(57)【要約】新規な神経性貝毒の提供。式（Ｉ）を有する新規な神経性貝毒、その成分の合成法、及びその貝毒の成分を用いて神経性貝毒の発生を調べるために、その貝毒の主な成分を検出する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
2005051956.tif 000004
を有する化合物。
【請求項２】
式（ＩＩ）：
2005051956.tif 000005
を有する化合物の末端に位置するアルデヒド基を酸化してカルボキシ基とすることを含む、請求項１記載の式（Ｉ）を有する化合物の製造方法。
【請求項３】
貝類中に存在する請求項１記載の式（Ｉ）を有する化合物を定量すること、およびこれを神経性貝毒による毒化マーカーとして使用することを含む、貝類中の神経性貝毒の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、毒化貝類中の神経性貝毒、その製造方法に関すると共に、その貝毒を用いて神経性貝毒を検出する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】  ニュージランドにおいて、１９９２年１２月から１９９３年３月の間に、二枚貝の摂取による神経性貝毒による中毒が発生した。これは、渦鞭毛藻Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ（Ｇ．）ｂｒｅｖｅの赤潮にさらされた貝を摂取することにより生じる食品中毒であり、患者に特徴的な神経系症候が現れるために、神経性貝中毒（ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ：ＮＳＰ）として知られている（非特許文献１及び２）。海中の特殊なプランクトンによって生成される毒成分が貝類に取り込まれた結果、人がその貝類を採集して食した場合に神経性貝中毒などを発症するが、これまでに、これら神経性貝毒として、図１に示すような、ＰｂＴｘ−２、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ１、ＢＴＸ−Ｂ２、ＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ４等のブレベトキシン類が解明されてきている（非特許文献３，４，５及び６）。しかし、貝類からのブレベトキシン類等の毒化合物の単離は極めて困難であるために、これらの化合物の研究及び新規なブレベトキシン類等の検索は殆ど行われていない。
【非特許文献１】ＭｃＦａｒｒｅｎ  ＥＦ，Ｓｉｌｖａ  ＦＪ，Ｔａｎａｂｅ  Ｈ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＷＢ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＪＥ，Ｌｅｗｉｓ  ＫＨ．．ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｃｉｇｕａｔｅｒａ−ｌｉｋｅ  ｐｏｉｓｏｎ  ｉｎ  ｏｙｓｔｅｒｓ，ｃｌａｍｓ，ａｎｄ  Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．１９６５  Ｎｏｖ；３（２）：１１１−２３．
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓ  ＰＤ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＤＳ，Ｔａｙｌｏｒ  ＴＪ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＪＩ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ．１９９１  Ａｐｒ；８１（４）：４７１−４．
【非特許文献３】Ｉｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｎｏｚａｗａ  Ａ，Ｔｏｔｏｒｉｂｅ  Ｋ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｎ，Ｎｕｋａｙａ  Ｈ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｙａｓｕｍｏｔｏ  Ｔ，Ｋａｓｐａｒ  Ｈ，Ｂｅｒｋｅｔｔ  Ｎ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．５，ｐｐ．７２５−７２８（１９９５）
【非特許文献４】Ｎｏｚａｗａ  Ａ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ，Ｉｓｈｉｄａ  Ｈ．Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｅｖｅｔｏｘｉｎ  Ｂ１  ａｎｄ  ＰｂＴｘ−３  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  ｂｙ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｔａｎｄｅｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．２００３  Ｊｕｌ；４２（１）：９１−１０３．
【非特許文献５】Ｉｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ，Ｓｅａ  ｆｏｏｄ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｂｒｅｖｅｔｏｘｉｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ．ＭｙｃＴｏｘｉｎ，Ｎｏ．４８，ｐｐ．２９−３１（１９９９）
【非特許文献６】Ｉｓｈｉｄａ  Ｈ，Ｍｕｒａｍａｔｓｕ  Ｎ，Ｎｕｋａｙａ  Ｈ，Ｋｏｓｕｇｅ  Ｔ，Ｔｓｕｊｉ  Ｋ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｎ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｃ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｙｓｔｅｒ，Ｃｒａｓｓｏｓｔｒｅａ  ｇｉｇａｓ，ｉｎ  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ．Ｔｏｘｉｃｏｎ．１９９６  Ｓｅｐ；３４（９）：１０５０−３．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】  本発明は、神経性貝毒であるブレベトキシンの新規誘導体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】  本発明は、式（Ｉ）：
2005051956.tif 000002
を有する化合物に関する。【０００５】  本発明は、式（ＩＩ）：
2005051956.tif 000003
を有する化合物の末端に位置するアルデヒド基を酸化してカルボキシ基とすることを含む、式（Ｉ）を有する化合物の製造方法に関する。【０００６】  さらに、本発明は、貝類中に存在する式（Ｉ）を有する化合物を定量すること、およびこれを神経性貝毒のマーカーとして使用することを含む、貝類中の神経性貝毒の検出方法に関する。
【発明の効果】
【０００７】  本発明により、他のブレベトキシン類に比べて、比較的多種類の貝類の中に良く見出され、しかも比較的安定である新規なブレベトキシン化合物（ブレベトキシンＢ５（ＢＴＸ−Ｂ５）を提供でき、また、これを用いることにより貝類中の神経性貝毒の検出を行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１はブレベトキシン類ＰｂＴｘ−２とＰｂＴｘ−３、及びその類似体ＢＴＸ−Ｂの構造を示す。
【図２】図２は、ＢＴＸ−Ｂ５の（１）（ａ）構造決定、並びに、（ｂ）その炭素及び水素原子の配置、更に、（２）ＢＴＸ−Ｂ１の炭素及び水素原子の化学的シフトのために使用されたＮＭＲ技術手法を示す。（ａ）太線及び矢印は、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ及びＨＭＢＣによって指定された部分構造をそれぞれ示す。（ｂ）添え字の番号は、１３Ｃ  ＮＭＲ（１Ｈ  ＮＭＲ）化学的シフト、ＣＤ３ＯＤ中でのｐｐｍを表わし、矢印は、エーテル結合の周辺における差ＮＯＥ測定（実験）（ＮＯＥ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって観測されたＮＯＥを示す。
【図３】図３は、前駆体としてｍ／ｚ９０９．５での分子イオンと供のＢＴＸ−Ｂ５のネガティブＦＡＢ  ＣＤ  ＭＳ／ＭＳ  スペクトルを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、標準ＢＴＸ−Ｂ２（５０ｎｇ／ｍＬ）の１０μｌの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトリークロマトグラム。〔ＳＲＭ検出で使用された前駆体−プロダクトイオンの組み合わせ及び極性が示される。〕縦軸：強度（×１０４）横軸：保持時間（ｍｉｎ）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、毒化トリガイ（ｇ／ｍＬ）の８０％ＭｅＯＨ抽出物からの８０％ＭｅＯＨ画分の１０μｌの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトリークロマトグラム。ＳＲＭ検出で使用された前駆体−プロダクトイオンの組み合わせ及び極性が示される。縦軸：強度（×１０５）横軸：保持時間（ｍｉｎ）。
【図４Ｃ】図４Ｃは、毒化ムラサキイガイ（ｇ／ｍＬ）の８０％ＭｅＯＨ抽出物からの８０％ＭｅＯＨ画分１０μｌの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトリークロマトグラム。ＳＲＭ検出で使用された前駆体−プロダクトイオンの組み合わせ及び極性が示される。縦軸：強度（×１０４）横軸：保持時間（ｍｉｎ）。
【図４Ｄ】図４Ｄは、毒化沖カキ（ｇ／ｍＬ）の８０％ＭｅＯＨ抽出物からの８０％ＭｅＯＨ画分１０μｌの選択反応モニタリング（ＳＲＭ）液体クロマトグラフィー−タンデムマススペクトリークロマトグラム。ＳＲＭ検出で使用された前駆体−プロダクトイオンの組み合わせ及び極性が示される。縦軸：強度（×１０５）横軸：保持時間（ｍｉｎ）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】  本発明の式（Ｉ）を有する化合物は、貝類中から後述の実施例に記載のように抽出し、単離することができる。【００１０】  本発明の式（１）の化合物は、式（ＩＩ）を有する化合物の末端に位置するアルデヒド基を、例えば酸化剤を用いて、酸化してカルボキシ基とすることにより合成することもできる。式（ＩＩ）を有する化合物は、ＰｂＴｘ−２として公知であり、Ｌｉｎ  Ｙ．Ｙ，Ｒｉｓｋ  Ｍ，Ｒａｙｓ  Ｍ，Ｅｕｇｅｎ  ＤＶ，Ｃｌａｒｄｙ  Ｊ，Ｇｏｌｉｋ  Ｊ，Ｊａｍｅｓ  ＪＣ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  Ｋ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，８１，６７７３−６７７５（１９８１）に記載の方法により製造できる。【００１１】  用いる酸化剤としては、アルデヒドの酸化に用いることができる酸化剤を挙げることができ、過酸化水素が好ましい。【００１２】  酸化反応は、触媒の存在下で行なうことが好ましく、触媒として、通常の酸化触媒を用いることができ、ＳｅＯ２が好ましい。【００１３】  酸化反応は、以下の条件で好適に実施できる。
・反応温度  ０〜５０℃（特に好ましくは５〜４５℃、更に１０〜４０℃：常温）
・反応圧力  ０．１〜１０ＭＰａ（特に好ましくは０．５〜５ＭＰａ：常圧）
・溶媒      有機極性溶媒（ｉ−ブタノールなどの低級アルコール系有機溶媒）
・触媒      ＳｅＯ２などの酸化触媒
・酸化剤    過酸化水素などの酸化剤【００１４】  本発明の化合物（ＢＴＸ−Ｂ５）は、他のブレベトキシン類に比べて、比較的多種類のブレベトキシンで汚染された貝類の中に良く見出され、しかも比較的安定であるため、貝類中に存在するＢＴＸ−Ｂ５を定量し、この化合物の存在の確認と含量をもって神経性貝毒による汚染の程度を知ることができる。よって、神経性貝毒の毒化のマーカーとしてこの化合物を用いることができ、貝類中の神経性貝毒の検出ができる。
【実施例１】
【００１５】ＢＴＸ−Ｂ５の精製、単離
Ｗｈａｎｇａｒｅｉ産の毒化トリガイ（１６０ｋｇ）の殻を剥き、凍結真空乾燥し、そして、粉砕したのち、８０％メタノールにより、還流（加熱）しながら、２回抽出した。抽出液を、ＣＨ２Ｃｌ２とＨ２Ｏの間で分配した。その有機物層を、さらに、ｎ−ヘキサンと８０％メタノールの間で分配した。そのメタノール層（１０９．２ｇ）を、ＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ−Ｈ２Ｏ（９５：５：０，６５：１５：２，６５：２０：３，及び６５：４５：１０）を用いる、ＳｉＯ２のクロマトグラフィー法分離を行って、ｆｒ１−１からｆｒ１−４の４画分をそれぞれ得た。ｆｒ１−１、ｆｒ１−２及びｆｒ１−３は、マウス評価において神経性中毒性を示した。マウス評価は以下のようにして行った。テスト試料のそれぞれを１％Ｔｗｅｅｎ６０−生理食塩水に懸濁し、１８〜２２ｇのｄｄＹマウスに腹腔内注射により投与した。マウスを６時間の間は連続的に、６〜１５時間の間は１時間毎に観察した。マウスユニット（ＭＵ）毒性を公定法プロトコル（Ｄｅｌａｎｅｙ．Ｊ．Ｅ．，１９８５．Ｃｈａｐｔｅｒ  ４：Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ  ｔｏｘｉｎｓ．Ｉｎ：Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ，Ｂｕｒｇ（Ｅｄｓ．）．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅａ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｈｅｌｌｆｉｓｈ，ｆｉｆｔｈ  ｅｄ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．ｐｐ．６６−７８．）において示された投与量−応答表から外挿した。ＢＴＸ−Ｂ１及びＰｂＴｘ−３のＭＵをマウス検出データに基づく３．６及び４．０μｇ／ＭＵの変換係数をそれぞれ用いて変換した。【００１６】  ｆｒ１−２及びｆｒ１−３より、ＯＤＳ−Ａ６０（ＹＭＣ−Ｇｅｌ）を用い、ｆｒ２−１からｆｒ２−６の画分を得た。７０％及び８０％ＭｅＯＨを使用して溶出される二つの画分ｆｒ２−５及びｆｒ２−６が活性を示した。次に、ｆｒ２−５をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０によるクロマトカラムグラフィー、最後に、ＹＭＣ  ＯＤＳ−Ａ３２４カラムクロマトグラフィーにかけＢＴＸ−Ｂ１（１２ｍｇ）を得た。【００１７】  ｆｒ１−１を、ＭｅＯＨを用いるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、８０％ＭｅＯＨを用いるＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８、８５％ＭｅＯＨを用いるＰｕｒｅｓｉｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｃ１８、そして、最後に８０％ＭｅＯＨを用いるＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ  ＲＰ−１８（Ｍｅｒｃｋ）による連続的なカラムクロマトグラフィーにかけ、更なる高純度化を行い、ＰｂＴｘ−３（約２．４ｍｇ）を得た。【００１８】  ｆｒ２−６を、ＭｅＯＨを用いるＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０、８０％ＭｅＯＨを用いるＰｕｒｅｓｉｌ  Ｃ１８（×２）、そして、最後に８０％ＭｅＯＨを用いるＬｉＣｈｒｏＣＡＲＴ  ＲＰ−１８での連続的なクロマトグラフィーを行うことによって、更に高純度化されたブレベトシキンＢ５（ＢＴＸ−Ｂ５）（約５００μｇ）を得た。マウス評価によって、各溶出液の毒活性の有無を調べた。
【実施例２】
【００１９】ＢＴＸ−Ｂ５の構造解析
実施例１で得られた毒性ＢＴＸ−Ｂ５は、次に示す性状を有する無色の無定形な固体である。
・ＦＡＢＭＳ  ｍ／ｚ  ネガティブ，９０９（Ｍ−Ｈ）−；ポジティブ，９３３（Ｍ＋Ｎａ）＋．
・ＨＲ−ＦＢＭＳ，ｍ／ｚ  ９３３．４６４５（Ｍ＋Ｎａ）＋（計算値Ｃ５０Ｈ７０Ｏ１５，９３３．４６４２）【００２０】  ＫＢｒ錠剤での赤外スペクトル上の吸収３４４６，１７３５，１６５２，１６０９，１２３０，１２１１及び８６５ｃｍ−１は、分子中にヒドロキシ基及び２つの共役カルボキシレート及びカルボキシル官能基の存在を示唆した。
この化合物は、ＰｂＴｘ−２及びＢＴＸ−Ｂ１と同様に、共役カルボキシレート及びカルボン酸発色基を有するために、紫外線スペクトル上に吸収（ＵＶ）λｍａｘ（ＭｅＯＨ）２０５ｎｍ（ε２７，３００）最高値吸収（吸収ピーク）を有する。【００２１】  ＢＴＸ−Ｂ５の１ＤプロトンＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ）スペクトルは、ＰｂＴｘ−２のものと近似しているが、そのアルデヒドのシグナルがなく、そして、側鎖のタウリン基によるシグナルを除いてＢＴＸ−Ｂ１のそれと実質的に同一である。（図１）【００２２】 １Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹの測定結果より、ＢＴＸ−Ｂ５とＢＴＸ−Ｂ１（２）との間でＨ２からＨ４０のプロトンの結合状態（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）、化学的シフト（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｈｉｆｔｓ）及び結合定数（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ）において、良好な同一性が示された。以上のことから、ＢＴＸ−Ｂ５は、ＢＴＸ−Ｂ１と同様に、同じポリエステル部分及び立体化学構造を有している。【００２３】  Ｃ４０−Ｃ４１（Ｃ５０）−Ｃ４２は、Ｈ５０とＨ４０の間の見られるアリル結合、並びに、Ｈ５０とＣ４２の間のＨＭＢＣ相関によって確認された。よって、ＢＴＸ−Ｂ５の側鎖中のＣ４２の官能基は、−ＣＯＯＨである。（図２）【００２４】  ＢＴＸ−Ｂ５（ＭｅＯＨ）は、ＣＤスペクトルにおいて
・ネガティブ  最大（Δε  −５．７８エン−ラクトン  ππ＊）ａｔ  ２２７ｎｍ  および
・ポジティブ  最大（Δε  ＋６．８８エン−ラクトン  ｎπ＊）ａｔ  ２５７ｎｍ
を示したが、それらは、ＢＴＸ−Ｂ１及びＰｂＴｘ−２において見出されたものと類似である。Ｈ３５からＨ４０−２の間のＮＯＥｓは、その側鎖がβ−配向性であることを示した。これらの結果は、ＢＴＸ−Ｂ５が、ＰｂＴｘ−２と同じ絶対配置（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）を有することを示す。【００２５】  提案した構造式は、ＢＴＸ−Ｂ５の（Ｍ−Ｈ）−イオン（ｍ／ｚ９０９）について行われた、衝撃的活性化解離（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）法によるネガティブイオン  ＦＡＢ  ＭＳ／ＭＳ実験によって、良くサポートされている。【００２６】  Ｃ３７−Ｃ３６及びＣ３９−Ｏの間の結合開裂は、イオンｍ／ｚ１１１（図３）の生成によって、証明された。他の主要なイオンは、報告されているＢＴＸ−Ｂ２において観測されているように（Ｍｕｒａｔａ  Ｋ，Ｓａｔａｋｅ  Ｍ，Ｎａｏｋｉ  Ｈ，Ｋａｓｐａｒ  ＨＦ，Ｙａｓｕｍｏｔｏ  Ｔ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４，７３５−７４２（１９９８））、エーテル環における特徴的な結合開裂によって生成し、そして、提案した構造式とも一致した。
【実施例３】
【００２７】ＢＴＸ−Ｂ５の合成
１）室温下、ＳｅＯ２（０．５ｍｇ）を含むｔ−ＢｕＯＨ（１ｍｌ）にＰｂＴｘ−２（１．０ｍｇ）を溶解した溶液に、撹拌しながら３０％Ｈ２Ｏ２（０．５ｍｌ）を除々に加えた。添加４時間後、反応液を水（９ｍｌ）で希釈したのち固相カラムＯａｓｉｓ  ＨＬＢ  ｐｌｕｓ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｗａｔｅｒｓ製）にアプライした。７０％メタノール（５ｍｌ）で洗浄後、９０％メタノールで生成物を溶出させた。この方法で、約０．９ｍｇのＢＴＸ−Ｂ５を得た。
２）ＢＴＸ−Ｂ５の合成
室温下、メタノール（１ｍｌ）にＰｂＴｘ−２（１．０ｍｇ）を溶解した溶液に、撹拌しながら５％ＮａＣｌＯ２（１．０ｍｌ）を除々に加えた。添加４時間後、反応液を水（９ｍｌ）で希釈したのち固相カラムＯａｓｉｓ  ＨＬＢ  ｐｌｕｓ  ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｗａｔｅｒｓ製）にアプライした。７０％メタノール（５ｍｌ）で洗浄後、９０％メタノールで生成物を溶出させた。この方法で、約０．９ｍｇのＢＴＸ−Ｂ５を得た。
【実施例４】
【００２８】ＢＴＸ−Ｂ５の定量
ＨＰＬＣ条件：カラム、Ｃａｄｅｎｚａ  ＣＤ−Ｃ１８（３ｍｍ×１５０ｍｍ、３μｍ）；移動相、２０分間の０．１％ギ酸−アセトニトリルのグラジエント（２０→８０％アセトニトリル）；流速、０．２ｍＬ／ｍｉｎ；２０μＬ注入。コーン電圧は、１００Ｖで設定され、衝突誘起解離は、７５ｅＶの衝突エネルギーで実施された。アルゴンが、衝突ガスとして使用された。【００２９】  液体クロマトグラフィータンデムマススペクトリーによってＢＴＸ−Ｂ５は、ＰｂＴｘ−３と共に、１９９３年の初期のＮＳＰの発生時に収穫されたニュージランド産の毒化貝トリガイ類、ムラサキイガイ（Ｐｅｒｎａ（Ｐ．）ｃｏｎａｌｉｃｕｌｕｓ）及び沖カキ中に見出された。一方、高いレベルと低いレベルのＢＴＸ−Ｂ１が、トリガイ及び沖カキの２つの貝で、それぞれ、確認された。（図４）【００３０】  前述のようにして単離されたＢＴＸ−Ｂ５の腹腔内投与での最小致死量（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅ）は、約０．３−０．５ｍｇ／ｋｇであった。注入後直ちに、その被検体動物は、他のブレベトキシン類によって引き起こされるものと極めて類似した神経性中毒症状を発現した。【００３１】  興味深いことには、ＰｂＴｘ−１、ＰｂＴｘ−２、及びＰｂＴｘ−３のような幾つかのブレベトキシン類が渦鞭毛藻Ｇ．ｂｒｅｖｅによって、おおよそ１／７／２の割合において産生されることがよく知られているけれども、強力な魚類性毒物のＰｂＴｘ−１及びＰｂＴｘ−２は、トリガイ類において、有為的なレベルで見出せないが、より魚類性毒性と致死性毒性の低いＢＴＸ−Ｂ３、ＢＴＸ−Ｂ１及びＢＴＸ−Ｂ５は、約５／２５／１の比率で見出される。【００３２】  極最近、高濃度のＰｂＴｘ−３およびＢＴＸ−Ｂ５が、同じムラサキイガイ中に見出された。これらの分析データに基づくと、ＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ５、及びＢＴＸ−Ｂ１が、トリガイのＮＳＰに関係した毒力に対応し、一方ムラサキイガイはＰｂＴｘ−３、ＢＴＸ−Ｂ５並びにＢＴＸ−Ｂ２、Ｂ３及びＢ４、及び沖カキはＰｂＴｘ−３及びＢＴＸ−Ｂ５が対応することが示された。【００３３】  このように、ＢＴＸ−Ｂ５およびＰｂＴｘ−３は、Ｇ．ｂｒｅｖｅの赤潮発生（ａｌｇａｌ  ｂｌｏｏｍ）後の貝の毒化を監視する優れたマーカーであり得る。ＢＴＸ−Ｂ２、ＢＴＸ−Ｂ３、及びＢＴＸ−Ｂ４は、トリガイからのみ得られているので、ブレベトキシンの代謝は、種特異的であることを示唆している。【００３４】  ブレベトキシン類、特に、ＰｂＴｘ−１及びＰｂＴｘ−２が、酸性及び塩基性の条件では、いずれも不安定であることが報告されていた。
ＰｂＴｘ−２のアルデヒド末端基が、マイルドな条件下の選択的酸化によって、対応するカルボン酸基に容易に変換されることが新たに見出された。解毒のためにＰｂＴｘ−２は全ての３つの貝類中でＢＴＸ−Ｂ５へ代謝され、ＢＴＸ−Ｂ５の多くはトリガイ内の酵素によってＢＴＸ−Ｂ１へ変換されることで消滅されるが、ムラサキイガイ及び沖カキ中の酵素によってはこの変換率はわずかである。この代謝は人体中におけるアルデヒド解毒経路と似ているので、我々の提案するトリガイ中のブレベトキシン類の解毒経路の解明は、人のＮＳＰ中毒の治療に有益な知見を提供すると考えられる。【００３５】  関連するブレベトキシン代謝に関わるメカニズム及び酵素は、今後更に詳細に明らかにする必要がある。
ブレベトキシン及びそれらの類似体に対するタンデムマススペクトロメトリー技術と連結した液体クロマトグラフィーを用いる高感度分析法は、貝毒のモニタリング及び代謝の研究にとって重要である。
【産業上の利用可能性】
【００３６】本発明におけるブレトキシン類縁体の一つで、新規な化合物（ＢＴＸ−Ｂ５）は、貝中の神経性貝毒の有無を調べる際に毒化マーカーとして使用することができるので、水産分野における食品企業、漁業組合などでの貝毒のモニタリングに使用できる。
【図１】
2005051956.tif 000006
【図２】
2005051956.tif 000007
【図３】
2005051956.tif 000008
【図４Ａ】
2005051956.tif 000009
【図４Ｂ】
2005051956.tif 000010
【図４Ｃ】
2005051956.tif 000011
【図４Ｄ】
2005051956.tif 000012
【国際調査報告】
2005051956.tif 000013
2005051956.tif 000014
2005051956.tif 000015
2005051956.tif 000016