(57)【要約】  本発明の目的は、生分解性のポリヒドロキシアルカノエートを溶剤抽出法により容易に得る方法を提供することである。  本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤とを５０〜１３０℃で混合することにより、ポリヒドロキシアルカノエートを析出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒドロキシアルカノエートを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤とを５０〜１３０℃で混合することにより、ポリヒドロキシアルカノエートを析出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項２】
ポリヒドロキシアルカノエートを良溶剤に溶解した溶液に、貧溶剤を添加して混合することにより、ポリヒドロキシアルカノエートを析出させることを特徴とする請求項１に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項３】
ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシブチレート、３−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエートおよび３−ヒドロキシデカノエートからなる群から選択されるモノマーのうち少なくとも２種類以上が共重合した共重合体であることを特徴とする請求項１又は２に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項４】
ポリヒドロキシアルカノエートが、必ず３−ヒドロキシヘキサノエートのユニットを含むことを特徴とする請求項３に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項５】
ポリヒドロキシアルカノエートが、３−ヒドロキシヘキサノエートと３−ヒドロキシブチレートとの共重合体であり、３−ヒドロキシヘキサノエートのユニット比が１３ｍｏｌ％未満の場合のポリヒドロキシアルカノエートを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤との混合温度が８５〜１３０℃であり、３−ヒドロキシヘキサノエートのユニット比が１３ｍｏｌ％以上の場合の該混合温度が５０〜８４℃であることを特徴とする請求項４に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項６】
ポリヒドロキシアルカノエートの良溶剤が、炭素数４〜１０の１価のアルコール類、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素類、炭素数３〜７のケトン類、及び炭素数４〜８の脂肪酸アルキルエステル類からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項７】
炭素数４〜１０の１価のアルコールが、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項６に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項８】
炭素数６〜１０の芳香族炭化水素類が、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、クメン、ブチルベンゼン、シメン、及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項６又は７に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項９】
炭素数３〜７のケトン類が、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノン、ヘプタノン、及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項６〜８の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１０】
炭素数４〜８の脂肪酸アルキルエステル類が、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシル、及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項６〜９の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１１】
貧溶剤が、炭素数６〜１２の脂肪族炭化水素であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１２】
貧溶剤がヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン、ウンデカン及びそれらの異性体からなる群より選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする請求項１１に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１３】
ポリヒドロキシアルカノエート及び良溶剤の合計量に対するポリヒドロキシアルカノエートの重量比が１重量％から２０重量％の範囲であることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１４】
貧溶剤及び良溶剤の合計量に対する貧溶剤の重量比が１０重量％から９０重量％であることを特徴とする請求項１〜１３の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１５】
良溶剤がトルエンであり、貧溶剤がヘプタンであることを特徴とする請求項１２〜１４の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１６】
ポリヒドロキシアルカノエートが、Ａｅｒｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｎｏｒｃａｄｉａ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属、Ｚｏｏｇｌｏｅａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属からなる群より選択される少なくとも１種の菌で生産されたポリヒドロキシアルカノエートであることを特徴とする請求項１〜１５の何れか１項に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１７】
ポリヒドロキシアルカノエートが、アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成遺伝子群を導入された形質転換体で生産されたポリヒドロキシアルカノエートである請求項１６に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１８】
アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成遺伝子群を導入された形質転換体が、アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成遺伝子群を導入されたＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａである請求項１７に記載のポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法。
【請求項１９】
ポリヒドロキシアルカノエートを含有するバイオマスからポリヒドロキシアルカノエートを抽出し、かつその溶媒含量を低下させることを特徴とする抽出残渣物質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１９記載の製造方法により製造した抽出残渣物質からなる動物用飼料、微生物用飼料、又は植物用肥料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマス内に蓄積したポリヒドロキシアルカノエートを、溶剤を用いて効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヒドロキシアルカノエート（以降、ＰＨＡと略す）は、多くの微生物種の菌体内にエネルギー貯蔵物質として合成、蓄積される生分解性の熱可塑性ポリエステルである。微生物によって天然の有機酸や油脂を炭素源に生産されるＰＨＡは、土中や水中の微生物により完全に生分解されるため自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることになる。従って、ＰＨＡは生態系への悪影響がほとんどない環境調和型のプラスチック材料と言える。近年、合成プラスチックが環境汚染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題となるに至り、ＰＨＡが環境に優しいグリーンプラスチックとして注目され、その実用化が切望されている。【０００３】
ＰＨＡを工業的に生産する場合には、生来的にＰＨＡを生産する微生物を用いる場合や、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を微生物や植物に組換え、形質転換体を取得しそれを製造用宿主として用いる場合がある。そのどちらの場合もＰＨＡはそれらバイオマス中に蓄積されるため、ＰＨＡの製造は、ＰＨＡを含むバイオマスを回収し、そのバイオマスから分離精製して行われることになる。【０００４】
バイオマスからのＰＨＡの分離精製に関しては、ＰＨＡ溶解性の溶剤を用いて抽出し、貧溶剤を用いて晶析を行い結晶を回収する方法が最も簡便な方法として知られている。例えば、ＰＨＡが蓄積されたバイオマスを乾燥し、乾燥バイオマスからクロロホルムや塩化メチレンなどのハロゲン系有機溶媒を用いてＰＨＡを抽出した後、抽出液をメタノールやヘキサンなどの貧溶媒と混合することによってＰＨＡを析出させて回収する方法（特許文献１）がある。これらの溶剤では、乾燥バイオマスからしか抽出できないため培養液から得られたバイオマスを乾燥する工程が必要となってくる。さらに環境規制に関わるハロゲン系有機溶媒を使用することなどの問題がある。
特許文献２には、溶剤による湿バイオマスからのＰＨＢ（３−ヒドロキシブチレートのホモポリマー）の抽出方法が記載されているが、ここで用いられる溶剤はプロパンジオールやグリセリンホルマールなどいずれも特殊なものであり、経済性等の点で工業的な利用には不十分である。【０００５】
また、特許文献３では、水との混和性のある溶剤での抽出が公開されている。そこでは、メタノール、エタノール、またはイソプロパノールが挙げられているが、これらの溶剤では沸点を大きく超える１００℃以上の加圧状態でバイオマスを処理しないとＰＨＡは抽出できないし、実施例１あるいは２で用いられている１４０℃という高温での溶解はＰＨＡの激しい分子量低下を起こすことが懸念される。さらに、特許文献３には、冷却により硬質で不透明なゲルを形成後、これを回転ロールで圧縮するとあるが、本発明者らはポリマーが硬質で不透明なゲルになると、反応容器からの払い出しがもはや不可能となり、実質的にＰＨＡは回収不能となることを経験した。
特許文献４では、主に植物からのＰＨＡの回収を溶剤を用いて行っているが、ＰＨＡ濃度１％で行っており、このような低濃度では使用する溶剤量が膨大となり実質的に工業化は困難である。また、上記条件においてもゲル化を防止できないことを本発明者らは経験した。【０００６】
このように、ＰＨＡを溶剤により抽出し回収する場合、晶析時のゲル化が激しいため実質的に簡便と考えられる溶剤抽出法が利用できない。あるいは、ゲル化を回避するためには低濃度での溶解と晶析を行うしかなく、ＰＨＡの回収が非効率になるため工業的に採算が合わない、という現状がある。このように、ＰＨＡのゲル化は深刻な問題であるが、ＰＨＡが実用化に到っていない大きな原因の一つになっているにもかかわらず、未だゲル化を回避する有効な手立ては見つかっていない。
【特許文献１】特開昭５９−２０５９９２号公報
【特許文献２】特開平２−６９１８７号公報
【特許文献３】特表平１０−５０４４６０号公報
【特許文献４】米国特許第５９４２５９７号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の課題は、ＰＨＡを含有するバイオマスより、溶剤を用いてＰＨＡを回収する時、ＰＨＡが実質的に払い出し不可能なゲル化した状態になるのを回避し、回収が極めて容易な状態の当該ポリマーを得る方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、バイオマス中からＰＨＡを良溶剤により抽出、回収する場合や、ＰＨＡ結晶を良溶剤に溶解し、回収する場合において、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤を混合させＰＨＡを析出させる際に、混合するときの温度が５０℃より下がると、ＰＨＡが流動性のないゲル状態になり、やがて固化し回収不能となることがわかった。そこで、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤との混合を５０〜１３０℃で行うことにより、従来得るのが極めて困難であった、流動性があり、払い出し可能で、さらには含液率の低いＰＨＡ結晶を得ることが初めて可能となることを見出し、ここに本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤とを５０〜１３０℃で混合することにより、ポリヒドロキシアルカノエートを析出させることを特徴とする、ポリヒドロキシアルカノエート結晶の製造方法に関する。【００１０】
以下に好ましい実施の形態を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に使用される良溶剤とは、その沸点でＰＨＡを３重量％以上溶解する溶剤を表すが、好ましくは４重量％以上、より好ましくは５重量％以上、とりわけ６重量％以上の溶解度をもつものが好ましい。良溶剤は炭素数４〜１０の１価のアルコール類、炭素数６〜１０の芳香族炭化水素類、炭素数３〜７のケトン類及び炭素数４〜８の脂肪酸アルキルエステル類からなる群より選ばれる少なくとも１種が好ましい。
炭素数４〜１０の１価のアルコールとしてはブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール、ノナノール、デカノール、及びそれらの異性体（例えば、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−メチル−１−ブタノール、３−メチル−１−ブタノール、ｎ−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、ｎ−ヘキサノール、１−ヘプタノール、２−ヘプタノール、３−ヘプタノール、１−オクタノール、２−オクタノール、ｎ−ノナノール、ｎ−デカノール、シクロヘキサノール、１−メチルシクロヘキサノール、２−エチルヘキサノール、ベンジルアルコールなど）が好ましい。
炭素数６〜１０の芳香族炭化水素類としては、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、クメン、ブチルベンゼン、シメン、及びそれらの異性体（例えば、１，２，３−トリメチルベンゼン、１，２，４−トリメチルベンゼンなど）が好ましい。【００１１】
また、炭素数３〜７のケトン類としては、アセトン、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノン、ヘプタノン、及びそれらの異性体（例えば、メチルイソブチルケトン、メチルｎ−アミルケトン、２−ヘキサノン、３−ヘキサノン、５−メチル−２−ヘキサノンなど）が好ましい。
さらに、炭素数４〜８の脂肪酸アルキルエステル類としては、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、プロピオン酸プロピル、プロピオン酸ブチル、プロピオン酸ペンチル、酪酸メチル、酪酸エチル、酪酸プロピル、酪酸ブチル、吉草酸メチル、吉草酸エチル、及びそれらの異性体（例えば、酢酸イソブチル、酢酸イソアミル、イソ酪酸イソブチルなど）が挙げられる。炭素数４〜８の脂肪酸アルキルエステル類としては、酢酸エチル、酢酸プロピル、酢酸ブチル、酢酸ペンチル、酢酸ヘキシル、及びそれらの異性体が好ましい。
上記良溶剤としては、１種又は２種以上を用いることができる。
これらの溶剤の中で、溶解度が高い点で、ｎ−ブタノール、イソブタノール、ｎ−ペンタノール、２−ペンタノール、３−ペンタノール、トルエン、ベンゼン、メチルエチルケトン、酢酸ブチル、プロピオン酸ブチル、酢酸エチルが本発明の良溶剤として特に好ましい。これら良溶剤では、溶解時のＰＨＡの分子量低下を防止できる芳香族炭化水素類、及びケトン類、すなわち、トルエン、ベンゼン、メチルエチルケトンが好ましいが、中でも比較的安価なトルエンがより好ましい。【００１２】
貧溶剤とは、１５〜２５℃で純化したＰＨＡを０．５重量％以上溶解しない溶剤を示す。貧溶剤としては炭素数６〜１２の脂肪族炭化水素が好ましく、例えば、ヘキサン、ヘプタン、メチルシクロヘキサン、オクタン、ノナン、デカン、ドデカン、ウンデカン、及びそれらの異性体（例えば、ｎ−ヘプタン、２−メチルヘキサン、３−メチルヘキサン、ｎ−オクタン、２−メチルヘプタン、３−メチルヘプタン等）などが挙げられるが、これら貧溶剤の中ではヘプタン、メチルシクロヘキサンが本発明の貧溶剤として特に好ましく、ヘプタンとしてはｎ−ヘプタンが特に好ましい。上記貧溶剤としては、１種又は２種以上を用いることができる。
本発明においては、良溶剤がトルエンであり、貧溶剤がヘプタンであることが好ましい。【００１３】
本発明の好ましい実施態様では、良溶剤に溶解させるＰＨＡの重量比は特に制限されないが、好ましくは、ＰＨＡ及び良溶剤の合計量に対して１重量％〜２０重量％になるよう良溶剤を加えればよい。より好ましい下限は２重量％、より好ましい上限は１５重量％、さらに好ましい下限は３重量％、さらに好ましい上限は１０重量％である。
湿バイオマスから抽出する場合には、溶剤抽出時の、湿バイオマスと良溶剤との混合物の最終水分含有率が一般に１重量〜１０重量％になるようバイオマスを調製することが好ましい。水分含量が１０重量％を超える場合、ＰＨＡの溶解性が低くなったり、溶剤の回収が困難となるので好ましくない。
ＰＨＡを抽出するための温度は５０℃以上であり、好ましくは６０℃以上、より好ましくは７０℃以上である。しかし、温度が高すぎると、ＰＨＡの分解が起こるため、１３０℃を越えないことが望ましい。
ＰＨＡを抽出するための時間は特に制限されないが、一般に１０〜６００分であり、好ましくは２０〜３００分であり、良好な抽出効率とＰＨＡの分解を防ぐ点から６０〜１２０分がより好ましい。
ＰＨＡ溶解後は溶液を抽出残渣と分離することが好ましい。分離は当業者には周知の方法で行うことができる。この場合加熱された濾過器等を使用するのが有利である。分離を行うときは加圧状態で行っても良い。【００１４】
本発明の好ましい実施態様によれば、ＰＨＡを良溶剤に溶解した後は、溶液の温度を５０〜１３０℃に保温することが好ましい。保温温度が５０℃より下がると、ＰＨＡが流動性のないゲル状態になり、やがて固化し回収不能となる場合がある。一方、保温温度が１３０℃を越えると、ＰＨＡが過度の分解を起こす場合がある。【００１５】
本発明のＰＨＡ結晶の製造方法では、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤とを５０〜１３０℃で混合する。上記混合温度の好ましい下限は６０℃、好ましい上限は１１０℃である。
さらに、本発明の好ましい実施態様によれば、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液中に貧溶剤を添加することもできるし、逆に、貧溶剤中にＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液を添加することもできる。さらには、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤を両方添加することもできるが、得られるＰＨＡ結晶の品質面からは、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液中に貧溶剤を添加する方法が好ましい。この添加は、攪拌しながら行ってもよいし攪拌せずに行ってもよいが、攪拌しながら行うことが好ましい。一例を挙げると、５０℃以上に保温した、ＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液中に、貧溶剤を徐々に添加しながら混合し、混合を続けてＰＨＡ結晶を析出させる。
本発明の好ましい実施態様によれば、ＰＨＡの晶析は、上記保温温度にて良溶剤及び貧溶剤との共存下で行われる。その後、必要に応じ、５０℃より低い温度まで冷却することにより析出量を増大させることもできる。なお、本発明は、加圧条件下で行うこともできるし、減圧条件下で行うこともできる。【００１６】
ここでさらに、ＰＨＡが３−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシヘキサノエートとの共重合体（ＰＨＢＨ）である例を挙げると、３−ヒドロキシヘキサノエート（以下３ＨＨと略す）のユニット比に応じてＰＨＡを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤との混合温度を変えることが、流動性があり、払い出し可能で、操作性の良いＰＨＡを得る上で重要であることがわかった。３ＨＨユニット比が１３ｍｏｌ％未満の場合には、好ましい混合温度は８５〜１３０℃である。一方、３ＨＨユニット比が１３ｍｏｌ％以上の場合には、好ましい混合温度は５０〜８４℃である。３ＨＨユニット比が１３ｍｏｌ％未満で混合温度を８５℃未満にすると、得られるＰＨＡがゲル状となる場合があり、また、３ＨＨユニット比が１３ｍｏｌ％以上で混合温度が８４℃を超えると、得られるＰＨＡが粘着性の高い結晶となる場合がある。このように、ＰＨＢＨを良溶剤に溶解した溶液と貧溶剤との最適混合温度は３ＨＨユニット比に依存する。【００１７】
貧溶剤の量としては、貧溶剤及び良溶剤の合計量に対する貧溶剤の重量比が１０重量％から９０重量％となる量が好ましい。より好ましい下限は２０重量％であり、さらには３０重量％である。また、より好ましい上限は８０重量％であり、さらには７０重量％である。この方法により、従来得るのが極めて困難であった、流動性があり、払い出し可能で、さらには良溶剤及び貧溶剤の含液率の低いＰＨＡを得ることが可能となる。【００１８】
晶析後のＰＨＡの回収は、ＰＨＡ溶解溶液から液体を濾過、遠心分離など当業者には周知の方法で行われる。回収したＰＨＡは先述した良溶剤と貧溶剤の中から選択される溶剤又はその混合物にて洗浄できるが、これらに限られるわけではなく、例えば水、メタノール、エタノール、アセトン、ヘキサンなどの溶剤またはその混合物でも洗浄できる。
ＰＨＡの乾燥は、当業者には周知の方法、たとえば気流乾燥、真空乾燥などで行われる。【００１９】
本発明におけるＰＨＡは、ヒドロキシアルカノエート成分としては特に限定されないが、具体的には、３−ヒドロキシブチレート（３ＨＢ）、３−ヒドロキシバレレート（３ＨＶ）、３−ヒドロキシプロピオネート、４−ヒドロキシブチレート、４−ヒドロキシバレレート、５−ヒドロキシバレレート、３−ヒドロキシヘキサノエート（３ＨＨ）、３−ヒドロキシヘプタノエート、３−ヒドロキシオクタノエート、３−ヒドロキシノナノエート、３−ヒドロキシデカノエートなどが挙げられる。本発明におけるＰＨＡは、これらヒドロキシアルカノエートの単重合体であっても、２種以上が共重合した共重合体であってもよいが、２種以上が共重合した共重合体が好ましい。ＰＨＡの具体例としては、３ＨＢの単重合体であるＰＨＢや、３ＨＢと３ＨＶの２成分共重合体であるＰＨＢＶ、３ＨＢと３ＨＨとの２成分共重合体であるＰＨＢＨ（特許第２７７７７５７号公報参照）または、３ＨＢと３ＨＶと３ＨＨとの３成分共重合体ＰＨＢＨＶ（特許第２７７７７５７号公報参照）などが例示できる。特に、生分解性ポリマーとしての分解性と柔らかい性質を持つ点で、モノマー成分として３ＨＨを有する共重合体が好ましく、より好ましくはＰＨＢＨである。このときＰＨＢＨを構成する各モノマー成分のユニット比については特に限定されるものではないが、晶析時の結晶性状の良好さから、好ましくは３ＨＨユニットは２０ｍｏｌ％以下であり、より好ましくは１５ｍｏｌ％以下、とりわけ１０ｍｏｌ％以下が好ましい。ＰＨＢＨＶの場合、構成する各モノマーユニット比については特に限定されるものではないが、例えば、３ＨＢユニットの含量は１〜９５ｍｏｌ％、３ＨＶユニットの含量は１〜９６ｍｏｌ％、３ＨＨユニットの含量は１〜３０ｍｏｌ％といった範囲のものが好適である。【００２０】
ＰＨＡが実用化できるためには、ＰＨＡはゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分子量標準とした重量平均分子量１万以上を有しなければならない。好ましくは５万以上、より好ましくは１０万以上、特に好ましくは２０万以上である。【００２１】
本発明に用いられるバイオマスは、細胞内にＰＨＡを蓄積することが可能な生物であれば特に限定されない。例えば、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｌａｔｕｓ等のアルカリゲネス属、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａなどのラルストニア属、シュウドモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ属、Ｚｏｏｇｌｏｅａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｙａｒｒｏｗｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属などの微生物は、培養条件を調整することによってＰＨＡを細胞内に蓄積することが可能である。また、これら微生物のＰＨＡ合成に関与する遺伝子群を導入した形質転換体であっても良い。その場合、宿主としては特に限定されず、上記微生物の他、大腸菌や酵母（ＷＯ０１／８８１４４参照）などの微生物や、さらには植物などが挙げられる。このなかで、アエロモナス属のＡ．ｃａｖｉａｅや、該Ａ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入した形質転換菌体が、ポリマーとして優れたＰＨＢＨを合成できる能力があるという点で好ましい。特に、Ａ．ｃａｖｉａｅのＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａがより好ましく、該微生物の１例は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ  ＡＣ３２（受託日：平成９年８月７日、受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）として日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。【００２２】
ここに挙げたＰＨＡ生産微生物の培養方法については特に限定されないが、例えば特開２００１−３４００７８号公報に示した当業者に周知の方法が用いられる。【００２３】
ＰＨＡを回収するうえで、培養後の微生物菌中のＰＨＡ含有率は、高い方が好ましいのは当然であり、工業レベルでの適用においては乾燥バイオマス中に５０重量％以上のＰＨＡが含有されているのが好ましく、以後の分離操作、分離ポリマーの純度等を考慮するとより好ましいＰＨＡ含有率は６０重量％以上、さらには７０重量％以上である。【００２４】
培養完了後は、バイオマスを常法で、例えば噴霧乾燥等により直接培養液から乾燥バイオマスを得る、あるいは、遠心や膜分離などの方法によりバイオマスを回収する。回収したバイオマスは、乾燥した状態、あるいは水で湿らした湿バイオマスの状態で抽出工程に用いることができる。また、回収バイオマスをメタノール、アセトン等の脂質溶剤で洗浄した湿バイオマス、あるいはこれを乾燥したものもＰＨＡ抽出用バイオマスとして用いることができる。【００２５】
本発明により得られたＰＨＡは、各種繊維、糸、ロープ、織物、編物、不織布、紙、フィルム、シート、チューブ、板、棒、容器、袋、部品、発泡体などの形状に成形できる。また、２軸延伸フィルムにも加工できる。その成形品は、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、その他の分野に好適に用いることができる。【００２６】
本発明は、また、ＰＨＡを含有するバイオマスからＰＨＡを抽出し、かつその溶媒含量を低下させることを特徴とする抽出残渣物質の製造方法である。
ＰＨＡを含有するバイオマスからＰＨＡを抽出する方法としては、上述のＰＨＡ結晶の製造方法を用いてもよいし、その他の公知の方法であってもよい。
上記抽出残渣物質の溶媒含量を低下させる方法としては特に限定されず、例えば、加熱乾燥、真空定温乾燥、ドラムヒーター、高温加熱炉、遠赤外線ヒーター等が挙げられる。
本発明により処理した後の抽出残渣物質は動物用飼料、微生物用飼料、あるいは植物用肥料として用いることが好ましい。従って、本発明で用いる溶媒は、飼料あるいは肥料として許容可能の量であることが好ましい。しかし、溶媒は抽出残渣物質から実質的に除去する方が好ましい。
上記抽出残渣物質からなる動物用飼料、微生物用飼料、又は植物用肥料も、本発明の一つである。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の方法により、ゲル化を防止し、流動性があり、払い出し可能で、さらには含液率の低いＰＨＡを得ることができるため、分離、洗浄性も良く、品質の良いＰＨＡを工業的に安価に生産、提供できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。実施例においては、いずれも共重合ポリエステルとして、ポリ（３−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシヘキサノエート）（以下、ＰＨＢＨと略す）を生産した。もちろん本発明はこれら実施例にその技術範囲を限定するものではなく、ＰＨＢＨに限られるものではない。
なお、本実施例におけるＰＨＢＨの重量平均分子量の測定は、Ｓｈｏｄｅｘ  Ｋ８０６Ｌ（３００×８ｍｍ、２本連結）（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ゲルクロマトグラフィーシステム（ＲＩ検出）を用いクロロホルムを移動相として分析した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。またＰＨＢＨの純度はＰＨＢＨをメチルエステル化しガスクロマトグラフィーにより測定した。湿バイオマスの水分含量はケット科学研究所製の赤外線水分計ＦＤ―２３０を用いて測定した。【００２９】
（実施例１）
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）を特開２００１−３４００７８号公報の実施例４（炭素源：ヤシ油５％のみ）に記載した方法で培養を行い、ＰＨＢＨの生産を行った。培養終了後遠心分離によりバイオマスを回収し湿バイオマスを得、さらにこのバイオマスを５０℃で１５時間真空乾燥し、乾燥バイオマスを得た。乾燥バイオマス中のＰＨＢＨの含量は６０重量％、重量平均分子量は１３０万、３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、３ＨＨと略す）ユニットは７ｍｏｌ％であった。この乾燥バイオマス２４．８ｇとイソブタノール２１１．４ｇをフラスコに入れ、１００℃で１時間抽出を行った。溶液を１００℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を９０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、回収したＰＨＢＨをイソブタノールとヘプタンの等量混合溶剤５０ｇで洗浄後４５℃で真空乾燥した。回収量は１４．１ｇ（９５％）、純度９９％以上、３ＨＨユニット７ｍｏｌ％であった。分子量は１０１万と減少したが、加工には十分な分子量であった。【００３０】
（比較例１）
実施例１と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、４０℃まで徐冷することにより晶析を試みたが、ＰＨＢＨが激しくゲル化し回収不能であった。従って、単に徐冷のみによる晶析では操作性の良いＰＨＢＨの回収は困難である。【００３１】
（実施例２）
実施例１で用いた培養液からバイオマスを遠心分離にて回収し、湿バイオマスを得た。水分含量４０％の湿バイオマス４１．３ｇ（乾燥バイオマス重量２４．８ｇ、乾燥バイオマス中のＰＨＢＨ含量６０重量％）にイソブタノール２１１ｇを加え、１００℃で２時間抽出を行った。その後１００℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶解液を回収した。回収した溶液を９０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、実施例１と同様に洗浄、乾燥した。回収量は１３．８ｇ（９３％）、純度９９％以上、３ＨＨユニットは７ｍｏｌ％であった。分子量は８８万と減少したが、加工には十分な分子量であった。【００３２】
（実施例３）
実施例１で得られた乾燥バイオマス２４．８ｇとトルエン２１１．４ｇをフラスコに入れ、１００℃で１時間抽出を行った。溶液を１００℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を９０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、回収したＰＨＢＨをトルエンとヘプタンの等量混合溶剤５０ｇで洗浄後４５℃で真空乾燥した。回収量は１４．３ｇ（９７％）、純度９９％以上、３ＨＨユニットは７ｍｏｌ％であった。分子量は１２８万とほとんど低下しなかった。【００３３】
（実施例４）
実施例２と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、ヘプタン２１０ｇを６０℃で添加することにより晶析を行ったが、ＰＨＢＨは溶剤を大量に含んだ流動性の悪いゲル状となり、ＰＨＢＨは何とか回収できたものの、濾過性はあまり良くなかった。【００３４】
（実施例５）
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）を特開２００１−３４００７８号公報の実施例２（炭素源：ヤシ油４％＋ヘキサン酸１％）に記載した方法で培養を行い、ＰＨＢＨの生産を行った。培養終了後遠心分離によりバイオマスを回収し湿バイオマスを得、さらにこのバイオマスを５０℃で１５時間真空乾燥し、乾燥バイオマスを得た。乾燥バイオマス中のＰＨＢＨの含量は６０重量％、重量平均分子量は７５万、３ＨＨユニットは１０ｍｏｌ％であった。この乾燥バイオマス２４．８ｇとトルエン２１１．４ｇをフラスコに入れ、１００℃で１時間抽出を行った。溶液を１００℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を９０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、回収したＰＨＢＨをトルエンとヘプタンの等量混合溶剤５０ｇで洗浄後４５℃で真空乾燥した。回収量は１４．０ｇ（９４％）、純度９９％以上、３ＨＨユニット１０ｍｏｌ％であった。分子量は７０万と減少したが、加工には十分な分子量であった。【００３５】
（実施例６）
実施例５と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、ヘプタン２１０ｇを７０℃で添加することにより晶析を行ったが、ＰＨＢＨは流動性の悪いゲル状となり、ＰＨＢＨは何とか回収できたものの、濾過性はあまり良くなかった。【００３６】
（実施例７）
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（寄託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）を特開２００１−３４００７８号公報の実施例２（炭素源：ヤシ油３％＋ヘキサン酸２％）に記載した方法で培養を行い、ＰＨＢＨの生産を行った。培養終了後遠心分離によりバイオマスを回収し湿バイオマスを得、さらにこのバイオマスを５０℃で１５時間真空乾燥し、乾燥バイオマスを得た。乾燥バイオマス中のＰＨＢＨの含量は６０％、重量平均分子量は１４５万、３ＨＨユニットは１４ｍｏｌ％であった。この乾燥バイオマス２４．８ｇとトルエン２１１．４ｇをフラスコに入れ、９８℃で１時間抽出を行った。溶液を９８℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を８０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、回収したＰＨＢＨをトルエンとヘプタンの等量混合溶剤５０ｇで洗浄後４５℃で真空乾燥した。回収量は１３．９ｇ（９３％）、純度９９％以上、３ＨＨユニット１４ｍｏｌ％であった。分子量は１３０万であった。【００３７】
（実施例８）
実施例７と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、ＰＨＢＨ溶解液を９０℃に保温してヘプタンを添加した場合は、最終的に粘着性のあるＰＨＢＨ結晶が得られた。また、ＰＨＢＨに着色も認められた。【００３８】
（実施例９）
アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素群遺伝子を導入したＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ（寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３８）を特開２００１−３４００７８の実施例２（炭素源：ヤシ油３％＋ヘキサン酸２％）に記載した方法で培養を行い、ＰＨＢＨの生産を行った。培養終了後遠心分離によりバイオマスを回収し湿バイオマスを得、さらにこのバイオマスを５０℃で１５時間真空乾燥し、乾燥バイオマスを得た。乾燥バイオマス中のＰＨＢＨの含量は６０％、重量平均分子量は１２０万、３ＨＨユニットは１５ｍｏｌ％であった。この乾燥バイオマス２４．８ｇとトルエン２１１．４ｇをフラスコに入れ、９８℃で１時間抽出を行った。溶液を９８℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を７０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加すると、白色のＰＨＢＨが析出した。この液を室温まで冷却した。ＰＨＢＨは濾過により容易に回収でき、回収したＰＨＢＨをトルエンとヘプタンの等量混合溶剤５０ｇで洗浄後４５℃で真空乾燥した。回収量は１４．１ｇ（９５％）、純度９９％以上、３ＨＨユニット１５ｍｏｌ％であった。分子量は１１０万であった。【００３９】
（実施例１０）
実施例９と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、ＰＨＢＨ溶解液を９０℃に保温してヘプタンを添加した場合は、最終的に粘着性のあるＰＨＢＨ結晶が得られた。また、ＰＨＢＨに着色も認められた。【００４０】
（比較例２）
実施例９と同様にＰＨＢＨの抽出を行い、溶解液を回収後、強攪拌下、ＰＨＢＨ溶解液を４０℃に保温してヘプタンを添加した場合は、ＰＨＢＨが激しくゲル化を起こした。濾過性も極めて悪く、ＰＨＢＨの回収は不可能であった。【００４１】
（比較例３）
実施例１で得られた乾燥バイオマス２４．８ｇとトルエン２１１．４ｇをフラスコに入れ、１００℃で１時間抽出を行った。溶液を９８℃に保温したジャケット式加圧濾過器に移し濾過によりＰＨＢＨ溶液を回収した。回収した溶液を耐圧容器に入れ、密閉下、１４０℃に保温し、溶液を強攪拌しながらヘプタン２１０ｇを徐々に添加した。添加終了後、激しく油状化したＰＨＢＨが得られ、これを強攪拌しながら室温まで徐々に冷却して濾過、乾燥すると、粘着性のかなり高いＰＨＢＨ固体が得られた。この固体には着色が認められ、純度は９５％と悪化した。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の方法により、ゲル化を防止し、流動性があり、払い出し可能で、さらには含液率の低いＰＨＡを得ることができるため、分離、洗浄性も良く、品質の良いＰＨＡを工業的に安価に生産、提供できるようになる。
【国際調査報告】
2005049692.tif 000002
2005049692.tif 000003