(57)【要約】  本発明は、胆道細胞からメチオニルtRNA合成酵素(MRS)を利用した胆道癌の診断方法に関するもので、より詳細には、メチオニルtRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物、診断用キット及び胆道癌の診断に必要な情報を提供するためにMRSを定性又は定量分析する方法に対するものである。  本発明によれば、MRSは、従来の病理検査の方法が異型細胞に分類した胆道細胞に対しても、胆道癌の有無の判定が可能で、胆道癌の診断マーカーとして迅速性と正確性の面で極めて優れた価値を有する。これにより、本発明は異型細胞から癌細胞と正常細胞を区別する方法を提供し、従来多くの癌マーカーが、実質的に細胞水準(つまり、細胞診)で診断の実効性を得難かったこととは対照的に、本発明によれば細胞水準からも感度、特異度及び正確度が殆ど100％で癌の確定が可能である。
2020521985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、胆道癌診断用組成物。
【請求項２】
前記メチオニルtRNA合成酵素タンパク質は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記製剤は、メチオニルtRNA合成酵素タンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーであることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
メチオニルtRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、胆道癌診断用キット。
【請求項５】
胆道癌診断に必要な情報を提供するために、潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法。
【請求項６】
前記方法は、
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階
を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記試料は、胆道細胞であることを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記方法は、前記（a)段階以前に、前記（a)段階と同時に、又は前記（a)段階以後に、下記段階を追加的に含むことを特徴とする、請求項６記載の方法：
(i）潜在患者から採取した胆道細胞を、
細胞核を染色するDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、メチレンブルー（methylene blue）、酢酸カーミン（acetocarmine）、トルイジンブルー（toluidine blue）、ヘマトキシリン（hematoxylin)及びヘキスト（Hoechst)からなる群から選択される１以上の染色溶液と、
細胞質を染色するエオシン（eosin)、クリスタルバイオレット（crystal violet）及びオレンジG（orange G）からなる群から選択される１以上の染色溶液とで細胞染色する段階；及び
（ii）前記細胞染色により、胆道細胞を、悪性腫瘍細胞、異型細胞(atypical cell)、又は正常細胞に判別する段階。
【請求項９】
前記胆道細胞は、ブラシ細胞診の方法で採取されることを特徴とする、請求項７又は８記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質の発現水準を測定する方法は、ウエスタンブロット、ELISA、放射線免疫分析、放射線免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫染色法、免疫沈降分析法、補体固定分析法、FACS又はタンパク質チップ方法のうちいずれか一つを利用することを特徴とする、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体は、MRSの配列番号20で示されるアミノ酸配列を含む領域のエピトープ（epitope)に特異的に結合することを特徴とする抗体又はその機能的断片であることを特徴とする、請求項３記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体は、配列番号14で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(VL)；及び
配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(VH)を含むことを特徴とする、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記（ii）段階は、前記（i)段階の細胞染色の結果から、細胞が３次元で塗抹される；細胞核／細胞質比率(N/C ratio)が高い；染色質の凝集現象出現；粗い形状の核膜；核小体の出現；及び類似分裂の出現からなる群から選択される２以上の形態学的異常を示す場合に悪性細胞に判定し、
細胞が一重で塗抹されて、細胞核／細胞質比率が小さく、核膜が滑らかな形状の場合には、正常細胞に判定し、
細胞の変化が悪性細胞には及ばないが、正常細胞に判定することができない場合、異型細胞（aypical cell）に判定することを特徴とする、請求項８記載の方法。
【請求項１４】
胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、感度及び特異度を向上させる方法：
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。
【請求項１５】
前記感度及び特異度が、90％以上であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞診検査は、ブラシ細胞診検査であることを特徴とする、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、形態学的検査と併用して、
（a)潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階
を含むことを特徴とする、補助療法を追加して遂行することを特徴とする、胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項１８】
前記補助療法は、形態学的検査と同時に(simultaneous)、別途に(separate）、又は順次的に(seqeuntial）遂行されることを特徴とする、請求項１７記載の胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項１９】
前記形態学的検査は、細胞の群集性；細胞核／細胞質比率(N/C ratio)；核膜の形状；染色質の凝集現象；核内核小体の出現；及び類似分裂の出現からなる群から選択される１以上を検査することを特徴とする、請求項１７又は１８記載の胆道癌診断に必要な情報を提供する方法。
【請求項２０】
前記製剤は、メチオニルtRNA合成酵素mRNAに特異的に結合するプライマー又はプローブであることを特徴とする、請求項１記載の組成物。
【請求項２１】
胆道癌の診断用製剤を製造するための、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤の使用。
【請求項２２】
被検体試料内のメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定することを特徴とする胆道癌の診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胆道細胞においてメチオニル-ｔRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)を利用した胆道癌の診断方法に関するもので、より詳細には、メチオニル-ｔRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物、診断用キット及び胆道癌の診断に必要な情報を提供するためにMRSを定性又は定量分析する方法に対することである。
【背景技術】
【０００２】
本出願は、2017年5月12日に出願された大韓民国特許出願第10-2017-0059318号に基づく優先権を主張し、前記明細書全体は参照により本出願に援用する。
【０００３】
胆道癌は国内で10万人当たり6.3人の発生率で、全体癌腫の9位を占め、死亡率は6位で予後が良くない。胆道癌の確診を受けるまでの通常的な診療過程は、以下の通りである。一般的に、患者が黄疸、腹部不快感、体重減少などの症状で病院に来院すると、１次的には、映像検査である腹部超音波（abdominal ultrasound、US）、内視鏡超音波（endoscopic ultrasound、EUS)、腹部コンピュータ断層撮影（computed tomography、CT）や腹部磁気共鳴画像診断（magnetic resonance imaging、MRI)を通じて、胆道癌の存在の有無を疑うことになるが、実質的に前記映像検査を通じては、腫瘤を形成した胆道癌に対してのみ診断の実効性があり、非腫瘤形成胆道癌(胆道浸潤型、胆道内成長型)においては、映像検査だけでは診断が難しい。結局、胆道癌の確定的な診断のためには、病理検査が必要である。つまり胆道癌が発生する形態は、腫瘤形成型、非腫瘤形成型に区分されるが、腹部超音波や腹部コンピュータ断層撮影でアクセスが可能な腫瘤がある場合には、これらの映像検査を利用して、組織検査が可能である。しかし、このような映像的に見える腫瘤が存在しなかったり、アクセスが困難な場合、つまり、胆道浸潤型や胆道内成長型の場合には、内視鏡的逆行性膵胆道造影術や経皮脛管胆道排液術を利用して、胆道内にアクセスして組織検査や細胞診検査を行う。
【０００４】
病理検査（pathological examination）とは、摘出した細胞、組織、又は臓器を利用して、主に形態学的立場から、疾病根源の解明を試みる検査を意味し、肉眼的所見の把握、光学、電子顕微鏡検索などの方法で疾病の診断に応用される重要な検査である。このような病理検査には、組織病理検査と細胞病理検査がある。胆道癌に対する組織検査方法では、腹部超音波誘導のもとで、組織検査、腹部コンピュータ断層撮影し、組織検査、内視鏡的逆行性膵胆道造影術（Endoscopic retrograde cholangiogram、ERCP）や経皮経管胆道排液術（Percutaneous transhepatic biliary drainage)を通じた組織検査があり、細胞検査には、内視鏡的逆行性膵胆道造影術や経皮脛管胆道倍液術を通じたブラシ細胞診検査（brushing cytology)及び胆汁内細胞診検査がある。
【０００５】
一方、組織検査と細胞診（cytodiagnosis)検査は、多くの差を有し、よく知られている癌マーカーを利用した分析実験において、組織検査と細胞診検査の間には、診断感度及び特異度で多く差を示すことが分かった。従って、従来知られた胆道癌マーカーであっても、具体的な検体（組織又は細胞）によって、実質的に診断実効性を得られるかは別の問題と考えられる。
【０００６】
組織検査は、目的部位を内視鏡で観察したり、又は癌への形質転換が疑われる組織から1g乃至109cells程度の一定の細胞組織を採取した後、染色などのような生化学的方法を通じて癌の診断を行う。これらの組織検査は、周辺の構造や細胞との比較を通じて、特定の領域に癌があるものと確診することが、比較的容易なことが知られている。或る研究者は、胆道癌の診断感度を高めるために、組織生検のための標本を数個採取することが良いかに対する研究結果を報告した（非特許文献１)。3つ以上の標本を採取する場合、偽陰性が0％に減少して、4つ以上採取した生検標本で陽性（positive）で表れた場合、100％陽性(positive)に確診することができると報告した。従って、悪性胆道疾患診断のためには、少なくとも3つ以上の組織標本を得る必要がある。しかし、生検標本の個数が多くなるほど、患者が受ける身体的負担は増加する。
【０００７】
未だに胆道の他の良性（benign）疾患と胆道癌の細胞又は組織を鑑別する時には、ヘマトキシリン・エオジン染色（Hematoxylin and eosin stain、HE stain）、パパニコロウ染色（Papanicolaou stain、Pap stain）などに依存してしており、これらの方法は、診断感度が40〜60％と低い状態で報告されている。さらに、細胞又は組織を体外に摘出して染色などの技法を通じて胆道癌を確定する病理検査の方法が、非侵襲的に行われる磁気共鳴画像診断の方法よりも感度が低いのに大きな問題がある。Xuらは悪性胆道狭窄が疑われる患者からの各診断方法の感度と特異度と関連して報告したが（非特許文献２)、前記文献によると、非侵襲的な磁気共鳴画像診断の場合、感度は80％、又は特異度が70-85％と低く、確診のためには組織検査及び細胞診検査が必要である。内視鏡的逆行性膵胆道造影術（ERCP）を利用したブラシ細胞診検査（brushing cytology)を単独で実施する場合、感度が23-56％で低く、ERCPを利用した組織検査（biliary biopsy）を単独で実施する場合、胆道癌(cholagiocarcinoma、CCA)では44-89％と感度が多様に報告されているのが実情である。前記ブラシ細胞診と組織検査を同時に実施する場合、感度が70％まで上昇するが、依然として非侵襲的なMRCP方法に比べて感度が低い状況である。
【０００８】
胆道癌を含めて胆道に発生する多くの疾患は、胆道狭窄を伴う場合が多いが、このような胆道狭窄が発見された患者から、その領域が悪性（胆道癌）であるか、又は、他の良性（benign）胆道疾患があるのかの鑑別診断が難しいのが実情である。胆道狭窄に対する正確な診断は、治療方向の決定に最も重要な部分であり、不要な手術や治療を避けて、患者に最も適切な治療法を提示することができる。狭い胆道内腔及び繊維化は胆道疾患の診断を困難にする主な要素の中の一つであって、過去では主に内視鏡的逆行胆膵管造影術又は経皮経管胆道排液術などを実施する途中に胆汁を吸引して、細胞の検査を実施した。このような方法で得られた細胞検体は、細胞充実度が低く、殆どの細胞が変性又は自家溶解され、診断用の細胞を得るのが困難であった(非特許文献３)。従って、最近では、内視鏡で逆行胆膵管造影術を施行しながら、狭窄を確認し、病変が疑われる部位から直接ブラシで細胞検体を得る胆道ブラシ細胞診検査が普遍化されている。細胞診（cytodiagnosis)は、主に細胞を光学又は位相差顕微鏡で検査して疾病を診断する方法を意味するもので、細胞診の場合、周辺の構造や細胞との比較が難しく、診断を確定するのに限界があるのが実情である。さらに、これらの細胞水準の検査では、単純に細胞数が多くなることから、診断効率が高くならない。具体的には、Jo YGらによると、細胞塊染色（cell-block techniques)と一般的なブラシ細胞診検査の結果を比較した。具体的には、ブラシ細胞診検査で得られた一般的な細胞を直接塗沫した標本（direct smear）と、細胞診を集めて細胞塊にした標本とについて診断効率を比較したが、結果的に二つの方法で感度と特異度に差がないと報告している（非特許文献４）。また、Bang KBらは、ブラシを利用した細胞診検査とバスケット（Basket）を利用して、細胞診を採取した比較研究で感度と特異度で差がなかったと報告した（非特許文献５）
【０００９】
体内で分離された細胞を病理学的に検査する場合において、障害となるものの中に異型細胞（atypical cell)に対する判断の難しさも一役買っているのが実情である。1976年に、Melamedらが、炎症性変化ではないながら、異型性に診断するには不十分な細胞の変化を扁平細胞異型性と発表した後、異型細胞の診断、解析及び治療方針決定に多くの議論があった。従って、これの改善のために、ベセスダ分類（The bethesda system、TBS）が制定され、TBSでは異型細胞（atypical cell)と言う用語の使用を、炎症性、全癌性又は腫瘍性細胞の変化に診断することができず、本質を知ることができない場合（undetermined significance)にのみ、極めて制限して使用している。異型細胞に対する治療的方針と関連して、他の見解もあり得るので問題とされている。特に、実際に癌が進行している状態にもかかわらず、組織又は細胞水準の検査で異型細胞又は組織にのみ結果が判定される場合が相当あることに問題がある。不定形の組織構造や細胞形態が、炎症性病変なのか、新生物なのかの区別が明確でない場合、異型（atypism）又は細胞異型（cellular atypia）と診断する場合が多い。従って、他の検査手段等により、何度も繰り返し再検査の必要性が伴い、これに伴う時間的、経済的費用が大幅に消費されているのが実情である。
【００１０】
これにより、細胞検査において多様なタンパク質マーカーが癌細胞を区別するために使用されてきたが、実質的に著しい効用性を収めることができなかった。一例として、p53の場合、1999年にブラシ細胞診で得られた細胞診からp53を利用した免疫蛍光染色法が試みられた。感度が43％と低く（非特許文献６）、その後、他の研究で、従来のH＆E染色法に比べて感度が低いと報告された（非特許文献７）。また、胆道癌細胞の28.9％からp53が発現されないという限界があることが分かった。また、他の一例として、ミニ染色体維持複製タンパク質（Minichromosome maintenance (MCM) replication proteins（Mcm2-7））が悪性膵胆道癌から発現できない点を利用して、免疫蛍光染色法を通じて胆道癌検出をしようとする試みがあったが、感度は66％で、低い水準にとどまった。（非特許文献８)。このように、従来知られた胆道癌分子マーカーは、細胞診検査水準から正確度及び信頼度が未だに低い水準なため、実質的な効用性を示すことができない限界があるのが実情であった。
【００１１】
このように、多くの研究と努力にもかかわらず、胆道癌の診断と関連して、細胞水準の検査だけでも、高い感度と特異度で悪性と良性(benign、胆道癌ではないその他の胆道疾患)を正確に区別及び判定できる、効果的なマーカー及び病理学的診断法がない状態である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Kawashima H, Itoh A, Ohno E, Goto H, Hirooka Y., Transpapillary biliary forceps biops y to distinguish benign biliary stricture from malignancy：how many tissue samples should be obtained?, Dig Endosc 2012; 24 Suppl 1: 22-27
【非特許文献２】Xu MM, Sethi A., Diagnosing Biliary Malignancy, Gastrointest Endosc Clin N Am 2015; 25: 677-90
【非特許文献３】ジンソヨンら、膵胆管疾患における胆管ブラシの細胞検査の有用性、The Korean Journal of Cytopathology: 2006, 17(1), 38-45
【非特許文献４】Jo YG et al., Diagnostic accuracy of brush cytology with direct smear and cell-block techniques according to preparation order and tumor characteristics in biliary strictures., Korean J Gastroenterol 2014; 63: 223-30
【非特許文献５】Bang KB, Kim HJ, Park JH et al., Comparison of brush and basket cytology in diffe rential diagnosis of bile duct stricture at endoscopic retrograde cholangiopancreatography., Hepatobiliary Pancreat Dis Int 2014; 13：622-7.
【非特許文献６】Tascilar M, Sturm PD, Ca spers E et al., Diagnostic p53 immunostaining of endobiliary brush cytology: preoperative cytology compared with the surgical specimen. Cancer 1999; 87: 306-11
【非特許文献７】Stewart CJ& Burke GM, Value of p53 immunostaining in pancreatico-biliary brush cytology specimens., Diagn Cytopathol 2000; 23: 308-13
【非特許文献８】Ayaru L, Stoeber K, Webster GJ et al. Diagnosis of pancreaticobiliary malignancy by detection of minichromosome maintenance protein 5 in bile aspirates. Br J Cancer 2008; 98: 1548-54
【発明の概要】
【００１３】
［発明の詳細な説明］
［技術課題］
これに本発明者らは、細胞水準でも正確に胆道癌を診断できる方法を研究する中で、組織検査だけでなく、細胞診(cytodiagnosis)においてMRSをマーカーとして利用する場合に、胆道癌の確定判定において感度及び予測度がほとんど100％の水準に表われるだけでなく、特に異型細胞(atypical cell)についても癌細胞と正確に区別することを確認して、本発明を完成した。
【００１４】
従って、本発明の目的は、メチオニルtRNA合成酵素（methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物及びこれを含む胆道癌診断用キットを提供することである。
【００１５】
本発明の他の目的は、胆道癌の診断に必要な情報を提供するために、潜在的な患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、感度及び特異度を向上させる方法を提供することである：
（a)潜在患者から採取した胆道試料から(methionyl-tRNA synthetase)tRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する段階;及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加したら胆道癌患者であると判断する段階。
【００１７】
本発明のさらに他の目的は、胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、形態学的検査と併用して
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、(methionyl-tRNA synthetase)tRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して実行することを特徴とする、胆道癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供することである。
【００１８】
［技術解決方法］
前記のような目的を達成するために、本発明は、
メチオニルtRNA合成酵素(methoionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物及びこれを含む胆道癌診断用キットを提供する。
【００１９】
本発明の他の目的を達成するために、本発明は、
胆道癌の診断に必要な情報を提供するために、潜在的な患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、感度及び特異度を向上させる方法を提供する：
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。
【００２１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は、胆道癌の細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、形態学的検査と併用して
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素が発現増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して実行することを特徴とする、胆道癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００２２】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２３】
本発明は、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む、胆道癌診断用組成物又は胆道癌診断用キットを提供する。
【００２４】
また、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤からなる、胆道癌診断用組成物又は胆道癌診断用キットを提供する。
【００２５】
また、本質的に、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤からなる、胆道癌診断用組成物又は胆道癌診断用キットを提供する。
【００２６】
また、本発明は、胆道癌の診断用製剤を製造するためのメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定する製剤の使用を提供する。
【００２７】
本発明者らは、MRSが、胆道癌細胞又は組織で特異的にその発現量が増加(過発現)することを最初に確認した。特に、悪性(胆道癌)と良性(benign、癌に対して正常)を判断しにくい胆道狭窄の患者にについて、細胞水準でのMRS発現増加を測定することだけでも、悪性状態を特異的に区分し、特に従来の細胞診病理検査の方法で異型細胞として確診を下し難い細胞に対しても、感度及び特異度が殆ど100％近く向上され、確診可能なものであることを見出して、胆道癌の診断マーカーとしてMRSの価値が極めて高いことを確認した。MRSの胆道癌の診断用途は、本発明者らによって初めて明らかになったものであり、また、異型細胞に対する胆道癌診断の使用又は異型細胞の癌細胞と正常細胞の区分の使用は、本明細書で最初に公開されるものである。
【００２８】
本発明で用語“胆道”とは、胆汁が十二指腸に排出されるすべての経路を意味するもので、“胆管”とも表現される。
【００２９】
本発明の用語“胆道癌”とは、胆道に発生した悪性(malignant)腫瘍、又は癌を含めて、増殖速度が速く、周囲の組織に浸透及び他の器官への転移する特徴を有する悪性(malignant)新生物を意味する。前記悪性腫瘍又は癌は、成長速度が遅く、転移されない特性を有する良性腫瘍(benign tumor)と区別される。
【００３０】
本発明で診断の目的とする胆道癌は、胆道(胆管)に悪性新生物が発生した状態であれば、これが胆道での原発癌であっても、転移による胆道に癌が発生したものであっても、その発生原因が特に制限されない。好ましくは胆道での原発癌を対象にするものでもある。
【００３１】
本発明で用語“正常”とは、悪性腫瘍又は癌でない状態(Negative for malignancy、悪性腫瘍細胞陰性)を意味するものであって、何らの疾患がない完全正常状態と“benign”に該当する(最終)疾患状態の判定に対する良性状態とを含む意味である。本明細書で前記用語“benign”に該当する良性状態は、“positive”で示される該当検査結果での陽性表示と区分されるもので、前記“positive”で示される陽性は、該当検査法で反応があるものに表示又は該当検査法で、癌の可能性を意味する結果が出ることを意味する。
【００３２】
本発明で、“MRS”とは、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)を意味するものであって、前記MRSは、アミノ酸メチオニンとtRNAのアミノアシルレーション（aminoacylation）反応を媒介する酵素である。本発明のMRSタンパク質は、当業界に公知されたヒト又は哺乳類のMRSアミノ酸配列を含むものであれば、その配列が特に制限されない。一例として、ヒトではMARSの遺伝子に符号化されていて、MRSの配列情報はNM_004990（mRNA）、NP_004981.2、P56192.2（タンパク質）などのGenbank accession numberで公知されている。好ましくは本発明のMRSは、配列番号1で示されるヒトのMRSタンパク質のアミノ酸配列を含むものでもある。前記MRSは、細胞質型（cytoplasmic form、cytoplasmic methionyl-tRNA synthetase)とミトコンドリア型（mitochondrial form、mitochondrial methionyl-tRNA ynthetase)の二種類のイソ型(isoform)がある。本発明でのMRSは、好ましくは、細胞質型（cytoplasmic form）でもある。
【００３３】
本発明での用語“発現（expression）”とは、細胞からタンパク質又は核酸が生成されることを意味する。
【００３４】
本発明で用語“タンパク質”とは、“ポリペプチド（polypeptide)”又は“ペプチド（peptide)”と互換性をもって使用され、例えば、天然状態のタンパク質から一般的に発見されるように、アミノ酸残基のポリマーを意味する。
【００３５】
本発明の用語“診断”とは、特定の疾病又は疾患に対する一つの個体の感受性（susceptibility）を判定すること、一つの個体が特定の疾病又は疾患を現在有しているか否かを判定すること、特定の疾病又は疾患に罹病した一つの個体の予後（prognosis)(例えば、前転移性又は転移性癌状態の同定、癌の段階決定又は治療に対する癌の反応性決定)を判定すること、又はテラメトリックス（therametrics）(例えば、治療効能に関する情報を提供するためにオブジェクトの状態をモニタリングすること)を全て含む概念である。本発明での診断は、MRSタンパク質の発現の有無、又は発現水準を測定して胆道癌の存在又は発症の有無を確認するものである。
【００３６】
前記MRSタンパク質の発現水準を測定する製剤は、当業界でタンパク質の発現水準測定に使用可能なものとして知られているものであれば、その種類は特に限定されないが、好ましくはMRSタンパク質に特異的に結合する抗体又はアプタマーでもある。
【００３７】
本発明で用語“抗体（antibody）”とは、抗原性部位に特異的に結合する免疫グロブリン(immunogobulin)を意味する。さらに具体的には、ジスルフィド結合によって互いに連結された少なくとも2つの重鎖（H)及び2つの軽鎖（L)を含む糖タンパク質を意味する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(以下、HCVR又はVHで略記)及び重鎖不変領域からなる。重鎖不変領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(以下、LCVR又はVLで略記)及び軽鎖不変領域からなる。軽鎖不変領域は、一つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれる、さらに保存された領域が散在している超可変性領域(相補性決定領域(CDR)と言われる)に、さらに細分することができる。VH及びVLのそれぞれは、下記順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端に配列された3つのCDR及び4つのFRで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の不変領域は、免疫系の多様な細胞(例、エフェクター細胞)及び伝統的な相補システムの最初の成分（C1q)を含めて、宿主組織又は因子に対する免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００３８】
本発明での抗体は、MRS以外には、他の種類のアミノアシルtRNA合成酵素を含む他のタンパク質には反応せず、MRSタンパク質のみに特異的に結合する抗体である。本発明では、MRSタンパク質に特異的に結合する抗体は、好ましくは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質(MRS)に特異的に結合する抗体でもある。MRS抗体は、MRS遺伝子を発現ベクターにクローニングして、前記遺伝子によって符号化されるタンパク質を得て、得られたタンパク質を動物に注入して生成される抗体を得るなどの当該技術分野の通常的な方法により製造することができる。前記MRS抗体は、MRS全長配列タンパク質を通じて製作されるものでもあって、又はMRS抗原性部位を含むMRSタンパク質の断片を利用して、MRSタンパク質の特異的な抗体を製造することもできる。本発明の抗体の具体的な配列とその形態は特に制限されず、ポリクローナル抗体(polyclonal antibody)又はモノクローナル抗体(monoclonal antibody)を含む。また、前記抗体は、提供される免疫グロブリンとしての種類が特に制限されず、一例にIgG、IgA、IgM、IgE、及びIgDからなる群から選ばれるものでもあって、好ましくはIgG抗体でもある。さらに、本発明の抗体には、MRSタンパク質に特異的に結合することができるものであれば、ヒト化抗体、キメラ抗体などの特殊抗体と、組換え抗体も含まれる。また、抗原-抗体結合性(反応)を有するものであれば、全体抗体の一部も、本発明の抗体に含まれ、MRSに特異的に結合する全ての種類の免疫グロブリン抗体が含まれる。例えば2つの全長の軽鎖及び2つの全長の重鎖を有する完全な形態の抗体だけでなく、抗体分子の機能的な断片、つまり、抗原結合機能を有するFab、F(ab）2、Fab'、F(ab'）2、Fv、ディアボディ（diabody)、scFvなどの形態でもある。
【００３９】
Fab（fragment antigen-binding）は、抗体の抗原結合断片で、重鎖と軽鎖それぞれの一つの可変ドメインと不変ドメインで構成されている。F(ab')2は、抗体をペプシンで加水分解させて生成される断片で、二つのFabが重鎖ヒンジ(hinge)で二硫化結合（disulfide bond）で連結された形態をしている。F(ab')は、F(ab')2断片の二硫化結合を還元して分離させた、Fabに重鎖のヒンジが付加された形態の単量体抗体断片である。Fv(variable fragment)は、重鎖と軽鎖それぞれの可変領域だけで構成された抗体断片である。scFv(single chain variable fragment)は、重鎖可変領域（VH）と軽鎖可変領域（VL）が柔軟なペプチドリンカーで連結されている組換え抗体断片である。ディアボディ(diabody)は、scFvのVHとVLが極めて短いリンカーで連結されて互いに結合できずに、同じ形態の他のscFvのVLとVHとそれぞれ結合して二量体を形成している形態の断片を意味し、本発明の目的上抗体の断片は、ヒトから由来したMRSタンパク質に対する結合特異性を維持しているのであれば構造や形態の制限を受けない。
【００４０】
本願発明で、前記の抗体(その機能的断片を含む)は、MRSタンパク質に特異的に結合することができるのであれば、前記抗体がMRSと相互作用(つまり、結合)する部位などは特に制限されないが、好ましくはMRSにおいて配列番号20で示されるアミノ酸配列を含む領域のエピトープ(epitope)に特異的に結合することを特徴とする抗体又はその機能的断片でもある。さらに好ましくは、配列番号1で示されるMRS(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の851番目乃至880番目のアミノ酸領域を含むエピトープ(epitope)に特異的に結合することを特徴とする抗体又はその機能断片が望ましい。
【００４１】
本発明の一実施例において、本発明者らは、胆道癌細胞に対するMRSの高感度の検出のため、MRSにおいて配列番号20で示されるアミノ酸配列の領域をエピトープとする抗体を得て、これらの抗体が、MRSに対する高感度の検出能を提供可能であることを確認した。
【００４２】
前記配列番号20で示されるアミノ酸配列を含む領域のエピトープ(epitope)に特異的に結合する抗体は、目的とする特異的結合能を有するかぎり、その具体的な配列が特に制限されないが、好ましくは、
配列番号2で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位1(CDR1)と；配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位2(CDR2)と；配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定部位3(CDR3)とを含む軽鎖可変領域、及び
配列番号8示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位1(CDR1)と；配列番号10で示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位2(CDR2)と；配列番号12で示されるアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定部位3(CDR3)とを含む軽鎖可変領域を含むものでもある。
【００４３】
前記CDR構成を有する好ましい一例として、本発明の抗体(その機能的断片を含む)は、軽鎖可変領域が配列番号14で示されるアミノ酸配列を含むことができ、重鎖可変領域は配列番号16で示されるアミノ酸配列を含むことができる。
【００４４】
最も好ましい一例として、本願発明は、配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖で構成される抗体を提供する。
【００４５】
本発明の前記抗体(その機能的断片を含む)は、その“検出”のために、一般的に検出可能な部分(moiety)で標識することができる。例えば、文献[Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, NY, Pubs]に記述された技術を用いて、放射性同位元素又は蛍光標識で標識することができる。あるいは、様々な酵素基質標識が利用可能であり、前記酵素標識の例は、ショウジョウバエルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）等のルシフェラーゼ、ルシフェリン（luciferin)、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ（urase)、ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRPO）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゼナーゼ)、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼなどを含む。抗体に酵素を接合させる技術は、例えば、文献[O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone& H. Van Vunakis, eds.), Academic press, NY, 73: 147-166]に記述されている。標識は、様々な公知の技術を利用して、抗体に直接又は間接的に接合することができる。例えば、抗体は、ビオチン(biotin)に接合することができ、前記記載の3種の広範囲なカテゴリーに属する任意の標識がアビジンと、又はその逆に接合することができる。ビオチンはアビジン(avidin)に選択的に結合し、従って、この標識はこのような間接的な方法で抗体に接合することができる。あるいは、抗体への標識の間接的接合を達成するために、抗体は小さなハプテン(hapten)(例えば、デオキシン[digoxin])と接合することができ、前記記載の相異する類型の標識の一つが抗ハプテン抗体に接合することができる(例えば、抗デオキシン抗体)。こうして、抗体に対する標識の間接的接合が達成できる。
【００４６】
本発明で用語“アプタマー”は、試料内の検出したい分析物質と特異的に結合することができる物質で、それ自体で安定した三次構造を有する単一鎖核酸(DNA、RNA又は変形核酸)を意味するもので、特異的に試料内の標的タンパク質の存在を確認することができる。アプタマーの製造は、一般的なアプタマーの製造方法により、確認したい標的タンパク質に対する選択的で高い結合力を有するオリゴヌクレオチドの配列を決定して合成した後、オリゴヌクレオチドの5'末端又は3'末端を、アプタマーチップの官能基に結合することができるように、-SH、-COOH、-OH、又は-NH2に変形させることにより、なされ得るがこれに制限されない。
【００４７】
本発明の胆道癌診断用キットには、MRSの発現水準を測定するために、選択的にMRSタンパク質をマーカーとして認識する抗体又はアプタマーだけでなく、分析方法に適した一種類又はそれ以上の他の構成成分組成物、溶液又は装置が含まれる。具体的な態様として、前記キットは、ウエスタンブロット、ELISA、放射免疫分析、放射線免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫染色法、免疫沈降分析法、補体固定分析法、FACS又はタンパク質チップ法を行うために必要な公知の必須的要素及び付随要素を含むことを特徴とする診断キットでもあるが、これに制限されない。
【００４８】
一例として、前記キットは、MRSマーカータンパク質に対する特異的な抗体を含む。抗体は、MRSマーカータンパク質に対する特異性及び親和性が高く、他のタンパク質に対する交差反応性が殆どない抗体で、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体又は組換え抗体である。また、前記キットは、対照群タンパク質に特異的な抗体を含むことができる。キットに提供される抗体は、それ自体で検出可能な部分で標識することができる。これは前述した通りである。その他、前記キットは、結合された抗体を検出することができる別の試薬、例えば、標識された二次抗体、発色団(chromophores)、酵素(抗体とコンジュゲートされた形として)及びその基質又は抗体と結合するすることができる他の物質などを含むことができる。また、本発明のキットは、余剰の発色基質及び結合されていないタンパク質などは削除して、抗体と結合されたタンパク質マーカーだけを保有することができる洗浄液又は溶離液を含む。
【００４９】
前記MRSタンパク質の発現水準を測定する製剤は、さらに、MRS mRNAを検出する製剤を含む意味でもある。タンパク質発現水準の増加は、前記タンパク質を符号化する遺伝子からの転写物（例えばmRNA）の増加が伴うので、当業者であれば、前述したようにMRSタンパク質自体を検出する手段だけでなく、間接的にMRSタンパク質発現と直接的に関係のある転写物を検出する手段を使用可能であることが明らかに理解可能である。
【００５０】
前記MRS mRNAを検出する製剤は、MRS mRNAに特異的に付着又は混成化（hybridization)するリガンドであれば、その種類は特に限定されないが、例えばプライマー(対)又はプローブでもある。
【００５１】
前記“プライマー”とは、短い自由3末端水酸化基（free 3'-hydroxyl group）を有する核酸配列で相補的なテンプレート（template）と塩基対を形成することができ、テンプレート鎖複写のための開始点として作用する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝液及び温度において、重合反応のための試薬(すなわち、DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素)及び異なる4種類のヌクレオシドトリホスフェートの存在下でDNA合成を開始することができる。PCR条件、センス及びアンチセンスプライマーの長さは、当業界に公知された技術に基づいて適切に選択することができる。
【００５２】
プライマーの配列は、鋳型の一部の塩基配列と完全に相補的な配列を有する必要はなく、鋳型と混成化されてプライマー固有の作用をすることができる範囲内での十分な相補性を有すれは十分である。従って、本発明でMRS mRNAの発現水準を測定するためのプライマーは、MRSコーティング遺伝子配列に完全に相補的な配列を有する必要はなく、DNA合成を通じてMRS mRNA又はMRS cDNAの特定の区間を増幅して、MRS mRNAの量を測定しようとする目的に合う長さと相補性を有するものであれば十分である。前記増幅反応のためのプライマーは、増幅しようとするMRS mRNAの特定区間の両側の端部の鋳型(あるいはセンス、sense)と反対側(アンチセンス、antisense)にそれぞれ相補的に結合する一対で構成される。プライマーは、当業者であれば、MRS mRNA又はcDNAの塩基配列を参照して容易にデザインすることができる。
【００５３】
“プローブ（probe)”とは、特定遺伝子のmRNAやcDNA(complementary DNA)に特異的に結合することができる短くは数個乃至長くは数百個の塩基(base pair)の長さのRNA又はDNAなど、ポリヌクレオチドの断片を意味し、標識(labeling)されていて、結合する対象mRNAやcDNAの存在の有無、発現量などを確認することができる。本発明の目的のためには、MRS mRNAに相補的なプローブと被検体の試料との混成化反応(hybridization)を遂行して、MRS mRNAの発現量を測定することにより、アルツハイマー病の診断に利用することができる。プローブの選択及び混成化条件は、当業界に公知された技術に基づいて適切に選択することができる。
【００５４】
本発明のプライマー又はプローブは、ホスホアミダイト（phosphoramidite)固体支持体合成法やその他の広く公知された方法を利用して化学的に合成することができる。さらに、プライマー又はプローブは、MRS mRNAとの混成化を妨害しない範囲で、当該技術分野で公知の方法に従って、多様に変形することができる。これらの変形の例としては、メチル化、カプセル化、天然ヌクレオチド一つ以上の同族体への置換及びヌクレオチドの間の変形、例えば荷電されていない連結体（例えば、メチルホスホネート、ホスフォートトリエステル、ホスホロアミドデート、カルバメートなど）又は荷電された連結体（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、並びに、蛍光又は酵素を利用した標識物質(labeling material)の結合などがある。
【００５５】
本発明の診断用キットには、MRSの発現水準を測定するためにMRS mRNAをマーカーに認識するプライマー又はプローブだけでなく、分析方法に適した一種類又はそれ以上の他の構成成分組成物、溶液又は装置が含まれる。前記キットは、当業界にプライマー(プライマー対)又はプローブを構成品に提供する分析キットとして知られたものであれば、その種類が特に限定はされないが、例えばPCR(polymerase chain reaction、重合酵素反応)、RNase保護分析法、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング又はDNAマイクロアレイチップ用キットなどを含む。
【００５６】
一例として、前記診断キットは、重合酵素反応を行うために必要な必須要素を含むことを特徴とする診断用キットでもある。重合酵素反応キットは、マーカー遺伝子(mRNA)に対して特異的なそれぞれのプライマー対を含む。プライマーは、各マーカー遺伝子(mRNA)の核酸配列に特異的な配列を有するヌクレオチドとして、約7bp乃至50bpの長さ、より好ましくは約10bp乃至30bpの長さである。また、対照群の遺伝子の核酸配列に特異的なプライマーを含むことができる。その他に、重合酵素反応キットは、テストチューブ又は他の適切なコンテナー、反応緩衝液(pH及びマグネシウム濃度は多様)、デオキシヌクレオチド(dNTPs)、DNAポリメラーゼ(例えば、Taq-ポリメラーゼ)及び逆転写酵素、DNAse、RNAse抑制剤、DEPC水（DEPC-water）、滅菌水等を含むことができる。
【００５７】
本発明の用語“〜を含む（comprising）”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同じく使用され、組成物又は方法において、記載されていない追加的な成分要素又は方法の段階などを排除していない。用語“〜からなる（consisting of)”とは“〜からなるで構成される”と同じく使用され、別に記載されていない追加的な要素、段階又は成分などを除外することを意味する。用語“本質的に〜からなる（essentially consisting of)”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分要素又は段階と共にその基本的な特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階などを含むことを意味する。
【００５８】
本発明は、被検体試料内のメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)タンパク質の発現水準を測定することを特徴とする、胆道癌の診断方法を提供する。
【００５９】
本発明の前記被検体とは、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、より好ましくは、診断が必要なヒト又は患者(patient)でもある。被検体に対しては、以下でさらに詳しく後述される。
【００６０】
具体的に、本発明は、胆道癌の診断に必要な情報を提供するために、潜在的な患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA成酵素タンパク質を定性又は定量分析する方法を提供する。
【００６１】
具体的に前記の方法は、
（a)潜在患者から採取した胆道試料からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むものでもある。
【００６２】
本発明で用語“分析”とは、好ましくは“測定”を意味するものでもあり、本発明で分析又は測定は、定性的な方法と定量的な方法を全て含めて制限なく行うことができる。タンパク質水準の測定において、定性的方法と定量的方法の種類は、当業界によく知られていて、本明細書で前述した実験法がこれに含まれる。各方法別に具体的なタンパク質水準の比較方法は、当業界でよく知られている。
【００６３】
本発明者らは、MRSが胆道癌の診断マーカーとして機能することができることを最初に発見しており、特にMRSは、細胞診(cytodiagnosis)用マーカーとして優れた胆道癌の診断効果を有する。ここで本発明は、MRSの発現水準を測定して胆道癌の診断に必要な情報を提供する方法を提供する。以下、本発明の方法を段階別に説明する。
【００６４】
前記（a)段階は、潜在的な患者から採取した胆道試料を提供し、前記試料からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階である。
【００６５】
前記試料は、胆道癌の存在の有無を診断しようとする個体(患者)、又は被検体から採取したものであれば特に制限されないが、例えば胆道組織又は胆道細胞でもある。具体的には、胆道から生検（biopsy）により収得した胆道組織や細胞、細針吸引、ブラシ細胞診又は胆汁吸引法などで得られた胆道細胞でもある。最も好ましくは、ブラシ細胞診の方法で得られた胆道細胞でもある。
【００６６】
好ましい一実施態様(mode)として、前記胆道細胞試料には、胆道から由来したことが明らかな上皮細胞が存在しなければならない。
【００６７】
前記収得した胆道細胞又は組織は、当業界に公知された通常の試料前処理(例えば、固定され、遠心分離、スライドに塗抹など)方式に基づいて前処理して提供することができる。好ましい一実施様態として、前記胆道細胞試料は、通常の液状単層細胞スライドの製作法(液状細胞検査用スライド作製法)によって前処理されて準備されるものでもあって、一例として、ThinPrep、SurePath、CellPrepなどを使用して、液状化単層付着方法によって実験用スライド(slide)上に提供されるものでもある。
【００６８】
本発明で用語“ブラシ細胞診(brush cytology)の方法で採取”とは、通常の細胞診ブラシ(cytology brush)を用いて胆道表面(特に、患部の疑いがある部位)をこすって細胞を採取する方法を意味するものであって、ブラシ細胞診、嘴子細胞診など、当業界で通常的に互換可能に使用される名称で、本明細書で記載することができる。
【００６９】
本発明での用語“潜在患者”とは、胆道癌に疑われる患者を意味するものであって、臨床症状、血液検査又は映像検査など、多様な検査を通じて胆道癌があると疑われる患者を意味する。
【００７０】
つまり、前記の潜在患者は、映像検査から胆道癌判定可能な患者及び判定不可能患者を含めて、映像検査から胆道癌判定が不可能であるとしても、臨床症状、血液検査で胆道癌が疑われる環者を意味する。胆道癌患者から表れる臨床症状では、腹部の痛症、黄疸、体重減少などがあるが、このような症状は、胆道癌のみに限られた特異症状ではない。また、血液検査上、黄疸や糖尿検査数値、CEA、CA19-9と同じ腫瘍標識者が上昇することがあるが、これらの全てが胆道癌が疑われる患者から表れるわけではない。映像検査は、腹部超音波、腹部内視鏡超音波、腹部CT、腹部MRI、PET-CTを施行することができて、このような映像検査は、胆道癌が腫瘤形成型で存在している時には、比較的癌の疑いが容易であるが、胆道浸潤型及び胆道内成長型で存在しているとき及び胆道狭窄などが同伴される場合は、映像的方法だけでは胆道癌の診断が非常に難しい。前記映像検査だけで胆道癌を確診することができない。胆道癌の最終的な確診は、病理検査に進行され、手術が可能な患者では、手術後に得られた組織を通じて確診されて、手術が不可能な患者では、組織検査や細胞診検査を通じて確診するようになる。
【００７１】
好ましくは、胆道癌で一般的に観察される症状の腹部痛症、黄疸、体重減少、などの一般的な症状があり、CT、超音波、MRIなどのような映像診断装置を通じて胆道癌に確診することができない患者を意味するものである。さらに好ましくは、前記潜在患者は、広い部位の侵襲的組織検査が不可能な患者で、細胞検査(細胞診)に依存的に胆道癌を明確に診断する必要がある患者でもある。つまり、手術を行うことができないので、胆道組織検査が不可能であるか、又は合併症など様々な原因により胆道生検さえも不可能なため、細胞学的分析によって胆道癌を明確に診断する必要がある患者でもあるが、これに限定されるものではない。
【００７２】
前記MRSタンパク質の発現水準を測定するのは、発現するかどうかを測定すること(つまり、発現の有無を測定すること)又は前記タンパク質の質的、量的変化水準を測定することを意味する。
【００７３】
本発明では、MRSタンパク質の“発現増加”の意味は、発現されなかったものが発現されたもの(つまり、検出されなかったことが検出されたもの)又は正常的な水準よりも相対的に過剰発現されたこと(つまり、検出量が多くなること)を意味する。
【００７４】
これに限定されないが、一例として、前記MRSタンパク質発現水準は、MRSタンパク質に特異的に結合する抗体を利用して検出したり、測定することができる。本発明でMRSタンパク質に特異的に結合する抗体に対しては、前述した通りである。MRSタンパク質発現水準を測定する方法は、当業界で公知されている方法であれば特に制限されないが、例えばウエスタンブロット、ELISA(酵素免疫測定法)、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、免疫染色法(免疫組織化学染色、免疫細胞化学染色及び免疫蛍光染色などを含む)、免疫沈降分析法、補体固定分析法、FACS又はタンパク質チップの方法のうちいずれか一つを利用するものでもある。他にも、前記測定方法は、本明細書の発明で提供するMRS発現水準の測定製剤及びこれを含むキットについて、前述したことに準じてその測定方法が理解される。
【００７５】
従来報告された胆道癌の診断マーカーの場合、細胞診検査の適用において、組織検査と異なり、細胞水準の診断では、感度及び特異度が落ちて、実効性を得難いのが実情である。さらに胆道狭窄がある患者では、従来の細胞診検査の結果は、胆道癌が発症したか、又はその他の良性(benign)胆道疾患があるのかに関する判断の難しさを経験している。つまり、従来の細胞診検査の場合には、胆道癌であるか又は正常細胞(胆道癌ではなく、良性（benign）疾患細胞を含む)であるか否かが不明確な異型細胞(atypical cell)として病理所見を出す場合が多く、このような場合、追加的に多数の反復的な再検査を必要とする。
【００７６】
これに対して、本発明によるMRSの場合には、細胞診検査に適用しても、感度及び特異度が100％の水準に現れ、検診の精度が極めて顕著に、細胞診検査のみで胆道癌の確診が可能と思慮され、これらの点は、特に胆道狭窄がある患者では、胆道癌と正常細胞を区別するにおいても大きなメリットを提供する。胆道狭窄が発見された患者に行われる従来の細胞診検査では、たまたま細胞が異型に判定されて診断不明の状態にされることがあったが、本発明によるMRSの場合には、胆道細胞水準で腫瘍の有無の明確な判断が可能になるため、より正確に胆道癌を診断することができる。癌を診断するために、一般的に使用されるH＆E染色、pap染色を通じては、腫瘍又は胆道炎などのようなその他の良性(benign)疾患であるか否かの区別が極めて難しい、異型細胞(atypical)からの悪性腫瘍の有無の判定が臨床的に極めて重要であるが、このような異型細胞でMRSの(高)発現が確認されると、悪性腫瘍細胞に判定できる点で極めて意味があると言える。また、生検を必要とする組織検査の場合、細胞診検査よりも試料取得における患者に身体的負担が加重されることを考慮したとき、細胞水準で正確な診断を提供する本願発明は、より大きな長所を有するものと言える。
【００７７】
これに本発明は、前記（a)段階の前に、同時に又は後に、従来使用されてきた形態学的診断方法の病理検査を行うことができる。つまり、前記（a)段階の前に、同時に又は後に、前記（i)及び（ii）の段階をさらに行うことができる：
（i)潜在患者から採取した胆道細胞を、細胞核を染色するDAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)、メチレンブルー(methylene blue)、酢酸カーミン(acetocarmine)、トルイジンブルー（toluidine blue）、ヘマトキシリン（hematoxylin)及びヘキスト(Hoechst)からなる群から選択される１以上の染色溶液と、
細胞質を染色するエオシン(eosin)、クリスタルバイオレット（crystal violet）及びオレンジG(orange G)からなる群から選択される１以上の染色溶液とで細胞を染色する段階；及び
（ii）前記細胞染色により、胆道細胞を、悪性腫瘍細胞、異型細胞(atypical cell)、又は正常細胞に判別する段階をさらに含むことを特徴とする方法。
【００７８】
前記（ii）段階で判明される悪性腫瘍細胞は、これに限定されないが、具体的には、前記形態学的診断方法の病理検査で 悪性腫瘍細胞の疑い（Suspicious of malignancy）及び 悪性腫瘍細胞陽性（positive for malignancy）と判定されることを全て含む意味でもある。
【００７９】
本発明で、用語“形態学的診断方法の病理検査”又は“形態学的検査”とは、正常細胞が癌に変化するときの非正常的な形態学的変化を検査することを意味する。非正常的な形態学的変化に関する具体的な検査項目又は基準は、当業界で癌細胞が有する形態学的変化の種類であれば、その具体的な内容が特に制限はされないが、好ましくは細胞群集性；細胞核／細胞質比（N/C ratio)；核膜の形状(核膜状の不規則性)；染色質の凝集現象；核内核小体の出現；及び類似分裂の出現からなる群から選択される１以上を検査するものでもある。前記形態学的検査は、前述した（a)及び（b)の段階を含む、胆道の診断に必要な情報を提供する方法と、同時(simultaneous)に、別途(separate)又は順次的(sequential)に行うことができる。
【００８０】
ここで、前記（ii）段階で、前記（i)段階の細胞染色の結果から、胆道細胞を悪性腫瘍細胞、異型細胞又は正常細胞に判別することは、正常細胞が癌に変化するときの非正常的な形態学的変化に基づいて判別されたものでもあって、その具体的な判別基準は、当業界でよく知られている。ここで、異型細胞とは、形態学的変化では、悪性腫瘍細胞(癌細胞)又は正常細胞への明確な判定が不可能な細胞を意味する。
【００８１】
本発明の好ましい一実施態様では、前記（ii）段階で、前記（i)段階の細胞染色の結果から、胆道細胞を悪性腫瘍細胞、異型細胞又は正常細胞に判別することは、好ましくも、下記の同じ基準により行われるものでもある：
細胞が３次元で塗抹される；細胞核／細胞質比率(N/c ratio、Nuclear to cytoplasmic ratio)が高い；染色質の凝集現象出現；粗い形状の核膜(核膜の不規則な程度が大きくなる)；核小体の出現；及び類似分裂の出現からなる群から選択される２以上の形態学的異常を示す場合に悪性細胞と判定し、
細胞が一重で塗抹されて、細胞核／細胞質比(N/C ratio)が小さく、核膜が滑らかな形状の場合には、正常細胞に判定して、
細胞の変化が悪性細胞には及ばないが、正常細胞(benign 含む)に判定することができない場合、異型細胞(atypical cell)に判定。
【００８２】
前記（i)及び（ii）段階を（a)段階の前に、同時に又は以後に並行して実行すると、細胞水準の検査(つまり、細胞診検査)だけでも極めて高い正確度の診断結果を得られることが特徴である。一例として、（a)段階の以前に、前記段階を実行する場合において、細胞染色を通じて腫瘍細胞又は正常細胞に判断された胆道細胞の場合には、後続的に実行される（a)段階でMRSの発現水準(有無)をさらに再分析することで、より確実に胆道癌の有無を判断することができて、診断エラーを完全に減らすことができ、前記細胞染色を通じて異型細胞に判断された場合には、後続的に遂行される（a)段階でMRS発現水準(有無)を分析することにより、腫瘍の有無を明確に判断が可能である。このように、細胞水準の検査で精度の高い確定診断が可能なことは、従来の異型細胞に検診結果が出たとき、組織生検を再度実行して再診断を余儀なくされる手間と、生検組織試料から正確な胆道癌確定のために３つ以上の組織標本が必要で、患者に身体的負担を引き起こすなど、従来の病理組織検査の問題点を画期的に改善したもので、極めて優れた診断効果を有するものと言える。
【００８３】
（b)段階は、前記（a)段階で測定した胆道試料からMRS水準が増加している場合は、その胆道試料を採取した患者を胆道癌患者に判定する段階である。
【００８４】
前記（b)段階で胆道癌診断の基準にされるMRS発現水準の増加の程度に対しては、当業者が使用される測定方法に基づいて、発現の有無で、あるいは発現程度の等級を分けて、決定することができる。例えば、多数の正常人と患者の試料からMRSの発現水準を測定して、データを蓄積して分析することにより、MRSの発現水準の程度に応じて、正常範疇、胆道癌発症範疇などで区分して、適切な診断の基準を提供することもできる。
【００８５】
前記（b)段階は、対照群(陰性対照群)と比較的に遂行されるものであって、前記対照群とは、検査対象(つまり、同じ潜在患者)個体からの正常胆道試料又は他の通常個体(胆道癌のない個体)からの胆道試料を全て含む意味である。また、本願発明で提供するMRS発現水準の測定製剤及びこれを含むキットに明示されるか、或いは付随的に提供される対照群でもある。これらの対照群に比べて検査対象の試料からMRS発現水準が高いと、胆道癌患者であると判断することができる。
【００８６】
また、本願発明は、（a)及び（b)の段階を含めて、異型細胞を癌細胞と正常細胞とに区別する方法を提供すると言える。
【００８７】
本発明で用語“感度”とは、最終臨床病理学的診断が胆道癌の試料又は患者に対して、対象検査法(ex.本願発明は検査)を通じて胆道癌の診断が下された比率を意味する。
【００８８】
本発明で用語“特異度”とは、最終臨床病理学的診断が正常の試料又は患者について、対象検査法(ex.本願発明は検査)を通じて、正常診断が下された比率を意味する。
【００８９】
胆道癌診断において、MRSをマーカーとして使用してその増加を検出する方式を採用する場合、組織及び細胞水準の検査において、診断の感度及び特異度がほぼ100％水準を示すことが特徴である。
【００９０】
具体的には、前記感度及び特異度は、90％以上の水準(90％ないし100％、好ましくは90％ないし99％、さらに好ましくは90ないし98％水準)を示すのが特徴である。
【００９１】
好ましくは、前記感度及び特異度は、95％以上の水準(95％ないし100％、好ましくは95％ないし99％、さらに好ましくは95ないし98％水準)を示すのが特徴である。
【００９２】
ここで本発明はさらに、
胆道癌に対する細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、下記段階を含むことを特徴とする、感度及び特異度を向上させる方法を提供する：
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階。
【００９３】
前記感度及び特異度の向上が正確度の向上につながるものであることは、当業者では明らかなことである。従って、本発明の方法は、精度を向上させる方法として理解されることができ、好ましくは精度が90％乃至100％、さらに好ましくは精度が90％乃至99％、さらに好ましくは93％乃至98％、最も好ましくは95％乃至98％水準を示すものでもある。
【００９４】
また、本発明は、胆道癌の細胞診(cytodiagnosis)検査又は組織検査において、形態学的検査と併用して、
（a)潜在患者から採取した胆道試料において、メチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase)タンパク質の発現水準を測定する段階；及び
（b)前記（a)段階でメチオニルtRNA合成酵素の発現が増加した場合、胆道癌患者であると判断する段階を含むことを特徴とする補助療法を、追加して遂行することを特徴とする、胆道癌診断に必要な情報を提供する方法を提供する。
【００９５】
前記形態学的検査とは、望ましい一例として、前述した（i)及び（ii）段階過程を含めて実行される検査を含む、これらの方法に準じて他の形態学的検査方法も全て含む意味である。これに対する説明は、前述したことを参照して、当業者であればその方法を適宜選択して使用可能である。
【００９６】
前記（a)及び（b)段階に対する、具体的な説明は前述した通りで、これらの段階が補助的に(つまり、補助療法として)遂行される場合、前記の形態学的検査と同時に(simultaneous)、別途に(separate)又は順次的に(sequential)実行される。また、前記（a)及び（b)段階を含む補助療法は、形態学的検査の前に、同時に又は後で遂行可能である。
【発明の効果】
【００９７】
MRSは、正常細胞及び他の良性胆道疾患と区別して、胆道癌のときにのみ過発現され、従来の細胞診、病理検査の方法で異型細胞(atypical cell)として確診し難い細胞に対しても、MRSを利用すれば、感度、特異度及び正確度が殆ど100％で胆道癌を確診可能なものと現れ、胆道癌の診断マーカーとしてMRSの価値が極めて高い。これにより、本発明は、異型細胞から癌細胞と正常細胞を区別する方法を提供し、従来多くの癌マーカーが実質的に細胞水準で診断の実効性を得難いこととは対照的に、本発明によれば、細胞水準(つまり、細胞診)でも感度、特異度、正確度が殆ど100％で癌の確診が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、si-MRSを処理したH460細胞の細胞溶出液を使用して、8A12抗体のMRS結合強度を、公知の市販MRS抗体と比較したウエスタンブロットの結果である。
【図２】図２は、8A12抗体の、他のARS(aminoacyl-tRNA synthetase)及びAIMPタンパク質に対する交差活性を確認するためにELISAを実施した結果をグラフで示したものである。
【図３】図３は、MRS+AIMP3タンパク質に対する8A12抗体の抗体親和力を確認するために行われたSPR(Surface plasmon resonance)実験結果を示したものである。
【図４】図４は、8A12抗体がAIMP3に対しては反応性がないことを確認したSPR実験結果を示したものである。
【図５】図５は、胆道癌に対する複数の診断事例において、従来の細胞学的検査方法としてpap染色（staining）後、形態学的観察結果と、本願発明のMRS免疫染色検査法を適用した結果とを、比較的に示したもので、x400倍率顕微鏡イメージである（以下のすべての実験群で、本発明のMRS染色実行前に、その試料がどのような判定を受けたのかは未知の状態で実行された）。  Ａ：従来の染色法(pap staining)を通じて、胆道癌細胞で病理所見を受け、最終的な臨床病理診断として胆道癌と診断された患者の胆道細胞に対して、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが強く染色(検出)されたことを確認した結果を示す。  Ｂ：従来の染色法(pap staining)を通じて、胆道癌が疑われる細胞で病理所見を受け、最終的な臨床病理診断として胆道癌と診断された患者の胆道細胞に対して、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが強く染色(検出)されたことを確認した結果を示す。  Ｃ：従来の染色法(pap staining)を通じて、異型細胞から病理所見を受け、最終的な臨床病理診断として胆道癌と診断された患者の胆道細胞に対して、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが強く染色(検出)されたことを確認した結果を示す。  Ｄ：従来の染色法(pap staining)を通じて、異型細胞から病理所見を受け、最終的な臨床病理診断として、正常(胆道癌ではなく、良性（benign）胆道狭窄)と診断された患者の胆道細胞に対して、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが染色(検出)されないことを確認した結果を示す。  Ｅ：従来のの染色法(pap staining)を通じて、正常胆道細胞に所見を受け、最終的な臨床病理診断として正常と診断された患者の胆道細胞に対して、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが染色(検出)されていないことを確認した結果を示す。
【図６】図６は、従来の染色法であるH＆E染色（stain）を通じて、正常胆道組織と判定された組織を対象に、本発明のMRS染色法を行った結果、MRSが染色(検出)されないことを確認した結果を示す(A：H＆E染色（stain）結果(x100)、B：本発明のMRS染色結果(x100)）。
【図７】図７は、従来の染色法であるH＆E染色（stain）を通じて、胆道癌組織と判定された組織を対象に、本発明のMRS染色法を行った結果、強く染色されたことを確認した結果を示す(A：本発明のMRS染色(検出)を行った組織全体の標本、B：Aにおける赤四角マーク領域に対応するH＆E染色（stain）結果(x100)、C：Aにおける赤四角マーク領域の拡大(x100))。
【図８】図８は、胆道癌と正常胆道組織が共存する組織から、本発明のMRS染色法の癌組織区分効果を比較的に示したものであって、従来の染色法であるH＆E染色（stain）を通じて、胆道癌組織と判定された領域でのみ特異的に、本発明のMRS染色法(x100)によって強い染色結果を示す一方で、正常胆道では染色(検出)がされていないことを確認した(A：本発明のMRS染色を行った組織全体の標本、B：Aにおける赤四角マーク領域に対応するH＆E染色(stain)結果(x100)、C：Aにおける赤四角マーク領域の拡大(x100)、黒矢印：胆道癌組織、白矢印：正常胆道組織)。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００９９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０１００】
ただし、下記実施例は、本発明を例示するのみで、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【０１０１】
＜実施例１＞
本願発明の胆道癌検査に対する有用抗体作製(MRSの特異性が高い抗体の収得)
生体内でのMRS(methionyl-tRNA synthetase)は、AIMP3（Aminoacyl tRNA synthetase complex-interacting multifunctional protein3）と結合された状態で存在し、UV照射などによって、これらの結合状態が分離されることが分かった。従って、実質的にMRSの正確な検出のためには、MRSがAIMP3と結合している状態などの状況でも、MRSだけを特異的に検出する必要があるが、現在、AIMP類及びARS類には、タンパク質構造上類似した点が多く、市販の抗体の場合、他のAIMP類及びARS類と交差反応性が表われる問題点がある。これに、本発明の胆道癌検査法の診断正確度のために、本発明者は、他のタンパク質には交差反応性がない高感度のMRS抗体を、以下のような方法で製造した。
【０１０２】
＜１−１＞MRS-AIMP3タンパク質の製造
大腸菌(E.coli)からMRS-AIMP3共精製（co-purified）タンパク質を発現及び精製し、具体的な実験方法は以下の通りである。BL21DE3株（strain）を利用して、MRS(配列番号1)とAIMP3(配列番号21、NCBI ref. NM_004280.4)とが発現するように形質転換し、LB培地で培養した後、単一コロニーをアンピシリン（ampicilin)を含む5ml LB液体培地でOD600の値が0.6乃至0.8になるように培養した。その後、1mMのIPTGを入れた後、37℃で3時間培養し、その後10分間遠心分離して細胞だけを獲得した。細胞液でSDS-PAGEを実施して、クマシー溶液（coomassie stain)を利用して、前記タンパク質の発現を確認した。その後、IPTGで過発現を誘導した細胞液を集めて遠心分離を実施して、細胞を獲得した。1ml DPBSで細胞を溶解した後、超音波破砕機を利用して細胞を溶解し、その後溶解された細胞で遠心分離を行い、MRS-AIMP3共精製タンパク質を分離した。
【０１０３】
＜１−２＞MRS-AIMP3タンパク質の注入を通じたマウス免疫化
ハイブリドーマ細胞の製造に必要な免疫化されたマウスを得るために、前記実施例１−１で得られたMRS-AIMP3共精製タンパク質を、8〜10週齢のマウス4匹の腹腔内に1次注射した。体重25乃至30gの10週齢BALB／cマウスをOrient Bio Co. (Sungnam、KyungKiDo、Republic of Korea)から購入し、動物舎の一定した条件(温度：20±2℃、湿度：40〜60％、コントラスト：12時間明暗周期)の下で十分に適応させた後で本研究に利用した。動物実験は、ソウル大学の大学動物管理及び使用委員会の指針を遵守した。
【０１０４】
１次免疫化後、マウスの免疫性を高めるために、2週間後に同じ容量のMRS-AIMP3共精製タンパク質を、マウスの腹腔内に2次注射した。その１週間後、細胞融合実験を実施する3日間前に、MRS-AIMP3共精製タンパク質をマウスの尻尾静脈にブースター（booster)注射した。前記免疫化されたマウスをエーテルで麻酔した後、ヘパリン処理された注射器で心臓から採血した後、血液を4℃で一夜静置させ、遠心分離して血清を分離した。分離された血清を適切に分注し、-80℃で保管した。
【０１０５】
＜１−３＞ハイブリドーマ細胞(hybridoma cell)の製造
まず、細胞融合のために骨髄腫細胞を準備した。骨髄腫細胞を培養して、細胞密度を2.5〜5×104 cell／mlにした。細胞融合の24時間前に、骨髄腫細胞を3分の1に希釈して準備した。前記実施例1-2で免疫化されたマウスをエーテルで麻酔させて、脾臓を採取してB細胞を分離した後、SF-DMEM2(DMEM+2×AA)で洗浄して細胞を溶出させた。細胞懸濁液を回収してチューブに詰めて静置させ、重い塊を沈めて、上澄み液を新しいチューブに移した後、1500rpmで5分間遠心分離した。遠心分離された脾臓細胞の上澄み液を除去し、タッピング（tapping)した後、SF-DMEM2を満たした。B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ遠心分離して洗浄した後、洗浄工程を1回繰り返した。洗浄した骨髄腫細胞の上澄み液を除去してタッピングした後、SF-DMEM2を満たした。また、洗浄したB細胞の上澄み液を除去してタッピングした後、LB(lysis buffer)1 mlに赤血球(RBC、red blood cell)を入れて処理した後、SF-DMEM2を満たした。その後、B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれ遠心分離して、遠心分離されたB細胞と骨髄腫細胞の上澄み液を除去した後、タッピングしてSF-DMEM2 10mlを満たした。B細胞と骨髄腫細胞をそれぞれe-チューブで100倍に希釈して、計数して濃度を決定した。B細胞と骨髄腫細胞は、10：1の比率に決定した[B細胞の濃度(1×108、8×107、5×107)、骨髄腫細胞の濃度(1×107、8×106、5×106)]。決定された濃度のB細胞と骨髄腫細胞とをチューブに一緒に入れて遠心分離した。遠心分離された細胞の上澄み液を除去した後、アルコール綿の上に伏せておいて、30秒〜1分間半乾燥させてタッピングした。ここでPEG(2ml)を1分間徐々に入れながらピペッティングして反応させ、SF-DMEM2を入れながらチューブを振った後、遠心分離した。遠心分離後、上澄み液を除去してタッピングしていない状態で、HT培地[HT50×(HT(sigma) 1 vial+SF-DMEM1 10ml) 1ml、FBS 10ml、SF-DMEM1(DMEM +1×AA)30ml]を滴下して、少しずつ速度を上げながら50mlになるようにした。この懸濁液を再び37℃、5％CO2培養器で3時間培養した。
【０１０６】
＜１−４＞MRS特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選別
前記実施例1-3で製造した融合細胞群の中で、MRSをよく認識しながら、AIMP3を認識しない細胞を選別して、抗体を生成するか否かを確認するために、次のように実験を実施した。
【０１０７】
まず、細胞融合後8〜9日目に培地を交換し、96ウェルで培養した場合、及び24ウェルで培養した場合で、よく育つまでcDMEM2で培養した。培地を交換した後5〜7日目に色が変わったウェルの上澄み液を採り、cDMEM2で満たした後、各融合細胞で生産された抗体と、MRS及びAIMP3との結合性に対するELISA試験を行った。ELISA試験後、ウェルを選択して、24ウェルに移して培養した。24ウェルで培養した後、再びELISA試験を行った。具体的には、24ウェルの融合細胞濃度を確認して、96ウェルプレートに0.5 cell/wellになるように、15mlの培養液に融合細胞を希釈した。融合細胞希釈液を各ウェル当り150μlずつ分注した。顕微鏡で検鏡して、1つの細胞が含まれているウェルをチェックした。細胞がある程度育ったウェルの上澄み液を収得し、ELISA及びウエスタンブロットで、各融合細胞から生産された抗体とMRS及びAIMP3との結合性を確認して、1次スクリーニングを行った。1次スクリーニングを基に選択された融合細胞を、24ウェルに移して培養し、遠心分離した後、上澄み液を収得してELISA及びウエスタンブロットで確認して、2次スクリーニングを行った。24ウェルで育てた融合細胞の吸光度をELISAで確認し、吸光度が1.0を超える融合細胞のみを選択して、25T/C培養フラスコに移して培養し、遠心分離した後、上澄み液を収得してELISA及びウエスタンブロットで確認して、3次スクリーニングを行った。3次スクリーニングを基に選択された融合細胞を再び75T/C培養フラスコに移して培養してELISAで吸光度を確認して、MRSをよく認識する一方でAIMP3を認識しない細胞を選択して、最終的に“8A12”クローンを確保した。
【０１０８】
＜１−５＞MRS特異的モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞の培養及び抗体精製
MRSに対するモノクローナル抗体は、前記の実施例1-4で選択された最終的な融合細胞(ハイブリドーマ細胞“8A12”)から、それぞれ次の二つの方法を通じて得ることができる。
【０１０９】
１）7〜8週齢の雌マウスの腹腔(abdominal cavity)にプリスタン(pristane)500μlを注射した。75T/C培養フラスコで培養した融合細胞を回収して遠心分離した後、上澄み液を除去して、リン酸緩衝液に入れてピペッティングした。プリスタン投与7〜10日後、前記実施例1-4で選択した融合細胞を、それぞれ8×105〜4×107でマウスの腹腔内に注射した。1〜2週後にマウスの腹腔内に腹水(ascites)がいっぱい溜まったとき18G注射針を用いて、腹水を4℃で一夜静置し、翌日遠心分離して黄色の脂肪層を含む塊物質を除去し、上澄み液だけを分離した。分離した上澄み液は分注して-20℃で保管した。
【０１１０】
前記腹水液から抗体精製のために、貯蔵液(20%エタノール)に貯蔵されているProtein Aを適量カラムに詰め、20％エタノールを流した後、5ベッドボリューム（Bed Volume）の結合緩衝液(20mM sodium phosphate、pH 7.0)で洗浄した。腹水液をリン酸緩衝液で適量希釈した後、Protein Aカラムにローディングした。3ベッドボリュームの結合緩衝液(20mM sodium phosphate、pH 7.0)で結合した後、3ベッドボリュームの溶出緩衝液(0.1M glycine buffer、pH 3.0~2.5)で0.5mlずつ分画を溶出した。各分画を35μlの中和緩衝液(1M Tris-HCl、pH 9.0)で中和させた。70％エタノールで冷蔵温度で一夜静置した後、再び貯蔵液(20% エタノール)で次回使用時まで冷蔵保管した。SDS-PAGEを通じて分画の純度を確認して、Ammersharm GE カラムで脱塩(desalting)した。
【０１１１】
２）前記実施例1-4で得られたハイブリドーマ細胞を、Cellstack-5(Corning、Corning、NY)を使用して、最大培養嵩860mLで培養を行った。無血清培地(Thermo)にGlutaMAX(Gibco)(最終5mM)と1xCholeserol lipid concentrate(Gibco)を添加し、初期細胞濃度は、1.4〜2.0×105 cell/mLで接種した。接種4〜5日後、2000rpmで10分間遠心分離して細胞を除去し、培養液上澄み液を回収した。上澄み液のpHを確認した後、製造された20X結合溶液(1M Potassium phosphate dibasic)(pH 9.0)を使用してpH7.6を合わせた。その後、0.22umフィルターで濾過して中和された抗体培養液を収得した。
【０１１２】
収得した抗体培養液を、protein Aカラムを使用して精製した。protein Aカラムに10カラム嵩の蒸留水を流した後、同量の1X結合溶液(50mM Potassium phosphate dibasic)(pH9.0)を流した。その後、収得した抗体培養液を流して、抗体をprotein Aに結合させた後、1X結合溶液(50mM Potassium phosphate dibasic)(pH9.0)で洗浄（washing）した。その後、protein Aに結合された抗体を溶出するために、2カラム嵩の溶出溶液(0.2M Citric acid)(pH3.0)を流して溶出液を得た。1M Trisで中和した後、抗体の濃度を280nmの吸光度で測定して確認した。
【０１１３】
その後、GE PD-10カラムを生理食塩水25mlで平衡させた後、遠心分離(1000g、2分)した。その後、protein Aカラムから得られた抗体溶出液2.5mlを、前記GE PD-10カラムに入れて遠心分離(1000g、2分)して、生理食塩水で溶液交換がなされた抗体を取り除いた。抗体濃度を280nmの吸光度で測定して確認後、分注して-80℃に保管した。
【０１１４】
＜１−６＞抗体の配列情報分析及びクローニング
8A12クローン発現抗体のクローニング及び配列分析は、YBIO inc、及びアブクローン(Abclon Inc. Korea)に依頼して行った。簡単に、まず8A12ハイブリドーマ細胞からRNAを抽出してcDNAを合成した。その後、それぞれVL、CL、VH及びCH1に特異的なプライマーを使用してPCRを行った。予想される大きさのPCR産物（product）をアガロースゲル(agarose gel）で精製してシーケンシング（sequencing）を通じて配列を確認し、Kabatナンバリング（numbering）を通じてCDR領域（region）を確認した。抗原結合部位の配列確認の結果を表1に示す。確認された配列でFabを合成して、MRSに高い結合力を示すことをELISAで確認した。
【０１１５】
また、前記で確認された配列は、前記実施例1-5でハイブリドーマ細胞をマウスの腹腔内に注入した後、腹水精製を通じて得られた抗体のタンパク質配列分析結果とも一致することを確認した。
【０１１６】
得られた8A12 Fab配列をmouse IgG heavy chain(pFUSE-mIgG2a-Fc、InvivoGen)及びmouse light chain序列ベクター（pFUSE2-CLIg-mK、InvivoGen）にクローニングした。その後、前記ベクターをfreestyle 293F細胞にPEI(Polysciences、23966-2)を利用して、共同形質転換させ、抗体の軽鎖と重鎖が細胞内で一緒に同時に発現するようにした。形質転換された293F細胞を37℃、8％CO2の条件で7日間培養した。その後、細胞を収得して遠心分離した後、上澄み液を得た。上澄み液のpHを確認した後、製造された20X結合溶液(1M Potassium phosphate dibasic)(pH9.0)を使用して上澄み液のpHを7.6に調整した。以降0.22μmのフィルターで上澄み液を濾過して中和された抗体の培養液を得た。抗体培養液から前記実施例1-5の2)に記述された方法で抗体を得た。このように得られた8A12 IgGの全抗体は、配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖でなることを確認した。
【０１１７】
【表１】
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【０１１８】
＜１−７＞ MRSに対する抗体の結合特異性の比較確認ウエスタンブロット実験
前記実施例で獲得した8A12抗体のMRS結合能力を確認するために、次のように実験を行った。H460細胞を、10％FBS(Fetal bovine serum、Hyclone、GE lifesciences)、1％ペニシリン(Hyclone、GE lifesciences)を含むDMEM(Hyclone、GE lifesciences)培地で培養した。各細胞は、5％CO2、37℃の条件で培養した。前記培養されたH460細胞にsi-MRSを72時間処理した。その後H460細胞を収得した後、溶解させ、H460細胞溶解度でウエスタンブロットを実施した。実験は2回繰り返えされた。1次抗体として8A12抗体を1：5000(0.2μg/ml)で希釈して使用し、結合能力比較のために市販の流通しているMRS抗体(Abcam、Ab50793)を同じ方法で使用し、対照群にはチューピュリン（Tublin）を使用した。
【０１１９】
実験結果図1に示した通り、市販の流通している従来のMRS抗体はsi-MRSを処理した群ではMRSを全く検出できず、si-MRSを非処理した群でも、本願発明の8A12抗体と比較して著しく低い水準の検出能を示した。一方、本願発明の8A12抗体は、従来の市販MRS抗体よりも顕著にMRS特異的結合能が優れたことを確認した。
【０１２０】
＜１−８＞他のタンパク質に対する交差反応性可否の確認-ELISA
前記実施例で獲得した8A12抗体が他のARS(aminoacyl-tRNA synthetase)タンパク質に対する交差活性(cross activity)があるか否かを確認するために、次のように実験を実施した。
【０１２１】
96ウェルプレート(Corning 3690 flat bottom、96-well half-area plates)にMRSタンパク質(His-MRS、MRS full)と他のARSタンパク質(DX2 tag free、34S-DX2、34S-AIMP2、His-CRS、His-AIMP1、His-GRS、His-WRS、His-KRS)をそれぞれ1μg/mlの濃度でコーティングした。8A12抗体を500ng/mlの濃度でそれぞれのARSタンパク質がコーティングされた96ウェルプレートに入れた後、1時間反応させた。その後、ＨＲＰ接合抗−マウスＩｇＧ（HRP-conjugated anti-mouse IgG）2次抗体を添加して1時間反応させ、ELISAを実施して450nmで吸光度を測定した。基質としては、TMB(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine)を使用した。
【０１２２】
その結果、図2に示した通り、8A12抗体は、MRSでのみ結合して反応し、他のARSタンパク質とAIMPタンパク質には反応しないことが明らかになった。これにより、8A12抗体は、他のARSタンパク質とAIMPタンパク質に対して交差活性がなく、MRSのみ特異的に検出することが確認できた。
【０１２３】
＜１−９＞表面プラズモン共鳴を利用して、抗体の親和性を確認
8A12抗体のMRS特異的親和性を確認するために、MRS-AIMP3共精製タンパク質(以下、MRS+AIMP3タンパク質)及びAIMP3タンパク質を利用して、SPR(Surface plasmon resonance、表面プラズモン共鳴)の実験を実施した。MRS+AIMP3又はAIMP3タンパク質をCM5チップ（chip）にコーティングして、8A12抗体を多様な濃度で流しながら、タンパク質との結合反応の程度を測定した。分析試料やバッファは30μl/minの流速で8分間注入して20分間洗浄した。
【０１２４】
その結果、図3及び図4に示した通り、8A12抗体はMRS+AIMP3タンパク質には結合するが、AIMP3タンパク質には結合しないことを確認することができた。また、8A12抗体は、MRSに対して1.56nM KD値（value）を有することを確認することができた。（図3）
【０１２５】
＜１−１０＞MRS抗体の結合部位確認
前記8A12抗体が結合する部位(エピトープ)を確認するために、次のように実験を実施した。
【０１２６】
まず、MRS全体タンパク質からGST、catalytic domain、tRNA binding domain部位を考慮して、それぞれの長さと位置が異なる複数個のMRS断片を製作し、pcDNA3ベクター（vector）(EV)にMRS全体のタンパク質又はそれぞれのMRS断片(MRS fragment)をクローニングした。各MRS断片の位置は、配列番号1のMRS全体のアミノ酸配列のうち、1〜266aa断片、267〜597aa断片、1〜598aa断片、598〜900aa断片、660〜860aa断片、660〜900aa断片、730〜900aa断片などを始め、複数の小単位領域を含む位置から選択される。この時、Mycタンパク質をそれぞれのペプチドN-末端に結合させ、Mycタンパク質を対照群として使用した。その後、H460細胞にクローニングしたベクターDNA 2μgを、メーカーの指示に基づいてTurbofect(Thermo)を使用してトランスフェクション（transfection）させた。24時間後、細胞を収得してウエスタンブロットを実施した。この時、8A12抗体を1：5000(0.2μg/mL)で希釈して使用した。
【０１２７】
前記実験を通じて、8A12抗体は、配列番号1のMRSタンパク質の中で少なくとも861-900aa領域にエピトープ（epitope）が存在していることが明らかになった。
【０１２８】
ここで、811-840aa断片、821-850aa断片、831-860aa断片、841-870aa断片、846-875aa断片、851-880aa断片、856-885aa断片、861-890aa断片、866-895aa断片、871-900aa断片をはじめ、多様な小単位断片ペプチドを製作し、それぞれのペプチドを300ng/wellずつ、96ウェルELISAプレートにコーティングして、通常のプロトコルに基づいてELISAを行った。1次抗体として、8A12抗体は10nMの濃度(1xPBST-Tween 0.05%)で希釈して使用し、2次抗体として、ＨＲＰ接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（HRP conjugated Goat anti-mouse IgG）(Thermo)を1：10000で希釈(1xPBST-Tween 0.05%)して使用し、450nmで吸光度を測定した。
【０１２９】
実験の結果、8A12抗体は、MRSタンパク質の中で851-880aa領域(KQGNIVRELKAQKADKNEVAAEVAKLLDLK、配列番号20)をエピトープとして特異的に認識することを確認した。これらの実験の結果は、851-880aa領域をエピトープで認識する他の結合分子(他の抗体及びその機能的断片など)も、MRS特異的結合及びMRS区分能が優れることを示唆する。
【０１３０】
以下で、本発明者らが新規に考案した胆道癌の検査法に対して、前記で製作したMRS検出能が優れた抗体を適用した一実施例を示す。
【０１３１】
＜実施例２＞
細胞診検査における胆道癌細胞特異的MRS発現検出法の確立及び効果確認
１）検体を、通常的なブラシ細胞診検査方法(Osnes M, Serck-Hanssen A, Myren J. Scand J Gastroenterol. 1975;10(8): 829-31.)に基づいて収得した。具体的には、GRBH-230-3-3.5ブラシ(Wilson-Cook Medical, Inc., Winston-Salem, NC)を用いて胆管ブラッシング（Bile duct brushing）を行った。ブラシは、病変部位を横切って5-8回程度往復運動(to-and-fro movement)した。その後、前記ブラシをロズウェルパーク記念研究所培地（Roswel Park Memorial Institute (RPMI)）1640(GibcoBRL、Rockville、MA、USA)培地で洗浄した後、液状ベース細胞学検査(Thinprep)のために、すぐに細胞学研究室に移動された。前記ブラシ(brush)をThinPrep固定液(PreservvCyt solution)に振って胆道細胞を遊離させ、このように得られた検体(胆道細胞)をThinPrep(Hologic.Inc)を利用して、通常的な方法でThinPrepスライドに塗抹して、細胞試料を準備した。これらの細胞試料は、それぞれ下記の検査法を適用して結果が比較された。
【０１３２】
２）従来の細胞学的検査方式による病理所見は、現在まで広く使用されているPap染色法により下され、前記Pap染色はヘマトキシリン（hematoxylin）、OG-6(Orange G-6)、エオシンアズール（eosin azure）を通常的なプロトコルにより使用して行われた。前記pap染色された検体を形態学的に分析して、ThinPrepスライド上に細胞が一重で塗抹されており、細胞核／細胞質比率(N/C ratio)が小さく、核膜が滑らかな状態である場合、良性(benign、正常)細胞と判定し、細胞が3次元的に塗抹され、細胞核／細胞質比率が高く、クロマチンの凝集現象が見られ、核膜が粗い形状であり、核小体及び類似分裂が出現する場合、悪性腫瘍細胞と判定し、細胞の変化が悪性細胞には及ばないが、良性に判定することができない場合、異型細胞(atypical cell)に判定する。
【０１３３】
３）臨床的な最終診断結果は、映像検査(腹部超音波、腹部コンピュータ断層撮影、腹部磁気共鳴画像診断、内視鏡的逆行性膵胆道造影術、陽電子放射断層撮影)と病理学的検査(細胞診検査、組織検査)により測定された結果により、医師が総合的に最終的な判断をした。
【０１３４】
４）本発明者らは、胆道癌細胞と正常胆道細胞でのMRSの発現度を測定するための免疫蛍光染色を、下記の通り開発した。具体的には、前記ThinPrepスライド試料を次のように処理した。
i) D.W洗浄（washing） 2回
ii) 前処理：2％ヤギ正常血清（Normal goat serum）、0.1％Tween-20及び0.09％アジ化ナトリウム（sodium azide）を含むPBSで室温で1時間反応(インキュベーション)
iii) 1次抗体処理：MRS抗体を2μg/mlの濃度で、PBS(0.1% BSA、0.09% sodium azideを含む)に希釈して、室温で1時間反応させて、本実験では、MRS抗体として配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖を有するMRS抗体(8A12抗体)を使用する
iv) 1x洗浄溶液（washing solution）TBST(1XTBS with 0.01% Tween-20)で2回洗浄
v) 発色：2次抗体(Goat-anti-mouse IgG(H+L)-Alexa Fluor 488(Thermo、cat#A11001))を1：100でPBS(0.1% BSA、0.09% sodium azideを含む)に希釈して、室温で1時間反応
vi) 1x洗浄溶液（washing solution）TBST(1X TBS with 0.01% Tween-20)で2回洗浄
vii) DAPI(Invitrogen P36931)適用後、カバーガラスで覆う
【０１３５】
前記試料標本から、MRS染色強度が、陰性対照群に比べて2倍以上増加した細胞を胆道癌細胞であると判断し、これらの結果を、前記検体に対する病理所見及び臨床的最終診断結果と比較し、診断の正確性(感度と特異度)を確認して、その結果は下記表2乃至表4に示す。
【０１３６】
【表２】
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【０１３７】
【表３】
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【０１３８】
【表４】
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【０１３９】
実験の結果を前記表2乃至表4で見る通り、従来の細胞学的検査方法と対比して、本発明で提供するMRS免疫染色検査法は、感度(Sensitivity)が97.9％及び特異度(Specificity)が96％で、ほぼ100％水準を示し、正確度が97.2（％）を示した。これは、本願発明の検査方法が、細胞水準での診断において、胆道癌細胞と正常胆道細胞(癌ではない良性胆道狭窄組織を含む)とを、殆ど100％の水準で正確に区分検出可能であることを示すものであって、従来使用されてきた細胞学的検査方法が78.1％の正確度水準であることと顕著に対比されるものである。
【０１４０】
図5は、前記表2の各診断の類型別に、代表的な診断事例を示す。胆道癌細胞は、MRSが細胞膜と細胞質で広く分布されて強い染色信号を示したが（図5のA乃至Cを参照）、正常細胞(benign)は、細胞質膜を始め、陰性又は極めて弱い程度の染色信号が示されることが観察された(図5のD乃至Eを参照)。前記の実験を通じて、胆道癌細胞診において、本願発明で提供するMRSを利用した新たな染色法は、高い感度と特異度を有する極めて有用な染色であることを確認した。特に、ブラシ細胞診で得られた検体に対して、従来の染色法で鑑別が困難であった異型細胞に対しても、MRS染色(検出)の有無によって鑑別が可能で、本発明による細胞診検査だけでも、臨床的に胆道癌に対する正確な診断が可能と思慮された。
【０１４１】
＜実施例３＞
生検組織検査における胆道癌細胞特異的MRS発現検出法の確立及び効果確認
胆道癌組織と正常胆道組織(癌ではない良性(benign)胆道狭窄組織を含む)でのMRSの発現水準を測定するための免疫組織化学法（immunohistochemistry、IHC）を、下記の通り開発した。具体的には、55個の未知の胆道生検組織に対して、一般的にパラフィン包埋して薄切される。その後、次のような順序で処理して最終標本を得た：
i) 薄切組織を24時間キシレンに浸しておく→100％アルコールで2分間2回処理→95％アルコールで2分間1回処理→90％アルコールで2分間1回処理→70％アルコールで2分間1回処理→DWで洗浄（washing）2-3回
ii) 抗原賦活化（Antigen retrieval）：市販クエン酸バッファー（citrate buffer）で希釈(DW9: citrate buffer 1)し、2分間予熱（preheating）後、スライドに入れて10分間加熱(電子レンジ)
iii) 加熱後すぐに水道水に2回浸して冷却(cooling)し、1TBSTで5分間3回洗浄
iv) 0.3％ H2O2を室温で10分処理→ブロッキング（Blocking）を(2% goat serum+2% BSA、1PBS base)室温で30分
v) １次抗体（Primary Antibody）(MRS抗体)1：500の割合で希釈処理し、室温で終夜（overnight）→1TBSTで5分間3回洗浄。本実験では、MRS抗体として配列番号18のアミノ酸配列からなる軽鎖及び配列番号19のアミノ酸配列からなる重鎖を有するMRS抗体を使用する。
vi) HRP(２次抗体（secondary antibody）)適用後、室温で30分処理→1TBSTで5分間3回洗浄
vii) DABで1分間処理、発色後DWで洗浄2-3回→ヘマトキシリンで3分間処理、発色後DWで洗浄2-3回
viii) 70％アルコールで2分間1回処理→90％アルコールで2分間1回処理→95％アルコールで2分間1回処理→100％アルコールで2分間2回処理→キシレンで5分間3回処理
ix) マウントソリューション適用後、カバーガラスで覆う
【０１４２】
前記標本で、浸潤様相を示す細胞から、MRSが内部の対象組織(internal control)である膵臓腺細胞(acinar cell)より強く染色されるとき、胆道癌細胞であることを判断し、これらの結果を、前記検体に対する臨床的最終診断結果と比較して、診断の正確性(感度と特異度)を確認し、その結果は下記表5に示す。臨床的最終診断の結果は、医師が総合的に最終な判断した。
【０１４３】
【表５】
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【０１４４】
実験の結果、前記の表5に示した通り、本発明で提供する検出法(染色法)を通じて、胆道癌組織と正常胆道組織に対して、感度と特異度とが100％に区分検出可能であることを確認した。図6乃至図8は、前記表5の55検体の診断において、各類型別に代表的な診断事例を示す。特に、従来の胆道組織染色方法であるH＆E染色を通じた病理所見(H＆Eを使用した形態学的診断方法は、前述した実施例2と同様)と比較しても、一致する結果を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
以上説明した通り、本発明は、胆道細胞からメチオニルtRNA合成酵素(methionyl-tRNA synthetase、MRS)を利用した胆道癌の診断方法に関するもので、より詳細には、メチオニルtRNA合成酵素タンパク質の発現水準を測定する製剤を含む胆道癌診断用組成物、診断用キット及び胆道癌の診断に必要な情報を提供するためにMRSを定性又は定量分析する方法に対するものである。
【０１４６】
MRSは、正常細胞及び他の良性胆道疾患と区別して胆道癌の場合にのみ、過発現されて、従来の細胞診病理検査の方法で異型細胞(atypical cell)として確診を下し難い細胞に対しても、MRSを利用して、胆道癌を感度、特異度及び正確度が殆ど100％に確診可能なものに現れ、胆道癌の診断マーカーとしてMRSの価値が極めて高いため、体外診断産業分野に活用可能性が極めて高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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