(57)【要約】  本発明は、新規なラパマイシン類自体（例えば、式1または式11のラパマイシン類字体）、渾合物、その産生方法、およびがん療法（例えば、予防および／または治療）におけるその使用に関する。
2020507632.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉおよび／または医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、またはその混合物の化合物、
【化１】
2020507632.tif 000047
式中、
Ｒは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄ（ＣＲ７Ｒ８Ｒ９）から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリハロメチル、または−Ｆであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、もしくはＣＯ２Ｒ１１であり、または、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、Ｘまたは、任意選択で−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０でモノ−、ジ−、トリ−置換される炭素原子３個〜８個のシクロアルキル環を形成することができ、  
Ｒ１０は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエチル、トリフェニルメチル、ベンジル、Ｃ２〜Ｃ８アルコキシメチル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエトキシメチル、クロロエチル、またはテトラヒドロピラニルであり、
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、またはＣ７〜Ｃ１０フェニルアルキルであり、
Ｘは、５−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、５−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキソラニル、または４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキソラニルであり、
ｂは０から６までの整数であり、
ｄは０から６までの整数、かつ、
ｆは０から６までの整数である。
【請求項２】
Ｒが、Ｈ、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、Ｘまたは−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルから選択される少なくとも１つの部分を含有する、請求項１に記載の、化合物および／または医薬的に許容される塩、溶媒和物、エステルもしくは混合物。
【請求項３】
請求項１または２に記載の、化合物、医薬的に許容される塩、溶媒和物、エステル、または混合物を含む組成物。
【請求項４】
医薬的に許容される担体をさらに含む請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
式ＩＩの化合物、および／または医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、またはその混合物。
【化２】
2020507632.tif 000048
【請求項６】
請求項５に記載の、化合物、医薬的に許容される塩、溶媒和物、エステル、または混合物を含む組成物。
【請求項７】
医薬的に許容される担体をさらに含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
式ＩＩの化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、式Ｉの化合物のそのエステル、およびこれらの混合物からなる群から選択される化合物を約７０％以上含む組成物。    
【化３】
2020507632.tif 000049
【請求項９】
前記式Ｉの化合物、前記式ＩＩの化合物の医薬的に許容される塩および溶媒和物ならびにそれらの混合物からなる群から選択される化合物を約９０％以上含む、請求項８に記載の組成物。    
【請求項１０】
前記組成物が、前記式ＩＩの化合物、前記式Ｉの化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物およびエステル、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される化合物の、本質的に純粋な混合物を含有する請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤、および１つもしくは複数のポリケチドを含む医薬組成物であって、１つの該ポリケチドがある場合、それが式ＩＩのポリケチドであり、かつ、該組成物中に２つ以上の該ポリケチドがある場合、該式ＩＩのポリケチドが、該医薬組成物の該ポリケチド構成成分の少なくとも約７０％を構成し、
【化４】
2020507632.tif 000050
該式ＩＩの化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物、および／または水和物が、該医薬組成物の該ポリケチド構成成分の少なくとも７０％を構成する医薬組成物。
【請求項１２】
前記式ＩＩの化合物が、前記医薬組成物の前記ポリケチド構成成分の少なくとも８０％の量で存在する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記式ＩＩの化合物が、前記医薬組成物の前記ポリケチド構成成分の少なくとも９０％の量で存在する、請求項１１に記載の医薬組成物。  
【請求項１４】
前記式ＩＩの化合物が、前記医薬組成物の前記ポリケチド構成成分の少なくとも９５％の量で存在する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記式ＩＩの化合物が、前記医薬組成物の前記ポリケチド構成成分の少なくとも９８％の量で存在する、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記式ＩＩの化合物が、前記医薬組成物において本質的に唯一の前記ポリケチドである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記溶媒和物が、存在する場合は水和物である、上記請求項１から１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、ビーズ、錠剤、カプセル、溶液または懸濁液であるか、またはそれらを含む、上記請求項１から１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
細胞の増殖を阻害する方法であって、該方法は、抗増殖有効量の化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、または、上記請求項１から１８のいずれかに記載のその混合物、ならびに／または抗増殖有効量の、上記請求項１から１８のいずれかに記載の組成物に、該細胞を接触させることを含む方法。
【請求項２０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞がヒトがん細胞である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ヒトがん細胞が、血液がん、骨がん、固形腫瘍、腺がん、脳がん、神経膠芽腫、乳房腺がん、骨髄がん、赤白血病、骨肉腫、結腸直腸がん、類表皮がん、上皮がん、子宮がん、線維肉腫、胃腺がん、腎臓がん、白血病、急性リンパ白血病、慢性骨髄性白血病、平滑筋芽腫、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病卵巣がん、卵巣腺がん、膵臓がん、前立腺腺がん、横紋筋肉腫、腎細胞がん、肉腫、子宮肉腫、扁平上皮がん、膀胱扁平上皮がん、頭頸部がん、および移行上皮がんからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法がｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法である、請求項１９から２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
前記方法がｉｎ  ｖｉｖｏの方法である、請求項１９から２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
疾病を有する哺乳類を治療する方法であって、該方法は、有効量の式ＩＩの化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、もしくはその混合物、および／もしくは該式ＩＩの化合物を含む混合物、ならびに／または該式ＩＩを含む有効量の組成物を、該哺乳類に投与することを含む方法。
【請求項２６】
前記哺乳類がヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾病ががんであり、該がんが、血液がん、骨がん、固形腫瘍、腺がん、脳がん、神経膠芽腫、乳房腺がん、骨髄がん、赤白血病、骨肉腫、結腸直腸がん、類表皮がん、上皮がん、子宮がん、線維肉腫、胃腺がん、腎臓がん、白血病、急性リンパ白血病、慢性骨髄性白血病、平滑筋芽腫、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病卵巣がん、卵巣腺がん、膵臓がん、前立腺腺がん、横紋筋肉腫、腎細胞がん、肉腫、子宮肉腫、扁平上皮がん、膀胱扁平上皮がん、頭頸部がん、および移行上皮がんからなる群から選択される、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
ただ一つの活性医薬品（医薬品類）として投与される前記式Ｉおよび／もしくは前記式ＩＩの化合物、または該式Ｉおよび／もしくは該式ＩＩの化合物（化合物類）が、１つもしくは複数の化学療法剤、抗がん剤、もしくは免疫調節薬、ならびに／または放射線療法および／もしくは手術と組み合わせて投与される、請求項２５から２７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２９】
前記哺乳類が、臓器移植拒絶反応または宿主対移植片疾病の予防が必要である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、非経口、経口、局所、頬側、舌下、経皮、医療機器、ステント、吸入、注射、皮下、筋肉内、または静脈内からなる群から選択される経路を介し、該投与が、同じもしくは異なる投薬で単一用量もしくは複数用量を含み、かつ／または、組み合わせの要素が、物理的および／もしくは時間的に同時にもしくは別々に投与される、請求項２５から２９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３１】
前記式Ｉおよび／または前記式ＩＩの化合物が、ビーズ、錠剤、カプセル、溶液、または懸濁液として提供される、請求項２５から３０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
請求項１、２、５、もしくは５５に記載の式Ｉの化合物、または医薬的に許容されるその塩を調製するプロセスであって、該プロセスは、遺伝子改変されてｒａｐＫ遺伝子またはその相同体が除去または不活性化されているラパマイシン産生株に対するフィードスタータ（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔａｒｔｅｒ）の式ＩＩＩのエキソ−（１Ｒ、２Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸塩を含み、
【化５】
2020507632.tif 000051
式中、Ｘ＝Ｈ、アルキル、ナトリウムまたはカリウムである、
プロセス。
【請求項３３】
式ＩＩのプロドラッグであって、該プロドラッグは、式Ｉのポリケチドおよび／または医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、その水和物、またはその混合物であり、
【化６】
2020507632.tif 000052
Ｒは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄ（ＣＲ７Ｒ８Ｒ９）から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリハロメチル、または−Ｆであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、もしくはＣＯ２Ｒ１１であり、または、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、Ｘまたは、任意選択で−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０でモノ−、ジ−、トリ−置換される炭素原子３個〜８個のシクロアルキル環を形成することができ、  
Ｒ１０は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエチル、トリフェニルメチル、ベンジル、Ｃ２〜Ｃ８アルコキシメチル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエトキシメチル、クロロエチル、またはテトラヒドロピラニルであり、
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、またはＣ７〜Ｃ１０フェニルアルキルであり、
Ｘは、５−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、５−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキソラニル、または４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキソラニルであり、
ｂは０から６までの整数であり、
ｄは０から６までの整数、かつ、
ｆは０から６までの整数である、
プロドラッグ。
【請求項３４】
前記式Ｉのプロドラッグが前記式ＩＩのポリケチドに置換する、上記請求項１から３３のいずれかに記載の組成物または方法。
【発明の詳細な説明】
【優先権】
【０００１】
本出願は、２０１７年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４５７，６７６号に優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、ラパマイシン類似体に関する。
【背景技術】
【０００３】
ラパマイシン（シロリムス）は、冠動脈ステントをコーティングし、臓器移植の拒絶反応を予防するために用いられるポリケチドである。この技術により、ラパマイシンおよびラパマイシン類似体を用いて、リンパ脈管筋腫症、肺炎症（特許文献１）、インスリン依存性糖尿病（非特許文献１を引用した特許文献２）、特定の冠動脈疾患（非特許文献２）、白血病およびリンパ腫（特許文献３）、ならびに眼の炎症（特許文献４）を治療できることも示されている。  
【０００４】
ラパマイシン（図４）は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＮＲＲＬ  ５４９１（Ｓｅｈｇａｌら、１９７５年；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５年；特許文献５；特許文献６）によって産生される。本開示の目的のために、ラパマイシンを、Ｆｉｎｄｌａｙら（１９８０年）または非特許文献３の番号付け規則よりむしろ、ＭｃＡｌｐｉｎｅら（１９９１年）（図３を参照されたい）の番号付け規則によって表している。    
【０００５】
特許文献７には、ラパマイシンのアシル化プロドラッグが開示されている。    
【０００６】
ラパマイシンならびに市販のその類似体であるテムシロリムスおよびエベロリムスは、とりわけインターロイキン−２の産生を抑えるｍＴＯＲに結合することにより、Ｔ細胞およびＢ細胞の活性化を阻害する。ｍＴＯＲは、構造的に異なる２つの複合体、すなわちｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２（非特許文献４）の触媒サブユニットである。ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２が異なる細胞内区画に局在することにより、それらの活性化と機能に影響を及ぼす。
【０００７】
科学的証拠により、ｍＴＯＲＣ１は、細胞の栄養状態およびエネルギー状態のセンサーとして機能し、タンパク質合成を制御する役割のあることが示されている（非特許文献５、非特許文献６）。ｍＴＯＲＣ１の活性は、ラパマイシン類似体、インスリン、成長因子、ホスファチジン酸、一部のアミノ酸およびアミノ酸誘導体、機械的刺激、ならびに酸化ストレスによって制御される。
【０００８】
科学的証拠により、ｍＴＯＲＣ２が、Ｆ−アクチンストレスファイバー、パキシリン、ＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、Ｃｄｃ４２、およびタンパク質キナーゼＣαの刺激によって、アクチン細胞骨格の重要な制御因子として機能することが示されている（非特許文献７）。ｍＴＯＲＣ２は、明らかに、Ａｋｔ／ＰＫＢのリン酸化を介して代謝および生存にも影響を及ぼす（非特許文献８）。ｍＴＯＲＣ２によるＡｋｔリン酸化は、ＰＤＫ１と相互作用し、Ａｋｔを完全に活性化させる（非特許文献９、非特許文献１０）。さらに、ｍＴＯＲＣ２は、ＩＧＦ−ＩＲおよびＩｎｓＲを活性化することができる（非特許文献１１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第５，０８０，９９９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，３６２，７１８号明細書
【特許文献３】欧州特許出願公開第０  ５２５  ９６０号明細書
【特許文献４】欧州特許出願公開第０  ５３２  ８６２号明細書
【特許文献５】米国特許第３，９２９，９９２号明細書
【特許文献６】米国特許第３，９９３，７４９号明細書
【特許文献７】米国特許第５，３６２，７１８号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔ．  Ｃｏｎｆ．  Ｉｎｆｌａｍｍ．  Ｒｅｓ．  Ａｓｓｏｃ．  １２１  （Ａｂｓｔｒａｃｔ），（１９９０）
【非特許文献２】Ｍｏｒｒｉｓ、（１９９２）Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １１：１９７
【非特許文献３】Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  （１１ｔｈ  Ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ  Ｉｎｄｅｘ，  １９８２−１９８６  ｐ６０７１９ＣＳ）
【非特許文献４】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８１：２４２９３‐３０３
【非特許文献５】Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １８：  １９２６‐４５
【非特許文献６】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｅｌｌ，  １１０：  １６３‐７５
【非特許文献７】Ｓａｒｂａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：１２９６‐３０２
【非特許文献８】Ｂｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ＰＮＡＳ  １１０：  １２５２６‐３４
【非特許文献９】Ｓａｒｂａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７：  １０９８‐１０１
【非特許文献１０】Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：  ７１０‐４
【非特許文献１１】Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２６：  ４６‐６５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
理論に縛られる意図はないものの、ｍＴＯＲＣ１とｍＴＯＲＣ２の両方を阻害することにより薬剤耐性を生じる可能性のあるエスケープ機構が作用しなくなるため、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を阻害するための、よりバランスのとれた（例えば選択性がより低い）能力を有するラパマイシンのようなｍＴＯＲのポリケチド阻害剤が、特定のがんの治療に望ましいと考えられる。
【００１２】
ラパマイシン類似体（ラパマイシンを包含する）には重要な治療的価値がある（Ｈｕａｎｇら、２００３年）。これらのポリケチドは、細胞の生存と増殖を媒介するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（Ｐｌ３Ｋ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）シグナル伝達経路の、セリンスレオニンキナーゼシグナル伝達経路下流のセリンスレオニンキナーゼであるｍＴＯＲの強力な阻害剤である。この阻害活性は、ラパマイシンがイムノフィリンＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）に結合した後に獲得される（Ｄｕｍｏｎｔ，  Ｆ．  Ｊ．およびＱ．  Ｘ．  Ｓｕ、１９９５年）。Ｔ細胞において、ラパマイシンは、ＩＬ−２受容体からのシグナル伝達およびそれに続くＴ細胞の自己増殖を阻害し、免疫抑制をもたらす。ラパマイシンは、移植片拒絶を防ぐための臓器移植患者の治療用の免疫抑制剤として市場に出されている（Ｈｕａｎｇら、２００３年）。免疫抑制に加え、がん治療への用途がラパマイシンで見出された（Ｖｉｇｎｏｔら、２００５年）。
【００１３】
ラパマイシンおよび多くのラパマイシン類似体には、高脂血症の誘発、Ｐ−糖タンパク質（「Ｐ−ｇｐ」、ＬａＰｌａｎｔｅら、２００２年、Ｃｒｏｗｅら、１９９９年）によって媒介される細胞排出、および、化合物を細胞から吸い出し、投与された薬剤化合物の効果を低下させる傾向があり、多剤耐性がんの治療に課題を提示する他の排出メカニズムなどの欠点がある。ラパマイシンの肝臓初回通過損失も大きく、これがさらにその低い経口バイオアベイラビリティの原因となっている。ラパマイシンのこの低い経口バイオアベイラビリティが個人間の著しいばらつきを生じさせ、その結果、一貫性のない治療成績となり、臨床的対応が困難になっている（Ｋｕｈｎら、２００１年、Ｃｒｏｗｅら、１９９９年）。
【００１４】
分子の化学的に利用可能な部位を用いる幅広い合成ラパマイシン類似体が、当技術分野で公知である。誘導体化または置換のための分子上の化学的に利用可能な部位としては、例えば、Ｃ４０およびＣ２８のヒドロキシル基（例えば特許文献８、特許文献９）、Ｃ３９およびＣ１６のメトキシ基（例えば特許文献１０、特許文献１１）、Ｃ３２、Ｃ２６、およびＣ９のケト基（例えば特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４）、Ｃ１７、Ｃ１９および／もしくはＣ２１での水素付加（例えば特許文献１５、特許文献１６）、ならびに／またはＣ３２、Ｃ４０および／もしくはＣ２８でのオキシムの形成（例えば特許文献１７、特許文献１８）のあることが、当技術分野で公知である。代謝攻撃に対する耐性（例えば特許文献１９）、バイオアベイラビリティ（例えば特許文献２０、特許文献２１、特許文献２２）、および／またはプロドラッグの産生（例えば特許文献２３、特許文献２４）を示す類似体も開発されている。したがって、当技術分野では、医薬的に有用で興味深いラパマイシン類似体の数は非常に多く、数値化することは難しいと理解されよう。
【００１５】
式Ｉおよび式ＩＩの化合物と類似性を有するラパマイシン類似体は、特許文献２５に開示されているポリケチドである。この開示では特許文献２５に記載されている化合物の立体異性体が提供されているが、特許文献２５では本開示で提供する新規ポリケチドは開示も提案もされておらず、また、特許文献２５ではその組成物中のポリケチドの大部分が図１および／または図２の化合物である組成物が提供されてもいない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
いくつかの実施形態では、本開示は、予想外でありかつ有益な医薬品用途を有する、ラパマイシンに類似したポリケチドを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、図１および／または図２に記載のポリケチド、ならびに他のポリケチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、図１および／または図２のポリケチドを産生する新規な方法を提供する。いくつかの実施形態では、図１および／もしくは図２のポリケチドの投与を含む、その必要性がある哺乳類の治療方法、ならびに／または、図１および／もしくは図２のポリケチドを含む組成物および／もしくは混合物を提供する。本明細書に記載されるように、かつ／または通常の当業者によって確認され得るように、他の実施形態も企図される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】式Ｉの化学構造である。
【図２】式ＩＩの、Ｃ３７−［（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン］ラパマイシンである。
【図３】本明細書で用いるラパマイシンの番号付け模式図である。
【図４】本発明のポリケチドに類似の市販のポリケチドである、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムスの化学構造である。
【図５】特許文献２５に開示されているポリケチドの、Ｃ３７Ｒ−［（１Ｓ，２Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン］ラパマイシンである。
【図６】マウス全血における式ＩＩの２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ（ＱＤｘ３日）の投薬を示す。
【図７】経時的な腫瘍量である。
【図７Ａ】経時的な平均腫瘍量である。
【図７Ｂ】経時的な腫瘍量の中央値である。
【図７Ｃ】経時的な平均腫瘍体積百分率である。
【図７Ｄ】経時的な腫瘍体積百分率の中央値である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本開示は、式Ｉおよび式ＩＩのポリケチドを提供し、そのポリケチドは、Ｃ３７−［（１Ｒ，２Ｓ，４Ｒ，５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン］ラパマイシンおよびそのプロドラッグエステルである。式Ｉの化合物は、本明細書に記載するように、哺乳類の疾病の治療に驚くべき予想外に有益な特性を有する式ＩＩの化合物のプロドラッグである。式Ｉを以下に示す。
【００１９】
【化１】
2020507632.tif 000003
【００２０】
式中、
Ｒは、水素または−Ｃ（Ｏ）（ＣＲ３Ｒ４）ｂ（ＣＲ５Ｒ６）ｄ（ＣＲ７Ｒ８Ｒ９）から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリハロメチル、または−Ｆであり、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ７は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、またはＣＯ２Ｒ１１であり、
Ｒ８およびＲ９は、それぞれ、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、−ＣＦ３、−Ｆ、もしくはＣＯ２Ｒ１１であり、または、Ｒ８およびＲ９は、一緒になって、Ｘまたは、任意選択で−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０でモノ−、ジ−、またはトリ−置換される炭素原子３個〜８個のシクロアルキル環を形成することができ、  
Ｒ１０は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエチル、トリフェニルメチル、ベンジル、Ｃ２〜Ｃ８アルコキシメチル、トリ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）シリルエトキシメチル、クロロエチル、またはテトラヒドロピラニルであり、
Ｒ１１は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、またはＣ７〜Ｃ１０フェニルアルキルであり、
Ｘは、５−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、５−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキサニル、４−（２，２−ジ−（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）［１，３］ジオキソラニル、または４−（２，２−ジ−（Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル）［１，３］ジオキソラニルであり、
ｂは０から６まで整数、
ｄは０から６までの整数、かつ、
ｆは０から６までの整数である。
好ましい実施形態では、Ｒが、−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０、Ｘまたは−（ＣＲ３Ｒ４）ｆＯＲ１０置換Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキルから選択される少なくとも１つの部分を含有する。このような化合物の医薬的に許容される塩も提供される。      
【００２１】
式Ｉのプロドラッグは、適切な哺乳類に投与する際に、式ＩＩの化合物に変換可能である。いくつかの実施形態では、投与された式Ｉの部分の濃度対時間のプロットにより形成される曲線下面積は、式ＩＩの化合物（１つまたは複数の化合物）の濃度対時間のプロットにより形成される曲線下面積よりも小さい。いくつかの実施形態では、式ＩＩのプロドラッグは、式ＩＩの化合物よりも少なくとも１０倍、および好ましくは少なくとも１００倍医薬的に活性が低い。いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物の少なくとも１０％、および好ましくは少なくとも５０％、およびより好ましくは少なくとも８５％が、投与された式Ｉの化合物の生物学的半減期と同等の式Ｉの化合物の哺乳類への投与後の期間に、式ＩＩの化合物に変換される。上述の実施形態では、実質的に、式Ｉの化合物は式ＩＩの化合物に変換されるまで医薬的に不活性である。しかし、他の実施形態では、式Ｉの化合物は式ＩＩの化合物に変換される前に著しく医薬的に活性である。  
【００２２】
好ましい実施形態では、式Ｉのポリケチドは式ＩＩのポリケチドである。  
【００２３】
【化２】
2020507632.tif 000004
【００２４】
本明細書で開示するポリケチド、例えば、式Ｉまたは式ＩＩのポリケチドは、特許文献２５で開示されているポリケチド、ラパマイシン、およびラパマイシンの他の類似体に構造的関連性を有しているにも関わらず、それらと比べて驚くべき予想外に有利な薬理学的プロファイルを示す。例えば、式ＩＩのポリケチドは、特許文献２５に開示されているポリケチドに対して、特定の病状の治療において予想外の優位性を有する。他の優位性を表１に示す。  
【００２５】
【表１】
2020507632.tif 000005
【００２６】
式Ｉのポリケチドプロドラッグ、および、特にかつ好ましくは式ＩＩのポリケチドは、予想外に有益な薬物動態も有する。特に、式ＩＩのポリケチドは、約０．４７（％Ｆ）で測定された高い経口バイオアベイラビリティを有する。この高い経口バイオアベイラビリティは、０．４７（％Ｆ）より約２分の１から４分の１低い、特許文献２５に開示されているポリケチドより、実質的にかつ著しく良好である。本発明の一態様では、この相対的バイオアベイラビリティにより、より低い毒性（例えば拡大された治療域）を有する式ＩＩの組成物の医薬的に有効な投与が可能になる。本発明の他の態様では、このバイオアベイラビリティの増加により、特許文献２５に開示されているポリケチドを経口投与する能力に比べ、式ＩＩの化合物を経口投与する能力が向上する。静脈内投与および他の投与経路に対しての経口投与の有益性は、当技術分野でよく理解されている。
【００２７】
式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチドの組成物は、任意選択ではあるが純粋である必要はない。本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）は混合物中で存在することができ、混合物中の本質的に全てのポリケチドは、式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の重量で９９．９％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の９９．５％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の少なくとも９９％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の９８％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の少なくとも９５％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の少なくとも９０％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、混合物中の８０％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドであり、または、混合物中の７０％のポリケチドは、式Ｉもしくは、好ましくは式ＩＩのポリケチドである。
【００２８】
さらに、本発明の上述のそれぞれの態様では、式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩの化合物は、任意選択で、式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩの化合物の塩、溶媒和物、またはエステルとして提供される。本発明のポリケチドの医薬的に許容される塩は、医薬的に許容される無機または有機の酸または塩基から形成される従来の塩、ならびに四級アンモニウム酸付加塩を包含する。適切な酸性塩のより具体的な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ギ酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルミチン酸、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化水素酸、リンゴ酸、ステロイック（ｓｔｅｒｏｉｃ）酸、タンニン酸などの塩を包含する。シュウ酸などの他の酸は、それら自体は医薬的に許容されないものの、任意選択で、本発明の化合物およびそれらの医薬的に許容される塩を得る際の中間体として、有用な塩の調製において有用であり得る。適切な塩基性塩のより具体的な例は、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインの塩を包含する。本発明の一態様では、式Ｉのポリケチドの医薬的に許容される塩は、１つまたは複数の医薬的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と一緒に組み合わされる。
【００２９】
同様に、本発明のポリケチド、および医薬的に許容されるその塩は、任意選択で、アルコール溶媒和物および水和物といった溶媒和物とすることができる。
【００３０】
本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）は、純粋な形態、例えば、結晶形態もしくは粉末形態、または、少なくとも１つの医薬的に許容される緩衝液、担体、もしくは賦形剤で希釈された形態で提供することができる。本発明の文脈中の、医薬的に許容される緩衝液、担体、および賦形剤は、好ましくは本発明のポリケチドと不利に相互作用せず、適切な期間において安定な製剤を提供し、そのほとんどの受容個体に対して過度に有害ではない。    
【００３１】
いくつかの実施形態では、本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）の溶液または懸濁液は、例えば、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、分散剤、例えばポリソルベート８０、界面活性剤、および可溶化剤、例えばポリエチレングリコール、Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ（ホスファチジルコリン、ダイズ脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコール、およびパルミチン酸アスコルビルからなる）などの賦形剤も含有する。
【００３２】
本発明の組成物（好ましくは式Ｉまたは式ＩＩの化合物、最も好ましくは式ＩＩ）は、非経口、経口、局所（頬側、舌下、または経皮を包含する）を包含するがこれらに限定されない何らかの適切な経路または手段を介して、ステントなどの医療機器を介して、吸入により、または注射（例えば、皮下、筋肉内、または静脈内）を介して投与することができる。その治療は、任意選択で単一用量からなるが、多くの実施形態では、好ましくは複数回の経時的な投与である。当業者は、本発明の化合物の個々の投薬の最適な量および間隔は、治療が行われている病患の性質および程度、投与の形態、経路および部位、ならびに治療されている特定の対象の年齢および状態によって決定されること、また、最終的には、用いる適当な投薬を医師が決定することを認識するであろう。この投薬は適当な頻度で繰り返されてよい。副作用が生じた場合は、投薬の量および／または頻度を通常の診療に従って変更し、または減らすことができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物は、ただ一つの活性医薬品として投与される。したがって、いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物は、任意選択で、１つまたは複数の医薬賦形剤を含有するが他の活性剤（活性剤類）は含まない医薬組成物として、疾病を予防および／または治療する目的で、ヒトなどの哺乳類に投与される。いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物は、少なくとも１つの他の活性剤を含む医薬組成物として、疾病を予防および／または治療する目的でヒトなどの哺乳類に投与され、また、任意選択で、１つまたは複数の医薬賦形剤も含有する。いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物は、任意選択で少なくとも１つの他の活性剤を含み、かつ、任意選択で１つまたは複数の医薬賦形剤も含有する医薬組成物として、疾病を予防および／または治療する目的でヒトなどの哺乳類に投与され、少なくとも１つの他の組成物は、少なくとも１つの他の活性剤も含み、任意選択で１つまたは複数の医薬賦形剤も含む（例えば、２つの組成物で、一方は少なくとも１つの式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物を含有し、他方の組成物は少なくとも１つの他の活性剤を含む）。それぞれが１つまたは複数の活性剤（式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物を含む、このような組成物の１つ）を含む複数の組成物も、疾病を予防および／または治療する目的で投与されてもよい。このような活性剤および／または組成物は、同時もしくは順次、またはそれらの何らかの組み合わせで投与されてもよく、かつ、哺乳類の同じもしくは異なる部位に、または同じもしくは異なる投与経路を通して投与されてもよい。
【００３４】
疾病の予防および／または治療のために、式Ｉの化合物、好ましくは式ＩＩの化合物と共に哺乳類に投与されてもよい活性剤は、１つまたは複数の化学療法剤、抗がん剤、放射線療法、免疫調節薬を包含するがこれらに限定されず、例えば、限定されず、以下に挙げるいずれかの１つまたは複数の活性剤である。すなわちその活性剤は、特定の種類のがん治療に関連した望ましくない何らかの副作用（例えば、疲労、貧血、食欲の変化、出血の問題、下痢、便秘、脱毛、吐き気、嘔吐、痛み、末梢神経障害、腫れ、皮膚および爪の変化、尿および膀胱の変化、嚥下障害など）を軽減または最小化する抗がん剤、アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロホスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸ナトリウムエストラムスチン、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシンなど）、代謝拮抗剤（例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、エノシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ薬剤（例えば、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフールなど）、アミノプテリン、ロイコボリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルバミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドクスウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチンなど）、抗がん性抗生物質（例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、サルコマイシン、カルジノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシンなど）、植物由来の抗がん剤（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビンなど）、免疫療法剤（例えば、抗体（例えば、抗ＰＤ１抗体、ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２５抗体、ＨＥＲ２抗体（例えばトラスツズマブ）、メシル酸イマチニブ、ＺＤ１８３９またはＥＧＦＲ抗体（例えばセツキシマブ）、ＶＥＧＦに対する抗体（例えばベバシズマブ）、ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲ阻害剤、およびＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ））、ピシバニール、クレスチン、シゾフラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾールなど）、メトトレキサート、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パミドロネート二ナトリウム、アナストロゾール、エキセメスタン、シクロホスファミド、エピルビシン、トレミフェン、レトロゾール、トラスツズマブ、メゲストロール、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビン、酢酸ゴセレリン、解糖阻害剤；１つまたは複数のホルモン治療剤（ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストロール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例えば、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェンなど）、ＥＲ分解薬（例えばフルベストラントなど）、ヒト閉経期ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ピル製剤、メピチオスタン、テストラクトン、アミノグルテチミド、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例えば、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害剤（例えば、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、抗アンドロゲン剤（フルタミド、ビカルタミド、ニルタミドなど）、５α還元酵素阻害剤（フィナステリド、デュタステリド、エプリステリドなど）、副腎皮質ホルモン薬（デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）；１つまたは複数のアンドロゲン合成阻害剤（例えばアビラテロンなど）；１つまたは複数のレチノイドおよび／またはレチノイド代謝を遅らせる薬剤（例えばリアロゾールなど）など、およびＬＨ−ＲＨアゴニスト（例えば、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、ロイプロレリン））；Ｌ−アスパラギナーゼ、アセグラトン、塩酸プロカルバジン、プロトポルフィリン−コバルト錯塩、水銀ヘマトポルフィリン−ナトリウム；トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカンなど）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えばソブゾキサンなど）、分化誘導剤（例えば、レチノイド、ビタミンＤなど）、α遮断剤（例えば、塩酸タムスロシン、ナフトピジル、ウラピジル、アルフゾシン、テラゾシン、プラゾシン、シロドシンなど）、セリンスレオニンキナーゼ阻害剤、エンドセリン受容体遮断剤（例えばアトラセンタンなど）、プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブなど）、Ｈｓｐ  ９０阻害剤（例えば１７−ＡＡＧなど）、スピロノラクトン、ミノキシジル、１１α−ヒドロキシプロゲステロン、骨吸収阻害／転移抑制剤（例えば、ゾ���ドロン酸、アレンドロン酸、パミドロン酸、エチドロン酸、イバンドロン酸、クロドロン酸）、血管新生阻害剤（例えばニンテダニブ（ＢＩＢＦ  １１２０、バルガテフ）、ベバシズマブ（アバスチン）、エベロリムス（アフィニトール）、テムシロリムス（トリセル）、レナリドマイド（レブリミド）、パゾパニブ（ボトリエント）、ラムシルマブ（サイラムザ）、ソラフェニブ（ネクサバール）、スニチニブ（スーテント）、サリドマイド（サロミド）、バンデタニブ（カプレルサ）、セジラニブ（レセンチン）、アキシチニブ（インリタ）、モテサニブ、バタラニブ、ドビチニブ、ブリバニブ、リニファニブ、チボザニブ、レンバチニブ、レゴラフェニブ（スチバルガ）、フォレチニブ、テラチニブ、カボザンチニブ（コメトリク）、ニロチニブ（タシグナ）、タンドゥチニブ、イマチニブ（グリベック）、ＢＭＳ−６９０５１４、キザルチニブ（ＡＣ２２０）、オランチニブ、オララツマブ、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、アファチニブ（ギロトリフ）、ラパチニブ（タイケルブ）、バルリチニブ、ＡＥＥ−７８８、トラスツズマブ（ハーセプチン）、セツキシマブ（エルビタックス）、パニツムマブ（ベクチビックス）、ニモツズマブ、ペルツズマブ（オムニターグ）、エルツマキソマブ、またはザルツムマブである。いくつかの実施形態では、血管新生阻害剤は、ニンテダニブ（ＢＩＢＦ  １１２０）、エベロリムス（アフィニトール）、テムシロリムス（トリセル）、パゾパニブ（ボトリエント）、アキシチニブ（インリタ）、ベバシズマブ（アバスチン）、ソラフェニブ（ネクサバール）、スニチニブ（スーテント）、サリドマイド（サロミド）、ドビチニブ、レゴラフェニブ（スチバルガ）、もしくはイマチニブ（グリベック）など、ならびに／または、任意選択で本明細書に記載の他のいずれかの活性剤もしくはそれ以外に当業者が利用可能であり得る活性剤と合わせた、それらの組み合わせおよび／もしくは混合物である。式Ｉまたは式ＩＩの化合物、最も好ましくは式ＩＩの化合物はまた、任意選択で、本明細書に記載の他のいずれかの活性剤、もしくはそれ以外に当業者が利用可能であり得る活性剤と合わせて、手術、放射線療法、遺伝子療法、温熱療法、寒冷療法、レーザー焼灼術などのいずれかの１つまたは複数、および／またはそれらの何らかの組み合わせと関連して投与されてもよい。
【００３５】
本発明のポリケチド（好ましくは式Ｉまたは式ＩＩの化合物、最も好ましくは式ＩＩの化合物）を含有する錠剤は、任意選択で、微結晶セルロース、ラクトース（例えば、ラクトース一水和物またはラクトース無水物）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシン、ブチル化ヒドロキシトルエン（Ｅ３２１）、クロスポビドン、ヒプロメロースなどの賦形剤、デンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモ、もしくはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および特定の複合ケイ酸塩などの崩壊剤、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン、またはアカシアなどの造粒結合剤を含有する。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびタルクなどの滑沢剤が任意選択で包含される。
【００３６】
同様の種類の固体組成物もゼラチンカプセルの充填剤として採用することができる。ここで、好ましい賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールを包含する。水性懸濁液および／またはエリキシル剤のために、本発明の化合物は、様々な甘味剤または香味剤、着色物質または色素と一緒に、乳化剤および／または懸濁剤と一緒に、ならびに水、エタノール、プロピレングリコール、およびグリセリンなどの希釈剤ならびにそれらの組み合わせと一緒に組み合をわせることができる。
【００３７】
任意選択で、１つまたは複数の副成分と共に圧縮または成形することにより錠剤を作製することができる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と任意選択で混合して、粉末または顆粒などの流動性形態の当該活性成分を適切な機械で圧縮することにより調製することができる。不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を適切な機械で成形することにより、成形錠剤を作製することができる。任意選択で、その錠剤はコーティングし、または切れ目を入れることができ、例えば、様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを用いて所望の放出プロファイルにし、その中の当該活性成分を徐放または制御放出するように製剤化することができる。
【００３８】
便宜上、任意選択で、製剤は単位剤形で提供され、薬学の分野でよく知られているいずれかの方法で調製することができる。このような方法は、当該活性成分（本発明の化合物）を、１つまたは複数の副成分を構成する担体に組み合わせるステップを包含する。一般に、前記製剤は、当該活性成分を液体担体もしくは微細化された固体担体またはそれら両方と均一にかつ直接的に組み合わせ、次いで、必要であれば製品の形を作ることによって調製することができる。
【００３９】
局所投与に適した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、含浸包帯、スプレー、エアロゾルまたはオイル、経皮デバイス、パウダーなどとして製剤化されてもよい。これらの組成物は、活性剤を含有する従来の方法によって調製されてもよい。したがって、それらは、防腐剤、薬剤の浸透を促進する溶剤、クリームまたは軟膏の皮膚軟化薬、およびローション用のエタノールまたはオレイルアルコールなどの、適合する従来の担体および添加剤を含んでもよい。このような担体は、組成物の約１％から最大約９８％で存在してもよい。より一般には、それは、組成物の最大約８０％を構成することになる。例示にすぎないが、クリームまたは軟膏は、所望の粘稠度を有するクリームまたは軟膏を生成するための十分な量の親水性物質と水とを混合することによって調製され、約５重量％から１０重量％の当該化合物を含有する。
【００４０】
経皮投与に適した医薬組成物は、長期間、受容個体の表皮に密着し続けることを意図した分離パッチとして提供されてもよい。例えば、当該活性剤はイオントフォレーシスによってパッチから送達されてもよい。
【００４１】
例えば、口および皮膚などの外部組織に適用する際は、当該組成物は好ましくは局所用の軟膏またはクリームとして適用される。軟膏に製剤化される場合、当該活性剤はパラフィン系または水混和性のどちらの軟膏基剤とも一緒に用いてよい。あるいは当該活性剤は、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤と一緒にクリームに製剤化されてもよい。
【００４２】
非経口投与には、当該活性成分および滅菌溶媒を利用して流体の単位剤形が製剤化され、滅菌溶媒は、これらに限定されないが、例えば、水、アルコール類、ポリオール類、グリセリンおよび植物油類であり、水が好ましい。当該活性成分は、その溶媒および用いる濃度に応じて、その溶媒への懸濁または溶解のどちらも可能である。溶液を調製する際は、当該活性成分を注射薬用の水に溶解し、ろ過滅菌し、その後適切なバイアルまたはアンプルに充填し、密封することができる。
【００４３】
有利には、局所麻酔薬、防腐剤、および緩衝剤などの薬剤を、前記溶媒に溶解することができる。安定性を高めるために、当該組成物をバイアルに充填し、真空下で水を除去した後、凍結することができる。次に、凍結乾燥した粉末をバイアルに密封し、付随する注射薬用の水のバイアルを供給して、使用前に前記液体を再構成してもよい。
【００４４】
非経口懸濁液は、当該活性成分を溶媒に溶解ではなく懸濁させるということを除いては、溶液と実質的に同じやり方で調製するが、滅菌をろ過によって行うことはできない。当該活性成分は、前記滅菌溶媒に懸濁する前に、エチレンオキシドにさらすことにより滅菌することができる。有利には、界面活性剤または湿潤剤が、当該活性成分を容易に均一分布させるために組成物に包含される。
【００４５】
式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物は、当技術分野で公知の医療機器を用いて投与されてもよい。例えば、一態様では、本明細書に記載の医薬組成物を、特許文献２６、特許文献２７、特許文献２８、特許文献２９、特許文献３０、特許文献３１、または特許文献３２に開示されている機器などの無針皮下注射器で投与することができる。よく知られた移植片およびモジュールの有用な例として、これらに限定されないが以下の特許文献が挙げられ、特許文献３３では、制御された速度で薬物を分注するための埋め込み型マイクロ注入ポンプが開示されており、特許文献３４では、皮膚を通して薬を投与するための治療用機器が開示されており、特許文献３５では、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプが開示されており、特許文献３６では、絶え間なく薬剤を送達するための流量可変埋め込み型注入装置が開示されており、特許文献３７では、複数チャンバーの区画を有する浸透圧薬剤送達システムが開示されており、かつ、特許文献３８では、浸透圧薬剤送達システムが開示されている。具体的な実施形態では、ポリケチド（例えば式Ｉまたは式ＩＩのポリケチド）およびそのポリケチドを含む組成物は、薬剤溶出ステントを用いて投与されてもよく、薬剤溶出ステントは、例えば、特許文献３９および関連する論文またはＰｅｒｉｎによって記された論文（Ｐｅｒｉｎ，Ｅ  Ｃ，２００５年）に記載のものに相当する薬剤溶出ステントなどである。他の多くのこのようなインプラント、送達システム、およびモジュールが当業者に公知である。
【００４６】
式Ｉおよび／または、好ましくは式ＩＩのポリケチドを含む本明細書に記載のポリケチドおよび組成物は、その必要性がある哺乳類の疾患または病状を治療、予防、または緩和するために投与することができる。好ましい実施形態では、この哺乳類はヒトである。この哺乳類に特有な何らかの病状を、医薬的に適量の式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩの製剤を、その必要性がある哺乳類に投与することによって治療することができる。通常の当業者は、本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）の投与経路およびその量を、慣例的な検査、ガイドライン、および手順に従って容易に選択することができる。本発明の化合物の投薬量は、特定の化合物、関与する疾病、前記対象、ならびに疾患の性質および重症度、ならびに前記対象の体調、ならびに選択した投与経路によって異なる。適当な投薬量は当業者によって容易に決定することができる。限定されないが、例えば、毎日約０．１ｍｇから最大１００ｍｇまでの用量、および任意選択で、毎日約０．１ｍｇから１５ｍｇ（またはより低い頻度でより多くの用量）が企図されてもよい。
【００４７】
当該組成物は、本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）の何らかの適切な組み合わせ、および他の構成成分を含有してもよい。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の組成物は、０．１重量％から７０重量％までの本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）、好ましくは５重量％から６０重量％まで、さらに好ましくは１０重量％から３０重量％までの本発明のポリケチド（式Ｉまたは、好ましくは式ＩＩのポリケチド）を、投与方法および他のファクターに応じて含有する。    
【００４８】
理論に縛られたくないが、ラパマイシンに関連するポリケチドの投与に伴う有害な副作用は、ｍＴＯＲＣ１阻害よりもｍＴＯＲＣ２阻害によって引き起こされると考えられる。したがって、当業者は、細胞のエスケープ機構が特に大きく懸念されていない病患については、ｍＴＯＲＣ１に選択的なポリケチドを選んでもよい。一方、がん細胞は、治療された哺乳類において薬剤耐性がんを発生させ得る急速なゲノム可塑性を示すことがよく知られている。これらの疾病については、よりバランスのとれたやり方で、ｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を阻害するｍＴＯＲ阻害ポリケチドを投与することが往々にして望ましい。式Ｉのポリケチド、特に式ＩＩのポリケチドを包含するポリケチドは、特許文献２５に開示されているポリケチドよりもバランスのとれた手段で、予想外にかつ有利にｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を阻害する。理論に縛られたくないが、本発明は、本明細書で開示するポリケチド（例えば、式Ｉおよび／または式ＩＩのポリケチド）を、その必要性がある哺乳類に投与することを含む、そのような哺乳類を治療する方法を提供し、治療される病患は、がんおよび他の増殖性異形成、真菌感染、全身性エリテマトーデスから選択される。本発明の一態様では、がん性の病患は、リンパ管平滑筋腫症、白血病、腎細胞がん、卵巣がん、膵臓がん、またはリンパ腫である。他の態様も本明細書に記載する。
【００４９】
本明細書に記載の式Ｉおよび／または式ＩＩのポリケチドは、式ＩＩＩのスタータ酸をフィードすることにより、直接発酵産物として産生することができる。    
【００５０】
【化３】
2020507632.tif 000006
【００５１】
このような工程に適切な条件は、特許文献４０（特許文献４１）および特許文献４２（特許文献４３）に記載されており、その内容は、その全体が参照により組み込まれる。具体的には、ラパマイシン産生生物であるストレプトマイセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）の変異株が作製されたが、その変異株はｒａｐＫ遺伝子を欠き、Ｓ．ハイグロスコピクスΔｒａｐＫ（ＢＩＯＴ−４０１０、特許文献２５の実施例１を参照されたく、その方法および材料は参照により本明細書に組み込まれる）と呼ばれる。他の適切な産生株は、Ｓ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０（ｐＬＬ１７８）、Ｓ．ハイグロスコピクスＮＲＲＬ５４９１の誘導体を包含する。Ｓ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０の産生については、特許文献４０（特許文献４１）の実施例２に記載されており、適切な産生株を作製するには、ｐＬＬ１７８（特許文献４２（特許文献４３）の実施例７に記載されている）などの発現プラスミドを用い、ｒａｐＩＪＭＮＯＱＬが補完されなければならない。ＢＩＯＴ−４０１０または、Ｓ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０（ｐＬＬ１７８）（特許文献４０（特許文献４１）、特許文献４２（特許文献４３））などの類似株を、これに限定されないがＭＤ６などの適切な培地で、２６℃などの適切な温度で、エキソ−（１Ｒ、２Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸塩を添加し、通常２４時間発酵させることで、本発明の化合物が十分に産生される。接種から３日ないし８日の間にピーク力価が観察される。式ＩＩの化合物の酸の形態は、エキソ−（１Ｒ、２Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸である。
【００５２】
ラパマイシン産生株は、ストレプトマイセス・ハイグロスコピクス、アクチノプラネスｓｐ．Ｎ９０２−１０９（Ｎｉｓｈｉｄａら（１９９５年）を参照されたい）、およびストレプトマイセスｓｐ．Ａ  ９１−２６１４０２（特許文献４４を参照されたい）を包含する。他のラパマイシン産生株については、特許文献４５で述べられている。特許文献４４および特許文献４５の内容は、その全体が参照により本特許明細書に組み込まれる。
【００５３】
本発明の化合物は、例えば他のポリケチド類を包含するがそれらに限定されない他の発酵産物から、フラッシュクロマトグラフィー、分取ＨＰＬＣ、および／または結晶化などの、それらに限定されないが何らかの適切な従来の分離技術によって精製することができる。
【００５４】
よって、一態様において、本発明は、本発明の化合物を実質的に純粋な形態で調製するためのプロセスを提供し、そのプロセスは、ステップ（ｉ）遺伝子改変されて、ｒａｐＫ遺伝子を除去または不活性化のどちらかがなされているラパマイシン産生株に、または、他の実施形態ではｒａｐＫ遺伝子産物ＲａｐＫ（Ａｎｄｅｘｅｒら，２０１１年を参照されたい）と同等の機能を有するコリスマターゼをコード化する遺伝子を除去もしくは不活性化されているラパマイシン産生株に、式ＩＩＩすなわち化３のスタータ酸をフィードするステップと、
【００５５】
【化４】
2020507632.tif 000007
【００５６】
ステップ（ｉｉ）本発明の化合物を単離および精製するステップとを含む。
【００５７】
式Ｉの化合物は、保護されたヒドロキシ酸およびポリプロ酸、活性化されているアルコキシカルボン酸またはポリアルコキシカルボン酸を用いて、式ＩＩの化合物をアシル化することによって調製し、続いて、もし所望であればアルコール保護基を除去することができる。カルボン酸塩の活性化のためのいくつかの手順が当技術分野において公知であるが、好ましい方法としては、カルボジイミド、混合無水物、または酸塩化物が利用される。例えば、適当な置換カルボン酸を、２，４，６−トリクロロベンゾイル無水物などのアシル化基で混合無水物として活性化することができる。穏やかな塩基性条件下で、混合無水物で式ＩＩを処理することにより、所望の化合物が提供される。あるいは、前記アシル化反応は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩およびジメチルアミノピリジンで行うことができる。    
【００５８】
式ＩＩの不安定なヒドロキシル基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル保護基などの適切な保護基を所定の手順で添加することによって、式Ｉの合成の間に保護することができ、その保護基は、後の段階で、酢酸／水／ＴＨＦの溶液などの穏やかな酸性条件下で除去することができる。さらに、脱保護については特許文献４６に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。代替の合成方法が特許文献４７の方法に似た方法で提供されており、特許文献４７は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
式Ｉおよび式ＩＩの化合物は、これに限定されないが分取精製クロマトグラフィーといった何らかの適切な分離技術によって精製することができる。
【００６０】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、先に記載したような式Ｉの化合物および／または医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、もしくはその混合物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、このような化合物、医薬的に許容される塩、溶媒和物、エステル、または混合物、および任意選択で、少なくとも１つの医薬的に許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＩのプロドラッグを提供し、そのプロドラッグは、式Ｉのポリケチド、ならびに医薬的に許容される式Ｉの化合物の塩、溶媒和物、および水和物である。いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＩの化合物、ならびに医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、もしくはその混合物、および／またはそれらを含む組成物（例えば、医薬的に許容される担体を含む医薬組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、式ＩＩの化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、式Ｉの化合物のそのエステル、および／またはそれらの混合物からなる群から選択される化合物を約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上（すなわち「実質的に純粋」）、約９５％以上、または約９９％以上含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、前記組成物は、本質的に純粋な混合物を含有し、本質的に純粋な混合物は、微量または医薬的に重要でない量の、他のポリケチド、式Ｉおよび好ましくは式ＩＩの化合物、医薬的に許容される式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩの化合物の塩、その溶媒和物、そのエステル、ならびにそれらの混合物からなる群から選択される化合物を含有してもよい。いくつかの実施形態では、本開示は、医薬的に許容される担体、希釈剤または賦形剤、ならびに式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩのポリケチドを含む医薬組成物を提供し、式Ｉおよび、好ましくは式ＩＩの化合物の医薬的に許容される塩、溶媒和物および／または水和物は、その医薬組成物のポリケチド構成成分の少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％を構成する。このような組成物のいくつかの実施形態では、前記ポリケチド化合物は、前記医薬組成物において本質的に唯一のポリケチドである。このような組成物のいくつかの実施形態では、式Ｉのプロドラッグは式ＩＩのポリケチドに置換されてもよい。いくつかの実施形態では、前記溶媒和物は、存在する場合は水和物である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、細胞の増殖を阻害する方法、その方法は、抗増殖有効量の式ＩＩの化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、もしくはその混合物および／もしくは式ＩＩを含む混合物、ならびに／または式ＩＩを含む組成物に、その細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、前記細胞はヒトの細胞であり、好ましくはヒトのがん細胞（これらに限定されないが、例えば、腺がん、膀胱がん、血液がん、骨がん、脳がん、固形腫瘍、神経膠芽腫、乳房腺がん、骨髄がん、赤白血病、骨肉腫、結腸直腸がん、類表皮がん、上皮がん、子宮がん、線維肉腫、胃腺がん、腎臓がん、白血病、急性リンパ白血病、慢性骨髄性白血病、平滑筋芽腫、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病卵巣がん、卵巣腺がん、膵臓がん、前立腺腺がん、横紋筋肉腫、腎細胞がん、肉腫、子宮肉腫、扁平上皮がん、膀胱扁平上皮がん、頭頸部がん、および／または移行上皮がんなど）などである。いくつかの実施形態では、前記方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法、またはｉｎ  ｖｉｖｏの方法である。いくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物の抗増殖性効果は、細胞数ＥＣ５０、ＩＣ５０、および／またはＧＩ５０を用いて判定される。いくつかの例示的な実施形態では、ＥＣ５０は、約１Ｅ−０３（０．００１）マイクロモル以下、もしくは１Ｅ−０３（０．００１）マイクロモルと７．１７Ｅ−０５（０．００００７１７）マイクロモルの間、およびまたはラパマイシンのＥＣ５０の少なくとも約１０％である。いくつかの例示的な実施形態では、細胞数ＩＣ５０は、約１Ｅ−０１（０．１）マイクロモル以下、または約１Ｅ−０１（０．１）マイクロモルと約２．９７Ｅ−０４（０．０００２９７）マイクロモルの間、および／または少なくともラパマイシンのＩＣ５０の約１０％である。いくつかの例示的な実施形態では、細胞数ＧＩ５０は、１Ｅ−０２（０．０１）マイクロモル、１Ｅ−０２（０．０１）マイクロモルと約８．７２Ｅ−０４マイクロモルの間、および／またはラパマイシンのＧＩ５０の少なくとも約１０％である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本開示は、がんを予防および／または治療する方法も提供し、その方法は、有効量（例えば治療有効量）の当該化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、式Ｉもしくは式ＩＩ、好ましくは式ＩＩの化合物のそのエステル、ならびに／またはそれらを含む組成物および／もしくは混合物を、前記哺乳類（例えばヒト）に投与することを含む。いくつかの実施形態では、その必要性がある哺乳類を治療する方法は、有効量の、式ＩＩの化合物、医薬的に許容されるその塩、その溶媒和物、そのエステル、もしくはその混合物および／もしくは式ＩＩの化合物を含む混合物、ならびに／または式ＩＩを含む組成物（例えば治療有効量）を前記哺乳類に投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記哺乳類は以下からなる群から選択される疾病を有し、その群は、がん（これらに限定されないが、例えば、血液がん、骨がん、固形腫瘍、腺がん、脳がん、神経膠芽腫、乳房腺がん、骨髄がん、赤白血病、骨肉腫、結腸直腸がん、類表皮がん、上皮がん、子宮がん、線維肉腫、胃腺がん、腎臓がん、白血病、急性リンパ白血病、慢性骨髄性白血病、平滑筋芽腫、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、白血病卵巣がん、卵巣腺がん、膵臓がん、前立腺腺がん、横紋筋肉腫、腎細胞がん、肉腫、子宮肉腫、扁平上皮がん、膀胱扁平上皮がん、頭頸部がん、および移行上皮がんなど）、全身性エリテマトーデス、肺炎症であり、かつ／または、前記哺乳類は、臓器移植拒絶反応もしくは宿主対移植片疾病の予防が必要である。いくつかの実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物は、ただ一つの活性医薬品（活性医薬品類）として投与され、または、式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物（化合物類）は、１つまたは複数の化学療法剤、抗がん剤もしくは免疫調節薬、ならびに／または放射線療法および／もしくは手術と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、この投与は、非経口、経口、局所、頬側、舌下、経皮、医療機器、ステント、吸入、注射、皮下、筋肉内、または静脈内からなる群から選択される経路を介し、その投与は、同じもしくは異なる投薬で単一用量もしくは複数用量を含み、かつ／または、組み合わせの要素は、物理的および／もしくは時間的に同時もしくは別々に投与される。いくつかの実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物（化合物類）は、ビーズ、錠剤、カプセル、溶液、または懸濁液として提供される。いくつかの実施形態では、本開示は、がんの予防および／または治療のための薬の調製において、式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物の使用を提供する。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後６時間までの間、哺乳類の全血中のおよその平均濃度が３５０ｎｇ／ｍＬから７００ｎｇ／ｍＬ（例えば、３８３ｎｇ／ｍＬから６５１ｎｇ／ｍＬ）になるように、式ＩＩの化合物を哺乳類に約２ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後約２４時間で、哺乳類の全血中のおよその平均濃度が１５ｎｇ／ｍＬから５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、１５ｎｇ／ｍＬから４３．７ｎｇ／ｍＬ）になるように、式ＩＩの化合物を哺乳類に約２ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後６時間までの間、哺乳類の全血中のおよその平均濃度が６００ｎｇ／ｍＬから３５００ｎｇ／ｍＬ（例えば、６５７ｎｇ／ｍＬから３３２３ｎｇ／ｍＬ）になるように、式ＩＩの化合物を哺乳類に約１０ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、投与後約２４時間で、哺乳類の全血中のおよその平均濃度が２０ｎｇ／ｍＬから１５０ｎｇ／ｍＬ（例えば、２１ｎｇ／ｍＬから１３８ｎｇ／ｍＬ）になるように、式ＩＩの化合物を哺乳類に約１０ｍｇ／ｋｇで投与することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、固形腫瘍を有する哺乳類に式ＩＩの化合物を投与することを含み、その哺乳類に複数の投与を行い、その結果、その固形腫瘍の体積が減少する（例えば、少なくとも約２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、または６０％のいずれか）。いくつかのこのような実施形態において、腫瘍量の著しい減少は、約８日間連続して式ＩＩを投与したことに起因する。いくつかの実施形態では、約４日間連続して式ＩＩの化合物を投与した後、腫瘍百分率によって測定された著しい減少が示されている。動物モデル（例えばマウス）を用いるようないくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物は３０日間哺乳類に投与され、結果として、９５％信頼区間が約０．３４８１から約１．１１、ダネット多重比較検定によって求められた調整Ｐ値が０．０００１で、未処置の哺乳類と比較した平均差腫瘍百分率は約０．７２９１である。いくつかの実施形態では、本開示は、式Ｉおよび／または式ＩＩの化合物の少なくとも１つの治療有効量を含むがんを予防および／または治療するためのキット、ならびに、がんを予防および／または治療するためのそのキットを用いる手順を提供する。
【００６３】
いかなる種類の投与でも利用してもよい。いくつかの実施形態では、当該化合物、組成物、および／または混合物は、アプリケーションにより埋め込み型医療機器（例えばステント）によって投与される。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、式Ｉの化合物または医薬的に許容されるその塩を調製するプロセスも提供し、そのプロセスは、遺伝子改変されてｒａｐＫ遺伝子またはその相同体が除去または不活性化されているラパマイシン産生株に対するフィードスタータ（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔａｒｔｅｒ）の式ＩＩＩのエキソ−（１Ｒ、２Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸塩を含み、
【００６５】
【化５】
2020507632.tif 000008
【００６６】
式中、Ｘ＝Ｈ、アルキル、ナトリウム、またはカリウムである。
【００６７】
用語「約」「およそ」などは、数値または範囲の列挙の前にある場合、その用語がその列挙または範囲の個々の値の直前にあるかのように、列挙または範囲の個々の値のことを個別に指す。それらの用語は、それらの用語が指す値が、正確に、それに近い、またはそれに類似していることを意味する。本明細書で用いられるように、対象または宿主または哺乳類は、個体であることを意味する。その対象は、猫および犬、家畜（例えば、牛、馬、豚、羊、山羊）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）ならびに鳥などの、飼育動物などの哺乳類を包含し得る。また、哺乳類が、霊長類またはヒトであってもよい。「任意選択の」または「任意選択で」は、続いて記載する事象または状況が生じる場合と生じない場合とがあり、かつ、その記載は、事象または状況が発生する事例と発生しない事例とを包含することを意味する。例えば、「任意選択で組成物は組み合わせを含むことができる」という表現は、その組成物は異なる化合物もしくは分子の組み合わせを含んでもよく、または組み合わせを含まなくてもよいことを意味し、したがって、この記載は、その組み合わせ（すなわち組み合わせの個々の要素）および組み合わせがないことの両方を包含する。用語「組み合わされた」または「組み合わせ」または「併用して」は、特定の疾病の治療、予防、および／または回復のために、一緒に投与される薬剤の物理的な組み合わせ、または投薬計画（例えば、物理的および／または時間的に分けて投与されるなど）における２つ以上の薬剤の使用を言う。本明細書では、「範囲」が、約１つの特定の値からおよび／または約別の特定の値までとして表されてもよい。このような「範囲」が表される場合、別の態様は、１つの特定の値から、および／または１つの特定の値までを包含する。同様に、値が近似として表される場合、前に「約」または「およそ」を用いることにより、特定の値が別のアスペクトを形成することが理解されよう。さらに、各範囲の終点は、他の終点との関係において、かつ他の終点とは独立して、両方で重要であることが理解されよう。「範囲」（例えば、９０％から１００％）は範囲そのものを包含し、ならびに、各値が個別に載せられているかのように範囲内の独立したそれぞれの値を包含することを意味する。本明細書および後の特許請求の範囲にわたって、文脈上他に要求されない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、ならびに含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、示された整数、ステップ、整数の群またはステップの群を包含するが、他の整数、ステップ、整数の群またはステップの群を除外しないことを示唆することが理解されよう。特許および特許出願を含む本出願で参照する全ての参考文献は、その全体が参照により本開示に組み込まれる。    
【００６８】
さらに、特定の実施形態を以下の実施例において記載する。これらの実施形態は、例として提供するに過ぎず、特許請求の範囲を限定することをなんら意図しない。
【実施例】
【００６９】
実施例１
この実施例では、本発明のポリケチドが、特許文献２５に開示されているポリケチドよりも低い選択性でｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を阻害することを実証する。この実施例からのデータを表１に開示する。
【００７０】
Ａ．細胞培養
ＰＣ３細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ−グルタミンを追加したＦ１２Ｋ培地に維持し、９５％空気および５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃で培養した。細胞を１００ｎＭの実施例（Ｉ）で２４時間処理し、ＲＩＰＡ緩衝液（３００ｎＭのＮａＣｌ、１．０％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）、ホスファターゼ阻害剤２，３（Ｓｉｇｍａ社））で回収した。洗剤親和性の改良ローリー法タンパク質アッセイ（ＤＣタンパク質アッセイ、Ｂｉｏｒａｄ社）を用い、タンパク質濃度を決定した。
【００７１】
Ｂ．  ウエスタンブロット解析
同量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｕ−Ｐａｇｅシステムを用いてニトロセルロースメンブレンに移行させた。そのメンブレンを５％ミルクで１時間ブロッキングし、以下の適当な抗体、すなわち、ａｎｔｉ−ｒｐＳ６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社  ＃２２１７）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ−ｒｐＳ６（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社  ＃２２１１）、ａｎｔｉ−ｐｈｏｓｐｈｏ  Ａｋｔ（Ｓ４７３）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社  ＃４６９１）で一晩インキュベートした。翌日、ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、２次抗体（ｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｒａｂｂｉｔ  ｈｒｐが結合）で２時間インキュベートし、最後にＴＢＳＴでさらに３回洗浄した。ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて目的のタンパク質を検出し、ＩｍａｇｅＪを用いてブロットを定量化した。ここで、そのデータを表１に報告する。この実施例は、式ＩＩのポリケチドが、特許文献２５に開示されているポリケチドよりも低い選択性でｍＴＯＲＣ１およびｍＴＯＲＣ２を阻害することを実証している。
【００７２】
実施例２
この実施例では、ハイコンテント蛍光イメージングまたはバイオルミネセンスにより、薬剤処理に対するがん細胞株の増殖応答を測定するＯｎｃｏＰａｎｅｌ（商標）細胞増殖アッセイを用いて、上記の細胞株の増殖の阻害を、スタウロスポリンおよびラパマイシンで観察されたものと比較する。
【００７３】
細胞を、ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、または専用の培地で成長させた。細胞を３８４ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ２の加湿した雰囲気中、３７℃でインキュベートした。細胞播種の翌日に化合物を添加した。同時に、時間ゼロの未処理細胞プレートを作製した。３日間のインキュベーションの後、核の蛍光イメージングができるように、細胞を固定し染色した。化合物（１ｍＭの原液）を、最高試験濃度（１マイクロモル）から半対数ステップで段階的に希釈し、最大アッセイ濃度の０．１％ＤＭＳＯで、１０の濃度についてアッセイした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＩｍａｇｅＸｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ  ＸＬハイコンテントイメージャーを用いて自動蛍光顕微鏡観察を行い、４Ｘ対物レンズで画像を収集した。１６ビットＴＩＦＦ画像を得、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ５．１．０．４１ソフトウェアで解析した。
【００７４】
取り込まれた核色素の蛍光強度によって細胞増殖を測定した。測定値は相対細胞数と呼ばれ、測定された核強度は、以下の式を用いて対照百分率（ＰＯＣ）に変換した。    
【００７５】
【数１】
2020507632.tif 000009
【００７６】
式中、Ｉｘは濃度ｘでの核強度、Ｉ０は未処理溶媒ウェルの平均核強度である。
【００７７】
細胞応答パラメータは、シグモイド単一部位投与量応答モデルへの非線形回帰を用いて計算した。  
【００７８】
【数２】
2020507632.tif 000010
【００７９】
式中、ｙは濃度ｘで測定した応答、ＡおよびＢは応答の下限値および上限値、Ｃは応答中間点の濃度（ＥＣ５０）、およびＤはヒルスロープ（Ｒｅｆ．１）である。
【００８０】
数３を用い、時間ゼロ未処理プレートを用いてアッセイ期間中の倍加の回数を求めた。
【００８１】
【数３】
2020507632.tif 000011
【００８２】
式中、Ｎはアッセイ終点の未処理ウェル中の細胞の数、ＮＴ０は化合物添加時の細胞の数である。
【００８３】
細胞数ＩＣ５０は、最大限可能な応答の５０％での試験化合物の濃度である。ＥＣ５０は、曲線の変曲点または有効応答の半分での試験化合物の濃度（近似曲線解のパラメータＣ）である。ＧＩ５０は、観察された成長を半分に減らすために必要な濃度（曲線の最大値と時間ゼロ値の間の中間）である。「細胞数活性面積」は、曲線の上部分の積分面積の概算である（非特許文献１２）。細胞数活性面積値は０から１０であり、ゼロの値は、全ての濃度で増殖が阻害されないことを表し、１０の値は全ての濃度で増殖が完全に阻害されることを表す。まれな事例では、値が＜０、または＞１０が観察されてもよい。これらの事例では、値＜０は０と同等であると考えられ、一方、値＞１０は１０と同等であると考えられるべきである。カーブフィッティング、計算、およびレポートの作製は、カスタムデータ削減エンジンおよびＭａｔｈＩＱベースのソフトウェア（ＡＩＭ）を用いて行った。溶媒バックグラウンドの試験細胞株への影響を表２にまとめた。
【００８４】
【表２】
2020507632.tif 000012
【００８５】
スタウロスポリン、ラパマイシン、および式ＩＩの化合物を用いて行ったこれらのアッセイの結果を表３に示す。
【００８６】
【表３−１】
2020507632.tif 000013
【００８７】
【表３−２】
2020507632.tif 000014
【００８８】
【表３−３】
2020507632.tif 000015
【００８９】
各細胞株の増殖に対する式ＩＩの化合物の影響について、さらに詳細な解析を下の表４に提供する。
【００９０】
【表４−１】
2020507632.tif 000016
【００９１】
【表４−２】
2020507632.tif 000017
【００９２】
【表４−３】
2020507632.tif 000018
【００９３】
【表４−４】
2020507632.tif 000019
【００９４】
【表４−５】
2020507632.tif 000020
【００９５】
【表４−６】
2020507632.tif 000021
【００９６】
【表４−７】
2020507632.tif 000022
【００９７】
【表４−８】
2020507632.tif 000023
【００９８】
【表４−９】
2020507632.tif 000024
【００９９】
【表４−１０】
2020507632.tif 000025
【０１００】
異種移植モデルが利用可能な細胞株に関するこのデータの概要を表５に提供する。
【０１０１】
【表５】
2020507632.tif 000026
【０１０２】
実施例３
この実施例では、本発明のポリケチドが、特許文献２５に開示されているポリケチドと比較して予想外に有利な薬物動態を有することを実証する。表６に、雄のスプラーグドーリーラットにおける２ｍｇ／ｋｇの単回急速静脈内投与の後の、実施例（Ｉ）の薬物動態パラメータを示す。
【０１０３】
【表６】
2020507632.tif 000027
【０１０４】
表７に、雄のスプラーグドーリーラットにおける１０ｍｇ／ｋｇの単回急速経口投与の後の、実施例Ｉの薬物動態パラメータを示す。
【０１０５】
【表７】
2020507632.tif 000028
【０１０６】
この実施例は、式ＩＩのポリケチドが、よりバランスのとれたＴＯＲＣ１／ＴＯＲＣ２選択性に加え、高い経口バイオアベイラビリティを包含するがこれに限定されない、予想外に望ましい薬物動態を有することを実証している。
【０１０７】
実施例４
この実施例では、本発明の化合物の薬物動態およびバイオアベイラビリティを判定する１つの方法について説明する。  
【０１０８】
当業者は、これらに限定されないが以下に記載の方法、ならびに、Ｇａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら（２０００年）およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら（１９９８年）ならびにそれらの参考文献に記載の方法を包含する、当業者に公知のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を用いて、本発明の化合物の薬物動態およびバイオアベイラビリティを判定することができる。化合物のバイオアベイラビリティは、複数のファクター（例えば、水溶性、細胞膜透過性、タンパク質結合および代謝の程度、ならびに安定性）によって判定され、それぞれのファクターは本明細書の実施例に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験によって判定されてもよく、１つまたは複数のこれらのファクターにおける改善が、化合物のバイオアベイラビリティの改善につながることが当業者には理解されよう。あるいは、本発明の化合物のバイオアベイラビリティは、より詳細に以下に記載するような、または本明細書の実施例に記載するようなｉｎ  ｖｉｖｏの方法を用いて測定されてもよい。
【０１０９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでバイオアベイラビリティを測定するためには、腹腔内（ｉ．ｐ．）または静脈内（ｉ．ｖ．）と経口（ｐ．ｏ．）との両方で試験動物（例えばマウスまたはラット）に化合物が投与されてもよく、薬剤の血漿濃度が経時的にどのように変化するかを調べるために、一定の間隔で血液試料が採取される。時間経過にともなう血漿濃度の経時変化を用いて、標準モデルを用いた割合としてその化合物の絶対バイオアベイラビリティを計算することができる。典型的な手順の例を以下に記載する。
【０１１０】
例えば、マウスまたはラットに、１ｍｇ／ｋｇないし３ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を静脈内投与するか、または、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの本発明の化合物を経口投与する。血液試料は５分、１５分、１時間、４時間、および２４時間の間隔で採取し、その試料中の前記化合物の濃度をＬＣＭＳ−ＭＳで定量した。次に、血漿中濃度または全血中濃度の経時変化を用いて主要パラメータを導き出すことができ、そのパラメータには、血漿中または血液中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ−体循環に達する未変化の薬剤の総量に正比例する）、血漿中または血中の最高（ピーク）薬剤濃度、血漿中または血液中の薬剤濃度が最高になる時間（ピーク時間）などがあり、さらに、バイオアベイラビリティの正確な判定に用いるファクターとして、化合物の終末相半減期、全身クリアランス、定常状態分布容積、およびＦ％がある。次に、非コンパートメント法またはコンパートメント法によってこれらのパラメータを解析して、計算された割合のバイオアベイラビリティを得る。この種類の方法の例として、Ｇａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら（２０００年）およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら（１９９８年）ならびにそれらの中の参考文献を参照されたい。
【０１１１】
以下に示すのは、式ＩＩの化合物をマウスに投与した後の全血中濃度である。式ＩＩの化合物を２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇでマウスに投与し、その化合物の全血中での濃度を定量した。この定量は、タンパク質沈殿、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、および質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を用いて行った。全血およびマトリックス較正標準の１０μｌのアリコートを９６ウェルプレートに分配し、マトリックスブランクのためのブランクマトリックスおよび対照ブランクの１０μｌのアリコートを対照として含めた。１０μｌの水を各試料に添加して、次いでボルテックスした。前記マトリックスブランク以外の各試料に１６０ｍｌの内部標準を添加し、前記マトリックスブランクに１６０μｌの水：アセトニトリル（ＡＣＮ）７０：３０を添加した。これに続いて、＞３５００ｒｐｍで５分間ボルテックスした。次に、得られた１５０μｌの上清を新しい９６ウェルプレートに移し、その試料を３５℃で送風乾燥した。次に、得られた産物を９０μｌのＡＣＮで再構成した。  ＬＣをＬＣ装置で行った。条件および較正標準を表８および表９に示す。
【０１１２】
【表８】
2020507632.tif 000029
【０１１３】
【表９】
2020507632.tif 000030
【０１１４】
これらの分析の結果を表１０および表１１にまとめた。
【０１１５】
【表１０】
2020507632.tif 000031
【０１１６】
【表１１】
2020507632.tif 000032
【０１１７】
上に示すように、式ＩＩは、２ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇを腹腔内経路（ＩＰ）を介して１日１回（ＱＤ）３日間投与した後、全血中で経時的に十分な濃度を示している。
【０１１８】
実施例５
異種移植研究
雌のヌードマウスにおいて、Ｕ−１１８  ＭＧ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１５、ヒト脳神経膠芽腫）固形腫瘍への式ＩＩの化合物の抗腫瘍有効性を判定するために研究を行った。この研究では、試験薬の抗腫瘍活性を評価するために、進行期の皮下異種移植を成立させ、臨床的に関連する活性のパラメータを求められるようにした。薬剤有効性の評価に用いるエンドポイントは、相対的な腫瘍成長（処置マウスと対照マウスの腫瘍を比較）とした。このモデルでは腫瘍成長をモニターし、通常、腫瘍が１００ｍｇから３００ｍｇの重量範囲に達すると、試験薬の処置が開始される。毒性および有効性を判定するために、腫瘍の大きさおよび体重を週に２回入手した。この研究に用いたＵ−１１８  ＭＧ  （「ＡＴＣＣ」  ＨＴＢ−１５）細胞株は、５０才男性のコーカサス人から採取された悪性神経膠芽腫から単離した。研究のエンドポイントを以下のパラメータを用いて求めた。そのパラメータは、腫瘍成長阻害百分率（％ＴＧＩ）＝１００（Ｗｃ−Ｗｔ）／Ｗｃ＝１００（１−Ｗｔ／Ｗｃ）、式中、Ｗｃは対照群の腫瘍重量中央値、およびＷｔは、処置群の腫瘍重量中央値；腫瘍の寛解および退行（％ＲＥＧ＝１００（Ｗ０−Ｗｉ）／Ｗ０、式中、Ｗ０は、処置群についての処置開始時の腫瘍重量中央値、およびＷｉはその群についての任意の一定時間での腫瘍重量中央値；ｌｏｇ１０細胞死滅［日単位のＴ−Ｃ値／（３．３２）（Ｔｄ）］、式中、Ｔ−Ｃは腫瘍成長遅延；Ｔ＝処置群の腫瘍が所定の大きさ（すなわち１，０００ｍｇ）に達するのに必要な時間（日数）中央値、Ｃは、対照群がその同じ大きさに達する時間（日数）中央値である；および、腫瘍のない生存マウスはこれらの計算から除外された、Ｔｄ＝対照群についての腫瘍倍加時間（日数）中央値である。
【０１１９】
雌の胸腺欠損ヌードＦｏｘｎ１ｎｕマウス（生後５週間から６週間、研究開始時（１日目）に体重がおよそ１９グラムから２３グラム（平均およそ２１ｇ））（Ｅｎｖｉｇｏ社、インディアナポリス、インディアナ州）を、尾のタトゥーで識別し、ポリカーボネートのトップ、照射済みのトウモロコシの穂軸の床敷、吊り下げた食べ物および水のボトルを備えたＯｐｔｉｍａｘポリカーボネートのケージに別々に収容した（１ケージあたり５匹）。順応および研究の期間中、温度が６７°Ｆ（１９℃）から７６°Ｆ（２４℃）の範囲、および相対湿度が３０％から７０％の実験室環境に動物を収容した。自動タイマーにより、１２時間の明かりと１２時間の暗闇を提供した。滅菌のＨａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ  Ｒｏｄｅｎｔ  ＣｈｏｗおよびｐＨ３．０の滅菌水を、動物が自由に利用できるようにした。Ｕ−１１８  ＭＧ（「ＡＴＣＣ」  ＨＴＢ−１５）腫瘍細胞を組織培養で成長させ、拡大させて、３ｘ１０６個の細胞をマウスの側腹部の無血清成長培地に皮下（ＳＣ）移植した。腫瘍成長を毎日モニターした。計算した腫瘍体積がおよそ１００ｍｍ３から３００ｍｍ３（または１００ｍｇから３００ｍｇ）に達した時に、担腫瘍マウスの体重を測定し、処置群に無作為化した。無作為化の後に処置を開始し（研究１日目）、以下に示すように継続させた（１群あたりマウス１０匹、ＱＤ、１０ｍｌ／ｋｇ、溶媒対照または１０ｍｇ／ｋｇの式ＩＩ（２％エタノール、４０％ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ  ４００）、および５８％生理食塩水の懸濁液（式ＩＩの化合物を最初に２％エタノールに溶解し、次にＰＥＧおよび生理食塩水を添加することにより調整した）として；２週間ごとに調製し、使用の間に−２０℃で凍結した懸濁液として）。腫瘍成長および体重を週に２回測定し、毒性および腫瘍潰瘍の徴候について動物を毎日観察した。腫瘍の測定を長さと幅に沿ってノギスを用いて行い、腫瘍体積を、次の式：（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて計算した。腫瘍体積（絶対値およびベースラインに対する百分率）および体重の測定値は、ダネットの多重比較事後分析を用いた一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて溶媒対照と比較した。優位水準をｐ≦０．０５に設定した。血液試料を１６日目および３０日目に、群２から４の動物１から５より採取した。後眼窩採血によって、１６日目の投与前および３０日目の投与後２４時間（トラフレベル）に、全血（Ｋ２ＥＤＴＡ，５０μｌ／マウス）を採取し、−８０℃で凍結保存した。予定された研究終了日（処置開始後３０日）の後、動物を生存させて、腫瘍成長に対して起こり得る溶媒効果を評価するために体重および腫瘍の測定を継続した。    
【０１２０】
腫瘍を皮下（ＳＣ）移植したマウスに、溶媒（２％エタノール（ＥｔＯＨ（Ｓｉｇｍａ社））／４０％ＰＥＧ  ４００（Ｓｉｇｍａ社）／５８％生理食塩水（ＶｅｔＰａｔｈ社））、または式ＩＩの化合物（１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ＩＰ）経路によって１日目から２０日目まで毎日投与した（ＱＤ）。先に記載したように、腫瘍成長および体重を週に２回測定し、毒性および腫瘍潰瘍の兆候について動物を毎日観察した。処置（持続性のある治療法）後の疾患進行、腫瘍体積および体重の測定に基づいて有効性を評価した。
【０１２１】
表１２にまとめたように、溶媒対照または式ＩＩの化合物のどちらも、投与３０日後の体重に著しい差はなかった。観察された１つの差は、溶媒対照で処置された動物は平均わずか２．２６％の体重増加であったのに比べ、式ＩＩの化合物で処置された動物は平均３．１３％の体重増加であったことである。  
【０１２２】
【表１２】
2020507632.tif 000033
【０１２３】
表１３から表１９および図７Ａから図７Ｄに示すデータは、式ＩＩの化合物の投与は、Ｕ１１８の腫瘍成長を抑制するのに有効であり、ベースラインの百分率として表される腫瘍体積への効果は早くも処置の４日目に観察され、平均腫瘍体積へ効果は早くも８日目に観察されたことを示している。そのデータを、表１３から表１９および図７Ａから図７Ｄに示す。
【０１２４】
【表１３】
2020507632.tif 000034
【０１２５】
【表１４】
2020507632.tif 000035
【０１２６】
【表１５−１】
2020507632.tif 000036
【０１２７】
【表１５−２】
2020507632.tif 000037
【０１２８】
【表１６−１】
2020507632.tif 000038
【０１２９】
【表１６−２】
2020507632.tif 000039
【０１３０】
【表１７】
2020507632.tif 000040
【０１３１】
【表１８−１】
2020507632.tif 000041
【０１３２】
【表１８−２】
2020507632.tif 000042
【０１３３】
【表１９−１】
2020507632.tif 000043
【０１３４】
【表１９−２】
2020507632.tif 000044
【０１３５】
表１３から表１９および図７Ａから図７Ｄに示すように、式ＩＩの化合物は、Ｕ１８８異種移植モデルにおいて、３０日間の試験期間にわたって著しく腫瘍の成長を抑制し、溶媒対照の投与と比較して、式ＩＩの投与（１日１回（ＱＤ）の腹腔内（ＩＰ）投与）の後、早くも４日で効果を示した。溶媒対照マウスにおいて、腫瘍の大きさは１１日目まで増加し、次いで、全般的に、平均範囲１８１ｍｍ３から２０５ｍｍ３（ベースラインから１３９％から１５７％の増加）を、３０日目まで維持した。ベースライン（１日目）に対する百分率としての腫瘍体積は、溶媒対照と比較して、式ＩＩの化合物で処置したマウスにおいて４日目から３０日目で著しく減少した。したがって、式ＩＩの化合物での処置は、腫瘍の大きさを経時的に評価することによって判定されたように、雌のヌードマウスにおいて、Ｕ−１１８  ＭＧ固形腫瘍の成長に対して著しい阻害効果を示した。溶媒対照または式ＩＩで処置した動物の生存は３０日目で１００％であった。
【０１３６】
実施例６
この実施例では、式ＩＩのポリケチドを作製する１つの方法について説明する。
【０１３７】
フィードスタータのエキソ−（１Ｒ、２Ｓ、４Ｒ、５Ｓ）−５−ヒドロキシビシクロ［２．２．１］ヘプタン−２−カルボン酸塩は以下であった。
【０１３８】
【化６】
2020507632.tif 000045
【０１３９】
Ｓ．ハイグロスコピクスＢＩＯＴ−４０１０またはＭＧ２−１０を、培地１寒天プレート（下記を参照されたい）で、２８℃で培養した。培地１での成長後に胞子のストックを調製し、蒸留水中２０％ｗ／ｖグリセロール：１０％ｗ／ｖラクトースに貯蔵し、−８０℃で保存した。２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬ培地２（下記を参照されたい）に、０．１ｍＬの凍結したストックを接種することにより生長培養物を調整した。その培養物を、２８℃、３００ｒｐｍで３６時間から４８時間インキュベートした。
【０１４０】
Ａ．産生方法
生長培養物を、２．５％ｖ／ｖから５％ｖ／ｖで培地３に接種した。２６℃、３００ｒｐｍで６日間から７日間、培養を行った。
【０１４１】
Ｂ．フィード手順
接種後２４時間から４８時間で式ＩＩＩのフィード／添加を行い、他に明記しない限り、最終濃度１ｍＭから２ｍＭでフィードした。
【０１４２】
培地１
構成成分                      供給元            カタログ＃          １Ｌあたり
コーンスティープパウダー      Ｓｉｇｍａ社      Ｃ−８１６０        ２．５ｇ
酵母エキス                    Ｄｉｆｃｏ社      ０１２７−１７      ３ｇ
炭酸カルシウム                Ｓｉｇｍａ社      Ｃ５９２９          ３ｇ
硫酸鉄                        Ｓｉｇｍａ社      Ｆ８６３３          ０．３ｇ
ＢＡＣＴＯ寒天                                                      ２０ｇ
小麦デンプン                  Ｓｉｇｍａ社      Ｓ２７６０          １０ｇ
水                                                                  １Ｌまで
この培地は、続いて１２１℃で２０分間、オートクレーブすることにより滅菌した。
【０１４３】
ＭＤ６培地（小スケール発酵培地）
構成成分                                                            １Ｌあたり
Ｔｏａｓｔｅｄ  Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）３０ｇ
コーンスターチ                  （Ｓｉｇｍａ社）                    ３０ｇ  
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）１９ｇ
酵母                            （Ａｌｌｉｎｓｏｎ社）              ３ｇ
コーンスティープソリッド        （Ｓｉｇｍａ社）                    １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                        ２．５ｇ  
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                  １０ｇ
ＮａＣｌ                                                            ５ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                          １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                 １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                 ２．５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                 １２０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                 ５０ｍｇ
ＭＥＳ（２−モルホリノエタン硫酸一水和物）                          ２１．２ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に補正する。
【０１４４】
滅菌の前に、０．４ｍＬのＳｉｇｍａ  α−アミラーゼ（ＢＡＮ  ２５０）を１Ｌの培地に添加した。培地を１２１℃で２０分間滅菌した。滅菌後、０．３５ｍＬの滅菌４０％フルクトースおよび０．１０ｍＬのＬ−リジン（水中１４０ｍｇ／ｍＬ、ろ過滅菌済み）を、７ｍＬのそれぞれに添加した。  
【０１４５】
ＲａｐＶ７  種培地
構成成分                                                           １Ｌあたり
Ｔｏａｓｔｅｄ  Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）３５ｇ
コーンスティープソリッド        （Ｓｉｇｍａ社）                    ４ｇ  
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                  ２ｇ
乳酸（８０％）                                                     １．６ｍＬ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                          ７ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整する。
【０１４６】
前記培地は、次に１２１℃で２０分間オートクレーブすることによって滅菌し、オートクレーブ後にｄ−グルコース（１０ｇ／Ｌ以下）を添加した。  
【０１４７】
ＭＤ６培地（小スケール発酵培地）
構成成分                                                            １Ｌあたり
Ｔｏａｓｔｅｄ  Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）３０ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）１９ｇ  
コーンスターチ                                                      ３０ｇ
酵母                            （Ａｌｌｉｎｓｏｎ社）              ３ｇ
コーンスティープソリッド        （Ｓｉｇｍａ社）                    １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                        ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                        ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                  １０ｇ
ＮａＣｌ                                                            ５ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                          １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２                                                    １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                  ２．５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                １２０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                  ５０ｍｇ
ＭＥＳ                                                              ２１．２ｇ
培地をｐＨ６．０に調整し、０．４ｍＬ／Ｌのαアミラーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ａ７５９５−ｌｉｑｕｉｄ、＞２５０ユニット／ｇ）を添加し、この培地を１２１℃で３０分間滅菌した。オートクレーブした後に、ｄ−フルクトース（２０ｇ／Ｌ以下）および１−リジン（一塩酸塩）（２ｇ／Ｌ以下）を添加した。
【０１４８】
ＭＤ６／５−１培地（中スケール発酵培地）
構成成分                                                            １Ｌあたり
Ｔｏａｓｔｅｄ  Ｎｕｔｒｉｓｏｙ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）１５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ社）５０ｇ
酵母                            （Ａｌｌｉｎｓｏｎ社）              ３ｇ
コーンスティープソリッド        （Ｓｉｇｍａ社）                    １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                        ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                        ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                  １０ｇ
ＮａＣｌ                                                            １３ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                          １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                  ３．５ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                  １５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                １５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                  ６０ｍｇ
ＳＡＧ  ４７１                                                 ０．５ｍｌ
培地を１２１℃で３０分間滅菌した。滅菌後、１Ｌあたり１５ｇのフルクトースを添加した。４８時間後、０．５ｇ／ＬのＬ−リジンを添加した。  
【０１４９】
実施例７
分析方法
分析方法Ａ
注入量：０．００５ｍＬから０．１ｍＬ（感度により必要に応じて）。Ａｇｉｌｅｎｔ  「Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ」「Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」カートリッジＳＢ  Ｃ８、３マイクロメートル、３０ｍｍ×２．１ｍｍで、以下の移動相を流してＨＰＬＣを行った。
【０１５０】
移動相Ａ：純水中０．０１％ギ酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０１％ギ酸
流速：１ｍＬ／分
０分での５％Ｂから２．５分での９５％Ｂまで、４分まで９５％Ｂで保持し、次のサイクルまでの間に５％Ｂに戻す線形グラジエントを用いた。検出は、２５４ｎｍのＵＶ吸光度、および／またはＭｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ−Ｍｉｃｒｏ装置を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析（正または負）によった。
【０１５１】
分析方法Ｂ
注入量：０．０２ｍＬ。３マイクロメートルのＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ社）カラム、１５０×４．６ｍｍで、５０℃に維持し、以下の移動相を流してＨＰＬＣを行った。
【０１５２】
移動相Ａ：脱イオン水で最大１Ｌに作製した、アセトニトリル（１００ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）
移動相Ｂ：アセトニトリルで最大１Ｌに作製した、脱イオン水（１００ｍＬ）、トリフルオロ酢酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）
流速：１ｍＬ／分  
５５％Ｂから９５％Ｂの線形グラジエントを１０分間にわたって用い、続いて９５％Ｂで２分、５５％Ｂまで０．５分、さらに５５％Ｂで２．５分とした。化合物検出は、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によった。
【０１５３】
分析方法Ｃ
前記ＨＰＬＣシステムはＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００を含み、３マイクロメートルのＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ社）カラム、１５０×４．６ｍｍで、４０℃を維持し、以下の移動相を流して行った。
【０１５４】
移動相Ａ：脱イオン水
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：１ｍＬ／分      
このシステムは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００エレクトロスプレー質量分析計と連結した。正と負の切り替えを、５００ダルトンから１０００ダルトンの走査範囲にわたって用いた。  
【０１５５】
５５％Ｂから９５％Ｂの線形グラジエントを１０分間にわたって用い、続いて９５％Ｂで２分、５５％Ｂまで０．５分、さらに５５％Ｂで２．５分とした。
【０１５６】
分析方法Ｄ
注入量：０．０２５ｍＬ。ＨＰＬＣを、３マイクロメートルのＧｅｍｉｎｉ  ＮＸ  Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）カラム、１５０×４．６ｍｍで、５０℃を維持し、以下の移動相を流して行った。
【０１５７】
移動相Ａ：ギ酸（０．１％）を含む脱イオン水
移動相Ｂ：ギ酸（０．１％）を含むアセトニトリル
流速：１ｍＬ／分      
５５％Ｂから９５％Ｂの線形グラジエントを１０分間にわたって用い、続いて９５％Ｂで２分、５５％Ｂまで０．５分、さらに５５％Ｂで２．５分とした。化合物検出は２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によった。
【０１５８】
分析方法Ｅ
移動相Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム／水
移動相Ｂ：ＡＣＮ
カラム：ＦｌｕｏｒｏＳｅｐ−ＲＰ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＨＳ、５０×２．１ｍｍ、５μｍ
カラム温度：周囲
オートサンプラーのニードル洗浄溶液：１０％ＡＣＮ／水中、０．５％ギ酸
注入量：０．０１２ｍＬ  
オートサンプラー温度：１０℃
ＷＹＥ−１２６６５７保持時間：３．８分
ＩＳ（ＷＡＹ−１３０７７９）保持時間：３．８分
総運転時間：６．７分
グラジエントプログラム
合計
時間      流速        移動相                移動相   
（分）    （ｍＬ／分）Ａ（％）    Ｂ（％）  グラジエントプロファイル
０．０    ０．６      ９０        １０      １．０
１．５    ０．６      ９０        １０      １．０
３．５    ０．６      １０        ９０      １．０
５．０    ０．６      １０        ９０      １．０
５．２    ０．６      ９０        １０      １．０
６．７    ０．６      ９０        １０      １．０
質量分析条件  
Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ  ４０００（製造番号：Ｖ０９３００５０９）Ｂａｔｍａｎ
実験：ＭＲＭ（多重反応モニタリング）
【０１５９】
【表２０】
2020507632.tif 000046
【０１６０】
実施例８
Ｓ．ハイグロスコピクスＢＩＯＴ−４０１０またはＭＧ２−１０の作製
Ｓ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０を作製する方法については、特許文献４０（特許文献４１）の実施例２を参照されたい。この株を、標準的な手順を用いてｐＬＬ１５８（特許文献４２（特許文献４３）、Ｇｒｅｇｏｒｙら、２０１２年）などのｒａｐＩＪＭＮＯＬを発現するベクターで形質転換した後に、ＢＩＯＴ−４０１０の代わりに用いて式ＩＩの化合物を作製することができる。
【０１６１】
ＢＩＯＴ−３４１０は、ラパマイシン産生株であるＳ．ハイグロスコピクスＮＲＲＬ５４９１の高産生誘導体であり、変異誘発および高産生変異体の選択によって作製され、ＢＩＯＴ−４０１０は、Ｓ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０について記載されているのと類似の方法を用いてｒａｐＫが特異的に除去されているＢＩＯＴ−３４１０の変異株である。したがって、ＢＩＯＴ−４０１０は、選択された株に基づいたＳ．ハイグロスコピクスＭＧ２−１０の高産生変異体である。しかし、Ｓ．ハイグロスコピクスＮＲＲＬ５４９１そのもの、または誘導体を用いて、本発明の化合物の産生が可能な株を作製することができる。
【０１６２】
ｒａｐＫの５′末端の近くに自然発生のＭｆｅｌ部位が存在する。組込みのための相同部の上流領域および下流領域を作製するために、ｐＲ  １９（Ｓｃｈｗｅｃｋｅら、１９９５年）からの７．３ｋｂｐの断片を、Ｎｃｏｌで消化されたｐｌｉｔｍｕｓ２８にクローン化し、脱リン酸化し、ｃｏｓｍｉｄ−２（Ｓｃｈｗｅｃｋｅｒら、１９９５年）からの４．２ｋｂｐのＮｈｅｉ／Ｐｓｔ  ｌ断片を、ＰｓｔＩ−Ｓｐｅｌで消化されたｐｌｉｔｍｕｓ２８にクローン化した。これにより、中間体プラスミドｐｌｉｔｍｕｓ２８−７．３およびｐｌｉｔｍｕｓ２８−４．２をそれぞれ得た。Ｍｆｅｌ部位からの所望の欠失部をｒａｐＫ内の部位へ導入するために、２つのオリゴヌクレオチドを用いて、鋳型としてプラスミドｐＲ  １９（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ、１９９５年）を用い、必要な領域であるＢｉｏＳＧ１５９：５′−ＣＣＣＣＡＡＴＴＧＧＴＧＴＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＧＣＣＣＧＧＧＴＧＡ−３′（配列番号１）およびＢｉｏＳＧ  １５８：５′−ＣＧＣＣＧＣＡＡＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＴＣＧＧＣＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧ−３′（配列番号２）を増幅した。得られた１．５ｋｂｐのＰＣＲ産物をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで処理し、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｌｉｔｍｕｓ２８にクローン化し、脱リン酸化し、そしてクローン化したＰＣＲ産物を配列決定した。このプラスミドからの１．５ｋｂｐのＭｆｅｉ−Ｂｇ／１１断片を切り取り、これを用いてｐｌｉｔｍｕｓ２８−４．２の２．３ｋｂｐのＭｆｅｉ−Ｂｇ／１１断片を置換した。構築物を完成させるために、このプラスミドの３．３ｋｂｐのＭｆｅｉ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、同様に消化したｐｌｉｔｍｕｓ２８−７．３に連結した。最後に、接合性ストレプトマイセスベクターｐＫＣ  １１３２（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２年）に、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｂａｌ断片として前記欠失構築物を導入した。最終構築物をｐＳＧ３９９８と名付けた。
【０１６３】
プラスミドｐＳＧ３９９８を、エレクトロポレーションによって大腸菌ＥＴ１２５６７：ｐＵＺ８００２に形質転換し、３０℃で一晩インキュベートしたアプラマイシン（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）、カナマイシン（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）、およびクロラムフェニコール（０．０１２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する２ＴＹプレート上で選定した。同じ抗生物質を含有する液体２ＴＹ培地（４ｍＬ）の接種にコロニーを用い、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩インキュベートした。一晩の培養物のおよそ０．８ｍＬを、同じ抗生物質を含有する２ＴＹ（１０ｍＬ）の接種に用いて、３０℃、２５０ｒｐｍでＯＤ−０．５（５９５ｎｍ）に達するまでインキュベートした。培養物を４０００ｒｐｍで遠心分離し、２ＴＹで２回洗浄し、得られた細胞ペレットを２ＴＹ（０．２５ｍｌ）に再懸濁した。ＢＩＯＴ−３４０１の胞子を解凍し、遠心分離（４０００ｒｐｍ）によってペレット化し、２ＴＹ（１ｍＬ）で洗浄した後に２ＴＹ（１ｍＬ）に懸濁した。次に、胞子を５０℃の熱ショックに１０分間さらした後、直ちに氷上に置いた。１接合あたりおよそ１００ｕＬの胞子のストックを用い、２ＴＹ（０．１５０ｍＬ）を添加して体積を０．２５ｍＬに調整した。０．２５ｍＬの洗浄した大腸菌細胞を、調整したＢＩＯＴ−３４０１胞子ストックと混合し、直ちに乾燥したＲ６プレート上に広げることによって接合を行った。プレートを簡単に乾燥させ、食品用ラップに包み、３７℃で２時間から３時間インキュベートした。次に、各プレートを、ナリジクス酸（０．０１５ｍＬの５０ｍｇ／Ｌ溶液）を含有する滅菌水（１ｍＬ）で覆い、３７℃で一晩、乾燥およびインキュベートした。次に、そのプレートを、アプラマイシン（０．０１５ｍＬの１００ｍｇ／Ｌ溶液）を含有する滅菌水（１ｍＬ）で覆い、３７℃でインキュベートした。４日から７日後に元の接合コロニーが現れ、アプラマイシン（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）およびナリジクス酸（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する培地１プレート上に採取し、３日間から４日間３７℃でインキュベートし、その後、アプラマイシン（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）およびナリジクス酸（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）を含有する培地１プレートに再パッチングした。次に、このパッチング工程を、抗生物質を含まない培地１プレート上で、３７℃でインキュベートしながら良好な成長が見られるまで３ラウンド繰り返した。次に、このパッチを培地１プレートに移し、２８℃でインキュベートして胞子形成を促した（約７日間から１０日間）。胞子を回収し、脱脂綿を通してろ過し、希釈系列を調製した。この希釈系列のアリコート（１００ｕＬ）を培地１プレート上に蒔き、コロニー上に胞子が見えるまで２８℃でインキュベートした。アプラマイシン（０．０５０ｍｇ／ｍＬ）含有および非含有のプレートに、並行してコロニーをパッチングした。次に、二次候補組換え体となるアプラマイシン感受性コロニーを成長させて、ラパマイシン産生を評価した。さらに、ラパログの変異合成（ｍｕｔａｓｙｎｔｈｅｔｉｃ）産生を確認し、ｒａｐＫの望ましい破壊を立証するために、外来のトランス−４−ヒドロキシＣＨＣＡを２４時間後に産生培地に添加することによって、非産生コロニーを試験した。
【０１６４】
実施例９
発酵および式ＩＩの単離
液体培養（小スケール）
ＢＩＯＴ−４０１０のプラグ（ｐｌｕｇ）を、フォーム栓で塞いだファルコンチューブ（５０ｍＬ）内のＲａｐＶ７種培地（７ｍＬ）の接種に用い、２８℃、３００ｒｐｍ  （２．５ｃｍ  ｔｈｒｏｗ）で４８時間培養した。この種培養物（０．５ｍＬ）を、ワイドボアチップを用いてＭＤ６産生培地（７ｍＬ）に接種し、２６℃、３００ｒｐｍ（２．５ｃｍ  ｔｈｒｏｗ）で６日間発酵させた。２４時間成長させた後に、式ＩＩＩを産生培地に添加した。フィードは、メタノール中０．３２Ｍ原液として調製し、０．０５０ｍＬを各チューブに添加して最終濃度を２ｍＭとすることができる。
【０１６５】
発酵（調製用）
播種条件
容器  ２Ｌ三角フラスコ（フォーム栓で栓をした）
作業体積  ４００ｍＬ
培地  ＲａｐＶ７種培地
接種材料  ０．２ｍＬ胞子ストック（０．０５％ｖ／ｖ）
温度  ２８℃
攪拌  ２５０ｒｐｍ、２．５ｃｍ  ｔｈｒｏｗ
通気  好気
移行  約４８時間
発酵条件
容器  ２２Ｌ  Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
作業体積  １５Ｌ(最終作業体積、種を含む）
培地  ＭＤ６／５−１
接種材料  ４００ｍＬ種（２．７％ｖ／ｖ）
温度  ２６℃
攪拌  ≧２００ｒｐｍ（カスケードＤＯ２制御）
通気  ７．５Ｌ／分の空気（０．５ｖ／ｖ／ｍ）
ｐＨ  ６．４０塩基（ＮａＯＨ）０時間から２４時間のみ制御（プレ前駆体）
６．９０酸（Ｈ２ＳＯ４）  ＞２４時間のみ制御（ポスト前駆体）
ＤＯ２  ≧３０％（カスケード攪拌制御）
消泡剤  要求に応じて、自動式（ＳＡＧ４７１）
ｄ−フルクトースの添加  滅菌後
ｌ−リジンの添加  約２４時間（前駆体の直前）
式ＩＩＩの添加  約２４時間（最終濃度２ｍＭ）
回収  ピーク化合物力価、通常１３２時間から１４４時間
抽出及び精製
発酵ブロスは遠心分離（３０００ｒｐｍ、３０分間）によって浄化し、上清は、全材料５％未満の含有であれば処分した。細胞のペーストをアセトニトリル（２容量）に懸濁し、室温で１時間攪拌した。得られたスラリーを遠心分離し、上清をデカントした。この手順を繰り返し、上清を混ぜ合わせ、減圧下４０℃でアセトニトリルを除去した。得られた水性スラリーを、同じ体積の酢酸エチルで２回抽出し、有機物のフラクションを混ぜ合わせ、減圧下４０℃で溶剤を除去した。得られた未精製抽出物を、３７Ｒ−ヒドロキシノルボルニルラパマイシン含量について分析し、クロマトグラフ分離の前に４℃で保存した。
【０１６６】
その未精製抽出物をメタノール：水（８０：２０、２００ｍＬから３００ｍＬ）に溶解し、同じ体積のヘキサンで２回抽出した。そのメタノール：水の相を確保し、減圧下４０℃で溶剤を除去して粘稠性の液体残渣を得た。この物質をフラッシュシリカゲル（２５×５  ｃｍカラム）でクロマトグラフし、最初にクロロホルム（１Ｌ）で溶出し、次に、クロロホルム中それぞれ１％、２％、３％の１Ｌ体積のメタノールで溶出した。約２５０ｍＬのフラクションを採取し、ＨＰＬＣで分析した。ＢＣ３１９を含有するフラクションから前記溶剤を除去し、固体残渣を残した。さらに、これをフラッシュシリカゲル（２０×２．５ｃｍカラム）でクロマトグラフし、酢酸エチル：ヘキサン（１：１）で溶出した。約２００ｍＬのフラクションを採取し、ＨＰＬＣによって分析した。フィードストックと同等のピークを含有するフラクションをプールし、溶剤を除去して固体残渣を残した。これを逆相シリカゲル（Ｗａｔｅｒｓ  ＸＴｅｒｒａ  Ｃ１８−ＯＤＳ２、粒子径１０マイクロメートル、１９×２５０ｍｍ）でクロマトグラフし、水（Ａ）およびアセトニトリル（Ｂ）のグラジエント、２１ｍＬ／分の流速、すなわちＴ＝０分、５０％Ｂ；Ｔ＝２５分、１００％Ｂで溶出した。フィードストックと同等のピークを含有するフラクションをプールし、真空中で溶剤を除去して式Ｉの化合物を得た。
【０１６７】
好ましい実施形態に関して特定の実施形態を記載したが、当業者が変形および改変を思い付くことが理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲が、以下の特許請求の範囲内にあるそのような同等の変形をすべて範囲に含むことを意図する。
【図１】
2020507632.tif 000053
【図２】
2020507632.tif 000054
【図３】
2020507632.tif 000055
【図４】
2020507632.tif 000056
【図５】
2020507632.tif 000057
【図６】
2020507632.tif 000058
【図７Ａ】
2020507632.tif 000059
【図７Ｂ】
2020507632.tif 000060
【図７Ｃ】
2020507632.tif 000061
【図７Ｄ】
2020507632.tif 000062
【国際調査報告】
2020507632.tif 000063
2020507632.tif 000064