(57)【要約】  本発明は、アルデヒドを含む標的分子に、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された化合物を結合させ方法であって、該化合物が対象部分も含む方法、この方法によって得られる、標的分子と対象部分の両方を含む化合物（コンジュゲート）、およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された新規物質に関する。2020516656.tif 0000322020516656.tif 000033
2020516656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩの化合物を生成する方法であって、
式Ｉの化合物を、以下に示すように、アルデヒド基を含む標的と反応させ、
【化１】
2020516656.tif 000028
それにより式ＩＩ
【化２】
2020516656.tif 000029
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｌは、存在しないかまたはリンカーであり、
Ｍは対象部分であり、
Ｔは、標的分子であり、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つが−ＬＭである。］
の化合物を得ることを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、独立して、Ｈまたはメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、対象部分Ｍが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、対象部分Ｍが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、標的分子Ｔが、固相、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、標的分子Ｔが、ポリペプチド、タンパク質または核酸である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、標的分子Ｔが抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、存在しないか、あるいは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはオリゴペプチドから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、ジスルフィド、カーボネート、カルバメート、アルケン、トリアゾール、ジヒドロピリダジンまたはホスホジエステル結合を介して、対象部分Ｍに結合している、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
式ＩＩ
【化３】
2020516656.tif 000030
［式中、Ｒ１からＲ８およびＴは、請求項１から１０において規定された通りである。］
の化合物。
【請求項１２】
式ＩＩＩ
【化４】
2020516656.tif 000031
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、
Ｒ８は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは−ＬＭである。］
の物質。
【請求項１３】
Ｍが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体およびマレイミドからなる群から選択される、請求項１２に記載の物質。
【請求項１４】
Ｍが、発光標識、細胞毒性剤およびビオチンまたはビオチン類似体からなる群から選択される、請求項１２または１３に記載の物質。
【請求項１５】
Ｍがオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドである、請求項１２または１３に記載の物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルデヒドを含む標的分子に、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された化合物を結合させ方法であって、該化合物が対象部分も含む、方法、この方法によって得られる、標的分子と対象部分の両方を含む化合物（コンジュゲート）、およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された新規物質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の部位特異的修飾は、特に診断または治療用途に使用される抗体の場合、難しい問題である。経済的で産業規模で適用可能な部位特異的ポリペプチド修飾の信頼できる方法は非常に重要である。
【０００３】
タンパク質の機能化の初期の方法は、タンパク質をマレイミドやＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルなどの過剰なチオールまたはアミン反応性試薬とそれぞれ反応させることにより、システインまたはリジン残基の反応性を利用するものであった。これらのアミノ酸は豊富で、広く分布しており、適切なカップリング化学が利用できるため、簡単に変更できる。
【０００４】
しかしながら、「リジン標識」戦略は、例えば抗体またはその抗原結合断片を標識するために使用される場合に、いくつかの欠点：ａ）多くの場合、抗原結合活性（抗原結合部位内またはその近くのリジン）の大幅な低下をもたらすこと；ｂ）同じ１：１の化学量論であっても単一標識コンジュゲートは、ポリペプチド内のリジンのうちの異なるものを介して結合した標識を含む混合物からなること；およびｃ）所望の１：１生成物の収率がかなり低いこと、がある。
【０００５】
部位特異的タンパク質標識のための最も重要な最近のアプローチの１つは、酵素反応を介して特定の部位のタンパク質に生体直交性機能を組み込むことである。「タンパク質の酵素標識」に関する最近のレビューについては、Ｍ．  Ｒａｓｈｉｄｉａｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４（２０１３年）、１２７７〜１２９４頁を参照されたい。このレビューで対象とする部位特異的コンジュゲーションに使用される酵素には、ホルミルグリシン生成酵素、シアリルトランスフェラーゼ、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ、Ｏ−ＧｌｃＮＡｃ翻訳後修飾、ソルタギング、トランスグルタミナーゼ、ファルネシルトランスフェラーゼ、ビオチンリガーゼ、リポ酸リガーゼ、およびＮ−ミリストイルトランスフェラーゼが含まれる。
【０００６】
アルデヒドおよびケトンを部位特異的にタンパク質に導入するために、様々な化学的、酵素的、遺伝的方法が開発されてきた。これらには、Ｎ末端セリンまたはトレオニン残基の過ヨウ素酸塩酸化が含まれる（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，  Ｋ．Ｆ．  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９２年）、３（２）：１３８〜１４６頁；ｐｙｒｉｄｏｘａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｒａｎｓａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｙｉｅｌｄ  ａｎ  ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏａｍｉｄｅ  ｏｒ  ｇｌｙｏｘａｍｉｄｅ（Ｇｉｌｍｏｒｅ，  Ｊ．Ｍ．ら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．（２００６年）４５（３２）：５３０７〜５３１１頁；Ｓｃｈｅｃｋ，  Ｒ．Ａ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２００８年）、１３０（３５）：１１７６２〜１１７７０頁；Ｗｉｔｕｓ，  Ｌ．Ｓ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２０１０年）、１３２（４７）：１６８１２〜１６８１７頁；ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｔｏｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｈｉｏｅｓｔｅｒｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  （Ｅｓｓｅｒ−Ｋａｈｎ，  Ａ．Ｐ．  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｍ．Ｂ．  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．（２００８年）、４７（２０）：３７５１〜３７５４頁）；ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｋｅｔｏｎｅｓ  ｖｉａ  ａｍｂｅｒ  ｓｔｏｐ  ｃｏｄｏｎ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｗａｎｇ，  Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ（２００３年）、１００（１）：５６〜６１頁；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ，  Ｂ．Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．（２０１１年）、１８（３）：２９９〜３０３頁；Ｋｉｍ，  Ｃ．Ｈ．ら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２０１２年）、１３４（２４）：９９１８〜９９２１頁）；ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔａｇｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｄｅｈｙｄｅ−  ｏｒ  ｋｅｔｏｎｅ−ｂｅａｒｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（Ｒａｓｈｉｄｉａｎ，  Ｍ．ら、Ｊ  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２０１２年）、１３４（２０）：８４５５〜８４６７頁；Ｃｈｅｎ，  Ｉ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００５年）２（２）：９９〜１０４頁）；および  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｉｔｅ  ｆｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ（ＦＧＥ），  ｔｈｅ  「ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｔａｇ」ｍｅｔｈｏｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ  ｂｙ  Ｃａｒｒｉｃｏ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ（Ｃａｒｒｉｃｏ，  Ｉ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．３（６）：３２１〜３２２頁；Ｗｕ，  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．米国（２００９年）、１０６：３０００〜３００５頁；Ｈｕｄａｋ，  Ｊ．Ｅ．ら、Ｊ  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２０１１年）、１３３（４０）：１６１２７〜１６１３５頁；Ｈｕｄａｋ，  Ｊ．Ｅ．ら（２０１２年）、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．（２０１２年）、５１（１７）：４１６１〜４１６５頁；Ｒａｂｕｋａ，  Ｄ．ら、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．（２０１２年）、７（６）：１０５２〜１０６７頁）。
【０００７】
反応性カルボニル基をタンパク質に導入する方法の多様性は、化学修飾に広く採用されている限られた数の反応とは対照的である。レポートの大部分は、上記のヒドラゾンおよびオキシム形成反応を使用しており、これは、それらの生体直交性、操作の単純さ（つまり、補助試薬が不要）、および穏やかな水性条件下で良好な収量に起因している。残念ながら、結果として生じるＣ＝Ｎ結合は加水分解を受けやすく（Ｍｕｅｌｌｅｒ，  Ｂ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９０年）、１（５）：３２５〜３３０頁）、不安定になる。しかしながら、多くの日常的な用途には長期的な安定性が必要である。
【０００８】
Ｔ．  Ｓａｓａｋｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．（２００８年）、１８：４５５０〜４５５３頁）により、ベータ位で置換されたインドール化合物が説明されている。国際公開第２００９／１５０８６５号では、ピクテ−スペングラー反応を使用して修飾タンパク質を生成する方法が開示されている。ベータ−Ｃ位で置換された複素環式インドール誘導体が記載されており、実施例では、ベータ−Ｃ位で置換されたインドール誘導体のみが使用され示されている。Ｂｅｒｔｏｚｚｉのグループは、ピクテ−スペングラー型の反応において、反応性を高めるためのインドール#oaアミノオキシまたはヒドラジン官能性を説明している（Ｐ．  Ａｇａｒｗａｌら、ＰＮＡＳ（２０１３年）、１１０（１）、４６〜５１頁；Ｐ．  Ａｇａｒｗａｌら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（２０１３年）、２４（６）、８４６〜８５１頁；国際公開第２０１４／０７８７３３号）。
【発明の概要】
【０００９】
驚くべきことに、ピロール環の窒素を介してアミノエチルが結合し、所望の対象部分をさらに含むＮ−（２−アミノエチル）ピロールをベースとする化合物が、例えば、反応速度論および収率に関する大きな利点を伴ってピクテ−スペングラー型反応で使用できることが今や見出された。さらに、この方法で得られたコンジュゲート（化合物）と特定のＮ−（２−アミノエチル）ピロール物質が開示される。
【００１０】
本発明は、アルデヒドを含む標的分子に、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された化合物を結合させ方法であって、この化合物は対象部分も含む、方法を開示する。より詳細には、式ＩＩの化合物を生成する方法であって、式Ｉの化合物を、以下に示すように、アルデヒド基を含む標的Ｔと反応させ、
【００１１】
【化１】
2020516656.tif 000003
【００１２】
それにより式ＩＩ
【００１３】
【化２】
2020516656.tif 000004
【００１４】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｌは、存在しないかまたはリンカーであり、Ｍは対象部分であり、Ｔは標的分子であり、ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つが−ＬＭである。］
の化合物（＝コンジュゲート）を得ることを含む、方法に関する。
【００１５】
さらに開示されるのは、本明細書に開示される方法によって得られるコンジュゲートであって、標的分子Ｔと対象部分Ｍの両方を含むコンジュゲート、例えば式ＩＩ
【００１６】
【化３】
2020516656.tif 000005
【００１７】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＴは上記で定義した通りである。］
の化合物である。
【００１８】
さらに開示されるのは、式ＩＩＩ
【００１９】
【化４】
2020516656.tif 000006
【００２０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、
Ｒ８は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは−ＬＭである。］
の物質である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、アルデヒドを含む標的分子に、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールから誘導された化合物を結合させ一般的な方法であって、この化合物は対象部分も含む、方法を開示する。
【００２２】
一実施形態では、本開示は、式ＩＩの化合物を生成する方法であって、式Ｉの化合物を、以下に示すように、アルデヒド基を含む標的Ｔと反応させ、
【００２３】
【化５】
2020516656.tif 000007
【００２４】
それにより式ＩＩ
【００２５】
【化６】
2020516656.tif 000008
【００２６】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｌは、存在しないかまたはリンカーであり、Ｍは対象部分であり、Ｔは標的分子であり、ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つが−ＬＭである。］
の化合物を得ることを含む、方法に関する。
【００２７】
「含む」という語、および「含む」や「含んでいる」などのバリエーションは、指定された整数あるいはステップまたは整数あるいはステップのグループを含むことを意味するが、いずれの他の整数もしくはステップ、または整数もしくはステップのグループも除外するものではない。
【００２８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を含む。
【００２９】
添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、置換基は、当業者に一般的に知られている意味を有する。
「アルキル」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、指定の炭素原子数を有する直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味する（すなわち、Ｃ１〜Ｃ２０は炭素数１〜２０であることを意味する）。飽和炭化水素基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、同族体および、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどの異性体などの基が含まれるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、アルキルは、１〜２０個の炭素原子の長さ、１〜１０個の炭素原子の長さ、または１〜６個の炭素原子の長さの直鎖または分岐アルキル鎖である。一実施形態では、アルキルはメチルまたはエチルである。
【００３０】
「アリール」および「ヘテロアリール」という用語は、それ自体または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、追加の芳香族環系（好ましくは、１〜４個の環）と縮合し得る芳香族環系（すなわち、５または６員環）を意味する。「ヘテロアリール」環系は、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を含む。「アリール」の例には、フェニルおよびナフチルなどの基が含まれるが、これらに限定されない。「ヘテロアリール」の例には、フラン、チオフェン、ピロール、イミダゾール、トリアゾールおよびインドールから誘導される基が含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
当業者が理解するように、アルキルまたはアリールのような化学的実体（２つの非限定的な例に言及するだけであるが）は「置換」、すなわち１つまたは複数の水素を置き換える／置換することができる。一実施形態では、水素は、ハロアルキル（例えば、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３）およびアシル（例えば、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３）、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、−ＯＲ’、＝Ｏ、−ＮＲ’Ｒ”、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ”’、−ＮＲ”Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ”、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ’、−ＣＮ、ハロゲンおよび−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルコキシ、およびフルオロ（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから選択される基で置換され、ここで、Ｒ’、Ｒ”およびＲ”’は、好ましくは、水素および置換または非置換アルキルから独立して選択される。好ましい置換基は、メチルまたはエチルのようなアルキル、フェニルまたはベンジルのようなアリール、メトキシまたはエトキシ、ジメチルアミノのようなアミン、カルボン酸のようなカルボン酸誘導体、エステルまたはアミド、およびニトロ、シアノ、アジドおよびハロゲンである。
【００３２】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体または別の用語と組み合わせて、上記の「アルキル」の下に記載された炭素原子の数およびＯ、Ｎ、ＰおよびＳからなる群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子からなる、安定な直鎖または分岐鎖、または環状炭化水素基、またはその組み合わせを意味する。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の任意の内部位置または末端位置、すなわち、ヘテロアルキル基が分子の残りに結合する位置の反対側に配置されてもよい。ヘテロ原子は、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールコア構造のピロール環と（ヘテロ）アルキルまたは（ヘテロ）アリール置換基の間に配置することもできる。好ましくは、内部位置で鎖または環のメンバーである各ヘテロ原子には、炭素原子が隣接している。内部位置のヘテロ原子は、非置換であってもよく、例えば、水素原子を有していても、アルキルおよびＯからなる群から選択される少なくとも１つの置換基を有していてもよい。ヘテロアルキルの例には、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ３、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＮＨ−ＣＨ３、−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３）２、−Ｎ（ＣＨ２−ＣＨ３）２およびポリ（アルキレンオキシド）、特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合の存在を除いて、そうでなければ上記のアルキルの下で定義される化学基を表す。
「ヘテロアルケニル」という用語は、少なくとも１つの二重結合の存在を除いて、そうでなければ上記のヘテロアルキルの下で定義される化学基を表す。
【００３４】
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈまたはメチルである。
一実施形態では、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３はすべてＨである。
当業者が理解するように、「リンカー」は、任意の所望の距離で２つの部分間の連結を提供する任意の適切な構造である。したがって、２つの部分は、互いに直接結合するのではなく、そのような連結構造またはリンカーを介して結合する。
【００３５】
一実施形態では、式ＩまたはＩＩそれぞれに含まれるリンカーＬは、その骨格長によって定義されてもよく、一実施形態では、原子数１〜１００個の骨格長を有する。一実施形態では、Ｌは、原子数１〜５０個の骨格長を有する。一実施形態では、Ｌは、直鎖または分岐の飽和、不飽和、非置換、または置換Ｃ１〜Ｃ５０アルキル鎖、または炭素原子およびＯ、ＮおよびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子からなる骨格を有する１〜５０原子鎖であるか、または炭素原子およびＯ、ＮおよびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子からなる骨格を有し、少なくとも１つのアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール基を含む１〜５０原子鎖（例えば、フェニレン環は、４つの原子の長さを占める）である。一実施形態では、本発明による化合物中のリンカーＬは、飽和Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖、または炭素原子およびＯ、ＮおよびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子からなる骨格を有する１〜２０原子鎖、または炭素原子およびＯ、ＮおよびＳから選択される１つまたは複数のヘテロ原子からなる骨格を有し、少なくとも１つのアリール、ヘテロアリール、置換アリールまたは置換ヘテロアリール基を含む１〜２０原子鎖（例えば、フェニレン環は、４つの原子の長さを占める）である。
【００３６】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるリンカーＬは、存在しないか、あるいは置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい。一実施形態では、Ｌは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
【００３７】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれの定義に含まれるようなリンカーＬは存在しない。
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるリンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい。一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるＬは、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、アミド結合およびオリゴペプチドから選択される。
【００３８】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるＬは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
一実施形態では、Ｌに含まれ得るペプチドはオリゴペプチドであり、２〜２０個のアミノ酸からなる。
【００３９】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるＬは、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、ジスルフィド、カーボネート、カルバメート、アルケン、トリアゾール、ジヒドロピリダジンまたはホスホジエステル結合を介して対象部分Ｍに結合している。
【００４０】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれ、本明細書に開示される方法で使用される「対象部分」（Ｍ）は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、すなわちオリゴペプチド、またはポリペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される。
【００４１】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは低分子量、すなわち、分子量が２００００ダルトン未満である。さらなる実施形態では、対象部分は、１００〜１５０００ダルトン、１００〜１００００ダルトン、１００〜５０００ダルトン、および１００〜２０００ダルトンの分子量を有する。
【００４２】
一実施形態では、本明細書で開示される方法で使用される対象部分Ｍを表し得るペプチドは、１〜１００個のアミノ酸からなる。
一実施形態では、リンカーＬまたは対象部分Ｍのいずれか一方のみがそれぞれオリゴペプチドまたはペプチドである。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に開示される方法で使用される対象部分Ｍを表し得るオリゴヌクレオチドは、２〜１００個のヌクレオチドからなる。
一実施形態では、対象部分Ｍはヌクレオチドを含む。
【００４４】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍの１つは標識である。リンカー（Ｌ）に共有結合できるいずれの標識も使用できる。標識は次の機能を果たす：（ｉ）検出可能な信号を提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、第１の標識または第２の標識によって提供される検出可能な信号を変更し、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を与える：（ｉｉｉ）移動度、例えば、電荷、疎水性、形状、または他の物理的パラメーターによる電気泳動移動度または細胞透過性に影響を与える：または（ｉｖ）捕捉部分を与え、例えば、イオン錯化を調整する。
【００４５】
多数の標識（染料とも呼ばれる）を使用でき、これらの標識は通常、次のカテゴリに分類できる。
（ａ）蛍光染料
蛍光染料は、例えば、Ｂｒｉｇｇｓらによる「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  Ａｍｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ」、Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｔｒａｎｓ．  １  （１９９７年）、１０５１〜１０５８頁）で説明されている。
【００４６】
蛍光標識または蛍光団には、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、ＦＩＴＣを含むフルオレセイン型の標識、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、ＴＡＭＲＡを含むローダミン型標識、リサミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ダンシル、シアニン、フィコエリスリンおよびその類似体が含まれる。蛍光標識は、本明細書に開示される技術を使用して、標的分子に含まれるアルデヒド基に結合され得る。蛍光色素および蛍光標識試薬は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（米国オレゴン州ユージーン）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （米国マサチューセッツ州ウォルサム）およびＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  （Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌ．）から市販されているものが含まれる。
（ｂ発光染料）
発光染料または標識は、化学発光染料と電気化学発光染料とにさらに分類できる。
【００４７】
異なるクラスの化学発光標識には、ルミノール、アクリジニウム化合物、セレンテラジンおよび類似体、ジオキセタン、ペルオキシシュウ酸をベースとする系およびそれらの誘導体が含まれる。免疫診断手順では、主にアクリジニウムベースの標識が使用される（詳細な概要は、Ｄｏｄｅｉｇｎｅ  Ｃ．ら、Ｔａｌａｎｔａ  ５１（２０００年）、４１５〜４３９頁）に与えられている）。
【００４８】
電気化学発光標識として使用される主要な関連性の標識は、ルテニウムおよびイリジウムのそれぞれをベースとする電気化学発光錯体である。電気化学発光体（ＥＣＬ）は、高感度で選択的な方法として分析用途において非常に有用であることが証明されている。これは、化学発光分析の分析上の利点（バックグラウンドの光信号がない）と、電極電位を適用することによる反応制御の容易さとを兼ね備えている。一般にルテニウム錯体、特に液相または液固界面でＴＰＡ（トリプロピルアミン）で再生する［Ｒｕ（Ｂｐｙ）３］２＋（〜６２０ｎｍで光子を放出する）はＥＣＬ標識として使用される。近年では、イリジウムベースのＥＣＬ標識も記載されている（国際公開第２０１２１０７４１９（Ａ１）号）。
（ｃ）３Ｈ、１１Ｃ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、６４Ｃｕ、６８Ｇｎ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、９９ＴＣ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｘｅ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔまたは１３１Ｂｉなどの放射性同位体（放射性核種）を使用する放射性標識
（ｄ）画像化および治療目的の標識として適切な金属キレート錯体は、当技術分野で周知である（米国特許出願公開第２０１０／０１１１８５６号、米国特許第５，３４２，６０６号、米国特許第５，４２８，１５５号、米国特許第５，３１６，７５７号、米国特許第５，４８０，９９０号、米国特許第５，４６２，７２５号、米国特許第５，４２８，１３９号、米国特許第５，３８５，８９３号、米国特許第５，７３９，２９４号、米国特許第５，７５０，６６０号、米国特許第５，８３４，４５６、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５（１９８３年）、１４７〜１５７頁、Ｍｅａｒｅｓら、Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １４２（１９８４年）、６８〜７８頁、Ｍｉｒｚａｄｅｈら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １（１９９０年）、５９〜６５頁、Ｍｅａｒｅｓら、Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９０年）、Ｓｕｐｐｌ．  １０：２１〜２６頁、Ｉｚａｒｄら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ３（１９９２年）、３４６〜３５０頁、Ｎｉｋｕｌａら、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２２（１９９５年）、３８７〜９０頁、Ｃａｍｅｒａら、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０（１９９３年）、９５５〜６２頁、Ｋｕｋｉｓら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９（１９９８年）、２１０５〜２１１０頁、Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４（２００３年）、１６６３〜１６７０頁、Ｃａｍｅｒａら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ２１（１９９４年）、６４０〜６４６頁、Ｒｕｅｇｇら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５０（１９９０年）、４２２１〜４２２６頁、Ｖｅｒｅｌら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４  （２００３年）、１６６３〜１６７０頁、Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１（２００１年）、４４７４〜４４８２頁、Ｍｉｔｃｈｅｌら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４４（２００３年）、１１０５〜１１１２頁、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １０  （１９９９年）、１０３〜１１１頁、Ｍｉｅｄｅｒｅｒら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４５  （２００４年）、１２９〜１３７頁、ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４（１９９８年）、２４８３〜９０頁、Ｂｌｅｎｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  １８（２００３年）、３５５〜３６３頁、Ｎｉｋｕｌａら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ４０（１９９９年）、１６６〜７６頁、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  ３９（１９９８年）、８２９〜３６頁、Ｍａｒｄｉｒｏｓｓｉａｎら、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．  ２０（１９９３年）、６５〜７４頁、Ｒｏｓｅｌｌｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ＆  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  １４（１９９９年）、２０９〜２０頁）。
【００４９】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍの１つは、細胞毒性剤である。一実施形態では、対象部分は、以下から選択される細胞毒性剤である：（ｉ）微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡ挿入剤として機能し得る化学療法剤、（ｉｉ）酵素的に機能し得るタンパク質毒素、および（ｉｉｉ）治療用放射性同位体。一実施形態では、対象部分は化学療法剤である。
【００５０】
例示的な化学療法剤には、マイタンシノイド、オーリスタチン、ドラスタチン、トリコテセン、ＣＣ１０６５、カリケアマイシンおよび他のエンジイン抗生物質、タキサン、アントラサイクリン、およびその立体異性体、アイソスター、類似体または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
タンパク質毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（緑膿菌由来）、リシンＡ鎖（Ｖｉｔｅｔｔａら（１９８７年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：１０９８）、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナあぶらぎり（支那油桐、大油桐）（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ダイアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−５）、ツルレイシ（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、およびトリコテセン（国際公開第９３／２１２３２号）が含まれる。
【００５２】
治療用放射性同位体には、３２Ｐ、３３Ｐ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、２１２Ｂ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体が含まれる。
【００５３】
放射性同位体は、既知の方法で組み込むことができる（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８０：４９〜５７頁、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」Ｃｈａｔａｌ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９年）。炭素−１４標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種の複合体へのコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号）。
【００５４】
上記のように、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる可能性のある対象部分Ｍの１つは、結合対のパートナーである。
本明細書で使用される結合対は、高い親和性で、すなわち１ナノモル以上の親和性で互いに結合する２つのパートナーからなる。当業者が容易に理解するように、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれるＭは、２つの可能なパートナー要素のうちの１つは、例えばハプテン／抗ハプテン結合対のハプテンを表す。結合対の実施形態は、例えば、受容体およびリガンド、ハプテンおよび抗ハプテン抗体からなる結合対、および天然に存在する高親和性結合対ベースの結合対である。特定の実施形態では、結合対のパートナーはリガンドまたはハプテンであるか、または天然に存在する高親和性結合対のパートナーである。
【００５５】
受容体−リガンド結合対の一例は、ステロイドホルモン受容体と対応するステロイドホルモンからなる対である。一実施形態では、リガンドはステロイドホルモンである。
一実施形態では、結合対のパートナーはハプテンであるか、または天然に存在する高親和性結合対のパートナーである。
【００５６】
本発明による一実施形態を代表する天然に存在する高親和性結合対ベースの結合対の例は、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンなどのビオチンまたはビオチン類似体、ならびにＦｉｍＧおよびＤｓＦ結合対である。ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対は、当技術分野で周知である。ＦｉｍＧ−ＤｓＦ結合対の基本原則は、例えば、国際公開第２０１２／０２８６９７号に記載されている。
【００５７】
本発明の結合対および実施形態のもう１つのタイプは、ハプテンおよび抗ハプテン抗体結合対である。ハプテンは、分子量が１００〜２０００ダルトンの有機分子である。一実施形態では、ハプテンの分子量は１００〜１０００ダルトンである。通常、そのような分子量の有機分子は免疫原性ではないか、比較的免疫原性が低い。ハプテンは、それを担体分子に結合することにより免疫原性にすることができ、抗ハプテン抗体は標準的な手順に従って生成することができる。一実施形態では、ハプテンは、ステロール、胆汁酸、性ホルモン、コルチコイド、カルデノリド、カルデノリド−グリコシド、ブファジエノリド、ステロイド−サポゲニンおよびステロイドアルカロイド、カルデノリドおよびカルデノリド−グリコシドを含む群から選択することができる。これらの物質クラスの代表は、ジゴキシゲニン、ジギトキシゲニン、ジトキシゲニン、ストロファンチジン、ジゴキシン、ジギトキシン、ジトキシン、ストロファンチンである。さらなる適切なハプテンは、例えばフルオレセインである。
【００５８】
当業者には明らかなように、いくつかの物質、例えばビオチンまたはその類似体は、両方とも天然に存在する結合対またはハプテンのパートナーであり、すなわち、それらはそれに結合する抗体を生成するために使用できる。
【００５９】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、カルボン酸、カルボン酸エステル、エポキシド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、ヒドラジン、ヒドロキシル、スルフヒドリル、マレイミド、アルケニル、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネート、ホスホルアミダイト、トランス−シクロオクテン、およびテトラジンからなる群から選択される官能基である。
【００６０】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、イソシアネート、イソチオシアネートおよびホスホルアミダイトからなる群から選択される官能基である。
【００６１】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、結合対のパートナーである。
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される。
【００６２】
好ましいジゴキシン類似体はジゴキシゲニンである。
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、ハプテン、ビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチン類似体、ＦｉｍＧ、リガンドおよびオリゴヌクレオチドから選択される。
【００６３】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、ハプテンおよびビオチン、またはアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチン類似体から選択される。
【００６４】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、ビオチンまたはアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンなどのビオチン類似体である。
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍはビオチンである。
【００６５】
ビオチン類似体は、アミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチンである。
当業者が理解するように、ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基およびリン酸基に結合したリボースまたはデオキシリボース糖からなる化合物であり、これは、例えば、核酸の基本構造単位（ＲＮＡおよびＤＮＡなど）である。ヌクレオチドは、糖、塩基、またはリン酸部分で修飾されてもよく、例えば、ピリミジン塩基のＣ５位で修飾されてもよい。好ましい例は、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジンおよび２’−デオキシチミジンの５’−リン酸またはポリリン酸である。他のヌクレオチド類似体または誘導体は、オリゴヌクレオチド（核酸）に関する詳細な説明で以下にさらに説明されている。
【００６６】
オリゴヌクレオチドは、リン酸エステル結合を介して接続された複数のヌクレオチドで構成され、オリゴヌクレオチドに組み込むことができる限り、例えば、グリコール、１，３−プロパンジオール、Ｇｌｅｎ  ＲｅｓｅａｒｃｈまたはＣｈｅｍｇｅｎｅｓのｄＳｐａｃｅｒ（登録商標）のようなスペーサー分子としての非ヌクレオチドビルディングブロック、またはさらには、置換ベンゼンのような芳香族ビルディングブロックも含み得る。そのようなオリゴヌクレオチドに含まれるヌクレオチドのいくつかは、標識部分（例えば、ビオチン、フルオレセイン）などの他の官能基で置換されていてもよい。
【００６７】
一実施形態では、対象部分Ｍを表すオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドビルディングブロックから選択される２〜５０個のサブユニットからなる。
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれ、本明細書に開示される方法で使用される対象部分Ｍは、２００００ダルトン未満の分子量を有し、官能基、結合対のパートナー、細胞毒性剤、または標識である。
【００６８】
一実施形態では、式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍは、１００〜２００００ダルトンの分子量を有し、結合対のパートナーおよび標識からなる群から選択される。
【００６９】
上記のように、本明細書に開示される方法は、アルデヒド基を含む任意の種類の標的分子Ｔを式Ｉの化合物に結合するのに非常に有用である。
一実施形態では、標的分子Ｔは、固相、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される。
【００７０】
「固相」、「固体支持体」または「固体表面」は通常、ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。当業者が理解するように、固相は、その性質によりアルデヒド官能基を含むか、化学的に修飾してアルデヒド基を導入することができる。さらに明らかなように、固相は、本発明の目的のためにアルデヒド基を含むポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、および核酸のいずれかでコーティングすることができる。固体支持体は、チューブ、ビーズ、またはマイクロプレートのディスクの形であってもよい。一実施形態では、固相は、ガラスまたは上述のポリマーのいずれかをベースとする常磁性ビーズである。
【００７１】
一実施形態では、標的分子Ｔは、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、および核酸からなる群から選択される。
「炭水化物」とは、炭素（Ｃ）、水素（Ｈ）、および酸素（Ｏ）原子で構成され、通常は水素と酸素の原子比が２：１（水など）、つまり、経験式Ｃｍ（Ｈ２Ｏ）ｎ（ここで、ｍは通常ｎと同じである）による生体分子である。いくつかの例外（ｍがｎとは異なる）が存在し、例えば、ＤＮＡの糖成分であるデオキシリボースは経験式Ｃ５Ｈ１０Ｏ４を有する。炭水化物は、技術的には炭素の水和物であり、構造的には、それらをポリヒドロキシアルデヒドおよびケトンと見なす方がより正確である。
【００７２】
炭水化物という用語は生化学で最も一般的であり、糖、デンプン、およびセルロースを含む分子のグループである「糖類」の同義語である。一実施形態では、炭水化物は、糖、デンプン、およびセルロースから選択される。
【００７３】
一実施形態では、標的分子Ｔは、ポリペプチド、タンパク質、および核酸からなる群から選択される。
一実施形態では、標的分子Ｔは、タンパク質および核酸からなる群から選択される。
【００７４】
一実施形態では、標的分子Ｔはポリペプチドまたはタンパク質である。
「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、当業者に知られており、本明細書で以下にさらに定義されている。
【００７５】
一般に、「ペプチド」という用語は、アミノ酸のモノマーがアミド結合を介して結合している２つ以上のアミノ酸（＝アミノ酸残基）を含むポリマーを指す。アミノ酸は、そのＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかであり得、ポリペプチドは、アミノ酸のＤ−異性体またはＬ−異性体のいずれかで構成され得る。一実施形態では、ペプチドはアミノ酸のＬ−異性体からなる。ペプチドという用語は、オリゴペプチドとポリペプチドの両方を含む。
【００７６】
「オリゴペプチド」という用語は、少なくとも２個から最大２０個のアミノ酸を含むペプチドに使用される。
「ポリペプチド」という用語は、少なくとも２１個のアミノ酸を含むペプチドに使用される。天然のポリペプチドは、天然のアミノ酸で構成されている。さらに、例えばβ−アラニン、フェニルグリシン、または／およびホモアルギニンなどの非天然アミノ酸を含むポリペプチドを合成することができる。ポリペプチドは、リン酸化やグリコシル化などのいわゆる二次修飾を受ける場合がある。そのような修飾されたポリペプチドもまた、本発明によるポリペプチドである。一実施形態では、本開示による方法で使用されるポリペプチドは、２１〜１０００個のアミノ酸残基を有する。
【００７７】
本発明の異なる態様の文脈において、「タンパク質」という用語は、二次および三次構造を再開する１つまたは複数のペプチド鎖を含む分子を指し、さらに、四次構造を形成するいくつかのペプチド鎖、すなわちいくつかのサブユニットで構成されるタンパク質を指す。タンパク質には、非ペプチド基が結合していることがあり、これは補欠分子族または補因子と呼ばれることがある。タンパク質はまた、二次修飾、例えばリン酸化、グリコシル化などを含んでもよい。
【００７８】
一実施形態では、アルデヒド基を含む標的分子Ｔにおいて、アルデヒド基はホルミル生成酵素（ＦＧＥ）方法論により導入される。手短に言えば、ホルミルグリシン生成酵素はペンタペプチドのコンセンサス配列ＣｘＰｘＲを認識し、この配列のシステインをホルミルグリシンに特異的に酸化する。ＦＧＥ認識配列またはアルデヒドタグは、原核生物または真核生物のいずれかの発現系で産生された異種組換えタンパク質に挿入できる（例：Ｒａｂｕｋａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１２年、７、１０５２〜１０６７頁を参照）。別の実施形態では、Ｎ末端グリシンは、アミノ交換反応によりアルデヒドに変換することができる（例えば、Ｇｉｌｍｏｒｅら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．  ２００６年、４５、５３０７頁を参照）。他の実施形態では、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニンをアルデヒドに酸化し、糖修飾タンパク質の糖構造を過ヨウ素酸塩で酸化してアルデヒド基を生成することができる。
【００７９】
一実施形態では、標的分子Ｔは、結合対のポリペプチドパートナーおよび抗体から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。
例えば、結合対のポリペプチドパートナーは、受容体リガンド結合対の受容体、ビオチンアビジンまたはストレプトアビジン結合対のアビジンまたはストレプトアビジン、またはＦｉｍＧ／ＤｓＦ結合対のＦｉｍＧである。
【００８０】
一実施形態では、本開示による方法で使用される標的分子Ｔは、ＦｉｍＧ、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。
一実施形態では、本開示による方法で使用される標的分子Ｔは、アビジン、ストレプトアビジンおよび抗体から選択されるポリペプチドまたはタンパク質である。
【００８１】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの完全な抗体から形成される多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体断片を具体的に包含する。
【００８２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の研究、診断または治療用途を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む場合がある。いくつかの実施形態では、抗体は、（１）例えば、ローリー法によって決定される抗体の９５重量％超、およびいくつかの実施形態では、９９重量％超に、（２）例えば、回転カップ・シーケネーターの使用により、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度までに、または、（３）例えば、クーマシーブルーまたは銀染色を使用した還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一化するために精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、少なくとも１つの精製ステップで単離抗体を調製する。
【００８３】
「天然抗体」は通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖にリンクされているが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。また、各重鎖と軽鎖には、一定の間隔を置いた鎖内ジスルフィド架橋がある。各重鎖の一端には可変ドメイン（ＶＨ）があり、その後にいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖には、一端に可変ドメイン（ＶＬ）があり、他端に定常ドメインがあり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。
【００８４】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは「ＶＨ」と呼ばれる場合がある。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。これらのドメインは通常、抗体の最も可変性の高い部分であり、抗原結合部位を含んでいる。
【００８５】
「可変」という用語は、可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で大幅に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかしながら、抗体の可変ドメイン全体にばらつきは均一に分布していない。軽鎖および重鎖可変ドメインの両方で、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、主にベータシート配置をとっている４つのＦＲ領域を含み、そのＦＲ領域は３つのＨＶＲによって接続され、ＨＶＲは、ベータシート構造を接続し、場合によりベータシート構造の一部を形成するループを形成する。各鎖のＨＶＲはＦＲ領域によって互いに近接して保持され、他の鎖のＨＶＲと一緒になって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、  ＭＤ（１９９１年）を参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００８６】
任意の脊椎動物種の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのいずれかに割り当てることができる。
【００８７】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体（免疫グロブリン）を異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２に分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は周知であり、例えば、Ａｂｂａｓら、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、Ｗ．Ｂ．  Ｓａｕｎｄｅｒｓ、Ｃｏ．（２０００年）において全体的に説明されている。抗体は、抗体と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合により形成される、より大きな融合分子の一部であり得る。
【００８８】
「全長抗体」、「完全な抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、以下に定義される抗体断片ではなく、実質的に完全な形態の抗体を指す。この用語は特に、Ｆｃ領域を含む重鎖を持つ抗体を指す。
【００８９】
「抗体断片」は、完全な抗体の一部、好ましくはその抗原結合領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００９０】
抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を持つ「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名前が容易に結晶化する能力を反映する残留「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を持ち、依然として抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。
【００９１】
「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。一実施形態では、二本鎖Ｆｖ種は、緊密な非共有結合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインを柔軟なペプチドリンカーで共有結合できるため、軽鎖および重鎖は、二本鎖Ｆｖ種の構造と類似した「二量体」構造で結合できる。この構成では、各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を定義する。集合的に、６つのＨＶＲは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合できる能力を有する。
【００９２】
Ｆａｂ断片は、重鎖および軽鎖可変ドメインを含み、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にいくつかの残基が追加されていることにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の指定である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、ヒンジシステインを間に持つＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００９３】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓｃＦｖのレビューについては、例えば、Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｖｏｌ．  １１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ（ｅｄｓ．）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９９４年）、２６９〜３１５頁を参照。
【００９４】
「ダイアボディ」という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む２つの抗原結合部位を持つ抗体断片を指す。同じ鎖上の２つのドメインをペアリングするには短すぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補ドメインとのペアリングを強制され、２つの抗原結合部位を作成する。ダイアボディは二価または二重特異性であり得る。ダイアボディは、例えば、欧州特許第０４０４０９７号、国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ、  Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（２００３年）、１２９〜１３４頁；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ、Ｐ．ら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０（１９９３年）６４４４〜６４４８頁においてより完全に記載されている。トリアボディおよびテトラボディは、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｐ．Ｊ．ら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ９（２００３年）１２９〜１３４頁においても記載されている。
【００９５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在する可能性のある突然変異、例えば天然に生じる突然変異を除いて同一である。したがって、修飾語「モノクローナル」は、個別の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。特定の実施形態では、そのようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合ポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプールなど、複数のクローンからのユニークなクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列は、例えば標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するために、細胞培養での産生を改善し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫原性を低下させ、多重特異性抗体を作成するなどのためにさらに変更でき、変更された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解すべきである。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、それらが典型的に他の免疫グロブリンによって汚染されていないという点で有利である。
【００９６】
上述のように、一実施形態では、本開示による方法で使用される標的分子Ｔは、固相、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチド、および核酸からなる群から選択される。
【００９７】
一実施形態では、本開示による方法で使用される標的分子Ｔは核酸である。
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」または「核酸」という用語は、一般に、少なくとも２ヌクレオチドおよび最大約１０００ヌクレオチドを含む短い、一般的に一本鎖のポリヌクレオチドを指す。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７または３０ヌクレオチドの長さを有することになる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５または３０ヌクレオチド以下の長さを有することになる。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、天然のヌクレオシド２’−デオキシアデノシン（ｄＡ）、２’−デオキシグアノシン（ｄＧ）、２’−デオキシシチジン（ｄＣ）、２’−デオキシチミジン（ｄＴ）、アデノシン、グアノシン、シチジンおよびウリジン、および２’−デオキシウリジン（ｄＵ）を含む。別の実施形態では、核酸は二本鎖であってもよい。
【００９８】
オリゴヌクレオチドまたは核酸という用語は広く理解されるべきであり、ＤＮＡおよびＲＮＡ、ならびにその類似体および修飾体を含む。核酸類似体は、例えば、標準塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルで置換基を運ぶ置換ヌクレオチドを含んでもよい。置換核酸塩基を含むそのようなヌクレオシドの例は、５メチルｄＣ、アミノアリルｄＵまたはｄＣなどの５−置換ピリミジン、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵまたは−ｄＣ、５ハロゲン化−ｄＵまたは−ｄＣ、Ｎ４−エチル−ｄＣなどのＮ置換ピリミジン、Ｎ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧなどのＮ置換プリン、８−［（６−アミノ−ヘキサ−１−イル）−アミノ］−ｄＧまたは−ｄＡなどの８個の置換プリン、８個のハロゲン化ｄＡまたはｄＧ、８−アルキルｄＧまたはｄＡ、および２アミノｄＡのような２置換ｄＡである。
【００９９】
核酸類似体は、ヌクレオチドまたはヌクレオシド類似体を含んでもよい。つまり天然に存在する核酸塩基は、５−ニトロインドールｄリボシドなどの核酸塩基類似体、３ニトロピロールｄリボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキシキサントシン（ｄＸ）、７デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ、７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩまたは−ｄＸ、８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩまたは−ｄＸ、ｄホルマイシン、擬似ｄＵ、擬似イソｄＣ、４チオｄＴ、６チオｄＧ、２チオｄＴ、イソｄＧ、５−メチル−イソ−ｄＣ、Ｎ８リンクの８−アザ−７−デアザ−ｄＡ、５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ、およびエテノｄＡまたはピロロ−ｄＣを使用して交換できる。当業者に明らかなように、相補鎖の核酸塩基は、二重鎖形成が特異的であるような方法で選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソ−ｄＣが１本の鎖（例えば（ａ））で使用される場合、イソｄＧは相補鎖（例えば（ａ’））に存在する必要がある。
【０１００】
核酸類似体において、オリゴヌクレオチド骨格は、置換糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間リン酸部分の修飾を含むように修飾され、および／またはＰＮＡであり得る。
オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮのような置換デオキシリボースを含むヌクレオチドを含有してもよい（ここで、Ｎは核酸塩基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴまたはＵである）。
【０１０１】
糖類似体は、例えば、キシロース、（２’−Ｏ、４’−Ｃメチレン）−架橋リボース（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）または（２’−Ｏ、４’−Ｃエチレン）−架橋リボース（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）などの２’、４’架橋リボース、Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）、シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）、アルトリトール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）、Ｃ３’およびＣ５’原子がシクロプロパン環に縮合したエチレン架橋によって接続されている三環式リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）、グリセロール（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）、グルコピラノース（ホモＤＮＡとして知られるオリゴマー）、カルバリボース（テトラヒドロフランサブユニットの代わりにシクロペンタンを使用）、ヒドロキシメチルモルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。
【０１０２】
修飾されたヌクレオシド間リン酸部分を含む多数の修飾もハイブリダイゼーション特性を妨げないことが知られており、そのような骨格修飾は置換ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体と組み合わせることができる。例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデートおよびメチルホスホネートオリゴヌクレオチドである。
【０１０３】
ＰＮＡ（リン酸とｄ−リボースを含まない骨格を有する）もＤＮＡ類似体として使用できる。上記の修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、およびオリゴヌクレオチド骨格修飾は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチドにおいて望まれるように組み合わせることができる。
【０１０４】
核酸またはオリゴヌクレオチドを標的分子Ｔとして使用する場合、特定の実施形態では、化学的または酵素的手段によりアルデヒド修飾を組み込むことができる。化学的手段により、ホルミル修飾ホスホルアミダイト（例えば、ホルミルインドールホスホロアミダイト、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してアルデヒド基を導入することができ、ＮＨＳエステル化学も適用することができる。アルデヒド修飾ヌクレオシド三リン酸を使用して、アルデヒド基を酵素的に組み込むことができる。
【０１０５】
本開示による方法では、式Ｉの化合物に含まれる対象部分Ｍについて、ならびに標的部分Ｔについて上述した様々な実施形態を組み合わせることができる。例えば、一実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる対象部分Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択され、標的分子Ｔはポリペプチドまたはタンパク質、例えば、抗体である。別の例では、式Ｉの化合物に含まれる対象部分Ｍはヌクレオチドであり、標的分子Ｔは核酸である。
【０１０６】
一実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる対象部分Ｍはオリゴヌクレオチドであり、標的分子Ｔはヌクレオチドである。一実施形態では、式Ｉの化合物に含まれる対象部分Ｍはオリゴヌクレオチドであり、標的分子Ｔはオリゴヌクレオチドである。
【０１０７】
一実施形態では、標的分子Ｔは、複数、すなわち２〜５０個のアルデヒド基を含む。結果として、本明細書に開示される方法を実施する場合、複数の対象部分Ｍが標的分子Ｔに連結される。
【０１０８】
また、本明細書に開示されているのは、標的分子Ｔおよび対象部分Ｍの両方を含む、本発明に記載および開示された方法により得られたコンジュゲートである。
一実施形態では、本開示は、式ＩＩ
【０１０９】
【化７】
2020516656.tif 000009
【０１１０】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＴはすべて、式Ｉの下で上記で定義された通りである。つまり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、またはＲ８のうちの少なくとも１つは−ＬＭであり、ＬおよびＭは上記で定義されている。当業者が理解するように、式ＩＩの化合物は、本明細書に開示される方法を実施する際に得られる生成物である。式ＩＩの化合物では、標的分子Ｔは、式ＩＩのコア構造、１，２，３，４−テトラヒドロピロロ［１，２−ａ］ピラジンを介して対象部分Ｍに結合する、または当業者が同様に呼ぶように言えば、コンジュゲートする。］
の化合物（またはコンジュゲート）に関する。
【０１１１】
本開示による方法では、一方で標的分子Ｔの様々な実施形態と、他方で様々な対象部分Ｍとを所望に応じて組み合わせることができる。組み合わせのためのこれらのオプションは、様々な使用分野で非常に有用な多種多様なコンジュゲートをもたらす。
【０１１２】
一実施形態では、標的分子として抗体および蛍光標識または発光標識、または対象部分としてビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体を含む式ＩＩの化合物（コンジュゲート）が生成される。一実施形態では、このような化合物は免疫学的検出方法に使用される。
【０１１３】
一実施形態では、標的分子として抗体および対象部分として細胞毒性剤を含む式ＩＩの化合物（コンジュゲート）が生成される。一実施形態では、そのような化合物は、治療目的、例えば、抗がん療法に使用される。
【０１１４】
一実施形態では、標的分子としてヌクレオチドおよび対象部分としてオリゴヌクレオチドを含む式ＩＩの化合物（コンジュゲート）が生成される。一実施形態では、そのような化合物は、次世代シーケンシングアプローチ、例えば、ナノポアシーケンスに使用される。
【０１１５】
さらに開示されるのは、式ＩＩＩ
【０１１６】
【化８】
2020516656.tif 000010
【０１１７】
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立してＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、
Ｒ８はＨ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナー、およびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは−ＬＭである。］
の物質である。
【０１１８】
式Ｉの化合物と式ＩＩＩの物質それぞれの重要な違いの１つは、式ＩＩＩのＲ８が−ＬＭではないという事実である。
一実施形態では、式ＩＩＩの物質中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈまたはメチルである。
【０１１９】
一実施形態では、式ＩＩＩの物質中のＲ１、Ｒ２およびＲ３はすべてＨである。
上記のように、式ＩＩＩの物質に含まれるリンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよい。これらの制限を除いて、式ＩＩＩの物質に含まれるリンカーＬは、それぞれ式Ｉおよび式ＩＩの化合物に含まれるリンカーＬについて上述した定義を満たす。
【０１２０】
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれるＬは、置換または非置換アルキル、および置換または非置換ヘテロアルキルから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
【０１２１】
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれるＬは、置換または非置換アルキル、置換または非置換ヘテロアルキル、およびオリゴペプチドから選択される。
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれるＬは、置換または非置換アルキルおよび置換または非置換ヘテロアルキルから選択される。
【０１２２】
式ＩＩＩに含まれるリンカーＬは、その骨格の長さによってさらに定義されてもよく、一実施形態では、１〜１００原子の骨格の長さを有する。
式ＩＩＩの物質に含まれる「対象部分」（Ｍ）は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される。これらの制限を除いて、式ＩＩＩの物質に含まれる対象部分Ｍは、式Ｉおよび式ＩＩの化合物それぞれに含まれる対象部分Ｍについて上述した定義を満たす。
【０１２３】
式ＩＩＩの物質に含まれる対象部分Ｍがヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーまたは官能基である場合、これらの部分はすべて上で定義した通りである。
【０１２４】
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれる対象部分は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される。
【０１２５】
ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光標識、発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたは式ＩＩＩの物質中の対象部分Ｍとして含まれるジゴキシン類似体はすべて上で定義した通りである。
【０１２６】
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれる対象部分は、発光標識、細胞毒性剤、およびビオチンまたはビオチン類似体からなる群から選択される。
一実施形態では、式ＩＩＩの物質に含まれる対象部分は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。
【０１２７】
実施例のセクションで実証されているように、式Ｉおよび式ＩＩＩそれぞれの両方に開示されているＮ位置で置換されたピロール化合物は、Ｃ置換ピロール化合物よりも高い反応性を示す。加えて、アルデヒドを含む標的分子と、ピロール環のＮ位置で置換されている本開示によるピロール化合物とを反応させることにより得られるコンジュゲーション生成物（式ＩＩの物質）も、より高い安定性を示した。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】α−、β−、およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールそれぞれと、ホルミルグリシン含有ペプチド（１１）（配列番号１）との反応を示す図である。（Ａ）では、反応が模式的に描かれている。（Ｂ）から明らかなように、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロール（図１ＢのＮ）の変換は、α−およびβ−（２−アミノエチル）ピロール（図１Ｂにおけるα、β）両方のそれぞれの変換よりも大幅に高速で効率的である。
【図２】ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）によるＣ末端アルデヒドタグ付きマウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体の部位特異的標識を模式的に示す図である。
【図３Ａ】ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）によるＣ末端（アルデヒド）タグ付きマウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、ホルミルグリシンを含有しないＣ末端変異体タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号４）を有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（Ａ）（コンジュゲートは形成されない）、およびＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号３）を含有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（それぞれ（Ｂ）および（Ｃ））（非常に効率的な標識）のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析により得られた結果である。
【図３Ｂ】ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）によるＣ末端（アルデヒド）タグ付きマウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、ホルミルグリシンを含有しないＣ末端変異体タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号４）を有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（Ａ）（コンジュゲートは形成されない）、およびＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号３）を含有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（それぞれ（Ｂ）および（Ｃ））（非常に効率的な標識）のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析により得られた結果である。
【図３Ｃ】ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）によるＣ末端（アルデヒド）タグ付きマウスモノクローナル抗ＴＳＨ抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、ホルミルグリシンを含有しないＣ末端変異体タグ（ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号４）を有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（Ａ）（コンジュゲートは形成されない）、およびＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ＝配列番号３）を含有するマウス抗ＴＳＨ抗体で得られたコンジュゲート（それぞれ（Ｂ）および（Ｃ））（非常に効率的な標識）のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析により得られた結果である。
【図４】ＴＳＨ−Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイおよび安定性試験におけるコンジュゲートの性能を示す図である。ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）を用いた、ＴＳＨに対するＣ末端アルデヒドタグ付きマウスモノクローナル抗体の部位特異的標識により得られたコンジュゲートを試験した。左から右への列は次の通りである。ｔ＝０における元来のコンジュゲート（「ｏｒｉ」とラベルされている；従来のＮＨＳ化学を介して得られた）、３５℃で７日後の元来のコンジュゲート；ｔ＝０における新規のコンジュゲート（ラベル「５」）；３５℃で７日後の新規のコンジュゲート。
【図５Ａ】Ｎ−およびアルファ−置換ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン［それぞれ化合物（５）および（７）］を用いた、ＴＳＨ抗体に対するＣ末端アルデヒドタグ付きマウスモノクローナル抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、（Ａ）Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）および（Ｂ）α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれと結合した、配列番号３のＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を含むＴＳＨ抗体に対するマウスモノクローナル抗体のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析である。図５Ｃは、ｔ＝０、または３５℃で３週間後の、アルデヒドタグ−標識Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）またはα−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれにより、従来のＮＨＳ化学（ｏｒｉ）によりまたは部位特異的に得られたコンジュゲートについて、ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体のＩｇＧ−ビオチンコンジュゲートの性能／安定性を示している。
【図５Ｂ】Ｎ−およびアルファ−置換ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン［それぞれ化合物（５）および（７）］を用いた、ＴＳＨ抗体に対するＣ末端アルデヒドタグ付きマウスモノクローナル抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、（Ａ）Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）および（Ｂ）α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれと結合した、配列番号３のＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を含むＴＳＨ抗体に対するマウスモノクローナル抗体のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析である。図５Ｃは、ｔ＝０、または３５℃で３週間後の、アルデヒドタグ−標識Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）またはα−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれにより、従来のＮＨＳ化学（ｏｒｉ）によりまたは部位特異的に得られたコンジュゲートについて、ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体のＩｇＧ−ビオチンコンジュゲートの性能／安定性を示している。
【図５Ｃ】Ｎ−およびアルファ−置換ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン［それぞれ化合物（５）および（７）］を用いた、ＴＳＨ抗体に対するＣ末端アルデヒドタグ付きマウスモノクローナル抗体の部位特異的標識を示す図である。示されているのは、（Ａ）Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）および（Ｂ）α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれと結合した、配列番号３のＣ末端アルデヒドタグ（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）を含むＴＳＨ抗体に対するマウスモノクローナル抗体のＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析である。図５Ｃは、ｔ＝０、または３５℃で３週間後の、アルデヒドタグ−標識Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）またはα−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれにより、従来のＮＨＳ化学（ｏｒｉ）によりまたは部位特異的に得られたコンジュゲートについて、ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体のＩｇＧ−ビオチンコンジュゲートの性能／安定性を示している。
【実施例】
【０１２９】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の趣旨から逸脱することなく、示された手順に変更を加えることができることが理解される。
【０１３０】
実施例１
（１）：Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン（２−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）−３−（１Ｈ−ピロール−１−イル）プロパン酸）の合成
【０１３１】
【化９】
2020516656.tif 000011
【０１３２】
Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６（４）、２２１９〜２２２３頁；２０１５年の手順に従って合成した。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 12.93 - 12.78 (m, 1H), 7.18 - 7.07 (m, 1H), 6.74 - 6.66 (m, 2H), 6.06 - 5.84 (m, 2H), 4.31 - 3.91 (m, 3H), 1.32 (s, 9H)
実施例２
（２）：Ｆｍｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ＯＨの合成
【０１３３】
【化１０】
2020516656.tif 000012
【０１３４】
Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン（１）（１５０ｍｇ、０．５９１ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２／ＴＦＡ（３ｍＬ、１：１）に溶解し、室温で１時間撹拌した。この時間後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を１，４−ジオキサン／Ｈ２Ｏ（５ｍＬ、１：１）に再溶解し、溶液を０℃に冷却した。ＮａＨＣＯ３（１５０ｍｇ、１．７７ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−ＯＳｕ（２２０ｍｇ、０．６５０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。１，４−ジオキサンを減圧下で除去し、水性残渣をヘキサンで洗浄し、次いでＨＣｌ（１Ｍ水溶液）で酸性化し、ＥｔＯＡｃで抽出した。ＳｉＯ２上のカラムクロマトグラフィーにより、所望の生成物を無色の固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ３７７．１［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  ３７７．１［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例３
（３）：Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステルの合成
【０１３５】
【化１１】
2020516656.tif 000013
【０１３６】
ＤＭＦ（１ｍＬ）およびトリエチルアミン（８３μＬ、０．５９ｍｍｏｌ）中のＢｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン（１）（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ペンタフルオロフェニル−トリフルオロアセテート（１００μＬ、０．５９ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。ヘキサンを溶液に加え、２時間冷却し、白色結晶沈殿物を収集し、さらに精製することなく次のステップに使用した。
【０１３７】
実施例４
（４）：Ｆｍｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステルの合成
【０１３８】
【化１２】
2020516656.tif 000014
【０１３９】
ＤＭＦ（２ｍＬ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（９３μＬ、０．５３４ｍｍｏｌ）中のＦｍｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン（２）（１００ｍｇ、０．２６７ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ペンタフルオロフェニル−トリフルオロアセテート（５０μＬ、０．２９２ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。飽和ＮａＣｌ水溶液（１５ｍＬ）を加え、ＥｔＯＡｃ（３×３０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ＳｉＯ２カラムクロマトグラフィー（ヘキサン／ＥｔＯＡｃ＝４：１）で精製して、所望の生成物（５８ｍｇ、４０％）を無色の固体として得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ５４３．１［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  ５４３．１３［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例５
（５）：Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチンの合成
【０１４０】
【化１３】
2020516656.tif 000015
【０１４１】
Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ＯＨ（１）を、従来のＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡケミストリーを用いてシリンジ内でＦｍｏｃ−ＰＥＧ  Ｂｉｏｔｉｎ  ＮｏｖａＴａｇ（商標）樹脂（０．３１ｍｍｏｌ／ｇ；Ｍｅｒｃｋから購入）でカップリングし、ＴＦＡで樹脂から切断した。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ５８３．４［Ｍ＋Ｈ］＋、２９２．３［Ｍ／２＋Ｈ］＋、計算値  ５８３．８［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例６
（６）：Ｎ−ピロロ−アラニン−（ＰＥＧ１０）２−ＰＥＧ２−ビオチンの合成
【０１４２】
【化１４】
2020516656.tif 000016
【０１４３】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ１０−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ（２回）およびＢｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ＯＨ（１回）を、従来の固相ペプチド合成条件を用いてシリンジ内でＦｍｏｃ−ＰＥＧ  Ｂｉｏｔｉｎ  ＮｏｖａＴａｇ（商標）樹脂（０．３１ｍｍｏｌ／ｇ；Ｍｅｒｃｋから購入）で連続的にカップリングし、ここで、ＨＡＴＵ／ＤＩＰＥＡをカップリング反応の試薬として使用し、ピペリジン（ＤＭＦ中２０％）をＦｍｏｃ脱保護ステップに使用した。ＴＦＡで処理することにより、樹脂からの開裂が得られた。ＨＰＬＣ精製により、所望の生成物を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ５３６．１［Ｍ／３＋Ｈ］＋、８０３．７［Ｍ／２＋Ｈ］＋、計算値  １６０６．９［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例７
（７）：α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチンの合成
【０１４４】
【化１５】
2020516656.tif 000017
【０１４５】
ＤＭＦ（３ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（２３１μＬ、１．３３ｍｍｏｌ）中のＦｍｏｃ−α−ＰｙｒＡｌａ（２５０ｍｇ、０．６６４ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。ペンタフルオロフェニル−トリフルオロアセテート（１００μＬ、０．５９ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で２時間撹拌した。この溶液６００μＬを、ＤＭＦ（１ｍＬ）中のビオチン−ＰＥＧ２−ＮＨ２（５０ｍｇ、０．１３３ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（４６μＬ、０．２６６ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。室温で２時間撹拌した後、ジエチルアミン（４００μＬ）を溶液に加え、さらに２０分間撹拌した。反応混合物を７５ｍＬの冷却ジイソプロピルエーテルに加え、所望の生成物を沈殿物として高純度で単離できた（２２ｍｇ、３３％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ５１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  ５１１．６［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例８
（８）：Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ７−ＮＨ２の合成
【０１４６】
【化１６】
2020516656.tif 000018
【０１４７】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＮＨ２−ＰＥＧ７−ＮＨ２（５０ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（２１μＬ、０．１２１ｍｍｏｌ）の溶液に、Ｂｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステル（３）（１１ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で１時間撹拌し、次いで溶媒を減圧下で除去した。分取ＨＰＬＣクロマトグラフィー（２０％ＭｅＣＮ−Ｈ２Ｏ中６０％ＭｅＣＮ＋０．１％ＴＦＡ）により、無色の樹脂として所望の生成物を得た（１３ｍｇ、８６％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：６０５．５［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例９
（９）：Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ７−ＮＨ−ＣＯ（ＣＨ２）５−マレイミドの合成
【０１４８】
【化１７】
2020516656.tif 000019
【０１４９】
１）ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ７−ＮＨ２（８）（１６ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１５μＬ、０．８８ｍｍｏｌ）および６−マレイミド−ヘキサン酸ＮＨＳエステル（１４ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１６時間撹拌した後、溶媒を除去した。分取ＨＰＬＣ（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中の２０％ＭｅＣＮ−６０％ＭｅＣＮ）により、無色の樹脂として所望の生成物を得た（９ｍｇ、５０％）。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ７９８．５［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  ７９８．９［Ｍ＋Ｈ］＋
２）得られた物質をＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）およびＴＦＡ（５００μＬ）に溶解し、室温で３０分間撹拌した。減圧下で溶媒を除去することにより、無色の樹脂として所望の生成物（８ｍｇ、定量）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ６９８．５［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  ６９８．８［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例１０
（１０）：ＳｕｌｆｏＢｉＰｙＲｕ−ＰＥＧ２−Ｎ−ピロロ−アラニンの合成
【０１５０】
【化１８】
2020516656.tif 000020
【０１５１】
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のＳｕｌｆｏＢｉＰｙＲｕ−ＮＨＳエステル（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（１５ｍｇ、０．０１２７ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（２２μＬ、０．１２７ｍｍｏｌ）および２，２’−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（１９μＬ、０．１２７ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を室温で１時間撹拌した。反応の完了後、溶媒を除去し、逆相分取ＨＰＬＣクロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ中の０％ＭｅＣＮ−２５％ＭｅＣＮ）により、オレンジ色の固体（８ｍｇ、０．００６８ｍｍｏｌ、５４％）として所望の生成物を得た。ＤＭＦ（２５０μＬ）中の得られたＳｕｌｆｏＢｉＰｙＲｕ−ＰＥＧ２−ＮＨ２（１０ａ）（４．５ｍｇ、０．００３８ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＤＩＰＥＡ（２μＬ、０．１１５ｍｍｏｌ）およびＦｍｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステル（６ｍｇ、０．０１１５ｍｍｏｌ）を加えた。カップリング反応の完了後、ジエチルアミン（５０μＬ）を反応物に加え、さらに３０分間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、逆相分取ＨＰＬＣ（０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液中の０％ＭｅＣＮ−３５％ＭｅＣＮ、ｐＨ＝７）により、オレンジ色の固体（２．５ｍｇ、５０％）として所望の生成物（１０ｂ）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ６５６．８［Ｍ／２＋Ｈ］＋、１３１０．８［Ｍ＋Ｈ］＋、計算値  １３１１．２［Ｍ＋Ｈ］＋
実施例１１
（１１）：ホルミルグリシン含有ペプチドの合成
【０１５２】
【化１９】
2020516656.tif 000021
【０１５３】
上記のペプチド（（１１）＝配列番号１）を、Ｒｕｓｈら、Ｏｒｇ．  Ｌｅｔｔ．、２００６年、８、１３１〜１３４頁に従って合成した。手短に言えば、ペプチドは、アルデヒド官能基の保護された前駆体としてジエチルアセタールが使用された従来の固相ペプチド合成により得られた。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ７７４．３［Ｍ／２＋Ｈ］＋、５１７．０［Ｍ／３＋Ｈ］＋
実施例１２
（１２）：５’−ピロロ−アラニン−アミノヘキサノ−ル−Ｔ１０−３’の合成
【０１５４】
【化２０】
2020516656.tif 000022
【０１５５】
５’−アミノヘキサノール−Ｔ１０−３’オリゴヌクレオチド（８０μＬ、Ｈ２Ｏで２．１５ｍＭ、１７２ｎｍｏｌ、従来のオリゴヌクレオチド合成手順に従って合成）をホウ酸ナトリウム緩衝液（２５０μＬ、ｐＨ＝８．５、０．１Ｍ）に加えた。その後、Ｆｍｏｃ−Ｎ−ピロロ−アラニン−ペンタフルオロフェニルエステル（４）（１５０μＬ、ＭｅＣＮで１０ｍＭ、１５００ｎｍｏｌ）を加えた。室温で２時間振とうした後、ジエチルアミン（１００μＬ）を溶液に加え、さらに３０分間振とうした。シリンジろ過および透析により、所望の生成物（１２０ｎｍｏｌ、７０％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  １０９７．３［（Ｍ−３Ｈ）／３］−
実施例１３
（１３）：４−ホルミルベンゾエートＮＨＳ−エステルの合成
【０１５６】
【化２１】
2020516656.tif 000023
【０１５７】
ＤＭＦ（３０ｍＬ）中の４−ホルミル安息香酸（１．００ｇ、６．６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＥＤＣ−ＨＣｌ（１．４０ｇ、７．３３ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（８４２ｍｇ、７．３３ｍｍｏｌ）を加えた。室温で１６時間撹拌した後、混合物をＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＣｌ水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を除去して、無色の固体として所望の生成物（１．４０ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、８５％）を得た。
1H NMR (クロロホルム-d, 400 MHz): δ = 10.13 (s, 1H), 8.21-8.37 (m, 3H), 7.96-8.07 (m, 3H), 2.93 ppm (d, J = 8.7 Hz, 6H)
実施例１４
（１４）：４−ホルミルベンズアミド−ウンデカノール−ヘキサホスフェート−シチジンの合成
【０１５８】
【化２２】
2020516656.tif 000024
【０１５９】
ＮＨ２−ウンデカノール−ヘキサホスフェート−シチジン（Ｆｕｌｌｅｒら、ＰＮＡＳ、１１３、５２３３に従って合成）（Ｈ２Ｏ中の７１４μＬ、５．６ｍＭ、４μｍｏｌ）および４−ホルミルベンゾエートＮＨＳ−エステル（１３）（ＭｅＣＮ中の８００μＬ、５０ｍＭ、４０μｍｏｌ）をホウ酸ナトリウム緩衝液（５００μＬ、ｐＨ＝８．５、０．１Ｍ）に加えた。室温で３時間振とうした後、反応混合物を逆相クロマトグラフィー（Ｈ２Ｏ中の０〜３５％ＭｅＣＮ、０．１Ｍトリエチルアンモニウムアセテート）で精製し、所望の生成物（１．８２μｍｏｌ、４６％）を得た。
ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  ５２２．２［（Ｍ−２Ｈ）／２＋３８］−、１０４５．３  ２  ［Ｍ−Ｈ＋３８］−
実施例１５〜２１は、ピロロ誘導体（式Ｉの化合物）とアルデヒド基を含有するモデル化合物、ならびにホルミルグリシン含有ペプチドおよび抗体とのコンジュゲーション実験を示す。
【０１６０】
実施例１５
２−（１Ｈ−ピロール−１−イル）エタン−１−アミンのモデルのピクテ−スペングラー反応
【０１６１】
【化２３】
2020516656.tif 000025
【０１６２】
２−（１Ｈ−ピロール−１−イル）エタン−１−アミン（１００ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）および２−（ベンジルオキシ）アセトアルデヒド（１３６ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）を酢酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．４、５ｍＬ）およびＭｅＣＮ（５ｍＬ）に溶解した。２４時間後、溶媒を減圧下で除去し、ＳｉＯ２（ＥｔＯＡｃ＋２％ＴＥＡ）でのカラムクロマトグラフィーにより、無色の固体として所望の生成物を得た。ＮＭＲ分光法により環化生成物を確認した。
Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ＋２％ＴＥＡ）：０．３８
1H NMR (400 MHz, クロロホルム-d) δ = 7.39 - 7.33 (m, 4H), 7.33 - 7.27 (m, 1H), 6.56 (dt, J=0.9, 1.8 Hz, 1H), 6.13 (dd, J=2.8, 3.5 Hz, 1H), 5.87 - 5.83 (m, 1H), 4.63 - 4.56 (m, 3H), 4.26 (dd, J=3.5, 8.7 Hz, 1H), 4.01 - 3.89 (m, 2H), 3.88 - 3.82 (m, 1H), 3.60 (dd, J=8.8, 9.4 Hz, 1H), 3.35 - 3.27 (m, 1H), 3.17 - 3.08 (m, 1H), 2.36 - 2.26 (m, 1H)
説明：２−（１Ｈ−ピロール−１−イル）エタン−１−アミンは、「タンパク質適合性」条件でアルデヒドと反応する。１Ｈ  ＮＭＲは、これらの条件下でピクテ−スペングラー反応（イミン形成とその後のＣ−Ｃ閉環）が起こることを証明し、安定した二環式生成物（１５）を提供する。
【０１６３】
実施例１６
ホルミルグリシン含有ペプチドと反応させたときの、α−、β−およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールそれぞれの変換率の比較：
α−、β−およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールを同一条件下でホルミルグリシン含有ペプチド（１１）（配列番号１）と反応させた。反応条件は、ペプチド（１１）（配列番号１）（１０ｍＭ水溶液）１０μＬおよびアミン（α−、β−およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールのそれぞれ、各アミン５０ｍＭ水溶液として）２０μＬを、酢酸塩緩衝液１７０μＬ（０．０５Ｍ、ｐＨ＝５．４）、３７℃、に加えた。この反応を図１Ａに模式的に示す。
【０１６４】
同一条件下でホルミルグリシン含有ペプチド（１１）と反応させたときの、α−、β−およびＮ−（２−アミノエチル）ピロールの反応速度を比較する。ピロールは、α位置でより反応性が高いことが知られており、これによれば、β置換ピロール（閉環はαで起こる）は、α置換ピロールよりもわずかに速く反応する。驚くべきことに、Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールの変換は、α−およびβ−（２−アミノエチル）ピロールそれぞれの両方の変換よりも大幅に高速である。Ｎ−（２−アミノエチル）ピロールのより高速で効率的な変換は、図１Ｂから容易に明らかになる。
【０１６５】
実施例１７
ホルミルグリシン含有ペプチド（１１）とＮ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）とのコンジュゲーション
【０１６６】
【化２４】
2020516656.tif 000026
【０１６７】
酢酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．４、７０μＬ）に、Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）（Ｈ２Ｏ中２０μＬ、５０ｍＭ）および＊Ａｃ−＊Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＧＳＬＦＴＧＲＫ＊−ＯＨ＊（１１）（配列番号１を参照）（Ｈ２Ｏ中１０μＬ、１０ｍＭ）を加え、混合物を３７℃で６時間振とうして、基質の所望の環化コンジュゲートへの完全な変換を得た（１６）。
【０１６８】
この実験から明らかになったように、ピロロピクテ−スペングラー化学を介して、温和な（＝タンパク質適合性）条件下で、式Ｉの標識、すなわち化合物（５）を生体分子（化合物（１１）に含まれるペプチド）に結合させることができる。６時間以内に中程度の過剰のピロール標識（５）を使用して、所望の生成物への完全な変換が得られる。
【０１６９】
実施例１８
４−ホルミルベンズアミド−ウンデカノ−ル−ヘキサホスフェート−シチジン（１４）と５’−ピロロ−アラニン−アミノヘキサノール−Ｔ１０−３’（１２）とのコンジュゲーション
【０１７０】
【化２５】
2020516656.tif 000027
【０１７１】
酢酸塩緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝５．４、５０μＬ）に、５’−ピロロ−アラニン−アミノヘキサノール−Ｔ１０−３’（１２）（Ｈ２Ｏ中３０μＬ、１．２ｍＭ）および４−ホルミルベンズアミド−ウンデカノール−ヘキサホスフェート−シチジン（１４）（Ｈ２Ｏ中、１０μＬ、３．６ｍＭ）を加え、混合物を３７℃で１６時間振とうして、基質の所望の環化コンジュゲート（１７）へのほぼ完全な変換を得た。
（１７）：ＭＳ（ＥＳＩ）：実測値  １４３９．７［（Ｍ−３Ｈ）／３］−  ＋３８
この例では、オリゴヌクレオチド／ヌクレオチドビルディングブロックのコンジュゲーションのためのピロロピクテ−スペングラー反応の実行可能性が実証されている。０．４ｍＭのＬＣＭＳの濃度での化学量論的１：１反応では、１６時間以内に基質のコンジュゲーション生成物へのほぼ定量的な変換が示される。
【０１７２】
実施例１９
ビオチン−ＰＥＧ３−Ｎ−ＰｙｒＡｌａ標識と抗体を含むホルミルグリシンとのバイオコンジュゲーション
抗体の発現と精製
ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖を、標準的なクローニング技術を使用して、重鎖Ｃ末端に１３アミノ酸アルデヒドタグ（ＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ；配列番号２）を含む哺乳動物発現ベクターにクローニングした。重鎖および軽鎖をコードするプラスミドと、ＳＵＭＦ１を過剰発現するプラスミド（ｐＲＥＣＥＩＶＥＲ−ＳＵＭＦ１、ＧｅｎｅＣｏｐｏｅｉａから購入）の両方をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に同時トランスフェクトした。ＳＵＭＦ１は、アルデヒドタグ配列に含まれるシステインをホルミルグリシンに変換し、したがってＬＣＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ（配列番号２）をＬ＊ホルミルグリシン＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ（配列番号３）に変換する。ＩｇＧを、供給元の指示に従って、一段階プロテインＡアフィニティー精製（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ）を介して培養上清から精製した。
【０１７３】
ビオチン化
Ｌ＊ホルミルグリシン＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ（２００μＭ）で各重鎖のＣ末端にタグ付けされたＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体を３７℃で、５倍で２４時間、または３倍過剰のピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）で４８時間コンジュゲートした。すべてのコンジュゲートを、Ｚｅｂａスピンカラム（４０Ｋ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入）を介して精製して、酵素と非コンジュゲート標識を除去した。
【０１７４】
ＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ−アナリティクス
ＩｇＧビオチン化を、フルオレセイン標識ストレプトアビジン（ＳＡ−ＦＬＵＯ）との錯体形成によって評価した。ＳＡ−ＦＬＵＯ−ＩｇＧ−ビオチン−ＳＡ−ＦＬＵＯ錯体を、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＴＳＫ  ＧＦＣ３００、ＴＯＳＯＨ）によって分析した。詳細には、等量（５０μｌ）のビオチン化ＩｇＧ（ｃ＝０．６ｍｇ／ｍｌ）およびＳＡ−ＦＬＵＯ（ｃ＝０．３ｍｇ／ｍｌ）を混合し、室温で５分間培養した。２０μｌの１００ｍＭビオチンを加えた。２５μｌの各試料をＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＷ  ７．８×１５０ｍｍカラムに注入し、２８０および４９４ｎｍで吸光プロファイルを監視した。２８０および４９４ｎｍで吸光プロファイルを有するＳＡ−ＦＬＵＯ−ＩｇＧ−ビオチン錯体の存在により、ビオチン化の成功を監視する。
【０１７５】
Ｅｌｅｃｓｙｓ  ＴＳＨの免疫学的測定
上記のように得られた、ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体からの部位特異的に標識されたＩｇＧ−ビオチンコンジュゲートを、ビオチン化抗ＴＳＨ抗体を含まない元来のＴＳＨ緩衝液中に２．５μｇ／ｍｌの濃度で使用し、これにより、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）免疫分析ラックパック（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のＲ１コンパートメント内のビオチン化試薬を交換する。ＴＳＨ  ＣａｌＳｅｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の２つのキャリブレーターであるＣａｌ１およびＣａｌ２を、Ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０モジュール上のＴＳＨ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）免疫分析（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、製造元（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）が提供する標準分析プロトコルに従って分析した。
【０１７６】
ビオチン−ＰＥＧ３−Ｎ−ＰｙｒＡｌａ標識と、ホルミルグリシン含有抗体および配列ＬＡＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ（配列番号４）を含む変異体抗体それぞれとのバイオコンジュゲーション
（Ａ）他のアルデヒドタグ付けに適した条件下では、１００倍過剰のＮ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン標識（５）は、配列番号４、すなわち、ホルミルグリシンを含まないポリペプチド配列（システインの代わりにアラニン；システインのみがホルミルグリシンに変換できる）を含む変異体抗体と非特異的に反応しない。
【０１７７】
（Ｂ）＆（Ｃ）５倍または３倍過剰のＮ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）で、配列番号３のＣ末端アルデヒドタグを含む抗体を、２４時間と４８時間それぞれ内で定量的にコンジュゲートする。（Ｂ）または（Ｃ）のコンジュゲーション反応を図２に示す。
【０１７８】
この方法で得られたコンジュゲートを、ＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析を使用したサイズ排除クロマトグラフィーにより分析する。ＴＳＫ  ＧＦＣ３００  ＳＡ−ＦＬＵＯ分析の結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。
【０１７９】
実施例２０
コンジュゲートの安定性試験
ＴＳＨに対するマウスモノクローナル抗体からの部位特異的に標識されたＩｇＧ−ビオチンコンジュゲート（実施例１９に記載のように得られた）を、Ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０モジュール上のＴＳＨ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）免疫分析（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で分析した。新規のコンジュゲートおよび元来の（ｏｒｉ）または標準のビオチンコンジュゲートを、それぞれ２．５μｇ／ｍｌの濃度で同じ緩衝液で希釈した。両方をＥｌｅｃｓｙｓ（登録商標）免疫分析ラックパック（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のＲ１コンパートメントに入れ、この市販のアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に指定された標準手順に従って分析を実施した。キャリブレーターの１つである安定性評価のために、元来のおよび新規のコンジュゲートの両方を使用して、ＴＳＨ  ＣａｌＳｅｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）のＣａｌ２を、Ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｅ１７０モジュール上のＴＳＨ  Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）免疫分析（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、ｔ＝０および７日後の３５℃のそれぞれで測定した。
【０１８０】
Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン標識（５）と、Ｃ−末端アルデヒドタグを含む抗体とのコンジュゲーションにより得られたＩｇＧ−ビオチンコンジュゲートは、３５℃で７日間培養した後、良好な安定性を示す。
【０１８１】
実施例２１
Ｎ−ピロロ−アラニンまたはα−ピロロ−アラニンのいずれかを使用して生成されたコンジュゲートの抗体コンジュゲーション効果と性能の比較
Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（５）およびα−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）それぞれと、配列番号３（Ｌ＊ＦｏｒｍｙｌＧｌｙ＊ＴＰＳＲＡＡＬＬＴＧＲ）のＣ末端アルデヒドタグを含む抗体とのコンジュゲーション効率の直接比較は、Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン標識が、ほぼ定量的に抗体を標識コンジュゲートに変換する（図５Ａを参照）一方、α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチンとの培養後、大量の非結合抗体が検出される（図５Ｂを参照）。ＴＳＨ−Ｅｌｅｃｓｙｓ分析の性能と３週間後のコンジュゲートの安定性を、本質的に実施例２０に記載されているように調査した。α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン抗体コンジュゲートは、Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン抗体コンジュゲートよりも安定性が低いため、使用した活性化α−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン（７）の低い反応性および／またはこのカップリング試薬との不完全な環化反応を示す。それとは反対に、Ｎ−ピロロ−アラニン−ＰＥＧ２−ビオチン抗体コンジュゲート、すなわち本明細書に開示される化合物および方法に基づくコンジュゲートは、高収率で生成することができ、免疫分析における良好な性能と良好な保存安定性の両方を実証する。
【図１】
2020516656.tif 000034
【図２】
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【図３Ａ】
2020516656.tif 000036
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2020516656.tif 000038
【図４】
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【図５Ａ】
2020516656.tif 000040
【図５Ｂ】
2020516656.tif 000041
【図５Ｃ】
2020516656.tif 000042
【配列表】
2020516656000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年9月3日(2018.9.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩの化合物を生成する方法であって、
式Ｉの化合物を、以下に示すように、アルデヒド基を含む標的と反応させ、
【化１】
2020516656.tif 000043
それにより式ＩＩ
【化２】
2020516656.tif 000044
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｌは、存在しないかまたはリンカーであり、
Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよび官能基からなる群から選択される対象部分であり、
Ｔは、固相、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドおよび核酸からなる群から選択される標的分子であり、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つが−ＬＭである。］
の化合物を得ることを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が、独立して、Ｈまたはメチルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、対象部分Ｍが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体、およびマレイミドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、標的分子Ｔが、ポリペプチド、タンパク質または核酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、標的分子Ｔが抗体である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、存在しないか、あるいは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンもしくはトリアゾールを含んでもよく、またはそれからなってもよい、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキルまたはオリゴペプチドから選択される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
式Ｉまたは式ＩＩの化合物それぞれにおいて、リンカーＬが、エステル、エーテル、チオエーテル、アミン、アミド、ジスルフィド、カーボネート、カルバメート、アルケン、トリアゾール、ジヒドロピリダジンまたはホスホジエステル結合を介して、対象部分Ｍに結合している、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
式ＩＩ
【化３】
2020516656.tif 000045
［式中、Ｒ１からＲ８およびＴは、請求項１から８において規定された通りである。］
の化合物。
【請求項１０】
式ＩＩＩ
【化４】
2020516656.tif 000046
［式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、独立して、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、置換もしくは非置換ヘテロアリール、または−ＬＭであり、
Ｒ８は、Ｈ、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、または置換もしくは非置換ヘテロアリールであり、
Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のうちの２つが連結して、置換もしくは非置換シクロアルキルまたは置換もしくは非置換ヘテロシクロアルキルを形成してもよく、
Ｍは、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド、標識、細胞毒性剤、結合対のパートナーおよびマレイミドからなる群から選択される対象部分であり、
リンカーＬは、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換ヘテロアルキル、またはオリゴペプチドから選択され、かつ、アミド結合、エステル結合、アルケンまたはトリアゾールを含んでもよく、
ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは−ＬＭである。］
の物質。
【請求項１１】
Ｍが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、蛍光または発光標識、細胞毒性剤、ビオチンまたはビオチン類似体、ジゴキシンまたはジゴキシン類似体およびマレイミドからなる群から選択される、請求項１０に記載の物質。
【請求項１２】
Ｍが、発光標識、細胞毒性剤およびビオチンまたはビオチン類似体からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の物質。
【請求項１３】
Ｍがオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドである、請求項１０または１１に記載の物質。
【国際調査報告】
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