(57)【要約】本開示は、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼが人工エネルギー再生を提供するために反応に加えられない、色素体、ミトコンドリアおよび／または葉緑体を含有する細胞溶解物を利用した反応における生物学的マクロ分子のインビトロ合成のためのシステム、方法およびキットに関する。【選択図】図１Ａ
2020507322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオポリマーの合成のためのシステムであって、前記システムが、
色素体、葉緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアを含む水性細胞溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、前記システムが、前記細胞溶解物、色素体、葉緑体、ミトコンドリア、または葉緑体およびミトコンドリアに対して外因性である加えられたクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、システム。
【請求項２】
ｐＨ緩衝剤、
マグネシウム、好ましくはＭｇ（Ｃ５Ｈ８ＮＯ４）２、
カリウム、好ましくはＫＣ５Ｈ８ＮＯ４、
ヌクレオシド三リン酸、
酵素、好ましくはＲＮＡポリメラーゼ、および
クロラムフェニコール、のうちの少なくとも一つをさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
ミトコンドリアを含む植物細胞由来の水性細胞溶解物、ＤＮＡ鋳型、ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．８、Ｍｇ（Ｃ５Ｈ８ＮＯ４）２、ＫＣ５Ｈ８ＮＯ４、ヌクレオシド三リン酸、ＲＮＡポリメラーゼ、およびクロラムフェニコールから本質的になる、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
少なくとも一つのバイオポリマーの合成方法であって、前記方法が、反応体積中で反応成分を合わせることを含み、前記反応成分が、
色素体、葉緑体および／またはミトコンドリアを含む細胞溶解物、
ポリマー鋳型、および
前記ポリマーのモノマー単位、を含み、
前記反応成分がクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない、方法。
【請求項５】
以下の条件：
前記方法によって製造されるバイオポリマーがポリペプチドである、
前記方法が、ＲＮＡおよび前記ＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの連結された合成のためのものである、
前記細胞溶解物が真核細胞溶解物である、
前記細胞溶解物がミトコンドリアを含む、
前記色素体、葉緑体、および／またはミトコンドリアが、前記細胞溶解物に対して外因性である、
前記反応成分がクレアチンキナーゼを含まない、
前記ポリマー鋳型がＲＮＡ分子である、
前記ポリマー鋳型がＤＮＡ分子である、
前記ポリマーの前記モノマー単位がヌクレオチドである、
前記ポリマーの前記モノマー単位が、前記細胞溶解物中に含まれるアミノ酸である、および
前記反応が、電子伝達系を阻害することまたは前記反応から酸素を除去することによって停止させられる、のいずれかの組み合わせが満足される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
バイオポリマーの合成が２０時間を超えて、好ましくは約４０時間にわたり起こる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
キットであって、
一つ以上の別個の体積に配置された、水性細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび／または葉緑体、およびポリマーのモノマー単位、ならびに
キットの成分およびクレアチンリン酸を含まない任意の追加の成分の混合を指定する説明書  を含む、キット。
【請求項８】
前記色素体、ミトコンドリアおよび／または葉緑体を含む前記細胞溶解物が一つの体積中に配置されており、かつ、前記ポリマーの前記モノマー単位が別個の体積中に配置されている、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記説明書が、前記細胞溶解物、色素体、ミトコンドリアおよび／または葉緑体、ならびに前記ポリマーのモノマー単位を、クレアチンリン酸を含まない反応体積中でポリマー鋳型と合わせるようにユーザーに指示する、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
ポリマー鋳型をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４５７，０７３号の優先権の利益を主張するものであり、その開示内容はこの参照によりその全体で本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、バイオポリマーのインビトロ製造に関する。一部の実施形態は、無真核細胞システム中の例えばポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／または多糖の製造に関する。特定の実施形態は、細胞小器官（例えば、色素体、ミトコンドリアまたはクロロプラスト）を利用して無細胞システムにおけるバイオポリマーの継続的製造のためのエネルギーを提供することで、システム内のある特定の望ましくないエネルギー貯蔵分子、例えばクレアチンリン酸の必要性がなくなる。
【背景技術】
【０００３】
新しい治療タンパク質、技術酵素、タンパク質エンジニアリング、および機能ゲノミクスの需要増加は、迅速かつ効率的なタンパク質製造およびスクリーニングプラットフォームを必要とする。Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．７（１）：２１−３９；Ｓｗａｒｔｚ（２０１２）Ａｉｃｈｅ  Ｊ．５８（１）：５−１３。無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）の新たな技術は、この需要を満たすのに役立ち得る。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．３０（５）：１１８５−９４。細胞系発現と比較して、ＣＦＰＳは、短いプロセス時間ならびに反応条件の直接的制御および監視などの利点を提供する。Ｓｗａｒｔｚ（２０１２）、上記．労力を要するクローニングおよび形質転換ステップのない複数のタンパク質の同時発現のために、ＰＣＲ産物を直接使用することができる。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．４６（１８）：３３５６−８；Ｙａｂｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ８（４）：１７３−９１；Ｇａｎ  ＆  Ｊｅｗｅｔｔ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．９（５）：６４１−５１。ＣＦＰＳプラットフォームにより、タンパク質の折り畳みを促進するアクセサリー因子の追加（Ｏｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．ＮＭＲ  ３２（３）：２３５−４１；Ｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３３（３）：１９９−２０９；Ｍａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｌｔｄ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７（２）：９３−１００）、または非天然アミノ酸の組み込み（Ａｌｂａｙｒａｋ  ＆  Ｓｗａｒｔｚ（２０１３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４１（１１）：５９４９−６３）；Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６０：７０−４）が可能となる。また、生細胞で製造できない細胞毒性タンパク質の発現を促進する。Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２７（１）：５３−６２；Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ８（１９）：３９３３−４６；Ｘｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６８（１）：２２−７。
【０００４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）無細胞溶解物は広く使用されており、その低コスト、スケーラビリティ、高生産性のため有利である。Ｚａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０８（７）：１５７０−８；Ｃａｓｃｈｅｒａ  ＆  Ｎｏｉｒｅａｕｘ（２０１４）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ９９：１６２−８．しかしながら、溶解物は細菌から生じるため、非効率的な酸化的折り畳みにより、またシャペロンおよびグリコシル化機構の欠如により、複数のサブドメインを有する複合タンパク質の製造には不適切である。無真核細胞システムは、かかるタンパク質の発現のためにより適しており、翻訳後修飾のほとんどの形態をサポートする。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５３（２）：３９７−４０９；Ｚｈａｎｇ  ＆  Ｋａｕｆｍａｎ（２００６）Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１７２）：６９−９１。最も頻繁に使用されるシステムは、小麦胚芽抽出物（ＷＧＥ）、昆虫細胞抽出物（ＩＣＥ）、およびウサギ網赤血球溶解物（ＲＬＬ）に基づく。しかし、これらのシステムは高価であり、抽出物調製は複雑である。Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２），上記。これにより、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔａｒｅｎｔｏｌａｅ（Ｍｕｒｅｅｖ  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２７（８）：７４７−５２）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｂｒｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１（１）：２５−３６）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｈｏｄｇｍａｎ＆Ｊｅｗｅｔｔ（２０１３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１０（１０）：２６４３−５４；Ｇａｎ  ＆  Ｊｅｗｅｔｔ（２０１４）、上記）に基づくものなどのさらなる真核ＣＦＰＳの需要が生じた。
【０００５】
無細胞システムを使用するインビトロタンパク質合成は、例えば、そのようなシステムの特徴である短い反応時間および低タンパク質製造量によって制限されてきた。これらの性質は、不良なタンパク質収量および製造されたタンパク質の単位当たりの過剰コストにつながる。
【０００６】
連続流れシステムを使用して、連続的な翻訳反応の使用を通してより長い反応時間が得られ得る。Ｓｐｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１１６２−１１６４。連続的な反応は、何十時間（または何百時間もの）以上にわたって実施され、連続流れに依存する方法は、必要な反応基質をチャンバーに絶えず供給する必要がある。したがって、これらの反応は、かなりの時間およびリソースの投資を必要とする。さらに、「連続的な」システムでの翻訳は、大量のタンパク質を製造する方向に向けられ、システムは、静的（「バッチ」）インビトロ翻訳反応を実施するために使用されるものと実質的に異なる。静的反応は、小さな反応容量（例えばマイクロリットル）で実行することができ、分取量（例えばミリグラム）のタンパク質を製造する方向には向けられない。こうしたバッチ反応は、１〜２時間で完了し得る。前述の全ての理由から、対応するバッチシステムと比較して反応期間およびタンパク質収量を増加させる一方で、連続反応システムはより高価な試薬を必要とする。
【０００７】
開示
本明細書に開示される一般的な戦略は、無細胞溶解物系反応において細胞小器官を利用して、反応システム内のエネルギー再生を提供する。この戦略は、一部の例では、バイオポリマー（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、および複合炭水化物）の改善されたインビトロ合成を達成するために有用である。特定の実施形態では、無真核細胞システムにおけるミトコンドリアの存在は、従来のバッチ式および連続反応に対する改善された反応システムをもたらし、これは例えば、エネルギー送達試薬（例えば、クレアチンリン酸および／またはクレアチンキナーゼ）の添加、および／またはアミノ酸補充の必要性を著しく低減または除去する一方、反応期間を長くすることによる。一部の例では、開示された無細胞重合反応は、当該技術分野で現在利用されている従来的反応よりも著しく効率的である。
【０００８】
反応体積中で細胞小器官（例えば、色素体、葉緑体および／またはミトコンドリア）を含む細胞溶解物、ポリマー鋳型およびポリマーのモノマー単位を合わせることを含む、バイオポリマーの合成方法が本明細書に記載される。一部の実施形態では、反応体積は、例えば、クレアチンリン酸／クレアチンキナーゼエネルギー再生システムを含まず、それにより、反応体積にリン酸塩が加えられないか、または最小のリン酸塩が加えられるようになる。特定の実施形態では、細胞小器官はミトコンドリアである。一部の実施形態では、細胞溶解物は、真核細胞溶解物；例えば、植物（例えば、タバコ、トウモロコシおよびダイズ）細胞由来の溶解物である。一部の例における細胞溶解物は、Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２（ＢＹ−２）タバコ細胞由来の溶解物である。一部の実施形態では、ポリマー鋳型はＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。ポリマー鋳型としてＲＮＡを利用する反応は、翻訳反応を通してモノマーアミノ酸からバイオポリマーとしてポリペプチドを製造する。ポリマー鋳型としてＤＮＡを利用する反応を利用して、インビトロ複製または転写反応を通してモノマーヌクレオチドからバイオポリマーとしてさらなる核酸分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を製造してもよく、または鋳型からの転写に連結させた翻訳反応を通してポリペプチドを製造してもよい。ある特定の実施形態では、バイオポリマーのエネルギーフリー合成の方法は、例えば、限定されないが、細胞小器官、ポリマー鋳型および／またはモノマー単位を反応体積に加えること、および／または反応体積からバイオポリマーを単離することを含み得る。一部の例では、溶解物の成分が、ＴＣＡサイクルからの中間体で始まる内因性生合成経路を用いてアミノ酸を生成できるので、反応体積は、タンパク質の発現をサポートするためのアミノ酸補充を必要としない。したがって、一部のこうした例では、細胞小器官を含む溶解物中に存在するアミノ酸は、ポリペプチドの持続した合成をサポートするのに十分であり得る。
【０００９】
開示された細胞溶解物システムは、エネルギー再生システムに不適当と考えられる量で反応体積が外因性クレアチンリン酸および／またはクレアチンキナーゼを含む限り、最小量の外因性クレアチンリン酸、最小量のクレアチンキナーゼまたはその両方を補充されてもよい。例えば、反応体積は、１５ｍＭ以下、１０ｍＭ以下、５ｍＭ以下、１ｍＭ以下、５００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、または１０μＭ以下の添加されたクレアチンリン酸を含有し得る。別の例では、反応体積は、１００μｇ／ｍＬ以下、５０μｇ／ｍＬ以下、１０μｇ／ｍＬ以下、５μｇ／ｍＬ以下、１μｇ／ｍＬ以下、０．５μｇ／ｍＬ以下、または０．１μｇ／ｍＬ以下の添加されたクレアチンキナーゼを含有し得る。これらの量は、バイオポリマー合成を維持するため（本明細書に開示される長期の期間にわたりバイオポリマー合成を維持するためなど）に適しておらず、したがって、本明細書に開示される方法およびシステムに従い、色素体、ミトコンドリア、または葉緑体などの細胞小器官を含めることを必要とする。
【００１０】
一部の実施形態は、人工エネルギー再生システムを使用することなく、バイオポリマーを合成するためのシステムを含む。これらの実施形態では、システムは、水性細胞溶解物、（内因性または外因性の）細胞小器官、ポリマー鋳型を含む。特定の実施形態では、システムはポリマーのモノマー単位も含む。インビトロバイオポリマー合成のための従来の無細胞システムはさらに、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含み、これは合成反応が進行するにつれてシステム内のエネルギー再生に使用される。本明細書の実施形態では、システムはクレアチンリン酸を実質的に欠いており、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼがシステムに添加されない。ある特定の例では、システムはクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼのいずれも含まない。特定の実施形態では、バイオポリマーの合成のためのシステムは、例えば、限定されないが、ｐＨ緩衝剤、マグネシウム（例えば、Ｍｇ（Ｃ５Ｈ８ＮＯ４）２）、カリウム（例えば、ＫＣ５Ｈ８ＮＯ４）、ヌクレオシド（例えば、ヌクレオチド三リン酸、ヌクレオシド二リン酸、およびヌクレオチド一リン酸）、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、およびクロラムフェニコールをさらに含んでもよい。特定の実施形態では、グルタミン酸塩以外のアミノ酸はシステムに既に存在するもの（すなわち、溶解物中および細胞小器官中に存在するアミノ酸）に追加されない。一部の例では、前述のシステムは、２０時間を超える長期（例えば、約４０時間）の活性を示してもよく、加えられるクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含む以外は同一の従来のシステムより有意に多くの（例えば、約６０％多くの）標的タンパク質を製造してもよい。
【００１１】
一部の実施形態は、人工エネルギー再生システムを使用することなくバイオポリマーを合成するためのキットを含む。一部の実施形態では、キットは、人工エネルギー再生システムを使用することなくバイオポリマーを合成するためのシステムの成分、およびキットの使用を指示するための書面説明書を含む。例えば、限定されないが、キットは、一つ以上の別々の体積中に配置された、水性細胞溶解物、（内因性または外因性の）細胞小器官、ポリマー鋳型、およびポリマーのモノマー単位のうちの一つ以上と共に、キットの成分の混合を指定する説明書ならびにクレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない任意の外因性成分を含んでもよい。さらなる例として、キットは、ｐＨ緩衝剤、マグネシウム、カリウム、ヌクレオシド、酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、およびクロラムフェニコールのうちの一つ以上をさらに含んでもよい。特定の実施形態によるバイオポリマーの合成のためのキットは、水性細胞溶解物（例えば、葉緑体および／またはミトコンドリアを含む）、ポリマーのモノマー単位（例えば、ヌクレオシド）、および書面説明書を含んでもよい。こうした特定の実施形態では、書面説明書は、ユーザーが、組み合わせにクレアチンリン酸（エネルギー再生のためのクレアチンキナーゼと共に）を加えることなく、これらの成分を目的のポリマー鋳型（例えば、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子）および任意の他の試薬に合わせることを指示するものであってもよい。
【００１２】
本明細書の実施形態は、進行中の合成反応におけるエネルギー再生のために活性ミトコンドリアを組み込み、それによって、インビトロ合成の状況内でミトコンドリア機能に影響する化合物またはタンパク質を定量的に調べるために利用され得る。さらに、ＴＣＡサイクルの中間体は、アミノ酸の補充が長期のポリペプチド合成に必要ないように、アミノ酸を産生するために合成反応の間に利用され得る。一部の実施形態では、本明細書の方法、システム、およびキットで使用するための細胞溶解物は、合成反応の酸素依存性を減少させる葉緑体を含む。例えば、細胞溶解物は、色素体、葉緑体および／またはミトコンドリアが溶解物中に保持されるように、光合成活性細胞から調製されてもよく、一方で望ましくない細胞材料は除去される。このような特定の例では、本明細書の方法、システム、およびキットは、色素体由来エネルギー、ミトコンドリア由来エネルギー再生、葉緑体由来エネルギー再生、または両方の組み合わせを利用し得る。
【００１３】
前記および他の特徴は、添付図面を参照して進めるいくつもの実施形態の以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１は、タバコＢＹ−２細胞溶解物（ＢＹＬ）を含む人工エネルギー再生を伴わないバイオポリマーの合成のためのシステムの成分および性能を含む。図１（Ａ）は、クレアチンリン酸（ＣＰ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）を含むシステムとの本システムの性能の比較を示す。鋳型としてレポーター遺伝子（すなわち、ｅＹＦＰ）を使用して２５℃で５２時間、連結された転写翻訳反応を行った。蛍光レポータータンパク質の収量は、４８５／２０ｎｍの励起および５２８／２０ｎｍの吸収フィルターと共に蛍光リーダーを使用して蛍光強度を測定することにより決定した。）
【図１Ｂ】図１（Ｂ）は、それぞれアジ化ナトリウム（アジド）およびテレノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）による電子伝達系阻害の阻害のレポーター収量に対する効果を示す。三つの独立した転写翻訳実験から、平均および標準偏差を算出した。
【図２】図２は、人工エネルギー再生を使用することなく合成するためのシステムにおけるＡＴＰ生成の提案される機構を表す図を含む。ミトコンドリアの内側に位置するＴＣＡサイクルを通して、主にＮＡＤＨの形態の、還元性同等物を製造するためにグルタミン酸を使用する。ＮＡＤＨは酸化的リン酸化の燃料となり、酸素は最終的な電子受容体として機能し、ＡＤＰはＡＴＰに変換される。
【図３Ａ】図３は、人工エネルギー再生を使用することなく合成するためのシステムにおけるｅＹＦＰ収量および微生物増殖に対する異なる抗菌物質の効果を示すチャートを含む。鋳型としてｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを使用して２５℃および７００ｒｐｍで４５時間、連結されたＢＹＬ反応を実施した。ｅＹＦＰの収量は、蛍光リーダーを使用して蛍光強度を測定することにより決定した。ＬＢプレート上に０．２μＬのＢＹＬ反応量をプレーティングした後、それを３７℃で１６時間インキュベートすることによりコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を決定した。三つの独立した実験からの平均および標準偏差を算出した。図３（Ａ）は、微生物増殖（ＣＦＵ／μｌ）に対する異なる濃度のクロラムフェニコールの影響を含む。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、ｅＹＦＰ収量に対する異なる抗菌物質の影響を、抗菌物質なし（１００％）での標準的な反応における収量に対して正規化したものを含む。
【図３Ｃ】図３（Ｃ）は、微生物増殖（ＣＦＵ／μｌ）に対する異なる抗菌物質の影響を含む。
【図３Ｄ】図３（Ｄ）は、ｅＹＦＰの収量（μｇ／ｍＬ）に対する異なる濃度のクロラムフェニコールの影響を含む。
【図４】図４は、人工エネルギー再生を使用することなく合成するためのシステムで使用されるＮＴＰ混合物のＤｏＥベースの最適化の視覚的表現を含む。クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼなしでの連結されたＢＹＬシステムにおけるｅＹＦＰ合成についての応答表面および輪郭プロットが提示されている。反応体積の他の成分が最適濃度で維持された時の、収量に対する異なるＮＴＰおよびグルタミン酸マグネシウムの効果が示されている。プロットは、グルタミン酸マグネシウムとＡＴＰ（図４（Ａ））、グルタミン酸マグネシウムとＧＴＰ（図４（Ｂ））、およびグルタミン酸マグネシウムとＣＴＰ／ＵＴＰ（図４（Ｃ））の間の有意な相互作用を示す。ＤＮＡ鋳型としてプラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを使用して２５℃および７００ｒｐｍで４６時間、反応を実施した。蛍光リーダーを使用して蛍光強度を測定することにより、ｅＹＦＰの収量（相対蛍光単位ＲＦＵで提供）を決定した。
【図５】図５は、人工エネルギー再生を使用することなく合成するためのシステムにおける生産性に対する溶解物濃度の増加の効果を示す棒グラフを含む。マンニトール（青）を用いて調製したＢＹ−２細胞溶解物との反応を、ソルビトール（緑）を用いて調製した新しい溶解物との反応と比較した。反応は、９６ウェルプレート中５０μＬの体積で行った。薄色のバーは４０％（ｖ／ｖ）の溶解物反応を表し、暗色バーは６０％（ｖ／ｖ）の溶解物反応を表す。「Ｍ」および「Ｓ」は、プロトプラスト形成、脱液胞化（ｅｖａｃｕｏｌａｔｉｏｎ）、および溶解物調製中の脱液胞化プロトプラストの洗浄のための、それぞれマンニトールおよびソルビトールの使用を指す。ＤＮＡ鋳型としてｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを使用して２５℃および７００ｒｐｍで４８時間、連結反応を実施した。ｅＹＦＰの収量は、蛍光リーダーを使用して蛍光強度を測定することにより決定した。二つの独立した実験から平均および標準偏差を算出した。日付は、大きな「ＢＹＬミックス」の融合日、およびそれぞれの新しい溶解物の調製日をそれぞれ示す。
【図６】図６は、人工エネルギー再生なしの連結されたＩＶＴＴ反応におけるｅＹＦＰ産生に対するエクトイン、ヒドロキシエクトイン、およびグルコシルグリセリドールの効果を示す棒グラフを含む。０〜８％（ｖ／ｖ）の量のエクトイン、ヒドロキシエクトイン、およびグルコシルグリセロールを試料に添加し、プラスミドｐＩＶＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを鋳型として使用した。９６ウェルプレートを使用して、６０％（ｖ／ｖ）の溶解物部分５０μＬ中、２５℃および５００ｒｐｍで４４時間、制御湿度（７０％）で反応を実施した。産生されたｅＹＦＰの量は、ｅＹＦＰ標準と比較して、蛍光リーダーの使用により決定した。ｅＹＦＰ標準は、ＩＶＴＴ転写翻訳システムを使用して製造し、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）により精製した。次いで、精製されたｅＹＦＰの濃度を比色アッセイを使用して決定した。データは、三つの独立した転写翻訳実験の平均および標準偏差を表す。
【図７】図７は、人工エネルギー再生なしの連結されたＩＶＴＴ反応に対するグルコシルグリセロールの影響を示す棒グラフを含む。五つの異なる溶解物バッチにおいてプラスミドｐＩＶＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰから産生されたｅＹＦＰの量を比較した。反応は、６０％または８０％（ｖ／ｖ）の溶解物を用いて、および０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロール（ＧＧ）を用いずにまたは用いて、実施した。反応は、９６ウェルプレート中５０μＬの体積で、２５℃および５００ｒｐｍで４８時間、制御湿度（７０％）で行った。データは、三つの独立した転写翻訳実験の平均および標準偏差を表す。
【図８】図８は、人工エネルギー再生なしの連結されたＩＶＴＴ反応におけるｅＹＦＰ産生の経時的なグラフィカル表現を含む。反応は、０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロール（ＧＧ）なしまたはありで、６０％または８０％（ｖ／ｖ）の溶解物のいずれかを含んだ。プラスミドｐＩＶＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを鋳型として使用し、産生されたｅＹＦＰの量（ｅＹＦＰ標準と比較した）を蛍光リーダーの使用により決定した。反応は、５０μＬの体積で９６ウェルプレート中、２５℃および５００ｒｐｍで６４時間、Ｋｕｈｎｅｒ（商標）シェーカー中の制御湿度（７０％）下で実施した。データは、異なる溶解物バッチを使用した三つの独立した転写翻訳実験の平均および標準偏差を表す。
【図９】図９は、人工エネルギー再生なしの連結されたＩＶＴＴ反応におけるｅＹＦＰの産生に対する分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の効果を含む。０〜２ｍＭのＢＣＡＡを最後の成分としてプラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを鋳型として使用する連結されたＩＶＴＴ反応に加えた。反応は、９６ウェルプレート中５０μＬの体積で、２５℃および５００ｒｐｍで６６時間行った。産生されたｅＹＦＰの量は、ｅＹＦＰ標準と比較して、蛍光リーダーの使用により決定した。データは、六つの独立した転写翻訳実験の平均および標準偏差を表す。溶解物を振盪フラスコ（ＳＦ）または連続的発酵（ＣＦ）から調製した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
Ｉ．いくつかの実施形態の概要
粗溶解物に基づく無細胞タンパク質合成（ＣＦＰＳ）システムは、インビボシステムに対していくつもの利点を提供し、広範な応用、特に、タンパク質エンジニアリング、バイオ医薬品製造、および研究において有用である。従来の粗溶解物は、翻訳、タンパク質折り畳み、およびエネルギー代謝に必要な成分を含み、そのため、ＲＮＡ鋳型によりコードされるほぼあらゆるタンパク質が、溶解物にエネルギー貯蔵試薬が補充される限り、アミノ酸、ヌクレオチド、および塩の存在下でその中で合成される。連結された転写／翻訳システムでは、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質の合成を指示するために、ＲＮＡポリメラーゼを加えることができる。細胞内合成とは対照的に、ＣＦＰＳは、より短いプロセス時間、タンパク質加水分解の減少、ならびに毒性タンパク質および定義された位置において特定の化学基または非天然アミノ酸を含有するタンパク質を発現する能力を許容し得る。さらに、反応は直接的に制御および監視され得る。
【００１６】
追加的なエネルギー貯蔵試薬の必要性を排除する、人工エネルギー再生システムなしで細胞溶解物を利用するバイオポリマー合成（例えば、ポリペプチド合成）のための無細胞システムが本明細書に開示される。実施形態において、システムは、酸化的リン酸化による合成反応の間のエネルギー再生のために細胞小器官（例えば、色素体、ミトコンドリアまたは葉緑体）を含む真核細胞溶解物を利用する。ある特定の例では、細胞溶解物は、ＢＹ−２細胞に由来するミトコンドリアを含むタバコＢＹ−２溶解物である。酸化的リン酸化中の細胞真核システムでは、電子は、ミトコンドリアの内膜内に位置する電子伝達系を介して電子供与体から酸素のような電子受容体へと移動する。これらの酸化還元反応はエネルギーを放出し、それはＡＤＰをＡＴＰにリン酸化するために使用される。本明細書の実施形態は、このプロセスからのエネルギーを利用して、溶解物中のバイオポリマーの継続的合成を促進する。したがって、本明細書の実施形態では、電子伝達系の阻害剤および気密条件を使用して、酸化的リン酸化によるエネルギー再生を停止させ、それにより、システムの翻訳作用を終了させることにより合成反応を停止させることができる。一部の実施形態では、システムは、嫌気性または実質的に嫌気性の条件で反応が進行することを可能にすることができる色素体、葉緑体を含む。
【００１７】
従来の無真核細胞システム（例えば、小麦胚芽抽出物、および昆虫細胞抽出物）はミトコンドリアを欠いている。代わりに、これらのシステムは、必要なＡＴＰ再生を達成してタンパク質の発現をサポートするために、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼの追加を必要とする。タンパク質の発現をサポートするためにエネルギー再生のために反応混合物に加えられる遊離リン酸（クレアチンリン酸に由来する）の多くの蓄積は、これらのシステムの性能における有意な制限因子である。Ｅｚｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２（６）：１５７０−７；Ｔａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：２７２−８；Ｂｒｏｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１１（１）：２５−３６；Ｈｏｄｇｍａｎ＆Ｊｅｗｅｔｔ（２０１３）、上記；Ｓｃｈｏｂｏｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．９（５）：６３０−４０。システムに導入された遊離リン酸は、マグネシウム（転写および翻訳に必要）に結合し、合成性能の早期の崩壊および低い生成物収量をもたらす。
【００１８】
合成性能を長持ちさせるために、現在利用可能な無真核細胞システムは、透析モードで「連続流れ」反応を使用して、長持ちするエネルギー供給源を提供し、反応区画内のリン酸のような阻害成分を希釈する。バイオポリマー合成のための人工エネルギー再生システムを含まない本明細書に記載のシステムは、阻害成分の産生がより少なく、かつそれら自体のエネルギー再生能力を有するので、反応透析の必要性を低減または排除する。しかしながら、本明細書のシステムは、実施者の裁量によって望ましい場合、連続流れの構成で利用されてもよい。
【００１９】
従来の無真核細胞タンパク質発現システムと比較して、本明細書に記載されるバイオポリマー合成のシステムは一般的に安価であり、またそれらはより長くタンパク質を製造し、結果的にバイオポリマー収量の増加をもたらす。さらに、本明細書のシステムは、例えば、無細胞タンパク質発現のさらなる促進因子として、ミトコンドリアおよび／または葉緑体機能に影響を与える化合物または経路を調査する可能性を提供する。したがって、本明細書の実施形態の基本的に異なるシステムは、いっそうさらなる利益を提供するように最適化され得る。
【００２０】
本明細書に記載されるバイオポリマー合成のための一部のシステムは、微生物の増殖をサポートする能力があり、かかる増殖によって、ＩＶＴＴ反応および／またはタンパク質分解における基質の枯渇が生じ、標的タンパク質の終了が低減されることがある。したがって、一部の実施形態では、システムは、微生物増殖を阻害するクロラムフェニコールを含み、これはこれらの実施形態においてタンパク質の発現を改善し得る。特定の実施形態では、システムは、例えば、１０〜５００μｇ／ｍＬ（例えば、２５〜２５０μｇ／ｍＬ、５０〜２００μｇ／ｍＬ、および１００〜２００μｇ／ｍＬ）の量のクロラムフェニコールを含む。
【００２１】
連結されたインビトロ転写／翻訳（ＩＶＴＴ）反応における特定の量のＮＴＰは、一部の実施形態において驚くべきロバストな発現を提供し得るという発見が本明細書に記載され、該発現は、標準的なＮＴＰ量から予測されたものの約２０％以上（例えば、１８％以上、１９％以上、２０％以上、２１％以上、２２％以上、２３％以上、２４％以上、２５％以上、１８〜２５％多い、１９〜２３％多い、約２０％多い）であり得る。したがって、一部の例では、システムは、約１５０ｍＭのＡＴＰ、約４０ｍＭのＧＴＰ、約２０ｍＭのＣＴＰ、および約２０ｍＭのＵＴＰを含み得る。これらの低減された量のＮＴＰを利用することのさらなる利点は費用の低減であり、これは従来の植物細胞システムよりもＧＴＰ（最も高価なＮＴＰ）の量が低減されることによる。
【００２２】
また、本明細書のシステムのいくつかの修正は、生成物収量および／または品質にかなりの改善を与え得るという驚くべき発見が本明細書に記載される。例えば、プロトプラスト形成および溶解物調製の脱液胞化工程の間のソルビトールの使用は、タンパク質産生量の増加をもたらし得ると同時に、ソルビトールはマンニトールなどの他の一般的に使用される浸透圧剤よりも安価であるので、システムのコストをさらに低減させ得る。さらなる例として、ＩＶＴＴ反応の溶解物の比率を５０〜９０％（例えば、５５〜８５％）（ｖ／ｖ）に増加させることは、いくつかの標的タンパク質のより高い発現を引き起こす。したがって、本明細書において特定の例は、例えば、約６０体積％（例えば、５８％、５９％、６０％、６１％、および６２％）、または約８０体積％（例えば、７８％、８９％、８０％、８１％、および８２％）の量で、プロトプラスト形成および脱液胞化の間にソルビトールを用いて調製された、細胞溶解物の使用を含む。また別の例として、グルコシルグリセロールの添加は、ＩＶＴＴ反応のタンパク質収量を劇的に増加させる。例えば、グルコシルグリセロールのない標準反応と比較して、０，２５％〜４％の量のグルコシルグリセロールは最大８０％多くのタンパク質をもたらした。いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、グルコシルグリセロールは、推定ではタンパク質および膜の安定性を増加させることによって、反応収量を高める。したがって、一部の実施形態では、システムは０．２５〜４％（例えば、０．２５〜２％、０．２５〜１％、約０．５％、および１．５％）のグルコシルグリセロールを含む。さらなる例として、必要ではないが、分岐アミノ酸（ＢＣＡＡ）ＢＣＡＡの追加を利用してタンパク質産生量を増加させることができる。したがって、一部の実施形態では、システムは、約０．２５〜４ｍＭの量または０．５〜２ｍＭの量（例えば、０．４８〜２．２ｍＭ、０．５〜２．０ｍＭ、０．５〜１ｍＭ、および約１ｍＭ）のＢＣＡＡを含む。
【００２３】
前述の修飾によれば、本明細書の特定の実施形態では、連結されたＩＶＴＴ反応における標的タンパク質の製造は、最大６４時間延長され得る。一例では、８０体積％の溶解物および０．５体積％のグルコシルグリセロールとの反応は、ほぼ２．５ｍｇ／ｍＬのｅＹＦＰをもたらす。
【００２４】
ＩＩ．略語
ＡＡＤ−１２  アリールオキシアルカノエートジオキシゲナーゼ−１２
ＡＤＰ  アデノシン二リン酸
ＡＴＰ  アデノシン三リン酸
ＢＣＡＡ  分岐鎖アミノ酸
ＢＹ−２  Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ−２
ＢＹＬ    ＢＹ−２細胞溶解物
ＣＦＰＳ  無細胞タンパク質合成
ＣＦＵ  コロニー形成単位
ＣＨＯ  チャイニーズハムスター卵巣
ＣＬ  セルラーゼ酵素
ＣＫ  クレアチンキナーゼ
ＣＰ  クレアチンリン酸
Ｃｒｙ１Ｆ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙ１Ｆデルタ−エンドトキシン
Ｃｒｙ３Ａ  Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  Ｃｒｙ３Ａデルタ−エンドトキシン
ＣＴＰ  シチジン三リン酸
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
ＤＯＥ  実験の設計
ＤＴＴ  ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ｅＹＦＰ  強化黄色蛍光タンパク質
ＦＡＤＨ  フラビンアデニンジヌクレオチド
ＧＴＰ  グアノシン三リン酸
ＩＣＥ  昆虫細胞抽出物  
ＩＭＡＣ  固定化金属親和性クロマトグラフィー
ＩＶＴＴ  インビトロ転写および翻訳
ＮＡＤＨ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ＮＡＤＰＨ  ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
ＮＥＢ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ
ＮＴＰ  ヌクレオチド三リン酸
ＰＣＲ  ポリメラーゼ連鎖反応
ＰＥＧ  ポリエチレングリコール
ＲＬＬ  ウサギ網赤血球溶解物
ＳＥＣ  サイズ排除クロマトグラフィー
ＴＣＡサイクルトリカルボン酸サイクル（「クレブスサイクル」）
ＴＴＡ  テノイルトリフルオロアセトン
ＵＴＰ  ウリジントリリン
ＵＴＲ  非翻訳領域
ＷＧＥ  小麦胚芽抽出物
【００２５】
ＩＩＩ．用語
単離された：「単離された」生物学的成分（例えば、核酸またはタンパク質）は、当該成分が天然に存在している、生物体の細胞中の他の生物学的成分（すなわち、他の染色体および染色体外のＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにタンパク質）から、当該成分において化学的変化または機能的変化に影響を与えながら、実質的に分離され、離れて産生され、または精製されている（例えば、核酸は、染色体中の残りのＤＮＡと当該核酸を繋ぐ化学的結合を破壊することにより、染色体から単離することができる）。「単離されている」核酸分子およびタンパク質としては、標準的な精製法により精製された核酸分子およびタンパク質が挙げられる。またこの用語は、宿主細胞中での組み換え発現により調製された核酸およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子、タンパク質、およびペプチドを包含する。
【００２６】
核酸分子：本明細書において使用される場合、「核酸分子」という用語は、多量体型のヌクレオチドを指す場合があり、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方を含み、ならびにそれらの合成型および混合型ポリマーを含む場合がある。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型を指す場合がある。本明細書で使用される場合、「核酸分子」は、「核酸」および「ポリヌクレオチド」と同義である。別段の言及がない限り、核酸分子は通常、少なくとも１０塩基の長さである。前記用語はＤＮＡの一本鎖および二本鎖の形を含む。核酸分子は、天然型、および／または非天然型のヌクレオチド結合によって、共に連結された天然型ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドのいずれか、または両方を含んでもよい。
【００２７】
核酸分子は、当業者によって容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されてもよく、あるいは非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。かかる修飾としては、例えば、標識、メチル化、一つ以上の天然型ヌクレオチドとアナログの置換、ヌクレオチド間修飾（例えば、非荷電結合：例えばホスホン酸メチル、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、およびカルバマート；荷電結合：例えばホスホロチオアートおよびホスホロジチオアート；ペンデント部分（ｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｉｅｔｉｅｓ）：例えば、ペプチド；インターカレーター：例えば、アクリジン、ソラレンなど；キレーター；アルキレーター；および修飾結合：例えば、アルファアノマー核酸など）が挙げられる。また、「核酸分子」という用語は、一本鎖、二本鎖、部分的に二重、三重、ヘアピン型、環状および南京錠型立体配座を含む位相幾何学立体配座も含む。
【００２８】
外因性：  「外因性」という用語は、本明細書の細胞溶解物に加えられる成分（例えば、色素体、ミトコンドリアまたはクロロプラスト）に適用される場合、その細胞溶解物とは異なる起源を有するこうした成分を意味する。例えば、その細胞溶解物を起源としない該溶解物に加えられる色素体、ミトコンドリア、または葉緑体は、該細胞溶解物にとって外因性である。外因性という用語は、いずれの場合にもその細胞溶解物自体に由来しない限り、細胞溶解物を派生させるために使用される細胞種と同じ細胞種または異なる細胞種（例えば、異なる組織または異なる種由来の細胞）からの色素体、ミトコンドリア、または葉緑体などの細胞小器官に適用されてもよい。さらに、外因性という用語は、本明細書に開示されるシステムの細胞溶解物で使用される色素体、ミトコンドリア、または葉緑体といった細胞小器官に別個にまたは追加で加えられるエネルギー再生システムの成分（例えば、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼ）を意味するために本明細書において使用され得る。
【００２９】
ＩＶ．バイオポリマー合成システム
本開示は、人工再生システムを使用することなく、バイオポリマーを合成するためのシステムを提供する。本明細書のシステムには、酸化的リン酸化が活性化され、エネルギー貯蔵試薬の非存在下での収量の増加を提供する、バイオポリマーの強化されたインビトロ合成を達成する組成物および方法が含まれる。収量の改善は、反応ＩＶＴＴ成分の組み合わせによって得られ、これは実施者によって組み立てられて混合されてもよく、または予混合された成分、混合されていない成分、もしくはこれら二つの組み合わせとしてキットに提供されてもよい。実施者は、自分が提供する成分と組み合わせて、キットの成分の一部またはすべてを利用してもよい；例えば、一部の実施形態では、キットは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型以外のタンパク質合成のためのシステムのすべての成分を含み、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型は選択されたタンパク質を合成するために実施者によって提供される。システムのすべての成分が、適切な環境条件下で反応体積中で混合されると、反応が開始され、明細書に記載される重要な変更と共に、一般的に従来のインビトロ無細胞合成反応にしたがって進行する。反応は、成分（例えば、ＮＴＰおよびアミノ酸）の一つ以上が反応体積中で使い果たされるまで、またはシステム内のエネルギー再生プロセスを終了するために環境条件を調節することによって停止されるまで進行が許容され得る。
【００３０】
本明細書に開示される方法および組成物は、真核細胞の細胞質環境を模倣し、先行技術の方法に対してタンパク質の製造およびタンパク質の折り畳みにおいて有意な改善をもたらす。例えば、細胞小器官の存在に起因して、酸化的リン酸化は反応体積で活性であるため、本明細書のシステムは、合成阻害に伴う二次エネルギー源の必要性を低減または完全に回避する。
【００３１】
本明細書の実施形態のシステムは、例えば、ＤＮＡの増幅、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写、ポリペプチドへのＲＮＡの翻訳、および単糖からの複合炭水化物の合成を含む、バイオポリマーの製造／複製に有用である。強化された合成は、一部の例では、システムで合成されるバイオポリマーの合計量または相対量の増加；単位時間当たりに合成されるバイオポリマーの合計量または相対量の増加；合成される生物学的活性バイオポリマー（例えば、適切に折り畳まれたかつ／または翻訳後修飾されたタンパク質）の合計量または相対量の増加；合成される可溶性バイオポリマーの合計量または相対量の増加、ならびに所与の量のバイオポリマーを合成するために必要な時間および／または費用の支出の低減のうちの一つ以上を含む。
【００３２】
本明細書の特定の実施形態は、ｍＲＮＡの翻訳を達成してポリペプチドを産生させ、この翻訳はＤＮＡ鋳型からのｍＲＮＡのインビトロ合成に連結されてもよい。こうした無細胞システムは、ｍＲＮＡの翻訳に必要なすべての因子、例えば、リボソーム、アミノ酸、ｔＲＮＡ、アミノアシル合成酵素、伸長因子、開始因子、およびリボソームリサイクル因子を含有する。本明細書の例では、このような無細胞システムは、真核細胞、例えば植物細胞（例えば、タバコＢＹ−２細胞）から本明細書に記載される方法で調製された細胞溶解物を含む。
【００３３】
細胞溶解物
本明細書の実施形態は、任意の真核細胞溶解物を利用するように適合され得る。無真核細胞溶解物は、様々な翻訳後プロセシング活性を保持する。真核細胞溶解物はまた、多種多様なウイルスおよび他の原核性ＲＮＡ、ならびに真核性ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳をサポートする。細胞溶解物が由来する生物体のコドン用法から逸脱するコドン用法を有する鋳型ｍＲＮＡは、例えば、該生物体中の希少なｔＲＮＡおよび／またはアミノ酸をシステムに補充することによって、効率的に使用され得る。本明細書の特定の例は、タバコＢＹ−２細胞溶解物を利用し、これはバッチ培養および攪拌タンク発酵槽の両方における懸濁培養において簡便かつコスト効果の高い発酵を提供することが示され、また充分に確立された遺伝子改変ツールに適している。
【００３４】
本明細書の実施形態による細胞溶解物の調製は、特に、細胞壁（植物細胞の場合）および細胞膜の破壊／除去、分解液胞の除去、および内因性ｍＲＮＡの除去を含み得る。
【００３５】
細胞壁および膜は、一部の実施形態では、例えば、限定されないが、機械的破壊、液体均質化、酵素消化、高周波音波、減圧、凍結／解凍サイクル、および手動粉砕などの技術によって破壊され得る。本明細書の特定の実施形態では、植物細胞溶解物は、一つ以上の細胞壁消化酵素（例えば、Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ  Ｏｎｏｚｕｋａ  ＲＳ（商標）、Ｐｅｃｔｏｌｙａｓｅ  Ｙ−２３（商標）、Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ  Ｒ−１０）、および液体酵素（例えば、Ｒｏｈａｍｅｎｔ  ＣＬ（商標）、Ｒｏｈａｍｅｎｔ  ＰＬ（商標）、およびＲｏｈａｐｅｃｔ  ＵＦ（商標）；これらは元々、果物ジュースおよび抽出物の製造を意図していた）を使用して細胞壁を消化することにより調製される。Ｒｏｈａｍｅｎｔ  ＣＬ（商標）はセルラーゼ濃縮物を含み、Ｒｏｈａｍｅｎｔ  ＰＬ（商標）はペクチナーゼ濃縮物であり、Ｒｏｈａｐｅｃｔ  ＵＦ（商標）は、専用のペクチナーゼおよびアラバナーゼを含む酵素複合体を含有する。これらの酵素の組み合わせの使用により、従来の方法と比較して、１００倍を超えてプロトプラスト形成のコストが低減された。
【００３６】
また、溶解物の調製の間、あらゆる分解液胞は除去され得る。こうした液胞は、ポリペプチドおよびｍＲＮＡの合成を妨げるプロテアーゼおよびリボヌクレアーゼなどの望ましくない酵素を含有する。本明細書の一部の実施形態では、分解液胞は、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配またはその他の任意の密度勾配において遠心分離により除去される。液胞は低密度を有し、したがってプロトプラストから分離されることができ、高密度脱液胞化プロトプラストが得られる。一部の例では、段階的なスクロース密度勾配を脱液胞化のために利用してもよく、ここでプロトプラストはＰｅｒｃｏｌｌフリーの上層に直接塗布される。遠心分離後、脱液胞化プロトプラストは、例えば、４０％〜７０％のＰｅｒｃｏｌｌ層（使用される勾配に応じて）の間の界面で濃縮された液体から分離されるが、分離された低密度の液胞は低密度の勾配にあり、例えば、上層上に浮遊する。
【００３７】
次いで、不安定な細胞成分を酸化から保護するために、脱液胞化プロトプラストを洗浄し、その後、Ｄｏｕｎｃｅ組織粉砕機または窒素分解によって破壊してもよい。核および破壊されていない細胞の除去後、１８Ｓおよび２８ＳリボソームＲＮＡの完全性が主に影響を受けないまま、溶解物を処理して内因性ｍＲＮＡを破壊し、バックグラウンドの翻訳を最小化し得る。本明細書の特定の例において、ヌクレアーゼＳ７が使用される。
【００３８】
鋳型
本明細書のシステムでバイオポリマーの合成を指示するために、保存された情報がポリマーに変換されるように、反応に鋳型が存在する必要がある。無細胞タンパク質合成のための鋳型は、対象の任意のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）またはポリペプチド（ＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）をコードするｍＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得る。連結された転写／翻訳システムは、認識可能なプロモーターを用いてＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを連続的に生成する。内因性ＲＮＡポリメラーゼが使用されてもよく、または外因性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ファージＲＮＡポリメラーゼ、一般的にＴ７またはＳＰ６）が、反応混合物に直接添加されてもよい。別の方法として、ｍＲＮＡは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであるＱＢレプリカ―ぜの鋳型にメッセージを挿入することによって継続的に増幅されてもよい。一部の実施形態では、複数のクローニング領域の一端にポリＡ配列を含有するベクターをＩＶＴＴ反応の鋳型として使用する。例えば、このようなベクターは、複数のクローニング領域の反対側末端にＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有してもよく、その結果、ベクターへのクローニングは、５’末端および３’末端におけるポリＡ配列のＲＮＡポリメラーゼプロモーターに隣接する遺伝子を産生する。ｍＲＮＡが鋳型として利用される実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、反応混合物に添加される前に化学修飾によって安定化され得る。
【００３９】
本明細書の実施形態による鋳型として利用されるＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列のヌクレオチド配列は、より高いレベルの発現を達成するように最適化され得る。いくつかのｍＲＮＡ構造特性は、コード配列の５’末端および３’末端における非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む翻訳効率に影響を及ぼす。５’ＵＴＲの構造は、翻訳開始、終結、およびｍＲＮＡ安定性に影響を与える。翻訳開始の速度制限ステップの一つは、４３Ｓ開始前複合体へのｍＲＮＡの結合である。翻訳機構は、リーダーシーケンスにおける５’キャップまたは翻訳エンハンサーによってリクルートされる。本明細書のある特定の実施形態では、鋳型ｍＲＮＡは、ＰＣＩＴＥ２ａにおける５’ＵＴＲ（これは脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来する内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有する）；ベクターｐＦ３Ａにおけるオオムギ黄萎ウイルス（ＢＹＤＶ）の配列；バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子の５’ＵＴＲ；ポリＡ配列を含む合成の３’ＵＴＲ；およびＡＲＣ−１配列エレメントを含む５’ＵＴＲ（これは内部１８Ｓ  ｒＲＮＡセグメントに相補的であり、４０Ｓリボソームサブユニットへの結合を促進する場合がある）；タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）５’−ＵＴＲ（オメガ配列）（最初のＧＵＡトリプレットの上流にＧＡＡＡＧＡを付加することによって改善され得る）を含む群から選択される非翻訳領域を含有してもよい。
【００４０】
一部の実施形態では、例えば、キャップアナログｍ７Ｇ［５’］ｐｐｐ［５’］Ｇの存在下で、キャップされたｍＲＮＡをインビトロで製造するためにＤＮＡ分子が使用される。非組み込みヌクレオチドおよびキャップアナログは、ゲル濾過によって除去されてもよく、その後、ポリペプチド合成の鋳型としての役割を果たす、精製されたｍＲＮＡが本明細書に記載される無細胞システムに導入され得る。
【００４１】
モノマー
連結されたＩＶＴＴ反応において、リボヌクレオチド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ）およびアミノ酸は、所望のバイオポリマーを合成するために使用されるモノマー単位としてシステムで必要とされる。本明細書の一部の実施形態では、システムは、従来のエネルギー再生システムを伴う同等のシステムに対して、一つ以上のＮＴＰのレベルが低減されて作動する。これらの実施形態では、開示されたシステムは、システムの作動に対する費用を有利に減少させる。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、２〜１０ｍＭ、例えば４〜８ｍＭ、または５〜７ｍＭのＡＴＰの最終ＡＴＰ濃度で作動する。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、０．８〜２．５ｍＭ、例えば１〜２ｍＭまたは１．４〜１．８ｍＭのＧＴＰの最終ＧＴＰ濃度で作動する。ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、０．４〜２．４ｍＭ、例えば０．５〜２ｍＭまたは０．６〜１．０ｍＭのＣＴＰの最終ＣＴＰ濃度で作動する。また、ある特定の実施形態では、開示されたシステムは、０．４〜２．４ｍＭ、例えば０．５〜２ｍＭまたは０．６〜１．０ｍＭのＵＴＰの最終ＵＴＰ濃度で作動する。例えば、システムは、６ｍＭまたは約６ｍＭのＡＴＰ、１．６ｍＭまたは約１．６ｍＭのＧＴＰ、０．８ｍＭまたは約０．８ｍＭのＣＴＰ、および０．８ｍＭまたは約０．８ｍＭのＵＴＰの最終ＮＴＰ濃度で作動し得る。特定の例において、合成反応は、約１５０ｍＭのＡＴＰ、約４０ｍＭのＧＴＰ、約２０ｍＭのＣＴＰ、および約２０ｍＭのＵＴＰを含有する低濃度ＮＴＰ混合物で補充され、ＮＴＰの最終濃度を提供するのに十分な量でミックスがシステムに追加される。アミノ酸はまた、例えば、最終濃度２０〜５００ｐＭの最終濃度まで加えられ得る。放射性標識アミノ酸（例えば、３５Ｓメチオニンおよび３Ｈロイシンを連結反応で使用し、その後、対応するアミノ酸をアミノ酸混合物から外してもよい。
【００４２】
塩
塩の濃度は、本明細書の実施形態によるシステムで制御される。例えば、システムは、例えば、限定されないが、カリウム、マグネシウム、アンモニウム、および（例えば、酢酸または硫酸の）マンガンなどの他の生物学的に関連する塩などの一つ以上の塩を加えられてもよい。こうした塩のうちの一つ以上は、カウンター陰イオンとしてアミノ酸を有してもよい。合成反応の機能に関してイオン種の間に相互依存性がある。反応媒体内の特定のイオンの濃度を変化させたとき、それに応じて別のイオンの濃度が変化し得る。例えば、追加された塩の濃度は、ヌクレオチドなどの他の成分の変化にしたがって同時に制御され得る。さらに、連続流反応器内の成分の濃度レベルは、経時的に変化し得る。
【００４３】
マグネシウム
マグネシウムは、リボソームの組み立てを強化し、組み立てられたリボソームの安定性を強化するため、タンパク質の翻訳に重要である。マグネシウムはまた、ポリメラーゼ結合の促進において役割を果たすようである。本明細書の実施形態では、細胞溶解物のマグネシウム濃度は、追加的なマグネシウム化合物によって調節され得る。一部の実施形態では、さらなるマグネシウム化合物は塩であり、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルタミン酸マグネシウムである。転写および翻訳を連結するために、十分な量のマグネシウム塩を溶解物に添加して、最終マグネシウム濃度を、ＲＮＡがＤＮＡから転写され、かつＲＮＡがタンパク質に翻訳されるレベルまで上昇させてもよい。一部の例では、最終的なマグネシウム濃度は１〜２０ｍＭに調整され得る。例えば、最終マグネシウム濃度は、使用される溶解物に応じて、５〜１５ｍＭ、７〜１３ｍＭ、２．５ｍＭ〜５．５ｍＭ、２．５ｍＭ〜３．５ｍＭ、２．６ｍＭ〜３．０ｍＭ、３．０ｍＭ〜５．２５ｍＭ、または４．０ｍＭ〜４．７５ｍＭであり得る。
【００４４】
本明細書のシステムにおけるマグネシウム濃度の精密な制御を提供するために、溶解物のマグネシウムレベルは、余分なマグネシウムを添加する前に、マグネシウムアッセイの使用を通して直接測定されてもよい。例えば、Ｌａｎｃｅｒ「Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  Ｒａｐｉｄ  Ｓｔａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｋｉｔ」（Ｏｘｆｏｒｄ  ＬａｂＷａｒｅＤｉｖｉｓｉｏｎ（商標）、Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）は、生体液のマグネシウムレベルを正確に測定できる一つのアッセイである。溶解物の所与のバッチについてマグネシウムイオン濃度が既知であると、追加的なマグネシウムを追加して、溶解物のマグネシウム濃度を望ましい範囲内にもたらし得る。
【００４５】
上述のように、反応の最終マグネシウム濃度は、他の条件および考慮事項によって影響を受ける。したがって、例えば、リボヌクレオチド三リン酸濃度が上昇すると、リボヌクレオチド三リン酸は溶液中のマグネシウムと会合またはキレート化する傾向があるので、最適なマグネシウム濃度は同時に増加する。したがって、リボヌクレオチド三リン酸濃度が増加すると、追加的なマグネシウムも反応に一般的に加えられる。マグネシウムの最適濃度も細胞溶解物のタイプによって変化する。追加する必要があるマグネシウムの量はまた、反応混合物で使用される溶解物の濃度によって変化し、溶解物の濃度を増加させると溶解物自体からのマグネシウムの寄与が増加する。
【００４６】
カリウム
一般的に、望ましいレベルのバイオポリマー合成を達成するために、カリウムもシステムに加えられる。カリウム（例えば、酢酸カリウムおよびグルタミン酸カリウム）は、一般的に５〜２５０ｍＭ（例えば、５〜１００ｍＭ、５〜７５ｍＭ、５〜５０ｍＭ、および５〜３０）の濃度で存在する。特定の例では、カリウム濃度は１０〜２０ｍＭであってもよく、さらに具体的には約２０ｍＭであってもよい。マグネシウムの場合と同様に、内因性の細胞溶解物成分の存在により、最終的なカリウム濃度はわずかに変化し得る。
【００４７】
追加の成分
合成反応の効率または安定性を改善するために必要に応じて、追加的な成分も特定の実施形態ではシステムに追加されてもよい。絶対的に必要ではないが、連結された転写および翻訳反応への一つの一般的な追加は、例えば、鎖伸長の効率を刺激するのに十分な量のポリアミンである。ポリアミンは、最適なマグネシウムレベルにも影響を与え、翻訳反応のための効果的なマグネシウム濃度を少し低下させることが知られている。したがって、ポリアミンは、一部のレベルでマグネシウムを置換することができ、特定の例では連結された転写および翻訳のための最適なマグネシウムレベルの低下を許容し得る。
【００４８】
望ましくない酵素活性に対する代謝阻害剤を反応混合物に加えてもよい。あるいは、望ましくない活性に関与する酵素または因子は、抽出物から直接除去されてもよく、または望ましくない酵素をコードする遺伝子は、不活性化または染色体から欠失されてもよい。
【００４９】
宿主生物体（Ｍｕｌｌｅｒ＆Ｂｌｏｂｅｌ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：７４２１−５を参照）から精製された、または合成の小胞もシステムに加えられ得る。これらは、タンパク質合成および折り畳みを強化するために使用され得る。例えば、本明細書に記載されるシステムは、膜タンパク質を活性化するため；例えば、タンパク質を挿入もしくは移動させるか、または他の化合物を移動させるために、無細胞反応のために使用されてもよく、またこれらのプロセスは、所望の膜タンパク質を含有する小胞を加えることによって特定の実施形態で支援されてもよい。
【００５０】
上記成分に加えて、その他の材料（タンパク質合成に特に利用されるもの）を本明細書に記載されるシステムに加えることができる。このような材料には、例えば、限定されないが、他の塩、フォリン酸、環状ＡＭＰ、タンパク質または核酸分解酵素の阻害剤、ＲＮａｓｉｎ、タンパク質合成の阻害剤または調節剤、酸化／還元電位の調整剤、ＤＴＴ、クロラムフェニコール、非変性界面活性剤、緩衝剤成分（反応ｐＨを安定化させるために溶液中で使用され得るものなど）、ＰＥＧ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、スペルミン、スペルミジン、およびプトレシンなどが含まれ得る。
【００５１】
一部の実施形態は、人工再生システムを使用することなくバイオポリマーを合成するためのシステムの成分を含むキットを含む。特定の実施形態では、キットは細胞溶解物を含み得る。代替的に、キットは、細胞溶解物の調製のための細胞を得るために培養および増幅させるための細胞を含み得る。特定の実施形態では、キットは、塩、ＮＴＰ、酵素（例えば、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ）、酵素阻害剤（例えば、ＲＮａｓｉｎ）、鋳型、およびその他の添加剤（例えば、クロラムフェニコール）のうちの一つ以上を含み得る。特定の例において、キットは、システム内の鋳型として使用するために、目的遺伝子をクローニングすることができるネイキッドベクターを含み得る。細胞溶解物を含むキットでは、溶解物は標準であってもよく、またはその塩濃度の調整がすでに製造中に行われているタイプであってもよく、または追加的に、連結された転写および翻訳のために必要な成分、試薬もしくは緩衝液のうちの一つ以上が含まれているタイプであってもよい。特定の例では、キットは鋳型を含まない場合があるが、代わりに鋳型の提供をユーザーに依存してもよい。キットは、合成反応を実施するために、キットの成分を利用する方法をユーザーに知らせるために、一組の説明書を含むか、または説明を含むウェブサイトへのリンクを含んでもよい。
【００５２】
Ｖ．バイオポリマー合成方法
上述のシステムは、一つ以上のバイオポリマーのインビトロ合成方法において使用されてもよい。インビトロ合成とは、生物学的抽出物および／または定義された試薬を含む反応混合物中の生物学的マクロ分子の無細胞合成を指す。本明細書のシステムを使用して、これらの構成が当技術分野で公知であるように、バッチ、連続フロー、および半連続フロー構成で無細胞合成反応を実施し得る。一部の実施形態では、バッチ培養細胞を使用してもよい。一部の実施形態では、再現性のある均質な細胞材料の供給を確実にするために、細胞を攪拌タンク発酵槽内で連続的に生育させることができる。
【００５３】
静的ＩＶＴＴ反応の使用と、連続またはフロースルー反応との間で違いがあり、これは一部の用途で考慮され得るが、他の用途ではそうではない。例えば、連続システムは一般的にタンパク質の大規模産業製造に使用されるが、静的システム反応は小規模のインビトロ翻訳（例えば、研究の状況）により適する。連続的な翻訳は実施することがはるかに高価であり、機器への投資、ならびに多くの量の試薬を必要とする。特に、連続真核生物反応作業を行うために使用されるＲＮＡポリメラーゼのレベルは、単純な研究用途に対して禁止されている場合がある（すなわち、２０，０００〜３０，０００Ｕ／反応）。さらに、連続反応は、比較的大容量で実施されるように設計されているが、静的反応は、典型的には１００μｌ以下のオーダーに過ぎないため、追加的な装置は必要なく、また少量の試薬のみを必要とする。
【００５４】
本明細書のシステムは、大規模反応器、小規模反応器を利用することができ、または複数の同時合成を実施するために多重系とされてもよい。連続反応は、試薬の流れを導入するために供給機構を使用し、プロセスの一部として最終生成物を単離してもよい。連続反応および静的反応の両方では、活性合成の期間を延長するために追加的な試薬を導入し得る。反応器は、バッチ、拡張バッチ、半バッチ、半連続型、流加バッチ、および連続的などの任意のモードで実行されてもよく、そのモードは適用目的にしたがって選択されてもよい。
【００５５】
反応は、これも用途および使用される装置に応じて、任意の容量で行われ得る。例えば、小規模反応では、反応容量は、１〜１５μｌ、少なくとも１５μｌ、少なくとも５０μｌ、少なくとも１００μｌ、少なくとも０．５ｍＬ、または少なくとも１ｍＬであるが、１０ｍＬ未満であってもよい。原則として、十分な酸素（またはその他の電子受容体）が供給される限り、反応は任意のスケールで行われ得る。最大量の生成物の製造のために、産業バイオリアクターを使用してもよい。
【００５６】
本明細書の方法は、合成されたバイオポリマーを単離するための手段、例えばタンパク質単離手段を利用してもよい。一部の実施形態では、連続操作モードで動作し、反応器からの生成物出力は膜を通して流れ、タンパク質単離手段に入る。半連続操作モードでは、膜の外側または外部表面は、所定の順序で周期的に変更される所定の溶液と接触する。これらの溶液は、アミノ酸およびヌクレオチドなどの基質を含み得る。この時点で、反応器は、透析または透析ろ過バッチまたは流加バッチモードで動作する。フィード溶液は、同じ膜または別個の注射ユニットを通して反応器に供給されてもよい。合成されたタンパク質は反応器内に蓄積され、次いでシステム操作の完了後にタンパク質精製の通常方法にしたがって単離され、精製される。
【００５７】
試薬の流れがある場合、液体流の方向は膜に垂直および／または接線方向とすることができる。接線流は、ＡＴＰリサイクリングおよび膜の詰まりの防止に有効であり、垂直流に重ねられ得る。膜に垂直な流れは、陽圧ポンプまたは真空吸引ポンプによって生じるか、または影響を受け得る。膜の外部表面と接触する溶液は周期的に変更されてもよく、膜に対して定常的な接線流としてもよい。さらに、反応器は、適切な撹拌手段によって内部または外部で攪拌されてもよい。
【００５８】
反応器内のタンパク質合成の間、望ましいタンパク質を選択的に単離するためのタンパク質単離手段は、抗体分子または合成された所望のタンパク質を吸着するための成分を固定化された他の分子で被覆された粒子を充填したユニットおよび適切なサイズの細孔を有する膜を含み得る。タンパク質単離手段は、交互使用のための二つのカラムを含むことが好ましい。
【００５９】
翻訳反応で生成されるタンパク質の量は、様々な様式で測定することができる。一つの方法は、翻訳されている特定のタンパク質の活性を測定するアッセイの利用可能性に依存する。タンパク質活性を測定するためのアッセイの例は、ルシフェラーゼアッセイシステム、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼアッセイシステムである。これらのアッセイは、翻訳反応から産生される機能的に活性なタンパク質の量を測定する。活性アッセイは、不適切なタンパク質折り畳みまたはタンパク質活性に必要なその他の翻訳後修飾の欠如に起因して不活性の全長タンパク質を測定しない。代替的に、特定のタンパク質は、キャピラリー電気泳動によってそのサイズにしたがって検出され得る。
【００６０】
連結されたインビトロ転写および翻訳反応において製造されたタンパク質の量を測定する別の方法は、３５Ｓ−メチオニン、３Ｈ−ロイシン、またはｌ４Ｃ−ロイシンなどの放射性標識アミノ酸の既知量を使用して反応を実施した後、新規翻訳タンパク質に組み込まれた放射性標識アミノ酸の量を測定する。組み込みアッセイは、切断タンパク質産物を含む、反応で生成されたすべてのタンパク質中の放射性標識アミノ酸の量を測定することになる。放射線標識タンパク質はタンパク質ゲル上でさらに分離されてもよく、オートラジオグラフィーによって生成物が適切なサイズであること、および二次タンパク質生成物が製造されていないことが確認されてもよい。
【実施例】
【００６１】
実施例１：材料および方法
植物材料
タバコ細胞（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  Ｌ．ｃｖ．Ｂｒｉｇｈｔ  Ｙｅｌｌｏｗ  ２、ＢＹ−２）を２６℃の暗所で２０〜２５％の充填細胞容量を維持しながら５Ｌ発酵槽（Ｔｙｐｅ  １００ｅ、Ａｐｐｌｉｃｏｎ（商標）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＡＣ  Ｓｃｈｉｅｄａｍ、オランダ）または振盪フラスコ中で培養した。３％（ｗ／ｖ）のスクロース、１ｍｇ／Ｌのチアミン−ＨＣｌ、０．２ｍｇ／Ｌの２，４ジクロロフェノキシ酢酸、１００ｍｇ／Ｌのミオイノシトール、２５０ｍｇ／Ｌのオルトリン酸二水素カリウム、およびＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｌ−６１消泡剤（ＢＡＳＦ（商標）、Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ、ＮＪ、ＵＳＡ）を添加したＭｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ液体培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ基底塩混合物）を使用した。
【００６２】
ＢＹ−２細胞溶解物の調製
２０〜２５％の一定の充填細胞体積での発酵の指数増殖期の間に、ＢＹ−２細胞を採取した。プロトプラストを調製するために、発酵培地中で直接的に３％（ｖ／ｖ）のＲｏｈａｍｅｎｔ（登録商標）ＣＬおよび０．２％（ｖ／ｖ）のＲｏｈａｐｅｃｔ（登録商標）ＵＦ（ペクチナーゼおよびアラバナーゼ）（ＡＢ  Ｅｎｚｙｍｅ（商標）、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で処理した。３６０ｍＭのマンニトールを添加することにより容量オスモル濃度を調節した。
【００６３】
生じたプロトプラストを脱液胞化するために、５０ｍＬのポリプロピレン管（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ（商標）、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）中の０．７Ｍのマンニトール、２０ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．０）中に（底部から上部まで）７０％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）、４０％（ｖ／ｖ、５ｍｌ）、３０％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）、１５％（ｖ／ｖ、３ｍｌ）および０％（３ｍｌ）のＰｅｒｃｏｌｌ（ＧＥ（商標）Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、ドイツ）を含有する不連続Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上にプロトプラストを層状とした。スインギング−バケットローター（ＪＳ−５．３、Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ（商標）、Ｋｒｅｆｅｌｄ  Ｇｅｒｍａｎｙ）中２５℃で１時間、６８００×ｇで遠心分離後、４０〜７０％（ｖ／ｖ）のＰｅｒｃｏｌｌ溶液境界面から脱液胞化プロトプラストを回収し、５０ｍＬ当たり１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（商標）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を添加した３〜３．５容量のＴＲ緩衝液（３０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．４）、６０ｍＭのグルタミン酸カリウム、０．５ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ）に懸濁させた。
【００６４】
次いで、プロトプラストを、Ｄｏｕｎｃｅ（商標）ホモジナイザー（Ｂｒａｕｎ（商標）、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、ドイツ）の１５ストロークを使用して氷上で破壊し、核および非破壊細胞を、５００×ｇで１０分間４℃で遠心分離することによって除去した。次いで上清を１ｍＬのアリコート中、−８０℃で凍結した。凍結の前に任意に、上清に０．５ｍＭのＣａＣｌ２を補充し、２０℃で１５分間、７５Ｕ／ｍＬのヌクレアーゼＳ７（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で処理し、その後、Ｃａ２＋イオンのキレート剤として２ｍＭのＥＧＴＡを補充してヌクレアーゼを不活性化させることができる。
【００６５】
プラスミド構築物
ベクターｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿ｅＹＦＰ−Ｈｉｓは、Ｔ７プロモーターおよび最初の６ヌクレオチドとしてＧＡＡＡＧＡを有するタバコモザイクウイルス５’オメガリーダー配列を含有するアニールしたオリゴヌクレオチドプライマー１（配列番号１）およびオリゴヌクレオチドプライマー２（配列番号２）をＮｓｐＩ部位およびＮｃｏＩ部位を使用してｐＩＶＥＸ１．３＿ｅＹＦＰ−Ｈｉｓ（Ｄｒ．Ｓｔｅｆａｎ  Ｋｕｂｉｃｋ（Ｆｒａｕｎｈｏｆｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ＩＺＩ、Ｐｏｔｓｄａｍ−Ｇｏｌｍ、ドイツ）の好意により提供された）に挿入することにより調製した。Ｎ末端ストレプトアビジンアフィニティタグを含有するベクターｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰについて、オリゴヌクレオチドプライマー３（配列番号３）およびオリゴヌクレオチドプライマー４（配列番号４）と共に鋳型としてｐＩＸ３．０＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰ（Ｄｒ．Ｓｔｅｆａｎ  Ｋｕｂｉｃｋの好意により提供された）を使用するＰＣＲによりＳｔｒｅｐ−ｅＹＦＰ配列を増幅した。ＰＣＲ産物をＰｃｉＩおよびＡｃｃ６５Ｉで消化し、ｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿ｅＹＦＰ−ＨｉｓのＮｃｏＩ部位およびＡｃｃ６５Ｉ部位に挿入した。
【００６６】
２１３３３、２２８０７、ＡＡＤ１２、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ３Ａ、Ｔｒａｐ８ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ａ、Ｃｒｙ６Ａ、１７９１２、およびＣｒｙ１Ｆを有するｐＩＶＥＸベクターは、オリゴヌクレオチドプライマー５〜２４（配列番号５〜２４）を使用する遺伝子のＰＣＲ増幅、およびＧｉｂｓｏｎアセンブリー（ＮＥＢ（商標）、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、ドイツ）によりＮｃｏＩおよびＫｐｎＩで切断したｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿ｅＹＦＰ−ＨｉｓへのＰＣＲ産物のその後の組込みにより作製した。
【００６７】
【表１】
2020507322.tif 000003
【００６８】
連結された転写翻訳無細胞タンパク質合成
連結された転写翻訳反応を、２５℃および７００ｒｐｍで４０〜５２時間、サーモミキサー（Ｄｉｔａｂｉｓ（商標）、Ｐｆｏｒｈｅｉｍ、ドイツによるＨＬＣ）中で５０μＬのアリコートにおいて実施した。クレアチンリン酸とクレアチンキナーゼとの反応液は、４０％（ｖ／ｖ）のタバコＢＹ−２細胞溶解物（ＢＹＬ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ  ７．８、１０ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、１０ｍＭのグルタミン酸カリウム、３ｍＭのＡＴＰ、１．２ｍＭのＧＴＰ、１．２ｍＭのＣＴＰ、１．２ｍＭのＵＴＰ、１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、５０ｎｇ／μＬのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、８０ｎｇ／μｌのプラスミド、３０ｍＭのクレアチンリン酸および１００μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼを含んだ。クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼを含まない反応液は、４０％（ｖ／ｖ）のＢＹＬ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ  ７．８）、９ｍＭのグルタミン酸マグネシウム、２０ｍＭのグルタミン酸カリウム、４ｍＭのＡＴＰ、１．６ｍＭのＧＴＰ、１．６ｍＭのＣＴＰ、１．６ｍＭのＵＴＰ、１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、３０ｎｇ／μＬのＴ７  ＲＮＡポメラ―ぜ、および４０ｎｇ／μＬのプラスミドを含んだ。
【００６９】
生成物の分析
ｅＹＦＰからの蛍光シグナルは、４８５／２０ｎｍの励起および５２８／２０ｎｍの吸収フィルターを用いて、Ｓｙｎｅｒｇｙ（商標）ＨＴ  Ｍｕｌｔｉ−Ｍｏｄｅ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ（商標）、Ｂａｄ  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｓｈａｌｌ、ドイツ）を使用して定量化した。ｅＹＦＰの量は、ＤＮＡ鋳型なしのＢＹＬ翻訳反応におけるｅＹＦＰの異なる濃度に基づいて標準曲線を生成することによって決定した。ｅＹＦＰ標準は、大腸菌に基づく社内でのインビトロ翻訳システム（Ｚａｗａｄａ（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０５：３１−４１）を使用して製造し、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。精製されたｅＹＦＰの濃度は、比色アッセイを使用して決定した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：  ２４８−５４．
【００７０】
標的タンパク質の残基特異的標識化
標的タンパク質をアミノ酸選択的に蛍光標識するために、ＦｌｕｏｒｏＴｅｃｔ（商標）ＧｒｅｅｎＬｙｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ（商標）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を製造業者の指示にしたがって使用した。本製品は、蛍光団ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）−ＦＬで標識された修飾電荷リシンｔＲＮＡを含有する。このシステムを使用すると、蛍光標識されたリシン残基は、翻訳中に複数の部位において新生タンパク質に組み込まれる。
【００７１】
ＪＣ−１染色
ＢＹＬ中のミトコンドリアの存在は、親油性カチオン性プローブ５，６−ジクロロ−２−［３−（５，６−ジクロロ−１，３−ジエチル−１，３−ジヒドロ−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−イリデン）−１−プロペニル］−１，３−ジエチル−ヨウ化物（ＪＣ−１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して実証した。生細胞中では、ＪＣ−１は、脱分極したミトコンドリア膜電位で緑色蛍光モノマー（４９０ｎｍ励起／５３０ｎｍ放射）として存在する。正常および過分極のミトコンドリア膜電位では、ＪＣ−１はミトコンドリア内で濃縮され、Ｊ凝集体を形成し、これは放射を５３０ｎｍから５９０ｎｍにシフトさせる。細胞ミトコンドリアは、増加していく負のミトコンドリア膜電位と共にＪ凝集体の増加的により高度になっていく赤色蛍光（５９０ｎｍ）を示す。Ｎｕｙｄｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９２：１５３−９；Ｒｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６０：４０６−１７；Ｓａｌｖｉｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１１：７７−８２．
【００７２】
ＢＹＬ染色のために、ＪＣ−１を５ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯ中に溶解した。ＪＣ−１ストック溶液を、最終濃度５μｇ／ｍＬで１０分以内にミトコンドリアを染色するために１：１０００希釈で使用した。
【００７３】
酸化的リン酸化の阻害剤を用いる無細胞タンパク質合成
無細胞タンパク質合成（５０μＬ反応）を、クレアチンリン酸およびクレアチンキナーゼのありおよびなしの両方で、ＢＹＬ系への酸化的リン酸化の阻害剤の添加のありおよびなしで行った。阻害剤は以下を含有した：アジ化ナトリウム（０．０５％、Ｂｏｇｕｃｋａ  ＆  Ｗｏｊｔｃｚａｋ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２２：３８１−９２）および２−テノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ、０．５ｍＭ）；Ｔａｐｐｅｌ（１９６０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：２８９−９６）。アジ化ナトリウムを水中に溶解した。ＴＴＡをメタノールに溶解した。メタノールを用いて実施した陰性対照は、この溶媒がこの研究で使用される濃度でタンパク質合成に影響を与えなかったことを示した。
【００７４】
実施例２：人工エネルギー再生を伴わないタンパク質合成
リン酸の放出を減少させるために、クレアチンリン酸（ＣＰ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）から成る人工再生システムは、無細胞ＢＹＬシステムで省略された。可変濃度の反応成分との反応は、ＣＰおよびＣＫありおよびなし；ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ  ７．８（０〜８０ｍＭ）、グルタミン酸マグネシウム（１〜１２ｍＭ）、グルタミン酸カリウム（０〜４０ｍＭ）、プラスミド（１０〜１００ｎｇ／μＬ（４．５〜４３ｎＭ））、ＮＴＰ（すなわち、ＡＴＰ／（ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ））（０．５／０．２〜４／１．６ｍＭ）、およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ（２０〜８０ｎｇ／μＬ）、ＣＰ（０〜４０ｍＭ）およびＣＫありおよびなしで、Ｄｅｓｉｇｎ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ＤｏＥ）ベースのアプローチ（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  ｖ８．０（Ｓｔａｔｅ−Ｅａｓｅ（商標）Ｉｎｃ．，ＭＮ，ＵＳＡ）における分別設計（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎｓ）および応答表面モデル）を利用して考案した。クロラムフェニコールの濃度は、ＣＰ／ＣＫのシステムから採用した。これらの実験から、両方のシステム（ＣＰ／ＣＫありおよびなし）に対して好ましい反応成分濃度が得られた。表２
【表２】
2020507322.tif 000004
【００７５】
ＣＰ／ＣＫありおよびＣＰ／ＣＫなしのＢＹＬシステムの比較は、ＣＰ／ＣＫなしのシステムが、約４０時間（ＣＰ／ＣＫありのＢＹＬでの２０時間と比較して）の長期的活性を示し、最大６０％多くの標的タンパク質をもたらすことを明らかにした。図１Ａ。ＢＹＬにおけるミトコンドリアの存在は、赤色で蛍光を発する選択的色素ＪＣ−１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたＢＹＬの染色によって実証され、ミトコンドリアはＢＹＬにおいてそれらの特徴的な膜電位を保持することを示した。酸化的リン酸化によるエネルギー再生は、電子伝達系の二つの異なる阻害剤であるアジ化ナトリウムおよびテノイルトリフルオロアセトン（ＴＴＡ）の使用によって実証された。アジ化ナトリウムおよびＡＴＰの両方は、標的タンパク質ｅＹＦＰの劇的に減少した生合成によって示されるように、システムをほぼ完全に阻害することが見出された。図１（Ｂ）。
【００７６】
ＣＰ／ＣＫなしのシステムにおけるエネルギーは、酸化的リン酸化によって提供されると考えられる。追加されたグルタミン酸マグネシウムおよびグルタミン酸カリウム由来のグルタミン酸は、ミトコンドリア内のクエン酸回路において代謝され、還元同等物であるＮＡＤＨおよびＦＡＤＨの生成がもたらされる。電子は、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨを介して電子伝達系に入り、分子状酸素の消費による酸化的リン酸化を通してＡＴＰを生成する。図２。
【００７７】
ＣＰ／ＣＫなしのＢＹＬシステム内の１０個の標的タンパク質の発現を、ＣＰ／ＣＫありのＢＹＬシステムと比較した。クレアチンリン酸（ＣＰ）およびクレアチンキナーゼ（ＣＫ）ありおよびなしの連結されたＢＹＬ転写翻訳反応は、２５℃で４０時間行った。それぞれの場合に、２μＬの反応容量を４〜１２％（ｗ／ｖ）の勾配のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにロードし、合成されたタンパク質の量をクマシー染色によって視覚化した。ＡＡＤ１２、Ｃｒｙ３Ａ、およびＣｒｙ１Ｆを含むいくつかの標的タンパク質は、クマシー染色ゲル中の強いバンドで表現されるように、最適化されたシステム（ＣＰ／ＣＫなし）において有意に高い発現レベルを示した。
【００７８】
人工エネルギー再生システムを持たないＢＹＬシステムは、安価かつより長く実行され、組み換え型タンパク質のレベルの増加につながる。さらに、ＢＹＬシステムは、ミトコンドリア機能に影響を与える化合物またはタンパク質を調査する可能性を提供する。
【００７９】
実施例３：人工エネルギー再生を伴わない連結された転写翻訳反応の修正
ＢＹ−２溶解物調製のためのソルビトールの使用
ＢＹ−２溶解物の調製のために、プロトプラスト形成および脱液胞化の間に容量オスモル濃度を調整するために多量の浸透性物質が必要である。マンニトールはこの目的のために日常的に使用され、溶解物調製の合計コストの約１０％を占める。浸透性物質としてソルビトール（約１０倍安価）を試験した。プロトプラスト形成および脱液胞化のためにマンニトールまたはソルビトールを使用した並行実験では、ソルビトールが驚くべきことにマンニトールとは同等ではなく、ｅＹＦＰの発現により決定される溶解物の収量および溶解物の品質の両方に関してより優れていることが明らかとなった（図５）。さらに、ソルビトールのより高い溶解性が、緩衝液の調製を促進することが判明した。しかしながら、脱液胞化したプロトプラストの最終洗浄のためにはマンニトールがソルビトールより優れていることも判明し、この工程でのソルビトールの利用はより低いｅＹＦＰ収量およびより粘性の反応混合物につながった。
【００８０】
微生物増殖の阻害
ＢＹ−２溶解物は、ＩＶＴＴ反応液がインキュベートされた時に微生物の増殖をサポートする能力があり、結果として反応基質の枯渇をもたらし、結果的に標的タンパク質の収量が低下する。したがって、いくつかの抗菌物質をＩＶＴＴ反応システムで試験した。ＩＶＴＴでのｅＹＦＰ産生および微生物増殖に対する効果に関して、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、およびアジ化ナトリウムを調査した。
【００８１】
抗菌物質をＢＹＬ反応液に加え、４５時間のインキュベーション後、０．２μＬのＢＹＬ反応混合物をＬＢプレート上に蒔き、微生物増殖を分析した。スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、およびアジ化ナトリウムは、微生物増殖に対して阻害効果を有しないか、またはｅＹＦＰの収量に有害な影響を示した。例えば、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度でのアジ化ナトリウムは、恐らくミトコンドリアのエネルギー再生を阻害することにより、微生物増殖および翻訳活性の両方をほぼ完全に阻害した。クロラムフェニコールのみが、翻訳活性のいかなる喪失もなしに微生物の増殖を阻害することができ（図３Ｂ；図３Ｃ）、それにより、ＩＶＴＴシステムにおける有用性が少なくともその他の抗菌物質とは異なる。用量応答試験は、１００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールで最も高いｅＹＦＰ収量が達成されたが（図３Ｄ、２００μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールで微生物増殖の完全な阻害が得られた（図３Ａ）ことを指し示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析もまた、ｅＹＦＰ収量およびタンパク質安定性に対するクロラムフェニコールの保護効果を示した。クロラムフェニコールの存在下で実施した反応とは異なり、クロラムフェニコールなしの反応は有意なタンパク質分解を示した。
【００８２】
ヌクレオシド三リン酸
システム内のＮＴＰの濃度をＤｏＥベースのアプローチによって調整した。ＡＴＰおよびＧＴＰは転写および翻訳の両方で使用される一方、ＣＴＰおよびＵＴＰは転写でのみ使用されるため、ＣＴＰおよびＵＴＰと比較して高濃度のＡＴＰおよびＧＴＰは連結されたＩＶＴＴシステムに対して有益であると予測された。したがって、単一のＮＴＰの濃度は、異なる量の固定ＮＴＰミックスを使用する代わりに、ＤｏＥベースの実験で変化させた。これらは、９６回の実験での三次ＩＶ最適設計（ｃｕｂｉｃ  ＩＶ−ｏｐｔｉｍａｌ  ｄｅｓｉｇｎ）を使用して最適濃度についてスクリーニングされた。ＩＶＴＴ反応用のプラスミド鋳型は、ｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰであった。グルタミン酸マグネシウムの濃度は、ＮＴＰのマグネシウムへの結合によって調節した。表３は、スクリーンされた各因子の濃度範囲を示す。二次モデル（ｑｕａｄｒａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌ）を実験データにフィッティングさせた。応答表面モデルを使用して、最も多くの生成ｅＹＦＰタンパク質を生じる因子の値を予測した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。すべての非有意項（ＡＮＯＶＡによりｐ＞０．０５）を無視し、モデルはＡＮＯＶＡ表において有意であることが示された（表４）。
【００８３】
実験により、反応において、最も多くの標的タンパク質が６ｍＭのＡＴＰ、０．８ｍＭのＣＴＰ、０．８ｍＭのＵＴＰ、および１．６ｍＭのＧＴＰで産生されることが明らかになった。図４    これらの結果は、１５０／４０／２０／２０ｍＭのＡＴＰ／ＧＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰからなる新しいＮＴＰミックスの開発につながった。２μｌの新しいＮＴＰミックスを使用すると、ＩＶＴＴシステムでｅＹＦＰの収量は２０％増加した。追加的な利益として、新しいＮＴＰミックスは、他のヌクレオチドと比較して、ＡＴＰの１０〜１５倍の低コストのため、標準ミックスよりも約４０％コストが低い。
【００８４】
【表３】
2020507322.tif 000005
【００８５】
【表４】
2020507322.tif 000006
【００８６】
より多くの溶解物量の使用
標的タンパク質発現に対するＩＶＴＴ反応の溶解物部分の増加の効果を調査するために、マンニトールを用いて調製したＢＹＬの他に、プロトプラスト形成および脱液胞化中にソルビトールを用いて調製したいくつかのＢＹ−２溶解物を使用して、４０％（２０μｌ）または６０％（３０μｌ）の溶解物を用いる５０μｌの反応を行った。プラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを鋳型として使用して、２５℃および７００ｒｐｍで４８時間にわたって反応を実施した。ソルビトールで調製した６０％（ｖ／ｖ）の溶解物を用いる反応は約１ｍｇ／ｍＬのｅＹＦＰを達成し、これは標準反応混合物と比較して８０％高い収量に対応する（図５）。リボソーム、翻訳因子、シャペロン、およびミトコンドリアの増加した量がエネルギー生成を増加または長期化させ、それによってより高い収量が得られたと推定される。この結果は、そのような大量においてより大きな阻害を生成する有害因子を溶解物が含まないことを示す。
【００８７】
人工エネルギー再生システムを伴わない無細胞システムおよび小麦胚芽抽出物における標的タンパク質の発現
人工エネルギー再生を伴わない無細胞発現システムが、基質全体にわたり一般的に効果的であることを確認するために、該システムを使用して、ｅＹＦＰ以外の１０個の追加的な標的遺伝子産物を発現させた。Ｓｔｒｅｐタグ化ｅＹＦＰおよび他の１０個の標的タンパク質を、ソルビトールを用いて調製した６０％のＢＹ−２細胞溶解物中、マンニトールを用いて調製した４０％のＢＹ−２細胞溶解物中、およびＣｅｌｌＦｒｅｅ（商標）ＳｃｉｅｎｃｅｓのＷＧＥシステムで発現させた。連結された転写翻訳反応を、５０μＬの容量で２５℃および７００ｒｐｍで４０時間にわたって実施した。ＷＧＥシステムを使用した連結された転写および翻訳反応は、製造業者の指示にしたがって行った。それぞれの場合に、１μＬの反応混合物および混合された二層反応液をそれぞれ４〜１２％（ｗ／ｖ）の勾配のＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにロードし、標的タンパク質をクマシー染色により視覚化した。ＢＹＬシステムは、試験した異なる遺伝子のうちの一つごとに成功裏に転写し、また転写後に翻訳を行ってあらゆる場合にタンパク質を産生した。実際、ＢＹＬシステムは、ＷＧＥシステムを使用して製造されたものと比較して、一貫してより強いバンドを生じさせた。Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰについて、三つのシステムで産生されたタンパク質を蛍光リーダーを使用して定量し、ｅＹＦＰ標準曲線と比較したところ、１１１５μｇ／ｍＬおよび４４１μｇ／ｍＬがＢＹＬシステムの２セットの条件下で産生され、ＷＧＥシステムでは１０５μｇ／ｍＬのみが産生されたことが明らかになった。
【００８８】
グルコシルグリセロールの添加およびより高い溶解物量の使用
人工的なエネルギー再生を伴わない無細胞溶解物の安定性を増加させるために、細胞および／またはタンパク質の凍結保護剤として記述された小分子が溶解物の翻訳活性を維持させることができるという仮説を立てた。こうした分子は極限環境微生物中に天然に存在し、浸透圧ストレス、熱、乾燥、およびＵＶ光から極限環境微生物を保護し、表面での水密度の増加を引き起こしてタンパク質の天然コンホメーションを促進することにより膜およびタンパク質を安定化させる。しかしながら、凍結保護剤はＩＶＴＴシステムに強い阻害効果を呈することが予想された。
【００８９】
異なる濃度の凍結保護剤、エクトイン、ヒドロキシエクトイン、およびグルコシルグリセリドを連結されたＩＶＴＴ反応に添加し、鋳型プラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰから産生されたｅＹＦＰの量を決定した。５０μＬのＩＶＴＴ反応（６０％（ｖ／ｖ）のＢＹＬ）を、９６ウェルプレート中、２５℃および５００ｒｐｍで４４時間、Ｋｕｈｎｅｒシェーカー（商標）の制御湿度で実施した。
【００９０】
エクトインおよびヒドロキシエクトインは、それぞれ最大１％および２％（ｖ／ｖ）の濃度でｅＹＦＰの収量に影響を与えなかった。図６    実際、より高濃度のエクトインおよびヒドロキシエクトインがシステムを阻害した。対照的に、グルコシルグリセロールは、ｅＹＦＰの収量に強い正の影響を及ぼした。０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロールを含む反応液は、グルコシルグリセリドを含まない標準反応液と比較して、４４時間後に約５０％多くのｅＹＦＰをもたらした。図６    
グルコシルグリセロールの正の影響は、０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロールなしおよびありでのＩＶＴＴ反応において五つの異なる溶解物バッチ（ＢＹＬ  ０８．０１．２０１６、ＢＹＬ  ２１．０１．２０１６、ＢＹＬ  １１．０３．２０１６、ＢＹＬ  ０１．０４．２０１６、ＢＹＬ  ０５．０４．２０１６）にわたって一貫していた。５０μＬのＩＶＴＴ反応を、９６ウェルプレート中２５℃および５００ｒｐｍで４８時間、制御湿度（７０％）下で、鋳型としてプラスミドｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを使用して６０％および８０％（ｖ／ｖ）の溶解物部分を用いて三連で実施した。６０％（ｖ／ｖ）の溶解物および０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロールを使用する反応では、グルコシルグリセロールなしの反応と比較して、約８０％多くのｅＹＦＰが産生された。図７    ８０％（ｖ／ｖ）の溶解物および０．５％（ｖ／ｖ）のグルコシルグリセロールを使用すると、ｅＹＦＰの収量は、グルコシルグリセリドなしの８０％（ｖ／ｖ）溶解物を使用する反応と比較して約１１０％（ほぼ２ｍｇ／ｍＬのｅＹＦＰ）増加した。図７    
人工エネルギー再生を伴わない無細胞システムにおけるＩＶＴＴ反応の時間経過を、６４時間までの異なる時点で産生されたタンパク質の量を測定することによって決定した。図８    １６時間後、０．５％グルコシルグリセロールありまたはなしでの６０％または８０％の溶解物を使用した反応は、ほぼ同量のタンパク質を産生した。図８    グルコシルグリセロールなしで、６０％および８０％（ｖ／ｖ）の両方の溶解物における翻訳活性は、２４時間後にさらに増加しなかった。図８    しかしながら、グルコシルグリセロールを用いたｅＹＦＰ産生は、６０％および８０％（ｖ／ｖ）の両方の溶解物で、少なくとも６４時間まで生産性のほぼ直線的な増加を示した。図８    この結果は、グルコシルグリセロールが、翻訳活性を６４時間を超えて延長するシステムに対する安定化効果を有することを裏付ける。平均して、８０％（ｖ／ｖ）の溶解物および０．５％（ｖ／ｖ）グルコシルグリセロールを用いる反応は、ほぼ２．５ｍｇ／ｍＬのｅＹＦＰをもたらした。
【００９１】
分岐鎖アミノ酸の添加．
無細胞発現系におけるタンパク質合成を促進する分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の能力も試験し、ＢＣＡＡの添加が標的タンパク質の収量を増加および安定化させることが観察された。システムに対するＢＣＡＡの正の効果を検証するために、振盪フラスコ（ＳＦ）または連続発酵（ＣＦ）から調製した四つの溶解物を使用する連結されたＩＶＴＴ反応に異なる濃度のＢＣＡＡを加えた。Ｋｕｈｎｅｒ（商標）シェーカー中の制御された湿度においてプラスミド鋳型ｐＩＶＥＸ＿ＧＡＡＡＧＡ＿Ｏｍｅｇａ＿Ｓｔｒｅｐ−ｅＹＦＰを使用する２５℃および５００ｒｐｍでの６６時間の９６ウェルプレート中での８０％（ｖ／ｖ）溶解物を用いる５０μＬのＩＶＴＴ反応において、溶解物が振盪フラスコから調製されたのか、それとも連続発酵から調製されたのかに関わらず、ＢＣＡＡは試験した全濃度においてｅＹＦＰの収量に正の影響を有した。図９    １ｍＭのＢＣＡＡを含む反応により、ＢＣＡＡなしの反応と比較して、約７０％多くのｅＹＦＰ（１ｍＬ当たり２．５ｍｇのｅＹＦＰの平均収量）が得られた。
【図１Ａ】
2020507322.tif 000007
【図１Ｂ】
2020507322.tif 000008
【図２】
2020507322.tif 000009
【図３Ａ】
2020507322.tif 000010
【図３Ｂ】
2020507322.tif 000011
【図３Ｃ】
2020507322.tif 000012
【図３Ｄ】
2020507322.tif 000013
【図４】
2020507322.tif 000014
【図５】
2020507322.tif 000015
【図６】
2020507322.tif 000016
【図７】
2020507322.tif 000017
【図８】
2020507322.tif 000018
【図９】
2020507322.tif 000019
【配列表】
2020507322000001.app
【国際調査報告】
2020507322.tif 000020