(57)【要約】本開示は、改善された多重ゲノム編集組成物および方法を提供する。本開示は、ヘモグロビン異常症、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の予防、治療、または寛解のためのゲノム編集された細胞を更に提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡドナー修復鋳型であって、
（ａ）第１の標的部位に対する第１の相同アーム対と、
（ｂ）第２の標的部位に対する第２の相同アーム対と、
（ｃ）１つ以上の導入遺伝子と、を含む、ＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２】
前記第１の相同アーム対が、前記第１の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームと、前記第１の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームと、を含む、請求項１に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３】
前記第２の相同アーム対が、前記第２の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームと、前記第２の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームと、を含む、請求項１または請求項２に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが独立して、約１００塩基対〜約２５００塩基対から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項５】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが独立して、約１００塩基対〜約１５００塩基対から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項６】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが独立して、約１００塩基対〜約１０００塩基対から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが独立して、約１００塩基対〜約５００塩基対から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項８】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが、約５００塩基対である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項９】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが、約３００塩基対である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１０】
前記第１の標的部位および／または前記第２の標的部位までの前記５’および３’相同アームの長さが、約１００塩基対である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１１】
前記第１の標的部位の前記５’相同アームが、前記第２の標的部位の前記５’相同アームの５’に位置する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１２】
前記第１の標的部位の前記３’相同アームが、前記第２の標的部位の前記３’相同アームの５’に位置する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１３】
前記第１の標的部位の前記３’相同アームが、前記第２の標的部位の前記３’相同アームの３’に位置する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１４】
前記第１の標的部位の前記５’相同アームおよび前記３’相同アームが、第１の導入遺伝子に隣接し、前記第２の標的部位の前記５’相同アームおよび前記３’相同アームが、第２の導入遺伝子に隣接する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１５】
前記第１の標的部位および前記第２の標的部位が、異なる遺伝子中にある、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１６】
前記第１の標的部位または前記第２の標的部位が、ＴＣＲα遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１７】
前記第１の標的部位または前記第２の標的部位が、免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１８】
前記第１の標的部位が、ＴＣＲα遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位であり、前記第２の標的部位が、免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項１９】
前記第１の標的部位が、第１の免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位であり、前記第２の標的部位が、第２の免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２０】
前記免疫系チェックポイント遺伝子が独立して、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン系阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）遺伝子からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２１】
免疫抑制シグナル伝達成分をコードする前記遺伝子が独立して、インターロイキン受容体１０アルファ、形質転換成長因子β受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ１（ＳＧＫ１）、結節性硬化症複合体２（ＴＳＣ２）、フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制因子（ＶＨＬ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、ならびにＣｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）からなる群から選択される、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２２】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２３】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から操作されたメガヌクレアーゼである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２４】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから操作されたメガヌクレアーゼである、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２５】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥである、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２６】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｍａＭＩ  ＬＨＥである、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２７】
前記操作されたヌクレアーゼが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２８】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項２７に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項２９】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１０．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１２．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１３．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１４．５個のＴＡＬＥ反復単位、または約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項２７に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３０】
前記１つ以上の導入遺伝子が、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３１】
前記１つ以上の導入遺伝子が、前記免疫能エンハンサー、前記免疫抑制シグナルダンパー、または前記操作された抗原受容体をコードする前記ポリヌクレオチドに操作可能に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを更に含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３２】
前記１つ以上の導入遺伝子が、１つ以上のＣＡＲをコードする、請求項３０または請求項３１に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３３】
前記１つ以上のＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲからなる群から選択される、請求項３２に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３４】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、短いＥＦ１αプロモーター、長いＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項３１に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、１つ以上の免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体に操作可能に連結した、それらの間に散在した、かつ／またはそれらに隣接する、１つ以上の自己切断ウイルスペプチドを更にコードする、請求項３０に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３６】
前記自己切断ウイルスペプチドが、２Ａペプチドである、請求項３５に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３７】
前記ポリヌクレオチドが、異種ポリアデニル化シグナルを更に含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３８】
前記１つ以上の免疫抑制シグナルダンパーが、免疫抑制因子に対抗する酵素機能；免疫抑制因子に結合するエキソドメイン（任意で、前記エキソドメインが、抗体もしくはその抗原結合断片である）；免疫抑制因子に結合するエキソドメインおよび膜貫通ドメイン；または免疫抑制因子に結合するエキソドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを伝達することができない修飾エンドドメインを含む、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項３９】
前記１つ以上の免疫能エンハンサーが独立して、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫増強因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４０】
前記１つ以上の免疫能エンハンサーが独立して、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４１】
前記１つ以上の操作された抗原受容体が独立して、操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、ＤＡＲＩＣ、またはゼータカインからなる群から選択される、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４２】
前記１つ以上の操作された抗原受容体が、ＣＡＲである、請求項４１に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４３】
前記１つ以上のＣＡＲが、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲからなる群から選択される、請求項４２に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項４４】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型を含む、ウイルスベクター。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項４４に記載のウイルスベクター。
【請求項４６】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、請求項４５に記載のウイルスベクター。
【請求項４７】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項４５または請求項４６に記載のウイルスベクター。
【請求項４８】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ６血清型を有する、請求項４５に記載のウイルスベクター。
【請求項４９】
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項４５に記載のウイルスベクター。
【請求項５０】
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである、請求項４９に記載のウイルスベクター。
【請求項５１】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、または請求項４４〜５０のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項５２】
前記１つ以上の導入遺伝子が、相同性指向性修復によって前記第１の標的部位および前記第２の標的部位に挿入されている、請求項５１に記載の細胞。
【請求項５３】
前記細胞が、造血細胞である、請求項５１または請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
前記細胞が、免疫エフェクター細胞である、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５５】
前記細胞が、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５６】
前記細胞が、Ｔ細胞である、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５７】
前記細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５８】
前記細胞の供給源が、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項５９】
請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載のウイルスベクター、または請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項６０】
生理学的に許容される賦形剤と、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、請求項４４〜５０のいずれか１項に記載のウイルスベクター、または請求項５１〜５８のいずれか１項に記載の細胞と、を含む、組成物。
【請求項６１】
癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する病態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または寛解する方法であって、有効量の請求項５９または請求項６０に記載の組成物を対象に投与することと、任意で、前記第１の標的部位にＤＳＢを、および前記第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項６２】
固形癌を治療する方法であって、有効量の請求項５９または請求項６０に記載の組成物を前記対象に投与することと、任意で、前記第１の標的部位および前記第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項６３】
前記固形癌が、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
血液学的悪性腫瘍を治療する方法であって、有効量の請求項５９または請求項６０に記載の組成物を前記対象に投与することと、任意で、前記第１の標的部位および前記第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを前記対象に投与することと、を含む、方法。
【請求項６５】
前記血液学的悪性腫瘍が、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記第１の標的部位または前記第２の標的部位が、ＴＣＲα遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項６７】
前記第１の標的部位または前記第２の標的部位が、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座、ＫＬＦ１遺伝子座、ＳＯＸ６遺伝子座、ＧＡＴＡ１遺伝子座、およびＬＳＤ１遺伝子座を含むがこれらに限定されない、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦの抑圧に寄与する遺伝子、β−グロビン遺伝子座のサラセミア対立遺伝子、またはβ−グロビン遺伝子座の鎌状化対立遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項６８】
前記操作されたヌクレアーゼが、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項６７に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項６９】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から操作されたメガヌクレアーゼである、請求項６７または６８に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７０】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから操作されたメガヌクレアーゼである、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７１】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥである、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７２】
前記操作されたヌクレアーゼが、Ｉ−ＳｍａＭＩ  ＬＨＥである、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７３】
前記操作されたヌクレアーゼが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび請求項６８〜７２のいずれか１項に記載の操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである、請求項６７〜７２のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７４】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項７３に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７５】
前記ＴＡＬＥ結合ドメインが、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１０．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１２．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１３．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１４．５個のＴＡＬＥ反復単位、または約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む、請求項７３に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７６】
前記１つ以上の導入遺伝子が、β−グロビン、δ−グロビン、γ−グロビン、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ１２０Ｅ／Ｋ９５Ｅ、またはβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項６７〜７５のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７７】
前記１つ以上の導入遺伝子が、前記グロビンまたは抗鎌状化グロビンをコードする前記ポリヌクレオチドに操作可能に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを更に含む、請求項６７〜７６のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７８】
前記ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターが、ヒトβ−グロビンＬＣＲおよびプロモーター、短いＥＦ１αプロモーター、長いＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される、請求項７７に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項７９】
前記ポリヌクレオチドが、１つ以上のグロビンまたは抗鎌状化グロビンに操作可能に連結した、それらの間に散在した、かつ／またはそれらに隣接する、１つ以上の自己切断ウイルスペプチドを更にコードする、請求項７８に記載のＤＮＡドナー修復鋳型。
【請求項８０】
請求項６７〜７９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型を含む、ウイルスベクター。
【請求項８１】
前記ウイルスベクターが、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである、請求項８０に記載のウイルスベクター。
【請求項８２】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する、請求項８１に記載のウイルスベクター。
【請求項８３】
前記ｒＡＡＶが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する、請求項８１または請求項８２に記載のウイルスベクター。
【請求項８４】
前記レトロウイルスが、レンチウイルスである、請求項８１に記載のウイルスベクター。
【請求項８５】
前記レンチウイルスが、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである、請求項８１に記載のウイルスベクター。
【請求項８６】
請求項６７〜７９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、または請求項８０〜８５のいずれか１項に記載のウイルスベクターを含む、細胞。
【請求項８７】
前記１つ以上の導入遺伝子が、相同性指向性修復によって前記第１の標的部位および前記第２の標的部位に挿入されている、請求項８６に記載の細胞。
【請求項８８】
前記細胞が、造血細胞である、請求項８６または請求項８７に記載の細胞。
【請求項８９】
前記細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項８６〜８８のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９０】
前記細胞が、ＣＤ１３３＋細胞である、請求項８６〜８９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９１】
請求項６７〜７９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、請求項８０〜８５のいずれか１項に記載のウイルスベクター、または請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項９２】
生理学的に許容される賦形剤と、請求項６７〜７９のいずれか１項に記載のＤＮＡドナー修復鋳型、請求項８０〜８５のいずれか１項に記載のウイルスベクター、または請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞と、を含む、組成物。
【請求項９３】
対象におけるヘモグロビン異常症を治療する方法であって、請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞または請求項９１または請求項９２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９４】
対象におけるヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を寛解する方法であって、請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞または請求項９１または請求項９２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９５】
対象におけるサラセミアを治療する方法であって、有効量の請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞または請求項９１または請求項９２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９６】
前記サラセミアが、β−サラセミアである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
対象における鎌状赤血球症を治療する方法であって、有効量の請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞または請求項９１または請求項９２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項９８】
対象におけるβ−サラセミアを治療する方法であって、有効量の請求項８６〜９０のいずれか１項に記載の細胞または請求項９１または請求項９２に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）条の下、２０１７年２月１５日出願の米国仮特許出願第６２／４５９，２０３号の利益を主張し、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する声明
本出願に関連する配列表は、印刷複写物の代わりにテキスト形式で提供され、これにより参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＢＬＢＤ＿０８４＿０１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは３０ＫＢであり、２０１８年２月１５日に作成されたものであり、本明細書の出願と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
技術分野
本開示は、ゲノム編集における使用のための改善されたドナー修復鋳型組成物に関する。より具体的には、本開示は、ゲノム内の複数の部位を同時に標的とするように設計された単一ドナー修復鋳型に関する。
【背景技術】
【０００４】
複数の遺伝子座を効率的かつ同時に編集する能力は、依然として理解が難しいものである。更に、ＤＮＡ修復鋳型およびゲノム編集ヌクレアーゼ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ系、およびメガＴＡＬヌクレアーゼなど）を使用して、複数の標的遺伝子座で相同性指向性修復を推進する能力は、特に困難であることが証明されている。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ＤＮＡ修復鋳型は、低い免疫原性を有し、かつ相同性指向性組換えを推進する上で効率的であるため、それらは多くの場合、単一ゲノム遺伝子座の編集のために選択されるが、既存の設計は、複数の遺伝子座を同時に標的とするには好適ではない。複数の遺伝子座を標的とする問題に対する一般的な解決策は、依然として複数のヌクレアーゼおよび複数のＤＮＡドナー修復鋳型を使用することである。この解決策は非効果的であり、かつ臨床用途のための複合ゲノム編集細胞系療法の製造には好適ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
改善された免疫エフェクター細胞組成物、および多重ゲノム編集組成物を使用してそれらを製造する方法が、本明細書において企図される。
【０００７】
様々な実施形態において、第１の標的部位に対する第１の相同アーム対と、第２の標的部位に対する第２の相同アーム対と、１つ以上の導入遺伝子とを含む、ＤＮＡドナー修復鋳型が提供される。
【０００８】
特定の実施形態において、第１の相同アーム対は、第１の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームと、第１の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームとを含む。
【０００９】
特定の実施形態において、第２の相同アーム対は、第２の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームと、第２の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームとを含む。
【００１０】
特定の実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは独立して、約１００塩基対〜約２５００塩基対から選択される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは独立して、約１００塩基対〜約１５００塩基対から選択される。
【００１２】
追加の実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは独立して、約１００塩基対〜約１０００塩基対から選択される。
【００１３】
特定の実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは独立して、約１００塩基対〜約５００塩基対から選択される。
【００１４】
更なる実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは、約５００塩基対である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは、約３００塩基対である。
【００１６】
追加の実施形態において、第１の標的部位および／または第２の標的部位までの５’および３’相同アームの長さは、約１００塩基対である。
【００１７】
特定の実施形態において、第１の標的部位の５’相同アームは、第２の標的部位の５’相同アームの５’に位置する。
【００１８】
特定の実施形態において、第１の標的部位の３’相同アームは、第２の標的部位の３’相同アームの５’に位置する。
【００１９】
いくつかの実施形態において、第１の標的部位の３’相同アームは、第２の標的部位の３’相同アームの３’に位置する。
【００２０】
更なる実施形態において、第１の標的部位の５’相同アームおよび３’相同アームは、第１の導入遺伝子に隣接し、第２の標的部位の５’相同アームおよび３’相同アームは、第２の導入遺伝子に隣接する。
【００２１】
更なる実施形態において、第１の標的部位および第２の標的部位は、異なる遺伝子中にある。
【００２２】
特定の実施形態において、第１の標的部位または第２の標的部位は、ＴＣＲα遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、第１の標的部位または第２の標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位を含む。
【００２４】
特定の実施形態において、第１の標的部位は、ＴＣＲα遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位であり、第２の標的部位は、免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位である。
【００２５】
特定の実施形態において、第１の標的部位は、第１の免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位であり、第２の標的部位は、第２の免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の操作されたヌクレアーゼ切断部位である。
【００２６】
更なる実施形態において、免疫系チェックポイント遺伝子は独立して、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン系阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）遺伝子からなる群から選択される。
【００２７】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子は独立して、インターロイキン受容体１０アルファ、形質転換成長因子β受容体Ｉ（ＴＧＦβＲＩ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）、血清およびグルココルチコイド制御キナーゼ１（ＳＧＫ１）、結節性硬化症複合体２（ＴＳＣ２）、フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制因子（ＶＨＬ）、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、ならびにＣｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）からなる群から選択される。
【００２８】
特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ、メガＴＡＬ、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼからなる群から選択される。
【００２９】
更なる実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉからなる群から選択されるＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）から操作されたメガヌクレアーゼである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択されるＬＨＥから操作されたメガヌクレアーゼである。
【００３１】
特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥである。
【００３２】
追加の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｍａＭＩ  ＬＨＥである。
【００３３】
特定の実施形態において、操作されたヌクレアーゼは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび操作されたメガヌクレアーゼを含むメガＴＡＬである。
【００３４】
更なる実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位〜約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００３５】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥ結合ドメインは、約９．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１０．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１１．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１２．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１３．５個のＴＡＬＥ反復単位、約１４．５個のＴＡＬＥ反復単位、または約１５．５個のＴＡＬＥ反復単位を含む。
【００３６】
追加の実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
特定の実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結したＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターを更に含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、１つ以上のＣＡＲをコードする。
【００３９】
特定の実施形態において、１つ以上のＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲからなる群から選択される。
【００４０】
更なる実施形態において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターは、短いＥＦ１αプロモーター、長いＥＦ１αプロモーター、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座、ユビキチンＣ（ＵＢＣ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターからなる群から選択される。
【００４１】
更なる実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体に操作可能に連結した、それらの間に散在した、かつ／またはそれらに隣接する、１つ以上の自己切断ウイルスペプチドを更にコードする。
【００４２】
追加の実施形態において、自己切断ウイルスペプチドは、２Ａペプチドである。
【００４３】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、異種ポリアデニル化シグナルを更に含む。
【００４４】
特定の実施形態において、１つ以上の免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に対抗する酵素機能；免疫抑制因子に結合するエキソドメイン（任意で、エキソドメインは抗体もしくはその抗原結合断片である）；免疫抑制因子に結合するエキソドメインおよび膜貫通ドメイン；または免疫抑制因子に結合するエキソドメイン、膜貫通ドメイン、および免疫抑制シグナルを伝達することができない修飾エンドドメインを含む。
【００４５】
特定の実施形態において、１つ以上の免疫能エンハンサーは独立して、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＢｉＴＥ）、免疫増強因子、およびフリップ受容体からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態において、１つ以上の免疫能エンハンサーは独立して、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒、サイトカイン受容体、およびそれらのバリアントからなる群から選択される。
【００４７】
特定の実施形態において、１つ以上の操作された抗原受容体は独立して、操作されたＴＣＲ、ＣＡＲ、ＤＡＲＩＣ、またはゼータカインからなる群から選択される。
【００４８】
追加の実施形態において、１つ以上の操作された抗原受容体は、ＣＡＲである。
【００４９】
特定の実施形態において、１つ以上のＣＡＲは、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲおよび抗ＣＤ１９  ＣＡＲからなる群から選択される。
【００５０】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型を含むウイルスベクターが提供される。
【００５１】
更なる実施形態において、ウイルスベクターは、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）またはレトロウイルスである。
【００５２】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来の１つ以上のＩＴＲを有する。
【００５３】
特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ１０からなる群から選択される血清型を有する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ６血清型を有する。
【００５５】
いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、レンチウイルスである。
【００５６】
追加の実施形態において、レンチウイルスは、インテグラーゼ欠損レンチウイルスである。
【００５７】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型および／またはウイルスベクターを含む細胞が提供される。
【００５８】
特定の実施形態において、１つ以上の導入遺伝子は、相同性指向性修復によって第１の標的部位および第２の標的部位に挿入されている。
【００５９】
いくつかの実施形態において、細胞は、造血細胞である。
【００６０】
特定の実施形態において、細胞は、免疫エフェクター細胞である。
【００６１】
特定の実施形態において、細胞は、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、またはそれらの組み合わせである。
【００６２】
追加の実施形態において、細胞は、Ｔ細胞である。
【００６３】
更なる実施形態において、細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、またはヘルパーＴ細胞である。
【００６４】
特定の実施形態において、細胞の供給源は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、または腫瘍である。
【００６５】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型、ウイルスベクター、または細胞を含む組成物が提供される。
【００６６】
様々な実施形態において、生理学的に許容される賦形剤と、本明細書において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型、ウイルスベクター、または細胞とを含む組成物が提供される。
【００６７】
様々な実施形態において、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する病態の少なくとも１つの症状を治療、予防、または寛解する方法が提供され、該方法は、有効量の本明細書において企図される組成物を対象に投与することと、任意で、第１の標的部位にＤＳＢを、および第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを対象に投与することとを含む。
【００６８】
様々な実施形態において、固形癌を治療する方法が提供され、該方法は、有効量の本明細書において企図される組成物を対象に投与することと、任意で、第１の標的部位および第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを対象に投与することとを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、固形癌は、肝臓癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、脳癌、肉腫、頭頸部癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を含む。
【００７０】
様々な実施形態において、血液学的悪性腫瘍を治療する方法が提供され、該方法は、有効量の本明細書において企図される組成物を対象に投与することと、任意で、第１の標的部位および第２の標的部位にＤＳＢを導入するように設計された、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする、有効量の１つ以上のポリヌクレオチドを対象に投与することとを含む。
【００７１】
特定の実施形態において、血液学的悪性腫瘍は、白血病、リンパ腫、または多発性骨髄腫である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】複数のＡＡＶドナー修復鋳型を使用して、複数の標的遺伝子座で相同性指向性修復を推進するための一般的かつ非効果的な戦略を示す。
【図２】単一ＡＡＶドナー修復鋳型を使用して、複数の標的遺伝子座で相同性指向性修復を効率的に推進するための代表的な本発明の戦略を示す。
【図３Ａ】ＰＤ−１遺伝子およびＴＣＲα定常領域を同時に標的とする単一ＡＡＶドナー修復鋳型の代表的な設計を示す。
【図３Ｂ】ＰＤ−１およびＴＣＲαメガＴＡＬ、ならびにＰＤ−１遺伝子およびＴＣＲα定常領域を同時に標的とする単一ＡＡＶドナー修復鋳型を使用して、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチド配列を導入する、相同性指向性修復実験の結果を示す。
【図４】ＣＤ３発現の欠如によって測定される、ＴＣＲα定常領域のノックアウト効率を示す。ＴＣＲαメガＴＡＬは、単独でまたはＰＤ−１メガＴＡＬとともに、８０％超のノックアウト効率を示した（レーン３および４）。
【図５】ＰＤ−１メガＴＡＬで治療しなかった細胞（レーン１、３、および５）と比較した、２４時間のＰＭＡ／イオノマイシン刺激後の、ＰＤ−１メガＴＡＬで治療した細胞（レーン２および４）におけるＰＤ−１発現の減少を示す。
【図６Ａ】ＰＤ−１遺伝子およびＴＣＲα定常領域を同時に標的とする単一ＡＡＶドナー修復鋳型の代表的な設計を示す。
【図６Ｂ】ＰＤ−１およびＴＣＲαメガＴＡＬ、ならびにＰＤ−１遺伝子およびＴＣＲα定常領域を同時に標的とする単一ＡＡＶドナー修復鋳型を使用して、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を導入する、相同性指向性修復実験の結果を示す。
【図７】二重ＡＡＶドナーの代表的な実施形態を示す。二重ＡＡＶドナーには、単一挿入断片または２つの異なる挿入断片を使用することができる。挿入断片および相同アームの位置および配向は、用途に応じて様々な組み合わせを有することができる。異なる相同アームの数を増加させて、複数の遺伝子座を単一ＡＡＶドナーで標的とすることができる。
【００７３】
配列識別子の簡潔な説明
配列番号１は、ＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列を明記する。
配列番号２は、ＡＡＶドナー修復鋳型のポリヌクレオチド配列を明記する。
配列番号３〜１３は、様々なリンカーのアミノ酸配列を明記する。
配列番号１４〜３８は、プロテアーゼ切断部位および自己切断ポリペプチド切断部位のアミノ酸配列を明記する。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
Ａ．概要
本明細書において企図される様々な実施形態は一般に、改善されたゲノム編集組成物、およびそれらを使用して改善された免疫エフェクター細胞組成物を製造する方法に部分的に関する。改善されたゲノム編集組成物および方法は、単一ＤＮＡドナー修復鋳型を使用したゲノム内の複数の標的部位の編集を可能にし、それにより治療細胞集団における多重ゲノム編集を大いに単純化し、その効率を増加させる。複数のゲノム編集を有する治療細胞は、ヘモグロビン異常症、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全を含むがこれらに限定されない、多数の病態の治療または予防における使用のために企図される。
【００７５】
様々な実施形態において、１つ以上の標的部位のゲノム編集を可能にするＤＮＡドナー修復鋳型が提供される。
【００７６】
様々な実施形態において、１つ以上の標的部位のゲノム編集を可能にするＤＮＡドナー修復鋳型を含むベクターが提供される。
【００７７】
様々な実施形態において、１つ以上の操作されたヌクレアーゼと、１つ以上の標的部位のゲノム編集を可能にするＤＮＡドナー修復鋳型とを含む細胞が提供される。特定の実施形態において、細胞は、造血幹細胞、造血前駆細胞、ＣＤ３４＋細胞、免疫エフェクター細胞、およびＴ細胞を非限定的に含む、造血細胞である。
【００７８】
特定の実施形態において、本明細書において企図される多重ゲノム編集に好適な標的部位には、γ−グロビン遺伝子発現、ヘモグロビン異常症、サラセミア、および鎌状赤血球症の抑圧に寄与する１つ以上の遺伝子座が含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
複数のゲノム編集を有するゲノム編集された造血幹細胞、造血前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座、ＫＬＦ１遺伝子座、ＳＯＸ６遺伝子座、ＧＡＴＡ１遺伝子座、およびＬＳＤ１遺伝子座を含むがこれらに限定されない、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦの抑圧に寄与する遺伝子、β−グロビン遺伝子座のサラセミア対立遺伝子、またはβ−グロビン遺伝子座の鎌状化対立遺伝子中の１つ以上の編集を含み得る。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ゲノム編集を通してグロビン遺伝子発現を正確に破壊または修飾するように設計された、操作されたヌクレアーゼは、治療ヘモグロビン発現の生成を強化し、かつヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を治療、予防、または寛解し得ることが企図される。
【００８０】
特定の実施形態において、本明細書において企図される多重ゲノム編集に好適な標的部位には、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達に寄与する１つ以上の遺伝子座、免疫系チェックポイント遺伝子、および免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
複数のゲノム編集を有するゲノム編集されたＴ細胞は、ＴＣＲアルファ（ＴＣＲα）遺伝子座およびＴＣＲベータ（ＴＣＲβ）遺伝子座を含むがこれらに限定されない、ＴＣＲシグナル伝達に寄与する遺伝子中の１つ以上の編集を含み得る。
【００８２】
複数のゲノム編集を有するゲノム編集されたＴ細胞は、免疫系チェックポイント遺伝子をコードする遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子中の１つ以上の編集を含んでも、それらを更に含んでもよい。免疫系チェックポイント遺伝子および免疫抑制シグナル伝達成分の機能を低減する編集を含むＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対してより耐性があり、かつ腫瘍環境においてＴ細胞耐久性および持続性が増加している。
【００８３】
免疫系チェックポイント遺伝子の例示的な例には、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原−４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン系阻害性モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）、ならびにキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子の例示的な例には、インターロイキン１０受容体アルファ（ＩＬ−１０Ｒα）、形質転換成長因子ベータ受容体１（ＴＧＦβＲ１）、形質転換成長因子ベータ受容体２（ＴＧＦβＲ２）、アイリル（ａｙｒｌ）炭化水素受容体（ＡＨＲ）、血清／グルココルチコイド制御キナーゼ１（ＳＧＫ１）、結節性硬化症複合体２（ＴＳＣ２）、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、フォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制因子（ＶＨＬ）、およびＣｂｌ癌原遺伝子Ｂ（ＣＢＬＢ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００８５】
いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、１つ以上のＴＣＲシグナル伝達成分の機能を破壊する１つ以上のゲノム編集を含むＴ細胞は、機能的な内在性ＴＣＲ発現を実質的に欠如し、それにより潜在的な移植片拒絶を低減するため、かつそれらは、アクセサリーシグナル伝達成分を取り除いて、操作された抗原受容体Ｔ細胞の有効性を強化するため、それらは、より安全かつより効果的な養子細胞療法を提供することが企図される。加えて、免疫系チェックポイント遺伝子中または免疫抑制シグナル伝達成分中の１つ以上のゲノム編集を含むＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対する感受性が低減した、Ｔ細胞耐久性が増加した、かつ腫瘍環境におけるＴ細胞持続性が増加した養子細胞療法を提供する。
【００８６】
様々な実施形態において、細胞は、複数の標的部位でＤＳＢを誘導する複数の操作されたヌクレアーゼと、相同性指向性修復（ＨＤＲ）を通して複数の標的部位に挿入される１つ以上の導入遺伝子をコードするＤＮＡドナー修復鋳型とを含む。
【００８７】
特定の実施形態において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型における使用に好適な導入遺伝子の例示的な例には、グロビン遺伝子および抗鎌状化グロビン遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【００８８】
特定の実施形態において企図されるＤＮＡドナー修復鋳型における使用に好適な導入遺伝子の例示的な例には、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体が含まれるが、これらに限定されない。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＴＣＲシグナル伝達、免疫系チェックポイント、および／または免疫抑制シグナル伝達に寄与する遺伝子をコードする複数の標的部位の破壊、ならびに免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子の遺伝子座への導入は、遺伝子破壊編集のみ、または免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、もしくは操作された抗原受容体の発現のみを含む養子細胞療法と比較して、結果として得られる養子細胞に、優れた安全性、有効性、耐久性、および／または持続性プロファイルを吹き込むことが企図される。
【００８９】
様々な実施形態において、１つ以上の操作されたヌクレアーゼをコードする１つ以上のポリヌクレオチド、および１つ以上の標的部位のゲノム編集を可能にするＤＮＡドナー鋳型を導入することによって、複数の標的部位で細胞のゲノムを編集する方法が提供される。
【００９０】
様々な実施形態において、ヘモグロビン異常症、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全、またはそれらに関連する病態の少なくとも１つの症状を、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞療法で治療、予防、または寛解する方法が提供される。
【００９１】
別段それとは反対に具体的に示されない限り、特定の実施形態の実施は、当該技術分野の範囲内の化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学、および細胞生物学の従来の方法を用い、それらの多くは、例示目的で後述されている。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ２００８）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）、Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）、Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、およびＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙなどの学術誌における研究書を参照されたい。
【００９２】
Ｂ．定義
別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。特定の実施形態の実施または試験において、本明細書に記載の方法および材料に類似または相当する任意の方法および材料を使用することができるが、組成物、方法、および材料の好ましい実施形態が本明細書に記載される。本発明の目的では、以下の用語が以下に定義される。
【００９３】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その」は、本明細書において、その冠詞の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つまたは１つ以上）の文法的目的語を指すために使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または１つ以上の要素を意味する。
【００９４】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、その選択肢の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味することが理解されたい。
【００９５】
「および／または」という用語は、その選択肢の一方または両方を意味することが理解されたい。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％だけ変動する含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「約」または「およそ」という用語は、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さについて、±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さの範囲を指す。
【００９７】
一実施形態において、範囲、例えば、１〜５、約１〜５、または約１〜約５は、その範囲によって包含される各数値を指す。例えば、非限定的かつ単に例示的な一実施形態において、「１〜５」という範囲は、１、２、３、４、５；または１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、もしくは５．０；または１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０という表現に相当する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さと比較して、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上である含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。一実施形態において、「実質的に同じ」は、基準となる含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さとおよそ同じである、ある効果、例えば、ある生理学的効果をもたらす、含量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量、または長さを指す。
【００９９】
本明細書を通して、別段文脈が必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語は、任意の他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の排除ではなく、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群の包含を暗示することが理解される。「からなる」によって、「からなる」という語句の後に続くものを含み、かつこれらに限定されることが意味される。したがって、「からなる」という語句は、列挙される要素が必要とされるかまたは必須であること、およびいかなる他の要素も存在し得ないことを示す。「から本質的になる」によって、この語句の後に列挙されるあらゆる要素を含み、かつそれらの列挙される要素について本開示に明記される活性または作用と干渉しないかまたはそれらに寄与しない他の要素に限定されることが意味される。したがって、「から本質的になる」という語句は、列挙される要素が必要とされるかまたは必須であること、しかし列挙される要素の活性または作用に実質的に影響を与えるいかなる他の要素も存在しないことを示す。
【０１００】
本明細書を通して、「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「特定の実施形態」、「追加の実施形態」、「様々な実施形態」、もしくは「更なる実施形態」、またはそれらの複数形もしくは組み合わせに対する言及は、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通した様々な場所での上述の語句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を指すものではない。更に、１つ以上の実施形態において、特定の特徴、構造、または特性は、任意の好適な様式で組み合わせてもよい。一実施形態におけるある特徴の明確な記述は、特定の実施形態において、その特徴を除外するための基礎として機能することもまた理解される。
【０１０１】
「単離された細胞」は、インビボ組織または器官から得られ、かつ細胞外マトリックスを実質的に含まない、天然に存在しない細胞、例えば、自然界に存在しない細胞、修飾された細胞、操作された細胞などを指す。一実施形態において、単離された細胞は、細胞内に天然に存在しない１つ以上のポリヌクレオチド配列を含む。
【０１０２】
「幹細胞」という用語は、（１）長期的な自己再生、または元の細胞の少なくとも１つの同一の複製物を生成する能力、（２）単細胞レベルで、複数のおよびいくつかの例では１つのみの特殊化細胞型への分化、ならびに（３）組織のインビボ機能再生をすることができる未分化細胞である細胞を指す。幹細胞は、それらの発生的な潜在性に従って、全能性、多能性、複能性、および少能性／単能性として細分類される。「自己再生」は、改変されていない娘細胞を生成する特有の能力、および特殊化細胞型（効力）を産生する特有の能力を指す。自己再生は、２つの方法で達成され得る。非対称性細胞分裂は、親細胞と同一である１つの娘細胞と、親細胞とは異なり前駆細胞または分化細胞である１つの娘細胞とを産生する。対称性細胞分裂は、２つの同一の娘細胞を産生する。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「前駆体」または「前駆細胞」という用語は、細胞が自己再生する能力およびより成熟した細胞へと分化する能力を有することを指す。多くの前駆細胞は単一の系譜に沿って分化するが、非常に広範な増殖能を有し得る。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「初代細胞」という用語は、ある組織から単離されており、かつインビトロまたはエクスビボでの成長のために確立されている細胞を指すことが当該技術分野において既知である。対応する細胞は、万一存在する場合でも受けている集団倍加は非常に少なく、したがって、連続細胞株と比較して、それらが由来する組織の主要な機能成分をより代表するものであるため、インビボ状態のより代表的なモデルとなっている。様々な組織から試料を得るための方法および初代細胞株を確立するための方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９７を参照されたい）。特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。本明細書において企図される方法における使用のための初代細胞は、臍帯血、胎盤血、動員末梢血、および骨髄に由来する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「細胞集団」という用語は、本明細書の他の箇所に記載のように、任意の数および／または組み合わせの同種または異種細胞型で構成され得る複数の細胞を指す。細胞集団は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約１００％の編集される標的細胞型を含み得る。
【０１０６】
「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、骨髄系譜（例えば、単球およびマクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、ならびにリンパ系譜（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）、ならびに他の当該技術分野において既知のもの（Ｆｅｉ，Ｒらの米国特許第５，６３５，３８７号、ＭｃＧｌａｖｅらの米国特許第５，４６０，９６４号、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｐらの米国特許第５，６７７，１３６号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７５０，３９７号、Ｓｃｈｗａｒｔｚらの米国特許第５，７５９，７９３号、ＤｉＧｕｉｓｔｏらの米国特許第５，６８１，５９９号、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏらの米国特許第５，７１６，８２７号を参照されたい）を含む、ある生物の全ての血液細胞型をもたらす複能性幹細胞を指す。致死的な放射線を浴びた動物またはヒトに移植された場合、造血幹細胞および前駆細胞は、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、およびリンパ造血細胞プールを再配置させることができる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、その細胞表面上にＣＤ３４タンパク質を発現する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４」は、多くの場合細胞間接着因子として機能する細胞表面糖タンパク質（例えば、シアロムチンタンパク質）を指す。「ＣＤ３４＋」は、造血幹細胞および前駆細胞両方の細胞表面マーカーである。「ＣＤ３４＋」は、造血幹細胞および前駆細胞両方の細胞表面マーカーである。本明細書において企図される特定の実施形態における使用に好適な造血細胞には、ＣＤ３４＋細胞が含まれるが、これに限定されない。本明細書において企図される特定の実施形態における使用に好適な造血細胞には、ＣＤ３４＋ＣＤ３８ＬｏＣＤ９０＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ３４＋、ＣＤ５９＋、Ｔｈｙ１／ＣＤ９０＋、ＣＤ３８Ｌｏ／−、Ｃ−キット／ＣＤ１１７＋、およびＬｉｎ（−）細胞、ならびにＣＤ３４＋、ＣＤ１３３＋細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
「免疫エフェクター細胞」は、１つ以上のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞殺滅活性、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣの誘導）を有する、免疫系の任意の細胞である。特定の実施形態において企図される例示的な免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球、具体的には細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＴＩＬ、およびヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）である。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。一実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む。
【０１０９】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、当該技術分野において認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えば、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得る。Ｔ細胞は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞）ＣＤ４＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＩＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞、またはＴ細胞の任意の他のサブセットであり得る。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。特定の実施形態における使用に好適な他の例示的なＴ細胞集団は、ナイーブＴ細胞およびメモリーＴ細胞を含む。
【０１１０】
特定の実施形態において、「強力なＴ細胞」および「幼若Ｔ細胞」は互換的に使用され、Ｔ細胞が増殖および同時に分化の減少が可能であるＴ細胞表現型を指す。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、「ナイーブＴ細胞」という表現型を有する。特定の実施形態において、幼若Ｔ細胞は、以下の生物学的マーカー、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１２２、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、１つ以上の以下の生物学的マーカー、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＣＤ３８のうちの１つ以上または全てを含む。一実施形態において、幼若Ｔ細胞は、ＣＤ５７、ＣＤ２４４、ＣＤ１６０、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、およびＬＡＧ３の発現を欠如する。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、対称性細胞分裂であるか非対称細胞分裂性であるかに関わらず、細胞分裂の増加を指す。特定の実施形態において、「増殖」は、造血細胞の対称性または非対称細胞分裂を指す。「増殖の増加」は、未治療の試料中の細胞と比較して、治療した試料中の細胞数の増加が存在するときに生じる。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、細胞の効力もしくは増殖を減少させるか、または細胞をより発生的に制限された状態へと移動させる方法を指す。特定の実施形態において、分化Ｔ細胞は、免疫エフェクター細胞機能を獲得する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞製造」もしくは「Ｔ細胞を製造する方法」という用語、または同等の用語は、Ｔ細胞の治療組成物を生成するプロセスを指し、これらの製造方法は、以下のステップ、収集、刺激、活性化、ゲノム編集、および拡大のうちの１つ以上または全てを含み得る。
【０１１４】
「エクスビボ」という用語は一般に、好ましくは天然条件の改変を最小にして、生物の外部の人工環境において生組織内または生組織上で行われる実験または測定などの、生物の外部で起こる活性を指す。特定の実施形態において、「エクスビボ」手順は、生物から取得し、通常無菌条件下で、典型的には数時間〜最大約２４時間（しかし状況に応じて最大４８または７２時間を含む）実験室装置内で培養または修飾した、生細胞または生組織に関与する。特定の実施形態において、そのような組織または細胞は、回収および凍結され、エクスビボ治療のために後に解凍されてもよい。生細胞または生組織を使用した、数日間よりも長く継続する組織培養実験または手順は、典型的には「インビトロ」であると見なされるが、特定の実施形態において、この用語は、エクスビボと互換的に使用され得る。
【０１１５】
「インビボ」という用語は一般に、細胞自己再生および細胞増殖または拡大などの生物の内部で起こる活性を指す。一実施形態において、「インビボ拡大」という用語は、細胞集団の数がインビボで増加する能力を指す。一実施形態において、細胞は、インビボで操作または修飾される。
【０１１６】
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がその同族リガンドと結合し、それによりＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を含むがこれに限定されない、シグナル伝達事象を媒介することによって誘導される一次応答を指す。
【０１１７】
「刺激分子」は、同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「刺激リガンド」は、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、およびＢ細胞など）上に存在するときに、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書において「刺激分子」と称される）と特異的に結合することができ、それにより活性化、免疫応答の開始、および増殖を含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドには、ＣＤ３リガンド、例えば、抗ＣＤ３抗体、およびＣＤ２リガンド、例えば、抗ＣＤ２抗体、およびペプチド、例えば、ＣＭＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１９】
「活性化」という用語は、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されているＴ細胞の状態を指す。特定の実施形態において、活性化はまた、サイトカイン産生の誘導および検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、他のものの中でも特に、増殖しているＴ細胞を指す。ＴＣＲ単独を通して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、１つ以上の二次シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要とされる。したがって、Ｔ細胞活性化は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を通した一次刺激シグナルと、１つ以上の二次共刺激シグナルとを含む。共刺激は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体またはＣＤ２を通した刺激などの一次活性化シグナルを受けたＴ細胞による増殖および／またはサイトカイン産生によって証明することができる。
【０１２０】
「共刺激シグナル」は、ＴＣＲ／ＣＤ３連結などの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および／または特定の分子（例えば、ＣＤ２８）の上方制御もしくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
【０１２１】
「共刺激リガンド」は、共刺激分子に結合する分子を指す。共刺激リガンドは、可溶性であっても、表面上に提供されてもよい。「共刺激分子」は、共刺激リガンド（例えば、抗ＣＤ２８抗体）と特異的に結合するＴ細胞上の同族結合パートナーを指す。
【０１２２】
「抗原（Ａｇ）」は、動物に注射または吸収される組成物（腫瘍特異的タンパク質を含む組成物など）を含む、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質、例えば、脂質、炭水化物、多糖類、糖タンパク質、ペプチド、または核酸を指す。抗原は、開示される抗原などの異種抗原によって誘導されるものを含む、特定の液性免疫または細胞性免疫の生成物と反応する。「標的抗原」または「対象となる標的抗原」は、本明細書において企図される操作された抗原受容体の結合ドメインが結合するように設計されている抗原である。一実施形態において、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０１２３】
「エピトープ」または「抗原決定基」は、結合剤が結合する抗原の領域を指す。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に存在する状態でそれに隣接する配列から精製されているポリヌクレオチド、例えば、その断片に通常隣接している配列から除去されているＤＮＡ断片を指す。「単離されたポリヌクレオチド」はまた、天然に存在せず、かつ人工的に作製された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、組換えＤＮＡ、または他のポリヌクレオチドも指す。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「単離されたタンパク質」、「単離されたペプチド」、または「単離されたポリペプチド」などは、細胞環境から、および細胞の他の成分との会合からの、ペプチド分子またはポリペプチド分子のインビトロ合成、単離、および／または精製を指す（すなわち、それはインビボの物質と有意に会合していない）。
【０１２６】
「強化する」または「促進する」または「増加させる」または「拡大する」または「増強する」は一般に、本明細書において企図される組成物が、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より大きな応答（すなわち、生理学的応答）を産生するか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答は、当該技術分野における理解および本明細書における記載から明らかである他のものの中でも特に、触媒活性、結合親和性、結合部位特異性、結合部位選択性、持続性、細胞溶解活性の増加、および／または炎症性サイトカインの増加を含み得る。「増加した」または「強化された」量は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって産生される応答の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（全ての整数、およびそれらの間でかつ１超の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の増加を含み得る。
【０１２７】
「減少させる」または「減らす」または「和らげる」または「低減する」または「軽減する」または「切除する」または「阻害する」または「減衰させる」は一般に、本明細書において企図される組成物が、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、より少ない応答（すなわち、生理学的応答）を産生するか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。測定可能な応答は、標的外結合親和性、標的外切断特異性、およびＴ細胞疲弊などの減少を含み得る。「減少させる」または「低減した」量は、典型的には「統計学的に有意な」量であり、ビヒクルまたは対照によって産生される応答（基準応答）の１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍、またはそれ以上（例えば、５００、１０００倍）（全ての整数、およびそれらの間でかつ１超の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８などを含む）の減少を含み得る。
【０１２８】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化がない」、または「実質的な変化がない」、または「実質的な減少がない」は一般に、本明細書において企図される組成物が、ビヒクルまたは対照のいずれかによって引き起こされる応答と比較して、実質的に類似または同等の応答（すなわち、下流効果）を産生するか、誘発するか、または引き起こす能力を指す。同等の応答は、基準応答と有意には異ならないか、または測定可能なほどには異ならない応答である。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」または「特異的に標的とする」という用語は、バックグラウンド結合よりも大きな結合親和性での１つの分子の別の分子への結合、例えば、ＤＮＡに結合するポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインを説明する。結合ドメインは、それが例えば、約１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、１／Ｍの単位を有する特定の結合相互作用の平衡会合定数）で標的部位に結合するか、またはそれと会合する場合に、標的部位に「特異的に結合する」。特定の実施形態において、結合ドメインは、約１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１、または１０１３Ｍ−１以上のＫａで標的部位に結合する。「高親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、少なくとも１０１３Ｍ−１、またはそれ以上のＫａを有する結合ドメインを指す。
【０１３０】
あるいは、親和性は、Ｍの単位（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ、またはそれ以下）を有する特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義することができる。特定の実施形態において企図されるＤＮＡ標的部位に対する１つ以上のＤＮＡ結合ドメインを含むヌクレアーゼバリアントの親和性は、従来の技術、例えば、酵母細胞表面提示を使用して、または標識リガンドを使用した結合会合アッセイもしくは置換アッセイによって容易に決定することができる。
【０１３１】
一実施形態において、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合よりも約２倍大きいか、バックグラウンド結合よりも約５倍大きいか、バックグラウンド結合よりも約１０倍大きいか、バックグラウンド結合よりも約２０倍大きいか、バックグラウンド結合よりも約５０倍大きいか、バックグラウンド結合よりも約１００倍大きいか、またはバックグラウンド結合よりも約１０００倍またはそれ以上大きい。
【０１３２】
「選択的に結合する」または「選択的に結合した」または「選択的結合」または「選択的に標的とする」という用語は、複数の標的外分子の存在下での、１つの分子の標的分子への優先的な結合（標的内結合）を説明する。特定の実施形態において、ＨＥまたはメガＴＡＬは、ＨＥまたはメガＴＡＬが標的外ＤＮＡ標的結合部位に結合するよりも、約５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、または１０００倍頻繁に標的内ＤＮＡ結合部位に選択的に結合する。
【０１３３】
「標的内」は、標的部位配列を指す。
【０１３４】
「標的外」は、標的部位配列と類似しているが、同一ではない配列を指す。
【０１３５】
「標的部位」または「標的配列」は、結合および／または切断に十分な条件が存在することを条件として、結合分子が結合および／または切断する核酸の一部分を定義する染色体または染色体外の核酸配列である。標的部位または標的配列の一本の鎖のみに言及するポリヌクレオチド配列または配列番号に言及する場合、ヌクレアーゼバリアントによって結合および／または切断される標的部位または標的配列は二本鎖であり、かつ基準配列およびその成分を含むことが理解される。
【０１３６】
「組換え」は、非相同末端結合および相同組換えによるドナー捕獲を含むがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報が交換されるプロセスを指す。本開示の目的では、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同性指向性修復（ＨＤＲ）機構を介した細胞内の二本鎖切断の修復中に起こるそのような交換の特殊化形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）を修復するための鋳型として「ドナー」分子を使用し、かつそれはドナーから標的への遺伝情報の転移をもたらすために「非クロスオーバー遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として多様に知られている。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、そのような転移は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーを使用して標的の一部となる遺伝情報を再合成する「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連プロセスに関与し得る。そのような特殊化ＨＲは多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるような標的分子の配列の改変をもたらす。
【０１３７】
「ＮＨＥＪ」または「非相同末端結合」は、ドナー修復鋳型または相同配列の不在下での二本鎖切断の解決を指す。ＮＨＥＪは、切断部位における挿入および欠失をもたらし得る。ＮＨＥＪは、各々が異なる変異結果を有するいくつかの下位経路によって媒介される。古典的ＮＨＥＪ経路（ｃＮＨＥＪ）は、ＫＵ／ＤＮＡ−ＰＫｃｓ／Ｌｉｇ４／ＸＲＣＣ４複合体を必要とし、最小のプロセシングによって末端を再びともに連結し、多くの場合切断の正確な修復をもたらす。代替的なＮＨＥＪ経路（ａｌｔＮＨＥＪ）もまたｄｓＤＮＡ切断を解決する上で活性であるが、これらの経路はより著しく変異原性であり、多くの場合挿入および欠失によって特徴付けられる切断の不正確な修復をもたらす。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、例えば、Ｔｒｅｘ２などの末端プロセシング酵素によるｄｓＤＮＡ切断の修飾が、修復をａｌｔＮＨＥＪ経路の方に偏らせることが企図される。
【０１３８】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の切断を指す。切断は、リン酸ジエステル結合の酵素加水分解または化学加水分解を含むがこれらに限定されない、様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能である。二本鎖切断は、２つの異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端またはねじれ型末端のいずれかの生成をもたらし得る。特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリペプチドおよびヌクレアーゼバリアント、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、メガＴＡＬなどが、標的二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。エンドヌクレアーゼ切断認識部位は、いずれのＤＮＡ鎖上にあってもよい。
【０１３９】
「外因性」分子は、通常は細胞内に存在しないが、１つ以上の遺伝学的方法、生化学的方法、または他の方法によって細胞に導入される分子である。例示的な外因性分子には、小有機分子、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖類、上記の分子の任意の修飾誘導体、または上記の分子のうちの１つ以上を含む任意の複合体が含まれるが、これらに限定されない。外因性分子を細胞に導入するための方法は当業者にとって既知であり、それらには脂質媒介性転移（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接注入、細胞融合、微粒子銃、バイオポリマーナノ粒子、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性転移、ならびにウイルスベクター媒介性転移が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
「内在性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在する分子である。追加の内在性分子は、タンパク質を含み得る。
【０１４１】
「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、およびそのような制御配列がコード配列および／または転写配列に隣接しているかに関わらず、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を指す。遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界領域、ターミネーター、ポリアデニル化配列、転写後応答エレメント、翻訳制御配列（リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位など）、複製開始点、マトリックス結合領域、ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
「遺伝子発現」は、ある遺伝子中に含有される情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の種類のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって修飾されるＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰリボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって修飾されるタンパク質も含み得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子操作された」または「遺伝子組換えの」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの形態の追加の遺伝子材料の、細胞内の全遺伝子材料への染色体付加または染色体外付加を指す。遺伝子組換えは、細胞のゲノム内の特定の部位を標的としても、標的としなくてもよい。一実施形態において、遺伝子組換えは、部位特異的である。一実施形態において、遺伝子組換えは、部位特異的ではない。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「ゲノム編集」という用語は、細胞のゲノム内の標的部位における遺伝子材料の置換、欠失、および／または導入を指し、これらは、遺伝子または遺伝子産物の発現を回復、補正、破壊、および／または修飾する。特定の実施形態において企図されるゲノム編集は、１つ以上のヌクレアーゼバリアントを細胞に導入して、任意でドナー修復鋳型の存在下で、細胞のゲノム内の標的部位またはその近位でＤＮＡ損傷を生成することを含む。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「遺伝子療法」という用語は、追加の遺伝子材料の、細胞内の全遺伝子材料への導入を指し、これは、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、もしくは修飾するか、または治療ポリペプチドを発現させることを目的とする。特定の実施形態において、遺伝子もしくは遺伝子産物の発現を回復、補正、破壊、もしくは修飾するか、または治療ポリペプチドを発現させることを目的とするゲノム編集による、遺伝子材料の細胞のゲノムへの導入は、遺伝子療法と見なされる。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「個体」および「対象」という用語は多くの場合、互換的に使用され、本明細書の他の箇所で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および方法で治療することができる免疫不全の症状を呈する任意の動物を指す。好適な対象（例えば、患者）には、実験室動物（マウス、ラット、ウサギ、もしくはモルモット）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコもしくはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、および好ましくはヒト対象が含まれる。典型的な対象は、免疫不全を有するか、免疫不全と診断されているか、または免疫不全を有するリスクがあるヒト患者を含む。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「患者」という用語は、本明細書の他の箇所で企図されるヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、遺伝子療法ベクター、ゲノム編集ベクター、ゲノム編集された細胞、および方法で治療することができる免疫不全と診断されている対象を指す。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「自己」は、ドナーおよびレシピエントが同じ対象である細胞を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「同種異系間」は、ドナー種およびレシピエント種が同じであるが、細胞は遺伝子的に異なる細胞を指す。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「同系間」は、ドナー種およびレシピエント種が同じであり、ドナーおよびレシピエントが異なる個体であり、かつドナー細胞およびレシピエント細胞が遺伝子的に同一である細胞を指す。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「異種間」は、ドナー種およびレシピエント種が異なる細胞を指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」は、ある疾患または病態の症状または病理に対する任意の有益なまたは所望される効果を含み、治療される疾患または病態（例えば、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全）の１つ以上の測定可能なマーカーの最小の低減さえも含み得る。治療は、任意で疾患または病態の進行を遅延させることを伴い得る。「治療」は、必ずしも疾患もしくは病態またはそれに関連する症状の完全な根絶または治癒を示すものではない。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「予防する」および「予防」、「予防される」、「予防すること」などの類似の用語は、疾患または病態（例えば、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全）の発生または再発の可能性を予防、阻害、または低減するためのアプローチを示す。それはまた、疾患もしくは病態の発症もしくは再発を遅延させること、または疾患もしくは病態の症状の発生もしくは再発を遅延させることも指す。本明細書で使用される場合、「予防」および類似の用語はまた、疾患または病態の発症または再発前に、疾患または病態の強度、効果、症状、および／または負荷を低減することも含む。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「の少なくとも１つの症状を寛解させる」という用語は、対象が治療されている疾患または病態（例えば、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、および免疫不全）の少なくとも１つの症状を減少させることを指す。特定の実施形態において、治療されているヘモグロビン異常症またはヘモグロビン異常症の病態は、β−サラセミアであり、寛解される１つ以上の症状には、脱力感、疲労、蒼白外見、黄疸、顔面骨奇形、緩慢成長、腹部膨満、暗色尿、（輸血の不在下での）鉄欠乏症、頻繁な輸血の必要性が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、治療されているヘモグロビン異常症またはヘモグロビン異常症の病態は、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）であり、寛解される１つ以上の症状には、貧血；腹部、胸部、骨、または関節における疼痛などの疼痛の原因不明のエピソード；手または足の腫脹；腹部膨満；発熱；頻繁な感染；蒼白皮膚または爪床；黄疸；成長遅延；視覚障害；脳卒中の兆候または症状；（輸血の不在下での）鉄欠乏症、頻繁な輸血の必要性が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、治療されている疾患または病態は、癌であり、寛解される１つ以上の症状には、脱力感、疲労、息切れ、易皮下出血性および易出血性、頻繁な感染、リンパ節腫大、（腹部器官腫大による）腹部膨隆または有痛腹部、骨痛および関節痛、骨折、予定外体重減少、食欲不振、寝汗、持続性微熱、ならびに（腎機能障害による）排尿減少が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「量」という用語は、有益なまたは所望される予防結果または治療結果（臨床結果を含む）を達成するのに十分な、「有効である量」または「有効量」のＤＮＡドナー修復鋳型、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞を指す。
【０１５６】
「予防有効量」という用語は、所望される予防結果を達成するのに十分な、ＤＮＡドナー修復鋳型、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞の量を指す。典型的ではあるが必ずしもそうでなくてもよいが、予防用量は、疾患前または疾患初期に対象において使用されるため、予防有効量は、治療有効量未満である。
【０１５７】
「治療有効量」のＤＮＡドナー修復鋳型、ヌクレアーゼバリアント、ゲノム編集組成物、またはゲノム編集された細胞は、個体の病状、年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望される応答を誘発する能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果がいかなる有毒または有害な効果にも勝るような量である。「治療有効量」という用語は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。治療量が示される場合、投与されるべき正確な量の、特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書を鑑みて、かつ年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（対象）の病態における個々の差を考慮して、医師により決定され得る。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「ヘモグロビン異常症」または「ヘモグロビン異常症の病態」という用語は、ヘモグロビンの構造の改変および／または合成から生じる異常なヘモグロビン分子の存在を伴う多様な群の遺伝性血液障害を指す。
【０１５９】
「免疫不全」は、免疫系からの応答を惹起する疾患を指す。特定の実施形態において、「免疫不全」という用語は、癌、移植片対宿主病、自己免疫疾患、または免疫不全を指す。一実施形態において、免疫不全は、感染性疾患を包含する。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は一般に、異常な細胞が制御されずに分裂し、かつ近くの組織に浸潤し得る、あるクラスの疾患または病態に関連する。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「悪性」という用語は、腫瘍細胞群が、制御されない成長（すなわち、正常な限度を超えた分裂）、浸潤（すなわち、隣接している組織への侵入およびそれらの破壊）、ならびに転移（すなわち、リンパまたは血液を介した体内の他の位置への伝播）のうちの１つ以上を示す癌を指す。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「転移する」という用語は、身体の一部分から別の部分への癌の伝播を指す。伝播した細胞によって形成される腫瘍は、「転移性腫瘍」または「転移」と呼ばれる。転移性腫瘍は、元の（原発）腫瘍内の細胞と同様の細胞を含有する。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、「良性」または「非悪性」という用語は、より大きく成長する可能性があるが、身体の他の部分には伝播しない腫瘍を指す。良性腫瘍は自己限定的であり、典型的には浸潤または転移しない。
【０１６４】
「癌細胞」または「腫瘍細胞」は、癌性腫瘍または組織の個々の細胞を指す。腫瘍は一般に、異常な細胞成長によって形成される腫脹または病変を指し、これらは、良性、前悪性、または悪性であり得る。ほとんどの癌は腫瘍を形成するが、いくつかの癌、例えば、白血病は必ずしも腫瘍を形成しない。腫瘍を形成する癌について、癌（細胞）および腫瘍（細胞）は互換的に使用される。ある個体における腫瘍の量は、その腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍負荷」である。
【０１６５】
「移植片対宿主病」または「ＧＶＨＤ」は、細胞、組織、または固形臓器移植後に生じ得る合併症を指す。ＧＶＨＤは幹細胞または骨髄移植後に生じる可能性があり、移植されたドナー細胞が移植レシピエントの身体を攻撃する。ヒトにおける急性ＧＶＨＤは移植後６０日以内に起こり、細胞溶解性リンパ球の作用によって皮膚、肝臓、および腸に対する損傷をもたらす。慢性ＧＶＨＤはより後に生じ、主に皮膚を冒す全身性自己免疫疾患であり、Ｂ細胞のポリクローナル活性化ならびにＩｇおよび自己抗体の過剰産生をもたらす。実質器官移植の移植片対宿主病（ＳＯＴ−ＧＶＨＤ）は、２つの形態で生じる。より一般的な種類は抗体媒介性であり、血液型Ａ、Ｂ、またはＡＢを有するレシピエントにおいて、血液型Ｏを有するドナーからの抗体がレシピエントの赤血球を攻撃し、軽度の一過的な溶血性貧血をもたらす。ＳＯＴ−ＧＶＨＤの第２の形態は、高い死亡率を有する細胞型に関連するものであり、ドナー由来のＴ細胞が、（ほとんどの場合、皮膚、肝臓、胃腸管、および骨髄における）免疫学的に異なる宿主組織に対する免疫学的攻撃を産生し、これらの器官において合併症をもたらす。
【０１６６】
「移植片対白血病」または「ＧＶＬ」は、ドナーの移植された組織（骨髄または末梢血など）に存在する免疫細胞による、人の白血病細胞に対する免疫応答を指す。
【０１６７】
「自己免疫疾患」は、身体がそれ自体の組織のいくつかの構成物に対する免疫原性（すなわち、免疫系）応答を産生する疾患を指す。換言すると、免疫系は、体内のいくつかの組織または系を「自己」として認識するその能力を失い、それが異質であるかの如くそれを標的とし、攻撃してしまう。自己免疫疾患の例示的な例には、関節炎、炎症性腸疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、ループス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、溶血性貧血、抗免疫甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、大腸炎、糖尿病、強皮症、および乾癬などが含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
「免疫不全」は、疾患または化学物質の投与によって免疫系が損なわれている患者の状態を意味する。この病態により、系は、異物に対する防御に必要とされる血液細胞の数および種類を欠損してしまう。免疫不全病態または疾患は、当該技術分野において既知であり、それらには、例えば、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、ＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）、選択的ＩｇＡ欠損症、分類不能免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、慢性肉芽腫症、高ＩｇＭ症候群、ウィスコット・オルドリッチ症候群（ＷＡＳ）、および糖尿病が含まれる。
【０１６９】
「感染性疾患」は、人から人へと、または生物から生物へと伝染し得、かつ微生物因子またはウイルス因子（例えば、感冒）によって引き起こされる疾患を指す。感染性疾患は、当該技術分野において既知であり、それらには、例えば、肝炎、性行為感染症（例えば、クラミジア、淋病）、結核、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、ジフテリア、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、コレラ、およびインフルエンザが含まれる。
【０１７０】
Ｃ．ドナー修復鋳型
本明細書において企図されるドナー修復鋳型は、単一ドナー分子および１つ以上の操作されたヌクレアーゼを使用した多重ゲノム編集に好適である。本明細書において企図されるドナー修復鋳型は、扱いにくく、かつ多くの場合編集の繰り返しならびに編集される各遺伝子座について別個のドナー鋳型および対応する操作されたヌクレアーゼを必要とする既存の方法と比較して、量子改善を提供する。特定の実施形態において、複数の操作されたヌクレアーゼを使用して、ＤＳＢを複数の標的部位に導入し、ＤＳＢは、複数の標的部位を標的とする単一ＤＮＡドナー修復鋳型の存在下で、相同性指向性修復（ＨＤＲ）機構を通して標的部位の各々において修復される。
【０１７１】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型を使用して、１つ以上の配列をゲノム内の複数の部位に挿入する。特定の好ましい実施形態において、ドナー修復鋳型を使用して、ゲノム内の複数の標的部位配列を修復または修飾する。
【０１７２】
様々な実施形態において、造血細胞（例えば、ＨＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞など）に、ドナー修復鋳型を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス、ＩＤＬＶなど）、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、またはワクシニアウイルスベクターを形質導入することによって、ドナー修復鋳型が導入される。
【０１７３】
特定の実施形態において、造血細胞（例えば、ＨＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞など）に、ドナー修復鋳型を含む一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、プラスミド、またはミニサークルＤＮＡを導入することによって、ドナー修復鋳型が導入される。
【０１７４】
様々な実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームを含む。
【０１７５】
様々な実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含み、各相同アーム対は、１つ以上の導入遺伝子に隣接する。
【０１７６】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含み、各相同アーム対は、異なる導入遺伝子に隣接する。
【０１７７】
様々な実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含み、各相同アーム対は、１つ以上の導入遺伝子に隣接し、相同アーム対の少なくとも２つが、同じ導入遺伝子に隣接する。
【０１７８】
「相同アーム対」は、２本の相同アームの群を指す。特定の実施形態において、相同アーム対は、５’相同アームおよび３’相同アームを含む。「５’相同アーム」は、標的部位（例えば、二本鎖切断部位）のＤＮＡ配列５’と同一、またはほぼ同一、または相同であるポリヌクレオチド配列を指す。「３’相同アーム」は、標的部位のＤＮＡ配列３’と同一、またはほぼ同一、または相同であるポリヌクレオチド配列を指す。特定の実施形態において、相同アーム対は、標的部位の再切断を最小化するための標的部位の変異を有する、二本鎖切断の標的部位を含むポリヌクレオチド配列を含む相同アームを含む。特定の実施形態において、相同アーム対における相同アームのいずれか一方または両方は独立して、標的部位から約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対、約１１００塩基対、約１２００塩基対、約１３００塩基対、約１４００塩基対、約１５００塩基対、約１６００塩基対、約１７００塩基対、約１８００塩基対、約１９００塩基対、約２０００塩基対、約２１００塩基対、約２２００塩基対、約２３００塩基対、約２４００塩基対、約２５００塩基対、約２６００塩基対、約２７００塩基対、約２８００塩基対、約２９００塩基対、または約３０００塩基対（標的部位からの全ての介在する距離を含む）に位置する。
【０１７９】
特定の実施形態において、企図される相同アームの好適な長さの例示的な例は、独立して選択することができ、それらには、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約５００塩基対、約６００塩基対、約７００塩基対、約８００塩基対、約９００塩基対、約１０００塩基対、約１１００塩基対、約１２００塩基対、約１３００塩基対、約１４００塩基対、約１５００塩基対、約１６００塩基対、約１７００塩基対、約１８００塩基対、約１９００塩基対、約２０００塩基対、約２１００塩基対、約２２００塩基対、約２３００塩基対、約２４００塩基対、約２５００塩基対、約２６００塩基対、約２７００塩基対、約２８００塩基対、約２９００塩基対、または約３０００塩基対、またはそれよりも長い相同アーム（全ての介在する長さの相同アームを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８０】
好適な相同アーム長さの追加の例示的な例には、約１００塩基対〜約６００塩基対、約１００塩基対〜約５００塩基対、約１００塩基対〜約４００塩基対、約１００塩基対〜約３００塩基対、約１００塩基対〜約２００塩基対、約２００塩基対〜約６００塩基対、約２００塩基対〜約５００塩基対、約２００塩基対〜約４００塩基対、約２００塩基対〜約３００塩基対、約３００塩基対〜約６００塩基対、約３００塩基対〜約５００塩基対、約１００塩基対〜約３０００塩基対、約２００塩基対〜約３０００塩基対、約３００塩基対〜約３０００塩基対、約４００塩基対〜約３０００塩基対、約５００塩基対〜約３０００塩基対、約５００塩基対〜約２５００塩基対、約５００塩基対〜約２０００塩基対、約７５０塩基対〜約２０００塩基対、約７５０塩基対〜約１５００塩基対、または約１０００塩基対〜約１５００塩基対（全ての介在する長さの相同アームを含む）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型に存在する５’および３’相同アームの長さは独立して、約１００塩基対、約２００塩基対、約３００塩基対、約４００塩基対、約５００塩基対、または約６００塩基対から選択される。一実施形態において、５’相同アームは約３００塩基対であり、３’相同アームは約３００塩基対である。一実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型における複数の５’相同アームの各々は約３００塩基対であり、ＤＮＡドナー修復鋳型における複数の３’相同アームの各々は約３００塩基対である。
【０１８２】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、複数の相同アーム対と、１つ以上の導入遺伝子とを含む。
【０１８３】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、複数の相同アーム対と、導入遺伝子とを含む。特定の実施形態において、相同アーム対の各々は、標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームと、標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームとを含み、相同アーム対の各々は、異なる標的部位に関連している。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、第１の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームを含む第１の相同アーム対、および第１の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームを含む第１の相同アーム対と、第２の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アーム、および第２の標的部位のＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームとを含み、第１の標的部位は、第２の標的部位と同一ではない。
【０１８４】
特定の実施形態において、相同アーム対の各々は同じ導入遺伝子配列に隣接し、各５’相同アームは導入遺伝子に対して５’に位置し、各３’相同アームは導入遺伝子に対して３’に位置する。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、第１の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同であり、かつ第２の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームの５’に位置する５’相同アーム（両方の５’相同アームは導入遺伝子に対して５’に位置する）と、第１の標的部位に対するＤＮＡ配列３’対して相同であり、かつ第２の標的部位に対するＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームの３’に位置する３’相同アーム（両方の３’相同アームは導入遺伝子の３’に位置する）とを含む。
【０１８５】
特定の実施形態において、相同アーム対の各々は同じ導入遺伝子配列に隣接し、各５’相同アームは導入遺伝子に対して５’に位置し、各３’相同アームは導入遺伝子に対して３’に位置する。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、第１の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同であり、かつ第２の標的部位のＤＮＡ配列５’に対して相同である５’相同アームに対して５’に位置する５’相同アーム（両方の５’相同アームは導入遺伝子に対して５’に位置する）と、第１の標的部位に対するＤＮＡ配列３’に対して相同であり、かつ第２の標的部位に対するＤＮＡ配列３’に対して相同である３’相同アームの５’に位置する３’相同アーム（両方の３’相同アームは導入遺伝子に対して３’に位置する）とを含む。
【０１８６】
特定の実施形態において、相同アーム対の各々は異なる導入遺伝子配列に隣接し、第１の相同アーム対は第１の導入遺伝子に隣接し、第２の相同アーム対は第２の導入遺伝子に隣接する。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、第１の標的部位に対するＤＮＡ配列５’に対して相同であり、かつ第１の導入遺伝子に対して５’に位置する５’相同アーム、および第１の標的部位に対するＤＮＡ配列３’に対して相同であり、かつ第１の導入遺伝子の３’に位置する３’相同アームを含む第１の相同アーム対と、第２の標的部位に対するＤＮＡ配列５’に対して相同であり、かつ第２の導入遺伝子に対して５’に位置する５’相同アーム、および第２の標的部位に対するＤＮＡ配列３’に対して相同であり、かつ第２の導入遺伝子に対して３’に位置する３’相同アームを含む第２の相同アーム対とを含む。
【０１８７】
好ましい実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、ヘモグロビン異常症を治療もしくは予防するための、またはヘモグロビン異常症のうち少なくとも１つの症状を寛解させるための、細胞系遺伝子療法の有効性を増加させる１つ以上の導入遺伝子をコードする。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、β−グロビンポリペプチド、抗鎌状化β−グロビンポリペプチド（例えば、βＡ−Ｔ８７Ｑ、βＡ−Ｋ１２０Ｅ、βＡ−Ｋ９５Ｅ、もしくはそれらの組み合わせ）、またはγ−グロビンポリペプチドを含むがこれらに限定されない、グロビンポリペプチドをコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。
【０１８８】
好ましい実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、養子細胞療法の安全性、有効性、耐久性、および／または持続性を増加させる１つ以上の導入遺伝子をコードする。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型は、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を含む。特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、ＴＣＲシグナル伝達、免疫系チェックポイント、および／または免疫抑制シグナル伝達に寄与する遺伝子をコードする複数の遺伝子座に（ＨＤＲを介して）１つ以上の導入遺伝子を挿入するように設計される。
【０１８９】
ドナー修復鋳型は、本明細書の他の箇所で企図されるプロモーターおよび／またはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、ならびに自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの１つ以上のポリヌクレオチドを更に含み得る。
【０１９０】
１．免疫能エンハンサー
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫能エンハンサーをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって、より強力なものとなる。本明細書で使用される場合、「免疫能エンハンサー」という用語は、Ｔ細胞活性化および／または機能を刺激および／または増強する天然に存在しない分子、免疫増強因子、ならびに腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞内で免疫賦活シグナルに変換する天然に存在しないポリペプチドを指す。
【０１９１】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、免疫能エンハンサーを１つの遺伝子座に、および別の免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０１９２】
特定の実施形態において、免疫能エンハンサーは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子；サイトカイン、ケモカイン、細胞毒、および／またはサイトカイン受容体を含むがこれらに限定されない、免疫増強因子；ならびにフリップ受容体からなる群から選択される。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、免疫能エンハンサー、免疫増強因子、またはフリップ受容体は、タンパク質不安定化ドメインを含む融合ポリペプチドである。
【０１９４】
ａ．二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）分子をコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって、より強力なものとなる。ＢｉＴＥ分子は、本明細書の他の箇所で企図される標的抗原、リンカー、またはスペーサーに結合する第１の結合ドメインと、免疫エフェクター細胞上の刺激分子または共刺激分子に結合する第２の結合ドメインとを含む、二分分子である。第１および第２の結合ドメインは独立して、リガンド、受容体、抗体またはそれらの抗原結合断片、レクチン、および炭水化物から選択され得る。
【０１９５】
特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗原結合ドメインである。
【０１９６】
特定の実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、抗体またはそれらの抗原結合断片である。一実施形態において、第１および第２の結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【０１９７】
特定の実施形態において、第１の結合ドメインによって認識および結合され得る標的抗原の例示的な例には、アルファ葉酸受容体、栄養膜糖タンパク質（ＴＰＢＧ）；αｖβ６インテグリン；Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）；Ｂ７−Ｈ３；Ｂ７−Ｈ６；ＣＤ２７６；ＣＤ１６；ＣＤ１９；ＣＤ２０；ＣＤ２２；ＣＤ３０；ＣＤ３３；ＣＤ４４；ＣＤ４４ｖ６；ＣＤ４４ｖ７／８；ＣＤ７０；ＣＤ７９ａ；ＣＤ７９ｂ；ＣＤ１２３；ＣＤ１３８；ＣＤ１７１；癌胎児抗原（ＣＥＡ）ポリペプチド；コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４）；上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）；ｅｒｂ−ｂ２受容体チロシンキナーゼ２（ＥＲＢＢ２）；ＥＧＦＲ遺伝子増幅およびバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）；上皮細胞接着分子（ＥＰＣＡＭ）；エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）；線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）；胎児アセチルコリン受容体（胎児ＡｃｈＲ）；ｂＤＧａｌｐＮＡｃ（１−４）［ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）］ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ（ＧＤ２）；ａＮｅｕ５Ａｃ（２−８）ａＮｅｕ５Ａｃ（２−３）ｂＤＧａｌｐ（１−４）ｂＤＧｌｃｐ（１−１）Ｃｅｒ（ＧＤ３）；グリピカン−３（ＧＰＣ３）；ヒト白血球抗原Ａ１  ＭＡＧＥファミリーメンバーＡ１（ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥＡ１）；ヒト白血球抗原Ａ２  ＭＡＧＥファミリーメンバーＡ１（ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥＡ１）；ヒト白血球抗原Ａ３  ＭＡＧＥファミリーメンバーＡ１（ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥＡ１）；ＭＡＧＥＡ１；ヒト白血球抗原Ａ１ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１）；ヒト白血球抗原Ａ２ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１）；ヒト白血球抗原Ａ３ニューヨーク食道扁平上皮癌１（ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１）；インターロイキン受容体１１アルファ（ＩＬ−１１Ｒα）；インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ−２（ＩＬ−１３Ｒα２）；ラムダ軽鎖；ルイス−Ｙ；カッパ軽鎖；メソテリン；ムチン１、細胞表面関連（ＭＵＣ１）；ムチン１６、細胞表面関連（ＭＵＣ１６）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）リガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、黒色腫における優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）、滑膜肉腫Ｘ（ＳＳＸ）、サバイビン、腫瘍関連糖タンパク質７２（ＴＡＧ７２）、腫瘍内皮細胞マーカー１（ＴＥＭ１）、腫瘍内皮細胞マーカー５（ＴＥＭ５）、腫瘍内皮細胞マーカー７（ＴＥＭ７）、腫瘍内皮細胞マーカー８（ＴＥＭ８）、血管内皮成長因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、およびウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１９８】
標的抗原の他の例示的な実施形態には、ＭＨＣ−ペプチド複合体が含まれ、任意で、ペプチドは、ＦＲα、ＴＰＢＧ、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ２７６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ軽鎖、ルイス−Ｙ、カッパ軽鎖、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からプロセシングされる。
【０１９９】
特定の実施形態において、第２の結合ドメインによって認識および結合され得る免疫エフェクター細胞上の刺激分子または共刺激分子の例示的な例には、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ２７８が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、ＢｉＴＥをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０２０１】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、ＢｉＴＥをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０２０２】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、ＢｉＴＥをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の各々に挿入される。
【０２０３】
ｂ．免疫増強因子
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫増強因子をコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって、より強力なものとなる。免疫増強因子は、免疫エフェクター細胞内の免疫応答を増強する特定のサイトカイン、ケモカイン、細胞毒、およびサイトカイン受容体を指す。
【０２０４】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＩＬ−２、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＴＮＦ−αからなる群から選択されるサイトカインをコードする。
【０２０５】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、およびＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるケモカインをコードする。
【０２０６】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、パーフォリン、グランザイムＡ、およびグランザイムＢからなる群から選択される細胞毒をコードする。
【０２０７】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、およびＩＬ−２１受容体からなる群から選択されるサイトカイン受容体をコードする。
【０２０８】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫増強因子をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０２０９】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫増強因子をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０２１０】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫増強因子をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の各々に挿入される。
【０２１１】
ｃ．フリップ受容体
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、腫瘍微小環境によって誘発される免疫抑制因子によって免疫抑制シグナルを正の免疫賦活シグナルに「フリッピング」または「反転」させることによって、疲弊に対してより耐性なものとなる。一実施形態において、Ｔ細胞は、フリップ受容体をコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。本明細書で使用される場合、「フリップ受容体」という用語は、腫瘍微小環境からの免疫抑制シグナルをＴ細胞内で免疫賦活シグナルに変換する、天然に存在しないポリペプチドを指す。好ましい実施形態において、フリップ受容体は、免疫賦活シグナルをＴ細胞に伝達する、免疫抑制因子、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインに結合するエキソドメインを含むポリペプチドを指す。
【０２１２】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、免疫増強サイトカイン受容体の免疫抑制サイトカイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインに結合するエキソドメインまたは細胞外結合ドメインを含むフリップ受容体を含む。
【０２１３】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制サイトカインに結合するエキソドメインを含み、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−６受容体、ＩＬ−８受容体、ＩＬ−１０受容体、ＩＬ−１３受容体、またはＴＧＦβ受容体；ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される膜貫通；およびＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離されるエンドドメインの細胞外サイトカイン結合ドメインである。
【０２１４】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、免疫抑制サイトカインに結合するエキソドメインを含み、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、またはＴＧＦβ；ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ３ポリペプチド、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離される膜貫通；およびＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離されるエンドドメインに結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【０２１５】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、免疫抑制因子、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインに結合するエキソドメインを含むフリップ受容体を含む。
【０２１６】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエキソドメインの例示的な例には、ＩＴＩＭおよび／またはＩＴＳＭを含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これに限定されない。
【０２１７】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエキソドメインの更なる例示的な例には、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲＩＩ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＩＬ１０Ｒ、ＩＬ１３Ｒα２、ＴＲＡＩＬＲ１、ＲＣＡＳ１Ｒ、およびＦＡＳの細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２１８】
一実施形態において、エキソドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、およびＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０２１９】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、免疫抑制サイトカイン、膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインに結合するエキソドメインを含むフリップ受容体を含む。
【０２２０】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適な膜貫通ドメインの更なる例示的な例には、以下のタンパク質、Ｔ細胞受容体、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４のＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、およびＴＧＦβＲＩＩアルファ鎖またはベータ鎖の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達複合体、例えば、ＣＤ３と会合する膜貫通ドメインを選択して、免疫賦活シグナルを増加させることが好ましくあり得る。
【０２２１】
様々な実施形態において、フリップ受容体は、免疫賦活シグナルを誘発するエンドドメインを含む。本明細書で使用される場合、「エンドドメイン」という用語は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、共刺激シグナル伝達ドメイン、一次シグナル伝達ドメイン、またはＴ細胞内の免疫賦活シグナルの誘発に関連する別の細胞内ドメインを含むがこれらに限定されない、免疫賦活性モチーフまたはドメインを指す。
【０２２２】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエンドドメインの例示的な例には、ＩＴＡＭモチーフを含むドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２３】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエンドドメインの追加の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、またはＺＡＰ７０から単離される共刺激シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２４】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエンドドメインの追加の例示的な例には、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１５受容体、またはＩＬ−２１受容体から単離されるエンドドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２５】
特定の実施形態において企図されるフリップ受容体の特定の実施形態における使用に好適なエンドドメインの更なる例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄから単離される一次シグナル伝達ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２６】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、またはＴＧＦβＲＩＩ由来の細胞外ドメイン；ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、およびＴＧＦβＲＩＩ由来の膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含むエキソドメインを含む。
【０２２７】
特定の実施形態において、フリップ受容体は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、またはＴＧＦβＲＩＩ由来の細胞外ドメイン；ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン；ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含むエキソドメインを含む。
【０２２８】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、フリップ受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０２２９】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、フリップ受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０２３０】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、フリップ受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の各々に挿入される。
【０２３１】
ｉ．ＰＤ−１フリップ受容体
ＰＤ−１は、Ｔ細胞上で発現され、腫瘍微小環境に存在する免疫抑制因子による免疫抑制に供される。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の発現は、いくつかのヒト悪性腫瘍の予後と相関する。ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１シグナル伝達経路は、Ｔ細胞疲弊の１つの重要な制御経路である。ＰＤ−Ｌ１は、癌細胞内および間質細胞内で大量に発現され、モノクローナル抗体を使用したＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１の遮断は、Ｔ細胞抗腫瘍機能を強化する。ＰＤ−Ｌ２はまたＰＤ−１にも結合し、Ｔ細胞機能を負に制御する。
【０２３２】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＰＤ−１フリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２３３】
特定の実施形態において企図されるＰＤ−１フリップ受容体は、ヒトＰＤ−１受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＰＤ−１、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２３４】
ｉｉ．ＬＡＧ−３フリップ受容体
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）は、Ｔ細胞機能に対して異なる生物学的効果を有する細胞表面分子である。ＬＡＧ−３シグナル伝達は、自己免疫応答のＣＤ４＋制御性Ｔ細胞抑制に関連する。加えて、ＬＡＧ−３発現はＣＤ８＋Ｔ細胞の抗原刺激時に増加し、腫瘍微小環境におけるＴ細胞疲弊に関連する。ＬＡＧ−３のインビボ抗体遮断は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の蓄積およびエフェクター機能の増加に関連する。１つのグループは、特定の抗腫瘍ワクチン接種と併用した抗ＬＡＧ−３抗体の投与が、腫瘍における活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加、および腫瘍実質部の破壊をもたらすことを示した。Ｇｒｏｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１７（１１）：３３８３−３３９２。
【０２３５】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＬＡＧ−３フリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２３６】
特定の実施形態において企図されるＬＡＧ−３フリップ受容体は、ヒトＬＡＧ−３受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＬＡＧ−３、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２３７】
ｉｉｉ．ＴＩＭ−３フリップ受容体
Ｔ細胞免疫グロブリン−３（ＴＩＭ−３）は負の制御分子として確立されており、免疫寛容における役割を果たす。ＴＩＭ−３発現は、癌における、および慢性感染中の疲弊したＴ細胞を特定する。ＴＩＭ−３を発現するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、サイトカインの産生量が低減しているか、または抗原に応答した増殖がより少ない。ＴＩＭ−３発現の増加は、Ｔ細胞増殖の減少、ならびにＩＬ−２、ＴＮＦ、およびＩＦＮ−γの産生の低減と関連する。ＴＩＭ−３シグナル伝達経路の遮断は増殖を回復させ、抗原特異的Ｔ細胞内のサイトカイン産生を強化する。
【０２３８】
ＴＩＭ−３は同時発現され、癌胎児抗原細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）（活性化Ｔ細胞上で発現され、Ｔ細胞阻害に関与する別の周知の分子である）を有するヘテロ二量体を形成する。ＣＥＡＣＡＭ１の存在は、ＴＩＭ−３に阻害機能を賦与する。ＣＥＡＣＡＭ１は、各分子の高度に関連した膜遠位のＮ末端ドメインを通してシスにおけるヘテロ二量体相互作用を形成することによって、ＴＩＭ−３の成熟および細胞表面発現を促進する。ＣＥＡＣＡＭ１およびＴＩＭ−３はまた、それらのＮ末端ドメインを通してトランスにおいても結合する。
【０２３９】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＴＩＭ−３フリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２４０】
特定の実施形態において企図されるＴＩＭ−３フリップ受容体は、ヒトＴＩＭ−３受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＴＩＭ−３、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２４１】
ｉｖ．ＣＴＬＡ−４フリップ受容体
ＣＴＬＡ４は主にＴ細胞上で発現され、初期のＴ細胞活性化の振幅を制御する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激受容体ＣＤ２８の活性に対抗する。ＴＣＲが最初に同族抗原に結合しない限り、ＣＤ２８はＴ細胞活性化には影響を与えない。抗原認識が生じると、ＣＤ２８シグナル伝達はＴＣＲシグナル伝達を強度に増幅して、Ｔ細胞を活性化する。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４は、同一のリガンド、ＣＤ８０（Ｂ７．１としても知られる）およびＣＤ８６（Ｂ７．２としても知られる）を共有する。ＣＴＬＡ４は、両方のリガンドに対してずっと高い全体的な親和性を有し、ＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する上でＣＤ２８を打ち負かすこと、ならびに阻害シグナルをＴ細胞に積極的に送達することによって、Ｔ細胞の活性化を減衰させる。ＣＴＬＡ４はまた、ＣＤ８０およびＣＤ８６のＣＤ２８結合からの隔離、ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６の抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面からの積極的な除去を通して、シグナル伝達非依存的Ｔ細胞阻害も与える。
【０２４２】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＣＴＬＡ−４フリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２４３】
特定の実施形態において企図されるＣＴＬＡ−４フリップ受容体は、ヒトＣＴＬＡ−４受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２４４】
ｖ．ＴＩＧＩＴフリップ受容体
Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン系阻害モチーフ［ＩＴＩＭ］ドメイン（ＴＩＧＩＴ）は、複数の固形腫瘍型にわたって一貫して高度に発現されるものとして特定されたＴ細胞共阻害受容体である。ＴＩＧＩＴは、抗腫瘍および他のＣＤ８＋Ｔ細胞依存的慢性免疫応答を制限する。ＴＩＧＩＴは、ヒトおよびマウスの腫瘍浸潤性Ｔ細胞上で高度に発現される。ＴＩＧＩＴの遺伝子破壊または抗体遮断は、インビトロおよびインビボでのＮＫ細胞殺傷およびＣＤ４＋Ｔ細胞抗原刺激を強化することが示されており、実験的自己免疫性脳炎などのＣＤ４＋Ｔ細胞依存的自己免疫疾患の重症度を増悪させる可能性がある（Ｇｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｊｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｌｅｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１、Ｌｏｚａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｓｔａｎｉｅｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｓｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。逆に、ＴＩＧＩＴ−Ｆｃ融合タンパク質またはアゴニスト抗ＴＩＧＩＴ抗体の投与は、インビトロでのＴ細胞活性化およびインビボでＣＤ４＋Ｔ細胞依存的遅延型過敏反応を抑制した（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ＴＩＧＩＴは、その対抗共刺激受容体ＣＤ２２６をＣＤ１５５への結合について打ち負かすことによって、その免疫抑制効果を発揮する可能性が高い。
【０２４５】
癌および慢性ウイルス感染の両方のモデルにおいて、ＴＩＧＩＴおよびＰＤ−Ｌ１の抗体同時遮断は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能を相乗的かつ特異的に強化し、それぞれ有意な腫瘍およびウイルスの排除をもたらした。
【０２４６】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＴＩＧＩＴフリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２４７】
特定の実施形態において企図されるＴＩＧＩＴフリップ受容体は、ヒトＴＩＧＩＴ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２４８】
ｖｉ．ＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体
形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）は、免疫系の多くのアームを極性化し得る、腫瘍細胞および免疫細胞によって産生される免疫抑制サイトカインである。腫瘍細胞および腫瘍浸潤性リンパ球による、ＴＧＦβを含む免疫抑制サイトカインの過剰産生は、免疫抑制腫瘍微小環境に寄与する。ＴＧＦβは頻繁に、腫瘍転移および浸潤、免疫細胞の機能の阻害、ならびに癌を有する患者における不良な予後に関連する。腫瘍特異的ＣＴＬ内のＴＧＦβＲＩＩを通したＴＧＦβシグナル伝達は、腫瘍におけるそれらの機能および頻度を減衰させ、モノクローナル抗体によるＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＴＧＦβシグナル伝達の遮断は、より急速な腫瘍サーベイランスおよび腫瘍部位におけるより多くのＣＴＬの存在をもたらす。
【０２４９】
一実施形態において、ＤＳＢは、相同組換えによってＤＳＢにおける１つ以上の遺伝子に挿入されるＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体をコードする導入遺伝子に隣接する１つ以上の相同アーム対を含むドナー修復鋳型の存在下で、操作されたヌクレアーゼによって、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中に導入される。
【０２５０】
特定の実施形態において企図されるＴＧＦβＲＩＩフリップ受容体は、ヒトＴＧＦβＲＩＩ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、ＴＧＦβＲＩＩ、ＣＤ３ポリペプチド、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、またはＣＤ１３７由来の膜貫通ドメイン、ならびにＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７８、および／またはＣＤ３ζ由来のエンドドメインを含む。
【０２５１】
２．免疫抑制シグナルダンパー
既存の養子細胞療法を悩ませる１つの制限または問題は、腫瘍微小環境によって媒介される疲弊による免疫エフェクター細胞の反応性低下である。疲弊したＴ細胞は、ナイーブＴ細胞、エフェクターＴ細胞、またはメモリーＴ細胞とは顕著に異なる特有の分子シグネチャーを有する。それらは、サイトカイン発現およびエフェクター機能が減少したＴ細胞として定義される。
【０２５２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、免疫抑制因子によるシグナル伝達を減少または減衰させることによって、疲弊に対してより耐性なものとなる。一実施形態において、Ｔ細胞は、免疫抑制シグナルダンパーをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０２５３】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、免疫抑制シグナルダンパーを１つの遺伝子座に、および免疫能エンハンサー、別の免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「免疫抑制シグナルダンパー」という用語は、腫瘍微小環境からＴ細胞への免疫抑制シグナルの伝達を減少させる、天然に存在しないポリペプチドを指す。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片である。好ましい実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ダンパーが免疫抑制因子に結合するエキソドメイン、および任意で膜貫通ドメイン、および任意で修飾エンドドメイン（例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン）を含むために、特定の免疫抑制因子またはシグナル伝達経路に対して抑制、減衰、またはドミナントネガティブ効果を誘発するポリペプチドを指す。
【０２５５】
特定の実施形態において、エキソドメインは、免疫抑制因子を認識し、それに結合する細胞外結合ドメインである。
【０２５６】
特定の実施形態において、修飾されたエンドドメインは、免疫抑制シグナルを減少または阻害するように変異されている。好適な変異戦略には、アミノ酸置換、付加、または欠失が含まれるが、これらに限定されない。好適な変異には、シグナル伝達ドメインを除去するためのエンドドメイン切断、シグナル伝達モチーフ活性に重要な残基を除去するための細胞内ドメインの変異、および受容体循環を遮断するためのエンドドメインの変異が更に含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、存在する場合、エンドドメインは、免疫抑制シグナルを伝達しないか、またはシグナル伝達が実質的に低減している。
【０２５７】
したがって、いくつかの実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、腫瘍微小環境由来の１つ以上の免疫抑制因子のシンクとして作用し、Ｔ細胞内の対応する免疫抑制シグナル伝達経路を阻害する。
【０２５８】
１つの免疫抑制シグナルは、トリプトファン異化反応によって媒介される。癌細胞内のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）によるトリプトファン異化反応は、腫瘍微小環境においてＴ細胞に対する免疫抑制効果を有することが示されているキヌレニンの産生をもたらす。例えば、Ｐｌａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７２（２１）：５４３５−４０を参照されたい。
【０２５９】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、キヌレニナーゼ活性を有する酵素を含む。
【０２６０】
特定の実施形態における使用に好適なキヌレニナーゼ活性を有する酵素の例示的な例には、Ｌ−キヌレニンヒドロラーゼが含まれるが、これに限定されない。
【０２６１】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、免疫抑制因子によって媒介される免疫抑制シグナル伝達を減少または遮断する免疫抑制シグナルダンパーをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０２６２】
特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーによって標的とされる免疫抑制因子の例示的な例には、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）、マクロファージコロニー刺激因子１（Ｍ−ＣＳＦ１）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合癌抗原リガンド（ＲＣＡＳ１）、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ４７、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６３】
様々な実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０２６４】
様々な実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合するエキソドメインを含む。
【０２６５】
特定の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合するエキソドメインと、膜貫通ドメインとを含む。
【０２６６】
別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、免疫抑制因子に結合するエキソドメインと、膜貫通ドメインと、免疫抑制シグナルを伝達しないか、またはそれを伝達する能力が実質的に低減した修飾エンドドメインとを含む。
【０２６７】
本明細書で使用される場合、「エキソドメイン」という用語は、抗原結合ドメインを指す。一実施形態において、エキソドメインは、免疫抑制シグナルを腫瘍微小環境からＴ細胞に伝達する免疫抑制受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。特定の実施形態において、エキソドメインは、免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）および／または免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む受容体の細胞外リガンド結合ドメインを指す。
【０２６８】
免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態における使用に好適なエキソドメインの例示的な例には、以下のポリペプチド、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、リンパ球活性化遺伝子３タンパク質（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメインタンパク質３（ＴＩＭ−３）、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、バンドＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシン系阻害モチーフドメイン（ＴＩＧＩＴ）、形質転換成長因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、マクロファージジコロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）、インターロイキン４受容体（ＩＬ４Ｒ）、インターロイキン６受容体（ＩＬ６Ｒ）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体１（ＣＸＣＲ１）、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体２（ＣＸＣＲ２）、インターロイキン１０受容体サブユニットアルファ（ＩＬ１０Ｒ）、インターロイキン１３受容体サブユニットアルファ２（ＩＬ１３Ｒα２）、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬＲ１）、ＳｉＳｏ細胞上で発現される受容体結合癌抗原（ＲＣＡＳ１Ｒ）、ならびにＦａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）の抗体もしくはそれらの抗原結合断片、またはそれらから単離される細胞外リガンド結合ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６９】
一実施形態において、エキソドメインは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＩＬ１０Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＣＳＦ１Ｒ、およびＴＧＦβＲＩＩからなる群から選択される受容体の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【０２７０】
特定の実施形態において、いくつかの膜貫通ドメインを使用することができる。特定の実施形態において企図される免疫抑制シグナルダンパーの特定の実施形態における使用に好適な膜貫通ドメインの例示的な例には、以下のタンパク質、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤδ、ＣＤ３ε、ＣＤγ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１の膜貫通ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【０２７１】
特定の実施形態において、本明細書において企図される養子細胞療法は、腫瘍微小環境からのＴＧＦβＲＩＩを通した免疫抑制ＴＧＦβシグナルの伝達を阻害または遮断する免疫抑制シグナルダンパーを含む。一実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含むエキソドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインと、切断型非機能性ＴＧＦβＲＩＩエンドドメインとを含む。別の実施形態において、免疫抑制シグナルダンパーは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外リガンド結合を含むエキソドメインと、ＴＧＦβＲＩＩ膜貫通ドメインと、切断型非機能性ＴＧＦβＲＩＩエンドドメインとを含み、エンドドメインを欠如する。
【０２７２】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫抑制シグナルダンパーをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０２７３】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫抑制シグナルダンパーをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０２７４】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、免疫抑制シグナルダンパーをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の各々に挿入される。
【０２７５】
３．操作された抗原受容体
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、操作された抗原受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、操作された抗原受容体をコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０２７６】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、操作された抗原受容体を１つの遺伝子座に、および免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または別の操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０２７７】
特定の実施形態において、操作された抗原受容体は、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＡＲＩＣ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体受容体である。
【０２７８】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、操作された抗原受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０２７９】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、操作された抗原受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０２８０】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、操作された抗原受容体をコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の各々に挿入される。
【０２８１】
ａ．操作されたＴＣＲ
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された免疫エフェクター細胞は、操作されたＴＣＲを含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、操作されたＴＣＲをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０２８２】
一実施形態において、本明細書において企図される操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子に挿入される操作されたＴＣＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＡＲＩＣ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体受容体のうちの１つ以上は、別のＴＣＲシグナル伝達成分、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中のＤＳＢに挿入される。
【０２８３】
天然に存在するＴ細胞受容体は、２つのサブユニットであるアルファ鎖サブユニットおよびベータ鎖サブユニットを含み、これらの各々は、各Ｔ細胞のゲノム内で組換え事象によって産生される特有のタンパク質である。ＴＣＲのライブラリは、特定の標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。この様式において、標的抗原に対する高い結合活性および反応性を有する天然のＴＣＲを選択し、クローニングし、その後養子免疫療法に使用されるＴ細胞集団に導入することができる。
【０２８４】
一実施形態において、Ｔ細胞は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子中のＤＳＢにＴＣＲのサブユニットをコードするポリヌクレオチドを含むドナー修復鋳型を導入することによって修飾され、ＴＣＲサブユニットは、Ｔ細胞に、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性を与えるＴＣＲを形成する能力を有する。特定の実施形態において、サブユニットが、ＴＣＲを形成し、トランスフェクト時にＴ細胞に標的細胞に戻る能力を与える能力を保持し、免疫学的に関連するサイトカインシグナル伝達に関与する限り、サブユニットは、天然に存在するサブユニットと比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、挿入、または修飾を有する。操作されたＴＣＲはまた、好ましくは高い結合活性を有する関連する腫瘍関連ペプチドを提示する標的細胞にも結合し、任意でインビボで関連するペプチドを提示する標的細胞の効率的な殺滅を媒介する。
【０２８５】
操作されたＴＣＲをコードする核酸は、好ましくはＴ細胞の（天然に存在する）染色体内のそれらの天然の文脈から単離されており、本明細書の他の箇所に記載の好適なベクターに組み込むことができる。それらを含む核酸およびベクターの両方は、細胞内、特定の実施形態において好ましくはＴ細胞内に転移させることができる。その後、修飾されたＴ細胞は、形質導入された核酸（複数可）によってコードされるＴＣＲの１つ以上の鎖を発現することができる。好ましい実施形態において、操作されたＴＣＲは外因性ＴＣＲであるが、これはそれが通常特定のＴＣＲを発現しないＴ細胞に導入されているためである。操作されたＴＣＲの本質的な態様は、それが主要組織適合複合体（ＭＨＣ）または類似の免疫学的成分によって提示される腫瘍抗原に対して高い結合活性を有することである。操作されたＴＣＲとは対照的に、ＣＡＲは、ＭＨＣ非依存的様式で標的抗原に結合するように操作されている。
【０２８６】
ＴＣＲは、結合した追加のポリペプチドが、アルファ鎖またはベータ鎖が機能性Ｔ細胞受容体を形成する能力およびＭＨＣ非依存的抗原認識と干渉しない限り、追加のポリペプチドがＴＣＲの本発明のアルファ鎖またはベータ鎖のアミノ末端部分またはカルボキシル末端部分に結合した状態で発現され得る。
【０２８７】
特定の実施形態において企図される操作されたＴＣＲによって認識される抗原には、血液癌および固形腫瘍の両方の抗原を含む癌抗原が含まれるが、これらに限定されない。例示的な抗原には、ＦＲα、ＴＰＢＧ、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ２７６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ軽鎖、ルイス−Ｙ、カッパ軽鎖、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８８】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾された、かつ／または非機能性のＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれた、操作されたＴＣＲのアルファ鎖および／またはベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
【０２８９】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターまたは第１の自己切断ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、１つの修飾された、かつ／または非機能性のＴＣＲα対立遺伝子に組み込まれた、操作されたＴＣＲのアルファ鎖およびベータ鎖をコードするポリヌクレオチドとを含む。
【０２９０】
特定の実施形態において、ドナー修復鋳型は、５’〜３’へ、ＴＣＲα対立遺伝子に対して相同である５’相同アームと、第１の自己切断ウイルスペプチドをコードするポリヌクレオチドと、操作されたＴＣＲのアルファ鎖をコードするポリヌクレオチドと、第２の自己切断ウイルスペプチをコードするポリヌクレオチドと、操作されたＴＣＲのベータ鎖をコードするポリヌクレオチドと、ＴＣＲα対立遺伝子に対して相同である３’相同アームとを含む。そのような場合、他のＴＣＲα対立遺伝子は機能性であっても、機能性が減少していても、ＤＳＢおよびＮＨＥＪによる修復によって非機能性になっていてもよい。一実施形態において、他のＴＣＲα対立遺伝子は、本明細書において企図される操作されたヌクレアーゼによって修飾されており、機能性が減少していても、非機能性になっていてもよい。
【０２９１】
特定の実施形態において、両方のＴＣＲα対立遺伝子が修飾されており、機能性が減少しているか、または非機能性である。
【０２９２】
ｂ．キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
特定の実施形態において、本明細書において企図される操作された免疫エフェクター細胞は、細胞傷害性を腫瘍細胞に対して再指向する１つ以上のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。ＣＡＲは、標的抗原（例えば、腫瘍抗原）に対する抗体系特異性をＴ細胞受容体活性化細胞内ドメインと組み合わせて、特異的な抗腫瘍細胞性免疫活性を呈するキメラタンパク質を生成する分子である。本明細書で使用される場合、「キメラ」という用語は、異なる起源由来の異なるタンパク質またはＤＮＡの部分からなることを説明する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＡＲをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０２９３】
一実施形態において、本明細書において企図される操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子に挿入されるＣＡＲを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖および／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＡＲＩＣ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体受容体のうちの１つ以上は、ＴＣＲシグナル伝達成分、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子中のＤＳＢに挿入される。
【０２９４】
様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、２つ以上の遺伝子座で１つ以上のＣＡＲを発現する。ＣＡＲは、同一であっても異なってもよい。一実施形態において、ＣＡＲをコードする導入遺伝子に隣接する様々なゲノム位置に対して相同である相同アーム対を含むＤＮＡドナー修復鋳型のために、同じＣＡＲが様々なゲノム位置に挿入される。
【０２９５】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、ＣＡＲを１つの遺伝子座に、および免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または別の操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０２９６】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、特異的な標的抗原に結合する細胞外ドメイン（結合ドメインまたは抗原特異的結合ドメインとも称される）と、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。ＣＡＲの主要な特性は、免疫エフェクター細胞特異性を再指向するそれらの能力であり、それによりモノクローナル抗体、可溶性リガンド、または細胞特異的共受容体の細胞特異的標的能力を活用して、増殖、サイトカイン産生、食作用、または主要組織適合性（ＭＨＣ）非依存的様式で標的抗原発現細胞の細胞死を媒介し得る分子の産生を引き起こす。
【０２９７】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、腫瘍細胞上で発現される標的ポリペプチド、例えば、標的抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「結合ドメイン」、「細胞外ドメイン」、「細胞外結合ドメイン」、「抗原結合ドメイン」、「抗原特異的結合ドメイン」、および「細胞外抗原特異的結合ドメイン」という用語は互換的に使用され、キメラ受容体、例えば、ＣＡＲまたはＤＡＲＩＣに、対象となる標的抗原に特異的に結合する能力を提供する。結合ドメインは、任意のタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、または生体分子（例えば、細胞表面受容体あるいは腫瘍タンパク質、脂質、多糖類、もしくは他の細胞表面標的分子またはそれらの成分）を特異的に認識しそれに結合する能力を持つペプチドを含み得る。結合ドメインは、任意の天然に存在する、合成、半合成、または組換え産生された、対象となる生体分子の結合パートナーを含む。
【０２９８】
特定の実施形態において、細胞外結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０２９９】
「抗体」は、ペプチド、脂質、多糖類、または抗原決定基を含有する核酸（免疫細胞によって認識されるものなど）などの標的抗原のエピトープを特異的に認識しそれに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドである結合剤を指す。抗体は、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ抗体もしくはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＦＮ３断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、またはそれらの他の抗体断片を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７もまた参照されたい。
【０３００】
好ましい一実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０３０１】
好ましい別の実施形態において、結合ドメインは、ラクダ抗体である。
【０３０２】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＦＲα、ＴＰＢＧ、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ２７６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ軽鎖、ルイス−Ｙ、カッパ軽鎖、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０３０３】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外結合ドメイン、例えば、抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片を含み、抗原は、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体である。
【０３０４】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、様々なドメイン間にリンカー残基を含む。「可変領域連結配列」は、重鎖可変領域を軽鎖可変領域に接続し、２つの下位結合ドメインの相互作用に適合するスペーサー機能を提供することで、結果として得られるポリペプチドが、同じ軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含む抗体と同じ標的分子に対する特異的結合親和性を保持するようになる、アミノ酸配列である。特定の実施形態において、ＣＡＲは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上のリンカーを含む。特定の実施形態において、リンカーの長さは、約１〜約２５アミノ酸長、約５〜約２０アミノ酸長、もしくは約１０〜約２０アミノ酸長、または任意の介在するアミノ酸長である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５アミノ酸長、またはそれ以上であり得る。
【０３０５】
特定の実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインの後には１つ以上の「スペーサードメイン」が続き、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離すように移動させて、適切な細胞間接触、抗原結合、および活性化を可能にする領域を指す（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９９９；６：４１２−４１９）。スペーサードメインは、天然、合成、半合成、または組み換え供給源のいずれかに由来し得る。特定の実施形態において、スペーサードメインは、１つ以上の重鎖定常領域、例えば、ＣＨ２およびＣＨ３を含むがこれらに限定されない、免疫グロブリンの一部分である。スペーサードメインは、天然に存在する免疫グロブリンのヒンジ領域または改変された免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３０６】
一実施形態において、スペーサードメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３を含む。
【０３０７】
一実施形態において、ＣＡＲの結合ドメインは、１つ以上の「ヒンジドメイン」に連結され、これは、抗原結合ドメインをエフェクター細胞表面から離すように位置付けて、適切な細胞間接触、抗原結合、および活性化を可能にする上で役割を果たす。ＣＡＲは一般に、結合ドメインと膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間に１つ以上のヒンジドメインを含む。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンのヒンジ領域または改変された免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。
【０３０８】
本明細書に記載のＣＡＲにおける使用に好適な例示的なヒンジドメインには、ＣＤ８αなどの１型膜タンパク質およびＣＤ４の細胞外領域由来のヒンジ領域（これらの分子由来の野生型ヒンジ領域であっても、改変されていてもよい）が含まれる。別の実施形態において、ヒンジドメインは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。
【０３０９】
一実施形態において、ヒンジは、ＰＤ−１ヒンジまたはＣＤ１５２ヒンジである。
【０３１０】
「膜貫通ドメイン」は、細胞外結合部分および細胞内シグナル伝達ドメインを融合し、ＣＡＲを免疫エフェクター細胞の細胞膜に固定するＣＡＲの部分である。ＴＭドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え供給源のいずれかに由来し得る。
【０３１１】
例示的なＴＭドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１に由来し得る（すなわち、その少なくとも膜貫通領域（複数可）を含む）。
【０３１２】
一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインを含む。別の実施形態において、本明細書において企図されるＣＡＲは、ＣＤ８α由来のＴＭドメインと、ＣＡＲのＴＭドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを連結する、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸長の短いオリゴポリペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーとを含む。グリシン−セリンリンカーは、特に好適なリンカーを提供する。
【０３１３】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、ＣＡＲが標的抗原に有効に結合しているというメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に伝達して、エフェクター細胞機能、例えば、活性化、サイトカイン産生、増殖、および細胞傷害活性（ＣＡＲに結合した標的細胞への細胞傷害性因子の放出を含む）、または細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合によって誘発される他の細胞性応答を誘発することに関与する、ＣＡＲの部分を指す。
【０３１４】
「エフェクター機能」という用語は、細胞の特殊化機能を指す。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性もしくは補助またはサイトカインの分泌を含む活性であり得る。したがって、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、特殊化機能を実行するように細胞を指向するタンパク質の部分を指す。通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合ドメイン全体を使用することは必要ではない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用される程度まで、そのような切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限り、ドメイン全体の代わりに使用することができる。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインのいかなる切断部分も含むことが意図される。
【０３１５】
ＴＣＲ単独を通して生成されるシグナルは、Ｔ細胞の完全な活性化には不十分であり、二次シグナルまたは共刺激シグナルもまた必要とされることが既知である。したがって、Ｔ細胞活性化は、２つの異なるクラスの細胞内シグナル伝達ドメイン、つまりＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）を通して抗原依存的一次活性化を開始する一次シグナル伝達ドメイン、および抗原非依存的様式で作用して、二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供する共刺激シグナル伝達ドメインによって媒介されると言うことができる。好ましい実施形態において、ＣＡＲは、１つ以上の「共刺激シグナル伝達ドメイン」および「一次シグナル伝達ドメイン」を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０３１６】
一次シグナル伝達ドメインは、刺激性の方法または阻害性の方法のいずれかでＴＣＲ複合体の一次活性化を制御する。刺激性の様式で作用する一次シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン系活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして知られるシグナル伝達モチーフを含有し得る。
【０３１７】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおける使用に好適な一次シグナル伝達ドメインを含有するＩＴＡＭの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものが含まれる。特定の好ましい実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端にタンデムの任意の順序で連結され得る。
【０３１８】
特定の実施形態において、ＣＡＲは、ＣＡＲ受容体を発現するＴ細胞の有効性および拡大を強化するための１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」または「共刺激ドメイン」という用語は、共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。
【０３１９】
特定の実施形態において企図されるＣＡＲにおける使用に好適なそのような共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３２０】
様々な実施形態において、ＣＡＲは、ＢＣＭＡ、ＣＤ１９、ＣＳＰＧ４、ＰＳＣＡ、ＲＯＲ１、およびＴＡＧ７２からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインと、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択されるポリペプチドから単離される膜貫通ドメインと、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、およびＣＤ１３７からなる群から選択されるポリペプチドから単離される１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインと、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択されるポリペプチドから単離されるシグナル伝達ドメインとを含む。
【０３２１】
ｃ．ＤＡＲＩＣ受容体
特定の実施形態において、操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のＤＡＲＩＣ受容体を含む。本明細書で使用される場合、「ＤＡＲＩＣ」または「ＤＡＲＩＣ受容体」という用語は、多鎖の操作された抗原受容体を指す。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＤＡＲＩＣの１つ以上の成分をコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０３２２】
一実施形態において、操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子に挿入されていないＤＡＲＩＣを含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖および／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、またはＤＡＲＩＣ受容体もしくはその成分のうちの１つ以上は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子中のＤＳＢに挿入される。
【０３２３】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、ＤＡＲＩＣを１つの遺伝子座に、および免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または別の操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０３２４】
ＤＡＲＩＣ構造および成分の例示的な例は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０１７２１４号および米国特許公開第２０１５／０２６６９７３号に開示されており、これらの各々は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３２５】
一実施形態において、ドナー修復鋳型は、以下のＤＡＲＩＣ成分、つまり第１の多量体化ドメイン、第１の膜貫通ドメイン、ならびに１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含むシグナル伝達ポリペプチドと、結合ドメイン、第２の多量体化ドメイン、および任意で第２の膜貫通ドメインを含む結合ポリペプチドとを含む。機能性ＤＡＲＩＣは、細胞表面上でＤＡＲＩＣ受容体複合体の形成を促進する架橋因子を含み、この架橋因子は、シグナル伝達ポリペプチドおよび結合ポリペプチドの多量体化ドメインに関連し、それらの間に配置される。
【０３２６】
特定の実施形態において、第１および第２の多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログ、クーママイシンまたはその誘導体、ジベレリンまたはその誘導体、アブシジン酸（ＡＢＡ）またはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、シクロスポリンＡまたはその誘導体、ＦＫＣｓＡまたはその誘導体、ＦＫＢＰ（ＳＬＦ）のトリメトプリム（Ｔｍｐ）合成リガンドまたはその誘導体、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される架橋因子に関連する。
【０３２７】
ラパマイシン類似体（ラパログ）の例示的な例には、米国特許第６，６４９，５９５号に開示されるものが含まれ、それらのラパログ構造は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、架橋因子は、ラパマイシンと比較して、免疫抑制効果が実質的に低減したラパログである。「実質的に低減した免疫抑制効果」は、臨床的にまたはヒト免疫抑制活性の適切なインビトロ（例えば、Ｔ細胞増殖の阻害）もしくはインビボ代替物中のいずれかで測定して、等モル量のラパマイシンについて観察または期待される免疫抑制効果の少なくとも０．１〜０．００５倍を有するラパログを指す。一実施形態において、「実質的に低減した免疫抑制効果」は、そのようなインビトロアッセイで、同じアッセイでラパマイシンについて観察されるＥＣ５０値よりも少なくとも１０〜２５０倍大きいＥＣ５０値を有するラパログを指す。
【０３２８】
ラパログの他の例示的な例には、エベロリムス、ノボリムス、ピメクロリムス、リダフォロリムス、タクロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、およびゾタロリムスが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２９】
特定の実施形態において、多量体化ドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログである架橋因子と会合する。例えば、第１および第２の多量体化ドメインは、ＦＫＢＰおよびＦＲＢから選択される対である。ＦＲＢドメインは、ＦＫＢＰタンパク質およびラパマイシンまたはそのラパログとともに三分子複合体を形成することができるポリペプチド領域（タンパク質「ドメイン」）である。ＦＲＢドメインは、ヒトおよび他の種由来のｍＴＯＲタンパク質（文献においてＦＲＡＰ、ＲＡＰＴ１、またはＲＡＦＴとも称される）を含むいくつかの天然に存在するタンパク質、Ｔｏｒ１およびＴｏｒ２を含む酵母タンパク質、ならびにカンジダＦＲＡＰ相同体に存在する。ヌクレオチド配列、クローニング、およびこれらのタンパク質の他の態様に関する情報は、当該技術分野において既に既知である。例えば、ヒトｍＴＯＲのタンパク質配列受入番号は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ３４０７５．１である（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３６９：７５６，１９９４）。
【０３３０】
本明細書において企図される特定の実施形態における使用に好適なＦＲＢドメインは一般に、少なくとも約８５〜約１００個のアミノ酸残基を含有する。特定の実施形態において、本開示の融合タンパク質における使用のためのＦＲＢアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｌ３４０７５．１のアミノ酸配列に基づいて、９３アミノ酸配列のＩｌｅ−２０２１からＬｙｓ−２１１３まで、およびＴ２０９８Ｌの変異を含む。特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣにおける使用のためのＦＲＢドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合したＦＫＢＰタンパク質の複合体に結合することができる。特定の実施形態において、ＦＲＢドメインのペプチド配列は、（ａ）ヒトｍＴＯＲの少なくとも示される９３アミノ酸領域または相同タンパク質の対応する領域に及ぶ、天然に存在するペプチド配列、（ｂ）天然に存在するペプチドの最大約１０アミノ酸、または約１〜約５アミノ酸もしくは約１〜約３アミノ酸、またはいくつかの実施形態において１アミノ酸のみが欠失、挿入、または置換されている、天然に存在するＦＲＢのバリアント、あるいは（ｃ）天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または天然に存在するＦＲＢドメインをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができるが、遺伝コードの縮退のためである、ＤＮＡ配列によってコードされるペプチドを含む。
【０３３１】
ＦＫＢＰ（ＦＫ５０６結合タンパク質）は、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンなどのマクロライドのサイトゾル受容体であり、種系統にわたって高度に保存されている。ＦＫＢＰは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、ＦＲＢ含有タンパク質または融合タンパク質とともに三分子複合体を更に形成することができる、タンパク質またはタンパク質ドメインである。ＦＫＢＰドメインはまた、「ラパマイシン結合ドメイン」とも称される。ヌクレオチド配列、クローニング、および様々なＦＫＢＰ種の他の態様に関する情報は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｓｔａｅｎｄａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４６：６７１，１９９０（ヒトＦＫＢＰ１２）、Ｋａｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１４：３６１，１９９６を参照されたい）。他の哺乳動物種、酵母、および他の生物における相同ＦＫＢＰタンパク質もまた当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される融合タンパク質に使用することができる。特定の実施形態において企図されるＦＫＢＰドメインは、ラパマイシンまたはそのラパログに結合し、（直接的であるか間接的であるかに関わらず、そのような結合を検出するための任意の手段によって決定され得る）ＦＲＢ含有タンパク質との三分子複合体に関与することができる。
【０３３２】
特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣにおける使用に好適なＦＫＢＰドメインの例示的な例には、好ましくはヒトＦＫＢＰ１２タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＡ５８４７６．１）から単離された天然に存在するＦＫＢＰペプチド配列、あるいはそれから、別のヒトＦＫＢＰから、マウスもしくは他の哺乳動物ＦＫＢＰから、または何らかの他の動物、酵母、もしくは真菌ＦＫＢＰから単離されたペプチド配列；天然に存在するペプチドの最大約１０アミノ酸、または約１〜約５アミノ酸もしくは約１〜約３アミノ酸、またはいくつかの実施形態において１アミノ酸のみが欠失、挿入、または置換されている、天然に存在するＦＫＢＰ配列のバリアント；あるいは天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子によって、または天然に存在するＦＫＢＰをコードするＤＮＡ分子に選択的にハイブリダイズすることができるが、遺伝コードの縮退のためである、ＤＮＡ配列によってコードされるペプチド配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０３３３】
特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣにおける使用に好適な多量体化ドメイン対の他の例示的な例には、ＦＫＢＰおよびＦＲＢ、ＦＫＢＰおよびカルシニューリン、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン、ＦＫＢＰおよび細菌ＤＨＦＲ、カルシニューリンおよびシクロフィリン、ＰＹＬ１およびＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１およびＧＡＩ、またはそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０３３４】
更に他の実施形態において、抗架橋因子は、架橋因子によるシグナル伝達ポリペプチドと結合ポリペプチドとの会合を遮断する。例えば、シクロスポリンまたはＦＫ５０６を抗架橋因子として使用して、ラパマイシンを滴定除去し、したがって１つの多量体化ドメインのみが結合しているためにシグナル伝達を停止させることができる。特定の実施形態において、抗架橋因子（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６）は、免疫抑制剤である。例えば、免疫抑制抗架橋因子を使用して、特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣ成分の機能を遮断または最小化し、かつ臨床設定において望まれないまたは病理学的な炎症応答を同時に阻害または遮断することができる。
【０３３５】
一実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパログＡＰ２１９６７である。
【０３３６】
別の実施形態において、第１の多量体化ドメインはＦＲＢを含み、第２の多量体化ドメインはＦＫＢＰ１２を含み、架橋因子はラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０３３７】
特定の実施形態において、シグナル伝達ポリペプチド、第１の膜貫通ドメイン、および結合ポリペプチドは、第２の膜貫通ドメインまたはＧＰＩアンカーを含む。第１および第２の膜貫通ドメインの例示的な例は、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から独立して選択されるポリペプチドから単離される。
【０３３８】
一実施形態において、シグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインおよび／または一次シグナル伝達ドメインを含む。
【０３３９】
特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣシグナル伝達成分における使用に好適な一次シグナル伝達ドメインの例示的な例には、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄ由来のものが含まれる。特定の好ましい実施形態において、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分は、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインと、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。細胞内一次シグナル伝達および共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインのカルボキシル末端にタンデムの任意の順序で連結され得る。
【０３４０】
特定の実施形態において企図されるＤＡＲＩＣシグナル伝達成分における使用に好適なそのような共刺激分子の例示的な例には、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０が含まれる。一実施形態において、ＤＡＲＩＣシグナル伝達成分は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３４１】
特定の実施形態において、ＤＡＲＩＣ結合成分は、結合ドメインを含む。一実施形態において、結合ドメインは、抗体またはその抗原結合断片である。
【０３４２】
抗体またはその抗原結合断片は、ペプチド、脂質、多糖類、または抗原決定基を含有する核酸（免疫細胞によって認識されるものなど）などの標的抗原のエピトープを特異的に認識しそれに結合する、少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含む。抗体は、抗原結合断片、例えば、ラクダＩｇ（ラクダ抗体もしくはそのＶＨＨ断片）、Ｉｇ  ＮＡＲ、ＤＡＲＰｉｎｓ、ＦＮ３断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、Ｆ（ａｂ）’３断片、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ抗体（「ｓｃＦｖ」）、ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、ミニボディ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）、および単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ、ナノボディ）、またはそれらの他の抗体断片を含む。この用語はまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロ共役抗体（二重特異性抗体など）、およびそれらの抗原結合断片などの遺伝子操作された形態も含む。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１９９４−１９９５（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、Ｋｕｂｙ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９７もまた参照されたい。
【０３４３】
好ましい一実施形態において、結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【０３４４】
好ましい別の実施形態において、結合ドメインは、ラクダ抗体である。
【０３４５】
特定の実施形態において、ＤＡＲＩＣ結合成分は、ＦＲα、ＴＰＢＧ、αｖβ６インテグリン、ＢＣＭＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＤ２７６、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、ＦＡＰ、胎児ＡｃｈＲ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＰＣ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＭＡＧＥＡ１、ＭＡＧＥＡ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、ラムダ軽鎖、ルイス−Ｙ、カッパ軽鎖、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ５、ＴＥＭ７、ＴＥＭ８、ＶＥＧＦＲ２、およびＷＴ−１からなる群から選択される抗原に結合する細胞外ドメインを含む。
【０３４６】
一実施形態において、ＤＡＲＩＣ結合成分は、細胞外ドメイン、例えば、クラスＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体またはクラスＩＩ  ＭＨＣ−ペプチド複合体などのＭＨＣ−ペプチド複合体に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【０３４７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＤＡＲＩＣ成分は、２つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ドメイン、領域、またはモチーフを接続するリンカーまたはスペーサーを含む。特定の実施形態において、リンカーは、約２〜約３５個のアミノ酸、または約４〜約２０個のアミノ酸、または約８〜約１５個のアミノ酸、または約１５〜約２５個のアミノ酸を含む。他の実施形態において、スペーサーは、抗体ＣＨ２ＣＨ３ドメインまたはヒンジドメインなどの特定の構造を有し得る。一実施形態において、スペーサーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
【０３４８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＤＡＲＩＣ成分は、１つ以上の「ヒンジドメイン」を含み、これは、ドメインを位置付けて、適切な細胞間接触、抗原結合、および活性化を可能にする上で役割を果たす。ＤＡＲＩＣは、結合ドメインと多量体化ドメインおよび／もしくは膜貫通ドメイン（ＴＭ）との間、または多量体化ドメインと膜貫通ドメインとの間に、１つ以上のヒンジドメインを含み得る。ヒンジドメインは、天然、合成、半合成、または組み換え供給源のいずれかに由来し得る。ヒンジドメインは、天然に存在する免疫グロブリンのヒンジ領域または改変された免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態において、ヒンジは、ＣＤ８αヒンジまたはＣＤ４ヒンジである。
【０３４９】
一実施形態において、ＤＡＲＩＣは、シグナル伝達ポリペプチドを含むは、ＦＲＢ  Ｔ２０９８Ｌの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパログＡＰ２１９６７である。
【０３５０】
一実施形態において、ＤＡＲＩＣは、シグナル伝達ポリペプチドを含むは、ＦＲＢの第１の多量体化ドメインと、ＣＤ８膜貫通ドメインと、４−１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含み、結合ポリペプチドは、ＣＤ１９に結合するｓｃＦｖと、ＦＫＢＰ１２の第２の多量体化ドメインと、ＣＤ４膜貫通ドメインとを含み、架橋因子は、ラパマイシン、テムシロリムス、またはエベロリムスである。
【０３５１】
ｄ．ゼータカイン
特定の実施形態において、本明細書において企図される操作された免疫エフェクター細胞は、１つ以上のキメラサイトカイン受容体を含む。一実施形態において、Ｔ細胞は、ゼータカインをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０３５２】
一実施形態において、本明細書において企図される操作されたＴ細胞は、ＴＣＲα対立遺伝子に挿入されていないキメラサイトカイン受容体を含み、免疫抑制シグナルダンパー、フリップ受容体、操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖および／もしくはベータ鎖、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＤＡＲＩＣ受容体もしくはその成分、またはキメラサイトカイン受容体受容体のうちの１つ以上は、１つ以上のＴＣＲα対立遺伝子中のＤＳＢに挿入される。
【０３５３】
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー鋳型は、ゼータカインを１つの遺伝子座に、および免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または別の操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子を１つ以上の異なる遺伝子座に挿入するように設計される。
【０３５４】
様々な実施形態において、ゲノム編集されたＴ細胞は、細胞傷害性を腫瘍細胞に対して再指向するキメラサイトカイン受容体を発現する。ゼータカインは、細胞外ドメインを細胞表面に繋ぎ止めることができる支持領域に連結した可溶性受容体リガンドを含む細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、キメラ膜貫通免疫受容体である。Ｔリンパ球の表面上で発現される場合、ゼータカインは、可溶性受容体リガンドが特異的である受容体を発現する細胞に対してＴ細胞活性を指向する。ゼータカインキメラ免疫受容体は、Ｔ細胞の抗原特異性を再指向し、特にヒト悪性腫瘍によって利用される自己分泌／パラ分泌サイトカイン系を介した様々な癌の治療に対する用途を有する。
【０３５５】
特定の実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、免疫抑制サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントと、リンカーと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３５６】
特定の実施形態において、サイトカインまたはそのサイトカイン受容体結合バリアントは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される。
【０３５７】
特定の実施形態において、リンカーは、ＣＨ２ＣＨ３ドメインまたはヒンジドメインなどを含む。一実施形態において、リンカーは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ４、またはＩｇＤのＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一実施形態において、リンカーは、ＣＤ８αまたはＣＤ４ヒンジドメインを含む。
【０３５８】
特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖またはベータ鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、およびＰＤ−１からなる群から選択される。
【０３５９】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび／または共刺激ドメインを含有するＩＴＡＭからなる群から選択される。
【０３６０】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される。
【０３６１】
特定の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ、およびＺＡＰ７０からなる群から選択される。
【０３６２】
一実施形態において、キメラサイトカイン受容体は、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、およびＣＤ１３４からなる群から選択される１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζ一次シグナル伝達ドメインとを含む。
【０３６３】
４．グロビン遺伝子
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された造血細胞は、グロビン遺伝子またはその抗鎌状化バリアントを含む。一実施形態において、造血細胞細胞は、グロビン遺伝子またはその抗鎌状化バリアントをコードするドナー修復鋳型の存在下で、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座、ＫＬＦ１遺伝子座、ＳＯＸ６遺伝子座、ＧＡＴＡ１遺伝子座、およびＬＳＤ１遺伝子座を含むがこれらに限定されない、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦの抑圧に寄与する遺伝子、β−グロビン遺伝子座のサラセミア対立遺伝子、またはβ−グロビン遺伝子座の鎌状化対立遺伝子をコードする１つ以上の遺伝子にＤＳＢを導入することによって操作される。
【０３６４】
特定の実施形態において、グロビンまたはその抗鎌状化バリアントには、β−グロビン、δ−グロビン、γ−グロビン、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ、β−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｋ１２０Ｅ／Ｋ９５Ｅ、またはβ−グロビンＡ−Ｔ８７Ｑ／Ｇ１６Ｄ／Ｅ２２Ａが含まれるが、これらに限定されない。
【０３６５】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、グロビンまたはその抗鎌状化バリアントをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位のうちの少なくとも１つに挿入される。
【０３６６】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の標的部位でＤＳＢを誘導するために、複数の操作されたヌクレアーゼが使用され、グロビンまたはその抗鎌状化バリアントをコードし、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アームによって隣接される導入遺伝子を含むＤＮＡドナー修復鋳型が細胞に導入され、相同組換えによって標的部位の２つ以上に挿入される。
【０３６７】
Ｄ．ヌクレアーゼ
特定の実施形態において企図される免疫エフェクター細胞組成物は、複数の遺伝子座を標的とする操作されたヌクレアーゼで達成される多重ゲノム編集によって生成される。特定の実施形態において、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位でＤＳＢを誘導するために、操作されたヌクレアーゼが免疫エフェクター細胞に導入される。
【０３６８】
免疫系チェックポイント遺伝子の例示的な例には、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、およびＫＩＲが含まれるが、これらに限定されない。
【０３６９】
免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子の例示的な例には、ＩＬ−１０Ｒα、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＡＨＲ、ＳＧＫ１、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、Ａ２ＡＲ、およびＣＢＬＢが含まれるが、これらに限定されない。
【０３７０】
特定の実施形態において企図される造血細胞組成物は、複数の遺伝子を標的とする操作されたヌクレアーゼで達成される多重ゲノム編集によって生成される。特定の実施形態において、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦの抑圧に寄与するポリペプチドをコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位でＤＳＢを誘導するために、操作されたヌクレアーゼが造血細胞に導入される。
【０３７１】
γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦを抑圧するポリペプチドの例示的な例には、ＢＣＬ１１Ａ、ＫＬＦ１、ＳＯＸ６、ＧＡＴＡ１、およびＬＳＤ１が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７２】
特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、標的配列内で一本鎖ＤＮＡニックまたは二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生成する。更に、ＤＳＢは、標的ＤＮＡにおいて、一本鎖ミック（ニッカーゼ）を生成する２つのヌクレアーゼの使用によって達成することができる。各ニッカーゼは、ＤＮＡの一本鎖を切断し、２つ以上のニッカーゼの使用は、標的ＤＮＡ配列内で二本鎖切断（例えば、ねじれ型二本鎖切断）をもたらし得る。好ましい実施形態において、ヌクレアーゼが、ドナー修復鋳型と組み合わせて使用され、これは、ＤＳＢでの相同組換えを介して、ＤＮＡ切断部位の標的配列に導入される。
【０３７３】
ゲノム編集に好適な、本明細書の特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインと、１つ以上のＤＮＡ切断ドメイン（例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼドメイン）と、任意で、本明細書において企図される１つ以上のリンカーとを含む。「操作されたヌクレアーゼ」は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のＤＮＡ切断ドメインを含むヌクレアーゼを指し、ヌクレアーゼは、ＤＮＡ切断標的配列に隣接しているＤＮＡ結合標的配列に結合するように設計および／または修飾されている。操作されたヌクレアーゼは、天然に存在するヌクレアーゼから、または以前に操作されたヌクレアーゼから設計および／または修飾することができる。特定の実施形態において企図される操作されたヌクレアーゼは、１つ以上の追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを更に含み得る。
【０３７４】
標的配列に結合しそれを切断するように操作され得るヌクレアーゼの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、メガＴＡＬ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓヌクレアーゼ系が含まれるが、これらに限定されない。
【０３７５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合および切断ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガＴＡＬ）を含む（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。他の実施形態において、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように改変されてもよい（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作されているメガヌクレアーゼ）。例えば、メガヌクレアーゼは、それらの同族結合部位とは異なる標的部位に結合するように設計されている（Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、核酸配列がある標的部位（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）を標的とすることを必要とする。
【０３７６】
１．ホーミングエンドヌクレアーゼ／メガヌクレアーゼ
様々な実施形態において、複数のホーミングエンドヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼが細胞に導入され、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位に結合するように、かつそれらに一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように操作される。「ホーミングエンドヌクレアーゼ」および「メガヌクレアーゼ」は互換的に使用され、１２〜４５塩基対の切断部位を認識し、かつ一般に配列および構造モチーフに基づいて５つのファミリー、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ−ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ−Ｃｙｓボックス、およびＰＤ−（Ｄ／Ｅ）ＸＫにグループ化される、天然に存在するヌクレアーゼまたは操作されたメガヌクレアーゼを指す。
【０３７７】
操作されたＨＥは、天然には存在せず、組換えＤＮＡ技術またはランダム変異原性によって得ることができる。操作されたＨＥは、天然に存在するＨＥまたは以前に操作されたＨＥにおいて、１つ以上のアミノ酸改変を作製すること、例えば、１つ以上のアミノ酸を変異、置換、付加、または欠失させることによって得ることができる。特定の実施形態において、操作されたＨＥは、ＤＮＡ認識界面に対する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
【０３７８】
特定の実施形態において企図される操作されたＨＥは、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを更に含み得る。特定の実施形態において、操作されたＨＥは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素とともにＴ細胞に導入される。ＨＥおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別々のｍＲＮＡ中で別個に、または例えば、融合タンパク質として一緒に、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物中に導入されてもよい。
【０３７９】
「ＤＮＡ認識界面」は、核酸標的塩基と相互作用するＨＥアミノ酸残基および隣接しているそれらの残基を指す。各ＨＥについて、ＤＮＡ認識界面は、側鎖対側鎖接触および側鎖対ＤＮＡ接触の広範なネットワークを含み、これらのほとんどは、特定の核酸標的配列を認識するために必然的に特有である。したがって、特定の核酸配列に対応するＤＮＡ認識界面のアミノ酸配列は有意に変動し、これはあらゆる天然のＨＥまたは操作されたＨＥの特徴である。非限定的な例として、特定の実施形態において企図される操作されたＨＥは、天然のＨＥ（または以前に操作されたＨＥ）のＤＮＡ認識界面に局在化した１つ以上のアミノ酸残基が変動する、ＨＥバリアントのライブラリを構築することによって導出することができる。ライブラリは、切断アッセイを使用して、予想される各ＴＣＲα遺伝子座標的部位に対する標的切断活性についてスクリーニングすることができる（例えば、Ｊａｒｊｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７（２０）：６８７１−６８８０を参照されたい）。
【０３８０】
ＬＡＧＬＩＤＡＤＧホーミングエンドヌクレアーゼ（ＬＨＥ）は、最もよく研究されたメガヌクレアーゼのファミリーであり、主に古細菌中ならびに緑藻および真菌における細胞小器官ＤＮＡ中でコードされ、最も高い全体的なＤＮＡ認識特異性を示す。ＬＨＥは、１つのタンパク質鎖当たり１つまたは２つのＬＡＧＬＩＤＡＤＧ触媒モチーフを含み、それぞれホモ二量体または単鎖単量体として機能する。ＬＡＧＬＩＤＡＤＧタンパク質の構造研究は、αββαββαの折り畳みを特徴とする高度に保存されたコア構造（Ｓｔｏｄｄａｒｄ２００５）を特定しており、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフは、この折り畳みの第１のヘリックスに属する。ＬＨＥ’の高度に効率的かつ特異的な切断は、タンパク質足場となって、新規の高度に特異的なエンドヌクレアーゼを導出する。しかしながら、非天然または非標準の標的部位に結合しそれを切断するようなＬＨＥの操作は、適切なＬＨＥ足場の選択、標的遺伝子座の試験、推定標的部位の選択、ならびに標的部位における塩基対位置の最大３分の２でＬＨＥを広範に改変して、そのＤＮＡ接触点および切断特異性を改変することを必要とする。
【０３８１】
操作されたＬＨＥが設計され得るＬＨＥの例示的な例には、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉが含まれるが、これらに限定されない。
【０３８２】
操作されたＬＨＥが設計され得るＬＨＥの他の例示的な例には、Ｉ−ＣｒｅＩおよびＩ−ＳｃｅＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０３８３】
一実施形態において、操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩからなる群から選択される。
【０３８４】
一実施形態において、操作されたＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩである。
【０３８５】
一実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とする操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥが、天然のＩ−ＯｎｕＩから生成された。好ましい実施形態において、ヒトＴＣＲα遺伝子を標的とする操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥが、以前に操作されたＩ−ＯｎｕＩから生成された。
【０３８６】
特定の実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、ＤＮＡ認識界面において１つ以上のアミノ酸置換を含む。特定の実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩまたはＩ−ＯｎｕＩの操作されたバリアントのＤＮＡ認識界面と少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を含む（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１Ａｕｇ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）。
【０３８７】
一実施形態において、Ｉ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩのＤＮＡ認識界面と少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を含む（Ｔａｅｋｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１１Ａｕｇ９；１０８（３２）：１３０７７−１３０８２）。
【０３８８】
特定の実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、ＤＮＡ認識界面において、特にＩ−ＯｎｕＩの２４〜５０位、６８〜８２位、１８０〜２０３位、および２２３〜２４０位に位置しているサブドメインにおいて、１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０３８９】
一実施形態において、操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩ配列全体のどこに位置してもよい追加の位置に１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。置換および／または修飾され得る残基には、核酸標的に接触するアミノ酸、または直接もしくは水分子を介して核酸骨格もしくはヌクレオチド塩基と相互作用するアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。非限定的な一例において、本明細書において企図される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥは、Ｉ−ＯｎｕＩの１９位、２４位、２６位、２８位、３０位、３２位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、４０位、４２位、４４位、４６位、４８位、６８位、７０位、７２位、７５位、７６位、７７位、７８位、８０位、８２位、１６８位、１８０位、１８２位、１８４位、１８６位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９５位、１９７位、１９９位、２０１位、２０３位、２２３位、２２５位、２２７位、２２９位、２３１位、２３２位、２３４位、２３６位、２３８位、２４０位からなる位置群から選択される少なくとも１つの位置に、１つ以上、好ましくは少なくとも５つ、好ましくは少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは少なくとも２０個、更により好ましくは少なくとも２５個の置換および／または修飾を含む。
【０３９０】
２．メガＴＡＬ
様々な実施形態において、複数のメガＴＡＬが細胞に導入され、γ−グロビン遺伝子発現を抑制するポリペプチド、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位に結合するように、かつそれらにＤＳＢを導入するように操作される。「メガＴＡＬ」は、操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む操作されたヌクレアーゼ、および操作されたメガヌクレアーゼを指し、任意で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、メガＴＡＬは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素とともにＴ細胞に導入されてもよい。メガＴＡＬおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別々のｍＲＮＡ中で別個に、または例えば、融合タンパク質として一緒に、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物中に導入されてもよい。
【０３９１】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」は、植物転写活性化因子を模倣して、植物トランスクリプトームを操作する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥまたはＴＡＬエフェクター）のＤＮＡ結合部分である（例えば、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７．Ｓｃｉｅｎｃｅ３１８：６４８−６５１を参照されたい）。特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、新規にまたは天然に存在するＴＡＬＥ、例えば、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｇａｒｄｎｅｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｔｒａｎｓｌｕｃｅｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ａｌｆａｌｆａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｉ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｅｕｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ、およびＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚａｅ由来のＡｖｒＢｓ３、ならびにＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ由来のｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７から操作される。ＤＮＡ結合ドメインを導出および設計するためのＴＡＬＥタンパク質の例示的な例は、米国特許第９，０１７，９６７号およびその中に引用される参考文献に開示されており、これらの全ては、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３９２】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのその対応する標的ＤＮＡ配列への結合に関与する１つ以上の反復単位を含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。単一の「反復単位」（「反復配列」とも称される）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長である。各ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位は、典型的には反復配列の１２位および／または１３位で反復可変二残基（ＲＶＤ）を構成する１つまたは２つのＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ認識の天然（標準）のコードは、ＨＤ配列の１２位および１３位がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＧがＴに結合するように決定されている。特定の実施形態において、非標準（非定型）のＲＶＤが企図される。
【０３９３】
特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬにおける使用に好適な非標準のＲＶＤの例示的な例には、グアニン（Ｇ）の認識のためのＨＨ、ＫＨ、ＮＨ、ＮＫ、ＮＱ、ＲＨ、ＲＮ、ＳＳ、ＮＮ、ＳＮ、ＫＮ；アデニン（Ａ）の認識のためのＮＩ、ＫＩ、ＲＩ、ＨＩ、ＳＩ；チミン（Ｔ）の認識のためのＮＧ、ＨＧ、ＫＧ、ＲＧ；シトシン（Ｃ）の認識のためのＲＤ、ＳＤ、ＨＤ、ＮＤ、ＫＤ、ＹＧ；ＡまたはＧの認識のためのＮＶ、ＨＮ；およびＡまたはＴまたはＧまたはＣの認識のためのＨ＊、ＨＡ、ＫＡ、Ｎ＊、ＮＡ、ＮＣ、ＮＳ、ＲＡ、Ｓ＊が含まれるが、これらに限定されず、（＊）は、１３位のアミノ酸が不在であることを意味する。特定の実施形態において企図される特定のメガＴＡＬにおける使用に好適なＲＶＤの追加の例示的な例には、米国特許第８，６１４，０９２号に開示されるものが更に含まれ、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０３９４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３〜３０個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、５〜１６個の反復単位、より好ましくは７〜１５個の反復単位、より好ましくは９〜１２個のｐａｔｅｎｔｓａｒｅｎｏｔｏｂｖｉｏｕｓｓ反復単位、およびより好ましくは９、１０、または１１個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０３９５】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３〜３０個の反復単位と、一組のＴＡＬＥ反復単位のＣ末端に位置する２０個のアミノ酸を含む追加の単一切断型ＴＡＬＥ反復単位、すなわち、追加のＣ末端半ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位（本明細書の他の箇所で以下に開示されるＣキャップのアミノ酸−２０〜−１）とを含む、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。したがって、特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、３．５〜３０．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。特定の実施形態において、メガＴＡＬは、３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位を含む。好ましい実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、５．５〜１３．５個の反復単位、より好ましくは７．５〜１２．５個の反復単位、より好ましくは９．５〜１１．５個の反復単位、およびより好ましくは９．５、１０．５、または１１．５個の反復単位を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。
【０３９６】
特定の実施形態において、メガＴＡＬは、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドと、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位と、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドと、操作されたメガヌクレアーゼとを含む。
【０３９７】
本明細書で使用される場合、「Ｎ末端ドメイン（ＮＴＤ）」ポリペプチドという用語は、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＮ末端部分または断片に隣接する配列を指す。存在する場合、ＮＴＤ配列は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであり得る。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、少なくとも１２０個〜少なくとも１４０個、またはそれ以上のアミノ酸を含む（０は最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、少なくとも約１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、または少なくとも１４０個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約＋１〜＋１２２から少なくとも約＋１〜＋１３７のＮＴＤポリペプチドを含む（０は最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、少なくとも約１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＲａｌｓｔｏｎｉａのＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸＋１〜＋１２１のＮＴＤポリペプチドを含む（０は最もＮ末端の反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＮＴＤポリペプチドは、ＲａｌｓｔｏｎｉａのＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインに対してＮ末端に、少なくとも約１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、または１３７個のアミノ酸を含む。
【０３９８】
本明細書で使用される場合、「Ｃ末端ドメイン（ＣＴＤ）」ポリペプチドという用語は、天然に存在するＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインのＣ末端部分または断片に隣接する配列を指す。存在する場合、ＣＴＤ配列は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン反復単位がＤＮＡに結合する能力を保持する限り、任意の長さのものであり得る。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復配列に対してＣ末端に、少なくとも２０〜少なくとも８５個、またはそれ以上のアミノ酸を含む（最初の２０個のアミノ酸は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端にある半反復単位である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復配列に対してＣ末端に、少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、または少なくとも８５個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端にある半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復配列に対してＣ末端に、少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。一実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＲａｌｓｔｏｎｉａのＴＡＬＥタンパク質の少なくともアミノ酸約−２０〜−１のＣＴＤポリペプチドを含む（−２０は、最後のＣ末端完全反復単位に対してＣ末端にある半反復単位のアミノ酸１である）。特定の実施形態において、ＣＴＤポリペプチドは、ＲａｌｓｔｏｎｉａのＴＡＬＥタンパク質のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインの最後の完全反復配列に対してＣ末端に、少なくとも約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のアミノ酸を含む。
【０３９９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、標的配列に結合するように操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む融合ポリペプチドと、標的配列に結合しそれを切断するように操作されたメガヌクレアーゼと、任意で、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のリンカーポリペプチドで任意で互いに結合したＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドとを含む。いかなる特定の理論によっても拘束されることを望むものではないが、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインならびに任意でＮＴＤおよび／またはＣＴＤポリペプチドを含むメガＴＡＬが、リンカーポリペプチド（これは操作されたメガヌクレアーゼに更に融合されている）に融合されることが企図される。したがって、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインによって結合される標的配列から約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個以内のヌクレオチドだけ離れたＤＮＡ標的配列に結合する。このように、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ゲノム編集の特異性および効率を増加させる。
【０４００】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＬＨＥとを含む。
【０４０１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＮＴＤと、１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、ＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＬＨＥとを含む。
【０４０２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、ＮＴＤと、約９．５〜約１１．５個のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合反復単位と、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥとを含む。
【０４０３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるメガＴＡＬは、約１２２アミノ酸〜１３７アミノ酸のＮＴＤと、約９．５、約１０．５、または約１１．５個の結合反復単位と、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤと、Ｉ−ＡａｂＭＩ、Ｉ−ＡａｅＭＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＡｐａＭＩ、Ｉ−ＣａｐＩＩＩ、Ｉ−ＣａｐＩＶ、Ｉ−ＣｋａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＩＩ、Ｉ−ＣｐａＭＩＶ、Ｉ−ＣｐａＭＶ、Ｉ−ＣｐａＶ、Ｉ−ＣｒａＭＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＥｊｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｅＭＩ、Ｉ−ＧｐｉＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩ、Ｉ−ＧｚｅＭＩＩＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＬｔｒＩＩ、Ｉ−ＬｔｒＩ、Ｉ−ＬｔｒＷＩ、Ｉ−ＭｐｅＭＩ、Ｉ−ＭｖｅＭＩ、Ｉ−ＮｃｒＩＩ、Ｉ−Ｎｃｒｌ、Ｉ−ＮｃｒＭＩ、Ｉ−ＯｈｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＩＩ、Ｉ−ＯｓｏＭＩＶ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩＩＩ、Ｉ−ＰｎｏＭＩ、Ｉ−ＳｃｕＭＩ、Ｉ−ＳｍａＭＩ、Ｉ−ＳｓｃＭＩ、およびＩ−Ｖｄｉ１４１Ｉ、または好ましくはＩ−ＣｐａＭＩ、Ｉ−ＨｊｅＭＩ、Ｉ−ＯｎｕＩ、Ｉ−ＰａｎＭＩ、およびＳｍａＭＩ、またはより好ましくはＩ−ＯｎｕＩからなる群から選択される操作されたＩ−ＯｎｕＩ  ＬＨＥとを含む。
【０４０４】
３．Ｔａｌｅｎ
様々な実施形態において、複数の転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が細胞に導入され、γ−グロビン遺伝子発現を抑制するポリペプチド、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位に結合するように、かつそれらに一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように操作される。「ＴＡＬＥＮ」は、本明細書の他の箇所で企図される操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を含む操作されたヌクレアーゼ、ならびに操作されたヌクレアーゼを指し、任意で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素とともにＴ細胞に導入されてもよい。ＴＡＬＥＮおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別々のｍＲＮＡ中で別個に、または例えば、融合タンパク質として一緒に、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物中に導入されてもよい。
【０４０５】
一実施形態において、標的とされる二本鎖切断は、２つのＴＡＬＥＮによって達成され、エンドヌクレアーゼ半ドメインを含む各々を使用して、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。別の実施形態において、標的とされる二本鎖切断は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび２つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一ポリペプチドを使用して達成される。
【０４０６】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤと、約３〜３０個の反復単位（例えば、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個の反復単位）を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインとを含む。
【０４０７】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、ＮＴＤと、約３〜３０個の反復単位（例えば、約３．５、４．５、５．５、６．５、７．５、８．５、９．５、１０．５、１１．５、１２．５、１３．５、１４．５、１５．５、１６．５、１７．５、１８．５、１９．５、２０．５、２１．５、２２．５、２３．５、２４．５、２５．５、２６．５、２７．５、２８．５、２９．５、または３０．５個の反復単位）を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、ＣＴＤと、エンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインとを含む。
【０４０８】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮは、本明細書の他の箇所で開示される約１２１アミノ酸〜約１３７アミノ酸のＮＴＤと、約９．５〜約１１．５個の反復単位（すなわち、約９．５、約１０．５、または約１１．５個の反復単位）を含むＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、約２０アミノ酸〜約８５アミノ酸のＣＴＤと、エンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインとを含む。
【０４０９】
特定の実施形態において、ＴＡＬＥＮは、種類制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、（認識部位で）ＤＮＡに配列特異的に結合し、結合部位またはその近くでＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去されており、分離可能な結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメインを有する部位でＤＮＡを切断する。一実施形態において、ＴＡＬＥＮは、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来のエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）と、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
【０４１０】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮにおける使用に好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインの例示的な例には、「ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｓｕｂｌｉｓｔ？Ｓ」に開示される少なくとも１６３３個のＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインが含まれる。
【０４１１】
特定の実施形態において企図されるＴＡＬＥＮにおける使用に好適なＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼドメインの追加の例示的な例には、Ａａｒ  Ｉ、Ａｃｅ  ＩＩＩ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｌｏ  Ｉ、Ａｌｗ２６  Ｉ、Ｂａｅ  Ｉ、Ｂｂｒ７  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｉ、Ｂｂｖ  ＩＩ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｃｃ  Ｉ、Ｂｃｅ８３  Ｉ、ＢｃｅＡ  Ｉ、Ｂｃｅｆ  Ｉ、Ｂｃｇ  Ｉ、ＢｃｉＶ  Ｉ、Ｂｆｉ  Ｉ、Ｂｉｎ  Ｉ、Ｂｍｇ  Ｉ、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓａＸ  Ｉ、Ｂｓｂ  Ｉ、ＢｓｃＡ  Ｉ、ＢｓｃＧ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、Ｂｓｉ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｍＦ  Ｉ、Ｂｓｐ２４  Ｉ、ＢｓｐＧ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、ＢｓｐＮＣ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｂｔｒ  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｃｄｉ  Ｉ、ＣｊｅＰ  Ｉ、Ｄｒｄ  ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｅｃｏ３１  Ｉ、Ｅｃｏ５７  Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ  Ｉ、Ｅｓｐ３  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ、Ｆｉｎ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｇｄｉ  ＩＩ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｈｉｎ４  ＩＩ、Ｈｐｈ  Ｉ、Ｋｓｐ６３２  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｍｌｙ  Ｉ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｍｎｌ  Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ  Ｐｌｅ  Ｉ、Ｐｐｉ  Ｉ、Ｐｓｒ  Ｉ、ＲｌｅＡ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、ＳｆａＮ  Ｉ、Ｓｉｍ  Ｉ、ＳｓｐＤ５  Ｉ、Ｓｔｈ１３２  Ｉ、Ｓｔｓ  Ｉ、ＴｓｐＤＴ  Ｉ、ＴｓｐＧＷ  Ｉ、Ｔｔｈ１１１  ＩＩ、ＵｂａＰ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、およびＢｓｍＢ  Ｉからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼのものが含まれる。
【０４１２】
一実施形態において、本明細書において企図されるＴＡＬＥＮは、Ｆｏｋ  ＩのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼドメインを含む。
【０４１３】
一実施形態において、本明細書において企図されるＴＡＬＥＮは、切断特異性を強化するために、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ由来のエンドヌクレアーゼ半ドメインとを含み、任意で、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小化または予防する１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０４１４】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に好適な切断半ドメインの例示的な例には、米国特許公開第２００５／００６４４７４号、同第２００６／０１８８９８７号、同第２００８／０１３１９６２号、同第２００９／０３１１７８７号、同第２００９／０３０５３４６号、同第２０１１／００１４６１６号、および同第２０１１／０２０１０５５号に開示されるものが含まれ、これらの各々は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０４１５】
４．ジンクフィンガーヌクレアーゼ
様々な実施形態において、複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が細胞に導入され、γ−グロビン遺伝子発現を抑制するポリペプチド、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位に結合するように、かつそれらに一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように操作される。「ＺＦＮ」は、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびエンドヌクレアーゼドメイン（またはそのエンドヌクレアーゼ半ドメイン）を含む操作されたヌクレアーゼを指し、任意で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、ＺＦＮは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素とともにＴ細胞に導入されてもよい。ＺＦＮおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別々のｍＲＮＡ中で別個に、または例えば、融合タンパク質として一緒に、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物中に導入されてもよい。
【０４１６】
一実施形態において、標的とされる二本鎖切断は、２つのＺＦＮを使用して達成され、エンドヌクレアーゼ半ドメインを含む各々を使用して、触媒活性切断ドメインを再構成することができる。別の実施形態において、標的とされる二本鎖切断は、１つ以上のジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよび２つのエンドヌクレアーゼ半ドメインを含む単一ポリペプチドによって達成される。
【０４１７】
一実施形態において、ＺＮＦは、本明細書の他の箇所で企図されるＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインと、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、本明細書の他の箇所で企図されるエンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）とを含む。
【０４１８】
一実施形態において、ＺＮＦは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、本明細書の他の箇所で企図されるメガヌクレアーゼとを含む。
【０４１９】
特定の実施形態において、ＺＦＮは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを有するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、エンドヌクレアーゼドメイン（またはエンドヌクレアーゼ半ドメイン）とを含む。典型的には、単一のジンクフィンガーモチーフは、約３０アミノ酸長である。ジンクフィンガーモチーフは、標準のＣ２Ｈ２ジンクフィンガーモチーフと、非標準のジンクフィンガーモチーフ（例えば、Ｃ３ＨジンクフィンガーおよびＣ４ジンクフィンガーなど）の両方を含む。
【０４２０】
ジンクフィンガー結合ドメインは、任意のＤＮＡ配列に結合するように操作されてもよい。所与の３塩基対のＤＮＡ標的配列の、候補ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが特定されており、対応する複合ＤＮＡ標的配列を標的とする多フィンガーペプチドに複数のドメインを連結するためのモジュラー組み立て戦略が考案されている。当該技術分野において既知である他の好適な方法、例えば、ファージ提示、ランダム変異原性、コンビナトリアルライブラリ、コンピュータ／合理的設計、親和性選択、ＰＣＲ、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリからのクローニング、および合成構築などを使用して、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸を設計および構築することもできる。（例えば、米国特許第５，７８６，５３８号、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９２：３４４−３４８（１９９５）、Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３：５６８９−５６９５（１９９４）、Ｒｅｂａｒ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：６７１−６７３（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ９１：１１１６３−１１１６７（１９９４）、Ｃｈｏｏ＆Ｋｌｕｇ，ＰＮＡＳ９１：１１１６８−１１１７２（１９９４）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ８９：７３４５−７３４９（１９９２）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：９３−９６（１９９５）、Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９２：９７５２−９７５６（１９９５）、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９４：５５２５−５５３０（１９９７）、Ｇｒｉｅｓｍａｎ＆Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７５：６５７−６６１（１９９７）、Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ９１：１１−９９−１１１０３（１９９４）を参照されたい）。
【０４２１】
個々のジンクフィンガーモチーフは、３つまたは４つのヌクレオチド配列に結合する。ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作される配列（例えば、標的配列）の長さは、操作されたジンクフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーモチーフの数を決定する。例えば、ジンクフィンガーモチーフが重複するサブサイトに結合しないＺＦＮの場合、６ヌクレオチドの標的配列は、２フィンガー結合ドメインによって結合され、９ヌクレオチドの標的配列は、３フィンガー結合ドメインによって結合されるなどである。特定の実施形態において、標的部位における個々のジンクフィンガーモチーフのＤＮＡ結合部位は、近接している必要はないが、多フィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーモチーフ間のリンカー配列の長さおよび性質に応じて１つまたは複数のヌクレオチドによって分離されてもよい。
【０４２２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来のエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインと、本明細書の他の箇所で企図される１つ以上のＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインとを含む。
【０４２３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、Ａａｒ  Ｉ、Ａｃｅ  ＩＩＩ、Ａｃｉ  Ｉ、Ａｌｏ  Ｉ、Ａｌｗ２６  Ｉ、Ｂａｅ  Ｉ、Ｂｂｒ７  Ｉ、Ｂｂｖ  Ｉ、Ｂｂｖ  ＩＩ、ＢｂｖＣ  Ｉ、Ｂｃｃ  Ｉ、Ｂｃｅ８３  Ｉ、ＢｃｅＡ  Ｉ、Ｂｃｅｆ  Ｉ、Ｂｃｇ  Ｉ、ＢｃｉＶ  Ｉ、Ｂｆｉ  Ｉ、Ｂｉｎ  Ｉ、Ｂｍｇ  Ｉ、Ｂｐｕ１０  Ｉ、ＢｓａＸ  Ｉ、Ｂｓｂ  Ｉ、ＢｓｃＡ  Ｉ、ＢｓｃＧ  Ｉ、ＢｓｅＲ  Ｉ、ＢｓｅＹ  Ｉ、Ｂｓｉ  Ｉ、Ｂｓｍ  Ｉ、ＢｓｍＡ  Ｉ、ＢｓｍＦ  Ｉ、Ｂｓｐ２４  Ｉ、ＢｓｐＧ  Ｉ、ＢｓｐＭ  Ｉ、ＢｓｐＮＣ  Ｉ、Ｂｓｒ  Ｉ、ＢｓｒＢ  Ｉ、ＢｓｒＤ  Ｉ、ＢｓｔＦ５  Ｉ、Ｂｔｒ  Ｉ、Ｂｔｓ  Ｉ、Ｃｄｉ  Ｉ、ＣｊｅＰ  Ｉ、Ｄｒｄ  ＩＩ、ＥａｒＩ、Ｅｃｉ  Ｉ、Ｅｃｏ３１  Ｉ、Ｅｃｏ５７  Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｍ  Ｉ、Ｅｓｐ３  Ｉ、Ｆａｕ  Ｉ、Ｆｉｎ  Ｉ、Ｆｏｋ  Ｉ、Ｇｄｉ  ＩＩ、Ｇｓｕ  Ｉ、Ｈｇａ  Ｉ、Ｈｉｎ４  ＩＩ、Ｈｐｈ  Ｉ、Ｋｓｐ６３２  Ｉ、Ｍｂｏ  ＩＩ、Ｍｌｙ  Ｉ、Ｍｍｅ  Ｉ、Ｍｎｌ  Ｉ、Ｐｆｌ１１０８、Ｉ  Ｐｌｅ  Ｉ、Ｐｐｉ  Ｉ、Ｐｓｒ  Ｉ、ＲｌｅＡ  Ｉ、Ｓａｐ  Ｉ、ＳｆａＮ  Ｉ、Ｓｉｍ  Ｉ、ＳｓｐＤ５  Ｉ、Ｓｔｈ１３２  Ｉ、Ｓｔｓ  Ｉ、ＴｓｐＤＴ  Ｉ、ＴｓｐＧＷ  Ｉ、Ｔｔｈ１１１  ＩＩ、ＵｂａＰ  Ｉ、Ｂｓａ  Ｉ、およびＢｓｍＢ  Ｉからなる群から選択される少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来のエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインとを含む。
【０４２４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるＺＮＦは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれ以上のジンクフィンガーモチーフを含むジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、Ｆｏｋ  ＩのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ由来のエンドヌクレアーゼドメインまたは半ドメインとを含む。
【０４２５】
一実施形態において、本明細書において企図されるＺＦＮは、切断特異性を強化するために、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと、少なくとも１つのＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ由来のエンドヌクレアーゼ半ドメインとを含み、任意で、エンドヌクレアーゼ半ドメインは、ホモ二量体化を最小化または予防する１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。
【０４２６】
５．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系
様々な実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼ系が細胞に導入され、γ−グロビン遺伝子発現を抑制するポリペプチド、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子を含むがこれらに限定されない、複数のゲノム標的部位に結合するように、かつそれらに一本鎖ニックまたは二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入するように操作される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、哺乳動物のゲノム操作に使用することができる細菌系に基づいた、最近操作されたヌクレアーゼ系である。例えば、これらの各々は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３７：８１６−８２１、Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９：８１９−８２３、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ３３９：８２３−８２６、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ１５２：１１７３−１１８３、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），ｅＬｉｆｅ２：ｅ００４７１、Ｄａｖｉｄ  Ｓｅｇａｌ（２０１３）ｅＬｉｆｅ２：ｅ００５６３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ８（１１）：２２８１−２３０８、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ１６３（３）：７５９−７７１を参照されたい。
【０４２７】
一実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系は、Ｃａｓヌクレアーゼと、Ｃａｓヌクレアーゼを標的部位に動員する１つ以上のＲＮＡ、例えば、トランス活性化ｃＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）およびＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、またはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを含む。ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、本明細書で「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と称されるポリヌクレオチド配列内に操作され得る。
【０４２８】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼもしくは触媒活性を失活させたＣａｓとして操作され、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡとともに標的複合体を形成して、γ−グロビン遺伝子発現、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）、免疫系チェックポイント、または免疫抑制シグナル伝達成分を抑制するポリペプチドをコードする遺伝子中に位置するプロトスペーサー標的配列を、部位特異的にＤＮＡ認識および部位特異的に切断する。プロトスペーサーモチーフは、Ｃａｓ／ＲＮＡ複合体を動員する上で役割を果たす短いプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に接している。Ｃａｓポリペプチドは、Ｃａｓポリペプチドに特異的なＰＡＭモチーフを認識する。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、特定のＣａｓポリペプチドに特異的な特定の３’ＰＡＭ配列に隣接した二本鎖ポリヌクレオチド配列の一方または両方の鎖を標的としそれ（ら）を切断することができる。ＰＡＭは、生物情報学を使用して、または実験的アプローチを使用して特定することができる。その全体が、本明細書に参照によって組み込まれる、Ｅｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１０（１１）：１１１６−１１２１。
【０４２９】
一実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、１つ以上の異種ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴＡＬＥＤＮＡ結合ドメインまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含む。ＴＡＬＥまたはジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインへのＣａｓヌクレアーゼの融合は、ＤＮＡ切断効率および特異性を増加させる。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは任意で、１つ以上のリンカーおよび／または追加の機能性ドメイン、例えば、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素の末端プロセシング酵素ドメインを含む。特定の実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、５−３’エキソヌクレアーゼ、５−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、３−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）、５’フラップエンドヌクレアーゼ、ヘリカーゼ、または鋳型非依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を呈する末端プロセシング酵素とともにＴ細胞に導入されてもよい。Ｃａｓヌクレアーゼおよび３’プロセシング酵素は、例えば、異なるベクターもしくは別々のｍＲＮＡ中で別個に、または例えば、融合タンパク質として一緒に、またはウイルス自己切断ペプチドもしくはＩＲＥＳエレメントによって分離された多シストロン性構築物中に導入されてもよい。
【０４３０】
様々な実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１である。
【０４３１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に好適なＣａｓ９ポリペプチドの例示的な例は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃａｃａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  プソイドｐｏｒｃｉｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｏｒｄｏｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｃｅｄｏｎｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｉｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｅｓｔｉｂｕｌａｒｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｏｗｎｅｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｕｂｆｌａｖａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｎｆｒａｎｃｉｓｃｅｎｓｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｖｉｎｃｅｎｔｉｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｈａｇｅｄｅｎｉｓ、およびＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａを含むがこれらに限定されない、細菌種から得ることができる。
【０４３２】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に好適なＣｐｆ１ポリペプチドの例示的な例は、特に、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ菌種、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ菌種、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ菌種、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ菌種を含むがこれらに限定されない、細菌種から得ることができる。
【０４３３】
Ｃａｓ９オルソログの保存領域は、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインと、分断されたＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインとを含む。Ｃｐｆ１オルソログは、ＲｕｖＣ／ＲＮａｓｅ  Ｈドメインを持つが、識別可能なＨＮＨドメインは持たない。ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣ様ドメインは各々、二本鎖ＤＮＡ標的配列の１本の鎖の切断を担う。Ｃａｓ９ヌクレアーゼポリペプチドのＨＮＨドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに対して相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ様ドメインは、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに対して非相補的なＤＮＡ鎖を切断する。Ｃｐｆ１は、二量体として機能することが予想され、Ｃｐｆ１の各ＲｕｖＣ様ドメインは、標的部位の相補鎖または非相補鎖のいずれかを切断する。特定の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼバリアント（例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ）は、ＨＮＨまたはＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインに、バリアントドメインのヌクレアーゼ活性を減少または消失させる１つ以上のアミノ酸付加、欠失、変異、または置換を含むことが企図される。
【０４３４】
このドメインのヌクレアーゼ活性を減少または消失させるＣａｓ９  ＨＮＨ変異の例示的な例には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ１０Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ９Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ１３Ａ）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ１６Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４３５】
このドメインのヌクレアーゼ活性を減少または消失させるＣａｓ９  ＲｕｖＣ様ドメイン変異の例示的な例には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｄ８３９Ａ、Ｈ８４０Ａ、またはＮ８６３Ａ）、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｓ（Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、またはＮ６２２Ａ）、Ｔ．ｄｅｎｔｉｃｏｌａ（Ｄ８７８Ａ、Ｈ８７９Ａ、またはＮ９０２Ａ）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（Ｄ５８７Ａ、Ｈ５８８Ａ、またはＮ６１１Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４３６】
Ｅ．ポリペプチド
免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、操作された抗原受容体、および操作されたヌクレアーゼを含むがこれらに限定されない、様々なポリペプチドが本明細書において企図される。別段それとは反対に明記されない限り、「ポリペプチド」、「ポリペプチド断片」、「ペプチド」、および「タンパク質」は互換的に、かつ従来の意味に従って（すなわち、アミノ酸の配列として）使用される。一実施形態において、「ポリペプチド」には、融合ポリペプチドおよび他のバリアントが含まれる。ポリペプチドは、様々な周知の組換え技術および／または合成技術のいずれかを使用して調製することができる。ポリペプチドは、特定の長さに限定されず、例えば、それらは、完全長タンパク質配列、完全長タンパク質の断片、または融合タンパク質を含んでもよく、かつポリペプチドの翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、およびリン酸化など、ならびに当該技術分野において既知である他の修飾（天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方）を含んでもよい。
【０４３７】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドの例示的な例には、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアント、メガＴＡＬ、グロビン、抗鎌状化グロビン、ＢｉＴＥ、サイトカイン、ケモカイン、細胞毒、およびサイトカイン受容体、フリップ受容体、免疫抑制シグナルダンパー、ＣＡＲ、ＤＡＲＩＣ、ＴＣＲ、およびゼータカインが含まれるが、これらに限定されない。
【０４３８】
ポリペプチドには、「ポリペプチドバリアント」が含まれる。ポリペプチドバリアントは、１つ以上のアミノ酸置換、欠失、付加、および／または挿入において天然に存在するポリペプチドとは異なり得る。そのようなバリアントは、天然に存在するものであっても、例えば、上記のポリペプチド配列の１つ以上のアミノ酸を修飾することによって合成的に生成されるものであってもよい。例えば、特定の実施形態において、１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入をポリペプチドに導入することによって、ポリペプチドの生物学的特性を改善することが望ましくあり得る。特定の実施形態において、ポリペプチドには、本明細書において企図される基準配列のいずれかと少なくとも約６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドが含まれ、典型的にはバリアントは、基準配列の少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０４３９】
ポリペプチドバリアントには、生物学的に活性な「ポリペプチド断片」が含まれる。生物学的に活性なポリペプチド断片の例示的な例には、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインなどが含まれる。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な断片」または「最小の生物学的に活性な断片」は、天然に存在するポリペプチド活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％を保持するポリペプチド断片を指す。好ましい実施形態において、生物学的活性は、標的配列に対する結合親和性および／または切断活性である。特定の実施形態において、ポリペプチド断片は、少なくとも５〜約１７００アミノ酸長のアミノ酸鎖を含み得る。特定の実施形態において、断片は、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、またはそれ以上のアミノ酸長であることが理解される。特定の実施形態において、ポリペプチドは、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントの生物学的に活性な断片を含む。特定の実施形態において、本明細書に明記されるポリペプチドは、「Ｘ」として表わされる１つ以上のアミノ酸を含み得る。「Ｘ」は、アミノ酸配列番号に存在する場合、任意のアミノ酸を指す。１つ以上の「Ｘ」残基が、本明細書において企図される特定の配列番号に明記されるアミノ酸配列のＮ末端およびＣ末端に存在し得る。「Ｘ」アミノ酸が存在しない場合、配列番号に明記される残りのアミノ酸配列は、生物学的に活性な断片と見なされ得る。
【０４４０】
上述のように、ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、切断、および挿入を含む様々な方法で改変されてもよい。そのような操作のための方法は一般に、当該技術分野において既知である。例えば、基準ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントは、ＤＮＡの変異によって調製することができる。変異原性およびヌクレオチド配列改変のための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８２：４８８−４９２）、Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１５４：３６７−３８２）、米国特許第４，８７３，１９２号、Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９８７）、およびそれらの中に引用される参考文献を参照されたい。対象となるタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）のモデルに見出すことができる。
【０４４１】
特定の実施形態において、バリアントは、１つ以上の保存的置換を含有する。「保存的置換」は、ポリペプチドの二次構造および疎水性親水性指標性質が実質的に変化しないことをペプチド化学分野の当業者が期待するような、あるアミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸に置換されるようなものである。修飾は、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造内で行うことができ、ポリペプチドには、望ましい特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする少なくとも約１つの機能性分子を有し、依然としてそれを得るポリペプチドが含まれる。ポリペプチドのアミノ酸配列を改変して、等価のまたは改善さえされたバリアントポリペプチドを作成することが所望される場合、当業者は、例えば、表１に従って、例えば、コーディングＤＮＡ配列のコドンのうちの１つ以上を変更することができる。
【表１】
2020507342.tif 000003
【０４４２】
生物学的活性を消失させずに、どのアミノ酸残基を置換、挿入、または欠失させることができるかを決定する上でのガイダンスは、ＤＮＡＳＴＡＲ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒ、Ｇｅｎｅｉｏｕｓ、Ｍａｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、またはＶｅｃｔｏｒ  ＮＴＩソフトウェアなどの当該技術分野において周知であるコンピュータプログラムを使用して見出すことができる。好ましくは、本明細書に開示されるタンパク質バリアントにおけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち、同様に荷電したアミノ酸または無電荷のアミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化は、それらの側鎖において関連する、あるファミリーのアミノ酸のうちの１つの置換を伴う。天然に存在するアミノ酸は一般に、４つのファミリー、つまり酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および無電荷極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン）のアミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは合わせて、芳香族アミノ酸として分類されることがある。ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保存的置換は当業者にとって既知であり、一般に結果として得られる分子の生物学的活性を改変することなく行うことができる。当業者であれば、一般に、ポリペプチドの非必須領域内の単一のアミノ酸置換は生物学的活性を実質的に改変しないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ，４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８７，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ．２２４を参照されたい）。
【０４４３】
一実施形態において、２つ以上のポリペプチドの発現が所望される場合、それらをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書の他の箇所で開示されるＩＲＥＳ配列によって分離されてもよい。
【０４４４】
特定の実施形態において企図されるポリペプチドには、融合ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態において、融合ポリペプチドおよび融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチドおよび融合タンパク質は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０個のポリペプチドセグメントを有するポリペプチドを指す。
【０４４５】
別の実施形態において、本明細書の他の箇所で開示される１つ以上の自己切断ポリペプチド配列を含む融合タンパク質として、２つ以上のポリペプチドが発現されてもよい。
【０４４６】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、１つ以上のＤＮＡ結合ドメインおよび１つ以上のヌクレアーゼ、ならびに１つ以上のリンカー、ならびに／または自己切断ポリペプチドを含む。
【０４４７】
一実施形態において、本明細書において企図される融合タンパク質は、ヌクレアーゼバリアントと、リンカーまたは自己切断ペプチドと、５’−３’エキソヌクレアーゼ、５’−３’アルカリエキソヌクレアーゼ、および３’−５’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔｒｅｘ２）を含むがこれらに限定されない、末端プロセシング酵素とを含む。
【０４４８】
融合ポリペプチドは、シグナルペプチド、細胞膜透過性ペプチドドメイン（ＣＰＰ）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヌクレアーゼドメインなどを含むがこれらに限定されない、１つ以上のポリペプチドドメインまたはセグメントと、エピトープタグ（例えば、マルトース結合タンパク質（「ＭＢＰ」）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳ６、ＭＹＣ、ＦＬＡＧ、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、およびＨＡ）と、ポリペプチドリンカーと、ポリペプチド切断シグナルとを含み得る。融合ポリペプチドは、典型的にはＣ末端対Ｎ末端で連結されるが、それらはまた、Ｃ末端対Ｃ末端、Ｎ末端対Ｎ末端、またはＮ末端対Ｃ末端で連結されてもよい。特定の実施形態において、融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得る。融合ポリペプチドまたは融合タンパク質はまた、融合ポリペプチドの所望される活性が保存される限り、保存的修飾バリアント、多形性バリアント、対立遺伝子、変異体、下位配列、および種間相同体も含むことができる。融合ポリペプチドは、化学合成法によってまたは２つの部分間の化学結合によって産生されても、一般に他の標準的技術を使用して調製されてもよい。融合ポリペプチドを含む連結されたＤＮＡ配列は、本明細書の他の箇所で開示される好適な転写または翻訳制御エレメントに操作可能に連結される。
【０４４９】
融合ポリペプチドは任意で、ポリペプチド中の１つ以上のポリペプチドまたはドメインを連結するために使用することができるリンカーを含んでもよい。ペプチドリンカー配列を用いて、ポリペプチドドメインがそれらの所望される機能を発揮することを可能にするための、各ポリペプチドのその適切な二次構造または三次構造への折り畳みを確実にするのに十分な距離だけ、２つ以上のポリペプチド成分を分離することができる。そのようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野において標準的な技術を使用して融合ポリペプチドに組み込まれる。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子、（１）それらが可動性の拡張立体構造をとる能力、（２）それらが第１および第２のポリペプチド上で機能性エピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと、（３）ポリペプチド機能性エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如に基づいて選択することができる。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有する。ＴｈｒおよびＡｌａなどの他の中性に近いアミノ酸もまた、リンカー配列内で使用することができる。リンカーとして有用に用いることができるアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ４０：３９−４６，１９８５、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：８２５８−８２６２，１９８６、米国特許第４，９３５，２３３号、および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるものが含まれる。特定の融合ポリペプチドセグメントが、機能性ドメインの分離および立体障害の予防に使用することができる非必須Ｎ末端アミノ酸領域を含有する場合、リンカー配列は必要とされない。好ましいリンカーは、典型的には組換え融合タンパク質の一部として合成される可動性のアミノ酸下位配列である。リンカーポリペプチドは、１〜２００アミノ酸長、１〜１００アミノ酸長、または１〜５０アミノ酸長（それらの間の全ての整数値を含む）であり得る。
【０４５０】
例示的なリンカーには、以下のアミノ酸配列、グリシン重合体（Ｇ）ｎ；グリシン−セリン重合体（Ｇ１−５Ｓ１−５）ｎ（式中、ｎは少なくとも１、２、３、４、または５の整数である）；グリシン−アラニン重合体−アラニン−セリン重合体；ＧＧＧ（配列番号３）；ＤＧＧＧＳ（配列番号４）；ＴＧＥＫＰ（配列番号５）（例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ５５２５−５５３０（１９９７）を参照されたい）；ＧＧＲＲ（配列番号６）（Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９５（上記））；（ＧＧＧＧＳ）ｎ（式中、ｎ＝１、２、３、４、または５である）（配列番号７）（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ９３，１１５６−１１６０（１９９６．）；ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号８）（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０）；ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号９）（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１０）；ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１１）；ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１２）；ＬＲＱＫＤ（ＧＧＧＳ）２ＥＲＰ（配列番号１３）が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、可動性リンカーは、ＤＮＡ結合部位およびペプチド自体の両方をモデリングすることができるコンピュータプログラム（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ＆Ｂｅｒｇ，ＰＮＡＳ９０：２２５６−２２６０（１９９３）、ＰＮＡＳ９１：１１０９９−１１１０３（１９９４）を使用して、またはファージ提示法によって合理的に設計することができる。
【０４５１】
融合ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドドメインの各々の間、または内在性読み取り枠とドナー修復鋳型によってコードされるポリペプチドとの間に、ポリペプチド切断シグナルを更に含んでもよい。加えて、任意のリンカーペプチド配列に、ポリペプチド切断部位を入れてもよい。例示的なポリペプチド切断シグナルには、プロテアーゼ切断部位、ヌクレアーゼ切断部位（例えば、希少な制限酵素認識部位、自己切断リボザイム認識部位）、および自己切断ウイルスオリゴペプチドなどのポリペプチド切断認識部位が含まれる（ｄｅＦｅｌｉｐｅ  ａｎｄ  Ｒｙａｎ，２００４．Ｔｒａｆｆｉｃ，５（８）；６１６−２６を参照されたい）。
【０４５２】
好適なプロテアーゼ切断部位および自己切断ペプチドは、当業者にとって既知である（例えば、Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｊ．Ｇｅｎｅｒ．Ｖｉｒｏｌ．７８，６９９−７２２、Ｓｃｙｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５，５８９−５９４を参照されたい）。例示的なプロテアーゼ切断部位には、ポティウイルスＮＩａプロテアーゼ（例えば、タバコエッチウイルスプロテアーゼ）、ポティウイルスＨＣプロテアーゼ、ポティウイルスＰ１（Ｐ３５）プロテアーゼ、ビオウイルスＮＩａプロテアーゼ、ビオウイルスＲＮＡ−２−コードプロテアーゼ、アフトウイルスＬプロテアーゼ、エンテロウイルス２Ａプロテアーゼ、ライノウイルス２Ａプロテアーゼ、ピコルナ３Ｃプロテアーゼ、コモウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ネポウイルス２４Ｋプロテアーゼ、ＲＴＳＶ（イネツングロ球状ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ＰＹＶＦ（パースニップ黄斑ウイルス）３Ｃ様プロテアーゼ、ヘパリン、トロンビン、因子Ｘａ、およびエンテロキナーゼの切断部位が含まれるが、これらに限定されない。その高い切断厳密性のために、一実施形態において、ＴＥＶ（タバコエッチウイルス）プロテアーゼ切断部位、例えば、ＥＸＸＹＸＱ（Ｇ／Ｓ）（配列番号１４）、例えば、ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１５）およびＥＮＬＹＦＱＳ（配列番号１６）（式中、Ｘは任意のアミノ酸を表す）（ＴＥＶによる切断はＱとＧとの間またはＱとＳとの間に生じる）が好ましい。
【０４５３】
特定の実施形態において、自己切断ポリペプチド部位は、２Ａまたは２Ａ様部位、配列、またはドメインを含む（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。特定の実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、アフトウイルス２Ａペプチド、ポティウイルス２Ａペプチド、またはカルジオウイルス２Ａペプチドである。
【０４５４】
一実施形態において、ウイルス２Ａペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）（Ｅ２Ａ）ペプチド、トセアアシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（ＴａＶ）（Ｔ２Ａ）ペプチド、ブタテッショウウイルス１（ＰＴＶ−１）（Ｐ２Ａ）ペプチド、タイロウイルス２Ａペプチド、および脳心筋炎ウイルス２Ａペプチドからなる群から選択される。
【０４５５】
２Ａ部位の例示的な例を、表２に提供する。
【表２】
2020507342.tif 000004
【０４５６】
Ｆ．ポリヌクレオチド
特定の実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型ポリヌクレオチド、ならびに本明細書において企図される免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、操作された抗原受容体、および操作されたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドが提供される。本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であり、かつ組換え、合成、または単離されたもののいずれかであり得る。ポリヌクレオチドには、プレメッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、合成ＲＮＡ、合成ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、または組換えＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドであるか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態であるかに関わらず、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、少なくとも１００００、または少なくとも１５０００、またはそれ以上のヌクレオチド長（および全ての中間の長さ）のヌクレオチドの重合体形態を指す。この文脈において、「中間の長さ」は、引用される値間の任意の長さ（６、７、８、９など、１０１、１０２、１０３など、１５１、１５２、１５３など、２０１、２０２、２０３など）を意味することが容易に理解される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドまたはバリアントは、基準配列と少なくともまたは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％，７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％，８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する。
【０４５７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コドン最適化されてもよい。本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコドンを置換して、ポリペプチドの発現、安定性、および／または活性を増加させることを指す。コドン最適化に影響を与える因子には、（ｉ）２つ以上の生物もしくは遺伝子間のコドンバイアス、または合成的に構築されたバイアス表の変動、（ｉｉ）ある生物、遺伝子、または一組の遺伝子におけるコドンバイアスの程度の変動、（ｉｉｉ）文脈を含むコドンの系統的変動、（ｉｖ）それらのデコーディングｔＲＮＡに従うコドンの変動、（ｖ）トリプレット全体またはその１つの位置のいずれかの、ＧＣ％に従うコドンの変動、（ｖｉ）基準配列、例えば、天然に存在する配列に対する類似性の程度の変動、（ｖｉｉ）コドン出現頻度カットオフの変動、（ｖｉｉｉ）ＤＮＡ配列から転写されたｍＲＮＡの構造的特性、（ｉｘ）コドン置換セットの設計が基づくべき、ＤＮＡ配列の機能についての以前の知識、（ｘ）各アミノ酸のコドンセットの系統的変動、および／あるいは（ｘｉ）偽翻訳開始部位の単離された除去のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０４５８】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、リン酸化糖とのＮグリコシド結合における複素環窒素性塩基を指す。ヌクレオチドは、中性塩基および当該技術分野において認識されている多様な修飾塩基を含むことが理解される。そのような塩基は一般に、ヌクレオチド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオチドは一般に、塩基と、糖と、リン酸基とを含む。リボ核酸（ＲＮＡ）において、糖はリボースであり、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）において、糖はデオキシリボース、すなわち、リボース中に存在するヒドロキシル基を欠如する糖である。例示的な中性窒素性塩基には、プリン、アデノシン（Ａ）およびグアニジン（Ｇ）、ならびにピリミジン、シチジン（Ｃ）、およびチミジン（Ｔ）（またはＲＮＡの文脈ではウラシル（Ｕ））が含まれる。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。ヌクレオチドは通常、一リン酸、二リン酸、または三リン酸である。ヌクレオチドは、未修飾であっても、糖、リン酸、および／または塩基部分で修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオチド類似体、ヌクレオチド誘導体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、および非標準ヌクレオチドとも称され、例えば、ＷＯ９２／０７０６５およびＷＯ９３／１５１８７を参照されたい）。修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約されている。
【０４５９】
ヌクレオチドはまた、糖のＣ−５に結合したヒドロキシル基上でエステル化が生じている、ヌクレオシドのリン酸エステルとも見なすことができる。本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、糖とのＮグリコシド結合における複素環窒素性塩基を指す。ヌクレオシドは、天然の塩基を含むこと、および周知の修飾塩基を含むこともまた、当該技術分野において認識されている。そのような塩基は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置する。ヌクレオシドは一般に、塩基と、糖基とを含む。ヌクレオシドは、未修飾であっても、糖および／または塩基部分で修飾されていてもよい（互換的に、ヌクレオシド類似体、ヌクレオシド誘導体、修飾ヌクレオシド、非天然ヌクレオシド、または非標準ヌクレオシドとも称される）。これもまた上述のように、修飾核酸塩基の例は、Ｌｉｍｂａｃｈら（１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２，２１８３−２１９６）によって要約されている。
【０４６０】
様々な例示的な実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドには、ＤＮＡドナー修復鋳型ポリヌクレオチド、ならびに本明細書において企図される免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、操作された抗原受容体、および操作されたヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ならびに本明細書において企図されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ウイルスベクター、および転移プラスミドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６１】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」などという用語は、基準ポリヌクレオチド配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド、または本明細書で以下に定義される厳密な条件下で基準配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。これらの用語はまた、少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、置換、または修飾によって基準ポリヌクレオチドとは区別されるポリヌクレオチドも包含する。したがって、「ポリヌクレオチドバリアント」および「バリアント」という用語は、１つ以上のヌクレオチドが付加もしくは欠失されているか、またはヌクレオチドで修飾もしくは置換されているポリヌクレオチドを含む。この点について、変異、付加、欠失、および置換を含む特定の改変を基準ポリヌクレオチドに対して行うことができ、それによって改変されたポリヌクレオチドが基準ポリヌクレオチドの生物学的機能または活性を保持することは、当該技術分野においてよく理解されている。
【０４６２】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、厳密な条件下で標的核酸配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む。「厳密な条件」下でハイブリダイズすることは、互いに少なくとも６０％同一であるヌクレオチド配列がハイブリダイズされたままである、ハイブリダイゼーションプロトコルを説明する。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くあるように選択される。Ｔｍは、標的配列に対して相補的であるプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする、（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下での）温度である。標的配列は一般に過剰量で存在するため、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態で占有されている。
【０４６３】
本明細書で使用される場合、「配列同一性」、または例えば、「と５０％同一である配列」を含むという記述は、配列が、ヌクレオチド毎に基づいてまたはアミノ酸毎に基づいて、比較のウィンドウにわたって同一である程度を指す。したがって、「配列同一性のパーセンテージ」は、２つの最適に整列した配列を比較のウィンドウにわたって比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、およびＭｅｔ）が両方の配列内で生じて、マッチした位置数をもたらす位置数を決定し、マッチした位置数を比較のウィンドウ内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージをもたらすことによって計算することができる。本明細書に記載の基準配列のいずれかと少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチドおよびポリペプチドが含まれ、典型的にはポリペプチドバリアントは、基準ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を維持する。
【０４６４】
２つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列関係を説明するために使用される用語には、「基準配列」、「比較ウィンドウ」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」、および「実質的同一性」が含まれる。「基準配列」の長さは、少なくとも１２個の単量体単位であるが、頻繁に１５〜１８個、および多くの場合少なくとも２５個の単量体単位（ヌクレオチドおよびアミノ酸残基を含む）である。２つのポリヌクレオチドは各々、（１）２つのポリヌクレオチド間で類似している配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部分のみ）と、（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列とを含み得るため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局在領域を特定および比較することによって実行される。「比較ウィンドウ」は、少なくとも６つ、通常は約５０〜約１００個、より通常は約１００〜約１５０個の近接位置の概念的なセグメントを指し、ここで、配列は、２つの配列を最適に整列させた後に、同じ数の近接位置の基準配列と比較される。比較ウィンドウは、２つの配列の最適な整列のために、（付加または欠失を含まない）基準配列と比較して、約２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウを整列させるための配列の最適な整列は、アルゴリズム（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ７．０内のＴＦＡＳＴＡ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ））のコンピュータ化実装によって、または検査および選択される様々な方法のいずれかによって生成される最適な整列（すなわち、比較ウィンドウにわたって最も高いパーセンテージの相同性をもたらすもの）によって実行することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９によって開示される、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムに対しても参照を行うことができる。配列分析の詳細な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，１９９４−１９９８，Ｃｈａｐｔｅｒ１５のＵｎｉｔ１９．３に見出すことができる。
【０４６５】
様々な実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図されるポリペプチドをコードするｍＲＮＡを含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、キャップと、１つ以上のヌクレオチドと、ポリアデニン鎖とを含む。
【０４６６】
本明細書で使用される場合、「５’キャップ」または「５’キャップ構造」または「５’キャップ部分」という用語は、ｍＲＮＡの５’末端に組み込まれている化学修飾を指す。５’キャップは、核外輸送、ｍＲＮＡ安定性、および翻訳に関与する。
【０４６７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、末端グアノシンキャップ残基とｍＲＮＡ分子の５’末端転写センスヌクレオチドとの間に５’−ｐｐｐ−５’−三リン酸結合を含む５’キャップを含む。その後、この５’−グアニル酸キャップはメチル化されて、Ｎ７−メチル−グアニル酸残基を生成することができる。
【０４６８】
本明細書において企図されるｍＲＮＡポリヌクレオチドの特定の実施形態における使用に好適な５’キャップの例示的な例には、非メチル化５’キャップ類似体、例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；メチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；
ジメチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；トリメチル化５’キャップ類似体、例えば、ｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、およびｍ２，２，７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ；ジメチル化対称性５’キャップ類似体、例えば、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ｇ、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ｃ、およびｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐｍ７（５’）Ａ；ならびに抗逆５’キャップ類似体、例えば、抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ）キャップ、指定３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、２’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、２’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ７２’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、３’Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｃ、ｍ７３’ｄ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、およびそれらの四リン酸誘導体）（例えば、Ｊｅｍｉｅｌｉｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ，９：１１０８−１１２２（２００３）を参照されたい）が含まれるが、これらに限定されない。
【０４６９】
特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、三リン酸架橋を介して第１の転写ヌクレオチドの５’末端に連結し、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（式中、Ｎは任意のヌクレオシドである）をもたらす７−グアニル酸メチル（「ｍ７Ｇ」）である、５’キャップを含む。
【０４７０】
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡは、５’キャップを含み、このキャップは、Ｃａｐ０構造（Ｃａｐ０構造は、塩基１および２に結合したリボースの２’−Ｏ−メチル残基を欠如する）、Ｃａｐ１構造（Ｃａｐ１構造は、塩基２に２’−Ｏ−メチル残基を有する）、またはＣａｐ２構造（Ｃａｐ２構造は、塩基２および３の両方に結合した２’−Ｏ−メチル残基を有する）である。
【０４７１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップを含む。
【０４７２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含む。
【０４７３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７４】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、２−メトキシ−アデニン、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７５】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、プソイドウリジン、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロプソイドウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、および４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７６】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、５−アザ−シチジン、プソイドイソシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドイソシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドイソシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドイソシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドイソシチジン、および４−メトキシ−１−メチル−プソイドイソシチジンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７７】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン、および２−メトキシ−アデニンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７８】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン、およびＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。
【０４７９】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジン、１つ以上の５−メチル−シトシン、および／または１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０４８０】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上のプソイドウリジンを含む。
【０４８１】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シチジンを含む。
【０４８２】
一実施形態において、ｍＲＮＡは、１つ以上の５−メチル−シトシンを含む。
【０４８３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるｍＲＮＡは、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解からの保護、ｍＲＮＡの安定化、翻訳の促進を補助するためのポリアデニン鎖を含む。特定の実施形態において、ｍＲＮＡは、３’ポリアデニン鎖構造を含む。
【０４８４】
特定の実施形態において、ポリアデニン鎖の長さは、少なくとも約１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０個、もしくは少なくとも約５００個以上のアデニンヌクレオチド、または任意の介在する数のアデニンヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリアデニン鎖の長さは、少なくとも約１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０２、２０３、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、もしくは２７５個、またはそれ以上のアデニンヌクレオチドである。
【０４８５】
特定の実施形態において、ポリアデニン鎖の長さは、約１０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約３００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２５０個のアデニンヌクレオチド、約１５０〜約２００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、約２００〜約３００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約５００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４５０個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約４００個のアデニンヌクレオチド、約２５０〜約３５０個のアデニンヌクレオチド、もしくは約２５０〜約３００個のアデニンヌクレオチド、または任意の介在する範囲のアデニンヌクレオチドである。
【０４８６】
ポリヌクレオチドの配向を説明する用語には、５’（通常、遊離リン酸基を有するポリヌクレオチドの末端）および３’（通常、遊離ヒドロキシル（ＯＨ）基を有するポリヌクレオチドの末端）が含まれる。ポリヌクレオチド配列には、５’〜３’の配向または３’〜５’の配向に注釈を付けてもよい。ＤＮＡおよびｍＲＮＡの場合、５’〜３’の鎖は、その配列がプレメッセンジャー（プレｍＲＮＡ）の配列と同一である（ＤＮＡのチミン（Ｔ）の代わりの、ＲＮＡのウラシル（Ｕ）を除く）ため、「センス」、「プラス」、または「コーディング」鎖と指定される。ＤＮＡおよびｍＲＮＡの場合、ＲＮＡポリメラーゼによって転写される鎖である相補的な３’〜５’の鎖は、「鋳型」、「アンチセンス」、「マイナス」、または「非コーディング」鎖と指定される。本明細書で使用される場合、「逆配向」という用語は、３’〜５’の配向で記述された５’〜３’の配列、または５’〜３’の配向で記述された３’〜５’の配列を指す。
【０４８７】
「相補的な」および「相補性」という用語は、塩基対合則によって関連付けられたポリヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、ＤＮＡ配列５’ＡＧＴＣＡＴＧ３’の相補鎖は、３’ＴＣＡＧＴＡＣ５’である。後者の配列は多くの場合、左側に５’末端および右側に３’末端、５’ＣＡＴＧＡＣＴ３’で、逆相補鎖として記述される。逆相補鎖に等しい配列は、回文配列であると言われる。相補性は「部分的」であってもよく、その場合、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対合則に従ってマッチしている。または、核酸間に「完全」または「全」相補性が存在してもよい。
【０４８８】
本明細書で使用される場合、「核酸カセット」または「発現カセット」という用語は、ＲＮＡ、およびその後ポリペプチドを発現することができるベクターにおける遺伝子配列を指す。一実施形態において、核酸カセットは、対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。別の実施形態において、核酸カセットは、１つ以上の発現制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル酸配列、および対象となる遺伝子（複数可）、例えば、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含有する。ベクターは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０個、またはそれ以上の核酸カセットを含み得る。核酸カセットは、カセット内の核酸がＲＮＡに転写され、かつ必要な場合にはタンパク質またはポリペプチドに翻訳され得るように、ベクター内において位置的および連続的に配向され、形質転換細胞の活性に必要とされる適切な翻訳後修飾を受け、適切な細胞内区画を標的とすることまたは細胞外区画への分泌によって、生物学的活性に適切な区画に転位置される。好ましくは、カセットは、ベクターへの迅速な挿入に適応した３’末端および５’末端を有し、例えば、それは、各末端に制限エンドヌクレアーゼ部位を有する。好ましい実施形態において、核酸カセットは、遺伝障害の治療、予防、または寛解に使用される治療遺伝子の配列を含有する。カセットを除去し、単一の単位としてプラスミドまたはウイルスベクターに挿入してもよい。
【０４８９】
ポリヌクレオチドは、対象となるポリヌクレオチド（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「対象となるポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドもしくは融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または本明細書において企図される阻害性ポリヌクレオチドの転写のための鋳型として機能するポリヌクレオチドを指す。
【０４９０】
更に、遺伝子コードの縮重の結果として、本明細書において企図されるポリペプチド、またはそのバリアントの断片をコードし得る多くのヌクレオチド配列が存在することが当業者によって理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにも関わらず、特定の実施形態において、コドン使用頻度の差のために変動するポリヌクレオチド、例えば、ヒトおよび／または霊長類のコドン選択のために最適化されるポリヌクレオチドが、特に企図される。一実施形態において、特定の対立遺伝子配列を含むポリヌクレオチドが提供される。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加、および／または置換などの１つ以上の変異の結果として改変されている内在性ポリヌクレオチド配列である。
【０４９１】
特定の実施形態において、対象となるポリヌクレオチドは、ドナー修復鋳型を含む。
【０４９２】
特定の実施形態において、対象となるポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、または別の阻害性ＲＮＡを含むがこれらに限定されない、阻害性ポリヌクレオチドを含む。
【０４９３】
一実施形態において、阻害性ＲＮＡを含むドナー修復鋳型は、例えば、本明細書の他の箇所に記載の、強度構成的ｐｏｌ  ＩＩＩ（例えば、ヒトもしくはマウスＵ６  ｓｎＲＮＡプロモーター、ヒトおよびマウスＨ１  ＲＮＡプロモーター、またはヒトバリンｔＲＮＡプロモーター）、あるいは強度構成的ｐｏｌ  ＩＩプロモーターなどの１つ以上の制御配列を含む。
【０４９４】
コーディング配列自体の長さに関わらず、特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に開示されるか、または当該技術分野において既知である、プロモーターおよび／もしくはエンハンサー、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コザック配列、ポリアデニル化シグナル、追加の制限酵素部位、複数のクローニング部位、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、リコンビナーゼ認識部位（例えば、ＬｏｘＰ、ＦＲＴ、およびＡｔｔ部位）、終結コドン、転写終結シグナル、転写後応答エレメント、ならびに自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、エピトープタグなどの他のＤＮＡ配列と組み合わせてもよいため、それらの全長は著しく変動し得る。したがって、特定の実施形態において、ほぼあらゆる長さのポリヌクレオチド断片を用いることができ、全長は好ましくは、調製の容易さ、および意図される組換えＤＮＡプロトコルにおける用途によって制限されることが企図される。
【０４９５】
当該技術分野において既知かつ利用可能である様々な確立した技術のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドを調製、操作、発現、および／または送達することができる。所望されるポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、適切なベクターに挿入され得る。所望されるポリペプチドはまた、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを細胞に送達することによっても発現させることができる。
【０４９６】
ベクターの例示的な例には、プラスミド、自己複製配列、および転位エレメント、例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、ＰｉｇｇｙＢａｃが含まれるが、これらに限定されない。
【０４９７】
ベクターの追加の例示的な例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体（酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）など）、バクテリオファージ（ラムダファージまたはＭ１３ファージなど）、および動物ウイルスが非限定的に含まれる。
【０４９８】
ベクターとして有用なウイルスの例示的な例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、およびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が非限定的に含まれる。
【０４９９】
発現ベクターの例示的な例には、哺乳動物細胞内での発現のためのｐＣｌｎｅｏベクター（Ｐｒｏメガ）；レンチウイルス媒介性遺伝子転移および哺乳動物細胞内での発現のための、ｐＬｅｎｔｉ４／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチドのコーティング配列をそのような発現ベクターに連結させて、哺乳動物細胞内でポリペプチドを発現させることができる。
【０５００】
特定の実施形態において、ベクターは、エピソームベクターまたは染色体外で維持されているベクターである。本明細書で使用される場合、「エピソーム」という用語は、宿主の染色体ＤＮＡ中に組み込まれずに、かつ宿主細胞の分裂によって徐々に喪失することなく複製することができるベクターを指し、該ベクターが染色体外またはエピソーム的に複製することもまた意味する。
【０５０１】
発現ベクターに存在する「発現制御配列」、「制御エレメント」、または「制御配列」は、ベクター複製起点の非翻訳領域、選択カセット、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（シャイン・ダルガーノ配列またはコザック配列）イントロン、転写後制御エレメント、ポリアデニル化配列、５’および３’非翻訳領域（宿主細胞性タンパク質と相互作用して、転写および翻訳を実行する）である。そのようなエレメントの強度および特異性は、変動し得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、任意の数の好適な転写および翻訳エレメント（遍在性プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）を使用することができる。
【０５０２】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、発現ベクターおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、ベクターを含む。ベクターは、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの、１つ以上の外因性、内在性、または異種性制御配列を含み得る。「内在性制御配列」は、ゲノム内の所与の遺伝子と天然に連結しているものである。「外因性制御配列」は、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によってある遺伝子に並置され、その遺伝子の転写が連結したエンハンサー／プロモーターによって指向されるものである。「異種性制御配列」は、遺伝子操作されている細胞とは異なる種に由来する外因性配列である。「合成」制御配列は、１つ以上の内在性配列および／もしくは外因性配列、ならびに／またはその特定の療法にとって最適なプロモーターおよび／もしくはエンハンサー活性を提供するインビトロもしくはインシリコで決定される配列のエレメントを含み得る。
【０５０３】
本明細書で使用され場合、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の認識部位を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーターに操作可能に連結したポリヌクレオチドを開始および転写する。特定の実施形態において、哺乳動物細胞内で作動可能なプロモーターは、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域、および／または転写開始点から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列、ＣＮＣＡＡＴ領域（式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）を含む。
【０５０４】
「エンハンサー」という用語は、転写の強化を提供することができる配列を含有し、かついくつかの例では別の制御配列に対してそれらの配向とは独立して機能することができる、ＤＮＡのセグメントを指す。エンハンサーは、プロモーターおよび／または他のエンハンサーエレメントと協同的または相加的に機能することができる。「プロモーター／エンハンサー」という用語は、プロモーター機能およびエンハンサー機能の両方を提供することができる配列を含有する、ＤＮＡのセグメントを指す。
【０５０５】
「操作可能に連結した」という用語は、記載の成分が、それらがそれらの意図される様式で機能することを許容する関係にある並立を指す。一実施形態において、この用語は、核酸発現制御配列（プロモーターおよび／またはエンハンサーなど）と第２のポリヌクレオチド配列（例えば、対象となるポリヌクレオチド）との間の機能性結合を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【０５０６】
本明細書で使用される場合、「構成的発現制御配列」という用語は、操作可能に連結した配列の転写を頻繁にまたは連続的に可能にするプロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーを指す。構成的発現制御配列はそれぞれ、多様な細胞型および組織型における発現を可能にする「遍在性」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであっても、制限された種類の細胞型および組織型における発現を可能にする「細胞特異的」、「細胞型特異的」、「細胞系譜特異的」、または「組織特異的」プロモーター、エンハンサー、またはプロモーター／エンハンサーであってもよい。
【０５０７】
特定の実施形態における使用に好適な例示的な遍在性発現制御配列には、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期もしくは後期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）ＬＴＲプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーター、ワクシニアウイルス由来のＨ５、Ｐ７．５、およびＰ１１プロモーター、短い伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−短）プロモーター、長い伸長因子１−アルファ（ＥＦ１ａ−長）プロモーター、初期増殖応答１（ＥＧＲ１）、フェリチンＨ（ＦｅｒＨ）、フェリチンＬ（ＦｅｒＬ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、真核生物翻訳開始因子４Ａ１（ＥＩＦ４Ａ１）、熱ショック７０ｋＤａタンパク質５（ＨＳＰＡ５）、熱ショックタンパク質９０ｋＤａベータ、メンバー１（ＨＳＰ９０Ｂ１）、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）、β−キネシン（β−ＫＩＮ）、ヒトＲＯＳＡ２６遺伝子座（Ｉｒｉｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２５，１４７７−１４８２（２００７））、ユビキチンＣプロモーター（ＵＢＣ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、β−アクチンプロモーターおよび骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、ｄｌ５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーター（Ｃｈａｌｌｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６９（２）：７４８−５５（１９９５））が含まれるが、これらに限定されない。
【０５０８】
特定の実施形態において、所望されるポリヌクレオチド配列の細胞型特異的、系譜特異的、または組織特異的発現を達成するために（例えば、あるサブセットの細胞型、細胞系譜、もしくは組織のみにおいて、または特定の発生段階中に、ポリペプチドをコードする特定の核酸を発現させるために）、細胞、細胞型、細胞系譜、または組織特異的発現制御配列を使用することが望ましくあり得る。
【０５０９】
本明細書で使用される場合、「条件的発現」は、誘導性発現；抑圧性発現；特定の生理学的状態、生物学的状態、または病状などを有する細胞または組織内での発現を含むがこれらに限定されない、任意の種類の条件的発現を指し得る。この定義は、細胞型または組織特異的発現を排除することは意図されない。特定の実施形態は、対象となるポリヌクレオチドの条件的発現を提供し、例えば、発現は、ポリヌクレオチドを発現させる処理または条件または対象となるポリヌクレオチドによってコードされるポリヌクレオチドの発現を増加もしくは減少させる処理または条件に細胞、組織、生物などを供することによって、制御される。
【０５１０】
誘導性プロモーター／系の例示的な例には、グルココルチコイドまたはエストロゲン受容体をコードする遺伝子のプロモーターなどのステロイド誘導性プロモーター（対応するホルモンでの処理によって誘導可能）、メタロチオニン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター（様々な重金属での処理によって誘導可能）、ＭＸ−１プロモーター（インターフェロンによって誘導可能）、「ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ」ミフェプリストン制御可能系（Ｓｉｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅ，３２３：６７）、キュメート（ｃｕｍａｔｅ）誘導性遺伝子スイッチ（ＷＯ２００２／０８８３４６）、テトラサイクリン依存的制御系などが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１１】
条件的発現はまた、部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼを使用することによっても達成することができる。特定の実施形態に従うと、ポリヌクレオチドは、部位特異的リコンビナーゼによって媒介される組換えのための少なくとも１つ（典型的には２つ）の部位（複数可）を含む。本明細書で使用される場合、「リコンビナーゼ」または「部位特異的リコンビナーゼ」という用語は、除去的または組み込み的タンパク質、酵素、補助因子、または１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、またはそれ以上）の組換え部位に関与する組換え反応に関与する関連タンパク質を含み、それらは、野生型タンパク質（Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３：６９９−７０７（１９９３）を参照されたい）、またはそれらの変異体、誘導体（例えば、組換えタンパク質配列またはそれらの断片を含有する融合タンパク質）、断片、およびバリアントであり得る。特定の実施形態における使用に好適なリコンビナーゼの例示的な例には、Ｃｒｅ、Ｉｎｔ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、Ｆｌｐ、Ｆｉｓ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、ΦＣ３１、Ｃｉｎ、Ｔｎ３リゾルバーゼ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ、ＴｎｐＸ、Ｈｊｃ、Ｇｉｎ、ＳｐＣＣＥ１、およびＰａｒＡが含まれるが、これらに限定されない。
【０５１２】
ポリヌクレオチドは、多様な部位特異的リコンビナーゼのいずれかのための１つ以上の組換え部位を含み得る。部位特異的リコンビナーゼのための標的部位は、ベクター、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターの組み込みに必要とされる任意の部位（複数可）に加えての部位であることを理解されたい。本明細書で使用される場合、「組換え配列」、「組換え部位」、または「部位特異的組換え部位」という用語は、リコンビナーゼが認識および結合する特定の核酸配列を指す。
【０５１３】
例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼの１つの組換え部位は、ｌｏｘＰであり、これは、８塩基対のコア配列に隣接する２つの１３塩基対の逆方向反復配列（リコンビナーゼ結合部位として機能する）を含む、３４塩基対配列である（Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照されたい）。他の例示的なｌｏｘＰ部位には、ｌｏｘ５１１（Ｈｏｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ｂｅｔｈｋｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９７）、ｌｏｘ５１７１（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｌｏｘ２２７２（Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｓａｉｔｏ，１９９８）、ｍ２（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ｌｏｘ７１（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、およびｌｏｘ６６（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１４】
ＦＬＰリコンビナーゼのための好適な認識部位には、ＦＲＴ（ＭｃＬｅｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）、Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、Ｆ４，Ｆ５（Ｓｃｈｌａｋｅ  ａｎｄ  Ｂｏｄｅ，１９９４）、ＦＲＴ（ＬＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、ＦＲＴ（ＲＥ）（Ｓｅｎｅｃｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
認識配列の他の例は、ａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬ、およびａｔｔＲ配列であり、これらは、リコンビナーゼ酵素λインテグラーゼ、例えば、ｐｈｉ−ｃ３１によって認識される。φＣ３１  ＳＳＲは、ヘテロタイプ部位ａｔｔＢ（３４塩基対長）とａｔｔＰ（３９塩基対長）との間のみの組換えを媒介する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。それぞれ細菌ゲノム上およびファージゲノム上のファージインテグラーゼの結合部位について名付けられた、ａｔｔＢおよびａｔｔＰはともに、φＣ３１ホモ二量体によって結合される可能性が高い不完全な逆方向反復配列を含有する（Ｇｒｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。産物部位ａｔｔＬおよびａｔｔＲは、更なるφＣ３１媒介性組換えに対しては効果的に不活性であり（Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、反応を不可逆的なものにする。触媒挿入について、ａｔｔＰ部位がゲノムａｔｔＢ部位に挿入されるよりも容易に、ａｔｔＢを持つＤＮＡがゲノムａｔｔＰ部位に挿入されることが見出されている（Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｂｅｌｔｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。したがって、典型的な戦略は、相同組換えによって、ａｔｔＰを持つ「ドッキング部位」を定義された遺伝子座に位置付け、これをその後、挿入のために、ａｔｔＢを持つ入って来る配列とパートナーにする。
【０５１６】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、一対のリコンビナーゼ認識部位に隣接したドナー修復鋳型ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、修復鋳型ポリヌクレオチドには、ＬｏｘＰ部位、ＦＲＴ部位、またはａｔｔ部位が隣接する。
【０５１７】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチドは、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の対象となるポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態において、複数のポリペプチドの各々の効率的な翻訳を達成するために、ポリヌクレオチド配列は、１つ以上のＩＲＥＳ配列、または自己切断ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列によって分離されてもよい。
【０５１８】
本明細書で使用される場合、「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質コード領域）の開始コドン（ＡＴＧなど）への直接的な配列内リボソーム進入を促進し、それにより遺伝子のキャップ非依存的翻訳をもたらすエレメントを指す。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ１５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｋａｍｉｎｓｋｉ．１９９５．ＲＮＡ１（１０）：９８５−１０００を参照されたい。当業者によって一般に用いられるＩＲＥＳの例には、米国特許第６，６９２，７３６号に記載のものが含まれる。当該技術分野において既知である「ＩＲＥＳ」の更なる例には、ピコルナウイルスから得ることができるＩＲＥＳ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）と、ウイルス性または細胞性ｍＲＮＡ源（例えば、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（ＢｉＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１１）：６１７８−６１９０）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）、およびインスリン様成長因子（ＩＧＦＩＩ）など）、翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｇならびに酵母転写因子ＴＦＩＩＤおよびＨＡＰ４、Ｎｏｖａｇｅｎから市販されている脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）（Ｄｕｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ６６（３）：１６０２−９）など）から得ることができるＩＲＥＳと、ＶＥＧＦ  ＩＲＥＳ（Ｈｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１８（１１）：６１７８−９０）とが含まれるが、これらに限定されない。ＩＲＥＳはまた、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ種、Ｄｉｃｉｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ種、およびＦｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ種のウイルスゲノム、ならびにＨＣＶ、フレンドマウス白血病ウイルス（ＦｒＭＬＶ）、およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）においても報告されている。
【０５１９】
一実施形態において、本明細書において企図されるポリヌクレオチド中で使用されるＩＲＥＳは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳである。
【０５２０】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コンセンサスコザック配列を有し、かつ所望されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用される場合、「コザック配列」という用語は、リボソームの小サブセットへのｍＲＮＡの初期結合を大いに促進し、翻訳を増加させる短いヌクレオチド配列を指す。コンセンサスコザック配列は、（ＧＣＣ）ＲＣＣＡＴＧＧ（配列番号３９）であり、式中、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ，１９８６．Ｃｅｌｌ．４４（２）：２８３−９２、およびＫｏｚａｋ，１９８７．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．１５（２０）：８１２５−４８）。
【０５２１】
異種核酸転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指向するエレメントは、異種遺伝子発現を増加させる。転写終結シグナルは一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見出される。特定の実施形態において、ベクターは、発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのポリアデニル化配列３’を含む。本明細書で使用される場合、「ポリＡ部位」、「ポリＡ配列」、「ポリアデニル酸部位」、または「ポリアデニル酸配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指向するＤＮＡ配列を表す。ポリアデニル化配列は、コーディング配列の３’末端へのポリアデニン鎖の付加によってｍＲＮＡ安定性を促進するため、翻訳効率の増加に寄与することができる。ポリアデニン鎖を欠如する転写物は不安定であり、かつ急速に分解されるため、組換え転写物の効率的ポリアデニル化が望ましい。ベクターにおいて使用することができるポリアデニル酸シグナルの例示的な例には、理想的なポリアデニル酸配列（例えば、ＡＡＴＡＡＡ、ＡＴＴＡＡＡ、ＡＧＴＡＡＡ）、ウシ成長ホルモンポリアデニル酸配列（ＢＧＨｐＡ）、ウサギβ−グロビンポリアデニル酸配列（ｒβｇｐＡ）、または当該技術分野において既知である別の好適な異種性もしくは内在性ポリアデニル酸配列が含まれる。
【０５２２】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドを持つポリヌクレオチドまたは細胞は、誘導性自殺遺伝子を含む自殺遺伝子を利用して、直接的な毒性および／または制御されない増殖のリスクを低減する。特定の実施形態において、自殺遺伝子は、ポリヌクレオチドまたは細胞を持つ宿主に対して免疫原性ではない。使用することができる自殺遺伝子の特定の例は、カスパーゼ−９もしくはカスパーゼ−８、またはシトシンデアミナーゼである。カスパーゼ−９は、特定の二量体化学誘導因子（ＣＩＤ）を使用して活性化させることができる。
【０５２３】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書において企図される遺伝子組換え細胞をインビボでの負の選択に対して感染しやすい遺伝子セグメントを含む。「負の選択」は、個体のインビボ条件の変化の結果として消失し得る、注入された細胞を指す。負の選択可能表現型は、投与される薬剤、例えば、化合物に対する感受性を与える遺伝子の挿入から生じ得る。負の選択遺伝子は、当該技術分野において既知であり、それらには、ガンシクロビル感受性を与える単純ヘルペスウイルスＩ型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ）遺伝子；細胞性ヒポキサンチンホスフリボシル（ｐｈｏｓｐｈｒｉｂｏｓｙｌ）トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子、細菌性シトシンデアミナーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０５２４】
いくつかの実施形態において、遺伝子組換え細胞は、インビトロでの負の選択可能表現型の細胞の選択を可能にする正のマーカーを更に含むポリヌクレオチドを含む。正の選択可能マーカーは、宿主細胞への導入時に、その遺伝子を運搬する細胞の正の選択を可能にする優性の表現型を発現する遺伝子であり得る。この種類の遺伝子は、当該技術分野において既知であり、それらには、ハイグロマイシンＢに対する耐性を与えるハイグロマイシン−Ｂホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｈ）、抗生物質Ｇ４１８に対する耐性をコードするＴｎ５由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏまたはａｐｈ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ＡＤＡ）、および多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２５】
一実施形態において、負の選択可能エレメントの喪失が正の選択可能マーカーの喪失もまた必然的に伴うように、正の選択可能マーカーおよび負の選択可能エレメントが連結される。特定の実施形態において、一方の喪失が強制的に他方の喪失をもたらすように、正および負の選択可能マーカーが融合される。発現産物として、上記の所望される正および負の選択の特徴の両方を与えるポリペプチドをもたらす融合ポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（ＨｙＴＫ）である。この遺伝子の発現は、インビトロでの正の選択のためのハイグロマイシンＢ耐性、およびインビボでの負の選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドをもたらす。優性の正の選択可能マーカーと負の選択可能マーカーとの融合に由来する二機能性選択可能融合遺伝子の使用を記載する、ＰＣＴ  ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１（Ｓ．Ｄ．Ｌｕｐｔｏｎ）の刊行物もまた参照されたい。
【０５２６】
好ましい正の選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｃｏ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来し、好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ  ＴＫ、ＶＺＶ  ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ、およびｇｐｔからなる群から選択される遺伝子に由来する。特定の実施形態において企図される例示的な二機能性選択可能融合遺伝子には、正の選択可能マーカーがｈｐｈまたはｎｅｏに由来し、かつ負の選択可能マーカーがシトシンデアミナーゼまたはＴＫ遺伝子または選択可能マーカーに由来する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２７】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、非ウイルス方法およびウイルス方法によって、造血細胞、例えば、Ｔ細胞に導入することができる。特定の実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチドの送達は、同じ方法もしくは異なる方法によって提供されても、かつ／または同じベクターもしくは異なるベクターによって提供されてもよい。
【０５２８】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、別の核酸分子を転移させるか、またはそれを輸送することができる核酸分子を指す。転移した核酸は一般に、ベクター核酸分子に連結、例えば、それに挿入される。ベクターは、細胞内での自己複製を指向する配列を含んでも、宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでもよい。特定の実施形態において、非ウイルスベクターを使用して、本明細書において企図される１つ以上のポリヌクレオチドをＴ細胞に送達する。
【０５２９】
非ウイルスベクターの例示的な例には、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、および細菌性人工染色体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３０】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドの非ウイルス送達の例示的な方法には、電気穿孔、超音波穿孔、リポフェクション、微量注入、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質：核酸共役体、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介転移、遺伝子銃、および熱ショックが含まれるが、これらに限定されない。
【０５３１】
特定の実施形態において企図される特定の実施形態における使用に好適なポリヌクレオチド送達系の例示的な例には、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｘｃｙｔｅ  Ｉｎｃ．、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃによって提供されるものが含まれるが、これらに限定されない。リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性脂質および中性脂質は、文献に記載されている。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１０：１８０−１８７、およびＢａｌａｚｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．２０１１：１−１２を参照されたい。特定の実施形態において、抗体を標的とし、細菌に由来する非生存ナノ細胞系送達もまた企図される。
【０５３２】
特定の実施形態において企図されるポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは、後述のように、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、もしくは頭蓋内注入）または局所投与による個々の患者への投与によって、インビボ送達することができる。あるいは、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、動員末梢血、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検など）または普遍的なドナー造血幹細胞などのエクスビボの細胞に送達し、その後細胞を患者に再移植してもよい。
【０５３３】
一実施形態において、ＤＮＡドナー修復鋳型をコードするウイルスベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与される。あるいは、ネイキッドＤＮＡが投与されてもよい。投与は、ある分子を血液または組織細胞と最終的に接触した状態へと導入するのに通常使用される経路（注射、注入、局所投与、および電気穿孔を含むがこれらに限定されない）のいずれかによる。そのような核酸の好適な投与方法は、当業者にとって利用可能かつ周知であり、２つ以上の経路を使用して特定の組成物を投与してもよいが、特定の経路は多くの場合、別の経路よりも速効性かつ効果的な反応を提供する。
【０５３４】
本明細書において企図される特定の実施形態における使用に好適なウイルスベクター系の例示的な例には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、およびワクシニアウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０５３５】
様々な実施形態において、細胞にポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を形質導入することによって、ＤＮＡドナー修復鋳型をコードするポリヌクレオチドが造血細胞、例えば、Ｔ細胞に導入される。
【０５３６】
ＡＡＶは、小さな（約２６ｎｍ）複製欠損の主にエピソームの無エンベロープ状ウイルスである。ＡＡＶは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染することができ、そのゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、典型的には最低でも導入遺伝子およびその制御配列と、５および３’ＡＡＶ逆方向終結反復配列（ＩＴＲ）とからなる。ＩＴＲ配列は、約１４５塩基対長である。特定の実施形態において、ｒＡＡＶは、ＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０から単離されたカプシド配列とを含む。
【０５３７】
いくつかの実施形態において、キメラｒＡＡＶが使用され、ＩＴＲ配列が１つのＡＡＶ血清型から単離され、カプシド配列が異なるＡＡＶ血清型から単離される。例えば、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列およびＡＡＶ６由来のカプシド配列を有するｒＡＡＶは、ＡＡＶ２／ＡＡＶ６と称される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲと、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０のいずれか１つ由来のカプシドタンパク質とを含み得る。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ６由来のカプシド配列とを含む。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ２由来のＩＴＲ配列と、ＡＡＶ２由来のカプシド配列とを含む。
【０５３８】
いくつかの実施形態において、操作および選択方法をＡＡＶカプシドに適用して、それらが対象となる細胞を形質導入する可能性をより高くすることができる。
【０５３９】
ｒＡＡＶベクターの構築、それらの産生および精製は、例えば、米国特許第９，１６９，４９４号、同第９，１６９，４９２号、同第９，０１２，２２４号、同第８，８８９，６４１号、同第８，８０９，０５８号、および同第８，７８４，７９９号に開示されており、これらの各々は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５４０】
様々な実施形態において、電気穿孔によって、複数のヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドが造血細胞に導入され、細胞にドナー修復鋳型を含むレトロウイルス、例えば、レンチウイルスを形質導入することによって、本明細書において企図されるドナー修復鋳型が造血細胞に導入される。
【０５４１】
本明細書で使用される場合、「レトロウイルス」という用語は、そのゲノムＲＮＡを線状二本鎖ＤＮＡ複製物に逆転写し、その後そのゲノムＤＮＡを宿主ゲノムに共有結合的に組み込むＲＮＡウイルスを指す。特定の実施形態における使用に好適な例示的なレトロウイルスには、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ））、ならびにレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０５４２】
本明細書で使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、複合レトロウイルスの群（または属）を指す。例示的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）ウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；ならびにサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＨＩＶ系ベクター骨格（すなわち、ＨＩＶシス作用配列エレメント）が好ましい。
【０５４３】
様々な実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、１つ以上のＬＴＲと、以下のアクセサリーエレメント、ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ、Ｐｓｉ（Ψ）パッケージングシグナル、輸送エレメント、ポリアデニル酸配列のうちの１つ以上または全てとを含み、任意で、本明細書の他の箇所に考察される、ＷＰＲＥまたはＨＰＲＥ、インスレーターエレメント、選択可能マーカー、および細胞自殺遺伝子を含んでもよい。
【０５４４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるレンチウイルスベクターは、組み込み的レンチウイルスまたは非組み込み的レンチウイルスまたは組み込み欠損レンチウイルスであってもよい。本明細書で使用される場合、「組み込み欠損レンチウイルス」または「ＩＤＬＶ」という用語は、ウイルスゲノムを宿主細胞のゲノムに組み込む能力を欠如するインテグラーゼを有するレンチウイルスを指す。組み込み不能ウイルスベクターは、特許出願第ＷＯ２００６／０１０８３４号に記載されており、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５４５】
インテグラーゼ活性を低減するのに好適なＨＩＶ−１  ｐｏｌ遺伝子中の例示的な変異には、Ｈ１２Ｎ、Ｈ１２Ｃ、Ｈ１６Ｃ、Ｈ１６Ｖ、Ｓ８１  Ｒ、Ｄ４１Ａ、Ｋ４２Ａ、Ｈ５１Ａ、Ｑ５３Ｃ、Ｄ５５Ｖ、Ｄ６４Ｅ、Ｄ６４Ｖ、Ｅ６９Ａ、Ｋ７１Ａ、Ｅ８５Ａ、Ｅ８７Ａ、Ｄ１１６Ｎ、Ｄ１１６１、Ｄ１１６Ａ、Ｎ１２０Ｇ、Ｎ１２０１、Ｎ１２０Ｅ、Ｅ１５２Ｇ、Ｅ１５２Ａ、Ｄ３５Ｅ、Ｋ１５６Ｅ、Ｋ１５６Ａ、Ｅ１５７Ａ、Ｋ１５９Ｅ、Ｋ１５９Ａ、Ｋ１６０Ａ、Ｒ１６６Ａ、Ｄ１６７Ａ、Ｅ１７０Ａ、Ｈ１７１Ａ、Ｋ１７３Ａ、Ｋ１８６Ｑ、Ｋ１８６Ｔ、Ｋ１８８Ｔ、Ｅ１９８Ａ、Ｒ１９９ｃ、Ｒ１９９Ｔ、Ｒ１９９Ａ、Ｄ２０２Ａ、Ｋ２１１Ａ、Ｑ２１４Ｌ、Ｑ２１６Ｌ、Ｑ２２１  Ｌ、Ｗ２３５Ｆ、Ｗ２３５Ｅ、Ｋ２３６Ｓ、Ｋ２３６Ａ、Ｋ２４６Ａ、Ｇ２４７Ｗ、Ｄ２５３Ａ、Ｒ２６２Ａ、Ｒ２６３Ａ、およびＫ２６４Ｈが含まれるが、これらに限定されない。
【０５４６】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、Ｄ１１６Ａ、Ｅ１５２Ｇ、またはＥ１５２Ａ変異；Ｄ６４Ｖ、Ｄ１１６Ｉ、およびＥ１５２Ｇ変異；またはＤ６４Ｖ、Ｄ１１６Ａ、およびＥ１５２Ａ変異を含む。
【０５４７】
一実施形態において、ＨＩＶ−１インテグラーゼ欠損ｐｏｌ遺伝子は、Ｄ６４Ｖ変異を含む。
【０５４８】
「末端反復配列（ＬＴＲ）」という用語は、レトロウイルスＤＮＡの末端に位置する塩基対のドメインを指し、それらは、それらの天然配列の文脈において直列反復配列であり、Ｕ３、Ｒ、およびＵ５領域を含有する。
【０５４９】
本明細書で使用される場合、「ＦＬＡＰエレメント」または「ｃＰＰＴ／ＦＬＡＰ」という用語は、その配列がレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）の中央ポリプリントラクト配列および中央終結配列（ｃＰＰＴおよびＣＴＳ）を含む核酸を指す。好適なＦＬＡＰエレメントは、米国特許第６，６８２，９０７号およびＺｅｎｎｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ，１０１：１７３に記載される。別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントおよび／またはＣＴＳエレメントに１つ以上の変異を有するＦＬＡＰエレメントを含有する。更に別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＴＳエレメントのいずれかを含む。更に別の実施形態において、レンチウイルスベクターは、ｃＰＰＴエレメントまたはＣＴＳエレメントを含まない。
【０５５０】
本明細書で使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスカプシドまたは粒子へのウイルスＲＮＡの挿入に必要とされるレトロウイルスゲノム内に位置するＰｓｉ［Ψ］配列を指し、例えば、Ｃｌｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５．Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６９，Ｎｏ．４；ｐｐ．２１０１−２１０９を参照されたい。
【０５５１】
「輸送エレメント」という用語は、核から細胞の細胞質へのＲＮＡ転写物の輸送を制御するシス作用転写後制御エレメントを指す。ＲＮＡ輸送エレメントの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｒｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）（例えば、Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１０５３、およびＣｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１．Ｃｅｌｌ５８：４２３を参照されたい）、ならびにＢ型肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＨＰＲＥ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５５２】
特定の実施形態において、転写後制御エレメント、効率的なポリアデニル化部位、および任意で転写終結シグナルをベクターに組み込むことによって、ウイルスベクターにおける異種配列の発現を増加させる。様々な転写後制御エレメントは、タンパク質における異種核酸、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８８６）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＰＲＥ）に存在する転写後制御エレメント（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：３８６４）、および同類のもの（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，９：１７６６）の発現を増加させることができる。
【０５５３】
レンチウイルスベクターは好ましくは、ＬＴＲの修飾の結果としていくらかの安全性強化を含有する。「自己不活型」（ＳＩＮ）ベクターは、例えば、第１巡のウイルス複製を超えたウイルス転写を予防するために、Ｕ３領域として知られる右側（３’）のＬＴＲエンハンサー−プロモーター領域が（例えば、欠失または置換により）修飾されている、複製欠損のベクターを指す。追加の安全性強化は、５’ＬＴＲのＵ３領域を異種プロモーターで置換して、ウイルス粒子の産生中のウイルスゲノムの転写を推進することによって提供される。使用することができる異種プロモーターの例には、例えば、ウイルス性シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、初期もしくは後期）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えば、最初期）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ルイス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（チミジンキナーゼ）プロモーターが含まれる。
【０５５４】
本明細書で使用される場合、「偽型」または「偽型化」という用語は、そのウイルスエンベロープタンパク質が好ましい特性を持つ別のウイルスのエンベロープタンパク質で置換されているウイルスを指す。例えば、ＨＩＶは、水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープタンパク質で偽型化することができ、これにより、ＨＩＶがより広範な細胞に感染することが可能となるが、これは、（ｅｎｖ遺伝子によってコードされる）ＨＩＶエンベロープタンパク質が通常、ウイルスの標的をＣＤ４＋提示細胞にするためである。
【０５５５】
特定の実施形態において、レンチウイルスベクターは、既知の方法に従って産生される。例えば、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；９：１０．ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７２−６７５０−９−１０、Ｋｕｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００９；４（４）：４９５−５０５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２００９．２２を参照されたい。
【０５５６】
本明細書において企図されるある種の特定の実施形態に従うと、ウイルスベクター骨格配列のほとんどまたは全ては、レンチウイルス、例えば、ＨＩＶ−１に由来する。しかしながら、レトロウイルス配列および／またはレンチウイルス配列の多くの異なる供給源を使用しても組み合わせてもよいこと、ならびにレンチウイルス配列の特定のものでは、転移ベクターが本明細書に記載の機能を実行する能力を損なうことなく、多数の置換および改変が受け入れられることを理解されたい。更に、様々なレンチウイルスベクターが当該技術分野において既知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、および１９９８）、Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号、ならびに同第５，９９４，１３６号を参照されたく、これらの多くは、本明細書において企図されるウイルスベクターまたは転移プラスミドの産生に適応することができる。
【０５５７】
様々な実施形態において、電気穿孔によって、複数のヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドが造血細胞に導入され、細胞にドナー修復鋳型を含むアデノウイルスを形質導入することによって、本明細書において企図されるドナー修復鋳型が造血細胞に導入される。
【０５５８】
アデノウイルス系ベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターでは、高い力価および高レベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて大量に産生することができる。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がＡｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、および／またはＥ３遺伝子を置換し、その後複製欠損のベクターがトランスにおいて欠失した遺伝子機能を供給するヒト２９３細胞内で増殖するように操作されている。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓、および筋肉内に見出されるものなどの非分裂分化細胞を含む複数の組織型をインビボで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きな運搬能力を有する。
【０５５９】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ａｄ５  ＤＮＡ断片によってヒト胎児由来腎臓細胞から形質転換されており、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する、２９３と指定される特有のヘルパー細胞株を利用することができる（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７）。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには不要であるため（Ｊｏｎｅｓ＆Ｓｈｅｎｋ，１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の補助によって、Ｅ１、Ｄ３のいずれかの領域、またはそれら両方の領域において異質ＤＮＡを運搬する（Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，１９９１）。アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓ＆Ｈｏｒｗｉｔｚ，１９９２、Ｇｒａｈａｍ＆Ｐｒｅｖｅｃ，９９２）において使用されている。組換えアデノウイルスの異なる組織への投与に関する研究には、気管滴下注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚ＆Ｇｅｒａｒｄ，１９９３）、および脳への定位接種（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３）が含まれる。臨床治験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド療法を伴った（Ｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１０８３−９（１９９８））。
【０５６０】
様々な実施形態において、電気穿孔によって、複数のヌクレアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドが造血細胞に導入され、細胞にドナー修復鋳型を含む単純ヘルペスウイルス、例えば、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２を形質導入することによって、本明細書において企図されるドナー修復鋳型が造血細胞に導入される。
【０５６１】
成熟ＨＳＶビリオンは、１５２キロベースの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有するエンベロープ状正二十面体カプシドからなる。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、１つ以上の必須または非必須ＨＳＶ遺伝子を欠損している。一実施形態において、ＨＳＶ系ウイルスベクターは、複製欠損である。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、１つ以上の中間初期、初期、または後期ＨＳＶ遺伝子を除去して複製を予防する、欠失を含有する。例えば、ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される最初期遺伝子を欠損し得る。ＨＳＶベクターの利点は、それが長期のＤＮＡ発現をもたらすことができる潜伏段階に入る能力、および最大２５キロベースの外因性ＤＮＡ挿入を受け入れることができるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。ＨＳＶ系ベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号、同第５，８４６，７８２号、および同第５，８０４，４１３号、ならびに国際特許出願第ＷＯ９１／０２７８８号、同第ＷＯ９６／０４３９４号、同第ＷＯ９８／１５６３７号、および同第ＷＯ９９／０６５８３号に記載されており、これらの各々は、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０５６２】
Ｇ．ゲノム編集された細胞
特定の実施形態において企図される方法によって製造される、ゲノム編集された細胞は、改善された細胞療法組成物を提供する。
【０５６３】
様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞は、造血幹細胞または前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。特定の実施形態において、ゲノム編集された造血幹細胞または前駆細胞は、ＢＣＬ１１Ａ遺伝子座、ＫＬＦ１遺伝子座、ＳＯＸ６遺伝子座、ＧＡＴＡ１遺伝子座、およびＬＳＤ１遺伝子座を含むがこれらに限定されない、γ−グロビン遺伝子発現およびＨｂＦの抑圧に寄与する１つ、２つ、３つ、もしくはそれ以上の遺伝子、β−グロビン遺伝子座のサラセミア対立遺伝子、またはβ−グロビン遺伝子座の鎌状化対立遺伝子中の複数の編集を含む。
【０５６４】
特定の実施形態において、１つ以上の造血幹細胞または前駆細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、複数の操作されたヌクレアーゼを細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターを細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、１つ以上の導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５６５】
特定の実施形態において、１つ以上の造血幹細胞または前駆細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、複数の操作されたヌクレアーゼを細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターを細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、異なる導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５６６】
特定の実施形態において、１つ以上の造血幹細胞または前駆細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、複数の操作されたヌクレアーゼを細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターを細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、１つ以上の導入遺伝子に隣接し、相同アーム対のうちの少なくとも２つが、同じ導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５６７】
様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞は、複数のゲノム編集を含む免疫エフェクター細胞、例えば、Ｔ細胞を含む。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書において企図される方法によって製造される、多重ゲノム編集された免疫エフェクター細胞には、改善されたインビボでの安全性、有効性、および耐久性の増加を含む、優れた特性が吹き込まれると考えられる。
【０５６８】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲシグナル伝達成分（例えば、ＴＣＲα遺伝子の定常領域）をコードする遺伝子、免疫系チェックポイント遺伝子（ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、およびＫＩＲ遺伝子を含むがこれらに限定されない）、または免疫抑制シグナル伝達成分（ＩＬ−１０Ｒα、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＡＨＲ、ＳＧＫ１、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、Ａ２ＡＲ、およびＣＢＬＢを含むがこれらに限定されない）中の複数の編集を含む。
【０５６９】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα遺伝子の定常領域、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ遺伝子、ＩＬ−１０Ｒα、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＡＨＲ、ＳＧＫ１、Ａ２ＡＲ、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、およびＣＢＬＢからなる群から選択される少なくとも２つのゲノム標的部位に挿入された、操作された抗原受容体を含む。
【０５７０】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα遺伝子の定常領域、ならびにＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ遺伝子、ＩＬ−１０Ｒα、ＴＧＦβＲ１、ＴＧＦβＲ２、ＡＨＲ、ＳＧＫ１、Ａ２ＡＲ、ＴＳＣ２、ＶＨＬ、およびＣＢＬＢからなる群から選択される１つ以上の遺伝子に挿入された、操作された抗原受容体を含む。
【０５７１】
特定の実施形態において、１つ以上のＴ細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を増殖するように刺激することと、複数の操作されたヌクレアーゼをＴ細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターをＴ細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、１つ以上の導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５７２】
特定の実施形態において、１つ以上のＴ細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を増殖するように刺激することと、複数の操作されたヌクレアーゼをＴ細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターをＴ細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、異なる導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５７３】
特定の実施形態において、１つ以上のＴ細胞内の複数の標的部位を編集する方法は、Ｔ細胞集団を活性化し、Ｔ細胞集団を増殖するように刺激することと、複数の操作されたヌクレアーゼをＴ細胞集団に導入することと、ゲノム内の複数の標的部位に対応する複数の相同アーム対を含むドナー修復鋳型を含むベクターをＴ細胞集団に形質導入することであって、各相同アーム対が、１つ以上の導入遺伝子に隣接し、相同アーム対のうちの少なくとも２つが、同じ導入遺伝子に隣接する、形質導入することとを含み、操作されたヌクレアーゼの発現は、ゲノム内の標的部位において二本鎖切断をもたらし、ドナー修復鋳型の相同アームは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位における相同性指向性修復（ＨＤＲ）による標的部位への１つ以上の導入遺伝子の組み込みを可能にする。
【０５７４】
Ｈ．組成物および配合物
特定の実施形態において企図される組成物は、本明細書において企図される、１つ以上のポリペプチド、ポリヌクレオチド、それらを含むベクター、ならびにゲノム編集組成物およびゲノム編集された細胞組成物を含み得る。特定の実施形態において企図されるゲノム編集組成物および方法は、単一ＤＮＡドナー修復鋳型を使用して、細胞内または細胞集団内の複数の標的部位を編集するのに有用である。好ましい実施形態において、操作されたヌクレアーゼおよびＤＮＡドナー修復鋳型を使用して、造血細胞（例えば、造血幹細胞もしくは前駆細胞）、ＣＤ３４＋細胞、Ｔ細胞、または免疫エフェクター細胞のゲノム内に複数の編集を導入する。
【０５７５】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ＤＮＡドナー修復鋳型を含む。
【０５７６】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、ＤＮＡドナー修復鋳型をコードするベクターを含む。
【０５７７】
様々な実施形態において、本明細書において企図される組成物は、操作されたヌクレアーゼおよび／またはＤＮＡドナー修復鋳型を含む。ヌクレアーゼバリアントは、本明細書に開示されるポリヌクレオチド送達法、例えば、電気穿孔、脂質ナノ粒子、形質導入などを介して細胞に導入されるｍＲＮＡの形態であり得る。一実施形態において、ホーミングエンドヌクレアーゼバリアントまたはメガＴＡＬをコードするｍＲＮＡを含む組成物、およびＤＮＡドナー修復鋳型が、本明細書に開示されるポリヌクレオチド送達法を介して細胞に導入される。ドナー修復鋳型の存在下での遺伝子編集酵素の発現を使用して、ゲノム編集された細胞内またはゲノム編集された細胞集団内の複数の標的部位に、ＨＤＲによってゲノム編集を導入することができる。特定の実施形態において、細胞集団は、遺伝子組換えの免疫エフェクター細胞を含む。
【０５７８】
組成物には、薬学的組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的組成物」は、単独または１つ以上の他の療法様式との組み合わせのいずれかでの細胞または動物への投与のために、薬学的に許容される溶液中または生理学的に許容される溶液中に配合された組成物を指す。所望される場合、組成物は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、小分子、化学療法剤、プロドラッグ、薬物、抗体、または他の様々な薬学的に活性な薬剤などの他の薬剤とも組み合わせて投与されてもよいこともまた理解される。組成物中に同様に含まれ得る他の成分に対する制限は実質的に存在しないが、但し、追加の薬剤が組成物に悪影響を与えないことを条件とする。
【０５７９】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症なく、合理的な損益比と釣り合って、ヒトおよび動物の組織と接触した使用に好適である化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で用いられる。
【０５８０】
「薬学的に許容される担体」という用語は、治療細胞が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。薬学的担体の例示的な例は、細胞培養培地、水、および油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、およびゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む）などの無菌液であり得る。食塩水ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注射可能溶液に用いることができる。特定の実施形態において、好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどが含まれる。いずれかの従来の培地または薬剤が活性成分と不適合である程度を除いて、治療組成物中でのその使用が企図される。補充のための活性成分もまた、組成物中に組み込まれてもよい。
【０５８１】
一実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、対象への投与に好適である。特定の実施形態において、担体を含む組成物は、非経口投与、例えば、血管内（静脈内もしくは動脈内）、腹腔内、または筋肉内投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される担体を含む組成物は、脳室内、脊髄内、またはくも膜下腔内投与に好適である。薬学的に許容される担体には、無菌水溶液、細胞培養培地、または分散液が含まれる。薬学的に活性な物質のためのそのような培地または薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。いずれかの従来の培地または薬剤が形質導入された細胞と不適合である程度を除いて、薬学的組成物中でのその使用が企図される。
【０５８２】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、遺伝子組換えＴ細胞と、薬学的に許容される担体とを含む。本明細書において企図される細胞系組成物を含む組成物は、経腸もしくは非経口投与法によって別々に、または所望される治療目標をもたらす他の好適な化合物と組み合わせて投与することができる。
【０５８３】
薬学的に許容される担体は、それが治療されているヒト対象への投与に好適になるために、十分に高い純度かつ低毒性のものでなくてはならない。それは更に、組成物の安定性を維持または増加させるべきである。薬学的に許容される担体は、液体であっても固体であってもよく、計画される投与様式を念頭に置いて、組成物の他の成分と組み合わせたときに、所望される容積、稠度などを提供するように選択される。例えば、薬学的に許容される担体は、非限定的に、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、もしくはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、カルシウム、硫酸、エチルセルロース、ポリアクリル酸、リン酸水素カルシウムなど）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）であり得る。本明細書において企図される組成物のための他の好適な薬学的に許容される担体には、水、塩類溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０５８４】
そのような担体溶液はまた、緩衝液、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。本明細書で使用される場合、「緩衝液」という用語は、ｐＨを有意に変化させることなく、その化学構造が酸または塩基を中和する溶液または液体を指す。本明細書において企図される緩衝液の例には、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、リンゲル溶液、５％のデキストロース水（Ｄ５Ｗ）、正常／生理食塩水（０．９％のＮａＣｌ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５８５】
薬学的に許容される担体は、組成物のｐＨを約７に維持するのに十分な量で存在し得る。あるいは、組成物は、約６．８〜約７．４の範囲内、例えば、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、および７．４のｐＨを有する。更に別の実施形態において、組成物は、約７．４のｐＨを有する。
【０５８６】
本明細書において企図される組成物は、無毒性の薬学的に許容される培地を含み得る。組成物は、懸濁液であり得る。本明細書で使用される場合、「懸濁液」という用語は、細胞が固体支持体に結合しない非付着条件を指す。例えば、懸濁液として維持される細胞は、撹拌されてもかき混ぜられてもよく、かつ培養皿などの支持体に結合していない。
【０５８７】
特定の実施形態において、本明細書において企図される組成物は、懸濁液中に配合され、ゲノム編集された細胞は、静脈内注射（ＩＶ）用袋内などの許容される液体培地または溶液（例えば、食塩水または無血清培地）中に分散される。許容される希釈剤には、水、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ、リンゲル溶液、等張塩化ナトリウム（食塩）水、無血清細胞培養培地、および低温貯蔵に好適な培地（例えば、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ（登録商標）培地）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５８８】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体は、ヒトまたは動物起源の天然タンパク質を実質的に含まず、ゲノム編集された細胞集団を含む組成物の貯蔵に好適である。治療組成物は、ヒト患者への投与が意図されるため、ウシ血清アルブミン、ウマ血清、およびウシ胎仔血清などの細胞培養成分を実質的に含まない。
【０５８９】
いくつかの実施形態において、組成物は、薬学的に許容される細胞培養培地中に配合される。そのような組成物は、ヒト対象への投与に好適である。特定の実施形態において、薬学的に許容される細胞培養培地は、無血清培地である。
【０５９０】
無血清培地は、血清含有培地と比較して、組成物の単純化およびより詳細な定義、混入物の程度の低減、感染病原体の可能性のある供給源の消失、ならびにより低い費用を含むいくつかの利点を有する。様々な実施形態において、無血清培地は、動物質を含まず、かつ任意でタンパク質を含まないものであってもよい。任意で、培地は、生物薬剤学的に許容される組換えタンパク質を含有してもよい。「動物質を含まない」培地は、成分が非動物源に由来する培地を指す。組換えタンパク質は、動物質を含まない培地中の天然動物タンパク質に取って代わり、栄養素は、合成源、植物源、または微生物源から得られる。対照的に、「タンパク質を含まない」培地は、タンパク質を実質的に含まないものと定義される。
【０５９１】
特定の組成物中で使用される無血清培地の例示的な例には、ＱＢＳＦ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．）、ＳｔｅｍＰｒｏ−３４（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＸ−ＶＩＶＯ１０が含まれるが、これらに限定されない。
【０５９２】
好ましい実施形態において、ゲノム編集された細胞を含む組成物は、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ中で配合される。
【０５９３】
様々な実施形態において、ゲノム編集された細胞を含む組成物は、凍結保存培地中で配合される。例えば、凍結保存剤を有する凍結保存培地を使用して、解凍後に高い細胞生存率の結果を維持することができる。特定の組成物中で使用される凍結保存培地の例示的な例には、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、およびＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ２が含まれるが、これらに限定されない。
【０５９４】
一実施形態において、組成物は、５０：５０のＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ対ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ１０を含む溶液中で配合される。
【０５９５】
特定の実施形態において、組成物は、マイコプラズマ、エンドトキシン、および微生物混入物を実質的に含まない。エンドトキシンに関して「実質的に含まない」は、生物製剤についてＦＤＡによって許容される量（１日当たり５ＥＵ／ｋｇの体重の全エンドトキシンであり、平均的な７０ｋｇの人では全用量の細胞当たり３５０ＥＵである）よりも少ないエンドトキシンが、１用量の細胞当たりに存在することを意味する。特定の実施形態において、本明細書において企図されるレトロウイルスベクターによって形質導入された造血幹細胞または前駆細胞を含む組成物は、約０．５ＥＵ／ｍＬ〜約５．０ＥＵ／ｍＬ、または約０．５ＥＵ／ｍＬ、１．０ＥＵ／ｍＬ、１．５ＥＵ／ｍＬ、２．０ＥＵ／ｍＬ、２．５ＥＵ／ｍＬ、３．０ＥＵ／ｍＬ、３．５ＥＵ／ｍＬ、４．０ＥＵ／ｍＬ、４．５ＥＵ／ｍＬ、もしくは５．０ＥＵ／ｍＬを含有する。
【０５９６】
特定の実施形態において、１つ以上の再プログラムヌクレアーゼをコードする１つ以上のｍＲＮＡ、および任意で末端プロセシング酵素を含むがこれらに限定されない、ポリヌクレオチドの送達に好適な組成物および配合物が企図される。
【０５９７】
エクスビボ送達のための例示的な配合物はまた、リン酸カルシウムなどの当該技術分野において既知である様々なトランスフェクション剤、電気穿孔、熱ショック、および様々なリポソーム配合物（すなわち、脂質媒介性トランスフェクション）の使用も含む。リポソームは、わずかな水性流体を封入する脂質二重層である。ＤＮＡは、（その電荷のために）カチオン性リポソームの外表面に自発的に会合し、それらのリポソームは、細胞膜と相互作用する。
【０５９８】
特定の実施形態において、薬学的に許容される担体溶液の配合物は、当業者にとって周知であり、例えば、経腸および非経口、例えば、血管内、静脈内、動脈内、骨内、脳室内、脳内、頭蓋内、脊髄内、くも膜下腔内、および髄内の投与および配合物を含む様々な治療レジメンにおいて、本明細書に記載の特定の組成物を使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発もまた同様である。本明細書において企図される特定の実施形態は、薬学の技術分野において周知であるもの、および例えば、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ  ａｎｄ  ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩ．２２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ  Ｊｒ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ；２０１２に記載のものなどの他の配合物を含み得ることが当業者によって理解される。
【０５９９】
Ｉ．ゲノム編集された細胞療法
本明細書において企図される組成物および方法によって製造されるゲノム編集された細胞は、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全のうちの少なくとも１つの症状の予防、治療、または寛解における使用のための改善された薬物製品を提供する。本明細書で使用される場合、「薬物製品」という用語は、本明細書において企図される組成物および方法を使用して産生される、遺伝子組換え細胞を指す。
【０６００】
特定の実施形態において、薬物製品は、遺伝子編集された造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞を含む。特定の実施形態において、ゲノム内の複数の編集を含む、有効量のゲノム編集された造血幹細胞もしくは前駆細胞、またはＣＤ３４＋細胞を対象に投与して、β−サラセミアおよび鎌状赤血球症を含むがこれらに限定されない、ヘモグロビン異常症の少なくとも１つの症状を予防、治療、または寛解する。
【０６０１】
特定の実施形態において、薬物製品は、遺伝子編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を含む。更に、特定の実施形態において企図されるゲノム編集されたＴ細胞は、Ｔ細胞疲弊に対して耐性があり、持続的な療法をもたらし得る腫瘍微小環境における耐久性および持続性の増加を示すため、それらは、より安全かつより効果的な養子細胞療法を提供する。
【０６０２】
特定の実施形態において、ゲノム内の複数の編集を含む、有効量のゲノム編集された免疫エフェクター細胞またはＴ細胞を対象に投与して、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状を予防、治療、または寛解する。
【０６０３】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、Ｔ細胞疲弊に対する耐性を増加させ、インビボでのＴ細胞耐久性を増加させ、かつ／またはインビボでのＴ細胞持続性を増加させる、遺伝子中の複数の標的部位に挿入された、１つ以上の免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または操作された抗原受容体を含む。
【０６０４】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα定常領域、免疫系チェックポイント遺伝子、および／または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子からなる群から選択される複数の標的部位に挿入された、ＣＡＲを含む。
【０６０５】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα定常領域に挿入されたＣＡＲと、１つ以上の免疫系チェックポイント遺伝子または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子に挿入された、免疫能エンハンサー、免疫抑制シグナルダンパー、または別の操作された抗原受容体をコードする１つ以上の導入遺伝子とを含む。
【０６０６】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα定常領域、１つ以上の免疫系チェックポイント遺伝子、および／または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子に挿入された、ＣＡＲまたはフリップ受容体を含む。
【０６０７】
特定の実施形態において、ゲノム編集された細胞は、ＴＣＲα定常領域、１つ以上の免疫系チェックポイント遺伝子、および／または免疫抑制シグナル伝達成分をコードする遺伝子に挿入された、１つ以上のフリップ受容体を含む。
【０６０８】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６０９】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫、非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳／ＣＮＳ癌、乳癌、気管支腫瘍、心臓腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、脊索腫、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、感覚神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、眼癌、卵管癌、線維性組織球腫、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞性腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、頭頸部癌、血管芽細胞腫、肝細胞癌、下咽頭癌、眼球内黒色腫、カポジ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、髄様癌、髄芽腫、髄膜腫、黒色腫、ルケル細胞癌、正中管癌、口腔癌（ｍｏｕｔｈ  ｃａｎｃｅｒ）、粘液肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄増殖性疾患、鼻腔癌および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、乏突起神経膠腫、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、口腔癌（ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ｃａｎｃｅｒ）、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵島腫瘍、乳頭癌、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌（ｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、褐色細胞腫、松果体腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽細胞腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、網膜芽細胞腫、腎細胞癌、腎盂腎癌および尿管癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮脂腺癌、皮膚癌、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、小細胞肺癌、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、汗腺癌、滑膜腫、精巣癌、咽頭癌（ｔｈｒｏａｔ  ｃａｎｃｅｒ）、胸腺癌、甲状腺癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、血管癌、外陰癌、およびウィルムス腫瘍を含むがこれらに限定されない、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６１０】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、肝臓癌、膵癌、肺癌、乳癌、膀胱癌、脳癌、骨癌、甲状腺癌、腎臓癌、または皮膚癌を非限定的に含む、固形腫瘍または癌の治療において使用される。
【０６１１】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、膵癌、膀胱癌、および肺癌を含むがこれらに限定されない、様々な癌の治療において使用される。
【０６１２】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、液性癌または血液学的癌の治療において使用される。
【０６１３】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫を含むがこれらに限定されない、Ｂ細胞悪性腫瘍の治療において使用される。
【０６１４】
特定の実施形態において、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞は、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫：急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単核性、赤白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、および真性赤血球増加症、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、セザリー症候群、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、多発性骨髄腫、顕性多発性骨髄腫、くすぶり型多発性骨髄腫、形質細胞白血病、非分泌型骨髄腫、ＩｇＤ骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、骨の孤立性形質細胞腫、ならびに髄外性形質細胞腫を含むがこれらに限定されない、液性癌の治療において使用される。
【０６１５】
本明細書において企図されるゲノム編集法における使用に好ましい細胞には、自己／自家（「自己」）細胞、好ましくは造血細胞が含まれる。
【０６１６】
特定の実施形態において、治療有効量の本明細書において企図されるゲノム編集された細胞、またはそれらを含む組成物を、単独でまたは１つ以上の治療剤と組み合わせて、それを必要とする患者に投与することを含む方法が提供される。特定の実施形態において、細胞は、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を発症するリスクにある患者の治療において使用される。したがって、特定の実施形態は、ヘモグロビン異常症、癌、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全の少なくとも１つの症状の治療または予防または寛解を含み、治療有効量の本明細書において企図されるゲノム編集された細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む。
【０６１７】
一実施形態において、それを必要とする対象における、ヘモグロビン異常症、癌、ＧＶＨＤ、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、または免疫不全を治療する方法は、有効量、例えば、治療有効量の、本明細書において企図されるゲノム編集された細胞を含む組成物を投与することを含む。投与の量および頻度は、患者の病態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投薬量は、臨床治験によって決定され得る。
【０６１８】
例示的な一実施形態において、対象に提供される有効量のゲノム編集された細胞は、少なくとも２×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも３×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも４×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも５×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも６×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも７×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも８×１０６個の細胞／ｋｇ、少なくとも９×１０６個の細胞／ｋｇ、もしくは少なくとも１０×１０６個の細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇ（全ての介在する細胞用量を含む）である。
【０６１９】
別の例示的な実施形態において、対象に提供される有効量のゲノム編集された細胞は、約２×１０６個の細胞／ｋｇ、約３×１０６個の細胞／ｋｇ、約４×１０６個の細胞／ｋｇ、約５×１０６個の細胞／ｋｇ、約６×１０６個の細胞／ｋｇ、約７×１０６個の細胞／ｋｇ、約８×１０６個の細胞／ｋｇ、約９×１０６個の細胞／ｋｇ、もしくは約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、またはそれ以上の細胞／ｋｇ（全ての介在する細胞用量を含む）である。
【０６２０】
別の例示的な実施形態において、対象に提供される有効量のゲノム編集された細胞は、約２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、約５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約１０×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、２×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、３×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、４×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約６×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約７×１０６個の細胞／ｋｇ、５×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ、または６×１０６個の細胞／ｋｇ〜約８×１０６個の細胞／ｋｇ（全ての介在する細胞用量を含む）である。
【０６２１】
当業者であれば、所望される療法をもたらすために、特定の実施形態において企図される組成物の複数回投与が必要とされることを認識する。例えば、組成物は、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、５年間、または１０年間のスパンにわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０回、またはそれ以上投与されてもよい。
【０６２２】
特定の実施形態において、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、その後再採血（またはアフェレーシスを実行する）し、そこからＴ細胞を活性化させ、これらの活性化かつ拡大されたＴ細胞を患者に再注入することが望ましくあり得る。このプロセスは、数週間毎に複数回実行してもよい。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、１００ｃｃ、１５０ｃｃ、２００ｃｃ、２５０ｃｃ、３００ｃｃ、３５０ｃｃ、もしくは４００ｃｃ、またはそれ以上の採血から活性化することができる。理論によって拘束されるものではないが、この複数回採血／複数回再注入プロトコルの使用は、特定のＴ細胞集団を選抜するように機能し得る。
【０６２３】
特定の実施形態において企図される組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、注入、または移植を含む、任意の従来の様式で実行することができる。好ましい実施形態において、組成物は、非経口投与される。本明細書で使用される場合、「非経口投与」および「非経口投与される」という語句は、通常注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を指し、血管内、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、腫瘍内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入を非限定的に含む。一実施形態において、本明細書において企図される組成物は、腫瘍、リンパ節、または感染部位への直接注入によって対象に投与される。
【０６２４】
一実施形態において、ヘモグロビン異常症と診断された対象を治療する方法は、末梢血細胞または骨髄細胞を対象から取り出すことと、該細胞のゲノムを編集し、ゲノム編集された造血幹細胞集団または前駆細胞集団を生成することと、ゲノム編集された細胞集団を同じ対象に投与することとを含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む。
【０６２５】
一実施形態において、癌と診断された対象を治療する方法は、免疫エフェクター細胞を対象から取り出すことと、該免疫エフェクター細胞のゲノムを編集し、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞集団を生成することと、ゲノム編集された免疫エフェクター細胞集団を同じ対象に投与することとを含む。好ましい実施形態において、免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞を含む。
【０６２６】
特定の実施形態において企図される細胞組成物を投与するための方法には、エクスビボでゲノム編集された細胞の再導入、または対象への導入時に成熟細胞へと分化する細胞のゲノム編集された前駆体の再導入をもたらすのに効果的である任意の方法が含まれる。１つの方法は、末梢血細胞または骨髄細胞をエクスビボでゲノム編集することと、形質導入された細胞を対象に戻すこととを含む。
【０６２７】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許出願、および発行特許は、個々の各刊行物、特許出願、または発行特許が参照によって組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのごとく、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０６２８】
上述の実施形態は、例示および例として、理解を明確にする目的である適度詳細に記載されているものの、本明細書において企図される教示を考慮すれば、当業者には、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲から逸脱せずに、それらには特定の変更および修正がなされ得ることが容易に明らかになる。以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供される。当業者は、変更または修正しても、本質的に類似の結果をもたらすことができる、様々な重要ではないパラメータを容易に認識する。
【実施例】
【０６２９】
実施例１
単一ＡＡＶ  ＨＤＲ  ＤＮＡドナー修復鋳型を使用した、
２つの異なる遺伝子座への導入遺伝子の標的組み込み
プロモーター、緑色蛍光タンパク質をコードする導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナル（配列番号１）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを設計および構築した。ＡＡＶ  ＩＴＲエレメントの組み込みをＸｍａＩ消化で確認した。導入遺伝子カセットには、ヒトプログラム死受容体１（ＰＤ−１）に対して相同性の領域、およびＴ細胞受容体アルファ（ＴＣＲα）遺伝子の定常領域が隣接した。ＰＤ−１相同アームは、ＰＤ−１エクソン１内のメガＴＡＬ切断部位に隣接する３００塩基対の領域を含有した。ＴＣＲα相同アームは、ＴＣＲα遺伝子の定常領域内のメガＴＡＬ切断部位に隣接する３００塩基対の領域を含有した。相同アームを直列で置き、ＴＣＲα相同アームが導入遺伝子カセットのすぐ５’および３’に置かれるようにした一方で、ＰＤ−１相同体アームはＴＣＲα相同アームのすぐ５’および３’に位置した（図３Ａ）。例示的な導入遺伝子発現カセットは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー、負の制御領域欠失、蛍光ポリペプチド（例えば、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）など）をコードするポリヌクレオチドに操作可能に連結したｄ１５８７ｒｅｖプライマー結合部位置換（ＭＮＤ）プロモーターを含有した。発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルも含有した。
【０６３０】
必要な複製、カプシド、およびアデノウイルスヘルパーエレメントを提供する１つ以上のプラスミドで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性に同時トランスフェクトすることによって、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）を調製した。イオジキサノール系勾配での超遠心分離を使用して、同時トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞培養物からｒＡＡＶを精製した。
【０６３１】
ＣＤ３およびＣＤ２８で活性化させた初代ヒトＴ細胞内での、メガＴＡＬ誘導性相同組換えを評価し、ＩＬ−２を補充した完全培地中で培養した。３日後、Ｔ細胞を洗浄し、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１を標的とするメガＴＡＬ、ＴＣＲα遺伝子の定常領域を標的とするメガＴＡＬ、または両方のメガＴＡＬを同時にコードするインビトロ転写ｍＲＮＡで電気穿孔した。その後、ＭＮＤ−ＧＦＰ導入遺伝子カセットをコードするＤＮＡドナー修復鋳型を含む、精製した組換えＡＡＶ標的化ベクターを、Ｔ細胞に形質導入した。対照には、ｒＡＡＶ標的化ベクター単独で治療したＴ細胞が含まれた。複数の時点でフローサイトメトリーを使用して、蛍光タンパク質を発現するＴ細胞の出現頻度を測定し、組み込まれていないｒＡＡＶ標的化ベクターの蛍光タンパク質の一過性発現を区別した。ＣＤ３発現について染色することによって、メガＴＡＬ媒介性ＴＣＲα破壊を検出した一方で、配列決定、およびポリクローナルＴ細胞活性化後のＰＤ−１発現の喪失によって、ＰＤ−１遺伝子の破壊を検出した。
【０６３２】
メガＴＡＬ（複数可）およびｒＡＡＶ標的化ベクターで治療したＴ細胞の４０〜７０％において、長期的な導入遺伝子発現が観察された（図３Ｂ）。対照試料は、ゲノムへの最小のランダム組み込みと一貫して、可変的なレベルの一過性蛍光タンパク質発現、および非常に低いレベル（１％未満）の長期的な蛍光タンパク質発現をもたらした。ＴＣＲα遺伝子のメガＴＡＬ媒介性破壊は、７０〜９０％の範囲であった（図４）一方で、ＰＤ−１遺伝子座のメガＴＡＬ媒介性破壊は、６０％〜８０％の範囲であった（図５）。各遺伝子座における切断は独立しており、ＰＤ−１を標的とするメガＴＡＬと、ＴＣＲαを標的とするメガＴＡＬとを組み合わせても、いずれかのメガＴＡＬを単独で使用したＰＤ−１標的部位またはＴＣＲα標的部位での切断率には、実質的な影響がなかった。同じｒＡＡＶ相同性鋳型では、ＰＤ−１遺伝子座またはＴＣＲα遺伝子座のいずれでも、類似の相同組換え率が観察された。ｒＡＡＶ鋳型とともに、ＰＤ−１およびＴＣＲαメガＴＡＬで併用治療した場合、６０〜７０％の安定したＧＦＰ発現がもたらされ、ＧＦＰ発現の可変性が増加した。ＧＦＰ発現の可変性の増加は、２つの異なる遺伝子位置におけるより異種な導入遺伝子組み込みパターンを示している。数人の独立したドナーから単離したＴ細胞に対して実行した実験において、結果を確認した。
【０６３３】
実施例２
単一ＡＡＶ  ＨＤＲ  ＤＮＡドナー修復鋳型を使用した、２つの異なる遺伝子座へのＢＣＭＡ特異的キメラ抗原受容体の標的組み込み
プロモーター、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする導入遺伝子、およびポリアデニル化シグナル（配列番号２）を含有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドを設計、構築、および検証した。ＣＡＲ発現カセットは、ＣＤ８α由来シグナルペプチドを含むＣＡＲに操作可能に連結したＭＮＤプロモーターと、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を標的とする一本鎖可変断片（ｓｃＦＶ）と、ＣＤ８α由来のヒンジ領域および膜貫通ドメインと、細胞内４−１ＢＢ共刺激ドメインと、ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインとを含有した。相同アームを直列で置き、ＴＣＲα相同アームが導入遺伝子カセットのすぐ５’および３’に置かれるようにした一方で、ＰＤ−１相同体アームはＴＣＲα相同アームのすぐ５’および３’に位置した（図６Ａ）。
【０６３４】
実施例１に記載のように、初代ヒトＴ細胞をＣＤ３およびＣＤ２８で活性化した。抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするＡＡＶドナー修復鋳型を使用した、ＰＤ−１およびＴＣＲα遺伝子のメガＴＡＬ誘導性相同性指向性修復を、ＰＤ−１遺伝子のエクソン１を標的とするメガＴＡＬ、ＴＣＲα遺伝子の定常領域を標的とするメガＴＡＬ、または両方のメガＴＡＬを同時にコードするインビトロ転写ｍＲＮＡで電気穿孔した、活性化初代ヒトＴ細胞を使用して評価した。電気穿孔したＴ細胞に、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするＤＮＡドナー修復鋳型を含む組換えＡＡＶ標的化ベクターを形質導入し、ＩＬ２の存在下、３０℃で一晩培養し、その後３７℃に移行させた。電気穿孔の７日（１０日間の全培養）後にＣＡＲ染色を実行した。対照には、メガＴＡＬ治療またはＡＡＶ治療を単独で含有するＴ細胞が含まれた。ＰＥ共役ＢＣＭＡ−Ｆｃで染色することによって、抗ＢＣＭＡ−ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【０６３５】
ＰＤ−１標的化メガＴＡＬ  ｍＲＮＡ、および抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするｒＡＡＶ  ＤＮＡドナー修復鋳型で治療したＴ細胞は、全細胞の２０〜３０％においてＣＡＲ発現を示した一方で、ＴＣＲα標的化メガＴＡＬ、および抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするｒＡＡＶ  ＤＮＡドナー修復鋳型で治療した細胞は、全細胞の３０〜５０％においてＣＡＲ発現を示した。ＰＤ−１およびＴＣＲαメガＴＡＬの両方で併用治療した場合、４０〜５５％の細胞において抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ発現がもたらされた（図６Ｂ）。ＰＤ−１およびＴＣＲα標的化メガＴＡＬの両方で治療した細胞では、ＣＡＲ発現のより大きな変動が観察され、これは、２つの異なる遺伝子位置におけるより異種な導入遺伝子組み込みパターンを示している。未治療のＴ細胞と、ＡＡＶで治療したＴ細胞と、メガＴＡＬ／ｒＡＡＶ抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲで治療したＴ細胞との間では、類似のＴ細胞拡大率および類似のＴ細胞表現型が観察された。
【０６３６】
一般に、以下の特許請求の範囲において、使用される用語は、特許請求の範囲を、本明細書および特許請求の範囲に開示される特定の実施形態に限定するものと解釈されるべきではないが、そのような特許請求の範囲が権利を有する等価物の全範囲とともに全ての可能性のある実施形態を含むものと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は、本開示によっては限定されない。
【図１】
2020507342.tif 000005
【図２】
2020507342.tif 000006
【図３Ａ】
2020507342.tif 000007
【図３Ｂ】
2020507342.tif 000008
【図４】
2020507342.tif 000009
【図５】
2020507342.tif 000010
【図６Ａ】
2020507342.tif 000011
【図６Ｂ】
2020507342.tif 000012
【図７】
2020507342.tif 000013
【配列表】
2020507342000001.app
【国際調査報告】
2020507342.tif 000014
2020507342.tif 000015