(57)【要約】  本発明は、石灰化組織代替物の製造方法に関する。この方法は、ブルシャイトを生成させるために、粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させること、ブルシャイトを粉砕すること、及びリン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応させることを含む。本発明はまた、この方法により製造された石灰化組織代替物、石灰化組織を修復するための石灰化組織代替物の使用、及び石灰化組織を送達するための送達装置に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
石灰化組織代替物の製造方法であって、
粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させてブルシャイトを生成し、
ブルシャイトを粉砕し、
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを反応させることを備える方法。
【請求項２】
粉砕された真珠層が、４００μｍ以下又は２００μｍ以下の粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粉砕された真珠層が、５０μｍ以上の粒径を有する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
粉砕された真珠層が、５０μｍ〜４００μｍ又は５０μｍ〜１００μｍの粒径を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
粉砕されたブルシャイトが１０μｍ〜１００μｍの粒径を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを４：１０の比で反応させる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
リン酸水素二ナトリウム溶液が８．２から９．５のｐＨを有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
リン酸水素二ナトリウム溶液が２．５％から４％の溶液である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムとを反応させ、及び／又は粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとを室温又はで約３７℃反応させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
さらに、ブルシャイトを粉砕する前にブルシャイトを乾燥させることを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、１０μｍから１００μｍの粒径を有する粉砕されたブルシャイトを分離することを含む請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとが４：10の比率で反応する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応が、リン酸四カルシウムをさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
粉砕された真珠層、粉砕されたブルシャイト、及びリン酸四カルシウムが、リン酸水素二ナトリウム溶液中で、６：９：５、７：８：５、８：７：５、９：６：５、又は１０：５：５の比率で反応する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
リン酸水素二ナトリウム溶液が、溶液中の他の反応物と反応する反応物比が２５％、３３％、４０％又は５０％である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組成物の硬化時間を変更する薬剤、任意にヘクトライト、ラポナイト又はアルファ硫酸カルシウムを添加することをさらに含む請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法により製造された石灰化組織代替物。
【請求項１８】
粒子状であり、粒子表面にヒドロキシアパタイトを含む、請求項１７に記載の代替物。
【請求項１９】
湿度１００％及び３７℃で硬化する、請求項１７又は１８に記載の代替物。
【請求項２０】
４５Ｎより大きいピーク荷重、又は２．３ＭＰａより大きい圧縮強度を有する、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の代替物。
【請求項２１】
移植可能又は注射可能である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の代替物。
【請求項２２】
３０分〜９０分の初期硬化時間（Ｔｉ）を有する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の代替物。
【請求項２３】
６０分〜１２０分の最終硬化時間（Ｔｆ）を有する、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の代替物。
【請求項２４】
石灰化組織を修復するための石灰化組織代替物の製造における、粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水の使用。
【請求項２５】
石灰化組織を修復するための方法であって、石灰化組織を請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の代替物と接触させることを含む方法。
【請求項２６】
石灰化組織が歯又は骨である、請求項１〜１６又は請求項２５のいずれか一項に記載の方法、又は請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
第１チャンバ及び第２チャンバを備える送達装置であって、第１チャンバは、粉砕された真珠層を含み、第２チャンバは、粉砕されたブルシャイトを含み、粉砕されたブルシャイトは、粉砕された真珠層と、リン酸一カルシウムと、水とを反応させ、得られたブルシャイトを粉砕することにより生成され、装置は、反応近接状態で粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを同時に送達し、それにより、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとをリン酸水素二ナトリウム溶液の存在下で反応させるように適合される装置。
【請求項２８】
第１のチャンバ及び／又は第２のチャンバは、リン酸水素二ナトリウム溶液をさらに含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
装置が、リン酸水素二ナトリウム溶液を含む第３チャンバを含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項３０】
送達が、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを混合することを含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の装置がシリンジである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、石灰化組織代替物の製造に関する。
【背景技術】
【０００２】
感染、外傷、炎症、腫瘍及び先天性の病因により引き起こされる障害は、広範な外科的治療を必要とする最も一般的な整形外科的及び歯科的状態である。多くの代替骨が、注射及び移植可能な形態で使用される医療機器として開発されてきたが、それらの大部分は十分な骨伝導性及び骨誘導性を欠いていた。それにもかかわらず、代替骨は、年間80億ドル以上の市場価値を持つ整形外科及び歯科の分野で広範な臨床応用を有している。
【０００３】
真珠層は骨の治癒を促進することが示されており、これはマヤの時代に遡ることができる。真珠層と真珠には、骨形成を誘発できる微量元素と生理活性タンパク質が含まれていることが報告されている。しかしながら、真珠層における炭酸カルシウムの急速な分解速度は、移植可能又は注射可能な骨代替物としてのその用途を制限してきた。
【０００４】
従って、石灰化組織を修復するための改善された組成物が必要である。
【０００５】
石灰化組織を修復するための多孔質材料の生成は、材料組成を改善するための重要な設計基準となる。現在、２つの主要な多孔質材料がある。プレハブの多孔質材料と、移植後に多孔質構造がその場で生成される多孔質材料である。一般に、プレハブの多孔質材料は、対応する固体材料よりも弱い機械的強度を示す一方、その場で多孔質にされた材料は、構成要素の劣化後に制御不能な機械的破損を受ける場合がある。
【０００６】
先行技術文献が本明細書で参照される場合、そのような参照は、その文献がオーストラリア又は他の国における当該技術分野の一般的な一般知識の一部を形成するという承認を構成しないことを理解されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、石灰化組織代替物における段階的な孔形成を誘導するマルチ−カルシウム塩吸収勾配を利用し、それにより、石灰化組織代替物の機械的特性を損なうことなく生体内で新しい骨形成を誘導する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
第１の態様は、石灰化組織代替物を生成する方法を提供し、この方法は、
粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させてブルシャイトを生成させ、
ブルシャイトを粉砕し、
リン酸水素二ナトリウム溶液中で、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの反応させることを含む。
【０００９】
第２の態様は、第１の態様の方法により生成されたときに石灰化組織代替品を提供する。
【００１０】
第３の態様は、石灰化組織を修復するための石灰化組織代替物の製造において、粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水の使用を提供する。
【００１１】
第４の態様は、石灰化組織を修復する方法を提供し、この方法は、石灰化組織を第２の態様の代替物と接触させることを含む。
【００１２】
第４の態様の代替形態は、石灰化組織を修復する方法で使用するための第２の態様の代替物を提供し、その方法は、石灰化組織を代替物と接触させることを含む。
【００１３】
態様のいずれか1つの態様において、石灰化組織は歯又は骨である。
【００１４】
第５の態様は、第１のチャンバと第２のチャンバとを備えた送達装置を提供し、第１のチャンバは粉砕された真珠層を備え、第２のチャンバは粉砕されたブルシャイトを備えており、粉砕されたブルシャイトは、粉砕された真珠層、リン酸一カルシウム、及び水を反応させ、得られたブルシャイトを粉砕することにより生成され、この装置は、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを同時に反応するように送達するように適合され、それにより、リン酸水素二ナトリウム溶液の存在下で粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを反応させる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、実施例１の方法の概略図を示す。
【図２】図２は、実施例２に従って製造された石灰化組織代替物の機械的特性を示す縦棒グラフを含む。図２Ａは、実施例２に従って調製された石灰化組織代替物（真珠-オルトリン酸塩粒子）のサンプルと多孔性市販製品（ＳＫＥＬＩＴＥＴＭ）の圧縮ピーク荷重（Ｎ）を示し、図２Ｂは圧縮強度（ＭＰａ）を示す。
【図３】図３は、実施例に従って調製された石灰化組織代替物（真珠層オルトリン酸塩粒子）の表面を示す３．３９ｋＸ倍率のＢＳＥモードで収集された走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）顕微鏡写真である。明るい灰色の矢印は真珠層に囲まれたオルトリン酸カルシウムを指し、暗い灰色の矢印はオルトリン酸カルシウムでコーティングされた真珠層粒子を指す。
【図４】図４は、実施例に従って調製された石灰化組織代替物（真珠オルトリン酸塩粒子）の表面を示す７．３９ｋＸ倍率のＢＳＥモードで収集されたＳＥＭ顕微鏡写真である。顕微鏡写真は、真珠層を取り囲むオルトリン酸カルシウムを示す。未反応の真珠層構造が観察される。
【図５】図５は、真珠層、ブルシャイト粒子、及びリン酸四カルシウムを６：９：５の比（ターコイズ）で使用して、実施例２に従って調製された石灰化組織代替物Ａで２４時間培養されたＨｅＬａ細胞のレーザー共焦点走査顕微鏡写真を含む。細胞膜のＦ−アクチンは蛍光ファロイジン（赤）で標識され、核はヘキスト（青）で標識された。Ａ．細胞の表面形態。Ｂ．石灰化組織代替物への細胞の接着の３Ｄ構造。白い矢印は、細胞、核、及び石灰化組織代替物を示す。Ｃ．石灰化組織代替物に付着した単一細胞の上昇。白い矢印は、細胞、核、及び石灰化組織代替物を示す。
【図６】図６は、１０：５：５の比率で真珠層粒子、ブルシャイト粒子、リン酸四カルシウムを使用して、実施例２に従って調製された石灰化組織代替物Ｅ（ターコイズ）で７２時間培養したＭＬＯ−Ｙ４細胞のレーザー共焦点走査顕微鏡写真と分析を含む。細胞膜中のＦ−アクチンは、蛍光ファロイジン（赤）で標識された。Ａ．石灰化組織代替物への細胞の接着の３Ｄ構造。Ｂ．石灰化組織代替物への単一細胞の接着の３Ｄ構造。骨細胞の樹状突起を示し、白い矢印は、細胞、樹状突起、及び石灰化組織代替物を示す。
【図７】図7は、レーザー共焦点走査顕微鏡写真と、６：９：５の比率で真珠層粒子、ブルシャイト粒子、リン酸四カルシウムを使用して、実施例２に従って調製した石灰化組織代替物Ａで７２時間培養したＭＬＯ−Ｙ４細胞の分析である。細胞膜のＦ−アクチンは、蛍光ファロイジン（赤）で標識された。顕微鏡写真は、骨細胞の樹状突起接続（ネットワーク）を示す。白い矢印は、樹状突起の接続と細胞とを特定している。
【図８】図８は、実施例２に従って調製された石灰化組織代替品（真珠層カルシウムオルトリン酸塩材料）上で７２時間まで培養されたＭＣ３Ｔ３細胞の細胞生存率を示す縦棒グラフである。細胞の生存率は、比色分析ＭＴＳアッセイを使用して決定した。
【図９】図９は、実施例２に従って調製された石灰化組織代替物Ａ、Ｃ及びＥ（オルトリン酸カルシウム材料）で７日間及び１４日間培養されたＭＣ３Ｔ３細胞の細胞ＡＬＰ活性を示す縦棒グラフである（比率６：９：５、８：７：５、及び１０：５：５）。骨形成分化マーカーのアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性は、製造業者（Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute、南京、中華人民共和国）の指示に従ってＡＬＰマイクロプレートテストキットを使用して、リン酸ｐ−ニトロフェニルの加水分解の黄色の最終生成物であるｐ−ニトロフェノールの量を定量することによって決定された。
【図１０】図１０は、ヒドロキシアパタイトと真珠層オルトリン酸カルシウムの生体内での生分解速度（経時的な重量損失の割合）を示す折れ線グラフ（Ａ）、及びヒドロキシアパタイトとオルトリン酸カルシウムの分解物の肉眼形態（Ｂ）を含む。*は、オルトリン酸カルシウムとヒドロキシアパタイトの統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１１】図１１は、実施例２、パート４のウサギ大腿骨皮質骨の骨欠損の動物モデルの外科的手順を示す写真を含む。図１１Ａは、麻酔ウサギの手術位置と剃毛を示す。図１１Ｂは、ウサギの術前の準備を示す。図１１Ｃは、遠位骨幹端領域の大腿骨皮質骨の露出を示す。図１１Ｄは、人工骨欠損を作るための穴を開けているところを示す。図１１Ｅは、骨欠損の基本的な形状であって、円形の貫通させた皮質骨欠損を示す。図１１Ｆは、骨欠損の直径が５ｍｍであることを示す。図１１Ｇは、骨欠損に移植された真珠層オルトリン酸カルシウムを示す。図１１Ｈは、骨欠損に移植されたヒドロキシアパタイトを示す。図１１Ｉは、切開部の縫合を示す。
【図１２】図１２は、動物モデルの画像確認を含む。円は骨欠損部位を強調している。図１２Ａは、真珠層オルトリン酸カルシウムを移植した群のＸ線画像である。図１２Ｂは、ヒドロキシアパタイトを移植した群のＸ線画像である。図１２Ｃは、ブランク対照群のＸ線画像である。図１２Ｄは、手術対照群のサンプルのマイクロＣＴスキャンであり、骨欠損の直径が５ｍｍであることを明確に示している。
【図１３】図１３は、動物モデルから取得したサンプルの形態を示す写真を含む。黒い矢印は、骨欠損部位に残った真珠層のオルトリン酸カルシウム粒子を指す。白い矢印は、骨欠損部位に残っているヒドロキシアパタイト粒子を指す。円は、対照群の骨欠損部位を示す。
【図１４ａ】図１４ａは、本開示の石灰化組織代替物によって強力な骨芽細胞活性が刺激されたされたことを示す一連の画像を含む。Ａ〜Ｄは、矢状面の２Ｄ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ画像と下記群の３Ｄ再構成画像を含む。Ａ−ＮＯ４（４週間のオルトリン酸カルシウム移植群）-黒い矢印は、新しい骨梁構造を指す。Ｂ−ＨＡ４（４週間ヒドロキシアパタイト注入群）Ｃ−ＢＣ４（４週間のブランク対照群）Ｄ−ＮＯ８（８週間の真珠層のオルトリン酸カルシウム移植群）
【図１４ｂ】図１４ｂは、本開示の石灰化組織代替物によって強力な骨芽細胞活性が刺激されたされたことを示す一連の画像を含む。Ｅ〜Ｆは、矢状面の２Ｄ  Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ画像と下記群の３Ｄ再構成画像を含む。Ｅ−ＨＡ８（８週間のヒドロキシアパタイト移植群）Ｆ−ＢＣ８（８週間のブランク対照群）
【図１５】図１５は、ＮＯ４、ＨＡ４、及びＢＣ４の群の４週間後のＭｉｃｒｏ−ＣＴの分析を示す縦棒グラフである。骨量／総量（ＢＶ／ＴＶ）、骨表面/骨量（ＢＳ／ＢＶ）、皮質厚（Ｃｔ．Ｔｈ）、フラクタル次元（ＦＤ）が表示される。＃は、真珠層オルトリン酸カルシウムとヒドロキシアパタイトの統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１６】図１６は、ＮＯ８、ＨＡ８及びＢＣ８の群の８週間後のＭｉｃｒｏ−ＣＴの分析を示す縦棒グラフを含む。骨量／総量（ＢＶ／ＴＶ）、骨表面／骨量（ＢＳ／ＢＶ）、皮質厚（Ｃｔ．Ｔｈ）、フラクタル次元（ＦＤ）が表示される。＃は、真珠層オルトリン酸カルシウムとヒドロキシアパタイトの統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【図１７】図１７は、ＮＯ４、ＨＡ４及びＢＣ４の群では４週間後、ＮＯ８、ＨＡ８及びＢＣ８の群では８週間後の骨欠損部位の空隙率のＭｉｃｒｏ−ＣＴデータの分析を示す縦棒グラフである。＃は、真珠層オルトリン酸カルシウムとヒドロキシアパタイトの統計的に有意な差を示す（Ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者らは、石灰化組織の修復のための改善された石灰化組織代替物、及び石灰化組織代替物の製造方法を開発した。本発明は、主要成分の異なる分解時間を利用して、生体内で固体材料を多孔質構造に変換する。つまり、構成成分において、残りの真珠層粒子は最も早い分解速度を有し、この分解速度は、体液との接触により生分解し始める速度である。真珠層の溶解が起こると、生理活性マトリックスが放出され、細胞統合が促進され、骨形成が誘導される。同時に、細胞の内部成長を可能にする細孔が生成される。本開示の石灰化組織代替物の他の成分であるブルシャイト（又はモネタイト）、炭酸アパタイト、及びストロンチウム置換ヒドロキシアパタイトは、真珠層と比較して異なる溶解性を有し、これらの成分は２〜８ヶ月で生分解される。これらの異なるオルトリン酸カルシウムは、マクロファージ、破骨細胞、及び他の細胞タイプの細胞活性により、食作用及び体液固体反応を介して徐々に吸収され、これにより、多孔性と細胞の内部成長が増大する。後に、石灰化組織代替物中のヒドロキシアパタイトは、骨伝導性足場として最大２年間体内に保持され、その後、細胞媒介吸収によって新しい骨に完全に置き換えられる。使用された場合、生体不活性薬物キャリアラポナイトは体内に残る。
【００１７】
表１は、その場で材料表面に多孔質構造を生成し、石灰化組織修復のために細胞及び組織の内部成長を可能にする真珠層オルトリン酸塩成分の生分解速度を示す。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
本発明は、真珠層粒子の表面にオルトリン酸カルシウムをコーティングする方法を提供し、この方法により製造されたオルトリン酸カルシウムでコーティングされた真珠層粒子を提供することにより、十分な骨伝導性及び骨誘導性の欠如、及び真珠層の急速な吸収の欠如を克服する。本発明はまた、例えばラポナイト粒子のように適切な添加物粒子に負荷された、正に帯電した抗体又は分子のオルトリン酸カルシウム被覆真珠層粒子からの制御された共放出を提供する。
【００２０】
理論に拘束されることを望まないが、石灰化組織代替物の未反応の真珠層は生理活性化合物を含み、それにより骨誘導性を高める。さらに、露出した真珠層は、他のオルトリン酸カルシウムよりも速く吸収される。4つの異なる主要成分の吸収勾配は、移植後の新しい骨形成を伴う段階的な孔形成のプロセスを提供する。従来のカルシウム塩材料で作られた従来の多孔性骨代替物と比較して、本発明の石灰化組織代替物の孔は生体内で生成され、それにより石灰化組織修復の初期段階でより強い機械的サポートを提供し、骨伝導性を高める。
【００２１】
使用において、石灰化組織代替物は、オルトリン酸カルシウムに比べて真珠層の吸収が速いため生体内で孔を発達させ、これは、骨形成を妨げるリン酸カルシウムベースの市販製品の吸収が遅いという問題を解決する。
【００２２】
本発明の態様のいずれにおいても、石灰化組織は骨又は歯であり得る。本明細書で使用される「修復」は、石灰化組織の改善、再建、再構築、又は回復を含む。感染、外傷、炎症、腫瘍性又は先天性の病因により修復が必要になる場合がある。本明細書で使用される「石灰化組織の修復」は、最終的に別の組織又は器官の治療、例えば、目的が脊柱管狭窄と、脊髄及び／又は脊髄神経圧迫とを緩和することである脊椎固定術の実行を含む。
【００２３】
本明細書で使用される石灰化組織「代替物」とは、骨形成、骨伝導及び／又は骨誘導を通じて石灰化組織の修復を促進させる石灰化組織と接触する材料を指す。石灰化組織「代替物」は、真珠層オルトリン酸カルシウム塩又は石灰化組織移植片とも呼ばれる。一実施形態では、石灰化組織代替物は、空隙を埋めるために使用される。
【００２４】
本明細書で使用される「骨形成」という用語は、石灰化組織の発達及び形成を指す。骨形成のプロセスには、骨伝導及び／又は骨誘導が含まれる場合がある。
【００２５】
「骨伝導」という用語は、移植部位近くの骨形成細胞が足場、すなわち石灰化組織代替物を横切って移動し、経時的に足場を新しい石灰化組織に置き換える受動的プロセスを指す。骨伝導性材料により、骨芽細胞及び破骨細胞は、付着、移動、成長、及び/又は分裂することができる。
【００２６】
「骨誘導」という用語は、石灰化組織の代替物又は移植片が骨形成細胞を移植部位に補充し、それらが新しい骨を形成するように誘導する能動的なプロセスを指す。骨誘導とは、初期系統の細胞（例えば、間葉系幹細胞又は骨前駆細胞）の骨形成細胞への誘引、増殖、及び分化を指し、新しい石灰化組織の形成をもたらす。
【００２７】
石灰化組織代替物を製造する方法は、出発材料及びさらなる反応物として真珠層を使用し、製造された石灰化組織代替物は真珠層を含む。真珠層は、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３）と生理活性剤とを含むアラゴナイト鉱物の有機又は無機の生物複合材料である。
【００２８】
真珠層は、特定の粒径の区分に粉砕又は粉にされ、その後、任意に水和物（Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２.Ｈ２Ｏ）としてリン酸一カルシウムと反応して、ブルシャイト結晶を形成する。ブルシャイト結晶は、特定の粒径の区分に粉砕又は粉にされる。ブルシャイト結晶は、粉砕又は粉にされる前に任意に乾燥される。一実施形態では、粉砕されたブルシャイトの粒径は、粉砕された真珠層の粒径よりも小さい。
【００２９】
理論に拘束されることを望まないが、石灰化組織代替物の製造において真珠層の粒径が重要であると思われる。粒径は硬化時間に影響する。粉砕された真珠層粒子が細かいほど、石灰化組織代替物の硬化時間は速くなる。従って、異なる修復の適用性が異なる硬化時間を必要とする限り、粉砕された真珠層の粒径、それゆえ石灰化組織代替物の硬化時間は、石灰化組織に必要な修復に従って適応され得る。
【００３０】
真珠層及びブルシャイトは、ボールミル、オプションで高エネルギーボールミル、又は遊星ボールミルによって粉砕又は粉にされる。
【００３１】
一実施形態では、粉砕された真珠層の粒径は、約１０００μｍ以下、約９００μｍ以下、約８００μｍ以下、約７００μｍ以下、約６００μｍ以下、約５００μｍ以下、約４００μｍ以下、約３００μｍ以下、約２００μｍ以下、約１００μｍ以下、約５０μｍ以下、又は約１０μｍ以下である。
【００３２】
一実施形態では、粉砕された真珠層の粒径は、約１μｍ以上、約５μｍ以上、約１０μｍ以上、約１５μｍ以上、約２０μｍ以上、約３０μｍ以上、約４０μｍ以上、約５０μｍ以上、約６０μｍ以上、約７０μｍ以上、約８０μｍ以上、約９０μｍ以上、又は約１００μｍ以上である。
【００３３】
一実施形態では、粉砕された真珠層の粒径は、約５０μｍ〜約１００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約４００μｍ、又は約５０μｍ〜約５００μｍである。
【００３４】
一実施形態では、粉砕ブルシャイト粒径は、約５００μｍ以下、約４００μｍ以下、約３００μｍ以下、約２００μｍ以下、約１００μｍ以下、約９０μｍ以下、約８０μｍ又は以下、約７０μｍ以下、約６０μｍ以下、約５０μｍ以下、約４０μｍ以下、約３０μｍ以下、約２０μｍ以下、約１０μｍ以下、約９μｍ以下、約８μｍ以下、約７μｍ以下、約６μｍ以下、約５μｍ以下、約４μｍ以下、約３μｍ以下、約２μｍ以下、又は約１μｍ以下である。
【００３５】
一実施形態では、粉砕ブルシャイト粒径は、約１μｍ以上、約２μｍ以上、約３μｍ以上、約４μｍ以上、約５μｍ以上、約６μｍ以上、約７μｍ又は以上、約８μｍ以上、約９μｍ以上、約１０μｍ以上、約１５μｍ以上、約２０μｍ以上、約３０μｍ以上、約４０μｍ以上、約５０μｍ以上、約６０μｍ以上、約７０μｍ以上、約８０μｍ以上、約９０μｍ以上、又は約１００μｍ以上である。
【００３６】
一実施形態では、粉砕ブルシャイト粒径は、約１０μｍ〜約２０μｍ、約１０μｍ〜約３０μｍ、約１０μｍ〜約４０μｍ、約１０μｍ〜約５０μｍ、約１０μｍ〜約６０μｍ、約１０μｍ〜約７０μｍ、約１０μｍ〜約８０μｍ、約１０μｍ〜約９０μｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、約１０μｍ〜約１５０μｍ、又は約１０μｍ〜約２００μｍである。
【００３７】
一実施形態では、石灰化組織代替物は約５ｍｍの粒径を有する。別の実施形態では、石灰化組織代替物は、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約５０μｍ、約１００μｍ、約５００μｍ、約１ｍｍ、約２ｍｍ、約３ｍｍ、約４ｍｍ、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、又は約１０ｍｍである。
【００３８】
本明細書で使用される「粒子」及び「微粒子」は、別個の構成単位を指すが、固体に融合される粒子を排除しない。従って、「粒子」及び「微粒子」とは、粉砕された真珠層及び粉砕されたブルシャイト、ならびにオルトリン酸カルシウムで被覆され又は囲まれた融合真珠層を含む石灰化組織代替物を指す。粒子は粉末であってもよい。
【００３９】
本明細書で使用する「粒径」とは、粒子が通過する選択的メッシュのポアサイズを指す。従って、規定の粒径を有する粉砕された真珠層、及び粉砕されたブルシャイトは、規定のポアサイズを有する１つ又は複数のメッシュを使用してふるい分けすることにより選択できる。ふるい及びメッシュは、当技術分野で知られている。
【００４０】
一実施形態において、粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムは、約４：１０の比率で反応する。別の実施形態において、粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムは、約４：５、約４：６、約４：７、約４：８、約４：９、約４：１１、約４：１２、約４：１３、約４：１４、約４：１５、約０．５：１０、約１：１０、約２：１０、約３：１０、約５：１０、約６：１０、約７：１０ 、約８：１０、又は約９：１０の比で反応する。
【００４１】
一実施形態では、粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムは室温で反応する。別の実施形態において、粉砕された真珠層とリン酸一カルシウムは、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃、約５０℃、又は約６０℃で反応する。
【００４２】
粉砕前に乾燥した場合、ブルシャイト結晶は、例えば風乾又は凍結乾燥されてもよい。
【００４３】
この方法の第２段階目では、追加の粉砕された真珠層を粉砕されたブルシャイトと混合し、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰ０４）溶液で反応させる。
【００４４】
一実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液は約８．２から約９．５のｐＨを有する。一実施形態において、リン酸水素二ナトリウム溶液は、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０、約１０．２、約１０．４、約１０．６、約１０．８、又は約１１のｐＨを有する。一実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液は約９．２５のｐＨを有する。
【００４５】
一実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液は、２．５％から４％の溶液である。別の実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液は約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約３．５％、約４％、約４．５％、約５％、約５．５％、約６％、約６．５％、約７％、約７．５％、約８％、約８．５％、約９％、約９．５％、又は約１０％である。
【００４６】
一実施形態において、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトは、約４：１０の比率で反応する。別の実施形態において、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトは、約４：５、約４：６、約４：７、約４：８、約４：９、約４：１１、約４：１２、約４：１３、約４：１４、約４：１５、約０．５：１０、約１：１０、約２：１０、約３：１０、約５：１０、約６：１０、約７：１０ 、約８：１０、又は約９：１０の比で反応する。
【００４７】
本方法の第２段階目のさらなる実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液中の粉砕された真珠層と粉砕ブルシャイトとの反応は、リン酸四カルシウム（Ｃａ４（ＰＯ４）２Ｏ）をさらに含む。この段階でリン酸四カルシウムを使用することには３つの利点がある。それはブルシャイトと早く反応してヒドロキシアパタイトを形成し、初期硬化につながる。真珠層とブルシャイトの間の反応を触媒し得る。また、真珠層、ブルシャイト、炭酸アパタイトとは異なる吸収速度を提供する。吸収勾配は、移植後の石灰化組織代替物の孔の段階的な生成に役立つ。
【００４８】
一実施形態では、リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）が水和反応によりヒドロキシアパタイトに変換するため、リン酸三カルシウム（α−ＴＣＰ）がリン酸四カルシウムの代わりに使用される。
【００４９】
一実施形態では、粉砕された真珠層、粉砕されたブルシャイト、及びリン酸四カルシウムは、リン酸水素二ナトリウム溶液中において、６：９：５、７：８：５、８：７：５、９：６：５、又は１０：５：５の比で反応する。
【００５０】
例２に示すように、粉砕された真珠層、粉砕されたブルシャイト、及びリン酸四カルシウムの比率を変えると、石灰化組織代替物の特性が変わる。Ｘ線回折（ＸＲＤ）で示されているように、粉砕された真珠層の割合を変えると、石灰化組織代替物の真珠層の割合が変わり、大きな利点が得られる。例えば、石灰化組織代替物Ｅのように、真珠層の割合が高い石灰化組織代替物も、比較的低い割合の真珠層を有する石灰化組織代替物と比較して、生理活性剤の割合が最も高く、それゆえ最高レベルの骨誘導性を有する。例えば、石灰化組織代替物Ｅのように真珠層の割合が高い石灰化組織代替物は、比較的低い割合の真珠層を有する石灰化組織代替物と比較して、生理活性剤の割合が最も高く、従って最高レベルの骨誘導性を有する。当然の結果として、石灰化組織代替物Ａのように、真珠層の割合がより低い石灰化組織代替物は、比較的高い割合の真珠層を持つ石灰化組織代替物と比較して、アパタイトの割合が最も高いため、骨伝導性のレベルが最も高くなる。すなわち、比較的低い割合の真珠層と高い割合のアパタイトとを有する石灰化組織代替物は、より遅い吸収速度を有し、それにより、より長い期間足場又は機械的支持を提供する。従って、石灰化組織代替物の構成は、石灰化組織が必要とされる特定の修復に従って変更できる。
【００５１】
一実施形態では、リン酸水素二ナトリウム溶液は、溶液中の他の反応物と約１：４、約１：３、約１：２、又は約１：１、又は約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３３％、約４０％、約５０％、又は約６０％で反応する。
【００５２】
一実施形態では、粉砕された真珠層及び粉砕されたブルシャイト、及び任意にリン酸四カルシウムは、約３７℃で反応する。この実施形態は、石灰化組織代替物が反応し、その場で硬化させ凝固させることができる手術に特に適している。体温が３７℃でない非ヒト動物の修復に石灰化組織代替物が使用される場合、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイト、及び必要に応じてリン酸四カルシウムは、体温で反応する。
【００５３】
別の実施形態では、粉砕された真珠層及び粉砕されたブルシャイト、及び任意のリン酸四カルシウムは、室温で、又は約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃、約５０℃、又は約６０℃で反応する。約３７℃を上回る又は下回る反応温度は、事前に凝固及び事前に硬化されて移植されることを目的とした石灰化組織代替物の製造に適している。
【００５４】
一実施形態では、この方法は、組成物の硬化時間を変更する薬剤、任意にヘクトライト、ラポナイト又はアルファ硫酸カルシウムを添加することをさらに含む。そのような添加物はまた、例えばラポナイト粒子のように適切な添加物粒子に負荷された、正に帯電した抗体又は分子の石灰化組織代替物（真珠層オルトリン酸塩粒子）からの制御された共放出を提供することにも役立ち得る。そのような制御された同時放出は、当技術分野で知られている（例えば、Xiao et al.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl（2016）60：348-56; Ordikhani et al.J Mater Sci Mater Med（2015）26（12）：269 ; Li et al.ACS Appl Mater Interfaces（2014）6（15）：12328-34; Wang et al。ACS Appl Mater Interfaces（2014）6（19）：16687-95）。
【００５５】
一実施形態では、本発明の方法により生成される場合、石灰化組織代替品は粒子状であり、粒子表面にオルトリン酸カルシウムを含む。
【００５６】
本明細書で使用する「オルトリン酸塩」とはアニオンPO43−を指し、「オルトリン酸カルシウム」とは、変化した化学量論を有したカルシウム及びオルトリン酸塩を含む複数の化合物を指す。一実施形態では、オルトリン酸カルシウムはヒドロキシアパタイトであってもよい。
【００５７】
一実施形態では、石灰化組織代替物は、体温が３７℃ではない非ヒト動物の修復に使用される場合、湿度１００％及び３７℃、又は湿度１００％及び体温で硬化する。この実施形態は、石灰化組織代替物が反応し、その場で硬化させることができる手術に特に適している。別の実施形態では、石灰化組織代替物は、約４℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃、約４０℃、約４２℃、約５０℃、又は約６０℃で硬化される。
【００５８】
別の実施形態では、石灰化組織代替物は、約９９％、約９８％、約９７％、約９６％、約９５％、約９４％、約９３％、約９２％、約９１％、約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、又は約５０％の湿度で硬化する。別の実施形態では、石灰化組織代替物は、上記の温度と湿度の任意の組み合わせで硬化する。
【００５９】
一実施形態では、石灰化組織代替物のピーク負荷は約４５Ｎを超える。別の実施形態では、石灰化組織代替物のピーク負荷は、約５０Ｎ超、約１００Ｎ超、約１５０Ｎ超、約２００Ｎ超、約２５０Ｎ超、約３００Ｎ超、約３５０Ｎ超、約４００Ｎ超、約４５０Ｎ超、約５００Ｎ超、約５５０Ｎ超、約６００Ｎ超、約６５０Ｎ超、約７００Ｎ超、約７５０Ｎ超、約８００Ｎ超、約８５０Ｎ超、約９００Ｎ超、約９５０Ｎ超、又は約１０００Ｎ超である。
【００６０】
一実施形態では、石灰化組織代替物は、約２．３ＭＰａより大きい圧縮強度を有する。別の実施形態では、石灰化組織代替物の圧縮強度は、約２．５ＭＰａ超、約３ＭＰａ超、約３．５ＭＰａ超、約４ＭＰａ超、約４．５ＭＰａ超、約５ＭＰａ超、約５．５ＭＰａ超、約６ＭＰａ超、約６．５ＭＰａ超、約７ＭＰａ超、約７．５ＭＰａ超、約８ＭＰａ超、約８．５ＭＰａ超、約９ＭＰａ超、約９．５ ＭＰａ超、約１０ＭＰａ超、約１０．５ＭＰａ超、約１１ＭＰａ超、約１１．５ＭＰａ超、又は約１２ＭＰａ超である。
【００６１】
上記のように、増大された機械的強度、例えばピーク負荷は、ある程度の改善され、延長された骨伝導を反映する。
【００６２】
一実施形態では、石灰化組織代替物は移植可能又は注射可能である。
【００６３】
一実施形態では、石灰化組織代替物は、３０分〜９０分の初期硬化時間（Ｔｉ）を有する。別の実施形態では、Ｔｉは約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、又は約９０分である。
【００６４】
一実施形態では、石灰化組織代替物は、６０分から１２０分の最終硬化時間（Ｔｆ）を有する。別の実施形態では、Ｔｆは約６０分、約６５分、約７０分、約７５分、約８０分、約８５分、約９０分、約９５分、約１００分、約１０５分、約１１０分、約１１５分、又は約１２０分である。
【００６５】
移植可能な石灰化組織代替物は、移植の前又は後に凝固又は硬化され得る。対照的に、注入可能な石灰化組織代替物は、注入後に凝固又は硬化され得る。
【００６６】
石灰化組織代替物の注入は、第５の態様の送達装置により促進される。送達装置は、修復時まで、しばしば手術時まで、石灰化組織代替物の凝固又は硬を遅らせる手段を提供する。凝固又は硬の遅延は、装置の別々のチャンバ内の粉砕したブルシャイトと粉砕した真珠層を提供することにより達成され、装置の作動により、粉砕したブルシャイトと粉砕した真珠層が反応する。
【００６７】
一実施形態では、第５の態様の送達装置の第１のチャンバ及び／又は第２のチャンバは、リン酸水素二ナトリウム溶液をさらに含む。別の実施形態では、送達装置は、リン酸水素二ナトリウム溶液を含む第３のチャンバを含む。
【００６８】
一実施形態では、送達装置からの送達は、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトを混合することを含む。
【００６９】
一実施形態では、送達装置は注射器である。
【００７０】
ここで使用される「反応近接」とは、粉砕された真珠層が粉砕されたブルシャイトと反応するのに十分な空間的関係を指し、粉砕された真珠層と粉砕されたブルシャイトとの混合を伴う場合がある。
【００７１】
石灰化組織代替物は、対象の石灰化組織の修復に使用するためのものである。
【００７２】
本明細書で使用される「対象」は、ヒト又は非ヒト動物、例えば家畜動物、動物園動物、又は愛玩動物であり得る。一実施形態では、対象は哺乳動物である。哺乳動物は有蹄動物であってもよく、及び／又は、例えば、ウマ、ウシ、シカ、ヒツジ、イヌ、又はネコであってもよい。一実施形態では、対象は霊長類である。一実施形態では、対象はヒトである。従って、本発明は、人間の医学的用途に加えて、馬、牛、羊などの家畜、及び犬や猫などの愛玩動物の治療を含む獣医学及び動物飼育の用途も有する。
【００７３】
治療有効量の石灰化組織代替物を対象に投与する正確な方法は、必要な修復に関して医療従事者の裁量であることが当業者に認識されるであろう。他の薬剤との組み合わせ、投与のタイミングなどを含む投与様式及びその類は、被験者の状態及び病歴と同様に、治療に対する被験者のあり得る反応性によって影響を受ける可能性がある。
【００７４】
石灰化組織代替物は、Good Medical Practiceに一致して製造及び投与される。この文脈で考慮すべき要因は、修復される特定の石灰化組織、石灰化組織が修復される特定の対象、対象の治療状態、投与部位、投与方法、投与のスケジュール、可能性のある副作用、及び、施術者に知られているその他の要因を含む。投与される石灰化組織代替物の治療的有効量は、このような考慮事項によって管理される。
【００７５】
「治療有効量」という用語は、対象の石灰化組織を修復するのに有効な石灰化組織代替物の量を指す。
【００７６】
この明細書における記載及びクレーム全体を通して、「含む」という単語、及び「含んでいる」及び「含まれた」のようにその単語の派生形は、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の添加物、成分の整数又はステップを除外することを意図していない。
以下の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。
【実施例】
【００７７】
−例１−
本発明は、真珠層粒子との多くの化学反応に関する。
【００７８】
１）真珠層が選択され、粉末状に粉砕される（粉砕層）。次いで、粉末を、５０から４００μｍまでの異なる孔径を有する選択的メッシュでふるい分けした。
【００７９】
２）粒径５０〜１００μｍの選択された真珠層粒子を、室温で３０分間、４：１０の比率でリン酸一カルシウムと混合した。
【００８０】
３）真珠層粒子を蒸留水中でリン酸一カルシウムと反応させ、室温でブルシャイト結晶とＣＯ２を形成させた。反応は数分で起った。結晶を室温で３日間風乾するか、２〜３時間凍結乾燥した。
【００８１】
４）ブルシャイト結晶は、１０〜１００μｍの粒径の粉末に粉砕された（粉砕ブルシャイト）。
【００８２】
５）結晶ブルシャイト粉末は、リン酸水素二ナトリウム溶液（ｐＨ８．２〜９．５）中に、室温で４：１０の比率で粒径５０〜４００μｍの真珠層粒子と混合された。この反応は、３７℃、湿度１００％で９０分で混合物を硬化させた。
【００８３】
６）合成ヘクトライト（ラポナイト）又はアルファ硫酸カルシウムを含む添加剤は、注射又は埋め込みデバイスとしてのさまざまな用途の硬化時間を制御するために追加され得る。
【００８４】
７）硬化後、真珠層の表面にヒドロキシアパタイトが見られた。
ステップ（２）と（３）の化学反応は次のとおり。
【００８５】
CaCO3 + Ca（H2P04）2・H2O + 2H2O → 2CaHPO4・2H2O + CO2
ステップ（５）の化学反応である：
5.2CaHPO4・2H2O + 3.6CaCO3 → Ca8.8（HPO4）0.7（PO4）4.5（CO3）0.7（OH）1.3 + 2.9CO2 + 12H2O
例１の方法の概要を図１に示す。
【００８６】
−例２−
１．実験手順
真珠層が選択され、粉末状に粉砕された。次いで、粉末は、孔径が２００μｍ未満の選択的メッシュでふるい分けされた。真珠層粒子をリン酸一カルシウムと４：１０の比率で混合し、混合物を室温で蒸留水と反応させて、ブルシャイト結晶とＣＯ２を形成させた。ブルシャイト結晶を３７℃で乾燥させた後、粉砕した。例1の場合、化学反応は次のとおり。
【００８７】
CaCO3 + Ca（H2PO4）2・H20 + 2H20 → 2CaHP04・2Η2O + C02
真珠層粒子は、５つの異なる比率（Ａ ６：９：５、Ｂ ７：８：５、Ｃ ８：７：５、Ｄ ９：６：５、Ｅ １０：５：５）でブルシャイト粒子とリン酸四カルシウムと混合された。５つの比率は、それぞれ３０％の真珠層、３５％の真珠層、４０％の真珠層、４５％の真珠層、５０％の真珠層に相当する。混合物を、４％リン酸水素二ナトリウム溶液（ｐＨ９．２５）で、室温で、液体／粉末（ｍＬ／ｇ）比１：３で反応させた。混合ペーストは、湿度１００％、３７℃で硬化した。化学反応は次のとおり。
【００８８】
2CaHPO4 + 2Ca4（PO4）2O → Ca10（PO4）6（OH）2
5.2CaHPO4・2H2O + 3.6CaCO3 → Ca8.8（HPO4）0.7（PO4）4.5（CO3）0.7（OH）1.3 + 2.9CO2 + 12H2O
２．物理的特性
ｉ．Ｘ線開設（ＸＲＤ）
Ａ〜Ｅの5つの石灰化組織代替物をＸ線回折装置（XRD、PANanalytical X 'Pert PRO、オランダ）で分析した。各石灰化組織代替物のサンプルは、回折角（2θ）の１０°から９０°の範囲でステップサイズ０．００７０°のステップスキャン法を使用してスキャンされ、回折計は４０ｋＶ及び４０ｍＡで動作された。
【００８９】
ＸＲＤの結果（表２）は、真珠層オルトリン酸カルシウム粒子、すなわち石灰化組織代替物の無機化学組成を示す。
【００９０】
【表２】
2020521597.tif 000004
【００９１】
ＸＲＤデータは、石灰化組織代替物Ｅでは、真珠層の割合が最も高く、従って生物活性成分の割合が最も高く、それゆえ骨誘導性が最も高いことを示している。石灰化組織代替物Ａでは、真珠層の割合が最も低く、アパタイトの割合が最も高かった。その結果、石灰化組織代替物Ａの吸収速度は最も遅いため、より長い時間機械的サポートを提供し、大きな石灰化組織欠損に有益である。
【００９２】
ｉｉ．圧縮試験
機械的特性評価（表３、図２）は、湿度１００％、３７℃で３日間保持された円筒状試験片（直径１０ｍｍx高さ２０ｍｍ）で実行され、即座にクロスヘッド速度０．１ｍｍ.ｍｉｎ-１で１ｋＮのロードセルを装備したインストロン試験機を使用して、圧縮試験に供された。この試験では、市販の円筒形多孔質骨代替材料（SKELITETM）がコントロール（直径５ ｍｍｘ高さ５ｍｍ）として使用された。
【００９３】
圧縮強度は、次の数１に従って計算される。
【００９４】
【数１】
2020521597.tif 000005
【００９５】
σは、圧縮強度である。
【００９６】
Ｆは、圧縮下で対象にかかる力である。
【００９７】
Ａは、力が適用される実際の断面積である。
【００９８】
ここで、
【００９９】
【数２】
2020521597.tif 000006
【０１００】
Ａ０は、対象の元の試験片領域だる。
【０１０１】
ΔLは、対象の長さが変化する量である。
【０１０２】
Ｌ０は、対象の元の長さである。
【０１０３】
【表３】
2020521597.tif 000007
【０１０４】
真珠層オルトリン酸塩粒子、すなわち石灰化組織代替物の圧縮強度は、市販製品の圧縮強度の２〜３倍である。従って、石灰化組織代替物は、石灰化組織欠損において、より強力な機械的サポートを提供する。
【０１０５】
ｉｉｉ．走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）
後方散乱電子（ＢＳＥ）及び二次電子（ＳＥ）モードの走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して、５つの石灰化組織代替物の微細構造と形態を分析した。
【０１０６】
図３及び４のＳＥＭ顕微鏡写真は、真珠層オルトリン酸塩粒子、すなわち石灰化組織代替物の表面形態をはっきりと示し、オルトリン酸カルシウムに囲まれた真珠層粒子、及びオルトリン酸カルシウムに被覆された真珠層粒子を示し、骨誘導性を高める生理活性組成物を供給する未反応の真珠層と、体内への移植後数週間で孔形成可能な早い吸収速度を有する露出した真珠層を示す。孔は、新しい石灰化組織の形成を初期段階で促進し、つまりオルトリン酸カルシウムは機械的サポートを提供するが、後の段階で石灰化組織に置き換えられる。
【０１０７】
ｉｖ．硬化時間
初期及び最終の硬化時間（表４及び５）は、Ｖｉｃａｔ針による水硬性セメントペーストが硬化する時間の標準的な試験方法であるＶｉｃａｔ法によって決定された。初期硬化時間は、反応開始から針のめり込みが２５ｍｍになるまでの時間として計算される。最終硬化時間は、針が試験材料にめり込まなくなるときの経過時間として計算される。測定値を３回収集し、平均値＋ＳＤで表した（ｎ＝５）。
【０１０８】
【表４】
2020521597.tif 000008
【０１０９】
【表５】
2020521597.tif 000009
【０１１０】
表４及び表５は、原料としてより微細な粒子を使用して製造された石灰化組織代替物の硬化時間は、より粗い粒子の使用よりも速いことを示している。従って、石灰化組織代替物の硬化時間には粒径が重要である。
【０１１１】
３．生体外試験
石灰化組織代替物の細胞適合性を調べるために、ＨｅＬａ、ＭＬ０−Ｙ４、及びＭＣ３Ｔ３細胞株を石灰化組織代替物で培養した（図５〜８）。細胞接着はレーザー共焦点走査顕微鏡により観察された。細胞増殖は、コントロールとしてヒドロキシアパタイトを使用した比色ＭＴＳ法により試験された。
【０１１２】
ｖ．レーザー走査型共焦点顕微鏡-細胞接着と細胞適合性
ａ．ＨｅＬａ細胞株（２４時間）
図５に示すＨｅＬａ細胞培養は、真珠層オルトリン酸塩粒子、すなわち石灰化組織の良好な細胞接着と細胞適合性を示した。
【０１１３】
ｂ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞株（７２時間）
ＭＬＯ−Ｙ４は、骨細胞様細胞株である。ＭＬＯ−Ｙ４細胞は、例２に従って調製された石灰化組織代替物Ａ上で、真珠層粒子、ブルシャイト粒子及びリン酸四カルシウムを６：９：５の比率で使用して７２時間培養した。細胞膜中のＦ−アクチンは、蛍光ファロイジン（赤）で標識された。レーザー共焦点走査顕微鏡は、石灰化組織代替物（ターコイズ）への細胞接着、及び石灰化組織代替物への進入する３Ｄ構造を示した。図６及び図７は、石灰化組織代替物への接着（図６）、樹状突起の成長（図６Ｂ）、及び樹状突起結合の生成（図７）を示している。
【０１１４】
ｃ．ＭＣ３Ｔ３細胞株（最大７２時間）
ＭＣ３Ｔ３は骨芽細胞前駆細胞株であり、培養７２時間までの細胞増殖アッセイに使用された。細胞増殖アッセイの結果を図８に示す。ネガティブコントロールは細胞を含まない試薬の吸光度であり、ポジティブコントロールは一般的な骨代替物であるヒドロキシアパタイト（Sigma-Aldrich）で培養したＭＣ３Ｔ３細胞である。図８に示すように、細胞がオルトリン酸カルシウム塩粒子、すなわち石灰化組織代替物上で培養されたとき、ヒドロキシアパタイトと比較して細胞増殖はより速かった。細胞骨形成分化の結果を図９に示す。これは、真珠層オルトリン酸カルシウム複合体に対するＡＬＰ活性がヒドロキシアパタイトよりも有意に高かったことを示す。この結果は、ヒドロキシアパタイトと比較して、オルトリン酸カルシウム材料が骨芽細胞に対してより強い骨誘導性を提供することを示した。
【０１１５】
４．動物試験
石灰化組織代替物の生分解効率を調査するために、円筒状の石灰化組織代替物をウサギの背中の表在筋膜下に移植した。そして、石灰化組織代替物の生体適合性と骨誘導性を調べるために、石灰化組織代替物をウサギ大腿骨の遠位骨幹端領域の人工の骨欠損部位に移植した。例２に従って調製した石灰化組織代替物Ｃを動物実験で使用し、ヒドロキシアパタイトをコントロールとして使用した。
【０１１６】
体重２．８＋０．３ｋｇの骨格的に成熟したニュージーランド白ウサギを動物実験で使用した。実験を開始する前に、動物を1週間順化させた。それらは、食物と水と共に、ケージごとに１匹ずつ滑らかな壁のステンレス製ケージに別々に保管され、National Health and Medical Research Council（NHMRC）の動物管理ガイドラインに従って取り扱われた。罹患率、瀕死、及び一般的な健康の観察（ケージ側）を１日１回行った。
【０１１７】
ｖｉ．生分解効率
ニュージーランドシロウサギを、アミロバルビトン（０．０３ ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈内注射により麻酔した。円筒形の材料（直径１０ｍｍ、高さ５ｍｍ、４つの真珠層リン酸カルシウム材料と４つのヒドロキシアパタイト材料）を、背側正中線アプローチ（左の真珠層カルシウムオルトリン酸塩材料、右のヒドロキシアパタイト材料）を介して動物の両側傍脊椎表層筋膜の下に移植した。各材料の1つを４つの異なる時点（３週間、６週間、９週間、又は１２週間）で取り出し、重量を測定し、それぞれの重量損失の割合を計算した。テストは3回実行され、各時間経過における減量率の平均±ＳＤを計算した。図１０Ａは、生分解速度を示す折れ線グラフであり、図１０Ｂは、経時的な分解された材料の形態を示す写真を含む。図１０Ａの折れ線グラフは、真珠層カルシウムオルトリン酸塩材料の生分解速度がヒドロキシアパタイトよりも大幅に速いことを示している。しかし、図１０Ｂに示すように、真珠層オルトリン酸カルシウム真珠層材料に対して、材料の侵食された表面が観察されたが、円筒形状は維持された。これは、石灰化組織代替物の生分解が、最も一般的に使用されている骨代替生体材料であるヒドロキシアパタイトよりも速いことを示している。そして、生物分解速度は、身体的支持が崩壊することなく、段階的で緩やかだった。
【０１１８】
ｖｉｉ．生体適合性と骨誘導性
ニュージーランドシロウサギを、アミロバルビトン（０．０３ ｍｇ／ｋｇ体重）の静脈内注射により麻酔した。動物を手術台の上に仰向けに置き、無菌状態で実験用膝（右）の毛を剃り、準備し、覆った。右大腿骨の骨幹端領域には、縦方向の内側傍膝蓋骨切開が入り、大腿骨の皮質骨を露出させるために膝蓋骨を横方向に脱臼させた。大腿骨の線骨端から２．５ｍｍ離れて、直径５ｍｍ、深さ５ｍｍの円形の欠損を、ステンレス鋼の歯科用ドリルで作成した。次に、表５に従って、異なる石灰化組織代替物（Nacre-Orthophosphate）又はコントロール材料（hydroxyapatite）を異なる骨欠損部位に移植した。切開は層ごとに閉じた。各ウサギには、１つの大腿骨のみが手術され、３３匹のウサギに合計３３個の欠陥が形成された（図１１）。術後、動物モデルは手術対照群のＸ線及びマイクロＣＴによって確認された（図１２）。その後、ウサギはケージに戻され、自由に歩き回ることができた。手術後の最初の３日間、セファゾリン（２００ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射により各ウサギに抗感染症治療が行われた。
【０１１９】
４週間及び８週間後、すべてのウサギを屠殺し、右大腿骨を回収し、軟部組織を除去した（図１３）。次に、Ｍｉｃｒｏ−ＣＴスキャンとアッセイを行う前に、サンプルをエタノール／水の体積分率でエタノール勾配で脱水した。
【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
回収された大腿骨をスキャンし、マイクロＣＴを使用して高解像度で再構築し、骨／移植の界面を観察した（図１４ａのＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、図１４ｂのＥ、Ｆ）。試験片を、すべての３次元で１０．５μｍの等方性解像度で７０ｋｅＶ及び１４５μＡでμＣＴ（Skyscanll72、Bruker、ドイツ）でスキャンした。大腿骨全体をスキャンした。各スキャンについて、大腿骨遠位でスキャンを実行し、０．５ｍｍ近位で継続した。選択した領域の総体積は一定であった（４８ｍｍ３）。３Ｄ画像に適用されたグレーの閾値を使用して、新しく形成された骨組織（閾値６０）を残留物（閾値１１０）から分離した。欠陥部位で新しく形成された骨組織の体積は、閾値１１０から閾値６０を引くことにより計算された。新しい骨組織の体積割合は、選択された体積の割合として表された。分解率は、さまざまな注入時間での材料の体積分率の差を計算することによって決定された。サンプルごとに３回繰り返した。その後、骨量／総量（ＢＶ／ＴＶ）、骨表面／骨量（ＢＳ／ＢＶ）、皮質厚（Ｃｔ．Ｔｈ）、フラクタル次元（ＦＤ）及び多孔率（ＰｏＶ／ＴＶ％）の値が計算された（図１５、１６、１７）。
【０１２２】
回収したサンプルの肉眼による観察（図１３）、及びＭｉｃｒｏ−ＣＴの画像（図１４ａのＡ及びＤ）から、骨欠損部位からの炎症性滲出、骨溶解、骨破壊などの炎症、感染又は拒絶の兆候はなかった。動物の一般的な健康観察から、ウサギは手術後は一般に健康であり、明らかな感染性及びアレルギーの兆候は検出されなかった。従って、この試験は、真珠層オルトリン酸カルシウム材料が安全で生体適合性のある移植片であることを示した。
【０１２３】
４週間後と８週間後のＭｉｃｒｏ−ＣＴの画像から、周囲の骨組織がオルトリン酸カルシウム材料にしっかりと接続されており、良好な材料の骨統合（図１４ａのＡ及びＤ）を示した。ブランク対照群（図１４ａのＣ及び図１４ｂのＦ）と比較して、移植された真珠層オルトリン酸カルシウムとヒドロキシアパタイトの両方が骨欠損の回復を促進した。しかし、８週間後、オルトリン酸カルシウムを移植した群は、ヒドロキシアパタイトを移植した群（図１４ａのＤ及び図１４ｂのＥ）よりも骨欠損側の皮質骨の良好な連続性を示し、より優れた骨治癒特性を示した。さらに重要なことは、真珠層オルトリン酸カルシウムを移植した群の皮質骨の厚さは、ヒドロキシアパタイトを移植した群よりも明らかに厚く、強い骨膜反応を示した。正確には、石灰化組織代替物によって刺激される強力な骨芽細胞活性を示した。
【０１２４】
Ｍｉｃｒｏ−ＣＴデータ分析の結果に示されているように（図１５、１６、１７）、オルトリン酸カルシウム移植群のＢＶ/ＴＶ及びＢＳ/ＢＶは、ヒドロキシアパタイト移植群よりも統計的に高かった。さらに、４週間で、真珠層オルトリン酸カルシウム移植群の骨欠損部位の空隙率は、ヒドロキシアパタイト移植群よりも低かった。結果は、真珠層オルトリン酸カルシウムを移植した群で、より多くの新しい骨が形成されたことを示す。これは、真珠層オルトリン酸カルシウム材料の骨誘導性によって説明できる。
【０１２５】
要約すると、前臨床試験の重要な部分として、動物の試験は、ヒドロキシアパタイトなどの従来のリン酸カルシウム材料と比較して、オルトリン酸カルシウム材料が、その迅速な生分解速度、良好な生体適合性、及び骨誘導性により、より良い骨代替物であることを確認した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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