(57)【要約】本発明によれば、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
【請求項２】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のジペプチド合成用蛋白質。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）
で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質
【請求項３】
以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］請求項１記載の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
【請求項４】
請求項３記載のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。
【請求項５】
請求項４記載の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
【請求項６】
形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である請求項５記載の形質転換体。
【請求項７】
微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項６記載の形質転換体。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項１記載の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項９】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する請求項１記載の蛋白質の製造法。
【請求項１０】
微生物がストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である請求項９記載の製造法。
【請求項１１】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトミセス属に属する微生物である請求項１０記載の製造法。
【請求項１２】
アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物が、ストレプトマイセス・アルボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｒｕｓ）またはストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）である請求項１１記載の製造法。
【請求項１３】
請求項１記載の蛋白質または請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
【請求項１４】
以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表される直鎖ジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］請求項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物
［２］請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
［３］請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
【請求項１５】
請求項１記載の蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトマイセス属に属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１６】
請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトマイセス属に属する微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項１７】
ストレプトマイセス属に属する微生物が、アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物である請求項１５または１６記載の製造法。
【請求項１８】
アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物が、ストレプトマイセス・アルボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｒｕｓ）またはストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）に属する微生物である請求項１７記載の製造法。
【請求項１９】
請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物である請求項１４記載の製造法。
【請求項２０】
請求項２記載のジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である請求項１９記載の製造法。
【請求項２１】
培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２２】
１種以上のアミノ酸が、Ｌ体もしくはＤ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体である請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２３】
ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４  （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体もしくはＤ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体を表す）で表されるジペプチドである請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の製造法。
【請求項２４】
Ｌ体またはＤ体のアミノ酸が、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、α−アミノ酪酸、アザセリン、テアニン、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリンおよび６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸である請求項２２または２３記載の製造法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、ジペプチド合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの製造法、ジペプチド合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する微生物または形質転換体、および該微生物または形質転換体を用いたジペプチドの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】  ペプチドの大量合成法については、化学合成法（液相法、固相法）、酵素的合成法およびＤＮＡ組換え法を用いた生物学的合成法が知られている。現在、５０残基以上の長鎖のペプチドに関しては酵素的合成法あるいは生物学的合成法が用いられ、ジペプチドに関しては化学合成法と酵素的合成法が主に用いられている。
化学合成法によるジペプチドの合成では、官能基の保護・脱保護などの操作が必要であり、またラセミ体も合成されることから、化学合成法は経済的、効率的な方法とはいえない。また、化学合成法は大量の有機溶媒等を使うため環境衛生上も好ましい方法ではない。【０００３】  酵素法によるジペプチドの合成に関しては、タンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の逆反応を利用した方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，７０７−７２０（１９３７）］、耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法（特開昭５８−１４６５３９号公報、特開昭５８−２０９９９１号公報、特開昭５８−２０９９９２号公報、特開昭５９−１０６２９８号公報）、非リボゾームペプチドシンセターゼ（以下、ＮＲＰＳと称す）を利用する方法［Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，７，３７３−３８４（２０００）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４９８，４２−４５（２００１）、米国特許第５７９５７３８号、米国特許第５６５２１１６号］が知られている。【０００４】  しかし、タンパク分解酵素の逆反応を利用した方法では、基質となるアミノ酸の官能基の保護・脱保護が必要であり、ペプチド形成反応の効率化およびペプチド分解反応の阻止が困難といった問題点がある。耐熱性アミノアシルｔ−ＲＮＡ合成酵素を利用する方法には、酵素の発現、目的産物以外の副生反応の阻止が困難という問題点がある。ＮＲＰＳを利用する方法に関しては、酵素分子が巨大なためにＤＮＡ組換え法を用いて該酵素を発現することが困難であること、補酵素である４’−ホスフォパンテテイン（４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅ）の供給が必要であり、効率的な製造法とはいえない。【０００５】  一方、酵素分子量がＮＲＰＳより小さく、補酵素である４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｅを必要としないγ−グルタミルシステインシンセターゼ（γ−ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、グルタチオンシンセターゼ（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）、Ｄ−アラニン−Ｄ−アラニン（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａ）リガーゼ（Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａｌｉｇａｓｅ）、ポリ−γ−グルタミン酸シンセターゼ（ｐｏｌｙ−γ−ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）等の一群のペプチドシンセターゼも知られている。これらの酵素の殆どはＤ−アミノ酸を基質に用いる、またはγ位のカルボキシル基でのペプチド結合の形成を触媒する等の特徴を有するため、Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でペプチド結合するジペプチドの合成に用いることはできない。【０００６】  Ｌ−アミノ酸のα位カルボキシル基でのペプチド結合形成活性によるジペプチド生成が知られているのはバチルス属に属する微生物由来のジペプチド抗生物質であるバシリシン合成酵素のみである。バシリシン合成酵素は、バシリシン（Ｌ−アラニル−Ｌ−アンチカプシン、Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−ａｎｔｉｃａｐｓｉｎ）およびＬ−アラニル−Ｌ−アラニン（Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ）を合成する活性を有することは知られているが、その他のジペプチドの合成活性については知られていない［Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２，２０１−２０８（１９８７）、Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．��２９，４００−４０６（２００１）］。【０００７】  ある種の微生物は２つのアミノ酸が環状につながった環状ジペプチド（ジケトピペラジン）構造を持つ化合物を生成することも知られている［Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５９，２９３−２９６（１９９６）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２８，２９９９（１９７２）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，８６，２９−５３（１９９９）］。ジケトピペラジンの生合成については、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｃｉｄｉｓｃａｂｉｅｓのＴｈａｘｔｏｍｉｎ生合成過程ではＮＲＰＳによってｃｙｃｌｏ−（Ｌ−４−ｎｉｔｒｏｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）構造が合成される［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３８，７９４−８０４（２０００）］こと、およびバチルス属細菌のＮＲＰＳの一部のモジュールの作用によってフェニルアラニンとプロリンからｃｙｃｌｏ（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ）が生成すること［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３，２２７７３−２２７８１（１９９８）］が報告されている。【０００８】  一方、抗生物質であるアルボノルシン（ａｌｂｏｎｏｕｒｓｉｎ）の生産株として知られているストレプトマイセス・ノルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）ＡＴＣＣ１１４５５株ではＮＲＰＳ酵素とは全く類似性のない蛋白質（ａｌｂＣ遺伝子産物）がシクロ（Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン）［ｃｙｃｌｏ（Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｙｌ−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎｅ）］構造の合成を担っていること、ａｌｂＣ遺伝子を導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓの培養液にｃｙｃｌｏ  ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｘｉｄａｓｅを作用させるとアルボノルシンが検出されたとの報告はある［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌ．，９，１３５５−１３６４（２００２）］が、ａｌｂＣ遺伝子産物が直鎖状のジペプチドを生成するとの報告はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明の目的は、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明は、以下の（１）〜（２４）に関する。
（１）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）。
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質
（２）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のジペプチド合成用蛋白質。
［１］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）
で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質
［３］配列番号１で表されるアミノ酸配列と６５％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質
（３）以下の［１］〜［３］のいずれかに記載のＤＮＡ（ただし、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）。
［１］上記（１）の蛋白質をコードするＤＮＡ
［２］配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ
［３］配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ
（４）上記（３）のＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ。【００１１】  （５）上記（４）の組換え体ＤＮＡを有する形質転換体。
（６）形質転換体が、微生物を宿主として得られる形質転換体である上記（５）の形質転換体。
（７）微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である上記（６）の形質転換体。【００１２】  （８）上記（５）〜（７）のいずれか１つに記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に上記（１）の蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。
（９）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物を培地に培養し、培養物中に該蛋白質を生成、蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取する上記（１）の蛋白質の製造法。【００１３】  （１０）微生物がストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生物である上記（９）の製造法。
（１１）ストレプトマイセス属に属する微生物が、アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトミセス属に属する微生物である上記（１０）の製造法。
（１２）アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物が、ストレプトマイセス・アルボラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｒｕｓ）またはストレプトマイセス・ノルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｎｏｕｒｓｅｉ）である上記（１１）の製造法。【００１４】  （１３）上記（１）の蛋白質または上記（２）のジペプチド合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。【００１５】  （１４）以下の［１］〜［３］から選ばれる培養物または該培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法。
［１］上記（５）〜（７）のいずれか１つに記載の形質転換体の培養物または該培養物の処理物
［２］上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
［３］上記（２）のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物
（１５）上記（１）の蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトマイセス属に属する微生物である上記（１４）の製造法。【００１６】  （１６）上記（２）のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、ストレプトマイセス属に属する微生物である上記（１４）の製造法。
（１７）ストレプトマイセス属に属する微生物が、アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物である上記（１５）または（１６）の製造法。【００１７】  （１８）アルボノルシンを生産する能力を有するストレプトマイセス属に属する微生物が、ストレプトマイセス・アルボラスまたはストレプトマイセス・ノルセイに属する微生物である上記（１７）の製造法。
（１９）上記（２）のジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物が、上記（２）のジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物である上記（１４）の製造法。
（２０）上記（２）のジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である上記（１９）の製造法。
（２１）培養物の処理物が、培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物、該菌体の蛋白質分画物、該菌体の固定化物あるいは該菌体より抽出して得られる酵素標品であることを特徴とする、上記（１４）〜（２０）のいずれか１つの製造法。【００１８】  （２２）１種以上のアミノ酸が、Ｌ体もしくはＤ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体である上記（１３）〜（２１）のいずれか１つの製造法。
（２３）ジペプチドが式（ＩＩ）
Ｒ３−Ｒ４  （ＩＩ）
（式中、Ｒ３およびＲ４は同一または異なって、Ｌ体もしくはＤ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体を表す）であらわされるジペプチドである上記（１３）〜（２２）のいずれか１つの製造法。【００１９】  （２４）Ｌ体またはＤ体のアミノ酸が、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、チロシン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、α−アミノ酪酸、アザセリン、テアニン、４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、オルニチン、シトルリンおよび６−ジアゾ−５−オキソノルロイシンから選ばれるアミノ酸である上記（２２）または（２３）の製造法。
【発明の効果】
【００２０】  本発明によれば、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡ、該組換え体ＤＮＡを保有する形質転換体、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の製造法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を用いたジペプチドの酵素的合成法、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物または形質転換体の培養物等を酵素源に用いたジペプチドの製造法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ジペプチドの合成活性を有する蛋白質の発現プラスミドベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕおよびｐＡＬ−ａｌｂの構築過程を示す図である。
【符号の説明】
【００２２】Ａｍｐｒ：アンピシリン耐性遺伝子
ｌａｃＩｑ：ラクトースリプレッサー遺伝子
ａｌｂＣ：ａｌｂＣ遺伝子またはａｌｂＣ類似遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】  本発明の蛋白質としては、以下の［１］〜［３］記載の蛋白質（ただし、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質を除く）、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質、
［２］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）
Ｒ１−Ｒ２  （Ｉ）
（式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なってアミノ酸を表す）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、および
［３］配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質、
をあげることができる。【００２４】  また、本発明のジペプチド合成用蛋白質としては、以下の［４］〜［６］記載のジペプチド合成用蛋白質、
［４］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するジペプチド合成用蛋白質、
［５］配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質、
［６］配列番号１で表されるアミノ酸配列と６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有するジペプチド合成用蛋白質、
をあげることができる。【００２５】  以下、上記本発明の蛋白質およびジペプチドの合成用蛋白質を合わせて本発明の蛋白質と称する場合もある。
上記において、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。【００２６】  欠失、置換または付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換または付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１または複数のアミノ酸が欠失、置換または付加されていてもよい。【００２７】  アミノ酸の置換が可能なアミノ酸としては、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列を公知のアライメントソフトウェアを用いて比較したときに、すべてのアミノ酸配列において保存されていないアミノ酸をあげることができる。公知のアライメントソフトウェアとしては、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株式会社）に含まれるアライメント解析ソフトをあげることができる。該解析ソフトの解析パラメータとしては、デフォルト値を用いることができる。【００２８】  また、アミノ酸の欠失または付加が可能なアミノ酸の位置としては、例えば配列番号１または２で表されるアミノ酸配列のＮ末端側およびＣ末端側をあげることができる。
欠失、置換または付加は同時に生じてもよく、置換または付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。【００２９】  以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、本発明の蛋白質が式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有するためには、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列との相同性が６５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有していることが望ましい。【００３０】  アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。【００３１】  本発明の蛋白質が、式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質であることを確認する手段としては、例えばＤＮＡ組換え法を用いて本発明の蛋白質を発現する形質転換体を作製し、該形質転換体を用いて本発明の蛋白質を製造した後、本発明の蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該水性媒体中に上記式（Ｉ）で表されるジペプチドが生成、蓄積するか否かをＨＰＬＣ等により分析する方法をあげることができる。【００３２】  本発明のＤＮＡとしては、以下の［１］〜［３］記載のＤＮＡ（ただし、配列番号３で表される塩基配列からなるＤＮＡを除く）、
［１］配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［２］配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［３］配列番号４で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００３３】  また、本発明の式（Ｉ）で表されるジペプチドの製造法に用いることができるＤＮＡとしては、上記［１］〜［３］記載のＤＮＡに加え、以下の［４］〜［６］記載のＤＮＡ、
［４］配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
［５］配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡ、および
［６］配列番号３で表される塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ式（Ｉ）で表されるジペプチド合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、
をあげることができる。【００３４】  ここでいう「ハイブリダイズする」とは、特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部にＤＮＡがハイブリダイズすることである。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザンまたはサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、またはＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡをあげることができるが、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡであってもよい。【００３５】  ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えば当業者であれば本願明細書に従い、ハイブリダイゼーションの条件を決定することができる。該ハイブリダイゼーションの条件は、モレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従っておこなうことができる。【００３６】  上記のストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件が好ましいが、より低いストリンジェント条件を用いることもできる。ストリンジェンな条件の変更は、ホルムアミドの濃度調整（ホルムアミドの濃度を下げるほど低ストリンジェントになる）、塩濃度および温度条件の変更により可能である。低ストリンジェント条件としては、例えば６×ＳＳＣＥ（２０×ＳＳＣＥは、３ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム、０．２ｍｏｌ／ｌのリン酸二水素ナトリウム、０．０２ｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で、３７℃で一晩インキュベートした後、５０℃の１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液を用いて洗浄する条件をあげることができる。また、さらに低いストリンジェントな条件としては、上記した低ストリンジェント条件において、高塩濃度（例えば５×ＳＳＣ）の溶液を用いてハイブリダイゼーションを行った後、洗浄する条件をあげることができる。【００３７】  上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、または変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて上記したパラメータ等に基づいて計算したときに、配列番号３または４で表される塩基配列と少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。【００３８】  配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡが、式（Ｉ）で表されるジペプチドの合成活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡであることは、例えば上記したように、組換えＤＮＡ法を用いて該ＤＮＡにコードされる蛋白質を製造し、該蛋白質の活性を測定することにより確認することができる。
（ｉ）本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法に用いられるＤＮＡの調製
本発明のＤＮＡ、および本発明の蛋白質またはジペプチドの製造法（以下、単に本発明の製造法ともいう）に用いられるＤＮＡは、例えば、配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計することができるプローブを用いた、ストレプトマイセス属に属する微生物の染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション、または配列番号３または４で表される塩基配列に基づき設計することができるプライマーＤＮＡを用いた、ストレプトマイセス属に属する微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ［ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）］により取得することができる。【００３９】  また、各種の遺伝子配列データベースに対して配列番号１または２で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の相同性を有する配列を検索し、該検索によって得られた塩基配列に基づき、該塩基配列を有する生物の染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡライブラリー等から上記した方法により本発明のＤＮＡ、または本発明の製造法に用いられるＤＮＡを取得することもできる。【００４０】  取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断し、常法によりベクターに組み込み、得られた組換え体ＤＮＡを宿主細胞に導入した後、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）］あるいは３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより、該ＤＮＡの塩基配列を決定することができる。【００４１】  塩基配列を決定した結果、取得されたＤＮＡが部分長であった場合は、該部分長ＤＮＡをプローブに用いた、染色体ＤＮＡライブラリーに対するサザンハイブリダイゼーション法等により、全長ＤＮＡを取得することができる。
更に、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。【００４２】  上記のようにして取得されるＤＮＡとして、例えば、配列番号３または４で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを組み込むベクターとしては、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＤＩＲＥＣＴ［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，６０６９（１９９０）］、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（ノバジェン社製）、ｐＣＲＩＩ（インビトロジェン社製）およびｐＣＲ−ＴＲＡＰ（ジーンハンター社製）などをあげることができる。【００４３】  宿主細胞としては、エシェリヒア属に属する微生物などをあげることができる。エシェリヒア属に属する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、エシェリヒア・コリＭＥ８４１５等をあげることができる。【００４４】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の製造法に用いられるＤＮＡを保有する微生物としては、例えば配列番号３で表される配列を有するＤＮＡを含有する組換え体ＤＮＡを保有する微生物であるエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕをあげることができる。
（ｉｉ）本発明の蛋白質および本発明のジペプチド合成用蛋白質の製造法
本発明の蛋白質および本発明のジペプチド合成用蛋白質は、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー等に記載された方法等を用い、例えば以下の方法により、上記（ｉ）の方法により取得した本発明のＤＮＡおよび本発明の製造法に用いられるＤＮＡを宿主細胞中で発現させて、製造することができる。【００４５】  本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡをもとにして、必要に応じて、本発明の蛋白質または本発明のジペプチド合成用蛋白質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製する。また、該蛋白質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該蛋白質の生産率を向上させることができる。【００４６】  該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換え体ＤＮＡを作製する。
該組換え体ＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、本発明の蛋白質を生産する形質転換体を得ることができる。
宿主細胞としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができ、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属、バチルス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア属に属する微生物をあげることができる。【００４７】  発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを有する組換え体ＤＮＡは、原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。【００４８】  発現ベクターとしては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ８（キアゲン社製）、ｐＱＥ６０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭＢＰ−５４０７）より調製］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製］、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）等を例示することができる。【００４９】  プロモーターとしては、エシェリヒア・コリ等の宿主細胞中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。【００５０】  さらにバチルス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）］やコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する微生物中で発現させるためのＰ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］、ストレプトマイセス属に属する微生物中で発現させるためのｘｙｌＡプロモーター（ＧｅｎｅｔｉｃＭａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ  Ｉｎｎｅｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ）なども用いることができる。【００５１】  リボソー��結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。
本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに結合させた組換え体ＤＮＡにおいては、転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。【００５２】  このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばｐＡＬ−ｎｕｏおよびｐＡＬ−ａｌｂをあげることができる。
原核生物としては、エシェリヒア属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム属（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アリシクロバチルス属（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アナベナ（Ａｎａｂｅｎａ）属、アナシスティス（Ａｎａｃｙｓｔｉｓ）属、アスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、アゾバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、メチロバクテリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フォルミディウム（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、セネデスムス（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、シネコッカス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｃｕｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物、例えば、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＸＬ２−Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリＤＨ１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、エシェリヒア・コリＭＣ１０００、エシェリヒア・コリＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリＷ１４８５、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＮｏ．４９、エシェリヒア・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＮＹ４９、エシェリヒア・コリＭＰ３４７、エシェリヒア・コリＮＭ５２２、バチルス・サチリスＡＴＣＣ３３７１２、バチルス・メガテリウム、バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＦＥＲＭ  ＢＰ−６０３０、バチルス・アミロリケファスエンス、バチルス・コアギュランス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・プミルス、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、ブレビバクテリウム・イマリオフィルム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４２９７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、ミクロバクテリウム・アンモニアフィルム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１５３５４、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンチコラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・リケファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）Ｄ−０１１０、アグロバクテリウム・ラジオバクタ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾジーンズ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉ）、アナベナ・シリンドリカ（Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ）、アナベナ・ドリオルム（Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ）、アナベナ・フロスアクア（Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓ−ａｑｕａｅ）、アースロバクター・オーレッセンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｕｒｅｓｃｅｎｓ）、アースロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）、アースロバクター・グロブフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｆｏｒｍｉｓ）、アースロバクター・ヒドロカーボグルタミカス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ）、アースロバクター・ミソレンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｍｙｓｏｒｅｎｓ）、アースロバクター・ニコチアナ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ）、アースロバクター・パラフィネウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ）、アースロバクター・プロトフォルミエ（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｒｏｔｏｐｈｏｒｍｉａｅ）、アースロバクター・ロセオパラフィナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｒｏｓｅｏｐａｒａｆｆｉｎｕｓ）、アースロバクター・スルフレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｅｕｓ）、アースロバクター・ウレアファシエン（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）、クロマチウム・ブデリ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ）、クロマチウム・テピダム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ）、クロマチウム・ビノサム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、クロマチウム・ワーミンギ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ）、クロマチウム・フルビアタティレ（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅ）、エルビニア・ウレドバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ）、エルビニア・カロトバラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、エルビニア・アナス（Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ）、エルビニア・ヘリコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）、エルビニア・パンクタタ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ）、エルビニア・テレウス（Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ）、メチロバクテリウム・ロデシアナム（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｏｄｅｓｉａｎｕｍ）、メチロバクテリウム・エクソトルクエンス（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ）、フォルミディウム・エスピー（Ｐｈｏｒｍｉｄｉｕｍｓｐ．）ＡＴＣＣ２９４０９、ロドバクター・カプスラタス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、ロドシュードモナス・ブラスチカ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ）、ロドシュードモナス・マリナ（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ）、ロドシュードモナス・パルストリス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ）、ロドスピリウム・リブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍｒｕｂｒｕｍ）、ロドスピリウム・サレキシゲンス（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ）、ロドスピリウム・サリナラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍ）、ストレプトマイセス・アンボファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・オーレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプトマイセス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトマイセス・フンジシディカ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・グリセオクロモゲナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、ストレプトマイセス・オリボグリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトマイセス・ラメウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ）、ストレプトマイセス・タナシエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトマイセス・ビナセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ）、ザイモモナス・モビリス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ）等をあげることができ、好ましくはエシェリヒア属、バチルス属、ストレプトマオセス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。【００５３】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等をあげることができる。
酵母菌株を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等を用いることができる。【００５４】  プロモーターとしては、酵母菌株中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターをあげることができる。
宿主細胞としては、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオマイミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、またはキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属等に属する酵母菌株をあげることができ、具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ａｌｌｕｖｉｕｓ）、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、キャンディダ・ウティリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓ）等をあげることができる。【００５５】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０）］、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］等をあげることができる。
動物細胞を宿主として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＭ８（フナコシ社より市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９）、ｐＡＳ３−３（特開平２−２２７０７５）、ｐＣＤＭ８［Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８４０（１９８７）］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ等を用いることができる。【００５６】  プロモーターとしては、動物細胞中で機能するものであればいずれも用いることができ、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のＩＥ（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターあるいはメタロチオネインのプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター等をあげることができる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。【００５７】  宿主細胞としては、マウス・ミエローマ細胞、ラット・ミエローマ細胞、マウス・ハイブリドーマ細胞、ヒトの細胞であるナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞またはナマルバＫＪＭ−１細胞、ヒト胎児腎臓細胞、ヒト白血病細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（特開昭６３−２９９）等をあげることができる。
マウス・ミエローマ細胞としては、ＳＰ２／０、ＮＳＯ等、ラット・ミエローマ細胞としてはＹＢ２／０等、ヒト胎児腎臓細胞としてはＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ヒト白血病細胞としてはＢＡＬＬ−１等、アフリカミドリザル腎臓細胞としてはＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７等をあげることができる。【００５８】  組換え体ＤＮＡの導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法［Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０）］、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６（１９７３）に記載の方法等をあげることができる。【００５９】  昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、蛋白質を生産することができる。【００６０】  即ち、組換え遺伝子導入ベクターおよびバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルスを得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、蛋白質を生産させることができる。
該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（いずれもインビトロジェン社製）等をあげることができる。【００６１】  バキュロウイルスとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）等を用いることができる。
昆虫細胞としては、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の卵巣細胞、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）の卵巣細胞、カイコ卵巣由来の培養細胞等を用いることができる。【００６２】  スポドプテラ・フルギペルダの卵巣細胞としてはＳｆ９、Ｓｆ２１（バキュロウイルス・イクスプレッション・ベクターズ  ア・ラボラトリー・マニュアル）等、トリコプルシア・ニの卵巣細胞としてはＨｉｇｈ５、ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（インビトロジェン社製）等、カイコ卵巣由来の培養細胞としてはボンビクス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）Ｎ４等をあげることができる。
組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への上記組換え遺伝子導入ベクターと上記バキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５）、リポフェクション法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７）］等をあげることができる。【００６３】  植物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクターとして、例えば、Ｔｉプラスミド、タバコモザイクウイルスベクター等をあげることができる。
プロモーターとしては、植物細胞中で機能するものであればいずれのものを用いてもよく、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、イネアクチン１プロモーター等をあげることができる。【００６４】  宿主細胞としては、タバコ、ジャガイモ、トマト、ニンジン、ダイズ、アブラナ、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ等の植物細胞等をあげることができる。
組換えベクターの導入方法としては、植物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を用いる方法（特開昭５９−１４０８８５、特開昭６０−７００８０、ＷＯ９４／００９７７）、エレクトロポレーション法（特開昭６０−２５１８８７）、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（特許第２６０６８５６、特許第２５１７８１３）等をあげることができる。【００６５】  酵母、動物細胞、昆虫細胞または植物細胞により発現させた場合には、糖あるいは糖鎖が付加された蛋白質を得ることができる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養し、培養物中に本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物から採取することにより、該蛋白質を製造することができる。
本発明の蛋白質を製造するための上記形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等いずれであってもよいが、好ましくは細菌、より好ましくはエシェリヒア属に属する微生物、さらに好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。【００６６】  上記形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。
エシェリヒア・コリ等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、該生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００６７】  炭素源としては、該生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。【００６８】  無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。【００６９】  また、培養中必要に応じて、アンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。【００７０】  動物細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，１９９，５１９（１９６７）］、イーグル（Ｅａｇｌｅ）のＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，７３，１（１９５０）］またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。【００７１】  培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているＴＮＭ−ＦＨ培地（ファーミンジェン社製）、Ｓｆ−９００  ＩＩ  ＳＦＭ培地（ライフ・テクノロジーズ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５［いずれもＪＲＨバイオサイエンシーズ社製］、Ｇｒａｃｅ’ｓＩｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ［Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２）］等を用いることができる。【００７２】  培養は、通常ｐＨ６〜７、２５〜３０℃等の条件下で１〜５日間行う。
また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
植物細胞を宿主として得られた形質転換体は、細胞として、または植物の細胞や器官に分化させて培養することができる。該形質転換体を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００７３】  培養は、通常ｐＨ５〜９、２０〜４０℃の条件下で３〜６０日間行う。
また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
上記のとおり、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを発現ベクターに連結した組換え体ＤＮＡを保有する微生物、昆虫細胞、動物細胞、あるいは植物細胞由来の形質転換体を、通常の培養方法に従って培養し、本発明の蛋白質を生成蓄積させ、該培養物より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００７４】  本発明の蛋白質の生産方法としては、宿主細胞内に生産させる方法、宿主細胞外に分泌させる方法、あるいは宿主細胞外膜上に生産させる方法があり、選択した方法に応じて、使用する宿主細胞を選択し、生産させる蛋白質の構造を変更すればよい。
本発明の蛋白質が宿主細胞内あるいは宿主細胞外膜上に生産される場合、ポールソンらの方法［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１７６１９（１９８９）］、ロウらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］、または特開平０５−３３６９６３、ＷＯ９４／２３０２１等に記載の方法を準用することにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。【００７５】  すなわち、遺伝子組換えの手法を用いて、本発明の蛋白質の活性部位を含む蛋白質の手前にシグナルペプチドを付加した形で生産させることにより、該蛋白質を宿主細胞外に積極的に分泌させることができる。
また、特開平２−２２７０７５に記載されている方法に準じて、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子等を用いた遺伝子増幅系を利用して生産量を上昇させることもできる。【００７６】  さらに、遺伝子導入した動物または植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）または植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いて本発明の蛋白質を製造することもできる。
本発明の蛋白質を生産する形質転換体が動物個体または植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育または栽培し、該蛋白質を生成蓄積させ、該動物個体または植物個体より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。【００７７】  動物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば公知の方法［Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６３９Ｓ（１９９６）、Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，６３，６２７Ｓ（１９９６）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，８３０（１９９１）］に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に本発明の蛋白質を生産する方法があげられる。
動物個体の場合は、例えば、本発明のＤＮＡまたは本発明の製造法に用いられるＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、本発明の蛋白質を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を製造することができる。該動物中の生成、蓄積させる場所としては、例えば、該動物のミルク（特開昭６３−３０９１９２）、卵等をあげることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で機能するものであればいずれも用いることができるが、例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター、ホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。【００７８】  植物個体を用いて本発明の蛋白質を製造する方法としては、例えば本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）、組織培養，２１（１９９５）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５，４５（１９９７）］に準じて栽培し、該蛋白質を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該蛋白質を採取することにより、該蛋白質を生産する方法があげられる。【００７９】  本発明の蛋白質を生産する形質転換体を用いて製造された本発明の蛋白質を単離・精製する方法としては、通常の酵素の単離、精製法を用いることができる。
例えば、本発明の蛋白質が、細胞内に溶解状態で生産された場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液にけん濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。【００８０】  該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化成社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。【００８１】  また、該蛋白質が細胞内に不溶体を形成して生産された場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈殿画分より、通常の方法により該蛋白質を回収後、該蛋白質の不溶体を蛋白質変性剤で可溶化する。
該可溶化液を、蛋白質変性剤を含まないあるいは蛋白質変性剤の濃度が蛋白質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、該蛋白質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【００８２】  本発明の蛋白質またはその糖修飾体等の誘導体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該蛋白質またはその糖付加体等の誘導体を回収することができる。
即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより可溶性画分を取得し、該可溶性画分から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、精製標品を得ることができる。【００８３】  このようにして取得される蛋白質として、例えば、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなる蛋白質をあげることができる。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質との融合蛋白質として生産し、融合した蛋白質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる。【００８４】  融合させる蛋白質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのＩｇＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチド、および任意の抗体のエピトープなどがあげられる〔山川彰夫，実験医学，１３，４６９−４７４（１９９５）〕。【００８５】  上記した融合させる蛋白質に親和性をもつ物質としては、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロテインＡのイムノグロブリンＧ結合領域、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ｇｌｕ）、プロテインＧ、マルトース結合タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン鎖（Ｈｉｓ−ｔａｇ）、Ｓペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質ドメイン、Ｔａｃ抗原、チオレドキシン、グリーン・フルオレッセント・プロテイン、ＦＬＡＧペプチドまたは任意の抗体のエピトープを認識する抗体、例えばイムノグロブリンＧなどをあげることができる。【００８６】  また、上記で取得された蛋白質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法により、本発明の蛋白質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ社、パーキン・エルマー社、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ社、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ社、島津製作所等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
（ｉｉｉ）本発明のジペプチドの製造法
（１）酵素的製造法
ジペプチドの酵素的製造法としては、本発明の蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質、１種以上のアミノ酸、およびＡＴＰを水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する方法をあげることができる。【００８７】  上記製造法において、基質に用いられる１種以上のアミノ酸、好ましくは１または２種のアミノ酸としては、Ｌ体またはＤ体のアミノ酸、グリシン（Ｇｌｙ）、β−アラニン（βＡｌａ）およびそれらの誘導体から選ばれるアミノ酸、好ましくはＬ−アミノ酸、ＧｌｙおよびβＡｌａ並びにそれらの誘導体からなる群より選ばれるアミノ酸をあげることができ、該アミノ酸であれば、いずれのアミノ酸をいずれの組み合わせで用いてもよい。Ｌ体またはＤ体のアミノ酸としては、例えばアラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、α−アミノ酪酸（α−ＡＢ）、アザセリン（Ａｚａｓｅｒｉｎｅ）、テアニン（ｔｈｅａｎｉｎｅ）、４−ヒドロキシプロリン（４−ＨＹＰ）、３−ヒドロキシプロリン（３−ＨＹＰ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）および６−ジアゾ−５−オキソノルロイシン（６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）などをあげることができ、Ｌ体のアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−Ｇｌｎ、Ｌ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｌ−Ｖａｌ、Ｌ−Ｌｅｕ、Ｌ−Ｉｌｅ、Ｌ−Ｐｒｏ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｍｅｔ、Ｌ−Ｓｅｒ、Ｌ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｌ−Ａｓｎ、Ｌ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｌｙｓ、Ｌ−Ａｒｇ、Ｌ−Ｈｉｓ、Ｌ−Ａｓｐ、Ｌ−α−ＡＢ、Ｌ−Ａｚａｓｅｒｉｎｅ、Ｌ−ｔｈｅａｎｉｎｅ、Ｌ−４−ＨＹＰ、Ｌ−３−ＨＹＰ、Ｌ−Ｏｒｎ、Ｌ−ＣｉｔおよびＬ−６−ｄｉａｚｏ−５−ｏｘｏ−ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅなどをあげることができる。【００８８】  アミノ酸の誘導体としては、例えばヒドロキシアミノ酸（β−ヒドロキシグルタミン、β−ヒドロキシグルタミン酸、γ−ヒドロキシグルタミン酸、α−ヒドロキシグリシン、β−ヒドロキシバリン、γ−ヒドロキシバリン、β−ヒドロキシロイシン、γ−ヒドロキシロイシン、δ−ヒドロキシロイシン、β−ヒドロキシイソロイシン、γ−ヒドロキシイソロイシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン、２，４，５−トリヒドロキシフェニルアラニン、β−ヒドロキシトリプトファン、５−ヒドロキシトリプトファン、α−ヒドロキシメチオニン、β−ヒドロキシセリン、γ−ヒドロキシスレオニン、Ｓ−ヒドロキシシステイン、β−ヒドロキシアスパラギン、β−ヒドロキシチロシン、β−ヒドロキシリジン、γ−ヒドロキシリジン、δ−ヒドロキシリジン、Ｎ−ヒドロキシリジン、β−ヒドロキシアルギニン、δ−ヒドロキシア���ギニン、Ｎ−ヒドロキシアルギニン、β−ヒドロキシヒスチジン、β−ヒドロキシアスパラギン酸、β−ヒドロキシオルニチン、γ−ヒドロキシオルニチン、Ｎ−ヒドロキシオルニチン）、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｎ−メチル−アラニン、Ｎ−メチル−グルタミン、Ｎ−メチル−グルタミン酸、Ｎ−メチル−グリシン、Ｎ−メチル−バリン、Ｎ−メチル−ロイシン、Ｎ−メチル−イソロイシン、Ｎ−メチル−プロリン、Ｎ−メチル−フェニルアラニン、Ｎ−メチル−トリプトファン、Ｎ−メチル−メチオニン、Ｎ−メチル−セリン、Ｎ−メチル−スレオニン、Ｎ−メチル−システイン、Ｎ−メチル−アスパラギン、Ｎ−メチル−チロシン、Ｎ−メチル−リジン、Ｎ−メチル−アルギニン、Ｎ−メチル−ヒスチジン、Ｎ−メチル−アスパラギン酸、Ｎ−メチル−オルニチン）などをあげることができる。【００８９】  上記製造法に用いられる、より好ましい１または２種のアミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ｐｈｅから選ばれる１または２種のアミノ酸、さらに好ましくは、Ｌ−Ａｌａ、Ｌ−ＬｅｕおよびＬ−Ｐｈｅから選ばれる１種のアミノ酸、またはＬ−ＬｅｕとＬ−Ｐｈｅとからなる２種のアミノ酸をあげることができる。
上記製造法において、本発明の蛋白質またはジペプチド合成用蛋白質は、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ添加する。【００９０】  上記製造法において、基質として用いるアミノ酸は、全量として０．１〜５００ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜２００ｇ／Ｌの濃度になるように水性媒体中に初発または反応途中に添加する。
上記製造法において、エネルギー源として用いるＡＴＰは、０．５ｍｍｏｌ／Ｌ〜１０ｍｏｌ／Ｌの濃度で用いる。
上記製造法で用いられる水性媒体としては、ジペプチドの生成反応を阻害しない限り、いかなる成分、組成の水性媒体であってもよく、例えば、水、りん酸塩、炭酸塩、酢酸塩、ほう酸塩、クエン酸塩、トリスなどの緩衝液などをあげることができる。また、メタノール、エタノールなどのアルコール類、酢酸エチルなどのエステル類、アセトンなどのケトン類、アセトアミドなどのアミド類を含有していてもよい。【００９１】  ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜５０℃、好ましくは２５〜４５℃の条件で２〜１５０時間、好ましくは６〜１２０時間行う。
上記方法で製造されるジペプチドとしては、式（Ｉ）で表されるジペプチドをあげることができ、好ましくは、式（Ｉ）においてＲ１およびＲ２が同時にまたは異なって、Ｌ体もしくはＤ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体であるジペプチド、より好ましくはＬ体のアミノ酸、グリシン、β−アラニンまたはそれらの誘導体であるジペプチドをあげることができる。【００９２】  Ｌ体のアミノ酸およびアミノ酸の誘導体としては、上記した物質をあげることができる。
上記方法で製造される、さらに好ましいジペプチドとしては、Ｌ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−アラニル−Ｌ−アラニン、Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシンおよびＬ−フェニルアラニル−Ｌ−フェニルアラニンなどをあげることができる。
（２）形質転換体または微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源として用いる製造法
形質転換体または微生物の培養物または培養物の処理物を酵素源として用いるジペプチドの製造法としては、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する形質転換体、または本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物の培養物もしくは培養物の処理物を酵素源に用い、該酵素源、および１種以上のアミノ酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に式（Ｉ）で表されるジペプチドを生成、蓄積させ、該媒体から該ジペプチドを採取する該ジペプチドの製造法をあげることができる。【００９３】  上記製造法に用いられる形質転換体としては、上記（ｉｉ）の方法により製造することができる、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生産する形質転換体をあげることができる。該形質転換体の宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞等、植物細胞等をあげることができ、好ましく細菌、より好ましくはエシェリヒア属、バチルス属、ストレプトマイセス属またはコリネバクテリウム属に属する微生物をあげることができる。【００９４】  エシェリヒア属に属する微生物としては、好ましくはエシェリヒア・コリに属する微生物等をあげることができ、バチルス属に属する微生物としては好ましくはバチルス・サチリスまたはバチルス・メガテリウム等に属する微生物をあげることができ、ストレプトマイセス属に属する微生物としては、好ましくはストレプトマイセス・リビダンスをあげることができ、コリネバクテリウム属に属する微生物としては好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムまたはコリネバクテリウム・アンモニアゲネス等に属する微生物をあげることができる。【００９５】  上記製造法に用いられる微生物は、本発明の蛋白質もしくはジペプチド合成用蛋白質を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物であってもよく、好ましくはストレプトマイセス属に属する微生物、より好ましくはアルボノルシン合成活性を有するストレプトマイセス属に属する微生物、さらに好ましくはストレプトマイセス・アルボラスまたはストレプトマイセス・ノウルセイより選ばれる種に属する微生物、最も好ましくは、ストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株、ストレプトマイセス・ノウルセイＡＴＣＣ１１４５５株またはＩＦＯ１５４５２株をあげることができる。【００９６】  培養物の処理物としては、培養物と同じ活性を維持している限り、公知のいかなる処理を施された培養物の処理物であってもよく、該処理物としては、例えば培養物の濃縮物、培養物の乾燥物、培養物を遠心分離して得られる菌体、該菌体の乾燥物、該菌体の凍結乾燥物、該菌体の界面活性剤処理物、該菌体の溶媒処理物、該菌体の酵素処理物および該菌体の固定化物等の生細胞からなる処理物、該菌体の超音波処理物、該菌体の機械的摩砕処理物、該菌体の蛋白質分画物および該菌体より抽出して得られる酵素標品などをあげることができる。【００９７】  上記製造法において、基質として用いるアミノ酸の種類、使用濃度および添加時期、並びに生産されるジペプチドは、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法のものと同様である。
また、微生物の培養物または該培養物の処理物を酵素源とした製造法において用いられる水性媒体としては、上記（ｉｉｉ）の（１）の酵素的製造法に用いられる水性媒体に加え、酵素源として用いた形質転換体または微生物の培養液も水性媒体として用いることができる。【００９８】  また上記製造法においては、必要に応じて、ＡＴＰの供給源として、ＡＴＰまたは形質転換体もしくは微生物が代謝してＡＴＰを生産し得る化合物、例えばグルコースのような糖類、エタノールのようなアルコール類、酢酸のような有機酸類などを水性媒体中に加えることができる。
さらに必要に応じて、水性媒体中に界面活性剤あるいは有機溶媒を添加してもよい。界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・オクタデシルアミン（例えばナイミーンＳ−２１５、日本油脂社製）などの非イオン界面活性剤、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイドやアルキルジメチル・ベンジルアンモニウムクロライド（例えばカチオンＦ２−４０Ｅ、日本油脂社製）などのカチオン系界面活性剤、ラウロイル・ザルコシネートなどのアニオン系界面活性剤、アルキルジメチルアミン（例えば三級アミンＦＢ、日本油脂社製）などの三級アミン類など、ジペプチドの生成を促進するものであればいずれでもよく、１種または数種を混合して使用することもできる。界面活性剤は、通常０．１〜５０ｇ／ｌの濃度で用いられる。有機溶剤としては、キシレン、トルエン、脂肪族アルコール、アセトン、酢酸エチルなどがあげられ、通常０．１〜５０ｍｌ／ｌの濃度で用いられる。【００９９】  培養物または該培養物の処理物を酵素源として用いる場合、該酵素源の量は、当該酵素源の比活性等により異なるが、例えば、基質として用いるアミノ酸１ｍｇあたり湿菌体重量として５〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜４００ｍｇ添加する。
ジペプチドの生成反応は水性媒体中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、２０〜６５℃、好ましくは２５〜５５℃、より好ましくは３０〜４５℃の条件で通常１分間〜１５０時間、好ましくは３分間〜１２０時間、より好ましくは３０分間〜１００時間行う。【０１００】  上記（ｉｉｉ）の（１）または（２）の製造法において、水性媒体中に生成、蓄積したジペプチドの採取は、活性炭やイオン交換樹脂などを用いる通常の方法あるいは、有機溶媒による抽出、結晶化、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等により行うことができる。
以下に、実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０１】 ａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子の取得
ストレプトマイセス・ノウルセイのａｌｂＣ遺伝子の塩基配列［Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌ．，９，１３５５（２００２）］に基づき、ストレプトマイセス・ノウルセイおよびストレプトマイセス・アルボラスよりａｌｂＣ遺伝子およびその類縁遺伝子を、以下の方法で取得した。
まず、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株とストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株を、それぞれ、１％グリシン添加したＫＭ７３培地［２ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、１０ｇ／ｌ可溶性デンプン（和光純薬工業社製）］、ＫＰ培地［１５ｇ／ｌグルコース、１０ｇ／ｌグリセロール、１０ｇ／ｌポリペプトン（日本製薬株式会社製）、１０ｇ／ｌ肉エキス（極東製薬工業株式会社製）、４ｇ／ｌ炭酸カルシウム］に植菌し２８℃で一晩振とう培養した。なお、ストレプトマイセス・ノウルセイＩＦＯ１５４５２株およびストレプトマイセス・アルボラスＩＦＯ１４１４７株は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  生物資源部門［Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎ（ＮＩＴＥ）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＢＲＣ）］（〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８）より分譲を受けた。【０１０２】  培養後、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｊｏｈｎ  ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎに記載の方法に従って該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
ａｌｂＣ遺伝子の塩基配列に基づき、パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製８９０５型ＤＮＡ合成機を用いて、配列番号５および６で表される塩基配列を有するＤＮＡ（以下、それぞれプライマーＡ、プライマーＢと呼ぶ）を合成した。プライマーＡは、ストレプトマイセス・ノウルセイの染色体ＤＮＡのａｌｂＣ遺伝子の開始コドンを含む領域の５’末端にＮｃｏＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。プライマーＢは、ａｌｂＣ遺伝子の終止コドンを含む配列と相補的な塩基配列の５’末端にＢｇｌＩＩ認識配列を含む塩基配列を付加したものである。【０１０３】  上記のプライマーＡおよびプライマーＢをプライマーセットに、鋳型としてストトレプトマイセス・ノウルセイまたはストレプトマイセス・アルボラスの染色体ＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは、鋳型として０．１μｇの染色体ＤＮＡ、０．５μｍｏｌ／Ｌの各プライマー、２．５ｕｎｉｔｓのＥｘ Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）、５μＬのＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ用×１０緩衝液（タカラバイオ社製）、各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）、５μＬのジメチルスルホキシドを含む反応液５０μＬを調製し、９４℃で１分間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間の工程を３０回繰り返すことにより行った。【０１０４】  該反応液の１／１０量をアガロースゲル電気泳動し、約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ［１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ］飽和フェノール／クロロホルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を添加し、混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍容量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃に３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを沈殿させた後、該ＤＮＡをそれぞれ２０μＬのＴＥに溶解した。【０１０５】  該溶解液それぞれ５μＬを用い、増幅したＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離した後、ジーンクリーンＩＩキット（ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ  ｋｉｔ、ＢＩＯ  １０１社製）を用いて、７００ｂｐのＤＮＡ断片をそれぞれ回収した。
ファージＴ５プロモーターを含む発現ベクターｐＱＥ６０（キアゲン社製）０．２μｇを制限酵素ＮｃｏＩおよびＢｇｌＩＩで切断後、アガロースゲル電気泳動によりＤＮＡ断片を分離し、上記と同様の方法により３．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。【０１０６】  上記で得られた各放線菌由来の０．７ｋｂ断片およびｐＱＥ６０由来の３．４ｋｂの断片をライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させ連結した。
該反応液を用いてエシェリヒア・コリＮＭ５２２株（ストラタジーン社製）を、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］によって形質転換し、該形質転換体を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム、寒天２０ｇ／ｌ］に塗布した後、３０℃で一晩培養した。【０１０７】  生育してきた形質転換体のコロニーより公知の方法に従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ファージＴ５プロモーター下流にストレプトマイセス・ノウルセイ由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ｎｏｕ、およびストレプトマイセス・アルブラス由来のＤＮＡが連結された発現ベクターであるｐＡＬ−ａｌｂが取得されていることを確認した（図１）。【０１０８】  それぞれのプラスミドに挿入された放線菌由来のＤＮＡ部分の塩基配列を塩基配列決定装置３７３Ａ・ＤＮＡシークエンサーを使って決定したところ、ｐＡＬ−ａｌｂには配列番号１で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有され、ｐＡＬ−ｎｏｕには配列番号２で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質をコードするＤＮＡ、すなわち配列番号４で表される塩基配列を有するＤＮＡが含有されていることを確認した。
【実施例２】
【０１０９】菌体を酵素源に用いたジペプチドの製造
実施例１で得られたｐＡＬ−ｎｏｕまたはｐＡＬ−ａｌｂを保有するエシェリヒア・コリＮＭ５２２（エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｏｕ株またはＮＭ５２２／ｐＡＬ−ａｌｂ株）およびプラスミドを保有しないＮＭ５２２株を５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地［１０ｇ／ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／ｌイーストエキス（ディフコ社製）、５ｇ／ｌ塩化ナトリウム］が入った試験管（プラスミドを持たない株の場合にはアンピシリンは無添加、以下同様）に接種し、３０℃で１７時間培養した。この培養液０．５ｍｌを５０ｍｌのＬＢ培地が入った２５０ｍｌ容の三角フラスコにそれぞれ植菌し、３０℃で１時間振とう培養した後、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を終濃度１ｍｍｏｌ／ｌになるように添加し、さらに４時間培養を継続した。該培養液を遠心分離し、湿菌体を取得した。【０１１０】  終濃度１００ｍｇ／ｍｌの該湿菌体、６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる３．０ｍｌの反応液を調製し、３０℃で反応を行った。反応１時間後にサンプリングし、アセトニトリルを２０％（ｖ／ｖ）になるように加えた後、反応生成物を以下のＨＰＬＣ分析により分析した。
分離カラム：ＯＤＳ−ＨＡカラム（ＹＭＣ社製）
溶離液：３０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル
流動速度：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：紫外吸収２１５ｎｍ
その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｕｏ株の反応液中には３６．７ｍｇ／ｌのｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）の蓄積が確認されたが、エシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）はまったく検出されなかった。同じ反応液を以下の条件でＨＰＬＣによって分析し、直鎖状のジペプチドであるＬ−ロイシル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）およびＬ−フェニルアラニル−Ｌ−ロイシン（Ｌ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ）を測定した。【０１１１】  直鎖状のジペプチドはＦ−ｍｏｃ化法で誘導体化した後にＨＰＬＣ分析により分析した。
分離カラム：野村化学社製のＯＤＳ−ＨＧ−５カラム
溶離液：
Ａ液−６ｍｌ／Ｌ酢酸、２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ４．８に調整）
Ｂ液−６ｍｌ／Ｌ酢酸、７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル（トリエチルアミンでｐＨ４．８に調整）
流動速度：０．６ｍｌ／ｍｉｎ
検出：励起波長２５４ｎｍ、蛍光波長６３０ｎｍ
溶離液混合比：表１のとおり【０１１２】
【表１】
2005103260.tif 000002
その結果、エシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｕｏ株の反応液中には２１．９ｍｇ／ｌのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅと１２．０ｍｇ／ｌのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕが蓄積していることが確認された。また対照株として用いたエシェリヒア・コリＮＭ５２２株の反応液中にはいずれの直鎖ジペプチドも検出されなかった。このことから、本発明で取得されたシクロジペプチド合成酵素は直鎖状のジペプチドを合成する能力をもつことが明らかになった。
【実施例３】
【０１１３】精製酵素を用いたジペプチドの製造（１）
実施例２と同様にエシェリヒア・コリＮＭ５２２／ｐＡＬ−ｎｕｏ株を培養した。培養終了後、遠心分離によって湿菌体を取得し、６０ｍｍｏｌ／ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄後、１０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール含有２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウムバッファーに懸濁した。この懸濁を４℃で超音波処理して菌体破砕液を取得した。この菌体破砕液（１０ｍｌ、蛋白質０．８６３ｍｇを含む）をアマシャム社製Ｈｉｓタグ精製カラムに通塔し、１０ｍｍｏｌ／ｌイミダゾール含有２０ｍｍｏｌ／ｌリン酸カリウムバッファー１５ｍｌを通塔することによる洗浄を行い、ＨｉｓタグつきａｌｂＣ蛋白質をカラム内にて精製した。次にこのＨｉｓタグ付きのａｌｂＣ蛋白質を保持するカラムに、実施例２と同組成の反応液（反応液組成：６０ｍｍｏｌ／Ｌのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）、１０ｍｍｏｌ／Ｌの塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／ＬのＡＴＰ、１ｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ、１ｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅからなる反応液）２ｍｌを通塔し、カラム内に基質を保持した状態で、３０℃にて、インキュベートした。２４時間後、同組成の反応液３ｍｌでカラム内の反応液を溶出し、実施例２と同様の方法により反応液中のシクロジペプチドおよびジペプチドを定量した。【０１１４】  その結果、ｃｙｃｌｏ（Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ）６．８ｍｇ／Ｌ、Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｐｈｅ  ２８．７ｍｇ／ＬおよびＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｌｅｕ  １８．５ｍｇ／Ｌが生成していることが分かった。ＡＴＰを含まない反応液で同様にインキュベートした場合は、シクロジペプチド、ジペプチドともに検出されなかった。
【実施例４】
【０１１５】精製酵素を用いたジペプチドの製造（２）
基質のアミノ酸を他のアミノ酸に換える以外は実施例３と同様の方法で酵素反応を行い、生成物を分析した。反応液は、基質のアミノ酸を、１ｇ／ＬのＬ−Ａｌａ、Ｌ−ＬｅｕまたはＬ−Ｐｈｅに置き換えた以外は実施例２と同じ組成の溶液を用いた。
その結果、反応開始後２４時間で、それぞれ９．４１ｍｇ／ＬのＬ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ、７．８５ｍｇ／ＬのＬ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ｌｅｕ、または５．２０ｍｇ／ＬのＬ−Ｐｈｅ−Ｌ−Ｐｈｅが生成していることが分かった。
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】配列番号５−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号６−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【図１】
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【国際調査報告】
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