(57)【要約】低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの作用により、目的タンパク質を高効率で製造することを課題とする。  メタン生成菌に属する常温性古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの作用により、目的タンパク質を正常型タンパク質として取得する。該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質、又は該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の共発現により目的タンパク質は正しく折り畳まれる。該融合タンパク質を発現することができるベクターによって、目的タンパク質は高効率で製造される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
メタン生成菌に属する常温性古細菌に由来することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項２】
前記常温性古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属古細菌であることを特徴とする請求項１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項３】
ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１又は２記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項４】
配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを、その一部に含むアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１、２又は３記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項５】
配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを、そのＮ末端領域に含まないアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１、２、３又は４記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項６】
配列番号６に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項７】
配列番号８に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項８】
配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項９】
ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする請求項１又は２記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項１０】
配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項１１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、実質的に同一の活性を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。
【請求項１２】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
前記制限酵素サイトは、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする請求項１２記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする請求項１２又は１３記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記ペプチドリンカーは、プロテアーゼ消化アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１４記載の発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１２、１３、１４又は１５記載の発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることを特徴とする発現ベクター。
【請求項１７】
前記第２コード領域は、抗体又は抗体の部分断片をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１８】
前記第２コード領域は、細胞内受容体タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１６記載の発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１６、１７又は１８記載の発現ベクターを含有することを特徴とする形質転換体。
【請求項２０】
宿主が大腸菌であることを特徴とする請求項１９記載の形質転換体。
【請求項２１】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと前記目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することを特徴とする請求項２１記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１６記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項２４】
請求項１６記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を合成し、次いで、該融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項２５】
前記発現ベクターは第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、第１コード領域と、プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列と、第２コード領域とを転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質を合成し、該融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより目的タンパク質を切り出すことを特徴とする請求項２４に記載の目的タンパク質の製造方法。
【請求項２６】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を同一宿主内で共発現させることにより、宿主内で目的タンパク質にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質を可溶化し、宿主の可溶画分から目的タンパク質を採取することを特徴とする目的タンパク質の製造方法。
【請求項２７】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを含む試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することにより、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ以外の成分を除去することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの精製方法。
【請求項２８】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を含む試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することにより、該融合タンパク質以外の成分を除去することを特徴とする融合タンパク質の精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、発現ベクター、形質転換体、融合タンパク質、融合タンパク質の製造方法、目的タンパク質の製造方法、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの精製方法、及び融合タンパク質の精製方法に関し、さらに詳細には、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクター、該発現ベクターを含有する形質転換体、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質とその製造方法、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを利用した目的タンパク質の製造方法、疎水性相互作用クロマトグラフィーによる該ＰＰＩａｓｅの精製方法、及び疎水性相互作用クロマトグラフィーによる該融合タンパク質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  近年、種々の生物のゲノム解析が終了しつつあり、今後の研究は、遺伝子の発現産物であるタンパク質の網羅的な機能解析へと進むものと考えられている。即ち、個々のタンパク質の性質を明らかにするとともに、タンパク質同士の相互作用を網羅的に解析することで、生命現象解明の一助としようとする研究が急速に増加しつつある。なかでも、各種の生理活性物質と特異的に結合し、その作用を伝達する細胞内受容体タンパク質は、その受容体タンパク質と結合する活性物質が新規医薬品の候補物質となり得ることから、その３次元構造決定に重大な関心が持たれている。【０００３】  タンパク質の性質を決定しようとする場合は、そのタンパク質を組換えＤＮＡ技術によって大量に合成し、解析試料とすることが多い。即ち、目的タンパク質をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、該発現ベクターをバクテリア、酵母、昆虫細胞等の宿主に導入し、宿主内で目的タンパク質の遺伝子を発現させ、得られた組換えタンパク質の性質を調べる方法が一般的である。しかし、タンパク質の性質を正確に評価するためには、一次構造のみならず三次元的な立体構造が極めて重要であるところ、上記のようにして得られた組換えタンパク質においては、宿主内で折り畳み反応が正しく行われず、正しい立体構造を有しない異常型タンパク質としてしか得られないケースにしばしば遭遇する。さらに、このような異常型タンパク質は可溶性ではなく封入体と呼ばれる不溶性の凝集体として得られることが多い。例えば、目的タンパク質が抗体の場合、大腸菌を宿主とすると、合成された組換えタンパク質のほとんどが不溶性の封入体となることが知られている（非特許文献１）。また、細胞内受容体タンパク質のように、元々は生体膜の表面上または内部に埋もれて存在しているタンパク質が目的タンパク質である場合も、組換えタンパク質として発現させると封入体になりやすい。【０００４】  また、組換えタンパク質が宿主細胞のプロテアーゼにより分解されたりしてしまい、解析対象の目的タンパク質がほとんど得られない場合もある。さらに、目的タンパク質が細胞に対する毒性を示す場合には、組換えタンパク質は発現にすら至らないこともある。【０００５】  封入体となった異常型タンパク質を折り畳み直して正しい立体構造に戻す方法としては、封入体を高濃度の塩酸グアニジンや尿素等で可溶化した後、適当な緩衝液等で３０〜１００倍程度に希釈する方法が知られている。例えば、特許文献１には、封入体を含む希釈した緩衝液中にタンパク質の折り畳みを促進する機能を有するシャペロニンを含有させることで、異常型タンパク質を正しく折り畳み、目的タンパク質を正常型タンパク質として取得する方法が記載されている。しかしながら、いったん封入体となった異常型タンパク質を折り畳み直して正しい立体構造に戻すことは予想以上に困難であり、上記した方法でもなかなか成功しないのが現実である。さらに、シャペロニンは、折り畳み反応の際に高エネルギー物質であるＡＴＰ等のヌクレオチド３リン酸を必要とし、経済的に不利である。また、シャペロニンは分子量８０万〜１００万の巨大な分子であるので、折り畳み反応に用いるには重量比にすると極めて多大な量が必要と���れ、やはり経済的に不利である。【０００６】  また、目的タンパク質を、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、ＮｕｓＡなどの作用により正常型タンパク質として取得する方法が提案されているが、いずれもその効果は十分とはいえない。【０００７】  一方、発現産物の収量を向上させることを目的とした方法もいくつか開示されている。特許文献２には、分子シャペロンの一つであるシャペロニンの部分断片と目的タンパク質（目的ポリペプチド）とを融合させることにより、目的タンパク質の収量を増大させる方法が開示されている。さらに、シグナルペプチドを目的タンパク質に付与し、例えば大腸菌のペリプラズム領域に分泌発現させれば、通常は封入体となる目的タンパク質が可溶性タンパク質として発現できることが開示されている。しかしながら、ペリプラズム領域への発現する場合は発現産物の収量が少ないだけでなく、可溶化効率自体も不十分である。【０００８】  ペプチジル−プロリル  シス−トランス  イソメラーゼ（Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｐｒｏｌｙｌ  ｃｉｓ−ｔｒａｎｓ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ。以下、「ＰＰＩａｓｅ」と称する。）は、タンパク質の折り畳みに関与する折り畳み因子の１つであり、細胞内で折り畳み途上のタンパク質中のアミノ酸のうち、プロリン残基のＮ末端側ペプチド結合のシス−トランス異性化反応を触媒する活性（ＰＰＩａｓｅ活性）を有するものである。そして、至適生育温度が５５℃以上である好熱性古細菌又は超好熱性古細菌に由来するＦＫＢＰ（ＦＫ５０６  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）型ＰＰＩａｓｅは、ＰＰＩａｓｅ活性のみならず、分子シャペロン活性を有することが知られている。ここで、「分子シャペロン活性」とは、タンパク質の不可逆的凝集を抑制すると同時に、変性タンパク質の再折り畳みを促進させる活性と定義される。そして、この分子シャペロン活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを用いて、正常型のタンパク質を得る方法が提案されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。この好熱性古細菌又は超好熱性古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが有する分子シャペロン活性は、シャペロニンが有する分子シャペロン活性と異なり、その活性発現にＡＴＰ等の高エネルギー物質を必要としない点で優れている。【０００９】
【特許文献１】特開平９−２２００９２号公報
【特許文献２】国際公開００／０７５３４６号パンフレット
【非特許文献１】プルックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第９巻、第５４５頁〜、１９９１年
【非特許文献２】古谷（Ｆｕｒｕｔａｎｉ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３９巻、第４５３頁〜、２０００年
【非特許文献３】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、ユーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第２６７巻、第３１３９頁〜、２０００年
【非特許文献４】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．）、第３５７巻、第４６５頁〜、２００１年
【非特許文献５】井手野（Ｉｄｅｎｏ）、アプライド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、第６８巻、第４６４頁−、２００２年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  通常、タンパク質を取り扱う際には、熱失活を避けるために低温から常温域、具体的には４〜３７℃程度の温度域で取り扱うことが多い。また、大腸菌や酵母等の宿主を用いて組換えタンパク質を生産する場合は、宿主の至適生育温度である２５〜３７℃で生産する場合が多い。しかし、上記した好熱性古細菌又は超好熱性古細菌の至適生育温度は５５℃以上であり、それらの古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの最大活性を示す温度も５５℃以上と考えられる。よって、これらのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは低温から常温域での活性が高くなく、試験管内又は宿主内で目的タンパク質を正しく折り畳むには不適である。一方、常温性の古細菌としては高度好塩菌が知られている。すなわち、好度好塩菌は３７℃前後に至適生育温度域を有しているため、同菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは低温から常温域での高い活性が期待される。しかしながら、高度好塩菌の菌体内は１〜３Ｍ程度という高い塩濃度に保たれているため、その高度好塩菌が有するタンパク質も高い塩濃度下でのみ活性を示すものが多く、通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すかは不明である。他方、他の常温性の古細菌としては、メタン生成能を有するメタン生成菌が知られている。しかし、メタン生成菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは未だ単離されておらず、その作用や物理化学的性質についても定かではない。【００１１】  本発明の目的は、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを提供することにあり、さらに、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクター、該発現ベクターを含有する形質転換体、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質の製造方法、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを利用した目的タンパク質の製造方法、該ＰＰＩａｓｅの精製方法、及び該融合タンパク質の精製方法を提供することも本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明者らは、鋭意検討の結果、メタン生成菌に属する常温性古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを単離し、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅが分子シャペロン活性を有しており、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すことを見出した。さらに、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの中でも特定のアミノ酸配列を有するもの、また、その中でも特に、特定のアミノ酸配列を欠失または元来保有しないものは、極めて高い分子シャペロン活性を有することを見いだした。さらに、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させることによって、極めて高効率で目的タンパク質を正しく折り畳むことができることを見出し、本発明を完成した。すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。【００１３】（１）メタン生成菌に属する常温性古細菌に由来することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（２）上記常温性古細菌は、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属古細菌であることを特徴とする（１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（３）ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする（１）又は（２）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（４）配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを、その一部に含むアミノ酸配列を有することを特徴とする（１）、（２）又は（３）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（５）配列番号４で表されるアミノ酸配列からなるモチーフを、そのＮ末端領域に含まないアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項（１）、（２）、（３）又は（４）記載のＰＰＩａｓｅ、
（６）配列番号６に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（７）配列番号８に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（８）配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（９）ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであることを特徴とする（１）又は（２）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（１０）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ、
（１１）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）又は（１０）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、実質的に同一の活性を有することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ。【００１４】  さらに、
（１２）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有し、前記制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができることを特徴とする発現ベクター、
（１３）上記制限酵素サイトは、前記第１コード領域の下流に位置することを特徴とする（１２）記載の発現ベクター、
（１４）上記第１コード領域と前記制限酵素サイトの間に、ペプチドリンカーをコードする塩基配列を有することを特徴とする（１２）又は（１３）記載の発現ベクター、
（１５）上記ペプチドリンカーは、プロテアーゼ消化アミノ酸配列を含むことを特徴とする（１４）記載の発現ベクター、
（１６）（１２）、（１３）、（１４）又は（１５）に記載の発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域が組み込まれていることを特徴とする発現ベクター、
（１７）上記第２コード領域は、抗体又は抗体の部分断片をコードする遺伝子であることを特徴とする（１６）記載の発現ベクター、
（１８）上記第２コード領域は、細胞内受容体タンパク質をコードする遺伝子であることを特徴とする（１６）記載の発現ベクター、
（１９）（１６）、（１７）又は（１８）記載の発現ベクターを含有することを特徴とする形質転換体、
（２０）宿主が大腸菌であることを特徴とする（１９）記載の形質転換体。【００１５】  さらに、
（２１）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質、
（２２）上記ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと前記目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有することを特徴とする（２１）記載の融合タンパク質、
（２３）（１６）記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を合成することを特徴とする融合タンパク質の製造方法、
（２４）（１６）記載の発現ベクターに組み込まれた第１コード領域及び第２コード領域を転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を合成し、次いで、該融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことを特徴とする目的タンパク質の製造方法、
（２５）前記発現ベクターは第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有し、第１コード領域と、プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列と、第２コード領域とを転写及び翻訳させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列を有する融合タンパク質を合成し、該融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより目的タンパク質を切り出すことを特徴とする（２４）に記載の目的タンパク質の製造方法、
（２６）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子と目的タンパク質をコードする遺伝子を同一宿主内で共発現させることにより、宿主内で目的タンパク質にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを作用させ、目的タンパク質を可溶化し、宿主の可溶画分から目的タンパク質を採取することを特徴とする目的タンパク質の製造方法、
（２７）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを含む試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することにより、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ以外の成分を除去することを特徴とするＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの精製方法、
（２８）（１）、（２）、（３）、（４）、（５）、（６）、（７）、（８）、（９）、（１０）又は（１１）記載のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を含む試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することにより、該融合タンパク質以外の成分を除去することを特徴とする融合タンパク質の精製方法。
【発明の効果】
【００１６】  本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅによれば、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも効率的に目的タンパク質を折り畳むことができる。【００１７】  本発明の発現ベクターによれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができ、目的タンパク質は低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも効率的に折り畳まれる。【００１８】  本発明の形質転換体によれば、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも十分な活性を示すＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を生産することができる。【００１９】  本発明の融合タンパク質によれば、目的タンパク質は低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下でも効率的に折り畳まれる。【００２０】  本発明の融合タンパク質の製造方法によれば、本発明の融合タンパク質を効率よく製造することができる。【００２１】  本発明の目的タンパク質の製造方法によれば、正しく折り畳まれた目的タンパク質を高効率で製造することができる。【００２２】  本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの精製方法によれば、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下で高い活性を示すＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを簡便に精製することができる。【００２３】  本発明の融合タンパク質の精製方法によれば、目的タンパク質の製造に有用な融合タンパク質を簡便に精製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】［図１］メタン生成菌に属する古細菌由来の９種のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列を並べて比較した図である。
［図２］実施例１で構築した発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２の構成を表す模式図である。
［図３］実施例５でＭａＦＫＢＰ１７．８を製造した結果を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢのゲルの写真である。
［図４］実施例８でＭａＦＫＢＰ２８．０を製造した結果を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢのゲルの写真である。
［図５］実施例９で行ったＭａＦＫＢＰ１７．８の分子シャペロン活性の評価結果を表すグラフである。
［図６］実施例１０におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢのゲルの写真であり、図６（ａ）は融合タンパク質を製造した結果を表し、図６（ｂ）はロダネーゼを製造した結果を表し、図６（ｃ）は比較例の結果を表す。
［図７］実施例１５、１６及び１７におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ＣＢＢのゲルの写真であり、図７（ａ）は実施例１５で融合タンパク質を製造した結果を表し、図７（ｂ）は実施例１６で融合タンパク質を製造した結果を表し、図７（ｃ）は実施例１７で融合タンパク質を製造した結果を表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】  以下、本発明を実施するための最良の形態について、詳しく説明する。【００２６】  本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの一つは、メタン生成菌に属する常温性古細菌に由来するものである。ここで、「常温性古細菌」とは常温菌（中温菌ともいう）のうち古細菌に属する生物種を指し、Ｍａｄｉｇａｎらの分類法によると、一般に、至適生育温度が２０〜４５℃である古細菌を指す（Ｍａｄｉｇａｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，“Ｂｌｏｃｋ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｚｍ”８ｔｈ  ｅｄ．，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。また、この場合の「至適生育温度」とは、その微生物の増殖速度が最も早められる温度を指す。メタン生成菌に属する常温性古細菌としては、特に限定されず、例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｈａｅｒａ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ属、及びＭｅｔｈａｎｏｉｇｎｉｓ属、並びにＭｅｔｈａｎｏｍｉｃｒｏｂｉａｌｅｓ目等に属する古細菌が挙げられる。特に、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属に属する古細菌、とりわけ、Ｍａｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ、及びＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、低温から常温域でかつ通常の生化学的な環境下において、ＰＰＩａｓｅ活性及び／又は分子シャペロン活性が高く、好適である。なお、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのタンパク質折り畳み作用は、その分子シャペロン活性によるところが大きいと考えられるが、ＰＰＩａｓｅ活性も寄与している。【００２７】  一般に、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、分子量が１６〜１８ｋＤａ程度のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと、分子量が２６〜３３ｋＤａ程度のロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとに大別される。そして、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、これまでの解析の結果、ショートタイプとロングタイプのいずれもが分子シャペロン活性を有するが、ＰＰＩａｓｅ活性については、ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの方がより高いことが知られている。さらに、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ショートタイプ及びロングタイプのいずれも、ＰＰＩａｓｅ活性及びＦＫ５０６結合活性を担うＦＫＢＰドメインを有し、ＦＫＢＰドメイン中に古細菌ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに特徴的なバルジ領域及びフラップ領域の２つの挿入配列を有していることが特徴である（Ｍａｒｕｙａｍａ  Ｔ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｒ，Ｆｕｒｕｔａｎｉ  Ｍ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．（２００４）９：１６８０−７２０）。そして、ロングタイプ古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、上記２つの挿入配列を有するＦＫＢＰドメインのＣ末端側に、約１００〜１５０アミノ酸からなるＣ末端ドメインを有する。本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、ショートタイプ、ロングタイプのいずれでもよい。【００２８】  また、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでショートタイプのものは、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列（以下、「コンセンサス配列Ｂ」と称する。）からなるモチーフを、その一部���含むアミノ酸配列を有することが好ましい。なお、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列中のＸａａは任意のアミノ酸で、それらは互いに異なるアミノ酸でもよいし、同じアミノ酸でもよい。コンセンサス配列Ｂは、配列番号１、２又は３の他に、下記一般式（Ｉ）で表すこともできる。
2005063964.tif 000002
【００２９】  さらに、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでショートタイプのものは、配列番号４で表されるアミノ酸配列（以下、「コンセンサス配列Ａ」と称する。）からなるモチーフを、そのＮ末端領域に含まないことが好ましい。ここで、Ｎ末端領域とは、そのタンパク質のＮ末端から略４０アミノ酸残基までの領域をいう。【００３０】  本発明者らは、メタン生成菌に属する常温性古細菌由来の９種のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列（遺伝子の塩基配列からの推定）を比較し、上記したコンセンサス配列の有無により３つのグループに分類されることを見出した。すなわち、グループ１のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、コンセンサス配列ＡをそのＮ末端領域に含まないが、コンセンサス配列Ｂをそのアミノ酸配列中に含むものである。また、グループ２ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、コンセンサス配列ＡそのＮ末端領域に含まないが、コンセンサス配列ＢのＰｈｅが他のアミノ酸に置き換わったアミノ酸配列をそのアミノ酸配列中に含むものである。また、グループ３のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、コンセンサス配列ＡをそのＮ末端領域に含み、かつコンセンサス配列Ｂもそのアミノ酸配列中に含むものである。これらのグループ１、グループ２及びグループ３のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのアミノ酸配列を並べて比較した図を図１に示す。なお、図１においてはアミノ酸配列を１文字表記で表している。【００３１】  図１において、ＭａＦＫＢＰ１７．８はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号８）、ＭｍＦＫＢＰ１８．０はＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来のグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号６）、ＭｂＦＫＢＰ１９はＭａｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来のグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１０）である。また、ＭｂＦＫＢＰ２１はＭ．ｂａｒｋｅｒｉ由来のグループ３型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１１）、ＭｍＦＫＢＰ１７．９はＭ．ｍａｚｅｉ由来のグループ３型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１２）、ＭａＦＫＢＰ１９はＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のグループ３型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１３）である。また、ＭａＦＫＢＰ１８．２はＭ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来のグループ２型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１４）、ＭｍＦＫＢＰ１８．２はＭ．ｍａｚｅｉ由来のグループ２型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１５）、ＭｂＦＫＢＰ１８はＭ．ｂａｒｋｅｒｉ由来のグループ２型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（配列番号１６）である。【００３２】  各コンセンサス配列についてさらに詳しく説明する。まずコンセンサス配列Ｂは、図１で囲んで示した各アミノ酸配列のＣ末端側の配列、「Ｄ＊ＮＨ＊ＬＡＧ＊＊＊＊Ｆ」（＊は任意のアミノ酸）に対応するアミノ酸配列である。このコンセンサス配列Ｂを一般化すると、Ａｓｐ−Ａ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｂ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｘ−Ｐｈｅ（Ａは任意のアミノ酸、Ｂは任意の���ミノ酸、Ｘは３〜５個の任意のアミノ酸からなるペプチド）と表現することができ、これは、配列番号１、２又は３で表されるアミノ酸配列と同じである。このコンセンサス配列Ｂは、古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに見られる特徴的なモチーフである。このコンセンサス配列Ｂの中で重要なアミノ酸はＣ末端のＰｈｅであり、前述の通り、本箇所のアミノ酸の種類によってショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを、グループ１とグループ２に分類することができる。なお、コンセンサス配列ＢのＸは、３〜５個の任意のアミノ酸からなるペプチドであるが、図１の例のように４個のアミノ酸からなる場合が多い。【００３３】  一方、コンセンサス配列Ａは、図１で囲んで示したグループ３のＮ末端側の配列、「ＧＳＧＣ」に対応するアミノ酸配列である。これは、配列番号４で表されるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓである。このコンセンサス配列Ａは、一部の常温性古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのＮ末端に近い領域に見られるモチーフであり、前述の通り、本モチーフの有無によってショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをグループ３とその他のグループに分類することができる。すなわち、本モチーフを有するショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、グループ３に属する。本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅにおいては、コンセンサス配列Ｂを有するグループ１が特に好ましく、さらに、コンセンサス配列ＢをＮ末端領域に有さないことが好ましい。なお、グループ３のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅであっても、そのＮ末端領域を改変又は欠失させることによってコンセンサス配列Ａを除去すれば、グループ１のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに変換することができる。【００３４】  これらのショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのなかでも、グループ１のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、グループ２又はグループ３のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅに比べて、その分子シャペロン活性が高い。このようなグループ１のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅは、例えば、上述のＭ．ｍａｚｅｉ、Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉ等のＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ属細菌に属する古細菌が有している。ここで、Ｍ．ｍａｚｅｉに由来するグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を配列番号５に、アミノ酸配列のみを配列番号６に示す。同様に、Ｍ．ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓに由来するグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を配列番号７に、アミノ酸配列のみを配列番号８に示す。また同様に、Ｍ．ｂａｒｋｅｒｉに由来するグループ１型ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を配列番号９に、アミノ酸配列のみを配列番号１０に示す。【００３５】  一方、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅのうち、ロングタイプの例として、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓに由来するロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする遺伝子の塩基配列と推定されるアミノ酸配列を配列番号１７に、アミノ酸配列のみを配列番号１８に示す。【００３６】  本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと実質的に同一のアミノ酸配列を有し、かつ、実質的に同一の活性を有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅもまた、本発明の１つである。ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を有する」とは、アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が欠失したもの、アミノ酸配列に１又は２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が付加したもの、アミノ酸配列中の１又は２個以上（好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたもの等を意味する。また、実質的に同一のアミノ酸配列を有するとは、相同性が少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上であることを意味する。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えば、ＣｕｌｕｓｔａｌＷ等の市販の多重整列プログラムを用いて計算することができる。【００３７】  また、「実質的に同一の活性」とは、分子シャペロン活性及び／又はＰＰＩａｓｅ活性が実質的に同一であることを指す。なお、分子シャペロン活性の評価は、例えば、ロダネーゼ、クエン酸合成酵素、リンゴ酸脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素等をモデル酵素とし、これを６Ｍ塩酸グアニジン等のタンパク質変性剤で変性処理後、検定対象物質を含む緩衝液で変性剤を希釈した際に開始する変性タンパク質の再生率や、変性タンパク質の凝集の抑制率を測定することにより行うことができる（河田、バイオサイエンスとインダストリー  ５６，５９３−、１９９８年；Ｈｏｒｏｗｉｔｚ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０、３６１−、１９９５年；Ｔａｇｕｃｈｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、８５２９−、１９９４年）。また、ＰＰＩａｓｅ活性の評価は、例えば、キモトリプシンカップリング法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９８，１８０（２）：３８８−３９４）により行なうことができる。【００３８】  本発明の発現ベクターは、上記した本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を発現できるものである。すなわち、本発明の発現ベクターは、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅをコードする第１コード領域と、少なくとも１つの制限酵素サイトを有するものであり、この制限酵素サイトに目的タンパク質をコードする第２コード領域を挿入することによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の融合タンパク質を発現することができる。ここで、融合タンパク質が発現できるということは、換言すれば、制限酵素サイトは、第１コード領域と同じ解読枠内に位置しているということである。さらに換言すれば、該制限酵素サイトに第２コード領域を挿入したときに、第１コード領域と第２コード領域の解読枠が一致しており、かつ第１コード領域と第２コード領域の間に終止コドンが存在しないということである。なお、制限酵素サイトの位置は第１コード領域の上流でもよいし下流でもよい。制限酵素サイトが第１コード領域の下流にあるときは、第１コード領域はプロモーターに有効に連結していることが必要である。そのような発���ベクターによれば、該プロモーターによって第１コード領域から転写が開始され、Ｎ末端側がＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅでＣ末端側が目的タンパク質である融合タンパク質を発現することができる。【００３９】  上記プロモーターとしては、用いる発現系に応じて適宜選択すればよく、宿主内で発現させる場合は、その宿主に適合したものを用いればよい。宿主が大腸菌であれば、例えば、Ｐｌａｃプロモーター、Ｐｔａｃプロモーター、ｘｙｌＡプロモーター、ＡｒａＢプロモーター、ｌａｍｂｄａプロモーター、Ｔ７プロモーター等を用いることができる。ほ乳細胞系によって発現させる場合は、ほ乳類細胞のゲノムから単離された、例えばマウスメタロチオネインプロモーター等のプロモーターや、これらの細胞で成長するウイルスから単離された、例えばバキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター等のプロモーターを用いることができる。【００４０】  本発明の発現ベクターにおいては、さらに、第１コード領域と前記制限酵素サイトの間にペプチドリンカーとなる塩基配列を有してもよい。そのようなペプチドリンカーの代表例はプロテアーゼ消化アミノ酸配列である。すなわち、本発明の発現ベクターにおいては、第１コード領域と前記制限酵素サイトとの間にプロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列を有することが好ましい。該プロテアーゼ消化アミノ酸配列をコードする塩基配列は、第１コード領域及び第２コード領域と同じ解読枠内で転写・翻訳され、プロテアーゼ消化アミノ酸配列となる。すなわち、本実施形態の発現ベクターによれば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質とがプロテアーゼ消化アミノ酸配列を介して連結された融合タンパク質を発現することができる。そして、該融合タンパク質に対応のプロテアーゼを作用させることにより、目的タンパク質を切り出すことができる。【００４１】  上記プロテアーゼとしては特に限定されず、例えば、トロンビン、ファクターＸａ、プレシジョンプロテアーゼ、エンテロキナーゼ等が挙げられる。これらのプロテアーゼとしては、例えば、市販されているものを用いることができる。また、プロテアーゼ認識アミノ酸配列以外のペプチドリンカーとしては、例えば、インテインの自己切断アミノ酸配列が挙げられる。すなわち、インティンの自己タンパク質スプライシング機能を利用して融合タンパク質から目的タンパク質を切り出すことができる。なお、ペプチドリンカーをコードする塩基配列の長さは特に限定されないが、１５〜９０塩基程度であることが好ましく、翻訳されてグリシンやセリン等の中性アミノ酸となる塩基配列を多く含むことが好ましい。【００４２】  本発明の発現ベクターは、さらに、他の従来公知の塩基配列を含んでいてもよい。上記他の従来公知の塩基配列としては特に限定されず、例えば、発現産物の安定性を付与する安定性リーダー配列、発現産物の分泌を付与するシグナル配列、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の形質転換された宿主において表現型選択を付与することが可能なマーキング配列等が挙げられる。【００４３】  上記した発現ベクターの制限酵素サイトに、目的タンパク質をコードする第２コード領域がすでに組み込まれている発現ベクターも、本発明の１つである。このような発現ベクターによれば、第２コード領域を組み込む操作が不要であり、そのまま転写・翻訳させることによりＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。第２コード領域にコードされる目的タンパク質としては、例えば、抗体又は抗体の部分断片が挙げられる。抗体の部分断片としては、Ｆａｂ、Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆｃ、抗体の各ドメインの２個以上の断片がペプチド結合で連結したポリペプチド等が挙げられる。また、上記抗体の由来動物やサブクラスは何でもよい。このように、抗体又は抗体の部分断片をコードする第２コード領域を含むベクターを使用すると、大腸菌等の宿主内で発現させても封入体とならず、正しく折り畳まれた抗体を得ることができる。その結果、従来のように動物を用いて抗体を作らせる必要がなく、より簡便かつ大量に抗体を得ることができる。なお、抗体をコードする遺伝子は、例えば、ハイブリドーマから調製することができる。そして、単一のハイブリドーマから得られる抗体をコードする遺伝子は単一であるので、得られる抗体はモノクローナルな抗体である。一方、ポリクローナルな抗体を取得する場合は、例えば、複数種のハイブリドーマからそれぞれ抗体をコードする遺伝子を取得し、それらの遺伝子を別々のベクターに組み込み、別々の形質転換体を作製し、それらの形質転換体を混合培養すればよい。【００４４】  第２コード領域にコードされる目的タンパク質の他の例としては、細胞内受容体タンパク質が挙げられる。生理活性物質を受容する細胞内受容体タンパク質は、ほとんどが生体膜中に存在する。これらの細胞内受容体タンパク質は細胞外の様々な物質に選択的に応答し、細胞内に多彩なシグナルを伝達することから、その機能を解明することが創薬に直接繋がるとして非常に注目されている。これらの細胞内受容体タンパク質は構造的によく保存されたファミリーを形成しており、大きく分けて、イオンチャネル内在型、チロシンカイネース型、及びＧタンパク質共役型の３つに分類される。【００４５】  イオンチャネル内在型は、リガンドが受容体に結合すると、受容体そのものに存在するイオンチャネルが開き、Ｎａ＋やＣａ２＋等を細胞内外のイオン勾配を利用して細胞内に移動させるタイプである。チロシンカイネース型は、リガンドの結合をリン酸化活性の上昇に転換させ、一連のカスケードを引き起こすことによりシグナルを増幅する。Ｇタンパク質共役型は、受容体自身はイオンチャネルや酵素活性を持たず、リガンドの結合による情報をＧタンパク質を介して細胞内に伝達する。【００４６】  細胞内受容体タンパク質を標的とした医薬品は数多く開発されているが、その多くがＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）をターゲットとしている。したがって、ＧＰＣＲの内因性リガンドを特定し、さらにその機能及び構造を明らかにすることによって、迅速な医薬品開発が可能になることが期待できる。これらのリガンドスクリーニングや構造解析のための結晶化や重水素化のためにはＧＰＣＲの大量発現技術の開発が不可欠��あるが、これまでＧＰＣＲの発現は大腸菌や酵母では不可能であるとされてきており、主にＣＨＯやＣＯＳ−７、ＨＥＫのような動物培養細胞で発現した微量なサンプルを用いて様々な分析を行っているのが現状であった。しかし、本発明の発現ベクターによれば、細胞内受容体タンパク質についても、大腸菌等を用いて組換え型タンパク質を安価に、かつ、大量に製造することができる。【００４７】  本発明の形質転換体は、上記した発現ベクターのうち、第２コード領域がすでに組み込まれている発現ベクターを含有するものである。本発明の形質転換体を培養することにより、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質を製造することができる。本発明の形質転換体の元となる宿主は、本発明の発現ベクターの特性と適合するものであれば特に制限はなく、例えば、細菌等の原核生物、酵母、真菌、植物、昆虫細胞、ほ乳類細胞等が挙げられる。ここで、宿主が発現ベクターの特性と適合するとは、宿主内においてその発現ベクターが複製可能であり、かつ第１コード領域と第２コード領域を転写・翻訳できるということである。特に、転写が正常に行われるためには、発現ベクター上のプロモーターが正常に働く宿主を選択することが必要である。【００４８】  上記宿主のうち、大腸菌はその取り扱いが容易であり、かつ宿主ベクター系も充実しているので特に好適である。大腸菌を宿主として用いる場合、発現ベクターから転写・翻訳される融合タンパク質は、細胞質に発現させてもよいし、ペリプラズム領域に発現させてもよい。ペリプラズム領域に融合タンパク質を発現させる場合は、融合タンパク質の５’末端にシグナル配列が付加されるように発現ベクターを構築し、大腸菌に導入すればよい。【００４９】  本発明の形質転換体を作成する際の、発現ベクターを宿主に導入する方法は、公知の種々の方法を用いることができ、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気穿孔、リポソーム融合、核注入、ウイルス又はファージ感染等が挙げられる。【００５０】  なお、本発明の発現ベクターは、宿主に導入する以外に、バクテリア又は真核生物抽出液等を用いた無細胞翻訳系（Ｓｐｉｒｉｎ，Ａ．Ｓ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１，２６５６−２６６４：Ｆａｌｃｏｎｅ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１，２６５６−２６６４）にて発現させることも可能である。無細胞翻訳系は、目的タンパク質が宿主に毒性を示すものである場合等に有効である。【００５１】  本発明の融合タンパク質の主な実施形態は、メタン生成菌に属する常温性古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質との融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質によれば、目的タンパク質が単独で発現すると正しく折り畳まれずに異常型タンパク質となってしまう場合でも、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させることで、目的タンパク質を正しく折り畳まれた正常型タンパク質として発現することができる。その結果、正常型の目的タンパク質の生産性を飛躍的に向上させることができる。なお、目的タンパク質は適宜の方法で融合タンパク質から切り出すことができる。例えば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の間にプロテ��ーゼ認識アミノ酸配列を挿入しておけば、融合タンパク質に該プロテアーゼを作用させることにより、目的タンパク質を切り出し、単離することができる。なお、本発明の融合タンパク質は、例えば、上記した発現ベクター上の第１コード領域と第２コード領域を転写・翻訳することにより製造することができる。さらに、第１コード領域と第２コード領域の間にプロテアーゼ認識アミノ酸配列をコードする塩基配列を挿入しておけば、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質の間にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を有する融合タンパク質を製造することができる。【００５２】  本発明の目的タンパク質の製造方法は、メタン生成菌に属する常温性古細菌由来のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの作用を利用して、正しく折り畳まれた正常型の目的タンパク質を製造するものである。この際、該ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅを目的タンパク質に作用させる態様は主に２つある。１つの態様は、上記したように、目的タンパク質をＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとの融合タンパク質として発現させる、融合発現法である。融合発現法の場合は、目的タンパク質を切り出す工程が必要である。もう１つの態様は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅと目的タンパク質をそれぞれ単独に同時に発現させる、共発現法である。共発現法によれば、目的タンパク質を切り出す必要がなく、製造工程を減らすことができる。なお、宿主を用いた共発現法の場合は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの遺伝子と目的タンパク質の遺伝子は、同じ発現ベクター上に存在してもよく、別々の発現ベクターに組み込まれていてもよい。同じ発現ベクター上に存在する場合は、例えば、それぞれの遺伝子が別々のプロモーター下流に組み込めばよい。さらに、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの遺伝子を宿主のゲノム上に、目的タンパク質の遺伝子を発現ベクター上に組み込む構成も可能である。【００５３】  本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質は、タンパク質の精製に一般的に用いられている手法、すなわち、塩析、膜分離、各種クロマトグラフィー等を組み合わせることにより精製することができる。特に、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅの分子表面が疎水性アミノ酸に富んでいることを利用し、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いることにより、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質を高純度に精製することができる。例えば、樹脂等に固定化された疎水基を介してＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を樹脂に吸着させ、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質が溶出されないような条件で樹脂を洗浄して不純物となる成分を除去することができる。なお、疎水基の例としては、Ｃ４〜Ｃ２０程度のアルキル基、フェニル基等が挙げられる。また、精製に供するためのＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質を含む試料は、例えば、それらの遺伝子を含有する形質転換体の培養物から調製することができる。【００５４】  また、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ及び融合タンパク質は、ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとＦＫ５０６との親和性を利用して精製することもできる。すなわち、ＦＫ５０６やラパマイシン、その類縁化合物を担持させた担体を調製して、該担体にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を含む試料を接触させ��担体上にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を捕捉することができる。その後、適宜の方法で担体からＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を回収すればよい。【００５５】  また、ヒスチジン６残基程度からなるヒスチジンタグをあらかじめ、本発明のＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質の末端に導入しておくことにより、それらの精製を容易にすることができる。すなわち、ヒスチジンタグを末端に有するＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質は、ニッケル等の金属をキレートした担体上に、ヒスチジンタグを介して結合する。具体的には、ニッケル等の金属をキレートした担体にＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を含む試料を接触させ、該担体上にヒスチジンタグを介してＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を捕捉することができる。その後、イミダゾール等で溶出して担体からＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質を回収すればよい。このようなタグを用いる方法としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ又はその一部分をタグとし、グルタチオン樹脂によるアフィニティークロマトグラフィーにより精製する方法や、マルトース結合タンパク質又はその一部をタグとし、マルトース樹脂により精製する方法等がある。なお、これらのタグは、ＰＰＩａｓｅ又は融合タンパク質のＮ末端側及びＣ末端側のいずれに導入してもよく、双方に導入してもよい。【００５６】  以下に実施例を掲げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。
【実施例１】
【００５７】  本実施例では、メタン生成菌に属する古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｍＦＫＢＰ１８．０）と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。なお、ＭｍＦＫＢＰ１８．０はグループ１型のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。【００５８】  Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ  Ｇｏｅ１（ＤＳＭ３６４７）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、フェノール／クロロホルム処理、及び、エタノール沈殿法により、ゲノムＤＮＡを回収した。一方、配列番号５に示される公知のＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号１９に示されるＭｍ１８−Ｆ１プライマー及び配列番号２０に示されるＭｍ１８−Ｒ１プライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍｍ１８−Ｆ１プライマー及びＭｍ１８−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍｍ１８−Ｆ１の５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＭｍ１８−Ｒ１の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。【００５９】  一方、配列番号３９に示されるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２及びその相補鎖であるリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２を合成した。なお、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２は、５’側にＳｐｅＩサイトを、３’側にＥｃｏＲＩサイトを有し、内部には目的タンパク質の遺伝子を導入するためのＢａｍＨＩサイト及びＮｄｅＩサイトを有している。さらに、融合タンパク質から目的タンパク質をトロンビンにより切り出せるように、ＢａｍＨＩサイトの上流に、翻訳されてトロンビン認識アミノ酸配列となる塩基配列を有している（図２）。次に、リンカーＴｈｒｏｍ−Ｆ２とリンカーＴｈｒｏｍ−Ｒ２をアニーリングさせ、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍを調製した。【００６０】  ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをＳｐｅＩ／ＥｃｏＲＩでそれぞれ処理し、あらかじめＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにて処理したｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡ（ノバジェン社製）に、ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子−２本鎖リンカーの順になるよう挿入して、発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２を構築した。発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２の構成を図２に示す。すなわち、発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２は、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１８．０遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードする塩基配列、ＢａｍＨＩサイト、及びＮｄｅＩサイトを有する。そして、ＢａｍＨＩサイト又はＮｄｅＩサイトに第２コード領域となる目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、ＭｍＦＫＢＰ１８．０と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭｍＦＫＢＰ１８．０と目的タンパク質の間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。
【実施例２】
【００６１】  本実施例では、メタン生成菌に属する古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭｂＦＫＢＰ１９．０）と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。なお、ＭｂＦＫＢＰ１９．０はグループ１型のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。【００６２】  Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｂａｒｋｅｒｉ  ｔｙｐｅ  ｓｔｒａｉｎ（ＤＳＭ８００）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、実施例１と同様の操作でゲノムＤＮＡを回収した。配列番号９に示される公知のＭｂＦＫＢＰ１９．０遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号２１に示されるＭｂ１９−Ｆ１プライマー及び配列番号２２に示されるＭｂ１９−Ｒ１プライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍｂ１９−Ｆ１プライマー及びＭｂ１９−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭｂＦＫＢＰ１９．０遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＭｂＦＫＢＰ１９．０遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍｂ１９−Ｆ１の５’末端に由来するＳｐｈＩサイト及びＭｂ１９−Ｒ１の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。次に、実施例１と同様にして、ＭｂＦＫＢＰ１９．０遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片と、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをｐＥＴ２１プラスミドＤＮＡに挿入して、発現ベクターｐＭｂ１９Ｆ２を構築した。すなわち、発現ベクターｐＭｂ１９Ｆ２は、図２に示される発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２の構成のうち、ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子に代わってＭｂＦＫＢＰ１９．０遺伝子とした構成を有する。
【実施例３】
【００６３】  本実施例では、メタン生成菌に属する古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ１７．８）と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。なお、ＭａＦＫＢＰ１７．８はグループ１型のショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅである。【００６４】  Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ（ＤＳＭ２８３４）の菌懸濁液から菌ペレットを回収し、実施例１と同様の操作でゲノムＤＮＡを回収した。配列番号７に示される公知のＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号２３に示されるＭａ１７．８−Ｆ１プライマー及び配列番号２４に示されるＭａ１７．８−Ｒ１プライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍａ１７．８−Ｆ１プライマー及びＭａ１７．８−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍａ１７．８−Ｆ１の５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＭａ１７．８−Ｒ１の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。次に、実施例１と同様にして、ＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片と、２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをｐＥＴ２１プラスミドＤＮＡに挿入して、発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２を構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２は、図２に示される発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２の構成のうち、ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子に代わってＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子とした構成を有する。
【実施例４】
【００６５】  本実施例では、Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ由来ロングタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＭａＦＫＢＰ２８．０）と目的タンパク質との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。【００６６】１．発現ベクターの構築
公知の配列番号１７に示されるＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして、配列番号３７で示されるＭａ２８−Ｆ１プライマー及び配列番号３８で示されるＭａ２８−Ｒ１プライマーを合成した。次に、実施例３で調製したＭｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ  Ｃ２Ａ（ＤＳＭ２８３４）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｍａ２８−Ｆ１プライマー及びＭａ２８−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｍａ２８−Ｆ１の５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＭａ２８−Ｒ１の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。次に、実施例１と同様にしてＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子及び２本鎖リンカーＴｈｒｏｍをｐＥＴ２１ｄプラスミドＤＮＡのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩサイトに挿入して、発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２を構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２は、図２に示される発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２の構成のうち、ＭｍＦＫＢＰ１８．０遺伝子に代わってＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子とした構成を有する。
【実施例５】
【００６７】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８を製造・精製した。【００６８】１．ＭａＦＫＢＰ１７．８の製造
実施例３で調製した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に導入し、形質転換体を得た。２Ｌ容の三角フラスコに、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む２×ＹＴ培地（１６ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌバクトトリプトン、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）７００ｍＬを仕込み、得られた形質転換体を白金耳で２〜３回接種し、３５℃で２４時間回転培養（１１０ｒｐｍ）した。培養終了後、培養液を遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分）し、菌体を回収した。得られた菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて凍結保存した。【００６９】  凍結保存した菌体懸濁液を融解し、超音波処理をして菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清（可溶性画分）と沈殿部（沈殿画分）に分離した。さらに沈殿画分を４％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁して３０分間処理し、膜成分を可溶化した。懸濁液を遠心分離して、沈殿を回収した。この操作を２回繰り返し、得られた沈殿を２０ｍＬの２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ６．８）に懸濁して封入体画分を調製した。可溶性画分１０μｇ（５μＬ）と、５μＬの封入体画分をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ供し、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）にてゲルを染色した。図３にゲルの写真を示す。図３において、左側のレーンが可溶性画分であり、右側のレーンが沈殿画分である。すなわち、ＭａＦＫＢＰ１７．８に相当するバンド（矢印）は、可溶性画分のみに検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８は封入体になることなく、可溶状態で回収された。【００７０】２．ＭａＦＫＢＰ１７．８の精製
得られた可溶性画分を下記条件の疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び、ゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、ＭａＦＫＢＰ１７．８をほぼ単一にまで精製した。なお、疎水性相互作用クロマトグラフィーの段階で、ＭａＦＫＢＰ１７．８はほとんど単一になっていた。
（ａ）疎水性相互作用クロマトグラフィーの条件
使用カラム：ＨｉｇｈＴｒａｐ  Ｐｈｅｎｙｌ  ＦＦ
（容量５ｍＬ、アマシャムバイオサイエンス社製）
溶離液
Ａ液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）／５００ｍＭ硫酸アンモニウム含有
Ｂ液：１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．８）
溶出条件：０−５０分：Ｂ液０−１００％の直線グラジェント溶出
５０−７０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：３ｍＬ／分
カラム温度：室温
（ｂ）ゲル濾過条件
使用カラム：ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ｃｏｌｕｍｎ
（２６ｍｍ×６０ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社製）
溶離液：１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ含有）
溶出条件：イソクラティック溶出
流速：３ｍＬ／分
カラム温度：室温【００７１】  次に、精製したＭａＦＫＢＰ１７．８のＰＰＩａｓｅ活性を以下の手順で評価した。ＰＰＩａｓｅ活性の測定はキモトリプシンカップリング法に準拠して行った。すなわち、２ｍＬの１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）に、ＭａＦＫＢＰ１７．８を２．５−２５ｎＭ、ＰＰＩａｓｅの基質ペプチドであるＮ−ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（ペプチド研究所）を最終濃度２μＭになるように加え、１５℃で２分間プレインキュベートした。次いで、キモトリプシンを最終濃度２μＭとなるように添加し、遊離されるｐ−ニトロアニリドの吸光度を測定することでＰＰＩａｓｅ活性を評価した。その結果、ＭａＦＫＢＰ１７．８のＰＰＩａｓｅ活性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）は３．３４ｓ−１・μＭ−１であった。この値は、以下の既報の好熱・超好熱菌由来ＦＫＢＰ型ショートタイプＰＰＩａｓｅのＰＰＩａｓｅ活性、すなわち、好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｌｉｔｈｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ由来ＰＰＩａｓｅ（ＭｔＦＫＢＰ１７）の０．３８ｓ−１・μＭ−１、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１  ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）の０．３５ｓ−１・μＭ−１、超好熱性古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来ＰＰＩａｓｅ（ＭｊＦＫＢＰ１８）の０．９２ｓ−１・μＭ−１の（Ｉｄｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２００２  Ｊｕｎ  １２；２９２（１−２）：５７−６３）と比較して、有意に高かった。
【実施例６】
【００７２】  本実施例では、ＭｍＦＫＢＰ１８．０を製造・精製した。【００７３】１．ＭｍＦＫＢＰ１８．０の製造
実施例１で調製した発現ベクターｐＭｍ１８Ｆ２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。次に、実施例５と同様にして、形質転換体を培養し、菌体回収後、菌体懸濁液を−２０℃で凍結保存した。さらに、実施例５と同様にして菌体懸濁液を超音波処理し、その上清画分（可溶性画分）を得た。上清画分１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＭｍＦＫＢＰ１８．０に相当する濃いバンドが検出され、ＭｍＦＫＢＰ１８．０が大量に可溶性画分に発現していることが確認された。【００７４】２．ＭｍＦＫＢＰ１８．０の精製
得られた上清画分を実施例５と同様の疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル濾過法、並びに、下記条件の陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、カラム精製を繰り返すことにより、ＭｍＦＫＢＰ１８．０をほぼ単一にまで精製した。
（ｃ）陰イオン交換クロマトグラフィー条件
使用カラム：ＤＥＡＥ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ｃｏｌｕｍｎ
（１６ｍｍ×６０ｃｍ；東ソー社）
溶離液
Ａ液：２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ衝液（ｐＨ６．８）
Ｂ液：０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ緩衝液（ｐＨ６．８）
溶出条件：０−３００分：Ｂ液０−１００％の直線グラジエント溶出
３００−４２０分：Ｂ液１００％のイソクラティック溶出
流速：１ｍＬ／分
カラム温度：室温
【実施例７】
【００７５】  本実施例では、ＭｂＦＫＢＰ１９．０を製造・精製した。【００７６】１．ＭｂＦＫＢＰ１９．０の製造
実施例２で調製した発現ベクターｐＭｂ１９Ｆ２を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を得た。次に、実施例５と同様にして、形質転換体を培養し、菌体回収後、菌体懸濁液を−２０℃で凍結保存した。さらに、実施例５と同様にして菌体懸濁液を超音波処理し、その上清画分（可溶性画分）を得た。上清画分１０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、ＭｂＦＫＢＰ１９．０に相当する濃いバンドが検出され、ＭｂＦＫＢＰ１９．０が大量に可溶性画分に発現していることが確認された。【００７７】２．ＭｂＦＫＢＰ１９．０の精製
得られた上清画分を実施例６と同様にして疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過法、及び、陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、カラム精製を繰り返すことにより、ＭｂＦＫＢＰ１９．０をほぼ単一にまで精製した。
【実施例８】
【００７８】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ２８．０を製造した。【００７９】  実施例５と同様にして、発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２を含有する形質転換体の作製、培養、菌体破砕、可溶性画分と沈殿画分の調製、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。図４にゲルの写真を示す。図４において、左側のレーンが可溶性画分であり、右側のレーンが沈殿画分である。すなわち、ＭａＦＫＢＰ２８．０に相当するバンド（矢印）は、可溶性画分のみに検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ２８．０は封入体になることなく、可溶状態で回収された。
【実施例９】
【００８０】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８が分子シャペロン活性を有することを確認した。【００８１】  ６Ｍ塩酸グアニジン及び５ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）にロダネーゼを最終濃度６３μＭになるよう溶解し、２５℃で６０分処理し、ロダネーゼを変性させた。得られた変性ロダネーゼ溶液を１０μＭ  ＭａＦＫＢＰ１７．８及び１０ｍＭ  ＤＴＴを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．８）で６０倍に希釈し、そのまま４５分間処理した。処理後、再生したロダネーゼの活性をホロビッチ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０，３６１−３６８（１９９５））の方法に従って評価した。再生したロダネーゼ活性の値を、ネイティブ型ロダネーゼの活性を１００％とした相対値で表し、分子シャペロン活性とした。対照として、ＭａＦＫＢＰ１７．８を添加しなかった溶液におけるロダネーゼの活性を測定した。結果を図５に示す。すなわち、ＭａＦＫＢＰ１７．８非存在下では、ロダネーゼは５％程度しか再生しなかったのに対し、ＭａＦＫＢＰ１７．８存在下では約７６％のロダネーゼが再生した。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８の作用によって変性ロダネーゼが正しく折り畳まれて正常型のロダネーゼに再生されることが示された。
【実施例１０】
【００８２】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８と超好熱菌（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）由来ロダネーゼからなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。さらに、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用い、該培養物より該融合タンパク質を精製した。さらに、精製された該融合タンパク質からロダネーゼを切り出し、ロダネーゼを正常型タンパク質として取得した。【００８３】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
理化学研究所より入手したＡｅｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（ＪＣＭ９８２０。ＤＳＭ１１８７９と同じ。）の菌ペレットを用いて実施例１と同様の方法によりゲノムＤＮＡを調製した。一方、配列番号４０に示される公知のＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子の塩基配列を参考にして、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号２５に示されるＡｐＴＳ−Ｆ１プライマー及び配列番号２６に示されるＡｐＴＳ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＡｐＴＳ−Ｆ１プライマー及びＡｐＴＳ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片の塩基配列を確認したところ、公知のＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子の塩基配列と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＡｐＴＳ−Ｆ１の５’末端に由来するＮｄｅＩサイト及びＡｐＴＳ−Ｒ１の３’末端に由来するＨｉｎｄＩＩＩサイトが導入された。次に、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理し、実施例３で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭｍＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼの間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【００８４】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。ゲルの写真を図６（ａ）に示す。すなわち、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質（（図中では「ＭａＦＫＢＰ１７．８−ｒｈｏ融合タンパク質」と表示））に相当するバンド（矢印）が、可溶性画分に認められた。以上より、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼはＭａＦＫＢＰ１７．８との融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。【００８５】３．融合タンパク質の精製
得られた可溶性画分を実施例５と同様の条件で疎水性相互作用クロマトグラフィー及びゲル濾過の順でカラム精製を繰り返すことにより、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼの融合タンパク質を精製した。【００８６】４．ロダネーゼの製造
精製した融合タンパク質１ｍｇ当たりに１Ｕのトロンビンを加え、２２℃にて１６時間処理した。反応液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。ゲルの写真を図６（ｂ）に示す。左側のレーンはトロンビン添加前、右側のレーンはトロンビン添加・処理後の試料である。すなわち、トロンビン添加前の試料ではＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質のみが検出されたが、トロンビン添加・処理後の試料では当該融合タンパク質は検出されず、ロダネーゼに相当するバンドとＭａＦＫＢＰ１７．８に相当するバンドが検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質のトロンビン認識サイトが切断され、ロダネーゼが切り出されていることが確認された。【００８７】  比較例として、以下の手順でＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子を単独で発現させた。実施例１０で調製したＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化産物を、あらかじめＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにより処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡに挿入し、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼを単独で発現する発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。作製した形質転換体を実施例４と同様の方法で培養・回収し、得られた菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。ゲルの写真を図６（ｃ）に示す。左側のレーンは可溶性画分、右側のレーンは沈殿画分である。すなわち、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ（矢印）は封入体画分にのみ検出され、可溶性画分にはほとんど検出されなかった
以上より、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼは、大腸菌内で単独で発現させると封入体となるが、ＭａＦＫＢＰ１７．８との融合タンパク質にすると、封入体とならず、可溶性画分に合成されることが分かった。
【実施例１１】
【００８８】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＦａｂ抗体断片からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【００８９】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  Ｆａｂ抗体断片の発現ベクターｐＥＨＥＬＦａｂ−１（Ｉｄｅｎｏ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８、４６４−、２００２）をＮｄｅＩ／Ｂｐｕｌ１０２Ｉにより処理し、アガローズゲル電気泳動により、ａｎｔｉ−ＨＥＬ  Ｆａｂ抗体断片の遺伝子断片を精製した。なお、この遺伝子断片は、Ｆａｂ抗体断片の重鎖をコードする遺伝子とＦａｂ抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子とが並んで配置され、転写によってポリシストロニックなｍＲＮＡが合成されるが、翻訳は別々に行われ、Ｆａｂ抗体断片の重鎖と軽鎖とが融合タンパク質としてではなくそれぞれが単独で合成される。次に、実施例３で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２のＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉサイトに、得られたａｎｔｉ−ＨＥＬ  Ｆａｂ抗体断片の遺伝子断片を挿入することにより、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＦａｂ抗体断片の重鎖との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるＦａｂ抗体断片の重鎖をコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＦａｂ抗体断片の重鎖との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＦａｂ抗体断片の重鎖との間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。なお、Ｆａｂ抗体断片の重鎖をコードする遺伝子の下流に位置しているＦａｂ抗体断片の軽鎖をコードする遺伝子により、Ｆａｂ抗体断片の軽鎖は単独で合成される。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【００９０】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。その結果、可溶性画分にＭａＦＫＢＰ１７．８とＦａｂ重鎖の融合タンパク質のメジャーバンドが認められた。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１９％が該融合タンパク質であり、該融合タンパクが大量に製造されていた。なお、Ｆａｂの軽鎖部分に相当するバンドは認められなかった。【００９１】  比較例として、以下の手順でＦａｂ抗体断片遺伝子を単独で発現させた。実施例１１で調製したＦａｂ抗体断片遺伝子のＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ消化産物を、あらかじめＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉにより処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡに挿入し、Ｆａｂ抗体断片を単独で発現する発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。作製した形質転換体を実施例５と同様の方法で培養・回収し、得られた菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。その結果、Ｆａｂ抗体断片の重鎖は封入体画分にのみ検出された。以上より、Ｆａｂ抗体断片の重鎖は、大腸菌内で単独で発現させると封入体となるが、ＭａＦＫＢＰ１７．８との融合タンパク質にすると、封入体とならず、可溶性画分に合成されることが分かった。
【実施例１２】
【００９２】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【００９３】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号２７に示されるＳＣＦ−Ｆ３プライマー及び配列番号２８に示されるＳＣＦ−Ｒ３プライマーを合成した。次に、プラスミドｐＡＡＬＳＣ（伊庭ら１９９７、Ｇｅｎｅ  １９４、３５−）を鋳型とし、ＳＣＦ−Ｆ３プライマー及びＳＣＦ−Ｒ３プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、マウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖ抗体断片（Ｄ１．３）遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子をＴＡクローニングにより、ｐＴ７ブルーベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）に挿入し、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、実施例３で構築したｐＭａ１７Ｆ２のＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入して、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるｓｃＦｖ抗体断片をコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片の間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【００９４】  作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＣＢＢにて染色した。その結果、可溶性画分に、ＭａＦＫＢＰ１７．８とマウス由来ａｎｔ１−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片の融合タンパク質のメジャーバンドが認められた。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１８％が該融合タンパク質であり、該融合タンパクが大量に製造されていた。【００９５】  比較例として、以下の手順でマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片（Ｄ１．３）を単体で発現させた。実施例１２で調製したマウス由来ａｎｔｉ−ニワトリリゾチーム（ＨＥＬ）ｓｃＦｖ抗体フラグメント（Ｄ１．３）遺伝子断片を、あらかじめ制限酵素ＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡに挿入し、ｓｃＦｖ抗体を単独で発現する発現ベクターを調製した。得られた発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。得られた形質転換体を実施例５と同様の方法で培養・回収し、得られた菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ゲルをＣＢＢにて染色した。その結果、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体は可溶画分にはほとんど発現せず、封入体画分に凝集体として発現することがわかった。以上より、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片は、大腸菌内で単独で発現させると封入体となるが、ＭａＦＫＢＰ１７．８との融合タンパク質にすると、封入体とならず、可溶性画分に合成されることが分かった。
【実施例１３】
【００９６】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８とヒト由来セロトニン（ＨＴ１ａ）レセプターからなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【００９７】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
公知のＨＴ１ａレセプター遺伝子の塩基配列情報（ＮＣＢＩコード：ＨＳＳＥＲＲ５１）をもとに、ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号２９に示されるＨＴ１ａ−Ｆ１プライマー及び配列番号３０に示されるＨＴ１ａ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社）を鋳型とし、ＨＴ１ａ−Ｆ１プライマー及びＨＴ１ａ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入後、その塩基配列を確認したところ、データベースの登録情報と一致した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＨＴ１ａ−Ｆ１の５’末端に由来するＮｄｅＩサイト及びＨＴ１ａ−Ｒ１の３’末端に由来するＮｏｔＩサイトが導入された。次に、ＨＴ１ａレセプター遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにて処理し、実施例３で構築した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２のＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＨＴ１ａレセプターとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ１７．８遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるＨＴ１ａレセプターをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＨＴ１ａレセプターとの融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ１７．８とＨＴ１ａレセプターの間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【００９８】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。融合タンパク質の検出は、ＣＢＢによるゲル染色と、抗セロトニンレセプター抗体を用いたウェスタンブロッティング法の両方を行った。その結果、可溶性画分にのみＭａＦＫＢＰ１７．８とＨＴ１ａレセプターの融合タンパク質が検出された。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２％が該融合タンパク質であった。
【実施例１４】
【００９９】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ１７．８とｓｃＦｖ抗体断片を宿主細胞内で共発現させて、ｓｃＦｖ抗体断片を製造した。【０１００】  実施例１２と同様にして、マウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片の遺伝子を増幅した。この増幅ＤＮＡ断片をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入し、ＮｄｅＩ／ＮｏｔＩ処理後、あらかじめＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにより処理しておいたｐＥＴ２１ａプラスミドＤＮＡに挿入し、上記ｓｃＦｖの発現ベクターｐＥＴｓｃＦｖを構築した。次に、ｐＥＴｓｃＦｖを鋳型とし、配列番号３５に示されるＴ７−Ｆ１プライマーと配列番号３６に示されるＴ７−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、上記ｓｃＦｖ遺伝子及びＴ７プロモーター部を含むｓｃＦｖの発現ユニットＤＮＡ断片を増幅した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、Ｔ７−Ｆ１プライマーの５’末端に由来するＳｐｈＩサイト及びＴ７−Ｒ１プライマーの３’末端に由来するＢａｍＨＩサイトが導入された。この増幅ＤＮＡ断片をＴＡクローニングによりｐＴ７ブルーＴベクターに挿入した後、制限酵素ＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩで処理後、ｐＡＣＹＣ１８４プラスミド（和光純薬社）のＳｐｈＩ／ＢａｍＨＩサイトに挿入し、共発現用ベクターｐＡＣｓｃＦｖを構築した。【０１０１】  ２種類のベクター、すなわち、共発現用ベクターｐＡＣｓｃＦｖと実施例３で調製した発現ベクターｐＭａ１７Ｆ２を、コンピテントセル大腸菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）株に導入し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地にて培養した。得られたコロニーを、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び１００μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地７００ｍＬに接種した。３５℃で回転培養（１１０ｒｐｍ）した後、ＯＤ６００が０．６となった時点で１００ｍＭ  ＩＰＴＧを７ｍＬ添加し、培養温度を２０℃に下げてさらに約１８時間培養し、ＭａＦＫＢＰ１７．８及びマウス由来ａｎｔｉ−ＨＥＬ  ｓｃＦｖ抗体断片の発現を誘導した。培養終了後、遠心分離（１００００ｒｐｍ×１０分）にて菌体を回収した。回収した菌体を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ６．８）２０ｍＬに懸濁し、−２０℃にて一晩凍結保存した。菌体を融解し、超音波破砕を行って上清（可溶画分）及び沈澱画分に分離し、それぞれをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにて染色した。一方、比較例として、ｐＡＣｓｃＦｖのみを導入した組換え大腸菌についても同様の操作を行った。その結果、ｐＡＣｓｃＦｖのみを導入した組換え大腸菌ではｓｃＦｖ抗体断片は全て沈殿画分に検出されたが、ｐＡＣｓｃＦｖとｐＭａ１７Ｆ２の両方を導入した組換え大腸菌では、ｓｃＦｖ抗体断片は上清画分に検出された。以上より、ＭａＦＫＢＰ１７．８と共発現させることにより、ｓｃＦｖは可溶性画分に発現させることが可能となった。
【実施例１５】
【０１０２】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ２８．０とｓｃＦｖ抗体断片からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクター含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【０１０３】１．発現ベクターの構築
実施例１２で調製したｓｃＦｖ抗体断片遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＮｏｔＩにて処理し、実施例４で構築した発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２のＮｄｅＩ／ＮｏｔＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ２８．０とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる発現ベクターＭａ２８Ｆ２−ｓｃＦｖを構築した。すなわち、発現ベクターＭａ２８Ｆ２−ｓｃＦｖは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるｓｃＦｖ抗体断片をコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ２８．０とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ２８．０とｓｃＦｖ抗体断片の間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターＭａ２８Ｆ２−ｓｃＦｖを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【０１０４】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。ゲルの写真を図７（ａ）に示す。すなわち、ＭａＦＫＢＰ２８．０とｓｃＦｖ抗体断片との融合タンパク質（図中では「ＭａＦＫＢＰ２８．０−ｓｃＦｖ融合タンパク質」と表示）に相当するバンド（矢印）が、可溶性画分に認められた。以上より、ｓｃＦｖ抗体断片はＭａＦＫＢＰ２８．０との融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。
【実施例１６】
【０１０５】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼからなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクター含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【０１０６】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
実施例１０で調製したＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片をＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩにて処理し、実施例４で構築した発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２のＮｄｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩサイトに挿入し、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２−ｒｈｏを構築した。すなわち、発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２−ｒｈｏは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼの間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターｐＭａ２８Ｆ２−ｒｈｏを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【０１０７】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢにてゲルを染色した。ゲルの写真を図７（ｂ）に示す。すなわち、ＭａＦＫＢＰ２８．０とＡ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼとの融合タンパク質（図中では「ＭａＦＫＢＰ２８．０−ｒｈｏ融合タンパク質」と表示）に相当するバンド（矢印）が、可溶性画分に認められた。以上より、Ａ．ｐｅｒｎｉｘ由来ロダネーゼはＭａＦＫＢＰ２８．０との融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。
【実施例１７】
【０１０８】  本実施例では、ＭａＦＫＢＰ２８．０とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰ（Ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。さらに、該発現ベクターを含有する形質転換体を作製した。さらに、該形質転換体を培養することにより、該融合タンパク質を製造した。【０１０９】１．発現ベクターの構築と形質転換体の作製
ＰＣＲ用のプライマーとして配列番号３１に示されるＧＦＰ−Ｆ１プライマー及び配列番号３２に示されるＧＦＰ−Ｒ１プライマーを合成した。次に、オワンクラゲ由来天然型ＧＦＰ遺伝子を含む発現ベクターであるコントロールベクターＧＦＰ（ロシュダイアグノスティックス社製Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍキットに含まれているもの）を鋳型とし、ＧＦＰ−Ｆ１プライマー及びＧＦＰ−Ｒ１プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、オワンクラゲ由来天然型ＧＦＰ遺伝子を増幅した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＧＦＰ−Ｆ１の５’末端に由来するＢａｍＨＩサイト及びＧＦＰ−Ｒ１の３’末端に由来するＥｃｏＲＩサイトが導入された。増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングによりｐＴ７ブルーベクターに挿入し、塩基配列を確認したところ、データベースに登録されているオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰ遺伝子の塩基配列と一致した。増幅されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで処理後、実施例４で構築したｐＭａ２８Ｆ２のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩでサイトに挿入して、ＭａＦＫＢＰ２８．０とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、該発現ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流に、順に、第１コード領域となるＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子、トロンビン認識アミノ酸配列をコードするアミノ酸配列、及び第２コード領域となるオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰをコードする遺伝子を有する。よって、該発現ベクターによれば、ＭａＦＫＢＰ２８．０とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰとの融合タンパク質を発現することができる。また、発現される該融合タンパク質は、ＭａＦＫＢＰ２８．０とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰの間にトロンビン消化アミノ酸配列を有する。次に、構築した発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体を作製した。【０１１０】２．融合タンパク質の製造
作製した形質転換体を、実施例５と同様の方法（ただし、培養温度は１５℃）により培養、回収した後、菌体破砕液の可溶性画分及び封入体画分を得た。実施例５と同様にして可溶性画分と封入体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＣＢＢによりゲルを染色した。ゲルの写真を図７（ｃ）に示す。すなわち、ＭａＦＫＢＰ２８．０とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰとの融合タンパク質（図中では「ＭａＦＫＢＰ２８．０−ＧＦＰ融合タンパク質」と表示）に相当するバンド（矢印）が、可溶性画分に認められた。以上より、オワンクラゲ由来天然型ＧＦＰはＭａＦＫＢＰ２８．０との融合タンパク質とすることにより、封入体とはならず、可溶状態で合成された。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約２８％が該融合タンパク質であり、大量に発現していた。【０１１１】  比較例として、超好熱古細菌由来ＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅで同様の操作を行った。すなわち、超好熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．ＫＳ−１由来ショートタイプＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅ（ＴｃＦＫＢＰ１８）の発現プラスミドｐＥＦＥ１−３（Ｉｉｄａ、Ｇｅｎｅ  ２２２、２４９−、１９９８）を鋳型とし、配列番号３３に示されるＴｃＦｕ−Ｆ１プライマー及び配列番号３４に示されるＴｃＦｕ−Ｒ２プライマーをプライマー対としてＰＣＲを行い、ＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。なお、増幅されたＤＮＡ断片の両端には、ＴｃＦｕ−Ｆ１の５’末端に由来するＮｃｏＩサイト及びＴｃＦｕ−Ｒ２の３’末端に由来するＳｐｅＩサイトが導入された。増幅されたＤＮＡ断片をｐＴ７ブルーＴベクターに挿入して塩基配列を確認したところ、データベースに登録されている塩基配列と一致した。増幅されたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩ／ＳｐｅＩで処理後、実施例３で構築したｐＭａ１７Ｆ２のＮｃｏＩ／ＳｐｅＩにサイトに挿入して、ＴｃＦＫＢＰ１８とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰとの融合タンパク質を発現することができる発現ベクターを構築した。すなわち、この発現ベクターは実施例１７で構築した発現ベクターのＭａＦＫＢＰ２８．０遺伝子がＴｃＦＫＢＰ１８遺伝子に置き換わったものである。この発現ベクターを用いて実施例１７と同様にして、形質転換体の作製、培養、及び菌体破砕物のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。その結果、実施例１７と同様に、可溶性画分にＴｃＦＫＢＰ１８とオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰの融合タンパク質が検出された。ＣＢＢ染色した可溶性画分の電気泳動像から、該融合タンパク質のバンド密度をデンシトメータで測定した結果、大腸菌由来全可溶性タンパク質の約１９％が該融合タンパク質であり、大量に発現していた。【０１１２】  実施例１７と上記比較例の各融合タンパク質の濃度を同一とした溶液試料を調製し、ＵＶＢを照射した。その結果、いずれの試料も蛍光を発したが、ＭａＦＫＢＰ２８．０との融合タンパク質を含む試料の蛍光強度は、ＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質を含む試料の蛍光強度の約２倍であった。以上より、可溶性画分から得られたＦＫＢＰ型ＰＰＩａｓｅとオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰとの融合タンパク質において���ＭａＦＫＢＰ２８．０との融合タンパク質の方がＴｃＦＫＢＰ１８との融合タンパク質に比べて、より多くのオワンクラゲ由来天然型ＧＦＰが正しく折り畳まれた。【０１１３】  以下の表に、上記した実施例で用いたＰＣＲ用のプライマーの塩基配列、制限酵素サイト、及び配列番号をまとめて記載した。
2005063964.tif 000003
2005063964.tif 000004
【図１】
2005063964.tif 000005
【図２】
2005063964.tif 000006
【図３】
2005063964.tif 000007
【図４】
2005063964.tif 000008
【図５】
2005063964.tif 000009
【図６】
2005063964.tif 000010
【図７】
2005063964.tif 000011
【配列表】
2005063964000001.app
【国際調査報告】
2005063964.tif 000012
2005063964.tif 000013
2005063964.tif 000014