(57)【要約】コモサインのミニ遺伝子のクローニングと発現、と有効量のコモサインと、アナナーゼ、ブロメライナーゼ、トリプシン、ペプシン、ケルセチン、ルチン、ナリンゲニン、ゲニステイン、ヘスペレチンなどと／またはそれらの混合物などのグリコポリペプチドとバイオフラボノイドを投与した様々なタイプの癌の治療と／または予防のための方法と組成物。【選択図】１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
本発見と発明は、哺乳動物における様々なタイプの癌を治療と／または予防するための方法と組成物に関し。これは、コモザイク、ブロメライナーゼ、アナナーゼ、ペプシンのグリコ−ポリペプチド酵素複合体の有効量の投与を含む。トリプシンとケルセチン、ルチン、ナリンゲニン、ゲニステイン、ヘスペルチンなどのバイオフラボノイドと／またはそれらの混合物。
【請求項２】
請求１の方法：前記哺乳類は人間です．
【請求項３】
請求１の方法：前記コモサイン、ブロメライナーゼ、アナナーゼなどのグリコポリペプチドは、アナナコモス、ペプシンとトリプシンが動物消化管液由来である。ケルセチン、ルチン、ゲニステイン、ナリンゲニン、ヘスペレチンは、フルクタスクラテグスと柑橘系の果物に由来し、上記の複合体の混合物は、有効量の上記成分と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む医薬組成物の形で投与されます。
【請求項４】
請求１の方法：前記コモサイン、ブロメライン、アナナーゼ、ペプシン、トリプシン、ケルセチン、ルチン、ゲニステイン、ナリンゲニン、ヘスペレチン、と／またはそれらの混合物の有効量は、０．１から５００ｍｇ／ｋｇ／体重の範囲である。
【請求項５】
請求１の方法：コモサイン、ブロメライナーゼ、アナナーゼ、ペプシン、トリプシンケルセチン、ルチン、ゲニステイン、ナリンゲニン、ヘスペレチンなどの複合体、と水、低アルコール、水性アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物溶液と／またはまたは酸性溶液。
【請求項６】
請求３の方法：前記コモサイン、ブロメライナーゼ、アナナーゼ、ペプシン、トリプシンケルセチン、ルチン、ゲニステイン、ナリンゲニン、ヘスペレチンなどの複合体は細胞傷害作用（Ｔ細胞と単核細胞による）、抗転移効果、抗血小板凝集、抗炎症、と抗腫瘍形成（抗増殖と腫瘍壊死因子ＴＮＦ）と様々な種類の試験管内で及びと生体内の動物と人実験における癌細胞株と細菌（乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、肝細胞癌）に対する効果である。
【請求項７】
請求３の方法：前記抗腫瘍、抗細菌、と抗炎症効果は、Ｔ細胞と単核細胞を介しています。ＣＤ−４４、ＣＤ−４４ｓ、ＣＤ−４４ｖ、ＣＤ−４５、ＣＤ−４７の表面抗原の溶解を誘導するＴＣＲＳ／ＣＤ−２、ＴＣＲＳ／ＣＤ−３からのインターロイキンＩＩＢ、ＩＩ６、ＩＩ８、とＴＮＦαの大量カスケード生産細菌と腫瘍細胞である。そして、次のメカニズムと経路を通じて：
（Ａ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）で発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示された抗原ペプチドで最初のシグナルが生成されます。
（Ｂ）２番目の刺激シグナルは、Ｔ細胞上のＣＤ２８受容体とＡＰＣ上のリガンドのＢ−７ファミリーとのライゲーションによって生成されます。
（Ｃ）核への受容体開始シグナルの伝達に関与するシグナル伝達経路の重要な要素は主要なマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＭＡＰＫ）とＥＲＫ−１とＥＲＫ−２の細胞外シグナル制御タンパク質キナーゼを介しています。ＥＲＫは、チロシンとトレオニン残基でリン酸化されると活性化されるセリン／トレオニンキナーゼ（ＴＰＫ、チロシンリン酸化キナーゼ）です。ＭＭＡＰＫには、Ｃ−ＪＵＮ（ＮＨ）２（ＪＮＫ）である他の２つのメンバーがあり、活性化にはリン酸化も必要です。プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫＳ）の阻害剤はＴ細胞受容体（ＴＣＲＳ）の活性化とインターロイキンＩＩＢ、ＩＩ−６、ＩＩ−８、と腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の生産に関連する多くのイベントを阻害するため、シグナル伝達の上記のすべてのイベントにはチロシンのリン酸化が必要である。
【請求項８】
コモサインのミニ遺伝子の発現ベクターのアセンブリと遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の準備。ゲノムコモサイン遺伝子の直接発現のために、遺伝子全体を含む４．８キロベース（ｋｂ）のコモサインのＢｓｔＴｙ／Ｓｅ−とＢａｍＡｓ／ＧＬフラグメント。合成リンカー（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）を使用して、ＢｓｔＴｙ／Ｓｅ（チロシン−セリン１０アミノ酸）部位をＢｓｔＡｓ／ＧＬ（アスパラギン−グリシン２０アミノ酸）部位に変換した後、断片は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ミニ遺伝子を含む発現ベクターｐＤＳＶＬのユニークなＢａｍＡｓ／ＧＬ部位に挿入されました。次いで、得られたプラスミドＤＳＶＬ−ｇＰｌＣＯＳ（遺伝子植物コモサイン）を使用して、リン酸カルシウム微小沈殿法によりニュージーランド白ウサギ卵巣（ＮＷＲＯ）細胞をトランスフェクトした。形質転換体は、ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地により選択された。使用した培地は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、とグルタミンを添加したダルベッコの改良イーグル培地である。
【請求項９】
コモサインｍＲＮＡの分離：コモサインからの４．８キロベースのＢｓｔｔｙ／ｓｅ−ＢａｍＡｓ／ＧＬ制限フラグメントをシャトルベクターｐＳＶ４ＳＴに挿入した。得られたキメラプラスミドｐＳＶｇＰＬＣｏｍｏを使用して、リン酸カルシウム微小沈殿法によりＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトした。７２時間培養した後、チャーグウィンらのグアニジニウムチオシアネート手順により、切断された細胞からＲＮＡを調製した。そして、ポリ（Ａ）ｍＲＮＡは、オリゴセルロースへの結合により単離されました。（アビブとレーダー）
【請求項１０】
ｃＤＮＡクローニング。コモサインｃＤＮＡバンクは、上記のｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡを使用して、岡山とベルクの一般的な手順の修正に従って構築されました。（分子細胞生物学２，ｐｇ１６１−１７０）
【請求項１１】
ＤＮＡシーケンス：宿主として大腸菌株ＪＭ１０３と／またはＪＭ１０９を使用することにより、制限断片をＭ１３ファージベクターにクローニングした（メッシングＪｏｆ酵素学の方法１９８３）そして、それらはサンガー他．のジデオキシ法によって配列されました。一部の領域は、マクサムとギルバートによって説明されているように、キナーゼ標識または制限断片のエンドフィル標識とそれに続く化学的切断によって配列決定されました。（Ｊｏｆ酵素学の方法１９８０）
【請求項１２】
最終的なコモサイン組換え体を収集し、抽出し、エチルアルコールで洗浄し、ＡＫＡＴプライム（ＧＥ会社）と／またはＦＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、将来の使用のためのＦ４、Ｆ５（他のブロメライナーゼ）、Ｆ−９ａとＦ−９ｂ（アナナーゼとコモサイン）を生成しました。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
哺乳類の様々な種類の癌の治療と／または予防におけるコモサインのミニゲニア免疫標的療法のクローニングと発現に関する。
（表紙ページ）
仕様：総ページ数:６５
１．発明のタイトル：ページ２
２．開示の概要：ページ３
３．発明者：ページ４
４．引用文献：ページ５
５．その他の参考文献：ページ７
６．請求：ページ２３
７．発明の概要と分野：ページ２７
８．発明の背景：ページ２８
９．図面の簡潔な説明：ページ３６
１０．発明の詳細な説明：ページ５５
１１．医薬品の製剤と調製：ページ５９−６１
１２．図面：ページ７２−９０
【背景技術】
【０００２】
発明者
リャオ・ベネディクト・Ｓ（カリフォルニア州のロサンゼルス郡）、
リャオ・アレックス・Ｂ（カリフォルニア州のロサンゼルス郡）、
リャオ・オースティン・Ｌ（カリフォルニア州のロサンゼルス郡）、
リャオ・ジュディ・Ｆ（カリフォルニア州のロサンゼルス郡）、
リャオ・バートン・Ａ（カリフォルニア州のロサンゼルス郡）
対応：リャオ・ベネディクト，Ｍ．Ｄ．
名前と住所：３１０６サウス  スイート＃  １，  イースト  ガーヴィー  アベニュー  ウェスト・コビーナ市，  カリフォルニア州  ９１７９１，  米国合衆国
譲受人名前と住所：リャオ・ベネディクト，Ｍ．Ｄ．
３１０６サウス  スイート＃  １，イースト  ガーヴィー  アベニュー  ウェスト・コビーナ市，  カリフォルニア州    ９１７９１，  米国合衆国
出願番号：６２／６０２，０８０
シリアル番号：６２／６０２，０８０
シリアルコード：  
提出済み：０４／１０／２０１７
【０００３】
＜引用文献：（米国特許文書）＞
特許番号／日付／発明者
ＵＳ／２０１２／０００３２３  ２０１２年６月  リャオ・ベン＆リャオ・アレックス他
ＵＳ３００２８９１  １９６１年１０月  ハイニッケ他
ＵＳ２９５０２２７  １９６０年８月  ギビアン＆ブラットフィッシュ他
ＵＳ６８３５８０９  ２００４年１２月  リュウ他
ＵＳ３６９１０１６  １９７２年９月  パテル他
ＵＳ４２４７６４２  １９８１年１月  ヒロハラ他
ＵＳ５５８０７５５  １９９６年１２月  ソウザ他
ＵＳ５５８２８２３  １９９６年１２月  ソウザ他
ＵＳ６８３５８０９  ２００４年１２月  リュウ＆フエイゲ他
ＵＳ７３３５３８２  ２００８年２月  ヂング＆アヅリアン他
６１８０６６０  ２００１年１月  ホイットニー他
６２３８６７３  ２００１年５月  ホワルド他
２００１００４６９６３  ２００１年１１月  ウェンゼル他
６２２５３３８  ２００１年５月  ロマンジーク他
６２２１３５７  ２００１年４月  ボック他
４３４６２２７  １９８２年８月  テレハラ他
５３５４７７２  １９９４年１０月  カタワラ他
Ｗ０／２０１３／０８９８０３  ２０１３年６月  リャオ・ベン  ＆  リャオ・アレックス他
ＵＳ２４２１０６１  １９４７  ヒグビエ＆ＣＡフルーツ生産者交換
ＵＳ２４２１０６２  １９４７  プリエイ，フオン・ルオエセケ＆ＣＡフルーツ生産者交換
ＵＳ２４２１０６３  １９４７  プリエイ，フオン・ルオエセケ＆ＣＡフルーツ生産者交換
ＵＳ２４４２１１０  １９４８  バイエル＆ＣＡフルーツ生産者交換
【０００４】
＜その他の参考文献＞
１）タウッシグＳ＆バツキンＳ他：アナナスコモスの酵素複合体であるブロメライン；民族薬理学ジャーナル２２，ｐｇ１９１−２０３，（１９８８）
２）タウッシグＳ，バツキンＳ，セケルツェスＪ他：タンパク質分解と抗凝固活性を伴うまたは伴わないブロメラインの抗転移効果；癌研究臨床腫瘍学ジャーナル１１４，ｐｇ５０７−５０８（１９８８）
３）タウッシグＳ，セケルツェスＪ，バツキンＳ他：パイナップル植物（アナナス・コモス）の抽出物であるブロメラインによる試験管内で及びでの腫瘍成長の阻害；プランタ・メディカス６，ｐｇ５３８−５３９（１９８５）
４）リャオ・ベネディクト，リャオ・アレックス，リャオ・オースティン，リャオ・ジュディ，リャオ・バートン，リャオ・ジャスティン，リャオ・エドワード，リャオ・ロバート，リャオ・リリー他：哺乳類の様々な種類の癌の治療と／または予防における化学療法剤としてのブロメライナン（ブロメラインプロテイナーゼ）；ＵＳ特許ＵＳ／２０１２／０００３２３，（ｖｉａＰＣＴ，特許協力条約）＆国際特許ＷＯ／２０１３／０８９８０３５）リャオ・ベネディクト，リャオ・アレックス，リャオ・オースティン，リャオ・ジュディ，リャオ・バートン，リャオ・ジャスティン，リャオ・エドワード，リャオ・ロバート，リャオ・リリー他：ルチン、ケルセチン、ケンフェロールとビテキシン、またはそれらの混合物などのフルクツス・クラテガスに由来する有効量のバイオフラボノイド抽出物を投与することを含む、高脂血症により誘発される心血管疾患と肝疾患を治療と／または予防する方法；２００３仮特許，Ｊｕｎｅ２００４公開
６）タウッシグＳ＆バツキンＳ他：アナナスコモスの酵素複合体であるブロメライン；民族薬理学ジャーナル２２，ｐｇ１９１−２０３（１９８８）
７）タウッシグＳ，バツキンＳ，セケルツェスＪ他：タンパク質分解と抗凝固活性を伴うまたは伴わないブロメラインの抗転移効果；癌研究臨床腫瘍学１１４，ｐｇ５０７−５０８（１９８８）
８）タウッシグＳ，セケルツェスＪ，バツキンＳ他：パイナップル植物（アナナス・コモス）の抽出物であるブロメラインによる試験管内で及びでの腫瘍成長の阻害；プランタ・メディカス６，ｐｇ５３８−５３９（１９８５）
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１２）レヴィラＥ＆ライアンＪ他：サンプル調製なしの高速液体クロマトグラフィー−フォトダイオードアレイ検出による、ブドウ抽出物とワイン中の潜在的な抗酸化特性を持ついくつかのフェノール化合物の分析；染色体学ジャーナル６，８８１（１−２），ｐｇ４６１−４６９（２０００）
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２７）松本Ｇ，ニエムＭ，野崎Ｎ，シュミッツＲ，ペニンガーＪ：リンホカイン活性化キラー細胞の細胞毒性におけるＣＤ４４とＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ接着受容体間の協力；免疫学ジャーナル１６０，ｐｇ５７８１−５８９（１９９８）
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３０）ハラチＴ，エッカートＫ，シュルツ−フォルスターＫ，ナックＲ，グルノウＤ，マウラーＨ，ライナー：ステムブロメラインからの塩基性プロテイナーゼの分離と部分的特性化；タンパク質化学ジャーナル１４，ｐｇ４１−５２（１９９５）
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３２）ヴァン・デ・ウィンケルＪ＆ヴァン・オメンＲ他：タンパク質分解は、人ＩｇＧに対する単球ＩＩ型ＦｃＲの結合親和性の増加を誘導する；免疫学ジャーナル１４３，ｐｇ５７１−５７８（１９８９）
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３４）ヘイルＩ＆ヘインズＢ他：人Ｔ細胞のブロメライン処理により、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＡ、Ｅ２／Ｍ１Ｃ２、ＣＤ６、ＣＤ７とＬｅｕ８／Ｌａｍ１表面分子が除去され、ＣＤ２を介したＴ細胞の活性化が著しく向上する；免疫学ジャーナル１４９，ｐｇ３８０９−３８１６（１９９２）
３５）タウッシグＳ，バツキンＳ，セケレゼＪ：パイナップル植物（アナナス・コモス）の抽出物であるブロメラインによる試験管内での腫瘍成長の阻害；プランタ・メディカ６，ｐｇ５３８−５３９（１９８５）
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４１）グラボウスカＥ，エッカートＫ，フィチナーＩ，シュルツェ・フォルスターＫ，マウラーＨ他：ブロメラインプロテアーゼはＢ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞の成長、浸潤と肺転移を抑制する；国際腫瘍学ジャーナル１１，ｐｇ２４３−２４８（１９９７）
４２）ハラチＴ，エッカートＫ，マウラーＨ他：酸性ブロメラインプロテイナーゼの２つの形態の分離と特性評価；タンパク質化学ジャーナル１７，ｐｇ３５１−３６１（１９９８）
４３）ガービンＦ，ハラチＴ，エッカートＫ，マウラーＨ他：ブロメラインプロテイナーゼＦ９は、試験管内での様々な腫瘍細胞の人リンパ球媒介成長阻害を増強する；国際腫瘍学ジャーナル５，ｐｇ１９７−２０３（１９９４）
４４）ハラチＴ，ゲバウアーＦ，エッカートＫ，クンツェＲ，マウラーＨ他：ブロメラインプロテイナーゼは試験管内で人モルト４／８白血病とＳＫ−Ｍｅｌ２８メラノーマ細胞上のＣＤ４発現を調節する；国際腫瘍学ジャーナル５，ｐｇ４８５−４８８（１９９４）
４５）エッカートＫ，グルンベルクＥ，ガービンＦ，マウラーＨＲ他：腫瘍患者の単核細胞に対するプロサイモシンａ−１の前臨床試験；国際免疫薬理学ジャーナル１９，ｐｇ４９３−５００（１９９７）
４６）ガービンＦ，ハラチＴ，エッカートＫ，バトナーＰ，ガーベＣ，マウラーＨ他：ブロメラインタンパクＦ９は、試験管内での様々な腫瘍細胞の人リンパ球媒介成長阻害を増強する；国際腫瘍学ジャーナル５，ｐｇ１９７−２０３（１９９４）
４７）ガービンＦ，ハラチ，クラウス・エッカート，ライナー，マウラーＨ他：プロサイモシンａ−１は試験管内で黒色腫患者の単球の不十分な抗腫瘍活性を増強する；抗癌研究１４，ｐｇ２４０５−２４１２（１９９４）
４８）デッサーＬ，レーバーガーＡ，コクロンＥ，パウコビッツＷ他：ポリ酵素製剤の経口投与後の人末梢血単核細胞におけるサイトカイン合成；腫瘍学５０，ｐｇ４０３−４０７（１９９３）
４９）デッサーＬ，レーバーガーＡ，パウコビッツＷ他：タンパク質分解酵素とアミラーゼは試験管内で人末梢血単核細胞のサイトカイン産生を誘導する；癌生物療法９，ｐｇ２５３−２６３（１９９３）
５０）スカビアＧ＆ラネレッティＦ他：ケルセチンは、ＩＩ型エストロゲン結合部位を発現する多剤耐性エストロゲン受容体陰性ＭＣＦ−７人乳癌細胞株の成長を阻害する；癌化学療法と薬理学２８，ｐｇ２５５−２５８（１９９１）
５１）スカビアＧ＆ラネレッティＦ他：リンパ芽球様細胞株のＩＩ型エストロゲン結合部位とエストロゲン、抗エストロゲン、バイオフラボノイドの成長阻害効果；国際癌ジャーナル４６，ｐｇ１１１２−１１１６（１９９０）
５２）ラネレッティＦ＆リッチＲ他：ケルセチンの増殖抑制効果と人結腸癌細胞株および原発性結腸直腸腫瘍におけるＩＩ型エストロゲン結合部位の存在；国際癌ジャーナル５０，ｐｇ４８６−４９２（１９９２）
５３）ピーターソンＧ＆バーンズＳ：人乳癌細胞の増殖のゲニステイン阻害：エストロゲン受容体と多剤耐性遺伝子からの独立；生化学と生物物理学研究コミュニティ１７９，ｐｇ６６１−６６７（１９９１）
５４）バーンズＳ他：癌の試験管内と生体内モデルに対するゲニステインの効果；栄養ジャーナル１２５，ｐｇ７７７Ｓ−７８３Ｓ（１９９５）
５５）ガスリーＮ＆モファットＭ他：グレープフルーツのフラボノイドであるナリンゲニンによる人乳癌細胞の増殖の阻害；国立乳癌フォーラム；モントリオール，ｐｇ１１９（１９９３）
５６）カンダスワミＣ＆パーキンスＥ他：試験管内での人扁平上皮癌に対する柑橘類フラボノイドの抗増殖効果；癌の手紙５６，ｐｇ１４７−１５２（１９９１）
５７）マナッハＣ他：４−オキソフラボノイドのバイオアベイラビリティ、代謝、と生理学的影響；栄養研究１６，ｐｇ５１７−５４４（１９９６）
５８）ハラチ，ティボール，エッカート，クラウス他：ステムブロメラインからの塩基性プロテイナーゼの分離と部分的特性評価；タンパク質化学ジャーナル，ｖｏｌ１４，ｎｏ１，ｐｇ４１−５２（１９９５）
５９）バーマＡ，ジョンソンＪ他：７，１２−ジメチルベンザアントラセンとＮ−ニトロソメチル尿素の阻害−食事性フラボノイドケルセチンによる乳癌の誘発；癌研究４８，ｐｇ５７５４−５７５８（１９８８）
６０）カスティージョＭ＆パーキンスＥ他：頭頸部由来の扁平上皮癌に対するバイオフラボノイドケルセチンの効果，米国手術ジャーナル１５８，ｐｇ．３５１−３５５（１９８９）
６１）シンハルＲ＆イェイＹ他：クセルセチンは人乳癌細胞のシグナル伝達をダウンレギュレートする；生化学と生物物理学研究コミュニティ２０８，ｐｇ４２５−４３１（１９９５）
６２）吉岡Ｓ，イズサＫ，武田Ｙ他：水溶液中の不活性化動力学酵素医薬品；医薬品研究４，ｐｇ４８０−４８５（１９９１）
６３）ガンサートＵ，ホフマンＭ，ルディＷ，レーバーＳ他：糖タンパク質ＣＤ４４の新しい変異体はラット癌細胞に転移能を付与する；細胞６５，ｐｇ１３−２４（１９９１）
バーチＭ，ミッチェルＳ，ハートＩ：高レベルと低レベルのＣＤ４４を発現する人メラノーマ細胞バリアントの分離と特性評価；癌研究５９，ｐｇ６６６０−６６６７（１９９１）
６４）ホフマンＭ，ルディＷ，ガンサートＵ他：ラットと腫瘍細胞の転移挙動との関係：ラットはＣＤ４４プロモーター活性を誘導し、ＣＲＥＦ細胞でのＣＤ４４の転移特異的変異体の低レベル発現をもたらす；癌研究５３，ｐｇ１５１６−１５２１（１９９３）
６５）マウラーＨ，エッカートＫ，セケレゼＪ他：補完的な腫瘍治療におけるブロメライン；腫瘍学ジャーナル３１，ｐｇ６６−７３（１９８９）
６６）クリーフＲ，デロヘリーＴ，ボブビエルグＤ他：ブロメラインプロテアーゼ−５によるリンパ球上の細胞接着分子の選択的調節；病理生物学６４，ｐｇ３３９−３４６（１９９６）
６７）マウラーＨ，ホズミＭ，ホンマＹ，オカベ−カドＪ他：ブロメラインは試験管内で白血病細胞の分化を誘導する：細胞増殖抑制効果の説明；プランタ・メディカ，ｐｇ３７７−３８１（１９８８）
６８）リャオ・ベネディクト，リャオ・アレックス，リャオ・オースティン，リャオ・ジュディ，リャオ・バートン，リャオ・ジャスティン，リャオ・エドワード，リャオ・スーザン，リャオ・ジョアン，リャオ・ルートヴィヒ他：フラクタス・クラテガスに由来するバイオフラボノイドは、抗癌剤と抗脂質剤として機能する；ＵＳＰＴＯ特許出願中，２００４年６月）
６９）ズアオＪ＆ワングＪ他：ブドウの種子から単離されたポリフェノール画分の抗腫瘍促進活性と最も効果的な抗酸化成分としてプロシアニジンＢ−５−３−ガレートの同定；発癌９月ｖｏｌ２０，ｎｏ９，ｐｇ１７３７−１７４５（１９９９）
７０）リャオ・ベネディクト，リャオ・ジャスティン，リャオ・エドワード，リャオ・ルートヴィヒ，リャオ・スーザン他：乳癌と大腸癌の動物実験における抗癌剤としてアナナス・コモス由来の植物エキスを報告；内部コミュニケーション、非出版物（１９８４）
７１）フィリポバＹ他：Ｌ−ピログルタミル−Ｌ−フェニル−アラニル−Ｌ−ロイシン−Ｐ−ニトロアニリン、チオプロテイナーゼアッセイの発色基質；分析生化学１４３，ｐｇ２９３−２９７（１９８４）
７２）ロールワーゲン他：インターロイキンＩＢ、ＩＩ−６、ＩＩ−８、と腫瘍壊死因子ＴＮＦの分泌を誘導する：今日の免疫学１７，ｐｇ５４８−５５０（１９９６）
７３）レンツィーニ他：ブロメラインは抗生物質の透過性を高める；薬物研究２，ｐｇ４１０−４１２（１９７２）
７４）ティノッツィ＆ベネゴニ他：抗生物質の組織透過性におけるブロメライン；薬物実験臨床研究１，ｐｇ３９−４４（１９７８）
７５）ネッティＣ＆バンディＧ他：ブロメラインとその浮腫に対する薬理効果；薬理学教育プロジェクトｖｏｌ８，ｎｏ２７，ｐｇ４５３−４６６（１９７２）
７６）ウーリッヒ＆サイフェルト他：ブロメラインとフィブリノーゲンの血中濃度、およびその線維素溶解作用；フオルシリッテ・デ・メヂジン１５，ｐｇ５５４−５５６（１９８１）
７７）スミスＲ＆ブレナンＲ他：プラスミン活性化とブロメラインとの関係；薬理学ダイナミ国際アーカイブ１３６，ｐｇ２３０−２３６（１９６２）
７８）ピロッタ他：比較的高用量のブロメライン投与でプロトロンビンと部分トロンボプラスチン時間を延長する；薬物実験臨床研究４，ｐｇ１−２０（１９７８）
７９）ガエータ・リビオ＆デ・ガエターノ他：ブロメラインとその血小板凝集効果；薬物実験臨床研究１，ｐｇ４９−５３（１９７８）
８０）森田Ａ＆内田Ｄ他：ブロメライン治療による試験管内での血小板凝集の阻害；薬理学ダイナミ国際アーカイブ２３９，ｐｇ３４０−３５０（１９７９）
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８２）セルツァーＡ他：ブロメラインは急性炎症時の滲出液中のプロスタグランジンＥ−２とトロンボキサンＡ−２の血中濃度を低下させる；毎月のＥＥＮＴ４３，ｐｇ５４−５７（１９６４）
８３）カントレル他：ブロメラインとその細胞内シグナル伝達、すなわちＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＤＣ２／ＣＤ３シグナル伝達とインターロイキンＩＩ（ＩＬ−２）産生のミクロソーム研究）；免疫学年次レビュー１４，ｐｇ２５９−２７４（１９９６）
８４）マイノットＡ＆エンゲルダＣ他：Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）／ＣＤ３、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼ経路を介してブロメラインによって活性化されたＣＤ２．ＵＳ特許７，８３３，９６３（２０１０）
８５）マーク・Ｈ・ベエルス＆ロバート・バーロウ：高脂血症：臨床的、生化学的と薬理学的側面；診断と治療のメルクマニュアル１７，ｐｇ２００−２１２（１９９９）
８６）ロスＲ他：アテローム性動脈硬化の病因：１９９０年代の展望，自然３６２，ｐｇ８０１−８０９（１９９３）
８７）スターリーＨ＆チャンドラーＡ他：高度な型のアテローム性動脈硬化病変の定義とアテローム性動脈硬化の組織学的分類：アテローム性動脈硬化評議会の血管病変に関する委員会からの報告，米国心臓協会；サーキュレーション９２，ｐｇ１３５５−１３７４（１９９５）．
８８）ルーバート＆ストライアー：脂質の生合成；生化学教科書２３，ｐｇ５５４−５６６（１９８８）
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９１）レヴィラＥ＆ライアンＪ他：高速液体クロマトグラフィーによるブドウ抽出物およびワイン中の潜在的な抗酸化特性を持ついくつかのフェノール化合物の分析−サンプル調製なしのフォトダイオードアレイ検出；クロマトグラフィージャーナル６，８８１（１−２）；ｐｇ４６１−４６９（２０００）
９２）ラインハルトＥ，テュービンゲン，アンモンＨ，ヘンデルＭ他：サンザシの毒性と薬理学；プランタ・メディカ４３，ｐｇ１０５−１２０，ｐｇ２１０−２３９，ｐｇ３１６−３２３（１９８１）
９３）ラコトアリソンＤ他：クラエタエグス・モノジナの花からのポリフェノール抽出物の抗酸化活性；フアルマジエ５２，ｐｇ６０−６４（１９９７）
９４）バイラーＴ他：バイオフラボノイドとその抗炎症作用；植物化学２８，ｐｇ２３７３−２３７８（１９８９）
９５）カウルＴ＆ミドルトンＥ他：柑橘類フラボノイドの人ウイルスに対する抗ウイルス効果；医療ウイルス学ジャーナル１５，ｐｇ７１−７９（１９８５）
９６）サイジャＡ＆スケールセＭ他：抗酸化剤としてのフラボノイド、ケルセチン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、とルチン；遊離基生物学と医学ｖｏｌ１９，ｎｏ４，ｐｇ４８１−４８６（１９９５）
９７）フェリシアＶ＆ナジュラ・ガスリー他：フラボノイドと柑橘類ジュースによるヒト乳癌細胞増殖の抑制と乳腺腫瘍発生の遅延；栄養と癌２６，ｐｇ１６７−１８１（１９９６）
９８）ボクＳ＆チョンＴ他：コラーゲン誘発血小板凝集阻害剤としての柑橘類の皮に由来するフラボノイド；米国広げた特許６，２２１，３５７
９９）ナイールＭ＆ワングＨ他：シアニジンを使用してシクロオキシゲナーゼと炎症を抑制する方法；米国広げた特許１０，００２，４０７
１００）シャンティＳ他：ラットにおけるサンザシのチンキ剤の脂質低下活性；インド生化学と生物物理学ジャーナル３１，ｐｇ１４３−１４６（１９９４）
１０１）ラージェンドランＳ＆ディーパラクシュミＰ他：アテローム発生食を与えられたラットの肝細胞膜のＬＤＬ受容体活性に及ぼすサンザシのチンキの影響；アテローム性動脈硬化１２３，ｐｇ２３５−２４１（１９９６）
１０２）ワングＳ＆リＹ他：サンザシの濃縮水性抽出物を与えたモルモットの肝臓と腸粘膜細胞における３−ＨＭＧＣｏＡ還元酵素活性の阻害；漢方薬ジャーナル７，ｐｇ４８３−４８４（１９８７）
１０３）ズアオＪ，ワングＪ，チエンＹ，アガルワＲ：マウス皮膚の２段階開始−促進プロトコルでブドウの種子から分離されたポリフェノール画分の抗腫瘍促進活性と、最も効果的な抗酸化成分としてプロシアニジンＢ５−３’−ガレートの同定；発癌２０，ｐｇ１７３７−１７４５（１９９９）
１０４）グアンＹ，ズアオＳ他：高脂血症の治療における血中脂質錠剤；漢方薬ジャーナル１５，ｐｇ１７８−１７９（１９９５）
１０５）スカビアＧ＆ラネレッティＦ他：ケルセチンは、多剤耐性エストロゲン受容体の増殖を阻害する-負のＭＣＦ−７人乳癌細胞株は、ＩＩ型エストロゲン結合部位を発現する；癌化学療法と薬理学２８，ｐｇ２５５−２５８（１９９１）
１０６）スカビアＧ＆ラネレッティＦ他：リンパ芽球様細胞株のＩＩ型エストロゲン結合部位とエストロゲン、抗エストロゲン、とバイオフラボノイドの成長阻害効果；国際癌ジャーナル４６，ｐｇ１１１２−１１１６（１９９０）
１０７）シンハルＲ＆イェイＹ他：ケルセチンは人乳癌細胞のシグナル伝達をダウンレギュレートする；生化学と生物物理学研究コミュニティ２０８，ｐｇ４２５−４３１（１９９５）
１０８）カスティージョＭ＆パーキンスＥ他：頭頸部由来の扁平上皮癌に対するバイオフラボノイド−ケルセチンの効果；米国手術ジャーナル１５８，ｐｇ３５１−３５５（１９８９）
１０９）ラネレッティＦ＆リッチＲ他：人結腸癌細胞株と原発性結腸直腸腫瘍におけるケルセチンの増殖阻害効果とＩＩ型エストロゲン結合部位の存在；国際癌ジャーナル５０，ｐｇ４８６−４９２（１９９２）
１１０）バーマＡ＆ジョンソンＪ他：食事性フラボノイドケルセチンによる７，１２−ジメチルベンザアントラセンとＮ−ニトロソメチル尿素誘発ラット乳腺癌の抑制；癌研究４８，ｐｇ５７５４−５７５８（１９８８）
１１１）アンモンＨ＆ヘンデルＭ他：サンザシ毒物学と薬理学；プランタ・メディカ４３，ｐｇ１０５−１２０，ｐｇ２１０−２３９，ｐｇ３１６−３２３（１９８１）
１１２）シュスラーＭ＆ホルツルＪ他：モルモットの心臓におけるケルセチン、ルチン、およびビテキシンによる心臓灌流の増加；アルツナイミテルフォルシュン４５，ｐｇ８４２−８４５（１９９５）
１１３）マナッハＣ他：４−オキソ−フラボノイドの生物学的利用能、代謝、と生理学的影響；栄養研究１６，ｐｇ５１７−５４４（１９９６）
１１４）ヘルトグＭ他：食事性抗酸化フラボノイドと冠状動脈性心臓病のリスク；ランセット３４２，ｐｇ１００７−１０１１（１９９３）
１１５）ピーターソンＧ＆バーンズＳ他：人乳癌細胞の増殖のゲニステイン阻害：エストロゲン受容体と多剤耐性遺伝子からの独立；生化学と生物物理学研究コミュニティ１７９，ｐｇ６６１−６６７（１９９１）
１１６）バーンズＳ他：癌の試験管内と生体内モデルに対するゲニステインの影響；栄養ジャーナル１２５，ｐｇ７７７Ｓ−７８３Ｓ（１９９５）
１１７）ガスリーＮ＆モファットＭ他：グレープフルーツのフラボノイドであるナリンゲニンによる人乳癌細胞の増殖の阻害；国立乳癌フォーラム，ｐｇ１１９（１９９３）
１１８）試験管内での人扁平上皮癌に対する柑橘類フラボノイドの抗増殖効果：癌の手紙５６，ｐｇ１４７−１５２（１９９１）
１１９）ハルチャーＦ＆オレソンＷ他：補酵素Ａの測定によるミクロソーム３−ヒドロキシ−３−メチル−グルタリル−Ｃｏ酵素Ａレダクターゼの簡易分光測光アッセイ；脂質研究ジャーナル１４，ｐｇ６２５−６４１（１９７３）
１２０）フォグトＦ＆ナンジＡ他：実験的アルコール性肝疾患におけるラット肝細胞の核倍数性と細胞相分布の変化：抗酸化酵素遺伝子発現との関係；毒性学と応用薬理学１３６，ｐｇ８７−９３（１９９６）
１２１）キーガンＡ＆マティーニＲ他：ラットのエタノール関連肝障害：脂肪症、炎症、中心部線維症のモデル；肝臓学ジャーナル２３，ｐｇ５９１−６００（１９９５）
１２２）フレミング・トーマス：サンザシ；漢方薬のための医師デスクのリファレンス２，ｐｇ２７１−２７５（２０００）
１２３）リー・フアングＳ他；米国国立科学アカデミーの議事録８１，ｐｐ２７０８−２９１２（１９８４）
１２４）サンガーＦ，ニッケンＳ，コールソンＡ；米国国立科学アカデミーの議事録７４，ｐｇ５４６３−５４６７（１９７７）
１２５）岡山Ｈ＆ベルグＰ；分子細胞生物学２，ｐｇ１６１−１７０（１９８２）
１２６）ガッサーＣ，シモンセンＣ，シリングＪ，シュミンケＲ；米国国立科学アカデミーの議事録７９，ｐｇ６５２２−６５２６（１９８２）
１２７）ウーＳ；酵素学の方法６８，ｐｇ３８９−３９５（１９７９）
１２８）マクサムＡ＆ギルガートＷ：酵素学の方法６５，ｐｇ４９９−５６０（１９８０）
１２９）リンＦ，ライＰ，スマルイングＲ，エグリＪ，ブラウンＪ，リンＣ，ワングＦ＆ゴールドワッサーＥ；実験血液学１２，ｐｇ３５７（要約１９８４）
１３０）三宅Ｔ，クングＣ，ゴールドワッサーＥ；生物化学ジャーナル２５３，ｐｇ５５５８−５５６４（１９７７）
１３１）ラヲンＲ，フリシチＥ，パーカーＲ，ブレイクＧ＆マニアティスＴ；細胞１５，ｐｇ１１５７−１１７４（１９７８）
【発明の概要】
【０００５】
様々な種類の癌と／または腫瘍性疾患を治療と／または予防するための方法と組成物。これらには、人と哺乳類の乳癌、大腸癌、肺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮癌、と肝細胞癌が含まれます。この方法は、有効量のグリコポリペプチドとバイオフラボノイド、例えばコモサイン、ブロメライン、アナナーゼ、ペプシン、トリプシン、ケルセチン、ルチン（ケルセチン−３−ルチノシド）、ゲニステイン、ナリンゲニン、ヘスペレチン、と／またはそれらの混合物を投与することを含む。一方、コモサイン組換え体は、遺伝子改変生物によって合成されています。
【０００６】
この特許出願を以前のＵＳ／２０１２／００３２３出願（出願番号＃１３／３７４，３２８、出願日２０１１年１２月１６日）とＷＯ／２０１３／０８９８０３と結合したエンティティと組み合わせます。「哺乳動物の様々な種類の癌の治療と／または予防における化学療法剤としてのブロメライナーゼ（コモサイン）」としての以前の発明タイトル。この証明書のコピーも、参照と専門知識の検討のためにここに記載されています。
【０００７】
人赤芽球細胞の遺伝子のクローニングと発現は、１９７０年初頭にいくつかの研究所によって開始されました。１９８４年にニューヨーク大学のリー−フアング博士は、人赤芽球細胞からの赤芽球タンパク質のクローニングに成功しました（米国国立科学アカデミーの議事録８１，２７０８−２７１２）。フーケ・リン、シドニー・サグス、ユージーン・ゴールドワッサーらは、人赤芽球細胞からのエリスロプロテインのクローニングにも成功し、商品化されました  米国国立科学アカデミーの議事録  ８２；７５８０−７５８４）。本発明者らは、コモサインミニ遺伝子でのクローニングと発現を行っており、臨床使用に供しています。
【０００８】
コモサインはブロメライナーゼ成分の８０％を占める（タンパク質化学ジャーナル  １４，ｐｇ４１−５２；１７，ｐｇ３５１−３６１；２０，ｐｇ５３−６４（１９９７）。ブロメラインプロテイナーゼの他の形態には、アナナーゼ、ブロメラインＦ−９ａ（１０％）、Ｆ４、Ｆ５、Ｆ−９ｂ、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８とコモサインを含む（細胞と分子生命科学５８，ｐｇ１２３４−１２４５（２００１）。
【０００９】
コモサイン遺伝子は、２０  ｍｅｒと１０  ｍｅｒの混合オリゴヌクレオチドプローブを使用して、ゲノムフェーズライブラリから分離されています。遺伝子のコード領域全体が４．８キロベースのＱ９Ｓ８Ｍ１-ＢｌａｓｔＶからＢｌａｓｔ−Ｇフラグメントに含まれています。この遺伝子には、４つの介在配列（３０２６塩基対）と４つのエクソン（１８１６塩基対）が含まれています。計算された分子量２３，５０９〜２３，５６９の２０のアミノ酸シグナルペプチドをエンコードします。コモサイン蛋白質遺伝子は、ニュージーランドの白ウサギ卵巣細胞に導入されると、生体外と生体内で生物学的に活性なコモサインを生成します。
【００１０】
非臨床試験の癌治療における経口ブロメラインの投与は、１９６８年の早い時期にウルフＭとランスバーガーＫが報告されました。生体外と動物の研究は、ブロメラインの抗転移効果を示唆しています。１９８８年にバツキン＆タウッシグは、経口投与されたブロメラインはマウスのルイス肺癌細胞における肺転移の発生率を低下させたと報告しました。１９８８年にバツキン＆タウッシグは、抗腫瘍メカニズムがブロメラインの線維素溶解作用によるものであることを示唆しました。１９８８年にバツキン＆タウッシグは、ブロメラインに抗血小板凝集効果があることを発見しました。１９８５年にタウッシグとバツキンは、ルイス肺癌、Ｖ−８リンパ腫、ＭＣ１−１腹水、ＫＡＴＯ胃癌細胞などの腫瘍細胞の成長の抑制も発見しました。１９９４年にマウラー・ホズミは、白血病細胞のブロメリア誘発分化を発見しました。１９９２年のヘイル  ＆  ヘインズと１９９６年のカントレル  他は、ＭＭＡＰＴ（主要なマイトジェン活性化プロテインキナーゼ）とＴＰＫ（チロシンリン酸化キナーゼ）阻害剤がブロメラインによって活性化されたことを示唆しています。ＴＢＣの活性化と、ＷＢＣのＣＤ−２、ＣＤ−３表面抗原を介したインターロイキンＩＩ−Ｂ、６、８、とＴＮＦ−ａ（腫瘍壊死因子）のカスケード生産。１９９４年にガービン、ハラチ、エッカートとマウアー、と１９９２年にヘイルとヘインズは、ブロメラインが乳癌の腫瘍細胞のＣＤ−４４、ＣＤ−４４  ｖ、ＣＤ−４４ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ  ４７の表面抗原を減少させることも示唆しました。上記の実験的研究から、我々は、リンパ球とＴ細胞におけるブロメラインプロテイナーゼの活性化が試験管内でと生体内の両方で抗転移効果を有すると結論付けています。
【００１１】
最近の研究と報告によると、様々な種類の癌と腫瘍性疾患が米国の死因の第１位となっています。１９６４年のコーエン、１９７２年のレンツィーニ、１９７８年のティノッツィ以来、他のほとんどの薬物と互換性のある非毒性で低副作用の新薬の探索が進められています。ボメラインは、１８９１年にマルカノによってアナナス・コモスフルーツから最初に分離されました（医薬品速報５，ｐｇ７７，１８９１）。ハイネックとゴートナーは、１９６１年にアセトンと硫酸アンモニウムで沈殿させることにより、１９５７年にアナナスコモス植物からの新しいプロテイナーゼ製剤として、ステムブロメラインを発見しました。粗調剤のさらなる精製は、１９６０年にギビアンとブラフフィッシュによって策定され、パイナップル研究所（ＵＳ３００２８９１）とＡＧシェーリング会社（ＵＳ２９５０２２７）に特許権が付与されました。バイエルＴは、１９８９年にフラボノイドの抗炎症効果を報告しました（植物化学２８，ｐｇ２３７３−２３７８，１９８９）  。
【００１２】
フラボノイドと柑橘類ジュースによる乳腺腫瘍の発生の阻害におけるケルセチン、ルチン（ケルセチン−３−レチノシド）、ナリンゲニンとヘスペレチン、ゲニステインなどの植物と／または果物フラボノイドの利用は、人乳癌細胞の増殖と遅延の阻害の証拠を示すためにサイジャＡ、スケールセ  Ｍ他（遊離基生物学と医学ｖｏｌ１９，ｎｏ４，ｐｇ４８１−４８６，１９９５）、フェリシアＶとナジュラ・ガスリー他によって報告されています（栄養と癌ｖｏｌ２６，ｎｏ２，ｐｇ１６７−１８１，１９９）。２０００年には、レヴィラＥ、とライアンＪ他はサンプル調製なしの高速液体クロマトグラフィー−フォトダイオードアレイ検出により、ブドウ抽出物とワインに潜在的な抗酸化特性を持ついくつかのフェノール化合物を分析しました（クロマトグラフィージャーナル６，８８１，ｐｇ４６１−４６９，２０００）。また、１９９１年にカンダスワイＣとパーキンスＥは、柑橘類のフラボノイドが試験管内で人扁平上皮癌に抗増殖効果があることを報告しました（癌の手紙５６，ｐｇ１４７−１５２，１９９１）。ガスリーＮとモファットＭ他は、グレープフルーツ由来のフラボノイドであるナリンゲニンは、人の乳癌細胞株に抗増殖効果があると主張しました（国立フォーラム乳癌，ｐｇ１１９，１９９３）。
【００１３】
バイオフラボノイドは、天然に存在する化合物のグループであり、複素環式ピロン環を介して結合した２つのベンゼン環で構成される共通のフラボン核を持っています。それらは、様々な植物、野菜、果物（柑橘類やブドウなど）、食品（ソバやオートミールなど）、天然由来の染料に豊富に含まれています。バイオフラボノイドは、抗酸化、抗炎症、抗癌、抗ウイルス、抗血小板凝集など、様々な生化学的と薬理学的活性を示します（ラコトアリソンＤ他：サンザシの花からのポリフェノール抽出物の抗酸化活性；フアルマジエ５２，ｐｇ６０−６４，１９９７）、（バイラーＴ他：植物化学２８，ｐｇ２３７３−２３７８，１９８９）、（ゴダＹ他；化学と医薬品速報４０，ｐｇ２４５５−２４５７，１９９２）、（カウルＴ＆エリオット・ミドルトン他：人ウイルスに対する柑橘類フラボノイドの抗ウイルス効果；医療ウイルス学ジャーナル１５，ｐｇ７１−７９，１９８５）、（サイジャＡ＆スケールセＭ他：抗酸化剤としての４つのフラボノイド、ケルセチン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、とルチン；遊離基生物学と医学ｖｏｌ１９，ｎｏ４，ｐｇ４８１−４８６，１９９５）、（フェリシアＶ＆ナジュラ・ガスリー他：フラボノイドと柑橘類ジュースによる人乳房癌細胞増殖の阻害と乳腺腫瘍形成の遅延；栄養と癌ｖｏｌ２６，ｎｏ２，ｐｇ１６７−１８１，１９９６）、（ボクＳ＆チョンＴ他：コラーゲン誘発血小板凝集阻害剤としての柑橘類の皮に由来するフラボノイド；米国公開特許６，２２１，３５７）、（ナイアＭ＆ワングＨ他：シアニジンを使用してシクロオキシゲナーゼと炎症を抑制する方法；米国公開特許１０，００２，４０７）。
【００１４】
ケルセチン（３、５、７、３’、４’ペンタヒドロキシフラボン）は、乳癌、大腸癌細胞、リンパ芽球様細胞株、扁平上皮癌細胞株に対する抗癌作用、と単純ヘルペスＩ型、ポリオウイルスＩ型、パラインフルエンザ３型、呼吸器合胞体ウイルスに対する抗ウィルス活性も持っています（スカビアＧ＆ラネレッティＦ他：癌化学療法；薬理学２８，ｐｇ２５５−２５８，１９９１）、（シンハルＲ＆イェイＹ他；生化学と生物物理学研究コミュニティ２０８，ｐｇ４２５−４５８，１９９５）、（ラネレッティＦ＆リッチＲ他；国際癌ジャーナル５０，ｐｇ４８６−４９２，１９９２）、（スカビアＧ＆ラネレッティＦ他；国際癌ジャーナル４６，ｐｇ１１１２−１１１６，１９９０）、（カスティージョＭ＆パーキンスＥ他；米国手術ジャーナル１５８，ｐｇ３５１−３５５，１９８９）、（バーマＡ＆ジョンソンＪ他；癌研究４８，ｐｇ５７５４−５７５８，１９８８）、（カウルＴ＆ミドルトンＥ他；医療ウイルス学ジャーナル１５，ｐｇ７１−７９，１９８５）、（日本公開特許４−２３４３２０）。
【００１５】
糖化ケルセチンであるルチン（ケルシチン−３−ルチノシド）は微生物によって分解され、腸に吸収されます。ビテキシン（アピゲニン、オリエントシド、またはフラボン、８−Ｄ−グルコシル−４’、５、７−トリヒドロキシ−）、とケンフェロール（３，５，７，４’テトラヒドロキシフラボン）にも降圧薬が含まれていますプロパティと冠動脈と心臓灌流を増加させます（アンモンＨ，ヘンデルＭ他：サンザシの毒性と薬理学；プランタ・メディカ４３，ｐｇ１０５−１２０，ｐｇ２１０−２３９，ｐｇ３１６−３２３，１９８１）、（シュスラーＭ＆ホルツルＪ他：モルモットの心臓におけるケルセチン、ルチン、とビテキシンによる心臓灌流の増加；アルツナイミテルフォルシュン４５，ｐｇ８４２−８４５，１９９５）、（マナッハＣ他：４−オキソ−フラボノイドの生物学的利用能、代謝、と生理学的影響；栄養研究１６，ｐｇ５１７−５４４，１９９６）。さらに、ヘルトグ他。食品中のルチンとケルセチンの高摂取は、高齢患者の冠状動脈性心臓病関連死亡率を低下させる可能性があると報告された（ヘルトグＭ他：食事性抗酸化フラボノイドと冠状動脈性心臓病のリスク；ランセット３４２，ｐｇ１００７−１０１１（１９９３）。
【００１６】
本発明者らは、サンザシの実に由来するバイオフラボノイド、また、ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、ビテキシン、ヘスペレチン、ナリンゲニン、ゲニステニンなどの柑橘類は、様々な種類の癌の治療と／または予防に効果的です。
【００１７】
ラコトアリソンＤ他の研究は、サンザシモノギナの花からのポリフェノール抽出物の抗酸化活性を示しました（フアルマジエ５２，ｐｇ６０−６４，１９９７）。カウルＴとエリオットミドルトン他も、人のウイルスに対する柑橘類のフラボノイドの抗ウイルス効果を報告しました（医療ウイルス学ジャーナル１５，ｐｇ７１−７９，１９８５）。パンツバイオフラボノイドは、抗酸化剤、抗炎症剤、抗癌剤、抗ウイルス剤、と抗血小板凝集を含む様々な生化学的と薬理学的活性を示すことも報告されています。
【００１８】
ナイアＭとワングＨ他は、シアン化を使用してシクロオキシゲナーゼと炎症を抑制する方法を報告しました（米国特許１０，００２，４０７）。ラネレッティＦとリッチＲ他は、ケルセチンの増殖抑制効果と人結腸癌細胞株と原発性結腸直腸腫瘍におけるＩＩ型エストロゲン結合部位の存在を報告しました（国際癌ジャーナル５０，ｐｇ４８６−４９２，１９９２）。スカビアＧとラネレッティＦ他は、ケルセチンが複数薬物耐性エストロゲン受容体（タイプＩＩエストロゲン結合部位を発現する負のＭＣＦ−７人乳癌細胞株）の増殖を阻害することを報告しました（癌化学療法；薬理学２８，ｐｇ２５５−２５８，１９９１）また、リンパ芽球細胞株のタイプＩＩエストロゲン結合部位とエストロゲン、抗エストロゲン、バイオフラボノイドの成長阻害効果についても報告されています（国際癌ジャーナル４６，ｐｇ１１１２−１１１６，１９９０）。カスティージョＭとパーキンスＥ他は、頭頸部起源の扁平上皮癌に対するバイオフラボノイド−ケルセチンの効果も報告しました（米国手術ジャーナル１５８，ｐｇ３５１−３５５，１９８９）。ズアオＪとワングＪ他は、ブドウの種から単離されたポリフェノール画分の抗腫瘍促進活性を示し、最も効果的な抗酸化成分としてプロシアニジンＢ５−３’−没食子酸塩の同定を示す研究を発表しました（発癌２０，ｐｇ１７３７−１７４５，１９９９）。
【００１９】
１９９５年にハラチＴ、エッカートＫ、シュルツ−フォルスターＫ、マウラーＨ、とライナー他は、ステムブロメラインからの塩基性プロテイナーゼの分離と部分的特性を報告しました（タンパク質化学ジャーナル１４，ｐｇ４１−５２，１９９５）。再び１９９７年に、彼らは酸性ブロメラインステムプロテイナーゼの２つの形態の分離と特性化を報告した（タンパク質化学ジャーナル２０，ｐｇ５３−６４，１９９７）。
【００２０】
１９８５年にタウッシグとバツキン他は、アナナスコモスの酵素複合体が試験管内で腫瘍成長の抑制をもたらすことを示唆しました（プランタ・メディカ６，ｐｇ５３８−５３９，１９８５）。そして彼らはその臨床応用を概説した（民族薬理学ジャーナル２２，ｐｇ１９１−２０３，１９８８）。同じ酵素複合体はまた、血小板抗凝集、と線溶活性を生成します（ハイネッケと横山１９５７、ハイネッケ１９７２、マルツ１９８２）。１９７９年にクラウエ、アーメン、ローマ他は、３度熱傷患者の化学的創面切除剤としてのブロメラインの使用を報告しました（欧州外科研究１９７９，ｐｇ３５５−３５９）。１９８８年に同じチームは、ブロメラインがそのタンパク質分解と抗凝固活性の有無にかかわらず、抗転移効果があることも発見しました（癌研究臨床腫瘍学ジャーナル１１４，ｐｇ５０７−５０８，１９８８）。
【００２１】
本発明者らはまた、アナナス・コモスの果実と茎に由来するブロメラインタンパク質の抽出物であるＧｌｃｏポリペプチドを発見した。（コモサイン、ブロメライン、アナナーゼ、炎症、エクストラナーゼ、トラウマナーゼ）は、様々な種類のがんや、乳がん、大腸がん、肺がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がんなどの腫瘍性疾患の治療と／または予防に有効です。該方法は、有効量のコモサイン、ブロメライン、アナナーゼ、ペプシン、トリプシン、ナリンゲニン、ヘスペレチン、ゲニスチンと／またはそれらの混合物を投与することを含む。以下の属性による：
（ａ）抗炎症特性
（ｂ）抗血小板凝集（１９９８年にマイノット他は、腫瘍表面抗原を変化させ、腫瘍細胞が正常組織を攻撃するのを防ぐことを示唆した。）
（ｃ）線溶特性
（ｄ）抗腫瘍の発生、この作用はおそらくＷＢＣのＴ細胞における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の放出によるものでした。１９８５年のタウッシグ他、１９８８年のタウッシグとバツキン他は両方とも、ブロメラインとコモサイン抽出物が腫瘍増殖、Ｔ細胞、ブロメラインの影響を受けた末梢血単核リンパ球（ＰＢＭＮ）の抑制に使用でき、ＴＣＲＳ／ＣＤ２、ＴＣＲＳ／ＣＤ３、インターロイキンＩＩＢ、ＩＩ−６、ＩＩ−８、とＴＮＦａは、ＣＤ４４、ＣＤ４４−ｖ、ＣＤ４４−ｓ、ＣＤ４５、ＣＤ４７の腫瘍表面抗原を攻撃します。これらのアクションメカニズムは、２つの主要な経路を介しています。
（ｄ−１）主要マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＭＡＰ）阻害剤
（ｄ−２）抗原提示細胞（ＡＰＣ）に発現した主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）が提示するブロメライン（抗原提示ポリペプチドＡＰＰ）の関与（カントレル１９９６）
（ｄ−３）チロシンリン酸化キナーゼ阻害剤
（ｅ）癌細胞株、動物、と人の実験における試験管内でと生体内の両方の抗脱分化。
【００２２】
本発明と発見は、哺乳動物における様々なタイプの癌と腫瘍性障害を治療と／または予防するための方法と組成物に関し、有効量のグリコポリペプチド（例えば、コモサイン、ブロメライナーゼ、アナナーゼ、ペプシン、トリプシン）の投与を含む。とケルセチンなどのバイオフラボノイド。ルチン（ケルセチン−３−ルチノシド）、ヘスペレチン、ゲニステイン、ナリンゲニンと／またはそれらの混合物。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】本願発明に係る説明図。
【図１Ｂ】本願発明に係る説明図。
【図１Ｃ】本願発明に係る説明図。
【図１Ｄ】本願発明に係る説明図。
【図１Ｅ】本願発明に係る説明図。
【図２】本願発明に係る説明図。
【図３Ａ】本願発明に係る説明図。
【図３Ｂ】本願発明に係る説明図。
【図４】本願発明に係る説明図。
【図５Ａ】本願発明に係る説明図。
【図５Ｂ】本願発明に係る説明図。
【図５Ｃ】本願発明に係る説明図。
【図６】本願発明に係る説明図。
【図７】本願発明に係る説明図。
【図８】本願発明に係る説明図。
【図９】本願発明に係る説明図。
【図１０】本願発明に係る説明図。
【図１１】本願発明に係る説明図。
【図１２】本願発明に係る説明図。
【図１３】本願発明に係る説明図。
【図１４】本願発明に係る説明図。
【図１５】本願発明に係る説明図。
【図１６】本願発明に係る説明図。
【図１７】本願発明に係る説明図。
【図１８】本願発明に係る説明図。
【図１９】本願発明に係る説明図。
【図２０】本願発明に係る説明図。
【図２１】本願発明に係る説明図。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の目的は、以下の説明と図面を参照することによりますます明らかになるであろう。コモサイン遺伝子の発現ベクターのアセンブリと遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）の調製
【００２５】
オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ合成が使用され、ホスホルアミダイト法がオリゴヌクレオチド合成に使用された。各プローブ混合物には、２０個のオリゴヌクレオチド配列のプールが含まれていました：  
プローブ混合物：バリン−プロリン−グルタミン−セリン−イソロイシンと同等のＣｏＭ−Ｖ配列、アスパラギン酸−トリプトファン−アルギニン−アスパラギン−チロシン−グリシン−アラニン−バリン−スレオニン−セリン−バリン−リジン−アスパラギン−グルタミン−グリシン。
プローブ混合物：
ＣｏＭ−Ｖ＝
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｓｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
３’ＣＡＡ，ＧＧＡ，ＧＴＴ，------------------------------------------------------------------，ＴＴＧ，ＧＴＴ，ＴＴ５’
Ｖ    Ｄ    Ｇ    Ｖ
Ｐ    Ｗ    Ａ    Ｋ
Ｑ    Ｒ    Ｖ    Ｎ
Ｓ    Ｎ    Ｔ    Ｑ
Ｉ    Ｙ    Ｓ    Ｇ
Ｖ＝バリン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｓ＝セリン、Ｉ＝イソロイシン。Ｄ＝アスパラギン酸、Ｗ＝トリプトファン、Ｒ＝アルギニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｙ＝チロシン。Ｇ＝グリシン、Ａ＝アラニン、Ｖ＝バリン、Ｔ＝トレオニン、Ｓ＝セリン。Ｖ＝バリン、Ｋ＝リジン、Ｎ＝アスパラギン、Ｑ＝グルタミン、Ｇ＝グリシン。プローブ混合物は、５’末端で［ｒ３２ｐ］ＡＴＰ、７５００−８０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ＩＣＮ）でラベル付けされました。
（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用。
【００２６】
ハイブリダイゼーション手順：ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓフィルターとＮＺＹＡＭプレートを除き、ウーの手順に従ってファージプラークを増幅しました（ＮＡＣＬ、５ｇ；ＭｇＣｌ２−６Ｈ２０、２ｇ；ＮＺ−アミンＡ、１０ｇ；酵母エキス、５ｇ；カザミノ酸、２ｇ；マルトース、２ｇ；寒天、１５ｇ（１リットルあたり）を使用）。ファージ粒子が破壊され、ＤＮＡがフィルターに固定された（８．４ｘ８．４ｃｍフィルターあたり５０，０００プラーク）。空気乾燥したフィルターを８００℃で１時間焼いた後、プロテイナーゼＫ消化にかけた（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、と０．２％ＮａＤｏｄＳｏ４を含む緩衝液１ｍｌあたり５０ｕｇのプロテイナーゼｋ、５５℃で３０分間）。１ＭＮａＣｌ／１％ＮａＤｏｄＳｏ４溶液を使用したプレハイブリダイゼーションを、５５℃で４時間以上実行しました。
ハイブリッド形成緩衝液は、０．９ＭＮａＣｌ／５ｍＭＥＤＴＡ／５０ｍＭ溶液リン酸塩、ＰＨ６．５／０．５％ＮａＤｏｄＳｏ４当たり１００ｕｇの酵母ｔＲＮＡの２０個のプローブ配列のそれぞれの０，０２５ｐｍｏｌ／ｍｌを含んでいた。ハイブリダイゼーションは、ＣｏｍＶプローブ混合物を使用して、４８℃で２０時間実施しました。つまり、混合物のメンバーの最低計算解離温度（ｔｄ）より２℃低い温度です。ハイブリダイゼーションの完了時に、フィルターを室温でハイブリダイゼーションと洗浄ごとに１０分間、０．９ＭＮａＣｌ／９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０／０．１％ＮａＤｏｄＳｏ４で３回洗浄した。
【００２７】
ゲノムコモサイン遺伝子の直接発現には、遺伝子全体を含む４．８キロベース（ｋｂ）のコモサインのＢｓｔＴｙ／Ｓｅ−とＢａｍＡｓ／ＧＬフラグメント。合成リンカー（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）でＢｓｔＴｙ／Ｓｅ（チロシン−セリン１０アミノ酸）部位をＢｓｔＡｓ／ＧＬ（アスパラギン−グリシン２０アミノ酸）部位に変換した後、フラグメントをユニークなＢａｍＡｓ／ＧＬに挿入しましたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ミニ遺伝子を含む発現ベクターｐＤＳＶＬの部位。次いで、得られたプラスミドＤＳＶＬ−ｇＰｌＣＯＳ（遺伝子植物コモサイン）を使用して、リン酸カルシウム微小沈殿法によりニュージーランド白ウサギ卵巣（ＮＷＲＯ）細胞をトランスフェクトした。形質転換体は、ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地により選択された。使用した培地は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、とグルタミンを添加したダルベッコの改良イーグル培地でした。
【００２８】
コモサインｍＲＮＡの分離：コモサインからの４．８キロベースのＢｓｔｔｙ／ｓｅ−ＢａｍＡｓ／ＧＬ制限断片をシャトルベクターｐＳＶ４ＳＴに挿入した。得られたキメラプラスミドｐＳＶｇＰＬＣｏｍｏを使用して、リン酸カルシウム共沈法によりＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトした。７２時間培養した後、チャーグウィン他のグアニジニウムチオシアネート手順により、切断された細胞からＲＮＡを調製し、オリゴセルロースに結合してｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを単離しました（アビブとレーダー）。
【００２９】
ｃＤＮＡクローニング：上記のｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、岡山とベルグの一般的な手順を変更して、コモサインｃＤＮＡバンクを構築しました（分子細胞生物学２，１６１−１７０，１９８２）。
【００３０】
ＤＮＡシーケンス：制限酵素断片は、大腸菌株ＪＭ１０３と／またはＪＭ１０９を宿主として使用してＭ１３ファージベクターにクローニングされ、サンガー他のジデオキシ法により配列決定されました（メッシング；酵素学の方法１９８３）。いくつかの領域は、マクサムとギルバートによって説明されているように、キナーゼ標識または制限断片のエンドフィル標識とそれに続く化学的切断によって配列決定されました（１９８０）。
【００３１】
最終的なコモサイン組換えを収集し、抽出し、エチルアルコールで洗浄し、ＡＫＡＴプライム（ＧＥ会社）と／またはＦＰＬＣ陽イオン交換クロマトグラフィーで精製して、Ｆ４、Ｆ５、とＦ−９ａ、Ｆ９ｂ（コモサインとアナナーゼ）将来使用するため。
【００３２】
表Ｉ、これらの特徴づけられた癌細胞の阻害に使用できるブロメライン（コモサイン）の概要。
【００３３】
本発明と発見では、乳房、肺、結腸、子宮頸部、卵巣、と子宮癌などを含む６種類の癌細胞株が使用された。私たちの癌細胞株のほとんどは、手術中に手術標本から直接採取され、例−２の細胞培養で詳細に準備され、説明されました。
【００３４】
材料と方法：ナリンゲニン、ヘスペレチン、ゲニステイン、トリプシン、ペプシン、とブロメライン（コモサイン）プロテイナーゼ分子は、ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ会社から購入しました。（細胞培養用，カタログ＃４８８２以上），完全な成長培地（カタログ＃Ｍ４６５５）、Ｔｗｅｅｎ−２０とＴｗｅｅｎ−８０溶液（カタログ＃Ｐ２２８７、＃Ｐ８１９２）、ペニシリン−ストレプトマイシン−ネオマイシン安定化溶液（カタログ＃Ｐ４０８３）、ウシ胎児血清（カタログ＃４７６２）。細胞培養器具は、ＮＪ州フランクリンレイクスのベクトン・ディキンソン会社からのものでした（カタログ＃３５３５０３）、液体カウントビーズ付きＢ−ＤＴＭ細胞生存率キット（カタログ＃３４９４８６）、Ｂ−ＤＦＡＣＳＡｒｒａｙｔｍバイオアナライザー（カタログ＃３４０１２８）。病理学的と顕微鏡画像は、アメスコープ三眼顕微鏡（米国光学会社、モデル番号Ｔ−４９０Ｂ−１０Ｍ）で撮影しました。
【００３５】
完全な成長培地（ＣＧＭ）：１０％熱不活性化ウシ胎児血清、２％Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ｉｕ／ｍｌ）を添加したダルベッコの修正必須培地（ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ会社）、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）、とネオマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）（ミズーリ州セントルイスのシグマアルドリッチ会社）．細胞は、空気湿度９０％、空気９０％、ＣＯ２１０％で３７°Ｃの標準的な組織培養インキュベーターで維持されました。すべての癌細胞株は、５Ｘ（１０）６細胞を７５ｃｍｓｑ組織培養フラスコに播種することにより開始され、ベースはＣＧＭ中の０．７５％寒天でコーティングされました。癌細胞株は、５〜７日間の培養で使用されました。
【００３６】
図−ＩＡ、様々な種類の腫瘍細胞株の増殖阻害試験管内で。Ｘ軸のｍｇ／ｍｌ単位の培地中のブロメライン、Ｙ軸の細胞増殖ＶＳコントロールのパーセント。６つのすべての癌株（乳房、結腸、肺、卵巣、子宮頸部、と子宮の癌）のブロメライン濃度の増加に伴う腫瘍細胞の成長の阻害。すべてのグループの細胞を、空気中１０％ＣＯ２で３７℃で７２時間インキュベートし、コールターカウンターでカウントした。グラフは、６つの腫瘍細胞培養物を含む６つの個別の実験／各実験の各腫瘍系統を表します。
【００３７】
図-ＩＢ、ＴＣＲＳ／ＣＤ２のインターロイキンＩＢ、ＩＩ６、ＩＩ８、ＴＮＦ−α、Ｔ細胞のＴＣＲＳ／ＣＤ３、と単核細胞の表面抗原産生の分析方法。５ｘ（１０）６のＷＢＣ細胞株培養液。インターロイキンＩＩＢを製造するためのブロメライン（コモサイン）の１ｍｇ／ｍｌ濃度では、１３，０００ｐｇｍ／ｍｌ／（１０６）ＷＢＣ（４００倍増加）、インターロイキンＩＩ６は２６，０００ｐｇｍ／ｍｌ／（１０）６ＷＢＣ（増加）６５０倍）、ＴＮＦ−αは１５００ｐｇｍ／ｍｌ／（１０）６ＷＢＣ（４２倍増加）でした。
【００３８】
図−Ｉ−Ｃ、ＣＤ４４−ｓ、ＣＤ４４−ｖの表面抗原、２つの異なるｍＡｂｓクローン、Ｌ−１７８、Ｉ−１７３による変調を示しています。乳がん細胞を、１０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌのブロメライン（コモサイン）処理とともに３７℃で１時間インキュベートした（放射免疫単クローン抗体検査の使用）。ＣＤ４４は、ブロメライン処理細胞の３５％、１０％、０％になります。ＣＤ４４ｖは、ブロメライン処理細胞の３３％、１１％、０％になります。
【００３９】
図ＩＤ、ペプシンとトリプシンによる試験管内での肺癌の腫瘍細胞増殖の阻害。これらの２つのグループの細胞を、空気中１０％ＣＯ２で３７℃で７２時間インキュベートし、コールターカウンターでカウントした。グラフは、ペプシンとトリプシンを使用した２つの実験を表しています。
【００４０】
図ＩＥ、試験管内でのクセルセチンとナリンゲニンによる乳癌細胞株の増殖阻害。
【００４１】
ルチン（Ｃ２７．Ｈ３０．Ｏ１６、分子量６１０．５２、グリコシル化ケルセチン、またはケルセチン−３−ルチノシド）；ケルセチン（Ｃ１５、Ｈ１０、Ｏ７、分子量３０２．２４、または３、５、７、３’、４’のペンタヒドロキシフラボン）；ケンフェロール（Ｃ１５Ｈ１０．Ｏ６、分子量２８６．２４、またはケルセチン−３−ラムノシド）；ビテキシン（アピゲニン）（Ｃ２１．Ｈ２０．Ｏ１０、分子量４３２．３８、または８−Ｄ−グルコシル−４’、５、７トリヒドロキシフラボン）（メルクインデックス２００１年第１３版）柑橘類、サンザシの実など、様々な植物、野菜、果物から抽出することができ、セカ、ポルシェ、モナッシュ（６９，２８４，１９３６）、ベルリンのゼンプレンとボグナー（１０４３，１９４３）、ＥＩＮＥＣＳ（２２２−９６３−８，欧州共同体ジャーナル，１９９０年６月）に記載されている従来のプロセスに従って合成することもできます。
【００４２】
例えば、ルチンは、サンザシの果実、花、葉、茎、と根に０．２〜５ｗｔ％の範囲の量で含まれる場合があります（ＰＤＲ漢方薬，２０００年第２版）。ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンは、高温高圧下で水またはエタノールアルコールなどの適切な溶媒を使用して、サンザシの実から抽出できます。もう１つの方法は、１／２ＮのＣａ（ＯＨ）ｓｕｂ２またはＮａＯＨの水溶液を使用し、中和後に粗抽出物と沈殿物を収集する方法です。さらに、サンザシの実、葉、茎、花、根の乾燥粉末も使用できます。一般に、果実中のルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンの含有量は、それぞれ５％、３％、２％、と０．５％です。
【００４３】
ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンは阻害性を有するだけでなく、高脂血症、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、脳卒中（脳血管障害）、狭心症などの血漿脂質レベル関連疾患、脂肪肝や脂肪変性などの肝疾患の治療効果も発揮します。さらに、ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンは、１５００ｍｇ／ｋｇ、１２５０ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇの用量でマウスに経口投与された場合、毒性と造血系、腎臓、肝臓系への悪影響を示さない／ｋｇで、体重５０ｋｇの人のサンザシの実抽出物５０〜１５０ｇｍの経口投与量に相当します。
【００４４】
本発明はまた、有効成分としてのサンザシの実抽出物と薬学的に許容される賦形剤、担体または希釈剤を含む、動脈内皮壁への脂肪線の形成を阻害するための医薬組成物を提供する。
【００４５】
本発明のサンザシ果実抽出物は、水または低級アルコール（エタノール）などの適切な溶媒とＣａ（ＯＨ）などのアルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物水溶液を使用することにより、従来の方法に従って調製することができる。またはＮａＯＨ溶液。例えば、１〜１０リットルの溶媒０．５〜１Ｎを１ｋｇの乾燥サンザシの実に加え、混合物を１〜１０時間２５〜７０℃の温度に保ちます。得られた抽出物をろ過し、濃縮して、濃縮サンザシの実抽出物を形成する。例えば、水性アルカリまたはアルカリ土類金属水酸化物溶液が使用される場合、濾液は、それに酸を加えることにより４．０から７．０の範囲のＰＨに調整される。得られた溶液を、５〜３０時間の範囲の期間、５〜２０℃の範囲の温度に保つ。次に沈殿物を乾燥させて、サンザシの実の抽出物を得る。一方、エタノールを溶媒として使用する場合、１〜１０リットルの３０％〜１００％の溶媒を１ｋｇの乾燥サンザシの実に加え、混合物を１〜１０時間の範囲の期間２５〜７０度の温度に保ちます。次いで、得られた混合物を濾過し、濃縮して、サンザシのベリー抽出物を得る。
【００４６】
サンザシの実抽出物の代わりに、サンザシの実の粉末を本発明で使用してもよい。サンザシの実の粉末は、従来の方法に従ってサンザシの実から固体材料を凍結乾燥または乾燥させ、それを５０から２５０μｍの範囲の粒子サイズに粉末化することにより調製することができる。
【００４７】
医薬製剤は、従来の方法と手順のいずれかに従って調製することができる。製剤の調製において、活性成分は、好ましくは担体と混合もしくは希釈されるか、カプセル、サシェ、または他の容器の形態であり得る担体内に封入される。担体が希釈剤として機能する場合、それは、活性成分のためのビヒクル、賦形剤または媒体として作用する固体、半固体、または液体材料であり得る。したがって、製剤は、錠剤、丸薬、粉末、サシェ、エリキシル、懸濁液、乳液、溶液、シロップ、エアロゾル、軟と硬ゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌包装粉末などの形態であってもよい。
【００４８】
適切な担体、賦形剤、と希釈剤の医薬品の例は、乳糖、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルカム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油。製剤は、充填剤、抗凝集剤、香味剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、防腐剤などをさらに含んでもよい。本発明の医薬組成物は、当技術分野で周知の手順と／または方法のいずれかを使用することにより、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供するように製剤化できる。
【００４９】
本発明の医薬組成物は、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．１ｔｏ５０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量の活性成分を含む。経口、経皮、皮下、筋肉内、静脈内、吸入、腹腔内、経粘膜などの様々な経路で投与できます。人におけるバイオフラボノイドの典型的な１日用量は０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは１．０〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、単回投与または分割投与で投与されてもよい。投与される活性成分の実際の量と正確な量は、患者の年齢、性別、体重、病気、病気の重症度、と投与経路によって異なる場合があります。
【００５０】
さらに、血漿脂質関連疾患の上昇を予防と／または治療する目的で、ケルセチン、ルチン、ケムフェロールとビテキシンを食品と／または飲料に組み込むことができる（例えば、高脂血症、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、脳血管障害、狭心症と肝疾患）。食品と飲料には、食品、肉、野菜ジュース、フルーツジュース、スナック、製菓（チョコレートとピザ）、ガム、乳製品、スープ、スープ、ペースト、ソース（ケチャップなど）、茶、アルコール飲料、炭酸飲料が含まれます飲料、ビタミン複合体、様々な健康食品。
【００５１】
食物または飲料中のルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシン、またはそれらの混合物の含有量は、０．１〜１０重量％の範囲であり得る。したがって、飲料１０００ｍｌあたり１〜１００ｇｍのルチン、ケルセチン、ケムフェロール、ビテキシンまたはそれらの混合物で構成されています。例１ホーホーンベリー抽出物の調製と分析。
【００５２】
サンザシの実（米国ユタ州オグデン）を室温で乾燥させ、１００〜２００μｍの範囲の粒子サイズに粉末化した。そして、５０ｍｌの８０％エタノールを１０ｇｍのサンザシの実の粉末に加え、６０℃の水浴で６時間抽出した。得られた抽出物を濾過し、冷却した後、エタノールを濾液に５０ｍｌの体積まで加えた。
【００５３】
３．０μｌの量の上記抽出物を、プロスターＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計リクロソーブＲＰ−８カラム（５μｍ、４回、２５０ｍｍ）を使用して高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にかけ、０．１Ｍホウ酸ナトリウム二二硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で事前に較正し、３０℃の温度に維持しました。抽出物を、０．５ｍｌ／分の流速で０．１Ｍのホウ酸塩ＳＤＳで溶出した。標準溶液は、ルチン、ケルセチン、ケンフェロール（米国ミズーリ州セントルイスのアルドリッチシグマケミカルカンパニー）とビテキシン（米国ＮＪ州サマービルのインドファインケミカルカンパニー）を０．１Ｍホウ酸塩ＳＤＳに最終濃度０．１で溶解することにより調製しました。それぞれ０．２、０．３、０．４、と０．５ｍｇ／ｍｌで、上記と同じ条件でＨＰＬＣにかけます。溶出液は、ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計で２５４ｎｍ（ルチン）、２５７ｎｍ（ケルセチン）、２６６ｎｍ（ケムフェロール）、２７０ｎｍ（ビテキシン）で検出され、ルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシンの含有量は、サンザシの実抽出物と標準溶液のＨＰＬＣプロファイル。サンザシの果実抽出物中のルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシンの含有量（％）を表１に示します。
１．ＴＡＢＬＥ１−サンザシの果実エキスの含有量ルチン５．２％、ケルセチン３．１％、ケムフェロール２．３％、とビテキシン０．５％。例２ホートンベリーエキスの調製
【００５４】
（Ａ）エタノールの使用方法
【００５５】
サンザシの実を室温で乾燥させ、８０％エタノール３００ｍｌを１００ｇの乾燥実に加えた。ベリーは６０℃で６時間抽出されました。得られた抽出物をチーズクロスで濾過し、濾液を真空下で濃縮して、５７ｇｍのシロップ抽出物を得た。ルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシンの含有量を、ルチン２．９０ｇｍ、ケルセチン１．８２ｇｍ、ケムフェロール１．３１ｇｍ、とビテキシン０．２８５ｇｍを含む実施例１の方法に従って調べた。
【００５６】
サンザシの実の抽出物の組成はＨＰＬＣにより確認され、結果は表ＩＩに示されている。
２．ＴＡＢＬＥＩＩ−成分含有量（％）、水分６７％、フルクトース４％、グルコース３％、スクロース２．９％、ルチン５．１％、ケルセチン３．２％、ケムフェロール２．３％、ビテキシン０．５％、その他１２．１％。
【００５７】
（Ｂ）ＮａＯＨを使用する方法
【００５８】
乾燥したサンザシの実（米国ユタ州オグデン）を１００ｇの量でＮａＯＨ溶液１／２Ｎ５００ｍｌに加え、撹拌しながら３時間室温に保った。得られた抽出物は、チーズクロスで濾過することにより得られ、その後、１ＮＨＣｌ溶液を濾液に加えてそのＰＨを４．５に調整した。上記と同じ手順を繰り返して、濾液を得て、そのＰＨを６．５に調整した。得られた濾液を６℃で１２時間保持し、次いで沈殿物を収集し、乾燥させて、それぞれ８．８グラムと９．８グラムの粉末を得た。組成は、サンザシのベリー抽出物がルチン（４．０８ｇｍ、４．５５ｇｍ）、ケルセチン（２．５６ｇｍ、２．８５ｇｍ）、ケムフェロール（１．８４ｇｍ、２．０５ｇｍ）、ビテキシン（０．４０ｇｍ、０．４５ｇｍ）を含むことを示すＨＰＬＣ分析によって確認されました。純度はそれぞれ２９．９％と２０％でした。
【００５９】
（Ｃ）Ｃａ（ＯＨ）ｓｕｂ２の使用方法
【００６０】
乾燥したサンザシの実（米国ユタ州オグデン）を１００ｇの量で1/2Ｎ５００ｍｌのＣａ（ＯＨ）ｓｕｂ．２溶液に加え、撹拌しながら３時間室温に保った。チーズクロスで濾過して得られた抽出物と、１ＮＨＣｌ溶液を得られた濾液に加えて、Ｐｈを４．５に調整しました。上記と同じ手順を繰り返して、濾液を得て、そのＰｈを６．５に調整した。得られた濾液を６℃で１２時間保持した後、沈殿物を収集して乾燥させ、それぞれ１ｇｍと２ｇｍの粉末を得た。粉末のＨＰＬＣ分析により、サンザシのベリー抽出物にはルチン（０．４６４ｇｍ、０．９２８ｇｍ）、ケルセチン（０．２９ｇｍ、０．５８ｇｍ）、ケムフェロール（０．２０９ｇｍ、０．４１８ｇｍ）、ビテキシン（０．４５５ｇｍ、０．９１０ｇｍ）が含まれ、純度はそれぞれ６０％と６３％。
実施例３経口投与によるマウスのルチン、ケルセチン、カメフェロールとビテキシンの毒性。
【００６１】
８週齢の２４標本、特定の病原体を含まない、それぞれ２５から３０ｇｍの体重のＩＣＲ雌マウスを４つのグループ（各６マウス）に分け、２３＋＿３°Ｃの環境下で別々のケージに保管しました。相対湿度４５＋＿５％、１２明／１２暗光周期、ハーラン・テクラッド２０１８グローバルげっ歯類飼料（１８％タンパク質）（ケイティー会社米国ウィスコンシン州マディソン）と水を滅菌してマウスに給餌しました。
【００６２】
ルチン、ケルセチン、ケフェロール（米国ミズーリ州セントルイス）とビテキシン（米国ＮＪ州サマービル）を０．５％のｔｗｅｅｎ−８０溶液に溶解して、最終濃度１５０ｍｇ／ｍｌ、１２．５ｍｇにした／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、それぞれ、マウスの体重２０ｇｍあたり０．２ｍｌの量で、ルチン１５００ｍｇ／ｋｇ、ケルセチン１２５ｍｇ／ｋｇ、ケムフェロール１０００ｍｇ／ｋｇとビテキシン５００ｍｇ／ｋｇのマウスの４つの別々のグループに経口投与しました。溶液を１回投与し、投与後１時間、４時間、８時間、１２時間、とその後１２時間ごとに、マウスの有害作用または死亡の兆候を１８０日間観察しました。各マウスの毎日の体重を記録した。１８１日目にマウスを屠殺し、肝臓、腎臓、心臓、肺、筋肉、胃、膀胱、腸、膵臓、脾臓などの内臓を視覚的と顕微鏡で検査しました。
【００６３】
すべてのマウスは１８０日目に生存しており、この観察期間中に体重減少は発生しませんでした。マウスは、視覚的または顕微鏡的に病理学的異常を発症しませんでした。したがって、ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンを含むサンザシの実抽出物は、哺乳動物に経口投与した場合、毒性がないと結論付けられています。
実施例４ホーホーンベリーバイオフラボノイドの投与；ウサギへのルチン、ケルセチン、カメフェロールとビテキシン。
【００６４】
（ステップＡ）体重２．５〜２．６ｋｇの３か月齢のニュージーランドシロウサギ（ハーランケイティー会社カリフォルニア州サンディエゴ）の３６個の標本に、温度２３＋＿３℃、相対湿度４５＋＿５％、光周期１２明／暗の条件下で給餌しました。ウサギはそれぞれ６頭の６つのグループに分けられ、６種類の食事を与えられました。ハーラン・タクラドウサギダイエット−ＴＤ−１３７６（米国ウィスコンシン州マディソン）対照群に１％のコレステロールを含んでいた；１％コレステロール＋１．５ｍｇ／ｋｇシンバスタチン（米国ＮＪのメルク社）比較グループ；ルチングループのコレステロール１％とルチン０．１５％；ケルセチン群のコレステロール１％とケルセトリン０．１５％；１％コレステロール＋ケムフェロールグループの０．１５％ケムフェロール；ビテキシングループの１％コレステロールと０．１５％ビテキシン。ハーラン・タクラドウサギダイエットＴＤ−１３７６には、水分１２％、粗タンパク質１６％、粗脂肪２％、粗繊維１５％、灰８％、と窒素を含まない物質４７％が含まれています。
【００６５】
ウサギは特定の高コレステロール食と水を自由に摂取できる状態で８週間飼育されました。体重は７日ごとに記録され、記録が分析されました。すべてのウサギは正常な成長率を示し、食事摂取量と体重増加に関して６つのグループ間で有意差はありませんでした。ルチン、ケルセチン、ケムフェロールは、米国ミズーリ州セントルイスのアルドリッチシグマ社から購入しました。ビテキシンは、米国ＮＪ州サマービルのインドフィン社から購入しました。
【００６６】
（ステップＢ）８週間の繁殖後、ケタミン７５ｍｇ／ｋｇを大腿筋に注射してウサギを麻酔し、屠殺しました。各ウサギの心臓から血液サンプルを収集し、以下からなる血液分析を決定しました。完全な血球数（ＣＢＣ）、化学７と２４（肝臓と腎機能検査を含む）、脂質プロファイル（総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ＶＬＤＬとトリグリセリドを含む）、からなる凝固因子；プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、と免疫グロブリンＥ（抗アレルギー因子）。
実施例５血漿中の太田田コレステロール、ＨＤＬ、とトリグリセリドのウサギにおける分析。
【００６７】
（ステップＣ）血漿コレステロールとトリグリセリド含量に対するウサギへのルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンの投与の効果を以下のように決定した。
【００６８】
６食餌グループのウサギから採取した血液サンプルを２時間静置した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しました（米国ＮＪ州メガフュージとバクスター・ヘレウス楽器会社）。上清を分離し、分析前に凍結した状態で保存しました。化学分析は、血液化学アナライザー（米国インディアナ州コブラス−インテグラ−７００とロシュダイアグノスティックラボ）によって実行され、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、トリグリセリド、肝機能検査（ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴなど）、Ｇ−ＧＰＴ）と凝固因子（ＰＴ、ＰＴＴ）（バイエル−ＭＬＡ−Ｅｌｅｃｔｒａ−９００自動凝固タイマー）。結果は、スチューデントｔ検定とＭｉｃｒｏｓｏｆｔｅｘｃｅｌ−７．０プログラムを使用し、表ＩＩＩに示します。
３．表ＩＩＩ６種類の高コレステロール食を与えられたウサギの血液分析対照群、シンバスタチン群、ルチン群、ケルセチン群、ケムフェロール群、ビテキシン群。
対照群：ＴＣ；（３８３．３＋＿５５．２ｍｇ／ｄｌ），ＴＲＧ（１６５．６＋＿４０．６ｍｇ／ｄｌ），ＨＤＬ（４５．６＋＿２２．４ｍｇ／ｄｌ），ＳＧＯＴ（３５＋＿６ｕ／ｌ），ＳＧＰＴ（６２．５＋＿６．５ｕ／ｌ），ＧＧＴＰ（５＋＿２ｕ／ｌ）；ＷＢＣ；（４．８＋＿２．０ｋ／ｕｌ），Ａ；（３３＋＿１０），Ｂ；（３．５＋＿０．５）
シンバスタチン群：ＴＣ；（２７７．３＋＿９０．７），ＴＲＧ；（１４１＋＿３０），ＨＤＬ；（４７．５＋＿１６．５），ＳＧＯＴ；（１１４．３＋＿３０．７），ＳＧＰＴ；（７１．２＋＿３．８），ＧＧＴＰ；（６＋＿１）；ＷＢＣ；（３．３＋＿２．６ｋ／ｕｌ），Ａ；（１３．５＋＿６．５），Ｂ；（２．８＋＿０．３）
ルチン群：ＴＣ；（２５４．５＋＿３６．５），ＴＲＧ；（１０８＋＿２２），ＨＤＬ；（３６＋＿６），ＳＧＯＴ；（５２．８＋＿１２．２），ＳＧＰＴ；（３３＋＿９），ＧＧＴＰ；（３＋＿１），ＷＢＣ；（４．８＋＿１．２），Ａ；（１１．３＋＿６），Ｂ；（２．６＋＿０．４）．ケルセチン群：ＴＣ；（２６２．３＋＿３０．７），ＴＲＧ；（１０５．６＋＿１８．４），ＨＤＬ；（４２＋＿８），ＳＧＯＴ；（６２＋＿７），ＳＧＰＴ；（４３＋＿１２），ＧＧＴＰ；（４＋＿１），ＷＢＣ；（４．５＋＿１．５）．Ａ；（１２．８＋＿５．４），Ｂ；（２．７＋＿０．３）
ケムフェロール群：ＴＣ；（２７５＋＿２３），ＴＲＧ；（１３０＋＿２６），ＨＤＬ；（４５．３＋＿７．３），ＳＧＯＴ（６５＋＿８．６），ＳＧＰＴ；（４２＋＿８．８），ＧＧＴＰ；（３．２＋＿１．８），ＷＢＣ；（４．６＋＿１．８），Ａ；（１３．５＋＿４．６），Ｂ；（２．８＋＿０．４）
ビテキシン群；ＴＣ；（２６９．５＋＿３８．５），ＴＲＧ；（１３８＋＿２８），ＨＤＬ；（４６＋＿１２），ＳＧＯＴ；（６０＋＿１２．５），ＳＧＰＴ；（４８＋＿１５），ＧＧＴＰ；（３＋＿１．５），ＷＢＣ；（４．９＋＿１．７），Ａ；（１３．７＋＿４．３），Ｂ；（２．９＋＿０．５）
ＴＣ総コレステロール、ＴＲＧトリグリセリド、ＷＢＣ白血球、ＨＤＬ高密度リポタンパク質、Ａ総大動脈領域に対する脂肪筋の割合（％）、Ｂ脂肪含有細胞の割合（％）割合。
【００６９】
表ＩＩＩのデータから、ルチンとケルセチン、ケムフェロールとビテキシンの投与により、血漿総コレステロールとトリグリセリドがそれぞれ３２〜３３％と４５〜４７％、また３０〜３０％と２２〜１７％減少した。コントロールグループの。ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンは、シンバスタチンよりも血漿総コレステロールとトリグリセリドを減少させる効果が高く、さらに、肝機能とＷＢＣはシンバスタチン群のように影響を受けません。
【００７０】
（ステップＤ）胸部大動脈における脂肪線沈着の分析。
【００７１】
各ウサギの胸壁（ステップＢで犠牲になった）を切開し、大動脈弁の上の１ｃｍの部位から５ｃｍ下方の胸部大動脈の一部を切り取りました。周囲の脂肪組織を取り除き、大動脈を縦に切開し、皿に固定した。その後、湿った大動脈の写真を撮って、エスパー、Ｅ。他によって記述された方法で脂肪条痕の染色を行った（ジャーナルオブラボ臨床医学；１２１、ｐｐ１０３−１１０（１９９３）以下の通り。
【００７２】
大動脈の開いた部分をウーデン舌圧子に固定し、無水プロピレングリコールで２分間３回洗浄し、プロピレングリコールに溶解したオイルレッドＯの飽和溶液で３０分間染色した。次に、大動脈を８５％プロピレングリコールで３分間２回洗浄し、通常の生理食塩水で洗浄することにより残っている染色液を除去した。大動脈を撮影し、写真を画像分析器（ＬＥＩＣＡ、Ｑ−６００、ドイツ）で追跡し、染色された部分の面積は脂肪筋領域であり、総大動脈面積に対するパーセンタイル（％）の割合を計算しました。結果を表ＩＩＩに示した。
【００７３】
図１ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦは、ウサギの大動脈が１％コレステロールコントロールグループで投与されたことを示しています；比較群の１％コレステロールと１．５ｍｇ／ｋｇのシンバスタチン；１％コレステロール＋０．１５％ルチングループ；１％のコレステロールと０．１５％のケルセチングループ；１％コレステロール＋０．１５％ケムフェロールグループ；１％コレステロール＋０．１５％ビテキシングループ。ＩＡのアロタ壁にマクロファージ脂質細胞複合体の厚い層を示したが、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＥ、ＩＦの大動脈壁にマクロファージ脂質細胞複合体の非常に薄い層または非常に薄い層を示した顕微鏡写真（この設定では画像は表示されません）。
【００７４】
本発明におけるルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシンは、マクロファージ−脂質細胞複合体の動脈内皮壁への沈着を防止と／または阻害できると結論付けられる。したがって、長期投与は、表ＩＩＩに示すように、アテローム性動脈硬化症と動脈硬化症が誘発する心血管疾患と脂肪肝の形成を予防と阻害します。結果は、スチューデントｔ検定とマイクロソフトエクセル７．０プログラムを使用してテストされました。
【００７５】
（ステップＥ）ウサギの臓器の病理学的検査。
【００７６】
大動脈、肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、膀胱、膵臓など、ステップＢで屠殺したウサギの内臓を視覚的に検査し、異常は認められませんでした。各器官の半分を凍結し、残りの半分を１０％中性緩衝ホルマリン溶液で２４時間固定した。次に、固定された臓器を水道水で洗浄し、７０％、８０％、９０％、１００％エタノールで段階的に脱水した後、シャンドン−ヒストセンター２を使用してパラフィンに包埋しました。埋め込まれた臓器ブロックを、ミクロトーム（米国光学会社マクベインＭ８２０）で厚さ４μｍに切断し、ヘマトキシリンとエオシン染色（Ｈ．Ｅ．）で染色しました。次に、染色された標本をキシレンで透明にし、マイクロスライドにパーマウントでマウントしました。顕微鏡検査では病理学的な異常や病変はありませんでした。
実施例６ウサギの肝臓における脂肪変性の抑制と予防
【００７７】
フォグトＦとナンジＡ（毒性学と応用薬理学；１３６，ｐｇ８７−９３，１９９６）とキーガンＡ他（ジャーナルオブ肝臓学；２３，ｐｇ５９１−６００，１９９５）の報告によれば、肝臓は、肝臓腺房の中心静脈の周りの細胞を含む異常な脂肪に基づいて４つのグレードに分類することができます．例：グレード１（０−２５％）、グレード２（２６−５０％）、グレード３（５１−７５％）、グレード４（７６−１００％）。実施例４のステップＢからのウサギの肝臓組織に対するルチン、ケルセチン、ケムフェロールとビテキシンの効果を調べた。結果を表ＩＩＩに示します。
【００７８】
図１２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、と２Ｆは、１％コレステロール、１％コレステロール＋１．５ｍｇ／ｋｇシンバスタチン、１％コレステロール＋０．１５％ルチン、１％コレステロール＋０．１５を投与したウサギの肝臓の顕微鏡的特徴を表しますケルセチン％、コレステロール１％＋０．１５％ケムフェロール、コレステロール１％＋０．１５％ビテキシンをそれぞれ。２Ａと２Ｂの特徴は、中心静脈の周りに多くの脂肪含有細胞を示しています。２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆのその他の特徴は、脂肪細胞を含まないほぼすべての肝細胞が正常であることを示しています。それは、ルチン、ケルセチン、ケムフェロール、とビテキシンが脂肪肝の形成と脂肪変性を抑制と予防できることを示し、示しています。さらに、２Ｂの１つには肝腺腫の画像が含まれています。これは、短期間の投与でもシンバスタチンが肝臓に深刻な副作用があることを示しています（この設定ではすべての写真が表示されていません）
実施例７ルチン、ケルセチン、ケンフェロールとビテキシンにより阻害されたＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素
【００７９】
３−ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性は、修正Ｈｕｌｃｈｅｒ法（脂質研究ジャーナル１４，６２５−６４１，１９７３）によって決定されました。この方法では、３−ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の作用により３−ＨＭＧ−ＣｏＡがメバロン酸塩に還元されると、Ｃｏ−Ａの濃度が生成されます。次に、レダクターゼを分光法によって決定し、３−ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性を計算しました。
【００８０】
図−Ｉ、実験動物と人モデルの様々なタイプの癌における腫瘍細胞の治療前の病理学的写真を示しています：
Ｉ−Ａ（乳癌）；Ｉ−Ｂ（コロン癌）；Ｉ−Ｃ（肺癌）；
Ｉ−Ｄ（卵巣癌）Ｉ−Ｅ（子宮頸癌）Ｉ−Ｆ（子宮癌）
【００８１】
図−ＩＩブロメラインの腹腔内注射で治療された実験動物モデルの様々な種類の癌における腫瘍細胞の治療後の病理学的写真を示しています。６種類の癌すべてを解決しました。
【００８２】
図ＩＩＩ経口と静脈内注入によりブロメラインで治療された人モデルの様々なタイプの癌のＣＴスキャン報告と／または病理写真による治療後を示しています。すべての腫瘍は完全に消散したか、５０％以上が消散しました。
【００８３】
ステムとフルーツの両方のブロメラインを含むブロメライン抽出物には、抗炎症、抗血小板凝集、線維素溶解特性、抗腫瘍成長、腫瘍細胞の分化効果など、天然のブロメラインが示すすべての効果があります。パイナップルからのフルーツブロメラインは、１８９１年にマルカノによって最初に単離され、１９６１年（ＵＳ３００２８９１）にアセトンと硫化アンモニウム硫化物（ハイモンケ）による沈殿によってパイナップルジュースから単離されました。ブロメラインの分子量は３３，０００です。それは糖タンパク質であり、１９６０年にギビアンとブラットフィッシュ他によって粗調製物から精製されました（米国２９５０２２７）。
【００８４】
ステムブロメラインは１９４１年にバルス他によって発見されました（工業化学３３、９５０）。フルーツとステムの両方のブロメラインは酸性で塩基性のタンパク質であり、紫外光の波長は２８０ｎｍ（Ａ１％／１ｃｍ２０．１）です。ブロメライン（コモサイン）抽出物の調製と分析。例−Ａコモサインのミニ遺伝子のクローニングと発現、とその抽出手順。コモサイン遺伝子の発現ベクターの組み立てと遺伝子組み換え生物（Ｇｍｏ）の調製
【００８５】
オリゴデオキシリボヌクレオチドプローブ合成が使用され、ホスホルアミダイト法がオリゴヌクレオチド合成に使用された。各プローブ混合物には、２０個のオリゴヌクレオチド配列のプールが含まれていました：
プローブ混合物：ＣｏＭ−Ｖ配列等量：バリン−プロリン−グルタミン−セリン−イソロイシン、
アスパラギン酸−トリトファン−アルギニン−アスパラギン−チロシン−グリシン−アラニン−バリン−スレオニン−セリン−バリン−リジン−アスパラギン−グルタルミン−グリシン。
プローブ混合物：ＣｏＭ−Ｖ＝
Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｉｓｏ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ
３’ＣＡＡ，ＧＧＡ，ＧＴＴ，------------------------------------------------------------------，ＴＴＧ，ＧＴＴ，ＴＴ５’
Ｖ    Ｄ    Ｇ    Ｖ
Ｐ    Ｗ    Ａ    Ｋ
Ｑ    Ｒ    Ｖ    Ｎ
Ｓ    Ｎ    Ｔ    Ｑ
Ｉ    Ｙ    Ｓ    Ｇ
Ｖ＝バリン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｓ＝セリン、Ｉ＝イソロイシン。
Ｄ＝アスパラギン酸、Ｗ＝トリプトファン、Ｒ＝アルギニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｙ＝チロシン。Ｇ＝グリシン、Ａ＝アラニン、Ｖ＝バリン、Ｔ＝スレオニニー、Ｓ＝セリン。
Ｖ＝バリン、Ｋ＝リジン、Ｎ＝アスパラギン、Ｑ＝グルタミン、Ｇ＝グリシン。
プローブ混合物は、５’末端で［ｒ３２ｐ］ＡＴＰ、７５００−８０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（ＩＣＮ）でラベル付けされました（１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用。
【００８６】
ハイブリダイゼーション手順：ＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎＰｌｕｓフィルターとＮＺＹＡＭプレートを除き、ウーの手順に従ってファージプラークを増幅しました。［ＮＡＣＬ５ｇ，ＭｇＣｌ２−６Ｈ２０２ｇ；ＮＺ−アミンＡ１０ｇ；酵母エキス５ｇ；カザミノ酸２ｇ；マルトース２ｇ；寒天１５ｇ（１リットルあたり）を使用し、ファージ粒子を破壊し、ＤＮＡをフィルターに固定しました（８．４ｘ８．４ｃｍフィルターあたり５０，０００プラーク）。空気乾燥したフィルターを８００℃で１時間焼いた後、プロテイナーゼＫ消化にかけた［０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ８．０）、０．１５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、と０．２％ＮａＤｏｄＳｏ４を含む緩衝液１ｍｌあたり５０ｕｇのプロテイナーゼｋ、５５℃で３０分間。１ＭＮａＣｌ／１％ＮａＤｏｄＳｏ４溶液を使用したプレハイブリダイゼーションを、５５℃で４時間以上実行しました。
ハイブリッド形成緩衝液は、０．０２５ｐｍｏｌ／ｍｌの０．９ＭＮａＣｌ／５ｍＭＥＤＴＡ／５０ｍＭリン酸溶液、ＰＨ６．５／０．５％ＮａＤｏｄＳｏ４／ｍｌ当たり１００ｕｇの酵母ｔＲＮＡの２０個のプローブ配列のそれぞれを含んでいた。ハイブリダイゼーションは、ＣｏｍＶプローブ混合物を使用して、４８℃で２０時間実施しました。これは、混合物のメンバーの最低計算解離温度（ｔｄ）より２℃低い。ハイブリダイゼーションの完了時に、フィルターを室温でハイブリダイゼーションと洗浄ごとに１０分間、０．９ＭＮａＣｌ／９０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０／０．１％ＮａＤｏｄＳｏ４で３回洗浄した。
【００８７】
ゲノムコモサイン遺伝子の直接発現には、遺伝子全体を含む４．８キロベース（ｋｂ）のコモサインのＢｓｔＴｙ／Ｓｅ−とＢａｍＡｓ／ＧＬフラグメント。合成リンカー（ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）でＢｓｔＴｙ／Ｓｅ（チロシン−セリン１０アミノ酸）部位をＢｓｔＡｓ／ＧＬ（アスパラギン−グリシン２０アミノ酸）部位に変換した後、フラグメントをユニークなＢａｍＡｓ／ＧＬに挿入しましたジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ミニ遺伝子を含む発現ベクターｐＤＳＶＬの部位。次いで、得られたプラスミドＤＳＶＬ−ｇＰｌＣＯＳ（遺伝子植物コモサイン）を使用して、リン酸カルシウム微小沈殿法によりニュージーランド白ウサギ卵巣（ＮＷＲＯ）細胞をトランスフェクトした。形質転換体は、ヒポキサンチンとチミジンを欠く培地により選択された。使用した培地は、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシン、とグルタミンを添加したダルベッコの改良イーグル培地でした。
【００８８】
コモサインｍＲＮＡの分離。：４．８キロベースのＢｓｔｔｙ／ｓｅ−コモサインのＢａｍＡｓ／ＧＬ制限フラグメントをシャトルベクターｐＳＶ４ＳＴに挿入しました。得られたキメラプラスミドｐＳＶｇＰＬＣｏｍｏを使用して、リン酸カルシウム共沈法によりＣｏｓ−１細胞をトランスフェクトした。７２時間培養した後、チャーグウィン他のグアニジンチオシアン酸塩手順により、切断細胞からＲＮＡを調製しました。そして、ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、オリゴセルロースへの結合により単離されました（アビブとレーダー）。
【００８９】
ｃＤＮＡクローニング：上記のｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡを使用して、岡山とベルグの一般的な手順を変更して、コモサインｃＤＮＡバンクを構築しました（分子細胞生物学２，１６１−１７０，１９８２）。
【００９０】
ＤＮＡシーケンス：大腸菌のＪＭ１０３と／またはＪＭ１０９を宿主として使用して、制限断片をＭ１３ファージベクターにクローニングし（メッシング；酵素学の方法１９８３）、サンガーらのジデオキシ法により配列決定された。いくつかの領域は、マクサムとギルバートによって説明されているように、キナーゼ標識または制限断片のエンドフィル標識とそれに続く化学的切断によって配列決定されました（酵素学の方法１９８０）。
【００９１】
最終的なコモサイン組換えを収集し、抽出し、エチルアルコールで洗浄し、ＡＫＡＴプライムで精製し（ＧＥ会社）、と／またはＦＰＬＣ-陽イオン交換クロマトグラフィー。将来の使用のためにＦ４、Ｆ５、とＦ−９ａ、Ｆ９ｂ（コモサインとアナナーゼ）を生成します。
【００９２】
例Ｂ（６８−Ｂを参照）ゲノムコモサイン遺伝子の直接発現
【００９３】
例−Ｃ（６８−Ｃを参照）コモサインｍ−ＲＮＡの分離
【００９４】
実施例Ｄ（６８−Ｄを参照）コモサインｃ−ＤＮＡのクローニング。［０６７−Ａ］ヌクレオチドとアミノ酸配列への補遺オリジナルページ５３から５６に追加
2020516698.tif 000003
2020516698.tif 000004
2020516698.tif 000005
【００９５】
例−１経口投与によるマウスのブロメライン（コモサイン）の毒性
【００９６】
特定の病原体を含まない、それぞれ２５−３０グラムのＩＣＲ雌マウスを含む８週齢の３０個の標本を５つのグループ（各６個のマウス）に分け、２３＋＿３°Ｃの環境下で別々のケージに保管しました。４５＋＿５％の相対湿度、と１２Ｈ光／１２Ｈ暗光周期、ハーラン・テクラッド２０１８グローバルロッド歯類飼料（１８％タンパク質）を与えられました（ウィスコンシン州マディソンケイティー会社）。飲料水は滅菌されました。
【００９７】
ブロメライン（コモサイン）は、それぞれ５０ｍｇ／ｍｌ、１００ｍｇ／ｍｌ、１２５ｍｇ／ｍｌ、と１５０ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで０．５％のトゥイーン８０溶液に溶解し、４つの別々のグループに経口投与しました。マウスの体重２０グラムあたり０．２ｍｌの量のマウス、つまり５００ｍｇ／ｋｇ、１０００ｍｇ／ｋｇ、１２５０ｍｇ／ｋｇ、と１５００ｍｇ／ｋｇを個別に含む。６匹のマウスの１つのグループは対照グループとして維持され、ブロメライン溶液は与えられなかった。溶液を２週間に１回投与し、次のスケジュールに従って、有害作用または死亡の兆候についてマウスを６か月間観察しました：１Ｈ、４Ｈ、８Ｈ、１２Ｈ（時間）、投与後それから１２時間。各マウスの毎日の体重を記録した。１８０日目（６ヶ月後）にマウスを屠殺し、肝臓、腎臓、心臓、肺、筋肉、胃、膀胱、腸、膵臓、脾臓などの内臓を視覚的と顕微鏡で検査しました。
【００９８】
すべてのマウスは６ヶ月で生存しており、この観察期間中に体重減少は発生しませんでした。マウスは、視覚的または顕微鏡的に病理学的異常を発症しませんでした。したがって、パイナップルからのブロメライン抽出物は、哺乳動物に経口投与しても毒性がないと結論付けられています。
例−２ブロメラインとケルセチンは、試験管内での癌細胞の成長を阻害します
【００９９】
癌細胞株は、手術中の手術標本からの直接採取または異なる腫瘍学研究所の友人から開発されました。標本を通常の生理食塩水で乳化し、５μｍ未満の粒子が通過できるメッシュで３回ろ過しました。上清は、標準組織培養での播種に使用できるようになるまで、８°Ｃで７５ｍｌフラスコの完全成長培地（ＣＧＭ）（ミズーリ州セントルイスシグマアルドリッチ会社）に保存されました。完全な成長培地（ＣＧＭ）：ダルベッコの修正エッセンシャル培地（ミズーリ州セントルイスシグマアルドリッチ会社）に１０％熱不活性化新生仔ウシ血清、と２％Ｌ−グルタミン、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）を添加、ストレプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌ）とネオマイシン（１０ｍｇ／ｍｌ）（ミズーリ州セントルイスシグマアルドリッチ会社）と加湿した空気９０％、ＣＯ１０％、細胞分裂１で３７℃でインキュベート：週２回２レート。
【０１００】
乳癌、肺癌、大腸癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌を含む６種類の癌細胞株を使用して、様々な濃度のブロメラインによる増殖阻害の感度をテストしました。細胞を９６ウェル組織培養マイクロタイタープレート（ＮＪ州フランクリンレイクスベクトン・ディキンソン会社）に２×（１０）３で播種しました。細胞は、完全成長培地（ＣＧＭ）の標準組織培養で維持されました。ブロメライン溶液を次の濃度で培地に加えました：０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、７２時間、腫瘍細胞をコールターカウンターでカウントしました（モデルＢベックマンコールター会社）。腫瘍細胞の増殖阻害の割合を図−２に示します。これは、すべての癌細胞株の増殖が高濃度のブロメライン（コモサイン）で抑制されたことを示しています。
例−３ブロメラインとケルセチンは、実験動物の癌細胞の成長を阻害します。ブロメラインとケルセチンの実験動物への腹腔内投与。
【０１０１】
それぞれ体重が１〜１．５ポンドの４〜６週齢の白ウサギの１４匹の実験動物に、２３＋＿３℃、相対湿度４５＋＿５％、１２明／１２暗の光周期の条件下で飼育しました。ウサギをそれぞれ２頭の７つのグループに分け、水分１２％、粗タンパク質１６％、粗脂肪２％、粗繊維１５％、灰を含むＨａｒｌａｎ−ＴａｋｌａｄウサギダイＴＤ−１３７６（ＷＩ、マディソン）を与えました８％、窒素を含まない物質は４７％。
【０１０２】
ウサギに３週間飼料を自由に摂取させ、７日ごとに水体重を記録し、記録を分析しました。すべてのウサギは正常な成長率を示し、食事摂取量または体重増加に関して７つのグループ間で有意差はありませんでした。癌細胞株をウサギの６つのグループに注入しました。つまり、各グループに２つのヘッドを持ち、２つのヘッドをコントロールとして使用しました（腫瘍細胞注入なし）。癌細胞株は実施例−２から開発された。各腹部に異なる細胞株液を腹腔内に、好ましくは腹膜層に注射し、その後、腹膜に腫瘍が成長するまでウサギに同じ食餌を３〜４週間与えた。腫瘍のサイズと位置が記録されました。腫瘍のサイズが直径３〜５ｍｍに達したとき。生理食塩水に溶かしたブロメライン２５．０ｍｇ／ｍｌ量１００ｍｇのビタミンＣを含むケルセチン５ｍｇ／ｍｌ（溶液を酸性に保つため）、ブロメライン２ｍｌをウサギの６つの異なるグループに注射し、ブロメラインは週２回８週間。
【０１０３】
８週間の治療後、ケタミン７５ｍｇ／ｋｇを大腿筋に注射してウサギを麻酔し、屠殺しました。各ウサギの心臓から血液サンプルを収集して、以下から構成される血液分析を決定しました：完全な血球数（ＣＢＣ）、化学７と２４（肝臓と腎機能検査を含む）、脂質プロファイル（総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬを含む）、ＶＬＤＬ、とトリグリセリド）、からなる凝固因子；プロトロンビン時間（ＰＴ）、部分トロンボプラスチン時間（ＰＰＴ）、と免疫グロブリン-Ｅ。すべての臨床検査が分析され、各グループ間または各グループ内で違いは示されませんでした。すべての実験室血液分析は、７つのグループすべてのウサギで実行されました。結果は、スチューデントｔ検定とマイクロソフトエクセル７プログラムを使用してテストされました。結果を表ＩＩに示します。
【０１０４】
表ＩＩ、表は、癌細胞株の接種後にブロメラインで治療された６つの異なるグループのウサギの血液分析を示しています。対照群；ＴＣ（１８３．３＋＿５０．２ｍｇ／ｄｌ），ＴＲＧ（１１０＋＿４０．６ｍｇ／ｄｌ），ＨＤＬ（４５．６＋＿２０．４ｍｇ／ｄｌ），ＳＧＯＴ（３８．６＋＿６．２ｕ／ｌ），ＳＧＰＴ（６２．５＋＿６．５ｕ／ｌ），ＧＧＴＰ（８＋＿２．４ｕ／ｌ），ＷＢＣ（６．８＋＿２．０ｋ／ｕｌ），Ｈｂ（１２．３＋＿２．２ｇｍ／ｄｌ）．ブロメライン治療群；ＴＣ（１７５．６＋＿３６．８ｍｇ／ｄｌ），ＴＲＧ（９２．６＋＿３８．８ｍｇ／ｄｌ），ＨＤＬ（４３．６＋＿１６．５ｍｇ／ｄｌ），ＳＧＯＴ（１１０．８＋＿３０．７ｕ／ｌ），ＳＧＰＴ（７１．２＋＿３．８ｕ／ｌ），ＧＧＴＰ（７＋＿１ｕ／ｌ），ＷＢＣ（７．３＋＿２．２ｋ／ｕｌ），Ｈｂ（１１．９＋＿１．９ｇｍ／ｄｌ）．ＴＣ総コレステロール、ＴＲＧトリグリセリド、ＷＢＣ白血球、ＨＤＬ高密度リポタンパク質、ＳＧＯＴ血清グルタモ−シュウ酸トランスフェラーゼ、ＳＧＰＴ血清グルタモ−ピルビックトランスフェラーゼ、Ｈｂヘモグロビン。
【０１０５】
肺、心臓、肝臓、腎臓、筋肉、大網、腸、胃の膀胱、膵臓など、このサンプルで犠牲になったウサギの内臓を目視で検査し、異常は認められませんでした。各器官の半分を凍結し、残りの半分を１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定した。次に、固定された臓器を水道水で洗浄し、７０％、８０％、９０％、１００％エタノールで段階的に脱水し、シャンドン−ヒストセンター２を使用してパラフィンに包埋しました。埋め込まれた臓器ブロックをミクロトームで厚さ４μｍに切断し（米国光学会社マクベインＭ８２０）、ヘマトキシリンとエオシン染色（Ｈ．Ｅ．）で染色された）。染色された標本をキシレンで透明にし、マイクロスライドにパーマウントでマウントしました。顕微鏡検査では病理学的な異常や病変はありませんでした。ウサギの６つのグループから収集されたすべての標本は、永続的な疾患または癌細胞の証拠を示さなかった。したがって、我々は、ブロメラインが副作用なしで実験動物の様々なタイプの癌の化学療法剤として役立つことができると結論付けます。実施例４腫瘍成長を阻害するために病期の癌患者を遅らせるためのブロメライナーゼ（コモサイン）とケルセチン経口投与
【０１０６】
２４人のボランティアは６つのグループに分けられ（各グループに４人）、６人が対照グループとして働いた（ブロメライン治療なし）。すべてが、乳房、肺、結腸、卵巣、子宮頸部、子宮などの様々な種類の癌を患う４０〜６０歳代でした。すべてがステージＩＩＩまたはステージＩＶのいずれかであり、癌は肺、肝臓、膀胱または直腸のいずれかに広く転移していた。すべては手術後に放射線療法または化学療法のいずれかで治療されていましたが、肯定的な結果はありませんでした。ブロメライナーゼは、体重５０〜６０ｋｇに基づいて２０〜３０ｍｇ／ｋｇ（７５〜１００ＧＤＵ／日）の用量で投与された。それは１５００ｍｇ〜２０００ｍｇ／日（または５，０００〜６，０００ＧＤＵ／日）であり、ケルセチンは２ｍｇ／ｋｇ／日で２回に分けられています。完全な血球数、化学７、化学２４、腎と肝機能検査、腫瘍マーカー、凝固因子、Ｘ線またはＣＴスキャンで構成される隔週の血液検査で患者をモニターし、適切な領域でサイズを決定しました腫瘍。すべての血液検査に異常はなく、貧血、白血球減少症、血小板減少症、腎臓異常、肝機能検査はありませんでした。腫瘍マーカーは減少し、腫瘍は縮小し、Ｘ線またはＣＴスキャン測定でサイズが縮小しました。患者のライフスタイルは管理しやすくなり、大幅に改善されました。治療期間は６ヶ月から１２ヶ月までさまざまでした。治療グループのこの報告では、失効した患者はいませんでしたが、治療を望まなかった対照グループのすべての患者は、６〜１２ヶ月で関連する癌で死亡しました。
【０１０７】
（Ｓｔｅｐ−Ａ）血液サンプルを収集し、２時間静置した後、４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離しました。メガフュージ、バクスター・ヘレウスは分析前に凍結し、化学分析は血液化学アナライザー（インディアナ州コブラ・インテグラ７００ロシュ診断研究所）によって実施され、総コレステロール、ＨＤＬ、ＬＤＬ、トリグリセリド、肝機能検査（ＳＧＯＴ、ＳＧＰＴ、Ｇ−ＧＰＴ）、腎機能検査、と凝固因子（ＰＴ、ＰＴＴ）（バイエル−ＭＬＡ−エレクトラ−９００自動凝固タイマー）。すべての結果は、スチューデントｔ検定とＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ−７．０プログラムでテストされました。結果を表ＩＩＩに示しますが、すべて正常な範囲内でした。この表ＩＩＩは、ブロメライン経口療法による様々な種類の癌に苦しむ２４人のボランティアの血液分析を示しています。ＴＣ（２１０．３＋＿３０．２ｍｇ／ｄｌ），ＴＲＧ（１６５．５＋＿２８．３ｍｇ／ｄｌ），ＨＤＬ（４３．３＋＿２２．２ｍｇ／ｄｌ），ＳＧＯＴ（３４．７＋＿６．２ｕ／ｌ），ＳＧＰＴ（６３．３＋＿５．６ｕ／ｌ），ＧＧＴＰ（７．２＋＿２．１ｕ／ｌ），ＷＢＣ（６．７＋＿２．８ｋ／ｕｌ），Ｈｂ（１２．３＋＿２．１ｇｍ／ｄｌ）。したがって、我々は、これらの様々な種類の癌の大量投与とブロメラインによる長期の治療が効果的であり、副作用がないと結論付けました。
実施例５人における腫瘍成長を阻害するためのブロメライン（コモサイン）静脈内投与
【０１０８】
未治療の２人のコントロールグループに加えて、テストグループは次のように設立されました：４歳から６０歳までの１２人のボランティアは、２つの６つのグループに分けられ、全員がステージ−３の卵巣癌、子宮頸癌、と子宮癌にありました癌。過去には、すべての患者は化学療法、と／または手術後に効果のない放射線療法を受けていました。彼らは、５０ＧＤＵ／ｋｇ（２０ｍｇ／ｋｇ）体重５０から６０ｋｇのブロメライン（コモサイン）を与えられました。これは、毎週１０００ｍｇに相当します／（５００ｍｇ週に２回）。ブロメラインは３〜６ヶ月間、６〜８時間で静脈内投与されました。ブロメラインの静脈内注入に加えて、試験群のすべての患者は、治療効果を高めるために５０ｍｇ／ｋｇ／日（３０００ｍｇ／日）の用量で経口ブロメラインも投与されました。ＣＢＣ、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−７、と２４を含む血液検査、肝臓と腎機能検査、脂質プロファイル、凝固因子、ＰＴ、ＰＴＴ、ＩＧＧ、腫瘍マークは６週。そして、腫瘍の大きさを測定するために、３〜４ヶ月ごとにＸ線とＣＴスキャンが行われました。これらの患者グループの血液分析では、ブロメライン注入治療による影響は示されませんでした（結果は示されていません）。６か月の治療期間の終わりに、結果は次のように示されます：
（Ａ）２人の乳癌患者
（１）１人の患者は、サイズが６．５ｃｍＸ６．４ｃｍから２．５ｃｍＸ１．８ｃｍに左乳房腫瘍の縮小を経験しました。左ａ窩リンパ節は、２．５ｃｍＸ１．６ｃｍから０．５ｃｍＸ０．４ｃｍに縮小し（左乳房）、３か月の静脈内（ＩＶ）ブロメライン療法により、６か月で完全寛解を達成しました。
（２）２番目の患者の右乳房腫瘍は、４か月のブロメライン静注療法で６．５ｃｍＸ４．８ｃｍから２．８ｃｍＸ１．５ｃｍに縮小しました。そして９ヶ月で完全な寛解を達成しました。
（Ｂ）２人の肺癌患者
（１）１人の患者は、１２週間の静脈内ブロメライン療法で４．６ｃｍｘ５．１ｃｍから１．８ｃｍｘ２ｃｍへの収縮を経験しました。４か月間のさらなる治療により、腫瘍は完全に寛解しました。
（２）３．９ｃｍｘ４．５ｃｍの肺腫瘍を持つ別の患者は、３か月の治療で腫瘍が１．５ｃｍｘ１．９ｃｍに縮小した。ブロメライン静注療法をさらに５か月行うことで、患者は完全に寛解しました。
（Ｃ）２人の結腸癌患者
ＩＶ期疾患で腹腔内に広く転移している２人の患者は、ブロメラインの静脈内注入で６〜９か月間治療され、持続性疾患の証拠は示されませんでした。
（Ｄ）２人の卵巣癌患者
両方の患者は広い腹腔内転移を伴うステージＩＩＩＣに苦しみ、両方とも６か月間静脈内ブロメライン注入で治療され、ＣＴスキャンと超音波検査で持続性疾患の証拠を示さなかった。
（Ｅ）２人の子宮頸癌患者
両方の患者は、直腸と膀胱浸潤を伴うＩＶ期でした。９か月間のブロメラインの静脈内強力治療後、膀胱または直腸浸潤のさらなる証拠はありませんでした。腫瘍は検出できませんでした。
（Ｆ）２人の子宮癌患者
両方の患者は、膣内転移を伴うステージＩＩＩでした。ブロメラインの静脈内治療を４〜６か月行った後、膣の腫瘍は壊死と線維化を示し、持続的な疾患の証拠はありませんでした。
（Ｇ）２人の治療を拒否した対照群を含む患者
子宮頸部に転移したＩＶ期の子宮頸部癌の患者１人と、肺に転移したＩＶ期の乳癌の患者１人。両方の患者は治療を拒否し、両方の病院でのケアと治療を頻繁に行った後、９〜１２か月で肺と敗血症の感染症で死亡しました。
（Ｈ）肝細胞癌（肝細胞癌）の症例
この腫瘍が発見されたとき、サイズが１５ＣＭｘ１５ＣＭｘ１０ＣＭと測定されたため、外科的切除は不可能でした。彼は化学療法の１つのコースを結果なしで受け、２か月間敗血症と菌血症に苦しみ、それからＰ．Ｏを与えられました。３０００ｍｇ／日の用量のコモサイン、と７か月間のブロメラインＩＶ療法、患者は完全寛解を達成しました。
【０１０９】
繰り返しますが、これは、人へのブロメライン（コモサイン）抽出物（ブロメライナーゼ）の投与が、様々なタイプの癌と腫瘍性疾患を治療できるという証拠です。肝臓と腎機能、脂質プロファイル、白血球とヘモグロビンは影響を受けていません。副作用や毒性はありません。
【０１１０】
実施例６医薬製剤と調製
【０１１１】
ハードと／またはソフトゼラチンカプセルは、次のような成分で調製されます：
【０１１２】
製剤１：量（ｍｇ／カプセル）有効成分（１）コモサイン５００、（２）ケルセチン２５０、アスコルビン酸２００、デンプンまたはラクトース（担体）５０、総１０００ｍｇ
【０１１３】
製剤２：量（ｍｇ／カプセル）有効成分（１）と（２）１０００、アスコルビン酸３００、デンプンまたはラクトース（担体）２００、総１５００ｍｇ
【０１１４】
製剤３：量（ｍｇ／カプセル）有効成分（１）と（２）１６００、アスコルビン酸３００、デンプンまたはラクトース（担体）１００、総２０００ｍｇ
【０１１５】
製剤４：量（ｍｇ／バイアル）有効成分（１）コモサイン１グラム、（２）ケルセチン２５０ｍｇ、アスコルビン酸１０００ｍｇ／ｃｃ、生理食塩水３．０ｍｌ。注射用の総量５ｍｌ
【０１１６】
製剤５：量（ｍｇ／バイアル）有効成分（１）コモサイン２グラム、（２）ケルセチン５００ｍｇ、アスコルビン酸１０００ｍｇ／ｃｃ、生理食塩水３．０ｍｌ、注射用総量５ｍｌ
【０１１７】
製剤６：量（ｍｇ／バイアル）有効成分（１）コモサイン３グラム、（２）ケルセチン７５０ｍｇ、アスコルビン酸１０００ｍｇ／ｃｃ、生理食塩水６．０ｍｌ、注射用総容量１０ｍｌ
【０１１８】
本発明と発見は、以下に関して説明されてきたが、上記の特定の説明と実施形態に、それが認識されるべきである様々な修正と変更が、本発明に対して行われ得る。定義された本発明の範囲内に入る当該技術分野のスキル添付の請求とそれらの法的同等物。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
2020516698.tif 000010
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020516698.tif 000016
【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020516698.tif 000021
【図１０】
2020516698.tif 000022
【図１１】
2020516698.tif 000023
【図１２】
2020516698.tif 000024
【図１３】
2020516698.tif 000025
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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