(57)【要約】  本発明は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームに関する。本発明は、医薬製剤の分野、特に標的医薬製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、表面がｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されていることを特徴とする血中滞留型リポソームであって、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されている、血中滞留型リポソームに関する。前記血中滞留型リポソームは、抗腫瘍活性剤を腫瘍新生血管内皮細胞及び腫瘍細胞の内部に標的送達することができ、インビボでのリポソームの滞留時間を延長することができ、それにより抗腫瘍医薬の治療効果を高める。【選択図】図４Ｂ
2020521004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面がｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されていることを特徴とする血中滞留型リポソームであって、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されている、血中滞留型リポソーム。
【請求項２】
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される、請求項１に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項３】
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは、前記リポソームの表面のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に結合されている、請求項３に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項４】
前記リポソームの表面は、化学結合を介してＰＥＧに結合されているｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームは抗がん剤を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項５】
前記リポソームの表面は、化学結合を介してＰＥＧに結合されているｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩である抗がん剤を含むことを特徴とする、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項６】
前記ＰＥＧは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００であり、より好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であり、最も好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項７】
前記ＰＥＧはＰＥＧ  ２０００である、請求項６に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項８】
（１）過剰なリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とを反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで前記反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）又はベンゾトリアゾリル（−ＢＴＣ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートし、その後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を溶出及び回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、好ましくはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩である、
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの調製方法。
【請求項９】
前記ＰＥＧは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００であり、より好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であり、最も好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（３）で添加した前記リン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項８又は請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（１）において、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、１：１．２、１：１．５、又は１：２、好ましくは１：１．２のモル比で添加される、請求項８〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、リン脂質−ＰＥＧ−ＮＨＳである、請求項８〜請求項１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リン脂質−ＰＥＧはジステアロイルホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＣ）からなる群より選択され、より好ましくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）である、請求項８〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（２）において、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％〜１２％、最も好ましくは８％である、請求項８〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とを１：１．２のモル比で反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、１：０．２のモル比のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧとの混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％、好ましくは８％〜１２％、最も好ましくは８％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートした後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、好ましくはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩であり、且つ
前記リン脂質−ＰＥＧはＤＳＰＥ−ＰＥＧであり、
好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
工程（３）において、前記デキストランゲルカラムはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムであり、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出される、請求項８〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（３）における前記フィルターメンブレンは、ポリカーボネートフィルターメンブレンである、請求項８〜請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（２）において、添加したリン脂質、コレステロール、及びリン脂質−ＰＥＧの重量比は３：１：１であり、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％である、請求項８〜請求項１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（１）における前記透析を、１０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析バッグを用いて実施する、請求項８〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
請求項８〜請求項１８のいずれか一項に記載の方法によって得られる血中滞留型リポソーム。
【請求項２１】
抗がん医薬の製造における請求項１〜請求項７及び請求項２０のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソームの使用。
【請求項２２】
前記医薬は、例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液である、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記医薬は、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などのがんを治療するために使用される、請求項２１又は請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
医薬としての使用のための、請求項１〜請求項７及び請求項２０のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項２５】
例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液形態の、請求項１〜請求項７及び請求項２０のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項２６】
例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などのがんの治療における使用のための、請求項１〜請求項７及び請求項２０のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項２７】
請求項１〜請求項７及び請求項２０のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソームを治療有効量投与することを含む、がんを治療するための方法であって、前記がんは、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などである、がんを治療するための方法。
【請求項２８】
リポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用、又は抗がん剤、特にドキソルビシン若しくはドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩を含むリポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤の分野、特に標的医薬製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、表面が環状［ＲＧＤ−（１Ｓ，３Ｒ）−３−アミノシクロペンタンカルボン酸］（「ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）」と略される）で修飾された血中滞留型リポソーム（ｌｏｎｇ−ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）に関する。リポソームは、抗がん剤の標的送達担体として有用である。例えば、前記リポソームは、ドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩を抗がん剤として含んでもよい。前記血中滞留型リポソームは、抗がん剤を腫瘍新生血管内皮細胞及び腫瘍細胞の内部に標的送達することができ、インビボでのリポソームの滞留時間を延長することができ、それにより前記抗がん剤の治療効果を高める。
【背景技術】
【０００２】
アドリアマイシンとしても知られるドキソルビシンは、１９６９年にＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ  ｖａｒ．  ｃａｅｓｉｕｓから抽出されたアントラサイクリン系抗生物質であり、強力な抗がん活性を有する。ドキソルビシンは、様々な悪性腫瘍を効果的に治療するために、単独で又は他の抗がん剤と組み合わせて臨床的に使用できる。通常、以下の化学構造を持つドキソルビシン塩酸塩の形態で使用される。
【０００３】
【化１】
2020521004.tif 000003
【０００４】
ドキソルビシン又はその医薬的に許容される塩（例えば、ドキソルビシン塩酸塩）は、細胞周期相の非特異的薬物であり、ＤＮＡ複製を防ぎ、ＤＮＡ依存性ポリメラーゼの作用を阻害し、主にＤＮＡ塩基対間に挿入することによりＲＮＡ転写プロセスを妨げてＤＮＡに強固に結合する。細胞分裂を防ぐその効果は、正常細胞と比較して腫瘍細胞に対して選択的ではない。したがって、ほとんどの化学療法剤と同様に、ドキソルビシン塩酸塩には多くの副作用がある。嘔吐、吐き気、脱毛などの一般的な副作用に加えて、この化合物は他の組織よりも心筋との親和性が非常に高く、セミキノン代謝物を介して心筋細胞を損傷する可能性があるため、重度の用量依存的心毒性を引き起こす。これは、その臨床応用が大幅に制限されている理由を説明するものである。ドキソルビシン抗腫瘍剤の心毒性は、累積投与量を減らすことである程度緩和することができるが、腫瘍に対する抑制効果はそれに応じて減少する。
【０００５】
ドキソルビシン塩酸塩の心毒性を軽減し、その副作用を減らすために、Ｅｌａｎ社は、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム注射剤「Ｍｙｏｃｅｔ」（別名「Ｅｖａｃｅｔ」）を開発し、これは主に転移性乳がんの治療に使用され、ボトルあたり２０ｍｇ／１０ｍＬ又は５０ｍｇ／２０ｍＬの仕様があり、通常１時間の静脈内注入によっても投与される。投与は３〜６ヶ月間、３週間間隔で２０〜５０ｍｇ・ｍ−２の用量で実施される。一般的な副作用には、赤血球減少症、血小板減少症、歯肉出血、鼻出血、嘔吐、悪心、下痢などがある。Ｍｙｏｃｅｔは、従来のドキソルビシン塩酸塩注射剤よりも心毒性を発症するリスクは低いが、肝臓と脾臓のマクロファージに容易に取り込まれるため、急速に排泄され、体内の滞留時間が短くなり、治療効果が低くなる。
【０００６】
血中滞留型リポソームは、従来の送達システムの表面を親水性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でさらに修飾することにより調製される。血中滞留型送達システムは、血漿によるオプソニンの作用を回避してマクロファージによる取り込みを回避することができ（このため、ポリエチレングリコールで修飾した血中滞留型送達システムは、ステルス送達システムとしても知られる）、それにより循環系での滞留時間と血中濃度を大幅に増加させる。血中滞留型送達システムは、ＥＰＲ効果（すなわち、固形腫瘍の血管透過性・滞留性亢進効果）を介して、腫瘍組織への薬物の蓄積を増加させ、それにより抗がん剤の標的送達を増加させることができる。正常組織の微小血管内皮は密度が高く、構造的に無傷であるため、巨大分子や脂質粒子が血管壁を透過するのは簡単ではない。しかし、固形腫瘍組織は血管が豊富で、血管壁の隙間が広く、構造的完全性が乏しく、リンパ還流がなく、高分子と脂質粒子の選択的な高い血管透過性及び滞留性をもたらす。この現象は、固形腫瘍の高い血管透過性・滞留性亢進効果として知られており、略してＥＰＲ効果とも称される。前述のメカニズムに基づいて、米国のＳｅｑｕｕｓ社は、ドキソルビシン充填ＰＥＧ修飾血中滞留型リポソームを開発及び発売した（商品名「Ｄｏｘｉｌ」）、ＡＬＺＡ社及びＳｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ社は、共同で別のドキソルビシン充填ＰＥＧ修飾血中滞留型リポソームを開発及び発売した（商品名「Ｃａｅｌｙｘ」）。ドキソルビシン充填ＰＥＧ修飾血中滞留型リポソームは、ドキソルビシンがステルスリポソーム送達システムにカプセル化されていることを特徴とする。血中滞留型リポソームの表面はＰＥＧの層で覆われているため、体内の免疫系によって認識及び貪食されることが防止されるため、薬物が数日間体内で循環し、それによりドキソルビシンの抗腫瘍作用時間が増加する。
【０００７】
血中滞留型リポソームは、体内での薬物の滞留時間を大幅に増加させ得る。血中滞留型リポソームに対する腫瘍組織のＥＰＲ効果が強化されているため、薬物充填血中滞留型リポソームは腫瘍組織に受動的に蓄積し得る。ただし、ほとんどの抗がん剤の標的は腫瘍細胞内にあるため、腫瘍組織内の抗がん剤の蓄積は、腫瘍細胞内の薬物濃度の増加を意味しない。したがって、治療効果を改善するための鍵は、腫瘍細胞への抗がん剤の送達の効率を改善することである。
【０００８】
中国特許第２００５１００６３３８８．０号は、注射用抗がん剤充填血中滞留型リポソームであって、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びアルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）又は直鎖ＲＧＤアナログ（インテグリンリガンド）配列を含む直鎖ポリペプチドフラグメントの両方で修飾され、前記抗がん剤は、例えば、アドリアマイシン（すなわち、ドキソルビシン）、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチンなどであり得る注射用抗がん剤充填血中滞留型リポソームに関する。この特許は、腫瘍細胞の表面上のインテグリンによって直鎖ＲＧＤが認識され、それによって腫瘍細胞への接着を媒介するという原理に基づいて、腫瘍への抗がん剤の標的送達を達成する。この特許では、直鎖及び環状ＲＧＤペプチドの両方がインテグリンαｖβ３に特異的に結合するが、これら２つのペプチドの作用メカニズムは異なると考えられている。環状ＲＧＤペプチドの標的は腫瘍細胞ではなく腫瘍血管新生にあり、環状ＲＧＤペプチドは腫瘍血管新生を破壊して腫瘍への栄養素及び酸素供給を遮断することにより抗腫瘍効果を発揮する一方で、直鎖ＲＧＤペプチドの標的は腫瘍細胞自体であり、その抗腫瘍効果は、腫瘍細胞による抗がん剤の取り込みを増加させることにより達成される。したがって、抗がん剤の腫瘍細胞への標的化を強化するために、上記特許によって保護されている発明は、直鎖ＲＧＤペプチド修飾リポソームである。
【０００９】
研究により、環状ＲＧＤペプチドは、直鎖ＲＧＤペプチドよりも、インテグリンαｖβ３に対する親和性、受容体選択性及び酵素安定性が優れていることが示されている。現在、主な研究は環状ＲＧＤペプチドの応用に焦点を当てている。実際、臨床研究に入った腫瘍診断試薬に対して行われたほとんど全てのＲＧＤ修飾は、環状ＲＧＤペプチドを利用している。その中で、ｃ（ＲＧＤｆｋ）がより多く報告されており、より良い標的分子であると認識されている。例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１４１３８０号は、環状ＲＧＤペプチドｃ（ＲＧＤｆｋ）で修飾されたポリマーからなるナノ粒子であって、前記ポリマーは、磁性金属酸化物でコ−ティングされた金属キレ−ト剤であり、少なくとも１つの活性剤がポリマーに共有結合したナノ粒子を報告した。
【００１０】
また、Ｊｉ−Ａｅ  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｉ−Ａｅ  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｙｃｌｉｃ  ＲＧＤ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  Ｃｙｃｌｏａｌｋａｎｅｓ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｓ  ＰＥＴ  Ｒａｄｉｏｔｒａｃｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ＡＣＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２０１４，  ５，  ９７９−９８２）の報告では、環状［ＲＧＤ−（１Ｓ，３Ｒ）−３−アミノシクロペンタンカルボン酸］（略称ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ））及び環状［ＲＧＤ−（１Ｓ，３Ｒ）−３−アミノシクロヘキサンカルボン酸］（略称ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ））は、インテグリンαｖβ３を発現するＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞に対する親和性が高かった。そしてＵ８７ＭＧ細胞の表面上のインテグリンαｖβ３へのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ）の結合は、参照としての環状ペプチドｃ（ＲＧＤｙＫ）の結合よりも優れており、ｃ（  ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ）のそれよりも有意に高かった。しかし、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ）をそれぞれコンジュゲ−トｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ＤＯＴＡ−６４Ｃｕ及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ）−ＤＯＴＡ−６４Ｃｕに調製した後、ＰＥＴイメ−ジングにより、前者のインビボターゲティングは後者よりも悪く、参照ｃ（ＲＧＤｙＫ）−ＤＯＴＡ−６４Ｃｕのターゲティングよりもさらに悪いことが示された（上記文献の図４を参照）。よって、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とｃ（ＲＧＤ−ＡＣＨ−Ｋ）とのインビトロの結合親和性はインビボのものと同じではなく、インビトロプロファイルとインビボプロファイルとの間に相関はない。
【００１１】
したがって、腫瘍細胞を十分に標的化する分子、及びそれから調製された標的化特性が改善され有害作用が低減された抗がん剤送達システムが依然として必要である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、抗がん剤の標的送達システムの作製のためにターゲティング特性の点でｃ（ＲＧＤｆｋ）に匹敵する又はより優れた標的分子を得ることを期待して、様々な直鎖及び環状ＲＧＤ配列を研究及び比較した。本発明者らは、驚くべきことに、リポソームを修飾するために使用される場合、全ての環状ＲＧＤペプチドが重要なターゲティングを行うわけではなく、多くの環状ＲＧＤ配列のターゲティング特性は明らかではないが、特定の環状ＲＧＤペプチドｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾された血中滞留型リポソームは、ｃ（ＲＧＤｆｋ）を含む他の直鎖及び環状ＲＧＤペプチドで修飾されたものよりも、腫瘍細胞に対しより顕著にターゲティングを行うことを見出した。したがって、本発明者らは、以前は診断研究にのみ使用されていた環状ＲＧＤペプチドｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）を使用したリポソームの修飾を初めて行った。この環状ペプチドにより修飾されたリポソームは、優れた標的特性を有していた。リポソームはシスプラチンの送達を著しく改善はしなかったが、抗がん剤であるドキソルビシン塩酸塩の送達に優れた改善を示す。
【００１３】
さらに、本発明者らは、驚くべきことに、先行技術の報告とは異なり、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームは、腫瘍血管新生だけでなく、腫瘍細胞自体も標的にし、抗がん剤を腫瘍細胞の内部にターゲティング送達することを可能にし、予想外に優れた送達効率と治療効果をもたらすことを見出した。またさらに驚くべきことに、このリポソームは以下の利点も有する。
【００１４】
１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は、インビトロでの腫瘍へのターゲティング特性の観点から、現在ＲＧＤペプチドを最もよくターゲティングするものの１つとして知られているｃ（ＲＧＤｆｋ）よりもはるかに優れている。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームは、ｃ（ＲＧＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソームよりも優れたインビトロ腫瘍ターゲティング特性を有し、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームのインビボ抗がん効果は、ｃ（ＲＧＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソームのそれよりも著しく優れている。したがって、インビボの結果はインビトロの結果と一致しており、それらの間には顕著な相関関係がある。
２）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームは、インテグリンαｖβ３高発現腫瘍細胞だけでなく、インテグリンαｖβ３低発現腫瘍細胞も標的にする。これは、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの腫瘍細胞へのターゲティング特性には、インテグリンαｖβ３による認識以外の未知のメカニズムが関与しているため、より多くの種類の腫瘍を標的とし、より良い薬物送達担体となることを示している。
３）ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの心臓への毒性は軽減される。
４）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームは、シスプラチンよりもドキソルビシン塩酸塩に対してより良い送達効果がある。
【００１５】
したがって、本発明は、表面がｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾された血中滞留型リポソームであって、前記ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されている、血中滞留型リポソームを提供する。前記血中滞留型リポソームは、抗がん剤を腫瘍新生血管内皮細胞及び腫瘍細胞の内部に標的送達することができ、生体内での薬物送達システムの滞留時間を延長することができ、それにより前記抗がん剤の抗腫瘍効果を高める。
【００１６】
一実施形態では、前記ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）などの本明細書に記載のリン脂質−ＰＥＧに含まれるリン脂質からなる群より選択される、前記血中滞留型リポソームが提供される。
【００１７】
一実施形態では、前記ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは、前記リポソームの表面のＤＳＰＥに結合されている、前記血中滞留型リポソームが提供される。
【００１８】
一実施形態では、前記リポソームの表面はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームは抗がん剤を含むことを特徴とする、前記血中滞留型リポソームが提供される。
【００１９】
好ましい実施形態では、前記リポソームの表面はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩を抗がん剤として含むことを特徴とする、前記血中滞留型リポソームが提供される。
【００２０】
前記血中滞留型リポソームは、その表面がＰＥＧで修飾されているので、体内の細網内皮系の捕捉から逃れることができるため、体内の血中滞留型リポソームの滞留時間が長くなる。標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）はＰＥＧの末端に結合されているため、ＰＥＧの作用及び受容体による薬物送達システムの認識は影響を受けない。さらに、標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は、共有結合の形成時に壊れにくい。
【００２１】
本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」及び「ＰＥＧ」という用語は互換性がある。前記ポリエチレングリコールは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００である。本発明で使用するポリエチレングリコールとしては、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００が挙げられる。
【００２２】
本発明に従って血中滞留型リポソームを調製するために使用されるリン脂質は、リポソームを調製するために使用され得る当技術分野で公知の任意のタイプのリン脂質である。例えば、本発明に従って血中滞留型リポソームを調製するために使用されるリン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びその任意の組み合わせからなる群より選択されてもよい。
【００２３】
本明細書で使用される「リン脂質−ポリエチレングリコール複合体」及び「リン脂質−ＰＥＧ」という用語は互換性があり、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＣ）などのエステル化反応性ポリエチレングリコールを指す。前記リン脂質−ポリエチレングリコール複合体は、当技術分野で公知の方法によって調製することが可能であり又市販されている。
【００２４】
本明細書で使用される「リポソーム」という用語は、リン脂質及びコレステロールを主要な材料として調製した脂質二重層小胞を指す。リポソームを調製するための方法及び材料は、当技術分野で公知である。例えば、リポソームを調製する方法には、受動的薬物充填法及び能動的薬物充填法が含まれる（例えば、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ．  ２０１２  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｏｒｌｄ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ，  ａｎｄ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｂｒａｎｃｈ  ｏｆ  Ｃｈｉｎａ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｓ  ｗｅｌｌ  ａｓ  “Ｊｉａｎｇｚｈｏｎｇ  Ｃｕｐ”  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｆｏｒｕｍを参照）。受動的薬物充填法には、薄膜分散、超音波分散、フィルム押出、注入、凍結乾燥、融解、逆相蒸発、界面活性剤可溶化、再乳化、凍結融解、微小流動化、遠心分離、噴霧乾燥法などが含まれる。能動的薬物充填法には、ｐＨ勾配法、硫酸アンモニウム勾配法、酢酸カルシウム勾配法、硫酸ナトリウム勾配法などが含まれる。本発明では、能動的薬物充填法が好ましく、硫酸ナトリウム勾配法がより好ましい。
【００２５】
本明細書で使用される「血中滞留型リポソーム」及び「ステルスリポソーム」という用語は互換性があり、ＰＥＧで修飾され、ＰＥＧによる表面の修飾により体内の細網内皮系による捕捉を逃れることができ、それにより体内での滞留時間が増加したリポソームを指す。
【００２６】
本明細書に記載のコレステロールの化学名は「（３β）−コレスタ−５−エン−３−オ−ル（（３β）−ｃｈｏｌｅｓｔ−５−ｅｎ−３−ｏｌ）」であり、生体膜の重要な成分の１つである。中性脂質で両親媒性分子であるが、親水性に比して親油性が高い。コレステロールは、リポソームのリン脂質二重膜を安定化するために使用される。コレステロールの化学構造は以下の通りである。
【００２７】
【化２】
2020521004.tif 000004
【００２８】
コレステロールは当技術分野で知られており、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．（米国）から市販されている。
【００２９】
本発明のリポソームに含まれるリン脂質とコレステロールとの重量比は、１〜１０００：１、好ましくは１〜８００：１、１〜５００：１、１〜２００：１、１〜１００：１又は１〜１０：１、より好ましくは１〜１００：１、最も好ましくは重量で１〜１０：１である。
【００３０】
本発明のリポソームは、静脈内投与のために注射可能な媒体に分散されていてもよい。注射可能な媒体は、例えば、０．９％塩化ナトリウム注射液、５％グルコ−ス注射液、ｐＨ＝７．４のＰＢＳ緩衝液である。
【００３１】
本明細書に記載のｃ（ＲＡＤｆｋ）は、化学名「シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）（ｃｙｃｌｏ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）
」及び以下の化学式を有する。
【００３２】
【化３】
2020521004.tif 000005
【００３３】
ｃ（ＲＡＤｆｋ）は当技術分野で知られており、例えば、上海のＱｉａｎｇｙａｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されている。
【００３４】
本明細書に記載のｃ（ＲＧＤｆｋ）は、化学名「シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ｃｙｃｌｏ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ））」及び以下の化学式を有する。
【００３５】
【化４】
2020521004.tif 000006
【００３６】
ｃ（ＲＧＤｆｋ）は当技術分野で知られており、例えば、上海のＱｉａｎｇｙａｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から市販されている。
【００３７】
本明細書に記載のＡＢＨＴは、化学名「Ｃ６−４−（３−アミノプロポキシ）ベンゾイル−β−ＨｏｍｏＴｙｒ［Ｎ−（３−プロピル）−４−メトキシピリジン−２−アミン］（Ｃ６−４−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｏｘｙ）ｂｅｎｚｏｙｌ−β−ＨｏｍｏＴｙｒ［Ｎ−（３−ｐｒｏｐｙｌ）−４−ｍｅｔｈｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎ−２−ａｍｉｎｅ］）」及び以下の化学式を有する。
【００３８】
【化５】
2020521004.tif 000007
【００３９】
ＡＢＨＴは当技術分野で知られており、例えば、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社から市販されている。
【００４０】
本明細書に記載のｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）は、化学名「シクロ［ＲＧＤ−２−（（２Ｒ，５Ｓ）−５−（アミノメチル）−４−（４−（アミノメチル）ベンジル）−３，６−ジオキソピペラジン−２−ｙｌ）酢酸］（ｃｙｃｌｏ［ＲＧＤ−２−（（２Ｒ，５Ｓ）−５−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）−４−（４−（ａｍｉｎｏｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚｙｌ）−３，６−ｄｉｏｘｏｐｉｐｅｒａｚｉｎ−２−ｙｌ）ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ］）」及び以下の化学式を有する。
【００４１】
【化６】
2020521004.tif 000008
【００４２】
ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）は当技術分野で知られており、例えば、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社から市販されている。
【００４３】
本明細書に記載のｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は、化学名「シクロ［ＲＧＤ−（１Ｓ，３Ｒ）−３−アミノシクロペンタン−１−カルボン酸］（ｃｙｃｌｏ［ＲＧＤ−（１Ｓ，３Ｒ）−３−ａｍｉｎｏｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  ａｃｉｄ］）」及び以下の化学式を有する。
【００４４】
【化７】
2020521004.tif 000009
【００４５】
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は当技術分野で知られており、例えば、Ｈａｎｇｚｈｏｕ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ社から市販されている。
【００４６】
本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、医薬の調製に有用であり、通常は安全、非毒性であり、生物学的あるいはその反対で望ましくないものでなく、獣医学及びヒト製薬学的使用に許容されるものを含む。本明細書で使用される「医薬的に許容される塩」という用語は、ドキソルビシンの所望の薬理活性を保持する医薬的に許容される塩を意味する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本発明に従って血中滞留型リポソームを調製する方法を提供する。前記方法は、
（１）過剰なリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とを反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで前記反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）又はベンゾトリアゾリル（−ＢＴＣ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％（例えば、４％、８％、１２％、又は１６％）である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートし、その後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を溶出及び回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出して、本発明に従うｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、ドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩である。
【００４８】
一実施形態では、前記ＰＥＧは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００であり、より好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であり、最も好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ  ２０００である、前記方法が提供される。
【００４９】
一実施形態では、工程（３）で添加した前記リン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、前記方法が提供される。
【００５０】
一実施形態では、工程（１）において、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１のモル比は、１：１．２、１：１．５、又は１：２、好ましくは１：１．２である、前記方法が提供される。
【００５１】
一実施形態では、前記リン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、リン脂質−ＰＥＧ−ＮＨＳである、前記方法が提供される。
【００５２】
一実施形態では、前記リン脂質−ＰＥＧはジステアロイルホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＣ）からなる群より選択され、より好ましくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）である、前記方法が提供される。
【００５３】
一実施形態では、工程（２）において、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％〜１２％、最も好ましくは８％である、前記方法が提供される。
【００５４】
より具体的な実施形態では、腫瘍を標的とする血中滞留型リポソームを調製する方法が提供される。前記方法は、
（１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とを１：１．２のモル比で反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、１：０．２のモル比のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧとの混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％（例えば、４％、８％、１２％、又は１６％）、より好ましくは８％〜１２％、最も好ましくは８％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートした後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、ドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩であり、且つ
前記リン脂質−ＰＥＧはＤＳＰＥ−ＰＥＧであり、
好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である。
【００５５】
一実施形態では、工程（３）において、前記デキストランゲルカラムはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムであり、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出される、前記方法が提供される。
【００５６】
一実施形態では、工程（３）における前記フィルターメンブレンは、ポリカーボネートフィルターメンブレンである、前記方法が提供される。
【００５７】
一実施形態では、工程（２）において、添加したリン脂質、コレステロール、及びリン脂質−ＰＥＧの重量比は３：１：１であり、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％である、前記方法が提供される。
【００５８】
一実施形態では、工程（１）における前記透析を、１０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析バッグを用いて実施する、前記方法が提供される。
【００５９】
別の態様では、本発明は、上記方法により得られたｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを提供する。
【００６０】
別の態様では、本発明は、本発明による治療有効量のｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームをがん患者に投与することを含む、がんの治療方法を提供する。前記がんは、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などのがんである。
【００６１】
別の態様では、本発明は、抗がん医薬の製造における、本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの使用を提供する。
【００６２】
一実施形態では、前記医薬は、例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液である。
【００６３】
別の態様では、医薬として使用するための、本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームが提供される。
【００６４】
別の態様では、本発明は、がん、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などの治療に使用するための、本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを提供する。
【００６５】
別の態様では、例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液である形態などの、本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームが提供される。
【００６６】
本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム又はそれから調製された抗がん医薬は、がん、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などの治療に使用することができる。
【００６７】
本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームは、治療有効量で投与され得る。適切な用量範囲は、通常０．１〜１０００ｍｇ・ｍ−２、好ましくは１〜１００ｍｇ・ｍ−２、最も好ましくは１０〜５０ｍｇ・ｍ−２であり、治療する疾患の重症度、個人の年齢及び相対的な健康状態、投与が実施される適応症、実施する医師の経験などの要因に応じて決定される。必要に応じて、上記の用量範囲よりも低くても高くてもよい。がん治療分野の当業者は、個人の知識及び本出願の開示に基づいて、過度の実験をすることなく、所定の疾患に対する本発明の活性化合物の治療有効量を決定することができる。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「治療有効量」という用語は、対象の疾患の改善又は治癒を引き起こすのに十分な量を意味する。「治療有効量」は、使用する化合物、治療する疾患、治療する疾患の重症度、対象の年齢及び健康状態、担当医師又は獣医師の判断、及びその他の要因によって変動する。
【００６９】
上述の通り、本発明によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームには多くの利点があり、本発明で使用される標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は低分子量であり、抗原性を低下させて免疫応答を起こりにくくする。本発明による調製方法は、温和な条件を使用し、迅速な反応、標的分子の単純なカップリング、及び成熟した手順を有し、工業生産規模に適している。
【００７０】
別の態様では、本発明は、リポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用を提供し、好ましくは抗がん剤、特にキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩を含むリポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃは、高含有量実験で試験された（ハイコンテンツアナライザー（Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国）、パッシブターゲティング血中滞留型リポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）、並びにＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＢＨＴ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）でそれぞれ修飾された血中滞留型リポソーム（それぞれｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏで表される）のインビトロ細胞ターゲティングを示した図である。この結果により、黒色腫Ｂ１６細胞（図１Ａ）、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ細胞）（図１Ｂ）、及び乳がん細胞（ＭＣＦ７細胞）（図１Ｃ）で試験した血中滞留型リポソームでは、高から低の順にｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏの順でターゲティングを認めたこと、及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏのターゲティングは、他の全てのリポソームのターゲティングよりも有意に高かったことが判明した。使用した３種類の細胞の中で、Ｂ１６細胞及びＨＵＶＥＣ細胞はインテグリンαｖβ３の高発現を示し、ＭＣＦ７細胞はインテグリンαｖβ３の低発現を示す。実験結果から、３種類の細胞全てが非常に特異的にｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏを取り込み、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏは、インテグリンαｖβ３高発現細胞だけでなく、インテグリンαｖβ３低発現細胞も標的にしたことを示すことが判明した。図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃにおいて、記号「＊」は、ＡＮＯＶＡ（分散分析）において有意差を示したことを表し（ｐ＜０．０５）、記号「＊＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて顕著な有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０１）。
【図２】図２は、高含有量実験で試験された（ハイコンテンツアナライザー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国）、得られたリポソームのインビトロ細胞ターゲティングにおける、異なる量のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧを使用した血中滞留型リポソームの調製の効果を示した図である。この結果により、Ｂ１６細胞モデルにおいて、ドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソームの調製に使用した異なる量のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧは、得られたリポソームのインビトロ細胞ターゲティングに著しい効果を有することが判明した。試験されたリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／リン脂質−ＰＥＧのモル比が０％〜２０％の範囲内で、ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームでは、高から低の順に８％＞１２％＞４％＞１６％＞０％＞２０％の順でインビトロ細胞ターゲティングを認めた。インビトロの細胞ターゲティングは、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／リン脂質−ＰＥＧのモル比が４％〜１６％の範囲内でより優れており、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／リン脂質−ＰＥＧのモル比が８％〜１２％の範囲内でさらに優れ、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／リン脂質−ＰＥＧのモル比が８％で最も優れていた。リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／リン脂質−ＰＥＧのモル比が、２０％に上昇した場合、細胞によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾リポソームの取り込みは、修飾されていないリポソームの取り込みよりも少なかった。図２において、記号「＊＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて顕著な有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０１）。図２の「標的密度」という用語は、リポソームの調製で添加されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル比を指す。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ドキソルビシン塩酸塩充填アクティブターゲティングリポソーム（ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ）並びにドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティングリポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）の尾静脈注射による投与後のマウスにおける腫瘍体積曲線を示した図である。図３Ａの曲線は、下から上にそれぞれｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、及びコントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）を示す。図３Ａから、腫瘍体積によって評価される腫瘍抑制効果に関する限り、これらのリポソームの腫瘍抑制効果は、高から低の順に次の通りであったことが認められた：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ＞コントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）。図３Ｂの曲線は、下から上にそれぞれｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、及びコントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）を示す。図３Ｂから分かるように、投与後７日目にｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏとＮｅｇ−ｌｉｐｏとの間（ｐ＜０．０５）、及び投与後９日目にｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏとｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏとの間（ｐ＜０．０５）に有意差が生じたことがＡＮＯＶＡにより示された。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ群は、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ陽性コントロ−ル群を上回る、最も優れた腫瘍抑制効果を示した。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、記号「＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０５）。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、様々なドキソルビシン塩酸塩充填アクティブターゲティングリポソーム（ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ）並びにドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティングリポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）の尾静脈注射による投与による実験終了時における、マウスの最終腫瘍体積及び最終腫瘍重量を示す写真を示した図である。図４Ａ及び図４Ｂから分かるようにこれらのリポソームの腫瘍抑制効果は、高から低の順に次の通りであった：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ≒ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ＞コントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）。全治療群の腫瘍抑制効果は、コントロ−ルであるＰＢＳ緩衝液に対して顕著な有意差を示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群の腫瘍抑制効果は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群に対して有意差を示し（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ治療群、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ治療群、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ治療群、及びＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ治療群に対して顕著な有意差を示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。すなわち、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群の腫瘍重量は、実験終了時の他の全群の腫瘍重量よりも有意に少なかった。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、記号「＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて有意差を示したことを表し（ｐ＜０．０５）、記号「＊＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて顕著な有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明することを意図しているが、本発明に対する限定として解釈されるべきではない。
【００７３】
略語：
ＰＢＳ      リン酸緩衝液
ＰＥＧ      ポリエチレングリコール
ＲＧＤ      アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
ＰＥ−ＰＥＧ      ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール
ＰＣ−ＰＥＧ      ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシスクシンアミド
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＢＴＡ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールベンゾトリアゾ−ル
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＡＤｆｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＡＤｆｋ）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＢＨＴ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールＡＢＨＴ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）
Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ      ＰＥＧのみで修飾され環状ペプチドで修飾されていないドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＡＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ＡＢＨＴ修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
特に指定しない限り、実施例で合成に使用される出発物質は全て当技術分野で公知であり、公知の方法で合成されるか市販されている。
【００７４】
実施例１  ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の調製におけるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）に対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳの異なるモル比に関する研究
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ及び標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）を、無水ジメチルホルムアミドに別々に溶解した。得られた標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の溶液の濃度は０．０１Ｍであり、得られたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳの溶液の濃度は、それぞれ０．０１０Ｍ、０．０１２Ｍ、０．０１５Ｍ、及び０．０２０  Ｍであった。同じ容量の２つの溶液を丸底フラスコに加え（それにより標的分子ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳとのモル比は１：１、１：１．２、１：１．５、及び１：２となる）、トリエチルアミンでｐＨ８〜９に調整した。前記混合物を４℃で４〜１０時間反応させ、その間、反応をＨＰＬＣで監視した（Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ、モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＬＣ、条件：Ａ：０．１％トリエチルアミン水溶液、Ｂ：アセトニトリル及び０．１％トリエチルアミンを含む水（８０：２０）、Ｂ：１０％〜３５％グラジエント、２０分）。
【００７５】
実験結果から、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳとのモル比が１：１の場合、標的分子のピ−クは最終的に完全に消失しなかったが、他の３つの比で完全に消え、標的分子は１：１．２、１：１．５、及び１：２の３つの比全てにおいて完全に反応し、ＮＨＳを置換してＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）を形成したことを示すことが分かった。したがって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳとのモル比は、反応完了時にそれぞれ１：０．２、１：０．５、及び１：１であった。これは、コンジュゲ−トを調製する反応において、過剰なＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳが完全な反応を促進したことも示した。
【００７６】
実施例２  ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＢＨＴ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の調製
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ及び標的分子ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）又はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）を、無水ジメチルホルムアミドに別々に溶解した。得られたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳ溶液の濃度は０．０１２Ｍであり、得られた標的分子ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、又はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の溶液の濃度は０．０１Ｍであった。これら２つの溶液を丸底フラスコに加え（標的分子とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳとのモル比は１：１．２）、トリエチルアミンでｐＨ８〜９に調整した。前記混合物を４℃で４〜１０時間反応させ、その間、標的分子のピ−クが完全に消えるまで、反応をＨＰＬＣで監視した（Ａｇｉｌｅｎｔ高速液体クロマトグラフ、モデル：Ａｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＬＣ、条件：Ａ：０．１％トリエチルアミン水溶液、Ｂ：アセトニトリル及び０．１％トリエチルアミンを含む水（８０：２０）、Ｂ：１０％〜３５％グラジエント、２０分）。反応をさらに１２時間続けた後、過剰のグリシンを加えることにより反応を終了させた。次に、反応生成物を透析バッグ（ＭＷ＝１０００）に入れ、蒸留水に対して４８時間透析した。透析液は使用のために凍結乾燥された。凍結乾燥条件は以下の通りであった。
【００７７】
予備凍結：    −４５℃、３００分
一次乾燥：    ステ−ジ１（−４０℃）：６００分
ステ−ジ２（−３０℃）：６００分
ステ−ジ３（−２０℃）：３６０分
ステ−ジ４（−１０℃）：３６０分
二次乾燥：    ステ−ジ１（１０℃）：６０分
ステ−ジ２（２０℃）：６０分
ステ−ジ３（２５℃）：１２０分
【００７８】
得られた凍結乾燥物は、それぞれＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＮＨＳに対するＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＡＢＨＴ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル比が１：０．２の混合物であった。
【００７９】
マトリックス支援レ−ザ−脱離／イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）（モデル：ｍｉｃｒｏｆｌｅｘ、製造元：Ｂｒｕｋｅｒ社、米国）を使用して、透析液に含まれる産物の分子量を分析した。結果から、分子量３５００で正規分布のピ−クがあることが示され、産物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＡＢＨＴ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が実際に合成されたことを証明した。
【００８０】
実施例３  ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されたドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソーム及びドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソームの調製
【００８１】
水素添加大豆レシチン、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３成分の重量比＝３：１：１）並びに実施例２で調製した凍結乾燥物（添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ＡＢＨＴ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ）、又はＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数の８％である）を丸底フラスコに入れ、クロロホルムに溶解し、ロータリーエバポレーター上で３７℃で３０分間蒸発させて有機溶媒を除去し、均一で透明な薄膜を得た。前記薄膜を真空オ−ブンに一晩入れて、残留有機溶媒を除去した。適切な量の硫酸アンモニウム水溶液（１２３ｍＭ、ｐＨ５．４）を加えた。塊を短時間ボルテックスし、その後、青色乳白光が現れるまでプロ−ブで超音波処理した。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムに通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出した（ｐＨ＝７．４）。リポソーム画分を回収して、ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、又はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されたブランク血中滞留型リポソームを得た。
【００８２】
ブランクパッシブターゲティング血中滞留型リポソームを、水素添加大豆レシチン、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のみを用いて上記の手順に従って調製した。
【００８３】
回収したブランク血中滞留型リポソームは、ドキソルビシン塩酸塩ストック液（水溶液、５ｍｇ／ｍｌ）を用いて６０℃で２０分間、振とうしながらインキュベートした。反応液をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムに通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出した（ｐＨ＝７．４）。赤色リポソーム画分を回収し、０．２２μｍポリカーボネートフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出して、表題生成物を得た。得られたｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されたドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソームを、それぞれ「ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ」、「ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ」、「ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ」、「ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ」、及び「ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ」と称し、得られたドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソームを「Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ」と称する。
【００８４】
実施例４  ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）でそれぞれ修飾されたドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソーム及びドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソームの物理化学的特性に関する研究
【００８５】
実施例３で調製された様々な血中滞留型リポソームの、粒径、粒径分布、多分散指数（ＰＤＩ）、及び表面電位などの物理化学的特性は、Ｍａｌｖｅｒｎ社の粒度分析計を使用して決定した（ＭＳ２０００ＭＵ）（機器モデル：Ｎａｎｏ  ＺＳ、条件：分散媒：水、サンプルセル：ＰＣＳ１１１５、温度：２５℃、測定回数：３回）。
【００８６】
カプセル封入効率及びドキソルビシン塩酸塩の放出は、紫外分光光度計によって決定した（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｔ６  Ｎｅｗ  Ｃｅｎｔｕｒｙ）。放出方法は以下の通りである：実施例３で調製した様々な血中滞留型リポソームの各等量と血清含有培地とを、放出培地としてＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）とともに透析バッグ（ＭＷ＝１４０００）に入れた。４８時間後、紫外線分光光度計（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｔ６  Ｎｅｗ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、検出波長：４８５ｎｍ）で活性剤の濃度を測定するために試料（５ｍｌ）を採取し、累積放出率を計算した。
【００８７】
同時に、放出方法の信頼性を検証するために、等濃度の遊離ドキソルビシン塩酸塩を用いて同じ放出方法を実施した。結果は、ほぼ全てのドキソルビシン塩酸塩が４８時間以内に放出されることを示し、これは、本実施例で使用した放出方法が信頼性があり、リポソームからのドキソルビシン塩酸塩の放出プロファイルを提示可能であることを示した。
【００８８】
【表１】
2020521004.tif 000010
【００８９】
実施例５  ｃ（ＲＡＤｆｋ）、ｃ（ＲＧＤｆｋ）、ＡＢＨＴ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）、又はｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されたドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソーム及びドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソームのインビトロターゲティングの研究
【００９０】
調製した血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングを高含有量実験（ハイコンテンツアナライザー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国）により試験した。実施例３で調製した様々な血中滞留型リポソームを、Ｂ１６細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、又はＭＣＦ７細胞と共に同じ濃度（３００ｎｇ／ｍｌ）で３７℃で２時間インキュベートした。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３７℃で２０分間固定し、最終的にＨｏｃｈｅｓｔ  ３３２５８で核を染色した。ハイコンテンツアナライザー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国）を用いて、細胞によるリポソームの取り込みを定量化した。測定蛍光値は、細胞によるリポソームの取り込みに直接比例し、細胞によるリポソームの取り込みのレベルを反映していた。図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃに実験結果を示す。
【００９１】
測定蛍光値の結果は、Ｂ１６細胞モデル（図１Ａ）、ＨＵＶＥＣ細胞モデル（図１Ｂ）、及びＭＣＦ７細胞モデル（図１Ｃ）において、３種類の細胞による被験血中滞留型リポソームの取り込みレベル、すなわち、被験血中滞留型リポソームの３種類の細胞へのターゲティングは、高から低の順に次の通りであったことを示した：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−Ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ。統計分析は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏのターゲティングが他の全てのリポソームのターゲティングよりも有意に高いことを示した（ｐ＜０．０５又はｐ＜０．０１）。使用した３種類の細胞の中で、Ｂ１６細胞及びＨＵＶＥＣ細胞は高インテグリンαｖβ３発現を示し、ＭＣＦ７細胞は低インテグリンαｖβ３発現を示す。実験結果から、３種類の細胞全てが、高い選択性でｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏを取り込んでおり、これは、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏが、受容体インテグリンαｖβ３高発現細胞だけでなく、受容体インテグリンαｖβ３低発現細胞も標的とすることを示したことが分かる。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏの腫瘍へのターゲティングのメカニズムは、受容体インテグリンαｖβ３によって選択的に認識されることに限定されず、受容体インテグリンαｖβ３低発現腫瘍細胞を標的とする能力と、そのような腫瘍細胞による取り込みにつながる、他の未知のメカニズムがまだ存在する。抗がん剤のキャリアとしてｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾リポソームは、より多様ながんに適用でき、より広い範囲の用途があることが示されている。
【００９２】
実施例６  血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングに対する異なる量のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の影響
血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングに対する異なるモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の影響を、高含有量実験（ハイコンテンツアナライザー、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、米国）により試験した。実施例３の方法に従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００とのモル比を０％、４％、８％、１２％、１６％、及び２０％として、ドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソームを調製した。調製したリポソームを同じ濃度（３００ｎｇ／ｍｌ）でＢ１６細胞と共に３７℃で２時間インキュベートした。次に、細胞を４％パラホルムアルデヒドで３７℃で２０分間固定し、最終的にＨｏｃｈｅｓｔ  ３３２５８で核を染色した。前記ハイコンテンツアナライザーを用いて、細胞によるリポソームの取り込みを定量化した。測定蛍光値は、細胞によるリポソームの取り込みに直接比例し、細胞によるリポソームの取り込みのレベルを反映していた。図２に実験結果を示す。
【００９３】
測定蛍光値の結果は、血中滞留型リポソームの調製における異なるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００モル比の使用が、Ｂ１６セルモデルにおける血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングに大きな影響を与えたことを示した。試験したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比が０％〜２０％の範囲内では、血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングは、高から低の順に次の通りであった：８％＞１２％＞４％＞１６％＞０％＞２０％。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比が４％〜１６％の範囲内で、血中滞留型リポソームのインビトロ細胞ターゲティングはより優れており、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比が８％〜１２％の範囲内でさらに優れ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比が８％で最も優れていた。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比が、２０％に上昇した場合、細胞によるｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾リポソームの取り込みは、修飾されていないリポソームの取り込みよりも少なかった。本発明者らは、同じ方法に従って、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル比を４０％として調製した血中滞留型リポソームのターゲティングについても検討したところ、細胞によるリポソームの取り込みは全く望ましいものではなかった。したがって、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）／ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００比は高すぎてはならない。
【００９４】
実施例７  ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの薬力学的研究
コントロ−ル：ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ＝７．４）及びドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）。
【００９５】
参照調製物：環状ペプチドｃ（ＲＧＤｆｋ）（ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ）又はｃ（ＲＡＤｆｋ）（ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ）で修飾されたドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソーム
試験調製物：ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、及びｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ
上記リポソームは、実施例３に記載されるように調製した。
【００９６】
実験動物：マウス黒色腫Ｂ１６を接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（体重１８〜２２ｇ、オス）を、それぞれ７〜９匹のマウスからなる５つの群に分けた。接種から１２日後、１３日目からマウスに尾静脈から２ｍｇのドキソルビシン塩酸塩／ｋｇ体重を１日おきに合計４回投与した。実験終了時の腫瘍体積及び最終腫瘍重量を、腫瘍増殖を示すパラメ−タ−として測定した。腫瘍体積は１日おきに測定した。最終的に、マウスを頸部脱臼により屠殺し、マウスの黒色腫を採取し、写真撮影を行い、重量を測定した。
【００９７】
実験結果：図３Ａ及び図３Ｂに、マウスにおける腫瘍体積の変化を示し、図４Ａ及び図４Ｂにマウス屠殺後の腫瘍の写真及び腫瘍重量を示す。
【００９８】
図３Ａ及び図３Ｂは、様々なドキソルビシン塩酸塩充填アクティブターゲティングリポソーム（ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ）並びにドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティングリポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）の尾静脈注射による投与後のマウスにおける腫瘍体積曲線を示した図である。図３Ａの曲線は、下から上にそれぞれｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、及びコントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）の結果を示す。図３Ａから分かるように、腫瘍体積によって示される腫瘍抑制効果に関して、様々なリポソームの腫瘍抑制効果は、高から低の順に次のとおりであった：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ＞コントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）。図３Ｂの曲線は、下から上にそれぞれｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、及びコントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）の結果を示す。図３Ｂから分かるように、初回投与後７日目（つまり、実験の１９日目）に、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏは、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏと比較して有意差を示し（ｐ＜０．０５）、初回投与後９日目（つまり、実験の２１日目）に、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏは、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏと比較して有意差を示した（ｐ＜０．０５）ことがＡＮＯＶＡにより示された。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ群は、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ陽性コントロ−ルを上回る、最も優れた腫瘍抑制効果を示した。図３Ａ及び図３Ｂにおいて、記号「＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０５）。
【００９９】
図４Ａ及び図４Ｂは、様々なドキソルビシン塩酸塩充填アクティブターゲティングリポソーム（ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ、ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ）並びにドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティングリポソーム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ）の尾静脈注射による投与による実験終了時における、マウスの最終腫瘍体積及び最終腫瘍重量を示す写真を示した図である。図４Ａ及び図４Ｂから分かるようにこれらのリポソームの腫瘍抑制効果は、高から低の順に次のとおりであった：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ＞Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ＞ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ≒ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ＞ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ＞コントロ−ル（ＰＢＳ緩衝液）。全治療群の腫瘍抑制効果は、コントロ−ルであるＰＢＳ緩衝液に対して顕著な有意差を示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群の腫瘍抑制効果は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群に対して有意差を示し（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）、Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ治療群、ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ治療群、ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ治療群、又はＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ治療群に対して顕著な有意差を示した（ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０１）。すなわち、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ治療群の腫瘍重量は、実験終了時の他の全群の腫瘍重量よりも有意に少なかった。図４Ａ及び図４Ｂにおいて、記号「＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて有意差を示したことを表し（ｐ＜０．０５）、記号「＊＊」は、ＡＮＯＶＡにおいて顕著な有意差を示したことを表す（ｐ＜０．０１）。
【０１００】
図１Ａ、図１Ｂ、及び図１Ｃのインビトロ実験結果から、ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームが最も優れたターゲティング特性を示したことが分かった。図３Ａ、図３Ｂ、図４Ａ、及び図４Ｂのインビボ実験結果からも、ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームが最も優れた抗腫瘍効果を有し、それによりドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームのインビボ実験結果は、インビトロ実験計画と一致していた。
【０１０１】
実施例８  本発明によるドキソルビシン塩酸塩充填血中滞留型リポソームの心毒性の評価
実施例７の薬力学的試験の終了後、各群のマウスの心臓をパラフィン切片化し、次にヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）を行った。各群のマウスの心筋細胞への損傷が顕微鏡下で観察された。
【０１０２】
結果は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏで治療した群は細胞壊死を全く示さず、全群の中で心毒性が最も低かったことを示した。
【０１０３】
実施例９  シスプラチン充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの調製及びその薬力学的研究
水素添加大豆レシチン、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、及び実施例２で調製した凍結乾燥物を丸底フラスコに入れ（水素添加大豆レシチン：コレステロール：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の重量比＝３：１：１とし、添加ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数の８％とした）、クロロホルムに溶解し、３７℃で３０分間ロータリーエバポレーター上で蒸発させて有機溶媒を除去し、均一で透明な薄膜を得た。前記薄膜を真空オ−ブンに一晩入れて、残留有機溶媒を除去した。適切な量の水溶液を加えた。塊を短時間ボルテックスし、その後、青色乳白光が現れるまでプロ−ブで超音波処理した。反応系をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムに通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出した（ｐＨ＝７．４）。リポソーム分画を回収してブランクｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを得た。
【０１０４】
ブランクパッシブターゲティング血中滞留型送達システムを、水素添加大豆レシチン、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のみを用いて上記の手順に従って調製した。
【０１０５】
回収したブランク送達システムを、それぞれ、振盪しながら５０℃で１時間、シスプラチン原液（１０ｍｇ／ｍｌ水溶液）と共にインキュベートした。反応系をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムに通し、ＰＢＳ緩衝液で溶出した（ｐＨ＝７．４）。リポソーム画分を回収し、０．２２μｍポリカーボネートフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出した。その結果、９６％の封入効率で所定の表題生成物が得られた。シスプラチン充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾リポソームは「ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎ」と称され、シスプラチン充填血中滞留型リポソームは、ブランクパッシブターゲティング送達システムから調製され「Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎ」と称される。
【０１０６】
コントロ−ル：ＰＢＳ溶液（ｐＨ＝７．４）及びパッシブターゲティング送達システム（Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎ）
【０１０７】
試験調製物：ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎ
【０１０８】
実験動物：マウス黒色腫Ｂ１６を接種したＣ５７ＢＬ／６マウス（体重１８〜２２ｇ、オス）を、それぞれ７〜９匹のマウスからなる５つの群に分けた。接種から１２日後、マウスに尾静脈から５ｍｇのシスプラチン／ｋｇ体重を１日おきに合計４回投与した。実験終了時の腫瘍体積及び最終腫瘍重量を、腫瘍増殖を示すパラメ−タ−として測定した。腫瘍体積は１日おきに測定した。最終的に、マウスを頸部脱臼により屠殺し、マウスの腫瘍を採取し、重量を測定した。
【０１０９】
結果は、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎ  の抗腫瘍効果は、ＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）の抗腫瘍効果よりも有意に優れていたが、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎとＮｅｇ−ｌｉｐｏ−ｐｌａｔｉｎとの間に腫瘍重量の統計的有意差はなかったことを示した。
【０１１０】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、均等物を置換できることを当業者は理解すべきである。そのような同等の技術的解決策はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。
【図１Ａ】
2020521004.tif 000011
【図１Ｂ】
2020521004.tif 000012
【図１Ｃ】
2020521004.tif 000013
【図２】
2020521004.tif 000014
【図３Ａ】
2020521004.tif 000015
【図３Ｂ】
2020521004.tif 000016
【図４Ａ】
2020521004.tif 000017
【図４Ｂ】
2020521004.tif 000018
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月28日(2020.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面がｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されていることを特徴とする血中滞留型リポソームであって、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されている、血中滞留型リポソーム。
【請求項２】
前記リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される、請求項１に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項３】
前記リポソームはドキソルビシン若しくは医薬的に許容されるドキソルビシン塩である抗がん剤を含むか、又は、前記リポソームはドキソルビシン塩酸塩である抗がん剤を含むことを特徴とする、請求項１又は請求項２に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項４】
前記ＰＥＧは分子量が２００〜５００００であるか、前記ＰＥＧは分子量が１０００〜５０００であるか、前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であるか、又は、前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項５】
前記化学結合は共有結合である、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項６】
（１）過剰なリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とを反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで前記反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）又はベンゾトリアゾリル（−ＢＴＣ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートし、その後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を溶出及び回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出して抗がん剤充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤はドキソルビシン若しくは医薬的に許容されるドキソルビシン塩であるか、又は、前記抗がん剤はドキソルビシン塩酸塩である、
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの調製方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧは分子量が２００〜５００００であるか、前記ＰＥＧは分子量が１０００〜５０００であるか、前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であるか、又は、前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００であり、
工程（２）で添加した前記リン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロ−ル、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（１）において、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、１：１．２、１：１．５、又は１：２のモル比で添加され、
前記リン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、リン脂質−ＰＥＧ−ＮＨＳである、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（２）で添加した前記リン脂質−ＰＥＧはジステアロイルホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＣ）からなる群より選択される、請求項６〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程（２）において、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％〜１２％である、請求項６〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（２）において、添加したリン脂質、コレステロール、及びリン脂質−ＰＥＧの重量比は３：１：１であり、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％である、請求項６〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
（１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｒ１とを１：１．２のモル比で反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、１：０．２のモル比のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数の４％〜１６％、又は８％〜１２％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートした後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤はドキソルビシン塩酸塩であり、且つ
工程（２）において添加した前記リン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びその任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
工程（３）において、前記デキストランゲルカラムはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムであり、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出され、
工程（３）における前記フィルターメンブレンは、ポリカーボネートフィルターメンブレンである、請求項６〜請求項１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（２）において、添加したリン脂質、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の重量比は３：１：１であり、添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のモル数の８％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
工程（１）における前記透析を、１０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析バッグを用いて実施する、請求項６〜請求項１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
請求項６〜請求項１５のいずれか一項に記載の方法によって得られる血中滞留型リポソーム。
【請求項１７】
医薬としての使用のための、請求項１〜請求項５及び請求項１６のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項１８】
前記医薬が、急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、及び黒色腫から選択されるがんの治療に使用される、請求項１７に記載の血中滞留型リポソーム。
【請求項１９】
リポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用、又は、ドキソルビシン若しくは医薬的に許容されるドキソルビシン塩を含むリポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
より具体的な実施形態では、腫瘍を標的とする血中滞留型リポソームを調製する方法が提供される。前記方法は、
（１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とを１：１．２のモル比で反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、１：０．２のモル比のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％（例えば、４％、８％、１２％、又は１６％）、より好ましくは８％〜１２％、最も好ましくは８％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートした後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、ドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩であり、且つ
前記リン脂質−ＰＥＧはＤＳＰＥ−ＰＥＧであり、
好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
略語：
ＰＢＳ      リン酸緩衝液
ＰＥＧ      ポリエチレングリコール
ＲＧＤ      アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
ＰＥ−ＰＥＧ      ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール
ＰＣ−ＰＥＧ      ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨＳ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールＮ−ヒドロキシスクシンアミド
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＢＴＣ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールベンゾトリアゾール
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＡＤｆｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＡＤｆｋ）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＡＢＨＴ      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールＡＢＨＴ
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）      ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコールｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）
Ｎｅｇ−ｌｉｐｏ      ＰＥＧのみで修飾され環状ペプチドで修飾されていないドキソルビシン塩酸塩充填パッシブターゲティング血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤｆｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＡＤｆｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＡＤｆｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ＡＢＨＴ−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ＡＢＨＴ修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＡＢ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）−ｌｉｐｏ      ドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソーム
特に指定しない限り、実施例で合成に使用される出発物質は全て当技術分野で公知であり、公知の方法で合成されるか市販されている。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１０】
本発明をその特定の実施形態を参照して説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行い、均等物を置換できることを当業者は理解すべきである。そのような同等の技術的解決策はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることを意図している。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
表面がｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されていることを特徴とする血中滞留型リポソームであって、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されている、血中滞留型リポソーム。
＜２＞
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びホスファチジルコリン（ＰＣ）からなる群より選択される、＜１＞に記載の血中滞留型リポソーム。
＜３＞
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）は化学結合を介してＰＥＧに結合されており、前記ＰＥＧは、前記リポソームの表面のジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に結合されている、＜２＞に記載の血中滞留型リポソーム。
＜４＞
前記リポソームの表面は、化学結合を介してＰＥＧに結合されているｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームは抗がん剤を含むことを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜５＞
前記リポソームの表面は、化学結合を介してＰＥＧに結合されているｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）で修飾されており、前記ＰＥＧは前記リポソームの表面のリン脂質に結合されており、前記リポソームはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩である抗がん剤を含むことを特徴とする、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜６＞
前記ＰＥＧは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００であり、より好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であり、最も好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜７＞
前記ＰＥＧはＰＥＧ  ２０００である、＜６＞に記載の血中滞留型リポソーム。
＜８＞
（１）過剰なリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とを反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで前記反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、リン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１との混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）又はベンゾトリアゾリル（−ＢＴＣ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートし、その後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を溶出及び回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してドキソルビシン塩酸塩充填ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、好ましくはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩である、
ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームの調製方法。
＜９＞
前記ＰＥＧは、分子量が２００〜５００００、好ましくは１０００〜５０００であり、より好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１１００、ＰＥＧ１２００、ＰＥＧ１３００、ＰＥＧ１４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１６００、ＰＥＧ１７００、ＰＥＧ１８００、ＰＥＧ１９００、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ２１００、ＰＥＧ２２００、ＰＥＧ２３００、ＰＥＧ２４００、ＰＥＧ２５００、ＰＥＧ２６００、ＰＥＧ２７００、ＰＥＧ２８００、ＰＥＧ２９００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ３２５０、ＰＥＧ３３５０、ＰＥＧ３５００、ＰＥＧ３７５０、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４２５０、ＰＥＧ４５００、ＰＥＧ４７５０又はＰＥＧ５０００であり、最も好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、＜８＞に記載の方法。
＜１０＞
工程（２）で添加した前記リン脂質は、大豆レシチン、水素添加大豆レシチン、ジラウロイルレシチン、ジミリストイルレシチン、ジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレシチン、１−ミリストイル−２−パルミトイルレシチン、１−パルミトイル−２−ミリストイルレシチン、１−パルミトイル−２−ステアロイルレシチン、１−ステアロイル−２−パルミトイルレシチン、卵黄レシチン、ジオレオイルレシチン、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルジセリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、脳ホスファチジルセリン、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルスフィンゴミエリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、及びそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、＜８＞又は＜９＞に記載の方法。
＜１１＞
工程（１）において、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）及びリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、１：１．２、１：１．５、又は１：２、好ましくは１：１．２のモル比で添加される、＜８＞〜＜１０＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１２＞
前記リン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１は、リン脂質−ＰＥＧ−ＮＨＳである、＜８＞〜＜１１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１３＞
前記リン脂質−ＰＥＧはジステアロイルホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）、ホスファチジルコリン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＰＣ）からなる群より選択され、より好ましくはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）である、＜８＞〜＜１２＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１４＞
工程（２）において、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％〜１２％、最も好ましくは８％である、＜８＞〜＜１３＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１５＞
（１）ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧ−Ｒ１とを１：１．２のモル比で反応させ、ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）が枯渇した後、グリシンで反応を停止し、反応生成物を透析し、その後前記反応生成物を凍結乾燥して、１：０．２のモル比のリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）とリン脂質−ＰＥＧとの混合物である凍結乾燥物を得る工程、ここでＲ１はスクシンイミジルエステル（−ＮＨＳ）である、
（２）リン脂質、コレステロール、リン脂質−ＰＥＧ、及び工程（１）で得られた前記凍結乾燥物からブランク血中滞留型リポソームを作製する工程、ここで添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の４％〜１６％、好ましくは８％〜１２％、最も好ましくは８％である、及び
（３）工程（２）で得られた前記ブランク血中滞留型リポソームを、抗がん剤溶液と共にインキュベートした後、反応生成物をデキストランゲルカラムに通し、赤色リポソーム部分を回収し、０．２２μｍフィルターメンブレンを通して繰り返し押し出してｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）修飾血中滞留型リポソームを生成する工程を含み、
前記抗がん剤は、好ましくはドキソルビシン又はドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩であり、且つ
前記リン脂質−ＰＥＧはＤＳＰＥ−ＰＥＧであり、
好ましくは前記ＰＥＧはＰＥＧ２０００である、＜８＞に記載の方法。
＜１６＞
工程（３）において、前記デキストランゲルカラムはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０カラムであり、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で溶出される、＜８＞〜＜１５＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１７＞
工程（３）における前記フィルターメンブレンは、ポリカーボネートフィルターメンブレンである、＜８＞〜＜１６＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１８＞
工程（２）において、添加したリン脂質、コレステロール、及びリン脂質−ＰＥＧの重量比は３：１：１であり、添加したリン脂質−ＰＥＧ−ｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）のモル数は、添加したリン脂質−ＰＥＧのモル数の８％である、＜８＞〜＜１７＞のいずれか一項に記載の方法。
＜１９＞
工程（１）における前記透析を、１０００ダルトンの分子量カットオフを有する透析バッグを用いて実施する、＜８＞〜＜１８＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２０＞
＜８＞〜＜１８＞のいずれか一項に記載の方法によって得られる血中滞留型リポソーム。
＜２１＞
抗がん医薬の製造における＜１＞〜＜７＞及び＜２０＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソームの使用。
＜２２＞
前記医薬は、例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液である、＜２１＞に記載の使用。
＜２３＞
前記医薬は、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などのがんを治療するために使用される、＜２１＞又は＜２２＞に記載の使用。
＜２４＞
医薬としての使用のための、＜１＞〜＜７＞及び＜２０＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜２５＞
例えば、注射水溶液などの注射剤、凍結乾燥粉末、又は輸液形態の、＜１＞〜＜７＞及び＜２０＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜２６＞
例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などのがんの治療における使用のための、＜１＞〜＜７＞及び＜２０＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソーム。
＜２７＞
＜１＞〜＜７＞及び＜２０＞のいずれか一項に記載の血中滞留型リポソームを治療有効量投与することを含む、がんを治療するための方法であって、前記がんは、例えば、リンパ球性白血病若しくは顆粒球性白血病などの急性白血病、悪性リンパ腫、乳がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、気管支原性がんなどの肺がん、卵巣がん、軟部肉腫、骨芽肉腫、横紋筋肉腫、ユーイング肉腫、腎芽腫、神経芽細胞腫、膀胱がん、甲状腺がん、前立腺がん、頭頸部扁平上皮がん、精巣がん、胃がん、肝がん、又は黒色腫などである、がんを治療するための方法。
＜２８＞
リポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用、又は抗がん剤、特にドキソルビシン若しくはドキソルビシン塩酸塩などの医薬的に許容されるドキソルビシン塩を含むリポソームの調製のためのｃ（ＲＧＤ−ＡＣＰ−Ｋ）の使用。

【国際調査報告】
2020521004.tif 000019
2020521004.tif 000020
2020521004.tif 000021
2020521004.tif 000022
2020521004.tif 000023
2020521004.tif 000024