(57)【要約】  ここに提供されるのは、非修飾形態の同じ抗体に比して抗体の生物学的性質を増強させる重鎖定常領域(「修飾重鎖定常領域」と称する)またはその機能的に等価なフラグメントである。修飾重鎖定常領域の例は、ＩｇＧ２ヒンジおよび３つの定常ドメイン(すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン)を含み、ここで、定常領域ドメインの１以上が非ＩｇＧ２アイソタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)のものである。重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧドメイン配列または同配列のバリアントを含み得る。またここに提供されるのは、非ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体の、内在化、アゴニズムおよびアンタゴニズムなどの、ある生物学的性質を増強する方法であって、抗体の非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換えることを含む、方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、修飾重鎖定常領域はＮ末端からＣ末端の順番でＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ヒンジはＩｇＧ２アイソタイプのものであり、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない、抗体。
【請求項２】
ヒンジが野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるかまたは野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
ヒンジがジスルフィド結合形成を減らす１以上の修飾を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒンジがアミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含む、請求項１〜３の何れかに記載の抗体。
【請求項５】
ヒンジが配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかのアミノ酸配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含む配列を含む、請求項１〜４の何れかに記載の抗体。
【請求項６】
ＣＨ１ドメインがＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである、請求項１〜５の何れかに記載の抗体。
【請求項７】
ＣＨ１ドメインが野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインであるかまたは野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６の何れかに記載の抗体。
【請求項８】
ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(配列番号７)を含む、請求項１〜７の何れかに記載の抗体。
【請求項９】
ＣＨ２ドメインがＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインである、請求項１〜８の何れかに記載の抗体。
【請求項１０】
ＣＨ２ドメインが野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインであるかまたは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜９の何れかに記載の抗体。
【請求項１１】
ＣＨ２ドメインがエフェクター機能を低減するかまたは排除する１以上の修飾を含む、請求項１〜１０の何れかに記載の抗体。
【請求項１２】
ＣＨ２ドメインがアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、請求項１〜１１の何れかに記載の抗体。
【請求項１３】
ＣＨ２ドメインがアミノ酸配列PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号４)を含む、請求項１〜１２の何れかに記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＨ３ドメインがＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインである、請求項１〜１３の何れかに記載の抗体。
【請求項１５】
ＣＨ３ドメインが野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインであるかまたは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜１４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６】
ＣＨ３ドメインがアミノ酸配列GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号５)を含む、請求項１〜１５の何れかに記載の抗体。
【請求項１７】
ＣＨ３ドメインがアミノ酸置換Ｅ３５６ＤおよびＭ３５８Ｌを含む、請求項１〜１６の何れかに記載の抗体。
【請求項１８】
ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規に導入された性質を有する、請求項１〜１７の何れかに記載の抗体。
【請求項１９】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性および抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２０】
Ｎ末端からＣ末端の順番でＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、
(ａ)ＣＨ１ドメインは配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と最大で５アミノ酸異なるかもしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８またはＲ２１７の少なくとも一つは置換または欠失されていない；
(ｂ)ヒンジは配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかまたはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含むもしくは最大で５アミノ酸異なる配列を含み、ここで、ヒンジはＣ２１９およびＣ２２０両者に置換または欠失を含まない；
(ｃ)抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する；および
(ｄ)修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２定常領域またはＣ２１９Ｓおよび／またはＣ２２０Ｓを含むＩｇＧ２定常領域ではない、
抗体。
【請求項２１】
ヒンジがアミノ酸配列ERKXCVECPPCPAP(配列番号１２９)またはERKCXVECPPCPAP(配列番号１３０)を含み、ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である、請求項２０に記載の抗体。
【請求項２２】
ヒンジがアミノ酸配列ERKSCVECPPCPAP(配列番号１３１)またはERKCSVECPPCPAP(配列番号１３２)を含む、請求項２１に記載の抗体。
【請求項２３】
Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５またはＧ２３７の少なくとも一つが欠失しているかまたは他のアミノ酸残基で置換されている、請求項２０〜２２の何れかに記載の抗体。
【請求項２４】
Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７が欠失されるかまたは他のアミノ酸残基で置換されている、請求項２３に記載の抗体。
【請求項２５】
アミノ酸残基Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の何れも置換または欠失されていない、請求項２０〜２４の何れかに記載の抗体。
【請求項２６】
アミノ酸残基Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の何れも置換または欠失されていない、請求項２４に記載の抗体。
【請求項２７】
Ｎ１９２が他のアミノ酸で置換されている、請求項２０〜２６の何れかに記載の抗体。
【請求項２８】
Ｆ１９３が他のアミノ酸で置換されている、請求項２０〜２７の何れかに記載の抗体。
【請求項２９】
抗体が野生型ＩｇＧ１のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ２ドメインを含む、請求項２０〜２８の何れかに記載の抗体。
【請求項３０】
抗体が野生型ＩｇＧ１のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ３ドメインを含む、請求項２０〜２９の何れかに記載の抗体。
【請求項３１】
ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインが野生型ＩｇＧ１  ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体が野生型ＩｇＧ１のものより強力であるエフェクター機能を有する、請求項２８〜３０の何れかに記載の抗体。
【請求項３２】
ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインが野生型ＩｇＧ１  ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体が野生型ＩｇＧ１のものより強力ではないエフェクター機能を有する、請求項２８〜３０の何れかに記載の抗体。
【請求項３３】
抗体が野生型ＩｇＧ４のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ２ドメインを含む、請求項２０〜３２の何れかに記載の抗体。
【請求項３４】
抗体が野生型ＩｇＧ４のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ３ドメインを含む、請求項２０〜３３の何れかに記載の抗体。
【請求項３５】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項２０〜３４の何れかに記載の抗体。
【請求項３６】
(ａ)ＣＨ１ドメインが野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである；
(ｂ)ヒンジは配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかの配列番号またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含む配列を含む；
(ｃ)ＣＨ２ドメインは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたは抗体に増強されたかまたは低減されたエフェクター機能を付与する修飾ＣＨ２ドメインである；および
(ｄ)ＣＨ３ドメインは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは抗体に増強されたかまたは低減されたエフェクター機能を付与する修飾ＣＨ３ドメインである、
請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかに示すアミノ酸配列または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３６の何れかに記載の抗体。
【請求項３８】
修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、重鎖定常領域は配列
【化１】
2020521751.tif 000079
または配列番号１３３と最大で１０アミノ酸異なるかもしくは配列番号１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＨ１ドメインおよびヒンジを含み、ここで、
Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも一つは他のアミノ酸で置換されていないかまたは欠失されていない；
Ｃ２１９およびＣ２２０は他の１個のアミノ酸で置換されても欠失されてもよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０は両者とも置換または欠失されていない；
１〜３アミノ酸がヒンジのＣＶＥとＣＰＰの間に挿入され得る；
ヒンジは、所望によりＣ末端に付加的アミノ酸、例えば、Ｇを含む；
アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１以上は他のアミノ酸(例えば、ＩｇＧ１からの対応するアミノ酸)で置換されていても、欠失されていてもよい；
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは野生型または修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３ドメインであってもよい；
修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして
ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規に導入された性質を有する、
抗体。
【請求項３９】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７；Ｓ１３８；Ｒ２１７の何れも他のアミノ酸で置換または欠失されていない、請求項３８または３９に記載の抗体。
【請求項４１】
Ｎ１９２および／またはＦ１９３が置換されないか、またはそれぞれＮ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｆである、請求項３８〜４０の何れかに記載の抗体。
【請求項４２】
Ｃ２１９がＣ２１９Ｓである、請求項３８〜４１の何れかに記載の抗体。
【請求項４３】
Ｃ２２０がＣ２２０Ｓである、請求項３８〜４１の何れかに記載の抗体。
【請求項４４】
Ｐ２３３〜Ｇ２３７が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項４５】
Ｖ２３４〜Ｇ２３７が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項４６】
Ａ２３５〜Ｇ２３７が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項４７】
Ｇ２３７が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項４８】
Ｐ２３３が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項４９】
Ｐ２３３〜Ｖ２３４が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項５０】
Ｐ２３３〜Ａ２３５が置換または欠失されている、請求項３８〜４３の何れかに記載の抗体。
【請求項５１】
抗体がエフェクター機能を有する、請求項３８〜５０の何れかに記載の抗体。
【請求項５２】
抗体がエフェクター機能を有しない、請求項３８〜５０の何れかに記載の抗体。
【請求項５３】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項３８〜５２の何れかに記載の抗体。
【請求項５４】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む、請求項３８〜５２の何れかに記載の抗体。
【請求項５５】
修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、重鎖定常領域は配列
【化２】
2020521751.tif 000080
または配列番号７と最大で１０アミノ酸異なるもしくは配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＨ１ドメインを含み、ここで、
Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも一つは置換または欠失されていない；
修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして
ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規に導入された性質を有するものである、
抗体。
【請求項５６】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項５５に記載の抗体。
【請求項５７】
アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されるかまたは欠失されていない、請求項５５または５６に記載の抗体。
【請求項５８】
Ｎ１９２および／またはＦ１９３は置換されないか、またはそれぞれＮ１９２および／またはＦ１９３である、請求項５５〜５７の何れかに記載の抗体。
【請求項５９】
抗体がエフェクター機能を有する、請求項５５〜５８の何れかに記載の抗体。
【請求項６０】
抗体がエフェクター機能を有しない、請求項５５〜５８の何れかに記載の抗体。
【請求項６１】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項５５〜６０の何れかに記載の抗体。
【請求項６２】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む、請求項５５〜６１の何れかに記載の抗体。
【請求項６３】
修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、重鎖定常領域が配列
【化３】
2020521751.tif 000081
または配列番号８と最大で５アミノ酸異なるアミノ酸配列を含むヒンジを含み、ここで、
Ｃ２１９およびＣ２２０は他の１個のアミノ酸で置換されていても欠失されていてもよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０は両者とも置換または欠失されていない；
アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１以上は置換または欠失されていてよい；
１〜３アミノ酸がヒンジのＣＶＥとＣＰＰの間に挿入されていてよい；
ヒンジは、所望によりＣ末端に付加的アミノ酸、例えば、Ｇを含む；
ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは野生型または修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであってよい；
修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして
ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規に導入された性質を有するものである、
抗体。
【請求項６４】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項６３に記載の抗体。
【請求項６５】
Ｃ２１９がＣ２１９Ｓである、請求項６３〜６４の何れかに記載の抗体。
【請求項６６】
Ｃ２２０がＣ２２０Ｓである、請求項６３〜６４の何れかに記載の抗体。
【請求項６７】
Ｐ２３３〜Ｇ２３７が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項６８】
Ｖ２３４−Ｇ２３７が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項６９】
Ａ２３５〜Ｇ２３７が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項７０】
Ｇ２３７が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項７１】
Ｐ２３３が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項７２】
Ｐ２３３〜Ｖ２３４が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項７３】
Ｐ２３３〜Ａ２３５が変異または欠失されている、請求項６３〜６６の何れかに記載の抗体。
【請求項７４】
抗体がエフェクター機能を有する、請求項６３〜７３の何れかに記載の抗体。
【請求項７５】
抗体がエフェクター機能を有しない、請求項６３〜７３の何れかに記載の抗体。
【請求項７６】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項６３〜７５の何れかに記載の抗体。
【請求項７７】
抗体が野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む、請求項６３〜７６の何れかに記載の抗体。
【請求項７８】
修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、重鎖定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ２ヒンジを含み、かつヒンジは１〜７アミノ酸を欠き、抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する、抗体。
【請求項７９】
抗体がアゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する、請求項７８に記載の抗体。
【請求項８０】
ヒンジが１〜４アミノ酸欠くＩｇＧ２ヒンジである、請求項７８または７９に記載の抗体。
【請求項８１】
ＩｇＧ２ヒンジがアミノ酸Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４を欠く、請求項８０に記載の抗体。
【請求項８２】
ヒンジがアミノ酸２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５を欠くＩｇＧ１ヒンジである、請求項７８または７９に記載の抗体。
【請求項８３】
抗体が野生型または修飾されたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む、請求項７８〜８２の何れかに記載の抗体。
【請求項８４】
抗体が野生型または修飾されたＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを含む、請求項７８〜８２の何れかに記載の抗体。
【請求項８５】
抗体がＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインを含む、請求項７８〜８４の何れかに記載の抗体。
【請求項８６】
抗体がＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む、請求項７８〜８４の何れかに記載の抗体。
【請求項８７】
抗体がＩｇＧ２  ＣＨ３ドメインを含む、請求項７８〜８６の何れかに記載の抗体。
【請求項８８】
抗体がＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む、請求項７８〜８６の何れかに記載の抗体。
【請求項８９】
ヒトまたはヒト化抗体またはその抗原結合部分である、請求項１〜８８の何れかに記載の抗体。
【請求項９０】
抗体が免疫制御に関与する抗原と特異的に結合する、請求項１〜８９の何れかに記載の抗体。
【請求項９１】
抗体が共刺激受容体のアゴニストまたは阻害受容体のアンタゴニストである、請求項９０に記載の抗体。
【請求項９２】
共刺激受容体がＢ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈからなる群から選択される、請求項９１に記載の抗体。
【請求項９３】
阻害受容体がＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４からなる群から選択される、請求項９１に記載の抗体。
【請求項９４】
抗原がＣＤ７３またはＣＤ３９である、請求項９０に記載の抗体。
【請求項９５】
共刺激受容体に特異的に結合し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項９６】
共刺激受容体がＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２７または任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーである、請求項９５に記載の抗体。
【請求項９７】
同じ可変領域および軽鎖を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、増強または改変されたアゴニスト活性を示す抗体である、請求項９５または９６に記載の抗体。
【請求項９８】
細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子の抗体介在内在化を誘発し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項９９】
細胞表面分子がＣＤ７３である、請求項９８に記載の抗体。
【請求項１００】
同じ可変領域および軽鎖を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、増強または改変された内在化性質を有する抗体である、請求項９８または９９に記載の抗体。
【請求項１０１】
阻害受容体に特異的に結合し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項１０２】
阻害受容体がＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４である、請求項１０１に記載の抗体。
【請求項１０３】
ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する同じ抗体に比して、より強力なまたは改変されたアンタゴニスト活性を示すか、または新規活性が導入されている抗体である、請求項１０１または１０２に記載の抗体。
【請求項１０４】
細胞表面分子に特異的に結合し、細胞内シグナル伝達を誘発する抗体であって、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項１０５】
細胞内シグナル伝達がアゴニスト活性、アンタゴニスト活性、細胞表面分子の内在化またはＡＤＣＣに介在する、請求項１０４に記載の抗体。
【請求項１０６】
同じ可変領域および軽鎖を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、より強力な細胞内シグナル伝達を誘発する抗体である、請求項１０４または１０５に記載の抗体。
【請求項１０７】
細胞表面分子に特異的に結合し、高分子量抗体細胞表面分子複合体の形成を誘発する抗体であって、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項１０８】
同じ可変領域および軽鎖を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比し、より高分子量の複合体の形成を誘発する抗体である、請求項１０７に記載の抗体。
【請求項１０９】
細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子のクラスター形成またはオリゴマー化を誘発する抗体であって、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む、抗体。
【請求項１１０】
同じ可変領域および軽鎖を有し、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、より多くの細胞表面分子のクラスター形成またはオリゴマー化を誘発する抗体である、請求項１０９に記載の抗体。
【請求項１１１】
第二結合特異性を有する分子と結合した請求項１〜１１０の何れかの何れかに記載の抗体を含む、抗体。
【請求項１１２】
第二剤に結合した請求項１〜１１１の何れかの何れかに記載の抗体を含む、免疫複合体。
【請求項１１３】
請求項１〜１１２の何れかに記載の抗体、二重特異性または免疫複合体および担体を含む、組成物。
【請求項１１４】
１以上の付加的治療剤をさらに含む、請求項４４に記載の組成物。
【請求項１１５】
付加的治療剤が免疫系を刺激する、請求項４５に記載の組成物。
【請求項１１６】
治療剤がチェックポイント阻害因子のアンタゴニストまたは共刺激受容体である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項１１７】
Ｎ末端からＣ末端の順番でＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、修飾重鎖定常領域を含む抗体を製造する方法であって、
(ａ)ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ヒンジではないＣＨ１ドメインおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；
(ｂ)該ヒンジおよび／または該ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインでそれぞれ置き換える工程
を含む、方法。
【請求項１１８】
細胞による抗体の内在化を増加する方法であって、
(ａ)ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ヒンジではないＣＨ１ドメインおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；
(ｂ)該ヒンジおよび／または該ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインでそれぞれ置き換えること
を含む、方法。
【請求項１１９】
抗体の内在化が、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む抗体の内在化と比較して増加している、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
抗体のアゴニスト活性を増加する方法であって、
(ａ)ヒンジおよび／またはＩｇＧ２ヒンジではないＣＨ１ドメインおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；
(ｂ)該ヒンジおよび／または該ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインでそれぞれ置き換えること
を含む、方法。
【請求項１２１】
アゴニスト活性が非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む抗体のアゴニスト活性と比較して増加している、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
ＩｇＧ２ヒンジが野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるかまたは野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１７〜１２１の何れかに記載の方法。
【請求項１２３】
ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも一つを、それぞれ異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインと置き換える工程を含む、請求項１１７〜１２２の何れかに記載の方法。
【請求項１２４】
(ａ)ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換える；
(ｂ)ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインで置き換える；および／または
(ｃ)ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインで置き換える
工程を含む、請求項１１７〜１２３の何れかに記載の方法。
【請求項１２５】
(ａ)ＣＨ１ドメインを野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える；
(ｂ)ＣＨ２ドメインを野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える；および／または
(ｃ)ＣＨ３ドメインを野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える
工程を含む、請求項１１７〜１２４の何れかに記載の方法。
【請求項１２６】
重鎖定常領域を配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかまたは配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２と少なくとも９５％同一の領域を含む重鎖定常領域で置き換える工程を含む、請求項１１７〜１２５の何れかに記載の方法。
【請求項１２７】
ヒンジがジスルフィド結合形成低減のために修飾される、請求項１１７〜１２６の何れかに記載の方法。
【請求項１２８】
ヒンジがアミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含む、請求項１１７〜１２７の何れかに記載の方法。
【請求項１２９】
ヒンジが配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかに示すアミノ酸配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含む配列を含む、請求項請求項１１７〜１２８の何れかに記載の方法。
【請求項１３０】
ＣＨ１ドメインがアミノ酸配列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(配列番号７)を含む、請求項１１７〜１２９の何れかに記載の方法。
【請求項１３１】
ＣＨ２ドメインがエフェクター機能を低減または排除するために修飾される、請求項１１７〜１３０の何れかに記載の方法。
【請求項１３２】
ＣＨ２ドメインがアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、請求項１１７〜１３１の何れかに記載の方法。
【請求項１３３】
ＣＨ２ドメインがアミノ酸配列PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号４)を含む、請求項１１７〜１３２の何れかに記載の方法。
【請求項１３４】
ＣＨ２ドメインがアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む、請求項１１７〜１３３の何れかに記載の方法。
【請求項１３５】
ＣＨ３ドメインがアミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号５)
を含む、請求項１１７〜１３４の何れかに記載の方法。
【請求項１３６】
請求項１１７〜１３５の何れかに記載の方法により製造された、抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３７】
ヒトまたはヒト化抗体である、請求項１３６に記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３８】
請求項１〜１３７の何れかに記載の抗体またはその抗原結合部分を投与することを含む、対象を処置する方法。
【請求項１３９】
１以上の付加的治療剤を投与する過程をさらに含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
治療剤が免疫系を刺激する、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
治療剤がチェックポイント阻害因子または共刺激分子である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
請求項１〜１４１の何れかに記載の組成物、二重特異性分子または免疫複合体を投与することを含む、対象を処置する方法。
【請求項１４３】
ヒトＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む修飾重鎖定常ドメインを含む抗体(またはその抗原結合フラグメント)であって、ここで、２３８位のアミノ酸はＰではなく、修飾重鎖定常ドメインは、２３８位のアミノ酸がプロリンである同じＩｇＧ重鎖定常ドメインに比して低減されたエフェクター機能を有する、抗体。
【請求項１４４】
ＩｇＧ重鎖定常ドメインがヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインである、請求項１４３に記載の抗体。
【請求項１４５】
２３８位のアミノ酸がＫである、請求項１４３または１４４に記載の抗体。
【請求項１４６】
Ｐ２３８がＰではなく(またはＰでもＳでもなく)、例えば、Ｐ２３８Ｋであり、ここで、修飾重鎖定常領域が配列番号１９８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４３〜１４５の何れかに記載の抗体。
【請求項１４７】
Ｐ２３８がＰではなく(またはＰでもＳでもなく)、例えば、Ｐ２３８Ｋであり、ここで、修飾重鎖定常領域が配列番号１９８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４６に記載の抗体。
【請求項１４８】
Ｐ２３８がＰではなく(またはＰでもＳでもなく)、例えば、Ｐ２３８Ｋであり、ここで、修飾重鎖定常領域が配列番号１９８と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４７に記載の抗体。
【請求項１４９】
修飾重鎖定常領域が米国特許５,６３７,４８１(その内容を引用により明示的に本明細書に包含させる)に開示の非Ｐ２３８アミノ酸修飾の１以上、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳおよびＣ２２９Ｓを含まない、請求項１４３〜１４８の何れかに記載の抗体。
【請求項１５０】
修飾重鎖定常領域が配列番号１９８からなるアミノ酸配列を含む、請求項１４３〜１４９の何れかに記載の抗体。
【請求項１５１】
抗体が修飾重鎖定常領域に結合した抗体の抗原結合フラグメント(例えば、ＤａｂまたはｓｃＦｖ)である、請求項１４３〜１５０の何れかに記載の抗体。
【請求項１５２】
抗体が修飾重鎖定常ドメインに結合した重鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインに結合した軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４３〜１５０の何れかに記載の抗体。
【請求項１５３】
抗体が完全長抗体である(重鎖および軽鎖がそれぞれ完全長重鎖および軽鎖である)、請求項１４３〜１５２の何れかに記載の抗体。
【請求項１５４】
修飾重鎖定常ドメインがエフェクター機能を低減する１以上の他の変異を含まない、請求項１４３〜１５３の何れかに記載の抗体。
【請求項１５５】
修飾重鎖定常ドメインがエフェクター機能を低減するここに開示する１以上の他の変異を含まない、請求項１５４に記載の抗体。
【請求項１５６】
修飾重鎖定常ドメインがエフェクター機能を低減する１〜３の他の変異を含む、請求項１４３〜１５３の何れかに記載の抗体。
【請求項１５７】
修飾重鎖定常ドメインがエフェクター機能を低減するここに開示する１〜３の他の変異を含む、請求項１５６に記載の抗体。
【請求項１５８】
抗体のエフェクター機能がＩｇＧ２抗体のものとほぼ同じである、請求項１４３〜１５７の何れかに記載の抗体。
【請求項１５９】
抗体が野生型ＩｇＧ１を有する抗体に比して低親和性ＦｃγＲに低い結合親和性を有する、請求項１４３〜１５８の何れかに記載の抗体。
【請求項１６０】
抗体が低親和性ＦｃγＲに検出可能な結合を有しない、請求項１５９に記載の抗体。
【請求項１６１】
低親和性ＦｃγＲがｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２である、請求項１５９または１６０に記載の抗体。
【請求項１６２】
抗体が低親和性ＦｃγＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８またはｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２に対して検出可能な結合を有しない(例えば、１０μM抗体濃度で)、請求項１６１に記載の抗体。
【請求項１６３】
抗体が高親和性ＦｃｇＲ  ＣＤ６４(ｈＦｃｇＲＩ)に野生型ＩｇＧ１定常領域を有する抗体に比して速い切断速度(解離速度)で結合する、請求項１４３〜１６２の何れかに記載の抗体。
【請求項１６４】
抗体が低親和性ＦｃγＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８またはｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２に対して検出可能な結合を有さず(例えば、１０μM抗体濃度で)、野生型定常領域を有する抗体に比して速い切断速度(解離速度)で結合する、請求項１４３〜１６３の何れかに記載の抗体。
【請求項１６５】
ＦｃγＲへの結合親和性および切断速度がＢｉａｃｏｒｅにより決定される、請求項１５９〜１６４の何れかに記載の抗体。
【請求項１６６】
抗体が野生型ＩｇＧ１定常領域を有する抗体に比して優れた熱安定性を有する、請求項１４３〜１６５の何れかに記載の抗体。
【請求項１６７】
抗体が野生型ＩｇＧ１定常領域を有する抗体に比して低減された不均質性を有する、請求項１４３〜１６６の何れかに記載の抗体。
【請求項１６８】
変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ３３７Ａを含むが、エフェクター機能を低減させるＡ３３０および／またはＰ３３１での変異を含まない(例えば、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓを含まない)重鎖定常領域を含む抗体であって、これらの変異がない同じ抗体に比して低減されたエフェクター機能(低減されたＡＤＣＣおよび所望により低減されたＣＤＣ)を有する、抗体。
【請求項１６９】
免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の阻害受容体に結合する、請求項１６８に記載の抗体。
【請求項１７０】
これらの変異がない同じ抗体に比して低減された親和性でＦｃγＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２およびｈＣＤ６４に結合する、請求項１６８または１６９に記載の抗体。
【請求項１７１】
重鎖定常領域が配列番号２３４または２４８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１６８〜１７０の何れかに記載の抗体。
【請求項１７２】
重鎖定常領域が１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)を含む配列番号２３４または２４８のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸置換が１以上のＦｃγＲへの結合を顕著に増加させない、請求項１６８〜１７１の何れかに記載の抗体。
【請求項１７３】
重鎖定常領域が、Ｃ末端リシンを含むかまたは除く配列番号２３４または２４８のアミノ酸配列を含む、請求項１６８〜１７２の何れかに記載の抗体。
【請求項１７４】
重鎖定常領域が、Ｃ末端リシンを含むかまたは除く配列番号２３６、２４９、２５２、２５３、２５９または２６０のアミノ酸配列を含む、請求項１６８〜１７２の何れかに記載の抗体。
【請求項１７５】
抗体がＣ末端リシンを伴うかまたは伴わない完全長抗体である(または完全長重鎖および完全長軽鎖を含む)、請求項１６８〜１７４の何れかに記載の抗体。
【請求項１７６】
抗体がチェックポイント阻害因子のアンタゴニストまたはチェックポイント刺激因子のアゴニストである、請求項１６８〜１７５の何れかに記載の抗体。
【請求項１７７】
抗体がＷＯ２０１８／０１３８１８に開示される抗体ではない、請求項１６８〜１７６の何れかに記載の抗体。
【請求項１７８】
抗体がヒトＴＩＭ３に結合しない、請求項１６８〜１７７の何れかに記載の抗体。
【請求項１７９】
変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ３３７Ａを含むが、エフェクター機能を低減させるＡ３３０および／またはＰ３３１での変異(例えば、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ)を含まない重鎖定常領域を含む融合タンパク質であって、これらの変異がない同じ抗体に比して低減されたエフェクター機能(低減されたＡＤＣＣおよび所望により低減されたＣＤＣ)を有する、融合タンパク質。
【請求項１８０】
これらの変異がない同じ抗体に比して低減された親和性でＦｃγＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２およびｈＣＤ６４に結合する、請求項１７９に記載の融合タンパク質。
【請求項１８１】
重鎖定常領域が配列番号２３４または２４８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７９または１８０に記載の融合タンパク質。
【請求項１８２】
重鎖定常領域が１〜５、１〜４、１〜３、１〜２または１アミノ酸置換(例えば、保存的アミノ酸置換)を含む配列番号２３４または２４８のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸置換が１以上のＦｃγＲへの結合を顕著に増加させない、請求項１７９〜１８１の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項１８３】
重鎖定常領域が、Ｃ末端リシンを含むかまたは除く配列番号２３４または２４８のアミノ酸配列を含む、請求項１７９〜１８２の何れかに記載の融合タンパク質。
【請求項１８４】
重鎖定常領域が、Ｃ末端リシンを含むかまたは除く配列番号２３６、２４９、２５２、２５３、２５９または２６０のアミノ酸配列を含む、請求項１７９〜１８３の何れかに記載の抗体。
【請求項１８５】
配列表に示すアミノ酸配列またはそれと少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖定常領域を含む、抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮出願番号６２／５１１,１７８(２０１７年５月２５日出願)および６２／５９９,２２１(２０１７年１２月１５日出願)に基づく優先権を主張する。ここに引用するあらゆる特許、特許出願および引用文献の内容を、全体として引用により本明細書に包含させる。
【背景技術】
【０００２】
背景
抗体治療剤は、癌および免疫障害などの疾患の処置において、最速で成長している領域の一つである。それにも関わらず、治療抗体による抗原の効率的ターゲティングは、医療において主要な課題のままである。それ故に、抗体工学は、医薬業界で主要な関心事となってきている。この状況から、抗体フラグメント、抗体薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)、修飾エフェクター領域を有する抗体および二重特異性抗体などの多くの新規改変抗体が出現している。
【０００３】
抗体は、多岐にわたる機構を介してその治療性能を展開している。抗体は、標的抗原を直接阻害または活性化し、そうして細胞シグナル伝達を制御する。抗体は、リガンドの受容体への結合を阻害し得る。抗体はまた、例えば、感染または癌と戦うために対象の免疫系を活性化することにより、免疫応答を誘発または阻害し得る(例えば、Ｔ細胞活性化の共刺激因子として)。
【０００４】
さらに、細胞表面受容体／抗原の抗体介在内在化は、治療抗体の主要作用機序として認識されている。この場合、抗体は標的を細胞表面から除き、その細胞内在化誘発によりその機能発揮を排除する。実際、抗体治療剤の先駆例の一つは、乳癌処置用のトラスツズマブである。トラスツズマブはＥｒｂＢ２受容体を標的とし、受容体／抗体内在化を誘発し、そうしてＥＧＦＲシグナル伝達を阻止する。しかしながら、抗体は、常に効率的内在化能を発揮するとは限らず、それゆえに改善された内在化機能有する抗体に対する継続するニーズがある。従って、既存の治療抗体の内在化を改善する方法が、高度に望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
要約
本発明は、非修飾形態の同じ抗体に比して抗体の生物学的性質を増強または修飾する、重鎖定常領域(「修飾重鎖定常領域」と称する)またはその機能的に等価なフラグメントを提供する。例えば、修飾定常領域を含む抗体は、増加した内在化および／またはアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を示す。従って、本発明の抗体は、元の非修飾抗体の至適化バージョンである。ある実施態様において、重鎖は、野生型重鎖定常領域に比して１以上の変異または修飾を含む修飾定常領域を含む。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は１つのＩｇＧ２ヒンジおよび３つの定常ドメイン(すなわち、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン)を含み、ここで、定常領域ドメインの１以上は非ＩｇＧ２ヒトアイソタイプ(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４)またはその機能的に等価なフラグメントである。修飾定常領域は、対応する野生型アミノ酸配列またはそのバリアント、例えば、野生型アミノ酸配列に比して、ヒンジまたはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３ドメイン内に１以上の(例えば、１〜１０またはそれ以上の)アミノ酸置換または欠失を含み得る。従って、ヒンジおよび／または各定常ドメインのアミノ酸配列は、対応する野生型アミノ酸配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上(すなわち、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％)同一である。
【０００６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジまたは野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ヒンジは、例えば、ジスルフィド結合形成を減らすための、付加的修飾をさらに含み得る。ある実施態様において、ヒンジは、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジに比して、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含む。ある実施態様において、ヒンジは、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２および１３４〜１４７の何れかに示すアミノ酸配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含むこれらの配列の一つを含む。
【０００７】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインのアミノ酸配列(配列番号７)と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ＣＨ２ドメインは付加的修飾をさらに含み得る(例えば、エフェクター機能を低減または排除するため)。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、野生型完全長ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２に比して、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、配列番号２４を含む。
【０００９】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。ＣＨ３ドメインは、特定のアロタイプを付与するために、付加的修飾をさらに含み得る。ある実施態様において、ＣＨ３ドメインは、別のアロタイプの野生型完全長ヒトＩｇＧ１(例えば、３５６位および３５８位にそれぞれＤおよびＬを有する「ｆａ」アロタイプ)に比して、３５６位にアミノ酸残基Ｅおよび３５８位にアミノ酸Ｍ(「ｆ」アロタイプ)を含む。ある実施態様において、ＣＨ３ドメインは、配列番号５を含む。
【００１０】
特定の実施態様において、抗体は修飾重鎖定常領域を含み、ここで、(ａ)ＣＨ１ドメインは、付加的修飾があるまたはない野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは野生型ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインであり、(ｂ)ヒンジはＣ２１９Ｓ置換があるまたはない野生型ＩｇＧ２ヒンジであり、(ｃ)ＣＨ２ドメインは付加的修飾があるまたはない野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたは野生型ＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインであり、そして(ｄ)ＣＨ３ドメインは、３５６位にアミノ酸Ｅおよび３５８位にアミノ酸Ｍがあるまたはない(例えば、アロタイプｆまたはｆａの)野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ３ドメインである。特定の実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ここに記載する、例えば、配列番号２６〜３７および７８〜９３の何れかに示す、アミノ酸配列を含む。
【００１１】
本発明の抗体(すなわち、修飾定常領域を有する抗体)は、完全ヒト抗体またはヒト化抗体であってよく、修飾重鎖定常領域がない同じ抗体と比較して、さらに１以上の増強または改変された特徴を示してよい。これらの特徴は、増加または改変した細胞による内在化、アゴニスト活性、大架橋複合体の形成、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性および抗腫瘍活性；または新規性質、例えば、アゴニスト活性の導入を含み得る。
【００１２】
本発明の修飾定常領域を含む二重特異性分子および免疫複合体ならびに抗体、二重特異性体または免疫複合体および許容される医薬担体を含む組成物も提供される。このような組成物はまた１以上の付加的治療剤、例えば、チェックポイント阻害因子、共刺激分子、抗ＣＤ３９抗体または抗Ａ２ＡＲ抗体などの免疫系を刺激する薬剤も含み得る。
【００１３】
修飾重鎖定常領域を含む抗体を製造する方法も提供される。ここに提供されるある方法は、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体と比較して、細胞による抗体の内在化を増加させる方法および抗体のアゴニスト活性を増加させる方法を含む。このような方法は、ＩｇＧ２ヒンジではないヒンジを有する抗体を準備し、該ヒンジをＩｇＧ２ヒンジ(例えば野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであるヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するヒンジまたはジスルフィド結合形成を低減するために修飾されているヒンジ、例えば、アミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含むヒンジ)と置き換える工程を含む。ある実施態様において、抗体の内在化は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増加され、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上のＴ１／２減少に至る。ある実施態様において、アゴニスト活性は、サイトカイン放出増加またはエフェクターＴ細胞の増殖増加；Ｔｒｅｇへの結合がＴｒｅｇ機能を減少させるならば、Ｔ制御細胞活性減少；またはＴｒｅｇ枯渇増加により定義して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増加または増強される。
【００１４】
ある実施態様において、方法は、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも一つを、異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインと置き換える工程をさらに含む。このような置き換えは、例えば、(ａ)ＣＨ１ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換える；(ｂ)ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたはＩｇＧ２  ＣＨ２ドメインで置き換える；そして／または(ｂ)ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたはＩｇＧ２  ＣＨ３ドメインで置き換えることを含み、ここで、該置き換えドメインは、野生型配列または野生型配列と少なくとも９５％同一性を有する。ある実施態様において、ＣＨ１ドメインは、配列番号７に示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインはエフェクター機能を低減または排除するために修飾され、例えば、ＣＨ２ドメインはアミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ(配列番号２４)を含む。ある実施態様において、ＣＨ３ドメインは３５６位にアミノ酸残基Ｅおよび３５８位にアミノ酸Ｍ(配列番号５、アロタイプ「ｆ」)を含み、ある実施態様において、ＣＨ３ドメインはアロタイプ「ｆａ」を含む。
【００１５】
ここに提供される方法は、修飾重鎖定常領域を含む抗体、二重特異性分子または免疫複合体の投与により対象を処置する方法を含む。１以上の付加的治療剤、例えば、チェックポイント阻害因子、共刺激分子などの免疫系を刺激する治療剤も共投与され得る。
【００１６】
ここに提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端の順番でＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含む抗体であって、ここで、(ａ)ＣＨ１ドメインは配列番号７のアミノ酸配列または配列番号７と最大で５アミノ酸異なるもしくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８またはＲ２１７の少なくとも一つは置換または欠失されていない；(ｂ)ヒンジは配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかまたはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含むもしくは最大で５アミノ酸異なる配列を含み、ここで、ヒンジはＣ２１９およびＣ２２０両者が同時に置換または欠失を含まない；(ｃ)抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する；そして(ｄ)修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２定常領域またはＣ２１９Ｓおよび／またはＣ２２０Ｓを含むＩｇＧ２定常領域ではない。ヒンジは、アミノ酸配列ERKXCVECPPCPAP(配列番号１２９)またはERKCXVECPPCPAP(配列番号１３０)を含んでよく、ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である。例えば、ヒンジはアミノ酸配列ERKSCVECPPCPAP(配列番号１３１)またはERKCSVECPPCPAP(配列番号１３２)を含み得る。ある実施態様において、アミノ酸残基Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の少なくとも一つまたは全ては欠失されるかまたは他のアミノ酸残基、例えば、ＩｇＧ１ヒンジにおける対応するアミノ酸で置換される。ある実施態様において、アミノ酸残基Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の何れもまたはＣ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の何れも置換または欠失されない。ある実施態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は他のアミノ酸で置換される。抗体は、野生型ＩｇＧ１のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ２ドメインを含み得る。抗体は、野生型ＩｇＧ１のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ３ドメインを含み得る。ある実施態様において、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは野生型ＩｇＧ１  ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体は、野生型ＩｇＧ１のものより強力であるエフェクター機能を有する。ある実施態様において、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは野生型ＩｇＧ１  ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインではなく、抗体は、野生型ＩｇＧ１のものより強力ではないエフェクター機能を有する。ある実施態様において、抗体は、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４のものと少なくとも９５％同一であるＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ１ドメインを含む。ある実施態様において、抗体は、アゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する。
【００１７】
ある実施態様において、抗体は修飾重鎖定常領域を含み、ここで、(ａ)ＣＨ１ドメインは野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである；(ｂ)ヒンジは配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２または１３４〜１４７の何れかの配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含む配列を含む；(ｃ)ＣＨ２ドメインは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたは抗体に増強されたまたは低減されたエフェクター機能を付与する修飾ＣＨ２ドメインである；そして(ｄ)ＣＨ３ドメインは野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたは抗体に増強されたまたは低減されたエフェクター機能を付与する修飾ＣＨ３ドメインである。修飾重鎖定常ドメインは、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかに示すアミノ酸配列または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の１以上と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み得る。これらの配列の何れかと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＦｃを含む重鎖に関して、これらの配列において生物学的活性を調節するために成した特定のアミノ酸変異は変わらないのが好ましい。
【００１８】
ある実施態様において、抗体は修飾重鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は配列
【化１】
2020521751.tif 000002
または配列番号１３３と最大で１０アミノ酸異なるもしくは配列番号１３３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＨ１ドメインおよびヒンジを含み、ここで、(ｉ)Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも一つは他のアミノ酸で置換されておらずまたは欠失されていない；(ii)Ｃ２１９およびＣ２２０は他のアミノ酸で置換されても欠失されてもよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０は両者が同時に置換または欠失されない；(iii)１〜３アミノ酸がヒンジのＣＶＥとＣＰＰの間に挿入され得る；(iv)ヒンジは、所望によりＣ末端に付加的アミノ酸、例えば、Ｇを含む；(ｖ)アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１以上は他のアミノ酸(例えば、ＩｇＧ１からの対応するアミノ酸)で置換されても、欠失されてもよい；(vi)ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは野生型または修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり得る；(vii)修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして(viii)抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する。ある実施態様において、抗体は、アゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有する。ある実施態様において、アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７；Ｓ１３８；Ｒ２１７の何れも他のアミノ酸で置換または欠失されない。ある実施態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は置換されないか、またはそれぞれＮ１９２および／またはＦ１９３である。ある実施態様において、Ｃ２１９はＣ２１９Ｓであり、Ｃ２２０はＣ２２０Ｓであり、Ｐ２３３〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｖ２３４〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ａ２３５〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｐ２３３は置換または欠失され；Ｐ２３３〜Ｖ２３４は置換または欠失され；またはＰ２３３〜Ａ２３５は置換または欠失される。抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が取り除かれてもよい。抗体は野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびまたは野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み得る。
【００１９】
ある実施態様において、抗体は修飾重鎖定常領域を含み、ここで、重鎖定常領域は、配列
【化２】
2020521751.tif 000003
または配列番号７と最大で１０アミノ酸異なるもしくは配列番号７と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７、Ｓ１３８およびＲ２１７の少なくとも一つは置換または欠失されない；(ii)修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして(iii)抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有し得る。ある実施態様において、アミノ酸Ｃ１３１；Ｒ１３３；Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されるかまたは欠失されない。ある実施態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３は置換されないか、またはそれぞれＮ１９２および／またはＦ１９３である。抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が取り除かれてもよい。抗体は野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびまたは野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み得る。
【００２０】
抗体は修飾重鎖定常領域を含んでよく、ここで、重鎖定常領域は配列
【化３】
2020521751.tif 000004
または配列番号８と最大で５アミノ酸異なるアミノ酸配列を含み、ここで、(ｉ)Ｃ２１９およびＣ２２０は他のアミノ酸で置換されても欠失されてもよいが、Ｃ２１９およびＣ２２０は両者とも置換または欠失されない；(ii)アミノ酸Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７の１以上は置換または欠失され得る；(iii)１〜３アミノ酸がヒンジのＣＶＥとＣＰＰの間に挿入され得る；(iv)ヒンジは、所望によりＣ末端に付加的アミノ酸、例えば、Ｇを含む；(ｖ)ＣＨ２およびＣＨ３ドメインは野生型または修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインであり得る；(vi)修飾重鎖定常領域は野生型ＩｇＧ２重鎖定常領域またはＣ２１９ＳもしくはＣ２２０Ｓを有する野生型ＩｇＧ２重定常ドメインではない；そして(vii)抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有し得る。ある実施態様において、Ｃ２１９はＣ２１９Ｓであり、Ｃ２２０はＣ２２０Ｓであり、Ｐ２３３〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｖ２３４〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ａ２３５〜Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｇ２３７は置換または欠失され；Ｐ２３３は置換または欠失され；Ｐ２３３〜Ｖ２３４は置換または欠失され；またはＰ２３３〜Ａ２３５は置換または欠失される。抗体はエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が取り除かれてもよい。抗体は野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびまたは野生型または修飾ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含み得る。
【００２１】
また提供されるのは、修飾重鎖定常領域を含む抗体であり、ここで、重鎖定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ２ヒンジを含み、かつヒンジは１〜７アミノ酸を欠き、抗体はＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む同じ抗体に比して少なくとも一つの増強された性質または新規導入された性質を有する。抗体は、アゴニスト活性、抗体介在受容体内在化、ＡＤＣＣ、受容体介在シグナル伝達、アンタゴニスト活性、免疫調節活性または抗腫瘍活性から選択される少なくとも一つの増強された性質またはアゴニスト活性である新たに導入された性質を有し得る。ヒンジは１〜４アミノ酸、例えば、アミノ酸Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４を欠くＩｇＧ２ヒンジであり得る。ヒンジはアミノ酸２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５を欠くＩｇＧ１ヒンジである。抗体は、野生型または修飾されたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン；野生型または修飾されたＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインを含み得る。
【００２２】
修飾重鎖定常領域を有する抗体は、ヒトまたはヒト化抗体またはその抗原結合部分であり得る。ある実施態様において、抗体は、免疫制御に関与する抗原と特異的に結合する。抗体は、共刺激受容体のアゴニストまたは阻害受容体のアンタゴニストであり得る。例えば、抗体は、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈからなる群から選択される共刺激受容体に結合でき、または抗体は、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４からなる群から選択される阻害受容体に結合できる。抗原は、内在化されることが必要である抗原、例えば、ＣＤ７３であり得る。抗原は、ＣＤ３９であり得る。
【００２３】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、共刺激受容体、例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ２７または任意の他のＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーと特異的に結合し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、増強または改変されたアゴニスト活性を示す。
【００２４】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は細胞表面分子、例えば、ＣＤ７３と特異的に結合し、細胞表面分子の抗体介在内在化を誘発し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５および１５２〜２３２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、増強または改変された内在化性質を有する。抗ＣＤ７３抗体は、配列番号２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される任意のアミノ酸配列を有するＦｃにも結合し得る。
【００２５】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、阻害受容体、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１およびＴＩＭ−４と特異的に結合し、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を有する同じ抗体に比して、より強力なまたは改変されたアンタゴニスト活性を示すか、または新規活性が導入される。ある実施態様において、Ｆｃは、エフェクター機能を調節、例えば、低減するための１以上の変異を含む。
【００２６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、細胞内シグナル伝達を誘発し、ここで、抗体は配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、細胞内シグナル伝達は、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、細胞表面分子の内在化またはＡＤＣＣに介在する。ある実施態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、より強力な細胞内シグナル伝達を誘発する。
【００２７】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、高分子量抗体細胞表面分子複合体の形成を誘発し、ここで、抗体は配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比し、より高分子量の複合体の形成を誘発する。
【００２８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、細胞表面分子に特異的に結合し、細胞表面分子のクラスター形成またはオリゴマー化を誘発し、ここで、抗体は配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２からなる群から選択される修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、抗体は、同じ可変領域および軽鎖を有するが、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む抗体に比して、より多くの細胞表面分子のクラスター形成またはオリゴマー化を誘発する。
【００２９】
またここに提供されるのは、第二結合特異性を有する分子に結合した修飾重鎖定常領域を含む抗体を含む、二重特異性分子である。またここに提供されるのは、第二剤に結合した修飾重鎖定常領域を含む抗体を含む、免疫複合体である。ここに記載する抗体、二重特異性または免疫複合体および担体を含む組成物も提供される。組成物は、１以上の付加的治療剤、例えば、免疫系を刺激し、例えば、チェックポイント阻害因子のアンタゴニストまたは共刺激受容体である治療剤を含み得る。
【００３０】
またここに提供されるのは、Ｎ末端からＣ末端の順番でＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、修飾重鎖定常領域を含む抗体を製造する方法であって、(ａ)ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインではないヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；そして(ｂ)ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインをそれぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換える工程を含む、方法である。さらにここに提供されるのは、(ａ)ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインではないヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；そして(ｂ)ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインをそれぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換えることを含む、細胞による抗体の内在化を増加させる方法である。抗体の内在化は、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む抗体の内在化と比較して増加し得る。また提供されるのは、(ａ)ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインではないヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し；そして(ｂ)ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインをそれぞれＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換えることを含む、抗体のアゴニスト活性を増加する方法である。アゴニスト活性は、非ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを含む同じ抗体、例えば、ＩｇＧ１定常領域を含む抗体のアゴニスト活性と比較して増加し得る。ＩｇＧ２ヒンジは野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジであってよくまたは野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、表４に示す配列を含み得る。方法は、ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの少なくとも一つを、それぞれ異なるアイソタイプのＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインと置き換える工程を含み得る。方法は、(ａ)ＣＨ１ドメインをＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換える；(ｂ)ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインで置き換える；および／または(ｂ)ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインで置き換える工程を含み得る。方法は、(ａ)ＣＨ１ドメインを野生型ヒトＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える；(ｂ)ＣＨ２ドメインを野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える；および／または(ｂ)ＣＨ３ドメインを野生型ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインまたはそれと少なくとも９５％同一のドメインで置き換える工程を含み得る。方法は、重鎖定常領域を配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかを含む修飾重鎖定常領域または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２と少なくとも９５％同一の領域で置き換える(またはＦｃにこれらの配列のアミノ酸変異を導入する)工程を含み得る。ヒンジは、ジスルフィド結合形成が低減または改変されるように修飾され得る。ヒンジはアミノ酸置換Ｃ２１９Ｓを含み得る。ヒンジは、配列番号８、２１〜２３、１２６〜１３２ま���は１３４〜１４７の何れかに示すアミノ酸配列またはＣＶＥとＣＰＰの間に挿入された１〜３アミノ酸を含む配列を含み得る。ＣＨ１ドメインは、アミノ酸配列ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV(配列番号７)を含み得る。ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減または排除するために修飾され得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含み得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸配列PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK(配列番号４)を含み得る。ＣＨ２ドメインは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを含み得る。ＣＨ３ドメインは、アミノ酸配列
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(配列番号５)
を含み得る。
【００３１】
またここに提供されるのは、１以上のＦｃγＲ(例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４)への結合が減少したまたは検出不可能である修飾重鎖定常領域である。このような修飾重鎖定常領域は、野生型重鎖定常領域に比して、１〜５、１〜３、１〜２または単一変異(例えば、置換)を有し得る。
【００３２】
また提供されるのは、ここに記載する、例えば、上記方法により産生した、抗体またはその抗原結合部分、例えば、ヒトまたはヒト化抗体である。対象、例えば、癌を有する対象を、ここに記載する抗体の何れかで処置する方法もここに包含される。方法は、１以上の付加的治療剤、例えば、免疫系を刺激する治療剤を投与することを含み得る。例えば、治療剤は、チェックポイント阻害因子または共刺激分子を標的とし得る。方法は、ここに記載する組成物、二重特異性分子または免疫複合体の投与を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａは、次の抗体によるＨ２２２８細胞(非小細胞肺癌細胞株)におけるＣＤ７３の抗体介在内在化の動態(kinetics)を示す：Ｈ２２２８細胞における１１Ｆ１１、４Ｃ３、６Ｄ１１、４Ｃ３Ｖｋ１軽鎖を有するＣＤ７３.３−ＩｇＧ１.１ｆ(「３−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１.１ｆ／４Ｃ３Ｖｋ１」)、１１Ｆ１１  Ｖｋ２軽鎖を有するＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ(「４−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ／１１Ｆ１１−Ｖｋ２」)、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ(「ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ」)、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(「ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ」)およびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ１.１ｆ(「ＣＤ７３.１０−Ｖｈ−ｈＨＣ−ＩｇＧ１.１ｆ」)抗体。１１Ｆ１１(これはＩｇＧ２アイソタイプのものである)、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ、ＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳおよびＣＤ７３.１０−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプである他の試験抗体より速くかつ高い程度で内在化する。
【００３４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＨＣＣ１５細胞(非小細胞肺癌細胞株)における図１Ａに示すのと同じ抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８細胞で得られたのに類似する結果を示す。
【００３５】
【図１Ｃ】図１Ｃは、Ｃａｌｕ６細胞における図１Ａおよび１Ｂに示すのと同じ抗体ならびにＣＤ７３.１１−ＩｇＧ２ＣＳ(「１１−Ｖｈ−ｈＶＣ−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ」)の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８およびＨＣＣ１５細胞で得られたのに類似する結果を示す。
【００３６】
【図１Ｄ】図１Ｄは、ＮＣＩ−２０３０細胞(非小細胞肺癌細胞株)における図１Ｃに示すのと同じ抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示し、Ｈ２２２８、ＨＣＣ１５およびＣａｌｕ６細胞で得られたのに類似する結果を示す。
【００３７】
【図１Ｅ】図１Ｅは、フローサイトメトリーにより測定したＣａｌｕ６細胞における示される抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示す。
【００３８】
【図１Ｆ】図１Ｆは、フローサイトメトリーで測定したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞(粘膜表皮性肺癌細胞株)における示される抗体の抗体介在ＣＤ７３内在化の動態を示すが、該抗体は、該細胞と抗体の最初のインキュベーション後、洗い落とさなかった。
【００３９】
【図１Ｇ】図１Ｇは、示される抗体で処理したＣａｌｕ６細胞で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、Ｃａｌｕ６細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００４０】
【図１Ｈ】図１Ｈは、示される抗体で経時的に処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００４１】
【図１Ｉ】図１Ｉは、示される抗体で経時的に処理したＳＮＵ−Ｃ１細胞(結腸癌細胞株)で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、ＳＮＵ−Ｃ１細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００４２】
【図１Ｊ】図１Ｊは、示される抗体で経時的に処理したＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞(非小細胞肺癌細胞株)で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００４３】
【図２】図２は、示される抗ヒトＧＩＴＲ抗体の抗ＣＤ３(プレート被覆)およびＣＤ２８活性化ヒトＣＤ４  Ｔ細胞への結合動態およびグラフから導いたその対応するＥＣ５０値を示す。
【００４４】
【図３】図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、種々の重鎖定常領域を有する可溶性抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の分泌を示す。図３Ａは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ２−ＩｇＧ１定常領域を有する抗ヒトＧＩＴＲ抗体で刺激したドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を示す。図３Ｂは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および種々の濃度のＩｇＧ１重鎖定常ドメインまたはＩｇＧ２−ＩｇＧ１ハイブリッド重鎖定常ドメインで刺激したドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。図３Ｃは、ＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞ならびに図３ＡおよびＢの抗体の種々の濃度のエフェクターレスバージョン(ＩｇＧ１.１)で刺激したドナーＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。
【００４５】
【図４】図４は、増加する量の示される抗ヒトＧＩＴＲ抗体：ハイブリドーマ抗ＧＩＴＲ(ＩｇＧ２)およびＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ１.１(エフェクターレス)またはＩｇＧ２ヒンジとのキメラとしての組み換え誘導体の存在下で、抗ＣＤ３モノクローナル抗体被覆プレートで培養した３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からのＩＬ−２分泌を示す。
【００４６】
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃおよび５Ｄは、ＩｇＧ２ヒンジの抗体／抗原複合体サイズに対する影響を示す。図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと種々の定常領域を含む抗体ＣＤ７３.４の複合体についてのＳＥＣクロマトグラムデータ、ＤＬＳデータおよびＭＡＬＳデータを示す。図５Ｄは、図５ＣのＭＡＬＳ決定質量から導いたｈＣＤ７３−ｈｉｓ／ｍＡｂ複合体の図式モデルを示す。
【００４７】
【図６】図６は、ＣＤ７３／ｍＡｂ複合体のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータを示す。
【００４８】
【図７】図７は、ＣＤ７３／ｍＡｂ複合体のＤＬＳデータを示す。
【００４９】
【図８Ａ】図８Ａは、示される抗体で経時的に処理したＣａｌｕ６細胞で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、Ｃａｌｕ６細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００５０】
【図８Ｂ】図８Ｂは、示される抗体で経時的に処理したＮＣＩ−Ｈ２９２細胞で内在化したＣＤ７３のパーセンテージを示し、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における示される抗体の経時的抗体介在ＣＤ７３内在化を示す。
【００５１】
【図８Ｃ】図８Ｃは、５μg／mlの示される抗体で０分間、５分間、１５分間または３０分間処理したＣａｌｕ６細胞の表面のＣＤ７３のレベルを示す。
【００５２】
【図９】図９は、示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋  Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す。
【００５３】
【図１０】図１０は、示す抗体の各々の添加後１時間、４時間または２１時間での抗体介在ＣＤ７３内在化のパーセンテージを示す。各抗体についてのバーを、２１時間(左)、４時間(中)および１時間(右)に示す。
【００５４】
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと種々の定常領域配列を含む１６の異なるＣＤ７３.４抗体の１：１モル濃度複合体についてのＳＥＣクロマトグラムデータの重層を示す。
【００５５】
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１０Ａのクロマトグラムの１１〜１９.５分のクロマトグラムデータの拡大であり、４つの別個の溶出種が示される。
【００５６】
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、１６の異なる抗体／ＣＤ７３−ｈｉｓ複合体についてプロットした、図１１Ｂのピーク２についてのＵＶシグナルシグナル面積のパーセンテージを示す。データを、ピーク面積が増加する順に左から右に並び替える。
【００５７】
【図１２】図１２は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕獲ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答は、１：１  ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論的Ｒｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についてのバーを、スライドの下の説明文に提供する順番で示す。
【００５８】
【図１３】図１３は、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕獲ＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答は、１：１  ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論的Ｒｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についてのバーを、スライドの下の説明文に提供する順番で示す。
【００５９】
【図１４Ａ】図１４Ａは、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕獲ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答は、１：１  ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論的Ｒｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についてのバーを、スライドの下の説明文に提供する順番で示す。
【００６０】
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕獲ＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質への抗体結合を示す。結合応答は、１：１  ｍＡｂ：ＦｃγＲ結合化学量論を仮定した理論的Ｒｍａｘのパーセンテージとしてプロットする。各抗体についてのバーを、スライドの下の説明文に提供する順番で示す。
【００６１】
【図１５】図１５は、抗ＧＩＴＲ抗体の内在化経時的解析を示す。
【００６２】
【図１６Ａ】図１６Ａは、０時のＧＩＴＲおよび初期エンドソームマーカーＥＥＡ２共局在化解析を示す。
【００６３】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、３０分および１２０分時点のＧＩＴＲおよび初期エンドソームマーカーＥＥＡ２共局在化解析を示す。
【００６４】
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、総染色に対する共局在化ピクセル強度の比としてプロットした、図１６Ａおよび１６Ｂに示すエンドソーム共局在化の定量化の結果を示す。
【００６５】
【図１７Ａ】図１７Ａは、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達活性化を示す。
【００６６】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＮＦｋＢシグナル伝達活性化を示す。
【００６７】
【図１８】図１８は、示される抗ＧＩＴＲ抗体で処理したＣＤ４＋  Ｔ細胞におけるＰ３８活性化を示す。
【００６８】
【図１９】図１９は、立体構造Ａ、ＢまたはＡ／Ｂを有するＩｇＧ２抗体におけるジスルフィド結合の配置を示す。
【００６９】
【図２０Ａ】図２０Ａは、種々の濃度の示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋  Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す。
【００７０】
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、５μg／mlの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋  Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す(図２０Ａのものと同じ実験)。
【００７１】
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、１.２５μg／mlの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋  Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−２のレベルを示す(図２０Ａのものと同じ実験)。
【００７２】
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、０.３１３μg／mlの示される定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体の存在下、ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞と共培養したＣＤ４＋  Ｔ細胞により分泌されたＩＬ−２のレベルを示す(図２０Ａのものと同じ実験)。
【００７３】
【図２１】図２１は、ｈＩｇＧ１ｆの一部のアミノ酸配列を示し、ここで、下線を引いた配列は下に再現され、野生型ＩｇＧ１に対するｈＩｇＧ１、ｈＩｇＧ１.１ｆ、ｈＩｇＧ１.３ｆおよびｈＩｇＧ１−Ｐ２３８Ｋアミノ酸配列における変異の位置を示す。
【００７４】
【図２２】図２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅ、２２Ｆ、２２Ｇ、２２Ｈ、２２Ｉ、２２Ｊ、２２Ｋおよび２２Ｌは、センサーグラムデータに基づく、示されるＦｃ受容体からの種々のＦｃ領域の状況における抗体Ｙ１２３８の解離速度の比較を示す。
【００７５】
【図２３】図２３Ａ、２３Ｂ、２３Ｃ、２３Ｄ、２３Ｅおよび２３Ｆは、ｉｃＩＥＦにより特徴づけられるｄＡｂ−Ｆｃ分子の電荷プロファイルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
詳細な記載
ある実施態様において、本発明は、少なくとも一部、抗体の次に示す性質が、抗体がＩｇＧ２ヒンジを含むとき、非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ抗体に比して、(または同じＩｇＧ１定常領域を含む抗体に比して)増強または改変されるとの発見に基づく：(ｉ)内在化；(ii)アゴニスト機能；(iii)受容体介在細胞内シグナル伝達；(iv)ＡＤＣＣ；および(ｖ)抗体／抗原複合体重量。さらに、抗体のこれらの増強または改変された特徴は、抗体が、ＩｇＧ２ヒンジに加えて、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含むとき、さらに増強または改変される。ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有するが、ＩｇＧ２ヒンジを有しない抗体が、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインを有する同じ抗体と比較して、増強または改変された活性を有することも観察された。特定の作用機序に限定されることを意図しないが、ＩｇＧ２ヒンジの増強効果は、抗体／抗原複合体のサイズの増加と相関することが判明した。抗体がＩｇＧ２ヒンジを有するとき、増強された抗体／抗原複合体のサイズは、他のアイソタイプと比較して、ＩｇＧ２ヒンジの高い強剛性に由来し得る。さらに、増強または改変された活性を保持するために、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインの特定の領域またはアミノ酸残基を修飾してよく、一方他は好ましくは修飾しないことが示された。
【００７７】
ここにさらに記載するとおり、抗体(またはその抗原結合領域)に増強または修飾活性を付与するこれらの修飾重鎖定常領域は、エフェクター機能を有し得る。それ故に、ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインにより付与される有利な性質を有し、またエフェクター機能を有する抗体を作製し得ることが示された。
【００７８】
本発明はまた、少なくとも一部、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体のヒンジのある部分の欠失が、ＩｇＧ１定常領域を有する抗体に比して、増強または改変された性質を有する抗体をもたらすとの発見に基づく。
【００７９】
またここに記載されるのは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣエフェクター機能を低減する変異、例えば、Ｐ２３８変異、例えば、Ｐ２３８Ｋを有する修飾重鎖領域であり、ある実施態様において、このような１以上の変異は、(ｉ)内在化；(ii)アゴニスト機能；(iii)受容体介在細胞内シグナル伝達；(iv)ＡＤＣＣ；および／または(ｖ)抗体／抗原複合体重量を増強する変異と組み合わされる。
【００８０】
従って、ここに提供されるのは、(ｉ)抗体の抗原結合領域に増強または改変された性質を付与する修飾重鎖定常領域を有する抗体およびその使用方法および(ii)非ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを含む抗体の内在化、アゴニズムおよびアンタゴニズムなどのある生物学的性質を増強または改変する方法であって、ここで、方法は、抗体の非ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを、ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはその一部と置き換えることを含む。
【００８１】
ここに提供されるのは、抗体、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する抗体のある生物学的性質を、異なる定常領域を有する同じ抗体に比して増強する「修飾重鎖定常領域」である。修飾重鎖定常領域の例は、ＩｇＧ２ヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含み、ここで、これらの定常ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではなく、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のものであり得る。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ１  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジを含む。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む。修飾重鎖定常領域は、野生型ＩｇＧ１に類するエフェクター機能を有してよくまたは野生型ＩｇＧに比してエフェクター機能が低減または増強するように改変され得る。修飾重鎖定常領域は、野生型ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインまたはそのバリアント、例えば、対応する野生型ドメインに比して１以上のアミノ酸置換、欠失または付加を有するおよび／または対応する野生型配列と少なくとも９０％またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有するＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含み得る。
【００８２】
また提供されるのは、ＩｇＧ１.３重鎖定常領域を含む抗体および融合タンパク質である。ＩｇＧ１.３重鎖定常領域を含む抗体は、チェックポイント阻害因子に対するアンタゴニスト抗体またはチェックポイント刺激因子に対するアゴニスト抗体などのアンタゴニストまたはアゴニスト抗体であり得る。
【００８３】
定義
本明細書の記載がより容易に理解され得るように、いくつかの用語をまず定義する。さらなる定義は、詳細な記載をとおして示される。
【００８４】
ここで使用する用語「抗体」は、抗体全体およびそのあらゆる抗原結合フラグメント(例えば、ヒンジを含む抗原結合フラグメント、ヒンジおよびＣＨ１ドメインを含む抗原結合フラグメント、ヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む抗原結合フラグメントまたはヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインの一部を含む抗原結合フラグメント)または一本鎖を含み得る。ある実施態様において、「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重(Ｈ)鎖および２つの軽(Ｌ)鎖を含むタンパク質、例えば、糖タンパク質またはその抗原結合部分を含む。各重鎖は、重鎖可変領域(ここではＶＨと略す)および重鎖定常領域を含む。ある天然に存在するＩｇＧ、ＩｇＤおよびＩｇＡ抗体において、重鎖定常領域はヒンジ、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインからなる。ある天然に存在する抗体において、各軽鎖は、軽鎖可変領域(ここではＶＬと略す)および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１ドメイン、ＣＬからなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域(ＦＲ)と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域(ＣＤＲ)と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲからなり、アミノ末端からカルボキシ末端方向で、次の順番に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第一成分(Ｃｌｑ)を含む宿主組織または因子への結合に介在し得る。
【００８５】
免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に知られるアイソタイプの何れからでもよい。ＩｇＧアイソタイプは、ある種ではサブクラスに分割される：ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に、そしてマウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３に。ある実施態様において、ここに記載する抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブタイプのものである。免疫グロブリン、例えば、ヒトＩｇＧ１は、数アロタイプが存在し、これは、互いに多くても数アミノ酸が異なる。「抗体」は、例として、天然に存在するおよび天然に存在しない両者の抗体；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体；完全合成抗体；および一本鎖抗体を含み得る。
【００８６】
ある実施態様において、抗体の重鎖は、Ｃ末端リシン；Ｃ末端グリシン(Ｃ末端リシンが欠失している)を含むかまたはＧＫを欠くかまたはＫを欠く。修飾重鎖定常領域を含むここに記載する抗体をいうとき、抗体は、Ｃ末端ＧＫまたはＫを有するあるいはＧＫまたはＫを欠く、提供される配列を含み得る。
【００８７】
アミノ酸のナンバリングは、Kabat(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD)におけるＥＵ指標に従うおよび米国特許出願公開２００８／０２４８０２８の図３ｃ〜３ｆに従う。
【００８８】
ここで使用する抗体の「抗原結合部分」なる用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合部分は、「ヒンジ含有抗原結合部分」であり得る。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントにより実現されることが示されている。ここに記載する抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含される結合フラグメントの例は、(ｉ)ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる単価フラグメントであるＦａｂフラグメント；(ii)ヒンジ領域のジスルフィド架橋により結合された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ(ａｂ’)２フラグメント；(iii)ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；(iv)抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、(ｖ)ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546)；および(vi)単離相補性決定領域(ＣＤＲ)または(vii)所望により合成リンカーにより連結され得る、２以上の単離ＣＤＲの組み合わせを含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別の遺伝子によりコードされるが、ＶＬおよびＶＨ領域が一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)として知られる単価分子を形成するように対結合する、単一タンパク質鎖として製造されることを可能とする、合成リンカーにより、組み換え法を使用して連結させ得る(例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883参照)。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」なる用語に包含されることが意図される。これらおよび他の潜在的構築物は、Chan &#38; Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301に記載される。これらの抗体フラグメントを、当業者に知られる慣用技法を使用して得て、フラグメントを、インタクト抗体と同じ方式で有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技法またはインタクト免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断により製造できる。
【００８９】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａ両者の組み合わせ、ＡｂＭ、接触および／または立体構造的定義または当分野で周知のＣＤＲ決定の方法の定義に従い同定される、超可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより最初に定義された超可変領域として同定され得る。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.参照。ＣＤＲの位置は、Ｃｈｏｔｈｉａらにより最初に記載された構造的ループ構造としても同定され得る。例えば、Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883参照。ＣＤＲ同定のための他のアプローチは、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの妥協点であり、Oxford Molecular's AbM antibody modeling software(現在Accelrys(登録商標))を使用して導かれる「ＡｂＭ定義」またはMacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745に示される観察抗原接触に基づくＣＤＲの「接触定義」を含む。ここでＣＤＲの「立体構造的定義」と称する他のアプローチにおいて、ＣＤＲの位置を、抗原結合にエンタルピー寄与をする残基として定義し得る。例えば、Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記アプローチの一つに厳密に従わないかもしれないが、それにも関わらず、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重複するが、特定の残基または残基群または全ＣＤＲが抗原結合に顕著に影響しないとの予測または実験的知見に従って、短縮または延長され得る。ここで使用するＣＤＲは、複数アプローチの組み合わせを含む当分野で既知の任意のアプローチにより定義されるＣＤＲである。ここで使用する方法は、これらのアプローチの何れかにより定義されたＣＤＲを使用し得る。１を超えるＣＤＲを含む任意のある実施態様に関して、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触および／または立体構造的定義の何れかにより定義され得る。
【００９０】
ここで使用する「アイソタイプ」は、重鎖定常ドメイン遺伝子によりコードされる抗体クラス(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤおよびＩｇＥ抗体)をいう。各野生型ヒトＩｇＧ定常領域の完全長アミノ酸配列(全ドメイン、すなわち、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む)は、オンラインで利用可能なＵｎｉＰｒｏｔデータベースに、例えば、Ｐ０１８５７(ＩｇＧ１)、Ｐ０１８５９(ＩｇＧ２)、Ｐ０１８６０(ＩｇＧ３)およびＰ０１８６１(ＩｇＧ４)として集積されているかまたはその異なるアロタイプである(それぞれ配列番号１、６、１１および１６)。ここで使用する重鎖定常領域のドメイン、例えば、ヒンジは、ドメインが、各アイソタイプまたはそのバリアントの対応する(各アイソタイプの対応するドメインに、他のアイソタイプに対するより高い相同性を有する)ドメインのアミノ酸配列を含むならば、「ＩｇＧ１アイソタイプ」、「ＩｇＧ２アイソタイプ」、「ＩｇＧ３アイソタイプ」または「ＩｇＧ４アイソタイプ」のものである。
【００９１】
「アロタイプ」は、特定のアイソタイプ群内の天然に存在するバリアントをいい、これらバリアントは数アミノ酸異なる(例えば、Jefferies et al. (2009) mAbs 1:1参照)。ここに記載する抗体は如何なるアロタイプであってもよい。
【００９２】
「野生型」タンパク質またはその一部は、天然に存在するままのタンパク質のバージョンである。野生型タンパク質のアミノ酸配列、例えば、重鎖定常領域は、天然に存在するままのタンパク質のアミノ酸配列である。アロタイプの差により、野生型タンパク質について１を超えるアミノ酸配列が存在し得る。例えば、天然に存在するヒトＩＧｇ１重鎖定常領域には数アロタイプがある(例えば、Jeffries et al. (2009) mAbs 1:1参照)。
【００９３】
「Ｆｃ領域」(結晶化可能フラグメント領域)または「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)に位置するＦｃ受容体または古典的補体系の第一成分(Ｃ１ｑ)への結合を含む、宿主組織または因子への結合に介在する抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。それ故に、アイソタイプＩｇＧの抗体のＦｃ領域は、第一定常領域免疫グロブリンドメイン(ＣＨ１)以外の、抗体の重鎖定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖各々におけるＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインを含む；ＩｇＭおよびＩｇＥ  Ｆｃ領域は、各ポリペプチド鎖に３つの重鎖定常ドメイン(ＣＨドメイン２〜４)を含む。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３からなる免疫グロブリンドメインを含む。本発明の目的のために、Ｆｃ領域は、アミノ酸２１６で始まり、アミノ酸４４７で終わるとして定義され、ここで、該ナンバリングは、ＫａｂａｔにおけるＥＵ指標(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD)および米国特許出願公開２００８／０２４８０２８の図３ｃ〜３ｆに従う。Ｆｃは、例えば、１、２、３、４、５、１〜５、１〜１０または５〜１０またはそれ以上のアミノ酸変異、例えば、置換、付加または欠失を含む、あらゆるアロタイプバリアントまたはバリアントＦｃ(例えば、天然に存在しないＦｃ)を含む、天然(または天然に存在するまたは野生型)Ｆｃであり得る。例えば、バリアントＦｃは、野生型Ｆｃと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。修飾または変異Ｆｃは、増強または低減されたエフェクター機能および／または半減期を有し得る。ＣＨ２およびＣＨ３領域は、エフェクター機能およびＦｃＲｎ結合の一次部位である。Ｆｃは、単離されたまたは「Ｆｃ融合タンパク質」(例えば、抗体またはイムノアドヘシン)とも称される「Ｆｃ領域を含む結合タンパク質」などのＦｃ含有タンパク質ポリペプチドの状況でのこの領域を指し得る。
【００９４】
「エフェクター機能」は、抗体Ｆｃ領域とＦｃ受容体もしくはリガンドの相互作用またはそれに由来する生化学的事象をいう。「エフェクター機能」の例は、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣおよび抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)などのＦｃγＲ介在エフェクター機能ならびに細胞表面受容体(例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ)の下方制御を含む。このようなエフェクター機能は、一般にＦｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と合わさることを必要とする。
【００９５】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、ＦｃγＲファミリーの受容体を含み、これらの受容体のアレルバリアントおよび選択的スプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲファミリーは３つの活性化(マウスでＦｃγＲＩ、ＦｃγＲIIIおよびＦｃγＲＩＶ；ヒトでＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲIIＡおよびＦｃγＲIIIＡ)および一つの阻害(ＦｃγＲIIＢ)受容体からなる。ヒトＦｃγＲの種々の性質を表１に要約する。自然エフェクター細胞型の大部分は、マウスおよびヒトで１以上の活性化ＦｃγＲおよび阻害ＦｃγＲIIＢを共発現し、一方ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞は一つの活性化Ｆｃ受容体(マウスでＦｃγＲIIIおよびヒトでＦｃγＲIIIＡ)を選択的に発現するが、阻害ＦｃγＲIIＢを発現しない。ヒトＩｇＧ１は大部分のヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性化Ｆｃ受容体に関してマウスＩｇＧ２ａと等価であると考えられる。
【００９６】
【表１】
2020521751.tif 000005
【００９７】
「ヒンジ」、「ヒンジドメイン」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに連結する重鎖定常領域のドメインをいい、ヒンジの上部、中部および下部部分を含む(Roux et al. J. Immunol. 1998 161:4083)。ヒンジは、抗体の結合領域とエフェクター領域間に種々のレベルの可動性を提供し、また２つの重鎖定常領域間の分子間ジスルフィド結合の部位も提供する。ここで使用するヒンジは、全ＩｇＧアイソタイプについてＧｌｕ２１６で始まり、Ｇｌｙ２３７で終わる(Roux et al., 1998 J Immunol 161:4083)。野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４ヒンジの配列を表２に示す。
【００９８】
【表２】
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＊ＣＨ１ドメインのＣ末端アミノ酸配列。
【００９９】
用語「ヒンジ」は、野生型ヒンジ(例えば表３に示すもの)およびそのバリアント(例えば、天然に存在しないヒンジまたは修飾ヒンジ)を含む。例えば、用語「ＩｇＧ２ヒンジ」は、表３に示す野生型ＩｇＧ２ヒンジおよび１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大で５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するバリアントを含む。ＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、１、２、３または全４システイン(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)が他のアミノ酸に変えられている、ＩｇＧ２ヒンジである。特定の実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９ＸまたはＣ２２０Ｘ置換を含み、ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である。ＩｇＧ２ヒンジは置換を含んでよく、これは、単独でまたは重鎖もしくは軽鎖の他の領域の１以上の置換と一体となって、ＡまたはＢ形態をとるヒンジを含む抗体をもたらす(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある実施態様において、ヒンジは、少なくとも２つのアイソタイプからの配列を含むハイブリッドヒンジである。例えば、ヒンジは、あるアイソタイプからの上部、中部または下部ヒンジを含み、ヒンジの残りは１以上の他のアイソタイプからであり得る。例えば、ヒンジはＩｇＧ２／ＩｇＧ１ヒンジであってよく、例えば、ＩｇＧ２の上部および中部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを含み得る。ヒンジはエフェクター機能を有しても、エフェクター機能が取り除かれてもよい。例えば、野生型ＩｇＧ１の下部ヒンジはエフェクター機能を提供する。
【０１００】
「非ＩｇＧ２」ヒンジは、ＩｇＧ２アイソタイプのものではないヒンジをいう。
【０１０１】
用語「ＣＨ１ドメイン」は、重鎖定常ドメインで可変ドメインをヒンジに結合させる重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ１ドメインはＡ１１８で始まり、Ｖ２１５で終わる。用語「ＣＨ１ドメイン」は野生型ＣＨ１ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号２およびＩｇＧ２について配列番号７を有する；表３)およびそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ１ドメインまたは修飾ＣＨ１ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ１ドメイン」は、野生型ＣＨ１ドメインならびに１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大で５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそのバリアントを含む。ＣＨ１ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物学的活性を修飾する変異を有するＣＨ１ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ１ドメインの修飾は、ここに提供される。
【０１０２】
用語「ＣＨ２ドメイン」は、重鎖定常ドメインでヒンジをＣＨ３ドメインに結合させる、重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ２ドメインはＰ２３８で始まり、Ｋ３４０で終わる。用語「ＣＨ２ドメイン」は野生型ＣＨ２ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号４を有する；表３)およびそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ２ドメインまたは修飾ＣＨ２ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ２ドメイン」は、野生型ＣＨ２ドメインならびに１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大で５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそのバリアントを含む。ＣＨ２ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物学的活性を修飾する変異を有するＣＨ２ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、エフェクター機能を低減させる置換Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓを含む。他の抗体の生物学的活性に影響するＣＨ２ドメインの修飾は、ここに提供される。
【０１０３】
用語「ＣＨ３ドメイン」は、重鎖定常ドメインでＣＨ２ドメインのＣ末端側である重鎖定常領域をいう。ここで使用するＣＨ３ドメインはＧ３４１で始まり、Ｋ４４７で終わる。用語「ＣＨ３ドメイン」は野生型ＣＨ３ドメイン(例えばＩｇＧ１について配列番号５を有する；表３)およびそのバリアント(例えば、天然に存在しないＣＨ３ドメインまたは修飾ＣＨ３ドメイン)を含む。例えば、用語「ＣＨ３ドメイン」は、野生型ＣＨ３ドメインならびに１、２、３、４、５、１〜３、１〜５、３〜５および／または最大で５、４、３、２または１変異、例えば、置換、欠失または付加を有するそのバリアントを含む。ＣＨ３ドメインの例は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたは半減期などの抗体の生物学的活性を修飾する変異を有するＣＨ３ドメインを含む。抗体の生物学的活性に影響するＣＨ３ドメインの修飾は、ここに提供される。
【０１０４】
【表３】
2020521751.tif 000007
【０１０５】
ここで使用する用語「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープ対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体または全抗体が特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体の組成物をいう。一般に、このようなモノクローナル抗体は、単一の細胞または抗体をコードする核酸に由来し、何らかの配列変更を意図的に導入せずに、増殖される。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来の可変領域および任意の定常領域を有する、モノクローナル抗体をいう。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、例えば、トランスジェニックまたはトランスクロモソーマル非ヒト動物(例えば、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウス)から得たＢ細胞を、不死化細胞に融合することにより得たハイブリドーマにより産生される。
【０１０６】
ここで使用する用語「組み換えヒト抗体」は、組み換え手段により調製、発現、創作または単離した全ヒト抗体、例えば、(ａ)ヒト免疫グロブリン遺伝子またはそれから調製したハイブリドーマについてトランスジェニックまたはトランスクロモソーマルである動物(例えば、マウス)から単離した抗体、(ｂ)抗体を発現するよう形質転換した宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、(ｃ)組み換え、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体および(ｄ)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列への置換を含む任意の他の手段により調製、発現、創作または単離された抗体を含む。このような組み換えヒト抗体は、生殖系列遺伝子によりコードされる特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列を利用するが、例えば、抗体成熟中に生じるその後の再配列および変異を含む、可変および定常領域を含む。当分野で知られるとおり(例えば、Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125参照)、可変領域は外来抗原に特異的な抗体を形成するよう再配列される種々の遺伝子によりコートされる、抗原結合ドメインを含む。再配列に加えて、可変領域は、該外来抗原に対する抗体の親和性を高めるために、複数の単一アミノ酸変化(体細胞変異または超変異と称する)によりさらに修飾され得る。定常領域は、抗原へのさらなる応答で変化する(すなわち、アイソタイプスイッチ)。それ故に、抗原に応答して軽鎖および重鎖免疫グロブリンポリペプチドをコードする再配列され、体細胞変異された核酸配列は、元の生殖系列配列と同一ではないかもしれないが、その代わり、実質的に同一であるかまたは類似する(すなわち、少なくとも８０％同一性を有する)。
【０１０７】
「ヒト」抗体(ＨｕＭＡｂ)は、フレームワークおよびＣＤＲ領域両者がヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来である可変領域を有する抗体をいう。さらに、抗体が定常領域を含むならば、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。ここに記載する抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロで無作為もしくは部位特異的変異誘発またはインビボで体細胞変異により導入した変異)を含み得る。しかしながら、ここで使用する用語「ヒト抗体」は、マウスなどの他の哺乳動物種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。用語「ヒト」抗体および「完全ヒト」抗体は、同義的に使用される。
【０１０８】
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体のＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てがヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置き換えられた抗体をいう。ヒト化形態の抗体のある実施態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、大部分または全てはヒト免疫グロブリンからのアミノ酸で置換され、一方、１以上のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、大部分または全ては変更がない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、特定の抗原に結合する抗体の能力を消失させない限り、許容される。「ヒト化」抗体は、元の抗体に類似する抗原特異性を保持する。
【０１０９】
「キメラ抗体」は、可変領域がマウス抗体由来であり、定常領域がヒト抗体由来である抗体のような、可変領域がある種由来であり、定常領域が他の種由来である抗体をいう。
【０１１０】
「二特異的」または「二機能性抗体」は、異なる抗原への特異性を有する２つの抗原結合部位を生じさせる、２つの異なる重／軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体をいう。二重特異性抗体は、ハイブリドーマ融合またはＦａｂ’フラグメントを含む、多様な方法により製造され得る。例えば、Songsivilai &#38; Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)参照。
【０１１１】
用語「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、ここでは用語「抗原に特異的に結合する抗体」と相互交換可能に使用する。
【０１１２】
ここで使用する「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体をいう(例えば、抗原「ｘ」に特異的に結合する単離抗体は、抗原「ｘ」以外に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかしながら、抗原「ｘ」のエピトープに特異的に結合する単離抗体は、異なる種からの他の抗原「ｘ」タンパク質と交差反応性を有し得る。
【０１１３】
ここで使用する「アゴニスト抗体」は、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０またはＣＤ２７、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈタンパク質などの、共刺激受容体のアゴニストである抗体、例えば、タンパク質の活性刺激と、続く免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の刺激により、対象の免疫系(または免疫応答)をブーストできる、抗体をいう。ある実施態様において、アゴニスト抗体は、阻害受容体、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４の活性を増強し、それにより免疫応答を阻止する抗体である。
【０１１４】
ここで使用する「アンタゴニスト抗体」は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の阻害シグナルのアンタゴニストである抗体、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２またはＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１またはＴＩＭ−４などのＴ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害因子)を阻止または遮断し、それにより、免疫応答を刺激できる、抗体をいう。ある実施態様において、アンタゴニスト抗体は、刺激受容体、例えば、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０またはＣＤ２７、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈの活性を阻止し、それにより免疫応答を阻害する抗体をいう。
【０１１５】
アゴニストおよびアンタゴニスト抗体両者は、抗原特異的Ｔ細胞応答増幅または抗原特異的Ｔ細胞応答(免疫チェックポイント制御因子)阻害をもたらす。
【０１１６】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、抗原(例えば、ＧＩＴＲ)上の免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する部位をいう。タンパク質抗原内のエピトープは、隣接アミノ酸(通常直線状エピトープ)またはタンパク質の三次元折り畳みにより並置される非隣接アミノ酸(通常配座エピトープ)両者により形成される。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、一般に、しかし常にではなく、変性溶媒への暴露により保持され、一方、三次元折り畳みにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理により一般に喪失する。エピトープは、一般に特有の空間的構造で、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸を含む。どのエピトープが、ある抗体(すなわち、エピトープマッピング)により結合されるかを決定する方法は当分野で周知であり、例えば、重複または隣接ペプチドがある抗体との反応性を試験される、免疫ブロットおよび免疫沈降アッセイを含む。エピトープの空間的構造を決定する方法は、文献およびここに記載する技法、例えば、ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴およびＨＤＸ−ＭＳを含む(例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996))。
【０１１７】
ここで使用する、ある対象物についての「天然に存在する」なる用語は、該対象物が天然に存在しているとの事実をいう。例えば、天然源から単離でき、実験室で意図的に修飾されていない生物(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然に存在する。
【０１１８】
「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に連結したアミノ酸残基を含む鎖をいい、鎖長の上限はない。タンパク質における１以上のアミノ酸残基は、グリコシル化、リン酸化またはジスルフィド結合などの、しかし、これに限定されない修飾を含み得る。「タンパク質」は１以上のポリペプチドを含み得る。
【０１１９】
ここで使用する用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよく、ｃＤＮＡであり得る。
【０１２０】
また提供されるのは、ここに示す配列の「保存的配列修飾」であり、例えば、保存的ヌクレオチドおよびアミノ酸置換、ならびに、ヌクレオチドおよびアミノ酸付加および欠失を含む。例えば、修飾は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ介在変異誘発などの、当分野で知られる標準技法により配列番号１〜７４に導入され得る。保存的配列修飾は、アミノ酸残基が類似側鎖を有するアミノ酸残基で置換された、保存的アミノ酸置換を含む。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を含む。
【０１２１】
ある実施態様において、重鎖定常領域またはそのドメインへのアミノ酸配列修飾は、重鎖定常領域のある性質を修飾または消失させない。これらの性質は、例えば、ヒンジの強剛性または剛性および抗体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を含む。ある実施態様において、重鎖定常領域またはそのドメインへのアミノ酸配列修飾は、重鎖定常領域のある性質を修飾または消失させる。
【０１２２】
抗体および／または定常領域性質を消失させるおよびさせないアミノ酸保存的置換を同定する方法は、例えば、ここで実施例部分において記載するとおり、当分野で周知である。
【０１２３】
核酸について、用語「相同性」は、２つの核酸またはその指定配列が、最適にアラインされ、比較したとき、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴い、ヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常少なくとも約９０％〜９５％およびそれ以上、好ましくはヌクレオチドの少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。あるいは、セグメントが、選択的ハイブリダイゼーション条件下、相補的鎖とハイブリダイズするとき、実質的相同性が存在する。
【０１２４】
ポリペプチドについて、用語「実質的相同性」は、２つのポリペプチドまたはその指定配列が、最適にアラインされ、比較したとき、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴い、アミノ酸の少なくとも約８０％、通常少なくとも約９０％〜９５％およびそれ以上、好ましくはアミノ酸の少なくとも約９８％〜９９.５％が同一であることを示す。
【０１２５】
２配列間のパーセント同一性は、配列が最適にアラインされたとき、これら配列により共有される同一位置の数の関数であり(すなわち、％相同性＝同一位置の数／位置の総数×１００)、最適アラインメントは、２配列の最適アラインメントために導入することが必要であったギャップ数および各ギャップ長を考慮して決定する。配列比較および２配列間のパーセント同一性決定は、下に非限定的例を述べる、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。
【０１２６】
２ヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム(http://www. gcg. comで利用可能)を使用して、NWSgapdna. CMPマトリクスおよびギャップ荷重４０、５０、６０、７０または８０および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して、決定できる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム(version 2.0)に組み込まれているE. Meyers and W. Miller(CABIOS, 4:11-17 (1989))のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０荷重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して、決定される。さらに、２アミノ酸配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム(http://www.gcg.comで利用可能)に組み込まれているNeedleman and Wunsch(J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970))アルゴリズム、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスおよびギャップ荷重１６、１４、１２、１０、８、６または４および長さ荷重１、２、３、４、５または６を使用して決定される。
【０１２７】
ここに記載する核酸およびタンパク質配列は、例えば、関連配列を同定するための、公的データベースに対するサーチを実施するための「クエリ配列」としてさらに使用され得る。このようなサーチは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム(version 2.0)を使用して、実施され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、ここに記載する核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア＝１００、単語長＝１２で実施され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、ここに記載するタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、スコア＝５０、単語長＝３で実施され得る。比較目的のギャップ付アラインメントを得るために、Gapped BLASTを、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402に記載のとおり利用し得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを使用するとき、各プログラム(例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ)のデフォルトパラーメータが使用され得る。www.ncbi.nlm.nih. gov参照。
【０１２８】
ここで使用する用語「抗原」は、タンパク質、ペプチドまたはハプテンなどのあらゆる天然または合成免疫原性物質をいう。抗原は完全長もしくは成熟タンパク質またはそのフラグメントであり得る。
【０１２９】
「免疫応答」は、外来因子に対する脊椎動物内の生物学的応答であり、この応答は、これらの因子およびそれらが原因の疾患から生物を保護する。免疫応答は、脊椎動物体内の侵入病原体、病原体に感染された細胞または組織、癌または他の異常細胞、または、自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および／または排除をもたらす、免疫系の細胞(例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球)およびこれらの細胞の何れかまたは肝臓により産生される可溶性巨大分子(抗体、サイトカインおよび補体)の作用が介在する。免疫反応は、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞またはＴｈ細胞、例えばＣＤ４＋またはＣＤ８＋  Ｔ細胞の活性化または阻害またはＴｒｅｇ細胞の阻害を含む。
【０１３０】
「免疫調節因子」または「免疫制御因子」は、免疫応答の調節、制御または修飾に関与し得る因子、例えば、シグナル伝達経路の成分をいう。免疫応答の「調節」、「制御」または「修飾」は、免疫系の細胞またはこのような細胞(例えば、エフェクターＴ細胞)の活性の何らかの改変をいう。このような調節は、種々の細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の増加または減少または免疫系内で生じ得る何らかの他の変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両者の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは、腫瘍微小環境で機能が増強し得る。好ましい実施態様において、免疫調節因子はＴ細胞表面に位置する。「免疫調節標的」または「免疫制御標的」は、物質、因子、部分、化合物または分子の結合の標的であり、その活性が該結合により改変される、免疫調節因子である。免疫調節標的は、例えば、細胞表面の受容体(「免疫調節受容体」)および受容体リガンド(「免疫調節リガンド」)を含む。
【０１３１】
「免疫療法」は、免疫応答を誘発、増強、抑制または他に修飾することを含む方法により、疾患を有するまたは再発のリスクにあるまたは再発している対象の処置をいう。
【０１３２】
「免疫刺激療法」または「免疫刺激性療法」は、例えば、癌を処置するための、対象における免疫応答の増加(誘発または増強)をいう。
【０１３３】
「内因性免疫応答増強」は、対象に存在する免疫応答の有効性または効力の増加を意味する。有効性および効力のこの増加は、例えば、内因性宿主免疫応答を抑制する機構の克服または内因性宿主免疫応答を増強する機構の刺激により達成され得る。
【０１３４】
「Ｔエフェクター」(「Ｔｅｆｆ」)細胞は、細胞溶解性活性を有するＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞)ならびにサイトカインを分泌し、他の免疫細胞を活性化および指示するＴヘルパー(Ｔｈ)細胞をいうが、制御Ｔ細胞(Ｔｒｅｇ細胞)は含まない。
【０１３５】
ここで使用する用語「結合」は、２以上の分子の会合をいう。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。結合はまた遺伝的(すなわち、組み換えによる融合)でもよい。このような結合は、化学コンジュゲーションおよび組み換えタンパク質産生などの多様な当分野で認識される技法を使用して、達成され得る。
【０１３６】
ここで使用する「投与する」は、当業者に知られる種々の方法および送達系の何れかを使用する、対象への治療剤を含む組成物の物理的投入をいう。ここに記載する抗体の好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方式をいい、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非々経腸経路で投与できる。投与はまた、例えば、１回、複数回および／または１以上の長期間にわたり実施し得る。
【０１３７】
ここで使用する用語「Ｔ細胞介在応答」は、エフェクターＴ細胞(例えば、ＣＤ８＋細胞)およびヘルパーＴ細胞(例えば、ＣＤ４＋細胞)を含む、Ｔ細胞が介在する応答をいう。Ｔ細胞介在応答は、例えば、Ｔ細胞の細胞毒性および増殖を含む。
【０１３８】
ここで使用する用語「細胞毒性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答」は、細胞毒性Ｔ細胞により誘発される免疫応答をいう。ＣＴＬ応答は、主にＣＤ８＋  Ｔ細胞により介在される。
【０１３９】
ここで使用する用語「阻害」または「遮断」(例えば、リガンドのその受容体またはその後の細胞内応答の阻害／遮断をいう)は、相互交換可能に使用され、部分的および完全阻害／遮断を包含する。ある実施態様において、抗体は、例えば、ここにさらに記載するとおり決定して、少なくとも約５０％、例えば、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％結合を阻害する。
【０１４０】
ここで使用する「癌」は、体内の異常細胞の制御されない増殖により特徴づけられる疾患の広範な群をいう。制御されない細胞分裂は、近隣組織に侵入し、リンパ系または血流を介して体の遠位部位に転移し得る、悪性腫瘍または細胞の形成をもたらし得る。
【０１４１】
ここで使用する用語「処置する」および「処置」は、疾患に付随する症状、合併症、状態または生化学的兆候の進行、発生、重症度または再発の回復、軽減、改善、阻止または遅延もしくは予防を目的とした、対象へのあらゆるタイプの介入もしくは手順または活性剤の投与をいう。予防は、疾患が生じることを予防するか、生じたとしてもその影響を最小化するための、疾患を有しない対象への介入をいう。
【０１４２】
「造血器腫瘍」は、リンパ腫、白血病、骨髄腫またはリンパ系悪性腫瘍ならびに脾臓およびリンパ節の癌をいう。リンパ腫の例は、Ｂ細胞リンパ腫およびＴ細胞リンパ腫両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫は、ホジキンリンパ腫および大部分の非ホジキンリンパ腫の両者を含む。Ｂ細胞リンパ腫の非限定的例は、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞リンパ球性リンパ腫(慢性リンパ球性白血病と重複)、マントル細胞リンパ腫(ＭＣＬ)、バーキットリンパ腫、縦隔大Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症を含む。Ｔ細胞リンパ腫の非限定的例は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫および血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫を含む。血液系腫瘍はまた、二次性白血病、慢性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病を含むが、これらに限定されない白血病も含む。血液系腫瘍は、さらに、多発性骨髄腫およびくすぶり型多発性骨髄腫などの、しかし、これらに限定されない骨髄腫を含む。他の血液学的および／またはＢ細胞もしくはＴ細胞関連癌は、用語造血器腫瘍に包含される。
【０１４３】
用語「有効用量」または「有効投与量」は、所望の効果の達成または少なくとも部分的達成に十分な量として定義される。薬物または治療剤の「治療有効量」または「治療的有効投与量」は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて使用したとき、疾患症状重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間増大または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防により証明される、疾患退縮を促進する薬物の何らかの量である。薬物の「予防有効量」または「予防有効投与量」は、疾患を発症または疾患を再発するリスクにある対象に単独でまたは他の治療剤と組み合わせて投与したとき、疾患の発症または再発を阻止する量である。治療または予防剤が疾患退縮を促進するまたは疾患の発症もしくは再発を阻止する能力は、臨床治験中のヒト対象、ヒトにおける有効性の予測的動物モデル系またはインビトロアッセイでの薬剤の活性のアッセイなどの、熟練実施者に知られる多様な方法を使用して評価できる。
【０１４４】
例として、抗癌剤は、対象における癌進行を遅延するまたは癌退縮を促進する薬物である。好ましい実施態様において、治療有効量の薬物は、癌を排除する点まで癌退縮を促進させる。「癌退縮促進」は、有効量の薬物単独または抗新生物剤との組み合わせ投与が、患者における腫瘍増殖またはサイズの低減、腫瘍壊死、疾患症状の少なくとも一つの重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間の増大、疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防または疾患症状の他の改善をもたらすことを意味する。薬理学的有効性は、患者における癌退縮を促進する薬物の能力をいう。生理学的安全性は、薬物投与に起因する、許容可能な低レベルの毒性または細胞、臓器および／または生物レベルでの他の有害生理学的作用(有害作用)をいう。
【０１４５】
腫瘍処置に関する例として、治療有効量または投与量の薬物は、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を未処置対象に比して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％阻害する。最も好ましい実施態様において、治療有効量または投与量の薬物は、細胞増殖または腫瘍増殖を完全に阻害する、すなわち、好ましくは細胞増殖または腫瘍増殖を１００％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、下記アッセイを使用して評価され得る。あるいは、組成物のこの性質は、化合物が細胞増殖を阻害する能力の試験により評価でき、このような阻害は、インビトロで熟練した当業者に知られるアッセイにより測定され得る。ここに記載する他の好ましい実施態様において、腫瘍退縮が観察でき、少なくとも約２０日、より好ましくは少なくとも約４０日またはさらにより好ましくは少なくとも約６０日の期間継続し得る。
【０１４６】
用語「患者」および「対象」は、予防または治療処置を受けるあらゆるヒトまたは非ヒト動物をいう。例えば、ここに記載する方法および組成物を、癌を有する対象の処置に使用できる。用語「非ヒト動物」は、全脊椎動物、例えば、哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。
【０１４７】
ここに記載する種々の態様を、次のサブセクションでさらに詳述する。
【０１４８】
Ｉ. 修飾重鎖定常領域
ここに記載されるのは、抗体に存在するとき、非ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体、例えば、ＩｇＧ１抗体などの修飾重鎖定常領域を有しない同じ抗体に比して、抗体のある生物学的性質または特徴を増強または改変する、「修飾重鎖定常領域」である。抗体の増強または改変される生物学的性質は：
(ａ)増加または改変した細胞による内在化；
(ｂ)増加または改変したアゴニスト活性；
(ｃ)増加または改変したアンタゴニストまたは遮断活性；
(ｄ)増強したＡＤＣＣ；
(ｄ)新規性質の発現；
(ｅ)増加または改変したシグナル伝達；
(ｆ)大型抗体／抗原架橋複合体の形成；
(ｇ)標的細胞表面分子の増加したクラスター形成またはオリゴマー化；
(ｈ)免疫応答の増加した刺激または増強；および／または
(ｉ)免疫応答の増加した阻害
を含む。
【０１４９】
またここに提供されるのは、エフェクター機能を修飾する、例えば、エフェクター機能を低減する１以上のアミノ酸変異を含む重鎖を含む抗体である。
【０１５０】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、抗体が細胞膜上のその標的に結合した後、抗体依存的受容体(またはリガンドもしくは表面分子)内在化により効率的に介在し、例えば、抗体は、細胞への内在化が高速でおよび／または高い程度で、標的または表面分子(例えば、受容体またはリガンド)を内在化しおよび／またはそれ自体内在化する。抗体の内在化の速度および程度は、例えば、実施例に示すとおり決定できる。内在化速度は、例えば、実施例に示すとおり、例えば、内在化のＴ１／２で測定して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強または増加され得て、Ｔ１／２の少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上の減少にいたる。例えば、１０分のＴ１／２を有する代わりに、修飾重鎖定常領域は内在化速度が増加され、それによりＴ１／２が５分に低減される(すなわち、内在化速度の２倍増加またはＴ１／２の２倍減少)。「Ｔ１／２」は、抗体が細胞に加えられた時間から測定して、最大内在化の半分が達成される時間として定義される。ある実施態様において、Ｔ１／２は、少なくとも１０分、３０分または１時間低減される。内在化の最大レベルは、抗体濃度または時間に対してプロットした内在化を表すぐらいのプラトーでの内在化のレベルであり得る。修飾重鎖定常領域は、抗体の内在化の最大レベルを少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増加させ得る。修飾重鎖定常領域を有する抗体と有しない同じ抗体などの種々の抗体の内在化有効性を比較する他の方法は、ある抗体濃度(例えば、１００nM)および／またはある時間(例えば、２分、５分、１０分または３０分)での内在化レベルの比較である。内在化レベルの比較はまた内在化のＥＣ５０レベルの比較によっても実施され得る。一つの抗体の内在化レベルを、ある(対照)抗体、例えば、ここに記載する抗体、例えば、１１Ｆ１１またはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１と比較し、ある(対照)抗体により得られた値のパーセンテージとして示し得る。内在化の程度は、これらの方法の何れかにより比較して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５１】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、より強力なアゴニスト活性を有する。ある実施態様において、増強されたアゴニスト活性は、標的分子、例えば、ＧＩＴＲまたは免疫応答を刺激もしくは共刺激する他の分子の刺激活性、例えば、Ｔ細胞活性を増強する。ある実施態様において、増強されたアゴニスト活性は、免疫応答、例えば、Ｔ細胞活性を阻害する標的分子(例えば、チェックポイント阻害因子)の阻害活性を増強する。抗体のＴ細胞活性を調節する増強されたアゴニスト活性は、例えば、実施例に示すとおり、例えば、抗体と接触させたＴ細胞からのＩＦＮ−γまたはＩＬ−２分泌レベルの測定により決定され得る。刺激性標的に結合する抗体のアゴニスト活性は、サイトカイン放出増加またはエフェクターＴ細胞増殖増加；Ｔｒｅｇへの結合がＴｒｅｇ機能を減少させるならば、Ｔ制御細胞活性減少；またはＴｒｅｇ枯渇増加により定義して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。例えば、修飾重鎖定常領域を含む刺激性標的に結合する抗体で刺激されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞より少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上高い。阻害性標的に結合する抗体のアゴニスト活性は、サイトカイン放出減少またはエフェクターＴ細胞増殖低減；Ｔ制御細胞活性増加；またはＴｒｅｇ枯渇減少により定義して、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強される。例えば、修飾重鎖定常領域を含む阻害性標的に結合する抗体で刺激されたＴ細胞から分泌されるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の量は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体で刺激されたＴ細胞より少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上低い可能性がある。
【０１５２】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、より強力なアンタゴニストまたは遮断活性を有する。抗体の増強されたアンタゴニスト活性は、例えば、Ｔ細胞活性化の条件を含む状況下でのサイトカイン放出および／または増殖の測定により決定できる。アンタゴニスト活性は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５３】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、増強したＡＤＣＣ活性を有する。増強したＡＤＣＣは、当分野で知られる方法により決定され得る。ＡＤＣＣは、少なくとも１０％、３０％、５０％、２倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５４】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、大型の抗体／抗原架橋複合体を形成する能力を有する。複合体を形成する能力は、例えば、実施例に記載するとおり決定され得る。修飾重鎖定常領域を含む抗体で形成される抗体／抗原複合体は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体で形成される複合体より、少なくとも５０％、２倍、３倍、５倍または１０倍大型であり得る。ある実施態様において、少なくとも２,０００kDa、３,０００kDa、５０００kDa、１０,０００kDa、５０,０００kDaまたは１００,０００kDaの複合体が、修飾重鎖定常領域を有する抗体で形成される。
【０１５５】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、細胞表面の標的分子のより多くのクラスター形成またはオリゴマー化を誘発する。クラスター形成およびオリゴマー化の程度は、例えば、抗体／抗原複合体サイズの測定により決定され得る。
【０１５６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、高レベルのまたは異なるタイプのシグナリングまたはシグナル伝達を伝達する。シグナル伝達を、シグナル伝達経路における１以上のタンパク質の活性化レベルの決定によりモニターし得る。ある実施態様において、シグナル伝達は、例えば、実施例に記載のとおり、シグナル伝達タンパク質、例えば、ＮＦｋＢまたはｐ３８の活性(またはリン酸化)の測定により決定する。修飾重鎖定常領域を含む抗体により誘発されるシグナル伝達は、修飾重鎖定常領域を含まない同じ抗体でのシグナル伝達より少なくとも１０％、２０％、５０％、２倍、５倍またはそれ以上高いかまたは低いものであり得る。例えば、刺激分子(例えば、ＧＩＴＲ)に結合し、修飾重鎖定常領域を含む抗体により誘発されるシグナル伝達は、ＩｇＧ１重鎖を有する同じ抗体で得られるものより少なくとも１０％増強され得る。例えば、ＮＦｋＢまたはｐ３８活性(例えば、リン酸化)のＥＣ５０は、少なくとも５０％、２倍、５倍またはそれ以上低減され得る。
【０１５７】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、免疫応答または免疫系を刺激または増強する能力が増加している。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアゴニスト活性および／または阻害受容体の増強されたアンタゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解性活性(標的細胞で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出により間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイにおけるＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍率に反映され得る。免疫応答または免疫系活性を刺激する能力は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１５８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、増加した抗増殖性または抗腫瘍活性を有する。抗体の増強された抗腫瘍活性は、例えば、抗体で処置している動物における腫瘍の増殖により決定され得る。抗腫瘍活性は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。抗腫瘍活性は、例えば、腫瘍増殖動態減少および完全腫瘍退縮により顕在化する、例えば、腫瘍負荷減少として測定され得る。
【０１５９】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、修飾重鎖定常領域を含まず、例えば、ＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、増加した免疫応答または免疫系を阻害または抑制する能力を有する。増加した免疫応答または免疫系を阻害または抑制する能力は、Ｔ細胞共刺激受容体の増強されたアンタゴニスト活性および／または阻害受容体の増強されたアゴニスト活性に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増加は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカイン放出、細胞溶解性活性(標的細胞で直接的にまたはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムの検出により間接的に決定)および増殖の変化を測定するアッセイにおけるＥＣ５０または活性の最大レベルの増加倍率に反映され得る。免疫応答または免疫系を阻害または抑制する能力活性は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７５％、２倍、３倍、５倍またはそれ以上増強され得る。
【０１６０】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域またはその一部、例えば、ヒンジは、他の重鎖定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４重鎖定常領域に比して硬い。例えば、修飾重鎖定常領域は、天然に存在する重鎖定常領域またはそのヒンジより硬いか、硬い部分、例えば、ヒンジを有する天然に存在しない重鎖定常領域である。重鎖定常領域またはヒンジなどのその一部の強剛性は、ヒンジを含む抗体の回転運動半径を測定または比較するための、例えば、コンピューターモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴(ＮＭＲ)などのスペクトロスコピー、Ｘ線結晶学(Ｂ因子)または超遠心沈降速度法(ＡＵＣ)により決定され得る。あるいは、重鎖定常領域またはその一部の強剛性は、例えば、ここにさらに記載するとおり、抗体／抗原複合体のサイズの測定により決定され得る。
【０１６１】
修飾重鎖定常領域を含み、当分野で知られ、かつここに記載する方法により決定して増強された機能的性質を有する抗体は、異なる重鎖定常領域を有する以外同じ抗体で見られるものに比して、特定の活性の統計的に有意な差異に関連することは理解される。
【０１６２】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジ(「ＩｇＧ２ヒンジ」)およびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの少なくとも一つはＩｇＧ２アイソタイプのものではない。ある実施態様において、修飾重鎖定常領域はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、ここで、重鎖定常ドメインは野生型ＩｇＧ２定常領域ではないかまたはアミノ酸２１９もしくは２２０に変異を有するＩｇＧ２定常領域ではない。ＩｇＧ２ヒンジは、野生型ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ(例えば、配列番号８を有する)またはそのバリアントであり得るが、ただし、ＩｇＧ２ヒンジは、非ＩｇＧ２ヒンジを含むまたはＩｇＧ１重鎖を含む同じ抗体に比して、抗体が増強された活性を有する能力を付与する。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジバリアントは、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものに類似する強剛性または剛性を保持する。ヒンジの強剛性は、例えば、ヒンジを含む抗体の回転運動半径を測定または比較するためのコンピューターモデリング、電子顕微鏡法、核磁気共鳴(ＮＭＲ)などのスペクトロスコピー、Ｘ線結晶学(Ｂ因子)または超遠心沈降速度法(ＡＵＣ)により決定され得る。ヒンジは、ヒンジを含む抗体が、上記の試験の一つにより得られた値が、異なるヒンジ、例えば、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体の値に比して５％、１０％、２５％、５０％、７５％または１００％未満で異なるならば、他方のヒンジのものに比して類似するまたは高い強剛性を有する。当業者は、試験から、試験結果の解釈により、あるヒンジが他のヒンジのものに少なくとも類似する強剛性を有するか否かを決定できる。
【０１６３】
ヒトＩｇＧ２ヒンジバリアントの例は、４つのシステイン残基(すなわち、Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｃ２２６およびＣ２２９)の１以上の他のアミノ酸での置換を含むＩｇＧ２ヒンジである。システインはセリンに置き換えられ得る。ＩｇＧ２ヒンジの例は、Ｃ２１９Ｘ変異またはＣ２２０Ｘ変異を含むヒトＩｇＧ２ヒンジであり、ここで、Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９Ｘ置換およびＣ２２０Ｘ置換両者を含まない。ある実施態様において、ＩｇＧ２ヒンジはＣ２１９ＳまたはＣ２２０Ｓを含むが、Ｃ２１９ＳおよびＣ２２Ｓ両者は含まない。使用し得る他のＩｇＧ２ヒンジバリアントは、Ｃ２２０、Ｃ２２６および／またはＣ２２９置換、例えば、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６ＳまたはＣ２２９Ｓ変異(これはＣ２１９Ｓ変異と組み合わせ得る)を含むヒトＩｇＧ２ヒンジである。ＩｇＧ２ヒンジはまた、ヒンジの一部が他のアイソタイプのものである(すなわち、キメラまたはハイブリッドヒンジである)が、ただし、キメラヒンジの強剛性は、野生型ＩｇＧ２ヒンジのものに少なくとも類似する、ＩｇＧ２ヒンジでものあり得る。例えば、ＩｇＧ２ヒンジは、下部ヒンジ(表２に定義)がＩｇＧ１アイソタイプのものであり、例えば、野生型ＩｇＧ１下部ヒンジであるＩｇＧ２ヒンジであり得る。
【０１６４】
「ハイブリッド」または「キメラ」ヒンジは、ヒンジの半分を超える連続的アミノ酸が特定のアイソタイプ由来であるならば、そのアイソタイプであると称する。例えば、ＩｇＧ２の上部および中部ヒンジおよびＩｇＧ１の下部ヒンジを有するヒンジは、ＩｇＧ２ハイブリッドヒンジと見なされる。
【０１６５】
ある実施態様において、抗体は、表４に示す配列、例えば、次の８、２１、２２、２３、１２６〜１２９および１３４〜１４７のアミノ酸配列の一つを含むＩｇＧ２ヒンジを含む、修飾重鎖定常領域を含む。ある実施態様において、ヒンジは配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｐ２３３、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３の１、２、３または全４アミノ酸(Ｃ末端４アミノ酸「ＰＶＡＧ」(配列番号１４８)に対応する)は欠失されるかまたは他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１ヒンジ(ＥＬＬＧ(配列番号１４９)またはＥＬＬＧＧ(配列番号１５０)のＣ末端アミノ酸で置換される。ある実施態様において、ヒンジは配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｖ２３４、Ａ２３５およびＧ２３７は欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換される。ある実施態様において、ヒンジは配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ａ２３５およびＧ２３７は欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換される。ある実施態様において、ヒンジは配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｇ２３７は欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換される。ある実施態様において、ヒンジは配列番号８、２１、１２６、１３４または１３５を含み、ここで、Ｖ２３４およびＡ２３５は欠失されるかまたは他のアミノ酸で置換される。配列番号２２もしくは１３８を有するハイブリッドヒンジまたはそのバリアント(例えば、表４参照)を得るための、ＩｇＧ２のＰＶＡＧ(配列番号１４３)のＩｇＧ１ヒンジの対応するアミノ酸、すなわち、(ＥＬＬＧ(配列番号１４４)またはＥＬＬＧＧ(配列番号１４５))での置換は、ＩｇＧ２ヒンジの利点とＩｇＧ１ヒンジのエフェクター機能を有するヒンジを提供する。
【０１６６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、表４における配列の一つ、例えば、配列番号８、２１、２２、２３、１２７〜１３２および１３４〜１４１からなるかまたは本質的にこれからなるヒンジを含み、ある実施態様において、付加的ヒンジアミノ酸残基を含まない。
【０１６７】
【表４】
2020521751.tif 000008
Ｘはシステイン以外の任意のアミノ酸である。
【０１６８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸がアミノ酸残基ＣＶＥとＣＰＰの間に挿入されている、表４に示すＩｇＧ２ヒンジを含む。ある実施態様において、ＴＨＴまたはＧＧＧが挿入される。ある実施態様において、１、１〜２または１〜３アミノ酸はヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入され得る。例えば、付加的グリシンはヒンジとＣＨ２ドメインの間に挿入され得る。
【０１６９】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域はＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域であり、ここで、ヒンジは１〜１０アミノ酸の欠失を含む。実施例に示すとおり、アミノ酸残基ＳＣＤＫＴＨＴ(Ｓ２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５；配列番号１５１)を欠くＩｇＧ１抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体より効率的に、抗体介在ＣＤ７３内在化に寄与した。同様に、ＩｇＧ２抗体の場合、アミノ酸残基ＣＣＶＥ(Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４；配列番号１５２)を欠くＩｇＧ２抗体は、野生型ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体より効率的に抗体介在ＣＤ７３内在化に寄与した。従って、ここに提供されるのは、ヒンジが、ＩｇＧ１抗体について残基２１９、Ｃ２２０、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５およびＩｇＧ２抗体について残基Ｃ２１９、Ｃ２２０、Ｖ２２２およびＥ２２４から選択される、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸残基の欠失を含む、修飾重鎖定常領域である。
【０１７０】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２アイソタイプの野生型ＣＨ１ドメイン(それぞれ「ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメイン」または「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」)である、ＣＨ１ドメインを含む。アイソタイプＩｇＧ３およびＩｇＧ４のＣＨ１ドメイン(それぞれ「ＩｇＧ３  ＣＨ１ドメインおよび「ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメイン」)も使用され得る。ＣＨ１ドメインはまた野生型ＣＨ１ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ１ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ１ドメインのバリアントの例は、Ａ１１４Ｃ、Ｃ１３１Ｓおよび／またはＴ１７３Ｃを含む。ＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインは置換Ｃ１３１Ｓを含んでよく、この置換は、ＩｇＧ２抗体またはＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジを有する抗体に、Ｂ形態(またはコンフォメーション)を与える。
【０１７１】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ２アイソタイプのものであるＣＨ１ドメインを含む。ある実施態様において、ＣＨ１ドメインは、例えば、アミノ酸配列
【化４】
2020521751.tif 000009
を有する、野生型ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインである。ある実施態様において、ＣＨ１ドメインは、配列番号７のバリアントであり、配列番号７に比して１〜１０、１〜５、１〜２または１アミノ酸置換または欠失を含む。実施例にさらに記載するとおり、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントが、ＩｇＧ１抗体に比して増強された性質を抗体に付し、抗体がまたＩｇＧ２ヒンジを含むとき、さらに増強された性質を抗体に付与することがここで示された。ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１バリアントは、次のアミノ酸残基Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の１以上にアミノ酸置換または欠失を含まず、このアミノ酸残基は、上記配列番号７で太字かつ下線で示される。例えば、修飾重鎖定常領域は、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されるか欠失されず、Ｃ１３１、Ｒ１３３、Ｅ１３７およびＳ１３８の何れも他のアミノ酸で置換されるか欠失されない、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含み得る。ある実施態様において、Ｃ１３１は他のアミノ酸、例えば、Ｃ１３１Ｓで置換され、この置換は、抗体が立体構造Ｂを取ることを誘発する。修飾重鎖定常領域を有する立体構造Ａおよび立体構造Ｂ抗体両者とも、ＩｇＧ１定常領域を有する同じ抗体に比して増強された活性を有することが、ここで示されている。
【０１７２】
ある実施態様において、Ｎ１９２および／またはＦ１９３(上記配列番号７で、斜体かつ下線として示した残基)は、他のアミノ酸、例えば、ＩｇＧ１の対応するアミノ酸で置換され、すなわち、Ｎ１９２Ｓおよび／またはＦ１９３Ｌである。
【０１７３】
ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの１以上のアミノ酸残基は、ＩｇＧ４における対応するアミノ酸残基で置換される。例えば、Ｎ１９２はＮ１９２Ｓであってよい；Ｆ１９３はＦ１９３Ｌであってよい；Ｃ１３１はＣ１３１Ｋ；および／またはＴ２１４はＴ２１４Ｒであってよい。
【０１７４】
抗体は、ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントおよびＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み得る。ヒンジおよびＣＨ１ドメインは、ここに記載する何れかのＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインとの組み合わせであり得る。ある実施態様において、ＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジは、次のアミノ酸配列
【化５】
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またはそれと最大で１〜１０アミノ酸異なるアミノ酸配列を含む。アミノ酸バリアントは、上のヒンジおよびＣＨ１ドメインについて記載のとおりである。
【０１７５】
ある実施態様において、抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインもしくはフラグメントまたは該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインの誘導体を含み、抗体は、(立体構造の)形態Ａをとる(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755参照)。ある実施態様において、抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりまたＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインもしくはフラグメントまたは該ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインの誘導体を含み、抗体は形態Ｂをとる(例えば、Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755参照)。
【０１７６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ２ドメイン(それぞれ「ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ２ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ２ドメイン」)であるＣＨ２ドメインを含む。ＣＨ２ドメインはまた野生型ＣＨ２ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ２ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ２ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節する、バリアントを含む。ある実施態様において、ＣＨ２ドメインは、Ａ３３０Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓ変異を有するヒトＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインであり、ここで、ＣＨ２ドメインは変異がない同じＣＨ２変異に比して低減したエフェクター機能を有する。ＣＨ２ドメインは増強されたエフェクター機能を有し得る。ＣＨ２ドメインは、次の変異ＳＥ(Ｓ２６７Ｅ)、ＳＥＬＦ(Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ)、ＳＤＩＥ(Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ)、ＳＥＦＦ、ＧＡＳＤＡＬＩＥ(Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ)の１以上および／または次のアミノ酸Ｅ２３３、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｈ２６８、Ｐ２７１、Ｌ３２８、Ａ３３０およびＫ３２２での１以上の変異を含み得る。これらの変異のいくつかは、実際、ここに定義するＣＨ２ドメインではなく、ヒンジの一部であることは注意すべきである。他の変異を、本明細書の他の箇所にさらに示す。
【０１７７】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプの野生型ＣＨ３ドメイン(それぞれ「ＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ２  ＣＨ３ドメイン」、「ＩｇＧ３  ＣＨ３ドメイン」または「ＩｇＧ４  ＣＨ３ドメイン」)である、ＣＨ３ドメインを含む。ＣＨ３ドメインはまた野生型ＣＨ３ドメインのバリアント、例えば、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４  ＣＨ３ドメインのバリアントであり得る。ＣＨ３ドメインのバリアントの例は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣなどの抗体のＦｃ領域の生物学的活性を調節するまたは抗体の半減期またはその安定性を調節するバリアントを含む。
【０１７８】
一般に、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインのバリアントは、対応する野生型ドメイン(それぞれＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメイン)に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の変異および／または最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１変異または１〜１０または１〜５変異を含むかまたは少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでよいが、特定のバリアントを含む重鎖定常領域は必要な生物学的活性を保持する。
【０１７９】
表５は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインを含むヒト重鎖定常領域の例を示し、ここで、各ドメインは、重鎖定常領域に所望の生物学的活性を提供する野生型ドメインまたはそのバリアントである。表５の空白セルは、ドメインが存在するかまたは存在せず、存在するならば、任意のアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であってよいことを示す。例えば、表５の重鎖定常領域１を含む抗体は、少なくともＩｇＧ２ヒンジを含み、またＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインも含んでよく、存在するならば、そのＣＨ１、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものである重鎖定常領域を含む、抗体である。表５の理解のための他の例として、重鎖定常領域８を含む抗体は、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインおよびＩｇＧ２ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含み、ＣＨ３ドメインも含んでも含まなくてもよく、存在するとき、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４アイソタイプのものであり得る、重鎖定常領域を含む抗体である。
【０１８０】
【表５】
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＊修飾重鎖定常領域
【０１８１】
ある実施態様において、表５に示す重鎖定常領域を含む抗体は、特定の重鎖定常領域を含まない重鎖定常領域を含む同じ抗体またはＩｇＧ１定常領域を含む同じ抗体に比して、増強された生物学的活性を示す。
【０１８２】
ある実施態様において、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗体の生物学的活性を改善する方法は、非ＩｇＧ２ヒンジおよび／または非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを含む抗体を準備し、そして非ＩｇＧ２ヒンジおよび非ＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインをそれぞれＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換えることを含む。修飾重鎖定常領域を含まない抗体の生物学的活性を改善する方法は、修飾重鎖定常領域を含まない抗体を準備し、そしてその重鎖定常領域を修飾重鎖定常領域で置き換えることを含み得る。
【０１８３】
修飾重鎖定常領域の例を表６に提供し、ドメインの各々の帰属性を示す。
【０１８４】
【表６】
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【０１８５】
ある実施態様において、抗体は、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかを含むＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアント、例えば、(ｉ)配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかと１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかと最大で５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかと１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるアミノ酸配列および／または(iv)配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６または１３７の何れかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＩｇＧ２ヒンジを含む修飾重鎖定常領域を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性を有する。
【０１８６】
ある実施態様において、ヒンジは、配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかのバリアントである配列を含み、ここで、Ｒ２１７(野生型ＩｇＧ２ヒンジ(配列番号８)における第二アミノ酸)は欠失されていないかまたは他のアミノ酸で置換されていない。ヒンジが配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６および１３７の何れかのバリアントであるある実施態様において、ヒンジは、野生型ＩｇＧ２のものに類似する剛性を有する。
【０１８７】
ある実施態様において、抗体は、配列番号２を含むＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインまたは配列番号７を含むＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたは配列番号２もしくは７のバリアントを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２または７と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２または７と最大で５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２または７と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２または７と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性を有する。
【０１８８】
ある実施態様において、抗体は、配列番号４もしくは２４または配列番号４もしくは２４のバリアントを含むＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号４または２４と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号４または２４と最大で５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号４または２４と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号４または２４と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性を有する。
【０１８９】
ある実施態様において、抗体は、配列番号５または配列番号５のバリアントを含むＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号５と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号５と最大で５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号５と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号５と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性を有する。
【０１９０】
修飾重鎖定常領域は、上記ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの組み合わせも含み得る。
【０１９１】
ある実施態様において、抗体は、ここに記載する修飾重鎖定常領域またはここに記載する修飾重鎖定常領域のバリアントを含み、このバリアントは、(ｉ)ここに記載する修飾重鎖定常領域と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)ここに記載する修飾重鎖定常領域と最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)ここに記載する修飾重鎖定常領域と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)ここに記載する修飾重鎖定常領域と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性を有する。
【０１９２】
ある実施態様において、抗体は、配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかを含む修飾重鎖定常領域または配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかのバリアントを含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかと１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかと最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかと１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号２６〜３７、５４〜５６、７８〜１２５、１５２〜２３２、２３４〜２４５および２４７〜２６２の何れかと少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、他の重鎖定常領域、例えば、非ＩｇＧ２ヒンジを含む重鎖定常領域または非ＩｇＧ２ヒンジを含む同じ修飾重鎖定常領域に比して、増強された生物学的活性(および／または低減されたエフェクター機能)を有する。
【０１９３】
修飾重鎖定常領域は、(ｉ)野生型重鎖定常領域に比して、類似する、低減したまたは増加したエフェクター機能(例えば、ＦｃγＲへの結合)およびまたは(ii)野生型重鎖定常領域に比して、類似する、低減したまたは増加した半減期(またはＦｃＲｎ受容体への結合)を有し得る。
【０１９４】
ある実施態様において、抗体(またはその抗原結合フラグメント)は、配列番号１９８またはＰ２３８Ｋを含むその一部または配列番号１９８の何れかのバリアントまたはその一部を含む修飾重鎖定常領域を含み、このバリアントは、(ｉ)配列番号１９８またはＰ２３８Ｋを含むその一部と１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列番号１９８またはＰ２３８Ｋを含むその一部と最大で１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列番号１９８またはＰ２３８Ｋを含むその一部と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５、３〜５、１〜１０または５〜１０アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列番号１９８またはＰ２３８Ｋを含むその一部と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで修飾重鎖定常領域は、ここに記載するアッセイで決定するなどで、低減されたエフェクター機能を有し、例えば、低親和性ＦｃγＲｓ(例えば、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ１６ａ)への結合が検出不可能であり、所望により高親和性ＦｃγＲ(ＣＤ６４)への結合が検出不可能である。
【０１９５】
ある実施態様において、Ｐ２３８Ｋ変異を含む(例えば、配列番号１９８またはその一部を含む)ＩｇＧ１  Ｆｃは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ、例えば、ここに記載するものに比して、他の変異を含まない。ある実施態様において、Ｐ２３８Ｋ変異を含む(例えば、配列番号１９８またはその一部を含む)ＩｇＧ１  Ｆｃは、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに比して、Ｐ２３８Ｋに加えて１〜５アミノ酸変化を含み、例えば、配列番号１９８またはその一部に比して、配列番号１９８またはその一部および１〜５アミノ酸変化を含むが、ただし、ＩｇＧ１  Ｆｃは低減されたエフェクター機能を有する。
【０１９６】
ある実施態様において、Ｐ２３８Ｋ変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃは、エフェクター機能を低減させる他の変異を何ら含まない。ある実施態様において、Ｐ２３８Ｋ変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃは、エフェクター機能を低減させる１〜５変異を含む。
【０１９７】
ある実施態様において、Ｐ２３８Ｋ変異を含むＩｇＧ  ＦｃはまたＬ２３５Ｅ変異および／またはＫ３２２Ａ変異を含み、ある実施態様において、Ｆｃエフェクター機能を調節する付加的Ｆｃ変異を含まなくてよく、例えば、Ｐ３３０、Ｐ３３１の変異または下部ヒンジ、例えば、アミノ酸２３４および２３６〜２３７の変異を含まない。ＩｇＧはＩｇＧ１でもＩｇＧ２でもよい。
【０１９８】
ある実施態様において、抗体は、ＩｇＧ２定常ドメインまたは少なくともそのヒンジを含む重鎖定常領域を含み、ここで、ＩｇＧ２定常ドメインまたはそのヒンジは、Ｐ２３８Ａ、Ｐ２３８Ｋ、Ｌ２３５Ａ、Ｋ３２２Ａおよび所望によりＣ２１９および／またはＣ２２０の変異、例えば、Ｃ２１９Ｓおよび／またはＣ２２０Ｓからなる群から選択される変異を含む。
【０１９９】
ある実施態様において、抗体は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａの１以上を含むＩｇＧ１定常ドメインを含む、重鎖定常領域を含む。ここで使用する「ＩｇＧ１.３」は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含むＩｇＧ１重鎖をいう(例えば、配列番号２４８参照)。これら３変異を含むＩｇＧ１定常領域はまたここに記載するものなどの付加的変異も含み得る。Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａ変異および付加的変異を含む配列の例は、配列表においてここに提供される。ＩｇＧ１.３  Ｆｃは、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどのエフェクター機能が顕著に低減した抗体を提供する。ある実施態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ１.３の変異および付加的変異、例えば、Ｐ２３８Ｋを含む。
【０２００】
ある実施態様において、抗体はＩｇＧ１.３重鎖定常領域を含み、この定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａに加えて、エフェクター機能を調節する他の変異を何ら含まない。ある実施態様において、抗体はＩｇＧ１.３重鎖定常領域を含み、この定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａに加えて、他の変異を含まない。
【０２０１】
重鎖定常領域は、配列表に提供される。ある実施態様において、抗体は、表に示す重鎖定常領域の一つを含み、ここで、定常領域は、表に示す配列に加えて、何ら変異を含まない。ある実施態様において、抗体は、表に示す重鎖定常領域の一つを含み、ここで、定常領域(ｉ)配列表における配列と１、２、３、４または５アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(ii)配列表における配列と最大で５、４、３、２または１アミノ酸置換、付加または欠失により異なる；(iii)配列表における配列と１〜５、１〜３、１〜２、２〜５または３〜５アミノ酸置換、付加または欠失により異なるおよび／または(iv)配列表における配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むものであり、ここで、(ｉ)〜(iv)の何れにおいても、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換でも非保存的アミノ酸置換でもよく；そしてここで定常領域の生物学的活性は、これらの変異により顕著に変わらない。
【０２０２】
重鎖定常領域は、重鎖領域を含む抗体に各個々の変異により付与される生物学的活性を付与する、変異の組み合わせを含み得る。例えば、アゴニスト活性、大きな細胞表面複合体形成を増強するまたは抗体の内在化を増強する１以上の変異を、エフェクター機能を調節する１以上の変異と組み合わせ得る。種々の生物学的機能を付与する変異の組み合わせを含む定常鎖配列の例を、配列表に示す。
【０２０３】
II. 修飾重鎖定常領域を有する抗体およびその標的抗原
修飾重鎖定常領域は、広範な抗体、例えば、内在化(例えば、抗体薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)および抗ＣＤ７３抗体)、アゴニスト活性(例えば、免疫応答調節、例えば、Ｔ細胞活性化刺激に有効な抗体、例えばアゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体)、アンタゴニスト活性(例えば、免疫応答、例えば、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質を阻害または遮断する抗体、例えばアンタゴニストＰＤ−１抗体)、エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣおよびＣＤＣまたは低減されたエフェクター機能、シグナル伝達または抗腫瘍活性を必要とする抗体に使用され得る。例えば、細胞表面阻害受容体の内在化は、その受容体と相互作用する能力を制限し、細胞機能を減少させ得る。
【０２０４】
ある実施態様において、修飾重鎖定常ドメインを含む抗体は、細胞表面と結合したとき、例えば、受容体介在エンドサイトーシスを誘発することによる、活性のために内在化を必要とする抗体(例えば、細胞表面受容体に特異的である抗体)である。このような抗体は、治療適用のための薬物、毒素、酵素またはＤＮＡの標的化送達の媒体として使用でき、それ故に、これらの抗体の内在化性質の増加が望ましい。有効な内在化により利益が得られ得る抗体の例は、抗体薬物コンジュゲートである。抗体の内在化性質を測定する種々のアッセイが当分野で知られ、ここに記載される。これらのアッセイは、例えば、抗体標識のために広範な色素を利用し、これは、内在化モニターのための洗浄または消光ベースのアッセイで使用され得る。抗体内在化は、蛍光標識に依存する無洗浄アッセイでもモニターされ得る。
【０２０５】
ある実施態様において、修飾重鎖定常ドメインを含む抗体は、活性のために、それらが結合する抗原、例えば、受容体またはリガンドなどの細胞表面分子の内在化を必要とする抗体である。それ故に、生物学的(例えば、治療的)活性のために下方制御が必要である細胞表面タンパク質に対する抗体は、ここに記載する修飾重鎖定常領域を使用できる。
【０２０６】
ある実施態様において、修飾重鎖定常ドメインを含む抗体は細胞表面分子に結合し、細胞表面分子、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｔｅｆｆ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、ランゲルハンス細胞、ＮＫ細胞、骨髄由来サプレッサー細胞、Ｂ細胞または任意の他の免疫細胞の細胞表面分子の生物学的活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする。細胞表面分子は、刺激、例えば、共刺激分子(例えば、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＩＣＯＳおよび他のＴＮＦＲファミリーメンバー)であり得て、抗体は活性をさらに刺激し得る(アゴニスト抗体)または抗体は活性を阻害し得る(アンタゴニスト抗体)。細胞表面分子は阻害分子(例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３)であり得て、抗体は活性をさらに刺激し得る(アゴニスト抗体)または抗体は活性を阻害し得る(アンタゴニスト抗体)。
【０２０７】
ある実施態様において、修飾重鎖定常ドメインを含む抗体は、例えば、Ｔ細胞からのＩＬ−２および／またはＩＦＮ−γ分泌誘発により、例えば、対象の免疫系をブーストする、刺激(または共刺激)分子のアゴニスト抗体である(例えば、抗ＧＩＴＲ抗体)。他のアゴニスト抗体は、Ｔ細胞免疫非存在下で癌を制御する可能性を有し、ＡＰＣを活性化する、抗腫瘍Ｔ細胞応答および／またはフォスター細胞毒性骨髄細胞を促進することが示されている。刺激分子のアゴニスト抗体は、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１などの負の免疫チェックポイントを遮断する阻害分子のアンタゴニスト抗体と異なる。Ｔ細胞増殖などのアゴニスト活性は、当分野で知られる多様な方法を使用して測定され得る。
【０２０８】
ある実施態様において、修飾重鎖定常ドメインを含む抗体は、例えば、活性化Ｔ細胞に発現される阻害受容体のターゲティングにより、抗ＣＴＬＡ−４または抗ＰＤ−１抗体などの負の免疫チェックポイントを遮断または阻害することにより、対象の免疫応答をブーストするチェックポイント阻害因子のアンタゴニスト抗体である。Ｔ細胞増殖の阻害などのアンタゴニスト活性は、当分野で知られる多様な方法を使用して測定され得る。
【０２０９】
ある実施態様において、抗体は、例えば、Ｔ細胞の、(ｉ)共刺激受容体のアゴニストまたは(ii)阻害シグナルのアンタゴニストであり、両者とも免疫応答、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答(免疫チェックポイント制御因子)の増強をもたらし得る。ある実施態様において、抗体は、例えば、Ｔ細胞の、(ｉ)共刺激受容体のアンタゴニストまたは(ii)阻害シグナルのアゴニストである。共刺激および共阻害分子は、免疫グロブリンスーパーファミリー(ＩｇＳＦ)のメンバーであり、修飾重鎖定常領域を有する抗体は、これらの何れかに結合し得る。共刺激または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの一つの重要なファミリーはＢ７ファミリーであり、これは、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−Ｈ１(ＰＤ−Ｌ１)、Ｂ７−ＤＣ(ＰＤ−Ｌ２)、Ｂ７−Ｈ２(ＩＣＯＳ−Ｌ)、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５(ＶＩＳＴＡ)およびＢ７−Ｈ６を含み、修飾重鎖定常領域を有する抗体は、これらの何れかに結合し得る。共刺激または共阻害受容体に結合する膜結合リガンドの他のファミリーは、同族ＴＮＦ受容体(ＴＮＦＲ)ファミリーメンバーに結合するＴＮＦファミリーの分子であり、これは、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌ、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ１３７、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２−Ｌ、ＴＲＡＩＬＲ１／ＤＲ４、ＴＲＡＩＬＲ２／ＤＲ５、ＴＲＡＩＬＲ３、ＴＲＡＩＬＲ４、ＯＰＧ、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫＲ／Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ、ＢＡＦＦＲ、ＥＤＡＲ、ＸＥＤＡＲ、ＴＡＣＩ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴ、ＤｃＲ３、ＨＶＥＭ、ＶＥＧＩ／ＴＬ１Ａ、ＴＲＡＭＰ／ＤＲ３、ＥＤＡＲ、ＥＤＡ１、ＸＥＤＡＲ、ＥＤＡ２、ＴＮＦＲ１、リンホトキシンα／ＴＮＦβ、ＴＮＦＲ２、ＴＮＦα、ＬＴα、ＬＴβ、ＬＴβＲ、リンホトキシンα１β２、ＦＡＳ、ＦＡＳＬ(ＣＤ１７８)、ＤＲ３(ＴＮＦＲＳＦ２５)、ＲＥＬＴ、ＤＲ６、ＴＲＯＹ、ＮＧＦＲを含む(例えば、Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1参照)。それ故に、ここに記載する抗体はこれらの表面分子に結合でき、これらは、例えば、癌などの増殖性疾患の処置のための、免疫応答の調節、例えば、刺激のための、例えば、(ｉ)Ｔ細胞活性化を阻害するＩｇＳＦファミリーまたはＢ７ファミリーまたはＴＮＦＲファミリーのタンパク質のアゴニストまたはアンタゴニスト(または阻害剤または遮断剤)またはＴ細胞活性化を阻害するサイトカイン(例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ；「免疫抑制性サイトカイン」)のアンタゴニストおよび／または(ii)ＩｇＳＦファミリー、Ｂ７ファミリーまたはＴＮＦファミリーの刺激受容体またはＴ細胞活性化を刺激するサイトカインのアゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【０２１０】
従って、修飾重鎖定常ドメインを有する抗体は、次の薬剤の一つとして使用し得る：
(１)Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８、４−１ＢＢ(ＣＤ１３７)、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＤＲ３またはＣＤ２８Ｈなどの、例えば、Ｔ細胞活性化を刺激するタンパク質のアゴニスト；または
(２)上記のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＬＡＧ−３および次のタンパク質ＴＩＭ−３、ガレクチン９、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＢＴＬＡ、ＣＤ６９、ガレクチン−１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１３、ＧＰＲ５６、ＶＩＳＴＡ、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＧＡＲＰ、ＣＤ７３、ＰＤ１Ｈ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−４、ＣＤ３９の何れかなどの、Ｔ細胞活性化を阻害するタンパク質(例えば、免疫チェックポイント阻害因子)のアンタゴニスト(阻害剤または遮断剤)。
【０２１１】
他の抗体は、ＮＫ細胞の阻害受容体のアンタゴニストおよびＮＫ細胞の活性化受容体のアゴニスト、例えば、ＫＩＲ、ＴＩＧＩＴ、ＮＫＧ２Ａを含む。
【０２１２】
一般に、修飾重鎖定常領域により利益を受け得る抗体は、例えば、正の共刺激受容体とライゲートするアゴニスト抗体、阻害受容体を介してシグナル伝達を減弱させる遮断抗体、アンタゴニスト抗体および抗腫瘍Ｔ細胞の出現頻度を全身性に増加させる抗体、腫瘍微小環境内の異なる免疫抑制経路に打ち勝つ抗体(例えば、阻害受容体結合(例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１相互作用)遮断、Ｔｒｅｇ(例えば、抗ＣＤ２５モノクローナル抗体)阻害または枯渇、ＩＤＯなどの代謝酵素阻害またはＴ細胞アネルギーまたは疲弊回復／予防)および腫瘍部位で自然免疫活性化および／または炎症を誘発する抗体を含む。阻害受容体の内在化増加は、潜在的阻害因子のレベル低下に転換され得る。
【０２１３】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は、治療剤とコンジュゲートして、抗体薬物コンジュゲート(ＡＤＣ)などの免疫複合体を形成する抗体であり、この免疫複合体は、その活性に内在化を必要とする。ＡＤＣにおいて、抗体は、癌細胞の抗原などのその抗原を発現する標的細胞にＡＤＣを指向させるためのターゲティング剤として機能する。この場合、抗原は腫瘍関連抗原、すなわち、癌細胞に特有に発現されるまたは過発現されるものであり得る。そこについたら、標的細胞またはその近位で薬物が放出され、治療剤として作用する。癌治療におけるＡＤＣの作用機序および使用のレビューのために、Schrama et al., Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147を参照のこと。
【０２１４】
癌処置のために、ＡＤＣの治療剤または薬物は、好ましくは標的癌細胞の死滅を引き起こす、細胞毒性薬物である。ＡＤＣで使用できる細胞毒性薬物は、次のタイプの化合物ならびにそのアナログおよび誘導体を含む：
(ａ)エンジイン、例えばカリケアミシン(例えば、Lee et al., J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464および3466参照)およびウンシアラマイシン(例えば、Davies et al., WO2007/038868A2(2007)およびChowdari et al., US8,709,431B2(2012)参照)；
(ｂ)ツブリシン(例えば、Domling et al., US7,778,814B2(2010); Cheng et al., US8,394,922B2(2013);およびCong et al., US2014/0227295A1参照)；
(ｃ)ＣＣ−１０６５およびデュオカルマイシン(例えば、Boger, US6,5458,530 B1 (2003); Sufi et al., US8,461,117B2(2013);およびZhang et al., US2012/0301490A1(2012)参照)；
(ｄ)エポチロン(例えば、Vite et al., US2007/0275904A1(2007)およびUSRE42930E (2011)参照)；
(ｅ)オーリスタチン(例えば、Senter et al., US6,844,869B2(2005)およびDoronina et al., US7,498,298B2(２００９)参照)；
(ｆ)ピロロベンゾジアゼピン(ＰＢＤ)二量体(例えば、Howard et al., US2013/0059800A1(2013); US2013/0028919A1(2013);およびWO2013/041606A1 (2013)参照)；および
(ｇ)メイタンシノイド、例えばＤＭ１およびＤＭ４(例えば、Chari et al., US5,208,020 (1993)およびAmphlett et al., US7,374,762B2(2008)参照)。
【０２１５】
ＡＤＣにおいて、抗体および治療剤は、リンカー、例えば、ペプチジル、ジスルフィドまたはヒドラゾンリンカーなどの切断可能リンカーを経てコンジュゲートし得る。例えば、リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、ＳｅｒまたはＧｌｕなどのペプチジルリンカーであり得る。ＡＤＣは、米国特許7,087,600;6,989,452;および7,129,261;PCT公開WO02/096910;WO07/038658;WO07/051081;WO07/059404;WO08/083312;およびWO08/103693;米国特許公開20060024317;20060004081;および20060247295に記載のとおり製造でき；これらの開示を引用により本明細書に包含させる。
【０２１６】
修飾重鎖定常領域で増強され得るＡＤＣの標的の例は、Ｂ７Ｈ４(Korman et al., US2009/0074660A1)；ＣＤ１９(Rao-Naik et al., 8,097,703B2)；ＣＤ２２(King et al., US2010/0143368A1)；ＣＤ３０(Keler et al., US7,387,776B2(2008)；ＣＤ７０(Terrett et al., US8,124,738B2)；ＣＴＬＡ−４(Korman et al., US6,984,720B1(2006))；ＰＤ−１(Korman et al., US8,008,449B2(2011)；ＰＳＭＡ(Huang et al., US2009/0297438A1およびCardarelli et al., US7,875,278B2)；ＰＴＫ７(Terrett et al., US2010/0034826A1)；グリピカン−３(Ｔerrett et al., US2010/0209432(A1))；ＲＧ１(Harkins et al., US7,335,748B2(2008))；メソテリン(Terrett et al., US8,268,970B2(2012))；およびＣＤ４４(Xu et al., US2010/0092484A1)を含む。
【０２１７】
修飾重鎖定常ドメインは、腫瘍学以外、例えば、関節リウマチ、ループスなどの免疫学的疾患で使用する抗体の一部であり得る。
【０２１８】
修飾重鎖定常ドメインは、非抗体分子(または抗体バリアント)またはそのフラグメントと融合でき、Ｆｃの存在に必要な任意のポリペプチドと融合できる。修飾重鎖定常ドメインを、ここにさらに定義するとおり(例えば、定義部分)、抗体の抗原結合フラグメントと融合できる。
【０２１９】
ある実施態様において、あるエフェクター機能を欠く、Ｐ２３８Ｋ変異を含む重鎖定常ドメインまたはその一部を、ポリペプチド、例えば、抗体の抗原結合フラグメントの重鎖部分と融合できる。ここにさらに記載するとおり、Ｐ２３８Ｋ変異を含み、例えば、配列番号１９８に示すアミノ酸配列を含むＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１のＦｃを抗体の重鎖可変ドメインと融合でき、ここで、抗体は任意の標的、例えば、ここに記載する標的タンパク質(例えば、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌ)に結合する。Ｐ２３８Ｋ変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ(例えば、配列番号１９８のアミノ酸配列を有するＰ２３８Ｋ  ＩｇＧ１  ｆａまたはＩｇＧ１の場合アロタイプｆを有する)を、エフェクター機能、特にＦｃγＲ  ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ１６ａへの結合が望まれないあらゆる抗体またはそのあらゆる抗原結合フラグメントで使用し得る。Ｐ２３８Ｋに加えて、重鎖定常領域はＦｃγＲ  ＣＤ６４への結合を低減させる付加的１または２変異、例えば、置換を含んでよくまたはＰ２３８Ｋを、ここにさらに記載するとおり、ＩｇＧ２ヒンジ、例えば、Ｃ２１９Ｓを含むＩｇＧ２ヒンジの状況で使用し得る。
【０２２０】
III. 抗体の生物学的活性を修飾する方法
ここに提供されるのは、ある抗体の次の生物学的活性の１以上などの生物学的活性を増強する方法である：
(ａ)増加または改変した細胞による内在化；
(ｂ)増加または改変したアゴニスト活性；
(ｃ)増加または改変したアンタゴニストまたは遮断活性；
(ｄ)増強されたまたは低減されたＡＤＣＣ；
(ｄ)新規性質の発現；
(ｅ)増加または改変したシグナル伝達；
(ｆ)大型抗体／抗原架橋複合体の形成；
(ｇ)標的細胞表面分子の増加したクラスター形成またはオリゴマー化；
(ｈ)免疫応答の増加した刺激または増強；および／または
(ｉ) 免疫応答の増加した阻害。
【０２２１】
抗体の生物学的活性を増強する方法は、重鎖定常領域またはその一部、例えば、ヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを修飾重鎖定常領域またはその一部、例えば、ＩｇＧ２ヒンジおよび／またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインで置き換えることを含み得る。
【０２２２】
ある実施態様において、抗体の生物学的活性を改善する方法は、(ｉ)ここに記載する修飾重鎖定常領域を含まない抗体を準備し；そして(ii)抗体の重鎖定常領域を抗体の生物学的活性を増強する修飾重鎖定常領域またはその一部で置き換えることを含む。ある実施態様において、抗体の生物学的活性を改善する方法は、(ｉ)非ＩｇＧ２ヒンジ(例えば、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ３ヒンジまたはＩｇＧ４ヒンジ)を含む抗体を準備し；そして(ii)抗体の非ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換えることを含む。ある実施態様において、抗体の生物学的活性を改善する方法は、(ｉ)非増強ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体を準備し；そして(ii)抗体の非増強ＩｇＧ２ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換えることを含む。「非増強ＩｇＧ２ヒンジ」は、抗体の生物学的活性増強に必要な特性をもはや有しない方法でＩｇＧ２ヒンジと異なるバリアントＩｇＧ２ヒンジ、例えば、野生型ＩｇＧ２ヒンジの剛性をもはや有しないバリアントヒンジである。
【０２２３】
抗体の生物学的活性を増強する方法の例は、(ｉ)非ＩｇＧ２ヒンジまたは非増強ＩｇＧ２ヒンジを含む抗体を準備し、そして(ii)ヒンジを配列番号８、２１、２２、２３、１２６〜１３２、１３４〜１３６または１３７またはそのバリアント、例えば、ここに記載するバリアントを含むヒンジで置き換えることを含む。抗体の生物学的活性を増強する方法はまた、(ｉ)修飾重鎖定常領域ではない重鎖定常領域を含む抗体を準備し、そして(ii)重鎖定常領域を修飾重鎖定常領域で置き換えることを含み得る。重鎖定常領域の置き換えは、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの置き換えを含み得る。例えば、重鎖定常領域を、ヒンジをＩｇＧ２ヒンジまたはそのバリアントで置き換えるおよび／またはＣＨ１ドメインをＩｇＧ１またはＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインまたはそのバリアントで置き換えることにより、修飾し得る。ある実施態様において、ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換え、ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインで置き換える。ある実施態様において、ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換え、ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインで置き換える。ある実施態様において、ヒンジをＩｇＧ２ヒンジで置き換え、ＣＨ１をＩｇＧ２ヒンジで置き換え、ＣＨ２ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインで置き換え、ＣＨ３ドメインをＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインで置き換える。ある実施態様において、重鎖定常領域を、上記表５に示す修飾重鎖領域１〜２７または表６に示すもしくはここに記載する重鎖定常領域で置き換える。
【０２２４】
またここに提供されるのは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体それぞれのヒンジの１〜１０アミノ酸を欠失することを含む、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体の生物学的活性を増強する方法である。例えば、アミノ酸２１９、Ｃ２２、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５の１以上が欠失され得る。ある実施態様において、アミノ酸２１９、Ｃ２２、Ｄ２２１、Ｋ２２２、Ｔ２２３、Ｈ２２４およびＴ２２５全てが欠失される。
【０２２５】
さらにここに提供されるのは、抗体のエフェクター機能を消失または低減させるために、例えば、Ｐ２３８を、例えば、Ｐ２３８Ｋさせることによる、エフェクターレス抗体またはその抗原結合フラグメントを製造および提供する方法である。
【０２２６】
ある実施態様において、例えば、生物学的活性を修飾するための、抗体の重鎖定常領域の置き換えは、その標的抗原への結合活性の減少または顕著な減少を伴わない。実施例に記載するとおり、抗ＧＩＴＲおよび抗ＣＤ７３抗体の重鎖定常領域の置換は、それぞれヒトＧＩＴＲおよびヒトＣＤ７３抗原への親和性を顕著に変化させなかった。
【０２２７】
特定のアイソタイプのドメインの異なるアイソタイプの同じドメインまたは変異、例えば、Ｐ２３８変異を含むドメインへの置き換えをいうとき、ドメインを文字通り置き換える必要はなく、むしろ、２つのアイソタイプ間で異なるアミノ酸を変えることのみが必要であり得ることは理解される。
【０２２８】
種々の抗原に対する抗体の結合能を評価する標準アッセイは当分野で知られ、さらにここに記載され、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットおよびＲＩＡを含む。適当なアッセイは、実施例に詳述される。抗体の結合動態(例えば、結合親和性)も、ＢＩＡＣＯＲＥ(登録商標)  ＳＰＲ分析によるなどの当分野で知られる標準アッセイにより評価し得る。修飾定常領域を有する抗体の性質(例えば、リガンド結合、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生)を評価するアッセイを下におよび実施例にさらに詳述する。
【０２２９】
ここに記載のとおり修飾され得る抗体の例は、例えば、癌を処置するための抗体、例えばヤーボイＴＭ(イピリムマブ)またはトレメリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)、ガリキシマブ(Ｂ７.１に対する)、ＢＭＳ−９３６５５８(ＰＤ−１に対する)、ＣＴ−０１１(ＰＤ−１に対する)、ＭＫ−３４７５(ＰＤ−１に対する)、ＡＭＰ２２４(Ｂ７ＤＣに対する)、ＢＭＳ−９３６５５９(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(Ｂ７−Ｈ１に対する)、ＭＥＤＩ−５７０(ＩＣＯＳに対する)、ＡＭＧ５５７(Ｂ７Ｈ２に対する)、ＭＧＡ２７１(Ｂ７Ｈ３に対する)、ＩＭＰ３２１(ＬＡＧ−３に対する)、ＢＭＳ−６６３５１３(ＣＤ１３７に対する)、ＰＦ−０５０８２５６６(ＣＤ１３７に対する)、ＣＤＸ−１１２７(ＣＤ２７に対する)、抗ＯＸ４０(Providence Health Services)、ｈｕＭＡｂＯＸ４０Ｌ(ＯＸ４０Ｌに対する)、アタシセプト(ＴＡＣＩに対する)、ＣＰ−８７０８９３(ＣＤ４０に対する)、ルカツムマブ(ＣＤ４０に対する)、ダセツズマブ(ＣＤ４０に対する)、ムロモナブ−ＣＤ３(ＣＤ３に対する)、イピリムマブ(ＣＴＬＡ−４に対する)を含む。
【０２３０】
ここに記載のとおり修飾され得る他の抗体は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体を含む。ここに記載のとおり修飾され得る抗ＰＤ−１抗体の例は、ニボルマブ(ＢＭＳ−９３６５５８)；WO2006/121168に記載される抗体１７Ｄ８、２Ｄ３、４Ｈ１、５Ｃ４、７Ｄ３、５Ｆ４および４Ａ１１の一つのＣＤＲまたは可変領域を含む抗体；WO2012/145493に記載のＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ)；WO2012/145493に記載のＡＭＰ−５１４；ＣＴ−０１１(ピディリズマブ；以前はCT-AcTibodyまたはＢＡＴ；例えば、Rosenblatt et al. (2011) J. Immunotherapy 34:409)；WO2009/014708、WO03/099196、WO2009/114335、WO2011/066389、WO2011/161699、WO2012/145493、WO2013/173223、米国特許7,635,757および8,217,149および米国特許公開2009/0317368に記載のものである。
【０２３１】
修飾され得るさらなる抗体は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、ＢＭＳ−９３６５５９(WO2007/005874および米国特許7,943,743で１２Ａ４と称される)；ＰＣＴ公開WO07/005874および米国特許7,943,743に記載の３Ｇ１０、１２Ａ４、１０Ａ５、５Ｆ８、１０Ｈ１０、１Ｂ１２、７Ｈ１、１１Ｅ６、１２Ｂ７および１３Ｇ４のＣＤＲまたは可変領域を含む抗体；ＭＥＤＩ４７３６(抗Ｂ７−Ｈ１としても知られる)；ＭＰＤＬ３２８０Ａ(ＲＧ７４４６としても知られる)；WO2013/173223、WO2011/066389、WO2012/145493、米国特許7,635,757および8,217,149および米国公開2009/145493に開示される抗ＰＤ−Ｌ１抗体の何れかを含む。
【０２３２】
修飾され得る他の抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えば、ヤーボイＴＭ(イピリムマブまたは抗体１０Ｄ１、ＰＣＴ公開WO01/14424に記載)；トレメリムマブ(以前はチシリムマブ、CP-675,206)；次の刊行物WO98/42752;WO00/37504;米国特許6,207,156；Hurwitz et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho et al. (2004) J. Clin. Oncology 22(145): Abstract No. 2505(抗体ＣＰ−６７５２０６)；およびMokyr et al. (1998) Cancer Res. 58:5301-5304の何れかに記載のモノクローナルまたは抗ＣＴＬＡ−４抗体；およびWO2013/173223に開示の抗ＣＴＬＡ−４抗体の何れかを含む。
【０２３３】
修飾され得る他の抗体は、抗ＬＡＧ−３抗体、例えば、ＢＭＳ−９８６０１６；US2011/007023に記載のＩＭＰ７３１；およびＩＭＰ−３２１を含む。
【０２３４】
修飾され得る他の抗体は、抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体、例えば、WO2006/105021に記載の抗ＧＩＴＲ抗体６Ｃ８またはそのヒト化バージョン；WO2011/028683に記載の抗体；および特開2008-278814に記載の抗体を含む。
【０２３５】
本明細書の他の箇所に記載するものを含む他の抗原を標的とする抗体も修飾され得る。例えば、抗Ｈｅｒ２内在化を必要とする抗体、例えば、トラスツズマブ(ハーセプチン)をここに記載のとおり修飾し得る。
【０２３６】
IV. さらなる重鎖定常ドメイン修飾
生物学的活性増強またはエフェクター機能低減のための抗体に対するここに記載する修飾に加えて、例えば、抗体のエフェクター機能のさらなる低減、ＦｃγＲへの結合および／または安定性のために、さらなる変異を、例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインに行い得る。例えば、ここに、例えば、下に記載する修飾の何れかを、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１−ＩｇＧ２ハイブリッドＦｃまたはその一部におけるようなＰ２３８、例えば、Ｐ２３８Ｋ変異と組み合わせ得る。
【０２３７】
Ｆｃおよび修飾Ｆｃ
ここに記載する抗体は、一般に、血清半減期、補体固定化、Ｆｃ受容体結合および／または抗体依存性細胞傷害などの抗体の１以上の機能的性質を改変するための１以上の修飾を含む、Ｆｃを含み得る。例えば、親Ｆｃに比して、(ａ)増加または減少した抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)、(ｂ)増加または減少した補体依存性細胞傷害(ＣＤＣ)、(ｃ)Ｃ１ｑに対する増加または減少した親和性および／または(ｄ)Ｆｃ受容体に対する増加または減少した親和性を有するＦｃバリアントを産生するために、Ｆｃ領域に修飾を行い得る。このようなＦｃ領域バリアントは、一般にＦｃ領域に少なくとも一つアミノ酸修飾を含む。アミノ酸修飾の組み合わせが、特に望ましいと考えられる。例えば、バリアントＦｃ領域は、例えばここに同定する特定のＦｃ領域位置に、２、３、４、５などの置換を含み得る。Ｆｃ配列バリアントの例はここに記載され、また米国特許5,624,821;6,277,375;6,737,056;6,194,551;7,317,091;8,101,720;PCT特許公開WO00/42072;WO01/58957;WO04/016750;WO04/029207;WO04/035752;WO04/074455;WO04/099249;WO04/063351;WO05/070963;WO05/040217、WO05/092925およびWO06/020114に開示される。
【０２３８】
エフェクター機能低減
ＡＤＣＣ活性を、Ｆｃ領域修飾により低減し得る。ある実施態様において、Ｆｃ受容体への結合に影響する部位、好ましくはサルベージ受容体結合部位以外の部位を除去できる(例えば、変異により)。他の実施態様において、Ｆｃ領域を修飾して、ＡＤＣＣ部位を除去し得る。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られる；例えば、ＩｇＧ１におけるＡＤＣＣ部位に関して、Sarmay et al. (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9参照。ある実施態様において、ヒトＩｇＧ１のＧ２３６ＲおよびＬ３２８Ｒバリアントは、効率的にＦｃγＲ結合を排除する。Horton et al. (2011) J. Immunol. 186:4223およびChu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926。他の実施態様において、ＦｃγＲへの結合が減少したＦｃは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＥおよびＧ２３７Ａを含む。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２３９】
ＣＤＣ活性も、Ｆｃ領域修飾により低減され得る。位置Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｐ３２９およびＰ３３１での変異、特にアラニン変異Ｄ２７０Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９ＡおよびＰ３３１Ａは、対応する抗体のＣ１ｑに結合し、補体を活性化する能力を顕著に低減させる。Idusogie et al. (2000) J. Immunol. 164:4178;WO99/51642。ＩｇＧ１の３３１位の修飾(例えばＰ３３１Ｓ)は、補体結合を低減することが示されている。Tao et al. (1993) J. Exp. Med. 178:661およびCanfield &#38; Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483。他の例では、アミノ酸位置２３１〜２３９内の１以上のアミノ酸残基が変えられ、それにより抗体が補体を固定する能力が低減される。WO94/29351。
【０２４０】
ある実施態様において、補体固定化が低減したＦｃは、アミノ酸置換Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを有する。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。
【０２４１】
エフェクター機能が全体で回避されるべき使用において、例えば抗原結合のみが所望の治療利益に十分であり、エフェクター機能が望ましくない副作用をもたらす(またはリスクを高める)のみであるとき、ＩｇＧ４抗体が使用できまたはＦｃ領域または実質的部分を欠く抗体またはフラグメントが考案できまたはＦｃをグリコシル化を全体で排除するために変異させ得る(例えばＮ２９７Ａ)。あるいは、ヒトＩｇＧ２(ＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域)およびヒトＩｇＧ４(ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン)のハイブリッド構築物が産生されており、これはエフェクター機能を欠き、ＦｃγＲに結合する能力を欠き(ＩｇＧ２のように)、活性化補体が不可能である(ＩｇＧ４のように)。Rother et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256。Mueller et al. (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn et al. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479もまた参照のこと(一般にエフェクター機能を低減するためのＦｃ修飾を記載)。
【０２４２】
他の実施態様において、Ｆｃ領域は、抗体の全エフェクター機能を低減するために、少なくとも一つアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置き換えることにより改変される。例えば、アミノ酸残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７、３１８、３２０および３２２から選択される１以上のアミノ酸を、抗体がエフェクターリガンドに対して減少した親和性を有するが、親抗体の抗原結合能を保持するように、異なるアミノ酸残基で置き換え得る。親和性が改変されるエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体(残基２３４、２３５、２３６、２３７、２９７)または補体Ｃ１成分(残基２９７、３１８、３２０、３２２)であり得る。両者ともWinter et al.の米国特許5,624,821および5,648,260。
【０２４３】
WO88/007089は、ＡＤＣＣ減少のためのＦｃγＲＩへの結合減少(２３４Ａ；２３５Ｅ；２３６Ａ；Ｇ２３７Ａ)またはＣＤＣを排除するための補体成分Ｃ１ｑへの結合遮断(Ｅ３１８ＡまたはＶ／Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ／Ｑ)のためのＩｇＧ  Ｆｃ領域における修飾を提案した。Duncan &#38; Winter (1988) Nature 332:563; Chappel et al. (1991) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 88:9036;およびSondermann et al. (2000) Nature 406:267も参照のこと(ＦｃγＲIII結合に対するこれら変異の影響を記載)。
【０２４４】
エフェクター機能を低減するＦｃ修飾はまた、２３４Ｇ、２３５Ｇ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、３２５Ｌおよび３２８Ｒなどの位置２３４、２３５、２３６、２３７、２６７、２６９、３２５および３２８への置換、挿入および欠失を含む。Ｆｃバリアントは、２３６Ｒ／３２８Ｒを含み得る。ＦｃｙＲおよび補体相互作用低減のための他の修飾は、置換２９７Ａ、２３４Ａ、２３５Ａ、２３７Ａ、３１８Ａ、２２８Ｐ、２３６Ｅ、２６８Ｑ、３０９Ｌ、３３０Ｓ、３３１Ｓ、２２０Ｓ、２２６Ｓ、２２９Ｓ、２３８Ｓ、２３３Ｐおよび２３４Ｖを含む。これらおよび他の修飾は、Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされている。ＩｇＧ１でＥ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、所望によりＧ２３６Δ、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ；ＩｇＧ４でＥ２３３Ｐ、Ｆ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、所望によりＧ２３６Δ；およびＩｇＧ２のＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓなどの位置２３３〜２３６および３２７〜３３１の１以上のＩｇＧ残基の変異により、新生児ＦｃＲ結合を維持しながら(半減期維持)、エフェクター機能(ＡＤＣＣおよび補体活性化両者)を低減することが可能である。Armour et al. (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613;WO99/58572参照。エフェクター機能を低減する他の変異は、ＩｇＧ１におけるＬ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ(Alegre et al. (1994) Transplantation 57:1537)；ＩｇＧ２におけるＶ２３４ＡおよびＧ２３７Ａ(Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613;米国特許5,834,597も参照)；およびＩｇＧ４のＳ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅ(Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925)を含む。ヒトＩｇＧ１におけるエフェクター機能を低減するための変異の他の組み合わせは、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３３１Ｓを含む。Oganesyan et al. (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700。一般にLabrijn et gal. (2008)Curr. Op. Immunol. 20:479参照。Ｆｃ(ＩｇＧ１)融合タンパク質(アバタセプト)においてエフェクター機能を減少することが判明したさらなる変異は、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９ＳおよびＰ２３８Ｓ(ＥＵ残基ナンバリング)である。Davis et al. (2007) J. Immunol. 34:2204。
【０２４５】
ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣが低減した他のＦｃバリアントは、Glaesner et al. (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287(ＩｇＧ４におけるＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを低減するためのＦ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ)；Hutchins et al. (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980(ＩｇＧ４におけるＦ２３４Ａ、Ｇ２３７ＡおよびＥ３１８Ａ)；An et al. (2009) MAbs 1:572および米国特許公開2007/0148167(ＩｇＧ２におけるＨ２６８Ｑ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ)；McEarchern et al. (2007) Blood 109:118５(ＩｇＧ１におけるＣ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ)；Vafa et al. (2014) Methods 65:114(ＩｇＧ２におけるＶ２３４Ｖ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｈ２６８Ａ、Ｖ３０９Ｌ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ)に開示される。
【０２４６】
ある実施態様において、本質的にエフェクター機能を有しない、すなわち、低減されたＦｃγＲへの結合および低減された補体固定化を有するように、Ｆｃが選択される。エフェクターレスであるＦｃ、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃの例は、次の５つの変異を含む：Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ。Gross et al. (2001) Immunity 15:289。これら５つの置換を、グリコシル化を同様に排除するため、Ｎ２９７Ａと組み合わせ得る。
【０２４７】
エフェクター機能増強
あるいは、ＡＤＣＣ活性を、Ｆｃ領域修飾により増加させ得る。ＡＤＣＣ活性に関して、ヒトＩｇＧ１≧ＩｇＧ３＞＞ＩｇＧ４≧ＩｇＧ２であり、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ではなく、ＩｇＧ１定常ドメインを、ＡＤＣＣが望まれるとき、薬物への使用に選択すべきである。あるいは、Ｆｃ領域を、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)増加および／またはＦｃγ受容体への親和性増加のために、次の位置：２３４、２３５、２３６、２３８、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６２、２６３、２６４、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７６、２７８、２８０、２８３、２８５、２８６、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１２、３１３、３１５、３２０、３２２、３２４、３２５、３２６、３２７、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３６０、３７３、３７６、３７８、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８または４３９の１以上のアミノ酸の修飾により修飾し得る。WO2012/142515参照;WO00/42072も参照。置換の例は、２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６８Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｅ、２６８Ｆ、３２４Ｔ、３３２Ｄおよび３３２Ｅを含む。バリアントの例は、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ａ／２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｆ／３２４Ｔ、２６７Ｅ／２６８Ｆ、２６７Ｅ／３２４Ｔおよび２６７Ｅ／２６８Ｆ／３２４Ｔを含む。例えば、所望によりＩ３３２Ｅと組み合わせ得るＧ２３６Ａバリアントを含むヒトＩｇＧ１Ｆｃは、ＦｃγIIＡ／ＦｃγIIＢ結合親和性比を約１５倍増加することが示されている。Richards et al. (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore et al. (2010) mAbs 2:181。ＦｃｙＲおよび補体相互作用増強のための他の修飾は、置換２９８Ａ、３３３Ａ、３３４Ａ、３２６Ａ、２４７Ｉ、３３９Ｄ、３３９Ｑ、２８０Ｈ、２９０Ｓ、２９８Ｄ、２９８Ｖ、２４３Ｌ、２９２Ｐ、３００Ｌ、３９６Ｌ、３０５Ｉおよび３９６Ｌを含むが、これらに限定されない。これらおよび他の修飾は、Strohl (2009)Current Opinion in Biotechnology 20:685-691にレビューされる。特に、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ両者は、ＩｇＧ１のＥ３３３位の変化、例えばＥ３３３Ａにより増強され得る。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591。ＩｇＧ１におけるエフェクター機能増強のためのＰ２４７ＩおよびＡ３３９Ｄ／Ｑ変異はWO2006/020114に開示され、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ±Ｓ２９８Ｄ／ＶがWO2004/074455に開示される。Ｋ３２６Ａ／ＷおよびＥ３３３Ａ／Ｓバリアントは、ヒトＩｇＧ１でおよびＥ３３３ＳはＩｇＧ２でエフェクター機能を増加させることが示されている。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。
【０２４８】
特に、ＦｃγＲ１、ＦｃγＲII、ＦｃγＲIIIおよびＦｃＲｎに対するヒトＩｇＧ１の結合部位はマッピングされており、結合が改善したバリアントは記載されている。Shields et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604。位置２５６、２９０、２９８、３３３、３３４および３３９での特定の変異は、組み合わせ変異体Ｔ２５６Ａ／Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ、Ｓ２９８Ａ／Ｋ２２４ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａを含み、ＦｃγＲIIIへの結合の改善を示した(増強したＦｃγＲIIIａ結合およびＡＤＣＣ活性を有する)。ＦｃγＲIIIａへの結合が強く増強された他のＩｇＧ１バリアントが同定されており、カニクイザルでＦｃγＲIIIａに対する親和性の最大増加、ＦｃγＲIIｂ結合減少および強力な細胞毒性活性を示したＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ変異を有するバリアントを含む。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan et al. (2010) Blood 115:1204; Desjarlais &#38; Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278。アレムツズマブ(ＣＤ５２特異的)、トラスツズマブ(ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的)、リツキシマブ(ＣＤ２０特異的)およびセツキシマブ(ＥＧＦＲ特異的)などの抗体への三重変異導入は、インビトロで大きく増強したＡＤＣＣ活性に転換され、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅバリアントは、サルでＢ細胞を枯渇させる能力の増大を示した。Lazar et al. (2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005。さらに、Ｂ細胞悪性腫瘍および乳癌モデルのヒトＦｃγＲIIIａを発現するトランスジェニックマウスにおいてＦｃγＲIIIａへの増強した結合および同時に増強したＡＤＣＣ活性を示したＬ２３５Ｖ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５ＩおよびＰ３９６Ｌ変異を含むＩｇＧ１変異体も同定されている。Stavenhagen et al. (2007) Cancer Res. 67:8882；米国特許8,652,466; Nordstrom et al. (2011) Breast Cancer Res. 13:R123。
【０２４９】
種々のＩｇＧアイソタイプは、また特異なＣＤＣ活性も示す(ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞＞ＩｇＧ２≒ＩｇＧ４)。Dangl et al. (1988) EMBO J. 7:1989。増強されたＣＤＣが望まれる使用について、Ｃ１ｑへの結合を増加させる変異を導入することも可能である。補体(ＣＤＣ)を動員する能力は、ＩｇＧ２における、Ｋ３２６Ｗ(ここではＡＤＣＣ活性を低減させる)およびＥ３３３ＳなどのＫ３２６および／またはＥ３３３での変異により増強でき、補体カスケードの第一成分であるＣ１ｑへの結合を増加させる。Idusogie et al. (2001) J. Immunol. 166:2571。ヒトＩｇＧ１へのＳ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ(単独または任意の組み合わせで)の導入はＣ１ｑ結合を増強させる。Moore et al. (2010) mAbs 2:181。Natsume et al. (2008) Cancer Res. 68:3863のＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドアイソタイプ抗体「１１３Ｆ」のＦｃ領域(その中の図１)も、ＣＤＣ増強に寄与する。Michaelsen et al. (2009) Scand. J. Immunol. 70:553およびRedpath et al. (1998) Immunology 93:595も参照のこと。
【０２５０】
エフェクター機能を増加または減少できる付加的変異は、Dall'Acqua et al. (2006) J. Immunol. 177:1129に開示される。Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008)Curr. Op. Immunol. 20:460も参照のこと。
【０２５１】
阻害受容体ＦｃｙＲIIｂへの親和性を増強させるＦｃバリアントも、例えばアポトーシス誘発またはアジュバント活性増強のために使用し得る。Li &#38; Ravetch (2011) Science 333:1030; Li &#38; Ravetch (2012) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 109:10966;米国特許公開2014/0010812。このようなバリアントは、例えばＢ細胞および単球を含むＦｃｙＲｌｌｂ＋細胞に関連する免疫調節活性を有する抗体を提供する。ある実施態様において、Ｆｃバリアントは、１以上の活性化受容体に比して、ＦｃｙＲｌｌｂに対する親和性を選択的に増強させる。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合改変のための修飾は、ＥＵ指標により２３４、２３５、２３６、２３７、２３９、２６６、２６７、２６８、３２５、３２６、３２７、３２８および３３２からなる群から選択される位置での１以上の修飾を含む。ＦｃｙＲｌｌｂ親和性増強のための置換の例は、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｆ、２３４Ｗ、２３５Ｄ、２３５Ｆ、２３５Ｒ、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３６Ｎ、２３７Ｄ、２３７Ｎ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２６６Ｍ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２７Ｄ、３２７Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗ、３２８Ｙおよび３３２Ｅを含むが、これらに限定されない。置換の例は、２３５Ｙ、２３６Ｄ、２３９Ｄ、２６６Ｍ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｗおよび３２８Ｙを含む。ＦｃｙＲｌｌｂへの結合増強のための他のＦｃバリアントは、２３５Ｙ／２６７Ｅ、２３６Ｄ／２６７Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／２６７Ｅ、２６７Ｅ／２６８Ｄ、２６７Ｅ／２６８Ｅおよび２６７Ｅ／３２８Ｆを含む。特に、ヒトＩｇＧ１のＳ２６７Ｅ＋Ｌ３２８Ｆ二重バリアントを含むＳ２６７Ｅ、Ｇ２３６Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｌ３２８ＦおよびＩ３３２Ｅバリアントは、阻害ＦｃｙＲｌｌｂ受容体の親和性の特異的増強に特に価値がある。Ｃhu et al. (2008) Mol. Immunol. 45:3926;米国特許公開2006/024298;WO2012/087928。ＦｃγＲIIｂに対する特異性増強(ＦｃγＲIIａＲ１３１と区別される)は、Ｐ２３８Ｄ置換付与により得られ得る。Mimoto et al. (2013) Protein. Eng. Des. &#38; Selection 26:589;WO2012/115241。
【０２５２】
グリコシル化
抗体のグリコシル化は、エフェクター機能の増加または低減のために修飾される。例えば、２９７位の保存的アスパラギン残基の変異(例えばＮ２９７Ａ)により、全エフェクター機能を欠くアグリコシル化抗体を製造でき、そうして補体およびＦｃγＲＩ結合を消失させる。Bolt et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. See also Tao &#38; Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595(ＩｇＧ１における２９７位のグリコシル化除去のためのＮ２９７Ｑの使用)。
【０２５３】
アグリコシル化抗体は、一般にエフェクター機能を欠くが、その機能を保持するように変異を導入できる。アグリコシル化抗体、例えばＮ２９７Ａ／Ｃ／Ｄ／またはＨ変異またはタンパク質をグリコシル化しない系(例えば大腸菌)由来のものを、ＦｃγＲ結合保持のためにさらに変異させることができ、例えばＳ２９８Ｇおよび／またはＴ２９９Ａ／Ｇ／またはＨ(WO2009/079242)またはＥ３８２ＶおよびＭ４２８Ｉ(Jung et al. (2010) Proc. Nat'l Acad. Sci (USA) 107:604)である。
【０２５４】
さらに、増強したＡＤＣＣを有する抗体を、グリコシル化の改変により製造できる。例えば、重鎖Ａｓｎ２９７結合オリゴ糖からのフコース除去は、ＦｃγＲIIIａへの結合改善に基づき、ＡＤＣＣを増強することが示されている。Shields et al. (2002) JBC 277:26733; Niwa et al. (2005) J. Immunol. Methods 306: 151; Cardarelli et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15:3376 (MDX-1401); Cardarelli et al. (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342)。このような低フコース抗体は、例えば、フコシルトランスフェラーゼ(ＦＵＴ８)を欠くノックアウトチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞(Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614)またはアフコシル化抗体を産生する他の細胞で産生され得る。例えば、Zhang et al. (2011) mAbs 3:289およびLi et al. (2006) Nat. Biotechnol. 24:210(両者とも糖鎖改変ピキア・パストリスにおける抗体産生を記載する); Mossner et al. (2010) Blood 115:4393; Shields et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa et al. (2003) J. Biol. Chem. 278:3466; EP1176195B1参照。ＡＤＣＣはまたフコースのＡｓｎ(２９７)結合炭水化物への能力が低減したバリアントＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３の使用と、またその宿主細胞で発現された抗体の得られる低フコシル化を開示する、ＰＣＴ公開WO03/035835に記載のとおりにも増強され得る(Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照)。あるいは、フコースアナログを、抗体産生中、抗体の炭水化物へのフコース取り込みを阻害するために、培養培地に加え得る。WO2009/135181。
【０２５５】
抗体結合オリゴ糖におけるバイセクトＧｌｃＮａｃ構造増加も、ＡＤＣＣを増強する。UmanaらのＰＣＴ公開WO99/54342は、操作細胞株で発現される抗体が、該抗体のＡＤＣＣ活性増加をもたらす、増加したバイセクトＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ(例えば、ベータ(１,４)−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII))を発現するように操作された細胞株を記載する(Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180も参照)。
【０２５６】
増強したＡＤＣＣおよびＡＤＣＰを示すが、ＣＤＣが減少したガラクトース、シアル酸、フコースおよびキシロース残基(いわゆるＧＮＧＮグリコフォーム)を欠く付加的グリコシル化バリアントならびに増強したＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣを示すシアル酸、フコースおよびキシロース(いわゆるＧ１／Ｇ２グリコフォーム)を欠くその他が開発されている。米国特許出願公開2013/0149300。これらのグリコシル化パターンを有する抗体は、所望により内因性キシロシルおよびフコシルトランスフェラーゼ遺伝子がノックアウトされている、遺伝子修飾ベンサミアナタバコ植物で産生される。
【０２５７】
糖鎖工学を使用して、Ｆｃ領域のＡｓｎ２９７に結合した炭水化物鎖のα２,６シアリル含量を変更することによりＩｇＧ構築物の抗炎症性性質を修飾するためにも使用でき、ここで、α２,６シアリル化形態の比率増加は、増強された抗炎症性効果をもたらす。Nimmerjahn et al. (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513参照。逆に、α２,６シアリル化炭水化物を有する抗体の割合の減少は、抗炎症性が望まれない場合に有用であり得る。例えば、α２,６シアリル化形態の選択的精製または酵素修飾による、抗体のα２,６シアリル化含量を修飾する方法は、米国特許出願公開2008/0206246に記載される。他の実施態様において、Ｆｃ領域のアミノ酸配列は、例えば、Ｆ２４１Ａ修飾の包含により、α２,６シアリル化の効果を模倣するように修飾される。WO2013/095966。
【０２５８】
ここに記載する抗体は、軽鎖または重鎖可変領域に１以上のグリコシル化部位を含み得る。このようなグリコシル化部位は、抗原結合改変により、抗体の免疫原性増加または抗体のｐＫ改変をもたらし得る(Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala and Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706)。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで生じることが知られている。
【０２５９】
生物学的半減期
ある実施態様において、抗体は、生物学的半減期を延長するために修飾される。種々のアプローチが可能である。例えば、これはＦｃ領域のＦｃＲｎへの結合親和性増加により行われ得る。ある実施態様において、抗体を、Prestaらの米国特許5,869,046および6,121,022に記載のとおり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２ループからとったサルベージ受容体結合エピトープを含むように、ＣＨ１またはＣＬ領域内で改変する。ＦｃＲｎへの結合が増加したおよび／または薬物動態が改善した他のＦｃバリアントの例は、例えば２５９Ｉ、３０８Ｆ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３４Ｓ、４３４Ｈ、４３４Ｆ、４３４Ｙおよび４３４Ｍを含む、位置２５９、３０８および４３４での置換を含む。ＦｃＦｃＲｎへの結合が増加した他のバリアントは、２５０Ｅ、２５０Ｑ、４２８Ｌ、４２８Ｆ、２５０Ｑ／４２８Ｌ(Hinton et al., 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton et al. 2006 Journal of Immunology 176:346-356)、２５６Ａ、２７２Ａ、３０５Ａ、３０７Ａ、３１１Ａ、３１２Ａ、３７８Ｑ、３８０Ａ、３８２Ａ、４３４Ａ(Shields et al, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604)、２５２Ｆ、２５２Ｙ、２５２Ｗ、２５４Ｔ、２５６Ｑ、２５６Ｅ、２５６Ｄ、４３３Ｒ、４３４Ｆ、４３４Ｙ、２５２Ｙ／２５４Ｔ／２５６Ｅ、４３３Ｋ／４３４Ｆ／４３６Ｈ(Del' Acqua et al. Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua et al., 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514-23524)を含む。米国特許8,367,805参照。
【０２６０】
ＩｇＧ  Ｆｃにおけるある保存残基(Ｉ２５３／Ｈ３１０／Ｑ３１１／Ｈ４３３／Ｎ４３４)の修飾、例えば、Ｎ４３４Ａバリアント(Yeung et al. (2009) J. Immunol. 182:7663)が、ＦｃＲｎ親和性を増強する、そうして循環における抗体の半減期を延長する方法として提案されている。WO98/023289。Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓを含む組み合わせＦｃバリアントは、最大５倍ＦｃＲｎ結合を増加し、血清半減期を延長することが示されている。Zalevsky et al. (2010) Nat. Biotechnol. 28:157。Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ修飾を含む組み合わせＦｃバリアントも、ＩｇＧ１抗体の半減期を延長する。Petkova et al. (2006) Int. Immunol. 18:1759。さらに、Ｍ２５２Ｙ／Ｍ４２８Ｌ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｈ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｆ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｙ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ａ、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４ＭおよびＭ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓバリアントを含む組み合わせＦｃバリアントも、半減期を延長することが示されている。WO2009/086320。
【０２６１】
さらに、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを含む組み合わせＦｃバリアントも、半減期を約４倍延長させる。Dall'Acqua et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:23514。ＦｃＲｎ親和性を増加させるが、ｐＨ依存を減少させる関連ＩｇＧ１修飾(Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ／Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ)が、他の抗体のＦｃＲｎへの結合を阻止するコンペティターとして使用するためのＩｇＧ１構築物(「ＭＳＴ−ＨＮ  Ａｂｄｅｇ」)作製に使用されており、内因性ＩｇＧ(例えば自己免疫状況)または他の外因性(治療的)ｍＡｂ何れかの他の抗体のクリアランスの増加をもたらした。Vaccaro et al. (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283;WO2006/130834。
【０２６２】
ＦｃＲｎ結合を増加させる他の修飾は、Yeung et al. (2010) J. Immunol. 182:7663-7671;6,277,375;6,821,505;WO97/34631;WO2002/060919に記載される。
【０２６３】
ある実施態様において、ＦｃＲｎ結合増加およびおそらく半減期延長のために、ハイブリッドＩｇＧアイソタイプを使用し得る。例えば、ＩｇＧ１／ＩｇＧ３ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ１位置を、この２アイソタイプが異なる位置でＩｇＧ３からのアミノ酸で置き換えることにより構築し得る。このように、１以上の置換、例えば、２７４Ｑ、２７６Ｋ、３００Ｆ、３３９Ｔ、３５６Ｅ、３５８Ｍ、３８４Ｓ、３９２Ｎ、３９７Ｍ、４２２Ｉ、４３５Ｒおよび４３６Ｆを含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。ここに記載する他の実施態様において、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ハイブリッドバリアントを、ＣＨ２および／またはＣＨ３領域におけるＩｇＧ２位置を、この２アイソタイプが異なる位置でＩｇＧ１からのアミノ酸で置き換えることにより構築し得る。このように、１以上の置換、例えば、次のアミノ酸置換２３３Ｅ、２３４Ｌ、２３５Ｌ、−２３６Ｇ(２３６位へのグリシンの挿入をいう)および３２７Ａの１以上を含むハイブリッドバリアントＩｇＧ抗体が構築され得る。米国特許8,629,113参照。血清半減期が延長され、発現が改善されたとされる、ＩｇＧ１／ＩｇＧ２／ＩｇＧ４配列のハイブリッドが産生されている。米国特許7,867,491(その中の配列番号１８)。
【０２６４】
本発明の抗体の血清半減期は、ペグ化によっても延長され得る。抗体は、例えば、抗体の生物学的(例えば、血清)半減期を延長するためにペグ化され得る。抗体をペグ化するために、抗体またはそのフラグメントを、一般にポリエチレングリコール(ＰＥＧ)試薬、例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体と、１以上のＰＥＧ基が抗体または抗体フラグメントに結合する条件下で反応させる。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子(または類似の反応性水可溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応により行う。ここで使用する用語「ポリエチレングリコール」は、モノ(Ｃ１−Ｃ１０)アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールまたはポリエチレングリコール−マレイミドなど、他のタンパク質の誘導体化に使用されているＰＥＧのあらゆる形態を包含することが意図される。ある実施態様において、ペグ化する抗体は、アグリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当分野で知られ、ここに記載する抗体に適用され得る。例えば、NishimuraらのEP0154316およびIshikawaらのEP0401384参照。
【０２６５】
あるいは、ある状況下では、本発明の抗体の半減期を、伸ばすのではなく短縮することが望ましいことがある。ヒトＩｇＧ１のＦｃにおけるＩ２５３Ａ(Hornick et al. (2000) J. Nucl. Med. 41:355)およびＨ４３５Ａ／Ｒ、Ｉ２５３ＡまたはＨ３１０Ａ(Kim et al. (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819)などの修飾は、医用画像などの迅速なクリアランスが好ましい状況で使用するために、ＦｃＲｎ結合を低減でき、そうして半減期を短縮(クリアランス増加)させ得る。Kenanova et al. (2005) Cancer Res. 65:622も参照。クリアランスを増加させる他の手段は、本発明の抗原結合ドメインの、ＦａｂフラグメントなどのＦｃＲｎとの結合能を欠く抗体フラグメントとしての整形を含む。このような修飾は、抗体の循環半減期を、数週間からせいぜい数時間に低減できる。必要であれば、抗体フラグメントの選択的ペグ化を使用して、抗体フラグメントの半減期を微調整(延長)し得る。Chapman et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:780。抗体フラグメントは、半減期を延長するために、例えば融合タンパク質構築物でヒト血清アルブミンと融合させ得る。Yeh et al. (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904。あるいは、二重特異性抗体を、第一の本発明の抗原結合ドメインと第二のヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)に結合する抗原結合ドメインで構築し得る。国際特許出願WO2009/127691およびその中で引用される特許参照。あるいは、特殊化ポリペプチド配列、例えば「ＸＴＥＮ」ポリペプチド配列を抗体フラグメントに付加して、半減期を延長し得る。Schellenberger et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186;国際特許出願WO2010/091122。
【０２６６】
安定性
ＩｇＧ１構築物のヒンジにおける潜在的プロテアーゼ切断部位をＤ２２１ＧおよびＫ２２２Ｓ修飾により除去して、抗体の安定性を増加し得る。WO2014/043344。
【０２６７】
ある実施態様において、ここに記載する抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミド化はＮ−ＧまたはＤ−Ｇ配列で生じ、ポリペプチド鎖にねじれを生じさせ得て、安定性を低減させ得る(イソアスパラギン酸効果)、イソアスパラギン酸残基の作製をもたらし得る。
【０２６８】
各抗体は、特有の等電点(ｐＩ)を有し、これは一般に６〜９.５のｐＨ範囲に入る。ＩｇＧ１抗体のｐＩは、一般に７〜９.５のｐＨ範囲内に入り、ＩｇＧ４抗体のｐＩは一般に６〜８のｐＨ範囲内に入る。通常の範囲外のｐＩを有する抗体は、インビボ条件下、一部変性し、不安定であり得るとの推測がある。それ故に、抗体が通常の範囲内のｐＩ値を含むのが好ましい。これは、通常の範囲内のｐＩを有する抗体の選択または荷電表面残基の修飾により達成され得る。
【０２６９】
各抗体は、特徴的融解温度を有し、融解温度が高いほど、インビボでの全体的安定性が大きい(Krishnamurthy R and Manning M C (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71)。一般に、ＴＭ１(最初の変性温度)は６０℃より高く、好ましくは６５℃より高く、さらにより好ましくは７０℃より高いのが好ましい。抗体の融点は、示差走査熱量測定(Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52)または円二色性(Murray et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9)を使用して測定され得る。
【０２７０】
好ましい実施態様において、迅速に分解しない抗体が選択される。抗体の分解は、キャピラリー電気泳動(ＣＥ)およびＭＡＬＤＩ−ＭＳ(Alexander A J and Hughes D E (1995) Anal Chem 67:3626-32)を使用して測定され得る。
【０２７１】
ＩｇＧ４定常ドメインを使用するとき、ＩｇＧ１におけるヒンジ配列を模倣し、それにより、例えば、治療抗体と処置患者の内因性ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換を減らすことによりＩｇＧ４分子を安定化する置換２２８Ｐを含むのが、通常好ましい。Labrijn et al. (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925。同様に、ＩｇＧ２ヒンジ含有抗体において、Ｃ２１９Ｓおよび／またはＣ２２０Ｓ変異は、ＩｇＧ２ヒンジ含有抗体を安定化する。
【０２７２】
凝集
他の好ましい実施態様において、望まない免疫応答および／または改変されたまたは都合悪い薬物動態性質を誘発し得る、凝集効果が最小の抗体を選択する。一般に、抗体は、２５％以下、好ましくは２０％以下、さらにより好ましくは１５％以下、さらにより好ましくは１０％以下、さらにより好ましくは５％以下の凝集が許容される。凝集は、サイズ排除カラム(ＳＥＣ)、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)および光散乱を含む数技法で測定され得る。
【０２７３】
Ｖ. 非抗体タンパク質および抗体誘導体
ここに記載する本発明は、ヒンジを含む限り、完全長抗体ではない分子にも適用され得る。例えば、生物学的活性が増強されたまたはエフェクター機能を欠くＩｇＧ融合タンパク質が製造され得る。従って、ここに提供されるのは、ＩｇＧ２ヒンジおよび所望によりＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはその一部を含むＩｇＧ定常領域、例えば、Ｆｃ領域に結合、例えば、共有結合したまたはエフェクター機能が低減した、例えば、Ｐ２３８に変異、例えば、Ｐ２３８Ｋを含むＩｇＧ(例えば、ＩｇＧ１)またはその一部に結合した、活性部分を含む融合タンパク質である。Ｆｃは、表５、６または配列表に示す修飾重鎖定常領域のＦｃ部分などの、ここに記載する修飾重鎖定常領域の任意のＦｃであり得る。
【０２７４】
ここに記載する抗体はまたＣＡＲ−Ｔ治療のための二重特異性分子または分子の形成にも使用され得る。抗体または抗原結合その一部を、少なくとも二つの異なる結合部位または標的分子に結合する二重特異性分子を産生するために、他の機能的分子、例えば、他のペプチドまたはタンパク質(例えば、受容体に対する他の抗体またはリガンド)で誘導体化するかまたは結合させ得る。ここに記載する抗体を、２を超える異なる結合部位および／または標的分子に結合する多特異的分子を産生するために、１を超える他の機能的分子で誘導体化するかまたは結合させ得る；このような多特異的分子もここで使用する用語「二重特異性分子」に包含されることを意図する。二重特異性分子を作製するために、ここに記載する抗体を、二重特異性分子が得られるように、他の抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたは結合模倣体などの１以上の他の結合分子に機能的に結合させ得る(例えば、化学カップリング、遺伝的融合、非共有会合またはその他)。
【０２７５】
VI. 組成物
さらに提供されるのは、薬学的に許容される担体と共に製剤されたここに記載する抗体またはその抗原結合部分の一つまたは組み合わせを含む、組成物、例えば、医薬組成物である。このような組成物は、ここに記載する抗体または免疫複合体または二重特異性分子の一つまたは組み合わせ(例えば、２以上の異なる)を含み得る。例えば、ここに記載する医薬組成物は、標的抗原の異なるエピトープに結合するまたは相補的活性を有する抗体(または免疫複合体または二重特異性体)の組み合わせを含み得る。
【０２７６】
ある実施態様において、組成物は、少なくとも１mg／ml、５mg／ml、１０mg／ml、５０mg／ml、１００mg／ml、１５０mg／ml、２００mg／ml、１〜３００mg／mlまたは１００〜３００mg／ml濃度でここに記載する抗体を含む。
【０２７７】
ここに記載する医薬組成物はまた組み合わせ治療で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与できる。例えば、組み合わせ治療は、ここに記載する抗体を、少なくとも一つの他の抗癌および／またはＴ細胞刺激(例えば、活性化)剤と組み合わせて含み得る。組み合わせ治療で使用され得る治療剤の例は、ここに記載する抗体の使用の部分で、下にさらに詳述する。
【０２７８】
ある実施態様において、ここに開示する治療組成物は、癌の処置に使用するための他の化合物、薬物および／または薬剤を含み得る。このような化合物、薬物および／または薬剤は、例えば、化学療法薬物、小分子薬物またはある癌に対する免疫応答を刺激する抗体を含む。ある例において、治療組成物は、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤＬ−１抗体、抗ＯＸ４０(ＣＤ１３４、ＴＮＦＲＳＦ４、ＡＣＴ３５および／またはＴＸＧＰ１Ｌとしても知られる)抗体または抗ＬＡＧ−３抗体の１以上を含み得る。
【０２７９】
ここで使用する「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性である任意かつ全ての溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経腸、脊髄または上皮投与(例えば、注射または点滴)に適する。投与経路により、活性化合物、すなわち、抗体、免疫複合体または二重特異性分子を、化合物を不活性化し得る酸および他の天然条件の作用から化合物保護する物質でコーティングし得る。
【０２８０】
ここに記載する医薬化合物は、１以上の薬学的に許容される塩を含む。「薬学的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、何ら望ましくない毒物学的影響を付与しない塩をいう(例えば、Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19参照)。このような塩の例は、酸付加塩および塩基付加塩を含む。酸付加塩は、非毒性無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸など、ならびに非毒性有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸など由来のものを含む。塩基付加塩は、アルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど、ならびに非毒性有機アミン、例えばＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど由来のものを含む。
【０２８１】
ここに記載する医薬組成物はまた薬学的に許容される抗酸化剤も含み得る。薬学的に許容される抗酸化剤の例は、(１)水可溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(２)油可溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール(ＢＨＡ)、ブチル化ヒドロキシトルエン(ＢＨＴ)、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなど；および(３)金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などを含む。
【０２８２】
ここに記載する医薬組成物で用い得る適当な水性および非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物、オリーブ油などの植物油およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により、維持され得る。
【０２８３】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含み得る。微生物の存在の阻止は、上記滅菌手順および種々の抗細菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの添加により確実にし得る。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に添加することも望ましいことがある。さらに、注射用剤型の長期吸収は、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤の添加により達成され得る。
【０２８４】
薬学的に許容される担体は、無菌水溶液または分散媒および無菌注射用溶液または分散剤の即時の調製用の無菌粉末を含む。薬学的に活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は当分野で知られる。慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合でない限り、ここに記載する医薬組成物へのその使用が意図される。追加の活性化合物も組成物に入れてよい。
【０２８５】
治療組成物は、一般に製造および貯蔵条件下、無菌かつ安定でなければならない。組成物を、高薬物濃度に適する溶液、マイクロエマルジョン、リポソームまたは他の秩序構造に製剤し得る。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど)およびそれらの適当な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用により、分散体の場合必要な粒子径の維持によりおよび界面活性剤の使用により、維持され得る。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトールまたは塩化ナトリウムを添加することが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、組成物に吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを添加することにより達成され得る。
【０２８６】
無菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物を、必要に応じて、上に挙げた成分の一つまたは組み合わせと共に適切な溶媒に取り込み、続いて滅菌微量濾過することにより製造され得る。一般に、分散剤は、活性化合物を、基本的分散媒体および上に挙げたものからの必要な他の成分を含む、無菌媒体に取り込むことにより製造する。無菌注射用溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、あらかじめ滅菌濾過した溶液から、活性成分と任意の付加的な所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥およびフリーズドライ(凍結乾燥)である。
【０２８７】
単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、処置する対象および特定の投与方式により変わる。単一剤形を製造するために担体物質と組み合わせ得る活性成分の量は、一般に治療効果を生じる組成物の量である。一般に、薬学的に許容される担体と組み合わせて、１００パーセント中、この量は、活性成分約０.０１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約０.１パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは活性成分約１パーセント〜約３０パーセントである。
【０２８８】
投与レジメンを、最適な所望の応答(例えば、治療応答)を提供するように調節する。例えば、単回ボーラスを投与してよく、数分割用量を長期で投与してよくまたは治療状況の緊急さにより用量を比例的に減少または増加してよい。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経腸組成物を投与量単位形態で製剤するのが特に有利である。ここで使用する投与量単位形態は、処置対象への単位投与量として適する物理的に分かれた単位を言い、各単位は必要な医薬担体と共に所望の治療効果を生じるよう計算された予定された量の活性化合物を含む。ここに記載される投与量単位形態の詳細は、(ａ)活性化合物の特有の性質および達成すべき特定の治療効果および(ｂ)個体の感受性処置のための活性化合物の製剤の分野に固有の限度により指示され、直接依存する。
【０２８９】
抗体の投与のために、投与量は約０.０００１〜１００mg／kg、より一般に０.０１〜５mg／kg宿主体重の範囲である。例えば投与量は、０.３mg／kg体重、１mg／kg体重、３mg／kg体重、５mg／kg体重または１０mg／kg体重または１〜１０mg／kg体重の範囲内である。処置レジメの例は、週１回、２週に１回、３週に１回、４週に１回、月に１回、３か月に１回または６か月に１回の投与を伴う。ここに記載する抗体の好ましい投与レジメンは、静脈内投与による１mg／kg体重または３mg／kg体重を含み、抗体は、次の投与スケジュールの一つを使用して与える：(ｉ)６用量４週毎、その後３か月毎；(ii)３週毎；(iii)３mg／kg体重を１回、続いて１mg／kg体重を３週毎。
【０２９０】
ある方法において、異なる結合特異性を有する２以上のモノクローナル抗体が同時に投与され、この場合、投与される各抗体の投与量は、指示された範囲内に入る。抗体は、通常複数回投与する。一投与量間の間隔は、例えば、毎週、毎月、３か月毎または毎年であり得る。間隔はまた患者における標的抗原に対する抗体の血中レベル測定により示され得る。ある方法において、投与量を、約１〜１０００μg／mlおよびある方法において約２５〜３００μg／mlの血漿抗体濃度を達成するように調節する。
【０２９１】
抗体を、徐放製剤、として投与でき、この場合、低頻度の投与が必要である。投与量および頻度は、患者における抗体の半減期により変わる。一般に、ヒト抗体は最長半減期を示し、ヒト化抗体、キメラ抗体および非ヒト抗体が続く。投与量および投与頻度は、処置が予防的かまたは治療的かにより変わり得る。予防適用において、比較的低投与量が、長期にわたり、比較的頻繁ではない間隔で投与される。一部患者は、処置を死亡まで受ける。治療適用において、比較的短い間隔での比較的高投与量が、疾患の進行が低減するかまたは停止するまで、好ましくは患者が、疾患症状の部分的または完全改善を示すまで、必要なことがある。その後、患者に予防レジメを投与し得る。
【０２９２】
ここに記載する医薬組成物の活性成分の実際の投与量レベルは、患者に毒性ではなく、特定の患者、組成物および投与方式で所望の治療応答を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変え得る。選択投与量レベルは、用いるここに記載する特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、用いる特定の化合物の排泄速度、処置期間、用いる特定の組成物と組み合わせて使用する他の薬物、化合物および／または物質、処置する患者の年齢、性別、体重、状態、一般的健康および病歴および医学分野で周知の類似因子を含む、多様な薬物動態因子により変わる。
【０２９３】
ここに記載する抗体の「治療的有効投与量」は、好ましくは疾患症状重症度低減、無疾患症状期間の頻度および期間増大または疾患罹患による機能障害もしくは身体障害の予防をもたらす。癌の状況において、治療的有効用量は、好ましくは癌と関連する身体症状のさらなる増悪を予防する。癌の症状は当分野で周知であり、例えば、異常な黒子特徴、非対称、境界、色および／または直径を含む黒子の見かけ変化、新たに着色された皮膚領域、異常黒子、爪の下の黒ずんだ領域、乳房腫瘤、乳首変化、乳房嚢胞、乳房痛、死亡、体重減少、脱力、過度の疲労、食事困難、食欲減退、慢性咳嗽、息切れ悪化、喀血、血尿、血便、悪心、嘔吐、肝臓転移、肺転移、骨転移、腹部膨満、鼓腸、腹水、膣出血、便秘、腹部膨満感、結腸穿孔、急性腹膜炎(感染、発熱、疼痛)、疼痛、吐血、大汗、発熱、高血圧、貧血、下痢、黄疸、めまい、悪寒、筋肉攣縮、結腸転移、肺転移、膀胱転移、肝臓転移、骨転移、腎臓転移および膵臓転移、嚥下困難など。
【０２９４】
治療的有効用量は、疾患の初期または前記症状が存在するとき望まれ得るような、癌発症を予防または遅延し得る。癌の診断に使用される臨床検査は、化学、血液学、血清学および放射線学を含む。従って、前記の何れかをモニターする任意の臨床的または生化学的アッセイを使用して、特定の処置が癌処置のための治療的有効用量であるか否かを決定し得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および選択した特定の組成物または投与経路などの因子に基づき、このような量を決定できる。
【０２９５】
ここに記載する組成物は、当分野で知られる多様な方法の１以上を使用して、１以上の投与経路で投与され得る。当業者に認識されるとおり、経路および／または投与方法は所望の結果により変わる。ここに記載する抗体の好ましい投与経路は、例えば注射または点滴による、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄または他の非経腸投与経路を含む。ここで使用する用語「非経腸投与」は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および点滴を含むが、これらに限定されない。
【０２９６】
あるいは、ここに記載する抗体を、局所、上皮または粘膜投与経路、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所的などの非経腸ではない経路で投与し得る。
【０２９７】
活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出製剤などの、化合物を急速な放出から保護する担体と共に製剤し得る。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用し得る。このような製剤を製造するための多くの方法が特許され、または当業者に一般に知られる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978参照。
【０２９８】
治療組成物を、当分野で知られる医療機器を用いて投与し得る。例えば、好ましい実施態様において、ここに記載する治療組成物を、米国特許5,399,163;5,383,851;5,312,335;5,064,413;4,941,880;4,790,824;または4,596,556に開示するデバイスなど無針皮下注射器を使用して投与し得る。ここに記載する抗体で使用するための周知のインプラントおよびモジュールの例は、制御された速度で薬物を分配するための埋め込み型マイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許4,487,603；皮膚を介して薬物を投与するための治療デバイスを開示する米国特許4,486,194；厳密な注入速度で薬物を送達する薬物注入ポンプを開示する米国特許4,447,233；連続薬物送達のための流量可変埋め込み型点滴装置を開示する米国特許4,447,224；多チャンバー区画を有する浸透圧薬物送達系を開示する米国特許4,439,196；および浸透圧薬物送達系を開示する米国特許4,475,196を含む。これらの特許は、引用により本明細書に包含させる。多くの他のこのようなインプラント、送達系およびモジュールは当業者に知られる。
【０２９９】
ある実施態様において、ここに記載する抗体は、インビボでの適切な分布のために製剤される。例えば、血液−脳関門(ＢＢＢ)は、多くの高度に親水性の化合物を排除する。ここに記載する治療化合物がＢＢＢを通ることを確実にするために(望むならば)、例えば、リポソームに製剤され得る。リポソームを製造する方法について、例えば、米国特許4,522,811;5,374,548;および5,399,331を参照のこと。リポソームは、特定の細胞または臓器に選択的に輸送される１以上の部分を含み、そうして標的薬物送達が増強される(例えば、V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。ターゲティング部分の例は、葉酸またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許5,416,016)；マンノシド(Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；界面活性剤プロテインＡ受容体(Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134)；ｐ１２０(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090)を含み；またK. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。
【０３００】
VII. 使用および方法
ここに記載する抗体、抗体組成物および方法は、例えば、種々の障害、例えば、癌の処置を含む、多数のインビトロおよびインビボでの有用性がある。例えば、ここに記載する抗体を、インビトロまたはエクスビボで培養細胞にまたは、例えば、インビボでヒト対象に適用され得る。従って、ここに提供されるのは、処置がされるように、対象に修飾重鎖定常領域を含む抗体を投与することを含む、対象を処置する方法である。またここに提供されるのは、対象における免疫応答が修飾されるように、対象に抗体を投与することを含む、対象の免疫応答を修飾する方法である。好ましくは、応答は増強、刺激または上方制御される。しかしながら、他の実施態様において、免疫応答は阻害される。
【０３０１】
好ましい対象は、免疫応答の増強が望ましいヒト患者である。方法は、免疫応答(例えば、Ｔ細胞介在免疫応答)増強により処置され得る障害を有するヒト患者の処置に特に適する。特定の実施態様において、方法は、インビボでの癌処置に特に適する。ある実施態様において、対象は腫瘍担持対象であり、腫瘍に対する免疫応答が刺激される。腫瘍は固形腫瘍または液性腫瘍、例えば、造血器腫瘍であり得る。ある実施態様において、腫瘍は免疫原性腫瘍である。ある実施態様において、腫瘍は非免疫原性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陽性である。ある実施態様において、腫瘍はＰＤ−Ｌ１陰性である。対象はまたウイルス担持対象でもあり得て、ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０３０２】
さらに提供されるのは、対象において腫瘍の増殖が阻害されるように対象にここに記載する抗体を投与することを含む、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法である。また提供されるのは、対象においてウイルス感染が処置されるように対象にここに記載する抗体を投与することを含む、対象におけるウイルス感染を処置する方法である。
【０３０３】
またここに包含されるのは、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ細胞枯渇を刺激するＦｃを含むここに記載する抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、腫瘍、例えば、癌性腫瘍を有する対象の腫瘍微小環境からＴｒｅｇ細胞を枯渇させる方法である。Ｆｃは、例えば、１以上の活性化Ｆｃ受容体との結合または増強された結合などのエフェクター機能または像児湯されたエフェクター機能を有するＦｃであり得る。
【０３０４】
ある実施態様において、修飾重鎖定常領域を含む抗体は刺激分子に結合し、その活性を阻害する、すなわち、刺激分子のアンタゴニストであるかまたは抗体は阻害分子に結合し、その活性を刺激し、すなわち、阻害分子のアゴニストである。このような抗体は、免疫系または免疫応答が下方制御されるべきである疾患、例えば、自己免疫性疾患の処置または移植片拒絶予防に使用され得る。
【０３０５】
癌
ここに提供されるのは、対象が処置されるように、例えば、癌性腫瘍の増殖が阻止または低減されるおよび／または腫瘍が退縮するように、対象にここに記載する抗体を投与することを含む癌を有する対象を処置する方法である。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体によるＧＩＴＲ活性化は、患者における癌細胞に対する免疫応答を像児湯し得る。抗体を単独で使用して、癌性腫瘍の増殖を阻止し得る。あるいは、抗体を他の薬剤、例えば、下記の他の免疫原性剤、標準癌処置または他の抗体と組み合わせて使用し得る。
【０３０６】
ここに記載する抗体を使用して増殖が阻止される癌は、一般に免疫療法に応答性の癌である。処置のための癌の非限定的例は、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平上皮非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、非ＮＳＣＬＣ、神経膠腫、消化器癌、腎臓癌(例えば明細胞癌)、卵巣癌、肝臓癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌(例えば、腎臓細胞癌(ＲＣＣ))、前立腺癌(例えばホルモン難治性前立腺腺癌)、甲状腺癌、神経芽腫、膵臓癌、神経膠芽腫(多形神経膠芽腫)、子宮頸癌、胃癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌および頭頸部癌(または癌)、胃癌、生殖細胞腫瘍、小児科肉腫、副鼻腔ナチュラルキラー、黒色腫(例えば、転移悪性黒色腫、例えば皮膚または眼内悪性黒色腫)、骨癌、皮膚癌、子宮癌、肛門部癌、精巣癌、卵管癌、子宮内膜癌腫、子宮頸癌腫、膣癌、外陰癌、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、小児固形腫瘍、輸尿管癌、腎盂癌、中枢神経系(ＣＮＳ)新生物、原発ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平上皮細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘発されるものを含む環境誘発癌、ウイルス関連癌(例えば、ヒトパピローマウイルス(ＨＰＶ)関連腫瘍)および２つの主要な血液細胞系譜、すなわち、骨髄細胞株(顆粒球、赤血球、血小板、マクロファージおよび肥満細胞産生)またはリンパ系細胞株(Ｂ、Ｔ、ＮＫおよび形質細胞産生)の何れか由来の血液系腫瘍、例えば全タイプの白血病、リンパ腫および骨髄腫、例えば、急性、慢性、リンパ球性および／または骨髄性白血病、例えば急性白血病(ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)および慢性骨髄性白血病(ＣＭＬ)、未分化ＡＭＬ(Ｍ０)、骨髄芽球性白血病(Ｍ１)、骨髄芽球性白血病(Ｍ２；細胞成熟を伴う)、前骨髄球性白血病(Ｍ３またはＭ３バリアント[Ｍ３Ｖ])、骨髄単球性白血病(Ｍ４または好酸球増加症を伴うＭ４バリアント[Ｍ４Ｅ])、単球系白血病(Ｍ５)、赤白血病(Ｍ６)、巨核芽球白血病(Ｍ７)、孤立性顆粒球肉腫および緑色腫；リンパ腫、例えばホジキンリンパ腫(ＨＬ)、非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、単球様Ｂ細胞リンパ腫、粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫、未分化(例えば、Ｋｉ  １＋)大細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞リンパ腫／白血病、マントル細胞リンパ腫、血管免疫芽細胞性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、原発縦隔Ｂ細胞リンパ腫、前駆体Ｔリンパ芽球性リンパ腫、Ｔリンパ芽球性；およびリンパ腫／白血病(Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ)、末梢Ｔ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害、真正組織球性リンパ腫、原発中枢神経系リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫(ＬＢＬ)、リンパ系造血性腫瘍、急性リンパ芽球性白血病、汎発性大Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、汎発性組織球性リンパ腫(ＤＨＬ)、免疫芽細胞性大細胞リンパ腫、前駆体Ｂリンパ芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫(ＣＴＬＣ)(菌状息肉症またはセザリー症候群とも称される)およびワルデンシュトレームマクログロブリン血症を伴うリンパ形質細胞性リンパ腫(ＬＰＬ)��骨髄腫、例えばＩｇＧ骨髄腫、軽鎖骨髄腫、非分泌型骨髄腫、くすぶり型骨髄腫(低悪性度骨髄腫とも称される)、孤立性形質細胞腫および多発性骨髄腫、慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)、ヘアリー細胞リンパ腫；骨髄系造血性腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍；精上皮腫、奇形癌腫、星状細胞腫を含む中枢および末梢神経腫瘍、シュワン腫；線維肉腫、横紋筋肉腫および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍；および黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞性癌および奇形癌腫、リンパ系造血性腫瘍、例えば小細胞および大脳様細胞型を含むＴ前リンパ球性白血病(Ｔ−ＰＬＬ)などのＴ細胞障害を含むが、これらに限定されないＴ細胞およびＢ細胞腫瘍を含む他の腫瘍；好ましくはＴ細胞型の大顆粒状リンパ球白血病(ＬＧＬ)；ａ／ｄ  Ｔ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫；末梢／胸腺後Ｔ細胞リンパ腫(多形性および免疫芽細胞サブタイプ)；血管中心性(鼻腔)Ｔ細胞リンパ腫；頭頚部癌、腎臓癌、直腸癌、甲状腺癌；急性骨髄リンパ腫、ならびに該癌の任意の組み合わせを含む。ここに記載する方法は、転移癌、難治性癌(例えば、先の免疫療法、例えば、遮断ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１抗体に癌難治性)および再発癌の処置にも使用され得る。
【０３０７】
組み合わせ治療
上記治療に加えて、ここに記載する抗体は、他の治療と組み合わせも使用され得る。例えば、癌処置のために、ここに記載する抗体を、化学療法、放射線、手術または遺伝子療法などの他の癌処置をすでに受けている対象に投与し得る。
【０３０８】
処置方法は、ここに記載する抗体(例えば、修飾重鎖定常領域を有するアンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体およびＡＤＣ)と他の分子、例えば、抗体(例えば、アンタゴニスト抗体、アゴニスト抗体およびＡＤＣ)の共投与を含む。免疫系を刺激するここに記載する抗体は、免疫系を刺激する他の分子、例えば、阻害分子の共刺激分子または阻害因子のアゴニストである分子と投与され得る。
【０３０９】
ここに記載する抗体は、単独でまたは１以上の付加的免疫刺激抗体(例えば、ＣＴＬＡ−４および／またはＰＤ−１および／またはＰＤ−Ｌ１および／またはＬＡＧ−３遮断)と共に、標準癌処置と組み合わせ得る。例えば、ここに記載する抗体は、単独でまたは１以上の付加的抗体と共に化学療法レジメと効率的に組み合わせ得る。これらの場合、本開示の組み合わせと投与される他の化学療法剤の用量を低減することが可能であり得る(Mokyr et al. (1998) Cancer Research 58: 5301-5304)。このような組み合わせの例は、黒色腫処置のための、ここに記載する抗体単独または付加的抗体との組み合わせの、ダカルバジンまたはＩＬ−２とのさらなる組み合わせである。
【０３１０】
ここに記載する抗体を、リツキサン(登録商標)(リツキシマブ)、ハーセプチン(登録商標)(トラスツズマブ)、ベキサール(登録商標)(トシツモマブ)、ゼヴァリン(登録商標)(イブリツモマブ)、キャンパス(登録商標)(アレムツズマブ)、Lymphocide(登録商標)(エプラツズマブ)、アバスチン(登録商標)(ベバシズマブ)およびタルセバ(登録商標)(エルロチニブ)などの抗新生物抗体と組み合わせ得る。ここに記載する抗体を、次の化学療法剤カンプトテシン(ＣＰＴ−１１)、５−フルオロウラシル(５−ＦＵ)、シスプラチン、ドキソルビシン、イリノテカン、パクリタキセル、ゲムシタビン、シスプラチン、パクリタキセル、カルボプラチン−パクリタキセル(タキソール)、ドキソルビシン、５−ｆｕまたはカンプトテシン＋ａｐｏ２ｌ／ＴＲＡＩＬ(6X combo))；プロテアソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブまたはＭＧ１３２)；Ｂｃｌ−２阻害剤(例えば、ＢＨ３Ｉ−２’(ｂｃｌ−ｘｌ阻害剤)、インドールアミンジオキシゲナーゼ−１(ＩＤＯ１)阻害剤(例えば、ＩＮＣＢ２４３６０)、ＡＴ−１０１(Ｒ−(−)−ゴシポール誘導体)、ＡＢＴ−２６３(小分子)、ＧＸ−１５−０７０(オバトクラックス)またはＭＣＬ−１(骨髄性白血病細胞分化タンパク質−１)アンタゴニスト)、ｉＡＰ(アポトーシスタンパク質阻害因子)アンタゴニスト(例えば、ｓｍａｃ７、ｓｍａｃ４、小分子ｓｍａｃ模倣体、合成ｓｍａｃペプチド(Fulda et al., Nat Med 2002;8:808-15参照)、ＩＳＩＳ２３７２２(ＬＹ２１８１３０８)またはＡＥＧ−３５１５６(ＧＥＭ−６４０))、ＨＤＡＣ(ヒストンデアセチラーゼ)阻害剤、抗ＣＤ２０抗体(例えば、リツキシマブ)、血管形成阻害剤(例えば、ベバシズマブ)、抗血管形成因子ターゲティングＶＥＧＦおよびＶＥＧＦＲ(例えば、アバスチン)、合成トリテルペノイド(Hyer et al., Cancer Research 2005;65:4799-808)、ｃ−ＦＬＩＰ(細胞ＦＬＩＣＥ阻害タンパク質)モジュレーター(例えば、ＰＰＡＲγ(ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ)の天然および合成リガンド)、５８０９３５４または５５６９１００)、キナーゼ阻害剤(例えば、ソラフェニブ)、トラスツズマブ、セツキシマブ、テムシロリムス、ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンおよびテムシロリムス、ボルテゾミブ、ＪＡＫ２阻害剤、ＨＳＰ９０阻害剤、ＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ阻害剤、レナリドミド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＡＰ阻害剤および／または遺伝毒性薬物の１以上とも組み合わせ得る。
【０３１１】
ここに記載する抗体および組み合わせ抗体治療を、１以上の抗増殖性細胞毒性剤と組み合わせてさらに使用し得る。抗増殖性細胞毒性剤として使用し得る化合物群は、次のものを含むが、これらに限定されない：
アルキル化剤(ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含むが、これらに限定されない)：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド(シトキサンＴＭ)  ホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレンメラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジンおよびテモゾロミド。
代謝拮抗剤(葉酸アンタゴニスト、ピリミジンアナログ、プリンアナログおよびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含むが、これらに限定されない)：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチンおよびゲムシタビン。
【０３１２】
ここに記載する抗体と組み合わせる適当な抗増殖剤は、タキサン、パクリタキセル(パクリタキセルはタキソールＴＭとして市販)、ドセタキセル、ディスコデルモライド(ＤＤＭ)、ジクチオスタチン(ＤＣＴ)、ペロルシドＡ、エポチロン、エポチロンＡ、エポチロンＢ、エポチロンＣ、エポチロンＤ、エポチロンＥ、エポチロンＦ、フラノエポチロンＤ、デスオキシエポチロンＢｌ、[１７]−デヒドロデスオキシエポチロンＢ、[１８]デヒドロデスオキシエポチロンＢ、Ｃ１２,１３−シクロプロピル−エポチロンＡ、Ｃ６−Ｃ８架橋エポチロンＡ、ｔｒａｎｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、ｃｉｓ−９,１０−デヒドロエポチロンＤ、１６−デスメチルエポチロンＢ、エポチロンＢ１０、ディスコデルモライド、パツピロン(ＥＰＯ−９０６)、ＫＯＳ−８６２、ＫＯＳ−１５８４、ＺＫ−ＥＰＯ、ＡＢＪ−７８９、ＸＡＡ２９６Ａ(ディスコデルモライド)、ＴＺＴ−１０２７(ソブリドチン)、ＩＬＸ−６５１(タシドチン塩酸塩)、ハリコンドリンＢ、エリブリンメシレート(Ｅ−７３８９)、ヘミアステリン(ＨＴＩ−２８６)、Ｅ−７９７４、クリプトフィシン、ＬＹ−３５５７０３、メイタンシノイド免疫複合体(ＤＭ−１)、ＭＫＣ−１、ＡＢＴ−７５１、Ｔ１−３８０６７、Ｔ−９００６０７、ＳＢ−７１５９９２(イスピネシブ)、ＳＢ−７４３９２１、ＭＫ−０７３１、ＳＴＡ−５３１２、エリュテロビン、１７ベータ−アセトキシ−２−エトキシ−６−オキソ−Ｂ−ｈｏｍｏ−エストラ−１,３,５(１０)−トリエン−３−オール、シクロストレプチン、イソラウリマライド、ラウリマライド、４−ｅｐｉ−７−デヒドロキシ−１４,１６−ジデチル−(＋)−ディスコデルモライドおよびクリプトチロン１に加えて、当分野で知られる他の微小管安定化剤を含むが、これらに限定されない。
【０３１３】
組み合わせ処置を同時にまたは逐次的に投与し得る。ある例において、組み合わせは固定用量組み合わせである。
【０３１４】
異ここに記載する抗体と組み合わせてまたはその前に常増殖細胞を静止状態にすることが望ましいとき、ホルモンおよびステロイド(合成アナログを含む)、例えば１７ａ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベストロール、テストステロン、プレドニゾン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、メチルプレドニゾロン、メチル−テストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、リュープロリド、フルタミド、トレミフェン、ゾラデックスＴＭも患者に投与し得る。ここに記載する方法または組成物を用いるとき、制吐剤などの腫瘍増殖または転移調節において臨床状況で使用される他の薬剤も、所望であれば投与してよい。
【０３１５】
化学療法剤を安全かつ有効に投与する方法は当業者に知られる。さらに、その投与は標準的文献に記載される。例えば、化学療法剤の多くの投与は、Physicians’ Desk Reference (PDR)、例えば, １９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, N. J. 07645-1742, USA)に記載され、引用によりその開示を本明細書に包含させる。
【０３１６】
化学療法剤および／または放射線治療を、当分野で周知の治療プロトコールに従い投与できる。化学療法剤および／または放射線治療の投与は、処置する疾患およびその疾患に対する化学療法剤および／または放射線治療の既知効果により変わり得ることは、当業者には明らかである。また、熟練した臨床医の知識により、治療プロトコール(例えば、投与量および投与時間)を、患者で観察される投与治療剤の効果の観点でおよび疾患に対して観察される投与治療剤の応答の観点で変え得る。
【０３１７】
本開示を、さらに限定すると解釈してはならない次の実施例によりさらに説明する。本明細書をとおして引用される全ての図および全ての引用文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許および公開特許出願の内容を引用により本明細書に包含させる。特に、ＰＣＴ出願WO09/045957、WO09/073533、WO09/073546、WO09/054863、PCT/US2013/072918、PCT/US15/61632および米国特許公開2011/0150892の開示を明示的に本明細書に包含させる。
【実施例】
【０３１８】
実施例１：ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体の非ＩｇＧ２ヒンジを有する同じ抗体に比して増強された内在化
ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗ＣＤ７３抗体１１Ｆ１１が、細胞ＣＤ７３阻害アッセイ、ＩｇＧ１またはＩｇＧ１.１(エフェクターレスＩｇＧ１)としての１１Ｆ１１抗体より強力であり、他のＩｇＧ１定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体より強力であることが観察された。少なくともこの観察に基づき、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体の、ＩｇＧ１ヒンジなどの非ＩｇＧ２ヒンジを有するものに比して増加した阻害活性は、抗体の内在化の増加によると仮説立てられた。この仮説を試験するために、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域またはその一部を有する抗ＣＤ７３抗体を内在化アッセイで試験した。
使用した抗体を表７に挙げ、これは、存在するならば、特定の変異を含む、各抗体の定常領域(全ヒト)のドメインの各々の帰属性を提供する。
【表７】
2020521751.tif 000013
１完全長重鎖の配列番号
２完全長軽鎖の配列番号
【０３１９】
抗体を、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞の重鎖および軽鎖発現により製造し、培養培地をトランスフェクション５日後に採取した。
ＦｃγＲに対する構築物の結合を測定した。ＩｇＧ１.１およびＩｇＧ２分子についてのｈＣＤ６４およびｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１結合データは、種々のＦｃについての予測値と一致した。ＩｇＧ１.１ｆは最も不活性なＦｃである。ＩｇＧ２およびＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓは、ＩｇＧ２に典型的ＦｃＲ結合を示した。予想通り、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−Ｇ１.１ｆのデータは、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ２より顕著に弱い結合を示したが、ＩｇＧ１.１ｆと比較して結合は増加した。
抗体のヒトＣＤ７３に対する親和性を測定して、定常領域の変化が影響するか否かを決定した。親和性を、次のとおり表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により測定した。ＣＤ７３結合動態および親和性を、Biacore T100装置(GE Healthcare)を２５℃で使用する、表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)により試験した。この実験は、固定化プロテインＡ表面に捕捉された抗体に対するｈＣＤ７３のＮ末端ドメイン(ヒトＣＤ７３の残基２６〜３３６からなる；命名Ｎ−ｈＣＤ７３)の結合を試験した。これらの実験のために、プロテインＡ(Ｐｉｅｒｃｅ)を、０.０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４、０.１５Ｍ  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.００５％ｖ／ｖ  ｔｗｅｅｎ  ２０のランニング緩衝液中、３０００〜４０００ＲＵの密度で、エタノールアミン遮断と共に、標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用してＣＭ５センサーチップ(GE Healthcare)のフローセル１〜４に固定化した。動態実験を、１０μl／分で３０秒接触時間を使用して、まず抗体(５〜１０μg／ml)をプロテインＡ表面に捕捉し、６００nM、２００nM、６６.７nM、２２.２nM、７.４nMおよび２.５nM  Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓとの結合を、３０μl／分の流速で１８０秒会合時間および３６０秒解離時間を使用した。動態実験のランニング緩衝液は１０mM  リン酸ナトリウム、１３０mM  塩化ナトリウム、０.０５％ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７.１であった。各サイクル後、流速３０μl／分の１０mM  グリシンｐＨ１.５の２回３０秒パルスを使用して、表面を再生した。センソグラムデータは、二重参照し、次いでBiacore T100評価ソフトウェアｖ２.０.４を使用して１：１ラングミュアモデルに適合させ、会合速度定数(ｋａ)、解離速度定常(ｋｄ)および平衡解離定数(ＫＤ)を決定した。
【０３２０】
結果を表８に示す。表は、種々の実験からのデータを集める。２セットの数字が示されている抗体について、各セットは、別の実験で得たデータに対応する。
【表８】
2020521751.tif 000014
結果は、抗体における異なる定常領域、例えば、ＣＤ７３.１０の存在が、抗体のヒトＣＤ７３に対する親和性を変えなかったことを示す。
【０３２１】
抗ＣＤ７３抗体の内在化を、二つの異なるアッセイで測定した。
Ａ. 高含量内在化アッセイ(２時間定期アッセイ)
抗ＣＤ７３抗体を使用して、抗体インキュベーション２時間後の細胞発現を評価することにより、Ｃａｌｕ６細胞における抗ＣＤ７３抗体依存的ＣＤ７３内在化を試験した。２０μlの完全培地(１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加Gibco RPMI Media 1640)中の細胞(２,０００細胞／ウェル)を、３８４  ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎプレートに播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で増殖させた。抗ＣＤ７３抗体を０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で連続希釈し、５μl／ウェルで細胞プレートに加えた。細胞を抗体と２時間、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度でインキュベートし、続いてＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。ホルムアルデヒド(最終ＰＢＳ中４％)を、次いで細胞プレートに２０μl／ウェルで加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。その後、全液体を吸引し、細胞を３０μl  ＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体(２.５μg／ウェルの抗ＣＤ７３  Ａｂ  ＣＤ７３.１０.ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ)を１５μg／ウェルで、固定細胞プレートに加えた。細胞を４℃で、一夜インキュベートした。翌日、プレートをＰＢＳ緩衝液で２回洗浄し、続いてＡｌｅｘａ−４８８ヤギ抗ヒトおよびＤＡＰＩを含む二次抗体を加え、１時間、室温で染色した。ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、プレートをArrayscan Vti(Cellomics, Pittsburgh, PA)で造影した。ＩＣ５０およびＹｍａｘを測定した。Ｙｍａｘを、内部最大としての１００nM用量の１１Ｆ１１との比較により決定した。全ての計算値を、１００％と設定したこの対照と比較した内在化のパーセンテージとして決定した。
結果を表９に提供する。
【表９】
2020521751.tif 000015
ＮＤ＝検出されず
ＮＡ＝適用せず
【０３２２】
結果は、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体が低ＥＣ５０および高Ｙｍａｘを有することを示す。
内在化動態試験を、内在化動態評価のために実施した。数細胞株を試験した：Ｈ２２２８細胞、ＨＣＣ１５細胞、Ｃａｌｕ６細胞およびＮＣＩ−Ｈ２０３０。２０μlの完全培地(１０％熱不活性化ウシ胎児血清添加Gibco RPMI Media 1640)中の細胞(２,０００細胞／ウェル)を384 BD Falconプレートに播種し、一夜、３７℃、５％ＣＯ２および９５％湿度で増殖させた。ＣＤ７３抗体を０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で１０μg／mlに希釈し、５μl／ウェルを細胞プレートに添加した。細胞を、抗体と０〜２時間タイムコースで３７℃でインキュベートし、続いてＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した。細胞をその後ホルムアルデヒド(最終ＰＢＳ中４％)で室温で１０分間固定し、次いで３０μl  ＰＢＳで１回洗浄した。検出抗体(２.５μg／ウェル抗ＣＤ７３  Ａｂ  ＣＤ７３.１０.ＩｇＧ２Ｃ２１９Ｓ)を０.２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ緩衝液で希釈し、１５μl／ウェルで固定細胞プレートに加えた。プレートを、４℃で一夜インキュベートした。翌日、ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄後、二次抗体Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗ヒトとＤＡＰＩを加えた。細胞を６０分間、室温で染色し、３回洗浄後、Arrayscan Vti(Cellomics, Pittsburgh, PA)を使用して画像を取得した。結果を図１Ａ〜Ｊおよび表１０および１１に提供する。表１０の値は、図１Ａ〜Ｊに示すデータに由来する。
【表１０】
2020521751.tif 000016
【０３２３】
【表１１】
2020521751.tif 000017
結果は、１１Ｆ１１(ＩｇＧ２抗体)が数分以内に内在化し、３０分でプラトーに達し、一方６Ｅ１１(ＩｇＧ１抗体)はよりゆっくり内在化し、約１時間でプラトーに達することを示す(図１Ａ〜Ｊ)。同様に、ＩｇＧ１定常領域を有する１１Ｆ１１は、ＩｇＧ２定常領域を有する１１Ｆ１１よりゆっくり内在化した。この傾向は、数細胞株で観察された(表１０および１１ならびに図１Ａ〜ＢＪ)。
【０３２４】
Ｂ. フローサイトメトリーにより測定した内在化
ＣＤ７３の抗ＣＤ７３抗体介在内在化を、フローサイトメトリーによっても試験した。示される細胞を、１０μg／mLの示される抗体と、３０分間氷上でインキュベートし、数回洗浄し、示される時間３７℃に移した。細胞を、示されるインキュベーション時間後、同じ時間に取得した。細胞を再び一次抗体で(最初のインキュベーションに使用したのと同じ抗体)、続いて抗ヒト二次抗体で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによりＣＤ７３の発現についてアッセイした。
図１Ｅおよび表１１に示す結果は、上記内在化アッセイで得られたものと一致し、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１を有する全抗体が迅速かつ完全な内在化を誘導することを示す。ＣＤ７３レベルは、洗い流した後、２２時間後も低いままであり、内在化が持続性であることを示す。
図１Ｆおよび表１１に示す類似結果は、抗体がインキュベーション時間の間培養液に維持された(洗い流しなし)ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株で得られた。同様に、これらのデータは、迅速かつ顕著な内在化および内因性ＣＤ７３の下方制御の維持を示す。
【０３２５】
内在化アッセイを、ヒトＳＮＵ−Ｃ１(結腸癌細胞株)およびＮＣＩ−Ｈ１４３７(非小細胞肺癌細胞株)細胞でも実施した。図１ＩおよびＪに示す結果も、迅速な内在化を示し、最大レベルに５時間以内に達し、ＳＮＵ−Ｃ１でＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆの最大内在化レベルは約５０％およびＮＣＩ−Ｈ１４３７細胞で６０％であった。図１ＧおよびＨは、Ｃａｌｕ６およびＮＣＩ−Ｈ２９２細胞におけるＣＤ７３.４.ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆの内在化の類似動態を示す。内在化ＣＤ７３の％を示すグラフについて、この数値は次のとおり得た。
【数１】
2020521751.tif 000018
(ここで、各抗体について、ＭＦＩｔ＝ｘはある時点のＭＦＩであり、ＭＦＩｔ＝０はｔ＝０での最大蛍光であり、ＭＦＩ背景は二次ＡｂのみのＭＦＩである。)
【０３２６】
【表１２】
2020521751.tif 000019
それ故に、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体は、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体に比して、速くかつ大きな程度で内在化する。
【０３２７】
実施例２：ＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体のＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体に比して増強されたアゴニスト活性
この実施例は、ＩｇＧ２ヒンジを含む抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体に比して、Ｔ細胞からのＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する能力が増加していることを示す。
上記ＣＨＯ−ＯＫＴ３および３Ａ９アッセイで、ＩｇＧ２定常領域を有するハイブリドーマ由来抗体が重鎖定常領域をＩｇＧ１またはエフェクターレスＩｇＧ１(ＩｇＧ１.１)に転換した同じ抗体より強力にサイトカイン分泌を刺激することが観察された。それ故に、ＩｇＧ２定常領域またはヒンジの効果を、これらのアッセイにより抗ＧＩＴＲ抗体でさらに試験した。
抗ヒトＧＩＴＲ抗体の重鎖可変領域(配列番号７５)を、表１３に示す重鎖定常領域と結合させた。抗ＧＩＴＲ抗体の軽鎖は配列番号７７を含んだ。表１３は定常領域の各ドメインの帰属性を示す。
【表１３】
2020521751.tif 000020
＊完全長重鎖定常領域の配列番号
【０３２８】
まず、これらのＧＩＴＲ抗体の結合親和性を、ＩｇＧ１ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体のものと比較した。可溶性ＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性を、次のとおりＢｉａｃｏｒｅで決定した。抗ＧＩＴＲ抗体をヒトカッパ被覆チップ(約５KRU; Southernbiotech cat#2060-01)に捕捉し、組み換えヒトＧＩＴＲ(rHGITR/Fc: R&#38;D systems, CAT#689-GR)を５００nM、２５０nM、１２５nM、６２nMおよび３１nM濃度でチップを流して横断させた。ｍＡｂ／体積の捕捉濃度は２〜４０μg／mL(１０μL／分で５μL)であった。抗原会合時間は、５分間、１５μL／分であり、抗原解離時間は６分であり、５０mM  ＨＣｌ／５０mM  ＮａＯＨ(１００μL／分で各１２μL)で再生を行った。
図２に示す結果は、全３つのＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体が、活性化Ｔ細胞にＩｇＧ１またはＩｇＧ１.１定常領域を有するＧＩＴＲ抗体と類似の親和性を有することを示す。
【０３２９】
次に、ＩｇＧ１定常領域またはＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するＧＩＴＲ抗体の能力を、抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)発現ＣＨＯ細胞で刺激されたヒトドナーＴ細胞からＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発する能力について試験した。ＣＨＯ細胞は、低レベルのＯＫＴ３を発現して、抗ＧＩＴＲ抗体によるアゴニズムの観察が可能となるために、最適以下の刺激を促進した。ドナーからのＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＫＴ３発現ＣＨＯ細胞および抗ＧＩＴＲ抗体で刺激し、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を測定した。実験を次のとおり行った。ＣＤ４＋Ｔ細胞での実験について、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、製造業者のプロトコールに従いRosetteSepヒトＣＤ４＋Ｔ細胞富化カクテル(StemCell Technology #15062)を用いてヒトＰＢＭＣから得た。抗ＣＤ３ｓｃＦｖ(ＯＫＴ３)発現ＣＨＯ細胞(ＣＨＯ−ＯＫＴ３)をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、５０ＫＲａｄ線量での照射に付した。細胞を取得し、培養培地(１０％ウシ胎児血清、２mM  Ｌ−グルタミン、５５nM  β−メルカプトエタノール、１mM  ピルビン酸ナトリウムおよび１００Ｕ／mLペニシリン／ストレプトマイシン添加ＲＰＭＩ−１６４０)に２.５×１０５／mLで再懸濁した。ウェルあたり２.５×１０４  ＣＨＯ−ＯＫＴ３細胞および１×１０５  Ｔ細胞を、９６ウェルＴＣグレード平底プレート(Costar)に播種した。細胞を、４０μg／mLで出発するＧＩＴＲ抗体の８点、４倍タイトレーションでインキュベートした。無関係なｈＩｇＧ１を、アイソタイプ対照として４０μg／mLで加えた。細胞のみのサンプルを、何ら処理しないベースライン活性を示すために包含させた。各サンプルからの上清を、ＩＬ−２測定のために３日目(ＣＤ４＋Ｔ細胞でのアッセイのためのみ)(BD opt EIA Human IL- 2 ELISA kit; BD Bioscience#555190)およびＩＦＮ−γ測定のために３日目(BD optEIA human IFN-g ELISA Kit; BD Bioscience#555142)に取得した。
図３ＡおよびＢに示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジ／ＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有する抗体(抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１)は、ＩｇＧ１定常領域を有する抗体(抗ＧＩＴＲ.ｇ１)より高い程度でＴ細胞からＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌を誘発した。類似する結果が、これらの定常ドメインのエフェクターレスバージョンで得られた(図３Ｃ)。
【０３３０】
ＩｇＧ２ヒンジを含む抗ＧＩＴＲ抗体でのＴ細胞活性化の増加をさらに確認するために、異なる実験形態でのＩＬ−２分泌を試験した。この実験において、ＧＩＴＲ抗体が３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞(ヒトＧＩＴＲを異所性に発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株)からＩＬ−２分泌を誘発する能力を次のとおり試験した。ヒトＧＩＴＲを異所性に発現するマウスＴ細胞ハイブリドーマ３Ａ９細胞株(３Ａ９−ｈＧＩＴＲ)を、抗ＣＤ３モノクローナル抗体被覆プレートで、示される抗体の増加量の存在下、培養した。５×１０４  ３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞を、１μg／ml抗ＣＤ３抗体(Clone 145-2C11; BD Biosciences)で被覆したプレートで培養し、示される濃度の抗体で７時間処理した。
図４に示すとおり、ＩｇＧ２ヒンジを有する全抗体(抗ＧＩＴＲ.ｇ２、抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ２.ｇ１.ｆ)は、ＩｇＧ１定常領域含有対応物(抗ＧＩＴＲ.ｇ１ｆおよび抗ＧＩＴＲ.ｇ１.１ｆ)より高い程度で３Ａ９−ｈＧＩＴＲ細胞からＩＬ−２分泌を誘発した。
これらの結果は、まとめて、抗ＩｇＧ２ヒンジおよびｇ１またはｇ１.１定常領域を有するＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体より強力であることを示唆する。
【０３３１】
実施例３：抗体／抗原複合体のサイズに対する種々のヒンジ／Ｆｃ組み合わせの影響
上記実施例に示されるとおり、ＩｇＧ２ヒンジを有する抗ＣＤ７３抗体はＣＤ７３細胞活性の良好な阻害剤であり、ＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体より良好に内在化し、抗ＩｇＧ２ヒンジを有するＧＩＴＲ抗体はＩｇＧ１ヒンジを有する同じ抗体より強力なアゴニストである。この観察およびＩｇＧ２ヒンジがＩｇＧ１ヒンジより硬いとの事実に基づき、ＩｇＧ１ヒンジを有する抗体に比して大型の複合体が、抗原とＩｇＧ２ヒンジを有する抗体の間で形成されると仮説立てられた。次の実験は、この仮説を分析するために実施した。
溶液中のＣＤ７３／抗体複合体の構造およびオリゴマー状態をＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳにより試験した。これらの試験について、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域を含む抗体を、Ｃ末端ポリヒスチジンタグ(ヒト−ＣＤ７３のアミノ酸残基２６〜５４６、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと命名)またはヒト−ＣＤ７３のＮ末端ドメインに対応するフラグメント(アミノ酸残基２６〜３３６、Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓと命名)を含むヒト−ＣＤ７３の完全長細胞外ドメインを含む組み換えタンパク質と、種々のモル濃度比で混合した。
ＣＤ７３／抗体複合体のオリゴマー状態を、インライン多角度光散乱検出器と連結したサイズ排除クロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＭＡＬＳ)で試験した。定組成分離を、Prominence Shimadzu UFLCに連結したShodex PROTEIN KW-803カラムで、０.０２％ナトリウムアジド(０.１μm濾過)を含む、２００mM  Ｋ２ＨＰＯ４、１５０mM  ＮａＣｌ、ｐＨ６.８含有緩衝液で、０.５mL／分で流して実施した。サンプルをSIL-20AC Prominence Shimadzuオートサンプラーを使用してカラムに注入し、データを、Prominence SPD-20ADダイオードアレイＵＶ／ｖｉｓ分光光度計、続いてWyatt miniDAWNTM TREOS Multi-Angle Light Scattering Detector、次いでWyatt Optilab T-rEX Refractive Index Detectorの順番に連結した３つのオンライン検出器から得た。データを集め、Astra(Wyatt)およびLabsolutions(Shimadzu)ソフトウェアを使用して解析した。
【０３３２】
動的光散乱法(ＤＬＳ)試験を、３８４ウェルプレートで、Wyatt DynaProプレートリーダーで２５℃で実施した。実験パラメータは、測定あたり５秒の２０収集であり、測定値をクアドロプリケートで記録し、平均および標準偏差を報告した。強度自動補正機能を、Dynamicsソフトウェア(Wyatt Technologies)の「規則化」アルゴリズムを使用して適合させた。
ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳの要約を図６および図７に提供する。抗体単独の分析は、各抗体について、単量体モノクローナル抗体に典型的な保持時間(約１６〜１７分)、質量(１４０〜１５０kDa)および流体力学半径(５.０〜５.４nm)を示す。ｈＣＤ７３−ｈｉｓタンパク質のデータは、溶液中の予測二量体構造の形をとるタンパク質と一致し、特に、ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータ(１２０kDa)から決定された質量はＣＤ７３−ｈｉｓ二量体(１１７kDa)について予測されたものに一致し、ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単量体(５８.５kDa)について予測されたものと不一致である。Ｎ−ｈＣＤ７３のデータは、溶液中で単量体である組み換えＮ−ドメインタンパク質に一致し(予測単量体質量＝３５.０kDaと比較して、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ測定質量＝３８kDa)、これは、タンパク質の二量体化を担う完全長ＣＤ７３細胞外ドメインの領域が、Ｎ−ドメイン残基の寄与なくＣ末端ドメイン内に含まれることから、予測される。
ある抗体とＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓの等モル混合物は、ＳＥＣにより抗体またはＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独より短い保持時間で単独種としておよびＤＬＳにより大型流体力学半径(Ｒｈ)で溶出され、これは、複合体の形成と一致する。ＭＡＬＳデータは、これらの複合体の約２１０kDaの質量を示す。これは、ある抗体の２つのＦａｂドメインの各々に１つのＮ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ分子が結合し、１：２抗体：Ｎ−ｈＣＤ７３−ｈｉｓ複合体を形成されるのと一致する。
【０３３３】
抗ＣＤ７３抗体とｈＣＤ７３−ｈｉｓ二量体の混合物のＳＥＣ−ＭＡＬＳデータは、混合物がｈＣＤ７３−ｈｉｓまたは抗体単独より速く溶出することを示し、複合体が形成されたことを示唆する。同じ可変領域であるが、異なる定常ドメインを含むｍＡｂのデータとの比較は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂ(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ)の複合体の溶出時間が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１.１ｆ定常ドメインを含むｍＡｂの複合体のものより速いことを示す。さらに、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂの複合体のＭＡＬＳ決定質量は、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体より大きい。ＤＬＳデータは、さらに、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むｍＡｂの複合体の流体力学半径が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ１定常ドメインを含むｍＡｂの複合体より大きいことを示す。例えば、３つの異なる定常領域(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ、ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆまたはＩｇＧ１.１ｆ)を有するＣＤ７３.４のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータを図５に示す。ここで、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２定常ドメインを含むＣＤ７３.４の複合体が、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆの複合体と比較して、短い保持時間(図５Ａ)、大型流体力学半径(図５Ｂ)および大型ＭＡＬＳ決定質量(図５Ｃ)を有することが見られ得る。ＭＡＬＳ質量に基づき、ｈＣＤ７３−ｈｉｓと抗体の複合体の構造および化学量論の図式モデルが図５Ｄに示され、そこで、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆを含む複合体は、主に小型の２：２(ピーク１＝約５５０kDa)または４：４  ｍＡｂ／ＣＤ７３二量体複合体(ピーク２＝約１３００kDa)を形成し、一方ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとはるかに大型の複合体(＞３０００kDa)を形成し、その厳密な構造および化学量論は、確信をもってモデル化はできなかった。
まとめて、ＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとＩｇＧ２ヒンジ領域(ＩｇＧ２−Ｃ２１９ＳまたはＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ)を含むｍＡｂの間で、ＩｇＧ１ヒンジ領域(ＩｇＧ１.１ｆ)を含むものと比較して、大型の複合体が形成されることを示す。
【０３３４】
実施例４：ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１は抗体介在ＣＤ７３内在化をさらに改善する
さらなる内在化アッセイをＣａｌｕ６およびＨ２９２細胞で実施し、内在化におけるアイソタイプの役割をさらに検討した。内在化アッセイを実施例１Ａおよび１Ｂ(抗体の洗い流し工程がないフローサイトメトリープロトコール)に記載のとおり実施し、表１４に示す種々のハイブリッドアイソタイプの抗体を、インキュベーション時間中、１０μg／mLで培養に維持した。フローサイトメトリー実験について、実施例１Ｂの方法を、９６ウェルプレート(４８ウェルプレートではない)および５０,０００細胞／ウェルのハイスループット分析に適合させた。
【０３３５】
【表１４】
2020521751.tif 000021
【０３３６】
ＦｃγＲ結合は各構築物について予想通りであることが示され、すなわち、ＦｃγＲ結合は下部ヒンジ／ＣＨ２領域により駆動される。
結果を図８Ａ、ＢおよびＣおよび表１５および１６に示す。表１５に示すデータは、実施例１Ｂに記載したのと同じプロトコールを使用して作成した(抗体の洗い流しなし)。表１６に示すデータは、実施例１Ａに記載したのと同じプロトコールを使用して作成した。
【表１５】
2020521751.tif 000022
【０３３７】
【表１６】
2020521751.tif 000023
【０３３８】
図８Ａ〜Ｃおよび表１５および１６は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体が、ＣＤ７３の内在化の駆動に最も効率的であり、一方ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は図における下の曲線に対応し、すなわち、内在化度が低い。さらに、ＩｇＧ２からのヒンジのみを有する抗体は、ヒトＩｇＧ１ヒンジと比較して、内在化が増加している。それ故に、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプを有する抗体に比して優れた内在化特性を有する。
それ故に、抗ＣＤ７３抗体ｍＡｂ−ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２ＣＳ−ＩｇＧ１.１ｆ(Ｃ２１９Ｓ置換を有するＩｇＧ２ヒンジとＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインを有する)は、試験細胞株に依存して迅速な内在化を誘発する。内在化のＴ１／２は、数分から１時間足らずの範囲である。試験した大部分の細胞株は、１０分足らずのＴ１／２を有する。ほぼ完全な内在化が一部細胞株で誘発され、試験した大部分は、表面ＣＤ７３発現の少なくとも５０％減少を示し、これは、一般に５時間までで、一部でははるかに短い時間で最大レベルに到達した。
【０３３９】
実施例５：ＩｇＧ２  ＣＨ１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＧＩＴＲ  Ａｂ誘発ＩＬ−２分泌を増強する
この実施例は、ＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインが、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する抗体に比して、抗ＧＩＴＲ抗体誘発Ｔ細胞活性を増強することを示す。
実施例４に使用したのと同じ修飾重鎖定常領域を、(実施例２の)抗ＧＩＴＲ抗体の可変領域と結合させた。ドナーＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＫＴ３−ｓｃＦｖ発現ＣＨＯ細胞および種々の抗ＧＩＴＲ抗体とインキュベートし、分泌ＩＬ−２レベルを測定した。これを、実施例２に記載のとおりに実施した。
図９に示す結果は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジに加えてＩｇＧ２アイソタイプのＣＨ１ドメインを有する全抗ＧＩＴＲ抗体が、ＩｇＧ１ヒンジおよびＣＨ１を有するものよりＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−２分泌に有効であることを示す。
それ故に、この実施例は、アゴニスト抗ＧＩＴＲ抗体におけるＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２  ＣＨ１ドメインの存在が、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよび／またはＣＨ１ドメインを有しない同じ抗体に比して、抗体のアゴニスト活性をさらに増強することを示す。ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジおよびＣＨ１ドメイン両者を有する抗体は、ＩｇＧ２アイソタイプのヒンジを有するが、ＣＨ１は違う抗体に比して強いアゴニスト効果を有し、さらに、ＩｇＧ２からのＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプからのＣＨ１ドメインを有する抗体より強いアゴニスト活性を有することを示す。ＩｇＧ２からのヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインを有する抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのＣＨ１およびヒンジを有する抗体より強いアゴニスト活性を有する。
【０３４０】
実施例６：抗体介在ＣＤ７３内在化改善におけるＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジのあるアミノ酸残基の関連
表１７に示す重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体(ＣＤ７３.４)を調製し、上記のとおり抗体介在ＣＤ７３内在化アッセイにおいて試験した。
【表１７】
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【０３４１】
図１０に示す結果は、ＣＤ７３内在化の状況で次の情報を提供する：
●ＣＨ２ドメインは、次で示されるとおり、影響を有しないように見える。
〇ａ)内在化能の極めて僅かな差異が、形式「ＡＹ」(ＩｇＧ２ヒンジERKCCVECPPCPAPPVAG(配列番号８)を有する)を有する修飾重鎖定常領域を含む抗体と形式「ＫＨ」(ERKCCVECPPCPAPELLGG(配列番号２２)のもので観察される(セット５、６および７)；
〇ｂ)ＣＨ２交換は、野生型Ｇ１またはＧ２と同等である(セット５および６)；および
〇ｃ)残基２３７は内在化に影響しない：ＩｇＧ２ヒンジへの「Ｇ」残基の付加もＩｇＧ１ヒンジへのＣ末端「Ｇ」の欠失も内在化に影響しなかった(セット９)。
【０３４２】
これは、ＣＨ２ドメインが内在化に影響しないことを示唆する(すなわち、ＣＨ２ドメインはＩｇＧ１またはＩｇＧ２由来であり得る)。
●ＩｇＧ１におけるセット３に示されるＣＨ１領域(KRGEGSSNLF;KRGEGS;SNLF;ITNDRTPRおよびSNLFPR)のＩｇＧ２への交換はほとんど利益をもたらさず、すなわち、内在化はＩｇＧ１に類似したままである(セット３参照)；
●ＩｇＧ２におけるセット４に示されるＣＨ１領域(RKEGSGNSFL;RKEGSG;NSFL;TIDNTRRPおよびNSFLRP)のＩｇＧ１のものへの交換の影響は可変である：NSFLの交換は影響がないが、他の２領域(RKEGSGおよびRP)は関係する(セット４参照)。セット３および４の結果に基づき、ＣＨ１領域とヒンジの間に相互作用があり、RKEGSGおよびRP領域がNSFL領域よりも重要であるように見える；
●ヒンジ領域は内在化に影響し、すなわち、ＩｇＧ２のヒンジは、ＩｇＧ１のヒンジより良好な内在化を提供する(セット７および８参照)。さらに、欠失を有するＩｇＧ１(Ｇ１−デルタ−ヒンジ)は、ＩｇＧ１より内在化を改善する。欠失を有するＩｇＧ２(Ｇ２−デルタ−ヒンジ)は、ＩｇＧ２ヒンジと類似する内在化レベルを提供する。これは、ヒンジ領域が内在化に影響し、この効果はＩｇＧ２  ＣＨ１により増強されることを示す(Ｇ２−Ｇ１−Ｇ２−Ｇ２−ＡＹはＧ１−Ｇ２−Ｇ１−Ｇ１−ＡＹと同等である)；
●ＩｇＧ２.４(Ｃ２２０Ｓ)は、ＩｇＧ２.３(Ｃ２１９Ｓ)に比して類似したまたは減少した内在化を示す。ＩｇＧ２.３／４(Ｃ２１９Ｓ／Ｃ２２０Ｓ)は、ＩｇＧ２.３またはＩｇＧ２.４単独と比較して、内在化がはるかに減少する(セット１０参照)。これは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＣ２１９Ｓを有する抗体の内在化が、Ｃ２２０Ｓを有するＩｇＧ２ヒンジのものとほぼ同じであり、両者ともＣ２１９ＳおよびＣ２２０Ｓ両者を有するＩｇＧ２ヒンジよりはるかに良好であることを示唆する；
●ＩｇＧ２.５(Ｃ１３１Ｓ変異)は、Ｃ１３１を有する構築物と比較して減少した内在化を有する(セット１、６および７参照)。
【０３４３】
それ故に、これらの結果は、ＣＨ１ドメインおよびヒンジが両者とも抗体介在ＣＤ７３内在化に関連し、これらのドメインからのＩｇＧ２配列を有する抗体は、ＩｇＧ１からのこれらの領域を有する抗体に比して、良好な効率で内在化することを示す。
【０３４４】
実施例７：ＩｇＧ２ヒンジを有する抗体および／またはＣＨ１ドメインは高分子量複合体を形成する
表１４に示す重鎖定常領域を有するＣＤ７３.４抗体を、実施例３に記載のとおりＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳ実験により高分子量複合体形成について試験した。
本試験の１６抗体中２つは先に試験された：ＣＤ７３.４−ＩｇＧ１.１ｆ、ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ(ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２.３とも称される)およびＣＤ７３.４−ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ−ＩｇＧ１.１ｆ(ＣＤ７３.４−ＩｇＧ２.３Ｇ１.１ｆ−ＫＨとも称される)。抗体単独のＳＥＣ−ＭＡＬＳおよびＤＬＳデータは、単量体モノクローナル抗体に典型的な保持時間、質量および流体力学半径を各抗体について示した。各抗体(５.５μM)とｈＣＤ７３−ｈｉｓ(５.５μM)の等モル複合体は、全複合体について抗体またはｈＣＤ７３−ｈｉｓ単独と比較して遅い保持時間を示し、複合体の形成が示される。１６複合体の各々からのＳＥＣクロマトグラムデータの重層を図１１Ａに示す。クロマトグラムデータを、４つの異なるピークに分割でき、これは図１１Ｂに示される。ピーク１は最大種を含み、ＭＡＬＳ決定質量は４：４  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体より大きい質量当量の複合体を示唆する。ピーク２は、約２：２  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体の複合体が示唆されるＭＡＬＳ決定質量の種を含む。ピーク３は、約１：１  ｈＣＤ７３−ｈｉｓ：ｍＡｂ複合体が示唆される低シグナルおよびＭＡＬＳ決定質量の微量種を含む。ピーク４はｍＡｂ単独の溶出に対応し、ＭＡＬＳ決定質量は遊離抗体と一致する。各種の相対量を定量するために、各シグナルの４個のピークをピーク１(＜１２.９分)、ピーク２(１２.９〜１５.１分)、ピーク３(１５.１〜１６.７分)、ピーク４(１６.７〜１９.３分)として積分した。積分はまた何らかの低分子量種を説明するピーク５(＞１９.３分)と称されるさらなる積分範囲も含んだが、これは無視できることが判明した(全複合体の＜３.５％)。この積分からの各種のパーセンテージを表１８に要約する。全複合体ｃは、類似する小さなパーセンテージのピーク３(約６〜９％)を含んだが、他のピークの量は可変であった。最も顕著なのは、ｈＣＤ７３−ｈｉｓとｈＩｇＧ１からのＣＨ１ドメインを含む抗体の全複合体が、小型複合体(ピーク２)のパーセンテージが顕著に大きく、ｈＩｇＧ２からのＣＨ１ドメインを有するものは、大型複合体(ピーク１)のパーセンテージが大きいことであった(表１８および図１１Ｃ)。これは、高次複合体形成におけるヒンジ領域だけでなく、ＣＨ１ドメインの重要性も示唆する。
【０３４５】
【表１８】
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【０３４６】
実施例８：操作された定常ドメインを有する抗体に対するＦｃ受容体結合
この実施例は、ＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジを含む修飾重鎖定常領域を有する抗体が、ＩｇＧ１のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むとき、ＦｃγＲに結合することを示す。
可変ドメインによる抗原結合に加えて、抗体は、定常ドメインとの相互作用を介してＦｃガンマ受容体(ＦｃｇＲ)と結合できる。これらの相互作用は、抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)および抗体依存性細胞貪食(ＡＤＣＰ)などのエフェクター機能に介在する。エフェクター機能活性はＩｇＧ１アイソタイプで高いが、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４についてはこれらのアイソタイプのＦｃｇＲに対する低親和性により極めて低いか、またはない。さらに、ＩｇＧ１のエフェクター機能は定常領域内のＦｃｇＲ親和性および選択性を変えるためのアミノ酸残基変異により修飾され得る。
抗体のＦｃガンマ受容体(ＦｃγＲまたはＦｃｇＲ)への結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)およびFortebio Biolayer Interferometry(ＢＬＩ)を含むバイオセンサーテクノロジーを使用して試験した。ＳＰ試験を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００装置(GE Healthcare)により２５℃で実施した。マウス抗６×Ｈｉｓ抗体からのＦａｂフラグメントを、約３０００ＲＵの密度までＥＤＣ／ＮＨＳを使用してＣＭ５センサーチップに固定化した。種々のｈｉｓタグ付ＦｃｇＲ(７μg／ml)を、１０μl／分で３０秒の接触時間を使用してＣ末端ｈｉｓタグを介して捕捉し、１.０μM抗体の結合を、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１のランニング緩衝液で評価した。これらの実験に使用したＦｃｇＲは、ＣＤ６４(ＦｃｇＲＩ)、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｈ１３１)、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｒ１３１)、ＣＤ３２ｂ(ＦｃｇＲIIｂ)、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｖ１５８)、ＣＤ１６ｂ−ＮＡ１(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ１)およびＣＤ１６Ｂ−ＮＡ２(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ２)を含んだ。ＢＬＩ実験をFortebio Octet RED装置(Pall、Fortebio)で２５℃で、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)、ｐＨ７.１中実施した。抗体を、プロテインＡ被覆センサーの非希釈発現上清から捕捉し、続いて１μM  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８または０.１μM  ｈＣＤ６４検体を結合させた。
【０３４７】
まず、種々の標的への、置換２６７Ｅ(ＳＥ)およびＳ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ(ＳＥＬＦ)を含む修飾ＩｇＧ１  ＦｃドメインならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２と称する変異Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７Ｄ、Ｅ２３３Ｄの種々の組み合わせを含む抗体の結合を行った。これらの抗体の結合をＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲにより試験し、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３(ＩｇＧ２−Ｃ２１９Ｓ)およびＩｇＧ４.１(ＩｇＧ４−Ｓ２２８Ｐ)抗体、ならびに全ＦｃｇＲへの結合が減少するように操作されているＩｇＧ１.１ｆ抗体と比較した。図１２に示す結果は、ＳＥおよびＳＥＬＦについてＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂ結合増加ならびにＶ４、Ｖ７、Ｖ８、Ｖ９およびＶ１２変異体のＣＤ３２ａ−Ｈ１３１およびＣＤ３２ａ−Ｒ１３１を超えるＣＤ３２ｂへの選択性増加を含む、ＩｇＧ１ｆ、ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ４.１および変異ＩｇＧ１抗体の予測ＦｃｇＲ結合性質が示される、図１２。
次のセットの構築物を使用して、そうしなければエフェクター機能陰性であるＩｇＧ２アイソタイプにエフェクター機能を操作した。この試験のために、上記変異を、ＩｇＧ２.３定常領域またはＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹと称されるＩｇＧ２.３／ＩｇＧ１ｆハイブリッドに導入した、表１９。抗体を上清で小規模で発現させ、Fortebio Octet BioLayer Interferometryバイオセンサーテクノロジーを使用してＦｃｇＲへの結合について試験した。抗体が上清に低濃度で存在するため、実験を、プロテインＡ被覆センサーを使用して上清から抗体を捕捉し、続いて溶液中ＦｃｇＲ検体を結合させて実施した。野生型ＩｇＧ１、ＳＥ、Ｐ２３８Ｄ、Ｖ４およびＶ１２抗体を含む精製および上清対照ＩｇＧ１ｆも比較のために包含させ、これら対照抗体の各々は予測ＦｃｇＲ結合性質を示した、図１３。ＩｇＧ２.３抗体も予測結合プロファイルを示し、ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１にのみ認識できる結合であった。しかしながら、ＩｇＧ２.３へのＳ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤまたはＥ２３３Ｄ変異を導入するための全変異は、対応する操作されたＩｇＧ１  ｍＡｂのＦｃｇＲ親和性再現に失敗した、図１３。対照的に、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ構築物は、ＩｇＧ２.３のＣＨ１およびヒンジ領域を保持しながら、野生型ＩｇＧ１のＦｃｇＲ結合性質を完全に保つことができた。さらに、Ｓ２６７Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２３８Ｄ、Ｐ２７１Ｇ、Ｈ２６８Ｄ、Ａ３３０Ｒ、Ｇ２３７ＤおよびＥ２３３Ｄを含む全ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ変異体は、同じ変異を有するＩｇＧ１バージョンｍＡｂと同等なＦｃｇＲ結合性質を示した、図１３。これは、野生型または変異体ＩｇＧ１のエフェクター機能と組み合わせてＩｇＧ２のＣＨ１およびヒンジ領域を有する抗体の操作成功を示す。
【０３４８】
【表１９】
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【０３４９】
この操作戦略を、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｓ２６７Ｅ(ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)に成形された他の抗体、ならびにＩｇＧ２−Ｂ形態バリアント(ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７)および他のＩｇＧ１およびＩｇＧ２定常ドメインの種々の組み合わせを含むハイブリッド抗体の産生およびBiacore SPRテクノロジーを使用する抗ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ｈｉｓタグ付ＦｃｇＲへのこれらの抗体の結合の試験によりさらに探索した。Ｏｃｔｅｔ上清データに一致して、ＳＰＲデータは、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体が、Ａ形態ＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.３)のＣＨ１およびヒンジ領域を含むにも関わらず、それぞれＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ１ｆ−Ｓ２６７Ｅと同等のＦｃｇＲ結合性質を有したことを示した(図１４ＡおよびＢおよび表２０)。類似データは、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７抗体を使用しても得られ、ＩｇＧ１ｆまたは修飾ＩｇＧ１ｆ様エフェクター機能を有するＢ形態ＩｇＧ２抗体(ＩｇＧ２.５と名付けたＣ１３１Ｓ変異含有)の操作の成功を示した。ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ、ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹまたはＩｇＧ２.５Ｇ１−ＡＹ−Ｖ２７定常領域を有するが、種々の可変領域を有する他の数抗体からのデータは、この操作戦略が可変ドメインと無関係に他の抗体に適用可能であることを示す(図１４ＡおよびＢおよび表２０)。ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性質を示す他の構築物はＩｇＧ１−Ｇ２.３Ｇ１−ＡＹおよびＩｇＧ１デルタＴＨＴであり、一方ＩｇＧ２.３Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.５Ｇ１−ＫＨ、ＩｇＧ２.３＋ＴＨＴ、ＩｇＧ２.５＋ＴＨＴおよびＩｇＧ２.３＋ＧＧＧ構築物を含む数修飾定常領域構築物は、ＩｇＧ１ｆ様ＦｃｇＲ結合性質を保持できなかった、(図１４ＡおよびＢおよび表２０)。
【０３５０】
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０３５１】
これらのデータは、合わせて、ヒンジ領域における保存的ＣＰＰＣＰＡＰモチーフのすぐＣ末端の配列がＦｃｇＲ介在エフェクター機能に寄与し、一方抗体のＣＨ１およびヒンジの上部部分は、ＩｇＧ２または修飾ＩｇＧ２配列と置き換えることができ、ＩｇＧ１および修飾ＩｇＧ１のエフェクター機能と、ＩｇＧ２  ＣＨ１および／またはヒンジ領域を含む抗体の優れた内在化またはシグナル伝達性質を組み合わせる可能性を示す。
【０３５２】
実施例９：ＧＩＴＲアゴニストＡｂ内在化はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体で増強される
ＧＩＴＲ発現を誘発するために、細胞を７２時間、３７℃で２０ng／ml抗ＣＤ３＋１０００ng／ml  ＣＤ２８とインキュベートした。Ｔ細胞活性化の別法として、大バッチの活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、３段階培養プロトコールにより調製した。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、１μg／ml可溶性ＣＤ２８添加プレート結合ＣＤ３(１.５μg／ml)で７２時間、３７℃で刺激し、２０μ／ml  ＩＬ２存在下、１４日間の培養で拡大し、最後に１０μg／ml  ＰＨＡ、２μ／ml  ＩＬ２および１μg／ml  ＣＤ２８の付加により、７２時間、３７℃で活性化のさらなるラウンドに曝した。刺激Ｔ細胞を、３８４ウェルＰＤＬ造影プレートに２時間播種して細胞を付着させ、１５分間、４℃に冷却し、次いでａｌｅｘａ  ４８８標識ＧＩＴＲ抗体を別々に１時間加えた。最後にプレートをＨＣＳで造影し、結果を細胞あたりの総強度としてデータ化した。
３つの異なるＧＩＴＲ抗体を、上記Ｔ細胞活性化方法を使用してモニターした。それらは、Ｇ１アイソタイプおよびＦｃ受容体に結合できない不活性(ＩｇＧ１.１)アイソタイプ、ならびにＩｇＧ１ヒンジの代わりにＩｇＧ２ヒンジとのキメラとしてのＧＩＴＲ.６抗体であった。
【０３５３】
ＧＩＴＲ抗体誘発内在化を、ＣＤ３刺激ＣＤ４＋Ｔ細胞でａｌｅｘａ消光アッセイ形式を使用して評価した。新たに得たＣＤ４陽性Ｔ細胞を、ＧＩＴＲ発現を誘発するために上記のとおりインキュベートした。刺激後、細胞を新鮮培地に再懸濁し、次のとおり内在化アッセイのために播種した。細胞を、上記のとおり抗体とインキュベートし、温培地で洗浄し、固定化および消光するまで、３７℃で示される時間インキュベートした。内在化抗体を、０時に観察される小さな消光不可能なシグナルを超える蛍光増加として測定し、最初に細胞に結合した「非消光対照」に対して総蛍光を正規化した。図１５に示すとおり、ＧＩＴＲライゲーションは、試験した各抗体で３０〜６０分でピークとなる迅速な内在化をもたらし、一方対照抗体は、原形質膜への局在化を維持することが判明した。結果は、ＩｇＧ２ヒンジ領域がＧＩＴＲライゲーション誘発内在化を誘発することを示す。
【０３５４】
内在化および関連動力学の詳細な機構をさらに精査するために、抗体エンドサイトーシスおよび初期エンドソーム区画への送達を分析した。この実験において、細胞を、非標識抗体でのパルスチェイス分析に付した。固定化により、細胞を透過性化し、初期エンドソームマーカーＥＥＡ１(cell signaling technology)で染色し、洗浄し、次いでａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−４８８コンジュゲート抗ウサギ二次抗体(ＥＥＡ１)およびａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート抗ヒト抗体(ＧＩＴＲ)で検出した。プレートを、６０倍水浸対物レンズのＯｐｅｒａ共焦点系で造影した。結果は、膜結合抗ＧＩＴＲ抗体染色と細胞内ＥＥＡ１シグナルの明確な分離を示した。培養物を温めることにより、ある抗体のクラスター形成が検出され、これはエンドソームタンパク質と共局在するように見えた。エンドソーム共局在化の定量化を、ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して行い、結果を総染色に対する共局在化ピクセル強度の比としてプロットした(図１６)。ＧＩＴＲ抗体および初期エンドソームの共局在化は、３０分で最も顕著であった。この試験時点で、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆは、ＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆ抗体より高いフラクション共局在化を示した。共局在化結果は、上記ａｌｅｘａ消光方法を使用してなした観察と一致し、モデルを支持し、Ｇ２ヒンジがＧＩＴＲ内在化誘発にＧ１より有利である可能性を示唆する。
【０３５５】
実施例１０：Ｔ細胞受容体活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＧＩＴＲアゴニストＡｂシグナル伝達はＩｇＧ２ヒンジおよびＣＨ１ドメインを有する抗体で増強される
抗ＧＩＴＲアゴニスト抗体の機構をさらに試験するために、ＮＦｋＢおよびＰ３８シグナル伝達経路などのＴ細胞活性化に関与する数シグナル伝達経路をモニターした。
健常ドナー(Ｍ６５７６)からのＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレート被覆０.４μg／ml抗ＣＤ３および０.４μg／ml抗ＣＤ２８で活性化した。３日後、細胞を取得し、シグナル伝達活性化のために３８４ウェル画像化プレートに播種した。細胞をプレートで２時間定着させた後、ＧＩＴＲ抗体で１５分間処理し、アッセイプレートに最終１０％でホルムアルデヒドを加えることにより、シグナル伝達事象を停止させた。次いで、細胞を透過性化し、シグナル伝達検出用ホスホロ−ｐ６５  ＮＦＫＢ抗体で染色した。図１７に示すとおり、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両者でＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆと比較して高いシグナル伝達応答を有した。内在化とシグナル伝達経路活性化を結び付ける直接的証拠はないが、Ｇ２アイソタイプがＧＩＴＲ.６に対してＩｇＧ１と比較して抗体機能的活性の両面を改善すると考えらえることに注視するのは興味深い。
各抗体についてシグナル伝達活性を定量するために、各抗体のＥＣ５０およびＥｍａｘ両者を、両パラメータがシグナル伝達事象の全範囲を捕捉するのに重要であるため、計算した。ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆの応答レベルを、１００％対照となるよう選択し、他の全抗体をこれに対して正規化した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体により活性化されたＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞両集団について表２１に示すとおり、効力(ＥＣ５０)および有効性(Ｅｍａｘ％)両者の点で、ＧＩＴＲ抗体にある範囲の活性があった。ＧＩＴＲ.６.Ｇ２、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆおよびＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆは、約１０nM範囲の類似する効力(ＥＣ５０)を示したが、有効性(Ｅｍａｘ)はアイソタイプが違えばかなり異なり、Ｇ１抗体は、Ｇ２またはキメラアイソタイプほど効率的にシグナル伝達されないことが示唆される。
【０３５６】
【表２３】
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【０３５７】
ＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆと比較したＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆのシグナル伝達差異がＮＦｋＢシグナル伝達のみに限定されるのか、他のシグナル伝達事象にも同様に当てはまるのかをさらに確認するために、Ｐ３８ＭＡＰＫシグナル伝達読み出し情報を調査した。図１８に示すとおり、ＧＩＴＲ.６.Ｇ２およびＧＩＴＲ.６.Ｇ２.Ｇ１ｆ抗体は、ＣＤ４＋細胞ｐ３８  ＭＡＰＫ活性化アッセイでＧＩＴＲ.６.Ｇ１ｆ抗体と比較して高いシグナル伝達応答を有した。それ故に、Ｇ１アイソタイプと比較してＧＩＴＲ.６.Ｇ２アイソタイプの良好なシグナル伝達活性はＮＦｋＢシグナル伝達に限定されるものではなかった。
増強されたアゴニスト活性および内在化に加えて、修飾重鎖定常領域が増強したＡＤＣＣ(例えば、刺激受容体のアゴニストに対して)を付与でき、同様に抗体に新規活性を提供することも示された。例えば、阻害性細胞表面分子に結合し、細胞表面分子(アンタゴニスト)の阻害活性を阻止する抗体の定常重鎖ドメインの、ここに記載する修飾重鎖定常領域への変更は、アンタゴニストである能力を失い、むしろアゴニスト活性(阻害活性の)が与えられた抗体をもたらした。
【０３５８】
実施例１１：ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ２.５構築物のジスルフィド結合の確認
定常ドメインＩｇＧ２.３(Ａ形態)、ＩｇＧ２.３Ｇ１(Ａ形態)およびＩｇＧ２.５(Ｂ形態)を含む抗体のジスルフィド結合構造を、非還元対還元Ｌｙｓ−Ｃ消化の比較により補正されるように確認した。
抗体サンプルを、リシン(Ｋ、Ｌｙｓ)残基のカルボキシル末端側のペプチド結合を選択的に開裂するＬｙｓ−Ｃで消化させた。消化物のペプチドを、Waters ACQUITY BEH C18カラム、１.７μm、２.１×１５０mm、逆相ＨＰＬＣカラムを使用して分離し、２１４nmの紫外(ＵＶ)検出器およびＴｈｅｒｍｏ  ＬＴＱ質量スペクトロメーターで検出した。
【０３５９】
Ｌｙｓ−Ｃ酵素消化およびジスルフィド結合還元：１００μgの抗体サンプルを含むバイアルに、１２０μL変性緩衝液を加え、３.７Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０.２Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７.０溶液を得た。混合物を５５℃で３０分間インキュベートした。タンパク質のアルキル化を、上記溶液中１μl  ５０mM  ヨードアセトアミドを加え、次いで暗所で室温で３０分間インキュベーションして実施した。アルキル化サンプルを８０μL  ｄＨ２Ｏで希釈し、Ｗａｃｏ  Ｌｙｓ−Ｃを酵素対基質比１：１０で加えた。抗体を、一夜、暗所で室温で消化させた。消化後、１００μL量をＬｙｓ−Ｃ消化サンプルから除去し、１０μLの０.５Ｍ  ＤＴＴを加えた。このサンプルを室温で１時間インキュベートして、ジスルフィド結合を還元させた。
【０３６０】
得られた結果は次のとおりである：
ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ２.３Ｇ１抗体(Ａ形態)のジスルフィド構造：重鎖Ｆａｂ領域内でＣｙｓ２２(Ｈ)  はＣｙｓ９８(Ｈ)と結合し、Ｃｙｓ１５１(Ｈ)はＣｙｓ２０７(Ｈ)と結合する。重鎖Ｆｃ領域内でＣｙｓ２６５(Ｈ)はＣｙｓ３２５(Ｈ)と結合し、Ｃｙｓ３７１(Ｈ)はＣｙｓ４２９(Ｈ)と結合する。軽鎖Ｆａｂ領域内でＣｙｓ２３(Ｌ)はＣｙｓ８８(Ｌ)と結合し、Ｃｙｓ１３４(Ｌ)はＣｙｓ１９４(Ｌ)と結合する。軽鎖のＣ末端Ｃｙｓ２１４(Ｌ)はＣｙｓ１３８(Ｈ)で重鎖と結合する。重鎖のヒンジ領域は３つのシステイン残基Ｃｙｓ２２７(Ｈ)、Ｃｙｓ２３０(Ｈ)およびＣｙｓ２３３(Ｈ)を含み、これらは３つの鎖間ジスルフィド結合を提供する。最も可能性のある結合は、Ｃｙｓ２２７(Ｈ)とＣｙｓ２２７(Ｈ)、Ｃｙｓ２３０(Ｈ)とＣｙｓ２３０(Ｈ)およびＣｙｓ２３３(Ｈ)とＣｙｓ２３３(Ｈ)であり、これは、ＩｇＧ２  Ａ形態の正確な理論的ジスルフィド配置である。
【０３６１】
ＩｇＧ２.５抗体(Ｂ形態)のジスルフィド構造：重鎖Ｆａｂ領域内でＣｙｓ２２(Ｈ)はＣｙｓ９８(Ｈ)と結合し、Ｃｙｓ１５１(Ｈ)はＣｙｓ２０７(Ｈ)と結合する。重鎖Ｆｃ領域内でＣｙｓ２６４(Ｈ)はＣｙｓ３２４(Ｈ)と結合し、Ｃｙｓ３７０(Ｈ)はＣｙｓ４２８(Ｈ)と結合する。軽鎖Ｆａｂ領域内でＣｙｓ２３(Ｌ)はＣｙｓ８８(Ｌ)と結合し、Ｃｙｓ１３４(Ｌ)はＣｙｓ１９４(Ｌ)と結合する。重鎖のヒンジ領域は４つのシステイン残基Ｃｙｓ２２６(Ｈ)、Ｃｙｓ２２７(Ｈ)、Ｃｙｓ２３０(Ｈ)およびＣｙｓ２３３(Ｈ)を含む。軽鎖のＣ末端Ｃｙｓ２１４(Ｌ)はヒンジ領域の重鎖のシステイン残基と結合し、残り３つのシステイン残基は３つの鎖間ジスルフィド結合を提供する。最も可能性のある結合は、Ｃｙｓ２１４(Ｌ)とＣｙｓ２２６(Ｈ)、次いでＣｙｓ２２７(Ｈ)とＣｙｓ２２７(Ｈ)、Ｃｙｓ２３０(Ｈ)とＣｙｓ２３０(Ｈ)およびＣｙｓ２３３(Ｈ)とＣｙｓ２３３(Ｈ)であり、これは、ＩｇＧ２  Ｂ形態の正確な理論的ジスルフィド配置である。さらに、ヒンジ領域のジスルフィド結合を、イオントラップ質量スペクトロメーターを使用する電子移動解離(ＥＴＤ)誘発タンデムマススペクトロメトリーを使用して確認した。
【０３６２】
実施例１２：Ｔ細胞のＧＩＴＲアゴニズム改善におけるＩｇＧ２  ＣＨ１およびヒンジのあるアミノ酸残基の関連
表１７に示す重鎖定常領域を有する抗ＧＩＴＲ抗体(ＧＩＴＲ.６)を調製し、実施例２に記載のとおりであるが、上清を４８時間ではなく、４０時間で取得するＩＬ−２産生アッセイで試験した。
図２０Ａ〜Ｄに示す結果は、本実施例で使用したのと同じ重鎖定常領域を有する抗ＣＤ７３抗体で得たＣＤ７３内在化結果(図１０参照)とほとんど一致した。
【０３６３】
実施例１３：Ｐ２３８Ｋ変異でのエフェクター機能の排除
抗体の可変領域を、単一アミノ酸残基が野生型ＩｇＧ１  Ｆｃと異なるＩｇＧ１  Ｆｃ、Ｐ２３８Ｋ(配列番号１９８)と融合させた。この単一変異で、抗体はエフェクター機能の欠失を示し、低親和性ＦｃγＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８またはｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２に対して本質的に検出可能な結合シグナルはない(実施例１４のデータ参照)。さらに、ＩｇＧ１  Ｐ２３８Ｋを有する抗体は、高親和性ＦｃγＲ  ＣＤ６４に対する結合親和性減少を示した(実施例１４のデータ参照)。抗体のＣＤ６４への結合は、野生型ＩｇＧ１定常ドメインを有する抗体に比して速い切断速度(解離定数)を示した。
Ｐ２３８Ｋ変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃ(配列番号１９８)のエフェクター機能欠如も、抗体バリアントで確認した。
それ故に、例えば、重鎖定常領域配列番号１９８のアミノ酸配列を含む、単一変異(Ｐ２３８Ｋ)を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃを、エフェクター機能が望ましくないあらゆる抗体で使用できる。
【０３６４】
実施例１４：Ｐ２３８Ｋおよび付加的変異によるエフェクター機能の排除
エフェクター機能、好ましくはＡＤＣＣおよびＣＤＣ両者をさらに低減するために変異を有するＦｃでさらなる抗体を作製した。表２２に示すとおり、変異体を、ＦｃＲ結合をさらに低減するために作成した。特に、上に示すとおり、Ｐ２３８ＫはＣＤ６４に対する以外検出可能なＦｃＲ結合を排除し、従って、目的は、ＣＤ６４結合を低減するためのＰ２３８Ｋと付加的変異であった。変異を、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２.３およびＩｇＧ２.５アイソタイプおよびＩｇＧ２.３Ｇ１アイソタイプ形式の状況で試験した。これらの抗体で使用したＦｃは、配列番号２３４〜２４５および２４７〜２６２を有するアミノ酸配列の一つを含む。
変異の位置を図２１に示す。
ヒトＦｃγＲの抗体への結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ系(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴により試験した。これらの試験について、プロテインＡを、約３０００ＲＵの密度まで、１０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤ｐ２０のランニング緩衝液中、エタノールアミン遮断と共に標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用して、ＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４に固定化した。精製抗体(１０μg／mL)または発現上清(約１０μg／mlに希釈)を、約１０００〜１２００ＲＵの密度までプロテインＡ表面に捕捉し、ＦｃγＲ検体の結合を、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０、緩衝液(ＰＢＳ−Ｔ)  ｐＨ７.１からなるランニング緩衝液中、２５℃で、流速２０μL／分で１２０秒会合時間および１２０秒解離時間を使用して試験した。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  ８Ｋ評価ソフトウェアを使用して、１００％分画活性と仮定した捕捉抗体のレベルに基づく、各抗体についての理論的最大結合応答のパーセンテージとしての測定結合応答(％Ｒｍａｘ)の測定により、グリコシル化されていないタンパク質質量のみを考慮して、次のとおり決定した。種々の分子のＦｃｇＲ結合比較のために、ＳＰＲ結合データを、一般に式１に示すとおり、理論的最大結合応答のパーセンテージとしての最大結合応答(％Ｒｍａｘ)の計算により分析した。
【数２】
2020521751.tif 000031
特に、％Ｒｍａｘを次の式を使用して計算した。
【数３】
2020521751.tif 000032
〔式中、「検体」は抗体であり、「リガンド」は捕捉ＦｃｇＲタンパク質である。〕。この分析は、抗体またはＦｃｇＲのグリコシル化の質量を考慮せず、捕捉リガンドについて１００％分画活性と仮定する。
【０３６５】
「％Ｒｍａｘ分析」は、比較的速い会合および解離動態および試験検体濃度(１マイクロモル濃度(μM))近辺またはそれより低い親和性を有し、従って表面飽和が一般にこれらの条件下で達成されない「低親和性」ＦｃｇＲ、例えば、ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２の結合の評価に特に有用である。対照的に、「高親和性」ＦｃｇＲ  ｈＣＤ６４は、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対して、他のＦｃｇＲより高い親和性および遅い解離動態で結合し、故に、これらのアイソタイプは一般にマイクロモル濃度検体濃度下でｈＣＤ６４表面を飽和し、％Ｒｍａｘを使用する親和性の区別がより困難である。これらの相互作用について、抗体間の差異は、センサーグラムデータにおける解離動態の比較により、容易に観察され得る。
【０３６６】
結果を表２２に示し、センサーグラムデータ例を図２１Ａ〜Ｌに提供する。
【表２４】
2020521751.tif 000033
【０３６７】
表２２および図２２に示すとおり、組み合わせ変異体は、極めて弱いＦｃＲ結合を示した。Ｐ２３８ＫアイソタイプへのＬ２３５変異富化は、ＩｇＧ１.３ｆと類似レベルまでＣＤ６４結合を減少させた。Ｌ２３５Ｅは、ＣＤ６４結合減少についてＬ２３５Ａ変異より優れた。Ｐ２３８Ｋ変異のＩｇＧ２への付加(ＩｇＧ２.３−Ｐ２３８Ｋ)は、完全不活性アイソタイプをもたらし、ＦｃＲタンパク質の何れかへの検出可能な結合を示さなかった。変異はまたＩｇＧ１およびＩｇＧ２. ｘＧ１形式において、類似傾向を示した。ｃ１ｑ結合(ＣＤＣ活性)を減少し、一部構築物に付加したＫ３２２Ａ変異は、ＦｃＲ結合に最小の効果を有し、従って、Ｋ３２２Ａの効果はたいして観察されなかった。
【０３６８】
実施例１４：ＩｇＧ１.３  Ｆｃでのエフェクター機能の排除
この実施例は、同時出願され、共同所有されている「MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH」なる表題のＰＣＴ出願の実施例２および３に記載される。
この実施例は、ＩｇＧ１.３  Ｆｃを有する抗体またはポリペプチドが、本質的にＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ６４への結合を欠くことを示す。ＩｇＧ１.３  Ｆｃが抗ＴＩＭ３抗体の可変ドメインに結合したときにも、これは観察されている(ＷＯ２０１８／０１３８１８参照)。ＩｇＧ１.３は、「ＩｇＧ１.１」Ｆｃ(「ＩｇＧ１.１」はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓ置換を有するＩｇＧ１である)から、Ａ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓを除去し、それにより５変異中３つ、すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａを保持することにより導かれた。ＩｇＧ１.１  ＦｃにおけるＡ３３０ＳおよびＰ３３１Ｓの欠失が、このＦｃの不活性さに顕著に影響しなかったのは驚くべき発見であった。次は、抗体におけるおよび非抗体タンパク質におけるＩｇＧ１.１およびＩｇＧ１.３の不活性さを比較する、ＩｇＧ１.１およびＩｇＧ１.３(および比較目的での他のＦｃ)含有抗体および融合タンパク質のＦｃγＲ結合測定の例である。
この実施例で使用した材料および方法は次のものを含む。
【０３６９】
ＦｃｇＲ結合ＳＰＲ：ＦｃｇＲ結合を、インビトロで精製ＦｃγＲを使用して、ＢｉａｃｏｒｅＴＭ表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)を使用して、測定できる。２つの方法をここで使用した。
一つの方法は、抗Ｈｉｓ抗体の固定化Ｆａｂフラグメント上に捕捉されたＨｉｓタグ付ＦｃｇＲタンパク質(ＦｃｇＲ−Ｈｉｓ(「ＦｃｇＲ」は「ＦｃγＲ」と相互交換可能に使用する)への精製抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質の結合を試験する。これらの実験は、BiacoreTM T100またはBiacoreTM T200装置(GE Healthcare)で、２５℃で行う。マウス抗６×Ｈｉｓ抗体(社内で産生)からのＦａｂフラグメントを、１０ミリモル濃度(mM)  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤ｐ２０(ＨＢＳ−ＥＰ＋)のランニング緩衝液中、約３０００共鳴単位(ＲＵ)まで、エタノールアミン遮断と共に標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用して、ＣＭ５センサーチップに固定化する。残りの試験全てｐＨ７.１で、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０(ＰＢＳ−Ｔ)のランニング緩衝液を使用して実施する。Ｃ末端６×ポリヒスチジンタグ(社内で産生)を含む種々のＦｃｇＲタンパク質をこの表面に、１０μl／分で３０秒(ｓ)の接触時間を使用して捕捉した(一般に約７μg／mlのＦｃｇＲ−Ｈｉｓタンパク質濃度を使用)。種々の濃度の精製抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質を、例えば３０μl／分で１２０秒の会合時間および３０μl／分で１２０秒の解離時間を使用して、結合について試験する。これらの試験で試験したＦｃｇＲタンパク質は「高親和性」ＦｃｇＲ  ｈＣＤ６４(ｈＦｃｇＲＩ)、ならびに「低親和性」ＦｃｇＲ  ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｈ１３１)、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１(ＦｃｇＲIIａ−Ｒ１３１)、ｈＣＤ３２ｂ(ＦｃｇＲIIｂ)、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｖ１５８)、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８(ＦｃｇＲIIIａ−Ｆ１５８)、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ１)およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２(ＦｃｇＲIIIｂ−ＮＡ２)を含む。
【０３７０】
結合応答を定量的に分析し、種々の分子のＦｃｇＲ結合を比較するために、ＳＰＲ結合データを一般に式１に示される理論的最大結合応答(％Ｒｍａｘ)のパーセンテージとして最大結合応答を計算することにより分析できる。
【数４】
2020521751.tif 000034
特に、％Ｒｍａｘは次の式を使用して計算できる。
【数５】
2020521751.tif 000035
〔式中、「検体」は抗体またはｄＡｂ−Ｆｃであり、「リガンド」は捕捉ＦｃｇＲタンパク質である。〕。この分析は、抗体、ｄＡｂ−ＦｃまたはＦｃｇＲのグリコシル化の質量を考慮せず、捕捉リガンドについて１００％分画活性と仮定する。
【０３７１】
「％Ｒｍａｘ分析」は、比較的速い会合および解離速度および試験検体濃度(１マイクロモル濃度(μM))近辺またはそれより低い親和性を有し、従って表面飽和が一般にこれらの条件下で達成されない「低親和性」ＦｃｇＲ、例えば、ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ａ−Ｆ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ１およびｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２の結合の評価に特に有用である。対照的に、「高親和性」ＦｃｇＲ  ｈＣＤ６４は、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対して、他のＦｃｇＲより高い親和性および遅い解離速度で結合し、故に、これらのアイソタイプは一般にマイクロモル濃度検体濃度下でｈＣＤ６４表面を飽和し、％Ｒｍａｘを使用する親和性の区別がより困難である。これらの相互作用について、抗体間の差異は、センサーグラムデータにおける解離速度の比較により、容易に観察され得る。
【０３７２】
抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質とＦｃｇＲタンパク質の相互作用を試験する第二ＳＰＲアッセイは、プロテインＡ捕捉方法である。これらの実験も、BiacoreTM T100またはBiacoreTM T200装置(GE Healthcare)で、２５℃で行う。これらの試験について、プロテインＡを、１０mM  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７.４、１５０mM  ＮａＣｌ、３mM  ＥＤＴＡ、０.０５％界面活性剤ｐ２０のランニング緩衝液中、約３０００ＲＵの密度で、エタノールアミン遮断と共に、標準エチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(ＥＤＣ)／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)化学を使用してＣＭ５センサーチップのフローセル１〜４に固定化した。抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質(一般に〜３〜１０μg／ml)をプロテインＡ表面に捕捉し、ＦｃｇＲ検体の結合を、例えば、流速３０μL／分で１２０秒会合時間および１８０秒解離時間を使用して、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ、０.０５％ｐ２０、緩衝液(ＰＢＳ−Ｔ)からなるランニング緩衝液中、ｐＨ７.１および２５℃で試験する。
プロテインＡ捕捉アッセイを、抗体またはｄＡｂ−Ｆｃ分子を含む未精製上清の分析にも使用できる。この分析のために、抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質を非希釈上清またはランニング緩衝液で希釈した上清から捕捉し得る。結合応答を定量的に分析し、種々の分子のＦｃｇＲ結合を比較するために、ＳＰＲ結合データを上記式１を使用して％Ｒｍａｘを計算することにより分析し、ここで、検体は精製ＦｃｇＲタンパク質であり、リガンドは捕捉抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質である。
％Ｒｍａｘ分析に加えて、結合の動態および親和性の定量的分析を、プロテインＡ捕捉抗体またはｄＡｂ−Ｆｃタンパク質への結合についてＦｃｇＲ検体のタイトレーションを試験することにより実施できる。例えば、３：１連続希釈のＦｃｇＲを、１０μMから０.１５nM(ｈＣＤ６４)または１.５nM(その他全ＦｃｇＲ)までタイトレーションして低減させ得る。これらの動態データを、BiacoreTM T200評価ソフトウェアを使用して１：１ラングミュアモデルまたは定常状態結合モデルに適合させて、動態的および親和性値を得ることができる。
【０３７３】
ｄＡｂ−Ｆｃ：この実施例で試験したｄＡｂ−Ｆｃを表２３に示す。これらの配列において、単一可変ドメイン３ｈ５６−２６９残基は、アミノ酸１〜１１８である(下線)。リンカーＡＳＴは二重下線を付す。
【表２５】
2020521751.tif 000036
表２３に示される、各々「ＥＰＫ」から始まるＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆの配列(すなわち、配列番号７７および７８の配列)は、それぞれＥＰＫから始まる配列番号８３および２４８の配列と同一である。
【０３７４】
対照ｍＡｂ：対照モノクローナル抗体(１Ｆ４)も、類似Ｆｃドメイン変異を用いて形成した。個々の鎖の配列を表２４に示し、可変領域およびＣＨ１領域を含む１Ｆ４重鎖の一部の配列(配列番号２６８)を含む。この配列は重鎖配列(配列番号２６９〜２７５)で下線を引く。各１Ｆ４  ｍＡｂバリアントの重鎖配列と軽鎖配列の対を表２５に示す。
【表２６】
2020521751.tif 000037
【表２７】
2020521751.tif 000038
【０３７５】
【表２８】
2020521751.tif 000039
【０３７６】
結果：ｄＡｂ−Ｆｃ分子を、ＦｃｇＲ結合を低減するためにＦｃドメインの変異を伴い産生した。特に、抗ＣＤ４０ドメイン抗体３ｈ５６−２６９は、次のＦｃドメインバリアントを用いて製造した：ＩｇＧ１.１ｆ、ＩｇＧ１.３ｆおよびＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ。３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１.１ｆ(配列番号７７)、３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１.３ｆ(配列番号７８)および３ｈ−５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ(配列番号７９)の小野おおにおいて、アミノ酸１〜１１６は３ｈ−５６−２６９  ｄＡｂであり、アミノ酸１１７〜１１９はリンカーであり、アミノ酸１２０〜３５１はＦｃドメインである。
【０３７７】
これらｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の各々ならびに３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４.１および３ｈ５６−２６９−ＣＴの各々は、BiacoreTM SPRで測定して精製ヒト−ＣＤ４０単量体(ｈＣＤ４０単量体、社内で産生)に高親和性で結合することが確認された。表２６に示すとおり、ＫＤ値は、種々のＦｃバリアントについて７.３nM〜１１.５nMの範囲である。ｄＡｂ−Ｆｃ分子の各々も、センサーチップの表面のｈＣＤ４０−Ｆｃおよび溶液中の可溶性検体としてｄＡｂ−Ｆｃ分子を使用するＳＰＲで測定して、高アビディティでヒトＣＤ４０と結合し、ここで、２５０nMおよび２５nM  ｄＡｂ−Ｆｃ検体注入のデータを、１：１ラングミュアモデルに適合させて、アビディティに影響される見かけのＫＤ値(ＫDapparent)は、全ｄＡｂ−Ｆｃで＜１nMとして推定された。表２６参照。
【表２９】
2020521751.tif 000040
＊３ｈ−５６−２６９−ＣＴはＵＣＯＥ−ＣＨＯ細胞から発現および精製。
【０３７８】
ｄＡｂ−Ｆｃ分子および種々の対照モノクローナル１Ｆ４抗体のＦｃｇＲ結合性質を、ＳＰＲにより特徴づけした。最初のアッセイは、１μMまたは１０μM  ｄＡｂ−Ｆｃまたはヒト−ＩｇＧ１ｆ抗体対照(１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆ)の抗Ｈｉｓ  Ｆａｂ捕捉ＦｃｇＲ−Ｈｉｓ表面への結合を含んだ。これらのデータを表２７に示す。
【表３０】
2020521751.tif 000041
【０３７９】
他のアッセイにおいて、ＦｃｇＲ検体(１μMまたは１０μM)を、プロテインＡ捕捉ｄＡｂ−Ｆｃ表面への結合(データは表２８に示す)および抗体表面への結合(データは表２９に示す)について試験した。
【表３１】
2020521751.tif 000042
【０３８０】
【表３２】
2020521751.tif 000043
【０３８１】
これらの実験における結合応答またはその欠如に基づき、高い親和性ｄＡｂ−Ｆｃ／ＦｃｇＲまたはＡｂ／ＦｃｇＲ相互作用と最強結合応答のサブセットを、検体タイトレーション(ＦｃｇＲ検体ｓ結合ｔｏプロテインＡ捕捉抗体またはｄＡｂ−Ｆｃ)を使用する動態論的／親和性特徴付けのために選択した。これらのデータを表３０に示す。
【表３３】
2020521751.tif 000044
【０３８２】
まとめて、これらのＦｃｇＲ結合ＳＰＲデータは、ＩｇＧ１ｆおよびＩｇＧ４.１アイソタイプ分子が修飾ＦｃバリアントＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１.１ｆ、ＩｇＧ１.３ｆまたはＣＴ分子と比較して、顕著に高いＦｃｇＲ親和性を全ＦｃｇＲにわたり有することを示す。修飾Ｆｃバリアントの中で、ｈＣＤ６４結合親和性は３ｈ５６−２６９−ＣＴ(ＫＤ＝４.６nM)が最強であり、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ(ＫＤ＝６２nM)が弱く、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.１ｆおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.３ｆが最弱であり、この親和性は本試験条件下で定量するには弱すぎた(ＫＤ＞５μM、これは試験した最高検体濃度の半分である)。ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１.１ｆ、ＩｇＧ１.３ｆおよびＣＴバリアントについての他の全てのＦｃｇＲ相互作用(ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ｈＣＤ３２ｂ、ｈＣＤ１６ａ−Ｖ１５８、ｈＣＤ１６ｂ−ＮＡ２)も、信頼できるＫＤ値を得るには弱すぎた(ＫＤ＞５μM)。しかしながら、相対的結合応答の差異は、％Ｒｍａｘデータで観察できた。例えば、ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａバリアントは、ｈＣＤ３２ａ−Ｈ１３１に対して、ＩｇＧ１.１ｆ、ＩｇＧ１.３ｆまたはＣＴバリアントより強い結合応答を有する(表２８)。対照的に、ＩｇＧ１.１ｆおよびＩｇＧ１.３ｆバリアントは、ｈＣＤ３２ａ−Ｒ１３１に対して、ＩｇＧ１−Ｄ２６５ＡおよびＣＴバリアントより強い結合応答を有する(表２８)。
【０３８３】
ＩｇＧ１.３含有融合タンパク質または抗体を、ＤＳＣ、ｉｃＩＥＦおよびマススペクトロメトリーにより評価した。材料および方法を下に記載する。
示差走査熱量測定：ＤＳＣ実験を、MicroCal VP-Capillary DSC装置(Malvern Instruments, Malvern, UK)で、１０mM  ＮａＰＯ４、１３０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ７.１で実施した。１mg／ml  ｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体のサンプルを、１０〜１１０℃の走査範囲および９０℃／時間の走査速度を使用して試験した。データをMicroCal-Origin 7.0ソフトウェアを使用して分析した。
【０３８４】
画像化キャピラリー等電点電気泳動：ｉｃＩＥＦ実験を、ProteinSimple iCE3TM System (ProteinSimple, San Jose, CA)で実施した。これらの試験について、一般に２mg／ml濃度の、ｄＡｂ−Ｆｃまたは抗体サンプルを、２Ｍ  尿素、０.３５％メチルセルロース、１％ファルマライト５〜８、３％ファルマライト８〜１０.５およびｐＩマーカー５.８５および１０.１０からなる担体両性電解質混合物と、最終タンパク質濃度０.２０mg／mLで混合し、プレフォーカス時間１分、１.５kVおよびフォーカス時間１０分、３kVを使用して分析した。
【０３８５】
マススペクトロメトリー：マススペクトロメトリー(mass spec)分析について、サンプルを１００mM  ＤＴＴを使用して還元し、ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼ(ＦＰＮＧａｓｅＦ)を使用してＮ−脱グリコシル化を実施した。使用した液体クロマトグラフィー−マススペクトロメトリー(ＬＣ／ＭＳ)装置は、Waters Synapt(登録商標)G2(Waters Corporation, Milford, MA)とWaters Acquity(登録商標)ＵＰＬＣ(超高速液体クロマトグラフィー)であった。ＵＰＬＣカラムはWaters Acquity(登録商標)BEH(エチレン架橋ハイブリッド粒子)Ｃ４(２.１×１５０mm、３００Å、１.７μm粒子)であった。勾配は、１０分間、２００μL／分流速で１０％〜３８％(移動相Ｂ)であった。移動相Ａは０.１％ギ酸水溶液であった。移動相Ｂは０.１％ギ酸アセトニトリル溶液であった。カラム温度は６０℃であった。データ分析を、Waters MassLynxTMソフトウェアの助けをかりて手動で実施した；スペクトルデコンボリューションをＭａｘＥｎｔ１アルゴリズムで実施した。
【０３８６】
加速安定性試験：加速安定性試験を、まず、ｄＡｂ−Ｆｃ分子を標的製剤緩衝液で４℃で徹底的に透析した。サンプルを回収し、Amicon(登録商標)Ultra Centrifugal Filter Units(Merck KgaA, Germany)を使用して濃縮し、透析緩衝液で種々の標的濃度に調製した。これらのサンプルを種々の温度で、一般に４℃、２５℃、３２℃および／または４０℃で数週間インキュベートし、一定量を取り出し、分析的サイズ排除クロマトグラフィーで分析した。分析的サイズ排除クロマトグラフィーを、ShodexTM K403-4Fカラム(Showa Denko America, Inc., New York, NY)を使用するＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣで、１００mM  リン酸ナトリウム、１５０mM  塩化ナトリウム、ｐＨ７.３の移動相、流速０.３ml／分で実施した。
【０３８７】
結果  −  示差走査熱量測定：ＤＳＣを使用して、タンパク質の熱安定性を測定できる。最良適合Ｔｍ値を表３１に要約する。
【表３４】
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【０３８８】
ＩｇＧ  Ｆｃドメインの特徴的熱変性プロファイルに基づき、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４.１のＦｃ  ＣＨ３ドメイン転移を、６９.６℃の中点(Ｔｍ)値を有する転移として割り当て、種々のＩｇＧ１分子のＦｃ  ＣＨ３ドメインを、約８２〜８３℃付近のＴｍを有する転移として割り当てた。ｄＡｂ−ＦｃについてのｄＡｂドメインおよびＣＨ２ドメインの変性は、６５℃未満の転移と割り当て、これは、熱変性開始(Ｔonset)、変性転移の形および最良適合Ｔｍ値の両者で、種々の構築物間で異なった。例えば、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４.１のｄＡｂおよびＣＨ２ドメインの熱転移は単一重複または協調的転移として見られ、Ｔｍ値６２.８℃である。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.１ｆおよび３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.３ｆのｄＡｂおよびＣＨ２ドメインの変性プロファイルは、全てより非対称の転移に一致し、これは、約５６〜６３℃のＴｍ値を有する２転移として最もよく示された。３ｈ５６−２６９−ＣＴは最低Ｔｏｎｓｅｔを有し、約４０℃で変性し始め、広い熱転移および最低適合Ｔｍ値Ｔｍ１＝５５.４℃およびＴｍ２＝６０.４℃であった。
【０３８９】
結果  −  画像化キャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)：画像化キャピラリー等電点電気泳動(ｉｃＩＥＦ)を使用して、サンプル均質性または不均質性を特徴づけできる。均質産物を産生する能力は、他の重要な発展性基準。結果として、新規タンパク質治療剤の発見および最適化中、種々の分析的方法がサンプル不均質性を特徴付けおよび定量するためおよび最も均質な分子を選択するために利用される。
ｄＡｂ−Ｆｃ分子の電荷プロファイルはｉｃＩＥＦにより特徴づけされた。データを図２３に示す。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４.１(図２３Ａ)、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.１ｆ(図２３Ｅ)および３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.３ｆ(図２３Ｆ)のｉｃＩＥＦプロファイルは全て比較的単純であり、各々６９〜８６％面積の明確な主ピークと、より少ない存在量の２〜４電荷バリアントからなる。このｉｃＩＥＦプロファイルは、抗体で得られる典型的プロファイルに類似する。３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１−Ｄ２６５Ａの主ピーク(図２３Ｄ)は、幾分存在量が少なく(４９％)、対応する高レベルの酸性バリアントと少なくとも６つの検出可能な種を伴う。対照的に、３ｈ５６−２６９−ＣＴのプロファイル(図２３Ｂ)は高度に不均一であり、少なくとも１６の異なる種からなり、明らかな主ピークがない。異なる細胞株(ＵＣＯＥ−ＣＨＯ)で発現された３ｈ５６−２６９−ＣＴのｉｃＩＥＦプロファイルは等しく不均一であったが(図２３Ｃ)、電荷バリアントの分布はＨＥＫ２９３発現物質と相当異なった。
【０３９０】
結果  −  マススペクトロメトリー：ＩｇＧまたはＦｃ含有タンパク質のＦｃドメインの典型的グリコシル化は、Ｇ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびあるＧ２Ｆ種の混合である。シアリル化または非フコシル化形態などの他のグリコフォームは、一般にはるかに低い存在量で見られるかまたは検出不可能なレベルである。
ｄＡｂ−Ｆｃタンパク質のグリコシル化プロファイルを特徴付けし、ｄＡｂ−Ｆｃタンパク質と類似Ｆｃ変異を有する対照抗体を比較するために、マススペクトロメトリー実験を実施した。データを表３２に示す。
【表３５】
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対照抗体１Ｆ４−ＩｇＧ１ｆおよび１Ｆ４−ＩｇＧ１.３ｆならびにｄＡｂ−Ｆｃ抗体３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ４.１、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.１ｆ、３ｈ５６−２６９−ＩｇＧ１.３ｆのマススペクトロメトリーデータは、これらのタンパク質がＧ０Ｆ、Ｇ１Ｆグリコフォームと、存在量が低いＧ２Ｆ種の典型的混合物からなることを示した。
【０３９１】
それ故に、ＩｇＧ１.３(重鎖定常領域およびＦｃ)は、本質的にＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂおよびＣＤ６４への結合を欠き、良好な生物物理的性質を有する。ＩｇＧ１.３  Ｆｃが抗ＴＩＭ３抗体の可変ドメインに結合したときも、これは観察された(ＷＯ２０１８／０１３８１８)参照。ＩｇＧ１.３を含む抗ＴＩＭ３抗体は良好な熱安定性(Ｔml＝６８.１℃、Ｔｍ２＝８０.３℃、Ｔｍ３＝８２.６℃)および熱可逆性(７４℃で９５.６％、８０℃で２５.５％)を有することが示されており、これは、本分子が熱ストレス下で構造的完全性を保持し、ストレスから解消されたとき堅牢な再折り畳み性質を有することを示唆する。
【０３９２】
【表３６】
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【表３７】
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【０３９３】
【表３８】
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【表３９】
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【０３９４】
【表４０】
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【表４１】
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【０３９５】
【表４２】
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【表４３】
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【０３９６】
【表４４】
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【表４５】
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【０３９７】
【表４６】
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【表４７】
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【０３９８】
【表４８】
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【表４９】
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【０３９９】
【表５０】
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【表５１】
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【０４００】
【表５２】
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【表５３】
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【０４０１】
【表５４】
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【表５５】
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【０４０２】
【表５６】
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【表５７】
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【０４０３】
【表５８】
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【表５９】
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【０４０４】
【表６０】
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【表６１】
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【０４０５】
【表６２】
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【表６３】
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【０４０６】
【表６４】
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【表６５】
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【０４０７】
【表６６】
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【表６７】
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【０４０８】
当業者は、日常的作業を超える実験を実施することなく、ここに記載する特定の実施態様の多くの等価物を認識しまたは確認することができる。このような等価物は、添付する特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020521751.tif 000101
【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
2020521751.tif 000129
【図２２−１０】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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