(57)【要約】  ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法。代表的には、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的なプライマーとを用いてＰＣＲを行うことにより、この組込みを検出できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法。
【請求項２】
上記肝臓組織のＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定して、ＭＬＬ４遺伝子中にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれたことを確認することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３中にＨＢＶ−ＤＮＡのＸ遺伝子を含む領域が組込まれたことを確認する請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３の５’末端から第１７５１５番目から第１７８１８番目の塩基までの領域へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＨＢＶ−ＤＮＡがＨＢＶのＸ遺伝子を含む領域である請求項１、４又は５に記載の方法。
【請求項７】
以下の工程を含む方法により、ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法；
(1)  上記肝臓組織からＤＮＡを抽出する工程、
(2)  (1)で得られたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第１のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、
又はさらに、
(3)  (2)で増幅されたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
【請求項８】
ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶとの融合転写産物を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ-ＤＮＡの組込みを検出する請求項１及び４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ領域との融合転写産物を検出する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＭＬＬ４とＨＢＶとの融合タンパク質を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ-ＤＮＡの組込みを検出する請求項１及び４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いる請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆する、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する方法。
【請求項１４】
１７番染色体と１９番染色体との接合部を含む塩基配列を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程を含む方法により、１７番染色体と１９番染色体との接合部を含む塩基配列を検出する請求項１４に記載の方法；
(1)  上記肝臓組織からＤＮＡを抽出する工程
(2)  得られたＤＮＡを鋳型として、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第１のプライマーと、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
(3)  増幅されたＤＮＡを鋳型として、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第２のプライマーと、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
【請求項１６】
ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出するためのキット。
【請求項１７】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出するためのキット。
【請求項１８】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶのＸ領域の組込みを検出するためのキット。
【請求項１９】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマー又はプローブと、ＨＢＶのＸ領域に特異的なプライマー又はプローブとを備える請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ領域との融合転写産物を検出するためのキット。
【請求項２１】
ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出するためのキット。
【請求項２２】
ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を備える請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出するためのキット。
【請求項２４】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマー又はプローブと、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的なプライマー又はプローブとを備える請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性肝炎又は肝硬変等の疾患組織から組織の腫瘍性を示唆する、ＭＬＬ４遺伝子のＨＢＶ−ＤＮＡの組込みの検出方法及びキット、またはこれらの融合物の検出方法及びキットに関する。さらに本発明は、組織の腫瘍性を示唆する、１９番染色体長腕上の遺伝子ＭＬＬ４のイントロン３と１７番染色体短腕との間の染色体転座の検出方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパドナウイルス科のファミリーであるヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、非常に狭い宿主範囲を呈し、肝実質細胞に対して強い親和性を示す。急性のＨＢＶ感染は、時に重大な病気をもたらし、そして、患者の約0.5％は劇症肝炎によって死亡する。一方、慢性の感染症は、例えば慢性肝炎、肝硬変および肝細胞癌のような中等症から重症の肝臓疾患を起こす(Beasley, R.P., et al., Lancet, 2, 1129-1133 (1981)；Block, T.M., et al., Oncogene, 22, 5093-5107 (2003))。慢性のＨＢＶ感染症をもつ患者の約25％は、最終的に処置不能の肝臓癌に帰結する。【０００３】
ＨＢＶは頻繁にヒト宿主ゲノムの中に組込まれ、それによる挿入突然変異生成は腫瘍形成において重大な役割を果たすと予測される。このため、ウイルスの組込み部位の特定は、癌に関連した遺伝子を特定するための有力なツールを提供することになる（Gozuacik, D., et al., Oncogene, 20, 6233-6240 (2001)；Brechot, C., Semin. Cancer Biol., 10,211-231 (2000))。これを示す事実として以下の事実が挙げられる。【０００４】
例えば、ウッドチャック(Woodchuck)動物モデルにおいて、80％以上の頻度で、ウッドチャック肝臓の腫瘍形成を説明し得るＮ−ｍｙｃファミリー癌遺伝子内又は隣接する領域に、ＨＢＶに関連のあるウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）が組込まれている（Hsu, T., et al., Cell, 55,627-635 (1988)；Fourel, G., et al., Nature, 347, 294-298 (1990)）。ヒトにおいては、ＨＢＶ−ＤＮＡの宿主ゲノムへのランダムな組込みが、慢性肝炎組織において知られている(Takada, S., et al., J. Virol., 64, 822-828 (1990))。さらに、約90％のＨＢｓ抗原陽性患者由来の肝細胞癌（ＨＣＣ）組織において、ＨＢＶ−ＤＮＡのクローナル又はオリゴクローナルな組込みがサザン・ブロッティング解析によって確認されている（Brechot, C., Semin. Cancer Biol., 10,211-231 (2000)）。【０００５】
肝細胞癌は、世界中で最も一般的な腫瘍疾患のひとつである。肝細胞癌の大多数は、ヒトＢ型肝炎ウイルスまたはヒトＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の慢性感染によって生じる。腫瘍関連ウイルスによる腫瘍形成の古典的なメカニズムは、細胞のゲノムの中にウイルスのゲノム組込みを通して、潜在的に癌化を起こし得る細胞遺伝子を活性化させることである。【０００６】
例えば、レチノイン酸受容体β及びサイクリンＡ２遺伝子の中へのＨＢＶゲノム組込みが腫瘍形成の原因になっていることが証明されている（Dejean,A., et al., Nature, 322, 70-72 (1986)；Wang,J., et al., Nature,343, 555-557 (1990)）。筋小胞体カルシウム-ATPase(ＳＥＲＣＡ：sarco／endoplasmic reticulum calcium ATPase)もまたＨＢＶの組込みの標的であり、融合産物であるＨＢｘ／ＳＥＲＣＡ１キメラ蛋白質が、アポトーシスを介して腫瘍形成に関連している可能性が報告されている（Chami, M., et al.,Oncogene, 19,2877-2886(2000)；Minami,M.,et al.）。しかし、これらの部位へのＨＢＶの組込みによる腫瘍形成は、他の肝細胞癌患者からの検体において再現性が得られていない。【０００７】
また、肝細胞癌組織においてＨＢＶ−ＤＮＡがヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のプロモーター領域の中に選択的に組込まれ、その結果、肝細胞癌のヒトテロメラーゼ逆転写酵素のシス活性化が起こるという複数の報告がある（Ferber,M.J.,et al., Oncogene,22, 3813-3820 (2003)；Paterlini-Brechot,P., et al., Oncogene, 22, 3911-3916 (2003)）。また、癌抑制遺伝子及び癌遺伝子がｈＴＥＲＴによる発癌抑制に関係しているという報告がある(Lin, S.Y.,and Elledge, S.J., Cell, 113, 881-889 (2003))。これらの報告から、ｈＴＥＲＴ遺伝子又はそのプロモーター中へのＨＢＶ−ＤＮＡ組込みが、腫瘍形成に直接的に影響を与え得ると考えられる。【０００８】
ここで、混合性白血病４（ＭＬＬ４）遺伝子（ATCCアクセッション番号：AD000671）は、ヒトにおけるＭＬＬ遺伝子の２番目の相同遺伝子として報告されたものである(Ruault, M., et al., Gene, 284, 73-81 (2002))。なお、ＭＬＬ４遺伝子は従来ＭＬＬ２と呼ばれており、この文献にはＭＬＬ２と記載されている。このＭＬＬ４遺伝子は、TRX/MLL遺伝子ファミリーのメンバーである（FitzGerald, K.T., and Diaz,M.O., Genomics,59,187-192 (1999)）。ＭＬＬ４遺伝子は、固形腫瘍において頻繁なゲノム再構成または増幅が報告（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）されている、染色体１９ｑ１３．１上に存在しており、成人ヒト組織に遍在的に発現している。ＨＢＶに関連した肝細胞癌において、染色体１９ｑ１３．１の遺伝子の増幅が、比較遺伝子競合法（Comparative genomic hybridization: ＣＧＨ）によって観察されている（非特許文献４）。また、固形腫瘍において、染色体１９ｑ１３．１の高頻度のゲノム再配置が報告されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献５）。【０００９】
またＭＬＬ遺伝子は、ヒト白血病と関連して頻繁に染色体転座の標的となる事が知られている（der Poel, S.Z., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88, 10735-10739 (1991)；Rowley, J.D., Annu. Rev. Genet., 96, 496-519 (1998)；Huntsman, D.G., et al., Oncogene, 18, 7975-7984 (1999)）。ＭＬＬとＭＬＬ４の間には高く保存された領域があるため、類似の可能性をＭＬＬ４遺伝子に対しても当てはめることができるが、ＭＬＬ４遺伝子を含んでいる染色体の領域が白血病における転座に関連してはいるとの報告はなされていない。【００１０】
このように、ＨＢＶ−ＤＮＡがヒト肝細胞の腫瘍形成に関係していると考えられるにもかかわらず、肝臓癌を引き起こすヒト染色体へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み位置についての情報は少なく、そのため、ＨＢＶに起因する肝臓癌を高確率で検出することができない。このことから、ＨＢＶに起因する肝臓癌におけるヒト染色体へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み位置の特定が求められている。
【非特許文献１】Mitelman, F., et al., Nat.Genet.,15,417-474 (1997)
【非特許文献２】Curtis,L.J.,et al., Genomics,53, 42-55 (1998)
【非特許文献３】Ferbus,D, et al., Int.J.Cancer, 80,369-372 (1999)
【非特許文献４】Marchio,a., et al., Genes Chromosom. Cancer, 18,59-65 (1997)
【非特許文献５】Urashima, T.,et al., J.Hepatol., 26, 771-778 (1997)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、腫瘍の疑いのある肝臓組織におけるＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み位置及び１７番染色体と１９番染色体間の転座を特定し、それにより組織の腫瘍性を示唆する一例として肝臓癌を効果的に検出できる方法及びそれに用いるキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記課題を解決するために本発明者らは、腫瘍を示唆する選択的なＨＢＶ−ＤＮＡの組込みの新規標的遺伝子を特定することを試みた。さらに、特定遺伝子への組込み又はその結果生じる可能性のある融合物を検出することにより、検体提供患者が当該特定遺伝子の機能異常に関連した肝癌であること又は将来肝癌になる可能性があることを検出する方法論の確立を目的として研究を重ね、以下の知見を得た。
(1)  ＨＢｓ抗原陽性を呈する１０名の肝細胞癌患者の肝腫瘍組織からＤＮＡを抽出し、ＨＢＶ−ＤＮＡ特異的なプライマーを用いたアダプターライゲーション／サプレッションＰＣＲ法(Siebert,P.D., et al., Nucleic Acids Res., 23, 1087-1088 (1995)) を行った。アダプターライゲーション／サプレッションＰＣＲ法は、プライマーに対応する特定塩基配列を、その特定塩基配列が挿入された周辺部位とともに増幅できる方法であり、上記操作により、腫瘍組織から抽出されたＤＮＡへのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み部位を特定できる。【００１３】
この結果、肝細胞癌１０検体中７検体においてＨＢＶ−ＤＮＡ組込みが検出され、そのうち４検体において、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みが確認された。【００１４】
このことから、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出することにより、ＨＢＶ感染による肝臓癌を検出できると考えられる。
(2)   ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みが確認された４検体のＤＮＡでは、Ｃ末端を除くＨＢＶのＸタンパク質のコード領域とＨＢＶのプロモーター領域とが含まれていた。このことから、ＨＢＶのＸ遺伝子（ＨＢｘ）とＭＬＬ４との融合転写産物が存在することが予測される。実際にＲＴ−ＰＣＲを行った結果、ＨＢｘ−ＤＮＡの挿入により読み枠がずれてＭＬＬ４遺伝子の途中にストップコドンが生じた融合転写産物と、読み枠がずれておらずＭＬＬ４遺伝子の途中にストップコドンが入らない融合転写産物とが生じていた。【００１５】
このことから、ＨＢｘ−ＤＮＡとＭＬＬ４遺伝子との融合転写産物を検出することにより、ＨＢＶ感染による肝臓癌を検出できると考えられる。
(3)  ＨＢｘ−ＤＮＡのＭＬＬ４のイントロン３への組込みが確認された４検体について、肝腫瘍組織及びそれに隣接する非腫瘍組織から全タンパク質を調製し、抗ＨＢｘモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング及び免疫沈降産物の検出を行った。この結果、腫瘍組織で見られ非腫瘍組織には見られないバンド又は免疫沈降産物が検出された。【００１６】
このことから、抗ＨＢｘモノクローナル抗体又はＭＬＬ４のイントロン３とＨＢＶのＸの各領域との融合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティング又は免疫沈降反応等を用いて、ＨＢＶ−ＭＬＬ４の融合タンパク質を検出することにより、ＨＢＶ感染による肝臓癌を検出できると考えられる。【００１７】
(4)  ＨＢｓ抗原陽性１０検体を含む、抗ＨＢｃ抗体陽性を呈する肝細胞癌組織検体の２６検体について、ＭＬＬ４のイントロン３（１９番染色体長腕）に対応するプライマーと１７番染色体短腕に対応するプライマーとを用いたＰＣＲを行うことにより、２２検体から、ＭＬＬ４のイントロン３（１９番染色体長腕）と１７番染色体短腕との間の染色体転座が検出された。【００１８】
このことから、ＰＣＲで、ＭＬＬ４のイントロン３（１９番染色体長腕）と１７番染色体短腕との間の染色体転座を検出することにより、ＨＢＶ感染による肝臓癌を高確率で検出できると考えられる。
(5)  これらの結果は、ＭＬＬ４のイントロン３が発癌に関連したＨＢＶの組込みに対する選択的な標的のうちの1つであることを強く示唆している。また、この領域での染色体の再構成が肝臓の腫瘍形成と病因学な関連がある可能性もある。【００１９】
本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、以下の検出方法及び検出用キットを提供する。【００２０】
項１．  ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法。【００２１】
項２．  上記肝臓組織のＤＮＡについてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、増幅したＤＮＡの塩基配列を決定して、ＭＬＬ４遺伝子中にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれたことを確認することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する項１に記載の方法。【００２２】
項３．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３中にＨＢＶ−ＤＮＡのＸ遺伝子を含む領域が組込まれたことを確認する項２に記載の方法。【００２３】
項４．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する項１に記載の方法。【００２４】
項５．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３の５’末端から第１７５１５番目から第１７８１８番目の塩基までの領域へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する項４に記載の方法。【００２５】
項６．  ＨＢＶ−ＤＮＡがＨＢＶのＸ遺伝子を含む領域である項１、４又は５に記載の方法。【００２６】
項７．  以下の工程を含む方法により、ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法；
(1)  上記肝臓組織からＤＮＡを抽出する工程、
(2)  (1)で得られたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第１のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、
又はさらに、
(3)  (2)で増幅されたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
項８．  ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶとの融合転写産物を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ-ＤＮＡの組込みを検出する項１及び４〜６のいずれかに記載の方法。【００２７】
項９．  ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ領域との融合転写産物を検出する項８に記載の方法。【００２８】
項１０．  ＭＬＬ４とＨＢＶとの融合タンパク質を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ-ＤＮＡの組込みを検出する項１及び４〜６のいずれかに記載の方法。【００２９】
項１１．  ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出する項１０に記載の方法。【００３０】
項１２．  ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いる項１０又は１１に記載の方法。【００３１】
項１３．  ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆する、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する方法。【００３２】
項１４．  １７番染色体と１９番染色体との接合部を含む塩基配列を検出することにより、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する項１３に記載の方法。【００３３】
項１５．  以下の工程を含む方法により、１７番染色体と１９番染色体との接合部を含む塩基配列を検出する項１４に記載の方法；
(1)  上記肝臓組織からＤＮＡを抽出する工程
(2)  得られたＤＮＡを鋳型として、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第１のプライマーと、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
(3)  増幅されたＤＮＡを鋳型として、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第２のプライマーと、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程
項１６．  ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出するためのキット。【００３４】
項１７．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出するためのキット。【００３５】
項１８．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶのＸ領域の組込みを検出するためのキット。【００３６】
項１９．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマー又はプローブと、ＨＢＶのＸ領域に特異的なプライマー又はプローブとを備える項１８に記載のキット。【００３７】
項２０．  ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ領域との融合転写産物を検出するためのキット。【００３８】
項２１．  ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出するためのキット。【００３９】
項２２．  ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質に特異的に結合する抗体又は抗体断片を備える項２１に記載のキット。【００４０】
項２３．  ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出するためのキット。【００４１】
項２４．  ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマー又はプローブと、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的なプライマー又はプローブとを備える項２３に記載のキット。【００４２】
項２５．ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーとして配列番号：１２で示されるプライマーを用い、ＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的なプライマーとして配列番号：４で示されるプライマーを用いる項７に記載の方法。【００４３】
項２６．ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとして配列番号：８で示されるプライマーを用い、ＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第１のプライマーとして配列番号：１４で示されるプライマーを用い、又はさらに、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとして配列番号：９で示されるプライマーを用い、ＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第２のプライマーとして配列番号：１４で示されるプライマーを用いる項７に記載の方法。【００４４】
項２７．１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第１のプライマーとして配列番号：２０で示されるプライマーを用い、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとして配列番号：８で示されるプライマーを用い、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的な第２のプライマーとして配列番号：２１で示されるプライマーを用い、１９番染色体ｑ１３．１のＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとして配列番号：９で示されるプライマーを用いる項１５に記載の方法。
【発明の効果】
【００４５】
本発明方法及びキットによれば、肝臓癌の疑いがあるヒト、特に、ＨＢＶに感染、又は／及び慢性肝炎や肝硬変などのヒトから採取された肝臓組織のＤＮＡについて、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みをＰＣＲ法で検出することができ、これにより、肝細胞組織の腫瘍性変化の示唆に基づきその有無を検出することができる。【００４６】
また本発明方法及びキットによれば、上記ＤＮＡについて、ＭＬＬ４遺伝子にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれた融合物、より詳しくは、ＭＬＬ４遺伝子にＨＢＶのＸ遺伝子領域を含むＤＮＡが組込まれた融合物、融合転写産物又は融合タンパク質を検出することができ、これにより腫瘍化に関する遺伝子診断を行うことができる。また、これらの融合産物は、慢性肝炎・肝硬変などの肝臓疾患患者における遺伝子の組込みと癌化との関連についての研究に利用できる。【００４７】
さらに本発明方法及びキットによれば、上記のＤＮＡについて、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出することができ、これにより腫瘍化に関する遺伝子診断を行える。また、本発明方法及びキットは、遺伝子再構成関連遺伝子の機能と細胞の癌化、特に肝細胞の癌化との係わりについての研究に利用できる。【００４８】
以上より、本発明方法及びキットは、ヒト慢性肝炎・肝硬変患者、或いはアルコール性肝障害、ウィルソン病のような代謝性疾患に基づく肝障害患者、ヘモクロマトーシス、アフラトキシンのような化学物質暴露による肝障害患者、自己免疫性肝炎などに罹っている患者などの疾患における肝臓組織の腫瘍性の発症機序の解明、特に肝細胞癌の発症機序の解明、組織の腫瘍性の把握、診断および予防に有用な情報及び手段を与えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】ＨＢＶ組込み部位を検出するためのアダプター・ライゲーション／サプレッション−ＰＣＲ及び特異的ＰＣＲの結果を示す図面である。
【００５０】
第１図ａは、アダプター・ライゲーション／サプレッション−ＰＣＲのプロトコール図面である。【００５１】
第１図ｂは、アダプター・ライゲーション／サプレッション−ＰＣＲによるＨＢＶ／細胞内ＤＮＡジャンクションのスクリーニングの結果を示す図面である。【００５２】
第１図ｃは、特異的プライマーでのＭＬＬ４遺伝子の中へのＨＢＶ−ＤＮＡ組込みのＰＣＲコンホメーションを示す図面である。
【図２】ＨＢＶ組込み部位周辺の配列を示す図面である。
【図３】４つの組込まれたＨＢＶゲノムの分析結果を示す図面である。
【図４】ＨＢｘ−ＭＬＬ４融合転写産物のＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を示す図面である。
【図５】肝細胞癌患者検体におけるＨＢｘ融合タンパク質の免疫検定結果を示す図面である。
【図６】ＭＬＬ４のイントロン３の遺伝子座における相互転座を示す図面である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５３】
以下、本発明を詳細に説明する。【００５４】
本発明は、ＭＬＬ４遺伝子の特定領域へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み、特にＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶのＸ遺伝子領域の組込みと慢性肝炎又は肝硬変の病歴を有する肝細胞癌患者の組織の腫瘍性の示唆とが関連しているという事実、１９番染色体上にあるＭＬＬ４遺伝子と１７番染色体の転座と慢性肝炎又は肝硬変の病歴を有する肝細胞癌患者の組織の腫瘍性の示唆とが関連しているという事実、さらにこれらの事実に基づく、ＭＬＬ４遺伝子の特定位置におけるＤＮＡの組込み又は遺伝子の転座を検出することにより肝細胞癌などの発症リスクを判定（予測診断）できるという事実の発見に基づいて完成されている。【００５５】
本明細書におけるアミノ酸、ペプチド、塩基配列、核酸等の略号による表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの規定〔IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984)〕、「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（特許庁編）及び当該分野における慣用記号に従う。
（Ｉ）ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みの検出方法
本発明の第１の検出方法は、ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法である。
対象
本発明の第１の検査方法の対象となるヒトは、特に限定されず、健常人又は肝疾患などの疾患に罹っているヒトのいずれであってもよい。中でも肝細胞癌に進行しやすい疾患である慢性肝炎、肝硬変、アルコール性肝障害、ウィルソン病のような代謝性疾患に基づく肝障害、ヘモクロマトーシス、アフラトキシンのような化学物質暴露による肝障害、自己免疫性肝炎などに罹っているヒトが好適な対象である。また、肝臓癌に罹っているヒトについて本発明の検査方法を行うことにより、ＨＢＶ感染による肝臓癌であることを確認することもできる。
ＭＬＬ４遺伝子
本明細書中に示されるヒトＭＬＬ４遺伝子のゲノム配列は、ヒューマン・ゲノム・センター(Human Genome Center)のラメルジン(Lamerdin, J.E.)らによってGenBankアクセッション番号：ＡＤ000671として報告された全長46,251塩基長(bp)の遺伝子のゲノム配列に従う。配列番号：１に、全長46,251塩基長(bp)のヒトＭＬＬ４遺伝子（ＡＤ000671）の第15295〜17983番目の塩基の領域で示されるエクソン３からエクソン４の塩基の配列を示す。【００５６】
ＭＬＬ４のゲノム配列から推定される遺伝子は、３７個のエクソンからなり（FitzGerald,K.T.,and Diaz,M.O.,Genomics,59,187-192(1999))、それらの間にイントロンが存在する。またＭＬＬ４のゲノム配列から推定される遺伝子は、固形腫瘍において頻繁な再配置または増幅が報告されている１９番染色体長腕１３．１（１９ｑ１３．１）上に局在しており、多くの染色体転座と白血病とに関連しているＭＬＬ遺伝子類似のＴＲＸ／ＭＬＬ遺伝子ファミリーのヒトメンバーである。【００５７】
第２図ｂ、第３図ｃ、第４図ｂ、及び第６図中には、ＭＬＬ４のイントロン３／エクソン４領域を含む配列が示されており、第６図中には１９番染色体上のＭＬＬ４遺伝子のＤＮＡ配列と１７番染色体との相互転座がＤＮＡ配列の挿入図として示されている。
ＨＢＶ−ＤＮＡ
本明細書中に示されるヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のゲノム配列は、自治医科大学のオカモトらによって報告されたGenBankアクセッション番号：ＡＢ033550として報告された全長3,215塩基長(bp)の遺伝子の塩基配列に従う。【００５８】
また、本発明において、ＭＬＬ４遺伝子への組込みが確認されたＨＢＶ−ＤＮＡの領域であるＸ遺伝子領域は、前記GenBankアクセッション番号：ＡＢ033550の塩基番号1374-1838で示される465塩基長(bp)の領域である（配列番号：２）。この遺伝子領域は、１５５個のアミノ酸配列長からなるタンパク質をコードする。第３図ａには、ＨＢＶの環状ゲノムが直線状にして示されている。
ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込み
第３図ｂには、本発明の実施例においてＨＢＶ−ＤＮＡの組込みが検出された４つの検体（ＨＣＣ００２（1051-1762）、ＨＣＣ１３１（1824-1826）、ＨＣＣ１４３（2974-1794）、ＨＣＣ１４６（-1807：片側未確定）の染色体ＤＮＡに組込まれたＨＢＶゲノムが示されている。ＨＢＶの組込みが確認された上記４検体においては、ＨＣＣ１３１でのみＨＢＶの全長が組込まれており、また４検体ともにＸ遺伝子のプロモーター領域及びＣ末端部分を除くコード領域が組込まれていた。【００５９】
従って、本発明方法においては、ＨＢＶ−ＤＮＡのいずれかの部分のＭＬＬ４遺伝子への組込みを検出すればよく、中でもＨＢＶのＸ遺伝子のプロモーター領域及びコード領域のいずれかの部分のＭＬＬ４遺伝子への組込みを検出することにより、一層高確率で肝臓癌など肝臓組織の腫瘍性についての検査を行うことができる。【００６０】
また第３図ｃに示されるように、上記４検体のＭＬＬ４遺伝子中のＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれた位置は、全てイントロン３内であった。より詳しくは、検体番号ＨＣＣ１４６はＭＬＬ４遺伝子の５’末端側から数えて17515番目の位置、ＨＣＣ００２はＭＬＬ４遺伝子の５’末端側から数えて17543番目の位置、ＨＣＣ１３１はＭＬＬ４遺伝子の５’末端側から数えて17753番目の位置、ＨＣＣ１４３はＭＬＬ４遺伝子の５’末端側から数えて17818番目の位置にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれていた。【００６１】
従って、本発明方法においては、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３におけるＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出することにより高確率で肝細胞癌を検査できる。中でも、ＭＬＬ４遺伝子の５’末端側から17515〜17818番目の領域へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出することにより、一層高確率で肝臓癌など肝臓組織の腫瘍性について検査できる。
ＤＮＡの調製
ヒト検体からのＤＮＡの抽出は、検査対象となるヒトから単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織からＤＮＡを調製する。【００６２】
本発明において遺伝子は、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡを包含し、またその長さは何ら制限されない。従って、本発明の遺伝子（ＤＮＡ）には、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（センス鎖）、該センス鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（アンチセンス鎖）、及びそれらの断片のいずれもが含まれる。本発明において遺伝子（ＤＮＡ）とは、調節領域、コード領域、エクソン、イントロンを含む。ポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡ及びＤＮＡを例示できる。ＤＮＡは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含み、特定アミノ酸配列を有するポリペプチドは、その断片、同族体、誘導体、及び変異体を含む。【００６３】
本発明の検査方法に用いられる遺伝子は、本発明により開示された遺伝子の具体例についての配列情報に基づいて、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）など参照〕。【００６４】
具体的には、遺伝子が発現される適当な起源、本発明においては肝細胞癌に進行し易い疾患である慢性肝炎・肝硬変、アルコール性肝障害、ウィルソン病のような代謝性疾患に基づく肝障害、ヘモクロマトーシス、アフラトキシンのような化学物質暴露による肝障害、自己免疫性肝炎などに罹っている患者から得られる遺伝子を例示できる。好ましくはヒト慢性肝炎患者、肝硬変患者、肝細胞癌患者からのヒト組織から、単離されるＤＮＡを調製すればよい。【００６５】
検体として、上記起源材料は、ヒト患者由来のＤＮＡまたはゲノムＤＮＡであるのが好ましい。これら起源材料からのＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、cＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法に従って実施することができる。【００６６】
遺伝子を単離されたＤＮＡや遺伝子の発現産物からスクリーニングする方法も、特に制限されず、例えば、遺伝子に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより、目的遺伝子を取得できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science, 222, 778 (1983)など〕。【００６７】
具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生される蛋白質に対して、該蛋白質の特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のＤＮＡ配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーションやこれらの組合せなどを例示できる。【００６８】
起源材料からのＭＬＬ４にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれたＤＮＡの抽出は、上記方法のほか、アダプターライゲーション／サプレッション−ＰＣＲ法により行うことができる。即ち、起源材料からゲノムＤＮＡを抽出した後、ゲノムＤＮＡを制限酵素で消化し、平滑末端とした後、アダプター配列を該ゲノムＤＮＡ断片に連結させ、ＨＢＶ配列に対して特異的プライマーとアダプター特異的プライマーとを加えて、１次ＰＣＲ反応を行い、目的ゲノムＤＮＡ断片を増幅することができる（Siebert,P.D., et al., Nucleic Acids Res., 23, 1087-1088 (1995)）。該ゲノムＤＮＡは、Genomewalker kit：クローンテック（Clontech）社製を用いて取得できる。【００６９】
抽出した遺伝子は、遺伝子増幅法によって増幅させることができる。この増幅によれば、本発明検出方法における検出をより容易に且つ精度の高いものとすることができる。【００７０】
遺伝子増幅法の例としては、ＰＣＲ法〔Science, 230, 1350 (1985)〕によるＤＮＡ／ＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、組織またはライブラリーから全長のcＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification ofcDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５'-ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕などの採用が好適である。【００７１】
ＰＣＲ法などで増幅させた遺伝子断片の単離精製は、常法、例えばゲル電気泳動法、カラム等により行うことができる。増幅産物の確認は例えばマススペクトル法等で行える。これらの方法により増幅させた遺伝子は、その増幅物の特性に応じて、本発明に係るＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡ遺伝子の組込みが存在するか否か、組込まれた融合物のＤＮＡ配列の決定、そのｍＲＮＡの量について分析できるかの検出に供される。
ＰＣＲによる組込みの検出
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶのＸ遺伝子の組込みを検出できる方法として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３にＨＢＶのＸ遺伝子が組込まれた特定配列部分を特異的に検出するためのプライマーセットを用いたＰＣＲを挙げることができる。【００７２】
スクリーニング用プライマーとしては、ＭＬＬ４遺伝子又はＨＢＶ−ＤＮＡ遺伝子に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡなどが一般的に使用できるが、既に取得された融合又は接合した遺伝子やその断片も良好に利用できる。また、遺伝子の塩基配列情報に基づき設定した遺伝子特異的フォワード・プライマー、リバース・プライマーをスクリーニング用プライマーとして用いることができる。【００７３】
このようなプライマーセットを用いたＰＣＲとして、代表的には、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーと、ＨＢＶのＸ遺伝子に特異的なプライマーとを用いたＰＣＲを挙げることができる。【００７４】
また、検出できる程度に増幅産物が得られない場合は、上記ＰＣＲの増幅産物を鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーと、ＨＢＶのＸ遺伝子に特異的なプライマーとを用いた２次ＰＣＲを行うことにより検出感度を向上させることができる。【００７５】
具体的には、ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆するＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出する方法の代表例として、以下の工程を含む方法が挙げられる。
(1)  上記肝臓組織からＤＮＡを抽出する工程、
(2)  (1)で得られたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第１のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第１のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程、
又はさらに、
(3)  (2)で増幅されたＤＮＡを鋳型として、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的な第２のプライマーとＨＢＶのＸ遺伝子領域に特異的な第２のプライマーとを用いてＰＣＲを行う工程を含む方法。【００７６】
これらの領域に特異的なプライマー（フォワード・プライマー及びリバース・プライマー）の配列は、ＭＬＬ４遺伝子及びＨＢＶ−ＤＮＡの塩基配列に基づき、常法に従い適宜設計することができる。プライマーの長さは、特に限定されないが、通常１０ヌクレオチド以上、好ましくは１０〜５０ヌクレオチド程度、より好ましくは１０〜３５ヌクレオチド程度、さらにより好ましくは１５〜３５ヌクレオチド程度とすればよい。【００７７】
具体的には、ＭＬＬ４については、ＭＬＬ４のイントロン３の１０〜３５ヌクレオチド程度、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の部分配列を認識してＤＮＡ合成を開始できるものであればよい。また、ＨＢＶ−ＤＮＡについては、ＭＬＬ４のイントロン３領域に挿入されたＨＢＶのＸ遺伝子の配列の１０〜３５ヌクレオチド程度、好ましくは１５〜３０ヌクレオチド程度の部分配列を認識してＤＮＡ合成を開始できるものであってもよい。【００７８】
このようなプライマーは、常法により合成できる。例えば、ホスホルアミダイト法またはリン酸トリエステル法などの化学合成法により合成でき、また市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置、例えば（Pharmacia LKB Gene Assembler Plus:ファルマシア社製）などを使用して合成することもできる。二本鎖断片は、相補鎖を合成し、適当な条件下で該鎖を共にアニーリングさせるか、または適当なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用い相補鎖を付加するかによって、化学合成した一本鎖生成物から得ることもできる。【００７９】
プライマー対の具体例を以下に挙げる。ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が組込まれた部分の前後のジャンクションをそれぞれ検出する場合には、以下の組合せを例示できる。【００８０】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が組込まれた部分の一方のジャンクションを検出する場合は、１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号８で示される６７１Ｆ１、リバース・プライマーとしては配列番号１４で示されるＭＤ２６を例示でき、２次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号９で示される６７１Ｆ２、リバース・プライマーとしては配列番号１４で示されるＭＤ２６を例示することができる。ここで、２次反応は任意に行うことができる。【００８１】
また、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が組込まれた部分の他方のジャンクションを検出する場合は、１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号４で示されるＭＤ２６ｃ、リバース・プライマーとしては配列番号１２で示される６７１Ｒ３を例示できる。ここで配列番号１２で示される６７１Ｒ３に代えて、配列番号１０で示される６７１Ｒ１又は配列番号１１で示される６７１Ｒ２をリバース・プライマーとして用いてもよい。【００８２】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が逆方向に組込まれた場合の、組込み部分の前後のジャンクションをそれぞれ検出する場合には、以下の組合せを例示できる。【００８３】
ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が逆方向に組込まれた部分の一方の部分のジャンクションを検出する場合は、１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号８で示される６７１Ｆ１、リバース・プライマーとしては配列番号４で示されるＭＤ２６ｃを例示することができる。また、２次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号９で示される６７１Ｆ２、リバース・プライマーとしては配列番号４で示されるＭＤ２６ｃを例示することができる。ここで、２次反応は任意に行うことができる。【００８４】
また、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が逆方向に組込まれた部分の他方の部分のジャンクションを検出する場合は、１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとして配列番号１４で示されるＭＤ２６、リバース・プライマーとしては、配列番号１２で示される６７１Ｒ３を例示できる。ここで６７１Ｒ３に代えて、配列番号１０または１１で示される６７１Ｒ１、６７１Ｒ２をリバース・プライマーにしてもよい。
プライマー対の好ましい組合せとしては、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が組込まれた部分のジャンクションを検出する場合は、フォワード・プライマーとして配列番号４で示されるＭＤ２６ｃと、リバース・プライマーとして配列番号１２で示される６７１Ｒ３との組み合わせを例示できる。また、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域にＨＢＶのＸ遺伝子が逆向きに組込まれた場合のジャンクションを検出する場合は、フォワード・プライマーとして配列番号８で示される６７１Ｆ１と、リバース・プライマーとして配列番号４で示されるＭＤ２６ｃとの組み合わせを好ましく例示できる。
ＰＣＲ増幅産物の検出・同定
上記ＰＣＲによりＤＮＡが増幅したことは、例えばアガロースゲル電気泳動などにより検出することができ、これによりＭＬＬ４遺伝子のイントロン３へのＨＢＶのＸ遺伝子の組込みを検出できる。【００８５】
さらに、この増幅産物をアガロースゲルから切り出されたバンドから抽出して、その塩基配列を決定することにより、ＭＬＬ４遺伝子中にＨＢＶ−ＤＮＡが組込まれたことを確認してもよい。【００８６】
ＤＮＡの塩基配列の決定は、常法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463 (1977)〕やマキサム−ギルバート法〔Methods in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などに従って行うことができる。また市販のシークエンスキットなどを用いれば、簡便に塩基配列を決定できる。
融合転写産物の検出
ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ遺伝子との融合転写産物を検出することによっても、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを検出することができる。ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ遺伝子との融合転写産物としては、ＭＬＬ４の全部又は一部とＨＢＶのＸ遺伝子の全部又は一部との融合転写産物を検出すればよい。【００８７】
かかる検出は常法に従って行うことができ、例えばＲＴ−ＰＣＲ〔Reverse Transcribed-Polymerase Chain Reaction; E.S. Kawasaki, et al., amplification of RNA. In PCR Protocol, a guide to methods and applications, AcademicPress,Inc.,SanDiego, 21-27 (1991)〕によるＲＮＡ増幅、ノーザンブロッティング解析〔Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Lab. (1989)〕、in situＲＴ−ＰＣＲ〔Nucl. Acids Res., 21, 3159-3166 (1993)〕、 in situ ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング［Sambrook, J., et al., MolecularCloning a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press:NY.(1989)］、蛍光in situ ハイブリダイゼーション［ＦＩＳＨ:Takahashi E., et al.,Hum. Genet., 86, 1416 (1990)］］、競合的ゲノミック・ハイブリダイゼーション［Comparative Genomic Hybridization:ＣＧＨ:Kallioneimi, A.,et al., Science, 258,818-821(1992)］、［Spectral karyotyping: ＳＫＹ: Rowley,J.D.,et al.,Blood, 93, 2038-2042(1999)］、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターのクローンをプローブとする方法［Lengauer, C., et al., Cancer Res., 52, 2590-2596(1992)］などを利用した細胞レベルでの測定、ＮＡＳＢＡ法〔Nucleic acid sequence-based amplification, Nature, 350, 91-92 (1991)〕及びその他の各種方法を挙げることができる。好適には、ＲＴ−ＰＣＲによる検出法を挙げることができる。【００８８】
ＲＴ−ＰＣＲによりＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ遺伝子との融合転写物を検出する場合は、ＭＬＬ４遺伝子を含む領域に特異的なプライマーと、ＨＢＶのＸ遺伝子に特異的なプライマーとのセットを用いればよい。【００８９】
ＲＴ−ＰＣＲのプライマーの長さは、上記説明したＰＣＲの場合と同様である。ＭＬＬ４遺伝子を含む領域に特異的なプライマー、及びＨＢＶのＸ遺伝子に特異的なプライマーについても上記説明したＰＣＲの場合と同様である。【００９０】
ＲＴ−ＰＣＲに用いる好ましいプライマーセットの具体例としては、フォワード・プライマーとして配列番号４で示されるＭＤ２６ｃと、リバース・プライマーとして配列番号１５で示されるＥ５−１とのセットや、フォワード・プライマーとして配列番号１３で示されるＭＤ２４と、リバース・プライマーとして配列番号１６で示されるＥ５−２又は配列番号１７で示されるＥ６−２とのセットを挙げることができる。中でも、フォワード・プライマーが配列番号４で示されるＭＤ２６ｃであり、リバース・プライマーが配列番号１５で示されるＥ５−１であるセットが好ましい。【００９１】
ＲＴ−ＰＣＲにより得られた増幅産物は、アガロースゲル電気泳動により検出することができ、これによりＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶのＸ遺伝子の組込みを判定できる。さらに、増幅産物の塩基配列を決定して、ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ遺伝子との融合転写産物が生成していたことを確認することもできる。【００９２】
このようにして、ＤＮＡレベル又は転写産物レベルでＭＬＬ４へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みが確認された場合に、組織の腫瘍性を示唆する一例として肝臓癌の存在が陽性であると判定される。
融合タンパク質の検出
ＭＬＬ４とＨＢＶとの融合タンパク質、好ましくはＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出することによっても、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶの組込みを検出することができる。ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質は、ＭＬＬ４の全部又は一部とＨＢＶのＸ領域の全部又は一部との融合タンパク質であればよい。【００９３】
上記検出は、ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域とからなる融合タンパク質に特異的に結合する抗体を用いた免疫学的なアッセイにより行える。抗体には抗体断片も含まれる。【００９４】
抗体の製造法自体は、当業者によく理解されており、本発明においてもこれら常法に従うことができる〔例えば、続生化学実験講座「免疫生化学研究法」、日本生化学会編（1986）など参照〕。【００９５】
かかる免疫学的アッセイとしては、ウェスタンブロット、免疫組織学的アッセイ及びＥＬＩＳＡアッセイなどの当該分野で知られた方法を制限なく使用できる。【００９６】
ＥＬＩＳＡによる融合タンパク質の検出方法の１例を詳しく説明すると、ＭＬＬ４とＨＢＶとの融合タンパク質を有することが予測される被検細胞を溶解し、全タンパク質を抽出した後、融合タンパク質又はＨＢＶのＸタンパク質に対するモノクローナル抗体と共にインキュベートし、免疫沈降法により、免疫沈降させた後、ペルオキシダーゼで標識した抗マウスＩｇＧウマ抗体と共にインキュベートする。このようにして抗体の結合によるシグナルを視覚化することができる。該抗原結合シグナルは、ＥＣＬウェスタン・ブロッティング検出システム（ECL Western Blotting Detection System：Amersham Biosciences社製）を用いて電気泳動ゲル上に検出できる。【００９７】
ウエスタンブロット法におけるＭＬＬ４とＨＢＶ融合タンパク質の検出の１例として、第５図には、本発明の実施例において、各種サイズ（ｋＤａ）のＭＬＬ４とＨＢＶとの融合タンパク質が検出されたことが示されている。【００９８】
この方法により融合タンパク質、ひいてはＨＢＶの組込みが検出された場合に、組織の腫瘍性を示唆する一例として肝臓癌の存在が陽性であると判定される。
（ＩＩ）ＭＬＬ４遺伝子における転座の検出方法
本発明の第２の検出方法は、ヒト検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から、組織の腫瘍性を示唆する、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する方法である。【００９９】
第２の方法の好適な対象となるヒト及びヒト検体のＤＮＡの調製方法については第１の方法と同様である。
１７番染色体
１７番染色体の染色体１７ｐ１１．２の位置上に表されるゲノム配列は、ホワイトヘッド研究所(Whitehead Institute)のビレン(Birren,B)らによって報告されたGenBankアクセッション番号：ＡＣ087294として報告された全長177,017塩基長(bp)のクローンのゲノム配列に従う。１７番染色体の第24481〜25200番目の塩基からなる領域の塩基配列を配列番号：３に示す。
ＰＣＲによる転座の検出  ＭＬＬ４遺伝子のt(１７；１９)（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出する方法の好適な具体例としては、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的なプライマーと、１９番染色体の長腕ｑ１３．１上に存在するＭＬＬ４遺伝子を含む領域に特異的なプライマーとを用いたＰＣＲを行い、増幅産物を検出する方法が挙げられる。ＭＬＬ４遺伝子を含む領域に特異的なプライマーは、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーであることが好ましい。【０１００】
転座の検出は感度が低いため、１次ＰＣＲ産物に対して、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的なプライマーと、１９番染色体の長腕上に存在するＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーとのセットを用いた２次ＰＣＲを行うことが望ましい。２次ＰＣＲで用いるプライマーは、通常、１次ＰＣＲにより増幅される領域の内側の領域を増幅できるように設定すればよい。【０１０１】
プライマーの好適な例としては、１９番染色体上のＭＬＬ４遺伝子と１７番染色体との接合部近辺のＭＬＬ４遺伝子の領域に特異的であるように設定されたＤＮＡに対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも１０個以上、好ましくは少なくとも１５〜３０個程度の連続した塩基を有するものを挙げることができる。他方のプライマーの好適な例としては、１９番染色体上のＭＬＬ４遺伝子と１７番染色体との接合部近辺の１７番染色体の領域に特異的であるように設定されたＤＮＡに対応する部分ヌクレオチドであって、少なくとも１０個以上、好ましくは少なくとも１５〜３０個程度の連続した塩基を有するものを挙げることができる。【０１０２】
ここで特異的とは、本発明の第１の検出方法の場合と同様に、当該部分を認識してＤＮＡ合成を開始できることをいう。【０１０３】
より具体的には、１９番染色体から１７番染色体方向の転座を検出するために、１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとしてＭＬＬ４遺伝子特異的プライマーの配列番号：８で示されるプライマー６７１Ｆ１、リバース・プライマーとしては、１７ｑ特異的プライマーの配列番号２０で示される１７−１を例示できる。１７番染色体から１９番染色体方向の転座を検出するために、２次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとしてＭＬＬ４遺伝子特異的プライマーの配列番号９で示される６７１Ｆ２、リバース・プライマーとしては１７ｑ特異的プライマーの配列番号２１で示される１７−２を例示することができる。【０１０４】
また１次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとしてＭＬＬ４遺伝子特異的プライマーの配列番号：８で示されるプライマー６７１Ｒ１、リバース・プライマーとしては、１７ｑ特異的プライマーの配列番号１８で示される１７Ｒ１を例示できる。１７番染色体から１９番染色体方向の転座を検出するために、２次ＰＣＲ反応用フォワード・プライマーとしてＭＬＬ４遺伝子特異的プライマーの配列番号１１で示される６７１Ｒ２、リバース・プライマーとしては１７ｑ特異的プライマーの配列番号１９で示される１７Ｒ２を例示することができる。【０１０５】
本発明方法により、上記の転座が検出された場合に、組織の腫瘍性を示唆する一例として肝臓癌の存在が陽性であると判定する。【０１０６】
上記説明した本発明の検出方法によれば、１９番染色体上にあるＭＬＬ４遺伝子と１７番染色体との転座を検出でき、これによって、ヒト慢性肝炎・肝硬変などの患者検体から単離された腫瘍の疑いのある肝臓組織から組織の腫瘍性（例えば肝細胞癌）の把握における肝細胞癌の発症機序の解明、組織の腫瘍性の把握、診断および予防に有用な情報及び手段を与えることができる。
（ＩＩＩ）検出用キット
本発明の第１の検出用キットは、ＭＬＬ４遺伝子、特にそのイントロン３へのＨＢＶ−ＤＮＡ、特にＨＢＶのＸ遺伝子の組込みを検出するための検出用キットである。【０１０７】
ＤＮＡレベルで上記組込みを検出する場合、具体的には、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマー及びＨＢＶのＸ遺伝子に特異的なプライマーを備えるキットが挙げられる。プライマーは前述した通りである。【０１０８】
このキットに含まれるプライマーセットの好ましい例としては、配列番号１０、１１または１２で示される塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるＤＮＡ断片と、配列番号４で示される塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるＤＮＡ断片とのセットが挙げられる。また、配列番号１４で示される塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるＤＮＡ断片と、配列番号８又は９で示される塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるＤＮＡ断片とのセットが挙げられる。【０１０９】
上記検出用キットは、ＰＣＲに必要なその他の成分を含んでいても良い。このような他の成分として、標識剤、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド三リン酸、ＤＮＡ増幅用２次プライマーなどが挙げられる。標識剤としては、放射性同位元素又は蛍光物質などの化学修飾物質などが挙げられるが、ＤＮＡ断片自身が予め該標識剤でコンジュゲートされていてもよい。更に、本発明の検査用キットには、測定の実施の便益のために適切な反応希釈液、標準抗体、緩衝液、洗浄剤、反応停止液などが含まれていてもよい。【０１１０】
また、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを、ＭＬＬ４遺伝子とＨＢＶのＸ遺伝子との融合転写産物を検出するためのキットを用いて検出することもできる。代表的には、ＲＴ−ＰＣＲにより融合転写産物を検出するためのキットとして、上記説明したＤＮＡレベルで組込みを検出するためのプライマー又はプローブセットを備えるキットを例示できる。【０１１１】
このＲＴ−ＰＣＲの好適なプライマーセットとしては、配列番号４で示される塩基配列若しくはそれに相補的な塩基配列を認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーと、配列番号１５若しくはそれに相補的な塩基配列を認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーとのセットが挙げられる。【０１１２】
また前述したように、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みは、ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質を検出することによっても、検出できる。この場合の検出用キットは、ＭＬＬ４とＨＢＶのＸ領域との融合タンパク質又はＨＢＶのＸ領域を特異的に認識する抗体又は抗体断片を備えていればよい。このような抗体については前述した通りである。このキットはさらに、ウェスタンブロッティング、免疫組織学的アッセイ又はＥＬＩＳＡなどの使用方法に応じた必要成分を含んでいてよい。【０１１３】
また本発明の第２の検出用キットは、ＭＬＬ４遺伝子のt（１７；１９）（ｐ１１．２；ｑ１３．１）における染色体転座を検出するためのキットである。このキットとしては、例えば、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３を含む領域に特異的なプライマーと、１７番染色体ｐ１１．２を含む領域に特異的なプライマーとを備えるものが挙げられる。プライマーについては前述した通りである。【０１１４】
好適なプライマーセットの例としては、１次ＰＣＲ反応用として配列番号：８で示される塩基配列若しくはその相補的配列の一部又は全部を認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーと、配列番号２０で示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーとのセットが挙げられる。またこのキットは望ましくは２次ＰＣＲ反応用プライマーセットを含み、２次ＰＣＲ用プライマーセットとしては、１７番染色体から１９番染色体方向の転座を検出するために、配列番号：９で示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーと、配列番号２１で示される塩基配列もしくはその相補的塩基配列の一部または全てを認識してＤＮＡ合成を開始できるプライマーとのセットが挙げられる。このキットにも、ＰＣＲに必要な他の成分や、測定の便宜のための試薬が含まれていてよい。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１５】
（ａ）肝細胞検体の組織的、血清学的検査
千葉大学病院第二外科において１９８７年から２００３年までの間に得られた、２６人の日本人患者由来の切除肝腫瘍組織（hepatocellular carcinoma: HCC）を用いて、以下の実験を行った。これらの患者には術前の治療は施されていない。【０１１６】
各検体の提供患者については、臨床的、組織的な検査、及び血清学的な検査を行った。組織的な検査としては、腫瘍のサイズ、腫瘍細胞の分化の程度（３段階）、及び肝臓の疾患の種類（慢性遷延性肝炎：CPH、慢性活動性肝炎：CAH、及び肝硬変：LC）を調べた。血清検査としては、ダイナボット社（Dinabot）のＥＩＡ（Enzyme Immuno Assay）キットを用いたＢ型肝炎表面抗原：ＨｂｓＡｇ（Hepatitis B surface antigen）の検出、ＲＩＡ（Radio Immuno Assay）キットを用いた抗ＨＢｓ抗体（antibody against the Hepatitis B surface antigen）の検出及び抗ＨＢｃ抗体（antibody against the Hepatitis B core antigen）の検出をそれぞれ行った。さらに、オーソダイアグノスティックシステムズ社（Ortho Diagnostic Systems）のリコンビナント・イムノブロット・アッセイ(recombinant immunoblot Assay)を用いて、ＨＣＶリコンビナント抗原 c25、c33c及びNS5を標的抗原とした抗ＨＣＶ抗体（antibody against the Hepatitis C）について調べた。【０１１７】
結果を以下の表１に示す。表１中、ＨＢｓＡｇはＢ型肝炎表面抗原を示し、Ａｎｔｉ−ＨＢｓはＢ型肝炎表面抗原に対する抗体を示し、Ａｎｔｉ−ＨＢｃはＢ型肝炎コア抗原を示し、Ａｎｔｉ−ＨＣＶはＣ型肝炎（ｃ２５、ｃ３３ｃ及びＮＳ５）に対する抗体を示す。ｍｏｄは中程度に分化したＨＣＣを示し、ｐｏｏｒは余り分化していないＨＣＣを示し、ｗｅｌｌはよく分化したＨＣＣを示す。ＣＰＨは慢性持続性肝炎、ＣＡＨは慢性活動性肝炎、ＬＣは肝硬変をそれぞれ示す。また、ＨＢＶ−ＤＮＡの検出は、ＨＢｘに特異的なプライマーＭＤ２４及びＭＤ２６を用いた単独のＰＣＲにより行った。【０１１８】
これらの試料を実験に用いるにあたっては、ヘルシンキ宣言(1975)の定める倫理指針に従い、また、千葉大学医学部の倫理審査委員会の承認を受けている。【０１１９】
【表１】
2005085436.tif 000002
【０１２０】
（ｂ）アダプターライゲーション／サプレッションＰＣＲ法によるＨＢＶ組込み部位の増幅
＜ＰＣＲ＞
各検体からのDNAは過去に報告された方法に従い抽出した（Urashima T, et al., J Hepatology 1997; 26: 771-778）。先ず、血清検査の結果、ＨｂｓＡｇ陽性であった患者から提供された１０検体について以下の実験を行った。これら各検体由来のＤＮＡについて、クローンテック社のGenomewalker kitを用いて、アダプターライゲーション／サプレッションＰＣＲ法（Siebert PD, et al., Nucleic Acids Res 1995; 23: 1087-1088）を実施し、ＨＢＶのヒトゲノム内への組込み部位（HBV/cellular DNA junctions）の周辺配列を増幅した。【０１２１】
以下に、第１図ａを参照しながら詳細なアダプター・ライゲーション／サプレッション−ＰＣＲの流れを示す。2.5μgのゲノムＤＮＡを制限酵素ＤｒａＩ、ＰｖｕＩＩ、ＥｃｏＲＶ、及びＳｃａＩ（Life Technologies社製）等で消化し、ＤＮＡ断片の両端に生じた平滑断端（blunt end）にアダプター配列を連結させた（ライゲーション）。上記の処理を施したゲノム断片と、0.2mM dNTPs、 10pmol の配列番号：４で示されるＨＢＶプライマー(ＭＤ２６ｃ)、 1Xバッファー (native Taq buffer, Invitogen)、 4% グリセロール、1 unit Taq (native Taq, Invitogen社製) 及び0.04 unit Vent DNA polymerase （New England Biolabs）とを含む50μlの反応液を準備し、ＰＣＲ反応前に80℃で3分間加熱した。次いで、この溶液に、2.5mM MgCl2及び10pmolの配列番号：６で示されるアダプター特異的プライマー(AP-1)を加え、94℃で1分間反応させた。【０１２２】
続いてＰＣＲ反応に入るが、特異性を上げるために、過去の報告例を参考にしてタッチダウンＰＣＲ法を用いた(Chami M, et al., Oncogene 2000; 19: 2877-2866)。【０１２３】
94℃で30秒間処理、65℃で30秒間処理、70℃で3分間処理を１サイクルとして、２サイクル毎にアニーリング温度を１℃づつ下げる方法で、最初の20サイクルを反応させた。続けて、20サイクル目の反応条件（94℃で30秒間処理、55℃で30秒間処理、70℃で3分間処理）で固定して、さらに20サイクルの反応を行った。さらに、最後のサイクルに続けて70℃で7分間反応させて１次ＰＣＲ増幅産物を得た。【０１２４】
この増幅産物をQIAGEN社のQIAquick PCR purification kitを用いて精製し、1/50量をテンプレートとして用い、10pmol ＨＢＶプライマーを配列番号：５で示されるＭＸ２、アダプター特異的プライマーを配列番号：７で示されるＡＰ−２に変えて、同様の手順で２次ＰＣＲ（nested PCR）を行った。【０１２５】
以上の操作によって得られた最終増幅産物を1.2%アガロースゲル上で電気泳動した。その結果を第１図ｂ及び第１図ｃに示す。
各図は、２次ＰＣＲ増幅後のアダプター・ライゲーション／サプレッション−ＰＣＲの代表的なアガロースゲルを示す。第１図ｂのレーン１−５におけるＰＣＲ産物は、ＰｖｕＩＩ消化されたアダプター・ライゲートされたＤＮＡライブラリーから得られた。レーン１−６は、ＨＣＣ９９０７、ＨＣＣ００２、ＨＣＣ００３、ＨＣＣ１４３、ＨＣＣ１４６、およびネガティブＰＣＲコントロール（ＤＮＡなし）をそれぞれ示す。レーンＭは、１ｋｂＤＮＡサイズマーカー(ライフ・テクノロジーズ社製)を表示している。【０１２６】
第１図ｃは、特異的プライマーを用いたＭＬＬ４遺伝子の中へのＨＢＶ−ＤＮＡ組込みのＰＣＲコンホメーションを示す。該図は、ＨＢｘ（ＭＤ２６ｃ：配列番号４）及びＭＬＬ４（１９Ｒ１：配列番号１０（６７１Ｒ１））に特異的なプライマーを用いた通常のＰＣＲの代表的なアガロースゲルの結果を示す。【０１２７】
レーン１−５は、ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、ＨＣＣ１４６、ＨＣＣ００２、およびネガティブＰＣＲコントロール（ＤＮＡなし）をそれぞれ示す。レーンＭは、１ｋｂＤＮＡサイズマーカー(ライフ・テクノロジーズ社製)を表示している。
＜増幅DNAの塩基配列決定＞
次いで、分離した個々のバンドを切り出して塩基配列を調べた。【０１２８】
シークエンス反応は、広く一般的に用いられているアプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)社製のBigDye Terminator Cycle Sequencing kitを使って行い、ABI PRISM 3700 DNA analyzerによって行った。その結果を表２に示す。【０１２９】
【表２】
2005085436.tif 000003
【０１３０】
表２に示されるように、１０検体中７検体（HCC131、HCC143、HCC146、HCC002、HCC003、HCC9907、H54）から、合計８つのＨＢＶ／細胞内ＤＮＡジャンクション(cellular DNA junction)を検出した。８つのジャンクションのうち、４つ（HCC131、HCC143、HCC146、HCC002）が１９ｑ１３．１上のＭＬＬ４（mixed linkage leukemia 4）のイントロン３に存在した。残りはそれぞれ、５ｑ１３上のｈＴＥＲＴ（human telomerase reverse transcriptase）のプロモーター領域、９ｑ１３−２１．３上の仮定上のたんぱく質をコードする領域、及び７ｐ１４−１５上のＥＳＴ（expressed sequence tag）領域に存在した。また、ｈＴＥＲＴの領域にＨＢＶが組込まれるという報告は過去に２つのグループ（Ferber MJ, et al., Oncogene 2003; 22: 3813-3820, Paterlini-Brechot P, et al., Oncogene 2003; 22: 3911-3916）からなされており、この結果はそれらを支持するものである。
（ｃ）ＭＬＬ４遺伝子特異的なプライマーを用いたＰＣＲよるＨＢＶ組込み部位の増幅
上記の結果より、ＨＢＶ／ＭＬＬ４ジャンクションが見られた４つのゲノムＤＮＡについて、ＨＢＶ特異的プライマーＭＤ２６ｃ（配列番号：４）とＭＬＬ４特異的プライマー６７１Ｒ１（配列番号：１０）、６７１Ｒ２（配列番号：１１）、または６７１Ｒ３（配列番号：１２）との組合せを用いて、慣用的なＰＣＲを行うことにより、ＭＬＬ４遺伝子へのＨＢＶ−ＤＮＡの組込みを確認した(第１図ｃ)。また、ＭＤ２６ｃに相補的な配列番号：１４で示されるＨＢＶ特異的プライマーＭＤ２６とＭＬＬ４特異的プライマー６７１Ｆ１（配列番号：８）、または６７１Ｆ２（配列番号：９）との組合せを用いたＰＣＲを行うことにより、他方のＭＬＬ４／ＨＢＶジャンクションを確認した。【０１３１】
以下に詳細な実験手順を示す。100ngのゲノムDNA、0.2mM dNTPs、 10pmolの各プライマー、 1XGCIバッファー (Takara)及び1 unit LA Taq DNA polymerase (Takara)を含む50μlの反応液を調製した。ＭＬＬ４／ＨＢＶジャンクションを調べるにあたっての反応では、プライマー６７１Ｆ１とＭＤ２６とを用いて、94℃で1分間加熱し、続けて98℃で10秒間、68℃で１−４分間を1サイクルとして35サイクル反応させ、72℃で10分間の伸長反応を最後に行った。以上を１次ＰＣＲとした。【０１３２】
次いで、プライマー６７１Ｆ２とＭＤ２６とを用いた２次ＰＣＲを上記と同じ条件で行った。ＨＢＶ／ＭＬＬ４ジャンクションを調べるにあたっての反応では、プライマーＭＤ２６ｃと６７１Ｒ３を用いて、94℃で１分間加熱し、続けて94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で45秒間を１サイクルとして30サイクル反応させた後、最後に72℃で５分間の伸長反応を行った。【０１３３】
その結果を第２図および第３図に示す。第２図は、上記PCRにより増幅されたＤＮＡ中のＨＢＶの組込み部位周辺の配列を示す。【０１３４】
第２図ａは、表１のＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、ＨＣＣ１４６、およびＨＣＣ００２のＭＬＬ４遺伝子におけるＨＢＶ／細胞内ＤＮＡジャンクションの配列を示している。1)〜4)の配列において、スラッシュの左方の配列は組込まれたＨＢＶ−ＤＮＡの配列を示し、右方の太文字で示した配列はフランキングＭＬＬ４遺伝子配列を示す。また、1)〜4)の配列の上部に記載した数字は、ＨＢＶ／細胞内ＤＮＡジャンクション(GenBankアクセッション番号ＡＢ033550，ＨＢＶゲノタイプＣ、サブタイプａｄｒ)でのＨＢＶヌクレオチド番号を示している。【０１３５】
また、第２図ｂは、ＭＬＬ4遺伝子（Genbankアクセッション番号AD000671)のイントロン３とＨＢＶ−ＤＮＡ組込み部位周辺の配列を示す。【０１３６】
第３図は、ＨＣＣ００２、ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、およびＨＣＣ１４６の４検体のＤＮＡに組込まれたＨＢＶゲノムの分析結果を示す図面である。第３図ａは、ＨＢＶゲノム（Genbankアクセッション番号AB033550)の遺伝子構成図のシェーマ的な表示を表わし、オープン・リーディング・フレーム(ORF)及び転写の方向が太線の矢印によって表示され、その上の数字は各オープン・リーディング・フレーム(ORF)の位置を示している。ＤＲ１およびＤＲ２は、１１塩基対のダイレクトリピートである。【０１３７】
また、第３図ｂは、ＨＣＣ００２、ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、およびＨＣＣ１４６の４検体のＤＮＡに組込まれたＨＢＶゲノムのシェーマ的な表示であり、●及び矢印は、組込まれたＨＢＶ−ＤＮＡ配列の５’末端及び３’末端を示す。なお、ＨＣＣ１４６に組込まれたＨＢＶ−ＤＮＡ配列の５’末端は特定できなかった。【０１３８】
第３図ｃは、ＭＬＬ４遺伝子のイントロン３（GenBankアクセッション番号ＡＤ000671の17316から17869ヌクレオチド番号に相当）、および組込み位置におけるＨＢＶ−ＤＮＡのシェーマ的な表示を表わし、この分析に用いられたＭＬＬ４特異的プライマーの方向と位置がシェーマにおいて示されている。【０１３９】
第２図及び第３図において示されるように、４つのゲノムＤＮＡにおいて、ＨＢＶはＭＬＬ４のイントロン３に存在するＡｌｕ繰り返し配列の中、またはその近傍に組込まれていることが確認された。【０１４０】
また、ＨＢＶのウイルス側の組込み領域は、通常、１１塩基対(bp)の繰り返し配列を含むＤＲ１、ＤＲ２の近傍で起こる事が多いが、今回の４つの例でも、全てＤＲ１近傍で組込みが起こっていた。ＨＣＣ１３１の例でのみ、ＨＢＶの全長の組込みが確認され、他の３例では部分的な組込みが見られた(第３図)。なお、日本人のＨＢＶ感染例では、ＨＣＣ１３１の場合のような遺伝型Ｃを呈する例がより一般的である。【０１４１】
さらに、全ての肝細胞癌(HCC)の検体について、配列番号：１３で示されるＨＢｘ特異的プライマーＭＤ２４と配列番号：１４で示されるＨＢｘ特異的プライマーＭＤ２６の組合せたＰＣＲを実施して、ＨＣＶ−ＤＮＡの存在を確認した（表１）。
【実施例２】
【０１４２】
ＲＴ−ＰＣＲによるＨＢｘ／ＭＬＬ４融合転写産物の検出
ＭＬＬ４／ＨＢＶ−ＤＮＡの組込みが確認された４例では全てがＣ末端を除くＨＢｘタンパク質のコード領域とＨＢｘ（ＨＢＶ−ＤＮＡのＸ遺伝子）のプロモーター領域とを含んでいた。従って、これらの４検体でＨＢｘとＭＬＬ４の融合転写産物が存在する事が予測された。ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、ＨＣＣ１４６、およびＨＣＣ００２から全ＲＮＡを抽出し、ＲＴ−ＰＣＲを行うことにより得られた転写産物について検討した。【０１４３】
以下に詳細な実験手順を示す。【０１４４】
トリゾール(Trizol：インビトロゲン社製)を用い、使用説明書に従ってＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡは1.2%のアガロースゲル上で電気泳動をして確認した。ＲＴ−ＰＣＲはSuperScript One-Step RT-PCR system(インビトロゲン社製) を用い、ＭＬＬ４のエクソン５、または６に設定した遺伝子特異的プライマー（Ｅ５−１：配列番号：１５、Ｅ５−２：配列番号：１６、およびＥ６−１：配列番号：１７）を逆転写プライマーとして、使用説明書に従って以下の通りに行った。500ngの各RNA、0.8μMの各プライマー（ＭＤ２６ｃ：配列番号：４を共通のセンスプライマーとして使用した）、２単位の酵素混合液(enzyme mixture：SuperScript II RT 及び Platinum Taq DNA polymeraseを含む)及び1Xバッファー (0.2mM dNTPsと1.2mM MgSO4を含む)を氷上で混合し、反応液を作成した。この反応液をヴォルテックスでよく攪拌し、50℃で30分間、94℃で2分間反応させた。続くＰＣＲ反応として、94℃で15秒間、55℃で30秒間、70℃で1分間を1サイクルとして30サイクル反応させた。ＰＣＲ産物は1.2%のアガロースゲル上で電気泳動をし、得られた各バンドを切り出してシークエンス解析に供した。【０１４５】
ＨＢｘ−ＭＬＬ４融合転写物のＲＴ−ＰＣＲ分析結果を第４図に示す。【０１４６】
第４図ａは、各種の転写産物がＭＤ２６ｃ／ＭＬＬエクソン５プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによって各肝細胞癌組織に対して得られたことを示している。第４図ａの各バンドのＲＴ−ＰＣＲ産物を塩基配列分析に供した。第４図ｂは、４つの肝細胞癌組織（ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ００２、ＨＣＣ１４３、およびＨＣＣ１４６）からの融合転写産物のシェーマ的な表示を表わしている。図４ａの各バンドの横に表示されたサークル内の数字と、図４bの融合転写産物の横のサークル内の数字とが対応している。【０１４７】
この結果、全ての肝細胞癌(HCC)から、ＭＬＬ４のエクソン４以降について読み枠がずれていない融合転写産物と、読み枠がずれ、途中にストップコドンが入ってしまう融合転写産物が検出された(第４図ｂ)。【０１４８】
ＨＣＣ１３１では２つの融合転写産物（イントロン３の配列を含むが、エクソン４以降の配列は読み枠がずれていない融合転写産物、及び、イントロン３、イントロン４を含み、エクソン６の途中にストップコドンが入ってしまっている融合転写産物）、ＨＣＣ００２では３つの融合転写産物（イントロン３がスプライスアウトされ、読み枠がずれていない融合転写産物、同じくイントロン３がスプライスアウトされているが、読み枠がずれ、エクソン４の途中にストップコドンが入った融合転写産物、及び、イントロン３を含み、イントロン３の途中にストップコドンが入ってしまっている融合転写産物）がそれぞれ検出され、ＨＣＣ１４６ではＨＣＣ００２と類似したパターンの３つの融合転写産物が検出された。ＨＣＣ１４３ではイントロン３にストップコドンが入ったものが２種類とエクソン４にストップコドンが入ったものが２種類、計４種類の読み枠がずれた融合転写産物が検出された他、読み枠がずれていないイントロン３を含む融合転写産物が１種類検出されたが、この転写産物ではＧＴ−ＡＧルールではなく、ＣＣ−ＧＴのサイトでスプライシングが起こっていた。
【実施例３】
【０１４９】
イムノブロット分析によるＨＢｘ／ＭＬＬ４融合タンパク質の検出
これら融合転写産物が実際にタンパク質に翻訳されている事を確かめる為に、ＨＣＣ１３１、ＨＣＣ１４３、ＨＣＣ００２の個体について、肝腫瘍細胞と隣接した細胞を用いて免疫的実験手法によって比較を行った。【０１５０】
以下に詳細な実験手順を示す。細胞100〜200mgを、0.1% SDS、0.5%デオキシコール酸(deoxycholate)、1% NP-40、150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH 8.0)、1mM APMSF及びその他のプロテアーゼインヒビター（complete protease inhibitor tablets, Roche社）を含むバッファーによって溶解し、12500rpmで30分間、4℃で遠心し全タンパク質を調整した。必要に応じて、得られた全タンパク500μgを、抗ＨＢｘ抗体(Hepatitis B Virus X protein)モノクローナル抗体（Advanced Immuno Chemical社製）と共にインキュベートし、標準的な方法で免疫沈降させた。【０１５１】
全タンパク質や上記の手順で調整された免疫沈降産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより泳動し、ＰＶＤＦメンブレン（Hybond-P; Amersham Biosciences社）に移した。メンブレンは抗体の非特異的な結合を防ぐ為に3%スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔ(Tris-bufferd saline and 0.1% Tween-20)で室温にて１時間プレインキュベートした後、抗ＨＢｘモノクローナル抗体と共に４℃で８時間インキュベートした。その後、ＴＢＳ−Ｔで４回ウォッシュし、ペルオキシダーゼが共役した抗マウスＩｇＧウマ抗体と共にインキュベートした。抗体の結合によるシグナルはＥＣＬウェスタンブロッティング・ディテクション・システム(ECL western blotting detection system:Amersham Biosciences社製)によって視覚化し、解析した。【０１５２】
その結果を第５図に示す。第５図ａは、抗ＨＢｘモノクローナル抗体を使用することによるＨＣＣ００２、ＨＣＣ１３１、およびＨＣＣ１４３からの腫瘍組織（Ｔ）および近傍の非腫瘍組織（Ｎ）のウェスタンブロット分析を表し、第５図ｂは、免疫沈降産物が抗ＨＢｘ抗体を用いた免疫検定によって示されている。【０１５３】
直接、全タンパク質に対してウェスタンブロットを行った結果では、ＨＣＣ１４３、およびＨＣＣ００２の腫瘍細胞に選択的に１７ｋＤａのタンパク質が検出された。これは、途中にストップコドンが入った短いＨＢｘ／ＭＬＬ４の融合タンパク質に相当する(第５図ａ)。ＨＣＣ１３１は融合タンパク質が検出されなかったが、抗ＨＢｘ抗体を用いた免疫沈降産物に対するウェスタンブロットでは、読み枠がずれていないＨＢｘ／ＭＬＬ４の融合タンパク質に相当する１６０ｋＤａのタンパク質が検出された(第５図ｂ)。
【実施例４】
【０１５４】
タッチダウンＰＣＲ法による染色体転座領域の増幅
ＨＢｓ抗原は陰性であったが、抗ＨＢｃ陽性であった検体(表１参照)について、ＭＬＬ４のイントロン３におけるＨＢＶの組込みを調べた。ＨＢＶプライマーＭＤ２６ｃ（配列番号：４）とＭＬＬ４特異的プライマー１９Ｒ１（配列番号：１０（６７１Ｒ１））とを用いた１次ＰＣＲ、及びＨＢＶプライマーＭＤ２６ｃ（配列番号：４）とＭＬＬ４特異的プライマー１９Ｒ２（配列番号：１１（６７１Ｒ２））とを用いた２次ＰＣＲを行い、実施例１の方法に従ってシークエンス解析を行った。この結果、これらの肝細胞癌(HCC)検体ではＭＬＬ４のイントロン３へのＨＢＶの組込みは検出されなかった。【０１５５】
しかし、その代わりにＭＬＬ４と１７ｐ１１．２の領域とのキメラ配列が検出された。この転座はＨＢＶ特異的プライマーとＭＬＬ４特異的プライマーを用いた実験で偶然発見されたものであるため、ＨＢＶ特異的プライマーの代わりに１７ｐに特異的なプライマー１７Ｒ１（配列番号：１８）、および１７Ｒ２（配列番号：１９）をデザインした。これらのプライマーを用い、肝細胞癌患者の２６検体について、１７番染色体と１９番染色体の転座について前述のタッチダウンＰＣＲ法を用いて確かめた。【０１５６】
１７番染色体/１９番染色体の境界を発見する為には、１９Ｒ１及び１７Ｒ１プライマーを１次ＰＣＲに用い、１９Ｒ２及び１７Ｒ２プライマーを２次ＰＣＲに用いた。また、１９番染色体/１７番染色体の境界を発見する為には、６７１Ｆ１（配列番号：８）及び１７−１プライマー（配列番号：２０）を１次ＰＣＲに用い、６７１Ｆ２（配列番号：９）及び１７−２プライマー（配列番号：２１）を２次ＰＣＲに用いた。【０１５７】
この結果、肝細胞癌患者の２６検体中２２検体について転座を確認できた(表２参照)。【０１５８】
また、第６図にＭＬＬ４のイントロン３の遺伝子座における相互転座を表した配列図面を示す。第６図は、染色体１９ｑ１３．１（左：GenBankアクセッション番号ＡＤ000671）と染色体１７ｐ１１．２（右：GenBankアクセッション番号ＡＣ087294）染色体の再構成が示されている。そして、Ａｌｕ繰り返し配列は、グレイ枠内の配列として示されている。Ａｌｕ繰り返し配列に隣接して横たわっているＨＢＶ組込み部位は、矢印で示されていおり、それぞれの染色体上の下向き記号の太線矢印は、再組換えがＡｌｕ繰り返し配列によって生じた後に新しく合成された染色体を示している（黒から黒および白から白）。【０１５９】
シークエンス解析の結果を表す第６図より、転座産物の染色体の境界となっている約２４０ｂｐにわたる領域はＡｌｕ繰り返し配列を含み、染色体間でおよそ８５％相同であることが判明した。【０１６０】
Ａｌｕ配列を介した相同組換えが転座を促進している可能性が考えられるが、ＭＬＬ４のイントロン３領域ではなく、ｈＴＥＲＴのプロモーター領域にＨＢＶが組込まれているＨＣＣ００３でも同様の転座が観察されている事から、肝癌の腫瘍形成そのものがゲノムの不安定化をもたらしている可能性もある。また、この転座の解析にあたっては、１次ＰＣＲの段階では疑わしい結果が得られる場合が多いので、２次ＰＣＲを行うことが望ましい。【０１６１】
また、１７番染色体のＡｌｕ配列にはＣＡ繰り返し配列が隣接しており、個人の識別等に有効である。
【図２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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