(57)【要約】Ｆｃガンマ受容体との結合が減少した改変ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを提供する。さらに、改変ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドを提供する。ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体ポリペプチドを提供し、ここで該抗体ポリペプチドは単一のＶＨドメインおよびＦｃドメインを含むドメイン抗体（ｄＡｂ）の融合物である。抗体ポリペプチドはＣＤ４０アゴニスト活性を示さず、未熟樹状細胞を実質的に活性化せず、改善された生物物理学的特性を有する。
2020521458.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＣガンマ受容体との結合を減少させるＫａｂａｔの２３８位の変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドであって、２３８位のプロリン（Ｐ２３８）がリジン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンから選択される残基のうち１つに変異している、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチド。
【請求項２】
Ｐ２３８がリジンに変異している、請求項１記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチド。
【請求項３】
配列番号１３４（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン））、配列番号６６（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ）、配列番号１３５（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン））、または配列番号６７（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチド。
【請求項４】
（Ａ）異種ポリペプチド、および（Ｂ）請求項１〜３のいずれかに記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、融合ポリペプチド。
【請求項５】
以下を含む、抗体ポリペプチド：
（１）以下を含む単一可変ドメイン：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、または配列番号１のＣＤＲ１領域と最大で２アミノ酸異なるＣＤＲ１領域、
（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、または配列番号２のＣＤＲ１領域と最大で３アミノ酸異なるＣＤＲ２領域、および
（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域、または配列番号３のＣＤＲ１領域と最大で６アミノ酸異なるＣＤＲ３領域、
ここで、該単一可変ドメインはＣＤ４０に結合する；ならびに
（２）請求項１〜３のいずれかに記載のヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン。
【請求項６】
該単一可変ドメインがＣＤ４０の活性に拮抗する、請求項５記載の抗体ポリペプチド。
【請求項７】
安定性が増加している、請求項５記載の抗体ポリペプチド。
【請求項８】
（ａ）ＣＤＲ１領域が、配列Ｘ１−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｙ１−Ｔｒｐ（配列番号４）からなり、ここでＸ１はＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｙ１はＭｅｔまたはＬｅｕであり；
（ｂ）ＣＤＲ２領域が、配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｙ２−Ｚ２−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ２−Ｇｌｙ（配列番号５）からなり、ここでＸ２はＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｙ２はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり、Ｚ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅであり、Ａ２はＬｙｓまたはＭｅｔであり；かつ
（ｃ）ＣＤＲ３領域が、配列Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｙ３−Ｚ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ３（配列番号６）からなり、ここでＸ３はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、Ｙ３はＰｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、Ｚ３はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、Ａ３はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｂ３はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、Ｃ３はＡｓｐ、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＳｅｒである、請求項５記載の抗体ポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）ＣＤＲ１領域が、配列番号１（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ１）のアミノ酸配列からなり、
（ｂ）ＣＤＲ２領域が、配列番号２（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ２）のアミノ酸配列からなり、かつ
（ｃ）ＣＤＲ３領域が、配列番号３（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなる、請求項５記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１０】
単一可変ドメインのアミノ酸配列が配列番号４１（３ｈ−５６−２６９配列）に記載されている、請求項５記載の抗体ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１３６または配列番号７０のアミノ酸配列を含む抗体ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号１３６または配列番号７０のアミノ酸配列からなる抗体ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号１３７または配列番号７１のアミノ酸配列を含む抗体ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号１３７または配列番号７１のアミノ酸配列からなる抗体ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１６】
請求項１５記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１６記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１８】
請求項５〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項５〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチドを対象に投与することを含む、対象の免疫疾患を処置または予防する方法。
【請求項２０】
免疫疾患が、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答（例えば血友病の第ＶＩＩ因子）、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
必要とする対象の免疫応答を処置または予防するための薬剤の調製における、請求項５〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチドの使用。
【請求項２２】
必要とする対象の免疫疾患の処置における使用のための請求項５〜１４のいずれかに記載の抗体ポリペプチドを含む薬剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、これは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年５月２３日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは200896_0014_00_WO_ST25.txtという名称であり、サイズは２４５，８８１バイトである。
【０００２】
技術分野
Ｆｃガンマ受容体との結合が減少した改変ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを提供する。抗ＣＤ４０の単一可変ドメインおよび改変Ｆｃドメインを含む抗体ポリペプチドを提供する。この抗体ポリペプチドはＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さず、未熟樹状細胞を活性化せず、治療物質としての開発に適した改善された生物物理学的特性を有する。この抗体ポリペプチドを含む組成物、ＣＤ４０活性に関与する疾患の処置のための使用方法、およびＣＤ４０活性に関与する疾患の処置のための薬剤の調製における使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む）上に存在する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する共刺激分子である。ＣＤ４０がＴＨ細胞上においてそのリガンドであるＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に結合すると、ＡＰＣが活性化される。ＣＤ４０介在性ＡＰＣ活性化は、様々な免疫応答（サイトカイン産生、共刺激分子（ＣＤ８６など）の上方制御、ならびに抗原提示およびＢ細胞増殖の増強を含む）に関与している。ＣＤ４０は、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞および上皮細胞によっても発現され得る。
【０００４】
ＣＤ４０の活性化はまた、例えば自己免疫、移植拒絶反応またはアレルギー反応に関連する様々な望ましくないＴ細胞応答に関与している。望ましくないＴ細胞応答を制御するための１つの戦略は、アンタゴニスト抗体を用いてＣＤ４０を標的とすることである。例えば、モノクローナル抗体ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ、以前はＣｈｉｒｏｎ１２１２として知られていた）は現在、特定のＣＤ４０介在性炎症性疾患の処置のための臨床試験中である。インターネット上のハイパーテキスト転送プロトコル:clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209（最終更新日２０１１年１月１１日）の"Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma", Clinical Trials Feeds参照。しかしながら、モノクローナル抗体はアゴニスト活性を示し得る。例えば、抗ＣＤ４０抗体Ｃｈｉ２２０の有用性はその弱い刺激性の能力によって制限されている。Adams, et al., 2005, "Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival", J. Immunol. 174: 542-50参照。
【０００５】
免疫疾患の処置および／または予防においてＣＤ４０の活性化を調節する治療法が必要とされ続けている。
【発明の概要】
【０００６】
Ｆｃガンマ受容体との結合を減少させるＫａｂａｔの２３８位における変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドを提供し、ここで２３８位のプロリン（Ｐ２３８）はリジン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンから選択される残基のうち１つに変異している。ＩｇＧ１ Ｆｃは配列番号６５のアミノ酸配列を含み得る。
【０００７】
Ｋａｂａｔの２３８位において置換されたリジンを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドを提供する。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は以下である：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン）；配列番号１３４）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６６）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン）；配列番号１３５）、および
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６７）。
【０００８】
（Ａ）異種ポリペプチド、および（Ｂ）上述のＦｃドメインを含む融合ポリペプチドを提供する。
【０００９】
以下を含む抗体ポリペプチドをさらに提供する：（１）以下を含む単一可変ドメイン：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、または配列番号１のＣＤＲ１領域と最大で２アミノ酸異なるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、または配列番号２のＣＤＲ２領域と最大で３アミノ酸異なるＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域、または配列番号３のＣＤＲ３領域と最大で６アミノ酸異なるＣＤＲ３領域、ここで該単一可変ドメインはＣＤ４０に結合する；および（２）Ｆｃガンマ受容体との結合を減少させるＫａｂａｔの２３８位における変異を含むヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインポリペプチドであるＦｃドメイン、ここで２３８位のプロリン（Ｐ２３８）はリジン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンから選択される残基のうち１つに変異している。本明細書に記載される抗体ポリペプチドの単一可変ドメインは、ＣＤ４０の少なくとも１つの活性に拮抗する。本明細書に記載される抗体ポリペプチドは、同一の単一可変ドメイン配列を有し、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと融合している基準ポリペプチドと比較して安定性が向上している。以下を含む抗体ポリペプチドを提供する：（１）上述の単一可変ドメイン、ここでヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインはＫａｂａｔの２３８位において置換されたリジンを有する。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は以下である：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン）；配列番号１３４）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６６）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端リジン）；配列番号１３５）、および
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６７）。
【００１０】
上述の抗体ポリペプチドをさらに提供し、ここで（ａ）ＣＤＲ１領域は配列Ｘ１−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｙ１−Ｔｒｐ（配列番号４）からなり、ここでＸ１はＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｙ１はＭｅｔまたはＬｅｕであり；（ｂ）ＣＤＲ２領域は配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｙ２−Ｚ２−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ２−Ｇｌｙ（配列番号５）からなり、ここでＸ２はＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｙ２はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり、Ｚ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅであり、Ａ２はＬｙｓまたはＭｅｔであり；（ｃ）ＣＤＲ３領域は配列Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｙ３−Ｚ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ３（配列番号６）からなり、ここでＸ３はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、Ｙ３はＰｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、Ｚ３はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、Ａ３はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｂ３はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、Ｃ３はＡｓｐ、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。
【００１１】
上述の抗体ポリペプチドをさらに提供し、ここで（ａ）ＣＤＲ１領域は配列番号１のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ１）からなり、（ｂ）ＣＤＲ２領域は配列番号２のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ２）からなり、（ｃ）ＣＤＲ３領域は配列番号３のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ３）からなる。上述の抗体ポリペプチドをさらに提供し、ここで単一可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号４１（＝３ｈ−５６−２６９配列）に記載されている。
【００１２】
以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる抗体ポリペプチドを提供する：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３６）、または
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７０）。
【００１３】
以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる抗体ポリペプチドを提供する：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３７）、または
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７１）。
【００１４】
本開示のヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチド、融合ポリペプチドまたは抗体ポリペプチドのいずれかをコードする核酸をさらに提供する。また、該核酸分子を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００１５】
上述の抗体ポリペプチドおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
上述の抗体ポリペプチドを対象に投与することを含む、対象の免疫疾患を処置または予防する方法を提供する。免疫疾患は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答（例えば血友病の第ＶＩＩ因子）、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎および潰瘍性大腸炎からなる群から選択され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１（図１Ａおよび１Ｂを含む）は、本開示に有用な代表的な抗体ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。図１Ａは、単一可変ドメイン抗体ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１）とＦｃドメイン（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６６）の抗体ポリペプチド融合物のアミノ酸配列（配列番号７０）を示す。Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６６）はイタリック体で示されている；下線が引かれたイタリック体の２３位の残基（Ｋａｂａｔの２３８位に対応する）はプロリンからリジンへの変異である。図１Ｂは、単一可変ドメイン抗体ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１）と別のＦｃドメイン（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６７）の抗体ポリペプチド融合物のアミノ酸配列（配列番号７１）を示す。Ｆｃドメインのアミノ酸配列（配列番号６７）はイタリック体で示されている。図１Ａおよび１Ｂの両方において、単一可変ドメインの３つの相補性決定領域であるＣＤＲ１（配列番号１）、ＣＤＲ２（配列番号２）およびＣＤＲ３（配列番号３）に下線が引かれている。４つのフレームワーク領域であるＦＲ１（配列番号４２）、ＦＲ２（配列番号４４）、ＦＲ３（配列番号４７）およびＦＲ４（配列番号５４）のアミノ酸には下線が引かれていない。リンカーのアミノ酸配列ＡＳＴ（配列番号５７）には二重下線が引かれている。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａは、最大９人のｉＤＣドナーについての様々な濃度のｄＡｂ−Ｆｃ融合物でのｉＤＣ活性化データを示す。ＣＤ８６発現に対するＢＭＳ−９８６０９０（ＩｇＧ４ Ｆｃと融合した抗ＣＤ４０ ｄＡｂ）、ＣＤ４０Ｌ（（イソロイシンジッパー三量体化モチーフを介した）可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体）およびｍＡｂ １３４−２１４１（アゴニスト抗ＣＤ４０抗体）の用量反応。ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４（対照−Ｌ６）：陰性対照。Ｕｎｓｔｉｍ：ｉＤＣのみ（未刺激）。濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、最大９人のｉＤＣドナーについての様々な濃度のｄＡｂ−Ｆｃ融合物でのｉＤＣ活性化データを示す。ＩＣＡＭ−１発現に対するＢＭＳ−９８６０９０（ＩｇＧ４ Ｆｃと融合した抗ＣＤ４０ ｄＡｂ）、ＣＤ４０Ｌ（（イソロイシンジッパー三量体化モチーフを介した）可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体）およびｍＡｂ １３４−２１４１（アゴニスト抗ＣＤ４０抗体）の用量反応。ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４（対照−Ｌ６）：陰性対照。Ｕｎｓｔｉｍ：ｉＤＣのみ（未刺激）。濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、最大９人のｉＤＣドナーについての様々な濃度のｄＡｂ−Ｆｃ融合物でのｉＤＣ活性化データを示す。ＩＬ−６放出に対するＢＭＳ−９８６０９０（ＩｇＧ４ Ｆｃと融合した抗ＣＤ４０ ｄＡｂ）、ＣＤ４０Ｌ（（イソロイシンジッパー三量体化モチーフを介した）可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体）およびｍＡｂ １３４−２１４１（アゴニスト抗ＣＤ４０抗体）の用量反応。ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４（対照−Ｌ６）：陰性対照。Ｕｎｓｔｉｍ：ｉＤＣのみ（未刺激）。濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、最大９人のｉＤＣドナーについての様々な濃度のｄＡｂ−Ｆｃ融合物でのｉＤＣ活性化データを示す。ＴＮＦアルファ放出に対するＢＭＳ−９８６０９０（ＩｇＧ４ Ｆｃと融合した抗ＣＤ４０ ｄＡｂ）、ＣＤ４０Ｌ（（イソロイシンジッパー三量体化モチーフを介した）可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体）およびｍＡｂ １３４−２１４１（アゴニスト抗ＣＤ４０抗体）の用量反応。ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４（対照−Ｌ６）：陰性対照。Ｕｎｓｔｉｍ：ｉＤＣのみ（未刺激）。濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、最大９人のｉＤＣドナーについての様々な濃度のｄＡｂ−Ｆｃ融合物でのｉＤＣ活性化データを示す。図２Ｅは、１００μｇ／ｍｌのＢＭＳ−９８６０９０または３ｈ−５９−２６９−ａｂａ（ｄＡｂ−ＩｇＧ１融合物）で処理された最大９人のドナー由来のｉＤＣの比較を示す。
【００１９】
【図３】図３（図３Ａ〜３Ｄを含む）は、ＣＤ８６発現（図３Ａ）、ＩＣＡＭ発現（図３Ｂ）およびサイトカイン放出（図３ＣのＩＬ−６および図３ＤのＴＮＦアルファ）によって測定されるように、３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ４のＣＤ３２介在性の架橋／クラスター形成によってｉＤＣ活性化が増加することを示す。溶液中において、または架橋（「ｘリンク」）を伴って、図に示す濃度（μｇ／ｍｌ）で処理されたｉＤＣを示す；架橋は、ＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞の添加を指す。ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４は陰性対照として働く。
【００２０】
【図４】図４は、ＩｇＧ４、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆおよびＣＴ Ｆｃ尾部を含む抗ＣＤ４０ ｄＡｂを用いたｉＤＣ活性化アッセイからのデータを示す。Ｌ６−ＩｇＧ４（ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４）は陰性対照として働く；アゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ １２３４−２１４１は陽性対照である。ｉＤＣを図に示す濃度（μｇ／ｍｌ）で処理した。ＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞のｉＤＣ培養物への添加（右側のパネル）は、３ｈ−５９−２６９−ＣＴを除く全ての融合タンパク質についてサイトカイン放出の大幅な増加および活性化マーカーの上方制御をもたらす。
【００２１】
【図５】図５（図５Ａ〜５Ｅを含む）は、ｄＡｂ−Ｆｃ分子のＤＳＣサーモグラムデータを示す。図５Ａ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１。図５Ｂ）３ｈ５６−２６９−ＣＴ。図５Ｃ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。図５Ｄ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆ。図５Ｅ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆ。各パネルにおいて、太線がサーモグラムデータを示し、細線が最も単純な最良適合を示す。
【００２２】
【図６】図６（図６Ａ〜６Ｆを含む）は、ｄＡｂ−Ｆｃ分子のｉｃＩＥＦデータを示す。図６Ａ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１。図６Ｂ）３ｈ５６−２６９−ＣＴ。図６Ｃ）（ＵＣＯＥ−ＣＨＯ細胞から産生した）３ｈ５６−２６９−ＣＴ。図６Ｄ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。図６Ｅ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆ。図６Ｆ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆ。ｐＩマーカーがパネルＡにおいてｐＩ５．８５およびｐＩ１０．１０に示されている。
【００２３】
【図７】図７は、１μＭにおける４つの１Ｆ４抗体の結合を伴う７μｇ／ｍｌ ｈＣＤ６４−Ｈｉｓの捕捉についてのＳＰＲセンサーグラム(sensorgram)データを示す。
【００２４】
【図８】図８は、ｐＩ値の表示を伴う、異なるＦｃドメインを持つ１３個の１Ｆ４モノクローナル抗体のｉｃＩＥＦデータを示す。
【００２５】
【図９】図９は、３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１−Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１−Ｎ２９７ＡのｉＤＣ活性化データを示す。Ｌ６−ＩｇＧ４（ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４）は陰性対照として働く；ＢＭＳ−９８６０９０（３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ４）は陽性対照である。ｉＤＣを図に示す濃度（μｇ／ｍｌ）の抗体で処理した。ＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞のｉＤＣ培養物への添加（「＋ＣＤ３２ ＣＨＯ」で示される各グラフの左側のデータ）は、陽性対照３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ４についてサイトカイン放出の大幅な増加および活性化マーカーの上方制御をもたらすが、Ｐ２３８の位置またはＮ２９７の位置に単一の変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ尾部と融合したｄＡｂにはもたらさない。
【００２６】
【図１０】図１０は、種々のＦｃ尾部を有する抗ＣＤ４０ドメイン抗体−Ｆｃ融合タンパク質のｉＤＣ活性化を示す。Ｌ６−ＩｇＧ４（ＣｈｉＬ６−ＩｇＧ４）は陰性対照として働く；アゴニストｍＡｂ １２３４−２１４１およびＢＭＳ−９８６０９０（３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ４）は陽性対照である。ｉＤＣを図に示す濃度（μｇ／ｍｌ）の抗体で処理した。ｉＤＣの活性化は、Ｐ２３８ＫまたはＮ２９７Ａ変異を含む融合物を除く全ての融合タンパク質で観察され、（「＋ＣＤ３２ ＣＨＯ」で示される各グラフの左側に示される）ＣＤ３２発現ＣＨＯの添加により増加する。
【００２７】
【図１１】図１１（図１１Ａ〜１１Ｄを含む）は、ｄＡｂ−Ｆｃ分子のＤＳＣサーモグラムデータを示す。図１１Ａ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓ。図１１Ｂ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ。図１１Ｃ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋ。図１１Ｄ）３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
この詳細な説明に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書において、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が他を明確に示していない限り複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば「抗体(an antibody)」への言及には複数のそのような抗体が含まれ、「その用量(the dosage)」への言及には１以上の用量および当業者に公知のその均等物への言及などが含まれる。
【００２９】
本明細書において、用語「約」は当業者によって理解されており、使用される文脈によってある程度変動する。一般に、約は参照値のプラス／マイナス１０％の値の範囲を包含する。
【００３０】
本明細書に記載の範囲の間のあらゆる全体または部分的な整数が本明細書に含まれることが理解される。
【００３１】
本明細書で使用される略語：
ＡＰＣ  抗原提示細胞
ＣＤ５４  ＩＣＡＭ−１とも呼ばれる
ＣＤＲ  相補性決定領域
ＣＨ  定常重鎖
ＣＬ  定常軽鎖
ＣＨＯ細胞  チャイニーズハムスター卵巣細胞
ｄＡｂ  ドメイン抗体
ＤＳＣ  示差走査熱量測定
ＦｃｇＲ  Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲと互換的である）
ＦＲ  フレームワーク領域
ＦＳＢ  ウシ胎仔血清
ＧＭ−ＣＳＦ  顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ｉＤＣ  未熟樹状細胞
ｉｃＩＥＦ  画像化キャピラリー等電点電気泳動(Imaged capillary isoelectric focusing)
ＩＦＮ  インターフェロン
ＩｇＧ  免疫グロブリンＧ
ＩＬ−４  インターロイキン４
ＩＬ−６  インターロイキン６
ｍＡｂ  モノクローナル抗体
ｍｇ  ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ  ミリリットル
ｎｇ  ナノグラム
ｐＩ  等電点
ＳＰＲ  表面プラズモン共鳴
ＴＮＦ  腫瘍壊死因子
μｇ  マイクログラム
ＶＬ  可変軽鎖
ＶＨ  可変重鎖
さらなる略語および定義が本明細書において提供される。
【００３２】
１．Ｆｃドメイン
重鎖のカルボキシ末端側の「半分」は、エフェクター機能に主に関与する定常領域（Ｆｃ）を規定する。本明細書において、用語「Ｆｃドメイン」は、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)に従って定められるＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む定常領域抗体配列を指す。本明細書に開示されるＦｃドメインはヒトＩｇＧに由来し、より具体的にはヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域に由来する。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｋａｂａｔの２３８位に変異を含む。変異は、２３８位のプロリン（Ｐ２３８）をリジン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）およびトリプトファン（Ｗ）から選択されるアミノ酸；または、リジンおよびセリンから選択されるアミノ酸；またはリジンから選択されるアミノ酸に置換する。
【００３３】
ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの例示的なコンセンサス配列は以下である：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＸＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（Ｄ／Ｅ）Ｅ（Ｌ／Ｍ）ＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＺ（配列番号６５）、ここでＸはＫ、Ｓ、Ａ、ＲまたはＷであり、ＺはＫであるか、または存在しない。この配列において、２３位（下線が引かれたＸ）はＫａｂａｔの２３８位に対応する。
【００３４】
例示的なＩｇＧ Ｆｃドメイン配列は表１である。変異している残基には下線が引かれている。配列番号１３４および１３５は、さらなる例示的なＩｇＧ Ｆｃドメイン配列である。
【表１】
2020521458.tif 000003
【００３５】
ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子はＣ末端リジンをコードするが、血液循環中の切断の結果、リジンは内在性抗体に存在しないことが多い。哺乳類細胞培養において発現させる場合、Ｃ末端リジンを含むＩｇＧ重鎖を有する抗体はＣ末端リジンが存在するレベルが様々であり得る（Cai et al, 2011, Biotechnol Bioeng. 108(2):404-12）。したがって、本明細書に開示されるあらゆるＩｇＧ重鎖ＦｃドメインのＣ末端リジンは省略され得る。例えば、配列番号６６および１３４、ならびに配列番号６７および１３５を参照。同様に、配列番号６８および配列番号６９のＣ末端のリジンは任意で存在しなくてもよい。
【００３６】
変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、Ｆｃガンマ受容体への結合の減少を示す。有利なことに、Ｆｃガンマ受容体への結合の減少は、以下の少なくとも１つによって測定されるようにｉＤＣの活性化を減少させ、または妨げる：１）サイトカインＩＬ−６および／またはＴＮＦアルファの放出；および２）ＣＤ８６および／またはＣＤ５４の細胞表面発現の上方制御。Ｆｃガンマ受容体への結合の減少はまた、未熟樹状細胞上のＦｃｇＲのクラスター形成／架橋を減少させ、または妨げると考えられている。さらに、変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体ポリペプチドの熱安定性および均一性に寄与し得る。
【００３７】
２．変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗体ポリペプチド
本開示は変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む融合ポリペプチドを含む。
【００３８】
２．１．異種ポリペプチド
本開示は、本開示の異種ポリペプチドと変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインの融合ポリペプチドを含む。異種ポリペプチドは重鎖可変ドメインを含み得、または重鎖可変ドメインからなり得る。重鎖可変ドメインのカルボキシル末端は、Ｆｃドメインのアミノ末端に連結または融合してい得る。あるいは、重鎖可変ドメインのカルボキシル末端はリンカーアミノ酸配列のアミノ末端に連結または融合してい得、リンカーアミノ酸配列自体がＦｃドメインのアミノ末端に融合している。あるいは、重鎖可変ドメインのカルボキシル末端はＣＨ１ドメインのアミノ末端に連結または融合してい得、ＣＨ１ドメイン自体がＦｃドメインに融合している。融合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に全体的または部分的にヒンジ領域を含み得る。例えば、アミノ酸リンカー配列は重鎖可変ドメインとＦｃドメインとの間に存在する。
【００３９】
２．２．ドメイン抗体
本開示はさらに、Ｆｃドメインと融合した単一可変ドメイン（ドメイン抗体）を含む。「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、抗原（ＣＤ４０など）に特異的かつ一価で結合できる単一可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨ）を含む。単一可変ドメインのカルボキシル末端は、Ｆｃ ＣＨ２ドメインのアミノ末端に連結または融合してい得る。あるいは、単一可変ドメインのカルボキシル末端はリンカーアミノ酸配列のアミノ末端に連結または融合してい得、リンカーアミノ酸配列自体がＦｃドメインのアミノ末端に融合している。あるいは、単一可変ドメインのカルボキシル末端はＣＨ１ドメインのアミノ末端に連結または融合してい得、ＣＨ１ドメイン自体がＦｃ ＣＨ２ドメインに融合している。このタンパク質は、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間に全体的または部分的にヒンジ領域を含み得る。例えば、アミノ酸リンカー配列は単一可変ドメインとＦｃドメインとの間に存在する。また、抗ヒトＣＤ４０ドメイン抗体および改変ヒトＦｃドメインを含む融合ポリペプチドである抗体ポリペプチドを提供する。任意で、抗体ポリペプチドはドメイン抗体とＦｃドメインとの間に介在するアミノ酸リンカーをさらに含む。例示的な抗体ポリペプチドを図１に示す。
【００４０】
２．２．１．抗ＣＤ４０ドメイン抗体
本開示の抗体ポリペプチドは、ヒトＣＤ４０に特異的に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さないドメイン抗体を含む。「ドメイン抗体」（ｄＡｂ）は、抗原（ＣＤ４０など）に特異的かつ一価で結合できる単一可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨ）を含む。ドメイン抗体は「ＶＨドメイン」を含み、ヒトである。二価抗ＣＤ４０抗体は細胞表面上に結合したＣＤ４０分子を架橋する能力を持つため、アゴニスト活性を示すと考えられている。特定の理論に限定されないが、一価ｄＡｂはＣＤ４０を架橋しないため、ＣＤ４０を活性化しないと考えられている。
【００４１】
ＣＤ４０は、Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂｐ５０、ＣＤ４０Ｌ受容体、ＣＤｗ４０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３、ｐ５０、ＴＮＦＲＳＦ５および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５としても知られている。「ヒトＣＤ４０」は、以下のアミノ酸配列を含むＣＤ４０を指す：
MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD 
CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD 
TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF 
FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI 
IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP 
VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ（配列番号６４）。
【００４２】
本明細書において、用語「可変ドメイン」は、Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991)に規定される免疫グロブリン可変ドメインを指す。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、周知のＫａｂａｔの番号付け規則に従う。例えば、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１）のＫａｂａｔ番号付けが、アミノ酸が連続的に番号付けされている同一の配列と表２において比較されている。Ｋａｂａｔの番号付けでは、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９は挿入残基５２Ａ、８２Ａ、８２Ｂ、８２Ｃを有し、残基１００が欠失している。
【表２】
2020521458.tif 000004
【００４３】
用語「ヒト」は、抗体ポリペプチドに適用される場合、抗体ポリペプチドがヒト免疫グロブリン由来の配列（例えばＦＲおよび／またはＣＨドメイン）を有することを意味する。配列は、以下のいずれかである場合、ヒト免疫グロブリンをコードする配列に「由来している」：（ａ）ヒト個体から、またはヒト個体からの細胞または細胞株から単離されている；（ｂ）クローン化ヒト抗体遺伝子配列またはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離されている；または（ｃ）上記の１つ以上のポリペプチドからの変異および選択によって多様化されている。本明細書における「単離された」化合物は、化合物が天然において関連している少なくとも１つの成分から取り出されていることを意味する。
【００４４】
本明細書において、「特異的結合」は、例えば表面プラズモン共鳴によって測定される約１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を伴う抗体ポリペプチドによる抗原の結合を指す。適切なアッセイシステムには、ビアコア（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システムおよびビアコア（商標）速度論的評価ソフトウェア（例えばバージョン２．１）が含まれる。
【００４５】
本願の抗体ポリペプチドのＣＤ４０への結合は、ＣＤ４０活性に拮抗する。「ＣＤ４０活性」には、限定されないが、Ｔ細胞活性化（例えば、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌の誘導）、マクロファージ活性化（例えば、マクロファージにおける活性酸素種および一酸化窒素の誘導）およびＢ細胞活性化（例えば、Ｂ細胞増殖、抗体アイソタイプスイッチまたは形質細胞への分化）が含まれる。ＣＤ４０活性は他の分子との相互作用によって媒介され得る。「ＣＤ４０活性」にはＣＤ４０と以下の分子との機能的な相互作用が含まれ、以下の分子は括弧内のＵｎｉｐｒｏｔアクセッション番号により特定される：
ＣＡＬＲ        （Ｐ２７７９７）；
ＥＲＰ４４      （Ｑ９ＢＳ２６）；
ＦＢＬ          （Ｐ２２０８７）；
ＰＯＬＲ２Ｈ    （Ｐ５２４３４）；
ＲＦＣ５        （Ｐ４０９３７）；
ＳＧＫ１        （Ｏ００１４１）；
ＳＬＣ３０Ａ７  （Ｑ８ＮＥＷ０）；
ＳＬＣ３９Ａ７  （Ｑ９２５０４）；
ＴＲＡＦ２      （Ｑ５Ｔ１Ｌ５）；
ＴＲＡＦ３      （Ｑ１３１１４）；
ＴＲＡＦ６      （Ｑ９Ｙ４Ｋ３）；
ＴＸＮ          （Ｑ５Ｔ９３７）；
ＵＧＧＴ１      （Ｑ９ＮＹＵ２）；および
ＵＳＰ１５      （Ｑ９Ｙ４Ｅ８）。
【００４６】
例えば、ＣＤ４０の「活性」にはＴＲＡＦ２との相互作用が含まれる。ＣＤ４０／ＴＲＡＦ２相互作用はＮＦ−κＢおよびＪＮＫを活性化する。Davies et al., Mol. Cell Biol. 25: 9806-19 (2005)参照。したがって、このＣＤ４０活性は、基準と比較したＣＤ４０依存性の細胞性ＮＦ−κＢおよびＪＮＫの活性化により決定され得る。本明細書において、用語「活性化する」、「活性化している」および「活性化される」は、所定の測定可能なＣＤ４０活性の基準と比較した少なくとも１０％（例えば少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上）の増加を指す。アンタゴニストが存在しない場合と比較してＣＤ４０活性が少なくとも１０％（例示的な実施態様において、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％（すなわち活性が検出できない））減少している場合、ＣＤ４０活性は「拮抗」されている。例えば、抗体ポリペプチドはＣＤ４０を活性化することなく、一部または全てのＣＤ４０活性に拮抗し得る。ある実施態様において、抗体ポリペプチドはＢ細胞増殖を活性化しない。別の実施態様において、抗体ポリペプチドはＴ細胞によるサイトカイン分泌を活性化せず、ここでこのサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインである。
【００４７】
本開示の抗体ポリペプチドはヒト患者に投与され得るが、他の種（例えばマウス）由来の抗体の投与によって誘発されることが多い抗抗体免疫応答の大部分を回避し得る。例えば、マウス抗体は、当分野で周知の手順に従ってマウスＣＤＲをヒト可変ドメインＦＲ上に移植することにより「ヒト化」され得る。しかしながら、本明細書に開示されるヒト抗体は、マウス抗体配列の遺伝子操作を必要とすることなく産生され得る。
【００４８】
本開示において有用な抗ＣＤ４０ドメイン抗体は３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含み、これらはアミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配列されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。３つのＣＤＲには、抗原と特異的な相互作用を形成し、抗原認識に主に関与する残基のほとんどが含まれている。
【００４９】
単一のＣＤ４０エピトープに特異的に結合する単一可変ドメイン抗体ポリペプチドの属は、２０１４年４月１０日に公開された"ANTIBODY POLYPEPTIDES THAT ANTAGONIZE CD40"という題名の米国出願公開第２０１４／００９９３１７号に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。抗体ポリペプチドは構造的および機能的に特徴付けられ、そのデータは２０１４年４月１０日に公開された米国出願公開第２０１４／００９９３１７号に記載されている。ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９は、米国出願公開第２０１４／００９９３１７号に開示されているヒトＣＤ４０に特異的に結合するが、ヒトＣＤ４０を刺激しない例示的な単一可変ドメイン抗体ポリペプチドである。
【００５０】
ＣＤＲには、抗原と特異的な相互作用を形成する残基のほとんどが含まれている。本開示の抗体ポリペプチドの単一可変ドメインは、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域と同一のアミノ酸配列を有するか、またはこのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とそれぞれ１、２、３、４、５または６つのアミノ酸が異なっているＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。
【００５１】
ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９（配列番号４１）のアミノ酸配列を以下に示す。
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【００５２】
３つの相補性決定領域のアミノ酸に下線が引かれている。ＣＤＲ１のアミノ酸配列はＤＹＥＭＷ（配列番号１）である。ＣＤＲ２のアミノ酸配列はＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）であり、ＣＤＲ３のアミノ酸配列はＬＰＦＲＦＳＤ（配列番号３）である。ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９のアミノ酸配列をコードする例示的な核酸配列は以下である：
gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 
tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgg gattatgaga tgtggtgggt ccgccaggct 
ccagggaagg gtctagagcg ggtctcagct attaatccgc agggtacgcg tacatactac 
gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 
ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacttccg 
tttaggtttt ccgaccgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc
（配列番号７２）。
【００５３】
本開示により提供される抗体ポリペプチドの可変ドメインは、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域（それぞれ配列番号１〜３）と同一のアミノ酸配列を有するか、またはこのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域とそれぞれ１、２、３、４、５または６つのアミノ酸が異なっているＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域を含む。ＣＤＲ１領域は、配列番号１から最大で２つのアミノ酸が変化し得る。ＣＤＲ２領域は、配列番号２から最大で３つのアミノ酸が変化し得る。ＣＤＲ３領域は、配列番号３から最大で６つのアミノ酸が変化し得る。したがって、抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、または配列番号１のＣＤＲ１領域と最大で２アミノ酸異なるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、または配列番号２のＣＤＲ２領域と最大で３アミノ酸異なるＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域、または配列番号３のＣＤＲ３領域と最大で６アミノ酸異なるＣＤＲ３領域、ここで該単一可変ドメインはＣＤ４０に結合する。抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域、または配列番号１のＣＤＲ１領域と最大で２アミノ酸異なるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域、または配列番号２のＣＤＲ２領域と最大で３アミノ酸異なるＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域、または配列番号３のＣＤＲ３領域と最大で６アミノ酸異なるＣＤＲ３領域、ここで該単一可変ドメインはＣＤ４０に結合する。
【００５４】
例示的な抗体ポリペプチドを２．５節に記載する。されなる例示的な抗体が本明細書に記載される。
【００５５】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列Ｘ１−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｙ１−Ｔｒｐ（配列番号４）からなるＣＤＲ１領域、ここでＸ１はＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｙ１はＭｅｔまたはＬｅｕである；（ｂ）配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｙ２−Ｚ２−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ２−Ｇｌｙ（配列番号５）からなるＣＤＲ２領域、ここでＸ２はＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｙ２はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり、Ｚ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅであり、Ａ２はＬｙｓまたはＭｅｔである；および（ｃ）配列Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｙ３−Ｚ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ３（配列番号６）からなるＣＤＲ３領域、ここでＸ３はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、Ｙ３はＰｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、Ｚ３はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、Ａ３はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｂ３はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、Ｃ３はＡｓｐ、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。
【００５６】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列Ｘ１−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｙ１−Ｔｒｐ（配列番号４）からなるＣＤＲ１領域、ここでＸ１はＡｓｐであり、Ｙ１はＭｅｔである；（ｂ）配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｙ２−Ｚ２−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ２−Ｇｌｙ（配列番号５）からなるＣＤＲ２領域、ここでＸ２はＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｙ２はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり、Ｚ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅであり、Ａ２はＬｙｓである；および（ｃ）配列Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｙ３−Ｚ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ３（配列番号６）からなるＣＤＲ３領域、ここでＸ３はＬｅｕであり、Ｙ３はＰｈｅ、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＭｅｔであり、Ｚ３はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、ＴｈｒまたはＰｈｅであり、Ａ３はＰｈｅであり、Ｂ３はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、Ｃ３はＡｓｐまたはＧｌｕである。
【表３】
2020521458.tif 000005
【００５７】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。
【００５８】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号７、配列番号８、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。
【００５９】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３５および配列番号３７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。
【００６０】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３６および配列番号３８からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号８のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。
【００６１】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号３９および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２７のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号８および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。
【００６２】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは以下を含み得る：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１領域；（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２領域；および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３領域。本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは、配列番号４１（３ｈ−５６−２６９配列）のアミノ酸配列を含み得るか、または該アミノ酸配列からなり得る。
【００６３】
本明細書に開示される抗体ポリペプチドの可変ドメインは、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域およびＣＤＲ３領域を含み得、ここでＣＤＲ１領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ２領域のアミノ酸配列およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：
（１）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号３；
（２）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号７；
（３）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号８；
（４）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号９；
（５）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１０；
（６）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１１；
（７）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１２；
（８）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１３；
（９）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１４；
（１０）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１５；
（１１）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１６；
（１２）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１７；
（１３）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１８；
（１４）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号１９；
（１５）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号２０；
（１６）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号２１；
（１７）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号２２；
（１８）それぞれ配列番号１、配列番号２および配列番号２３；
（１９）それぞれ配列番号１、配列番号２７および配列番号７；
（２０）それぞれ配列番号１、配列番号２７および配列番号８；
（２１）それぞれ配列番号１、配列番号２７および配列番号２４；
（２２）それぞれ配列番号１、配列番号２７および配列番号２５；
（２３）それぞれ配列番号１、配列番号２７および配列番号２６；
（２４）それぞれ配列番号１、配列番号２８および配列番号７；
（２５）それぞれ配列番号１、配列番号２９および配列番号８；
（２６）それぞれ配列番号１、配列番号３０および配列番号７；
（２７）それぞれ配列番号１、配列番号３１および配列番号８；
（２８）それぞれ配列番号１、配列番号３２および配列番号７；
（２９）それぞれ配列番号１、配列番号３３および配列番号８；
（３０）それぞれ配列番号１、配列番号３４および配列番号８；
（３１）それぞれ配列番号１、配列番号３５および配列番号７；
（３２）それぞれ配列番号１、配列番号３６および配列番号８；
（３３）それぞれ配列番号１、配列番号３７および配列番号７；
（３４）それぞれ配列番号１、配列番号３８および配列番号８；
（３５）それぞれ配列番号３９、配列番号２７および配列番号８；
（３６）それぞれ配列番号３９、配列番号２７および配列番号２４；
（３７）それぞれ配列番号４０、配列番号２７および配列番号８；ならびに
（３８）それぞれ配列番号４０、配列番号２７および配列番号２４。
【００６４】
抗体ポリペプチドの可変ドメインは、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９の可変ドメインと最大で１０個のアミノ酸またはその間のあらゆる整数値のアミノ酸が異なり得、ここでこの可変ドメインバリアントはＣＤ４０に特異的に結合する。あるいは、可変ドメインバリアントは、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９の配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９５％または９８％の配列同一性）を有し得る。同一でないアミノ酸残基または２つの配列の間で異なっているアミノ酸は、アミノ酸の置換、付加または欠失を表し得る。２つの配列が任意の適切なアミノ酸配列アラインメントアルゴリズム（ＢＬＡＳＴなど）によってアラインされている場合、２つの配列の間で異なる残基は同一でない位置として現れる。
【００６５】
可変ドメインは、ヒト生殖系列抗体遺伝子セグメントによってコードされる対応するフレームワーク領域と同一のアミノ酸配列を有する１以上のフレームワーク領域（ＦＲ）を含み得る。例えば、ドメイン抗体は、ＶＨ生殖系列遺伝子セグメントＤＰ４７、ＤＰ４５もしくはＤＰ３８、Ｖκ生殖系列遺伝子セグメントＤＰＫ９、ＪＨセグメントＪＨ４ｂ、またはＪκセグメントＪκ１を含み得る。
【００６６】
例示的なフレームワーク領域には、３ｈ−５６−２６９からのフレームワーク領域が含まれる：ＦＲ１＝ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲ（３ｈ−５６−２６９のアミノ酸１〜３０）；ＦＲ２＝ＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳ（３ｈ−５６−２６９のアミノ酸３６〜４９）；ＦＲ３＝ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（３ｈ−５６−２６９のアミノ酸６７〜９８）；ＦＲ４＝ＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（３ｈ−５６−２６９のアミノ酸１０６〜１１６）。これらの配列は、表３の配列番号４２、４４、４７および５４にそれぞれ対応する。他の例示的なフレームワーク領域を表３に示す。
【表４】
2020521458.tif 000006
【００６７】
他の例示的なフレームワーク領域は、米国出願公開第２０１４−００９９３１７号に開示されている３ｈ−５６−２６９系列クローンのフレームワーク領域である。
【００６８】
変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドは、免疫疾患の処置または予防において治療的価値を有する。タンパク質治療薬を市場に出すには、一般に化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）と呼ばれる開発に適した物理的および化学的特性を持つ分子が必要とされる。分子の物理的および化学的特性（安定性、溶解性および均一性を含む）は、まとめて「開発可能性(developability)」とも呼ばれる。有利なことに、変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドは、他のＩｇＦ１およびＩｇＦ４ Ｆｃドメインと連結した同一の抗ＣＤ４０可変ドメインと比較して改善された開発可能性を示す。変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドは、ＳＰＲにより測定されるＦｃガンマ受容体との結合の減少を示し、１）サイトカインＩＬ−６および／またはＴＮＦアルファの放出；および２）ＣＤ８６および／またはＣＤ５４の細胞表面発現の上方制御のうち少なくとも１つにより測定されるｉＤＣの活性化の減少または検出不能なｉＤＣの活性化を示す。さらに、変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドは、ＤＳＣにより測定される改善された熱安定性を有し、加速ストレス条件下で測定される改善された物理的安定性を有する。変異ＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む抗ＣＤ４０抗体ポリペプチドは、改善された均一性を有する。
【００６９】
２．３．リンカー
ある実施態様において、融合抗体ポリペプチドの抗体ポリペプチドは、「アミノ酸リンカー」または「リンカー」によって連結されてい得る。例えば、ｄＡｂはアミノ酸リンカーのＮ末端と融合してい得、ＦｃドメインはリンカーのＣ末端に融合してい得る。アミノ酸リンカーはいかなる長さであってもよく、アミノ酸のあらゆる組合せからなり得るが、リンカーの長さは連結したドメイン間の相互作用を減少させるために相対的に短くてもよい（例えば５個以下のアミノ酸）。リンカーのアミノ酸組成は、かさ高い側鎖を持つアミノ酸または二次構造を導入する可能性のあるアミノ酸の数を減少させるように調整され得る。適切なアミノ酸リンカーには、限定されないが、最大で３、４、５、６、７、１０、１５、２０または２５アミノ酸長のアミノ酸リンカーが含まれる。リンカーＡＳＴ（配列番号５７）は、融合ポリペプチドに使用され得る。他の代表的なアミノ酸リンカー配列には、ＧＧＧＧＳ（配列番号５８）およびＧＧＧＧＳのコピーを２、３、４または５つ含むリンカー（それぞれ配列番号５９〜６２）が含まれる。表４には、本開示で使用される例示的なリンカー配列が記載されている。
【表５】
2020521458.tif 000007
【００７０】
２．４．例示的な抗体ポリペプチド
例示的な抗体ポリペプチドは以下を含む：（１）以下を含む単一可変ドメイン：（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域、または配列番号１のＣＤＲ１領域と最大で２アミノ酸異なるＣＤＲ１領域、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域、または配列番号２のＣＤＲ２領域と最大で３アミノ酸異なるＣＤＲ２領域、および（ｃ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３領域、または配列番号３のＣＤＲ３領域と最大で６アミノ酸異なるＣＤＲ３領域、ここで該単一可変ドメインはＣＤ４０に結合する；および（２）Ｆｃガンマ受容体との結合を減少させるＫａｂａｔの２３８位における変異を含むヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインポリペプチドであるＦｃドメイン、ここで２３８位のプロリン（Ｐ２３８）はリジン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンから選択される残基のうち１つに変異している。本明細書に記載される抗体ポリペプチドの単一可変ドメインは、ＣＤ４０の少なくとも１つの活性に拮抗する。本明細書に記載される抗体ポリペプチドは、野生型ＩｇＧ１ Ｆｃドメインと融合している同一の単一可変ドメイン配列を有する基準ポリペプチドと比較して安定性が向上している。以下を含む抗体ポリペプチドを提供する：（１）上述の単一可変ドメイン、ここでヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインはＫａｂａｔの２３８位において置換されたリジンを有する。
【００７１】
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は以下である：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号１３４）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６６）、
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号１３５）、および
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ；配列番号６７）。
【００７２】
例示的な抗体ポリペプチドは上述されており、ここで（ａ）ＣＤＲ１領域は配列Ｘ１−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｙ１−Ｔｒｐ（配列番号４）からなり、ここでＸ１はＡｓｐまたはＧｌｙであり、Ｙ１はＭｅｔまたはＬｅｕである；（ｂ）ＣＤＲ２領域は配列Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｘ２−Ｇｌｙ−Ｙ２−Ｚ２−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａ２−Ｇｌｙ（配列番号５）からなり、ここでＸ２はＧｌｎ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、ＴｒｐまたはＡｌａであり、Ｙ２はＴｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｙ、ＳｅｒまたはＧｌｎであり、Ｚ２はＡｒｇ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ＨｉｓまたはＰｈｅであり、Ａ２はＬｙｓまたはＭｅｔである；および（ｃ）ＣＤＲ３領域は配列Ｘ３−Ｐｒｏ−Ｙ３−Ｚ３−Ａ３−Ｂ３−Ｃ３（配列番号６）からなり、ここでＸ３はＬｅｕ、ＰｒｏまたはＧｌｕであり、Ｙ３はＰｈｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、ＭｅｔまたはＴｙｒであり、Ｚ３はＡｒｇ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＭｅｔまたはＳｅｒであり、Ａ３はＰｈｅまたはＴｙｒであり、Ｂ３はＳｅｒ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、ＧｌｕまたはＧｌｙであり、Ｃ３はＡｓｐ、Ｔｙｒ、ＧｌｕまたはＳｅｒである。
【００７３】
例示的な抗体ポリペプチドは上述されており、ここで（ａ）ＣＤＲ１領域は配列番号１のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ１）からなり、（ｂ）ＣＤＲ２領域は配列番号２のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ２）からなり、（ｃ）ＣＤＲ３領域は配列番号３のアミノ酸配列（３ｈ−５６−２６９のＣＤＲ３）からなる。上述の抗体ポリペプチドをさらに提供し、ここで単一可変ドメインのアミノ酸配列は配列番号４１（＝３ｈ−５６−２６９配列）に記載されている。
【００７４】
例示的な抗体ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７０）。
【００７５】
例示的な抗体ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３６）。
【００７６】
例示的な抗体ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号７１）。
【００７７】
例示的な抗体ポリペプチドは以下のアミノ酸配列を含むか、または以下のアミノ酸配列からなる：
ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲＤＹＥＭＷＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＲＶＳＡＩＮＰＱＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＬＰＦＲＦＳＤＲＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＫＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３７）。
【００７８】
２．５．抗体ポリペプチド調製
本開示の抗体ポリペプチドは、通常の技術のみを用いてあらゆる適切な哺乳類宿主細胞株（ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳおよびＮＳＯなど）において産生および精製され得、その後１つの方法（プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換または逆相技術などを含む）または方法の組合せを用いて精製され得る。
【００７９】
本開示は、本開示の抗体ポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。核酸はベクター（例えばｐＨＥＮ−１などの適切な発現ベクターなど）に挿入され得る(Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137)。本開示の抗体ポリペプチドをコードするベクターおよび／または核酸を含む単離された宿主細胞をさらに提供する。
【００８０】
３．医薬組成物および処置方法
医薬組成物は、治療有効量の１以上の抗体ポリペプチドおよび任意で薬学的に許容され得る担体を含む。薬学的に許容され得る担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ブドウ糖、グリセロールおよびエタノールなど、ならびにそれらの組合せが含まれる。薬学的に許容され得る担体は少量の補助物質（融合タンパク質の有効期間または有効性を増強する湿潤剤、乳化剤、保存剤または緩衝液など）をさらに含み得る。組成物は、投与後に活性成分の迅速な放出、持続放出または遅延放出を提供するように処方され得る。適切な医薬組成物およびそれらを調製する方法は当分野で周知である。例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co. (2005)参照。
【００８１】
医薬組成物は、免疫抑制物質／免疫調節物質および／または抗炎症物質をさらに含み得る。
【００８２】
免疫疾患の処置を必要とする患者の免疫疾患を処置する方法は、治療有効量の医薬組成物を患者に投与することを含み得る。ＣＤ４０介在性Ｔ細胞活性化への拮抗は、例えば自己免疫、移植拒絶反応またはアレルギー反応中に生じる望ましくないＴ細胞応答を阻害し得る。ＣＤ４０介在性Ｔ細胞活性化の阻害は、これらの疾患の進行および／または重症度を緩和し得る。
【００８３】
また、免疫疾患の処置を必要とする患者の免疫疾患の処置のための薬剤の調製における本開示の抗体ポリペプチドまたはその薬学的に許容され得る塩の使用を提供する。薬剤は、例えば免疫抑制物質／免疫調節物質および／または抗炎症物質と組み合わせて投与され得る。
【００８４】
本明細書において、「患者」は動物（例えばヒトを含む哺乳類）を意味する。患者は免疫疾患と診断されてい得る。「処置」または「処置する」または「処置している」とは、症状、障害、状態または疾患の進行または重症度を緩和することを含むプロセスを指す。「免疫疾患」は、個体における免疫反応（細胞性免疫反応および／または液性免疫反応を含む）の発生に関連するあらゆる疾患を指す。免疫疾患の例として、限定されないが、炎症、アレルギー、自己免疫疾患または移植関連疾患が含まれる。「自己免疫疾患」は、個体における自己免疫反応（細胞性免疫反応および／または液性免疫反応を含む）の発生に関連するあらゆる疾患を指す。自己免疫疾患の例は炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（限定されないが、潰瘍性大腸炎やクローン病を含む）である。他の自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、関節リウマチ、糖尿病、乾癬、強皮症およびアテローム性動脈硬化症が含まれる。移植関連疾患には、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶反応および慢性移植拒絶反応が含まれる。
【００８５】
本開示の医薬組成物を投与することによって処置され得る疾患は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠動脈心疾患、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え製剤に対する免疫応答（例えば血友病の第ＶＩＩ因子）、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、移植拒絶反応、血管炎および潰瘍性大腸炎からなる群から選択され得る。
【００８６】
医薬組成物は単独で、または免疫抑制物質／免疫調節物質および／または抗炎症物質を用いた治療と組み合わせて（すなわち、同時または連続的に）投与され得る。種々の免疫疾患は免疫疾患の処置に有用な特定の補助化合物の使用を必要とし得、これは患者ごとに決定され得る。例えば、医薬組成物は１以上の適切なアジュバント（例えばサイトカイン（例えばＩＬ−１０およびＩＬ−１３）または他の免疫刺激物質（例えばケモカイン、腫瘍関連抗原およびペプチド））と組み合わせて投与され得る。適切なアジュバントは当分野で公知である。
【００８７】
抗体ポリペプチドまたは医薬組成物を投与するために、あらゆる適切な方法または経路が使用され得る。投与経路には、例えば、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与が含まれる。投与される抗体ポリペプチドの治療有効用量は、多くの要素（例えば、処置される免疫疾患の種類および重症度、併用療法の使用、抗体ポリペプチドまたは医薬組成物の投与経路、および患者の体重を含む）に依存する。ドメイン抗体の治療有効量の限定されない範囲は、患者の体重に対して０．１〜２０ｍｇ／ｋｇであり、ある態様において１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００８８】
４．キット
ヒト患者の免疫疾患の処置に有用なキットを提供する。ある実施態様において、キットは、（ａ）１回分の本開示の抗体ポリペプチド、および（ｂ）本明細書に開示されるヒト患者の免疫疾患を処置する方法において抗体ポリペプチドを使用するための説明資料を含む。
【００８９】
本明細書における用語「説明資料」には、出版物、記録、図、またはキットにおける本発明の組成物および／または化合物の有用性を伝えるために使用され得るあらゆる他の表現媒体が含まれる。キットの説明資料は、例えば本発明の化合物および／または組成物を含む容器に添付され得るか、または該化合物および／または組成物を含む容器とともに出荷され得る。あるいは、説明資料は、レシピエントが説明資料および化合物を協同的に使用することを意図して容器とは別に出荷され得る。説明資料の送達は、例えば出版物またはキットの有用性を伝える他の表現媒体の物理的送達によるものであり得、あるいは電子送信（例えば、電子メールまたはウェブサイトからのダウンロードなどのコンピューターによる手段）によって達成され得る。
【実施例】
【００９０】
材料および方法：この節は、以下の実施例において使用される材料および方法を記載する。さらなる方法が実施例において開示される。
【００９１】
タンパク質：抗体およびｄＡｂ−Ｆｃタンパク質をＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎臓細胞由来の細胞株）またはＥｘｐｉ２９３細胞のいずれかに発現させ、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーおよびその後の分取サイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。いくつかの選択された試料をＵＣＯＥ−ＣＨＯ細胞から発現および精製した（「ＵＣＯＥ−ＣＨＯ」で示された試料）。
【００９２】
ＣＤ４０結合動態および親和性：固定化したプロテインＡセンサーチップ表面上にｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体を捕捉し、ＰＢＳ−Ｔ ｐＨ７．１中において３０マイクロリットル／分（μｌ／分）で１８０秒の結合時間および３６０秒の解離時間を用いてヒトＣＤ４０単量体タンパク質（社内で産生）を結合することによって、ｄＡｂ−Ｆｃおよび抗体分子のＣＤ４０結合親和性をビアコア（商標） Ｔ１００またはＴ２００装置（GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA）上でＳＰＲにより測定した。結合を結合活性で特徴付けるために、ヒトＣＤ４０−Ｆｃ（社内で産生）をＣＭ５センサーチップ上に固定化し、ｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体分析物を３０μｌ／分で１８０秒の結合時間および２４０秒の解離時間を用いて結合について調べた。
【００９３】
実施例１：ＦｃγＲ架橋の存在下または非存在下におけるｄＡｂ−Ｆｃ分子によるｉＤＣの処理
３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１は、抗ＣＤ４０ ｄＡｂ−ＦＣ（ＩｇＧ４）融合タンパク質（配列番号７５）である。例えばＷＯ２０１２／１４５６７３に記載されるように、Ｂ細胞またはＴ細胞除去末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）における３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１の直接的なアゴニスト活性は観察されていない。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１の生物活性および安全性プロファイルをさらに特徴付けるために、未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に対する３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１の効果をアッセイした。この実施例に使用された材料および方法は以下を含む：
【００９４】
初代細胞の単離および培養：末梢血を正常で健康なヒトのドナーから採取した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配分離によりヘパリン添加ヒト血液から単離した。単球を、手動のＥａｓｙＳｅｐプロトコル（STEMCELL（商標） Technologies, Vancouver, Canada）に従ってＰＢＭＣから単離した。単離した１００万個の単球を、６ウェルプレートの各ウェル中の６ｍｌの完全培地（ＲＰＭＩ−１６４０、１０％熱失活ウシ胎仔血清、１００ユニット／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン；ＩＬ−４（１００ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍｌ））およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）をさらに含む）にプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２で６日間インキュベートした。培地を１日おきに交換し、同じ濃度のサイトカインを含む新鮮な培地に交換した。未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を６日目に遠心分離により回収し、十分に洗浄し、完全培地に再懸濁した。
【００９５】
未熟樹状細胞活性化アッセイ：未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を、特定のサイトカインの放出および特定の細胞表面分子の発現を評価することにより、活性化についてアッセイした。様々な生物学的物質の滴定を完全培地中で行い、９６ウェルプレートを複製するために添加した。（ＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞の添加による）架橋の場合、アッセイされる抗体をＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞の添加の３０分前にｉＤＣに添加した。ＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞とｉＤＣとの比は１：６であった。
【００９６】
サイトカインを評価するために、細胞を３７℃および５％ＣＯ２で約１８〜２０時間インキュベートした；１５０マイクロリットル（μＬ）の上清を各ウェルから取り出し、１：５に希釈し、市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems, Minneapolis, MN）を用いて製造者の説明書に従ってＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２のタンパク質濃度を評価した。
【００９７】
ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４とも呼ばれる）およびＣＤ８３の発現を評価するために、回収された上清からプレート中に残存している細胞を２回の処理ごとに１つの試料にまとめ、新しい９６ウェル丸底（ＲＢ）プレートに移し、４℃でプレーティングした。細胞をＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＤ−ＰＢＳで洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標） Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ−ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて細胞生存率のために氷上で３０分間染色した。細胞を洗浄し、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＤ−ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．１％ＮａＮ３（染色緩衝液）中に再懸濁し、染色緩衝液中において５μＬ／ウェルのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）（Fc Receptor Blocking Solution, Biolegend, San Diego, CA）でブロックした。ｉＤＣを、ＰｅｒＣｐＣｙ５．５標識αＣＤ３、αＣＤ１９、αＣＤ１４（Ｌｉｎ−）、ＢＵＶ３９５標識αＣＤ１１ｃ（BD Biosciences, San Diego, CA）、ＡＰＣ標識αＣＤ８６（Biolegend, San Diego, CA）、ＰＥ標識αＣＤ８３（eBioscience, San Diego, CA）、ＦＩＴＣ標識αＣＤ５４（Biolegend, San Diego, CA）で免疫染色し、４℃で４５分間インキュベートした。次に、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ Ｆｉｘａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（BD Bioscience, San Diego, CA）を添加することによって固定（遮光して室温（ＲＴ）で１５分間）した。ｉＤＣを、ＬＳＲＩＩ−Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（BD Biosciences, San Diego, CA）およびＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（Tree Star Inc., Ashland, OR）を用いてＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８３の発現について評価した。
【００９８】
ＣＰ−８７０，８９３ ｍＡｂは周知のアゴニストＣＤ ｍＡｂである（例えばVonderheide et al., 2007, J. Clin. Oncol. 25(7): 876-883参照）。これらの試験において、ＣＰ−８７０，８９３ ｍＡｂ（本明細書ではｍＡｂ １３４−２１４１とも呼ばれる；社内で産生）は陽性対照として機能した。第２の陽性対照は、イソロイシンジッパー三量体形成モチーフによって三量体化している可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体分子（社内で産生）であった。いくつかの実験において、非ＣＤ４０結合タンパク質とＩｇＧ４．１ Ｆｃ尾部との融合タンパク質であるＣＨＩ−Ｌ６ ＩｇＧ４（社内で産生）は陰性対照として機能した。
【００９９】
ｄＡｂ−Ｆｃ：本実験で試験したｄＡｂ−Ｆｃのアミノ酸配列を表５に示す。これらの配列において、単一可変ドメイン３ｈ５６−２６９残基は１〜１１８位のアミノ酸（下線）である。リンカーであるＡＳＴ（配列番号５７）には二重下線が引かれている。フォーマットされていないＣ末端残基はＦｃドメインである。
【表６】
2020521458.tif 000008
【０１００】
結果：未熟樹状細胞（ｉＤＣ）に対する３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１の効果をアッセイした。サイトカイン放出（例えばＩＬ−６、ＴＮＦ）と同様にＣＤ８６およびＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）発現の上方制御を評価した。９人の異なるドナーからのｉＤＣに対してアッセイを行った。ｉＤＣ上のＣＤ８６発現の軽度の増加が、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１により３０μｇ／ｍｌでは９人のドナーのうち１人において、１００μｇ／ｍｌでは９人のドナーのうち２人において観察され、サイトカイン放出の同様の軽度の増加が９人のドナーのうち１人において観察された。図２Ａ〜２Ｄ参照。したがって、Ｆｃ−抗ＣＤ４０ ｄＡｂ融合３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１はドナーの小さなサブセットにおいて未熟樹状細胞（ｉＤＣ）を活性化したと結論付けられた。
【０１０１】
未熟ＤＣはＦｃｇＲとＣＤ４０の両方を発現し、ＣＤ４０の活性化に感受性がある。したがって、ＦｃｇＲ介在性クラスター形成または架橋が、観察された３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１によるｉＤＣ活性化に関与してい得る可能性を調べた。３ｈ−５６−２６９−ＣＴ（配列番号７６）は、本明細書において「ＣＴ」または「ａｂａ」と呼ばれるＦｃｇＲ結合が減少しているＩｇＧ１ Ｆｃ尾部との同一の抗ＣＤ４０ ｄＡｂ（３ｈ−５６−２６９）の融合物である。ＣＴ Ｆｃドメインは、オレンシア（登録商標）（アバタセプト、Bristol-Myers Squibb Company, New York, NY）中に存在するＦｃドメインである。アバタセプトは、Ｆｃドメインエフェクター機能を減少させ、ＩｇＧ１ヒンジ領域の鎖間ジスルフィド結合を除去するように改変されたＩｇＧ１ ＦｃドメインとＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインとの融合物である。３ｈ−５６−２６９−ＣＴはＦｃｇＲ結合が減少している。
【０１０２】
３ｈ−５９−２６９−ＣＴを、９人のドナーからのｉＤＣを用いて１００μｇ／ｍｌにおいて調べた。９人のドナーのｉＤＣは、非ＣＤ４０タンパク質とＩｇＧ４ Ｆｃ尾部との融合タンパク質であるＣＨＩ−Ｌ６ ＩｇＧ４からなる陰性対照と比較して、サイトカインの放出もＣＤ８６またはＣＤ５４の上方制御も示さなかった。対照的に、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１は９人のドナーのうち３人のサブセットでｉＤＣ活性化を示し、ｉＤＣ活性化の少なくとも１つの尺度が対照よりも大きいことが観察された。ＣＤ４０アゴニストｍＡｂ １３４−２１４は、調べた全てのドナーでＣＤ８６およびＩＣＡＭの発現ならびにサイトカイン放出を刺激した。図２Ｅ参照。
【０１０３】
これらのデータは、ｉＤＣ活性化における融合タンパク質のＦｃ部分の役割を示唆する。具体的には、これらの観察は、ｉＤＣの表面上の３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１のＩｇＧ４．１ ＦｃドメインによるＦｃｇＲのクラスター形成または架橋が、ドナーのサブセットにおいて観察される活性化の原因であり得ることを示唆する。３ｈ−５９−２６９−ＣＴ融合タンパク質のｉＤＣ活性化の減少は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価されるＦｃｇＲ受容体（ＣＤ３２（ＦｃｇＲＩＩ）およびＣＤ１６（ＦｃｇＲＩＩＩ）を含む）への結合の減少と一致している。
【０１０４】
ｉＤＣの細胞表面マーカー発現およびサイトカイン放出に対するＦｃｇＲ介在性ｄＡｂ架橋の影響をさらに調べるために、８人の血液ドナーにおいてさらなる実験を行い、親和性が低いＦｃｇＲであるＣＤ３２ａを高度に過剰発現するＣＨＯ細胞を用いて３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１をクラスター形成／架橋させた。これらの実験において、ＣＨＯ細胞とｉＤＣの比率が１：６であったことに留意すべきである。この比は過剰なレベルのクラスター形成／架橋であり、正常な生理学的条件下で生じると予想されるレベルを超えている可能性がある。先述のｉＤＣ試験（図２）で観察されたものと同様に、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１は架橋の非存在下において、ＣＨＩ−Ｌ６ ＩｇＧ４対照と比較して少数のドナーにおいてＣＤ８６およびＩＬ−６の産生により測定される軽度なｉＤＣ活性化を引き起こした。対照的に、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞を組み込んだ場合、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１は１０μｇ／ｍｌ以上の濃度において、両方の細胞表面マーカーおよびサイトカイン放出によって測定されるように、アゴニストＣＤ４０抗体の架橋と類似したｉＤＣ活性化をもたらした（図３）。
【０１０５】
実施例２：ＦｃｇＲ結合が損なわれたｄＡＢ−Ｆｃ分子
さらなるＦｃ変異がＦｃｇＲクラスターまたは架橋によって媒介される間接的なｉＤＣ活性化を減少させ得るか否かを決定するために、ＦｃｇＲ結合を減少させるようにＦｃドメインに変異を有する他のｄＡｂ−Ｆｃ分子を産生した。ＦｃｇＲ結合親和性をＳＰＲによって特徴付けた。本実施例で使用される材料および方法は以下を含む。
【０１０６】
ＦｃｇＲ結合ＳＰＲ：ＦｃｇＲ結合は、精製したＦｃｇＲおよびビアコア（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いてインビトロで測定できる。本明細書では２つの方法を用いた。
【０１０７】
１つの方法では、精製した抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質の、抗Ｈｉｓ抗体の固定化されたＦａｂフラグメント上に捕捉されたＨｉｓタグ付きＦｃｇＲタンパク質（ＦｃｇＲ−Ｈｉｓ）への結合をテストする。これらの実験は、ビアコア（商標）Ｔ１００またはビアコア（商標）Ｔ２００装置（GE Healthcare）のいずれかにおいて２５℃で実施される。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体（社内で産生）由来のＦａｂフラグメントを、エタノールアミンブロッキングを含む標準的なエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の化学を用いて、１０ミリモル濃度（ｍＭ）ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ＋）の泳動用緩衝液中に約３０００の共鳴ユニット(Resonance Unit)ＲＵの密度でＣＭ５センサーチップ上に固定化する。残りの全ての試験をｐＨ７．１の１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ）の泳動用緩衝液を用いて実施する。Ｃ末端６ｘポリヒスチジンタグを含む様々なＦｃｇＲタンパク質（社内で産生）を、（通常、約７μｇ／ｍｌのＦｃｇＲ−Ｈｉｓタンパク質濃度を用いて）１０μｌ／分で３０秒（ｓ）の接触時間でこの表面上に捕捉した。様々な濃度の精製した抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質を、（例えば３０μｌ／分で１２０秒の結合時間および３０μｌ／分で１２０秒の解離時間を用いて）結合について調べる。これらの試験でテストしたＦｃｇＲタンパク質には、「高親和性」ＦｃｇＲ ｈＣＤ６４（ｈＦｃｇＲＩ）、ならびに「低親和性」ＦｃｇＲ ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｈ１３１）、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｒ１３１）、ｈＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩｂ）、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｖ１５８）、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｆ１５８）、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ１）およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）が含まれる。
【０１０８】
結合応答を定量的に分析し、種々の分子のＦｃｇＲ結合を比較するために、ＳＰＲ結合データは、最大の結合応答を理論的に最大の結合応答（％Ｒｍａｘ）の割合として計算することによって、一般的に式１に示されるように分析され得る：
【数１】
2020521458.tif 000009
具体的には、％Ｒｍａｘは以下の式を用いて計算される：
【数２】
2020521458.tif 000010
ここで「分析物」は抗体またはｄＡｂ−Ｆｃであり、「リガンド」は捕捉されたＦｃｇＲタンパク質である。この分析は、抗体、ｄＡｂ−ＦｃまたはＦｃｇＲのグリコシル化の質量を考慮しておらず、捕捉されたリガンドの１００％の活性率を仮定している。
【０１０９】
「％Ｒｍａｘ分析」は、「低親和性」ＦｃｇＲ（例えば、ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２、これらは比較的速い結合速度および解離速度、ならびにテストされる分析物の濃度（１マイクロモル濃度（μＭ））付近またはそれ以下の親和性を持つため、これらの条件下では一般に表面の飽和は達成されない）の結合を評価するのに特に有用である。対照的に、「高親和性」ＦｃｇＲ ｈＣＤ６４は、他のＦｃｇＲよりも高い親和性および遅い解離反応速度で（特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４と）結合するため、これらのアイソタイプは通常、マイクロモル濃度の分析物濃度下でｈＣＤ６４表面を飽和させ、％Ｒｍａｘを用いて親和性を区別するのがより困難となる。これらの相互作用について、抗体間の差異はセンサーグラムデータの解離速度を比較することにより容易に観察され得る。
【０１１０】
抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質とＦｃｇＲタンパク質との間の相互作用を調べるための第２のＳＰＲアッセイは、プロテインＡ捕捉法である。これらの実験は、ビアコア（商標）Ｔ１００またはビアコア（商標）Ｔ２００装置（GE Healthcare）のいずれかにおいて２５℃で実施される。これらの試験のために、プロテインＡを、エタノールアミンブロッキングを含む標準的なエチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）の化学を用いて、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤ｐ２０の泳動用緩衝液中に約３０００ＲＵの密度でＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４上に固定化する。抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質（通常約３〜１０μｇ／ｍｌ）をプロテインＡ表面上に捕捉し、ＦｃｇＲ分析物の結合を（例えば、３０μＬ／分の流速で１２０秒の結合時間および１８０秒の解離時間を用いて）１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０、緩衝液（ＰＢＳ−Ｔ）からなる泳動用緩衝液中でｐＨ７．１および２５℃で調べる。
【０１１１】
プロテインＡ捕捉アッセイは、抗体またはｄＡｂ−Ｆｃ分子を含む未精製の上清を分析するのに使用され得る。この分析のために、抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質は、希釈していない上清または泳動用緩衝液で希釈した上清のいずれかから捕捉され得る。結合応答を定量的に分析し、種々の分子のＦｃｇＲ結合を比較するために、ＳＰＲ結合データは上記の式１を用いて％Ｒｍａｘを計算することにより分析され得、ここで分析物は精製されたＦｃｇＲタンパク質であり、リガンドは捕捉された抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質である。
【０１１２】
％Ｒｍａｘ分析に加えて、結合の速度論および親和性の定量分析が、プロテインＡで捕捉された抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質への結合についてＦｃｇＲ分析物の滴定を調べることによって実施され得る。例えば、３：１の段階希釈におけるＦｃｇＲは、１０μＭから０．１５ｎＭ（ｈＣＤ６４）または１．５ｎＭ（他の全てのＦｃｇＲ）のいずれかまで滴定され得る。これらの動態データは、ビアコア（商標）Ｔ２００評価ソフトウェアを用いて１：１のラングミュアモデルまたは定常状態結合モデルに適合され得、動態および親和性の値が取得され得る。
【０１１３】
ｄＡｂ−Ｆｃ：本実施例で試験したｄＡｂ−Ｆｃは表５に示されるｄＡｂ−Ｆｃを含む。本実験で試験されたさらなるｄＡｂ−Ｆｃのアミノ酸配列を表６に示す。これらの配列において、単一可変ドメイン３ｈ５６−２６９残基は１〜１１８位のアミノ酸（下線）である。リンカーＡＳＴ（配列番号５７）には二重下線が引かれている。Ｃ末端残基はＦｃドメインである。
【表７】
2020521458.tif 000011
【０１１４】
対照ｍＡｂ：対照モノクローナル抗体（１Ｆ４）を類似のＦｃドメイン変異体とともに構成(format)した。抗体はＣＤ４０に結合しない。表７の配列番号８０は対照抗体重鎖可変領域（下線）およびＣＨ１の配列であり、配列番号８１は軽鎖可変領域（下線）およびＣＬの配列である。様々に構成された重鎖を配列番号８２〜８７として表７に示す。ＩＦ４重鎖可変領域およびＣＨ１領域の配列は、配列番号８２〜８７において下線が引かれている。各１Ｆ４ ｍＡｂバリアントの重鎖配列と軽鎖配列の対を表８に示す。
【表８−１】
2020521458.tif 000012
【表８−２】
2020521458.tif 000013
【表９】
2020521458.tif 000014
【０１１５】
結果：ＦｃｇＲ結合を減少させるＦｃドメイン内の変異を持つｄＡｂ−Ｆｃ分子を産生した。具体的には、抗ＣＤ４０ドメイン抗体３ｈ５６−２６９を、以下のＦｃドメインバリアントとともに構成した：ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆおよびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆ（配列番号７７）、３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆ（配列番号７８）および３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ（配列番号７９）のそれぞれにおいて、１〜１１６位のアミノ酸は３ｈ−５６−２６９ ｄＡｂであり、１１７〜１１９位のアミノ酸はリンカーであり、１２０〜３５１位のアミノ酸はＦｃドメインである。
【０１１６】
これらの各ｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ならびに３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１および３ｈ５６−２６９−ＣＴのそれぞれが、ビアコア（商標）ＳＰＲによって測定されるように、精製されたヒトＣＤ４０単量体（ｈＣＤ４０単量体、社内で産生）に高い親和性で結合することが確認された。表９に示されるように、種々のＦｃバリアントのＫＤ値は７．３ｎＭ〜１１．５ｎＭの範囲である。センサーチップの表面上のｈＣＤ４０−Ｆｃおよび溶液中の可溶性分析物としてのｄＡｂ−Ｆｃ分子を用いたＳＰＲによって測定されるように、各ｄＡｂ−Ｆｃ分子は高い結合活性でヒトＣＤ４０に結合し、ここで２５０ｎＭおよび２５ｎＭのｄＡｂ−Ｆｃ分析物の注入についてのデータを１：１ラングミュアモデルに適合させ、全てのｄＡｂ−Ｆｃの結合活性に影響される見かけのＫＤ値（ＫＤａｐｐａｒｅｎｔ）を１ｎＭ未満と概算した。表９参照。
【表１０】
2020521458.tif 000015
＊ＵＣＯＥ−ＣＨＯ細胞から発現および精製された３ｈ−５６−２６９−ＣＴ。
【０１１７】
ｄＡｂ−Ｆｃ分子および様々な対照モノクローナル１Ｆ４抗体のＦｃｇＲ結合特性をＳＰＲによって特徴付けた。最初のアッセイは、１μＭまたは１０μＭ ｄＡｂ−ＦｃまたはヒトＩｇＧ１ｆ抗体対照（１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆ）と、抗Ｈｉｓ Ｆａｂに捕捉されたＦｃｇＲ−Ｈｉｓ表面との結合を含んでいた。これらのデータを表１０に示す。
【表１１】
2020521458.tif 000016
【０１１８】
別のアッセイにおいて、ＦｃｇＲ分析物（１μＭまたは１０μＭ）を、プロテインＡに捕捉されたｄＡｂ−Ｆｃ表面への結合（表１１に示されるデータ）および抗体表面への結合（表１２に示されるデータ）についてテストした。
【表１２】
2020521458.tif 000017
【表１３】
2020521458.tif 000018
【０１１９】
これらの実験における結合応答またはその欠如に基づいて、最も強い結合応答を有するより高い親和性のｄＡｂ−Ｆｃ／ＦｃｇＲまたはＡｂ／ＦｃｇＲ相互作用のサブセットを、分析物の滴定を用いた動態／親和性の特徴付けのために選択した（ＦｃｇＲ分析物とプロテインＡに捕捉された抗体またはｄＡｂ−Ｆｃとの結合）。これらのデータを表１３に示す。
【表１４】
2020521458.tif 000019
【０１２０】
まとめると、これらのＦｃｇＲ結合のＳＰＲデータは、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ４．１アイソタイプ分子が、改変ＦｃバリアントＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆまたはＣＴ分子と比較して全てのＦｃｇＲにおいて有意に高いＦｃｇＲ親和性を有することを示す。改変Ｆｃバリアントのうち、ｈＣＤ６４結合親和性は３ｈ５６−２６９−ＣＴで最も強く（ＫＤ＝４．６ｎＭ）、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａでより弱く（ＫＤ＝６２ｎＭ）、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆで最も弱く、この親和性は弱すぎてテストした条件下では定量化できなかった（ＫＤ＞５μＭ、これはテストした最も高い分析物濃度の半分である）。ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆおよびＣＴバリアントの他の全てのＦｃｇＲ相互作用（ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２）は弱すぎて信頼性のあるＫＤ値を得られなかった（ＫＤ＞５μＭ）。しかしながら、相対的な結合応答の差異は％Ｒｍａｘデータにおいて観察され得る。例えば、ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａバリアントは、ＩｇＧ１．１ｆ、ＩｇＧ１．３ｆまたはＣＴバリアントと比較してｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１についてより強い結合応答を有する（表１１）。対照的に、ＩｇＧ１．１ｆおよびＩｇＧ１．３ｆバリアントは、ＩｇＧ１−Ｄ２６５ＡおよびＣＴバリアントと比較してｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１についてより強い結合応答を有する（表１１）。
【０１２１】
ｄＡｂ−Ｆｃ分子を、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞の架橋を伴う、および伴わない（実施例１に記載される）ｉＤＣアッセイにおいてテストした。これらのデータを図４に示す。３ｈ−５９−２６９−ＣＴ分子は、ＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞を用いて架橋した場合（図４の右側のパネル）でさえ、最大で１００μｇ／ｍｌの濃度において対照のレベルを超えるｉＤＣ活性化を生じなかった（図４の左側のパネル）。しかしながら、ＦｃｇＲ結合を最小化するように設計された変化を伴うドメイン抗体のＦｃ融合物（３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１．１ｆおよび３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１．３ｆ）は、最も高い濃度である１００μｇ／ｍｌでテストされた４人のドナーのうちの少なくとも１人からのＣＤ５４（ＩＣＡＭ１とも呼ばれる）およびＣＤ８６発現の上方制御ならびにサイトカイン放出の増加によって測定される、減少した（未だ測定可能な）ｉＤＣ活性化を示した。架橋を導入するためのＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞の包含は、４人のドナー全員におけるＣＤ８６およびＣＤ５４発現の上方制御によって測定される、頑強なｉＤＣ活性化をもたらした。これらのデータは観察されたｉＤＣ活性化のＦｃｇＲ依存性を示す。
【０１２２】
実施例３：ｄＡｂ−Ｆｃタンパク質の開発可能性の評価
タンパク質治療薬を市場に出すには、一般に化学、製造および品質管理（ＣＭＣ）と呼ばれる開発に適した物理的および化学的特性を持つ分子が必要とされる。分子の物理的および化学的特性（安定性、溶解性および均一性を含む）は、まとめて「開発可能性」とも呼ばれる。タンパク質治療薬の候補分子の開発可能性を評価するための多くの技術およびアッセイが開発されており、その一部には示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、質量分析（ＭＳ）および加速安定性研究が含まれる。
【０１２３】
様々なｄＡｂ−Ｆｃタンパク質の開発可能性を、ＤＳＣ、ｉｃＩＥＦおよび質量分析によって評価した。材料および方法を以下に記載する。
【０１２４】
示差走査熱量測定：ＤＳＣ実験を、ＭｉｃｒｏＣａｌ ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ装置（Malvern Instruments, Malvern, UK）上で１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．１中において実施した。１ｍｇ／ｍｌ ｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体の試料を、１０〜１１０℃の走査範囲および９０℃／時間の走査速度を用いてテストした。ＭｉｃｒｏＣａｌ−Ｏｒｉｇｉｎ ７．０ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１２５】
画像化キャピラリー等電点電気泳動：ｉｃＩＥＦ実験を、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ ｉＣＥ３（商標）システム（ProteinSimple, San Jose, CA）上で実施した。これらの試験のために、通常２ｍｇ／ｍｌの濃度のｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体試料を、２Ｍ尿素、０．３５％メチルセルロース、１％ファルマライト５−８、３％ファルマライト８−１０．５ならびにｐＩマーカー５．８５および１０．１０からなる担体両性電解質混合物とタンパク質の終濃度が０．２０ｍｇ／ｍＬとなるように混合し、１．５ｋＶで１分間の前泳動時間(pre-focusing time)および３ｋＶで１０分間の泳動時間(focusing time)を用いて分析した。
【０１２６】
質量分析：質量分析（ｍａｓｓ ｓｐｅｃ）のために、試料を１００ｍＭ ＤＴＴを用いて還元し、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ（ＦＰＮＧａｓｅＦ）を用いてＮ−脱グリコシル化を行った。使用した液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ）装置は、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標） ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）を備えたＷａｔｅｒｓ Ｓｙｎａｐｔ（登録商標） Ｇ２（Waters Corporation, Milford, MA）であった。ＵＰＬＣカラムは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ（登録商標） ＢＥＨ（エチレン架橋型ハイブリッド粒子）Ｃ４（２．１ｘ１５０ｍｍ、３００Å、１．７ｕｍ粒子）であった。勾配は、２００μＬ／分の流速で１０分間において１０％から３８％（移動相Ｂ）であった。移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸であった。移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。カラムの温度は６０℃であった。データ分析を、Ｗａｔｅｒｓ ＭａｓｓＬｙｎｘ（商標） ソフトウェアを用いて手動で行った；スペクトルのデコンボリューションをＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムを用いて行った。
【０１２７】
加速安定性研究：加速安定性の研究を、最初にｄＡｂ−Ｆｃ分子を標的製剤緩衝液(target formulation buffer)中に４℃で大規模に透析することによって実施した。試料を回収し、アミコン（登録商標）ウルトラ遠心式フィルターユニット（Merck KgaA, Germany）を用いて濃縮し、透析緩衝液で種々の標的濃度に調製した。これらの試料を、一定分量を取り出して分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって分析しながら、様々な温度（通常４℃、２５℃、３２℃および／または４０℃）で数週間インキュベートした。分析用サイズ排除クロマトグラフィーを、Ｓｈｏｄｅｘ（商標） Ｋ４０３−４Ｆカラム（Showa Denko America, Inc., New York, NY）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ １２６０ ＨＰＬＣ上において０．３ｍｌ／分の流速の１００ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．３の移動相で行った。
【０１２８】
結果−示差走査熱量測定：ＤＳＣは、タンパク質の熱安定性を測定するために使用され得る。種々のＦｃドメインとともに構成された３ｈ５６−２６９ ｄＡｂのＤＳＣデータを図５に示す。最適なＴｍ値を表１４にまとめる。
【表１５】
2020521458.tif 000020
【０１２９】
ＩｇＧ Ｆｃドメインの特徴的な熱変性プロファイルに基づいて、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１のＦｃ ＣＨ３ドメインの遷移は、６９．６℃の中間点（Ｔｍ）の値を有する遷移として帰属された；様々なＩｇＧ１分子のＦｃ ＣＨ３ドメインは、約８２〜８３℃のＴｍを伴う遷移として帰属された。ｄＡｂ−ＦｃのｄＡｂドメインおよびＣＨ２ドメインの変性は６５℃未満の遷移に帰属され、これは熱変性の開始（Ｔｏｎｓｅｔ）、アンフォールディング遷移の形状および最適なＴｍ値の全てにおいて種々のコンストラクトの間で異なっていた。例えば、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１のｄＡｂおよびＣＨ２ドメインの熱遷移は、６２．８℃のＴｍ値を有する単一の重複遷移または協同的遷移として生じる。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆのｄＡｂおよびＣＨ２ドメインの変性プロファイルはすべてより非対称な遷移と一致し、これは約５６〜６３℃のＴｍ値を有する２つの遷移によって最もよく説明された。３ｈ５６−２６９−ＣＴは最も低いＴｏｎｓｅｔを有し、約４０℃でアンフォールドが始まり、幅広い熱転移ならびにＴｍ１＝５５．４℃およびＴｍ２＝６０．４℃の最も低い適合したＴｍ値を有していた。
【０１３０】
結果−画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）：画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）は、試料の均一性または不均一性を特徴付けるために使用され得る。均質な製品を生成する能力は、別の重要な開発可能性の基準である。結果として、新規タンパク質治療薬の発見および最適化の際に、様々な分析方法が試料の不均一性を特徴付けおよび定量化し、最も均一な分子を選択するために利用される。
【０１３１】
ｄＡｂ−Ｆｃ分子の電荷プロファイルをｉｃＩＥＦによって特徴付けた。データを図６に示す。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１（図６Ａ）、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆ（図６Ｅ）および３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆ（図６Ｆ）のｉｃＩＥＦプロファイルはすべて比較的単純であり、各プロファイルは６９〜８６％の面積を持つ明確な主要ピークおよびより低い存在量の２〜４つの荷電バリアントからなっている。このｉｃＩＥＦプロファイルは、抗体について得られる典型的なプロファイルに類似している。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａの主要ピーク（図６Ｄ）は存在量が少し低く（４９％）、少なくとも６種類の検出可能な種を含む対応するより高いレベルの酸性バリアントを伴っている。対照的に、３ｈ５６−２６９−ＣＴのプロファイル（図６Ｂ）は非常に不均一であり、少なくとも１６種からなり、明確な主要ピークは存在しない。異なる細胞株（ＵＣＯＥ−ＣＨＯ）に発現させた３ｈ５６−２６９−ＣＴのｉｃＩＥＦプロファイルは同様に不均一であった（図６Ｃ）が、荷電バリアントの分布はＨＥＫ２９３に発現させたものとはかなり異なっていた。
【０１３２】
結果−質量分析：ＩｇＧまたはＦｃ含有タンパク質のＦｃドメイン上の典型的なグリコシル化は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびいくつかのＧ２Ｆ種の混合物である。他のグリコフォーム（シアル化または非フコシル化など）は一般に、非常に低い存在量または検出できないレベルで見出される。
【０１３３】
ｄＡｂ−Ｆｃタンパク質のグリコシル化プロファイルを特徴付け、ｄＡｂ−Ｆｃタンパク質を類似のＦｃ変異を持つ対照抗体と比較するために、質量分析実験を行った。データを表１５に示す。
【表１６】
2020521458.tif 000021
【０１３４】
対照抗体１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆおよび１Ｆ４−ＩｇＧ１．３ｆ、ならびにｄＡｂ−Ｆｃ抗体３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４．１、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．１ｆ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１．３ｆの質量分析データは、これらのタンパク質がより低い存在量のＧ２Ｆ種を含むＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆグリコフォームの典型的な混合物からなることを示した。
【０１３５】
ＦｃドメインにＤ２６５Ａ変異を含むｄＡｂ−Ｆｃおよび抗体分子はともに、Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ種の混合物を含んでいたが、より高いレベルのシアル化グリコフォームをさらに有していた。これらのＤ２６５Ａ分子はすべて、標準的なＰＮＧａｓｅ酵素処理プロトコルを用いて脱グリコシル化され得る；このデータは、Ｎ結合型であり、Ｆｃドメインの共通するＡｓｎ２９７残基を占めるＤ２６５Ａ分子のグリカンと一致する。
【０１３６】
対照的に、ＨＥＫ２９３細胞もしくはＵＣＯＥ−ＣＨＯ細胞のいずれかにおいて発現された３ｈ５６−２６９−ＣＴまたは対照１Ｆ４−ＣＴ抗体の質量分析データは、多数の異なる複合的にグリコシル化された種（高度にシアル化された種を含む）の証拠を伴って、これらのタンパク質が非常に不均一であったことを明らかにした。３ｈ５６−２６９−ＣＴのデータを表１６に示す。
【表１７−１】
2020521458.tif 000022
【表１７−２】
2020521458.tif 000023
【０１３７】
対照１Ｆ４−ＣＴ抗体の質量分析データを表１７に示す。
【表１８】
2020521458.tif 000024
【０１３８】
さらに、３ｈ５６−２６９−ＣＴおよび１Ｆ４−ＣＴ分子は、ＰＮＧａｓｅでの処理によって効果的に脱グリコシル化できなかった；これらの結果は、複合グリカン(complex glycan)の少なくともいくつかがＳｅｒまたはＴｈｒ残基におけるＯ結合型であったことを示唆している。これらのデータは、同一の改変ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ変異を含む）を含むアバタセプトの既知のグリコシル化と一致する。アバタセプトでは、導入されたこれらのＳｅｒ変異がヒンジ領域のＯ結合型グリコシル化部位であることが示されており、これが不均一にグリコシル化され、シアル酸種が多くなっている。
【０１３９】
結果−加速安定性研究：３ｈ５６−２６９−ＣＴはＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞の架橋の非存在下または存在下のいずれにおいてもｉＤＣアッセイで応答を示さなかった唯一のｄＡｂ−Ｆｃ分子であったため、３ｈ５６−２６９−ＣＴをさらなる開発可能性の評価を含むさらなる研究のために選択した。特に、安定性研究を、３２℃および４０℃ならびに４℃および２５℃の低温での加速ストレス条件下で行った。これらの研究の製剤緩衝液（２０ｍＭリン酸カリウム、２５０ｍＭスクロース、５０μＭ ＤＴＰＡおよび０．０５％ＰＳ８０、ｐＨ７．０）を、好ましい熱安定性（Ｔｍ）および凝集の開始（Ｔａｇｇ）を与える条件を特定するためにＵＮｉｔプラットフォーム（Unchained Labs, Woburn, MA）を用いた分子の熱安定性のスクリーニングに基づいて選択した。精製した３ｈ５６−２６９−ＣＴタンパク質をこの製剤バッファーに透析により交換し、５０ｍｇ／ｍｌまたは１５０ｍｇ／ｍｌの終濃度に濃縮および調製し、様々な温度で４週間インキュベートした。タンパク質の物理的安定性を評価するために、種々の温度でのインキュベーションを開始した後、時間ゼロ（ｔ０）、１週間後（１ｗ）および４週間後（４ｗ）において一定分量を取り出した。試料を分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ａＳＥＣ）によって分析し、単量体タンパク質、高分子量凝集体（ＨＭＷ）および低分子量種（ＬＭＷ）のレベルを決定した。ＨＭＷデータを表１８に示す。
【表１９】
2020521458.tif 000025
【０１４０】
ａＳＥＣデータは、特により高いタンパク質濃度およびより高い温度における３ｈ５６−２６９−ＣＴの高レベルのＨＭＷ形成を示した。
【０１４１】
実施例４：Ｆｃドメインバリアント
実施例１および２に示されるように、３ｈ５６−２６９−ＣＴ分子は有利なことに、（特に低親和性ＦｃｇＲ（ｈＣＤ３２ａ、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ、ｈＣＤ１６ｂ）に対して）有利に弱いＦｃｇＲ結合を有することが見出され、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞架橋を含むｉＤＣアッセイにおける応答の欠如が示された。しかしながら、実施例３に示されるように、３ｈ５６−２６９−ＣＴの生物物理学的特徴は、この分子が低い熱安定性、高い不均一性および低い物理的安定性を有していることを示した。したがって、Ｏ結合型グリカンの減少または排除、シアル酸含有量の減少または排除、不均一性の減少、ならびに熱安定性および物理的安定性の改善を目的として、有利に弱いＦｃｇＲ結合およびｉＤＣアッセイにおけるシグナルの欠如を維持しながら３ｈ５６−２６９−ＣＴ分子を改善する取り組みを開始した。
【０１４２】
３ｈ５６−２６９−ＣＴの生物物理学的特徴の改善を試みるために、一連の変異体ｄＡｂ−Ｆｃ分子を設計し、個々のＣ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ変異の３ｈ５６−２６９−ＣＴの特性への寄与を理解することを試み、望ましい弱いＦｃｇＲ結合およびＦｃ介在性シグナル伝達の欠如から望ましくない開発可能性の課題を分離することを試みた。変異の戦略は、２２０、２２６、２２９および２３８位（Ｋａｂａｔの番号付け）でのいくつかのバリアントの設計を含んでいた。以下のバリアントを設計した：
【０１４３】
ａ）２２０、２２６、２２９および２３８位における単一および組合せのＳｅｒ変異体のセットであって、これらの変異の個々の効果および組合せの効果をテストするための変異体のセット。表１９の配列番号８８〜９６参照。下線が引かれた配列は、抗ＣＤ４０単一可変ドメインである。
【表２０−１】
2020521458.tif 000026
【表２０−２】
2020521458.tif 000027
【０１４４】
ｂ）Ｏ結合型グリコシル化の主要部位および分子特性への影響を同定するための、２２６、２２９および２３８位の単一および組合せのＡｌａ変異体または組合せのＡｌａおよびＳｅｒ変異体のセット。Ｓｅｒ変異と同様に、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９のＡｌａ変異はジスルフィド結合の形成を妨げることが予想される。しかしながら、Ｓｅｒとは異なり、Ａｌａ残基はＯ結合型グリコシル化の部位ではない。表２０の配列番号９７〜１０９参照。
【表２１−１】
2020521458.tif 000028
【表２１−２】
2020521458.tif 000029
【表２１−３】
2020521458.tif 000030
【０１４５】
ｃ）リジンに変異させたＰ２３８（Ｐ２３８Ｋ）を有する変異体のセットを、より下流のヒンジ領域のこの位置における非保存的な正に帯電した残基によってＦｃｇＲ結合親和性が減少し得るか否かをテストするために設計した。表２１の配列番号１１０〜１１６参照。
【表２２−１】
2020521458.tif 000031
【表２２−２】
2020521458.tif 000032
【０１４６】
ｄ）ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｆアロタイプの両方に関して、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ変異（「ＬＡＬＡ」と略される）を含むｄＡｂ−Ｆｃ分子を作成した。表２２の配列番号１１７〜１１８参照。
【表２３】
2020521458.tif 000033
【０１４７】
ｅ）ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｆアロタイプの両方に関して、単一のＮ２９７Ａ変異を含むｄＡｂ−Ｆｃ分子を作成した。表２３の配列番号１１９〜１２０参照。
【表２４】
2020521458.tif 000034
【０１４８】
ｄＡｂ−Ｆｃバリアントに加えて、関連するＦｃ変異体のより小さなセットを設計し、完全ＩｇＧに関する類似の変異が特性にｄＡｂ−Ｆｃの構成と同様の影響をもたらすか否かを決定した。全てのＩｇＧバリアントを、対照１Ｆ４抗体の可変ドメインを用いて生成した。これらのバリアントの重鎖の配列を表２４に示す。可変領域およびＣＨ１領域を含む１Ｆ４重鎖の部分の配列（配列番号８０）をイタリック体で示す。これらの各バリアント１Ｆ４モノクローナル抗体について、軽鎖配列は配列番号８１であった（表７参照）。バリアントは以下を含んでいた。
【０１４９】
ａ）単一および二重Ｃ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓバリアント。表２４の配列番号１２１〜１２３参照。
【０１５０】
ｂ）単一および二重Ｃ２２６ＡおよびＣ２２９Ａバリアント。表２４の配列番号１２４〜１２６参照。
【０１５１】
ｃ）Ｐ２３８ＳおよびＰ２３８Ｋバリアント。表２４の配列番号１２７〜１２８参照。
【０１５２】
ｄ）Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ三重変異体をＩｇＧ１ｆアロタイプに関してテストした。表２４の配列番号１２９参照。
【０１５３】
ｅ）Ｎ２９７Ａ変異をＩｇＧ１ｆアロタイプに関してテストした。表２４の配列番号１３０参照。
【表２５−１】
2020521458.tif 000035
【表２５−２】
2020521458.tif 000036
【表２５−３】
2020521458.tif 000037
【０１５４】
各１Ｆ４ ｍＡｂバリアントの重鎖配列および軽鎖配列の対を表２５に示す。
【表２６】
2020521458.tif 000038
【０１５５】
全ての１Ｆ４−ＩｇＧバリアントを、抗体軽鎖のＣ末端Ｃｙｓ残基と対となるように未変化の野生型Ｃｙｓ２２０残基を伴って生成した。
【０１５６】
実施例５：バリアントＦｃドメインを含む１Ｆ４対照抗体の特徴付け
Ｆｃを改変した１Ｆ４抗体分子のＦｃｇＲ結合特性を特徴付けるために、実施例２に記載されるように１μＭまたは１０μＭの精製された抗体分析物と抗Ｈｉｓに捕捉されたＦｃｇＲ表面との結合をテストすることにより、ＳＰＲ実験を行った。結合応答を分析し、％Ｒｍａｘ値によって示した；結果を表２６に示す。
【表２７】
2020521458.tif 000039
【０１５７】
これらのデータは、ヒンジ領域の２２６位（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓ）または２２９位（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２９Ｓ）における単一のＣｙｓ→Ｓｅｒ変異が、野生型ＩｇＧ１ｆ抗体（１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆ）と比較してＦｃｇＲ結合に対してわずかな影響しか与えないことを示す。Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ二重変異体（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓ−Ｃ２２９Ｓ）は、すべての低親和性ＦｃｇＲタンパク質に対して有意に弱い結合応答を有する；しかし、この結合応答は１Ｆ４−ＣＴ分子の結合応答よりも有意に強い。これらのデータは、１Ｆ４−ＣＴ分子の追加のＰ２３８Ｓ変異がＦｃｇＲ結合の減少にさらに寄与していることを示唆する。
【０１５８】
単一のＣ２２６Ａ（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ａ）またはＣ２２９Ａ（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２９Ａ）変異体は、単一のＣ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異体と同様にＦｃｇＲに結合した；同様に、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ二重変異体（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ａ−Ｃ２２９Ａ）は、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ二重変異体（１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓ−Ｃ２２９Ｓ）と同様にＦｃｇＲに結合した。これらの部位におけるＡｌａ変異は、これらの部位におけるＳｅｒ変異と同様に重鎖間ジスルフィド結合の形成を妨げる。しかし、Ｓｅｒ変異とは異なり、Ａｌａ変異はＯ−グリコシル化部位ではない。したがって、これらのデータは、Ｓ２２６および／またはＳ２２９でのＯ−グリコシル化がＦｃｇＲ結合にあまり影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１５９】
Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａバリアント（それぞれ１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋおよび１Ｆ４−Ｎ２９７Ａ）は低親和性ＦｃｇＲに対して最も弱い結合応答を示し、これはｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８またはｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２に対して検出可能な結合シグナルが本質的に存在しないことを示す。１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋバリアントは１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｓバリアントよりも弱いＦｃｇＲ結合を示し、これは２３８位のＬｙｓがその位置のＳｅｒよりもＦｃｇＲ結合の破壊に効果的であることを示唆している。さらに、ＳＰＲセンサーグラムデータは、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａおよび１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８ＫのｈＣＤ６４への結合の解離速度が１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆまたは１Ｆ４−ＣＴよりも有意に速いことを示した。図７参照。
【０１６０】
Ｆｃバリアント１Ｆ４抗体の熱安定性を、実施例３に記載されるようにＤＳＣによって特徴付けた。熱的遷移を、ＩｇＧ分子の十分に特徴付けられた熱変性プロファイルに基づいてＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはＦａｂドメインのいずれかに割り当てた。最適なＴｍ値を表２７にまとめる。
【表２８】
2020521458.tif 000040
【０１６１】
１Ｆ４抗体のＦａｂドメインは、７１．６℃〜７４．７℃の適切なＴｍを有する。全ての分子のＣＨ３ドメインは８２．１℃〜８３．１℃で融解し、これは野生型（未改変）ＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインに典型的である。ＣＨ２ドメインは抗体の最も安定性が低いドメインであり、融解温度は種々の変異体で異なっており、これはヒンジ／ＣＨ２領域の変異がＣＨ２の熱安定性に影響を与えることを示唆した。１Ｆ４−ＣＴｆ（５４．３℃）および１Ｆ４−ＣＴ（５５．１℃）のＣＨ２ドメインのＴｍ値は１℃未満で異なっており、これはＩｇＧ１アロタイプがＣＨ２ドメインの熱安定性にわずかな影響しか与えないことを示唆した。しかしながら、これらのＣＨ２ドメインは、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆの野生型ＣＨ２ドメイン（７２．２℃）と比較して著しく（約１７〜１８℃）不安定化した。これらのデータは、３ｈ５６−２６９−ＣＴのＣＨ２／ｄＡｂドメインで観察された低い熱安定性と一致する。
【０１６２】
ヒンジ領域に単一のＣｙｓ→Ｓｅｒ変異を有するＦｃ変異体は、野生型ＩｇＧ１ｆと比較してＣＨ２ドメインの安定性が少し低く、ＣＨ２ドメインのＴｍ値は１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓで７０．３℃、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２９Ｓで６９．９℃であった。両方のヒンジＣｙｓ残基のＳｅｒへの変異は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳのＣＨ２ドメインのＴｍを６４．８℃にさらに減少させた。単一のＰ２３８Ｓ変異は、野生型１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆと比較してＣＨ２ドメインの安定性を減少させた（６２．４℃）。したがって、これらのデータは、１Ｆ４−ＣＴの３つの個々の変異のいずれかが単独でＣＨ２ドメインの低い安定性に関与しているのではなく、３つ全ての変異（Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｐ２３８Ｓ）の組合せがＣＨ２ドメインの著しい不安定化をもたらすことを示している。
【０１６３】
ヒンジ１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ａおよび１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２９Ａの単一のＣｙｓ→Ａｌａ変異体は、これらの位置のＣｙｓ→Ｓｅｒ変異体とほとんど同じＣＨ２ドメインのＴｍ値を有し、二重変異体１Ｆ４−Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａは、Ｃｙｓ→Ｓｅｒ二重変異体１Ｆ４−Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳのＣＨ２ドメインのＴｍよりも少し（１．２℃）安定なＣＨ２ドメインのＴｍを有する。１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８ＫのＣＨ２ドメイン（Ｔｍ＝６４．０℃）は、この位置のＳｅｒ変異体１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｓ（Ｔｍ＝６２．４℃）よりも１．６℃安定である。
【０１６４】
試料の不均一性に対するヒンジ／Ｆｃ変異の影響を決定するために、１Ｆ４−ＩｇＧ分子を実施例３に記載されるようにｉｃＩＥＦによって特徴付けた。１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆタンパク質のｉｃＩＥＦプロファイルはモノクローナルＩｇＧ１抗体に典型的であり、７９．７％の存在量の主要ピークおよびはるかに低い存在量の約２〜４つの酸性または塩基性バリアントを有していた。図８参照。ＣＴ Ｆｃドメイン（３ｈ５６−２６９−ＣＴ）を有するドメイン抗体と同様に、１Ｆ４−ＣＴ分子のｉｃＩＥＦプロファイルは不均一であり、少なくとも８つの異なる荷電バリアントからなり、明確に優位な種は存在しなかった。この不均一性は、上述のように、質量分析によって観察されたグリカンの不均一性（表１７）に関連している可能性がある。
【０１６５】
二重Ｃｙｓ→Ｓｅｒバリアント１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳのｉｃＩＥＦデータは１Ｆ４−ＣＴ分子のデータと類似しており、明確な主要ピークのない多数の異なる荷電バリアントの存在を示した。単一変異体Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓのデータはすべて１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆに類似した複雑さであった。これらのデータは、ヒンジ／Ｆｃ領域の高レベルのＯ結合型シアル化グリコシル化にはＣ２２６ＳとＣ２２９Ｓの両方の変異が必要であり、これらの変異は重鎖ヒンジ間(inter heavy chain hinge)のジスルフィド結合をともに破壊することを示唆する。
【０１６６】
１Ｆ４−ＩｇＧ１．３ｆ、１Ｆ４−Ｎ２９７Ａ、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋならびにそれぞれの単一および二重Ａｌａ変異体のｉｃＩＥＦデータは、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆのｉｃＩＥＦデータに類似した均一性を示し、それぞれは少量の約２〜３つの酸性または塩基性バリアントを伴う６２〜８０％の存在量の主要ピークからなっていた。
【０１６７】
まとめると、ｉｃＩＥＦデータは、ヒンジＣｙｓ２２６残基およびＣｙｓ２２９残基の両方をＳｅｒに変異させた全ての分子が他のバリアントよりも有意に高い不均一性を有することを示す。
【０１６８】
対照抗体データの概要：
１Ｆ４−ＩｇＧ分子のＳＰＲ、ＤＳＣ、ｉｃＩＥＦおよび質量分析データは、ＣＴ ＦｃドメインのＦｃｇＲ結合、熱安定性および不均一性に対するＣ２２６、Ｃ２２９およびＰ２３８変異の役割に関する洞察を与える。
【０１６９】
単一のヒンジＣ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓ変異体は、熱安定性がわずかに低下し、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆに類似した不均一性およびＦｃｇＲ結合を示したが、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓヒンジ二重変異体は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆと比較して熱安定性の著しい低下、不均一性の増加、およびＦｃｇＲ結合の低下を示した。単一のＰ２３８Ｓ変異は、熱安定性およびＦｃｇＲ結合の低下に対してＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ二重変異体に類似した影響を与えたが、不均一性は増加しなかった。完全な１Ｆ４−ＣＴ分子を産生するためのＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓヒンジ変異とＰ２３８Ｓの組合せは、単独のＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓに類似した不均一性を示したが、熱安定性およびＦｃｇＲ結合をさらに低下させた。まとめると、これらのデータは、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ変異プラスＰ２３８Ｓの組合せが野生型Ｆｃと比較した熱安定性の低下およびＦｃｇＲ結合の低下にそれぞれ寄与していることを示唆し、Ｏ結合型グリコシル化の主要な部位が変異ヒンジＳ２２６およびＳｅｒ２２９残基上にあることを示唆する。
【０１７０】
ヒンジ領域の２２６位および２２９位の単一および二重Ｃｙｓ→Ａｌａ変異は、それらの部位のＣｙｓ→Ｓｅｒ変異体に類似した熱安定性およびＦｃＲ結合を示す。しかしながら、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ変異体はＳｅｒ残基上のＯ結合型グリコシル化部位を持たず、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ変異体で観察された高い不均一性は示さない。これは、ヒンジ領域のＯ結合型グリコシル化がＦｃｇＲ結合にあまり影響を及ぼさないことを示唆する。
【０１７１】
１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ変異体は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｓよりも弱いＦｃｇＲ結合を示したが、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｓと比較して類似した不均一性および優れた熱安定性を有していた。１Ｆ４−ＣＴ分子と比較して、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋは、弱いＦｃｇＲ結合、改善された熱安定性および優れた均一性を示した。したがって、単一のＰ２３８Ｋ変異は意外にも、このヒンジ／Ｆｃバリアントのセットを設計する場合に望まれる３つの特性（１Ｆ４−ＣＴと比較して、同等または弱いＦｃｇＲ結合、優れた熱安定性および低下した不均一性）すべてを提供した。
【０１７２】
１Ｆ４−Ｎ２９７Ａ分子は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆと比較してＣＨ２ドメインの低い熱安定性および弱いＦｃｇＲ結合を示し、これはＮ２９７Ａ変異を含む他のＩｇＧ１抗体についての文献報告と一致する特性である。１Ｆ４−Ｎ２９７Ａの均一性は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆに類似していた。
【０１７３】
全体として、最も弱いＦｃｇＲ結合を示した１Ｆ４−ＩｇＧ分子は、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ、１Ｆ４−Ｎ２９７Ａおよび１Ｆ４−ＣＴ分子であった。これらのうち、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋおよび１Ｆ４−Ｎ２９７Ａは、１Ｆ４−ＣＴと比較して優れた熱安定性および均一性を有し、１Ｆ４−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋは１Ｆ４−Ｎ２９７Ａよりも優れた熱安定性を有していた。結果として、Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａアイソタイプをさらなる特徴付けのリードとして選択した。
【０１７４】
実施例６：バリアントＦｃドメインを含むｄＡｂ−Ｆｃ抗体の特徴付け
１Ｆ４−ＩｇＧ分子のＦｃｇＲ結合のＳＰＲ、ＤＳＣ、ｉｃＩＥＦおよびＭＳデータは、実施例５において議論されたように、ＦｃｇＲ結合、安定性および不均一性に寄与するＣＴアイソタイプの領域および変異に関する多くの洞察を与えた。したがって、これらのデータを用いて、ＦｃｇＲ結合のＳＰＲによるスクリーニングについて、小規模の発現上清としての発現のためにｄＡｂ−Ｆｃアイソタイプバリアントのサブセットに優先順位を付けた。
【０１７５】
例えば、１Ｆ４抗体のＰ２３８ＫおよびＮ２９７Ａ単一変異体は、ＣＴアイソタイプ分子よりも優れた熱安定性および均一性を維持しながら、有利に弱いＦｃｇＲ結合特性を示した。したがって、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａ分子をｄＡｂ−Ｆｃ分析に含めた。
【０１７６】
さらに、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ二重変異体と比較したＣ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ二重変異体の優れた均一性、類似の熱安定性およびＦｃｇＲ結合特性は、Ｐ２３８ＳまたはＰ２３８Ｋと組み合わせたＣ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ二重変異体が、Ｃ２２６、Ｃ２２９をそれぞれＳｅｒに変異させた結果としての高い不均一性およびＯ結合型グリカンを有することなく、望ましい弱いＦｃｇＲ結合を有し得る可能性を高める。結果として、バリアント（すなわち、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋバリアント）をさらなる調査のために選択した。
【０１７７】
１Ｆ４−ＩｇＧ１分子のＣ２２０残基は、抗体の軽鎖との天然のジスルフィド結合を保証するために野生型Ｃｙｓとして保持されていたため、２２０位の変異の影響は１Ｆ４−ＩｇＧ分子に関して調べていなかった。しかし、ｄＡｂ−Ｆｃ抗体ポリペプチドは軽鎖を持たないため、Ｃ２２０残基は遊離Ｃｙｓを形成するか、または別の遊離Ｃｙｓ（パートナーのｄＡｂ−Ｆｃ鎖のＣ２２０残基など）と潜在的なジスルフィド結合を形成するかのいずれかである。したがって、分子のＦｃｇＲ結合特性に対するこの位置での変異の影響を決定するために、ｄＡｂ−Ｆｃバリアント解析にＣ２２０変異体のサブセットを含めた。
【０１７８】
比較のために、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）二重変異体を、ＩｇＧ１ａおよびＩｇＧ１ｆアロタイプの両方に関して作成した。
【０１７９】
上述の方法に加えて、本実施例で用いた方法は以下を含む。
【０１８０】
ＣＤ４０Ｌにより誘導されたヒトＢ細胞増殖の阻害：ヒト扁桃Ｂ細胞を通常の扁桃摘出術中に小児患者から取得し、組織を細かく刻み、穏やかにすりつぶし、細胞をスクリーンに通し、ヒトLympholyte（登録商標）-H separation media (Cedarlane Labs, Burlington, ON)を用いた密度勾配分離により単核細胞を単離することによって単離した。単核細胞を界面から回収し、洗浄し、ヒツジ赤血球(SRBC, Colorado Serum Company; Denver, CO)とともに４℃で１時間ロゼット形成させた後、Ｔ細胞を除去するために密度勾配分離を行った。細胞を再度洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ（完全培地）に再懸濁した。抗体の滴定を完全培地中で行い、９６ウェル丸底（ＲＢ）プレートに３通りずつ添加した。１Ｘ１０５個のヒト扁桃Ｂ細胞を添加し、可溶性ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ（２μｇ／ｍＬ）、または１０，０００ｒａｄで照射したヒトＣＤ４０Ｌを安定にトランスフェクトしたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ｈＣＤ４０Ｌ）のいずれかで刺激し、各ウェルの最終容量が２００μＬとなるように２Ｘ１０３細胞／ウェルでプレーティングした。プレートを３７℃および５％ＣＯ２で７２時間インキュベートし、ウェルあたり０．５μＣｉの３［Ｈ］−チミジンで最後の６時間標識し、採取し、液体シンチレーションで計数した。Ｂ細胞増殖をチミジンの取り込みに基づいて定量化した。
【０１８１】
結果−ＳＰＲ：実施例２に記載されるように、選択したｄＡｂ−Ｆｃバリアントを小規模の上清として発現させ、固定化されたプロテインＡビアコア（商標） ＳＰＲセンサーチップ表面上に捕捉し、精製したＦｃｇＲ分析物（μＭ）との結合をテストした。データを表２８に示す。
【表２９】
2020521458.tif 000041
【０１８２】
３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０ＳバリアントのＦｃｇＲ結合のＳＰＲデータは３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａに類似しており、これはＣ２２０Ｓ変異がＦｃｇＲ結合にわずかな影響しか与えないことを示唆した。しかしながら、この変異は製造中または保存期間中の不均一性のリスクになり得る潜在的な反応性チオール基を除去するため、ｄＡｂ−Ｆｃの形式における開発可能性の観点から好ましい場合がある。
【０１８３】
他のｄＡｂ−Ｆｃ分子のＦｃｇＲ結合のＳＰＲデータは、１Ｆ４−ＩｇＧバリアントのデータとよく一致していた。例えば、Ｐ２３８ＫまたはＮ２９７Ａを含む全てのバリアントは野生型と比較して弱いｈＣＤ６４との結合を示し、他の全てのＦｃｇＲとの結合は本質的に検出できなかった。Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａバリアントは３ｈ５６−２６９−ＣＴよりも弱いｈＣＤ６４結合を示し、これは類似の１Ｆ４−ＩｇＧバリアントについて観察されたものと類似していた。１Ｆ４−ＩｇＧバリアントと同様に、単一のＰ２３８Ｓ変異またはＣ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ二重変異はＦｃｇＲ結合を低下させたが、これら３つの変異の組合せ（３ｈ５６−２６９−ＣＴ）よりも低下させなかった。また、両方のヒンジＣｙｓをＡｌａに変異させた変異体（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ）は、ヒンジＣｙｓからＳｅｒへの二重バリアント（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ）に類似したＦｃｇＲ結合を示した。Ｐ２３８Ｓ変異の追加により、１Ｆ４−ＩｇＧ分子で観察されたものに類似して、ＦｃｇＲ結合がさらに低下した（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓ）。
【０１８４】
テストされたＬＡＬＡバリアントは、特に野生型と比較して著しく低下したＦｃｇＲ結合を有し、テストされたあらゆるバリアントで最も弱いｈＣＤ６４結合を示した。しかしながら、これらは３ｈ５６−２６９−ＣＴまたはＰ２３８ＫもしくはＮ２９７Ａ分子のいずれよりも強いｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８結合を示した。
【０１８５】
ｄＡｂ−Ｆｃ上清を用いて得られたＳＰＲデータに基づいて、低親和性ＦｃｇＲへの結合が最も弱いｄＡｂ−Ｆｃバリアントを精製およびさらなる特徴付けのために選択した。これらのバリアントには、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａが含まれる。４つの分子すべてがＳＰＲを用いてＣＤ４０標的に高い親和性で結合することが示された。データを表２９に示す。
【表３０】
2020521458.tif 000042
【０１８６】
精製したｄＡｂ−ＦｃのＦｃｇＲへの結合を、実施例２に記載されるようにＳＰＲによって評価した。ｄＡｂ−ＦＣおよび１Ｆ４抗体対照のデータを表３０に示す。
【表３１】
2020521458.tif 000043
【０１８７】
（１Ｆ４抗体対照を伴う）精製したｄＡｂ−ＦｃのＳＰＲデータはｄＡｂ−Ｆｃ上清のデータと一致しており、これはＣＴ、Ｎ２９７ＡおよびＰ２３８Ｋバリアントが低親和性ＦｃｇＲとの結合が最も弱いことを示している。表３０参照。この傾向は、１Ｆ４抗体とｄＡｂ−Ｆｃ形式の両方で一貫している。実際、ｄＡｂ−Ｆｃ形式では、テストされた最も高い濃度において、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ、および３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａのすべてが、３ｈ５６−２６９−ＣＴよりもさらに弱いＦｃｇＲ結合応答を示した。
【０１８８】
結果−ｉＤＣ活性化：３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ分子を、実施例１に記載されるように単独で、またはＣＤ３２介在性クラスター形成／架橋を伴ってｉＤＣを活性化する能力について調べた。このデータは、ＩｇＧ１ Ｆｃ尾部のこれらの変異があらゆるｉＤＣ活性化を除去し得、これらのｉＤＣ活性化アッセイにおいて抗ＣＤ４０ ｄＡｂ−Ｆｃ分子を不活性にし得ることを示す。図９参照。サイトカイン産生ならびにＣＤ８６およびＣＤ５４の上方制御によって測定されるｉＤＣの活性化は、単独の融合タンパク質またはＣＤ３２介在性クラスター形成を伴う融合タンパク質のいずれにおいても観察されず、これはこれらの変異が免疫活性化の可能性がないＣＤ４０アンタゴニストを生成する可能性を強調した。これらの同一のドナーでは、３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ４．１単独で刺激した場合にテストされた６つの試料のうち２つのｉＤＣにおいて、およびＣＤ３２介在性クラスター形成／架橋を含んでいた場合に６つのドナーすべてのｉＤＣにおいて、ｉＤＣ活性化の少なくとも１つの測定値のわずかな増加が観察された。
【０１８９】
結果−ＣＤ４０Ｌにより誘導されたヒトＢ細胞増殖の阻害：種々のＦｃ尾部を持つ融合タンパク質の異なる活性にもかかわらず、これらの変化は免疫細胞（Ｂ細胞など）のＣＤ４０Ｌ介在性の活性化を阻害する能力に影響を与えない。これは、３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ融合物の活性によって例示される。可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体およびＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞で刺激したＢ細胞増殖はともに、３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１−Ｐ２３８Ｋまたは３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１−Ｎ２９７Ａによって同様に強力に阻害される（表３１）。
【表３２】
2020521458.tif 000044
【０１９０】
結果−ＤＳＣ：低いＦｃｇＲ結合を示した精製した４つのｄＡｂ−Ｆｃの熱安定性を、実施例３に記載されるようにＤＳＣによって特徴付けた。以前に特徴付けられたＩｇＧ１型ｄＡｂ−Ｆｃ分子と同様に、４つの新たな分子すべてがヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＣＨ３ドメインに特徴的な８３℃付近の遷移を示し、より低い温度の遷移がｄＡｂおよびＣＨ２ドメインに帰属されている。これらのデータは表３２である。図１１も参照。
【表３３】
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【０１９１】
３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋバリアントの両方のより低い温度遷移は、約４０℃付近の低いＴｏｎｓｅｔ、および５５．７〜５５．８℃のＴｍ１値を伴う幅広いアンフォールディング遷移を有し、これは３ｈ５６−２６９−ＣＴについて観察された以前のデータに類似していた。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａの熱安定性は、約５０℃付近のＴｏｎｓｅｔ、ならびに６０．５℃（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａ）および６１．５℃（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋ）のＴｍ１値を伴って非常に良好であった。
【０１９２】
結果−加速安定性研究：ｄＡｂ−Ｆｃ分子の物理的安定性を加速ストレス条件下で研究した。最初に、４つの最適化された新たなバリアント（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋ、および３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａ）の物理的安定性を元の３ｈ５６−２６９−ＣＴ分子と直接比較する研究を行った。ここでは、試料を２０ｍＭ酢酸、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ５．０中に１５ｍｇ／ｍｌで調製し、４０℃で４週間インキュベートした。一定分量を研究の開始時（時間ゼロ、ｔ０）、１週間目および４週間目に取り出し、分析用ＳＥＣ分析（ａＳＥＣ）にかけた。データを表３３に示す。
【表３４】
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【０１９３】
これらのデータは、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ、および３ｈ５６−２６９−ＣＴについてＨＭＷ種の大幅な増加（例えば、０．５％から１３％を超える増加）を示し、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａについてわずかな増加（例えば、０％から１．２％）を示した。
【０１９４】
最適化された４つのｄＡｂ−Ｆｃタンパク質の物理的安定性をさらに比較するため、より高い濃度で第２の試験を行った。試料を２０ｍＭ酢酸、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ５．０中で、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｋ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａについて７０ｍｇ／ｍｌに、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓについて３０ｍｇ／ｍｌに調製し（後者の試料は、低い発現レベルおよび精製後の低い収率に起因する材料の制限のために低い濃度であった）、４０℃、２５℃または冷蔵温度（４℃）のいずれかで４〜１２週間インキュベートし、一定分量を様々な時点で取り出し、分析用ＳＥＣ分析にかけた。データを表３４に示す。
【表３５】
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【０１９５】
これらのデータは、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａと比較して、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８Ｓおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ａ、Ｃ２２９Ａ、Ｐ２３８ＫのＨＭＷ種の大幅な増加からはるかに大幅な増加を示した。ＨＭＷの増加は、テストした３つの各温度において、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ａ−Ｃ２２０Ｓ、Ｐ２３８Ｋおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｃ２２０Ｓ、Ｎ２９７Ａで類似していた。
【０１９６】
ＦｃｇＲ結合特性を変化および増強させる（野生型ＩｇＧ１ｆ Ｆｃドメインを含むもの（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ）を含む）か、またはｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびｈＣＤ３２ｂとの結合を増強させるさらなる点変異（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｓ２６７Ｅ）もしくはｈＣＤ３２ｂに対する特異性を増強させるさらなる点変異（３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ−Ｇ２３７Ｄ、Ｐ２３８Ｄ、Ｈ２６８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ａ３３０Ｒ、これは３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｖ１１とも呼ばれる）を持つさらなる対照ｄＡｂ−Ｆｃ分子を生成した。表３５の配列１３１〜１３３参照。
【表３６】
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【０１９７】
これらのｄＡｂ−ＦｃをＳＰＲを用いてヒトＦｃｇＲへの結合について調べた。このデータは予想される結合特異性を示した。表３６参照。
【表３７】
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【０１９８】
３ｈ−５９−２６９−ＩｇＧ１−Ｖ１１、３ｈ−５９−２６９−Ｓ２６７ＥのｉＤＣ活性化データは、ＣＤ３２発現ＣＨＯ細胞の非存在下および存在下の両方において、テストした全ての濃度で頑強なｉＤＣ活性化を示す。図１０参照。免疫細胞の活性化を調整する能力は３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１ｆ融合物の活性によって示され、これはＣＤ３２介在性の架橋の非存在下においてわずかな活性化のみを示し、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞を伴って増加する。図１０参照。
【０１９９】
本実施態様は上記の実施例を参照して詳細に説明されているが、様々な改変がこれらの実施態様の精神から逸脱することなく行われ得、当業者には容易に知られることが理解される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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