(57)【要約】本発明は、改善された細胞生存度で細胞集団を凍結保存する方法を提供する。いくつかの局面において、方法は、細胞集団と、例えば、凍結保護剤溶液に製剤化した、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーとを接触させる段階、および、過冷却細胞集団を生成するために、細胞集団を少なくとも約3時間の期間0℃〜約-20℃の温度で冷却する段階を含む。本発明の過冷却法は、すぐれた解凍後細胞生存および回復を提供する。一定の態様において、細胞集団は、本発明の過冷却法を実施することによって凍結保存する組織または臓器中に存在する。2020516652.tif 000111
2020516652.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改善された細胞生存度で細胞集団を凍結保存する方法であって、 
（a）細胞集団を、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーまたはその塩と接触させる段階；および
（b）過冷却細胞集団を生成するために、該細胞集団を少なくとも約3時間の期間0℃〜約-20℃の温度に冷却する段階
を含み、
ここで、0℃超に加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約50％が生存する、方法。
【請求項２】
温度が約-10℃〜約-20℃である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
温度が約-20℃である、請求項1記載の方法。
【請求項４】
期間が少なくとも約8または16時間である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
期間が約2〜約5日間である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
期間が約2、3、4、または5日間である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
期間が少なくとも約5日間である、請求項1記載の方法。
【請求項８】
37℃に加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約50％が生存する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約60％が生存する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約70％が生存する、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約80％が生存する、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約90％が生存する、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
改善された細胞生存度が、対照過冷却細胞集団と比較して、加温後に生存する過冷却細胞集団の増殖の増強を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
対照過冷却細胞集団がペプトイドポリマーと接触していない、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
加温の約3日後における過冷却細胞集団の細胞数が、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約1倍大きい、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
加温の約6日後における過冷却細胞集団の細胞数が、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約2倍大きい、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
ペプトイドポリマーが、その温度で氷晶形成を低減または阻害するのに十分な量で存在する、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
ペプトイドポリマーが、約100nM〜約1000mMの量で存在する、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
細胞集団が組織または臓器を構成する、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
細胞集団が、初代細胞、心臓細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞、膵細胞、胃細胞、腸細胞、筋細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞、免疫細胞、線維芽細胞、泌尿生殖器細胞、骨細胞、幹細胞、精細胞、卵母細胞、胚細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
（c）過冷却細胞集団を0℃超に加温する段階
をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
ペプトイドポリマーが、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーを含む、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
極性ペプトイドモノマーが、ヒドロキシル基を含む独立に選択された側鎖を有する、請求項1記載の方法。
【請求項２４】
独立に選択された側鎖が、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
C1-18ヒドロキシアルキル基が、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーおよび1つまたは複数のアミノ酸を含むペプトイド-ペプチドハイブリッドまたはその塩であり、
ここで、該1つまたは複数のアミノ酸が、ペプトイドポリマーの一端もしくは両端、および/または1つもしくは複数のペプトイドモノマーの間に位置する、
請求項1記載の方法。
【請求項２７】
ペプトイドポリマーが式（I）の構造を有するか、その互変異性体またはその立体異性体である、請求項1記載の方法：
2020516652.tif 000099
式中：
各R1はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、置換されていてもよいカルボキシアルキル、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(C3-10シクロアルキル)アルキル、(ヘテロシクロアルキル)アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より独立に選択され；
ここで、少なくとも1つの場合のR1は、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキルであり、かつ
ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基のいずれかは1つまたは複数のR3基で独立に置換されていてもよく；
各R2はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、および置換されていてもよいカルボキシアルキルからなる群より独立に選択され；
各R3はハロゲン、オキソ、チオキソ、-OH、-SH、アミノ、C1-8アルキル、C1-8ヒドロキシアルキル、C1-8アルキルアミノ、およびC1-8アルキルチオからなる群より独立に選択され；
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成し；かつ
ポリマー中のモノマーの数を表す下付き文字nは、2〜50である。
【請求項２８】
少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の場合のR1が、独立に選択された置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
C1-18ヒドロキシアルキル基が、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
各R1が下記からなる群より独立に選択される、請求項27記載の方法：
2020516652.tif 000100
式中：
mは1〜8であり；かつ
R3はH、C1-8アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、アミン、オキソ、およびチオキソからなる群より選択される。
【請求項３１】
1つまたは複数のR1がR1bの構造を有する、請求項30記載の方法：
2020516652.tif 000101
。
【請求項３２】
各R1が下記からなる群より独立に選択される、請求項27記載の方法
2020516652.tif 000102
。
【請求項３３】
各場合のR2がHである、請求項27記載の方法。
【請求項３４】
nが6〜25である、請求項27記載の方法。
【請求項３５】
nが6〜20である、請求項27記載の方法。
【請求項３６】
nが10〜25である、請求項27記載の方法。
【請求項３７】
XがH、C1-8アルキル、およびC1-8アシルからなる群より選択され；かつYが-OHおよびアミノからなる群より選択される、請求項27記載の方法。
【請求項３８】
ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーが配列[HaPb]nまたは[PbHa]nを有するように配置された1つまたは複数の第1の疎水性ペプトイドモノマーHと1つまたは複数の第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニットを含み、ここで、
サブユニット内の連続した第1の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字aは、1〜10であり；
サブユニット内の連続した第1の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字bは、1〜10であり；かつ
ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、2〜50である、
請求項1記載の方法。
【請求項３９】
ペプトイドポリマーが配列X-[HaPb]n-YまたはX-[PbHa]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
請求項38記載の方法。
【請求項４０】
サブユニットが、ペプトイドポリマーが配列[HaPbHcPd]nまたは[PbHaPdHc]nを有するような第2の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または第2の極性ペプトイドモノマーをさらに含み、ここで、
サブユニット内の連続した第2の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字cは、0〜10であり；
サブユニット内の連続した第2の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字dは、0〜10であり；かつ
cおよびdの両方が0であることはない、
請求項38記載の方法。
【請求項４１】
ペプトイドポリマーが配列X-[HaPbHcPd]n-YまたはX-[PbHaPdHc]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
請求項40記載の方法。
【請求項４２】
1つもしくは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または1つもしくは複数の極性ペプトイドモノマーを含む配列Zをさらに含み、ここで、Zは、第1のサブユニットの前、最後のサブユニットの後、および/または1つもしくは複数のサブユニットの間に位置する、請求項38記載の方法。
【請求項４３】
ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーが配列[H2P2]nH2または[P2H2]nH2を有するように配置された
（a）2つの第1の疎水性ペプトイドモノマーHと2つの第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニット、および
（b）ペプトイドポリマーのC末端に位置する2つの第2の疎水性ペプトイドモノマー
を含み、
ここで、ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、1〜50である、
請求項1記載の方法。
【請求項４４】
ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーが配列X-[H2P2]nH2-YまたはX-[P2H2]nH2-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
請求項43記載の方法。
【請求項４５】
nが1〜10である、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
第1および/または第2の疎水性ペプトイドモノマーが下記からなる群より独立に選択される、請求項38記載の方法：
2020516652.tif 000103
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である。
【請求項４７】
ペプトイドポリマーが、ヒドロキシル基を含む側鎖を有する極性ペプトイドモノマーを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４８】
第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーが下記からなる群より独立に選択される、請求項38記載の方法：
2020516652.tif 000104
2020516652.tif 000105
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である。
【請求項４９】
第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーがそれぞれ、(C1-6アルコキシ)(C1-6アルキレン)、オリゴ(エチレングリコール)、(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)、および(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)からなる群より独立に選択される側鎖を含む、請求項38記載の方法。
【請求項５０】
(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)が4〜6員複素環を含み、ここで、少なくとも1つの構成員は、OおよびNからなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)がテトラヒドロフラニルまたはオキソピロリジニル部分を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000106
を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
極性ペプトイドモノマーがすべて
2020516652.tif 000107
である、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)が5〜6員芳香環を含み、ここで、少なくとも1つの環構成員は、OおよびNからなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５５】
(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)がフラニル部分を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５６】
ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000108
を含む、請求項55記載の方法。
【請求項５７】
側鎖がメトキシエチル基を含む、請求項49記載の方法。
【請求項５８】
ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000109
を含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
側鎖がオリゴ(エチレングリコール)部分を含む、請求項49記載の方法。
【請求項６０】
オリゴ(エチレングリコール)部分が2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル部分である、請求項59記載の方法。
【請求項６１】
ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000110
を含む、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
nが2〜10である、請求項38記載の方法。
【請求項６３】
aが1〜5である、請求項38記載の方法。
【請求項６４】
bが1〜5である、請求項38記載の方法。
【請求項６５】
aが1〜3であり、かつbが1〜3である、請求項63記載の方法。
【請求項６６】
cが0〜5である、請求項40記載の方法。
【請求項６７】
dが0〜5である、請求項40記載の方法。
【請求項６８】
ペプトイドモノマーの約10、20、30、40、50、60、70、80、または90％が疎水性である、請求項38記載の方法。
【請求項６９】
ペプトイドポリマー塩が塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、メシレート塩、硝酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、およびその組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項７０】
ペプトイドポリマーを凍結保護剤溶液に製剤化する、請求項1記載の方法。
【請求項７１】
凍結保護剤溶液が、イオン種、浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤、抗酸化剤、細胞膜安定化化合物、アクアポリンまたは他のチャネル形成化合物、アルコール、糖、糖誘導体、非イオン性界面活性剤、タンパク質、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、フィコール(登録商標)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒアルロナン、ホルムアミド、天然または合成ヒドロゲル、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
請求項1記載の方法によって生成した、改善された細胞生存度を有する過冷却細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年4月12日提出の米国特許仮出願第62/484,704号に対する優先権を主張し、その開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
再生医療において取り組むべき主要な障害は、凍結保存がうまくいかないことである。細胞組織療法が中枢的試験および商業的製造に移行するにつれて、新鮮な生物原料および最終薬物製品を輸送する物流が決定的なハードルであることが明らかにされてきた。これらの療法の成功にとって中心となるのは、零下の温度での長期貯蔵後に、高いレベルかつ再現性のあるレベルの生存および回復を提供するシステムである。細胞組織療法の低温保存（または凍結保存）は、早期臨床試験、投与前の長期貯蔵、および中心的に製造され、大規模な患者ネットワークに分配される後期療法のために必須である。細胞懸濁液または移植組織として投与されるそのような療法は、細胞に適合し、レシピエントにとって非毒性で、かつ投与前の十分な時間、高い生存度および機能で療法を貯蔵するのに適切な媒体としての、凍結保存溶液の使用を必要とする。
【０００３】
凍結保存技術は、古く、有毒かつ無効で、解凍後の典型的な細胞生存率は50％未満であり、効力は信頼性がなく、このことは標準化された輸送、バッチ製造、日程計画、および最終製品発売試験を大幅に妨害する。DMSOなどの凍結保護剤（CPA）の広範な使用は、氷成長を阻止することにより凍結保存した生体標本の解凍後の生存度を改善するが、DMSOは細胞製品と、続いて処置した患者に対して有毒であるため、応需型バイオバンキングおよび高度な再生医療提供の実現を妨げる。Sauer-Heilborn et al., Transfusion, 44 (6):907-16 (20040; Hubel, Transfusion, 41 (5):579-580 (2001)（非特許文献1）参照。解凍後にDMSOを除去しても非効率的で、回復は60％未満にとどまる。Calmels et al., Bone Marrow Transplant, 31 (9):823-828 (2000)（非特許文献2）参照。強溶剤として、DMSOは注入チューブおよび容器を溶解して浸出し、これはcGMPプロセスに対するリスクを高める。構造および組成が定義されていない天然物としての動物およびヒト由来血清（例えば、ウシ胎仔血清、FBS）は、バッチ毎の変動、さらなる生物災害を誘導し、供給連鎖の問題および地理的制限によって大きく影響される。他の凍結媒体は、貯蔵寿命の短縮を引き起こす不安定なタンパク質、または単一の製品として化学的に定義されていないポリマーを含み得る。FDAは適切な代替物によりDMSOおよび血清の使用を抑制しようとしており、これら代替物は、非常に有効かつ既製の細胞および組織製品のための強固な基盤を可能にするために必要とされる。
【０００４】
したがって、高い生存度および機能で細胞系および組織系試料を保存するための非毒性および高活性氷防止材料および方法が当技術分野において必要とされている。本開示はこの必要性を満たし、他の利点も提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sauer-Heilborn et al., Transfusion, 44 (6):907-16 (20040; Hubel, Transfusion, 41 (5):579-580 (2001)
【非特許文献２】Calmels et al., Bone Marrow Transplant, 31 (9):823-828 (2000)
【発明の概要】
【０００６】
いくつかの局面において、本明細書において提供するのは、改善された細胞生存度で細胞集団を凍結保存する方法であって、
（a）細胞集団を、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーまたはその塩と接触させる段階；および
（b）過冷却細胞集団を生成するために、該細胞集団を少なくとも約3時間の期間0℃〜約-20℃の温度に冷却する段階
を含み、ここで、0℃超に加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約50％が生存する、方法である。
【０００７】
いくつかの態様において、加温後に生存する過冷却細胞集団のパーセントは、凍結保存法を生き残った細胞の数を出発細胞数と比較することによって計算する。いくつかの態様において、加温後に生存する過冷却細胞集団のパーセントは、凍結保存法を生き残った細胞の数を非凍結細胞の所定の細胞数（例えば、出発細胞数）に正規化することによって計算する。一定の態様において、過冷却細胞集団のパーセントは、加温後約1日以下（例えば、約4、8、12、16、または20時間）の時点で凍結保存法を生き残った細胞の数を判定することによって計算する。
【０００８】
いくつかの態様において、細胞集団を、約-5℃〜約-20℃、約-6℃〜約-20℃、約-7℃〜約-20℃、約10℃〜約-20℃、または約-15℃〜約-20℃の温度に冷却する。他の態様において、細胞集団を、0℃〜約-15℃、0℃〜約10℃、または0℃〜約-5℃の温度に冷却する。さらなる態様において、細胞集団を、約-5℃〜約-15℃、約-5℃〜約-10℃、約-6℃〜約-15℃、約-7℃〜約-15℃、または約-10℃〜約-15℃の温度に冷却する。一定の態様において、細胞集団を約0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃、-5℃、-6℃、-7℃、-8℃、-9℃、-10℃、-11℃、-12℃、-13℃、-14℃、-15℃、-16℃、-17℃、-18℃、-19℃、または-20℃の温度に冷却する。いくつかの態様において、冷却した細胞集団を、その温度で解凍する（例えば、氷のない液体懸濁液中）。
【０００９】
いくつかの態様において、 細胞集団を、少なくとも約4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64、68、72、76、80、84、88、92、96、100、104、108、112、116、または120時間の期間冷却する。他の態様において、細胞集団を約1〜約10日、約2〜約10日、約3〜約10日、約4〜約10日、約5〜約10日、約1〜約8日、約2〜約8日、約3〜約8日、約4〜約8日、約5〜約8日、約1〜約5日、約2〜約5日、約3〜約5日、約4〜約5日、約2〜約4日、約2〜約3日、または約3〜約4日の期間冷却する。さらなる態様において、細胞集団を、少なくとも約5日（例えば、少なくとも約6、7、8、9、または10日）の期間冷却する。一定の態様において、細胞集団を、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24日の期間冷却する。
【００１０】
いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％が、約5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、または35℃以上の温度に加温した後に生存する。他の態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％が、約1℃〜約37℃、約5℃〜約37℃、約10℃〜約37℃、約15℃〜約37℃、約20℃〜約37℃、約25℃〜約37℃、約30℃〜約37℃、約35℃〜約37℃、約1℃〜約35℃、約10℃〜約35℃、約20℃〜約35℃、約30℃〜約35℃、約1℃〜約30℃、約10℃〜約30℃、約20℃〜約30℃、約1℃〜約25℃、約10℃〜約25℃、約20℃〜約25℃、約1℃〜約20℃、約10℃〜約20℃、約1℃〜約15℃、約10℃〜約15℃、約1℃〜約10℃、約5℃〜約10℃、または約1℃〜約5℃の温度に加温した後に生存する。一定の態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％が、約1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、または37℃の温度に加温した後に生存する。
【００１１】
いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約55％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約60％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約65％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約70％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約75％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約80％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約85％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約90％が、加温後に生存する。いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約95％が、加温後に生存する。
【００１２】
いくつかの態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％（例えば、少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％）が、加温後少なくとも約1日間生存する。他の態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％（例えば、少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％）が、加温後約1〜約10日、約2〜約10日、約3〜約10日、約4〜約10日、約5〜約10日、約1〜約8日、約2〜約8日、約3〜約8日、約4〜約8日、約5〜約8日、約1〜約5日、約2〜約5日、約3〜約5日、約4〜約5日、約2〜約4日、約2〜約3日、または約3〜約4日の期間生存する。さらなる態様において、過冷却細胞集団の少なくとも約50％（例えば、少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％）が、加温後少なくとも約2日間（例えば、少なくとも約3、4、5、6、または7日間）生存する。一定の態様において、少なくとも約50％（例えば、少なくとも約55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％）が、加温後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24日間生存する。
【００１３】
いくつかの態様において、改善された細胞生存度は、対照過冷却細胞集団と比較して、加温後に生存する過冷却細胞集団の増殖の増強を含む。いくつかの態様において、対照過冷却細胞集団はペプトイドポリマーと接触していない（例えば、対照集団は、凍結保護溶液のみ、DMSOを含む溶液、または細胞培養培地のみと接触した）。一定の態様において、加温後（例えば、加温の約1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上の日数の後）の特定の時点での過冷却細胞集団の細胞数は、その時点での対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約1倍大きい（例えば、少なくとも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍大きい）。非限定例として、加温の約3日後における過冷却細胞集団の細胞数は、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約1倍大きい可能性がある。もう1つの非限定例として、加温の約6日後における過冷却細胞集団の細胞数は、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約2倍大きい可能性がある。
【００１４】
関連する局面において、本明細書において提供するのは、改善された細胞生存度で細胞集団を凍結保存する方法であって、
（a）細胞集団を、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーまたはその塩と接触させる段階；および
（b）過冷却細胞集団を生成するために、該細胞集団を少なくとも約3時間の期間0℃〜約-20℃の温度に冷却する段階
を含み、ここで、改善された細胞生存度は、対照過冷却細胞集団と比較して、加温後に生存する過冷却細胞集団の増殖の増強を含む、方法である。
【００１５】
いくつかの態様において、対照過冷却細胞集団はペプトイドポリマーと接触していない（例えば、対照集団は、凍結保護溶液のみ、DMSOを含む溶液、または細胞培養培地のみと接触した）。一定の態様において、加温後（例えば、加温の約1、2、3、4、5、6、7、またはそれ以上の日数の後）の特定の時点での過冷却細胞集団の細胞数は、その時点での対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約1倍大きい（例えば、少なくとも約1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍大きい）。本発明のこれらの局面に関連するさらなる態様は、例えば、上記の段落[0007]から[0012]に記載されている。
【００１６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、細胞集団を冷却する温度で氷晶形成を低減または阻害するのに十分な量で存在する。一定の場合において、ペプトイドポリマーは、約100nM〜約1000mMの量、例えば、約100nM〜約100mMの量で存在する。
【００１７】
いくつかの態様において、細胞集団は組織または臓器を構成する。いくつかの態様において、細胞集団は初代細胞を含む。一定の態様において、細胞集団は、心臓細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞、膵細胞、胃細胞、腸細胞、筋細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞、免疫細胞、線維芽細胞、泌尿生殖器細胞、骨細胞、幹細胞、精細胞、卵母細胞、胚細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびその組み合わせからなる群より選択される。泌尿生殖器細胞の非限定例には、例えば、平滑筋海綿体細胞、上皮海綿体細胞、およびその組み合わせなどの、海綿体細胞が含まれる。
【００１８】
いくつかの態様において、方法は、
（c）過冷却細胞集団を0℃超に加温する段階
をさらに含む。
【００１９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーを含む。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーは、ヒドロキシル基を含む独立に選択された側鎖を有する。いくつかの態様において、独立に選択された側鎖は、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、C1-18ヒドロキシアルキル基は、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である。一定の場合に、極性ペプトイドモノマーの1つもしくは複数またはすべての側鎖は以下の構造を有する：
2020516652.tif 000003
。
【００２０】
極性ペプトイドモノマーの非限定例には下記が含まれる：
2020516652.tif 000004
2020516652.tif 000005
2020516652.tif 000006
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である（例えば、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、反復単位mは、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10であり得る。
【００２１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の疎水性ペプトイドモノマーを含む。疎水性ペプトイドモノマーの非限定例には下記が含まれる：
2020516652.tif 000007
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である（例えば、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、反復単位mは、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10であり得る。
【００２２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーおよび1つまたは複数のアミノ酸を含むペプトイド-ペプチドハイブリッドまたはその塩であり、ここで、1つまたは複数のアミノ酸は、ペプトイドポリマーの一端もしくは両端、および/または1つもしくは複数のペプトイドモノマーの間に位置する。
【００２３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは式（I）の構造であるか、その互変異性体またはその立体異性体である：
2020516652.tif 000008
式中：
各R1はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、置換されていてもよいカルボキシアルキル、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(C3-10シクロアルキル)アルキル、(ヘテロシクロアルキル)アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より独立に選択され；
ここで、少なくとも1つの場合のR1はC1-18ヒドロキシアルキルであり、かつ
ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基のいずれかは1つまたは複数のR3基で独立に置換されていてもよく；
各R2はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、および置換されていてもよいカルボキシアルキルからなる群より独立に選択され；
各R3はハロゲン、オキソ、チオキソ、-OH、-SH、アミノ、C1-8アルキル、C1-8ヒドロキシアルキル、C1-8アルキルアミノ、およびC1-8アルキルチオからなる群より独立に選択され；
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成し；かつ
ポリマー中のモノマーの数を表す下付き文字nは、2〜50である。
【００２４】
いくつかの態様において、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の場合のR1は、独立に選択された置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、C1-18ヒドロキシアルキル基は、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である。
【００２５】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1はR1bの構造を有する：
2020516652.tif 000009
。
【００２６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1は、下記からなる群より選択される：
2020516652.tif 000010
式中：
mは1〜8であり；かつ
R3はH、C1-8アルキル、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、アミン、オキソ、およびチオキソからなる群より選択される。
【００２７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1は、下記からなる群より選択される：
2020516652.tif 000011
。
【００２８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1はC1-18ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1はC1-6ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1は同じC1-6ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1は：
2020516652.tif 000012
である。
【００２９】
いくつかの態様において、各場合のR2はHである。
【００３０】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、3〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、5〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜20である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜20である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10〜25である。
【００３１】
いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8 カルボキシアルキル、またはハロゲンである。
【００３２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーのXおよびYは一緒になって共有結合を形成する。
【００３３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、表9、または表10に示すポリマーの群より選択される。
【００３４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列[HaPb]nまたは[PbHa]nを有するように配置された1つまたは複数の第1の疎水性ペプトイドモノマーHと1つまたは複数の第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニットを含み、ここで、
サブユニット内の連続した第1の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字aは、1〜10であり；
サブユニット内の連続した第1の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字bは、1〜10であり；かつ
ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、2〜50である。
【００３５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列X-[HaPb]n-YまたはX-[PbHa]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する。
【００３６】
いくつかの態様において、サブユニットは、ペプトイドポリマーが配列[HaPbHcPd]nまたは[PbHaPdHc]nを有するような第2の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または第2の極性ペプトイドモノマーをさらに含み、ここで、
サブユニット内の連続した第2の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字字cは、0〜10であり；
サブユニット内の連続した第2の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字dは、0〜10であり；かつ
cおよびdの両方が0であることはない。
【００３７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列X-[HaPbHcPd]n-YまたはX-[PbHaPdHc]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する。
【００３８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、1つもしくは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または1つもしくは複数の極性ペプトイドモノマーを含む配列Zを含み、ここで、Zは、第1のサブユニットの前、最後のサブユニットの後、および/または1つもしくは複数のサブユニットの間に位置する。いくつかの場合に、Zは1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーを含む。他の場合に、Zは1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。さらに他の場合に、Zは1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。
【００３９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは：ペプトイドポリマーが配列[H2P2]nH2または[P2H2]nH2を有するように配置された、（a）2つの第1の疎水性ペプトイドモノマーHと2つの第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニット、および（b）ペプトイドポリマーのC末端に位置する2つの第2の疎水性ペプトイドモノマーを含み、ここで、ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、1〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは化合物81を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列X-[H2P2]nH2-YまたはX-[P2H2]nH2-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する。いくつかの態様において、nは1〜10である。
【００４１】
いくつかの態様において、第1および/または第2の疎水性ペプトイドモノマーは前述の疎水性ペプトイドモノマーから独立に選択される。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ヒドロキシル基を含む側鎖を有する極性ペプトイドモノマーを含む。いくつかの態様において、第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーは前述の極性ペプトイドモノマーから独立に選択される。
【００４２】
いくつかの態様において、第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーはそれぞれ、(C1-6アルコキシ)(C1-6アルキレン)、(オリゴ[エチレングリコール])、(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)、および(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)からなる群より独立に選択される側鎖を含む。いくつかの態様において、(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)は4〜6員複素環を含み、ここで、少なくとも1つの構成員はOおよびNからなる群より選択される。いくつかの態様において、(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)はテトラヒドロフラニルまたはオキソピロリジニル部分を含む。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000013
を含む。特定の場合に、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000014
である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは化合物63、化合物76、化合物86、または化合物87を含む。
【００４３】
いくつかの態様において、(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)は5〜6員芳香環を含み、ここで、少なくとも1つの環構成員はOおよびNからなる群より選択される。いくつかの態様において、(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)はフラニル部分を含む。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000015
を含む。特定の場合に、ペプトイドポリマーは化合物73を含む。
【００４４】
いくつかの態様において、側鎖はメトキシエチル基を含む。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000016
を含む。特定の場合に、ペプトイドポリマーは化合物62を含む。
【００４５】
いくつかの態様において、側鎖はオリゴ(エチレングリコール)部分を含む。いくつかの態様において、オリゴ(エチレングリコール)部分は2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル部分である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000017
を含む。特定の場合に、ペプトイドポリマーは化合物67を含む。
【００４６】
いくつかの態様において、nは2〜10である。いくつかの態様において、aは1〜5である。いくつかの態様において、bは1〜5である。いくつかの態様において、aは1〜3であり、かつbは1〜3である。いくつかの態様において、cは0〜5である。いくつかの態様において、dは0〜5である。
【００４７】
いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約10％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約20％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約30％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約40％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約50％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約60％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約70％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約80％は疎水性である。いくつかの態様において、ペプトイドモノマーの約90％は疎水性である。
【００４８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーまたはペプトイド-ペプチドハイブリッドは塩の形態である。塩の非限定例には、本明細書に記載のペプトイドポリマーおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドの塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、メシレート、硝酸塩、酒石酸塩、およびグルコン酸塩が含まれる。
【００４９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーおよび／またはペプトイド-ペプチドハイブリッドは、凍結保護剤溶液へと製剤化される。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、イオン種、透過性凍結保護剤、非透過性凍結保護剤、抗酸化剤、細胞膜安定化化合物、アクアポリンまたは他のチャネル形成化合物、アルコール、糖、糖誘導体、非イオン性界面活性剤、タンパク質、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、フィコール(登録商標)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒアルロナン、ホルムアミド、天然または合成ヒドロゲル、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む。
【００５０】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、メタノール、ブチレングリコール、アドニトール、エタノール、トリメチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、エリスリトール、ソルビトール、キシシリトール（xythyritol）、ポリプロピレングリコール、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、マンニトール、イノシトール、ジチオリトール（dithioritol）、1,2-プロパンジオール、およびその組み合わせからなる群より選択されるアルコールをさらに含む。
【００５１】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、単糖、二糖、多糖、およびその組み合わせからなる群より選択される糖をさらに含む。いくつかの場合において、糖は、グルコース、ガラクトース、アラビノース、果糖、キシロース、マンノース、3-O-メチル-D-グルコピラノース、およびその組み合わせからなる群より選択される単糖である。他の場合において、糖は、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、およびその組み合わせからなる群より選択される二糖である。さらに他の場合において、糖は、ラフィノース、デキストラン、およびその組み合わせからなる群より選択される多糖である。
【００５２】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、約3,000g/mol未満の平均分子量を有するPEGまたはPPGをさらに含む。特定の場合において、PEGまたはPPGは約200〜400g/molの平均分子量を有する。
【００５３】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質をさらに含む。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、キトサン、ヒアルロン酸、またはその組み合わせを含む天然または合成ヒドロゲルをさらに含む。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリソルベート80、およびその組み合わせからなる群より選択される非イオン性界面活性剤をさらに含む。
【００５４】
さらなる局面において、本明細書に記載の方法のいずれかにより作製される、細胞生存度が向上した過冷却細胞集団が本明細書に提供される。
【００５５】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、下記の詳細な説明および図面から当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】「サブモノマー」アプローチを用いてのペプトイドオリゴマー合成のための一般的プロトコルを例示する。
【図２】図2Aおよび2Bは、-20℃で実施した毛細管凍結アッセイの結果を示す。図2Aは、化合物1（1当量）および10（1当量）をMilliQ水に溶解し、零度未満の温度にさらすアッセイを例示する。水単独およびエチレングリコール（EG）（18当量）溶液との比較を行なった。図2Bは、図2Aに示すアッセイの正規化した結果を示す。
【図３】図3A〜3Dは、x線回折（XRD）結晶解析データを示す。図3Aは、5mMの化合物12および17.5体積％のエチレングリコール（EG）を含む溶液のXRDデータを示す。図3Bは、30体積％のEGを含む溶液のXRDデータを示す。図3Cは、17.5体積％のEGを含む溶液のXRDデータを示す。図3Dは、EG、化合物2（「B」と表記；SEQ ID NO:10）、化合物12（「D」と表記；SEQ ID NO:8）、および/または化合物8（「E」と表記；SEQ ID NO:9）を含むいくつかの溶液のアイスリングスコアを示す。それぞれ異なる溶液について、2つの別々のアイスリングスコアを判定した。
【図４Ａ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4A：化合物10のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｂ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4B：化合物12のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｃ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4C：化合物8のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｄ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4D：化合物13のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｅ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4E：化合物11のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｆ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4F：化合物58のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図４Ｇ】図4A〜4Gは、5mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、15体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図4G：EG対照のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ａ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5A：化合物10のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｂ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5B：化合物12のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｃ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5C：化合物8のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｄ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5D：化合物13のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｅ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5E：化合物11のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｆ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5F：化合物58のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図５Ｇ】図5A〜5Gは、1mg/mLの化合物10、化合物12、化合物8、化合物13、化合物11、および化合物58を含む溶液のx線回折（XRD）結晶解析データを、エチレングリコール（EG）対照と比較して示す。各溶液は300mM NaCl、100mM HEPES、17.5体積％エチレングリコールも含み、pHは7.2に調節した。図5G：EG対照のXRD結晶解析パターン（左）およびスペクトルプロット（右）。XRDスペクトルプロットについて、強度を角度（2θ度）の関数としてプロットした。
【図６】図6A〜6Cは、急速凍結し、再加温し、続いて再凍結した2つの溶液を示す。対照溶液は22.5体積％のエチレングリコール（EG）を含んでいた一方で、試験溶液は22.5％EGおよび5mg/mL（0.5％（w/v））の化合物12を含んでいた。図6Aは、液体窒素中での急速凍結中に、化合物12を含む溶液はガラス化した一方で、対照溶液は完全に凍結したことを示す。図6Bは、37℃で再加温中に、化合物12を含む溶液は解凍（2秒以内）した一方で、対照は凍結したままであったことを示す。図6Cは、-20℃のフリーザー内で終夜放置後、化合物12の溶液は、対照とは異なり、解凍したままであったことを示す。
【図７】化合物12（四角）またはDMSO（丸）を細胞培養培地に加えたHEK 293細胞に対して実施した細胞毒性試験の結果を示す。化合物12もDMSOも加えない試料（「培養培地」（三角））を対照とした。化合物12およびDMSOの異なる濃度を試験するために、連続希釈を実施した。
【図８】エチレングリコール（EG）を含む溶液を、EGおよび化合物12を含む溶液と比較する、HEK 293細胞に対して実施した凍結保存アッセイの結果を示す。解凍の12時間後に細胞生存度を測定した。
【図９】5mg/mLの化合物12ならびにグリコール、二糖、および一般的緩衝液を含む溶液を、VS2EまたはM22を含む溶液と比較する、HEK 293細胞に対して実施した凍結保存アッセイの結果を示す。解凍の16時間後に細胞生存度を測定した。細胞を液体窒素（LN2）でガラス化した。
【図１０Ａ】-20℃でジャーカット細胞を72時間貯蔵した後に収集したフローサイトメトリーデータの一例を示す。細胞数は比較のために非凍結対照に対して正規化した。調製物XT-SC3およびXT-SC4は、HTK緩衝液、化合物12、および他の構成要素を含む。HTK緩衝液およびDMEM＋10％FBSはいずれも24時間の貯蔵後に生存をほとんどからまったく示さなかった。XT-SC4は72時間後に細胞死をほとんどからまったく示さず、XT-SC3は時点が長くなるにつれて細胞生存のわずかな低下を示すにすぎなかった。
【図１０Ｂ】-20℃でHEK293細胞を72時間貯蔵した後の蛍光生存度アッセイを示し、ジャーカット細胞によるフローサイトメトリーの結果を確証している。ここでは、HTKおよびDMEM/FBSは24時間後に-20℃で生存をまったく示さず、4℃で非常に低い生存を示した。
【図１１】-20℃で最大48時間、過冷却調製物（XT-SC5〜8）およびHTK溶液中で貯蔵したラット海綿体（CC）内皮細胞の経時的生存を示す。過冷却媒体での処理後、カルセインAMでの染色前に、細胞を37℃で24時間、培地（50×希釈）中で回復させた。定量的蛍光シグナルは細胞生存を棒グラフで示し、対応する細胞画像を下に示す。
【図１２】1％化合物12を含むXT調製物、XT調製物のみ、10％DMSO調製物、またはDMEM細胞培地のみのいずれか中、-20℃で3日間凍結保存したSK-OV-3細胞の生存を示す。細胞生存を加温の1日後に測定した。
【図１３】1％化合物12を含むXT調製物、10％DMSO調製物、またはDMEM細胞培地のみのいずれか中、-20℃で3日間凍結保存したSK-OV-3細胞の増殖を示す。細胞生存度を加温の3日後に測定した。
【図１４】1％化合物12を含むXT調製物、XT調製物のみ、10％DMSO調製物、またはDMEM細胞培地のみのいずれか中、-20℃で3日間凍結保存したK562細胞の増殖を示す。細胞生存度を加温の3日後に測定した。
【図１５】1％化合物12を含むXT調製物、XT調製物のみ、10％DMSO調製物、またはDMEM細胞培地のみのいずれか中、-20℃で3日間凍結保存したK562細胞の増殖を示す。細胞生存度を加温の6日後に測定した。
【図１６】1％化合物12、27、62、74、もしくは76を含むXT調製物、10％DMSO調製物、またはDMEM細胞培地のみのいずれか中、-20℃で3日間凍結保存したK562細胞の増殖を示す。細胞生存度を加温の7日後に測定した。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
発明の詳細な説明
I.  序論
凍結保存を用いての低温での細胞および組織のバンキングは、多くの生物学的製品および適用にとって重要であるが、依然として、完全な回復の成功または生存能力のある治療的細胞、組織、および臓器を可能にしなければならない大きな問題である。凍結保存は、典型的には、凍結保護剤（CPA）により実施し、これらはジメチルスルホキシド（DMSO）、ウシ血清アルブミン（BSA）などの重要な化学添加物である。CPAは、氷晶の核形成および成長を防止することにより、凍結保存した生物系の解凍後の生存度を改善するために用いる。しかし、これらの作用物質は、その有効濃度で様々なレベルの細胞毒性を示し、したがって、凍結保存、バイオバンキング、および高度な再生医療の成功を制限する。この有効かつ安全なCPAの欠如は、有毒なCPAが広く使用される一因となっている。
【００５８】
本発明は、部分的には、少なくとも1つの極性ペプトイドモノマー（例えば、ヒドロキシル基などの極性側鎖を有する）を含むペプトイドポリマーは、細胞集団を過冷却温度（例えば、0℃〜-20℃）に少なくとも約3時間冷却した場合に、3〜24時間後に細胞生存度が完全に欠損するペプトイドポリマーなしの対照試料と比較して、すぐれた細胞生存および回復を提供し、無氷過冷却法において使用し得るとの発見に基づく。非限定例として、本明細書に記載の無氷過冷却法を用いたヒトモデル細胞型（例えば、HEK-293、K562、ジャーカット、SK-OV-3）による試験は、時に85％を超える典型的な解凍後（例えば、加温後）細胞回復を示し、解凍後16時間でほぼ100％の生存を達成する。
【００５９】
II.  略語および定義
本明細書において用いられる略語は、特に記載がないかぎり、従来のものである。以下の略語はペプトイドポリマーのモノマー単位を指すために用いられる：Nsb（2-(sec-ブチルアミノ)酢酸）、Nib（2-(イソブチルアミノ)酢酸）、Nbu（2-ブチルアミノ)酢酸）、Npr（2-プロピルアミノ)酢酸）、Nip（2-(イソプロピルアミノ)酢酸）、Nme（2-(メチルアミノ)酢酸）、Nhp（2-((2-ヒドロキシプロピル)アミノ)酢酸）、Nhe（2-((2-ヒドロキシエチル)アミノ)酢酸）、Ndp（2-((2,3-ジヒドロキシプロプリル)アミノ)酢酸、Nyp（2-((1-ヒドロキシプロパン-2-イル)アミノ)酢酸）、Nep（2-((1-(4-ヒドロキシフェニル)エチル)アミノ)酢酸、Ndh（2-((1,3,-ジヒドロオキシプロパン-2-イル)アミノ)酢酸、Nop（2-((3-(2-オキソピロリンジン-1-イル)プロピル)アミノ)酢酸、Nmo(2-(2-メトキシエチルアミノ)酢酸)、Ntf(2-((テトラヒドロフラン-2-イル)メチルアミノ)酢酸)、Nff (2-(フラノ-2-イルメチルアミノ)酢酸)、Nmb(2-(2-メチルブチルアミノ)酢酸)、Nrh (2-(R)-(2-ヒドロキシプロピルアミノ)酢酸)、Nsh (2-(S)-(2-ヒロドキシプロピルアミノ)酢酸)、N3p (2-(2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチルアミノ)酢酸)、Nbr ((2-(R)-sec-ブチルアミノ)酢酸)、およびNbs ((2-(S)-sec-ブチルアミノ)酢酸)。以下の略語は化学化合物を指すために用いられる：DMF（N,N'-ジメチルホルムアミド）、DIEA（ジイソプロピルエチルアミン、DIC（N,N'-ジイソプロピルカルボジイミド）、ACN（アセトニトリル）、DCM（塩化メチレン）、HFIP（ヘキサフルオロイソプロピルアルコール）；Fmoc（9-フルオレニルメトキシカルボニル）。
【００６０】
本明細書において用いられる「1つの（a）」、「1つの（an）」、または「その（the）」なる用語は、1つの構成要素による局面を含むだけでなく、複数の構成要素による局面も含む。例えば、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、複数の指示物を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「作用物質（the agent）」への言及は、当業者には公知の1つまたは複数の作用物質への言及を含み、他も同様である。
【００６１】
数値を修飾するために本明細書において用いられる「約」なる用語は、その値の前後の規定された範囲を示す。「X」が値である場合、「約X」は0.9X〜1.1Xの値、より好ましくは0.95X〜1.05Xの値を示す。「約X」への言及はいずれも、少なくとも値X、0.95X、0.96X、0.97X、0.98X、0.99X、1.01X、1.02X、1.03X、1.04X、および1.05Xを具体的に示す。したがって、「約X」は、例えば、「0.98X」というクレーム限定のための明細書記載のサポートを教示および提供することが意図される。
【００６２】
「アルキル」とは、示された数の炭素原子を有する、直鎖または分枝、飽和、脂肪族基を意味する。アルキルは、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C1-7、C1-8、C1-9、C1-10、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含み得る。例えば、C1-6アルキルには、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、それらに限定されない。アルキルは、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどであるが、それらに限定されない、最大30までの炭素原子を有するアルキル基も意味し得る。アルキル基は、置換されていても無置換でもよい。アルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６３】
「アルケニル」とは、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの二重結合を有する、直鎖または分枝炭化水素を意味する。アルケニルは、C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、およびC6などの、任意の数の炭素を含み得る。アルケニル基は、1、2、3、4、5またはそれ以上を含むが、それらに限定されない、任意の適切な数の二重結合を有し得る。アルケニル基の例には、ビニル（エテニル）、プロペニル、イソプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、イソペンテニル、1,3-ペンタジエニル、1,4-ペンタジエニル、1-ヘキセニル、2-ヘキセニル、3-ヘキセニル、1,3-ヘキサジエニル、1,4-ヘキサジエニル、1,5-ヘキサジエニル、2,4-ヘキサジエニル、または1,3,5-ヘキサトリエニルが含まれるが、それらに限定されない。アルケニル基は置換されていても無置換でもよい。アルケニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６４】
「アルキニル」とは、少なくとも2つの炭素原子および少なくとも1つの三重結合を有する、直鎖または分枝炭化水素のいずれかを意味する。アルキニルは、C2、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C2-7、C2-8、C2-9、C2-10、C3、C3-4、C3-5、C3-6、C4、C4-5、C4-6、C5、C5-6、およびC6などの、任意の数の炭素を含み得る。アルキニル基の例には、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、イソブチニル、sec-ブチニル、ブタジイニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、イソペンチニル、1,3-ペンタジイニル、1,4-ペンタジイニル、1-ヘキシニル、2-ヘキシニル、3-ヘキシニル、1,3-ヘキサジイニル、1,4-ヘキサジイニル、1,5-ヘキサジイニル、2,4-ヘキサジイニル、または1,3,5-ヘキサトリイニルが含まれるが、それらに限定されない。アルキニル基は置換されていても無置換でもよい。アルキニル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６５】
「アルキレン」とは、示された数の炭素原子を有し、かつ少なくとも2つの他の基を連結する、直鎖または分枝、飽和、脂肪族基、すなわち、二価炭化水素基を意味する。アルキレンに連結された2つの部分は、アルキレン基の同じ原子または異なる原子に連結され得る。例えば、直鎖アルキレンは、nが適切な炭素原子の任意の数である、-(CH2)n-の二価の基であり得る。代表的なアルキレン基には、メチレン、エチレン、プロピレン、イソプロピレン、ブチレン、イソブチレン、sec-ブチレン、ペンチレンおよびヘキシレンが含まれるが、それらに限定されない。アルキレン基は置換されていても無置換でもよい。アルキレン基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６６】
「アルケニレン」とは、少なくとも2つの他の基を連結する、前述の定義のアルケニル基、すなわち、二価炭化水素基を意味する。アルケニレンに連結された2つの部分は、アルケニレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。アルケニレン基には、エテニレン、プロペニレン、イソプロペニレン、ブテニレン、イソブテニレン、sec-ブテニレン、ペンテニレンおよびヘキセニレンが含まれるが、それらに限定されない。アルケニレン基は置換されていても無置換でもよい。アルケニレン基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６７】
「アルキニレン」とは、少なくとも2つの他の基を連結する、前述の定義のアルキニル基、すなわち、二価炭化水素基を意味する。アルキニレンに連結された2つの部分は、アルキニレンの同じ原子または異なる原子に連結され得る。アルキニレン基には、エチニレン、プロピニレン、イソプロピニレン、ブチニレン、sec-ブチニレン、ペンチニレンおよびヘキシニレンが含まれるが、それらに限定されない。アルキニレン基は置換されていても無置換でもよい。アルキニレン基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００６８】
「ハロゲン」または「ハロ」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
【００６９】
「アミン」または「アミノ」とは、R基が、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールなどであり得る、-N(R)2基を意味する。R基は同じでも異なっていてもよい。アミノ基は一級（各Rが水素である）、二級（1つのRが水素である）または三級（各Rが水素以外である）であり得る。アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００７０】
「ヒドロキシル」または「ヒドロキシ」とは、-OH基を意味する。ヒドロキシルは任意の適切な炭素原子に存在し得る。
【００７１】
「チオール」とは、-SH基を意味する。チオール基は任意の適切な炭素原子に存在し得る。
【００７２】
「オキソ」とは、二重結合されたO基（=O、-C(O)-）を意味する。オキソ基は任意の適切な炭素原子に存在し得る。
【００７３】
「チオキソ」とは、二重結合されたS基（=S）を意味する。チオキソ基は任意の適切な炭素原子に存在し得る。
【００７４】
「ニトロ」とは、-NO2基を意味する。ニトロ基は任意の適切な炭素原子に存在し得る。
【００７５】
「カルボキシ」とは、式-C(O)OHまたは-CO2Hのカルボン酸基を意味する。
【００７６】
「シクロアルキル」とは、3〜12の環原子、または示された数の原子を含む、飽和または部分不飽和、単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体を意味する。シクロアルキルは、C3-6、C4-6、C5-6、C3-8、C4-8、C5-8、C6-8、C3-9、C3-10、C3-11、およびC3-12などの、任意の数の炭素を含み得る。飽和単環式シクロアルキル環には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロオクチルが含まれる。飽和二環式および多環式シクロアルキル環には、例えば、ノルボルナン、[2.2.2]ビシクロオクタン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが含まれる。シクロアルキル基は、環内に1つまたは複数の二重または三重結合を有する、部分不飽和でもあり得る。部分不飽和である代表的シクロアルキル基には、シクロブテン、シクロペンテン、シクロヘキセン、シクロヘキサジエン（1,3-および1,4-異性体）、シクロヘプテン、シクロヘプタジエン、シクロオクテン、シクロオクタジエン（1,3-、1,4-および1,5-異性体）、ノルボルネン、およびノルボルナジエンが含まれるが、それらに限定されない。シクロアルキルが飽和単環式C3-8シクロアルキルである場合、例示的な基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルおよびシクロオクチルが含まれるが、それらに限定されない。シクロアルキルが飽和単環式C3-6シクロアルキルである場合、例示的な基には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが含まれるが、それらに限定されない。シクロアルキル基は置換されていても無置換でもよい。シクロアルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、チオール、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。例えば、シクロアルキル基は、C1-6アルキルまたはオキソ（=O）などで置換されていてもよい。
【００７７】
「ヘテロシクロアルキル」とは、3〜12の環構成員および1〜4つのN、OおよびSのヘテロ原子を有する、飽和環系を意味する。B、Al、SiおよびPを含むが、それらに限定されない、さらなるヘテロ原子も有用であり得る。ヘテロ原子は酸化されて、例えば、-S(O)-および-S(O)2-を含むがそれらに限定されない部分を形成してもよい。ヘテロシクロアルキル基は、3〜6、4〜6、5〜6、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、3〜9、3〜10、3〜11、または3〜12の環構成員などの、任意の数の環原子を含み得る。1、2、3、もしくは4、または1〜2、1〜3、1〜4、2〜3、2〜4、もしくは3〜4などの、任意の適切な数のヘテロ原子が、ヘテロシクロアルキル基に含まれ得る。ヘテロシクロアルキル基には、アジリジン、アゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、アゼパン、アゾカン、キヌクリジン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン（1,2-、1,3-および1,4-異性体）、オキシラン、オキセタン、テトラヒドロフラン、オキサン（テトラヒドロピラン）、オキセパン、チイラン、チエタン、チオラン（テトラヒドロチオフェン）、チアン（テトラヒドロチオピラン）、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、ジオキソラン、ジチオラン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサン、またはジチアンなどの基が含まれ得る。ヘテロシクロアルキル基は芳香環または非芳香環系に縮合して、インドリンを含むが、それらに限定されない、構成員を形成してもよい。ヘテロシクロアルキル基は無置換でも置換されていてもよい。ヘテロシクロアルキル基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。例えば、ヘテロシクロアルキル基は、C1-6アルキルまたはオキソ（=O）などで置換されていてもよい。
【００７８】
ヘテロシクロアルキル基は、環上の任意の位置で連結され得る。例えば、アジリジンは1-または2-アジリジンであり得、アゼチジンは1-または2-アゼチジンであり得、ピロリジンは1-、2-または3-ピロリジンであり得、ピペリジンは1-、2-、3-または4-ピペリジンであり得、ピラゾリジンは1-、2-、3-、または4-ピラゾリジンであり得、イミダゾリジンは1-、2-、3-または4-イミダゾリジンであり得、ピペラジンは1-、2-、3-または4-ピペラジンであり得、テトラヒドロフランは1-または2-テトラヒドロフランであり得、オキサゾリジンは2-、3-、4-または5-オキサゾリジンであり得、イソキサゾリジンは2-、3-、4-または5-イソキサゾリジンであり得、チアゾリジンは2-、3-、4-または5-チアゾリジンであり得、イソチアゾリジンは2-、3-、4-または5-イソチアゾリジンであり得、かつモルホリンは2-、3-または4-モルホリンであり得る。
【００７９】
ヘテロシクロアルキルが3〜8つの環構成員および1〜3つのヘテロ原子を含む場合、代表的な構成員には、ピロリジン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、オキサン、テトラヒドロチオフェン、チアン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、モルホリン、チオモルホリン、ジオキサンおよびジチアンが含まれるが、それらに限定されない。ヘテロシクロアルキルは、5〜6つの環構成員および1〜2つのヘテロ原子を有する環も形成し得、代表的な構成員にはピロリジン、ピペリジン、テトラヒドロフラン、テトラヒドロチオフェン、ピラゾリジン、イミダゾリジン、ピペラジン、オキサゾリジン、イソキサゾリジン、チアゾリジン、イソチアゾリジン、およびモルホリンが含まれるが、それらに限定されない。
【００８０】
「アリール」とは、任意の適切な数の環原子および任意の適切な数の環を有する、芳香環系を意味する。アリール基は、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15または16の環原子などの、任意の適切な数の環原子、ならびに6〜10、6〜12、または6〜14の環構成員を含み得る。アリール基は単環式であるか、縮合して二環式もしくは三環式基を形成するか、または結合により連結されてビアリール基を形成し得る。代表的アリール基には、フェニル、ナフチルおよびビフェニルが含まれる。他のアリール基には、メチレン連結基を有する、ベンジルが含まれる。フェニル、ナフチルまたはビフェニルなどの、いくつかのアリール基は、6〜12の環構成員を有する。フェニルまたはナフチルなどの、他のアリール基は、6〜10の環構成員を有する。フェニルなどの、他のアリール基は、6つの環構成員を有する。アリール基は置換されていても無置換でもよい。アリール基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００８１】
「ヘテロアリール」とは、環原子の1〜5つはN、OまたはSなどのヘテロ原子である、5〜16の環原子を含む、単環式または縮合二環式もしくは三環式芳香環集合体を意味する。B、Al、SiおよびPを含むが、それらに限定されない、さらなるヘテロ原子も有用であり得る。ヘテロ原子は酸化されて、例えば、-S(O)-および-S(O)2-を含むがそれらに限定されない部分を形成してもよい。ヘテロアリール基は、3〜6、4〜6、5〜6、3〜8、4〜8、5〜8、6〜8、3〜9、3〜10、3〜11、または3〜12の環構成員などの、任意の数の環原子を含み得る。1、2、3、4、もしくは5、または1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、2〜3、2〜4、2〜5、3〜4、もしくは3〜5などの、任意の適切な数のヘテロ原子が、ヘテロアリール基に含まれ得る。ヘテロアリール基は、5〜8つの環構成員および1〜4つのヘテロ原子、または5〜8つの環構成員および1〜3つのヘテロ原子、または5〜6つの環構成員および1〜4つのヘテロ原子、または5〜6つの環構成員および1〜3つのヘテロ原子を有し得る。ヘテロアリール基には、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、テトラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（1,2,3-、1,2,4-および1,3,5-異性体）、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾールなどの基が含まれ得る。ヘテロアリール基は、フェニル環などの芳香環系に縮合して、ベンゾピロール、例えば、インドールおよびイソインドール、ベンゾピリジン、例えば、キノリンおよびイソキノリン、ベンゾピラジン（キノキサリン）、ベンゾピリミジン（キナゾリン）、ベンゾピリダジン、例えば、フタラジンおよびシンノリン、ベンゾチオフェン、ならびにベンゾフランを含むが、それらに限定されない、構成員を形成してもよい。他のヘテロアリール基には、ビピリジンなどの、結合により連結されたヘテロアリール環が含まれる。ヘテロアリール基は置換されていても無置換でもよい。ヘテロアリール基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００８２】
ヘテロアリール基は、環上の任意の位置で連結され得る。例えば、ピロールは1-、2-および3-ピロールを含み、ピリジンは2-、3-および4-ピリジンを含み、イミダゾールは1-、2-、4-および5-イミダゾールを含み、ピラゾールは1-、3-、4-および5-ピラゾールを含み、トリアゾールは1-、4-および5-トリアゾールを含み、テトラゾールは1-および5-テトラゾールを含み、ピリミジンは2-、4-、5-および6-ピリミジンを含み、ピリダジンは3-および4-ピリダジンを含み、1,2,3-トリアジンは4-および5-トリアジンを含み、1,2,4-トリアジンは3-、5-および6-トリアジンを含み、1,3,5-トリアジンは2-トリアジンを含み、チオフェンは2-および3-チオフェンを含み、フランは2-および3-フランを含み、チアゾールは2-、4-および5-チアゾールを含み、イソチアゾールは3-、4-および5-イソチアゾールを含み、オキサゾールは2-、4-および5-オキサゾールを含み、イソキサゾールは3-、4-および5-イソキサゾールを含み、インドールは1-、2-および3-インドールを含み、イソインドールは1-および2-イソインドールを含み、キノリンは2-、3-および4-キノリンを含み、イソキノリンは1-、3-および4-イソキノリンを含み、キナゾリンは2-および4-キノアゾリン（quinoazoline）を含み、シンノリンは3-および4-シンノリンを含み、ベンゾチオフェンは2-および3-ベンゾチオフェンを含み、かつベンゾフランは2-および3-ベンゾフランを含む。
【００８３】
いくつかのヘテロアリール基には、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（1,2,3-、1,2,4-および1,3,5-異性体）、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、イソキサゾール、インドール、イソインドール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、フタラジン、シンノリン、ベンゾチオフェン、およびベンゾフランなどの、5〜10の環構成員およびN、OまたはSを含む1〜3つの環原子を有するものが含まれる。他のヘテロアリール基には、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、トリアジン（1,2,3-、1,2,4-および1,3,5-異性体）、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾール基などの、5〜8つの環構成員および1〜3つのヘテロ原子を有するものが含まれる。いくつかの他のヘテロアリール基には、インドール、イソインドール、キノリン、イソキノリン、キノキサリン、キナゾリン、フタラジン、シンノリン、ベンゾチオフェン、ベンゾフランおよびビピリジンなどの、9〜12の環構成員および1〜3つのヘテロ原子を有するものが含まれる。さらに他のヘテロアリール基には、ピロール、ピリジン、イミダゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、チオフェン、フラン、チアゾール、イソチアゾール、オキサゾール、およびイソキサゾールなどの、5〜6つの環構成員およびN、OまたはSを含む1〜2つの環原子を有するものが含まれる。
【００８４】
「(シクロアルキル)アルキル」とは、アルキル構成要素およびシクロアルキル構成要素を有する基であって、アルキル構成要素がシクロアルキル構成要素を結合点に連結する基を意味する。アルキル構成要素は、それがシクロアルキル構成要素および結合点に連結するために、少なくとも二価、すなわちアルキレンであることを除き、前述の定義のとおりである。アルキル構成要素は、C1-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含み得る。シクロアルキル構成要素は、この中の定義のとおりである。例示的な(シクロアルキル)アルキル基には、メチル-シクロプロピル、メチル-シクロブチル、メチル-シクロペンチルおよびメチル-シクロヘキシルが含まれるが、それらに限定されない。
【００８５】
「(ヘテロシクロアルキル)アルキル」とは、アルキル構成要素およびヘテロシクロアルキル構成要素を有する基であって、アルキル構成要素がヘテロシクロアルキル構成要素を結合点に連結する基を意味する。アルキル構成要素は、それがヘテロシクロアルキル構成要素および結合点に連結するために、少なくとも二価、すなわちアルキレンであることを除き、前述の定義のとおりである。アルキル構成要素は、C0-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含み得る。ヘテロシクロアルキル構成要素は前述の定義のとおりである。(ヘテロシクロアルキル)アルキル基は置換されていても無置換でもよい。
【００８６】
「アリールアルキル」とは、アルキル構成要素およびアリール構成要素を有する基であって、アルキル構成要素がアリール構成要素を結合点に連結する基を意味する。アルキル構成要素は、それがアリール構成要素および結合点に連結するために、少なくとも二価、すなわちアルキレンであることを除き、前述の定義のとおりである。アルキル構成要素は、C0-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含み得る。アリール構成要素は前述の定義のとおりである。アリールアルキル基の例には、ベンジルおよびエチル-ベンゼンが含まれるが、それらに限定されない。アリールアルキル基は置換されていても無置換でもよい。
【００８７】
「ヘテロアリールアルキル」とは、アルキル構成要素およびヘテロアリール構成要素を有する基であって、アルキル構成要素がヘテロアリール構成要素を結合点に連結する基を意味する。アルキル構成要素は、それがヘテロアリール構成要素および結合点に連結するために、少なくとも二価、すなわちアルキレンであることを除き、前述の定義のとおりである。アルキル構成要素は、C0-6、C1-2、C1-3、C1-4、C1-5、C1-6、C2-3、C2-4、C2-5、C2-6、C3-4、C3-5、C3-6、C4-5、C4-6およびC5-6などの、任意の数の炭素を含み得る。ヘテロアリール構成要素はこの中の定義のとおりである。ヘテロアリールアルキル基は置換されていても無置換でもよい。
【００８８】
「カルボキシアルキル」とは、前述のアルキルに連結されたカルボキシ基であって、一般には式-C1-8アルキル-C(O)OHを有する基を意味する。任意の適切なアルキル鎖が有用である。カルボキシアルキル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００８９】
「アシル」とは、結合点にオキソ置換炭素を含むアルキル（-C(O)-C1-8アルキル）を意味する。任意の適切なアルキル鎖が有用である。アシル基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。
【００９０】
「ヒドロキシアルキル」とは、水素原子の少なくとも1つがヒドロキシ基で置き換えられている、前述の定義のアルキル基を意味する。アルキル基に関して、ヒドロキシアルキル基は、C1-6などの、任意の適切な数の炭素原子を有し得る。例示的なヒドロキシアルキル基には、ヒドロキシ-メチル、ヒドロキシエチル（ヒドロキシは1-または2-位にある）、ヒドロキシプロピル（ヒドロキシは1-、2-または3-位にある）、ヒドロキシブチル（ヒドロキシは1-、2-、3-または4-位にある）、ヒドロキシペンチル（ヒドロキシは1-、2-、3-、4-または5-位にある）、ヒドロキシヘキシル（ヒドロキシは1-、2-、3-、4-、5-または6-位にある）、1,2-ジヒドロキシエチルなどが含まれるが、それらに限定されない。ヒドロキシアルキル基は、ハロ、チオール、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。当業者であれば、他のヒドロキシアルキル基も本発明において有用であることを理解するであろう。
【００９１】
「アルコキシ」とは、少なくとも1つの架橋酸素原子を有するアルキル基を意味する。架橋酸素原子はアルキル鎖内の任意の場所であり得（アルキル-O-アルキル）、または架橋酸素原子はアルキル基を結合点に連結し得る（アルキル-O-）。いくつかの態様において、架橋酸素原子は、末端ヒドロキシ基（例えば、-OH）としては存在しない。いくつかの場合において、アルコキシは1、2、3、4、または5つの架橋酸素原子を含む。アルキル基に関して、アルコキシ基は、C1-2、C1-4、およびC1-6などの、任意の適切な数の炭素原子を有し得る。アルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ-プロポキシ、メチルオキシ-エチルオキシ-エチル（C1-O-C2-O-C2-）などが含まれる。アルコキシ基の一例は、ポリエチレングリコール（PEG）であって、ポリエチレングリコール鎖は2〜20のエチレングリコールモノマーを含み得る。アルコキシ基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、チオール、アルキルアミノ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。アルコキシ基は置換されていても無置換でもよい。
【００９２】
「アルキルアミノ」とは、1つまたは複数のアミノ基を有する、この中の定義のアルキル基を意味する。アミノ基は一級、二級または三級であり得る。本発明において有用なアルキルアミノ基には、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミンおよびエタノールアミンが含まれるが、それらに限定されない。アミノ基は、アルキル基のいかなる位置にあっても、アルキルアミノを化合物の残部との結合点に連結し得、またはアルキル基の少なくとも2つの炭素原子を一緒に連結し得る。アルキルアミノ基は、ハロ、ヒドロキシ、チオール、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。当業者であれば、本発明において他のアルキルアミノも有用であることを理解するであろう。
【００９３】
「アルキルチオ」とは、1つまたは複数のチオール基を有する、この中の定義のアルキル基を意味する。本発明において有用なアルキルチオ基には、エチルチオール、プロピルチオール、およびイソプロピルチオールが含まれるが、それらに限定されない。チオール基は、アルキル基のいかなる位置にあっても、アルキルチオを化合物の残部との結合点に連結し得、またはアルキル基の少なくとも2つの炭素原子を一緒に連結し得る。アルキルチオ基は、ハロ、ヒドロキシ、アミノ、アルキルアミノ、アルコキシ、ハロアルキル、カルボキシ、アミド、ニトロ、オキソ、チオキソ、およびシアノから選択される1つまたは複数の部分で置換されていてもよい。当業者であれば、本発明において他のアルキルチオも有用であることを理解するであろう。
【００９４】
「オキシエチル」なる用語は、式?OCH2CH2-を有する二価の基を意味する。
【００９５】
「波線」なる用語は、置換基の分子の残部への結合点を示す。波線が特定の環原子に特に付加していると示されない場合、結合点は置換基の任意の適切な原子に対してであり得る。例えば、以下の構造：
2020516652.tif 000018
の中の波線は、結合点として、任意の置換可能な原子を含むことが意図される。
【００９６】
「再生医学」なる用語は、正常な機能を回復または確立するために、ヒト細胞、組織、または臓器を置き換える、操作する、または再生する方法を扱う、医学の部門を意味する。いくつかの態様において、再生医学は、体がそれ自体を直すことができない場合に、組織および臓器を実験室で成長させ、それらを安全に移植することを含む。
【００９７】
「過冷却」なる用語は、転移を生じることなく物質を相転移温度より低く冷却するプロセスを意味する。例えば、過冷却は、凝固または結晶化することなく液体の温度を氷点より低く下げるプロセスを意味することもできる。
【００９８】
「生物工学によって作製された組織」なる用語は、再生医学の目的のために作製された、1つまたは複数の合成的に作製された細胞、組織、または臓器を意味する。いくつかの態様において、生物工学によって作製された組織とは、実験室で発生させた細胞、組織、または臓器を意味する。いくつかの態様において、生物工学によって作製された組織とは、実験室由来の心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、角膜、幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞、造血幹細胞）、リンパ球、顆粒球、免疫系細胞、骨細胞、原形質類器官、胚細胞、卵母細胞、精細胞、血小板、神経細胞、またはその組み合わせを意味する。
【００９９】
「凍結保護剤溶液」なる用語は、氷晶形成によって引き起こされる凍結損傷を低減または防止するために用いられる溶液を意味する。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、本明細書に記載の1つまたは複数のペプトイドポリマーを含む。他の態様において、凍結保護剤溶液は、本明細書に記載の1つまたは複数のペプトイドポリマーおよび1つまたは複数のペプトイド-ペプチドハイブリッドを含む。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は生体試料を凍結損傷から保護する。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は非生体試料を氷晶形成から保護する。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は生体試料を、それが低温にさらされなかった場合よりも長い期間保存する。
【０１００】
「ガラス化する」および「ガラス化」なる用語は、物質のガラス（すなわち、非結晶アモルファス固体）への変換を意味する。水の文脈において、ガラス化とは、氷晶形成をもたらす通常の凍結とは対照的に、氷晶の形成なしに水がガラスへと変換することを意味する。ガラス化はしばしば、非常に急速な冷却および/または氷晶形成を抑制する作用物質の導入によって達成される。一方で、「脱ガラス化する」および「脱ガラス化」とは、以前は無結晶（アモルファス）であったガラスにおける結晶化の工程を意味する。水氷の文脈において、脱ガラス化は、以前は非結晶アモルファスであった固体が融解を起こす際の、氷晶の形成を意味し得る。
【０１０１】
「ペプトイドポリマー」または「ペプトイド」なる用語は、アミド窒素原子上に置換基「R1」を有する、約2〜1,000（例えば、約2〜1,000、2〜950、2〜900、2〜850、2〜800、2〜750、2〜700、2〜650、2〜600、2〜550、2〜500、2〜450、2〜400、2〜350、2〜300、2〜250、2〜200、2〜150、2〜100、2〜90、2〜80、2〜70、2〜60、2〜50、2〜40、2〜30、2〜20、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、2〜4、または2〜3）のペプチドモノマーのポリアミドを意味する。任意で、第二の独立に選択された置換基「R2」が、カルボニル基に対してαの炭素原子に連結（すなわち、α-炭素原子に連結）されていてもよい。R2は、Hであり得るが、それに限定されない。特定の場合において、ペプトイドは、α-炭素原子に連結されていたであろう側鎖が代わりにアミド窒素原子に連結されている、ペプチドの合成類縁体である。一般的に、ペプトイドは、異なる化学的機能を有する多様な側鎖を含むために、自動固相有機合成によって作製し得る、モノマー配列および長さが制御された合成ポリマーである。ペプトイドモノマー中のアミド窒素原子に結合されたR1基には、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、置換されていてもよいカルボキシアルキル、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(C3-10シクロアルキル)アルキル、(ヘテロシクロアルキル)アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキル基が含まれ得るが、それらに限定されず、ここで、任意のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、またはヘテロアリール基は、1つまたは複数の「R3」基で独立に置換されていてもよい。各R3基は、ハロゲン、オキソ、チオキソ、-OH、-SH、スルホンアミド、アミノ、C1-8アルキル、C1-8ヒドロキシアルキル、C1-8アルキルアミノ、またはC1-8アルキルチオ基から独立に選択され得る。さらに、R1基は、任意のアミノ酸アラニン（Ala）、システイン（Cys）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、フェニルアラニン（Phe）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、アルギニン（Arg）、リシン（Lys）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asn）、プロリン（Pro）、グルタミン（Gln）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、バリン（Val）、トリプトファン（Trp）、またはチロシン（Tyr）の側鎖を含み得る。この用語は遊離アミン形態も塩形態も含む。
【０１０２】
「極性ペプトイドモノマー」および「極性側鎖を有するペプトイドモノマー」なる用語は、置換基「R1」が極性側鎖であるか、またはR1および置換基「R2」の両方が極性側鎖である、ペプトイドモノマーを指すために交換可能に用いられる。 一般に、極性側鎖は、ヒドロキシル基および/または水素結合に関与し得る原子（例えば、硫黄、窒素、酸素）を含む。いくつかの場合に、極性側鎖は、本質的に極性よりも疎水性である原子または基（例えば、芳香環）を含む。これらの場合、側鎖は、側鎖全体が疎水性よりも極性であるような原子または基も含む。非限定例として、極性側鎖は、1つまたは複数のヒドロキシル基が連結している芳香環を含み得る。
【０１０３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、Nop、Nhp、Nhe、Ndp、Nyp、Nep、Ndh、およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。
【０１０４】
「疎水性ペプトイドモノマー」および「疎水性側鎖を有するペプトイドモノマー」なる用語は、置換基「R1」が疎水性側鎖である（例えば、極性ではない）か、またはR1および置換基「R2」の両方が疎水性側鎖である、ペプトイドモノマーを指すために交換可能に用いられる。一般に、疎水性側鎖は、無置換アルキル、無置換シクロアルキル、または無置換芳香族基を含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、Nsb、Nib、Nbu、Npr、Nip、Nme、およびその組み合わせからなる群より選択される1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーを含む。
【０１０６】
「ペプトイド-ペプチドハイブリッド」なる用語は、ペプトイドモノマー単位とα-アミノ酸（すなわち、ペプチド単位）との両方で構成されるオリゴマーを意味する。この用語は遊離アミン形態も塩形態も含む。
【０１０７】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」なる用語は、アミノ酸残基のポリマー、またはアミノ酸残基の複数のポリマーの集合体を指すために、本明細書において交換可能に用いられる。
【０１０８】
「アミノ酸」なる用語には、天然α-アミノ酸およびそれらの立体異性体が含まれるが、それらに限定されない。アミノ酸の「立体異性体」とは、L-アミノ酸またはD-アミノ酸などの、アミノ酸の鏡像異性体を意味する。例えば、天然アミノ酸の立体異性体とは、天然アミノ酸の鏡像異性体（すなわち、D-アミノ酸）を意味する。
【０１０９】
天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に改変されているアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン）である。天然α-アミノ酸には、アラニン（Ala）、システイン（Cys）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、フェニルアラニン（Phe）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asn）、プロリン（Pro）、グルタミン（Gln）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、バリン（Val）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。天然α-アミノ酸の立体異性体には、D-アラニン（D-Ala）、D-システイン（D-Cys）、D-アスパラギン酸（D-Asp）、D-グルタミン酸（D-Glu）、D-フェニルアラニン（D-Phe）、D-ヒスチジン（D-His）、D-イソロイシン（D-Ile）、D-アルギニン（D-Arg）、D-リジン（D-Lys）、D-ロイシン（D-Leu）、D-メチオニン（D-Met）、D-アスパラギン（D-Asn）、D-プロリン（D-Pro）、D-グルタミン（D-Gln）、D-セリン（D-Ser）、D-スレオニン（D-Thr）、D-バリン（D-Val）、D-トリプトファン（D-Trp）、D-チロシン（D-Tyr）、およびその組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【０１１０】
アミノ酸は、本明細書において、それらの一般に公知の三文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨される一文字記号のいずれかで示し得る。例えば、L-アミノ酸は本明細書においてその一般に公知の三文字記号（例えば、L-アルギニンのArg）または大文字の一文字アミノ酸記号（例えば、L-アルギニンのR）で表し得る。D-アミノ酸は本明細書においてその一般に公知の三文字記号（例えば、D-アルギニンのD-Arg）または小文字の一文字アミノ酸記号（例えば、D-アルギニンのr）で表し得る。
【０１１１】
III.  態様の詳細な説明
本明細書において提供するのは、例えば、組織または臓器に存在する細胞などの細胞集団を凍結保存する方法である。いくつかの局面において、この方法は、細胞集団を、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーと接触させる段階、および細胞集団を所望の期間、例えば少なくとも0℃〜約-20℃の温度に約3時間冷却する段階を含む。本発明の過冷却法は、移植に適した組織および臓器のすぐれた解凍後細胞生存および回復を有利に提供する。
【０１１２】
A.  ペプトイドポリマー
いくつかの局面において、本明細書において提供するのは式（I）のペプトイドポリマー、その互変異性体、またはその立体異性体である：
2020516652.tif 000019
式中：
各R1は独立して、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18 ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、置換されていてもよいカルボキシアルキル、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(C3-10シクロアルキル)アルキル、(ヘテロシクロアルキル)アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より選択され、
ここで、少なくとも1つの場合のR1はC1-18ヒドロキシアルキルであり、かつ
ここで、任意のシクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は独立して、1つまたは複数のR3基で置換されていてもよく；
各R2は独立して、H、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、および置換されていてもよいカルボキシアルキルからなる群より選択され；
各R3は独立して、ハロゲン、オキソ、チオキソ、-OH、-SH、アミノ、C1-8アルキル、 C1-8ヒドロキシアルキル、C1-8アルキルアミノ、およびC1-8アルキルチオからなる群より選択され；
XおよびYは独立して、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒に共有結合を形成し；かつ
下付き文字nは、ポリマー中のモノマーの数を表して、2〜50である。
【０１１３】
いくつかの態様において、nが3〜7であるとき、すべての場合のR1はヒドロキシエチルではない。いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1は下記からなる群より選択される：
2020516652.tif 000020
式中：mは1〜8であり；かつR3は、H、C1-8アルキル、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、アミン、オキソ、およびチオキソからなる群より選択される。いくつかの態様において、反復単位、mは1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、または1〜7であり得る。いくつかの態様において、反復単位、mは1、2、3、4、5、6、7、または8である。
【０１１４】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1モノマーは、R1a：
2020516652.tif 000021
の構造を有する。
【０１１５】
いくつかの態様において、各R1a基は独立して、
2020516652.tif 000022
から選択される。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、このモノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１１６】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1モノマーは、R1b：
2020516652.tif 000023
の構造を有する。
【０１１７】
いくつかの態様において、各R1b基は独立して、
2020516652.tif 000024
から選択される。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、このモノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１１８】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1モノマーは、R1c：
2020516652.tif 000025
の構造を有する。
【０１１９】
いくつかの態様において、各R1c基は独立して、
2020516652.tif 000026
から選択される。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、このモノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１２０】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1モノマーは、R1d：
2020516652.tif 000027
の構造を有する。
【０１２１】
いくつかの態様において、各R1d基は独立して、
2020516652.tif 000028
から選択される。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、このモノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１２２】
いくつかの態様において、1つまたは複数のR1モノマーは、R1e：
2020516652.tif 000029
の構造を有する。
【０１２３】
いくつかの態様において、各R1e基は独立して、
2020516652.tif 000030
から選択される。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、このモノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１２４】
本明細書における任意のモノマーが立体化学を示さないときはいつでも、任意の立体異性体を用い得る。いくつかの態様において、2つの立体異性体の混合物が選択される。立体異性体の混合物を含む態様において、ペプトイドポリマー中のモノマーのR立体異性体とS立体異性体との比は、約95：5〜約90：10、約90：10〜約85：15、約85：15〜約80：20、約80：20〜約75：25、約75：25〜約70：30、約70：30〜約65：35、約65：35〜約60：40、約60：40〜約55：45、約55：45〜約50：50、約50：50〜約45：55、約45：55〜約40：60、約40：60〜約35：65、約35：65〜約30：70、約30：70〜約25：75、約25：75〜約20：80、約20：80〜約15：85、約15：85〜約10：90、または約10：90〜約5：95の範囲であり得る。いくつかの態様において、モノマーのR立体異性体だけが選択される。いくつかの態様において、モノマーのS立体異性体だけが選択される。
【０１２５】
特定の立体化学がくさびまたは破線で示されるときはいつでも、モノマーは実質的に他の立体異性体を含まない。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも70％の純度を意味する。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも80％の純度を意味する。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも90％の純度を意味する。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも95％の純度を意味する。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも99％の純度を意味する。いくつかの態様において、実質的に含まないとは少なくとも99.9％の純度を意味する。
【０１２６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1は下記からなる群より選択される：
2020516652.tif 000031
。
【０１２７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の場合のR1は、独立に選択されたC1-18ヒドロキシアルキル基（例えば、独立に選択されたC1-6ヒドロキシアルキル基）である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の各場合のR1はC1-18ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1はC1-6ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1は同じC1-6ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、各場合のR1はヒドロキシアルキル基であり、ここで、各ヒドロキシアルキル基中のアルキルの長さは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18またはそれ以上の炭素原子から選択される。いくつかの態様において、ヒドロキシアルキル基は、1、2、3、4、5、6、7、または8つのヒドロキシ置換基を含む。いくつかの態様において、各場合のR1は：
2020516652.tif 000032
である。
【０１２８】
いくつかの態様において、各場合のR2はHである。いくつかの態様において、少なくとも1つのR2はハロゲンである。
【０１２９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、3〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、5〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、6〜20である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜25である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、8〜20である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、約10〜約28、約12〜約26、約14〜約24、約16〜約22、または約18〜約20であり得る。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、約8〜約50、約8〜約45、約8〜約40、約8〜約35、約8〜約30、約10〜約25、約10〜約20、または約10〜約15であり得る。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13 ,14 、15、16 、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50であり得る。
【０１３０】
いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、またはハロゲンである。いくつかの態様において、Xはアセチル基である。いくつかの態様において、Yはカルボキシである。
【０１３１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーのXおよびYは一緒に共有結合を形成する。XとYとの間の共有結合の形成は、以下に示すとおり、末端NR1基および末端C=O基が連結されている、ペプトイドポリマーの環状化型をもたらす。
2020516652.tif 000033
【０１３２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、表1に示すモノマーの群より選択されるモノマー単位からなる。当業者であれば、本発明の範囲は表1に挙げるモノマーに限定されないこと、および任意の有用なN-置換置換基はN-置換ペプトイドモノマーとして使用し得ることを理解するであろう。いくつかの態様において、N-置換ペプトイドモノマー上のN-置換置換基は、アミノ酸アラニン（Ala）、システイン（Cys）、アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、フェニルアラニン（Phe）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、アルギニン（Arg）、リジン（Lys）、ロイシン（Leu）、メチオニン（Met）、アスパラギン（Asn）、プロリン（Pro）、グルタミン（Gln）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、バリン（Val）、トリプトファン（Trp）、またはチロシン（Tyr）の任意の側鎖である。
【０１３３】
【表１】
2020516652.tif 000034
2020516652.tif 000035
【０１３４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、表2、表3、表4、表5、表6、表7、表8、または表9に示すペプトイドポリマーの群より選択される。
【０１３５】
【表２】
2020516652.tif 000036
【０１３６】
【表３】
2020516652.tif 000037
【０１３７】
【表４】
2020516652.tif 000038
【０１３８】
【表５】
2020516652.tif 000039
【０１３９】
【表６】
2020516652.tif 000040
【０１４０】
【表７】
2020516652.tif 000041
【０１４１】
【表８】
2020516652.tif 000042
【０１４２】
【表９】
2020516652.tif 000043
【０１４３】
【表１０】
2020516652.tif 000044
2020516652.tif 000045
2020516652.tif 000046
2020516652.tif 000047
【０１４４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNsbモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNsbモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNsbモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNsbモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNsbモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNsbモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNsbモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNsbモノマー、8つのNhpモノマーと2つのNsbモノマー、9つのNhpモノマーと1つのNsbモノマー、または10のNhpモノマーを含む。
【０１４５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは配列
2020516652.tif 000048
を有し、ここで、XはHまたはC1-8アシルであり、かつYは-OHまたは-NH2またはC1-8アルキルである。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは配列
2020516652.tif 000049
を有し、ここで、XはHまたはC1-8アシルであり、かつYは-OHまたは-NH2またはC1-8アルキルである。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは配列
2020516652.tif 000050
を有し、ここで、XはHまたはC1-8アシルであり、かつYは-OHまたは-NH2またはC1-8アルキルである。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは配列
2020516652.tif 000051
を有し、ここで、XはHまたはC1-8アシルであり、かつYは-OHまたは-NH2またはC1-8アルキルである。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは配列
2020516652.tif 000052
を有し、ここで、XはHまたはC1-8アシルであり、かつYは-OHまたは-NH2またはC1-8アルキルである。いくつかの態様において、Yは二級アミンまたは三級アミンである。
【０１４６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNmeモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNmeモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNmeモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNmeモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNmeモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNmeモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNmeモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNmeモノマー、および8つのNhpモノマーと2つのNmeモノマー、または9つのNhpモノマーと1つのNmeモノマーを含む。
【０１４７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：1つのNheモノマーと9つのNsbモノマー、2つのNheモノマーと8つのNsbモノマー、3つのNheモノマーと7つのNsbモノマー、4つのNheモノマーと6つのNsbモノマー、5つのNheモノマーと5つのNsbモノマー、6つのNheモノマーと4つのNsbモノマー、7つのNheモノマーと3つのNsbモノマー、8つのNheモノマーと2つのNsbモノマー、9つのNheモノマーと1つのNsbモノマー、または10のNheモノマーを含む。
【０１４８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNbuモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNbuモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNbuモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNbuモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNbuモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNbuモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNbuモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNbuモノマー、8つのNhpモノマーと2つのNbuモノマー、または9つのNhpモノマーと1つのNbuモノマーを含む。
【０１４９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNibモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNibモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNibモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNibモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNibモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNibモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNibモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNibモノマー、8つのNhpモノマーと2つのNibモノマー、または9つのNhpモノマーと1つのNibモノマーを含む。
【０１５０】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNprモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNprモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNprモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNprモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNprモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNprモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNprモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNprモノマー、8つのNhpモノマーと2つのNprモノマー、または9つのNhpモノマーと1つのNprモノマーを含む。
【０１５１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、10であり、かつペプトイドポリマーは：10のNipモノマー、1つのNhpモノマーと9つのNipモノマー、2つのNhpモノマーと8つのNipモノマー、3つのNhpモノマーと7つのNipモノマー、4つのNhpモノマーと6つのNipモノマー、5つのNhpモノマーと5つのNipモノマー、6つのNhpモノマーと4つのNipモノマー、7つのNhpモノマーと3つのNipモノマー、8つのNhpモノマーと2つのNipモノマー、または9つのNhpモノマーと1つのNipモノマーを含む。
【０１５２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、14であり、かつペプトイドポリマーは：6つのNhpモノマーと8つのNsbモノマー、7つのNhpモノマーと7つのNsbモノマー、8つのNhpモノマーと6つのNsbモノマー、10のNhpモノマーと4つのNsbモノマー、または14のNhpモノマーを含む。
【０１５３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、14であり、かつペプトイドポリマーは：6つのNhpモノマーと8つのNibモノマー、7つのNhpモノマーと7つのNibモノマー、8つのNhpモノマーと6つのNibモノマー、10のNhpモノマーと4つのNibモノマー、または14のNhpモノマーを含む。
【０１５４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、16であり、かつペプトイドポリマーは：5つのNhpモノマーと11のNsbモノマー、7つのNhpモノマーと9つのNsbモノマー、8つのNhpモノマーと8つのNsbモノマー、10のNhpモノマーと6つのNsbモノマー、12のNhpモノマーと4つのNsbモノマー、または16のNhpモノマーを含む。
【０１５５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長nは、22であり、かつペプトイドポリマーは：7つのNhpモノマーと15のNsbモノマー、10のNhpモノマーと12のNsbモノマー、11のNhpモノマーと11のNsbモノマー、14のNhpモノマーと8つのNsbモノマー、17のNhpモノマーと5つのNsbモノマー、または22のNhpモノマーを含む。
【０１５６】
他の局面において、本明細書において提供するのは、ペプトイドポリマーが配列[HaPb]nまたは[PbHa]nを有するように配置された1つまたは複数の第1の疎水性ペプトイドモノマーHと1つまたは複数の第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニットを含むペプトイドポリマーであり、ここで、下付き文字aはサブユニット内の連続した第1の疎水性ペプトイドモノマーの数を表し、下付き文字bはサブユニット内の連続した第1の極性ペプトイドモノマーの数を表し、かつ下付き文字nはペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す。いくつかの態様において、aは1〜10である（例えば、aは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。他の態様において、bは1〜10である（例えば、bは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの場合に、aは1〜5である。他の場合に、bは1〜5である。特定の場合に、aは1〜3であり、bは1〜3である。
【０１５７】
いくつかの態様において、nは2〜50である（例えば、nは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50である）。いくつかの場合に、nは2〜10である（例えば、nは2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、nは3〜25である。いくつかの態様において、nは5〜25である。いくつかの態様において、nは8〜50である。いくつかの態様において、nは8〜25である。いくつかの態様において、nは8〜20である。いくつかの態様において、nは約10〜約28、約12〜約26、約14〜約24、約16〜約22、または約18〜約20であり得る。いくつかの態様において、nは約8〜約50、約8〜約45、約8〜約40、約8〜約35、約8〜約30、約10〜約25、約10〜約20、または約10〜約15であり得る。
【０１５８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は6〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は10〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は16〜100である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は16〜50である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は16〜40である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は約20〜約56、約24〜約52、約28〜約48、約32〜約44、または約36〜約40であり得る。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は約16〜約100、約16〜約90、約16〜約80、約16〜約70、約16〜約60、約20〜約50、約20〜約40、または約20〜約30であり得る。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーの配列長は4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、またはそれ以上であり得る。
【０１５９】
ペプトイドポリマー中に複数の疎水性ペプトイドモノマーが存在する場合、すべての疎水性ペプトイドモノマーは同じであってもよく、すべて異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。同様に、ペプトイドポリマー中に複数の極性ペプトイドモノマーが存在する場合、すべての極性ペプトイドモノマーは同じであってもよく、すべて異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。
【０１６０】
いくつかの態様において、サブユニットは、ペプトイドポリマーが配列[HaPbHcPd]nまたは[PbHaPdHc]nを有するような第2の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または第2の極性ペプトイドモノマーをさらに含み、ここで、下付き文字cはサブユニット内の連続した第2の疎水性ペプトイドモノマーの数を表し、かつ下付き文字dはサブユニット内の連続した第2の極性ペプトイドモノマーの数を表す。いくつかの態様において、cは0〜10である（例えば、cは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。他の態様において、dは0〜10である（例えば、dは0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。特定の態様において、cおよびdの両方が0であることはない。いくつかの場合に、cは0〜5である。他の場合に、dは0〜5である。
【０１６１】
非限定例として、本発明のペプトイドポリマーのサブユニットは配列HP、PH、HHPP、PPHH、HPHP、PHPH、HPPH、PHHP、HHP、PHH、HPP、PPH、HPPP、PPPH、HHPPHH、PPHHPP、HHHPPP、PPPHHH、HHHP、PHHH、HHHPPPHHH、またはPPPHHHPPPを含み得る。aが1であり、かつbが1である場合、サブユニットは配列HPまたはPHを含み得る。aが2であり、かつbが2である場合、サブユニットは配列HHPPまたはPPHHを含み得る。aが1であり、かつbが2である場合、サブユニットは配列HPPまたはPPHを含み得る。aが2であり、かつbが1である場合、サブユニットは配列HHPまたはPHHを含み得る。aが1であり、かつbが3である場合、サブユニットは配列HPPPまたはPPPHを含み得る。aが3であり、かつbが1である場合、サブユニットは配列HHHPまたはPHHHを含み得る。aが3であり、かつbが3である場合、サブユニットは配列HHHPPPまたはPPPHHHを含み得る。
【０１６２】
さらなる非限定例として、a、b、c、およびdが1である場合、サブユニットは配列HPHPまたはPHPHを含み得るが、これらの配列はそれぞれ式 [H1P1]2および[P1H1]2により表すこともでき、ここで、nは2である。aが1であり、bが2であり、cが1であり、かつdが0である場合、サブユニットは配列HPPHを含み得る。aが2であり、bが1であり、cが0であり、かつdが1である場合、サブユニットは配列PHHP（すなわち、P1H2P1H0）を含み得る。a、b、およびcが2であり、かつdが0である場合、サブユニットは配列HHPPHHを含み得る。a、b、およびdが2であり、かつcが0である場合、サブユニットは配列PPHHPP（すなわち、P2H2P2H0）を含み得る。a、b、およびcが3であり、かつdが0である場合、サブユニットは配列HHHPPPHHHを含み得る。a、b、およびdが3であり、かつcが0である場合、サブユニットは配列PPPHHHPPP（すなわち、P3H3P3H0）を含み得る。
【０１６３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列X-[HaPb]n-Y、X-[PbHa]n-Y、X-[HaPbHcPd]n-Y、またはX-[PbHaPdHc]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含む。XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択される。いくつかの態様において、Xはアセチル基である。いくつかの態様において、Yはカルボキシである。または、XおよびYは一緒になって共有結合を形成する。XとYとの間の共有結合の形成は、ペプトイドポリマーの環化形態をもたらす。
【０１６４】
いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、またはハロゲンである。他の態様において、XまたはYは二級アミンまたは三級アミンである。
【０１６５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、1つもしくは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または1つもしくは複数の極性ペプトイドモノマーを含む配列Zをさらに含む。Zは、第1のサブユニットの前、最後のサブユニットの後、および/または1つもしくは複数のサブユニットの間に位置する。いくつかの場合に、Zは1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーを含む。他の場合に、Zは1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。特定の場合に、Zは1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。Zはいくつかの隣接する疎水性ペプトイドモノマーと、続いていくつかの隣接する極性ペプトイドモノマーを含み得、逆もまた同じである。または、Zはいくつかの隣接する疎水性ペプトイドモノマーと、続いていくつかの隣接する極性ペプトイドモノマーと、続いてさらなる疎水性ペプトイドモノマーなどを含み得る。配列Z中に複数の疎水性ペプトイドモノマーが存在する場合、すべての疎水性ペプトイドモノマーは同じ型のものであってもよく、それぞれ異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。同様に、配列Z中に複数の極性ペプトイドモノマーが存在する場合、すべての極性ペプトイドモノマーは同じ型のものであってもよく、それぞれ異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、配列Zの複数（例えば、2、3、4、5、またはそれ以上）の場合を含む。そのようなとき、すべての場合のZは同じであってもよく、それぞれ異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。特定の態様において、配列Zは1、2、3、4、またはそれ以上の疎水性ペプトイドモノマーを含む。さらに他の態様において、配列Zは1、2、3、4、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーを含む。
【０１６６】
他の局面において、本明細書において提供するのは：ペプトイドポリマーが配列[H2P2]nH2または[P2H2]nH2を有するように配置された、（a）2つの第1の疎水性ペプトイドモノマーHと2つの第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニット、および（b）ペプトイドポリマーのC末端に位置する2つの第2の疎水性ペプトイドモノマーを含み、ここで、ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは1〜50である、ペプトイドポリマーである。
【０１６７】
さらに他の局面において、本明細書において提供するのは：ペプトイドポリマーが配列[H2P2]nP2または[P2H2]nP2を有するように配置された、（a）2つの第1の疎水性ペプトイドモノマーHと2つの第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニット、および（b）ペプトイドポリマーのC末端に位置する2つの第2の極性ペプトイドモノマーを含み、ここで、ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは1〜50である、ペプトイドポリマーである。
【０１６８】
様々な態様において、すべての疎水性ペプトイドモノマーは同じであってもよく、すべて異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。同様に、すべての極性ペプトイドモノマーは同じであってもよく、すべて異なっていてもよく、またはその組み合わせでもよい。
【０１６９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、ペプトイドポリマーが配列X-[H2P2]nH2-Y、X-[P2H2]nH2-Y、X-[H2P2]nP2-Y、またはX-[P2H2]nP2-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含む。いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択される。または、XおよびYは一緒になって共有結合を形成する。XとYとの間の共有結合の形成は、ペプトイドポリマーの環化形態をもたらす。
【０１７０】
いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、またはハロゲンである。他の態様において、XまたはYは二級アミンまたは三級アミンである。
【０１７１】
いくつかの態様において、nは1〜50である（例えば、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50である）。いくつかの場合に、nは1〜10である（例えば、nは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、nは1〜25である。いくつかの態様において、nは3〜25である。いくつかの態様において、nは5〜25である。いくつかの態様において、nは8〜50である。いくつかの態様において、nは8〜25である。いくつかの態様において、nは8〜20である。いくつかの態様において、nは約10〜約28、約12〜約26、約14〜約24、約16〜約22、または約18〜約20であり得る。いくつかの態様において、nは約8〜約50、約8〜約45、約8〜約40、約8〜約35、約8〜約30、約10〜約25、約10〜約20、または約10〜約15であり得る。
【０１７２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは化合物62、化合物63、化合物67、化合物73、化合物76、化合物86、または化合物87を含む（すなわち、nが2の場合）。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物76を含む。他の態様において、ペプトイドポリマーは化合物81を含む（すなわち、nが1の場合）。
【０１７３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、前記表1に示すモノマーの群より選択される1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーを含む。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、前記表1に示すモノマーの群より選択される1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、前記表1に示すモノマーの群より選択される1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含む。
【０１７４】
いくつかの態様において、第1および/または第2の疎水性ペプトイドモノマーは下記からなる群より独立に選択される：
2020516652.tif 000053
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である（例えば、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、反復単位、mは、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10であり得る。
【０１７５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の疎水性ペプトイドモノマーは、独立に選択されたアルキル基を含む側鎖（例えば、R1）を有し、ここで、アルキル基は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、またはそれ以上の炭素原子を有する。特定の態様において、アルキル基は5つの炭素原子を有する。いくつかの場合に、5-炭素アルキル基はペンチル基である。他の場合に、5炭素アルキル基は置換ブチル基（例えば、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチルなど）である。さらに他の場合に、5炭素アルキル基は置換プロピル基（例えば、1-エチルプロピル、1,2-ジメチルプロピルなど）である。
【０１７６】
いくつかの態様において、第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーは下記からなる群より独立に選択される：
2020516652.tif 000054
2020516652.tif 000055
2020516652.tif 000056
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である（例えば、mは1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10である）。いくつかの態様において、反復単位、mは、1〜2、1〜3、1〜4、1〜5、1〜6、1〜7、1〜8、1〜9、または1〜10であり得る。
【０１７７】
いくつかの態様において、第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーは、ヒドロキシル基を含む側鎖（例えば、R1）を有する。他の態様において、ペプトイドポリマー中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーは、独立に選択されたC1-18ヒドロキシアルキル基（例えば、独立に選択されたC1-6ヒドロキシアルキル基）を含む側鎖（例えば、R1）を有する。いくつかの場合に、各C1-18ヒドロキシアルキル基はC1-6ヒドロキシアルキル基である。特定の場合に、各C1-6ヒドロキシアルキル基は同じC1-6ヒドロキシアルキル基である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーは、独立に選択されたヒドロキシアルキル基を含む側鎖（例えば、R1）を有し、ここで、ヒドロキシアルキル基のアルキルの長さは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、またはそれ以上の炭素原子から選択される。特定の態様において、ヒドロキシアルキル基は1、2、3、4、5、6、7、または8つのヒドロキシ置換を含む。
【０１７８】
いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーはいずれも、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基を含む側鎖（例えば、R1）を含まない。
【０１７９】
いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)基または(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)基を含む。アルキレン部分は、例えば、メチレン、エチレン、n-プロピレン（すなわち、-CH2CH2CH2-）、またはn-ブチレン（すなわち、-CH2CH2CH2CH2-）などの直鎖アルキレン部分であり得る。アルキレンリンカーは、sec-ブチレン（すなわち、-CH(CH3)CH2CH2-）またはイソブチレン（すなわち、-CH2CH(CH3)CH2-）の場合のような、分枝でもあり得る。いくつかの態様において、アルキレン部分はメチレン（すなわち、-CH2-）である。いくつかの態様において、アルキレン部分はn-プロピレンである。いくつかの態様において、4-、5-、6-、7-、8-、9-、または10員環の少なくとも1つの構成員はOである。他の態様において、4-、5-、6-、7-、8-、9-、または10員環の少なくとも1つの構成員はNである。
【０１８０】
ヘテロシクロアルキル部分は、4〜8員環、4〜6員環、または5〜6員環であり得るが、それらに限定されない。ヘテロシクロアルキル部分は、例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼパニル、アゾカニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、オキセパニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、またはモルホリニルであり得る。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分は、ピロリジン-1-イル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、テトラヒドロフラン-2-イル、およびテトラヒドロフラン-3-イルから選択される。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分はピロリジン-1-イルである。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分はテトラヒドロフラン-2-イルである。いくつかの態様において、ピロリジニルまたはテトラヒドロフラニルにおける1つまたは複数の炭素環構成員はオキソで置換されている。
【０１８１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000057
を含む。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物63、化合物76、化合物86、および/または化合物87を含む。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000058
である。他の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000059
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物76、化合物86、または化合物87である。
【０１８２】
ヘテロアリール部分は、5〜10員環、5〜9員環、または5〜6員環であり得るが、それらに限定されない。ヘテロアリール部分は、例えば、インドリル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、フタラジニル、シンノリニル、ベンゾフラニル、ピロリル、ピリジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、チオフェニル、またはフラニルであり得る。いくつかの態様において、ヘテロアリール部分は、フラン-2-イル、フラン-3-イル、チオフェン-2-イル、チオフェン-3-イル、ピロル-1-イル、ピロル-2-イル、およびピロル-3-イルから選択される。
【０１８３】
いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(2-オキソピロリジン-1-イル)(C1-4アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(テトラヒドロフラン-2-イル)(C1-4アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(フラン-2-イル)(C1-4アルキレン)基を含む。
【０１８４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000060
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000061
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物73である。
【０１８５】
いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は2〜20員アルコキシ基を含む。側鎖（例えば、R1）は、例えば、1〜4つの酸素原子を有する2〜12員アルコキシ基、または1もしくは2つの酸素原子を有する2〜6員アルコキシを含み得る。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は-CH2CH2OR'を含み、ここで、R'はC1-6アルキルである。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は-CH2CH2O(CH2CH2O)nR'を含み、ここで、R'はC1-6アルキルであり、かつ下付き文字nは1、2、または3である。
【０１８６】
いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(C1-6アルコキシ)(C1-6アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(オリゴ[エチレングリコール])または(オリゴ[プロピレングリコール])基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）はメトキシエチル基を含む。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000062
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000063
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物62である。
【０１８７】
いくつかの態様において、オリゴ(エチレングリコール)部分は2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル部分である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000064
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000065
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物67である。
【０１８８】
さらに他の局面において、本明細書において提供するのは、1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーである。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーはいずれも、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基を含む側鎖（例えば、R1）をまない。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)基を含む。他の態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は2〜20員アルコキシ基を含む。側鎖（例えば、R1）は、例えば、1〜4つの酸素原子を有する2〜12員アルコキシ、または1もしくは2つの酸素原子を有する2〜6員アルコキシを含み得る。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は-CH2CH2OR'を含み、ここで、R'はC1-6アルキルである。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は-CH2CH2O(CH2CH2O)nR'を含み、ここで、R'はC1-6アルキルであり、かつ下付き文字nは1、2、または3である。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は(C1-6アルコキシ)(C1-6アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーの側鎖（例えば、R1）は(オリゴ[エチレングリコール])または(オリゴ[プロピレングリコール])基を含む。
【０１８９】
アルキレン部は、例えば、メチレン、エチレン、n-プロピレン（すなわち、-CH2CH2CH2-）、またはn-ブチレン（すなわち、-CH2CH2CH2CH2-）などの直鎖アルキレン部分であり得る。アルキレンリンカーは、sec-ブチレン（すなわち、-CH(CH3)CH2CH2-）またはイソブチレン（すなわち、-CH2CH(CH3)CH2-）の場合のような、分枝でもあり得る。いくつかの態様において、アルキレン部分はメチレン（すなわち、-CH2-）である。いくつかの態様において、アルキレン部分はn-プロピレンである。いくつかの態様において、4-、5-、6-、7-、8-、9-、または10員環の少なくとも1つの構成員はOである。他の態様において、4-、5-、6-、7-、8-、9-、または10員環の少なくとも1つの構成員はNである。
【０１９０】
ヘテロシクロアルキル部分は、4〜8員環、4〜6員環、または5〜6員環であり得るが、それらに限定されない。ヘテロシクロアルキル部分は、例えば、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、アゼパニル、アゾカニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、オキセパニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、またはモルホリニルであり得る。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分は、ピロリジン-1-イル、ピロリジン-2-イル、ピロリジン-3-イル、テトラヒドロフラン-2-イル、およびテトラヒドロフラン-3-イルから選択される。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分はピロリジン-1-イルである。いくつかの態様において、ヘテロシクロアルキル部分はテトラヒドロフラン-2-イルである。いくつかの態様において、ピロリジニルまたはテトラヒドロフラニルにおける1つまたは複数の炭素環構成員はオキソで置換されている。
【０１９１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000066
を含む。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物63、化合物76、化合物86、および/または化合物87を含む。いくつかの態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000067
である。他の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000068
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物76、化合物86、または化合物87である。
【０１９２】
ヘテロアリール部分は、5〜10員環、5〜9員環、または5〜6員環であり得るが、それらに限定されない。ヘテロアリール部分は、例えば、インドリル、キノリニル、キノキサリニル、キナゾリニル、フタラジニル、シンノリニル、ベンゾフラニル、ピロリル、ピリジニル、イミダゾリル、ピラゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、チオフェニル、またはフラニルであり得る。いくつかの態様において、ヘテロアリール部分は、フラン-2-イル、フラン-3-イル、チオフェン-2-イル、チオフェン-3-イル、ピロル-1-イル、ピロル-2-イル、およびピロル-3-イルから選択される。
【０１９３】
いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(2-オキソピロリジン-1-イル)(C1-4アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(テトラヒドロフラン-2-イル)(C1-4アルキレン)基を含む。いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）は(フラン-2-イル)(C1-4アルキレン)を含む。
【０１９４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000069
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000070
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物73である。
【０１９５】
いくつかの態様において、側鎖（例えば、R1）はメトキシエチル基を含む。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000071
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000072
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物62である。
【０１９６】
いくつかの態様において、オリゴ(エチレングリコール)部分は2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル部分である。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは
2020516652.tif 000073
を含む。特定の態様において、極性ペプトイドモノマーはすべて
2020516652.tif 000074
である。いくつかの場合に、ペプトイドポリマーは化合物67である。
【０１９７】
いくつかの態様において、1つまたは複数の疎水性ペプトイドモノマーは下記からなる群よりそれぞれ独立に選択される：
2020516652.tif 000075
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である。
【０１９８】
いくつかの態様において、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーは下記からなる群よりそれぞれ独立に選択される：
2020516652.tif 000076
。
【０１９９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは、それぞれペプトイドポリマーのN末端およびC末端に位置する置換基XおよびYをさらに含む。いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択される。または、XおよびYは一緒になって共有結合を形成する。XとYとの間の共有結合の形成は、ペプトイドポリマーの環化形態をもたらす。
【０２００】
いくつかの態様において、XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、またはハロゲンである。他の態様において、XまたはYは二級アミンまたは三級アミンである。
【０２０１】
本明細書に記載の任意のペプトイドモノマーが立体化学を示さないときはいつでも、任意の立体異性体を用いてもよい。いくつかの態様において、立体異性体の混合物を選択する。疎水性ペプトイドモノマーおよび極性ペプトイドモノマーの立体異性体の非限定例ならびにペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーのR立体異性体とS立体異性体の例示的割合は前述している。
【０２０２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約1％と約99％との間（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）は疎水性ペプトイドモノマーである。他の態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約1％と約99％との間（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99％）は極性ペプトイドモノマーである。
【０２０３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約5％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約95％は極性である。
【０２０４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約10％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約90％は極性である。
【０２０５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約15％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約85％は極性である。
【０２０６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約20％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約80％は極性である。
【０２０７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約25％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約75％は極性である。
【０２０８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約30％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約70％は極性である。
【０２０９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約35％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約65％は極性である。
【０２１０】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約40％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約60％は極性である。
【０２１１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約45％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約55％は極性である。
【０２１２】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約50％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約50％は極性である。
【０２１３】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約55％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約45％は極性である。
【０２１４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約60％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約40％は極性である。
【０２１５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約65％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約35％は極性である。
【０２１６】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約70％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約30％は極性である。
【０２１７】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約75％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約25％は極性である。
【０２１８】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約80％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約20％は極性である。
【０２１９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約85％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約15％は極性である。
【０２２０】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約90％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約10％は極性である。
【０２２１】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中のペプトイドモノマーの約95％は疎水性であり、ペプトイドモノマーの約5％は極性である。
【０２２２】
特定の態様において、ペプトイドポリマーは約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95質量％の疎水性ペプトイドモノマーを含む。他の態様において、ペプトイドポリマーは約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、または95質量％の極性ペプトイドモノマーを含む。
【０２２３】
いくつかの態様において、本明細書に記載のペプトイドポリマーはヘリックス構造を形成する。いくつかの態様において、ヘリックス構造は、ポリプロリンヘリックスに類似の構造をとる。一定の場合において、ペプトイドポリマーはポリプロリンIヘリックスを形成する。一定の他の場合において、ペプトイドポリマーはポリプロリンIIヘリックスを形成する。いくつかの態様において、ペプトイドポリマーが少なくとも1つのN-アリール側鎖を含む場合、ヘリックス構造をとる。いくつかの態様において、N-アリール側鎖はNepモノマーである。
【０２２４】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマーは約0℃〜約-20℃の範囲内の温度で氷晶形成を低減または阻止する。他の態様において、ペプトイドポリマーは約-10℃〜約-20℃の範囲内の温度で氷晶形成を低減または阻止する。一定の態様において、ペプトイドポリマーは約-5℃、約-10℃、約-15℃、または約-20℃で氷晶形成を低減または阻止する。
【０２２５】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー（例えば、凍結保護剤溶液などの組成物、製剤、または製品中に存在する）の濃度は、約100nM〜約100mMである。一定の態様において、ペプトイドポリマー（例えば、凍結保護剤溶液などの組成物、製剤、または製品中に存在する）の濃度は、約100nM〜約250nM、約250nM〜約500nM、約500nM〜約750nM、約750nM〜約1μM、約1μM〜約5μM、約5μM〜約25μM、約25μM〜約50μM、約50μM〜約100μM、約100μM〜約250μM、約250μM〜約500μM、約500μM〜約750μM、約750μM〜約1mM、約1mM〜約10mM、約10mM〜約50mM、約50mM〜約100mM、約100mM〜約250mM、約250mM〜約500mM、約500mM〜約750mM、または約750mM〜約1Mである。いくつかの態様において、ペプトイドポリマー（例えば、凍結保護剤溶液などの組成物、製剤、または製品中に存在する）の濃度は約100nM〜約100mMである。他の態様において、ペプトイドポリマー（例えば、凍結保護剤溶液などの組成物、製剤、または製品中に存在する）の濃度は、約100nM、約500nM、約1μM、約10μM、約100μM、約500μM、約1mM、約10mM、約100mM、約500mM、または約1Mである。特定の態様において、ペプトイドポリマーの濃度は約1〜100mM（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100mMである。
【０２２６】
B.  ペプトイド-ペプチドハイブリッド
もう1つの局面において、本発明は、ペプトイド-ペプチドハイブリッドを提供する。いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは、本明細書に記載のペプトイドポリマーと1つまたは複数のアミノ酸とを含む。アミノ酸は天然アミノ酸またはその変種であり得る。いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは約1〜10のアミノ酸（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のアミノ酸）を含む。他の態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは約10〜100のアミノ酸（例えば、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100のアミノ酸）を含む。いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは約100よりも多くのアミノ酸を含む。他の態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは、2〜50のペプトイドモノマー（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、42、44、45、46、47、48、49、または50のペプトイドモノマー）と少なくとも約1〜100のアミノ酸（例えば、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100のアミノ酸）とを含む。
【０２２７】
アミノ酸は、N-およびC-末端ならびに/または任意のペプトイドモノマーまたはサブユニットの中間を含む、ポリマー内の任意の位置に配置され得る。ペプトイド-ペプチドハイブリッドが複数のアミノ酸を含む場合において、アミノ酸はすべて隣接していてもよく、またはそれらの一部だけが隣接していてもよい。または、すべてのアミノ酸が1つまたは複数のペプトイドモノマーまたはサブユニットで分離されていてもよい。
【０２２８】
いくつかの態様において、アミノ酸はD-アミノ酸である。他の態様において、アミノ酸はL-アミノ酸である。いくつかの他の態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドはD-およびL-アミノ酸の組み合わせを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、アルギニン、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびその組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合において、1つまたは複数のアミノ酸は、イソロイシン、スレオニン、アラニン、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【０２２９】
いくつかの態様において、ペプトイドポリマー中の1つまたは複数のNsbペプトイドモノマーは1つまたは複数のイソロイシンアミノ酸残基で置き換えられて、ペプトイド-ペプチドハイブリッドを生成する。1つまたは複数のイソロイシンアミノ酸はD-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせであり得る。他の態様において、ペプトイドポリマー中の1つまたは複数のNhpペプトイドモノマーは1つまたは複数のスレオニンアミノ酸残基で置き換えられて、ペプトイド-ペプチドハイブリッドを生成する。1つまたは複数のスレオニンアミノ酸はD-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせであり得る。いくつかの他の態様において、ペプトイドポリマー中の1つまたは複数のNmeペプトイドモノマーは1つまたは複数のアラニンアミノ酸残基で置き換えられて、ペプトイド-ペプチドハイブリッドを生成する。1つまたは複数のアラニンアミノ酸はD-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせであり得る。
【０２３０】
いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは配列：
2020516652.tif 000077
を含み、ここで、Xaaアミノ酸残基は、D-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせなどの、独立に選択されたアミノ酸である。非限定例として、すべての場合のXaaは、Arg、Ala、Val、および/またはSerアミノ酸残基である。
【０２３１】
他の態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは配列：
2020516652.tif 000078
を含み、ここで、Xaaアミノ酸残基は、D-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせなどの、独立に選択されたアミノ酸である。非限定例として、すべての場合のXaaは、Arg、Ala、Val、および/またはIleアミノ酸残基である。
【０２３２】
さらに他の態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは配列：
2020516652.tif 000079
を含み、ここで、Xaaアミノ酸残基は、D-アミノ酸、L-アミノ酸、またはその組み合わせなどの、独立に選択されたアミノ酸である。非限定例として、すべての場合のXaaは、Arg、Ala、Val、および/またはLeuアミノ酸残基である。
【０２３３】
いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは配列：
2020516652.tif 000080
を含み、ここで、Argアミノ酸残基はD-アミノ酸またはL-アミノ酸である。いくつかの態様において、ペプトイド-ペプチドハイブリッドは表11に示す構造を含む。
【０２３４】
【表１１】
2020516652.tif 000081
【０２３５】
C.  合成法
もう1つの局面において、本明細書における発明は、ペプトイドポリマーまたはペプトイド-ペプチドハイブリッドの合成法を提供する。本発明のペプトイドポリマーおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドは、容易に入手可能な出発原料から、本明細書に記載の一般的方法および手順を用いて調製することができる。典型的または好ましい工程条件（すなわち、反応温度、時間、反応物のモル比、溶媒、圧など）が与えられている場合、特に記載がないかぎり、他の工程条件も使用し得ることが理解されるであろう。最適な反応条件は、用いる特定の反応物または溶媒によって変動し得るが、そのような条件は、当業者であれば、通常の最適化手順によって決定することができる。
【０２３６】
本発明のペプトイドポリマーおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドは、有機合成の当業者であれば、公知または市販の出発原料および試薬から調製し得る。溶媒および試薬は商業的供給元から購入し、それ以上精製せずに用いる。
【０２３７】
いくつかの態様において、ペプトイド合成のためにサブモノマーアプローチ（図1）を用い、ここで、各N-置換グリシンモノマーを2つの容易に入手可能な「サブモノマー」から組み立てる。オリゴマーペプトイドの合成は、ペプチド合成に類似の、標準的固相法の強固な化学に基づいている。モノマー付加の各サイクルは、アシル化段階および求核置換段階の2つの段階からなる。いくつかの態様において、固相組立は、保護が必要な反応性側鎖官能基がないため、N-保護モノマーの必要性を取り除く。当業者であれば、自動のロボット合成機を含む、多くの固相合成法があることを理解するであろう。いくつかの態様において、用いる合成機はProtein Technologies, Inc.製のSymphony(登録商標) X Multiplex Peptide Synthesizerである。いくつかの態様において、用いる合成機はProtein Technologies, Inc.製のOverture Peptide Synthesizerである。他の態様において、ペプトイドを、当技術分野において公知の伝統的有機化学法を用いて手動で合成する。適切なアミノ酸を、ペプトイドモノマーの正しい場所に合成中の適切な時点で提供することにより、前述のものと同じ技術または類似の技術をペプトイド-ペプチドオリゴマーの合成に適用することができる。
【０２３８】
非限定例として、ペプトイドポリマーを100mgのRinkアミド樹脂（NovaBiochem；0.49mmol/g）上で合成することができる。Rinkアミド樹脂（100mg）を、1.5mLのDCM中で2回洗浄し、続いて1.5mLのDMF中で膨潤させることができる。膨潤段階は2回実施し得る。Fmoc保護基を、20％ピペリジン/DMFの添加により樹脂から除去することができる。混合物を10分間撹拌し、排液し、ピペリジン処理をくり返し、続いてDMF（1.5mLで5回）による十分な洗浄を行なうことができる。2mLのDCM中の37mgのブロモ酢酸（0.27mmol；Sigma-Aldrich）および189μLのDIEA（1.08mmol；Chem Impex International）を振盪機台上、室温で30分間反応させ、続いてDCM（2mLで5回）およびDMF（2mLで5回）で十分に洗浄することにより、第一のモノマーを手動で付加することができる。ブロモアシル化樹脂を2mLのDMF中1Mアミンサブモノマーと共に、振盪機台上、室温で30分間インキュベートし、続いてDMF（2mLで5回）で十分に洗浄することができる。ブロモ酢酸を最初に手動でロードした後、第一のサブモノマー置換段階および続くすべてのブロモアセチル化およびアミン置換段階を、所望のオリゴマー長が得られるまで、ロボット合成機により実施することができる。1660μLのDMF中1.2Mブロモ酢酸および400μLのDIC（Chem Impex International）を加えることにより、自動ブロモアセチル化段階を実施することができる。混合物を20分間撹拌し、排液し、DMF（2mLで3回）で洗浄することができる。次に、2mLのDMF中1Mサブモノマー（2mmol）溶液を加えて、臭素の求核置換により側鎖を導入することができる。混合物を20分間撹拌し、排液し、DMF（2mLで3回）で洗浄し、DCM（2mLで3回）洗浄することができる。ペプトイド-樹脂を2mLのDCM中20体積％HEIP（Alfa Aesar）中、室温で切断することができる。切断は、ガラスチューブ中、30分間の持続的撹拌により実施することができる。HFIP/DCMを窒素気流下で蒸発させることができる。最終生成物を5mLのHPLC等級のH2O中50％ACNに溶解し、0.5pmステンレススチールフリットシリンジチップフィルター（Upchurch Scientific）でろ過することができる。ペプトイドオリゴマーを、Beckman Coulter System Gold機器を用い、C18逆相分析用HPLCカラムにより室温で（Peeke Scientific、5pm、120Å、2.0×50mm）分析することができる。20分間で5〜95％アセトニトリル/水（0.1％TFA、Acros Organics）の直線勾配を、0.7mL/分の流速で用いることができる。試料溶液中にわずかなHFIPがあればこれを除去するために、50％ACN/H2Oに溶解した線形前駆体を終夜凍結乾燥することができる。
【０２３９】
ペプトイドポリマーおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドは、エレクトロスプレーイオン化（ESI）質量分析によって分析することができる。一般には、分析する1〜5μMのペプトイドポリマーまたはペプトイド-ペプチドハイブリッド0.5〜2mLを、1％のトリフルオロ酢酸などの有機酸を含む50％脱イオンH2O/50％HPLC等級ACN中で調製する。調製した試料を電子照射によりイオン化して、分子を荷電フラグメントへと分解させる。次いで、フラグメントを加速し、それらを電場または磁場に曝露することにより、イオンをそれらの質量電荷比に応じて分離する。イオンを、電子増倍管などの、荷電粒子を検出することができるメカニズムによって検出する。特定した質量に質量を相関させることにより、または特徴的なフラグメンテーションパターンを通して、ペプトイドおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドを特定する。
【０２４０】
D.  使用法
いくつかの局面において、本発明は凍結保護剤溶液を提供する。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は、本明細書に記載のペプトイドポリマー、本明細書に記載のペプトイド-ペプチドハイブリッド、またはその組み合わせを含む。他の態様において、凍結保護剤溶液は、イオン種、透過性凍結保護剤、非透過性凍結保護剤、抗酸化剤、細胞膜安定化化合物、アクアポリンまたは他のチャネル形成化合物、アルコール、糖、糖誘導体、非イオン性界面活性剤、タンパク質、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、フィコール(登録商標)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒアルロナン、ホルムアミド、天然または合成ヒドロゲル、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む。特定の態様において、透過性凍結保護剤は細胞膜を透過して細胞内水分濃度を低下させ、それにより任意の温度で形成される氷の量を低減する。他の特定の態様において、非透過性凍結保護剤は、コロイド浸透圧の変化を誘導し、誘導されたイオン性相互作用により細胞外水分と細胞膜との結合を改変する。
【０２４１】
いくつかの場合において、凍結保護剤溶液は、プロピレングリコール、エチレングリコール、グリセロール、メタノール、ブチレングリコール、アドニトール、エタノール、トリメチレングリコール、ジエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、エリスリトール、ソルビトール、キシシリトール、ポリプロピレングリコール、2-メチル-2,4-ペンタンジオール（MPD）、マンニトール、イノシトール、ジチオリトール（dithioritol）、1,2-プロパンジオール、およびその組み合わせからなる群より選択されるアルコールをさらに含む。
【０２４２】
他の場合において、凍結保護剤溶液は、単糖、二糖、多糖、およびその組み合わせからなる群より選択される糖をさらに含む。特定の場合において、糖は、グルコース、3-O-メチル-D-グルコピラノース、ガラクトース、アラビノース、果糖、キシロース、マンノース、スクロース、トレハロース、ラクトース、マルトース、ラフィノース、デキストラン、およびその組み合わせからなる群より選択される。
【０２４３】
他の場合において、凍結保護剤溶液は、PEG、PPG、または複数の異なるPEGもしくはPPG化合物をさらに含む。いくつかの他の場合において、PEGまたはPPG化合物の少なくとも1つは約3,000g/mol未満（例えば、約3,000、2,500、2,000、1,500、1,000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、または100g/mol未満）の平均分子量を有する。特定の場合において、PEGまたはPPG化合物の少なくとも1つは約200〜400g/mol（例えば、約200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、または400g/mol）の平均分子量を有する。いくつかの場合において、凍結保護剤溶液は、PEG200、PEG300、PEG400、およびその組み合わせからなる群より選択される、PEGまたは複数のPEG化合物を含む。
【０２４４】
他の場合において、凍結保護剤溶液は、卵アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、ゼラチン、およびその組み合わせからなる群より選択されるタンパク質をさらに含む。さらに他の場合において、凍結保護剤溶液は、キトサン、ヒアルロン酸、またはその組み合わせを含む天然または合成ヒドロゲルをさらに含む。
【０２４５】
有効濃度、粘度、水溶性、および/または膜透過性などの、凍結保護剤溶液の様々な特性の非限定例は、尿生殖器細胞（例えば、平滑筋海綿体細胞および／または上皮海綿体細胞などの海綿体細胞）、幹細胞、肝組織または肝細胞、腎臓、腸、心臓、膵臓、骨髄、原形質類器官、および他の生体組織を含むが、それらに限定されない、凍結保存のためのモデル細胞または組織を用いて評価することができる。
【０２４６】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液は約0℃〜約-20℃の範囲内の温度で氷晶形成を低減または阻止する。他の態様において、凍結保護剤溶液は約-10℃〜約-20℃の範囲内の温度で氷晶形成を低減または阻止する。特定の態様において、凍結保護剤溶液は約-5℃、約-10℃、または約-20℃で氷晶形成を低減または阻止する。
【０２４７】
いくつかの態様において、凍結保護剤溶液中のペプトイドポリマーおよび/またはペプトイド-ペプチドハイブリッドの濃度は、約100nM〜約1Mである。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液中のペプトイドポリマーおよび/またはペプトイド-ペプチドハイブリッドの濃度は、約100nM〜約250nM、約250nM〜約500nM、約500nM〜約750nM、約750nM〜約1μM、約1μM〜約5μM、約5μM〜約25μM、約25μM〜約50μM、約50μM〜約100μM、約100μM〜約250μM、約250μM〜約500μM、約500μM〜約750μM、約750μM〜約1mM、約1mM〜約10mM、約10mM〜約50mM、約50mM〜約100mM、約100mM〜約250mM、約250mM〜約500mM、約500mM〜約750mM、または約750mM〜約1Mである。いくつかの態様において、凍結保護剤溶液中のペプトイドポリマーおよび/またはペプトイド-ペプチドハイブリッドの濃度は、約100nM〜約100mMである。他の態様において、凍結保護剤溶液中のペプトイドポリマーおよび/またはペプトイド-ペプチドハイブリッドの濃度は、約100nM、約500nM、約1μM、約10μM、約100μM、約500μM、約1mM、約10mM、約100mM、約500mM、または約1Mである。特定の態様において、凍結保護剤溶液中のペプトイドポリマーおよび/またはペプトイド-ペプチドハイブリッドの濃度は約1〜100mM（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100mM）である。
【０２４８】
他の局面において、本明細書において提供するのは、生体試料を保存するための方法である。特定の態様において、生体試料は細胞組成物を有する。いくつかの態様において、生体試料は細胞である。いくつかの態様において、生体試料は初代細胞を含む。他の態様において、生体試料は組織または臓器である。特定の態様において、生体試料は1つまたは複数の細胞、組織、臓器、またはその組み合わせを含む。いくつかの態様において、方法は、生体試料を、本明細書に記載のペプトイドポリマー、本明細書に記載のペプトイド-ペプチドハイブリッド、本明細書に記載の凍結保護剤溶液、またはその組み合わせと接触させる段階を含む。いくつかの場合において、組成物または溶液の組み合わせを用いる場合、生体試料を組成物または溶液と接触させる段階は複数の段階で達成し得る。非限定例として、生体試料をまず本明細書に記載のペプトイドポリマーと接触させ、次いで後の時点で生体試料を本明細書に記載の凍結保護溶液と接触させることができる。
【０２４９】
特定の場合において、組織は生物工学によって作製された組織である。いくつかの態様において、生体試料は、心臓、肝臓、肺、腎臓、膵臓、腸、胸腺、角膜、神経細胞、血小板、精細胞、卵母細胞、胚細胞、幹細胞、骨細胞、およびその組み合わせからなる群より選択される。他の例において、生体試料は、心臓細胞、肝臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、膵臓細胞、胃細胞、腸細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞、免疫細胞、線維芽細胞、尿生殖器細胞、骨細胞、肝細胞、精細胞、卵母細胞、胚細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびその組み合わせからなる群より選択される細胞（例えば、初代細胞）の集団を含む。
【０２５０】
生体試料の凍結保護は、任意の数の目的のために有用である。非限定例には、原形質類器官保存、幹細胞保存（例えば、造血幹細胞、胚幹（ES）細胞、多能性幹細胞（PSC）、および人工多能性幹細胞（iPSC））、成人細胞および細胞株（例えば、リンパ球、顆粒球、免疫系細胞、骨細胞）の保存、胚、精子、および卵母細胞の保存、組織保存、ならびに臓器保存が含まれる。組織、臓器、および他の生体試料および構造の保存は、例えば、臓器移植の分野において特に有用である。生体試料に対する本発明の他の有用な適用は、当業者には容易に知られるであろう。
【０２５１】
さらに他の局面において、本明細書において提供するのは、1つまたは複数の生体高分子を保存するための方法である。前記生体高分子は天然または非天然であり得る。本発明の方法による凍結保護に適した生体高分子の非限定例には、核酸（例えば、DNA、RNA）、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、脂質、および複合構造（例えば、リポソーム）が含まれる。いくつかの態様において、方法は、生体高分子を本明細書に記載のペプトイドポリマー、本明細書に記載のペプトイド-ペプチドハイブリッド、本明細書に記載の凍結保護剤溶液、またはその組み合わせと接触させる段階を含む。いくつかの場合において、生体高分子は単離タンパク質である。特定の場合において、単離タンパク質はプロテアーゼタンパク質である。いくつかの場合において、組成物または溶液の組み合わせを用いる場合、1つまたは複数の生体高分子を組成物または溶液と接触させる段階は、複数の段階で達成することができる。非限定例として、1つまたは複数の生体高分子をまず本明細書に記載のペプトイドモノマーと接触させ、次いで後の時点で生体試料を本明細書に記載の凍結保護溶液と接触させることができる。
【０２５２】
生体高分子の凍結保護は、任意の数の目的のために有用である。そのような目的の非限定例には、DNA（例えば、ゲノムDNA）およびRNA試料の保存、幹細胞成長因子の保存、ならびに抗体の保存が含まれる。本発明の他の有用な目的および適用は、当業者には容易に知られるであろう。
【０２５３】
本発明による凍結保護に適した生体試料および高分子は、任意の生物界（例えば、動物界（ヒトおよび家畜を含むが、それらに限定されない）、植物界、真菌類（キノコを含むが、それらに限定されない）、原生生物界、古細菌/始原菌、および細菌/真正細菌）由来であり得る。
【０２５４】
E.  凍結保存プロトコル
本明細書に記載の方法は、高度氷点下温度（例えば、0℃〜-20℃）への過冷却中の凍結保存のために有用である。臓器移植の分野において、臓器を典型的には氷上で冷却（例えば、0℃〜4℃まで）し、これは移植ウィンドウを約10時間に制限する。標準の小分子CPAを含む凍結保護剤でのエクスビボ機械灌流を用いることにより、臓器を-6℃の温度で最大96時間まで保存することが可能となっている。可能な凍結保存時間を延ばすであろう-6℃未満まで凍結保存温度をさらに下げることが望ましいが、さらに温度を下げるために必要な標準的CPAの高い濃度は、CPA関連毒性による不可逆的な臓器損傷を引き起こすため、そうすることは可能ではなかった。さらなる情報については、例えば、Uygun K, et. al. Nat. Protoc. 10(3):484-94 (2015)を参照されたい。エクスビボ灌流法を用いること、またはそれ以外に生体試料（例えば、臓器および組織）もしくは高分子を本明細書に記載のペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/もしくは凍結保護剤溶液と接触させることは、高度氷点下温度に過冷却するために有用であり、現在実行可能なものよりも低い温度で長期間の凍結保存を可能にする。高度氷点下温度の過冷却への本発明の他の適切な適用は、当業者には容易に知られるであろう。
【０２５５】
当業者であれば、本明細書に記載のペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および凍結保護剤溶液の濃度および組成は、凍結保存中の特定の生体試料および/または高分子ならびに用いている特定の凍結保存プロトコルに応じて、改変され得ることを容易に理解するであろう。
【０２５６】
F.  スクリーニング法
関連する局面において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液の活性をスクリーニングする方法が本明細書において提供される。
【０２５７】
1つの態様において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液の水の氷点低下能力を、氷晶形成を検出するための偏光顕微鏡を用いてスクリーニングする。偏光顕微鏡法は、光源として偏光を用いる光学顕微鏡技術である。画像コントラストが平面偏光と複屈折（または二重屈折）種との相互作用から生じて、それぞれ互いに垂直な平面で偏光する2つの個々の波成分が生じる。正常および異常波面と呼ばれる、これらの成分の速度は異なり、標本を通しての伝播方向によって変動する。標本を出た後、光成分は位相からはずれるが、分析器を通過するときに強め合う干渉および弱め合う干渉と再結合する。この干渉は試料において検出可能なコントラストを生じる。氷晶は複屈折種であるため、氷晶形成はこの技術を用いて容易に検出される。標準の実験において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を含む試料を、所望の温度で所望の時間冷却する。1つまたは複数の試料を、所望の温度で、偏光顕微鏡下に置き、氷晶の形成を目視検査する。
【０２５８】
1つの態様において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液の水溶液の氷点低下能力を、熱ヒステリシス活性を定量するための示差走査熱量測定を用いてスクリーニングする。示差走査熱量測定は、試料および参照の温度を高めるのに必要とされる熱の量の差を温度の関数として測定する、熱分析技術である。相転移などの物理的変換が起こると、同じ温度で両方を維持するために、参照よりも多い、または少ない熱が試料に流れる必要がある。参照および試料の相転移の間の温度の差が、0℃未満の温度で氷晶形成を低減または阻止する試料の能力について報告する。標準の実験において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を含む試料を、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を含まない参照と比較する。
【０２５９】
G.  活性を試験するための細胞生存度アッセイ
関連する局面において、ペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液の、低温で細胞生存度を維持する能力を試験するための細胞生存度アッセイが本明細書において提供される。
【０２６０】
いくつかの態様において、細胞生存度を、Thermo Fisher Scientific, Inc.が提供するalamarBlue(登録商標) Cell Viability Assay Protocolを用いて試験する。簡単に言うと、alamarBlue(登録商標)は、青色で実質的に非蛍光の非毒性細胞透過性化合物であるレサズリン（7-ヒドロキシ-3H-フェノキサジン-3-オン10-オキシド）の商標である。細胞に侵入後、レサズリンは、赤色で高度に蛍光性の化合物であるレゾルフィンに還元される。生細胞はレサズリンをレゾルフィンへと持続的に変換し、細胞周囲の培地の全体の蛍光および色を増大させる。非生細胞はレサズリンをレゾルフィンに変換せず、したがって細胞周囲の培地の全体の蛍光および色は試料中の生細胞の相対量の指標となる。標準の実験において、細胞ならびにペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を、任意の適切な容器内で混合する。次いで、混合物を所望の0℃未満の温度に冷却し、所望の時間維持する。次いで、細胞を周囲温度に戻し、almarBlue(登録商標)試薬を加え、インキュベートし、Thermo Fisherのプロトコルに従って測定する。典型的には、細胞生存度の直接読み出しを、波長λEx約560nm/λEm約590nmで試料の相対的蛍光を測定することにより判定する。
【０２６１】
いくつかの態様において、細胞生存度を、Thermo Fisher Scientific, Inc.が提供する哺乳動物細胞のためのLIVE/DEAD(登録商標) Viability/Cytotoxicity Kitを用いて試験する。このキットは2つの指標分子：カルセインAMおよびエチジウムホモドイマー-1（EthD-1）を用いる。生細胞を、実質的に非蛍光の細胞透過性カルセインAMの強度蛍光性カルセインへの酵素的変換により判定する、遍在性細胞内エステラーゼ活性の存在により識別する。ポリアニオン性色素カルセインは生細胞内でよく保持され、生細胞中で強い均質な緑色蛍光を生じる（λEx約495nm/λEx約515nm）。反対に、EthD-1は膜が損傷した細胞に侵入し、核酸に結合した後、蛍光の40倍の増強を起こし、それにより死細胞中で明るい赤色蛍光を生じる（λEx約495nm/λEm約635nm）。注目すべきことに、EthD-1は生細胞の無傷の形質膜により排除され、したがって生細胞および死細胞の判定は容易に識別可能である。カルセインおよびEthD-1は通常のフルオレセインロングパスフィルターで同時に見ることができる。または、これらの色素からの蛍光は別々に観察してもよい；カルセインは標準のフルオレセインバンドパスフィルターで見ることができ、EthD-1はヨウ化プロピジウムまたはTexas Red(登録商標)色素用のフィルターで見ることができる。標準の実験において、細胞ならびにペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を任意の適切な容器内で混合する。次いで、混合物を所望の0℃未満の温度に冷却し、その温度で所望の時間維持し、次いで周囲温度に戻す。カルセインAMおよびEthD-1試薬の添加ならびにアッセイ結果の測定を含むその後の段階を、Thermo Fisherのプロトコルに記載のとおりに実施する。典型的には、細胞生存度の直接読み出しを、相対的蛍光を両方の試薬について前記波長で測定することにより判定する。
【０２６２】
いくつかの態様において、MTTアッセイを用いて細胞生存度を試験する。MTTアッセイは、黄色のテトラゾリウムMTT（臭化3-(4,5-ジメチルチアゾリル-2)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム）が、紫色を有する不溶性ホルマザンへ還元することに依る、比色細胞生存度および増殖アッセイである。テトラゾリウム色素還元は、代謝的に活性細胞のサイトゾル区画に主に局在する、NAD(P)H依存性酸化還元酵素に依存する。MTTアッセイは、例えば、ATCC（www.atcc.org）またはSigma-Aldrich（www.sigmaaldrich.com）から利用可能である。標準の実験において、細胞ならびにペプトイドポリマー、ペプトイド-ペプチドハイブリッド、および/または凍結保護剤溶液を、任意の適切な容器内で混合する。次いで、混合物を所望の0℃未満の温度に冷却し、所望の時間維持する。次いで周囲温度に戻し、MTT試薬を加え、インキュベートし、ATCCおよびSigma-Aldrichのプロトコルに従って測定する。典型的には、変換された色素の吸光度を570nmの波長で、630〜690nmでバックグラウンドを差し引いて測定する。
【実施例】
【０２６３】
IV.  実施例
以下の実施例を、特許請求する発明を例示するために提供するが、限定のためではない。
【０２６４】
実施例1.  氷晶形成のペプトイド媒介性阻止
本実施例は、N-置換ペプトイドポリマーおよびペプトイド-ペプチドハイブリッドの0℃未満の温度での氷晶阻止特性を例示する。
【０２６５】
毛細管アッセイ
この実験において、4つの水性試料を、MilliQ精製水を含む毛細管中で調製した。1つの試料は水だけを含み、もう1つの試料は160mMエチレングリコール（EG）を含んでいた。他の2つの試料はそれぞれ9mMのペプトイドポリマーを含んでいた。ペプトイドポリマー試料の1つは「化合物1」と呼ぶペプトイドポリマーを含み、他の試料は「化合物10」と呼ぶペプトイドポリマーを含んでいた。ペプトイドポリマーの配列は以下のとおりである：
2020516652.tif 000082
。これらの化合物の化学構造を表2に提供する。
【０２６６】
試料調製後、すべての試料をゆっくり冷却し、Peltier冷却プレート上、-20℃でインキュベートした。1時間後、試料を取り出し、180倍のStereo Zoom顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを用いてただちに撮影した（図2A）。水試料およびEG試料は有意な氷晶形成を示したが、EG試料は水だけの試料よりも氷形成は少なかった。これとは対照的に、ペプトイドポリマー化合物を含む試料はどれも有意な氷晶形成を示さなかった。正規化データを図2Bに示す。注目すべきことに、ペプトイド試料濃度よりも約18倍高いCPA濃度を含むEG試料は、なお有意な氷晶形成を示したが、ペプトイド試料は示さなかった。
【０２６７】
結晶学的x線回折アッセイ
ライブラリ分析の処理量を高めるために、結晶学的x線回折（XRD）技術を用いて、氷晶形成を評価した。これらの実験のために、「化合物2」、「化合物8」、「化合物10」、「化合物11」、「化合物12」、「化合物13」、および「化合物58」なる名称の化合物を試験した。化合物2、8、10、11、12、および13はペプトイドポリマーで、その構造を表2に提供する。化合物58はペプトイド-ペプチドハイブリッドで、その構造を表11に提供する。化合物58は、アルギニンアミノ酸がN末端に付加されていること以外は、化合物12と同様である。
【０２６８】
これらの実験のために、15体積％〜30体積％のEG濃度を用いた。典型的には、EG、DMSO、および他の凍結保護剤をXRD試料分析中に35〜40体積％の濃度で用いて、溶液をガラス化し、氷晶からの回折干渉を回避した。1および5mg/mLの濃度のペプトイドおよびペプトイド-ペプチド化合物を用いた。図3A、3B、および3Cは、それぞれ完全ガラス化、角氷が存在する部分ガラス化、および凍結（角氷晶）の条件下での例示的XRDデータを示す。化合物8、10、11、12、13、および58のXRDデータを図4A〜4Gおよび図5A〜5Gに提供する。図3Dは、様々なEG濃度および化合物2、8、および12の2つの濃度のアイスリングスコアを提供する。
【０２６９】
試験溶液試料セットのいくつかの混合物は、強い氷結防止効果を示した。図3Dは、EGと比べてのいくつかのペプトイドポリマー溶液の実験結果を示す。「アイスリング1」および「アイスリング2」は氷形成スコアを意味し、これは0（氷形成なし）から15（大きい氷形成）の範囲である。化合物2、12、および8ならびにその他は、必要なEG濃度を有意に低下させた一方で、氷形成を防止した。
【０２７０】
水中5mg/mL（0.5％（w/v））の濃度の化合物12および17.5体積％の濃度のEGを含む試料は、急速凍結後に氷結しなかった。この特定の混合物は、液体窒素蒸気流中での急速凍結の複数回の試行を通してすべての氷形成を完全に除去し(図3A）、30％EGの標準溶液よりも大幅にすぐれている（図3B）ことが判明した。図中、黒い点およびリングは氷晶を表す。同じモル濃度のEGと比べて、この氷結防止効果は500倍強く、いかなる特定の理論にも縛られることなく、天然の不凍タンパク質によって用いられるメカニズムである、氷結防止の非束一的メカニズムを示唆する。
【０２７１】
より大量のアッセイ
より大規模での本発明の組成物の有用性を試験するために、標準の卵細胞および幹細胞保存に用いられる量と同様の溶液量を用いて、実験を実施した。これらの実験のために、1つは22.5％EGおよび緩衝液だけを含み、もう1つは22.5％EGおよび5mg/ml（0.5％w/v）の化合物12および緩衝液を含む、2つの試料を液体窒素中で急速凍結した。図6Aに示すとおり、化合物12溶液は、液体窒素から取り出した直後、氷形成を伴わない完全なガラス化を示した一方、対照溶液は明らかに凍結し、白い氷晶の塊を生じた。37℃の水浴中で溶液を再加温すると、予想外の有益な結果につながった。化合物12溶液は再加温後2秒未満で脱ガラス化を回避した（図6B、右）が、20秒後の対照試料中には氷の塊が浮いているのが見られた(図6B、左）。チューブは実際にはまだ室温よりもはるかに低かったため、各チューブ上で凝結が見られた。この結果は、化合物12は解凍中の活性な除氷剤として作用することを示す。
【０２７２】
さらに、-20℃のフリーザーに100μL試料を終夜放置した後、化合物12溶液は未凍結であることが判明した(図6C、右）。この結果は、本発明の組成物が0℃未満の温度で長期間、いかなる氷形成もなしに、試料を保存する能力を提供することを示している。さらに、これらの実験は、本発明の化合物を組み込むことにより、-20℃での低温凍結保存、またはガラス化近傍温度から-80℃に至る過冷却法において無氷状態を達成して、透過性CPAの臨界濃度を有意に低下させ、凍結保存毒性を軽減し得ることを示している。
【０２７３】
ここで示すとおり、化合物12の製剤は、ミリリットル未満の量でのガラス化中に氷形成を防止することが判明した。事実、溶液は-20℃で完全に未凍結のまま残ることができ、-196℃で急速凍結すると、ガラス化することもできた。現在、体外受精のための標準的なヒト卵細胞保存技術は、50％以上の凍結保護剤濃度を用いる一方で、5μL未満（多くの場合0.5〜2.5μL）の溶液量に限定されている。したがって、化合物12は実際的な量で、非常に少ない凍結保護剤により氷形成を防止することができ、これにより、例えば、体外受精のためのヒト卵母細胞を保存するために有用となる。
【０２７４】
実施例2.  細胞毒性および凍結保存スクリーニング
本実施例は、本明細書に記載の組成物が細胞毒性をほとんどまたはまったく有さず、既存の化合物と比べるとすぐれた凍結保存を達成し得、同時にCPAの必要量を低減し、したがってCPA関連毒性を低減することを示す。
【０２７５】
細胞毒性アッセイ
本発明の凍結保護剤組成物の安全性を示すために、組織培養中でヒト胚腎細胞から増殖させた丈夫で強健な幹細胞株であるHEK 293細胞株を用いて、高処理量の細胞ベース細胞毒性アッセイを開発した。
【０２７６】
Tecan Genesis Robotic Workstationを用いて96穴および384穴プレート中で溶液を調製した。溶液は培養培地、緩衝液、本発明の凍結保護剤組成物（化合物12）またはDMSOを含んでいた。溶液を所望のpHに調節した。連続希釈を行なって、様々な濃度の化合物12およびDMSOを含む溶液を得た。対照実験は培養培地だけを用いて実施した。
【０２７７】
これらの実験のために、細胞を低密度（すなわち、10％コンフルエンス）で播種し、化合物12またはDMSOを含む溶液に曝露し、37℃のインキュベーター内に置いた。空の媒体だけで処理した対照細胞が70％コンフルエンスに近づくまで（典型的には約3〜5日間）細胞を増殖させた。化合物の細胞毒性の評価をMTTアッセイにより行なった。
【０２７８】
図7に見られるとおり、MTTアッセイにより分析した場合、化合物12の毒性は培養培地だけのものから有意に逸脱していなかった。一方、DMSOは0.5体積％よりも高いいかなる濃度でも、長期間の生存を可能にしなかった。注目すべきことに、化合物12は、非生体試料で氷形成を防止し得る濃度（0.5％w/v）で毒性を示さず、この濃度よりも4倍高い濃度でも有意な毒性を示さなかった。
【０２７９】
これらの結果は、DMSO毒性が細胞生存を有意に低減する濃度においても、本発明の組成物が氷防止に有効であったことを示す。
【０２８０】
凍結保存アッセイ
最初の凍結保存アッセイは、混乱させる外部因子を最小限にするために、化合物12を加えた、および加えていない、非常に単純な溶液を用いて実施した。この第一の実験セットのために、2つの試料溶液を調製した。第一の試料溶液は単純な緩衝液および22.5体積％の濃度のエチレングリコール（EG）を含み、第二の試料溶液は単純な緩衝液、EG（22.5体積％）、および5mg/mL（0.5％（w/v））の化合物12を含んでいた。
【０２８１】
HEK 293細胞を70％コンフルエントになるまで増殖させ、次いでトリプシンで処理して接着タンパク質を除去し、浮遊細胞を得た。細胞を血球計算器を用いて計数し、試料細胞濃度を1マイクロリットルあたり10,000細胞の最終濃度に調節した。次いで、細胞を遠心沈降で圧縮して堅いペレットとし、続いて各試料を20μLの試料溶液の1つと混合した。次いで、試料を液体窒素に浸漬して急速凍結し、続いて37℃の水浴中で再加温した。凍結-解凍工程の後、細胞を回収するために400倍量の培養培地中に懸濁した。陽性対照試料は37℃で培養培地により処理し、凍結-解凍工程には供さなかった。陰性対照試料は、凍結-解凍工程中に培養培地だけで処理した。回収後、細胞をカルセインAMで30分間染色し、細胞生存度を蛍光プレート読み取り器を用いて測定した。
【０２８２】
図8に示すとおり、化合物12を加えると、細胞生存が大きく改善され、この化合物の細胞を凍結保存する能力が示された。化合物12を含む試料は、凍結工程中に氷形成することなく完全なガラス化を達成することが観察された。加えて、脱ガラス化の工程は、化合物12を含まない試料に比べて、はるかに迅速に回避された。
【０２８３】
第二の実験セットを、5mg/mLの化合物12と、グリコール、二糖、および一般的緩衝液の混合物とを含む製剤の凍結保存能力を評価するために実施した。液体窒素中でのガラス化に続く解凍後の生存を、前述のとおりに評価した。図9に見られるとおり、製剤はほぼ100％（すなわち、98％）の細胞の解凍後生存を達成し、これは凍結処理に曝露しなかった対照群と同様であった。細胞の形態および蛍光シグナルは非凍結対照と同じに見え、実験中の細胞にほとんど損傷は起こらないことを示した。
【０２８４】
第二の実験セットの一部として、製剤の凍結保存能力を、2つの公知の凍結保存試薬と比較した。VS2Eは化学的に定義されていないポリマーを含む無DMSOおよび無血清溶液（例えば、Nishigaki et al. Int. J. Dev. Biol. 55:3015-311 (2011)参照）であり、M22は21st Century Medicineから入手可能な臓器ガラス化溶液である。図9は、VS2EおよびM22での細胞生存がそれぞれ72％および51％であったことから、化合物12を含む製剤がすぐれた凍結保存を達成したことを示す。M22試料について、画像における生細胞の数は51％よりもはるかに少ない細胞が生存することを示唆したため、バックグラウンド蛍光がこの結果をゆがめた可能性があることに留意すべきである。
【０２８５】
本発明の組成物は、有意に少ないエチレングリコールを含む溶液中で氷形成を防止するのに非常に有効であった。特に、低濃度の組成物（例えば、0.5％（w/v））は、様々な種類の細胞を保存するのに有用な規模である20uL規模で、ガラス化中の氷成長を防止するため、および溶液を無氷状態の液体に維持するために十分であった。
【０２８６】
まとめると、これらの結果は、本発明の組成物がすぐれた凍結保存を達成し、CPAの必要量を低減し、したがってCPAに関連する細胞毒性を低減し得ることを示す。本発明の組成物のすぐれた特性は、特定の感受性細胞株の処理のために、および/または細胞をより長期間培養しなければならない場合に、特に有用である。
【０２８７】
実施例3.  細胞の長期間の過冷却
本実施例は、本明細書に記載の過冷却調製物および方法を用いての細胞保存が、長期間にわたって可能であることを示す。
【０２８８】
保存した細胞および組織を、零度を大きく下回る温度で研究室から患者に移動させることで：1）4℃での貯蔵に比べて細胞生存の増大および貯蔵期間の延長（24時間を超える）；（2）LN2の使用を回避することによる凍結保存と比べての輸送コストの削減；ならびに（3）深冷貯蔵プロトコルにおける水の相転移（例えば、-80℃および-196℃）中に起こる氷害の回避が得られる。従来の浸透性CPAは、有害毒性により過冷却貯蔵中に-6℃を下回る低温に達することができない。より低い温度での貯蔵は、より長い細胞貯蔵期間のために、より長く代謝を停止することができ、-20℃での冷却/輸送のためのコールドチェーン基盤と統合して、最も実用的な使用を達成することもできる。
【０２８９】
過冷却保存プロトコル
本発明者らは、HEK293細胞とK562細胞を用いて様々な調製物を比較した。簡単に言うと、100μLの細胞（0.5×106細胞/mL）を試験凍結保護剤（または非凍結対照用の培地）中に反復して懸濁した。試験管を-20℃の冷凍庫の棚に置き、指定の時点で取り出した。試料を37℃の水浴で温め、各10μLを500uL DMEM＋10％FBSを含む回復ウェルに加え、インキュベーター（37℃、5％CO2）中に16時間放置して、アポトーシスを起こしている細胞を通過させた。細胞をアラマーブルー(登録商標)で染色するか、またはデータをフローサイトメトリーにより得ることで、冷却および加温プロトコルに供したものと同じ成長段階の非凍結細胞との比較を改善した。細胞数を非凍結群に対して正規化した。
【０２９０】
試料を、凍結バイアル中で-20℃の冷凍庫に直接置くか、または、凍結バイアルを冷却する速度を約1℃/分（-80℃の冷凍庫に入れた場合）に制御するために用いるイソプロパノール含有装置である、Mr. Frostyに入れることによってより正確に制御した。-20℃での各試験管の外観を、-20℃まで冷却した後の各試験間隔で検査して、液体、半固体、または結晶のいずれかと記録し、これは氷の形成と細胞生存との間の相関を示すために設計されたものであった。
【０２９１】
結果
調製物について、-20℃での1日および3日貯蔵における細胞生存を示した。細胞生存の増大が、結晶形成が比較的少ない、またはまったくない調製物で観察された。しかし、細胞生存の増大に対するより良い相関が、活性ペプトイドを含む調製物で認められた。また、調製物は第1日および第3日の後に一貫した細胞生存度を示したが、DMSOおよび培地は時点の間で強烈な差を示す。
【０２９２】
調製物をさらに、様々な基本緩衝液、小分子CPA濃度、および選択した細胞保護剤の交差実験で調節した。-20℃で3、24、48、72、および120時間の細胞保存後に、多くの他の調製物比較と共に、プロトコルの改善を調べた。本発明者らは、その細胞モデルを、非接着性血液細胞の代表としてのK562細胞およびジャーカット細胞を含めるように拡大した。
【０２９３】
図10Aおよび10Bは、本発明の方法が-20℃での細胞の過冷却を可能にしたことを示す。化合物12などのペプトイドポリマーを含む調製物は、-20℃で細胞を保存し、過冷却条件下で72時間後に顕著な生存度を示す特有の能力を有した。これに対して、移植用のヒト臓器を輸送するために設計された、FDAが承認する臓器保存溶液であるHTK緩衝液は、その推奨される輸送/作業温度（4℃）で、24時間未満しか細胞生存を維持しなかった。
【０２９４】
実施例4.  移植用の初代泌尿生殖器細胞および組織の過冷却
本実施例は、本明細書に記載の過冷却調製物および方法を用いて、初代泌尿生殖器（GU）細胞保存が成功したことを示す。
【０２９５】
ヒトGU細胞型の例には、BJ（ヒト包皮線維芽細胞）、PC-3（ヒト前立腺腺癌）、およびSK-OV-3（ヒト卵巣腺癌）が含まれる。初代GU細胞型の例には、平滑筋および内皮細胞などの初代海綿体（CC）細胞が含まれる。陰茎組織において、CC内皮および平滑筋細胞は基本的な形態および機能を提供する。細胞保存実験をGU移植片を用いて実施することができる。
【０２９６】
内皮細胞
簡単に言うと、海綿体（CC）組織を回収し、処理し、消化し、ろ過して、単一内皮細胞を得、これを次いで細胞培地に再懸濁した後、5日間培養した。Chung et al., Korean Journal of Urology, 53(8):556-563 (2012)参照。コンフルエントな接着性内皮細胞をさらに処理し、RPMI培地に再懸濁し、70μmナイロンメッシュを通してろ過した。次いで細胞をビオチン化抗ラットCD146抗体と共に20℃で30分間インキュベートした。洗浄後、細胞を緩衝液に再懸濁し、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズと共にインキュベートした。磁気標識されたCD146細胞を磁気カラムを用いて単離した。Weber et al., Pediatr Res, 70(3):236-41 (2011)参照。溶出物をEC培地に再懸濁し、培養した。
【０２９７】
平滑筋細胞
海綿体組織を洗浄し、処理し、最少量の補足DMEM中、37℃、95％空気と5％CO2の加湿雰囲気に置いた。Pilatz et al., European Urology, 47(5):710-719 (2005)参照。さらなる処理の後、細胞は移植片から移動し（4〜10日）、移植片を除去し、細胞を培地中、D-バリンによりコンフルエントにさせて、平滑筋細胞の形態に影響することなく、線維芽細胞の成長を制御した。細胞を、免疫染色および蛍光顕微鏡法によりアルファ平滑筋アクチン（α-SMA）発現について調べた。
【０２９８】
過冷却保存プロトコル
少量のCC内皮および平滑筋細胞を、約70％の平均コンフルエンスで用いた。この実験ではより少量が必要であったため、Biorad 96穴PCRプレートでいくつかの調製物19μL中に調製細胞スラリー1μLを懸濁した（約250,000細胞/mL）。ウェルプレートを、温度を安定させるためにペルチェプレートを備えた-20℃の冷凍庫に置き、細胞を指定の時点で採取した。20％FBSを含む199培地（初代細胞）またはDMEM＋10％FBS（HEK293対照）のいずれか1mLを含む24穴組織培養プレートを37℃、5％CO2で1時間、予備平衡化した。凍結保存した細胞溶液（20μL）を24穴組織培養プレートにピペッティングし、終夜回復させた後、カルセインAMで加温後24時間生存アッセイした。HEK293細胞を外部細胞数標準として用い、高忠実度（R2＞98）で定量した。
【０２９９】
結果
-20℃で貯蔵した初代細胞と混合した調製物は、-20℃まで過冷却した後の各時点で凍結していないようであった。図11は、HTK溶液は-20℃でCC内皮細胞を保護することができず、48時間後に細胞生存ゼロという結果になり、これはおそらくは保存中の固体氷形成によることを示す。CC平滑筋細胞でも同様の結果が得られた。重要なことに、過冷却調製物XT-SC5の使用は、調製物XT-SC6、XT-SC7、およびXT-SC8に比べて、48時間後に初代CC内皮細胞および平滑筋細胞の高い生存をもたらした。XT-SC5はXT-SC6、XT-SC7、およびXT-SC8と同じ基本緩衝液を含むが、0.5％ペプトイド化合物12が添加されている。4つの調製物はすべて異なる濃度の小分子CPAを含む（XT-SC5＝XT-SC6、XT-SC7＝1.25×、およびXT-SC8＝1.5×）。
【０３００】
内皮細胞の保存および経時的生存試験により、ペプトイドポリマーを加えたXT-SC5は48時間の時間経過で並外れた細胞生存（94％）を提供するが、ペプトイドポリマーなしの調製物およびCPA濃度が高い調製物は48時間で内皮細胞の生存低下（約20％）を示すことが明らかである。平滑筋細胞生存の全般的傾向は、内皮細胞保存から得られた結果と一致している。
【０３０１】
実施例5.  モデル細胞株由来の泌尿生殖器細胞の過冷却
本実施例は、本明細書に記載の過冷却調製物および方法を用いて、モデルヒト泌尿生殖器（GU）細胞株由来のGU細胞の保存が成功したことを示す。
【０３０２】
凍結保存実験を-20℃で実施した。生存、生存度、および増殖を調べた。細胞を蛍光プレート読み取りアッセイにより分析した。
【０３０３】
細胞株SK-OV-3（ヒト卵巣腺癌）を、モデルヒト泌尿生殖器細胞型として、ペプトイドポリマー（例えば、化合物1〜8）を含む様々な凍結保存溶液中、-20℃で保存した。各溶液は5つの時点で4つの同じ複製物を有した。各時点で、細胞数を外部標準により定量した。
【０３０４】
簡単に言うと、100μLの細胞（0.5×106細胞/mL）を試験凍結保護剤（または非凍結対照用の培地）中に反復して懸濁した。試験管を-20℃の冷凍庫の棚に置き、指定の時点で取り出した。試料を37℃の水浴で温め、各10μLを500μL DMEM＋10％FBSを含む回復ウェルに加え、インキュベーター（37℃、5％CO2）中に16時間放置して、アポトーシスを起こしている細胞を通過させた。細胞を染色し、細胞数を正規化した。
【０３０５】
本発明者らは、凍結させた調製物中の細胞の生存を非凍結調製物と比較した。表12に示すとおり、ほとんどの調製物は、-20℃まで過冷却した後に凍結しないままである（「液体」）場合、氷晶での結晶のシーディングにより凍結させた（「凍結」）調製物に比べて、6日間で非常に高い生存を示した。これらの結果は、-20℃で6日間液体のままである細胞ははるかに高い生存度を有することを示し、過冷却した非凍結溶液は、低温および低代謝条件下で細胞生存を増強することを確立した。
【０３０６】
（表１２）
2020516652.tif 000083
【０３０７】
実施例6.  過冷却細胞における生存および増殖試験
本実施例は、本明細書に記載の過冷却調製物および方法に従って保存した細胞は生存可能であり、ペプトイドポリマーなしの対照試料に比べて、生存および増殖が増強されていることを示す。
【０３０８】
SK-OV-3細胞
本発明者らは、いくつかの調製物中のSK-OV-3細胞を、有意に少ない小分子凍結保護剤（約1/5の濃度）を含む溶液中、-20℃で3日間過冷却保存した後に、細胞生存および増殖を評価した。1％化合物12を含む凍結保存調製物（「XT調製物＋1％化合物12」）とXT調製物のみ、10％DMSO調製物（凍結保存の標準）、および/またはDMEM（基本培地、陰性対照）との間で比較を行なった。「XT調製物」はHTK緩衝液および他の構成要素を含む。
【０３０９】
図12は、ペプトイドポリマーを含む調製物は、本明細書に記載の過冷却保存法後に、SK-OV-3細胞生存の増強において有効であったことを示す。特に、ペプトイドポリマー調製物中で過冷却した細胞は、出発細胞数に比べて、加温の1日後に少なくとも50％が生存し、ペプトイド調製物中の細胞数は、ペプトイドポリマーなしの調製物またはDMSO調製物に比べて、加温の1日後に少なくとも約2〜4倍大きかった。
【０３１０】
図13は、ペプトイドポリマーを含む調製物は、本明細書に記載の過冷却保存法後に、SK-OV-3細胞生存度の増強において有効であったことを示す。特に、ペプトイド調製物中の細胞数は、DMSOを含む調製物に比べて、加温の3日後に少なくとも約5〜6倍大きかった。
【０３１１】
K562細胞
本発明者らは、いくつかの調製物中のK562細胞を-20℃で過冷却保存した後、加温後3、6、または7日間のインキュベーション後に、細胞増殖を評価した。K562細胞を-20℃で3日間過冷却することにより保存し、ペプトイドポリマー（例えば、化合物12）を含むXT調製物と、XT調製物のみ（すなわち、ペプトイドなし）、10％DMSO調製物（凍結保存の標準）、およびDMEM（基本培地、陰性対照）とを比較した。簡単に言うと、200μLの細胞（0.5×106細胞/mL）を凍結バイアル中、アルミニウムブロックを用い、試験凍結保護剤（または非凍結対照用の培地）中に4℃で10分間反復して懸濁した。試験管を-20℃の冷凍庫の棚に置き、指定の時点で取り出した。試料を37℃の水浴でゆっくり撹拌して温め、各2μL（10,000細胞）を200μL DMEM＋10％FBSを含む回復ウェルに加え、インキュベーター（37℃、5％CO2）中に置いた。細胞を3、6、または7日間インキュベートし、様々な間隔で染色し、プレート読み取り器で分析した。
【０３１２】
図14および15は、ペプトイドポリマーを含む調製物は、本明細書に記載の過冷却保存法後に、K562細胞生存度の増強において有効であったことを示す。特に、図14は、化合物12を含むペプトイド調製物中の細胞数は、ペプトイドポリマーなしの調製物またはDMSO調製物に比べて、加温の3日後に少なくとも約1〜2倍大きかったことを示す。図15は、化合物12を含むペプトイド調製物中の細胞数は、ペプトイドポリマーなしの調製物またはDMSO調製物に比べて、加温の6日後に少なくとも約2〜3倍大きかったことを示す。
【０３１３】
図16は、様々なペプトイドポリマーを含む多くの調製物は、本明細書に記載の過冷却保存法後に、K562細胞生存度の増強において有効であったことを示す。特に、化合物12、27、62、74、または76を含むペプトイド調製物中の細胞数は、DMSOを含む調製物に比べて、加温の7日後に少なくとも約3〜4倍大きかった。
【０３１４】
V.  例示的態様
本開示の主題に従って提供される例示的態様には、特許請求の範囲および以下の態様が含まれるが、それらに限定されない。
1. 改善された細胞生存度で細胞集団を凍結保存する方法であって、 
（a）細胞集団を、1つまたは複数の極性ペプトイドモノマーを含むペプトイドポリマーまたはその塩と接触させる段階；および
（b）過冷却細胞集団を生成するために、該細胞集団を少なくとも約3時間の期間0℃〜約-20℃の温度に冷却する段階
を含み、
ここで、0℃超に加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約50％が生存する、方法。
2. 温度が約-10℃〜約-20℃である、態様1の方法。
3. 温度が約-20℃である、態様1または2の方法。
4. 期間が少なくとも約8または16時間である、態様1〜3のいずれかの方法。
5. 期間が約2〜約5日間である、態様1〜3のいずれかの方法。
6. 期間が約2、3、4、または5日間である、態様5の方法。
7. 期間が少なくとも約5日間である、態様1〜3のいずれかの方法。
8. 37℃に加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約50％が生存する、態様1〜7のいずれかの方法。
9. 加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約60％が生存する、態様1〜8のいずれかの方法。
10. 加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約70％が生存する、態様1〜8のいずれかの方法。
11. 加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約80％が生存する、態様1〜8のいずれかの方法。
12. 加温した後に過冷却細胞集団の少なくとも約90％が生存する、態様1〜8のいずれかの方法。
13. 改善された細胞生存度が、対照過冷却細胞集団と比較して、加温後に生存する過冷却細胞集団の増殖の増強を含む、態様1〜12のいずれかの方法。
14. 対照過冷却細胞集団がペプトイドポリマーと接触していない、態様13の方法。
15. 加温の約3日後における過冷却細胞集団の細胞数が、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約1倍大きい、態様13または14の方法。
16. 加温の約6日後における過冷却細胞集団の細胞数が、対照過冷却細胞集団の細胞数よりも少なくとも約2倍大きい、態様13または14の方法。
17. ペプトイドポリマーが、その温度で氷晶形成を低減または阻害するのに十分な量で存在する、態様1〜16のいずれかの方法。
18. ペプトイドポリマーが、約100nM〜約1000mMの量で存在する、態様17の方法。
19. 細胞集団が組織または臓器を構成する、態様1〜18のいずれかの方法。
20. 細胞集団が、初代細胞、心臓細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞、膵細胞、胃細胞、腸細胞、筋細胞、皮膚細胞、神経細胞、血液細胞、免疫細胞、線維芽細胞、泌尿生殖器細胞、骨細胞、幹細胞、精細胞、卵母細胞、胚細胞、上皮細胞、内皮細胞、およびその組み合わせからなる群より選択される、態様1〜19のいずれかの方法。
21. （c）過冷却細胞集団を0℃超に加温する段階
をさらに含む、態様1〜20のいずれかの方法。
22. ペプトイドポリマーが、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の極性ペプトイドモノマーを含む、態様1〜21のいずれかの方法。
23. 極性ペプトイドモノマーが、ヒドロキシル基を含む独立に選択された側鎖を有する、態様1〜22のいずれかの方法。
24. 独立に選択された側鎖が、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である、態様23の方法。
25. C1-18ヒドロキシアルキル基が、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である、態様24の方法。
26. ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーおよび1つまたは複数のアミノ酸を含むペプトイド-ペプチドハイブリッドまたはその塩であり、
ここで、1つまたは複数のアミノ酸が、ペプトイドポリマーの一端もしくは両端、および/または1つもしくは複数のペプトイドモノマーの間に位置する、
態様1〜25のいずれかの方法。
27. ペプトイドポリマーが式（I）の構造を有するか、その互変異性体またはその立体異性体である、態様1〜26のいずれかの方法：
2020516652.tif 000084
式中：
各R1はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいアルコキシ、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、置換されていてもよいカルボキシアルキル、C3-10シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、(C3-10シクロアルキル)アルキル、(ヘテロシクロアルキル)アルキル、アリールアルキル、およびヘテロアリールアルキルからなる群より独立に選択され；
ここで、少なくとも1つの場合のR1は、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキルであり、かつ
ここで、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基のいずれかは1つまたは複数のR3基で独立に置換されていてもよく；
各R2はH、置換されていてもよいC1-18アルキル、置換されていてもよいC2-18アルケニル、置換されていてもよいC2-18アルキニル、置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-18アルキルアミノ、置換されていてもよいC1-18アルキルチオ、および置換されていてもよいカルボキシアルキルからなる群より独立に選択され；
各R3はハロゲン、オキソ、チオキソ、-OH、-SH、アミノ、C1-8アルキル、C1-8ヒドロキシアルキル、C1-8アルキルアミノ、およびC1-8アルキルチオからなる群より独立に選択され；
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、アセチル、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成し；かつ
ポリマー中のモノマーの数を表す下付き文字nは、2〜50である。
28. 少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、またはそれ以上の場合のR1が、独立に選択された置換されていてもよいC1-18ヒドロキシアルキル基である、態様27の方法。
29. C1-18ヒドロキシアルキル基が、独立に選択された置換されていてもよいC1-6ヒドロキシアルキル基である、態様28の方法。
30. 各R1が下記からなる群より独立に選択される、態様27の方法：
2020516652.tif 000085
式中：
mは1〜8であり；かつ
R3はH、C1-8アルキル、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ニトロ、アミン、オキソ、およびチオキソからなる群より選択される。
31. 1つまたは複数のR1がR1bの構造を有する、態様30の方法：
2020516652.tif 000086
。
32. 各R1が下記からなる群より独立に選択される、態様27の方法
2020516652.tif 000087
。
33. 各場合のR2がHである、態様27〜32のいずれかの方法。
34. nが6〜25である、態様27〜33のいずれかの方法。
35. nが6〜20である、態様27〜33のいずれかの方法。
36. nが10〜25である、態様27〜33のいずれかの方法。
37. XがH、C1-8アルキル、およびC1-8アシルからなる群より選択され；かつYが-OHおよびアミノからなる群より選択される、態様27〜36のいずれかの方法。
38. ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーが配列[HaPb]nまたは[PbHa]nを有するように配置された1つまたは複数の第1の疎水性ペプトイドモノマーHと1つまたは複数の第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニットを含み、ここで、
サブユニット内の連続した第1の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字aは、1〜10であり；
サブユニット内の連続した第1の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字bは、1〜10であり；かつ
ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、2〜50である、
態様1〜26のいずれかの方法。
39. ペプトイドポリマーが配列X-[HaPb]n-YまたはX-[PbHa]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
態様38の方法。
40. サブユニットが、ペプトイドポリマーが配列[HaPbHcPd]nまたは[PbHaPdHc]nを有するような第2の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または第2の極性ペプトイドモノマーをさらに含み、ここで、
サブユニット内の連続した第2の疎水性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字cは、0〜10であり；
サブユニット内の連続した第2の極性ペプトイドモノマーの数を表す下付き文字dは、0〜10であり；かつ
cおよびdの両方が0であることはない、
態様38または39の方法。
41. ペプトイドポリマーが配列X-[HaPbHcPd]n-YまたはX-[PbHaPdHc]n-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
態様40の方法。
42. 1つもしくは複数の疎水性ペプトイドモノマーおよび/または1つもしくは複数の極性ペプトイドモノマーを含む配列Zをさらに含み、ここで、Zは、第1のサブユニットの前、最後のサブユニットの後、および/または1つもしくは複数のサブユニットの間に位置する、態様38〜41のいずれかの方法。
43. ペプトイドポリマーが、  ペプトイドポリマーが配列[H2P2]nH2または[P2H2]nH2を有するように配置された
（a）2つの第1の疎水性ペプトイドモノマーHと2つの第1の極性ペプトイドモノマーPとを含むサブユニット、および
（b）ペプトイドポリマーのC末端に位置する2つの第2の疎水性ペプトイドモノマー
を含み、
ここで、ペプトイドポリマー内のサブユニットの数を表す下付き文字nは、1〜50である、
態様1〜26のいずれかの方法。
44. ペプトイドポリマーが、ペプトイドポリマーが配列X-[H2P2]nH2-YまたはX-[P2H2]nH2-Yを有するような置換基XおよびYをさらに含み、ここで、
XおよびYは、H、置換されていてもよいC1-8アルキル、置換されていてもよいC1-8アシル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、-OH、-SH、-NH2、カルボキシ、置換されていてもよいC1-8ヒドロキシアルキル、置換されていてもよいC1-8アルキルアミノ、置換されていてもよいC2-8アルキルチオ、置換されていてもよいC1-8カルボキシアルキル、およびハロゲンからなる群より独立に選択されるか、または
代わりにXおよびYは一緒になって共有結合を形成する、
態様43の方法。
45. nが1〜10である、態様43または44の方法。
46. 第1および/または第2の疎水性ペプトイドモノマーが下記からなる群より独立に選択される、態様38〜45のいずれかの方法：
2020516652.tif 000088
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である。
47. ペプトイドポリマーが、ヒドロキシル基を含む側鎖を有する極性ペプトイドモノマーを含む、態様38〜46のいずれかの方法。
48. 第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーが下記からなる群より独立に選択される、態様38〜47のいずれかの方法：
2020516652.tif 000089
2020516652.tif 000090
2020516652.tif 000091
式中、下付き文字mは反復単位の数であって、1〜10である。
49. 第1および/または第2の極性ペプトイドモノマーがそれぞれ、(C1-6アルコキシ)(C1-6アルキレン)、オリゴ(エチレングリコール)、(4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)、および(5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)からなる群より独立に選択される側鎖を含む、態様38〜48のいずれかの方法。
50. (4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)が4〜6員複素環を含み、ここで、少なくとも1つの構成員は、OおよびNからなる群より選択される、態様49の方法。
51. (4〜10員ヘテロシクロアルキル)(C1-6アルキレン)がテトラヒドロフラニルまたはオキソピロリジニル部分を含む、態様49または50の方法。
52. ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000092
を含む、態様51の方法。
53. 極性ペプトイドモノマーがすべて
2020516652.tif 000093
である、態様52の方法。
54. (5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)が5〜6員芳香環を含み、ここで、少なくとも1つの環構成員は、OおよびNからなる群より選択される、態様49の方法。
55. (5〜10員ヘテロアリール)(C1-6アルキレン)がフラニル部分を含む、態様49または54の方法。
56. ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000094
を含む、態様55の方法。
57. 側鎖がメトキシエチル基を含む、態様49の方法。
58. ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000095
を含む、態様57の方法。
59. 側鎖がオリゴ(エチレングリコール)部分を含む、態様49の方法。
60. オリゴ(エチレングリコール)部分が2-(2-(2-メトキシエトキシ)エトキシ)エチル部分である、態様59の方法。
61. ペプトイドポリマーが
2020516652.tif 000096
を含む、態様60の方法。
62. nが2〜10である、態様38〜42または46〜61のいずれかの方法。
63. aが1〜5である、態様38〜42または46〜62のいずれかの方法。
64. bが1〜5である、態様38〜42または46〜63のいずれかの方法。
65. aが1〜3であり、かつbが1〜3である、態様63または64の方法。
66. cが0〜5である、態様40〜42または46〜65のいずれかの方法。
67. dが0〜5である、態様40〜42または46〜66のいずれかの方法。
68. ペプトイドモノマーの約10、20、30、40、50、60、70、80、または90％が疎水性である、態様38〜67のいずれかの方法。
69. ペプトイドポリマー塩が塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、メシレート塩、硝酸塩、酒石酸塩、グルコン酸塩、およびその組み合わせからなる群より選択される、態様1〜68のいずれかの方法。
70. ペプトイドポリマーを凍結保護剤溶液に製剤化する、態様1〜69のいずれかの方法。
71. 凍結保護剤溶液が、イオン種、浸透性凍結保護剤、非浸透性凍結保護剤、抗酸化剤、細胞膜安定化化合物、アクアポリンまたは他のチャネル形成化合物、アルコール、糖、糖誘導体、非イオン性界面活性剤、タンパク質、ジメチルスルホキシド（DMSO）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG）、フィコール(登録商標)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒアルロナン、ホルムアミド、天然または合成ヒドロゲル、およびその組み合わせからなる群より選択される化合物をさらに含む、態様70の方法。
72. 態様1〜70のいずれかの方法によって生成した、改善された細胞生存度を有する過冷却細胞集団。
【０３１５】
本明細書において例示し、論じる態様は、本発明を作製し、使用するための、発明者らが知る最良のやり方を当業者に教示することを意図するにすぎない。本明細書におけるなにものも本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。示したすべての例は代表例であって限定ではない。本発明の前述の態様は、前述の教示に照らして当業者には理解されるとおり、本発明から逸脱することなく改変または変更され得る。したがって、特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内で、本発明を、具体的に記載した以外で実施し得ることが理解される。本明細書において引用するすべての出版物、特許、および特許出願は、それぞれ個々の出版物、特許、および特許出願が具体的かつ個別に参照により本明細書に組み入れられると示されたがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。
【０３１６】
VI.  略式配列リスト
2020516652.tif 000097
2020516652.tif 000098
【図１】
2020516652.tif 000112
【図２】
2020516652.tif 000113
【図３】
2020516652.tif 000114
【図４Ａ】
2020516652.tif 000115
【図４Ｂ】
2020516652.tif 000116
【図４Ｃ】
2020516652.tif 000117
【図４Ｄ】
2020516652.tif 000118
【図４Ｅ】
2020516652.tif 000119
【図４Ｆ】
2020516652.tif 000120
【図４Ｇ】
2020516652.tif 000121
【図５Ａ】
2020516652.tif 000122
【図５Ｂ】
2020516652.tif 000123
【図５Ｃ】
2020516652.tif 000124
【図５Ｄ】
2020516652.tif 000125
【図５Ｅ】
2020516652.tif 000126
【図５Ｆ】
2020516652.tif 000127
【図５Ｇ】
2020516652.tif 000128
【図６】
2020516652.tif 000129
【図７】
2020516652.tif 000130
【図８】
2020516652.tif 000131
【図９】
2020516652.tif 000132
【図１０Ａ】
2020516652.tif 000133
【図１０Ｂ】
2020516652.tif 000134
【図１１】
2020516652.tif 000135
【図１２】
2020516652.tif 000136
【図１３】
2020516652.tif 000137
【図１４】
2020516652.tif 000138
【図１５】
2020516652.tif 000139
【図１６】
2020516652.tif 000140
【国際調査報告】
2020516652.tif 000141
2020516652.tif 000142
2020516652.tif 000143
2020516652.tif 000144