(57)【要約】  本開示は、対象において角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、反応混合物を含み、反応混合物は、変異ＴＧＦＢＩヌクレオチド配列を含む１つ以上の標識プローブを含み；反応混合物は、対象由来の生体試料からのＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するための少なくとも１つの増幅プライマー対をさらに含み；ＴＧＦＢＩ遺伝子における、Ｇ６２３Ｄ、Ｍ５０２Ｖ、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒ変異からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を検出するステップであって、検出するステップが、標識検出プローブを使用して、１つ以上の変異を検出することを含む、ステップを含む、方法を提供する。反応混合物を含む反応キットがさらに提供される。
2020516280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において角膜ジストロフィーを検出するための反応混合物であって、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列を含む標識プローブを含む、反応混合物。
【請求項２】
配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列を含む、対応する標識プローブをさらに含む、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
前記標識プローブが、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列からなり、および／または前記対応する標識プローブが、配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列からなる、請求項２に記載の反応混合物。
【請求項４】
配列番号３６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブおよび配列番号３０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５】
前記標識プローブが、蛍光標識されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項６】
前記標識プローブのそれぞれが、異なるプローブを含み、そして独立してＶＩＣ、ＦＡＭ、ＡＢＹまたはＪＵＮで標識されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７】
前記対象由来の生体試料からのＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するために、少なくとも１つの増幅プライマー対をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項８】
（ａ）配列番号７〜１２および４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するフォワードプライマー、および
（ｂ）配列番号１３〜１８および４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するリバースプライマー
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項９】
（ａ）請求項４〜８のいずれか一項に記載の反応混合物と、（ｂ）前記反応混合物とは別個に、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される１つ以上のＴＧＦＢＩ変異のための１つ以上の標識プローブとを含む、反応キット。
【請求項１０】
前記１つ以上の標識プローブが、配列番号１９、２５、２０、２６、２１、２７、２３、２９、５０および５４のヌクレオチド配列を含む標識プローブからなる群から選択される、請求項９に記載の反応キット。
【請求項１１】
配列番号１９または２５のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４Ｓプローブを含む、請求項９に記載の反応キット。
【請求項１２】
配列番号２０または２６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ａ５４６Ｄプローブを含む、請求項９に記載の反応キット。
【請求項１３】
配列番号２１または２７のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ５７２Ｒプローブを含む、請求項９に記載の反応キット。
【請求項１４】
配列番号２３、２９、５０または５４のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ６２６Ｒプローブを含む、請求項９に記載の反応キット。
【請求項１５】
第３の増幅プライマーセットをさらに含む、請求項８に記載の反応キット。
【請求項１６】
角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、
（Ａ−１）少なくとも第１の増幅プライマー対および少なくとも２つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、対象由来の生体試料からの第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップと、
（Ｂ−１）前記少なくとも２つの検出プローブのセットの第１および第２の検出プローブを、Ｇ６２３Ｄ変異を有する第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列およびＭ５０２Ｖ変異を含む第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とそれぞれハイブリダイズするステップと、
（Ｃ−１）前記第１および第２の検出プローブの、それぞれ前記第１および第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、前記ＴＧＦＢＩ遺伝子配列における１つ、２つまたはそれ以上の変異を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項１７】
前記反応混合物が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
（Ａ−２）前記生体試料からの第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップであって、前記反応混合物が、Ｒ１２４Ｓ，Ａ５４６Ｄ，Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される第３のＴＧＦＢＩ変異のための第３の標識プローブをさらに含むステップと、
（Ｂ−２）前記第３の標識プローブを、前記第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とハイブリダイズするステップと、
（Ｃ−２）前記第３の検出プローブの、前記第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、前記第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列における変異を検出するステップと
をさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップ（Ａ−１）および前記第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップ（Ａ−２）が、別個に実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ハイブリダイズするステップ（Ｂ−１）および前記ハイブリダイズするステップ（Ｂ−２）が、別個に実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出するステップ（Ｃ−１）および前記検出するステップ（Ｃ−２）が、別個に実施される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【出願の分野】
【０００１】
本出願は、概して、角膜ジストロフィーを検出するまたは診断するためのプローブ、および角膜ジストロフィーを検出するまたは診断する方法に関する。
【背景】
【０００２】
リアルタイムＰＣＲを使用して、実質的に同一の配列を有する核酸配列間の差異を検出することができる。差次的に標識された蛍光核酸プローブ、例えば、野生型配列と結合するものおよび変異配列と結合するものの使用を介して、ヒトゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化を、迅速かつ確実に検出することができる。この解像力は、医療診断に適用されてきており、ここで、一塩基多型（ＳＮＰ）、すなわち、タンパク質のコーディングおよび／または非コーディング配列内で見られる単一塩基変化は、ヒト疾患と相関する。
【０００３】
しかしながら、リアルタイムＰＣＲ解析は、高品質試料の収集および単離に高度に依存している。不十分な試料収集および／または単離は、より長いアッセイ条件およびより大量のリアルタイムＰＣＲ試薬の使用を必要とし、そのいずれも、コストの増大および生産性の低減をもたらす。さらに、リアルタイムＰＣＲ一塩基多型検出アッセイの失敗は、追加試料を収集する必要性をもたらす場合があり、時間および資源におけるより大きな損失を引き起こすことさえある。
【０００４】
したがって、アッセイの全体的な成功率を改善し、アッセイに必要とされる試薬を低減し、追加試料を後に収集する必要性を低減させる、試料収集および単離の改善をもたらす方法が、非常に望ましい。さらに、より少ない量の試料材料を用いてリアルタイムＰＣＲ  ＳＮＰ検出アッセイを実施するための方法は、高品質試料の収集および単離に関連する課題も低減させることになる。
【０００５】
角膜は、網膜に光を収束させるプロセスを開始し、眼の屈折力の３分の２前後を占める、眼の前面にある無血管透明組織である。いくつかの遺伝的条件が角膜の透明度に影響し、それらは、影響を受けた角膜層によって、後部、間質または表面として分類される。常染色体優性（ＡＤ）、Ｘ染色体連鎖劣性（ＸＲ）および常染色体劣性（ＡＲ）遺伝パターンはいずれも観察されており、多くの場合、疾患遺伝子座がマッピングされ、原因遺伝子が同定されている。最も研究されている角膜ジストロフィーは、染色体５ｑ３１．１に位置する形質転換成長因子ベータ誘導遺伝子（ＴＧＦＢＩ）における常染色体優性ミスセンス突然変異によって引き起こされるものであり、これは、細胞接着、移動、増殖および分化を媒介することにより、生理的および病理学的応答において中心的役割を果たすと考えられる細胞外マトリックスタンパク質をエンコードする。これまでのところ、６２のＴＧＦＢＩ突然変異が、ヒト遺伝子突然変異データベース（ＨＧＭＤ）において、顆粒状角膜ジストロフィー１型（ＧＣＤ１）および２型（ＧＣＤ２、アベリノ角膜ジストロフィーと以前に指定された）、上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）、格子角膜ジストロフィー（ＬＣＤ）、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィー（ＲＢＣＤ）およびティール・ベンケ角膜ジストロフィー（ＴＢＣＤ）を含む、角膜アミロイドおよび非アミロイド沈着を伴う一連の異なる上皮間質角膜ジストロフィーを引き起こすことが報告されている。異なるＴＧＦＢＩ変異は、特異的な角膜ジストロフィーを引き起こし得、遺伝子型と表現型の相関は、２つの突然変異ホットスポット、Ｒ１２４およびＲ５５５において実証されている。
【０００６】
レーザーインサイチュ角膜曲率形成術（ＬＡＳＩＫ）は、近視（近眼）、遠視（遠眼）および乱視に対する視力矯正を提供する外科的処置である。角膜上皮において薄いフラップを切断して折り畳み、露出した間質層をレーザーによって再形成して、その角膜の収束力を変化させる。微小切開水晶体抽出（ＳＭＩＬＥ）は、近視の矯正のための低侵襲手術である。レーザーによって上皮層内に小さな切開を作製し、間質の小片（水晶体）を除去して、間質を再形成する。光学的角膜切除術（ＰＲＫ）および光線治療的表層角膜切除術（ＰＴＫ）手術は、角膜から表面の混濁および表面不整を除去することによって、視力矯正に影響するまたは種々の眼障害を治療する。これらの侵襲性角膜手術は、間質層において創傷を誘発し、これが、ＴＧＦＢＩの発現を上方調節させ、ＴＧＦＢＩ変異を担持する個体の角膜内において角膜アミロイド沈着をもたらし、角膜ジストロフィーに関連する病理を招く。ＬＡＳＩＫは、顆粒状角膜ジストロフィー（ＧＣＤ）を持つ個体においては禁忌である。市販の遺伝子検査は、ＴＧＦＢＩ遺伝子内において、５つの最も一般的な種類の角膜ジストロフィーに関係する５つの最も一般的な突然変異：顆粒状角膜ジストロフィー２型ではＲ１２４Ｈ、格子角膜ジストロフィー１型ではＲ１２４Ｃ、ライス・ビュックラー角膜ジストロフィーではＲ１２４Ｌ、顆粒状角膜ジストロフィー１型ではＲ５５５Ｗ、およびティール・ベンケ角膜ジストロフィーではＲ５５５Ｑを検出することができる。この５つの変異遺伝子検査は、元来、ＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィー症例の大多数が、Ｒ１２４Ｈ変異によって引き起こされるＧＣＤ２として診断される、韓国人および日本人の集団のために設計されたものである。韓国および日本国内において、該検査は、屈折矯正手術前のスクリーニングツールとして主に使用される。しかしながら、米国および欧州では、該検査は、屈折矯正手術候補者をスクリーニングするためおよび角膜ジストロフィー疾患の臨床診断のための確認試験としての両方で使用される。
【０００７】
上記の背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされるのは、種々の集団および地理的位置における異なるＴＧＦＢＩ変異の有病率を再調査して、世界中の異なる集団において使用するための遺伝子検査を改善することである。
【概要】
【０００８】
一態様において、本開示は、対象において角膜ジストロフィーを検出するための反応混合物であって、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列を含む標識プローブを含む、反応混合物を提供する。反応混合物は、配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列を含む、対応する標識プローブをさらに含んでよい。いくつかの実施形態において、標識プローブは、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列からなり、および／または、対応する標識プローブは、配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列からなる。追加の実施形態において、反応混合物は、配列番号３３または３６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブ、および配列番号２４または３０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブを含む。またさらなる実施形態において、標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、標識プローブは、蛍光標識されている。追加の実施形態において、標識プローブのそれぞれは、異なるプローブを含む。さらなる実施形態において、標識プローブのそれぞれは、独立して、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＡＢＹまたはＪＵＮで標識されている。
【００１０】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、対象由来の生体試料からのＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するために、少なくとも１つの増幅プライマーをさらに含む。追加の実施形態において、反応混合物は、（ａ）配列番号７〜１２および４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するフォワードプライマー、ならびに（ｂ）配列番号１３〜１８および４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するリバースプライマーを含む。反応混合物が、配列番号３３または３６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブ、および配列番号２４または３０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブを含む場合、反応混合物は、（ａ）配列番号１０および１２を含む対応するフォワードプライマー、ならびに（ｂ）配列番号１６および１８を含む対応するリバースプライマーをさらに含み得る。
【００１１】
一態様において、本開示は、本明細書において記述されている反応混合物を含む反応キットを提供する。一態様において、反応キットは、ＴＧＢＩ遺伝子におけるＧ６２３ＤおよびＭ５０２Ｖ変異のための検出プローブを含む反応混合物を含む。いくつかの実施形態において、反応キットは、ＴＧＢＩ遺伝子におけるＲ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒ変異のための１つ以上の検出プローブをさらに含む。一態様において、本開示は、本明細書において記述されている反応混合物と、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される１つ以上のＴＧＦＢＩ変異のための１つ以上の標識プローブとを含む、反応キットを提供する。いくつかの実施形態において、１つ以上の標識プローブは、反応混合物とは別個である。追加の実施形態において、１つ以上の標識プローブは、配列番号１９、２５、２０、２６、２１、２７、２３、２９、５０および５４のヌクレオチド配列を含むまたはそれらからなる標識プローブからなる群から選択される。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号１９または２５のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４Ｓプローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２０または２６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ａ５４６Ｄプローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２１または２７のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ５７２Ｒプローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２３、２９、５０または５４のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ６２６Ｒプローブを含む。さらなる実施形態において、反応キットは、追加の増幅プライマーセットをさらに含む。またさらなる実施形態において、反応キットは、Ｒ１２４Ｓ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第３の増幅プライマーセット、Ａ５４６Ｄ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第４の増幅プライマーセット、Ｈ５７２Ｒ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第５の増幅プライマーセット、および／またはＨ６２６Ｒ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第６の増幅プライマーセットをさらに含む。
【００１２】
一態様において、本開示は、角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、ＴＧＦＢＩ遺伝子において、Ｇ６２３Ｄ、Ｍ５０２Ｖ、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒ変異からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの変異を検出するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、検出するステップは、ＴＧＦＢＩ遺伝子を配列決定するステップを含む。追加の実施形態において、検出するステップは、標識検出プローブを使用して変異を検出するステップを含む。
【００１３】
一態様において、本開示は、角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、（Ａ−１）少なくとも第１の増幅プライマー対および少なくとも２つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、対象由来の生体試料からの第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップと、（Ｂ−１）少なくとも２つの検出プローブのセットの第１および第２の検出プローブを、Ｇ６２３Ｄ変異を有する第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列およびＭ５０２Ｖ変異を有する第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とそれぞれハイブリダイズするステップと、（Ｃ−１）第１および第２の検出プローブの、それぞれ第１および第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、ＴＧＦＢＩ遺伝子配列における１つ、２つまたはそれ以上の変異を検出するステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（Ａ−２）生体試料からの第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップであって、反応混合物が、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される第３のＴＧＦＢＩ変異のための第３の標識プローブをさらに含むステップと、（Ｂ−２）第３の標識プローブを第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とハイブリダイズするステップと、（Ｃ−２）第３の検出プローブの、第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列における変異を検出するステップとをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａは、種々のＴＧＦＢＩ変異を持つ報告症例の世界地図を例証する。地域または国に置かれた各吹き出しは、民族性、突然変異および症例数等の報告された症例情報を含有する。地図は、ＴＧＦＢＩ変異症例が、限られた研究能力または公開のための言語的困難を持つ地域を除いて世界中で報告されていることを例証する。南米からは極めて少数の症例しか報告されず、アフリカからもロシアからも症例報告は同定されなかった。
【図１Ｂ】図１Ｂは、吹き出し内に含有される情報の例として、英国を指し示している赤色矢印を例証する。左側の凡例は、各報告された変異について、報告された変異、民族性および総症例数を示す。
【００１５】
【図２】図２は、地理的地域による比較を提供する。５つの変異を用いる元の遺伝子検査、６つの追加の変異および提案された拡張１１の変異パネルを、１，６００を上回る報告症例においてモデル化した。５つの変異を用いる利用可能な遺伝子検査の検出率は、欧州およびアジアの間に非常に近接していた。
【００１６】
【図３】図３は、報告症例内で５つの最も一般的な突然変異を、最高から最低まで順位付けする表を提供する。加えて、これは、６つの追加の変異について、症例数を高から低へ収載する。
【００１７】
【図４】図４は、Ｒ１２４Ｃ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ５５５ＱおよびＲ１２４Ｌについての利用可能な遺伝子検査の理論的結果を示す表を提供する。この検査は、ムーアフィールドの角膜ジストロフィー研究によって同定された６８のＴＧＦＢＩ  ＣＤコホートの９０％を検出するであろう。表は、文献調査を通して同定された６つの追加の変異を使用した結果も示す。それらは、検出率を７％だけ増大させ、それにより、英国における全体的な検出率を９７％にする。
【００１８】
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、実施例において使用した標的、プライマーおよびプローブについて、例示的な配列を提供する。
【００１９】
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、Ｍ５０２ＶおよびＧ６２３Ｄ  ＴＧＦＢＩプローブを使用する実施例４からの識別プロット結果を示す。
【詳細な説明】
【００２０】
Ｉ．序論
本開示は、反応混合物の発見に少なくともある程度基づく、角膜ジストロフィーの検出を改善するための反応キットである。
【００２１】
アジアにおけるＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィーの報告されている有病率は、韓国においては８７０分の１および中国においては４１６分の１である。アジアは、高い近視率を有し、Ｈｏｌｄｅｎらによって行われた研究は、２０５０年までに、アジア太平洋人口が、４９．８％の世界的な有病率と比較して、６６．４％という全人口の中で最も高い近視有病率を有することになるであろうと予測した。これらのアジア人口における近視の高い有病率により、ＬＡＳＩＫ視力矯正手術の使用は一貫して増大しつつあり、上昇し続けることが予測されている。アジア人口におけるＴＧＦＢＩ変異の公知の有病率および高近視率により、突然変異検査はこの地域において重要であり、その後、アジア太平洋人口において、５つの変異の遺伝子検査が最初に導入された。
【００２２】
１９８８年における、顆粒状角膜ジストロフィーの原因としてのＴＧＦＢＩ変異についてのＦｏｌｂｅｒｇらによる最初の記述から、この疾患に関する我々の意識および理解は、着実に増大してきた。最も一般的なＲ１２４およびＲ５５５変異は文書で十分に立証されており、追加の変異は、一般的な変形体の次の段階を理解するために、より厳密に検討されている。本開示は、この疾患の有病率を理解するために、種々のＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィーに関する文献における報告の再調査を提供する。この疾患の世界的な有病率は未知であるが、疾患の転帰は衰弱性である。究極の治療は、角膜移植であり、疾患の再発性は、多くの場合、その後の角膜移植を必要とし、これは、患者および眼科医の両方に心的外傷性かつ高価である。したがって、変異を検出するための分子診断検査を用いる予防および事前スクリーニングが肝要である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、１つの目的は、屈折矯正手術の前の事前スクリーニング検査において検査能力の強化を提供することである。別の目的は、遺伝子検査および臨床診断によって生じる検出率間の差を縮めることである。
【００２４】
ＩＩ．選択定義
用語「発明」または「本発明」は、本明細書において使用される場合、本発明のいずれか１つの具体的な実施形態への限定を意図しておらず、概して、特許請求の範囲および明細書において記述されている通りの本発明のありとあらゆる実施形態に当てはまる。
【００２５】
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他の意味に解すべき場合を除き、複数の参照物を含む。故に、例えば、「方法」への言及は、本開示を読んだ際に当業者に明らかになるであろう、本明細書において記述されている種類の１つ以上の方法および／またはステップを含む。
【００２６】
本明細書において使用される場合、用語「多型」およびその変形体は、異なるゲノムまたは個体の間または中における２つ以上の代替的なゲノム配列または対立遺伝子の発生を指す。用語「遺伝子変異」または「遺伝的変形」およびその変形体は、多型を含む。
【００２７】
本明細書において使用される場合、用語「単一ヌクレオチド多型」（「ＳＮＰ」）およびその変形体は、対立遺伝子間で変動する１つのヌクレオチドの部位を指す。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、単一塩基変化または点突然変異であるがいわゆる「インデル」突然変異（ヌクレオチドの挿入または削除）も含み、個体間における遺伝的変形をもたらす。すべてのヒト遺伝的変形の約９０％を構成するＳＮＰは、３０億塩基のヒトゲノムに沿って１００から３００塩基ごとに発生する。ＳＮＰは、ゲノムのコーディングまたは非コーディング領域において発生することができる。コーディング領域のＳＮＰは、タンパク質産物のアミノ酸配列を変化させてもさせなくてもよい。非コーディング領域のＳＮＰは、プロモーターまたはプロセシング部位を改変することができ、遺伝子転写および／またはプロセシングに影響し得る。個体が目的のゲノム領域に特定のＳＮＰを有するか否かの知識は、様々な疾患について、診断、予防および治療用途を開発するために十分な情報を提供し得る。いくつかの実施形態において、本開示は、ＴＧＢＩ遺伝子由来の産物のアミノ酸配列における変異をもたらすアミノ酸配列を改変する、コーディング領域におけるＳＮＰの検出に関する。例えば、本開示は、ＴＧＦＢＩ遺伝子において、Ｇ６２３Ｄ、Ｍ５０２Ｖ、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２Ｒ、Ｈ６２６Ｒ、Ｇ６２３Ｄ、Ｒ１２４Ｓ、Ｈ４０３Ｑ、Ｒ１２４Ｃおよび／またはＲ１２４Ｈ変異を引き起こすＳＮＰの検出に関する。
【００２８】
用語「プライマー」およびその変形体は、ＰＣＲ反応においてＤＮＡ合成の開始点として作用する、オリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、通常、長さ約１５から約３５ヌクレオチドであり、標的配列を補完する領域とハイブリダイズする。
【００２９】
用語「プローブ」およびその変形体（例えば、検出プローブ）は、ＰＣＲ反応において標的核酸とハイブリダイズする、オリゴヌクレオチドを指す。標的配列は、解析される核酸の領域を指し、目的の多型部位を含む。
【００３０】
特に定義しない限り、本明細書において使用されるすべての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において記述されているものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または検査において使用することができるが、方法および材料の種々の実施形態が、本明細書において具体的に記述されている。
【００３１】
ＩＩＩ．反応混合物
一態様において、本開示は、対象において角膜ジストロフィーを検出するための反応混合物であって、ＴＧＢＩにおける突然変異を検出するための検出プローブを含む、反応混合物を提供する。いくつかの実施形態において、検出プローブは、本明細書において記述されているアミノ酸変異を引き起こすＳＮＰを検出する。一態様において、本開示は、対象において角膜ジストロフィーを検出するための反応混合物であって、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列を含む、反応混合物を提供する。反応混合物は、配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列を含む、対応する標識プローブをさらに含んでよい。いくつかの実施形態において、標識プローブは、配列番号２５〜３０、３６および５４からなる群から選択される変異ヌクレオチド配列からなり、および／または、対応する標識プローブは、配列番号１９〜２４、３３および５０からなる群から選択される正常ヌクレオチド配列からなる。追加の実施形態において、反応混合物は、配列番号３３または３６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブ、および配列番号２４または３０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブを含む。またさらなる実施形態において、標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブは、配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブは、配列番号３０のヌクレオチド配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態において、反応混合物は、対象由来の生体試料からのＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するために、少なくとも１つの増幅プライマーをさらに含む。追加の実施形態において、反応混合物は、（ａ）配列番号７〜１２および４１からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するフォワードプライマー、ならびに（ｂ）配列番号１３〜１８および４７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む対応するリバースプライマーを含む。反応混合物が、配列番号３３または３６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３Ｄプローブ、および配列番号２４または３０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブを含む場合、反応混合物は、（ａ）配列番号１０および１２を含む対応するフォワードプライマー、ならびに（ｂ）配列番号１６および１８を含む対応するリバースプライマーをさらに含み得る。
【００３３】
いくつかの実施形態において、標識プローブは、蛍光標識されている。追加の実施形態において、標識プローブのそれぞれは、異なるプローブを含む。さらなる実施形態において、標識プローブのそれぞれは、独立して、ＶＩＣ、ＦＡＭ、ＡＢＹまたはＪＵＮで標識されている。
【００３４】
ＩＶ．診断キット
一態様において、本明細書において記述されている試薬のいずれかまたはすべては、診断キットにパッケージ化されている。そのようなキットは、本明細書において記述されているプライマー、プローブ、緩衝液および／または他の試薬のいずれかおよび／またはすべてを、任意の組合せで含む。
【００３５】
一態様において、本開示は、ＴＧＢＩ遺伝子において、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２Ｒ、Ｈ６２６Ｒ、Ｇ６２３ＤおよびＭ５０２Ｖ変異を検出するための、プライマーセット、検出プローブおよび／または試薬を含む、反応キットを提供する。一態様において、本開示は、ＴＧＢＩ遺伝子において、Ｇ６２３ＤおよびＭ５０２Ｖ変異を検出するための、プライマーセット、検出プローブおよび／または試薬を含む反応キットを、Ｇ６２３ＤおよびＭ５０２Ｖを検出するための、プライマーセット、プローブおよび／または試薬の組合せを含む単一反応混合物とともに提供する。いくつかの実施形態において、反応キットは、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される１つ、２つ、３つまたは４つのＴＧＦＢＩ変異を検出するための、１つ、２つ、３つまたは４つのプライマーセット、検出プローブおよび／または試薬をさらに含む。追加の実施形態において、反応キットは、Ｇ６２３Ｄ、Ｒ１２４Ｓ、Ｈ４０３Ｑ、Ｒ１２４ＣおよびＲ１２４Ｈからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＴＧＦＢＩ変異を検出するための、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのプライマーセット、検出プローブおよび／または試薬をさらに含む。
【００３６】
一態様において、本開示は、上述した反応混合物と、１つ以上の追加の試薬とを含む、反応キットを提供する。いくつかの実施形態において、反応キットは、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される１つ、２つ、３つまたは４つのＴＧＦＢＩ変異を検出するための、１つ、２つ、３つまたは４つのプライマーセット、標識プローブおよび／または試薬をさらに含む。いくつかの実施形態において、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される１つ、２つ、３つまたは４つのＴＧＦＢＩ変異を検出するための、１つ、２つ、３つまたは４つのプライマーセット、標識プローブおよび／または試薬が、キット内の反応混合物とは別個である。追加の実施形態において、反応キットは、配列番号１９〜２４、３３、５０、２５〜３０、３６および５４のヌクレオチド配列を含む標識プローブからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７の標識プローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号１９のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４Ｓ正常プローブおよび／または配列番号２５のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４Ｓ変異プローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ａ５４６Ｄ正常プローブおよび／または配列番号２６のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ａ５４６Ｄ変異プローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２１のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ５７２Ｒ正常プローブおよび／または配列番号２７のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ５７２Ｒ変異プローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、配列番号２３もしくは５０のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ６２６Ｒ正常プローブおよび／または配列番号２９もしくは５４のヌクレオチド配列を含む標識ＴＧＦＢＩ  Ｈ６２６Ｒ変異プローブを含む。また追加の実施形態において、反応キットは、ＴＧＦＢＩ  Ｇ６２３ＤプローブがＴＧＢＩ  Ｍ５０２Ｖプローブと別個に保管されているまたは混合されていないキットを除外する。さらなる実施形態において、反応キットは、追加の増幅プライマーセットをさらに含む。またさらなる実施形態において、反応キットは、Ｒ１２４Ｓ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第３の増幅プライマーセット、Ａ５４６Ｄ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第４の増幅プライマーセット、Ｈ５７２Ｒ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第５の増幅プライマーセット、および／またはＨ６２６Ｒ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子を増幅するための第６の増幅プライマーセットをさらに含む。本明細書において、Ｒ１２４Ｓ変異を含むＴＧＦＢＩ遺伝子は、ＴＧＢＩタンパク質産物においてＲ１２４Ｓ変異を引き起こすＳＮＰを含むＴＧＦＢＩ遺伝子を指す場合がある。
【００３７】
追加の実施形態において、反応キットは、Ｇ６２３Ｄ、Ｒ１２４Ｓ、Ｈ４０３Ｑ、Ｒ１２４ＣおよびＲ１２４Ｈからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＴＧＦＢＩ変異を検出するための、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのプライマーセット、検出プローブおよび／または試薬をさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、キット内の試薬は、凍結乾燥粉末として含まれる。いくつかの実施形態において、キット内の試薬は、再構成の説明書と共に凍結乾燥粉末として含まれる。いくつかの実施形態において、キット内の試薬は、液体として含まれる。いくつかの実施形態において、試薬は、プラスチックおよび／もしくはガラスバイアルまたは他の適切な容器内に含まれる。いくつかの実施形態において、プライマーおよびプローブは、キット内の個々の容器にすべて含有される。いくつかの実施形態において、プライマーは、１つの容器内に一緒にパッケージ化され、プローブは、別の容器内に一緒にパッケージ化される。いくつかの実施形態において、プライマーおよびプローブは、単一の容器内に一緒にパッケージ化される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、キットは、対照ｇＤＮＡおよび／またはＤＮＡ試料をさらに含む。いくつかの実施形態において、含まれる対照ＤＮＡ試料は、Ｇ６２３正常配列を有するＴＧＦＢＩ試料および／またはＭ５０２正常配列を有するＴＧＦＢＩ試料である。いくつかの実施形態において、含まれる対照ＤＮＡ試料は、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒを含む、検出される変異に対応する。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料ならびにＲ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗ、Ｒ５５５Ｑおよび／またはＨ６２６Ｐに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料ならびにＲ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈ、Ｒ１２４Ｌ、Ｒ５５５Ｗおよび／またはＲ５５５Ｑに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料ならびにＲ１２４Ｃ、Ｒ１２４Ｈおよび／またはＲ１２４Ｌに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料ならびにＲ５５５Ｗおよび／またはＲ５５５Ｑに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料およびＲ１２４Ｃに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常ＤＮＡに対応する対照ＤＮＡ試料およびＲ１２４Ｈに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料およびＲ１２４Ｌに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常ＤＮＡに対応する対照ＤＮＡ試料およびＲ５５５Ｗに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料およびＲ５５５Ｑに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。いくつかの実施形態において、ＴＧＦＢＩ  Ｒ１２４正常に対応する対照ＤＮＡ試料およびＨ６２６Ｐに対応する変異ＤＮＡ試料が含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡ試料の濃度は、５ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、３０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、６０ｎｇ／μＬ、７０ｎｇ／μＬ、８０ｎｇ／μＬ、９０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１１０ｎｇ／μＬ、１２０ｎｇ／μＬ、１３０ｎｇ／μＬ、１４０ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬ、１６０ｎｇ／μＬ、１７０ｎｇ／μＬ、１８０ｎｇ／μＬ、１９０ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡ試料の濃度は、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡ試料の濃度は、１００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡ試料は、同じ濃度を有する。いくつかの実施形態において、対照ＤＮＡ試料は、異なる濃度を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態において、キットは、緩衝液、例えば、ＧＴＸｐｒｅｓｓ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試薬混合物または任意の同等の緩衝液をさらに含むことができる。いくつかの実施形態において、緩衝液は、本明細書において記述されている任意の緩衝液を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、キットは、ベクター（例えば、Ｍ１３ベクターを含む）等、クローン作成において使用するための試薬をさらに含むことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、キットは、ＤＮＡの精製において使用するための試薬をさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、キットは、対象における角膜ジストロフィーの検出のためのキットを使用するための説明書をさらに含む。いくつかの実施形態において、これらの説明書は、本明細書において記述されているプロトコールの種々の態様を含む。
【００４５】
Ｖ．核酸解析
一態様において、本開示は、角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、ＴＧＦＢＩ遺伝子において、Ｇ６２３Ｄ、Ｍ５０２Ｖ、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒ変異からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのＴＧＦＢＩ変異を検出するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、Ｇ６２３Ｄ、Ｒ１２４Ｓ、Ｈ４０３Ｑ、Ｒ１２４ＣおよびＲ１２４Ｈからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＴＧＦＢＩ変異を検出するステップをさらに含んでよい。
【００４６】
いくつかの実施形態において、検出するステップは、ＴＧＦＢＩ遺伝子を配列決定するステップを含む。追加の実施形態において、検出するステップは、標識検出プローブを使用して変異を検出するステップを含む。
【００４７】
一態様において、本開示は、角膜ジストロフィーを検出するための方法であって、（Ａ−１）少なくとも第１の増幅プライマー対および少なくとも２つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、対象由来の生体試料からの第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップと、（Ｂ−１）少なくとも２つの検出プローブのセットの第１および第２の検出プローブを、Ｇ６２３Ｄ変異を有する第１のＴＧＦＢＩ遺伝子配列およびＭ５０２Ｖ変異を有する第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とそれぞれハイブリダイズするステップと、（Ｃ−１）第１および第２の検出プローブの、それぞれ第１および第２のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、ＴＧＦＢＩ遺伝子配列における１つ、２つまたはそれ以上の変異を検出するステップと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、方法は、（Ａ−２）生体試料からの第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列を増幅するステップであって、反応混合物が、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＨ６２６Ｒからなる群から選択される第３のＴＧＦＢＩ変異のための第３の標識プローブをさらに含むステップと、（Ｂ−２）第３の標識プローブを第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とハイブリダイズするステップと、（Ｃ−２）第３の検出プローブの、第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列とのハイブリダイゼーションに基づき、第３のＴＧＦＢＩ遺伝子配列における変異を検出するステップとをさらに含む。
【００４８】
いくつかの実施形態において、本明細書における方法は、ゲノム試料を単離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、対象由来の細胞の試料を準備するステップを含む。追加の実施形態において、対象は、ヒトであってよい。いくつかの実施形態において、細胞は、患者の細胞表面を、細胞を基質上に可逆的に固定することができる基質と接触させることによって、収集される。
【００４９】
開示されている方法は、様々な試料から取得された様々な細胞型に適用可能である。いくつかの実施形態において、開示されている方法で使用するための細胞型は、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、心細胞、尿細胞、メラノサイト、ケラチノサイト、血球、白血球、バフィーコート、有毛細胞（例えば、毛根細胞を含む）および／または唾液細胞を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞は、上皮細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、被膜下血管周囲（上皮型１）、淡染（上皮型２）、中間（上皮型３）、暗調（上皮型４）、未分化（上皮型５）および大髄様（上皮型６）である。いくつかの実施形態において、細胞は、口腔上皮細胞（例えば、口腔スワブを使用して収集された上皮細胞）である。いくつかの実施形態において、開示されている方法において使用される細胞の試料は、上記で同定した細胞型の任意の組合せを含む。いくつかの実施形態において、準備される細胞は、口腔上皮細胞である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、試料は、有利なことに、非侵襲的な様式で収集され、そのため、試料収集はどこでもかつほぼ誰によってでも遂行される。例えば、いくつかの実施形態において、試料は、医院で、対象の自宅で、またはＬＡＳＩＫ手術が実施されているもしくは実施される予定の施設で、収集される。いくつかの実施形態において、患者、患者のかかりつけ医、看護師もしくは医師助手または他の臨床職員が、試料を収集する。
【００５１】
例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料を含むがこれらに限定されない、試料におけるＳＮＰを解析するための様々な方法は、当該技術分野において公知であり、リアルタイムＰＣＲ解析、マイクロアレイ解析、ハイブリダイゼーション解析および核酸配列解析等のＰＣＲ方法、ならびに、核酸組成が解析され、当業者に公知である様々な他の方法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ｔｈｒｅｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ｓｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０１２）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；２００３−２０１３）を参照されたい。
ａ．リアルタイムＰＣＲ
【００５２】
リアルタイムＰＣＲアッセイの設計のために、２つのプライマーの側面に配置され、その後増幅される、多くの場合、アンプリコンとも称されるＤＮＡフラグメント、使用される２つのプライマーおよび検出プローブ（１つ以上）を含む、数個の部分が配位される。
【００５３】
リアルタイムＰＣＲは、ゲノム対立遺伝子と配列特異的な方式で会合する短いポリヌクレオチド（「検出プローブ」と称される）とコンジュゲートしている蛍光色素の可視発光に依存している。単一ヌクレオチドによって異なるリアルタイムＰＣＲプローブは、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて、異なる波長で蛍光を発するプローブのコンジュゲーションおよび検出によって分化され得る。リアルタイムＰＣＲは、検出用途（診断用途）、定量化用途および遺伝子型決定用途において使用を見出している。
【００５４】
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号明細書、ならびにＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３７６１−６，１９９３）、分子ビーコンプローブ（米国特許第５，９２５，５１７号および同第６，１０３，４７６号明細書、ならびにＴｙａｇｉ  ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−８，１９９６）、自己プローブ化アンプリコン（スコーピオン）（米国特許第６，３２６，１４５号明細書、およびＷｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８０４−７，１９９９）、アンプリセンサー（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：４２１０−６，１９９８）、アンプリフロール（米国特許第６，１１７，６３５号明細書、およびＮａｚａｒｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５１６−２１，１９９７）、置換ハイブリダイゼーションプローブ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：Ｅ５，２００２）、ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ（Ｔｏｄｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：６２５−３０，２０００）、蛍光制限酵素検出（Ｃａｉｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３１８：６８４−９０，２００４）および隣接ハイブリダイゼーションプローブ（米国特許第６，１７４，６７０号明細書、およびＷｉｔｔｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１３０−１，１３４−８，１９９７）に依拠するアッセイを含む、リアルタイムＰＣＲを実施するための数種の関連する方法が、当該技術分野において開示されている。
【００５５】
一態様において、本開示は、ＴＧＦＢＩ遺伝子における、Ｇ６２３Ｄ、Ｍ５０２Ｖ、Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２Ｒ、Ｈ６２６Ｒ、Ｇ６２３Ｄ、Ｒ１２４Ｓ、Ｈ４０３Ｑ、Ｒ１２４Ｃおよび／またはＲ１２４Ｈ変異を引き起こすＳＮＰの検出に関する。いくつかの事例において、リアルタイムＰＣＲは、例えばＳＮＰを含むがこれに限定されない様々な遺伝子変異の検出をもたらすことができる。いくつかの実施形態において、特異的な遺伝子候補におけるＳＮＰの検出は、テザー消光部分の使用による蛍光分子の分子内消光の使用に基づき、リアルタイムＰＣＲを使用して実施される。故に、例示的な実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲ方法は、分子ビーコン技術の使用も含む。分子ビーコン技術は、その蛍光が目的のＤＮＡ標的と結合することによって修復される内部消光フルオロフォアを持つヘアピン型分子を利用する（例えば、Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３０３−３０８，１９９６を参照）。いくつかの実施形態において、分子ビーコンプローブの、蓄積するＰＣＲ産物との結合の増大を使用して、ゲノムＤＮＡ中に存在するＳＮＰを特異的に検出する。
【００５６】
多くの好適な遺伝子型決定手順の１つは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイである。このアッセイのいくつかの事例において、プローブの５’末端において蛍光レポーター色素でおよびプローブの３’末端において消光色素で標識化されたオリゴヌクレオチドプローブが利用される。消光剤のインタクトなプローブとの近接は、レポーターのための低蛍光を維持する。ＰＣＲ反応中に、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性はプローブを開裂し、色素および消光剤を分離する。これは、レポーターの蛍光における増大をもたらす。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光における増大をモニターすることによって、直接検出される。ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、プローブが標的とハイブリダイズし、ＰＣＲ中に増幅される場合のみ、レポーターと消光剤との間のプローブを開裂する。プローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合のみ、標的ＳＮＰ位置にまたがり、核酸分子とハイブリダイズするように設計される。
【００５７】
ほんの一例として、ＴＧＦＢＩ遺伝子のエクソン４に位置するアベリノ角膜ジストロフィー関連ＳＮＰを増幅するために、フォワードおよびリバースＰＣＲプライマー対を、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２／００７７２００号明細書において記述されている通りに構築した。
ｂ．リアルタイムＰＣＲサイクル
【００５８】
リアルタイムＰＣＲ方法は、増幅のための方法の一部として、様々なステップまたはサイクルを含む。これらのサイクルは、二本鎖核酸を変性させること、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列とアニールすること、ならびにアニールされたフォワードプライマーおよびリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成すること（すなわち、複製すること）を含む。この３つのステッププロセスを、本明細書においてはサイクルと称する。
【００５９】
いくつかの実施形態において、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５または６０サイクルが用いられる。いくつかの実施形態において、約１０から約６０サイクル、約２０から約５０または約３０から約４０サイクルが用いられる。いくつかの実施形態において、４０サイクルが用いられる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、二本鎖核酸を変性させるステップは、約８０℃から１００℃、約８５℃から約９９℃、約９０℃から約９５℃の温度で、約１秒から約５秒間、約２秒から約５秒間または約３秒から約４秒間にわたって発生する。いくつかの実施形態において、二本鎖核酸を変性させるステップは、９５℃の温度で、約３秒間にわたって発生する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列とアニールするステップは、約４０℃から約８０℃、約５０℃から約７０℃、約５５℃から約６５℃で、約１５秒から約４５秒間、約２０秒から約４０秒間、約２５秒から約３５秒間にわたって発生する。いくつかの実施形態において、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列とアニールするステップは、約６０℃で、約３０秒間にわたって発生する。
【００６２】
いくつかの実施形態において、アニールされたフォワードプライマーおよびリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成すること（すなわち、複製すること）は、約４０℃から約８０℃、約５０℃から約７０℃、約５５℃から約６５℃で、約１５秒から約４５秒間、約２０秒から約４０秒間、約２５秒から約３５秒間にわたって発生する。いくつかの実施形態において、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列とアニールするステップは、約６０℃で、約３０秒間にわたって発生する。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本明細書において記述されている本発明の方法に従って調製された約１μＬ、約２μＬ、約３μＬ、約４μＬまたは約５μＬのゲノムＤＮＡ試料を、約０．０５μＬ、約０．１０μＬ、約０．１５μＬ、約０．２０μＬ、約０．２５μＬまたは約０．２５μＬの３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘまたは１００ＸリアルタイムＰＣＲアッセイミックスおよび蒸留水のみと組み合わせて、ＰＣＲマスターミックスを形成することがわかった。いくつかの実施形態において、ＰＣＲマスターミックスは、約１．５μＬ、約２．５μＬ、約５μＬ、約６μＬ、約７μＬ、約８μＬ、約９μＬ、約０μＬ、約１１μＬ、約１２μＬ、約１３μＬ、約１４μＬ、約１５μＬ、約１６μＬ、約１７μＬ、約１８μＬ、約１９μＬもしくは約２０μＬまたはそれ以上の最終体積を有する。いくつかの実施形態において、ＰＣＲマスターミックスを形成するために、２μＬの上述した通りに調製したゲノムＤＮＡ試料を、約０．１５μＬの４０ＸリアルタイムＰＣＲアッセイミックスおよび２．８５μＬの蒸留水のみと組み合わせることがわかった。
【００６４】
例示的な反応が本明細書において記述されているが、当業者ならば、プローブ設計に基づき、温度および時間をどのように修正するかを理解するであろう。その上、本発明の方法は、上記の時間および温度のあらゆる組合せを企図している。
【００６５】
ｃ．ＰＣＲプライマーおよびプライマー設計
いくつかの実施形態において、プライマーは、実験室の設定で試験および設計される。いくつかの実施形態において、プライマーは、コンピュータベースのインシリコ法によって設計される。プライマー配列は、アンプリコンの配列または増幅される標的核酸配列に基づく。より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンと比較して、より効率的に複製し、より効率的な増幅を招く。
【００６６】
プライマーを設計する際、当業者は、設計されているプライマーのＧＣおよびＡＴ含有量ならびに二次構造の考慮事項（ＧＣ含有量の増大は、二次構造の増大を招き得る）に基づき、融解温度（Ｔｍ；プライマー標的二重鎖の半分が解離され、一本鎖になり、二重安定性の兆候である温度；Ｔｍの増大は、安定性の増大を示す）を考慮に入れる必要性を理解するであろう。ＴＭは、当該技術分野において公知である様々な方法を使用して計算することができ、当業者ならば、ＴＭを計算するためのそのような種々の方法を容易に理解するであろうが、そのような方法は、例えば、ワールド・ワイド・ウェブでｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍにおいて利用可能なＴＭ計算機等、オンラインツールにおいて利用可能なものを含むがこれらに限定されない。プライマー特異性は、Ｔａｑポリメラーゼによって伸長される部分である３’末端配列と組み合わせたその完全配列によって定義される。いくつかの実施形態において、３’末端は、偽プライミングおよび不正確な増幅産物の作成を低減させるのを助けるために、標的配列のどこにも見られない少なくとも５から７つのユニークなヌクレオチドを有すべきである。フォワードおよびリバースプライマーは、典型的には、同様の効率で標的と結合する。いくつかの事例において、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（ワールド・ワイド・ウェブでｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖに位置する）等のツールを用いて、アライメントを実施し、プライマー設計を補助する。
【００６７】
プライマー設計の追加の態様は、プライマー複雑度または言語配列複雑度である（Ｋａｌｅｎｄａｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９８（２）：１３７−１４４（２０１１）を参照）。より大きい言語配列複雑度（例えば、ヌクレオチド配置および組成）を持つプライマーは、典型的には、より効率的である。いくつかの実施形態において、言語配列複雑度の計算方法を使用して、単純な配列の繰り返し、不完全な直接または逆向きの繰り返しを含む低複雑度領域、ポリプリンおよびポリピリミジン三本鎖ｃＤＮＡ構造、ならびに四本鎖構造（Ｇ−四重鎖等）の検出のために、比較される配列間の保存領域を捜索する。いくつかの実施形態において、言語複雑度（ＬＣ）測定は、全配列長と共にアルファベットキャパシティＬグラム法を使用して実施され（Ａ．Ｇａｂｒｉｅｌｉａｎ，Ａ．Ｂｏｌｓｈｏｙ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２６３−２７４（１９９９）およびＹ．Ｌ．Ｏｒｌｏｖ，Ｖ．Ｎ．Ｐｏｔａｐｏｖ，Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：ａｎ  ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：Ｗ６２８−Ｗ６３３（２００４）を参照）、配列における１からＬサイズ語までの観察範囲（ｘｉ）の和を、この配列長についての期待（Ｅ）値の和で割ったものとして計算される。いくつかのＧ−リッチ（およびＣ−リッチ）核酸配列は、大量のＧ−カルテットを含有する四本鎖ＤＮＡ構造に折り畳まれる（ワールド・ワイド・ウェブでｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ．ｏｒｇを参照）。いくつかの事例において、これらの四重鎖は、２つもしくは４つのＤＮＡ分子の分子間会合、２つのＧ−塩基を含有する配列の二量体化によって、またはグアニンの４つのブロックを含有する一本鎖の分子間フォールディングによって形成され（Ｐ．Ｓ．Ｈｏ，ＰＮＡＳ，９１：９５４９−９５５３（１９９４）；Ｉ．Ａ．Ｉｌ’ｉｃｈｅｖａ，Ｖ．Ｌ．Ｆｌｏｒｅｎｔ’ｅｖ，Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２６：５１２−５３１（１９９２）；Ｄ．Ｓｅｎ，Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１１：１９１−１９９（１９９２）；Ｐ．Ａ．Ｒａｃｈｗａｌ，Ｋ．Ｒ．Ｆｏｘ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４３：２９１−３０１（２００７）；Ｓ．Ｂｕｒｇｅ，Ｇ．Ｎ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ，Ｐ．Ｈａｚｅｌ，Ａ．Ｋ．Ｔｏｄｄ，Ｋ．Ｎｅｉｄｌｅ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３４：５４０２−５４１５（２００６）；Ａ．Ｇｕｅｄｉｎ，Ｊ．Ｇｒｏｓ，Ｐ．Ａｌｂｅｒｔｉ，Ｊ．Ｍｅｒｇｎｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３８：７８５８−７８６８（２０１０）；Ｏ．Ｓｔｅｇｌｅ，Ｌ．Ｐａｙｅｔ，Ｊ．Ｌ．Ｍｅｒｇｎｙ，Ｄ．Ｊ．ＭａｃＫａｙ，Ｊ．Ｈ．Ｌｅｏｎ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５：ｉ３７４−ｉ３８２（２００９）を参照）、いくつかの事例において、その低い言語複雑度、（ＴＴＡＧＧＧ）４についてＬＣ＝３２％により、これらはプライマー設計から除外される。
【００６８】
これらの方法は、ＣＧ含有量および融解温度に関して、ＧＣスキュー、（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）、ＡＴスキュー、（Ａ−Ｔ）／（Ａ＋Ｔ）、ＣＧ−ＡＴスキュー、（Ｓ−Ｗ）／（Ｓ＋Ｗ）、またはプリン−ピリミジン（Ｒ−Ｙ）／（Ｒ＋Ｙ）スキューを有する配列における、パターン解析のための種々のバイオインフォマティクスツールを含み、言語配列複雑度プロファイルを決定するためのツールを提供する。例えば、ｎ個の［ここで、ｎは、正の整数である］塩基のスライディングウィンドウにおけるＧＣスキューは、１塩基のステップで、式（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）［式中、Ｇは、グアニンの総数であり、Ｃは、ウィンドウ内のすべての配列についてのシトシンの総数である］に従って計算される（Ｙ．Ｂｅｎｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：ｅ９９（２００３））。正のＧＣスキュー値は、Ｇ塩基の過剰を示したのに対し、負のＧＣスキュー値は、Ｃ塩基の過剰を表した。同様に、他のスキューを配列において計算する。そのような方法およびその他を用いて、いくつかの実施形態においてプライマー複雑度を決定する。
【００６９】
非限定的な例の実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲは、エキソヌクレアーゼプライマー（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）を使用して実施される。そのような実施形態において、プライマーは、Ｔａｑ等の熱安定性ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、増幅反応において存在する二重標識プローブを開裂する（例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２２：１３０−１３８，１９９７を参照）。ＰＣＲ産物を補完するものではあるが、このアッセイにおいて使用されるプライマープローブは、ＰＣＲプライマーとは異なり、蛍光が可能な分子および蛍光を消光することができる分子の両方で二重に標識化されている。プローブがインタクトである場合、ＤＮＡプローブ内の蛍光シグナルの分子内消光は、小シグナルを招く。蛍光分子が増幅中にＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性によって解放される場合、消光は大きく低減され、蛍光シグナルの増大を招く。蛍光プローブの非限定的な例は、６−カルボキシ−フルオレセイン部分等を含む。例示的な消光剤は、ブラックホール消光剤１部分等を含む。
【００７０】
例示的なプライマーは、本明細書において記述されているものを含むがこれらに限定されない。開示されている方法において使用するためのプライマーは、あらゆる目的のための参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１２００７７２００号明細書においても見られる。いくつかの実施形態において、本開示の方法において使用するためのＰＣＲプライマーは、図５Ｂおよび図５Ｃの表に収載されている下記のものを含むがこれらに限定されず、ＴＧＦＢＩ遺伝子の検出において使用を見出している。各プライマーについての生物物理学的パラメータは、ワールド・ワイド・ウェブを使用してｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｅｒ．ｈｔｍｌにおいて計算され得る。
【００７１】
いくつかの実施形態において、開示されている方法で使用するためのリアルタイムＰＣＲプライマーは、少なくとも７０％、少なくとも７２％、少なくとも７５％、少なくとも７７％、少なくとも８０％、少なくとも８２％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の言語配列複雑度を有する。
【００７２】
ｄ．検出プローブ設計および検出プローブ
当業者によって一般的に用いられる検出プローブは、加水分解プローブ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、５’ヌクレアーゼプローブまたは二重標識プローブとしても公知）、ハイブリダイゼーションプローブおよびスコーピオンプライマー（プライマーおよび検出プローブを１個の分子中で組み合わせたもの）を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、プローブは、効率的なシグナル生成を促進するために、プライマーよりも高いＴｍを有するように設計される。Ｔｍは、当該技術分野において公知である様々な方法のいずれかを使用して計算され、当業者ならば、Ｔｍを計算するためのそのような種々の方法を容易に理解するであろうが、そのような方法は、例えば、ワールド・ワイド・ウェブでｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍにおいて利用可能な計算機など、オンラインツールにおいて利用可能なものを含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、検出プローブは、種々の修飾を含有する。いくつかの実施形態において、検出プローブは、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３’末端リン酸修飾および／または３’アルキル置換などであるがこれらに限定されない、修飾された核酸残基を含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、検出プローブは、修飾により、標的配列に対する親和性が増大している。そのような検出プローブは、長さが増大した検出プローブおよび化学修飾を含有する検出プローブを含む。そのような修飾は、２’−フルオロ（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）修飾、ＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジップ核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ポリカチオン性コンジュゲートおよび２’−ピレン修飾を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、検出器プローブは、２’フルオロ修飾（別名２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）、ＬＮＡ（ロックされた核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ジップ核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデートおよび／またはポリカチオン性コンジュゲートを含む１つ以上の修飾を含有する。
【００７５】
いくつかの実施形態において、検出プローブは、本明細書において記述されているものおよび当業者に公知である任意の検出可能な部分等、検出可能な部分を含有する。そのような検出可能な部分は、例えば、蛍光標識および化学発光標識を含むがこれらに限定されない。そのような検出可能な部分の例は、ＦＲＥＴ対のメンバーも含み得る。いくつかの実施形態において、検出プローブは、検出可能な実体を含有する。
【００７６】
蛍光標識の例は、ＡＢＹ、ＪＵＮ、ＡＭＣＡ、ＤＥＡＣ（７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸）；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３；７−ヒドロキシクマリン−３；ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）；７−メトキシクマリン−３；ＡＭＦ（４’−（アミノメチル）フルオレセイン）；５−ＤＴＡＦ（５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＤＴＡＦ（６−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）；６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン；別名ＦＡＭ；ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＦＡＭ（商標）を含む）；ＴＡＱＭＡＮ  ＶＩＣ（登録商標）；５（６）−ＦＡＭカダベリン；５−ＦＡＭカダベリン；５（６）−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＡＭエチレンジアミン；５−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ異性体Ｉ；フルオレセイン−５−イソチオシアネート）；５−ＦＩＴＣカダベリン；フルオレセイン−５−マレイミド；５−ＩＡＦ（５−ヨードアセトアミドフルオレセイン）；６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）；５−ＣＲｌ  ｌＯ（５−カルボキシローダミン１１０）；６−ＣＲｌ  ｌＯ（６−カルボキシローダミン１１０）；５−ＣＲ６Ｇ（５−カルボキシローダミン６Ｇ）；６−ＣＲ６Ｇ（６−カルボキシローダミン６Ｇ）；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇカダベリン；５（６）−カルボキシローダミン６Ｇエチレンジアミン；５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；６−ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）；５−ＴＡＭＲＡカダベリン；６−ＴＡＭＲＡカダベリン；５−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；６−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン；５−ＴＭＲ  Ｃ６マレイミド；６−ＴＭＲ  Ｃ６マレイミド；ＴＲ  Ｃ２マレイミド；ＴＲカダベリン；５−ＴＲＩＴＣ；Ｇ異性体（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）；６−ＴＲＩＴＣ；Ｒ異性体（テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート）；ダンシルカダベリン（５−ジメチルアミノナフタレン−ｌ−（Ｎ−（５−アミノペンチル））スルホンアミド）；ＥＤＡＮＳ  Ｃ２マレイミド；フルオレスカミン；ＮＢＤ；およびピロメテンならびにそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。
【００７７】
化学発光標識の例は、サザン・ブロットおよびウエスタン・ブロット・プロトコールで使用される標識を含むがこれらに限定されない（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（３ｒｄ  ｅｄ．）（２００１）を参照）。例は、−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）；アクリジニウムエステルおよびアダマンチル安定化１，２−ジオキセタンならびにそれらの誘導体を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
いくつかの実施形態において、標識プローブは、増幅中に増幅領域内でハイブリダイズするために使用される。プローブは、それらが増幅のためのプライマーとして作用するのを回避するように修飾されてよい。検出プローブは、一方が他方の色素の蛍光を消光することができる２つの蛍光色素で標識化されてよい。一方の色素はプローブの５’末端に結合し、他方は内部部位に結合するため、消光は、プローブが非ハイブリダイズ状態である場合に発生する。
【００７９】
典型的には、リアルタイムＰＣＲプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する一対の色素（レポーター色素およびアクセプター色素）からなり、それにより、アクセプター色素は、レポーター色素の発光を消光する。概して、蛍光標識プローブは、アンプリコン定量化の特異性を増大させる。
【００８０】
開示されている方法のいくつかの実施形態において使用されるリアルタイムＰＣＲは、この開示を考慮して当業者によって決定される通り、１つ以上のハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、検出プローブ）の使用も含む。非限定的な例として、そのようなハイブリダイゼーションプローブは、記述されている方法において準備されるものの１つ以上を含むがこれらに限定されない。ＨＥＸチャネルおよび／またはＦＡＭチャネルプローブ等の例示的なプローブは、当業者によって理解される。
【００８１】
例の実施形態によれば、検出プローブおよびプライマーは、例えば、プライマー設計ソフトウェアを使用するインシリコ解析を使用し、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）に寄託された遺伝子およびゲノムの利用可能なヌクレオチドデータベースを相互参照して、便利に選択される。いくつかの追加のガイドラインが、いくつかの実施形態においてプライマーおよび／またはプローブの選択に使用されてよい。例えば、いくつかの実施形態において、プライマーおよびプローブは、近くに位置するが重複していないようなものが選択される。いくつかの実施形態において、プライマーは、同じ（または近いＴＭ）（例えば、約５８℃から約６０℃の間）を有してよい。いくつかの実施形態において、プローブのＴＭは、プライマーのＴＭのために選択されたものよりもおよそ１０℃高い。いくつかの実施形態において、プローブおよびプライマーの長さは、約１７から３９塩基対の間等となるように選択される。これらおよび他のガイドラインは、いくつかの事例において、適切なプライマーおよび／またはプローブを選択する際に、当業者によって使用される。
【００８２】
本発明の方法において使用するためのプローブは、図５Ｂおよび図５Ｃに収載されている下記の例示的なプローブを含むがこれらに限定されない。
【００８３】
実施例
実施例１：世界の文献検索
【００８４】
ＨＧＭＤデータベースを調べると、６２の異なるＴＧＦＢＩ変異が見つかった。ＨＧＭＤデータベースを使用して、世界的な分布の全体像を構築するために、これらの変異が記述された論文を同定した（図１Ａおよび１Ｂ）。世界地図における各旗は、特定の地域または国において報告された突然変異の概要を含有する。概要は、民族性、突然変異、および各突然変異について報告された症例の総数を含む（図１Ａ）。突然変異は、特定の集団または地理的地域において、分布に有意差なく広がる。南米からは極めて少数の症例しか報告されず、アフリカからもロシアからも症例報告はなかった。地図を使用して、国固有の情報、例えば、図１Ｂにおいて赤色矢印によって示されるロンドンを抽出することができる。
【００８５】
世界的に、１，６００を上回る症例において報告されたＴＧＦＢＩ変異の７５％は、利用可能な遺伝子検査によって現在検出されている５つの変異の１つからなるものであった。新規ＴＧＦＢＩ変異の報告が公開される可能性が高いが、コドンＲ１２４およびＲ５５５において見られる最も一般的なＴＧＦＢＩ変異は、逆に過少報告されている。したがって、文献内でＴＧＦＢＩジストロフィーの真の世界的な検出率の正確な推定を取得することは困難である。
【００８６】
本発明者らの研究からの最高報告症例数の順位に基づき、利用可能な遺伝子検査パネルに６つの変異を追加することによる、ＴＧＦＢＩ変異検出率に対する効果を評価した。５つの最も一般的な変異および拡張検査に提案された６つの追加の変異のそれぞれについて、症例報告数を、図３の表に示す。Ｈ６２６Ｒが、Ｒ１２４Ｌに次いで４番目に多く見られる変異であることは、注目に値する。この所見は、ＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィーの診断のための拡張パネルにおけるこの変異の包含を裏付けるものである。Ｍ５０２Ｖに関連するＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィーの４つの症例のみが文献（補足資料）内で報告されているが、Ｍ５０２Ｖについてヘテロ接合性変異が１つの試料において検出された。したがって、これは拡張パネルに含まれた。
【００８７】
文献において報告されている症例から、既存のパネルへの６つの新たな変異の追加は、世界的な検出率を７５％から９０％に増大させ得る（図２）。利用可能な遺伝子検査への追加の変異の追加は、理論上は、南米において３２％および北米において３０％だけ、検出率を増大させるであろう。検出率においていずれも１３％の増大があった欧州およびアジアは、提案された１１の変異パネルからも利益を得るであろう（図２）。
【００８８】
実施例２：世界の利用可能な遺伝子検査データ解析
【００８９】
２００８年以降、世界中で６００，０００を超える試料が利用可能な遺伝子検査によって検査されたが、試料のほとんどは韓国および日本からのものであり、ここで、検査は、屈折矯正手術前のスクリーニングに使用されるものである。世界の検査データの解析は、韓国における検出率が１０，０００人中およそ１５人であり、これは８７０人中１人という報告されている有病率と厳密に一致することを実証した１０。日本におけるＴＧＦＢＩ変異の検出率（１０，０００人中３人）は、韓国におけるものよりも低かった。韓国では、検査はすべての屈折矯正手術候補者に対する一般的なスクリーニングとして施されるのに対し、日本では、患者は最初に厳格な臨床診察に供され、角膜異常が検出されなかった患者のみが、遺伝子検査に試料を提出される。
【００９０】
韓国および日本における診療所／病院は、遺伝子検査が屈折矯正手術の実践ガイドラインの一部を形成することから、それをスクリーニング目的で使用する。米国において、一部の診療所／病院は、視力矯正手術のための術前診察中のスクリーニングに該検査を使用するのに対し、その他は、臨床診断のための確認として、または患者の角膜において認められた欠陥について外科医が何らかの疑いを有する場合にはＴＧＦＢＩ変異を除外するために、それを使用する。欧州の診療所は、該検査を主にこの種の臨床確認のために利用する。
【００９１】
実施例３：６つの追加の変異を加えた拡張パネルの評価
【００９２】
２０１６  ＵＣＬ、ムーアフィールドの角膜ジストロフィー研究のような数少ない集団研究が、ＴＧＦＢＩ遺伝子全体に対してサンガー配列決定を行った。この研究は、所与の集団におけるピックアップ率を強化するために、６つの新たな変異部位の追加を評価するためのデータのセットを本発明者らに提供した。手短に述べると、研究は、９１の無関係なＴＧＦＢＩ角膜ジストロフィー症例からなるものであり、このうち６８は上皮間質ＴＧＦＢＩ関連ジストロフィー（ＲＢＣＤ、ＴＢＣＤ、ＬＣＤおよびＧＣＤ）の診断を有し、２３は両側上皮基底膜ジストロフィー（ＥＢＭＤ）の診断を有するものであった４。英国人集団については、６つのＴＧＦＢＩ変異のセットを評価して、５つの変異遺伝子検査と組み合わせたこれらの変異が適切であるか否かを決定した。データは、英国コホートにおける検出率が９０％から９７％に増大するであろうことを示した（図４における表）。検出率をほぼ１００％に増大させるために、図４の表からのＶ６２５ＤおよびＡ６２０Ｄなど、他の候補変異が考慮され得る。この所見は、利用可能な遺伝子検査への６つの追加の変異の包含が、ピックアップ率を増大させながら、英国人集団において見られるいくつかの重要な変異を依然として免れるであろうことを実証するものである。
【００９３】
元の遺伝子検査により陰性と出た臨床的適応を持つ１９の試料のうち１６は、依然として陰性であった（全体の８４．２％）が、一方、３つは拡張パネルにより検査で陽性と出た（全体の１５．７％）。遅発性のＬＣＤの臨床診断を受けた母と息子のペアのＷＥＳ結果は、ヘテロ接合性ＴＧＦＢＩ  Ｈ６２６Ｒ変異について陽性であった。並行のリアルタイムＰＣＲ検査は、同じヘテロ接合性Ｈ６２６Ｒ変異を示した。第３の試料は、Ｍ５０２Ｖについてヘテロ接合性であることが明らかになった。サンガー配列決定で結果を確認し、その後の患者病歴により、患者が左角膜に非常に小さな角膜瘢痕を有することが明白になった。角膜ジストロフィーも混濁も家族歴はなかった。
【００９４】
文献におけるエビデンスに基づき、利用可能な遺伝子検査に６つの変異を追加することにより、検出率を１５％だけ増大させるであろう。これは、本発明者らの試料コホートについての検出における１５．７％の増大率（１９の試料のうち３つ）と合致する。地理または人口差は検出されず、したがって、新たに提案された６つの追加の変異は、本発明の遺伝子検査の強化としての世界的な使用に適切である。新たな変異は、変異検出率を大幅に改善するであろう。
【００９５】
拡張パネルにおける６つの追加の変異の存在について１９の試料の検査は、拡張遺伝子検査が、ＴＧＦＢＩ変異の検出可能性の増大を有するであろうことを証明した。
【００９６】
実施例４：変異の多重検出
【００９７】
第一に、図５Ｂに示す通りの変異のそれぞれについて、バージョン１（Ｖ１）プライマー、正常配列を持つＶＩＣ標識プローブ、および変異配列を持つＦＡＭ標識プローブを組み合わせて、変異を検出した。Ｒ１２４Ｓ、Ａ５４６Ｄ、Ｈ５７２Ｒ、Ｇ６２３Ｄ、Ｈ６２６ＲおよびＭ５０２Ｖのそれぞれについての検出は、成功した。第二に、図５Ｂに示す通りのＡ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＧ６２３Ｄ変異のそれぞれについて、Ｖ１プライマー、正常配列を持つＡＢＹ標識プローブ、および変異配列を持つＪＵＮ標識プローブを組み合わせて、変異を検出した。Ｇ６２３Ｄ変異の検出のみが、成功した。第三に、図５Ｃに示す通りのＲ１２４Ｓ、Ｈ６２６ＲおよびＭ５０２Ｖ変異のそれぞれについて、バージョン２（Ｖ２）プライマー、正常配列を持つＶＩＣ標識プローブ、および変異配列を持つＦＡＭ標識プローブを組み合わせて、変異を検出した。Ｈ６２６Ｒのみについての検出が、成功した。第四に、図５Ｃに示す通りのＡ５４６Ｄ、Ｈ５７２ＲおよびＧ６２３Ｄ変異のそれぞれについて、Ｖ２プライマー、正常配列を持つＡＢＹ標識プローブ、および変異配列を持つＪＵＮ標識プローブを組み合わせて、変異を検出した。変異はいずれも適正に検出されなかった。第五に、単一の反応混合物中で、変異の異なる組合せを検出するためのプライマーおよびプローブを混合した。
【００９８】
下記のＰＣＲマスターミックス体積計算およびＰＣＴ条件を使用した：
ＴａｑＰａｔｈ  ＰｒｏＡｍｐマスターミックス体積；検査１回あたり２．５μＬ、
Ｍ５０２Ｖ  Ｖ１プライマーフォワードおよびリバースプライマー、ならびにＶＩＣおよびＦＡＭプローブミックス体積；検査１回あたり０．０５μＬ、
Ｇ６２３Ｄ  ２０  ｐＭ  Ｖ１プライマーフォワードおよびリバースプライマー体積：検査１回あたり０．０５μＬ、
Ｇ６２３Ｄ  ５０  ｐＭ  Ｖ１  ＡＢＹプローブ体積：検査１回あたり０．０２５μＬ、
Ｇ６２３Ｄ  ５０  ｐＭ  Ｖ１  ＪＵＮプローブ体積：検査１回あたり０．０２５μＬ、
水体積：検査１回あたり２．３５μＬ、
ＰＣＲ蛍光検出増幅サイクリング数および条件：
サイクル数：４０サイクル、
サイクリング条件；
ＰＣＲ読み出し前（保留状態）：６０．０℃−０１：００分、
保留状態：９５．０℃−００：２０分、
サイクリング状態：４０サイクル、９５．０℃−００：３０分、
ＰＣＲ読み出し後（保留状態）：６０．０℃−０１：００分。
【００９９】
単一の反応混合物における変異の異なる組合せのためのプライマーおよびプローブのうち、Ｖ１  Ｍ５０２ＶプライマーならびにＶＩＣおよびＦＡＭプローブのみが、Ｖ１  Ｇ６２３ＤプライマーならびにＡＢＹおよびＪＵＮプローブとともに、図６Ａおよび図６Ｂに示す通り、単一の反応混合物において両方の変異を首尾よく検出した。Ｒ１２４ＳおよびＡ５４６Ｄ、Ｈ６２６ＲおよびＨ５７２Ｒのための試薬の組合せは、変異を適正に検出することに失敗した。
【０１００】
下記は、ＧＲＣｈ３８．ｐ７ホモサピエンス形質転換成長因子ベータ誘導（ＴＧＦＢＩ）、染色体５上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２６４６．１（配列番号６１）を示す。
1 agagggaaca gaagcatcta ggagagattt ggaaagaaca cctgcaggat cttggtgact
61 gattgcacgt gggggaccag agagcaggga caggcaaaac tgaatgcaag gtttccaacc
121 ttgagcggca ccacaggcaa gaatgaagaa atgaagaagg ggagctggac gaaagagcca
181 agggatttct gcattttgga atgaattgct gctgggtggt gtccatttcc ctgaaggcct
241 ttatcctacg tgcaagaaaa ctcgtgggaa gcagaggaaa ggcatgtgta agccaacaat
301 catctgtggg catccttcca ctaaagtatt tgaggtcagg caactaaagc aacctcaaaa
361 gtgcctctgg attcttctta gatattttag ctgagccaaa tcaatgaaac tctcatgaaa
421 aatcggtttc cctggaaaat gaaattgggt tctaaccaac aagtagcatt tggcaggccc
481 tgattaagaa agccagtgtt tggagaagtt gtgaaaacag ccaagtcatt taagaaacta
541 aacactgggg cctaatgcca ttctagggct gcgacggctg ttctgttccc atcaattgca
601 gagcccgaag cctcaagttt gttttaagtt cctgccatta caaacctgtc gattatccca
661 gcctcccttg cgggctttga aaagagagaa gaatggaagg tgactgtggc caatttcccc
721 tccctgtcca gtgtgtggaa gacactgaat atgcaactac tgaccttgtg cctgggcatc
781 ttgaaggtct tccacaaagt gagctgggcc tcagcggaag atgagagttc ctctgtggtc
841 acttcactgg tacacatttt caggtgtatt tcgtttcttc catgcctaca taaattgaat
901 cctctgttaa ccacctctga gctcatagct atttaacatg accctgtagt cctgtgcata
961 caaatcacct tgggatctgg tgaaaatgca gattcagtgg gtcttgggag gttgggaggt
1021 tataagattc cacgtttctt catgagagct agaaaaaata aataaataaa taaaaaattt
1081 ttaaattttc cacatttcta atgaactctg gggttgtgct gatgatgctg ttttgcagat
1141 cacattttga gtggcaagac tgtggaaaat ccttgagaaa tcaatccaaa atcccctaaa
1201 tggtactaca atcacacctt aatgttagta aactgagatg tttcttacct ttatttgtaa
1261 catggaaaaa acaattactg tatatgaagt accattctaa gttctgtgtg ttacacaagg
1321 gatggcaatt ttccccaaaa tttgattcac atcttttcat ttggatatct cttgccaaaa
1381 ctcacctttt tttctcccta gcaagtcttg gggagctgaa ttttaagagc tctttattta
1441 gctatatggt ggcctctgaa aatgattttg actgtatctt ctgtctccat gtatgcccaa
1501 gcatcaccag gaactttagg gagtaaggaa aaggcaggcc tggtgtcagc tgggctgcag
1561 atgccagctc tcccaccaac aggcccagaa ccagtttctt tcctaggttc ctttgtgaag
1621 aacttgttgg aactactaat ttatcatgat gcataaagct tgttgtcata ccctacagta
1681 ttattttcaa aacctgaatg tttttggtga cctttcatgt gccacaaaat gtaaaagcag
1741 tcatttttta aaaagtgctt gaaaaagtct agtaaagatt cttccaagca agcctcactt
1801 tctcctgttt agattgttta atctggaagg aaaaaattct ttctcaaatg acagggtttc
1861 tggtgctctg tgtttgcctg gttggctctg ggtcatctgg ggatggaggg tccctgctct
1921 tacctccagc agcatcactc ttgtctccaa agaagcagca acctcaggtg ggagaatggt
1981 tatactcaca gcattctgct tttcatgttt gaaagagggg atgggtggtg gggcatggat
2041 gtgggatttt aaaaaaatat ctaaaccata aataaagtat tactgcaatc tctttactga
2101 gctcatggaa aaactcaagt catcgaatgt tagttttgca gactggagaa gtgaggtcca
2161 gtgaacttgc ttgacttgcc ctaaatcttg ctagagagag agctggaacc agatggcagg
2221 gctcctggcc tcttacatac aaggagcatt tttcctagaa actgcaatgc agccaaattc
2281 tactggtctc aggggaaact tgttctggga gtcagcctga gcttgaatcc ctttgggttc
2341 ttcccattat cctatgccaa gcagtcatgc tgaaaccgag aaatgttttg ctttcaataa
2401 atgaaatgag cattttcaga taattatttc tgtagttgct caaaactatc atattgtttc
2461 attgaaccct actatataga acaatgactg gggagaggta ataataataa tagcaatgca
2521 tatttattgg ccattttact tgaattgtat catgtaatct agtttagagt cctgtgaggt
2581 aggttttatt atcctctcta tgaggttgaa taacttgccc aagaccacac agctaggaag
2641 tagaaagact ggtatttgaa cccatcttct ccttttcttc tccttcctcc tcctcctctc
2701 ttccaacacc tgctcccaag gaagctcatc cagtgcatga ctttagctac cacctgctcg
2761 tagtggtgac tcaaatctgc atctccaatc ctcataccta tcctgagctc aagacctttg
2821 aatatagctc cctcctgtcc atccctcctg gaaatgcagg tggcttgttc acacataatg
2881 tgaacacaaa tggagcactc tcctcacaca cccaaatgtg caccttcacc agcgtgccca
2941 gcacaggcat cccttcctgc cagctatgag cctcgaggtt agctctactc cccctcccta
3001 accctgcatg cccaaggggt ttccaagtct aatcaatgct accactaaaa tctcccatac
3061 acctgttccc tcctctccac tagcttgatc actccccatg caggccctca gttgctttat
3121 gctctcagta ggccctcctc cagtgcccac actctctccc ttctccttcc caccttcttt
3181 ctaccagagt tctaacctct ccaagccccg cttgtctttt tctttccctg gctgccatcc
3241 taactcgccc cttcccttct cagacaagct tctacatgct actcatctct ccatcaaacc
3301 accatattcg ggctttggcc atctgctctc cacagccaag tccccagtgg cctctctgct
3361 tctgacacag tgaaagccat tcagatctgt cttgttggca gcattcctca ctttgagcag
3421 cgccctccta ctaggatacc cctccttgac tacaacccca cattctctac ttcctgggct
3481 cttctgtcac tggaggatga ctcccaggtg tgaatcttca tcccgcgtcc ctcactcaag
3541 cccccgatcc tcatatccag ctttatcctc atgggatgct tcaccaggat gagtcataag
3601 cacctcagac tcagggtgtc ccaaaccact catctacctg gcaagcctgc actctgcatg
3661 tgcctcattc tgaacatggc accatcacct gctgcaatgt ccagaccaca aacaccctac
3721 aatatccttg actctccttt ctccccttct ccctgtatac agactccaaa ttctattgag
3781 actattacct cctacacccc tcacatttgc ccagccttcc ccatctctgc ctctaccacc
3841 atagttcaag ctctcccatg gtcccttcct ggttacctgt tcttcttgcc tccttaagcc
3901 tctcatgaca ctggccatgt cacttgcctc cacccatcac ccgctaggct cttagctgga
3961 gtctgggccc tgctaccttc ctccccttct tccctaccct tgactccacc tccctgtgct
4021 tcagccaacc agataacttg agtttcgtga atgcatgcct cagtttacct gattaactca
4081 ttttcatctt tcaggcctca gagcaggtat caccctgtca gggccaggtg cctcttctta
4141 gctcccaaag ccccagctac tcttcatgga acatcattgg cttgggctac ggatcttccc
4201 aaattggagc tttttcacaa agggcttagg tctcactcat tctattaatc catctgtgtc
4261 tccccagggc tagcagtgcc aagtaactga caggtgatta atagatgctt gggtaagtat
4321 cacctcttta ccatgtgaca atttgtttac ctgccttgag ctcctccagg gcaggactct
4381 tgcctttgca gaatctatct ggcaggtact gttgcagaga tgtttactga agaagggaat
4441 gaattagtac caaggtgagg accccaccct tccccacggg ctccaaaagc agcttagagc
4501 ccaacaaaac ctgccccaca tttttggcgt ttctgtggat cacacgattt actcatctgt
4561 ctttcaatga gcatgacagg tggggtgggg gtggagggat tagagattga ggagctgggg
4621 agggtggtca gctcctgggg tgcagaaaca agtctgatgg gccatggtgt tctgggaatc
4681 agcactgcct cccctcaccc ctccctgcag tgttttgtag cctcaagatc agtgagggaa
4741 tcttcgggcc cccagcatgc aggaccgaag cccccgagac agctgtccct cagtcccaag
4801 gtccccattt ggaagcagcc acaggaggcc taagggacct atacccttgg tttgaggaag
4861 actgtggcga gggagagagg gagggagggc tggcagtgag ggcaagggct gggaaaactg
4921 agcacgggca cagtgcggga gcgggtgggt gcccagggca gccaggggcg cacgggttgg
4981 gaggcgccag gcggcccgcc ctccttgcac gggccggccc agcttccccg cccctggcgt
5041 ccgctccctc ccgctcgcag cttacttaac ctggcccggg cggcggaggc gctctcactt
5101 ccctggagcc gcccgcttgc ccgtcggtcg ctagctcgct cggtgcgcgt cgtcccgctc
5161 catggcgctc ttcgtgcggc tgctggctct cgccctggct ctggccctgg gccccgccgc
5221 gaccctggcg ggtcccgcca agtcgcccta ccagctggtg ctgcagcaca gcaggctccg
5281 gggccgccag cacgggtaag ccgagccgcc tggccagggg ctgcggaagg tcaggtagtc
5341 ggggctcgga gcgcaagccg ctgggggcat tgaactgggc tgggggcgca ggggacaaag
5401 cccgaactaa aaaccttgca gcatggagcg ctcggacacc agccctgcac gcggtggaag
5461 gagagaggga gggaggtgga ggaccatgga gggaaagcgg gaggccgccg ctttgtagaa
5521 gggagtgggg aagtggacca gagactttcg acgcaggcca agagcctgag acggacagcg
5581 ctttcagctt ctcctcccag ccactgcaga aagggggaaa tggcaactct ttggccataa
5641 tcaccgtggg agggtgccaa gggcaaagcc cacccagcag tacacctatt ccaacccagc
5701 caggcccccg gccagcgact ccagacaaga acctgggcca cacacggtgg cagcatctaa
5761 ggtgccccag gctcctgtgc tcctggccag gccctgcact cagacactgc tggcacccga
5821 cactgctctc tgggtacagc aagggcaatg tggcacttct tgtcctgccc gatgaagagc
5881 aggagaatgc actgggccct cacacacact gttcaaatgg ggaaactgag tcctgagtgg
5941 ttccactttc ccacagtcct gaagtgtgca ctggagccag gattggagtc tgtcttaaag
6001 taatagctgg gtttgtaaat gtaggacact atcattgcag gaattccttt gagaccctga
6061 agatgtgttg gctttaggag acaaactcaa gcagaaggtc tggtctgata gtggccctaa
6121 tactgaccca ggcagaggca ggcaacattt ctacctcaaa aaccaggcca tacctgcgtc
6181 acaaataccc aggctttgct gcagcttcca gcctacctgg ttgcaccaac ttctttttca
6241 taactaggta aaactatata tgagtagaat cttgtagtga ctcctcagag gaagcctaaa
6301 taccatcggg gtctggcgtt cacacccaca agcaatgccc aaacctccaa gagactgggc
6361 agatctgtgc tcaaatcaaa actcattgtt gggggtgata gagttgactt cacaggccct
6421 gaaagtcttg gctccttgca ctaggagtgc tctgggtacg ggtacaggct gccccttgta
6481 gggcatagtt gctcttgttt cctctacttg tggctttatg gtctaggcct ttcaggagtt
6541 tggggctctg gcggagaggg cctgctggga gcacatctgg ccaccctgca gagtgaaatc
6601 aaaccaggcc tggctgcaac ctcaacaccc tcctggaaag aggagaatac tggggatatc
6661 ctggggtctt tctggaagtg ggagaatcag ctttgacttg ggcagtgtgc agaatagagt
6721 gaggggggat gtcagaaaga tgagagggat atgaggcctc aacatcaaaa tgcaagcacc
6781 tggcattttt attatctctg cccacctctc cgttggtctc tctgcctttc ctgccaatga
6841 attgtgttat gtttgggtgc ctcaatttgc ctaggagggt tctatttctt ctgtatcttc
6901 gccactaagt caggagaaga tccttatagc atgccctgca acagtgtcac ctgtaagggc
6961 atctctctgc acagccacag tgaaggatcc tcaaaggtat tgagggcttt ccatcaagag
7021 ccatctttac agcaaacctc tttcccttca gagcccagaa gagtgctgac cagctggaaa
7081 acagggtttt tttcttaaat gcagatgctc ttgattatga gttccagata ttagatcaac
7141 ttccccacca tacccctgca ggcaaagcct cttaattagc ttcctgcagc acagctggaa
7201 aggcctattg taatctgtga tgggcagagt aatctaagaa gtcacaggag cacccctgtc
7261 ccagtagaat ctggatgcgc aggcacatga accatggcaa aatggttgca ggcacagttg
7321 tatttactct gatctaactg tccctgttaa tgccacaggg ctgcctggcc tggcacacag
7381 ggctgtggcg ccttgtgcaa atggataacg ttgttctagc tccagccttt cattcaaagt
7441 gaaaactgtt agaaagggaa ggaaaacttt gctattttaa ggaattgtag cgtgctgcct
7501 gatatgaagg aagaaataac agctgtgcct tgcttgtgcg cagcactcga ttgccgcttt
7561 tgctttcgac ctcaccacaa cacagtgaga tctactgttc atgttcccat tttacaggag
7621 gtgaaactgc agcttagtga ggtagagagt gacttagttc agacacagaa tgctgttggg
7681 agagtaataa ctatgatatg gtctcttgac tcccagctat atctgtgttg ctatagggaa
7741 ggggaaaaat aatactgaaa gagaagtaaa aatacaatca cacttccaaa catcaaccac
7801 caaaaactga actgaatttc ctgaagcact tggttttcaa atctaagctg aacatcaatg
7861 ctgttattct tgaggcccag aagcaacttg ctcatttcaa ttaagcttca gcatgaactt
7921 cctatgtaca cagcccaccc acactccccg atgtgagaag gagagggtca cagccgcccc
7981 cagcctctgc tgctgccaca aggacagcag cagtggaaac attcagcaaa ggaatgttgg
8041 agccacatcc acaagagact cactgaagat tcgccaaacg cctacggaaa gtggcaggga
8101 attcattgac agtaattgtt tcctgcttga tcagattgaa gagcttctgg gattctgtaa
8161 caataaatag gaccgggggc tggagtatgg ccagcaagga ctcttcaggg gttattcagg
8221 gactgtctaa cctgtgaatc ctaggcagca aacagaaacc aggtattcag aaatctggag
8281 gatttggtca ggcccagcta ggactaggga ggcatgggcc tctgctggct gtggtccctt
8341 ctccagcctt cacttctctt gtccctagat ccttacatgg attcattaat gctcattgtc
8401 cctcctgggc ccactcactt tcacctgttg aacaaaaaac tggccaagag gtgacagtca
8461 tatcaccgca gaagagacag ggcagagaaa tgaaggggca gaatggactc ccacccaaaa
8521 gcctgactct gaatatttga gaattgttca agttcctgca gaggaatcat gatggggaca
8581 gtaggtgtag tttttactgc aatattggtg tcttcttaac aaatacgctg cacatcaagt
8641 gatgtctgtg gatggcattc ttaaagtaac agggaaattg atgttaaaga aatacttcat
8701 cctttgggtg atacctgaag ttctctgagc ttggaggtct tgtgaaagcc ctcagtattg
8761 tttgttttat ttgctttcct ctgacttgtg attcagtcag atgcatgcct gcctctggct
8821 caggaagatc aaccctctcc tgactgacca cgcctctcct gactgaccac gtagcacagc
8881 agcttccttt ccctaggggc tcctaatgaa gctttcacaa tcacctggcc tgagcacagt
8941 ttgggtcagg acttggtata cttgaaaaaa acatgcaaaa ccaaaatcct gtggttctgg
9001 aaaaggcttc ttagcagaac ccccagacat ttacactctg ctttttcaca gggtccctga
9061 ggattctttg gatctgggta gtttggggag cagtattttc aacaagttca tttcgtgctc
9121 cttctacacc ctgcctggat gctaggcccc atctagaatg tgaacaacag aacaaggcag
9181 aacacttgtc ctcaaggttc tgttgagtgt tagatgcaga gaagagacac cccccacctc
9241 cccgcatcac ttacaggaat tctgtttgga acccaacatc aaataaggac cgtatccact
9301 gtcagaggat gggaagcagc atgtcatctg ggacattgga gaaaggctcc tgggggaagt
9361 gggacttgag ctgtgatcta agtaatgaac aactgagagt taaatgggag agcatcccct
9421 atcagggtcc tgagagcaac cagccatggt ttaaaccagc tataaagcct cgggtttata
9481 ggatagacag taacaatggc ttgtctttgg gagccaagca gctggtccag gcatgcagag
9541 catgtctgta tggagagctg cctgagagat gcttttgttt acacttatca attgcccatg
9601 tcaaagaagg atatgtacat gaagttacat cagtatgtaa gagagatttt aacaattttt
9661 gcaggggaag ctttcatggg ggctgatggg aatctaggta aacagaacca aagtctaaac
9721 ccaagatatc cccagtacca agactgaaat gactctctcc tctatctcta gaaagttcca
9781 gtgacccaag gaggcaaaca cgatgggagt cattaaagtg gggtggacgt gctgatcatc
9841 ttcctaattc tgctgctttt gttttcagcc ccaacgtgtg tgctgtgcag aaggttattg
9901 gcactaatag gaagtacttc accaactgca agcagtggta ccaaaggaaa atctgtggca
9961 aatcaacgtg agtatctgta accagccagg agaccaagct gtatgcacgc tggctgcagt
10021 tccccagggc ctgggccagc cttctagaag gtcaggttgc ctaaaaagcc atgaagatgc
10081 atgtgcgaac atgtctggga cctgcgtgct agggagtggc atttttagga agctggccaa
10141 ttttgttttg catttttaag gctgctgaca agacttggag acatttttca gggctggttt
10201 gggtttgcaa gaaacatgaa acactgcgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tctcaatcct
10261 cataaaataa tacagatatg cagtggagaa gccaccagca tgtgactctg gaaaagaaag
10321 cccattggtg aatctgtact aaagaatgcc atccctatct tacagtccta aggtaaacac
10381 cccaaaaaga cttagagcac taaacatatg cagattatga gacagcatag catataatat
10441 ttgcacagac ttcctcattc aaaccctagc tctacctggg ccagtcgatt catctttaga
10501 accctccatt gctttacctg aaaagttcgt ataacaaaag gacccacctt atggggttgt
10561 tacaaggatt gaatgaaata atgtacataa gagactgaat atggtgccca gcatatatca
10621 gtgctcaata aatgctagct actattatta ttatcaccct agatttgcaa atctagacca
10681 cacaagcaga agtaagagtg ccaacggggt gtggaccagt gtggttacaa tagggcttgt
10741 tgatgtctgt ttcagcaagg agggaggcag cttttacccc actgcccagc tccctggtgg
10801 aatcaggtgc atgttctaac aattctgggg aaacctaatc tgttttggca ctgtcaacag
10861 atctcaaagc tggctgtctc ctatagctag gaagatgtgt atgacaaatc tcctgagcca
10921 cttgtgaagg cctgaccttc ctcctgtctc catacataat gggatgatta agaaactcta
10981 agccactctc ttaagcactt ttcaatgtta gggattttta agtttattgt tgtgacattg
11041 cttttgagca gacatctcct ccaatttaat agccaactga aagaagagaa aatgctcttt
11101 ccttaaactg tatgtggaaa taaatattcc aatgtgtgac cctgattatg ttaggcaatt
11161 agcaatccta atatgaattg agggaagttg ggattcatgg cacagctggg gagataccag
11221 cagtccctgg gagcctgtcc agggcaggtc catggcagct tgctccatgc ctgattgaca
11281 gcccagcctg caagctaaaa gttgagtgag ctaggaggac acactgccaa gattcagcta
11341 acagacaccc agcgatattc ttgctgctat gaacaaaagg agactatgca aattatacac
11401 cacccattct tccaggatgc ctgacttaaa aaataagaaa aaagatgggc cgggcacagt
11461 ggctcacgcc tgtaatccca acactttggg aggccgaggt gggcggatca caaggtcagg
11521 agacagagac catcctggct aacatggtga aaccccgtct ctactaaaaa aatacaaaaa
11581 tattagcggg cgtggtggcg ggcacctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgaggcagga
11641 gaatggcgtg aacctgggag gcggagcttg cagtgagcca agatcgtgcc actgcagtcc
11701 agcctgggtg acagagtgag acaccgtctc aaaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaagaaaac
11761 ctttagtact gattgatttt ttcccatgtg tgtatattat ctactcaaat taacaattaa
11821 ttacttaatt aaacacaaag ccaggcctca cctaattgct tcttggaagg tgaccagagt
11881 gctagtgcca agcaaacaac tcttctatat ctcaagagcc ctgggcttca gagggccatc
11941 ttttttgtta attcaagttt ctctgaaaat ggagacccgt ttatgatgac aagctggcta
12001 cagggtagca tctgccacac tgtttcgggg gtgccgctgg gctgaagcat ttgcccagct
12061 agttaacaat agctcgataa cattccctat cagtgtccag gctgagaata ctgtcagtga
12121 tgagtcgcct tggctcttgt acctgtatct ttgtgtgcca ggacaaggca caagcaacag
12181 agctgtgtgt tgccaaaatg ttcctgatga gcaggtcaac ccctcggggg caggtttgga
12241 tatgataatg tggtgatgtg gtggcgcagc tcccttaccc agtgagcaca aggggagtcc
12301 tctaggaaaa ggaagaaatg tctggatgag gtggggagat ggggttcaga gtggactcag
12361 gcaaagcccg atgcccagtc ccagctgttg gcctagtctc acaaagccag aaggatatga
12421 catttacatt caactcttga atttgtggcc actgctttgg gcaacttcaa agagagaaaa
12481 tgaagataga aaaatattat ttgatataaa acttctagga caagagaggc ccttcctgga
12541 acattacatg tagtattagg aaggtggagc tgccctggaa aagatccaga gaactcagag
12601 agaggaagag gtggaaccca tctctgttct tgtagagagc tcagtaagag tggcttggca
12661 gggctcctgt gtacctgaga ccaagaccag tgaggaggct actgtctgac caccatacgg
12721 tcagaattca gtgccatggg tggtcaggtg ggaaggggag aggactgtgc tggctggagt
12781 tgatgttatc ctggggaaag taggtcccta gatgccttta gttgagtgag gagcagactg
12841 ggaaatggga gcacagtagt ggttggggca aaaaggactg tctctgcatg aggtccatag
12901 gcagttggaa ttttctcagc aagactccag agaaggaggc tggagcagag gtgtatgttg
12961 ggatgaaaag gagtaaagta tcatggggga ggaggcagct caggttgtca agggtcaaga
13021 aaccagaagg agaatttcac cttggaagca gacaacgggt accaagcata caggggaata
13081 ctttgtggtg agaggtcaca cagagataca ggagccgacc tggtgagaca ggagcctgga
13141 gccacctgcc tgcttttgtg aggccccaga ctccactgct atcatcaggt gaagctctgt
13201 tgcctgcaca caaaagcttt tctgcattta caaagagaga agggcctgag tttctggtgc
13261 aatgcgtcaa gctgacatat ggactttatt acaggaagtg gttaccagtg ggtccctatt
13321 tagtggctgt tattgtgaat tttattgttc ggaaattcac tttagcattt atttcagatc
13381 ctaaatagca ccggagtgat acaatggcta atcaaacaaa gagggctgtg gggagcagac
13441 agtcagcatc cccctctgtg atttcaggcc ctggtttgat tagtagccat aaaatttttt
13501 acgtgtggca ctttgagcaa aggtgcagga aattgtggtc aggaagcctg gctgcctctc
13561 gacaggcttc ctttgtgcta gccccaggga gaggaggcct atttaacagc caagtccaag
13621 ttgacatcat gggactggaa tagtcatagc aggagctcag acatcataaa cgtggcatag
13681 ggagggctgg tggaggagct agcgggtatg ggtggcagct attcattcca aaagtcttga
13741 aattgtttca cgagcaacac atttcacaag tgcgaagccc ttctctggag ccaagatgag
13801 ctggcagagc actcctgttt ctctagtagc aagtgttcct ttgcccaggg gcaaaaatat
13861 taatactcct tcagcactgc attaatgctt aaagatttaa cttttaaaga gatcagctgg
13921 tgcatggtcg agcttttcca tcagctggca gggctttttc agtaggtgtc cttctgggca
13981 gggcactggg gacagctgac gtgaaggtga agaagagctg tcgttttcct cccttatatc
14041 ccacaacctt ggtcccaaga ggaaaaaaaa gaagatggtg agaagtcatc caagcagacc
14101 ccagacccat actagtgcct cctttcctgt ttcatatccc tgtgcagcca gctgggatct
14161 cttgaataat ctgctctggg ggcactgaga ttggacatac accaaacagc ggagatcgac
14221 caaacgcctc tgttgggcag tgtttcctga gggttctgtc ccattctgta aactaggagg
14281 ctgactagct gacaaggaat tttattctgt tgggtattta catgaaccta tgtgccacct
14341 ggggtaagac cctgtggtag gtagaaacat gacttcccaa aaatgtccac atcctaatct
14401 ctaattctgt aaatatattc ccttactgga aaaagagact ttgcaggtgt gattaaatta
14461 aggatcataa gagggagaga ttatccagga ttatttgatg agtctaatat aatcatcagg
14521 gtacttaaaa gagggaggca ggctgtgcct ggtggttcac gcctttaatc ccagcacttt
14581 gggagactga ggcgagcggg tcacgaggac aggagttgga gaccagcctg accaacatgg
14641 tgaaactccc cctctagtaa aaaaaaaaat acaaaaatta gccaggcatg gtggtacaca
14701 cctgtaatcc cagctactca ggaggctgag gcgggagaat tgcttgaacc caggaggcag
14761 aggttgtggt gagctgagat cgcaccactg ccctccagcc tgggcaacag agcaagactc
14821 catctcaaaa aaaaaaaaag agggaggcag tgggatcaga gtcagagaag gcaacgtgat
14881 gatgaaagct gacatttgag tgatgcaacc acaagccaag gaatgcaggc agcttctcaa
14941 agctggaaag gacgagcaat ggattcttcc ctacagcctc tgtgaggaat gcagcctttg
15001 attttaaccc cataaggccg atttctgact ctagcctctg gaattgtaag ataatttgca
15061 tgatctcaag ccactaaatt tgtggtaatt tgtcacagaa agcaatggga agccaacaca
15121 ggccttattt gttgacttat agatgcattt ttctttattt caatgtactt ttatcaatgg
15181 tctcatgtag ggtattgctt tcaatgaaga tattaacata gtttcaactt taaggtttat
15241 atctggagtt tctttagaag cttcacaact gaccacttag taaacagtaa gcatctgtta
15301 agtgcttctc atatgtaagt tcattcaatt ctcacaatca cactataaga taaatatgat
15361 tattagccca tttacagatg aggagacagg ctcaaaagac ttttatgcaa cctggtcaaa
15421 gtcattcact ggtaagctga ggaggtctgt ccacttcctt ttgctgcccc cagggggtat
15481 caagcctggc agttagtgtc agcgacttag gaggtgaaca agtgagcagg cctgtaggac
15541 ctggctaaac tgccccaggt ctctgtctac agcctcaaac ctgtggctgt gggtcccaga
15601 gacaaggcct cctcagcatc agagaaggat gcctttgtct cagggtcatc aaccttctcc
15661 aggttgctca ccccctgctg taaaggggat ccccaagacc gctcatcaga caaggagctt
15721 gggaactgag gagacacagt cagcctccag gagtgcccaa aatgccctca catgctgcat
15781 acagattgcc acaaataaag tacatccaca ttctgaagac tctgtcctca tcaccaacca
15841 ggctggcccc tggtgagggc tgtagtggtt gaggcctttg ttggtagaca gtaggttaaa
15901 gcaagccatg attttctatt gggaggcttc agaatcagct cagctgtgtt tccaagacca
15961 ggagggcaga aagcaaacca tcccaggcaa gcagtccatg ggccatgtca gatgtctaga
16021 cgttatgggt ctgtgtttgc tctgccattc ctctcggaaa ctatgatgcc ctgtatggtt
16081 taccttcagt cacaggtgac tggcctacag ggccattcct tgttccaacg acttctcgag
16141 tataattaat ccccaggcat ttacggccag agcagccggc caaatccgtg aagtgcagtg
16201 gttgttttaa attatattaa cttcttggaa acttatttta gggagagaaa actcagtact
16261 tctctctatc caatcttgag taaaaatgtt agaagggact ggtggagagc ctcccagaca
16321 tccctacaca tagactttgg gttgacatta tctctttgca ccttccttga aactttcttc
16381 taaattaggt gccttcccta atttaggcac cttcccagta ctagtctgtg acctgttagg
16441 aaccaggcca cacagcagga gttgagtggc agggagtgag cattattgcc tgagctccgc
16501 ctcctgtcag atcagcagtg gcattagatt ctcatagcag tccgaatact attgtgaact
16561 gtgcgtgtaa gggatctagc ttgtgcattc cttatgagaa tctaatgccc gatggtctga
16621 gatggaagag tttcatacca aaaccacccc ttccccctgc caccatctgg ggaaatattg
16681 tctaccacga aactgatccc tggtgccaaa aaggttgggg accgctgtcc taagggatct
16741 gctttttctg acctgaggtt tttctttatt agactgtatc tggctgagga gaagcctgaa
16801 gcctttaatc ggaacagctt tggctgatga gattagattc agaaaccaac agattggtct
16861 tttctatgca gggaagccta ggaactgggg ggctatggct gggaagcccc ctattgtttc
16921 catcctttcc tatgttcatc ctggaggaat ggcatcagac ccatgcctct gtgattgctc
16981 ccagcccatc caaccacagc atctatgttc tgcctgggac cagggccagg gagcatggca
17041 cactgagctg agtataagga gagtggagca ggccactgcc agcccagaaa attttggtca
17101 aagttgcctg aaatcttctc agccttcgat tcacagctgc tctctgctgc tctggggcca
17161 tgcagaccag ttcagaaaag agttaatttg ttggggcagt tggaggcagg tggactgcca
17221 gctttgacac cttcccagcc cacaggctgc tgcactgggg ctgaaggcgt ggctaacccc
17281 tgcacaccta gagagtgaca gagatgccag actgggcagc aggaaggcaa gaggattaag
17341 agagagcttc ctggctgaaa gccacactcg gttaaccagg aaaaagccct tggcacgaga
17401 agactcagtg gcctgaggga ctgagccttg gttgttgggc atgtgctgca taagccatcc
17461 atgtgtgaca gtagagtgta gtccagccac tgtgggacat gggtgctgaa agaccacatg
17521 gagaggaaca gtgagtgctg acaagggcta gccttgatca ctttggagac accccctgtg
17581 tcttctagat gtcagacttt ccaaatctgt ctgctatcct ccaaacgtgc attttcaaga
17641 gcaatggaaa aaggattgga cttgatggaa tgcagcaaga gtcctaggtc tgttactacc
17701 tacctatgac cttaagaaac tccttcaccc ctcagaaccc ttacagcttt ctttctgatt
17761 ctatcctgag ttactctact ccaagctgag acttttctgc ttagatctat cccttcctcc
17821 taaaccccca acctccattt ctcctggtgt ctttctttac acacccctca gcatacacac
17881 acacctagcc acaggaacca atgagttaat atttgaggag ttggttttct tttgtcctca
17941 atgagatcct ggtgaggcca cttgagctgt tcagctccct tgcggtattt tggggatgga
18001 actcagaagc caacaatata gaaaaagagt ctttggccag ctttcccagg ggctccatgc
18061 catagagagt actgcacccg tgtgcacagg gggccctgac atgaggactt tgaggataac
18121 actattcctc caactctgct tcagcatctc catggatttt cacacagaca ctttaggaaa
18181 gaaactaagt ttggggggac ttgacctaat cccacatcac agccccagta atacagccct
18241 ggaatttatc acagaaagcc tagaatccca tgcatatccc atgcatatgc atccctagtc
18301 ctatgggttc aaggcttgga gctctccctg gatttagctg ggaaaagttg gcagacagtt
18361 cttctctgtc ttctagaaat atggactaga atcgtgagtg tgagattgca agtaactttt
18421 aaaatcatct agtttaactt caccccattt catagaccaa gaaactgaga ccagagagag
18481 aaatggactt tcaagttcac cctgctagtt actgatggat cacaagtcaa atctcctgat
18541 tctagcactg tttctcttac accacaccac ctttgaaagt gtgtcaatca aatcttactt
18601 tagttgcaga ggatgacttt agtttctgaa gataaaattg tgagtcaatc aagatgagtc
18661 ccaagacaat agcctgttta gcccttataa gttcagggat gaaaggttag aaagaaacag
18721 gatggaagga ggactggaga aaaaaacaaa agaggaagga aggaggagga agcaaacagg
18781 aaaaaaaaag aatgtgcata gcttgtcact cctcagtcat ttcctgggag cccatttcta
18841 gcaaagtgac agctgcaact ccctggccac ctgagcatct tagctgatct gtctctgaaa
18901 caccccctgg agaacagatg aatcaggctt catcttcgct taactaagtc ttccctgaga
18961 cgactccatt taaatgaaca agagcaggat ttcctgggca cactgagagc accttccaga
19021 ggcccctcca gagccctaaa gcctgtattt cttccagtcg gcctgtttct ttcctggtga
19081 tgtcattaaa cgccctttga gagtcccaca gtgagcagtt ctgcggtaaa acccgctgca
19141 attaaagtct gagtcctttc ctgtctcaaa gggcatattc atatagaaga aaggaaaagg
19201 aaggactggc tgtttgcatt tggttccagg cctgttgagt agaggtcgtg ctcactccac
19261 cgaaggtaca gggtagcctt cagcagaacc tggggatttg gttttaagca agtctttctt
19321 aggtgtgggc tttcagaaca cttccttcct tgcaatatta tttgaaattc tcagtgtttt
19381 agccgtcccc agaatattgg ttcgttaaag ctgtgtattt cagatctcca gacagtggtc
19441 actgtttgta tattttcaat ttcaaaccag aaaacaaaag ttcttattga ttactttttt
19501 tatttaaaaa ataaaaagta agtatcttcg taagaggagc tttgttttaa ttttaaagtt
19561 taaaatttga ttgtgaagac agagaaaaac ttgatgattg tagatatatt cccctctttg
19621 gctattcaat cagagaacta gaaaatcatg agagatttaa tgaccactgc ctgatacaca
19681 tatgtgtttt acagatgagg aaactgagac ccagagagat gatgaaattg gctgaggatg
19741 gcccagctgg tcagtgaaag actcagagcc agagctggtg cagggctctt tctattcctt
19801 cctgttccct ttcaggaaca ctcaccatcg gctttcctgt gaataatgtt gagataaaat
19861 ccttggtgca ttatgttttc tagtcacaac attgactagg ctgccagagt cctctgttct
19921 cccagttggt tggctgtagg tgttggcagc cgccaggagc attctacaga acagaggagg
19981 agtgagactc tccttgctca ggaaaggcag acctatgact tagcaaataa ctcctaagag
20041 gagagtgttt cacccaccat tcctcttcct tggctgtgga ggcaacttag tggagagggg
20101 ccagatgacc tgtgaggaac agtgaagccc tgcctaacac aatgtatggt tgtcttgtta
20161 cagagtcatc agctacgagt gctgtcctgg atatgaaaag gtccctgggg agaagggctg
20221 tccagcaggt gaatgaatcc tccgggcctt gcctgttggt gtgggtggaa gggaatggtg
20281 ggagagagga gtacccacat aaaaggcagc agagtgtgaa tgggggcagt ggcacaagga
20341 catggcattc tccccacgtg cccactggcc ccaggctcta tgcgaggggc tgaggaatgg
20401 aagctggaaa cagcgcattt cctgagctgc tcctcctggc ctccttacca cactggtgga
20461 gtagactcca actgtggcct gtccatgccc ttcccagcag gcacaggctc aggctcaggc
20521 tcttggcctc tgcctctggc tgggagtgat tctaaacaca tccagcaggg tcagcctgat
20581 agcccatcag tttccgatca gctctgctag agagccgatg ggatgtggga ggagggggtc
20641 actggtgggc tggcaacccc aagccatccc catctccctc tgtgtctaaa cttggccctt
20701 tggagttcgg tagggagaag agccataggc caggtgggct cacccagagt cagcagagag
20761 tcccacaaat ggttgcactg ggcgaaagac agcatggcac ctgtgaattt tattagagct
20821 tttcttttag tgctacacac aagtgactgt acaggggagt tagtattttg ttttaatttt
20881 gaaatagagt catcttttgg tatctgcggg ggattgattc taggacccat tctaggatgc
20941 catatcctca gatgttcaag tccctgatat aaagtggtat agtatttgca tgtaatctat
21001 gcatattctt ccatgtactt taaatcatct caagattact tataatacca aatataatgt
21061 aaatcctatg taagtagttg ttataccctc ttttaaattt ttgtattatc ttttattgta
21121 tttcaaaaaa tatttttggt ccatgtttag ttgaatctgt gggtgaagaa cccacagata
21181 cgaagggcca actgtattgg ctattttttt agttaagaat gtgagactga ggccaggcgc
21241 agtggctcat gcctttgatt ccagcacttt gggaggccaa gaggggacga tcacctgagc
21301 caagaattcg agaccagcag cccgtgcaac atagtgagac cttgtctctt aaagattgtg
21361 agactgggct gggcacggtg gctcacgcct gtaatcctag cactttggga ggccaaggca
21421 ggtggatcaa ctgaggtcag gagtttgaga tcagcctggc taacatagtg aaactctgtc
21481 tctactaaaa atacaaaaaa attagctggg tgtggtggtg ggcgcctata atcccagcta
21541 ctcaggaggc tgaggcagga gaatcgcttg tatccaggag gcggaggttg cagtgagctg
21601 agatagggcc gttgcactcc agcctgggca agaagagcaa aactccatct caaaaataaa
21661 taaataaata aataaataaa tcatgagact gagacataac aggaaggagg gcaatttggt
21721 tggttccaag gttcctagag tatgtgatgg gagaggttgg tgcgggtggg gccatggagg
21781 tactgactca agtggaggga caggtgggga aatgggatgg gaaaagaaga ttgaccttag
21841 aaggggagct caacctctga accctaattt cagacccttc aaaatgaata ttaagctcat
21901 tttggtctaa gaaacaaaaa acaaatgaac atgaaactca ttttggtctt ataaggtctg
21961 agaaacccct tctaaacttc aagctgcttt aagaaataac attttattac ctgcaaatac
22021 acacagtact ttggagattt ataatagtct cttattctaa tagaagccat tagggaacca
22081 gtttcaataa acaggtaaat ctgtaagact agtttgtaat taggatatct gtttccagtg
22141 tccattcctg cctctgttat ctaaatgtct gggaacaaga gctgtgctct gctgtgttta
22201 aaatgattaa aaatcaccaa ttagttgagt tcacgtagac aggcatttga cttattgagt
22261 tgttttaaga agactataac aagccttaag ccccccagaa acagcctgtc tttgggcttt
22321 cccacatgcc tcctcgtcct ctccacctgt agatgtaccg tgctctctgt cagagaaggg
22381 agggtgtggt tgggctggac ccccagaggc catccctcct tctgtcttct gctcctgcag
22441 ccctaccact ctcaaacctt tacgagaccc tgggagtcgt tggatccacc accactcagc
22501 tgtacacgga ccgcacggag aagctgaggc ctgagatgga ggggcccggc agcttcacca
22561 tcttcgcccc tagcaacgag gcctgggcct ccttgccagc tgtgagatga cctccgtctg
22621 cccgggggac tcttatgggg aactgcctta cttccccgag gggtgggcat gatgaatggg
22681 agtctgcagt catttcctac tgtttcagga agctttctcc ttaacccctt agaaaaggct
22741 gtggaacttg agctaaaata tgtcttacca ggttgcgtct aatgcccccc gttccctact
22801 gggcagaaag acttgggtgc ttcctgagga gggatccttg gcagaagaga ggcctgggct
22861 cacgagggct gagaacatgt ttcccagagt tgcaaggacc catctcttaa acacagagtc
22921 tgcagcccct aactgacacc ctgtccttcc tcctaggaag tgctggactc cctggtcagc
22981 aatgtcaaca ttgagctgct caatgccctc cgctaccata tggtgggcag gcgagtcctg
23041 actgatgagc tgaaacacgg catgaccctc acctctatgt accagaattc caacatccag
23101 atccaccact atcctaatgg ggtaggggat ccccagccat actgcatggc ccttggtgca
23161 taatgaaccc atttctgttc catgtgtggg ctggtttctg gggtttaagc tgtagacaac
23221 ccaccctctt tgtgcctgct tctccttggg ccctctattc cacagcttgt ggaacccaca
23281 ttttgctact gtgtttgaaa acactgtttt ctcctcccgg ggctttggga ctatgcctct
23341 gttgtgttga ctgctcatcc ttgctgcttc tctgggcaga ttgtaactgt gaactgtgcc
23401 cggctgctga aagccgacca ccatgcaacc aacggggtgg tgcacctcat cgataaggtc
23461 atctccacca tcaccaacaa catccagcag atcattgaga tcgaggacac ctttgagacc
23521 cttcgggtaa gggactgccc tgggtggagg cccaggcttg ggacacattg cctcccaaga
23581 ggggcctagc aggaactctt ctgcaggaga ggtagaggat ggctcctgta ggggaacata
23641 gagcaggttc ccctgaatgc ccttgaacat ggagaattca ttgaccagac attcagcttg
23701 acctaacctg tgaaattctc catcttcttt ataaagtgtt cccttccttg cctcccctgg
23761 aaaggtcagt ggtgtgtggc tgcagcagca cagtgtcctc tgagccctgg acctgcactg
23821 tggcttccag aggtggcagt tcccacatgg ggtactagaa taaatggcct atcaggctgt
23881 gtgtgctttg ggatcacatg tccccaccct aggaccctgg ttccaaccat acgcatgttc
23941 tcttggagcc cagaacagca gagaagccac cagtgtggac acagaagtca agggtctgat
24001 ttccagcctg gcttctgact gctctggggc cgcaggaata cggttccttc ccccatgccc
24061 agcaggcatt tgtcttacaa ctggagggga aggcatgttc ctcttggcaa ggactgctca
24121 ggaggaagtg gaggcaggct gccctgtcag ggtttttgcc ttgattcaag gagaacttcc
24181 taaccacaaa ggatacaagt gggagtgagg cggaccctcc ctagagatct ccaacacaga
24241 gagacaaaca cgctggggct ggctggcact gacaggcctc gcaggtgtgg atggctgtta
24301 gctgggagct tcgctgtcta agctcctctc ccatgctttt cttctgggtt gctcgaagga
24361 cgggggtctg caagaaaatg atgttcccac atagttggca gcacgtgaac agcaattgat
24421 ccctttgcat cacctcctct tactgtttag atttggtaaa tatttcttcc ttccctcttc
24481 tgaccctcca ttttgccgat ctttccttct tataacacat acttactagg tacctgctac
24541 ttcccgggtg ggcctatgtg ccaggagtat agaggtgaac aaggaaggca aagttctatt
24601 ctcagtagag ctaatactct atctggagag agacaacaaa caaatcaaca aggtagccag
24661 gggctgtgat aatttatgtc aagtgggcag gtaaatcggg agtgacagta gtgcagggag
24721 gattggaaag tcagggagtt ctctctggag gaggtggctt ttgatctgca gcctaaagga
24781 tgagaatggg tccattatac aaaatgctgg ggcaagagca cacccagtag aggggagagt
24841 aatagcaaag gctcagggca ggaagggcaa gggagaggcc agtgggtgag gtcacatgtg
24901 aagggcatac aatgggcaaa gacaaggcca gagtggccag gcccaatcct ccaggacttg
24961 cagacctggg aaagagtgca tctccatcct gggagcagca ggaaaccact caggccttta
25021 gaagatcctt ctggcagctg tgtagagaat gggtggtgtg atccttccat gcatgggctc
25081 atgtacgtga ttaccagtaa ctgtcgagtg acagtgtgag gagggctgca agccatgagt
25141 gtaggcacag cagacagact cacctttgtc tggcggtgag atggggtggg aagtgtgcca
25201 agttgacctc ccaaagaaat gatattttag tggaagaatg aatagaatca gagaagcaaa
25261 gtaagaggga agagcagaga ggacagcagg gacaaggact tgggggcagg aagaggaaag
25321 gcaggttaag gacatgaaag atggccaggc tggctggagc tcaggcccag caaggccccc
25381 tgggggccat ggtcatgggt gagcttgggt ttggcttctg ttttcgtctt gggcttctgt
25441 gaaagcctcg agcccttgcg gggaaccagt gaagctgtgt gtgcatcttc tgtggggagt
25501 gccagagtct tcagggagca ctccatcttc tctcctcccc acaggctgct gtggctgcat
25561 cagggctcaa cacgatgctt gaaggtaacg gccagtacac gcttttggcc ccgaccaatg
25621 aggccttcga gaagatccct agtgagactt tgaaccgtat cctgggcgac ccagaagccc
25681 tgagaggtga gcatcctttg gctcctgctg ctgcctcatt tgtgcagcta gattgagccc
25741 aagacctgct ctggtccaag atgaacatac cacctgccat gaggtgaccc tcaggatatc
25801 cactgcagcc atgggctggg gtcatcctgt cctgttgctt cagctaaccg tgtctctagc
25861 agccacacta ctctgagggc tgactacaga atccagcagc ttttgtctgg gagagctgga
25921 ctgaagagag gcatagctgg agacccatag ctggccctgg ccagaaacag ggagagtgaa
25981 aggctggaat agccaaggcc agagcaaggc taataggtag agcaacagct tacaggtgtg
26041 ggggtggcag atactggcac ccttgaaatg gattcctcat gcccacgctt cactattctt
26101 ctctgtggct aggggattta tggataaacc aaaattacag ttaaaaacca gccataggcc
26161 aggcacagtg actcacgcct ttaatatcag cactttggga ggacaaggtg ggcggatcac
26221 ctgagatctg gaatttgaga ccagcctggc caacatggcg aaaccccatc tctactaaaa
26281 atacaaaaat tagctgggca tggtggtggg cacctgtaat cccagttact caggggctga
26341 ggcaggagaa ccacttgaac ccaggaggtg gaggttgcag tgagccaagc ttgcaccact
26401 gcactccagc ctgggtgaca cagcgacact ccgtctcaag aaaaaaaaaa aaaaaaacag
26461 ttatagtagt caacttttga ctctccattt cagatttcgt catgccctcc tcaatgagct
26521 gctaagttag gcagtgcatt gattattgct gcaggagagg gaaggaagga gctaacgtgt
26581 tttcacatgt tttccttttg gagatgagaa aggaggactc tgccttcccc ctaccctgcc
26641 cctttctact ccaggacctc tgaaaggcca tgagcacaaa gctgctgcct gagtcccctg
26701 aaatgcaggg tacgccccag gtctctgatg taccccacca cacttttcct ctcaaacata
26761 ttccaggatc acttgatttc ttttgaatct atttaaaccc accgtgtcaa tgtgctatat
26821 aaaatgtcta atgcatttca gacaccctat acatctatac atttaaagtg ttctccttct
26881 atctgtgcag ggatgggaaa gggcatattt ctgaaagcac agatgggaag acgggatttg
26941 ttccgtgtcc aggtgattat ggtacctcta tgcgcctggc cggcactggg gacagaggcc
27001 atgaaaatga atacagcaca gcctttgcct ccaagaaact taagacctag tagaaatggc
27061 aggctttaaa acaggttgtt gggatctgat ttggtgagtg caatgacaga gatactcaca
27121 gcacaaaatg gggaatgagg gcgggcattg ggacacacat agccttaagg ggcccaaagg
27181 cttttagaac tgtattccct attaaaacat gatttgcaca gagcacattc tttgctttgg
27241 agacctcaga actccttact ataggccggg catggttata atcccagcac tttgggaagc
27301 caaggcgggc agatcacttg aggctgagag ttcaagacca gcctggccaa catggtaaaa
27361 ccccgtctct actaaaaata caaaaattag ctgggtgtgg tggtggccac ctgtaatccc
27421 agctactcag gaggctgagg taggagaatc acttgaacct gggaggcaga agttgcaata
27481 agcccagatc atgccactgc actccagcct gggcaacaaa gctagactct ctcaaaagaa
27541 aaaaacaaaa caaaacaaaa caaaacaaaa aaaactcctt attataaact gtaagaaaaa
27601 aaaggcccct acttcgtccc ttttgcaaat ctgccttttc ctactcacta accagctggt
27661 tcagagcaag gacactctgt ttggtgccat cgctgcagac tggaaggaag aggtccttgc
27721 cccacaccca acagtctcct gctgttaccg gcaggttggc aggcaggcag gcgagaagca
27781 gccagggctg gtggtgtgtc cagtttgaag actagtttcc agccctggcc ctgctcaccc
27841 tccaagtggc cctggcaggt tcctctacca catcgtggac ttcaccttcc ttctctaaga
27901 agctcaatcc ccaaggcctc attcccatag gccttctcac cctttttctt tccctctggc
27961 tgaatgtggc cagcacgggc ttccaaggcc atcaactcgt ctgcagcagc cccatgcctt
28021 gcagggcctc agagcttcct cctgcctatg acagtgtggt tttggttccc acacttggga
28081 tcagattgaa actcgcctcc gtggtgagaa tatgggacat agagcctcgg tgaccttggt
28141 gagcagcagt ccaggccacc tgctcagcct ggggttgggg ggggctcctc ctccttgact
28201 ggtccttgca tttgcctcca tccagcctgt ctgggctctc cgaggcaatg gagaccagca
28261 ggagtcacga tgggtcagga gccccctttg ggcctcagcc ctgccctgcc ccctaaagta
28321 gcacttggat aagcaaataa attattatac ttactattta tgggtgtggt gaatgggatg
28381 gcaaaggcca agtcttactg atcaccaaac cttaagatat atcctggcag ctagtagacc
28441 cttgggctaa atgaacagaa aactggacaa ataaagtgta cacaaataac tcaaagctgt
28501 catttgtaca cttttcgtct tttcctacta cagtttacat ttttataaag gtgagtagat
28561 ttctaaaatc ccgtggtagg ctctcttgag tttttcttgt atccctgaag ttcagctaca
28621 aataagctaa tcactaacat ttgttgagca tttactctgt tgtcaggccc cgtgccgagt
28681 gctttaggtt cagaatttca tgtcatcccc acagcagccc taggagatga atgcaattct
28741 tatgtccact tgactgataa ggaagttgag gttcaaagag gctaaatgac tctcccaggg
28801 tcccacagct ggaaagtggc cacagggccc cagctggttt tctagggcag caggcagaag
28861 gcgaggagga tctgggccct gtggtgcccc agcctcatct gagggtcctc atctgagaga
28921 acaggatcct cacagcatgg gcaggctgca agtggtccct gaggttatcg tggagtggac
28981 cctgacttga cctgagtctg tttggacccc agacctgctg aacaaccaca tcttgaagtc
29041 agctatgtgt gctgaagcca tcgttgcggg gctgtctgta gagaccctgg agggcacgac
29101 actggaggtg ggctgcagcg gggacatgct cactatcaac gggaaggcga tcatctccaa
29161 taaagacatc ctagccacca acggggtgat ccactacatt gatgagctac tcatcccaga
29221 ctcaggtagg ccaggcctcc gggggccttg gccctgcctg gcccaccatc tcttctgcca
29281 tcctttgtgg cgggggaggg gaaattcaga gatctttggg cgacttccct gcctggaccc
29341 agctcacagc ttctcggcca ctgcaaatgt gtgggttgtg accagactga tgtgtcttga
29401 gcttcaggct tgcaagtgca gtggagaggc agtggggagc tattgaaggg gtctggggac
29461 agactcaatc acagaggcct ttcagaagat ctgcctgctg tgcatgggca aagagggcca
29521 cttgctgacc tcagagcatg tgctttctca gtagtgccca agctgtccca tggtcactga
29581 cccagttaga atgactgaat ggactttggc ttgtgtctca ttaggaatcc tagccccatt
29641 ctagtcttcc agtgagatct gtccatgagt gaaggaatct cacaggaaaa aacaaaatgc
29701 ttctatgggt gtggttgctg gccttatcta caccacagaa gccatcacac agactgtctt
29761 tcttcccatt gttagaatgt gccctgacca agcagcccac agggcctggg acagaggctg
29821 atctctgcct aactgagctc acctctcctc cctctcctcc tgactggtta gattttctag
29881 gtgactgttc ccctgatgac acaagcccgc tgggccccag cagtgtttag aggggttgtt
29941 gactcacgag atgacattcc tgctgatgtg tgtcatgccc tggggtggat gaatgataaa
30001 tgaaaacagc gcttttaact tttgaaccca ctttctcctt ccttgtagcc aagacactat
30061 ttgaattggc tgcagagtct gatgtgtcca cagccattga ccttttcaga caagccggcc
30121 tcggcaatca tctctctgga agtgagcggt tgaccctcct ggctcccctg aattctgtat
30181 tcaaaggtaa catggggaag gcatccctgt tagattgtcc ctggaggcag cttccccacc
30241 cctgtcacct ccacaacact ctccgattta cagcacccca tgggacatta gaacttccac
30301 tcagctcaac caaaagcaga tgtgacttca gcagaaactt cagaggctct gttgtttcat
30361 taggcagtgc agagaatgcc tttggggagc cgttcctcag aactcaagac ttgacatctg
30421 ggaggcagcc gttcctcaga actcaagact tgacatctgg gagagcagag cattcccttg
30481 cctttctatt tgcagggtca cttgccaatg tatagtcaag aggtcagagt gagggtacag
30541 ctgagctgca gccccaggaa ggcagagaag ggggccaagt tgtgtgcgtg cctgcccttc
30601 cctcttaggg caaaactcca aacacccttg attatctgga tcttctttaa ttctccatag
30661 aagataccag atgttaagga atattggcag cttcacttgg tttctcaatc cctgtttcca
30721 aactcaagga gggatgggct ttttcactgt atttatctct catcactctc ttcattgcag
30781 gagcacatct ctctggacct aaccatcacc ctttcttgta gatggaaccc ctccaattga
30841 tgcccataca aggaatttgc ttcggaacca cataattaaa gaccagctgg cctctaagta
30901 tctgtaccat ggacagaccc tggaaactct gggcggcaaa aaactgagag tttttgttta
30961 tcgtaatgta agttctgggt cctaaatcat gctcctggga agctccttac tgtgggactt
31021 gtattagtgt aaaaaaaaat gtcctcaata agcaggagtt tgcatgagaa ctggttgctg
31081 acaaggaagg aaataatttc tggaaaatat agataacaaa atgagatcct gcagaaggat
31141 tggaatctct ttttctggag gcctttgaga ataaaccaca caattatcca acctgtattg
31201 tgaaggaata agtccttctt gaattcagga attaacacct gggaggaggg atggagttca
31261 gactctttct gagcttatga gaagagaagc cccctaaact aaaatacagc cctccttggt
31321 ccaaaaggtg ccttctctct tctgctgtat cttctttgtt ttcaaaccca acagttaccc
31381 tggaaatcaa aaaggaagta caactcaaca tagctcttgc ctgggaccaa ccagcaccat
31441 ttggctaaag atggttatca tctgttaaac aaagaaataa ataaatgggt tcaacgtatt
31501 tatttcaaca ttgtcaatgg acctcatgtg taactgatat tctcattatg ggacctctgt
31561 gtgactttat tggggcctct ctaaccgttc tttccttaag gaagaccatt tattgtttta
31621 tttcctggag aaaatacatc attttatccc agccttaata acccatccca gtgtatactc
31681 cttcatcttc atggataatg accctgctac atgctctgaa caaatcagga ggcccctcgt
31741 ggaagtataa ccagtccttt ctttctctgt ccctcttctg tgcagagcct ctgcattgag
31801 aacagctgca tcgcggccca cgacaagagg gggaggtacg ggaccctgtt cacgatggac
31861 cgggtgctga cccccccaat ggggactgtc atggatgtcc tgaagggaga caatcgcttt
31921 aggtaattag ttccatcccc gggtggagct tctgcccagt ggtcatgctg gagtgggatg
31981 tggggcccca gctatttgtc aagctttctt ctaccttggg gattcaatta acactagcag
32041 tgcactgctg cgaccttcca gacttgggat ggggaaaagg caagggtcgc cttgaaagct
32101 tacattggga agaagggtta cttctaagag tgtaatcttc acatgcatgg gaagcaggga
32161 ggggggacta catttttatg actgaagtgc aaggaaaaca tcaccctctc attgtaaagc
32221 tccaagtgag ccaagagcac atagtttaca gtgcacgatg agcctctcac tctctgcgca
32281 gtatctgttt attgcaactg aagcaccctt gtgagtttgt tttcttgccc ggctatctcc
32341 atttctgact tgctcattca ccttggggtg ctgtcatatt gaatgtttcc ctgtcactga
32401 cttcagccac ctgcacaagg gcttggagac cacacccctc tgccctccca gaatcatatc
32461 cctggaggct cagctagtct ctgggtcagc catacctctg ccctttcttt tccctccttt
32521 ctcctgtggc ctctgacgtc tggccattta acagagctta gcatttttgc tgggtggaga
32581 gagctggagc ctggaatcac tccctctttg tgcatacgga gggcatgaaa accaaggtgt
32641 gtgcattcca gtggcctgga ctctactatc ctcagtggtg aggtatttaa ggaaaatacc
32701 tctcagcgtg gtgaggtatt taaggaaaat acctgttgac aggtgacatt ttctgtgtgt
32761 gtatctacag catgctggta gctgccatcc agtctgcagg actgacggag accctcaacc
32821 gggaaggagt ctacacagtc tttgctccca caaatgaagc cttccgagcc ctgccaccaa
32881 gagaacggag cagactcttg ggtaaagacc aacttaagta cacgtctcca tttttctaaa
32941 gtagtgatcc ctcagggccc cagcagcaaa cagttggcac atcaaggatt gacttgaagg
33001 gattttatga caagactatt agtgaaagag tgggcgggac taaaggaact agcaaaggat
33061 gaggccaacc agggactagc aaccctggga agcctttact acccctaggc ctgggggaat
33121 gggaggatga gagcaggaac cagggaggtc atgagccttg gacaagggca cagaacagca
33181 gccagagcca tgtgcagcca gccactgtca gaaccatgca agggggacca ctcagcgccc
33241 cagcctccct ctcagacagt tgccatctgg gtctcttgtt ggctgatgcg agagcaggag
33301 ggagcccact gatgcagttc atagagctca gcctcctggg caggaaaccg ggcagagagg
33361 agtagaaaag aattaagggt ggctgcgacc agcccagtca ctgaggcacg tttcccactg
33421 gagacctatg agcacagtga taataaagcc agttacctgc actgactatc cctccagaca
33481 aaagctttcc caagaagtta gtcatggctc tgagagatct agttgaggat gtttggcagg
33541 ggatctagtg gttacgggtg gctaagaaaa atgaggaagg taagagtatc ttgcagcctg
33601 tgttgggagg attaaatagg atgccacaca cagggccagg cagacagcct ggtcagtaat
33661 agccatgacg atgggggcgg ggggagcagg aatgggagtt gcagtgttta gctcagatgc
33721 atgcctgtga gagatgcttc cactctcaca gaaagatgag accaaggaaa aggaggagga
33781 agaggaagga ccttgacaaa ccttggggcc cacattgtct acacctccct tcctgctcta
33841 gagcagaata gaaagttcag gttgcaggca gctctaagtt gaattcgtgt cctgtttaat
33901 tttctttatt gctaaatgaa tgcctgtgtc tgtgatgctg acgtatgttc ctaaggagag
33961 gggagaagtt cattctgaac ataaactttt catcctctct ctgtccagca agaatggaat
34021 attccccaag tggcctgagc cagcttggct ttctttttgt tttcaattat gtgggagttg
34081 aggaggggga tgggaaaagc ttcccaaaca caccctcccc caggcctgag gcacccctgg
34141 gggacagaga gtgttagagg ttggtacagg tgttagagat attgaaagga catcccatgc
34201 accccagggg ctggtgtggc tctgtacttc caggcaatat tttgtggaag gggaaccttg
34261 tcagctccag gttgtggatg tttgaaaatc agttggtacc cagtggctcc atcctctggc
34321 aggcatgtgg atttgtcaat aaccaagtga actctccaaa ataagttaaa acttcctccc
34381 ttctcagttt caagatgctg gaaatagctg ttcataagcc ctggggaaat ttagcccttt
34441 ggctggtaat gggagtatcc gagatgagag ggcagctgga aactttcgga atgacctccc
34501 acacttaatt tgggaaatgc ctctgcacct ttatgggcaa ccagatgcct gccccagttg
34561 ctggagacac tgatgtgggc tgaaaggaat gctgagacgt gacgaggaga gatgctgcgg
34621 agggaatatc cccctcagcc ctgacctcat cggctccatg gctcctccac agtacagctg
34681 tctactcttt taagttctcc cttcaggaaa tagccatctc aaacagaatg tgcatttgag
34741 ggcagaatgt gtaaatattg cactactgtg ttataaccgt caggagccat gctgatgatg
34801 aaacgtccca gatgccggtg ctggaaaggt ccctggcttt ccaagcaaat atttatctca
34861 tggaaacatg agtcatactc acagaggagt atggattaac tccttctcag cagccaggga
34921 gcccagcatc ccagacagca tatttaaccc agaggccaac tgactgctgg ggcagatttg
34981 tggtcatgaa catgtgcttt gtgtcctctg accattagac agattgtggg tcacaacgtt
35041 gagtatacag tgggagctta ataagtgctt attccctggg cagggagttc ttcatttcag
35101 gggtgaccac ttacatcttc tcctctgggc cctccttgac caggctaatt accattcttg
35161 ggattaactc tatctccttt tcccgcaacc tgcaggagat gccaaggaac ttgccaacat
35221 cctgaaatac cacattggtg atgaaatcct ggttagcgga ggcatcgggg ccctggtgcg
35281 gctaaagtct ctccaaggtg acaagctgga agtcagcttg gtaagtgtcc tgcaaatcaa
35341 aggctggcta aatttcccca gggcagggct ccaggacata tctcaccccc aggatggaat
35401 tatacacaca caaccttcaa gttgcagccc gaatctctga gtgtaattcg tccaaagaaa
35461 aagagaaaag agaagagggt cttcagggaa atcaagtgag atcatagtta gacatgagta
35521 agaacttcca gatttacaag ggaatagagc atctgatttg gcatctgaga gaggctatta
35581 gatcttcctt ctcttaagga ggttgtaggc aactagttat gtgactgaag agatcagtct
35641 gtactcacac catcccaccc cccaaaccca gggcttcact gagttgtacc atgaaccaga
35701 ccatcccaag aggctttttg agttctgaca cttgctctgt gagccttccc ttgctctgca
35761 cattgatgat ataactttgt aactgcacta agagtgttcc taaagcagat agccagccga
35821 gctccagaaa tctccctggc tgcacctgca gaggccactg acccctctgt ggagggaccg
35881 ctcttcagtg tgtggctggc ttctactctc tgctcctctc tcttggtctt cagccatcca
35941 ttgctcacca gtttctcacg aggagcatag gaagatatgc atgtagggag gtaggcacgg
36001 ggatgacttg tttgacttta gcaggtcatt caagaatctc ctcgcacctg gtttcagatg
36061 ctggggtcct gtctgtcaca ggcttctgtg cctcctaccc ccttgagttt gtcacatggc
36121 ccttcaggaa ggcctgagat agatttgccc tgggtgggcc tcctatgaga aaatcttaag
36181 tgaggcaccc aggcaaaatg gaaagagcct tttgcccaga gcaggaagcc tgtcttccat
36241 ttccagctgt tccacctact tagcttaaaa gaggcacttc gcctgtcttc agtctcagtc
36301 tcagtctcct cttctgtgga atgggacaat aatatctact ctccttatca tacactgctg
36361 tgaggactga gtggatcaca caaaaaagca ttatgtaaat tgcaaagtgc taaatccaca
36421 caggagattt gaattaatcc accacactga aggtctgtca agggcaggga ctgtttcatt
36481 caccagagta tccccagtct aacacaggac ttggcatatg aaaagtgttc agtaggccgg
36541 gtgcagtggc tcatgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccaaagtggg cggatcatct
36601 gaggtcagga gttcaagtcc agcctggcca acgtggtgaa accacatctc tactaaaaat
36661 acaaaattag ctgggcgtgg tggcacatgc ctgtaatcac agctactctg gaggctgagg
36721 caggagaatc acttgaaccc aggaggcgga ggttgcagtg agtcgagatc atgccactgc
36781 actccagcct gggcgacaag attgaaactc catctcaaaa acaaagaaca aggaaaaaaa
36841 cgaaaactgt tcagtaaaca cttgctgaat gaataaaata aatatataaa tgtataaata
36901 aatgctctac tttcaaccac tactctgttt ttcttttaga aaaacaatgt ggtgagtgtc
36961 aacaaggagc ctgttgccga gcctgacatc atggccacaa atggcgtggt ccatgtcatc
37021 accaatgttc tgcagcctcc aggtaagtgt cgcatcccca ctgactctgc agccagtcct
37081 tttcttcatg tggcagttgg tggagagaag aaaaactgtt ctaaacaatg atgagaataa
37141 catgtaattg tgatagttaa actgtgccta tgtgactgat tgcagagtga attgggagct
37201 gttggttttg aatgcaccac actaaggaat gtgaggacac attgctcttt gcggagttgc
37261 ccagctatat tagctcccct cggacacagc ccagttttct gtattcgcgt ggatgctgtc
37321 cgcgcgattc ccagcactcc tcttacagca tctcacctca gtgtatgttc cttgcctcca
37381 gtgcagttga acctcagtcc tgcctctcct catgtgtgca ttcacctttc ttggtgctct
37441 ctccccatgg gccaagttct accatgagtt atgaaacatt atggagaaaa catgtctttg
37501 gaaatgtgag ccagaaagcc caccagtgcc cctcagtcac ggttgttatg aatgacatgc
37561 taatggtttc actctggtca aacctgcctt ttctttcctc ttcagccaac agacctcagg
37621 aaagagggga tgaacttgca gactctgcgc ttgagatctt caaacaagca tcagcgtttt
37681 ccagggtaag atgcctgcta ggtttgcgcc tagcctgagc agcctcaggt cctctgtttg
37741 ggccatagag gagcctctcc agcccctgtc ttccttggct gctccccagg gctctcttaa
37801 aacttctccc cactcccact gaggcatcct cagccccagc ctgtgtcaaa ttcagagtaa
37861 agaaccaagg caactccctg gctttcatgg gccaaagcgc aggctttcac accgaggcct
37921 ctgagcctca gatcatgggg aagtcactgc tggagagaac agacatagct ctggaagcca
37981 tctgcccaag agggcagccc atcccaagtt catcttacag tggccaggcc tgccctgagc
38041 cggggcctct gggtcactct tctgctgtcc atggcattgc ccatcctggg tgaggctggg
38101 gctctcctgg gcactgtatg tattctggat acagggatac tgggctcgct atgtgtgtgg
38161 agccatccct tccttgcccc agccccacct ccctctcaaa ccctctctgg ctctttctga
38221 gcttcctttc ctgctcccca gcttgcccag tgctcagtgc cccacttggc tcttttgcta
38281 cttcgggtca ggtggagcct cttgggaatg tgaagtgcct tacagaaaga ttgcacttca
38341 agaggagagg ctgcagggag ccatcctaaa cccagaggcc tggagcttac tgtgtcactt
38401 tacttttgta cacaggggtc tccttagtgc cctcgagaag gattcttggc cctgagcttc
38461 tactcctgag gccacctctg tgcagcccca gctccctcaa ctctaggctg tagtctcagt
38521 gggaaagcct ggcttggggg tctcctagga atgtccacct gaaggcacac ttgatagggg
38581 cttgcacaac ttatgtctgc caaggccacc tgaggaactc cctggtgcct ataagttcca
38641 ccttcccctt cctcttcctc gccccagcat tttttctgag taggggtggc aatgggcaaa
38701 gccattgtca taagcagttg caggtataac tttcactaga aaacctgaca ccttgtgttt
38761 tctttcaggc ttcccagagg tctgtgcgac taggtgagtc tggtctgggt ttgaagtcat
38821 tgcagacctg tttaggcctt acccccaagc aagcccaagc ctgccatctg ctgtatatag
38881 ataagaacat catggtgcag taaaagaagc ctggcctttg gagtcagaac agcagggtga
38941 cttggggtca gacccagagc accccatttc cttctctgta agatgaggat aataagagta
39001 acaacctttt agggttaagg tgagttttca gcttaggaag tctgggaata ttgcaaaggg
39061 cttggcagga acccatggtg aggatctagt tccaagttga taggtacaga aaaccagaac
39121 atcgggcctt gagtaaagag tgaagtttca caaaccacaa agcacctgct atgtgcagga
39181 gagcatggca gaaggaggct gcttggccct ggtccttgag attctgacag tgtcctagac
39241 agacatgggg agatctgcac ctatttgacg ttaccaactt ctctttttca gcccctgtct
39301 atcaaaagtt attagagagg atgaagcatt agcttgaagc actacaggag gaatgcacca
39361 cggcagctct ccgccaattt ctctcagatt tccacagaga ctgtttgaat gttttcaaaa
39421 ccaagtatca cactttaatg tacatgggcc gcaccataat gagatgtgag ccttgtgcat
39481 gtgggggagg agggagagag atgtactttt taaatcatgt tccccctaaa catggctgtt
39541 aacccactgc atgcagaaac ttggatgtca ctgcctgaca ttcacttcca gagaggacct
39601 atcccaaatg tggaattgac tgcctatgcc aagtccctgg aaaaggagct tcagtattgt
39661 ggggctcata aaacatgaat caagcaatcc agcctcatgg gaagtcctgg cacagttttt
39721 gtaaagccct tgcacagctg gagaaatggc atcattataa gctatgagtt gaaatgttct
39781 gtcaaatgtg tctcacatct acacgtggct tggaggcttt tatggggccc tgtccaggta
39841 gaaaagaaat ggtatgtaga gcttagattt ccctattgtg acagagccat ggtgtgtttg
39901 taataataaa accaaagaaa catacgtcct gtgtgcatgg tacagtgtgc tgacctgagg
39961 ccgtcatgct cctccacacc tcaattctgc tctggagaag ctcagaaagg agccccgagg
40021 gatggttttg gggagattcc agcagccagc cctcagacag ccagacagct catgggggtt
40081 tgagcctgtc tttgccaaac aggtttttat ttcaccctcc tccggtcctg gggtttcaag
40141 ttttcagtgt tgccttcacc ccgcacttta ttcctcttat tacttggaag taccttccct
40201 ccagcatggt gatcccctgc ctgtgtgctg gacttttgag tcctcagcac caacctgtga
40261 agtggttgcc agcataatcc cattatgcag atgaggagac caaggcccag ggaagggaga
40321 accaccagca gcacgtaaaa tagctgagct gggactggaa ctcacacctc ctgactctca
40381 gtgaccacca ctgacaacag cataagtcca ggttttccag gcccatcccc tctgtgccaa
40441 cccacattca gattccttcc ccggctcccg taatctctgg catctagaat atcctcagga
40501 ctctgagagg tgatatcatg tggttgtggt gccattgccc cctacctgtg tggcctgggg
40561 ccagtcatgt gacctcccag ggtctcctct tctgtaatag ggagatgacc gtcacatcta
40621 cttcatgggt ccatcgtgag gatgaaatga gatgatctat ataaaatgct tggtacaaca
40681 ttaggtggcc ttatttttat cctgccgtct gggactgctc aggatcaatg cgccagagag
40741 cctttatttg tgtctttccc acaggtgggc tggcccactt tcctagagaa tgggacagac
40801 ctccttccca cccacaccca tctctgccaa ggctgattca ctccagcagg cggagctcat
40861 ttcacttcat ggaaccaatg acccaaagat atatccccag cactactgct ggtcagtcca
40921 ctgctgctgg gaatacagca atggtagtgg cagacagagg ccctctctta aatagcttcc
40981 agtctgagga aagagagata tgacatcaat ccattaaaat cattcatcca ttggttccac
41041 aaatatttgt tgagggctac ctatgtgcac ccccatgtta gaccctgggg aatagacatg
41101 tcattctcat gaggcttctc tactgatggg ggggaagaga attgtcaacc agataatggc
41161 actacagcct gtgtgttctt agtgactctg aggatagcac tgtggttctg tgacagataa
41221 tgaaggattt ggaagcagga atgcccagga gctcccagaa gtgggaagag atgagaggaa
41281 tggaaggaac ttacctgaag gtgaaggcat caggctaggg gaccaaggga gaaggtgtcc
41341 tgagaggtaa ggcttaacct tgggtgtgaa ttcagttccc gtcactctcc catagctctg
41401 tcctgctgtt cccacctccc ctgcagccat gcgggcttgg gcggctagtg agggccttgc
41461 tcatgctggg tatcctatgc tatgcttcac tttgagcacc taaaatacac acactgcact
41521 ttaccaagat gacctcggaa accaaagagg tgatcagcat aagttttaaa gacccttaaa
41581 tttaaagtaa aaatcactac aggatccatt ataaatgcca aacactaaga tgtgtgtttc
41641 cagttctccc cttcatttgt ccctgccact ccctgccctg actttgcccc accccctagt
41701 aatgtgggct ccactctatg ctccaaactc tccctggaga gaaatcctcc ctgtggttga
41761 ggacaaggcg cagccttccc ctcccaccaa agaaggtcag attccctttt ttggttccta
41821 accatccata ccccttcttt tctcatgaag actcgggcta agcattcatt agggctgcca
41881 tctggaggat ggacccttag agctgagggg ccagcactgt gtgt
【０１０１】
下記は、ＴＧＦＢＩ遺伝子タンパク質産物（βＩＧ−Ｈ３タンパク質配列；ＮＣＢＩ参照番号ＮＧ＿０１２６４６．１）（配列番号６２）を示す。
MALFVRLLALALALALGPAATLAGPAKSPYQLVLQHSRLRGRQHGPNVCAVQKVIGTNRKYFTNCKQWYQRKICGKSTVISYECCPGYEKVPGEKGCPAALPLSNLYETLGVVGSTTTQLYTDRTEKLRPEMEGPGSFTIFAPSNEAWASLPAEVLDSLVSNVNIELLNALRYHMVGRRVLTDELKHGMTLTSMYQNSNIQIHHYPNGIVTVNCARLLKADHHATNGVVHLIDKVISTITNNIQQIIEIEDTFETLRAAVAASGLNTMLEGNGQYTLLAPTNEAFEKIPSETLNRILGDPEALRDLLNNHILKSAMCAEAIVAGLSVETLEGTTLEVGCSGDMLTINGKAIISNKDILATNGVIHYIDELLIPDSAKTLFELAAESDVSTAIDLFRQAGLGNHLSGSERLTLLAPLNSVFKDGTPPIDAHTRNLLRNHIIKDQLASKYLYHGQTLETLGGKKLRVFVYRNSLCIENSCIAAHDKRGRYGTLFTMDRVLTPPMGTVMDVLKGDNRFSMLVAAIQSAGLTETLNREGVYTVFAPTNEAFRALPPRERSRLLGDAKELANILKYHIGDEILVSGGIGALVRLKSLQGDKLEVSLKNNVVSVNKEPVAEPDIMATNGVVHVITNVLQPPANRPQERGDELADSALEIFKQASAFSRASQRSVRLAPVYQKLLERMKH
【０１０２】
すべての見出しおよび節指定は、明瞭さおよび参照目的のみのために使用され、決して限定とはみなされるべきではない。例えば、当業者ならば、異なる見出しからの種々の態様を組み合わせることの有用性を、本明細書において記述されている発明の趣旨および範囲に従って適切なものとして理解するであろう。
【０１０３】
本明細書において引用されているすべての参考文献は、各個々の刊行物または特許または特許出願が、参照によりその全体があらゆる目的のために組み込まれることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度まで、参照によりその全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
当業者には明らかであろう通り、本出願の多くの修正および変形が、その趣旨および範囲から逸脱することなく、為され得る。本明細書において記述されている具体的な実施形態および実施例は、ほんの一例として提示されるものであり、本出願は、特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲とともに、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2020516280.tif 000003
【図１Ｂ】
2020516280.tif 000004
【図２】
2020516280.tif 000005
【図３】
2020516280.tif 000006
【図４】
2020516280.tif 000007
【図５Ａ】
2020516280.tif 000008
【図５Ｂ】
2020516280.tif 000009
【図５Ｂｃｏｎｔｉｎｕｅｄ】
2020516280.tif 000010
【図５Ｃ】
2020516280.tif 000011
【図６Ａ】
2020516280.tif 000012
【図６Ｂ】
2020516280.tif 000013
【配列表】
2020516280000001.app
【国際調査報告】
2020516280.tif 000014
2020516280.tif 000015
2020516280.tif 000016