(57)【要約】  本開示は、逆転写と多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法とを組み合わせて用いる、ＲＮＡ増幅法を提供する。結果として生じるアンプリコンが第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び固有分子識別子バーコード配列を含むようなプライマーが使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素、及びＲＮＡ鋳型鎖の５′ポリ（Ａ）配列に相補的な３′ポリ（Ｔ）配列を有する逆転写プライマー配列を用いて、前記ＲＮＡ鋳型鎖をｃＤＮＡ鋳型鎖に逆転写すること、ここで、前記逆転写プライマー配列は５′自己アニーリング配列、バーコードプライマーアニーリング部位、４〜１２ヌクレオチド長の第一の細胞特異的バーコード配列、及び１０〜３０ヌクレオチド長の第一の固有分子識別子バーコード配列をさらに含み、前記ｃＤＮＡ鋳型鎖はｃＤＮＡ鋳型鎖の５′側に前記逆転写プライマー配列を含み、前記ｃＤＮＡ鋳型鎖は前記ＲＮＡ鎖にハイブリダイズする、
過剰分の逆転写プライマー配列を酵素で消化すること、
前記ＲＮＡ鎖を分解して前記ｃＤＮＡ鋳型鎖を一本鎖として生成すること、
前記逆転写酵素を失活させること、
前記酵素を失活させること、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び自身の５′末端に前記自己アニーリング配列を含む伸長プライマーを用いて、前記逆転写プライマー配列を含む前記ｃＤＮＡ鋳型鎖に対する相補鎖を生成すること、ここで前記相補鎖は５′末端に前記自己アニーリング配列を含み、３′末端に前記自己アニーリング配列の相補体を含む、
（ｂ）前記ｃＤＮＡ鋳型鎖を前記相補鎖から変性解離させ、前記相補鎖を３′末端の自己アニーリング配列と５′末端の前記自己アニーリング配列の相補体とのアニーリングによりループ状にして前記相補鎖の増幅を阻害すること、
（ａ）及び（ｂ）のステップを複数回繰り返して前記ｃＤＮＡ鋳型鎖から複数のループ状相補鎖を生成すること、
前記複数のループ状の相補鎖を変性させ、前記自己アニーリング配列を含む増幅プライマーを用いて前記変性された相補鎖を増幅して、前記逆転写プライマー配列を含む二本鎖アンプリコンを生成すること、
前記二本鎖アンプリコンを変性させ、（１）前記バーコードプライマーアニーリング部位に相補的である３′配列を有し、５′自己アニーリング配列、シーケンシングプライミング配列、及び４〜１２ヌクレオチド長の第二の細胞特異的バーコード配列をさらに含む、外側バーコードプライマー、並びに、（２）３′自己アニーリング配列を含むプライマーを用いて前記変性されたアンプリコンを繰り返し複数回増幅することで、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び第一の固有分子識別子バーコード配列を有する二本鎖アンプリコン生成物を結果として生成すること
を含む、ＲＮＡ鋳型鎖の増幅方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、又は低分子干渉ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡが単一細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡが不均一な細胞集団内の単一細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＲＮＡが単一出生前細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＲＮＡが単一がん細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡが単一循環腫瘍細胞由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記逆転写酵素が、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｍａｘｉｍａ逆転写酵素、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、又はＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記３′ポリ（Ｔ）配列が１０〜３０個のＴヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記自己アニーリング配列がＧＡＴ５又はＧＡＴ１である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記バーコードプライマーアニーリング部位が、ＲＴ３、Ｒｅａｄ１ＳＰ、又はＲｅａｄ２ＳＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が鎖置換活性を有するポリメラーゼであるか、又は、前記酵素が５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素が、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ  ３１７３、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＴＯＰＯ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  （ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異型、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（完全長）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５、Ｐｈｕｓｉｏｎ、又はＫａｐａ  ＨｉＦｉである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ鎖が７５℃〜８５℃の温度で分解される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記逆転写酵素及び前記酵素が７５℃〜８５℃の温度で失活される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記伸長プライマーが０℃〜１０℃の温度で前記ｃＤＮＡ鋳型鎖にアニールする、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記相補鎖が１０℃〜６５℃の温度で生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記相補鎖のループ化が５５℃〜６０℃の温度で生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（ａ）及び（ｂ）のステップが７〜１２回繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記変性された相補鎖の増幅がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記変性された相補鎖の増幅が１５〜２０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記変性されたアンプリコンの増幅がポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記変性されたアンプリコンが３〜７サイクルのＰＣＲを用いて繰り返し増幅される、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記二本鎖アンプリコン生成物がシークエンシングのために処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一の固有分子識別子バーコード配列がセミランダムな配列パターンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記過剰分の転写プライマーを酵素で消化するステップが、セミランダムな配列パターンを含み、且つ、第一の固有分子識別子バーコード配列とは異なる、１０〜３０ヌクレオチド長の第二の固有分子識別子バーコード配列を有する逆転写プライマーを添加することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年５月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５１２，１４４号に基づく優先権を主張するものであり、全ての目的のためその内容全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府の利益に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所による助成番号ＣＡ１７４５６０及びＣＡ１８６６９３の政府援助の下でなされたものである。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の技術分野
本発明の実施形態は、全体としては、シングルセルメッセンジャーＲＮＡ増幅のための方法及び組成物、例えば単一細胞由来のメッセンジャーＲＮＡに関する。
【０００４】
関連技術の記述
シングルセルＲＮＡシークエンシングは公知の技術である。Ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０１６）１７：１７，ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１３０５９−０１６−０９４１−０；Ｍｏｒｔａｚａｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１２２６；Ｃｈａｐｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（３）：ｅ０１２０８８９，ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１２０８８９（２０１５）；及びＳｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．４１４５（２０１７）を参照されたい。ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑの最初の報告はＴａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）、ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｗｈｏｌｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，６，３７７−３８２によるものであり、ｃＤＮＡ合成のためにポリＴプライマーが使用され、続いて、ポリＡ鎖付加、第二鎖合成、及びＰＣＲが行われた。その後の技術の進歩としては、ＲＮＡ回収効率の向上のためのテンプレートスイッチングの付加（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．，Ｋｊａｌｌｑｕｉｓｔ，Ｕ．，Ｍｏｌｉｎｅｒ，Ａ．，Ｚａｊａｃ，Ｐ．，Ｆａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｌｏｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．（２０１１）Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｂｙ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＲＮＡ−ｓｅｑ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ，２１，１１６０−１１６７；Ｐｉｃｅｌｌｉ，Ｓ．，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ，Ａ．Ｋ．，Ｆａｒｉｄａｎｉ，Ｏ．Ｒ．，Ｓａｇａｓｓｅｒ，Ｓ．，Ｗｉｎｂｅｒｇ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓａｎｄｂｅｒｇ，Ｒ．（２０１３）Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２  ｆｏｒ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，１０９６−１０９参照）、試料の多重化を可能にする細胞特異的バーコード（Ｊａｉｔｉｎ，Ｄ．Ａ．，Ｋｅｎｉｇｓｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｋｅｒｅｎ−Ｓｈａｕｌ，Ｈ．，Ｅｌｅｆａｎｔ，Ｎ．，Ｐａｕｌ，Ｆ．，Ｚａｒｅｔｓｋｙ，Ｉ．，Ｍｉｌｄｎｅｒ，Ａ．，Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．，Ｊｕｎｇ，Ｓ．，Ｔａｎａｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１４）Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｆｏｒ  ｍａｒｋｅｒ−ｆｒｅｅ  ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３４３，７７６−７７９；Ｆａｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｆｕ，Ｇ．Ｋ．ａｎｄ  Ｆｏｄｏｒ，Ｓ．Ｐ．（２０１５）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４７，１２５８３６７を参照）、酵素条件の最適化（Ｓａｓａｇａｗａ，Ｙ．，Ｎｉｋａｉｄｏ，Ｉ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｔ．，Ｄａｎｎｏ，Ｈ．，Ｕｎｏ，Ｋ．Ｄ．，Ｉｍａｉ，Ｔ．ａｎｄ  Ｕｅｄａ，Ｈ．��．（２０１３）Ｑｕａｒｔｚ−Ｓｅｑ：ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ，ｒｅｖｅａｌｓ  ｎｏｎ−ｇｅｎｅｔｉｃ  ｇｅｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，１４，Ｒ３１を参照）、固有分子識別子（ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）（ＵＭＩ）によるユニークなｃＤＮＡの標識（Ｉｓｌａｍ，Ｓ．，Ｚｅｉｓｅｌ，Ａ．，Ｊｏｏｓｔ，Ｓ．，Ｌａ  Ｍａｎｎｏ，Ｇ．，Ｚａｊａｃ，Ｐ．，Ｋａｓｐｅｒ，Ｍ．，Ｌｏｎｎｅｒｂｅｒｇ，Ｐ．ａｎｄ  Ｌｉｎｎａｒｓｓｏｎ，Ｓ．（２０１４）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｗｉｔｈ  ｕｎｉｑｕｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１１，１６３−１６６；Ｓｈｉｒｏｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｊｉａ，Ｔ．Ｚ．，Ｓｉｍｓ，Ｐ．Ａ．ａｎｄ  Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．（２０１２）Ｄｉｇｉｔａｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｍｉｎｉｍｉｚｅｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｉａｓ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ｗｉｔｈ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｂａｒｃｏｄｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，１０９，１３４７−１３５２を参照）、ｃＤＮＡのインビトロ転写による増幅バイアスの低減（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ，Ｔ．，Ｓｅｎｄｅｒｏｖｉｃｈ，Ｎ．，Ａｖｉｔａｌ，Ｇ．，Ｋｌｏｃｈｅｎｄｌｅｒ，Ａ．，ｄｅ  Ｌｅｅｕｗ，Ｙ．，Ａｎａｖｙ，Ｌ．，Ｇｅｎｎｅｒｔ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｓ．，Ｌｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．，Ｒｏｚｅｎｂｌａｔｔ−Ｒｏｓｅｎ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＣＥＬ−Ｓｅｑ２：ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｈｉｇｈｌｙ−ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，１７，７７を参照）、及びマイクロ流体デバイスを用いた自動化（Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．Ｘ．，Ｔｅｒｒｙ，Ｊ．Ｍ．，Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ，Ｐ．，Ｒｙｖｋｉｎ，Ｐ．，Ｂｅｎｔ，Ｚ．Ｗ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｒ．，Ｚｉｒａｌｄｏ，Ｓ．Ｂ．，Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｔ．Ｄ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｇ．Ｐ．，Ｚｈｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ，８，１４０４９，Ｍａｃｏｓｋｏ，Ｅ．Ｚ．，Ｂａｓｕ，Ａ．，Ｓａｔｉｊａ，Ｒ．，Ｎｅｍｅｓｈ，Ｊ．，Ｓｈｅｋｈａｒ，Ｋ．，Ｇｏｌｄｍａｎ，Ｍ．，Ｔｉｒｏｓｈ，Ｉ．，Ｂｉａｌａｓ，Ａ．Ｒ．，Ｋａｍｉｔａｋｉ，Ｎ．，Ｍａｒｔｅｒｓｔｅｃｋ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｃｅｌｌｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎａｎｏｌｉｔｅｒ  Ｄｒｏｐｌｅｔｓ．Ｃｅｌｌ，１６１，１２０２−１２１４；Ｋｌｅｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｍａｚｕｔｉｓ，Ｌ．，Ａｋａｒｔｕｎａ，Ｉ．，Ｔａｌｌａｐｒａｇａｄａ，Ｎ．，Ｖｅｒｅｓ，Ａ．，Ｌ���，Ｖ．，Ｐｅｓｈｋｉｎ，Ｌ．，Ｗｅｉｔｚ，Ｄ．Ａ．ａｎｄ  Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｍ．Ｗ．（２０１５）Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｂａｒｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓ  ａｐｐｌｉｅｄ  ｔｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ，１６１，１１８７−１２０１）が挙げられる。
【０００５】
このような進歩にもかかわらず、これらの方法に共通する１つの限界として、ＲＮＡ検出効率の低さがあり、概して２０％以下である（Ｚｉｅｇｅｎｈａｉｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｔｈ，Ｂ．，Ｐａｒｅｋｈ，Ｓ．，Ｒｅｉｎｉｕｓ，Ｂ．，Ｇｕｉｌｌａｕｍｅｔ−Ａｄｋｉｎｓ，Ａ．，Ｓｍｅｔｓ，Ｍ．，Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ，Ｈ．，Ｈｅｙｎ，Ｈ．，Ｈｅｌｌｍａｎｎ，Ｉ．ａｎｄ  Ｅｎａｒｄ，Ｗ．（２０１７）Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ，６５，６３１−６４３  ｅ６３４；Ｌｉｕ，Ｓ．ａｎｄ  Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．（２０１６）Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｍａｉｎｉｎｇ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｆ１０００Ｒｅｓ，５を参照）。これは、サンプリングノイズによりＲＮＡ定量化に不確実性を与え、低発現転写産物の検出漏れの原因となる。別の限界としては、ＵＭＩが付加されても、ＵＭＩのカウントミスによりＲＮＡ定量化が不正確となる点である。これは、ＵＭＩを含有する逆転写プライマーがｃＤＮＡ増幅の前に完全には除去されていない場合があり、既存の方法では除去効率を測定できないことに起因する。最後に、ＰＣＲを利用してｃＤＮＡの増幅を行う方法においては、その指数関数的な増幅プロセスが増幅バイアスの原因となり得る。総じて、これらの問題によって、既存のｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ法の完全性、正確性、及び対費用効果は制限される。そのため、１又は複数の欠陥に悩まされない、例えば単一細胞又は小細胞群に由来する、少量のＲＮＡを増幅するさらなる増幅法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本開示の実施形態は、例えば、個体又は基質から採取された、単一細胞若しくは同一細胞型の複数の細胞、又は、組織試料、体液試料、若しくは血液試料から得られたＲＮＡなど、少量のＲＮＡ又は限られた量のＲＮＡなどのＲＮＡを増幅する方法に関する。本明細書に記載の方法は、記載されるプライマーを用いてＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを生成した後、本明細書に記載の多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法に従って該ｃＤＮＡを増幅し（多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ）について説明している、その全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｚｏｎｇ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｘｉｅ，Ｘ．Ｓ．（２０１２），Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３８，１６２２−１６２６に記載の、単一細胞由来のゲノムＤＮＡの増幅法を参照されたい）、本明細書に記載の第一の細胞特異的バーコード、第二の細胞特異的バーコード、及び固有分子識別子バーコード配列を有する二本鎖アンプリコンを生成することを含む。本開示の特定の態様によれば、本明細書に記載の方法は、プログラム可能な熱サイクルを用いて、単一チューブの中で実行可能である。
【０００７】
本明細書に記載のシングルセルＲＮＡ増幅法は、他の方法の欠点を克服している、デジタルトランスクリプトミクスのための多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ−ＤＴ）と称される場合がある。本明細書に記載のＭＡＬＢＡＣ−ＤＴ法は、ｃＤＮＡ増幅の際にランダムプライマーを用いてｃＤＮＡにアニールさせることで、捕捉効率を向上させており、より高いＲＮＡ検出効率を有する。さらに、この準線形ｃＤＮＡ増幅により、増幅バイアスが低減し、それにより転写ドロップアウトが減少する。加えて、本明細書に記載のＭＡＬＢＡＣ−ＤＴ法は、ＵＭＩの設計により、精度が高い。ある態様は、ｃＤＮＡ増幅前に逆転写プライマーの分解効率を測定する方法をさらに含む。
【０００８】
ある態様では、ＲＮＡ鋳型鎖の５′ポリ（Ａ）配列に相補的な３′ポリ（Ｔ）配列を含む逆転写プライマーが用いられる。逆転写酵素プライマーは、５′自己アニーリング配列、バーコードプライマーアニーリング部位、第一の細胞特異的バーコード配列、及び第一の固有分子識別子バーコード配列をさらに含み、ＲＮＡ鋳型に対応するｃＤＮＡが生成され、前記ｃＤＮＡは前記逆転写プライマーも含んでいる。
【０００９】
次いで、ｃＤＮＡに、第一の低温において、自身の５′末端に自己アニーリング配列を有するプライマーを加えると、その相補鎖は、５′末端に自己アニーリング配列を含み、３′末端に前記自己アニーリング配列の相補体を含むこととなり、前記プライマーは前記ｃＤＮＡにアニールする。次に、５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する１又は複数の鎖置換型ポリメラーゼなどの、少なくとも１種類のポリメラーゼの存在下で、より高温でのプライマー伸長を行う。伸長産物と鋳型ｃＤＮＡとを分離した後、その混合物をより低温にさらし、その温度で前記伸長産物の末端同士をアニールさせてループ状にして前記伸長産物がさらに伸長又は増幅できないようにする。次に、再度、鋳型ｃＤＮＡを上記のようにして伸長させた後、伸長産物をループ化させる。このプロセスを複数回繰り返すことにより、ループ状の伸長産物の集団を得る。次に、このループ状の伸長産物を脱ハイブリダイズ又は融解した後、その一本鎖を、第二の細胞特異的バーコード配列を含むプライマーを用いて増幅する。この増幅により、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及びセミランダム配列を有する固有分子識別子配列（ＵＭＩ）を含む二本鎖アンプリコンが生じる。ある態様では、数回の熱サイクルの実行により、ｃＤＮＡの増幅、並びに伸長産物のさらなる伸長及び増幅を阻害するループ状の伸長産物の形成が行われる。この増幅は線形増幅又は準線形増幅ということがある。次に、このループ状の伸長産物を、標準的又は非標準的なＰＣＲサイクルで増幅することができる。ある特定のポリメラーゼにより例示的な結果が与えられる。
【００１０】
ある特定の態様において、少なくとも１個の細胞、１個若しくは複数個の細胞、又は複数個の細胞、例えば２個以上の細胞を、例えば本明細書に記載の方法によるＲＮＡ増幅のために、処理する方法が提供される。例示的な一実施形態では、単一細胞を単離した後に一定量の液体に溶解することで、当該細胞のＲＮＡが得られる。例示的な一実施形態では、複数の単一細胞をそれぞれ単離した後に一定量の液体に溶解して、当該細胞のＲＮＡを得て、その後に、当該細胞のＲＮＡをマルチプレックス形式で逆転写及び増幅してもよい。
【００１１】
本発明のある実施形態のさらなる特徴及び利点は、以下の実施形態及びその図面の説明において、並びに特許請求の範囲から、より十分に理解されることとなる。
【００１２】
本特許又は出願書類には、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含まれる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開の写しは、特許庁へ申請し、必要な手数料を支払うことで提供される。本発明の前述した特徴及び他の特徴、並びに利点は、添付の図面と併せて、例示的な実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ｍＲＮＡ転写産物からのｃＤＮＡの作製方法を模式的に示す図である。ＵＭＩパターン「Ａ」（ＵＭＩＡ）及び細胞バーコードＣｎを有するポリ（Ｔ）含有プライマー（ＲＴ−Ａｎ）が、標的ｍＲＮＡのポリ（Ａ）領域にアニールされる。逆転写酵素であるＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶとのインキュベーションによりｃＤＮＡ合成が触媒される。次に、残留するＲＴプライマーを全て消化してｃＤＮＡ増幅時のプライマー結合を阻止するために、エキソヌクレアーゼＩが添加される。ＵＭＩＡパターンではなくＵＭＩＢパターンを有するＲＴ−Ｂｎプライマーを添加すると、不完全な消化によりＵＭＩＡを有するｃＤＮＡ増幅産物とＵＭＩＢを有するｃＤＮＡ増幅産物との混合物が生じることとなるため、エキソヌクレアーゼによる分解効率の測定が可能となる。最後に、混合物を８０℃でインキュベートすることでＲＮＡが分解され、エキソヌクレアーゼＩ及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶが熱失活される。
【図２】多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ）を用いたｃＤＮＡ増幅法を模式的に示す図である。ＧＡＴ５配列及び７ヌクレオチドのランダム配列を含有するプライマー（ＧＡＴ５−７Ｎ）が、前記ｃＤＮＡにランダムにアニールする。前記プライマーはＢ１スペーサー配列を含んでいてもよい。ＤＮＡポリメラーゼである３′→５′エキソヌクレアーゼ欠損Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔとのインキュベーションにより、第二鎖の合成が触媒される。これらの鎖を変性後に冷却することで、第二鎖に安定なヘアピンループ構造が形成され、さらなる増幅が阻止される。これが９回繰り返されることで、複数のループが生成され、ｃＤＮＡが準線形に増幅される。これらの準線形工程の後、ループが変性され、ＧＡＴ５−Ｂ１プライマーを用いたＰＣＲで１７サイクル増幅される。最後に、ＭＡＬＢＡＣの後、外側バーコードプライマーが添加され、外側バーコードプライマー及びＧＡＴ５−Ｂ１プライマーを用いてさらに５サイクルのＰＣＲが実行される。
【図３】タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）と呼ばれるトランスポゾンに基づく方法を用いたライブラリー調製プロトコルを模式的に示す図である。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔなどから得られる、機能亢進性Ｔｎ５トランスポザーゼを用いたタグメンテーションにより、ｃＤＮＡに隣接してバーコード配列及びＲｅａｄ１  ＳＰを有する所望の生成物と共に、複数の産物が得られる。ＤＮＡポリメラーゼを用いた７２℃でのギャップ修復の後、Ｒｅａｄ  １インデックスアダプタープライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＳ５ＸＸと称される）及びＲｅａｄ  ２インデックスアダプタープライマーを用いた５サイクルのＰＣＲにより、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングに適合するライブラリーが生成される。Ｉｎｄｅｘ１／Ｉｎｄｅｘ２はＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシング用のインデックスであり、Ｐ５／Ｐ７はフローセルアニーリング用のアダプターである。
【図４】（Ａ）は、ＨＥＫ２９３Ｔ培養物について配列決定された約７００個の細胞内で一貫して検出された１２，０００種の遺伝子のｍＲＮＡの相関行列データを示す図である（上段）。ｔ確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）のアルゴリズムによるＨＥＫ２９３Ｔデータセットについて、（Ｂ）は遺伝子のクラスタリングを示す図であり（左）、（Ｃ）は細胞のクラスタリングを示す図である（右）。（Ｂ）の遺伝子クラスタリングプロットにおいて、各遺伝子クラスターは、前記相関行列内の四角に対応している。遺伝子クラスタリングプロットにおいて、各ドットは１２，０００種の遺伝子の１つであり、各クラスターは前記相関行列内の四角に対応している。（Ｃ）の細胞クラスタリングプロットにおいて、各ドットは約７００個のＨＥＫ細胞のうちの１つであり、分解可能なクラスターは存在しない。
【図５】ＨＥＫ２９３Ｔ培養物内で一貫して検出された１２，０００種の遺伝子のうちの３０００種のｍＲＮＡについての相関行列データを示す図である（上段）。図５は、Ｕ−２  ＯＳ培養物内で一貫して検出された１２，０００種の遺伝子のうちの３０００種のｍＲＮＡについての相関行列データを示している（下段）。色の強度は２つの遺伝子間のピアソン相関係数と関連している。対角線上の四角ブロックはそれぞれ、強い相関が認められる遺伝子クラスターを示している。遺伝子クラスターは、転写調節と生物学的機能とが共通している可能性がある遺伝子群である。前記２種の細胞株の間で共有される細胞クラスターのうちの２つは、細胞周期クラスター及びタンパク質合成クラスターとして標識されている。
【図６】図５で標識されたタンパク質合成クラスターを強調する図である。このクラスターの遺伝子は、ｔＲＮＡ合成、アミノ酸合成、アミノ酸輸送、及び翻訳開始の制御に関与する遺伝子に富んでおり、これらはすべて、タンパク質合成プロセスにおいて重要である。したがって、相互に関連した遺伝子クラスターは、関連した生物学的機能及び転写調節を有する。
【図７】Ｕ−２  ＯＳ細胞株とＨＥＫ２９３Ｔ細胞株との相関モジュールを比較する図である。細胞周期進行及びタンパク質合成などの普遍的な細胞機能に関連したいくつかのモジュールが両細胞株に共通しているが、ｐ５３及び骨細胞外マトリックスなどの他のモジュールは、一方の細胞型に特異的である。この細胞種特異性は差次的発現に必ずしも反映されるわけではない。２種の細胞株間で差次的発現があるにもかかわらず保存されているモジュールもあれば、差次的発現がないにもかかわらず消失しているモジュールもある。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
ある実施形態の実施又はある実施形態の特徴には、特に記載がない限り、当該技術分野において通常の技能の範囲内にある、分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡなどの従来技術を用いてよい。そのような技術は下記の文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９），ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  Ｅｄ．，１９８４），ＡＮＩＭＡＬ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｅｄ．，１９８７），ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ  ＶＥＣＴＯＲＳ  ＦＯＲ  ＭＡＭＭＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬＳ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．ａｌｏｓ  ｅｄｓ．１９８７），ＨＡＮＤＢＯＯＫ  ＯＦ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｅｄｓ．）ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｉｅｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，ａｎｄ  Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ，ｅｄｓ．，１９８７），ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（Ｊ．Ｅ．ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；ＡＮＮＵＡＬ  ＲＥＶＩＥＷ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ；及びＡＤＶＡＮＣＥＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹなどの学術誌中の研究論文を参照されたい。上記及び下記の本明細書に記載された全ての特許、特許出願、及び刊行物は、参照により本明細書に取り込まれる。
【００１５】
本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、当該分野において標準的な論文及び教科書、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ１９９１）；Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）などの用語及び記号に従っている。
【００１６】
本発明は、部分的には、細胞又は細胞集団に由来する１以上又は複数の標的ＲＮＡ配列を増幅する方法の発見に基づいており、アンプリコン生成物は第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び固有分子識別子バーコード配列を含む。前記アンプリコンは、シーケンシングのためのライブラリーなどのライブラリーに処理することができる。このようにして、不均一な集団内の個々の細胞のトランスクリプトームの特徴付けに用いられるシングルセルＲＮＡシークエンシング法において、１以上又は複数の標的ＲＮＡ配列を決定することができる。
【００１７】
本開示の態様は、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば２０ヌクレオチド長の固有分子識別子バーコード配列（ＵＭＩ）を利用する。固有分子識別子バーコード配列がそのような長さであると、２種類の転写産物が同一のＵＭＩを含む可能性が減少する。すなわち、本開示の態様は、各ＲＮＡ転写産物又はその関連ｃＤＮＡに、異なる固有分子識別子バーコード配列を対応付けることに関する。このようにして、各ＲＮＡ転写産物が、それ自体にユニークに対応付けられた固有分子識別子バーコード配列を有することとなる。このようにして、複数のＲＮＡ転写産物中の各ＲＮＡ転写産物が、該複数のＲＮＡ転写産物の他のメンバーとは異なる固有分子識別子バーコード配列を有することとなる。また、固有分子識別子バーコード配列がそのような長さであると、ＵＭＩ配列同士が遠く離れることから、すなわち、ＵＭＩ間のハミング距離が、別個のＵＭＩと誤って解釈されるシークエンシングの誤読の機会を減らすのに十分な距離となることから、ＵＭＩの増幅エラー又はシークエンシングエラーで生じた誤ったＵＭＩ配列（通常、真のＵＭＩと１個又は２個のヌクレオチドだけ異なる）が区別可能となる。
【００１８】
本開示の態様は、本明細書に記載のセミランダムなパターンを有するＵＭＩ（ＵＭＩＡ及びＵＭＩＢ）を利用する。ＵＭＩについてのセミランダムなパターンを用いた場合、そのパターンから外れた塩基をカウントすることによってシークエンシングエラー又は増幅エラーの測定が可能となり、これにより、シークエンシングエラー率の経験的な測定値が得られる。特に、ＵＭＩにおける挿入エラー又は欠失エラーは、そのセミランダムなパターンにより容易に判別できる。エラー率を知ることは、そのＵＭＩの信頼性を理解する上で重要となる。
【００１９】
ある態様において、ＵＭＩＡ及びＵＭＩＢは共に、セミランダムパターンの１０〜３０塩基対の配列、例えば２０塩基対の配列である。ＵＭＩＡのパターンは、［（ＨＢＤＶ）５］であり、式中、ＨはＧではなく、ＢはＡではなく、ＤはＣではなく、ＶはＴではない。ＵＭＩＢのパターンは［（ＶＤＢＨ）５］である。なお、他のセミランダムパターンを設計することもできる。このセミランダムパターンには２つの利点がある。１つ目は、塩基が予想パターンから外れている場合に、ＵＭＩにおける増幅エラー又はシークエンシングエラーを検出することができる点であり、これにより経験的なエラー率の測定が可能となる。２つ目は、ＵＭＩＢはＵＭＩＡと区別可能であるため、ＵＭＩＡが組み込まれたリードとＵＭＩＢが組み込まれたリードとの割合から、エキソヌクレアーゼ分解効率を決定できる点である。
【００２０】
本開示の態様は、本明細書に記載の逆転写法において得られる、逆転写プライマー（ＵＭＩＡパターンを有するＲＴ−Ａ）の分解率を測定する方法に関する。エキソヌクレアーゼによる消化により、過剰分の逆転写プライマーがＤＮＡに結合することが阻止されることで定量化の精度が向上する。その他の場合、これらのプライマーは、複数のＵＭＩを同一のｍＲＮＡ転写産物のコピーに結合し、過剰なカウントの原因となる。本方法によれば、逆転写（ＲＴ）の際に使用されたＲＴ−ＡプライマーのＵＭＩパターンと別の、異なるＵＭＩパターンを有する逆転写プライマー（ＵＭＩＢパターンを有するＲＴ−Ｂ）が、逆転写後及びプライマー分解工程中に混合物に添加される。これにより、ＵＭＩＡパターンを含む産物とＵＭＩＢパターンを含む産物との最終的なリード比により決定される、ＲＴプライマー分解効率の測定が可能となる。
【００２１】
本開示の態様は、個々の細胞又は試料に由来するＲＮＡを標識するための２種類の細胞特異的バーコードの使用に関する。２種類のバーコードの使用により、バーコードの可能な組み合わせの総数が（１種類のバーコードを使用する場合と比較して）増加することで、ＲＮＡが細胞又は試料と関連付けられる。２種類のバーコードを用いた多重化により、ライブラリー調製において、複数の細胞に由来する増幅ｃＤＮＡを一緒にプールさせることができる。２つの別個のバーコード配列、例えば、４８種類の配列が可能なバーコード配列Ｃｎ及び４８種類の配列が可能なバーコード配列Ｇｍがプライマーにより組み入れられる（２３０４の組み合わせ）。これにより、実行の必要がある個々のライブラリー調製の回数が最少となり、試薬コストが減少する。可能性のあるバーコードの組み合わせ数は、プライマーの数と二次関数的な関係にある。これは、１種類のみのプライマーを用い、全てのバーコードについて１種類の別個のプライマーが必要とされる、バーコード付加方式とは区別される。
【００２２】
本開示の態様は、試料中のＲＮＡに対応付けられ、標準的なライブラリー調製キットに適合するように設計された、アンプリコンを作製する方法に関する。特注のライブラリー調製プロトコル及び特注のシークエンシングプライマーが必要とされるシングルセル多重増幅法と区別される、本明細書に記載の標準キットを用いたライブラリー調製に適合するよう、最終増幅産物は設計される。
【００２３】
本開示は、少量試料、単一細胞、又は細胞小集団などに由来するＲＮＡからのｃＤＮＡ合成法を提供する。次に、ｃＤＮＡを多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法を用いて増幅することで、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び固有分子識別子バーコード配列を含むアンプリコンが生成される。次に、アンプリコンは、シークエンシングライブラリーに処理するなどして、配列決定することができる。
【００２４】
ある態様において、各実施形態により、単一のチューブ内で、又はマイクロタイタープレート内で、例えばハイスループットな形式で、実行できる３つの工程からなる手順が提供される。第一の工程は、本明細書に記載の、又は当業者に公知の、プライマー、逆転写酵素、ヌクレアーゼ、並びに他の好適な試薬及び培地を用いてＲＮＡをｃＤＮＡへと逆転写することで、プライマー配列が結合したｃＤＮＡを生成することを含む。第二の工程では、このｃＤＮＡを線形増幅法又は準線形増幅法により増幅することで、各末端にプライマー配列を有するループ化した伸長産物が生成される。第三の工程では、例えば本明細書に記載の、又は当業者に公知のＰＣＲプライマー、試薬、及び条件を用いてこのループ状の伸長産物を増幅することにより、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び固有分子識別子バーコード配列を有する二本鎖アンプリコンが得られる。反応混合物中のｃＤＮＡ試料が少なくとも１種のＤＮＡポリメラーゼにより伸長又は増幅され、前記プライマーがＤＮＡにアニールすることで、前記ＤＮＡポリメラーゼにより前記プライマーの３′末端から相補ＤＮＡ鎖が合成され、ＤＮＡ産物が生成される。前記ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅工程は、必要に応じて、ＤＮＡ産物を変性すること；プライマーをＤＮＡにアニールしてＤＮＡ−プライマーハイブリッドを形成させること；及び前記ＤＮＡ−プライマーハイブリッドを核酸塩基の存在下でインキュベートすることで、前記ＤＮＡポリメラーゼにより前記プライマーが伸長されＤＮＡ産物が合成されることである。
【００２５】
ある態様において、逆転写、伸長、又は増幅のための反応混合物は、少なくとも１種類の一本鎖核酸分子を含み、本明細書に記載の少なくとも１つのプライマーが前記一本鎖核酸分子内のある領域にハイブリダイズした、一本鎖核酸分子／プライマー混合物を形成する。特定の実施形態では、複数のプライマーが一本鎖核酸分子の複数の部位にハイブリダイズする。別の特定の実施形態では、前記混合物は、複数の縮重プライマーがハイブリダイズした複数の一本鎖核酸分子を含む。別の特定の実施形態では、前記一本鎖核酸分子はｃＤＮＡ又はＲＮＡである。
【００２６】
増幅では、反応混合物は複数の熱サイクル処理を受ける。特定の熱サイクルにおいて、反応混合物を、アニーリング温度としても知られている第一の温度に第一の期間さらすことで、プライマーのｃＤＮＡ配列への十分なアニーリングが可能となる。この態様によれば、前記プライマーは、第一の工程で、約３０℃未満の温度、例えば約０℃〜約１０℃でｃＤＮＡ配列にアニールされる。次に、前記反応混合物を、増幅温度としても知られている第二の温度に第二の期間さらすことで、前記ｃＤＮＡ配列の増幅が可能となる。この態様によれば、ｃＤＮＡ配列は、第二の工程で、約１０℃以上の温度、例えば約１０℃〜約６５℃で増幅される。増幅が起こる温度が使用される特定のポリメラーゼに依存することは、当業者には理解されよう。例えば、Φ２９ポリメラーゼは約３０℃で完全活性となり、Ｂｓｔポリメラーゼ及びｐｙｒｏｐｈａｇｅ３１７３ポリメラーゼ（ｅｘｏ−）は約６２℃で完全活性となる。次に、二本鎖ＤＮＡが融解温度としても知られている第三の温度で第三の期間融解されることで、増幅鋳型として使用され得る一本鎖ＤＮＡ型のアンプリコンが得られる。この態様によれば、前記二本鎖ＤＮＡは、第三の工程で、約９０℃以上の温度、例えば約９０℃〜約１００℃で一本鎖ＤＮＡに脱ハイブリダイズされる。
【００２７】
ある態様において、各末端に自己アニーリング配列を有する伸長産物のループ化は、伸長産物の自己アニーリング末端が互いにアニールしてループを形成する限りにおいて、ループ化温度としても知られている約５５℃〜約６０℃という第四の温度で実行され得る。温度の例は約５８℃である。
【００２８】
前記反応混合物が融解温度に曝されて、さらなる処理、増幅、又はシーケンシングのためのアンプリコンが生成されることで、最終増幅サイクルは終了する。この態様によれば、前記アンプリコンは、十分な量であるならば、本明細書に記載のシーケンシングのためにさらに処理されてもよい。別の態様によれば、前記アンプリコンは、例えば当業者に公知の緩衝液、プライマー、及びポリメラーゼを用いた標準的なＰＣＲ法により、さらに増幅されてもよい。さらに別の態様によれば、アンプリコンは、十分な量であるならば、当業者に公知のハイスループットシーケンシング法を用いて配列決定されてもよい。
【００２９】
ある特定の態様によれば、まず、反応混合物を、約６５℃〜約８５℃に、例えば約７２℃に、約１０秒間〜約５分間、例えば約３分間、加熱することにより、増幅対象のＲＮＡが変性される。この工程の間、プライマーは反応混合物中に存在していてもよい。あるいは、前記プライマーは、熱変性前に、変性工程中の任意の時点に、又は熱変性工程後に増幅対象のＲＮＡ試料を含有する反応混合物に添加することもできる。
【００３０】
次に、反応混合物が冷却されて、プライマーがアニールされる。プライマーを一本鎖ＲＮＡにアニールさせる温度にまで、前記反応混合物の温度を低下させる。プライマーのアニーリング温度は、約１０秒間〜約５分間の時間で、約０℃〜約３０℃、例えば約０℃〜約１０℃、又は約４℃、とすべきである。次に、特定の逆転写酵素が活性化されてｃＤＮＡ合成を開始する温度にまで反応温度を上昇させる。異なる逆転写酵素は異なる温度で機能的となり得るため、逆転写酵素が順次活性化されｃＤＮＡ合成を開始できるように、サイクルでは昇温又は温度上昇がなされ得る。合計インキュベーション時間は、約２分間〜約１５分間、より好ましくは約１０分間であってもよい。ｃＤＮＡ生成の効率を有意に変化させることなく、逆転写工程の温度、インキュベーション時間、及び昇温時間を、本明細書で開示される値に基づいて変化させてもよいことを理解されたい。本開示に基づいて、パラメーターを変更可能であることは、当業者には理解される。反応条件及びパラメーターの軽微な変更は本開示の範囲内に含まれる。
【００３１】
前記第一の一連の反応において増幅されるｃＤＮＡを、約７０℃〜約９０℃、例えば約８０℃に、約１０秒間〜約５分間、例えば約２分間加熱することにより、ＲＮＡが分解される。この工程の間、プライマーは反応混合物中に存在していてもよい。あるいは、プライマーは、ＲＮＡが分解された後のｃＤＮＡ試料を含有する反応混合物に添加することもできる。
【００３２】
ループ状の伸長産物の増幅において、反応混合物の温度を上げることで、ループ状の伸長産物を変性させ一本鎖形態とする。プライマーをｃＤＮＡにアニールさせる温度にまで、温度を低下させる。プライマーのアニーリング温度は、約１０秒間〜約５分間の時間で、約０℃〜約３０℃、例えば約０℃〜約１０℃である。次に、特定のＤＮＡポリメラーゼが活性化されてｃＤＮＡ合成を開始する温度にまで、反応温度を上昇させる。異なるＤＮＡポリメラーゼは異なる温度で機能的となり得るため、異なるＤＮＡポリメラーゼが順次活性化されＤＮＡ合成を開始できるように、サイクルでは昇温又は温度上昇がなされ得る。合計インキュベーション時間は、約２分間〜約７分間、より好ましくは約５分間であってもよい。
【００３３】
ＤＮＡ増幅の効率を有意に変化させることなく、ＤＮＡ増幅工程の温度、インキュベーション時間、及び昇温時間を、本明細書で開示される値に基づいて変化させてもよいことを理解されたい。本開示に基づいて、パラメーターを変更可能であることは、当業者には理解される。反応条件及びパラメーターの軽微な変更は本開示の範囲内に含まれる。
【００３４】
アンプリコン生成物は次に、本明細書に記載のように、又は当業者に公知のように、シーケンシングのために処理され得る。
【００３５】
ＲＮＡ、細胞型、及び試料
用語「ＲＮＡ」とは、本明細書で使用される場合、遺伝子のコーディング、デコーディング、調節、及び発現における、様々な生物学的役割において必須の重合分子を指すと当業者には理解され得る。ＤＮＡと同様に、ＲＮＡは核酸である。ＲＮＡはヌクレオチド鎖として構築され、それ自体が折り重なって二次構造を形成した一本鎖として存在する場合が多い。ＲＮＡは、通常、ヌクレオチドであるＧ、Ｕ、Ａ、及びＣを含むことで、窒素含有塩基であるグアニン、ウラシル、アデニン、及びシトシンを表す。ＲＮＡの種類としては、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、及び当業者に公知の他のＲＮＡ種が挙げられる。
【００３６】
ある態様において、ＲＮＡは、検査対象の天然又は人工の供給源に由来するメッセンジャーＲＮＡ又は他のＲＮＡである。別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ試料は、哺乳類ＲＮＡ、植物ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、又は原核生物ＲＮＡである。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＮＡ試料は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、トリ、魚、エビ、植物、酵母、ウイルス、又は細菌から得られる。好ましくは、前記ＲＮＡ試料は単一細胞由来のメッセンジャーＲＮＡである。
【００３７】
ある態様において、ＲＮＡは単一の細胞由来である。ある態様において、ＲＮＡは不均一な細胞集団内の単一の細胞由来である。ある態様において、ＲＮＡは単一の出生前細胞由来である。ある態様において、ＲＮＡは単一のがん細胞由来である。ある態様において、ＲＮＡは単一の循環腫瘍細胞由来である。
【００３８】
用語「単離ＲＮＡ」（例えば、「単離ｍＲＮＡ」）は、組み換え技術で生成された場合は他の細胞性物質若しくは培地を実質的に含まないＲＮＡ分子、又は化学合成された場合は化学前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まないＲＮＡ分子を指す。
【００３９】
ある態様において、試料はインビトロ試料であってもよい。用語「インビトロ」は、当該技術分野において認識されているその意味を有しており、例えば、精製された試薬又は抽出物、例えば、細胞抽出物を含む。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「生物試料」は、組織、細胞、生体液、並びに対象及び対象内に存在する組織、細胞、及び体液から分離されたその分離物を包含することが意図されるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書に記載の方法により処理されるＲＮＡは、有用な任意の供給源、例えば、ヒト試料などから得ることができる。試料は、ヒト由来の任意の試料であってもよく、例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、頬擦過標本、乳頭吸引液、生検材料、精液（射出精液と称される場合がある）、尿、糞便、毛包、唾液、汗、免疫沈降したクロマチン又は物理的に単離したクロマチンなどである。特定の実施形態では、試料は単一細胞を含む。特定の実施形態では、前記試料は単一細胞のみを含む。
【００４２】
特定の実施形態では、試料から増幅された核酸分子から、診断情報又は予後情報が得られる。例えば、試料から調製された核酸分子から、ゲノムのコピー数及び／又は配列の情報、対立遺伝子変異の情報、がん診断、出生前診断、父子鑑別情報、疾患の診断、検出、モニタリング、及び／又は治療の情報、配列情報などを得ることができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「単一細胞」は１個の細胞を指す。本明細書に記載の方法で使用できる単一細胞は、目的の組織から得ることもできるし、あるいは、生検材料、血液試料、又は細胞培養物から得ることもできる。さらに、本明細書に記載の方法においては、特定の臓器、組織、腫瘍、新生物などに由来する細胞を入手し使用することができる。さらに、通常、前記方法においては、例えば、細菌又は酵母を含む原核生物性又は真核生物性の単細胞生物集団など、任意の集団に由来する細胞を使用することができる。単一細胞懸濁液は、当該技術分野において公知の標準方法を用いて得ることができ、例えば、酵素法によりトリプシン若しくはパパインを用いて組織試料における細胞同士を接続しているタンパク質を消化する方法、又は接着細胞を培養液中へ剥離する方法若しくは試料中の細胞を機械的に分離する方法が挙げられる。単一細胞は、単一細胞を個々に処理することが可能な任意の好適な反応容器内に入れることができる。例えば、９６ウェルプレートが挙げられ、各単一細胞が単一ウェル内に入れられる。
【００４４】
本開示の範囲に含まれる細胞として、ＤＮＡ量を理解することが当業者に有用と見なされる、任意の種類の細胞が包含される。本開示における細胞は、任意の種類のがん細胞、肝細胞、卵母細胞、胚、幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、神経細胞、赤血球、メラニン細胞、アストロサイト、生殖細胞、オリゴデンドロサイト、腎細胞などを包含する。ある態様によれば、本発明の方法は単一細胞から得られた細胞ＲＮＡを用いて実行される。複数の細胞には、約２〜約１，０００，０００個の細胞、約２〜約１０個の細胞、約２〜約１００個の細胞、約２〜約１，０００個の細胞、約２〜約１０，０００個の細胞、約２〜約１００，０００個の細胞、約２〜約１０個の細胞、又は約２〜約５個の細胞が含まれる。
【００４５】
単一細胞を操作するための方法は当該技術分野において公知であり、例えば、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ７６：１４５３−５５  １９７９）、顕微操作、及び半自動化細胞ピッキング装置（例えば、Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ社製のＱｕｉｘｅｌｌ（商標）細胞移送システム）の使用が挙げられる。個々の細胞は、例えば、位置、形態、又はレポーター遺伝子発現などの、顕微鏡観察によって検出可能な特徴に基づいて、個々に選別することができる。さらに、勾配遠心分離及びフローサイトメトリーを併用することによって、単離又は選別の効率を上げることができる。
【００４６】
目的の細胞が同定された後、当業者に公知の方法を用いて細胞は溶解され、ＲＮＡを含む細胞内容物が放出される。細胞内容物は容器内、すなわち収集容積中に収容される。本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡなどの細胞内容物は、細胞を溶解することにより細胞から放出させることができる。溶解は、例えば、細胞の加熱、又は界面活性剤若しくは他の化学的手法の使用、又はこれらの組み合せにより達成可能である。ただし、当該技術分野において公知の任意の好適な溶解法を使用できる。例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０存在下で、７２℃で２分間、細胞を加熱することにより、細胞は十分に溶解される。あるいは、細胞を、水中で６５℃、１０分間加熱してもよく（Ｅｓｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６０（４）：４３９−５１（２００８））、０．５％ＮＰ−４０を添加したＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）中で７０℃、９０秒間加熱してもよく（Ｋｕｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４（５）：ｅ４２（２００６））、又はプロテアーゼＫなどのプロテアーゼを用いて、若しくはグアニジンイソチオシアネートなどのカオトロピック塩を用いて溶解してもよい（米国特許出願公開第２００７／０２８１３１３号）。本明細書に記載の方法によるＲＮＡの増幅は細胞溶解液に対して直接的に実行できるため、反応混合物を細胞溶解液に添加することができる。あるいは、細胞溶解液を、当業者に公知の方法を用いて、２以上の容器、チューブ、又は領域などの中に、２以上の体積に分割し、細胞溶解液の一部を、各々の容積容器、チューブ、又は領域内に収容することができる。各々の容器、チューブ、又は領域内に収容されたＲＮＡは、その後、本明細書に記載の方法又は当業者に公知の方法によって増幅できる。
【００４７】
ＲＮＡからのｃＤＮＡの合成
本明細書に記載の方法は、ｍＲＮＡを出発物質とするＰＣＲの一種である、「逆転写ＰＣＲ」（「ＲＴ−ＰＣＲ」）を利用する。逆転写酵素を用いて、出発ｍＲＮＡが酵素により相補ＤＮＡ又は「ｃＤＮＡ」に変換される。次にｃＤＮＡは、ＰＣＲ反応のための鋳型として使用される。
【００４８】
ある態様によれば、ｃＤＮＡがＲＮＡから生成され、得られたｃＤＮＡには、第一の細胞特異的バーコード配列及び第一の固有分子識別子バーコード配列が含まれる。ある態様によれば、ｃＤＮＡはＲＮＡ鋳型から合成され、ＲＮＡ鋳型としては、例えば、単一細胞から得られた、すなわち溶解された、ｍＲＮＡ鋳型などがある。反応容器中で、ＲＮＡ鋳型が変性によって二次構造から一本鎖形態になる。ＲＮＡ鋳型鎖の５′ポリ（Ａ）配列に相補的な３′ポリ（Ｔ）配列を有する逆転写プライマー配列が添加される。逆転写プライマー配列は、５′自己アニーリング配列、バーコードプライマーアニーリング部位、４〜１２ヌクレオチド長の第一の細胞特異的バーコード配列、及び１０〜３０ヌクレオチド長の第一の固有分子識別子バーコード配列をさらに含む。所与のｍＲＮＡについて、逆転写プライマー配列の、１０〜３０個のＴヌクレオチドを含み得る３′ポリ（Ｔ）配列が、ＲＮＡ鋳型鎖の５′ポリ（Ａ）配列にハイブリダイズする。
【００４９】
逆転写酵素の存在下、且つ、好適な条件及び試薬の下で、ＲＮＡ鋳型鎖が逆転写されて、ｃＤＮＡ鋳型鎖の５′側に逆転写プライマー配列を含むｃＤＮＡ鋳型鎖が生成される。ｃＤＮＡ鋳型鎖はＲＮＡ鎖にハイブリダイズしている。過剰分の逆転写プライマー配列が消化酵素などにより消化される。ＲＮＡ鎖が分解されて、一本鎖としてのｃＤＮＡ鋳型鎖が得られる。逆転写酵素が失活される。消化酵素が失活される。次に得られたｃＤＮＡが増幅される。
【００５０】
逆転写酵素（ＲＴ）は、ＲＮＡ鋳型から相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素であり、このプロセスは逆転写と呼ばれる。ある態様において、使用できる逆転写酵素の例は、市販の逆転写酵素及び／又は当業者に公知の逆転写酵素である。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれる手法において、逆転写酵素によって、ＲＮＡがポリメラーゼ連鎖反応法に供される。本開示では、逆転写酵素を用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーが作製される。逆転写酵素の例としては、市販品のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｍａｘｉｍａ逆転写酵素、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、又は公知若しくは市販の他の多数の適合性の逆転写酵素である。
【００５１】
プライマーの消化に用いる酵素は当業者に公知の市販のものである。消化酵素の例としては、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ＋Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｔ、及び他の好適なヌクレアーゼなどが挙げられる。
【００５２】
上記のｃＤＮＡ合成法では、反応容器内の反応媒体がいくつかの温度にさらされることで、前記方法の種々の態様が達成される。例えば、ＲＮＡ鎖は７５℃〜８５℃の温度で分解される。逆転写酵素及び前記酵素は７５℃〜８５℃の温度で失活される。
【００５３】
多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法を用いたｃＤＮＡ増幅
次に、得られた一本鎖ｃＤＮＡ分子が、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法を用いて増幅される。ある態様では、好適な条件下、且つ自身の５′末端に自己アニーリング配列を有する伸長プライマーを含む試薬の下、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、逆転写プライマー配列を含むｃＤＮＡ鋳型鎖に対する相補鎖が生成される。得られる相補鎖は、５′末端に自己アニーリング配列を含み、３′末端に前記自己アニーリング配列の相補体を含む。ｃＤＮＡ鋳型鎖を相補鎖から変性させ、３′末端の自己アニーリング配列と５′末端の相補体とのアニーリングにより、相補鎖がループ化する。ループ化されると、ループ状の相補鎖の増幅が阻止される。鋳型ｃＤＮＡに対する相補鎖を生成し、ｃＤＮＡ鎖から相補鎖を変性させた後、相補鎖をループ化する工程が、複数回、例えば７〜１２回繰り返されることで、それぞれのｃＤＮＡ鋳型鎖から複数のループ状の相補鎖が生成される。
【００５４】
複数のループ状の相補鎖が変性された後、自己アニーリング配列を含む増幅プライマーを用いて増幅されることで、逆転写プライマー配列を含む二本鎖アンプリコンが生成される。二本鎖アンプリコンは変性され、（１）バーコードプライマーアニーリング部位に相補的な３′配列を有し、５′自己アニーリング配列、シーケンシングプライミング配列、及び４〜１２ヌクレオチド長の第二の細胞特異的バーコード配列をさらに含む、外側バーコードプライマー、並びに、（２）５′自己アニーリング配列を含むプライマーを用いて、複数回繰り返し増幅される。得られた二本鎖アンプリコンは、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び第一の固有分子識別子バーコード配列を含む。得られた二本鎖アンプリコンはシーケンシングのために処理される。
【００５５】
ある態様において、第一の固有分子識別子バーコード配列はセミランダムな配列パターンを含んでいてもよい。
【００５６】
自己アニーリング配列の例としては、当業者に公知のものであり、ＧＡＴ５及びＧＡＴ１などが挙げられる。
【００５７】
バーコードプライマーアニーリング部位配列の例としては、当業者に公知のものであり、ＲＴ３、Ｒｅａｄ２ＳＰ、及びＲｅａｄ１ＳＰなどが挙げられる。
【００５８】
ある態様において、１以上又は複数のＲＮＡ配列から逆転写された１以上又は複数のｃＤＮＡ配列、プライマー、及び少なくとも１種のポリメラーゼの反応混合物が提供される。ある態様において、鎖置換活性を有するか、又は５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼが提供される。鎖置換型ポリメラーゼは、伸長時に下流の断片を外すポリメラーゼである。鎖置換型ポリメラーゼとしては、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ  ３１７３、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＴＯＰＯ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異型、又はこれらの混合物が挙げられる。Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（完全長）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらの混合物などの５′フラップエンドヌクレアーゼ又は５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を有する１又は複数のポリメラーゼを用いて、不均等なプライミングによる残留バイアスを取り除くことができる。例えば、Ｑ５、Ｐｈｕｓｉｏｎ、及びＫａｐａ  ＨｉＦｉなど、鎖置換活性を有しない他のポリメラーゼを使用することもできる。
【００５９】
シーケンシングライブラリーの作製に使用できるシーケンシングプライミング配列、アダプター配列、シーケンシングインデックス、フローセルアニーリングアダプターは、当業者に公知であって市販されており、例えば、Ｒｅａｄ１ＳＰ、Ｒｅａｄ２ＳＰ、インデックス１、インデックス２、Ｐ５、及びＰ７が挙げられる。
【００６０】
以下の表１に例示的な配列を記載する。配列は全て５′から３′に向かって列挙されている。ＨはＧではなく、ＢはＡではなく、ＤはＣではなく、ＶはＴではない。Ｒｅａｄ１ＳＰ、Ｒｅａｄ２ＳＰ、インデックス１、インデックス２、Ｐ５、及びＰ７の配列は当業者に公知であり、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社及びＩｌｌｕｍｉｎａ社が発表した情報から入手可能である。
【００６１】
【表１】
2020521486.tif 000002
【００６２】
上記の多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法では、反応容器内の反応媒体がいくつかの温度に曝されることで、前記方法の種々の態様が達成される。例えば、伸長プライマーは０℃〜１０℃の温度でｃＤＮＡ鋳型鎖にアニールする。相補鎖は１０℃〜６５℃の温度で生成される。相補鎖のループ化は５５℃〜６０℃の温度で生じる。
【００６３】
ある態様において、変性された相補鎖の増幅の工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、１５〜２０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応により実行される。
【００６４】
ある態様において、変性されたアンプリコンの増幅の工程は、ポリメラーゼ連鎖反応、例えば、３〜７サイクルのポリメラーゼ連鎖反応により実行される。
【００６５】
ある態様において、シーケンシングプライミング配列はＲｅａｄ２ＳＰ又はＲｅａｄ１ＳＰである。
【００６６】
逆転写プライマー分解効率の測定
ある態様において、逆転写プライマー分解効率を測定するための、又はそれを求めるための方法が提供される。前記方法は、消化酵素の存在下で、１０〜３０ヌクレオチド長の第二の固有分子識別子バーコード配列を有する逆転写プライマーを添加することを含む。第二の固有分子識別子バーコード配列は、第一の固有分子識別子バーコード配列とは異なるセミランダムな配列パターンを含む。このようにして、第一の固有分子識別子バーコード配列を含む産物と第二の固有分子識別子バーコード配列を含む産物との最終的な比から、ＲＴプライマー分解効率を測定できる。
【００６７】
増幅
ある態様では、増幅はＰＣＲを用いて達成される。ＰＣＲは、プライマー対、すなわち上流プライマーと下流プライマーとからなるプライマーセット、及びＤＮＡポリメラーゼなどの重合触媒、通常は耐熱性ポリメラーゼ酵素を用いて、標的ポリヌクレオチドの複製コピーが作製される反応である。ＰＣＲ法は当該技術分野において周知であり、例えば、ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）に教示されている。Ｍｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、及び同第４，９６５，１８８号）による「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニング又は精製を含まない、標的配列の断片の濃度を増加させるための方法を指す。この標的配列増幅プロセスは、目的の標的配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー及び増幅用試薬を供給した後、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）存在下で厳密な一連の温度サイクルを実行することを含む。これらのプライマーは、二本鎖である標的配列の各々の鎖（「プライマー結合配列」）に対して相補的である。通常、増幅を実行するにあたり、二本鎖標的配列が変性された後、プライマーが標的分子内の各相補的配列にアニーリングされる。アニーリングの後、各プライマーがポリメラーゼにより伸長されて、新たな相補鎖対が形成される。変性工程、プライマーアニーリング工程、及びポリメラーゼ伸長工程を、複数回繰り返すことで（すなわち、変性、アニーリング及び伸長が１つの「サイクル」を成し；多数の「サイクル」が実行され得る）、目的の標的配列の高濃度増幅断片を得ることができる。目的の標的配列の増幅断片の長さはプライマー同士の相対位置によって決定されるため、この長さは調節可能なパラメーターである。このプロセスの反復的な態様から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下、「ＰＣＲ」）と称され、標的配列は「ＰＣＲ増幅物」と称される。
【００６８】
「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」、及び「増幅産物」という用語は、変性工程、アニーリング工程、及び伸長工程からなるＰＣＲサイクルが２サイクル以上完了した後に得られる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１又は複数の標的配列の１又は複数の断片の増幅が起こった場合も包含する。
【００６９】
適切なプライマー分子セットを用いることで、任意のオリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列が増幅可能である。ＰＣＲを実行するための方法及びキットは当該技術分野において周知である。本明細書では、ＰＣＲ又は遺伝子クローニングなど、ポリヌクレオチドの複製コピーを生成するプロセスは全て、まとめて複製と称される。
【００７０】
「増幅」又は「増幅する」という表現は、特定のポリヌクレオチドの余分なコピー又は複数のコピーが形成されるプロセスを指す。増幅には、ＰＣＲ、ライゲーション法による増幅（すなわちリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）、及び他の増幅方法などの方法が含まれる。これらの方法は当該技術分野において公知であり、広く実施されている。例えば、ＰＣＲについては、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、並びにＩｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、“ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（１９９０）；ＬＣＲについては、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（又はライブラリー）内の特定遺伝子に対するプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）続く、ＤＮＡポリメラーゼを用いた、複数回のアニーリング、伸長、及び変性を含む増幅、並びに、（ｉｉｉ）正確なサイズのバンドについてのＰＣＲ産物のスクリーニングから構成される遺伝子増幅法として説明される。使用されるプライマーは、重合の開始を実現するのに十分な長さ及び適切な配列を有するオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の各々の鎖に相補的となるように特別に設計されている。
【００７１】
増幅反応を実行するための試薬及びハードウェアは市販されている。特定の遺伝子領域から配列を増幅するのに有用なプライマーは、標的領域内の配列又はその隣接領域内の配列に相補的であり、且つそれに特異的にハイブリダイズすることが好ましく、当業者に公知の方法を用いて作製することができる。増幅によって作製された核酸配列はそのまま配列決定に用いることができる。
【００７２】
２本の一本鎖ポリヌクレオチド間で逆向きのハイブリダイゼーションが生じる場合、その反応は「アニーリング」と呼ばれ、それらのポリヌクレオチドは「相補的」であるとされる。二本鎖ポリヌクレオチドはもう一方のポリヌクレオチドに対して、第一のポリヌクレオチドの一方の鎖と第二のポリヌクレオチドの一方の鎖との間でハイブリダイゼーションが起こり得る場合に、相補的又は相同であるとすることができる。相補性又は相同性（あるポリヌクレオチドがもう一方のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に認められている塩基対形成法則に従って、互いに水素結合を形成すると予想される対向する鎖内の塩基の割合によって、数量化できる。
【００７３】
用語「増幅試薬」は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素以外の、増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など）を指し得る。通常、増幅試薬は他の反応成分と共に、反応容器（試験管、マイクロウェルなど）内に添加及び含有される。増幅法には、当業者に公知のＰＣＲ法が含まれ、また、ローリングサークル増幅（Ｂｌａｎｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，８９３５−８９４０，１９８９）、超分岐ローリングサークル増幅（Ｌｉｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９，２２５−２３２，１９９８）、及びループ介在等温増幅（Ｎｏｔｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，ｅ６３，２０００）も含ま、各文献はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【００７４】
本開示においては、それぞれ参照により本明細書に取り込まれる英国特許出願第ＧＢ２，２０２，３２８号及びＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号に記載されるような他の増幅法を使用してもよい。本開示においては、エマルジョンＰＣＲを用いてもよい。他の好適な増幅法としては、「ＲＡＣＥ」及び「片側ＰＣＲ（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ  ＰＣＲ）」（Ｆｒｏｈｍａｎ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９９０、各々参照によって本明細書に組み込まれる）が挙げられる。結果として生成される「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下で、２本（以上）のオリゴヌクレオチドをライゲーションすることで、このジ−オリゴヌクレオチドを増幅することに基づく方法も、本開示におけるＤＮＡ増幅に使用してよい（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０−５６９，１９８９、参照により本明細書に取り込まれる）。
【００７５】
増幅されるＲＮＡは、単一細胞から得てもよいし、あるいは細胞小集団から得てもよい。本明細書に記載の方法により、単一反応容器内で実行される単一反応混合物などの反応混合物において、任意の種又は生物に由来するＲＮＡの増幅が可能になる。ある態様において、本明細書に記載の方法には、これらに限定されないが、ヒトＲＮＡ、動物ＲＮＡ、植物ＲＮＡ、酵母ＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、真核生物ＲＮＡ及び原核生物ＲＮＡを含む、任意の供給源由来ＲＮＡの配列非依存的な増幅が含まれる。
【００７６】
プライマー
本明細書で使用される場合、通常、用語「プライマー」には、シーケンシングプライマーなど、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成した際に核酸合成の開始点として働き、鋳型に沿ってその３′末端から伸長されることで伸長された二本鎖が形成され得る、天然又は合成のオリゴヌクレオチドが包含される。プライマーとしては、伸長プライマー、増幅プライマー、又は逆転写プライマーが挙げられる。
【００７７】
伸長プロセスの際に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素によって伸長される。プライマーは、通常３〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有し、また、５〜２４ヌクレオチド又は１４〜３６ヌクレオチドの範囲内の長さを有することもある。本発明の範囲に含まれるプライマーには、直交性プライマー（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｐｒｉｍｅｒ）、増幅プライマー、及び構築プライマー（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ  ｐｒｉｍｅｒ）などが含まれる。プライマー対は、１つの目的配列又は一連の目的配列に隣接させることができる。プライマー及びプローブは、縮重配列又は準縮重配列であってもよい。本発明の範囲に含まれるプライマーは標的配列に隣接して結合する。「プライマー」は、通常、遊離３′−ＯＨ基を有し、目的試料中に存在し得る標的又は鋳型に、該標的とハイブリダイズすることにより結合し対応後、該標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、短いポリヌクレオチドと見なされ得る。本発明のプライマーは、１７〜３０ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドから構成される。ある態様では、プライマーは、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも１８ヌクレオチド、少なくとも１９ヌクレオチド、少なくとも２０ヌクレオチド、少なくとも２１ヌクレオチド、少なくとも２２ヌクレオチド、少なくとも２３ヌクレオチド、少なくとも２４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも２６ヌクレオチド、少なくとも２７ヌクレオチド、少なくとも２８ヌクレオチド、少なくとも２９ヌクレオチド、少なくとも３０ヌクレオチド、少なくとも５０ヌクレオチド、少なくとも７５ヌクレオチド、又は少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００７８】
シーケンシング
アンプリコンは、例えば当業者に公知のハイスループットシーケンシング法を用いて、配列決定される。目的の核酸配列の配列決定は、これらに限定されないが、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（ＳＢＨ）、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１７２８）、定量的漸増増加性蛍光ヌクレオチド付加シーケンシング（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的なライゲーション及び切断、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化、パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシーケンシング（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱ用ビーズ（米国特許第７，４２５，４３１号）、ゆらぎシーケンシング（ｗｏｂｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５）、マルチプレックスシークエンシング（米国特許出願公開第１２／０２７，０３９号、２００８年２月６日出願；Ｐｏｒｒｅｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４：９３１）、重合コロニー（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ  ｃｏｌｏｎｙ）（ＰＯＬＯＮＹ）シーケンシング（米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、及び同第６，５１１，８０３号、並びにＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５）；ナノグリッドローリングサークルシーケンシング（ＲＯＬＯＮＹ）（米国特許出願公開第１２／１２０，５４１号、２００８年５月１４日出願）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーションされた直鎖状プローブとローリングサークル増幅（ＲＣＡ）による読み取りを利用した単一鋳型分子ＯＬＡ、ライゲーションされたパッドロックプローブ、及び／又は連結された環状パッドロックプローブとローリングサークル増幅（ＲＣＡ）による読み取りを利用した単一鋳型分子ＯＬＡ）などを含む、当該技術分野において公知の種々のシーケンシング法を用いて行うことができる。例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢ−ＳＯＬｉＤ、及びＨｅｌｉｃｏｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒなどのプラットフォームを用いるハイスループットシーケンシング法も利用できる。種々の光学ベースのシークエンシング技術が、当該技術分野において公知である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．８：７６９−７６；Ｋｗｏｋ（２０００）Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：９５−１００；及びＳｈｉ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１６４−１７２）。
【００７９】
増幅したＤＮＡは任意の好適な方法で配列決定することができる。特に、増幅ＤＮＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製のＳＯＬｉＤシーケンシング技術、又はＩｌｌｕｍｉｎａ社製のＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒなど、ハイスループットスクリーニング法を用いて配列決定することができる。本発明のある態様では、増幅されたＤＮＡはショットガンシーケンシングをすることができる。リード数は、少なくとも１０，０００、少なくとも１，０００，０００、少なくとも１０，０００，０００、少なくとも１００，０００，０００、又は少なくとも１，０００，０００，０００とすることができる。別の態様では、リード数は、１０，０００〜１００，０００、あるいは１００，０００〜１，０００，０００、１，０００，０００〜１０，０００，０００、１０，０００，０００〜１００，０００，０００、又は１００，０００，０００〜１，０００，０００，０００であってもよい。「リード」とは、シークエンシング反応によって得られる、連続した核酸配列の長さである。
【００８０】
「ショットガンシーケンシング」は、非常に大量のＤＮＡ（ゲノム全体など）の配列決定に使用される方法を指す。この方法では、まず、配列決定しようとするＤＮＡが、個々に配列決定可能なより小さな断片に断片化される。その後、これらの断片の配列が、重複している配列に基づいて元の順番に再構築され、これにより完全配列が得られる。ＤＮＡの「断片化」は、制限酵素消化又は機械的剪断を含む種々の異なる手法を用いて行うことができる。重複配列は通常、適切にプログラミングされたコンピュータによってアライメントされる。ｃＤＮＡライブラリーをショットガンシーケンシングするための方法及びプログラムは当該技術分野において周知である。
【００８１】
これらの増幅法及びシーケンシング法は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、及び臨床試験モニタリングを予後判定（予測）の目的に使用することで、個人を予防的に治療する、予測医療の分野において有用である。したがって、本発明のある態様は、個人が障害及び／又は疾患を発症する危険性の有無を判定するための、ＲＮＡを特定するための診断アッセイに関する。このようなアッセイを、予後判定又は予測の目的に使用することで、障害及び／又は疾患の発症前に個人を予防的に治療することができる。したがって、ある特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載の発現プロファイリング法のうちの１又は複数を用いた、１又は複数の疾患及び／又は障害を診断及び／又は予後予測する方法が提供される。
【００８２】
相補性及びハイブリダイゼーション
本明細書で使用される場合、「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連付けられたヌクレオチド配列同士を指して使用される。例えば、５′−ＡＧＴ−３′という配列は、５′−ＡＣＴ−３′という配列に対して相補的である。相補性は部分的又は全体的であってもよい。部分的な相補性は、１又は複数の核酸塩基が塩基対合則に従ってマッチングしていない場合に生じる。核酸間の全体的又は完全な相補性は、塩基対合則に基づいて、１つ１つの核酸塩基がもう一方の塩基とマッチングしている場合に生じる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に対し重大な影響を及ぼす。
【００８３】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的な核酸同士が対合することを指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の結合の強度）は、例えば、核酸間の相補性の程度、関連条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのＴｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比などの要素に影響を受ける。単一分子で、その構造内に相補的な核酸同士の対合が存在するものは、「セルフハイブリダイズ」しているといわれる。
【００８４】
用語「Ｔｍ」は、核酸の融解温度を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が半分二解離して一本鎖になる温度である。核酸のＴｍの計算式は当該技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されるように、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中に存在する場合、Ｔｍの単純な推定値は、式：Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって算出され得る（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５）を参照）。他の参考文献では、Ｔｍの算出のために、配列的特徴だけでなく構造的特徴も考慮に入れた、より高度な計算が含まれる。
【００８５】
用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが実行される、温度、イオン強度、及び有機溶剤などの他の化合物の存在の条件を指す。
【００８６】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「低ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート試薬（５０×デンハート試薬は５００ｍＬ当たり、５ｇのフィコール（Ｔｙｐｅ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、５ｇのＢＳＡ（Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ；Ｓｉｇｍａ社製）を含有する）及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、並びに、その後の５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄と等価な条件を含む。
【００８７】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「中ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、並びに、その後の１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄と等価な条件を含む。
【００８８】
核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合の「高ストリンジェンシー条件」は、約５００ヌクレオチド長のプローブが使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４（Ｈ２Ｏ）、及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬、及び１００ｍｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、並びに、その後の０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃での洗浄と等価な条件を含む。
【００８９】
ソフトウェア、電子装置、及び媒体
ある特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載の１又は複数のＲＮＡ配列又はｃＤＮＡ配列を含む電子装置可読媒体が提供される。本明細書で使用される場合、「電子装置可読媒体」とは、直接的に電子装置による読み取り及びアクセスが可能な、データ又は情報を記憶、保持、は格納するための、あらゆる好適な媒体を指す。そのような媒体としては、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープなどの磁気記憶媒体；コンパクトディスクなどの光学式記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、及びＥＥＰＲＯＭなどの電子記憶媒体；一般的なハードディスク、並びに磁気／光学式記憶媒体などのこれらのカテゴリーの複合型を挙げることができるが、これらに限定されない。媒体は、本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルが記録されるように適合又は構成される。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「電子装置」は、任意の好適な演算装置若しくは処理装置、又はデータ若しくは情報を記憶するように構成若しくは適合された他のデバイスを包含することが意図される。本発明において好適に使用される電子装置の例としては、独立型演算装置；構内ネットワーク（ＬＡＮ）、広域ネットワーク（ＷＡＮ）インターネット、イントラネット、及びエクストラネットを含むネットワーク；携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、及びポケットベルなどの電子装置；並びに局所内処理システム及び分散処理システムが挙げられる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「記録」とは、情報を電子装置可読媒体上に記憶又はコード化するための処理を指す。当業者であれば、情報を公知の媒体上に記録して、本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルを含む製品を生み出すため、現在知られている任意の方法を容易に採用することができる。
【００９２】
種々のソフトウェアプログラム及びフォーマットを用いて、本発明のＲＮＡ情報又はｃＤＮＡ情報を電子装置可読媒体上に記憶することができる。例えば、核酸配列は、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ及びＭｉｃｒｏＳｏｆｔ  Ｗｏｒｄなどの市販のソフトウェアでフォーマットされたワードプロセッシングテキストファイル中に、又は、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、若しくはＯｒａｃｌｅなどのデータベースアプリケーションに記憶されたＡＳＣＩＩファイルの形式で、及び他の形式で表すことができる。本明細書に記載の１又は複数の発現プロファイルが記録された媒体を得る、又は作製するために、任意の数のデータプロセッサ構造化フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を用いてよい。
【００９３】
本発明の実施形態を説明してきたが、これらは本発明の原理の適用のいくつかを例示したに過ぎないことを理解されたい。当業者は、本明細書に提供された教示に基づいて、本発明の趣旨の範囲内で、多くの変更を行うことができる。本願に引用された全ての文献、特許、及び特許出願公開の内容は、全ての目的のためそれらの全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【００９４】
本発明を代表するものとして、以下に実施例を記載する。本開示、図面及び添付の特許請求の範囲に鑑みれば、これら及び他の等価な実施形態は明らかとなるため、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００９５】
実施例Ｉ
ｍＲＮＡ鋳型からのｃＤＮＡ合成
図１は、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する１つの例示的な方法を示している。４μＬの細胞溶解緩衝液（１×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）中の溶解ＲＮＡ、０．５％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、５００ｍＭ  ｄＮＴＰ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１Ｍ  ベタイン、１Ｕ  ＳＵＰＥＲａｓｅ  Ｉｎ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２．５μＭ  「ＲＴ−Ａ」逆転写プライマー（ＩＤＴ社））を７２℃に３分間加熱して、ＲＮＡの二次構造を変性させる。加熱後、この混合物を４℃に冷却して、逆転写酵素プライマー（”ＲＴ−Ａ）をｍＲＮＡ転写産物のポリ（Ａ）領域にアニールさせる。ＲＴ−Ａプライマーは、（５′末端から出発して）ｃＤＮＡ増幅時に自己アニーリングループの形成に利用されるＧＡＴ５配列、Ｂ１スペーサー配列、最後のＰＣＲ工程時に外側バーコードプライマーのアニーリング部位として利用されるＲＴ３配列、ハミング距離が３以上離れている、「ｎ」通りの６ヌクレオチド細胞特異的バーコードの１つであるＣｎ配列、各々の転写産物に対してユニークにバーコード付加するために約３５億（３２０）通りの組み合わせが可能な、複雑さが低減された、すなわちセミランダムな、２０塩基長のＵＭＩＡ配列、及び、１２ヌクレオチド長のポリ（Ｔ）領域を含んでいる（表１参照）。２μＬの逆転写酵素ミックス（１×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１Ｕ  ＳＵＰＥＲａｓｅ  Ｉｎ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、６０Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））を添加し、その混合物を５５℃で１０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成を触媒する。後のｃＤＮＡ増幅時の余剰ＲＴ−Ａプライマーによるアニーリングを防ぐため、２μＬのプライマー消化ミックス（１×Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）、１２Ｕ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＮＥＢ社）、２．５μＭ  「ＲＴ−Ｂ」逆転写プライマー（ＩＤＴ社））を添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、逆転写プライマーを消化する。ある態様では、第二の逆転写プライマー（”ＲＴ−Ｂ）を添加するが、この第二の逆転写プライマーはＵＭＩＡパターンの代わりにＵＭＩＢパターンを含むこと以外はＲＴ−Ａと同一であり（表１参照）、これにより、不完全な消化によってＵＭＩＡバーコードとＵＭＩＢバーコードとの混合物を含むｃＤＮＡ増幅産物が生じることとなるため、エキソヌクレアーゼ消化効率の測定が可能となる。消化後、この混合物を８０℃で２０分間加熱することで、ＲＮＡを分解し、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを熱失活させる。
【００９６】
実施例ＩＩ
ｃＤＮＡ増幅
図２は、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ）を用いた実施例ＩのｃＤＮＡの増幅を例示しており、ループ化された伸長産物が形成された後、そのループ状の伸長産物のＰＣＲ増幅が行われる。ＭＡＬＢＡＣ法については、それぞれその全体が参照により本明細書に取り込まれる、Ｚｏｎｇ，Ｃ．，Ｌｕ，Ｓ．，Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｒ．及びＸｉｅ，Ｘ．Ｓ．（２０１２）Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｃｏｐｙ−ｎｕｍｂｅｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３８，１６２２−１６２６；並びにＣｈａｐｍａｎ，Ａ．Ｒ．，Ｈｅ，Ｚ．，Ｌｕ，Ｓ．，Ｙｏｎｇ，Ｊ．，Ｔａｎ，Ｌ．，Ｔａｎｇ，Ｆ．及びＸｉｅ，Ｘ．Ｓ．（２０１５）Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭＡＬＢＡＣ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，１０，ｅ０１２０８８９に記載されている。
【００９７】
ＭＡＬＢＡＣについて、２２μＬのｃＤＮＡ増幅ミックス（１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０μＭ「ＧＡＴ５−Ｂ１−７Ｎ」プライマー（ＩＤＴ社）、５０μＭ「ＧＡＴ５−Ｂ１」プライマー（ＩＤＴ社）、２Ｕ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＮＥＢ社））をｃＤＮＡ合成ミックスに添加する。この混合物を９５℃で５分間加熱した後、４℃で５０秒、１０℃で５０秒、２０℃で５０秒、３０℃で５０秒、４０℃で４５秒、５０℃で４５秒、６５℃で４分、９５℃で２０秒、５８℃で２０秒のインキュベーションプログラムを１０回繰り返すことにより、準線形ｃＤＮＡ増幅を実行する。このインキュベーションプログラムは、最初に前記混合物を冷却することで、ＧＡＴ５−Ｂ１−７Ｎプライマーを、前記ｃＤＮＡにランダムにアニールさせている。６５℃に昇温させることで、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）に、第二鎖の合成を触媒させる。９５℃で変性させて第二鎖が分離され、５８℃に冷却することで第二鎖（伸長産物）に相補的である５′配列及び３′配列に安定なループが形成され、さらなる増幅が阻害される。準線形増幅の後、ＧＡＴ５プライマーを用いて、ＰＣＲ増幅を１７サイクル実行する。ＭＡＬＢＡＣの後、０．４μＬの５０μＭ  外側バーコードプライマーを添加し、ＯＢｍ及びＧＡＴ５−Ｂ１を用いてＰＣＲをさらに５サイクル実行して、最終産物を得る。この外側バーコードプライマーは（５′末端から出発して）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＲｅａｄ  ２シーケンシングプライミング配列であるＲｅａｄ２ＳＰ配列、ハミング距離が２以上離れている、「ｍ」通りの４〜７ヌクレオチド細胞特異的バーコードの１つであるＧｍ配列、及びＭＡＬＢＡＣによるｃＤＮＡ産物にアニールするＲＴ３配列を含む。この外側バーコードの付加により、計ｍ×ｎ通りの可能なバーコードが与えられる。０．８×Ａｍａｚｉビーズ（Ａｌｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてこの産物を精製し、１５０塩基対未満のプライマー二量体を除去する。
【００９８】
実施例ＩＩＩ
ライブラリー調製
図３は、実施例ＩＩのアンプリコンからシークエンシングのためのライブラリーを調製する方法を図示している。実施例ＩＩのアンプリコン産物を、複数の化学作用により、Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングに適合するライブラリーとして調製できる。ライブラリー調製について、高活性Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）から得られるもの）を用いて、Ｒｅａｄ  １シーケンシングアダプターの一部をアンプリコンに付着させ、次に、完全長シーケンシングアダプターを用いてＰＣＲを実行することで、Ｉｌｌｕｍｉｎａに適合するシーケンシングライブラリーが得られる（図３）。Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いたタグメンテーションにより複数の産物が得られ、目的産物はｃＤＮＡに隣接するバーコード配列及びＲｅａｄ  １シーケンシングプライミング配列（Ｒｅａｄ１ＳＰ）を含む。このタグメンテーション産物を５０μＬのＰＣＲ増幅ミックス（１×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．５μＭ  Ｓ５ＸＸプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、０．５μＭ  Ｒｅａｄ  ２  Ｉｎｄｅｘ  Ａｄａｐｔｅｒプライマー（ＩＤＴ社））に添加し、７２℃で３分、９８℃で３０秒、その後、９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、及び７２℃で３分を５サイクルのインキュベーションプログラムを用いて増幅する。最終的なシーケンシングライブラリーを再度０．８×Ａｍａｚｉビーズで精製した後、シークエンシング前の濃度調整のためにＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いてサイズ分類する。
【００９９】
実施例ＩＶ
同種ヒト細胞培養物内の組織特異的転写調節モデルの決定
デジタルトランスクリプトミクスのための多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ−ＤＴ）を以下の２種のヒト細胞株に対して実行した。Ｕ２−ＯＳ骨肉腫（ｂｏｎｅ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ）細胞株及びＨＥＫ２９３Ｔ胎児由来腎臓細胞株を、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ロックヴィル）から入手した。Ｕ２−ＯＳ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＡＴＣＣ）中で維持した。回収のため、細胞を０．０５％Ｔｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で懸濁した後、１×ＰＢＳで洗浄し、１０％ウシ胎児血清、２μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び１μＭカルセインＡＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加したダルベッコ変法イーグル培地で再度懸濁した。ＭｏＦｌｏ  Ａｓｔｒｉｏｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）を用いて、カルセインＡＭのシグナルが陽性であり且つヨウ化プロピジウムのシグナルが陰性である単一生細胞を、９６ウェルプレートにソーティングした。前記９６ウェルプレートの各ウェルには、３μＬの溶解緩衝液（１×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、０．５％ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、５００ｍＭ  ｄＮＴＰ、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１Ｍベタイン、１Ｕ  ＳＵＰＥＲａｓｅ  Ｉｎ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、２．５μＭ  「ＲＴ−Ａ」逆転写プライマー（ＩＤＴ社）、ＥＲＣＣの２．４×１０７希釈液）を含んでいた。ＲＴ−Ａプライマーは、（５′末端から出発して）ｃＤＮＡ増幅時に自己アニーリングループの形成に利用されたＧＡＴ５配列、Ｂ１スペーサー配列、最後のＰＣＲ工程時に外側バーコードプライマーのアニーリング部位として利用されたＲＴ３配列、ハミング距離が３以上離れている、「ｎ」通りの６ヌクレオチド細胞特異的バーコードの１つであるＣｎ配列、各々の転写産物に対してユニークにバーコード付加するために約３５億（３２０）通りの組み合わせが可能な、複雑さが低減された、ランダムな２０塩基長のＵＭＩＡ配列、及び、１２ヌクレオチド長のポリ（Ｔ）配列を含んでいた（表１）。
【０１００】
ｃＤＮＡ合成について、プレートを遠心し、７２℃で３分間インキュベートすることでＲＮＡ二次構造を変性させ、その後４℃に冷却して、プライマーのアニーリングを行った。１μＬの逆転写ミックス（１×ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１Ｍ  ＤＴＴ、１Ｕ  ＳＵＰＥＲａｓｅ  Ｉｎ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、６０Ｕ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社））を添加し、その混合物を５５℃で１０分間インキュベートしてｃＤＮＡ合成を触媒した。後のｃＤＮＡ増幅時の過剰分のＲＴ−Ａプライマーによるアニーリングを防ぐため、２μＬのプライマー消化用ミックス（１×Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）、１２Ｕ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＮＥＢ社）、２．５μＭ「ＲＴ−Ｂ」逆転写プライマー（ＩＤＴ社））を添加し、３７℃で３０分間インキュベートして、逆転写プライマーを消化した。ＲＴ−ＢプライマーはＵＭＩＡパターンの代わりにＵＭＩＢパターンを含むこと以外はＲＴ−Ａと同一であり（表１）、これにより、不完全な消化によってＵＭＩＡバーコードとＵＭＩＢバーコードとの混合物を含むｃＤＮＡ増幅産物が生じることとなるため、エキソヌクレアーゼ消化効率の測定が可能となった。消化後、この混合物を８０℃で２０分間加熱することで、ＲＮＡを分解し、Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶを熱失活させた。
【０１０１】
得られたｃＤＮＡを、多重アニーリング及びループ化による増幅サイクル法（ＭＡＬＢＡＣ）を用いて増幅した（図２）。ＭＡＬＢＡＣについて、２４μＬのｃＤＮＡ増幅ミックス（１×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ社）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、１．２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４、５０μＭ  「ＧＡＴ５−Ｂ１−７Ｎ」プライマー（ＩＤＴ社）、５０μＭ  「ＧＡＴ５−Ｂ１」プライマー（ＩＤＴ社）、２Ｕ  Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ＤＮＡ  ポリメラーゼ（ＮＥＢ社））を前記ｃＤＮＡ合成ミックスに添加した。この混合物を９５℃で５分間加熱した後、４℃で５０秒、１０℃で５０秒、２０℃で５０秒、３０℃で５０秒、４０℃で４５秒、５０℃で４５秒、６５℃で４分、９５℃で２０秒、５８℃で２０秒を１０サイクル繰り返すことにより、準線形ｃＤＮＡ増幅を実行した。準線形増幅の後、９８℃で１分間加熱した後、９５℃で２０秒、５８℃で３０秒、７２℃で３分のインキュベーションプログラムを１７回繰り返すことにより、ＰＣＲ増幅を実行した。ＭＡＬＢＡＣの後、０．４μＬの５０μＭ  外側バーコードプライマー（配列については表１を参照）を添加し、９５℃で１分間加熱した後、９５℃で２０秒、５８℃で３０秒、及び７２℃で３分を５サイクル繰り返し、７２℃で５分間インキュベートすることにより、ＰＣＲをさらに１回実行した。外側バーコードプライマーは（５′末端から出発して）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＲｅａｄ  ２シーケンシングプライミング配列であるＲｅａｄ２ＳＰ配列、ハミング距離が２以上離れている、「ｍ」通りの４〜７ヌクレオチド細胞特異的バーコードの１つであるＧｍ配列、及びＭＡＬＢＡＣによるｃＤＮＡ産物にアニールするＲＴ３配列を含んでいた。この外側バーコードの付加により、計ｍ×ｎ通りの可能なバーコードが与えられた。０．８×Ａｍａｚｉビーズ（Ａｌｉｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いてこの産物を精製し、１５０塩基対未満のプライマー二量体を除去した。
【０１０２】
Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、前記産物をＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングに適合するライブラリーとして調製した。Ｎｅｘｔｅｒａキットを用いたタグメンテーションにより複数の産物が得られ、目的産物は、ｃＤＮＡの一端にバーコード配列及びＲｅａｄ  １シーケンシングプライミング配列（Ｒｅａｄ１ＳＰ）を含み、もう一端にはＮ５ＸＸ配列を含んでいた。このタグメンテーション産物をＰＣＲ増幅用ミックスに添加して計５０μＬのＰＣＲミックス（１×Ｋａｐａ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、０．５μＭ  Ｎ５ＸＸプライマー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）、０．５μＭ  Ｒｅａｄ  ２  Ｉｎｄｅｘ  Ａｄａｐｔｅｒプライマー（ＩＤＴ社））を作製し、７２℃で３分間加熱し、９８℃で３０秒、次いで、９８℃で１０秒、６３℃で３０秒、及び７２℃で３分を５サイクル繰り返すことで増幅を実行した。この産物を０．８×Ａｍａｚｉビーズを用いて精製し、２０μＬに溶出した後、Ｅ−Ｇｅｌ  ＳｉｚｅＳｅｌｅｃｔ  ２％  Ａｇａｒｏｓｅ  Ｇｅｌ（Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて３００〜５００ｂｐのバンドにサイズ選択した。次に、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ社）を用いて定量化して濃度調整した後、シーケンシングのためにＨｉＳｅｑ４０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）にロードした。
【０１０３】
約７００個の均質培養ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及び約７００個の均質培養Ｕ−２ＯＳ細胞を、細胞当たり１０６リードの平均シーケンシング深度でシーケンシングを行った。８０％のリードがエキソームにマップされ、このことは、このライブラリーがトランスクリプトームを正確に反映していることを示唆している。この深度では、１２，０００種の遺伝子が一貫して検出された。ＨＥＫ２９３Ｔの遺伝子発現相関行列を図４（Ａ）に示す。対角線上の四角ブロックはそれぞれ、強い相関が認められる遺伝子クラスターを示している。これらの観察結果は、非平衡定常状態の培養物におけるゆらぎによるものである。１２，０００種の遺伝子の中に、合計で１００〜２００程度のクラスターがある。ｔ確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）のアルゴリズムを用いたＨＥＫ２９３Ｔデータセットについて、図４（Ｂ）は遺伝子のクラスタリングを示しており（左）、図４（Ｃ）は細胞のクラスタリングを示している（右）。図４（Ｂ）の遺伝子クラスタリングプロットにおいて、各遺伝子クラスターは、前記相関行列内の四角に対応している。遺伝子クラスタリングプロットにおいて、各ドットは１２，０００種の遺伝子のうちの１つであり、各クラスターは前記相関行列内の四角に対応している。図４（Ｃ）の細胞クラスタリングプロットにおいて、各ドットは約７００個のＨＥＫ細胞のうちの１つであり、分解可能なクラスターは存在しない。これは、前記遺伝子クラスターが、表現型が異なる細胞のクラスターによるものではないことを意味している。ＨＥＫ２９３Ｔの１２，０００種の遺伝子のうちの３０００種について、遺伝子クラスターを比較したものを図５に示す（上段）。Ｕ−２  ＯＳの１２，０００種の遺伝子のうちの３０００種について、遺伝子クラスターを比較したものを図５に示す（下段）。これら２種の細胞株の間では、細胞周期やタンパク質合成に関与するものなど、いくつかの共通するクラスターが存在している。しかし、細胞種特異的な転写調節プロセスであり得る、異なる遺伝子クラスターも存在する。図６は、図５で標識されたタンパク質合成クラスターが強調されている。このクラスターの遺伝子は、ｔＲＮＡ合成、アミノ酸合成、アミノ酸輸送、及び翻訳開始の制御に関与する遺伝子に富んでおり、これらはすべて、タンパク質合成プロセスにおいて重要である。すなわち、相互に関連した遺伝子クラスターは、関連した生物学的機能及び転写調節を有する。
【０１０４】
実施例Ｖ
キット
本開示の逆転写法及び増幅法に必要とされる材料及び試薬はキット内に一緒にまとめてもよい。本開示のキットは、通常、本願の方法を実施するために必要な本明細書に記載の、逆転写酵素、逆転写プライマー、分解酵素、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、伸長プライマー、及び増幅プライマーを少なくとも含んでいてもよい。好ましい実施形態では、キットは、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、該ｃＤＮＡを増幅するための指示書も含んでいてもよい。好ましくは、キットは、いずれの場合も、個々の試薬、酵素、又は反応物のそれぞれについて、別個の容器を含んでいてもよい。好ましくは、通常、各試薬は各々の容器に好適に分注されていてもよい。キットの収容手段として、通常、少なくとも１つのバイアル又は試験管を含んでいてもよい。フラスコ、ビン、及び試薬を入れ分注するための他の収容手段もまた可能である。好ましくは、キットの個々の容器は、商業販売用にきつく密閉した状態で維持されてもよい。好適なより大型の容器として、射出成形又は吹出し成形されたプラスチック容器が含まれ、その中に、所望のバイアルが保定されてもよい。説明書がキットと共に提供されることが好ましい。
【０１０５】
実施形態
本開示において、逆転写酵素、及び前記ＲＮＡ鋳型鎖の５′ポリ（Ａ）配列に相補的な３′ポリ（Ｔ）配列を有する逆転写プライマー配列を用いて、前記ＲＮＡ鋳型鎖をｃＤＮＡ鋳型鎖に逆転写すること、ここで、前記逆転写プライマー配列は５′自己アニーリング配列、バーコードプライマーアニーリング部位、４〜１２ヌクレオチド長の第一の細胞特異的バーコード配列、及び１０〜３０ヌクレオチド長の第一の固有分子識別子バーコード配列をさらに含み、前記ｃＤＮＡ鋳型鎖はｃＤＮＡ鋳型鎖の５′側に前記逆転写プライマー配列を含み、前記ｃＤＮＡ鋳型鎖は前記ＲＮＡ鎖にハイブリダイズする、
過剰分の逆転写プライマー配列を酵素で消化すること、
前記ＲＮＡ鎖を分解して前記ｃＤＮＡ鋳型鎖を一本鎖として生成すること、
前記逆転写酵素を失活させること、
前記酵素を失活させること、
（ａ）ＤＮＡポリメラーゼ、及び自身の５′末端に前記自己アニーリング配列を含む伸長プライマーを用いて、前記逆転写プライマー配列を含む前記ｃＤＮＡ鋳型鎖に対する相補鎖を生成すること、ここで、前記相補鎖は５′末端に前記自己アニーリング配列を含み、３′末端に前記自己アニーリング配列の相補体を含む、
（ｂ）前記ｃＤＮＡ鋳型鎖を前記相補鎖から変性解離させ、前記相補鎖を３′末端の自己アニーリング配列と５′末端の前記自己アニーリング配列の相補体とのアニーリングによりループ状にして前記相補鎖の増幅を阻害すること、
（ａ）及び（ｂ）のステップを複数回繰り返して前記ｃＤＮＡ鋳型鎖から複数のループ状相補鎖を生成すること、
前記複数のループ状の相補鎖を変性させ、前記自己アニーリング配列を含む増幅プライマーを用いて前記変性された相補鎖を増幅して、前記逆転写プライマー配列を含む二本鎖アンプリコンを生成すること、
前記二本鎖アンプリコンを変性させ、（１）前記バーコードプライマーアニーリング部位に相補的である３′配列に有し、５′自己アニーリング配列、シーケンシングプライミング配列、及び４〜１２ヌクレオチド長の第二の細胞特異的バーコード配列をさらに含む、外側バーコードプライマー、並びに、（２）３′自己アニーリング配列を含むプライマーを用いて前記変性されたアンプリコンを繰り返し複数回増幅することで、第一の細胞特異的バーコード配列、第二の細胞特異的バーコード配列、及び第一の固有分子識別子バーコード配列を有する二本鎖アンプリコン生成物を結果として生成すること
を含む、ＲＮＡ鋳型鎖の増幅方法が提供される。
ある態様において、前記ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、又は低分子干渉ＲＮＡである。ある態様において、前記ＲＮＡは単一細胞由来である。ある態様において、前記ＲＮＡは不均一な細胞集団内の単一細胞由来である。ある態様において、前記ＲＮＡは単一出生前細胞由来である。ある態様において、前記ＲＮＡは単一がん細胞由来である。ある態様において、前記ＲＮＡは単一循環腫瘍細胞由来である。ある態様において、前記逆転写酵素は、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、Ｍａｘｉｍａ逆転写酵素、Ｐｒｏｔｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素、又はＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素である。ある態様において、前記３′ポリ（Ｔ）配列は１０〜３０個のＴヌクレオチドを含む。ある態様において、前記自己アニーリング配列はＧＡＴ５又はＧＡＴ１である。ある態様において、前記バーコードプライマーアニーリング部位は、ＲＴ３、Ｒｅａｄ１ＳＰ、又はＲｅａｄ２ＳＰである。ある態様において、前記酵素は鎖置換活性を有するポリメラーゼであるか、又は、前記酵素は５′→３′エキソヌクレアーゼ活性を有する。ある態様において、前記酵素は、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｐｙｒｏｐｈａｇｅ  ３１７３、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＴＯＰＯ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  （ｅｘｏ−）ポリメラーゼ、９°Ｎｍポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗ断片、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異型、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（完全長）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ  Ｔａｑポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５、Ｐｈｕｓｉｏｎ、又はＫａｐａ  ＨｉＦｉである。ある態様において、前記ＲＮＡ鎖は７５℃〜８５℃の温度で分解される。ある態様において、前記逆転写酵素及び前記酵素は７５℃〜８５℃の温度で失活される。ある態様において、前記伸長プライマーは０℃〜１０℃の温度で前記ｃＤＮＡ鋳型鎖にアニールする。ある態様において、前記相補鎖は１０℃〜６５℃の温度で生成される。ある態様において、前記相補鎖のループ化は５５℃〜６０℃の温度で生じる。ある態様において、（ａ）及び（ｂ）のステップは７〜１２回繰り返される。ある態様において、前記変性された相補鎖の増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。ある態様において、前記変性された相補鎖の増幅は１５〜２０サイクルのポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。ある態様において、前記変性されたアンプリコンの増幅はポリメラーゼ連鎖反応を用いて行われる。ある態様において、前記された変性アンプリコンは３〜７サイクルのＰＣＲを用いて繰り返し増幅される。ある態様において、前記二本鎖アンプリコン生成物はシークエンシングのために処理される。ある態様において、前記第一の固有分子識別子バーコード配列はセミランダムな配列パターンを含む。ある態様において、前記過剰分の転写プライマーを酵素で消化するステップは、セミランダムな配列パターンを含み、且つ、第一の固有分子識別子バーコード配列とは異なる、１０〜３０ヌクレオチド長の第二の固有分子識別子バーコード配列を有する逆転写プライマーを添加することを含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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