(57)【要約】  （１）体液、組織または洗浄液を収集または調製するステップと、（２）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現を測定するステップであって、ＡＬＸ受容体リガンドのレベルが臨床転帰または治療法の選択を予測する、ステップとを含む、患者における慢性炎症の疾患の重症度を判定する方法が開示されている。【選択図】図１Ａ−Ｅ
2020507761.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）体液、組織または洗浄液を収集または調製するステップと、
（ｂ）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現を測定するステップであって、ＡＬＸ受容体リガンドのレベルが臨床転帰または治療法の選択を予測する、ステップと
を含む、患者における慢性炎症の疾患の重症度を判定する方法。
【請求項２】
ＡＬＸ受容体リガンドがＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４およびＳＡＡで構成される群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定が比率をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
慢性炎症の疾患が、病的肺炎症、関節炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬で構成される群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
肺炎症の疾患が嚢胞性線維症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
肺炎症の疾患が喘息である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
肺炎症の疾患が、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、細気管支炎、間質性肺疾患、移植拒絶、肺炎、肺膿瘍、肺血管疾患、肺塞栓、およびＡＲＤＳで構成される群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
体液または洗浄液が気管支肺胞洗浄液である、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
体液、組織または洗浄液は、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸膜液、心膜液および関節液で構成される群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
リポキシンＡ４および血清アミロイドＡのレベルが測定され、比が肺炎症の増加、喘息症状の増加、肺機能の低下および喘息併存症のリスク増加を含む重篤な疾患の臨床転帰を予測する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
組織、体液または洗浄液中のマクロファージによるＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体の発現が、肺炎症の増加、喘息症状の増加、肺機能の低下および喘息併存症のリスク増加を含む重篤な疾患の臨床転帰を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現を測定する方法であって、方法が、
（ａ）患者の組織、体液または洗浄液を取得するステップと、
（ｂ）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現の量を判定するステップと
を含む、方法。
【請求項１３】
体液、組織または洗浄液は気管支肺胞洗浄液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
体液、組織または洗浄液が、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸膜液、心膜液および関節液で構成される群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
測定が、ＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、およびＳＡＡのうちの少なくとも１つの測定である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
測定が、ＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、およびＳＡＡのうちの少なくとも２つの測定である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１７】
測定がＥＬＩＳＡによるものである、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１７年１月３１日に提出された米国仮出願第６２／４５２，５３３号の優先権を主張し、この出願は参照により以下に完全に記載されているかのように組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＨＬ１０９１７２に基づく政府の支援により行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
喘息は慢性肺炎症の最も一般的な疾患であり、ほぼ１３人に１人のアメリカ人が罹患している（１）。喘息の診断のための現在の臨床基準には、不均一な疾患プロセスおよび薬物療法への明確な反応を有する広範な患者が含まれる（２）。喘息患者の約１０〜１５％は、喘息を標的としてコントロールする薬物の使用にもかかわらず、日常的な症状と不十分な喘息コントロールを伴う重症喘息（ＳＡ）を患っている。これらのＳＡ患者では、頻繁な外来受診、入院、さらには生命にかかわる悪化を含む重大な有害転帰を伴う罹病率が高い（３）。患者の臨床的特徴を利用したクラスター分析により、喘息患者における少なくとも５つの異なるクラスターが特定されている（４、５）。喘息の病因における疾患メカニズムを特定することは、患者の臨床フェノタイピングから分子エンドタイピングに分野を移行し、喘息管理を改善するための精密な医学的アプローチを可能にするために重要である（６）。２型「高」炎症は喘息の病理生物学の約５０％を占めるが（７）、喘息対象の残りの５０％については疾患メカニズムが確認されていない。喘息における非２型炎症の根底にあるメカニズムをより詳細に理解する必要がある。
【０００４】
健康において、炎症の解消は、必須脂肪酸に由来する特殊化された炎症解消メディエーター（ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ，ＳＰＭ）により調節される特定の細胞イベントによって支配される活動プロセスである（８）。ＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は、急性炎症を強力に調節する内因性アラキドン酸由来のＳＰＭであるが、ＳＡを含む多くの炎症性疾患では十分に産生されていない（９）。リポキシンとその安定な類似体は、アレルギー性肺炎症のマウスモデルでは予防的に働き、ヒト白血球に対する細胞型特異的作用を示してグループ２の先天性リンパ系細胞による炎症誘発性インターロイキン−１３の産生を抑制し、顆粒球の輸送と活性化を停止し、Ｔ細胞サイトカイン産生を減少させ、ナチュラルキラー細胞の機能を強化し、マクロファージＣＤ２０６の発現およびエフェロサイトーシスを刺激して、組織の炎症を解消させる（（９）で検討）。リポキシンはまた、喘息における生体内を含むロイコトリエン媒介起炎性作用を阻害し（１０）、サイトカイン誘発性ヒト気道収縮反応を減少させる（１１）。末梢血、呼気凝縮液、痰およびＢＡＬＦでは、非重症喘息（ＮＳＡ）に比べてＳＡのＬＸＡ４レベルが低下し（１２−１５）、一部の喘息患者における不完全な解消メカニズムと持続的な気道炎症との関連性を示唆している。
【０００５】
ＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は、特定の受容体と相互作用して、その炎症解消作用を発揮する。それらの高親和性同族受容体は、約１ｎＭのＫＤを有するＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体（ＡＬＸ）である（１６）。興味深いことに、ＡＬＸは脂質とペプチドの両方のリガンドに関与すると報告された最初の受容体であり（１６）、その後、ＡＬＸのいくつかの脂質とペプチドのリガンドが同定された。リガンド認識部位はＡＬＸ受容体の細胞外ドメインが異なり、関与するリガンドに応じて受容体のシグナル伝達特性を劇的に変化させる明確な下流イベントを引き起こす（１７）。ＬＸＡ４の対抗制御的シグナル伝達とは対照的に、ＳＡＡは同じＡＬＸ受容体に関与して炎症を促進する（１８、１９）。ＳＡＡは、ＡＬＸを介したＳＰＭシグナル伝達を圧倒するＬＸＡ４よりも２〜３ログオーダー高い量でＣＯＰＤ悪化の急性期タンパク質として生成される（１８）。重症喘息に関与している可能性がある別のＡＬＸリガンドは、アネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１）であり、これはＡＬＸ受容体と相互作用してＬＸＡ４に似た炎症解消作用を伝達できるコルチコステロイド誘導性タンパク質である（２０）。興味深いことに、見かけ上健康な人が皮膚刺激物で攻撃されると、リポキシンの産生とＡＬＸ受容体の発現に基づいて、皮膚創傷の高速レゾルバと低速レゾルバに分かれる（２１）。したがって、リポキシンはＳＡＡとＡＬＸの相互作用をアロステリックに阻害できるため、これらの脂質およびペプチドＡＬＸリガンドの相対レベルは気道疾患における炎症性宿主反応のレオスタットとして機能する可能性がある（１８）。合わせて、これらの炎症誘発性ＡＬＸリガンドと炎症解消性ＡＬＸリガンドの相対的な量と作用は、気道の炎症傾向を生化学的に調節し、ＳＡの未解決の炎症に寄与する可能性がある。
【０００６】
以下の例では、ＮＨＬＢＩ  ＳＡＲＰ−３に参加している対象から収集したＢＡＬＦサンプルを分析し、ＳＡにおける好中球性炎症、喘息症状の増加および肺機能の低下に関連するＡＬＸ受容体リガンドＬＸＡ４およびＳＡＡのレベルに関する新しい喘息の生化学エンドタイプを特定した。このエンドタイプは他の炎症系疾患の診断と治療に役立つであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一実施形態では、本発明は、（ａ）体液、組織または洗浄液を収集または調製するステップと、（ｂ）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現を測定するステップであって、ＡＬＸ受容体リガンドのレベルが臨床転帰または治療法の選択を予測する、ステップとを含む、患者における慢性炎症の疾患の重症度を判定する方法である。好ましくは、ＡＬＸ受容体リガンドは、ＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４およびＳＡＡで構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、測定は比率をもたらす。
【０００８】
本発明の一実施形態では、慢性炎症の疾患は、病的肺炎症、関節炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬で構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、肺炎症の疾患は嚢胞性線維症または喘息である。他の実施形態では、肺炎症の疾患は、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、細気管支炎、間質性肺疾患、移植拒絶、肺炎、肺膿瘍、肺血管疾患、肺塞栓、およびＡＲＤＳで構成される群から選択される。いくつかの実施形態では、リポキシンＡ４および血清アミロイドＡのレベルが測定され、その比は、肺炎症の増加、喘息症状の増加、肺機能の低下および喘息併存症のリスク増加を含む重篤疾患の臨床転帰を予測する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、体液または洗浄液は気管支肺胞洗浄液である。いくつかの実施形態では、体液、組織または洗浄液は、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸膜液、心膜液および関節液で構成される群から選択される。
【００１０】
本発明の一実施形態では、組織、体液または洗浄液中のマクロファージによるＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体の発現は、肺炎症の増加、喘息症状の増加、肺機能の低下および喘息併存症のリスク増加を含む重篤な疾患の臨床転帰を予測する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現を測定する方法であって、この方法は、（ａ）患者の組織、体液または洗浄液を取得するステップと、（ｂ）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドまたはＡＬＸ受容体発現の量を判定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、体液、組織または洗浄液は、気管支肺胞洗浄液であるか、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸水、心膜液および関節液で構成される群から選択されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ−Ｅ】喘息において異なるＢＡＬＦのＡＬＸリガンドおよびＡＬＸ受容体発現の相対的存在量を示す図である。ＢＡＬＦは、喘息に罹患した対象（ｎ＝１２０）と健康なドナー（ｎ＝４７、灰色の丸）から取得した。喘息対象を、ＳＡＲＰ基準により、ＮＳＡ（ｎ＝５１、青い四角）およびＳＡ（ｎ＝６９、赤い三角形）コホートに割り当てた。（Ａ）ＬＸＡ４および（Ｂ）１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４をＢＡＬＦから抽出し、ＥＬＩＳＡで定量した（方法を参照）。（Ｃ）ＡＮＸＡ１および（Ｄ）ＳＡＡレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定した。散布図は、タンパク質レベルに正規化された各対象の個々のデータポイントを示し、中央値は水平線で示されている（Ｅ）フローサイトメトリーは、ＨＤ（ｎ＝３２）、ＮＳＡ（ｎ＝３３）、およびＳＡ（ｎ＝３８）対象の生存能力のあるＢＡＬマクロファージで実行して表面のＡＬＸ発現を測定した。データはＡＬＸ指数（ＭＦＩ  ＡＬＸをＭＦＩアイソタイプ対照で除算）として表している。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１に続いて、多重比較のためのＤｕｎｎ検定を行った。ＢＡＬＦは気管支肺胞洗浄液、ＡＬＸは気道リポキシンＡ４受容体、ＨＤは健康なドナー、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＳＡＲＰは重症喘息研究プログラム、ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は１５−エピマーリポキシンＡ４、ＥＬＩＳＡは酵素結合免疫吸着アッセイ、ＡＮＸＡ１はアネキシンＡ１、ＳＡＡは血清アミロイドＡ、ＭＦＩは蛍光強度の中央値を表す。
【図２】喘息におけるＡＬＸリガンド、肺炎症、喘息症状および肺機能の関係を示す図である。ＢＡＬＦのＡＬＸリガンドレベル、ＢＡＬ白血球、喘息症状スコア、および肺機能測定値の関係を、ＮＳＡ（ｎ＝５１）およびＳＡ（ｎ＝６９）対象についてピアソン相関行列（方法を参照）によって決定した。正の相関関係は青で、負の相関関係は赤で示されている。色の濃さはピアソン相関係数に比例し、濃い色は強い関連性を示す。ピアソン相関分析による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＢＡＬＦは気管支肺胞洗浄液、ＡＬＸは気道リポキシンＡ４受容体、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は１５−エピマーリポキシンＡ４、ＡＮＸＡ１はアネキシンＡ１、ＳＡＡは血清アミロイドＡ、ＡＣＱは喘息管理アンケート、ＡＣＴは喘息コントロールテスト、ＦＥＶ１は努力呼気１秒量、ＦＶＣは努力肺活量、ＦｅＮＯは呼気一酸化窒素、ＰＣ  ２０はＦＥＶ１の２０％低下を引き起こす誘発試験を表す。
【図３Ａ−Ｈ】ＢＡＬの好中球は重度喘息において増加し、ＢＡＬＦのＬＸＡ４およびＳＡＡレベルと示差的に関連することを示す図である。ＮＳＡおよびＳＡ対象からＢＡＬサンプルを取得し、白血球サブセットを列挙した。（Ａ）円グラフは、ＨＤ（ｎ＝４７）、ＮＳＡ（ｎ＝５１）、およびＳＡ（ｎ＝６９）対象におけるＢＡＬの好中球、リンパ球、好酸球およびマクロファージの平均割合を表す。（Ｂ〜Ｄ）散布図は、ＨＤ（灰色の丸）、ＮＳＡ（青い四角）、ＳＡ（赤い三角形）コホートにおけるＢＡＬの（Ｂ）好中球、（Ｃ）リンパ球、（Ｄ）好酸球の平均±ＳＥＭで個々の対象のデータポイントを示す。＊＊両側スチューデントｔ検定によるｐ＜０．０１。（Ｅ〜Ｆ）ＢＡＬＦの好中球とＬＸＡ４との関係を（Ｅ）すべての喘息対象および（Ｆ）ＳＡコホートのみについて判定した。（Ｇ〜Ｈ）ＢＡＬＦの好中球とＳＡＡとの関係を、（Ｇ）すべての喘息対象および（Ｈ）ＳＡコホートのみについて決定した。検出不能なＳＡＡレベルには０ｐｇ／μｇタンパク質の値を割り当て、相関分析に含めた。ピアソン相関のｒ値と有意性を記録し、回帰直線が示されている。ＨＤは健康なドナー、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、ＳＡＡは血清アミロイドＡを表す。
【図４Ａ−Ｌ】ＳＡＡとマクロファージＡＬＸ発現が重症喘息における症状の増加に関連することを示す図である。喘息対象を、ＳＡＡ（Ａ〜Ｄ）、ＬＸＡ４（Ｅ〜Ｈ）およびマクロファージＡＬＸ発現（Ｉ〜Ｌ）の「低」または「高」ＢＡＬＦレベルに基づいてサブグループに分類した。各変数の中央値を使用して、「低」および「高」サブグループ間のカットオフを定義した（ＳＡＡカットオフ＝１．２２ｐｇ／μｇタンパク質、ＬＸＡ４カットオフ＝０．２５  ｐｇ／μｇタンパク質、ＡＬＸ指数カットオフ＝４．６）。カットオフ値は灰色の縦線で区切られている。ヒストグラムは、ＢＡＬＦの（Ａ）ＳＡＡレベル、（Ｅ）ＬＸＡ４レベル、および（Ｉ）ＢＡＬマクロファージＡＬＸ指数に基づく対象の分布を示す。（Ｂ、Ｆ、Ｊ）喘息症状（ＡＣＱおよびＡＣＴスコア）の有効な測定値を、ＳＡＡ、ＬＸＡ４、およびＡＬＸ指数の低（白丸）および高（黒丸）サブグループ間で比較した。（Ｃ、Ｇ、Ｋ）ＮＳＡ（青）およびＳＡ（赤）対象間のＳＡＡ、ＬＸＡ４およびＡＬＸ指数の分布がバイオリンプロットに示されている。（Ｄ、Ｈ、Ｌ）ＳＡＡ、ＬＸＡ４およびＡＬＸ指数の低（白三角）および高（黒三角）サブグループについて、ＳＡ対象のＡＣＱおよびＡＣＴスコアを比較した。散布図は、個々の対象のデータを平均±ＳＥＭで示す。ＮＳＡ対象のｎ＝５１、ＳＡ対象のｎ＝６９。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定または両側スチューデントｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＳＡＡは血清アミロイドＡ、ＡＣＱは喘息管理アンケート、ＡＣＴは喘息コントロールテスト、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、ＡＬＸは気道リポキシンＡ４受容体を表す。
【図５Ａ−Ｆ】ＢＡＬＦのＳＡＡおよびＬＸＡ４レベルが臨床的に重症の喘息と非重症の喘息とで異なることを示す図である。（Ａ）ＬＸＡ４およびＳＡＡのＢＡＬＦレベルが中央値の下（「低」）または上（「高」）である喘息対象の数と割合を特定し、ＬＸＡ４およびＳＡＡレベルに基づいて対象を４つのフェノタイプにグループ化した。注目すべきはＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ群（ベージュの象限）、およびＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ（紫の象限）の対象である。個々の対象のＬＸＡ４およびＳＡＡレベルの関係を、すべての喘息対象について決定した。（Ｂ）対象についてＢＡＬＦのＳＡＡおよびＬＸＡ４の低および高コホートに基づいて対象の４群を決定し、喘息の重症度によってＮＳＡ（左）およびＳＡ（右）に層別化した。（Ｃ）喘息対象（ｎ＝１２０）において、ＳＡＡ／ＬＸＡ４比とＢＡＬ好中球（％）との関係を決定した。ピアソン相関ｒ値と有意性を記録し、回帰直線が示されている。（Ｄ〜Ｆ）散布図は、（Ｄ）炎症（ＢＡＬＦ好中球（％））、（Ｅ）喘息症状（ＡＣＱ、ＡＣＴスコア）および（Ｆ）肺機能（ＦＥＶ１およびＦＶＣ予測％）の測定値について、ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ群の対象（ベージュ）とＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ群の対象（紫）との比較を示す。（Ｇ）ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ群およびＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ群の対象を、ＳＡＲＰ−１（５）で定義された臨床クラスターに割り当て、ＮＳＡおよびＳＡクラスターに割り当てられた対象の割合を示している。ＮＳＡ対象のｎ＝５１、ＳＡ対象のｎ＝６９。両側スチューデントｔ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、ＳＡＡは血清アミロイドＡ、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＡＣＱは喘息管理アンケート、ＡＣＴは喘息コントロールテスト、ＦＥＶ１は努力呼気１秒量、ＦＶＣは努力肺活量、ＳＡＲＰは重症喘息研究プログラムを表す。
【図６Ａ−Ｄ】ヒトＡＬＸ受容体（Ａ５４９ｈＡＬＸ）を発現する好中球化学誘引物質ＩＬ−８  Ａ５４９ヒト上皮細胞の産生を調節するＡＬＸ受容体を介したＳＡＡおよび１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４シグナル伝達を、ＨＤ、ＮＳＡまたはＳＡ対象からのＢＡＬＦに曝露し（２４時間、３７℃、５％ＣＯ２）、ＥＬＩＳＡによって無細胞上清中でＩＬ−８レベルを測定した（方法を参照）。（Ａ）Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞のインキュベーションに使用した対象（ｎ＝１５）からのＢＡＬＦのＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、およびＳＡＡの平均レベルを積み上げ棒グラフで示し、相対的な割合を円グラフで示す。（Ｂ）生理食塩水対照またはＳＡＡ（２．５ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間インキュベートした後、Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞によるＩＬ−８産生を測定した。（Ｃ）ＨＤ（ｎ＝３）、ＮＳＡ（ｎ＝６）またはＳＡ（ｎ＝５）からのＢＡＬＦに２４時間曝露した後、Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞によるＩＬ−８産生を測定し、生理食塩水対照と比較した増加として表した。生理食塩水対照と比較してＩＬ−８産生が増加しないＢＡＬＦとのインキュベーションにはゼロの値を割り当てた。（Ｄ）Ａ５４９ｈＡＬＸ上皮細胞を、内因性レベルがＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ（ｎ＝５）またはＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ（ｎ＝６）である対象からのＢＡＬＦに曝露し、続いて外因性１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４（１００ｎＭ）に曝露した。１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４曝露後のＩＬ−８産生の阻害率（％）を計算した。（Ｂ）一元配置分散分析、（Ｃ）Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定および（Ｄ）Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定による＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。ＡＬＸは気道リポキシンＡ４受容体、ＬＸＡ４はリポキシンＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は１５−エピマーリポキシンＡ４、ＳＡＡは血清アミロイドＡ、ＨＤは健康なドナー、ＮＳＡは非重症喘息、ＳＡは重症喘息、ＩＬ−８はインターロイキン−８、ＢＡＬＦは気管支肺胞洗浄液を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
全般
【００１４】
患者の健康の研究において、炎症の解消は、特殊化された炎症解消メディエーターおよび受容体によって支配される活動プロセスとして知られている。ＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体（ＡＬＸ）は、シグナル伝達イベントに対抗するために炎症解消性リガンドおよび炎症誘発性リガンドの両方を標的とし、これは炎症反応の運命におけるＡＬＸの極めて重要な役割を出願人に示唆する。
【００１５】
以下の実施例で、出願人はＡＬＸの発現およびリガンドが重症喘息（ＳＡ）に関連しているかどうかを調査した。ＡＬＸ発現と炎症解消性リガンド（リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４およびアネキシンＡ１（ＡＮＸＡ１））、および炎症誘発性リガンド（血清アミロイドＡ（ＳＡＡ））のレベルを重症喘息研究プログラム−３（ＳＡ（ｎ＝６９）、非重症喘息（ＮＳＡ、ｎ＝５１）または健康なドナー（ＨＤ、ｎ＝４７））から採取した気管支鏡検査サンプルで測定した。
【００１６】
すなわち出願人は、ＮＳＡに比べてＳＡで気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液のＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４が減少し、ＳＡＡが増加することを見出した（ＳＡＡ中央値：ＮＳＡの０ｐｇ／μｇタンパク質と比較してＳＡでは１１．３５ｐｇ／μｇタンパク質）。ＢＡＬマクロファージのＡＬＸ発現はＳＡで増加した（健康なドナーのＢＡＬマクロファージＡＬＸ指数（ＭＦＩ）約３と比較して、ＳＡでは約５）。ＬＸＡ４低／ＳＡＡ高レベルを有する対象は、ＢＡＬの好中球増加、喘息症状の増加、肺機能の低下、ならびに喘息増悪、副鼻腔炎および胃食道逆流症の相対リスク増加を示し、ＳＡ臨床クラスターに割り当てられる頻度が高かった。ＳＡＡおよびＬＸＡ４低／ＳＡＡ高ＢＡＬＦのアリコートはＡＬＸ受容体を発現する肺上皮細胞によるインターロイキン８の産生を誘導し、インターロイキン８の産生は１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４との共インキュベーションによって阻害された。
【００１７】
出願人は、これらの発見が、選択されたＡＬＸ受容体リガンドと喘息などの慢性炎症性疾患の重症度との間に関連性を確立し、炎症性疾患の新しい生化学的エンドタイプを定義し、組織炎症の運命におけるＡＬＸシグナル伝達の極めて重要な機能的役割を裏付けていると結論付ける。
【００１８】
本発明
ａ．診断方法
【００１９】
一実施形態では、本発明は、患者における慢性炎症の疾患の重症度（および／または治療）を判定する方法であり、（１）体組織、体液または洗浄液の収集または調製と、（２）体液、組織または洗浄液中のＡＬＸ受容体リガンドのレベルの測定とを含む。ＡＬＸ受容体リガンドのレベルまたはリガンドの比率は、臨床転帰または治療法の選択を予測する。
【００２０】
「ＡＬＸ受容体リガンド」は、喘息性炎症に対する不適切な反制御的応答を表すＨＤ対照以下のレベルのリポキシンＡ４（ＬＸＡ４）および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４を特に含むことを意味し、ＮＳＡに対するＳＡの診断と一致する可能性が高い。
【００２１】
好ましくは、ＡＬＸ受容体リガンド血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）も測定され得る。一部の患者では、ＳＡの気道炎症によりＳＡＡのレベルが上昇する。ＢＡＬＦ  ＳＡＡの増加は、ＳＡに関連する１ｐｇ／μｇタンパク質以上に相関し得る。合わせて調べると、リポキシンＡ４（低）および血清アミロイドＡ（高）のレベルは、肺炎症の増加、喘息の症状の増加、肺機能の低下、および喘息併存症のリスク増加など、重症疾患の臨床転帰を予測する。
【００２２】
たとえば、重症喘息などの重度の免疫学的疾患では、非重症喘息に比べて比率（ＳＡＡ／ＬＸＡ４）が少なくとも３倍、好ましくは少なくとも５倍以上増加する可能性がある。比率に関する詳細については、ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ、２０１７：２［４］ｅ９３５３４、Ｒｉｃｋｌｅｆｓら、ＡＬＸ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｄｅｆｉｎｅ  ａ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｄｏｔｙｐｅ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａの図５を参照されたい（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００２３】
本発明の方法の対照は、同じ疾患のより軽度／可逆的な形態（本明細書ではＮＳＡの場合）または潜在的に健康な対象のいずれかであり得る。組織は、測定の好ましい標準であり得る。
【００２４】
本発明の一実施形態では、慢性炎症疾患の疾患は肺炎症であり、重症喘息（ＳＡ）または嚢胞性線維症であり得る。別の実施形態において、肺炎症は、ＣＯＰＤ、気管支拡張症、細気管支炎、間質性肺疾患、移植拒絶、肺炎、肺膿瘍、肺血管疾患、肺塞栓、またはＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）の一部である。
【００２５】
本発明の別の実施形態では、慢性炎症疾患は、肺炎症、関節炎、炎症性腸疾患、アテローム性動脈硬化症および乾癬で構成される群から選択される。
【００２６】
非ＳＡ炎症性疾患を診断する場合、予想されるバイオマーカーと範囲は同じではないとしても類似する。最も好ましくは、各適応症に特有の罹患組織を使用する。
【００２７】
本発明では、最初に患者の組織、体液または洗浄液を検査しなければならない。本発明のいくつかの実施形態、特にＳＡ診断に関与する実施形態では、体液または洗浄液は気管支肺胞洗浄液である。他の実施形態では、組織または体液は、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸水、心膜液および関節液で構成される群から選択される。
【００２８】
本発明の別の実施形態では、上記で得られた情報を使用して、治療計画を決定するであろう。上記のマーカーの評価により、患者がＳＡなどの炎症性疾患を有していることを決定することができ、炎症解消メディエーターが示され得る。
【００２９】
最も重要なのは、炎症解消メディエーターがＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体のリガンドとして機能することである。１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４はそのようなリガンドである。１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は、同じ受容体で炎症誘発性シグナル伝達血清アミロイドＡのアロステリック阻害剤として機能し、同じＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体との相互作用を介して炎症解消作用も仲介する。１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４に加えて、ＡＬＸ／ＦＰＲ２の他の炎症解消性リガンドには、リポキシンＡ４、リポキシンＡ４生理活性類似体および模倣物、１７−エピ−レゾルビンＤ１、レゾルビンＤ１、ならびにレゾルビンＤ１生理活性類似体および模倣物が含まれる。たとえば、例示的なリポキシンＡ４類似体については米国特許第７，９０６，６７８号および第６，８３１，１８６号を調べることができる。他の例示的な類似体は、米国特許第７，７００，６５０号、ＰＣＴ／ＵＳ０２／０６４０４、ＰＣＴ／ＵＳ０２／３５８６０、およびＰＣＴ／ＵＳ００／０６５８２に開示されている。
【００３０】
別の実施形態では、マクロファージ（組織、体液または洗浄液中）によるＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体の発現について組織、体液または洗浄液を調べる。対照サンプルと比較して増加すると、肺炎症の増加、喘息症状の増加、肺機能の低下、喘息併存症のリスク増加など、重篤な疾患の臨床転帰が予測される。以下の実施例は、受容体発現の増加がＳＡを予測する好ましい実施形態を開示する。
【００３１】
本発明のこの実施形態では、好ましくは少なくとも５の増加がＮＳＡではなくＳＡの診断の可能性増加を示すという方法で増加を評価する。
【００３２】
ａ．バイオマーカーの測定
別の実施形態では、本発明は、患者の組織、体液または洗浄液を検査し、リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）などの特定のＡＬＸ受容体リガンドのレベルを測定または検査する方法である。好ましい一実施形態では、３つのマーカーすべてを測定するであろう。別の実施形態では、ＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４またはＳＡＡと共にＬＸＡ４を測定する。本発明の好ましいバージョンでは、マーカーを測定し、ＬＸＡ４とＳＡＡとの比を決定する。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態、特にＳＡ診断に関与する実施形態では、体液または洗浄液は気管支肺胞洗浄液である。他の実施形態では、組織または体液は、血液、血清、血漿、尿、鼻洗浄液、痰、呼気凝縮液、涙、母乳、精液、胸水、心膜液および関節液で構成される群から選択される。
【００３４】
マーカーは、典型的には、当技術分野で現在知られている方法により測定される。たとえば、以下および標準的な参考文献に記載されているＥＬＩＳＡ法を使用することができる。有用な抗体は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ミシガン州）などのカスタム研究製品組織で入手できる。他の方法には、リピドミクスやプロテオミクスなどの物理的な検出方法が含まれ得る。
【実施例】
【００３５】
対象の特徴
【００３６】
ＳＡおよびＮＳＡ、ならびに非喘息ＨＤの対象は、全米の７つの研究センターでＳＡＲＰ−３に参加するために募集された。ＮＳＡと比較して、ＳＡの対象は、喘息コントロールテスト（ＡＣＴ）のスコアが低く喘息コントロールアンケート（ＡＣＱ）のスコアが高いことから明らかなように、症状が増加していた。肺機能の肺活量測定は、ＳＡコホートがより喘息を標的とした薬物を使用しているにもかかわらず、ＳＡの方がＮＳＡおよびＨＤよりも低かった（表１）。対象のサブセットは、ベースラインのフェノタイプ検査の一部としての気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）による気管支鏡検査に同意した。ＳＡ対象は肺炎症が多く、ＢＡＬの好中球が増加していた（表１）。
【００３７】
重症喘息対象では、リポキシンが減少し、ＳＡＡおよびマクロファージのＡＬＸ受容体発現が増加している。
【００３８】
先天性炎症反応の運命は、ＡＬＸ受容体シグナル伝達（１６、２１）によって部分的に決定されるため、炎症誘発特性（すなわちＳＡＡ）または炎症解消特性（すなわちＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４およびＡＮＸＡ１）を有するＢＡＬ液（ＢＡＬＦ）ＡＬＸリガンドの存在、およびＢＡＬ細胞表面のＡＬＸ受容体発現を測定した。ＳＡ対象のＢＡＬＦ  ＬＸＡ４（中央値０．２３ｐｇ／μｇタンパク質、平均０．２８ｐｇ／μｇタンパク質）および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４（中央値１．０２ｐｇ／μｇタンパク質、平均１．２４ｐｇ／μｇタンパク質）は、ＮＳＡ対象（ＬＸＡ４の中央値０．３２ｐｇ／μｇタンパク質、平均０．４０ｐｇ／μｇタンパク質、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４の中央値１．４７ｐｇ／μｇタンパク質、平均１．８８ｐｇ／μｇタンパク質）に比べて有意に少なかった（図１Ａ〜図１Ｂ）。ＢＡＬＦリポキシンはＨＤと比較してＮＳＡで有意に増加したが、ＳＡコホートとＨＤコホートとの間に有意差はなく（図１Ａ〜図１Ｂ）、以前のＳＡＲＰコホートでの結果と一致した（１４）。コホート間で免疫反応性ＡＮＸＡ１レベルの有意な差は確認されなかった（図１Ｃ）。対照的に、ＳＡＡレベルは、ＮＳＡ（中央値０ｐｇ／μｇタンパク質、平均１１．２１ｐｇ／μｇタンパク質）と比較して、ＳＡ（中央値３．０３ｐｇ／μｇタンパク質、平均１１．３５ｐｇ／μｇタンパク質）で増加した（図１Ｄ）。注目すべきことに、ＢＡＬＦのＳＡＡレベルは１２０人の喘息対象のうち５１人で検出限界を下回り、これらのサンプルには分析のために０ｐｇ／μｇタンパク質の値を任意に割り当てた。ＢＡＬＦがタンパク質に対して補正されていない場合、ＢＡＬＦのＡＬＸリガンドレベルの違いも存在した。ＢＡＬマクロファージ表面のＡＬＸ受容体の発現は、ＡＬＸの正規化指数（ＡＬＸのＭＦＩをアイソタイプ対照のＭＦＩで割った値）として表されるデータを用いて、フローサイトメトリーによって決定した（方法を参照）。ＨＤからＮＳＡ、ＳＡへのＢＡＬマクロファージＡＬＸ指数の段階的な増加が検出された（図１Ｅ）。
【００３９】
ＡＬＸリガンドは、喘息の炎症、症状、肺機能と示差的に相関する。
【００４０】
ＢＡＬＦのＡＬＸリガンドレベルと喘息の臨床パラメータとの関係をスクリーニングするために、すべての喘息対象の疾患活動性の測定値を使用してピアソン相関行列を構築した（ＮＳＡおよびＳＡのｎ＝１２０）（図２）。ＬＸＡ４レベルは１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４と正の相関があり、ＳＡＡと逆の相関があった。また、ＡＬＸリガンドを肺炎症、喘息症状および肺機能測定の臨床パラメータと比較した。特に、ＢＡＬＦの好中球の割合はＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４と逆相関し、ＳＡＡと正の相関があった。予想どおり、ＡＣＱスコアとＡＣＴスコアは逆相関しており、肺機能と有意に関連した。ＬＸＡ４のＢＡＬＦレベルは、喘息症状と逆相関した（すなわちＡＣＱスコアが高く、ＡＣＴスコアが低い）。ＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４も肺機能と正の関連があった。ＳＡＡは喘息症状や肺機能のパラメータとは有意に関係しなかった。ＢＡＬＦのＡＬＸリガンドレベルとＦｅＮＯ、メタコリンＰＣ２０、またはアルブテロールによる肺機能の可逆性との間に有意な相関はなかった。サンプル数が限られているため、この分析は多重比較試験用に修正されていないが、選択したＡＬＸリガンドと臨床喘息の主要な特性、すなわち肺炎症、喘息症状、肺機能との関係を強く示唆した。
【００４１】
重症喘息におけるＢＡＬ好中球増加は、ＬＸＡ４レベルの減少とＳＡＡレベルの増加に関連している。
【００４２】
ＢＡＬ白血球のサブセットをＮＳＡ対象、ＳＡ対象およびＨＤにおいて決定した。予想どおり、マクロファージはＢＡＬ白血球の８８〜９２％を占める最も数の多いＢＡＬ細胞型であった（図３Ａ）。ＳＡ対象では、ＮＳＡ対象よりもＢＡＬ好中球の割合が有意に高かった（ＳＡの平均＋／−ＳＥＭ３．３２＋／−０．５９％に対してＮＳＡ１．３８＋／−０．１９％、図３Ｂ）。ＮＳＡおよびＨＤと比較して、ＳＡではＢＡＬリンパ球および好酸球が増加する傾向もあった（図３Ｃ〜図３Ｄ）。ＢＡＬＦのＬＸＡ４レベルは、喘息コホート全体またはＳＡコホートを個別に分析したときのＢＡＬ好中球率と逆相関した（図３Ｅ〜図３Ｆ）。対照的に、ＳＡＡレベルは、すべての喘息コホートおよびＳＡを個別に分析したときのＢＡＬ好中球率と正の相関があった（図３Ｇ〜図３Ｈ）。ＬＸＡ４レベルも肺機能（すなわちＦＥＶ１およびＦＶＣ（予測値％））と正の相関があったが、このコホートではＳＡＡレベルと肺機能との間に相関はなかった。
【００４３】
ＡＬＸ受容体リガンドと発現は、喘息症状に関連している。
【００４４】
ＡＬＸシグナル伝達経路と喘息症状の測定値との関係をさらに調査するために、ＢＡＬ  ＡＬＸリガンドの連続変数を中央値を使用してカテゴリの高サブグループと低サブグループとに変換し、サブグループ間のカットオフを定義した。ＢＡＬＦ  ＳＡＡ値の中央値（１．２２ｐｇ／μｇタンパク質、図４Ａ）を使用して、「ＳＡＡｈｉｇｈ」対象と「ＳＡＡｌｏｗ」対象との関係と喘息症状の測定値を決定した。ＳＡＡｈｉｇｈと定義された対象では、ＳＡＡｈｉｇｈ群の喘息症状の増加と一致して、ＳＡＡｌｏｗ対象と比較してＡＣＱスコアが著しく増加し、ＡＣＴスコアが減少した（図４Ｂ）。喘息の重症度によって層別化すると、ＳＡＡｌｏｗであるＮＳＡ対象が増え、ＳＡＡｈｉｇｈであるＳＡ対象が増えた（図４Ｃ）。ＳＡの対象のみを考慮すると、ＡＣＱスコアはＳＡＡｌｏｗとＳＡＡｈｉｇｈの対象間で有意差があった（図４Ｄ）。注目すべきことに、ＡＣＱおよびＡＣＴスコアのＳＡＡｈｉｇｈコホートおよびＳＡＡｌｏｗコホート間の有意差は、ＮＳＡコホートでは明らかではなかった。
【００４５】
ピアソン相関により、ＢＡＬＦのＬＸＡ４レベルはＳＡＡレベルと喘息症状に反比例するため（図２）、ＬＸＡ４ｈｉｇｈ群とＬＸＡ４ｌｏｗ群の対象および喘息症状の差を決定した。ＬＸＡ４レベルの中央値を群間のカットオフとして使用した（０．２３ｐｇ／μｇタンパク質、図４Ｅ）。ＬＸＡ４ｌｏｗの対象では、ＬＸＡ４ｌｏｗ群のより多くの症状と一致して、ＬＸＡ４ｈｉｇｈの対象と比較してＡＣＱスコアが高く、ＡＣＴスコアが有意に低かった（図４Ｆ）。重症度で層別化すると、ＮＳＡの対象はＬＸＡ４ｈｉｇｈ群でより多く、ＬＸＡ４ｌｏｗコホートの約７０％がＳＡの対象であった（図４Ｇ）。ＳＡＡでの所見とは対照的に、ＬＸＡ４の低レベルはＳＡコホートの症状スコアと有意に関係しなかった（図４Ｈ）。ただし、ＮＳＡ対象の中で、ＬＸＡ４ｈｉｇｈ群は、ＡＣＴスコアが高いことから明らかなように症状が有意に少なかった（補足図３Ｂ）。注目すべきことに、筋肉内トリアムシノロンの単回投与は、ＳＡまたはＮＳＡのいずれかの対象においても、３〜６週間後のＬＸＡ４レベルまたはＳＡＡレベルのいずれにおいても識別可能な変化をもたらさなかった。
【００４６】
ＡＬＸリガンドＳＡＡおよびＬＸＡ４の喘息症状に対する相反する関係を受けて、次にＢＡＬマクロファージＡＬＸ指数について同様の分析を行った。サブグループ間のカットオフを定義するために、ＡＬＸ指数の中央値を使用して喘息対象をＡＬＸｈｉｇｈコホートとＡＬＸｌｏｗコホートに分類した（中央値＝４．６１、図４Ｉ）。ＡＬＸｈｉｇｈの喘息対象は、喘息症状の増加と一致して、ＡＣＱスコアが高くＡＣＴスコアが有意に低かった（図４Ｊ）。喘息重症度による層別化（図４Ｋ）後、ＡＬＸｈｉｇｈの対象は、ＳＡコホートにおける両方の測定（すなわち、ＡＣＱおよびＡＣＴ）で有意な症状の増加を有した（図４Ｌ）。ＡＬＸ指数は、ＮＳＡコホートの症状スコアと有意に関連しなかった（補足図３Ｃ）。さらに興味深いことに、ＢＡＬマクロファージＡＬＸ指数は、喘息対象におけるＭＨＣクラス２のマクロファージ指数およびＣＤ２０６発現と相関があった。
【００４７】
ＳＡＡレベルおよびＬＸＡ４レベルは共に、ＳＡとＮＳＡとを区別する生化学的エンドタイプを表している。
【００４８】
個々に、ＳＡＡレベルおよびＬＸＡ４レベルは両方とも喘息重症度と関連していた。より多くのＳＡ対象がＳＡＡｈｉｇｈおよびＬＸＡ４ｌｏｗレベルを有し、より多くのＮＳＡ対象がＳＡＡｌｏｗおよびＬＸＡ４ｈｉｇｈレベルを有していた（図４）。ＳＡでは、マクロファージのＡＬＸ発現が増加し（図１）、喘息症状の増加に関連したため（図４）、次に、ＡＬＸリガンドの組み合わせのＢＡＬＦレベルがＳＡに関連しているかどうかを決定した。喘息対象をＢＡＬＦのＬＸＡ４およびＳＡＡレベルに基づいて４群に分けた（図５Ａ）。個々のＢＡＬＦ  ＬＸＡ４レベルとＳＡＡレベルの関係から、これらのＡＬＸリガンドが独立して調節されていることが示唆されたため、（中央値に基づいて）高低のカテゴリ分類のアプローチを選択した（図５Ａ）。対象を臨床的重症度によって層別化すると、ＮＳＡの半分以上およびＳＡの１／４未満がＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗであることが顕著であった（図５Ｂ、ベージュ）。対照的に、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈは、ＮＳＡ対象の２２％と比較してＳＡ対象では４１％であった（図５Ｂ、紫）。注目すべきことに、喘息対象の場合、ＢＡＬＦのＳＡＡとＬＸＡ４レベルの相対比は、個々のＡＬＸリガンドのいずれのレベル（図３Ｅおよび図３Ｇ）よりも、ＢＡＬ好中球増加と強く相関していた（図５Ｃ）。これら２つの異なる群の喘息対象を比較すると、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ群は、ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ群よりも有意に高いＢＡＬ好中球および喘息症状（すなわち、より高いＡＣＱ、より低いＡＣＴ）およびより低い肺機能（すなわち、ＦＥＶ１およびＦＶＣ予測％）を示した（図５Ｄ−図５Ｆ）。総ＢＡＬ白血球数とリンパ球および好酸球の割合は、２群間で差はなかった。ＡＣＱスコアが１．５を超える対象の割合は、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈコホートで高く、この群の症状増加の別の尺度を表している。
【００４９】
ＳＡＲＰ−１のクラスター分析では、臨床パラメータを使用して５つの喘息サブタイプ（軽度のアレルギー性喘息、軽度から中等度のアレルギー性喘息、より重度の高年齢発症喘息、重度の可変性アレルギー性喘息、重度の固定性気流喘息）を特定した（５）。ここでＳＡＡおよびＬＸＡ４をＡＬＸ受容体シグナル伝達の生化学マーカーとしてこの分類を使用すると、ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗ群の７１％がＮＳＡクラスターの１つに割り当てられ、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象の６４％がＳＡクラスターの１つに割り当てられたことは注目に値した（図５Ｇ、図６Ｅ）。
【００５０】
ＳＡＡは急性期タンパク質であり、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈエンドタイプと喘息重症度および好中球性肺炎症との関係により、次に、ＬＸＡ４およびＳＡＡと増悪および一般的な喘息併存症との関係があるかどうかを決定した。高いＳＡＡレベルと低いＬＸＡ４レベルの両方は、副鼻腔炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）および肥満（ＢＭＩ＞３０）と有意に関連し、低いＬＸＡ４は、前年よりも頻繁な急性増悪の履歴とも関連していた（表２）。合わせて、低いＬＸＡ４レベルと高いＳＡＡレベルの組み合わせ（すなわち、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈエンドタイプ）は、これらの喘息併存症とさらに密接に関連していた（表２）。
【００５１】
ＡＬＸ受容体を介したＳＡＡおよび１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４シグナル伝達は、好中球化学誘引物質ＩＬ−８の産生を調節する。
【００５２】
これらのＡＬＸ受容体リガンドの機能的関係を決定するため、次に、慢性閉塞性肺疾患で以前に認定したＡＬＸ依存ｉｎ  ｖｉｔｒｏレポーターアッセイに注目した（１８）。Ａ５４９肺上皮細胞を安定してトランスフェクトして、ヒトＡＬＸ／ＦＰＲ２受容体（ｈＡＬＸ）を発現させた。ＢＡＬＦサンプルは、代表レベルのＡＬＸリガンドを有するＨＤ、ＮＳＡ、ＳＡ対象から選択した（図６Ａ）。ＳＡＡは、Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞によるＩＬ−８産生の濃度依存性（０〜１０ｎｇ／ｍｌ）の増加をもたらした（図６Ｂ）。Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞をＢＡＬＦに曝露すると（方法を参照）、代表的なＳＡ  ＢＡＬＦのいくつかはＩＬ−８産生を大幅に増加させ（図６Ｃ）、ＢＡＬＦ  ＳＡＡとＬＸＡ４の相対量を反映した。外因性１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４の添加は、ＢＡＬＦで条件付けされた細胞によるＡ５４９ｈＡＬＸ細胞のＩＬ−８産生を阻害した（図６Ｄ）。注目すべきことに、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４によるＩＬ−８産生の最大の阻害は、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象からのＢＡＬＦで条件付けされたＡ５４９ｈＡＬＸ細胞に対するものであった（図６Ｄ）。
【００５３】
考察
【００５４】
本明細書では、ＳＡＲＰ−３において喘息気道反応に対する相反する影響の可能性を有するＡＬＸ受容体の４つのリガンド、すなわちＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、ＡＮＸＡ１およびＳＡＡの量を測定した。ＳＡでは、ＢＡＬマクロファージのＡＬＸ受容体発現が増加し、ＡＬＸのＢＡＬＦリガンドが選択的に調節された。ＳＡでは、炎症解消性リポキシンのＢＡＬＦレベルが低下し、炎症誘発性ＳＡＡのレベルが上昇した。リポキシンレベルは、ＳＡＡ、ＢＡＬ好中球および喘息症状と逆相関し、リポキシンは肺機能の測定値と正の相関があった。ＳＡＡｈｉｇｈおよびＡＬＸｈｉｇｈの対象はＳＡであることが多く、ＡＣＱスコアが増加し、ＡＣＴスコアが減少していた。組み合わせたエンドタイプでＬＸＡ４とＳＡＡのレベルを合わせて考慮すると、いずれかのメディエーターを個別に考慮した場合に比べて、喘息症状、肺機能および気道好中球増加症とのより強い関連がみられた。ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象は、ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗの対象に比べて肺炎症と喘息症状が多く、肺機能が低下していた。ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈおよびＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗの対象は、それぞれＳＡおよびＮＳＡ臨床クラスターに分けられた。重要なことに、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象は、過去１年間の喘息増悪の可能性が有意に高く、喘息併存症（副鼻腔炎、ＧＥＲＤおよび肥満）の可能性が有意に高かった。ＳＡ対象からのＳＡＡまたはＢＡＬＦへの曝露により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＬＸ発現ヒト肺上皮細胞による好中球化学誘引物質ＩＬ−８の産生が増加した。上皮細胞によるこのＳＡＡ駆動のＩＬ−８産生は、薬理学的用量の１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４への曝露によって緩和され、ＳＡの好中球性炎症に関連するＡＬＸリガンド間の機能的相互作用を裏付ける。合わせると、これらの所見は、喘息の患者層別化のための新しい生化学的エンドタイプを定義するＳＡの肺炎症におけるＳＡＡおよびＬＸＡ４によるＡＬＸ受容体シグナル伝達の機械的役割を裏付ける。
【００５５】
ＡＬＸ受容体は、炎症反応の運命を調節する興味深い標的である。ＬＸＡ４とＳＡＡはＡＬＸ受容体と相互作用して、炎症に対して相反する効果を発揮する（１８）。ＡＬＸ受容体は、７つの膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体であり、好中球（２２）、好酸球（２３）、グループ２先天性リンパ系細胞（２４）、ナチュラルキラー細胞（２４）、リンパ球（２５）、単球（２６）、樹状細胞（２７、２８）、マクロファージ（２９）および気道構造細胞（３０）など、喘息の病因に関連するいくつかの肺細胞に存在する。ＬＸＡ４は、ＡＬＸに対する高親和性リガンドであり、抗炎症性および炎症解消性の細胞応答を示す（１６）。ＳＡＡはより低い親和性で結合するが、この急性期反応物は、感染および急性炎症の上昇工程中にＬＸＡ４よりもかなり豊富である（１８）。併存症を有するＳＡ患者にも関連しており、コルチコステロイドは、特にＬＰＳとの併用でＳＡＡ産生を促進することができる（１８）。ＬＸＡ４の７番目の膜貫通ドメインおよび隣接領域（３１、３２）との相互作用とは異なり、ＳＡＡは１番目と２番目の細胞外ループドメイン（３３）と相互作用し、受容体の立体構造と二量体化に顕著な変化をもたらし、それが受容体の炎症解消性シグナル伝達を炎症誘発性シグナル伝達に変化させる（１７）。本明細書において、ＳＡでは、ＡＬＸの発現はＢＡＬマクロファージで増加し、喘息症状の増加に関連していた。マクロファージのＡＬＸ発現は、表面ＣＤ２０６の発現と相関しており、炎症解消の内因性経路に関与する「Ｍ２」マクロファージを示している（３４、３５）。ＳＡのＢＡＬＦにおけるＳＡＡの増加とリポキシンの減少と共に、ＢＡＬマクロファージでのＡＬＸ発現の増加は、コルチコステロイドの投与量が多いにもかかわらず肺炎症の増加（ＢＡＬ好中球増加など）を含むＳＡＡ駆動の結果を反映する可能性がある。肺のＡＬＸ受容体の近くにＳＡＡとＬＸＡ４が存在し、炎症反応に対するそれらの多様な影響により、ＡＬＸ受容体は急性炎症またはその解消の極めて重要なシグナル伝達ネクサスとして機能する態勢を整えている。
【００５６】
リポキシンは、構造的および機能的にロイコトリエンおよびプロスタグランジンとは異なるアラキドン酸代謝の産物である。リポキシンＡ４は、喘息を含む肺疾患に罹患した患者からのＢＡＬＦにおいてヒトで最初に検出された（３６）。リポキシンは、ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒ（ＳＰＭ）と呼ばれる内因性化学シグナルの新属の主要メンバーであり、炎症性組織での顆粒球の動員と活性化を阻害し、マクロファージを介した回復期の死滅細胞、微生物および破片の一掃を促進する能力によって部分的に定義される（８）。一部の喘息患者によるロイコトリエン産生の増加とは異なり、リポキシンのレベルはコントロールされていない重症の喘息で減少する（１３）。現在の抗ロイコトリエン薬は、喘息のリポキシンを増加させるとは期待されていない。重症喘息における不完全なリポキシン産生の原因になり得る複数の要因があるが、ＳＡにおける気道の酸化ストレスの増加がリポキシン生成の減少の主な原因であると最近判断された（１１）。ヒトの研究では、吸入されたＬＸＡ４は喘息の気管支誘発を抑制し（１０）、リポキシンは、メタコリン、ヒスタミンおよびトロンボキサンに対する気管支収縮においてサイトカインに媒介される増加を調節する（１１）。最近、安定したＬＸＡ４類似体が、若年性湿疹の患者のアレルギー性炎症および症状を著しく減少させることが示された（３７）。前臨床研究により、代謝の不活性化に抵抗するＬＸＡ４類似体は、メタコリン、気道粘液化生、および２型炎症に対するアレルゲン駆動の気道過敏性を予防し、強力に低下させることができることが立証された（３８、３９）。ｈＡＬＸ受容体のトランスジェニック発現は、アレルゲンに対する炎症反応の減少も示し、抗炎症および炎症解消における内因性ＡＬＸリガンドの役割を裏付けている（２３）。ＡＬＸに加えて、リポキシンは、抗ロイコトリエン薬のクラスのうち１つの薬理学的標的であるｃｙｓＬＴ１を含む追加の受容体と相互作用できる（４０）。合わせると、これらの所見は、気道の炎症反応をコントロールし、その解消を促進するための、健康におけるリポキシンの極めて重要な炎症解消の役割を示している。ここで、ＳＡにおけるリポキシンの減少したＢＡＬＦレベルが気道炎症、粘液および過敏性の主要な内因性調節経路を無効にすることは以前の出版物から予測され得、本発明者らの結果は、低いＬＸＡ４とＳＡにおける肺炎症、喘息症状および併存症の増加、ならびに肺機能低下との強力で一貫した相関を示している。
【００５７】
リポキシンとは対照的に、炎症反応を促進するためにこれらの受容体に関与するＡＬＸ受容体のいくつかのペプチドリガンドがある。急性期反応物ＳＡＡはＡＬＸペプチドリガンドの１つであり、ＡＬＸを介して好中球の走化性と活性化を誘導することができる（４１、４２）。ＳＡＡは重度のアレルギー性喘息で増加し（４３）、樹状細胞のアポトーシスを防止してＣＤ４＋Ｔ細胞の糖質コルチコイド耐性を誘導することができる（４４）。本明細書では、ＳＡにおけるＢＡＬＦのＳＡＡレベルが上昇し、ＢＡＬ好中球と強く関連していた。ＳＡＡｈｉｇｈの対象は喘息の症状が増加し、副鼻腔炎、ＧＥＲＤおよび肥満の相対的リスクが上昇した。対象が低いＬＸＡ４レベルおよび高いＳＡＡレベルの両方（すなわち、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈ）を有していた場合、ＢＡＬ好中球、喘息症状および肺機能低下の相対的リスクがすべて上昇した。最近、非２型炎症を有するＳＡの一部の対象がＩＬ−６ｈｉｇｈであることが確認された（４５）。ＩＬ−６はＳＡＡ発現を誘導し（４６）、この急性期タンパク質と共謀して、特に肥満に関連する全身代謝変化を伴うＳＡの好中球および非２型肺炎症を活性化する可能性がある。Ａ５４９ｈＡＬＸ上皮細胞では、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象からのＢＡＬＦは好中球化学誘引物質ＩＬ−８の産生を増加させたが、これは１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４によって阻害された。ＡＬＸ受容体では、ＳＡＡの１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４阻害は本質的にアロステリックであり（１８）、薬理学的用量で投与すると、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのヒト気道上皮細胞によるＳＡＡ駆動ＩＬ−８産生およびマウスのｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＡＡを介する急性炎症を減少させることができる（１８）。ＳＡにとって興味深いことに、ＳＡＡの産生はコルチコステロイドによって増加し、その発現はステロイドとＬＰＳとの組み合わせによって相乗的に増加する（１８）。ＳＡＡとの別個のまたは相乗的な経路を介して作用する追加の可溶性メディエーターも、重症喘息における上皮細胞のＩＬ−８産生および好中球の化学誘引に寄与する可能性がある。ＳＡＲＰ−３に登録された対象は、筋肉内トリアムシノロンの前後に臨床的に特徴付けられ、ＳＡの成人対象は、全身コルチコステロイド後のＮＳＡと比較してＦＥＶ１の低下と喘息コントロールの悪化を示し続けた（４７）。注目すべきは、ステロイド投与の３〜６週間後に測定した場合、ＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ  ＬＸＡ４、およびＳＡＡのＢＡＬＦレベルは、筋肉内トリアムシノロンの単回投与によって有意に変化しなかった。１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４とは異なり、コルチコステロイドはＳＡＡを介した肺炎症を抑制せず（１８）、このことは、ＳＡに罹患した一部の対象についてその慢性好中球性肺炎症がコルチコステロイドによって永続化される可能性があることを示唆し、また、ＳＡＡレベルは、コルチコステロイドのこの意図しない結果の危険にさらされている対象の特定を支援することによって、より正確な喘息管理に役立つ可能性があることを示唆する。
【００５８】
本明細書における生化学的分析は、ＡＬＸ受容体シグナル伝達をＳＡの病態生理に関連付ける。臨床的および統計的アプローチを使用して成人喘息の５つのフェノタイプが定義されているが（５）、これらのフェノタイプをＳＡの病因の異なる分子メカニズムに関連付ける必要性が残っている（６）。本発明者らは、ＡＬＸシグナル伝達をＳＡ、ならびに対象を個別の臨床クラスターに分けるＢＡＬ  ＬＸＡ４レベルおよびＳＡＡレベルにリンクする前臨床証拠に基づいて候補経路アプローチを選択し、この生化学経路が喘息エンドタイプとして患者の層別化に追加の価値をもたらすことができることを示唆した。本明細書における所見は、これらのＡＬＸリガンドが、ＳＡにおける患者のエンドタイピングの遺伝的、代謝的、環境的影響と臨床的特徴を包括的にモデル化するために設計される将来の研究に含まれるべきであることを示唆している。
【００５９】
本明細書では、ＢＡＬＦのＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈレベルと好中球性肺炎症およびコントロール不良喘息との有意な関連が特定されたが、考慮すべき潜在的な制限がいくつかある。生化学分析でこの慎重にフェノタイプが決定された喘息対象の群から比較的多数のＢＡＬサンプルを得たことは有利であったが、臨床（または臨床試験）設定で気管支鏡検査を日常的に行うことは実用的ではない。今後の研究では、気管支鏡検体を用いて本明細書で明らかになった関係に対する解剖学的コンパートメントの影響を判断するために、侵襲性の低い手段（すなわち、痰、呼気凝縮液）で収集された呼吸サンプルを取得および分析することが重要であろう。本明細書における分析の横断的性質は、このエンドタイプの安定性に対処おらず、これは侵襲性の低い手段で得られるサンプルで最もよく対処される問題である。追加のＡＬＸリガンドに関して、本明細書でＡＮＸＡ１に使用したＥＬＩＳＡは無傷のタンパク質と切断されたタンパク質とを区別しないため、本明細書で関係がなくても、より厳密な実験ツールが利用可能になる場合にはその潜在的な存在を排除しない。喘息エンドタイプの特定のためのＡＬＸシグナル伝達の識別力をさらに高める可能性のあるＡＬＸ受容体のペプチドおよび脂質リガンドもいくつかある。
【００６０】
要約すると、ＡＬＸ受容体の発現は喘息ＢＡＬマクロファージで増加し、本発明者らは喘息のＢＡＬＦで選択的に調節されるＡＬＸ受容体リガンドのカセットを特定した。リポキシンおよびＳＡＡのレベルは、肺炎症および喘息コントロールの臨床パラメータと相関していた。特に、ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈＢＡＬＦの対象は、ＢＡＬ好中球の増加、喘息症状および喘息併存症、ならびに肺機能低下を伴うＳＡに罹患している可能性が高かった。薬理レベルでは、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４は、ＡＬＸ受容体でのＳＡＡシグナル伝達に機能的に相反して、好中球化学誘引物質ＩＬ−８の産生を阻害していた。ＢＡＬＦ  ＬＸＡ４ｌｏｗＳＡＡｈｉｇｈの対象は、ＬＸＡ４ｈｉｇｈＳＡＡｌｏｗの対象とは異なる臨床クラスターに割り当てられ、これらの生化学的メディエーターが喘息対象のサブグループを識別し、ＳＡの非２型ステロイド抵抗性炎症の新しい喘息生化学的エンドタイプとして機能することが示唆された。
【００６１】
材料および方法
【００６２】
研究設計
【００６３】
ＳＡＲＰ−３は、ＳＡおよびＮＳＡに罹患した対象における分子、細胞および生理学的フェノタイプを特徴付けるために設計された、ＮＨＬＢＩが資金提供した研究である（ＮＣＴ０１６０６８２６）。喘息対象および健康な対象を募集し、ベースラインの特徴評価を完了し、一部の対象は気管支鏡検査に同意した。ＳＡＲＰの方法、対象の登録、および研究手順に関する詳細は参考文献に見出すことができる（４５）。
【００６４】
参加者とサンプル収集
【００６５】
１３歳以上の喘息対象および健康な対照対象を２０１２年１１月から２０１５年２月の間に米国の地理的に分散した７つの研究センターによって募集した。欧州呼吸器学会／アメリカ胸部学会のガイドラインを使用して対象をＳＡまたはＮＳＡに分類した（４８）。対照対象は、一般的な健康状態を報告し、肺疾患、アトピー性疾患またはアレルギー性鼻炎の病歴のない非喫煙者であった。ＢＡＬは温かい生理食塩水の５０ｍＬアリコートで３回行い、ＢＡＬＦは手で吸引して回収した。対象は、筋肉内トリアムシノロン（１ｍｇ／ｋｇ〜最大量４０ｍｇ）を投与され、一部の対象は３〜６週間後に２回目の気管支鏡検査を受けることに同意し、同じ方法でＢＡＬサンプルを収集した。ＢＡＬ細胞を数え、白血球数の差を決定した。無細胞ＢＡＬＦ上清をいくつかのアリコートに分けた。ＢＡＬＦの１アリコート（１ｍｌ）を氷冷メタノール（２ｍｌ、１：２、体積／体積）と直接混合した後、−８０℃で保存した。他のアリコートは−８０℃で直接保存した。保存したアリコートは、分析のために後でブリガム・アンド・ウィメンズ病院に送った。
【００６６】
脂質抽出
【００６７】
ＢＵＣＨＩ  Ｒｏｔａｖａｐｏｒ  Ｒ−２００／２０５を使用して、ＢＡＬＦとメタノール（１：２、体積／体積）のアリコートを真空中で乾燥させた。サンプルをメタノール（５００μｌ）と蒸留／脱イオン水（１０ｍｌ）で再懸濁した後、（１３）のようにＣ１８  ＳｅｐＰａｋカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を使用して抽出した。ギ酸メチル画分を穏やかな窒素気流下で乾燥させ、各サンプルを１ｍｌのメタノールに再懸濁し、ＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４のＥＬＩＳＡを行うまで−８０℃で保存した。
【００６８】
タンパク質アッセイ
【００６９】
ＢＡＬＦのタンパク質測定には、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用した。タンパク質が２５μｇ未満のサンプルは、さらなる分析から除外した（ｎ＝３、ＮＳＡ＝１、ＳＡ＝２）。
【００７０】
ＥＬＩＳＡ
【００７１】
ＢＡＬＦのＬＸＡ４および１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４レベルは、ＥＬＩＳＡ（Ｎｅｏｇｅｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ケンタッキー州）で測定した。メタノール中に保存した抽出されたＢＡＬＦサンプルを穏やかな窒素気流下で乾燥させ、ＥＬＩＳＡバッファーに再懸濁した。ＳＡＡおよびＡＮＸＡ１レベルは、メタノールの非存在下で保存したＢＡＬＦのアリコートにおいてＥＬＩＳＡで測定した（ＳＡＡ：Ａｂａｚｙｍｅ、Ｎｅｅｄｈａｍ、マサチューセッツ州、ＡＮＸＡ１：Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、テキサス州）。ＬＸＡ４、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４、ＳＡＡおよびＡＮＸＡ１レベルは、ＢＡＬＦの総タンパク質含有量に対して正規化した。一部の対象のＳＡＡレベルは検出限界未満であり、これらのサンプルには分析のためにタンパク質０ｐｇ／μｇの値を割り当てた。ＬＸＡ４およびＳＡＡの中央値を使用して、対象を「高」および「低」サブグループに分けた。
【００７２】
フローサイトメトリー
【００７３】
ＢＡＬの細胞ペレットは対象のサブグループから入手することができた。ｅｘ  ｖｉｖｏ染色では、ＢＡＬＦ細胞をＰＢＳ中のマウス血清（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を用いて４℃で３０分間ブロッキングした。次に、細胞を製造元の指示に従ってＶｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒＲ６６０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）とインキュベートし、続いてヒトタンパク質に対する抗体（抗ＡＬＸ（クローン３０４４０５、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）−ＰｅｒＣＰ、抗ＨＬＡ−ＤＲ（主要組織適合複合体クラスＩＩ、Ｌ２４３）−アロフィコシアニン−Ｃｙ７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）および抗ＣＤ２０６（マクロファージマンノース受容体、１９．２）−フィコエリトリン（ＰＥ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）または同じアイソタイプの直接結合非関連抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を４℃で使用）と３０分間インキュベートした。データはＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０．１（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ａｓｈｌａｎｄ、オレゴン州）を使用して分析した。マクロファージは単一細胞（二重排除による）、生存細胞（Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒＲ６６０陰性）、ＣＤ２０６＋細胞として同定した。ＡＬＸ、ＭＨＣクラスＩＩおよびＣＤ２０６のＭＦＩをマクロファージで評価し、アイソタイプ対照抗体のＭＦＩで正規化した（ＭＦＩ細胞表面マーカー／ＭＦＩアイソタイプ対照＝ＭＦＩ指数）。
【００７４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ａ５４９細胞培養
【００７５】
ヒトＡＬＸ受容体を安定して発現するようにトランスフェクトされたＡ５４９を使用した（（１８）のように）。Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞を４８ウェルプレート（５ｘ１０４細胞／ウェル）に播種し、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｌｏｎｚａ）に、２ｍＭのＬ−グルタミン、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充して、３７℃、５％ＣＯ２でコンフルエントになるまで培養した。コンフルエントになったら、Ａ５４９ｈＡＬＸ細胞を無血清培地で１６時間培養した後、ＢＡＬＦ（１００μｌ）および無血清ＲＰＭＩ培地（１００μｌ、１：１体積：体積）に２４時間（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）曝露した。一部の実験では、組換えヒトＳＡＡ（０〜１０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４（１００ｎＭ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）またはビヒクル対照を追加した。インキュベーションの終了時に、上清を氷上で収集し、−８０℃で保存した。上清のＩＬ−８レベルをＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）で測定した。ＢＡＬＦへの曝露後にＩＬ−８産生の増加がなかった場合、サンプルにはゼロの値を割り当てた（図６Ｃ）。
【００７６】
統計分析
【００７７】
図では、データは個別に中央値を示すか、または平均±ＳＥＭとして表し、表では、データは平均±ＳＤとして表している。図４のバイオリンプロットでは、基礎となるデータ分布に基づいて、ＳＰＳＳで各変数のビンサイズと幅を自動的に決定した。差の統計的有意性は、両側スチューデントｔ検定、一元配置分散分析、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定（正規性の前提条件が満たされていない場合）、またはＳＰＳＳバージョン２３．０（ＩＢＭ）を使用して記載のようにカイ二乗検定によって評価した。複数の比較を修正するために、ポストホックチューキー検定（分散分析用）とダン検定（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ分析用）を使用した。ピアソン相関係数（ｒ）で相関を評価し、線形または非線形（対数軸のグラフの場合）の回帰直線を示している。相関分析には、統計分析の値０のサンプルが含まれていたが、値０のデータポイントは検出可能なＡＬＸリガンドの回帰線分析では除外した。＜０．０５のｐ値を有意とみなし、報告されたｐ値は複数の比較のために調整した。
【表１】
2020507761.tif 000003
【００７８】
【表２】
2020507761.tif 000004
【００７９】
参考文献
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１２．Ｋａｚａｎｉ  Ｓ，Ｐｌａｎａｇｕｍａ  Ａ，Ｏｎｏ  Ｅ，Ｂｏｎｉｎｉ  Ｍ，Ｚａｈｉｄ  Ｍ，Ｍａｒｉｇｏｗｄａ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｈａｌｅｄ  ｂｒｅａｔｈ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ  ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３；１３２（３）：５４７−５３．
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１４．Ｐｌａｎａｇｕｍａ  Ａ，Ｋａｚａｎｉ  Ｓ，Ｍａｒｉｇｏｗｄａ  Ｇ，Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｏ，Ｍａｒｉａｎｉ  ＴＪ，Ｉｓｒａｅｌ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａｉｒｗａｙ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｒｅ  ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２００８；１７８（６）：５７４−８２．
１５．Ｖａｃｈｉｅｒ  Ｉ，Ｂｏｎｎａｎｓ  Ｃ，Ｃｈａｖｉｓ  Ｃ，Ｆａｒｃｅ  Ｍ，Ｇｏｄａｒｄ  Ｐ，Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ＬＸ４，ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００５；１１５（１）：５５−６０．
１６．Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ，Ｄａｈｌｅｎ  ＳＥ，Ｄｒａｚｅｎ  ＪＭ，Ｈａｙ  ＤＷ，Ｒｏｖａｔｉ  ＧＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｌｉｐｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＬＸ：ｐｏｔｅｎｔ  ｌｉｇａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ．２００６；５８（３）：４６３−８７．
１７．Ｃｏｏｒａｙ  ＳＮ，Ｇｏｂｂｅｔｔｉ  Ｔ，Ｍｏｎｔｅｒｏ−Ｍｅｌｅｎｄｅｚ  Ｔ，ＭｃＡｒｔｈｕｒ  Ｓ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｄ，Ｃｌａｒｋ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｇａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＡＬＸ／ＦＰＲ２  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｐｒｏｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１３；１１０（４５）：１８２３２−７．
１８．Ｂｏｚｉｎｏｖｓｋｉ  Ｓ，Ｕｄｄｉｎ  Ｍ，Ｖｌａｈｏｓ  Ｒ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｍ，ＭｃＱｕａｌｔｅｒ  ＪＬ，Ｍｅｒｒｉｔｔ  ＡＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｏｐｐｏｓｅｓ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｌｕｎｇ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２０１２；１０９（３）：９３５−４０ｆｆｆ．
１９．Ｈｅ  Ｒ，Ｓａｎｇ  Ｈ，ａｎｄ  Ｙｅ  ＲＤ．Ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ＩＬ−８  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＰＲＬ１／ＬＸＡ４Ｒ．Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（４）：１５７２−８１．
２０．Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｌａ  Ｍ，Ｆｉｅｒｒｏ  ＩＭ，Ｍａｒｕｌｌｏ  Ｓ，Ｇｅｔｔｉｎｇ  ＳＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｉｐｉｄ−ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ａｎｄ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００２；８（１１）：１２９６−３０２．
２１．Ｍｏｒｒｉｓ  Ｔ，Ｓｔａｂｌｅｓ  Ｍ，Ｃｏｌｖｉｌｌｅ−Ｎａｓｈ  Ｐ，Ｎｅｗｓｏｎ  Ｊ，Ｂｅｌｌｉｎｇａｎ  Ｇ，ｄｅ  Ｓｏｕｚａ  ＰＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｉｃｈｏｔｏｍｙ  ｉｎ  ｄｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｒｉｓｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．２０１０；１０７（１９）：８８４２−７．
２２．Ｆｉｏｒｅ  Ｓ，Ｍａｄｄｏｘ  ＪＦ，Ｐｅｒｅｚ  ＨＤ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９４；１８０（１）：２５３−６０．
２３．Ｌｅｖｙ  ＢＤ，Ｄｅ  Ｓａｎｃｔｉｓ  ＧＴ，Ｄｅｖｃｈａｎｄ  ＰＲ，Ｋｉｍ  Ｅ，Ａｃｋｅｒｍａｎ  Ｋ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  ＢＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｕｌｔｉ−ｐｒｏｎｇｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００２；８（９）：１０１８−２３．
２４．Ｂａｒｎｉｇ  Ｃ，Ｃｅｒｎａｄａｓ  Ｍ，Ｄｕｔｉｌｅ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｘ，Ｐｅｒｒｅｌｌａ  ＭＡ，Ｋａｚａｎｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｓｔｈｍａ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３；５（１７４）：１７４ｒａ２６．
２５．Ａｒｉｅｌ  Ａ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ａｒｉｔａ  Ｍ，Ｐｅｔａｓｉｓ  ＮＡ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ａｎｄ  Ｂ４  ａｎａｌｏｇｓ  ｂｌｏｃｋ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３；１７０（１２）：６２６６−７２．
２６．Ｒｏｍａｎｏ  Ｍ，Ｍａｄｄｏｘ  ＪＦ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ａｃｕｔｅ  ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  （ＴＨＰ−１）  ｂｙ  ｌｉｐｏｘｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｕｎｉｑｕｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｖｅｒｓｕｓ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ｂ４：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｃａ２＋ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５７（５）：２１４９−５４．
２７．Ａｌｉｂｅｒｔｉ  Ｊ，Ｈｉｅｎｙ  Ｓ，Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ  Ｃ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ，ａｎｄ  Ｓｈｅｒ  Ａ．Ｌｉｐｏｘｉｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＣｓ：ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００２；３（１）：７６−８２．
２８．Ｙａｎｇ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｑ，Ｌｅ  Ｙ，Ｗａｎｇ  ＪＭ，ａｎｄ  Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｏｒｍｙｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ  １  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６６（６）：４０９２−８．
２９．Ｍａｄｅｒｎａ  Ｐ，Ｃｏｔｔｅｌｌ  ＤＣ，Ｔｏｉｖｏｎｅｎ  Ｔ，Ｄｕｆｔｏｎ  Ｎ，Ｄａｌｌｉ  Ｊ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．ＦＰＲ２／ＡＬＸ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｒｅ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ａｎｄ  ａｎｎｅｘｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ．ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０；２４（１１）：４２４０−９．
３０．Ｂｏｎｎａｎｓ  Ｃ，Ｆｕｋｕｎａｇａ  Ｋ，Ｌｅｖｙ  ＭＡ，ａｎｄ  Ｌｅｖｙ  ＢＤ．Ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００６；１６８（４）：１０６４−７２．
３１．Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｆｉｅｒｒｏ  ＩＭ，Ｇｒｏｎｅｒｔ  Ｋ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｌｉｐｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｖｏｋｅｓ  ｌｉｇａｎｄ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０００；１９１（７）：１１９７−２０８．
３２．Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｇｒｏｎｅｒｔ  Ｋ，Ｃｌｉｓｈ  ＣＢ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＪＡ，Ｆｒｅｅｍａｎ  ＭＷ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｂ４  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ｒｅｖｅａｌ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｌｅｓ  ｆｏｒ  ｌｉｐｏｘｉｎｓ  ａｎｄ  ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｌｉｐｏｘｉｎｓ  ｉｎ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ．１９９９；１０４（３）：３０９−１６．
３３．Ｂｅｎａ  Ｓ，Ｂｒａｎｃａｌｅｏｎｅ  Ｖ，Ｗａｎｇ  ＪＭ，Ｐｅｒｒｅｔｔｉ  Ｍ，ａｎｄ  Ｆｌｏｗｅｒ  ＲＪ．Ａｎｎｅｘｉｎ  Ａ１  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＦＰＲ２／ＡＬＸ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２０１２；２８７（２９）：２４６９０−７．
３４．Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｄａｌｌｉ  Ｊ，Ｃｏｌａｓ  ＲＡ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｄ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；２１２（８）：１２０３−１７．
３５．Ｄａｋｉｎ  ＳＧ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ＦＯ，Ｙａｐｐ  Ｃ，Ｗｅｌｌｓ  Ｇ，Ｏｐｐｅｒｍａｎｎ  Ｕ，Ｄｅａｎ  ＢＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｅｎｄｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；７（３１１）：３１１ｒａ１７３．
３６．Ｌｅｅ  ＴＨ，Ｃｒｅａ  ＡＥ，Ｇａｎｔ  Ｖ，Ｓｐｕｒ  ＢＷ，Ｍａｒｒｏｎ  ＢＥ，Ｎｉｃｏｌａｏｕ  ＫＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｉｄｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅｓ  Ｃ４，Ｄ４，ａｎｄ  Ｅ４  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．１９９０；１４１（６）：１４５３−８．
３７．Ｗｕ  ＳＨ，Ｃｈｅｎ  ＸＱ，Ｌｉｕ  Ｂ，Ｗｕ  ＨＪ，ａｎｄ  Ｄｏｎｇ  Ｌ．Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  １５（Ｒ／Ｓ）−ｍｅｔｈｙｌ−ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）  ｉｎ  ｔｏｐｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｅｃｚｅｍａ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１３；１６８（１）：１７２−８．
３８．Ｈａｗｏｒｔｈ  Ｏ，Ｃｅｒｎａｄａｓ  Ｍ，Ｙａｎｇ  Ｒ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ，ａｎｄ  Ｌｅｖｙ  ＢＤ．Ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｅ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２３，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｔｈｅ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；９（８）：８７３−９．
３９．Ｌｅｖｙ  ＢＤ，Ｌｕｋａｃｓ  ＮＷ，Ｂｅｒｌｉｎ  ＡＡ，Ｓｃｈｍｉｄｔ  Ｂ，Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  ＷＪ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４  ｓｔａｂｌｅ  ａｎａｌｏｇｓ  ｒｅｄｕｃｅ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｖｉａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｆｒｏｍ  ＣｙｓＬＴ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ．ＦＡＳＥＢ  ｊｏｕｒｎａｌ  ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．２００７；２１（１４）：３８７７−８４．
４０．Ｇｒｏｎｅｒｔ  Ｋ，Ｍａｒｔｉｎｓｓｏｎ−Ｎｉｓｋａｎｅｎ  Ｔ，Ｒａｖａｓｉ  Ｓ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｄ（４），ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  Ｂ（４），ａｎｄ  ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ（４）  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  １５−ｅｐｉ−ＬＸＡ（４）  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．２００１；１５８（１）：３−９．
４１．Ｓｕ  ＳＢ，Ｇｏｎｇ  Ｗ，Ｇａｏ  ＪＬ，Ｓｈｅｎ  Ｗ，Ｍｕｒｐｈｙ  ＰＭ，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｅｖｅｎ−ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＰＲＬ１，ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９９９；１８９（２）：３９５−４０２．
４２．Ｅｌ  Ｋｅｂｉｒ  Ｄ，Ｊｏｚｓｅｆ  Ｌ，Ｋｈｒｅｉｓｓ  Ｔ，Ｐａｎ  Ｗ，Ｐｅｔａｓｉｓ  ＮＡ，Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ，ｅｔ  ａｌ．Ａｓｐｉｒｉｎ−ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ  ｌｉｐｏｘｉｎｓ  ｏｖｅｒｒｉｄｅ  ｔｈｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｄｅｌａｙｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｓ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９（１）：６１６−２２．
４３．Ｂｕｙｕｋｏｚｔｕｒｋ  Ｓ，Ｇｅｌｉｎｃｉｋ  ＡＡ，Ｇｅｎｃ  Ｓ，Ｋｏｃａｋ  Ｈ，Ｏｎｅｒｉｙｉｄｏｇａｎ  Ｙ，Ｅｒｄｅｎ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｕｔｅ  ｐｈａｓｅ  ｒｅａｃｔａｎｔｓ  ｉｎ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ａｉｒｗａｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｅ  Ｔｏｈｏｋｕ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００４；２０４（３）：２０９−１３．
４４．Ａｔｈｅｒ  ＪＬ，Ｆｏｒｔｎｅｒ  ＫＡ，Ｂｕｄｄ  ＲＣ，Ａｎａｔｈｙ  Ｖ，ａｎｄ  Ｐｏｙｎｔｅｒ  ＭＥ．Ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｅ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ＆  ｄｉｓｅａｓｅ．２０１３；４：ｅ７８６．
４５．Ｐｅｔｅｒｓ  ＭＣ，ＭｃＧｒａｔｈ  ＫＷ，Ｈａｗｋｉｎｓ  ＧＡ，Ｈａｓｔｉｅ  ＡＴ，Ｌｅｖｙ  ＢＤ，Ｉｓｒａｅｌ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ａｓｔｈｍａ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ：ａ  ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ．２０１６；４（７）：５７４−８４．
４６．Ｈａｇｉｈａｒａ  Ｋ，Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  Ｔ，Ｓｕｇａｍａｔａ  Ｙ，Ｓｏｎｇ  Ｊ，Ｉｓｏｂｅ  Ｔ，Ｔａｇａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｄｒｉｖｅｎ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｒｕｍ  ａｍｙｌｏｉｄ  Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ  ：ｄｅｖｏｔｅｄ  ｔｏ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．２００５；１０（１１）：１０５１−６３．
４７．Ｐｈｉｐａｔａｎａｋｕｌ  Ｗ，Ｍａｕｇｅｒ  ＤＴ，Ｓｏｒｋｎｅｓｓ  ＲＬ，Ｇａｆｆｉｎ  ＪＭ，Ｈｏｌｇｕｉｎ  Ｆ，Ｗｏｏｄｒｕｆｆ  ＰＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｇｅ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  ｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  Ａｓｔｈｍａ．Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１６．
４８．Ｃｈｕｎｇ  ＫＦ，Ｗｅｎｚｅｌ  ＳＥ，Ｂｒｏｚｅｋ  ＪＬ，Ｂｕｓｈ  Ａ，Ｃａｓｔｒｏ  Ｍ，Ｓｔｅｒｋ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＥＲＳ／ＡＴＳ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｏｎ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｓｔｈｍａ．Ｅｕｒ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｊ．２０１４；４３（２）：３４３−７３．
【図１Ａ−Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｈ】
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【図４Ａ−Ｌ】
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【図５Ａ−Ｆ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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