(57)【要約】１つまたは複数のヌクレオチド配列が２つのウイルス転写ユニットの間に挿入された、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスを含む製剤、および組換えアデノウイルスを使用した処置の方法が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位および／またはＬ５−Ｅ４挿入部位に挿入されている。本発明のベクターは、同等なレベルの２つまたはそれを上回る導入遺伝子が所望される場合に、または二本鎖タンパク質から完全に天然の鎖を発現させるために、有利に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記挿入部位が、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンと第２のウイルス転写ユニットの終止コドンとの間に位置しており、
前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第１のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第２のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記ヌクレオチド配列が挿入される前は、前記第１のウイルス転写ユニットと前記第２のウイルス転写ユニットとの間にウイルス転写ユニットが存在しない、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＸ遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスファイバー遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、４、および５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、４、および６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、請求項１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８００に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２０に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４０に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６０に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８０に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９００に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、９、および１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、９、および１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列と、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置しており、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４または請求項１５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１７】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１８】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４または請求項１５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１９】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８０１に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２１に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４１に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６１に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８１に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１８および２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２３】
前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項４から８および１４から２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２４】
前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、または１３０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項９から２３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列が、プロモーターをさらに含み、前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２７】
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）プロモーター、
（ｉｉｉ）導入遺伝子、
（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２８】
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである請求項２７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２９】
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉｉ）プロモーター、
（ｉｖ）導入遺伝子、
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および
（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されており、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３０】
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである請求項２９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３１】
前記プロモーターが、遍在的プロモーター、組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的プロモーターである、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３２】
Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列が、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列と、第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が、リンカーによって分離されている、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３４】
前記リンカーが、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする、請求項３３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３５】
前記リンカーが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型２Ａペプチドをコードする、請求項３３または請求項３４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３６】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位とＥｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している、請求項３２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３７】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２または請求項３６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３８】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３９】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４から１９１７に対応する欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４０】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド１６１１から２１５３に対応する欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４１】
前記Ｅ３挿入部位が、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスファイバー遺伝子の開始部位との間に位置している、請求項３２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４２】
前記Ｅ３挿入部位が、前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンとＥ３−１４．７Ｋの終止コドンとの間に位置している、請求項３２または請求項４１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４３】
前記Ｅ３挿入部位が、約５００〜約３１８５個、約５００〜約３０００個、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約３１８５個、約１０００〜約３０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約３１８５個、約１５００〜約３０００個、約１５００〜約２０００個、約２０００〜約３１８５個、約２０００〜約３０００個、約２０００〜約２５００個、約２５００〜約３１８５個、約２５００〜約３０００個、または約３０００〜約３１８５個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２、４１、および４２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４４】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約５００〜約１５５１個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約１５５１個、約１０００〜約１５００個、または約１５００〜約１５５１個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４５】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約１，０５０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４６】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに続く１，０６３個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４７】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５  ｄｌ３０９  Ｅ３欠失に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４８】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド２９７７３〜３０８３６に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４９】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド２９１１９から３０６２２に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５０】
機能性Ｐｅａ３結合部位の１つまたは複数の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５１】
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５２】
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５３】
前記欠失が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５から２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５４】
前記Ｅ１ａプロモーターが、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５５】
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５６】
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５７】
機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーター、および／または機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における前記遺伝子の選択的な発現を可能にする、前記遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５８】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、請求項５７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５９】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、請求項５８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６０】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、請求項５９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６１】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＴＡＴＡボックス全体の欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６２】
前記Ｅ１ａプロモーターの−２７から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６３】
前記Ｅ１ａプロモーターの−３１から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６４】
前記Ｅ１ａプロモーターの−４４から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６５】
前記Ｅ１ａプロモーターの−１４６から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６６】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４７２から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６７】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４６８から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６８】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４５５から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６９】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３５３から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７０】
配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、請求項５７から６９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７１】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、請求項５７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７２】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、請求項７１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７３】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、請求項７２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７４】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７５】
前記Ｅ１ａプロモーターの−７６から−６８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７６】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４２３から４３１に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７７】
配列ＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号４６）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、請求項７１から７６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７８】
Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７から４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から８０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７９】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体のタンパク質をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８０】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、治療活性を有するＲＮＡをコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８１】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、少なくとも１つの結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８２】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、免疫調節性分子をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８３】
前記免疫調節性分子が、共刺激リガンド、サイトカイン、またはサイトカイン受容体である、請求項８２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８４】
前記免疫調節性分子が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０トラップ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３Ａ／ｐ１９、ＩＬ２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βトラップ、ＩＬ−１０トラップ、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦ、ＩＣＡＭ、ポドカリキシン、これらの機能性断片、ならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８２または請求項８３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８５】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原結合性分子をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８６】
前記抗原結合性分子が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこれらの機能性断片である、請求項８５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８７】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原または前記抗原に対するリガンドをコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８８】
前記抗原が、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、Ｆｌｔ３Ｉ、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、４−１ＢＢ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＫＲＡＳ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、ＥｐｈＡ３、カルシウム活性化クロライドチャネル−２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＳＡＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、未成熟ラミニン受容体、葉酸受容体−ａ、テロメラーゼ、チロシナーゼ、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒ−ａ２、ｘ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／−２、ＴＲＰ−１／−２、Ｐポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ＢＲＡＦ、アンドロゲン受容体、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｔ細胞受容体、腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８９】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、毒素をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９０】
前記毒素が、シュードモナス外毒素、リシン毒素、またはジフテリア毒素である、請求項８９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９１】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、酵素をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９２】
前記酵素が、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、エステラーゼ、メタロプロテイナーゼ、リラキシン、コラゲナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルギナーゼ、ＮＯＳ−２、これらの断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９３】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、細胞周期制御因子、増殖因子、抗凝血剤、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝子、抗血小板剤、凝固因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、これらの断片、またはこれらの誘導体をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９４】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、アンジオスタチン、エンドスタチン、アセチルコリン、ＤＫＫ１／Ｗｎｔ、Ｏｘ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、分泌フラジェリン、チミジンキナーゼ、これらの機能性断片、またはこれらの誘導体をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９５】
５型アデノウイルス（Ａｄ５）または３５型アデノウイルス（Ａｄ３５）である、請求項１から９４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９６】
腫瘍溶解性である、請求項１から９５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９７】
過剰増殖性細胞において選択的に複製する、請求項１から９６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９８】
過剰増殖性細胞において導入遺伝子を選択的に発現する、請求項１から９７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９９】
前記過剰増殖性細胞が、腫瘍細胞である、請求項９７または請求項９８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１００】
請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、単離されたヌクレオチド配列であって、必要に応じて、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のヌクレオチド配列を含む、単離されたベクター。
【請求項１０２】
請求項１００に記載のヌクレオチド配列または請求項１０１に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０３】
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスに曝露することであって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
【請求項１０４】
腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することであって、前記腫瘍の成長を阻害することを含む、方法。
【請求項１０５】
前記腫瘍が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、前記組換えアデノウイルスが、機能性Ｐｅａ３結合部位の１つ以下の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍が、乳がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵臓がん、または非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）からのものである、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記腫瘍が、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、請求項１０３または請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
がんの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することであって、前記対象における前記がんを処置することを含む、方法。
【請求項１０９】
前記がんが、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部がん、乳がん、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん、腎細胞癌、前立腺がん、胃食道がん、結腸直腸がん、精巣がん、膀胱がん、卵巣がん、肝細胞癌、胆管癌、脳がん、子宮内膜がん、神経内分泌がん、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、および膵臓がんから選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することを含む、方法。
【請求項１１１】
前記疾患または状態が、感染、糖尿病性網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎、子宮内膜症、黄斑変性障害および良性成長障害、たとえば、前立腺肥大および脂肪腫、血管障害、心臓血管疾患、感染、肝臓の硬変症、結合組織障害、腫瘍、血管病変、潰瘍性病変、炎症、血栓症、ならびに新内膜形成からなる群から選択される、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１０４から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象が、ヒトである、請求項１０４から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記対象が、小児のヒトである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記対象が、成人のヒトである、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記組換えアデノウイルスが、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮内、吸入、経皮、局所、点眼、鼻内、経粘膜、または直腸投与によって投与される、請求項１０４から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記対象に、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、およびウイルス療法からなる群から選択される１つまたは複数の治療法を投与することをさらに含む、請求項１０４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記対象に、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を投与することをさらに含む、請求項１０４から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記免疫チェックポイント調節剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される１つまたは複数の分子の阻害剤、アンタゴニスト、またはアゴニストである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２１】
アデノウイルスの製剤であって、
（ａ）請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、
（ｂ）少なくとも１つの緩衝剤と、
（ｃ）少なくとも１つの張度改変剤と、
（ｄ）少なくとも１つの糖もしくは少なくとも１つの安定剤、またはその両方とを含み、
約７．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する、製剤。
【請求項１２２】
前記安定剤が、グリセロールである、請求項１２１に記載の製剤。
【請求項１２３】
前記安定剤が、約２％〜約５％（体積／体積）である、請求項１２１または請求項１２２に記載の製剤。
【請求項１２４】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２５】
前記緩衝剤が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２６】
前記張度改変剤が、ＮａＣｌである、請求項１１９から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２７】
前記張度改変剤が、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度である、請求項１１９から１２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２８】
第１の張度改変剤および第２の張度改変剤を含み、前記第１の張度改変剤が、一価カチオンであり、前記第２の張度改変剤が、二価カチオンである、請求項１１９から１２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２９】
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、ＭｇＣｌ２である、請求項１１９から１２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３０】
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３１】
前記糖が、スクロースである、請求項１１９から１３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３２】
前記糖が、体積に対する重量の百分率で約２％〜約８％である、請求項１１９から１３１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３３】
少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１１９から１３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３４】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０である、請求項１３３に記載の製剤。
【請求項１３５】
前記非イオン性界面活性剤が、約０．００１％〜約１％の濃度である、請求項１３３または請求項１３４に記載の製剤。
【請求項１３６】
少なくとも１つのフリーラジカル酸化阻害剤をさらに含む、請求項１１９から１３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３７】
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、ＥＤＴＡである、請求項１３６に記載の製剤。
【請求項１３８】
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、約０．０１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、請求項１３６または請求項１３７に記載の製剤。
【請求項１３９】
少なくとも１つの凍結保護剤をさらに含む、請求項１１９から１３８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４０】
前記凍結保護剤が、ＥｔＯＨである、請求項１３９に記載の製剤。
【請求項１４１】
前記凍結保護剤が、約０．５％の濃度である、請求項１３９または請求項１４０に記載の製剤。
【請求項１４２】
約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する、請求項１１９から１４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４３】
前記組換えアデノウイルスが、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの濃度である、請求項１１９から１４２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４４】
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約２．５％のグリセロールを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４５】
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約３〜５％のスクロースを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４６】
約１０ｍＭのＴｒｉｓ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約５％のスクロース、約０．０２％のポリソルベート−８０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、約０．５％のＥｔＯＨを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４７】
少なくとも１つのイムノアジュバントをさらに含む、請求項１１９から１４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４８】
前記イムノアジュバントが、１）ミョウバン、２）サポニン、３）非イオン性ポリマー界面活性剤、４）モノホスホリルリピドＡ、５）ムラミルジペプチド、および６）サイトカインから選択される、請求項１４７に記載の製剤。
【請求項１４９】
少なくとも１つの色素をさらに含む、請求項１１９から１４８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５０】
少なくとも１つの可逆的プロテアーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１１９から１４９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５１】
前記可逆的プロテアーゼ阻害剤が、Ｌ３／ｐ２３システインプロテアーゼの阻害剤である、請求項１５０に記載の製剤。
【請求項１５２】
少なくとも１つの抗酸化剤をさらに含む、請求項１１９から１５１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５３】
前記抗酸化剤が、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、または葉酸塩である、請求項１５２に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／５１１，８２２号に対する優先権およびその利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する陳述
本出願に付随する配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提出され、ここに参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＥＰＲＸ＿００２＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、約１２８ＫＢであり、２０１８年５月２９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。
【０００３】
発明の分野
本明細書に記載される発明は、概して、ウイルス学、ウイルス療法、および分子生物学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
がんなどの疾患を処置するためのウイルス療法の使用は、治療用遺伝子または導入遺伝子を装備した複製選択的ウイルスの利用を包含する。ウイルス療法剤として開発された様々な感染性ウイルス種の中でも、アデノウイルスは、正常な非形質転換細胞に対する毒性が最小限であるだけでなく、複数の内在遺伝子から構成されるそのゲノムが、内在遺伝子の欠失および外来遺伝子の挿入という形式をとることが一般的である操作に適しているため、最も有望なものの１つとなっている。この操作の欠点は、内在遺伝子の欠失または外来遺伝子の付加のほとんどが、ウイルスの複製能および感染能を低下または減弱させることである。（Larsonら、Oncotarget、６巻（２４号）：１９９７６〜８９頁（２０１５年））
【０００５】
これらの領域に導入遺伝子を保持するウイルスの複製効率の低減は、がんの処置のための腫瘍溶解性ウイルスの場合などには、ウイルスが腫瘍内で増えて近隣のがん性細胞に感染する能力を損ない、感染細胞内のウイルスゲノムのコピー数が減少し、そのため治療用導入遺伝子の転写が低減されることが多く、ウイルスの製造に必要とされる産生培地のサイズが大きくなるため、望ましくない。したがって、標的とされる細胞または組織、たとえば、腫瘍において、高いレベルで複製するように組換えアデノウイルスの能力を改善し、それによって、標的とされる細胞または組織を、特定の外来遺伝子産物の産生のための「工場」へと急速に変化させるための新しい方法に対する必要性が存在する。
典型的には、腫瘍溶解性ウイルスに、２つまたはそれを上回る別個のタンパク質またはポリペプチド鎖を発現させるためには、１つを上回るウイルスベクターの使用、または２つの導入遺伝子間におけるリンカー、たとえば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）の使用が必要である。いずれの方法も、大きな欠点を有する。２つまたはそれを上回るウイルスベクターは、必ずしも、単一の細胞または組織内で良好に発現しない場合がある。当該技術分野において公知のように、ＩＲＥＳの下流の配列は、上流の配列よりも大幅に低いレベルで発現される。（Mizuguchiら、Mol.  Ther.、１巻（４号）：３７６〜８２頁（２０００年））加えて、内在性ではないリンカーは、免疫原性の可能性を有する。したがって、単一のウイルス内で１つを上回るペプチド鎖を発現させるための、より効率的なウイルスベクターに対する必要性が、存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Larsonら、Oncotarget、６巻（２４号）：１９９７６〜８９頁（２０１５年）
【非特許文献２】Mizuguchiら、Mol.  Ther.、１巻（４号）：３７６〜８２頁（２０００年）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、部分的に、ウイルスゲノムにおいて２つのウイルス転写ユニット間に挿入された１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスが、効率的に複製し、標的とされる細胞または組織においてそのヌクレオチド配列を発現することができ、ウイルスの腫瘍溶解活性に著しい影響を及ぼさないという発見に基づく。本発明のベクターは、同等なレベルの２つまたはそれを上回る導入遺伝子が所望される場合に、または二本鎖タンパク質から完全に天然の鎖を発現させるために、有利に使用することができる。
【０００８】
一態様では、本発明は、挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、挿入部位が、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンと、第２のウイルス転写ユニットの終止コドンとの間に位置しており、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンから第２のウイルス転写ユニットの終止コドンの方が、第１のウイルス転写ユニットの開始部位から第２のウイルス転写ユニットの終止コドンよりも近く、第２のウイルス転写の終止コドンから第１のウイルス転写ユニットの終止コドンの方が、第２のウイルス転写ユニットの開始部位から第１のウイルス転写ユニットの終止コドンよりも近く、ヌクレオチド配列が挿入される前は、第１のウイルス転写ユニットと第２のウイルス転写ユニットとの間にウイルス転写ユニットは存在しない、組換えアデノウイルスを提供する。
【０００９】
ある特定の実施形態では、第１のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＩＸ遺伝子であり、第２のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子である。ある特定の実施形態では、第１のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスファイバー遺伝子であり、第２のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７である。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５型アデノウイルス（Ａｄ５）である。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、３５型アデノウイルス（Ａｄ３５）である。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入される。ある特定の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の約４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の約３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。
【００１１】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入される。ある特定の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８００に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２０に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４０に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６０に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８０に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または約３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の約３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。
【００１２】
ある特定の実施形態では、前述の組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９ｋ挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスファイバー遺伝子の開始部位との間に位置している。
【００１３】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列と、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノウイルスを提供する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の約４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。ある特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の約３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第１のヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。
【００１５】
ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８００に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２０に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４０に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６０に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８０に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または約３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の約３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。
【００１６】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列は、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーターをさらに含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【００１７】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）導入遺伝子、（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列（１つまたは複数の導入遺伝子を含む）は、第１のポリアデニル化シグナルと第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、第１のポリアデニル化シグナルと第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。
【００１８】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【００１９】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、（ｉｉｉ）プロモーター、（ｉｖ）導入遺伝子、（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列（１つまたは複数の導入遺伝子を含む）は、第１のポリアデニル化シグナルと第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。一部の実施形態では、１つまたは複数の導入遺伝子は、第１のポリアデニル化シグナルと第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、第４のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。
【００２０】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【００２１】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、遍在的プロモーター、組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的プロモーターである。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、または１３０個のヌクレオチドの欠失を含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コンセンサスコザック配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）をコードするヌクレオチド配列の部分的または完全な欠失を含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、前述の組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９ｋ挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスファイバー遺伝子の開始部位との間に位置している。
【００２５】
ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチド、たとえば、２０２個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４〜１９１７に対応する欠失を含むか、または第１の治療用導入遺伝子は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１７１４に対応するヌクレオチドと１９１７に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第１の治療用導入遺伝子は、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）とＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）との間に挿入され、たとえば、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）、第１の治療用導入遺伝子、およびＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、約５００〜約３１８５個、約５００〜約３０００個、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約３１８５個、約１０００〜約３０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約３１８５個、約１５００〜約３０００個、約１５００〜約２０００個、約２０００〜約３１８５個、約２０００〜約３０００個、約２０００〜約２５００個、約２５００〜約３１８５個、約２５００〜約３０００個、または約３０００〜約３１８５個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンとＥ３−１４．７Ｋの終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約５００〜約１５５１個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約１５５１個、約１０００〜約１５００個、または約１５００〜約１５５１個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約１０５０個のヌクレオチドの欠失を含み、たとえば、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する１０６３個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ５  ｄｌ３０９  Ｅ３欠失に対応する欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド２９７７３〜３０８３６に対応する欠失を含むか、または第２の治療用導入遺伝子は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の２９７７３に対応するヌクレオチドと３０８３６に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド２９１１９〜３０６２２に対応する欠失を含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性Ｐｅａ３結合部位の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む。たとえば、ウイルスは、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失、またはＥｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５〜２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含み、かつ／またはＥ１ａプロモーターは、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、この遺伝子に作動可能に連結された改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーター、および／または機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、この遺伝子に作動可能に連結された改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、初期遺伝子プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーターである。
【００３０】
ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＴＡＴＡボックス全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａプロモーターの−２７から−２４、−３１から−２４、−４４から＋５４、または−１４６から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４７２から４７５、４６８から４７５、４５５から５５２、または３５３から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、初期遺伝子プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーターである。
【００３３】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａプロモーターの−７６から−６８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【００３４】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４２３から４３１に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列ＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号４６）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７から４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【００３５】
ある特定の実施形態では、挿入されるヌクレオチド配列は、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列および第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含み、ここで、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、リンカーによって分離されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、リンカーは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型２Ａペプチドをコードする。ＩＲＥＳは、たとえば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、およびポリオウイルスＩＲＥＳからなる群から選択され得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入またはＬ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入された第３の導入遺伝子を含む第３のヌクレオチド配列をさらに含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数の導入遺伝子を含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体タンパク質、またはその一部をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および／または第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、治療活性を有するＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および／または第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、少なくとも１つの結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする。
【００３８】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、免疫調節性分子をコードする。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、共刺激リガンド、サイトカイン、またはサイトカイン受容体である。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０トラップ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＩＬ−２３Ａ／ｐ１９、ＩＬ２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βトラップ、ＩＬ−１０トラップ、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦ、ＩＣＡＭ、ポドカリキシン、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
【００３９】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、抗原結合性分子をコードする。ある特定の実施形態では、抗原結合性分子は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこれらの機能性断片である。
【００４０】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、抗原または抗原に対するリガンドをコードする。ある特定の実施形態では、抗原は、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、４−１ＢＢ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＫＲＡＳ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、ＥｐｈＡ３、カルシウム活性化クロライドチャネル−２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、未成熟ラミニン受容体、葉酸受容体−ａ、テロメラーゼ、チロシナーゼ、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒ−ａ２、ｘ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／−２、ＴＲＰ−１／−２、Ｐポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ＢＲＡＦ、アンドロゲン受容体、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｔ細胞受容体、腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
【００４１】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、毒素をコードする。ある特定の実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素、リシン毒素、またはジフテリア毒素である。
【００４２】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、酵素をコードする。ある特定の実施形態では、酵素は、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、エステラーゼ、メタロプロテイナーゼ、リラキシン、コラゲナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルギナーゼ、ＮＯＳ−２、これらの断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、細胞周期制御因子、増殖因子、抗凝血剤、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝子、抗血小板剤、凝固因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、これらの断片、またはこれらの誘導体をコードする。
【００４４】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、アンジオスタチン、エンドスタチン、アセチルコリン、ＤＫＫ１／Ｗｎｔ、Ｏｘ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、分泌フラジェリン、チミジンキナーゼ、これらの機能性断片、またはこれらの誘導体をコードする。
【００４５】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、腫瘍溶解性である。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、過剰増殖性細胞において選択的に複製する。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、過剰増殖性細胞において導入遺伝子を選択的に発現する。ある特定の実施形態では、過剰増殖性細胞は、腫瘍細胞である。
【００４６】
別の態様では、本発明は、前述の組換えアデノウイルス配列のうちのいずれかを含む単離されたヌクレオチド配列であって、必要に応じて、このヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、単離されたヌクレオチド配列を提供する。別の態様では、本発明は、アデノウイルスヌクレオチド配列を含む、単離されたベクターを提供する。別の態様では、本発明は、アデノウイルスヌクレオチド配列またはベクターを含む、単離された細胞を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかに曝露することであって、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法を提供する。
【００４８】
別の態様では、本発明は、対象における状態を処置する方法を提供する。一部の実施形態では、状態は、がんである。本方法は、対象に、有効量の、本明細書に記載される組換えアデノウイルスを投与することであって、対象におけるがん疾患を処置することを含む。
【００４９】
別の態様では、本発明は、腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかを投与することであって、腫瘍成長を阻害することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される。
【００５０】
別の態様では、本発明は、疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、感染、糖尿病性網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎、子宮内膜症、黄斑変性障害および良性成長障害、たとえば、前立腺肥大および脂肪腫、血管障害、心臓血管疾患、肝臓の硬変症、結合組織障害、腫瘍、血管病変、潰瘍性病変、炎症、血栓症、ならびに新内膜形成からなる群から選択される。
【００５１】
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、小児のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、成人のヒトである。
【００５２】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮内、吸入、経皮、局所、点眼、鼻内、経粘膜、および／または直腸投与によって投与される。
【００５３】
ある特定の実施形態では、前述の方法は、対象に、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、およびウイルス療法からなる群から選択される１つまたは複数の治療法を投与することをさらに含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、前述の方法は、対象に、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される１つまたは複数の分子の阻害剤、アンタゴニスト、またはアゴニストである。
【００５５】
別の態様では、本発明は、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明は、アデノウイルスの製剤であって、
ａ）前述の組換えアデノウイルスのいずれかのうちの１つまたは複数と、
ｂ）少なくとも１つの緩衝剤と、
ｃ）少なくとも１つの張度改変剤と、
ｄ）少なくとも１つの糖もしくは少なくとも１つの安定剤、またはその両方とを含み、
約７．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する、製剤を提供する。
【００５７】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する。ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかに含まれる組換えアデノウイルスは、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの濃度である。
【００５８】
本発明のこれらおよび他の態様および利点は、以下の図面、詳細な説明、および特許請求の範囲によって例証される。
【００５９】
本発明は、以下の図面を参照することによって、より完全に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、ヒトＡｄ５のゲノム組成を示すグラフである。図の上部に、ゲノムが線として示されており、従来的な左端からの長さが、ｋｂｐ単位で記入されている。太い矢印は、初期および後期転写ユニット（それぞれ、黒色および灰色）を表す。白抜きの囲みは、主要なイントロンを表す。Ｅ４遺伝子は、直線スケールとして拡大されており、長さがｂｐ単位で示されている。一次転写産物は、５’から３’の方向に黒色の矢印として示され、潜在的なコードタンパク質のそれぞれが、白抜きの囲みで示されている。コーディング領域がイントロン配列によって分割されているタンパク質は、線で繋がれた囲みとして示されている。
【００６１】
【図２】図２は、ウイルスＴＡＶ−（Ｅ１Ｂ−１９Ｋ）ｍＧＭＣＳＦもしくはＴＡＶ−（Ｌ５−Ｅ４）ｍＧＭＣＳＦを感染させたか、または未感染対照として保持した、Ａ５４９細胞、ＡＤＳ−１２細胞、およびＷＩ−３８細胞からのマウスＧＭＣＳＦ発現レベルを示す。マウスＧＭＣＳＦ発現は、それらの馴化培地において測定した。
【００６２】
【図３】図３は、ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−エンプティ、ＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−ＩＬ７、ＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−ＧＭＣＳＦ、またはＴＡＶ  ＩＸ−ＧＭＣＳＦ  Ｌ５−ＩＬ７を感染させたＡ５４９細胞からのＧＭＣＳＦ発現レベルを示す。ＧＭＣＳＦ発現は、馴化培地において測定した。ＧＭＣＳＦを、ＩＸ−Ｅ２発現カセットから発現させた場合に、Ｌ５−Ｅ４発現カセットよりも高い発現が、確認された。
【００６３】
【図４】図４は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位の初期設計および修正された設計を示す。
【００６４】
【図５】図５は、ウイルス（ＴＡＶ−Δ１９ｋ、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリン、ＴＡＶ−ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−エンプティ、ＷＴ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２、またはＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２）を３連で感染させ、感染の４日後にクリスタルバイオレット（生存細胞を紫色に染色する）で染色した、Ａ５４９細胞を示す。
【００６５】
【図６】図６は、ウイルス（ＴＡＶ−Δ１９ｋ、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリン、ＴＡＶ−ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−エンプティ、ＷＴ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２、またはＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２）を感染させた、Ａ５４９細胞からのＩＬ−１２発現レベルを示す。Ａ５４９細胞に、示されているウイルスを３連で感染させ、感染の４日後に、馴化培地中のＩＬ１２を、ＥＬＩＳＡで測定した。
【００６６】
【図７】図７は、ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＳＶ４０ｗｔ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ（ＳＶ４０野生型と表記）またはＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ（ｈＥＦ１Ａと表記）のいずれかを感染させたＡ５４９細胞からのＩＬ−１７およびＧＭＣＳＦの発現レベルを示す。
【００６７】
【図８】図８は、ＡＤＰ遺伝子インタクト型［ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ、＋ＡＤＰと表記］または欠失型［ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ−ΔＡＤＰ、ΔＡＤＰとして表記］を感染させたＡ５４９細胞からのＩＬ−１７およびＧＭＣＳＦの発現レベルを示す。馴化培地を、感染後の示されている時点で採取し、ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦを、ＥＬＩＳＡで測定した。
【００６８】
【図９】図９は、ウイルス［ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１、ＩＲＥＳと表記］、［ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１、１９Ｋ−ＩＸ−５と表記］、または対照ウイルス［ＴＡＶ−（１９ｋ）エンプティ−（ＩＸ）エンプティ−（Ｌ５）エンプティ、エンプティと表記］を感染させたＡ５４９細胞におけるＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、およびＩＣＡＭ１染色を示す。
【００６９】
【図１０】図１０は、ウイルス［ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１、ＩＲＥＳと表記］、［ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１、１９Ｋ−ＩＸ−５と表記］、または対照ウイルス［ＴＡＶ−（１９ｋ）エンプティ−（ＩＸ）エンプティ−（Ｌ５）エンプティ、エンプティと表記］を感染させたＨＴ２９細胞におけるＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、およびＩＣＡＭ１染色を示す。
【００７０】
【図１１】図１１は、ウイルス［ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１、ＩＲＥＳと表記］、［ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１、１９Ｋ−ＩＸ−５と表記］、または対照ウイルス［ＴＡＶ−（１９ｋ）エンプティ−（ＩＸ）エンプティ−（Ｌ５）エンプティ、エンプティと表記］を感染させたＡＤＳ１２細胞におけるＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、およびＩＣＡＭ１の染色を示す。
【００７１】
【図１２】図１２は、ウイルス［ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１、ＩＲＥＳと表記］、［ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１、１９Ｋ−ＩＸ−５と表記］、または対照ウイルス［ＴＡＶ−（１９ｋ）エンプティ−（ＩＸ）エンプティ−（Ｌ５）エンプティ、エンプティと表記］を感染させたＦ２４４細胞におけるＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、およびＩＣＡＭ１染色を示す。
【００７２】
【図１３】図１３は、５のＭＯＩでの感染後のＡ５４９細胞におけるウイルスＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティ（「エンプティ」と表記）およびＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２（「ｍＩＬ１２」と表記）の腫瘍溶解活性を示す。ウェルを、感染後の示されている日数で、クリスタルバイオレットで染色した。
【００７３】
【図１４】図１４は、ウイルスＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２の導入遺伝子の発現である。Ａ５４９細胞に、５のＭＯＩでＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティ（「エンプティ」と表記）またはＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２（「ｍＩＬ１２」と表記）を感染させ、感染の５日後に馴化培地を採取し、それをＥＬＩＳＡに使用して、ヘテロ二量体マウスＩＬ−１２を測定した。高レベルのマウスＩＬ−１２は、ＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２ウイルスでは発現されたが、対照のＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティウイルスでは発現されなかった。バーは、３連の試料の平均ＩＬ−１２レベルを示し、エラーバーは、標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
詳細な説明
本発明は、部分的に、ウイルスゲノムにおいて２つのウイルス転写ユニット間に挿入された１つまたは複数のヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスが、効率的に複製し、標的とされる細胞または組織においてそのヌクレオチド配列を発現することができるという発見に基づく。
【００７５】
Ｉ．組換えアデノウイルス
アデノウイルスは、ヌクレオキャプシドおよび二本鎖線状ＤＮＡゲノムから構成される、エンベロープを持たない正十二面体ウイルスである。アデノウイルスは、宿主の複製機構を使用して、哺乳動物細胞の核内で複製する。「アデノウイルス」という用語は、Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄｉａｅ属の任意のウイルスを指し、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウス、およびサルアデノウイルス亜属を含むがこれらに限定されない。具体的には、ヒトアデノウイルスは、亜属Ａ〜Ｆ、ならびにそれらの個々の血清型を含み、個々の血清型および亜属Ａ〜Ｆには、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１型（Ａｄ１１ａおよびＡｄ１１ｐ）、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、および９１型が含まれるが、これらに限定されない。ウシアデノウイルスという用語には、ウシアデノウイルス１型、２型、３型、４型、７型、および１０型が含まれるが、これらに限定されない。イヌアデノウイルスという用語には、イヌ１型（株ＣＬＬ、Ｇｌａｘｏ、ＲＩ２６１、Ｕｔｒｅｃｔ、Ｔｏｒｏｎｔｏ  ２６−６１）および２型が含まれるが、これらに限定されない。ウマアデノウイルスという用語には、ウマ１型および２型が含まれるが、これらに限定されない。ブタアデノウイルスという用語には、ブタ３型および４型が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
一部の実施形態では、ヒトアデノウイルス５型および３５型に由来する組換えウイルスが、提供される。「ウイルスベクター」および「ウイルス」という用語は、本明細書において、タンパク質合成機構もエネルギー生成機構も有さない偏性細胞内寄生体のうちの任意のものを指して、互換可能に使用される。
【００７７】
アデノウイルスの複製サイクルは、２つの段階を有し、初期段階では、転写ユニットＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、およびＥ４が発現される。これらの転写ユニット内の遺伝子によってコードされるタンパク質は、ほとんどが、ウイルス転写の調節、ウイルスＤＮＡの複製、および感染に対する宿主応答の抑制に関与する。Ｌ１〜Ｌ５転写ユニットは、ウイルス再生サイクルの後期に転写され、ほとんどが、ウイルスキャプシドの成分を構成するかまたはキャプシドのアセンブリーに関与するタンパク質をコードする。Ｌ１〜Ｌ５転写ユニットは、主として、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）により発現される。
【００７８】
成熟したアデノビリオン（Adenovirion）の一般構造は、異なるアデノウイルス種間で保存されている。アデノウイルスキャプシドは、３つのメジャータンパク質（ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ）ならびに５つのマイナータンパク質、ＶＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＩＩＩａ、およびＩＶａ２から構成される。本明細書において使用される「ＩＶａ２遺伝子」は、ＩＶａ２タンパク質、その改変されたバージョン、および／または断片をコードする、遺伝子を指す。本明細書において使用される「ＩＸ遺伝子」は、ＩＸタンパク質、その改変されたバージョン、および／または断片をコードする、遺伝子を指す。
【００７９】
Ａｄ５ゲノムの概略図およびＥ４遺伝子の詳細を、図１に示す。Ｅ４由来の一次転写産物は、代替的なスプライシング事象に供され、７つの異なるポリペプチド：ＯＲＦ１、ＯＲＦ２、ＯＲＦ３、ＯＲＦ３／４、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、およびＯＲＦ６／７をコードすると予測されている。（Leppardら、Journal  of  General  Virology、７８巻：２１３１〜８頁（１９９７年））「ＯＲＦ」は、ポリペプチド、またはポリペプチド、その改変されたバージョン、および／もしくは断片をコードするヌクレオチド配列のいずれかを指して、本明細書において使用される。
【００８０】
加えて、ファイバータンパク質（タンパク質ＩＶまたはＳＰＩＫＥとしても公知である）は、正十二面体キャプシドのそれぞれの頂点から突出するスパイクを形成する。本明細書において使用される「ファイバー遺伝子」は、Ｌ５遺伝子としても公知であるファイバータンパク質、その改変されたバージョン、および／または断片をコードする、遺伝子を指す。
【００８１】
Ａ．挿入部位
一態様では、本発明は、挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、挿入部位が、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンと、第２のウイルス転写ユニットの終止コドンとの間に位置しており、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンから第２のウイルス転写ユニットの終止コドンの方が、第１のウイルス転写ユニットの開始部位から第２のウイルス転写ユニットの終止コドンよりも近く、第２のウイルス転写の終止コドンから第１のウイルス転写ユニットの終止コドンの方が、第２のウイルス転写ユニットの開始部位から第１のウイルス転写ユニットの終止コドンよりも近い、組換えアデノウイルスを提供する。一部の実施形態では、第１のウイルス転写ユニットおよび第２のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスゲノム内で互いに隣接しており、たとえば、ヌクレオチド配列が挿入される前は、第１のウイルス転写ユニットと第２のウイルス転写ユニットとの間にウイルス転写ユニットは存在しない。
【００８２】
本明細書において使用される「ウイルス転写ユニット」という用語は、ウイルスゲノムにおいて、転写開始部位から転写終止部位に及ぶ、線形配列のヌクレオチド配列を指す。ウイルス転写ユニットは、天然に存在するものであってもよく、改変されていてもよく、またはその断片であってもよい。「ウイルス転写ユニット」および「ウイルス遺伝子」という用語は、本明細書において互換可能に使用される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスである。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス１型、２型、３型、４型、４ａ型、５型、６型、７型、８型、９型、１０型、１１型、１２型、１３型、１４型、１５型、１６型、１７型、１８型、１９型、１９ａ型、２０型、２１型、２２型、２３型、２４型、２５型、２６型、２７型、２８型、２９型、３０型、３１型、３２型、３３型、３４型、３４ａ型、３５型、３５ｐ型、３６型、３７型、３８型、３９型、４０型、４１型、４２型、４３型、４４型、４５型、４６型、４７型、４８型、または９１型である。一部の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５型アデノウイルス（Ａｄ５）または３５型アデノウイルス（Ａｄ３５）である。
【００８４】
ある特定の実施形態では、第１のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＩＸ遺伝子であり、第２のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子である。ある特定の実施形態では、第１のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスファイバー遺伝子であり、第２のウイルス転写ユニットは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７である。
【００８５】
ある特定の実施形態では、挿入部位は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位である。ある特定の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５１に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７１に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に、挿入される。
【００８６】
一部の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９および４０９３に対応するヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９および３９７０に対応するヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８７】
ある特定の実施形態では、挿入部位は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位である。ある特定の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８０１に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２１に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４１に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６１に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８１に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。
【００８８】
一部の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５から３２９１６に対応するヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９および３１８２１に対応するヌクレオチドに対して、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を有する。
【００８９】
ＩＸ−Ｅ２挿入部位および／またはＬ５−Ｅ４挿入部位に外来ヌクレオチド配列の挿入を有する組換えアデノウイルスは、これまでに説明されていなかった。そのような組換えアデノウイルスは、予想外なことに、正常細胞と比較して、腫瘍細胞において非常に良好な腫瘍選択的発現を示す。一態様では、本発明は、天然タンパク質を発現する方法を提供する。別の態様では、本発明は、天然構造の、たとえば、二量体または多量体のタンパク質を発現する方法を提供する。
【００９０】
別の態様では、本発明は、標的細胞において２つまたはそれを上回る治療用導入遺伝子を発現させる方法を提供する。本方法は、細胞を、有効量の本明細書に記載される組換えウイルスに曝露して、標的導入遺伝子を発現させることを含む。
【００９１】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーターをさらに含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【００９２】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）導入遺伝子、（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列は、第１のポリアデニル化シグナルと第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【００９３】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、（ｉｉｉ）プロモーター、（ｉｖ）導入遺伝子、（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列は、第１のポリアデニル化シグナルと第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、第４のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【００９４】
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ調節配列を含むヌクレオチド領域を指して、その通常の意味で本明細書において使用され、ここで、調節配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向の）コーディング配列の転写を開始することができる、遺伝子に由来する。
【００９５】
「作動可能に連結されている」とは、そのように記載される構成要素が、それらの通常の機能を行うことができるように構成されている、エレメントの配置を指す。したがって、コーディング配列に作動可能に連結されている制御エレメントは、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。制御エレメントは、コーディング配列の発現を指示するように機能する限り、必ずしもコーディング配列と連続している必要はない。したがって、たとえば、翻訳されないが転写はされる介在配列が、プロモーター配列とコーディング配列との間に存在してもよく、プロモーター配列は、依然として、コーディング配列に「作動可能に連結されている」と考えることができる。
【００９６】
ある特定の実施形態では、プロモーターは、遍在的プロモーター、組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的プロモーターである。
【００９７】
一部の実施形態では、導入遺伝子は、遍在的プロモーター、たとえば、βＡｃｔプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＥＧＲ１プロモーター、ｅＩＦ４Ａ１プロモーター、ＦｅｒＨプロモーター、ＦｅｒＬプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＲＰ７８プロモーター、ＧＲＰ９４プロモーター、ＨＳＰ７０プロモーター、β−Ｋｉｎプロモーター、ＰＧＫ−１プロモーター、ＲＯＳＡプロモーター、ユビキチンＢプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、またはＣＭＶプロモーターに作動可能に連結されている。一実施形態では、高レベルの構成的発現が、所望されるであろう。有用な構成的プロモーターの例としては、限定することなく、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（必要に応じて、ＲＳＶエンハンサーを有する）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（必要に応じて、ＣＭＶエンハンサーを有する）（たとえば、Boshartら、Cell、４１巻：５２１〜５３０頁（１９８５年）を参照されたい）、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、およびＥＦ１αプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。外来で供給される化合物によって調節される誘導性プロモーターもまた、有用であり、これには、亜鉛誘導性ヒツジメタロチオニン（metallothionine）（ＭＴ）プロモーター、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）誘導性マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系（ＷＯ  ９８／１００８８）、エクジソン昆虫プロモーター（Noら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、９３巻：３３４６〜３３５１頁（１９９６年））、テトラサイクリン抑制系（Gossenら、Proc.  Natl.  Acad  Sci.  USA、８９巻：５５４７〜５５５１頁（１９９２年））、テトラサイクリン誘導系（Gossenら、Science.、２６８巻：１７６６〜１７６９頁（１９９５年）、Harveyら、Curr.  Opin.  Chem.  Biol.、２巻：５１２〜５１８頁（１９９８年）もまた参照されたい）、ＲＵ４８６誘導系（Wangら、Nat.  Biotech.、１５巻：２３９〜２４３頁（１９９７年）およびWangら、Gene  Ther.、４巻：４３２〜４４１頁（１９９７年））、ならびにラパマイシン誘導系（Magariら、J.  Clin.  Invest.、１００巻：２８６５〜２８７２頁（１９９７年））が含まれる。この状況において有用であり得る他の種類の誘導性プロモーターには、特定の生理学的状態、たとえば、温度、急性期、細胞の特定の分化状態によって、または複製細胞のみにおいて、調節されるものがある。
【００９８】
別の実施形態では、導入遺伝子の天然のプロモーターが使用されるであろう。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現が、天然の発現を模倣すべきことが所望される場合に、好まれる場合がある。天然のプロモーターは、導入遺伝子の発現を、時間的もしくは発達的に、または組織特異的様式で、または特定の転写刺激に応答して、調節しなければならない場合に、使用され得る。さらなる実施形態では、他の天然の発現制御エレメント、たとえば、エンハンサーエレメント、ポリアデニル化部位、またはコザックコンセンサス配列もまた、天然の発現を模倣するために使用され得る。
【００９９】
導入遺伝子の別の実施形態には、組織特異的プロモーター、たとえば、Ｂ２９プロモーター（Ｂ細胞）、ＣＤ１４プロモーター（単核球細胞）、ＣＤ４３プロモーター（白血球および血小板）、ＣＤ４５プロモーター（造血細胞）、ＣＤ６８プロモーター（マクロファージ）、デスミンプロモーター（筋肉）、エラスターゼ−１プロモーター（膵腺傍細胞）、エンドグリンプロモーター（内皮細胞）、エンドグリンプロモーター（内皮細胞）、Ｆｌｔ−１プロモーター（内皮細胞）、ＧＦＡＰプロモーター（星状細胞）、ＧＰＩＩｂプロモーター（巨核球）、ＩＣＡＭ−２プロモーター（内皮細胞）、マウスＩＮＦ−βプロモーター（造血細胞）、Ｍｂプロモーター（筋肉）、ＮｐｈｓＩプロモーター（有足細胞）、ＯＧ−２プロモーター（骨芽細胞、象牙芽細胞（Odonblast））、ＳＰ−Ｂプロモーター（肺）、ＳＹＮ１プロモーター（ニューロン）、ＷＡＳＰプロモーター（造血細胞）、ＳＶ４０／ｂＡｌｂプロモーター（肝臓）、またはＳＶ４０／ｈＡｌｂプロモーター（肝臓）に作動可能に連結された導入遺伝子が含まれる。組織特異的プロモーターは、特定の種類の細胞または組織において活性である。たとえば、骨格筋における発現が所望される場合、筋肉において活性なプロモーターを、使用すべきである。これらには、骨格α−アクチン、ミオシン軽鎖２Ａ、ジストロフィン、筋クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来するプロモーター、ならびに天然に存在するプロモーターよりも高い活性を有する合成の筋プロモーターが含まれる（Liら、Nat.  Biotech.、１７巻：２４１〜２４５頁（１９９９年）を参照されたい）。組織特異的なプロモーターの例は、とりわけ、肝臓（アルブミン、Miyatakeら、J.  Virol.、７１巻：５１２４〜３２頁（１９９７年）；Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモーター、Sandigら、Gene  Ther.、３巻：１００２〜９頁（１９９６年）；アルファ−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、Arbuthnotら、Hum.  Gene  Ther.、７巻：１５０３〜１４頁（１９９６年））、骨オステオカルシン（Steinら、Mol.  Biol.  Rep.、２４巻：１８５〜９６頁（１９９７年））、骨シアロタンパク質（Chenら、J.  Bone  Miner.  Rep.、１１巻：６５４〜６４頁（１９９６年））、リンパ球（ＣＤ２、Hansalら、J.  Immumnol.、１６１巻：１０６３〜８頁（１９９８年）；免疫グロブリン重鎖；Ｔ細胞受容体ａ鎖）、神経細胞、たとえば、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（Andersenら、Cell.  Mol.  Neurobiol.、１３巻：５０３〜１５頁（１９９３年））、神経フィラメント軽鎖遺伝子（Piccioliら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８８巻：５６１１〜５頁（１９９１年））、およびニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子（Piccioliら、Neuron.、１５巻：３７３〜８４頁（１９９５年））が公知である。
【０１００】
導入遺伝子の別の実施形態としては、腫瘍特異的プロモーター、たとえば、ＡＦＰプロモーター（肝細胞癌）、ＣＣＫＡＲプロモーター（膵臓がん）、ＣＥＡプロモーター（上皮がん）、ｃ−ｅｒｂＢ２プロモーター（乳がんおよび膵臓がん）、ＣＯＸ−２プロモーター（腫瘍）、Ｅ２Ｆ−１プロモーター（腫瘍）、ＨＥ４プロモーター（腫瘍）、ＬＰプロモーター（腫瘍）、ＭＵＣ１プロモーター（癌細胞）、ＰＳＡプロモーター（前立腺および前立腺がん）、サバイビンプロモーター（腫瘍）、ＴＲＰ１プロモーター（メラニン細胞および黒色腫）、Ｔｙｒプロモーター（メラニン細胞および黒色腫）、ＣＸＣＲ４プロモーター（腫瘍）、またはＡＦＰ／ｈＡＦＰプロモーター（肝細胞癌）に作動可能に連結された導入遺伝子が挙げられる。腫瘍特異的プロモーターは、腫瘍細胞において特異的に活性である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、コンセンサスコザック配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）をコードするヌクレオチド配列の部分的または完全な欠失を含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、本発明は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列と、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノウイルスを提供する。これらの実施形態は、アデノウイルスが、２つまたはそれを上回る別個の外来導入遺伝子を発現することを可能にする。このアプローチは、自己切断型リンカーにより結合された２つの導入遺伝子を含む融合タンパク質を発現するアデノウイルスでは切断されたリンカーが免疫原性となる可能性があるため、それよりも優れたある特定の利点を有する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、（ｉｖ）リンカー、（ｖ）第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列、（ｖｉ）第２のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉｉ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、（ｉｉｉ）プロモーター、（ｉｖ）第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、（ｖ）リンカー、（ｖｉ）第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉｉｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、第４のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ＩＸ−Ｅ２挿入部位は、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｌ５−Ｅ４挿入部位は、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、または１３０個のヌクレオチドの欠失を含む。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−５５Ｋの開始部位との間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスファイバー遺伝子（Ｌ５）の開始部位との間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ４挿入部位は、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ１の開始コドンからＯＲＦ６／７の終止コドンの間に位置している。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ１ｂ−１９Ｋ挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ３挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ１ｂ−１９Ｋ挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ３挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＥ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列およびＬ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列、ならびにＥ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入された第３のヌクレオチド配列を、さらに含む。
【０１０９】
アデノウイルスＥｌｂ−１９ｋ遺伝子は、主として、抗アポトーシス遺伝子として機能し、細胞内抗アポトーシス遺伝子ＢＣＬ−２のホモログである。子孫ウイルス粒子の成熟前の宿主細胞の死により、ウイルス複製が制限されることになるため、Ｅｌｂ−１９ｋは、成熟前の細胞死を防止し、それによって、感染が進行し成熟したビリオンを生成することを可能にするように、Ｅｌカセットの一部として発現される。したがって、ある特定の実施形態では、Ｅｌｂ−１９Ｋ挿入部位を含む組換えウイルスが、提供され、たとえば、このアデノウイルスは、Ｅｌｂ−１９Ｋ挿入部位に挿入された外来ヌクレオチド配列を有する。ある特定の実施形態では、挿入部位は、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位と、Ｅｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチド、たとえば、２０２個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４〜１９１７に対応する欠失を含むか、または導入遺伝子をコードする外来ヌクレオチド配列は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１７１４に対応するヌクレオチドと１９１７に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、導入遺伝子をコードする外来ヌクレオチド配列は、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）とＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）との間に挿入され、たとえば、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）、導入遺伝子をコードする外来ヌクレオチド配列、およびＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド１６１１〜２１５３または１６１１〜１９１５に対応する欠失を含む。
【０１１１】
ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチド、たとえば、２０２個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４〜１９１７に対応する欠失を含むか、または第１の治療用導入遺伝子は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１７１４に対応するヌクレオチドと１９１７に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第１の治療用導入遺伝子は、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）とＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）との間に挿入され、たとえば、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、ＣＴＧＡＣＣＴＣ（配列番号３）、第１の治療用導入遺伝子、およびＴＣＡＣＣＡＧＧ（配列番号２）を含む。
【０１１２】
ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、約５００〜約３１８５個、約５００〜約３０００個、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約３１８５個、約１０００〜約３０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約３１８５個、約１５００〜約３０００個、約１５００〜約２０００個、約２０００〜約３１８５個、約２０００〜約３０００個、約２０００〜約２５００個、約２５００〜約３１８５個、約２５００〜約３０００個、約３０００〜約３１８５個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンとＥ３−１４．７Ｋの終止コドンとの間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約５００〜約１５５１個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約１５５１個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約１５５１個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約１０５０個のヌクレオチドの欠失を含み、たとえば、Ｅ３挿入部位は、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する１０６３個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ５  ｄｌ３０９  Ｅ３欠失に対応する欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド２９７７３〜３０８３６に対応する欠失を含むか、または第２の治療用導入遺伝子は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の２９７７３に対応するヌクレオチドと３０８３６に対応するヌクレオチドとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、Ｅ３挿入部位は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド２７１９９〜３０６２２に対応する欠失を含む。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、Ｅ４挿入部位は、Ｅ４遺伝子のＯＲＦ、すなわち、ＯＲＦ１の開始コドンからＯＲＦ６／７の終止コドンの間のうちのいずれか１つを含む。たとえば、ヌクレオチド配列は、Ｅ４  ＯＲＦ１および／またはＥ４  ＯＲＦ２に挿入され得る。ある特定の実施形態では、Ｅ４領域の一部分または全体が、欠失していてもよい。ある特定の実施形態では、前述のウイルスのいずれにおいても、組換えアデノウイルスは、Ｅ４欠失をさらに含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位（すなわち、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始コドン、たとえば、配列番号１のヌクレオチド３４０７５〜３４０７７に対応するものをコードするヌクレオチド配列）と、右側の末端逆位反復（ＩＴＲ、たとえば、配列番号１のヌクレオチド３５８３６〜３５９３８に対応する）との間に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位と、Ｅ４−ＯＲＦ１の開始部位との間（すなわち、Ｅ４−ＯＲＦ１の開始コドン、たとえば、配列番号１のヌクレオチド３５５２４〜３５５２６に対応するものをコードするヌクレオチド配列）に位置している。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位とＥ４−ＯＲＦ１の開始部位との間のヌクレオチド配列の欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約２５００個、約１５００〜約２０００個、または約２０００〜約２５００個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位に隣接する約２５０〜約１５００個、約２５０〜約１２５０個、約２５０〜約１０００個、約２５０〜約７５０個、約２５０〜約５００個、５００〜約１５００個、約５００〜約１２５０個、約５００〜約１０００個、約５００〜約７５０個、７５０〜約１５００個、約７５０〜約１２５０個、約７５０〜約１０００個、約１０００〜約１５００個、または約１０００〜約１２５０個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位に隣接する約１４５０個のヌクレオチドの欠失を含み、たとえば、Ｅ４欠失は、Ｅ４−ＯＲＦ６／７の開始部位に隣接する約１４４９個のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド３４０７８〜３５５２６または３４０８３〜３５５４１に対応する欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ４欠失は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド３３００４〜３４４２２または３１８２７〜３４４１５に対応する欠失を含む。
【０１１４】
Ｂ．改変された転写制御領域
これまでに開発された腫瘍溶解性ウイルスとしては、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０／１０１９２１号においてＴＡＶ−２５５と称される腫瘍溶解性５型血清型アデノウイルス（Ａｄ５）が挙げられ、これは、正常細胞においては転写が減弱されるが、がん細胞においては転写が活性である。ＴＡＶ−２５５ベクターがこの腫瘍選択性を達成する機構は、特定のＤＮＡ配列への結合を通じて、ウイルスが宿主細胞に進入した後に転写される最初の遺伝子であるＥ１ａのアデノウイルス発現を調節するタンパク質である、転写因子Ｐｅａ３およびＥ２Ｆに対する３つの転写因子（ＴＦ）結合部位の標的化された欠失によるものであると考えられる。これら３つのＰｅａ３およびＥ２Ｆ欠失により、成長が停止された正常な細胞における複製は減弱されるが、悪性のものにおいては減弱されず、これらのＤＮＡ配列が、がん細胞における転写調節および成長についてのみ必要とされないことが示される。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかは、改変されたＥ１ａ調節配列を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性Ｐｅａ３結合部位の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む。たとえば、ウイルスは、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失、またはＥｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５〜２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含み、かつ／またはＥ１ａプロモーターは、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、この遺伝子に作動可能に連結された改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーター、および／または機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、この遺伝子に作動可能に連結された改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、初期遺伝子プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーターである。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＴＡＴＡボックス全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａプロモーターの−２７から−２４、−３１から−２４、−４４から＋５４、または−１４６から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４７２から４７５、４６８から４７５、４５５から５５２、または３５３から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７〜４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、初期遺伝子プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、Ｅ１ａプロモーターである。
【０１２１】
ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ａプロモーターの−７６から−６８に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４２３から４３１に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、配列ＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号４６）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７から４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、本発明は、２つの治療用導入遺伝子であって、発現されると、単一のポリペプチド鎖を産生し、これが、翻訳後に切断されて２つのポリペプチド鎖となり得る、２つの治療用導入遺伝子を発現させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列および第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、リンカーによって分離されている。ある特定の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、リンカーは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。ＩＲＥＳは、たとえば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、およびポリオウイルスＩＲＥＳからなる群から選択され得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入またはＬ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、ここで、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入された第３のヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、ウイルスは、調節配列またはプロモーターに対する１つまたは複数の改変を有する。調節配列またはプロモーターに対する改変は、調節配列またはプロモーターの野生型配列と比較して、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換、または付加を含む。
【０１２５】
一実施形態では、調節配列またはプロモーターの改変は、転写因子に対する親和性を低減させるような、転写因子結合部位の配列の、たとえば、その一部分を欠失させることによるか、または結合部位に単一点突然変異を挿入することによる、改変を含む。ある特定の実施形態では、追加の改変された調節配列は、新生物細胞における発現を強化するが、正常細胞における発現は減弱させる。
【０１２６】
Ｅｌａ調節配列は、Ｐｅａ３  Ｉ、Ｐｅａ３  ＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＶ、およびＰｅａ３  Ｖと表記される、転写因子Ｐｅａ３に対する５つの結合部位を含み、ここで、Ｐｅａ３  Ｉが、Ｅｌａ開始部位に最も近接するＰｅａ３結合部位であり、Ｐｅａ３  Ｖが、最も遠位である。Ｅｌａ調節配列はまた、本明細書にＥ２Ｆ  ＩおよびＥ２Ｆ  ＩＩと表記される、転写因子Ｅ２Ｆに対する結合部位も含み、ここで、Ｅ２Ｆ  Ｉが、Ｅｌａ開始部位に最も近接するＥ２Ｆ結合部位であり、Ｅ２Ｆ  ＩＩは、より遠位にある。Ｅｌａ開始部位から、結合部位は、以下のように並んでいる：Ｐｅａ３  Ｉ、Ｅ２Ｆ  Ｉ、Ｐｅａ３  ＩＩ、Ｅ２Ｆ  ＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＶ、およびＰｅａ３  Ｖ。
【０１２７】
一実施形態では、これらの７つの結合部位のうちの少なくとも１つ、または機能性結合部位が、欠失される。本明細書において使用されるとき、「機能性結合部位」とは、それぞれの結合パートナー、たとえば、転写因子に結合することができる結合部位、たとえば、対応する野生型結合部位配列の結合活性のうち少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％を有する結合部位を指す。本明細書において使用されるとき、「非機能性結合部位」は、たとえば、対応する野生型結合部位配列の３０％未満、２０％未満、１０％未満、または０％の結合活性を有する、結合部位を指す。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性Ｐｅａ３結合部位の欠失、たとえば、Ｐｅａ３結合部位全体の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む。本明細書において使用されるとき、「機能性Ｐｅａ３結合部位」とは、それぞれの転写因子（たとえば、Ｐｅａ３）に結合することができるＰｅａ３結合部位、たとえば、対応する野生型Ｐｅａ３結合部位配列の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％のＰｅａ３結合活性を有するＰｅａ３結合部位を指す。本明細書において使用されるとき、「非機能性Ｐｅａ３結合部位」は、対応する野生型Ｐｅａ３結合部位配列の３０％未満、２０％未満、１０％未満、または０％のＰｅａ３結合活性を有する、Ｐｅａ３結合部位を指す。Ｐｅａ３結合部位が、Ｐｅａ３に結合するかどうかを判定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイ、およびＤＮＡｓｅフットプリントアッセイが挙げられる。
【０１２９】
一実施形態では、少なくとも１つのＰｅａ３結合部位または機能性Ｐｅａ３結合部位が、欠失される。欠失されるＰｅａ３結合部位は、Ｐｅａ３  Ｉ、Ｐｅａ３  ＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＶ、および／またはＰｅａ３  Ｖであり得る。一実施形態では、欠失されるＰｅａ３結合部位は、Ｐｅａ３  ＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＶ、および／またはＰｅａ３  Ｖである。別の実施形態では、欠失されるＰｅａ３結合部位は、Ｐｅａ３  ＩＶおよび／またはＰｅａ３  Ｖである。別の実施形態では、欠失されるＰｅａ３結合部位は、Ｐｅａ３  ＩＩおよび／またはＰｅａ３  ＩＩＩである。別の実施形態では、欠失されるＰｅａ３結合部位は、Ｐｅａ３  ＩＩおよびＰｅａ３  ＩＩＩの両方である。別の実施形態では、Ｐｅａ３  Ｉ結合部位または機能性Ｐｅａ３  Ｉ結合部位は、保持される。
【０１３０】
一実施形態では、少なくとも１つのＥ２Ｆ結合部位または機能性Ｅ２Ｆ結合部位が、欠失される。別の実施形態では、少なくとも１つのＥ２Ｆ結合部位または機能性Ｅ２Ｆ結合部位は、保持される。一実施形態では、保持されるＥ２Ｆ結合部位は、Ｅ２Ｆ  Ｉおよび／またはＥ２Ｆ  ＩＩである。別の実施形態では、保持されるＥ２Ｆ結合部位は、Ｅ２Ｆ  ＩＩである。別の実施形態では、全欠失は、Ｐｅａ３  ＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＩＩ、Ｐｅａ３  ＩＶ、および／またはＰｅａ３  Ｖのうちの１つまたは複数から本質的になる。一実施形態では、ウイルスは、たとえば、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５〜２４４に対応し、本明細書において以降ＴＡＶ−２５５欠失と称される、Ｅｌａ開始部位の上流−３０５から−２５５に位置する５０塩基対の領域の欠失を有する。ある特定の実施形態では、ＴＡＶ−２５５欠失は、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含むＥ１ａプロモーターをもたらす。
【０１３１】
一実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１０１０１９２１号および米国公開第２０１６００１７２９４号Ａ１において記載されるＴＡＶ−２５５と称される腫瘍溶解性血清型５型アデノウイルス（Ａｄ５）におけるものと同じかまたは類似するＥ１ａ改変を有し、これらの文献のそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＴＡＶ−２５５ベクターがこの腫瘍選択性を達成する機構は、特定のＤＮＡ配列への結合を通じて、ウイルスが宿主細胞に進入した後に転写される最初の遺伝子であるＥ１ａのアデノウイルス発現を調節するタンパク質である、転写因子Ｐｅａ３およびＥ２Ｆに対する３つの転写因子（ＴＦ）結合部位の標的化された欠失によるものであると考えられる。これら３つのＰｅａ３およびＥ２Ｆ欠失により、成長が停止された正常な細胞における複製は減弱されるが、悪性のものにおいては減弱されず、これらのＤＮＡ配列が、がん細胞における転写調節および成長についてのみ必要とされないことが示される。
【０１３２】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、機能性Ｐｅａ３結合部位の１つまたは複数の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ｅｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５〜２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、Ｅ１ａプロモーターは、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む。
【０１３３】
一実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を含む。他の実施形態では、組換えアデノウイルスは、Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を含む。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞および／または非成長停止細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、その遺伝子に作動可能に連結された改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターを含む。本明細書において使用されるとき、「機能性ＴＡＴＡボックス」とは、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に結合することができるＴＡＴＡボックス、たとえば、対応する野生型ＴＡＴＡボックス配列の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％のＴＢＰ結合活性を有するＴＡＴＡボックスを指す。本明細書において使用されるとき、「非機能性ＴＡＴＡボックス」とは、たとえば、対応する野生型ＴＡＴＡボックス配列の３０％未満、２０％未満、１０％未満、または０％のＴＢＰ結合活性を有する、ＴＡＴＡボックスを指す。ＴＢＰがＴＡＴＡボックスに結合するかどうかを判定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイ、およびＤＮＡｓｅフットプリントアッセイが挙げられる。
【０１３５】
本明細書において使用されるとき、「改変されたＴＡＴＡボックス」とは、野生型ＴＡＴＡボックス配列と比べて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換、または付加を有するＴＡＴＡボックスを指す。
【０１３６】
たとえば、ウイルスは、Ｅ１ａの開始部位の上流−２９から−２６、−３３から−２６、−４４から＋５２、または−１４８から＋５２に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。ある特定の実施形態では、欠失は、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３５３〜５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、ＴＡＴＡボックスの欠失は、配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むＥ１ａプロモーターをもたらす。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞および／または非成長停止における遺伝子の選択的な発現を可能にする、その遺伝子に作動可能に連結された改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む。ＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターおよびＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターは、同じプロモーター（たとえば、Ａｄ５  Ｅ１ａプロモーター）であってもよく、または異なるプロモーターであってもよい。
【０１３８】
本明細書において使用されるとき、「ＣＡＡＴボックス」とは、Ｃ／ＥＢＰまたはＮＦ−Ｙタンパク質に結合することができる、ヌクレオチド配列を指す。ＣＡＡＴボックスは、典型的に、ＧＧ（Ｔ／Ｃ）ＣＡＡＴＣＴのコンセンサス配列を含む。
【０１３９】
本明細書において使用されるとき、「改変されたＣＡＡＴボックス」とは、野生型ＣＡＡＴボックス配列と比べて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換、または付加を有するＣＡＡＴボックスを指す。
【０１４０】
本明細書において使用されるとき、「機能性ＣＡＡＴボックス」とは、Ｃ／ＥＢＰまたはＮＦ−Ｙタンパク質に結合することができるＣＡＡＴボックス、たとえば、対応する野生型ＣＡＡＴボックス配列の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、または少なくとも４０％のＣ／ＥＢＰまたはＮＦ−Ｙ結合活性を有するＣＡＡＴボックスを指す。本明細書において使用されるとき、「非機能性ＣＡＡＴボックス」とは、たとえば、対応する野生型ＣＡＡＴボックス配列の３０％未満、２０％未満、１０％未満、または０％のＣ／ＥＢＰまたはＮＦ−Ｙ結合活性を有する、ＣＡＡＴボックスを指す。Ｃ／ＥＢＰまたはＮＦ−Ｙタンパク質がＣＡＡＴボックスに結合するかどうかを判定するためのアッセイは、当該技術分野において公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイ、およびＤＮＡｓｅフットプリントアッセイが挙げられる。
【０１４１】
本明細書において使用されるとき、「ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター」とは、ＣＡＡＴボックスを含む任意の遺伝子プロモーターを指す。
【０１４２】
本明細書において使用されるとき、「改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター」とは、野生型ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターと比べて、１つまたは複数のヌクレオチドの欠失、置換、または付加によって改変されている、ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを指す。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、野生型ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失を含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、野生型ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター配列の１つまたは複数のヌクレオチドの欠失からなる。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、野生型ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター配列のＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、野生型ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター配列のＣＡＡＴボックス全体の欠失からなる。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター全体の欠失を含む。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、ＣＡＡＴボックスに基づくプロモーター全体の欠失からなる。ある特定の実施形態では、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変は、別個の機能性プロモーター配列の付加もそれとの置換も含まない。
【０１４３】
ウイルス遺伝子をコードする核酸は、従来的なトランスフェクションまたは形質転換の技法を通じて、プラスミドに組み込むことができ、宿主細胞に導入することができる。具体的な産生および精製の条件は、ウイルスおよび利用される産生系に応じて変動するであろう。アデノウイルスについては、ウイルス粒子の生成のための従来的な方法は、コトランスフェクション、ならびにそれに続くシャトルプラスミド（通常、アデノウイルスゲノムの小さなサブセットを含み、必要に応じて可能性のある導入遺伝子および発現カセットを含む）およびアデノウイルスヘルパープラスミド（アデノウイルスゲノム全体のほとんどを含む）のｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えである。アデノウイルスの生成のための代替的な技術は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）系、相補的なアデノウイルス配列を含む２つのプラスミドを利用したｒｅｃＡ＋細菌株におけるｉｎ  ｖｉｖｏ細菌組換え、ならびに酵母人工染色体（ＹＡＣ）系が挙げられる。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、腫瘍溶解性ウイルス、たとえば、腫瘍選択的複製および／またはウイルスに媒介される溶解を呈するウイルスである。ある特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、非過剰増殖性細胞と比べて、過剰増殖性細胞、たとえば、がん細胞、腫瘍細胞における治療用導入遺伝子の選択的な発現を呈する。ある特定の実施形態では、非過剰増殖性細胞における治療用導入遺伝子の発現は、過剰増殖性細胞における遺伝子の発現の約９０％、約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、または約５％である。ある特定の実施形態では、ウイルスは、非過剰増殖性細胞において治療用導入遺伝子の検出可能な発現を呈さない。治療用導入遺伝子の発現は、当該技術分野において公知の任意の適切な方法、たとえば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡによって、判定することができる。過剰増殖性細胞は、がん細胞、たとえば、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺がん、肺がん、消化管がん、結腸直腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、胃がん、甲状腺がん、中皮腫、肝臓がん、腎臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、または脳がんの細胞であり得る。
【０１４５】
Ｃ．導入遺伝子
本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、前述の挿入部位、たとえば、ＩＸ−Ｅ２挿入部位、Ｌ５−Ｅ４挿入部位、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位のうちのいずれかに挿入された、１つまたは複数の外来ヌクレオチド配列を含む。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、プロモーターをさらに含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）導入遺伝子、（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列は、第１のポリアデニル化シグナルと第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、Ｌ５転写ユニットのポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、Ｅ４転写ユニットのポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ転写ユニットのポリアデニル化シグナルであり、第２のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、（ｉｉｉ）プロモーター、（ｉｖ）導入遺伝子、（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、および／または第２のヌクレオチド配列は、第１のポリアデニル化シグナルと第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入される。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、第４のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、Ｌ５転写ユニットのポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、Ｅ４転写ユニットのポリアデニル化シグナルである。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、第１のポリアデニル化シグナルは、ＩＸ転写ユニットのポリアデニル化シグナルであり、第３のポリアデニル化シグナルは、導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、第４のポリアデニル化シグナルは、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列および第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列を含む、ヌクレオチド配列をさらに含み、ここで、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、リンカーによって分離されている。
【０１５０】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）プロモーター、（ｉｉｉ）第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、（ｉｖ）リンカー、（ｖ）第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列、（ｖｉ）第２のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉｉ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、５’から３’の方向に、（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、（ｉｉｉ）プロモーター、（ｉｖ）第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列、（ｖ）リンカー、（ｖｉ）第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列、（ｖｉｉ）第３のポリアデニル化シグナル、および（ｖｉｉｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、ここで、導入遺伝子は、プロモーターに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態では、第２のポリアデニル化シグナルは、第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。ある特定の実施形態では、第４のポリアデニル化シグナルは、第３のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある。
【０１５１】
ある特定の実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする。ある特定の実施形態では、リンカーは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型２Ａペプチドをコードする。ＩＲＥＳは、たとえば、脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ、口蹄疫ウイルスＩＲＥＳ、およびポリオウイルスＩＲＥＳからなる群から選択され得る。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入またはＬ５−Ｅ４挿入部位に挿入され、ここで、組換えアデノウイルスは、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入された第３のヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、１つまたは複数の導入遺伝子を含む。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、ヌクレオチド配列、第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列のうちの１つまたは複数は、
ａ）転写開始領域、
ｂ）導入遺伝子を含むヌクレオチド配列であって、導入遺伝子が、転写開始領域の転写制御下にある、ヌクレオチド配列、および
ｃ）転写終止領域を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、転写開始領域は、プロモーターを含む。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体のタンパク質、またはその一部をコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、治療活性を有するＲＮＡをコードする。ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、少なくとも１つの結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、免疫調節性分子をコードする。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、共刺激リガンド、サイトカイン、またはサイトカイン受容体である。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０トラップ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３Ａ／ｐ１９、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βトラップ、ＩＬ−１０トラップ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦトラップ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦ、ＩＣＡＭ、ポドカリキシン、これらの機能性断片、ならびにこれらの誘導体からなる群から選択される。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、Ｎ末端からＣ末端の方向に、サイトカイン受容体の細胞外ドメインの可溶性部分、アミノ酸リンカー、免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ領域、および免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｆｃドメインを含む、融合タンパク質をコードする。一部の実施形態では、サイトカイン受容体は、ＴＧＦβ  ＩＩ型（ＴβＲＩＩ）受容体である。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、ＣＤ８０またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、ＣＤ１３７Ｌまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入される。ある特定の実施形態では、ＣＤ１３７Ｌまたはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入され、ＣＤ８０またはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列は、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入される。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５もしくはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０もしくはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列、およびＩＦＮ−αもしくはその機能性断片をコードするヌクレオチド配列を含む。これらのヌクレオチド配列は、ＩＸ−Ｅ２挿入部位、Ｌ５−Ｅ４挿入部位、Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、および／またはＥ４挿入部位に挿入され得る。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および／または第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、抗原結合性分子をコードする。ある特定の実施形態では、抗原結合性分子は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこれらの機能性断片である。例示的な抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ならびにアテゾリズマブ（以前のＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＭＥＤＩ４７３６、アベルマブ、およびＰＤＲ００１が挙げられる。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、抗原または抗原に対するリガンドをコードする。ある特定の実施形態では、抗原は、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、Ｆｌｔ３Ｉ、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、４−１ＢＢ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＫＲＡＳ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、ＥｐｈＡ３、カルシウム活性化クロライドチャネル−２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、ＳＡＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、未成熟ラミニン受容体、葉酸受容体−ａ、テロメラーゼ、チロシナーゼ、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒ−ａ２、ｘ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／−２、ＴＲＰ−１／−２、Ｐポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ＢＲＡＦ、アンドロゲン受容体、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｔ細胞受容体、腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、毒素をコードする。ある特定の実施形態では、毒素は、シュードモナス外毒素、リシン毒素、またはジフテリア毒素である。
【０１６３】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、酵素をコードする。ある特定の実施形態では、酵素は、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、エステラーゼ、メタロプロテイナーゼ、リラキシン、コラゲナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルギナーゼ、ＮＯＳ−２、これらの断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、細胞周期制御因子、増殖因子、抗凝血剤、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝子、抗血小板剤、凝固因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、これらの断片、またはこれらの誘導体をコードする。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子、第１の導入遺伝子、および第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数は、アンジオスタチン、エンドスタチン、アセチルコリン、ＤＫＫ１／Ｗｎｔ、Ｏｘ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、分泌フラジェリン、チミジンキナーゼ、これらの機能性断片、またはこれらの誘導体をコードする。
【０１６６】
ＩＩ．処置の方法
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかに曝露して、腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法を提供する。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかを投与して、腫瘍成長を阻害することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、腫瘍は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、組換えアデノウイルスは、機能性Ｐｅａ３結合部位の１つ以下の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む。一部の実施形態では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍は、乳がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵臓がん、または非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）からのものである。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、腫瘍は、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される。
【０１６９】
本明細書に開示される組換えアデノウイルスは、様々な医療適応症、たとえば、がんを処置するために使用することができる。本明細書において使用されるとき、「処置する」、「処置すること」、および「処置」とは、対象、たとえば、ヒトにおける疾患の処置を意味する。これには、（ａ）疾患を阻害すること、すなわち、その発達を停止させること、および（ｂ）疾患を軽減すること、すなわち、疾患状態の退縮を引き起こすことが含まれる。本明細書において使用されるとき、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載される方法および組成物によって処置される生物を指す。そのような生物には、好ましくは、哺乳動物（たとえば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれるがこれらに限定されず、より好ましくは、ヒトが含まれる。
【０１７０】
一態様では、本発明は、対象における過剰増殖性疾患を処置する方法を提供する。本方法は、対象に、有効量の、本明細書に記載される組換えウイルスを投与することであって、対象における過剰増殖性疾患を処置することを含む。ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患は、がん、アテローム性動脈硬化症、リウマチ性関節炎、乾癬、ループス、特発性肺線維症、強皮症、および肝硬変からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、過剰増殖性疾患は、がんである。
【０１７１】
一部の実施形態では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法を提供する。本方法は、対象に、有効量の、本明細書に記載される組換えアデノウイルスを投与することであって、対象におけるがん疾患を処置することを含む。
【０１７２】
がんの例としては、固形腫瘍、軟組織腫瘍、造血腫瘍、および転移病変が挙げられる。造血腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、もしくはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、たとえば、変質（transformed）ＣＬＬ、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、有毛細胞性白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、またはリヒター症候群（リヒター変質（Richter's  Transformation））が挙げられる。固形腫瘍の例としては、様々な器官系の悪性腫瘍、たとえば、肉腫、腺癌、および癌腫、たとえば、頭頸部（咽頭を含む）、甲状腺、肺（小細胞もしくは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、乳房、リンパ系、消化管（たとえば、口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、肛門管）、生殖器および泌尿生殖管（たとえば、腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣）、ＣＮＳ（たとえば、神経細胞もしくはグリア細胞、たとえば、神経芽細胞腫もしくは神経膠腫）、または皮膚（たとえば、黒色腫）に罹患するものが挙げられる。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、がんは、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部がん、乳がん、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん、腎細胞癌、前立腺がん、胃食道がん、結腸直腸がん、精巣がん、膀胱がん、卵巣がん、肝細胞癌、胆管癌、脳がん、子宮内膜がん、神経内分泌がん、および膵臓がんから選択される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、がんは、鼻咽頭がん、基底細胞癌、滑膜がん、肝細胞がん、腎臓がん、結合組織のがん、黒色腫、肺がん、腸がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、脳がん、咽喉がん、口腔がん、肝臓がん、骨がん、膵臓がん、絨毛腫、ガストリノーマ、神経内分泌、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、Ｔ細胞性白血病／リンパ腫、神経腫、フォンヒッペル・リンダウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、尿管がん、脳がん、乏突起神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨がん、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、原発部位不明のがん、カルチノイド、消化管のカルチノイド、線維肉腫、乳がん、ページェット病、子宮頸がん、結腸直腸がん、直腸がん、食道がん、胆嚢がん、頭部がん、眼がん、頸部がん、腎臓がん、ウィルムス腫瘍、肝臓がん、カポジ肉腫、前立腺がん、肺がん、精巣がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔がん、皮膚がん、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣がん、膵臓内分泌がん、グルカゴノーマ、膵臓がん、副甲状腺がん、陰茎がん、下垂体がん、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸がん、胃がん、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛がん、胞状奇胎、子宮がん、子宮内膜がん、膣がん、外陰がん、聴神経腫、菌状息肉腫、膵島細胞腺腫、カルチノイド症候群、ソマトスタチン産生腫瘍、歯肉がん、心臓がん、口唇がん、髄膜がん、口腔がん（mouth  cancer）、神経がん、口蓋がん、耳下腺がん、腹膜がん、咽頭がん、胸膜がん、唾液腺がん、舌がん、および、扁桃がんから選択される。
【０１７５】
一部の態様では、本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかに曝露することを含む、方法を提供する。
【０１７６】
別の態様では、本発明は、腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、腫瘍は、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される。
【０１７７】
別の態様では、本発明は、疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、対象に、有効量の、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかを投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態では、疾患または状態は、感染、糖尿病性網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎、子宮内膜症、黄斑変性障害および良性成長障害、たとえば、前立腺肥大および脂肪腫、血管障害、心臓血管疾患、感染、肝臓の硬変症、結合組織障害、腫瘍、血管病変、潰瘍性病変、炎症、血栓症、および新内膜形成からなる群から選択される。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物である。ある特定の実施形態では、対象は、ヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、小児のヒトである。ある特定の実施形態では、対象は、成人のヒトである。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、筋肉内、静脈内、動脈内、または腫瘍内注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、皮内、吸入、経皮、局所、点眼、鼻内、経粘膜、および直腸投与によって投与される。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、前述の組換えアデノウイルスは、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、およびウイルス療法からなる群から選択される１つまたは複数の治療法と組み合わせて、対象に投与される。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、チロシンキナーゼ阻害剤、たとえば、エルロチニブと組み合わせて投与される。
【０１８２】
ある特定の実施形態では、本発明の組換えアデノウイルスは、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて投与される。ある特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される１つまたは複数の分子の阻害剤、アンタゴニスト、またはアゴニストである。一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、および／またはＣＴＬＡ４に対する抗体である。例示的な抗ＰＤ−１抗体としては、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏ．）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．）、ならびにアテゾリズマブ（以前のＭＰＤＬ３２８０Ａ）、ＭＥＤＩ４７３６、アベルマブ、およびＰＤＲ００１が挙げられる。
【０１８３】
医薬製剤は、好ましくは、滅菌される。滅菌は、任意の好適な方法、たとえば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって、達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。
【０１８４】
「有効量」という用語は、本明細書において使用されるとき、有益または所望される結果を達成するのに十分な活性成分の量（たとえば、本発明の組換えウイルスの量）を指す。有効量は、１つまたは複数の投与、適用、または投薬量で、投与され、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図するものではない。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、活性成分の治療有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。ある特定の実施形態では、組換えウイルスの治療有効量は、１０２〜１０１５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、たとえば、１０２〜１０１０、１０２〜１０５、１０５〜１０１５、１０５〜１０１０、または１０１０〜１０１５プラーク形成単位の範囲である。投与される量は、処置される疾患または適応症の種類および程度、患者の全般的な健康状態、抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ効力、医薬製剤、ならびに投与の経路といった変数に依存するであろう。初期投薬量は、所望される血液レベルまたは組織レベルを急速に達成するために、上位レベルを上回って増加させてもよい。あるいは、初期投薬量は、最適値よりも少なくてもよく、１日投薬量を、処置過程の間に徐々に増加させてもよい。ヒト投薬量は、たとえば、０．５ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇで実行するように設計される従来的なフェーズＩの用量漸増研究において、最適化することができる。投薬頻度は、投与の経路、投薬量、ウイルスの血清半減期、および処置されている疾患などの要因に応じて、変動し得る。例示的な投薬頻度は、１日に１回、１週間に１回、および２週間に１回である。１つの投与経路は、非経口、たとえば、静脈内注入である。ウイルスに基づく薬物の製剤化は、当業者の技能の範囲内である。ある特定の実施形態では、組換えウイルスは、凍結乾燥された後、投与の時点で、緩衝食塩水中で再構成される。
【０１８６】
「組み合わせて」投与されるという用語は、本明細書において使用されるとき、対象が障害に罹患している過程で、２つ（またはそれを上回る）異なる処置が対象に送達され、その結果、患者に対する処置の効果が、ある時点でオーバーラップすることを意味すると理解される。ある特定の実施形態では、１つの処置の送達は、第２の送達が開始するときに依然として生じており、そのため、投与という点で、オーバーラップが存在する。これは、本明細書において、「同時」または「並行送達」と称されることがある。他の実施形態では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達が開始する前に終了する。いずれの事例でも一部の実施形態では、処置は、投与を組み合わせたため、より有効である。たとえば、第２の処置がより有効である、たとえば、第２の処置を第１の処置なしで投与した場合に見出されるであろうものよりも、より少ない第２の処置で同等の効果が見出されるか、または第２の処置は症状を低減させる程度がより大きいか、あるいは類似の状況が、第１の処置で見出される。ある特定の実施形態では、送達は、症状、または障害に関連する他のパラメーターにおける低減が、一方の処置を他方が存在しない状態で送達した場合に観察されるであろうものよりも大きくなるようなものである。２種類の処置の効果は、部分的に相加性、全体的に相加性、または相加性を上回るものであってもよい。送達は、送達される第１の処置の効果が、第２のものが送達されたときに依然として検出可能となるようなものであり得る。
【０１８７】
ＩＩＩ．医薬組成物／製剤
本開示はまた、前述の組換えアデノウイルスのうちのいずれかと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物を提供する。本明細書において使用されるとき、「薬学的に許容される担体」は、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに好適であり、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは併発症を有さず、妥当な利益／危険性比に釣り合う、緩衝剤、担体、および賦形剤を意味する。担体は、製剤中の他の成分と適合性があり、レシピエントにとって有害でないという意味で、「許容される」必要がある。薬学的に許容される担体としては、医薬の投与に適合性がある、緩衝剤、溶媒、分散媒、コーティング剤、等張剤、および吸収遅延剤などが挙げられる。
【０１８８】
本明細書に開示される組換えアデノウイルスを含む医薬組成物および製剤は、その意図される投与経路との適合性を有するように製剤化され得る。投与経路の例は、筋肉内、静脈内、動脈内、または腫瘍内、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜、および直腸投与である。
【０１８９】
一態様では、本開示は、組換えアデノウイルスの安定化および保管のためのアデノウイルス製剤を提供する。一部の実施形態では、本発明は、アデノウイルスの製剤であって、
ｅ）前述の組換えアデノウイルスのいずれかのうちの１つまたは複数と、
ｆ）少なくとも１つの緩衝剤と、
ｇ）少なくとも１つの張度改変剤と、
ｈ）少なくとも１つの糖もしくは少なくとも１つの安定剤、またはその両方と、を含み、
約７．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する、製剤を提供する。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、安定剤は、グリセロールである。ある特定の実施形態では、安定剤は、約２％〜約５％（体積／体積）である。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、緩衝剤は、Ｔｒｉｓ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび／もしくはモノ−Ｔｒｉｓを含む）、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ブルシン四水和物、ＥＰＰＳ、トリシン、またはヒスチジンである。ある特定の実施形態では、緩衝剤は、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である。
【０１９２】
一部の実施形態では、張度改変剤は、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＮａＣｌ、またはＫＣｌである。一実施形態では、張度改変剤は、ＮａＣｌである。一実施形態では、張度改変剤は、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である。一実施形態では、張度改変剤は、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度である。一実施形態では、張度改変剤は、約２５ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度である。一実施形態では、張度改変剤は、約２５ｍＭの濃度である。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、本製剤は、第１の張度改変剤および第２の張度改変剤を含み、ここで、第１の張度改変剤は、一価カチオンであり、第２の張度改変剤は、二価カチオンである。ある特定の実施形態では、一価カチオンは、ＮａＣｌまたはＫＣｌである。ある特定の実施形態では、二価カチオンは、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣａＣｌ２、またはＺｎＣｌ２である。ある特定の実施形態では、張度改変剤または二価カチオンは、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である。
【０１９４】
一部の実施形態では、糖は、スクロースまたはトレハロースである。一実施形態では、糖は、スクロースである。一実施形態では、糖は、体積に対する重量の百分率で約２％〜約８％である。一実施形態では、糖は、体積に対する重量の百分率で約３％〜約５％である。一実施形態では、糖は、体積に対する重量の百分率で約５％である。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０である。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．００１％〜約１％の濃度である。一実施形態では、非イオン性界面活性剤は、約０．０２％の濃度である。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つのフリーラジカル酸化阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、フリーラジカル酸化阻害剤は、ＥＤＴＡである。一実施形態では、フリーラジカル酸化阻害剤は、約０．０１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である。一実施形態では、フリーラジカル酸化阻害剤は、約０．０５ｍＭ〜約２ｍＭの濃度である。一実施形態では、フリーラジカル酸化阻害剤は、約０．１ｍＭの濃度である。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つの凍結保護剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、凍結保護剤は、ＥｔＯＨである。一部の実施形態では、凍結保護剤は、約０．０１％〜５％の濃度である。一部の実施形態では、凍結保護剤は、約０．１％〜２％の濃度である。一実施形態では、凍結保護剤は、約０．５％の濃度である。
【０１９８】
一部の実施形態では、製剤は、約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約３００ｍＯｓ／Ｌ〜約６００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する。一部の実施形態では、製剤は、約４００ｍＯｓ／Ｌ〜約５００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかに含まれる組換え腫瘍溶解性アデノウイルスは、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの濃度である。
【０２００】
ある特定の実施形態では、製剤は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約２．５％のグリセロールを含み、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、製剤は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約３〜５％のスクロースを含み、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、製剤は、約１０ｍＭのＴｒｉｓ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約５％のスクロース、約０．０２％のポリソルベート−８０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、約０．５％のＥｔＯＨを含み、約８．０のｐＨを有する。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つのイムノアジュバントをさらに含む。ある特定の実施形態では、イムノアジュバントは、１）ミョウバン、２）サポニン、３）非イオン性ポリマー界面活性剤、４）モノホスホリルリピドＡ、５）ムラミルジペプチド、および６）サイトカインから選択される。
【０２０２】
ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つの色素をさらに含む。ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、少なくとも１つの可逆的プロテアーゼ阻害剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、可逆的プロテアーゼ阻害剤は、Ｌ３／ｐ２３システインプロテアーゼの阻害剤である。ある特定の実施形態では、前述の製剤のうちのいずれかは、抗酸化剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、または葉酸塩である。
【０２０３】
「のうちの少なくとも１つ」という表現は、この表現の前に列挙された対象物のそれぞれを独立して含み、文脈および使用により別途理解されない限り、列挙された対象物のうちの２つまたはそれを上回るものの様々な組合せを含むことを、理解されたい。３つまたはそれを上回る列挙される対象物と併用される「および／または」という表現は、文脈により別途理解されない限り、同じ意味を有することを理解されたい。
【０２０４】
「含む（include）」、「含む（includes）」、「含むこと（including）」「有する（have）」、「有する（has）」、「有すること（having）」、「含む（contain）」、「含む（contains）」、または「含むこと（containing）」という用語の使用は、これらの文法上の同等物を含め、概して、拡張可能かつ非限定的であるとして、たとえば、文脈により別途具体的に言及または理解されない限り、列挙されていない追加の要素またはステップを排除しないとして、理解されるべきである。
【０２０５】
「約」という用語が、定量値の前に使用されている場合、本発明は、別途具体的に示されない限り、その具体的な定量値自体も含む。本明細書において使用されるとき、「約」という用語は、別途指示または推定されない限り、公称値から±１０％の変動を指す。
【０２０６】
ステップの順序またはある特定の動作を行う順序は、本発明が実行可能である限り、重要ではないことが理解される。さらに、２つまたはそれを上回るステップまたは動作は、同時に行われてもよい。
【０２０７】
本明細書におけるあらゆる例または例示的な語法、例として、「たとえば」または「を含む」の使用は、単に、本発明をより良好に例示することを意図するものであり、特許請求されていない限り、本発明の範囲に対して制限を課すものではない。本明細書におけるいずれの語法も、任意の特許請求されていない要素を本発明の実施に必須であると示すものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０８】
以下の作業例は、例示であり、制限することを意図するものではなく、当業者であれば他の実施形態を利用することができることを容易に理解するであろう。
【０２０９】
（実施例１）
【０２１０】
例示的なＩＸ−Ｅ２挿入部位（ＮＣＢＩ参照配列ＡＣ＿０００００８．１（配列番号１）による番号付けでヌクレオチド４０２９〜４０９３）のヌクレオチド配列は、以下の通りである。アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドン（左側の「ＴＡＡ」、配列番号８）およびアデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドン（右側の「ＴＴＡ」、配列番号９）を、下線で示す。
【化１】
2020521471.tif 000003
【０２１１】
（実施例２）
【０２１２】
例示的なＬ５−Ｅ４挿入部位（ＮＣＢＩ参照配列ＡＣ＿０００００８．１（配列番号１）による番号付けでヌクレオチド３２７８５〜３２９１６）のヌクレオチド配列は、以下の通りである。アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドン（左側の「ＴＡＡ」、配列番号８）およびアデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６／７の終止コドン（右側の「ＴＣＡ」、配列番号１０）を、下線で示す。
【化２】
2020521471.tif 000004
【０２１３】
（実施例３）
【０２１４】
発現カセットにクローニングされた導入遺伝子をＬ５−Ｅ４部位に有するウイルスを生成するために、アデノウイルスヌクレオチド配列（Ｅ３領域におけるＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７ｋ遺伝子、ならびにＥ４領域におけるＯＲＦ１〜ＯＲＦ４遺伝子の欠失を含む）を有するプラスミドを、ＳＶ４０プロモーターおよびターミネーターとともに介在ＳｗａＩ制限部位（「ＡＴＴＴＡＡＡＴ」、配列番号１１）を有する発現カセットをＬ５−Ｅ４部位に挿入することによって改変した。この改変形態のヌクレオチド配列の、Ｌ５転写ユニットのポリアデニル化シグナル（「ＡＡＴＡＡＡ」、配列番号１２）から、Ｅ４転写ユニットのポリアデニル化シグナル（「ＴＴＴＡＴＴ」、配列番号１３）までは、以下の通りである。
【化３】
2020521471.tif 000005
【０２１５】
配列番号１４において、Ｌ５およびＥ４転写ユニットのポリアデニル化シグナル、ならびにＳｗａＩ制限部位のヌクレオチドを、下線で示す。
【０２１６】
マウスＧＭＣＳＦをコードする導入遺伝子を、次いで、ＳｗａＩ部位にクローニングして、以下の配列を生成した。
【化４】
2020521471.tif 000006
【０２１７】
配列番号１５において、Ｌ５およびＥ４転写ユニットのポリアデニル化シグナル、ならびにＳｗａＩ制限部位の残りのヌクレオチドを下線で示し、マウスＧＭＣＳＦをコードする導入遺伝子を、太字で示す。
【０２１８】
以下の改変（アデノウイルス５型のｄｌ３０９株と比較して）を保持するウイルスＴＡＶ−（Ｌ５−Ｅ４）ｍＧＭＣＳＦを生成した：がん性細胞における選択的な複製を付与するためのＥ１ＡプロモーターにおけるＴＡＶ−２５５欠失、ウイルスＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子までは及ばないウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子の５’末端の欠失、Ｅ３  ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７ｋ遺伝子の欠失、配列番号１５の配列、ならびにＥ４  ＯＲＦ１−ＯＲＦ４遺伝子の欠失。
【０２１９】
ｍＧＭＣＳＦ発現を試験するために、Ａ５４９細胞（ヒトがん細胞株）、ＡＤＳ−１２細胞（マウスがん細胞株）、およびＷＩ３８細胞（ヒト正常細胞株）に、５のＭＯＩ（感染多重度）で、ＴＡＶ−（Ｌ５−Ｅ４）ｍＧＭＣＳＦを感染させた。対照として、追加の細胞は、感染なしで培養したか、またはアデノウイルス５型のｄｌ３０９株と比較して以下の改変を保持するウイルスＴＡＶ−（Ｅ１Ｂ−１９Ｋ）ｍＧＭＣＳＦを感染させた：Ｅ１ＡプロモーターにおけるＴＡＶ−２５５欠失、およびＥ１Ｂ−５５Ｋ遺伝子を破壊することなく、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子の５’末端を置き換えるｍＧＭＣＳＦ遺伝子。感染の４日後に、馴化培地を、ＥＬＩＳＡで使用して、マウスＧＭＣＳＦ発現を測定した。結果を、図２に示すが、いずれのウイルスも、Ａ５４９細胞では高いレベルの発現、ＡＤＳ−１２では中等度のレベルの発現、およびＷＩ３８細胞では低いレベルの発現をもたらした。
【０２２０】
（実施例４）
【０２２１】
ＩＸ−Ｅ２部位における発現カセット挿入を調査するために、まず、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶプロモーター）およびウシ成長ホルモンの転写ターミネーター（ＢＧＨターミネーター）を有し、導入遺伝子の挿入を促進するためにプロモーターとターミネーターとの間にＮｏｔＩ制限部位（「ＧＣＧＧＣＣＧＣ」、配列番号１６）を含む、発現カセットを挿入した。ＩＸのポリアデニル化シグナル（「ＡＡＴＡＡＡ」、配列番号１２）からＥ２転写ユニットのポリアデニル化シグナル（「ＴＴＴＡＴＴ」、配列番号１３）までのヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【化５】
2020521471.tif 000007
【化６】
2020521471.tif 000008
【０２２２】
ＩＸおよびＥ２転写産物のポリアデニル化シグナル、ならびにＮｏｔＩ制限部位を、下線で示す。
【０２２３】
ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−エンプティは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、ＩＸ−Ｅ２部位に野生型ウイルス配列を保持し、配列番号１４の配列（Ｌ５−Ｅ４部位における空の発現カセット）を保持していた。ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−ＩＬ７は、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、ＩＸ−Ｅ２部位に野生型ウイルス配列を保持し、配列番号１４のＬ５−Ｅ４カセットにクローニングされた配列番号１８の配列を保持していた（以下を参照されたく、マウスＩＬ−７遺伝子を大文字で示し、下線で示されているＳｗａＩ制限部位からの残りのヌクレオチドを含むＬ５−Ｅ４発現カセットからの隣接するヌクレオチドを小文字で表す）。
【化７】
2020521471.tif 000009
【０２２４】
ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−ＧＭＣＳＦは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、ＩＸ−Ｅ２部位に野生型ウイルス配列を保持し、配列番号１４のＬ５−Ｅ４カセットにクローニングされた配列番号１９の配列を保持していた（マウスＧＭＣＳＦ遺伝子を大文字で示し、下線で示されているＳｗａＩ制限部位からの残りのヌクレオチドを含むＬ５−Ｅ４発現カセットからの隣接するヌクレオチドを小文字で表す）。このウイルスは、配列番号１５に示されるウイルスＴＡＶ−（Ｌ５−Ｅ４）ｍＧＭＣＳＦに使用されているコドン最適化形態のマウスＧＭＣＳＦではなく、野生型マウスＧＭＣＳＦを保持している。
【化８】
2020521471.tif 000010
【化９】
2020521471.tif 000011
【０２２５】
ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＧＭＣＳＦ  Ｌ５−ＩＬ７は、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、配列番号１７のＩＸ−Ｅ２カセットにクローニングされた配列番号２０の配列（マウスＧＭＣＳＦ遺伝子を大文字で示し、下線で示されるＮｏｔＩ制限部位からの残りのヌクレオチドを含むＩＸ−Ｅ２発現カセットの隣接するヌクレオチドを小文字で表す）を保持し、配列番号１８および配列番号１４に示されるＬ５−Ｅ４カセットにクローニングされたマウスＩＬ−７を保持していた。マウスＧＭＣＳＦの配列は、ウイルスＴＡＶ  ＩＸ−ＷＴ  Ｌ５−ＧＭＣＳＦおよびＴＡＶ  ＩＸ−ＧＭＣＳＦ  Ｌ５−ＩＬ７で同一であるが、一方のウイルスではＩＸ−Ｅ２発現カセットに挿入され、他方のウイルスにおいてはＬ５−Ｅ４発現カセットに挿入されていた。
【化１０】
2020521471.tif 000012
【０２２６】
これらのウイルスによる導入遺伝子の発現を試験するために、Ａ５４９細胞に、５のＭＯＩでウイルスを感染させ、４日後に、馴化培地を採取し、馴化培地を、ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦのＥＬＩＳＡに使用した。ＧＭＣＳＦについてのＥＬＩＳＡにより、図３に示されるように、ＣＭＶプロモーターによって作動されるＩＸ−Ｅ２部位におけるカセットから、ＳＶ４０プロモーターによって作動されるＬ５−Ｅ４部位のカセットからのものよりも実質的に高い発現が示された。
【０２２７】
（実施例５）
【０２２８】
初期ＩＸ−Ｅ２設計のウイルス（図４）において、本発明者らは、ＣＭＶプロモーターが意図していたものとは逆の方向に転写を作動させる可能性があればそれを遮断することによって、ウイルスの成長をさらに最適化することができるのではないかと考えた（Seilaら、Science.、（２００８年）、３２２巻（５９０９号）：１８４９〜５１頁）。本発明者らは、したがって、この部位のインサートを、インサートの５’末端および３’末端の両方が、通常のウイルス遺伝子からインサートへおよびインサートから通常のウイルス遺伝子への両方に転写産物のポリアデニル化を進めるように指向されたポリアデニル化シグナルを含むように、修正した。図４の修正されたＩＸ−Ｅ２設計を参照されたい。
【０２２９】
修正されたインサートのヌクレオチド配列は、ＩＸ転写産物のポリアデニル化シグナルから、Ｅ２転写産物のポリアデニル化シグナルまで、以下の通りである。
【化１１】
2020521471.tif 000013
【０２３０】
フォワードポリアデニル化シグナル（「ＡＡＴＡＡＡ」、配列番号１２）およびリバースポリアデニル化シグナル（「ＴＴＴＡＴＴ」、配列番号１３）のそれぞれ、ならびにＮｏｔＩ部位（「ＧＣＧＧＣＣＧＣ」、配列番号１６）を、下線で示す。修正されたＩＸ−Ｅ２設計を有する発現カセットを保持するウイルスは、初期ＩＸ−Ｅ２設計を有するウイルスよりも、効率的に成長した。
【０２３１】
（実施例６）
【０２３２】
ウイルスＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−エンプティは、ウイルスＥ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、配列番号２１（修正されたＩＸ−Ｅ２設計の空の発現カセット）を保持し、配列番号１４（Ｌ５−Ｅ４部位における空の発現カセット）を保持していた。ウイルスＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２は、ウイルスＥ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、修正されたＩＸ−Ｅ２発現カセットにヒトＩＬ１２Ａ鎖をコードする遺伝子（配列番号２２に示される）を保持し、Ｌ５−Ｅ４発現カセットにヒトＩＬ１２Ｂ鎖をコードする遺伝子（配列番号２３に示される）を保持していた。配列番号２２において、フォワードポリアデニル化シグナル（「ＡＡＴＡＡＡ」、配列番号１２）およびリバースポリアデニル化シグナル（「ＴＴＴＡＴＴ」、配列番号１３）のそれぞれ、ならびにＮｏｔＩ部位からの残りのヌクレオチドを、下線で示し、ヒトＩＬ１２Ａ鎖をコードする遺伝子を、太字で示す。配列番号２３において、Ｌ５およびＥ４転写ユニットのポリアデニル化シグナル、ならびにＳｗａＩ制限部位の残りのヌクレオチドを、下線で示し、ヒトＩＬ１２Ｂ鎖をコードする遺伝子を、太字で示す。
【化１２】
2020521471.tif 000014
【化１３】
2020521471.tif 000015
【０２３３】
ウイルスＷＴ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２を、ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２と同一のゲノム構造で作製したが、ただし、このウイルスは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持するのではなく、野生型Ｅ１Ａプロモーターを保持していることを除く。これらのウイルスのそれぞれはまた、Ｅ３  ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７ｋ遺伝子の欠失、ならびにＥ４  ＯＲＦ１−ＯＲＦ４遺伝子の欠失を有する。
【０２３４】
この設計アプローチを、ＩＬ１２を腫瘍溶解性アデノウイルスに組み込む別の戦略と比較するために、本発明者らは、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ部位に保持される、フューリン切断部位（アミノ酸ＲＡＫＲ、配列番号２４）によって連結されたヒトＩＬ１２Ａ鎖およびＩＬ１２Ｂ鎖をコードする遺伝子を保持するアデノウイルスを試験した。融合タンパク質が細胞によって合成されると、フューリン部位は、ゴルジ内の酵素フューリンによって、ＲＡＫＲ配列の最後のＲと、次のアミノ酸（成熟ＩＬ１２Ａの最初のアミノ酸）との間で切断される。本発明者らは、フューリン切断部位をリンカーとして使用することにより、ヘテロ二量体ＩＬ１２タンパク質の高レベルな発現がもたらされることをこれまでに見出していた。その融合遺伝子（大文字で示す）、クローニングに使用される隣接するＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限部位（下線で示す）、ならびにそれがアデノウイルスゲノムに挿入された部位を示すアデノウイルスヌクレオチド（小文字）の核酸配列は、以下である。
【化１４】
2020521471.tif 000016
【０２３５】
ウイルスＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリンは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ領域に配列番号２５を保持する。対照ウイルスＴＡＶ−Δ１９ｋは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ領域の欠失を保持する。
【０２３６】
腫瘍溶解活性およびＩＬ１２発現を試験するために、Ａ５４９細胞に、ＴＡＶ−Δ１９ｋ、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリン、ＴＡＶ−ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−エンプティ、およびＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２を、５のＭＯＩで３連に感染させた。感染の４日後に、馴化培地を採取し、ＩＬ１２を、アセンブリーされたＩＬ１２Ａ−ＩＬ１２Ｂヘテロ二量体のみを検出するＥＬＩＳＡで測定し、残りの細胞を、クリスタルバイオレットで染色した。図５において示されるように、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリンは、対応する対照ウイルスＴＡＶ−Δ１９ｋよりもわずかに溶解性が低かったが、これは、導入遺伝子をＥ１Ｂ−１９Ｋ領域に挿入した場合の本発明者らの一般的な経験と整合性があり、一方で、ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２は、ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−エンプティおよびＴＡＶ−Δ１９ｋと同程度に溶解性であった。これは、ＩＸ−Ｅ２領域およびＬ５−Ｅ４領域への発現カセットの挿入が、ウイルスの適合性に対して最小限の影響しか有さず、この点に関して、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ領域への導入遺伝子の挿入に勝り得ることを示す。
【０２３７】
図６に示されるように、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリンは、ＩＸ−Ｅ２およびＬ５−Ｅ４カセットを使用したウイルスよりも高いレベルのＩＬ１２を発現した。これは、２つの発現カセットのうちの少なくとも一方が、最適以下であり得ることを示唆し、この設計の改善に関するさらなる調査が促された。しかしながら、ＴＡＶ−ｈＩＬ１２−フューリンから生成されたＩＬ１２タンパク質は、ＩＬ１２Ｂ鎖のＣ末端に非天然のＲＡＫＲ配列（残るフューリン認識部位）を含み、これは、導入遺伝子または天然のＩＬ１２に対する免疫原性などの望ましくないｉｎ  ｖｉｖｏ作用をもたらす可能性があるが、ＴＡＶ−ＩＸｒＬ５−ｈＩＬ１２によって生成されたＩＬ１２は、完全に天然であるという利点を有する。
【０２３８】
（実施例７）
【０２３９】
Ｌ５−Ｅ４カセットからは、ＩＸ−Ｅ２カセットと比較して相対的に低い発現が観察されたことに基づいて、本発明者らは、Ｌ５−Ｅ４カセットが、ＩＬ−１２ヘテロ二量体の低い発現の原因であるという仮説を立てた。本発明者らは、ＩＸ−Ｅ２領域に使用したアプローチと同様に、Ｌ５−Ｅ４領域を、両方の末端に二方向ポリアデニル化シグナルを含むように修正した。
【０２４０】
配列番号２６のヌクレオチド配列を、Ｌ５−Ｅ４領域にクローニングし、５’末端および３’末端におけるＬ５およびＥ４転写産物のポリアデニル化シグナル、ならびにすべてのポリアデニル化シグナル、ならびにＳｗａＩ制限部位を下線で示す。
【化１５】
2020521471.tif 000017
【化１６】
2020521471.tif 000018
【０２４１】
Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を有し、配列番号２１に示されるＩＸ−Ｅ２領域に導入遺伝子を有さない修正ＩＸ−Ｅ２カセットを有し、配列番号２６に示されるＬ５−Ｅ４領域に導入遺伝子を有さない修正Ｌ５−Ｅ４カセットを有する、ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）エンプティ−（Ｌ５ｒ）エンプティを、作製した。
【０２４２】
ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７−（Ｌ５ｒ）ｍＧＭＣＳＦは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、配列番号２０に示されるようなＮｏｔＩ部位にクローニングされたマウスＧＭＣＳＦ遺伝子を有する配列番号２１に示される修正されたＩＸ−Ｅ２カセットを含み、配列番号１８に示されるようなＳｗａＩ部位にクローニングされたマウスＩＬ−７遺伝子を有する配列番号２６に示される修正されたＬ５−Ｅ４カセットを含んでいた。
【０２４３】
ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＧＭＣＳＦ−（Ｌ５ｒ）ｍＩＬ７は、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、配列番号２７に示されるようなＮｏｔＩ部位にクローニングされたマウスＩＬ−７遺伝子を有する配列番号２１に示される修正されたＩＸ−Ｅ２カセットを含み、配列番号１９に示されるようなＳｗａＩ部位にクローニングされたマウスＧＭＣＳＦ遺伝子を有する配列番号２６に示される修正されたＬ５−Ｅ４カセットを含んでいた。したがって、ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＧＭＣＳＦ−（Ｌ５ｒ）ｍＩＬ７およびＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７−（Ｌ５ｒ）ｍＧＭＣＳＦは、ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦの遺伝子が、修正されたＩＸ−Ｅ２部位または修正されたＬ５−Ｅ４部位のどちらの部位に挿入されたかだけが異なる。
【化１７】
2020521471.tif 000019
【０２４４】
これらのウイルスによる導入遺伝子の発現を試験するために、Ａ５４９細胞に、それぞれのウイルスを、５のＭＯＩで３連に感染させた。４日後に、馴化培地を採取し、ＧＭＣＳＦおよびＩＬ−７を、ＥＬＩＳＡで測定した。ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦの両方について、修正されたＬ５−Ｅ４部位よりも、修正されたＩＸ−Ｅ２部位に遺伝子を保持するウイルスによる発現が、高かった。これにより、ＣＭＶプロモーターを使用したＩＸ−Ｅ２における発現カセットでは、ＳＶ４０プロモーターを使用したＬ５−Ｅ４におけるカセットよりも高いレベルで発現され、このことは、Ｌ５−Ｅ４部位を二方向ポリアデニル化シグナルを含むように修正することによって影響を受けないというこれまでの発見が確認された。
【０２４５】
（実施例８）
【０２４６】
本発明者らは、次に、Ｌ５−Ｅ４部位におけるプロモーターを改善することをさらに調査した。初期に使用していたＳＶ４０プロモーターは、主要転写開始部位に、Ｇ（野生型ＳＶ４０配列）からＴ（Ｌ５−Ｅ４インサート）への点突然変異を有していたため、配列番号２８に示されるように、そのヌクレオチドを野生型のＧに変更したＬ５−Ｅ４インサートを生成した。以前に突然変異させたヌクレオチド、ポリアデニル化シグナル、およびＳｗａＩ制限部位を下線で示す。異なるプロモーターを使用することについても調査し、ＳＶ４０プロモーターの代わりにヒトＥＦ１Ａプロモーターを使用したＬ５−Ｅ４インサートを生成した。配列番号２９は、ヒトＥＦ１Ａプロモーターを使用したＬ５−Ｅ４インサートを示し、Ｌ５転写産物からのポリアデニル化シグナルから、Ｅ４転写産物のポリアデニル化シグナルまでを、ポリアデニル化シグナルおよびＳｗａＩ制限部位に下線を付けて示す。
【化１８】
2020521471.tif 000020
【０２４７】
Ｌ５−Ｅ４におけるこれらの修正された発現カセットを試験するために、本発明者らは、ＩＸ−Ｅ２部位にマウスＩＬ−７遺伝子を保持し、新しいＬ５−Ｅ４部位にマウスＧＭＣＳＦ遺伝子を保持するウイルスを生成した。ＩＸ−Ｅ２部位に使用したマウスＩＬ−７遺伝子は、遺伝子の３’末端の付近の２つの領域に、発現の低減をもたらすように、ポリアデニル化シグナルとしてプロセシングされ得る配列ＡＡＴＡＡＡを用いてサイレント突然変異を導入し、コードされるタンパク質配列を変化させることはないが、内部ＡＡＴＡＡＡ配列を排除する同義配列で置換することによって、改変した。配列番号３０は、ヌクレオチド配列を示すが、ＩＬ−７コーディングヌクレオチドを大文字で示し、突然変異を下線で示し、ＩＸ−Ｅ２カセットの隣接するヌクレオチドを小文字で示し、ＮｏｔＩ部位の残りのヌクレオチドを下線で示す。Ｌ５−Ｅ４部位におけるマウスＧＭＣＳＦ遺伝子の発現を改善するよう試みるために、コンセンサスコザック配列（ヌクレオチドＧＣＣＡＣＣ）を、ＳｗａＩ部位の残りのヌクレオチドと、ＧＭＣＳＦ遺伝子の開始コドンとの間に含めた。配列番号３１は、ヌクレオチド配列を示すが、マウスＧＭＣＳＦ遺伝子およびコザック配列を大文字で示し、コザック配列を下線で示し、Ｌ５−Ｅ４カセットの隣接するヌクレオチドを小文字で示し、ＳｗａＩ部位の残りのヌクレオチドを下線で示す。
【化１９】
2020521471.tif 000021
【０２４８】
ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＳＶ４０ｗｔ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、配列番号３０に示されるようなＮｏｔＩ部位にクローニングされた可能性のある内部ポリアデニル化部位に同義突然変異を有するマウスＩＬ−７遺伝子を有する、配列番号２１に示される修正されたＩＸ−Ｅ２インサートを含み、配列番号３１に示されるようなＳｗａＩ部位にクローニングされたコンセンサスコザック配列を含むマウスＧＭＣＳＦ遺伝子を有する、配列番号２８に示される野生型ＳＶ４０プロモーターを有するＬ５−Ｅ４インサートを含んでいた。ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦは、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、配列番号３０に示されるようなＮｏｔＩ部位にクローニングされた可能性のある内部ポリアデニル化部位に同義突然変異を有する、マウスＩＬ−７遺伝子を有する配列番号２１に示される修正されたＩＸ−Ｅ２インサートを含み、配列番号３１に示されるようなＳｗａＩ部位にクローニングされたコンセンサスコザック配列を含むマウスＧＭＣＳＦ遺伝子を有する、配列番号２９に示されるヒトＥＦ１Ａプロモーターを有するＬ５−Ｅ４インサートを含んでいた。
【０２４９】
導入遺伝子発現についてこれらのウイルスを試験するために、Ａ５４９細胞に、２つのウイルスを５のＭＯＩで３連に感染させた。４日後に、馴化培地を採取し、ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦの発現を測定するためにＥＬＩＳＡで使用した。結果を、図７に示す。ヒトＥＦ１Ａプロモーターが、中等度に高い発現を有し、さらなる開発のために選択した。ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦを、ＳＦ−ＢＭＡｄＲ  ２８１細胞（Ａ５４９細胞に由来する）の無血清懸濁培養においてウイルスを増幅させ、細胞を溶解させ、クロマトグラフィーによってウイルスを精製し、２５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２．５％のグリセロールを含むｐＨ８の緩衝液中に透析することによって、マウス実験のための医薬剤として調製した。このようにして調製したウイルスは、５．８×１０１１ｖｐ／ｍｌのウイルス粒子濃度および３．０×１０１０ＩＵ／ｍｌの感染力価を有していた。
【０２５０】
（実施例９）
【０２５１】
本発明者らは、さらに、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）の欠失により、導入遺伝子の発現を改善することができるかどうかを調査した。ＡＤＰは、ウイルス複製の後期に発現され、宿主細胞を溶解して、子孫ビリオンを放出するため、その除去により、細胞が殺滅される前に、より長く生存し、導入遺伝子を発現することが可能となり得る。ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦウイルスにおいて使用されるＥ３  ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７Ｋ欠失の状況のＡＤＰ遺伝子のヌクレオチド配列を、配列番号３２に示すが、ＡＤＰをコードするヌクレオチドを大文字で示し、Ｅ３  ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７Ｋ欠失の部位をハイフンで示し、隣接するアデノウイルスヌクレオチドを小文字で示す。ΔＡＤＰ欠失を作製するために、配列番号３２内の下線で示したヌクレオチドを、欠失させた。
【化２０】
2020521471.tif 000022
【０２５２】
ウイルスＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ−ΔＡＤＰは、ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦと同一のゲノムで作製したが、このウイルスは、配列番号３２に下線で示されるＡＤＰ遺伝子のヌクレオチドの欠失も含むことを除く。
【０２５３】
ＡＤＰの欠失が、より長期かつ高度な導入遺伝子発現をもたらすかどうかを試験するために、Ａ５４９細胞に、５のＭＯＩで、ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦおよびＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ−ΔＡＤＰを感染させ、感染後３日ごとに、馴化培地を採取して、ＩＬ−７およびＧＭＣＳＦをＥＬＩＳＡで測定した。結果を、図８に示す。２つのウイルスの間に、導入遺伝子の発現レベルに関して、説得力のある違いは存在しなかったが、実験の過程で細胞を観察し、細胞死が、ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦでの感染約３日後から、ＴＡＶ−（ＩＸｒ）ｍＩＬ７ｎｏＰＡ−（Ｌ５ＥＦ１Ａ）ＫｏｚａｋｍＧＭＣＳＦ−ΔＡＤＰでは感染約９日後に遅延された。したがって、この実験にあるように可溶性サイトカインの発現は、強化されなかったが、感染した細胞の表面上での共刺激分子の発現など、一部の適用については、細胞がより長く生存し、細胞表面上の共刺激分子がより長期間にわたって標的細胞を活性化することができるように、ＡＤＰを欠失させることが有利であり得る。
【０２５４】
（実施例１０）
【０２５５】
本発明者らは、次に、ＩＸ−Ｅ２部位およびＬ５−Ｅ４部位を、共刺激分子であるＣＤ８０およびＣＤ１３７Ｌ、ならびに接着分子であるＩＣＡＭ１という３つの導入遺伝子を発現させるウイルスの設計の一部として使用した。本発明者らは、これまでに、ウイルスＥ１Ｂ−１９Ｋ遺伝子の５’末端の代わりに、これらの導入遺伝子を３つすべて保持し、３つの導入遺伝子のそれぞれの間にＩＲＥＳを有する、ウイルスを作製した。クローニングに使用した５’隣接アデノウイルスヌクレオチド配列およびＳａｌＩ制限部位（小文字）、マウスＣＤ８０（大文字）、脳心筋炎ウイルスに由来するＩＲＥＳ（小文字）、マウスＣＤ１３７Ｌ（大文字）、口蹄疫ウイルスに由来するＩＲＥＳ（小文字）、マウスＩＣＡＭ１（大文字）、ならびにクローニングに使用したＸｈｏＩ制限部位を含む３’隣接アデノウイルスヌクレオチド配列を有する、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ領域におけるそのウイルスのヌクレオチド配列を、配列番号３３に示す。このウイルスＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１は、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、Ｅ１Ｂ−１９Ｋ部位に配列番号３３を含み、Ｅ３領域のＡＤＰ、ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７Ｋ遺伝子の欠失を含み、Ｅ４領域のＯＲＦ１〜４遺伝子の欠失を含む。
【化２１】
2020521471.tif 000023
【化２２】
2020521471.tif 000024
【０２５６】
ＩＲＥＳの後の遺伝子の発現が、翻訳がＩＲＥＳによって開始されない遺伝子と比較して、概して不良であることを見出したため、ＩＸ−Ｅ２部位およびＬ５−Ｅ４部位を代替的な戦略として使用して、調査した。本発明者らは、配列番号３４に示されるようにＥ１Ｂ−１９Ｋ部位にマウスＣＤ８０を保持し（ＣＤ８０遺伝子を大文字で示し、隣接するアデノウイルス配列および制限部位を小文字で示す（今回は、他のウイルスで使用したＳａｌＩおよびＸｈｏＩ制限部位の代わりにＢｓｕ３６Ｉ制限部位を使用した））、配列番号２１のＩＸ−Ｅ２部位にマウスＣＤ１３７Ｌ遺伝子を保持し（配列番号３５に示されるようにＣＤ１３７Ｌ遺伝子がＮｏｔＩ部位に挿入されており、ＣＤ１３７Ｌ遺伝子を大文字で示し、隣接する発現カセット配列および残りのＮｏｔＩ制限部位を小文字で示す）、配列番号２９のＬ５−Ｅ４部位にマウスＩＣＡＭ１遺伝子を保持する（配列番号３６に示されるようにＩＣＡＭ１遺伝子がＳｗａＩ部位に挿入されており、ＩＣＡＭ１遺伝子を大文字で示し、隣接する発現カセット配列および残りのＳｗａＩ部位を小文字で示す）、ウイルスＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１を生成した。このウイルスはまた、Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を含み、Ｅ３領域のＡＤＰ、ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７Ｋ遺伝子の欠失を含み、Ｅ４領域のＯＲＦ１〜４遺伝子の欠失を含む。
【化２３】
2020521471.tif 000025
【化２４】
2020521471.tif 000026
【化２５】
2020521471.tif 000027
【０２５７】
これらの２つのウイルスによる発現を試験するために、Ａ５４９細胞、ＨＴ２９細胞、ＡＤＳ１２細胞、およびＦ２４４細胞に、３のＭＯＩで、ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１、ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１、またはＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１と同じ構造を有するが導入遺伝子を有さない対照ウイルスＴＡＶ−（１９ｋ）エンプティ−（ＩＸ）エンプティ−（Ｌ５）エンプティを感染させた。２日後に、細胞を、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、およびＩＣＡＭ１に関して染色し、結果を、図９〜図１２に示す。ＴＡＶ−ｍＣＤ８０（ＩＲＥＳ）ｍＣＤ１３７Ｌ（ＩＲＥＳ）ｍＩＣＡＭ１においてＩＲＥＳの後に発現される場合、ＣＤ１３７ＬおよびＩＣＡＭ１遺伝子の発現の不良が存在するが、ＴＡＶ−（１９ｋ）ｍＣＤ８０−（ＩＸ）ｍＣＤ１３７Ｌ−（Ｌ５）ｍＩＣＡＭ１では、ＩＸ−Ｅ２部位およびＬ５−Ｅ４部位からのこれらの遺伝子の強力な発現があった。
【０２５８】
（実施例１１）
【０２５９】
上に記載される実験は、ヒトアデノウイルス５型に基づくアデノウイルスを使用したが、他のアデノウイルスは、非常に類似する構造を有し、上に記載されるＩＸ−Ｅ２およびＬ５−Ｅ４部位に相同な明確に特定可能な部位を有する。たとえば、ヒトアデノウイルス３５型は、配列番号３７に示されるＩＸ−Ｅ２部位の配列を有し、配列番号３８に示されるＬ５−Ｅ４部位の配列を有し、ここで、ポリアデニル化シグナルが、それぞれの配列において下線で示されている。
【化２６】
2020521471.tif 000028
【０２６０】
発現カセットをこれらの部位に挿入することができるかどうかを判定するために、ＩＸ−Ｅ２部位を、配列番号３９に示されるようにアデノウイルス５型の修正されたＩＸ−Ｅ２部位において使用した同じ配列で改変し（発現カセットは、アデノウイルス５型とは反対の方向で挿入したため、小文字で示されている隣接するウイルス配列は、配列番号３７に示されている従来的なアノテーションの逆相補体である）、またＬ５−Ｅ４部位を、配列番号４０に示されるようにＥＦ１Ａプロモーターを有するアデノウイルス５型部位で使用した同じ配列で改変した。ＩＸ−Ｅ２およびＬ５−Ｅ４部位に発現カセットの両方を保持し、Ｅ３  ＲＩＤα、ＲＩＤβ、および１４．７Ｋ遺伝子ならびにＥ４  ＯＲＦ１〜４遺伝子における欠失を保持するアデノウイルス３５型をレスキューし、これらの部位が、他の血清型のアデノウイルスにおいて発現カセットの挿入に使用され得ることを示す。互いに対向するポリアデニル化部位を有する２つの隣接する転写ユニット間に発現カセットを挿入する戦略は、原理上、アデノウイルスに限定されず、他のウイルスにも同様に適用できる可能性がある。
【化２７】
2020521471.tif 000029
【０２６１】
（実施例１２）
【０２６２】
本発明者らは、修正されたＩＸ−Ｅ２部位およびＬ５−Ｅ４部位を使用して、前臨床実験においてモデルとして使用するためのマウスＩＬ１２ＡおよびＩＬ１２Ｂ遺伝子を保持するウイルスを生成した。マウスＩＬ１２Ａの遺伝子を、配列番号２１に示される発現カセットを有する修正されたＩＸ−Ｅ２部位のＮｏｔＩ制限部位にクローニングして、配列番号４２の配列を生成した。ＮｏｔＩ制限部位の残りのヌクレオチドを、下線で示す。マウスＩＬ１２Ｂの遺伝子を、配列番号２９に示されるＥＦ１Ａプロモーターを使用して発現カセットを有するＬ５−Ｅ４部位のＳｗａＩ制限部位にクローニングして、配列番号４３の配列を生成した。ＳｗａＩ制限部位の残りのヌクレオチドを、下線で示す。
【化２８】
2020521471.tif 000030
【０２６３】
Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、配列番号２１に示される導入遺伝子を有さないＩＸ−Ｅ２発現カセットを保持し、配列番号２９に示される導入遺伝子を有さないＬ５−Ｅ４発現カセットを保持する、ウイルスＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティを生成した。Ｅ１ＡプロモーターにＴＡＶ−２５５欠失を保持し、配列番号４２のマウスＩＬ１２Ａ遺伝子を含むＩＸ−Ｅ２発現カセットを保持し、配列番号４３のマウスＩＬ１２Ｂ遺伝子を含むＬ５−Ｅ４発現カセットを保持する、ウイルスＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２を生成した。
【０２６４】
腫瘍溶解についてこれらのウイルスを試験するために、Ａ５４９細胞に、ＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティまたはＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２のウイルスを、５のＭＯＩで感染させたか、または未感染対照として保ち、ウェルを、感染後２日ごとにクリスタルバイオレットで染色した。図１３に示されるように、エンプティ対照ウイルスおよびマウスＩＬ−１２を保持するウイルスの両方が、４〜６日以内に溶解性であった。
【０２６５】
導入遺伝子の発現について試験するために、Ａ５４９細胞に、ＴＡＶ−ＩＸ５−エンプティまたはＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２ウイルスを、５のＭＯＩで３連に感染させ、馴化培地を感染の５日後に採取して、マウスＩＬ１２Ａ鎖およびマウスＩＬ１２Ｂ鎖の両方を有するヘテロ二量体のみを検出するＥＬＩＳＡでマウスＩＬ−１２を測定した。図１４に示されるように、ＴＡＶ−ＩＸ５−ｍＩＬ１２は、高レベルのＩＬ−１２ヘテロ二量体の発現を誘導した。
【０２６６】
ヒトアデノウイルス５、完全ゲノム
ＮＣＢＩ参照配列：ＡＣ＿０００００８．１（配列番号１）
＞ＡＣ＿０００００８．１、ヒトアデノウイルス５、完全ゲノム
【化２９】
2020521471.tif 000031
【化３０】
2020521471.tif 000032
【化３１】
2020521471.tif 000033
【化３２】
2020521471.tif 000034
【化３３】
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【化３４】
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【化３５】
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【化３６】
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【化３７】
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【化３８】
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【化３９】
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【化４０】
2020521471.tif 000042
【化４１】
2020521471.tif 000043
【０２６７】
ヒトアデノウイルス３５、完全ゲノム
ＮＣＢＩ参照配列：ＡＣ＿００００１９．１（配列番号４１）
【化４２】
2020521471.tif 000044
【化４３】
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【化４４】
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【化４５】
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【化４６】
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【化４７】
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【化４８】
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【化４９】
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【化５０】
2020521471.tif 000052
【化５１】
2020521471.tif 000053
【０２６８】
参照による組込み
本明細書において参照される特許文書および科学論文のそれぞれの全開示が、あらゆる目的で参照により組み込まれる。
【０２６９】
均等物
本発明は、その趣旨または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化され得る。前述の実施形態は、したがって、本明細書に記載される本発明を制限するのではなく、あらゆる点に関して、例示的であるとみなされるべきである。本発明の範囲は、したがって、前述の説明ではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入るすべての変化は、そこに含まれることが意図される。
【図１】
2020521471.tif 000054
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020521471.tif 000063
【図１１】
2020521471.tif 000064
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月28日(2020.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記挿入部位が、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンと第２のウイルス転写ユニットの終止コドンとの間に位置しており、
前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第１のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第２のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記ヌクレオチド配列が挿入される前は、前記第１のウイルス転写ユニットと前記第２のウイルス転写ユニットとの間にウイルス転写ユニットが存在しない、組換えアデノウイルス。
【請求項２】
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＸ遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３】
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスファイバー遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７である、請求項１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４】
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、４、および５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、２、４、および６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９】
Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、請求項１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８００に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２０に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４０に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６０に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８０に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９００に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、９、および１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１３】
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１、３、９、および１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１４】
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列と、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置しており、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
【請求項１５】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１６】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４または請求項１５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１７】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１８】
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４または請求項１５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１９】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２０】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８０１に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２１に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４１に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６１に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８１に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２１】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２２】
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、請求項１４から１８および２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２３】
前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項４から８および１４から２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２４】
前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、または１３０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項９から２３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２５】
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの導入遺伝子を含む、請求項１から２４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列が、プロモーターをさらに含み、前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２７】
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）プロモーター、
（ｉｉｉ）導入遺伝子、
（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２８】
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである請求項２７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項２９】
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉｉ）プロモーター、
（ｉｖ）導入遺伝子、
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および
（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されており、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３０】
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである請求項２９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３１】
前記プロモーターが、遍在的プロモーター、組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的プロモーターである、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３２】
Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３３】
前記ヌクレオチド配列が、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列と、第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が、リンカーによって分離されている、請求項１から３２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３４】
前記リンカーが、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする、請求項３３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３５】
前記リンカーが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型２Ａペプチドをコードする、請求項３３または請求項３４に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３６】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位とＥｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している、請求項３２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３７】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２または請求項３６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３８】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項３９】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４から１９１７に対応する欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４０】
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド１６１１から２１５３に対応する欠失を含む、請求項３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４１】
前記Ｅ３挿入部位が、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスファイバー遺伝子の開始部位との間に位置している、請求項３２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４２】
前記Ｅ３挿入部位が、前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンとＥ３−１４．７Ｋの終止コドンとの間に位置している、請求項３２または請求項４１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４３】
前記Ｅ３挿入部位が、約５００〜約３１８５個、約５００〜約３０００個、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約３１８５個、約１０００〜約３０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約３１８５個、約１５００〜約３０００個、約１５００〜約２０００個、約２０００〜約３１８５個、約２０００〜約３０００個、約２０００〜約２５００個、約２５００〜約３１８５個、約２５００〜約３０００個、または約３０００〜約３１８５個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２、４１、および４２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４４】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約５００〜約１５５１個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約１５５１個、約１０００〜約１５００個、または約１５００〜約１５５１個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４５】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約１，０５０個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４６】
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに続く１，０６３個のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４７】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５  ｄｌ３０９  Ｅ３欠失に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４８】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド２９７７３〜３０８３６に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項４９】
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド２９１１９から３０６２２に対応する欠失を含む、請求項３２および４１から４６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５０】
機能性Ｐｅａ３結合部位の１つまたは複数の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、請求項１から４９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５１】
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５２】
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５３】
前記欠失が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５から２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５４】
前記Ｅ１ａプロモーターが、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む、請求項５０に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５５】
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５６】
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５７】
機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーター、および／または機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における前記遺伝子の選択的な発現を可能にする、前記遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む、請求項１から４８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５８】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、請求項５７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項５９】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、請求項５８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６０】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、請求項５９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６１】
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＴＡＴＡボックス全体の欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６２】
前記Ｅ１ａプロモーターの−２７から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６３】
前記Ｅ１ａプロモーターの−３１から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６４】
前記Ｅ１ａプロモーターの−４４から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６５】
前記Ｅ１ａプロモーターの−１４６から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６６】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４７２から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６７】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４６８から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６６に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６８】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４５５から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項６９】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３５３から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項６８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７０】
配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、請求項５７から６９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７１】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、請求項５７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７２】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、請求項７１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７３】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、請求項７２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７４】
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む、請求項７１から７３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７５】
前記Ｅ１ａプロモーターの−７６から−６８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７６】
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４２３から４３１に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７７】
配列ＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号４６）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、請求項７１から７６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７８】
Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７から４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５７から８０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項７９】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体のタンパク質をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８０】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、治療活性を有するＲＮＡをコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８１】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、少なくとも１つの結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８２】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、免疫調節性分子をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８３】
前記免疫調節性分子が、共刺激リガンド、サイトカイン、またはサイトカイン受容体である、請求項８２に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８４】
前記免疫調節性分子が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０トラップ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３Ａ／ｐ１９、ＩＬ２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βトラップ、ＩＬ−１０トラップ、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦ、ＩＣＡＭ、ポドカリキシン、これらの機能性断片、ならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８２または請求項８３に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８５】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原結合性分子をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８６】
前記抗原結合性分子が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこれらの機能性断片である、請求項８５に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８７】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原または前記抗原に対するリガンドをコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８８】
前記抗原が、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、Ｆｌｔ３Ｉ、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、４−１ＢＢ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＫＲＡＳ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、ＥｐｈＡ３、カルシウム活性化クロライドチャネル−２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＳＡＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、未成熟ラミニン受容体、葉酸受容体−ａ、テロメラーゼ、チロシナーゼ、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒ−ａ２、ｘ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／−２、ＴＲＰ−１／−２、Ｐポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ＢＲＡＦ、アンドロゲン受容体、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｔ細胞受容体、腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項８７に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項８９】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、毒素をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９０】
前記毒素が、シュードモナス外毒素、リシン毒素、またはジフテリア毒素である、請求項８９に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９１】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、酵素をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９２】
前記酵素が、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、エステラーゼ、メタロプロテイナーゼ、リラキシン、コラゲナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルギナーゼ、ＮＯＳ−２、これらの断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、請求項９１に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９３】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、細胞周期制御因子、増殖因子、抗凝血剤、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝子、抗血小板剤、凝固因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、これらの断片、またはこれらの誘導体をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９４】
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、アンジオスタチン、エンドスタチン、アセチルコリン、ＤＫＫ１／Ｗｎｔ、Ｏｘ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、分泌フラジェリン、チミジンキナーゼ、これらの機能性断片、またはこれらの誘導体をコードする、請求項２５から７８のいずれか一項に記載の組換え
アデノウイルス。
【請求項９５】
５型アデノウイルス（Ａｄ５）または３５型アデノウイルス（Ａｄ３５）である、請求項１から９４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９６】
腫瘍溶解性である、請求項１から９５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９７】
過剰増殖性細胞において選択的に複製する、請求項１から９６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９８】
過剰増殖性細胞において導入遺伝子を選択的に発現する、請求項１から９７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項９９】
前記過剰増殖性細胞が、腫瘍細胞である、請求項９７または請求項９８に記載の組換えアデノウイルス。
【請求項１００】
請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、単離されたヌクレオチド配列であって、必要に応じて、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０１】
請求項１００に記載のヌクレオチド配列を含む、単離されたベクター。
【請求項１０２】
請求項１００に記載のヌクレオチド配列または請求項１０１に記載のベクターを含む、単離された細胞。
【請求項１０３】
腫瘍細胞の増殖を阻害するための組成物であって、前記腫瘍細胞が前記組成物に曝露されることを特徴とし、前記組成物は、前記腫瘍細胞の増殖を阻害する有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、組成物。
【請求項１０４】
腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行うための組成物であって、前記組成物は、前記腫瘍の成長を阻害する有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、組成物。
【請求項１０５】
前記腫瘍が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、前記組換えアデノウイルスが、機能性Ｐｅａ３結合部位の１つ以下の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍が、乳がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵臓がん、または非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）からのものである、請求項１０５に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記腫瘍が、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、請求項１０３または請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０８】
がんの処置を、それを必要とする対象において行うための組成物であって、前記組成物は、前記対象における前記がんを処置する有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、組成物。
【請求項１０９】
前記がんが、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部がん、乳がん、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん、腎細胞癌、前立腺がん、胃食道がん、結腸直腸がん、精巣がん、膀胱がん、卵巣がん、肝細胞癌、胆管癌、脳がん、子宮内膜がん、神経内分泌がん、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、および膵臓がんから選択される、請求項１０８に記載の組成物。
【請求項１１０】
疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行うための組成物であって、前記組成物は、有効量の、請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、組成物。
【請求項１１１】
前記疾患または状態が、感染、糖尿病性網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎、子宮内膜症、黄斑変性障害および良性成長障害、たとえば、前立腺肥大および脂肪腫、血管障害、心臓血管疾患、感染、肝臓の硬変症、結合組織障害、腫瘍、血管病変、潰瘍性病変、炎症、血栓症、ならびに新内膜形成からなる群から選択される、請求項１１０に記載の組成物。
【請求項１１２】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１０４から１１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１３】
前記対象が、ヒトである、請求項１０４から１１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１４】
前記対象が、小児のヒトである、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１５】
前記対象が、成人のヒトである、請求項１１３に記載の組成物。
【請求項１１６】
前記組成物が、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮内、吸入、経皮、局所、点眼、鼻内、経粘膜、または直腸投与によって投与されるものであることを特徴とする、請求項１０４から１１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１７】
前記組成物が、前記対象に、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、およびウイルス療法からなる群から選択される１つまたは複数の治療法と組み合わせて投与されることをさらに特徴とする、請求項１０４から１１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１８】
前記組成物が、前記対象に、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて投与されることをさらに特徴とする、請求項１０４から１１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１９】
前記免疫チェックポイント調節剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される１つまたは複数の分子の阻害剤、アンタゴニスト、またはアゴニストである、請求項１１７に記載の組成物。
【請求項１２０】
請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
【請求項１２１】
アデノウイルスの製剤であって、
（ａ）請求項１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、
（ｂ）少なくとも１つの緩衝剤と、
（ｃ）少なくとも１つの張度改変剤と、
（ｄ）少なくとも１つの糖もしくは少なくとも１つの安定剤、またはその両方とを含み、約７．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する、製剤。
【請求項１２２】
前記安定剤が、グリセロールである、請求項１２１に記載の製剤。
【請求項１２３】
前記安定剤が、約２％〜約５％（体積／体積）である、請求項１２１または請求項１２２に記載の製剤。
【請求項１２４】
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２５】
前記緩衝剤が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である、請求項１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２６】
前記張度改変剤が、ＮａＣｌである、請求項１１９から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２７】
前記張度改変剤が、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度である、請求項１１９から１２４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２８】
第１の張度改変剤および第２の張度改変剤を含み、前記第１の張度改変剤が、一価カチオンであり、前記第２の張度改変剤が、二価カチオンである、請求項１１９から１２５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２９】
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、ＭｇＣｌ２である、請求項１１９から１２８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３０】
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、請求項１１９から１２９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３１】
前記糖が、スクロースである、請求項１１９から１３０のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３２】
前記糖が、体積に対する重量の百分率で約２％〜約８％である、請求項１１９から１３１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３３】
少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１１９から１３２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３４】
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０である、請求項１３３に記載の製剤。
【請求項１３５】
前記非イオン性界面活性剤が、約０．００１％〜約１％の濃度である、請求項１３３または請求項１３４に記載の製剤。
【請求項１３６】
少なくとも１つのフリーラジカル酸化阻害剤をさらに含む、請求項１１９から１３５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１３７】
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、ＥＤＴＡである、請求項１３６に記載の製剤。
【請求項１３８】
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、約０．０１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、請求項１３６または請求項１３７に記載の製剤。
【請求項１３９】
少なくとも１つの凍結保護剤をさらに含む、請求項１１９から１３８のいずれか一項に
記載の製剤。
【請求項１４０】
前記凍結保護剤が、ＥｔＯＨである、請求項１３９に記載の製剤。
【請求項１４１】
前記凍結保護剤が、約０．５％の濃度である、請求項１３９または請求項１４０に記載の製剤。
【請求項１４２】
約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する、請求項１１９から１４１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４３】
前記組換えアデノウイルスが、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの濃度である、請求項１１９から１４２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４４】
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約２．５％のグリセロールを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４５】
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約３〜５％のスクロースを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４４のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４６】
約１０ｍＭのＴｒｉｓ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約５％のスクロース、約０．０２％のポリソルベート−８０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、約０．５％のＥｔＯＨを含み、約８．０のｐＨを有する、請求項１１９から１４５のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４７】
少なくとも１つのイムノアジュバントをさらに含む、請求項１１９から１４６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１４８】
前記イムノアジュバントが、１）ミョウバン、２）サポニン、３）非イオン性ポリマー界面活性剤、４）モノホスホリルリピドＡ、５）ムラミルジペプチド、および６）サイトカインから選択される、請求項１４７に記載の製剤。
【請求項１４９】
少なくとも１つの色素をさらに含む、請求項１１９から１４８のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５０】
少なくとも１つの可逆的プロテアーゼ阻害剤をさらに含む、請求項１１９から１４９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５１】
前記可逆的プロテアーゼ阻害剤が、Ｌ３／ｐ２３システインプロテアーゼの阻害剤である、請求項１５０に記載の製剤。
【請求項１５２】
少なくとも１つの抗酸化剤をさらに含む、請求項１１９から１５１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１５３】
前記抗酸化剤が、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、または葉酸塩である、請求項１５２に記載の製剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
本発明のこれらおよび他の態様および利点は、以下の図面、詳細な説明、および特許請求の範囲によって例証される。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される：
（項目１）
挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記挿入部位が、第１のウイルス転写ユニットの終止コドンと第２のウイルス転写ユニットの終止コドンとの間に位置しており、
前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第１のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記第２のウイルス転写ユニットの終止コドンから前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでの方が、前記第２のウイルス転写ユニットの開始部位から前記第１のウイルス転写ユニットの終止コドンまでよりも近く、
前記ヌクレオチド配列が挿入される前は、前記第１のウイルス転写ユニットと前記第２のウイルス転写ユニットとの間にウイルス転写ユニットが存在しない、組換えアデノウイルス。
（項目２）
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＸ遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子である、項目１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３）
前記第１のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスファイバー遺伝子であり、前記第２のウイルス転写ユニットが、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７である、項目１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４）
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
（項目５）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、２、および４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、２、４、および５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、２、４、および６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９）
Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列を含む、組換えアデノウイルスであって、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンと、アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
（項目１０）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、項目１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１１）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８００に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２０に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４０に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６０に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８０に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９００に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、３、９、および１０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１２）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、３、および９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１３）
前記ヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１、３、９、および１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１４）
ＩＸ−Ｅ２挿入部位に挿入された第１のヌクレオチド配列と、Ｌ５−Ｅ４挿入部位に挿入された第２のヌクレオチド配列とを含む、組換えアデノウイルスであって、前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、アデノウイルスＩＸ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＩＶａ２遺伝子の終止コドンとの間に位置しており、前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、アデノウイルスファイバー遺伝子の終止コドンとアデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６またはＯＲＦ６／７の終止コドンとの間に位置している、組換えアデノウイルス。
（項目１５）
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１６）
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４０２９に対応するヌクレオチドと４０５０に対応するヌクレオチドとの間、４０５０に対応するヌクレオチドと４０７０に対応するヌクレオチドとの間、または４０７０に対応するヌクレオチドと４０９３に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４または項目１５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１７）
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１８）
前記第１のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３８９９に対応するヌクレオチドと３９２０に対応するヌクレオチドとの間、３９２０に対応するヌクレオチドと３９４０に対応するヌクレオチドとの間、または３９４０に対応するヌクレオチドと３９７０に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４または項目１５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１９）
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドから３２９１６に対応するヌクレオチドの間に挿入されている、項目１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２０）
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３２７８５に対応するヌクレオチドと３２８００に対応するヌクレオチドとの間、３２８０１に対応するヌクレオチドと３２８２０に対応するヌクレオチドとの間、３２８２１に対応するヌクレオチドと３２８４０に対応するヌクレオチドとの間、３２８４１に対応するヌクレオチドと３２８６０に対応するヌクレオチドとの間、３２８６１に対応するヌクレオチドと３２８８０に対応するヌクレオチドとの間、３２８８１に対応するヌクレオチドと３２９００に対応するヌクレオチドとの間、または３２９０１に対応するヌクレオチドと３２９１６に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４から１９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２１）
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２２）
前記第２のヌクレオチド配列が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の３１７９９に対応するヌクレオチドと３２８１０に対応するヌクレオチドとの間、または３２８１０に対応するヌクレオチドと３１８２１に対応するヌクレオチドとの間に挿入されている、項目１４から１８および２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２３）
前記ＩＸ−Ｅ２挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、または６０個のヌクレオチドの欠失を含む、項目４から８および１４から２２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２４）
前記Ｌ５−Ｅ４挿入部位が、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、または１３０個のヌクレオチドの欠失を含む、項目９から２３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２５）
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの導入遺伝子を含む、項目１から２４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２６）
前記ヌクレオチド配列が、プロモーターをさらに含み、前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されている、項目２５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２７）
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）プロモーター、
（ｉｉｉ）導入遺伝子、
（ｉｖ）第２のポリアデニル化シグナル、および
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第３のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されている、項目１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２８）
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである項目２７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目２９）
５’から３’の方向に、
（ｉ）第１のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉ）第２のポリアデニル化シグナル、
（ｉｉｉ）プロモーター、
（ｉｖ）導入遺伝子、
（ｖ）第３のポリアデニル化シグナル、および
（ｖｉ）第４のポリアデニル化シグナルを含み、
前記導入遺伝子が、前記プロモーターに作動可能に連結されており、前記導入遺伝子が、前記第１のポリアデニル化シグナルと前記第４のポリアデニル化シグナルとの間に挿入されており、前記第２のポリアデニル化シグナルが、前記第１のポリアデニル化シグナルとは逆の転写方向にある、項目１から２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３０）
前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ファイバー（Ｌ５）遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＥ４遺伝子のＯＲＦ６もしくはＯＲＦ６／７のポリアデニル化シグナルであるか、または前記第１のポリアデニル化シグナルが、前記ＩＸ遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第３のポリアデニル化シグナルが、前記導入遺伝子のポリアデニル化シグナルであり、前記第４のポリアデニル化シグナルが、前記アデノウイルスＩＶａ２遺伝子のポリアデニル化シグナルである項目２９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３１）
前記プロモーターが、遍在的プロモーター、組織特異的プロモーター、または腫瘍特異的プロモーターである、項目２６から３０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３２）
Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位、Ｅ３挿入部位、またはＥ４挿入部位に挿入されたヌクレオチド配列をさらに含む、項目１から３１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３３）
前記ヌクレオチド配列が、第１の導入遺伝子を含む第１のヌクレオチド配列と、第２の導入遺伝子を含む第２のヌクレオチド配列とを含み、前記第１のヌクレオチド配列および前記第２のヌクレオチド配列が、リンカーによって分離されている、項目１から３２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３４）
前記リンカーが、１つまたは複数のプロテアーゼによって切断可能なペプチドをコードする、項目３３に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３５）
前記リンカーが、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型２Ａペプチドをコードする、項目３３または項目３４に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３６）
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅｌｂ−１９Ｋの開始部位とＥｌｂ−１９Ｋの終止コドンとの間に位置している、項目３２に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３７）
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約１００〜約３０５個、約１００〜約３００個、約１００〜約２５０個、約１００〜約２００個、約１００〜約１５０個、約１５０〜約３０５個、約１５０〜約３００個、約１５０〜約２５０個、または約１５０〜約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２または項目３６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３８）
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ｅ１ｂ−１９Ｋの開始部位に隣接する約２００個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目３９）
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド１７１４から１９１７に対応する欠失を含む、項目３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４０）
前記Ｅ１ｂ−１９Ｋ挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド１６１１から２１５３に対応する欠失を含む、項目３２、３６、および３７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４１）
前記Ｅ３挿入部位が、アデノウイルスｐＶＩＩＩ遺伝子の終止コドンとアデノウイルスファイバー遺伝子の開始部位との間に位置している、項目３２に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４２）
前記Ｅ３挿入部位が、前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンとＥ３−１４．７Ｋの終止コドンとの間に位置している、項目３２または項目４１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４３）
前記Ｅ３挿入部位が、約５００〜約３１８５個、約５００〜約３０００個、約５００〜約２５００個、約５００〜約２０００個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約３１８５個、約１０００〜約３０００個、約１０００〜約２５００個、約１０００〜約２０００個、約１０００〜約１５００個、約１５００〜約３１８５個、約１５００〜約３０００個、約１５００〜約２０００個、約２０００〜約３１８５個、約２０００〜約３０００個、約２０００〜約２５００個、約２５００〜約３１８５個、約２５００〜約３０００個、または約３０００〜約３１８５個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２、４１、および４２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４４）
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約５００〜約１５５１個、約５００〜約１５００個、約５００〜約１０００個、約１０００〜約１５５１個、約１０００〜約１５００個、または約１５００〜約１５５１個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４５）
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに隣接する約１，０５０個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４６）
前記Ｅ３挿入部位が、Ｅ３−１０．５Ｋの終止コドンに続く１，０６３個のヌクレオチドの欠失を含む、項目３２および４１から４４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４７）
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５  ｄｌ３０９  Ｅ３欠失に対応する欠失を含む、項目３２および４１から４３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４８）
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）のヌクレオチド２９７７３〜３０８３６に対応する欠失を含む、項目３２および４１から４７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目４９）
前記Ｅ３挿入部位が、Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）のヌクレオチド２９１１９から３０６２２に対応する欠失を含む、項目３２および４１から４６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５０）
機能性Ｐｅａ３結合部位の１つまたは複数の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、項目１から４９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５１）
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流約−３００から約−２５０に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５２）
前記欠失が、Ｅｌａの開始部位の上流−３０５から−２５５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５３）
前記欠失が、Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の１９５から２４４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５４）
前記Ｅ１ａプロモーターが、配列ＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号４）を含む、項目５０に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５５）
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を含む、項目１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５６）
Ｅ１Ａ領域における１つまたは複数のＰｅａ３転写結合部位の欠失を有さない１つまたは複数のＥ２Ｆ転写結合部位の欠失を含む、項目１から５４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５７）
機能性ＴＡＴＡボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における遺伝子の選択的な発現を可能にする、遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーター、および／または機能性ＣＡＡＴボックスが欠如しており、過剰増殖性細胞における前記遺伝子の選択的な発現を可能にする、前記遺伝子に作動可能に連結された、改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターを含む、項目１から４８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５８）
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、項目５７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目５９）
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、項目５８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６０）
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、項目５９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６１）
前記改変されたＴＡＴＡボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＴＡＴＡボックス全体の欠失を含む、項目５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６２）
前記Ｅ１ａプロモーターの−２７から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６３）
前記Ｅ１ａプロモーターの−３１から−２４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から６２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６４）
前記Ｅ１ａプロモーターの−４４から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から６３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６５）
前記Ｅ１ａプロモーターの−１４６から＋５４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から６４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６６）
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４７２から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から６０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６７）
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４６８から４７５に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目６６に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６８）
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４５５から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目６７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目６９）
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の３５３から５５２に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目６８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７０）
配列ＣＴＡＧＧＡＣＴＧ（配列番号５）、ＡＧＴＧＣＣＣＧ（配列番号４４）、および／またはＴＡＴＴＣＣＣＧ（配列番号４５）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、項目５７から６９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７１）
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、初期遺伝子プロモーターである、項目５７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７２）
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーター、Ｅ１ｂプロモーター、またはＥ４プロモーターである、項目７１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７３）
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターが、Ｅ１ａプロモーターである、項目７２に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７４）
前記改変されたＣＡＡＴボックスに基づくプロモーターに含まれる改変が、ＣＡＡＴボックス全体の欠失を含む、項目７１から７３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７５）
前記Ｅ１ａプロモーターの−７６から−６８に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７６）
Ａｄ５ゲノム（配列番号１）の４２３から４３１に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目７１から７４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７７）
配列ＴＴＣＣＧＴＧＧＣＧ（配列番号４６）を含むウイルスをもたらす、ポリヌクレオチド欠失を含む、項目７１から７６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７８）
Ａｄ３５ゲノム（配列番号４１）の４７７から４８４に対応するヌクレオチドの欠失を含む、項目５７から８０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目７９）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、単量体、二量体、三量体、四量体、または多量体のタンパク質をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８０）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、治療活性を有するＲＮＡをコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８１）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、少なくとも１つの結合ドメインを含む融合タンパク質をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８２）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、免疫調節性分子をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８３）
前記免疫調節性分子が、共刺激リガンド、サイトカイン、またはサイトカイン受容体である、項目８２に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８４）
前記免疫調節性分子が、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１０トラップ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１２Ａ／ｐ３５、ＩＬ−１２Ｂ／ｐ４０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３Ａ／ｐ１９、ＩＬ２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５受容体融合タンパク質、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−βトラップ、ＩＬ−１０トラップ、ＶＥＧＦ、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、ＣＤ８０、ＣＤ１３７Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、またはＧＭ−ＣＳＦ、ＧＩＴＲリガンド（ＧＩＴＲＬ）、ＯＸ４０リガンド（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、薬物誘導性ＣＤ４０（ｉＣＤ４０）、ＣＤ１５４、ＣＤ７０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＢＯＲＩＳ／ＣＴＣＦＬ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ＴＮＦＳＦ９、ＦＧＦ、ＩＣＡＭ、ポドカリキシン、これらの機能性断片、ならびにこれらの誘導体からなる群から選択される、項目８２または項目８３に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８５）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原結合性分子をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８６）
前記抗原結合性分子が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこれらの機能性断片である、項目８５に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８７）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、抗原または前記抗原に対するリガンドをコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８８）
前記抗原が、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４４、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５（Ｆｌｔ３）、Ｆｌｔ３Ｉ、ＣＤ１３８、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染細胞抗原、４−１ＢＢ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＥｐＣＡＭ、ｅｒｂＢ２、ｅｒｂＢ３、ｅｒｂＢ４、ＦＢＰ、胎児性アセチルコリン受容体、ＫＲＡＳ、ＨＰＶ  Ｅ６、Ｅ７、ＢＩＮＧ−４、ＥｐｈＡ３、カルシウム活性化クロライドチャネル−２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＳＡＰ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、未成熟ラミニン受容体、葉酸受容体−ａ、テロメラーゼ、チロシナーゼ、メラン−Ａ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＧＤ３、ｈＴＥＲＴ、ＩＬ１３Ｒ−ａ２、ｘ−軽鎖、ＫＤＲ、ＬｅＹ、ＬＩ細胞接着分子、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＲＴ１、ＭＡＲＴ２、ＭＵＣ１、メソテリン、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳ０−１、ｇｐ１００、ＴＲＰ−１／−２、ＴＲＰ−１／−２、Ｐポリペプチド、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異的抗原、ＢＲＡＦ、アンドロゲン受容体、β−カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、フィブロネクチン、ｐ５３、ＴＧＦ−βＲＩＩ、Ｔ細胞受容体、腫瘍胎児性抗原、５Ｔ４、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＴＡＧ−７２、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＷＴ−１、これらの機能性断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目８７に記載の組換えアデノウイルス。
（項目８９）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、毒素をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９０）
前記毒素が、シュードモナス外毒素、リシン毒素、またはジフテリア毒素である、項目８９に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９１）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、酵素をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９２）
前記酵素が、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ベータ−ラクタマーゼ、エステラーゼ、メタロプロテイナーゼ、リラキシン、コラゲナーゼ、ストレプトキナーゼ、アルギナーゼ、ＮＯＳ−２、これらの断片、およびこれらの誘導体からなる群から選択される、項目９１に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９３）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、細胞周期制御因子、増殖因子、抗凝血剤、プロドラッグ活性化遺伝子、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシス遺伝子、抗血小板剤、凝固因子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質、これらの断片、またはこれらの誘導体をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９４）
前記導入遺伝子、前記第１の導入遺伝子、および前記第２の導入遺伝子のうちの１つまたは複数が、アンジオスタチン、エンドスタチン、アセチルコリン、ＤＫＫ１／Ｗｎｔ、Ｏｘ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、分泌フラジェリン、チミジンキナーゼ、これらの機能性断片、またはこれらの誘導体をコードする、項目２５から７８のいずれか一項に記載の組換え
アデノウイルス。
（項目９５）
５型アデノウイルス（Ａｄ５）または３５型アデノウイルス（Ａｄ３５）である、項目１から９４のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９６）
腫瘍溶解性である、項目１から９５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９７）
過剰増殖性細胞において選択的に複製する、項目１から９６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９８）
過剰増殖性細胞において導入遺伝子を選択的に発現する、項目１から９７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルス。
（項目９９）
前記過剰増殖性細胞が、腫瘍細胞である、項目９７または項目９８に記載の組換えアデノウイルス。
（項目１００）
項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを含む、単離されたヌクレオチド配列であって、必要に応じて、前記ヌクレオチド配列がｃＤＮＡである、単離されたヌクレオチド配列。
（項目１０１）
項目１００に記載のヌクレオチド配列を含む、単離されたベクター。
（項目１０２）
項目１００に記載のヌクレオチド配列または項目１０１に記載のベクターを含む、単離された細胞。
（項目１０３）
腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、有効量の、項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスに曝露することであって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、方法。
（項目１０４）
腫瘍成長の阻害を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することであって、前記腫瘍の成長を阻害することを含む、方法。
（項目１０５）
前記腫瘍が、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍であり、前記組換えアデノウイルスが、機能性Ｐｅａ３結合部位の１つ以下の欠失を有するＥ１ａプロモーターを含む、項目１０４に記載の方法。
（項目１０６）
前記ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍が、乳がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、唾液腺がん、子宮内膜がん、膵臓がん、または非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）からのものである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記腫瘍が、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部腫瘍、乳房腫瘍、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺腫瘍、腎細胞癌、前立腺腫瘍、胃食道腫瘍、結腸直腸腫瘍、精巣腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、脳腫瘍、子宮内膜腫瘍、神経内分泌腫瘍、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、および膵臓腫瘍からなる群から選択される、項目１０３または項目１０４に記載の方法。
（項目１０８）
がんの処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することであって、前記対象における前記がんを処置することを含む、方法。
（項目１０９）
前記がんが、黒色腫、皮膚の扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、頭頸部がん、乳がん、肛門がん、子宮頸がん、非小細胞肺がん、中皮腫、小細胞肺がん、腎細胞癌、前立腺がん、胃食道がん、結腸直腸がん、精巣がん、膀胱がん、卵巣がん、肝細胞癌、胆管癌、脳がん、子宮内膜がん、神経内分泌がん、メルケル細胞癌、消化管間質腫瘍、肉腫、前立腺がん、白血病、リンパ腫、および膵臓がんから選択される、項目１０８に記載の方法。
（項目１１０）
疾患または状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、前記対象に、有効量の、項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスを投与することを含む、方法。
（項目１１１）
前記疾患または状態が、感染、糖尿病性網膜症、乾癬、リウマチ性関節炎、子宮内膜症、黄斑変性障害および良性成長障害、たとえば、前立腺肥大および脂肪腫、血管障害、心臓血管疾患、感染、肝臓の硬変症、結合組織障害、腫瘍、血管病変、潰瘍性病変、炎症、血栓症、ならびに新内膜形成からなる群から選択される、項目１１０に記載の方法。
（項目１１２）
前記対象が、哺乳動物である、項目１０４から１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記対象が、ヒトである、項目１０４から１１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１４）
前記対象が、小児のヒトである、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
前記対象が、成人のヒトである、項目１１３に記載の方法。
（項目１１６）
前記組換えアデノウイルスが、筋肉内、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮内、吸入、経皮、局所、点眼、鼻内、経粘膜、または直腸投与によって投与される、項目１０４から１１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１７）
前記対象に、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、およびウイルス療法からなる群から選択される１つまたは複数の治療法を投与することをさらに含む、項目１０４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１８）
前記対象に、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を投与することをさらに含む、項目１０４から１１７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１９）
前記免疫チェックポイント調節剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＧＩＴＲ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、およびＣＴＬＡ４からなる群から選択される１つまたは複数の分子の阻害剤、アンタゴニスト、またはアゴニストである、項目１１７に記載の方法。
（項目１２０）
項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、少なくとも１つの薬学的に許容される担体または希釈剤とを含む、医薬組成物。
（項目１２１）
アデノウイルスの製剤であって、
（ａ）項目１から９９のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスと、
（ｂ）少なくとも１つの緩衝剤と、
（ｃ）少なくとも１つの張度改変剤と、
（ｄ）少なくとも１つの糖もしくは少なくとも１つの安定剤、またはその両方とを含み、約７．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する、製剤。
（項目１２２）
前記安定剤が、グリセロールである、項目１２１に記載の製剤。
（項目１２３）
前記安定剤が、約２％〜約５％（体積／体積）である、項目１２１または項目１２２に記載の製剤。
（項目１２４）
前記緩衝剤が、Ｔｒｉｓである、項目１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１２５）
前記緩衝剤が、約１ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度である、項目１２１から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１２６）
前記張度改変剤が、ＮａＣｌである、項目１１９から１２３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１２７）
前記張度改変剤が、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度である、項目１１９から１２４のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１２８）
第１の張度改変剤および第２の張度改変剤を含み、前記第１の張度改変剤が、一価カチオンであり、前記第２の張度改変剤が、二価カチオンである、項目１１９から１２５のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１２９）
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、ＭｇＣｌ２である、項目１１９から１２８のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３０）
前記張度改変剤または前記二価カチオンが、約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、項目１１９から１２９のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３１）
前記糖が、スクロースである、項目１１９から１３０のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３２）
前記糖が、体積に対する重量の百分率で約２％〜約８％である、項目１１９から１３１のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３３）
少なくとも１つの非イオン性界面活性剤をさらに含む、項目１１９から１３２のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３４）
前記非イオン性界面活性剤が、ポリソルベート−８０またはポリソルベート−４０である、項目１３３に記載の製剤。
（項目１３５）
前記非イオン性界面活性剤が、約０．００１％〜約１％の濃度である、項目１３３または項目１３４に記載の製剤。
（項目１３６）
少なくとも１つのフリーラジカル酸化阻害剤をさらに含む、項目１１９から１３５のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１３７）
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、ＥＤＴＡである、項目１３６に記載の製剤。
（項目１３８）
前記フリーラジカル酸化阻害剤が、約０．０１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度である、項目１３６または項目１３７に記載の製剤。
（項目１３９）
少なくとも１つの凍結保護剤をさらに含む、項目１１９から１３８のいずれか一項に
記載の製剤。
（項目１４０）
前記凍結保護剤が、ＥｔＯＨである、項目１３９に記載の製剤。
（項目１４１）
前記凍結保護剤が、約０．５％の濃度である、項目１３９または項目１４０に記載の製剤。
（項目１４２）
約２００ｍＯｓ／Ｌ〜約８００ｍＯｓ／Ｌのモル浸透圧濃度を有する、項目１１９から１４１のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４３）
前記組換えアデノウイルスが、約１×１０７ｖｐ／ｍＬ〜１×１０１３ｖｐ／ｍＬの濃度である、項目１１９から１４２のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４４）
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約２．５％のグリセロールを含み、約８．０のｐＨを有する、項目１１９から１４３のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４５）
約２０ｍＭのＴｒｉｓ、約２５ｍＭのＮａＣｌ、約３〜５％のスクロースを含み、約８．０のｐＨを有する、項目１１９から１４４のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４６）
約１０ｍＭのＴｒｉｓ、約７５ｍＭのＮａＣｌ、約５％のスクロース、約０．０２％のポリソルベート−８０、約１ｍＭのＭｇＣｌ２、約０．１ｍＭのＥＤＴＡ、約０．５％のＥｔＯＨを含み、約８．０のｐＨを有する、項目１１９から１４５のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４７）
少なくとも１つのイムノアジュバントをさらに含む、項目１１９から１４６のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１４８）
前記イムノアジュバントが、１）ミョウバン、２）サポニン、３）非イオン性ポリマー界面活性剤、４）モノホスホリルリピドＡ、５）ムラミルジペプチド、および６）サイトカインから選択される、項目１４７に記載の製剤。
（項目１４９）
少なくとも１つの色素をさらに含む、項目１１９から１４８のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１５０）
少なくとも１つの可逆的プロテアーゼ阻害剤をさらに含む、項目１１９から１４９のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１５１）
前記可逆的プロテアーゼ阻害剤が、Ｌ３／ｐ２３システインプロテアーゼの阻害剤である、項目１５０に記載の製剤。
（項目１５２）
少なくとも１つの抗酸化剤をさらに含む、項目１１９から１５１のいずれか一項に記載の製剤。
（項目１５３）
前記抗酸化剤が、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２、葉酸、または葉酸塩である、項目１５２に記載の製剤。
【国際調査報告】
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