(57)【要約】乳酸菌の生産する或はナイシン以外のバクテリオシンに対する乳酸菌の耐性を指標とし、或はナバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜することで、バッチ培養においても、液体培地で増殖させた場合、培地上清１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシン生産能を有する乳酸菌を取得することができ、該培養物を食品又は飼料に用いることで食品又は飼料の保存性を高めることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体培地によるバッチ培養において培地の上清１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産する乳酸菌。
【請求項２】
乳酸菌が上清１ｍＬあたり８，１００ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産するものである請求の範囲第１項記載の乳酸菌。
【請求項３】
乳酸菌が上清１ｍＬあたり１０，１２５ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産するものである請求の範囲第１記載の乳酸菌。
【請求項４】
液体培地が０．５％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、１．５％の炭酸カルシウムを含有する液体培地である請求の範囲第１項記載の乳酸菌。
【請求項５】
生産するナイシンがナイシンＡ又はナイシンＺである請求の範囲第１項記載の乳酸菌。
【請求項６】
乳酸菌がラクトコッカス属に属するものである請求の範囲第１項記載の乳酸菌。
【請求項７】
乳酸菌がラクトコッカス・ラクティスＡＪ１１０２１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８５５２）である請求の範囲第６項記載の乳酸菌。
【請求項８】
乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜することを特徴とするナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
【請求項９】
バクテリオシンがエンテロシン又はナイシンである請求の範囲第８項記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
【請求項１０】
バクテリオシンが培地１ｍＬあたり１１，０００〜９０，０００ＩＵのナイシンである請求の範囲第８項記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
【請求項１１】
バクテリオシンが培地１ｍＬあたり２０，０００〜８０，０００ＩＵのナイシンである請求の範囲第８項記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
【請求項１２】
請求の範囲第１項乃至第７項記載の乳酸菌を培地中で培養することにより得られる乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌の除去された培養液上清又は該培養液上清の乾燥物。
【請求項１３】
請求の範囲第１２項記載の乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌を除去した培養液上清又は該培養液上清の乾燥物を含有する保存性が向上した飲食品又は飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はナイシンを生産する乳酸菌とその選抜方法、及び同乳酸菌を利用した食品又は飼料に関するものである。
【背景技術】    乳酸菌の一種であるラクトコッカス・ラクティス（以下、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓと記す）の一部は、発酵により糖類から乳酸ならびにペプチド性の抗菌物質ナイシンを生産し、その菌体並びに培養液は微生物に対する静菌、殺菌効果があり、近年特に食品の保存性向上機能に対する関心が高まっている。
ナイシンは３４個のアミノ酸より構成されており分子内にランチオニン、β−メチルランチオニン、デヒドロアラニン、及びデヒドロブチリンを有する分子量約３．５ｋＤａの抗菌性ペプチドである。現在までに、ナイシンには天然のアミノ酸置換体として、ナイシンＡ、ナイシンＺ、ナイシンＱが報告されている。また、その抗菌スペクトルは広くグラム陽性菌のみならずグラム陰性菌に対しても抗菌効果を示すことが知られている（Ｇｉｌｌ  Ａ．Ｏ．ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００３，Ｖｏｌ．８０，ｐ２５１−９．）。
また、ナイシンはバクテリオシンの中で唯一米国ＦＤＡにＧＲＡＳ物質として認定されており、食品や飼料、医薬品などに幅広く利用されている安全な物質である。
ナイシンを生産するＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ及びその培養物の静菌剤としての利用例として、培養液の食品添加剤としての利用（特開平５−２６８９７５号公報）や、生鮮食品または発酵食品にＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓを混合することによる食品の保存方法（特開平５−２１１８５９号公報）が挙げられる。
また、食品以外での利用法としては口腔洗浄剤や医薬品としての利用法（特開平９−０７７６８１号公報）などが挙げられる。
ナイシンを生産する能力の高い菌株としてＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓに属する乳酸菌が培養液１ｍＬあたり６，７５０ＩＵのナイシンを生産するとの報告がある（Ｄｅ  Ｖｕｙｓｔ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，１９９４，ｐ１５１−２２１）。但し、具体的な培養条件についての開示はない。また、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ＵＬ７１９をバッチ培養した際に、培養液１ｍＬあたり４，１００ＩＵのナイシンを生産するとの報告がある（Ａｍｉａｌｉ  ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｙ，１９９８，ｐ８８７−８９４）。
ナイシンを生産する能力の高い菌株の選抜方法として、エリスロマイシン耐性を指標とした選抜により、５０００ＩＵ／ｍＬのナイシンに対し耐性を持つようになり、親株として利用したＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  Ｎ８株に対し、菌数あたりの最高ナイシン生産能が１０倍になったという報告がある（Ｑｉａｏ  ｅｔ．ａｌ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔ．，１９９７，ｐ１９９−２０２）。但し、最高２．８×１０−５ＩＵ／ｃｆｕとあるが、培養液あたりの菌数が記載されておらず、具体的なナイシン生産能すなわち培養液１ｍＬあたり何ＩＵのナイシンを生産するかは示されていない。Ｑｉａｏ  ｅｔ．ａｌ．の文献以外に、ナイシンを生産する能力の高い菌株の選抜方法に関する報告はなく、ナイシン耐性を指標とするナイシンを生産する能力の高い菌株の選抜方法についての報告もない。
ナイシンを高濃度で取得する方法として、ナイシン生産能の低い乳酸菌の培養液を膜濃縮する方法や、連続培養などにより培地中に蓄積する方法（特開２００２−８５０８３号公報）などが挙げられるが、連続培養では複雑で高価な装置が必要であること、また濃縮法ではナイシン活性が低下することから必ずしも効率の良い方法とはいえない。
また、ナイシン生産乳酸菌培養物の微生物に対する静菌効果は乳酸菌体込みの方が高いという報告もあり（米国特許第５，９６５，１７８号公報）、実際に味噌の製造法（特開２００１−２２４３５９号公報）や煮豆の製造法（特開２００３−１１６４７７号公報）では菌体とナイシン溶液の両者を併用して静菌効果を上げている。
一方、上述した濃縮や連続培養による高濃度のナイシン溶液の調製法では菌体が除去されるという問題があることから、バッチ培養のような簡便な方法で高濃度ナイシン、及び乳酸菌体を含む培養液を調製することが望まれる。そのためには、ナイシンを高生産する乳酸菌を育種、選抜する方法を開発し、ナイシン生産能の高い乳酸菌が開発することが有効であり、ナイシン生産能の高い乳酸菌が開発されれば、その培養物を飲食品や飼料に利用することにより、それら飲食品や飼料の保存性を効率よく向上させることができる。
【発明の開示】
本発明は、簡便なバッチ培養においても高濃度のナイシンを培養液中に生産可能な乳酸菌及びその培養液を提供すること及びナイシン生産能の高い乳酸菌を簡便に選抜する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、乳酸菌の生産するバクテリオシン、特にエンテロシンやナイシンに対する耐性を指標とし、乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜することで、バッチ培養においても、これまで報告されているより高いナイシン生産能を有する乳酸菌を取得できることを見出した。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）液体培地によるバッチ培養において培地の上清１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産する乳酸菌。
（２）乳酸菌が上清１ｍＬあたり８，１００ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産するものである（１）記載の乳酸菌。
（３）乳酸菌が上清１ｍＬあたり１０，１２５ＩＵ以上のナイシンを培地中に生産するものである（１）記載の乳酸菌。
（４）液体培地が０．５％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、１．５％の炭酸カルシウムを含有する液体培地である（１）記載の乳酸菌。
（５）生産するナイシンがナイシンＡ又はナイシンＺである（１）記載の乳酸菌。
（６）乳酸菌がラクトコッカス属に属するものである（１）記載の乳酸菌。
（７）乳酸菌がラクトコッカス・ラクティスＡＪ１１０２１２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８５５２）である（６）記載の乳酸菌。
（８）乳酸菌の生産するバクテリオシンを含有する合成培地上で生育する菌を選抜することを特徴とするナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
（９）バクテリオシンがエンテロシン又はナイシンである（８）記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
（１０）バクテリオシンが培地１ｍＬあたり１１，０００〜９０，０００ＩＵのナイシンである（８）記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
（１１）バクテリオシンが培地１ｍＬあたり２０，０００〜８０，０００ＩＵのナイシンである（８）記載のナイシン生産乳酸菌の選抜方法。
（１２）（１）乃至（７）記載の乳酸菌を培地中で培養することにより得られる乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌の除去された培養液上清又は該培養液上清の乾燥物。
（１３）（１２）記載の乳酸菌を含有する培養液又は該乳酸菌を含有する培養液の乾燥物又は該乳酸菌を除去した培養液上清又は該培養液上清の乾燥物を含有する保存性が向上した飲食品又は飼料。
本発明の乳酸菌は乳酸菌の生産するバクテリオシンに対する耐性を有し、かつ０．５％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、１．５％の炭酸カルシウムを含有する液体培地によるバッチ培養において培地の上清１ｍＬあたり、６，８００ＩＵ以上のナイシンを生産する株である。
乳酸菌培養物の取得方法は、次の通りである。
使用する液体培地は、基本的にはナイシンを生産する乳酸菌が増殖可能であることが要件であり、一般的に糖源、窒素源、無機塩類等の水溶液より構成される合成培地である。この合成培地には、糖源としてはブドウ糖、ガラクトース等の単糖類、乳糖、蔗糖のうち少なくとも１種が含まれており、窒素源としては蛋白質分解物、ペプトン、酵母エキス、魚肉エキス、カザミノ酸、麦芽汁等のうち少なくとも１種が含まれている。無機塩類としては、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム等を含有している。好ましくは、０．５％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、１．５％の炭酸カルシウムを含有する液体培地であり、培地のｐＨは６．０〜７．０に調整し、殺菌後冷却し使用する。培養中のｐＨを６．０〜７．０に調整することはナイシンの生産に重要であり、炭酸カルシウムはこのｐＨ調整の目的で添加している。
調製した培地に、ナイシンを生産する乳酸菌を１０５〜１０９個／ｍＬとなるよう接種し、２５℃〜３５℃、望ましくは２７．５℃〜３２．５℃で、ｐＨを５．０〜６．５、望ましくは５．５に調製しながら、０（静置）〜１５０ｒｐｍの低速で攪拌し、１５〜３５時間培養をおこなう。ナイシンを生産する乳酸菌はＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｓｐ．ｌａｃｔｉｓに属し、ＪＣＭ７６３８、ＡＴＣＣ１１４５４、ＮＣＤＯ４９７、ＩＦＯ１２００７などを例示することができる。
培養液のナイシン活性測定法は石崎らの方法に従う（Ａｄｖ．Ｊ．Ｆａｃ．Ａｇｒ．，Ｋｙｕｓｈｕ  Ｕｎｉｖ．，４０，ｐ７３−８５）。即ち取得した培養液を、ＨＰＬＣにて測定する。スタンダードにはナイシンＡ製剤（シグマ社）を利用する。このとき、ナイシン量１μｇあたりの活性値は国際単位で定められている４０ＩＵ／μｇとする。
ナイシン活性測定用のサンプル調製の際は、サンプリングした培養液に終濃度０．１％となるようＴｗｅｅｎ−２０を加えてよく混合した後、遠心分離もしくは０．２２μｍのフィルター処理にて乳酸菌体を除去する。
次に、ナイシン高生産乳酸菌の取得法について述べるが、菌株の突然変異を利用する。まず、増殖可能な合成液体培地にて乳酸菌を培養後、プランタリシンＳ、ヘルベティシンＪ、ペディオシンＰＡ−１、エンテロシン等のバクテリオシンを添加した液体培地中に、好ましくはプランタリシンＳ、ヘルベティシンＪ、ペディオシンＰＡ−１、エンテロシン等乳酸菌の生産するバクテリオシンを添加した液体培地中に、より好ましくはラクティシン４８１、ラクトシンＳ、ナイシン等ランティビオティクス（ｌａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；乳酸菌の生産するバクテリオシンの一分類）或はペディオシンＰＡ−１、エンテロシン等ＣｌａｓｓＩＩ−ｔｙｐｅバクテリオシン（乳酸菌の生産するバクテリオシンの一分類）を添加した液体培地中に、更に好ましくはランティビオティクスに分類されるナイシン又はＣｌａｓｓＩＩ−ｔｙｐｅバクテリオシンに分類されるエンテロシンを添加した液体培地中に、特に好ましくは親株が生産する量以上のナイシンを添加した液体培地中に、乳酸菌培養液の一部を接種し３０℃で増殖させ、自然変異若しくは突然変異誘発剤、紫外線等にて変異を誘導する。突然変異誘発剤の例としてはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニヂン（ＮＴＧ）やエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）、４−ジメチルアミノベンゼンジアゾスルホン酸ナトリウム（ＤＡＰＡ）などが挙げられる。
突然変異を誘発した株をナイシン等のバクテリオシンを含む合成寒天培地に塗布する。その際の合成寒天培地のナイシン濃度は１１，０００〜９０，０００ＩＵ／ｍＬ、好ましくは２０，０００〜８０，０００ＩＵ／ｍＬである。ナイシン以外のバクテリオシンとしてはナイシン以外のランティビオティクスやＣｌａｓｓＩＩ−ｔｙｐｅバクテリオシンを塗布する。塗布量は、親株の生育を抑制可能な量以上、好ましくは２〜２００倍量、より好ましくは５〜２００倍量である。例えば、エンテロシンの場合は、親株によっても異なるが、藤田らの報告結果（２００４年度日本乳酸菌学会発表「Ｂａｃｔｅｒｉｏｃｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＴＵＡ  １３４４Ｌ」）から考えて、一般的に０．５μｇ／ｍＬ以上、１〜１００μｇ／ｍＬ、２．５〜１００μｇ／ｍＬ、１０〜１００μｇ／ｍＬと例示することができる。培地に播く乳酸菌数は出現するコロニーが互いに接触しないような数であることが好ましく、具体的には１プレートあたり１００〜３００コロニー程度が好ましい。ナイシン生産能の向上した突然変異種を効率よく選抜するために、上記培地上で生育した株の中から親株より生育の良い株を選抜する。この生育の良し悪しは目視で行なう。
選抜した株を前述の乳酸菌培養液の取得法に従って培養する。同培養液を使用して、マイクロプレートアッセイを行い、指標菌に対する抗菌活性が親株以上の菌株を選抜する。マイクロプレートアッセイ法を以下に説明する。まず、マイクロプレートのウェル中にそれぞれ、菌体を除いた各乳酸菌株の培養液を段階希釈した液と、ナイシンに感受性のあるグラム陽性菌の培養液を指標菌液として、菌体数が１０２〜１０５個／ｍＬとなるように加えて混釈する。このとき使用する指標菌の例として、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＪＣＭ１４６５Ｔ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｋｅｉ  ＪＣＭ１１５７Ｔなどが挙げられる。次に、このマイクロプレートを３７℃で４〜２４時間、好ましくは１２〜２１時間インキュベートし、指標菌の生育度合いで抗菌活性、即ち培養液中のナイシン活性を測定する。生育度合いは、ウェル中の濁度（Ａｂｓ＝５９５ｎｍ）の高低にて、判断する。培養液中のナイシン活性が高く指標菌の生育が阻害されると、ウェル中の濁度は上昇しない。ウェルの濁度が上昇する培養液上清の最大希釈率を親株と変異株とで比較し、この希釈率が親株以上になった株は親株以上のナイシンを生産している可能性があるものとして選抜する。
最後に上記で選抜した株を培養して、培養液中のナイシン量をＨＰＬＣにて定量することにより培養液中のナイシン活性すなわち乳酸菌のナイシン生産能が上昇したことを確認する。
上記の方法により、バッチ培養でも十分に高濃度のナイシンを培養液中に生産可能な乳酸菌を効率よく取得することが可能である。これまでの報告の中で最高ナイシン生産量は６，７５０ＩＵ／ｍＬ（Ｄｅ  Ｖｕｙｓｔ  ｅｔ．ａｌ．）であるが、０．５４％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、１．５％炭酸カルシウムからなる液体培地で最適な条件下で、ｐＨを維持しながら培養することにより、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌よりも高いナイシン生産能を有する乳酸菌、すなわち上清１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシン生産能を有する乳酸菌を取得することが可能である。具体的には、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の１．１倍のナイシン生産能である上清１ｍＬあたり７，４２５ＩＵ／ｍＬ以上のナイシンを生産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の１．２倍のナイシン生産能である上清１ｍＬあたり８，１００ＩＵ／ｍＬ以上のナイシンを生産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の１．５倍のナイシン生産能である上清１ｍＬあたり１０，１２５ＩＵ／ｍＬ以上のナイシンを生産する乳酸菌、公知の中で最高ナイシン生産能を有する乳酸菌の１．８倍のナイシン生産能である上清１ｍＬあたり１２，１５０ＩＵ／ｍＬ以上のナイシンを生産する乳酸菌を得ることが可能である。また、ナイシン生産能を有する乳酸菌を例えばセリン、システインを添加する等さらに適当な培地にて培養することにより上清１ｍＬあたり最高２０，０００ＩＵのナイシンを得ることが可能であると考えられる。
また、上記の方法により取得したナイシン生産能の高い乳酸菌をＹＤＣＳ培地（０．５４％の酵母エキス、０．５％の塩化ナトリウム、３％のグルコース、０．６７ｍｇ／ｄｌのセリン、０．６７ｍｇ／ｄｌのシステイン、１．５％炭酸カルシウムのような乳酸菌の生育しやすい培地でのバッチ培養することにより、ナイシン生産能の高い乳酸菌及び乳酸菌を含有する培養液を効率よく製造することができる。その乳酸菌を含有する培養液を例えば噴霧乾燥あるいはドラム乾燥することにより乳酸菌を含有する培養液の乾燥物を製造することができる。また、乳酸菌を含有する培養液を例えばフィルター処理あるいはデカンテーション処理することにより乳酸菌の除去された培養液上清を製造することができ、その培養液上清を例えば噴霧乾燥あるいはドラム乾燥することにより培養液上清の乾燥物を製造することができる。上記の方法により得られた培養物は、飲食品や飼料に０．０１〜１０％添加することにより保存性を高めることができる。このときの培養物とは、培養液そのものや、殺菌した培養液、菌体を除去した培養液、これらの濃縮物又は乾燥物のいずれかでかまわない。更に飲食品としては、ジュースや乳製品、肉製品、漬物又は味噌や醤油などの発酵食品調味料などが挙げられる。また、飼料としてはサイレージなどがある。例えば、味噌、醤油製造における製麹工程で該ナイシン生産乳酸菌及び高濃度のナイシンを含む培養液を撒水することにより、バチルス属細菌など望ましくない微生物の汚染をこれまでより効果的に抑えることが出来るようになるため、官能に優れ、微生物汚染の少ない製品を作ることが容易となる。さらに上記のような培養液を麹に使用することにより麹の微生物汚染を抑制することができ、麹を無塩分解し、タンパクを高度に分解することにより新しい調味料の製造することも可能となる。
ナイシンを含む培養液を食品用静菌剤として利用する際には、培地成分の官能が使用する食品に悪影響を及ぼすことも考えられるが、該ナイシン生産乳酸菌を使った高濃度のナイシンを含む培養液を利用することで、培養液の添加量が少量で済むため、このような培地成分による官能上の悪影響はなくなる。また、チーズの製造においては、チーズに多孔を形成するクロストリジウム属細菌の増殖を抑えるためナイシン生産乳酸菌をスターターとして接種している例があるが、該ナイシン高生産乳酸菌を使用した場合当然その静菌効果は高くなるため、より確実に目的のチーズを製造できるようになる。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、実施例により本発明を詳しく説明する。もちろん、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  まず、自然界から分離したナイシンＺ生産菌（表３記載の親株）をナイシン濃度１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００ＩＵ／ｍＬとなるように調製したＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ製）に塗布し、３０℃で２日培養した。本株はナイシン濃度１，０００、２，０００ＩＵ／ｍＬのＭ１７培地では生育したが、５，０００、１０，０００ＩＵ／ｍＬのＭ１７培地では生育しなかった。この結果より、本株のナイシンに対する最小生育阻止濃度（ＭＩＣ）は、５，０００ＩＵ／ｍＬであることが確認された。
この自然界から分離したナイシンＺ生産乳酸菌をＭ１７培地で前培養し、生育した菌を５００μｇ／ｍＬのＮＴＧにて処理し、突然変異を誘発した。
上記の変異処理した株をナイシン濃度１，０００、２，０００、４，０００、８，０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００、８０，０００、１００，０００ＩＵ／ｍＬとなるよう調製したＭ１７培地に塗布し、３０℃で１〜３日インキュベートした。
その結果、各ナイシン濃度の培地で生育していた株数を表１に示す。
【表１】
2005080550.tif 000002
表１のように、ナイシン濃度８，０００ＩＵ／ｍＬ以上より、プレート上に生育可能な菌数が減少し始めた。そこで、８，０００ＩＵ／ｍＬ以上１００，０００ＩＵ／ｍＬ以下のナイシンを含有する合成培地で、ナイシンを高生産する乳酸菌の絞込みが可能と考え、各プレートから３００株ずつ選抜しマイクロプレートアッセイによって親株よりもナイシン生産能の向上した株を選抜した。
選抜した乳酸菌をそれぞれＴｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にて３７℃で２４時間培養し、その培養液を５０ｍＬのＹＤ培地（０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム，３．０％グルコース，１．５％炭酸カルシウムｐＨ  ７．０、坂口フラスコ）にシードして１００ｒｐｍで振とうし、バッチ培養を行った。
各菌株の生産するナイシン量をＨＰＬＣにて測定した結果、培地１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシンを生産する菌株数を表２に、それぞれのプレートで得られた変異株のナイシン活性を表３に示す。
【表２】
2005080550.tif 000003
【表３】
2005080550.tif 000004
結果、２０，０００ＩＵ／ｍＬ〜８０，０００ＩＵ／ｍＬのナイシンを含有する培地にて、ナイシン生産量が６，８００ＩＵ／ｍＬ以上となる株を効率的に選抜可能であることが判明した。
４０，０００ＩＵ／ｍＬのナイシン含有プレートで選抜した株より、最もナイシン生産能の高いＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＪ１１０２１２株を得た。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＪ１１０２１２株は親株の約３．０倍、一般的なナイシンＺ株であるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＪＣＭ７６３８株の約３．４倍のナイシン生産能を有することが判明した。また、これまでの報告の中での最高ナイシン生産量であるＤｅ  Ｖｕｙｓｔ  ｅｔ．ａｌ．の文献に記載された６，７５０ＩＵ／ｍＬと比較しても約１．８倍のナイシンを生産する能力を有することが判明した。なお、Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＪ１１０２１２株は２００３年１１月１９日に独立行政法人  産業技術総合研究所  特許生物寄託センターにＦＥＲＭ  ＢＰ−８５５２の受託番号で寄託されている。
【実施例２】  エンテロシン含有溶液を次のようにして調整した。エンテロシン生産菌であるＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ  ＪＣＭ  ５８０４をＭＲＳ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にて３７℃で２２時間振とう培養した。培養液を遠心分離後、上清液をフィルター濾過（ＡＤＶＡＮＴＥＣ製  Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ，  Ｄｉｓｍｉｃ−２５ｃｓ，Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  Ａｃｅｔａｔｅ  ０．４５μｍ）した。限外濾過膜を用いて前述の上清液の粗精製を行った。即ち、遠心分離を行って、限外濾過（脱塩）を行い、上清画分を採取した。本工程によって、培養液中のエンテロシンを濃縮し、エンテロシンを約２００μｇ／ｍＬ含む溶液を調製した。濃縮前後の抗菌活性は、実施例１で使用した自然界より単離したナイシンＺ生産乳酸菌を用いて、ｓｐｏｔ−ｏｎ−ｌａｗｎ法により確認した。
自然界から分離したナイシンＺ生産乳酸菌（表３記載の親株）をＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ製）で前培養し、生育した菌を５００μｇ／ｍＬのＮＴＧにて処理し、突然変異を誘発した。
上記の変異処理した株をＭ１７培地及びエンテロシン含有濃度が約２０μｇ／ｍＬになるように調製したＭ１７培地に塗布し、３０℃で１〜３日インキュベートした。プレート上に生育してきたコロニー数は、エンテロシンを含有するＭ１７培地ではＭ１７培地に比べて１／１００であった。よって、ナイシン含有Ｍ１７培地での結果から考えて、本濃度でのエンテロシン含有Ｍ１７培地でナイシンを高生産する乳酸菌の絞込みが可能と考え、１０８株選抜しマイクロプレートアッセイにて親株よりもナイシン生産能の向上した株を選抜した。
選抜した乳酸菌をそれぞれＴｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にて３７℃で２４時間培養し、その培養液を５０ｍＬのＹＤ培地（０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム，３．０％グルコース，１．５％炭酸カルシウムｐＨ  ７．０、坂口フラスコ）にシードして１００ｒｐｍで振とうし、バッチ培養を行った。
各菌株の生産するナイシン量をＨＰＬＣにて測定した結果、培地１ｍＬあたり６，８００ＩＵ以上のナイシンを生産する菌株を２４株取得した。
このようにしてエンテロシン含有プレートで選抜した株より、最もナイシン生産能の高いＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＪ  １１０３７６株（ナイシン活性１０，８０２ＩＵ／ｍＬ）を得た。Ｌ．ｌａｃｔｉｓ  ＡＪ  １１０３７６株は親株の約２．７倍、一般的なナイシンＺ株であるＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＪＣＭ７６３８株の約３．４倍のナイシン生産能を有することが判明した。また、これまでの報告の中での最高ナイシン生産量であるＤｅ  Ｖｕｙｓｔ  ｅｔ．ａｌ．の文献に記載された６，７５０ＩＵ／ｍＬと比較しても約１．６倍のナイシンを生産する能力を有することが判明した。
比較例１
実施例１記載のＬ．ｌａｃｔｉｓ  ＃Ｎ４３をエリスロマイシン濃度０．０１〜０．２μｇ／ｍＬとなるよう調製したＭ１７培地に塗布し、３０℃で１〜３日インキュベートした。その後、生育していた乳酸菌をそれぞれＴｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にて３７℃で２４時間培養し、その培養液を５０ｍＬのＹＤ培地（０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム，３．０％グルコース，１．５％炭酸カルシウムｐＨ  ７．０、坂口フラスコ）にシードして１００ｒｐｍで振とう培養を行った。各菌株が培地上清中に生産するナイシン量をＨＰＬＣにて測定した結果を表４に示す。
【表４】
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表４のように親株よりナイシン生産能が向上した菌株は得られず、Ｑｉａｏ  ｅｔ．ａｌ．の文献にあるようなエリスロマイシン耐性を指標とした選抜により、ナイシン生産能を向上させることはできなかった。よって、エリスロマイシン耐性を指標とする選抜方法と比較し、ナイシンを指標とする選抜方法がはるかに効率的であると考えられる。
比較例２
実施例１記載の自然界から分離したナイシンＺ生産乳酸菌（表３中の親株）をＭ１７培地（Ｄｉｆｃｏ製）で前培養し、生育した菌を５００μｇ／ｍＬのＮＴＧにて処理し、突然変異を誘発した。
上記の変異処理した株をエリスロマイシン濃度０．２μｇ／ｍＬとなるよう調製したＭ１７培地に塗布し、３０℃で１〜３日インキュベートした。その後、生育していた乳酸菌からランダムに２０株選抜した。それぞれＴｉｏｇｌｙｃｏｌａｔｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｇｌｕｃｏｓｅ培地（Ｄｉｆｃｏ製）にて３７℃で２４時間培養し、その培養液を５０ｍＬのＹＤ培地（０．５％酵母エキス，０．５％塩化ナトリウム，３．０％グルコース，１．５％炭酸カルシウムｐＨ  ７．０、坂口フラスコ）にシードして１００ｒｐｍで振とう培養を行った。各菌株が培地上清中に生産するナイシン量をＨＰＬＣにて測定したところ、親株以上のナイシン活性を有する菌株を取得できなかった。
このように親株よりナイシン生産能が向上した菌株は得られず、Ｑｉａｏ  ｅｔ．ａｌ．の文献にあるようなエリスロマイシン耐性を指標とした選抜により、ナイシン生産能を向上させることはできなかった。よって、エリスロマイシン耐性を指標とする選抜方法と比較し、ナイシンやナイシン以外のバクテリオシンを指標とする選抜方法がはるかに効率的であると考えられる。
【産業上の利用可能性】  本発明の乳酸菌の選抜方法によりナイシン生産能の高い乳酸菌を得ることができ、本発明の乳酸菌は高濃度のナイシンを生産することができるので、簡便なバッチ培養においてもナイシン活性の高い培養液を得ることができる。この培養液はさまざまな飲食品、飼料に使用されることで、飲食品、飼料の保存性を向上させることができる。従って、本発明は工業上、特に食品分野、飼料分野において極めて有用である。
【国際調査報告】
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