(57)【要約】本発明は、家畜哺乳動物、特に牛の低カルシウム血症の疾病を予防、治療および／または処置する方法を提供する。具体的には、ビタミンＤ誘導体、特に１α−ヒドロキシビタミンＤ３および／または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の疾病を予防、治療および／または処置するビタミンＤ誘導体の投与方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の予防方法。
【請求項２】
家畜哺乳動物が牛である請求の範囲１に記載の低カルシウム血症の予防方法。
【請求項３】
ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する請求の範囲１または２に記載の低カルシウム血症の予防方法。
【請求項４】
膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を予防する請求の範囲１乃至３のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の予防方法。
【請求項５】
ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である請求の範囲１乃至４のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の予防方法。
【請求項６】
ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の治療方法。
【請求項７】
家畜哺乳動物が牛である請求の範囲６に記載の低カルシウム血症の治療方法。
【請求項８】
ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する請求の範囲６または７に記載の低カルシウム血症の治療方法。
【請求項９】
膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を治療する請求の範囲６乃至８のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の治療方法。
【請求項１０】
ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である請求の範囲６乃至９のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の治療方法。
【請求項１１】
ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の処置方法。
【請求項１２】
家畜哺乳動物が牛である請求の範囲１１に記載の低カルシウム血症の処置方法。
【請求項１３】
ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する請求の範囲１１または１２に記載の低カルシウム血症の処置方法。
【請求項１４】
膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を処置する請求の範囲１１乃至１３のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の処置方法。
【請求項１５】
ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である請求の範囲１１乃至１４のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の処置方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は家畜動物の低カルシウム血症の予防、治療および／または処置方法に関する。さらに詳しく言えば、本発明は家畜哺乳動物にビタミンＤ誘導体を経膣投与してその低カルシウム血症を予防、治療および／または処置する方法に関するものである。
【背景技術】  乳牛における分娩性低カルシウム血症に対する予防、治療および／または処置法の一つとして一般的にビタミンＤ３（以下、ＶＤ３と略記することがある。）が使用されている。
ＶＤ３は、肝臓において２５−ヒドロキシビタミンＤ３へ代謝され、腎臓においてさらに１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（以下、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３と略記することがある。）へ代謝される。
カルシウム代謝を調節するＶＤ３代謝物の中でも生理学的に最も活性な１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を乳牛へ投与し低カルシウム血症を予防、治療および／または処置する方法も試みられている（特開昭６１−２３３６２０号公報（関連出願：米国特許第３２２４６２号）およびＧａｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．６２巻：１００９〜１０１３頁，１９７９年参照）。
薬物の投与を膣を経由して行うことは、古代エジプト時代から知られている。前世紀には、ヒトと動物でエストロジェン、プロジェステロン、プロスタグランジン、抗生物質、ノノキシノール９、メタゾン、無機化合物などの多くの物質の膣からの吸収が確認されている。
近年、牛において発情周期の調節のためにプロジェステロンを含んだ膣内挿入物が広く用いられている（特表２００１−５２３５１５号公報（関連出願：国際公開第９９／２６５５６号パンフレット）およびＪ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．７０巻：２１６２〜２１６７頁，１９８７年参照）。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は、乳牛の分娩性低カルシウム血症の予防、治療および／または処置のために、静脈、筋肉および経口投与法で用いられてきたが、その膣内投与の有効性について知見は得られていない。
【発明の開示】
本発明の課題は、家畜哺乳動物にビタミンＤ誘導体を経膣投与することにより、家畜哺乳動物の低カルシウム血症、特に牛の死亡および廃用の主要原因の一つである分娩時起立不能症等の疾病を容易に予防、治療および／または処置する方法を提供することにある。
本発明者らは、脂溶性ビタミンであるビタミンＤ、ＡおよびＥ類を牛に経膣投与しその吸収性について鋭意研究した結果、これら脂溶性ビタミン類の吸収性は一般に低いが、特定のビタミンＤ誘導体のみが良好に膣から容易に吸収され低カルシウム血症の疾病の予防、治療および／または処置に有効であるとの知見を得て本発明を完成した。
すなわち、本発明は、家畜哺乳動物にビタミンＤ誘導体を経膣投与することにより家畜哺乳動物、例えば牛、馬、羊、山羊、豚、犬、猫の低カルシウム血症の疾病（特に牛の起立不能症等）の予防、治療および／または処置に有用な、下記１〜１５のビタミンＤ誘導体の投与方法を提供するものである。
１．ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の予防方法。
２．家畜哺乳動物が牛である前記１に記載の低カルシウム血症の予防方法。
３．ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する前記１または２に記載の低カルシウム血症の予防方法。
４．膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を予防する前記１乃至３のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の予防方法。
５．ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である前記１乃至４のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の予防方法。
６．ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の治療方法。
７．家畜哺乳動物が牛である前記６に記載の低カルシウム血症の治療方法。
８．ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する前記６または７に記載の低カルシウム血症の治療方法。
９．膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を治療する前記６乃至８のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の治療方法。
１０．ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である前記６乃至９のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の治療方法。
１１．ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与することを特徴とする低カルシウム血症の処置方法。
１２．家畜哺乳動物が牛である前記１１に記載の低カルシウム血症の処置方法。
１３．ビタミンＤ誘導体を含む膣内挿入物を膣腔へ投与する前記１１または１２に記載の低カルシウム血症の処置方法。
１４．膣内投与されたビタミンＤ誘導体が家畜哺乳動物の膣腔で吸収されその体内でカルシウム濃度を上げることにより疾病を処置する前記１１乃至１３のいずれか１項に記載の低カルシウム血症の処置方法。
１５．ビタミンＤ誘導体が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である前記１１乃至１４のいずれが１項に記載の低カルシウム血症の処置方法。
発明の詳細な説明
本発明で、家畜哺乳動物の膣腔に投与するビタミンＤ誘導体としては、下記一般式（１）
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（式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素原子を表わすか、またはＲ１とＲ２とは一緒になって二重結合を形成していてもよく、Ｒ３は水素原子またはメチル基を表わし、Ｒ４は水素原子またはヒドロキシル基を表わす。）で示されるビタミンＤ誘導体が挙げられる。
上記一般式（１）で示されるビタミンＤ誘導体の具体例としては、Ｒ１とＲ２とが一緒になって二重結合を形成しＲ３がメチル基を表わすカルシフェロール誘導体（ビタミンＤ２誘導体）、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３がそれぞれ水素原子を表わすコレカルシフェロール誘導体（ビタミンＤ３誘導体）が挙げられる。
これらビタミンＤ２誘導体およびビタミンＤ３誘導体の中でも、１α−ヒドロキシビタミンＤ誘導体および／または１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ誘導体が好ましく、その代表例として、１α−ヒドロキシビタミンＤ２、１α−ヒドロキシビタミンＤ３、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３が挙げられる。
膣腔への投与は、ビタミンＤ誘導体を含んだ膣内挿入物を用いて行われる。膣内挿入物の形態（デリバリータイプ）としては一般に用いられている、ジェル、タブレット、マイクロスフェアー、ＣＩＤＲなどを利用することができる。
ビタミンＤ誘導体の膣粘膜からの吸収は、膣腔に投与したビタミンＤ誘導体と数種のミネラル（カルシウム（Ｃａ）、無機リン（ｉＰ）およびマグネシウム（Ｍｇ））の変化を観察することにより確認することができる。
例えば牛の膣腔に、エタノールの溶解した１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を体重１ｋｇあたり１μｇ程度の割合で膣内に投与し、エタノールを投与した対照と比較することにより確認できる。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与した牛は、血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３値が変動し、血漿Ｃａ値、血漿ｉＰ値、血漿Ｍｇ値が変動する。その血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３値の変動を観測することにより、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の吸収を確認することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、実施例１における１α−ＶＤ３の膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３）濃度の経時的な推移を示す。
図２は、実施例１における１α−ＶＤ３の膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中カルシウム（Ｃａ）濃度の経時的な推移を示す。
図３は、実施例１における１α−ＶＤ３の膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中無機リン（ｉＰ）濃度の経時的な推移を示す。
図４は、実施例１における１α−ＶＤ３の膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中マグネシウム（Ｍｇ）濃度の経時的な推移を示す。
図５は、比較例１におけるＶｉｔＡＤ３Ｅの膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中ビタミンＡ（ＶｉｔＡ）濃度の経時的な推移を示す。
図６は、比較例１におけるＶｉｔＡＤ３Ｅの膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中ビタミンＥ（ＶｉｔＥ）濃度の経時的な推移を示す。
図７は、比較例１におけるＶｉｔＡＤ３Ｅの膣内投与による各供試牛（ＣｏｗＡ、ＣｏｗＢ）ごとの血中２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５−ＯＨＤ３）濃度の経時的な推移を示す。
図８は、実施例２において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３（ｎ＝５；●）およびエタノール（ｎ＝１；■）を膣内に投与された育成雌牛における血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３濃度の経時的変化を示す。
図９は、実施例２において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３（ｎ−５；●）およびエタノール（ｎ＝１；■）を膣内に投与された育成雌牛における血漿ミネラル（Ｃａ、ｉＰおよびＭｇ）濃度の経時的変化を示す。
図１０は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３濃度の経時的推移を示す。ただし、図１０中、「ｉｖ」は静脈投与を示している（図１１〜図１６においても同じ。）。
図１１は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における血漿Ｃａ濃度の経時的推移を示す。
図１２は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における血漿ｉＰ濃度の経時的推移を示す。
図１３は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における血漿Ｍｇ濃度の経時的推移を示す。
図１４は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における尿Ｃａ／クレアチニン（Ｃｒｅ）値の経時的推移を示す。
図１５は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における尿ｉＰ／クレアチニン（Ｃｒｅ）値の経時的推移を示す。
図１６は、実施例３において１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内に投与された育成雌牛における尿Ｍｇ／クレアチニン（Ｃｒｅ）値の経時的推移を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例および比較例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらによってなんら限定されるものではない。下記の例において、血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３濃度の測定は放射免疫キット（１，２５−（ＯＨ）２Ｄ  ＲＩＡ  ｋｉｔ，Ｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫ）を用いて行った。血漿および尿中の、Ｃａ濃度はオルトクレゾールフタレイン  コンプレクソン（Ｏ−ＣＰＣ；ｏｒｔｈｏｃｒｅｓｏｌｐｈｔｈａｌｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘｏｎｅ）法により、無機リン（ｉＰ）濃度はモリブデン（Ｍｏ）法により、マグネシウム（Ｍｇ）濃度はキシリジルブルー（ｘｙｌｉｄｙｌ  ｂｌｕｅ）法により測定した。尿中クレアチニン濃度はヤッフェ（Ｊａｆｆ▲ｅ▼）法によって測定した。尿中のカルシウム（Ｃａ）、無機リン（ｉＰ）、およびマグネシウム（Ｍａ）濃度は、クレアチニン（Ｃｒｅ）に対する比（それぞれＣａ／Ｃｒｅ、ｉＰ／Ｃｒｅ、およびＭａ／Ｃｒｅ）で示した。
【実施例１】  １α−ヒドロキシビタミンＤ３を牛の膣腔に投与し血液生化学的変化を観察した。
供試動物として、下記ホルスタイン種乳牛２頭（ＣｏｗＡおよびＣｏｗＢ）を使用した。試験期間中、屋外パドックにて乾草の自由採食（自由飲水）・配合飼料２ｋｇ／日（ＤＭ中ＴＤＮ６４．１％，ＣＰ１３．６％，Ｃａ０．２％，Ｍｇ０．０９％，Ｋ１．３９％）として飼い養った。
ＣｏｗＡ：２歳１１ヶ月齢，雌、１産，卵巣摘出済み，５６０ｋｇ
ＣｏｗＢ：２歳１０ヶ月齢，雌，１産，卵巣摘出済み，５８０ｋｇ
下記の供試薬剤を用いた。
１α−ヒドロキシビタミンＤ３（１α−ＶＤ３；日清ファルマ製，粉体）
試験内容およびスケジュールは下記のとおりとした。
１．対照試験：２０％エタノール４ｍＬ膣内投与（１週間）
２．１α−ＶＤ３試験：１α−ＶＤ３１μｇ／ｋｇ（体重比）を２０％エタノール４ｍＬに溶解して膣内投与（２週間）
下記の方法で膣内投与した。
供試牛を予め排尿させ、氷水上にて上記試薬を調製後、１０ｍＬプラスチック・シリンジにて膣内深部に投与し、直ちに瞬間接着剤にて外陰部皮膚を閉鎖した。
各試験における採血時間は、投与直前（０ｈｒ）と投与後０．５、１、２、３、６、１２、２４、４８、７２時間（ｈｒｓ）とした。
下記の項目について血液生化学的検査を行った。
対照試験：１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３［１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３］、カルシウム（Ｃａ）、無機リン（ｉＰ）、マグネシウム（Ｍｇ）。
１α−ＶＤ３試験：１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、Ｃａ、ｉＰ、Ｍｇ。
得られたデータの解析は、供試牛ごとに１α−ＶＤ３試験の各血液生化学的検査成績を対照試験の成績と比較し、各薬剤の膣内吸収の有無を検討することにより行った。
上記方法により１α−ＶＤ３の膣内投与による血中１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、Ｃａ、ｉＰおよびＭｇ濃度の推移を観測した。１α−ＶＤ３を膣内投与した場合における濃度推移の観測成績を図１〜図４に示す。
本実施例１の成績と下記比較例１の成績を比較考察すると、１α−ＶＤ３の膣内投与では、１α−ＶＤ３は膣壁より体内に吸収され、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３へ速やかに変換されることによりＣａ代謝に影響を与えることが分かる。
下記比較例１のビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥの膣内投与では、投与した薬剤が膣壁から吸収された証拠は確認されなかった。
比較例１
供試薬剤、試験内容および血液生化学的検査項目を下記（１）〜（３）に記載のとおりとした以外は実施例１と同様にして、ビタミンＡ、ビタミンＤ３、ビタミンＥを牛の膣腔に投与し、投与後の血液生化学的な変化を観測した。
（１）供試薬剤
ビタミンＡ（ＶｉｔＡ；薬剤製造用原体，液体）、
ビタミンＤ３（ＶｉｔＤ３；薬剤製造用原体，液体）、
ビタミンＥ（ＶｉｔＥ；薬剤製造用原体，液体）。
（２）試験内容
ＶｉｔＡＤ３Ｅ試験：１頭当たりＶｉｔＡ（１０００万ＩＵ）＋ＶｉｔＤ３（５００万ＩＵ）＋ＶｉｔＥ（９２０ＩＵ）を２０％エタノールにて８ｍＬにメスアップして膣内投与
（３）血液生化学的検査項目
対照試験：ＶｉｔＡ，２５−ヒドロキシビタミンＤ３（２５−ＯＨＤ３）、ＶｉｔＥ、カルシウム（Ｃａ）、無機リン（ｉＰ）、マグネシウム（Ｍｇ）。
ＶｉｔＡＤ３Ｅ試験：ＶｉｔＡ、２５−ＯＨＤ３、ＶｉｔＥ。
得られたデータの解析は、供試牛ごとにＶｉｔＡＤ３Ｅ試験の各血液生化学的検査成績を対照試験の成績と比較し、各薬剤の膣内吸収の有無を検討することにより行った。
上記方法によりＶｉｔＡＤ３Ｅの膣内投与による血中ＶｉｔＡ，２５−ＯＨＤ３およびＶｉｔＥ濃度の推移を観測した。ＶｉｔＡＤ３Ｅを膣内投与した場合における濃度推移の観測成績を図５〜図７に示す。
本比較例１の成績と前記実施例１の成績を比較考察すると、実施例１の１α−ＶＤ３の膣内投与では、１α−ＶＤ３は膣壁より体内に吸収され、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３へ速やかに変換されることによりＣａ代謝に影響を与えることが分かるが、比較例１のＶｉｔＡＤ３Ｅの膣内投与では、投与薬剤が膣壁から吸収された証拠は確認されなかった。
【実施例２】  牛の膣腔に投与した１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣吸収を確認するために、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を雌牛の膣内に投与した後の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３とミネラルの血液生化学的な変化を観測した。
臨床的に健康な６頭のホルスタイン種雌牛（３〜６ケ月齢、体重９７〜１１８ｋｇ）を同じ囲いの中で、ミネラル摂取量が日量Ｃａ２１ｇ、Ｐ１３ｇ、Ｍｇ４ｇでＮＲＣ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ）の要求量を満たす飼料（乾物としてイネ科牧草１．５６ｋｇ、配合飼料０．５５ｋｇ、アルファルフアヘイキューブ１．４４ｋｇ）を毎日与えて、水は自由飲水として飼い、少なくとも１週間飼い馴らした。
５頭の雌牛各々に、体重１ｋｇあたり１μｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３（メルシャン（株）製の結晶を９９％エタノールにて１ｍｇ／ｍＬの濃度になるように溶解し、使用直前まで−２０℃にて冷凍保存したもの）を膣内投与した。
膣内投与は、１４ゲージ６４ｍｍ長の注射用留置針の外套（Ｓｕｒｆｌｏ，Ｔｅｒｕｍｏ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ）とプラスチックポンプ（Ｔｏｐ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｓｙｒｉｎｇｅ，Ｔｏｐ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｉｗａｎ）を用いて行った。
他の１頭の雌牛には、対照として９９％エタノール３．０ｍＬを投与した。
ヘパリン加血液サンプルは、投与直前（０ｈｒ）と投与後２、６、１２、２４、４８、７２および９６時間に頚静脈から採取した。
血液生化学値は、平均値±標準偏差として表現した。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３膣内投与の効果をみるために反復測定分散分析を用い、効果が有意であった場合には０時の値と投与後のそれぞれの値をＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ多重比較により検定した。有意差は、Ｐ＜０．０５とした。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与した雌牛において、血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、Ｃａ、ｉＰおよびＭｇ濃度に有意な変化が認められたが、これら変動する血漿濃度は、ｉＰを除いてエタノール投与による影響を受けなかった（図８および図９）。
図８から明らかなように、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与した雌牛における血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３濃度の値は、０時の値に比べ有意（ｂ）Ｐ＜０．０１）な変化が認められる。
また、図９から明らかなように、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与した雌牛における血漿ミネラル（Ｃａ，ｉＰおよびＭｇ）濃度の値は、０時の値に比べ有意（ａ）Ｐ＜０．０５，ｂ）Ｐ＜０．０１）な変化が認められる。
血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は、投与前（０時間）に８８．３±２０．３ｐｇ／ｍＬであったものが１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与後６時間には１９６７．４±１１３９．６ｐｇ／ｍＬへと有意（Ｐ＜０．０１）に増加して高まり、その後低下した。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与雌牛の血漿Ｃａ濃度は、投与前値（１０．４±０．４ｍｇ／ｄＬ）に比べ投与後１２〜７２時間で有意（Ｐ＜０．０１）に高く、２４時間には最高値（１１．９６±０．７ｍｇ／ｄＬ）を示した。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与した雌牛において観察された血漿ｉＰ濃度の変動は、エタノール投与を受けた１頭のものと同様であった。
血漿ｉＰ値は、０時の値（７．３±０．５ｍｇ／ｄＬ）と比較すると１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与後６時間（８．１±０．８ｍｇ／ｄＬ；Ｐ＜０．０５）と２４〜９６時間（９．１±０．７〜８．６±０．６ｍｇ／ｄＬ；Ｐ＜０．０１）で有意に高かった。
血漿Ｍｇ値は、０時の値（２．１±０．１ｍｇ／ｄＬ）と比較すると、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３投与後２４および４８時間（１．８±０．１および１．８±０．１ｍｇ／ｄＬ）で有意（Ｐ＜０．０１）に低かった。
本結果では、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与２時間の雌牛にのみ血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の急激な増加と高まりが観察された。
これにより、牛の膣壁からの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の吸収が確認された。
なお、上記血漿１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３濃度変動の様子は、非泌乳、非妊娠の成牛に１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を筋注して観察した結果と類似している。また、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の主な生理作用は、血漿ＣａおよびｉＰ濃度を腸管からの吸収により増加させ高めることであるが、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与した育成雌牛における本結果は、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の静注により血漿中のＣａおよびｉＰ値が高いレベルに導かれるのに類似している。
しかしながら、本実験結果ではエタノールを投与した育成雌牛に血漿ｉＰ濃度の初期の低下とその後の上昇がみられた。
ウサギを用いた血漿ｉＰ値の同様な二相性の変化では、低リン血症はエタノールがエタノールデヒドロゲナーゼによって触媒される代謝過程のために初期におこり、高リン血症はその後にエタノールの代謝物であるアセトアルデヒドによって誘導されていると考えられている。
それ故に、本実験の血漿ｉＰ濃度の変化から１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３ばかりでなくエタノールもまた牛の膣壁を通して吸収されると考えられる。
成牛に１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を筋注した後あるいは膣内に投与した後の低Ｍｇ血症の原因は明らかではないが、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は尿細管のＭｇ再吸収を低下させることによってＭｇの腎排泄の増加を起こすことによると考えられる。
牛の膣上皮の厚さは、卵巣ホルモンの分泌に応答して変化すると考えられている。本実施例で用いた育成雌牛は、春機発動に達していない。それ故に、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣からの吸収は膣上皮の厚みの変化が無く、薄いので成牛におけるよりも安定していると考えられる。しかしながら、本実験結果は分娩性低Ｃａ血症の予防に１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣内投与が充分可能であることを示している。
【実施例３】  供試動物として、３〜９歳、体重６１６〜８０４ｋｇの卵巣摘出ホルスタイン雌牛５頭を使用し、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣内投与ルートの用量反応テストを行った。
雌牛をしきり棒につなぎ毎日５．３ｋｇのオオアワガエリの干し草と、０．１８ｋｇのアルファルファの干し草と、０．７１ｋｇのビートパルプペレットと１．７ｋｇの市販の穀物ミックスを与え、ＤＭ  ｂａｓｉｓによって測定し、水は自由に与えた。毎日のミネラル摂取は、カルシウム４８．４ｇ、無機リン２０．２ｇ、マグネシウム１２．７ｇとし、これはＮＲＣ勧告を充分に超えていた。
５頭の雌牛は、それぞれ膣内用量レベルとして０．１２５、０．２５、０．５、１．０μｇ／ｋｇ（体重比）、静脈注射用量レベルとして１．０μｇ／ｋｇ（体重比）の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を２週間以上のインターバルで５×５のラテン方格法に従い投与された。
使用した１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３（メルシャン（株）製）は結晶性粉末の形態で、９９％のエタノールに２００μｇ／ｍＬで溶かし、使用するまで−２０℃で凍結保存した。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３０．１２５、０．２５、０．５、１．０μｇ／ｋｇ（体重比）になるように２０％エタノール溶液５ｍＬとした薬剤を、Ｓｐｌｉｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｈｅａｔｈ（ＩＭＶ  Ｉｎｔ．Ｃｏ．，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて直腸膣腔法で膣内腔に投与した。その後膣内腔から１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３溶液が誤って排出されるのを避けるために、陰門が接着剤で接着された。静脈内投与は、血液サンプル採取のために前もって取り付けられたカニューラ（１４−ｇａの動物用カニューラ、ニプロ医工（株）製）を用いて行なった。
ヘパリン血液サンプルは、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与の直前（０時間）、２，４，６，１２，２４，４８，７２，９６，１２０時間後にカニューラから採取した。
次に、血液を直ちに遠心分離し、血漿中の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、カルシウム、無機リン、およびマグネシウム濃度を測定した。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３０．１２５および１．０μｇ／ｋｇ（体重比）で膣内投与を行い、１．０μｇ／ｋｇ（体重比）で静脈投与を行なった雌牛から血液サンプルを採取するのと同時に膀胱カテーテル法によって尿を採取し、尿中のクレアチニン、カルシウム、無機リン、マグネシウムの濃度を測定した。血漿および尿サンプルは分析まで−２０℃で凍結保存した。
その結果、４つのレベルの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与された雌牛の血漿中１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３、カルシウム、無機リン、マグネシウム濃度の変化は有意差があったものの、異なるレベルの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与されたグループ同士の違いは、血漿中１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を除いて、有意差が無かった。同様に、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を静脈内投与された雌牛の、血漿中カルシウム、無機リン、マグネシウムの変化は有意差があったが、膣内投与と静脈内投与のグループの間には違いはなかった。
０．１２５、０．２５、０．５、１．０μｇ／ｋｇ（体重比）膣内投与されたときの血漿中１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３レベルは、処置後２時間から２４時間までの間、０時間（７．４±５．３、６．５±１．３、８．７±５．６、６．６±１．６ｐｇ／ｍＬ）に比べて有意に上昇していた。これらは２時間でピークに達し（２２１９．３±８１２．０、３４４８．７±７３７．９、６３８８．５±１１２７．４、１２３１５．７±２２８８．３ｐｇ／ｍＬ）、その後減少した。０．１２５×０．５、０．１２５×１．０、０．２５×０．５、０．２５×１．０、０．５×１．０μｇ／ｋｇ（体重比）で１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与されたグループの間では有意差があった（図１０）。静脈内投与を受けた雌牛では血漿中１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は投与後２時間後までには膣内投与されたものと同様となり、その後同様に変化した。
膣内投与においては、０．１２５または０．２５μｇ／ｋｇ（体重比）の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与された雌牛の血漿中カルシウム濃度は１２から１２０時間の間においては、０時間（８．９±０．５、８．９±０．４ｍｇ／ｄＬ）と比較して有意に高く、４８時間でピークに達した（１１．１±０．９と１１．２±０．７ｍｇ／ｄＬ）。そして０．５または１．０μｇ／ｋｇ（体重比）の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与の雌牛においては６から１２０時間の間においては、０時間（８．９±０．２と８．８±０．７ｍｇ／ｄＬ）より有意に高く、４８時間でピークに達した（１１．５±０．６と１２．０±０．６ｍｇ／ｄＬ）。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を静脈内投与された雌牛の血漿中カルシウム濃度の変化（０時間で８．８±０．５ｍｇ／ｄＬ、ピークで１１．５±１．２ｍｇ／ｄＬ）は、０．５または１．０μｇ／ｋｇ（体重比）を膣内投与された雌牛と同様であった（図１１）。
０．１２５，０．５，１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与された雌牛の血漿中無機リン濃度（０時間では５．３±１．０、５．３±０．６、５．４±１．３ｍｇ／ｄＬ）は、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣内投与後２４時間で有意に上昇し（それぞれ７．７±０．８、７．９±０．９、８．０±１．２ｍｇ／ｄＬ）、２４時間から１２０時間までの間に最高値に達した。０．２５μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与された雌牛では、血漿中無機リンレベルは、１２時間から１２０時間では０時間のレベル（４．７±０．６ｍｇ／ｄＬ）と比べて有意に高かった（６．７±０．９から８．６±１．２ｍｇ／ｄＬ）。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を静脈内投与された雌牛の血漿中無機リン濃度（０時間で５．２±１．３ｍｇ／ｄＬ）の変化は、１２時間で増加して（７．２±０．８ｍｇ／ｄＬ）、２４時間から１２０時間（９．１±１．６から９．０±１．２ｍｇ／ｄＬ）の間に頂点に達した（図１２）。
膣内投与では、０．１２５，０．２５，１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与された雌牛の血漿中マグネシウム濃度は、それぞれの０時間での値（２．２±０．２、２．０±０．２、２．１±０．１ｍｇ／ｄＬ）と比べて、２４時間から１２０時間の間では有意に低く（１．９±０．１、１．８±０．１、１．８±０．２から１．８±０．３、１．７±０．２、１．７±０．４ｍｇ／ｄＬ）、０．５μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与された雌牛では、１２時間から１２０時間の間では０時間での値（２．２±０．２）と比べて有意に低かった（１．９±０．２から１．７±０．２ｍｇ／ｄＬ）。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を静脈内投与された雌牛での血漿中マグネシウム濃度の変化は（０時間では２．２±０．２ｍｇ／ｄＬ、２４時間から１２０時間の間では１．９±０．３から１．７±０．２ｍｇ／ｄＬ）、０．１２５，０．５，１．０μｇ／ｋｇの体重比で膣内投与された雌牛と同様であった（図１３）。
体重比１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与されたものと静脈内投与されたもの両方の雌牛で、尿のカルシウム／クレアチニン比（Ｃａ／Ｃｒｅ）、無機リン／クレアチニン比（ｉＰ／Ｃｒｅ）、マグネシウム／クレアチニン比（Ｍｇ／Ｃｒｅ）の値には有意な変化があった。これらの値は体重比０．１２５μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与された雌牛では影響されなかった。体重比０．１２５または１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与された雌牛または体重比１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を静脈内投与された雌牛でのＭｇ／Ｃｒｅ値はグループ間で有意差があったものの、Ｃａ／Ｃｒｅ値とｉＰ／Ｃｒｅ値はグループ間で有意差がなかった。
体重比１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与されたときの尿Ｃａ／Ｃｒｅ値は、膣経由では２４時間で有意に上昇し、静脈内経由では１２時間と２４時間で有意に上昇した（図１４）。
体重比１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与されたときの尿ｉＰ／Ｃｒｅ値は、投与直前の値と比較して、膣経由では４８時間から１２０時間の間で、静脈経由では７２時間から１２０時間の間で有意に高かった（図１５）。
体重比１．０μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与されたときの尿のＭｇ／Ｃｒｅ値は、膣経由では６時間から１２時間まで、静脈経由では６時間で、有意に高かった（図１６）。
５頭の雌牛の個々のバイオアベイラビリティーは７１．１、１２４．２、１１３．３、９０．０、６６．５％であった。なお、バイオアベイラビリティーは１．０μｇ／ｋｇ（体重比）の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を膣内投与したものと、同じ量を静脈内投与したものの、血漿濃度−時間曲線の下の対応する領域（ＡＵＣ）を比較することによって測定され、膣内投与のＡＵＣの静脈内投与のＡＵＣに対する比をパーセンテージで表した。
本結果は、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が卵巣摘出された雌牛の膣内腔内に投与されると、４つの異なる用量全てについて用量比例的に膣壁から吸収されることを示している。また、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が膣内腔内に投与された量と、血漿中のカルシウム、無機リン、マグネシウム濃度の投与後の変化との間には用量相関がなく、尿へのミネラル排出は体重比０．１２５μｇ／ｋｇの１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与された場合、血漿中カルシウム濃度および無機リン濃度の上昇と血漿中マグネシウム濃度の減少にも関わらず影響を受けず、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が膣内腔に投与されたうちの約９３％が全身の循環系に入ったものと考えられる。
経口投与では用量増加に伴う血清中カルシトリオールのＡＵＣ（血漿濃度−時間曲線の下の対応する領域）の比例的上昇がみられないことが知られているが（Ｍｕｉｎｄｉらの報告（２００２）；Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ  ｏｒａｌ  ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ：Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ  ａｎｄ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７２：６４８−６５９．）、本結果は１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が膣壁から用量依存的に吸収されたことを示しているのでこの点における１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の膣内投与の優位性は明らかである。
１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を４つの用量レベル（３０，９０，２７０，６００μｇ）で静脈投与された雌牛は尿中カルシウム排出が増加し、それがステロイドの静脈用量とは直接関係しないことが知られているが（Ｈｏｆｆｓｉｓらの報告（１９７９）；Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  １，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｃｈｏｌｅｃａｌｃｉｆｅｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒｔｕｒｉｅｎｔ  ｈｙｐｏｃａｌｃｅｍｉａ  ｉｎ  ｄａｉｒｙ  ｃｏｗｓ．Ｂｏｖｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｔｉｏｎｅｒ  １３：８８−９５．）、本結果では、体重比０．１２５μｇ／ｋｇを膣内投与された雌牛では、尿中カルシウム排出量は、血漿中カルシウム濃度が上昇したにもかかわらず、有意な増加はなかった。尿中無機リンおよびマグネシウム排出の変化も尿中カルシウムについてと同様な結果を示した。これらの結果は、膣内腔への１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与の４つの用量のうち体重比０．１２５μｇ／ｋｇが適当であることを示している。しかし、最も低い用量レベル（体重比０．１２５μｇ／ｋｇ）でも血漿中カルシウムおよびリン濃度が増加して、血漿中マグネシウムは他の用量レベル同様減少した。
膣経由での１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３のバイオアベイラビリティーは今まで知られていなかった。長期の透析を受けた若い患者に６０ｎｇ／ｋｇという一用量のカルシトリオールを投与した後２４時間後のバイオアベイラビリティーは、経口では６２％で、腹腔経由では６７％であることが知られている（Ｓａｌｕｓｋｙらの報告（１９９０）；Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃａｌｃｉｔｒｉｏｌ  ｉｎ  ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．１６：１２６−３２．）。この報告では、腸および／または肝臓での初回通過効果（ｆｉｒｓｔ−ｐａｓｓ  ｅｆｆｅｃｔ）と腹膜の透析物システムがバイオアベイラビリティーを低下させたと示唆されている。本結果に示されているバイオアベイラビリティー（約９３％）は前記報告のものより明らかに高い。よって、本結果は乳牛に１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３を投与するには膣内腔が効果的なルートであることを示している。
本結果は、膣内腔に投与された１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は用量比例的に雌牛に吸収されることを示し、より低い用量の１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が雌牛に投与されたときの血液および尿の成分への影響は考えられるが、膣内腔への１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３投与の用量は最も低い用量（体重比０．１２５μｇ／ｋｇ）が適切であることを示している。
【産業上の利用可能性】  ビタミンＤ誘導体を家畜哺乳動物に経膣投与する本発明の方法によれば、第１に、医療器具を必要とせず投与が簡単であること、第２に、肝臓における初回通過効果を受けず膣からの物質の吸収が効率良く起ること、第３に、デリバリータイプが豊富でジェル、タブレット、マイクロスフェアー、ＣＩＤＲ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｒｕｇ  ｒｅｌｅａｓｅ：一種のタンポン形式）などの形態を投与に利用できること、第４に、血液供給がよく発達した組織により構成された膣を利用するため速やかに吸収されることから、家畜哺乳動物、特に牛の低カルシウム血症による起立不能症等の疾病の予防、治療および／または処置が容易に行える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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