(57)【要約】ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１および／またはその関連分子であるＴＲＡＰδまたはＤｖｌ１との結合能を評価して、ＦＡＬＳの臨床悪性度を判定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＴＲＡＰδとの結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法。
【請求項２】
ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１およびＤｖｌ１との結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法。
【請求項３】
ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１との結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法。
【請求項４】
ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定におけるＮＥＤＬ１またはその基質の使用。
【請求項５】
単離ＳＯＤ１変異体を用いることを特徴とする請求項４に記載のＮＥＤＬ１の使用。
【請求項６】
前記基質がＴＲＡＰδまたはＤｖｌ１であることを特徴とする請求項５に記載のＮＥＤＬ１の使用。
【請求項７】
ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤。
【請求項８】
前記基質がＴＲＡＰδまたはＤｖｌ１であることを特徴とする請求項７に記載の阻害剤。
【請求項９】
神経細胞において、候補薬剤がＳＯＤ変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤であるか否かを決定することを特徴とする、ＦＡＬＳの治療において有用な薬剤をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＮＥＤＬ１およびその関連因子と、ＳＯＤ１変異体との相互作用に基づく、ＦＡＬＳの判定方法、或いは治療薬（方法）に関する。
【背景技術】
【０００２】  筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、脊椎、運動皮質、脳幹の運動ニューロンの変性、脱落により筋萎縮を生じる、予後不良の神経変性疾患である。現在、家族性のＡＬＳ（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：以下、ＦＡＬＳという）は、ＡＬＳ全体の５〜１０％の頻度で認められるが、その一部の家系で原因遺伝子が、ＣＵ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ１）遺伝子であることが判明しており、ＦＡＬＳ全体の約２０％がＳＯＤ１遺伝子変異を原因としている。ＳＯＤ１は、好気性代謝の過程で細胞内に生じる活性酵素の一種であり、スーパーオキシドを不活性化する。近年、変異型ＳＯＤ１（以下、ＳＯＤ１変異体という）が細胞内で凝集体を形成し、細胞毒性を発揮するという凝集体仮説がＦＡＬＳの病因として最も有力なものとされつつある（非特許文献１）。【０００３】  本発明者らは、以前予後良好な神経芽腫と予後不良な神経芽腫との比較において、予後良好な神経芽腫で発現が増強されているＮＥＤＬ１と命名した新規なＨＥＣＴ型ユビキチンライゲースを見出した（特許文献１）。さらに、ＮＥＤＬ１はＳＯＤ１変異体をユビキチン化することも見出した。【０００４】  ＳＯＤ１変異体の細胞内情報伝達経路については、不明な部分が多いがＳＯＤ１変異体のみと結合し、正常ＳＯＤ１（野生型ＳＯＤ１）とは結合しない蛋白因子として、小胞体トランスロコン成分であるＴＲＡＰδ（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）が報告されている（非特許文献２、非特許文献３）。【０００５】  このようにＦＡＬＳの原因遺伝子であるＳＯＤ１変異体とその関連分子との間の相互作用については、解明されつつあるが、ＦＡＬＳの病理発生については、前記凝集体仮説が正しいとしてもそのメカニズムの全容の解明には程遠い現状である。
【特許文献１】国際公開ＷＯ  ０３／０１８８４２パンフレット
【非特許文献１】中野亮一、細胞工学、第２０巻、第１１号、１５０８−１５１２、２００１
【非特許文献２】Ｒｙｅｎ  Ｄ．Ｆｏｎｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｋ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６０，Ｎｏ．４，２００３（５２９−５３９）
【非特許文献３】Ｋｕｎｓｔ  Ｃ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５，９１−９４（１９９７）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】  ＳＯＤ１変異体とその関連分子との間の相互作用におけるＮＥＤＬ１の役割について明らかにし、ＦＡＬＳの発症メカニズムの凝集体仮説を検証する。その過程において、各種分子間の結合、相互作用を評価すると、ＦＡＬＳの治療・診断につながる知見が得られる可能性がある。【０００７】  本発明は、ＳＯＤ１変異体とその関連分子との結合、相互作用（ＮＥＤＬ１が介在するか、または介在しない）を遺伝子または蛋白レベルで解明することを１つの目的とする。さらに、本発明は、そこで得られた知見を臨床に応用すること、すなわちＦＡＬＳの新たな治療剤（方法）、診断薬（方法）を提供することを別の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、ＮＥＤＬ１がＴＲＡＰδとが結合し、さらにこれらはＳＯＤ１変異体と複合体を形成して、該複合体における結合強度はＦＡＬＳの臨床悪性度とほぼ比例することを見出した。さらに、同様にＮＥＤＬ１がＤｉｓｈｅｖｅｌｌ１（以下、Ｄｖｌ１という）と結合し、さらにこれらはＳＯＤ１変異体と複合体を形成して、該複合体における結合強度はＦＡＬＳの臨床悪性度とほぼ比例することを見出した。また、ＮＥＤＬ１とＳＯＤ１変異体との相互作用もＦＡＬＳの臨床悪性度とほぼ比例することを見出した。【０００９】  特定的には、ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＴＲＡＰδとの結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法が提供される。【００１０】  また、ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１およびＤｖｌ１との結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法も提供される。【００１１】  また、ＦＡＬＳ患者由来の被検体からＳＯＤ１変異体を単離し、該ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１との結合能を評価することを特徴とする、ＦＡＬＳの臨床悪性度の判定方法も提供される。【００１２】  要するに、本発明はＦＡＬＳの臨床悪性度の判定におけるＮＥＤＬ１またはその基質の使用を提供する。具体的には、その判定において、単離ＳＯＤ１変異体を用いることを特徴とする。ここで、好ましくは前記基質は、ＴＲＡＰδまたはＤｖｌ１である。【００１３】  くわえて、ＳＯＤ変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤が提供される。【００１４】  好ましくは、前記基質がＴＲＡＰδまたはＤｖｌ１である。【００１５】  また、神経細胞において、候補薬剤がＳＯＤ変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤であるか否かを決定することを特徴とする、ＦＡＬＳの治療において有用な薬剤をスクリーニングする方法も提供される。
【発明の効果】
【００１６】  本発明に従えば、ＦＡＬＳの原因遺伝子であるＳＯＤ１変異体とその関連分子（ＴＲＡＰδ、Ｄｖｌ１等）との間にＮＥＤＬ１が介在して、複合体が形成されることが明らかとなり、ＦＡＬＳの発症メカニズムとしての凝集体説が確かめられた。さらに、このような複合体におけるＳＯＤ１変異体と前記分子との結合能（ＮＥＤＬ１を介するか、介さないかして）がＦＡＬＳの臨床悪性度に関連しているので、該結合能を評価することによって、ＦＡＬＳの臨床悪性度を判定することができる。【００１７】  また、上記の凝集体の形成を阻止することができれば、ＦＡＬＳの治療に繋がる。したがって、本発明に従えば、ＦＡＬＳの治療に有用であろう、ＳＯＤ変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤が見出される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、ヒトＮＥＤＬ１（ｈＮＥＤＬ１）とマウスＮＥＤＬ１（ｍＮＥＤＬ１）との間の保存的アミノ酸配列のアライメントを示す図である。図中、右欄番号は、イニシエーターであるメチオニンからの塩基数を表す。Ｃ２ドメイン、ＷＷドメインおよびＨＥＣＴドメインがそれぞれ示されている。
【図２】ＮＥＤＬ１とＴＲＡＰ−δとの結合を示す免疫ブロットした電気泳動図（免疫ブロット図）である。
【図３】ＮＥＤＬ１と内因性ＴＲＡＰ−δとの結合を示す免疫ブロットした電気泳動図である。
【図４】ＮＥＤＬ１とＳＯＤ１変異体との結合を示す免疫ブロット図である。
【図５】ＮＥＤＬ１の野生型ＳＯＤ１およびＳＯＤ１変異体に対するユビキチン化を示す免疫ブロット図である。
【図６】ＮＥＤＬ１の存在下、ＳＯＤ１変異体および野生型ＳＯＤ１の分解の経時変化を示す免疫ブロット図である。
【図７】ＳＯＤ１変異体と外因性ＴＲＡＰδとの結合を示す免疫ブロット図である。
【図８】ＮＥＤＬ１とＤｖｌ１との結合を示す免疫ブロット図である。
【図９】ＮＥＤＬ１のＤｖｌ１に対するユビキチン化を示す免疫ブロット図である。
【図１０】ＮＥＤＬ１の存在下、Ｄｖｌ１の分解の経時変化を示す免疫ブロット図である。
【図１１】ＮＥＤＬ１の存在下、ＳＯＤ１変異体とＤｖｌ１との結合を示す免疫ブロット図である。
【図１２】ＦＡＬＳ病理発生におけるＳＯＤ１変異体とその関連分子との間の相互作用の模式図を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】  以下、本発明について、好適な実施の形態を参照して、詳細に説明する。【００２０】  本発明に係るＮＥＤＬ１遺伝子は、全長６２００塩基（コード領域４７５５塩基）を有する遺伝子であり、その塩基配列を配列表の配列番号２に示す。該遺伝子がコードするＮＥＤＬ１タンパク質は、１５８５個のアミノ酸からなり、その全長を配列表の配列番号１に示す。なお、前記塩基配列およびアミノ酸配列は、ＧｅｎｅＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）に受理番号ＡＢ０４８３６５として登録されている。【００２１】  図１にヒトＮＥＤＬ１（ｈＮＥＤＬ１）とマウスＮＥＤＬ１（ｍＮＥＤＬ１）のアライメント（ホモロジー解析）を示す。ＮＥＤＬ−１タンパク質は、ＨＥＣＴ型ユビキチンリガーゼの特徴である以下のドメインを有することが分かる。すなわち、（１）Ｎ末端にＣ２ドメイン（カルシウム依存的に膜脂質に結合する）、（２）中央部にＷＷドメイン（プロリンリッチ領域との結合に関与）、（３）Ｃ末端領域にＨＥＣＴドメイン（ユビキチン結合酵素Ｅ２の結合部位）である。【００２２】  ＮＥＤＬ１の基質を同定するために、本発明者らは、前記ＷＷドメイン（７５７−１１１４位）を用いて、ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄスクリーニングを行った。その結果、１つの基質としてＴＲＡＰδが見出された。【００２３】  ＴＲＡＰδは、小胞体膜を横切るタンパク質のトランスロケーションに関連する因子である、トランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）複合体の構成タンパク質の１つのサブユニットである。ＴＲＡＰδが野生型ＳＯＤとは結合しないが、ＳＯＤ１変異体と結合することは既に報告されている（Ｋｕｎｓｔ  Ｃ．Ｂ．ら、前掲）。そこで、本発明者らは、ＮＥＤＬ１、ＴＲＡＰδ、およびＳＯＤ１間の相互作用を調べた。具体的には、ＣＯＳ７細胞をこれらの発現構築物で共トランスフェクトし、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイによって、解析した。【００２４】 ＮＥＤＬ１とＴＲＡＰδとの結合
上記の解析の結果、図２、３に示すように、ＮＥＤＬ１は、内因性および外因性のＴＲＡＰδと結合していることが確認される。この結合は、ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄスクリーニングでも前記ＷＷドメインを介していることが確認される。しかし、ＴＲＡＰδは、ＮＥＤＬ１によってユビキチン化されない。【００２５】 ＮＥＤＬ１とＳＯＤ１との結合
上記の解析の結果、図４に示すように、ＮＥＤＬ１は、ＳＯＤ１変異体と結合するが、野生型ＳＯＤ１とは結合しないことが確認される。また、ＮＥＤＬ１と様々なＳＯＤ１変異体との結合能は、ＳＯＤ１変異体が単離されたＦＡＬＳ患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。【００２６】  くわえて、ＮＥＤＬ１がＳＯＤ１変異体をユビキチン化することが確認され（図５）、そのユビキチン化の程度は、ＳＯＤ１変異体が単離されたＦＡＬＳ患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。【００２７】  ＮＥＤＬ１の存在下、ＳＯＤ１変異体の分解の経時変化を示したものが、図６であるが、ここでも臨床悪性度に比例して、ＳＯＤ１変異体が分解していることが分かる。【００２８】  これらの結果から、ＳＯＤ１変異体のユビキチン化を経由する分解には、ＮＥＤＬ１が介在し、臨床悪性度に比例して、分解が進行することが示される。【００２９】 ＴＲＡＰδとＳＯＤ１との結合
上記の解析の結果、図７に示すように、外因性ＴＲＡＰδは、ＳＯＤ１変異体と結合するが、野生型ＳＯＤ１とは結合しないことが確認される。また、ＮＥＤＬ１の場合と同様に、ＴＲＡＰδと様々なＳＯＤ１変異体との結合能は、ＳＯＤ１変異体が単離されたＦＡＬＳ患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。【００３０】  以上の結果および他の研究結果を総合して、ＦＡＬＳの病理発生におけるＮＥＤＬ１の役割として、（１）ＮＥＤＬ１は、単独でまたはＴＲＡＰδと共にＳＯＤ１変異体をユビキチン化する（２）ＮＥＤＬ１とＴＲＡＰδは、ＳＯＤ１変異体と凝集体を形成し、これがゴルジ装置の断片化を誘起、ニューロンのアポトーシスをもたらす（３）凝集体の形成は、ＮＥＤＬ１および／またはＴＲＡＰδの機能不全を引き起こし、それが運動ニューロン死に結びつく疾患となる（４）ＮＥＤＬ１／ＴＲＡＰ−δ／ＳＯＤ１変異体の凝集体は、その正常な機能が運動ニューロンの生存に重要である分子シャペロンのような因子を取り込み、不活性化する、などであろう。【００３１】  次いで、ユビキチン化依存性蛋白分解時のＮＥＤＬ１の基質を同定するために、本発明者らは、ＮＥＤＬ１のＷＷドメインを含む別のドメイン（３８２−１４４８位）を用いて、ｙｅａｓｔ  ｔｗｏ  ｈｙｂｒｉｄスクリーニングを行った。その結果、Ｄｖｌ１が基質として同定された。【００３２】  ヒトＤＶｌ１は、６７０個のアミノ酸からなるタンパク質で、以下のドメインを有する。すなわち、（１）カノニカルＷｎｔ／ＴＣＦシグナリングに必要とされるＤＩＸドメイン、（２）ＰＤＺドメイン（Ｓｔｂｍ、ＣＫＩ結合の標的）、（３）ＤＥＰドメイン（ＰＣＰシグナリング中の膜局在化に関与）である（Ｄ．Ｊ．Ｓｕｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６６，７３−８６（１９９４）；Ａ．Ｗｏｄａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１４，５９−８８（１９９８）；Ｍ．Ｂｏｕｔｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９４，１０９−１１８（１９９８））であり、ＤＥＰドメインとＮＥＤＬ１のＷＷドメインが結合するものと考えられる。【００３３】  ＴＲＡＰδの場合と同様に、ＮＥＤＬ１、ＤＶｌ１およびＳＯＤ１間の相互作用を調べた。具体的には、ＣＯＳ７細胞をこれらの発現構築物で共トランスフェクトし、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイによって、解析した。【００３４】 ＮＥＤＬ１とＤｖｌ１との結合
上記の解析の結果、図８に示すように、ＮＥＤＬ１は、Ｄｖｌ１と結合していることが確認される。また、ＮＥＤＬ１は、Ｄｖｌ１をユビキチン化することが確認され、（図９）さらにＮＥＤＬ１の存在下、Ｄｖｌ１の分解の経時変化を示したものが図１０である。【００３５】 Ｄｖｌ１とＳＯＤ１との結合
上記の解析の結果、図１１に示すように、Ｄｖｌ１は、ＳＯＤ１とＮＥＤＬ１の存在下結合することが確認される。また、Ｄｖｌ１と様々なＳＯＤ１変異体との結合能は、ＳＯＤ１変異体が単離されたＦＡＬＳ患者の臨床悪性度とほぼ比例することが分かる。【００３６】  ＡＬＳ患者の運動ニューロンで細胞骨格異常が報告されており、ＮＥＤＬ１介在Ｄｖｌ１分解に対する前記のＳＯＤ１変異体の影響が運動ニューロン死に関与していることは可能である（Ｌｕｏ，Ｚ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ  ３５，４８９−５０５（２００２））。【００３７】 結論
神経細胞Ｅ３ユビキチンリガーゼであるＮＥＤＬ１は、ＴＲＡＰδと結合（相互作用）するが、Ｄｖｌ１とも結合し、これをユビキチン化して分解する。ＮＥＤＬ１は、このようにＳＯＤ１変異体、ＤＶｌ１、ＴＲＡＰδと複合体を形成するので、特にユビキチン介在の分解を逃れたＳＯＤ１変異体と巨大な凝集体を形成する。標的タンパク質（基質）であるＤＶｌ１またはＴＲＡＰδの活性に影響を与えるＮＥＤＬ１の機能は、ＳＯＤ１変異体によって調節される。これら個々の相互作用がすべて、ＦＡＬＳの病理発生に関係しているようである。したがって、前記複合体もしくは巨大凝集体形成の分子メカニズムの解明は、ＡＬＳにおける運動ニューロン死を説明し、ひいてはＡＬＳに対する新たな治療薬・治療方法の展望を開くことになる。図１２に、本発明において得られた知見に基づく、ＦＡＬＳ病理発生におけるＳＯＤ１変異体とその関連分子との間の相互作用の模式図を示す。【００３８】 ＦＡＬＳの治療剤および治療方法
上記のような考察に基づいて、本発明によれば、ＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質との相互作用における阻害剤の開発が提供される。阻害剤としての候補薬剤は、核酸、タンパク質、低分子化合物（化学合成または天然由来）、タンパク質以外の高分子化合物などである。【００３９】  このような阻害剤のスクリーニング方法としては、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（例えば、Ｇｙｕｒｉｓ，Ｊ．Ｃｅｌｌ，１９９３，７５，７９１−８０３；Ｇｏｌｅｍｉｓ，Ｅ．Ａ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）１９９６，Ｃｈ．２０．０−２０．１）が挙げられる。また、免疫学的手法で、阻害剤のスクリーニング法を実施することもできる。具体的には、細胞（神経細胞）内でＳＯＤ１変異体（特に、臨床悪性度の高いもの）とＮＥＤＬ１および／またはその基質を発現させ、一定時間候補薬剤と共に培養した後、細胞を粉砕して細胞溶解液を調製する。一方の分子に対する抗体で免疫沈降させ、沈殿中に含まれる他方の分子（それ以外）を免疫学的手法（免疫ブロット等）で検出ないし、定量することで、候補薬剤の各分子の相互作用に及ぼす影響を検出できる。ここで、上記培養系に適当なアゴニストと候補薬剤とを同時に添加して、上記アッセイを行い、候補薬剤を含まない細胞からの免疫沈降物と比較することで阻害剤のスクリーニングが可能である。【００４０】  上記のスクリーニング方法で同定されたＳＯＤ１変異体とＮＥＤＬ１および／またはその基質における阻害剤であるタンパク質等は、ＦＡＬＳを患う患者またはその可能性のある患者に経口的に、または非経口的に投与する。この目的で、そのタンパク質を薬学的組成物として調製する。これは、有効量の該結合阻害を薬学的に許容される担体、もしくは希釈剤と混合して、適当な剤形とする。投与に適した剤形は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、カプセル剤、坐剤、注射剤等である。
【実施例】
【００４１】（方法）
（ヒトＮＥＤＬ１  ｃＤＮＡのクローニング）
ヒトＮＥＤＬ１  ｃＤＮＡのクローニングについては、国際公開ＷＯ  ０３／０１８８４２パンフレット（ＰＣＴ／ＪＰ０２／０８５２４）に詳述してあるが、本発明では、以下のようにして、実施した。すなわち、フォワード・プライマー（５’−ＧＧＴＴＴＴＴＡＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＣ−３’、配列番号３）およびリバース・プライマー（５’−ＣＡＡＴＧＡＧＧＴＡＣＡＴＧＣＣＡＡＴＣＣ−３’、配列番号４）を使用し、ヒト胎児脳（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）をテンプレートとして、ＮＥＤＬ１ｃＤＮＡ（ヒト神経芽細胞種からのｃＤＮＡライブラリー）の５’部分を増幅した。全長ヒトＮＥＤＬ１ｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅断片（ヌクレオチド１位（翻訳開始部位）〜６８位）とＫＩＡＡ０３２２  ｃＤＮＡ（（財）かずさＤＮＡ研究所、Ｔ．Ｎａｇａｓｅ氏より寄贈）と融合させて、作成した。【００４２】  （細胞培養およびトランスフェクション）
細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で増殖した。ＣＯＳ７およびＮｅｕｒｏ２ａ細胞は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清とペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）に維持した。細胞は、空気中水飽和５％炭酸ガス雰囲気下、３７℃で培養し。各発現プラスミドの共トランスンスフェクションは、製造者の指示書に従い、リポフェクトアミン（ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）を用いて実施した。ある種の実験では、トランスフェクトした細胞をＭＧ−１３２を用いて、終濃度４０μＭで３０分間処理した。【００４３】  （Ｙｅａｓｔ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）
スクリーニングは、ヒト胎児脳（１次スクリーニング）およびヒト成人脳（２次スクリーニング）から得られたｃＤＮＡライブラリーを用いる、Ｇａｌ４−ｂａｓｅｄ  ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ社製）を使用して実行した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｃｉａｅ  ＣＧ１９４５細胞をｐＡＳ２−１−ＮＥＤＬ１−１（７５７−１１１４位、１次スクリーニング）またはｐＡＳ２−１−ＮＥＤＬ１−２（３８２−１４４８位、２次スクリーニング）で形質転換した。これらの発現ベクターは共にＬａｃＺの転写のみを活性化しない。形質転換体をさらに前記ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。ＬａｃＺ陽性コロニーを選択した。これら陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出して、その核酸配列を決定した。【００４４】  （インビトロユビキチン化アッセイ）
インビトロユビキチン化アッセイは、以下のように実施した。０．５μｇの精製ＧＳＴ融合蛋白０．２５μｇ酵母Ｅ１（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社製）、Ｅ２ｓを発現するＥ．ｃｏｌｉからの粗細胞溶解物１μｌおよび１０μｇウシＵｂ（Ｓｉｇｍａ社製）を２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１．２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および３０ｍＭジチオスレイトール中でインキュベートした。３０℃で２時間後、ＳＤＳサンプルバッファを添加して、反応を停止した。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、メンブランに移し、抗ユビキチンモノクローナル抗体（Ｍｅｄｉａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）で免疫ブロットした。【００４５】  （発現構築物）
ヘマグルチニンタグおよび（Ｈｉｓ６）タグされたユビキチンの哺乳動物用発現プラスミドは、Ｄ．Ｂｏｈｍａｎｎ氏より寄贈された。全長ＮＥＤＬ１  ｃＤＮＡを哺乳動物用発現プラスミドｐＥＦ１／Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）またはｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に導入した。野生型または変異型のＳＯＤ１をコードするｃＤＮＡをＦＬＡＧもしくはＭｙｃエピトープタグ配列のカルボキシ末端に接合し、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ２にサブクロニーングした。同様に、ＦＬＡＧもしくはＭｙｃエピトープタグをＴＲＡＰδのカルボキシ末端に接合した。さらに、ＦＬＡＧもしくはＭｙｃエピトープタグをＤｖｌ１のアミノ末端に接合した。コード配列は、自動ＤＮＡ塩基配列決定によって確認した。【００４６】  （免疫沈降およびウエスタンブロット分析）
ウサギでＮＥＤＬ１オリゴペペチド（４６０−４８２位）とＴＲＡＰδオリゴペプチド（９３−１２６位）に対して、それぞれ抗ＮＥＤＬ１抗体と抗ＴＲＡＰδ抗体を作成した。免疫沈降実験では、ＣＯＳ７細胞またはＮｅｕｒｏ２ａ細胞を様々な組合わせで、発現プラスミドを用いて共トラスフェクトした。４８時間後、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ社製）を追加したＴＮＥバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）中で細胞溶解した。全細胞溶解物を抗ＮＥＤＬ１抗体、抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２、Ｓｉｇｍａ社製）または抗Ｍｙｃ抗体（９Ｂ１１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて、免疫沈降させた。免疫複合体をＧＴＰ結合タンパク質セファロースビーズ上で回収し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファ中で沸騰させて溶出し、ＳＤＳポリアミドゲルで電気泳動し、エレクトロブロットによりポリビニリデンジフルオリドメンブラン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移した。ユビキチン化実験では、細胞溶解をＲＩＰＡバッファ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で実施し、その後強力な超音波処理を行った。メンブレンを第１抗体でプローブし、それからホースラディシュペルオキシダーゼ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．製）で標識した二次抗体とともにインキュベートした。免疫反応性のバンドをＥＣＬ増強化学発光法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）によって検出した。タンパク質分解実験では、Ｎｅｕｒｏ２細胞を所定の発現プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ社製）の５０μｇ／ｍｌ濃度で所定時間処理した。その後、全細胞溶解物の等量（５０μｇ）をウエスタンブロットにかけ、続いてＩｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｅｒ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ  Ｉｍａｇｅ社製）を用いて、定量した。【００４７】  （実施例１）ＮＥＤＬ１とＴＲＡＰδとの結合
ＣＯＳ７細胞を図２に示した発現プラスミド（ＮＥＤＬ１およびＦＬＡＧ−ＴＲＡＰδ）で共トランスフェクトした。全細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体（第１パネル）または抗ＮＥＤＬ１抗体（第２パネル）で免疫沈降（ＩＰ）させた。免疫沈降物を図に示した抗体を用いて免疫ブロット（ＩＢ）した。全細胞溶解物を各タンパク質の発現レベルについて、免疫ブロット解析した（第３パネル、第４パネル）。検出は、ホースラディシュペルオキシダーゼ共役された二次抗体を用いて行った。ＣＯＳ７細胞をｘｐｒｅｓｓ−ＮＥＤＬ１発現プラスミドでトランスフェクトし、同様の実験を行った（図３）。これらの結果から、ＮＥＤＬ１とＴＲＡＰδとの結合が外因性ＴＲＡＰδについて確認された。【００４８】  （実施例２）ＮＥＤＬ１とＳＯＤ１変異体との結合
ＮＥＤＬ１およびＦＬＡＧタグＳＯＤ１変異体または野生型ＳＯＤ１を過剰発現するＣＯＳ７細胞からの全細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体（第１パネル）または抗ＮＥＤＬ１抗体（第２パネル）を用いて、免疫沈降させ、それから抗ＮＥＤＬ１抗体または抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、免疫ブロットした。ＮＥＤＬ１またはＦＬＡＧタグＳＯＤ１変異体の発現を抗ＮＥＤＬ１抗体（第３パネル）または抗ＦＬＡＧ抗体（第４パネル）を用いて、それぞれ解析した（図４）。発症後、急速な臨床経過を辿り、患者が１．５年以内に死亡するＳＯＤ１変異体（Ｃ６Ｆ、Ａ４Ｖ）は、ＮＥＤＬ１と強く結合していることが分かる（図４、レーン３、４）。一方、発症後緩徐な臨床経過を示す、ＳＯＤ１変異体（Ｌ１２６Ｓ、Ｈ４６Ｒ、Ｄ９０Ａ）は、ほとんどＮＥＤＬ１と結合をしていないことが分かる（図４、レーン１１〜１３）。発症後特異な神経症状を示す変異である、ＳＯＤ１変異体（Ｇ９３Ａ）は、ＮＥＤＬ１と中程度の結合をしていることが分かる。また、野生型ＳＯＤ１とＮＥＤＬ１は結合しない（共沈しない）ことも分かる（レーン２）。【００４９】  （実施例３）ＴＲＡＰδとＳＯＤ１変異体との結合
ＣＯＳ７細胞をＦＬＡＧタグＴＲＡＰδおよびＭｙｃタグＳＯＤ１変異体またはＭｙｃタグ野生型ＳＯＤ１をコードする発現プラスミドで一過的に共トランスフェクトした。全細胞溶解物を抗Ｍｙｃ抗体（第１パネル）または抗ＦＬＡＧ抗体（第２パネル）を用いて、免疫沈降させ、それから抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｍｙｃ抗体を用いて、免疫ブロットした（図７）。ＦＬＡＧタグＴＲＡＰδまたはＭｙｃタグＳＯＤ１変異体の発現を抗ＦＬＡＧ抗体（第３パネル）または抗Ｍｙｃ抗体（第４パネル）を用いて、それぞれ解析した。発症後、急速な臨床経過を辿り、患者が１．５年以内に死亡するＳＯＤ１変異体（Ａ４Ｖ）は、ＴＲＡＰδと強く結合していることが分かる（図７、レーン４）。一方、発症後緩徐な臨床経過を示す、ＳＯＤ１変異体（Ｈ４６Ｒ）は、ほとんどＴＲＡＰδと結合をしていないことが分かる（レーン６）。また、野生型ＳＯＤ１とＴＲＡＰδは結合しない（共沈しない）ことも分かる（レーン３）。【００５０】  （実施例４）ＮＥＤＬ１依存性ユビキチン化
ＮＥＤＬ１は、ＳＯＤ１変異体をＳＯＤ１のタイプに依存する様式でユビキチン化した。
ＣＯＳ７細胞を図５に示した発現プラスミドを用いて、一過的に共トランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの全細胞溶解物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させて、抗ユビキチン抗体を用いて免疫ブロットした（上部パネル）。ユビキチン化の程度は、ほぼＦＡＬＳの臨床重症度（Ａ４Ｖ＞Ｇ９３Ａ＞Ｈ４６Ｒ）に比例した。全細胞溶解物を抗ＮＥＤＬ１抗体で免疫ブロットし、トランスフェクトしたＮＥＤＬ１の発現を確認した（下部パネル）。図中、矢印は、ユビキチン化されていないＳＯＤ１の位置を示し、左側に分子量マーカーの位置を示してある。【００５１】  （実施例５）ＮＥＤＬ１の存在下、または不在下の野生型ＳＯＤ１およびＳＯＤ１変異体の半減期
シクロヘキシジンを添加後（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、図６に示したような異なる時点で回収した、空ベクターまたはＮＥＤＬ１発現プラスミドでトランスフェクトしたＮｅｕｒｏ２ａ細胞の溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットして、ＳＯＤ１蛋白レベルを分析した。ＳＯＤ１変異体は、野生型ＳＯＤ１より迅速に分解された。ＮＥＤＬ１は、野生型ＳＯＤ１の分解に影響を及ぼさなかった。ＳＯＤ１変異体タンパク質の分解は、促進され、ＮＥＤＬ１の存在下、ＳＯＤ１変異体タンパク質の半減期は、ほぼＦＡＬＳの重症度（Ａ４Ｖ＞Ｇ９３Ａ＞Ｈ４６Ｒ）に比例して減少してゆくことが分かる。【００５２】  （実施例６）ＮＥＤＬ１とＤｖｌ１との結合
ＣＯＳ７細胞中、ＭｙｃタグＤｖｌ１をＮＥＤＬ１とともに過剰発現させた。全細胞溶解物を抗ＮＥＤＬ１抗体で免疫沈降させ、続いて抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫ブロットした（図８の上部パネル）。ＭｙｃタグＤｖｌ１の発現レベルを抗Ｍｙｃ抗体を用いて、免疫ブロットし解析した（下部パネル）【００５３】  （実施例７）Ｄｖｌ１のＮＥＤＬ１依存性ユビキチン化
ＮＥＤＬ１は、ＣＯＳ７細胞中Ｄｖｌ１をユビキチン化した。ＣＯＳ７細胞を図９に示した発現プラスミドを用いて、一過的に共トランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＯＳ７細胞からの全細胞溶解物を抗Ｍｙｃ抗体で免疫沈降させて、抗ユビキチン抗体を用いて免疫ブロットした（上部パネル）。全細胞溶解物を抗ｘｐｒｅｓｓ−ＮＥＤＬ１抗体（中段パネル）または抗Ｍｙｃ抗体（下段パネル）で免疫ブロットし、トランスフェクトしたＮＥＤＬ１またはＭｙｃ−Ｄｖｌ１の発現を確認した。【００５４】  （実施例８）ＮＥＤＬ１によるＤｖｌ１の分解
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞をＦＬＡＧタグＤｖｌ１用の発現プラスミドを用いて、ＮＥＤＬ１発現プラスミドの存在下、または不在のもとでトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をシクロヘキシジン添加後（終濃度５０μｇ／ｍｌ）、図１０に示したような異なる時点で回収した。
Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞溶解物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫ブロットして、Ｄｖｌ１蛋白レベルを分析した。ＮＥＤＬ１の存在下、ＦＬＡＧ−Ｄｖｌ１の半減期は、顕著に減少した。【００５５】  （実施例９）Ｄｖｌ１とＳＯＤ１変異体との結合
ＣＯＳ７細胞を図１１に示した発現プラスミドで一過的に共トランスフェクトした。全細胞溶解物を抗Ｍｙｃ抗体で、免疫沈降させ、それから抗ＦＬＡＧ抗体または抗Ｍｙｃ抗体を用いて、免疫ブロットした。ＮＥＤＬ１の存在下、Ｄｖｌ１とＳＯＤ１変異体との結合が強まっていることが分かる（図１１、レーン４）。結合能は、ほぼＦＡＬＳの重症度（Ａ４Ｖ＞Ｇ９３Ａ＞Ｈ４６Ｒ）に比例して減少してゆくことも分かる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】  以上説明したように、本発明は、ＮＥＤＬ１とＳＯＤ１変異体との結合能、或いはＮＥＤＬ１存在下、または非存在下でのＮＥＤＬ１関連因子とＳＯＤ１変異体との結合能を評価することによって、前記ＳＯＤ１変異体が単離されたＦＡＬＳ患者の臨床悪性度の判定を可能にし、ＦＡＬＳの診断に役に立つ。
【図１】
2005056822.tif 000002
【図２】
2005056822.tif 000003
【図３】
2005056822.tif 000004
【図４】
2005056822.tif 000005
【図５】
2005056822.tif 000006
【図６】
2005056822.tif 000007
【図７】
2005056822.tif 000008
【図８】
2005056822.tif 000009
【図９】
2005056822.tif 000010
【図１０】
2005056822.tif 000011
【図１１】
2005056822.tif 000012
【図１２】
2005056822.tif 000013
【国際調査報告】
2005056822.tif 000014
2005056822.tif 000015
2005056822.tif 000016
2005056822.tif 000017
2005056822.tif 000018
2005056822.tif 000019