(57)【要約】本発明は前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するための方法であって、以下の工程：ａ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；及びｂ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；を含む、方法に関する。本発明の前立腺癌の判定方法を用いれば、簡易かつ高感度に前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定することができるので、前立腺癌の診断、経過観察、予後の予測、発症前診断、保因者診断等に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するための方法であって、以下の工程：
ａ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；及び
ｂ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；
を含む、方法。
【請求項２】
変異がミスセンス変異、ナンセンス変異、サイレント変異及び欠失によるフレームシフト変異からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第７番目のアルギニンのロイシンへの変異、第８番目のアラニンのバリンへの変異、第３０番目のアラニンのスレオニンへの変異、第４１番目のスレオニンのイソロイシンへの変異、第７３番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、第１３７番目のグリシンのアルギニンへの変異、第１４４番目のセリンのプロリンへの変異、第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ミスセンス変異がＰＣＡ−１ポリペプチドの第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異をもたらす変異である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第４２６番目のグアニンのチミンへの変異、第４２９番目のシトシンのチミンへの変異、第４９４番目のグアニンのアデニンへの変異、第５２８番目のシトシンのチミンへの変異、第６２３番目のグアニンのアデニンへの変異、第８１５番目のグアニンのアデニンへの変異、第８３６番目のチミンのシトシンへの変異、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、第１１０５番目のアデニンのチミンへの変異、及び第１１８９番目のアデニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、第１１０５番目のアデニンのチミンへの変異、及び第１１８９番目のアデニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ナンセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２６１番目のリジンのストップコドンへの変異をもたらす変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ナンセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１１８７番目のアデニンのチミンへの変異である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
サイレント変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第５６８番目のチミンのシトシンへの変異、及び第１１３２番目のグアニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
サイレント変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１１３２番目のグアニンのチミンへの変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
欠失が、ＰＣＡ−１遺伝子の第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの残基の欠失である、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
以下の工程を含む、請求項１に記載の方法：
ａ）当該被検者からポリヌクレオチドを単離又は精製する工程；
ｂ）当該ポリヌクレオチドからＰＣＡ−１遺伝子を増幅する工程；
ｃ）増幅されたＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列を決定する工程；
ｄ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；
ｅ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程。
【請求項１５】
配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、第５６８番目のチミンのシトシンへの置換、第１１３２番目のグアニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１６のポリペプチドを免疫特異的に認識する抗体。
【請求項１８】
前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するためのキットであって、ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬を含む、キット。
【請求項１９】
ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬が、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するために使用できる、又は使用すべきであることを記載した記載物を更に含む、請求項１８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、前立腺癌の判定方法に関する。更に詳しくは、本発明は、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するための方法であって、以下の工程：
ａ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；及び
ｂ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；
を含む、方法に関する。
【背景技術】  前立腺癌は、欧米において男性癌罹患率、死亡率の上位を占める悪性腫瘍である。日本でも近年、食生活の欧米化と高齢化に伴い前立腺癌の罹患率、死亡率が急速に上昇している。
現在前立腺癌の診断は、癌グレード（ｔｕｍｏｒ  ｇｒａｄｅ）やステージ等の組織病理学的判定やＰＳＡ値などの生化学的パラメーターに依存している。中でも、集団検診や人間ドックにおいて、血中前立腺特異抗原（Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ：ＰＳＡ）濃度の測定が急速に普及し、比較的早期に前立腺癌が発見できるようになった。しかし、血中ＰＳＡ濃度の上昇は前立腺癌の発症後において認められるものであり、また血中ＰＳＡ濃度による診断は前立腺肥大症（ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）や前立腺炎（ｐｒｏｓｔａｔｉｔｉｓ）との区別が困難である場合があり、前立腺癌の検出、診断、経過観察のための、より特異的で高感度な新たなマーカーの開発が望まれている。
本願発明者らは、前立腺癌の治療標的分子を検索する目的で、前立腺癌患者から摘出された前立腺組織を、病理組織学的に腫瘍部分と非腫瘍部分とに分離し、非腫瘍部分と腫瘍部分との間で発現量に差のある遺伝子を解析した。その結果、非腫瘍部分と比較して腫瘍部分に特異的に高発現している遺伝子として、ＰＣＡ−１（ヒトＡｌｋＢホモローグ３（ｈｕｍａｎ  ＡｌｋＢ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３：ｈＡＢＨ３）とも呼ばれる）と呼ばれる遺伝子のクローニングに成功した（第１２３回日本薬学会年会要旨集４、ｐ１５、２００３年）。近年、ＰＣＡ−１はＤＮＡ，ＲＮＡアルキル化損傷修復酵素であることが確認され、その機能が注目されている（ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第４２１巻、ｐ８５９−８６３、２００３年）。
上記事情に鑑み、本発明は、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定する新たな方法を提供することを目的とする。
【発明の開示】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、前立腺癌組織においてＰＣＡ−１遺伝子の発現が上昇し、ＰＣＡ−１の機能の亢進が前立腺癌の発症あるいは進行と何らかの因果関係があると考えられたのとは対照的に、前立腺癌患者においては、ＰＣＡ−１の機能異常を起こし得るようなＰＣＡ−１遺伝子の変異が高頻度で認められることを見出し、本発明を完成させるに至った。
即ち、本発明は以下の（１）〜（１９）に関する。
（１）前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するための方法であって、以下の工程：
ａ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；及び
ｂ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；
を含む、方法。
（２）変異がミスセンス変異、ナンセンス変異、サイレント変異及び欠失によるフレームシフト変異からなる群から選ばれる、上記（１）に記載の方法。
（３）ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第７番目のアルギニンのロイシンへの変異、第８番目のアラニンのバリンへの変異、第３０番目のアラニンのスレオニンへの変異、第４１番目のスレオニンのイソロイシンへの変異、第７３番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、第１３７番目のグリシンのアルギニンへの変異、第１４４番目のセリンのプロリンへの変異、第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である、上記（２）に記載の方法。
（４）ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である、上記（３）に記載の方法。
（５）ミスセンス変異がＰＣＡ−１ポリペプチドの第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異をもたらす変異である、上記（４）に記載の方法。
（６）ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第４２６番目のグアニンのチミンへの変異、第４２９番目のシトシンのチミンへの変異、第４９４番目のグアニンのアデニンへの変異、第５２８番目のシトシンのチミンへの変異、第６２３番目のグアニンのアデニンへの変異、第８１５番目のグアニンのアデニンへの変異、第８３６番目のチミンのシトシンへの変異、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、第１１０５番目のアデニンのチミンへの変異、及び第１１８９番目のアデニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、上記（３）に記載の方法。
（７）ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、第１１０５番目のアデニンのチミンへの変異、及び第１１８９番目のアデニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、上記（６）に記載の方法。
（８）ミスセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異である、上記（７）に記載の方法。
（９）ナンセンス変異が、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２６１番目のリジンのストップコドンへの変異をもたらす変異である、上記（２）に記載の方法。
（１０）ナンセンス変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１１８７番目のアデニンのチミンへの変異である、上記（９）に記載の方法。
（１１）サイレント変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第５６８番目のチミンのシトシンへの変異、及び第１１３２番目のグアニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である、上記（２）に記載の方法。
（１２）サイレント変異が、ＰＣＡ−１遺伝子の第１１３２番目のグアニンのチミンへの変異である、上記（１１）に記載の方法。
（１３）欠失が、ＰＣＡ−１遺伝子の第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの残基の欠失である、上記（２）に記載の方法。
（１４）以下の工程を含む、上記（１）に記載の方法：
ａ）当該被検者からポリヌクレオチドを単離又は精製する工程；
ｂ）当該ポリヌクレオチドからＰＣＡ−１遺伝子を増幅する工程；
ｃ）増幅されたＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列を決定する工程；
ｄ）当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；
ｅ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程。
（１５）配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、第５６８番目のチミンのシトシンへの置換、第１１３２番目のグアニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド。
（１６）配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（１７）上記（１６）のポリペプチドを免疫特異的に認識する抗体。
（１８）前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するためのキットであって、ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬を含む、キット。
（１９）ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬が、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するために使用できる、又は使用すべきであることを記載した記載物を更に含む、上記（１７）に記載のキット。
本発明の前立腺癌の判定方法を用いれば、簡易かつ高感度に前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定することができるので、前立腺癌の診断、経過観察、予後の予測、発症前診断、保因者診断等に有効である。
【図面の簡単な説明】  図１はＭＭＳ濃度と接着細胞数の関係を示すグラフである。縦軸は接着細胞数をコントロール群を１００％としたときの相対値として示す。横軸はＭＭＳ濃度（ｍＭ）を示す。また、黒色カラムはコントロール群を、斜線カラムはＰＣＡ−１ＷＴトランスフェクション群を、白色カラムはＰＣＡ−１Δ７７７−８６５トランスフェクション群をそれぞれ示す。
発明の詳細な説明
本発明において、「前立腺癌」とは、前立腺において発生した癌を広く包含する概念であり、前立腺に発生した腺癌のみならず、扁平上皮癌、移行上皮癌、神経内分泌癌、未分化癌等をも包含する。好ましくは、前立腺癌は前立腺に発生した腺癌である。
ヒトにおいて、ＰＣＡ−１はヒトＡｌｋＢホモローグ３（ｈｕｍａｎ  ＡｌｋＢ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３：ｈＡＢＨ３）あるいはＤＥＰＣ−１とも呼ばれる分子である。
正常ヒトＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列（ｃＤＮＡ塩基配列）としては、例えば、配列番号１等が挙げられ、このうち第４０７番目−第１２６７番目の残基（配列番号３）がタンパク質コード領域に該当し、配列番号２のアミノ酸配列からなるＰＣＡ−１ポリペプチドをコードする。本発明において、ＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列における残基の位置は、上記配列番号１、２の配列をそれぞれ基準とする。ここで、配列番号１において第９２３〜１２４３番目の残基及び配列番号２における第１７２〜２７９番目のアミノ酸残基がＰＣＡ−１の脱アルキル化酵素活性部位に相当する。
ヒトＰＣＡ−１遺伝子は第１１番染色体のｐ１１のローカスにコードされており、ＰＣＡ−１遺伝子およびその周辺の染色体ＤＮＡ塩基配列は、例えば、ジーンバンクアクセッション番号ＮＴ＿００９２３７（ＮＣＢＩホームページ）等に開示されている。
ヒトＰＣＡ−１遺伝子は、１０のエクソンを含み、配列番号１において、エクソン１は、第１番目−第３３４番目の残基、エクソン２は、第３３５番目−第４８５番目の残基、エクソン３は、第４８６番目−第５９２番目の残基、エクソン４は、第５９３番目−第６２４番目の残基、エクソン５は、第６２５番目−第６７０番目の残基、エクソン６は、第６７１番目−第７７６番目の残基、エクソン７は、第７７７番目−第８６５番目の残基、エクソン８は、第８６６番目−第１０７５番目の残基、エクソン９は、第１０７６番目−第１１７２番目の残基、エクソン１０は、第１１７３番目−第１５２０番目の残基、にそれぞれ該当する。
本発明の前立腺癌の判定方法は、少なくとも以下の工程：
ａ）被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程；及び
ｂ）ＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度により、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険の有無又は程度を判断する工程；
を含む。
被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度を解析する工程においては、被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子を、正常ＰＣＡ−１遺伝子と比較する。
被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子と正常ＰＣＡ−１遺伝子との比較は、特に限定されないが、例えば正常ＰＣＡ−１遺伝子のｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、染色体ＤＮＡ等の塩基配列との比較である。
ここで、「正常ＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列との比較」は、正常ＰＣＡ−１遺伝子の全長塩基配列との比較以外に、当該配列の相補的配列、部分配列、部分配列の相補的配列、特定残基の配列等との比較であってもよい。
ここで、上記部分配列の長さは、少なくとも１０塩基以上、好ましくは３０塩基以上である。部分配列の好ましい態様としては、ＰＣＡ−１のタンパク質コード領域の塩基配列、ＰＣＡ−１遺伝子のエクソン領域の塩基配列が挙げられる。
被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度の解析は、自体公知のいずれの方法を用いることができる。
例えば、被検者由来のポリヌクレオチド中のＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列を決定してもよい。また、当該分野で塩基の変化を検出するために現在使用されているあらゆる方法、例えば、ＲＦＬＰ法、ＴａｑＭａｎ試験、オリゴヌクレオチドリガーゼ法、一重鎖コンホメーション多形性、鋳型核酸のオリゴヌクレオチドアレーへのハイブリダイゼーションに基づく試験法、変性グラジェントゲル電気泳動法、ＰＣＲ−ＳＳＰＣ法、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＡＳＯ法、ミスマッチプライマーを用いるＡＲＭＳ法等も用いることができる。あるいは、将来開発される方法も、上記比較による変異の存否の解析方法に用いることができる。好ましくは、被検者由来のポリヌクレオチド中のＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列を決定する。
被検者由来のポリヌクレオチド中のＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列を決定するにあたっては、まず被検者よりポリヌクレオチドを単離又は精製する。当該ポリヌクレオチドは、好ましくは、当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子を含む。
当該ポリヌクレオチドは、当該被検者由来の試料、例えば、組織、細胞、液体成分等から単離又は精製される。
組織としては、特に限定されないが、例えば、前立腺、毛髪、皮膚等が挙げられ、好ましくは前立腺である。
細胞には、被検者から分離され培養されていない細胞、生体から分離され培養された細胞いずれもが含まれる。例えば血液細胞、前立腺由来細胞等が挙げられ、好ましくは前立腺由来細胞である。
液体成分としては、例えば、血液、精液、唾液、尿、汗等が挙げられる。
ポリヌクレオチドとしては、例えば、ＤＮＡ（染色体ＤＮＡ、ｃＤＮＡ等）及びＲＮＡ（ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡ等）が挙げられ、好ましくは染色体ＤＮＡ、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡまたはｍＲＮＡである。
ポリヌクレオチドは自体公知の方法により単離又は精製することができる。
染色体ＤＮＡの単離又は精製には、例えば、プロテイナーゼＫ／フェノール抽出法、プロテイナーゼＫ／フェノール／クロロホルム抽出法、アルカリ溶解法、ボイリング法等を用いることができる。
また、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの単離又は精製には、例えばグアニジン−塩化セシウム超遠心法、ＡＧＰＣ法（Ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ−Ｐｈｅｎｏｌ−Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）等を用いることができる。あるいは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）、Ｉｓｏｇｅｎ（ニッポンジーン社製）等の市販のキットを用いることもできる。
ｍＲＮＡの単離又は精製は、精製されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡをオリゴｄＴカラム等に供することによって達成することができる。
ポリヌクレオチドがＲＮＡ、特にｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡである場合は、逆転写酵素等を利用した自体公知の方法により、ｃＤＮＡを合成することが好ましい。
当該ポリヌクレオチド中のＰＣＡ−１遺伝子の塩基配列の決定にあたっては、好ましくは、当該ポリヌクレオチドを鋳型として、ポリヌクレオチド中のＰＣＡ−１遺伝子を増幅する。鋳型とされるポリヌクレオチドは、特に限定されないが、好ましくは染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡである。
遺伝子増幅の方法は、特に制限されないが、ポリメラーゼ連鎖反応法（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ法）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、ＷＯ  ００／２８０８２参照）、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）（例えば、ＷＯ  ００／５６８７７参照）、自己持続的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４〜１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３〜１１７７）、Ｑ−βレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）等が例示され、いずれも用いることが可能であるが、ＰＣＲ法が簡便であり好ましい。ＰＣＲ技術の一般的使用についての参考文献は、Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，（１９８７），Ｅｈｒｌｉｃｈ（ｅｄ），ＰＣＲ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９，Ｅｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６４３−１６５０（１９９１），ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９９０）等に詳しい。
ＰＣＲ法によるＰＣＡ−１遺伝子の増幅において用いられるポリメラーゼとしては、当業者が通常用いるＴａｑポリメラーゼ等をいずれも用いることが可能であるが、好ましくは比較的フィデリティの高いポリメラーゼ、例えばＫＯＤ  Ｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が用いられる。
ＰＣＲ法によるＰＣＡ−１遺伝子の増幅においては、当該遺伝子の増幅を可能とするようなオリゴヌクレオチドプライマー対を用いる。当該プライマー対は、例えば配列番号１の塩基配列等の本明細書中の情報や、ジーンバンクアクセッション番号ＮＴ＿００９２３７（ＮＣＢＩホームページ）等に開示されたヒト第１１番染色体のｐ１１の領域の塩基配列等に基づき、Ｏｌｉｇｏ  ４．０．６（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  ＭＮ）等の適切なプログラム等を用いて、当業者が適切に設計することが可能である。
ＰＣＲにおける鋳型が、ｃＤＮＡである場合には、当該プライマー対が設定される領域は特に限定されないが、当該プライマー対は、好ましくは、配列番号１において、第４２６番目のグアニン、第４２９番目のシトシン、第４９４番目のグアニン、第５２８番目のシトシン、第５６８番目のチミン、第６２３番目のグアニン、第８１５番目のグアニン、第８３６番目のチミン、第１０９０番目のシトシン、第１１０５番目のアデニン、第１１３２番目のグアニン、第１１８７番目のアデニン、第１１８９番目のアデニン、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの残基からなる群から選択される少なくとも１つ、より好ましくは２つ以上、最も好ましくは全ての残基を増幅しうるように、設定される。
また、ＰＣＲにおける鋳型が染色体ＤＮＡである場合には、当該プライマー対が設定される領域は特に限定されないが、当該プライマー対は、好ましくは、エクソン領域を増幅し得るように設定され、より好ましくは、上述の残基に対応する染色体ＤＮＡ上の残基を少なくとも１つ、更に好ましくは２つ以上、最も好ましくは全て増幅しうるように設定される。複数のプライマー対を設定してもよい。
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの大きさは、適宜選択することが可能であるが、通常１０〜１００ｂｐ、好ましくは１２〜５０ｂｐ、より好ましくは１５〜３０ｂｐである。
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのＧＣ含量は、適宜設定することが可能であるが、通常２０〜８０％、好ましくは３０〜７０％、より好ましくは４０〜６０％の範囲である。
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドのＴｍ値は、通常６０±２０℃の範囲に設定される。Ｔｍ値はバッファー中の塩濃度等に依存して異なるが、自体公知の方法、例えばｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ法（例えば「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５，３５５５−３５６２，１９９６」など参照）等により算出することが出来る。
オリゴヌクレオチドは、天然に存在するもの又は合成されたもののいずれでもよいが、ホスホトリエチル法、ホスホジエステル法等により、通常用いられる核酸自動合成装置を利用して合成することが可能である。
当該プライマーは、増幅産物の大きさが通常５０〜３００００ｂｐ程度となるように設定される。増幅効率等を考慮すると、増幅産物の大きさが、好ましくは、５０〜３０００ｂｐ程度、より好ましくは１００〜２０００ｂｐ程度となるように設定される。
好ましいプライマー対としては、例えば、
プライマー１：ＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣ  （配列番号４）
プライマー２：ＧＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧ  （配列番号５）
からなるプライマー対等が挙げられる。
増幅されたＰＣＡ−１遺伝子は、周知の方法により塩基配列が決定される。好ましい方法としては、Ｓａｎｇｅｒ等の方法を用いた鋳型ポリメラーゼ生成複写物への末端ヌクレオチドの取込みに基づくものが挙げられる。また、代替法としては、例えば、アダプター配列決定（ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２６７８）、連結に基づく配列決定（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５２４５）、ハイブリダイゼーションによる配列決定（Ａ．Ｄ．Ｍｉｒｚａｂｅｋｏｖ、ＴＩＢＴｅｃｈ１２：２７−３２、１９９４）等が挙げられる。
決定された塩基配列に基づいて、当該被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の変異の有無又は程度が解析される。
上記増幅において用いた鋳型が染色体ＤＮＡである場合には、好ましくは、決定された塩基配列中のＰＣＡ−１遺伝子のエクソン領域に含まれる塩基配列を、正常ＰＣＡ−１遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列中の対応塩基配列と比較する。また、上記増幅において用いた鋳型がｃＤＮＡである場合には、決定された塩基配列と正常ＰＣＡ−１遺伝子のｃＤＮＡ塩基配列中の対応塩基配列とを比較する。
被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子に変異が検出された場合、即ち解析した被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子において、正常ＰＣＡ−１遺伝子とは異なる残基が１塩基またはそれ以上検出された場合は、当該被検者は、前立腺癌を発症している危険がある（又は高い）又は発症する危険がある（又は高い）と判断する。逆に、被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子に変異が検出されない場合、当該被検者は前立腺癌を発症している危険がない（又は低い）又は発症する危険がない（又は低い）と判断する。
また、本発明の方法においては、変異の程度が大きいほど、当該被検者が前立腺癌を発症している危険又は発症する危険が高くなると判断することができる。「変異の程度」とは、例えば変異部位の数、変異に係る塩基の長さ等をいう。
また、ＰＣＡ−１遺伝子の変異は、被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子の対立遺伝子のどちらか一方に存在すれば、当該被検者が前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険があると判断するが、対立遺伝子の双方に変異がある場合は、一方のみに変異がある場合と比較してより危険がある（又は高い）と判断することができる。
また対立遺伝子間に優劣がある場合には、優勢遺伝子に変異がある場合は、劣勢遺伝子に変異がある場合と比較してより危険がある（又は高い）と判断することができる。
また、本発明の方法は、他の前立腺癌の診断方法等と組合せて用いることにより、判定の精度を向上させることができる。他の前立腺癌の診断方法としては、触診検査、血清中等の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）濃度を用いる方法、前立腺針生検サンプルを用いた病理検査、超音波検査、ＭＲＩ、ＣＴ、骨シンチ等が挙げられる。また、ＰＣＡ−１遺伝子が前立腺癌組織において発現が向上していることを指標とした検査方法（非特許文献１参照）とも、本発明の方法を組合せて用いることができる。
上記ＰＣＡ−１遺伝子の変異の部位は、特に限定されない。
染色体ＤＮＡにおいては、ＰＣＡ−１遺伝子をコードする領域（例えばエンハンサー領域、プロモーター領域、エクソン領域、イントロン領域等）のいずれであってもよいが、好ましくはエクソン領域又はイントロン領域であり、より好ましくはエクソン領域である。
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡにおいては、当該ＰＣＡ−１遺伝子の変異の部位は、好ましくはタンパク質コード領域である。
上記ＰＣＡ−１遺伝子の変異の種類は、特に限定されず、例えばミスセンス変異、ナンセンス変異又はサイレント変異等の置換による変異、欠失、挿入等により生じるフレームシフト変異などが挙げられるが、好ましくは変異はミスセンス変異、ナンセンス変異、サイレント変異及び欠失により生じるフレームシフトからなる群から選択される。
ＰＣＡ−１遺伝子のミスセンス変異におけるアミノ酸変異の態様は、特に限定されない。好ましくは、ミスセンス変異は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第７番目のアルギニン、第８番目のアラニン、第３０番目のアラニン、第４１番目のスレオニン、第７３番目のアスパラギン酸、第１３７番目のグリシン、第１４４番目のセリン、第２２８番目のアスパラギン酸、第２３３番目のグルタミン酸、及び第２６１番目のリジンからなる群から選択されるアミノ酸残基の変異をもたらす変異である。
この場合、当該置換後のアミノ酸の種類は、特に限定されない。好ましくは、ミスセンス変異は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第７番目のアルギニンのロイシンへの変異、第８番目のアラニンのバリンへの変異、第３０番目のアラニンのスレオニンへの変異、第４１番目のスレオニンのイソロイシンへの変異、第７３番目のアスパラギン酸のアスパラギンへの変異、第１３７番目のグリシンのアルギニンへの変異、第１４４番目のセリンのプロリンへの変異、第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である。
より好ましくは、当該ミスセンス変異は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの脱アルキル化酵素活性部位（ＰＣＡ−１ポリペプチドの第１７２〜２７９番目のアミノ酸残基に相当）におけるアミノ酸の変異、即ち、第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異、第２３３番目のグルタミン酸のアルパラギン酸への変異、及び第２６１番目のリジンのアスパラギンへの変異からなる群から選択されるアミノ酸の変異をもたらす変異である。
更に好ましくは、当該ミスセンス変異は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２２８番目のアスパラギン酸のグルタミン酸への変異をもたらす変異である。
上記ミスセンス変異においては、変異後のアミノ酸をコードする塩基配列は特に限定されない。好ましくは、当該ミスセンス変異は、ＰＣＡ−１遺伝子の、第４２６番目のグアニンのチミンへの変異、第４２９番目のシトシンのチミンへの変異、第４９４番目のグアニンのアデニンへの変異、第５２８番目のシトシンのチミンへの変異、第６２３番目のグアニンのアデニンへの変異、第８１５番目のグアニンのアデニンへの変異、第８３６番目のチミンのシトシンへの変異、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの変異、第１１０５番目のアデニンのチミンへの変異、及び第１１８９番目のアデニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である。
ＰＣＡ−１遺伝子のナンセンス変異におけるアミノ酸変異の態様は、特に限定されないが、当該ナンセンス変異は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの第２６１番目のリジンのストップコドンへの変異をもたらす変異が好ましい。
当該ナンセンス変異においては、変異後のストップコドンをコードする塩基配列は特に限定されない。好ましくは、当該ナンセンス変異は、ＰＣＡ−１遺伝子塩基配列の第１１８７番目のアデニンのチミンへの変異である。
ＰＣＡ−１遺伝子のサイレント変異における変異部位は、特に限定されないが、当該サイレント変異は、好ましくは、ＰＣＡ−１遺伝子の第５６８番目のチミン、第１１３２番目のグアニンからなる群から選択される残基における変異であり、より好ましくは、第１１３２番目のグアニンにおける変異である。
当該サイレント変異においては、変異後の塩基は特に限定されない。好ましくは、当該サイレント変異は、ＰＣＡ−１遺伝子の、第５６８番目のチミンのシトシンへの変異、及び第１１３２番目のグアニンのチミンへの変異からなる群から選択される変異である。
ＰＣＡ−１遺伝子の欠失において、欠失される塩基の数、位置等は特に限定されない。好ましくは、欠失は一つ又は複数個のエクソン領域の欠失であり、より好ましくは、欠失は一つのエクソン領域の欠失である。
欠失されるエクソン領域は、特に限定されないが、ヒトＰＣＡ−１遺伝子の場合、好ましくは、エクソン７（配列番号１における第７７７番目−第８６５番目の残基）である。
当該欠失は、ＰＣＡ−１ポリペプチドの、第１２４番目からのアミノ酸の置換をもたらすと共に、第１３６番目のアミノ酸のストップコドンへの置換をもたらすので、第１３５番目のアミノ酸まででタンパク質翻訳が終止される。
また、本発明は、配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、第５６８番目のチミンのシトシンへの置換、第１１３２番目のグアニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドに関する。好ましくは、当該ポリヌクレオチドは、配列番号１と比較して、上記群から選択される１以上の置換を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドである。
また、上記ポリヌクレオチドの一部であって、配列番号１と比較して、上記群から選択される１以上の置換又は欠失を有するポリヌクレオチドも本発明に包含される。当該ポリヌクレオチドの一部の長さは少なくとも１０ｂｐ以上、好ましくは３０ｂｐ以上である。
上記本発明のポリヌクレオチドは、ヒトＰＣＡ−１遺伝子の変異の解析において、例えばミスマッチプライマーやミスマッチプローブ等の試薬として、あるいは変異を有するＰＣＡ−１遺伝子を含むことが既に明らかとなっているポリヌクレオチドコントロールとして有用である。
また、本発明のポリヌクレオチドを機能的に挿入した適当な発現ベクターを、前立腺癌細胞等の宿主細胞に導入し、変異を有するＰＣＡ−１ポリペプチドを発現させた後に、当該宿主細胞を解析すること等で、ＰＣＡ−１遺伝子の変異と前立腺癌との関連について研究することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドは、前立腺癌研究用試薬として有用である。
本発明のポリヌクレオチドは好ましくは単離され又は精製されている。
また、本発明は、配列番号１と比較して、第４２６番目のグアニンのチミンへの置換、第４２９番目のシトシンのチミンへの置換、第４９４番目のグアニンのアデニンへの置換、第５２８番目のシトシンのチミンへの置換、第６２３番目のグアニンのアデニンへの置換、第８１５番目のグアニンのアデニンへの置換、第８３６番目のチミンのシトシンへの置換、第１０９０番目のシトシンのグアニンへの置換、第１１０５番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８９番目のアデニンのチミンへの置換、第１１８７番目のアデニンのチミンへの置換、及び第７７７番目のアデニンから第８６５番目のシトシンまでの配列の欠失からなる群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。好ましくは、当該ポリペプチドは、配列番号１と比較して、上記群から選択される１以上の置換又は欠失を有する塩基配列にコードされるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
また、上記ポリペプチドの部分であって、上記群の置換又は欠失により置換されたアミノ酸を少なくとも１つ含むポリペプチドも本発明に包含される。当該部分ポリペプチドの長さは少なくとも６アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上である。
本発明のポリペプチドは好ましくは単離され又は精製されている。
本発明のポリペプチドは、上記の変異を有するヒトＰＣＡ−１のポリペプチドを免疫特異的に認識する抗体の製造のための免疫原として有用である。本発明は当該抗体にも関する。
「免疫特異的」とは、当業者が通常抗体を使用する条件において、その抗体が他のポリペプチドに対するその親和性よりも特定のポリペプチドに対して、実質的に高い親和性を示すことを意味する。本発明において「他のポリペプチド」としては、例えば正常ヒトＰＣＡ−１ポリペプチド等が挙げられる。
抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）等の天然型抗体、遺伝子組換技術を用いて製造され得るキメラ抗体、ヒト化抗体や一本鎖抗体、ヒト抗体産生トランスジェニック動物等を用いて製造され得るヒト抗体、Ｆａｂ発現ライブラリーによって作製された抗体断片、およびこれらの結合性断片が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびこれらの結合性断片である。
結合性断片とは、前述の抗体の一部分の領域を意味し、具体的には例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、ｓＦｖ、ｄｓＦｖ（ｄｉｓｕｌｐｈｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｓｅｄ  Ｆｖ）、ｄＡｂ（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）等が挙げられる（Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐ．４４１−４５６，１９９６）。
抗体のクラスは、特に限定されず、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等のいずれのアイソタイプを有する抗体をも包含する。好ましくは、ＩｇＧまたはＩｇＭであり、精製の容易性等を考慮するとＩｇＧがより好ましい。
本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、マウス、ウサギ等の哺乳動物（好ましくはヒト以外の哺乳動物）に当該ポリペプチド等を投与すること等により得られる。
モノクローナル抗体の調製には、ケーラー及びミルシュタインらの方法（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．２５６，ｐ．４９５−４９７，１９７５）及びそれに準じる修飾方法に従って行うことができる。本発明のポリペプチドに特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングにおいては、本発明のポリペプチドに含まれる変異部位が、正常ＰＣＡ−１のアミノ酸に置換された対応コントロールペプチドを用い、本発明のポリペプチドには反応するが、対応コントロールペプチドには反応しないクローンを選択することができる。
ポリクローナル抗体の調製は、好ましくは、本発明のポリペプチドを免疫した動物の血清を本発明のポリペプチドを結合させたカラム等によって精製される。更に好ましくは、より特異性を高めるために、上記対応コントロールペプチドを結合させたカラムを用いて正常ヒトＰＣＡ−１に反応しうる画分が除去される。
本発明の抗体は、好ましくは、飽和硫酸アンモニウム、ユーグロブリン沈澱法、カプロイン酸法、カプリル酸法、イオン交換クロマトグラフィー（ＤＥＡＥまたはＤＥ５２等）、抗イムノグロブリンカラムあるいはプロテインＡカラム、免疫原を架橋させたカラム等を用いたアフィニティカラムクロマトグラフィーにより単離又は精製される。
本発明の抗体は変異を有するヒトＰＣＡ−１ポリペプチドを免疫特異的に認識するので、例えばウェスタンブロット法、免疫組織染色、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、表面プラズモン共鳴法、プロテインチップ等により、被検者由来のＰＣＡ−１遺伝子が変異を有するか否かを解析することが可能である。
本発明の前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するための方法は、上記抗体を用いた方法をも包含する。
また、本発明は、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するためのキットであって、ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬を含むキットに関する。
当該キットには、好ましくは、当該ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬は、前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定するために使用できる、又は使用すべきであることを記載した記載物が更に含まれる。
ＰＣＡ−１遺伝子変異解析用試薬は、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。例えば、ＰＣＡ−１遺伝子の増幅に用いられるオリゴヌクレオチドプライマー対、正常ＰＣＡ−１遺伝子を含むことが既に明らかとなっている単離され又は精製されたポリヌクレオチド、変異を有するＰＣＡ−１遺伝子を含むことが既に明らかとなっている単離され又は精製されたポリヌクレオチド、変異を有するヒトＰＣＡ−１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体等が挙げられる。
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】  化学療法又はホルモン療法をこれまでに受けたことのない前立腺癌患者４人の術後標本より、病理組織学的に癌部およびその周辺非癌部にわけ組織標本を採取した。またヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ−３，ＤＵ１４５，ＬＮ−ＣａＰ）も使用した。
採取された組織ならびに細胞は凍結し、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ抽出に供した。凍結した検体はＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）中でホモジナイズし、製造業者提供のプロトコールに従ってｔｏｔａｌ  ＲＮＡを単離した。混入された可能性のあるＤＮＡはＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅＩ（和光純薬株式会社製）処理により除去した。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（５μｇ）、オリゴｄＴプライマー及びＡＭＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．製）を用いて逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡの一部を用いて、ＰＣＲによりＰＣＡ−１遺伝子を増幅した。用いたＰＣＲ用反応混合液の組成は、２５μｌＰＣＲバッファー中に、上記ｃＤＮＡ（２０ｎｇ）、ＫＯＤ  ｄａｓｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、ｄＮＴＰ（各０．２Ｍ）、１０ｘ  ＫＯＤ  ｄａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ（２．５μｌ）、プライマー１（配列番号４：０．２μＭ）、プライマー２（配列番号５：０．２μＭ）である。反応はＤＮＡサーマルサイクラー（ＤＮＡ  Ｔｈｅｒｍａｌｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ４６０，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｉｎｃ．社製）を用いて、９５℃  ３０秒間、６０℃  ３０秒間、７２℃  １分３０秒間を３５サイクル、最後に７２℃１０分間の条件で行った。反応混合液をアガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物を分離した。増幅産物を含むバンドを単離し、Ｃｏｎｃｅｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）により増幅産物を精製した。増幅産物をｐＴ７−ｖｅｃｔｏｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にサブクローニングし、ＰＲＩＳＭ  ３１０  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰｅｒｉｎＥｌｍｅｒ社製）により塩基配列を決定した。
決定された塩基配列を配列番号１の塩基配列と比較し、また決定された塩基配列から予想されるアミノ酸配列と配列番号２の配列とを比較し、変異の有無を解析した。表１に結果を示す。
プライマー１（配列番号４）：ＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＣ  （配列番号１における第３７３番目〜第３９３番目の残基に対応）
プライマー２（配列番号５）：ＧＧＴＣＴＡＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＡＧ  （配列番号１における第１４４２番目〜第１４５９番目の残基に対応）
【表１】
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表１中、「Ａｌａ３０Ｔｈｒ」は「第３０番目のアラニンのスレオニンへの変異」を意味する。「Ｌｙｓ２６１＊」は「第２６１番目のリジンのストップコドンへの変異」を意味する。「Ｔ５６８Ｃ」は「第５６８番目のチミンのシトシンへの変異」を意味する。「ｄｅｌ（７７７−８６５）」は「第７７７番目−第８６５番目の残基の欠失」を意味する。
また検体番号１〜４は前立腺癌患者の癌部を、検体番号５はＬＮ−ＣａＰ細胞を、検体番号６はＰＣ−３細胞を、検体番号７はＤＵ１４５細胞をそれぞれ示す。
表１から明らかなように、全ての前立腺癌の検体において、ＰＣＡ−１遺伝子の変異が認められた（前立腺癌患者：４／４、前立腺癌細胞株：３／３）。変異の箇所、種類は多様であったが、Ｇ１１３２Ｔの変異が全ての前立腺癌患者において確認され（４／４）、またＡｓｐ２２８Ｇｌｕのアミノ酸置換を伴うＣ１０９０Ｇの変異が全ての前立腺癌細胞株（３／３）において確認された。第２６１番目のリジンにおける変異も比較的高頻度に認められた（２／７）。複数の変異を有する検体がほとんどであった（前立腺癌患者：４／４、前立腺癌細胞株：２／３）。
また、ＰＣＡ−１の脱アルキル化酵素活性部位のアミノ酸変異をもたらす変異が、極めて高頻度に確認された（前立腺癌患者：３／４、前立腺癌細胞株：３／３）。このことは、ＰＣＡ−１遺伝子の変異によるＰＣＡ−１の脱アルキル化酵素活性の異常と前立腺癌の発症、進行等との関連を示唆する。
一方、非癌部においては上記ＰＣＡ−１遺伝子の変異は認められなかった（３人中３人）。
【実施例２】  正常ＰＣＡ−１（ＰＣＡ−１ＷＴ）遺伝子ならびに第７７７番目−第８６５番目の塩基を欠失したＰＣＡ−１（ＰＣＡ−１Δ７７７−８６５）遺伝子を哺乳類発現ベクター（ｐＥＧＦＰ）に組み込んだ。これらの発現ベクター（各５μｇ）をＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法によりＣＯＳ−７細胞（１ｘ１０６）にトランスフェクションした。コントロール群としては、空の発現ベクターを細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション４８時間目に、０．２５ｍＭメチルメタンスルホン酸（ＭＭＳ）を加え、核酸のアルキル化傷害を誘発し、その２４時間後に接着細胞数を測定した。結果を図１に示す。
図１から明らかなように、コントロール群ならびにＰＣＡ−１Δ７７７−８６５トランスフェクション群において、０．２５ｍＭのＭＭＳによる核酸のアルキル化傷害にともなう約４０％の細胞死が認められた。一方、ＰＣＡ−１ＷＴトランスフェクション群においては、ＭＭＳ誘発アルキル化傷害が顕著にレスキューされた。この結果から、正常ＰＣＡ−１はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、アルキル化ＤＮＡの脱アルキル化活性を発現するが、ＰＣＡ−１Δ７７７−８６５はその活性を欠失していることが示された。また、ＰＣＡ−１の脱アルキル化酵素活性部位の変異は、脱アルキル化活性の異常をもたらし得ることが示された。
【産業上の利用可能性】  本発明の前立腺癌の判定方法を用いれば、簡易かつ高感度に前立腺癌を発症している危険がある又は発症する危険がある被検者を判定することができるので、前立腺癌の診断、経過観察、予後の予測、発症前診断、保因者診断等に有効である。
本出願は、日本で出願された特願２００４−４７０３６を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含されるものである。
【配列表フリーテキスト】配列番号４：ＰＣＡ−１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号５：ＰＣＡ−１遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマーとして作用すべく設計されたオリゴヌクレオチド
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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