列(例えば別のトランスジーンまたは制御配列を含む配列)がない、組み換えポリヌクレオチド配列を含む。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は単一のプロモーター(任意に第1のヌクレオチド配列の第1のヌクレオチドに対して5'に配置される)に操作可能に連結され、単一のポリペプチド鎖として発現される。
【００３６】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、腫瘍崩壊性ウイルス、例えば腫瘍選択的複製および/またはウイルス媒介性溶解を示すウイルスである。ある態様において、腫瘍崩壊性ウイルスは、治療的トランスジーンの選択的発現を可能にし、例えば該ウイルスは、新生物細胞において治療的トランスジーンの発現を可能にするが、正常細胞においては発現を弱める。ある態様において、非過増殖性細胞における治療的トランスジーンの発現は、過増殖性細胞における発現の約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%または約5%である。ある態様において、ウイルスは、非過増殖性細胞において治療的トランスジーンの検出可能な発現を示さない。治療的トランスジーン発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法、例えばウエスタンブロットまたはELISAにより決定され得る。過増殖性細胞は、癌細胞、例えば癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、肺癌、胃腸管癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、甲状腺癌、中皮腫、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頸部癌または脳癌の細胞であり得る。
【００３７】
I. ウイルス
用語「ウイルス」は、タンパク質合成機構またはエネルギー生成機構を有さない偏性細胞内寄生体のいずれかをいうために本明細書において使用される。ウイルスゲノムはRNAまたはDNAであり得る。本発明の実施において有用なウイルスとしては、組み換えにより改変されたエンベロープを含むかまたはエンベロープを含まないDNAウイルスおよびRNAウイルスが挙げられ、好ましくはバキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科(picornoviridiae)、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科(poxyiridae)またはアデノウイルス科から選択される。組み換えにより改変されたウイルスは、本明細書において「組み換えウイルス」と称される。組み換えウイルスは、例えば複製欠陥、条件的複製もしくは複製コンピテントになるように組み換えDNA技術により改変され得るか、および/または外来性トランスジーンの発現を含むように組み換えDNA技術により改変され得る。親ベクターの特性のそれぞれの有利な要素を利用するキメラウイルスベクター(例えばFeng et al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870参照)も、本発明の実施に有用であり得る。治療される種由来のウイルスを使用することが一般的に好ましいが、いくつかの例において、好ましい病原性特徴を有する異なる種由来のベクターを使用することが有利であり得る。例えば、ヒト遺伝子治療のためのウマヘルペスウイルスベクターがPCT公開公報WO98/27216に記載される。該ベクターは、ウマウイルスがヒトに対して病原性でないためにヒトの治療に有用であると記載される。同様に、ヒツジアデノウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスベクターに対する抗体を回避すると主張されているので、ヒトの遺伝子療法に使用され得る。かかるベクターは、PCT公開公報WO97/06826に記載される。
【００３８】
好ましくは、組み換えウイルスはアデノウイルスである。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線状DNAゲノムで構成される、中程度の大きさ(90〜100nm)のエンベロープを有さない(ネイキッド)正二十面体ウイルスである。アデノウイルスは、宿主の複製機構を使用して哺乳動物細胞の核内で複製する。用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス属(genus Adenoviridiae)の任意のウイルスをいい、限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属が挙げられる。特に、ヒトアデノウイルスとしてはA〜F亜属およびそれらの個々の血清型が挙げられ、個々の血清型およびA〜F亜属としては限定されないが、ヒトアデノウイルスの1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11aおよびAd11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および91型が挙げられる。ヒトアデノウイルスの2および5型由来の組み換えウイルスが好ましい。そうではないと記載されない限り、全てのアデノウイルス5型ヌクレオチド番号は、本明細書において配列番号：1に示されるNCBI参照配列AC_000008.1に関連する。
【００３９】
アデノウイルス複製サイクルは2つの段階：4つの転写単位E1、E2、E3およびE4が発現される初期段階ならびにウイルスDNA合成の開始後、後期転写産物が主要後期プロモーター(major late promoter)(MLP)から主に発現される際に起こる後期段階を有する。後期メッセージは、ウイルスの構造タンパク質のほとんどをコードする。E1、E2およびE4の遺伝子産物は、転写活性化、細胞形質転換、ウイルスDNA複製およびその他のウイルス機能の原因であり、ウイルス増殖に必要である。
【００４０】
用語「操作可能に連結された」は、機能的な関係にあるポリヌクレオチド要素の連結をいう。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に「操作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、遺伝子の転写に影響を及ぼす場合に、遺伝子に操作可能に連結される。操作可能に連結されたヌクレオチド配列は典型的に連続である。しかしながら、エンハンサーは一般的に、プロモーターから数キロベース離れ、イントロン配列が一定でない(variable)長さであり得る場合に機能するので、いくつかのポリヌクレオチド要素は操作可能に連結され得るが、直接的に隣り合わず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスに機能さえし得る。
【００４１】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、制御配列またはプロモーターに対して1つ以上の改変を有する。制御配列またはプロモーターに対する改変は、制御配列またはプロモーターの野生型配列と比較して、1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付加を含む。
【００４２】
ある態様において、制御配列またはプロモーターの改変は、例えば転写因子結合部位の一部を欠失することによりまたは該結合部位に1つの点変異を挿入することにより、転写因子に対する親和性を低減するような、転写因子結合部位の配列の改変を含む。ある態様において、改変された制御配列は、新生物細胞における発現を高め、および/または正常細胞における発現を弱める。
【００４３】
ある態様において、改変された制御配列は、タンパク質をコードする配列に操作可能に連結される。ある態様において、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子(コーディング領域)の少なくとも1つは、改変された制御配列に操作可能に連結される。ある態様において、E1a遺伝子は、改変された制御配列に操作可能に連結される。
【００４４】
E1a制御配列は、Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 Vと命名される転写因子Pea3に対する5つの結合部位を含み、Pea3 Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるPea3結合部位であり、Pea3 Vは最も遠位にある。E1a制御配列はまた、本明細書でE2F IおよびE2F IIと命名される転写因子E2Fに対する結合部位を含み、E2F Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるE2F結合部位であり、E2F IIはより遠位にある。結合部位はE1a開始部位から以下のように整列される：Pea3 I、E2F I、Pea3 II、E2F II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 V。
【００４５】
ある態様において、これらの7つの結合部位の少なくとも1つまたは7つの機能性結合部位の少なくとも1つが欠失される。本明細書で使用する場合、「機能性結合部位」は、それぞれの結合パートナー、例えば転写因子に結合し得る結合部位、例えば対応する野生型結合部位配列の結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有する結合部位をいう。本明細書で使用する場合、「非機能性結合部位」は、例えば対応する野生型結合部位配列の結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有する結合部位をいう。
【００４６】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性Pea3結合部位の欠失、例えばPea3結合部位全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性Pea3結合部位」は、そのそれぞれの転写因子(例えばPea3)に結合し得るPea3結合部位、例えば対応する野生型Pea3結合部位配列のPea3結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するPea3結合部位をいう。本明細書で使用する場合、「非機能性Pea3結合部位」は、例えば対応する野生型Pea3結合部位配列のPea3結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するPea3結合部位をいう。Pea3結合部位がPea3に結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００４７】
ある態様において、少なくとも1つのPea3結合部位または機能性Pea3結合部位が欠失される。欠失されるPea3結合部位はPea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vであり得る。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IIおよび/またはPea3 IIIである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IIおよびPea3 IIIの両方である。ある態様において、Pea3 I結合部位または機能性Pea3 I結合部位は保持される。
【００４８】
ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位または機能性E2F結合部位が欠失される。ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位または機能性E2F結合部位は保持される。ある態様において、保持されるE2F結合部位はE2F Iおよび/またはE2F IIである。ある態様において、保持されるE2F結合部位はE2F IIである。ある態様において、全欠失は本質的に、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vの1つ以上からなる。
【００４９】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分の欠失を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分の欠失を含み、Pea3結合部位の欠失を含まない。
【００５０】
ある態様において、ウイルスは、例えばAd5ゲノム(配列番号：1)の195〜244に対応するE1a開始部位の上流-304〜-255に配置される50塩基対の領域の欠失を有し、以降TAV-255欠失と称する。ある態様において、TAV-255欠失は、配列GGTGTTTTGG(配列番号：4)を含むE1aプロモーターを生じる。
【００５１】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性TATAボックスの欠失、例えばTATAボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性TATAボックス」は、TATAボックス結合タンパク質(TBP)に結合し得るTATAボックス、例えば対応する野生型TATAボックス配列のTBP結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するTATAボックスをいう。本明細書で使用する場合、「非機能性TATAボックス」は、例えば対応する野生型TATAボックス配列のTBP結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するTATAボックスをいう。TBPがTATAボックスに結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野において公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００５２】
例えば、ある態様において、組み換えアデノウイルスは、それぞれAd5ゲノム(配列番号1)のヌクレオチド472〜475、468〜475、455〜552および353〜552に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-27〜-24、-31〜-24、-44〜+54または-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、アデノウイルス5型E1aプロモーターの-29〜-26、-33〜-26、-44〜+52または-148〜+52に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、Ad5ゲノム(配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列CTAGGACTG (配列番号：5)、AGTGCCCG (配列番号：16)またはTATTCCCG (配列番号：17)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失されるポリヌクレオチド配列に隣り合う。ある態様において、該ウイルスは、配列CTAGGACTG (配列番号：5)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む。
【００５３】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、機能性CAATボックスの欠失、例えばCAATボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性CAATボックス」は、C/EBPまたはNF-Yタンパク質に結合し得るCAATボックス、例えば対応する野生型CAATボックス配列のC/EBPまたはNF-Y結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するCAATボックスをいう。本明細書で使用する場合、「非機能性CAATボックス」は、例えば対応する野生型CAATボックス配列のC/EBPまたはNF-Y結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するCAATボックスをいう。C/EBPまたはNF-Yタンパク質がCAATボックスに結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００５４】
例えば、ある態様において、組み換えアデノウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド423〜431に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列TTCCGTGGCG (配列番号：18)を含むウイルスを生じ得るポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失されるポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００５５】
アデノウイルスE1b-19k遺伝子は主に抗アポトーシス遺伝子として機能し、細胞性抗アポトーシス遺伝子BCL-2のホモログである。子孫ウイルス粒子の成熟の前の宿主細胞死はウイルス複製を制限するので、E1b-19kは、成熟前の細胞死を防ぎ、それにより感染を進行させ成熟ビリオンを生成させるためのElカセットの一部として発現される。したがって、ある態様において、E1b-19K挿入部位を含む組み換えアデノウイルスが提供され、例えば該組み換えアデノウイルスは、E1b-19K挿入部位に挿入されたトランスジーンをコードするヌクレオチド配列を有する。ある態様において、該挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19Kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-55Kの開始部位(すなわちE1b-55kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド2019〜2021に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19Kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-19Kの停止部位(すなわちE1b-19kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド2242〜2244に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。
【００５６】
本明細書および特許請求の範囲を通して、2つの部位の間の挿入、例えば(i)第1の遺伝子(例えばE1b-19k)の開始部位と第2の遺伝子(例えばE1b-55K)の開始部位、(ii)第1の遺伝子の開始部位と第2の遺伝子の停止部位、(iii)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の開始部位、または(iv)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の停止部位の間の挿入は、挿入の周囲にある所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部または一部が最終的なウイルス内に存在し得るかまたは非存在であり得ることを意味することが理解される。同様に、2つのヌクレオチドの間の挿入は、挿入の周囲にあるヌクレオチドが最終的なウイルス内に存在し得るかまたは非存在であり得ることを意味することが理解される。
【００５７】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間またはAd5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、CTGACCTC (配列番号：2)とTCACCAGG (配列番号：3)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：2)、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列およびTCACCAGG (配列番号：3)を含む。CTGACCTC (配列番号：2)およびTCACCAGG (配列番号：3)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE1b-19K挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。本明細書および特許請求の範囲を通して、部位に隣接する欠失、例えば遺伝子の開始部位に隣接する欠失または遺伝子の停止部位に隣接する欠失は、該欠失が所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部、一部またはゼロ個の(none)欠失を含み得ることを意味すると理解される。
【００５８】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはE3欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、pVIIIの停止部位(すなわちpVIIIの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド27855〜27857に対応するヌクレオチド配列)とFiberの開始部位(すなわちFiberの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド31042〜31044に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位(すなわちE3-10.5Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29770〜29772に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。
【００５９】
ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位(すなわちE3-gp19Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29215〜29217に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。
【００６０】
ある態様において、E3挿入部位を含む組み換えアデノウイルスが提供され、例えば該組み換えアデノウイルスは、E3挿入部位に挿入される治療的トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を有する。ある態様において、組み換えアデノウイルスはE3欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、pVIIIの停止部位(すなわちpVIIIの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド27855〜27857に対応するヌクレオチド配列)とFiberの開始部位(すなわちFiberの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド31042〜31044に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位(すなわちE3-10.5Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29770〜29772に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3欠失は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含む。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、CAGTATGA (配列番号：19)とTAATAAAAAA (配列番号：20)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA (配列番号：19)、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列およびTAATAAAAAA (配列番号：20)を含む。CAGTATGA (配列番号：19)およびTAATAAAAAA (配列番号：20)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE3挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。
【００６１】
ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位(すなわちE3-gp19Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29215〜29217に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列は、TGCCTTAA (配列番号：21)とTAAAAAAAAAT (配列番号：22)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA (配列番号：21)、第1のヌクレオチド配列、第3のヌクレオチド配列、第2のヌクレオチド配列およびTAAAAAAAAAT (配列番号：22)を含む。TGCCTTAA (配列番号：21)とTAAAAAAAAAT (配列番号：22)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE3挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。
【００６２】
ある態様において、組み換えアデノウイルスはE4欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位(すなわちE4-ORF6/7の開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド34075〜34077に対応するヌクレオチド配列)と右逆方向末端反復(ITR；例えば配列番号：1のヌクレオチド35836〜35938に対応する)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位(すなわちE4-ORF1の開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド35524〜35526に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間にあるヌクレオチド配列の欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500または約1000〜約1250ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1449ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む。
【００６３】
II. ウイルス産生の方法
本発明の組み換えウイルスを産生するための方法は当該技術分野で公知である。典型的に、開示されるウイルスは、感染性ウイルス粒子を産生させるのに適した条件下で、トランスフェクトされたかまたは感染された宿主細胞を培養することを含む従来技術を使用して、適切な宿主細胞株中で産生される。ウイルス遺伝子をコードする核酸をプラスミドに組み込み得、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入し得る。開示されるウイルスの産生に適した例示的な宿主細胞としては、HeLa、Hela-S3、HEK293、911、A549、HER96またはPER-C6細胞などのヒト細胞株が挙げられる。特定の産生および精製の条件は、使用するウイルスおよび産生系に応じて変化する。アデノウイルスについて、ウイルス粒子の生成のための伝統的な方法は、その後のシャトルプラスミド(通常アデノウイルスゲノムの小サブセットを含み、任意にあり得るトランスジーン発現カセットを含む)およびアデノウイルスヘルパープラスミド(全アデノウイルスゲノムのほとんどを含む)のインビボ組み換えへと続く共トランスフェクションである。
【００６４】
アデノウイルスの生成のための代替的な技術としては、細菌人工染色体(BAC)系、相補的アデノウイルス配列を含む2つのプラスミドを利用するrecA+細菌株におけるインビボ細菌組み換え、および酵母人工染色体(YAC)系の利用が挙げられる。
【００６５】
産生後、感染性ウイルス粒子を培養から回収して、任意に精製する。典型的な精製工程としては、プラーク精製、遠心分離、例えば塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えばベンゾナーゼまたはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換クロマトグラフィーまたはろ過工程が挙げられ得る。
【００６６】
III. 治療的トランスジーン
開示される組み換えアデノウイルスは、治療的トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み得る。ある態様において、開示される組み換えアデノウイルスは、第1および第2の治療的トランスジーンのそれぞれをコードする第1のヌクレオチド配列および第2のヌクレオチド配列を含み得る。
【００６７】
治療的トランスジーンは、治療的核酸、例えばアンチセンスRNAまたはリボザイムRNAをコードし得る。治療的トランスジーンは、治療的ペプチドもしくは治療的ポリペプチド、例えばアポトーシス剤、抗体、CTL応答性ペプチド、サイトカイン、細胞溶解性剤、細胞傷害性剤、酵素、免疫応答を誘起させるために腫瘍細胞の表面上に発現された異種抗原、免疫刺激性剤もしくは免疫調節剤、インターフェロン、溶解性ペプチド、癌タンパク質、細胞死をもたらすプロセスを触媒するポリペプチド、体細胞における遺伝子欠陥を補完するポリペプチド、腫瘍サプレッサータンパク質、ワクチン抗原またはこれらの任意の組合せをコードし得る。
【００６８】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、アセチルコリン、抗CTLA-4抗体重鎖または軽鎖、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD40L、CD70、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、GITRL、GM-CSF、ICAM、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10トラップ、IL-15、IL-15 IL-15受容体融合タンパク質、IL-17、IL-23、IL-23A/p19、IL-12B/p40、IL-24、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、IL-35、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、Ox40L、p53、分泌フラジェリン、TGF-β、TGF-βトラップ、チミジンキナーゼおよびTNF-αから選択されるポリペプチドをコードする。
【００６９】
ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、アセチルコリン、抗CTLA-4抗体重鎖または軽鎖、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖(light)、BORIS/CTCFL、CD19、CD20、CD40L、CD70、CD80、CD86、CD137、CD137L、CD154、DKK1/Wnt、FGF、GITRL、GM-CSF、ICAM、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10トラップ、IL-12、IL-12A/p35、IL-12B/p40、IL-15、IL-15 IL-15受容体融合タンパク質、IL-23A/p19、インターフェロンγ、MAGE、NY-ESO-1、Ox40L、p53、分泌フラジェリン、TGF-β、TGF-βトラップ、チミジンキナーゼおよびTNF-αから選択されるポリペプチドをコードする。
【００７０】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマータンパク質、例えばヘテロダイマーサイトカインの第1および第2のサブユニットのそれぞれをコードする。例えばある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-12を構成するIL-12A/p35およびIL-12B/p40から選択される。例えば、第1の治療的トランスジーンはIL-12B/p40をコードし得、第2の治療的トランスジーンはIL-12A/p35をコードし得る。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：8のヌクレオチド17〜1000、配列番号：8のヌクレオチド1013〜1606および/または配列番号：8のヌクレオチド17〜1606によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：8のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号：8に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００７１】
さらに、ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-23を構成するIL-23A/p19およびIL-12B/p40から選択される。例えば、第1の治療的トランスジーンはIL-12B/p40をコードし得、第2の治療的トランスジーンはIL-23A/p19をコードし得る。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、配列番号：9のヌクレオチド17〜1000、配列番号：9のヌクレオチド1013〜1582および/または配列番号：9のヌクレオチド17〜1582によりコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。ある態様において、組み換えアデノウイルスは配列番号：9のヌクレオチド配列を含むか、または配列番号：9に対して80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%もしくは99%の配列同一性を有する配列を含む。
【００７２】
さらに、ある態様において、第1および/または第2の治療的トランスジーンは、ヘテロダイマーサイトカインIL-23を構成するIL-27A/p28およびIL-27B/EBI3から選択される。
【００７３】
配列同一性は、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法で、例えば公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegalign (DNASTAR)ソフトウェアを使用して決定され得る。プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるアルゴリズムを使用したBLAST (Basic Local Alignment Search Tool)分析(Karlin et al., (1990) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 87:2264-2268; Altschul, (1993) J. MOL. EVOL. 36, 290-300; Altschul et al., (1997) NUCLEIC ACIDS RES. 25:3389-3402、参照により援用される)は、配列類似性の検索のために調整される。配列データベースの検索における基本的な問題の議論については、参照により十分に援用されるAltschul et al., (1994) NATURE GENETICS 6:119-129参照。当業者は、比較される配列の全長にわたり最大の整列(alignment)を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメーターを決定し得る。ヒストグラム、ディスクリプション、アラインメント、エクスペクト(すなわちデータベース配列に対する適合を報告するための統計的有意さ閾値)、カットオフ、マトリックスおよびフィルターについての検索パラメーターは、デフォルト設定にある。blastp、blastx、tblastnおよびtblastxにより使用されるデフォルトスコアリングマトリックスは、BLOSUM62マトリックスである(Henikoff et al., (1992) PROC. NATL. ACAD. SCI. USA 89:10915-10919、参照により十分に援用される)。4つのblastnパラメーターは以下の通りに調整され得る：Q=10(ギャップ生成ペナルティー)；R=10(ギャップ伸長ペナルティー(gap extension penalty))；wink=1(クエリに沿ってwink.sup.thの位置毎にワードヒットを生じる)；およびgapw=16(ギャップのあるアラインメントが生成されるウィンドウ幅を設定する)。同等のBlastpパラメーター設定は、Q=9；R=2；wink=1；およびgapw=32であり得る。検索はまた、NCBI (National Center for Biotechnology Information) BLAST Advanced Optionパラメーターを使用して実施され得る(例えば：-G、オープンギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて5/タンパク質について11；-E、伸長ギャップについてのコスト[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて2/タンパク質について1；-q、ヌクレオチドミスマッチについてのペナルティー[整数]：デフォルト=-3；-r、ヌクレオチド適合についての報酬(reward)[整数]：デフォルト=1；-e、予測値[実数]：デフォルト=10；-W、ワードサイズ[整数]：デフォルト=ヌクレオチドについて11/megablastについて28/タンパク質について3；-y、ビットでのblast伸長についてのドロップオフ(X)：デフォルト=blastnについて20/その他について7；-X、ギャップのあるアラインメントについてのXドロップオフ値(ビット(in bit))：デフォルト=全てのプログラムについて15であるがblastnには適用可能ではない；および-Z、ギャップのあるアラインメントについての最終Xドロップオフ値(ビット)：blastnについて50、その他について25)。ペアワイズタンパク質アラインメントについてのClustalWも使用され得る(デフォルトパラメータは、例えばBlosum62マトリックスおよびギャップオープンペナルティー(Gap Opening Penalty)=10およびギャップ伸長ペナルティー=0.1を含み得る)。GCGパッケージバージョン10.0において利用可能な配列間の最適合比較はDNAパラメーターGAP=50(ギャップ生成ペナルティー)およびLEN=3(ギャップ伸長ペナルティー)を使用し、タンパク質比較における同等の設定はGAP=8およびLEN=2である。
【００７４】
ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００７５】
ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約5000、約3000〜約4000または約4000〜5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500〜約7000、約500〜約6000、約500〜約5000、約500〜約4000、約500〜約3000、約500〜約2000、約500〜約1000、約1000〜約7000、約1000〜約6000、約1000〜約5000、約1000〜約4000、約1000〜約3000、約1000〜約2000、約2000〜約7000、約2000〜約6000、約2000〜約5000、約2000〜約4000、約2000〜約3000、約3000〜約7000、約3000〜約6000、約3000〜約5000、約3000〜約4000、約4000〜約7000、約4000〜約6000、約4000〜約5000ヌクレオチド、約5000〜約7000、約5000〜約6000または約6000〜約7000ヌクレオチドを含む。
【００７６】
ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000または約5000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、少なくとも約500、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000ヌクレオチド、約6000または約7000ヌクレオチドを含む。ある態様において、合わせた場合の第1および第2の治療的トランスジーンのサイズは、約1600ヌクレオチド、約1650ヌクレオチドまたは約3100ヌクレオチドを含む。
【００７７】
ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンはリンカーにより分離される。リンカーは、切断部位、例えばタンパク質分解性もしくは非タンパク質分解性の切断部位、またはリボソームスキッピング配列(ribosome skipping sequence)、例えばT2A配列を含み得る。ある態様において、第1および第2の治療的トランスジーンはタンパク質分解性切断部位により分離される。ある態様において、タンパク質分解性切断部位は、特定の組織、細胞小器官または細胞内区分に存在するプロテアーゼにより切断される。ある態様において、リンカーは、タンパク質分解性切断部位、およびタンパク質分解性切断後にジスルフィド結合を生じる2つのシステイン残基を含む。ある態様において、タンパク質分解性切断部位は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)、フューリン、PC1、PC2、PC3、カテプシンB、プロテイナーゼ3およびカスパーゼ3から選択されるプロテアーゼにより切断される。
【００７８】
ある態様において、該切断部位は、真核生物の小胞体またはゴルジ体内に存在するプロテアーゼにより切断されるタンパク質分解性切断部位である。ある態様において、タンパク質分解性切断部位はフューリン切断部位である。フューリンは、遍在的に発現されゴルジ体に局在化されるプロテアーゼであり、コンセンサス配列RX1X2R (配列番号：6)(式中X1は任意のアミノ酸であり、X2はLysまたはArgである)を認識し、最後のArgの後で切断する。フューリンは、ゴルジ体を通って移送されるタンパク質のプロペプチドの切断において生物学的な役割を果たす。したがって、ある態様において、タンパク質分解性切断部位は、配列RX1X2R (配列番号：6)(式中、X1は任意のアミノ酸であり、X2はLysまたはArgである)を含むフューリン切断部位、例えば配列RAKR (配列番号：7)を含むフューリン切断部位である。
【００７９】
III. 医薬組成物
治療的使用のために、本明細書に開示される組み換えアデノウイルスは、好ましくは薬学的に許容可能な担体と合わされる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を有さず、妥当な利益/リスク比と釣り合ったヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切なバッファ、担体および賦形剤を意味する。担体(1つまたは複数)は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能である」べきである。薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与に適合性であるバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。
【００８０】
組み換えアデノウイルスを含む医薬組成物は、単位剤型で与えられ得、任意の適切な方法で調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜および直腸の投与である。有用な製剤は、医薬の分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適した製剤化成分としては、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；EDTAなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性調整のための剤が挙げられる。
【００８１】
静脈内投与について、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物から保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
【００８２】
好ましくは、医薬製剤は滅菌されている。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜を用いた濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、有益または望ましい結果をもたらすのに十分な活性成分の量(例えば組み換えアデノウイルスの量)をいう。有効量は1つ以上の投与、適用または用量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
【００８４】
ある態様において、活性成分の治療有効量は、0.1mg/kg〜100mg/kg、例えば1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜10mg/kgの範囲である。ある態様において、組み換えアデノウイルスの治療有効量は、102〜1015プラーク形成単位(pfu)、例えば102〜1010、102〜105、105〜1015、105〜1010または1010〜1015プラーク形成単位の範囲である。投与量は、治療される疾患または徴候(indication)の型および程度、患者の全体的な健康、活性成分のインビボ効力、医薬製剤ならびに投与経路などの変数に依存する。所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は高い方のレベルを超えて増加され得る。代替的に、初期用量は最適よりも小さくあり得、日用量は治療の過程の間に段々に増加され得る。ヒト用量は、例えば0.5mg/kg〜20mg/kgで実施するように設計される従来の第I相用量増加試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、組み換えアデノウイルスの血清半減期および治療される疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。
【００８５】
IV. 治療的使用
本明細書に開示される組み換えアデノウイルスは、種々の医学的徴候、例えば癌を治療するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること；および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)が挙げられ、より好ましくはヒトが挙げられる。
【００８６】
癌の例としては、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、血液の腫瘍および転移性の病変が挙げられる。血液の腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ球白血病(CLL)、例えば変形(transformed)CLL、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、骨髄異形成症候群(myelodyplastic syndrome)(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫またはリクター症候群(リクター形質転換(Richter's Transformation))が挙げられる。固形腫瘍の例としては悪性疾患、例えば種々の臓器系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば頭部および頸部(咽頭を含む)、甲状腺、肺(小細胞または非小細胞肺癌(NSCLC))、乳房、リンパ系、胃腸(例えば口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、肛門管)、生殖器および尿生殖器管(例えば腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣)、CNS(例えば神経またはグリア細胞、例えば神経芽腫または神経膠腫)、または皮膚(例えば黒色腫)が冒されるものが挙げられる。
【００８７】
ある態様において、癌は、肛門癌、基底細胞癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、癌腫、胆管癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、胃食道癌、胃腸(GI)癌、消化管間質腫瘍、肝細胞癌、婦人科癌、頭頸部癌、血液癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、神経内分泌癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、小児癌、前立腺癌、腎細胞癌、肉腫、皮膚癌、小細胞肺癌、皮膚の扁平上皮癌、胃癌、精巣癌および甲状腺癌から選択される。
【００８８】
ある態様において、癌は、鼻咽頭癌、基底細胞癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、神経内分泌、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル-リンダウ病、ゾリンジャー-エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、希突起膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発性部位の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜の癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、唇の癌、髄膜癌、口の癌、神経癌、口蓋の癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃癌から選択される。
【００８９】
ある態様において、組み換えアデノウイルスは、1つ以上の治療、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法またはウイルス療法と組み合わせて被験体に投与される。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブと組み合わせて投与される。ある態様において、組み換えアデノウイルスは、チェックポイント阻害剤、例えば抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて投与される。例示的な抗PD-1抗体としては、例えばニボルマブ(Opdivo(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Co.)、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標)、Merck Sharp & Dohme Corp.)、PDR001 (Novartis Pharmaceuticals)およびピジリズマブ(pidilizumab) (CT-011、Cure Tech)が挙げられる。例示的な抗PD-L1抗体としては、例えばアテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標)、Genentech)、デュバルマブ(duvalumab) (AstraZeneca)、MEDI4736、アベルマブおよびBMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.)が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」投与されるは、被験体の障害による苦痛の過程で、患者に対する治療の効果がある時点で(at a point in time)重複するように、2つ(またはそれ以上)の異なる治療を被験体に送達することを意味することが理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が開始された場合に依然として行われているので、投与期間の重複がある。これは本明細書において時々「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、組合せの投与のために治療はより効果的になる。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療で同等の効果が見られるか、もしくは第2の治療は、第2の治療を第1の治療の非存在下で投与した場合に見られるよりも大きな程度まで症状を低減するか、または第1の治療により同様の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連のある他のパラメーターの低減がもう一方の治療の非存在下で1つの治療を送達した場合に観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が第2のものを送達する場合に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【００９１】
ある態様において、組み換えウイルスの有効量は、被験体における抗原に対する免疫応答を測定することにより同定され、および/または被験体を治療する方法は、被験体において抗原に対する免疫応答を測定する工程をさらに含む。癌は免疫抑制により特徴付けられ得、被験体における抗原に対する免疫応答の測定は、被験体における免疫抑制のレベルを示し得る。したがって、被験体における抗原に対する免疫応答の測定は、治療の効力および/または組み換えウイルスの有効量を示し得る。被験体における抗原に対する免疫応答は、当該技術分野で公知の任意の方法により測定され得る。ある態様において、抗原に対する免疫応答は、被験体の皮膚の注射部位で被験体に抗原を注射して、注射部位での硬変のサイズまたは炎症の量を測定することにより測定される。ある態様において、抗原に対する免疫応答は、抗原への暴露の際の被験体の細胞からのサイトカイン(例えばインターフェロンγ、IL-4および/またはIL-5)の放出により測定される。
【００９２】
明細書を通して、ウイルス、組成物および系が特定の成分を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、追加的に、記載される成分から本質的になるかまたは記載される成分からなる本発明の組成物、デバイスおよび系があることならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたは記載されるプロセス工程からなる本発明のプロセスおよび方法があることが企図される。
【００９３】
本願において、要素もしくは成分が記載される要素もしくは成分のリストに含まれるおよび/または該リストから選択されるといわれる場合、要素もしくは成分は、記載される要素もしくは成分のいずれか1つであり得るか、または要素もしくは成分は記載される要素もしくは成分の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【００９４】
さらに、本明細書に記載されるウイルス、組成物、系、方法またはプロセスの要素および/または特徴は、本明細書において明示的であるか黙示的であるのいずれにせよ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定のウイルスについて参照がなされる場合、該ウイルスは、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の組成物および/または本発明の方法の種々の態様で使用され得る。すなわち、本願の範囲内で、態様は、明確かつ簡潔な適用が記載および図示されるのを可能にする様式で記載され、示されるが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく、種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され理解される。例えば、本明細書に記載されかつ示される全ての特徴は、本明細書に記載されかつ示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
【００９５】
文脈および使用からそうではないと理解されない限り、語句「の少なくとも1つ」は個々に、該語句の後に記載される物のそれぞれおよび記載される物の2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載される物に関しての語句「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有することが理解されるべきである。
【００９６】
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、それらの文法上の同等物を含めて、そうではないと具体的に記されるかまたは文脈から理解されない限り、一般的に開放型であり非限定的であり、例えば記載されないさらなる要素または工程を排除しないと理解されるべきである。
【００９７】
本明細書の種々の場所において、ウイルス、組成物、系、プロセスおよび方法またはそれらの特徴は、群または範囲において開示される。該記載は、かかる群および範囲の構成メンバーのそれぞれおよび全ての個々の下位組合せ(subcombination)を含むことが具体的に意図される。他の例として、1〜20の範囲の整数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20を個々に開示することが具体的に意図される。
【００９８】
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、そうではないと具体的に記されない限り、本発明は特定の量的値自身も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されるかまたは推測されることがない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
【００９９】
工程の順序または特定の行為を行う順序は、本発明が実施可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は、同時に行われてもよい。
【０１００】
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、特許請求されない限り本発明の範囲に対して限定を与えない。本明細書における用語は、任意の特許請求されない要素を本発明の実施についての必須のものとして示すと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１０１】
実施例
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することを意図しない。
【０１０２】
実施例1：ヘテロダイマーIL-12の発現
インターロイキン12(IL-12)は、細胞媒介性免疫を促進するサイトカインである。IL-12は、一緒になってIL-12p70と示される活性なヘテロダイマーを形成する2つの別々のタンパク質鎖、IL-12A/p35およびIL-12B/p40を含む。この実施例には、IL-12サブユニットIL-12A/p35およびIL-12B/p40の両方を含むヒトIL-12ヘテロダイマーの発現が記載される。
【０１０３】
アデノウイルス5型ゲノムの一部を保有するプラスミドpAd1を、治療的トランスジーンの挿入を容易にするためにE1b-19k領域の開始部位にSalI部位およびSalI部位の200塩基対3'側にXhoI部位を保有するように改変した。得られたプラスミドは、以降pAd1-Δ19kと称する。
【０１０４】
改変されたE1b-19k領域のヌクレオチド配列は以下のとおりであり、融合されたSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引く：
【化１】
2020516293.tif 000002
(配列番号：10)
【０１０５】
脳心筋炎ウイルス(EMCV) IRESを続け、ヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を、pAd1-Δ19kの改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたプラスミドは、以降pAd1-hIL-12-IRESと称する。E1b-19k領域に挿入した、EMCV IRESを続け、ヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12A/p35およびIL-12B/p40コーディング領域は大文字であり、IRESは小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化２−１】
2020516293.tif 000003
【化２−２】
2020516293.tif 000004
(配列番号：11)
【０１０６】
さらに、フューリン切断部位(RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を、pAd1-Δ19kの改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたプラスミドは、以降pAd1-hIL-12-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12B/p40およびIL-12A/p35コーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI切断部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化３−１】
2020516293.tif 000005
【化３−２】
2020516293.tif 000006
(配列番号：8)
【０１０７】
さらに、2Aペプチドをコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を、pAd1-Δ19kの改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたプラスミドは、以降pAd1-hIL-12-2Aと称する。E1b-19k領域に挿入した、2Aペプチドをコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12B/p40およびIL-12A/p35コーディング領域は大文字であり、2Aコーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化４】
2020516293.tif 000007
(配列番号：12)
【０１０８】
試験したプラスミドの詳細を表1に示す。
【表１】
2020516293.tif 000008
【０１０９】
プラスミドを一過的にHEK-293細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの4日後に条件づけ培地(conditioned media)を回収して、IL-12A/p35およびIL-12B/p40サブユニットのヘテロダイマーを特異的に検出するELISA (Biolegend 431704)においてIL-12濃度を測定した。図1に示されるように、フューリン切断部位を保有するプラスミド(pAd1-hIL-12-フューリン)は、IRESを利用するプラスミド(pAd1-hIL-12-IRES)または2Aペプチドを利用するプラスミド(pAd1-hIL-12-2A)のいずれよりも有意に高いヘテロダイマーIL-12発現を誘起した。
【０１１０】
実施例2：IL-12発現アデノウイルス
この実施例には、ヒトIL-12サブユニットIL-12A/p35およびIL-12B/p40を発現する組み換え5型(Ad5)アデノウイルスが記載される。
【０１１１】
(米国特許第9,073,980号に以前に記載されるように)E1a開始の上流-304〜-255に位置するヌクレオチド領域の欠失を保有し、E1a発現を癌選択的にするアデノウイルス5型ウイルスを構築した。得られたウイルスは、以降TAVと称する。
【０１１２】
TAVはさらに、治療的トランスジーンの挿入を容易にするためにE1b-19k領域の開始部位にSalI部位およびSalI部位の200塩基対3'側にXhoI部位を保有するように改変した。得られたウイルスは、以降TAV-Δ19kと称する。改変されたE1b-19k領域のヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、融合したSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引く：
【化５】
2020516293.tif 000009
(配列番号：10)
【０１１３】
TAV-Δ19kは、E3領域中にdl309破壊を保有した。そうでなければウイルスゲノムが大きすぎてウイルスカプシドに封入されなくなる治療的トランスジーンを保有するウイルスを作製するために、TAV-Δ19kを、ER3領域のRIDα、RIDβおよび14.7k遺伝子の全体を欠失するようにさらに改変した。得られたウイルスは、以降TAV-Δ19k-ΔE3と称する。改変されたE3領域のヌクレオチド配列は以下のとおりであり、欠失の点をハイフンで示す：
【化６】
2020516293.tif 000010
(配列番号：13)
【０１１４】
フューリン切断部位(RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-hIL-12-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、IL-12B/p40およびIL-12A/p35コーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化７】
2020516293.tif 000011
(配列番号：8)
【０１１５】
さらに、ヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングし、ヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE3領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-hIL-12-分離と称する。E1b-19k領域に挿入したヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列は、以下のとおりであり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化８】
2020516293.tif 000012
(配列番号：14)
【０１１６】
E3領域に挿入したヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、隣接するアデノウイルス配列に下線を引く：
【化９】
2020516293.tif 000013
(配列番号：15)
【０１１７】
試験したウイルスの詳細を表2に示す。
【表２】
2020516293.tif 000014
【０１１８】
これらのウイルスおよび対照ウイルス(dl309)の溶解物由来のウイルスゲノムDNAを、E1Aプロモーターに隣接するプライマー、E1b-19k領域に隣接するプライマー、ならびにE3 RIDα、RIDβおよび14.7k領域に隣接するプライマーを用いてPCR増幅して、所望の要素の存在を確認した。図2に示すように、ウイルスは、所望の特徴、すなわち予測されるサイズのPCR産物を有した。両方のウイルス中のIL-12コーディング領域を、確認のために配列決定した。
【０１１９】
実施例3：IL-23発現アデノウイルス
この実施例には、ヒトIL-23サブユニットIL-23A/p19およびIL-12B/p40を発現する組み換えアデノウイルス5型(Ad5)が記載される。
【０１２０】
TAV-Δ19k-ΔE3ウイルスは実施例2に記載されるように作製する。フューリン切断部位(RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-23A/p19をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングする。得られたウイルスは、以降TAV-hIL-23-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、ヒトIL-23A/p19をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12B/p40およびIL-23A/p19コーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１０−１】
2020516293.tif 000015
【化１０−２】
2020516293.tif 000016
(配列番号：9)
【０１２１】
実施例4：IL-12発現アデノウイルス
この実施例には、IRESを用いてマウスIL-12サブユニットIL-12AおよびIL-12Bを発現する組み換えアデノウイルス5型(Ad5)が記載される。
【０１２２】
TAV、TAV-Δ19kおよびTAV-Δ19k-ΔE3ウイルスは実施例2に記載されるように作製した。EMCV IRESを続け、マウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Aをコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-mIL-12-IRESと称する。E1b-19k領域に挿入した、EMCV IRESを続け、マウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Aをコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、マウスIL-12BおよびIL-12Aコーディング領域は大文字であり、IRESは小文字であり、隣接する制限部位およびアデノウイルス配列に下線を引く：
【化１１−１】
2020516293.tif 000017
【化１１−２】
2020516293.tif 000018
(配列番号：23)
【０１２３】
TAV-mIL-12-IRESの細胞傷害活性を試験した。ADS-12(マウス肺癌)細胞に、10の感染多重度(MOI)で、TAV-mIL12-IRES、TAV-Δ19kウイルスを感染させたか、またはウイルスを感染させず、生細胞を紫色に染色するクリスタルバイオレットで染色した。図3に示されるように、TAV-mIL12-IRESは細胞傷害活性を保持したが、対照TAV-Δ19kウイルスよりも低いレベルであった。
【０１２４】
TAV-mIL-12-IRESからのIL-12発現を試験した。ADS-12細胞に、5のMOIで、TAV-Δ19kまたはTAV-mIL-12-IRESを感染させた。感染の5日後に条件づけ培地を回収し、IL-12ヘテロダイマーに特異的なELISAでIL-12濃度を測定した。図4に示されるように、TAV-Δ19kを感染させた細胞から検出可能な発現はなかったが、TAV-mIL-12-IRESを感染させた細胞は、67ng/mlのIL-12ヘテロダイマーを発現した。
【０１２５】
TAV-mIL-12-IRESのウイルス複製を試験した。ADS-12細胞に、5のMOIで、TAV-mIL12-IRESまたはTAV-Δ19kを感染させた。感染の5日後に培地および細胞溶解物を回収して滴定した。感染ADS-12細胞当たりのウイルスのプラーク形成単位(PFU)の数を測定してウイルス複製をアッセイした。図5に示されるように、TAV-mIL-12は、TAV-Δ19kと比較してADS-12細胞においてより低いレベルで複製した。
【０１２６】
実施例5：IL-12発現アデノウイルス
この実施例には、IRESを使用してヒトIL-12サブユニットIL-12AおよびIL-12Bを発現する組み換えアデノウイルスならびにフューリン切断部位を使用してヒトIL-12サブユニットIL-12AおよびIL-12Bを発現する組み換えアデノウイルスが記載される。
【０１２７】
TAV、TAV-Δ19k、TAV-Δ19k-ΔE3およびTAV-hIL-12-フューリンウイルスは実施例2に記載されるように作製した。さらに、EMCV IRESを続け、ヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたアデノウイルスは、以降TAV-hIL-12-IRESと称する。E1b-19k領域に挿入した、EMCV IRESを続け、ヒトIL-12B/p40をコードするヌクレオチド配列を続けたヒトIL-12A/p35をコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12A/p35およびIL-12B/p40コーディング領域は大文字であり、IRESは小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１２−１】
2020516293.tif 000019
【化１２−２】
2020516293.tif 000020
(配列番号：11)
【０１２８】
TAV-hIL-12-フューリンおよびTAV-hIL-12-IRES由来のIL-12発現を試験した。A549細胞に、5のMOIで、TAV-Δ19k、TAV-hIL-12-IRES、TAV-hIL-12-フューリンを感染させたか、またはウイルスを感染させなかった。感染の4日後に条件づけ培地を回収し、ELISA (Biolegend 431704)によりIL-12濃度を測定した。図6に示されるように、TAV-hIL-12-フューリン由来の発現(170ng/ml)は、TAV-hIL-12-IRES由来のもの(23ng/ml)より高かった。
【０１２９】
TAV-hIL-12-フューリンの細胞傷害活性を試験した。A549細胞に、5のMOIで、TAV-Δ19k、TAV-hIL12-フューリンを感染させたか、またはウイルスを感染させず、生細胞を紫色に染色するクリスタルバイオレットで染色した。図7に示されるように、TAV-hIL12-フューリンは、対照TAV-Δ19kウイルスと同様のレベルの細胞傷害活性を保持した。
【０１３０】
TAV-hIL-12-フューリンおよびTAV-hIL-12-IRESのウイルス複製を試験した。A549細胞に、5のMOIで、TAV-hIL-12-フューリン、TAV-hIL-12-IRESまたはTAV-Δ19kを感染させた。感染の6日後に培地および細胞溶解物を回収して滴定した。感染したA549細胞当たりのウイルスのプラーク形成単位(PFU)の数を測定してウイルス複製をアッセイした。図8に示されるように、TAV-hIL-12-フューリンはTAV-hIL-12-IRESよりも効率的に複製した。
【０１３１】
実施例6：IL-12、IL-23およびIL-27発現アデノウイルス
この実施例には、フューリン切断部位を使用してマウスIL-12、IL-23およびIL-27の2つのサブユニットを発現する組み換えアデノウイルスが記載される。
【０１３２】
TAV、TAV-Δ19kおよびTAV-Δ19k-ΔE3ウイルスは、実施例2に記載されるように作製した。フューリン切断部位 (RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-12Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-mIL-12-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-12Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12BおよびIL-12Aコーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１３】
2020516293.tif 000021
(配列番号：24)
【０１３３】
さらに、フューリン切断部位(RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-23Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-mIL-23-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-23Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-12Bをコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-12BおよびIL-23Aコーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１４】
2020516293.tif 000022
(配列番号：25)
【０１３４】
さらに、フューリン切断部位(RAKR)をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-27Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-27Bをコードするヌクレオチド配列を、TAV-Δ19k-ΔE3の改変されたE1b-19k領域にクローニングした。得られたウイルスは、以降TAV-mIL-27-フューリンと称する。E1b-19k領域に挿入した、フューリン切断部位をコードするヌクレオチド配列を続け、マウスIL-27Aをコードするヌクレオチド配列を続けたマウスIL-27Bをコードするヌクレオチド配列は以下のとおりであり、IL-27BおよびIL-27Aコーディング領域は大文字であり、フューリン切断部位コーディング領域は小文字であり、SalIおよびXhoI制限部位を含む隣接するE1b-19k配列に下線を引く：
【化１５−１】
2020516293.tif 000023
【化１５−２】
2020516293.tif 000024
(配列番号：26)
【０１３５】
TAV-mIL-12-フューリン由来のIL-12発現を試験した。A549細胞に、1、5または10のMOIで、TAV-mIL-12-フューリンを感染させたか、またはウイルスを感染させなかった。感染後の種々の時間に条件づけ培地を回収し、ELISAによりIL-12濃度を測定した。図9に示されるように、IL-12は、用量依存的および時間依存的な様式で発現された。
【０１３６】
TAV-mIL-23-フューリンおよびTAV-mIL-27-フューリン由来のIL-23およびIL-27発現を試験した。A549細胞に、5のMOIで、TAV-mIL-23-フューリン、TAV-mIL-27-フューリンを感染させたか、またはウイルスを感染させなかった。感染の4日後に条件づけ培地を回収し、ELISAによりIL-23およびIL-27濃度を測定した。図10に示されるように、両方のウイルスは対応するヘテロダイマーサイトカインを発現した。
【０１３７】
参照による援用
本明細書に参照される特許文献および科学文献のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
【０１３８】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての局面において本明細書に記載される発明の限定ではなく例示とみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明に含まれることが意図される。
【図１】
2020516293.tif 000025
【図２】
2020516293.tif 000026
【図３】
2020516293.tif 000027
【図４】
2020516293.tif 000028
【図５】
2020516293.tif 000029
【図６】
2020516293.tif 000030
【図７】
2020516293.tif 000031
【図８】
2020516293.tif 000032
【図９】
2020516293.tif 000033
【図１０】
2020516293.tif 000034
【配列表】
2020516293000001.app
【国際調査報告】
2020516293.tif 000035
2020516293.tif 000036
2020516293.tif 000037
2020516293.tif 000038
2020516293.tif 000039
2020516293.tif 000040