(57)【要約】本発明は、大規模なプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーカラムの状況におけるバイオバーデンの低減を含む、様々なクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法を提供する。様々なクロマトグラフィーマトリックス、特に、プロテインＡなどのタンパク質性リガンドを伴うクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンを低減させるために大規模なＧＭＰおよびＣＧＭＰの状況で使用できる新規の効果的な方法の必要性が存在する。本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための組成物および方法を提供することによりこの必要性および他の必要性に対処する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが約１時間〜約４時間行われる、方法。
【請求項２】
前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が約０．１Ｍの酢酸を含み、前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物が約０．５Ｍの酢酸を含み、前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
【請求項１０】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が酢酸塩をさらに含む、請求項１または９に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が約２〜約３の間のｐＨを有する、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法。
【請求項１９】
前記接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が約８Ｍの尿素を含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
【請求項２６】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させるステップが１５℃〜３０℃の間の温度で実行される、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記接触させるステップが２０℃〜２５℃の間の温度で実行される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記クロマトグラフィーマトリックスが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）  Ａ、ｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）  Ｌ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）  ＰｒｉＭａｂ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）  Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＫａｎＣａｐＡ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｘｔｒａ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
医薬物質を含む組成物を精製のためにアプライする前に微生物負荷を低減させる方法であって、
クロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
請求項１に記載の方法を行うステップ、および
前記医薬物質を含む前記組成物を前記クロマトグラフィーマトリックスにアプライするステップ
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１月３０日に出願された，米国仮出願番号第６２／４５２，１４０号に基づく優先権を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、大規模なプロテインＡベースのアフィニティークロマトグラフィーカラムの状況におけるバイオバーデンの低減を含む、様々なクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗体薬物は、最も普及したバイオ医薬製品である。例えば、天然のまたは操作されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡリガンドを用いて行われるアフィニティークロマトグラフィーは、抗体薬物の製造プロセスにおいて不純物および汚染物を除去するための捕捉方法として広く使用されている。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に結合し、プロテインＡカラムはモノクローナル抗体の精製について選択的であると考えられる。プロテインＡを用いるアフィニティークロマトグラフィーは、典型的に、沈殿または変性した物質などのカラムに結合した不純物を洗浄および除去するために定置洗浄（ｃｌｅａｎ−ｉｎ−ｐｌａｃｅ）（ＣＩＰ）ステップを伴う。ＣＩＰは、通常、水酸化ナトリウム溶液を用いて行われる。
【０００４】
洗浄に加えて、プロテインＡクロマトグラフィーマトリックスまたはカラム中の微生物の数を低減させるために、水酸化ナトリウム溶液、またはベンジルアルコールを含むリン酸溶液が使用される。モノクローナル抗体産生細胞を培養するために使用される培地、ならびに関連する宿主細胞のタンパク質およびＤＮＡからの細菌は、使用中にプロテインＡカラムのバイオバーデンを急速に増加させ得る。そのような細菌および微生物としてのバイオバーデンの増加はカラム上に蓄積する。カラム性能は、一般に、バイオバーデンが増加するにつれて劣化する。そのような劣化の徴候としては、製造物純度の減少、カラムパッキングの悪化、およびバックプレッシャーの増加が挙げられる。
【０００５】
プロテインＡカラムは非常に高価であり、そのような親和性カラムのパッキングおよびアンパッキングは労働集約的であるので、プロテインＡカラム上の微生物バイオバーデンの管理および低減は重要である。プロテインＡカラムを交換しまたはプロテインＡカラム精製の上流に処理ステップを加える費用を回避するために、プロテインＡの構造および機能に負に影響することなくカラムから迅速に大量のバイオバーデンを除去し、下流への効果をほとんど有しない薬剤を発見する必要がある。
【０００６】
微生物バイオバーデンの低減の重要性はプロテインＡクロマトグラフィーマトリックスに限定されず、支持体に連結されたタンパク質性リガンドを用いる他のクロマトグラフィーマトリックス、およびタンパク質性リガンドを伴わないマトリックス、例えば、様々なイオン交換クロマトグラフィーマトリックス、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックス、ミックスモードクロマトグラフィーマトリックス、サイズ排除クロマトグラフィーマトリックスなども包含される。
【０００７】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減は、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）、または現行医薬品適正製造基準（ＣＧＭＰ）の状況において特に重要である。そのような基準は、米国食品医薬品局などの規制機関の要件を満たすように製造ステップおよび製造物の品質の一貫性を提供しなければならない。ＧＭＰおよびＣＧＭＰは、製造プロセスにおける高い程度の予測可能性および標準化、特に、ヒト患者において使用される製造される治療用生体分子の純度を確実にすることを必要とする。生体分子を製造するための培養物の生育に関与する労働力と共に、失敗が起こった時に大きな費用が発生する。過度のバイオバーデンはカラム性能を減少させることがあり、それは標準化されかつ予測可能な方式での製造物の精製に干渉することがあり、また他の失敗点の誘発を引き起こす可能性がある。
【０００８】
バイオバーデンを低減させるための当該技術分野において現在公知の剤は、負の下流の効果を有する。例えば、水酸化ナトリウムに基づく溶液、およびベンジルアルコールを含むリン酸に基づく溶液は、微生物の殺滅に効果的なことがあるが、タンパク質性（ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｉｏｕｓ）リガンド（例えば、プロテインＡ）を変性させ、それらの機能に負に影響する傾向もある。
【０００９】
さらに、酸化剤およびそのような溶液の他の成分は、精製されたモノクローナル抗体と共に残存することがあり、下流でそれらをさらに劣化させる可能性がある。
【００１０】
したがって、クロマトグラフィーマトリックス、特にタンパク質性リガンドを有するマトリックス、例えばプロテインＡクロマトグラフィーマトリックスにおいてバイオバーデンを低減させることは難しいことを当業者は理解している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の要旨
上に明記した通り、様々なクロマトグラフィーマトリックス、特に、プロテインＡなどのタンパク質性リガンドを伴うクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンを低減させるために大規模なＧＭＰおよびＣＧＭＰの状況で使用できる新規の効果的な方法の必要性が存在する。本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための組成物および方法を提供することによりこの必要性および他の必要性に対処する。
【００１２】
一態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約２時間行われる、方法を提供する。
【００１３】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００１４】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法を提供する。
【００１６】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍの酢酸から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、方法を提供する。
【００１８】
別の実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、方法を提供する。
【００１９】
さらなる実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約８Ｍの尿素から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００２０】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約８Ｍの尿素および約２０％のエタノールから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、医薬物質を含む組成物を精製のためにアプライする前に微生物負荷を低減させる方法であって、（ａ）クロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、（ｂ）本発明の上記の方法のいずれかを行うステップ、および（ｃ）医薬物質を含む組成物をクロマトグラフィーマトリックスにアプライするステップを含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の説明、特許請求の範囲および図面において当業者に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、０．５Ｍの酢酸を含む溶液でのスパイク試験の結果を示すグラフである。細菌殺滅の程度を、クロマトグラフィーマトリックスなしで溶液中で測定する。黒のバーは、０．５Ｍの酢酸への曝露前（Ｔ＝０）および酢酸への曝露の１時間後（Ｔ＝１時間）のＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａカラムにおけるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓの量を表し、斜線のバーはＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓの量を表す。
【００２４】
【図２】図２は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓで溶液をスパイクし、かつ細菌力価を測定することによる、クロマトグラフィーマトリックスなしでの溶液中のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓの殺滅の結果を示すグラフである。以下の剤を別々の溶液に加えた：（ａ）注射水（ＷＦＩ）、（ｂ）８Ｍの尿素、（ｃ）８Ｍの尿素および２０％のエタノール、（ｄ）６Ｍの塩酸グアニジン、（ｅ）塩酸グアニジンと２０％のエタノール。それぞれについて、ＰＢＳ中でのスパイク確認測定、ならびに０分、３０分、および６０分の時点での測定を行った。黒のバーはＷＦＩ、水平線のバーは８Ｍの尿素、白のバーは８Ｍの尿素と２０％のエタノール、斜線のバーは６Ｍの塩酸グアニジン、網掛けのバーは６Ｍの塩酸グアニジンおよび２０％のエタノールである。
【００２５】
【図３】図３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓで溶液をスパイクし、かつ細菌力価を測定することによる、クロマトグラフィーマトリックスなしでの溶液中のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓの殺滅の結果を示すグラフである。以下の剤を加えた：（ａ）注射水（ＷＦＩ）、（ｂ）８Ｍの尿素、（ｃ）８Ｍの尿素および２０％のエタノール、（ｄ）６Ｍの塩酸グアニジン、（ｅ）塩酸グアニジンと２０％のエタノール。ＰＢＳ中でのスパイク確認測定、ならびに０分、３０分、および６０分の時点での測定を行った。黒のバーはＷＦＩ、水平線のバーは８Ｍの尿素、白のバーは８Ｍの尿素および２０％のエタノール、斜線のバーは６Ｍの塩酸グアニジン、網掛けのバーは６Ｍの塩酸グアニジンおよび２０％のエタノールである。
【００２６】
【図４】図４は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓで溶液をスパイクし、かつ細菌力価を測定することによる、クロマトグラフィーマトリックスなしでの溶液中のＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの殺滅の結果を示すグラフである。以下の剤を加えた：（ａ）注射水（ＷＦＩ）、（ｂ）８Ｍの尿素、（ｃ）８Ｍの尿素および２０％のエタノール、（ｄ）６Ｍの塩酸グアニジン、（ｅ）塩酸グアニジンと２０％のエタノール。ＰＢＳ中でのスパイク確認測定、ならびに０分、３０分、および６０分の時点での測定を行った。黒のバーはＷＦＩ、水平線のバーは８Ｍの尿素、白のバーは８Ｍの尿素および２０％のエタノール、斜線のバーは６Ｍの塩酸グアニジン、網掛けのバーは６Ｍの塩酸グアニジンおよび２０％のエタノールである。
【００２７】
【図５】図５は、異なる期間にわたり０．５Ｍの酢酸に曝露したプロテインＡ含有樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ）に対して行った様々な製造物品質試験の結果を示す図である。黒丸は、０．５Ｍの酢酸に３７５時間曝露した、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａについての値を示す。バツ印は、０．５Ｍの酢酸に５、１０、２５、２００もしくは４００時間曝露しなかった、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅについての値を示す。
【図６】図６は、異なる期間にわたり０．５Ｍの酢酸に曝露したプロテインＡ含有樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ）に対して行った様々な製造物品質試験の結果を示す図である。黒丸は、０．５Ｍの酢酸に３７５時間曝露した、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａについての値を示す。バツ印は、０．５Ｍの酢酸に５、１０、２５、２００もしくは４００時間曝露しなかった、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅについての値を示す。
【図７】図７は、異なる期間にわたり０．５Ｍの酢酸に曝露したプロテインＡ含有樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ）に対して行った様々な製造物品質試験の結果を示す図である。黒丸は、０．５Ｍの酢酸に３７５時間曝露した、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａについての値を示す。バツ印は、０．５Ｍの酢酸に５、１０、２５、２００もしくは４００時間曝露しなかった、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅについての値を示す。
【図８】図８は、異なる期間にわたり０．５Ｍの酢酸に曝露したプロテインＡ含有樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ）に対して行った様々な製造物品質試験の結果を示す図である。黒丸は、０．５Ｍの酢酸に３７５時間曝露した、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａについての値を示す。バツ印は、０．５Ｍの酢酸に５、１０、２５、２００もしくは４００時間曝露しなかった、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅについての値を示す。
【図９】図９は、異なる期間にわたり０．５Ｍの酢酸に曝露したプロテインＡ含有樹脂（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ）に対して行った様々な製造物品質試験の結果を示す図である。黒丸は、０．５Ｍの酢酸に３７５時間曝露した、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａについての値を示す。バツ印は、０．５Ｍの酢酸に５、１０、２５、２００もしくは４００時間曝露しなかった、または全く曝露しなかったＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅについての値を示す。
【００２８】
【図１０】図１０は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への３７５時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理後の範囲の全ては酸処理前の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１１】図１１は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への３７５時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理後の範囲の全ては酸処理前の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１２】図１２は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への３７５時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理後の範囲の全ては酸処理前の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１３】図１３は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への３７５時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理後の範囲の全ては酸処理前の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１４】図１４は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への３７５時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理後の範囲の全ては酸処理前の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【００２９】
【図１５】図１５は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への４００時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。範囲は、統計的に有意な程度まで酸への曝露後により大きい。
【図１６】図１６は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への４００時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理前の範囲は酸処理後の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１７】図１７は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への４００時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理前の範囲は酸処理後の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１８】図１８は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への４００時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理前の範囲は酸処理後の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【図１９】図１９は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅプロテインＡ樹脂に対して行った様々な製造物品質試験のＡＮＯＶＡ分析を示す図である。酸処理後の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への４００時間の曝露の表１からの値を反映する。酸処理前の欄において、黒丸は、０．５Ｍの酢酸への０時間の曝露の表１からの値を反映する。菱形は、９５％信頼区間に基づく範囲を指し示す。酸処理前の範囲は酸処理後の範囲と重なり合う。ＡＮＯＶＡ分析は、０．５Ｍの酢酸への樹脂の長期の曝露からのタンパク質の品質に対する統計的に有意な負の効果を示さない。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
一態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約２時間行われる、方法を提供する。様々な実施形態では、接触させるステップは、２〜５時間、２〜１０時間、２〜２５時間、２〜２００時間、２〜３７５時間、または２〜４００時間行われる。一実施形態では、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。様々な実施形態では、接触させるステップは、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。一実施形態では、組成物は約０．１Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。一実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。様々な実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３１】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は、約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる。
【００３２】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約２時間行われる、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。様々な実施形態では、接触させるステップは、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。１つの特定の実施形態では、組成物は約０．１Ｍの酢酸から本質的になり、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。別の特定の実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸から本質的になり、接触させるステップは少なくとも約４時間行われる。様々な実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３３】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。様々な実施形態では、接触させるステップは、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。一実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。様々な実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸を含み、接触させるステップは、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３４】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は、約０．５Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる。
【００３５】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。様々な実施形態では、組成物は約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸から本質的になり、接触させるステップは、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。１つの特定の実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸から本質的になり、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。様々な実施形態では、組成物は約０．５Ｍの酢酸から本質的になり、接触させるステップは、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３６】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。様々な実施形態では、接触させるステップは、少なくとも約１時間、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、少なくとも約４時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３７】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は、約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる。１つの特定の実施形態では、組成物は、約０．５Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。様々な実施形態では、接触させるステップは、少なくとも約１時間、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、少なくとも約４時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００３９】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物は酢酸塩をさらに含む。
【００４０】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物は約２〜約３の間のｐＨを有する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法を提供する。一実施形態では、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。一実施形態では、組成物は約８Ｍの尿素を含む。
【００４２】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は約８Ｍの尿素および約２０％のエタノールから本質的になる。
【００４３】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。１つの特定の実施形態では、組成物は８Ｍの尿素から本質的になる。
【００４４】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。
【００４５】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は約８Ｍの尿素および約２０％のエタノールから本質的になる。
【００４６】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの塩酸グアニジンを含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法を提供する。一実施形態では、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。一実施形態では、組成物は約６Ｍの塩酸グアニジンを含む。
【００４８】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は約６Ｍの塩酸グアニジンおよび約２０％のエタノールから本質的になる。
【００４９】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの塩酸グアニジンから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは少なくとも約１時間行われる。１つの特定の実施形態では、組成物は約６Ｍの塩酸グアニジンから本質的になる。
【００５０】
関連する態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの塩酸グアニジンを含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも４ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。
【００５１】
一実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。１つの特定の実施形態では、組成物は約６Ｍの塩酸グアニジンおよび約２０％のエタノールから本質的になる。
【００５２】
一実施形態では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの塩酸グアニジンから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）の量の少なくとも４ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、例えば、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、または（５）細菌同定試験などのアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、グラム陽性細菌（例えば、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、およびグラム陰性細菌（例えば、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ）のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす。
【００５３】
一態様では、本発明は、クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸ならびに（ｉ）約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素および／または（ｉｉ）約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの塩酸グアニジンを含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。１つの特定の実施形態では、組成物はアルコールをさらに含む。使用できるアルコールの非限定的な例としては、エタノール（例えば、約２０％）およびベンジルアルコール（例えば、約１％〜約２％）が挙げられる。
【００５４】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、接触させるステップは１５℃〜３０℃の間の温度で実行される。１つの特定の実施形態では、接触させるステップは２０℃〜２５℃の間の温度で実行される。
【００５５】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物は実質的に酸化剤を含まない。
【００５６】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物はペルオキシ酸を含まない。
【００５７】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物は過酸化物を含まない。
【００５８】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、組成物はＮａＯＨを含まない。
【００５９】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、接触させるステップは少なくとも１回繰り返される。
【００６０】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスはクロマトグラフィーカラム中に詰め込まれる。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの間の内径および１５ｃｍ〜３０ｃｍの間の床高さを有する。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、約１ｃｍの内径および約２０ｃｍの床高さを有する。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、４０ｃｍ〜１．６メートルの間の内径および１５ｃｍ〜３０ｃｍの間の床高さを有する。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、約１．４メートルの内径および約２０ｃｍの床高さを有する。
【００６１】
本発明の上記の方法のいずれかの一実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、支持体に連結されたタンパク質性リガンドを含む。１つの特定の実施形態では、タンパク質性リガンドは、１つまたは複数の免疫グロブリン結合ドメインを含む。１つの特定の実施形態では、タンパク質性リガンドは、プロテインＡまたはその断片もしくは誘導体である。１つの特定の実施形態では、タンパク質性リガンドは、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＧ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、ならびにこれらの断片および誘導体からなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）  Ａ、ｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）  Ｌ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）  ＰｒｉＭａｂ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）  Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＫａｎＣａｐＡ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｘｔｒａ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＰＣＣ、およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、タンパク質性リガンドは、本方法が行われた後に、測定できる程度には変性しない。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．５Ｍの酢酸から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、方法を提供する。
【００６３】
別の実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、方法を提供する。様々な実施形態では、接触させるステップは、少なくとも約１時間、１〜５時間、１〜１０時間、１〜２５時間、１〜２００時間、１〜３７５時間、１〜４００時間、少なくとも約４時間、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。
【００６４】
さらなる実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約８Ｍの尿素から本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００６５】
さらに別の実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約８Ｍの尿素および約２０％のエタノールから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００６６】
さらなる実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約６Ｍの塩酸グアニジンから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００６７】
別の実施形態では、本発明は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、クロマトグラフィーマトリックスを約６Ｍの塩酸グアニジンおよび約２０％のエタノールから本質的になる組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、方法を提供する。
【００６８】
一実施形態では、本発明は、医薬物質を含む組成物を精製のためにアプライする前に微生物負荷を低減させる方法であって、（ａ）クロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、（ｂ）本発明の上記の方法のいずれかを行うステップ、および（ｃ）医薬物質を含む組成物をクロマトグラフィーマトリックスにアプライするステップを含む、方法を提供する。
【００６９】
本発明は、記載される特定の方法および実験条件に限定されず、そのような方法および条件は変更され得ることが理解されるべきである。本明細書で使用される学術用語は特定の実施形態を記載する目的のものに過ぎず、限定的であることは意図されず、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されることも理解されるべきである。
【００７０】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「方法（ａ  ｍｅｔｈｏｄ）」への言及は、本明細書に記載される種類のおよび／または本開示を読んだ当業者に明らかになるであろう１つもしくは複数の方法、および／またはステップを含む。
【００７１】
別段の定義がなければ、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００７２】
「約（ａｂｏｕｔ）」および「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、統計的に意味のある値の範囲内を意味するために交換可能に使用される。そのような範囲は、所与の値または範囲の５０％以内、より好ましくは２０％以内、さらにより好ましくは１０％以内、よりいっそう好ましくは５％以内であり得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」または「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」という用語は、細菌および古細菌などの原核生物、および真菌などの真核生物を包含する。これらの用語は、生細胞および胞子（胞子形成生物の場合）の両方、ならびに微生物産物、例えばエンドトキシンを包含する。
【００７４】
本明細書で使用される「微生物バイオバーデンの低減（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」および「微生物バイオバーデンの低減（ｍｉｃｒｏｂｅ  ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、微生物の殺滅および微生物とクロマトグラフィーマトリックスとの間の相互作用への何らかの干渉を組み合わせる。本発明による微生物バイオバーデンの低減は、クロマトグラフィーカラムまたはマトリックス上に存在する可能性がある微生物の本質的に全て、または少なくとも９９％を殺滅するように設計されたあらゆる以前に開示された消毒プロセスと同じではない。
【００７５】
むしろ、本発明は、非胞子形成微生物の８０％未満、７０％未満、６０％未満、または４０〜６０％を殺滅することができる方法を含む。そのような実施形態では、カラム上の胞子形成微生物、例えばＢａｃｉｌｌｕｓの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満もしくは１０％未満、または１０〜２０％が本発明の方法により殺滅される。
【００７６】
本発明は、カラム上の細菌の全てを殺滅しない方法を含むが、生物濾過アッセイ、または本明細書に開示されるおよび当該技術分野において公知の任意の他の微生物学的アッセイにより検出できる生存可能な微生物の少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、約９８％、約９９％または約１００％が処理後にクロマトグラフィーマトリックスから除去される。本発明の一部の実施形態では、微生物バイオバーデンのレベルは、使用前のフラッシュ試料中、平衡試料中、ロード試料中、またはその実行後に採取したロードからの全てのＧＭＰ試料中でＧＭＰ許容レベル未満に低減される。微生物の全てを殺滅することさえなく、本発明は、特許請求される発明の方法中にも起こる微生物とクロマトグラフィーマトリックスとの間の相互作用への干渉により、微生物バイオバーデンをＧＭＰ警告レベル未満に低減させることができる。この干渉は、微生物とクロマトグラフィーマトリックスとの間の親和性、結合、または任意の他の相互作用の低減などの機序を伴い得るがこれらに限定されない。そのような機序は、クロマトグラフィーカラム上でカラムからの宿主細胞タンパク質およびＤＮＡなどの不純物に使用される一般的なストリップステップに類似している。したがって、この干渉は、生物学的医薬品のＧＭＰ製造の要件に合致するレベルまで微生物バイオバーデンが低減された時に、微生物の全てを殺滅しない本発明の方法の使用後に検出され得る。カラム上の微生物の全てを殺滅するようには設計されていない本発明の方法の１つを使用することにより、試薬は必ずしも苛酷なものでなく、したがって、プロセスおよび製造物を市場に承認すべき規制機関、例えばＦＤＡまたはＥＭＡからの承認のためにより好都合である。好ましくは、生物学的医薬のＧＭＰ製造の間にクロマトグラフィーカラムに使用される同じストリップ緩衝剤成分または少なくとも活性剤（酢酸が一般的である）を使用して、より高い濃度（例えば、１０Ｘ、１５Ｘ、または２０Ｘ）およびより長いコントラクト時間（例えば、３Ｘ、４Ｘ、または５Ｘ）でアプライされた時に微生物バイオバーデンを低減させることができる。さらに、より長い時間にわたりより高い濃度で同じストリップ緩衝剤を使用することが微生物バイオバーデンを低減させるためにより効率的なことがある。
【００７７】
本明細書に記載される任意の方法、態様、および実施形態は、医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）、または現行医薬品適正製造基準（ＣＧＭＰ）の部分として使用することができる。そのような基準は、規制機関、例えば米国食品医薬品局の要件を満たすように製造ステップおよび製造物の品質において一貫性を提供しなければならない。ＧＭＰおよびＣＧＭＰは、典型的に、製造プロセスに高い程度の予測可能性および標準化を必要とし、特に、ヒト患者において使用される製造される治療用生体分子の純度を確実にすることを必要とする。プロセスの停止および／または製造バッチの廃棄を必要とするパラメーターが検出される多くの失敗点がＧＭＰまたはＣＧＭＰ中にある。生体分子を製造するための培養物の生育に関与する労働力と共に、失敗が起こった時に大きな費用が発生する。
【００７８】
バイオバーデンまたは微生物負荷がクロマトグラフィーカラム、または分離において使用されるマトリックスにおいて高くなり過ぎた場合、様々な予測できないかつ／または望ましくない効果が発生し得る。微生物で汚染された製造物が同定され、さらに製造されないように、プロセスを停止するように失敗点が誘発され得る。失敗点を防止するために、１０ｍＬ当たり少なくとも５ＣＦＵのバイオバーデンの検出により警告が誘発され得る。１０ｍＬ当たり少なくとも１０ＣＦＵのバイオバーデンはアクションを誘発することができ、該アクションは、本明細書に記載される方法または実施形態のうちの１つまたは複数を単独でまたは組合せで行ってバイオバーデンを低減させることを含むことができる。
【００７９】
例えば、微生物が製造物中に導入されて、製造物を治療的使用のために許容できないものとすることがある。過度のバイオバーデンはまた、カラム性能を減少させることがあり、それが標準化された予測可能な方式での製造物の精製に干渉することがあり、また他の失敗点の誘発を引き起こし得る。したがって、バイオバーデンを低減させる本明細書に記載される態様および実施形態を前もって使用して、ＧＭＰまたはＣＧＭＰへの準拠を確実にし、失敗点の誘発、ならびに関連するトラブルシューティングおよびダウンタイムを最小化することが望ましい。
【００８０】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、接触させるステップ後の精製のために低分子含有または生体分子含有（例えば、モノクローナル抗体含有）調製物をアプライするステップをさらに含んでもよい。精製のために低分子含有または生体分子含有（例えば、モノクローナル抗体含有）調製物をアプライする前の微生物負荷の低減のための方法は、本明細書に記載される任意の微生物バイオバーデンの低減の方法のステップを含み得る。あるいは、生体分子を精製する方法は、本明細書に記載される任意の方法のステップを実行するステップ、およびその後にクロマトグラフィーマトリックスに生体分子を含む調製物をアプライするステップを含み得る。
【００８１】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、クロマトグラフィーマトリックスが貯蔵から取り出された後に、精製のために薬物含有、生体分子含有、またはモノクローナル抗体含有調製物をアプライする前に、行われてもよい。長期貯蔵の間に、クロマトグラフィーマトリックスまたはカラム中に存在する小量の細菌が増殖してバイオバーデンを増加させることがある。
【００８２】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、無菌化技術の部分として、または無菌化技術を支持するために使用されてもよい。クロマトグラフィーマトリックスにおけるバイオバーデンの結果として得られた低減は、無菌化技術のために十分なものであり得るか、または無菌化技術における他のステップの前もしくは後に使用され得る。バイオバーデンを低減させる記載された方法は、無菌化技術の失敗点が誘発される見込みを低減させることができ、差し迫った失敗点の誘発への応答において使用することができる。
【００８３】
別の態様では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスは、該マトリックスを約０．５Ｍの酢酸から本質的になる組成物と少なくとも４時間接触させることにより微生物バイオバーデンの低減を受ける。様々な実施形態では、接触させるステップは、４〜５時間、４〜１０時間、４〜２５時間、４〜２００時間、４〜３７５時間、または４〜４００時間行われる。別の態様では、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａクロマトグラフィーマトリックスは、該マトリックスを０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる組成物と少なくとも４時間接触させることにより微生物バイオバーデンの低減を受ける。
【００８４】
様々なクロマトグラフィーマトリックスを使用することができる。クロマトグラフィーマトリックスは、支持体に連結されたタンパク質性リガンドを含んでもよい。次いで、タンパク質性リガンドは、１つまたは複数の免疫グロブリン結合ドメインを含んでもよい。他の有用なクロマトグラフィーマトリックスとしては、様々なイオン交換クロマトグラフィーマトリックス、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）マトリックス、ミックスモードクロマトグラフィーマトリックス、およびサイズ排除クロマトグラフィーマトリックスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８５】
クロマトグラフィーマトリックスのタンパク質性リガンドは、プロテインＡまたはその断片もしくは誘導体であってもよい。例示的なタンパク質性リガンドとしては、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＧ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、ならびにＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡ、ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＧ、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡのいずれかの断片および誘導体が挙げられる。
【００８６】
ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡは、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの細胞壁上に見出すことができる。プロテインＡは、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間でＦｃ領域において抗体に結合し得る。プロテインＡは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ中で培養されてもよく、または他の細菌、例えば、Ｅ．  ｃｏｌｉもしくはＢｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ中で組換えにより産生されてもよい。ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＡの断片または誘導体もまた、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとの間でＦｃ領域において抗体に結合し得る。
【００８７】
ＰｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＬは、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｇｎｕｓの表面上に見出すことができ、抗体軽鎖との相互作用を介して抗体に結合することができる。プロテインＡとは異なり、プロテインＬは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ断片に結合し得る。プロテインＬの断片または誘導体もまた、抗体の軽鎖、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）およびＦａｂ断片に結合し得る。
【００８８】
ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓのプロテインＧは、群Ｇ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ株の細胞壁上に見出すことができる。プロテインＧは、ＦａｂおよびＦｃ領域において抗体に結合し得る。プロテインＧは、他の細菌、例えばＥ．  ｃｏｌｉ中で組換えにより産生されてもよい。プロテインＧの断片または誘導体もまた、ＦａｂおよびＦｃ領域において抗体に結合し得る。
【００８９】
クロマトグラフィーマトリックスは、カラムの部分である樹脂であってもよい。１つの好適な樹脂はＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製のＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）である。小規模精製のために好適な例示的なカラムは、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）を詰め込まれており、約１．０ｃｍの直径、および約２０ｃｍの長さである。１．４ｍ×２０ｃｍなどのより大きいカラムを製造スケールの精製のために使用することができる。
【００９０】
より一般に、本発明の方法は、実験室スケール、大きい処理スケール、および非常に大きい処理スケールなどの様々なサイズのクロマトグラフィーカラムのために使用することができる。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、０．５ｃｍ〜１．５ｃｍの間の内径および１５〜３０ｃｍの間（例えば、２０ｃｍ）の床高さを有してもよい。内径は、０．７〜１．２ｃｍの間、あるいは０．９〜１．４ｃｍ、１．２〜１．５ｃｍ、１．０〜１．２ｃｍ、または約１ｃｍであってもよい。一部の実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、４０ｃｍ〜１．６メートルの間（例えば、６０ｃｍ、８０ｃｍ、１．０メートル、１．２メートル、または１．４メートル）の内径を有してもよい。クロマトグラフィーカラムは、１５〜３０ｃｍ（例えば、２０ｃｍ）の間の床高さを有してもよい。
【００９１】
例示的なクロマトグラフィーマトリックスとしては、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）  Ｌ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）  ＰｒｉＭａｂ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）  Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＫａｎＣａｐＡ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｘｔｒａ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗが挙げられる。
【００９２】
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、およびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸは、高度に架橋されたアガロースマトリックスに取り付けられたＥ．  ｃｏｌｉ中で製造された組換えプロテインＡリガンドを有する。
【００９３】
微生物バイオバーデンの低減は、交換するよりはむしろ追加の精製のために使用できるようにクロマトグラフィーマトリックスの性能を回復させることができる。したがって、本明細書に記載される任意の方法において、微生物バイオバーデンの低減は、クロマトグラフィーマトリックスが使用された後に実行することができる。そのような場合、目的のモノクローナル抗体を含む細胞培養ブロスからクロマトグラフィーマトリックス中に導入され得る細菌および他の微生物を除去することができる。タンパク質性リガンド、例えばプロテインＡを含むクロマトグラフィーマトリックスを使用した時に、大きな費用を節約することができる。
【００９４】
さらには、通常使用される水酸化ナトリウム含有溶液の代わりに酢酸含有溶液を使用することにより、タンパク質リガンドのより少ない変性およびクロマトグラフィーマトリックスへのより小さい損傷をもたらすことができる。タンパク質リガンドの変性および／またはクロマトグラフィーマトリックスへの損傷は、クロマトグラフィーマトリックスの様々な性能的特徴をアッセイすることにより、例えば、マトリックスから溶出する製造物の純度および量をアッセイすることによりおよびマトリックスの成分（例えば、プロテインＡ）の残留溶出をアッセイすることにより、間接的に測定することができる。例えば、タンパク質性リガンドがプロテインＡの場合、モノクローナル抗体の純度および量がアッセイされる。例示的なアッセイとしては、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＵＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動（例えば、ＣＥ−ＳＤＳ）、任意選択で全カラムイメージングを含み得るキャピラリー等電点電気泳動（ｉＣＩＥＦ）が挙げられる。また、カラムからの残留プロテインＡは、（例えば、ＥＬＩＳＡを含むアッセイにより）測定することができる。
【００９５】
本明細書に記載される方法にしたがって行われる微生物バイオバーデンの低減は、プロテインＡを損傷させることなく細菌を除去することにより、プロテインＡまたは他のタンパク質性リガンドを含むカラムの性能を維持するための費用効果の高い方式であり得る。例えば、３７５または４００時間にわたる酢酸含有溶液（例えば、０．５Ｍの酢酸）へのプロテインＡ含有マトリックスの曝露は、プロテインＡを含むカラムの性能のいかなる統計的に有意な損失にも繋がらない。例えば、実施例６、表１０および図５〜１９を参照。例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、還元もしくは非還元条件下でのキャピラリー電気泳動、またはキャピラリー等電点電気泳動により溶出するモノクローナル抗体の純度の統計的に有意な損失はない。
【００９６】
本明細書に記載される方法による微生物バイオバーデンの低減は、細菌の全てを殺滅することなく細菌のほぼ全てを除去することができる。理論に縛られることを望まないが、酢酸は、細菌とタンパク質性リガンド、例えばプロテインＡとの間の親和性に干渉し得る。微生物汚染マトリックスまたはカラムは、微生物と樹脂との間の相互作用を破壊することにより本明細書に記載される方法にしたがって低減された微生物を有し得る。細菌は酢酸含有溶液中に残存する傾向がある。細菌の除去は、酢酸との接触させるステップを繰り返すことによりまたは酢酸含有溶液を用いるクロマトグラフィーマトリックスの追加のフラッシングを行うことによりさらに増進され得る。
【００９７】
一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィーマトリックスから胞子形成細菌を除去する。胞子形成細菌は、内生胞子形態に切り替わる能力を有する。内生胞子形態は、細菌がそれ自身を該形態に低減させることができる、必要最低限の、休眠状態の形態である。内生胞子の形成は、通常、栄養分の欠如または苛酷な条件、例えば酸性または塩基性環境により誘発される。内生胞子により、細菌は、不都合な条件においてさえ長期間休眠状態でいることができる。環境がより好都合なものになると、内生胞子は生長可能な状態に再活性化することができる。内生胞子を形成できる細菌の例としては、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍが挙げられる。これらの胞子形成細菌は、製造プロセスにおけるこれらの胞子形成細菌にとって不都合な条件の存在によりクロマトグラフィー精製プロセスにおける通常の作業条件下で内生胞子を形成できると考えられる。胞子形成細菌を検出するために使用できる多くの方法があり、顕微鏡細菌染色法、ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、無菌試験、および細菌同定試験（例えば、生化学反応、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定、または分類群特異的配列決定）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９８】
一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィーマトリックスからグラム陽性細菌を除去する。一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィーマトリックスからグラム陰性細菌を除去することができる。一部の実施形態では、本方法は、クロマトグラフィーマトリックスから胞子形成細菌、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を除去する。接触させるステップは、クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験、および（５）細菌同定試験（例えば、生化学反応、１６Ｓ  ｒＲＮＡ配列決定、または分類群特異的配列決定）からなる群から選択されるアッセイの検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらし得る。生物濾過アッセイは、米国薬局方第７１章、タイトル「Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｓ」に記載されている。生物濾過アッセイにおいて、カラムからの溶出液は、細菌に選択的に結合するフィルターを通過する。次に、細菌を生育させるために適切な培地を含む寒天上にフィルターを置き、インキュベートし、細菌を計数する。カラム溶出液の希釈を必要に応じて行うことができる。
【００９９】
顕微鏡細菌染色は、米国薬局方第６１章、タイトル「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｅｒｉｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｓ」に記載されている。ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法は、ＢＲＵＫＥＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ＡＮ＃４０５  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａ．  Ｍｅｎｄｅｚ−Ｖｉｌａｓ（編）に記載されている。微生物学的試験は、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，  Ｊ．ら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ：  ｅｎｄｏｓｐｏｒｅ  ｓｔａｉｎ」、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｃ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００９年、補遺３：補遺３Ｊに記載されている。
【０１００】
一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．１Ｍ〜約１．０Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．２Ｍ〜約０．８Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．４Ｍ〜約０．７Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．５Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．１Ｍ〜約０．５Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の酢酸の濃度は約０．１Ｍである。
【０１０１】
一部の実施形態では、組成物中の尿素の濃度は約４Ｍ〜約１２Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の尿素の濃度は約６Ｍ〜約１０Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の尿素の濃度は約６Ｍ〜約８Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の尿素の濃度は約８Ｍである。
【０１０２】
一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約３Ｍ〜約１０Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約４Ｍ〜約８Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約５Ｍ〜約７Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約６Ｍである。
【０１０３】
一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約３Ｍ〜約１０Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約４Ｍ〜約８Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約５Ｍ〜約７Ｍである。一部の実施形態では、組成物中の塩酸グアニジンの濃度は約６Ｍである。
【０１０４】
一部の実施形態では、溶液のｐＨは少なくとも２．０である。ｐＨは２．０〜７．０であってもよい。ｐＨは、２．５〜６．５、３．０〜６．０、４．０〜７．０、２．０〜５．０、３．５〜５．５、３．０〜４．０、または約４．０であってもよい。ｐＨは、おおよそ以下のもののいずれかであってもよい：２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０。
【０１０５】
一部の実施形態では、組成物はエタノールを含む。組成物は、１〜４０％のエタノール、５〜３５％のエタノール、１０〜２５％のエタノール、１５〜３０％のエタノール、１８〜２４％のエタノール、約２０％のエタノール、または２０％のエタノールを含んでもよい。一部の実施形態では、組成物は約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールを含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．１Ｍの酢酸および約２０％のエタノールから本質的になる。ベンジルアルコールの存在から生じ得るヒトにおける毒性、またはヒトにおける有害効果により、使用されるベンジルアルコールの量を最小化し、またはベンジルアルコールを回避しながら、エタノールを使用することは利点がある。
【０１０６】
一部の実施形態では、組成物は酢酸塩をさらに含む。酢酸塩は、酢酸を含む組成物のための緩衝剤として働き得る。例えば、組成物は、組成物が緩衝液であるように、酢酸に加えて酢酸ナトリウムを含んでもよい。組成物は、０．１Ｍの酢酸ナトリウムから１．０Ｍの酢酸ナトリウム、０．２〜０．８Ｍの酢酸ナトリウム、０．４〜０．７Ｍの酢酸ナトリウム、約０．５Ｍの酢酸ナトリウム、または０．５Ｍの酢酸ナトリウムを含んでもよい。酢酸ナトリウムまたは別の酢酸塩を用いて酢酸を緩衝化することは、クロマトグラフィーマトリックス中で溶液のｐＨを維持するために効果的であり得る。ｐＨは、少なくとも２．０、約２〜３、２．０〜３．０、２．０〜７．０、２．５〜６．５、３．０〜６．０、４．０〜７．０、２．０〜５．０、３．５〜５．５、３．０〜４．０、または約４．０であってもよい。ｐＨは、おおよそ以下のもののいずれかであってもよい：２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、または７．０。
【０１０７】
組成物が酢酸を含む一部の実施形態では、接触させるステップは、少なくとも１時間、あるいは１〜４時間、あるいは少なくとも２時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは２〜４時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは少なくとも４時間行われる。様々な実施形態では、接触させるステップは、９０分〜６時間、２時間〜５時間、４時間〜５時間、４時間〜６時間、９０分〜３時間、５時間〜６時間、４時間〜１０時間、４時間〜２５時間、４時間〜２００時間、４時間〜３７５時間、または４時間〜４００時間行われる。
【０１０８】
組成物が尿素を含む一部の実施形態では、接触させるステップは、少なくとも３０分間、あるいは少なくとも１時間、あるいは少なくとも２時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは１〜２時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは少なくとも２時間行われる。様々な実施形態では、接触させるステップは、３０分〜４時間、１時間〜３時間、または９０分〜２時間行われる。
【０１０９】
組成物が塩酸グアニジンを含む一部の実施形態では、接触させるステップは、少なくとも３０分間、あるいは少なくとも１時間、あるいは少なくとも２時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは１〜２時間行われる。一部の実施形態では、接触させるステップは少なくとも２時間行われる。様々な実施形態では、接触させるステップは、３０分〜４時間、１時間〜３時間、または９０分〜２時間行われる。
【０１１０】
組成物が尿素または塩酸グアニジンを含む一部の実施形態では、接触させるステップは、少なくとも３０分間、あるいは少なくとも約１時間、あるいは１〜４時間、あるいは少なくとも２時間行われる。
【０１１１】
一部の実施形態では、接触させるステップを繰り返すことができる。例えば、接触させるステップは、約１時間行われた後、複数回繰り返されてもよい。一部の実施形態では、接触させるステップは、２、３、４、５、または６回繰り返される。微生物バイオバーデンの低減を繰り返すことにより、カラムは追加の酢酸に曝露されることがあり、それが、クロマトグラフィーマトリックスからの細菌および微生物の追加の破壊をもたらし得る。接触させるステップを繰り返すことにより、クロマトグラフィーマトリックス、例えば、プロテインＡリガンド、およびカラムからの細菌および微生物のより多くのフラッシング、または除去に繋がり得る。微生物バイオバーデンの低減プロセスは、複数回連続して実行された時に、バイオバーデンをより多く低減させ得る。
【０１１２】
本明細書に記載される任意の微生物バイオバーデンの低減方法の有効性は、任意の数のバイオバーデンアッセイを使用することによりモニタリングすることができる。１つのそのようなアッセイは濾過アッセイであり、該アッセイでは、多量の溶出液をフィルター膜に通過させ、フィルター膜が溶出液中に存在する細菌を捕捉する。細菌力価は、フィルター膜上の細菌がプレート上でコロニーを形成するようにフィルター膜を寒天プレート上に置くことにより決定することができる。寒天プレートはトリプチケースソイ寒天（ＴＳＡ）を含有してもよい。培養は３〜７日間、２５℃〜３７℃の間の温度で行うことができる。次に、コロニーの数が計数される。形成されるコロニーが多すぎる場合、溶出液の希釈を行うことができる。
【０１１３】
一部の実施形態では、胞子形成細菌の量の少なくとも１．５ｌｏｇ１０の低減がある。例えば、クロマトグラフィーマトリックスがＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓで汚染されている場合、そのようなマトリックスを８Ｍの尿素溶液、８Ｍの尿素／２０％のエタノール溶液、６Ｍの塩酸グアニジン溶液、または６Ｍの塩酸グアニジン／２０％のエタノール溶液と少なくとも１時間接触させることにより、ＢａｃｉｌｌｕｓＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓの数を少なくとも１．５ｌｏｇ１０低減させることができる。
【０１１４】
一部の実施形態では、微生物バイオバーデンの低減のための方法が行われる時に、クロマトグラフィーマトリックスの結合能力は、１０サイクルまたはそれより多くのサイクルにわたって保存される。他の実施形態では、結合能力は、５０サイクルまたはそれより多くのサイクルにわたって保存される。一部の他の実施形態では、結合能力は、１００サイクルまたはそれより多くのサイクルにわたって保存される。一部の実施形態では、結合能力は、２００サイクルまたはそれより多くのサイクルにわたって保存される。
【０１１５】
一部の実施形態では、組成物への曝露が、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも２５時間、少なくとも２００時間、少なくとも３７５時間、または少なくとも４００時間である、接触させるステップの間にまたは複数の接触させるステップにわたって、クロマトグラフィーマトリックスの実質的な分解はない。一部の実施形態では、組成物への曝露が、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、少なくとも２５時間、少なくとも２００時間、少なくとも３７５時間、または少なくとも４００時間である、接触させるステップの間にまたは複数の接触させるステップにわたって、クロマトグラフィーマトリックスの測定可能な分解はない。一部の実施形態では、クロマトグラフィーマトリックスの分解は、マトリックスに結合するタンパク質（例えば、プロテインＡマトリックスに結合するモノクローナル抗体）のタンパク質の品質により測定される。
【０１１６】
一部の実施形態では、タンパク質性リガンドは、測定できる程度には変性しない。変性は、例えば、カラム性能、製造物の収率および／または品質、マトリックスから浸出可能なタンパク質性リガンド、タンパク質性リガンドの変性の測定などの機能アッセイを使用して決定することができる。
【０１１７】
一部の実施形態では、接触させるステップの間にまたは複数の接触させるステップにわたって、タンパク質性リガンド、またはプロテインＡの測定可能な浸出はない。一部の実施形態では、５時間、１０時間、２５時間、２００時間、３７５時間または４００時間にわたる組成物（例えば、０．５Ｍの酢酸）へのクロマトグラフィーマトリックスの曝露後にタンパク質性リガンド、またはプロテインＡの統計的に有意な測定可能な浸出はない。プロテインＡの浸出の測定は、１つのそのような例示的なアッセイである。プロテインＡの変性は、それがもはやクロマトグラフィーマトリックス中のビーズまたは他の固相支持体と相互作用しないようにその確認を変化させ得る。その後、変性プロテインＡはビーズまたは固体支持体から浸出して液相に入る。親和性カラムの溶出液または液相中のタンパク質性リガンド、またはプロテインＡの検出は、したがって、測定可能な変性を指し示し得る。プロテインＡの他に、他のタンパク質性リガンドの変性もまた、クロマトグラフィーマトリックスからのそれらの浸出に繋がり得る。一部の実施形態では、プロテインＡおよび／または他のタンパク質性リガンドの浸出の測定はＥＬＩＳＡを含む。例示的なアッセイは、実施例６ならびに図８、１３および１８に記載されている。
【実施例】
【０１１８】
以下の実施例は、上記される様々な態様および実施形態を記載する。しかしながら、これらおよび本明細書中のいずれかの場所にある他の例の使用は説明的なものに過ぎず、本開示のいずれかまたは任意の例示される事項の範囲および意味を決して限定しない。同様に、任意の特許請求の範囲の主題は、本明細書に記載されるいかなる特定の好ましい実施形態にも限定されない。実際、多くの改変およびバリエーションが本明細書を読んだ当業者に明らかとなり得、そのようなバリエーションは、本明細書に開示される態様および実施形態の精神または範囲から離れることなく実施することができる。したがって、任意の特許請求の範囲の主題は、添付の特許請求の範囲に付与される均等物の全範囲と共に、それらの特許請求の範囲の事項によってのみ限定される。
（実施例１）
酢酸溶液はプロテインＡカラム中のバイオバーデンを低減させる
【０１１９】
カラムを特定の細菌でスパイクした後、および０．５Ｍの酢酸溶液で微生物を低減させた後に再びバイオバーデンを測定することにより、３つの詰め込まれた１ｃｍのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａカラムにおける微生物の低減を評価した。
【０１２０】
最初に、カラムを２カラム体積の注射水（ＷＦＩ）でフラッシュした。２０ｍＬの試料を回収し、これをカラム中の細菌の量に関する陰性対照とした。
【０１２１】
３つのＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａカラムのそれぞれにおいて、微生物をＷＦＩに加えてスパイクされたＷＦＩを形成させることにより代表的な微生物をカラムに加え、微生物はおよそ１０５ｃｆｕ／ｍＬの力価で存在する。１つのカラムを胞子形成細菌、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓでスパイクした。１つのカラムをグラム陽性細菌、特にＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．でスパイクした。第３のカラムをグラム陰性細菌、特にＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａでスパイクした。
【０１２２】
次に、スパイクされた各ＷＦＩを各カラムにロードした。次に、カラムを１４カラム体積のＷＦＩを用いて２２９ｃｍ／時でフラッシュし、それを回収した。各カラムを１時間保持した後、スパイクしたＷＦＩで再びフラッシュした。２０ｍＬの試料を各カラムから陽性対照として回収し、試料中のグラム陰性細菌、グラム陽性細菌および胞子形成細菌のそれぞれの量をその後にアッセイした。
【０１２３】
次に、２カラム体積の０．５Ｍの酢酸の微生物低減溶液を２２９ｃｍ／時で各カラムにアプライした。各カラムを１時間保持した後、２カラム体積のＷＦＩを用いて２２９ｃｍ／時でフラッシュした。Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａについて、１．５カラム体積のＷＦＩをカラムに通してフラッシュした後、１．５カラム体積の排出液を回収した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓについて、２カラム体積の平衡緩衝液（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）をカラムに通してフラッシュした後、１．５カラム体積の排出液を回収した。
【０１２４】
０．５Ｍの酢酸の微生物低減溶液をカラムにアプライした後に１時間の代わりに４時間カラムを保持して、上記の実験を繰り返した。
【０１２５】
濾過ベースのバイオバーデンアッセイを行った。ＴＳＡ培地を有する寒天プレートを調製する。
【０１２６】
クロマトグラフィーカラムからの上記試料の全てをコニカルチューブに入れ、１０回反転させた後、０．４５ミクロンのフィルター膜を有する無菌の使い捨てフィルターファンネルに接続されたフィルターマニホールド、または０．４５ミクロンのフィルター膜を有するＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）フィルターファンネルユニットを有するＭｉｌｌｉｆｌｅｘ（登録商標）プラスポンプに通過させた。クロマトグラフィー試料中に見られない追加の細菌を導入しないように、フィルターマニホールドまたはフィルターファンネルユニットの取扱いにおいて無菌技術を使用した。次に、ＴＳＡ培地を用いて調製された寒天プレートの上に各膜を置いた。プレートを５〜７日間３０〜３５℃でインキュベートした。次に、コロニー形成単位の数を計数し、記録した。
【０１２７】
０．４５ミクロンのフィルター膜を有する別々のフィルターマニホールドまたはフィルターファンネルユニットに１００ｍＬの無菌のＰＢＳを通過させることにより陰性対照プレートを調製する。次に、ＴＳＡ培地を用いて調製された寒天プレートの上に各膜を置いた。プレートを５〜７日間３０〜３５℃でインキュベートした。次に、コロニー形成単位の数を計数し、ｌｏｇ１０の形式で表した。
【０１２８】
以下の表は、３つの細菌種類のそれぞれについて低減前および低減後のコロニー形成単位を示す。
【表１】
2020507371.tif 000002
【表２】
2020507371.tif 000003
【表３】
2020507371.tif 000004
【０１２９】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓについて、０．５Ｍの酢酸の微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に０．４ｌｏｇ１０の低減が観察された。０．５Ｍの酢酸の微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に４時間保持した時に３．４ｌｏｇ１０の低減が観察された。
【０１３０】
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．細菌について、０．５Ｍの酢酸の微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に１．４ｌｏｇ１０の低減が観察され、４時間保持した時に５．６ｌｏｇ１０の低減が観察された。
【０１３１】
Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ細菌について、０．５Ｍの酢酸の微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に５．５ｌｏｇ１０の低減が観察され、４時間保持した時に６．２ｌｏｇ１０の低減が観察された。
【０１３２】
０．５Ｍの酢酸は、プロテインＡカラム中に４時間保持された時に、胞子形成細菌を含む広範な微生物を除去するために効果的である。
（実施例２）
酢酸／エタノール溶液はプロテインＡカラム中のバイオバーデンを低減させる
【０１３３】
０．５Ｍの酢酸の代わりに０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノールの溶液を使用した以外は、上記の実施例１のステップを行った。実施例１と同様に、０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノール溶液を１セットの実験では１時間、別のセットの実験では４時間保持した。以下の結果もまた、微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間または４時間保持した後の細菌の量の大幅な減少を示す。
【表４】
2020507371.tif 000005
【表５−１】
2020507371.tif 000006
【表５−２】
2020507371.tif 000007
【表６】
2020507371.tif 000008
【０１３４】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓについて、０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノールの微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に０．４ｌｏｇ１０の低減が観察された。０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノールの微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に４時間保持した時に２．５ｌｏｇ１０の低減が観察された。
【０１３５】
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．細菌について、０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノールの微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に４．５ｌｏｇ１０の低減が観察され、４時間保持した時に５．１ｌｏｇ１０の低減が観察された。
【０１３６】
Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ細菌について、０．１Ｍの酢酸および２０％のエタノールの微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した時に５．３ｌｏｇ１０の低減が観察され、４時間保持した時に５．１ｌｏｇ１０の低減が観察された。
（実施例３）
尿素溶液はプロテインＡカラム中のバイオバーデンを低減させる
【０１３７】
０．５Ｍの酢酸の代わりに、８Ｍの尿素の溶液および８Ｍの尿素／２０％のエタノールの溶液を使用し、１時間の保持のみを測定した以外は、上記の実施例１のステップを行った。以下の表７の結果は、微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した後の細菌の大幅な減少を示す。特にわずか１時間の処理後の、胞子形成Ｂ．  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓの低減は大規模かつ予想外であった。
【表７】
2020507371.tif 000009
（実施例４）
塩酸グアニジン溶液はプロテインＡカラム中のバイオバーデンを低減させる
【０１３８】
０．５Ｍの酢酸の代わりに、６Ｍの塩酸グアニジンの溶液および６Ｍの塩酸グアニジン／２０％のエタノールの溶液を使用し、１時間の保持のみを測定した以外は、上記の実施例１のステップを行った。以下の表８の結果は、微生物バイオバーデン低減溶液をカラム中に１時間保持した後の細菌の大幅な減少を示す。特にわずか１時間の処理後の、胞子形成Ｂ．  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓの低減は大規模かつ予想外であった。
【表８】
2020507371.tif 000010
（実施例５）
溶液中の微生物バイオバーデン低減剤の試験
【０１３９】
０．５Ｍの酢酸を使用して溶液スパイク試験を行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓおよびＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓの殺滅の程度をクロマトグラフィーマトリックスなしで溶液中で測定した。データを図１に示す。１時間後にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓの殺滅はほとんど観察されなかったが、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓのある程度の殺滅があった。０．５Ｍの酢酸でのクロマトグラフィーマトリックス上のこれらの細菌の微生物バイオバーデンの低減には殺滅のみが関与するものではないことをこれらのデータは示す。クロマトグラフィーマトリックスとＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓとＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓとの間の相互作用の破壊は、殺滅から予想されるよりもバイオバーデンの低減の増加に繋がる。
【０１４０】
他の剤を使用して追加の溶液スパイク試験を行い、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｕｅｄｏｆｉｒｍｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ、およびＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの殺滅の程度を溶液中で測定した。以下の剤を加えた：（ａ）注射水（ＷＦＩ）、（ｂ）８Ｍの尿素、（ｃ）８Ｍの尿素および２０％のエタノール、（ｄ）６Ｍの塩酸グアニジン、（ｅ）６Ｍの塩酸グアニジンと２０％のエタノール。ＰＢＳ中でのスパイク確認測定、ならびに０分、３０分、および６０分の時点での測定を行った。データを図２〜４に示し、青のバーはＷＦＩ、黄色のバーは８Ｍの尿素、灰色のバーは８Ｍの尿素および２０％のエタノール、赤のバーは６Ｍの塩酸グアニジン、緑のバーは６Ｍの塩酸グアニジンおよび２０％のエタノールである。
【０１４１】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓについて、少なくとも以下の溶液：０．５Ｍの酢酸、８Ｍの尿素および８Ｍの尿素／２０％のエタノール、６Ｍの塩酸グアニジンおよび６Ｍの塩酸グアニジン／２０％のエタノールで、殺滅および微生物とクロマトグラフィー樹脂との間の相互作用の破壊の組合せにより、バイオバーデンの低減が達成される。
【０１４２】
Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓについて、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓの１００％を殺滅できない溶液である８Ｍの尿素および０．５Ｍの酢酸について、殺滅と相互作用の破壊との組合せによりバイオバーデンの低減が起こり得る。しかしながら、溶液中のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの１００％を殺滅することが観察された８Ｍの尿素／２０％のエタノール、６Ｍの塩酸グアニジンおよび６Ｍの塩酸グアニジン／２０％のエタノールでのバイオバーデンの低減には殺滅が概ね関与し得る。同様に、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａについて、８Ｍの尿素、８Ｍの尿素／２０％のエタノールは、溶液中のＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａの１００％を殺滅することができた。
【０１４３】
要約すると、実施例１〜５は、０．５Ｍの酢酸は４時間の保持、８Ｍの尿素は１時間の保持、８Ｍの尿素／２０％のエタノールは１時間の保持、６Ｍの塩酸グアニジンは１時間の保持、６Ｍの塩酸グアニジン／２０％のエタノールは１時間の保持で、詰め込まれたＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａカラムの製造における効果的な微生物バイオバーデンの低減方法であることが発見された。実施例１〜５に記載されるように、これらの剤は、微生物の殺滅および微生物とクロマトグラフィー樹脂との間の相互作用の破壊との組合せを通じて、または１００％微生物の殺滅を通じて効果的である。
【０１４４】
さらに、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ樹脂の０．５Ｍの酢酸への曝露は、プロテインＡ樹脂に対して最小の影響力をもたらした。
（実施例６）
親和性カラムは酢酸への長期の曝露後に性能を維持する
【０１４５】
２つの異なるクロマトグラフィー親和性樹脂、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅの性能的特徴を、樹脂を様々な期間０．５Ｍの酢酸に浸した後に評価した。具体的には、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ（ｍＡｂ  Ａを捕捉するために使用）の一部を０．５Ｍの酢酸中に３７５時間浸した。陰性対照として、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａの別の部分を０．５Ｍの酢酸中に浸さなかった。ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ（ｍＡｂ  Ｂを捕捉するために使用）の５つの異なる部分を０．５Ｍの酢酸中にそれぞれ５時間、１０時間、２５時間、２００時間、または４００時間浸した。対照として、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅの別の部分を０．５Ｍの酢酸中に浸さなかった。
【０１４６】
次いで、上記の各部分に対して５つの異なる実験を実行して性能を評価した。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＳＥ−ＵＰＬＣ）を行って、上記の各クロマトグラフィー親和性樹脂の精製後のｍＡｂ純度を評価した。
【表９】
2020507371.tif 000011
【０１４７】
２つの異なるキャピラリー電気泳動実験を行った。ＣＥ−ＳＤＳをｍＡｂ  Ａについて実行し、ＰＩＣＯ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ  ＣＥ−Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＩＣＯ  ＭＣＥ−ＳＤＳ）をｍＡｂ  Ｂについて実行した。キャピラリー電気泳動をＳＤＳ含有ゲル充填キャピラリー（ＣＥ−ＳＤＳ）中で実行して、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の分子量分布および相対量を測定した。これらのタンパク質をサイズおよび電気泳動モビリティに基づいて分離した。全軽鎖および重鎖の相対量は、還元および非還元条件下で実行した。Ｂａｒｅ  Ｆｕｓｅｄ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ（キャピラリー長５７ｃｍ、有効長さ５０ｃｍ）を有するＩｇＧ  Ｐｕｒｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ１０６６３）を使用してＣＥ−ＳＤＳを行った。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）  ＧＸＩＩ、またはＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）  ＧＸＩＩ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、７６０４９９または７６０５２８）を使用してＰＩＣＯ  ＭＣＥ−ＳＤＳを行った。内部標準を使用して相対泳動時間を軟正した。
【０１４８】
プロテインＡ含有マトリックスに対する酢酸の効果をアッセイするために、ハイスループットＥＬＩＳＡによりＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＸｔｒａおよびＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅカラムからの溶出液に対して残留プロテインＡの分析を行い、定量化した。
【０１４９】
全カラムイメージング（ｉＣＩＥＦ）を伴うキャピラリー等電点電気泳動を行って、モノクローナル抗体試料中の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の量を定量化した。観察された各試料由来等電点（パイ）分布ピーク下の面積を積分し、ＣＤＲ２に帰せられるパーセンテージを算出することにより、各電気泳動図においてＣＤＲ２の相対量を算出した。報告するｉＣＩＥＦ領域２は中性種の主要なピークであり、内部参照標準における最大のタンパク質ピークに対応する。
【０１５０】
上記の各分析の結果を以下の表１０に示す。
【表１０−１】
2020507371.tif 000012
【表１０−２】
2020507371.tif 000013
【０１５１】
上記の表からのデータを図５〜９のそれぞれに示す。これらの図の目視検査は、性能的特徴と０．５Ｍの酢酸への曝露期間との間の負の相関を示さない。
【０１５２】
製造物品質データの分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行って、樹脂条件当たり３回のクロマトグラフィーの実行を使用した０．５Ｍの酢酸への長期曝露の前および後の樹脂間の統計的有意差を評価した。図１０〜１４は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｘｔｒａ精製後に得られたｍＡｂ  Ａプールのタンパク質の品質を示す。
【０１５３】
図１５〜１９は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ精製後に得られたｍＡｂ  Ｂプールのタンパク質の品質を示す。タンパク質の品質のＡＮＯＶＡ分析は、ｍＡｂ  Ｂ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプールのＳＥ−ＵＰＬＣパーセント純度における以外に統計的有意性を示さない（ｐ＜０．０５）。しかしながら、酸処理後プール純度は酸処理前プール純度より高い。したがって、０．５Ｍの酢酸への長期曝露を有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅでの精製後のｍＡｂ  Ｂプールに対する負の効果はない。
特許請求の範囲の主題は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、特許請求の範囲の主題の様々な改変が前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書中に物理的に存在するかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020507371.tif 000014
【図２】
2020507371.tif 000015
【図３】
2020507371.tif 000016
【図４】
2020507371.tif 000017
【図５】
2020507371.tif 000018
【図６】
2020507371.tif 000019
【図７】
2020507371.tif 000020
【図８】
2020507371.tif 000021
【図９】
2020507371.tif 000022
【図１０】
2020507371.tif 000023
【図１１】
2020507371.tif 000024
【図１２】
2020507371.tif 000025
【図１３】
2020507371.tif 000026
【図１４】
2020507371.tif 000027
【図１５】
2020507371.tif 000028
【図１６】
2020507371.tif 000029
【図１７】
2020507371.tif 000030
【図１８】
2020507371.tif 000031
【図１９】
2020507371.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月27日(2019.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが約１時間〜約４時間行われる、方法。
【請求項２】
（ａ）前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、および／または
（ｂ）前記組成物が約０．１Ｍの酢酸もしくは約０．５Ｍの酢酸を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
【請求項４】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールであり、必要に応じて、前記組成物が約２０％のエタノールまたは約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらし、必要に応じて、前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）前記組成物が酢酸塩をさらに含む、
（ｂ）前記組成物が約２〜約３の間のｐＨを有する、および／または
（ｃ）前記クロマトグラフィーマトリックスが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）  Ａ、ｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）  Ｌ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）  ＰｒｉＭａｂ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）  Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＫａｎＣａｐＡ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｘｔｒａ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからなる群から選択される、
請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法。
【請求項９】
（ａ）前記接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、および／または
（ｂ）前記組成物が約８Ｍの尿素を含む、
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
【請求項１１】
前記組成物がアルコールをさらに含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールであり、必要に応じて、前記組成物が約２０％のエタノールまたは約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらし、必要に応じて、前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触させるステップが１５℃〜３０℃の間または２０℃〜２５℃の間の温度で実行される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
医薬物質を含む組成物を精製のためにアプライする前に微生物負荷を低減させる方法であって、
クロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
請求項１に記載の方法を行うステップ、および
前記医薬物質を含む前記組成物を前記クロマトグラフィーマトリックスにアプライするステップ
を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５３】
図１５〜１９は、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ精製後に得られたｍＡｂ  Ｂプールのタンパク質の品質を示す。タンパク質の品質のＡＮＯＶＡ分析は、ｍＡｂ  Ｂ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅプールのＳＥ−ＵＰＬＣパーセント純度における以外に統計的有意性を示さない（ｐ＜０．０５）。しかしながら、酸処理後プール純度は酸処理前プール純度より高い。したがって、０．５Ｍの酢酸への長期曝露を有するＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅでの精製後のｍＡｂ  Ｂプールに対する負の効果はない。
特許請求の範囲の主題は、本明細書に記載される特定の実施形態により範囲を限定されない。実際、本明細書に記載されるものに加えて、特許請求の範囲の主題の様々な改変が前述の記載から当業者に明らかとなるであろう。そのような改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図される。
本明細書に引用される全ての特許、出願、刊行物、試験方法、文献、および他の資料は、本明細書中に物理的に存在するかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約０．５Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが約１時間〜約４時間行われる、方法。
(項目２)
前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記組成物が約０．１Ｍの酢酸を含み、前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、項目１に記載の方法。
(項目４)
前記組成物が約０．５Ｍの酢酸を含み、前記接触させるステップが少なくとも約４時間行われる、項目１に記載の方法。
(項目５)
前記組成物がアルコールをさらに含む、項目１から４のいずれか一項に記載の方法。
(項目６)
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、項目５に記載の方法。
(項目７)
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、項目６に記載の方法。
(項目９)
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの酢酸を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも３ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
(項目１０)
前記組成物がアルコールをさらに含む、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、項目１１に記載の方法。
(項目１３)
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、項目１１に記載の方法。
(項目１４)
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす、項目９に記載の方法。
(項目１５)
前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、項目１４に記載の方法。
(項目１６)
前記組成物が酢酸塩をさらに含む、項目１または９に記載の方法。
(項目１７)
前記組成物が約２〜約３の間のｐＨを有する、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが少なくとも約３０分間行われる、方法。
(項目１９)
前記接触させるステップが少なくとも約１時間行われる、項目１８に記載の方法。
(項目２０)
前記組成物が約８Ｍの尿素を含む、項目１８または項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記組成物がアルコールをさらに含む、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
(項目２２)
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、項目２１に記載の方法。
(項目２３)
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、項目２２に記載の方法。
(項目２５)
クロマトグラフィーマトリックスの微生物バイオバーデンの低減のための方法であって、前記クロマトグラフィーマトリックスを約４．０Ｍ〜約１２．０Ｍの尿素を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、胞子形成細菌の量の少なくとも２ｌｏｇ１０の低減、グラム陽性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減、およびグラム陰性細菌の量の少なくとも５ｌｏｇ１０の低減のうちの１つまたは複数をもたらす、方法。
(項目２６)
前記組成物がアルコールをさらに含む、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
前記アルコールがエタノールまたはベンジルアルコールである、項目２６に記載の方法。
(項目２８)
前記組成物が約２０％のエタノールを含む、項目２７に記載の方法。
(項目２９)
前記組成物が約１％〜約２％のベンジルアルコールを含む、項目２７に記載の方法。
(項目３０)
前記接触させるステップが、前記クロマトグラフィーマトリックスにおいて、（１）生物濾過アッセイ、（２）顕微鏡細菌染色、（３）ＩＲ／ＦＴＩＲ分光法、（４）無菌試験法、および（５）細菌同定試験からなる群から選択されるアッセイによる決定で検出限界未満までの、胞子形成細菌、グラム陽性細菌、およびグラム陰性細菌のうちの１つまたは複数の量の低減をもたらす、項目２５に記載の方法。
(項目３１)
前記胞子形成細菌がＢａｃｉｌｌｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓであり、前記グラム陽性細菌がＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．であり、前記グラム陰性細菌がＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａである、項目３０に記載の方法。
(項目３２)
前記接触させるステップが１５℃〜３０℃の間の温度で実行される、項目１から３１のいずれか一項に記載の方法。
(項目３３)
前記接触させるステップが２０℃〜２５℃の間の温度で実行される、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記クロマトグラフィーマトリックスが、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  Ｘｔｒａ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ｐｃｃ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）  ＳｕＲｅ  ＬＸ、ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ（商標）  Ａ、ｎＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂ、ｒｍｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｃａｐｔｏ（商標）  Ｌ、ＰｒｏＳｅｐ（商標）−Ａ、ＰｒｏＳｅｐ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｌｕｓ、ＡｂＳｏｌｕｔｅ（商標）、ＣａｐｔｉｖＡ（商標）  ＰｒｉＭａｂ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｄｉａｍｏｎｄ、Ｅｓｈｍｕｎｏ（商標）  Ａ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（商標）  ＡＦ−ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ａｍｓｐｈｅｒｅ（商標）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ＫａｎＣａｐＡ（商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｘｔｒａ、およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
(項目３５)
医薬物質を含む組成物を精製のためにアプライする前に微生物負荷を低減させる方法であって、
クロマトグラフィーマトリックスを提供するステップ、
項目１に記載の方法を行うステップ、および
前記医薬物質を含む前記組成物を前記クロマトグラフィーマトリックスにアプライするステップ
を含む、方法。
【国際調査報告】
2020507371.tif 000033
2020507371.tif 000034
2020507371.tif 000035
2020507371.tif 000036
2020507371.tif 000037