(57)【要約】  標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善するための方法および組成物が、本明細書に記載される。本明細書で、本発明者らは、ｎＣａｓ９  Ｒループ形成とは無関係にオフターゲットｓｓＤＮＡ標的部位において脱アミノ化しないようにデアミナーゼドメインの能力を制限するために、一方はＺＦに融合され一方は１つまたは複数のＵＧＩを含むｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質に融合された、極近傍に持ち寄られた場合に機能的であるスプリットデアミナーゼ（ｓＤＡ）を使用するダイマー性塩基編集（ＢＥ）テクノロジーを記載する。従って、（ｉ）プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに融合されたスプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（「ｓＤＡＩ」）；または（ｉｉ）ｎＣａｓ９タンパク質に融合されたスプリットデアミナーゼの第２の部分（「ｓＤＡ２」）を含む融合タンパク質が、本明細書で提供される。本発明は、ベクター、およびベクターを含む細胞、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および核酸を含むキットもまた含む。
2020521451.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ジンクフィンガー（ＺＦ）、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ならびに触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）ニック導入性Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）からなる群から選択されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに融合され、任意選択で１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）配列に融合されたスプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（ｓＤＡ１）であって、前記ｓＤＡ１が、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、およびそれらのバリアントからなる群から選択される親デアミナーゼの、Ｎ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、スプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（ｓＤＡ１）；あるいは
（ｉｉ）ｎＣａｓ９、および１つもしくは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）タンパク質、またはその相補的なｓＤＡ１部分に使用されるものと直交性の任意のＤＮＡ標的化ドメインに融合されたスプリットデアミナーゼの第２の部分（ｓＤＡ２）であって、前記ｓＤＡ２が、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１*、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、およびそれらのバリアントの、Ｃ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、スプリットデアミナーゼの第２の部分（ｓＤＡ２）
を含む融合タンパク質であって、
真核生物細胞における（ｉ）の融合タンパク質と（ｉｉ）の融合タンパク質との共発現、および隣接ゲノム標的部位におけるそれらの引き続く共局在化が、触媒的に活性な塩基エディターを提供する、
融合タンパク質。
【請求項２】
（ｉ）１つまたは複数のＺＦに融合され、任意選択で１つまたは複数のＵＧＩ配列に融合されたスプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（ｓＤＡ１）を含む第１の融合タンパク質であって、前記ｓＤＡ１が、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、および変更された基質特異性または活性を有するそれらのバリアントからなる群から選択される親デアミナーゼの、Ｎ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、第１の融合タンパク質；ならびに
（ｉｉ）ｎＣａｓ９タンパク質および１つまたは複数のＵＧＩタンパク質に融合されたスプリットデアミナーゼの第２の部分（ｓＤＡ２）を含む第２の融合タンパク質であって、前記ｓＤＡ２が、ＳＤＡ１と同じ親デアミナーゼの、Ｃ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、第２の融合タンパク質
を含み、
真核生物細胞における（ｉ）の融合タンパク質と（ｉｉ）の融合タンパク質との共発現、および隣接ゲノム標的部位におけるそれらの引き続く共局在化が、触媒的に活性な塩基エディターを提供する、
請求項１に記載の融合タンパク質の対。
【請求項３】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項４】
１つまたは複数の核酸を含む組成物であって、前記核酸が、請求項２に記載の融合タンパク質の対をコードする、組成物。
【請求項５】
核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項２に記載の融合タンパク質の対、および前記融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡと接触させるステップを含み、好ましくは、前記融合タンパク質の一方が、ｎＣａｓ９を含み、他方の融合タンパク質が、ＺＦまたはＴＡＬＥを含み、前記ＺＦまたはＴＡＬＥが、前記ｎＣａｓ９に対する前記ｇＲＮＡの標的部位に隣接する９〜２４ｂｐの配列に対して標的化され、前記ｇＲＮＡが、前記選択されたシトシンを含む前記核酸に結合する、方法。
【請求項６】
前記核酸が細胞中にあり、前記方法が、前記細胞を前記融合タンパク質と接触させるステップまたは前記細胞において前記融合タンパク質を発現させるステップを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が真核生物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
細胞中の標的化された脱アミノ化の特異性を改善する方法であって、前記細胞において請求項２に記載の融合タンパク質の対、および前記融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つもしくは複数のｇＲＮＡを発現させるステップ、または前記細胞を、請求項２に記載の融合タンパク質の対、および前記融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つもしくは複数のｇＲＮＡと接触させるステップを含み、好ましくは、前記融合タンパク質の一方が、ｎＣａｓ９を含み、他方の融合タンパク質が、ＺＦまたはＴＡＬＥを含み、前記ＺＦまたはＴＡＬＥが、前記ｎＣａｓ９に対する前記ｇＲＮＡの標的部位に隣接する９〜２４ｂｐの配列に対して標的化され、前記ｇＲＮＡが、選択されたシトシンを含む核酸に結合する、方法。
【請求項９】
前記融合タンパク質が、前記融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つもしくは複数のｇＲＮＡを有するリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体、ｍＲＮＡ、またはプラスミドとして送達される、請求項５から８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンを脱アミノ化する方法であって、前記核酸を、請求項２に記載の融合タンパク質の対と接触させるステップを含む、方法。
【請求項１１】
請求項１に記載の精製された融合タンパク質または請求項２に記載の融合タンパク質の対を含む組成物。
【請求項１２】
１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項１５】
幹細胞である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記幹細胞が造血幹細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年５月２５日出願の米国仮特許出願第６２／５１１，２９６号；２０１７年８月４日出願の米国仮特許出願第６２／５４１，５４４号；および２０１８年１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／６２２，６７６号の利益を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＧＭ１１８１５８の下で政府の支援で行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善するための方法および組成物が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
塩基編集（ＢＥ）テクノロジーは、シトシンデアミナーゼドメインを特異的ゲノム位置に動員して、部位特異的シトシン→チミン遷移（transition）置換をもたらすために、操作されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＲＮＡガイドされる触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９すなわちｄＣａｓ９）、ニッカーゼ（nickase）バージョンのＣａｓ９（ｎＣａｓ９）またはジンクフィンガー（ＺＦ）アレイ）を使用する1、2。ＢＥは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって正確な変異をなすことが治療的に有益ではあるが伝統的なヌクレアーゼベースのゲノム編集テクノロジーでは創出が困難である、細胞の状況で顕在化する遺伝性疾患を処置するための特に魅力的なツールである。例えば、緩徐に分裂しているまたは有糸分裂後の細胞集団から主に構成される組織においてＨＤＲの結果を達成することは困難であるまたは不可能であるが、それは、ＨＤＲ経路が、細胞周期のＧ２期およびＳ期に限定されるからである3。さらに、ヌクレアーゼ誘導性切断の非相同末端結合媒介性修復によって引き起こされる可変長さのインデル変異の競合的でより効率的な誘導によって、ＨＤＲの効率は実質的に制限され得る。対照的に、ＢＥテクノロジーは、細胞型によって可変性のＤＮＡ修復機構を必要とすることなしに、実施者が高度に制御可能で高度に正確な変異をなすことができる可能性を有する。
【発明の概要】
【０００５】
塩基エディタープラットフォーム（ＢＥ）は、ドナーＤＮＡ分子を必要とせずに、正確なユーザー定義されたゲノム編集事象を生じる独自の能力を有する。シトシンデアミナーゼドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）ドメインに融合された一本鎖ニック導入性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）タンパク質を含む塩基エディター（ＢＥ）（例えば、ＢＥ３）は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）スペーサー配列によって決定される部位特異的様式で、シトシンからチミンへの（ＣからＴへの）塩基遷移を効率的に誘導する1。全てのゲノム編集試薬を用いる場合と同様、遺伝的にコードされた有害で不可逆的な副作用を生じる可能性を制限するために、治療薬として使用する前に、ＢＥがオフターゲット変異を生じる能力をまず決定し、次いで軽減することが重要である。本明細書で、本発明者らは、ｎＣａｓ９  Ｒループ形成とは無関係にオフターゲットｓｓＤＮＡ標的部位において脱アミノ化しないようにデアミナーゼドメインの能力を制限するために、一方はＺＦに融合され一方は１つまたは複数のＵＧＩを含むｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質に融合された、極近傍に持ち寄られた場合に機能的であるスプリットデアミナーゼ（ｓＤＡ）を使用するダイマー性ＢＥを記載する。
【０００６】
従って、（ｉ）例えば、ＺＦ、ＴＡＬＥ、Ｃａｓ９、触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄＣａｓ９）またはＣａｓ９オルソログ（即ち、別の種由来の相同なタンパク質、例えば、ｄＣｐｆ１）、ニック導入性Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）またはニック導入性Ｃａｓ９オルソログからなる群から好ましくは選択されるプログラム可能なＤＮＡ結合ドメインに融合された、スプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（「ｓＤＡ１」）であって、ｓＤＡ１が、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、およびそれらのバリアント、例えば、変更された基質特異性または活性を有するバリアント、例えばｅＡ３Ａからなる群から選択される親デアミナーゼの、Ｎ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、スプリットデアミナーゼ酵素の第１の部分（「ｓＤＡ１」）；あるいは（ｉｉ）例えば、以前に記載された塩基エディター構造と類似の様式でｎＣａｓ９タンパク質、好ましくはｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質、またはその相補的なｓＤＡ１部分に使用されるものと直交性の任意のＤＮＡ標的化ドメイン（例えば、ｄＣｐｆ１、ＴＡＬＥ、ＺＦ）に融合された、スプリットデアミナーゼの第２の部分（「ｓＤＡ２」）であって、ｓＤＡ２が、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１*、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、および／または例えば変更された基質特異性もしくは活性を有するそれらのバリアント、例えばｅＡ３Ａからなる群から選択される親デアミナーゼの、Ｃ末端トランケートされた、触媒的に不活性なまたは欠損性の誘導体である、スプリットデアミナーゼの第２の部分（「ｓＤＡ２」）を含む融合タンパク質が、本明細書で提供される。本発明の方法では、スプリットデアミナーゼは、全長タンパク質ではないが、その断片であり、真核生物細胞における、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ１部分を含む（ｉ）の融合タンパク質と、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ２部分を含む（ｉｉ）の融合タンパク質との共発現、および隣接ゲノム標的部位におけるそれらの引き続く共局在化が、触媒的に活性な塩基エディターを提供する。用語「ｓＤＡ１」および「ｓＤＡ２」は、第１および第２のスプリットデアミナーゼを一般に指すために本明細書で使用されるのであって、本明細書に記載される例示的なスプリットデアミナーゼを具体的に指すわけではない。
【０００７】
本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸、およびこれらの核酸のうち１つまたは複数を含む組成物もまた、本明細書で提供され、例えば、この核酸は、例えば、同じ親デアミナーゼ由来のＳＤＡ１およびＳＤＡ２部分を含む融合タンパク質の対をコードする。さらに、この核酸を含むベクター、およびこの核酸を含み任意選択でその核酸を発現する単離された宿主細胞が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞である。
【０００８】
さらに、核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化のための方法が、本明細書で提供される。本方法は、核酸を、同じ親デアミナーゼ由来のＳＤＡ１およびＳＤＡ２部分を含む本明細書に記載される融合タンパク質の対、ならびに融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質の一方は、ｎＣａｓ９を含み、他方の融合タンパク質は、ＺＦまたはＴＡＬＥを含み、ＺＦまたはＴＡＬＥは、ｎＣａｓ９に対するｇＲＮＡの標的部位に隣接する９〜２４ｂｐの配列に対して標的化され、ｇＲＮＡは、選択されたシトシンを含む核酸に結合する。
【０００９】
一部の実施形態では、核酸は、細胞、例えば、真核生物細胞中にあり、本方法は、細胞を融合タンパク質と接触させるステップまたは細胞において融合タンパク質を発現させるステップを含む。
【００１０】
細胞において、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ１およびｓＤＡ２部分を含む本明細書に記載される融合タンパク質の対、ならびに融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡを発現させるステップ、または細胞を、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ１およびｓＤＡ２部分を含む本明細書に記載される融合タンパク質の対、ならびに融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡと接触させるステップによる、細胞、例えば、真核生物細胞中の標的化された脱アミノ化の特異性を改善するための方法もまた、提供される。一部の実施形態では、融合タンパク質の一方は、ｎＣａｓ９を含み、他方の融合タンパク質は、ＺＦまたはＴＡＬＥを含み、ＺＦまたはＴＡＬＥは、ｎＣａｓ９に対するｇＲＮＡの標的部位に隣接する９〜２４ｂｐの配列に対して標的化され、ｇＲＮＡは、選択されたシトシンを含む核酸に結合する。
【００１１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される。
【００１２】
核酸を、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ１およびｓＤＡ２部分を含む本明細書に記載される融合タンパク質の対、ならびに融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡと接触させるステップによる、核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンを脱アミノ化するための方法もまた、本明細書で提供される。
【００１３】
さらに、本明細書に記載される精製された融合タンパク質または融合タンパク質の対、好ましくは、同じ親デアミナーゼ由来のｓＤＡ１およびｓＤＡ２部分を含む本明細書に記載される融合タンパク質の対を含み、任意選択で融合タンパク質中のＣａｓ９ドメインと相互作用する１つまたは複数のｇＲＮＡを含む組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。
【００１４】
本明細書に記載されるバリアントｓｐＣａｓ９タンパク質と、Ｃａｓ９またはＣａｓ９誘導体を含むスプリットデアミナーゼ融合タンパク質によって標的化されるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体もまた、本明細書で提供される。
【００１５】
核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化のための方法、または核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の特異性を改善するための方法であって、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムのうち１つまたは複数と接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提供される。
【００１６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡとして送達される。
【００１７】
核酸中の選択されたシトシンを脱アミノ化するための方法であって、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提供される。
【００１８】
さらに、本明細書に記載される精製された融合タンパク質または塩基編集システムを含む組成物が、本明細書で提供される。
【００１９】
さらに、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムをコードする核酸、ならびにこの核酸を含むベクター、およびこの核酸を含む宿主細胞、例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞が、本明細書で提供される。
【００２０】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当該分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００２１】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】例示的な典型的な高効率塩基編集設定の図。その２つのヌクレアーゼドメインのうち１つにおいて触媒的に不活性化性の変異を有するニック導入性Ｃａｓ９は、ｇＲＮＡの可変性のスペーサー配列によって指示される標的部位に結合する。安定なＲループの形成は、脱アミノ化されていない鎖上にｓｓＤＮＡ編集ウインドウを創出する。Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ中に一本鎖切断を創出し、宿主細胞が、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用して損傷を修復するのを促進し、そうして、シトシン→チミン遷移置換に向けて修復を偏らせる。Komor et al., 2016を参照のこと。
【図２】図２Ａ〜２Ｇ  以下の模式図：２Ａ．）オンターゲット部位を標的化し、オンターゲット部位において脱アミノ化する第１世代塩基エディターであって、デアミナーゼは、オンターゲットｎＣａｓ９によって生成されるＲループを標的化する。２Ｂ．）そのｎＣａｓ９標的化能とは無関係にオフターゲットゲノムＲループに結合しそれを脱アミノ化する第１世代塩基エディター。２Ｃ．）そのｎＣａｓ９標的化能とは無関係にオフターゲットゲノム転写バブルに結合しそれを脱アミノ化する第１世代塩基エディター（注意：２Ｂおよび２Ｃは、ＢＥ脱アミノ化に潜在的に利用可能なゲノムｓｓＤＮＡ標的の例示的な場合であり、徹底的なリストを構成するわけではない）。２Ｄ．）ｎＣａｓ９媒介性Ｒループおよび隣接ＴＡＬＥまたはＺＦ結合を用いてゲノム部位を標的化するスプリットデアミナーゼ（ｓＤＡ）ＢＥ。２つのスプリットデアミナーゼ部分（ｓＤＡ１およびｓＤＡ２）は、隣接結合によって極近傍に持ち寄られ、それらの触媒活性を再構成し、オンターゲット脱アミノ化を可能にすることに留意されたい。２Ｅおよび２Ｆ．）スプリットＢＥの一方の半分は、そのｓＤＡドメインを介してｓｓＤＮＡの非標的小片、例えば、ゲノムＲループまたは転写バブルに結合できる場合であっても、デアミナーゼ酵素活性を再構成するのに十分な機構を有さない（ｓＤＡ２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ半分が示される）。２Ｇ．ｓＤＡシステムのＺＦまたはｎＣａｓ９構成成分（ＺＦ−ｓＤＡ１が示される）のオフターゲット結合は、デアミナーゼ酵素活性を再構成するのに十分な機構の共局在化を生じない。
【図３】図３Ａ〜３Ｂ  代表的な候補スプリット部位を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ。ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ構造の多重回転図が示される。マゼンタ色のループ領域は、二次構造の欠如および触媒中心からの距離に基づいて選択された候補スプリット部位である。ＰＤＢ：３Ｅ１Ｕ。
【図４】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．１−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。ＺＦ結合部位が、中間にある３１ｂｐを伴う直列配向で、ｇＲＮＡ結合部位の上流にある場合、ｓＤＡ１．１およびｓＤＡ２．１対は、顕著なＣからＴへの変換を生じた。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図５】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．１−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。ｓＤＡ１．１およびｓＤＡ２．２対は、試みたいずれの配向でも、識別可能なＣからＴへの変換を刺激しなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図６】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．２−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。低レベルのＣからＴへの変異が、いずれかのＺＦと共にｇＲＮＡ２を使用した場合に主に観察され、ｇＲＮＡ１実験は、検出可能ではあるが減少したレベルの活性を生じた。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図７】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．２−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。低レベルのＣからＴへの変異は、いずれかのＺＦと共にｇＲＮＡ２を使用した場合に主に観察され、ｇＲＮＡ１実験は、検出可能ではあるが減少したレベルの活性を生じた。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図８】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．２−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．３−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図９】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．３−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１０】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．２−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．３−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１１】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．３−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．４−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１２】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．４−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．３−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１３】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．４−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．４−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１４】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．５−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．４−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１５】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．５−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．６−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１６】いくつかの示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．６−３ＡＣ３Ｌ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．６−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質からなるスプリットｒＡＰＯ１塩基エディターアーキテクチャによる、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子中のＣからＴへの遷移変異。各位置における変換率は、顕著な変異が観察された残基についての重ね合わせた百分率数と共に、影付きボックスによって示される。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）およびＺＦ結合部位（Ｎ→Ｃ配向に準拠したＺＦ結合の方向を示す矢印を用いて）を示す。およその編集ウインドウ（ｇＲＮＡ標的部位中の残基４〜８）が示される。実験を二連で実施した。各サンプルからの配列決定が独立して示される。顕著な変異は検出されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１７】本研究において使用した両方のｇＲＮＡを用いた第１世代ＢＥ３（参考文献１に記載される）による、ＣからＴへの変換データ（これらのサンプルの呈色勾配は、上のグラフよりも明るい影がつけられており、直接的な比較は、相対的な数的比率の評価を必要とすることに留意されたい）。配向情報が示され、矢印は、ｇＲＮＡ結合部位を示す（ＰＡＭの方向を示す矢印を用いて）。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１８−１】図１８  隣接ｓＤＡ２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩなしの個々のＮ−ｓＤＡ１−ＺＦ−Ｃタンパク質の、ＣからＴへの変換率。識別可能な編集は観察されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１８−２】図１８−１と同じである。
【図１８−３】図１８−１と同じである。
【図１９−１】図１９  隣接Ｎ−ｓＤＡ１−ＺＦ−Ｃなしの個々のＮ−ｓＤＡ２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃタンパク質の、ＣからＴへの変換率。識別可能な編集は観察されなかった。ＥＧＦＰ標的配列、ＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴ（配列番号１）。
【図１９−２】図１９−１と同じである。
【図１９−３】図１９−１と同じである。
【図２０】示された配向の、隣接して標的化するＮ−ｓＤＡ１．Ｘ−ＮＬＳ−ＺＦ−ＣおよびＮ−ｓＤＡ２．Ｘ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＣヒトＡＰＯＢＥＣ３ａ（ｈＡ３Ａ）スプリット塩基エディターを使用した場合の、ＣからＴへの変換の証拠。ｎＣａｓ９  ｇＲＮＡ結合部位（ｇＲＮＡ２）およびＺＦ結合部位（ＺＦ１）を示す先のとがったボックスが示され、先のとがった末端は、それぞれ、ｇＲＮＡのＰＡＭ近位末端を示し、ＺＦのＮ→Ｃ配向を示す。各位置における変換率は、影付きボックスによって示される。スプリットＢＥ対による脱アミノ化の比率は、ｓＤＡ１．６＋ｓＤＡ２．６構成を使用するとシトシン１つ当たりおよそ２．５％であり、ｓＤＡ１．１＋ｓＤＡ２．１構成についてはシトシン１つ当たりおよそ１．７％であるが、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ陽性対照は、活性なｈＡ３Ａ半酵素（halfase）対のオンターゲット活性の３〜４×の量を有した。ｇＲＮＡ標的領域：ＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧ（配列番号２）。
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｄ  組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子座における、ベンチマークＢＥ３塩基エディターと比較した、全てのｒＡＰＯ１半酵素組合せ塩基エディターの、ＣからＴへの変換率のまとめ。標的ｇＲＮＡのおよその編集ウインドウの内部またはその近傍の３つのシトシンの周囲のＣからＴへの総編集百分率の合計が、２つの反復試料間の平均として示される。２１Ａは、ＺＦ１＋ｇＲＮＡ１のデータを示し、２１Ｂは、ＺＦ１＋ｇＲＮＡ２のデータを示し、２１Ｃは、ＺＦ２＋ｇＲＮＡ１のデータを示し、２１Ｄは、ＺＦ２＋ｇＲＮＡ２のデータを示す。
【図２１−２】図２１−１と同じである。
【図２２】ｒＡＰＯ１半酵素組合せ実験に使用したＥＧＦＰレポーター遺伝子の一部分および標的部位の提示。ＥＧＦＰ標的領域：ＧＣＴＴＣＡＧＣＣＧＣＴＡＣＣＣＣＧＡＣＣＡＣＡＴＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧ（配列番号３）。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
今日までに記載された最も効率的なＢＥ構成では、シトシンデアミナーゼ（ＤＡ）ドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ；ゲノムからのウラシルの切り出しを担う酵素である宿主細胞のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を阻害する小さなバクテリオファージタンパク質1、4）は共に、ｎＣａｓ９（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のいずれかに由来する）に融合される。ｎＣａｓ９は、そのシングルガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と隣接プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識とによって特定される標的部位においてＲループを形成し、ＲループのＰＡＭ遠位末端近傍で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として露出された、およそ４〜８ヌクレオチドの非標的鎖を残す（図１）。ｓｓＤＮＡのこの領域は、ｓｓＤＮＡ特異的ＤＡドメインによって脱アミノ化されて、グアノシン：ウラシル（Ｇ：Ｕ）ミスマッチを生じることができる鋳型であり、編集ウインドウを規定する。ｎＣａｓ９は、ＤＮＡの脱アミノ化されていない鎖にニック導入し、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用してニック損傷を修復するように細胞に指示することによって、Ｇ：Ｕミスマッチの変換を、アデニン：チミン（Ａ：Ｔ）塩基対へと偏らせる。今日まで、これらの融合タンパク質中の記載されたデアミナーゼドメインは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）、ヤツメウナギに由来するＣＤＡ（ＰｍＣＤＡ）と称される活性化誘導性シトシンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）、または核外輸送シグナルを欠くｈＡＩＤの高活性形態、またはｅＡ３Ａと称される、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ｈＡ３Ａ）の操作されたバリアントであった1〜2、5〜7、16。これらのＢＥ由来のこれらのデアミナーゼドメインのいずれかが、本発明の融合タンパク質において親デアミナーゼとして使用され得る。ＢＥテクノロジーは、そのｎＣａｓ９ドメインとしてＳｐＣａｓ９タンパク質（ｎＳｐＣａｓ９）を使用して当初確立された。本明細書では、本発明者らはｎＣａｓ９に言及しているが、一般に、任意のＣａｓ９様ニッカーゼが、特記しない限り、Ｃｐｆ１タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログに基づいて使用してこの機能を実施し得る。さらに、完全に酵素的に死んだｄＣａｓ９（またはＣａｓ９様酵素）もまた、機能的ＢＥ酵素の標的化機構として使用され得る。
【００２４】
治療設定におけるＢＥの使用に関する重要な考慮事項は、オフターゲット変異誘発についてそのゲノムワイドの能力をアセスメントすること、および有害なオフターゲット変異を刺激するリスクを最小化する、または理想的には排除するようにテクノロジーを改変することである。本明細書では、本発明者らは、潜在的な望ましくないＢＥ変異誘発を低減させるまたは排除するために使用され得るＢＥに対する科学技術的改善を記載した。
【００２５】
望ましくないオフターゲット塩基エディター脱アミノ化を制限するために、スプリットデアミナーゼを使用する
ゲノムＤＮＡ中のシトシンおよびＲＮＡ中のシトシンに結合しそれを脱アミノ化するＡＩＤ／ＡＰＯＢＥＣ酵素の天然の能力に起因して、非特異的な誤った脱アミノ化事象は、ＣＲＩＳＰＲ塩基エディターテクノロジーからのゲノムおよびトランスクリプトーム中のオフターゲット変異誘発の、おそらくは重要な供給源である。理論上、ＢＥのｎＣａｓ９ドメイン（ならびに任意の潜在的なｄＣａｓ９、ＴＡＬＥおよび／またはＺＦドメイン）が極めて特異的であっても、これは、ＡＰＯＢＥＣ酵素の、ＲＮＡを標的化する天然の能力およびｓｓＤＮＡを標的化する天然の能力が、トランスクリプトーム、または活発に転写される領域もしくは複製を受けているＤＮＡなど、ｓｓＤＮＡとして露出されているゲノムの任意の領域にわたって全体的に非特異的に脱アミノ化してしまうのを防止する役には立たない可能性がある。実際、デアミナーゼを試験する大腸菌（E. coli）ベースのアッセイは、活発に転写される領域が、種々の過剰発現された哺乳動物デアミナーゼに曝露された場合に、Ｃ→Ｔ遷移変異について高度に富化され得る（約７〜５３０倍）ことを示した4。さらに、１つのグループは、酵母細胞における２つの別々のつながっていないタンパク質としてのＰｍＣｄａ１およびｎＣａｓ９の共発現が、これら２つの構成成分が直接的融合パートナーとして発現された場合と同様、ｇＲＮＡにより特定される標的部位において類似のレベルの脱アミノ化を生じることを見出しており、このことは、これらのタンパク質が、ゲノム位置に親和性が拘束されることなく、溶液からのｓｓＤＮＡを脱アミノ化することが可能であることを実証している5。この懸念は今や、Ｒループが、以前に考えられていたよりも、真核生物細胞のゲノム中により一般的に存在し、従って、ＡＰＯＢＥＣが結合して脱アミノ化できる多くの潜在的な定常状態オフターゲットｓｓＤＮＡ基質を生じることに、科学者がますます気づいてきているので、特に重大である6。ＢＥの過剰発現自体が、全体的なゲノム規模で誤った脱アミノ化および変異誘発を十分に刺激できるかどうかは、いまだ証明されていないが、異常で過度に活発なＡＰＯＢＥＣデアミナーゼ活性は、腫瘍化変異誘発の公知の駆動因子であり7、少なくともｈＡＰＯ３の過剰発現8〜11は、ゲノムシトシン超変異を刺激することが示されている。従って、ＢＥなどの過剰発現されたデアミナーゼの天然に全体的な脱アミノ化活性を制限することがＢＥテクノロジーを治療適用に転換するために重要であるというのは、理にかなったことである。注目すべきことに、ほとんどのＢＥは、脱アミノ化事象を有効なＣ→Ｔ変異に向けて偏らせるために少なくとも１つのＵＧＩインヒビターを含むので、全体的オフターゲットＢＥ活性は、腫瘍発生の間の異常なデアミナーゼ活性単独の影響よりも、なおさらに変異原性である可能性がある。
【００２６】
全体的にではなく、その意図した標的配列に対して作用するように、より厳密な要件をＢＥに課すために、本発明者らは、隣接して標的化されたＤＮＡ結合ドメインに融合された相互補完的なデアミナーゼトランケーションバリアントからなる２つの別々のタンパク質から構成されるスプリットＢＥアーキテクチャを創出した。これらのダイマー性ＢＥテクノロジーは、適切に機能するために、隣接ＤＮＡ部位における両方のｓＤＡドメインの共局在化（「ＡＮＤゲート」）を必要とする「スプリットデアミナーゼ」（ｓＤＡ）を使用する。このシナリオでは、ダイマー性塩基エディターのいずれかの「半酵素」の誤った結合事象は、有効な脱アミノ化事象を生じる可能性が低いが、それは、各構成成分それ自体では、シトシン脱アミノ化を触媒するために必要な酵素機構の一式全体を含まないからである（図２Ａ〜２Ｇ）。
【００２７】
ダイマー性ＢＥを創出するために、Ｎ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーションが一緒になって機能的酵素を形成するように、本発明者らは、スプリットデアミナーゼ酵素のＮ末端トランケーション（ｓＤＡ１）を、約９〜２４ｂｐの配列に対して標的化されたＺＦ（Ｃａｓ９に対して直交性の任意のＤＮＡ標的化ドメイン、例えば、Ｃｐｆ１、ＴＡＬＥ、ＺＦ、またはｓＤＡ２を標的化するために使用されるｎＣａｓ９に対して直交性のｄＣａｓ９が、適切であり得るが）に融合させ、デアミナーゼの相互補完的なまたはいくらか重複するＣ末端トランケーションを、ｎＣａｓ９−ＵＧＩ融合タンパク質に融合させた。例示的なＢＥを、約１７〜２４ｂｐの標的部位を伴う隣接配列を標的化する第１世代ＢＥ３酵素（ｓＤＡ２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）と類似の配向で作製した1。本発明者らが知る限り、機能的スプリットＡＰＯＢＥＣ酵素（または他の哺乳動物デアミナーゼ）の記録は存在しないが、酵母シトシンデアミナーゼ（ｙＣＤ）は、タンパク質ダイマー化によってスプリットおよび再構成した場合12、（ＤＮＡを脱アミノ化することができることは示されていないが、代謝物としてのシトシン、およびプロドラッグ５−フルオロシトシンに対して）少なくとも部分的に機能的な酵素を構成することが示されており、種々のＡＰＯＢＥＣタンパク質がどのように効果的に二分され得るかを知らせるための有用な鋳型として機能する；しかし、ｙＣＤは、哺乳動物デアミナーゼに対する一次配列相同性をほとんど共有せず、またスプリットｙＣＤは、ＤＮＡに対して機能しないことが報告されており、その構成要素小片を一緒にするためにタンパク質足場を使用したので、ｙＣＤスプリットデアミナーゼが、ＢＥのための使用についてこれまでに記載されたものと直接比較できるかは、明らかではない。従って、本発明者らは、構造不定のリンカー領域を、ＡＰＯＢＥＣ酵素をスプリットする潜在的位置として決定するためにＡＰＯＢＥＣ構造情報を使用したが（図３Ａ〜３Ｂ）、それは、これらの部位が、構成要素サブドメインの全体的機能性またはフォールディングに影響する可能性があまり高くないからである。このスプリットデアミナーゼ戦略は、野生型バージョンのデアミナーゼ酵素で使用され得、記載され得る任意の操作されたバリアントもまた、スプリットＢＥが操作されたデアミナーゼの任意の特別な特色を潜在的に保持する形で使用され得る16。
【００２８】
このアーキテクチャは、誤った脱アミノ化の能力を事実上排除するはずであるが、それは、２つの構成要素半酵素のいずれかによる任意の他のＤＮＡ結合事象が、いずれのデアミナーゼ酵素活性も欠如し、従って、ゲノムＤＮＡを乱すことができないからである。さらに、スプリットＢＥは一般に、スプリットＢＥシステムが、より多い数の連続的／隣接ＤＮＡ塩基の結合を必要とし、それによって、いずれかの半酵素それ自体のオフターゲット結合によって付与されるオフターゲット効果を減少させるという事実のおかげで、典型的なＢＥと比較して、編集の特異性を増加させるはずである。ＣＲＩＳＰＲ  ＢＥアーキテクチャは、それらのｇＲＮＡに対して不完全マッチである一部のゲノム部位において、ヒト細胞中でＣからＴへの変異を誘導することが公知である13。また、ＺＦがオフターゲット部位に対していくらかの能力で結合することは公知であるので、ＺＦ−ＢＥアーキテクチャもまたオフターゲット変異誘発をいくらかの能力まで誘導するというのは、理にかなっている14。
【００２９】
標的化機構が、特異的ＤＮＡ結合、および再構成されたスプリットデアミナーゼによる作用にｓｓＤＮＡを曝露させるＲループの創出を生じる限り、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来のＣａｓ９、または種々の生物由来のＣｐｆ１タンパク質を含む、任意のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓベースの標的化システムは、ｓＤＡ２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ融合タンパク質のｎＣａｓ９部分の代わりに使用され得ることが考えられ、またその可能性が高い。表１は、代表的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ標的化システム、およびニッカーゼおよび触媒的に不活性な（死んだ）変異体を創出するために重要であることが公知のその中の残基／変異のリストを含む。Ｃｐｆ１ニッカーゼはいまだ記載されていないが、触媒的にヌルのＣｐｆ１オルソログが機能的ｓＤＡ２半酵素の基礎を形成できるように、ｎＣａｓ９の標的化特徴を再現し得ることに留意されたい。一部の実施形態では、ＺＦドメインは、それらの小さいサイズ、免疫原性の推定される欠如に起因して、ｓＤＡ１のためのＤＮＡ結合ドメインとして選択されるが、それは、ＣＲＩＳＰＲベースの標的化システムとは異なり、それらが、結合の際にＲループを創出せず、さらなる基質ｓｓＤＮＡをデアミナーゼドメインに曝露させないからである。しかし、原則として、任意の操作されたＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＣＲＩＳＰＲベースの標的化複合体またはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの使用は、機能的ｓＤＡ１半酵素をなおも生じることができた。本明細書に示される例では、組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子を標的化するＺＦドメインを、ｓＤＡ１半酵素のために使用した15。
【００３０】
プログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン
本発明の融合タンパク質は、プログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、例えば、操作されたＣ２Ｈ２ジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、ならびにｓｓＤＮＡニッカーゼ（ｎＣａｓ９）またはそれらのアナログならびに触媒的に不活性な死んだＣａｓ９（ｄＣａｓ９）およびそのアナログを含むそれらのバリアント、ならびに任意の操作されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）バリアントを含み得る。プログラム可能なＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的配列に結合するように操作され得るＤＮＡ結合ドメインである。
【００３１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ
本明細書では、本発明者らはｎＣａｓ９に言及しているが、一般に、任意のＣａｓ９様ニッカーゼが、特記しない限り、Ｃｐｆ１タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログに基づいて使用され得る。
【００３２】
【表１】
2020521451.tif 000003
当該分野で公知のこれらのオルソログ、ならびにそれらの変異体およびバリアントは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかにおいて使用され得る。例えば、国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレット（これは、増加した特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）および国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット（これは、変更されたＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）を参照のこと。
【００３３】
化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（以後単にＣａｓ９）は、１７〜２０ヌクレオチドの操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、シングルガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧとマッチするＰＡＭの隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間での単純な塩基対相補性を介して、ガイドされ得る（Shen et al., Cell Res (2013)；Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)；Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)；Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)；Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c)；Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１由来の操作されたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼもまた、例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015)；Schunder et al., Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013)；Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 722-736 (2015)；Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されるように使用され得る。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、単一の４２ｎｔのｃｒＲＮＡのみを必要とし、これは、その３’末端に、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに対して相補的な２３ｎｔを有する（Zetsche et al., 2015）。さらに、ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサーの３’側にあるＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識するが、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’側に見出されるＴＴＴＮ  ＰＡＭを認識する（同上）。
【００３４】
一部の実施形態では、本発明のシステムは、細菌中にコードされた、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、ならびに／またはそのＰＡＭ認識特異性および／もしくはそのゲノムワイドの特異性において改変された、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の野生型もしくはバリアントＣａｓ９タンパク質、またはアシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６もしくはラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６由来の野生型Ｃｐｆ１タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されている；例えば、とりわけ、国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１４７明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8):869-74；Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5；Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97；Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298；Dahlman et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61；Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5；Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-31；Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34；Osborn et al., Hum Gene Ther. 2015 Feb;26(2):114-26；Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8；Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45；およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):569-76を参照のこと。
【００３５】
ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１と一緒に、細胞中で発現されるまたは細胞中に存在する。ガイドＲＮＡもしくはヌクレアーゼのいずれか、または両方は、細胞において一過的にもしくは安定に発現され得、または精製されたタンパク質もしくは核酸として導入され得る。
【００３６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させる、以下の変異のうち１つもまた含む；例えば、ＳｐＣａｓ９については、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａにおける変異（これは一本鎖ニッカーゼを創出する）。
【００３７】
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を破壊する、以下のアミノ酸位置のうち１つにおける変異もまた含む：タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするための、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙ；これらの位置における置換は、アラニン（Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある通り）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳもしくはＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照のこと）。
【００３８】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）タンパク質配列に融合される；例示的なＵＧＩ配列は以下の通りである：
ＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号４；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７３９）。典型的には、ＵＧＩは、ＢＥ融合タンパク質のＣ末端にあるが、おそらくは、Ｎ末端にあり得、またはＤＮＡ結合ドメインとｓＤＡドメインとの間にあり得る。当該分野で公知のリンカーは、ドメインを分離するために使用され得る。
【００３９】
ＴＡＬエフェクターリピートアレイ
キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌の転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、宿主ＤＮＡに結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患において重要な役割を果たす、または防御を誘発する。特異性は、エフェクター毎に異なる数の、不完全な、典型的には約３３〜３５アミノ酸のリピートに依存する。多型は、本明細書でリピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる、リピート位置１２および１３に主に存在する。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、いくらかの縮重度を伴い、明白なコンテクスト依存性なしに、直接的で直線的な様式で、１つのＲＶＤ対１つのヌクレオチドで、それらの標的部位中のヌクレオチドに対応する。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、三残基またはトリプレットとして表され得る。
【００４０】
各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み得、ここで、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担う。一部の実施形態では、ＲＶＤは、以下のうち１つまたは複数を含み得る：Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；Ｔを認識するためのＹＧ；およびＧを認識するためのＮＫ、ならびに以下のうち１つまたは複数：Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ*、ここで、*は、ＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを示す；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ*、ここで、*は、ＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを示す；およびＴを認識するためのＩＧ。
【００４１】
ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム操作における相同組換えを促進できる標的化されたキメラヌクレアーゼとして、研究およびバイオテクノロジーにおいて（例えば、植物において、バイオ燃料または生物再生可能エネルギー（biorenewables）として有用な形質を追加または増強するために）有用であり得る。これらのタンパク質はまた、例えば、転写因子として、および特に、非常に高いレベルの特異性を必要とする治療的適用、例えば、非限定的な例としては病原体（例えば、ウイルス）に対する治療薬のために、有用であり得る。
【００４２】
操作されたＴＡＬＥアレイを生成するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願第６１／６１０，２１２号明細書およびReyon et al., Nature Biotechnology 30,460-465 (2012)に記載される高速ライゲーションベース自動化可能固相ハイスループット（fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput）（ＦＬＡＳＨ）システム；ならびにBogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011)；Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010)；Scholze & Boch, J. Curr Opin Microbiol (2011)；Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009)；Moscou & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009)；Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)；Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21617-21622 (2010)；Morbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011)；Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)；Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011)；Weber et al., PLoS ONE 6, e19722 (2011)；Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011)；Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011)；Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011)；Cermak et al., Nucleic Acids Res 39, e82 (2011)；Wood et al., Science 333, 307 (2011)；Hockemeye et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)；Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011)；Sander et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)；Huang et al., Nat Biotechnol 29, 699-700 (2011)；およびZhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)に記載される方法を参照のこと；これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合物であるＭｅｇａＴＡＬもまた、本発明の方法における使用に適切である；例えば、Boissel et al., Nucl. Acids Res. 42(4):2591-2601 (2014)；Boissel and Scharenberg, Methods Mol Biol. 2015;1239:171-96を参照のこと。
【００４４】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガー（ＺＦ）タンパク質は、独立して折り畳まれた亜鉛含有ミニドメインである１つまたは複数のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は、当該分野で周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609；Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99；Lee et al., 1989, Science. 245:635;およびKlug, 1993, Gene, 135:83で定義されている。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびそのバリアントの結晶構造は、相互作用の半保存されたパターンを示し、ここで、ジンクフィンガーのアルファ−ヘリックス由来の典型的には３つのアミノ酸は、ＤＮＡ中の３つ隣接する塩基対すなわち「下位部位」に接触する（Pavletich et al., 1991, Science, 252:809；Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451）。従って、Ｚｉｆ２６８の結晶構造は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列中の３塩基対「下位部位」との間の一対一相互作用によって、モジュラー様式で機能し得ることを示唆した。天然に存在するジンクフィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、タンデムアレイで典型的には一緒に連結されて、連続ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成する（Klug, 1993, Gene 135:83）。
【００４５】
複数の研究が、ＤＮＡ結合に関与するアルファ−ヘリックス位置のアミノ酸をランダム化すること、およびファージディスプレイなどの選択方法論を使用して、目的のＤＮＡ標的部位に結合することが可能な所望のバリアントを同定することによって、個々のジンクフィンガーのＤＮＡ結合特徴を人工的に操作することが可能であることを示している（Rebar et al., 1994, Science, 263:671；Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163；Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689；Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 344）。かかる組換えジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を変更し、モデル生物、植物およびヒト細胞のゲノム中に、標的化された変更を導入するために、機能的ドメイン、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、メチル化ドメインおよびヌクレアーゼに融合され得る（Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463-68；Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07；Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci., 64:2933-44）。
【００４６】
「モジュラーアセンブリ（modular assembly）」として公知の、ジンクフィンガーアレイを操作するための１つの既存の方法は、予め選択されたジンクフィンガーモジュールを一緒に、アレイへと単純に連結することを提唱する（Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48；Beerli et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141；Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34:W516-523；Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41；Liu et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:3850-56；Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280；Wright et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52）。任意の研究者によって実施されるのに十分に明快ではあるが、最近の報告は、特に、ジンクフィンガーヌクレアーゼの状況で、この方法について高い失敗率を実証しており（Ramirez et al., 2008, Nat. Methods, 5:374-375；Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）、任意の所与の標的遺伝子について、非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベースの試験を典型的には必要とするという限界を実証している（Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）。
【００４７】
ランダム化されたライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリアル選択ベースの方法は、モジュラーアセンブリよりも高い成功率を有することが示されている（Maeder et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301；Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-92；Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660）。好ましい実施形態では、ジンクフィンガーアレイは、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載され、またはこれらに記載されるように生成される。さらなる適切なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、米国特許第６，０１３，４５３号明細書、米国特許第６，００７，９８８号明細書および米国特許第６，５０３，７１７号明細書ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に記載されている。
【００４８】
塩基エディター
一部の実施形態では、塩基エディターは、シトシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼ由来のシトシンデアミナーゼ（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を参照のこと）；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導性シトシンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）である。以下の表２は、例示的な配列を提供する；他の配列も使用することができる。
【００４９】
【表２】
2020521451.tif 000004
【００５０】
例示的なスプリットデアミナーゼ領域は、表３に示される。表３に列挙された各スプリット領域は、二次構造を欠き、酵素的に重要な機能から離れて位置するリンカー領域であることが公知の、または構造情報が欠如しているｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇとのアラインメントに基づいてリンカーであると予測される、酵素の領域を示す（*は、十分な構造情報を欠如しているタンパク質を示す）。構造不定の認識ループは、基質結合および特異性を決定する上で重要なので、含めなかった。全てのタンパク質配列は、uniprot.orgから得た。全ての位置情報は、以下に記載される全長タンパク質配列内の位置を指す。記載された候補スプリット領域は、どのスプリットが機能的であるかの先験的な予測における本発明者らの最良の試みを示すに過ぎない。
【００５１】
【表３】
2020521451.tif 000005
【００５２】
スプリットデアミナーゼ領域は、例えば、ｎＣａｓ９−ＵＧＩ部分に対してなされた場合に塩基編集を増強し得る変異、例えば、配列番号４６のＷ９０、Ｒ１２６またはＲ１３２に対応する変異、例えば、配列番号４６のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１３２Ｅに対応する変異を含み得る（例えば、Kim et al. “Increasing the Genome-Targeting Scope and Precision of Base Editing with Engineered Cas9-Cytosine Deaminase Fusions.” Nature Biotechnology 35(4):371-376 (2017)を参照のこと）。あるいは、またはさらに、スプリットデアミナーゼ領域は、配列番号４９のＮ５７、Ｙ１３０またはＫ６０のうち１つまたは複数に対応する位置における変異、例えば、配列番号４９のＮ５７Ｇ、Ｎ５７Ａ、Ｎ５７Ｑ、Ｙ１３０Ｆ、Ｋ６０Ｄに対応する変異を含み得る（例えば、参考文献１７を参照のこと）。
【００５３】
バリアント
一部の実施形態では、融合タンパク質の構成成分は、例示的な配列（例えば、本明細書で提供される）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である、例えば、本明細書に記載される変異を含む、またはこれに加えて、例示的な配列の残基の最大で１％、２％、５％、１０％、１５％または２０％において、例えば保存的変異によって置き換えられた差異を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、任意選択で、改善された特異性または変更された基質特異性を有して、親の所望の活性、例えば、ニッカーゼ活性、ならびに／あるいはガイドＲＮＡおよび／もしくは標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。
【００５４】
２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方において導入され得、非相同な配列は、比較目的のために無視され得る）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書で使用する場合、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列間のパーセント同一性は、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）中に取り込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；（Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方式で決定される。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較の長さは、最大で全長でありかつ全長を含む任意の長さであり得る（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）。本発明の組成物および方法の目的のために、配列の全長の少なくとも８０％がアラインされる。
【００５５】
本開示の目的のために、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティと共に、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用して達成され得る。
【００５６】
保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００５７】
スプリットデアミナーゼ（split deaminase）融合タンパク質をコードする単離された核酸、バリアントタンパク質を発現させるための１つまたは複数の調節ドメインに任意選択で作動可能に連結された単離された核酸を含むベクター、ならびにかかる核酸を含み、バリアントタンパク質を任意選択で発現させる、宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞である。
【００５８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥまたはｎＣａｓ９）とＢＥドメインとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質中で（または連結構造にある融合タンパク質間で）使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列が含まれ得る。好ましい実施形態では、リンカーは短く、例えば、２〜２０アミノ酸であり、典型的には、柔軟性がある（すなわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの、高い程度の自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６）からなる１つまたは複数の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号５）またはＧＧＧＧＳ（配列番号６）単位の、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多いリピートを含む。他のリンカー配列もまた使用され得る。
【００５９】
一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質には、細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータンまたはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが含まれる。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8；Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611；およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照のこと。
【００６０】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞質または他のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアおよび核中への、細胞膜を横切る広範な生体分子の移動を促進する短いペプチドである。ＣＰＰによって送達され得る分子の例には、治療的薬物、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子およびリポソームが含まれる。ＣＰＰは、一般には３０アミノ酸以下であり、天然に存在するもしくは天然に存在しないタンパク質またはキメラ配列に由来し、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニンの高い相対的存在量、または極性および非極性アミノ酸の交互のパターンのいずれかを含有する。当該分野で一般に使用されるＣＰＰには、Ｔａｔ（Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193、Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）およびトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が含まれる。
【００６１】
ＣＰＰは、共有結合または非共有結合戦略を介して、それらのカーゴと連結され得る。化学的架橋（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質のクローニング（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）などの、ＣＰＰとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐための方法が、当該分野で公知である。カーゴと、極性および非極性ドメインを含む短い両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合的カップリングは、静電相互作用および疎水性相互作用を介して確立される。
【００６２】
ＣＰＰは、細胞中へ、潜在的に治療的な生体分子を送達するために、当該分野で利用されてきた。例には、免疫抑制のための、ポリアルギニンに連結されたシクロスポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍発生を阻害するための、ＭＰＧと呼ばれるＣＰＰに連結された、サイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞の成長を低減させるための、ＣＰＰに連結された腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol. Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および喘息を処置するための、Ｔａｔに融合されたドミナントネガティブ形態のＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405）が含まれる。
【００６３】
ＣＰＰは、画像化およびバイオセンシング適用のために、細胞中に造影剤を輸送するために、当該分野で利用されてきた。例えば、Ｔａｔに結合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、がん細胞を標識するために使用されてきた（Shokolenko et al., (2005) DNA Repair 4(4):511-518）。量子ドットにコンジュゲートされたＴａｔは、ラット脳の可視化のために、血液脳関門を首尾よく横断するために使用されてきた（Santra et al., (2005) Chem. Commun. 3144-3146）。ＣＰＰは、細胞画像化のための核磁気共鳴画像化技術とも組み合わされてきた（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm. 347(1):133-140）。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-7258(15)00141-2もまた参照のこと。
【００６４】
あるいは、またはさらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、核局在化配列、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号７））およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号８））を含み得る。他のＮＬＳは、当該分野で公知である；例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415；Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照のこと。
【００６５】
一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、リガンドに対する高い親和性を有する部分、例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。かかる親和性タグは、組換えスプリットデアミナーゼ融合タンパク質の精製を促進することができる。
【００６６】
本明細書に記載されるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細胞のゲノムを変更するために使用され得る。本方法は一般に、細胞においてスプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現または接触させるステップを含む；１つまたは２つのＣａｓ９を使用するバージョンでは、本方法は、細胞のゲノムの選択された部分に対して相補的な領域を有するガイドＲＮＡを使用するステップを含む。細胞のゲノムを選択的に変更するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２４号明細書；米国特許第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許第２０１６００２４５１０号明細書；米国特許第２０１６００１７３６６号明細書；米国特許第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許第２０１５０３７６６５２号明細書；米国特許第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許第２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許第２０１５０２９１９６５号明細書；米国特許第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許第２０１５０２４７１５０号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８３号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許第２０１５０２０３８７２号明細書；米国特許第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許第２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許第２０１５０１７６０６４号明細書；米国特許第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許第２０１５０１６６９６９号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７５号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許第２０１５００９３４７３号明細書；米国特許第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許第２０１５００６７９２２号明細書；米国特許第２０１５００５６６２９号明細書；米国特許第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１５００２４４９９号明細書；米国特許第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許第２０１４０３５６８６７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許第２０１４０２７３２２６号明細書；米国特許第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１１３３７６号明細書；米国特許第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許第２０１３０３３０７７８号明細書；米国特許第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許第２０１２００８８６７６号明細書；米国特許第２０１１０３００５３８号明細書；米国特許第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許第２０１１０２１７７３９号明細書；米国特許第２０１１０００２８８９号明細書；米国特許第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許第２０１１０１８９７７６号明細書；米国特許第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許第２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００４５５４６号明細書；米国特許第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許第２０１４０３３５６２０号明細書；米国特許第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許第２０１４０３１５９８５号明細書；米国特許第２０１４０３１０８３０号明細書；米国特許第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許第２０１４０３０９４８７号明細書；米国特許第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５６号明細書；米国特許第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許第２０１４０２８７９３８号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３４号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３１号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許第２０１４０２５６０４６号明細書；米国特許第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７００号明細書；米国特許第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許第２０１４０２４２６６４号明細書；米国特許第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許第２０１４０２１２８６９号明細書；米国特許第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許第２０１４０１９９７６７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第２０１４０１８６９１９号明細書；米国特許第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許第２０１４０１７９００６号明細書；米国特許第２０１４０１７０７５３号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedings of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日出願の米国特許出願第６１／６５２，０８６号明細書；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照のこと。
【００６７】
スプリットデアミナーゼ融合タンパク質が細胞に送達される方法について、これらのタンパク質は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、または適切な宿主細胞における、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸からの発現によって、産生され得る；タンパク質を産生するためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、タンパク質は、酵母、大腸菌（E. coli）、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動物または培養哺乳動物細胞において産生され得、それらから精製され得る；例えば、Palomares et al., “Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions,” Methods Mol Biol. 2004;267:15-52を参照のこと。さらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、任意選択で、タンパク質が細胞の内側に入ると切断されるリンカーを伴って、細胞中への移行を促進する部分、例えば、脂質ナノ粒子に連結され得る。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照のこと。
【００６８】
発現系
本明細書に記載されるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合があり得る。これは、種々の方式で実施され得る。例えば、スプリットデアミナーゼ融合物をコードする核酸は、複製および／または発現のために、原核生物細胞または真核生物細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングされ得る。中間ベクターは、典型的には、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の産生のためのスプリットデアミナーゼ融合物をコードする核酸の格納または操作のための、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００６９】
発現を得るために、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；および Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）およびサルモネラ属（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:229-235）。かかる発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、市販もされている。
【００７０】
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質が、遺伝子調節のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターが、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の特定の使用に依存して使用され得る。さらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の投与のための好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ  ＴＫ、または類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に対して応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系もまた含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照のこと）。
【００７１】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞における核酸の発現のために必要とされるさらなるエレメントを全て含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、例えば、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結のために必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットのさらなるエレメントには、例えば、エンハンサー、および異種スプライスイントロンシグナル（heterologous spliced intronic signal）が含まれ得る。
【００７２】
細胞中に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の意図した使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターには、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに市販のタグ融合物発現系、例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺが含まれる。
【００７３】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターは、真核生物発現ベクターにおいて使用される場合が多い。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【００７４】
スプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクションの後に、哺乳動物細胞におけるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質の発現を可能にする。
【００７５】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下にあるｇＲＮＡコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するなどの、高収量の発現系もまた適切である。
【００７６】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントには、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の独自の制限部位もまた含まれる。
【００７７】
標準的なトランスフェクション法は、標準的な技術を使用して次いで精製される大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を産生するために使用される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362(Wu et al., eds, 1983)を参照のこと）。
【００７８】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための公知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウイルスベクター、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、Sambrook et al.、上記を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順が、少なくとも１つの遺伝子を、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に首尾よく導入できることだけが必要である。
【００７９】
融合タンパク質がＣａｓ９ドメインを含む方法では、本方法は、Ｃａｓ９と相互作用するｇＲＮＡを送達するステップもまた含む。
【００８０】
あるいは、本方法は、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質およびガイドＲＮＡを、例えば、複合体として、一緒に送達することを含み得る。例えば、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質およびｇＲＮＡは、宿主細胞において過剰発現され得、精製され得、次いで、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するためにガイドＲＮＡと（例えば、試験管中で）複合体化され得、細胞に送達され得る。一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細菌発現プラスミドの使用を介して、細菌において発現され得、そこから精製され得る。例えば、Ｈｉｓタグ化スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細菌細胞において発現され得、次いで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。ＲＮＰの使用は、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードする、またはヌクレアーゼをｍＲＮＡとしてコードするプラスミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達は、特異性も改善し得るが、これはおそらくは、ＲＮＰの半減期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的な発現（プラスミドから得られるような）が存在しないからである。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に送達され得る。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnology 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research 24.6 (2014): 1012-1019を参照のこと。
【００８１】
本発明は、例えば、本明細書に記載される方法における使用のための、ベクター、およびベクターを含む細胞、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および核酸を含むキットもまた含む。
【実施例】
【００８２】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
【００８３】
材料および方法
以下の材料および方法を、以下の実施例において使用した。
【００８４】
分子クローニング
ｓＤＡ１含有発現プラスミドを、それらが顕著な重複末端を有するように、ＰＣＲ法によって、ｒＡＰＯ１、ｈＡ３ＡまたはＢＥ３遺伝子の所望の領域、ならびに３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳまたはＮＬＳのみのリンカーおよび所望のＥＧＦＰ標的化ＺＦをコードするＤＮＡ配列を選択的に増幅すること、および等温アセンブリ（または「Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、ＮＥＢ）を使用して、ｐＣＡＧ発現ベクター中に所望の順番でそれらをアセンブルすることによって構築した。ｓＤＡ２含有発現プラスミドを、ＰＣＲによってＢＥ３遺伝子をトランケートすること、およびＧｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して、得られた小片をｐＣＡＧ発現プラスミド中に配置することによって構築した。ＰＣＲを、Ｑ５またはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して実施した。
【００８５】
細胞培養およびトランスフェクション
組み込まれたＥＧＦＰレポーター遺伝子が組み込まれたＨＥＫ２９３細胞株（未公開）を、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）、１％の１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地を使用して培養物中で成長させた。細胞を、３〜４日毎に継代して、活発に成長している集団を維持し、無酸素状態を回避した。１．０マイクログラムのトランスフェクション品質ＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−またはＭｉｎｉｐｒｅｐ）を含むトランスフェクションを、２４ウェルのＴＣ処理したプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に１．５×１０5個の細胞を播種し、製造業者のプロトコール（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬を使用することによって実施した。スプリットデアミナーゼ実験について：１．０マイクログラムのトランスフェクトしたＤＮＡのうち、４００ナノグラムは、ｓＤＡ１コードプラスミドを含み、４００ナノグラムは、ｓＤＡ２コードプラスミドを含み、２００ナノグラムは、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９  ｇＲＮＡをコードする発現プラスミドを含んだ。ＢＥ対照実験について：４００ナノグラムは、ＢＥ発現プラスミドを含み、４００ナノグラムは、ｐＭａｘ−ＧＦＰコードプラスミド（Ｌｏｎｚａ）を含み、２００ナノグラムは、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９  ｇＲＮＡをコードする発現プラスミドを含んだ。個々の半酵素対照について：４００ナノグラムは、ｓＤＡコードプラスミドを含み、４００ナノグラムは、ｐＭａｘ−ＧＦＰコードプラスミド（Ｌｏｎｚａ）を含み、２００ナノグラムは、ＥＧＦＰレポーター遺伝子を標的化するＳｐＣａｓ９  ｇＲＮＡをコードする発現プラスミドを含んだ。ゲノムＤＮＡを、ＤＮＡｄｖａｎｃｅキット（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して、トランスフェクションの３日後に回収した。
【００８６】
ハイスループットアンプリコン配列決定
標的遺伝子座における塩基編集の比率を、トランスフェクトされた細胞から単離されたゲノムＤＮＡから増幅されたＰＣＲアンプリコンのディープシークエンシングによって決定した。標的部位ゲノムＤＮＡを、ｓＤＡ２  ｎＣａｓ９結合部位に隣接するＥＧＦＰ特異的ＤＮＡプライマーを使用して増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプターを、ＰＣＲまたはＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキット（ＮＥＢ）のいずれかによって、アンプリコンの末端に付加し、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｄｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＮＥＢ）を用いて分子的にインデックス化した。サンプルを、ライブラリーへと組み合わせ、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。配列決定結果を、バッチバージョンのソフトウェアＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ．ｒｏｃｋｓ）を使用して分析した。
【００８７】
ｇＲＮＡおよびＺＦ標的配列
ＺＦ１結合部位：ａＧＡＡＧＡＴＧＧＴｇ（配列番号９）
ＺＦ２結合部位：ｇＧＴＣＧＧＧＧＴＡｇ（配列番号１０）
ｇＲＮＡ１結合部位（ＰＡＭを有する）：ＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧ（配列番号１１）
ｇＲＮＡ２結合部位（ＰＡＭを有する）：ＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣＡＧＧ（配列番号１２）
【００８８】
関連するタンパク質配列
以下の配列中で、「Ｘ」は、特異的ＤＮＡ結合を担うＺＦの可変性の領域を示す、未決定のアミノ酸残基を示している。
【００８９】
３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳリンカー
【００９０】
【化１】
2020521451.tif 000006
【００９１】
ＮＬＳリンカー
【００９２】
【化２】
2020521451.tif 000007
【００９３】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．１−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【００９４】
【化３】
2020521451.tif 000008
【００９５】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．２−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【００９６】
【化４】
2020521451.tif 000009
【００９７】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．３−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【００９８】
【化５】
2020521451.tif 000010
【００９９】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．４−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１００】
【化６】
2020521451.tif 000011
【０１０１】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．５−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１０２】
【化７】
2020521451.tif 000012
【０１０３】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ１．６−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１０４】
【化８】
2020521451.tif 000013
【０１０５】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１０６】
【化９】
2020521451.tif 000014
【０１０７】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１０８】
【化１０】
2020521451.tif 000015
【０１０９】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．３−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１１０】
【化１１】
2020521451.tif 000016
【０１１１】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．４−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１１２】
【化１２】
2020521451.tif 000017
【０１１３】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．５−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１１４】
【化１３】
2020521451.tif 000018
【０１１５】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１  ｓＤＡ２．６−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１１６】
【化１４】
2020521451.tif 000019
【０１１７】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．１−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１１８】
【化１５】
2020521451.tif 000020
【０１１９】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．２−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１２０】
【化１６】
2020521451.tif 000021
【０１２１】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．３−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１２２】
【化１７】
2020521451.tif 000022
【０１２３】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．４−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１２４】
【化１８】
2020521451.tif 000023
【０１２５】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．５−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１２６】
【化１９】
2020521451.tif 000024
【０１２７】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ１．６−ＮＬＳ−ＺＦ−Ｃ
【０１２８】
【化２０】
2020521451.tif 000025
【０１２９】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１３０】
【化２１】
2020521451.tif 000026
【０１３１】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．２−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１３２】
【化２２】
2020521451.tif 000027
【０１３３】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．３−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１３４】
【化２３】
2020521451.tif 000028
【０１３５】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．４−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１３６】
【化２４】
2020521451.tif 000029
【０１３７】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．５−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１３８】
【化２５】
2020521451.tif 000030
【０１３９】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ｓＤＡ２．５−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−Ｃ
【０１４０】
【化２６】
2020521451.tif 000031
【０１４１】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９
【０１４２】
【化２７】
2020521451.tif 000032
【０１４３】
カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）Ｃａｓ９
【０１４４】
【化２８】
2020521451.tif 000033
【０１４５】
パルビバクラム・ラバメンチボランス（P. lavamentivorans）Ｃａｓ９
【０１４６】
【化２９】
2020521451.tif 000034
【０１４７】
ナイセリア・シネレア（N. cinerea）Ｃａｓ９
【０１４８】
【化３０】
2020521451.tif 000035
【０１４９】
ｈＡＩＤ
【０１５０】
【化３１】
2020521451.tif 000036
【０１５１】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【０１５２】
【化３２】
2020521451.tif 000037
【０１５３】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域およびＣ末端のあまり構造化されていない領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【０１５４】
【化３３】
2020521451.tif 000038
【０１５５】
ｒＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）
【０１５６】
【化３４】
2020521451.tif 000039
【０１５７】
ｍＡＰＯＢＥＣ３
【０１５８】
【化３５】
2020521451.tif 000040
【０１５９】
ｍＡＰＯＢＥＣ３触媒ドメイン
【０１６０】
【化３６】
2020521451.tif 000041
【０１６１】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ｈＡ３Ａ）
【０１６２】
【化３７】
2020521451.tif 000042
【０１６３】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ
【０１６４】
【化３８】
2020521451.tif 000043
【０１６５】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ触媒ドメイン
【０１６６】
【化３９】
2020521451.tif 000044
【０１６７】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ
【０１６８】
【化４０】
2020521451.tif 000045
【０１６９】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ
【０１７０】
【化４１】
2020521451.tif 000046
【０１７１】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ触媒ドメイン
【０１７２】
【化４２】
2020521451.tif 000047
【０１７３】
カンピロバクター・ラリ（C. lari）Ｃａｓ９
【０１７４】
【化４３】
2020521451.tif 000048
【０１７５】
ＭｂＣｐｆ１
【０１７６】
【化４４】
2020521451.tif 000049
【０１７７】
[実施例1]
複数の哺乳動物デアミナーゼが機能的ＢＥタンパク質を構成し得、複数のトランケーションポイントが機能的スプリットＢＥを生じ得るので、本発明者らは、スプリットＢＥ候補対の広範なセットを試験しようとした（上の表２は、ＢＥ適用に適切であり得るデアミナーゼの代表的なリストを示す）。デアミナーゼトランケーションポイントは、構造情報を評価すること、およびデアミナーゼドメイン内のどのアミノ酸残基が意味ある二次構造構成成分に寄与する可能性が低く、従って、インタクトな酵素の機能性に影響を与える可能性が低いかを決定することによって選択した。本発明者らは、６つの哺乳動物デアミナーゼについて６つの潜在的トランケーション領域を選択する（予測されたスプリット領域の完全な表は、上の表３に含まれる）。各スプリット領域は、タンパク質アラインメントに基づいて、列挙されたデアミナーゼの各々中の相同な領域に対応する。スプリット領域Ｘからのトランケーションバリアントを含むｓＤＡ１半酵素はｓＤＡ１．Ｘと呼ばれ、ｓＤＡ２半酵素も同様に命名される。
【０１７８】
表４〜６は、本発明者らが創出し評価した正確なトランケーションバリアントを示す。正確に相互補完的な半酵素対（ここで、ＢＥのｓＤＡ１およびｓＤＡ２部分は、規定されたスプリット部位によって完全に二分されたデアミナーゼのトランケーションバリアントを含む）に加えて、本発明者らは、半酵素が重複するペプチド配列を共有するスプリットＢＥもまた試験した。本発明者らは、この「余分な」重複が、デアミナーゼの機能的再構成を可能にするように、構成要素半酵素の適切なフォールディングを可能にし得ると判断し、ほとんどの機能的スプリットｙＣＤ対が、ペプチド配列中に顕著な重複を含んだことにも注目した12。
【０１７９】
【表４】
2020521451.tif 000050
【０１８０】
【表５】
2020521451.tif 000051
【０１８１】
【表６】
2020521451.tif 000052
【０１８２】
いくつかのスプリットＢＥ半酵素組合せは、ＥＧＦＰレポーター遺伝子が組み込まれたヒトＨＥＫ２９３細胞株において隣接ＤＮＡ配列に標的化された場合に、活性を示した。各ｒＡＰＯＢＥＣ１対を、合計４つの配向対になるように２つの異なるＺＦドメインおよび２つの異なるｇＲＮＡを用いて、ＺＦおよびｇＲＮＡ結合部位に関して２つの異なる配向で試験した。直接相互補完的なｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ対のみを試験した（例えば、ｓＤＡ１．１およびｓＤＡ２．１）。各半酵素について１：１のおよその比でプラスミドトランスフェクションによって共送達した場合の各ＢＥ半酵素対の活性は、ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ対の各配向については図４〜１６（図１７は、比較のための陽性ＢＥ３対照である）に、ｈＡ３Ａ対については図２０に示される。各配向での全てのｒＡＰＯ１半酵素対の累積編集効率の概略（ｇＲＮＡ編集ウインドウ内のシトシンにおける編集率の合計）は、図２１に示される。ｒＡＰＯ１実験のための標的部位構成およびそれに使用される全てのＤＮＡ標的化タンパク質は、図２２に示される。示される全てのｒＡＰＯ１スプリットＢＥは、ｓＤＡ１−３ＡＣ３Ｌ−ＮＬＳ−ＺＦ構成を有するｓＤＡ１半酵素を含むが、全てのｈＡ３ＡスプリットＢＥは、ｓＤＡ１−ＮＬＳ−ＺＦ構成を有するｓＤＡ１を含む。特に、種々の配向の、ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ１．１＋ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ２．１、ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ１．２＋ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ２．１、ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ１．２＋ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ２．２、ｈＡ３Ａ  ｓＤＡ１．１＋ｓＤＡ２．１およびｈＡ３Ａ  １．６＋ｈＡ３Ａ  ２．６は、陽性ＢＥ３対照と比較して、有意な活性を示す（図４、６、７、２０および２１）。
【０１８３】
ｓＤＡ構成成分と標的化ドメインとの間のタンパク質リンカーの性質、ｓＤＡ１結合部位とｓＤＡ２結合部位との間の間隔、ｓＤＡがスプリットされる正確な部位、ｓＤＡ構成成分の相対的濃度、供給源デアミナーゼ、ｎＣａｓ９標的化機構の供給源、およびｓＤＡ１構成成分に使用される標的化ドメインの型を含むいくつかのパラメーターの最適化が、スプリットＢＥプラットフォームの性質に影響し得る、それを変化させ得るまたはそれを増強し得ることが考えられ、またその可能性が高い。さらに、以前に記載された塩基エディターと同様ｎＣａｓ９−ＵＧＩドメインに融合されたｓＤＡ２を含まないスプリット塩基エディター対は、それらのＤＮＡ標的化タンパク質がＤＮＡの隣接配列へと持ち寄られる限り、いくらかの限定的な変異原性能をなおも保持する可能性が高いが、それは、再構成されたデアミナーゼドメインが、かかる標的部位の周囲でなおも活性であるからである。
【０１８４】
重要なことに、個々のｒＡＰＯ１半酵素のいずれも、それ自体では活性でなく、このことは、機能的デアミナーゼドメインの本当の再構成のための、両方の半酵素についての要件を示唆している（図１８および１９）。さらに、機能的組合せが、他の配向よりも特定の配向を好むようであるという事実（例えば、ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ１．１＋ｒＡＰＯ１  ｓＤＡ２．１は、試験した配向のうちの１つにおいて主に機能的である）は、これらのデアミナーゼドメインが、機能するためにはそれらのＤＮＡ標的化ドメインの隣接結合を純粋に必要とし、それにより、デアミナーゼドメインがゲノム中の他の部位において再構成され得る可能性が低くなり、従って、誤ったゲノム脱アミノ化を引き起こす可能性が低くなることを示唆している。
【０１８５】
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【０１８６】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、本発明の範囲を限定するのではなく例示する意図であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2020521451.tif 000053
【図２】
2020521451.tif 000054
【図３】
2020521451.tif 000055
【図４】
2020521451.tif 000056
【図５】
2020521451.tif 000057
【図６】
2020521451.tif 000058
【図７】
2020521451.tif 000059
【図８】
2020521451.tif 000060
【図９】
2020521451.tif 000061
【図１０】
2020521451.tif 000062
【図１１】
2020521451.tif 000063
【図１２】
2020521451.tif 000064
【図１３】
2020521451.tif 000065
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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