(57)【要約】本発明は、ヒト「ＴＩＭＰ２」に結合する抗体またはその抗原結合性断片に関する。さらに、本明細書に開示された、単離されたＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片による処置を必要とする、ヒト被験体を含む被験体を処置するための方法が提供される。さらに、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体および抗原結合性断片の医薬組成物または滅菌組成物であって、抗体またはその抗原結合性断片が、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合されている組成物が提供される。さらに、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物を含む１つまたは複数の構成成分を含むキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＩＭＰ−２に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片であって、
アミノ酸配列ＥＳＩＳＧＷ（配列番号１）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号２）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列ＱＣＳＹＧＩＮＧＮＳＥＨＧＮＰ（配列番号３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数またはそれぞれ；ならびに
アミノ酸配列ＧＦＴＩＳＳＮＹＹ（配列番号４）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＩＬＧＧＳＧＴＹＴ（配列番号５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列ＡＲＱＡＰＡＤＴＹＬＹＧＧＹＧＰＦＮＬ（配列番号６）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数、必要に応じてそれらのうちのそれぞれ；
あるいは
アミノ酸配列ＤＨＩＮＮＷ（配列番号２４）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＧＡ（配列番号２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２６）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＩＤＰＳＤＳＥＴ（配列番号２８）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列ＡＲＲＤＹＧＳＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号２９）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数またはそれぞれ
を含むモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
前記抗体が、
（ｉ）
配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；
配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および
配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列
を含む軽鎖配列；ならびに／あるいは
配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；
配列番号５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および
配列番号６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列
を含む重鎖配列；
あるいは
（ｉｉ）
配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；
配列番号２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および
配列番号２６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列
を含む軽鎖配列；ならびに／あるいは
配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；
配列番号２８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および
配列番号２９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列
を含む重鎖配列
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項３】
前記抗体が、
アミノ酸配列
【化２６】
2020516603.tif 000027
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列；および
アミノ酸配列
【化２７】
2020516603.tif 000028
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列
を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項４】
前記抗体が、
アミノ酸配列
【化２８】
2020516603.tif 000029
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列；および
アミノ酸配列
【化２９】
2020516603.tif 000030
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列
を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項５】
配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）を有するペプチドへの結合をめぐって、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む抗体または抗原結合性断片と競合するモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項６】
配列ＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫ（配列番号４４）を有するペプチドへの結合をめぐって、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む抗体または抗原結合性断片と競合するモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項７】
配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）に結合するかまたは配列ＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫ（配列番号４４）に結合するモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項８】
配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）、ＨＰＱＱＡＦＣＮＡ（配列番号２２）およびＲＳＤＧＳＣＡＷＹＲ（配列番号２３）に結合する、請求項５または７の一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項９】
前記抗体が、シグナル発生エレメントにコンジュゲートされている、請求項１から８の一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項１０】
前記抗体が、固体支持体に固定されている、請求項１から８の一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片。
【請求項１１】
請求項１から８の一項に記載の第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片を含むキットであって、ヒトＴＩＭＰ−２に特異的に結合する第２のモノクローナル抗体または抗原結合性断片をさらに含み、前記抗体および前記第２の抗体が、ヒトＴＩＭＰ−２とサンドイッチ複合体を形成する、キット。
【請求項１２】
前記第２のモノクローナル抗体もまた、請求項１から８の一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片である、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記第１の抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含み；前記第２の抗体が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記第１の抗体が、配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）に結合し、前記第２の抗体が、配列ＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫ（配列番号４４）に結合する、請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記キットが、生体試料中のヒトＴＩＭＰ−２の存在または量に関連する検出可能なシグナルを発生させるよう構成された使い捨ての試験デバイスをさらに含み、前記第１の抗体もしくは抗原結合性断片または前記第２の抗体もしくは抗原結合性断片が、前記使い捨ての試験デバイス内の表面に固定されている、請求項１１から１４の一項に記載のキット。
【請求項１６】
前記使い捨ての試験デバイスが、ラテラルフロー試験デバイスである、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記第１の抗体もしくは抗原結合性断片または前記第２の抗体もしくは抗原結合性断片のうちの一方が、前記使い捨ての試験デバイス内の表面に固定されており、前記第１の抗体もしくは抗原結合性断片または前記第２の抗体もしくは抗原結合性断片のうちの他方が、検出可能に標識されている、請求項１５または１６の一項に記載のキット。
【請求項１８】
検出可能に標識されている前記抗体または抗原結合性断片が、前記使い捨ての試験デバイスとは別の容器内に提供される、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
検出可能なシグナルをＴＩＭＰ−２の濃度に関連付ける較正をさらに含む、請求項１１から１８の一項に記載のキット。
【請求項２０】
前記較正が、電子記憶デバイスに提供される較正曲線である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記キットが、生体試料中のヒトＴＩＭＰ−２の存在または量に関連するシグナルを提供するアッセイ方法を実施するよう構成され、前記アッセイ方法におけるＴＩＭＰ−２の検出可能な最小濃度が、１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い、請求項１１から２０の一項に記載のキット。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体が、ウサギ抗体である、請求項１から１０に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片。
【請求項２３】
生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量を決定するための方法であって、
ヒトＴＩＭＰ２とのサンドイッチ複合体を一緒に形成する第１のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片および第２のモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片を用いて、前記生体試料に対してイムノアッセイを実施するステップであって、前記イムノアッセイが、前記サンドイッチ複合体に結合した前記生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の前記存在または量に関連する検出可能なシグナルを提供する、ステップと；
前記検出可能なシグナルを前記生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の前記存在または量に関連付けるステップ
とを含み、
前記第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片が、請求項１から８の一項に記載の抗体である、方法。
【請求項２４】
前記第２のモノクローナル抗体もまた、請求項１から８の一項に記載のモノクローナル抗体または抗原結合性断片である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１の抗体が、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含み；前記第２の抗体が、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む、請求項２３または２４の一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１の抗体が、配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）に結合し、前記第２の抗体が、配列ＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫ（配列番号４４）に結合する、請求項２３または２４の一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記イムノアッセイにおけるＴＩＭＰ−２の検出可能な最小濃度が、１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い、請求項２３から２６の一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記イムノアッセイが、ラテラルフローフォーマットで実施される、請求項２３から２７の一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記イムノアッセイが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用である、請求項２３から２８の一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記イムノアッセイが、ヒト患者試料を使い捨ての試験デバイスに適用することによって実施され、前記検出可能なシグナルが、前記使い捨ての試験デバイスを分析機器に挿入することによって得られ、前記第１および第２の抗体または抗原結合性断片を含む前記サンドイッチ複合体が、前記使い捨ての試験デバイスの所定のゾーンに、検出のために固定されており、前記分析機器が、固定されたサンドイッチ複合体を検出して前記検出可能なシグナルを提供する、請求項２３から２９の一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の抗体または抗原結合性断片が、シグナル発生エレメントにコンジュゲートされている、請求項２３から３０の一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の抗体または抗原結合性断片が、ヒト患者試料との反応混合物を形成し、前記ヒト患者試料が、前記反応混合物を前記使い捨ての試験デバイスに適用することによって前記使い捨ての試験デバイスに適用される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記第２の抗体または抗原結合性断片が、固体支持体の前記所定のゾーンに固定されている、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記第１および第２の抗体または抗原結合性断片のうちの少なくとも１つが、ウサギ抗体である、請求項２３から３３の一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月５日に出願された米国仮特許出願第６２／４８２，０８９号の利益を主張し、全ての表、図および特許請求の範囲を含む、出願の全てが参照による本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景についての以下の議論は、本発明を理解するに当たり読み手を補助するために提供されるにすぎず、本発明に対する先行技術について記載するまたは先行技術を構成することを認めるものではない。
【０００３】
メタロプロテイナーゼ阻害剤２（「メタロプロテイナーゼ２の組織阻害剤」および「ＴＩＭＰ２」としても公知のＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ１６０３５）は、メタロプロテイナーゼと複合体形成し、触媒性亜鉛補因子に結合することによってメタロプロテイナーゼを不可逆的に不活性化する分泌タンパク質である。ＴＩＭＰ２は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６およびＭＭＰ−１９に作用することが公知である。ＴＩＭＰ２は、内皮細胞の増殖を抑制することが報告されている。結果として、コード化タンパク質は、血管新生因子に応じた静止組織の増殖を抑制することによって、およびリモデリングを受けている組織のプロテアーゼ活性を阻害することによって、組織恒常性の維持における役割を果たすことが示唆される。
【０００４】
さらに、そのそれぞれが、表、図および特許請求の範囲のすべてを含む全体として、参照により本明細書に援用されるＷＯ２０１０／０４８３４６およびＷＯ２０１１／０７５７４４は、個別にとマルチマーカーパネルでの両方で、被験体の腎臓の状況を評価するためのＴＩＭＰ２の使用について記載する。特に、イムノアッセイによって測定されるＴＩＭＰ２レベルは、腎臓の状況のリスク層別化、診断、ステージ分類、予後、分類およびモニタリングと相関することが示される。ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５０１９５は、このようなアッセイにおいて使用するためのある特定の抗体を開示する。
イムノアッセイなどの特異的結合アッセイから得られるシグナルは、１つまたは複数の結合種（例えば、抗体）と標的生体分子（すなわち、分析物）および抗体が結合する必要なエピトープ（複数可）を含有するポリペプチドとの間に形成される複合体の直接的結果である。イムノアッセイは、分析物を「検出する」ことができる場合が多いが、抗体のエピトープはおよそ８個のアミノ酸であるため、目的のマーカーを検出するよう構成されたイムノアッセイは、マーカーの配列に関連するポリペプチドがアッセイにおいて使用される抗体（複数可）に結合するのに必要なエピトープ（複数可）を含有する限り、マーカーの配列に関連するポリペプチドも検出することとなる。このようなアッセイは、バイオマーカーの全長を検出し得、アッセイの結果は、目的のバイオマーカーの濃度として表され得るが、アッセイからのシグナルは、実際には、試料中に存在するこのような「免疫反応性」ポリペプチドすべての結果である。このような結合アッセイは、追加の種、例えば、結合タンパク質、受容体、ヘパリン、脂質、糖など（但し、これらの追加の種は、結合種と標的生体分子の間の結合を妨げないことを条件とする）と複合体を形成する生体試料中に存在する免疫反応性ポリペプチドも検出する可能性がある。しかし、典型的には、特異的結合アッセイは、精製した分析物を使用して作り出され、複合体形成および断片化のパターンは考慮されない。これは、このような追加の結合種の正体が公知でない場合に、特にそうである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０４８３４６号
【特許文献２】国際公開第２０１１／０７５７４４号
【特許文献３】国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５０１９５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の目的は、ＴＩＭＰ２の新規エピトープに結合する抗体を提供することである。このような抗体は、特に、腎損傷の評価において、およびＴＩＭＰ２結合が望まれる治療方法において使用される場合、臨床性能が改善したイムノアッセイにおける使用を見出すことができる。
【０００７】
第一の態様では、本発明は、ヒトＴＩＭＰ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
アミノ酸配列ＥＳＩＳＧＷ（配列番号１）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＲＡＳ（配列番号２）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＣＳＹＧＩＮＧＮＳＥＨＧＮＰ（配列番号３）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＦＴＩＳＳＮＹＹ（配列番号４）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＩＬＧＧＳＧＴＹＴ（配列番号５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列ＡＲＱＡＰＡＤＴＹＬＹＧＧＹＧＰＦＮＬ（配列番号６）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数、必要に応じてそれらのうちのそれぞれを含む、抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、
配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および／あるいは配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖配列；ならびに／あるいは
配列番号４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および／あるいは配列番号６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖配列
を含む。
【０００９】
ある特定の好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、
アミノ酸配列
【化１】
2020516603.tif 000002
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列；および／あるいは
アミノ酸配列
【化２】
2020516603.tif 000003
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列
を含む。
【００１０】
ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【００１１】
ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。このような抗体は、本明細書において、抗体「４０Ｈ２−４０Ｋ３」と称される。
【００１２】
さらに別の関連する態様では、上記の抗体または抗原結合性断片は、同様にＴＩＭＰ２と結合する第２の抗体または抗原結合性断片と共にサンドイッチ複合体を形成する１対の抗体のメンバーである。ほんの一例として、第２の抗体は、６Ｅ２．１として以下に記載される抗体またはその抗原結合性断片であってもよい。
【００１３】
関連する態様では、本発明は、ＴＩＭＰ２に結合する抗体または結合断片、例えば、抗体４０Ｈ２−４０Ｋ３であって、その抗体が、配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）に結合する抗体または結合断片に関する。この配列に結合する好ましい抗体は、上記の抗体であり、最も好ましくは、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。エピトープ結合は、好ましくは、ＴＩＭＰ−２配列（配列番号４５）に由来する１つのアミノ酸残基のステッピングを伴う直鎖状の１５マーのペプチドのネスティドセット（ｎｅｓｔｅｄ  ｓｅｔ）内で、非突然変異（ペプチドセット１）および二重アラニン突然変異（ペプチドセット２）を使用するアラニンスキャニングによって決定される。例えば、McBrideら、Methods  Mol.  Biol.１３５２巻：６７〜８３頁、２０１６年；Kongら、J.  Virol.８６巻：１２１１５〜２８頁、２０１２年を参照のこと。
【００１４】
ある特定の実施形態では、配列ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ（配列番号２１）に結合する抗体は、不連続エピトープに結合する。これらの実施形態では、ＴＩＭＰ２に結合する抗体または結合断片は、配列ＨＰＱＱＡＦＣＮＡ（配列番号２２）および配列ＲＳＤＧＳＣＡＷＹＲ（配列番号２３）にさらに結合する。
【００１５】
関連する態様では、本発明は、ヒトＴＩＭＰ２に結合するこのような抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ヒトＴＩＭＰ２に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、
アミノ酸配列ＤＨＩＮＮＷ（配列番号２４）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＳＧＡ（配列番号２５）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２、
アミノ酸配列ＱＱＹＷＳＴＰＦＴ（配列番号２６）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３、
アミノ酸配列ＧＹＳＦＴＳＹＷ（配列番号２７）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ１、
アミノ酸配列ＩＤＰＳＤＳＥＴ（配列番号２８）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２、および
アミノ酸配列ＡＲＲＤＹＧＳＲＹＤＡＭＤＹ（配列番号２９）またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３
のうちの１つまたは複数、必要に応じてそれらのうちのそれぞれを含む、抗体またはその抗原結合性断片に関する。
【００１７】
ある特定の実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、
配列番号２４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号２５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および／あるいは配列番号２６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖配列；ならびに／あるいは
配列番号２７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；配列番号２８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列；および／あるいは配列番号２９のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖配列
を含む。
【００１８】
ある特定の好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、
アミノ酸配列
【化３】
2020516603.tif 000004
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列；および／あるいは
アミノ酸配列
【化４】
2020516603.tif 000005
またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列
を含む。
【００１９】
ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【００２０】
ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号３９のアミノ酸配列を含む軽鎖配列を含む。このような抗体は、本明細書において、抗体「６Ｅ２．１」と称される。
【００２１】
さらに別の関連する態様では、上記の抗体または抗原結合性断片は、同様にＴＩＭＰ２に結合する第２の抗体または抗原結合性断片と共にサンドイッチ複合体を形成する１対の抗体のメンバーである。ほんの一例として、第２の抗体は、４０Ｈ２−４０Ｋ３として上述されている抗体またはその抗原結合性断片であってもよい。
【００２２】
関連する態様では、本発明は、ＴＩＭＰ２に結合する抗体または結合断片、例えば、抗体６Ｅ２．１であって、その抗体が、配列ＰＷＤＴＬＳＴＴＱＫＫ（配列番号４４）に結合する抗体または結合断片に関する。この配列に結合する好ましい抗体は、上記の抗体であり、最も好ましくは、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。ある特定の最も好ましい実施形態では、このような抗体または抗原結合性断片は、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。エピトープ結合は、好ましくは、ＴＩＭＰ−２配列（配列番号４５）に由来する１つのアミノ酸残基のステッピングを伴う直鎖状の１５マーのペプチドのネスティドセット内で、単一および二重アラニン突然変異を使用するアラニンスキャニングによって決定される。例えば、McBrideら、Methods  Mol.  Biol.１３５２巻：６７〜８３頁、２０１６年；Kongら、J.  Virol.８６巻：１２１１５〜２８頁、２０１２年を参照のこと。
【００２３】
関連する態様では、本発明は、ヒトＴＩＭＰ２に結合するこのような抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸に関する。
【００２４】
特許請求される方法において使用するための抗体または抗原結合性断片は、様々な種から得ることができる。例えば、本発明の抗体または抗原結合性断片は、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ヒト、リャマもしくはラクダの配列、またはこのような配列の組み合わせ（いわゆるキメラ抗体）である免疫グロブリン配列を含んでもよい。このような抗体または抗原結合性断片は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよい。本発明において使用するための抗体は、イムノアッセイにおけるそれらの性能によって特定され、次いで、その性能に関連するエピトープを理解するためのエピトープマッピングによって特徴付けられ得る。ウサギ抗体またはウサギ抗体に由来するヒト化バージョンが好ましい。
【００２５】
このような抗体または抗原結合性断片は、シグナル発生エレメント（ｓｉｇａｎｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｅｌｅｍｅｎｔ）にコンジュゲートされているかまたは固体支持体に固定されていてもよい。さらに、このような抗体または抗原結合性断片は、いくつかの競合的およびサンドイッチアッセイフォーマットにおいて使用することができる。サンドイッチアッセイの例では、第１の抗体または抗原結合性断片（検出可能に標識された）および第２の抗体または抗原結合性断片（試験デバイスの所定のゾーンに固定された）は、試験デバイスの所定のゾーンで、試料中のＴＩＭＰ２とサンドイッチ複合体を形成する。サンドイッチアッセイでは、第１および第２の抗体または抗原結合性断片は、同一であっても（特に、ポリクローナル抗体が使用される場合）異なっていてもよい。よって、本発明の抗体または抗原結合性断片を、サンドイッチ対において使用するかまたはポリクローナル抗体もしくはアプタマーなどのモノクローナル抗体ではない別の結合実体と共に個々に使用してもよい。
【００２６】
本発明の抗体または抗原結合性断片は、生体試料中のＴＩＭＰ−２を検出するための試験キットにおける試薬として使用することができる。このような試験キットは、例えば、生体試料中のヒトＴＩＭＰ−２の存在または量に関連する検出可能なシグナルを発生させるよう構成された使い捨ての試験デバイスを含んでもよい。あるいは、このような試験キットは、使い捨ての試験デバイスを利用しない臨床分析器においてアッセイを実施するよう作り出されてもよい。好ましくは、試験キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用である。「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用」という用語は、本明細書で使用される場合、それが、単にまたは主として、生理学的もしくは病理学的状態に関するかまたは先天的異常に関する情報を提供することを目的として、あるいは潜在的レシピエントとの安全性および適合性を決定するために、あるいは治療手段をモニタリングするために、ヒトの身体に由来する血液および組織供与物を含む検体の検査のために、製造業者によって、単独で使用されるかまたは組み合わせて使用されるかに関係なく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用されることを意図する試薬、試薬製品、標準物質、対照材料、キット、機器、装置、設備、またはシステムである医学デバイスであることを指す。
【００２７】
ある特定の実施形態では、イムノアッセイは、ラテラルフローフォーマットで実施される。ラテラルフロー試験は、試験試料がクロマトグラフィー様式で吸水性または非吸水性多孔性固体基質に沿って流れるイムノアッセイの形態である。ラテラルフロー試験は、競合的またはサンドイッチフォーマットアッセイのいずれかとして作動することができる。好ましいラテラルフローデバイスは、使い捨ての、単回使用試験デバイスである。試料は、試験デバイスに適用ゾーンにおいて適用され、基質を移行し、そこで、抗体または抗原で前処理されたラインまたはゾーンに遭遇する。「試験ゾーン」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の分析物の存在または量に関連するシグナルを発生させるために情報が得られる、ラテラルフロー試験ストリップ上の別個の位置を指す。検出可能なシグナルは、視覚的に読み取ることができるか、または使い捨ての試験デバイスを分析機器、例えば、反射率計、蛍光光度計、もしくは透過光度計へと挿入することによって得ることができる。このリストは、制限することを意味しない。試料は、前処理なしで、適用ゾーンに適用してもよく、または適用前に１つまたは複数のアッセイ試薬と予め混合されてもよい。後者の場合、抗体は、使い捨ての試験デバイスとは別の容器中に提供され得る。
【００２８】
本発明の抗体または抗原結合性断片は、試料が表面と接触すると試料中に溶け込むように、拡散により、使い捨ての試験デバイス内の表面に固定されてもよい。サンドイッチアッセイフォーマットでは、この拡散によって結合した抗体は、試料中のそのコグネイト抗原に結合することができ、次いで、抗原に、検出ゾーンで、拡散によらずに結合した第２の抗体または抗原結合性断片が結合すると、検出ゾーンに固定され得る。競合的フォーマットでは、試料中のそのコグネイト抗原は、拡散によって結合した抗体への結合をめぐって、アッセイ試薬として提供される標識抗原と競合し得る。
【００２９】
発明のキットはさらに、検出可能なシグナルをＴＩＭＰ−２の濃度に関連付ける較正を含むことができる。例として、較正曲線は、使い捨ての試験デバイスを収容する分析機器によって読み取られる電子記憶デバイス、例えば、ＲＯＭチップ、フラッシュドライブ、ＲＦＩＤタグなどにおいて提供され得る。あるいは、較正曲線は、２Ｄバーコードなどの光学的に読み取られるか、またはネットワーク接続を介して伝送されるコード標識で提供することができる。次いで、分析機器によって、この較正曲線が使用され、アッセイからの検出可能なシグナルをＴＩＭＰ−２濃度に関連付けることができる。
【００３０】
ある特定の実施形態では、本発明の１つまたは複数の抗体を使用して実施されるアッセイ方法は、生体試料中のヒトＴＩＭＰ−２の存在または量に関連するシグナルを提供し、ここで、このアッセイ方法におけるＴＩＭＰ−２の最低検出可能濃度は、１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより低く、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬまたはそれより低く、最も好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い。
【００３１】
関連する態様では、本発明は、生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量を決定するための方法であって、
ヒトＴＩＭＰ２とのサンドイッチ複合体を一緒に形成する第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片および第２のモノクローナル抗体または抗原結合性断片を用いて、生体試料に対してイムノアッセイを実施するステップであって、イムノアッセイが、サンドイッチ複合体に結合した、生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関連する検出可能なシグナルを提供する、ステップと；
検出可能なシグナルを生体試料中のヒトＴＩＭＰ２の存在または量に関連付けるステップ
とを含む、方法を提供する。好ましくは、イムノアッセイにおけるＴＩＭＰ−２の最低検出可能濃度は、１０ｎｇ／ｍＬまたはそれより低く、より好ましくは１ｎｇ／ｍＬまたはそれより低く、最も好ましくは０．１ｎｇ／ｍＬまたはそれより低い。
【００３２】
特に好ましい実施形態では、第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片および第２のモノクローナル抗体または抗原結合性断片のうちの１つまたは両方は、本明細書に記載されている本発明の抗体である。ある特定の実施形態では、
第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片は、配列番号８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号７のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含み、
第２のモノクローナル抗体または抗原結合性断片は、配列番号３１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域配列および配列番号３０のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む。
【００３３】
特に好ましい実施形態では、第１のモノクローナル抗体または抗原結合性断片は、４０Ｈ２−４０Ｋ３またはその抗原結合性断片であり、第２のモノクローナル抗体または抗原結合性断片は、６Ｅ２．１またはその抗原結合性断片である。
【００３４】
好ましいアッセイ方法は、ヒトＴＩＭＰ−２を検出するイムノアッセイを実施するステップを含む。このようなイムノアッセイは、前記体液試料を、マーカーを検出する抗体または抗原結合性断片と接触させることと、その抗体への結合を検出することとを含み得る。本発明は、概して、イムノアッセイに関して記載されるが、免疫グロブリン足場に基づかない他の結合実体（例えば、アプタマー）を、抗体の代わりに、このような方法において使用してもよい。好ましくは、体液試料は、尿、唾液、血液、血清、および血漿からなる群から選択され、最も好ましくは尿である。
【００３５】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細が、添付の図面および以下の説明に示される。本開示の他の特色、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
定義
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「メタロプロテイナーゼ阻害剤２」および「ＴＩＭＰ−２」は、メタロプロテイナーゼ阻害剤２前駆体（ヒト前駆体：Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  Ｐ１６０３５（配列番号４５））に由来する生体試料中に存在する１つまたは複数のポリペプチドを指す。
【化５】
2020516603.tif 000006
【００３８】
以下のドメインは、メタロプロテイナーゼ阻害剤２において特定された：
【化６】
2020516603.tif 000007
【００３９】
本明細書で別段具体的に注記されていなければ、使用される用語の定義は、薬学の技術分野で使用される標準的定義である。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単一形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明確に指示していなければ、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「医薬担体」への言及は、２つまたはそれよりも多いこのような担体の混合物などを含む。
【００４０】
用語「被験体」は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは非ヒト生物を指す。したがって、本明細書に記載される方法および組成物は、ヒト疾患と獣医学的な疾患の両方に適用可能である。さらに、被験体は、好ましくは生きている生物であるが、本明細書に記載される発明は、死後の分析においても同様に使用され得る。好ましい被験体はヒト、最も好ましくは「患者」であり、「患者」は、本明細書で使用される場合、疾患または状態に対する医療を受けている生きているヒトを指す。これは、病理の徴候について調査されている、定義された病気を有さない人々を含む。
【００４１】
好ましくは、分析物は、試料中で測定される。このような試料は、被験体から得ることができるか、または被験体に提供されることが意図される生物学的材料から得ることができる。例えば、試料は、被験体への移植の可能性について評価されている腎臓、および既存の傷害について腎臓を評価するために使用される分析物測定から得ることができる。好ましい試料は、体液試料である。
【００４２】
「体液試料」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の被験体、例えば、患者または移植ドナーの診断、予後、分類または評価の目的のために得られる体液の試料を指す。ある特定の実施形態では、このような試料は、進行中の状態の転帰または状態に関する処置レジメンの効果を決定する目的のために得られ得る。好ましい体液試料として、血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、痰、および胸水が挙げられる。さらに、当業者は、ある特定の体液試料が、分画または精製手順、例えば、全血の血清または血漿成分への分離後に、より容易に分析されることを理解するであろう。
【００４３】
用語「診断」は、本明細書で使用される場合、当業者が、患者が所与の疾患または状態に罹患しているか否かの確率（「尤度」）を推定および／または決定することができる方法を指す。本発明の場合には、「診断」は、本発明の腎臓損傷マーカーについてのアッセイ、最も好ましくはイムノアッセイの結果を使用して、必要に応じて他の臨床特徴と併せて、試料が入手およびアッセイされた被験体について急性腎損傷またはＡＲＦの診断（すなわち、発生または不発生）に至ることを含む。このような診断が「決定」されることは、診断が１００％正確であることを示すことを意味しない。多くのバイオマーカーは、複数の状態の指標である。熟練臨床医は、情報が欠如している状態（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｖａｃｕｕｍ）ではバイオマーカーの結果を使用せず、むしろ、試験結果を他の臨床的徴候と併せて使用して診断に至る。したがって、所定の診断閾値の一方の側にある測定バイオマーカーレベルは、所定の診断閾値のもう一方の側にある測定レベルに比べて、被験体における疾患の発生のより大きな尤度を示す。
【００４４】
同様に、予後リスクは、所与の経過または転帰が生じる確率（「尤度」）を示唆する。予後指標のレベルまたはレベルの変化は、その結果として、罹患確率の増加（例えば、腎機能の悪化、将来のＡＲＦ、または死亡）に関連し、患者の有害転帰の「尤度増加の指標」であると言及される。
【００４５】
「ラテラルフロー」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に平坦な多孔性材料を通る長手方向の試薬の流れを指す。このような多孔性材料は、材料の厚さが、長さおよび幅寸法の１０％以下である場合、「実質的に平坦」である。
【００４６】
デバイスの第１の領域に対して本明細書で使用される「下流領域」という用語は、その流体が第１の領域にすでに到達した後に、流体が流れ込むものを指す。
【００４７】
「試料適用領域」という用語は、本明細書で使用される場合、目的の流体試料が、その構成成分を決定する目的で導入されるアッセイデバイスの一部を指す。
【００４８】
マーカーアッセイ  
【００４９】
一般的に、イムノアッセイは、目的のバイオマーカーを含有するかまたは含有する疑いがある試料をバイオマーカーに特異的に結合する少なくとも１つの抗体と接触させることを含む。次いで、試料中のポリペプチドの抗体への結合によって形成された複合体の存在または量を示すシグナルを発生させる。次いで、シグナルは、試料中のバイオマーカーの存在または量と関連付けられる。バイオマーカーの検出および分析のための多くの方法およびデバイスが当業者に周知である。例えば、すべての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が参照によりいずれも本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５７６号；同第６，１１３，８５５号；同第６，０１９，９４４号；同第５，９８５，５７９号；同第５，９４７，１２４号；同第５，９３９，２７２号；同第５，９２２，６１５号；同第５，８８５，５２７号；同第５，８５１，７７６号；同第５，８２４，７９９号；同第５，６７９，５２６号；同第５，５２５，５２４号；および同第５，４８０，７９２号、ならびにThe  Immunoassay  Handbook、David  Wild編、Stockton  Press、New  York、１９９４年を参照のこと。
【００５０】
当技術分野で公知のアッセイデバイスおよび方法は、種々のサンドイッチ、競合的、または非競合的アッセイフォーマットで標識分子を利用し、目的のバイオマーカーの存在または量と関連するシグナルを発生させることができる。好適なアッセイフォーマットは、クロマトグラフィー、質量分析、およびタンパク質「ブロッティング」方法も含む。さらに、ある特定の方法およびデバイス、例えば、バイオセンサーおよび光学イムノアッセイを、標識分子を必要とすることなく、分析物の存在または量を決定するために用いることができる。例えば、すべての表、図面および特許請求の範囲を含むその全体が参照によりいずれも本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３１，１７１号；および同第５，９５５，３７７号を参照のこと。当業者は、ロボット機器、例えば、これらに限定されないが、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＡＣＣＥＳＳ（登録商標）、Ａｂｂｏｔｔ  ＡＸＳＹＭ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ  ＥＬＥＣＳＹＳ（登録商標）、Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＳＴＲＡＴＵＳ（登録商標）システムは、イムノアッセイを実施することができるイムノアッセイ分析器の中の１つであることも認識する。しかし、任意の好適なイムノアッセイ、例えば、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイなどを利用してもよい。
【００５１】
抗体または他のポリペプチドは、アッセイにおいて使用するための様々な固体支持体上に固定されていてもよい。特異的結合メンバーを固定するために使用され得る固相として、固相結合アッセイにおける固相として開発されおよび／または使用されるものが挙げられる。好適な固相の例として、膜フィルター、セルロース系の紙、ビーズ（ポリマー、ラテックスおよび常磁性粒子を含む）、ガラス、シリコンウエハー、微小粒子、ナノ粒子、ＴｅｎｔａＧｅｌ、ＡｇｒｏＧｅｌ、ＰＥＧＡゲル、ＳＰＯＣＣゲル、およびマルチプルウェルプレートが挙げられる。アッセイストリップは、１つまたは複数の抗体を一列に固体支持体上でコーティングすることによって調製することができる。次いで、このストリップは、試験試料中に浸漬され、次いで、洗浄および検出ステップにより直ちに処理され、測定可能なシグナル、例えば、着色スポットを生じ得る。抗体または他のポリペプチドは、アッセイデバイスの特異的ゾーンに、アッセイデバイス表面に直接コンジュゲートすることによって、または間接的により結合させることによって、結合させることができる。後者の場合の一例では、抗体または他のポリペプチドは、粒子または他の固体支持体に固定されていてもよく、その固体支持体はデバイス表面に固定されていてもよい。
【００５２】
生物学的アッセイでは、検出するための方法が必要とされ、結果の定量化のための最も一般的な方法の１つは、検出可能な標識を、研究される生物系内の構成成分のうちの１つに対する親和性を有するタンパク質または核酸にコンジュゲートさせることである。検出可能な標識として、それ自体が検出可能である分子（例えば、蛍光部分、電気化学標識、金属キレートなど）および検出可能な反応生成物の生成により（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素）またはそれ自体検出可能であり得る特異的結合分子（例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、マルトース、オリゴヒスチジン、２，４−ジニトロベンゼン、ヒ酸フェニル、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡなど）により間接的に検出され得る分子を挙げることができる。
【００５３】
固相および検出可能な標識コンジュゲートの調製には、化学架橋剤の使用が含まれる場合が多い。架橋試薬は、少なくとも２つの反応基を含有し、一般的に、ホモ官能性架橋剤（同一の反応基を含有する）およびヘテロ官能性架橋剤（非同一の反応基を含有する）に分類される。アミン、スルフヒドリルを介して連結する、または非特異的に反応するホモ二官能性架橋剤は、多くの商業的供給源から入手可能である。マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、アルファ−ハロアシルならびにピリジルジスルフィドは、チオール反応基である。マレイミド、ハロゲン化アルキルおよびアリール、ならびにアルファ−ハロアシルは、スルフヒドリルと反応し、チオールエーテル結合を形成し、一方、ピリジルジスルフィドは、スルフヒドリルと反応し、混合ジスルフィドを生成する。ピリジルジスルフィド生成物は、切断可能である。イミドエステルはまた、タンパク質−タンパク質架橋に非常に有用である。様々なヘテロ二官能性架橋剤は、それぞれコンジュゲーションを成功させるための異なる属性を組み合わせて市販されている。
【００５４】
ある特定の態様では、本発明は、記載されているマーカーの分析のためのキットを提供する。キットは、マーカーに特異的に結合する少なくとも１つの抗体を含む少なくとも１つの試験試料の分析のための試薬を含む。キットはまた、本明細書に記載の診断および／または予後相関のうちの１つまたは複数を実施するためのデバイスおよび説明書も含み得る。好ましいキットは、サンドイッチアッセイを実施するための抗体対、または競合的アッセイを実施するため、分析物のための標識種を含む。好ましくは、抗体対は、固相にコンジュゲートされた第１の抗体および検出可能な標識にコンジュゲートされた第２の抗体を含み、ここで、第１および第２の抗体のそれぞれは、腎臓損傷マーカーに結合する。最も好ましくは、抗体のそれぞれは、モノクローナル抗体である。キットを使用し、相関を実施するための説明書は、ラベルの形態とすることができ、これは、その製造、輸送、販売または使用中の任意の時に、キットに添付された、またはそうでなければキットに付随する、任意の記載されたまたは記録された資料を指す。例えば、ラベルという用語は、広告チラシおよびパンフレット、包装材料、説明書、オーディオまたはビデオカセット、コンピュータディスク、ならびにキット上に直接プリントされた文字を包含する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、マーカーアッセイは、単回使用の使い捨ての試験デバイスを使用して実施される。このような試験デバイスは、ラテラルフローデバイスの形態をとることが多く、これは、現在、処方箋なしで購入できる妊娠テストの一般的な使用からよく知られている。一般的に、これらのアッセイデバイスは、伸長したベース層を有し、その上では、試料添加領域と評価領域の間で区別がなされ得る。典型的な使用では、試料は、試料添加領域に適用され、ベース層に平行に走っている液体輸送経路に沿って流れ、次いで、評価領域に流れ込む。捕捉試薬は、評価領域中に存在し、捕捉された分析物は、捕捉された分析物に付随している視認可能な部分を検出するための様々なプロトコールにより検出することができる。例えば、アッセイによって、視認可能なシグナル、例えば、色変化、蛍光、ルミネセンスなどを生じ、その際には、生体試料中の分析物の有無が示され得る。
【００５６】
試料添加領域は、例えば、ハウジング内のオープンチャンバーの形態；吸収パッドの形態；などで提供することができる。試料添加領域は、様々な形状、すなわち、円形、長方形、正方形などのポートとすることができ、またはその領域は、デバイス内のトラフとすることができる。
【００５７】
フィルターエレメントを、試料から粒子を濾過するため、例えば、血液から血液細胞を除去するかまたは遅延させるために、試料添加領域内、その上、またはそれに隣接して配置することができ、その結果、血漿は、デバイスを通ってさらに移動することができる。次いで、濾液は、フィルターに流動的に接続された多孔性部材中に移動することができる。血液中に存在する細胞材料を除去するかまたは遅延させるのに好適なフィルターは、当技術分野で周知である。例えば、その全体が参照によりいずれも本明細書に組み込まれる米国特許第４，４７７，５７５号；同第５，１６６，０５１号；同第６，３９１，２６５号；および同第７，１２５，４９３号を参照のこと。多くの好適な材料が当業者に公知であり、ガラス繊維、合成樹脂繊維、孔のサイズが約６５から約１５μｍで変化する非対称膜フィルターを含む種々のタイプの膜、およびこのような材料の組み合わせを挙げることができる。さらに、フィルターエレメントは、赤血球の血液血漿からの分離を促進する、１つまたは複数の化学物質を含むことができる。このような化学物質の例は、トロンビン、レクチン、カチオン性ポリマー、１つまたは複数の赤血球表面抗原に対する抗体などである。赤血球の血漿からの分離を促進するこのような化学物質（複数可）は、フィルターエレメントにおいて、共有結合手段、非特異的吸収などにより提供されてもよい。
【００５８】
ある特定の実施形態では、標識ゾーンは、試料受容ゾーンの下流に位置し、拡散により位置付けられた標識試薬（目的の分析物に結合するかまたは結合種への結合をめぐって目的の分析物と競合する）を含有する。あるいは、標識試薬が試料受容ゾーンへの適用前に試料と予め混合される場合、標識ゾーンはなしにすることもできる。検出ゾーンは、標識ゾーンの下流に配置され、目的の分析物に結合する固定された捕捉試薬を含有する。
【００５９】
本発明において使用するための膜に対する最適な孔径は、約１０から約５０μｍである。膜は、典型的には、約１ミルから約１５ミルの厚さであり、典型的には、５から１０ミルの範囲であるが、最大２００ミル、およびそれより厚くてもよい。膜は、一般的に、水不浸透性層、例えば、Ｍｙｌａｒ（登録商標）ポリエステルフィルム（ＤｕＰｏｎｔ  Ｔｅｉｊｉｎ  Ｆｉｌｍｓ）により裏打ちされ得る。用いられる場合、バッキングは、一般的に、接着剤、例えば、３Ｍ  ４４４両面接着テープによって、膜に固定される。典型的には、水不浸透性バッキングが、厚さの薄い膜のために使用される。多種多様なポリマーが使用され得るが、但し、それらがアッセイ構成成分に非特異的に結合せず、試料の流れを妨害しないことを条件とする。例示的なポリマーとして、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレンなどが挙げられる。あるいは、膜は、自立するものであってもよい。他の非吸水性膜、例えば、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、酢酸ビニルと塩化ビニルとのコポリマー、ポリアミド、ポリカーボネート、ポリスチレンなどもまた使用することができる。種々の実施形態では、標識ゾーン材料は、ブロッキング剤および安定化剤を含む溶液で前処理されてもよい。ブロッキング剤として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、メチル化ＢＳＡ、カゼイン、脱脂粉乳が挙げられる。デバイスは、追加の構成成分、例えば、例として、緩衝剤、ＨＡＭＡ阻害剤、洗浄剤、塩（例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウムなどの塩化物および／または硫酸塩）、およびタンパク質構成成分（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、乳タンパク質など）も含むことができる。このリストは制限することを意味するものではない。
【００６０】
デバイスは、試験デバイスが適正に動作したことを決定するために読み取られる種々のコントロール位置をさらに含んでもよい。例として、手順コントロールゾーンは、アッセイ検出ゾーンとは別に、試料の流れが予想通りであることを確認するために提供され得る。コントロールゾーンは、好ましくは、空間的に別個の領域であり、そこで、試薬の適正な流れを示すシグナルが発生され得る。手順コントロールゾーンは、目的の分析物、またはその断片を含有してもよく、これらに、分析物アッセイにおいて使用される過剰の標識抗体が結合することができる。作動中、標識試薬は、目的の分析物が試験試料に存在しない場合でも、コントロールゾーンに結合する。コントロールラインにおけるシグナルの出現は、陰性の結果に対しても、試験結果を読み取ることができる時間を示すという点で、コントロールラインの使用は助けになる。よって、予想されたシグナルは、コントロールラインで現れた場合、捕捉ゾーン中のシグナルの有無を示すことができる。デバイスは、陰性コントロール領域をさらに含んでもよい。このコントロール領域の目的は、試験デバイスが適正に作用していないことをユーザーに警告することである。適正に作用している場合、シグナルまたはマークは、陰性コントロール領域で視認されないはずである。
【００６１】
このようなアッセイデバイスの外側のケーシングまたはハウジングは、種々の形態をとり得る。典型的には、細長いケーシングを含み、複数の中間取り付け部品（ｉｎｔｅｒｆｉｔｔｉｎｇ  ｐａｒｔ）を有し得る。特に好ましい実施形態では、ハウジングは、上カバーおよび底部支持体を含む。上カバーは、適用開口部および観察ポートを含有する。好ましい実施形態では、ハウジングは、水分不浸透性固体材料、例えば、プラスチック材料から構成される。様々な市販のプラスチック、例えば、これらに限定されないが、ビニル、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスルファン、ポリエステル、ウレタン、およびエポキシがハウジングを構築するために使用され得ることが企図される。ハウジングは、従来の方法論、例えば、当技術分野で周知であり、使用されている標準成形技術によって調製され得る。ハウジングは、成形技術によって生成することができ、成形技術として、これらに限定されないが、射出成形、圧縮成形、トランスファー成形、ブロー成形、押出成形、発泡成形、および熱成形が挙げられる。前述の成形技術は、当技術分野で周知であり、そのため、本明細書では詳細に議論しない。例えば、Processes  And  Materials  Of  Manufacture、第３版、R.  A.  Lindsberg（１９８３年）Allyn  and  Baron、３９３〜４３１頁を参照のこと。
【００６２】
必要な場合、用いられる検出可能な標識の比色分析、ルミネセンス、または蛍光強度は、次いで、標識に適切な機器を用いて評価され得る。例として、蛍光光度計は、蛍光標識を検出するするために使用することができ；反射率計は、光を吸収する標識を検出するために使用することができるなどである。試料中の目的の分析物の濃度は、測定された応答を試料流体中の分析物の量に相関させることによって決定することができる。
【００６３】
アッセイの相関
【００６４】
「相関させること」および「関連付けること」という用語は、本明細書で使用される場合、アッセイにおけるバイオマーカーの測定に関しては、アッセイから得られたシグナルに基づき、試料中のバイオマーカーの存在、またはより好ましくは量を決定することを指す。これは、アッセイに参加する１つの種に関して、検出可能な標識から発生したシグナルを、シグナルをバイオマーカーの濃度または閾値量に変換するために使用することができる所定の検量線と比較する形態をとる場合が多い。
【００６５】
「相関させること」および「関連付けること」という用語は、本明細書で使用される場合、診断または予後のためのバイオマーカーの使用に関しては、患者におけるバイオマーカー（複数可）の存在または量を、所与の状態を患うことが知られているか、もしくはそのリスクがあることが知られている個人；または所与の状態を有さないことが知られている個人におけるその存在または量と比較することを指す。これは、バイオマーカー濃度の形態のアッセイ結果を、疾患の発生もしくは不発生またはいくつかの将来の転帰の可能性を示すために選択された所定の閾値と比較する形態をとる場合が多い。
【００６６】
診断閾値を選択することは、とりわけ、疾患の確率、異なる試験閾値での真偽の診断の分布、および診断に基づく処置の結果（または処置の失敗）の推定の検討に関与する。例えば、非常に有効であり、リスクのレベルが低い特定の療法を投与することを検討する際、試験はほとんど必要なく、これは、臨床医が、実質的な診断の不確実性を受け入れることができるからである。他方、処置の選択がより有効でなくよりリスクが高い状況では、臨床医は、診断確実性のより高い程度を必要とする場合が多い。よって、コスト／ベネフィット分析は、診断閾値を選択することに関与する。
【００６７】
好適な閾値は、様々な方法で決定され得る。例えば、心筋トロポニンを使用する急性心筋梗塞の診断に対する１つの推奨される診断閾値は、正常集団において見られる濃度の９７．５パーセンタイルである。別の方法は、同じ患者由来の連続試料を見ることとしてもよく、この場合、前の「ベースライン」結果が、バイオマーカーレベルの一時的な変化をモニタリングするために使用される。
【００６８】
集団研究は、決定閾値を選択するために使用されてもよい。受信者作動特性（「ＲＯＣ」）は、レーダー画像の分析のために第二次世界大戦中に開発されたシグナル検出理論の分野から生じ、ＲＯＣ分析は、「疾患」亜集団を「非疾患」亜集団から最もよく区別することができる閾値を選択するために使用されることが多い。この場合における偽陽性は、個人の試験は陽性であるが、実際には、疾患を有していない場合に生じる。他方、偽陰性は、個人の試験は陰性であり、健康であることが示唆され、その際、実際には、疾患を有している場合に生じる。ＲＯＣ曲線を描くために、決定閾値が連続して変動するので、真陽性率（ＴＰＲ）および偽陽性率（ＦＰＲ）が決定される。ＴＰＲは、感度と同等であり、ＦＰＲは１−特異性に等しいので、ＲＯＣグラフは、感度対（１−特異性）プロットと呼ばれる場合がある。完全な試験は、１．０のＲＯＣ曲線下面積を有し；ランダム試験は、０．５の面積を有することとなる。閾値は、特異性および感度の許容されるレベルを提供するよう選択される。
【００６９】
この状況では、「疾患」は１つの特徴（疾患もしくは状態の存在またはいくつかの転帰の発生）を有する集団を指すことを意味し、「非疾患」は、その特徴を欠く集団を指すことを意味する。単一の決定閾値は、このような方法の最も簡単な適用であるが、複数の決定閾値が使用され得る。例えば、第１の閾値未満では、疾患の非存在は比較的高い信頼度で割り当てられ、第２の閾値を超えると、疾患の存在はまた、比較的高い信頼度で割り当てられ得る。２つの閾値間は、未定であると考えられてもよい。これは、本質的に例示にすぎないことが意味される。
【００７０】
閾値比較に加えて、アッセイ結果を患者分類（疾患の発生または不発生、転帰の可能性など）に相関させるための他の方法として、決定木、ルールセット、ベイジアン方法、およびニューラルネットワーク方法が挙げられる。これらの方法は、被験体が複数の分類から１つの分類に属する程度を表す確率値を生じ得る。
【００７１】
試験精度の測定値は、Fischerら、Intensive  Care  Med.２９巻：１０４３〜５１頁、２００３年において記載されるように得ることができ、所与のバイオマーカーの有効性を決定するために使用することができる。これらの測定値は、感度および特異性、予測値、尤度比、診断オッズ比、ならびにＲＯＣ曲線面積を含む。ＲＯＣプロットの曲線下面積（「ＡＵＣ」）は、分類指標が、ランダムに選択された陽性例をランダムに選択された陰性例よりも高くランク付けする確率に等しい。ＲＯＣ曲線下面積は、考慮する２つの群が連続データのものである場合に２つの群において得られるスコア間の中央値差に対して試験する、マンホイットニーのＵ検定、またはランクのウィルコクソン検定と同等であると考えることができる。
【００７２】
上記で議論されるように、好適な試験は、これらの種々の測定値に関する以下の結果のうちの１つまたは複数を示すことができる：０．５より高い、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．７、さらにより好ましくは少なくとも０．８、なおより好ましくは少なくとも０．９および最も好ましくは少なくとも０．９５の特異性、対応する感度は０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．４より高く、さらにより好ましくは少なくとも０．５、なおより好ましくは０．６、その上より好ましくは０．７より高く、さらにより好ましくは０．８より高く、より好ましくは０．９より高く、最も好ましくは０．９５より高く；０．５より高い、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは少なくとも０．７、さらにより好ましくは少なくとも０．８、なおより好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５の感度、対応する特異性は０．２より高く、好ましくは０．３より高く、より好ましくは０．４より高く、さらにより好ましくは少なくとも０．５、なおより好ましくは０．６、その上より好ましくは０．７より高く、さらにより好ましくは０．８より高く、より好ましくは０．９より高く、最も好ましくは０．９５より高く；少なくとも７５％の特異性と合わせた少なくとも７５％の感度；０．５より大きい、好ましくは少なくとも０．６、より好ましくは０．７、さらにより好ましくは少なくとも０．８、なおより好ましくは少なくとも０．９、最も好ましくは少なくとも０．９５のＲＯＣ曲線面積；１とは異なるオッズ比、好ましくは少なくとも約２もしくはそれより大きいかまたは約０．５もしくはそれより小さく、より好ましくは少なくとも約３もしくはそれより大きいかまたは約０．３３もしくはそれより小さく、さらにより好ましくは少なくとも約４もしくはそれより大きいかまたは約０．２５もしくはそれより小さく、なおより好ましくは少なくとも約５もしくはそれより大きいかまたは約０．２もしくはそれより小さく、最も好ましくは少なくとも約１０もしくはそれより大きいかまたは約０．１もしくはそれより小さく；１を超える、少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、さらにより好ましくは少なくとも５、最も好ましくは少なくとも１０の陽性尤度比（感度／（１−特異性）として計算される）；ならびにあるいは、１未満、０．５未満または０．５に等しい、より好ましくは０．３未満または０．３に等しい、最も好ましくは０．１未満または０．１に等しい陰性尤度比（（１−感度）／特異性として計算される）。
【００７３】
抗体
【００７４】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、抗原またはエピトープに特異的に結合可能な１つもしくは複数の免疫グロブリン遺伝子、またはその断片由来の、それらからモデル化された、またはそれらにより実質的にコードされるペプチドまたはポリペプチドを指す。例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第３版、Ｗ．Ｅ．  Ｐａｕｌ編、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９３年）；Ｗｉｌｓｏｎ（１９９４年；Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１７５巻：２６７〜２７３頁；Ｙａｒｍｕｓｈ（１９９２年）Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２５巻：８５〜９７頁を参照のこと。用語の抗体は、抗原結合部分、すなわち、抗原に結合する能力を保持する「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含み、これには、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結した２つのＦａｂ断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。また、用語「抗体」の言及には、単鎖抗体も含まれる。
【００７５】
好ましい治療用抗体は、ＩｇＧ抗体である。用語「ＩｇＧ」は、本明細書で使用される場合、認識される免疫グロブリンガンマ遺伝子によって実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。抗体のＩｇＧクラスにおける公知のＩｇドメインは、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ、およびＣＬである。ＩｇＧは、いくつかの実用上の理由で、治療用抗体として好ましいクラスである。ＩｇＧ抗体は、安定で、容易に精製され、医薬品サプライチェーンに対して実用的である条件下で保存することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＩｇＧ抗体は、単にサイズの関数ではなく、いわゆるＦｃ受容体（またはＦｃＲｎ）との相互作用の結果でもある長期の生物学的半減期を有する。この受容体は、ＩｇＧを細胞内における異化から保護すると考えられ、ＩｇＧを血漿に戻して再循環させる。
【００７６】
抗体は、特異的抗原に結合する免疫学的タンパク質である。ヒトおよびマウスを含むほとんどの哺乳動物では、抗体は、ポリペプチド重鎖とポリペプチド軽鎖との対合により構築される。軽鎖および重鎖可変領域は、抗体間で顕著な配列多様性を示し、標的抗原への結合を担う。各鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインで構成され、したがって、一般的用語である免疫グロブリンは、このようなタンパク質に対して使用される。
【００７７】
用語「特異的に結合する」は、上記で注記されたように、抗体は抗体が結合するエピトープ（複数可）を提示する任意のポリペプチドに結合するため、抗体はその意図される標的に排他的に結合するということを示すことは意図されない。むしろ、抗体の意図される標的に対する親和性が、適当なエピトープ（複数可）を提示しない非標的分子に対する親和性と比較したときに、約５倍大きい場合に、抗体は「特異的に結合する」。好ましくは、抗体の親和性は、非標的分子に対する親和性よりも、標的分子に対して少なくとも約５倍、好ましくは１０倍、より好ましくは２５倍、さらにより好ましくは５０倍、最も好ましくは１００倍またはそれを超えて大きい。好ましい実施形態では、好ましい抗体は、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは約１０８Ｍ−１から約１０９Ｍ−１の間、約１０９Ｍ−１から約１０１０Ｍ−１の間、または約１０１０Ｍ−１から約１０１２Ｍ−１の間の親和性により結合する。
【００７８】
親和性は、Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ（ｋｏｆｆは、解離速度定数であり、Ｋｏｎは、会合速度定数であり、Ｋｄは、平衡定数である）として計算される。親和性は、種々の濃度（ｃ）において標識リガンドの結合した割合（ｒ）を測定することによって平衡状態で決定され得る。データは、Ｓｃａｔｃｈａｒｄの式：ｒ／ｃ＝Ｋ（ｎ−ｒ）を使用してグラフ化される：式中、ｒ＝平衡状態における、結合リガンドのモル／受容体のモル；ｃ＝平衡状態における、遊離リガンド濃度；Ｋ＝平衡会合定数；および、ｎ＝受容体分子１つ当たりのリガンド結合部位数である。グラフ分析によって、ｒ／ｃは、Ｘ軸上のｒに対してＹ軸上にプロットされており、このようにしてＳｃａｔｃｈａｒｄプロットを生成する。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析による抗体親和性測定は、当技術分野で周知である。例えば、ｖａｎ  Ｅｒｐら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、１２巻：４２５〜４３頁、１９９１年；ＮｅｌｓｏｎおよびＧｒｉｓｗｏｌｄ、Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．  ２７巻：６５〜８頁、１９８８年を参照のこと。
【００７９】
本発明の抗体は、本明細書に記載されるイムノアッセイにおいて最も大きな臨床上の有用性を有する抗体およびエピトープが選択され得るように、エピトープマッピングによってさらに特徴付けることができる。用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することができる抗原決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面群からなり、通常、特異的な三次元構造特徴、および特異的な電荷特徴を有する。コンフォメーションおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で、前者への結合は失われるが、後者への結合は失われないということで識別される。好ましくは、標的分子上に存在するが、非標的分子上には部分的または全体的に存在しないエピトープが標的とされる。
【００８０】
一部の実施形態では、抗体足場は、異なる種由来の配列の混合物であり得る。したがって、抗体が１種の抗体であれば、このような抗体は、キメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。一般に、「キメラ抗体」と「ヒト化抗体」は両方、１つを超える種由来の領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、伝統的に、マウス（または一部の場合には、ラット）由来の可変領域（複数可）およびヒト由来の定常領域（複数可）を含む。「ヒト化抗体」は、一般的に、ヒト抗体中に見出される配列にスワップされた可変ドメインフレームワーク領域を有した非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く全抗体が、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされているかまたはＣＤＲ内を除きこのような抗体と同一である。ＣＤＲは、それらの一部またはすべてが非ヒト生物内で発生する核酸によりコードされており、ＣＤＲをヒト抗体可変領域のベータシートフレームワークに移植することで、移植されたＣＤＲにより特異性が決定される抗体を作出する。このような抗体の作出は、例えばＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁に記載されている。選択されたアクセプターフレームワーク残基の、対応するドナー残基への「復帰変異」は、多くの場合、初期移植構築物内で喪失している親和性を回復する必要がある（米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第５，８５９，２０５号；米国特許第５，８２１，３３７号；米国特許第６，０５４，２９７号；米国特許第６，４０７，２１３号）。ヒト化抗体は、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部分、典型的にヒト免疫グロブリンのものも含み、それにより、典型的には、ヒトＦｃ領域を含むことになる。ヒト化抗体は、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを使用して作製することもできる。Ｒｏｑｕｅら、２００４年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  ２０巻：６３９〜６５４頁。非ヒト抗体をヒト化して再形成するための様々な技法および方法は、当技術分野で周知である（ＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ、２００４年、Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ、５３３〜５４５頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）、およびそれに引用された参考文献を参照のこと）。ヒト化方法としては、これらに限定されないが、Ｊｏｎｅｓら、１９８６年、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年；Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁；Ｑｕｅｅｎら、１９８９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜３３頁；Ｈｅら、１９９８年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０巻：１０２９〜１０３５頁；Ｃａｒｔｅｒら、１９９２年���Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜９頁、Ｐｒｅｓｔａら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５７巻（２０号）：４５９３〜９頁；Ｇｏｒｍａｎら、１９９１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、１１巻：３２１〜８頁に記載された方法が挙げられる。ヒト化、または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減する他の方法は、例えば、Ｒｏｇｕｓｋａら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９１巻：９６９〜９７３頁に記載された通り、リサーフェシング方法を含み得る。一実施形態では、親抗体は、当技術分野で公知の通り、親和性成熟されている。構造に基づく方法は、例えば、米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載された通り、ヒト化および親和性成熟に用いられ得る。選択に基づく方法は、これらに限定されないが、Ｗｕら、１９９９年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９４巻：１５１〜１６２頁；Ｂａｃａら、１９９７年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻（１６号）：１０６７８〜１０６８４頁；Ｒｏｓｏｋら、１９９６年、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７１巻（３７号）：２２６１１〜２２６１８頁；Ｒａｄｅｒら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９５巻：８９１０〜８９１５頁；Ｋｒａｕｓｓら、２００３年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１６巻（１０号）：７５３〜７５９頁に記載された方法を含む、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟するのに用いられ得る。他のヒト化方法は、これらに限定されないが、米国特許出願第０９／８１０，５０２号；Ｔａｎら、２００２年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９巻：１１１９〜１１２５頁；Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓら、２００２年、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９巻：３０７６〜３０８４頁に記載された方法を含む、ＣＤＲのほんの一部の移植に関与し得る。
【００８１】
一実施形態では、抗体は、完全ヒト抗体である。「完全ヒト抗体」または「完全なヒト抗体」は、ヒト染色体に由来する抗体の遺伝子配列を有するヒト抗体を指す。完全ヒト抗体は、例えば、トランスジェニックマウス（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９７年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、８巻：４５５〜４５８頁）または選択方法と組み合わせたヒト抗体ライブラリー（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９８年、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、９巻：１０２〜１０８頁）を使用して、得てもよい。
【００８２】
抗体生成
【００８３】
モノクローナル抗体調製物を、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術の使用、またはこれらの組み合わせを含む当技術分野で公知の多様な技法を使用して生成することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当技術分野で公知であり、例えばＨａｒｌｏｗら、ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、１９８８年）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  Ｔ−ＣＥＬＬ  ＨＹＢＲＩＤＯＭＡＳ、５６３〜６８１頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８１年）（その両方が、全体が参照により組み込まれる）に教示された技法を含むハイブリドーマ技法を使用して生成することができる。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、ハイブリドーマ技術によって生成された抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」は、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一クローンに由来するが、それを生成する方法には由来しない抗体を指す。
【００８４】
ラットおよびマウス以外の動物に由来するモノクローナル抗体は、特有の利点を提供する。シグナル伝達および疾患に関連する多くのタンパク質標的は、マウスとラットとヒトとの間で高度に保存されており、それゆえに、マウスまたはラット宿主により自己抗原として認識されてしまい、免疫原性が低い可能性がある。この問題は、宿主動物としてウサギを使用する場合には回避され得る。例えばＲｏｓｓｉら、Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．、１２４巻、２９５〜３０２頁、２００５年を参照のこと。
【００８５】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を生成およびスクリーニングするための方法は、日常的であり、当技術分野で周知である。非限定的例において、マウスは、目的の抗原またはこのような抗原を発現する細胞により免疫化することができる。例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されるなど、免疫応答が検出されれば、マウス脾臓を回収して、脾臓細胞を単離する。次いで、脾臓細胞は、周知技法により任意の適切な骨髄腫細胞に融合する。ハイブリドーマを選択して、限界希釈によりクローニングする。次いで、ハイブリドーマクローンを、抗原に結合することが可能な抗体を分泌する細胞に関して当技術分野で公知の方法によりアッセイする。マウスに陽性ハイブリドーマクローンを腹腔内接種することにより、一般的には、高レベルの抗体を含有する腹水液を作製することができる。
【００８６】
抗体作製の方法において使用することができるアジュバントとしては、これらに限定されないが、タンパク質アジュバント；細菌アジュバント、例えば、全細菌（ＢＣＧ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）ならびに細胞壁骨格、トレハロースジミコレート、モノホスホリル脂質Ａ、結核菌のメタノール抽出性残渣（ＭＥＲ）、完全または不完全フロイントアジュバントを含む細菌成分；ウイルスアジュバント；化学的アジュバント、例えば、水酸化アルミニウム、ヨード酢酸塩およびコレステリルヘミスクシネート、または；ネイキッドＤＮＡアジュバントが挙げられる。本発明の方法で使用され得る他のアジュバントとしては、コレラ毒、パロポクスタンパク質（ｐａｒｏｐｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；参照により本明細書に組み込まれるＢｉｅｇら（１９９９年）「ＧＡＤ６５  Ａｎｄ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｂ  Ｃｈａｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  （９−２３）  Ａｒｅ  Ｎｏｔ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｔｙｐｅ  １  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  ＢＢ  Ｒａｔ」、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ、３１巻（１号）：１５〜２４頁も参照のこと）、ＭＰＬ（登録商標）（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；これらのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｄｍｅｌｌら（２０００年）「ＤＮＡ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｉｃｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒａｂｉｅｓ  Ｖｉｒｕｓ：  Ｅｆｆｅｃｔｓ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｒｏｕｔｅ  Ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  （ＭＰＬ）」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８巻：１０５９〜１０６６頁；Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９年）「３−Ｏ−Ｄｅｓａｃｙｌ  Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ：  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４２巻：４６４０〜４６４９頁；Ｂａｌｄｒｉｄｇｅら（１９９９年）「Ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ａ  （ＭＰＬ）  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９巻：１０３〜１０７頁も参照のこと）、ＲＣ−５２９アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｉｘａのアミノアルキルグルコサミニド４−リン酸（ＡＧＰ）化学ライブラリー由来のリード化合物。ｗｗｗ．ｃｏｒｉｘａ．ｃｏｍも参照のこと）、およびＤＥＴＯＸ（商標）アジュバント（Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＤＥＴＯＸ（商標）アジュバントは、ＭＰＬ（登録商標）アジュバント（モノホスホリル脂質Ａ）およびマイコバクテリア細胞壁骨格を含む；その両方が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｔｏｎら（１９９８年）「Ａｃｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｗｉｔｈ  Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｂ−Ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  Ｗｈｏｌｅ  Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｌｕｓ  ＤＥＴＯＸ  Ｉｎ  Ｐａｔｉ���ｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｍｅｌａｎｏｍａ」、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ４巻（３号）：６１９〜６２７頁；およびＧｕｐｔａら（１９９５年）「Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  Ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−−Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ，  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１３巻（１４号）：１２６３〜１２７６頁も参照のこと）が挙げられる。
【００８７】
数多くの刊行物により、選択された分析物への結合に関するポリペプチドライブラリーを生成およびスクリーニングするファージディスプレイ技術の使用が議論されている。例えば、Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８７巻、６３７８〜８２頁、１９９０年；Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、４０４〜６頁、１９９０年、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、３８６〜８８頁、１９９０年；ならびにＬａｄｎｅｒらの米国特許第５，５７１，６９８号を参照のこと。ファージディスプレイ方法の基本的概念は、スクリーニングされるポリペプチドをコードするＤＮＡとそのポリペプチドの間の物理的会合の確立である。この物理的会合は、ポリペプチドをコードするファージゲノムを封入するカプシドの一部としてポリペプチドを提示するファージ粒子により提供される。ポリペプチドとそれらの遺伝物質の間の物理的会合の確立は、異なるポリペプチドを有する非常に多数のファージの同時マススクリーニングを可能にする。標的への親和性を有するポリペプチドを提示するファージが、その標的に結合し、これらのファージが、標的への親和性スクリーニングにより濃縮される。これらのファージから提示されたポリペプチドの正体を、それらの各ゲノムから決定することができる。これらの方法を使用して、所望の標的への結合親和性を有するとして同定されたポリペプチドが、その後、従来の手段によりバルクで合成され得る。例えば、すべての表、図、および特許請求の範囲を含む全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０５７，０９８号を参照のこと。
【００８８】
これらの方法により作製された抗体は、次いで、目的の精製ポリペプチドとの親和性および特異性について第１のスクリーニングを行うこと、そして必要に応じて、その結果を、結合から除外されることが望ましいポリペプチドと抗体との親和性および特異性と比較することにより選択することができる。スクリーニング手順は、マイクロタイタープレートの個別のウェルにおいて精製ポリペプチドを固定化することに関与し得る。潜在的な抗体または抗体群を含有する溶液を、次いで、各マイクロタイターウェルに入れて、約３０分から２時間インキュベートする。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄して、標識された二次抗体（例えば、産生させた抗体がマウス抗体であれば、アルカリホスファターゼにコンジュゲートされた抗マウス抗体）をウェルに添加して約３０分間インキュベートし、次いで、洗浄する。基質をウェルに添加し、固定されたポリペプチド（複数可）への抗体が存在すれば、呈色反応が現れる。
【００８９】
このように同定された抗体は、次いで、選択されたアッセイデザインにおいて親和性および特異性についてさらに分析され得る。標的タンパク質についてのイムノアッセイの開発において、精製された標的タンパク質が、選択された抗体を使用するイムノアッセイの感度および特異性を決定する標準として作用する。様々な抗体の結合親和性は、異なる場合があり、ある特定の抗体対（例えば、サンドイッチアッセイにおいて）は、互いに立体的に干渉する場合があることなどにより、抗体のアッセイ性能は、抗体の絶対的な親和性および特異性よりも重要な尺度になり得る。
【００９０】
抗体は、機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないがヒト免疫グロブリン遺伝子は発現し得るトランスジェニックマウスを使用して生成することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為に、または相同組換えにより、マウス胚性幹細胞に導入することができる。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、およびダイバーシティ領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ）をマウス胚性幹細胞にも導入してもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に非機能性にされ得る。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内在性抗体の生成を防止する。修飾された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを生成する。次いで、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性の子孫を産み出す。トランスジェニックマウスを、選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部分で、従来の方法論を使用して免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体を、従来のハイブリドーマ技術を使用して免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが抱えるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再構成し、次に、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。したがって、このような技法を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生成することが可能になる。ヒト抗体を生成するためのこの技術の概要については、全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｏｎｂｅｒｇら（１９９５年）「Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｍｉｃｅ」、Ｉｎｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３巻：６５〜９３頁を参照のこと。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのこの技術、ならびにこのような抗体を生成するためのプロトコールの詳細な議論については、例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、および同第ＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照のこと。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）などの会社は、先に記載された技術と類似の技術を使用して選択された抗原に対するヒト抗体を提供するよう契約することができる。
【００９１】
抗体の組換え発現
【００９２】
本発明の抗体をコードする核酸配列が得られたら、抗体生成のためのベクターを、当技術分野で周知の技法を使用する組換えＤＮＡ技術により生成することができる。当業者に周知である方法を使用して、抗体コード配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えがある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９９０年、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌら編、１９９８年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹを参照のこと）。
【００９３】
抗体のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、従来の技法（例えば、電子穿孔、リポソームトランスフェクション、およびリン酸カルシウム沈降法）により宿主細胞に移入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を、従来の技法で培養して本発明の抗体を生成する。具体的な実施形態では、抗体の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異性プロモーターにより調節される。
【００９４】
本明細書に開示された抗ＴＩＭＰ２抗体は、組換えによって（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７発現系、哺乳動物細胞発現系または下等真核生物発現系において）製造されてもよい。この実施形態では、本発明の抗体免疫グロブリン分子（例えば、ＶＨまたはＶＬ）をコードする核酸をｐＥＴ系プラスミドへと挿入し、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｔ７系で発現させ得る。例えば、本発明は、抗体もしくはその抗原結合性断片またはその免疫グロブリン鎖を宿主細胞（例えば、細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、例えば、ＢＬ２１またはＢＬ２１ＤＥ３）内で発現させるための方法であって、Ｔ７プロモーターに作動可能に連結される免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドも含む細胞内でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現させるステップを含む、方法を含む。例えば、本発明の実施形態では、細菌宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｌａｃプロモーターに作動可能に連結したＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含み、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含む宿主細胞のインキュベーションによってポリメラーゼおよび鎖の発現が誘導される。
【００９５】
よって、本発明は、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体もしくはその抗原結合性断片、またはその免疫グロブリン鎖を作製するための組換え方法であって、抗体または断片の１つまたは複数の免疫グロブリン鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖および／または免疫グロブリン軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを導入するステップと；このような発現に好まれる条件下で宿主細胞（例えば、ＣＨＯまたはＰｉｃｈｉａ属またはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）を培養するステップと、必要に応じて、宿主細胞および／または宿主細胞が成長する培地から抗体または断片または鎖を単離するステップとを含む、方法を含む。
【００９６】
抗ＴＩＭＰ２抗体は、米国特許第６，３３１，４１５号に示される方法のいずれかによって合成することもできる。
【００９７】
本明細書に開示された抗体または断片または免疫グロブリン鎖の発現のための宿主として哺乳動物細胞を含む真核宿主細胞および原核宿主細胞は、当技術分野において周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手できる多くの不死化細胞系統を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳ０、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞およびいくらかの他の細胞系統を含む。哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を含む。特に好ましい細胞系統は、どの細胞系統が高発現レベルを有するかを決定することにより選択される。使用することができる他の細胞系統は、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞系統、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。真菌細胞としては、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｃｌａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｉｎｕｔａ（Ｏｇａｔａｅａ  ｍｉｎｕｔａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｌｉｎｄｎｅｒｉ）、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅｕｍ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓおよびＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．、任意のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、任意のＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、任意のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ、任意のＦｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａを含む酵母細胞および糸状菌細胞が挙げられる。重鎖またはその抗原結合部分もしくは断片、軽鎖および／またはその抗原結合性断片をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞へ導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体もしくは断片もしくは鎖の発現、または、宿主細胞が成長する培養培地への分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。
【００９８】
様々な宿主−発現ベクター系を利用して、本発明の抗体を発現させることができる。このような宿主−発現系は、それによって抗体のコード配列を生成し、次に、精製することができるビヒクルを表すが、また適当なヌクレオチドコード配列で形質転換またはそれをトランスフェクトしたときに本発明の抗体をｉｎ  ｓｉｔｕで発現し得る細胞も表す。これらには、これらに限定されないが、免疫グロブリンコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；免疫グロブリンコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｉｃｈｉａ）；免疫グロブリンコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））を感染させたか、もしくは免疫グロブリンコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換した植物細胞系；または哺乳動物細胞ゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ細胞（米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）、Ｐｅｒ  Ｃ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌによって開発されたラット網膜細胞））が含まれる。
【００９９】
細菌系では、発現される抗体を意図した使用に依存して、いくつかの発現ベクターを都合よく選択することができる。例えば、抗体の医薬組成物を作製するために、大量のこのようなタンパク質を生成する場合は、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を導くベクターが望ましい場合がある。このようなベクターには、これらに限定されないが、融合タンパク質が生成されるように、抗体コード配列を個々にｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームでベクターにライゲーションすることができるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、（１９８３年）「Ｅａｓｙ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｃｌｏｎｅｓ」、ＥＭＢＯ  Ｊ．  ２巻：１７９１〜１７９４頁）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら（１９８５年）「Ｕｐ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｌｐｐ  Ｇｅｎｅ  Ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３巻：３１０１〜３１１０頁；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅら（１９８９年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２４巻：５５０３〜５５０９頁）などが含まれる。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するためには、ｐＧＥＸベクターも使用することができる。一般的に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリクスグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合した後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離できるように、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１００】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で成長する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に配置することができる。
【０１０１】
哺乳動物宿主細胞では、ウイルスに基づくいくつかの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして使用する場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三要素リーダー配列（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）にライゲーションすることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによりアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）における挿入は、生存可能で、感染した宿主内で免疫グロブリン分子の発現が可能な組換えウイルスをもたらすことになる。（例えば、Ｌｏｇａｎら（１９８４年）「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｌｅａｄｅｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  Ｌａｔｅ  Ａｆｔｅｒ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）８１巻：３６５５〜３６５９頁を参照のこと）。挿入した抗体コード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要な場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、インサート全体の翻訳を保証するためには、開始コドンが、所望のコード配列のリーディングフレームと同相でなければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、由来が種々であってよく、天然および合成の両方であってよい。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを包含させることにより増強できる（Ｂｉｔｔｅｒら（１９８７年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｙｅａｓｔ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５３巻：５１６〜５４４頁を参照のこと）。
【０１０２】
さらに、挿入した配列の発現をモジュレートするか、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物を翻訳後にプロセシングおよび修飾するための特徴的で特異的な機序を有する。適当な細胞系統または宿主系を選択すると、発現される外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを保証することができる。そのためには、一次転写物の適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化の細胞機構を所有する真核生物宿主細胞を使用することができる。このような哺乳動物宿主細胞には、これらに限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０、ならびにＨｓ５７８Ｂｓｔが含まれる。
【０１０３】
組換えタンパク質を長期にわたり高収量で生成するためには、安定的発現が好ましい。例えば、本発明の抗体を安定的に発現する細胞系統を操作することができる。宿主細胞は、ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）により制御されたＤＮＡおよび選択マーカーを用いて形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、強化培地中で１〜２日間、操作された細胞の成長を可能にすることができ、次いで、選択培地に切り替える。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が、それ自体の染色体にプラスミドを安定的に組み込み、その後クローニングして細胞系統へと増殖することができるフォーカスを形成するように成長を可能にする。この方法は、本発明の抗体を発現する細胞系統を操作するために都合よく使用できる。このような操作された細胞系統は、本発明の抗体と直接的にまたは間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【０１０４】
これらに限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）「Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｏｆ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｃｅｌｌ、１１巻：２２３〜２３２頁）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａら（１９６２年）「Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｅｓｓ  Ｌｉｎｅ．  ＩＶ．  ＤＮＡ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ａ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｒａｉｔ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）４８巻：２０２６〜２０３４頁）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら（１９８０年）「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ＤＮＡ：  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｈｅ  Ｈａｍｓｔｅｒ  Ａｐｒｔ  Ｇｅｎｅ」、Ｃｅｌｌ、２２巻：８１７〜８２３頁）遺伝子を含むいくつかの選択系を、それぞれ、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞で用いることができる。また、以下の遺伝子の場合は、選択基準として代謝拮抗剤耐性を使用することができる：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら（１９８０年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｗｉｔｈ  Ａｎ  Ａｍｐｌｆｉａｂｌｅ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ａｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７巻：３５６７〜３５７０頁；Ｏ’Ｈａｒｅら（１９８１年）「Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｍｏｕｓｅ  Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ｂｙ  Ａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  Ａ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８巻：１５２７〜１５３１頁）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎら（１９８１年）「Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７８巻：２０７２〜２０７６頁）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｔａｃｈｉｂａｎａら（１９９１年）「Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  Ｂｙ  Ｈｕｍａｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  Ｂｙ  ｐＳＶ２−Ｎｅｏ  Ｇｅｎｅ」、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６巻（３号）：２１９〜２２６頁；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ（１９９３年）「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｒｉａｌｓ  Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ３２巻：５７３〜５９６頁；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３年）「Ｔｈｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０巻：９２６〜９３２頁；およびＭｏｒｇａｎら（１９９３年）「Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６２巻：１９１〜２１７頁）。使用できる組換えＤＮＡ技術の、当技術分野で一般的に公知な方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編）、１９９３年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０年、ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＡＮＤ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉら（編）、１９９４年、ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＨＵＭＡＮ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ．の第１２章および第１３章；Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら（１９８１年）「Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｆｏｒ  Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０巻：１〜１４頁に記載されており、ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏである（Ｓａｎｔｅｒｒｅら（１９８４年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  Ｆｏｒ  Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  Ａｎｄ  Ｇ４１８  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  Ａｓ  Ｄｏｍｉｎａｎｔ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ  Ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｌ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｇｅｎｅ、３０巻：１４７〜１５６頁）。
【０１０５】
本発明の抗体の発現レベルは、ベクター増幅により増加させることができる（総説は、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｆ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎ  Ｍａｍｍａｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」、ＤＮＡ  ＣＬＯＮＩＮＧ、３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７年）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤レベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域が、抗体のヌクレオチド配列と関連しているため、抗体産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅら（１９８３年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ」、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻：２５７〜２６６頁）。
【０１０６】
宿主細胞に、第１のベクターが重鎖由来のポリペプチドをコードし、第２のベクターが軽鎖由来のポリペプチドをコードする本発明の２つの発現ベクターを同時トランスフェクトし得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含有することができる。あるいは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一ベクターを使用することができる。このような状況では、軽鎖は、過剰な毒性遊離重鎖を回避するために重鎖の前に配置されるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ（１９８６年）「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  Ｍｉｎｉｇｅｎｅｓ」、Ｎａｔｕｒｅ、３２２巻：５６２〜５６５頁；Ｋｏｈｌｅｒ（１９８０年）「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｃｈａｉｎ  Ｌｏｓｓ  Ｉｎ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｌｉｎｅｓ」、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  （Ｕ．Ｓ．Ａ．）７７巻：２１９７〜２１９９頁）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１０７】
一般的に、特定の細胞系統またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質は、細胞系統またはトランスジェニック動物において産生される糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有する。したがって、抗体の特定のグリコシル化パターンは、抗体を生成するために使用される特定の細胞系統またはトランスジェニック動物に依存する。しかし、本明細書で提供される核酸分子によりコードされるか、または本明細書で提供されるアミノ酸配列を含むすべての抗体は、抗体が有する可能性のあるグリコシル化パターンとは無関係に、本発明を構成する。同様に、特定の実施形態では、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンを有する抗体が有利であり得る。なぜなら、これらの抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方において、それらのフコシル化対応物より高い効力を典型的に呈することが示されているからである（例えば、Ｓｈｉｎｋａｗａら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７８巻：３４６６〜３４７３頁（２００３年）；米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号を参照のこと）。非フコシル化Ｎ−グリカンを有するこれらの抗体が免疫原性である可能性は低い。なぜなら、それらの炭水化物構造は、ヒト血清ＩｇＧにおいて存在する集団の正常成分であるからである。
【０１０８】
本発明の抗体が組換えにより発現されると、抗体は、抗体精製に関して当技術分野で公知の任意の方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、特に、プロテインＡ後の特異的抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差示的溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的な技法によって精製することができる。
【０１０９】
抗体コンジュゲート
【０１１０】
本明細書に開示された抗ＴＩＭＰ２抗体およびその抗原結合性断片は、化学部分にコンジュゲートされていてもよい。化学部分は、とりわけ、ポリマー、放射線核種または細胞毒性因子であってもよい。特定の実施形態では、化学部分は、被験体の体内の抗体または断片の半減期を増加させるポリマーである。好適なポリマーとして、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、２ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１２ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａまたは４０ｋＤａの分子量のＰＥＧ）、デキストランおよびモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を含むがこれらに限定されない親水性ポリマーが挙げられる。Leeら、（１９９９年）（Bioconj.  Chem.１０巻：９７３〜９８１頁）は、ＰＥＧコンジュゲート単鎖抗体を開示する。Wenら、（２００１年）（Bioconj.  Chem.１２巻：５４５〜５５３頁）は、放射性金属キレート剤（ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ  ｃｈｅｌａｔｏｒ）（ジエチレントリアミン四酢酸（ＤＴＰＡ））に付加したＰＥＧと抗体をコンジュゲートすることを開示する。
【０１１１】
本明細書に開示された抗体およびその抗原結合性断片は、標識、例えば、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７ＣＵ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、および４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅとコンジュゲートされていてもよい。
【０１１２】
本明細書に開示された抗体および抗原結合性断片は、例えば、その生物学的（例えば、血清）半減期を増加させるためにＰＥＧ化されてもよい。抗体または断片をＰＥＧ化するために、抗体または断片を、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性形態、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１つまたは複数のＰＥＧ基が抗体または抗体断片に付加されるような条件下で、反応させる。特定の実施形態では、ＰＥＧ化は、反応性ＰＥＧ分子（または類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、他のタンパク質、例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドを誘導体化するために使用されるＰＥＧの任意の形態を包含することを意図する。ある特定の実施形態では、ＰＥＧ化される抗体または断片は、アグリコシル化抗体または断片である。タンパク質をＰＥＧ化するための方法は、当技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４を参照のこと。
【０１１３】
本明細書に開示された抗体および抗原結合性断片は、希土類キレート、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、イソチオシアネート、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレスカミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム（acridimium）塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識ならびに安定な遊離ラジカルなどのフルオロフォアを含む蛍光または化学発光標識とコンジュゲートされていてもよい。
【０１１４】
本発明の抗体およびその抗原結合性断片は、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ体外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉのタンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｉａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、ならびにエノマイシンなどの細胞毒性因子にコンジュゲートされていてもよい。
【０１１５】
Hunterら、（１９６２年）Ｎａｔｕｒｅ、１４４巻：９４５頁；Davidら、（１９７４年）Biochemistry、１３巻：１０１４頁；Painら、（１９８１年）J.  Immunol.  Meth.４０巻：２１９頁；およびNygren,  J.、（１９８２年）Histochem.  and  Cytochem.３０巻：４０７頁によって記載されるこれらの方法を含む、本発明の抗体およびその抗原結合性断片を種々の部分にコンジュゲートするための、当技術分野で公知の任意の方法を用いてもよい。抗体および断片をコンジュゲートするための方法は、従来通りであり、当技術分野で非常に周知である。
【０１１６】
抗ＴＩＭＰ２抗体の治療的使用
【０１１７】
本明細書に開示された単離された抗体またはその抗原結合性断片による処置を必要とする、ヒト被験体を含む被験体を処置するための方法が、さらに提供される。
【０１１８】
本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体および抗原結合性断片（例えば、抗体６Ｅ２．１または４０Ｈ２−４０Ｋ３およびそのヒト化バージョン）の医薬または無菌組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合性断片は、薬学的に許容される担体または賦形剤と混ぜられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＵ．Ｓ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ：  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８４年）を参照のこと。
【０１１９】
治療および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁物の形態で、許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製されてもよい（例えば、Hardmanら（２００１年）Goodman  and  Gilman's  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、McGraw-Hill、New  York、NY；Gennaro（２０００年）Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、Lippincott,  Williams,  and  Wilkins、New  York、NY；Avisら（編）（１９９３年）Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Parenteral  Medications、Marcel  Dekker、NY；Liebermanら（編）（１９９０年）Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Tablets、Marcel  Dekker、NY；Liebermanら（編）（１９９０年）Pharmaceutical  Dosage  Forms:  Disperse  Systems、Marcel  Dekker、NY；WeinerおよびKotkoskie（２０００年）Excipient  Toxicity  and  Safety、Marcel  Dekker,  Inc.、New  York、NYを参照のこと）。
【０１２０】
単独でまたは別の治療剤と組み合わせて投与される本発明の抗体の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死の用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順で決定することができる。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトでの使用のための投薬量範囲の製剤化に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および投与経路に依存してこの範囲内で異なってもよい。
【０１２１】
さらなる実施形態では、さらなる治療剤が、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３（Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；第５７版（２００２年１１月１日））に従って、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａまたはそのヒト化バージョン）に付随して被験体に投与される。
【０１２２】
投与様式は変化し得る。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、ガス注入、局所、皮膚、経皮、または動脈内が挙げられる。
【０１２３】
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａまたはそのヒト化バージョン）は、注射によるなど侵襲的経路で投与され得る。本発明のさらなる実施形態では、抗ＴＩＭＰ２抗体もしくはその抗原結合性断片、またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路による投与（例えば、経口的に、例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤で）も本発明の範囲内にある。
【０１２４】
本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）またはその医薬組成物のいずれかを含むベッセル（例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空針またはシリンジシリンダーを有するプラスチックまたはガラスバイアル）を提供する。本発明はまた、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）またはその医薬組成物のいずれかを含む注射デバイスを提供する。注射デバイスは、非経口経路、例えば、筋肉内、皮下または静脈内を介して、物質を患者の体内に導入するデバイスである。例えば、注射デバイスは、例えば、注射される流体（例えば、抗体もしくは断片またはその医薬組成物）を保持するシリンダーまたはバレル、流体を注射するための皮膚および／または血管を刺すための針；ならびに流体をシリンダーから押し出して針の穴を通すためのプランジャーを含むシリンジ（例えば、医薬組成物を予め充填した、例えば、自動注射器）であってもよい。本発明の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物を含む注射デバイスは、静脈内（ＩＶ）注射デバイスである。このようなデバイスは、カニューレまたはトロカール／針を介して患者の体内へと導入される流体（例えば、生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２を含む、および必要に応じてグルコースを含む乳酸加リンゲル液）を保持するためのバッグまたはリザーバーに取り付けられていてもよいチューブに取り付けられていてもよいカニューレまたはトロカール／針中に、抗体もしくは断片またはその医薬組成物を含む。抗体もしくは断片またはその医薬組成物は、本発明の実施形態では、トロカールおよびカニューレが被験体の静脈に挿入されるとデバイスに導入されてもよく、トロカールは挿入されたカニューレから除去される。ＩＶデバイスは、例えば、（例えば、手または腕の）末梢静脈に；上大静脈もしくは下大静脈、または心臓の右心房内（例えば、中心ＩＶ）に；あるいは鎖骨下静脈、内頚静脈、または大腿静脈に挿入されてもよく、例えば、ＩＶデバイスが上大静脈または右心房（例えば、中心静脈線）に到達するまで心臓に向かって進めてもよい。本発明の実施形態では、注射デバイスは、自動注射器；ジェット式注射器または外部輸液ポンプである。ジェット式注射器は、表皮を貫通して、抗体もしくは断片またはその医薬組成物を患者の体に導入する液体の細い高圧ジェットを使用する。外部輸液ポンプは、抗体もしくは断片またはその医薬組成物を、量を制御して、患者の体内に送達する医学デバイスである。外部輸液ポンプは、電気的にまたは機械的に動力を供給されてよい。様々なポンプが様々な方法で作動し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに流体を保持し、可動ピストンが流体送達を制御し、エラストマーポンプは伸縮自在なバルーンリザーバー中に流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力が流体送達を駆動する。蠕動ポンプでは、一組のローラーが、ある長さの可撓性チューブを挟み、流体を前方に押す。マルチチャネルポンプでは、複数の速度で複数のリザーバーから流体を送達することができる。
【０１２５】
本明細書に開示された医薬組成物はまた、米国特許第６，６２０，１３５号；同第６，０９６，００２号；同第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。医薬組成物を含むこのような無針デバイスはまた、本発明の一部である。本明細書に開示された医薬組成物はまた、注入によって投与することができる。医薬組成物を投与するための周知のインプラントおよびモジュールの例として、速度を制御して薬品を分注するための埋め込み型微注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬品を送達するための薬品注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号に開示されるものが挙げられる。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが、当業者に周知であり、本発明の医薬組成物を含むものは本発明の範囲内である。
【０１２６】
代わりに、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体または抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）は、全身方式よりも局所方式で、例えば、抗体または断片の腫瘍、例えば、ＴＩＭＰ２＋腫瘍への直接的注射を介して、投与されてもよい。さらに、抗体または断片は、標的化薬物送達システムにおいて、例えば、免疫病理学によって特徴付けられる、例えば、腫瘍、例えば、ＴＩＭＰ２＋腫瘍を標的とする、例えば、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームにおいて、投与されてもよい。リポソームは、罹患した組織に送り込まれ、罹患した組織によって選択的に取り込まれることになる。このような方法およびリポソームは、本発明の一部である。
【０１２７】
投与レジメンは、治療用抗体または抗原結合性断片の血清または組織の代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生体マトリクスにおける標的細胞の接近性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小限にすると同時に、標的疾患の状況の改善をもたらすのに十分な治療用抗体または断片を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、部分的に、特定の治療用抗体および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体または断片の適当な用量を選択するガイダンスが利用可能である（例えば、Wawrzynczak（１９９６年）Antibody  Therapy、Bios  Scientific  Pub.  Ltd、Oxfordshire、UK；Kresina（編）（１９９１年）Monoclonal  Antibodies,  Cytokines  and  Arthritis、Marcel  Dekker、New  York、NY；Bach（編）（１９９３年）Monoclonal  Antibodies  and  Peptide  Therapy  in  Autoimmune  Diseases、Marcel  Dekker、New  York、NY；Baertら（２００３年）New  Engl.  J.  Med.３４８巻：６０１〜６０８頁；Milgromら（１９９９年）New  Engl.  J.  Med.３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Slamonら（２００１年）New  Engl.  J.  Med.３４４巻：７８３〜７９２頁；Beniaminovitzら（２０００年）New  Engl.  J.  Med.３４２巻：６１３〜６１９頁；Ghoshら（２００３年）New  Engl.  J.  Med.３４８巻：２４〜３２頁；Lipskyら（２０００年）New  Engl.  J.  Med.３４３巻：１５９４〜１６０２頁を参照のこと）。
【０１２８】
適当な用量の決定は、臨床医によって、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野で公知かまたは影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因子を使用してなされる。一般的に、用量は、やや最適の用量未満の量から始め、その後、所望の効果または最適の効果が、あらゆる負の副作用と比べて達成されるまで、わずかな増分だけ増加される。重要な診断尺度は、例えば、炎症の症状の尺度または生成された炎症性サイトカインのレベルを含む。一般的に、使用される生物製剤が、処置のために標的とされた動物と同じ種に由来し、それによって、試薬に対する任意の免疫応答を最小限にすることが望ましい。ヒト被験体の場合では、例えば、ヒト化および完全ヒト抗体が望ましい場合がある。
【０１２９】
本明細書に開示された抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）は、連続的注入によって、または、例えば、毎日、１週間に１〜７回、毎週、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、半年毎、毎年など、投与された用量によって提供することができる。用量は、例えば、静脈内に、皮下に、局所的に、経口的に、経鼻的に、直腸に、筋肉内に、脳内に、脊髄内に、または吸入によって提供され得る。毎週の総用量は、一般的に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれよりも多い（例えば、Yangら（２００３年）New  Engl.  J.  Med.３４９巻：４２７〜４３４頁；Heroldら（２００２年）New  Engl.  J.  Med.３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Liuら（１９９９年）J.  Neurol.  Neurosurg.  Psych.６７巻：４５１〜４５６頁；Portieljiら（20003）Cancer  Immunol.  Immunother.５２巻：１５１〜１４４頁を参照のこと）。用量はまた、被験体の血清中の抗ＴＩＭＰ２抗体の所定の標的濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれよりも高い濃度を達成するために提供されてもよい。他の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体は、例えば、皮下または静脈内に、毎週、２週間毎、「４週間毎」、毎月、２カ月毎、または３カ月毎を基準に、被験体当たり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ投与される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、細胞、組織、または被験体に、単独でまたは追加の治療剤と組み合わせて投与される場合に、疾患の１つまたは複数の症状、例えば、がんまたはがんの進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効な本発明の抗ＴＩＭＰ２またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）の量を指す。有効用量は、さらに、少なくとも部分的な症状の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）、例えば、腫瘍収縮または除去、腫瘍成長の欠如、生存時間の増加をもたらすのに十分な抗体または断片の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、有効用量は、その成分を単独で指す。組み合わせに適用される場合、有効用量は、逐次的にまたは同時に組み合わせて投与されるか否かにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量を指す。治療薬の有効量は、少なくとも１０％の；通常は、少なくとも２０％の；好ましくは、少なくとも約３０％の；より好ましくは少なくとも４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の診断尺度またはパラメーターの改善をもたらすことになる。有効量はまた、主観的な尺度が疾患の重症度を評価するために使用される場合には、主観的な尺度に改善をもたらすことができる。
【０１３１】
実験的および診断的使用
【０１３２】
本明細書で開示された抗ＴＩＭＰ２抗体およびその抗原結合性断片を、親和性精製剤として使用することができる。このプロセスでは、抗ＴＩＭＰ２抗体およびその抗原結合性断片を当技術分野で周知の方法を使用して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ガラスまたはアガロース樹脂または濾紙などの固相に固定する。固定した抗体または断片を、精製されるＴＩＭＰ２タンパク質（またはその断片）を含有する試料と接触させ、その後、支持体を、固定した抗体または断片が結合したＴＩＭＰ２タンパク質を除く試料中の実質的にすべての材料を除去する適切な溶媒で洗浄する。最終的に、支持体を、結合したＴＩＭＰ２（例えば、プロテインＡ）を溶出する溶媒で洗浄する。このような固定した抗体および断片は、本発明の一部を形成する。
【０１３３】
例えば、ウエスタンブロットおよび本明細書で議論される他のイムノアッセイを実施するために有用な二次抗体を生成するための抗原がさらに提供される。
【０１３４】
抗ＴＩＭＰ２抗体（例えば、ヒト化抗体）およびその抗原結合性断片は、例えば、特定の細胞、組織、または血清、例えば、メラノーマ細胞などの腫瘍細胞において、その発現を検出する診断アッセイにおいて、ＴＩＭＰ２タンパク質に対して有用であり得る。このような診断方法は、種々の疾患の診断に有用であり得る。
【０１３５】
本発明は、本明細書に開示された抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片（例えば、抗体１３１Ａおよびそのヒト化バージョン）の使用を組み込むＥＬＩＳＡアッセイ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含む。
【０１３６】
例えば、このような方法は、以下のステップ：
（ａ）抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片で基質（例えば、マイクロタイタープレートウェル、例えば、プラスチックプレートの表面）をコーティングするステップ；
（ｂ）ＴＩＭＰ２の存在について試験される試料を基質に塗布するステップ；
（ｃ）プレートを洗浄し、その結果、試料中の未結合の材料が除去されるステップ；
（ｄ）ＴＩＭＰ２抗原に対しても特異的である検出可能に標識された抗体（例えば、酵素結合抗体）を適用するステップ；
（ｅ）基質を洗浄し、その結果、未結合の、標識された抗体が除去されるステップ；
（ｆ）標識された抗体が酵素に結合されている場合、酵素によって蛍光シグナルへと変換される化学物質を適用するステップ；および
（ｇ）標識された抗体の存在を検出するステップ
を含む。基質と関連する標識の検出は、ＴＩＭＰ２タンパク質の存在を示す。
【０１３７】
さらなる実施形態では、標識された抗体またはその抗原結合性断片を、ＡＢＴＳ（例えば、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸））または３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンと反応するペルオキシダーゼで標識し、検出可能な色の変化を生じさせる。あるいは、標識された抗体または断片を、検出可能なラジオアイソトープ（例えば、３Ｈ）で標識し、これを、閃光（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）の存在下で、シンチレーションカウンターによって検出することができる。
【０１３８】
本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片は、ウエスタンブロットまたは免疫−タンパク質ブロット手順で使用され得る。このような手順は、本発明の一部を形成し、例えば、ＴＩＭＰ２の存在について試験される試料に由来する（例えば、試料中のタンパク質のＰＡＧＥまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動による分離に由来する）タンパク質を、当技術分野で公知の方法（例えば、セミドライブロッティングまたはタンクブロッティング）を使用して、必要に応じて、膜または他の固体基質上に移すことと；結合したＴＩＭＰ２またはその断片の存在について試験される膜または他の固体基質を本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片と接触させることと；膜を１回または複数回洗浄して、未結合の抗ＴＩＭＰ２抗体または断片および他の未結合の物質を除去することと；結合した抗ＴＩＭＰ２抗体または断片を検出することとを含む。
【０１３９】
このような膜は、非変性ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲルにおいて、ＴＩＭＰ２の存在について試験されるタンパク質が移される（例えば、ゲルにおける電気泳動による分離後に）ニトロセルロースまたはビニル系（例えば、ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ））の膜の形態をとり得る。膜を抗ＴＩＭＰ２抗体または断片と接触させる前に、膜は、必要に応じて、例えば、脱脂粉乳などでブロッキングされ、膜上の非特異的タンパク質結合部位に結合する。
【０１４０】
結合した抗体または断片の検出により、ＴＩＭＰ２タンパク質が、膜または基質上および試料中に存在することが示される。結合した抗体または断片の検出は、抗体または断片を、検出可能に標識された二次抗体（抗免疫グロブリン抗体）と結合させ、次いで、二次抗体の存在を検出することによってもよい。
【０１４１】
本明細書に開示された抗ＴＩＭＰ２抗体およびその抗原結合性断片を、免疫組織化学のために使用してもよい。このような方法は、本発明の一部を形成し、例えば、ＴＩＭＰ２タンパク質の存在について試験される細胞（例えば、メラノーマ細胞などの腫瘍細胞）を本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片と接触させるステップと；細胞上または細胞内の抗体または断片を検出するステップとを含む。
【０１４２】
抗体または断片自体が、検出可能に標識されている場合、抗体または断片は、直接的に検出され得る。あるいは、抗体または断片を、検出される、検出可能に標識された二次抗体によって結合してもよい。
【０１４３】
本明細書に開示されたある特定の抗ＴＩＭＰ２抗体およびその抗原結合性断片を、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍イメージングのために使用してもよい。このような方法は、放射線標識された抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片の、ＴＩＭＰ２発現に関連する（例えば、腫瘍細胞表面に、例えば、ＴＩＭＰ２を発現する）腫瘍の存在について試験される患者の体内への注射と、その後の、標識された抗体または断片の存在を、例えば、腫瘍に結合した抗体または断片を高濃度で含む位置で検出するための患者の身体の核イメージングとを含み得る。位置の検出によって、ＴＩＭＰ２＋腫瘍および腫瘍細胞の存在が示される。
【０１４４】
イメージング技法は、ＳＰＥＣＴイメージング（単一光子放出型コンピュータ断層撮影）またはＰＥＴイメージング（ポジトロン放射断層撮影）を含む。例えば、標識は、例えば、ＳＰＥＣＴイメージングと併せたヨウ素１２３（１２３Ｉ）およびテクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）または、例えば、ＰＥＴイメージングと併せた１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏもしくは１８Ｆまたはインジウム１１１を含む（例えば、Gordonら、（２００５年）International  Rev.  Neurobiol.６７巻：３８５〜４４０頁を参照のこと）。
【０１４５】
医薬組成物および投与
【０１４６】
本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体および抗原結合性断片の医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体またはその抗原結合性断片を、薬学的に許容される担体または賦形剤と混合する。例えば、Remington's  Pharmaceutical  SciencesおよびU.S.  Pharmacopeia:  National  Formulary、Mack  Publishing  Company、Easton、PA（１９８４年）を参照のこと。
【０１４７】
治療剤および診断剤の製剤は、例えば、凍結乾燥粉末、スラリー、水溶液または懸濁物の形態の許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって調製されてもよい（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら（２００１年）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００年）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ａｖｉｓら（編）（１９９３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら（編）（１９９０年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：  Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００年）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）。
【０１４８】
単独でまたは別の治療剤と組み合わせて投与される、本発明の抗体の毒性および治療有効性を、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数（ＬＤ５０／ＥＤ５０）である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られるデータを、ヒトでの使用のための投薬量範囲の製剤化に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどまたはまったくない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、用いられる剤形および投与経路に依存して、この範囲内で変更可能である。
【０１４９】
さらなる実施形態では、Physicians'  Desk  Reference、２００３年（Thomson  Healthcare；第５７版（２００２年１１月１日））に従って、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片と関連して、さらなる治療剤が被験体に投与される。
【０１５０】
投与方式は変化し得る。投与経路としては、経口、直腸、経粘膜、腸、非経口；筋肉内、皮下、皮内、髄内、髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、眼内、吸入、ガス注入、局所、皮膚、経皮、腫瘍内、または動脈内が挙げられる。
【０１５１】
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片は、注射によるなど侵襲的経路で投与され得る。本発明のさらなる実施形態では、抗ＴＩＭＰ２抗体もしくはその抗原結合性断片、またはその医薬組成物は、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、腫瘍内に、または吸入、エアロゾル送達によって投与される。非侵襲的経路による投与（例えば、経口的に；例えば、丸剤、カプセル剤または錠剤で）も本発明の範囲内にある。
【０１５２】
本発明は、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片またはその医薬組成物のいずれかを含む容器（例えば、キャップまたはクロマトグラフィーカラム、中空針またはシリンジシリンダーなどを有するプラスチックまたはガラスバイアル）を提供する。本発明はまた、本発明の抗体もしくは抗原結合性断片またはその医薬組成物のいずれかを含む注射デバイスを提供する。注射デバイスは、非経口経路、例えば、筋肉内、皮下または静脈内を介して、物質を患者の体内に導入するデバイスである。例えば、注射デバイスは、例えば、注射される流体（例えば、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物）を保持するシリンダーまたはバレル、流体を注射するための、皮膚および／または血管を刺すための針、ならびに流体をシリンダーから押し出して針の穴を通すためのプランジャーを含むシリンジ（例えば、医薬組成物を予め充填した、例えば、自動注射器）であってもよい。本発明の実施形態では、本発明の抗体もしくはその抗原結合性断片またはそれらの医薬組成物を含む注射デバイスは、静脈内（ＩＶ）注射デバイスである。このようなデバイスは、カニューレまたはトロカール／針を介して患者の体内に導入される流体（例えば、生理食塩水；またはＮａＣｌ、乳酸ナトリウム、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２を含む、および必要に応じてグルコースを含む乳酸加リンゲル液）を保持するためのバッグまたはリザーバーに取り付けられていてもよいチューブに取り付けられていてもよいカニューレまたはトロカール／針中に抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を含む。抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物は、本発明の実施形態では、トロカールおよびカニューレが被験体の静脈に挿入されるとデバイスに導入されてもよく、トロカールは挿入されたカニューレから除去される。ＩＶデバイスは、例えば、（例えば、手または腕の）末梢静脈；上大静脈もしくは下大静脈、または心臓の右心房内（例えば、中央ＩＶ）に；あるいは鎖骨下静脈、内頚静脈、または大腿静脈に挿入されてもよく、例えば、ＩＶデバイスが上大静脈または右心房（例えば、中心静脈線）に到達するまで心臓に向かって進めてもよい。本発明の実施形態では、注射デバイスは、自動注射器、ジェット式注射器または外部輸液ポンプである。ジェット式注射器は、表皮を貫通して、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を患者の体に導入する液体の細い高圧ジェットを使用する。外部輸液ポンプは、抗体もしくは断片またはそれらの医薬組成物を、量を制御して、患者の体内に送達する医学デバイスである。外部輸液ポンプは、電気的にまたは機械的に動力を供給されてよい。様々なポンプが様々な方法で作動し、例えば、シリンジポンプはシリンジのリザーバーに流体を保持し、可動ピストンが流体送達を制御し、エラストマーポンプは伸縮自在なバルーンリザーバー中に流体を保持し、バルーンの弾性壁からの圧力が流体送達を駆動する。蠕動ポンプでは、一組のローラーが、ある長さの可撓性チューブを挟み、流体を前方に押す。マルチチャネルポンプでは、流体は、複数の速度で複数のリザーバーから流体を送達することができる。
【０１５３】
本明細書に開示される医薬組成物はまた、米国特許第６，６２０，１３５号；同第６，０９６，００２号；同第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号または同第４，５９６，５５６号に開示されるデバイスなどの無針皮下注射デバイスを用いて投与することができる。医薬組成物を含むこのような無針デバイスはまた、本発明の一部である。本明細書に開示される医薬組成物はまた、注入によって投与することができる。医薬組成物を投与するための周知のインプラントおよびモジュールの例として、速度を制御して薬品を分注するための埋め込み型微注入ポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；正確な注入速度で薬品を送達するための薬品注入ポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；連続的薬物送達のための可変流量埋め込み型注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；マルチチャンバーコンパートメントを有する浸透薬物送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号に開示されるものが挙げられる。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが、当業者に周知であり、本発明の医薬組成物を含むものは本発明の範囲内である。
【０１５４】
代わりに、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体または抗原結合性断片は、全身方式よりも局所方式で、例えば、抗体または断片の腫瘍、例えば、ＴＩＭＰ２＋腫瘍への直接的注射を介して、投与されてもよい。さらに、抗体または断片は、標的化薬物送達システムにおいて、例えば、免疫病理学によって特徴付けられる、例えば、腫瘍、例えば、ＴＩＭＰ２＋腫瘍を標的とする、例えば、組織特異的抗体でコーティングされたリポソームにおいて、投与されてもよい。リポソームは、罹患した組織に送り込まれ、罹患した組織によって選択的に取り込まれることになる。このような方法およびリポソームは、本発明の一部である。
【０１５５】
投与レジメンは、治療用抗体または抗原結合性断片の血清または組織の代謝回転速度、症状のレベル、治療用抗体の免疫原性、および生体マトリクスにおける標的細胞の接近性を含むいくつかの因子に依存する。好ましくは、投与レジメンは、望ましくない副作用を最小限にすると同時に、標的疾患の状況の改善をもたらすのに十分な治療用抗体または断片を送達する。したがって、送達される生物製剤の量は、部分的に、特定の治療用抗体、および処置される状態の重症度に依存する。治療用抗体または断片の適当な用量を選択するガイダンスが利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ（１９９６年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．  Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）（１９９１年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｃｈ（編）（１９９３年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｂａｅｒｔら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８巻：６０１〜６０８頁；Ｍｉｌｇｒｏｍら（１９９９年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４１巻：１９６６〜１９７３頁；Ｓｌａｍｏｎら（２００１年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４４巻：７８３〜７９２頁；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら（２０００年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４２巻：６１３〜６１９頁；Ｇｈｏｓｈら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４８巻：２４〜３２頁；Ｌｉｐｓｋｙら（２０００年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４３巻：１５９４〜１６０２頁を参照のこと）。
【０１５６】
適当な用量の決定は、臨床医によって、例えば、処置に影響を及ぼすことが当技術分野で公知かまたは影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因子を使用してなされる。一般的には、用量は、やや最適の用量未満の量から始め、その後、所望の効果または最適の効果が、あらゆる負の副作用と比べて達成されるまで、わずかな増分だけ増大される。重要な診断尺度は、例えば、炎症の症状の尺度または生成された炎症性サイトカインのレベルを含む。一般的に、使用される生物製剤が、処置のために標的とされた動物と同じ種に由来し、それによって、試薬に対する任意の免疫応答を最小限にすることが望ましい。ヒト被験体の場合では、例えば、ヒト化および完全ヒト抗体が望ましい場合がある。
【０１５７】
本明細書に開示される抗体またはその抗原結合性断片は、連続的注入によって、または、例えば、毎日、１週間に１〜７回、毎週、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎、半年毎、毎年など、投与された用量によって提供することができる。用量は、例えば、静脈内に、皮下に、局所的に、経口的に、経鼻的に、直腸に、筋肉内に、脳内に、脊髄内に、または吸入によって提供され得る。毎週の総用量は、一般的に、少なくとも０．０５μｇ／ｋｇ体重、より一般的には、少なくとも０．２μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、０．２５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇまたはそれよりも多い（例えば、Ｙａｎｇら（２００３年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４９巻：４２７〜４３４頁；Ｈｅｒｏｌｄら（２００２年）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３４６巻：１６９２〜１６９８頁；Ｌｉｕら（１９９９年）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  Ｐｓｙｃｈ．  ６７巻：４５１〜４５６頁；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら（２０００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ５２巻：１５１〜１４４頁を参照のこと）。用量はまた、被験体の血清中の抗ＴＩＭＰ２抗体の所定の標的濃度、例えば、０．１、０．３、１、３、１０、３０、１００、３００μｇ／ｍｌまたはそれよりも高い濃度を達成するために提供されてもよい。他の実施形態では、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体は、例えば、皮下または静脈内に、毎週、２週間毎、「４週毎」、毎月、２カ月毎、または３カ月毎を基準に、被験体当たり１０、２０、５０、８０、１００、２００、５００、１０００または２５００ｍｇ投与される。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、細胞、組織、または被験体に、単独でまたは追加の治療剤と組み合わせて投与される場合に、疾患の１つまたは複数の症状、例えば、がんまたはがんの進行における測定可能な改善を引き起こすのに有効な本発明の抗ＴＩＭＰ２またはその抗原結合性断片の量を指す。有効用量は、さらに、少なくとも部分的な症状の好転、例えば、腫瘍収縮または除去、腫瘍成長の欠如、生存時間の増加をもたらすのに十分な抗体または断片の量を指す。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、有効用量は、その成分を単独で指す。組み合わせに適用される場合、有効用量は、逐次的にまたは同時に組み合わせて投与されるか否かにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分の組み合わせた量を指す。治療薬の有効量は、少なくとも１０％の；通常は、少なくとも２０％の；好ましくは、少なくとも約３０％の；より好ましくは少なくとも４０％の、最も好ましくは少なくとも５０％の診断尺度またはパラメーターの改善をもたらすことになる。有効量はまた、主観的な尺度が疾患の重症度を評価するために使用される場合には、主観的な尺度に改善をもたらすことができる。
【０１５９】
キット
【０１６０】
本明細書で議論されるように、これらに限定されないが、薬学的に許容される担体および／または治療剤を含む１つまたは複数の追加の構成成分と関連して、本明細書で議論されるように、これらに限定されないが、抗ＴＩＭＰ２抗体または抗原結合性断片を含む１つまたは複数の構成成分を含むキットがさらに提供される。抗体もしくは断片および／または治療剤は、純粋な組成物としてまたは医薬組成物中で、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤化され得る。
【０１６１】
一実施形態では、キットは、１つの容器内に（例えば、滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル内に）、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体もしくはその抗原結合性断片またはその医薬組成物を、ならびに別の容器内に（例えば、滅菌ガラスまたはプラスチックバイアル内に）その医薬組成物および／または治療剤を含む。
【０１６２】
別の実施形態では、キットは、単一の、共通の容器内に、薬学的に許容される担体と共に、必要に応じて一緒に製剤化される１つまたは複数の治療剤と組み合わせて、必要に応じて、医薬組成物中に、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片を含む、本発明の組み合わせを含む。
【０１６３】
キットが、被験体への非経口投与のための医薬組成物を含む場合、キットは、このような投与を実施するためのデバイスを含むことができる。例えば、キットは、上記で議論したように、１つまたは複数の皮下針または他の注射デバイスを含むことができる。
【０１６４】
キットは、キットにおける医薬組成物および剤形に関する情報を含む添付文書を含み得る。一般的に、このような情報は、封入されている医薬組成物および剤形を有効かつ安全に使用することにおいて患者および医師を補助する。例えば、本発明の組み合わせに関する以下の情報が添付文書において供給されてもよい：薬物動態、薬力学、臨床研究、有効性パラメーター、適応症および用法、禁忌、警告、予防策、有害反応、過剰投薬、適当な投薬量および投与、供給方法、適当な保存条件、参考資料、製造業者／流通業者情報ならびに特許情報。
【０１６５】
便宜上、本発明の抗ＴＩＭＰ２抗体またはその抗原結合性断片をキット内に、すなわち、所定量の試薬の診断または検出アッセイを実施するための説明書とのパッケージングした組み合わせに提供することができる。抗体または断片が酵素で標識されている場合、キットは、酵素が必要とする基質と補助因子（例えば、検出可能なクロモフォアまたはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むことになる。さらに、安定剤、緩衝液（例えば、ブロック緩衝液または溶解緩衝液）などの他の添加剤を含んでよい。種々の試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液濃度を提供するように広く変えてもよい。特に、試薬は、通常凍結乾燥されて、溶解の際に適切な濃度を有する試薬溶液を提供する賦形剤を含む乾燥粉末として提供されてもよい。
【０１６６】
診断または検出試薬、および、例えば、ＥＬＩＳＡ（サンドイッチ型または競合的フォーマット）などのイムノアッセイを含む、様々な検出アッセイにおいて使用するための、１つまたは複数のこのような試薬を含むキットも提供される。キットの構成成分は、固体支持体に予め取り付けられてもよく、またはキットを使用する場合、固体支持体の表面に適用されてもよい。本発明の一部の実施形態では、シグナル生成手段は、本発明の抗体もしくは断片と予め関連していてもよく、または使用前に、１つもしくは複数の構成成分、例えば、緩衝液、抗体−酵素コンジュゲート、酵素基質などとの組み合わせを必要とし得る。キットはまた、追加の試薬、例えば、固相表面への非特異的結合を低減するためのブロッキング試薬、洗浄試薬、酵素基質なども含み得る。固相表面は、チューブ、ビーズ、マイクロタイタープレート、ミクロスフェア、またはタンパク質、ペプチド、もしくはポリペプチドを固定するのに好適な他の材料の形態であり得る。特定の態様では、化学発光もしくは発色性生成物の形成または化学発光もしくは発色性基質の低減を触媒する酵素は、シグナル生成手段の構成成分である。このような酵素は、当技術分野で周知である。キットは、本明細書に記載の捕捉剤および検出試薬のうちのいずれを含み得る。必要に応じて、キットは、本発明の方法を実行するための説明書を含んでもよい。
【０１６７】
バイアルまたは瓶などの容器中にパッケージングされた抗ＴＩＭＰ２抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合性断片を含み、容器に添付されるかまたはパッケージングされるラベルをさらに含むキットであって、ラベルが、容器の内容物を説明し、本明細書に記載されている１つまたは複数の疾患状況を処置するための、容器の内容物の使用に関する表示および／または説明を提供する、キットも提供される。
【０１６８】
一態様では、キットは、がんを処置するためのものであり、抗ＴＩＭＰ２抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合性断片およびさらなる治療剤またはワクチンを含む。キットは、必要に応じて、非経口、例えば、静脈内投与のためのシリンジをさらに含んでもよい。別の態様では、キットは、抗ＴＩＭＰ２抗体（例えば、ヒト化抗体）またはその抗原結合性断片と、ワクチンまたはさらなる治療剤との抗体または断片の使用を説明する、容器に添付されるかまたはパッケージングされるラベルとを含む。なお別の態様では、キットは、ワクチンまたはさらなる治療剤と、抗ＴＩＭＰ２抗体または断片とのワクチンまたはさらなる治療剤の使用を説明する、容器に添付されるかまたはパッケージングされるラベルとを含む。ある特定の実施形態では、抗ＴＩＭＰ２抗体およびワクチンまたはさらなる治療剤は、別個のバイアル中にあるかまたは同一の医薬組成物中に一緒に組み合わされる。
【０１６９】
併用療法の項において上記で議論したように、２つの治療剤の同時投与は、薬剤がそれらの治療効果を発揮する期間において重複がある限り、薬剤を同時に、または同一の経路で投与することは必要ではない。異なる日数または週数での投与のように、同時または逐次投与が企図される。
【０１７０】
本明細書に開示された抗体、ペプチド、抗原結合性断片、またはポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つ、および検出試薬もしくは治療剤として組成物を使用するための説明書を含む、本明細書に開示された治療および検出キットを調製してもよい。このようなキットで使用するための容器は、典型的には、検出および／または治療組成物（複数可）のうちの１つまたは複数が、配置され、好ましくは好適に等分され得る、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジまたは他の好適な容器を含み得る。第２の治療剤も提供される場合、キットは、この第２の検出および／または治療組成物が配置され得る、第２の別個の容器も含有し得る。あるいは、複数の化合物を、単一の医薬組成物において調製することができ、バイアル、フラスコ、シリンジ、瓶、または他の好適な単一容器などの、単一の容器手段にパッケージングされ得る。本明細書に開示されたキットはまた、典型的には、所望のバイアル（複数可）が保持される、例えば、射出またはブロー成形されたプラスチック容器などの、市販のために厳重に管理されたバイアル（複数可）を含有するための手段を含む。放射性標識、発色、蛍光発生的、または他の種類の検出可能な標識または検出手段がキット内に含まれる場合、標識剤は、検出または治療組成物自体と同一の容器内に提供されるか、または代替として、この第２の組成物が配置され、好適に等分され得る、第２の別個の容器手段に配置されてもよい。あるいは、検出試薬および標識は、単一の容器手段内に調製されてもよく、ほとんどの場合では、キットは、典型的には、市販および／または好都合なパッケージングおよび配送のために厳重に管理されたバイアル（複数を含む）を含有するための手段も含むことになる。
【０１７１】
本明細書に記載の検出またはモニタリング方法を実行するためのデバイスまたは装置も提供される。このような装置は、試料を入れることができるチャンバーまたはチューブと、デバイスを通る試料の流れを方向付けるための弁またはポンプを必要に応じて含む流体処理システムと、必要に応じて、血液から血漿または血清を分離するためのフィルターと、捕捉剤または検出試薬の添加のための混合チャンバーと、必要に応じて、捕捉剤免疫複合体に結合した検出可能な標識の量を検出するための検出デバイスとを含んでもよい。試料の流れは、受動的（例えば、一度試料が適用されると、デバイスのさらなる操作を必要としない、毛細血管、静水学的、または他の力によって）もしくは能動的（例えば、機械的ポンプ、電気浸透ポンプ、遠心力、または空気圧の増加を介して生じる力の印加によって）、または能動的および受動的な力の組み合わせによるものであってもよい。
【０１７２】
さらなる実施形態では、プロセッサ、コンピュータ可読メモリ、およびコンピュータ可読メモリに格納され、本明細書に記載の方法のいずれをも実施するようにプロセッサ上で実行されるように適合されるルーチンもまた提供される。好適なコンピューティングシステム、環境、および／または構成の例としては、パーソナルコンピュータ、サーバコンピュータ、ハンドヘルドもしくはラップトップデバイス、マルチプロセッサシステム、マイクロプロセッサに基づくシステム、セットトップボックス、プログラム可能な消費家電製品、ネットワークＰＣ、ミニコンピュータ、メインフレームコンピュータ、上記のシステムもしくはデバイスのいずれかを含む分散コンピューティング環境、または当技術分野で公知の任意の他のシステムが挙げられる。
【０１７３】
一般的方法
【０１７４】
分子生物学の標準的方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ（１９８２年および１９８９年第２版、２００１年第３版）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ（２００１年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；Ｗｕ（１９９３年）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ、２１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に記載される。標準的方法はまた、細菌細胞におけるクローニングとＤＮＡ変異誘発（１巻）、哺乳動物細胞と酵母におけるクローニング（２巻）、糖コンジュゲートとタンパク質発現（３巻）、およびバイオインフォマティクス（４巻）について記載するＡｕｓｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１〜４巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹにもみられる。
【０１７５】
免疫沈降、クロマトグラフィー、電気泳動、遠心分離、および結晶化を含むタンパク質精製のための方法について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、タンパク質のグリコシル化について記載されている（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２０００年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ＮＹ、ＮＹ、１６．０．５〜１６．２２．１７頁；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃｏ．（２００１年）Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；４５〜８９頁；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（２００１年）ＢｉｏＤｉｒｅｃｔｏｒｙ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、３８４〜３９１頁を参照のこと）。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生成、精製、および断片化について記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９９９年）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、上掲）。リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準的技法が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４巻、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【０１７６】
モノクローナル、ポリクローナル、およびヒト化抗体は調製することができる（例えば、ＳｈｅｐｅｒｄおよびＤｅａｎ（編）（２０００年）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎおよびＤｕｂｅｌ（編）（２００１年）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１３９〜２４３頁；Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５巻：６２０５頁；Ｈｅら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０巻：１０２９頁；Ｔａｎｇら（１９９９年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４巻：２７３７１〜２７３７８頁；Ｂａｃａら（１９９７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻：１０６７８〜１０６８４頁；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁；ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ（１９９２年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４巻：４８７〜４９９頁；米国特許第６，３２９，５１１号を参照のこと）。
【０１７７】
ヒト化への代替法は、ファージに提示されたヒト抗体ライブラリーまたはトランスジェニックマウスのヒト抗体ライブラリーを使用することである（Ｖａｕｇｈａｎら（１９９６年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻：３０９〜３１４頁；Ｂａｒｂａｓ（１９９５年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１巻：８３７〜８３９頁；Ｍｅｎｄｅｚら（１９９７年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１５巻：１４６〜１５６頁；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＣｈａｍｅｓ（２０００年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ、２１巻：３７１〜３７７頁；Ｂａｒｂａｓら（２００１年）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙら（１９９６年）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；ｄｅ  Ｂｒｕｉｎら（１９９９年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １７巻：３９７〜３９９頁）。
【０１７８】
単鎖抗体およびダイアボディについて記載されている（例えば、Ｍａｌｅｃｋｉら（２００２年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９９巻：２１３〜２１８頁；Ｃｏｎｒａｔｈら（２００１年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：７３４６〜７３５０頁；Ｄｅｓｍｙｔｅｒら（２００１年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：２６２８５〜２６２９０頁；ＨｕｄｓｏｎおよびＫｏｒｔｔ（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１巻：１７７〜１８９頁；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。二官能性抗体が提供される（例えば、Ｍａｃｋら（１９９５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９２巻：７０２１〜７０２５頁；Ｃａｒｔｅｒ（２００１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８巻：７〜１５頁；Ｖｏｌｋｅｌら（２００１年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１４巻：８１５〜８２３頁；Ｓｅｇａｌら（２００１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８巻：１〜６頁；Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１〜８３頁；Ｒａｓｏら（１９９７年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７２巻：２７６２３頁；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：１２０２〜１２０７頁；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら（１９９１年）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０巻：３６５５〜３６５９頁；ならびに米国特許第５，９３２，４４８号、同第５，５３２，２１０号、および同第６，１２９，９１４号を参照のこと）。
【０１７９】
多重特異性抗体も提供される（例えば、Ａｚｚｏｎｉら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６１巻：３４９３頁；Ｋｉｔａら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２巻：６９０１頁；Ｍｅｒｃｈａｎｔら（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ７４巻：９１１５頁；Ｐａｎｄｅｙら（２０００年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５巻：３８６３３頁；Ｚｈｅｎｇら（２００１年）Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  ２７６巻：１２９９９頁；Ｐｒｏｐｓｔら（２０００年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６５巻：２２１４頁；Ｌｏｎｇ（１９９９年）Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７巻：８７５頁；Ｌａｂｒｉｊｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１１０巻：５１４５〜５０頁、２０１３年；ｄｅ  Ｊｏｎｇら、ＰＬＯＳ  Ｂｉｏｌ、１４巻（１号）：ｅ１００２３４４頁、２０１６年（ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｂｉｏ．１００２３４４を参照のこと）。
抗原の精製は、抗体の作製にとって必須ではない。動物は、目的の抗原を有する細胞で免疫化することができる。次いで、脾臓細胞を免疫化動物から単離することができ、脾臓細胞を骨髄腫細胞系統と融合してハイブリドーマを生成することができる（例えば、Ｍｅｙａａｒｄら（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、７巻：２８３〜２９０頁；Ｗｒｉｇｈｔら（２０００年）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１３巻：２３３〜２４２頁；Ｐｒｅｓｔｏｎら、上掲；Ｋａｉｔｈａｍａｎａら（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６３巻：５１５７〜５１６４頁を参照のこと）。
【０１８０】
抗体は、例えば、小型薬物分子、酵素、リポソーム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされ得る。抗体は、治療、診断、キットまたは他の目的に有用であり、例えば、色素、放射性同位体、酵素、または金属、例えば、コロイド金に連結した抗体を含む（例えば、Ｌｅ  Ｄｏｕｓｓａｌら（１９９１年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４６巻：１６９〜１７５頁；Ｇｉｂｅｌｌｉｎｉら（１９９８年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０巻：３８９１〜３８９８頁；ＨｓｉｎｇおよびＢｉｓｈｏｐ（１９９９年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６２巻：２８０４〜２８１１頁；Ｅｖｅｒｔｓら（２００２年）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６８巻：８８３〜８８９頁を参照のこと）。
【０１８１】
蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を含むフローサイトメトリーのための方法が利用可能である（例えば、Ｏｗｅｎｓら（１９９４年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｇｉｖａｎ（２００１年）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、第２版；Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪ；Ｓｈａｐｉｒｏ（２００３年）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪを参照のこと）。例えば、診断試薬として使用するための核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチド、ならびに抗体を修飾するのに適する蛍光試薬が利用可能である（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（２００３年）カタログ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２００３年）カタログ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）。
【０１８２】
免疫系の組織学の標準的方法が記載されている（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｈａｒｍｅｌｉｎｋ（編）（１９８６年）Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｕｓ：  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｈｉａｔｔら（２０００年）Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ、ＰＡ；Ｌｏｕｉｓら（２００２年）Ｂａｓｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：  Ｔｅｘｔ  ａｎｄ  Ａｔｌａｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹを参照のこと）。
【０１８３】
例えば、抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング、機能的ドメイン、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（登録商標）Ｓｕｉｔｅ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）；ＧＣＧ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；ＤｅＣｙｐｈｅｒ（登録商標）（ＴｉｍｅＬｏｇｉｃ  Ｃｏｒｐ．、Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｂａｙ、Ｎｅｖａｄａ）；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、１６巻：７４１〜７４２頁；Ｍｅｎｎｅら（２０００年）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｎｏｔｅ、１６巻：７４１〜７４２頁；Ｗｒｅｎら（２００２年）Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄ．  ６８巻：１７７〜１８１頁；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３３巻：１７〜２１頁；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ（１９８６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４巻：４６８３〜４６９０頁を参照のこと）。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
ウサギにおけるモノクローナル抗体の発生
【０１８５】
雌のニュージーランドウサギを、抗原／アジュバントエマルションで皮下注射（ＳＱ）によって免疫化した。一次免疫化は、完全フロイントアジュバントを用いてなされ、不完全フロイントアジュバントは、次のすべての追加免疫に対して使用した。ウサギは、ウサギ１頭当たり２５０μｇのＴＩＭＰ２抗原を３週間毎にＳＱ注射した（２つの部位、臀部と肩甲骨を交互に）。試験採血は、２回目の追加免疫の７日後に耳翼辺縁静脈（ｍａｒｇｉｎａｌ  ｅａｒ  ｖｅｉｎ）から採取した。この試験採血（免疫血清）を間接ＥＬＩＳＡアッセイによって試験し、ウサギの免疫応答がモノクローナル抗体の発生にとって適当であるかどうかを決定した。最良の応答を示すウサギに最後のＳＱ追加免疫を与え、４日後に、失血により安楽死させた。全血は、心臓穿刺により採取した。目的の抗体を産生するＢ細胞は、標的抗原に関する間接ＥＬＩＳＡによって特定し、免疫グロブリン遺伝子を単離した。重鎖および軽鎖を別々の哺乳動物発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ細胞にトランスフェクトし（一過性トランスフェクション）、ウサギのモノクローナル抗体を含有する組織培養上清を回収した。
【０１８６】
４０Ｈ２−４０Ｋ３と示した抗体を単離し、核酸およびタンパク質の配列を以下のように決定した：
重鎖
配列番号９
【化７】
2020516603.tif 000008
【化８】
2020516603.tif 000009
配列番号１０：
【化９】
2020516603.tif 000010
【０１８７】
太字でマークし、下線を付したヌクレオチドおよび対応する定常ドメインのアミノ酸は置き換えられていてもよく、例えば、Ｇ＞Ａは、アミノ酸置換、例えば、Ｒ＞Ｑを生じる。この位置において好ましい残基：Ｒ、Ｑ、Ｎ。
【化１０】
2020516603.tif 000011
軽鎖
配列番号１５：
【化１１】
2020516603.tif 000012
配列番号１６
【化１２】
2020516603.tif 000013
【化１３】
2020516603.tif 000014
【化１４】
2020516603.tif 000015
【０１８８】
６Ｅ２．１と示した抗体を単離し、核酸およびタンパク質の配列を以下のように決定した：
重鎖
配列番号３２：
【化１５】
2020516603.tif 000016
配列番号３３：
【化１６】
2020516603.tif 000017
【化１７】
2020516603.tif 000018
軽鎖
配列番号３８：
【化１８】
2020516603.tif 000019
配列番号３９
【化１９】
2020516603.tif 000020
【化２０】
2020516603.tif 000021
【化２１】
2020516603.tif 000022
【０１８９】
（実施例２）
患者試料に関する抗体のスクリーニング（マイクロタイターに基づくＥＬＩＳＡ方法）
【０１９０】
材料：
９６ウェルの高結合ＥＬＩＳＡプレート−Ｃｏｓｔａｒ  ３５９０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）
ＥＬＩＳＡコーティング緩衝液：ＰＢＳ
ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液：０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ
ＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号Ｎ５０２）
ＥＬＩＳＡ試薬希釈液：２００ｍＭのＴｒｉｓ、１％のＢＳＡ（ＢｉｏＦｘ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８．１
ニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１００１）
１ステップＵｌｔｒａ  ＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３４０２８）
ストップ溶液：２Ｎの硫酸
捕捉抗体（６Ｅ２．１）
ビオチンコンジュゲート検出抗体（４０Ｈ２−４０Ｋ３）
組換えヒトＴＩＭＰ２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、カタログ番号４１０−０２）
ＥＸＬｘ４０５プレート洗浄液（Ｂｉｏｔｅｋ）
Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣプレートリーダー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
【０１９１】
試験手順
【０１９２】
精製した、組換えＴＩＭＰ２分析物を、試薬希釈液中に加え、連続希釈して、濃度の範囲をカバーする標準試料のセットを生成した。患者試料の凍結した単回使用アリコートを室温の水浴中で１０分間解凍し、次いで、試薬希釈液により所望のレベルまで希釈した。
【０１９３】
コーティング緩衝液中で調製した５μｇ／ｍＬのＣａｐｔｕｒｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ溶液１００μＬを９６ウェル高結合ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに添加し、室温（２２℃から２５℃）で終夜インキュベートした。各ウェルを吸引して、自動洗浄機を使用して３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、２５０μＬのＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液を各ウェルに添加した。室温で２時間インキュベートした後、上記吸引／洗浄ステップを繰り返した。
【０１９４】
１００μＬの標準試料または患者試料を調製したプレートの各ウェルに添加し、水平オービタルシェーカー上で室温でインキュベートした。２時間インキュベートした後、プレートを上記したように洗浄した。次いで、試薬希釈液中で調製した０．１μｇ／ｍＬの検出抗体溶液１００μＬを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを再度洗浄した。ニュートラアビジン−ＨＲＰコンジュゲートの０．１μｇ／ｍＬ溶液を試薬希釈液中で調製し、この溶液１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄した。１ステップｕｌｔｒａ  ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに添加し、光から保護して室温で１０分間インキュベートし、その後、５０μＬのストップ溶液を添加した。各ウェルの光学密度を、４５０ｎｍの波長に設定したマイクロプレートリーダーで測定した。
【０１９５】
（実施例３）
患者試料に関する抗体のスクリーニング（ラテラルフローストリップ試験方法）
【０１９６】
材料：
ニトロセルロース膜
バッキングカード
試料パッド
ウィッキングパッド
膜ブロッキング緩衝液：１０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のショ糖、０．１％のＢＳＡ、０．２％のＰＶＰ−４０、ｐＨ８．０
試料パッドブロッキング緩衝液：５ｍＭのホウ酸塩、０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、０．２５％のＰＶＰ−４０、０．５％のＢＳＡ、ｐＨ８．５
ランニング緩衝液Ｊ：５００ｍＭのＴｒｉｓ、０．２％の１０Ｇ、０．３５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．２５％のＰＶＰ−４０、ｐＨ８．５
蛍光によりコンジュゲートした抗体（４０Ｈ２−４０Ｋ３）
試験系抗体（６Ｅ２．１）
ヤギ−抗マウス陽性対照抗体
組換えヒトＴＩＭＰ−２
【０１９７】
ストリップアセンブリー
【０１９８】
ニトロセルロース膜をＡＤ３０５０吸引分注システムを使用して試験系抗体に関してストリップし、膜ブロッキング緩衝液でブロッキングし、３７℃で３０分間乾燥させた。デシケーター内で終夜キュアリングした後、ストリップされブロッキングされたニトロセルロース膜を、試料パッドブロッキング緩衝液で前処理したウィッキングパッドと試料パッドを有するバッキングカード上にラミネートした。カードを５ｍｍ幅の試験ストリップに切断し、次いで、これをカートリッジへと配置した。
【０１９９】
試料の調製
【０２００】
精製した組換えＴＩＭＰ−２分析物をランニング緩衝液Ｊ中に加え、連続希釈して、濃度の範囲をカバーする標準試料のセットを生成した。凍結した患者試料の単回使用アリコートを室温の水浴中で１０分間解凍し、次いで、ランニング緩衝液Ｊにより所望のレベルまで希釈した。
【０２０１】
試験手順
【０２０２】
１０μＬのＰＢＳ中で蛍光によりコンジュゲートした抗体（０．０２５μｇ／μＬ）を試料１００μＬに添加した。次いで、１００μＬのこの溶液を、カートリッジのインプットポートにローディングした。結果は、蛍光リーダーと関連するソフトウェアを使用して、ｔ＝２０分で読み取った。
【０２０３】
（実施例４）
ペプチドのＰｅｐｓｃａｎ合成方法およびｐｅｐｓｃａｎスクリーニングを使用するエピトープマッピング
【０２０４】
合成線状ペプチドを、Slootstraら（Slootstraら、１９９６年、Mol.  Diversity、１巻、８７〜９６頁）およびTimmermanら（Timmermanら、２００７年、J,  Mol  Recognit、２０巻、２８３〜２９９頁）によって記載されている通りに合成およびスクリーニングした。各ペプチドへの抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮに基づく酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。共有結合により連結したペプチドを、試料（例えば、５％のウマ血清（ｖｏｌ／ｖｏｌ）および４％のオボアルブミン（重量／ｖｏｌ）を含有するＰＢＳ溶液中で希釈した１μｇ／ｍＬの抗体）および１％のＴｗｅｅｎ  ８０と共に、４℃で終夜インキュベートした。洗浄した後、ペプチドを、ヤギ−抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で２５℃で１時間インキュベートし、次に、洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２μｇ／ｍＬ  ３％のＨ２Ｏ２を添加した。１時間後、発色を測定した。
【０２０５】
ペプチドセット１は、１つのアミノ酸残基のステップを有するＴＩＭＰ−２配列由来のネスティド線状１５マーペプチドからなり、一方、ペプチドセット２は、ペプチドの１１および１２位に二重アラニン突然変異体を有するペプチドの同一のセットからなった。例として、ネイティブＴＩＭＰ２（配列番号４５）の第１の残基から出発する、ペプチドセット１の３つのペプチドは、以下の通りである：
【化２２】
2020516603.tif 000023
【化２３】
2020516603.tif 000024
以下は、対応する突然変異配列に関する：
【化２４】
2020516603.tif 000025
アラニンがネイティブ配列に存在する場合、アラニンは、対応する突然変異配列においてグリシンと置き換えられることに留意されたい。セット１に関して高い結合を示すが、セット２に関しては示さないペプチドによって、結合に対して重要な残基が特定される。
【０２０６】
この方法論を使用して、抗体６Ｅ２．１に対して有力なエピトープを
【化２５】
2020516603.tif 000026
として特定し、下線を付した残基が最も重要な残基である。
【０２０７】
抗体４０Ｈ２−４０Ｋ３は、３つの結合領域、１４５ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ１５６（配列番号２１）、３３ＨＰＱＱＡＦＣＮＡ４１（配列番号２２）、および１９６ＲＳＤＧＳＣＡＷＹＲ２０５（配列番号２３）を示し、可能性のある不連続エピトープを示した。コア結合領域を、１４５ＮＨＲＹＱＭＧＣＥＣＫＩ１５６（配列番号２１）として特定した。
【０２０８】
本発明は、当業者がこれを作製および使用するのに十分詳細に記載および例示されたが、種々の変更、修正、および改良は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく明らかであるべきである。本明細書に提供される例は、好ましい実施形態の代表例であり、例示であり、本発明の範囲の限定を意図するものではない。そこにおける修正および他の使用が当業者に対して生じるであろう。これらの修正は、本発明の精神内に包含され、請求項の範囲によって定義される。
【０２０９】
本明細書における「または（ｏｒ）」の使用は、別段述べられていなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換的であり、限定を意図するものではない。
【０２１０】
種々の実施形態の記載が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、当業者は、一部の具体例では、実施形態が、言語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ
ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を使用して代わりに記載され得ることをさらに理解する。
【０２１１】
別段定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、この開示が属する技術分野における当業者に通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または均等な任意の方法および試薬が、開示された方法および組成物の実践において使用することができるが、例示的方法および材料がここに記載される。
【０２１２】
本明細書で言及されるすべての刊行物は、本明細書の記載と関連して使用され得る刊行物に記載される方法論を記載および開示する目的で、完全に参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、この開示の出願日前の、本発明が属する技術分野の当業者のレベルの指標である。本明細書のいずれも、本発明者らが、前の開示のために、このような開示に先行する権利を有さないことを認めるものと解釈されるべきではない。
【０２１３】
本発明の範囲および精神を逸脱することなく、様々な置き換えおよび修正が本明細書に開示された発明に対してなされ得ることは、当業者にとって容易に明らかとなろう。
【０２１４】
本明細書に例示的に記載された発明は、本発明に具体的に開示されていないいずれの要素（複数可）、限定（複数可）もない場合に実践することができる。したがって、例えば、本明細書の各場合には、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」のいずれかは、他の２つの用語のいずれかと置き換えることができる。用いられた用語および表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用され、このような用語および表現の使用において、示されかつ記載された特色の任意の均等物またはその部分を除外する意図はないが、種々の修正が特許請求された発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい実施形態と必要に応じた特色によって具体的に開示されているが、開示された本明細書の概念の修正および変形が当業者によって行われる場合があり、このような修正および変形は、添付の特許請求の範囲によって定義されたこの発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０２１５】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内に示される。
【配列表】
2020516603000001.app
【国際調査報告】
2020516603.tif 000031
2020516603.tif 000032
2020516603.tif 000033