(57)【要約】長鎖のｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させる活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ結合活性を有するタンパク質の共存下でｄｓＲＮＡにｄｓＲＮＡ分解活性を持ったタンパク質を作用させることにより、特定の長さのｄｓＲＮＡを効率よく調製できる方法及び当該核酸結合活性を有するタンパク質がｄｓＲＮＡ合成に代表されるＲＮＡ合成反応においてもその効率を向上させる方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質であって、ｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成する活性を有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質。
【請求項２】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを有することを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｄｉｃｅｒの機能ドメインが、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなることを特徴とする請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
さらにＰＡＺドメインを含むことを特徴とする請求項３記載のタンパク質。
【請求項５】
特定の長さのｄｓＲＮＡが、約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号３又は１６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を製造する方法であって、コドンを宿主での発現に適したものに変換するか、あるいはレアコドンに対する補強がなされた宿主を使用することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項９】
請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質の製造方法であって、当該タンパク質を低温誘導性ベクターを用いて発現させることを特徴とするｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質の製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有するキット。
【請求項１１】
核酸結合活性を有するタンパク質の存在下でｄｓＲＮＡにｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を作用させ、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成することを特徴とするｄｓＲＮＡの分解方法。
【請求項１２】
核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が融合タンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸結合活性を有するタンパク質が、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質がコールド  ショック  プロテインであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コールド  ショック  プロテインが、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
コールド  ショック  プロテインがサーモトガ  マリティマ由来のコールド  ショック  プロテインＢであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
特定の長さのｄｓＲＮＡが、約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、天然型Ｄｉｃｅｒあるいはその機能的同等物であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項２０】
核酸結合活性を有するタンパク質の存在下でＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を用いてＲＮＡ合成反応を行うことを特徴とするＲＮＡの合成方法。
【請求項２１】
核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質を用いることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
核酸結合活性を有するタンパク質が、コールド  ショック  プロテインであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
コールド  ショック  プロテインが、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であることを特徴とする請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
コールド  ショック  プロテインが、サーモトガ  マリティマ由来のコールド  ショック  プロテインＢであることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ＲＮＡ合成活性を有するタンパク質が、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
請求項１１記載の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタンパク質並びにｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項２７】
請求項１１記載の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキット。
【請求項２８】
請求項２０記載の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項２９】
請求項２０記載の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成する活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、当該タンパク質と核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ結合活性を有するタンパク質を組み合わせたｄｓＲＮＡの効率的な分解方法並びに核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を組み合わせたＲＮＡの効率的な合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  最近、低分子ｄｓＲＮＡを利用する遺伝子工学的手法が報告されている。
例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ）は、ｄｓＲＮＡによってその配列特異的にｍＲＮＡが分解され、その結果遺伝子発現が抑制される現象である。ｄｓＲＮＡによって遺伝子サイレンシングができることがわかった発端は、線虫におけるアンチセンスを用いた研究からであった。１９９５年、ＧｕｏとＫｅｍｐｈｕｅｓはｐａｒ−１と呼ばれる遺伝子をアンチセンスＲＮＡで抑制する実験を行なった。アンチセンスＲＮＡを加えると、予想通りｐａｒ−１の発現を抑制したが、驚いたことに、コントロールとして用いたセンスＲＮＡも同様にｐａｒ−１の発現を抑制し、ｐａｒ−１変異株の表現形を示した。（例えば、非特許文献１）
この矛盾は、１９９８年にＦｉｒｅらによって解き明かされた。アンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡを、それぞれＲＮＡポリメラーゼを用いて合成するとき、わずかに非特異的に逆向きのＲＮＡができてしまう。そのコンタミネーションよってできるｄｓＲＮＡが遺伝子サイレンシングの本体であり、アンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは遺伝子の発現を抑制できないこと、またアンチセンスＲＮＡとセンスＲＮＡをアニールさせたｄｓＲＮＡが効率よく遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった。（例えば、非特許文献２）【０００３】  上記ＲＮＡ干渉においては、Ｄｉｃｅｒと呼ばれる酵素がｄｓＲＮＡから小分子のＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を生成させる。（例えば、非特許文献３）
この酵素の作用により生じたｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）と呼ばれる複合体に取り込まれ、該複合体が標的ｍＲＮＡを認識し、分解すると考えられている。しかしながら、ＲＮＡ干渉に関与すると考えられる各因子についての正確な機能についてはまだまだ未知の部分が多いのが現状であった。（例えば、非特許文献４）【０００４】  上記ＲＮＡ干渉を効率よく行うためには、ｄｓＲＮＡならびにｓｉＲＮＡを効率よく生成させることが重要である。上記Ｄｉｃｅｒとしてはヒト由来Ｄｉｃｅｒ（例えば、非特許文献５）が例示され、さらにリコンビナントＤｉｃｅｒ（例えば、非特許文献６）がジーンセラピーシステムズ社あるいはストラタジーン社より販売されている。
しかしながら、上記のようなリコンビナントＤｉｃｅｒについては、本来の酵素学的な性能を十分に発揮しているかどうかについては詳細に検討されていない。また、上記Ｄｉｃｅｒの少なくともどのドメインを含有すれば、ｄｓＲＮＡに作用させて好適なｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を生成させる活性を保持することができるか、さらにその遺伝子工学的な生産性を向上できるかについては知られていない。
さらに、ｄｓＲＮＡを効率よく生成させる方法についても特に有効な方法は知られていないのが現状であった。【０００５】  さらに、ＲＮＡポリメラーゼを用いて合成した約２１ヌクレオチドの鎖長のｄｓＲＮＡをそのままｓｉＲＮＡとして利用する方法も報告されている（例えば、非特許文献７）。従って、ＲＮＡが効率よくできる方法があれば上記方法にも利用できる。【０００６】
【非特許文献１】Ｇｕｏ  Ｓ．他１名  Ｃｅｌｌ  １９９５年  ｖｏｌ．８１、ｐ６１１−６２０
【非特許文献２】Ｆｉｒｅ  Ａ．他５名  Ｎａｔｕｒｅ  １９９８年  ｖｏｌ．３９、ｐ８０６−８１１
【非特許文献３】Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  Ｅ．他３名  Ｎａｔｕｒｅ  ２００１年  ｖｏｌ．４０９、ｐ３６３−３６６
【非特許文献４】Ｔａｂａｒａ  Ｈ．他３名  Ｃｅｌｌ  ２００２年  ｖｏｌ．１０９、ｐ８６１−８７１
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇ  Ｈ．他４名  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００２年  ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１，ｐ５８７５−５８８５
【非特許文献６】Ｍｙｅｒｓ  Ｊ．Ｗ．他３名  Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００３年  ｖｏｌ．２１、ｐ３２４−３２８
【非特許文献７】Ｄｏｎｚｅ  Ｏ．他１名  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００２年  ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．１０，ｅ４６
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の課題は、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させる活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質の提供、ＲＮＡ干渉等に利用可能な特定の長さのｄｓＲＮＡを効率よく生成させる方法並びにＲＮＡ合成の促進方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明者らは、上記課題を解決するため、鋭意検討した結果、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを解析し、長鎖のｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させる活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を見出した。また、核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ結合活性を有するタンパク質の共存下でｄｓＲＮＡにｄｓＲＮＡ分解活性を持ったタンパク質を作用させることにより、特定の長さのｄｓＲＮＡを効率よく調製できること、さらに当該核酸結合活性を有するタンパク質がｄｓＲＮＡ合成に代表されるＲＮＡ合成反応においてもその効率を向上させることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】  すなわち、本発明の第１の発明は、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質であって、ｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成する活性を有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質に関する。
本発明の第１の発明において、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを有することが好ましく、例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなるものが好ましい。さらに、ＰＡＺドメインを含んでいても良い。また、本発明の第１の発明のタンパク質を用いることにより、特定の長さのｄｓＲＮＡが約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡを生成させることができる。また本発明の第１の発明のタンパク質としては、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列あるいは配列表の配列番号３又は１６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質が例示される。あるいは、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。また、本発明の第１の発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、コドンを宿主での発現に適したものに変換することによって、あるいはレアコドンに対する補強がなされた宿主を使用することによって効率よく製造することができる。
また、当該タンパク質を低温誘導性ベクターを用いて発現させることができる。さらに本発明の第１の発明のタンパク質は、コンポーネントとしてキットに含有させることができる。【００１０】  本発明の第２の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下でｄｓＲＮＡにｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を作用させ、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成することを特徴とするｄｓＲＮＡの分解方法に関する。
本発明の第２の発明において、核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は融合タンパク質であっても良い。また、核酸結合活性を有するタンパク質は、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質であっても良い。当該ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質は、コールド  ショック  プロテインであってもよく、その由来は好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であっても良い。特に限定はされないが例えば、サーモトガ  マリティマ由来のコールド  ショック  プロテインＢが例示される。
本発明の第２の発明の方法により、特定の長さのｄｓＲＮＡが、約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡを生成することができる。さらに、本発明の第２の発明において、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、本発明の第１の発明のタンパク質であっても良いし、天然型Ｄｉｃｅｒあるいはその機能的同等物であっても良い。【００１１】  本発明の第３の発明は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下でＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を用いてＲＮＡ合成反応を行うことを特徴とするＲＮＡの合成方法に関する。
本発明の第３の発明において、核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質は融合タンパク質であっても良い。また、当該核酸結合活性を有するタンパク質は、コールド  ショック  プロテインであってもよく、その由来は好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であっても良い。特に限定はされないが例えば、サーモトガ  マリティマ由来のコールド  ショック  プロテインＢが例示される。さらに、ＲＮＡ合成活性を有するタンパク質はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼであってもよい。【００１２】  本発明の第４の発明は、本発明の第２の発明の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタンパク質並びにｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物に関する。【００１３】  本発明の第５の発明は、本発明の第２の発明の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキットに関する。【００１４】  本発明の第６の発明は、本発明の第３の発明の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物に関する。【００１５】  本発明の第７の発明は、本発明の第３の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキットに関する。
【発明の効果】
【００１６】  本発明により、特定の長さのｄｓＲＮＡを調製できるｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が提供される。さらに本発明により、ＲＮＡ干渉等に利用できる特定の長さのｄｓＲＮＡを効率よく生成させることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】  本明細書においてＤｉｃｅｒとは、ＲＮＡｉの初期段階で長鎖のｄｓＲＮＡをｓｉＲＮＡにプロセッシングできる機能を有するタンパク質のことを言う。天然型のＤｉｃｅｒとしては、とくに限定はされないが例えばＮ末端側よりＡＴＰ結合ドメイン、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、機能未知なＰＡＺドメイン、ＲＮａｓｅＩＩＩａ及びｂドメイン、さらにｄｓＲＮＡ結合ドメインから構成されているものが挙げられる。【００１８】  本明細書において、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインとは、長鎖ｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成できる活性に関与する領域をコードする部位のことを言う。【００１９】  上記機能ドメインとしては、特に限定はされないが例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂドメイン並びにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなるものが例示される。当該ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂドメインは、Ｚｈａｎｇ  Ｈ．他４名  Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２００２年  ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．２１，ｐ５８７５−５８８５に記載のように、２本鎖ＲＮＡに特異的に作用し、５’末端にリン酸基をもつを特定の鎖長のオリゴヌクレオチドを生成させる活性に関与する領域をコードする部位であっても良い。さらに、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、２本鎖ＲＮＡに特異的に結合する活性をコードする部位であっても良い。【００２０】  本明細書においてｄｓＲＮＡとは、ＲＮＡ干渉の対象となるｍＲＮＡと該ｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するＲＮＡとの２本鎖構造を形成したＲＮＡのことを言う。
また、本明細書においてｄｓＲＮＡの分解反応による生成物の応用例としては、主に以下に示すｓｉＲＮＡがある。【００２１】  本明細書において特定の長さのｄｓＲＮＡとは、特に限定はされないが例えば、約１０〜１００塩基対の範囲中の特定の長さのｄｓＲＮＡのことを言う。さらに、約１５〜３０塩基対の範囲中の特定の長さ、特に２０〜２５塩基対の範囲中の特定の長さのｄｓＲＮＡであっても良い。これらのｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとして使用できる。【００２２】  本明細書において核酸結合活性を有するタンパク質とは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡに結合する活性を有するタンパク質のことを言う。当該タンパク質としては、核酸の二次構造を解消する機能を有するものが好ましく、例えば、ＤＮＡヘリカーゼ、ＲＮＡヘリカーゼあるいはその機能的同等物が挙げられる。【００２３】  本明細書において低温誘導性ベクターとは、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターのことを言い、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターが挙げられる。【００２４】  本明細書においてコールド  ショック  プロテインとは、本来の生育条件よりも低温になるような状況下でその温度低下により刺激されて発現されるタンパク質の総称を言う。【００２５】  本明細書において基質となる長鎖のｄｓＲＮＡを完全に分解するとは、分解反応後に未切断の基質となる長鎖のｄｓＲＮＡが電気泳動法において確認されない程度に分解することを言う。【００２６】  本明細書においてＰＡＺドメインとは、ＤｉｃｅｒのＲＮＡヘリカーゼドメインとＲＮａｓｅＩＩＩａおよびｂドメインの間に存在するドメインである。例えば、配列表の配列番号１記載のヒト由来Ｄｉｃｅｒアミノ酸配列のアミノ酸番号８９８〜１０６４（配列番号２の塩基番号２６９２〜３１９２）の領域である。【００２７】  本発明においてレアコドンとは、使用頻度の低いコドンを意味する。１つのアミノ酸は複数のコドンにより規定されているが、生物種により、この複数のコドンの間で使用する頻度に偏りが見られる。一般に、使用頻度の低いコドンに対応するトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の量が少なく、レアコドンを含有する塩基配列にコードされるアミノ酸を発現させる場合に、発現効率が低下することが知られている。従って、レアコドンに対応するｔＲＮＡの量を増大させるなど、レアコドンに対する補強を行うことにより、効率よくタンパク質を製造することができる。【００２８】  以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、該タンパク質の製造方法ならびに該タンパク質を含有するキット
本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、ｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成することができる。当該ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質としては、長鎖のｄｓＲＮＡから特定の長さのｄｓＲＮＡを生成できるものであれば特に限定はなく、例えば、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを有するタンパク質が例示される。当該Ｄｉｃｅｒの機能ドメインは、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなるタンパク質であっても良い。また、長鎖のｄｓＲＮＡから特定の長さのｄｓＲＮＡを生成できるものであれば、そのタンパク質の由来は問わない。
当該ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂドメイン並びにｄｓＲＮＡ結合ドメインは、特に限定はされないが例えばヒト由来Ｄｉｃｅｒの場合、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列のＮ末端側のアミノ酸１２７１〜１９２４（配列表の配列番号２記載の塩基配列番号３８１１〜５７７２）を有するものが挙げられる。例えば、配列表の配列番号４記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｄｉｃｅｒ変異体）あるいは配列表の配列番号１２記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号１３記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｄｉｃｅｒ変異体）が例示される。
また、Ｄｉｃｅｒはサイズの大きいタンパク質であり、組換え体を製造するのに適していない。一方、本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、ネイティブな酵素に比べてサイズが小さくコンパクトであり、組換え体を製造するのに有用である。一般に、ヒトなどの高等生物由来の酵素を組換え体として大腸菌などのバクテリア細胞で製造する場合、同等の酵素活性を保持したまま組換え体を製造することは困難を伴うことが多い。従って、本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、その由来となる生物以外の細胞で製造する際に非常に有用である。【００２９】  さらに本発明のタンパク質においては、ＰＡＺドメインを含有していても良く、特に限定はされないが例えば、配列表の配列番号１記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号８９８〜１９２４（配列表の配列番号２記載の塩基番号２６９２〜５７７２）を有するタンパク質、配列表の配列番号１７記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号１６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｄｉｃｅｒ変異体）あるいは配列表の配列番号１８記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号１９記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質（Ｄｉｃｅｒ変異体）が例示される。【００３０】  さらに、変異体により、さらに酵素的に安定なものにすることが可能である。特に限定はされないが、例えば、ＰＡＺドメイン＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインの場合、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインのみの変異体タンパク質に比べて安定性を向上させることができる。より多くの凍結、融解を施した場合でも活性を保持でき、またある保存緩衝液中では溶液状態でより長期間の活性保持が可能である。【００３１】  本発明のタンパク質は、特に限定はされないが例えば、長鎖ｄｓＲＮＡを分解し、ＲＮＡ干渉に有効なｓｉＲＮＡを生成させることができる。
また、上記機能を有する範囲であれば上記アミノ酸配列あるいは塩基配列において、一ないしは複数個のアミノ酸あるいは塩基の置換、欠失、挿入あるいは付加されたものも本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質に含まれる。
特に限定はされないが、本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質において、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したものも本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質に含まれる。前記タンパク質としては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号１２又は１８記載のアミノ酸配列を有するｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。
本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、長鎖のｄｓＲＮＡを特定の長さのｄｓＲＮＡにすることができる。すなわち、本発明においては使用するｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を選択することにより、所望の特定の長さのｄｓＲＮＡを調製することができる。当該特定の長さのｄｓＲＮＡは、特に限定はされないが例えば、約１０〜１００塩基対の範囲、好ましくは約１５〜３０塩基対の範囲、特に好ましくは約２０〜２５塩基対の範囲中の特定の長さのｄｓＲＮＡが例示される。
また、従来市販されている酵素によって、基質として用いたｄｓＲＮＡは完全に分解されないのに対し、本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、基質となる長鎖のｄｓＲＮＡを実質的に全て切断することができる。従って、基質のｄｓＲＮＡを全て切断することができ、なおかつその分解産物によるＲＮＡ干渉作用が同等であるので、基質となる長鎖のｄｓＲＮＡのスケールダウン、ひいては未分解のｄｓＲＮＡ除去工程の省略も可能となる。
さらに、本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、特に限定はされないが例えばＤｉｃｅｒ変異体は、ｐＨ８．５以上のトリス−塩酸緩衝液中で塩化マグネシウムの存在下で保存することにより、４℃保存ならびに−２０℃保存のいずれの場合においてもその活性を長期間安定に保持することができる。
本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質は、下記（２）に記載の核酸結合活性を有するタンパク質、特に限定はされないが例えば、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態であっても良い。特に限定はされないが、上記Ｄｉｃｅｒ変異体と核酸結合活性を有するタンパク質、例えば、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質が例示される。【００３２】  本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を製造するための方法としては、コドンを宿主での発現に適したものに変換するか、あるいはレアコドンに対する補強することを含む方法であっても良い。特に限定はされないが例えば、発現遺伝子のコドン改変を含む製造方法であってもよく、当該タンパク質のアミノ酸配列の一部又は全てをタンパク発現の至適のコドン状態に変換したもの、もしくはそれに準じる状態の宿主を用いて発現させることができる。前記至適のコドン状態、もしくはそれに準じる状態の宿主としては、特に限定はされないが例えば、特定のコドンを認識するｔＲＮＡ量を遺伝子工学的に通常この細胞中で産生する量よりも数倍以上高めた宿主が例示される。当該宿主としては、大腸菌が例示され、例えばアルギニンのコドン（ＡＧＡ、ＡＧＧ）のｔＲＮＡを補充した大腸菌、さらにイソロイシン（ＡＵＡ）、プロリン（ＣＣＣ）、ロイシン（ＣＵＡ）のｔＲＮＡを補充した大腸菌等が挙げられる。
さらに、コドン改変を行って、宿主中での目的のタンパク質の発現を向上させる方法を用いても良く、その際にｍＲＮＡの２次構造を考慮にいれても良い。
すなわち、発現遺伝子のコドン変換、補強等によりタンパク発現が向上するような方法であれば特に限定はされない。【００３３】  本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を製造するためのベクターには、特に限定はなく、市販のベクター、発現系のいずれもが使用できる。特に、限定はされないが例えばｐＥＴシステム（ノバジェン社製）を用いることができる。さらに、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターが挙げられる。
本発明の製造方法の一態様としては、上記Ｄｉｃｅｒ変異体を低温で機能し得るプロモーターを有するベクター、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターで製造する方法が例示される。
すなわち、本発明の製造方法においては、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させ得る機能を保持できるタンパク質を発現できるベクターであればいずれもが好適に使用できる。
また、当該特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させ得る機能を最終的に保持できるタンパク質を得られるならば、タンパク発現時は封入体の形態であるがその後のリホールディング操作により当該機能を回復できるものを発現できるベクターも含まれる。
本発明の方法の一態様、例えば上記Ｄｉｃｅｒ変異体を製造する場合においては、従来のヒト由来Ｄｉｃｅｒの全長を発現させた場合に比較して、生産量が向上し、さらに当該タンパク質の活性保持体の取得率も向上させることができる。
本発明のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質の製造方法においては、下記（２）に記載の核酸結合活性を有するタンパク質、特に限定はされないが例えば、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態で発現させる方法も含まれる。【００３４】（２）本発明の核酸結合活性を有するタンパク質によるｄｓＲＮＡの分解の促進方法並びに当該タンパク質を用いたＲＮＡ合成促進方法
本発明の特定の長さのｄｓＲＮＡを生成することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解の促進方法は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下に行うことを特徴とする。当該核酸結合タンパクとしては、結果的にｄｓＲＮＡ分解活性を促進するものであれば特に限定はなく、例えば、上記ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質等が好適に使用できる。
当該ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質としては特に限定はないが、コールド  ショック  プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が例示される。特に常温域で機能し得るコールド  ショック  プロテインが好適に使用でき、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド  ショック  プロテインが好ましい。特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１０記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好適に使用できる。当該サーモトガ  マリティマ由来のＣｓｐＢタンパク質は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ  ｓｔｒａｉｎ  ＭＳＢ８を、ドイッチェ  ザムルンク  フォン  ミクロオルガニスメン  ウント  ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入（ＤＳＭ３１０９）し、プロテイン  サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の方法に従い遺伝子工学的に組換え体を製造することができる。さらに、低温で機能し得るプロモーターを有するベクターが好適に使用でき、例えば国際公開第９９／２７１１７号パンフレットに記載のｐＣｏｌｄ系ベクターが挙げられる。
当該ＣｓｐＢタンパク質をｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質と組み合わせることにより、当該ｄｓＲＮＡ分解活性を促進させることができる。さらに本発明の方法は、上記（１）記載の特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させるｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質、例えばＤｉｃｅｒ変異体、天然型Ｄｉｃｅｒあるいは市販のリコンビナントＤｉｃｅｒのような機能的同等物のいずれにおいてもその特定の長さのｄｓＲＮＡを生成させる活性を促進できる。
本発明の方法において、核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を組み合わせることにより、当該ｄｓＲＮＡ分解活性を促進させることができ、得られる分解産物は核酸結合活性を有するタンパク質を組合わせなかった場合の分解産物と比べて、ＲＮＡ干渉作用において単位重量あたり同等の活性を有する。従って、核酸結合活性を有するタンパク質を使用することは、ＲＮＡ干渉において非常に有用である。
また、従来行われている方法では、基質として用いたｄｓＲＮＡは完全に分解されないのに対し、本発明の方法において、基質となる長鎖のｄｓＲＮＡを実質的に全て切断することができる。従って、基質のｄｓＲＮＡを全て切断することができ、なおかつその分解産物によるＲＮＡ干渉作用が同等であれば、基質となる長鎖のｄｓＲＮＡのスケールダウン、ひいては未分解のｄｓＲＮＡ除去工程の省略も可能となる。
さらに、本発明の方法においては、当該核酸結合活性を有するタンパク質、例えばＲＮＡ合成活性を有するタンパク質は、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質との融合タンパク質の形態のものであってもよい。【００３５】  一方、本発明のＲＮＡ合成の促進方法は、核酸結合活性を有するタンパク質の存在下に行うことを特徴とする。当該核酸結合タンパクとしては、結果的にＲＮＡ合成活性を有するタンパク質のＲＮＡ合成活性を促進するものであれば特に限定はなく、核酸結合活性を有するタンパク質、コールドショックプロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用できる。当該コールド  ショック  プロテインは、特に限定はされないが好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のものが好適に使用できる。当該コールドショックプロテインとしては特に限定はされないが、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１０記載の塩基配列）を有するサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が例示される。
当該ＣｓｐＢタンパク質をＲＮＡ合成系に共存させることにより、例えばＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡ合成活性を促進させることができる。当該タンパク質は、生成物が一本鎖あるいは二本鎖ＲＮＡのいずれの場合においても、その合成活性を促進することができる。【００３６】  さらに、本発明のＲＮＡ合成の促進方法は、長鎖ｄｓＲＮＡのみならず、短鎖ｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡの合成に利用することができる。当該ｓｉＲＮＡ合成においては、特に限定はされないがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ等を用いて、好ましくは約１５〜３０塩基対、特に好ましくは約２０〜２５塩基対のものを合成する際に利用できる。【００３７】  さらに本発明の方法においては、核酸結合活性を有するタンパク質がＲＮＡ合成活性を有するタンパク質によるｄｓＲＮＡの合成ならびにｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質のｄｓＲＮＡ分解の二つの反応を促進するため、特にＲＮＡ干渉において重要なｄｓＲＮＡの合成ならびにｓｉＲＮＡの生成系に利用することができる。この場合、各タンパク質は別個であってもよいし、融合タンパク質の形態であってもよい。【００３８】（３）本発明の方法に使用される組成物
本発明の組成物は、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応及び／又はＲＮＡの合成反応を効率よく行うための組成物である。
当該組成物は、上記（２）記載の核酸結合活性を有するタンパク質を含み、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド  ショック  プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド  ショック  プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列（配列表の配列番号１０記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列）を有するサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好ましい。【００３９】  本発明の組成物には、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及び／又はＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含んでいてもよい。特定の長さのｄｓＲＮＡを生成し得るｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質としては、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを有するものが好ましく、例えば、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなるタンパク質が好適に使用できる。特に限定はされないが例えば、上記（１）記載のＤｉｃｅｒ変異体、天然型Ｄｉｃｅｒあるいは、市販のリコンビナントＤｉｃｅｒのような機能的同等物のいずれであっても良い。当該Ｄｉｃｅｒ変異体を含む組成物としては、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列からなるもの、あるいは配列表の配列番号３又は１６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質を含む組成物であってもよい。また、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を含む組成物であってもよい。
上記ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質において、さらに発現ベクター由来の配列、例えば、発現あるいは翻訳増強配列（例えば、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列等）、発現タンパク質精製用のタグ配列（例えば、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列等）、あるいは発現タンパク質のＮ末端側の付加配列を除去するための配列（例えば、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａ配列等）などのアミノ酸配列を付加したタンパク質であっても良い。前記タンパク質としては、特に限定はされないが、例えば配列表の配列番号１２又は１８記載のアミノ酸配列を有するｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が挙げられる。さらに、本発明の組成物には、上記（１）記載のＤｉｃｅｒ変異体を安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。【００４０】  さらに、ＲＮＡ合成活性を有するタンパク質としては、例えばＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。
さらに本発明の組成物の別態様としては、上記（２）記載の核酸結合活性を有するタンパク質、例えば、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質と特定の長さのｄｓＲＮＡを生成し得るｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質との融合タンパク質及び／又は核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質を含有していてもよい。
本発明の組成物は、特定の長さのｄｓＲＮＡへの効率の良い分解及び／又は一本鎖あるいは２本鎖ＲＮＡの合成反応を簡便に行なうことができる。【００４１】  また、本発明の組成物の一態様としては、長鎖ｄｓＲＮＡのみならず、短鎖ｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡの合成に利用することができる組成物が挙げられる。当該組成物は、約１０〜１００塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対、特に好ましくは約２０〜２５塩基対のｄｓＲＮＡを合成する際に有効である。【００４２】（４）本発明の方法に使用されるキット
本発明の方法に使用されるキットは、特定の長さのｄｓＲＮＡに分解する反応及び／又はＲＮＡの合成反応を効率よく行うためのキットである。
当該キットは、上記（２）記載の核酸結合活性を有するタンパク質を含み、当該核酸結合活性を有するタンパク質は特に限定はされないが、コールド  ショック  プロテインが好適であり、例えば、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来のコールド  ショック  プロテイン（Ｃｓｐ：ｃｏｌｄ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が好適に使用でき、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列を有するサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質が好適に使用できる。【００４３】  本発明のキットには、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成する活性を有する、ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及び／又はＲＮＡ合成活性を有するタンパク質を含んでいてもよい。該ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及び／又はＲＮＡ合成活性を有するタンパク質としては、上記（３）で挙げられたものが好適に使用できる。さらに、本発明のキットには、上記（１）記載のＤｉｃｅｒ変異体を安定化させるための緩衝液を含んでいてもよい。
さらに本発明のキットの別態様としては、上記（２）記載の核酸結合活性を有するタンパク質、例えば、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質と特定の長さのｄｓＲＮＡを生成し得るｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質との融合タンパク質及び／又は核酸結合活性を有するタンパク質とＲＮＡ合成活性を有するタンパク質との融合タンパク質を含有していてもよい。
さらに、本発明のキットには、上記以外のコンポーネント、例えば反応の結果生成された特定の長さのｄｓＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い。特に限定はされないが例えば、約２１塩基対のｓｉＲＮＡを精製するための試薬、それを生体サンプルに導入する試薬等を含有していても良い
本発明のキットを用いることで、特定の長さのｄｓＲＮＡへの効率の良い分解及び／又はＲＮＡの合成を簡便に行なうことができる。【００４４】  また本発明のキットの一態様としては、長鎖ｄｓＲＮＡのみならず、短鎖ｄｓＲＮＡ、例えばｓｉＲＮＡの合成に利用することができるキットが挙げられる。当該キットは、約１０〜１００塩基対、好ましくは約１５〜３０塩基対、特に好ましくは約２０〜２５塩基対のｄｓＲＮＡを合成する際に有効である。
【実施例】
【００４５】  以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
また、本明細書に記載の操作のうち、プラスミドの調製、制限酵素消化などの基本的な操作については２００１年、コールド  スプリング  ハーバー  ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー  クローニング：ア  ラボラトリー  マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．）に記載の方法によった。【００４６】実施例１  ヒト由来ＤｉｃｅｒのＲＮａｓｅＩＩＩドメインの発現
（１）発現ベクターの構築
配列表の配列番号１記載のヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸１２７１〜１９２４（塩基番号３８１１〜５７７２）よりなるポリペプチドを発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号５及び６記載の塩基配列を有する合成プライマー１及び２をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー１は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１２７１〜１２７７に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー２は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１９１９〜１９２４に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３６にもつ。【００４７】  上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡライブラリー、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、タカラバイオ社製）２μｌ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー１、１０ｐｍｏｌの合成プライマー２、０．５ＵのＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００４８】  反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約２ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロース電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００４９】  次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを調製した。
次に上記ｐＣｏｌｄ０８ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００５０】  目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒとした。当該プラスミドは、ｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒと命名、表示され、平成１５年８月１１日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７４として寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１２７１〜１９２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１２に、塩基配列を配列表の配列番号１３に示す。【００５１】（２）発現、精製及び各種ｂｕｆｆｅｒ条件でのサンプル調製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−Ｒを用いて大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を１００ｍｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。前記培養後、１５℃に保温したインキュベーター内で１０分間振とうした後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、５ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ（トライトン）Ｘ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール、２ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。【００５２】  上記上清の抽出液約５ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）にｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００］を１０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄して、約１ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ１５ｍｍのカラムに充填し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで２回洗浄した。次に５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］、続いて５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。【００５３】  洗浄後、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］で透析を行ない、その後、セントリコン（アミコン社製）を用いて約１０倍まで濃縮を行なった。この精製濃縮サンプルの一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量約７６，８００のところに目的タンパク質のバンドが確認された。さらに、当該サンプルについてＡｎｔｉ  Ｈｉｓ  ＨＲＰ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（キアゲン社製）を用い、その添付プロトコルに従って抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティング検出を行なったところ、目的のタンパク質バンドが発色検出された。以下、このヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質をｈＤｉＲと称する。【００５４】  さらに上記方法ではｂｕｆｆｅｒＤでの溶出後、ｂｕｆｆｅｒＥ（これをタンパク質サンプルＩとする）で透析を行なっているが、タンパク形状緩衝液の条件設定のため、以下の組成の緩衝液での透析も同様にして実施した。
１：ｂｕｆｆｅｒＦを用いた透析［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］→タンパク質サンプルＩＩ
２：ｂｕｆｆｅｒＧを用いた透析［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］→タンパク質サンプルＩＩＩ
３：ｂｕｆｆｅｒＨを用いた透析［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］→タンパク質サンプルＩＶ【００５５】実施例２  ｄｓＲＮＡ分解活性の測定
（１）反応液の調製
上記実施例１−（２）で調製したタンパク質サンプルＩ〜ＩＶについてそのＤｉｃｅｒ活性を測定した。当該活性測定は以下のようにして行った。
まず、活性測定に用いた基質となるｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。
すなわち、プラスミドｐＱＢＩ１２５（和光純薬社製）に挿入されているＲｅｄ−ｓｈｉｆｔ  Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（以下ＧＦＰと略称する）をコードする遺伝子（配列表の配列番号１１）について、プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（タカラバイオ社製）に挿入したｐＤＯＮ−ｒｓＧＦＰを鋳型とし、配列表の配列番号７記載のＴ７プロモーター配列をもった合成プライマー３と配列表の配列番号８記載の合成プライマー４を用いてＰＣＲを行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによるＲＮＡ合成反応により約７００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。【００５６】  上記方法で調製したｄｓＲＮＡ  １μｇ、上記（２）で調製したｈＤｉＲ  １μｌ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  １μｌ、５×反応緩衝液（それぞれ最終透析に用いた緩衝液の５倍濃縮したもの）２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。【００５７】  また、市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）の場合は、Ｄｉｃｅｒ酵素液２μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ０．５μｌ、付属の反応緩衝液  ４μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。【００５８】  以上の反応液を調製し、３７℃で１７時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。電気泳動後にエチジウムブロマイド染色したゲルより、約２１ヌクレオチドの分解産物の確認されたものを活性有とした。【００５９】（２）活性測定
上記（１）で調製した反応液の活性測定を行い、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉＲ）への影響を検討した。さらに、各緩衝液中における安定性についても検討するため、精製直後のサンプルを用いた場合と、４℃及び−２０℃条件で５日間保存したサンプルを用いた。その結果、特にタンパク質サンプルＩＩＩ、タンパク質サンプルＩＶにおいては、４℃保存ならびに−２０℃保存のいずれの場合においても市販Ｄｉｃｅｒと同じ大きさの約２１ヌクレオチドの分解産物が確認され、その活性を安定に保持していることが確認できた。【００６０】  以上のことから、ヒト由来ＤｉｃｅｒのＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉＲ）は、ｐＨ８．５以上のトリス−塩酸緩衝液中、塩化マグネシウムが存在する条件で保存することで活性を安定化できることが判明した。【００６１】実施例３  ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子の検討
（１）ｄｓＲＮＡ生産及び分解に寄与する因子を検討するために、常温域で核酸結合活性を有するタンパク質について検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質は入手が困難であった。従って、配列表の配列番号９記載のアミノ酸配列を有するサーモトガ  マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のＣｓｐＢタンパク質をモデルタンパク質として用いた。当該タンパク質は、プロテイン  サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の方法で調製した。【００６２】（２）サーモトガマリティマ由来ＣｓｐＢのｄｓＲＮＡ分解への効果
ＣｓｐＢを添加した形でのｄｓＲＮＡ分解活性は以下のように測定した。
すなわち、ｈＤｉ−Ｒを酵素として用いた場合、実施例１−（２）で調製したｈＤｉＲ（酵素液）１μｌ、上記（１）で調製したＣｓｐＢ溶液  １μｌ、基質として実施例２−（１）で使用したｄｓＲＮＡ  １μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  １μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍＭ  ＤＴＴ］２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。また市販のＤｉｃｅｒの場合は、添付資料記載の組成に基質となるｄｓＲＮＡを１μｇ加え、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。なお市販のＤｉｃｅｒについては、ＧＴＳ社、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のものを使用した。【００６３】  添加したＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で４．６ｎｇ／μｌ、９．２ｎｇ／μｌ、１８．４ｎｇ／μｌ、９２ｎｇ／μｌになるように添加し、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。【００６４】  以上の反応液を調製し、３７℃で１８時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い分解産物を確認した。さらに、当該ゲルをＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析によって、約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分解物の定量を行なった。その結果、市販Ｄｉｃｅｒ及びＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉＲ）のいずれの場合においてもＣｓｐＢ添加によるｄｓＲＮＡの分解量の向上が全ての添加量に関して確認できた。特に９．２ｎｇ／μｌの前後で分解量が向上することが確認できた。【００６５】  すなわち、ＣｓｐＢを反応液中に添加することで、市販のＤｉｃｅｒ、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質のいずれにおいてもｄｓＲＮＡ分解産物がより多く得られることが明らかとなった。【００６６】（３）サーモトガ  マリティマ由来ＣｓｐＢのＲＮＡ合成への効果
ＲＮＡ干渉においては、ｄｓＲＮＡを合成するためにＲＮＡ合成系の活性を促進することも重要であるとの見地に基づき、サーモトガ  マリティマ由来ＣｓｐＢのＲＮＡ合成への効果を検討した。モデル系として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ系を選択した。ＲＮＡ合成系への影響については以下のようにして行った。すなわち、ＣｓｐＢを添加した形でのＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写量を目安とした。常法により調製したＴ７プロモーターを有するｐＥＴ１６ｂ（ノバジェン社製）に配列表の配列番号１１記載の塩基配列を有するｒｓＧＦＰ遺伝子を導入したプラスミドを鋳型ＤＮＡとして１μｇ、１０×Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ用緩衝液（タカラバイオ社製）２μｌ、５０ｍＭ  ＤＴＴ  ２μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター（タカラバイオ社製）０．４μｌ、２５ｍＭ  ＮＴＰ  ２μｌ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）１μｌ、ＣｓｐＢ溶液  １μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて容量を２０μｌとしたものを反応液とし、３７℃で４時間反応させた。なお本実施例でＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９０ｎｇ／μｌ、１８０ｎｇ／μｌ、４６０ｎｇ／μｌ、９２０ｎｇ／μｌになるように添加し、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。
反応後のサンプル２μｌに、１０×ＭＯＰＳ緩衝液（２００ｍＭ  ＭＯＰＳ、５０ｍＭ  酢酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＥＧＴＡ）２μｌ、ホルムアルデヒド  ２μｌ、脱イオン化ホルムアミド  ９μｌ及びｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水  ３μｌを添加して７０℃、１０分間保温し、その後氷中で１分間インキュベートした。これに１０×ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２μｌを添加して、１×ＭＯＰＳ緩衝液中でエチジウムブロマイドを含む１．２５％アガロースゲルを用いて電気泳動解析を行なった。そのゲルをＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析によって、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｍＲＮＡの定量を行なった。その結果、いずれの濃度においても転写産物量の向上が確認できた。特に、ＣｓｐＢの添加量が４６０ｎｇ／μｌ以上の場合、転写産物量が無添加時の場合の約２倍以上に、さらに９２０ｎｇ／μｌ添加した場合は約３倍になることが確認できた。【００６７】（４）サーモトガ  マリティマ由来ＣｓｐＢのｄｓＲＮＡ合成への効果
次にサーモトガ  マリティマ由来ＣｓｐＢのｄｓＲＮＡ合成に対する影響について検討した。本実施例においては、実施例２−（１）で調製したｄｓＲＮＡ合成用鋳型を利用した。ＲＮＡへの転写については、市販のＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ジーンセラピーシステムズ社製）を用いて、その添付プロトコルに従った。なお、この際に添加したＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９０ｎｇ／μｌ、１８０ｎｇ／μｌ、４６０ｎｇ／μｌ、９２０ｎｇ／μｌになるようにし、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。３７℃、４時間反応後に１μｌのＤＮａｓｅＩを添加し、３７℃で１５分間反応させた。この反応液の４０倍希釈液１μｌをエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル電気泳動に供した。そのゲルを上記（３）と同様の方法でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたｄｓＲＮＡの定量を行なった。その結果、いずれの濃度においても転写産物量の向上が確認できた。特に、ＣｓｐＢの添加量が９２０ｎｇ／μｌ以上の場合、転写産物量が無添加時の場合の約２倍以上なることが確認できた。【００６８】  上記実施例と同様に別態様のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ転写系についても検討した。すなわち、実施例２−（１）で調製したｄｓＲＮＡ合成用鋳型１μｇ、１０×Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ緩衝液（タカラバイオ社製）１μｌ、５０ｍＭ  ＤＴＴ  １μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター（タカラバイオ社製）０．２μｌ、２５ｍＭ  ＮＴＰ  １μｌ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社製）０．５μｌ、ＣｓｐＢ溶液  １μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて容量を１０μｌとしたものを反応液とし、３７℃で４時間反応させた。なおこの際に添加したＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９０ｎｇ／μｌ、１８０ｎｇ／μｌ、４６０ｎｇ／μｌ、９２０ｎｇ／μｌになるようにし、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。反応後のサンプルにＤＮａｓｅＩ（タカラバイオ社製）を０．５μｌ加えて、３７℃で１５分間反応させた。この反応液の４０倍希釈液１μｌをエチジウムブロマイドを含む１％アガロースゲル電気泳動に供した。そのゲルについてもｄｓＲＮＡの定量を行なった。その結果、いずれの濃度においても転写産物量の向上が確認できた。特に、ＣｓｐＢの添加量が９２０ｎｇ／μｌ以上の場合、転写産物量が無添加時の場合の約３倍以上なることが確認できた。【００６９】  以上のように、ＣｓｐＢを反応液中に添加することで、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによる転写産物がより多く得られることが明らかとなった。この効果は、１本鎖ＲＮＡ合成ならびに２本鎖ＲＮＡ合成のいずれの場合においても確認できた。【００７０】実施例４  ヒト由来ＤｉｃｅｒのＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインの発現
（１）発現ベクターの構築
配列表の配列番号１記載のヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列のＮ末端側よりアミノ酸６７９〜１９２４（塩基番号２０３５〜５７７２）よりなるポリペプチドを発現させるため、以下のようにして発現ベクターを構築した。
まず、ジーンバンク登録Ｎｏ．ＡＢ０２８４４９で公開されている塩基配列より、配列表の配列番号１４及び１５記載の塩基配列を有する合成プライマー５及び６をＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマー５は、制限酵素ＫｐｎＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号６７９〜６８５に相当する塩基配列を塩基番号１６〜３６にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマー６は、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を塩基番号９〜１４に、さらにヒト由来Ｄｉｃｅｒのアミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号１９１９〜１９２４に相当する塩基配列を塩基番号１８〜３５にもつ。【００７１】  上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、鋳型ＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡライブラリー、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｓ、タカラバイオ社製）２μｌ、５μｌの１０×ＬＡ  ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマー５、１０ｐｍｏｌの合成プライマー６、０．５ＵのＴａｋａｒａ  ＬＡ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃  １分、５５℃  １分、７２℃  ３分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。【００７２】  反応終了後、該反応液５μｌを１．０％アガロースゲル電気泳動に供した。確認された目的の約２．７ｋｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動ゲルより回収・精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＫｐｎＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、１．０％アガロースゲル電気泳動によりそのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化物を抽出精製し、ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【００７３】  次に実施例１−（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８ＮＣ２ベクターを上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。【００７４】  目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認し、この組み換えプラスミドをｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩとした。当該プラスミドは、ｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩと命名、表示され、平成１５年９月２６日（原寄託日）より独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６））にＦＥＲＭ  ＢＰ−１００７６として寄託されている。このｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩは、ヒト由来Ｄｉｃｅｒ  アミノ酸配列（配列番号１）のアミノ酸番号６７９〜１９２４のアミノ酸配列をコードする塩基配列（配列表の配列番号１６記載の塩基配列、配列番号１７記載のアミノ酸配列）を含むプラスミドである。前記プラスミドから発現させたタンパク質は、Ｐｅｒｆｅｃｔ  ＤＢ配列、Ｈｉｓ  ｔａｇ配列、並びにＦａｃｔｏｒ  Ｘａ配列を有している。当該タンパク質のアミノ酸配列を配列表の配列番号１８に、塩基配列を配列表の配列番号１９に示す。【００７５】（２）発現、精製
上記（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩを用いて大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ  ｓｔｒａｉｎ（ストラタジーン社製）を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２．５ｍｌのＬＢ液体培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この一部を１００ｍｌの同ＬＢ培地に植菌し、３７℃で対数増殖期まで培養した。前記培養後、１５℃に保温したインキュベーター内で１０分間振とうした後、ＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、そのまま１５℃で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、５ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トライトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  フェニルメチルスルフォニルフルオライド］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１１，０００ｒｐｍ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。【００７６】  上記上清の抽出液約５ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。
すなわち、樹脂容積にして１ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）にｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トライトンＸ−１００］を１０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄して、約１ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ１５ｍｍのカラムに充填し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで２回洗浄した。次に５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、４０ｍＭ  イミダゾール］、続いて５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。【００７７】  洗浄後、３ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．１％トライトンＸ−１００、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。次に、５００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＥ［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％トリトンＸ−１００、１ｍＭ  ジチオスレイトール］で透析を行ない、その後、セントリコン（アミコン社製）を用いて約１０倍まで濃縮を行なった。その一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ  ｓｔｒａｉｎ（ストラタジーン社製）を宿主として用いたサンプルで分子量約１４４，０００のところに目的タンパク質のバンドが確認され、これを以下の活性の確認に使用した。以下、このヒト由来Ｄｉｃｅｒ  ＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質をｈＤｉ−ＡＳＩとする。【００７８】（３）ｄｓＲＮＡ分解活性の測定
上記実施例４−（２）で調製したタンパク質サンプルについて、実施例２記載の方法でそのｄｓＲＮＡ分解活性を測定した。
その結果、電気泳動後にエチジウムブロマイド染色したゲルより、約２１ヌクレオチドの分解産物が確認され、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉＲ）とＰＡＺ領域を含むタンパク質（ｈＤｉ−ＡＳＩ）においてもｄｓＲＮＡ分解活性が確認された。【００７９】  さらに、凍結・融解における安定性についても検討するため、−８０℃条件で上記タンパク質サンプルを凍結、その後、室温で融解させるという操作を６回、及び１０回繰り返した。また、コントロールとして実施例１−（２）で調製したｈＤｉＲについても同様の検討を行った。
その結果、ＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉ−ＡＳＩ）の場合、凍結・融解を６回、１０回繰り返しても分解活性を保持していた。一方、ｈＤｉＲについては６回の凍結・融解まで活性は確認された。このことから、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインにさらにＰＡＺドメインを含むことにより当該タンパク質は、より多くの凍結・融解に対する安定性を獲得することが確認できた。【００８０】（４）分解に寄与する因子についての検討
上記実施例４−（２）で調製したｈＤｉ−ＡＳＩについて、常温域で核酸結合活性を有するタンパク質の影響を検討した。
上記核酸結合活性を有するタンパク質としては、上記実施例３で調製したサーモトガ  マリティマ由来のＣｓｐＢタンパク質を用いた。また、ｄｓＲＮＡ分解への効果については、以下のように測定した。
すなわち、実施例４−（２）で調製したｈＤｉ−ＡＳＩ（酵素液）１μｌ、実施例３で調製したＣｓｐＢ溶液  １μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  １μｌ、５×反応緩衝液［２５０ｍＭ  トリス−塩酸（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、０．５％トライトンＸ−１００、５ｍＭ  ＤＴＴ］を２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。ＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９．２ｎｇ／μｌ、１８．４ｎｇ／μｌ、９２ｎｇ／μｌになるように添加し、無添加の場合のコントロールとしてＣｓｐＢの形状緩衝液である１０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）を１μｌ添加した。
以上の反応液を調製し、３７℃で１７時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。さらに、当該ゲルをＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析によって、約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分解物の定量を行なった。
その結果、ｈＤｉ−ＡＳＩの場合においても、ＣｓｐＢ添加によるｄｓＲＮＡの分解量の向上が確認できた。特に９．２ｎｇ／μｌの前後で分解量が向上することが確認できた。【００８１】  すなわち、ＣｓｐＢは、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む天然型、あるいは変異型のヒト由来ＤｉｃｅｒのいずれにおいてもそのｄｓＲＮＡ分解活性を促進することが確認できた。【００８２】実施例５
本発明のヒト由来ｈＤｉＲを用いて調製したｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社）を用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例２−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例１−（２）記載のｈＤｉＲ並びに市販のＤｉｃｅｒを１０単位用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１８時間で切断した。これらの切断産物をＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  １、２（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。【００８３】  すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：５×１０４）２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。約８０％コンフレントになった状態で５０μｌの無血清培地に３μｌのＴｒａｎｓＩＴ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。そこに４μｌのＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ試薬を加えて穏やかに混和し、室温で５分間放置した。そこに上記ｓｉＲＮＡを５００ｎｇ加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置し、これをＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液とした。Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに、ＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液を滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液を導入した場合のＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表１に示す。【００８４】
【表１】
2005017144.tif 000002
【００８５】  表１に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、ｈＤｉＲによって得られるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同様にＲＮＡ干渉効果を示し、市販Ｄｉｃｅｒのものよりも強いＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のｈＤｉＲがＲＮＡ干渉ためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。【００８６】  実施例６
本発明のｈＤｉＲを用いて調製したｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の効果について、ｓｉＲＮＡの添加量を換えて検討した。対照として、市販のＤｉｃｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ｄｓＲＮＡの切断については、基本的に上記実施例２−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例１−（２）記載のｈＤｉＲ並びに市販のＤｉｃｅｒを１０μｌ用いて、ｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１８時間で切断した。なおこの際には、実施例３−（２）で使用したＣｓｐＢを最終濃度９．２ｎｇ／μｌになるように添加し、反応させた。
これらの切断産物をＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  １、２（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。【００８７】  すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約９５％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（和光純薬社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡ  １６６．７ｎｇ、５５．６ｎｇ、１８．５ｎｇを加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を，Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表２に示す。【００８８】
【表２】
2005017144.tif 000003
【００８９】  表２に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較して平均蛍光強度の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、ｈＤｉＲによって得られるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同様にＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のｈＤｉＲがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。【００９０】  上記細胞サンプルについてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出しｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲに供しｒｓＧＦＰのｍＲＮＡを定量する事で、ＲＮＡ干渉の評価を行った。【００９１】  すなわち、ｓｉＲＮＡ導入後ＣＯ２インキュベーターで３７℃、２４時間培養した細胞からｔｒｉｚｏｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用してトータルＲＮＡを抽出、精製した。なおこの際の作業は、添付のプロトコルに従って行った。そのトータルＲＮＡを８０ｎｇ、５×Ｍ−ＭＬＶ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）４μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ（タカラバイオ社製）１μｌ、ｒａｎｄｏｍ  ｈｅｘａｍｅｒ  １００ｐｍｏｌ、ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（タカラバイオ社製）２０Ｕ、Ｍ−ＭＬＶ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  １００Ｕ、を加え、滅菌水で全量を２０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、４２℃  １０分、９５℃  ２分の反応を行った。この反応液に２０μｌの反応希釈液（１×Ｍ−ＭＬＶ  ｂｕｆｆｅｒ、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅ）を加え、これを１０μｌずつに分注した。前述の反応物１０μｌに、１０×Ｒ−ＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、２５０ｍＭ  Ｍｇ２＋  ０．３μｌ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ０．７５μｌ、ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｒ−ＰＣＲ（タカラバイオ社製）１．２５Ｕ、滅菌水で３０００倍希釈したＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（タカラバイオ社製）２．５μｌ、１００％  ＤＭＳＯ  １．２５μｌを加え、β−ａｃｔｉｎ（タカラバイオ社製）、ＧＡＰＤＨ（タカラバイオ社製）、ｒｓＧＦＰ（ｒｓＧＦＰ−Ｆ：配列番号２０、ｒｓＧＦＰ−Ｒ：配列番号２１）、Ｎｅｏ（Ｎｅｏ−Ｆ：配列番号２２、Ｎｅｏ−Ｒ：配列番号２３）を検出するための合成プライマーを５ｐｍｏｌずつ加え、滅菌水で全量を２５μｌとした。前記反応液をＳｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｕｎｉｔ（タカラバイオ社製）にセットし、９５℃、１０秒で熱変性を行った後、９５℃  ５秒、６０℃  ２０秒を１サイクルとする４５サイクルの反応を行なった。得られたデータを解析することで，ヒト由来のβ−ａｃｔｉｎ、ＧＡＰＤＨ、および導入プラスミド由来のｒｓＧＦＰ、ＮｅｏのｍＲＮＡ量を定量した。その結果を表３に示す。【００９２】
【表３】
2005017144.tif 000004
【００９３】  表３に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してｒｓＧＦＰのｍＲＮＡ量が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、ｈＤｉＲは、市販Ｄｉｃｅｒと同様にＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のｈＤｉＲは、ＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。【００９４】  実施例７
上記実施例１−（２）、実施例４−（２）で調製したサンプルについてそのｄｓＲＮＡ分解活性の基質となるｄｓＲＮＡをルシフェラーゼ遺伝子より作製し評価した。実施例２−（１）と同様にｄｓＲＮＡは、ＴｕｒｂｏＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＧＴＳ社製）を用いて、その添付プロトコルに従って合成した。【００９５】  すなわち、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）に挿入されているルシフェラーゼをコードする遺伝子について、プラスミドｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（プロメガ社製）を鋳型とし、配列表の配列番号２４記載のＴ７プロモーター配列をもったｄｓｌ−１プライマーと配列表の配列番号２５記載のｄｓｌ−２プライマーを用いてＰＣＲ（増幅断片長約５００塩基対）を行い、増幅産物を得た。次に得られた２本鎖ＤＮＡを鋳型として、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ合成反応により約５００ｂｐの長さのｄｓＲＮＡを調製した。【００９６】  本発明のｈＤｉＲ、ｈＤｉ−ＡＳＩを用いて調製したｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販のＤｉｃｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ｄｓＲＮＡの切断については、基本的に上記実施例２−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例１−（２）記載のｈＤｉＲ、実施例４−（２）記載のｈＤｉ−ＡＳＩ並びに市販のＤｉｃｅｒを１０μｌ用いて、上記のｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１８時間で切断した。なおこの際には、実施例３−（２）で使用したＣｓｐＢを最終濃度９．２ｎｇ／μｌになるように添加し、反応させた。
これらの切断産物をＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  １、２（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。【００９７】  すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）２４ｗｅｌｌプレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約９５％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．５μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌと０．１μｇのｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡを１６６．７ｎｇ、５５．６ｎｇ、１８．５ｎｇを加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
このように調製した２種類の溶液を、Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたアッセイに供することで、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対する、ｓｉＲＮＡを添加した場合のＧＬ３タンパク質発現の阻害効果を測定した。その結果を表４に示す。【００９８】
【表４】
2005017144.tif 000005
【００９９】  表４では、コントロール（ベクターのみ）と比較してそのＧＬ３発現量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、ｈＤｉＲ、ｈＤｉ−ＡＳＩによって得られるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同様にＲＮＡ干渉効果を示すことが確認できた。
以上のことから、本発明のｈＤｉＲ、ｈＤｉ−ＡＳＩがＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。【０１００】  実施例８
本発明のｈＤｉＲ、ｈＤｉ−ＡＳＩを用い、ＣｓｐＢを添加して調製したｓｉＲＮＡと無添加で調製したｓｉＲＮＡについて、そのＲＮＡ干渉の効果について検討した。なお実際の操作は実施例７記載のルシフェラーゼを用いた方法に習った。対照として、市販のＤｉｃｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いた。ｄｓＲＮＡの切断については、基本的に上記実施例２−（１）記載の方法で行った。すなわち、実施例１−（２）記載の方法で調整したｈＤｉＲ、実施例４−（２）記載の方法で調整したｈＤｉ−ＡＳＩ並びに市販のＤｉｃｅｒを１０μｌ用いて、上記のｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１８時間で切断した。なおこの際には、実施例３−（２）で使用したＣｓｐＢを最終濃度９．２ｎｇ／μｌになるように添加した場合と添加しない場合とで反応させた。
これらの切断産物をＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  １、２（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。【０１０１】
【表５】
2005017144.tif 000006
【０１０２】  表５では、コントロール（ベクターのみ）と比較してそのＧＬ３発現量の値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっていると考えられる。従って、ＣｓｐＢの添加、無添加サンプルの間に、ＲＮＡ干渉効果の差はないことを示した。
以上のことからＲＮＡ干渉のためのｓｉＲＮＡ調製の際に、本発明のＣｓｐＢがｓｉＲＮＡに対し、質的な影響を与えないことが確認できた。【０１０３】実施例９  酵素の安定性
実施例４−（２）で精製したＰＡＺドメイン＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉ−ＡＳＩ）にＣｓｐＢを終濃度で９２ｎｇ／μｌになるように加えたものを保存緩衝液Ｉ（５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０％  グリセロール）中で保存し、一定期間ごとに以下のようにして、そのｄｓＲＮＡ分解活性を測定した。実施例２−（１）で調製したｄｓＲＮＡ  １μｇ、上記４−（２）で調製したタンパク質サンプル  １μｌ、５×反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム）２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で１８時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。その結果、６ヶ月以上の保存サンプルにおいて約２１塩基対の分解産物が確認され、ｄｓＲＮＡ分解活性が確認された。一方、同緩衝液条件においては、ＲＮａｓｅＩＩＩドメインタンパク質（ｈＤｉＲ）にＣｓｐＢを加えたものについて、活性が３ヶ月以上保持された。【０１０４】実施例１０  ｐＣｏｌｄ１４−ＴｍＣｓｐＢの作製、組み換え体の培養、及び精製
（１）ｐＣｏｌｄ１４−ＴｍＣｓｐＢの作製
以下のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＣｓｐＢ（以降、ＴｍＣｓｐＢとする）のクローニングに際しては、プロテイン  サイエンス（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第８巻、３９４−４０３頁（１９９９）記載の配列（アミノ酸配列を配列番号９、塩基配列を配列番号１０に示す。）を参照した。
まず、配列表の配列番号２６及び２７記載の塩基配列を有する合成プライマーＥ及びＦをＤＮＡ合成機で合成し、常法により精製した。上記合成プライマーＥは、制限酵素ＮｄｅＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、さらにＴｍＣｓｐＢのアミノ酸配列（配列番号２６）のアミノ酸番号１〜７に相当する塩基配列を塩基番号１４〜３４にもつ合成ＤＮＡである。また、合成プライマーＦは、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列を塩基番号１１〜１６に、ＴｍＣｓｐＢのアミノ酸配列（配列番号２６）のアミノ酸番号６１〜６６に相当する塩基配列を塩基番号２０〜３７にもつ合成ＤＮＡである。【０１０５】  上記合成プライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲの反応条件を以下に示す。
すなわち、実施例３−（１）の鋳型ＤＮＡ１μｌ（５０ｎｇ）、５μｌの１０×Ｅｘ  Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ社製）、５μｌのｄＮＴＰ混合液（タカラバイオ社製）、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＥ、１０ｐｍｏｌの合成プライマーＦ、０．５ＵのＴａｋａｒａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ社製）を加え、滅菌水を加えて全量を５０μｌとした。前記反応液をＴａＫａＲａ  ＰＣＲ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＳＰ（タカラバイオ社製）にセットし、９４℃１分、５５℃１分、７２℃１分を１サイクルとする３０サイクルの反応を行なった。
反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供し、目的の約２２０ｂｐのＤＮＡフラグメントを確認した。残りのＰＣＲ反応液を電気泳動し、そのフラグメントを回収、精製し、エタノール沈殿を行なった。エタノール沈殿後の回収ＤＮＡを５μｌの滅菌水に懸濁し、制限酵素ＮｄｅＩ（タカラバイオ社製）及び制限酵素ＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）で２重消化し、３．０％アガロース電気泳動によりそのＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化物を抽出精製し、ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片を得た。【０１０６】  次に国際公開第９９／２７１１７号パンフレットの実施例１〜６記載の方法に従い、ｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターを調製した（以下、このｐＣｏｌｄ０４ＮＣ２ベクターをｐＣｏｌｄ１４ベクターと称する）。【０１０７】  次に上記ｐＣｏｌｄ１４ベクターを、上記ＤＮＡ断片を調製した時に用いたのと同じ制限酵素で切断し、末端を脱リン酸処理したものを調製し、上記ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡ断片と混合し、ＤＮＡライゲーションキット（タカラバイオ社製）を用いて連結した。その後、ライゲーション反応液２０μｌを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。
目的のＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドは、シークエンシングすることにより確認した。【０１０８】（２）ＣｓｐＢの５リットルジャーでの培養、及び精製
上記実施例１０−（１）で調製したｐＣｏｌｄ１４−ＴｍＣｓｐＢを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを３０ｍｌのＬＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ０．３ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ０．１５ｇ、ＮａＣｌ  ０．１５ｇ、アンピシリン１．５ｍｇ）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液３０ｍｌ分を３リットルのＬＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ３０ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  １５ｇ、ＮａＣｌ  １５ｇ、アンピシリン１５０ｍｇ）を含む５リットルジャーファーメンター（エイブル社製）に植菌後、１５０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝０．５リットル／ｍｉｎ、３７℃の条件で対数増殖期まで培養し、その後、１５℃に冷却した。冷却後にＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、１５０ｒｐｍ、Ａｉｒ＝０．５リットル／ｍｉｎ、１５℃の条件で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、１１ｇの湿菌体を得た。湿菌体１１ｇを４４ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１０，０００×ｇ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。この上清の抽出液をさらに超遠心分離（７０，０００×ｇ  ２０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。【０１０９】  上記上清の抽出液、約５３ｍｌを水浴上で熱処理（７０℃、１０分）を行い、遠心分離（１０，０００×ｇ  ２０分）により上清と沈殿とに分離した。この熱処理上清に終濃度２００ｍＭとなるようにＮａＣｌを添加し、さらにｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２００ｍＭ  塩化ナトリウム］で平衡化したＡｎｉｏｎＥｘｃｈａｎｇｅｒ  ＤＥ５２  １０ｍリットルを添加し、４℃で一晩緩やかに攪拌した。遠心分離（３，０００×ｇ  ２０分）により上清と沈殿とに分離し、上清をさらにガラスフィルターで濾過を行った。この濾液４５ｍｌにつき、３リットルのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］に対して透析を行なった。【０１１０】  φ２０ｍｍのカラムに充填した樹脂容積にして１００ｍｌ分のＱ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦ．Ｆ．（アマシャム・バイオサイエンス社製）に透析後の液５０ｍｌを添加し、４００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で洗浄を行った。この非吸着画分を回収し、ＵＦ３０，０００カット  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−３０（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を通過させた。このＵＦ通過液２６０ｍｌをφ３０ｍｍのカラムに充填した４０ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（アマシャム・バイオサイエンス社製）に添加し、１６０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］で洗浄を行なった。その後、２００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］の０〜１Ｍ塩化ナトリウムグラジエントで目的タンパク質の溶出を行なった。トリシン−ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動にて分子量約７，５００の目的タンパク質���確認された画分を回収し、３リットルのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）］に対して透析を行なった。この透析後の液６５ｍｌをＵＦ３，０００カット  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ  ＹＭ−３（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）を用いて約１４４倍まで濃縮を行い、約４５０μｌのタンパク質サンプルを得た。このタンパク質サンプルに等量のグリセロールを添加し、５０％グリセロール溶液（Ｗ／Ｗ）８５０μｌを得た。その一部についてトリシン−ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約７，５００の位置に目的タンパク質の単一な染色バンドが確認された。【０１１１】（３）ＣｓｐＢタンパク質による切断活性の上昇について。
次に実施例実施例１−（２）、実施例４−（２）で調製したタンパク質サンプルについて、核酸結合活性を有するタンパク質（ＣｓｐＢ）の影響を検討した。なおこの際には、実施例１０−（２）で調製したＴｍＣｓｐＢを用いた。
すなわち、実施例１−（２）、実施例４−（２）で調製したタンパク質サンプル（ｈＤｉ−Ｒ酵素液）、またはタンパク質サンプル（ｈＤｉ−ＡＳＩ酵素液）１μｌ、実施例１０−（２）で調製したＣｓｐＢ溶液（９２ｎｇ／μｌ）を１μｌ、実施例２−（１）で調製した基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、５×反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム）２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。ＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９．２ｎｇ／μｌになる。また、この際のコントロールとして市販のＤｉｃｅｒについても同様に行なった。市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）の場合は、酵素液  ２μｌ、ＣｓｐＢ溶液  １μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ０．５μｌ、付属の反応緩衝液  ４μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。さらに、ＴｍＣｓｐＢの代わりに１μｌのｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えたものをネガティブコントロールとした。
以上の反応液を調製し、３７℃で１８時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。当該ゲルをＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析によって、約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分解物の定量を行なった。
その結果、実施例１０−（２）で発現、精製されたＴｍＣｓｐＢは、実施例３−（１）で発現、精製されたＴｍＣｓｐＢと同様に、ｄｓＲＮＡの分解量の向上が確認された。【０１１２】実施例１１  ｈＤｉ−ＡＳＩの３０リットルジャーでの培養、及び精製
（１）発現、精製
上記実施例４−（１）で調製したｐＣｏｌｄ０８  ｈＤｉ−ＡＳＩを用いて、大腸菌ＢＬ２１を形質転換し、その形質転換体を１．５％（ｗ／ｖ）濃度の寒天を含むＬＢ培地（アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含む）上で生育させた。生育したコロニーを２００ｍｌのＴＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ２．４ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ４．８ｇ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ０．８ｍｌ、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、アンピシリン１０ｍｇ）に植菌し、３７℃で一晩培養した。この培養液２００ｍｌ分を２０リットルのＴＢ液体培地（ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ  ２４０ｇ、ｂａｃｔｏ−ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ  ４８０ｇ、ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ８０ｍｌ、１７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ  Ｋ２ＨＰＯ４、アンピシリン１ｇ）を含む３０リットルジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ社製）に植菌後、１００ｒｐｍ、Ａｉｒ＝６リットル／ｍｉｎ、３７℃の条件で対数増殖期まで培養し、その後、１５℃に冷却した。冷却後にＩＰＴＧを終濃度１．０ｍＭになるように添加し、１００ｒｐｍ、Ａｉｒ＝６リットル／ｍｉｎ、１５℃の条件で２４時間培養して発現誘導させた。その後菌体を遠心分離により集め、２６ｇの湿菌体を得た。湿菌体の一部１２ｇを４８ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ベーリンガーマンハイム社製）］に再懸濁した。超音波破砕により菌体を破砕し、遠心分離（１２，０００ｒｐｍ  ３０分）により上清の抽出液と沈殿とに分離した。
上記上清の抽出液約５６ｍｌを用いてさらにニッケルカラムによる精製を以下のように行なった。【０１１３】  すなわち、樹脂容積にして１６ｍｌ分のＮｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社製）に細胞破砕溶液を５０ｍｌ添加し、混和後、１，５００ｒｐｍで数分間遠心し、上清を廃棄する操作を２回繰り返して、約８ｍｌの樹脂を回収した。菌体破砕液より調製した約５６ｍｌの上清を添加し、４℃で約１時間、ロータリーシェイカーで穏やかに混和した。その後、この目的タンパク質の吸着した樹脂をφ２０ｍｍのカラムに充填し、４０ｍｌの細胞破砕溶液［５０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、プロテアーゼインヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ，ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ、ベーリンガーマンハイム社製）］で洗浄した。次に４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］で樹脂を洗浄後、４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＢ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、２０ｍＭ  イミダゾール］、続いて４０ｍｌのｂｕｆｆｅｒＡで洗浄を行い目的以外の不要タンパク質の除去を行った。
洗浄後、２４ｍｌのｂｕｆｆｅｒＣ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール、１００ｍＭ  イミダゾール］で溶出操作を行った。次に、３００ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］に対して透析を行なった。【０１１４】  透析後の酵素溶液をφ１０ｍｍのカラムに充填した１ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）に添加し、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒＤ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］で洗浄を行なった。次に、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｅ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、２００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］、その後、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｆ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］、５ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｇ［２０ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、８００ｍＭ  塩化ナトリウム、１ｍＭ  塩化マグネシウム、１０％  グリセロール］でタンパク質の溶出を行なった。その後、各溶出サンプルについてＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（アミコン社製）を用いて約２０倍まで濃縮を行ない、約２５０μｌのタンパク質サンプルを得た。その一部について１０％ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、分子量約１４４，０００の位置に目的タンパク質のバンドが確認され、これを以下の活性の確認に使用した。以上の過程で発現、精製されたものを、実施例４−（２）で大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ−ＲＩＬ  ｓｔｒａｉｎ（ストラタジーン社製）を宿主として発現、精製したものと比較すると１００ｍｌ培養液あたりの活性で約２倍程度の収量を得ることができた。【０１１５】（２）ｄｓＲＮＡ分解活性の測定
上記実施例１１−（１）で調製したタンパク質サンプルについて、実施例２−（１）で調製したｄｓＲＮＡ  １μｇ、上記１１−（１）で調製したタンパク質サンプル１μｌ、５×反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム）２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。３７℃で１８時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動、エチジウムブロマイドによる染色に供して切断産物の確認を行なった。その結果、約２１塩基対の分解産物が確認され、ｄｓＲＮＡ分解活性が確認された。【０１１６】（３）ＣｓｐＢタンパク質による切断活性の上昇について
次に実施例１１−（１）で調製したタンパク質サンプルについて、核酸結合活性を有するタンパク質（ＣｓｐＢ）の影響を検討した。
すなわち、実施例１０−（３）と同様にして、実施例１１−（１）で調製したタンパク質サンプル（酵素液）１μｌ、実施例１０−（２）で調製したＣｓｐＢ溶液  １μｌ、実施例２−（１）で調製した基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、５×反応緩衝液（１００ｍＭ  トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、７５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１２．５ｍＭ  塩化マグネシウム）２μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、全量を１０μｌとしたものを反応液とした。ＣｓｐＢタンパク質の濃度は終濃度で９．２ｎｇ／μｌになるように添加した。また、この際のコントロールとして市販のＤｉｃｅｒについても同様に行なった。市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社製）の場合は、酵素液２μｌ、ＣｓｐＢ溶液  １μｌ、基質となるｄｓＲＮＡ  １μｇ、１０ｍＭ  ＡＴＰ溶液  １μｌ、５０ｍＭ  塩化マグネシウム溶液  ０．５μｌ、付属の反応緩衝液  ４μｌ、これにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えて、容量を１０μｌとしたものを反応液とした。なお、この際にはＣｓｐＢの代わりにｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ水を加えたものをコントロールとした。【０１１７】  以上の反応液を調製し、３７℃で１８時間反応後、５μｌを１５％ポリアクリルアミド電気泳動に供し、エチジウムブロマイドによる染色を行い切断産物を確認した。さらに、当該ゲルをＴｏｔａｌ  Ｌａｂ  ｖｅｒ．１．１１（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）による画像解析によって、約２１ヌクレオチドのｄｓＲＮＡ分解物、並びに未切断ｄｓＲＮＡの解析を行なった。
その結果、本発明のＰＡＺ＋ＲＮａｓｅＩＩＩドメインを含む変異体タンパク質（ｈＤｉ−ＡＳＩ）を用いた場合において、ＣｓｐＢ添加によるｄｓＲＮＡの分解量の向上が確認でき、さらには、未切断の基質がほとんど存在せず、ほぼ全てが分解されていることが確認された。一方、市販のＤｉｃｅｒの場合は、ｄｓＲＮＡ分解の上昇が確認されるものの、半分程度の未切断の基質が存在していることが確認された。
すなわち、本発明のタンパク質を用いた場合、ＣｓｐＢ添加により基質を完全に分解することが可能であることが明らかとなった。【０１１８】実施例１２  ｈＤｉ−ＡＳＩによる切断産物のＲＮＡｉ効果
実施例１１−（１）のタンパク質を用いて調製したｓｉＲＮＡのＲＮＡ干渉の効果について検討した。対照として、市販のＤｉｃｅｒ（ＧＴＳ社）を用いた。ｄｓＲＮＡ分解産物の調製は、基本的に上記実施例１１−（３）記載の方法で行った。なおｈＤｉ−ＡＳＩの場合には、実施例１０−（２）で調製したＣｓｐＢを終濃度で９．２ｎｇ／μｌになるように添加した。すなわち、実施例１１−（１）記載の酵素にＣｓｐＢを添加したもの、並びに市販のＤｉｃｅｒを用いて、実施例２−（１）で調製したｄｓＲＮＡ１０μｇ分を、３７℃、１８時間で切断した。これらの切断産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００、Ｍｉｃｒｏｐｕｒｅ−ＥＺ（共にタカラバイオ社製）を用いて精製し、これらを以下のＲＮＡ干渉の評価に使用した。【０１１９】  すなわち、ｓｉＲＮＡ導入を行なう２４時間前に２９３細胞を、１０％  ＦＢＳおよび１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含むＤ−ＭＥＭ培地（ＳＩＧＭＡ社製）で適当量（ｃｅｌｌ数：１．５×１０５）を２４ｗｅｌｌ穴プレートにまき、一晩ＣＯ２インキュベーター内で培養した。この培養細胞が約９５％コンフレントになった時点で、４９μｌの無血清培地に１μｌのＧｅｎｅｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加え、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、０．３μｇのｐＱＢＩ２５（タカラバイオ社製）を加えて、穏やかに混和し、５分間室温で放置した。
同時に、別チューブに４７μｌの無血清培地に３μｌのＲｉｂｏｊｕｉｃｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ社製）を加えたものを用意し、激しく撹拌した。室温で５分間放置し、上記ｓｉＲＮＡを５５．６ｎｇを加えて穏やかに混和し、５分間室温で放置した。【０１２０】  このように調製した２種類の溶液を、Ｗｅｌｌ中の１０％ＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地を２５０μｌになるように添加したものに滴下し、Ｗｅｌｌ内の溶液が均一になるように穏やかに混和を行なった。またコントロールとして、ベクター（ＤＮＡ）のみを添加したもの、また滅菌水のみを加えたものも同時に行なった。その後ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した。この細胞をＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）を用いたフローサイトメトリーに供し、ベクター（ＤＮＡ）のみを導入したものに対するＤＮＡ／ｓｉＲＮＡ溶液を導入した場合のｒｓＧＦＰ発現の阻害効果を測定した。その結果を表６に示す。【０１２１】
【表６】
2005017144.tif 000007
【０１２２】  表６に示したように、コントロール（ベクターのみ）と比較してその平均蛍光値が小さいほどＲＮＡ干渉が起こっている。従って、ｈＤｉ−ＡＳＩ＋ＣｓｐＢによって得られるｓｉＲＮＡは、市販Ｄｉｃｅｒと同様にＲＮＡｉ効果を示し、ＲＮＡｉに有効であることが示された。さらに、効率よくｓｉＲＮＡを生産することができ、同量のｓｉＲＮＡを使用した場合、市販の酵素より高いＲＮＡｉ効果が得られることを確認した。
以上のことから、本発明の方法で調製したタンパク質がＲＮＡ干渉ためのｓｉＲＮＡ調製に有用であることが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】  本発明により特定の長さのｄｓＲＮＡを生成するｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が提供される。また、本発明の方法によりＲＮＡ干渉等において有用な、特定の長さのｄｓＲＮＡへの分解促進方法及び／又はＲＮＡ合成促進方法が提供される。さらに本発明の特定の長さのｄｓＲＮＡへの分解促進方法及び／又はＲＮＡ合成促進方法を簡便に実施することができる組成物ならびにキットが提供される。
【配列表フリーテキスト】
【０１２４】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３；Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４；Ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  １  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ２  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ３  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ４  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｄ−ｓｈｉｆｔｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ５  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ６  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６；Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７；Ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８；Ａｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９；Ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｃｅｒ  ｍｕｔａｎｔ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｒｓＧＦＰ−Ｆ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｒｓＧＦＰ−Ｒ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｒｓＧＦＰ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｎｅｏ−Ｆ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｎｅｏ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｎｅｏ−Ｒ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  Ｎｅｏ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｓｌ−１  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  ｄｓｌ−２  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｅ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣｓｐＢ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７；Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ  Ｆ  ｔｏ  ａｍｐｌｉｆｙ  ａ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ＣｓｐＢ
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月13日(2007.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質であって、Ｄｉｃｅｒの機能ドメインを有し、ＤｉｃｅｒのＡＴＰ結合ドメインおよびＲＮＡヘリカーゼドメインが欠失し、ｄｓＲＮＡに作用して特定の長さのｄｓＲＮＡを生成する活性を有することを特徴とするｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質。
【請求項２】
Ｄｉｃｅｒの機能ドメインが、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｄｉｃｅｒの機能ドメインが、ＲＮａｓｅＩＩＩａ、ｂならびにｄｓＲＮＡ結合ドメインからなり、さらにＰＡＺドメインを含むことを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
特定の長さのｄｓＲＮＡが、約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項５】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列、あるいは配列表の配列番号３又は１６記載の塩基配列でコードされるアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
ｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が、配列表の配列番号４又は１７記載のアミノ酸配列において、一ないしは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入あるいは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であることを特徴とする請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質をコードする核酸により宿主を形質転換する工程を包含する、請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
核酸のコドンを宿主での発現に適したものに変換するか、あるいはレアコドンに対する補強がなされた宿主を使用することを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項９】
低温誘導性ベクターを用いて発現させることを特徴とする請求項７記載の製造方法。
【請求項１０】
請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有するキット。
【請求項１１】
核酸結合活性を有するタンパク質の存在下で、ｄｓＲＮＡに請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を作用させ、特定の長さのｄｓＲＮＡを生成することを特徴とするｄｓＲＮＡの分解方法。
【請求項１２】
核酸結合活性を有するタンパク質とｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質が融合タンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸結合活性を有するタンパク質が、ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ結合活性を有するタンパク質がコールド  ショック  プロテインであることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
コールド  ショック  プロテインが、好熱性菌あるいは耐熱性菌由来であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
コールド  ショック  プロテインがサーモトガ  マリティマ由来のコールド  ショック  プロテインＢであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
特定の長さのｄｓＲＮＡが、約１５〜３０塩基対のｄｓＲＮＡであることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
請求項１１記載の方法に用いるための組成物であって、核酸結合活性を有するタンパク質並びに請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とする組成物。
【請求項１９】
請求項１１記載の方法に用いるためのキットであって、核酸結合活性を有するタンパク質と請求項１記載のｄｓＲＮＡ分解活性を有するタンパク質を含有することを特徴とするキット。
【国際調査報告】
2005017144.tif 000008
2005017144.tif 000009
2005017144.tif 000010
2005017144.tif 000011
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2005017144.tif 000013
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2005017144.tif 000015