(57)【要約】  組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲ経路依存性レポーターを含む単離細胞が本明細書に記載され、該組み換えＴ細胞受容体はＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原に特異的である。自己免疫疾患または癌を処置するための薬として使用され得るナノ粒子（ｐＭＨＣ−ＮＰ）に結合されるペプチド主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）の機能または効力を判定するアッセイとして単離細胞を使用する方法がさらに記載される。【選択図】図１Ｈ
2020516594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物であって、該組成物は：
ａ）少なくとも１つの細胞であって：
ｉ．組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む、組み換えＴＣＲと；
ｉｉ．Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターであって、前記組み換えＴＣＲは主要組織適合性（ＭＨＣ）分子に結合された疾患関連抗原に特異的である、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターと、を含む少なくとも１つの細胞；および、
ｂ）ナノ粒子に結合されたＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンを含む、組成物。
【請求項２】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原は、１０：１以上の比率で前記ナノ粒子に結合される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ナノ粒子は約１ナノメートル〜約１００ナノメートルの直径を有する、請求項１または３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項５】
前記ナノ粒子は金属コアを含む、請求項１または４のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項６】
前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項７】
前記自己免疫性疾患関連抗原原または炎症性疾患関連抗原は、Ｉ型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡ関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する、請求項１〜７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの細胞は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４から選択される、請求項１〜９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１１】
前記疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３５２のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項１〜１０のうちのいずれか１つの組成物。
【請求項１２】
前記疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３〜４５５のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１４】
前記単一のポリペプチドのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記リボソームスキッピング配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５６〜５２３のいずれか１つにおいて記載される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、５３３、あるいは５３８のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される、請求項１〜１２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６  ５３９、５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、あるいは５４２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は細胞の表面で発現される、請求項１〜１８のうちのいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２０】
前記細胞はＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１９のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドはＩＲＥＳ核酸配列を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＩＲＥＳ核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６のいずれか１つにおいて記載される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２あるいは５５７のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％相同する核酸配列を含む、請求項２０〜２２のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２４】
ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される、請求項１〜２３のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項２５】
前記ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴ細胞受容体経路依存性レポーターを含む細胞であって、ここで、前記組み換えＴ細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である、細胞。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される、請求項２６に記載の細胞。
【請求項２８】
前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項２６または２７に記載の細胞。
【請求項２９】
前記自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、Ｉ型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項２８に記載の細胞。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する、請求項２６〜２９のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３１】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２６〜３０のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３２】
前記細胞は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４から選択される、請求項２６〜３１のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３３】
前記疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３５２のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項２６〜３２のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３４】
前記疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３〜４５５のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである、請求項２６〜３３のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３５】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される、請求項２６〜３４のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項３６】
前記単一のポリペプチドのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３７】
前記リボソームスキッピング配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５６〜５２３のいずれか１つにおいて記載される、請求項３６に記載の細胞。
【請求項３８】
前記単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、５３３、あるいは５３８のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載の細胞。
【請求項３９】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される、請求項２６〜３４のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項４０】
前記ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６  ５３９、５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、あるいは５４２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２６〜３９のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項４１】
前記ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は細胞の表面で発現される、請求項２６〜４０のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項４２】
前記細胞はＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項２６〜４１のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項４３】
前記少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドはＩＲＥＳ核酸配列を含む、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記ＩＲＥＳ核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６のいずれか１つにおいて記載される、請求項４３に記載の細胞。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２あるいは５５７のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％相同する核酸配列を含む、請求項４２〜４４のいずれか１つに記載の細胞。
【請求項４６】
請求項２６〜４５のいずれか１つに記載の細胞の集団。
【請求項４７】
ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される、請求項２６〜４５のいずれか１つに記載の細胞あるいは請求項４６に記載の細胞の集団。
【請求項４８】
前記ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
ナノ粒子に結合されたＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロの方法であって、該方法は：
ａ）ナノメディシンを、請求項２６〜４５のいずれかに記載の細胞または請求項４６に記載の細胞の集団と接触させる工程と；
ｂ）Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、
を含む、方法。
【請求項５０】
ナノメディシンは複数のナノ粒子を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記複数のナノ粒子は、前記ナノ粒子に結合されたＭＨＣ分子に結合される複数の疾患関連抗原を含む複数のナノ粒子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、Ｉ型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記複数のナノ粒子は、約１ナノメートル〜約１００ナノメートルの直径を有する複数のナノ粒子を含む、請求項４９〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターのシグナルを定量化する工程をさらに含む、請求項４９〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項５６】
定量化は、最大応答の約５０％である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定することを含み、ここで、前記最大応答とは、複数の濃度のナノメディシンが前記細胞または細胞の集団と接触する時に、前記細胞または細胞の集団と接触するナノメディシンの最高濃度で開始される応答である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の濃度のナノメディシンは、同じアッセイ中の前記細胞または細胞の集団と接触する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記定量化は、陰性対照の少なくとも約２００％である応答を始める前記ナノメディシンの濃度を決定し、ここで、前記陰性対照は、前記細胞または細胞の集団の組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と特異的に相互作用しないナノメディシンを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
シグナルは酵素によって生成される、請求項４９〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６０】
前記酵素はルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記シグナルは蛍光シグナルである、請求項４９〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項６２】
前記方法は、製造プロセスの品質管理工程として利用される、請求項４９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１７年４月７日に出願された米国仮出願第６２／４８３，２９８の優先権の利益を主張し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫性疾患は、自己抗原の不完全に定義されたリスト上の多数の抗原エピトープを認識するＴ細胞およびＢ細胞に関与する慢性自己免疫反応に起因する（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，  Ｐ．  （２０１０）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２：４３７−４４５；  Ｂａｂｂｅ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：３９３−４０４；  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，  Ｇ．Ｓ．  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３５６−３６１）。全身性免疫を損なわずに、個々の自己免疫疾患におけるポリクローナル自己反応性Ｔ細胞特異性（既知または未知）をすべて除去または抑制することは、現在可能ではない。
【０００３】
抗原主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）分子と結合されたナノ粒子が、インビボでの１型制御性Ｔ（ＴＲ１）細胞の再プログラミングおよび増殖を引き起こし得ることが最近発見された。ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＩＢ２０１６／０００６９１を参照。しかし、安定した抗原特異性Ｔ細胞クローンの必要性、初代細胞の使用に関連する非常に可変な実験間の変動性、および抗原受容体誘発事象の遠位の読み取りの不十分な定量的実験間の再現性を考慮すると、インビトロのｐＭＨＣ結合ナノ粒子またはナノ粒子に結合しないｐＭＨＣ複合体の生物学的効力ならびに拡大効力を測定するためのハイスループット方法は存在しない。さらに、当技術分野における方法（例えば、ウエスタンブロットによって測定されるような半量的近位のＴＣＲシグナル伝達事象）は、ナノ粒子上のｐＭＨＣ密度と濃度範囲にわたる生物活性との間の複雑な関係を厳密に模倣することができない。その結果、これらの方法は、特定の調製が最適な生体応答をもたらすのに十分な品質であるのか否かを正確に予測することができない。したがって、当技術分野において、ｐＭＨＣのアゴニスト効力または拡大効力を測定するためのインビトロの方法を開発する必要がある。本開示は、この必要性を満たすとともに、関連する利点も提供する。
【発明の概要】
【０００４】
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）、多発性硬化症および関節リウマチなどの自己免疫性疾患は、自己抗原の不完全に定義されたリスト上の多数の抗原エピトープを認識するＴ細胞およびＢ細胞に関与する慢性自己免疫反応に起因する（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ，  Ｐ．  （２０１０）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３２：４３７−４４５；  Ｂａｂｂｅ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：３９３−４０４；  Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ，  Ｇ．Ｓ．  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：３５６−３６１）。全身性免疫を損なわずに、個々の自己免疫疾患におけるポリクローナル自己反応性Ｔ細胞特異性（既知または未知）をすべて除去または抑制することは、現在可能ではない。
【０００５】
エクスビボで拡大されたポリクローナルＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の養子移植が、代替的治療手段として提案されている（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２１２：８−２７）。バイスタンダー免疫抑制（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の可能性、インビトロで抗原特異性Ｔｒｅｇ細胞を拡大するための有効な方策の欠如、およびＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の系列の不安定性は、この手段の臨床解釈を妨げている（Ｚｈｏｕ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １０：１０００−１００７；  Ｋｏｍａｔｓｕ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ２０：６２−６８；  Ｂａｉｌｅｙ−Ｂｕｃｋｔｒｏｕｔ，  Ｓ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３９：９４９−９６２）。サイトカインＩＬ−１０およびＩＬ−２１を産生し、および表面マーカーＣＤ４９ｂおよびＬＡＧ−３ならびに転写因子ｃ−Ｍａｆ  ８を発現するＴＲ１  ＦＯＸＰ３−ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞は、ヒト炎症性疾患の処置のために最近開発された別の制御性Ｔ細胞のサブセットを構成する（ＭｃＬａｒｎｏｎ，  Ａ．  （２０１２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．  Ｈｅｐａｔｏｌ．  ９：５５９；  Ｄｅｓｒｅｕｍａｕｘ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １４３：１２０７−１２１７；  Ｒｏｎｃａｒｏｌｏ，  Ｍ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ２４１：１４５−１６３）。しかし、ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞のように、インビボで自己抗原または疾患特異的ＴＲ１様の細胞を拡大することができる薬理学的手段はない。
【０００６】
出願人は、主要組織適合性複合体分子に結合する自己免疫疾患関連（米国特許第８，３５４，１１０号）、胃腸関連（国際公開第２０１３／１４４８１１号）、または癌あるいは腫瘍関連（米国特許第９，５１１，１５１号）のペプチドでコーティングされたナノ粒子の全身送達が、患者からのリンパ球でヒト化されたマウスを含む様々なマウスモデルにおける抗原特異的制御性細胞の生成および増殖を引き起こし、確立された自己免疫現象の解決に導くことを以前に示している。（さらに国際公開第２０１６／１９８９３２号およびＣｌｅｍｅｎｔｅ−Ｃａｓａｒｅｓ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  “Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ，”  Ｎａｔｕｒｅ  ５３０：４３４−４４０）。しかし、安定した抗原特異的Ｔ細胞クローンの必要性、初代細胞の使用に関連する技術的困難および非常に可変な実験間の変動性、ならびに抗原受容体誘発事象の遠位の読み取りの不十分な定量的実験間の再現性を考慮すると、インビトロのｐＭＨＣ結合ナノ粒子およびナノ粒子に結合しないｐＭＨＣ複合体の生物学的効力ならびに拡大効力を測定するためのハイスループット方法は存在しない。
【０００７】
本明細書で提示されたデータは、その天然リガンド（ペプチドＭＨＣクラスＩＩあるいはペプチドＭＨＣクラスＩ分子）に反応する経路依存性レポーターおよび受容体複合体（ＴＣＲとＣＤ４またはＣＤ８共受容体）で形質導入された／トランスフェクトされた細胞株によって初代ＴＣＲ−ＭＨＣペプチド相互作用が正確にインビトロでモデル化されるという予期しない結果をもたらす。図１のＩ対Ｊを参照する。この開示に記載される方法および組成物は、一般に、その同族の受容体あるいはリガンドを発現する細胞と相互作用するリガンドまたは受容体のいずれかを含む、ナノメディシンの効力の測定に適用可能である。例えば、本明細書に記載される方法および組成物は、本明細書に記載されるナノ粒子、ならびに細胞応答をインビボで変更および再プログラムするために展開できる受容体のリガンドを含むナノメディシンを設計するために使用することができる。例えば、β細胞機能は、Ｅ、Ｐ、およびＮ−カドヘリン（ｃａｄｈｅｒｅｉｎｓ）に結合することによって良い影響を受ける。本明細書に記載される方法および組成物は、ナノ粒子およびＥ、Ｐ、またはＮ−カドヘリンを含む、物質の組成物の開発および試験を可能にする。そのような組成物は、Ｍｉｎ６細胞株（グルコース反応性β細胞株）などの適切な細胞株と、グルコースに対するその反応のために選択され得るβ細胞レポーターと合わせることができる。
【０００８】
特定の実施形態では、この開示は、ナノ粒子に随意に結合するｐＭＨＣ複合体のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性あるいは「効力」を測定する組成物および方法を提供する。一態様では、以下をコードする１以上のポリヌクレオチドで形質導入された単離細胞がもたらされる：組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；ＴＣＲ経路依存性レポーター；および、クラスＩあるいはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）リガンドを結合する共受容体。さらなる態様では、細胞はＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体を発現する。さらなる実施形態では、細胞は、共刺激分子および／またはサイトカインの１つ以上の受容体あるいはリガンドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドで形質導入される。
【０００９】
ＭＨＣリガンドの非限定的な例は、以下を結合する受容体の群から選択される：古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣ二量体（Ｆｃ融合）、ＭＨＣ四量体、またはＭＨＣタンパク質の多量体型。一態様では、ポリヌクレオチドはＣＤ８などのＭＨＣクラスＩ共受容体をコードする。他の態様では、ポリヌクレオチドはＣＤ４などのＭＨＣクラスＩＩ共受容体をコードする。ポリヌクレオチドは、随意にポリヌクレオチドの発現を駆り立てる調節エレメントに有効に結合され、さらに随意にエンハンサーエレメントに結合される。
【００１０】
一態様では、Ｔ細胞受容体をコードするポリヌクレオチドは、ＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドに有効に結合される調節エレメントを随意に含有するＴＣＲαおよび／またはＴＣＲβをコードする。これらのポリヌクレオチドは、随意にリボソームスキッピング配列をさらに含むことができる。一態様では、リボソームスキッピング配列は、２Ａリボソームスキッピング配列を含むか、またはさらに本質的にそれからなるか、あるいは代替的にそれからなる。２Ａリボソームスキッピング配列の非限定的な例は、Ｆ２Ａ、ａＴ２Ａ、またはＰ２Ａリボソームスキッピング配列、あるいはその組み合わせを含むか、または代替的に本質的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる。
【００１１】
さらなる態様では、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、遺伝子発現、活性、タンパク質局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用の１つ以上の測定を随意に提供することができるＴＣＲ活性化またはＴＣＲ経路活性化のレポーターである。さらなる態様では、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、あるいは蛍光タンパク質の群から選択されるタンパク質を含むか、または代替的に本質的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる。さらなる態様では、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターを含む。
【００１２】
別の実施形態では、細胞は、随意に、細胞表面（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）上でのＣＤ３シグナル複合体の発現のための制御配列に有効に結合される、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで形質導入された。一実施形態では、細胞はＣＤ３シグナル複合体を内因的に発現しない。
【００１３】
細胞は任意の抗原の活性化能を判定するのに有用であり、そのような例としては、限定されないが、ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）に随意に結合される自己免疫性抗原または癌関連抗原が挙げられる。ｐＭＨＣは、ナノ粒子コアあるいは他の担体に随意に結合される。一態様では、ｐＭＨＣは、随意に、コアへのリンカーによって、またはコア上のコーティングによって、ナノ粒子コアに複合体化される。１ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣの数は、例えば、約１０：１〜約１０００：１まで変動し、および１０：１〜約１０００：１までの幅がある。ナノ粒子コアは、適宜、複数の共刺激分子および／またはサイトカインを随意にさらに含むことができる。
【００１４】
特定の態様では、ｐＭＨＣは、サイトカインおよび／または共刺激分子は、コア上のコーティングによってナノ粒子コアに複合体化された。コーティングは、例えば、ポリマー、随意にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングであってもよく、１つのコア当たりのｐＭＨＣ、サイトカイン、および／または共刺激分子の数は、「密度」あるいはポリマーでコーティングされたナノ粒子コアの１表面積当たりのｐＭＨＣの数によって測定することができる。任意の密度は、例えば、ナノ粒子コアの１表面積当たり約０．０２５のｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１００のｐＭＨＣ／１００ｎｍ２まで測定することができ、ナノ粒子コアの表面積当たり約０．０２５のｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜１００のｐＭＨＣ／１００ｎｍ２までの幅がある。
【００１５】
任意の適切な真核細胞は、必要な要素をコードするポリヌクレオチドで形質導入することができ；そのような非限定的な例としては、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４が挙げられる。細胞は、任意の適切な種、動物、哺乳動物（例えば、ヒト）のものであり得る。さらなる態様では、細胞がＣＤ３鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで形質導入される場合、細胞はＣＤ３鎖シグナル複合体を内因的に発現しない。
【００１６】
本明細書で同定される細胞の集団がさらに提供され、一態様では、実質的に均質である。細胞および細胞の集団を培養する方法が本明細書でさらに提供される。
【００１７】
本開示は、本明細書に記載される単離細胞を調製する方法をさらに提供する。一態様では、該方法は、以下をコードする１つ以上のポリヌクレオチドで単離細胞を形質導入する工程を含むか、または代替的に該工程から本質的になるか、あるいは該工程からさらになる：組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；およびＴＣＲ経路依存性レポーター；ならびにクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）リガンドを結合する共受容体。一実施形態では、方法は、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチドで単離細胞を形質導入することを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。方法は、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、およびクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）リガンドを結合する受容体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドの発現に好都合である条件下で、細胞を培養することをさらに含む。別の実施形態では、方法は、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体の発現に好都合である条件下で、細胞を培養することをさらに含む。
【００１８】
さらなる実施形態では、方法は、以下の１つ以上の受容体またはリガンドを発現する１つ以上のポリヌクレオチドで細胞を形質導入することをさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる：複数の共刺激分子、複数の共同刺激抗体、複数の抑制受容体遮断抗体、および／または複数のサイトカイン。
【００１９】
受容体および形質導入されたポリヌクレオチドの発現産物を発現する細胞は、例えば、フローサイトメトリーなどの当技術分野において既知の方法によって、発現産物を結合する探知可能に標識されたリガンドおよび／または抗体を使用した、当技術分野において既知の任意の適切な方法によって同定することができる。
【００２０】
細胞の形質導入時に、細胞は、ポリヌクレオチドの発現に好都合な条件下で、および細胞の集団の産生のために成長する。
【００２１】
細胞および細胞集団は、組成物を、受容体をリガンドに結合するのに好都合である本明細書に記載される単離細胞と接触させ、その後、レポーターにより生成された任意のＴＣＲ経路依存性レポーターシグナルを検出することによって、抗原−ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）（随意にナノ粒子コアに結合される）、ならびに随意に、共刺激分子および／またはサイトカインを含む組成物のアゴニスト活性またはアンタゴニスト活性を測定するインビトロの方法に有用である。当業者にとって明白なように、組成物および細胞は可能性のある相互作用について選択され、例えば、組成物はｐＭＨＣクラスＩＩ特異的ＴＣＲ分子を含有し、細胞はＭＨＣクラスＩＩ共受容体（例えば、ＣＤ４）を発現する。
【００２２】
一態様では、細胞を組成物と接触させた後、細胞または集団によって生成された任意のレポーターシグナルを定量化する。測定された反応を分類化し、その後、アゴニスト活性あるいはアンタゴニスト活性の決定前測定値（ｐｒｅ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）および／または決定後測定値（ｐｏｓｔ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を用いて定量化されたシグナルと比較して、他の治療または組成物に対する治療の有効性をモニターすることができる。組成物が共刺激分子および細胞を含み、かつ細胞集団が適切な受容体を発現する場合、測定された反応を分類化し、その後、拮抗する活性の決定前測定値および／または決定後測定値で数量化されたシグナルと比較して、他の治療または組成物に対する治療の有効性をモニターすることができる。
【００２３】
したがって、本開示の特定の態様は、本明細書に記載される単離された形質導入細胞または形質導入細胞集団、単離された複合体を少なくとも含み、ここで、該単離された複合体は、該複数のｐＭＨＣ複合体に結合されるナノ粒子コアを含むか、または代替的にそれから実質的になるか、あるいはそれからさらになり、ここで、該ナノ粒子コアは随意に、ナノ粒子コアに結合される１以上の共刺激分子および／または１以上のサイトカインをさらに含むか、またはそれらからさらになるか、あるいは代替的にそれから実質的になる。
【００２４】
複数の複合体を含有するこのような組成物について、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体のＭＨＣは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の結合価は互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価は、互いに同じまたは異なるものである。
【００２５】
一態様では、以下を含む組成物が本明細書記載され、該組成物は：（ａ）（ｉ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターを含む少なくとも１つの細胞であって、ここで、該組み換えＴＣＲは主要組織適合性（ＭＨＣ）分子に結合される疾患関連抗原に特異的である、少なくとも１つの細胞と；ならびに（ｂ）ナノ粒子に結合されたＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原を含むナノメディシンと、を含む。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される。ある実施形態では、ＭＨＣ分子に結合される疾患関連抗原は、１０：１以上の比率でナノ粒子に結合される。ある実施形態では、ナノ粒子は、１ナノメートル〜１００ナノメートルの直径を有する。ある実施形態では、ナノ粒子は金属コアを含む。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、喘息またはアレルギー喘息の抗原、Ｉ型糖尿病抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらのその組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせを含むリストから選択されるポリヌクレオチド配列からなる。ある実施形態では、少なくとも１つの細胞は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４から選択される。ある実施形態では、疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１〜３５２のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３〜４５５のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳さ���る。ある実施形態では、単一のポリペプチドのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５６〜５２３のいずれか１つにおいて記載される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、５３３、あるいは５３８のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は別個のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖であって、ここで、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６  ５３９、５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、あるいは１００％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、または５４２のいずれか１つと、少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は細胞の表面で発現される。ある実施形態では、細胞は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、該少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドはＩＲＥＳ核酸配列を含む。ある実施形態では、該ＩＲＥＳ核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６のいずれか１つにおいて記載される。ある実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２あるいは５５７のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％  ９０％  ９５％、１００％相同する核酸配列を含む。ある実施形態では、組成物は、ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用するためのものである。ある実施形態では、ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである。
【００２６】
他の態様では、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴ細胞受容体経路依存性レポーターを含む細胞が本明細書に記載され、ここで、組み換えＴ細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは能動的に転写される。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、喘息またはアレルギー喘息の抗原、Ｉ型糖尿病抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらのその組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ遺伝子、βラクタマーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子の転写を活性化する。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ならびにそれらの組み合わせからなるリストから選択されるポリヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、細胞は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４から選択される。ある実施形態では、疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜３５２のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、疾患関連抗原は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５３〜４５５のいずれか１つおよびそれらの組み合わせからなるポリペプチドである。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、単一のポリペプチドのＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、リボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、リボソームスキッピング配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５６〜５２３のいずれか１つにおいて記載される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７、５３３、あるいは５３８のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は別個のポ���ペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖であって、ここで、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６  ５３９、５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、ならびに、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、あるいは５４２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は細胞の表面で発現される。ある実施形態では、細胞は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、該少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドはＩＲＥＳ核酸配列を含む。ある実施形態では、該ＩＲＥＳ核酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６のいずれか１つにおいて記載される。ある実施形態では、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２あるいは５５７のいずれか１つに記載のものと少なくとも８０％  ９０％  ９５％、または１００％相同する核酸配列を含む。ある実施形態では、細胞は細胞の集団である。ある実施形態では、細胞または細胞の集団は、ナノメディシンの効力または活性を判定する際にインビトロで使用される。ある実施形態では、ナノメディシンはヒト個体で使用するためのものである。
【００２７】
他の態様では、ナノ粒子に結合されるＭＨＣ分子に結合する疾患関連抗原を含む、ナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロでの方法が本明細書に記載され、該方法は：（ａ）ナノメディシンを本明細書に記載される細胞または細胞の集団と接触させる工程と；（ｂ）Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、を含む。ある実施形態では、ナノメディシンは複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、該複数のナノ粒子は、ナノ粒子に結合されたＭＨＣ分子に結合される複数の疾患関連抗原を含む複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、疾患関連抗原は自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原である。ある実施形態では、自己免疫性疾患関連抗原または炎症性疾患関連抗原は、Ｉ型糖尿病抗原、喘息またはアレルギー喘息の抗原、多発性硬化症抗原、末梢神経障害抗原、原発性胆汁性肝硬変抗原、視神経脊髄炎スペクトル障害抗原、全身硬直症候群抗原、自己免疫性脳炎抗原、尋常性天疱瘡抗原、落葉状天疱瘡抗原、乾癬抗原、シェーグレン病／症候群抗原、炎症性腸疾患抗原、関節炎または関節リウマチの抗原、全身性エリテマトーデス抗原、強皮症抗原、ＡＮＣＡに関連脈管炎抗原、グッドパスチャー症候群抗原、川崎病抗原、セリアック病、自己免疫性心筋症抗原、重症筋無力症抗原、自己免疫性ブドウ膜炎抗原、グレーヴス病抗原、抗リン脂質抗体症候群抗原、自己免疫性肝炎抗原、硬化性胆管炎抗原、原発性硬化性胆管炎抗原、慢性閉塞性肺疾患抗原、あるいはブドウ膜炎関連抗原、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される。ある実施形態では、複数のナノ粒子は、約１ナノメートル〜約１００ナノメートルの直径を有する複数のナノ粒子を含む。ある実施形態では、該方法は、Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターのシグナルを定量化する工程をさらに含む。ある実施形態では、定量化は、最大応答の約５０％である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定する工程を含み、ここで、該最大応答とは、複数の濃度のナノメディシンが細胞または細胞の集団と接触する時に、細胞または細胞の集団と接触するナノメディシンの最高濃度で開始される応答である。ある実施形態では、ナノメディシンの複数の濃度は、同じアッセイ中の細胞または細胞の集団と接触する。ある実施形態では、定量化は、陰性対照の少なくとも約２００％である応答を開始するナノメディシンの濃度を判定することを含み；ここで、該陰性対照は、細胞または細胞の集団の組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と特異的に相互作用しないナノメディシンを含む。ある実施形態では、シグナルは酵素によって生成される。ある実施形態では、酵素はルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼである。ある実施形態では、シグナルは蛍光シグナルである。ある実施形態では、該方法は、製造プロセスの品質管理工程として利用される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
以下の図面は、本明細書の部分を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれら図面の１つ以上を参照することによって、より良く理解され得る。
【００２９】
【図１Ａ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ａは、ｐＭＨＣ結合価およびＮＰ数に応じて、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＳＦＰに応答した８．３のＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｂ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｂは、アッセイ中のｐＭＨＣ濃度に応じて、図１ＡからのＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＳＦＰのアゴニスト特性を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｃ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｃ−１Ｄは、アッセイ中のｐＭＨＣ−ＮＰ（図１Ｃ）またはｐＭＨＣ濃度（図１Ｄ）に応じて、２つの異なるＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ結合価と結合されたＰＦに応答した８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｄ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｃ−１Ｄは、アッセイ中のｐＭＨＣ−ＮＰ（図１Ｃ）またはｐＭＨＣ濃度（図１Ｄ）に応じて、２つの異なるＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ結合価と結合されたＰＦに応答した８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｅ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｅ−Ｆは、ｐＭＨＣ−ＮＰ（図１Ｅ）またはｐＭＨＣ濃度（図１Ｆ）に応じて、低いＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ結合価でコーティングされた小さな（ＳＦＰ）ＶＳより大きな（ＰＦ）ＮＰのアゴニスト特性の比較を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｆ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｅ−Ｆは、ｐＭＨＣ−ＮＰ（図１Ｅ）またはｐＭＨＣ濃度（図１Ｆ）に応じて、低いＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ結合価でコーティングされた小さな（ＳＦＰ）ＶＳより大きな（ＰＦ）ＮＰのアゴニスト特性の比較を示す。図１Ａ−１Ｆのデータは、三通り作ったウェル（エラーバーは、通常、データを表示するために使用されるシンボルのサイズよりも小さかった）中のＩＦＮγ分泌の平均の＋ＳＥＭ値に相当し、各パネルは少なくとも３つの独立した実験からの１つの代表に対応する。陰性対照は、ＮＰ（つまり、Ａ中の５０×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の高濃度で、非結合ＮＰまたはシステイン結合ＮＰの使用を含み、０のＩＦＮγ値をもたらす。
【図１Ｇ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｇは、ｐＭＨＣ−ＮＰ（上）またはｐＭＨＣ濃度（下）に応じて、ＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋Ｔ細胞上の１０の異なるＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７結合価で結合されたＰＦ  ＮＰのアゴニスト特性の比較を示す。示されたデータは、１つの実験に対応する。５および１０μｇのｐＭＨＣに関するデータをさらに２回繰り返し、同様の結果を得た。陰性対照として、出願人は、１０ｐＭＨＣ／ＮＰ調製物（９５ｘ１０１１ＮＰ／ｍＬ）の１０μｇのｐＭＨＣ／ｍＬのものと同等の鉄の濃度でシステイン結合ＮＰを使用し、０のＩＦＮγ値を得た。
【図１Ｈ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｈは、１０μｇ／ｍＬ（左）および５μｇ／ｍＬ（右）（ほぼ最大のアゴニスト活性の濃度をもたらすｐＭＨＣ）で、ＰＦ  ＮＰ（閾値より下、閾値、最小最適、および閾値を超える密度に基づいてグループ化された）上のＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７結合価と密度（それぞれ上と下の横軸）とアゴニスト活性上のＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋Ｔ細胞との間の関係を示す。閾値より下／閾値ＶＳ最小最適な結合価／閾値上の結合価の間のＰ値は、マン・ホイットニーのＵ検定によって計算された。
【図１Ｉ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｉは、ＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−ＰＦ−Ｍ（１２．５μｇ／ｍＬ）、溶解可能な抗ｈＣＤ３εｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）、およびＰＭＡ／イオノマイシンでの様々な期間の刺激に応答した、ＢＤＣ２．５−ＴＣＲ／ｍＣＤＡ／ＮＦＡＴルシフェラーゼ表現ＪｕｒＭＡ細胞中のルシフェラーゼ活性（三通りの平均＋ＳＥＭ）を示す。ＲＬＵ（相対的な光の単位）。陰性対照として、出願人は、１０ｐＭＨＣ／ＮＰ調製物（４５．５×１０１１ＮＰ／ｍＬ）の５μｇのｐＭＨＣ／ｍＬのものと同等の鉄の濃度でシステイン結合ＮＰを使用して、１．０５のＲＬＵを得た。示されたデータは、１つの刺激条件当たり少なくとも３つの独立した実験の代表である。条件間のＰ値は、二元配置分散分析によって計算された。
【図１Ｊ】図１Ａ−１Ｊは、Ｔ細胞アゴニスト活性およびＴＣＲシグナル伝達に対するＮＰサイズならびにｐＭＨＣ結合価の効果を示す。図１Ｊは、５μｇ／ｍＬでの、ＰＦ  ＮＰ（閾値より下、閾値、最小最適、および閾値を超える密度に基づいてグループ化された）上のＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７結合価およびＢＤＣ２．５−ＴＣＲ／ｍＣＤ４／ＮＦＡＴルシフェラーゼ表現ＪｕｒＭＡ細胞上のアゴニスト活性と密度との関係を示す（それぞれ上と下の横軸）。Ｐ値はマン・ウィットニーＵによって計算された。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、同族Ｔ細胞に結合するｐＭＨＣ−ＮＰの略図を示す。図２Ａの上パネルは：４つの密にコーディングされたｐＭＨＣ−ＮＰ（それぞれ４ｎｍずつ間隔を置いたｐＭＨＣ単量体を保持する）に結合する、１４０ｎｍ（４ｎｍの球状のサイズのＴＣＲαβおよび５ｎｍの間隔を仮定して）に及ぶ１６単位からなるＴＣＲナノクラスタの略図である。下パネルの模式図は、ＮＰの観点から見られるように、これらの４つのｐＭＨＣ−ＮＰがＴＣＲの島（左）またはナノクラスタ（右）とどのように相互作用するかを例証する。図２Ｂは、全体の結合能、ｐＭＨＣ−ＴＣＲ関連率および解離率、ならびに動的校正と協同的ＴＣＲシグナル伝達モデルの両方を考慮に入れて、閾値を超える、閾値、および閾値より下の結合価でコーティングされたｐＭＨＣ−ＮＰ（左）およびクラスタ中でＴＣＲシグナル伝達を誘発するそれらの相対的な能力を例証する。これらのクラスタ中の近接しているＴＣＲヘテロ二量体を結合することができるｐＭＨＣ−ＮＰは、ＴＣＲシグナル伝達の誘発に効率的である。これらのモデルは、緊密に並置されたｐＭＨＣでコーティングされた小さなＮＰが最適な免疫学的特性を有する理由を説明する。
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ａおよび３Ｂは、閾値を超えるｐＭＨＣ密度（４６ｐＭＨＣ／ＮＰ）でコーティングされたＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−Ｖ７ならびにＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍでそれぞれインキュベートされた、ＢＤＣ２．５ｍｉＣＤ４＋（図３Ａ）または８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３Ｂ）の２Ｄ  ＴＥＭ画像を示す。図３Ａ中の２つの右パネルおよび図３Ｂ中の４つの右パネルは、３７°Ｃで３時間のインキュベーション後の細胞内小胞中のＮＰの存在を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ａおよび３Ｂは、閾値を超えるｐＭＨＣ密度（４６ｐＭＨＣ／ＮＰ）でコーティングされたＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−Ｖ７ならびにＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍでそれぞれインキュベートされた、ＢＤＣ２．５ｍｉＣＤ４＋（図３Ａ）または８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞（図３Ｂ）の２Ｄ  ＴＥＭ画像を示す。図３Ａ中の２つの右パネルおよび図３Ｂ中の４つの右パネルは、３７°Ｃで３時間のインキュベーション後の細胞内小胞中のＮＰの存在を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ｃは、非同族ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−ＭおよびＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−ＰＦ−Ｍでそれぞれインキュベートされた、ＢＤＣ２．５ｍｉ−ＣＤ４＋ならびに８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞の２Ｄ  ＴＥＭ画像を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ｄの左パネル：３Ｄ画像：ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍ−Ａｌｅｘａ−６４７で４°Ｃで３０分間インキュベートされた、８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞の超解像顕微鏡法。中間パネルと右パネル：２Ｄの画像：４°Ｃで３０分間、および４°Ｃで３０分間、その後、３７°Ｃで１時間インキュベートされたＴ細胞。ヒストグラムプロットは、インキュベーションの時間および温度（１７９．１±４．６ｎｍ〜４０１．７±４．２ｎｍ；ｎ＝１００クラスタ／条件；Ｐ値はマン・ウィットニーＵにより計算）と共に、ＮＰクラスタの直径が増大することを示す。薄いグレー：ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−ＭＡｌｅｘａ−６４７；濃いグレー：ＤＡＰＩ。棒：１μｍ。
【図３Ｅ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ｅおよび３Ｆは、閾値より下の１０ｐＭＨＣ／ＮＰを保有するＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−ＰＦ−Ｍ調製物でインキュベートされたＢＤＣ２．５ｍｉ−ＣＤ４＋Ｔ細胞の２Ｄ  ＴＥＭ画像を示し；（ｅ）または閾値（２４ｐＭＨＣ／ＮＰ；（ｆ）ｐＭＨＣ結合価。図３Ｅおよび図３Ｆは、左の４枚のパネルがＴ細胞膜上のマイクロクラスタの不在（ｅ）または存在（ｆ）を示す。図３Ｅおよび図３Ｆの２つの右パネルが、細胞内小胞の存在を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ｅおよび３Ｆは、閾値より下の１０ｐＭＨＣ／ＮＰを保有するＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−ＰＦ−Ｍ調製物でインキュベートされたＢＤＣ２．５ｍｉ−ＣＤ４＋Ｔ細胞の２Ｄ  ＴＥＭ画像を示す；（ｅ）または閾値（２４ｐＭＨＣ／ＮＰ；（ｆ）ｐＭＨＣ結合価。図３Ｅおよび図３Ｆは、左の４枚のパネルがＴ細胞膜上のマイクロクラスタの不在（ｅ）または存在（ｆ）を示す。図３Ｅおよび図３Ｆの２つの右パネルが、細胞内小胞の存在を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ−３Ｇは、ｐＭＨＣ密度に応じて、同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性結合およびクラスタ化を示す。図３Ｇは、（５９．５±６．５ｎｍ）、（２７１．２±１７．３ｎｍ）、および（３７０±２１．３ｎｍ）でコーティングされたｐＭＨＣ−ＮＰの存在下において、培養された細胞中のマイクロクラスタの平均サイズを示し；（ｎ＝９−１５の細胞／条件上の５０−６０のクラスタ）。Ｐ値は、マン・ウィットニーＵにより計算された。この図でされる実験は反復可能であり、一貫した結果で再現することができる。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いた同族Ｔ細胞上のｐＭＨＣ−ＮＰの持続性のクラスタ化を示す。図４Ａは、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍの不在下（左）または存在下（右）における８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞の３Ｄ  ＳＥＭ画像を示す。拡大率、１００，０００Ｘ；棒：５００ｎｍ。黒い破線は代表的なｐＭＨＣ−ＮＰクラスタに対応する。図４ＢはＥＤＳ分光分析を示す。拡大したＳＥＭ画像中で示される３つの代表的なクラスタを含有する（ａ−ｃ）およびクラスタを含有しない（ｄ−ｆ）膜面積が、ＥＤＳおよびヒストグラムとしてプロットされたデータによって分析された。Ｐ値はマン・ホイットニーＵ検定により得られた。
【図５】図５は、効力アッセイのアッセイ間の変動性の結果を示す。
【図６Ａ】図６は、ｐＭＨＣがＴ細胞株を刺激する能力に対する血清および抗−ｐＭＨＣ−ＮＰ成分抗体の効果を判定するために、効力アッセイを使用した結果を示す。ｐＭＨＣ−ＮＰ、図６Ｃおよび図６Ｄに示されるようにヒト血清でプレインキュベートされたか、あるいは図６Ａまたは６Ｂに示されるようにヒト血清なしでインキュベートされ；その後、示された抗体あるいはウサギ高度免疫（Ｈ．Ｉ）血清でインキュベートされた。それぞれの抗体は、図６Ｂおよび図６Ｄにおける血清の１：１０、１；１００、および１：１０００の希釈（左から右）で、ならびに１：１、１：４、および１：１６のＡｂ：ｐＭＨＣのモル比（左から右）で示されるような細胞およびｐＭＨＣでインキュベートされた。棒は標準偏差を示す。
【図６Ｂ】図６は、ｐＭＨＣがＴ細胞株を刺激する能力に対する血清および抗−ｐＭＨＣ−ＮＰ成分抗体の効果を判定するために、効力アッセイを使用した結果を示す。ｐＭＨＣ−ＮＰ、図６Ｃおよび図６Ｄに示されるようにヒト血清でプレインキュベートされたか、あるいは図６Ａまたは６Ｂに示されるようにヒト血清なしでインキュベートされ；その後、示された抗体あるいはウサギ高度免疫（Ｈ．Ｉ）血清でインキュベートされた。それぞれの抗体は、図６Ｂおよび図６Ｄにおける血清の１：１０、１；１００、および１：１０００の希釈（左から右）で、ならびに１：１、１：４、および１：１６のＡｂ：ｐＭＨＣのモル比（左から右）で示されるような細胞およびｐＭＨＣでインキュベートされた。  棒は標準偏差を示す。
【図６Ｃ】図６は、ｐＭＨＣがＴ細胞株を刺激する能力に対する血清および抗−ｐＭＨＣ−ＮＰ成分抗体の効果を判定するために、効力アッセイを使用した結果を示す。ｐＭＨＣ−ＮＰ、図６Ｃおよび図６Ｄに示されるようにヒト血清でプレインキュベートされたか、あるいは図６Ａまたは６Ｂに示されるようにヒト血清なしでインキュベートされ；その後、示された抗体あるいはウサギ高度免疫（Ｈ．Ｉ）血清でインキュベートされた。それぞれの抗体は、図６Ｂおよび図６Ｄにおける血清の１：１０、１；１００、および１：１０００の希釈（左から右）で、ならびに１：１、１：４、および１：１６のＡｂ：ｐＭＨＣのモル比（左から右）で示されるような細胞およびｐＭＨＣでインキュベートされた。  棒は標準偏差を示す。
【図６Ｄ】図６は、ｐＭＨＣがＴ細胞株を刺激する能力に対する血清および抗−ｐＭＨＣ−ＮＰ成分抗体の効果を判定するために、効力アッセイを使用した結果を示す。ｐＭＨＣ−ＮＰ、図６Ｃおよび図６Ｄに示されるようにヒト血清でプレインキュベートされたか、あるいは図６Ａまたは６Ｂに示されるようにヒト血清なしでインキュベートされ；その後、示された抗体あるいはウサギ高度免疫（Ｈ．Ｉ）血清でインキュベートされた。それぞれの抗体は、図６Ｂおよび図６Ｄにおける血清の１：１０、１；１００、および１：１０００の希釈（左から右）で、ならびに１：１、１：４、および１：１６のＡｂ：ｐＭＨＣのモル比（左から右）で示されるような細胞およびｐＭＨＣでインキュベートされた。棒は標準偏差を示す。
【図７】図７Ａ−Ｄは、ＩＧＲＰ１３−２５ポリペプチドで複合体化されるＤＲに特異的なＴＣＲを発現するＧＦＰ標識ＪＵＲＭＡ細胞のフローサイトメトリーを示す。図７Ａは細胞株自体を示し；図７Ｂは、標準ロイシンジッパー二量体化技術によって作られたＰＥ標識ＤＲ３  ＩＧＲＰ１３−２５でインキュベートされた細胞株を示し；図７Ｃは、ロイシンジッパーを欠く、ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）およびｃｙｓ補足の二量体化技術を使用して作られたＰＥ標識ＤＲ３  ＩＧＲＰ１３−２５でインキュベートされた細胞株を示し；図７Ｄは、無関係なＰＥ標識ＭＨＣクラスＩＩヘテロ二量体でインキュベートされた細胞株を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、ナノ粒子と結合されるＩＧＲＰ１３−２５ポリペプチドで複合体化されたＤＲに特異的なＴＣＲを発現するＪＵＲＭＡ細胞の刺激を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
一態様では、組成物が本明細書に記載され、該組成物は：（ａ）（ｉ）ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）組み換えＴＣＲは主要組織適合性（ＭＨＣ）分子に結合される疾患関連抗原に特異的であるＴ細胞受容体経路依存性レポーターを含む少なくとも１つの細胞と；（ｂ）ナノ粒子に結合されるＭＨＣ分子に結合された疾患関連抗原を含むナノメディシンと、を含む。
【００３１】
他の態様では、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴ細胞受容体経路依存性レポーターを含む、細胞が本明細書に記載され、ここで、組み換えＴ細胞受容体は、主要組織適合性分子に結合される疾患関連抗原に特異的である。
【００３２】
他の態様では、ナノ粒子に結合されるＭＨＣ分子に結合された疾患関連抗原を含むナノメディシンのアゴニスト活性を測定するインビトロの方法が本明細書に記載され、該方法は：（ａ）ナノメディシンを本明細書に記載される細胞または細胞の集団と接触させる工程と；（ｂ）Ｔ細胞受容体経路依存性レポーターによって生成されたシグナルを検出する工程と、を含む。
【００３３】
この開示全体にわたって、およびこの開示内では、この開示が関連する最先端技術をより十分に説明するために技術文献および特許文献を参照する。一部の公報はアラビア数字によって識別され、公報の完全な書誌情報は請求項の直前の参照セクションで見られる。この開示が関係する最先端技術をより十分に説明するために、すべての公報は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本開示は、記載される特定の実施形態に制限されず、当然ながら異なり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみについて説明するためのものであり、且つ、本開示の範囲が添付の請求項のみによって制限されないことから、制限を意図するものではないことも理解されたい。
【００３５】
本明細書や添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈で特段の定めのない限り、複数の指示物を含んでいる。故に、例えば「賦形剤（ａｎ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」への言及は、複数の賦形剤を含む。用語「少なくとも１つ」は１以上を意図する。
【００３６】
本出願の全体にわたって、用語「約」は、値を判定するために利用されている装置または方法に関する誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。用語「約」は、範囲を含む数の指定（例えば、温度、時間、量、および濃度）の前に使用される場合、最大１０％（＋）または（−）で異なり得る近似を示す。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本開示の属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用されるように、以下の用語は以下の意味を有している。
【００３８】
本明細書で使用されるように、用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他の要素は除外しないことを意味するように意図されている。「〜から実質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、明示された目的のための組み合わせに不可欠な有意性の他の要素を除くことを意味する。故に、本明細書で定義されるような要素から実質的になる組成物は、多発性硬化症を処置または予防するための組成物などの、請求された開示の基本的かつ新しい特徴には実質的に影響しない他の材料または工程を除外するものではない。「〜からなる」は、他の成分および実質的な方法の工程の微量元素より多くを除外することを意味する。このような移り変わる用語（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｔｅｒｍ）の各々により定められる実施形態は、本開示の範囲内である。
【００３９】
「生体適合性」とは、送達システムの構成要素がヒト生体系に組織損傷または損傷を引き起こさないことを意味する。生体適合性を付与するために、ヒトにおける安全な使用の履歴を有しており、またはＧＲＡＳ（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ａｃｃｅｐｔｅｄ  Ａｓ  Ｓａｆｅ）の状態を伴うポリマーおよび賦形剤が優先的に使用される。「生体適合性」とは、組成物に使用される成分および賦形剤が最終的に「生体吸収」されるか、または身体への悪影響無しに身体により取り除かれることを意味する。組成物が生体適合性であり、かつ無毒であると見なされるためには、細胞に毒性を引き起こしてはならない。同様に、用語「生体吸収可能な」とは、患者における材料の長期間の蓄積が回避されるように、一定期間にわたりインビボで生体吸収を受ける材料から作られるナノ粒子を指す。ある実施形態において、生体適合性ナノ粒子は、２年未満の期間、好ましくは１年未満、更に好ましくは６か月未満にわたり生体吸収される。生体吸収の速度は、粒子の大きさ、使用される材料、および当業者に十分認識されている他の要素に関連する。生体吸収可能で生体適合性の材料の混合物が、本開示に使用されるナノ粒子コアを形成するために使用されてもよい。一実施形態において、酸化鉄と、生体適合性で生体吸収可能なポリマーとが組み合わされ得る。例えば、ナノ粒子を形成するために酸化鉄とＰＧＬＡとが組み合わされ得る。
【００４０】
用語「主要組織適合性複合体」または「ＭＨＣ」は、抗原関連免疫細胞を形成する抗原と関連する能力を持っている免疫細胞上の抗原提示分子を指す。いくつかの実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩまたはＩＩの分子である。いくつかの実施形態では、ＭＨＣは、古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣ二量体（Ｆｃ融合）、ＭＨＣ四量体、またはＭＨＣタンパク質のタンパク質の多量体型を含むか、それからなるか、あるいはそれから本質的になる。ＭＨＣ結合細胞表面分子はＣＤ４およびＣＤ８から選択される。
【００４１】
ポリペプチド／抗原−ＭＨＣ−ナノ粒子の複合体（「ＮＰ複合体」または「複合体」あるいは「ｐＭＨＣ−ＮＰ」または「ナノ粒子複合体」）は、ナノ粒子コアなどの表面上でＭＨＣ分子によって提示される、ペプチド、炭水化物、脂質、または他の抗原部分、フラグメント、あるいは抗原分子かタンパク質のエピトープ（すなわち、自己ペプチドまたは自己抗原）の提示を指す。
【００４２】
「ナノ粒子コア」は、層またはコーティングを含むか、または含まないナノ粒子基質である。ナノ粒子複合体は、少なくともｐＭＨＣ複合体がコアに結合されているコアを含む。ナノ粒子コアは、様々な材料のいずれかから作ることができ、および生体適合性であり得る。
【００４３】
本明細書で使用されるように、用語「活性化Ｔ細胞核内因子」または「ＮＦＡＴ」は、免疫応答（例えば、Ｔ細胞調節免疫応答を活性化する）において重要であると示される転写因子のファミリーに適用される一般名である。免疫系は、限定されないが、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、およびＮＦＡＴ５を含む、ＮＦＡＴファミリーメンバーの１以上のメンバーを発現することができる。ＮＦＡＴｃ１〜ＮＦＡＴｃ４は、カルシウムシグナル伝達によって調節される。カルモジュリン（ＣａＭ）（既知のカルシウムセンサータンパク質）がセリン／トレオニン  ホスファターゼ  カルシニューリン（ＣＮ）を活性化するので、カルシウムシグナル伝達はＮＦＡＴ活性化に重要である。ＮＦＡＴタンパク質の核内移行は、核中の輸送キナーゼ（ｅｘｐｏｒｔ  ｋｉｎａｓｅｓ）および細胞質中の維持キナーゼによって対抗される。ＰＫＡおよびＧＳＫ−３βなどの輸送キナーゼは、ＮＦＡＴ核内繋留のために不活性化されなければならない。一実施形態では、ＮＦＡＴ転写因子は、ｒａｓ−ＭＡＰＫまたはＰＫＣなどの他のシグナル伝達経路を用いたカルシウムシグナルの統合および一致検出を可能にする。
【００４４】
本明細書で使用されるように、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、ＭＨＣ分子によって提示された時、ペプチドを認識することができる分子を指す。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、Ｔ細胞受容体α−鎖（ＴＣＲα）およびＴ細胞受容体β−鎖（ＴＣＲβ）を含むヘテロ二量体であり、各鎖は、可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域、膜貫通ドメイン、ならびに細胞質ドメインを含む。ＶおよびＣの領域は、免疫グロブリンＶおよびＣの領域に通常相同であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。両方のＴＣＲ鎖は、ＴＣＲを提示する細胞の細胞膜に固定される。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲγ−鎖（ＴＣＲγ）およびＴＣＲδ−鎖（ＴＣＲδ）を含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態において、ＴＣＲは単鎖ＴＣＲ構築物である。ＴＣＲαの非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＢ３１８８０．１、ＡＡＢ２８３１８．１、ＡＡＢ２４４２８．１、およびＡＤＷ９５８７８．１、ならびにその各々の等価物）。ＴＣＲβの非限定的な例もＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＢ３１８８７．１、ＡＫＧ６５８６１．１、ＡＤＷ９５９０８．１およびＡＡＭ５３４１１．１、ならびにその各々の等価物）。一実施形態では、ＴＣＲγ−鎖は、ＧｅｎＢａｎｋで見られる１つ以上の配列を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＭ２１５３３．１、ＤＡＡ３０４４９．１およびＡＢＧ９１７３３．１、ならびにその各々の等価物）。一実施形態では、ＴＣＲδ−鎖は、ＧｅｎＢａｎｋで見られる１つ以上の配列を含む（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｑ７ＹＲＮ２．１、ＡＡＣ４８５４７．１、ＪＣ４６６３およびＮＰ＿００１００９４１８．１、ならびに各々の等価物）。単鎖ＴＣＲは当技術分野において既知である。単鎖ＴＣＲの非限定的な例は、ＷＯ１９９６０１８１０５およびＵＳ２０１２０２５２７４２に開示され、その各々は、参照によってその全体が組み込まれる。一実施形態では、ポリヌクレオチドおよびＴＣＲβのポリペプチド配列は、下で提供される例示的な配列表で列挙され、ＴＣＲβのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドの等価物である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＴＣＲはＣＤ３と関連し、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体（またはＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を形成する。これらの実施形態では、細胞は、αおよびβのＴＣＲ鎖、ＣＤ３γ、δ、およびεのポリペプチド、ならびにζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになるポリペプチドによって形成される、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体をコードする１つ以上のポリヌクレオチドで形質導入される。様々なモジュールで形成され、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。これらの実施形態では、複合体は、主に、ＣＤ３およびζの鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｅｒ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ）（「ＩＴＡＭ」）の存在を介したシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原、超抗原、または抗体（例えば、抗受容体抗体）によって刺激されたＴＣＲシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の外因的発現は、ＣＤ３陰性細胞におけるＴＣＲシグナル伝達経路を促進する。ＣＤ３陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、ＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−４７２）、Ｎｋ−９２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＳ−ＣＲＬ−３０００）、およびＪｅＫｏ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−３００６）を含む。
【００４６】
本明細書で使用されるように、用語「単離細胞」は、ｐＭＨＣに結合されるナノ粒子を含む検査剤の効力を評価するために提供される細胞を指す。一実施形態では、細胞は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、またはＭｏｌｔ−４から選択されたＴ系列細胞である。それらは、任意の適切な種（例えば、動物、哺乳動物、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、またはヒツジ）であってもよい。別の実施形態では、単離細胞は、免疫細胞などのエフェクター細胞である。いくつかの実施形態において、エフェクター細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ関連ＣＤ３マルチユニット鎖複合体、および／またはＴＣＲ経路依存性レポーター、およびＣＤ４またはＣＤ８の受容体を発現する。さらなる態様では、細胞は、さらに共刺激分子および／またはサイトカインに対する受容体も発現する。ある実施形態では、ＴＣＲはマウス化される（つまり、ＴＣＲはマウスＣＤ４分子と相互作用するように最適化される）。
【００４７】
本明細書で使用されるように、用語「レポーター」は、特性（例えば、活性、発現、局在化、相互作用、修飾など）を有する単離細胞上の、または単離細胞内の要素を意味し、その要素は以下の１つ以上であり：細胞の生理学的変化または疾病に依存するか、相関するか、またはそれによって活性化される。例えば、「ＴＣＲ経路依存性レポーター」は、細胞上の、または細胞内の要素を指し、その特性は活性化されるか、あるいはＴＣＲ経路の活性化または調節に依存する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、上流転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター（例えば、ＮＦＡＴ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、およびＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター）によって活性化される。一実施形態では、レポーター（例えば、ＴＣＲ経路依存性レポーター）は、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、数量化できる遺伝子産物、および／またはそれらの組み合わせからなる群から選択されたタンパク質をコードする遺伝子を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。
【００４８】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＤ３」（分化のクラスタ３）は、Ｔ細胞受容体に関連するタンパク質複合体を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ３に対して作られる抗体は、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成することができる。限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７を含む他のＴ細胞活性化リガンドも使用することができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３は４つの別個の鎖を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる。哺乳動物について、４つの別個の鎖は以下のとおりである：ＣＤ３ｇａｍｍａ、ＣＤ３ｄｅｌｔａ、ＣＤ３ｅｐｓｉｌｏｎとＣＤ３ｚｅｔａ。ＣＤ３鎖の非限定的な例はＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＣＡＡ７２９９５．１、ＡＡＩ４５９２７．１、ＮＰ＿９９８９４０．１、ＡＡＢ２４５５９．１、ＮＰ＿０００７２３．１、ＡＥＱ９３５５６．１、およびＥＡＷ６７３６６．１）。
【００４９】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＤ４」（分化のクラスタ４）は、免疫細胞（例えば、ヘルパーＴ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞）の表面で見られる糖タンパク質を指す。いくつかの実施形態において、ＣＤ４はＴＣＲに対する共受容体として作用し、チロシンキナーゼ（例えば、Ｌｃｋ）を補充する。ＣＤ４の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＣ３６０１０．１、ＣＡＡ７２７４０．１、ＡＦＫ７３３９４．１、ＣＡＡ６０８８３．１、およびＡＡＨ２５７８２．１）。ＣＤ４の例示的なポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、以下で提供される例示的な配列表に列挙される。
【００５０】
用語「リボソームスキッピング配列」は、遺伝子配列が別々のポリペプチド（として翻訳される（つまり、ビシストロニック（ｂｉｓｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）または多シストロン性の配列として翻訳される）ように、同じプロモーターの管理下で２つ以上の遺伝子配列間に導入され得る任意の配列を指す。リボソームスキッピング配列の例は、限定されないが、２Ａペプチド配列を含む。一実施形態では、１つのリボソームスキッピング配列は遺伝子配列間で導入される。別の実施形態では、２つ以上のリボソームスキッピング配列は遺伝子配列間で導入される。
【００５１】
用語「２Ａリボソームスキッピング配列」はＶａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのコンセンサスモチーフを含むペプチド配列を指し、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、２Ａリボソームスキッピング配列は、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）；Ｔ２Ａ、トセア・アシグナウイルス（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ）２Ａ（Ｔ２Ａ））；ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）；ＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）、またはその組み合わせを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。２Ａペプチド配列の非限定的な例は、以下に提供される例示的な配列表中で提供される配列である。
【００５２】
２Ａリボソームスキッピング配列は、１つの発現ベクター中の同義遺伝子の発現を可能にする。例えば、２Ａリボソームスキッピング配列を有する発現ベクターは、ＣＤ３複合体を構成する４つのタンパク質すべてを発現することができる。一実施形態では、発現ベクターの非限定的な例示的コード領域配列は、以下に提供される例示的な配列表に列挙される：マウスＣＤ３ｄｅｌｔａ−Ｆ２Ａγ−Ｔ２Ａイプシロン−Ｐ２Ａ−ゼータのポリヌクレオチド配列およびマウスＣＤ３ｄｅｌｔａ−Ｆ２Ａγ−Ｔ２Ａイプシロン−Ｐ２Ａ−ゼータのポリペプチド配列、ならびにそれらの各々の等価物。
【００５３】
他の態様では、２Ａリボソームスキッピング配列を有する発現ベクターは、ＴＣＲのマルチサブユニットを発現することができる。いくつかの実施形態において、発現ベクターの非限定的な例示的コード領域配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２７〜５３１（ＩＧＲＰ１３−２５ＴＣＲ）、５３３〜５３７（マウス化されたＩＧＲＰ１３−２５ＴＣＲ）、５３８〜５４２（ＰＰＩ７６−９０ＴＣＲ）、または５４３〜５４７（ＢＤＣ２．５ＴＣＲ）において提供される。
【００５４】
用語「ＩＲＥＳ配列」または「内部リボソーム侵入部位配列」は、ＲＮＡ配列の途中で翻訳開始を可能にするヌクレオチド配列を指す。いくつかの実施形態において、２つの遺伝子配列（例えば、レポーター読み取り枠）間のＩＲＥＳ配列の挿入は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に結合された５’−キャップ構造とは独立して、下流タンパク質コード領域の翻訳を誘導することができる。適切なＩＲＥＳ配列は当技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、ＩＲＥＳ配列は、ポリオウイルス、ライノウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、古典的ブタコレラウイルス、およびウシウイルス性下痢症ウイルスに由来する。ＩＲＥＳ配列の非限定的な例は、ｗｗｗ．ｉｒｅｓｉｔｅ．ｏｒｇで見つけることができ、それは、参照によってその全体が組み込まれる。ＩＲＥＳ配列の非限定的な例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６において提供され、限定されないが、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列、ｐＢａｇ１  ＩＲＥＳ配列、および合成ＩＲＥＳ配列、ならびにその各々の等価物を含む。
【００５５】
用語「ルシフェラーゼ」は、生物発光の反応を触媒することができるタンパク質を意味する。例えば、基質（例えば、ルシフェリン、長鎖アルデヒドまたはコレントラジン（ｃｏｌｅｎｔｒａｚｉｎｅ））、エネルギー源（例えば、ＡＴＰ）、および、および酸素が提供される場合、酵素としてのルシフェラーゼはシグナルを生成することができる。この開示に適切なルシフェラーゼ配列は当技術分野において既知である。一実施形態では、ルシフェラーゼ遺伝子は、ホタル（例えば、フォティヌス・ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ））からのものである。ルシフェラーゼ配列の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋにあり得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＲ２０７９２．１、ＡＡＬ４０６７７．１、ＡＡＬ４０６７６．１、およびＡＡＶ３５３７９．１、ならびにそれらの各々の等価物）。ルシフェラーゼレポーターシステムは市販されている（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．＃  Ｅ１５００またはＥ４５５０）。以下で提供されるように、ルシフェラーゼタンパク質およびポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５５および５５６において提供される。
【００５６】
用語「βラクタマーゼ」は、β‐ラクタム環を分解できる酵素またはタンパク質を指す。一実施形態では、βラクタマーゼは、細菌によって生成された、β−ラクタム系抗生物質中のβ−ラクタム環を部分的にまたは完全に加水分解することができる酵素である。βラクタマーゼ配列の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋにあり得る（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＭＭ７０７８１．１、ＣＡＡ５４１０４．１、およびＡＡＡ２３４４１．１、ならびにそれらの各々の等価物）。
【００５７】
用語「クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ」あるいは「ＣＡＴ」は、アセチル化された補酵素Ａからクロラムフェニコールあるいは関連する誘導体までアセチル基を移動させることができる酵素またはタンパク質を指す。「ＣＡＴ」の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋにあり得る（例えば、受入番号：ＯＣＲ３９２９２．１、ＷＰ＿０７２６４３７４９．１、ＣＵＢ５８２２９．１、およびＫＩＸ８２９４８．１、ならびにそれらの各々の等価物）。ＣＡＴアッセイは市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｆｉｓｈｅｒ社の  ＦＡＳＴ  ＣＡＴ（商標）  Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｆ−２９００））。
【００５８】
用語「分泌型胚性アルカリホスファターゼ」または「ＳＥＡＰ」は、試験プロモーター活性あるいは遺伝子発現に対するレポーターとして使用される、ＳＥＡＰ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＰ  ００１６２３およびその等価物、２０１７年１月１２日に最終アクセスされた）によってコードされた酵素を指す。ＳＥＡＰ配列の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＤＶ１０３０６．１、ＡＡＢ６４４０４．１、ＥＥＢ８４９２１．１、およびＥＦＤ７０６３６．１、ならびにそれらの各々の等価物）にあり得る。ＳＥＡＰ活性は、ルミノメーター（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＴｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｖｅｒｉｔａｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で測定することができる。
【００５９】
用語「蛍光タンパク質」は、適切な電磁放射線で励起させられる時に光を発することができる任意のタンパク質を指し、該タンパク質は、天然または設計されたアミノ酸配列を有し、ならびにオワンクラゲ関連蛍光タンパク質のアミノ酸配列に由来する。蛍光タンパク質から放射する光は、蛍光性リーダー（例えば、ＦＬ６００蛍光マイクロプレートリーダ）により判定することができる。蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色タンパク質（ＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または他の適切な蛍光タンパク質、あるいはそれらの組み合わせ、またはそれらの蛍光性の部分または誘導体を含む。蛍光タンパク質の配列は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦＡ５２６５４．１、ＡＣＳ４４３４８．１、およびＡＡＱ９６６２９．１、ならびに各々の等価物）にあり得る。蛍光タンパク質プロモーターレポーターは市販されている（例えば、ＴａｋａＲａ  Ｃａｔ．＃６３１０８９）。
【００６０】
「転写調節下で」とは、当技術分野においてよく理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列（通常、ＤＮＡ配列）の転写が、転写の開始に寄与するか、または転写を促進する要素に有効に結合されることに依拠することを示す。「有効に結合される」とは、ポリヌクレオチドが細胞中で機能することを可能にする様式でポリヌクレオチドが配置されることを示す。
【００６１】
ポリヌクレオチドに適用される際の用語「コードする」とは、ポリペプチドを「コードする」と言われているポリヌクレオチドが、天然の状態であるか、あるいは当業者に既知の方法によって操作される場合、ポリペプチドおよび／またはそのフラグメントについてのｍＲＮＡを生成するために転写および／または翻訳され得ることを指す。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補体であり、コードする配列はそこから推定することができる。
【００６２】
用語「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を始めるＤＮＡの領域を指す。プロモーターは、適切に転写を始めるために必要なプロモーターの最小部分であるコアプロモーターを含み、転写因子結合部位などの調節エレメントも含むことができる。調節エレメントは転写を促進または阻害することができる。プロモーター中の調節エレメントは、転写活性化因子または転写抑制因子用の結合部位であり得る。プロモーターは構成的または誘導性であり得る。構成的プロモーターは常に活性であり、および／または転写の基礎レベルを超える遺伝子の転写を常に指示するものを指す。そのようなものの非限定的な例は、ホスホグリセレートキナーゼ１（ＰＧＫ）プロモーター；ＳＳＦＶ、ＣＭＶ、ＭＮＤＵ３、ＳＶ４０、Ｅｆ１ａ、ＵＢＣ、およびＣＡＧＧを含む。誘導性プロモーターは、細胞に添加されるか、または細胞中で発現される分子または因子によって誘発されることができるものである。誘導性プロモーターは、誘発の不在下で、依然として転写の基礎レベルを生成することがあるが、誘発は、典型的にはタンパク質の産生を大幅に増加する。
【００６３】
エンハンサーは標的配列の発現を増大させる調節エレメントである。「プロモーター／エンハンサー」はプロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を提供することができる配列を含有するポリヌクレオチドである。例えば、レトロウイルスの末端反復配列は、プロモーターおよびエンハンサーの機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは「内因性」または「外因性」あるいは「異種性」であってもよい。「内因性」のエンハンサー／プロモーターは、ゲノム内の所与の遺伝子と自然に結合されるものである。「外因性」または「異種性」のエンハンサー／プロモーターは、その遺伝子の転写が結合されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるように、遺伝子操作（つまり、分子生物学的技術）による遺伝子に並置されるものである。この開示のポリヌクレオチドは随意にエンハンサー配列を含む。
【００６４】
本明細書で使用されるように、用語「ＮＦＡＴプロモーター」、「ＮＦＡＴ転写因子結合ＤＮＡ配列」、または「活性化Ｔ細胞プロモーターの核因子」は、１つ以上のＮＦＡＴ要素を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、ＮＦＡＴ転写因子（例えば、ＮＦＡＴｃ１、ＮＦＡＴｃ２、ＮＦＡＴｃ３、ＮＦＡＴｃ４、またはＮＦＡＴ５）によるＮＦＡＴプロモーターの結合は、下流配列（例えば、レポーター）の転写を増大させるか、あるいは促進する。ＮＦＡＴプロモーター配列は、通常ＧｅｎＢａｎｋの中にあり、それは、限定されないが、受入番号：ＤＱ９０４４６２．１、ＫＸ５９１０５８．１、ＡＦ４８０８３８．１、およびそれらの各々の等価物のＧｅｎＢａｎｋからの以下の配列、ならびにそれらの少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいは１００％の同一性を有する配列を含む。
【００６５】
本明細書で使用されるように、用語「ＡＰ−１プロモーター」または「ＡＰ−１転写因子を結合ＤＮＡ配列」は、１つ以上のＡＰ−１転写活性化要素を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、ＡＰ−１転写因子によるＡＰ−１プロモーターの結合は、下流配列（例えば、ルシフェラーゼまたはＣＡＴのようなレポーター）の転写を増大させるか、または促進する。ＡＰ−１プロモーターは、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、ハエまたは他の種に由来してもよい。一実施形態では、ＡＰ−１プロモーターは、ＡＴＧＡＧＴＣＡＴの配列、およびその等価物、またはＡＴＧＡＧＴＣＡＴと等価で少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、あるいは１００％の配列同一性を有する配列を有する。
【００６６】
本明細書で使用されるように、用語「ＮＦ−κＢプロモーター」または「ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列」は、１つ以上のＮＦ−κＢ要素を含むか、または代替的にそれからからなるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、ホモ二量体またはヘテロ二量体のいずれかとしてのＲｅｌ／ＮＦ−κＢ転写因子のＮＦ−κＢプロモーターへの結合は、下流配列（例えば、ルシフェラーゼまたはＣＡＴのようなレポーター）の転写を増大させるか、あるいは開始する。ＮＦ−κＢプロモーターまたは結合部位のいくつかの実施形態は、米国特許第８，２９９，２３７号に開示され、参照によってその全体中が組み込まれる。
【００６７】
本明細書で使用されるように、用語「ＩＬ−２プロモーター」または「ＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列」は、Ｔ細胞シミュレーションに応答する１つ以上のＩＬ−２転写活性化要素を含むか、または代替的にそれからなるか、あるいはそれからさらになる配列を指す。一実施形態では、転写因子のＩＬ−２プロモーターへの結合は、下流配列（例えば、ルシフェラーゼまたはＣＡＴのようなレポーター）の転写を増大させるか、開始する。一実施形態では、ＩＬ−２プロモーターは、ヒト、マウス、ラット、またはゼブラフィッシュに由来する。いくつかの非限定的な例示的ＩＬ−２プロモーター配列は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋから、受入番号：ＡＪ００６８８４．１、ＥＦ３９７２４１．１、ＡＢ０４１３４１．１、ＫＵ０５８８４６．１、ＥＦ４５７２４０．１、およびＨＭ８０２３３０．１、ならびにそれらの各々の等価物で入手可能である。
【００６８】
本明細書で使用されるように、用語「ベクター」は、例えば、形質転換のプロセスにより細胞内に配置される時にベクターが複製され得るように、無傷のレプリコンを含む非染色体核酸を指す。ベクターはウイルスまたは非ウイルスであってもよい。ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウィルス、バキュロウイルス、修飾バキュロウイルス、パポウイルス（ｐａｐｏｖｉｒｕｓ）または他の方法で修飾された自然発生のウイルスを含む。核酸を送達するための例示的な非ウイルスベクターは、ネイキッドＤＮＡ；単独であるいはカチオン性ポリマーと組み合わせた、カチオン性脂質で複合体化されたＤＮＡ；アニオン性およびカチオン性リポソーム；場合によっては、リポソーム中に含まれる、異質性ポリリシン、定められた長さのオリゴペプチド、およびポリエチレンイミンなどのカチオン性ポリマーと共に縮合されるＤＮＡを含むＤＮＡタンパク質複合体および粒子；ならびに、ウイルスおよびポリリシンＤＮＡを含む三元複合体の使用を含む。
【００６９】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボ、あるいはインビトロのいずれかで宿主細胞へと送達されるポリヌクレオチドを含む、組換えで生成されたウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどを含む。セムリキ森林ウイルスベースのベクターおよびシンドビスウイルスベースのベクターなどのアルファウイルスベクターも、遺伝子治療および免疫療法での使用のために開発されている。Ｓｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  （１９９９）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ５：４３４−４３９  ａｎｄ  Ｙｉｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５（７）：８２３−８２７参照。
【００７０】
遺伝子移入がレンチウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物は、レンチウイルスゲノムまたはその一部、ならびに治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるように、「レンチウイルス媒介遺伝子導入」または「レンチウイルス形質導入」は同じ意味を持ち、および、細胞に入り、かつそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスにより、遺伝子または核酸配列が安定して宿主細胞へと転写されるプロセスを指す。ウイルスは、感染のその正常なメカニズムを介して宿主細胞を侵入することができるか、またはそれが異なる宿主細胞表面レセプタあるいはリガンドに結合して細胞に侵入するように修飾することができる。レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でそれらの遺伝子情報を保有するが；一旦ウイルスが細胞を感染させると、該ＲＮＡは、感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込むＤＮＡの形態へと逆転写される。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと呼ばれる。本明細書で使用されるように、レンチウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス性侵入機構を介して細胞へと外因性核酸を導入することができるウイルス粒子を指す。「レンチウイルスベクター」は、他のレトロウイルスベクターと比較して、非分裂細胞を形質導入する際に特定の利点を有する当技術分野において既知のレトロウイルスベクターの一種である。Ｔｒｏｎｏ  Ｄ．  （２００２）  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｓｐｒｉｎｇ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇを参照。
【００７１】
本発明のレンチウイルスベクターは、オンコレトロウイルス（ＭＬＶを含有するレトロウイルスのサブグループ）、およびレンチウイルス（ＨＩＶを含有するレトロウイルスのサブグループ）に基づくか、またはそれらに由来する。例としてはＡＳＬＶ、ＳＮＶ、およびＲＳＶが挙げられ、それらのすべてがレンチウイルスベクター粒子産生システムのためにパッケージングおよびベクター成分へと分割されている。本発明のレンチウイルスベクター粒子は、遺伝的または他の方法（例えば、細胞系をパッケージングする特定の選択）で変更されたバージョンの特定のレトロウイルスに基づいてもよい。
【００７２】
発明のベクター粒子は特定のレトロウイルスに「基づく」ことは、ベクターがその特定のレトロウイルスに由来することを意味する。ベクター粒子のゲノムは、そのレトロウイルスからの成分を骨格として含む。ベクター粒子は、逆転写および組み込みシステムを含むＲＮＡゲノムと互換性のある必須のベクター成分を含有している。通常、これらは、特定のレトロウイルスに由来するｇａｇタンパク質およびｐｏｌタンパク質を含む。したがって、ベクター粒子の構造成分の大半は、所望の有用な特性をもたらすために遺伝的にあるいは他の方法で変更されている可能性があるが、通常はそのレトロウイルスに由来する。しかし、特定の構造成分および特にｅｎｖタンパク質は、異なるウイルスに由来してもよい。感染または形質導入されたベクター宿主域および細胞型は、ベクター粒子産生システム内の異なるｅｎｖ遺伝子を使用してベクター粒子に異なる特異性を与えることによって、変更することができる。
【００７３】
本明細書で使用されるように、用語「Ｊｕｒｋａｔ」は、ヒトのリンパ球株を指す。様々な型のＪｕｒｋａｔ細胞が存在する。一実施形態では、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＩＬ−２を生成することができる。Ｊｕｒｋａｔ細胞は市販されているか、または細胞株リポジトリ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−１５２）から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載される。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語「ＪｕｒＭａ」または「Ｊｕｒｋａｔ／ＭＡ」は、内因性ＴＣＲ発現を欠くＪｕｒｋａｔ細胞株を指す。ＪｕｒＭａ細胞の一実施形態は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ  Ｍｅｄｉｓｃｈ  Ｃｅｎｔｒｕｍ，  ＡｍｓｔｅｒｄａｍのＥｒｉｋ  Ｈｏｏｉｊｂｅｒｇ  Ｖｒｉｊｅ博士によって確立された（Ａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ８（２）：  ｅ５６８２０  （２０１３）（２０１７年１月１２日に最終アクセスされた）を参照）。
【００７５】
本明細書で使用されるように、用語「ＢＷ５１４７」は、Ｔ細胞機能を試験するために使用することができるリンパ球株を指す。いくつかの実施形態において、ＢＷ５１４７細胞はリンパ腫に由来する。多くのタイプのＢＷ５１４７細胞（市販されているか、または細胞株リポジトリ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−４７２）から利用可能）、ならびに細胞を培養する方法および組成物が本明細書に記載されている。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「ＨｕＴ−７８」はリンパ球株を指す。一実施形態では、ＨｕＴ−７８はＴ細胞性リンパ腫細胞株である。ＨｕＴ−７８細胞は、市販されているか（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、または細胞株リポジトリ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−１６１）から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
【００７７】
本明細書で使用されるように、用語「ＣＥＭ」はリンパ球株を指す。一実施形態において、ＣＥＭ細胞は末梢血リンパ芽球細胞である。ＣＥＭ細胞は、細胞株リポジトリ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２２６５またはＣＣＬ−１１９）から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
【００７８】
本明細書で使用されるように、用語「Ｍｏｌｔ−４」はリンパ球株を指す。一実施形態では、Ｍｏｌｔ−４細胞は急性リンパ芽球性白血病細胞である。Ｍｏｌｔ−４細胞は市販されているか（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、または細胞株リポジトリ（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８２）から利用可能であり、細胞を培養する方法および組成物は本明細書に記載されている。
【００７９】
「結合価」は、１ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣ、あるいは１ナノ粒子当たりの共同刺激、および／または１ナノ粒子コア当たりのサイトカインの数に関連する。
【００８０】
「密度」は、１ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣ、または１ナノ粒子当たり共同刺激、および／または１ナノ粒子コア当たりのサイトカインを参照する場合、リンカーをさらに含むことができる外部層を有するナノ粒子コアの表面積として計算される。表面積は、使用される構成物の利用可能な表面積の合計である。
【００８１】
「抗原」は、本明細書で使用されるように、被験体の免疫応答、または免疫細胞、好ましくは、Ｔ細胞またはＢ細胞の増殖を引き起こし得る分子の、全て、一部、フラグメント、あるいはセグメントを指す。一態様では、抗原は癌関連抗原である。他の態様では、抗原は自己免疫疾患関連抗原である。さらなる態様では、抗原はアレルゲンである。
【００８２】
用語「アルキル」は、１〜１０の炭素原子（すなわち、Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、１〜６の炭素原子（すなわち、Ｃ１−Ｃ６アルキル）、または１〜４の炭素原子を有する一価の飽和脂肪族ヒドロカルビル基を指す。この用語は、一例として、メチル（ＣＨ３）、エチル（ＣＨ３ＣＨ２）、ｎプロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２）、イソブチル（（ＣＨ３）２ＣＨＣＨ２）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ３）（ＣＨ３ＣＨ２）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ３）３Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、およびネオペンチル（（ＣＨ３）３ＣＣＨ２−）などの直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を含む。
【００８３】
用語「アルコキシ」は−Ｏ−アルキルを指す。
【００８４】
「模倣物」は、所与のリガンドまたはペプチドのアナログであり、該アナログはリガンドに実質的に類似する。「実質的に類似する」とは、模倣物が約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満の分子量のリガンドを総体的に占める１以上の官能基または修飾を有していることを除いて、アナログがリガンドと同様の結合プロファイルを有していることを意味する。
【００８５】
「免疫細胞」は、例えば、骨髄、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）、および脊髄由来の細胞（好中球、好酸球、好塩基性細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞）において生成された造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（白血球）を含む。本明細書で使用されるように、用語「Ｂ細胞」は、適応免疫系の液性免疫におけるリンパ球の一種を指す。Ｂ細胞は主に、抗体を作り、抗原提示細胞としての役割を果たし、サイトカインを放出し、および抗原相互作用による活性化の後に記憶Ｂ細胞を発達させるように機能する。Ｂ細胞は、細胞表面上のＢ細胞受容体の存在により、Ｔ細胞などの他のリンパ球と区別される。本明細書で使用されるように、用語「Ｔ細胞」は、胸腺において成熟するリンパ球の一種を指す。Ｔ細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、細胞表面上のＴ細胞受容体の存在によりＢ細胞などの他のリンパ球と区別される。Ｔ細胞は、市販で入手可能なソースから分離され、またはそこから獲得される場合もある。「Ｔ細胞」は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、ナチュラルキラーＴ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、およびガンマ−デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現させる免疫細胞の全ての種類を含む。「細胞傷害性細胞」は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球を含み、これら細胞は細胞毒性反応を媒介することができる。
【００８６】
用語「エフェクターＴ細胞」は、本明細書で使用されるように、さらなる分化を必要とすることなく、抗原を特異的に結合しかつ免疫応答（エフェクター機能）を媒介することができるＴ細胞を指す。エフェクターＴ細胞の例は、ＣＴＬ、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、エフェクター記憶細胞、およびヘルパーＴ細胞を含む。エフェクターＴ細胞とは対照的に、ナイーブＴ細胞は、それらの特異性抗原、ＭＨＣ複合体に遭遇せず、増殖およびエフェクターＴ細胞への分化によって該複合体に反応もしない。エフェクターＴ細胞は、（細胞周期のＧ０相において）静止するか、または活性化（増殖）され得る。
【００８７】
用語「抗病原性自己反応性Ｔ細胞」は、抗病原性特性を持つＴ細胞（すなわち、ＭＳ、ＭＳ関連性疾患または障害、あるいは糖尿病前症などの自己免疫疾患を相殺するＴ細胞）を指す。このようなＴ細胞は、抗炎症性Ｔ細胞、中央記憶Ｔ細胞、エフェクター記憶Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、低結合活性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、自己調節性Ｔ細胞、細胞障害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ＴＲ１細胞、サプレッサーＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞などを含み得る。
【００８８】
用語「抗炎症性Ｔ細胞」は、抗炎症反応を促進するＴ細胞を指す。Ｔ細胞の抗炎症機能は、抗炎症性タンパク質、サイトカイン、ケモキネスなどの生成および／または分泌を通じて達成される場合がある。抗炎症性タンパク質は、免疫応答を抑える抗増殖シグナルを包含するようにも意図される。抗炎症性タンパク質は、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、ＩＦＮ−α、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１ｒａ、Ｇ−ＣＳＦ、および、ＴＮＦならびにＩＬ−６の可溶性受容体を含む。
【００８９】
用語「分化された」とは、第１のタイプの細胞が第２のタイプの細胞へと発達するように誘発される時を指す。いくつかの実施形態において、同族Ｔ細胞は、調節性ＴＲ１細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、活性化Ｔ細胞はＴＲ１細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、記憶Ｔ細胞はＴＲ１細胞へと分化される。いくつかの実施形態において、Ｂ細胞は調節性Ｂ細胞へと分化される。
【００９０】
本明細書で使用されるように、「ノブ・イン・ホール」は、突起がヘテロ多量体の形成を促進するように腔の中に位置するこができるように、第１のポリペプチドの界面において突起（または「ノブ」）を必要とし、および第２のポリペプチドの界面において対応する腔（または「ホール」）を必要とするポリペプチジル構造を指す。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、フェニルアラニンまたはチロシン）と交換することにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と交換することによって、隆起と同一または同様のサイズの空洞が、第２のポリペプチドの界面に作られる。隆起および空洞は、当業者による慣例方法を使用して、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって、またはペプチド合成などによって合成手段により作られ得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの界面は、第１のポリペプチドのＦｃドメイン上に位置し、第２のポリペプチドの界面は、第２のポリペプチドのＦｃドメイン上に位置する。ノブ・イン・ホールのヘテロ多量体、およびそれらの調製物ならびに使用の方法は、米国特許第５，７３１，１６８号；第５，８０７，７０６号；第５，８２１，３３３号；第７，６４２，２２８号；第７，６９５，９３６号；第８，２１６，８０５号；および、第８，６７９，７８５号に開示され、これらのすべては、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９１】
本明細書で使用されるように、「ＭＨＣ−アルファ−Ｆｃ／ＭＨＣ−ベータ−Ｆｃ」は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体を指し、ここで、該第１のポリペプチドはＭＨＣクラスＩＩα−鎖および抗体Ｆｃドメインを含み；該第２のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩβ−鎖および抗体Ｆｃドメインを含む。ノブ・イン・ホールＭＨＣ−アルファ−Ｆｃ／ＭＨＣ−ベータ−Ｆｃは、各ポリペプチドのＦｃドメインが、他のＦｃドメイン上の対応する空洞内の１つのＦｃドメイン上の隆起の相補的位置決めによって互いに相互作用することをさらに必要とする。
【００９２】
用語「分離された」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントが通常自然において関連する、構成要素、細胞、またはその他のものから単離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドは、通常は染色体に関連する５’および３’の配列から単離されるものである。当業者にとって明白なように、自然には生じないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、これらを自然に発生する等価物と区別するために「単離」を必要としない。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、体積当たりの分子の濃度または数が、その自然に発生する等価物のものよりも濃縮されており、またはその自然に発生する等価物のものよりも分離されていないという点で、その自然に発生する等価物と区別することができる。それらの一次配列、または例えば、それらの糖鎖付加パターンが自然に発生する点で等価物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、それらの一次配列、または代替的にそれらの糖鎖付加パターンなどの別の特徴によって、自然に発生する等価物と区別可能であることから、単離された形態で存在する必要はない。Ｔ細胞などの哺乳動物細胞は、生体で見つけられる解剖学的部位から除去されると単離される。
【００９３】
「自己反応性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞を含有する同じ個体により生成および含有される分子である「自己抗原」を認識するＴ細胞である。
【００９４】
「病原性Ｔ細胞」は、Ｔ細胞を含有する被験体に有害なＴ細胞であるが、非病原性Ｔ細胞は被験体には実質的に有害ではなく、抗病原性Ｔ細胞は、病原性Ｔ細胞の害を減少させるか、改善するか、阻害するか、または無効にする。
【００９５】
本明細書で使用されるように、調節性Ｂ細胞または制御性Ｂ細胞（「Ｂ−ｒｅｇ」）は、ＣＤ１ｄおよびＣＤ５の発現、ならびにＩＬ−１０の分泌を特徴とする抗炎症作用の原因となる細胞を指す。Ｂ−ｒｅｇはまた、Ｔｉｍ−１の発現により同定され、Ｔｉｍ−１のライゲーションを介して誘発されることで耐性を促すことができる。Ｂ−ｒｅｇの能力は、トール様受容体、ＣＤ４０リガンド、およびその他のものなどの多くの刺激因子により促進されることが示された。しかし、Ｂ−ｒｅｇの完全な特徴化は進行中である。Ｂ−ｒｅｇはまた、高レベルのＣＤ２５、ＣＤ８６、およびＴＧＦ−βを発現させる。このＢ細胞のサブセットは、Ｔｈ１増殖を抑え、従って自己寛容の維持に寄与し得る。Ｂ−ｒｅｇの機能の活性化は、多くの免疫調節薬物の目的となり、自己免疫疾患のより優れた制御に寄与しなければならない。例えば：２０１３年１０月３１日に最終アクセスされたｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２３７０７４２２を参照。
【００９６】
１型調節性Ｔ（ＴＲ１）細胞は、調節特性を有し、かつインビトロおよびインビボで抗原特異的免疫応答を抑えることができるＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットである。このようなＴＲ１細胞は、サイトカイン産生のそれらの特有のプロファイルによって定義され、高レベルのＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを作るが、ＩＬ−４またはＩＬ−２は作らない。このような細胞により生成されたＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータは、インビトロで原発性のナイーブＴ細胞の阻害を媒介する。さらに、ＴＲ細胞がインビボで存在するという証拠が存在しており、および、同種幹細胞移植を受けている重症複合免疫不全症の患者において高度なＩＬ−１０を生成するＣＤ４（＋）Ｔ細胞の存在が実証されている。ＴＲ１細胞は、末梢性寛容の調節に関係し、これらはインビボで免疫応答を調節するために細胞療法として潜在的に使用され得る。例えば：２０１３年１０月３１日に最終アクセスされたｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１０８８７３４３を参照。
【００９７】
ＴＲ１細胞は、高レベルのＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータを生成する能力によって定義される。様々な抗原に特異的なＴＲ１細胞はインビボで生じるが、インビトロでのＩＬ−１０の存在下ではナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞から分化することもある。ＴＲ１細胞の増殖能は低く、これはＩＬ−１５により克服され得る。ＴＲ１細胞は、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−ベータの生成を介して、１型または２型のナイーブおよび記憶Ｔヘルパーの反応を抑える。分子レベルでのＴＲ１細胞のさらなる特徴化は、それらの作用機構を定義し、かつＴｒ細胞の他のサブセットとの関係を明確にする。新たな治療剤の開発のために新たな標的を同定するための、および末梢性寛容を調節するための細胞療法としてのＴＲ１細胞の使用が予見され得る。例えば、２０１３年１０月３１日に最終アクセスされたｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／１１７２２６２４を参照。
【００９８】
「有効な量」は、意図した目的を達成するのに十分な量であり；そのような非限定的な例は、Ｔ細胞受容体の複合体化、免疫応答の開始、免疫応答の調節、炎症反応の抑制、およびＴ細胞活性またはＴ細胞集団の調節含む。一実施形態では、有効な量は標的細胞のＴＣＲ経路を刺激するのに十分な量である。一態様において、有効な量は、明示された治療目的を達成するか、測定可能な応答を提供するように機能する量（例えば、治療上有効な量）である。本明細書で詳細に記載されるように、有効な量または投与量は目的および組成物に依存し、本開示に従って決定され得る。
【００９９】
有効な量の治療用組成物は、意図した目的に基づいて決定される。用語「単位投与量」あるいは「投与量」は、被験体に使用するのに適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、投与に関連して、つまり、適切な経路およびレジメンに関連して、上で述べられた所望の反応を引き起こすために計算されたあらかじめ決められた量の組成物を含む。投与される量は、処置の数および単位投与量の両方に従って、望ましい結果および／または保護に依存する。組成物の正確な量はさらに医師の判断に委ねられ、各個体に特有である。投与量に影響する因子は、被験体の物理的および臨床的状態、投与経路、意図した治療目的（症状の緩和対治癒）および効力、安定性、および特定の組成物の毒性を含んでいる。製剤化に際して、溶液は、投与量製剤と適合する手法で、および治療上あるいは予防的に有効な量で投与される。製剤は上記の注入可能な溶液のタイプなど、様々な剤形で容易に投与される。
【０１００】
「ＭＨＣ多量体」とは、この用語が本明細書で使用されるように、２以上、通常は４つ、または最大で５０以上のＭＨＣモノマーの複合体を意味する。
【０１０１】
本明細書で使用されるように、「多量複合体（ｍｕｌｔｉｍｅｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」は、標的細胞集団と１以上のｐＭＨＣ複合体との間の複合体を指し、ｐＭＨＣ複合体のＭＨＣタンパク質はＭＨＣタンパク質の多量体形態を含む。いくつかの実施形態において、ＭＨＣタンパク質の多量体形態は、二量体、三量体、四量体、五量体、またはデキストラマーを含む。
【０１０２】
本明細書で使用されるように、句「免疫応答」またはその同等物「免疫学的応答」は、（抗原特異性Ｔ細胞またはそれらの分泌物により媒介される）細胞媒介性反応の進行を指す。細胞性免疫応答は、ウイルス感染を処置または予防し、および／または抗原特異性Ｂｒｅｇ細胞、ＴＣ１、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、および／またはＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞、および／または疾患生成の自己調節性Ｔ細胞およびＢ細胞の「記憶」細胞を増殖するために、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子に関連したポリペプチドエピトープの提示により誘発される。該応答は、他の成分の活性化にも関係し得る。いくつかの態様において、用語「免疫応答」は、免疫細胞の調節ネットワークの形成を包含するように使用され得る。したがって、用語「調節ネットワーク形成」とは、免疫細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくは調節性Ｔ細胞が、限定されないが、Ｂ細胞または抗原提示細胞（非限定的例として、樹状細胞、単球、およびマクロファージを含む）などを含む他の免疫細胞のさらなる分化を引き起こすように誘発される、免疫応答を指す。ある実施形態において、調節ネットワーク形成は調節性Ｂ細胞へと分化されるＢ細胞に関係し、ある実施形態において、調節ネットワーク形成は寛容原性抗原提示細胞の形成に関係している。
【０１０３】
本明細書に記載されるように、「ナノ球体」、「ＮＰ」、または「ナノ粒子」は、適宜、被験体、細胞標本、または組織標本に単独または複数で投与される、小さな別個の粒子を意味する。ある実施形態では、用語「ナノ粒子」は、本明細書で使用されるように、ナノ粒子コアの周囲の任意の層も含み、したがって、リンカー層などの層を有する、または有しないコアを含む。ある実施形態において、ナノ粒子の形状は実質的に球状である。ある実施形態において、ナノ粒子はリポソームまたはウイルス粒子である。さらなる実施形態において、ナノ粒子は、任意の適切な物質、例えば、固体、固体コア、金属、デンドリマー、高分子ミセル、金属酸化物、またはタンパク質、あるいはそれらのフラグメントまたは組み合わせで構成される。用語「実質的に球状」とは、本明細書で使用されるように、粒子の形状が約１０％を超えて球体から逸脱しないことを意味する。
【０１０４】
用語「炎症反応」および「炎症」は、本明細書で使用されるように、病原体、損傷を受けた細胞、または刺激物などの有害な刺激に対する個体の血管組織の複雑な生体応答を示すものであり、サイトカイン、より好ましくは炎症促進性サイトカイン（即ち、活性化免疫細胞により優勢的に生成されかつ炎症反応の増幅に関与するサイトカイン）の分泌を含む。典型的な炎症促進性サイトカインは、限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７、ＩＬ２１、ＩＬ２３、ＩＬ２７、およびＴＧＦ−βを含む。典型的な炎症は急性炎症および慢性炎症を含む。急性炎症は、血漿および白血球による組織の浸潤を原因とする炎症（腫れ、発赤、疼痛、熱、および機能の損失）の典型的な兆候を特徴とする短期のプロセスを示す。急性炎性が典型的に、有害な刺激が存在する限り発生し、一旦刺激が取り除かれるか、弱まるか、または瘢痕（繊維症）により仕切られる（ｗａｌｌｅｄ  ｏｆｆ）と刺激は止まる。慢性炎症は、同時発生の活性炎症、組織破壊、および修復の試みを特徴とする疾病を示す。慢性炎症は、上で列挙された急性炎性の典型的な兆候を特徴としない。代わりに、慢性的に炎症を起こした組織は、単核免疫細胞（単球、マクロファージ、リンパ球、および形質細胞）の浸潤、組織破壊、ならびに血管新生と繊維症を含む治癒の試みを特徴とする。炎症は、個体における炎症に関連した複雑な生体応答を形成する事象のいずれか１つに影響を及ぼし、具体的には、阻害することにより、本開示の意味において阻害することができる。
【０１０５】
本明細書で使用されるように、用語「疾患関連」抗原は、選択された疾患を処置するために選択された抗原またはそのフラグメントを指し、および疾患プロセスに関与する。例えば、糖尿病関連抗原は、提示された時に糖尿病を処置する役目を果たす免疫応答を生成する抗原またはそのフラグメントであり、故に、そのような効果を生成する糖尿病関連抗原は、糖尿病を処置するために選択される。多発性硬化症（ＭＳ）関連抗原は、ＭＳを処置するために選択される。糖尿病関連の抗原は、ＭＳを処置するためには選択されない。同様に、自己免疫関連抗原は、自己免疫疾患に関連する抗原であり、自己免疫以外の障害または疾患（例えば、癌）の処置のためには選択されない。限定されない例示的な疾患関連抗原が本明細書に開示され、さらに、そのような抗原は、文献中で実証される技術、機構、および方法に基づいて特定の疾患について決定され得る。
【０１０６】
「自己免疫疾患または障害」は、個体自身の組織または器官から生じ、かつそれらに向けられる疾患または障害、あるいはそれらの出現（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）またはそれらの結果として生じる疾病を含む。一実施形態において、自己免疫疾患または障害は、正常な身体組織および抗原に反応性のＴ細胞による生成の結果として生じるか、またはその生成によって悪化する疾病を指す。自己免疫疾患または障害の例は、限定されないが、関節炎（などの関節リウマチ、急性関節炎、慢性関節リウマチ、痛風、または痛風性関節炎、急性の痛風性関節炎、急性免疫性関節炎、慢性炎症性関節炎、変性関節炎、ＩＩ型コラーゲン誘発関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬性関節炎、スチル病、脊椎関節炎、若年発症型関節リウマチ、変形性関節症、慢性進行性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、変形関節炎、原発性慢性多発関節炎（ｐｏｌｙａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｃｈｒｏｎｉｃａ  ｐｒｉｍａｒｉａ）、反応性関節炎、および強直性脊椎炎）、炎症性過剰増殖皮膚病（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｈｙｐｅｒｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｋｉｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、尋常性乾癬  、滴状乾癬、膿胞性乾癬および爪の乾癬などの乾癬、枯草熱およびヨブ症候群などのアトピー性疾患を含むアトピー、接触皮膚炎、慢性接触皮膚炎、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、一次刺激性接触皮膚炎、およびアトピー性皮膚炎を含む皮膚炎、ｘ連鎖高ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、慢性自己免疫性蕁麻疹を含む慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹などの蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性表皮壊死症、強皮症（全身性強皮症を含む）、全身性硬化症、スピノ光学（ｓｐｉｎｏ−ｏｐｔｉｃａｌ）ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）などの多発性硬化症（ＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、多発性硬化症（ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔａ）、失調性硬化症などの硬化症、視神経脊髄炎スペクトル障害（デビック病またはデビック症候群としても知られるＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫性媒介性胃腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性結腸炎、顕微鏡的大腸炎、コラーゲン大腸炎、ポリープ茸腫様大腸炎、壊死性小腸大腸炎、全層性大腸炎、および自己免疫性炎症性腸疾患、腸炎症、壊疽性膿皮症、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、成人を含む呼吸窮迫症候群、または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、脳膜炎、葡萄膜のすべてまたは一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、リウマチ様脊椎炎、リウマチ性滑膜炎、遺伝性血管浮腫、髄膜炎などにおける脳神経損傷、妊娠性疱疹、妊娠性類天疱瘡、陰嚢掻痒症（ｐｒｕｒｉｔｉｓ  ｓｃｒｏｔｉ）、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫性疾病による突発難聴、アナフィラキシー性およびアレルギー性およびアトピー性鼻炎などのＩｇＥ媒介性疾患、ラスムッセン脳炎および大脳辺縁系および／または脳幹脳炎などの脳幹脳炎、急性前���虹彩炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、晶状体抗原性（ｐｈａｃｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ）ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、または自己免疫性ブドウ膜炎などのブドウ膜炎、慢性または急性糸球体腎炎（例えば、原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性腎症）、特発性膜性ＧＮ、または特発性膜性腎症、Ｉ型およびＩＩ型を含む膜性（ｍｅｍｂｒａｎｏ）または膜質増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）、急速進行性ＧＮ）などのネフローゼ症候群を伴う、または伴わない糸球体腎炎（ＧＮ）、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎、例えば形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、層状魚鱗癬、表皮溶解性角化症、前癌性角化症、壊疽性膿皮症、アレルギー性症状および応答、アレルギー反応、アレルギー性またはアトピー性湿疹、皮脂欠乏性湿疹、異汗性湿疹、および水疱性掌蹠湿疹（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｐａｌｍｏｐｌａｎｔａｒ  ｅｃｚｅｍａ）などの湿疹、気管支喘息、気管支喘息、および自己免疫喘息などの喘息、Ｔ細胞の浸潤および慢性炎症反応に関与する疾病、妊娠中の胎児のＡ−Ｂ−Ｏ血液型などの異種抗原に対する免疫反応、慢性炎症性肺疾患、自己免疫性心筋炎、白血球接着不全症、例えば狼瘡腎炎、狼瘡脳炎、小児狼瘡、非腎臓狼瘡、腎外狼瘡、円板状狼瘡、および円板状エリテマトーデス、脱毛狼瘡を含む狼瘡、皮膚ＳＬＥまたは亜急性皮膚ＳＬＥ、新生児狼瘡症候群（ＮＬＥ）、および播種性紅斑性狼瘡などの全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、成人潜在性自己免疫性糖尿病（または１．５型糖尿病）を含む。さらに熟考されるのは、以下と関連する免疫応答である：サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介した急性または遅延型過敏症、サルコイドーシス、リンパ腫様肉芽腫症を含む肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、顆粒球減少症、脈管炎を含む脈管炎、大型血管炎（リウマチ性多発筋痛および巨大Ｔ細胞（Ｔａｋａｙａｓｕ）動脈炎を含む）、中型血管炎（川崎病および結節性多発性動脈炎／結節性動脈周囲炎を含む）、顕微鏡的多発動脈炎、免疫脈管炎（ｉｍｍｕｎｏｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、ＣＮＳ脈管炎、皮膚血管炎、過敏症脈管炎、全身的壊死性脈管炎などの壊死性脈管炎、およびチャーグ・ストラウス症候群または症候群（ＣＳＳ）ならびにＡＮＣＡ関連小型血管炎などのＡＮＣＡ関連脈管炎、側頭動脈炎、再生不良性貧血、自己免疫性再生不良性貧血、クームス試験陽性の貧血（Ｃｏｏｍｂｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｅｍｉａ）、ダイアモンド・ブラックファン貧血、自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）を含む溶血性貧血または免疫性溶血性貧血、アジソン病、自己免液性好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外漏出に関与する疾患、ＣＮＳ炎症性障害、アルツハイマー病、パーキンソン病、敗血症、外傷、または出血に続発するものなどの多臓器損傷症候群、免疫複合体媒介疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、��ェーグレン症候群、スティーヴェンズ−ジョンソン症候群、水疱性類天疱瘡（ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  ｂｕｌｌｏｕｓ  ）および皮膚類天疱瘡（ｓｋｉｎ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）などの天疱瘡様、天疱瘡（尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、天疱瘡粘液膜類天疱瘡、ならびに紅斑性天疱瘡を含む）、自己免疫性の多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、温熱性外傷、子癇前症、免疫複合体性腎炎などの免疫複合体障害、抗体腎炎、ポリニュートパシー、ＩｇＭポリニュートパシーあるいはＩｇＭ媒介神経障害などの慢性の神経障害、慢性または急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）などの自己免疫性または免疫性媒介血小板減少症、後天性血小板減少性紫斑病、特発性角膜強膜炎（ｃｅｒａｔｏ−ｓｃｌｅｒｉｔｉｓ）などの強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎と卵巣炎を含む精巣と卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫性甲状腺炎などの甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、または亜急性甲状腺炎を含む自己免疫性内分泌疾患、自己免疫性甲状腺疾患、原発性甲状腺機能低下症、グレーヴス病、多腺性自己免疫症候群（または、多腺性内分泌病症候群）などの多腺性症候群、ランバート−イートン筋無力症候群またはイートン−ランバート症候群などの神経系腫瘍随伴症候群を含む腫瘍随伴症候群、全身硬直症候群（ｓｔｉｆｆ−ｍａｎ  ｏｒ  ｓｔｉｆｆ−ｐｅｒｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、アレルギー性脳脊髄炎（ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｏｒ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ａｌｌｅｒｇｉｃａ）および実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）などの脳脊髄炎、胸腺腫関連性重症筋無力症などの重症筋無力症、小脳変性症、神経ミオトニー、  眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調（ＯＭＳ）、および感覚性ニューロパチー、多巣性運動ニューロパチー、シーハン症候群、自己免疫性肝炎、慢性肝炎、ルポイド肝炎、巨大Ｔ細胞肝炎、活動性慢性肝炎または自己免疫性活動性慢性肝炎、リンパ性間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン・バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡ腎症）、特発性ＩｇＡ腎症、線状ＩｇＡ皮膚病、急性熱性好中球性皮膚症、角層下膿疱性皮膚症、一過性棘融解性皮膚症、原発性胆汁性肝硬変および肺硬変症などの硬変症、自己免疫性腸疾患症候群、セリアック病（Ｃｅｌｉａｃ  ｏｒ  Ｃｏｅｌｉａｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、セリアックスプルー（グルテン腸症）、難治性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリッグ病）、冠動脈疾患、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）などの自己免疫性耳疾患、自己免疫性難聴、難治性または回帰性あるいは再発性多発性軟骨炎などの多発性軟骨炎、肺胞タンパク症、コーガン症候群／非梅毒性角膜実質炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状疱疹関連性疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増加症、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症（例えば、良性単クローン性免疫グロブリン血症および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、ＭＧＵＳ）を含む原発性リンパ球増加症、末梢性ニューロパシー、腫瘍随伴症候群���癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、聴覚喪失、失明、周期性麻痺などのチャネル病およびＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性筋疾患、巣状または分節性あるいは巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、網膜ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病学的障害、線維筋痛、多発性内分泌不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老性痴呆、自己免疫性脱髄症および慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーなどの脱髄性疾患、ドレスラー症候群、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｇｒｅａｔａ）、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着症、レイノー現象、食道蠕動運動低下、強指症、および毛細血管拡張症）、例えば抗精子抗体による男性および女性の自己免疫性不妊症、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、反復流産、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球性脈管炎、アルポート症候群、アレルギー性肺胞炎および線維化性肺胞炎などの肺胞炎、間質性肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア熱、リーシュマニア症などの寄生虫症、キパノシミアシス（ｋｙｐａｎｏｓｏｍｉａｓｉｓ）、住血吸虫症、回虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維症、びまん性間質性肺線維症、間質性肺線維症、肺線維症、特発性肺線維症、膵嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ  ｆａｃｉｉｔｉｓ）、シュルマン症候群、フェルティ症候群、フィラリア（ｆｌａｒｉａｓｉｓ）、慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性または慢性）またはフックス毛様体炎（Ｆｕｃｈ’ｓ  ｃｙｃｌｉｔｉｓ）などの毛様体炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウイルス感染症、敗血症、内毒血症、膵炎、甲状腺中毒症（ｔｈｙｒｏｘｉｃｏｓｉｓ）、パルボウイルス感染、風疹ウイルス感染、ワクチン接種後症候群、先天性風疹感染、エプスタイン・バーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァン症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、レンサ球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎（ｔｈｒｏｍｂｏａｎｇｉｔｉｓ  ｕｂｉｔｅｒａｎｓ）、甲状腺中毒、脊髄癆、脈絡膜炎、巨大Ｔ細胞多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、乾
性角結膜炎、流行性角結膜炎、特発性腎炎症候群、微小病変症、良性家族性および虚血再潅流障害、移植臓器再灌流、網膜性自己免疫、ジョイント炎症、気管支炎、閉塞性気道疾患／肺疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化の障害、精子形成欠如（ａｓｐｅｒｎｉｏｇｅｎｅｓｅ）、自己免疫性溶血、ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎（ｅｎｄｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ｐｈａｃｏａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃａ）、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発顔面神経麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音性（ｓｅｎｓｏｎｅｕｒａｌ）難聴、血色素尿症発作（ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎｕｒｉａ  ｐａｒｏｘｙｓｍａｔｉｃａ）、性機能低下、回腸炎領域（ｉｌｅｉｔｉｓ  ｒｅｇｉｏｎａｌｉｓ）、白血球減少症、単核球症感染症、横断性脊髄炎（ｔｒａｖｅｒｓｅ  ｍｙｅｌｉｔｉｓ）、原発性特発性粘液水腫、ネフローゼ、交感神経眼炎（ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ  ｓｙｍｐｈａｔｉｃａ）、肉芽腫性精巣炎、膵炎、急性多発神経根炎、壊疽性膿皮症、Ｑｕｅｒｖａｉｎ甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、白斑、毒素ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤に関与する疾病、白血球接着不全症、サイトカインおよびＴリンパ球により媒介される急性および遅延型過敏症に関連する免疫応答、白血球漏出に関与する疾患、多臓器損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、アレルギー性神経炎、自己免疫性多内分泌症、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫性萎縮性胃炎、交感性眼炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌不全、Ｉ型自己免疫性多発内分泌腺症候群、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、心筋症、例えば拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、節骨、前頭、上顎骨、または蝶形骨の副鼻腔炎、好酸性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加筋痛症候群、レフレル症候群、慢性好酸球性肺炎、熱帯性好酸球増多性肺疾患、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギローマ、または好酸球を含有する肉芽腫、アナフィラキシー、血清反応陰性脊椎関節炎、多腺性自己免疫症候群、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、一過性乳児低ガンマグロブリン血症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、毛細管拡張性失調症症候群、脈管拡張症、コラーゲン病に関連した自己免疫障害、リウマチ、神経系疾患、リンパ節炎、血圧応答の減少、血管機能不全、組織傷害、心血管虚血、痛覚過敏症、腎虚血、脳虚血、および血管新生、アレルギー性過敏症障害、糸球体腎炎、再潅流障害、虚血性再潅流障害、心筋または他の組織の再潅流障害を伴う疾患、リンパ腫の気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性要素を伴う皮膚病、多臓器不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連性症候群、サイトカインに誘導される毒性、ナルコレプシー、急性の重度の炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎��動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、気腫、円形脱毛症、脂肪組織炎症／ＩＩ型糖尿病、肥満症関連性脂肪組織炎症／インスリン抵抗性、および子宮内膜症。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、自己免疫障害または疾患は、限定されないが、Ｉ型およびＩＩ型の真性糖尿病、糖尿病前症、移植拒絶反応、多発性硬化症、多発性硬化症関連疾患、早期卵巣機能不全、強皮症、シェーグレン病／症候群、狼瘡、白斑、脱毛症（禿頭症）、多腺不全、グレーヴス病、甲状腺機能不全、多発性筋炎、天疱瘡、クローン病、大腸炎、自己免疫性肝炎、下垂体前葉機能低下症、心筋炎、アジソン病、自己免疫性皮膚病、ブドウ膜炎、悪性貧血、副甲状腺機能低下症、および／またはリウマチ性関節炎を含み得る。対象の他の指標は、限定されないが、喘息、アレルギー性喘息、原発性胆汁性肝硬変、硬変症、視神経脊髄炎スペクトル障害（デビック病、視神経脊髄型多発性硬化症（ＯＳＭＳ））、尋常性天疱瘡、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、リウマチ性関節炎、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、セリアック病、乾癬、自己免疫性心筋症、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣＭ）、重症筋無力症、ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、免疫媒介性筋障害、前立腺癌、抗リン脂質抗体症候群（ＡＮＣＡ＋）、アテローム性動脈硬化症、皮膚筋炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、脊髄損傷、外傷、たばこ誘発肺破壊、ＡＮＣＡ関連性脈管炎、乾癬、硬化性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、および中枢神経系と末梢神経系の疾患を含む。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、自己免疫障害または疾患は、限定されないが、糖尿病、多発性硬化症、セリアック病、原発性胆汁性肝硬変、天疱瘡、落葉状落葉状天疱瘡、尋常性天疱瘡、視神経脊髄炎スペクトル障害、関節炎（リウマチ性関節炎を含む）、アレルギー性喘息、炎症性腸疾患（クローン病と潰瘍性大腸炎を含む）、全身性エリトマトーデス、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患、気腫、乾癬、自己免疫性肝炎、ブドウ膜炎、シェーグレン症候群、強皮症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連性脈管炎、およびスティフ・マン症候群を含み得る。
【０１０９】
多発性硬化症（ＭＳ）は「多発硬化症（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、「散在性脳脊髄炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅ）」または「アレルギー性脳脊髄炎」としても知られている。ＭＳは、脳および脊髄の軸索まわりの脂肪ミエリン鞘が損傷し、脱髄および瘢痕化の他に、広範囲の徴候および症状につながる炎症性疾患である。多発性硬化症関連障害は、例えば、視神経脊髄炎スペクトル障害（ＮＭＯ）、ブドウ膜炎、神経障害性疼痛などを含む。
【０１１０】
「ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質」（ＭＯＧ）は、中枢神経系（ＣＮＳ）における神経の髄鞘化のプロセスにおいて重要であると考えられる糖タンパク質である。ヒトにおいて、このタンパク質は、ＭＯＧ遺伝子によってコードされる。それは、ミエリン鞘に構造的完全性を提供する必要な「接着分子」として機能すると推測され、オリゴデンドロサイト上で遅れて進行すると知られている。ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＮＭ＿００１００８２２８．２およびＮＰ＿００１００８２２９．１は、それぞれ、ＭＯＧ遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質配列を表す。これらのＧｅｎＢａｎｋ受入番号の各々に関連する配列は、すべての目的のために参照によって組み込まれる。
【０１１１】
本明細書で使用されるように、「癌（ｃａｎｃｅｒ）」および「癌性の（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」という用語は、典型的に未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すか、またはそれについて記載している。癌の例は、限定されないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病、ならびにそれらの転移を含む。「転移」という用語は、血液またはリンパ管あるいは膜表面を介して、疾患を引き起こす有機体または悪性あるいは癌性の細胞を身体の他の部分への転移を指す。そのような癌の非限定的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮の癌腫、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、および様々なタイプの頭頸部癌を含む。表２は、この開示で使用される癌関連抗原の例示的で非限定的なリストである。
【０１１２】
本明細書に記載されるように、「共刺激」という用語は、ナイーブＴ細胞を、上記の特定の抗原を有する細胞に対する免疫反応をもたらすことができる抗原特異的Ｔ細胞へと活性化する働きをする二次シグナルをインビボで生成する分子を指す。本開示は、特定の共刺激分子に限定されない。様々な共刺激分子が当該技術分野において周知である。共刺激分子のいくつかの限定しない例は、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０Ｌ、およびＩＣＯＳＬであり、それらをコードするそれぞれの受容体およびポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、本開示の共刺激分子は、以下のリガンドおよびそれらのそれぞれの受容体のいずれか１つ以上であってもよい：Ｂ７−１／ＣＤ８０，  ＢＴＬＡ，  Ｂ７−２／ＣＤ８６，  ＣＤ２８，  Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１，  ＣＴＬＡ−４，  Ｂ７−Ｈ２，  Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５，  Ｂ７−Ｈ３，  ＩＣＯＳ，  Ｂ７−Ｈ４，  ＰＤ−１，  Ｂ７−Ｈ６，  ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ，  Ｂ７−Ｈ７，  ＰＤＣＤ６，  ＬＩＬＲＡ３／ＣＤ８５ｅ，  ＬＩＬＲＢ２／ＣＤ８５ｄ／ＩＬＴ４，  ＬＩＬＲＡ４／ＣＤ８５ｇ／ＩＬＴ７，  ＬＩＬＲＢ３／ＣＤ８５ａ／ＩＬＴ５，  ＬＩＬＲＢ１／ＣＤ８５ｊ／ＩＬＴ２，ＬＩＬＲＢ４／ＣＤ８５ｋ／ＩＬＴ３，  ４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７，  ＧＩＴＲ  リガンドＴＮＦＳＦ１８，  ４−１ＢＢ  リガンド／ＴＮＦＳＦ９，  ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４，  ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ，  ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４，  ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ，  リンホトキシン−α／ＴＮＦ−β，  ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７，  ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４，  ＣＤ２７  リガンド／ＴＮＦＳＦ７，  ＯＸ４０  リガンド／ＴＮＦＳＦ４，  ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８，  ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ，  ＣＤ３０  リガンド／ＴＮＦＳＦ８，  ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ，ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５，  ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５，  ＣＤ４０  リガンド／ＴＮＦＳＦ５，  ＴＮＦ−α，  ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５，  ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ，  ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８，  ２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４，  ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５，  ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８，  ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３，  ＣＤ２，  ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７，ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９，  ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６，  ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２，  ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０，  ＣＤ５８／ＬＦＡ−３，  ＣＤ７，  ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６，  ＣＤ９６，  ＥｐｈＢ６，  ＣＤ１６０，  インテグリンα  ４  β  １，  ＣＤ２００，  インテグリンα  ４  β  ７／ＬＰＡＭ−１，  ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１，  ＬＡＧ−３，  ＣＲＴＡＭ，  ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ，  ＤＡＰ１２，  ＴＩＭ−４，  Ｄｅｃｔｉｎ−１／ＣＬＥＣ７Ａ，  ＴＳＬＰ  Ｒ，  ＩＣＯＳＬ、および／またはその各々の生物学的同等物。
【０１１３】
本明細書で使用されるように、用語「共同刺激的リガンド」は、共刺激分子と相互作用する細胞表面分子を意図している。
【０１１４】
本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、分子および細胞のレベルで身体内の広範囲の生物学的過程を制御するためのシグナル伝達分子として作用する、免疫系において様々な細胞によって分泌された低分子量タンパク質を包含する。「サイトカイン」は、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインのクラス内にある個々の免疫調節タンパク質を含む。
【０１１５】
本明細書で使用されるように、用語「糖尿病」は、遺伝的および環境的要因の組み合わせによって引き起こされた炭水化物代謝の可変的な障害を指し、通常、インスリンの不適切な分泌または利用、過度の尿産生、血液および尿における糖の過剰量、および渇き、空腹、および体重減少を特徴とする。糖尿病は、１型糖尿病および２型糖尿病を特徴とする。非肥満糖尿病（「ＮＯＤ」）マウスは、糖尿病に関する試験および処置のための容認された動物モデルである。マウスにおける１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）は、自己反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞と関連する。非肥満糖尿病（ＮＯＤ）ハツカネズミは、自己抗原の増え続けるリストを認識するＴ細胞による膵臓のβ細胞の選択的な破壊に起因するヒトＴ１Ｄに非常によく似ているＴ１Ｄの形態を発展させる。Ｔ１Ｄの開始はＣＤ４＋細胞の寄与を明らかに必要とするが、Ｔ１ＤがＣＤ８＋Ｔ細胞依存性であるという有力な証拠がある。ＮＯＤマウスにおける島関連ＣＤ８＋細胞のかなりの割合が、「８．３−ＴＣＲ様」と呼ばれるＣＤＲ３不変Ｖα１７Ｊα４２＋ＴＣＲを使用することが発見されている。ＭＨＣ分子Ｋｄの文脈での（組み合わせのペプチドライブラリを使用して定義された）ミモトープＮＲＰ−Ａ７を認識するこれらの細胞は、既に最も初期のＮＯＤ島ＣＤ８＋浸潤物の重要な成分であり、糖尿病誘発性であり、および未知の機能を有するタンパク質である島特異的なグルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連のタンパク質（ＩＧＲＰ）からペプチドを標的とする。このペプチド（ＮＲＰ−Ａ７に類似した、ＩＧＲＰ２０６−２１４）を認識するＣＤ８＋細胞は、循環が異常に頻繁である（＞１／２００のＣＤ８＋細胞）。顕著なことに、ＮＯＤマウスにおける糖尿病への膵島炎の進行には、循環するＩＧＲＰ２０６−２１４反応性ＣＤ８＋プールの周期的な拡張（ｃｙｃｌｉｃ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、およびその島関連対応物の貪欲な成熟が常に伴う。より最近では、ＮＯＤマウスにおける島関連ＣＤ８＋細胞が、複数のＩＧＲＰエピトープを認識することが示され、これは、ＩＧＲＰが、少なくともマウスＴ１ＤにおいてＣＤ８＋細胞に対する優性の自己抗原であることを示唆している。ＮＯＤ島関連ＣＤ８＋細胞、特に疾患プロセスの早い時期に見られるものも、インスリンエピトープ（Ｉｎｓ  Ｂ１５−２３）を認識する。
【０１１６】
本明細書で使用されるように、用語「糖尿病前症」は、無症候性のβ細胞損傷を特徴とする糖尿病状態に先行する無症候性期を意図し、ここで患者は正常な血漿グルコースレベルを示す。それはまた、島細胞自己抗体（ＩＣＡ）の存在を特徴とし、臨床症状の発症に近づくと、グルコースへの不耐性が伴う可能性がある。
【０１１７】
本明細書で使用されるように、用語「多発性硬化症関連障害」は、ＭＳに対する感受性またはＭＳと共存する障害を意図する。そのようなものの非限定的な例は、視神経脊髄炎スペクトル障害（ＮＭＯ）、ブドウ膜炎、神経障害性疼痛硬化症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、散在性硬化症、全身性硬化症、脊髄視神経ＭＳ、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症ならびに失調性硬化症を含む。
【０１１８】
用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が反応または認識する抗原上の部位を指すように交換可能に使用される。Ｂ細胞エピトープは、連続アミノ酸またはタンパク質の三次フォールディングによって並置された非連続アミノ酸から形成することができる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒への曝露で保持され、一方で三次フォールディングによって形成されたエピトープは、典型的に変性溶媒での処置によって失われる。エピトープは、典型的に、特有の空間構造に少なくとも３のアミノ酸、およびより一般的には、少なくとも５または８−２０のアミノ酸を含む。エピトープの空間構造を判定する方法は、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元の核磁気共鳴を含む。例えば、Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （１９９６）を参照。Ｔ細胞は、ＣＤ８細胞に対して約９のアミノ酸またはＣＤ４細胞に対して約９−２０のアミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープに応答するプライムされたＴ細胞により３Ｈ−チミジン取込みによって判定されるように、エピトープを認識するＴ細胞は、抗原依存性増殖を測定するインビトロのアッセイ（Ｂｕｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｆ．  Ｄｉｓ．  ，  １７０：１１１０−１１１９，  １９９４），  ｂｙ    （ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｓｓａｙ，  Ｔｉｇｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ，  １５６（１０）：３９０１−３９１０，  １９９６）によって、抗原依存性死滅によって、またはサイトカイン分泌によって同定することができる。細胞媒介性免疫反応の存在は、増殖アッセイ（ＣＤ４＋Ｔ細胞）またはＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）アッセイによって判定することができる。
【０１１９】
随意に、抗原または好ましくは抗原のエピトープは、ＭＨＣおよびＭＨＣ関連タンパク質などの、他のタンパク質との融合タンパク質に化学的に結合されるか、または該融合タンパク質として発現され得る。
【０１２０】
本明細書で使用されるように、「個体」、「患者」、および「被験体」という用語は、同義的に使用され、哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体はヒトである。他の実施形態では、個体は、獣医薬を必要とする哺乳動物、または研究室で一般に使用される哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、またはヒツジである。
【０１２１】
本開示で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、組換え体であるか、または総ゲノム核酸のない状態で単離されている核酸分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」には、オリゴヌクレオチド（核酸１００残基以下の長さ）、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。ある態様において、ポリヌクレオチドは、それらの自然発生の遺伝子またはタンパク質コード化配列から実質的に単離された制御配列を含んでいる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、そのアナログ、またはその組み合わせであってもよい。ポリペプチドのすべてまたは一部をコードする核酸は、以下の長さのこうしたポリペプチドのすべてまたは一部をコードする連続した核酸配列を含んでもよい：１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４４１、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、１０１０、１０２０、１０３０、１０４０、１０５０、１０６０、１０７０、１０８０、１０９０、１０９５、１１００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、９０００、１００００、またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、あるいは塩基対。所定の種からの特定のポリペプチドが、わずかに異なる核酸配列を有するにもかかわらず、同じまたは実質的に同様のタンパク質、ポリペプチド、あるいはペプチドをコードする、天然の変異を含有する核酸によってコードされ得ることも熟考される。
【０１２２】
ポリヌクレオチドは、以下の５つのヌクレオチド塩基の特異的配列から構成される：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡでる場合のチミンに対するウラシル（Ｕ）。したがって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表示である。このアルファベット表示は、中央処理装置を有するコンピューターにおけるデータベースに入力され得、ゲノム機能解析およびホモロジー検索などのバイオインフォマティクス用途に使用され得る。
【０１２３】
ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書で使用されるように、用語「単離された」または「組み換えの」は、巨大分子およびポリペプチドの天然源に存在する、他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子をそれぞれ指す。用語「単離されたまたは組み換えの核酸」は、フラグメントとして自然発生しない、および自然状態で見られないであろう核酸フラグメントを含むことを意図する。用語「単離された」は、本明細書において、他の細胞タンパク質から単離されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびタンパク質を指すために使用され、精製されたポリペプチドおよび組み換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。他の実施形態では、用語「単離されたまたは組み換えの」は、構成成分、細胞から分離されていること、そうでなければ、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントが、通常、自然に関連することを意味する。例えば、単離された細胞は、類似していない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離される細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、通常、その天然または自然の環境において（例えば染色体上で）関連する、３’および５’の連続ヌクレオチドから分離される。当業者に明白なように、自然に発生しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらのフラグメントは、これらを自然に発生する等価物と区別するために「分離」を必要としない。
【０１２４】
核酸またはポリヌクレオチドに関して「外因性」とは、核酸が組み換え核酸構築物の一部であることを示すか、またはその自然環境にないことを示す。例えば、外因性核酸は、別の種（つまり、異種核酸）へと導入された１つの種からの配列であり得る。典型的には、そのような外因性核酸は、組み換え核酸構築物によって他の種へと導入される。外因性核酸はさらに、生物に固有であり、その生物の細胞へと再導入される配列であってもよい。天然配列を含む外因性核酸は、外因性核酸（例えば、組み換え核酸構築物中の天然配列に隣接するか、あるいはイントロン配列を欠いている、非天然制御配列（プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、ＩＲＥＳ、配列スキッピングリボソーム））に結合された非天然配列の存在によって自然発生の配列としばしば区別することができる。さらに、安定して形質転換された外因性核酸は、天然配列が自然に見られる位置以外の位置で典型的に組み込まれる。外因性要素は、例えば、遺伝的組換えを使用して構築物に加えられてもよい。
【０１２５】
本明細書で使用されるように、「相同する」、「相同性」、または「パーセント相同性」の用語は、参照配列と比較して核酸配列を記載するために本明細書で使用される場合、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：  ２２６４−２２６８，  １９９０，  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ａｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７，  １９９３）によって記載される式を用いて決定され得る。こうした式は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−４１０，  １９９０）のｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラムに組み入れられる。配列のパーセント相同性は、この出願の出願日の時点での、ＢＬＡＳＴの最新バージョンを使用して決定可能である。
【０１２６】
参照ポリペプチド配列に対するパーセント（％）配列同一性は、最大パーセントの配列同一性を達成するために配列を整列させ、必要に応じてガスを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージを指し、あらゆる保存的置換を配列同一性の一部として考慮しない。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列は、既知の様々な方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公開されている利用可能なコンピューター・ソフトウェアを用いて達成可能である。配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができ、それは、比較される配列の完全長にわたって最大の配列を達成するために必要とされるアルゴリズムを含む。しかし、本明細書における目的のために、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社よって作成され、そのソースコードは米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．２０５５９）にユーザー文書と共に提出されており、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  Ｃａｌｉｆ．）から公に利用可能であるか、またはソースコードからコンパイルできる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、デジタルＵＮＩＸ（登録商標）  Ｖ４．０Ｄを含むＵＮＩＸ（登録商標）オペレーティングシステム上で使用するためにコンパイルされなければならない。配列比較パラメータのすべてが、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され、変化しない。
【０１２７】
ＡＬＩＧＮ−２がアミノ酸配列の比較のために使用される状況において、所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列Ｂとの、または所与のアミノ酸配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａの％アミノ酸配列同一性（所与のアミノ酸配列Ｂへの、所与のアミノ酸配列との、または所与のアミノ酸配列Ｂに対して特定の％アミノ酸配列同一性を有するか、あるいはそれを含む所与のアミノ酸配列Ａとして代替的に表現することができる）は、以下のように計算される：画分Ｘ／Ｙの１００倍、ここで、ＸがそのプログラムのＡとＢのアライメントにおいて、配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２によって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、およびここで、ＹがＢにおけるアミノ酸残基の合計数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが理解されよう。特に別記しない限り、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムを使用して直前の段落で記載されるように、本明細書で使用されるすべての％アミノ酸配列同一性値が得られる。
【０１２８】
「組成物」は、活性薬剤と、不活性（ｉｎｅｒｔ）（例えば、検出可能な薬剤またはラベル）またはアジュバントなどの活性（ａｃｔｉｖｅ）な別の化合物または組成物との組み合わせを意味するように意図される。ある実施形態では、組成物はアジュバントを含有していない。
【０１２９】
「医薬組成物」は、医薬組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断または治療の用途に適したものにする、不活性または活性な担体との組み合わせを含むように意図される。
【０１３０】
本明細書で使用されるように、「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む分子を指す。
【０１３１】
本開示の他の目的、特徴、および利点は、後述する詳細な説明から明らかになるだろう。追加の定義もそこで提供される。しかし、本開示の精神および範囲内の様々な変更および修正が、詳細な説明から当業者に明白になるため、この詳細な説明および具体的な例が、本開示の具体的な実施形態を示唆しながらも、例示目的のみで与えられることが理解されるべきである。
【０１３２】
この開示はアッセイを実施するのに必要な新規なアッセイおよび組成物を提供する。１つのそのような組成物は、外因的に導入された組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、およびクラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）複合体を結合する共受容体を含む単離細胞である。さらなる態様では、単離細胞は、外因的に導入されたＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体を含む。さらなる態様では、単離細胞は、共刺激分子および／またはサイトカイン受容体に対して外因的に導入された受容体を含む。
【０１３３】
＜細胞＞
本明細書に記載される効力アッセイで利用される細胞は真核細胞である。細胞は最小限で発現する：１）分析するためにｐＭＨＣ−ＮＰに結合されるペプチド−ＭＨＣを特異的に結合する組み換えまたは天然のＴＣＲ；２）ＣＤ３シグナル複合体３）、ＴＣＲ経路依存性レポーター；および、４）ＭＨＣ共受容体。いくつかの細胞または細胞株は、本明細書に記載されるアッセイを実行するのに十分なレベルで、ＣＤ３シグナル複合体およびＭＨＣ共受容体（例えば、ＣＤ４またはＣＤ８）を自然に発現することができる。しかし、特定の細胞または細胞株に基づいて、ＭＨＣ共受容体、あるいはＣＤ３シグナル複合体の１つ以上のポリペプチドは、外因性ポリヌクレオチドによって導入されて、均質様式でシグナルを増加させるか、またはシグナルを調節することができる。細胞は、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、ＭＨＣ共受容体、またはＣＤ３シグナル複合体の１つ以上のポリペプチドの１つ以上を発現するために設計された初代細胞あるいは細胞株であり得る。設計され得る適切な細胞株の非限定的な例は、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４、またはこの組み合わせを含む。細胞が、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、ＭＨＣ共受容体、またはＣＤ３シグナル複合体の１つ以上のポリペプチドのいずれも内因的に発現しない場合、その成分は細胞または細胞株に導入されたポリヌクレオチドから発現され得る。ある実施形態では、細胞はＣＤ３シグナル複合体を内因的に発現しない。ある実施形態では、細胞はＭＨＣ共受容体を内因的に発現しない。一態様では、細胞は、内因的に共刺激分子および／またはサイトカインに対して受容体を発現する。ある実施形態では、細胞は低レベルで発現するか、または共刺激分子および／またはサイトカインに対する受容体を発現しないが、Ｔ細胞が活性化される場合、その発現がアップレギュレートされる。細胞は、ＭＨＣ共受容体、ＣＤ３シグナル複合体の一部であるポリペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチドの任意の１つ以上の追加を含むことができる。ある実施形態では、ＣＤ３シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５３と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＣＤ３シグナル複合体の一部であるポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態では、ＭＨＣ共受容体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４９あるいは５５１と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％と同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ＭＨＣ共受容体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５０あるいは５５２と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１３４】
＜Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）＞
本明細書に記載される効力アッセイに利用される細胞または細胞株は、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する。組み換えＴ細胞受容体は、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、イントロン配列、または天然のプロモーターあるいはエンハンサーエレメントの１つ以上を欠くポリヌクレオチドによってコードされるものである。この組み換えＴＣＲは、形質導入、トランスフェクション、または感染により導入された外因性ポリヌクレオチドによってコードすることができる。ある実施形態では、外因性ポリヌクレオチドは細胞または細胞株のゲノムへ組み込まれる。Ｔ細胞受容体の非限定的な例は、限定されないが、ＴＣＲαおよびＴＣＲβを含むヘテロ二量体、ＴＣＲγおよびＴＣＲδを含むヘテロ二量体、ならびに単鎖ＴＣＲ構築物を含む。ある実施形態では、ＴＣＲはマウス化される（つまり、ＴＣＲはマウスＣＤ４分子と相互作用するために最適化される）。ＴＣＲαの非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＢ３１８８０．１、ＡＡＢ２８３１８．１、ＡＡＢ２４４２８．１、およびＡＤＷ９５８７８．１、ならびにその各々の等価物）。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に導入され、細胞表面上の発現のための有効に結合された制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターをさらに含むことができる。
【０１３５】
ＴＣＲβの非限定的な例もまた、ＧｅｎＢａｎｋで見つけることができる（受入番号：ＡＡＢ３１８８７．１、ＡＫＧ６５８６１．１、ＡＤＷ９５９０８．１、およびＡＡＭ５３４１１．１、ならびにその各々の等価物）。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。一実施形態では、ＴＣＲγ−鎖は、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＭ２１５３３．１、ＤＡＡ３０４４９．１、およびＡＢＧ９１７３３．１、ならびにその各々の等価物）で見つかった１つ以上の配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。一実施形態では、ＴＣＲδ−鎖は、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：Ｑ７ＹＲＮ２．１、ＡＡＣ４８５４７．１、ＪＣ４６６３、およびＮＰ＿００１００９４１８．１、ならびにその各々の等価物）で見つかった１つ以上の配列を含む。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。単鎖ＴＣＲは当技術分野において既知である。単鎖ＴＣＲの非限定的な例は、それについてＷＯ１９９６０１８１０５およびＵＳ２０１２０２５２７４２、およびその各々の等価物で開示され、その各々は参照によってその全体が取り込まれる。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入され、有効に結合された細胞表面上の発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターをさらに含む。
【０１３６】
一態様では、ＴＣＲは、ＷＯ１９９６０１８１０５およびＵＳ２０１２／０２５２２７４２に開示されるような単鎖ＴＣＲである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
【０１３７】
ある実施形態では、本明細書に記載される方法および細胞株と共に使用される組み換えＴＣＲは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は別々に翻訳される。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単鎖ＴＣＲとして単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の間の切断部位を含む単一のポリペプチドとして翻訳される。ある実施形態では、切断部位はリボソームスキッピング配列を含む。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、成熟した（切断された分泌リーダー配列）形態で細胞の表面上で発現される。
【０１３８】
ある実施形態では、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６  ５３９、５４１、５４４、あるいは５４６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、５４２、５４５、あるいは５４７のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８、５３０、５３４、５３６、５３９あるいは５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９、５３１、５３５、５３７、５４０、あるいは５４２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０１３９】
ある実施形態では、ＴＣＲは、ＤＲＢ１＊０３０１／ＤＲＡ＊０１０１に結合されるヒト島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）アミノ酸１３〜２５（ＱＨＬＱＫＤＹＲＡＹＹＴＦ）に特異的である。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２８あるいは５３０のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２９あるいは５３１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３４あるいは５３６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３５あるいは５３７のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０１４０】
ある実施形態では、ＴＣＲは、ＤＲＢ１＊０４０１／ＤＲＡ＊０１０１に結合されたヒトプレプロインスリンアミノ酸７６〜９０（ＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧ）に特定である。ある実施形態では、ＴＣＲα鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３９あるいは５４１のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり、ＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４０あるいは５４２のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。
【０１４１】
さらなる態様では、ＴＣＲαおよびＴＣＲβをコードするポリヌクレオチドは、リボソームスキッピング配列をさらにコードし、その非限定的な例は、限定されないが、２Ａリボソームスキッピング配列（例えば、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、あるいはＴ２Ａを含む）またはＩＲＥＳ配列を含む。したがって、一態様では、リボソームスキッピング配列は、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、またはＴ２Ａのリボソームスキッピング配列を含む。いくつかの実施形態では、２Ａリボソームスキッピング配列は、Ｖａｌ／Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｘ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏのコンセンサスモチーフを含み、ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表す。２Ａペプチド配列の非限定的な例は、例示的な配列表にて提供される。ポリヌクレオチドは、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列をさらに含むことができる。リボソームスキッピング配列の例は、ＷＯ２０１３／０５７５８６で見つけることができ、それは参照によって組み込まれる。
【０１４２】
ＩＲＥＳ配列およびリボソームスキッピング配列の非限定的な例は、表３および４にて提供される。
【０１４３】
ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリペプチドとして産生され、およびＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５６〜５２３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を有するリボソームスキッピング配列によって分離される。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４、５２６、あるいは５４３のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４、５２６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、単一のポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２６のいずれか１つと少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
ある実施形態では、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖は単一のポリヌクレオチドによってコードされ、該ポリヌクレオチドはＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖との間にＩＲＥＳ配列を含む。ある実施形態では、該ＩＲＥＳ配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２４〜５２６のいずれか１つに記載されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、該ＴＣＲα鎖および／またはＴＣＲβ鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３２あるいは５５７に少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のポリヌクレオチドによってコードされる。このポリヌクレオチドは、安定して細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０１４５】
本明細書に記載の効力アッセイで利用される細胞によって発現されたＴＣＲは、自己免疫性または炎症性疾患関連抗原に特異的である。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、ＭＨＣ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、自己免疫性または疾患関連抗原は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、ＴＣＲは表１に記載される任意のポリペプチド抗原に結合する。
【０１４６】
本明細書に記載の効力アッセイで利用される細胞によって発現されたＴＣＲは、癌抗原に特異的である。ある実施形態では、癌抗原はＭＨＣ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原はＭＨＣクラスＩ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原はＭＨＣクラスＩＩ分子に結合されるポリペプチドである。ある実施形態では、癌抗原は表２に記載されるポリペプチドである。
【０１４７】
＜ＴＣＲ依存性レポーター＞
いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターはＴＣＲ活性化またはＴＣＲ経路活性化のレポーターである。一実施形態では、レポーターは、細胞の濃度、発現、活性、局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用の１つ以上を提供する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ）（ＳＥＡＰ）、蛍光タンパク質、またその組み合わせを含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターの核因子、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ−−１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、あるいはＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターを含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５５と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、ルシフェラーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５６と少なくとも８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％相同のポリヌクレオチドによってコードされる。
【０１４８】
ＴＣＲ依存性レポーターは上流のプロモーターによって活性化される。プロモーターの非限定的な例が本明細書に記載され、それは、限定されないが、ＮＦＡＴ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、およびＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターを含む。さらなる例が例示的な配列表にて提供される。さらなる態様では、ポリヌクレオチドはエンハンサー配列をさらに含む。
【０１４９】
他の態様では、ＴＣＲ依存性レポーターは、数量化できる遺伝子産物レポーターを含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。該数量化できる遺伝子産物レポーターの非限定的な例は、限定されないが、ルシフェラーゼ、βラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、またはその組み合わせを含む。レポーターとしての取り込みのためのルシフェラーゼ配列の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＲ２０７９２．１、ＡＡＬ４０６７７．１、ＡＡＬ４０６７６．１、およびＡＡＶ３５３７９．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。ルシフェラーゼレポーターシステムは市販されている（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔ．＃Ｅ１５００またはＥ４５５０）。さらなる例は、例示的な配列表にて提供される。βラクタマーゼ配列の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＭＭ７０７８１．１、ＣＡＡ５４１０４．１、およびＡＡＡ２３４４１．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。「ＣＡＴ」の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、受入番号：ＯＣＲ３９２９２．１、ＷＰ＿０７２６４３７４９．１、ＣＵＢ５８２２９．１、およびＫＩＸ８２９４８．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ＣＡＴアッセイは市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｆｉｓｈｅｒ社のＦＡＳＴ  ＣＡＴ（商標）  Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ  Ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｆ−２９００））。ＳＥＡＰ配列の非限定的な例は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＤＶ１０３０６．１、ＡＡＢ６４４０４．１、ＥＥＢ８４９２１．１、およびＥＦＤ  ７０６３６．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。ＳＥＡＰ活性は、ルミノメーター（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＴｕｒｎｅｒ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｖｅｒｉｔａｓ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）で測定することができる。蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、増強された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または他の適切な蛍光タンパク質、あるいはそれらの組み合わせ、またはそれらの蛍光性の部分または誘導体を含む。蛍光タンパク質の配列は、２０１７年１月１２日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＦＡ５２６５４．１、ＡＣＳ４４３４８．１、およびＡＡＱ９６６２９．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞に形質導入され得る。蛍光タンパク質プロモーターレポーターは市販されている（例えば、ＴａｋａＲａ  Ｃａｔ．＃６３１０８９）。
【０１５０】
＜ＭＨＣ共受容体＞
形質転換細胞は、ＭＨＣリガンド（例えばクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣリガンド）を結合するＭＨＣ共受容体も発現する。いくつかの実施形態において、該ＭＨＣリガンドは、古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩタンパク質、古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、非古典的ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＭＨＣ二量体（Ｆｃ融合）、ＭＨＣ、ＭＨＣ多量体、またはＭＨＣタンパク質の多量体型を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。
【０１５１】
一態様では、ＭＨＣクラスＩ共受容体はＣＤ８複合体を含む。ＣＤ８の例示的な配列は、２０１７年１月１９日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＡＡＡ９２５３３．１、ＡＪＰ１６７０６．１、ＡＡＡ７９２１７．１、および１２０３２１６Ａ、ならびにその各々の等価物）にあり得る。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、エンハンサー、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
【０１５２】
他の様相では、ＭＨＣクラスＩＩ共受容体はＣＤ４分子を含む。例示的なＣＤ４タンパク質配列は、２０１７年１月１９日に最終アクセスされたＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＣＡＡ７２７４０．１、ＡＭＲ４４２９３．１、ＡＣＧ７６１１５．１、ＡＡＣ３６０１０．１、およびＡＡＢ  ５１３０９．１、ならびにその各々の等価物）にあり得る。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。ポリヌクレオチドは、細胞表面上での発現のための制御シグナル、ならびに形質導入および発現のためのベクターに有効に結合され得る。
【０１５３】
＜ＣＤ３＞
さらなる態様では、「ＣＤ３」をコードするポリヌクレオチド（分化のクラスタ３）分子は、細胞に形質導入され、内因性ＣＤ３を欠く細胞はタンパク質を発現するようになる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３は４つの別個の鎖を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからなる。ＣＤ３鎖の非限定的な例は、ＧｅｎＢａｎｋ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号：ＣＡＡ７２９９５．１、ＡＡＩ４５９２７．１、ＮＰ＿９９８９４０．１、ＡＡＢ２４５５９．１、ＮＰ＿０００７２３．１、ＡＥＱ９３５５６．１、およびＥＡＷ６７３６６．１、ならびにその等価物）で見つけることができ、この開示に有用である。当業者には明白であるように、ＣＤ３をコードするポリヌクレオチドは、細胞表面上でのＣＤ３の発現のための調節エレメント、随意に、エンハンサーに有効に結合され、ポリヌクレオチドの発現のためのベクター内に含まれてもよい。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において既知の方法を使用して細胞に形質導入される。
【０１５４】
一実施形態では、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体は、αとβのＴＣＲ鎖のポリペプチドまたはポリペプチド、ＣＤ３γ、δ、ならびにεのポリペプチド、およびζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。様々なモジュールで形成され、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。いくつかの実施形態では、複合体は、主に、ＣＤ３鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）の存在を介したシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原、超抗原、または抗体（例えば、受容体抗体）によって刺激されたＴＣＲシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の外因的発現は、ＣＤ３陰性細胞におけるＴＣＲシグナル伝達経路を促進する。
【０１５５】
＜共刺激的受容体および／またはサイトカイン＞
さらなる態様では、細胞は、選択された共刺激分子またはサイトカイン分子に対する受容体をコードするポリヌクレオチドを用いて形質導入される。共刺激サイトカイン分子の非限定的な例は本明細書で提供される。
【０１５６】
＜ベクター＞
ベクターまたは他の遺伝子送達システムは、上記のようなポリヌクレオチドで細胞を形質導入するために使用することができる。一態様では、用語「ベクター」は、非分裂細胞および／またはゆっくり分裂する細胞を感染させて形質導入し、かつ標的細胞のゲノムへ組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは野生型のウイルスまたはプラスミド（例えば、プラスミド）に由来するか、またはにそれに基づく。さらなる態様では、ベクターは野生型のレンチウイルスに由来するか、またはそれに基づく。そのようなものの例としては、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）が挙げられる。あるいは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）などのベクター骨格の基礎として他のレトロウイルスを使用することができると考えられる。本発明のウイルスベクターを特定のウイルスの成分に限定する必要がないことは明白である。ウイルスベクターは、２つ以上の異なるウイルスに由来した成分を含み、合成成分をさらに含むことがある。ベクター成分は、標的細胞特異性などの所望の特性を得るために操作することができる。
【０１５７】
この開示の組換えベクターは霊長類および非霊長類に由来する場合がある。霊長類レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体、およびサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。非霊長類レンチウイルス群は、原型「スローウイルス」ビスナ／マエディウイルス（ＶＭＶ）、ならびに関連するヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡＶ）、およびより最近報告されたネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）ならびにウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）を含む。従来の組み換えレンチウイルスベクターは、当技術分野において既知であり、例えば、米国特許第６，９２４，１２３号；第７，０５６，６９９号；第７０７，９９３号；第７，４１９，８２９号、および第７，４４２，５５１号を参照、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５８】
米国特許第６，９２４，１２３号は、特定のレトロウイルス配列が標的細胞ゲノムへの組み込みを促進することを開示する。この特許は、各レトロウイルスのゲノムが、ビリオンタンパク質および酵素をコードするｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖと呼ばれる遺伝子を含むことを教示する。これらの遺伝子は、末端反復配列（ＬＴＲ）と呼ばれる領域によって両末端で隣接している。ＬＴＲはプロウイルスの組み込みおよび転写の原因となる。それらはエンハンサー−プロモーター配列としても機能する。言いかえれば、ＬＴＲは、ウイルス遺伝子の発現を制御することができる。レトロウイルスＲＮＡのキャプシド形成は、ウイルスゲノムの５’末端にあるｐｓｉ配列によって生じる。ＬＴＲそれ自体が、Ｕ３、ＲおよびＵ５と呼ばれる３つの要素に分割することができる同一の配列である。Ｕ３は、ＲＮＡの３’末端に固有の配列に由来する。Ｒは、ＲＮＡの両末端で反復される配列に由来し、Ｕ５は、ＲＮＡの５’末端に固有の配列に由来する。３つの要素のサイズは、様々なレトロウイルス中でかなり変わることもある。ウイルスゲノムについて。およびポリ（Ａ）の添加（終結）の部位は、右側ＬＴＲのＲとＵ５との間の境界にある。Ｕ３は、プロウイルスの転写調節エレメントのほとんどを含有しており、それは、細胞、ならびに場合によっては、ウイルスの転写活性化因子タンパク質に反応するプロモーターおよび複数のエンハンサー配列を含む。
【０１５９】
構造遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ自体に関して、ｇａｇはウイルスの内部構造タンパク質をコードする。ｇａｇタンパク質は、成熟したタンパク質ＭＡ（マトリックス）、ＣＡ（キャプシド）およびＮＣ（ヌクレオカプシド）へとタンパク分解性処理される。ｐｏｌ遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するＤＮＡポリメラーゼ、関連ＲＮＡ分解酵素Ｈ、およびインテグラーゼ（ＩＮ）を含有する逆転写酵素（ＲＴ）をコードする。
【０１６０】
ウイルスベクター粒子の産生については、ベクターＲＮＡゲノムは、宿主細胞中でそれをコードするＤＮＡ構築物から発現される。ベクターゲノムによってコードされない粒子の成分は、宿主細胞中で発現される追加の核酸配列（ｇａｇ／ｐｏｌおよびｅｎｖの遺伝子のいずれか、または両方を通常含む「パッケージングシステム」）によってトランスにおいて提供される。ウイルスベクター粒子の産生に必要な配列のセットは、一時的なトランスフェクションによって宿主細胞に導入され得るか、またはそれらは宿主細胞ゲノムへ組み込まれ得るか、あるいはそれらは混合した方法で提供され得る。関連する手法は当業者に知られている。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。関連する実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびアルファウイルスベクターからなる群から選択される。さらなる実施形態では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【０１６２】
非ウイルスベクターは、インビトロか、インビボか、またはエクスビボのいずれかで標的細胞に送達することができる異種性ポリヌクレオチドを含むプラスミドを含む。異種性ポリヌクレオチドは対象の配列を含み、１つ以上の調節エレメントに有効に結合でき、かつ対象の核酸配列の転写を制御することができる。本明細書で使用されるように、ベクターは最終の標的細胞または被験体の複製可能である必要はない。
【０１６３】
一実施形態では、さらなる調節エレメントは、プロモーター、エンハンサー、および／またはプロモーター／エンハンサーの組み合わせである。ＶＥＧＦタンパク質をコードする核酸の発現を調節するプロモーターは、構成的のプロモーターになりえる。一態様では、自殺遺伝子の発現を調節するプロモーターは構成的プロモーターである。構成的プロモーターの非限定的な例は、ＳＦＦＶ、ＣＭＶ、ＰＫＧ、ＭＤＮＵ３、ＳＶ４０、Ｅｆ１ａ、ＵＢＣ、およびＣＡＧＧを含む。一態様では、エンハンサーは、ウッドチャック調節後エレメント（  Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｐｏｓｔ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ）（「ＷＰＲＥ」）（例えば、  Ｚｕｆｆｅｒｅｙ，  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３（４）：２８８６−２９９２）を参照）。
【０１６４】
この開示に有用なプロモーターは、構成的または誘導可能であり得る。プロモーターのいくつかの例は、ＳＶ４０の初期のプロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルスマヨール後期プロモーター、単純疱疹ウイルスプロモーター、およびＣＭＶプロモーターを含む。一実施形態では、テトラサイクリン活性化タンパク質の発現を調節するプロモーターは構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、発現を一時的に調節する誘導可能なプロモーター、組織特異的プロモーターあるいはプロモーターである。一実施形態では、プロモーターはホスホグリセレートキナーゼプロモーター（ＰＧＫ）である。
【０１６５】
さらなる態様では、ベクターは、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）などをコードする遺伝子などのマーカーまたは検知できるラベルをさらに含む。これらは市販されており、技術分野で説明される。
【０１６６】
本発明の遺伝子を送達する他の方法は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、またはリポソーム媒介トランスフェクションを含む。この発明のベクターでトランスフェクトされる宿主細胞は、（限定されないが）大腸菌または他の細菌、酵母、菌類、昆虫細胞（例えば、ＳＦ９昆虫細胞の中の発現のためにバキュロウイルスのベクターを使用）、あるいはマウス、ヒト、または他の動物（例えば、哺乳動物）に由来する細胞を含む。タンパク質のインビトロの発現において、融合、ポリペプチドフラグメント、またはクローン化ＤＮＡによってコードされた突然変異体も使用され得る。分子生物学の当業者は、組み換えタンパク質およびその断片を産生するために、種々様々の発現系および浄化システムが使用されてもよいと理解する。
【０１６７】
＜細胞集団＞
一態様では、本開示は単離細胞の集団に関連し、限定されないが、この開示の細胞（例えば、明細書に記載されるように修飾されるＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４）を含む。他の態様では、細胞はＣＤ３陰性細胞である。ＣＤ３陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、ＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−４７２）、Ｎｋ−９２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＳ−ＣＲＬ−３０００）、およびＪｅＫｏ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−３００６）を含む。いくつかの実施形態では、集団は実質的に均質である。他の実施形態では、集団は実質的に不均質である。ある実施形態では、集団はこの開示の複数の細胞である。ある実施形態では、集団は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９５％、９８％、または９９％純粋である、少なくとも１ｘ１０２〜１ｘ１０９の細胞を含む。
【０１６８】
＜モニタリング発現＞
当業者には明白であるように、形質導入されたポリペプチドの有効な発現は当技術分野において既知の方法を使用して判定される（例えば、形質導入および細胞と細胞集団上での培養後に、量的にあるいは質的にモニタリングできる、検知できる標識抗体またはそのフラグメントの使用）。
【０１６９】
＜細胞を調製するための方法＞
他の態様では、本開示は、単離細胞を調製する方法にも関連し、以下をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを用いた単離細胞の形質導入を含むか、またはそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる：組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、およびＭＨＣ共受容体。さらなる態様では、該方法は、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体をコードするポリヌクレオチド、および／または共刺激分子、および／またはサイトカインで細胞を形質導入する工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、該方法は、形質導入されたポリヌクレオチド（例えば、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、クラスＩまたはクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）リガンドを結合する共受容体、随意に、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体、共刺激分子および／またはサイトカインをコードするポリヌクレオチド）の１つ以上の発現に好都合な条件下で細胞を培養する工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、該方法は、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＴＣＲ経路依存性レポーター、クラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）リガンドを結合する共受容体、および／または、随意に、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体、および随意に、共刺激分子および／またはサイトカインを発現する細胞を単離させる工程を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、細胞はフローサイトメトリーを含む方法によって単離される。単離細胞は、形質導入されたポリヌクレオチドの拡大および継続的な発現のための条件下で培養され、それゆえ、細胞の集団が提供される。
【０１７０】
ある態様では、本開示は、ナノ粒子コアに随意に結合されるｐＭＨＣ分子の効力を測定するインビトロの方法に関する。該方法は：（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＴＣＲ経路依存性レポーターならびにＭＨＣリガンドを結合する共受容体を発現する形質導入された細胞を、ｐＭＨＣを含む有効な量の組成物と接触させる工程と、（ｂ）上記ＴＣＲ経路依存性レポーターあるいは上記レポーターからのシグナルを検出する工程を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。さらなる態様では、細胞は、ＣＤ３複合体および／または共刺激受容体、および／またはサイトカイン受容体をさらに含む。
【０１７１】
別の実施形態では、接触はインビトロである。
【０１７２】
一実施形態では、複合体上の少なくとも１つのｐＭＨＣはＴＣＲと相互作用し、ここで、相互作用はＴＣＲ依存性経路を活性化する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、ＴＣＲ活性化またはＴＣＲ経路活性化のレポーターである。一実施形態では、レポーターの特性は、細胞の濃度、発現、活性、局在化、タンパク質修飾、またはタンパク質間の相互作用を含む。一実施形態では、レポーターは、エフェクター細胞型に対して内因性である天然のレポーターであり、検知可能で、かつＴＣＲ活性化あるいはＴＣＲ経路活性化と相関する特性を有する。いくつかの実施形態において、レポーターは、エフェクター細胞型に対して外因性である人工レポーターであり、検出可能で、かつＴＣＲ活性化あるいはＴＣＲ経路活性化と相関する特性を有する。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、単離細胞は上記の通りである（例えば、ＪｕｒＭＡ、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７、ＨｕＴ−７８、ＣＥＭ、Ｍｏｌｔ−４、または初代Ｔ細胞の１つ以上を含むエフェクター細胞）。ＣＤ３陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、ＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−４７２）、Ｎｋ−９２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＳ−ＣＲＬ−３０００）、およびＪｅＫｏ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−３００６）を含む。
【０１７４】
一実施形態では、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、ルシフェラーゼ（ホタルまたはウミシイタケ）、βラクタマーゼ、ＣＡＴ、ＳＥＡＰ、蛍光タンパク質、および数量化できる遺伝子産物からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子を含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ経路依存性レポーターは、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターの核因子、ＮＦ−κＢ転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、ＡＰ−１転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーター、あるいはＩＬ−２転写因子結合ＤＮＡ配列またはプロモーターを含むか、それから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。一実施形態では、レポーターは遺伝子からなり、その発現はＴＣＲ経路依存性経路に制御下にある。
【０１７５】
一実施形態では、ＴＣＲ関連マルチサブユニットＣＤ３鎖シグナル複合体は、αおよびβのＴＣＲ鎖、ＣＤ３γ、δ、ならびにεのポリペプチド、およびζ鎖を含むか、代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。様々なモジュールで形成され、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は様々な役割を担うことができる。一実施形態では、複合体は抗原特異的認識に関与する。いくつかの実施形態において、複合体は、主に、ＣＤ３鎖の細胞質側末端におけるチロシン依存性免疫受容体活性化モチーフ（「ＩＴＡＭ」）の存在を介するシグナル伝達に関与する。いくつかの実施形態において、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、抗原、超抗原、または抗体（例えば、抗受容体抗体）によって刺激されたＴＣＲシグナル伝達経路に関与する。一実施形態では、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の外因的発現は、ＣＤ３陰性細胞のＴＣＲシグナル伝達経路を促進する。ＣＤ３陰性細胞の非限定的な例は、限定されないが、ＢＷ５１４７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＴＩＢ−４７２）、Ｎｋ−９２（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−２４０７）、Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＳ−ＣＲＬ−３０００）、およびＪｅＫｏ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−３００６）を含む。さらなる態様では、細胞は、サイトカインおよび／または個別に共刺激分子の受容体を内生的に発現する。
【０１７６】
＜効力アッセイの使用＞
一態様では、効力アッセイは、ｐＭＨＣ−ナノ粒子の効力、純度、または活性を測定することができる。アッセイは、例えば、様々なバッチまたは多くのｐＭＨＣ−ＮＰをモニターする品質管理工程として使用して、ロットが、Ｔ細胞を結合し、および／または所望の免疫応答を誘導することが可能な機能するｐＭＨＣを含むことを確認することができる。一態様では、効力アッセイは、ｐＭＨＣ−ナノ粒子の活性を測定することができ、随意に、ナノ粒子コアに結合される共刺激分子および／または１つ以上のサイトカインの１つ以上を含むか、それからさらになるか、あるいは代替的にそれから本質的になる。
【０１７７】
該アッセイにおいてテストすることができるナノ粒子について、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体は互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体のＭＨＣは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価および／または密度は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価および／または密度は、互いに同じまたは異なるものである。一態様では、組成物が分析され、ここで、組成物は、複数ｐＭＨＣ複合体を有するナノ粒子、次に、共同刺激および随意にサイトカインを有する別個の複数のナノ粒子を含む。上記のように、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体のＭＨＣは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインは、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、ナノ粒子コアの直径は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の結合価は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のｐＭＨＣ複合体の密度は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上の共刺激分子の結合価および／または密度は、互いに同じまたは異なるものであり；および／または、各ナノ粒子コア上のサイトカインの結合価および／または密度は、互いに同じまたは異なるものである。
【０１７８】
ある態様では、該アッセイにおいてテストすることができるナノ粒子が、本明細書で提供される複数のナノ粒子複合体を含む組成物において提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、担体、随意に医薬担体をさらに含む。
【０１７９】
該アッセイを使用して、ナノ粒子（例えば、ｐＭＨＣ−ナノ粒子）に随意に結合されるｐＭＨＣの効力を判定することができる。用語「粒子」、「ナノ粒子」、「微粒子」、「ビーズ」、「ミクロスフェア」、および本明細書において文法上の同等物は、被験体に投与可能である小さな離散粒子に適用される。ある実施形態では、粒子は実質的に球状である。用語「実質的に球状」は、本明細書で使用されるように、粒子の形状が約１０％を超えて球体から逸脱しないことを意味する。本開示の様々な既知の抗原またはペプチドの複合体は、粒子に適用され得る。
【０１８０】
互換性があり、本明細書に記載される効力アッセイを使用して分析可能なペプチドＭＨＣナノ粒子は、少なくと、非限定的な例として、ＷＯ２００８／１０９８５２、ＷＯ２０１２／０４１９６８、ＷＯ２０１２／０６２９０４、ＷＯ２０１３１４４８１１、ＷＯ２０１４／０５０２８６、ＷＯ２０１５／０６３６１６、ＷＯ２０１６／１９８９３２、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／００１５０８に記載されるものであり、それらのすべてが参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
本明細書に記載される効力アッセイは、組み換えＴＣＲおよび経路依存性レポーターで少なくとも形質導入された細胞からのシグナルを定量化するために使用することができる。当業者によってシグナルの定量化が多くの方法で実施および利用することができる。ある実施形態では、シグナルは定量化され、プリセットされた閾値と比較され、ナノメディシンまたはナノ粒子の所与の調製物が品質管理工程を通過するか否かを判定することができる。閾値は、陰性対照から定量化されたシグナルの少なくとも約１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、または１，０００％である。陰性対照は、例えば、組み換えＴＣＲを有し、かつ定量化される種類のレポーターを欠いている細胞であってもよく；あるいは、無関係なペプチドＭＨＣ複合体を含むか、ペプチドＭＨＣ複合体を含まないナノメディシンまたはナノ粒子であってもよい。ある実施形態では、効力アッセイは、特定のナノ粒子調製物のＩＣ５０を定義するために使用することができる。
【０１８２】
＜ナノ粒子コアおよび層組成＞
ｐＭＨＣ−ＮＰのナノ粒子コアは、コア、例えば、ソリッドコア、金属コア、デンドリマーコア、高分子ミセルナノ粒子コア、ナノロッド、フラーレン、ナノシェル、コアシェル、タンパク質ベースのナノ構造体、または脂質ベースのナノ構造体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、生体吸収性および／または生分解性である。いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、コアから成長する樹状構造を有する高度に分枝した巨大分子を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、デンドリマーナノ粒子コアである。さらなる態様では、デンドリマーナノ粒子コアは、ポリ（アミドアミン）−ベースのデンドリマーまたはポリ−Ｌ−リジンベースのデンドリマーを含み得るか、代替的にそれから本質的になり得るか、またはそれからさらになり得る。ある態様では、ナノ粒子コアは、ナノスケールのコアシェル構造へと構築された両親媒性ブロックコポリマーを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、高分子ミセルコアである。さらなる態様では、高分子ミセルコアは、ポリエチレングリコール−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンブロックコポリマーを使用して生成された高分子ミセルを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。さらなる態様では、ナノ粒子コアは、金属を含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。別の態様では、ナノ粒子コアはリポソームではない。コア材の追加の例は、限定されないが、標準および専門のガラス、シリカ、ポリスチレン、ポリエステル、ポリカーボネート、アクリルポリマー、ポリアクリルアミド、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、フッ素重合体、シリコン、セルロース、シリコン、金属（例えば、鉄、金、銀）、ミネラル（例えば、ルビー）、ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子、コロイド粒子、金属酸化物、金属硫化物、金属セレニド、および酸化鉄などの磁性材料）、およびそれらの合成物を含む。いくつかの実施形態では、酸化鉄ナノ粒子コアは、酸化鉄（ＩＩ、ＩＩＩ）を含む。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する２つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ粒子が使用される。これらの金属の粒子またはナノ粒子は、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ｃｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｍｎ、Ｓｍ、Ｎｄ、Ｐｒ、Ｇｄ、Ｔｉ、Ｚｒ、Ｓｉ、およびＩｎ、それらの前駆体、それらの二元合金、それらの三元合金ｋならびにそれらの金属間化合物から形成することができる。米国特許第６，７１２，９９７号を参照し、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ある実施形態では、ナノ粒子が生体適合性かつ生体吸収性であることを前提に、コアおよび層（以下に記載される）の組成物は変わり得る。コアは、均質組成であり得るか、または望まれる特性に依存する２つ以上のクラスの材料の合成物であり得る。ある態様では、金属ナノ球体が使用される。これらの金属ナノ粒子は、Ｆｅ、Ｃａ、Ｇａなどから形成され得る。ある実施形態では、ナノ粒子は、金または酸化鉄などの金属あるいは金属酸化物を含むコアを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる。いくつかの実施形態において、複数の共刺激分子および／または複数のサイトカインは、ナノ粒子デンドリマーコアあるいは高分子ミセルコアに結合される。
【０１８３】
粒子は、典型的に、実質的に球状のコアおよび随意に１つ以上の層またはコーティングからなる。コアは、本明細書に記載されるように、サイズおよび組成が異なり得る。コアに加えて、粒子は、対象の用途に適切な機能性を提供するために１つ以上の層を有してもよい。層の厚さは、存在する場合、具体的な用途の必要性によって様々であり得る。例えば、層は有用な光学的性質を与えることができる。
【０１８４】
層はまた、化学的に活性なまたは生物学的に活性な層のとして本明細書で言及される、化学的または生物学的な機能性を与えることができる。これらの層は、典型的に、粒子の外部表面上に適用され、ｐＭＨＣ−ＮＰに機能性を与えることができる。層は、（望ましい粒子直径に依存して）約０．００１マイクロメートル（１ナノメートル）から約１０マイクロメートルを超えて、または約１ｎｍから５ｎｍまで、または代替的に約１ｎｍから約１０ｎｍまで、または代替的に約１ｎｍから約４０ｎｍまで、または約１５ｎｍから約２５ｎｍまで、あるいは約１５ｎｍから約２０ｎｍの厚さにおよび、それらの間の範囲の厚さである。
【０１８５】
層またはコーティングは、生分解性の糖または他のポリマーを含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。生分解性の層の例は、限定されないが、デキストラン；ポリ（エチレングリコール）；ポリ（酸化エチレン）；マンニトール；ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）に基づいたポリ（エステル）；ＰＨＢ−ＰＨＶクラスのポリ（ヒドロキシアルカノエート）；およびデンプン、セルロース、およびキトサンなどの、他の修飾ポリ（サッカライド）を含む。さらに、ナノ粒子は、化学的な結合またはカップリングの部位に対して化学的な機能性を付与するための適切な表面を有する層を含んでもよい。
【０１８６】
層は、当業者に既知の様々な方法でナノ粒子上で生成され得る。例は、Ｉｌｅｒ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  １９７９；  Ｂｒｉｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒｅｒ，  Ｓｏｌ−ｇｅｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９９０）などに記載されるゾルーゲル化学技術を含む。ナノ粒子上の層の生産へのさらなるアプローチは、Ｐａｒｔｃｈ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．  Ａｄｈｅｓｉｏｎ，  ６７：２５９−２７６，  １９９８；Ｐｅｋａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６７：２５８，  （１９９４）；Ｈａｎｐｒａｓｏｐｗａｔｔａｎａ，  Ｌａｎｇｍｕｉｒ，  １２：３１７３−３１７９，  （１９９６）；Ｄａｖｉｅｓ，  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  １０：１２６４−１２７０，  （１９９８）；およびその中の参照などに記載される界面化学およびカプセル封入技術を含む。蒸着技術が使用されてもよく；例えば、Ｇｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｅｎｇｉｎ．，  ６：１−６，  （２０００）；および米国特許第６，３８７，４９８号を参照する。さらに他のアプローチは、Ｓｕｋｈｏｒｕｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ａｄｖ．  Ｔｅｃｈ．  ，  ９（１０−１１）：７５９−７６７，  （１９９８）；Ｃａｒｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ３２（７）：２３１７−２３２８，  （１９９８）；Ｃａｒｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ，  １２１（２５）：６０３９−６０４６，  （１９９９）；米国特許６，１０３，３７９号およびその中で参照された文献などに記載されるような交互積層法（ｌａｙｅｒ−ｂｙ−ｌａｙｅｒ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）を含む。
【０１８７】
ナノ粒子は、被験体に有効な量を投与した時、Ｔ細胞集団を拡大および分化させ、かつ疾患を処置するのに役立つ複数の疾患関連抗原−ＭＨＣ複合体に結合されるナノ粒子コアを含み得るか、それから本質的になり得るか、あるいはそれからさらになり得る。いくつかの態様では、１ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣの数（ナノ粒子複合体の「結合価」と本明細書と呼ばれる）は、上記の、参照によって本明細書に組み込まれる様々な範囲を有する。
【０１８８】
いくつかの態様では、ナノ粒子コアは、コアから成長する樹状構造を有する高度に分枝した巨大分子を含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる、デンドリマーナノ粒子コアである。さらなる態様では、デンドリマーナノ粒子は、ポリ（アミドアミン）ベースのデンドリマーまたはポリ−Ｌ−リジンベースのデンドリマーを含み得るか、または代替的にそれから本質的になり得るか、あるいはそれからさらになり得る。ある態様では、ナノ粒子コアは、ナノスケールのコアシェル構造へと構築された両親媒性ブロックコポリマーを含むか、代替的にそれから本質的になるか、またはそれからさらになる、高分子ミセルコアである。さらなる態様では、高分子ミセルコアは、ポリエチレングリコール−ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミンブロックコポリマーを使用して生成された高分子ミセルを含み得るか、代替的にそれから本質的になり得るか、またはそれからさらになり得る。デンドリマーコアまたは高分子ミセルコアは、本明細書に記載される外側の被膜または層をさらに含み得る。
【０１８９】
ある実施形態では、デンドリマーナノ粒子またはナノ粒子のデンドリマーナノ粒子コアとの合成の具体的な手段には、“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ−Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ．”  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  （１０９）：６９２−７０４  （２００５）に開示される方法など、金属イオンが、デンドリマーの内部へと抽出され、その後、化学的に還元されて、３ｎｍ未満の寸法を有するほぼ径単分散された（ｎｅａｒｌｙ  ｓｉｚｅ−ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ）粒子がもたらされる必要があり得、ここで、結果として生じるデンドリマーコア成分は、ナノ粒子を調製するための鋳型として機能するだけでなく、ナノ粒子を安定させるために機能することによって、溶解度を調整することを可能にし、固体担体上のナノ粒子の固定化のための手段を提供する。いくつかの実施形態において、複数の共刺激分子および／または複数のサイトカインは、ナノ粒子デンドリマーコアあるいは高分子ミセルコアに結合される。
【０１９０】
ナノ粒子コアのサイズは、約１ｎｍから約１μｍまでの範囲であり得る。ある実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約１未満μｍである。他の実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満である。さらなる実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約１ｎｍから約１０ｎｍまで、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、７５ｎｍ、または１００ｎｍである。特異的な実施形態では、ナノ粒子コアは、直径が約１ｎｍから約１００ｎｍ；約１ｎｍから約７５ｎｍ；約１ｎｍから約５０ｎｍ；約１ｎｍから約２５ｎｍ；約１ｎｍから約２５ｎｍ；約５ｎｍから約１００ｎｍ；約５ｎｍから約５０ｎｍ；約５ｎｍから約２５ｎｍ；約１５ｎｍから約２５ｎｍ；または、約２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ナノ粒子コアは、約２５ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約５０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約４０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約３５ｎｍ、約１５ｎｍ〜約３０ｎｍ、約１５ｎｍ〜約２５ｎｍ、あるいは代替的に、約１５ｎｍ、約２０ｎｍ、約２５ｎｍ、約３０ｎｍ、約３５ｎｍ、または約４０ｎｍの直径を持つ。
【０１９１】
ｐＭＨＣ−ＮＰのサイズは、層の有無にかかわらず、直径が約５ｎｍから約１μｍまでの範囲であり得る。ある実施形態では、ｐＭＨＣ−ＮＰ複合体は、直径が約１μｍ未満または代替的に１００ｎｍ未満である。他の実施形態では、ｐＭＨＣ−ＮＰ複合体は、直径が約５００ｎｍ未満、約４００ｎｍ未満、約３００ｎｍ未満、約２００ｎｍ未満、約１００ｎｍ未満、または約５０ｎｍ未満である。さらなる実施形態では、複合体は、直径が約５ｎｍ、または１０ｎｍから約５０ｎｍ、または約５ｎｍから約７５ｎｍ、または約５ｎｍから約５０ｎｍ、または約５ｎｍから約６０ｎｍ、または約１０ｎｍから約５０ｎｍ、または約１０ｎｍから約６０ｎｍ、または約１０ｎｍから約７０ｎｍ、または約１０ｎｍから約７５ｎｍ、または約２０ｎｍから約５０ｎｍ、または約２０ｎｍから約６０ｎｍ、または約２０ｎｍから約７０ｎｍ、または約２０ｎｍから約７５ｎｍ、または約３０ｎｍから約５０ｎｍ、または約３０ｎｍから約６０ｎｍ、または約３０ｎｍから約７０ｎｍ、または約３０ｎｍから約７５ｎｍまでであるか、あるいは一態様では、約５５ｎｍである。具体的な実施形態では、ｐＭＨＣ−ＮＰ複合体は、直径が約３５ｎｍから約６０ｎｍ、約３５ｎｍから約７０ｎｍ、または約３５ｎｍから約７５ｎｍまでである。一態様では、ｐＭＨＣ−ＮＰ複合体は、直径００２Ｅが約３０ｎｍから約５０ｎｍまでである。
【０１９２】
＜抗原−ＭＨＣ複合体＞
ナノ粒子は、層の有無にかかわらず、抗原−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体に結合された、ナノ粒子コアを含む。抗原は、特定の自己免疫疾患、アレルゲン、感染症、または癌の処置のために選択される。
【０１９３】
個々のポリペプチド（例えば、ＭＨＣ）および抗原（例えば、ペプチド）成分は、共有結合または非共有結合（例えば、水素結合、イオン結合、または疎水結合）によって複合体を形成する。そのような複合体の調製には、様々な程度の操作が必要とされ得、そのような方法は文献において既知である。いくつかの態様では、抗原成分は、例えば、ＭＨＣと抗原成分を混合することによってＭＨＣ成分のポケット部分と非共有結合的に関連付けられ得；これは、ＭＨＣと抗原との間の天然の結合親和性に依存する。代替的に、いくつかの態様では、ＭＨＣ成分は、限定されないが、既知のカップリング剤または光親和性標識の導入などの標準手順を使用して、抗原成分に共有結合され得る（例えば、  Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２４：５７０２−５７１１  （１９８５）を参照）。ある態様では、抗原成分は、ペプチド結合、または、限定されないが、例えば、アルファまたはベータ鎖の炭水化物部分を含む、糖タンパク質上の炭水化物群による結合を含む、文献中で論じられる他の方法によって、ＭＨＣ成分に有効に結合され得る。特定の実施形態では、抗原成分は、適切なＭＨＣ分子のＮ末端またはＣ末端に結合され得る。代替的に、ある実施形態では、ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣをコードする配列に抗原成分の配列を組み込むことによって組み換えで形成されることができ、その結果、その両方はそれらの機能特性を保持する。
【０１９４】
複数の抗原−ＭＨＣ複合体は、同じナノ粒子コアに結合することができ；これらの複合体、ＭＨＣ、および／または抗原は互いに同じであるか、または異なってもよく、ならびに、ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣの数（ナノ粒子複合体の「結合価」と本明細書で呼ばれる）は本明細書に記載される様々な範囲を有する。結合価は、約１ｐＭＨＣ複合体に対してナノ粒子コア（１：１）〜約６０００ｐＭＨＣ複合体に対して１つのナノ粒子コア（６０００：１）、または代替的に、約８：１〜約６０００：１、あるいは代替的に約１０：１〜６０００：１；または代替的に約１１：１〜約６０００：１、または代替的に約１２：１〜約６０００：１、または代替的に少なくとも２：１、または代替的に少なくとも８：１、または代替的に少なくとも９：１、または代替的に少なくとも１０：１、または代替的に少なくとも１１：１、または代替的に少なくとも１２：１の間の範囲であり得る。いくつかの態様では、結合価は、約１０：１から約６０００：１、または約２０：１から約５５００：１、または代替的に約１０：１から約５０００：１、または代替的に約１０：１から約４０００：１、または代替的に約１０：１から約３５００：１、または代替的に約１０：１から約３０００：１、または代替的に約１０：１から約２５００：１、または代替的に約１０：１から約２０００：１、または代替的に約１０：１から約１５００：１、または代替的に約１０：１から１０００：１、または代替的に約１０：１から約５００：１、または代替的に約１０：１から約１００：１、または代替的に約２０：１から約５０：１、または代替的に約２５：１から約６０：１、または代替的に約３０：１から約５０：１、または代替的に約３５：１から約４５：１、または代替的に４０：１である。他の態様では、１ナノ粒子コア当たりのｐＭＨＣ複合体の結合価は、約１０：１から約１００：１、または代替的に約１０：１から約１０００：１、または代替的に８：１から１０：１、または代替的に１３：１から５０：１である。
【０１９５】
出願人は、ナノ粒子上のｐＭＨＣ密度が、用量非依存的な方法でＴＲ１細胞の形成を引き起こすかまたは分化するｐＭＨＣ−ＮＰの能力を調節することも発見した。密度は、ナノ粒子の単位面積当たりの複合体の数として計算される。ナノ粒子の表面積は、限定されないが、ｐＭＨＣ複合体をナノ粒子に結合させるリンカーを含む層を用いてまたは層を用いずに判定され得る。密度を計算する目的で、関連する表面積値は、ナノ粒子コア上の外側層を用いてまたは層を用いずに、ｐＭＨＣ複合体を有しない粒子構成物の最終的な直径に基づく。
【０１９６】
このような態様において、１ナノ粒子当たりのｐＭＨＣ密度は、ナノ粒子コアの表面積の約０．０２５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１００ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または代替的に約０．４０６ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約５０ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、あるいは代替的に約０．０５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２である。ある態様では、１ナノ粒子当たりのｐＭＨＣ密度は、約０．２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２０のｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１３ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または、約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１１．６ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１１．５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１１ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１０ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約９ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約８ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約６ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約３ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２．５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１．５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２である。
【０１９７】
さらに別の態様では、ナノ粒子は、約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約１．３ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または代替的に約０．５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２から約０．９ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、または代替的に約０．６ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約０．８ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２の本明細書に定義されるｐＭＨＣ密度を有し、さらにここで、ナノ粒子コアは約２５ｎｍ〜約６０ｎｍ、または約２５ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約４０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約３５ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約３０ｎｍ、または約１５ｎｍ〜約２５ｎｍ、または代替的に約１５ｎｍ、または約２０ｎｍ、または約２５ｎｍ、または約３０ｎｍ、または約３５ｎｍ、あるいは約４０ｎｍの直径を有する。一実施形態では、１ナノ粒子当たりのｐＭＨＣ複合体の密度は、ナノ粒子の表面積の約０．２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜ナノ粒子の表面積の約０．８または１０ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２を含む。他の態様では、１ナノ粒子当たりのｐＭＨＣ複合体の密度は、ナノ粒子の表面積の約０．６５ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜ナノ粒子の表面積の約１２ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２、ならびに本明細書に開示され、参照によって本明細書に組み込まれるさらなる濃度範囲である。
【０１９８】
いくつかの態様では、ｐＭＨＣ複合体の分子間の距離は、約４ｎｍ〜約３００ｎｍ、または代替的に約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍ、または代替的に約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、または代替的に約１０〜約１５０ｎｍ、または代替的に約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、または代替的に約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または代替的に約１２ｎｍ〜約３０ｎｍ、または代替的に約１２ｎｍ〜約２０ｎｍである。いくつかの実施形態において、ｐＭＨＣ複合体の分子間の距離は約１５ｎｍ〜約２０ｎｍである。
【０１９９】
いくつかの態様では、ナノ粒子コアを含む複合体が本明細書で提供され、ここで、複数の疾患関連抗原−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体がコアに結合され；コアの直径は約１５ｎｍ〜約２５ｎｍであり；およびここで、ナノ粒子上のｐＭＨＣ密度は、ナノ粒子の表面積の約０．４ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２〜約６ｐＭＨＣ／１００ｎｍ２である。いくつかの実施形態において、複合体はナノ粒子コア上の外側層をさらに含み、ここで、ｐＭＨＣ複合体はナノ粒子コアおよび／または外側層に結合され、およびここで、ナノ粒子コアおよび外側層の直径は約３５ｎｍ〜約７５ｎｍ、または代替的に約３５ｎｍ〜約７０ｎｍ、あるいは約３５ｎｍ〜約６５ｎｍである。
【０２００】
本明細書で使用されるように、用語「有効に結合された」または「コーティングされた」とは、個々のポリペプチド（例えば、ＭＨＣ）および抗原（例えば、ペプチド）成分が組み合わせられて、標的部位（例えば、免疫細胞）で結合する前に活性な複合体を形成する状況を指す。これは、被験体への投与前に、個々のポリペプチド複合体成分が、合成されるかまたは組み換えで発現され、続いて、単離され、組み合わせられて、インビトロで複合体を形成する状況；キメラまたは融合ポリペプチド（すなわち、複合体の各々の離散したタンパク質成分が、単一のポリペプチド鎖に含有されている）が、合成されるかまたは無傷の複合体として組み換えで発現される状況を含む。典型的に、ポリペプチド複合体がナノ粒子に加えられて、以下の分子数の比率を有する吸着されたまたは結合されたポリペプチド複合体を有するナノ粒子が産出される：約少なくとも、または多くても約０．１、０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、またはそれ以上：１、より典型的には、０．１：１、１：１〜５０：１、または３００：１、ならびに比率が各範囲の選択されたエンドポイントを提供する場合のそれらの間の範囲のナノ粒子の数。ナノ粒子のポリペプチド含有量は、標準技術を使用して判定され得る。
【０２０１】
＜抗原／ＭＨＣのＭＨＣ＞
本明細書で使用されるように、および他に具体的に留意されない限り、ｐＭＨＣ複合体に関連する用語ＭＨＣは、古典的あるいは非古典的なＭＨＣクラスＩタンパク質および／または古典的あるいは非古典的なＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＨＬＡ  ＤＲ、ＨＬＡ  ＤＱ、ＨＬＡ  ＤＰ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＣＤ１ｄの任意の遺伝子座、またはそれらのフラグメントか生物学的同等物、二本鎖または一本鎖構築物、二量体（Ｆｃ融合）、四量体、多量体形態、ならびにＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩの多量体型を意図する。いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣは一本鎖構築物であり得る。いくつかの実施形態では、ｐＭＨＣは二本鎖構築物であり得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣタンパク質は二量体または多量体であってもよい。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣタンパク質は、ノブ・イン・ホール−ベースのＭＨＣ−アルファ−Ｆｃ／ＭＨＣ−ベータ−Ｆｃヘテロ二量体または多量体を含み得る。
【０２０４】
上で留意されるように、隆起がヘテロ多量体の形成を促進するように空洞内に位置付けられ得るように、「ノブ・イン・ホール」は、第１のポリペプチドの界面で隆起（または「ノブ」）および第２のポリペプチドの界面で対応する空洞（または「ホール」）を必要とするポリペプチジル構造である。隆起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばフェニルアラニンまたはチロシン）と交換することにより構築される。大きなアミノ酸側鎖をより小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と交換することによって、隆起と同一のまたは同様サイズの空洞が、第２のポリペプチドの界面に作られる。隆起および空洞は、当業者にとっての慣例方法を使用して、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって、またはペプチド合成などによって、合成手段により作られ得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの界面は、第１のポリペプチドのＦｃドメイン上に位置し、第２のポリペプチドの界面は、第２のポリペプチド上のＦｃドメイン上に位置する。
【０２０５】
上で留意されるように、「ＭＨＣ−アルファ−Ｆｃ／ＭＨＣ−ベータ−Ｆｃ」は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含むヘテロ二量体であり、ここで、第１のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩα鎖および抗体Ｆｃドメインを含み、第２のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩβ鎖および抗体Ｆｃドメインを含む。ノブ・イン・ホールＭＨＣ−アルファ−Ｆｃ／ＭＨＣ−ベータ−Ｆｃはさらに、各ポリペプチドのＦｃドメインが、他のＦｃドメイン上の対応する空洞内の１つのＦｃドメイン上の隆起の相補的位置決めによって、互いに相互作用することを必要とする。
【０２０６】
本開示の特定の実施形態では、特定の抗原が同定され、適切なＭＨＣクラスＩまたはＩＩポリペプチドの文脈において抗原−ＭＨＣナノ粒子複合体中で提示される。Ｔ細胞への抗原の提示は、２つの別個のクラスの分子、すなわちＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）およびＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）によって媒介され、これらは別々の抗原プロセシング経路を利用する。細胞内抗原に由来するペプチドは、ＭＨＣクラスＩ分子によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示され、これは事実上すべての細胞上で発現され、一方で細胞外抗原に由来するペプチドは、ＭＨＣ−ＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示される。しかし、この二分に対する特定の例外がある。いくつかの試験は、細胞内に取り込まれた微粒子または可溶性タンパク質から生成されたペプチドが、マクロファージの他に樹状細胞においてＭＨＣ−Ｉ分子上に提示されることを示した。ある態様では、被験体の遺伝的構造は、特定の患者およびペプチドの特定のセットに対してどのＭＨＣポリペプチドが使用されるかを判定するために評価され得る。ある実施形態では、ＭＨＣクラスＩ成分は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、またはＣＤ−１分子のすべてまたは一部を含み得るか、またはそれらから本質的になり得るか、あるいは代替的にそれらからさらになり得る。ＭＨＣ成分がＭＨＣクラスＩＩ成分である実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ成分は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰのすべてまたは一部を含み得るか、またはそれらから本質的になり得るか、あるいは代替的にそれらからさらになり得る。ある実施形態では、ＭＨＣは、ＨＬＡ  ＤＲＢ１、ＨＬＡ  ＤＲＢ３、ＨＬＡ  ＤＲＢ４、ＨＬＡ  ＤＲＢ５、ＨＬＡ  ＤＱＢ１、ＨＬＡ  ＤＱＡ１、ＩＡｇ７、Ｉ−Ａｂ、Ｉ−Ａｄ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＥまたはＣＤ１ｄを含み得る。
【０２０７】
非古典的なＭＨＣ分子はまた、本開示のＭＨＣ複合体での使用のために熟考される。いくつかの実施形態では、非古典的なＭＨＣ分子は非多形的であり、種間で保護され、および、狭く、深い、疎水性リガンド結合ポケットを有する。これらの結合ポケットは、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞に糖脂質およびリン脂質を提示することができる。ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞マーカーおよび半不変Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を同時発現する特有のリンパ球集団を表す。それらは、広範囲の疾患に関連する免疫反応の調節に関係している。
【０２０８】
上で留意されるように、用語「ＭＨＣ」とは、ヒトＭＨＣに関して使用されるときに、用語「ヒト白血球抗原」（ＨＬＡ）と交換可能に使用されることができ、それ故、ＭＨＣは、限定されないが、上に開示された古典的なＭＨＣ遺伝子を含む、以下のすべてのＨＬＡサブタイプを指す：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＲ、すべての変異体に加えて、アイソフォーム、アイソタイプ、および他の生物学的同等物。
【０２０９】
本開示に従った使用のためのＭＨＣは、当該技術分野で既知の技術によって、生成、単離、または精製されてもよい。ＭＨＣを得るための共通プロトコルは、限定されないが、電気泳動または電荷あるいはサイズベースの分離（ｓｉｚｅ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）の他の技術、ビオチン化または他のタギング法および精製、またはＭＨＣタンパク質を発現するベクター構築物のトランスフェクションおよび誘導を含むステップを含む。精製された動物抗体も、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、およびＴｏｎｂｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓなどの小売り業者を含む、市販のソースを介して入手可能である。
【０２１０】
ある実施形態では、抗原−ＭＨＣ複合体のＭＨＣは、古典的ＭＨＣＩ、非古典的ＭＨＣＩ、典型的ＭＨＣＩＩ、非古典的ＭＨＣＩＩ、二量体（Ｆｃ融合）、ＭＨＣ四量体、多量体、またはＭＨＣの多量体型であってもよい。いくつかの実施形態において、ＭＨＣ多量体は当技術分野において十分に立証された方法に従って生成され、例えば、Ｂａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  “ＭＨＣ  Ｍｕｌｔｉｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，”  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７（４）：４２８−４３３  （２００５）およびその中の参照文献を参照する。非限定的な典型的な方法は、ＭＨＣ単量体と結合するストレプトアビジンまたはアビジンなどのビオチン化剤の使用を含み、骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）としての薬剤を用いて多重体構造を作り上げる。ＭＨＣ二量体は、具体的には、抗体定常領域またはＦｃ領域を用いて融合によって代替的に生成することができ、これには、直接的に、またはリンカー（例えば、システインリンカー）を介した有効なカップリング（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）が伴い得る。
【０２１１】
＜ｐＭＨＣの抗原＞
抗原および抗原成分の具体的な例が本明細書に開示されるが、本開示はそれらに限定されない。具体的に他に明記されない限り、本明細書には、単離または精製されたポリペプチド抗原の同等物が含まれ、これらは、本明細書に記載されるようなアミノ酸配列、または抗原のアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性、または代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％の配列同一性を有するポリペプチド、または抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに対して約８０％の配列同一性、あるいは代替的に少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体、あるいは中程度から高度のストリンジェンシー条件下で抗原のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドへとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチド、またはその補体を含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからさらになる。さらに、本明細書に開示された抗原ポリペプチドをコードする単離および精製されたポリヌクレオチド、またはそれに対して少なくとも約８０％の配列同一性、あるいは代替的に開示された配列に対して少なくとも８５％、または代替的に少なくとも９０％、または代替的に少なくとも９５％、または代替的に少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸、または同等物、あるいはストリンジェントな条件下でポリヌクレオチド、その同等物またはその補体へとハイブリダイズするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチドによってコードされた単離または精製されたポリペプチドが提供される。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それらが自然に関連付けられていない非自然発生物質、例えば、担体、薬学的に許容可能な担体、ベクター、およびＭＨＣ分子と組み合わせられてもよい。本明細書に開示される抗原に加えて、出願人のＷＯ２０１６／１９８９３２に開示される抗原（参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０２１２】
＜修飾ペプチドおよびその同等物＞
抗原のポリペプチド、タンパク質、ならびにそれらのフラグメントは、様々なアミノ酸の欠失、挿入、および／または置換によって修飾され得る。特定の実施形態では、修飾されたポリペプチドおよび／またはペプチドは、被験体における免疫反応を調節することができる。本明細書で使用されるように、「タンパク質」または「ポリペプチド」あるいは「ペプチド」は、少なくとも５つのアミノ酸残基を含む分子を指す。いくつかの実施形態において、タンパク質またはペプチドの野生型のバージョンが使用されるが；開示の多くの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドはペプチド／ＭＨＣ／ナノ粒子複合体を生成するために使用される。ペプチド／ＭＨＣ／ナノ粒子複合体は、免疫反応を発生させるため、および／または免疫系のＴ細胞集団を修飾する（すなわち、免疫系を再教育する（ｒｅ−ｅｄｕｃａｔｅ））ために使用され得る。上記の用語は、本明細書で交換可能に使用されてもよい。「修飾タンパク質」または「修飾ポリペプチド」あるいは「修飾ペプチド」は、その化学構造、特にそのアミノ酸配列が野生型のタンパク質またはポリペプチドに関して変更される、タンパク質またはポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドは、少なくとも１つの修飾された活性または機能を有する（タンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、複数の活性または機能を有し得ることを認識）。修飾されたタンパク質またはポリペプチドあるいはペプチドが、１つの活性または機能に関してさらに変更されても、ＭＨＣ／ナノ粒子複合体の文脈において免疫原性または免疫系の他の細胞と相互作用する能力などの、他の関連での野生型の活性または機能を保持し得ることが具体的には熟考される。
【０２１３】
本開示のタンパク質は、組み換え型であり得るか、インビトロで合成され得る。代替的に、組み換えタンパク質は、細菌または他の宿主細胞から単離され得る。
【０２１４】
配列が生物学的タンパク質活性（例えば、免疫原性）の維持を含む上述の基準を満たす限り、アミノ酸および核酸の配列が、それぞれ、追加のＮ末端またはＣ末端のアミノ酸などの追加の残基、あるいは５’または３’の核酸配列を含むことができ、さらに、本質的に本明細書に開示される配列の１つに記載される通りのものであることも理解される。末端配列の追加は、特に、例えば、コード領域の５’または３’部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に適用される。
【０２１５】
＜疾患関連抗原＞
ナノ粒子は、本明細書に記載されるような治療方法に有用である。ｐＭＨＣ−ＮＰのｐＭＨＣ複合体は、処置される疾患に基づいて使用のために選択される。例えば、糖尿病関連抗原は、抗原が疾患プロセスの誘因またはその病態形成における中心的存在ではなく、提示されたときに糖尿病を処置する働きをする免疫反応を生成する場合であっても、その自己免疫性疾患において標的とされた細胞、組織、または臓器において発現される、および自己免疫反応によって引き起こされた細胞、組織、または臓器の損傷で免疫系に曝露される抗原またはそのフラグメントであり；したがって、この定義を満たす糖尿病関連抗原は、糖尿病を処置するために選択される。ＭＳ関連抗原は、ＭＳを処置するために選択される。糖尿病関連抗原は、ＭＳを処置するためには選択されないだろう。非限定的な典型的な疾患関連抗原が本明細書に開示され、さらに、そのような抗原は、文献において十分に立証された技術、機構、および方法に基づいて、特定の疾患のために判定され得る。
【０２１６】
対象の疾患の非限定的な例としては、限定されないが、喘息、真性糖尿病Ｉ型およびＩＩ型、糖尿病前症、多発性硬化症、末梢神経障害、アレルギー喘息、原発性胆汁性肝硬変、肝硬変、視神経脊髄炎スペクトル障害、全身硬直症候群などの自己抗体関連神経症候群、自己免疫性脳炎、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、天疱瘡、葉状、乾癬、シェーグレン病／症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節炎、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、強皮症、ＡＮＣＡ関連の脈管炎、グッドパスチャー症候群、川崎病、セリアック病、自己免疫性心筋症、特発性拡張型心筋症（ＩＤＣＭ）、重症筋無力症、自己免疫性ブドウ膜炎、強直性脊椎炎、グレーヴス病、免疫介在性ミオパチー、抗リン脂質抗体症候群（ＡＮＣＡ＋）、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性肝炎、硬化性胆管炎、原発性硬化性胆管炎、皮膚筋炎、慢性閉塞性肺疾患、脊髄損傷、外傷、タバコ誘発性肺破壊、気腫、天疱瘡、ブドウ膜炎、中枢および末梢の神経系の他の関連する癌および／または疾患が挙げられる。
【０２１７】
例示的な抗原または抗原成分は、限定されないが、米国特許出願第１５／３４８、９５９号に開示されるものを含み、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１８】
＜糖尿病関連の抗原＞
糖尿病関連抗原は、限定されないが、ＰＰＩ、ＩＧＲＰ、ＧＡＤ、島細胞自己抗原−２（ＩＣＡ２）、および／またはインスリンに由来する抗原を含む。自己反応性の糖尿病関連抗原ペプチドは、限定されないが、ｈＩｎｓＢ１０−１８（ＨＬＶＥＡＬＹＬＶ）、ｈＩＧＲＰ２２８−２３６（ＬＮＩＤＬＬＷＳＶ）、ｈＩＧＲＰ２６５−２７３（ＶＬＦＧＬＧＦＡＩ）、ＩＧＲＰ２０６−２１４（ＶＹＬＫＴＮＶＦＬ）、ｈＩＧＲＰ２０６−２１４（ＶＹＬＫＴＮＬＦＬ）、ＮＲＰ−Ａ７  （ＫＹＮＫＡＮＡＦＬ）、ＮＲＰ−Ｉ４（ＫＹＮＩＡＮＶＦＬ）、ＮＲＰ−Ｖ７（ＫＹＮＫＡＮＶＦＬ）、ＹＡＩ／Ｄｂ（ＦＱＤＥＮＹＬＹＬ）ＩＮＳ  Ｂ１５−２３（ＬＹＬＶＣＧＥＲＧ）、ＰＰＩ７６−９０（Ｋ８８Ｓ）（ＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＳＲＧ）、ＩＧＲＰ１３−２５（ＱＨＬＱＫＤＹＲＡＹＹＴＦ）、ＧＡＤ５５５−５６７（ＮＦＦＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ）、ＧＡＤ５５５−５６７（５５７Ｉ）：（ＮＦＩＲＭＶＩＳＮＰＡＡＴ）、ＩＧＲＰ２３−３５（ＹＴＦＬＮＦＭＳＮＶＧＤＰ）、Ｂ２４−Ｃ３６（ＦＦＹＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤ）、ＰＰＩ７６−９０（ＳＬＱＰＬＡＬＥＧＳＬＱＫＲＧ）、ならびに、米国特許公報第２００５／０２０２０３２号に開示されるペプチドおよびタンパク質を含み、それは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。自己反応性ペプチドまたは対照ペプチドとして、この開示とともに使用することができる他のペプチドは、限定されないが、ＩＮＳ−Ｉ９（ＬＹＬＶＣＧＥＲＩ）、ＴＵＭ（ＫＹＱＡＶＴＴＴＬ）、およびＧ６Ｐａｓｅ（ＫＹＣＬＩＴＩＦＬ）、ならびにその各々の等価物を含む。さらなる例は、Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＬ２−１０、ＡＬＷＭＲＬＬＰＬ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＬ３−１１、ＬＷＭＲＬＬＰＬＬ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＬ６−１４、ＲＬＬＰＬＬＡＬＬ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ５−１４、ＨＬＣＧＳＨＬＶＥＡ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ１０−１８、ＨＬＶＥＡＬＹＬＶ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ１４−２２、ＡＬＹＬＶＣＧＥＲ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ１５−２４、ＬＹＬＶＣＧＥＲＧＦ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ１７−２５、ＬＶＣＧＥＲＧＦＦ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ１８−２７、ＶＣＧＥＲＧＦＦＹＴ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ２０−２７、ＧＥＲＧＦＦＹＴ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ２１−２９、ＥＲＧＦＦＹＴＰＫ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ２５−Ｃ１、ＦＹＴＰＫＴＲＲＥ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＢ２７−Ｃ５、ＴＰＫＴＲＲＥＡＥＤＬ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＣ２０−２８、ＳＬＱＰＬＡＬＥＧ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＣ２５−３３、ＡＬＥＧＳＬＱＫＲ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＣ２９−Ａ５、ＳＬＱＫＲＧＩＶＥＱ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＡ１−１０、ＧＩＶＥＱＣＣＴＳＩ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＡ２−１０、ＩＶＥＱＣＣＴＳＩ；Ｐｒｏ−ｉｎｓｕｌｉｎＡ１２−２０、ＳＬＹＱＬＥＮＹＣまたはその等価物および／またはそれらの組み合わせを含む。糖尿病関連抗原としては、限定されないが、表１に列挙されるものおよびその等価物ならびに組み合わせが挙げられる。
【０２１９】
＜ＭＳ関連抗原＞
本開示の抗原は、多発性硬化症に関連する抗原を含む。そのような抗原は、例えば、米国特許出願公開番号２０１２／００７７６８６に開示される抗原、およびミエリン塩基性タンパク質に由来する抗原、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイトミエリンオリゴタンパク質、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質、熱ショックタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質ＮＯＧＯ  Ａ、糖タンパク質Ｐｏ、末梢ミエリンタンパク質２２、ならびに２’３’−環状ヌクレオチド３’−ホスホジエステラーゼを含む。ある実施形態では、抗原は、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）に由来する。
【０２２０】
さらなる態様では、ＭＳおよびＭＳ関連障害の処置のためのペプチド抗原は、限定されることなく：ＭＯＧ３５−５５、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；ＭＯＧ３６−５５、ＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ；ＭＡＧ２８７−２９５、ＳＬＬＬＥＬＥＥＶ；ＭＡＧ５０９−５１７、ＬＭＷＡＫＩＧＰＶ；ＭＡＧ５５６−５６４、ＶＬＦＳＳＤＦＲＩ；ＭＢＰ１１０−１１８、ＳＬＳＲＦＳＷＧＡ；ＭＯＧ１１４−１２２、ＫＶＥＤＰＦＹＷＶ；ＭＯＧ１６６−１７５、ＲＴＦＤＰＨＦＬＲＶ；ＭＯＧ１７２−１８０、ＦＬＲＶＰＣＷＫＩ；ＭＯＧ１７９−１８８、ＫＩＴＬＦＶＩＶＰＶ；ＭＯＧ１８８−１９６、ＶＬＧＰＬＶＡＬＩ；ＭＯＧ１８１−１８９、ＴＬＦＶＩＶＰＶＬ；ＭＯＧ２０５−２１４、ＲＬＡＧＱＦＬＥＥＬ；ＰＬＰ８０−８８、ＦＬＹＧＡＬＬＬＡ  ＭＡＧ２８７−２９５、ＳＬＬＬＥＬＥＥＶ；ＭＡＧ５０９−５１７、ＬＭＷＡＫＩＧＰＶ；ＭＡＧ５５６−５６４、ＶＬＦＳＳＤＦＲＩ、ＭＯＧ９７−１０９（ＴＣＦＦＲＤＨＳＹＱＥＥＡ）、ＭＯＧ９７−１０９（Ｅ１０７Ｓ）（ＴＣＦＦＲＤＨＳＹＱＳＥＡ）、ＭＢＰ８９−１０１（ＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰ），  ＰＬＰ１７５−１９２  （ＹＩＹＦＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫ），  ＰＬＰ９４−１０８（ＧＡＶＲＱＩＦＧＤＹＫＴＴＩＣ、ＭＢＰ８６−９８（ＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲ−ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１（１３量体のペプチド）、ＰＬＰ５４−６８（ＮＹＱＤＹＥＹＬＩＮＶＩＨＡＦ）、ＰＬＰ２４９−２６３（ＡＴＬＶＳＬＬＴＦＭＩＡＡＴＹ）、ＭＯＧ１５６−１７０（ＬＶＬＬＡＶＬＰＶＬＬＬＱＩＴ）、ＭＯＧ２０１−２１５（ＦＬＲＶＰＣＷＫＩＴＬＦＶＩＶ）、ならびにその等価物および／または組み合わせを含む。多発性硬化症関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２１】
＜セリアック病（ＣＤ）関連抗原＞
セリアック病関連抗原は、限定されないが、ａＧｌｉａに由来する抗原を含む。非限定的なセリアック病関連抗原はグリアジンを含む。他の非限定的な例示的なセリアック病関連抗原は以下ｍｐものを含む：ａＧｌｉａ５７−６８：ＱＬＱＰＦＰＱＰＥＬＰＹ（１２量体のペプチド）；ａＧｌｉａ６２−７２：ＰＱＰＥＬＰＹＰＱＰＥ（１１量体のペプチド）；ａＧｌｉａ２１７−２１９；およびＳＧＥＧＳＦＱＰＳＱＱＮＰ（１３量体のペプチド）、その等価物ならびに組み合わせ。セリアック病関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２２】
＜原発性胆汁性肝硬変症（ＰＢＣ）関連抗原＞
原発性胆汁性肝硬変症関連抗原は、限定されないが、ＰＤＣ−Ｅ２に由来する抗原を含む。代表的な抗原の非限定的な例は以下を含む：ＰＤＣ−Ｅ２１２２−１３５：ＧＤＬＩＡＥＶＥＴＤＫＡＴＶ（１４量体のペプチド）；ＰＤＣ−Ｅ２２４９−２６２：ＧＤＬＬＡＥＩＥＴＤＫＡＴＩ（１４量体のペプチド）；ＰＤＣ−Ｅ２２４９−２６３：ＧＤＬＬＡＥＩＥＴＤＫＡＴＩＧ（１５量体のペプチド）；およびＰＤＣ−Ｅ２６２９−６４３：ＡＱＷＬＡＥＦＲＫＹＬＥＫＰＩ（１５量体のペプチド）、その等価物および組み合わせ。原発性胆汁性肝硬変関連抗原は、表１に列挙されるもの、ならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２３】
＜落葉状天疱瘡（ＰＦ）および尋常性天疱瘡（ＰＶ）関連抗原＞
ＰＦおよびＰＶ関連抗原は、限定されないが、ＤＧ１ＥＣ２、デスモグレイン３（ＤＧ３またはＤＳＧ３）、および／またはデスモグレイン１（ＤＧ１またはＤＳＧ１）に由来する抗原を含む。非限定的な例は以下を含む：ＤＧ１ＥＣ２２１６−２３５：ＧＥＩＲＴＭＮＮＦＬＤＲＥＩ（１４量体のペプチド）；ＤＧ３９７−１１１：ＦＧＩＦＶＶＤＫＮＴＧＤＩＮＩ（１５量体のペプチド）；およびＤＧ３２５１−２６５：ＣＥＣＮＩＫＶＫＤＶＮＤＮＦＰ（１５量体のペプチド）、その等価物ならびに組み合わせ。落葉状天疱瘡および尋常性天疱瘡関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２４】
＜視神経脊髄炎（ＮＭＯ）関連抗原＞
ＮＭＯ関連抗原は、限定されないが、ＡＱＰ４またはａｑｕａｐｏｒｉｎａ  ４に由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む：ＡＱＰ４１２９−１４３：ＧＡＧＩＬＹＬＶＴＰＰＳＶＶＧ（１５量体のペプチド）；ＡＱＰ４２８４−２９８：ＲＳＱＶＥＴＤＤＬＩＬＫＰＧＶ（１５量体のペプチド）；ＡＱＰ４６３−７６：ＥＫＰＬＰＶＤＭＶＬＩＳＬＣ（１４量体のペプチド）；ＡＱＰ４１２９−１４３：ＧＡＧＩＬＹＬＶＴＰＰＳＶＶＧ（１５量体のペプチド）；およびＡＱＰ４３９−５３：ＴＡＥＦＬＡＭＬＩＦＶＬＬＳＬ（１５量体のペプチド）、その等価物および組み合わせ。ＮＭＯ関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２５】
＜コラーゲン誘発性関節炎関連抗原＞
コラーゲン誘発性関節関連抗原は、限定されないが、ＣＩＩに由来するものを含む。非限定的な例は以下を含む：ｃＣＩＩ２３０−２４４：ＡＰＧＦＰＧＰＲＧＰＰＧＰＱＧ（１５量体のペプチド）；ｃＣＩＩ６３２−６４６：ＰＡＧＦＡＧＰＰＧＡＤＧＱＰＧ（１５量体のペプチド）；およびＣＩＩ２５９−２７３：ＧＩＡＧＦＫＧＤＱＧＰＫＧＥＴ（１５量体のペプチド）、またはその等価物および組み合わせ。関節炎関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２６】
＜アレルギー喘息関連抗原＞
アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、ＤＥＲＰ１およびＤＥＲＰ２に由来するものを含む。アレルギー喘息関連抗原は、限定されないが、表１に表記されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２７】
＜大腸炎関連抗原＞
実験的大腸炎関連抗原は、限定されないが、バクテロイデスインテグラーゼ、Ｆｌａ−２／Ｆｌａ−Ｘ、およびＹＩＤＸに由来したものを含む。大腸炎関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２８】
＜全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）関連抗原＞
ＳＬＥ関連抗原は、限定されないが、Ｈ４、Ｈ２Ｂ、Ｈ１’ｄｓＤＮＡ、ＲＮＰ、Ｓｍｉｔｈ（Ｓｍ）、ＳＳＡ／Ｒｏ、ＳＳＢ／Ｌａ（ＳＳ−Ｂ）、および／またはヒストンに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む：Ｈ４７１−９４：ＴＹＴＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬＫＲＱＧ、Ｈ４７４−８８：ＥＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹ（１５量体のペプチド）；Ｈ４７６−９０：ＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬ（１５量体のペプチド）；Ｈ４７５−８９：ＨＡＫＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡ（１５量体のペプチド）；Ｈ４７８−９２：ＲＫＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬＫＲ（１５量体のペプチド）；Ｈ４８０−９４：ＴＶＴＡＭＤＶＶＹＡＬＫＲＱ（１５量体のペプチド）；Ｈ２Ｂ１０−２４：ＰＫＫＧＳＫＫＡＶＴＫＡＱＫＫ（１５量体のペプチド）；およびＨ２Ｂ１６−３０：ＫＡＶＴＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫ（１５量体のペプチド）、Ｈ１’２２−４２：ＳＴＤＨＰＫＹＳＤＭＩＶＡＡＩＱＡＥＫＮＲ；ならびにＨ１’２７−４１：ＫＹＳＤＭＩＶＡＡＩＱＡＥＫＮ、ならびにその等価物および組み合わせ。ＳＬＥ関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２２９】
＜高脂肪食誘発性アテローム動脈硬化症関連抗原＞
高脂肪食誘発性アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、ＡｐｏＢに由来するものを含む。非限定的な例は、各タンパク質の以下のセグメントを含む：ＡｐｏＢ３５０１−３５１６：ＳＱＥＹＳＧＳＶＡＮＥＡＮＶＹ（１５量体のペプチド）；ＡｐｏＢ１９５２−１９６６：ＳＨＳＬＰＹＥＳＳＩＳＴＡＬＥ（１５量体のペプチド）；ＡｐｏＢ９７８−９９３：ＴＧＡＹＳＮＡＳＳＴＥＳＡＳＹ（１５量体のペプチド）；ＡｐｏＢ３４９８−３５１３：ＳＦＬＳＱＥＹＳＧＳＶＡＮＥＡ（１５量体のペプチド）；ＡｐｏＢ２１０Ａ：ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫＫＮＫＨ（２０量体のペプチド）；ＡｐｏＢ２１０Ｂ：ＫＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹ（１５量体のペプチド）；およびＡｐｏＢ２１０Ｃ：ＴＴＫＱＳＦＤＬＳＶＫＡＱＹＫ（１５量体のペプチド）ならびにその等価物および組み合わせ。アテローム動脈硬化症関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２３０】
＜ＣＯＰＤおよび気腫関連抗原＞
ＣＯＰＤおよび／または気腫関連抗原は、限定されないが、エラスチンに由来するものを含む。非限定的な例は、エラスチンの以下のセグメントを含む。ＣＯＰＤおよび／または気腫関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。
【０２３１】
＜乾癬関連抗原＞
乾癬関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な乾癬関連抗原は、ヒトａｄａｍｉｓ様タンパク質５（ＡＴＬ５）、カテリシジン抗菌性ペプチド（ＣＡＰ１８）、および／またはＡＤＡＭＴＳ様タンパク質５（ＡＤＭＴＳＬ５）を含む。
【０２３２】
＜自己免疫性肝炎関連抗原＞
自己免疫性肝炎関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的な自己免疫性肝炎関連抗原は、シトクロムＰ４５０  ２Ｄ６（ＣＹＰ２Ｄ６）および／または可溶性肝臓抗原（ＳＬＡ）を含む。
【０２３３】
＜ブドウ膜炎関連抗原＞
ブドウ膜炎関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なブドウ膜炎関連抗原は、アレスチン、Ｓ−アレスチン、ヒト網膜のＳ抗原、および／または光受容体レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）を含む。
【０２３４】
＜シェーグレン症候群関連抗原＞
シェーグレン症候群関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。他の非限定的な典型的なシェーグレン症候群関連抗原は、ＳＳＡ／Ｒｏ（ＴＲＯＶＥ）、ＳＳＢ／Ｌａ、および／またはムスカリン受容体３（ＭＲ３）を含む。
【０２３５】
＜強皮症関連抗原＞
強皮症関連抗原は、限定されないが、セントロメア自己抗原セントロメアタンパク質Ｃ（ＣＥＮＰ−Ｃ）、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ（ＴＯＰ１）、および／またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む。
【０２３６】
＜抗リン脂質抗体症候群関連抗原＞
抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的な抗リン脂質抗体症候群関連抗原は、β−２−糖タンパク質１（ＢＧ２Ｐ１またはＡＰＯＨ）を含む。
【０２３７】
＜ＡＮＣＡ関連血管炎関連抗原＞
ＡＮＣＡ関連血管炎関連抗原は、限定されないが、表１に列挙されるものならびにその等価物および組み合わせを含む。非限定的な典型的なＡＮＣＡ関連血管炎関連抗原は、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、プロテイナーゼ（ＰＲ３）、あるいは細菌の透過性増加因子（ＢＰＩ）を含む。
【０２３８】
【表１−１】
2020516594.tif 000003
【０２３９】
【表１−２】
2020516594.tif 000004
【０２４０】
【表１−３】
2020516594.tif 000005
【０２４１】
【表１−４】
2020516594.tif 000006
【０２４２】
【表１−５】
2020516594.tif 000007
【０２４３】
【表１−６】
2020516594.tif 000008
【０２４４】
【表１−７】
2020516594.tif 000009
【０２４５】
【表１−８】
2020516594.tif 000010
【０２４６】
【表１−９】
2020516594.tif 000011
【０２４７】
＜癌関連抗原＞
ある態様では、疾患関連抗原は癌関連の抗原である。さらなる態様では、癌は、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および／またはこれらからまたは他の癌からの転移の混合型である。典型的な癌または腫瘍関連の抗原は、限定されないが、表２に開示されるものを含む。
【０２４８】
【表２−１】
2020516594.tif 000012
【０２４９】
【表２−２】
2020516594.tif 000013
【０２５０】
【表２−３】
2020516594.tif 000014
【０２５１】
他の癌関連抗原は、２０１５年５月６日を最後に参照された、このオンラインデータベースｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｉｍｍｕｎｉｔｙ．ｏｒｇ／ｐｅｐｔｉｄｅ／における表中に要約されるものおよび参照によって本明細書に組み込まれるものを含む。
【０２５２】
本開示の組成物では、組成物中に１ｍｌ当たり約０．００１ｍｇ〜約１０ｍｇの総タンパク質量があると考えられる。ｐＭＨＣによって測定されるように、有効量は約０．０００４ｍｇ／ｋｇ〜約２．０２７ｍｇ／ｋｇであり、および０．０００４ｍｇ／ｋｇ〜約２．０２７ｍｇ／ｋｇの間の範囲であるとさらに考えられる。したがって、組成物中のタンパク質の濃度は、約、少なくとも約、または多くても約０．００１、０．０１０、０．０５０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、５０、１００μｇ／ｍｌあるいはｍｇ／ｍｌ以上（あるいはそこから推論可能な任意の範囲）であり得る。このうち、約、少なくとも約、または多くても約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％は、ペプチド／ＭＨＣ／ナノ粒子複合体であることがある。
【０２５３】
加えて、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，５５４，１０１号（Ｈｏｐｐ）は、親水性に基づいて原発性のアミノ酸配列からのエピトープの同定および調製を教示する。Ｈｏｐｐで開示された方法により、当業者は、アミノ酸配列内からの潜在的なエピトープを同定し、それらの免疫原性を確認することができる。多くの科学的な出版物が、アミノ酸配列の分析による二次構造の予測およびエピトープの同定を扱っている（Ｃｈｏｕ  ＆  Ｆａｓｍａｎ，  １９７４ａ，ｂ；  １９７８ａ，ｂ；  １９７９）。米国特許第４，５５４，１０１号におけるＨｏｐｐの教示を補足するために、必要に応じてこれらのいずれかを使用してもよい。
【０２５４】
＜サイトカイン＞
ある態様では、ＮＰは、少なくとも１つのサイトカイン分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。本明細書で使用されるように、用語「サイトカイン」は、分子および細胞のレベルで身体内の広範囲の生物学的過程を制御するためのシグナル伝達分子として作用する、免疫系において様々な細胞によって分泌された低分子量タンパク質を包含する。「サイトカイン」は、リンホカイン、インターロイキン、またはケモカインのクラス内にある個々の免疫調節タンパク質を含む。
【０２５５】
非限定的な典型的な例が本明細書に開示される。例えば、ＩＬ−１ＡおよびＩＬ−１Ｂは、ヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）ファミリーの２つの別個のメンバーである。成熟したＩＬ−１Ａは１８ｋＤａタンパク質であり、線維芽細胞活性化因子（ＦＡＦ）、リンパ球活性化因子（ＬＡＦ）、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦ）、白血球内因性メディエーター（ＬＥＭ）などとしても知られている。ＩＬ−４は、Ｔヘルパー−２（Ｔｈ２）細胞分化を誘発するサイトカインであり、ＩＬ−１３と同様の機能を有する。ＩＬ−５は、Ｔｈ２細胞およびマスト細胞によって生成される。それは、Ｂ細胞成長を刺激し、免疫グロブリン分泌を増加させるように作用する。それは好酸球活性化にも関係している。ＩＬ−６は、炎症促進性または抗炎症性のサイトカインのいずれかとして作用することができるインターロイキンである。それはＴ細胞およびマクロファージによって分泌されて、外傷または炎症につながる他の組織損傷に対する免疫反応を刺激する。ＩＬ−６はまた、筋収縮に応じて筋肉から生成される。ＩＬ−８は、マクロファージ、および上皮細胞ならびに内皮細胞などの他の細胞タイプによって生成されるケモカインであり、先天性免疫系反応において免疫反応の重要なメディエーターとして作用する。ＩＬ−１２は、Ｔヘルパー（Ｔｈ１またはＴｈ２）細胞へのナイーブＴ細胞の分化に関与する。ヘテロ二量体サイトカインとして、ＩＬ−１２は、２つの別々の遺伝子、すなわちＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）によってコードされる２つのサブユニットが、タンパク質合成後に二量化した後に形成される。ＩＬ−１２ｐ７０は、このヘテロ二量体組成物を示唆している。多くの細胞型、特に、Ｔｈ２細胞によって分泌されたサイトカインであるＩＬ−１３は、アレルギー性の炎症および疾患の重要なメディエーターである。ＩＬ−１７は、Ｔヘルパー細胞によって生成されるサイトカインであり、ＩＬ−２３によって誘発され、遅延型反応における破壊的な組織損傷が結果として生じる。ＩＬ−１７は、細胞外病原体による免疫系の侵入に反応し、病原体の細胞マトリックスの破壊を誘発する炎症促進性サイトカインとして機能する。ＩＰ−１０、すなわちインターフェロンガンマ誘発性タンパク質１０は、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１０（ＣＸＣＬ１０）または小誘導性サイトカイン（ｓｍａｌｌ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ）Ｂ１０としても知られている。ＣＸＣケモカインファミリーに属する小さなサイトカインとして、ＩＰ−１０は、ＩＦＮ−γに応じていくつかの細胞型（単球、内皮細胞、および線維芽細胞を含む）によって分泌される。マクロファージ炎症タンパク（ＭＩＰ）は、ケモカインのファミリーに属している。ヒトのＭＩＰ、ＭＩＰ−１α、およびＭＩＰ−１βの２つの主要な形態が存在し、これらは、それぞれ、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド３（ＣＣＬ３）ならびにＣＣＬ４としても知られている。それらの両方は、菌体内毒素による刺激後にマクロファージによって生成される。コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）としても知られている果粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦ）は、コロニー刺激因子ホルモンである。Ｇ−ＣＳＦ���、糖タンパク質、増殖因子、および骨髄を刺激して顆粒球および幹細胞を生成するために、多くの異なる組織によって生成されたサイトカインである。Ｇ−ＣＳＦはまた、好中球前駆体および成熟した好中球の生存、増殖、分化、および機能を刺激する。上皮増殖因子またはＥＧＦは、高親和性でその受容体ＥＧＦＲに結合することによって、細胞の成長、増殖、および分化の調節に重要な役割を果たす増殖因子である。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）は、脈管形成（胚循環系のデノボ形成）および血管新生（先在する脈管構造からの血管の成長）の両方に関与する重要なシグナル伝達タンパク質である増殖因子のファミリーである。
【０２５６】
サイトカインは、ｐＭＨＣ複合体と同じ方法でナノ粒子に結合され得る。本開示の一実施形態では、サイトカインおよびｐＭＨＣ複合体は、ナノ粒子に別々に結合される。本開示の別の実施形態では、サイトカインまたはサイトカイン分子およびｐＭＨＣ複合体は、最初に一緒に複合体化され、その後、ナノ粒子に複合体化される。複数のサイトカインがナノ粒子に結合されてもよく；これらは、同じサイトカインまたは異なるサイトカインの複数のサイトカインであってもよい。
【０２５７】
＜共刺激分子成分＞
ある態様では、ＮＰは、少なくとも１つの共刺激分子をさらに含むか、または代替的にそれから本質的になるか、あるいはそれからさらになる。共刺激分子は、上記特異的抗原を有する細胞に対する免疫反応を生成することができる抗原特異的Ｔ細胞へと、ナイーブＴ細胞を活性化する働きをする二次シグナルをインビボで生成する分子である。本開示は、いかなる特異的共刺激分子にも限定されない。様々な共刺激分子が当該技術分野で周知である。共刺激分子のいくつかの限定しない例は、４−ＩＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０、ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒａ、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ３０Ｌ、およびＩＣＯＳＬである。１つの特異的共刺激分子のみが１つのナノ粒子に結合することができ、または様々な共刺激分子が同じナノ粒子に結合することができる。特定の実施形態では、共刺激分子は、Ｔ細胞上の共刺激受容体を刺激することができる抗体などのタンパク質である。この場合、抗体は、抗原特異的な方法でナイーブＴ細胞を活性化し、および免疫反応を誘発するのに必要とされる共刺激シグナルを誘発することができる。さらにまたは代替的に、本明細書で使用されるように、用語「共刺激分子」はまた、天然の共刺激シグナル伝達分子、例えば、ＣＤ２８の共刺激反応を生成する抗ＣＤ２８またはＣＤ２８リガンドに対するアゴニスト作用を有することによって共刺激シグナルを生成することができる薬剤を指し得る。いくつかの態様では、共刺激分子の結合価は約１〜約６０００であり、および／または共刺激分子の結合価はそれぞれナノ粒子コア当たり約１〜約６０００である。
【０２５８】
＜組成物＞
ある態様において、本明細書で提供される複数の複合体を含む組成物が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、担体、随意に医薬担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される組成物は、１以上の共刺激分子および／またはサイトカインに結合される１以上のナノ粒子コアを随意に含み得る。従って、いくつかの実施形態において、組成物は、以下のものを含むか、または代替的にそれらから実質的になるか、あるいはさらにそれらからなる：１）複数の抗原−ＭＨＣ複合体に結合される複数のナノ粒子コアであって、ナノ粒子コアの少なくとも一部が、１以上の共刺激分子および／または１以上のサイトカインをさらに含み、ならびにナノ粒子コアの別の部分は、共刺激分子および／またはサイトカインをさらに含まない、複数のナノ粒子コアと、２）１以上の共刺激分子および／またはサイトカインに結合される複数のナノ粒子コア。
【０２５９】
＜ナノ粒子およびｐＭＨＣ複合体を作る方法＞
ｐＭＨＣ−ＮＰおよびナノ粒子は、例えば、ＷＯ２００８／１０９８５２、ＷＯ２０１２／０４１９６８、ＷＯ２０１２／０６２９０４、ＷＯ２０１３１４４８１１、ＷＯ２０１４／０５０２８６、ＷＯ２０１５／０６３６１６、ＷＯ２０１６／１９８９３２、またはＰＣＴ／ＩＢ２０１７／００１５０８に記載される様々な方法によって作ることができる。
【実施例】
【０２６０】
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を例示するために与えられるものであり、本開示をいかなる様式でも限定することを目的としていない。当業者は、目的を実行し、言及された目標と利点と同様に、本明細書に固有の目標および利点本開示を得るために、本開示がよく適応していることを容易に認識するだろう。本実施例は、本明細書に記載される方法と共に、現在、実施形態の代表であり、例示的なものであり、本開示の範囲を制限するものとしては意図されない。請求項の範囲によって定義される本開示の精神内に包含される変化および他の使用が当業者に想到される。
【０２６１】
＜方法＞
マウス
ＮＯＤ／ＬｔマウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ  （Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＭＥ）のものであった。１７．４α／８．３β（８．３−ＮＯＤ）およびＢＤＣ２．５ＮＯＤマウス（ＩＧＲＰ２０６−２１４またはＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄおよび２．５ｍｉ／ＩＡｇ７の遺伝子導入Ｔ細胞受容体をそれぞれ表現する）に記載されている（１９、２０、２１）。
【０２６２】
ｐＭＨＣ生成
２つの異なる方法を使用して、組み換えｐＭＨＣクラスＩ複合体を発現した。１つ目の方法は、ペプチドの存在下において細菌中で発現されるＭＨＣクラスＩ重鎖および軽鎖をリフォールディングし、続いて、ゲルろ過および陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製することを含む（２２、２３）。２つ目の方法は、単鎖構築物として、ミコプラズマを含まないレンチウイルスに形質導入された自由型チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において、ＭＨＣクラスＩ複合体を高収率で発現させる工程を含み、ここで、ペプチドコード化配列、ＭＨＣクラスＩ軽鎖および重鎖が軟性グリシン−セリン（ＧＳ）リンカー２４で順次に繋留され、続いて、ＢｉｒＡ部位をコードするＣ末端のリンカー、遊離システインで終わる６ｘＨｉｓおよびｓｔｒｅｐ  ｔａｇで繋留される。分泌されたタンパク質は、ｓｔｒｅｐ  ｔａｇおよび／またはニッケルカラムを使用して培養液上清から精製し、ＮＰコーティングに直接使用するか、あるいは蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用してｐＭＨＣ四量体を生成するためにビオチン化した。
【０２６３】
組み換えｐＭＨＣクラスＩＩ単量体は、複合体のペプチドＭＨＣα鎖およびＭＨＣβ鎖がリボソームスキッピングＰ２Ａ配列によって分離されるモノシストロニックメッセージをコードする、レンチウイルスで形質導入されたフリースタイルＣＨＯ細胞中で生成された。Ｂｉｒ部位をコードするリンカー、ｓｔｒｅｐおよび／または６ｘＨｉｓのタグ、ならびに遊離システインを構築物のＣ末端に加えた。自己組織化されたｐＭＨＣクラスＩＩ複合体を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって培養上清から精製し、ＮＰ上をコーティングするために使用するか、あるいは上記のようなビオチン化ならびに四量体形成のために処理する。
【０２６４】
ＮＰ合成
金ナノ粒子（ＧＮＰ）を、（Ｐｅｒｒａｕｌｔ，  Ｓ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．  ９（５）：１９０９−１９１５）に記載されるクエン酸ナトリウムで塩化金酸（ＨＡｕＣｌ４）の化学的環元によって合成した。簡潔に言えば、２ｍＬの１％のＨＡｕＣｌ４（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｏａｋｖｉｌｌｅ，  ＯＮ）を、勢いよく撹拌しながら１００ｍＬのＨ２Ｏに加え、溶液を油浴において加熱した。６ｍＬ（１４ｎｍのＧＮＰの場合）または２ｍＬ（４０ｎｍのＧＮＰの場合）の１％のクエン酸ナトリウムを沸騰しているＨＡｕＣｌ４溶液に加え、これをさらに１０分間撹拌して、その後、室温に冷ました。ＧＮＰを、ｐＭＨＣの受容体としてカルボキシル（−ＣＯＯＨ）または一級アミン（−ＮＨ２）の基を用いて官能化された１ｕＭのチオール−ポリエチレングリコール（チオール−ＰＥＧ）リンカー（Ｎａｎｏｃｓ，  ＭＡ）を加えることによって安定化した。ペグ化されたＧＮＰを水で洗浄して遊離チオール−ＰＥＧを取り除き、濃縮して、さらなる分析のために水中で保存した。ＮＰ密度はベールの法則に従って吸光度測定法測定から計算された。
【０２６５】
ＳＦＰシリーズ酸化鉄（Ｆｅ３Ｏ４）ＮＰを、界面活性剤の存在下において、有機溶媒中で鉄アセチルアセトネートの熱分解によって生成し、その後、ペグ化によって水性緩衝液中で溶媒にした  （Ｘｉｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９（２０）：３１６３−３１６６；  Ｘｉｅ，  Ｊ．Ｐ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ  ７８（５）：１００３−１０１４；  Ｘｕ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ５６（７）：８２１−８２）。簡潔に言えば、２ｍｍｏｌのＦｅ（ａｃａｃ）３（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１０ｍＬのベンジルエーテルおよびオレイルアミンの混合物中に溶解し、１００°Ｃに１時間加熱し、その後、窒素ブランケットの保護下で還流で３００°Ｃに２時間加熱した。合成されたＮＰをエタノールの添加によって沈殿させて、ヘキサン中で再懸濁した。酸化鉄ＮＰのペグ化のために、１００ｍｇの異なるドーパミン結合ＰＥＧ（ＤＰＡ−ＰＥＧ、３．５ｋＤａ）リンカー（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈ  ＵＳＡ）を、クロロホルムおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の混合物中に溶解した。その後、ＮＰ溶液（２０ｍｇのＦｅ）をＤＰＡ−ＰＥＧ溶液に加え、室温で４時間撹拌した。ペグ化したＳＦＰ  ＮＰをヘキサンの添加によって夜通し沈殿させ、水中で再懸濁した。微量の凝集体を、高速遠心分離（２０，０００ｘｇ、３０分）によって取り除いた。単分散のＳＦＰ  ＮＰを、ｐＭＨＣ結合のために水中で保存した。鉄の濃度を、２Ｎ塩酸（ＨＣｌ）中で、４１０ｎｍで、分光測光で判定した。ＳＦＰ  ＮＰの分子構造および直径に基づいた（Ｆｅ３Ｏ４；８＋１ｎｍの直径）（Ｘｉｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９（２０）：３１６３−３１６６；  Ｘｉｅ，  Ｊ．Ｐ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ  Ｃｈｅｍ  ７８（５）：１００３−１０１４）、出願人は、１ｍｇの鉄を含有するＳＦＰ溶液が５ｘ１０１４のＮＰを含有すると推測した。
【０２６６】
出願人は、その後、界面活性剤（ＰＦシリーズ酸化鉄ＮＰ）の完全な非存在下でのペグ化酸化鉄ＮＰの形成を、１工程で、さらに熱分解によって可能にした新しい酸化鉄ＮＰ設計を開発した。この設計では、ＰＥＧ分子をインサイチュの表面コーティング剤として使用した。典型的な反応では、３ｇのＰＥＧ（２ｋＤａ  ＭＷ）を１００°Ｃで５０ｍＬの丸底沸騰フラスコ中でゆっくり溶かし、その後、７ｍＬのベンジルエーテルおよび２ｍｍｏｌのＦｅ（ａｃａｃ）３と混合した。その反応物を１時間勢いよく撹拌し、還流で２６０°Ｃにさらに２時間加熱した。反応混合物を室温に冷却し、遠心分離管に移し、３０ｍＬの水と混合した。不溶性物質を遠心分離によって２，０００ｘｇで３０分間取り除いた。遊離ＰＥＧ分子を、Ａｍｉｃｏｎ−１５フィルター  （ＭＷＣＯ  １００  ｋＤａ，  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を介した限外ろ過によって取り除いた。酸化鉄ＮＰは、テストされたＰＥＧ分子のすべてではないが、その大部分で生成された。酸化鉄ＮＰのサイズは、熱分解反応で使用されるＰＥＧリンカーの官能基によって異なる。磁気（ＭＡＣＳ）カラム  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）またはＩＭａｇ細胞分離システム（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，  ＯＮ）を使用して、ＮＰを容易に精製することができる。精製した酸化鉄ＮＰを、室温または４°Ｃで、水中で、検出可能な凝集なしで保存した。上記のようにＳＦＰ  ＮＰにいてＮＰ密度を計算した。
【０２６７】
ＮＰへのｐＭＨＣ結合遠位の一級アミン（−ＮＨ２）あるいはカルボキシル（−ＣＯＯＨ）群を運ぶＰＥＧリンカーを用いて生成されたＮＰへのｐＭＨＣ結合は、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）の存在下でのアミド結合の形成によって達成された。−ＣＯＯＨ基を有するＮＰ（ＧＮＰ−Ｃ、ＳＦＰ−Ｃ、およびＰＦ−Ｃ）は、２０ｍＭの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、ｐＨ  ５．５中に最初に溶解された。その後、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（ｓｕｌｐｈｏ−ＮＨＳ；１０ｍＭ）およびＥＤＣ（１ｍＭ）（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を、ＮＰ溶液に加えた。２０分間室温で撹拌した後に、該ＮＰ溶液を、ｐＭＨＣモノマー溶液（２０ｍＭのホウ酸塩緩衝液中、ｐＨ８．２）に液滴で加えた。混合物を４時間撹拌した。ＮＨ２官能化ＮＰ（ＧＮＰ−Ｎ、ＳＦＰＮ、およびＰＦ−Ｎ）にｐＭＨＣを結合するために、ｐＭＨＣ複合体を、１００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含有する２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液、ｐＨ  ５．５に最初に溶解した。その後、Ｓｕｌｐｈｏ−ＮＨＳ（１０ｍＭ）およびＥＤＣ（５ｍＭ）をｐＭＨＣ溶液に加えた。活性化したＭＨＣ分子を、２０ｍＭのホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．２）中のＮＰ溶液に加え、室温で４時間撹拌した。
【０２６８】
マレイミド官能化ＮＰ（ＳＦＰ−ＭおよびＰＦ−Ｍ）にｐＭＨＣを結合するために、遊離Ｃ末端システインをコードするように設計されたｐＭＨＣ分子を、２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１５０ｍＭのＮａＣｌを含有する４０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ６．０）中のＮＰと混合し、室温で夜通しインキュベートした。ｐＭＨＣは、マレイミド基とシステイン残基との間の炭素−硫黄結合の形成によってＮＰと共有結合する。
【０２６９】
クリックケミストリーを使用して、アジド基（ＳＦＰ−Ｚ）で官能化されたＮＰにｐＭＨＣを結合した。この反応について、ｐＭＨＣ分子を、室温で、２時間、ジベンゾシクロオクチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ−ＮＨＳ，  Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ，  Ｓｃｏｔｔｄａｌｅ，  ＡＺ）で最初にインキュベートした。透析によって遊離ＤＢＣＯ分子を夜通し取り除いた。その後、ｐＭＨＣ−ＤＢＣＯは結合体をＳＦＰ−Ｚで２時間インキュベートし、ｐＭＨＣ分子とＮＰとの間のトリアゾール結合の形成が結果として生じる。
【０２７０】
異なるｐＭＨＣ−ＮＰ結合反応における非結合ｐＭＨＣ複合体を、３００ｋＤａ分子量の分離膜（ｃｕｔ  ｏｆｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｌａｂｓ）を用いて、４°Ｃで、ＰＢＳに対する広範な透析、ｐＨ  ７．４によって取り除いた。あるいは、ｐＭＨＣ結合酸化鉄ＮＰを磁気分離によって精製した。非結合ＮＰは、ＡｍｉｃｏｎのＵｌｔｒａ−１５ユニット（１００ｋＤａのＭＷＣＯ）を介した限外ろ過によって濃縮し、ＰＢＳに保存した。
【０２７１】
ＮＰ特徴づけ
非結合ＮＰおよびｐＭＨＣ結合ＮＰのコアのサイズおよび分散度を、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ，  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ７６５０）によって最初に評価した。動的光散乱（ＤＬＳ，  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ，  Ｍａｌｖｅｒｎ，  ＵＫ）  を使用して、ＮＰおよびｐＭＨＣ−ＮＰの水力学的サイズを判定した。小角電子線回折（ＳＥＢＤ）を使用して、ＮＰのＰＦシリーズの酸化鉄コアの化学的性質を評価した。フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して表面の化学的性質を評価した。ｐＭＨＣ結合ＮＰを、天然ＰＡＧＥおよび変性ＰＡＧＥ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、アミノ酸分析、ならびにドット酵素結合免疫吸着アッセイ（ｄｏｔ−ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）（ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ）によって分析した。
【０２７２】
フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）
ＰＦシリーズ酸化鉄ＮＰ設計の表面の化学的性質を、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）を使用して評価した。ＰＦ−ＮＰ表面上で固定された対照ＰＥＧおよびＰＥＧのＦＴＩＲスペクトルは、ＡＴＲ（減衰全反射法）モード上でＮｉｃｏｌｅｔ  ＦＴＩＲ分光光度計を使用して得た。スペクトルの各々を、４ｃｍ−１のスペクトル分解での２５６回の走査の平均として記録した。ＰＥＧ骨格の分子振動特性（Ｃ−Ｈ非対称伸縮振動  、Ｃ−Ｏ−Ｃ振動、およびＣＨ２横ゆれ振動によって表わされる）、ならびにそれらの遠位のｐＭＨＣ−受容体官能基を同定した。
【０２７３】
アガロースゲル電気泳動
ペグ化またはｐＭＨＣコーティングに応じてＮＰ電荷上の変化を早く評価するために、ＮＰを０．８％のアガロースゲル上で電気泳動にさらした。ペグ化したＮＰは、全体的な表面電荷に応じて陰性または陽極に移動した。
【０２７４】
天然および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｐＭＨＣ結合ＮＰを天然ＰＡＧＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％）分析にさらしてｐＭＨＣ−ＮＰ調製物中の遊離（非結合ｐＭＨＣ）の不在を確認し、ＮＰの表面上に無傷の三分子ｐＭＨＣ複合体の存在を確認した。
【０２７５】
ｐＭＨＣ結合価の測定
個々のＮＰ（ｐＭＨＣ結合価）上に結合したｐＭＨＣ単量体の数を評価するために、出願人は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、アミノ酸分析（加水分解されたｐＭＨＣ−ＮＰ調製物中の１７の異なるアミノ酸のＨＰＬＣベースの定量化）（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｏｒｏｎｔｏ）、およびドット酵素結合免疫吸着定アッセイ（ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ）を含む様々なアプローチを使用して、ｐＭＨＣ−ＮＰ調製物のｐＭＨＣ濃度、ならびにｐＭＨＣ分子数対ＮＰ数の比率に変換された値を測定した。簡潔に言えば、「ｄｏｔ−ＥＬＩＳＡ」アプローチでは、ｐＭＨＣ結合および非結合ＮＰおよびｐＭＨＣモノマー溶液（基準としての）を、ＰＢＳにおいて連続的に希釈し、マルチウェルフィルタプレート（ＰＡＬＬ株式会社）においてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜に吸収された。プレートを室温で半乾燥させ、その後、ｐＭＨＣ特異的一次抗体（つまり、ｐＭＨＣクラスＩコーティングＮＰの抗−β２Ｍおよび抗Ｋｄ抗体、クローン２Ｍ２およびＳＦ１−１．１のそれぞれ；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）でインキュベートし、続いて、ＨＲＰ結合二次抗体またはＡＰ結合二次抗体でインキュベートした。酵素発色反応の発生に際して、ウェルの内容物を従来のＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、プレートリーダーを使用してそれらの吸光度を４５０ｎｍで測定した。これらの様々な方法によって生成された値が類似したので、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ブランクとして非結合ＮＰを使用）は容易かつ簡単な選択の方法になった。
【０２７６】
ＴＣＲ／ｍＣＤＡトランスフェクトされたＪｕｒＭＡ細胞におけるＴＣＲシグナル伝達
ＢＤＣ２．５−ＴＣＲをコードするＴＣＲαおよびＴＣＲβのｃＤＮＡを、５’  ＲＡＣＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０  ｋｉｔ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＵＳＡ）ならびにＴＣＲαまたはＴＣＲβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋Ｔ細胞由来のｍＲＮＡから生成した。結果として生じるＰＣＲ産物をｐＣＲ８プラスミドにクローン化し、配列決定した。その後、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのｃＤＮＡがＰ２Ａリボソームスキッピング配列によって分離される単一の読み取り枠として、完全長のｃＤＮＡをＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセットの上流のレトロウイルスベクターにサブクローン化した。
【０２７７】
ＴＣＲα−Ｐ２Ａ−ＴＣＲβ融合タンパク質のポリペプチド配列は、以下の例示的な配列表において提供される。
【０２７８】
ＴＣＲα−Ｐ２Ａ−ＴＣＲβ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列が、以下の例示的な配列表において提供される。
【０２７９】
レトロウイルスを産生するＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞株との共培養によってマウスＣＤ４をコードするレトロウイルスで、ヒトＣＤ３＋／ＴＣＲβ−ＪｕｒＭＡレポーター細胞株（ＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼを発現するように設計された）を形質導入した。形質導入された細胞を拡大し、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍＣＤ４（ＧＫ１．５）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ＮＪ）で選別した。その後、ＢＤＣ２．５ＴＣＲαβおよびＩＲＥＳ−ｅＧＦＰをコードするレトロウイルスでＣＤ４＋Ｊｕｒｋａｔ／ＭＡ細胞を形質導入した。ｅＧＦＰおよびｍＣＤ４の二重の陽性細胞をフローサイトメトリーによって選別し、ＰＥ標識ＢＤＣ２．５／ＩＡｇ７  ｐＭＨＣ四量体で染色してそれらの特異性を確認した。
【０２８０】
ルシフェラーゼのＮＦＡＴ駆動発現を測定するために、野生型およびＢＤＣ２．５／ｍＣＤ４＋ＪｕｒＭＡ細胞を、２０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と０．５μＭのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＤ３εｍＡｂ（ＯＫＴ３，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または１２．５μｇ／ｍＬのＢＤＣ２．５／ＩＡｇ７コーティングされたＰＦ−Ｍの存在下または不在下において、１０％のＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、２０ｍＭのＬ−グルタミン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）、１０ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）、ならびに抗生物質で補充された２００μｌのＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）において５００，０００細胞／ウェルで４８ウェルプレートに蒔いた。刺激後の様々な時間で細胞をウェルから収集し、９６ウェルプレートに移し、ＰＢＳで３回洗浄した。１０５の細胞を新しい９６ウェルプレートに移し、２０μｌの細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中で溶解し、注射器を伴うＶｅｒｉｔａｓ（商標）マイクロプレート照度計（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、乳白色プレート  （Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＧｍｂＨ，  Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ，  Ａｕｓｔｒｉａ）中の１００μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）でインキュベートした。ルシフェラーゼ活性を、非刺激細胞のルシフェラーゼ活性に対して正規化された相対的な発光単位（ＲＬＵ）として表した。
【０２８１】
インビトロのｐＭＨＣ−ＮＰのアゴニスト活性
ＴＣＲトランスジェニックマウスからのＦＡＣＳで選別された脾臓のＣＤ８＋またはＣＤ４＋細胞（２．５ｘ１０５細胞／ｍＬ）を、３７°Ｃで２４−４８時間ｐＭＨＣ結合ＮＰの濃度または対照ＮＰの濃度の範囲でインキュベートした。上清をＥＬＩＳＡによってＩＦＮγについて分析した。
【０２８２】
アゴニストｍＡｂおよびｐＭＨＣコーティングされたＮＰへのヒトＴ細胞クローンの応答性を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ｍＡｂコーティングされたビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；１：１のビーズ対細胞の比率で）、ＰＰＩ７６−９０（８８Ｓ）／ＤＲＢ１＊０４０１コーティングされたＰＦ−Ｍ（５０μｇのペプチド／ＭＨＣ／ｍｌ）、または同一数の対照のシステインコーティングされたＰＦ−Ｍを含有する５００μｌの完全なＲＰＭＩ−１６４０培地の４８ウェルプレート中で、５ｘ１０５のクローンＴ細胞を培養することによって評価した。２日目に、ルミネックスによるサイトカイン内容分析のために上清を収集し、ＲＮＡ抽出のために細胞ペレットを収集した。他の実験では、Ｔ細胞クローンを、ＰＰＩ７６−９０（８８Ｓ）／ＤＲＢ１＊０４０１コーティングされたＰＦ−ＭまたはシステインコーティングされたＰＦ−Ｍで最大５日間インキュベートした。０、２、３、４、および５日目に細胞を収集して、ＲＮＡ抽出に使用した。
【０２８３】
ｐＭＨＣ−ＮＰ／細胞抱合体の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）
ビオチン−ストレプトアビジンＣＤ４＋あるいはＣＤ８＋Ｔリンパ球濃縮キット（ＢＤＣ  ＩｍａｇＴＭ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＴＣＲトランスジェニック動物から単離されたＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋および８．３ＣＤ８＋Ｔ細胞（５ｘ１０６／ｍＬ）を、２．５ｍｉ／ＩＡｇ７コーティングされたＰＦ−Ｍ  ＮＰおよびＮＲＰ−Ｖ７／ＫｄコーティングされたＰＦ−Ｍ  ＮＰで、４°Ｃで、３０分間インキュベートした（１５−２０μｇ／ｍＬのｐＭＨＣ）。培養物を示された時間にわたって３７°Ｃでさらにインキュベートし、冷たいＰＢＳで洗浄して非結合ＰＦ−Ｍ  ＮＰを取り除き、固定して、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ７６５０を用いたＴＥＭ画像化のために切断した（７０ｎｍ）。
【０２８４】
超解像顕微鏡
精製した８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍ−Ａｌｅｘａ−６４７  ＮＰで、４°Ｃで３０分間または３７°Ｃでさらに１時間インキュベートした。細胞を冷たいＰＢＳ  ｐＨ  ７．４で３回洗浄し、その後、氷上で２％のＰＦＡにおいて１５分間固定した。洗浄後、細胞をＲＴの１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩによって５分間染色し、超解像顕微鏡（ＥＬＹＲＡ  １３１、Ｚｅｉｓｓ）下で観察した。クラスタ直径の画像処理および定量分析を、ＺＥＮ  ２０１２ソフトウェアを用いて行った（ｎ＝１００）。
【０２８５】
ｐＭＨＣ−ＮＰ／細胞の結合体の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）およびＸ線分光測定
上記のように、チオグリコール酸塩誘発腹腔マクロファージおよび骨髄由来のＤＣを調製した。ＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋および８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ビオチン−ストレプトアビジンＣＤ４＋あるいはＣＤ８＋Ｔリンパ球濃縮キット（（ＢＤ  ＩｍａｇＴＭ，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＢＤＣ２．５−ＮＯＤまたは８．３−ＮＯＤマウス脾臓から陰性選択した。細胞をカバーガラス上で蒔き、３７°Ｃでのさらに６０分間のまたは１８０分間のインキュベーションを伴って／伴わずに、非結合またはシステイン結合ＰＦ−Ｍ、ＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７−ＰＦ−ＭあるいはＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＰＦ−Ｍで４°Ｃで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を０．０５Ｍのカコジル酸塩緩衝液（ＣＢ）ｐＨ  ７．４で洗浄し、その後、２．５％のグルタルアルデヒドを用いて４°Ｃで夜通し固定した。検体を段階的エタノール中で連続的な脱水にさらし、乾燥のためにヘキサメチルジシラザンに３分間浸した。サンプルを金メッキによってＸＬ３０  ＳＥＭ（Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）下で観察した。エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＳ）を使用して要素分析を行った。
【０２８６】
実施例１−ナノ粒子（ＮＰ）表面対ｐＭＨＣベースのナノメディシンの生物学的活性上の分子のｐＭＨＣ密度
ペプチド主要組織適合性複合体（ｐＭＨＣ）およびｐＭＨＣ−ナノ粒子（ＮＰ）濃度の結合価がこれらの化合物の生物学的活性にどのように寄与するか理解するために、出願人は、様々なＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ−ＮＰ調製物の、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）−トランスジェニック８．３−ＮＯＤマウスからの同族の（ＮＲＰ−Ｖ７／Ｋｄ／ＩＧＲＰ２０６−２１４−特異的）ＣＤ８＋Ｔ細胞を一時的に活性化する能力を比較した。図１Ａで示されるように、ＳＦＰ−ＮＰの存在下で培養された時、８ｐＭＨＣ／ＮＰでコーディングされた８．３−ＣＤ８＋Ｔ細胞は少量のインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を産生したが、広範囲のｐＭＨＣ−ＮＰ濃度あるいはｐＭＨＣ濃度にわたって、１１ｐＭＨＣ／ＮＰという低さでさえ、より高いｐＭＨＣ結合価でコーディングされたＮＰに応答して実質的により多くの量のＩＦＮγを産出した。この観察は、ＳＦＰ−ＮＰのアゴニスト活性のためのｐＭＨＣ結合価の閾値が、９〜１１ｐＭＨＣ／ＮＰ（図１Ａおよび１Ｂ）の間に位置することを示唆した。理論によって制限されずに、ｐＭＨＣ−ＮＰ濃度の増加は、「閾値の」または「閾値を超える」ｐＭＨＣ結合価を保持するｐＭＨＣ−ＮＰのアゴニスト特性を増強することができる。
【０２８７】
この観察を確認するために、出願人は、次に、ＳＦＰ−ＮＰより大きく、したがって、より大きなｐＭＨＣ−コーティング能力を有するＰＦ−ＮＰを使用した。はるかに高いｐＭＨＣ結合価（６１ｐＭＨＣ／ＮＰ、図１Ｃおよび１Ｄ、ならびにデータは図示せず）を表示するＰＦ−ＮＰと比較して、１３あるいはそれより少数のｐＭＨＣ／ＮＰを保持するｐＭＨＣ−ＰＦ  ＮＰは非常に弱く、〜８ｘ１０１２ＮＰ／ｍＬまでの生物学的活性がない。これは、アゴニスト活性に必要なｐＭＨＣの閾値がＮＰサイズによって増加するという考えを裏付けた（つまり、〜８ｎｍのＳＦＰ−ＮＰの場合＞８ｐＭＨＣ〜２０ｎｍのＰＦ−ＮＰの場合＞１３ｐＭＨＣ）。アゴニスト活性に対するＮＰサイズおよびｐＭＨＣ結合価の逆効果は、ｐＭＨＣ密度（ＮＰのｐＭＨＣ／表面積）への役割を示唆した。これは、図１Ｅおよび１Ｆでさらに例示され、そこでは、出願人は、ＮＰまたはｐＭＨＣの濃度の範囲にわたって、同様の数のｐＭＨＣでコーティングされたＳＦＰ−ＮＰおよびＰＦ−ＮＰの生物学的活性を比較した（異なるサイズのＮＰの同一濃度を使用する場合に総ｐＭＨＣ「ロード」の絶対差を補うため）。
【０２８８】
実施例２−閾値ｐＭＨＣ密度を超える生物学的活性の急速な増加
これらのデータは、ＮＰ上の個々のｐＭＨＣ単量体を分離する距離に対応する定数によって生物学的活性閾値が定義されることを示唆した。出願人は、異なるサイズの最大閾値結合能力と予測された閾値結合能力とを比較し、ｐＭＨＣ−密度閾値を特定した。理論的なｐＭＨＣ密度閾値は０．００４４６８ｐＭＨＣ／ｎｍ２にあり、これは、８ｎｍのＮＰの場合１１ｐＭＨＣあるいは２０ｎｍのＮＰの場合２２ｐＭＨＣに相当する。これらの値は〜１６．８８ｎｍの計算された分子間距離に相当する。Ｔ細胞抗原レセプタ（ＴＣＲ）複合体は、ＣＤ３γ−ＣＤ３ε−ＴＣＲαβ−ＣＤ３ζ−ＣＤ３ζ−ＴＣＲαβ−ＣＤ３δ−ＣＤ３ε複合体内に最大２ＴＣＲαβヘテロ二量体を含有すると思われる（Ｒｏｊｏ，  Ｊ．Ｍ．  ＥＴ  ＡＬ．  （１９９１）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １２（１０）：３７７−３７８；  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｉｇｕｅｌ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６（４）：１５４７−１５５２）。この構造は、３Ｄ再構成（１２ｎｍ）  （Ａｒｅｃｈａｇａ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２（１１）：８９７−９０３）に基づいたＴＣＲ複合体の予測された幅と一致し、アゴニスト閾値に達するための１６．８８ｎｍの計算されたｐＭＨＣ間の距離と一致している。出願人は〜３．６２ｎｍで可能性のある最小の分子間の距離を計算し、それは、ＴＣＲαβナノクラスタ内の個々のＴＣＲに及ぶ、予測された３−６ｎｍの距離に都合良く合う）；この距離は、Ｔ細胞（図２Ａ）上のＮＰの上のｐＭＨＣおよび同族ＴＣＲのほぼ完全なアライメントを可能にする。これらのクラスタ中の隣接するＴＣＲヘテロ二量体を結合することができるｐＭＨＣ−ＮＰは、ＴＣＲシグナル伝達を誘発するのに効率的である。これらのモデルは、緊密に並置されたｐＭＨＣでコーティングされた小さなＮＰが最適な免疫学的特性を有する理由を説明する。ｐＭＨＣ密度はＴｒｅｇ細胞転換を制御する。なぜなら、それが大きなＴＣＲマイクロクラスタの持続的な集合体を促進することができ、迅速で、ロバストで、長期のＴＣＲシグナル伝達をもたらすからである（図２Ｂ）。
【０２８９】
ｐＭＨＣクラスＩコーティングされたＮＰを使用して生成されたデータに基づいた仮説は、広範囲の結合価上にわたってｐＭＨＣクラスＩＩ単量体でコーティングされたＰＦ−ＮＰの効力を誘発するＴＣＲの比較によりテストされた。ＢＤＣ２．５−ＴＣＲ−トランスジェニックＮＯＤマウスから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、最大２２の同族（ＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７）ｐＭＨＣ複合体でコーディングされたＰＦ−Ｍ  ＮＰに応答して、少量のＩＦＮγを産生した（０．００４５ｐＭＨＣ／ｎｍ２、図１Ｇ）。著しく、１０および５μｇのｐＭＨＣ／ｍＬ（用量反応効果がプラトーに達する濃度）で得られたＩＦＮγ分泌データをプロットすることにより、ＩＦＮγ分泌の規模は、ｐＭＨＣ結合価の比較的小さな増加に応答して指数関数的に増大し、それは、〜２２ｐＭＨＣ（予測された閾値結合価）から開始して〜３２ｐＭＨＣ／ＮＰ（０．００６５ｐＭＨＣ／ｎｍ２、本明細書で「最小最適な結合価」と呼ばれる）（図１Ｈ）で終了する。この最小最適な結合価上のｐＭＨＣ結合価／密度の実質的な増加は、有効により高い効力を結果としてもたらさない（図１Ｈ）。
【０２９０】
実施例３−ｐＭＨＣ密度は、ｐＭＨＣ−ＮＰ−誘発ＴＣＲシグナル伝達の規模を制御する。
ＴＣＲシグナル伝達の効率におけるｐＭＨＣ密度依存性差によってこれらの生物学的効果を説明することができるか否かを確認するために、出願人は、ＢＤＣ２．５  ＴＣＲαβヘテロ二量体およびマウスＣＤ４共受容体をコードするレンチウイルスでＪｕｒｋａｔ／ＭＡ（ＪｕｒＭＡ）ヒトＴ細胞株を形質導入した（内因性ＴＣＲβ鎖発現を欠き、活性化Ｔ細胞（ＮＦＡＴ）転写因子結合ＤＮＡ配列の核因子によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを保持する）（Ｓｃｈｏｌｔｅｎ，  Ｋ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１４（２）：１１９−１２９）。図１Ｉに示されるように、アゴニスト抗ヒトＣＤ３εｍＡｂまたはＰＭＡ／イオノマイシンの最適な濃度と比較されるように、ＢＤＣ２．５−ＴＣＲ／ｍＣＤ４−ＪｕｒＭＡ細胞はＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７コーティングされたＰＦ−Ｍに対して迅速（２時間以内）に、活発に、長期間（＞２４時間）応答し、それは、１４時間でピークに達し、その後徐々に減少する非常に低速の応答を引き起こした。顕著に、広範囲のＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７結合価でコーティングされたＰＦ−Ｍ  ＮＰを使用した実験は、ルシフェラーゼ発現（ＴＣＲシグナル伝達の直接読み出し）の規模が、初代ＢＤＣ２．５−ＣＤ４＋Ｔ細胞で見られるものに著しく似ている速度論に従っていたことを示し、これは、閾値および閾値を超えるｐＭＨＣ密度が何らかの形で協同ＴＣＲシグナル伝達を促進することを示した（図１Ｊ）。
【０２９１】
さらに、（ａ）協同シグナル伝達と一致する形状、および（ｂ）閾値および最小最適な密度を定義する特定のｐＭＨＣ結合価／密度の両方の点から、ナイーブ初代ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞を使用する場合、ｐＭＨＣ−密度応答曲線を非常によく模倣するＳ字状曲線（図１Ｊ）を提示するこの開示のアッセイを観察することは予想外である。外因性ＴＣＲ／共受容体の対を過剰発現するトランスフェクトされた細胞株にとって、これは完全に驚くべきことである。トランスフェクトされたマウスＴＣＲおよびＣＤ４分子の分子数と正確な化学量論を一致させることが困難であること、ならびに宿主細胞株はヒト起源（そのＣＤ３鎖成分を含む）のものであるが、テストされたｐＭＨＣおよびＴＣＲ／ＣＤ４分子がマウスであったことを考慮すると、当業者は、トランスフェクトされた細胞からの線形（Ｓ字形状曲線の形と対照的に）反応を予想しただろう。
【０２９２】
実施例４−ｐＭＨＣ−ＮＰは、マウス同族Ｔ細胞での抗原受容体クラスタ化を誘発する。
出願人は、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）を介してこれらのＴ細胞にｐＭＨＣを送達するのではなく、同族Ｔ細胞上のＴＣＲを直接結合することにより、ｐＭＨＣ−ＮＰがＴｒｅｇ細胞転換を促進することを示している（Ｃｌｅｍｅｎｔｅ−Ｃａｓａｒｅｓ，  Ｘ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  ５３０（７５９１）：４３４−４４０）。上記実験によって明らかにされたｐＭＨＣ密度効果は、他の刺激（図１Ｊ）と比較して、ｐＭＨＣ−ＮＰ−曝露ＴＣＲ／ｍＣＤ４トランスフェクトＪｕｒＭＡ細胞におけるＮＦＡＴ駆動ルシフェラーゼの迅速で持続的な産生とあいまって、長期のＴＣＲライゲーションを誘導することによって、ｐＭＨＣ−ＮＰが作動するかもしれないことを示唆した（低い親和性の単量体のｐＭＨＣ／ＴＣＲ相互作用の一時的な性質に対立するものとして）。
【０２９３】
ＴＣＲは、最大〜２００ｎｍの直径／長さの線形クラスタ  （Ｓｃｈａｍｅｌ，  Ｗ．Ｗ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２５１（１）：１３−２０）または非線形の集合体  （Ｌｉｌｌｅｍｅｉｅｒ，  Ｂ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（１）：９０−９６）として、ナイーブＴ細胞の表面上で組織化され、最大３０の緊密に関連するＴＣＲで構成される（ナノクラスタ）（Ｚｈｏｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（６）：ｅ５９４５）。これらのＴＣＲ集合体のナノクラスタ構造は、プロフェショナルＡＰＣ上の同族ｐＭＨＣのＴ細胞の物理的活性（従って、官能性の感度）を増加させ、緊密に並置されたＴＣＲユニット中の協同細胞内シグナル伝達を促進すると思われる。ＴＣＲナノクラスタ形成が構成的で、ｐＭＨＣライゲーション（通常、３００−８００ｎｍのサイズの範囲で、最大７０のＴＣＲを含有する）に起因するＴＣＲマイクロクラスタ形成（長期のＴＣＲシグナル伝達をもたらす）に先行するという証拠がある  （Ｌｉｌｌｅｍｅｉｅｒ，  Ｂ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１（１）：９０−９６；  Ｙｏｋｏｓｕｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６（１２）：１２５３−１２６２；  Ｃｈｏｕｄｈｕｒｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５８４（２４）：４８２３−４８３１；  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３５（５）：７０５−７２０）。
【０２９４】
上記のｐＭＨＣ密度効果に対する洞察力を得るために、出願人は、同族Ｔ細胞に対するｐＭＨＣコーティングされたＮＰ（閾値を超えるｐＭＨＣ密度）の結合の幾何学的形状および速度論（ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を調査した。ＴＥＭ試験は、〜１００−１５０ｎｍに及ぶいくつかのＮＰのクラスタ（島）として、ｐＭＨＣ−ＮＰが同族ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を結合することを明らかにした（図３Ａおよび３Ｂ）。この結合の幾可学的形状は、４°Ｃで３０分以内に既に見られており、その後、３７°Ｃでのインキュベーション時にクラスタ成長（〜４００ｎｍの直径／長さへの）が続き（図３Ａ、３ＢおよびＧ）、結合後〜３時間から開始する細胞内小胞中のＮＰのインターナリゼーションに結果的になった（図３Ａおよび３Ｂ）。ｐＭＨＣ−ＮＰを非同族Ｔ細胞でインキュベートした時、ＮＰの結合もインターナリゼーションも見られなかったので、このクラスタ化された結合は抗原特異性であった（図３Ｃ）。これらの結果は、超解像顕微鏡（図３Ｄ）および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（図４Ａおよび４Ｂ）によって実証され、同族Ｔ細胞の表面上でのクラスタ化されたｐＭＨＣ−ＮＰの存在を確認した。
【０２９５】
まとめると、これらのデータは、ｐＭＨＣ−ＮＰがＴＣＲナノクラスタ結合およびマイクロクラスタ誘発デバイスとして機能し、このプロセスがＴｒｅｇ細胞転換の原因となるか、あるいは、少なくともＴｒｅｇ細胞転換に寄与する可能性を高めることを示唆した。Ｔｒｅｇ転換がｐＭＨＣ密度の直接的な機能であるので、出願人はｐＭＨＣ密度における変動がＴＣＲマイクロクラスタ形成に何らかの効果を有するかどうか調査した。出願人は、閾値より下の、閾値の、および閾値を超える密度で、ｐＭＨＣを保持するＢＤＣ２．５ｍｉ−ＩＡｇ７−ＮＰ調製物を比較した。注目すべきことに、閾値より下の密度でコーティングされたＮＰは、同族ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合し、および同族ＣＤ４＋Ｔ細胞によって、クラスタを形成することなく最終的にはインターナライズされた（図３Ｅおよび３Ｇ）。これに対して、閾値の密度でコーティングされたＮＰはクラスタの形成を容易に誘発し、これらのクラスタのサイズは、閾値を超える密度でコーティングされたＮＰを使用して増加した（図３Ａ、３Ｆおよび３Ｇ）。
【０２９６】
上記のデータは、同族Ｔ細胞へのｐＭＨＣベースのナノメディシンの結合幾可学的形状が、観察されたｐＭＨＣ−密度効果の主な原因になることを示す。ＮＰ表面上の緊密に並置されたｐＭＨＣ単量体は、個々のＮＰ上の一時的に分離されたｐＭＨＣ単量体の反復される再結合を促進し、したがって、ＴＣＲインターナリゼーションを遅らせ、個々のＴＣＲ−ｐＭＨＣ相互作用のｔ１／２を延長する（Ｚｈｏｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（６）：  ｅ５９４５；  Ｈｕｐｐａ，  Ｊ．Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎａｔｕｒｅ  ４６３（７２８３）：９６３−９６７）。その後、結果として生じるシグナル伝達事象によって誘発された細胞骨格再構成は、大きなＴＣＲマイクロクラスタへの近位のｐＭＨＣ−ＮＰ−ＴＣＲユニットの持続的な集合体を促進し（Ｂｕｎｎｅｌｌ，  Ｓ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５８（７）：１２６３−１２７５）、ＴＣＲシグナル伝達の持続時間および規模をさらに増幅する（Ｙｏｋｏｓｕｋａ，  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６（１２）：１２５３−１２６２）。高いｐＭＨＣ密度は、細胞膜クラスタ上のＮＰ内およびその間の両方で、構造変化の協同増殖ならびにｐＭＨＣ結合ＴＣＲからそれらの非結合ネイバー（ｕｎｂｏｕｎｄ  ｎｅｉｇｈｂｏｕｒｓ）（Ｇｉｌ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｃｅｌｌ  １０９（７）：９０１−９１２；  Ｍｉｎｇｕｅｔ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２６（１）：４３−５４）までの関連する下流シグナル伝達事象も促進する（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ２（８３）：ｒａ４３）。この解釈は、Ｔ細胞活性化の動的校正（ＭｃＫｅｉｔｈａｎ，  Ｔ．Ｗ．  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２（１１）：５０４２−５０４６）および連続的ＴＣＲ結合モデル  （Ｖａｌｉｔｕｔｔｉ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔｕｒｅ  ３７５（６５２７）：１４８−１５１）の両方に適合する。
【０２９７】
これらの化合物の予期しないｐＭＨＣ密度および抗原受容体をクラスタ化する依存性シグナル伝達特性は、本明細書に記載されるもの、または効力とバッチ放出アッセイで類似するものなどの抗原受容体を表現するレポーター細胞株の使用を可能にする。
【０２９８】
実施例５−ルシフェラーゼベースの効力アッセイのための例示的プロトコル
ｐＭＨＣ−ナノ粒子の所定の調製物の効力の判定に使用される例示的な効力アッセイを、この例にて詳述する。この場合の細胞は、ＮＦＡＴプロモーターの管理下でルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＪｕｒＭＡ細胞がヒト細胞株であるため、マウスＣＤ４が発現され、この例で分析されたｐＭＨＣのＭＨＣ成分はマウスＩ−Ａｇ７である。ＪｕｒＭＡ細胞株がヒトＭＨＣならびにマウスで機能することが考えられ、続く例において示される（ＪｕｒＭＡ細胞は、ヒトＣＤ４の内因性発現を表示するので）。
１．９６ウェルプレート（三通りの）において、２００のμＬのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に５００，０００のＢＤＣ２．５／ｍＣＤ４＋ＪｕｒＭＡ細胞を加え  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｄ６４２９−５００ＭＬ）、以下のいずれかの存在下で１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｆ６１７８）で補充した：１）２０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｐ８１３９）と０．５μＭのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｉ３９０９−１ＭＬ）、１０μｇ／ｍＬの抗ｈＣＤ３εｍＡｂ（ＯＫＴ３，  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（陽性対照として）；２）１０−４８ｐＭＨＣ／ＮＰに及ぶ様々な結合価の１２．５または５．０μｇ／ｍＬのｐＭＨＣコーティングされたＮＰあるいはＰＦ−Ｍ  ＮＰ；または、３）システインコーティングされたＮＰ（ｐＭＨＣ−ＮＰに対して同等の鉄濃度を有する陰性対照として）。９％のＣＯ２を供給しながら、３７°ＣでＣＯ２インキュベーターで夜通しインキュベートする。対照として、野生型ＪｕｒＭＡ細胞を用いてこのセットアップを複製する。
２．翌日、細胞を１２００ｒｐｍで５分間遠心分離機にかけて、培地を取り除く。この後、２００μＬのＰＢＳを加えて、細胞を３回洗浄する。
３．１００μＬの溶解緩衝液１ｘ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ，  Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃａｔ．  ＃Ｅ１５３１）中で細胞ペレットを再撹拌し、軽く振盪させながら３０分間インキュベートする。
４．２０μＬの可溶化液を取り出し、それを乳白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ  Ｒｅｆ．  ＃６５５０７５）に移す。
５．ウェル毎に１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃａｔ．  ＃  Ｅ１５００）を加え、その後、Ｖｅｒｉｔａｓ（商標）マイクロプレート照度計を使用してすぐに読み取る（この機器の注射器は自動的にウェル毎に１００μＬのルシフェラーゼアッセイ試薬を加える。プレートは、注入後の読み取りプロセスを繰り返すために次のウェルに前進する）。生成された光を１０秒間（積分時間）測定した。遅延時間は２秒である。
【０２９９】
以下の例において示されるように、この方法は、様々な型のナノ粒子組成物の効力および活性のためのアッセイに通常適用可能である。
【０３００】
実施例６−アッセイ間の変動性の測定
アッセイ間の変動性を測定するために、出願人は、同じ特異性を有するｐＭＨＣ−ＮＰ（つまり、コアに結合された同じｐＭＨＣ複合体）を調製し、ＳＤ５０（片対数のプロット中で測定されるように、最大活性の半分をもたらす濃度）について分析した。これらの実験には、Ｉ−Ａｇ７（ＢＤＣ  ２．５ｍｉ）に結合されたＧＡＤ５２４−５４３に特異的な組み換えＴＣＲおよび組み替えマウスＣＤ４でトランスフェクトされたＪｕｒＭＡ細胞を利用した。結果が図５に要約され、７回の実験を用いた現在のデータが８．９１プラス／マイナス１のマイクログラム／ｍＬ（平均プラス／マイナスの平均値の標準偏差）であることを示す。レポーターが実際にはＴＣＲ近位のシグナル伝達事象ではないので、出願人のアッセイを用いてテストされかつ観察された再現性は予期しないものであり、当業者は示されたよりも大きいアッセイ間の変動性を予測する。しかし、このデータ計算は厳格な応答（ｔｉｇｈｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）を示し、そのような定量アッセイは従来のそれほど定量的ではないアッセイあるいは半定量アッセイ（例えば、ＴＣＲシグナル伝達レポーターの上流のシグナル伝達中間体のリン酸化の強度の測定）よりずっと好ましいことを証明する。生物学的活性の原因となるｐＭＨＣ密度の閾値の低い実験間の変動性および忠実な再現と関連する定量化の利点は、この開示の組成物および品質の優れた高い感受性のあるバッチ間の比較を提供することができる。
【０３０１】
実施例７−インビトロのＴ細胞の刺激機能におけるＮａｖａｃｉｍに対する抗Ｎａｖａｃｉｍ抗体の可能性のある効果を評価する細胞ベースの効力アッセイ
インビボでの送達後、免疫応答性の宿主がｐＭＨＣ−ＮＰの様々な成分に対する体液性応答を生成する可能性が存在する。これらは、ｐＭＨＣ−ＮＰの構造成分であるＰＥＧと同様に、表面にコーティングされたｐＭＨＣ単量体内に存在する６ｘＨｉｓタグなどのタンパク質の精製タグを含む。この例では、ｐＭＨＣ−ＮＰ（ｐＭＨＣ、ＰＥＧ、Ｈｉｓタグ）の様々な成分に対して向けられた抗体が、Ｔ細胞中のＴＣＲシグナル伝達に関与して誘発するｐＭＨＣ−ＮＰの能力に対してかなりの効果があるか否かを評価する。前の結果は、抗ＰＥＧ（ＡＧＰ４）の結合を阻むｐＭＨＣ−ＮＰおよび粒子への抗Ｈｉｓ（６Ｇ２Ａ９）抗体へのヒト血清の曝露の能力およびを実証した。したがって、このアッセイは、抗Ｈｉｓ、抗ＰＥＧ、あるいは抗ＭＨＣモノクローナル抗体、またはウサギ高度免疫血清への曝露後の同族ＪｕｒＭＡ  Ｔ細胞を刺激するそれらの能力について、ヒト血清のあらかじめ曝露された粒子および曝露されていない粒子の両方をテストするだろう。
＜試薬および実験レイアウト＞
抗ｐＭＨＣ  ｍＡｂ
●精製された抗マウス／ラットＭＨＣクラスＩＩ  ＲＴ１Ｂ  ｍＡｂ（クローンＯＸ−６）（１  ｍｇ／ｍＬ  ｉｎ  ＰＢＳ，  Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＭＣＡ４６Ｒ）
●精製された抗ＰＥＧ  ｍＡｂ（クローンＡＧＰ４）（ＰＢＳ中の１．４ｍｇ／ｍＬ、抗ＰＥＧ、  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  ＡＧＰ４−ＰＡＢＭ−Ａ）
●精製された抗ＨｉｓタグｍＡｂ（クローン６Ｇ２Ａ９）（ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ａ００１８６）
●精製されたマウスＩｇＧ（クローンＭＯＰＣ２１）（ＰＢＳ中の０．５ｍｇ／ｍＬ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃５５４１２１）
血清
●抗ＰＥＧ過免疫ウサギ血清
●抗ＢＤＣ２．５ｍｉのｐＭＨＣ過免疫ウサギ血清
●免疫前のウサギ血清
●ヒト血清（Ｓｉｇｍａ，  Ｃａｔ  ＃Ｈ４５２２）
ｐＭＨＣ−ＮＰ
●ＢＤＣ２．５ｍｉＰＦＭ−１１２０１７（Ｆｅ：２．１５ｍｇ／ｍＬ、ｐＭＨＣ：０．９７ｍｇ／ｍＬ、結合価４２ｐＭＨＣ／ＮＰ）
●システインＰＦＭ−１１１４１７（Ｆｅ：１．５２ｍｇ／ｍＬ）
ルシフェラーゼ検出方法：
●細胞培養溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃Ｅ１５００）を用いたＰｒｏｍｅｇａホタルルシフェラーゼ・アッセイ・キット
●試薬注射器を有するＳｐｅｃｔｒａｍａｘｉ３ｘプレート読み取り照度計効力アッセイを、実施例５−ルシフェラーゼベースの効力アッセイのための例示的プロトコルに従って実施した。
【０３０２】
＜結果＞
ヒト血清の前曝露の有無に関わらず、予想通りに、抗−ＭＨＣ−ＩＩ（抗ＢＤＣ２．５ｍｉ／ＩＡｇ７）対象ｍＡｂあるいは抗血清は、力価依存性方法でインビトロの効力アッセイでのＮａｖａｃｉｍ活性を著しく阻害することができた。これらの処置は、アッセイの検証を支援するために陽性阻害対照として含まれていた。図６Ａ−６Ｄを示されるように、陰性対照（マウスＩｇＧあるいはウサギ前免疫血清）と比較して、ｐＭＨＣ−ＮＰ活性の阻害は、ヒト血清前曝露の有無に関わらず、抗Ｈｉｓタグ、抗ＰＥＧ  ｍＡｂ、またはウサギ抗ＰＥＧ過免疫血清で見られなかった。ヒト血清前露光も不在下で、抗ＰＥＧ  ｍＡｂは、ｐＭＨＣ−ＮＰ  Ｔリンパ球刺激に対する強力な増強効果を実際に示した（これは抗ＰＥＧ過免疫血清では見られないので、おそらくｐＭＨＣ−ＮＰ複合体の五量体構造によって架橋することによる）。この効果は、ヒト血清へのＮａｖａｃｉｍｓの前曝露によって妨げられ、血清曝露が抗ＰＥＧ抗体結合を妨げたという我々の以前の発見と一致している。したがって、ヒト血清へのＮａｖａｃｉｍｓ曝露は、ＪｕｒＭＡアッセイにおけるそれらの効力を減少しない。
【０３０３】
実施例８−ＩＧＲＰ１３−２５／ＤＲ３  ｐＭＨＣヘテロ二量体結合中の、同族ＴＣＲを発現する設計された細胞株に結合する。
システイン補足、ジッパーレス（ｚｉｐｐｅｒｌｅｓｓ）、ノブ・イン・ホールＩＧＲＰ１３−２５  ｐＭＨＣ−ＤＲ３ヘテロ二量体のＴ細胞受容体を結合する能力をテストした。これについては、ＩＧＲＰ１３−２５  ｐＭＨＣ−ＤＲ３に特異的なヒトＴ細胞受容体からのα鎖およびβ鎖を発現するレポーター細胞株を使用した。
【０３０４】
＜ＩＧＲＰ−ＴＣＲをコードするレトロウイルスを用いたＪＵＲＭＡ−ｈＣＤ４細胞株の形質導入プロトコル＞
ＧＰ＋ＥｎｖＡＭ１２パッケージング細胞株の生成我々は、ｇａｇ／ｐｏｌおよびＶＳＶパッケージング構築物と共に、ＩＧＲＰ−ＴＣＲおよびＧＦＰレポーターを発現するレトロウイルスで２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＶＳＶシュードタイプ化された３日後に、濃縮した上清を収集し、等分し、冷凍した。これらのアリコートを使用して、スピン感染法（ｓｐｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）（２７００ｒｐｍ  １時間）によって、アンホトロピックパッケージング細胞株ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−９６４１）を形質導入した。５回のスピン感染の後、形質導入したＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２を、必要に応じて、ＧＦＰの発現のために選別した。
【０３０５】
＜ＩＧＲＰ−ＴＣＲをコードするレトロウイルスでのＪＵＲＭＡ−ｈＣＤ４細胞株の形質導入＞
３００万の形質導入および選別されたＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２を、６ウェルプレートのウェル毎に３ｍｌの最終体積で蒔いた。次の日、８ｕｇ／ｍｌのポリブレンで補充された３ｍｌの最終体積で、１００，０００のＪＵＲＭＡ−ｈＣＤ４をあらかじめ蒔かれた、形質導入されたＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２で共培養した。２または３日毎に培地を変更して、この共培養を２週間間維持した。共培養の後、ＪＵＲＭＡ−ｈＣＤ４細胞を収集し、フローサイトメトリーによって分析し、高い導入遺伝子発現のために選別した。その後、細胞をＰＥ標識ヘテロ二量体で染色した。図７Ａは陰性対照としての非染色細胞を示し、図７Ｄは無関係の四量体で染色された細胞を示し、図７Ｂはシステイン補足およびロイシンジッパー技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体で染色することを示し、図７Ｃは、ロイシンジッパーなしで、システイン補足およびノブ・イン・ホール技術を使用して発現されたヘテロ二量体から作られた四量体を示す。いずれかの技術を使用して作られたヘテロ二量体間の着色は頑強であった。これらのデータは、ジッパーレス、システイン補足ノブ・イン・ホール技術を使用して作られたヘテロ二量体がＴ細胞受容体を結合することができることを実証する。
【０３０６】
実施例９−ＩＧＲＰ１３−２５／ＤＲ３ノブ・イン・ホールｐＭＨＣヘテロ二量体は、インビトロのレポーター細胞株を刺激する。
酸化鉄ナノ粒子に結合された時、システイン捕捉、ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体のＴ細胞シグナル伝達を刺激する能力の能力を、ＮＦＡＴプロモーターの管理下で、ヒトＩＧＲＰ１３−２５ＴＣＲおよびルシフェラーゼを発現するＪｕｒＭＡ細胞を使用してテストした。図８Ａおよび図８Ｂで示されるこれらの結果は、システイン捕捉ノブ・イン・ホール安定化ヘテロ二量体が、酸化鉄ナノ粒子に結合された時、誘導するＴ細胞シグナル伝達を誘発することができることを示す。
【０３０７】
本開示は特定の実施形態およびオプション機能によって具体的に開示されたが、本明細書に開示される例示された本開示の修正、改良、および変形は、当業者に頼ることができ、ならびに、そのような修正、改良、および変形はこの開示の範囲内であると考えられると理解されなければならない。材料、方法、および本明細書で提供される例は、特定の実施形態の代表であり、例示であり、ならびに本開示の範囲に対する限定として意図されない。
【０３０８】
本開示は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示内にあるより狭い種および亜属のグルーピングの各々は、本開示の一部も形成する。これは、切り取られた材料が具体的に本明細書に詳述されるかどうかにかかわらず、属から任意の主題を取り除く条件付きまたは否定的な限定を用いる本開示の一般的な記載を含む。
【０３０９】
加えて、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から記載されている場合、当業者は本開示がマーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点からも記載されていることを認識するだろう。
【０３１０】
請求項中の用語「または（ｏｒ）」の使用は、代替物のみを指すように明確に意図されない限り、あるいは、その代替物が相互に排他的でない限り、「および／または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみあるいは「および／または」を指す定義を支持する。
【０３１１】
この明細書および請求書で使用されるように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｏｒｉｓｅｓ）」などの含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などの有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態）、あるいは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態）は、包括的であるか、または変更可能であり、ならびに追加の記載されていない要素あるいは方法の工程を除外しない。
【０３１２】
この開示、様々な公報、特許および公開された特許明細書全体にわたって、引用を識別することによって参照される。あたかも各々が参考文献によって個々に組み込まれるのと同じ程度に、公報、特許出願、特許、および本明細書で言及された他の参考文献はすべて、参照によってその全体が明確に組み込まれる。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が統制することになる。
【０３１３】
＜例示的な配列表＞
【０３１４】
【表３−１】
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【０３１５】
【表３−２】
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【０３１６】
【表４】
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【０３１７】
【表５−１】
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【０３１８】
【表５−２】
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【０３１９】
【表５−３】
2020516594.tif 000020
【０３２０】
【表５−４】
2020516594.tif 000021
【０３２１】
【表５−５】
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【０３２２】
【表５−６】
2020516594.tif 000023
【０３２３】
【表５−７】
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【０３２４】
【表５−８】
2020516594.tif 000025
【０３２５】
【表５−９】
2020516594.tif 000026
【０３２６】
【表５−１０】
2020516594.tif 000027
【０３２７】
【表５−１１】
2020516594.tif 000028
【０３２８】
【表５−１２】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020516594.tif 000031
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020516594.tif 000057
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