(57)【要約】  本発明は、生体コンジュゲーション方法、及びそれに用いられる化合物を提供する。生体コンジュゲーション方法は、第１の不飽和官能基を含有する生体分子を、第２の不飽和官能基を含むペイロードとコンジュゲートさせる工程を含み、第１及び第２の不飽和官能基は、コンジュゲーションが、シクロヘキセン環を形成するディールス−アルダー反応を介した前記官能基同士の反応であるように、互いと相補的である。
2020521735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の不飽和官能基を含有する生体分子を、第２の不飽和官能基を含むペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む生体コンジュゲーション方法であって、前記第１の不飽和官能基及び前記第２の不飽和官能基は、コンジュゲーションが、シクロヘキセン環を形成するディールス−アルダー反応を介した前記官能基同士の反応であるように、互いと相補的である、生体コンジュゲーション方法。
【請求項２】
前記第１の官能基はジエンである、請求項１に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項３】
前記第２の官能基は、ジエノフィルであり、例えば、マレイミド、マレイン酸のエステル、フマル酸のエステル、アクリル酸のエステル、メタクリル酸、アクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチルビニルケトン、２−ブチン二酸のアミド及びエステル、キノン、アセチレンである、請求項２に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項４】
前記第２の官能基はジエンである、請求項１に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項５】
前記第１の官能基は、マレイン酸のエステル、マレイミド、フマル酸のエステル、アクリル酸のエステル、メタクリル酸、アクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチルビニルケトン、２−ブチン二酸のアミド及びエステル、キノン、アセチレンから選択されるジエノフィルである、請求項４に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項６】
前記ジエノフィルは、非天然のアミノ酸、例えばノルボルネンを含む非天然のアミノ酸内に含有される、請求項３又は５に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項７】
前記ジエンは、直鎖状ジエン、炭素環ジエン、又は複素環ジエンである、請求項２〜６のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項８】
前記ジエンは、ブタジエン、シクロペンタジエン、１，３−シクロヘキサジエン、フラン、又はアントラセンを含む、請求項７に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項９】
前記ジエンは、非天然のアミノ酸内に含有される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１０】
前記ジエンは、リシン、システイン、セレノシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、及びチロシンに由来する非天然のアミノ酸である、請求項９に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１１】
前記ジエンは、アミノ酸の側鎖内にある、請求項８又は９に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１２】
前記非天然のアミノは、式（Ｉ）を有し：
ＲＸ−Ｘ１−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−アミノ残基  （Ｉ）
式中：
ＲＸは：
ｉｖ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｖ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｖｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、最大５つの置換基（例えば、１、２、又は３つの置換基）を有してよく、例えば前記置換基は、Ｃ１〜３アルキル、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択され；
Ｘ１は
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）カルボシクリル若しくはヘテロシクリル由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和（特に、飽和）の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており、
Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）は、アミノ酸の側鎖を介して連結されている、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１３】
前記置換基は、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される、請求項１２に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１４】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩ）の構造の残基であり：
【化１】
2020521735.tif 000082
式中、
Ｘ２は、−Ｃ−、−Ｃ（Ｒ’）−、−ＣＨ２、又はＯを表し；
Ｒａは、
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）式（ＩＩ）において定義される５員環由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上（例えば、１、２、若しくは３つ）の基によって置換されており；
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｅは、Ｈ、飽和又は不飽和の、分枝状又は枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、１つ以上の炭素は、場合によっては、−Ｏ−によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、１つ以上のハロゲン原子（例えばヨード）、Ｎ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルによって置換されている、請求項１２又は１３に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１５】
Ｒａは、−ＣＨ（ＣＨ２）ＣＨ２ＣＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＣＨ２）Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、−ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−、Ｃ１〜６アルキレン（例えば−ＣＨ２ＣＨ２−）であり、ｍは、０又は１を表す、請求項１４に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１６】
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項１４又は１５に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１７】
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１８】
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項１９】
Ｒｅは、Ｈ又は−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ３を表す、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２０】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩａ）の構造の残基であり：
【化２】
2020521735.tif 000083
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上に定義されている、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２１】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｂ）の構造を有し：
【化３】
2020521735.tif 000084
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上に定義されている、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２２】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｃ）の構造を有し：
【化４】
2020521735.tif 000085
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは、上に定義されており、Ｘ２’は、−Ｃ−又は−ＣＲ’である、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２３】
前記非天然のアミノ酸は：
【化５】
2020521735.tif 000086
を含む群から選択される、請求項９〜２２のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２４】
前記ジエノフィルは、非天然のアミノ酸の側鎖である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２５】
前記方法は、前記生体分子内のアミノ酸残基にリンカーを介してジエン又はジエノフィル（特にジエン）をコンジュゲートさせるプレ工程を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸は、システイン又はリシンである、請求項２５に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２７】
前記生体分子内の前記アミノ酸残基への付加前の前記ジエンは、式（ＩＩＩ）の構造：
ＲＸ−Ｂｎ−Ｘ３ｍ−Ｙｐ−Ｚ  （ＩＩＩ）
又はその、Ｏ若しくはＮ結合糖を有する誘導体を有し、
ｎは、０又は１を表し；
ｍは、０又は１を表し；
ｐは、０又は１を表し；
ＲＸは：
ｉ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｉｉ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｉｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、最大５つの置換基（例えば、１、２、又は３つの置換基）を有してよく、例えば前記置換基は、Ｃ１〜３アルキル、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択され；
Ｂは、Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ３〜４シクロアルキルＣ１〜６アルキレン−を表し；場合によっては、糖残基（例えば、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、ラクトース、マンノース、及びフルクトース）が、Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ３〜４シクロアルキルＣ１〜６アルキレン−の任意の１つのアルキレン鎖内に含有され、Ｂについて定義された前記可変部分の任意の１つの前記アルキレン鎖は、場合によっては、Ｎ−及びＯ−結合糖残基（例えば、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、ラクトース、マンノース、及びフルクトース）から独立して選択される１つ又は２つの置換基を有し：
Ｘ３は、−（Ｒ１）ＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ−を表し；
Ｒ１は、Ｈ又は−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、−Ｎ３、Ｃ２〜５アルキニル、又はハロゲン、例えばヨードを表し；
Ｙは、−（ＯＣＨ２）ｑＣ２〜６アルキレン、又は場合によっては−ＮＲ３Ｒ４で置換されている−Ｃ２〜６アルキレンを表し、
ｑは、１〜７０００であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ又はＣ１〜３アルキルを表し；
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｒ５’、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ２〜５アルキレン、ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２、アルキン、アジド、３−アリールプロピオロニトリル、又はハロゲン、例えばヨードを表し；
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、スクシンイミド、Ｃ６Ｆ４Ｈ（テトラフルオロヘキシル）、又はＨを表し：
Ｒ５’は、硫黄架橋基、例えば、ジブロモマレイミド、ジクロロアセトン、又はそれらの任意の１つの誘導体を表し、
Ｒ６は：
【化６】
2020521735.tif 000087
を表し、
式中、
Ｒ７は、場合によっては、ヒドロキシル、スルホ、アミノ、及び−（ＯＣＨ２）ｖＣ２〜６アルキレンから選択される１つ以上（例えば、１、２、又は３つ）の基を有するＣ１〜６アルキレン、並びに、場合によっては、ヒドロキシル、スルホ、アミノ、及び−（ＯＣＨ２）ｖＣ２〜６アルキレンから選択される１つ以上（例えば、１、２、又は３つ）の基を有するフェニルであり、
ｖは、整数１、２、３、４、又は５であり、
【化７】
2020521735.tif 000088
は、フラグメントが、残りの前記分子に連結される場所を表す、請求項２５又は２６に記載の生体コンジュゲーション反応。
【請求項２８】
前記ジエンは：
【化８】
2020521735.tif 000089
の構造を有する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項２９】
前記反応は、１０〜４０℃の範囲の温度、例えば周囲温度にて実行される、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項３０】
前記反応は、水性溶媒、例えば水性有機溶媒系、バッファ、例えば、場合によっては、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯ、若しくは界面活性剤、例えばポリソルベート８０を含むＰＢＳ、又はそれらの組合せ中で実行される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項３１】
前記生体分子はポリペプチドである、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、リガンド、受容体、抗体分子を含む群から選択される、請求項３１に記載の生体コンジュゲーション反応。
【請求項３３】
前記生体分子は治療分子である、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション方法。
【請求項３４】
前記生体分子は、１つ以上のリジン残基を、元の、又は天然の配列から除去するように操作されている、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション反応。
【請求項３５】
前記ペイロードは：
ａ．例えば、チューブリシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、ドキソルビシン、チューブリシン、及びデュオカルマイシンを含む群から選択される、オーリスタチン；
ｂ．マイタンシノイド、例えば、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、及びＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）、
ｃ．毒物、
ｄ．ポリマー、例えば天然のポリマー、例えば、デンプン、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リシン）、若しくはアルブミン、又は合成ポリマー、例えばＰＥＧ
から選択される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の生体コンジュゲーション反応。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法から得られた、又は入手可能な、ペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項３７】
ペイロードにコンジュゲートした生体分子であって、前記生体分子を前記ペイロードに連結するコンジュゲーション反応は、ジエンとジエノフィル間のディールス−アルダー反応を介して、シクロヘキセン環を形成する、ペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項３８】
前記シクロヘキセン環は、例えば最大２０個の原子を含む、縮合環系の一部である、請求項３７に記載のペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項３９】
式（ＩＶａ）の、請求項３８に記載のペイロードにコンジュゲートした生体分子であって：
【化９】
2020521735.tif 000090
式中、
ＲＹは、前記ペイロードを表し；
ＲＺは、前記生体分子を表す、
ペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項４０】
式（ＩＶｂ）の、請求項３８に記載のペイロードにコンジュゲートした生体分子であって：
【化１０】
2020521735.tif 000091
式中、
ＲＹは、前記ペイロードを表し；
ＲＺは、前記生体分子を表し；
Ｘ４は、−Ｏ−又は−ＣＨ２−を表す、
ペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項４１】
前記生体分子は、抗体、又はその結合フラグメントである、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載のペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項４２】
前記ペイロードは：
ａ．例えば、チューブリシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、ドキソルビシン、及びデュオカルマイシンを含む群から選択される、オーリスタチン；
ｂ．マイタンシノイド、例えばＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、及びＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）、
ｃ．毒物、
ｄ．ポリマー、例えば天然ポリマー、例えば、デンプン、ポリ（グルタミン酸）、若しくはアルブミン、又は合成ポリマー、例えばＰＥＧ
から選択される、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載のペイロードにコンジュゲートした生体分子。
【請求項４３】
請求項３６〜４２のいずれか一項に規定のペイロードにコンジュゲートした生体分子、並びに希釈剤、キャリア、及び／又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項４４】
前記組成物は、非経口製剤である、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
治療的に有効な量の、請求項３６〜４２のいずれか一項に規定のペイロードにコンジュゲートした生体分子、又は請求項４３若しくは４４に規定の医薬組成物を投与することを含む、患者を処置する方法。
【請求項４６】
処置に用いるための、請求項３６〜４２のいずれか一項に規定のペイロードにコンジュゲートした生体分子、及び希釈剤、又は請求項４３若しくは４４に規定の医薬組成物。
【請求項４７】
医薬の製造のための、請求項３６〜４２のいずれか一項に規定のペイロードにコンジュゲートした生体分子、及び希釈剤、又は請求項４３若しくは４４に規定の医薬組成物の使用。
【請求項４８】
ジエン又はジエノフィルを含む非天然のアミノ酸。
【請求項４９】
前記ジエン又は前記ジエノフィルは、側鎖内にある、非天然のアミノ酸。
【請求項５０】
リシンアスパラギン、グルタミン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸に由来する、請求項４８又は４９に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５１】
式（Ｉ）を有し：
ＲＸ−Ｘ１−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−アミノ残基  （Ｉ）
式中：
ＲＸは：
ｉｖ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｖ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｖｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、最大５つの置換基（例えば、１、２、又は３つの置換基）を有してよく、例えば置換基は、Ｃ１〜３アルキル、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択され；
Ｘ１は
ｉｉｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｖ）カルボシクリル若しくはヘテロシクリル由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和（特に、飽和）の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており、
−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−は、アミノ酸の側鎖を介して連結されている、
請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５２】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩ）：
【化１１】
2020521735.tif 000092
又はその塩を有し、式中、
Ｘ２は、−Ｃ−、−ＣＨ２、又はＯを表し；
Ｒａは、
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）５員環由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）ｐから選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｅは、Ｈ、飽和又は不飽和の、分枝状又は枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、１つ以上の炭素は、場合によっては、−Ｏ−によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、１つ以上のハロゲン原子（例えばヨード）、Ｎ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルによって置換されている、
請求項５１に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５３】
Ｒａは、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣ（Ｏ）−であり、ｍは、０又は１を表す、請求項５２に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５４】
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項５２又は５３に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５５】
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項５２又は５３に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５６】
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５７】
Ｒｅは、Ｈ又は−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ３を表す、請求項５２〜５６のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５８】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩａ）：
【化１２】
2020521735.tif 000093
又はその塩の構造の残基であり、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上の式（ＩＩ）の化合物で定義されている、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項５９】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｂ）：
【化１３】
2020521735.tif 000094
又はその塩の構造を有し、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上の式（ＩＩ）の化合物で定義されている、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項６０】
前記非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｃ）：
【化１４】
2020521735.tif 000095
又はその塩の構造を有し、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは、上に定義されており、Ｘ２’は、−Ｃ−、又は上に定義される−ＣＲ’である、請求項５２〜５８のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項６１】
前記非天然のアミノ酸は：
【化１５】
2020521735.tif 000096
又はそれらの任意の１つの塩を含む群から選択される、請求項６０に記載の非天然のアミノ酸。
【請求項６２】
請求項５１〜６１のいずれか一項に記載の非天然のアミノ酸を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生体分子をペイロードにコンジュゲートさせる方法、前記方法によって形成される分子、これを含む組成物、方法への使用に特に適した特定の新規のアミノ酸構造、並びに処置、特に癌が挙げられる炎症応答の処置への生体分子及び組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマー又は毒物に連結されるタンパク質／ポリペプチド構成要素を含む医薬品がいくつか登録されている。多くの場合、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。そしてそれは、システインアミノ酸残基又はリシンアミノ酸残基（特にリシン残基の側鎖）を、マレイミド基又はＮＨＳ−エステル基とそれぞれ反応させることによって、ポリペプチドにコンジュゲートする。他の治療用化合物、例えば抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が、同じように調製され、毒物／薬物は、抗体への付着用の反応性マレイミド又は他の適切な官能基を有する。そのような反応の実施例が、以下で一般的に示される：
【化１】
2020521735.tif 000003
【０００３】
ポリペプチド中の天然のアミノ酸残基を使用することで、種の混合物を含有するコンジュゲーション生成物が生じ得る。さらに、コンジュゲーション反応用の標的アミノ酸残基が、タンパク質の折畳み内にある、又は例えば溶媒アクセス不能であるならば、コンジュゲーション反応を完了させるのに厳しい条件が必要とされる場合がある。しかしながら、生体分子の存在下ではマイルドな条件を使用することが通常所望される。なぜなら、分子の活性が、厳しい条件によって損なわれるおそれがあるからである。
【０００４】
生体分子内の天然の残基への連結のための基本的なコンジュゲーション反応は、ここ５〜１０年、ほとんど変わっておらず、以下で示されるような反応例がある。しかしながら、これらの反応は、ますます重要になっている。というのも、第２世代のバイオ製品、例えば抗体薬物コンジュゲートがおそらく、疾患、例えば癌の処置に大いに寄与するからである。化学、例えばいわゆるクリックケミストリが、例えば、アジド−アルキン付加環化反応、歪んだ（ｓｔｒａｉｎｅｄ）アジド−アルキン付加環化、アルキン−ニトロン付加、アルケン及びアジドの反応［３プラス２付加環化］、アルケン及びテトラジン逆需要ディールス−アルダー反応、又はアルケン及びテトラゾール［Ｈｕｓｉｇｅｎ］反応を使用して、非天然の官能基との生体コンジュゲーションに用いられてよい。
【０００５】
これらの反応に必要とされる非天然の官能基は、天然のリシン、システイン、若しくはチロシンの化学修飾によって、又は非天然のアミノ酸をタンパク質構造中に組み込んだタンパク質を発現することによって、タンパク質上に取り付けられ得る。そのような化学の実施例が、以下に示される：
【化２】
2020521735.tif 000004
【０００６】
上記にて示されるコンジュゲーション化学の多くが、生体コンジュゲートを調製するのに利用可能な可能性を広げてきた一方、その治療用分子を調製するための用途は、以下の理由で制限される場合がある；長い反応時間、タンパク質官能基を酸化させ得る触媒の必要性、タンパク質の特性、例えば凝集する傾向に影響を及ぼす疎水性反応パートナー、爆発性の中間体（すなわちアジド化合物）に関する潜在的な安全性の懸念（２〜３の問題が挙げられる）。
【０００７】
さらに、上に示される化学を使用して、非天然のタンパク質官能基への連結を介してＡＤＣを生成するには、適切な、優れた（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）反応基を含有する毒物／薬物の開発が必要とされ、これが、薬物開発を複雑にし得る。というのも、一部の反応基が、特定のペイロードと適合しない場合があり、且つ／又はペイロード特性、例えば疎水性及び溶解度に影響を及ぼす場合があるからである。現在、システインチオールへのコンジュゲーション用のマレイミド基を含む多くのＡＤＣペイロードが開発されている。生体分子を、例えば、現在利用可能であり（例えばマレイミド）、且つ広範囲の所望のペイロードと適合することが知られている官能基を利用するポリマー又はペイロード等の別の実体にコンジュゲートさせる代替方法があれば、有用であろう。又、以下の特性、特異的な、速い、マイルド又は穏やかな条件の使用、そして溶媒曝露されないアミノ酸残基と反応する能力の１つ以上を有するコンジュゲーション反応があれば、有用であろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ゆえに、一態様において、提供されるのは、第１の不飽和官能基を含有する生体分子を、第２の不飽和官能基を含むペイロードとコンジュゲートさせる工程を含む生体コンジュゲーション方法であって、第１及び第２の不飽和官能基は、コンジュゲーションが、シクロヘキセン環を形成するディールス−アルダー反応を介した前記官能基同士の反応であるように、互いと相補的である、方法である。
【０００９】
本明細書中で使用されるディールス−アルダー反応は、縮合環系の一部であってよいシクロヘキセン環を形成する４プラス２付加環化反応を指す。反応の包括的な例が、以下に示される：
【化３】
2020521735.tif 000005
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、この反応が、生体分子を含む特定のコンジュゲーション反応におけるマイルドな条件下で使用され得ることを確立した。一部の例において、当該反応は、室温にて僅か２時間しかかからない。他の例において、生体コンジュゲーション反応は、ペイロード、タンパク質、及び溶媒以外の追加の試薬の必要なく、一工程で起こり得る。
【００１１】
さらに、効率的なディールス−アルダー変換に所望される、反応性架橋剤、及びジエン官能基を含む非天然のアミノ酸が、合成的に入手可能（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）であり、そして単純且つ簡単な経路で、高収率で生成され得る。
【００１２】
ジエン又はジエノフィルは、リンカーの付加を介して、又は非天然のアミノ酸をポリペプチド配列中に組み込むことによって、生体分子中に組み込まれ得る。次に、必要な相補的な官能基が、ペイロード中に組み込まれ得る。
【００１３】
以下は、アミノ酸内にジエンを含む非天然のアミノ酸へのペイロードのコンジュゲーションの略図である：
【化４】
2020521735.tif 000006
【００１４】
好都合にも、コンジュゲーション反応の生成物は、生物学的環境において、体温にて安定している。しかしながら、所望される場合、反応は、コンジュゲーション生成物を高温、例えば６０℃以上に曝すことによって、取り消され（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）得る。
【００１５】
一実施形態において、第１の官能基（すなわち、生体分子内）は、ジエンである。
【００１６】
一実施形態において、第２の官能基（すなわち、ペイロード内）は、ジエノフィルであり、例えば、マレイミド、マレイン酸のエステル、フマル酸のエステル、アクリル酸のエステル、メタクリル酸、アクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピリジン、２−ブチン二酸（ｂｕｔ−２−ｙｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄ）のアミド及びエステル、キノン、アセチレンから選択される。
【００１７】
一実施形態において、第２の官能基は、ジエンである。
【００１８】
一実施形態において、第１の官能基（すなわち、生体分子内）は、ジエノフィル、例えば、マレイン酸のエステル、マレイミド、フマル酸のエステル、アクリル酸のエステル、メタクリル酸、アクリロニトリル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メチルビニルケトン、ビニルピリジン、２−ブチン二酸のアミド及びエステル、キノン、アセチレンである。
【００１９】
一実施形態において、第１の官能基は、非天然のアミノ酸、例えばノルボルネンを含む非天然のアミノ酸内のジエノフィルである。
【００２０】
一実施形態において、ジエンは、直鎖状ジエン、炭素環ジエン、又は複素環ジエンであり、例えば、ジエンは、ブタジエン、シクロペンタジエン、１，３−シクロヘキサジエン、フラン、又はアントラセンを含む。
【００２１】
一実施形態において、ジエンは、非天然のアミノ酸、例えば、リシン、システイン、セレノシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グリシン、及びチロシンに由来する非天然のアミノ酸内に含有される。
【００２２】
一実施形態において、ジエンは、アミノ酸の側鎖内にある。
【００２３】
一実施形態において、非天然のアミノは、式（Ｉ）を有し：
ＲＸ−Ｘ１−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−アミノ酸残基  （Ｉ）
式中：
ＲＸは：
ｉ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｉｉ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｉｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、最大５つの置換基（例えば、１、２、又は３つの置換基）を有してよく、例えば置換基は、Ｃ１〜３アルキル、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択され；
Ｘ１は
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）カルボシクリル若しくはヘテロシクリル由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和（特に、飽和）の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、若しくは−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており、
−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−は、アミノ酸の側鎖を介して連結されている。
【００２４】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩ）の構造の残基であり：
【化５】
2020521735.tif 000007
式中、
Ｘ２は、−Ｃ−、−Ｃ（Ｒ’）−、−ＣＨ２、又はＯを表し；
Ｒ’は、Ｈ又はＣ１〜３アルキルを表し、
Ｒａは、
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）５員環由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和（特に、飽和）の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｅは、Ｈ、飽和又は不飽和（特に、飽和）の、分枝状又は枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、１つ以上の炭素は、場合によっては、−Ｏ−によって置換されており、鎖は、場合によっては、１つ以上のハロゲン原子（例えばヨード）、Ｎ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルによって置換されている。
【００２５】
一実施形態において、Ｒａは、−（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）−、−ＣＨ２（ＣＨ３）Ｃ（Ｏ）−、−（ＣＨ２）ｍＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、−ＣＨＣＨＣＨ２ＯＣ（Ｏ）−、又は−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯＣ（Ｏ）−であり、ｍは、０又は１を表す。
【００２６】
一実施形態において、Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである。
【００２７】
一実施形態において、Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである。
【００２８】
一実施形態において、Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２Ｎ３、又は−ＣＣＨである。
【００２９】
一実施形態において、Ｒｅは、Ｈ又は−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｎ３を表す。
【００３０】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩａ）の構造の残基であり：
【化６】
2020521735.tif 000008
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上に定義される。
【００３１】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｂ）の構造を有し：
【化７】
2020521735.tif 000009
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、上に定義される。
【００３２】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｃ）の構造を有し：
【化８】
2020521735.tif 000010
式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅは、上に定義されており、Ｘ２’は、上にて定義される−Ｃ−、又は−ＣＲ’である。
【００３３】
通常、化合物、例えば式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、及び（ＩＩｃ）は、多くともたった１つのアジド基を含有することとなる。
【００３４】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、以下を含む群から選択される：
【化９】
2020521735.tif 000011
【００３５】
一実施形態において、当該方法は、例えばアミノ酸がシステイン又はリシンである場合、生体分子内のアミノ酸残基にリンカーを介してジエン又はジエノフィル（特にジエン）をコンジュゲートさせるプレ工程を含む。
【００３６】
一実施形態において、生体分子内の前記アミノ酸残基への付加前のジエンは、式（ＩＩＩ）の構造を有し：
式中、
ＲＸ−Ｂｎ−Ｘ３ｍ−Ｙｐ−Ｚ  （ＩＩＩ）
ｎは、０又は１を表し；
ｍは、０又は１を表し；
ｐは、０又は１を表し；
ＲＸは：
ｉ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｉｉ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｉｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、最大５つの置換基（例えば、１、２、又は３つの置換基）を有してよく、例えば置換基は、Ｃ１〜３アルキル、オキソ、ハロゲン、スルホ、スルフヒドリル、アミノ、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルから独立して選択され；
Ｂは、Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ３〜４シクロアルキルＣ１〜６アルキレン−を表し；場合によっては、糖残基（例えば、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、ラクトース、マンノース、及びフルクトース）が、Ｃ１〜６アルキレン、−Ｃ３〜４シクロアルキルＣ１〜６アルキレン−の任意の１つのアルキレン鎖内に含有され、Ｂについて定義された前記可変部分（ｖａｒｉａｂｌｅ）の任意の１つのアルキレン鎖は、場合によっては、Ｎ−及びＯ−結合糖残基（例えば、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、ラクトース、マンノース、及びフルクトース）から独立して選択される１つ又は２つの置換基を有し：
Ｘ３は、−（Ｒ１）ＮＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ−を表し；
Ｒ１は、Ｈ又は−ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２Ｒ２を表し；
Ｒ２は、−Ｎ３、Ｃ２〜５アルキニル、又はハロゲン、例えばヨードを表し；
Ｙは、−（ＯＣＨ２）ｑＣ２〜６アルキレン、又は場合によっては−ＮＲ３Ｒ４で置換されている−Ｃ２〜６アルキレンを表し、
ｑは、１〜７０００であり；
Ｒ３及びＲ４は、独立して、Ｈ又はＣ１〜３アルキルを表し；
Ｚは、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ５、Ｒ５’、−ＮＣ（Ｏ）Ｒ６、−Ｃ２〜５アルキレン、ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２、アルキン、アジド、３−アリールプロピオロニトリル（３−ａｒｙｌｐｒｏｐｉｏｌｏｎｉｔｒｉｌｅ）、又はハロゲン、例えばヨードを表し；
Ｒ５は、Ｃ１〜６アルキル、スクシンイミド、Ｃ６Ｆ４Ｈ（テトラフルオロヘキシル）、又はＨを表し：
Ｒ５’は、硫黄架橋基、例えば、ジブロモマレイミド、ジクロロアセトン、又はそれらの任意の１つの誘導体を表し、
Ｒ６は、以下を表し：
【化１０】
2020521735.tif 000012
式中、
Ｒ７は、場合によっては、ヒドロキシル、スルホ、アミノ、及び−（ＯＣＨ２）ｖＣ２〜６アルキレンから選択される１つ以上（例えば、１、２、又は３つ）の基を有するＣ１〜６アルキレン、並びに、場合によっては、ヒドロキシル、スルホ、アミノ、及び−（ＯＣＨ２）ｖＣ２〜６アルキレンから選択される１つ以上（例えば、１、２、又は３つ）の基を有するフェニルであり、
ｖは、整数１、２、３、４、又は５であり、
【化１１】
2020521735.tif 000013
は、フラグメントが残りの分子に連結される場所を表す。
【００３７】
一実施形態において、ジエンは、以下の構造を有する：
【化１２】
2020521735.tif 000014
【００３８】
一実施形態において、反応は、１０〜４０℃の範囲の温度、例えば周囲温度にて実行される。
【００３９】
一実施形態において、反応は、水性溶媒、例えば水性有機溶媒系、バッファ、例えば、場合によっては、極性非プロトン性溶媒、例えばＤＭＳＯ、若しくは界面活性剤、例えばポリソルベート８０を含むＰＢＳ、又はそれらの組合せ中で実行される。
【００４０】
一実施形態において、治療用生体分子は、ポリペプチドであり、例えば、リガンド、受容体、抗体分子を含む群から選択される。
【００４１】
一実施形態において、生体分子は、１つ以上のリジン残基を加え、又は元の、若しくは天然の配列から除去するように操作される。
【００４２】
一実施形態において、生体分子は、１つ以上のシステイン残基を加え、又は元の、若しくは天然の配列から除去するように操作される。
【００４３】
一実施形態において、生体分子は、１つ以上のチロシン残基を加え、又は元の、若しくは天然の配列から除去するように操作される。
【００４４】
一実施形態において、生体分子は、１つ以上の天然又は非天然のアミノ酸残基を、元の、又は天然の配列に加えるように操作される。
【００４５】
一実施形態において、生体分子は、治療用分子である。
【００４６】
一実施形態において、ペイロードは：
ａ．例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、ドキソルビシン、チューブリシン、及びデュオカルマイシンを含む群から選択される、オーリスタチン；
ｂ．マイタンシノイド、例えば、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、及びＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）、
ｃ．ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）又はイミノベンゾジアゼピン（ＩＢＤ）、
ｄ．トポイソメラーゼ阻害剤、例えば、ＳＮ−３８、イリノテカン、エキサテカン、又はＤｘＤ１、
ｅ．毒物、並びに
ｆ．ポリマー、例えば天然のポリマー、例えば、デンプン、ポリ（グルタミン酸）、ポリ（アスパラギン酸）、ポリ（リシン）、若しくはアルブミン、又は合成ポリマー、例えばＰＥＧ
から選択される。
【００４７】
さらに独立した態様において、提供されるのは、本開示に従う方法から得られた、又は入手可能な、ペイロードにコンジュゲートした生体分子である。
【００４８】
独立した一態様において、提供されるのは又、ジエンとジエノフィル間のディールス−アルダー反応を介してペイロードにコンジュゲートされて、シクロヘキセン環を形成した生体分子である。
【００４９】
一実施形態において、シクロヘキセン環は、例えば最大２０個の原子を含む、縮合環系の一部である。
【００５０】
一実施形態において、縮合環系は、式（ＩＶａ）を有し：
【化１３】
2020521735.tif 000015
式中、
ＲＹは、例えば本明細書中で定義される、ペイロードを表し；
ＲＺは、例えば本明細書中で定義される、生体分子を表し、又は
式（ＩＶｂ）を有し：
【化１４】
2020521735.tif 000016
式中、
ＲＹは、例えば本明細書中で定義される、ペイロードを表し；
ＲＺは、例えば本明細書中で定義される、生体分子を表し；
Ｘ４は、−Ｏ−若しくは−ＣＨ２−を表す。
【００５１】
一実施形態において、生体分子は、抗体、又はその結合フラグメントである。
【００５２】
又、提供されるのは、本開示に従うペイロードにコンジュゲートした生体分子であり、ペイロードは：
ａ．例えば、チューブリシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）ＭＭＡＥ（モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルオーリスタチンＦ）、ドキソルビシン、及びデュオカルマイシンを含む群から選択される、オーリスタチン；
ｂ．マイタンシノイド、例えばＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−マイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ  ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ３）、及びＮ  ２’−デアセチル−Ｎ  ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−マイタンシン（ＤＭ４）、
ｃ．毒物、
ｄ．ポリマー、例えば天然ポリマー、例えば、デンプン、ポリ（グルタミン酸）、若しくはアルブミン、又は合成ポリマー、例えばＰＥＧ
から選択される。
【００５３】
又、提供されるのは、例えば組成物が非経口製剤である場合、本開示に従うペイロードにコンジュゲートした生体分子、並びに希釈剤、キャリア、及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である。
【００５４】
本開示はさらに、本明細書中で開示される、治療的に有効な量の、ペイロードにコンジュゲートした生体分子、又は医薬組成物を投与することを含む、患者を処置する方法を提供する。
【００５５】
ゆえに、提供されるのは、処置に用いるための、本明細書中で開示される、ペイロードにコンジュゲートした生体分子、又は医薬組成物である。
【００５６】
医薬の製造のための、本明細書中で開示される、ペイロードにコンジュゲートした生体分子、又は医薬組成物の使用が、本発明の更なる態様である。
【００５７】
独立した態様において、提供されるのは、ジエン又はジエノフィルを含む非天然のアミノ酸であり、例えば、ジエン又はジエノフィルは、側鎖内にある。
【００５８】
一実施形態において、本開示の非天然のアミノ酸は、リシンアスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、グリシン、及びチロシンに由来する。
【００５９】
一実施形態において、本開示に従う非天然のアミノ酸は、式（Ｉ）を有し：
ＲＸ−Ｘ１−Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）−アミノ酸残基  （Ｉ）
式中：
ＲＸは：
ｉ）Ｃ４〜９直鎖状共役ジエンと、
ｉｉ）共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルと、
ｉｉｉ）Ｏ、Ｎ、及びＳから選択される１、２、又は３つのヘテロ原子、並びに共役ジエンを含む５〜１４員のヘテロシクリルと
から選択される不飽和基を表し、
ｉ）、ｉｉ）、及びｉｉｉ）は、１、２、又は３つの置換基を有してよく；
Ｘ１は、Ｃ１〜５アルキルを表し、
Ｏ０〜１Ｃ（Ｏ）は、アミノ酸の側鎖を介して連結される。
【００６０】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩ）：
【化１５】
2020521735.tif 000017
又はその塩を有し、式中、
Ｘ２は、−Ｃ−、ＣＲ’、−ＣＨ２、又はＯを表し；
Ｒａは、
ｉ）飽和若しくは不飽和の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；又は
ｉｉ）５員環由来の炭素と一緒に、飽和若しくは不飽和（例えば、飽和）の、分枝状若しくは枝状に分かれていないＣ１〜６アルキレン鎖に連結されたシクロプロパン環を表し、少なくとも１つの炭素（例えば、１、２、若しくは３つの炭素）は、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲン、アミノから独立して選択される１つ以上の基によって置換されており；
Ｒｂは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｃは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｄは、Ｈ、−ＯＣ１〜３アルキル、場合によってはヒドロキシル置換基を有するＣ１〜６アルキル、−Ｃ１〜３アルキレンＮ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルを表し；
Ｒｅは、Ｈ、飽和又は不飽和の、分枝状又は枝状に分かれていないＣ１〜８アルキレン鎖を表し、１つ以上の炭素は、場合によっては、−Ｏ−によって置換されており、鎖は、場合によっては、１つ以上のハロゲン原子（例えばヨード）、Ｎ３、又は−Ｃ２〜５アルキニルによって置換されている。
【００６１】
一実施形態において、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、及びＲｅは、本明細書中で定義される通りである。
【００６２】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩａ）：
【化１６】
2020521735.tif 000018
又はその塩の構造の残基であり、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、式（ＩＩ）の化合物で先に定義される。
【００６３】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｂ）：
【化１７】
2020521735.tif 000019
又はその塩の構造を有し、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、式（ＩＩ）の化合物で先に定義される。
【００６４】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、式（ＩＩｃ）：
【化１８】
2020521735.tif 000020
又はその塩の構造を有し、式中、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄ、Ｒｅ、及びＸ２は、式（ＩＩ）の化合物で先に定義される。
【００６５】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、以下を含む群から選択される：
【化１９】
2020521735.tif 000021
又はそれらの任意の１つの塩。
【００６６】
又、提供されるのは、本開示に従う非天然のアミノ酸を含むポリペプチドである。
【００６７】
一実施形態において、生体コンジュゲーション反応は、ゲル又は粒子に生体分子をコンジュゲートさせない。
【００６８】
独立した一態様において、提供されるのは、第１の不飽和官能基を含有する生体分子を、第２の不飽和官能基を含む実体とコンジュゲートさせる工程を含む生体コンジュゲーション方法であって、第１及び第２の不飽和官能基は、相補的な連結の一方の官能基がジエンであり、相補的な連結の他方の官能基がジエノフィルであり、且つコンジュゲーションが、シクロヘキセン環を形成する、ディールス−アルダー反応を介した前記官能基同士の反応であるように、互いと相補的な連結であるが、ジエンが非置換フランでないことを条件とする、方法である。
【００６９】
独立した一態様において、提供されるのは、非天然のアミノ酸内に第１の不飽和官能基を含有する生体分子を、第２の不飽和官能基を含む実体とコンジュゲートさせる工程を含む生体コンジュゲーション方法であって、第１及び第２の不飽和官能基は、相補的な連結の一方の官能基がジエンであり、相補的な連結の他方の官能基がジエノフィルであり、且つコンジュゲーションが、シクロヘキセン環を形成する、ディールス−アルダー反応を介した前記官能基同士の反応であるように、互いと相補的な連結である、方法である。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１．１】フラン−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析を示す。
【図１．２】ＭＭＡＥとの２０時間の反応後のｍＡｂ−フラン−リンカーサンプルの還元（ｒｅｄｕｃｅｄ）脱グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図１．３】ｍＡｂ−フラン−リンカーａｌｌｏｃリシン反応生成物の還元脱グリコシル化質量分析を示す。
【図２．１】実施例２に記載するシクロペンタジエン架橋剤（Ａ）及びシクロペンタジエンＮＮＡＡ（Ｂ）の一般的な設計。
【図３．１】ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析を示す。
【図３．２】重ｍＡｂ鎖及び軽ｍＡｂ鎖の双方を示すためにズームしたｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーマレイミドＭＭＡＥ反応生成物の還元グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図３．３】ｍＡｂ重鎖領域を示すためにズームインしたｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーマレイミドＭＭＡＥ反応生成物の還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図３．４】ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーａｌｌｏｃリシン反応生成物の還元脱グリコシル化質量分析を示し、コンジュゲーションが起こらなかったことを示している。
【図４．１】ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析を示す。
【図４．２】１５分及び２．５時間での、未修飾ｍＡｂ、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（図中でｍＡｂ−ＣＰ１として表す）及びＡＭ−ＭＭＡＥ−反応ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（図中でｍＡｂ−ＣＰ１  ＡＭ−ＭＭＡＥとして表す）の還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図４．３】マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応。未反応ＣＰ１ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。
【図５．１】ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析を示す。
【図５．２】５分及び１５０分での、未修飾ｍＡｂ、ＣＰ−１修飾ｍＡｂ、及びＰＭ−ＭＭＡＥ反応ＣＰ１−ｍＡｂ−リンカーの還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図５．３】マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応を示す。Ａ）経時的な未反応ＣＰ１ジエンのモル濃度。ｍＡｂあたりの未反応ＣＰ１ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。Ｂ）反応速度を算出するのに用いた逆濃度プロット。
【図６．１】突然変異ＴＲＳ又はｗｔ  ＴＲＳを含む哺乳類細胞内での発現後の１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの力価を示す。培地中のＣＰ１−ＮＮＡＡの最終濃度及びフィード時間は、ｘ軸上に示すように変動した。
【図６．２】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析を示す。Ａ）ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示す質量範囲。Ｂ）ｍＡｂ重鎖のみを示すズームしたスペクトル。
【図６．３】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析を示し、単量体生成物が得られたことを示している。高分子量固体（ＨＭＷＳ）を示している。
【図６．４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの分析を示す。
【図６．５】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元脱グリコシル化質量分析を示す。
【図６．６】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析を示す。
【図６．７】１：１の比率として存在するＣＰ１−ＮＮＡＡ及び化合物異性体の化学構造を示す。
【図６．８】文献に記載されるＣＰ１−ＮＮＡＡのフラン類似体である化合物５０の化学構造を示す。この化合物を、１２Ｇ３Ｈ１１  ｍＡｂによる発現研究用の対照として用いた。
【図６．９】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元脱グリコシル化質量分析を示す。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物、Ｃ）ＰＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖及び軽鎖の双方を示している。
【図６．１０】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析を示す。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖及び軽鎖の双方、そして又高分子量種を示している。
【図７．１】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのラット血清安定性を示す。ＡＤＣを、ラット血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。
【図７．２】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＰＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのラット血清安定性を示す。ＡＤＣを、ラット血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、リンカー切断が、フェニルアセトアミド基にて観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【図７．３】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのマウス血清安定性を示す。ＡＤＣを、マウス血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、ほぼ完全なリンカー切断が、ｖａｌ−ｃｉｔジペプチドにて観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【図７．４】１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＰＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのマウス血清安定性を示す。ＡＤＣを、マウス血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、ほぼ完全なリンカー切断が観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【図７．５】ＭＭＡＥペイロードの化学構造及びその分子量を示す。
【図７．６】マウス血清中でのＡＤＣのインキュベーション後に観察された主たる切断生成物の化学構造を示す。Ａ）及びＢ）はそれぞれ、ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲート及びＰＭ−ＭＭＡＥコンジュゲートについて、抗体上に残っている種を示す（ＣＰ１−マレイミド結合は不図示）。Ｃ）は、ｖａｌ−ｃｉｔジペプチド切断後に遊離した種を示す。
【図７．７】ラット血清インキュベーション後のＰＭ−ＭＭＡＥ切断生成物の化学構造を示す。Ａ）抗体上に残っている種、及びＢ）遊離した種。
【図８．１】実施例８に記載するスピロシクロペンタジエン架橋剤（Ａ）及びスピロシクロペンタジエンＮＮＡＡ（Ｂ）の一般的な設計。
【図９．１】ＣＰ２−ＮＨＳとの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量スペクトルを示す。（Ｂ）におけるピーク下の数字は、ｍＡｂ中に導入されたＣＰ２−リンカー基の数を示す。ピーク強度によるＣＰ２−リンカー導入の推定は、１ｍＡｂあたり３．２９  ＣＰ２−リンカーを与える。
【図９．２】ＡＭ−ＭＭＡＥ及びＰＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの還元脱グリコシル化質量分析を示す。スペクトルにズームして、重鎖及び軽鎖の双方を示している。
【図９．３】ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーマレイミドＭＭＡＥ反応生成物の還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。スペクトルにズームして、抗体重鎖を示す。
【図１０．１】４時間及び４８時間でのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー及びＡＭ−ＭＭＡＥ−反応ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。スペクトルにズームインして、重鎖のみを示している。
【図１０．２】４時間及び４８時間でのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー及びＰＭ−ＭＭＡＥ反応ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの還元脱グリコシル化質量スペクトルを示す。スペクトルにズームインして、重鎖のみを示している。
【図１０．３】マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの反応を示す。Ａ）経時的な未反応ＣＰ２ジエンのモル濃度。１ｍＡｂあたりの未反応ＣＰ２ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。Ｂ）反応速度を算出するのに用いた逆濃度プロット。
【図１１．１】突然変異ｔＲＳ又は野生型ｔＲＳを含む哺乳類細胞内での発現後の１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの力価及び細胞生存度を示す。
【図１１．２】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの脱グリコシル化質量スペクトルを示す。
【図１１．３】１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの脱グリコシル化質量分析を示す。
【図１１．４】１Ｃ１野生型ｍＡｂの脱グリコシル化質量分析を示す。
【図１１．５】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析を示し、単量体生成物が得られたことを示している。
【図１１．６】１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析を示し、単量体生成物が得られたことを示している。
【図１１．７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１Ｃ１−Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及び１Ｃ１−Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの分析を示す。
【図１２．１】ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及び２３９Ｃ−ｍＡｂ  ＡＤＣの生成についての一般的なスキームを示す。
【図１２．２】ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ分子及びｍＡｂ−システイン分子の還元グリコシル化質量分析を示す。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ重鎖を示している。
【図１２．３】ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ及びｍＡｂ−システイン分子の還元グリコシル化質量分析を示す。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ軽鎖を示している。
【図１２．４】ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィ分析を示す。
【図１２．５】ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの還元逆相高性能クロマトグラフィ分析を示す。
【図１２．６】ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１２．７】ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーションの前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣの還元脱グリコシル化質量分析を示す。質量スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）のみを示している。
【図１２．８】ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーションの前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ  ＤＡＲの定量化を示す。ＤＡＲを、図１２．７に示す質量スペクトルのピーク高さから算出した。値を、平均±標準偏差（ｎ＝３）として報告している。
【図１２．９】ＰＣ３癌細胞に向けたｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣのインビトロでの細胞毒性を示す。
【図１３．１】Ａ）ＣＰ１−ＮＨＳリンカー、及びＢ）ＣＰ１ｂ−ＮＨＳリンカー内のエステル位置を示す。
【図１４．１】ｍＡｂ−ＣＰ１ｂコンジュゲートの質量分析を示す。ピーク上の数字は、ｍＡｂにコンジュゲートしたリンカー（Ｂ及びＥ）又はＡＭ−ＭＭＡＥ（Ｃ及びＦ）の数を示す。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化した。
【図１４．２】ｍＡｂ−Ｆ２コンジュゲートの質量分析を示す。ピーク上の数字は、ｍＡｂにコンジュゲートしたリンカー（Ｂ及びＥ）又はＡＭ−ＭＭＡＥ（Ｃ及びＦ）の数を示す。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化した。
【図１４．３】ｍＡｂ−システインコンジュゲートの質量分析を示す。ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）（Ａ〜Ｄ）、並びにコンジュゲートしたＭＭＡＥの数（Ｂ及びＤ）を示している。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化して、還元した。
【図１４．４】ｍＡｂ、ｍＡｂ−リンカーコンジュゲート、及びＡＤＣのｒＲＰ−ＨＰＬＣ分析を示す。ｍＡｂの軽鎖及び重鎖を示しており、ｍＡｂにコンジュゲートしたＭＭＡＥの数も又、ＡＤＣサンプルについて示している。
【図１４．５】ｍＡｂ、ｍＡｂ−リンカーコンジュゲート、及びＡＤＣのＳＥＣ分析を示す。高分子量種（ＨＭＷＳ）を示している。
【図１４．６】７日間のラット血清中でのインキュベーション後のＡＤＣ上での薬物保持を示す。
【図１４．７】受容体−陽性のＡ）ＮＣＩ−Ｎ８７細胞及びＢ）ＳＫＢＲ３細胞に向けたＡＤＣのインビトロ活性を示す。
【図１４．８】マウスの皮下Ｎ８７異種移植腫瘍モデルに向けたハーセプチン−リンカーＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。
【図１５．１】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａ）非還元、Ｂ）還元。
【図１５．２】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ  ＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析を示す。Ａ）未反応ｍＡｂ、Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１５．３】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＥＣ分析を示し、高単量体生成物が得られたことを示している。高分子量固体（ＨＭＷＳ）を示している。
【図１６．１】１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣ及び１Ｃ１システインＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。Ａ）非還元サンプル、Ｂ）還元サンプル。
【図１６．２】１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１６．３】１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１６．４】１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１６．５】１Ｃ１  Ｓ２３９Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１６．６】１Ｃ１  Ｋ２７４Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１６．７】１Ｃ１  Ｎ２９７Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析についての分析データを示す。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【図１７．１】ラット血清中でのインキュベーションの前後の、１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及び１Ｃ１システイン−ＡＺ１５０８  ＡＤＣの代表的な還元グリコシル化質量スペクトルを示す。（Ａ）位置Ｓ２３９、（Ｂ）位置Ｋ２７４、（Ｃ）位置Ｎ２９７。非コンジュゲート種及びコンジュゲート種を示す。
【図１７．２】ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の、ＣＰ２−ＮＮＡＡ又はシステイン操作抗体に取り付けられたままのＡＺ１５０８の定量化を示す。薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、還元グリコシル化質量スペクトルから算出した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１７．３】マウス血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の、ＣＰ２−ＮＮＡＡ又はシステイン操作抗体に取り付けられたままのＡＺ１５０８の定量化を示す。薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、還元グリコシル化質量スペクトルから算出した。脱アセチル化ＡＺ１５０８を、分析用のコンジュゲート種と考えた。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図１８．１】還元グリコシル化質量分析によって測定した、ＡＺ１５０８との１Ｃ１  ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及び１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのコンジュゲーションカイネティクスを示す。データを、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ、及び１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡについて、平均±絶対誤差（ｎ＝２）として、そして１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡについて平均±標準偏差（ｎ＝３）としてプロットしている。
【図１８．２】ＡＺ１５０８とのＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及びＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの反応後直ぐのジエンの消費を示す逆濃度プロットを示す。（Ａ）１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、（Ｂ）１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、及びＮ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ。データを、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ、及び１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡについて、平均±絶対誤差（ｎ＝２）として、そして１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡについて平均±標準偏差（ｎ＝３）としてプロットしている。
【図１９．１】マウスのＰＣ３異種移植腫瘍モデルに対する１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの抗腫瘍活性を示す。
【図２０．１】１Ｃ１野生型（ＷＴ）又は１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体（ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ）との２５℃にて２時間のインキュベーションの前後の、６０ｎｍマレイミド官能化金ナノ粒子の動的光散乱分析（ＤＬＳ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
詳細な開示
本明細書中で使用される生体分子は、少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチドである。
【００７２】
一実施形態において、生体分子は、治療用生体分子、すなわち治療、特にヒトの治療に使用され得る生体分子である。
【００７３】
本明細書中で使用されるコンジュゲーション（反応）は単純に、分子を別の実体に連結する反応である。本明細書の文脈において、例えばペイロードにコンジュゲートした生体分子は、コンジュゲーション反応から得られる生成物である。
【００７４】
本明細書中で使用される生体コンジュゲーション方法は、生体分子を、別の実体、例えばペイロードに連結する方法を指す。
【００７５】
本明細書の文脈における実体として、ペイロード、例えばポリマー及び／又は毒物、固体表面（例えばプレート）、粒子等が挙げられる。ペイロードの例が、以下でより詳細に記載される。
【００７６】
本明細書中で使用されるアミノ酸残基は、天然又は非天然のアミノ酸であって、例えば別のアミノ酸に、アミノ酸のＮ及び／又はＣ末端を介して連結しており、特に、少なくとも１つの連結がペプチド結合である、天然又は非天然のアミノ酸を指す。
【００７７】
本明細書中で使用される非天然のアミノ酸は、２１の天然に存在するアミノ酸を除くアミノ酸を指す。例えば、非天然のアミノ酸は、ジエン又はジエノフィルを含み、そして又、天然のアミノ酸に特有の相対位置にアミノ官能基及びカルボン酸官能基を含有する。特定の非天然のアミノ酸、及びこれを製造する方法は、国際公開第２０１５／０１９１９２号パンフレットに開示されており、これは参照によって本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ジエノフィルは、非天然のアミノ酸、例えばノルボルネンリシン内に含有され、これは米国特許出願公開第２０１５／０００５４８１号明細書に開示されており、この出願は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００７８】
非天然のアミノ酸は通常、天然のアミノ酸に由来する。天然のアミノ酸に由来するとは、非天然のアミノ酸が、天然のアミノ酸の構造に基づいており（又はこれを組み込んでおり）、又はこれに類似しており、例えば、リシン内のアルキレン鎖は、短くされて、天然の４炭素鎖とは対照的に３炭素鎖を提供するが、リシンとの構造的な関係又は類似性がなお存在し得るという事実を指す。ゆえに、天然のアミノ酸の誘導体は、ジエン又はジエノフィルを組み込むこと、アルキレン鎖を長く、若しくは短くすること、１つ以上の置換基を側鎖内の窒素、酸素、硫黄に加えること、又は窒素、酸素、若しくは硫黄を、異なる官能基、若しくは任意の官能基の組合せに変換すること等の修飾を含む。通常、大部分の修飾は、非天然のアミノ酸における構造の付加であろう。しかしながら、修飾は、アミノ酸内で天然に見出される原子を除去又は置換すること含んでもよい。
【００７９】
本明細書中で使用される天然のアミノ酸は、２１のタンパク質構成アミノ酸（すなわち、アルギニン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セレノシステイン、グリシン、プロリン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン）を指す。
【００８０】
一実施形態において、ジエン又はジエノフィルを含む非天然のアミノ酸は、例えば組換えポリペプチドの発現プロセスにおいて、生体分子のアミノ酸配列内に組み込まれる。これは、アミノ酸を正確な位置に位置決めしてから、ペイロードとの非常に特異的なコンジュゲーション反応を促進するので、有利である。
【００８１】
一実施形態において、非天然のアミノ酸は、リンカー及びコンジュゲーション反応を介して生体分子に付加されてよい。
【００８２】
本明細書中で使用されるジエノフィルは、ジエンと反応する官能基である。一実施形態において、ジエノフィルは、アルケン（１つの二重結合、特に１つの二重結合を有する）を含む。
【００８３】
本明細書中で使用されるジエンは、２つの二重結合（２つの−ｅｎｅ基）を指す。しかしながら、前記２つの基は、互いに近接している必要がある。したがって、通常、本明細書中で使用されるジエンは、文脈がそうでないと示さない限り、共役ジエンを指すこととなる。
【００８４】
本明細書中で使用される共役ジエンは、直鎖状又は環状の文脈において、二重結合−単結合−二重結合を指す。
【００８５】
直鎖状の文脈における共役ジエンとして、Ｃ４〜９直鎖状共役ジエン、例えば、ブタジエン、ペンタジエン、ヘキサジエン、ヘプタジエン、オクタジエン、及びノナジエンが挙げられる。この文脈における直鎖状は、非環状を指すので、共役ジエンを含むＣ４〜９炭素鎖の分枝状バージョンを含む。
【００８６】
環状の文脈における共役ジエンとして、例えば、一環式炭素環、例えばシクロペンタジエン若しくはシクロヘキサジエン、又は二環式炭素環系若しくは三環式炭素環系、例えば、別の環に融合したシクロペンタジエン若しくはシクロヘキサジエンを含む系が挙げられる。一実施形態において、共役ジエンは、芳香族でない。共役ジエンは、コンジュゲーション反応と混同されるべきでなく、２つは「無関係である」。
【００８７】
本明細書中で使用される炭素環は、系を形成する環が炭素原子でできている、すなわちヘテロ原子が環構造に寄与しない環系を指す。しかしながら、炭素環は、１つ又は複数の置換基を有してよく、そして置換基は、ヘテロ原子を含有してよい。一実施形態において、炭素環は、部分的に不飽和又は芳香族である。
【００８８】
シクロプロパンは、三員炭素環である。一部の実施形態において、シクロプロパン環は、例えば本明細書中の構造の一部において示されるように、炭素環ジエン環又は複素環ジエン環から付加される。これは、反応性ジエンで起こり得る、自己反応するジエンの性質を最小にするので、有利である。本明細書におけるこのシクロプロパン環は、それ自体が置換基として定義されず、むしろ、ジエンを含む環系に取り付けられる鎖又は「リンカー」の観点から定義される。
【００８９】
本明細書中で使用される共役ジエンを含むＣ５〜１４カルボシクリルは、１つ以上の置換基、例えば１、２、３、４つの置換基を有してよい５〜１４員の炭素環系を指す。
【００９０】
共役ジエン又はジエノフィルを含む炭素環は、非天然のアミノ酸内に見出される反応性官能基の一部であり、又は「ペイロード」とのコンジュゲーションに先立って加えられるリンカーの構成要素となることとなる。Ｃ５〜１４炭素環の例として、シクロペンタジエン（置換された、又は非置換のシクロペンタジエンが挙げられる）、シクロヘキサジエン（置換された、又は非置換のシクロヘキサジエンが挙げられる）、アントラセン（置換された、又は非置換のアントラセンが挙げられる）が挙げられる。
【００９１】
一実施形態において、非天然のアミノ酸又はリンカー内のシクロペンタジエンは、非置換である。一実施形態において、シクロペンタジエンは、非天然のアミノ酸又はライナーに、シクロプロパン環を介して連結される。
【００９２】
一実施形態において、非天然のアミノ酸又はリンカー内のシクロペンタジエンは、１、２、３、４、又は５つのＣ１〜３アルキル置換基を含み、例えば、シクロペンタジエンは、５つのメチル置換基を有する。
【００９３】
本明細書中で使用されるヘテロシクリルは、Ｏ、Ｎ、及びＳから独立して選択される１つ以上、例えば１、２、３、又は４つのヘテロ原子を含む飽和した、部分的に不飽和な、又は芳香族の環であって、場合によっては環内の１又は２つの炭素が、オキソ置換基を有してよい、環を指す。明らかに、環構造を形成又は保持する際に使用されないヘテロ原子のいずれの原子価も、必要に応じて、水素又は置換基によって満たされ得る。ゆえに、複素環上の置換基は、炭素上に、又は必要に応じて、ヘテロ原子、例えばＮ上にあり得る。
【００９４】
５〜１４員の複素環は、例えば１、２、又は３つのヘテロ原子を含む環系を構成する５〜１４員子を含有することとなる。複素環は、例えば、１、２、又は３つの置換基を有してよい。通常、複素環は、ジエン又はジエノフィルを概して含むこととなるので、少なくとも部分的に不飽和となることとなり、そして芳香族であってもよい。
【００９５】
５〜１４員の複素環は通常、非天然のアミノ酸又はリンカー中に組み込むためのジエン又はジエノフィルを含むこととなる。ジエンを含む複素環の例として、フラン（置換された、又は非置換のフラン、特に置換されたフランが挙げられる）及び２Ｈピラン（その置換された、又は非置換の形態が挙げられる）が挙げられる。ジエノフィルを含む複素環の例として、マレイミド、ビニルピリジン、ピロリン（例えば２−ピロリン及び３−ピロリン）、及び３，４−ジヒドロピランが挙げられる。
【００９６】
一実施形態において、フランは、少なくとも１つの置換基、例えば電子供与基、例えばアルコキシ、特に１つ（例えば１つ）のメトキシを有する。
【００９７】
ジエン又はジエノフィルがリンカーを介して生体分子中に導入される場合、官能基、例えばＮ３、ハロ、スクシンイミド、又はアルキンは、例えば、生体分子のアミノ酸配列内のリシンと反応し得る。
【００９８】
本明細書中で用いられるアルキルは、直鎖又は分枝鎖のアルキル、例えば、限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、ｎ−ブチル、及びｔｅｒｔ−ブチルを指す。一実施形態において、アルキルは、直鎖アルキルを指す。
【００９９】
本明細書中で用いられるアルコキシは、直鎖又は分枝鎖のアルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシを指す。本明細書中で使用されるアルコキシは又、酸素原子がアルキル鎖内に位置決めされている実施形態、例えば−Ｃ１〜３アルキルＯＣ１〜３アルキル、例えば−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３又は−ＣＨ２ＯＣＨ３に及ぶ。ゆえに、一実施形態において、アルコキシは、炭素を介して分子の残部に連結される。一実施形態において、アルコキシは、酸素を介して分子の残部に連結される（例えば−Ｃ０アルキルＯＣ１〜６アルキル）。一実施形態において、本開示は、直鎖アルコキシに関する。
【０１００】
本明細書中で使用されるアミノは、−ＮＨ２、Ｃ１〜４モノ又はジアシルアミノを指し、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル及び（−ＮＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル）Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル）をそれぞれ指すことが意図される。
【０１０１】
Ｃ１〜４モノ又はジアルキルアミノは、−ＮＨＣ１〜４アルキル及び−Ｎ（Ｃ１〜４アルキル）（Ｃ１〜４アルキル）をそれぞれ指すことが意図される。
【０１０２】
ハロゲン又はハロとして、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨード、特にフルオロ、クロロ、又はブロモ、とりわけフルオロ又はクロロが挙げられる。
【０１０３】
本明細書中で用いられるオキソは、Ｃ＝Ｏを指し、通常Ｃ（Ｏ）として表されることとなる。
【０１０４】
本明細書中で使用されるアルキレンは、分枝状の、又は枝状に分かれていない炭素ラジカル、例えばメチレン（−ＣＨ２−）又はその鎖を指す。
【０１０５】
本明細書中で使用されるＣ２〜５アルキンは：三重結合；及び直鎖状配置又は分枝状配置内に２〜５つの炭素原子を含有する基又はラジカルを指す。
【０１０６】
少なくとも１つの炭素（例えば１、２、又は３、適切には１又は２、特に１つの炭素）が、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）０〜３から選択されるヘテロ原子によって置換されており、前記鎖は、場合によっては、オキソ、ハロゲンから独立して選択される１つ以上の基によって置換されている、飽和した、又は不飽和の、分枝状の、又は枝状に分かれていないＣ１〜８アルキル鎖に関して、ヘテロ原子は、技術的な必要に応じて、第一級、第二級、若しくは第三級炭素、すなわちＣＨ３、−ＣＨ２−、若しくは−ＣＨ−、又は分枝状炭素基を置換してよいことが、当業者にとって明らかであろう。
【０１０７】
本明細書中で使用されるＮ３は、アジドを指す。
【０１０８】
本明細書中で使用されるスルホは、１、２、又は３つの酸素原子に結合された硫黄原子を指す。
【０１０９】
本明細書中で使用されるスルフヒドリルは、１つ以上の水素原子に結合された硫黄原子を指し、これは、プロトン化された形態とプロトン化されていない形態との間で平衡して存在し得る。
【０１１０】
ディールス−アルダー機構を介した本開示に従う反応のコンジュゲートされた生成物を特徴付ける特徴であるシクロヘキセン環は、単環式系、又は縮合環系、例えばビシクロ系の一部である。
【０１１１】
式（ＩＩＩ）の化合物への付加に適した糖として、グルコース、グルコサミン、ガラクトース、ガラクトサミン、マンノース、フルクトース、ガラクトース、マルトース、及びラクトースが挙げられる。有利には、糖分子の付加は、溶解度を増大させ得る。
【０１１２】
本開示において使用されるポリペプチド
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において互換的に使用される。ポリマーは、直鎖でも分枝鎖でもよく、それは、改変アミノ酸を含み得、それは、非アミノ酸により中断されていてよい。この用語は、天然に又は介入；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、もしくは任意の他の操作もしくは改変、例えば、標識構成要素とのコンジュゲーションにより改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。定義には、例えば、アミノ酸の１つ以上のアナログ（例として、例えば、非天然アミノ酸など）及び当分野において公知の他の改変を含有するポリペプチドも含まれる。これは、本開示のポリペプチドが抗体をベースとするためであることが理解される。
【０１１３】
本明細書において用いられるポリペプチドは、少なくとも１つのチオール基を含む二次又は三次構造を有し、又は有さない５つ以上のアミノ酸の配列を指す。したがって、本開示において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を含む。これらは、特に記載のない限り、互換的に使用される。
【０１１４】
一実施形態において、ポリペプチドは、タンパク質である。タンパク質は、一般に、二次及び／又は三次構造を含有し、単量体又は多量体の形態であり得る。
【０１１５】
一実施形態において、タンパク質は、単鎖又は会合鎖としての抗体又はその結合断片である。
【０１１６】
本明細書中で使用される抗体分子は、抗体、抗体結合フラグメント、及び抗体フォーマット、例えば前記抗体を含む多特異的抗体又はその結合フラグメントを指す総称語である。
【０１１７】
本明細書において互換的に使用される用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は、全抗体及び任意の抗原結合断片又はそれらの単鎖を含む。
【０１１８】
典型的な抗体は、ジスルフィド結合により相互連結されている少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨ、ＶＨ領域、又はＶＨドメインとして略記）及び重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３又は４つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４を含む。Ｆｃ領域は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチド、及びその断片を含む。したがって、ＩｇＧについて、「Ｆｃ領域」は、ＣＨ２及びＣＨ３ならびに場合により、それらのドメインに対するフレキシブルヒンジ領域Ｎ末端の全部又は一部を指す。用語「Ｆｃ領域」は、単離されたこの領域、又は抗体、抗体断片、もしくはＦｃ融合タンパク質に関するこの領域を指し得る。
【０１１９】
それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬ、ＶＬ領域、又はＶＬドメインとして略記）及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。
【０１２０】
ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＷ）と称されるより保存されている領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに下位分類することができる。それぞれのＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＷから構成される：ＦＷ１、ＣＤＲ１、ＦＷ２、ＣＤＲ２、ＦＷ３、ＣＤＲ３、ＦＷ４。フレームワーク領域は、それらのそれぞれのＶＨ及びＶＬ領域により指定することができる。したがって、例えば、ＶＨ−ＦＷ１は、ＶＨの第１のフレームワーク領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、宿主組織又は因子、例として、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【０１２１】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位（結合部位とも称される）を介して標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又は上記の組合せを認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子又はその抗原結合断片を意味する。本明細書において使用される用語「抗体」は、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片）、単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ及びジスルフィド安定化ｓｃＦｖ（ｄｓＦｖ））、少なくとも２つの異なる抗体から生成される多重特異的抗体、例えば、二重特異的抗体又は抗体断片から形成される多重特異的抗体（例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第９６／２７０１１号パンフレット，国際公開第２００７／０２４７１５号パンフレット、国際公開第２００９０１８３８６号パンフレット、国際公開第２００９／０８０２５１号パンフレット、国際公開第２０１３００６５４４号パンフレット、国際公開第２０１３／０７０５６５号パンフレット、及び国際公開第２０１３／０９６２９１号パンフレット参照）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合断片を含む融合タンパク質、及び抗原結合断片を含む任意の他の改変免疫グロブリン分子を、その抗体が所望の生物学的活性を示す限り、包含する。
【０１２２】
抗体は、任意の５つの主要なクラスの免疫グロブリン：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、又はサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）、又はアロタイプ（例えば、Ｇｍ、例えば、Ｇ１ｍ（ｆ、ｚ、ａ又はｘ）、Ｇ２ｍ（ｎ）、Ｇ３ｍ（ｇ、ｂ、又はｃ）、Ａｍ、Ｅｍ、及びＫｍ（１、２又は３））のものであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元立体配置を有する。抗体は、任意の哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなど、又は他の動物、例えば、鳥類（例えば、ニワトリ）から誘導することができる。
【０１２３】
用語「抗原結合断片」は、インタクト抗体の抗原決定可変領域を含む断片を指す。抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片により実施され得ることは、当分野において公知である。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、直鎖抗体、単鎖抗体、及び抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。
【０１２４】
したがって、一実施形態において、本発明において使用される抗体は、全長重鎖及び軽鎖を有する完全抗体分子又はその断片を含み得、限定されるものではないが、Ｆａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価又は四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、それらの組合せ及び上記のいずれかのエピトープ結合断片であり得る。
【０１２５】
具体的に企図される他の抗体は、区別されるモノクローナル抗体の所定の混合物である「オリゴクローナル」抗体である。例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第９５／２０４０１号パンフレット；米国特許第５，７８９，２０８号明細書及び米国特許第６，３３５，１６３号明細書参照。好ましくは、オリゴクローナル抗体は、１つ以上のエピトープに対する抗体の所定の混合物からなり、単一細胞中で生成される。より好ましくは、オリゴクローナル抗体は、共通の軽鎖と対合して複数の特異性を有する抗体を生成し得る複数の重鎖を含む（例えば、ＰＣＴ出願公開の国際公開第０４／００９６１８号パンフレット）。単一標的分子上の複数のエピトープを標的化することが望ましい場合、オリゴクローナル抗体は特に有用である。当業者は、どのタイプの抗体又は抗体の混合物が意図される目的及び所望の必要性に適用可能であるかを知っており、又は決定し得る。
【０１２６】
本開示における使用に具体的に企図される他の部分は、小型遺伝子操作タンパク質ドメイン、例えば、足場（例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２６３０号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０１５７５６１号明細書参照）である。足場は、公知の天然存在、非抗体ドメインファミリー、具体的には、タンパク質細胞外ドメインをベースとし、典型的には、小サイズ（約１００から約３００ＡＡ）で、挿入、欠失又は他の置換を可能とする高い立体構造トレランスの可変ドメインと会合している高度に構造化されたコアを含有する。これらの可変ドメインは、任意の標的化タンパク質のための推定結合界面を作出し得る。一般に、一般的なタンパク質足場の設計は、２つの主要なステップからなる：（ｉ）所望の特徴部を有する好適なコアタンパク質の選択及び（ｉｉ）高い構造可変性を許容するドメインの一部又は全部の突然変異誘発による複雑なコンビナトリアルライブラリーの生成、適切なフォーマット（すなわち、ファージ、リボソーム、細菌、又は酵母）のこれらのライブラリーのディスプレイ及び所望の結合特徴（例えば、標的特異性及び／又は親和性）を有する突然変異誘発足場についてのライブラリーのスクリーニング。親足場の構造は、高度に多様であり得、高度に構造化されたタンパク質ドメイン、例として、限定されるものではないが、ＦｎＩＩＩドメイン（例えば、ＡｄＮｅｃｔｉｎ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１８、４３５−４４４（２００５）、米国特許出願公開第２００８／００１３９７９１号明細書、及び国際公開第２００５／０５６７６４号パンフレット参照、ＴＮ３、例えば、国際公開第２００９／０５８３７９号パンフレット及び国際公開第２０１１／１３０３２４号パンフレット参照）；プロテインＡのＺドメイン（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７，４５５−４６２（２００４）及び欧州特許出願公開第１６４１８１８Ａ１号明細書参照）；ＬＤＬ受容体からのドメインＡ（アビマー、例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１２），１５５６−１５６１（２００５）及びＥｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  Ｄｒｕｇｓ  １６（６）、９０９−９１７（Ｊｕｎｅ  ２００７）参照）；アンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９−５０３（２００３）、ＰＮＡＳ（２００３）及びＢｉｏｌ．３６９、（２００７）及び国際公開第０２／２０５６５号パンフレット）；Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン、例えば、国際公開第０２／４８１８９号パンフレット参照）を含む。所望により、２つ以上のそのような遺伝子操作足場ドメインを一緒に結合させて多価結合タンパク質を形成させることができる。個々のドメインは、使用／疾患適応症に応じて単一タイプのタンパク質又はいくつかのタンパク質を標的化し得る。
【０１２７】
実質的に任意の分子（又はその一部、例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフ又はエピトープ）は、部分、例として、限定されるものではないが、内在性膜タンパク質、例として、イオンチャネル、イオンポンプ、Ｇタンパク質共役受容体、構造タンパク質；接着タンパク質、例えば、インテグリン；トランスポーター；シグナル伝達に関与するタンパク質及び脂質固定タンパク質、例として、Ｇタンパク質、酵素、例えば、キナーゼ、例として、膜固定キナーゼ、膜結合酵素、プロテアーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、脂肪酸合成酵素、消化酵素、例えば、ペプシン、トリプシン、及びキモトリプシン、リゾチーム、ポリメラーゼ；受容体、例えば、ホルモン受容体、リンホカイン受容体、モノカイン受容体、成長因子受容体、サイトカイン受容体；サイトカインなどにより標的化し、及び／又はそれに取り込むことができる。
【０１２８】
一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＣＳＦ１（Ｍ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ−ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ−２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ−２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦＲＬ１、ＦＧＦＲ６、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２Ｒ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷ１、ＦＩＬ１、ＦＩＬ１（ＥＰＳＩＬＯＮ）、ＦＩＬ１（ＺＥＴＡ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２８ＲＡ、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＡＣＶＲＬ１、ＧＦＲＡ１、ＬＴＡ（ＴＮＦ−ベータ）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ−アルファ）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４−１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ−Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（Ｔｒａｉｌ受容体）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（Ｔｒａｉｌ受容体２）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（Ｔｒａｉｌ受容体３）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ（Ｔｒａｉｌ受容体４）、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＫＤＲ、ＦＬＴ１、ＦＬＴ４、ＮＲＰ１、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２��ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、ＡＬＫ及びＴＨＰＯの中から選択される成長因子、サイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、成長因子、受容体リガンド又は受容体の全部又は一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフ又はエピトープ）を標的化し、及び／又は取り込む。
【０１２９】
一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、ＣＣＬ１（Ｉ−３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１ａ）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ−１ｂ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ−３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ−２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ−４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ−１ｄ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ−４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ−３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ−３ａ）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス（ｅｘｏｄｕｓ）−２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ−１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ−１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ−２／エオタキシン−２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン−３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ−７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ−２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤ１）、ＳＣＹＥ１、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ−１ｂ）、ＢＬＲ１（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲ１（ＣＫＲ１／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ−１ＲＢ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ−Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ−Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ−９−６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ−ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ−Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒａ）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒｂ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＩＦ１Ａ、ＩＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬの中から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、又はケモカイン関連タンパク質の全部又は一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフ又はエピトープ）を標的化し、及び／又は取り込む。
【０１３０】
一部の態様において、本開示において用いられるポリペプチドは、例えば、レニン；成長ホルモン、例として、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；アルファ−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えば、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、及びフォンウィルブランド因子；抗凝固因子、例えば、プロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺サーファクタント；プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ウロキナーゼ又はヒト尿又は組織型プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血成長因子；腫瘍壊死因子−アルファ及びベータ；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（活性化調節型の正常Ｔ細胞発現及び分泌物（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−アルファ）；血清アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン；ミュラー管阻害因子；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えば、ベータ−ラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；細胞毒性Ｔリンパ球性関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えば、ＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；プロテインＡ又はＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、又はＮＴ−６）、又は神経成長因子；上皮成長因子（ＥＧＦ）；インスリン様成長因子結合タンパク質；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ８０及びＣＤ１４７；エリスロポエチン；骨誘導因子；免疫毒素；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；分解促進因子；ウイルス抗原、例えば、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部、例えば、ｇｐ１２０；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ  １、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３及びＶＣＡＭ、ａ４／ｐ７インテグリン、及び（Ｘｖ／ｐ３インテグリン、例として、その１つ又は複数のサブユニットのいずれか、インテグリンアルファサブユニット、例えば、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、アルファ７、アルファ８、アルファ９、アルファＤ、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ５１、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４１、アルファＩＩｂ、アルファＩＥＬｂ；インテグリンベータサブユニット、例えば、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、ＣＤ１０４、ベータ５、ベータ６、ベータ７及びベータ８；インテグリンサブユニット組合せ、例として、限定されるものではないが、αＶβ３、αＶβ５及びα���β７；アポトーシス経路のメンバー；ＩｇＥ；血液群抗原；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣ；Ｅｐｈ受容体例えば、ＥｐｈＡ２、ＥｐｈＡ４、ＥｐｈＢ２など；ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）例えば、ＨＬＡ−ＤＲ；補体タンパク質、例えば、補体受容体ＣＲ１、Ｃ１Ｒｑ及び他の補体因子、例えば、Ｃ３、及びＣ５；糖タンパク質受容体、例えば、ＧｐＩｂα、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ及びＣＤ２００の中から選択されるタンパク質の全部又は一部（例えば、サブユニット、ドメイン、モチーフ又はエピトープ）を標的化し、及び／又は取り込む。
【０１３１】
癌抗原、例として、限定されるものではないが、ＡＬＫ受容体（プレイオトロフィン受容体）、プレイオトロフィン、ＫＳ１／４汎癌抗原；卵巣癌抗原（ＣＡ１２５）；前立腺酸性ホスフェート（ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）；前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）；黒色腫関連抗原ｐ９７；黒色腫抗原ｇｐ７５；高分子量黒色腫抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）；前立腺特異的膜抗原；癌胎児性抗原（ＣＥＡ）；多形上皮ムチン抗原；ヒト乳脂肪球抗原；結腸直腸腫瘍関連抗原、例えば、ＣＥＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＯ１７−１Ａ、ＧＩＣＡ１９−９、ＣＴＡ−１及びＬＥＡ；バーキットリンパ腫抗原−３８．１３；ＣＤ１９；ヒトＢリンパ腫抗原−ＣＤ２０；ＣＤ３３；黒色腫特異的抗原、例えば、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２及びガングリオシドＧＭ３；腫瘍特異的移植型細胞表面抗原（ＴＳＴＡ）；ウイルス誘導腫瘍抗原、例として、Ｔ抗原、ＤＮＡ腫瘍ウイルス及びＲＮＡ腫瘍ウイルスのエンベロープ抗原；癌胎児性抗原−アルファ−フェトプロテイン、例えば、結腸のＣＥＡ、５Ｔ４癌胎児性栄養芽層糖タンパク質及び膀胱腫瘍癌胎児性抗原；分化抗原、例えば、ヒト肺癌抗原Ｌ６及びＬ２０；線維肉腫の抗原、ヒト白血病Ｔ細胞抗原−Ｇｐ３７；ネオ糖タンパク質；スフィンゴ脂質；乳癌抗原、例えば、ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）；ＮＹ−ＢＲ−１６、ＮＹ−ＢＲ−１６；ＨＥＲ２抗原（ｐ１８５ＨＥＲ２）及びＨＥＲ３；多形上皮ムチン（ＰＥＭ）；悪性ヒトリンパ球抗原−ＡＰＯ−１；分化抗原、例えば、胎児赤血球中に見出されるＩ抗原；成人赤血球中に見出される一次内胚葉Ｉ抗原；着床前胚；胃腺癌中に見出されるＩ（Ｍａ）；乳房上皮中に見出されるＭ１８、Ｍ３９；骨髄性細胞中に見出されるＳＳＥＡ−１；ＶＥＰ８；ＶＥＰ９；Ｍｙｌ；ＶＩＭ−Ｄ５；結腸直腸癌中に見出されるＤ１５６−２２；ＴＲＡ−１−８５（血液型Ｈ）；精巣及び卵巣癌中に見出されるＳＣＰ−１；結腸腺癌中に見出されるＣ１４；肺腺癌中に見出されるＦ３；胃癌中に見出されるＡＨ６；Ｙハプテン；胚性癌細胞中に見出されるＬｅｙ；ＴＬ５（血液型Ａ）；Ａ４３１細胞中に見出されるＥＧＦ受容体；膵臓癌中に見出されるＥ１系列（血液型Ｂ）；胚性癌細胞中に見出されるＦＣ１０．２；胃腺癌抗原；腺癌中に見出されるＣＯ−５１４（血液型Ｌｅａ）；腺癌中に見出されるＮＳ−１０；ＣＯ−４３（血液型Ｌｅｂ）；Ａ４３１細胞のＥＧＦ受容体中に見出されるＧ４９；結腸腺癌中に見出されるＭＨ２（血液型ＡＬｅｂ／Ｌｅｙ）；結腸癌中に見出される１９．９；胃癌ムチン；骨髄性細胞中に見出されるＴ５Ａ７；黒色腫中に見出されるＲ２４；胚性癌細胞中に見出される４．２、ＧＤ３、Ｄ１．１、ＯＦＡ−１、ＧＭ２、ＯＦＡ−２、ＧＤ２、及びＭ１：２２：２５：８ならびに４〜８細胞期胚中に見出されるＳＳＥＡ−３及びＳＳＥＡ−４；皮膚Ｔ細胞リンパ腫抗原；ＭＡＲＴ−１抗原；シアリ（Ｓｉａｌｙ）Ｔｎ（ＳＴｎ）抗原；結腸癌抗原ＮＹ−ＣＯ−４５；肺癌抗原ＮＹ−ＬＵ−１２バリアントＡ；腺癌抗原ＡＲＴ１；腫瘍随伴性脳−精巣−癌抗原（腫瘍及び神経細胞の共通抗原（ｏｎｃｏｎｅｕｒｏｎａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）ＭＡ２；傍腫瘍性神経抗原）；神経腫瘍腹��抗原２（Ｎｅｕｒｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｖｅｎｔｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ２）（ＮＯＶＡ２）；肝細胞癌抗原遺伝子５２０；腫瘍関連抗原ＣＯ−０２９；腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ−Ｃ１（癌／精巣抗原ＣＴ７）、ＭＡＧＥ−Ｂ１（ＭＡＧＥ−ＸＰ抗原）、ＭＡＧＥ−Ｂ２（ＤＡＭ６）、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−４ａ、ＭＡＧＥ−４ｂ及びＭＡＧＥ−Ｘ２；癌−精巣抗原（ＮＹ−ＥＯＳ−１）；ならびに上記に列記されたポリペプチドのいずれかの断片に特異的に結合し、及び／又はそれを含む部分も企図される。
【０１３２】
一実施形態において、用いられるポリペプチドは、組換え体である。「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術を介して産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。遺伝子操作宿主組織中で発現される組換え産生ポリペプチド及びタンパク質は、任意の好適な技術により分離され、分別され、又は部分的もしくは実質的に精製された天然又は組換えポリペプチドと同様に本開示の目的のために単離されているとみなす。本明細書に開示のポリペプチドは、当分野において公知の方法を使用して組換え産生することができる。あるいは、本明細書に開示のタンパク質及びペプチドは、化学合成することができる。
【０１３３】
ペイロード分子
実体として、粒子（例えば、ナノ粒子又はマイクロ粒子）、固体支持体（例えばプレート）が挙げられ、そして又ペイロードが挙げられる。
【０１３４】
ペイロードは通常、粒子又は固体支持体を含むように拡大しない。通常、ペイロードは、一部の向上を生体分子にもたらし、そして例えば、結果として生じる治療用コンジュゲーション生成物の特性を増大させ、又は最適化することとなる。向上として、標的化、溶解度の増大、半減期の増大、エフェクタ機能、活性の付加（更なる新しい活性）、増大、検出可能なラベルの付与、毒性の引下げ（例えば、ペイロードは、生体分子をプロドラッグに変換し得る）が挙げられる。
【０１３５】
本明細書において用いられるペイロードは、ポリペプチドへのコンジュゲーションによる標的領域位置への「送達」を目的とする分子又は構成要素を指す。一般に、ペイロードは、一般に、例えば、毒素、例えば、細胞毒素、例えば、化学療法剤、薬物、プロドラッグ、酵素、免疫調節剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、サイトカイン、ホルモン、抗体又はその断片、合成又天然存在ポリマー、核酸及びその断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの断片（例えば、アンチセンス分子又は遺伝子）、放射性核種、特に放射性ヨウ化物、放射性同位体、キレート金属、ナノ粒子及びレポーター基、例えば、蛍光化合物又はＮＭＲもしくはＥＳＲ分光法により検出することができる化合物からなる群から選択されるエフェクタ分子である。
【０１３６】
一実施形態において、ペイロードは、毒素、薬物、放射性核種、免疫調節剤、サイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、成長因子、腫瘍壊死因子、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、ペプチド核酸、光活性治療剤、抗血管新生剤、アポトーシス促進剤、非天然アミノ酸、ペプチド、脂質、ポリマー、炭水化物、足場分子、蛍光タグ、可視化ペプチド、ビオチン、血清半減期延長剤、捕捉タグ、キレート剤、固体担体、又はそれらの組合せを含む群から選択される。
【０１３７】
一実施形態において、ペイロードは、薬物分子（本明細書において薬物とも称される）である。本開示において使用される薬物分子の例としては、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレア、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸アナログ、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジンアナログ、プリンアナログ、抗生物質、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、白金配位錯体、ビンカアルカロイド、置換ウレア、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトテシン、ドキソルビシン、ドキソルビシンアナログ、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗有糸分裂薬、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ９０）阻害剤、プロテオソーム阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、アポトーシス促進剤、メトトレキセート、ＣＰＴ−１１、又はそれらの組合せが挙げられ、それらにおいてコンジュゲーションが存在する。
【０１３８】
特定の態様において、薬物は、アミフォスチン、シスプラチン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、メクロレタミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、ドキソルビシンリポ、ゲムシタビン、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ、プロカルバジン、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ゲフィチニブ、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシルアロマターゼ阻害剤、及びそれらの組合せである。
【０１３９】
一実施形態において、薬物は、アルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害剤、タキソイド及びスラミンを含む群から選択される。
【０１４０】
一実施形態において、ペイロードは、チューブリシン、例えばチューブリシンＡを含み、これは、抗縮瞳（ａｎｔｉｍｉｏｔｉｃ）活性を有する細胞毒性ペプチドである。
【０１４１】
一実施形態において、毒素は、細胞毒素又は細胞毒性剤、例として、細胞に有害な（例えば、細胞を殺傷する）任意の薬剤を含む。例としては、アプリジン、アナストロゾール、アザシチジン、ボルテゾミブ、ブリオスタチン−１、ブスルファン、コンブレスタチン、カルムスチン、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアステリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムプロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシンならびにそれらのアナログ又はホモログが挙げられる。
【０１４２】
一実施形態において、薬物（この場合、細胞毒素とも）は、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパ  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、カルボプラチン、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（旧名ダウノマイシン）及びドキソルビシン又はドキソルビシングルクロニド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（旧名アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアミシン又はデュオカルマイシン）、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）を含む。
【０１４３】
一部の態様において、薬物は、アウリスタチン（米国特許第５，６３５，４８３号明細書；米国特許第５，７８０，５８８号明細書）、例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）又はＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）である。他の態様において、薬物は、ドラスタチン又はドラスタチンペプチド性アナログ又は誘導体である。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管ダイナミクス、ＧＴＰ加水分解、ならびに核及び細胞分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３５８０−３５８４（２００１））、抗癌活性を有することが示されている（米国特許第５，６６３，１４９号明細書）。ドラスタチン又はアウリスタチン薬物部分は、コンジュゲート化合物にペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端又はＣ（カルボキシル）末端を介して付着させることができる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２００２／０８８１７２号パンフレット参照。
【０１４４】
他の態様において、薬物は、メイタンシノイドである。一部の態様において、メイタンシノイドは、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）又はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初に西アフリカ低木メイテナス・セラタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａ）から単離された（米国特許第３，８９６，１１１号明細書）。続いて、ある微生物も、メイタンシノイド、例えば、メイタンシノール及びＣ−３メイタンシノールエステルを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号明細書）。合成メイタンシノールならびにその誘導体及びアナログは、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第４，１３７，２３０号明細書；米国特許第４，２４８，８７０号明細書；米国特許第４，２５６，７４６号明細書；米国特許第４，２６０，６０８号明細書；米国特許第４，２６５，８１４号明細書；米国特許第４，２９４，７５７号明細書；米国特許第４，３０７，０１６号明細書；米国特許第４，３０８，２６８号明細書；米国特許第４，３０８，２６９号明細書；米国特許第４，３０９，４２８号明細書；米国特許第４，３１３，９４６号明細書；米国特許第４，３１５，９２９号明細書；米国特許第４，３１７，８２１号明細書；米国特許第４，３２２，３４８号明細書；米国特許第４，３３１，５９８号明細書；米国特許第４，３６１，６５０号明細書；米国特許第４，３６４，８６６号明細書；米国特許第４，４２４，２１９号明細書；米国特許第４，４５０，２５４号明細書；米国特許第４，３６２，６６３号明細書；及び米国特許第４，３７１，５３３号明細書に開示されている。
【０１４５】
メイタンシノイド薬物部分は、抗体薬物コンジュゲート中の魅力的な薬物部分である。それというのも、それらは（ｉ）発酵又は化学改変、発酵産物の誘導体化による調製に相対的に利用しやすいため、（ｉｉ）抗体への非ジスルフィドリンカーを介するコンジュゲーションに好適な官能基による誘導体化を受けやすいため、（ｉｉｉ）血漿中で安定であるため、及び（ｉｖ）種々の腫瘍細胞系に対して有効であるためである。メイタンシノイドを含有するコンジュゲート、それを作製する方法、及びその治療的使用は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，２０８，０２０号明細書、米国特許第５，４１６，０６４号明細書及び欧州特許第０４２５２３５号明細書；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３（１９９６）（ＤＭ１と命名されるメイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載）；ならびにＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）に開示されている。
【０１４６】
メイタンシノイドは当分野において周知であり、公知技術により合成し、又は天然源から単離することができる。好適なメイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号明細書に開示されている。例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、改変芳香族環を有するもの、例えば、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号明細書）（アンサマイトシンＰ２の水素化アルミニウムリチウム還元により調製）；Ｃ−２０−ヒドロキシ（又はＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号明細書及び米国特許第４，３０７，０１６号明細書）（ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）又はアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を使用する脱メチル化又はＬＡＨを使用する脱塩素化により調製）；及びＣ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号明細書）（塩化アシルを使用するアシル化により調製）ならびに他の位置における改変を有するものが挙げられる。例示的なメイタンシノイド薬物部分としては、改変を有するもの、例えば、メイタンシノールとＨ２Ｓ又はＰ２Ｓ５との反応により調製されるＣ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号明細書）；Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号明細書）；ノカルディア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から調製されるＣ−１４−ヒドロキシメチル又はアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨ又はＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号明細書）；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの変換により調製されるＣ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号明細書）；トレウイア・ヌディフロラ（Ｔｒｅｗｉａ  ｎｕｄｉｆｌｏｒａ）から単離されるＣ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号明細書及び米国特許第４，３１５，９２９号明細書）；ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）によるメイタンシノールの脱メチル化により調製されるＣ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第，３６２，６６３号明細書及び米国特許第４，３２２，３４８号明細書）；及びメイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号明細書）も挙げられる。メイタンシン化合物上の多くの位置は、結合のタイプに応じて結合位置として有用であることが公知である。例えば、エステル結合の形成のため、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルにより修飾されているＣ−１４位、ヒドロキシル基により修飾されているＣ−１５位及びヒドロキシル基を有するＣ−２０位が全て好適である。
【０１４７】
一部の態様において、薬物は、カリケアミシンである。抗生物質のカリケアミシンファミリーは、サブピコモル濃度において二本鎖ＤＮＡ分解を産生し得る。カリケアミシンファミリーのコンジュゲートの調製については、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，７１２，３７４号明細書、米国特許第５，７１４，５８６号明細書、米国特許第５，７３９，１１６号明細書、米国特許第５，７６７，２８５号明細書、米国特許第５，７７０，７０１号明細書、米国特許第５，７７０，７１０号明細書、米国特許第５，７７３，００１号明細書、米国特許第５，８７７，２９６号明細書を参照。使用することができるカリケアミシンの構造的アナログとしては、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ−アセチル−γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ１１が挙げられる（Ｈｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−３３４２（１９９３），Ｌｏｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２９２８（１９９８）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄの上記米国特許）。
【０１４８】
一部の態様において、薬物は、チューブリシンである。チューブリシンは、粘液細菌種から単離された天然生成物のクラスのメンバーである（Ｓａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．５３：８７９−８８５（２０００））。細胞骨格相互作用剤として、チューブリシンは、チューブリン重合を阻害し、細胞周期停止及びアポトーシスをもたらす有糸分裂毒である（Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４３：４８８８−４８９２（２００４）；Ｋｈａｌｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ．７：６７８−６８３（２００６）；Ｋａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９６：２３５−２４２（２００６））。チューブリシンは、任意の臨床関連慣習的化学療法薬、例えば、エポチロン、パクリタキセル、及びビンブラスチンの細胞成長阻害を上回る非常に強力な細胞毒性分子である。さらに、これらは多剤耐性細胞系に対して強力である（Ｄｏｍｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ９：１４１−１４７（２００５））。これらの化合物は、癌細胞系のパネルに対して試験される高い細胞毒性を示し、ＩＣ５０値は低ピコモル範囲内であり；したがって、それらは、抗癌治療薬として興味深い。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２０１２０１９１２３号パンフレット参照。チューブリシンコンジュゲートは、例えば、米国特許第７，７７６，８１４号明細書に開示されている。
【０１４９】
一部の態様において、薬物は、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。ＰＢＤは、比較的小さい分子であり、一部は、ＤＮＡの副溝中の特異的配列を認識し、それに共有結合する能力を有し、したがって、抗生物質／抗腫瘍活性を示す。多数のＰＢＤ及びそれらの誘導体、例えば、ＰＢＤ二量体（例えば、ＳＪＧ−１３６又はＳＧ２０００）、Ｃ２−不飽和ＰＢＤ二量体、Ｃ２アリール置換を担持するピロロベンゾジアゼピン二量体（例えば、ＳＧ２２８５）、加水分解により活性化されるＰＢＤ二量体プロドラッグ（例えば、ＳＧ２２８５）、及びポリピロール−ＰＢＤ（例えば、ＳＧ２２７４）が、当分野において公知である。ＰＢＤは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる国際特許出願公開の国際公開第２０００／０１２５０７号パンフレット、国際公開第２００７／０３９７５２号パンフレット、国際公開第２００５／１１０４２３号パンフレット、国際公開第２００５／０８５２５１号パンフレット、及び国際公開第２００５／０４０１７０号パンフレット、ならびに米国特許第７，６１２，０６２号明細書にさらに開示されている。
【０１５０】
一部の態様において、薬物は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ）の作用をブロックする化合物であり、これは、正常な細胞周期中のＤＮＡ鎖のリン酸ジエステル骨格の切断及び再結合を触媒することによって、ＤＮＡ構造の変更を制御する酵素である。
【０１５１】
一部の態様において、毒素は、例えば、アブリン、ブルシン、シクトキシン、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、志賀毒素、内毒素、破傷風毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素、コレラ毒素、ファルカリノール、アルファ毒素、ゲルダナマイシン、ゲロニン、ロタウストラリン、リシン、ストリキニーネ、テトロドトキシン、サポニン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌腸毒素Ａ、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、緑膿菌外毒素、緑膿菌内毒素、又はそれらの組合せを含む。他の態様において、毒素は、例えば、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、アブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ツルレイシ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン、フェノマイシン、ネオマイシン、トリコテセン、又はそれらの組合せを含む。例えば、国際特許出願公開の国際公開第１９９３／０２１２３２号パンフレット参照。
【０１５２】
一部の態様において、キレート剤は、ＤＴＰＡ、ＥＣ、ＤＭＳＡ、ＥＤＴＡ、Ｃｙ−ＥＤＴＡ、ＥＤＴＭＰ、ＤＴＰＡ、ＣｙＤＴＰＡ、Ｃｙ２ＤＴＰＡ、ＢＯＰＴＡ、ＤＴＰＡ−ＭＡ、ＤＴＰＡ−ＢＡ、ＤＴＰＭＰ、ＤＯＴＡ、ＴＲＩＴＡ、ＴＥＴＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡ−ＭＡ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、ｐＮＢ−ＤＯＴＡ、ＤＯＴＰ、ＤＯＴＭＰ、ＤＯＴＥＰ、ＤＯＴＰＰ、ＤＯＴＢｚＰ、ＤＯＴＰＭＥ、ＨＥＤＰ、ＤＴＴＰ、Ｎ３Ｓトリアミドチオール、ＤＡＤＳ、ＭＡＭＡ、ＤＡＤＴ、Ｎ２Ｓ４ジアミンテトラチオール、Ｎ２Ｐ２ジチオール−ビスホスフィン、６−ヒドラジノニコチン酸、プロピレンアミンオキシム、テトラアミン、シクラム、又はそれらの組合せである。
【０１５３】
一実施形態において、薬物は、アウリスタチン、チューブリシン又はピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）である。
【０１５４】
一実施形態において、アウリスタチンは、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）又はＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）である。
【０１５５】
一実施形態において、薬物は、メイタンシノイド、例えば、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）又はＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。
【０１５６】
放射性核種の例としては、３Ｈ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６２Ｃｕ、６５Ｚｎ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇｅ、７５Ｂｒ、７５Ｓｅ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、８０ｍＢｒ、８５Ｓｒ、８９Ｓｒ、９０Ｙ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、９９Ｍｏ及び９９ｍＴｃ、１０３Ｐｄ、１０３ｍＲｈ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｈ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、１０９Ｐｄ、１０９Ｐｔ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１３Ｓｎ、１１５Ｉｎ、１１７Ｓｎ、１１９Ｓｂ、１２１ｍＴｅ、１２１Ｉ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１２５Ｉ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、１３３Ｉ、１３３Ｘｅ、１４０Ｌａ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１５２Ｄｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６１Ｈｏ、１６１Ｔｂ、１６５Ｔｍ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１６９Ｅｒ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８８Ｗ、１８９ｍＯｓ、１８９Ｒｅ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、１９７Ｐｔ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、２０１Ｔｌ、２０３Ｈｇ、２１１Ａｔ、２１１Ｂｉ、２１１Ｐｂ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１５Ｐｏ、２１７Ａｔ、２１９Ｒｎ、２２１Ｆｒ、２２３Ｒａ、２２４Ａｃ、２２５Ａｃ、２２５Ｆｍ、２５２Ｃｆならびにそれらの組合せが挙げられる。
【０１５７】
一実施形態において、放射性核種は、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタン（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテニウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）、又はそれらの組合せを含み、又はそれからなる群から選択される。
【０１５８】
一実施形態において、放射性核種は、本開示のコンジュゲート化合物にキレート剤により付着している。
【０１５９】
一実施形態において、ペイロードは、例えば、アルブミン、アルブミン結合ポリペプチド、ＰＡＳ、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のβサブユニット、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ＸＴＥＮ、アルブミン結合小分子、又はそれらの組合せを含む血清半減期延長剤である。
【０１６０】
エフェクタ分子がポリマーである場合、それは、一般に、合成又は天然存在ポリマー、例えば、場合により置換されている直鎖もしくは分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンもしくはポリオキシアルキレンポリマー又は分枝鎖もしくは非分枝鎖多糖、例えば、ホモもしくはヘテロ多糖であり得る。
【０１６１】
上記合成ポリマー上に存在し得る具体的な任意選択置換基としては、１つ以上のヒドロキシ、メチル又はメトキシ基が挙げられる。
【０１６２】
具体的な天然存在ポリマーとしては、ラクトース、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、アルギン酸塩、セルロースアミロース、デキストラン、グリコゲン又はそれらの誘導体が挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、ポリシアル酸（ＰＳＡ）、ヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、炭水化物、多糖、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、ポリアルキレングリコール（ＰＡＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリカルボキシラート、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレン−コ−無水マレイン酸、ポリスチレン−コ−無水マレイン酸、ポリ（１−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール）（ＰＨＦ）、２−メタクリロイルオキシ−２’−エチルトリメチルアンモニウムホスファート（ＭＰＣ）である。一部の実施形態において、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。本発明の一実施形態において、ポリエチレングリコールは、分子量範囲が３００〜１０，０００，０００、５００〜１００，０００、１０００〜５０，０００、１５００〜３０，０００、２，０００〜２０，０００Ｄａ、３，０００〜５，０００Ｄａ、そして４，０００〜５，０００Ｄａである。他の実施形態において、ポリエチレングリコールは、分子量が約１，０００Ｄａ、約１，５００Ｄａ、約２，０００Ｄａ、約３，０００Ｄａ、約４，０００Ｄａ、約５，０００Ｄａ、約１０，０００Ｄａ、約２０，０００Ｄａ、約３０，０００Ｄａ、約４０，０００Ｄａ、約５０，０００Ｄａ以上である。これは、１〜７０００ＰＥＧモノマー単位、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００単位に変換され得る（本明細書中の他の場所で定義される）。
【０１６４】
一実施形態において、ペイロード又はポリペプチド（生体分子）は、視覚化ラベルを含む。視覚化ラベルとして、以下に限定されないが、発色団、フルオロフォア、蛍光タンパク質、燐光性色素、タンデム色素、粒子、ハプテン、酵素、放射性同位体、又はそれらの組合せが挙げられる。
【０１６５】
一実施形態において、可視化標識は、可視化ペプチドである。一部の態様において、可視化ペプチドは、インビトロ、インビボ、エクスビボ、又は任意のそれらの組合せのコンジュゲート化合物の可視化又は局在化を可能とする。一部の態様において、可視化ペプチドは、例えば、ビオチンアクセプターペプチド、リポ酸アクセプターペプチド、蛍光タンパク質、重ヒ素色素のライゲーション又は準安定テクネチウムをコンジュゲートさせるためのシステイン含有ペプチド、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベース近接アッセイのためのユーロピウム包接化合物をコンジュゲートさせるためのペプチド、又は任意のそれらの組合せである。一部の態様において、蛍光タンパク質は、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、又は任意のそれらの組合せである。一部の態様において、蛍光タンパク質は、フィコビリタンパク質、又はその誘導体である。
【０１６６】
蛍光タンパク質、特にフィコビリタンパク質は、タンデム色素により標識された標識試薬を作出するために有用である。これらのタンデム色素は、蛍光タンパク質及び発光スペクトルが蛍光タンパク質吸収スペクトルの波長からさらにシフトする場合により大きいストークスシフトを得る目的のためのフルオロフォアを含む。これは、発光蛍光が最大に最適化される場合、換言すると、皆無かそれに近い発光が蛍光タンパク質により再吸収される場合、試料中の低い量の標的を検出するために有効であり得る。この作業のため、蛍光タンパク質及びフルオロフォアは、エネルギー移動ペアとして機能し、蛍光タンパク質はフルオロフォアが吸収する波長において発光し、次いでフルオロフォアが、蛍光タンパク質のみを用いて得ることができたものよりも蛍光タンパク質から遠い波長において発光する。機能的組合せは、当分野において公知のフィコビリタンパク質及びスルホローダミンフルオロフォア、又はスルホン化シアニンフルオロフォアであり得る。フルオロフォアはエネルギードナーとして機能することもあり、蛍光タンパク質はエネルギーアクセプターである。
【０１６７】
他の態様において、重ヒ素色素は、４’，５’−ビス（１，３，２−ジチオアルソラン−２−イル）フルオレセイン（ＦｌＡｓＨ）である。一部の態様において、ビオチンアクセプターペプチドは、アビジン及びストレプトアビジンベース試薬のコンジュゲーションを容易にする。一部の態様において、リポ酸アクセプターペプチドは、結合したリポ酸へのチオール反応性プローブのコンジュゲーション又は蛍光リポ酸アナログの直接的ライゲーションを容易にする。
【０１６８】
一実施形態において、Ｒ１又はポリペプチド（特にＲ１）は、蛍光タグを含む。一部の態様において、蛍光タグは、例えば、フルオレセイン型色素、ローダミン型色素、ダンシル型色素、リサミン型色素、シアニン型色素、フィコエリスリン型色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ型色素、又は任意のそれらの組合せを含む。本明細書に開示のシステイン遺伝子操作抗体又はその抗原結合断片へのコンジュゲーションに好適なフルオロフォアとしては、限定されるものではないが、ピレン（対応する誘導体化合物のいずれかを含む）、アントラセン、ナフタレン、アクリジン、スチルベン、インドール又はベンズインドール、オキサゾール又はベンズオキサゾール、チアゾール又はベンゾチアゾール、４−アミノ−７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）、シアニン（任意の対応する化合物を含む）、カルボシアニン（任意の対応する化合物を含む）、カルボスチリル、ポルフィリン、サリチレート、アントラニレート、アズレン、ペリレン、ピリジン、キノリン、ボラポリアザインダセン（任意の対応する化合物を含む）、キサンテン（任意の対応する化合物を含む）、オキサジン（任意の対応する化合物を含む）又はベンズオキサジン、カルバジン（任意の対応する化合物を含む）、フェナレノン、クマリン（対応する開示化合物を含む）、ベンゾフラン（対応する化合物を含む）及びベンズフェナレノン（任意の対応する化合物を含む）ならびにそれらの誘導体が挙げられる。本明細書において使用されるオキサジンとしては、レゾルフィン（任意の対応する化合物を含む）、アミノオキサジノン、ジアミノオキサジン、及びそれらのベンゾ置換アナログ、又は任意のそれらの組合せが挙げられる。
【０１６９】
ある態様において、フルオロフォアとしては、例えば、、キサンテン（ロドール、ローダミン、フルオレセイン及びそれらの誘導体）クマリン、シアニン、ピレン、オキサジン、ボラポリアザインダセン、又は任意のそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、このようなフルオロフォアは、例えば、スルホン化キサンテン、フッ素化キサンテン、スルホン化クマリン、フッ素化クマリン、スルホン化シアニン、又は任意のそれらの組合せである。ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（登録商標）、ＤＹＬＩＧＨＴ（登録商標）、ＣＹ  ＤＹＥＳ（登録商標）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮ（登録商標）、ＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＬＵＥ（登録商標）、ＩＲＤＹＥＳ（登録商標）、ＦＡＭ（登録商標）、ＦＩＴＣ（登録商標）、及びＲＯＸ（登録商標）の商品名のもと販売され、一般に公知の色素も挙げられる。
【０１７０】
本明細書に開示のリンカー「Ｚ」を介して付着しているフルオロフォアの選択は、最終化合物の吸収及び蛍光発光特性を決定する。使用することができるフルオロフォア標識の物理的特性としては、限定されるものではないが、スペクトル特徴（吸収、発光及びストークスシフト）、蛍光強度、寿命、分極及び光退色速度、又はそれらの組合せが挙げられる。これらの物理的特性の全てを使用してあるフルオロフォアを別のものから区別し、それにより多重化分析を可能とすることができる。ある態様において、フルオロフォアは、４８０ｎｍよりも長い波長における吸収最大を有する。一部の態様において、フルオロフォアは、４８８ｎｍから５１４ｎｍ（特にアルゴンイオンレーザー励起源の出力による励起に好適）においてもしくはその近くで、又は５４６ｎｍ（特に水銀アークランプによる励起に好適）の近くで吸収する。一部の態様において、フルオロフォアは、組織又は生物全体の適用についてＮＩＲ（近赤外領域）中で発光し得る。蛍光標識の他の所望の特性としては、例えば、抗体の標識を細胞又は生物（例えば、生存動物）中で実施すべき場合、細胞浸透性及び低い毒性を挙げることができる。
【０１７１】
一実施形態において、ポリペプチドは、捕捉タグを含む。一部の態様において、捕捉タグは、ビオチン又はＨｉｓ６タグである。ビオチンは、有用である。それというのも、それは酵素系中で機能して検出可能なシグナルをさらに増幅させ得、単離目的のための親和性クロマトグラフィ中で使用することができるタグとしても機能し得るためである。検出目的のため、ビオチンについての親和性を有する酵素コンジュゲート、例えば、アビジン−ＨＲＰを使用することができる。
【０１７２】
続いて、ペルオキシダーゼ基質を添加して検出可能なシグナルを生成することができる。ビオチンに加え、他のハプテン、例として、ホルモン、天然存在及び合成薬物、汚染物質、アレルゲン、エフェクタ分子、成長因子、ケモカイン、サイトカイン、リンホカイン、アミノ酸、ペプチド、化学中間産物、ヌクレオチドなどを使用することができる。
【０１７３】
一実施形態において、ペイロードは、酵素を含む。酵素は、有効な標識である。それというのも、検出可能なシグナルの増幅を得ることができ、アッセイ感度の増加をもたらすためである。酵素自体は検出可能な応答を生成しないことが多いが、それが適切な基質により接触される場合に基質を分解するように機能し、その結果、変換された基質が蛍光、発色又は発光シグナルを生成する。酵素は、検出可能なシグナルを増幅させる。それというのも、標識試薬上の１つの酵素が、検出可能なシグナルに変換される複数の基質をもたらし得るためである。酵素基質は、計測可能な生成物、例えば、発色、蛍光又は化学ルミネセンスを生じさせるように選択する。このような基質は、当分野において広く使用され、当分野において公知である。
【０１７４】
一部の実施形態において、発色又は蛍光発生基質及び酵素の組合せは、酸化還元酵素、例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及び基質、例えば、区別される色を生じさせる３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及び３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）（それぞれ、褐色及び赤色）を使用する。検出可能産物を生じさせる他の発色オキシドレダクターゼ基質としては、限定されるものではないが、２，２−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−ジアニシジン、５−アミノサリチル酸、４−クロロ−１−ナフトールが挙げられる。蛍光発生基質としては、限定されるものではないが、ホモバニリン酸又は４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル酢酸、還元フェノキサジン及び還元ベンゾチアジン、例として、Ａｍｐｌｅｘ（登録商標）Ｒｅｄ試薬及びそのバリアントならびに還元ジヒドロキサンテン、例として、ジヒドロフルオレセイン及びジヒドロローダミン、例として、ジヒドロローダミン１２３が挙げられる。
【０１７５】
本開示は、チラミド試薬であるペルオキシダーゼ基質を用いることに及び、それは、酵素の作用前に固有に検出可能であり得るが、チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）として記載される方法におけるペルオキシダーゼの作用により「位置固定される」という点で、ペルオキシダーゼ基質のユニーククラスを表す。これらの基質は、顕微鏡観察、フローサイトメトリー、光学走査及び蛍光光度法によるそれらの後続の検出のために細胞、組織又はアレイである試料中の標的を標識するために広く活用される。
【０１７６】
本開示は、発色（及び一部の場合、蛍光発生）基質及び酵素組合せに及び、それは、ホスファターゼ酵素、例えば、酸性ホスファターゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はそのようなホスファターゼの組換え型を、発色基質、例えば、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、６−クロロ−３−インドリルホスフェート、５−ブロモ−６−クロロ−３−インドリルホスフェート、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、もしくはｏ−ニトロフェニルホスフェートとの、又は蛍光発生基質、例えば、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリニルホスフェート（ＤｉＦＭＵＰ、米国特許第５，８３０，９１２号明細書）フルオレセインジホスフェート、３−Ｏ−メチルフルオレセインホスフェート、レゾルフィンホスフェート、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）ホスフェート（ＤＤＡＯホスフェート）、もしくはＥＬＦ９７、ＥＬＦ３９もしくは関連ホスフェートとの組合せで使用することもある。
【０１７７】
本開示は又、グリコシダーゼ、特にベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ及びベータ−グルコシダーゼを含むペイロードに及び、それらは追加の好適な酵素である。適切な発色基質としては、限定されるものではないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）及び類似のインドリルガラクトシド、グルコシド、ならびにグルクロニド、ｏ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）及びｐ−ニトロフェニルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。一部の実施形態において、蛍光発生基質としては、レゾルフィンベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、フルオレセインジガラクトシド（ＦＤＧ）、フルオレセインジグルクロニド及びそれらの構造バリアント、４−メチルウンベリフェリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド、カルボキシウンベリフェリルベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドならびにフッ素化クマリンベータ−Ｄ−ガラクトピラノシドが挙げられる。
【０１７８】
追加の酵素としては、限定されるものではないが、ヒドロラーゼ、例えば、コリンエステラーゼ及びペプチダーゼ、オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ及びシトクロムオキシダーゼ、ならびに好適な基質が公知のレダクターゼが挙げられる。
【０１７９】
化学ルミネセンスを生成する酵素及びその適切な基質が、本開示の分子中への組込みに有用である。これらとして、以下に限定されないが、ルシフェラーゼ及びエクオリンの天然の形態及び組換え形態が挙げられる。安定したジオキセタン、ルミノール、イソルミノール、及びアクリジニウムエステルを含有するもの等の、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、及びオキシダーゼ用の化学ルミネセンス生成基質が、付加的に利益をもたらす。
【０１８０】
他の定義
提供される実施形態を詳述する前に、本開示は具体的な組成物にもプロセスステップにも限定されるものではなく、それ自体変動し得ることを理解すべきである。本明細書及び付属の特許請求の範囲において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が特に明示しない限り、複数の参照物を含む。用語「ａ」（又は「ａｎ」）は、ならびに用語「１つ以上の」及び「少なくとも１つ」は、本明細書において互換的に使用することができる。
【０１８１】
さらに「及び／又は」は、本明細書で使用される場合、他方を伴って又は伴わずに、２つの規定の特徴部又は構成要素のそれぞれを具体的に開示すると解釈すべきである。したがって、本明細書において「Ａ及び／又はＢ」などの語句において使用される及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句において使用される用語「及び／又は」は、以下の態様のそれぞれを包含するものとする：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【０１８２】
特に定義のない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が関する技術分野の当業者が一般に理解するものと同一の意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ、２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及びＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示において使用される用語の多くについて一般的辞書を当業者に提供する。
【０１８３】
単位、接頭辞、及び記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）により容認された形式で表示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を包含する。特に記載のない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右に記載される。本明細書に提供される見出しは、本開示の種々の態様を限定するものではなく、本明細書を全体として参照することにより把握され得るものである。したがって、この直後に定義される用語は、本明細書を全体として参照することにより、さらに完全に定義される。
【０１８４】
アミノ酸は、本明細書中で、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される、一般的に知られている３文字記号又は１文字記号のいずれかによって言及される。ヌクレオチドも同様に、一般的に受け入れられている１文字コードによって言及される。抗体内のアミノ酸残基の位置が数字によって言及される場合、ナンバリングは、カバットナンバリング系に従う。
【０１８５】
用語「対象」は、特定の治療のレシピエントになり得る任意の動物（例えば、哺乳動物）、例として、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを指す。典型的には、用語「対象」及び「患者」は、ヒト対象への言及において互換的に使用することができる。
【０１８６】
用語「医薬組成物」は、活性成分（例えば、本明細書に開示のコンジュゲート化合物）の生物学的活性が有効であることを許容するような形態であり、組成物が投与される対象に対して許容されない毒性である追加の構成要素を含有しない製剤を指す。このような組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。このような組成物は、無菌であり得る。
【０１８７】
本明細書に開示のコンジュゲート化合物の「有効量」は、具体的に記述される目的を実施するために十分な量である。「有効量」は、記述される目的に関して経験的に、及び定型的に決定することができる。
【０１８８】
用語「治療有効量」は、対象又は哺乳動物における疾患又は障害を「治療する」ために有効な本明細書に開示のコンジュゲート化合物又は他の薬物の量を指す。
【０１８９】
語「標識」は、本明細書において使用される場合、「標識された」コンジュゲート化合物を生成するために本明細書に開示の遺伝子操作抗体又はその断片（例えば、システイン遺伝子操作抗体又はその断片）に直接又は間接的にコンジュゲートしている検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、それ自体により検出可能であり得（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能である基質化合物又は組成物の化学変化を触媒し得る。
【０１９０】
例えば、「治療する」又は「治療」又は「治療すること」という用語は、（１）診断された病態又は障害の症状を治癒し、減速させ、軽減し、及び／又はその進行を停止させる治療的措置、ならびに（２）標的化される病状又は障害の発症を予防し、及び／又は遅延させる予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）的措置の両方を指す。したがって、治療を必要とされる者としては、すでに障害を有する者；障害に罹患しやすい者；及び障害を予防すべき者が挙げられる。ある態様において、患者が、例えば、疾患又は病態、例えば、あるタイプの癌の完全、部分的又は一過的寛解を示す場合、対象は、本開示の方法により疾患又は病態、例えば、癌について良好に「治療」される。
【０１９１】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー、例として、ＤＮＡ及びＲＮＡを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／もしくはそれらのアナログ、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びそれらのアナログを含み得る。
【０１９２】
本明細書において使用される用語「ベクター」は、宿主細胞中に目的の１つ以上の遺伝子又は配列を送達し、一部の態様において、発現し得る構築物を指す。ベクターの例としては、限定されるものではないが、ウイルス性ベクター、ネイキッドＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター、カチオン縮合剤と会合しているＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に封入されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、ならびにある真核細胞、例えば、プロデューサー細胞が挙げられる。
【０１９３】
本明細書において使用される用語「〜を含む」は、本明細書に関して「例として、〜が挙げられる」と解釈すべきである。
【０１９４】
本明細書において使用される「本開示において用いられる」は、本開示の方法において用いられること、本開示の中間体を含む分子中で用いられること、又はその両方を、使用される用語の文脈に応じて適宜指す。
【０１９５】
言語「含む」によりどの態様が本明細書に記載されようとも、「〜からなる」及び／又は「本質的に〜からなる」に関して記載される他の点で類似の態様も提供されることが理解される。
【０１９６】
本明細書に記載の任意の積極的実施形態又はそれらの組合せは、消極的除外、すなわち、ディスクレーマーを基礎とし得る。
【０１９７】
組成物
本開示は、本明細書に記載の分子（例えば、本開示の加水分解された分子）を含む組成物、特に、本開示の分子及び医薬賦形剤、希釈剤又は担体を含む医薬組成物（又は診断組成物）に及ぶ。
【０１９８】
組成物は、通常、薬学的に許容可能な担体を通常含む無菌医薬組成物の一部として供給される。本発明の医薬組成物は、ワクチン配合物に関して薬学的に許容可能なアジュバントをさらに含み得る。
【０１９９】
本開示は又、前記組成物を調製する方法、例えば、本開示の分子、例えば、本開示の加水分解された分子を、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と一緒に添加し、混合することを含む、医薬又は診断組成物の調製に及ぶ。
【０２００】
本開示の抗体は、医薬もしくは診断組成物中の唯一の活性成分であり得、又は他の活性成分を伴い得る。
【０２０１】
医薬組成物は、好適には、治療有効量の本開示による分子を含む。本明細書において使用される用語「治療有効量」は、標的疾患もしくは病態を治療、改善もしくは予防するため、又は検出可能な治療もしくは予防効果を示すために必要とされる治療剤の量を指す。治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類のいずれかにおいて最初に推定することができる。動物モデルを使用して適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、このような情報を使用してヒトにおける有用な用量及び投与経路を決定することができる。
【０２０２】
組成物は、患者に個々に投与することができ、又は他の薬剤、薬物もしくはホルモンとの組合せで（例えば、同時に、連続的に又は別個に）投与することができる。
【０２０３】
薬学的に許容可能な担体は、それ自体、組成物を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導すべきでなく、毒性であるべきでない。好適な担体は、大型の緩慢に代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子であり得る。
【０２０４】
治療組成物中の薬学的に許容可能な担体は、液体、例えば、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールをさらに含有し得る。さらに、助剤物質、例えば、湿潤剤及び乳化剤又はｐＨ緩衝物質がそのような組成物中に存在し得る。このような担体により、医薬組成物を患者による摂取のために錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤及び懸濁液として配合することができる。
【０２０５】
好適な投与形態としては、非経口投与に好適な形態、例えば、注射又は注入によるもの、例えば、ボーラス注射又は連続注入によるものが挙げられる。生成物が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液剤、液剤、又はエマルジョンの形態をとり得、それは配合剤、例えば、懸濁化剤、保存剤、安定剤及び／又は分散剤を含有し得る。あるいは、本開示の分子は、適切な無菌液体による使用前の再構成のための乾燥形態であり得る。
【０２０６】
本開示による配合物において、好適には、最終配合物のｐＨは、抗体の等電点の値と類似せず、例えば、配合物のｐＨが７である場合、８〜９以上のｐＩが適切であり得る。理論により拘束されるものではないが、これは、最終的に、改善された安定性を有する最終配合物を提供し得、例えば、抗体は溶液中で残留することが考えられる。
【０２０７】
本発明の医薬組成物は、任意数の経路、例として、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレット参照）、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路により投与することができる。皮下噴射器を使用して本発明の医薬組成物を投与することもできる。典型的には、治療組成物は、注射剤として、溶液剤又は懸濁液剤のいずれかとして調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の液剤、又は懸濁液剤に好適な固体形態を調製することもできる。
【０２０８】
組成物の直接送達は、一般に、注射、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内送達により達成することができ、又は組織の間質腔に送達される。組成物は、病変中に投与することもできる。投薬治療は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであり得る。
【０２０９】
薬学的に許容可能な担体の詳細な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎ．Ｊ．１９９１）において入手可能である。
【０２１０】
治療
本開示は又、治療有効量の本開示による分子又は組成物、例えば、それを含む医薬組成物を投与することにより、治療が必要とされる患者を治療する方法に及ぶ。
【０２１１】
一実施形態において、治療において使用される、特に、本明細書に記載の疾患又は病態、例えば、癌の治療において使用される本開示の分子又はそれを含む組成物が提供される。
【０２１２】
一実施形態において、本明細書に記載の病態又は疾患、例えば、癌を治療するための医薬品の製造における、本開示の分子又はそれを含む組成物の使用が提供される。
【０２１３】
したがって、本発明の分子は、病態の治療及び／又は予防において有用である。
【０２１４】
本発明により提供される抗体は、疾患又は障害、例として、炎症疾患及び傷害、免疫疾患及び障害、線維障害及び癌の治療において有用である。
【０２１５】
用語「炎症疾患」又は「障害」及び「免疫障害又は障害」は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、スティル病、マックス・ウェルズ病、乾癬、クローン病、潰瘍性大腸炎、ＳＬＥ（全身性エリテマトーデス）、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、多発性硬化症、血管炎、Ｉ型糖尿病、移植及び移植片対宿主病を含む。
【０２１６】
用語「線維障害」は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、全身性硬化症（又は強皮症）、腎線維症、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、高血圧症、末期腎不全、腹膜線維症（連続携行式腹膜透析）、肝硬変、加齢黄斑変性（ＡＲＭＤ）、網膜症、心反応性線維症、瘢痕化、ケロイド、火傷、皮膚潰瘍、血管形成術、冠状動脈バイパス外科手術、関節形成及び白内障手術を含む。
【０２１７】
用語「癌」は、皮膚中に見出される上皮、又はより一般に、身体器官の内層、例えば、乳房、卵巣、前立腺、結腸、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱又は腸から生じる悪性新生物を含む。癌は、隣接組織中に浸潤し、遠位器官、例えば、骨、肝臓、肺又は脳に拡散（転移）する傾向がある。
【０２１８】
治療すべき対象は、動物であり得る。しかしながら、１つ以上の実施形態において、組成物は、ヒト対象への投与に適合される。
【０２１９】
本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるべきである。
【０２２０】
特定の特徴／要素を含む本発明の実施形態は、関連する要素／特徴から「なる」又は「本質的になる」代替の実施形態にも及ぶことが意図されている。
【０２２１】
技術的な必要に応じて、本発明の実施形態は、組み合わされ得る。
【０２２２】
特許及び出願等の技術参考文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２２３】
本明細書中で具体的且つ明示的に詳述されるいずれの実施形態も、単独で、又は１つ以上の更なる実施形態と組み合わされて、除くクレーム（ｄｉｓｃｌａｉｍｅｒ）の基礎を形成し得る。
【０２２４】
本発明はさらに、添付の図を参照する以下の実施例において、単なる実例として説明される：
【０２２５】
頭字語
ＮＮＡＡ  非天然のアミノ酸
ＤＡＲ    薬物：抗体比（通常、コンジュゲートされたあらゆる種、例えばリンカーについての比率を説明するのにも用いられる）。
【実施例】
【０２２６】
実施例１．ＡＤＣの生成のためのフラン−マレイミド反応
ＡＤＣを生成するコンジュゲーション様式として、フラン−マレイミド反応を評価した。フラン−ＮＨＳを、ＳｙｎＣｈｅｍ，Ｉｎｃ．から９０％の純度にて得た。
【０２２７】
ｍＡｂ上へのフラン官能基の導入：ＮＨＳ−エステル活性フランリンカーとのリシン第一級アミンの反応によって、フランジエン官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ｍＡｂ−フランリンカーと呼ばれる、修飾ｍＡｂとランダムにコンジュゲートしたアミド結合フラン基をもたらした。なお、ｍＡｂ−フラン−リンカーは、特定の図において、ｍＡｂ−フランとして表され得る。明確にするための図のキャプション参照。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１５ｍｇ  ｍＡｂ、０．１μｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、３０μＬフラン−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、０．３μｍｏｌ、３当量）を加えた。反応を氷上で５分間、次いで室温にて１時間、連続混合しながら進めた。反応の進行を、質量分析によって監視して、フラン−ＮＨＳを、約２フラン／ｍＡｂのコンジュゲーションの程度が達成されるまで、３０μＬ部中に加えた。合計で、フラン−ＮＨＳの３付加を実行し、総容量で９０μＬ（０．９μｍｏｌ、９当量）を加えた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。
【化２０】
2020521735.tif 000022
【０２２８】
スキーム１．１．ｍＡｂ上へのフラン官能基の導入。
マレイミド−ＭＭＡＥとのフラン修飾ｍＡｂの反応：ＭＭＡＥ上に含有されるアルキルマレイミド基又はフェニルマレイミド基へのフラン基のディールス−アルダー４＋２付加環化カップリングを通して、ＭＭＡＥ  ＡＤＣペイロードをｍＡｂ−フラン−リンカー上に取り付けた。最初に、ｍＡｂ−フラン−リンカー溶液（２８６μＬ、３．５ｍｇ／ｍＬ、６．７ｎｍｏｌ、１当量）を、１０％ｖ／ｖ  ＮａＨ２ＰＯ４及び２０％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯと組み合わせた。次に、ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ溶液（１０μＬのＤＭＡｃ中１０ｍＭストック液、１００ｎｍｏｌ、１５当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を、周囲雰囲気下でキャッピングして、３７℃にて２０時間混合しながら反応を進めた。２０時間の反応期間が完了した後、Ｎ−アセチルシステイン（８μＬの１００ｍＭ溶液、８当量）を加えて、溶液をさらに、室温にて１５分間インキュベートして、マレイミド基をクエンチした。クエンチングの後、以下に記載する脱グリコシル化質量分析による分析に先立って、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、コンジュゲートを精製した。Ａｌｌｏｃ−リシンを、上に記載するフラン−リンカー修飾ｍＡｂと、７５ｍＭ  ＮａＯＨ（１０μＬ、２μｍｏｌ、３００当量）中２００ｍＭストック液を用いて反応させた。
【化２１】
2020521735.tif 000023
【０２２９】
スキーム１．２．Ａ）マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−フラン−リンカーの反応、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ及びＰＭ−ＭＭＡＥの化学構造。
質量分析：最初に、５０μＬサンプル（１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ）を５μＬグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）及び５μＬ  Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  ＥｎｄｏＳ（ＰＢＳ中１：１０の希釈、２０，０００単位／ｍＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と組み合わせてから３７℃にて１時間インキュベートすることによって、ｍＡｂ又はｍＡｂコンジュゲートを、ＥｎｄｏＳ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で脱グリコシル化した。５μＬ  Ｂｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ  ＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の付加及び３７℃にて１０分間のインキュベーションによって、還元サンプルを調製した。ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００  Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ＲＲＨＤ、１．８ミクロン、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６５２０Ｂ  Ｑ−ＴＯＦ質量スペクトロメータを用いて、質量分析を実行した。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）のパラメータは、以下の通りであった：流量、０．５ｍｌ／分；移動相Ａは、ＨＰＬＣグレードのＨ２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であった。カラムを、９０％Ａ／１０％Ｂ中で平衡化させた。これを又、ｍＡｂサンプルを脱塩してから、２０％Ａ／８０％Ｂ中に溶出するのに用いた。１００〜３０００ｍ／ｚ、正極性、３５０℃のガス温度、４８ｌｂ／ｉｎ２のネブライザ圧力、及び５，０００Ｖのキャピラリ電圧についての質量スペクトルデータを収集した。ベンダーが供給する（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｖ．Ｂ．０４．００）ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、データを分析して、デコンボリューションしたスペクトル由来のピーク強度を用いて、各サンプルにおける種の相対割合を導き出した。
【０２３０】
図１．１．フラン−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析。
【０２３１】
図１．２．ＭＭＡＥとの２０時間の反応後のｍＡｂ−フラン−リンカーサンプルの還元脱グリコシル化質量スペクトル。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ重鎖のみの質量領域を示している。類似の結果が、ｍＡｂ軽鎖について観察された。ＭＭＡＥを観察して、フラン有り又は無しのｍＡｂ重鎖が増しており、非特異的コンジュゲーションを示した。
【０２３２】
【表１】
2020521735.tif 000024
【０２３３】
図１．３．ｍＡｂ−フラン−リンカーａｌｌｏｃリシン反応生成物の還元脱グリコシル化質量分析。コンジュゲートの予想される質量に対応するピークは観察されなかった。ａｌｌｏｃ−リシンの構造を、グラフの下に示す。
【０２３４】
アミン反応性フラン−ＮＨＳ分子を用いて、抗体中へのフラン官能基の導入を達成した。ｍＡｂ修飾反応に用いたフラン−ＮＨＳの量によって、フラン官能基の程度を制御した。モルフィード比を然るべく調整することによって、フランを少なからず達成することができる。マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−フラン−リンカーの反応は、非効率的且つ非特異的であった。３７℃にて２０時間の反応時間の後でさえ、アルキルマレイミドペイロードもフェニルマレイミドペイロードも、５％超の特異的コンジュゲーションを達成しなかった。ｍＡｂに対する非特異的反応（おそらくアミンへのマイケル付加を介する）は、ＰＭ−ＭＭＡＥについて、ＡＭ−ＭＭＡＥと比較して１２倍高く、このマレイミド基のより高い反応性が示された。さらに、非特異的反応（おそらくアミンに対する）は、ＰＭ−マレイミドＭＭＡＥペイロードについて、フランへの特異的反応よりも約４倍高いようであった。フラン−マレイミドカップリングは、ＡＤＣの生成に適用可能でない。
【０２３５】
実施例２．シクロペンタジエン（ＣＰ１）含有化合物の合成
架橋剤及び非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）を、図２．１に示す一般的な設計に基づいて調製した。
【０２３６】
材料及び方法：特に明記しない限り、反応を、試薬グレードの溶媒を用いて、Ｎ２雰囲気下で行った。ＤＣＭ及びトルエンを、３Åモレキュラーシーブ上で貯蔵した。ＴＨＦを、活性アルミナのカラムに通させた。商業的に得た全ての試薬を、受領したままの状態で用いた。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ２５４プレコーテッドプレート（０．２５ｍｍ）で行って、ＵＶ光（２５４ｎｍ）への曝露によって視覚化し、又はｐ−アニスアルデヒド、ニンヒドリン、若しくは過マンガン酸カリウムで染色した。順相シリカゲル（６０Å、０．０４０〜０．０６３ｍｍ、Ｇｅｄｕｒａｎ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを実行した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録して（４００、５００、又は６００ＭＨｚ）、重水素化溶媒シグナルに関して報告する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、以下の通り報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度、カップリング定数（Ｈｚ）、及び積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録した（１００、１２５、又は１５０ＭＨｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、化学シフト（δｐｐｍ）に関して報告する。質量スペクトルを、ＵＣ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから、電界脱離（ＦＤ）源を有する（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）ＧＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ高解像度飛行時間型質量スペクトロメータで得た。
【０２３７】
ＣＰ１−ＮＮＡＡ（４）の合成
【化２２】
2020521735.tif 000025
２−（シクロペンタジエニル）エタノール異性体（１）：
メチルブロモアセタート（６．０ｍＬ、６３ｍｍｏｌ、１．０５当量）を、ＴＨＦ（６０ｍＬ）に加えて、−７８℃に冷却した。シクロペンタジエニドナトリウム（２Ｍ  ＴＨＦ溶液、３０ｍＬ、６０ｍｍｏｌ、１当量）を、１０分にわたって滴加した。反応物を、−７８℃にて２時間撹拌した。反応を、Ｈ２Ｏ（６ｍＬ）及びシリカゲル（６ｇ）でクエンチして、室温に温めた。反応混合物をシリカのプラグで濾過してから、ＤＣＭ（１００ｍＬ）でリンスした。有機層を組み合わせて、溶媒を除去して、メチル２−（シクロペンタジエニル）アセタート異性体（１：１）を茶色の油として得、これを次の工程に直接用いた。
【０２３８】
ＬＡＨ（４．５５ｇ、１２０ｍｍｏｌ、２当量）を、ＴＨＦ（３００ｍＬ）に加えて、０℃に冷却した。ＴＨＦ（１０ｍＬ）中に溶解した粗メチル２−（シクロペンタジエニル）アセタート（６０ｍｍｏｌ）を、４部中に１時間にわたって滴加した。反応物を室温に温めて、出発材料の消費まで撹拌した（ＴＬＣ、２時間）。反応物を０℃に冷却して、Ｈ２Ｏ（１０ｍＬ）に続くＮａＯＨ（Ｈ２Ｏ中４Ｍ、５ｍＬ）の滴下により、ゆっくりクエンチした。Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）を加えて、混合物を濾過して、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）でリンスした。濾液を組み合わせて、溶媒を除去した。残留物を、ブライン（１００ｍＬ）中に懸濁させて、Ｅｔ２Ｏ（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせて、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去した。残留物を、シリカのプラグ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１）で濾過して、溶媒を除去して、琥珀色の油として１（５．４５ｇ、８３％）を得た。二量体化を妨げるために、１をベンゼンマトリックス内で凍結して貯蔵するべきである。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，４：１）：０．１１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．５０−６．１３（ｍ，３Ｈ），３．８１（ｔｄ，Ｊ＝６．３，１０．１Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．９５（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），２．７０（ｄｔ，Ｊ＝１．２，６．５Ｈｚ，１Ｈ），２．６６（ｄｔ，Ｊ＝１．４，６．４Ｈｚ，１Ｈ），１．５２（ｓ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【化２３】
2020521735.tif 000026
【０２３９】
２−（シクロペンタジエニル）エチル４−ニトロフェニルカルボナート異性体（２）：
２（２．８６ｇ、２６．０ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）に加えて、０℃に冷却した。ピリジン（５．２ｍＬ、６５ｍｍｏｌ、２．５当量）に続いて、４−ニトロフェニルクロロホルマート（５．７６ｇ、２８．６ｍｍｏｌ、１．１当量）を、２部中に１０分にわたって加えた。氷浴を取り除いて、反応物を、出発材料の消費まで撹拌した（ＴＬＣ、４０分）。反応物を分液漏斗中に注いで、Ｈ２Ｏ中飽和ＮＨ４Ｃｌ（１００ｍＬ）で洗浄した。水層を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせて、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去した。残留物を、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１）にかけて、黄色の油として２（５．６９ｇ、８０％）を得、これをフリーザ内で固めた。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，４：１）：０．４３；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．３４−８．２４（ｍ，２Ｈ），７．４０−７．３４（ｍ，２Ｈ），６．５６−６．１３（ｍ，３Ｈ），４．４７（ｔｄ，Ｊ＝６．８，１０．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０２（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．９８（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１Ｈ），２．８８（ｄｔｄ，Ｊ＝１．０，６．９，１６．１Ｈｚ，２Ｈ）ｐｐｍ．
【化２４】
2020521735.tif 000027
【０２４０】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（２−（シクロペンタジエニル）エチルホルマート）−ＯＨ異性体（３）：
２（３．６０ｇ、１３．１ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ（３０ｍＬ）に加えてから、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（５．７８ｇ、１５．７ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（５．４ｍＬ、３２ｍｍｏｌ、２．４当量）を加えた。反応物を、出発材料の消費まで撹拌し（ＮＭＲ、３．５時間）、その後、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１４０ｍＬ）中に注いだ。水層を、ＨＣｌ（１Ｍ、６０ｍＬ）で酸性化して、分液漏斗に注いで、層を分離した。水層を、ＥｔＯＡｃ（２×１００ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせて、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１、続いてＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、８９：１０：１）にかけて、白色の泡として３（４．７３ｇ、７２％）を得た。
Ｒｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ，８９：１０：１）：０．５０；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．７６（ｄ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．６６−７．５６（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），６．５７−５．９６（ｍ，３Ｈ），５．８５−５．５４（ｍ，１Ｈ），４．８４−４．１１（ｍ，７Ｈ），３．２７−２．６１（ｍ，６Ｈ），１．９９−１．１１（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
【化２５】
2020521735.tif 000028
【０２４１】
ＣＰ１−ＮＮＡＡ（４）：
３（４．６１ｇ、９．１３ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ（１３０ｍＬ）に加えてから、ピペリジン（１４．４ｍＬ）を加えた。反応物を、出発材料の消費まで撹拌し（ＴＬＣ、９０分）、その後、溶媒を除去した。Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を残留物に加えて、懸濁液を５分間超音波処理した。懸濁液を濾過して、Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）でリンスした。固体をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中に懸濁して、１０分間撹拌して、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍＬ）を加えて、懸濁液を濾過して、Ｅｔ２Ｏ（５０ｍＬ）でリンスした。化合物を減圧下で乾燥させて、黄褐色の粉末として４（２．１５ｇ、８４％）を得た。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ４＋一滴のＴＦＡ）δ  ６．５３−６．０７（ｍ，３Ｈ），４．２９−４．１１（ｍ，２Ｈ），３．９６（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ），３．１１（ｔ，Ｊ＝１．０Ｈｚ，２Ｈ），３．０１−２．６２（ｍ，３Ｈ），２．０２−１．８１（ｍ，２Ｈ），１．６２−１．３５（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；ＭＳ（ＦＤ）精密質量Ｃ１４Ｈ２２Ｎ２Ｏ４［Ｍ＋Ｈ］＋：２８３．１７，実測値：２８３．１９．
【０２４２】
ＣＰ１−ＮＨＳ（６）の合成
【化２６】
2020521735.tif 000029
４−（２−（シクロペンタジエニル）エトキシ）−４−オキソブタン酸異性体（５）：
ＤＣＭ（１．５ｍＬ）を、１（０．３３ｇ、３．０ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。Ｅｔ３Ｎ（０．４２ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、０．１当量）、及び無水コハク酸（０．３３ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えて、反応物を、空気雰囲気下でキャッピングして、出発材料の消費まで室温にて撹拌した（ＴＬＣ、６０分）。反応混合物を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）と共に分液漏斗中に注いで、水性ＨＣｌ（１Ｍ、５０ｍＬ）に続いてＨ２Ｏ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層をＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、黄褐色の粉末として５（０．５７ｇ、９０％）を得た。
Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）：０．６７；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １１．４９（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．４９−６．０５（ｍ，３Ｈ），４．２７（ｔｄ，Ｊ＝７．０，９．０Ｈｚ，２Ｈ），２．９４（ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８０−２．５６（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ．
【化２７】
2020521735.tif 000030
【０２４３】
ＣＰ１−ＮＨＳ（６）：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）を、５（０．４２ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。ＮＨＳ（０．３２ｇ、２．８ｍｍｏｌ、１．４当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（０．４６ｇ、２．４ｍｍｏｌ、１．２当量）、及びＤＣＭ（５ｍＬ）を加えて、反応物を、空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１）にかけて、澄明な、粘性油として６（０．４８ｇ、７８％）を得た。ＣＰ１−ＮＨＳは、抗体へのコンジュゲーション後にＣＰ１−リンカーと呼ばれる。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，１：１）：０．３８；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．４９−６．４０（ｍ，３Ｈ），６．３１（ｄｄ，Ｊ＝１．２，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｔｄ，Ｊ＝１．５，２．８Ｈｚ，１Ｈ），６．１１（ｔｄ，Ｊ＝１．８，３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．３０（ｔｄ，Ｊ＝７．０，９．０Ｈｚ，４Ｈ），３．００−２．９０（ｍ，８Ｈ），２．８５（ｂｒ．ｓ．，８Ｈ），２．８０−２．６８（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７０．８，１７０．８，１６８．９，１６８．８，１６７．６，１６７．６，１４４．３，１４２．３，１３４．２，１３４．１，１３２．３，１３１．４，１２８．４，１２８．０，６４．５，６４．２，４３．５，４１．４，２９．７，２９．０，２８．７，２６．２，２５．５  ｐｐｍ．
【０２４４】
シクロペンタジエン（ＣＰ）官能化非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）の合成を、メチルブロモアセタートとの市販のＮａＣｐの反応から開始した。粗エステルを、ＬＡＨでアルコール１に還元し、異性体の混合物（約１：１）として得た。１は、−２０℃にて貯蔵すると二量体化することとなり、ベンゼンマトリックス内で凍結して貯蔵するか、直ちに用いるべきである。４−ニトロフェニルクロロホルマートとの１の反応により、活性カルバマート２が生じた。これは、−２０℃にて数週間貯蔵することができる。リシン銅（ｃｏｐｐｅｒ  ｌｙｓｉｎａｔｅ）との２の反応を試みたが、８−ヒドロキシキノリン又はＥＤＴＡによる処理後のＮＮＡＡ  ４の単離は、効果的でなかった。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨとの２の反応により、７１％（又はトリホスゲンを用いて１から直接的に、３８％）のＢｏｃ保護ＮＮＡＡが得られたが、ＴＦＡ、ギ酸、又はルイス酸を用いてＢｏｃ基を除去する労力により、ＣＰ環が迅速に分解する。２をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨと反応させることで、Ｆｍｏｃ保護された３が生じ、これは、ピペリジンを用いて脱保護されて、ＮＮＡＡ  ４が得られ得る。化合物４は、一般に用いられる重溶媒中での溶解度が不十分である。ＴＦＡ滴を加えて溶解度を増大させることができるが、数時間後に分解に至る。Ｄ２Ｏ中に溶解した場合、触媒ＮａＯＨにより、シーケンシャルな［１，５］−ヒドリドシフトに起因して、４中のＣＰプロトンは交換される。
【０２４５】
ＣＰ１官能化ＮＨＳエステルの合成は、無水コハク酸との１の反応から開始して、酸５が生じた。酸５は、ＥＤＣ・ＨＣｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応して、ＮＨＳエステル６が生じた。室温にて、６上のＣＰ環は、数日にわたって二量体化することとなるが、−２０℃にて１ヵ月超にわたって貯蔵され得る。
【０２４６】
実施例３．架橋剤修飾ｍＡｂを介したＡＤＣの調製用のＣＰ１ジエン−マレイミドコンジュゲーション
シクロペンタジエン−マレイミド反応を、生体コンジュゲーションについて評価し、そこではリンカーを介してシクロペンタジエン基を導入した。
【０２４７】
ｍＡｂ上へのＣＰ１官能基の導入：ＣＰ１−ＮＨＳ（化合物６）とのリシン第一級アミンの反応によって、ＣＰ１ジエン官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーと呼ばれる、修飾ｍＡｂとランダムにコンジュゲートした、アミド結合シクロペンタジエン基をもたらした。なお、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーは、一部の図において、ｍＡｂ−ＣＰ１とも呼ばれ得る。明確にするための図のキャプション参照。典型的なｍＡｂ修飾反応を、以下で説明する。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１５ｍｇ  ｍＡｂ、１００ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、３０μＬ  ＣＰ１−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、３００ｎｍｏｌ、３当量）を加えた。氷上で５分間の反応、次いで室温にて１時間の反応を、連続混合しながら進めた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって、ＣＰ１−リンカー導入を定量化して、この実施例において１ｍＡｂあたり２．３ＣＰ１であることが見出された。これは、ＣＰ１−ＮＨＳの、抗体コンジュゲートへの７７％の変換に相当する。種々の条件下で実行したこの反応についての結果の概要を、付属書類Ａ３．１に記載する。
【化２８】
2020521735.tif 000031
【０２４８】
スキーム３．１．ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーを生成するためのＣＰ１−ＮＨＳによるｍＡｂの修飾。
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ１修飾ｍＡｂの反応：ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（２．３ＣＰ１ジエン／ｍＡｂ、１ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ  ｍＡｂ、１当量）を、３．５ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、ＤＭＳＯを加えて、２０％ｖ／ｖ溶液を得てから、１Ｍ第１リン酸ナトリウムを加えて、１０％ｖ／ｖ溶液を得た。全ての溶液構成要素の付加により、２．７ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、４１．４μＭ  ＣＰ１ジエン、１．７８Ｍ  ＤＭＳＯ、１１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む混合物を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ（１０μＬのＤＭＡｃ中１０ｍＭストック液、１００ｎｍｏｌ、１５当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、混合しながら２２℃又は３７℃にて進めた。４時間の反応の後、Ｎ−アセチルシステイン（８μＬの１００ｍＭ溶液、１２０当量）を加えて、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元脱グリコシル化質量分析によって、サンプルを分析した。
【化２９】
2020521735.tif 000032
【０２４９】
スキーム３．２．マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応。
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０２５０】
図３．１．ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析。（Ｂ）におけるピーク下の数字は、ｍＡｂ中に導入されたＣＰ１−リンカー基の数を示す。なお、（Ａ）におけるより高いＭＷピークのセットは、グリコシル化ｍＡｂを表す。ピーク強度によるＣＰ１−リンカー導入の推定は、１ｍＡｂあたり２．３ＣＰ１−リンカーを与える。
【０２５１】
【表２】
2020521735.tif 000033
【０２５２】
図３．２．ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーマレイミド−ＭＭＡＥ反応生成物の還元グリコシル化質量スペクトル。ズームして、ｍＡｂの重鎖及び軽鎖の双方を示す。
【０２５３】
図３．３．ｍＡｂ重鎖領域を示すためにズームインしたｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーマレイミドＭＭＡＥ反応生成物の還元脱グリコシル化質量スペクトル。ＤＡＲ−０は、ＭＭＡＥがｍＡｂ重鎖にコンジュゲートしなかったことを示し、ＤＡＲ−１は、１つのＭＭＡＥがｍＡｂ重鎖にコンジュゲートしたことを示し、そしてＤＡＲ−２は、２つのＭＭＡＥがｍＡｂ重鎖にコンジュゲートしたことを示す。非コンジュゲートＣＰ１−リンカーピークは、反応生成物中で検出されず、そして全てのＭＭＡＥコンジュゲートピークは、対応する重鎖ＣＰ１−リンカーピークから追跡され、コンジュゲーションがＣＰ１−リンカー基に特異的であったことを示す。
【０２５４】
【表３】
2020521735.tif 000034
【０２５５】
図３．４．ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーａｌｌｏｃリシン反応生成物の還元脱グリコシル化質量分析。コンジュゲートの予想される質量に対応するピークは観察されなかった。
【０２５６】
抗体の表面上に取り付けられたＣＰ１ジエン基は、室温にて４時間以内にマレイミド−ＭＭＡＥプロドラッグと完全に反応した。非特異的コンジュゲーションは、質量分析によって観察されなかった。というのも、全てのＣＰ１−リンカー−ＭＭＡＥコンジュゲートピークが、未修飾ｍＡｂピーク（すなわち、ＣＰ１−リンカーを欠いている）ではなく、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーピークから追跡されたからである。これは、３７℃にて２０時間後に、非特異的コンジュゲーションを含む、ほんの約２〜２０％のコンジュゲーションしか観察されなかった、マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−フラン−リンカーの反応とは大きく異なる。ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーとのジエン−マレイミドコンジュゲーションは、ｍＡｂ−フラン−リンカーベースのカップリングに勝る向上である。
【０２５７】
実施例４．ＣＰ１−ｍＡｂ−リンカー上に含有されるジエン基に対して０．６モル当量マレイミド−ＭＭＡＥでの、マレイミド−ＭＭＡＥへのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーコンジュゲーションのカイネティクス
マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応カイネティクスを、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー上に含有されるジエンに対して０．６モル当量のマレイミド−ＭＭＡＥの化学量論にて調査した。
【０２５８】
ｍＡｂ上へのＣＰ１官能基の導入：ＣＰ１−ＮＨＳ（化合物６）とのリシン第一級アミンの反応によって、ＣＰ１ジエン官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ランダムにコンジュゲートした、アミド結合シクロペンタジエン基をもたらした。生じたコンジュゲートは、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーと呼ばれ、そして又ｍＡｂ−ＣＰ１とも呼ばれ得る。明確にするための図のキャプション参照。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、３．７ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１１．１ｍｇ  ｍＡｂ、７４ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、４０μＬ  ＣＰ１−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、４００ｎｍｏｌ、５．４当量）を加えた。反応を室温にて１時間、連続混合しながら進めた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって、ＣＰ１ジエン導入を定量化して、１ｍＡｂあたり３．９９ＣＰ１ジエンであることが見出された。これは、ＣＰ１−ＮＨＳの、抗体コンジュゲートへの７４％の変換に相当する。
【０２５９】
マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応：ＣＰ１修飾ｍＡｂ（３．９９ＣＰ１ジエン／ｍＡｂ、３ｍｇ、８０ｎｍｏｌ  ＣＰ１ジエン、１当量）を、１．７ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、ＤＭＳＯを加えて、２０％ｖ／ｖ溶液を得てから、１Ｍ第１リン酸ナトリウムを加えて、１０％ｖ／ｖ溶液を得た。全ての溶液構成要素の付加により、１．３ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、３４．６μＭ  ＣＰ１ジエン、１．７８Ｍ  ＤＭＳＯ、１１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む混合物を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ（５．２μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック液、５２ｎｍｏｌ、０．６７当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、混合しながら２２℃にて進めた。アリコート（１８０μＬ）を種々の時点にて取り出して、Ｎ−アセチルシステイン（２μＬの１００ｍＭ溶液、３８当量）を加えて、マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元脱グリコシル化質量分析によって、サンプルを分析した。
【０２６０】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０２６１】
ＣＰ１ジエン−マレイミド反応速度定数の計算：抗体ジエンとのマレイミド−ＭＭＡＥの反応についての二次速度定数を、脱グリコシル化還元質量スペクトルにおけるピーク強度から判定した。反応の進行を、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーピークの消滅及びｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー−ＡＭ  ＭＭＡＥピークの出現の双方によって監視したが、抗体重鎖上のｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーピーク強度のみを用いて、反応したＣＰ１ジエンの相対存在量を算出した。ｍＡｂ重鎖上の未反応ＣＰ１ジエン基の相対量を、以下の式を用いて算出した：
【数１】
2020521735.tif 000035
ａ＝未修飾重鎖のピーク強度
ｂ＝１つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｃ＝２つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｄ＝３つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度
注：マレイミド−ＭＭＡＥ含有重鎖も又、計算に含めた。例えば、ＣＰ１−リンカー−２＋１マレイミド−ＭＭＡＥは、ＣＰ１−リンカー−１種として含められることとなる。
【０２６２】
結果
図４．１．ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析。
【０２６３】
図４．２．１５分及び２．５時間での、未修飾ｍＡｂ、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（ｍＡｂ−ＣＰ１）及びＡＭ−ＭＭＡＥ−反応ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（ｍＡｂ−ＣＰ１  ＡＭ−ＭＭＡＥ）の還元脱グリコシル化質量スペクトル。
【０２６４】
図４．３．マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの経時的な反応。未反応ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。
【０２６５】
【表４】
2020521735.tif 000036
【０２６６】
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ１ジエン（ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー上に含有される）の反応は、水性条件下で迅速且つ特異的であり、完全な反応は１０分程で達成された。マレイミド−ＭＭＡＥベースの算出されたモルフィード比は、インタクト質量スペクトル由来のコンジュゲーションの観察される程度にマッチする。というのも、ＭＭＡＥモルフィード、及びコンジュゲートへのジエンの変換が、本質的に同じであったからである。
【０２６７】
実施例５．ジエン基に対して１．０モル当量マレイミド−ＭＭＡＥでの、マレイミド−ＭＭＡＥへのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーコンジュゲーションのカイネティクス
２２℃でのマレイミドＭＭＡＥとのＣＰ１ジエンの反応カイネティクスを評価した。
【０２６８】
ｍＡｂ上へのＣＰ１官能基の導入：ＣＰ１−ＮＨＳ（化合物６）とのリシン第一級アミンの反応によって、ＣＰ１ジエン官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ランダムにコンジュゲートした、アミド結合シクロペンタジエン基をもたらした。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、５ｍｇ  ｍＡｂ、１００ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、４０μＬ  ＣＰ１−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、４００ｎｍｏｌ、４当量）を加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、室温にて１時間、連続混合しながらインキュベートした。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって、ＣＰ１ジエン導入を定量化して、１ｍＡｂあたり３．７ＣＰ１ジエンであることが見出された。これは、ＣＰ１−ＮＨＳの、抗体コンジュゲートへの９２％の変換に相当する。
【０２６９】
マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応：ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（３．７ＣＰ１ジエン／ｍＡｂ、３ｍｇ、７４ｎｍｏｌ  ＣＰ１ジエン、１当量）を、１．７ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、ＤＭＳＯを加えて、２０％ｖ／ｖ溶液を得てから、１Ｍ第１リン酸ナトリウムを加えて、１０％ｖ／ｖ溶液を得た。全ての溶液構成要素の付加により、１．３ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、３２．３μＭ  ＣＰ１ジエン、１．７８Ｍ  ＤＭＳＯ、１１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む混合物を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ（７．４μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック液、７４ｎｍｏｌ、１当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、混合しながら２２℃にて進めた。アリコート（１８０μＬ）を種々の時点にて取り出して、Ｎ−アセチルシステイン（３μＬの１００ｍＭ溶液、５１当量）を加えて、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元脱グリコシル化質量分析によって、サンプルを分析した。
【０２７０】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０２７１】
ＣＰ１ジエン−マレイミド反応速度定数の計算：ｍＡｂジエンとのマレイミド−ＭＭＡＥの反応についての二次速度定数を、脱グリコシル化還元質量スペクトルにおけるピーク強度から判定した。反応の進行を、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーピークの消滅及びｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー−マレイミド−ＭＭＡＥピークの出現の双方によって監視したが、抗体重鎖上のｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーピーク強度のみを用いて、反応したＣＰ１ジエンの相対存在量を算出した。ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー上の未反応ＣＰ１ジエン基を、以下の式を用いて算出した：
【数２】
2020521735.tif 000037
ａ＝未修飾重鎖のピーク強度
ｂ＝１つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｃ＝２つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｄ＝３つのＣＰ１−リンカー基を有する重鎖のピーク強度
ｅ＝未修飾軽鎖のピーク強度
ｆ＝１つのＣＰ１−リンカー基を有する軽鎖のピーク強度の合計
ｇ＝２つのＣＰ１−リンカー基を有する軽鎖のピーク強度の合計
【０２７２】
コンジュゲーションデータをさらに、モル濃度の単位で分析して、カイネティクス定数を判定した。二次速度定数を、１／［ＣＰ１］対時間をプロットして生じた曲線の傾き、及び直線回帰分析から判定した。反応半減期を、以下に示す式を用いた二次反応速度定数から算出した：
【数３】
2020521735.tif 000038
ｋ２＝二次速度定数
［ＣＰ１］０＝時間＝０でのＣＰ１ジエン濃度
【０２７３】
図５．１．ＣＰ１−ＮＨＳとのｍＡｂの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量分析。ピーク上の数字は、ｍＡｂ種上に存在するＣＰ１リンカー基の数を示す。
【０２７４】
図５．２．５分及び１５０分での、未修飾ｍＡｂ、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（ｍＡｂ−ＣＰ１）、及びＰＭ−ＭＭＡＥ反応ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー（ｍＡｂ−ＣＰ１  ＰＭ−ＭＭＡＥ）の還元脱グリコシル化質量スペクトル。スペクトルにズームインして、重鎖のみを示す。
【０２７５】
図５．３．マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−リンカーの反応。Ａ）経時的な未反応ＣＰ１ジエンのモル濃度。ｍＡｂあたりの未反応ＣＰ１ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。Ｂ）反応速度を算出するのに用いた逆濃度プロット。
【０２７６】
【表５】
2020521735.tif 000039
【０２７７】
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ１ジエンの反応は、迅速且つ特異的であり、半減期が数分程であった。反応変換は、双方のマレイミド−ＭＭＡＥについて、９０％以上であった。フェニルマレイミド反応速度は、アルキルマレイミド速度よりも僅かに高かった。しかしながら、速度及び最終変換は、マレイミドの２つのタイプ間で匹敵した。
【０２７８】
実施例６．抗体中へのＣＰ１−ＮＮＡＡの組込み
ＣＰ１−ＮＮＡＡを、抗体の位置Ｋ２７４に組み込んで、発現されたｍＡｂの質、及び抗体組込み後のＣＰ１ジエンの反応性を評価した。
【０２７９】
ＣＰ１−ＮＮＡＡストック液の調製：ＣＰ１−ＮＮＡＡ（０．５ｇ、１．７７ｍｍｏｌ）を、６．８１ｍＬ  Ｈ２Ｏ及び１．３８ｍＬ  １Ｍ  ＮａＯＨと組み合わせた。生じたスラリーを、全ての固体が溶解するまで（１０分）、室温にて撹拌した。完全な溶解の後に、淡い黄色の溶液を、０．２μｍフィルタに通させて、分注して、使用まで−８０℃にて貯蔵した。この手順により、８．２ｍＬの２１６ｍＭ  ＣＰ１及び１６８ｍＭ  ＮａＯＨのストック液が生じた。
【０２８０】
抗体発現：Ｆｃ位置Ｋ２７４又はＳ２３９にてアンバー突然変異を有する１２Ｇ３Ｈ１１又は１Ｃ１  ＩｇＧ１抗体遺伝子を、自社所有のｐＯＥ抗体発現ベクター中にクローニングした。構築体を、ＰＥＩｍａｘ（１．５ＬのＧ２２細胞）によって、ＰｙｌＲＳ二重突然変異体（Ｙ３０６Ａ／Ｙ３８４Ｆ）又は野生型ＰｙｌＲＳをコードするプラスミド、及びｔＲＮＡ発現カセットのタンデムリピートを含有するプラスミド（ｐＯＲＩＰ  ９Ｘ  ｔＲＮＡ）と共に、ＣＨＯ−Ｇ２２中に形質移入した。形質移入の４時間後、３．３％フィードＦ９（自社所有）及び０．２％フィードＦ１０（自社所有）を細胞に加えて、当該細胞をさらに、３４℃にてインキュベートした。その翌日、ＣＰ１−ＮＮＡＡを、１Ｃ１．Ｋ２７４形質移入細胞に対して、０．２６ｍＭの最終濃度にて加えた。細胞に再度、３日目及び７日目に、６．６％フィードＦ９及び０．４％フィードＦ１０をフィードした。細胞をスピンダウンして、上清を１１日目に収穫した。上清を、ＩｇＳｅｌｅｃｔアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって精製した。抗体を、５０ｍＭグリシン、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５溶出バッファで溶出して、１ＭトリスバッファｐＨ７．５で中和して、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析した。溶出された抗体の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度測定によって判定した。逆算した力価は、１Ｃ１．Ｋ２７４について４７ｍｇ／Ｌであった。１２Ｇ３Ｈ１１  ｍＡｂを、同様の方法で、より小さなスケールにて、ＣＰ１−ＮＮＡＡのフィード濃度及びフィード時間を変えて発現させた。回収した抗体を、標準的な方法を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。又、抗体を、以下に記載するサイズ排除クロマトグラフィ及び質量分析によって分析した。ＣＰ１−ＮＮＡＡを組み込んだ抗体を、ｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡと表して、ｍＡｂ−ＣＰ１−リンカー構築体又はｍＡｂ−［位置］ＣＰ１−ＮＮＡＡから区別する。ここで、［位置］は、ＣＰ１−ＮＮＡＡに突然変異したアミノ酸番号及びアミノ酸記号を示す。
【０２８１】
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）：トリプルディテクタアレイを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＬＣ系（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  ３０１、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ、Ｈｏｕｓｏｎ、ＴＸ）を用いて、ＳＥＣ分析を実行した；波長を２８０ｎｍにセットして、サンプルを、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．８、流量１ｍＬ／分を用いたＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上で走らせた。
【０２８２】
マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡのコンジュゲーション：ｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡ（０．４ｍｇ、２．７ｎｍｏｌ、１当量）を、ＰＢＳ（０．１３３ｍＬ）で３ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＭＳＯ（２７μＬ）及び１Ｍ第１リン酸ナトリウム（１３μＬ）を加えて、それぞれ約２０％及び１０％ｖ／ｖの溶液を得た。マレイミド−ＭＭＡＥ（５μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、１３ｎｍｏｌ、５当量）を、ｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡ溶液に加えて、混合物を簡単にボルテックスした。ＡＤＣを、ＡＭ−ＭＭＡＥ及びＰＭ−ＭＭＡＥの双方で調製した。反応を、室温にて１時間、連続混合しながら進めた。Ｎ−アセチルシステイン（１．１μＬの１００ｍＭ、１０８ｎｍｏｌ、４０当量）を加えて、溶液をさらに１５分間インキュベートして、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元質量分析によって、サンプルを分析した。
【化３０】
2020521735.tif 000040
【０２８３】
スキーム６．１．Ａ）マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡの反応。リシンの、ＣＰ１−ＮＮＡＡへの突然変異によって、位置Ｋ２７４にてＣＰ１−ＮＮＡＡを組み込んだ。
質量分析：脱グリコシル化ｍＡｂ分析のために、ＥｎｄｏＳ（５μＬ  Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  ＥｎｄｏＳ（ＰＢＳ中１：１０の希釈、２０，０００単位／ｍＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、５０μＬサンプル（１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ）及び５μＬグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と組み合わせてから、３７℃にて１時間インキュベートした。５μＬ  Ｂｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ  ＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の付加及び３７℃にて１０分間のインキュベーションによって、還元サンプルを調製した。ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００  Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ＲＲＨＤ、１．８ミクロン、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６５２０Ｂ  Ｑ−ＴＯＦ質量スペクトロメータを用いて、質量分析を実行した。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）パラメータは、以下の通りであった：流量、０．５ｍｌ／分；移動相Ａは、ＨＰＬＣグレードのＨ２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であった。カラムを、９０％Ａ／１０％Ｂ中で平衡化させた。これを又、ｍＡｂサンプルを脱塩してから、２０％Ａ／８０％Ｂ中に溶出するのに用いた。１００〜３０００ｍ／ｚ、正極性、３５０℃のガス温度、４８ｌｂ／ｉｎ２のネブライザ圧力、及び５，０００Ｖのキャピラリ電圧についての質量スペクトルデータを収集した。先に記載するように、ベンダーが供給する（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｖ．Ｂ．０４．００）ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、データを分析して、デコンボリューションしたスペクトル由来のピーク強度を用いて、各サンプルにおける種の相対割合を導き出した。
【０２８４】
図６．１．突然変異ｔＲＮＡシンセターゼ又はｗｔ  ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴＲＳ）を含む哺乳類細胞内での発現後の１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの力価。培地中のＣＰ１−ＮＮＡＡの最終濃度及びフィード時間は、ｘ軸上に示すように変動した。なお、非天然アミノ酸＃５０の構造を、図６．８に示す。
【０２８５】
【表６】
2020521735.tif 000041
【０２８６】
図６．２．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ａ）ｍＡｂ軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示す質量範囲。Ｂ）ｍＡｂ重鎖のみを示すズームしたスペクトル。観察された重鎖質量（５１１２９．５５ａｍｕ）は、算出した重鎖質量（５１１２７ａｍｕ）に密接にマッチし、抗体重鎖中へのＣＰ１ＮＮＡＡの組込みが想定された。
【０２８７】
図６．３．単量体生成物が得られたことを示す、１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析。高分子量種（ＨＭＷＳ）を示している。
【０２８８】
図６．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ（１Ｃ１．Ｋ２７４ＣＰ１）の分析。
【０２８９】
図６．５．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元脱グリコシル化質量分析。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物、Ｃ）ＰＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ重鎖のみを示している。
【０２９０】
図６．６．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ重鎖（ＨＣ）のみを示している。重鎖及び軽鎖の双方を示すズームアウトしたスペクトルを、図６．９及び図６．１０に示す。
【０２９１】
図６．７．１：１の比率として存在する、化合物異性体を示すＣＰ１−ＮＮＡＡの化学構造。
【０２９２】
図６．８．文献に記載されるＣＰ１−ＮＮＡＡのフラン類似体である化合物５０の化学構造。この化合物を、１２Ｇ３Ｈ１１  ｍＡｂによる発現研究用の対照として用いた。
【０２９３】
図６．９．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元脱グリコシル化質量分析。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物、Ｃ）ＰＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖及び軽鎖の双方を示している。
【０２９４】
図６．１０．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ−ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析。Ａ）未反応抗体、Ｂ）ＡＭ−ＭＭＡＥ反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖及び軽鎖の双方、そして又高分子量種を示している。
【０２９５】
【表７】
2020521735.tif 000042
【０２９６】
位置Ｋ２７４での抗体中へのＣＰ１−ＮＮＡＡの組込みを、２つの異なる抗体構築体；１２Ｇ３Ｈ１１及び１Ｃ１を用いて確認した。回収した抗体は、質が高く、切断された生成物はなく、非常に限られた凝集体しかなかった。１Ｃ１抗体の１．７Ｌスケールの生成について達成された力価は、細胞にフィードしたＣＰ１−ＮＮＡＡの低い量を考えると、適度に高かった。ＡＤＣへの抗体のほぼ完全な変換によって示されるように、発現及び精製プロセスの全体を通して、ＣＰ１ジエン反応性が保存された。
【０２９７】
実施例７．ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂマレイミドＭＭＡＥ抗体薬物コンジュゲートの血清安定性
４＋２付加環化生成物（シクロペンタジエン−マレイミド結合）の、ラット及びマウス血清内での３７℃にて７日間のエクスビボインキュベーションによる生理学的環境内での安定性。
【０２９８】
ＡＤＣの生成：位置Ｋ２７４にてＣＰ１−ＮＮＡＡを有する１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡを、マレイミドＭＭＡＥにコンジュゲートして、所望のＡＤＣを生成した。最初に、１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ（０．４ｍｇ、２．７ｎｍｏｌ、１当量）を、ＰＢＳ（０．１３３ｍＬ）で３ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＭＳＯ（２７μＬ）及び１Ｍ第１リン酸ナトリウム（１３μＬ）を加えて、それぞれ約２０％及び１０％ｖ／ｖの溶液を得た。マレイミド−ＭＭＡＥ（５μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、１３ｎｍｏｌ、５当量）を、１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ溶液に加えて、混合物を簡単にボルテックスした。反応を、室温にて１時間、連続混合しながら進めた。Ｎ−アセチルシステイン（１．１μＬの１００ｍＭ、１０８ｎｍｏｌ、４０当量）を加えて、溶液をさらに１５分間インキュベートして、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元質量分析によってサンプルを分析して、コンジュゲーションを確認し、且つ薬物：抗体比を定量化した。
【０２９９】
血清安定性アッセイ：ＡＤＣサンプルを、全ラット血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ：０１２−０００−１２０）及び全マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔ：０１５−０００−１２０）中で評価した。凍結乾燥した血清生成物を、メーカーのプロトコルに従って、滅菌水で再構成した。ＡＤＣサンプルを血清に加えて、０．２ｍｇ／ｍＬの抗体溶液をもたらした。ＡＤＣ／血清混合物を、０．２μｍフィルタに通させて、気密バイアル内にキャッピングして、３７℃にてインキュベートした。アリコートを取り出して凍結して、Ｔ＝０日目の基準として扱った。残ったサンプルを、３７℃にて７日間インキュベートしてから、Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧアガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた免疫捕獲によって、抗体（コンジュゲート型及び非コンジュゲート型）を回収した。樹脂をＰＢＳで２回、ＩｇＧ溶出バッファで１回、その後ＰＢＳで２回以上リンスした。次に、ＡＤＣ血清サンプルを、抗ヒトＩｇＧ樹脂（１００μＬのＡＤＣ−血清混合物、５０μＬの樹脂スラリー）と組み合わせて、室温にて１５分間穏やかに混合した。樹脂を、遠心分離によって回収してから、ＰＢＳで２回洗浄した。樹脂ペレットを、１００μＬ  ＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁させて、室温にて５分間さらにインキュベートした。樹脂を、遠心分離によって取り出してから、２０μＬの１０Ｘグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）及び５μＬ  Ｅｎｄｏ  Ｓ（Ｒｅｍｏｖｅ  ｉＴ  ＥｎｄｏＳ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を上清に加えてから、３７℃にて１時間インキュベートした。脱グリコシル化ヒト抗体溶液を滅菌濾過して、ＴＣＥＰ（Ｂｏｎｄ  Ｂｒｅａｋｅｒ  ０．５Ｍ  ＴＣＥＰ溶液、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で還元して、ＬＣ／ＭＳによって分析した。コンジュゲートした抗体のパーセント、及びリンカー切断生成物の定量化を、質量スペクトルのピーク高さから判定した。
【０３００】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０３０１】
図７．１．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのラット血清安定性。ＡＤＣを、ラット血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。
【０３０２】
図７．２．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＰＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのラット血清安定性。ＡＤＣを、ラット血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、リンカー切断が、フェニルアセトアミド基にて観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【０３０３】
図７．３．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのマウス血清安定性。ＡＤＣを、マウス血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、ほぼ完全なリンカー切断が、ｖａｌ−ｃｉｔジペプチドにて観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【０３０４】
図７．４．１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＰＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣのマウス血清安定性。ＡＤＣを、マウス血清中で３７℃にて７日間インキュベートして、還元質量分析に先立って、免疫捕獲によって回収した。スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）質量領域の詳細を示している。大きな脱コンジュゲーションは観察されなかった。しかしながら、ほぼ完全なリンカー切断が観察された。切断生成物の説明について、付属書類７参照。
【０３０５】
【表８】
2020521735.tif 000043
【０３０６】
図７．５．分子量を示すＭＭＡＥペイロードの化学構造。
【０３０７】
図７．６．マウス血清中でのＡＤＣのインキュベーション後に観察された主たる切断生成物の化学構造。Ａ）及びＢ）はそれぞれ、ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲート及びＰＭ−ＭＭＡＥコンジュゲートについて、抗体上に残っている種を示す（ＣＰ１−マレイミド結合は不図示）。Ｃ）は、ｖａｌ−ｃｉｔジペプチド切断後に遊離した種を示す。
【０３０８】
図７．７．ラット血清インキュベーション後のＰＭ−ＭＭＡＥ切断生成物の化学構造。Ａ）抗体上に残っている種、及びＢ）遊離した種。
【０３０９】
ｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡとマレイミド−ＭＭＡＥ間のシクロペンタジエン−マレイミドコンジュゲーション生成物は、ＭＭＡＥペイロード上に含有されるマレイミドのタイプに関係なく、ラット血清及びマウス血清中で、７日間にわたって安定している。ＡＤＣペイロードの他の部分は、マレイミド−ＣＰ１ジエン結合前に分解したことが見出された。具体的には、フェニルマレイミド−ＭＭＡＥペイロード及びアルキルマレイミド−ＭＭＡＥペイロードの双方が、高度に曝露されたＫ２７４コンジュゲーション部位への酵素アクセシビリティにおそらく起因して、マウス血清中で高いｖａｌ−ｃｉｔジペプチド切断を示した。フェニル−マレイミドコンジュゲートは、フェニルマレイミドとｖａｌ−ｃｉｔジペプチド間で、フェニルアセトアミドでの更なる構造的責任（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）を示した。この切断は、マウス血清よりもラット血清においてより明らかであった。プロセスのどの時点でフェニルアセトアミド切断が起こったかは、０日目から７日目まで増大しなかったため、不明である。切断が、免疫捕獲の間に起こった可能性があり、免疫捕獲は、低ｐＨリンス工程を含む。全体として、生理学的環境内でのシクロペンタジエン−マレイミドコンジュゲーション生成物の安定性が実証された。
【０３１０】
実施例８．スピロシクロペンタジエン（ＣＰ２）−含有化合物の合成
スピロシクロペンタジエン含有架橋剤及び非天然アミノ酸（ＮＮＡＡ）を、以下に示す一般的な構造で調製した：
【０３１１】
図８．１．実施例８に記載するスピロシクロペンタジエン架橋剤（Ａ）及びスピロシクロペンタジエンＮＮＡＡ（Ｂ）の一般的な設計。
【０３１２】
ＣＰ２−ＮＮＡＡ（１０）の合成は、Ｃａｒｒｅｉｒａの反応１の修飾バージョンにおけるエピクロルヒドリンとの市販のＮａＣｐ溶液の反応で開始した。ラセミ体のエピクロルヒドリンを用いたが、エナンチオピュアなエピクロルヒドリンを用いて、７を９１％ｅｅで合成することができる。４−ニトロフェニルクロロホルマートとの７の反応により、活性カルバマート８が生じた。８をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨと反応させることで、Ｆｍｏｃ保護９が生じ、これは、ピペリジンを用いて脱保護されて、ＮＮＡＡ  １０が得られ得る。化合物１０は、−２０℃にて貯蔵した場合に、４と比較して、酸に対してより高い安定性を示し、そしてその合成における中間体はいずれも、二量体化も分解も示さない。
【０３１３】
ＣＰ２官能化ＮＨＳ−エステル１２の合成は、無水コハク酸との７の反応から開始して、酸１１が生じた。酸７を、ＥＤＣ・ＨＣｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳエステル１２を得た。化合物１２は、室温にて数日間貯蔵した場合に、二量体化しないようである。
【０３１４】
材料及び方法：特に明記しない限り、反応を、試薬グレードの溶媒を用いて、Ｎ２雰囲気下で行った。ＤＣＭ及びトルエンを、３Åモレキュラーシーブ上で貯蔵した。ＴＨＦを、活性アルミナのカラムに通させた。商業的に得た全ての試薬を、受領したままの状態で用いた。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ２５４プレコーテッドプレート（０．２５ｍｍ）で行って、ＵＶ光（２５４ｎｍ）への曝露によって視覚化し、又はｐ−アニスアルデヒド、ニンヒドリン、若しくは過マンガン酸カリウムで染色した。順相シリカゲル（６０Å、０．０４０〜０．０６３ｍｍ、Ｇｅｄｕｒａｎ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを実行した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録して（４００、５００、又は６００ＭＨｚ）、重水素化溶媒シグナルに関して報告する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、以下の通り報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度、カップリング定数（Ｈｚ）、及び積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録した（１００、１２５、又は１５０ＭＨｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、化学シフト（δｐｐｍ）に関して報告する。質量スペクトルを、ＵＣ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから、電界脱離（ＦＤ）源を有する（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）ＧＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ高解像度飛行時間型質量スペクトロメータで得た。
【０３１５】
ＣＰ２−ＮＮＡＡ（１０）の合成
【化３１】
2020521735.tif 000044
スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−１−イルメタノール（７）：
シクロペンタジエニドナトリウム（２Ｍ  ＴＨＦ溶液、１０ｍＬ、２０ｍｍｏｌ、４当量）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に加えて、０℃に冷却した。エピクロルヒドリン（０．３９ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ、１当量）を滴加して、反応物を０℃にて１．５時間、その後室温にてさらに２時間撹拌した。反応物をＨ２Ｏ（４０ｍＬ）でクエンチしてから、分液漏斗に移した。ＮａＨＣＯ３のＨ２Ｏ飽和溶液（４０ｍＬ）及びエーテル（４０ｍＬ）を加えて、層を分離した。有機層をブライン（４０ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過してから、溶媒を除去した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１）にかけて、茶色の油として７（０．４８ｇ、７８％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，２：１）：０．２２；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．６４（ｔｄ，Ｊ＝１．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．５１（ｔｄ，Ｊ＝１．７，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｔｄｄ，Ｊ＝１．０，２．１，５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｔｄ，Ｊ＝１．７，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．０８−３．８８（ｍ，１Ｈ），３．５９（ｄｄ，Ｊ＝８．８，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．４８−２．４０（ｍ，１Ｈ），１．８７（ｄｄ，Ｊ＝４．３，８．７Ｈｚ，１Ｈ），１．６９（ｄｄ，Ｊ＝４．４，７．０Ｈｚ，１Ｈ），１．５７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １３９．４，１３３．９，１３１．７，１２８．６，６４．９，４１．９，３０．０，１７．６  ｐｐｍ．
【化３２】
2020521735.tif 000045
【０３１６】
４−ニトロフェニルスピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−１−イルメチルカルボナート（８）：
７（２．８０ｇ、２２．９ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）に加えて、０℃に冷却した。ピリジン（４．６１ｍＬ、５７．３ｍｍｏｌ、２．５当量）を加えてから、４−ニトロフェニルクロロホルマート（５．０８ｇ、２５．２ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えた。反応物を、出発材料の消費まで、０℃にて撹拌した（ＴＬＣ、３０分）。反応物を分液漏斗中に注いで、ＮＨ４ＣｌのＨ２Ｏ飽和溶液（１００ｍＬ）で洗浄した。水層を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を組み合わせて、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、６：１〜４：１）にかけて、琥珀色の油として８（５．１７ｇ、７９％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，４：１）：０．２８；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．２８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，２Ｈ），６．６２（ｔｄ，Ｊ＝１．７，５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．５３（ｔｄ，Ｊ＝１．７，４．８Ｈｚ，１Ｈ），６．２５（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．５Ｈｚ，１Ｈ），６．１１（ｔｄ，Ｊ＝１．６，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．５３（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１１．３Ｈｚ，１Ｈ），２．５２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），１．９２（ｄｄ，Ｊ＝４．７，８．６Ｈｚ，１Ｈ），１．７６（ｄｄ，Ｊ＝４．７，６．７Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １５５．４，１５２．３，１４５．３，１３８．６，１３３．８，１３１．７，１２９．４，１２５．２，１２１．７，７０．９，４１．５，２４．６，１６．９  ｐｐｍ．
【化３３】
2020521735.tif 000046
【０３１７】
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−１−イルメチルカルボナート）−ＯＨ（９）：
８（５．１２ｇ、１７．８ｍｍｏｌ、１当量）を、ＤＭＦ（４０ｍＬ）に加えてから、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（７．８７ｇ、２１．４ｍｍｏｌ、１．２当量）及びＤＩＰＥＡ（７．４４ｍＬ、４２．７ｍｍｏｌ、２．４当量）を加えた。反応物を、出発材料の消費まで撹拌し（ＮＭＲ、３．５時間）、その後、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）及びＨ２Ｏ（１４０ｍＬ）中に注いだ。水層を、ＨＣｌ（１Ｍ、１００ｍＬ）でｐＨ２〜３に酸性化して、分液漏斗中に注いで、層を分離した。水層を、ＥｔＯＡｃで抽出した（２×１００ｍＬ）。有機層を組み合わせて、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去した。残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１、続いてＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＡｃＯＨ、８９：１０：１）にかけて、溶媒を除去した。残留したＡｃＯＨ及びＤＭＦを、生成物をＤＣＭ中に懸濁させて、ブラインで洗浄して、有機層をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過してから溶媒を除去することによって、除去して、帯黄白色の泡として９（７．４３ｇ、８１％）を得た。
Ｒｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，９０：１０）：０．３９；１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ８．６２（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．７５（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），７．６６−７．４９（ｍ，２Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ），６．５４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．４７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．２１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．０４（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），５．７４（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ），４．９１（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），４．５３−４．００（ｍ，５Ｈ），３．２１−３．００（ｍ，２Ｈ），２．９７（ｓ，１Ｈ），２．９０（ｄ，Ｊ＝０．８Ｈｚ，１Ｈ），２．４７−２．３１（ｍ，１Ｈ），１．９５−１．２７（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６３．２，１５６．７，１４３．６，１４１．２，１３８．９，１３４．５，１３０．９，１２８．９，１２７．６，１２７．０，１２５．１，１１９．９，１１５．６，６７．０，６６．５，５３．５，４７．１，４１．６，４０．４，３６．８，３１．８，２９．２，２５．７，２２．２，２１．４，１７．１  δ  ｐｐｍ．
【化３４】
2020521735.tif 000047
【０３１８】
ＣＰ２−ＮＮＡＡ（１０）：
９（５．５０ｇ、１０．６ｍｍｏｌ、１当量）をＤＭＦ（１５０ｍＬ）に加えてから、ピペリジン（１６．８ｍＬ）を加えた。反応物を、出発材料の消費まで撹拌し（ＴＬＣ、９０分）、その後、溶媒を除去した。Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）を残留物に加えて、懸濁液を５分間超音波処理した。懸濁液を濾過して、Ｈ２Ｏ（２×１００ｍＬ）及びＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）でリンスした。固体を、ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中に懸濁して、穏やかに加温（約４０℃）しながら１０分間撹拌して、Ｅｔ２Ｏ（４０ｍＬ）を加えて、懸濁液を濾過して、Ｅｔ２Ｏでリンスした（２×５０ｍＬ）。化合物を減圧下で乾燥させて、白色の粉末として１０（２．２４ｇ、７１％）を得た。
Ｒｆ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ，８５：１５）：０．２９；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６＋一滴のＴＦＡ）δ  ８．２０（ｂｒ．ｓ．，３Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４０（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．３２（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．１２（ｔｄ，Ｊ＝１．９，４．９Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｄｄ，Ｊ＝６．７，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），３．９９（ｄｄ，Ｊ＝７．６，１１．５Ｈｚ，１Ｈ），３．８８（ｄ，Ｊ＝５．１Ｈｚ，１Ｈ），２．９４（ｄ，Ｊ＝５．９Ｈｚ，２Ｈ），２．３７（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），１．８３−１．６３（ｍ，４Ｈ），１．４４−１．１９（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６＋一滴のＴＦＡ）：
１７１．２，１５６．２，１３９．３，１３５．２，１３０．４，１２８．３，６５．３，５１．９，４２．０，２９．７，２８．９，２５．７，２１．６，１６．４；ＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１５Ｈ２２Ｎ２Ｏ４［Ｍ］＋：２９４．１５８０，実測値：２９４．１５７１．
【０３１９】
ＣＰ２−ＮＨＳ（１２）の合成
【化３５】
2020521735.tif 000048
４−オキソ−４−（スピロ［２．４］ヘプタ−４，６−ジエン−１−イルメトキシ）ブタン酸（１１）：
ＤＣＭ（１．５ｍＬ）を、１（０．３７ｇ、３．０ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。Ｅｔ３Ｎ（０．４２ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、１当量）、ＤＭＡＰ（３７ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、０．１当量）、及び無水コハク酸（０．３３ｇ、３．３ｍｍｏｌ、１．１当量）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、出発材料の消費まで室温にて撹拌した（ＴＬＣ、１．７５時間）。反応混合物を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）と共に分液漏斗中に注いで、水性ＨＣｌ（１Ｍ、５０ｍＬ）で洗浄した。水層を、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出して、有機層を組み合わせて、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、次の反応に十分な純度の１１が得られた。
Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）：０．５６；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．６０（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．５７（ｔｄ，Ｊ＝１．９，５．３Ｈｚ，１Ｈ），６．５０（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｔｄ，Ｊ＝１．７，５．２Ｈｚ，１Ｈ），６．０７（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．１Ｈｚ，１Ｈ），４．３７（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｄｄ，Ｊ＝７．０，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．７４−２．５７（ｍ，４Ｈ），２．４２（ｑｕｉｎ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），１．８５（ｄｄ，Ｊ＝４．５，８．４Ｈｚ，１Ｈ），１．６９（ｄｄ，Ｊ＝４．３，７．０Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ．
【化３６】
2020521735.tif 000049
【０３２０】
ＣＰ２−ＮＨＳ（１２）：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）を、１１（理論値（ｔｈｅｏ）３．０ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。ＮＨＳ（０．４８ｇ、４．２ｍｍｏｌ、１．４当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（０．６９ｇ、３．６ｍｍｏｌ、１．２当量）、及びＤＣＭ（５ｍＬ）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１：１）にかけて、無色の粘性油として１２（０．５９ｇ、２工程越しで６２％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，１：１）：０．３４；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．５６（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｔｄ，Ｊ＝１．８，５．１Ｈｚ，１Ｈ），６．２１（ｔｄ，Ｊ＝１．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），６．０６（ｔｄ，Ｊ＝１．６，３．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３６（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），４．２１（ｄｄ，Ｊ＝７．４，１１．７Ｈｚ，１Ｈ），２．９３（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｓ，４Ｈ），２．７３（ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，２Ｈ），２．４２（五重項，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），１．８３（ｄｄ，Ｊ＝４．３，８．６Ｈｚ，１Ｈ），１．６８（ｄｄ，Ｊ＝４．５，６．８Ｈｚ，１Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７０．８，１６８．９，１６７．６，１３８．８，１３４．３，１３１．２，１２９．０，６６．６，４１．５，２８．６，２６．２，２５．５，２５．１，１７．３  ｐｐｍ．
【０３２１】
１．Ｌｅｄｆｏｒｄ，Ｂ．Ｅ．；Ｃａｒｒｅｉｒａ，Ｅ．Ｍ．，Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ（＋）−Ｔｒｅｈａｚｏｌｉｎ：Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｈｅｐｔａｄｉｅｎｅｓ  ａｓ  Ｕｓｅｆｕｌ  Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ｃｙｃｌｏｐｅｎｔｉｔｏｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １９９５，１１７，１１８１１−１１８１２．
【０３２２】
実施例９．架橋剤−修飾ｍＡｂを介したＡＤＣの調製用のＣＰ２ジエン−マレイミドコンジュゲーション
生体コンジュゲーションについてのスピロシクロペンタジエン−マレイミド反応の実現可能性を評価した。スピロシクロペンタジエン基を、実施例３に記載する同じ一般的な戦略により、アミン反応性ヘテロ二機能性リンカーを介して導入した。
【０３２３】
ｍＡｂ上へのＣＰ２官能基の導入：ＮＨＳ−エステル活性ＣＰ２ジエンとのリシン第一級アミンの反応によって、ＣＰ２ジエン官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ランダムにコンジュゲートした、アミド結合シクロペンタジエン基をもたらした。生じた抗体は、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーと呼ばれるが、図においてｍＡｂ−ＣＰ２としても表され得る。明確にするための図のキャプション参照。典型的なｍＡｂ修飾反応を、以下に記載する。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１５ｍｇ  ｍＡｂ、１００ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、３５μＬ  ＣＰ２−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、３５０ｎｍｏｌ、３．５当量）を加えた。氷上で５分間の反応、次いで室温にて１時間の反応を、連続混合しながら進めた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって、ＣＰ２導入を定量化して、この実施例において１ｍＡｂあたり３．２９ＣＰ２−リンカー（そして、ゆえにジエン）であることが見出された。これは、ＣＰ２−ＮＨＳの、抗体コンジュゲートへの９４％の変換に相当する。
【化３７】
2020521735.tif 000050
【０３２４】
スキーム９．１．ＣＰ２−ＮＨＳとのｍＡｂの修飾
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ２修飾ｍＡｂの反応：ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー（３．２９ＣＰ２ジエン／ｍＡｂ、１ｍｇ、６．７ｎｍｏｌ  ｍＡｂ、１当量）を、３．１６ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、ＤＭＳＯを加えて、２０％ｖ／ｖ溶液を得てから、１Ｍ第１リン酸ナトリウムを加えて、１０％ｖ／ｖ溶液を得た。全ての溶液構成要素の付加により、２．４３ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、５３．３μＭ  ＣＰ２、１．７８Ｍ  ＤＭＳＯ、１１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む混合物を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ（１０μＬのＤＭＡｃ中１０ｍＭストック液、１００ｎｍｏｌ、１５当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、混合しながら２２℃又は３７℃にて進めた。４時間の反応後、Ｎ−アセチルシステイン（８μＬの１００ｍＭ溶液、１２０当量）を加えて、未反応マレイミド基をクエンチした。サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元脱グリコシル化質量分析によって、サンプルを分析した。
【化３８】
2020521735.tif 000051
【０３２５】
スキーム９．２．マレイミドＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの反応。
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０３２６】
図９．１．ＣＰ２−ＮＨＳとの（Ａ）反応前の、そして（Ｂ）反応後のインタクト脱グリコシル化質量スペクトル。（Ｂ）におけるピーク下の数字は、ｍＡｂ中に導入されたＣＰ２−ジエン基の数を示す。ピーク強度によるＣＰ２−リンカー導入の推定は、１ｍＡｂあたり３．２９ＣＰ２−ジエンを与える。
【０３２７】
【表９】
2020521735.tif 000052
【０３２８】
図９．２．ＡＭ−ＭＭＡＥ及びＰＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの還元脱グリコシル化質量分析。スペクトルにズームして、重鎖及び軽鎖の双方を示している。
【０３２９】
図９．３．ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーマレイミドＭＭＡＥ反応生成物の還元脱グリコシル化質量スペクトル。スペクトルにズームして、抗体重鎖を示す。コンジュゲート種の数を、各ピーク上に示す。
【０３３０】
【表１０】
2020521735.tif 000053
【０３３１】
抗体の表面上に取り付けられたＣＰ２ジエン基は、室温にて４時間以内にマレイミド−ＭＭＡＥプロドラッグと部分的に反応した。非特異的コンジュゲーションは、質量分析によって観察されなかった。というのも、全てのコンジュゲートピークが、未反応ｍＡｂではなく、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーピークから追跡されたからである。この反応は、マレイミド−ＭＭＡＥペイロードとの反応について、フランジエンよりもずっと効率的であるが、ＣＰ１ジエンよりも効率的でない。このアプローチは、生体コンジュゲートの生成に用いられ得る。
【０３３２】
実施例１０．ジエン基に対して１．０モル当量マレイミド−ＭＭＡＥでの、マレイミド−ＭＭＡＥへのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーコンジュゲーションのカイネティクス
２２℃でのマレイミドＭＭＡＥとのＣＰ２ジエンの反応カイネティクスを評価した。
【０３３３】
ｍＡｂ上へのＣＰ２ジエン官能基の導入：ＮＨＳ−エステル活性ＣＰ２とのリシン第一級アミンの反応によって、ＣＰ２官能基を、ＩｇＧ１  ｍＡｂ上に取り付けた。このアプローチは、ランダムにコンジュゲートした、アミド結合シクロペンタジエン基をもたらした。典型的なｍＡｂ修飾反応を、以下に記載する。Ｍａｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１５ｍｇ  ｍＡｂ、１００ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、３５μＬ  ＣＰ２−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、３５０ｎｍｏｌ、３．５当量）を加えた。氷上で５分間の反応、次いで室温にて１時間の反応を、連続混合しながら進めた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、０℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって、ＣＰ２−リンカー導入を定量化して、この実施例において１ｍＡｂあたり３．２９ＣＰ２−リンカー（そして、ゆえにジエン）であることが見出された。これは、ＣＰ２−ＮＨＳの、抗体コンジュゲートへの９４％の変換に相当する。
【０３３４】
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ２修飾ｍＡｂの反応：ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー（３ｍｇ、３．２９ＣＰ２／ｍＡｂ、６６ｎｍｏｌ  ＣＰ２ジエン、１当量）を、１．７ｍｇ／ｍＬの最終濃度に、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した。次に、ＤＭＳＯを加えて、２０％ｖ／ｖ溶液を得てから、１Ｍ第１リン酸ナトリウムを加えて、１０％ｖ／ｖ溶液を得た。全ての溶液構成要素の付加により、１．３ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、３２．３μＭ  ＣＰ２ジエン、１．７８Ｍ  ＤＭＳＯ、１１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む混合物を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ又はＰＭ−ＭＭＡＥ（６．６μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック液、６６ｎｍｏｌ、１当量）を抗体溶液に加えた。反応混合物を簡単にボルテックスして、混合しながら２２℃にて進めた。アリコート（１８０μＬ）を種々の時点にて取り出して、Ｎ−アセチルシステイン（３μＬの１００ｍＭ溶液、４５当量）を加えて、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出した。次に、以下に記載する還元脱グリコシル化質量分析によって、サンプルを分析した。
【０３３５】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０３３６】
ＣＰ２ジエン−マレイミド反応速度定数の算出：ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーにおけるＣＰ２ジエンとのマレイミド−ＭＭＡＥの反応についての二次速度定数を、脱グリコシル化還元質量スペクトルにおけるピーク強度から判定した。反応の進行を、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーピークの消滅及びｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー−ＭＭＡＥコンジュゲートピークの出現の双方によって監視したが、抗体重鎖上のｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーピーク強度のみを用いて、反応したＣＰ２ジエンの相対存在量を算出した。ｍＡｂ重鎖上の未反応ＣＰ２ジエン基を、以下の式を用いて算出した：
【数４】
2020521735.tif 000054
ａ＝未修飾重鎖のピーク強度
ｂ＝１つのＣＰ２ジエン基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｃ＝２つのＣＰ２ジエン基を有する重鎖のピーク強度の合計
ｄ＝３つのＣＰ２ジエン基を有する重鎖のピーク強度
ｅ＝未修飾軽鎖のピーク強度
ｆ＝１つのＣＰ２ジエン基を有する軽鎖のピーク強度の合計
ｇ＝２つのＣＰ２ジエン基を有する軽鎖のピーク強度の合計
【０３３７】
コンジュゲーションデータをさらに、モル濃度の単位で分析して、カイネティクス定数を判定した。二次速度定数を、１／［ＣＰ２ジエン］対時間をプロットして生じた曲線の傾き、及び直線回帰分析から判定した。反応半減期を、以下に示す式を用いた二次反応速度定数から算出した：
【数５】
2020521735.tif 000055
ｋ２＝二次速度定数
［ＣＰ２］０＝時間＝０でのＣＰ２ジエン濃度
【０３３８】
図１０．１．４時間及び４８時間でのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー及びＡＭ−ＭＭＡＥ−反応ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカーの還元脱グリコシル化質量スペクトル。スペクトルにズームインして、重鎖のみを示している。各ピークを標識して、コンジュゲートした種の数を示している。
【０３３９】
図１０．２．４時間及び４８時間でのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー及びＰＭ−ＭＭＡＥ反応ＣＰ２−ｍＡｂの還元脱グリコシル化質量スペクトル。スペクトルにズームインして、重鎖のみを示している。各ピークを標識して、コンジュゲートした種の数を示している。
【０３４０】
図１０．３．マレイミド−ＭＭＡＥとのｍＡｂ−ＣＰ２−リンカージエンの反応。Ａ）経時的な未反応ＣＰ２ジエンのモル濃度。ｍＡｂあたりの未反応ＣＰ２ジエンを、還元脱グリコシル化質量スペクトルのピーク強度から判定した。Ｂ）反応速度を算出するのに用いた逆濃度プロット。
【０３４１】
【表１１】
2020521735.tif 000056
【０３４２】
マレイミド−ＭＭＡＥとのＣＰ２ジエンの反応は、ＣＰ１ジエンよりも遅く、半減期が数時間程であった。ＣＰ１ジエンとは異なり、反応速度差異は、フェニルマレイミド対アルキルマレイミドについて示されなかった。反応変換は、４８時間の反応の後、ＡＭ−ＭＭＡＥについて９０％であったが、ＰＭ−ＭＭＡＥについて７３％のみであった。双方の基質について類似の速度定数を考えると、これらの条件下での長い時間の後に、フェニルマレイミドの一部が分解するので、変換全体を制限している可能性がある。
【０３４３】
実施例１１．抗体中へのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込み
ＣＰ２−ＮＮＡＡを、抗ＥｐｈＡ２（１Ｃ１）抗体の位置Ｋ２７４又はＳ２３９に組み込んで、発現されたｍＡｂの質、及び抗体組込み後のＣＰ２−ＮＮＡＡジエンの反応性を評価した。
【０３４４】
ＣＰ２  ＮＮＡＡストック液の調製：ＣＰ２  ＮＮＡＡ（０．５ｇ、１．７ｍｍｏｌ）を、７．８ｍＬのＨ２Ｏ中０．２Ｍ  ＮａＯＨと組み合わせた。生じたスラリーを、全ての固体が溶解するまで（１０分）、室温にて撹拌した。完全な溶解の後に、淡い黄色の溶液を、０．２μｍフィルタに通させて、分注して、使用まで−８０℃にて貯蔵した。この手順により、８．２ｍＬの２１６ｍＭ  ＣＰ２  ＮＮＡＡストック液が生じた。
【化３９】
2020521735.tif 000057
【０３４５】
抗体発現：Ｆｃ位置Ｋ２７４又はＳ２３９にてアンバー突然変異を有する１２Ｇ３Ｈ１１又は１Ｃ１  ＩｇＧ１抗体遺伝子を、自社所有のｐＯＥ抗体発現ベクター中にクローニングした。構築体を、ＰＥＩｍａｘ（１．５ＬのＧ２２細胞）によって、ＰｙｌＲＳ二重突然変異体（Ｙ３０６Ａ／Ｙ３８４Ｆ）又は野生型ＰｙｌＲＳをコードするプラスミド、及びｔＲＮＡ発現カセットのタンデムリピートを含有するプラスミド（ｐＯＲＩＰ  ９Ｘ  ｔＲＮＡ）と共に、ＣＨＯ−Ｇ２２中に形質移入した。形質移入の４時間後、３．３％フィードＦ９（自社所有）及び０．２％フィードＦ１０（自社所有）を細胞に加えて、当該細胞をさらに、３４度にてインキュベートした。その翌日、ＣＰ２−ＮＮＡＡを、１Ｃ１．Ｋ２７４形質移入細胞及び１Ｃ１  Ｓ２３９形質移入細胞に対して、０．２６ｍＭの最終濃度にて加えた。細胞に再度、３日目及び７日目に、６．６％フィードＦ９及び０．４％フィードＦ１０をフィードした。細胞をスピンダウンして、上清を１１日目に収穫した。上清を、ＩｇＳｅｌｅｃｔアフィニティカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）によって精製した。抗体を、５０ｍＭグリシン、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ３．５溶出バッファで溶出して、１ＭトリスバッファｐＨ７．５で中和して、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中に透析した。溶出された抗体の濃度を、２８０ｎｍでの吸光度測定によって判定した。逆算した力価は、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡについて５７ｍｇ／Ｌ、そして１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡについて７６ｍｇ／Ｌであった。１２Ｇ３Ｈ１１  ｍＡｂを、同様の方法で、より小さなスケールにて、ＣＰ２−ＮＮＡＡのフィード濃度を変えて発現させた。回収した抗体を、標準的な方法を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。又、抗体を、以下に記載するサイズ排除クロマトグラフィ及び質量分析によって分析した。ＣＰ２−ＮＮＡＡを組み込んだ抗体を、ｍＡｂ−ＣＰ１−ＮＮＡＡと表して、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー構築体又はｍＡｂ−［位置］ＣＰ２−ＮＮＡＡから区別する。ここで、［位置］は、ＣＰ２−ＮＮＡＡに突然変異したアミノ酸番号及びアミノ酸記号を示す。
【０３４６】
サイズ排除クロマトグラフィ：トリプルディテクタアレイを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＬＣ系（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  ３０１、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ、Ｈｏｕｓｏｎ、ＴＸ）を用いて、ＳＥＣ分析を実行した；波長を２８０ｎｍにセットして、サンプルを、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ６．８、流量１ｍＬ／分を用いたＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上で走らせた。
【０３４７】
質量分析：脱グリコシル化ｍＡｂ分析のために、ＥｎｄｏＳ（５μＬ  Ｒｅｍｏｖｅ−ｉＴ  ＥｎｄｏＳ（ＰＢＳ中１：１０の希釈、２０，０００単位／ｍＬ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を、５０μＬサンプル（１ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ）及び５μＬグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）と組み合わせてから、３７℃にて１時間インキュベートした。５μＬ  Ｂｏｎｄ−Ｂｒｅａｋｅｒ  ＴＣＥＰ溶液（０．５Ｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の付加及び３７℃にて１０分間のインキュベーションによって、還元サンプルを調製した。ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００  Ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ＲＲＨＤ、１．８ミクロン、２．１ｍｍ×５０ｍｍ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ６５２０Ｂ  Ｑ−ＴＯＦ質量スペクトロメータを用いて、質量分析を実行した。高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）パラメータは、以下の通りであった：流量、０．５ｍｌ／分；移動相Ａは、ＨＰＬＣグレードのＨ２Ｏ中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸であった。カラムを、９０％Ａ／１０％Ｂ中で平衡化させた。これを又、ｍＡｂサンプルを脱塩してから、２０％Ａ／８０％Ｂ中に溶出するのに用いた。１００〜３０００ｍ／ｚ、正極性、３５０℃のガス温度、４８ｌｂ／ｉｎ２のネブライザ圧力、及び５，０００Ｖのキャピラリ電圧についての質量スペクトルデータを収集した。ベンダーが供給する（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｖ．Ｂ．０４．００）ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ  Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを用いて、データを分析して、デコンボリューションしたスペクトル由来のピーク強度を用いて、各サンプルにおける種の相対割合を導き出した。
【０３４８】
図１１．１．突然変異ｔＲＳ又は野生型ｔＲＳを含む哺乳類細胞内での発現後の１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの力価及び細胞生存度。培地中のＣＰ２−ＮＮＡＡ最終濃度を、図のレジェンド中に示している。突然変異ｔＲＳによる１２Ｇ３Ｈ１１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの発現は、野生型ｔＲＳによるアジド−リシンに匹敵し、毒性は最小であった。
【０３４９】
【表１２】
2020521735.tif 000058
【０３５０】
図１１．２．脱グリコシル化１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの質量分析。Ａ）インタクトｍＡｂ、Ｂ）軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示すようにズームした還元ｍＡｂ。観察されたインタクト質量は、算出したインタクト質量（１４７５４６．０３）に密接にマッチし、インタクトｍＡｂ構造中への２つのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みが想定された。観察された重鎖質量は、算出した重鎖質量（５０３２５．９３）に密接にマッチし、抗体重鎖中への１つのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みが想定された。ｍＡｂ軽鎖中へのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みは、観察されなかった。１Ｃ１野生型ｍＡｂについての類似したスペクトルが、図１１．４に示される。
【０３５１】
図１１．３．脱グリコシル化１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの質量分析。Ａ）インタクトｍＡｂ、Ｂ）軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示すようにズームした還元ｍＡｂ。観察されたインタクト質量は、算出したインタクト質量（１４７６２８．２３）に密接にマッチし、インタクトｍＡｂ構造中への２つのＣＰ２アミノ酸の組込みが想定された。観察された重鎖質量は、算出した重鎖質量（５０３６７．０３）に密接にマッチし、抗体重鎖中へのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みが想定された。ｍＡｂ軽鎖中へのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みは、観察されなかった。１Ｃ１野生型ｍＡｂについての類似したスペクトルが、図１１．４に示される。
【０３５２】
図１１．４．脱グリコシル化１Ｃ１野生型ｍＡｂの質量分析。Ａ）インタクトｍＡｂ、Ｂ）軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示すようにズームした還元ｍＡｂ。Ａ）インタクトｍＡｂを示す質量範囲、Ｂ）軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）を示す質量範囲。
【０３５３】
【表１３】
2020521735.tif 000059
【０３５４】
図１１．５．単量体生成物が得られたことを示す、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析。高分子量種（ＨＭＷＳ）を示している。
【０３５５】
図１１．６．単量体生成物が得られたことを示す、１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのＳＥＣ分析。
【０３５６】
図１１．７．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる１Ｃ１−Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及び１Ｃ１−Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの分析。
【０３５７】
位置Ｋ２７４及びＳ２３９での抗体中へのＣＰ２−ＮＮＡＡの組込みを、質量分析によって確認した。回収した抗体は、質が高く、切断された生成物はなく、非常に限られた凝集体しかなかった。１Ｃ１抗体について２Ｌ生成スケールにて達成された力価は、細胞にフィードしたＣＰ２−ＮＮＡＡの低い量を考えると、適度に高かった。
【０３５８】
実施例１２．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及び１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂとのＡＤＣの生成及び評価
抗ＥｐｈＡ２（１Ｃ１）抗体の位置Ｋ２７４又はＳ２３９でのｍＡｂ中への組込み後のＣＰ２−ＮＮＡＡの反応性を、ＡＭ−ＭＭＡＥとのコンジュゲーションによって評価した。生じたＡＤＣを評価して、薬物：抗体比（ＤＡＲ）、血清安定性、及びインビトロ細胞毒性を判定した。
【０３５９】
ＣＰ２−ｍＡｂ  ＡＤＣの調製：抗体をアルキル−マレイミドＭＭＡＥ（ＡＭ−ＭＭＡＥ）と簡単に混合することによって、ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ  ＡＤＣを１工程で調製した。最初に、１Ｃ１−Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ溶液（８ｍｇ、５３ｎｍｏｌ、１当量）を、ＰＢＳで２ｍｇ／ｍＬに希釈した（４ｍＬの総容量）。ＤＭＳＯ（８１３μＬ）及び１Ｍ第１リン酸ナトリウム（４０７μＬ）を加えて、それぞれ約２０％及び約１０％ｖ／ｖの溶液を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ（５３．３μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、５３３ｎｍｏｌ、１０当量）を、１Ｃ１−Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ溶液に加えて、混合物を簡単にボルテックスした。反応を、室温にて７時間、連続混合しながら進めた。Ｎ−アセチルシステイン（４３μＬの水中１００ｍＭストック、４．３μｍｏｌ、８０当量）を加えて、溶液をさらに１５分間インキュベートして、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、反応混合物を、蒸留水で３倍に希釈して、ＣＨＴクロマトグラフィ（Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｍｉｎｉ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ４０μｍ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｌｕｍｎ）にかけた。ＡＤＣを、バッファＡ（１０ｍＭホスファート、ｐＨ７．０）からバッファＢ（２Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭホスファートｐＨ７．０）の勾配で、２５分にわたって溶出した。ＣＨＴクロマトグラフィの後、サンプルを、４℃でのｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセットにおける透析によって、１ｍＭ  ＥＤＴＡを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４にバッファ交換した。反応を室温にて１７時間進めたこと以外は、１Ｃ１−Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂをＡＭ−ＭＭＡＥと、同様にコンジュゲートさせた。
【０３６０】
部位特異的システインＡＤＣの調製：いくつかの実験のために、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣを、システインコンジュゲートＡＤＣと比較した。この目的で、位置２３９にてシステインを含む抗体（１Ｃ１−２３９Ｃと呼ぶ）を生成した。１Ｃ１−２３９ＣへのＡＭ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションを、３工程で行った；ｉ）還元及び透析、ｉｉ）酸化、ｉｉｉ）ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応。最初に、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する１０ｍＭ  ＰＢＳ  ｐＨ７．４中の４ｍＬの２．５ｍｇ／ｍＬ抗体溶液（１０ｍｇ抗体、６６．７ｎＭ、１当量）を、５３μＬの５０ｍＭ  ＴＣＥＰ水溶液（２．７μｍｏｌ、ｍＡｂに対して４０当量）と組み合わせてから、３７℃にて３時間穏やかに混合することによって、抗体を穏やかに還元して、遊離スルフヒドリルを生成した。還元した抗体を、ｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒ透析カセット（１０Ｋ  ＭＷＣＯ）に移して、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃、２４時間に対して、数回バッファ交換をしながら透析した。デヒドロアスコルビン酸（２７μＬのＤＭＳＯ中５０ｍＭストック、１．３μｍｏｌ、２０当量）を加えてから室温にて４時間混合することによって、還元した抗体を酸化させて、内部ジスルフィドを改質した。酸化した抗体溶液を、２０％ｖ／ｖ  ＤＭＳＯと組み合わせてから、ＡＭ−ＭＭＡＥ（５３μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、５３０ｎｍｏｌ、８当量）を加えた。反応を、混合しながら室温にて１時間進めてから、Ｎ−アセチルシステイン（４３μＬの水中１００ｍＭストック、４．２μｍｏｌ、６４当量）を加えて、未反応マレイミドをクエンチした。次に、反応混合物を、蒸留水で３倍に希釈して、先に記載するようにＣＨＴクロマトグラフィ及び透析にかけた。
【０３６１】
図１２．１．ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−２３９Ｃ  ＡＤＣの生成、及びＡＭ−ＭＭＡＥの構造。なお、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣの生成は、１工程で達成されたが、ｍＡｂ−２３９Ｃ  ＡＤＣの生成は、４工程で起こった。（Ｂ）で示すＲ基は、内生チオール含有小分子、例えばシステインであってよい。
【０３６２】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０３６３】
ＨＩＣクロマトグラフィ分析：Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＨＩＣ  Ｂｕｔｙｌ  ＮＰＳカラム（４．６×３５ｍｍ、５μｍ、Ｓｅｐａｘ）を用いて、１００％Ａから１００％Ｂ（移動相Ａ：２５ｍＭトリス  ｐＨ８．０、１．５Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、移動相Ｂ：２５ｍＭトリス  ｐＨ８．０、５％（ｖ／ｖ）イソプロピルアルコール）の勾配で、室温にて２２分にわたって溶出するサイズ排除クロマトグラフィによって、ＡＤＣを分析した。タンパク質を、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって検出した。各分析について、おおよそ５０〜１００μｇのタンパク質を注入した。
【０３６４】
ｒＲＰ−ＨＰＬＣ分析：各分析について、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中４２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて、抗体及びＡＤＣを、３７℃にて２０分間還元した。１０μｇの還元した抗体及びＡＤＣを、ＰＬＲＰ−Ｓ、１０００Åカラム（２．１×５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）上にロードして、５％Ｂから１００％Ｂ（移動相Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸、そして移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配で、０．５ｍＬ／分の流量で４０℃にて２５分にわたって溶出した。コンジュゲーションパーセントを、クロマトグラム由来の積分ピーク面積を用いて判定した。
【０３６５】
ＡＤＣの血清安定性：ＡＤＣをラット血清中でインキュベートして、ディールス−アルダーコンジュゲートの安定性を検証した。ＡＤＣを、健常ラット血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に加えて、０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭ抗体）の最終濃度を達成した。血清に加えたＡＤＣ溶液の総容量は、１０％未満であった。ＡＤＣ−血清混合物を滅菌濾過して、アリコートをこの混合物から取り出して、ｔ＝０対照として凍結した。次に、残りのサンプルを、密封容器内で３７℃にて撹拌せずにさらにインキュベートした。コンジュゲートヒト抗体及び非コンジュゲートヒト抗体を、Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧ−アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた免疫沈降によって、ラット血清から回収した。樹脂を、ＰＢＳで２回、ＩｇＧ溶出バッファで１回、その後ＰＢＳで２回以上リンスした。次に、ＡＤＣ−マウス血清サンプルを、抗ヒトＩｇＧ樹脂（１００μＬのＡＤＣ−血清混合物、５０μＬの樹脂スラリー）と組み合わせて、室温にて１５分間混合した。樹脂を、遠心分離によって回収してから、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した樹脂を、１００μＬ  ＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁させて、室温にて５分間さらにインキュベートした。樹脂を、遠心分離によって取り出してから、２０μＬの１０Ｘグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を上清に加えた。回収したヒト抗体溶液を滅菌濾過して、ＥｎｄｏＳと３７℃にて１時間インキュベートした。次に、脱グリコシル化ｍＡｂを、先に記載するように、ＴＣＥＰで還元して、ＬＣ／ＭＳによって分析した。コンジュゲート抗体パーセントを、質量スペクトルのピーク高さから判定した。
【０３６６】
インビトロ細胞毒性分析：ヒト前立腺癌細胞系ＰＣ３を、米国菌培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ）から得た。ＰＣ３細胞を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＨＩ−ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、５％ＣＯ２内で３７℃にて維持した。細胞を、指数増殖期まで増殖させて、マイルドなトリプシン処理によって収穫して、９６ウェル培養プレート中に１５００細胞／ウェルにて播種した。細胞を、２４時間接着させてから、４０００ｎｇ／ｍＬから始めて二反復で４倍段階希釈して９つの濃度にした抗体及びＡＤＣで処理した。処理した細胞を６日間培養して、細胞生存度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って判定した。細胞生存度を、対照非処理細胞のパーセンテージとして算出した。ＡＤＣの細胞毒性のＩＣ５０を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）によるロジスティック非線形回帰分析を用いて判定した。
【０３６７】
図１２．２．ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ及びｍＡｂ−システインの還元グリコシル化質量分析。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ重鎖を示している。薬物：抗体比（ＤＡＲ）０及び１のピークを、ＡＤＣサンプルについて示しており、重鎖あたり１薬物（ＤＡＲ  １）が、各構築体について予想される。
【０３６８】
図１２．３．ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応の前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ及びｍＡｂ−システインの還元グリコシル化質量分析。スペクトルにズームインして、ｍＡｂ軽鎖を示している。ＡＭ−ＭＭＡＥ軽鎖コンジュゲートは検出されなかった。このことは、コンジュゲーションが、ｍＡｂ重鎖に部位特異的であったことを示している。
【０３６９】
【表１４】
2020521735.tif 000060
【０３７０】
図１２．４．ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの疎水性相互作用クロマトグラフィ分析。１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡの保持時間に相当するピークの消滅及び保持時間が増大したピークの出現は、ｍＡｂへのＡＭ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションを示す。なお、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣについて、ＤＡＲ  １種及びＤＡＲ  ２種を検出している。
【０３７１】
図１２．５．ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの還元逆相高性能クロマトグラフィ分析。ＡＤＣにおける重鎖ピークの消滅及びより長い保持時間のピークの出現は、重鎖へのＡＭ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションを示す。軽鎖（ＬＣ）ピーク保持時間は、コンジュゲーションの前後で変わらなかった。このことは、コンジュゲーションがｍＡｂ重鎖に特異的であったことを示す。
【０３７２】
【表１５】
2020521735.tif 000061
【０３７３】
図１２．６．ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【０３７４】
図１２．７．ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーションの前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣの還元脱グリコシル化質量分析。質量スペクトルにズームして、重鎖（ＨＣ）のみを示している。血清インキュベートサンプル（Ｄ及びＨ）における非コンジュゲートＨＣシグナルの欠如は、ディールス−アルダーコンジュゲートが安定していたことを示す。
【０３７５】
図１２．８．ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーションの前後の、ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ  ＤＡＲの定量化。ＤＡＲを、図１２．７に示す質量スペクトルのピーク高さから算出した。値を、平均±標準偏差（ｎ＝３）として報告している。薬物喪失は、これらの条件下で検出されなかった。
【０３７６】
図１２．９．ＰＣ３癌細胞に向けたｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及びｍＡｂ−システインＡＤＣのインビトロでの細胞毒性。ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＭ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣは、ＡＭ−ＭＭＡＥの部位特異的システインコンジュゲーションによって調製した類似ＡＤＣと同様の効力を示した。
【０３７７】
ＣＰ２−ＮＮＡＡジエンを、ＡＭ−ＭＭＡＥ上に含有されるマレイミドと反応させた。システインスルフヒドリル基への変換は類似した。ｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ対ｍＡｂ−システインＡＤＣの調製の主要な差異は、コンジュゲーションプロセスにおける工程数の減少であった。システインｍＡｂは、生成に３工程及び２日を必要としたが、ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ  ＡＤＣは、１工程において２４時間未満で生成された。生じたｍＡｂ−ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣは、生理学的に関連する条件下で安定しており、ラット血清中で３７℃にて７日間インキュベートした場合に、薬物喪失を示さなかった。ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ  ＡＤＣは、インビトロで強力であり、部位特異的システインコンジュゲーションによって調製したＡＤＣと活性が類似した。
【０３７８】
実施例１３．シクロペンタジエン及びフラン含有化合物の合成。
材料及び方法：特に明記しない限り、反応を、試薬グレードの溶媒を用いて、Ｎ２雰囲気下で行った。ＤＣＭ及びトルエンを、３Åモレキュラーシーブ上で貯蔵した。ＴＨＦを、活性アルミナのカラムに通させた。商業的に得た全ての試薬を、受領したままの状態で用いた。薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）を、Ｅ．Ｍｅｒｃｋシリカゲル６０  Ｆ２５４プレコーテッドプレート（０．２５ｍｍ）で行って、ＵＶ光（２５４ｎｍ）への曝露によって視覚化し、又はｐ−アニスアルデヒド、ニンヒドリン、若しくは過マンガン酸カリウムで染色した。順相シリカゲル（６０Å、０．０４０〜０．０６３ｍｍ、Ｇｅｄｕｒａｎ）を用いて、フラッシュカラムクロマトグラフィを実行した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録して（４００、５００、又は６００ＭＨｚ）、重水素化溶媒シグナルに関して報告する。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、以下の通り報告する：化学シフト（δｐｐｍ）、多重度、カップリング定数（Ｈｚ）、及び積分。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎスペクトロメータで記録した（１００、１２５、又は１５０ＭＨｚ）。１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルについてのデータを、化学シフト（δｐｐｍ）に関して報告する。質量スペクトルを、ＵＣ  Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから、電界脱離（ＦＤ）源を有する（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．）ＧＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ高解像度飛行時間型質量スペクトロメータで得た。
【０３７９】
ＣＰ３−ＮＨＳ（１３）の合成
【化４０】
2020521735.tif 000062
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（１，２，３，４，５−ペンタメチルシクロペンタ−２，４−ジエニル）メチルスクシナート（１３）：
ＤＣＭ（８ｍＬ）を、（１，２，３，４，５−ペンタメチルシクロペンタ−２，４−ジエニル）メタノール１（０．３３ｇ、２．０ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。Ｅｔ３Ｎ（０．６４ｍＬ、４．６ｍｍｏｌ、２．３当量）、ＤＭＡＰ（４６ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、０．２当量）、及び無水コハク酸（０．４６ｇ、４．６ｍｍｏｌ、２．３当量）を加えて、反応物を、空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。反応物をＨ２Ｏ（１ｍＬ）でクエンチしてから、分液漏斗中に注いだ。ＨＣｌ（１Ｍ、５０ｍＬ）を加えて、ＤＣＭで抽出した（２×５０ｍＬ）。有機層を組み合わせて、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、４−オキソ−４−（（１，２，３，４，５−ペンタメチルシクロペンタ−２，４−ジエニル）メトキシ）ブタン酸を得、これを次の反応に直接用いた。
Ｒｆ（ＥｔＯＡｃ）：０．２４；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ３．９８（ｓ，２Ｈ），２．６４−２．５９（ｍ，２Ｈ），２．５９−２．５４（ｍ，２Ｈ），１．７６（ｓ，６Ｈ），１．７４（ｓ，６Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ．
【０３８０】
ＴＨＦ（１０ｍＬ）を、４−オキソ−４−（（１，２，３，４，５−ペンタメチルシクロペンタ−２，４−ジエニル）メトキシ）ブタン酸（約２ｍｍｏｌ）を含有するバイアルに加えた。ＮＨＳ（０．６１ｇ、５．３ｍｍｏｌ、２．７当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（０．８７ｇ、４．６ｍｍｏｌ、２．３当量）、及びＤＣＭ（６ｍＬ）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、３：１→２：１）にかけて、白色の固体として７（０．３９ｇ、２工程越しで５５％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，７：３）：０．２７；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ４．００（ｓ，２Ｈ），２．８９（ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，２Ｈ），２．８５（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．７７（ｓ，６Ｈ），１．７４（ｓ，６Ｈ），０．９５（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７０．７，１６８．９，１６７．６，１３８．４，１３５．０，６８．２，５５．３，２８．６，２６．２，２５．５，１６．８，１１．０，１０．１  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）２９７３，２９３５，１８１５，１７８２，１７２９，１２０８，１０８９，１０６９，９６７  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１９Ｈ２５ＮＯ６［Ｍ］＋：３６３．１６８２，実測値：３６３．１６７６．
【０３８１】
Ｆ２−ＮＨＳ（１７）の合成
【化４１】
2020521735.tif 000063
メチル９，９−ジエトキシ−６−ヒドロキシノン−７−イノアート（１４）：
３，３−ジエトキシプロパ−１−イン（０．７２ｍＬ、５．０ｍｍｏｌ、１当量）をＴＨＦ（１５ｍＬ）に加えてから、−７８℃に冷却した。ｎＢｕＬｉ（ヘキサン中２．３３Ｍ、２．４ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ、１．１当量）を滴加してから、反応混合物を−７８℃にてさらに３０分撹拌した。ＴＨＦ（５ｍＬ）中に溶解したメチル６−オキソヘキサノアート（０．８７ｇ、６．０ｍｍｏｌ、１．２当量）を滴加してから、反応混合物を−７８℃にて１時間撹拌した。反応混合物を、重炭酸ナトリウム飽和水溶液（１００ｍＬ）を含有する分液漏斗中に注いでから、Ｅｔ２Ｏ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層をブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、ＭｇＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１）にかけて、澄明で無色の油として１４（１．１ｇ、８０％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，６：４）：０．４１；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ５．２８（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１Ｈ），４．４７−４．３６（ｍ，Ｊ＝３．５Ｈｚ，１Ｈ），３．７６−３．６７（ｍ，２Ｈ），３．６７−３．６３（ｍ，３Ｈ），３．５６（ｑｄ，Ｊ＝７．０，９．４Ｈｚ，２Ｈ），２．３４−２．２７（ｍ，３Ｈ），１．７６−１．５９（ｍ，４Ｈ），１．５４−１．４２（ｍ，２Ｈ），１．２１（ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，６Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７４．０，９１．２，８６．２，８０．０，６１．８，６０．８，６０．８，５１．５，３６．９，３３．８，２４．６，２４．４，１５．０  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）３４５１，２９３２，１７３６，１４３７，１３２８，１１３５，１０５１，１０１２  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１４Ｈ２３Ｏ５［Ｍ−Ｈ］＋：２７１．１５４５，実測値：２７１．１５４６．
【化４２】
2020521735.tif 000064
【０３８２】
メチル５−（３−メトキシフラン−２−イル）ペンタノアート（１５）：
ＭｅＯＨ（３．９ｍＬ）を、１４（１．０６ｇ、３．８９ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。ＰＰｈ３ＡｕＮＴｆ２（２９ｍｇ、０．０３９ｍｍｏｌ、０．０１当量）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。反応混合物を、ブライン（５０ｍＬ）を含有する分液漏斗中に注いでから、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、１５：１→９：１）にかけて、澄明で無色の油として１５（０．３５ｇ、４３％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，９：１）：０．３５；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．１１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ），２．６１（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．３３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９−１．６０（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７４．１，１４３．３，１３９．２，１３８．９，１０２．９，５９．４，５１．４，３３．７，２７．５，２４．５，２４．３  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）２９５０，１７３４，１６６２，１６００，１２３０，１１７９，１１１１  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１１Ｈ１６Ｏ４［Ｍ］＋：２１２．１０４９，実測値：２１２．１０４５．
【化４３】
2020521735.tif 000065
【０３８３】
５−（３−メトキシフラン−２−イル）ペンタン酸（１６）：
ＭｅＯＨ（４ｍＬ）中に溶解した１５（０．３３１ｇ、１．５６ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに、ＮａＯＨ（０．１２５ｇ、３．１２ｍｍｏｌ、２当量）のＨ２Ｏ溶液（４ｍＬ）を加えた。反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて３０分撹拌した。反応混合物を、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）を含有する分液漏斗中に注いで、ＨＣｌ（Ｈ２Ｏ中１Ｍ）をｐＨ２〜３になるまで加えた（約４ｍＬ）。水層をＤＣＭで抽出した（２×５０ｍＬ）。組み合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、澄明で無色の油として１６（０．２８０ｇ、９０％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，１：１）：０．５５；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．３７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），７．１２（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２８（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．６２（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），２．３８（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ），１．７３−１．６１（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７９．８，１４３．４，１３９．１，１３９．０，１０２．９，５９．４，３３．７，２７．４，２４．４，２４．０  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）３１３３，２９４０，１７０６，１６６２，１４５４，１４１１，１２７９，１２３６，１１０９  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１０Ｈ１４Ｏ４［Ｍ］＋：１９８．０８９２，実測値：１９８．０８９０．
【化４４】
2020521735.tif 000066
【０３８４】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル５−（３−メトキシフラン−２−イル）ペンタノアート（１７）：
ＴＨＦ（５ｍＬ）を、１６（０．２６５ｇ、１．３４ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。ＮＨＳ（０．２１６ｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．４当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（０．３０８ｇ、１．６１ｍｍｏｌ、１．２当量）、及びＤＣＭ（３ｍＬ）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１→１：１）にかけて、無色の粘性油として１７（０．２９３ｇ、７４％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，２：１）：０．３３；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ７．１１（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），６．２７（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．８２（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ），２．６９−２．５４（ｍ，４Ｈ），１．８１−１．６０（ｍ，４Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６９．１，１６８．５，１４３．５，１３９．１，１３８．７，１０２．８，５９．３，３０．５，２７．０，２５．５，２４．２，２３．８  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）２９４８，１８１４，１７３５，１６３８，１４１３，１２０６，１０５８，１０４６  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１４Ｈ１７ＮＯ６［Ｍ］＋：２９５．１０５６，実測値：２９５．１０６２．
【０３８５】
ＣＰ１ｂ−ＮＨＳ（１９）の合成
【化４５】
2020521735.tif 000067
３−（シクロペンタ−１，３−ジエニル）プロパン酸及び３−（シクロペンタ−１，４−ジエニル）プロパン酸（１２）：
エチル３−ブロモプロピオナート（１．６５ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ、１当量）を、ＴＨＦ（３０ｍＬ）に加えて、−７８℃に冷却した。シクロペンタジエニドナトリウム（２Ｍ  ＴＨＦ溶液、６．４５ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ、１当量）を５分にわたって滴加して、反応物を−７８℃にて３．５時間撹拌した。反応物をＤＣＭ（２０ｍＬ）中に注いで、シリカゲルを加えた（６ｇ）。反応混合物を、ＤＣＭ（１００ｍＬ）によりシリカゲルで濾過して、溶媒を除去して、黄色の油としてエチル３−（シクロペンタジエニル）プロパノアート異性体を得た。
【０３８６】
スペクトルデータは、文献の報告データ３のものにマッチした。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，９：１）：０．４５；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．４７−６．０２（ｍ，３Ｈ），４．１７−４．１１（ｍ，２Ｈ），２．９６（ｓ，０．３１Ｈ），２．９１（ｄ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，１．６９Ｈ），２．７８−２．６８（ｍ，Ｊ＝１．７Ｈｚ，２Ｈ），２．５９−２．５３（ｍ，２Ｈ），１．２６（ｔ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，３Ｈ）．
【０３８７】
ＥｔＯＨ（２０ｍＬ）中に溶解したエチル３−（シクロペンタジエニル）プロパノアート異性体（約１２．９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＮａＯＨ（２．０ｇ、５０ｍｍｏｌ、３．９当量）のＨ２Ｏ溶液（２０ｍＬ）を加えた。反応物を室温にて１５分間撹拌した。反応混合物を、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）及びＤＣＭ（５０ｍＬ）を含有する分液漏斗中に注いだ。水層を、ＨＣｌ（Ｈ２Ｏ中１Ｍ）でｐＨ２に酸性化した（約７０ｍＬ）。層を分離してから、水層をＤＣＭ（５０ｍＬ）で抽出した。組み合わせた有機層を、ブライン（５０ｍＬ）で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させて、濾過して、溶媒を除去して、茶色の固体として１８（０．５０ｇ、２８％  ２工程）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，１：２）：０．６９；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １０．５７（ｂｒ．ｓ．，１Ｈ），６．４９−６．０２（ｍ，３Ｈ），２．９７（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，１．０７Ｈ），２．９２（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，０．９３Ｈ），２．８２−２．６８（ｍ，２Ｈ），２．６８−２．５８（ｍ，２Ｈ）ｐｐｍ；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １７９．７，１７９．７，１４７．１，１４４．９，１３４．２，１３４．１，１３２．３，１３１．１，１２７．０，１２６．４，４３．３，４１．３，３３．９，３３．３，２５．５，２４．７  ｐｐｍ；ＩＲ（ＡＴＲ）３０７０，２９２６，１７０５，１４１２，１２８３，１２０５，９１３  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ８Ｈ１０ＮＯ２［Ｍ］＋：１３８．０６８１，実測値：１３８．０６７８．
【化４６】
2020521735.tif 000068
【０３８８】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（シクロペンタ−１，３−ジエニル）プロパノアート及び２，５−ジオキソピロリジン−１−イル３−（シクロペンタ−１，４−ジエニル）プロパノアート（１９）：
ＴＨＦ（１０ｍＬ）を、１８（０．４６０ｇ、３．３３ｍｍｏｌ、１当量）を含有するバイアルに加えた。ＮＨＳ（０．５３７ｇ、４．６６ｍｍｏｌ、１．４当量）、ＥＤＣ・ＨＣｌ（０．７６６ｇ、４．００ｍｍｏｌ、１．２当量）、及びＤＣＭ（６ｍＬ）を加えて、反応物を空気雰囲気下でキャッピングして、室温にて一晩撹拌した。溶媒を除去して、残留物をフラッシュカラムクロマトグラフィ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ、２：１→１：１）にかけて、帯黄白色の粉末として１９（０．４３８ｇ、５６％）を得た。
Ｒｆ（ヘキサン：ＥｔＯＡｃ，２：１）：０．２９；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  ６．４７−６．０８（ｍ，３Ｈ），２．９７（ｄ，Ｊ＝１．２Ｈｚ，１．２Ｈ），２．９２（ｄ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，０．８Ｈ），２．９０−２．７５（ｍ，８Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ  １６９．１，１６８．２，１６８．１，１４５．７，１４３．９，１３４．４，１３３．８，１３２．２，１３１．４，１２７．７，１２７．１，４３．２，４１．４，３０．８，３０．２，２５．５，２５．３，２４．５；ＩＲ（ＡＴＲ）２９４７，１８１０，１７７９，１７３５，１４２０，１３６６，１２０４，１０６２，１０４６  ｃｍ−１；ＨＲＭＳ（ＥＩ）精密質量Ｃ１２Ｈ１３ＮＯ４［Ｍ］＋：２３５．０８４５，実測値：２３５．０８４８．
【０３８９】
アクリル酸エチルに対する除去を経る代わりとしての、Ｃｐ＊Ｌｉ及びエチル３−ブロモプロピオナートを用いてペンタメチルシクロペンタジエン（ＣＰ３）ＮＨＳ誘導体を合成する試みは、失敗した。ブロモ酢酸メチルとのＣＰ＊Ｌｉの反応は成功したが、エステル加水分解及び酸性化の後、化合物は予想外の環化を受けた。第３の戦略として、Ｂｏｙｄｓｔｏｎの（１，２，３，４，５−ペンタメチルシクロペンタ−２，４−ジエニル）メタノール１を用いた。これを、無水コハク酸と反応させると、酸中間体が生じ、これを、さらに精製することなく用いた。ＥＤＣ・ＨＣｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、ＮＨＳエステル１３を得た。フラン（Ｆ２）ＮＨＳ誘導体の設計及び合成は、３−アルコキシフランのＳｈｅｐｐａｒｄの研究２からヒントを得た。３，３−ジエトキシプロパ−１−インのリチウム塩を、メチル６−オキソヘキサノアートに加えて、アルコール１４を形成し、これを、触媒金（Ｉ）を用いてメタノール中で環化して、３−メトキシフラン１５を得た。１５のエステルを加水分解してから、ＥＤＣ・ＨＣｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて、ＮＨＳエステル１７を得た。
【０３９０】
内部エステルを含有しないＣＰ１  ＮＨＳ−誘導体（ＣＰ１ｂ）の合成を、エチル３−ブロモプロピオナートとのＮａＣＰの反応から開始して、その後エステル加水分解して、酸１２を得た。ＥＤＣ・ＨＣｌ及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応により、ＮＨＳエステル１９を得た。ＣＰ１とＣＰ１ｂの構造的差異を、図１３．１に示す。
【０３９１】
図１３．１．Ａ）ＣＰ１−ＮＨＳリンカー、及びＢ）ＣＰ１ｂ−ＮＨＳリンカー内のエステル位置の概観。
１．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｉ．；Ｃｈｕｒｃｈ，Ｄ．Ｃ．；Ｙａｋｅｌｉｓ，Ｎ．Ａ．；Ｂｏｙｄｓｔｏｎ，Ａ．Ｊ．，１，２−ｏｘａｚｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｒ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ｆｏｒ  ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  ２０１４，５５，５９８０−５９８５．
２．Ｆｏｓｔｅｒ，Ｒ．Ｗ．；Ｂｅｎｈａｍｏｕ，Ｌ．；Ｐｏｒｔｅｒ，Ｍ．Ｊ．；Ｂｕｃｈａｒ，Ｄ．−Ｋ．；Ｈａｉｌｅｓ，Ｈ．Ｃ．；Ｔａｍｅ，Ｃ．Ｊ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｔ．Ｄ．，Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｅｎｄｏ−Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ａｌｋｏｘｙｆｕｒａｎｓ：Ａ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏ−Ｃａｎｔｈａｒｉｍｉｄｅｓ．Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  ａｎ  Ｄｅｒ  Ｂｅｒｇｓｔｒａｓｓｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）２０１５，２１，６１０７−６１１４．
３．Ｈｏｎｚｉｃｈｅｋ，Ｊ．；Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，Ａ．；Ｓａｎｔｏｓ−Ｓｉｌｖａ，Ｔ．；Ｒｏｍａｏ，Ｍ．Ｊ．；Ｒｏｍａｏ，Ｃ．Ｃ．，Ｒｉｎｇ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｍｏｌｙｂｄｅｎｏｃｅｎｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ  ２００９，２８，２８７１−２８７９．
【０３９２】
実施例１４．リンカー修飾抗体で調製したＡＤＣの評価。
リンカー修飾抗体へのＡＭ−ＭＭＡＥのディールス−アルダーコンジュゲーションによって生じたＡＤＣの安定性及び効力を評価した。ディールス−アルダーコンジュゲートを、システインコンジュゲートと比較した。
【０３９３】
材料。標準的な分子生物学の方法を用いて、全ての抗体（ＩｇＧ１フォーマット）を発現させて、精製した。特に明記しない限り、全ての試薬を、商業的ベンダーから購入した。フラン−２−イルメチルスクシンアミド酸ＮＨＳエステル（Ｆ１−ＮＨＳ）及びマレイミドカプロイル−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル−モノメチル−オーリスタチン−Ｅ（ＡＭ−ＭＭＡＥ）を、ＳｙｎＣｈｅｍ，Ｉｎｃ．（Ｅｌｋ  Ｇｒｏｖｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ、ＩＬ）から購入した。
【０３９４】
ｍＡｂ−リンカーコンジュゲートの調製：リシンアミンとの、先に記載するＮＨＳエステル含有リンカー１７及び１９（Ｆ２及びＣＰ１ｂ）の反応によって、ジエン官能基を抗体中にランダムに組み込んだ。ｍＡｂ修飾の程度を、反応に用いるＮＨＳ−リンカーの量によって制御し、そして実験に応じて、様々なリンカー密度を目標とした。ＣＰ１によるｍＡｂの修飾についての一般的な手順を、以下に記載する：最初に、ｍＡｂ溶液を、ＰＢＳ  ｐＨ７．２に続く１０％ｖ／ｖ  １Ｍ  ＮａＨＣＯ３の付加によって、５ｍｇ／ｍＬ（３ｍＬ、１５ｍｇ  ｍＡｂ、１００ｎｍｏｌ、１当量）に調整した。この溶液を氷上で冷やして、３０μＬ  ＣＰ１ｂ−ＮＨＳ（ＤＭＡｃ中１０ｍＭストック、３００ｎｍｏｌ、３当量、ＣＰ１−リンカーとも呼ぶ）を加えた。氷上で５分間の反応、次いで室温にて１時間の反応を、連続混合しながら進めた。反応したｍＡｂを、ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、４℃に対する２４時間の透析（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、１０ｋＤａ  ＭＷＣＯ）によって精製した。ＣＰ１−リンカー導入を、以下に記載するインタクト脱グリコシル化質量分析によって定量化した。
【化４７】
2020521735.tif 000069
【０３９５】
スキーム１４．１ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカーコンジュゲート及びｍＡｂ−Ｆ２−リンカーコンジュゲートの調製。
ＡＤＣの調製：抗体薬物−コンジュゲートを、リンカーを介したディールス−アルダーコンジュゲーション及び抗体システインチオールへの直接的コンジュゲーションの双方を用いたハーセプチン（オンターゲット）ｍＡｂ又はＩｇＧ−１アイソタイプ対照−１（オフターゲット）ｍＡｂから調製した。以下にｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカーについて記載する同じ一般的な手順を用いて、ディールス−アルダーＡＤＣを、ＣＰ１ｂ−ＮＨＳ（化合物１９）及びＦ２−ＮＨＳ（化合物１７）リンカー修飾抗体から調製した：ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカー（１０ｍｇ、６７ｎｍｏｌ、１当量）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で４．２７ｍｇ／ｍＬに希釈してから、ＤＭＳＯ（４９３μＬ）及び１Ｍ第１リン酸ナトリウム（２４７μＬ）を加えて、それぞれ約２０％及び１０％ｖ／ｖの溶液を得た。ＡＭ−ＭＭＡＥ（５３．３μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、５３０ｎｍｏｌ、８当量）を、抗体溶液に加えて、反応を、室温にて４時間、混合しながら続けた。Ｎ−アセチルシステイン（４３μＬの１００ｍＭ水溶液、４．３μｍｏｌ、６４当量）を加えて、未反応マレイミドをクエンチした。ＣＨＴクロマトグラフィを用いて、ＡＤＣを反応混合物から精製した。ＡＤＣ溶液を、蒸留水で３倍に希釈して、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ  Ｍｉｎｉ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ  ＣＨＴ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ４０μｍ  ｍｅｄｉａ  ｃｏｌｕｍｎ上にロードした。ＡＤＣを、バッファＡ（１０ｍＭホスファート、ｐＨ７．０）からバッファＢ（２Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭホスファートｐＨ７．０）の勾配で、５ｍＬ／分の流量にて２５分にわたって溶出した。ＣＨＴクロマトグラフィの後、ＡＤＣサンプルを、４℃にてｓｌｉｄｅ−ａ−ｌｙｚｅｒカセットを用いて、ＰＢＳにバッファ交換した。ＡＭ−ＭＭＡＥコンジュゲーション反応を室温にて２４時間続けたことを除いて、ｍＡｂ−Ｆ２−リンカー構築体で調製したＡＤＣについて、同じ手順に従った。なお、ＡＭ−ＭＭＡＥとの反応に先立つ各ｍＡｂについてのジエン含有量を、表１４．１に示す。コンジュゲーション反応に用いたｍＡｂに対して８当量のＡＭ−ＭＭＡＥは、ジエンに対しておおよそ２モル当量のＡＭ−ＭＭＡＥに相当する。
【０３９６】
又、抗体ヒンジ領域内に含有されるシステインチオールへのＡＭ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションによって、ＡＤＣを調製した。最初に、抗体（１０ｍｇ、６７ｎｍｏｌ、１当量）溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳで２．５ｍｇ／ｍＬに調整した。次に、ＴＣＥＰ（１０μＬの５０ｍＭ水溶液、５００ｎｍｏｌ、７．５当量）を加えて、ヒンジジスルフィドを還元して、混合物を、３７℃にて１時間、混合しながらインキュベートした。次に、ＤＭＳＯ（４１０μＬ、反応物中１０％ｖ／ｖの最終濃度）を加えて、反応を、室温にて１時間、混合しながら続けた。Ｎ−アセチルシステインを加えて、未反応マレイミド基をクエンチして、ＡＤＣを、先に記載するＣＨＴクロマトグラフィ及び透析によって精製した。例えば、ヒンジシステインへのコンジュゲーションによって調製したＡＤＣを、名前の中でＣｙｓで表す：ハーセプチン−Ｃｙｓ−ＭＭＡＥ。
【０３９７】
ｒＲＰ−ＨＰＬＣ分析：各分析について、抗体及びＡＤＣを、ＰＢＳ  ｐＨ７．２中４２ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて、３７℃にて２０分間還元した。１０μｇの還元した抗体及びＡＤＣを、ＰＬＲＰ−Ｓ、１０００Åカラム（２．１×５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ）上にロードして、５％Ｂから１００％Ｂ（移動相Ａ：水中０．１％トリフルオロ酢酸、そして移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％トリフルオロ酢酸）の勾配で、０．５ｍＬ／分の流量で４０℃にて６０分にわたって溶出した。コンジュゲーションパーセントを、クロマトグラム由来の積分ピーク面積を用いて判定した。
【０３９８】
サイズ排除クロマトグラフィ分析：トリプルディテクタアレイを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＬＣ系（Ｖｉｓｃｏｔｅｋ  ３０１、Ｖｉｓｃｏｔｅｋ、Ｈｏｕｓｏｎ、ＴＸ）を用いて、ＳＥＣ分析を実行した；波長を２８０ｎｍにセットして、サンプル（５０μｇ）を、１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、１０％イソプロピルアルコール、ｐＨ６．８、流量１ｍＬ／分を用いたＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上で走らせた。
【０３９９】
血清安定性分析：抗体−ペイロード結合の安定性を検証するために、ＡＤＣをラット血清中でインキュベートした。ＡＤＣを、健常ラット血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）に加えて、０．２ｍｇ／ｍＬ（１．３３μＭ抗体）の最終濃度を達成した。血清に加えたＡＤＣ溶液の総容量は、１０％未満であった。ＡＤＣ−血清混合物を滅菌濾過して、アリコートをこの混合物から取り出して、ｔ＝０対照として凍結した。次に、残りのサンプルを、密封容器内で３７℃にて７日間さらにインキュベートした。コンジュゲートヒト抗体及び非コンジュゲートヒト抗体を、Ｆｃ特異的抗ヒトＩｇＧ−アガロース樹脂（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた免疫沈降によって、ラット血清から回収した。樹脂を、ＰＢＳで２回、ＩｇＧ溶出バッファで１回、その後ＰＢＳで２回以上リンスした。次に、ＡＤＣ−マウス血清サンプルを、抗ヒトＩｇＧ樹脂（１００μＬのＡＤＣ−血清混合物、５０μＬの樹脂スラリー）と組み合わせて、室温にて１５分間混合した。樹脂を、遠心分離によって回収してから、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄した樹脂を、１００μＬ  ＩｇＧ溶出バッファ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁させて、室温にて５分間さらにインキュベートした。樹脂を、遠心分離によって取り出してから、２０μＬの１０Ｘグリコバッファ１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を上清に加えた。回収したヒト抗体溶液を滅菌濾過して、ＥｎｄｏＳと３７℃にて１時間インキュベートした。次に、脱グリコシル化ｍＡｂを、先に記載するように、ＴＣＥＰで還元して、ＬＣ／ＭＳによって分析した。コンジュゲート抗体パーセントを、実施例１２に記載するように、質量スペクトルのピーク高さから判定した。
【０４００】
質量分析：実施例１に記載するように、サンプルを分析した。
【０４０１】
インビトロ細胞毒性分析：ＳＫＢＲ３癌細胞系及びＮ８７癌細胞系を、米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ）から得た。細胞を、１０％熱不活化胎仔ウシ血清（ＨＩ−ＦＢＳ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、５％ＣＯ２内で３７℃にて維持した。指数増殖期に収穫したＳＫＢＲ３細胞及びＮＣＩ−Ｎ８７細胞を、９６ウェル培養プレート中に２５００及び２０００細胞／ウェルにて播種して、一晩中接着させた。その後、細胞を、次の日に、４０００及び６４，０００ｎｇ／ｍＬから二反復で４倍段階希釈（９つの濃度）のＡＤＣで処理した。処理した細胞を６日間培養して、細胞生存度を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、メーカーのプロトコルに従って判定した。細胞生存度を、対照非処理細胞のパーセンテージとして算出した。ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）によるロジスティック非線形回帰分析を用いて判定した。
【０４０２】
腫瘍増殖インビボ阻害：Ｆ２リンカー修飾ｍＡｂ及びＣＰ１ｂリンカー修飾ｍＡｂで調製したハーセプチン−ＭＭＡＥ  ＡＤＣを、マウスの皮下Ｎ８７異種移植モデルにおけるインビボ抗腫瘍活性について、さらに評価した。４〜６週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスの皮下中へのＮ８７細胞（５０％マトリゲル中５００万Ｎ８７細胞）の接種によって、腫瘍を調製した。腫瘍がおおよそ２００ｍｍ３に達したときに、マウスを群（１群あたり５頭のマウス）に無作為に割り付けた。ＡＤＣを、示した用量にて投与ＩＶし、細胞接種後５日目に投薬した。腫瘍寸法（長軸及び短軸）を、キャリパで週に２回測定した。腫瘍容量を、以下の式を用いて算出した：
【数６】
2020521735.tif 000070
式中、
ａ＝腫瘍長軸ｍｍ
ｂ＝腫瘍短軸ｍｍ。
【０４０３】
図１４．１．ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカーコンジュゲートの質量分析。ピーク上の数字は、ｍＡｂにコンジュゲートしたリンカー（Ｂ及びＥ）又はＡＭ−ＭＭＡＥ（Ｃ及びＦ）の数を示す。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化した。
【０４０４】
図１４．２．ｍＡｂ−Ｆ２−リンカーコンジュゲートの質量分析。ピーク上の数字は、ｍＡｂにコンジュゲートしたリンカー（Ｂ及びＥ）又はＡＭ−ＭＭＡＥ（Ｃ及びＦ）の数を示す。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化した。
【０４０５】
図１４．３．ｍＡｂ−システインコンジュゲートの質量分析。ｍＡｂの軽鎖（ＬＣ）及び重鎖（ＨＣ）（Ａ〜Ｄ）、並びにコンジュゲートしたＡＭ−ＭＭＡＥの数（Ｂ及びＤ）を示している。全てのサンプルを、分析に先立って、ＥｎｄｏＳで脱グリコシル化して、還元した。
【０４０６】
図１４．４．ｍＡｂ、ｍＡｂ−リンカーコンジュゲート、及びＡＤＣのｒＲＰ−ＨＰＬＣ分析。ｍＡｂの軽鎖及び重鎖を示しており、ｍＡｂにコンジュゲートしたＡＭ−ＭＭＡＥの数も又、ＡＤＣサンプルについて示している。
【０４０７】
図１４．５．ｍＡｂ、ｍＡｂ−リンカーコンジュゲート、及びＡＤＣのＳＥＣ分析。高分子量種（ＨＭＷＳ）を示している。
【０４０８】
図１４．６．Ａ）７日間のラット血清中でのインキュベーション後のＡＤＣの還元脱グリコシル化質量分析。スペクトルにズームして、重鎖のみを示している。薬物喪失を、ＤＡＲ−０ピーク高さに対する、ＤＡＲ−１種及びＤＡＲ−２種のピーク高さの低下として示している。Ｂ）質量分析データを用いた、残った薬物の定量化（％）。データを、平均＋／−標準偏差（ｎ＝３）として示している。
【０４０９】
図１４．７．Ａ）ＮＣＩ−Ｎ８７細胞及びＢ）ＳＫＢＲ３細胞に向けたＡＤＣのインビトロ活性。
【０４１０】
図１４．８．マウスの皮下Ｎ８７腫瘍モデルに向けたハーセプチン−リンカーＭＭＡＥ  ＡＤＣの腫瘍増殖阻害活性。
【０４１１】
【表１６】
2020521735.tif 000071
【０４１２】
【表１７】
2020521735.tif 000072
【０４１３】
ハーセプチンｍＡｂ及びＩｇＧアイソタイプ対照ｍＡｂに対するマレイミド−ＭＭＡＥのディールス−アルダー反応又はマイケル付加を介して、ＡＤＣを調製された。ディールス−アルダー反応基を、架橋剤を介してリシンアミン上に導入してから、ＡＭ−ＭＭＡＥと反応させたが、ＡＭ−ＭＭＡＥのマイケル付加は、天然のシステインチオールで起こった（Ｃｙｓ−ＡＤＣと呼ぶ）。双方のコンジュゲーション方法により、１ｍＡｂあたり３〜４ＭＭＡＥ薬物の薬物含有量の異種ＡＤＣを得た。
【０４１４】
ＣＰ１ｂ−修飾ｍＡｂ及びＦ２リンカー−修飾ｍＡｂへのＡＭ−ＭＭＡＥのディールス−アルダー付加は、効率的であり、ほぼ定量的な変換を質量分析によって確認した。さらに、シクロペンタジエン又はメトキシフランリンカーによるｍＡｂの修飾、及び以降の、ディールス−アルダー反応によるＡＭ−ＭＭＡＥの付着は、ＳＥＣ分析によって示されるように、凝集体含有量を、コンジュゲート生成物において増大させなかった。全体として、ディールス−アルダーコンジュゲーションによって生じたＡＤＣは、質が高かった。
【０４１５】
質量分析によるラット血清中のＡＤＣ安定性の分析は、ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカー及びｍＡｂ−Ｆ２−リンカーで調製したディールス−アルダー構築体が、システインチオールへのマイケル付加によって生じた構築体よりも安定していることを実証した。３７℃にて７日間のラット血清中でのインキュベーションにより、ｍＡｂ−システインＡＤＣについて６０％の薬物喪失が生じたが、ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカーＡＤＣ及びｍＡｂ−Ｆ２−リンカーＡＤＣは、同じ条件下で示した薬物喪失は１０％未満であった。
【０４１６】
ハーセプチンｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカーＡＤＣ及びハーセプチンｍＡｂ−Ｆ２−リンカーＡＤＣは、Ｈｅｒ２陽性Ｎ８７及びＳＫＢＲ３細胞系に向けた、細胞増殖の強力な阻害剤であり、ＩＣ５０値は、対応するシステイン結合ＡＤＣに類似した。非ターゲティングアイソタイプ対照ＡＤＣは、ディールス−アルダーＡＤＣ構築体及びシステインＡＤＣ構築体について観察したインビトロ効力が類似した、標的ハーセプチン構築体よりも、２０００〜４０００倍強力でなかった。最後に、ＣＰ１ｂリンカー−修飾ｍＡｂ及びＦ２リンカー−修飾ｍＡｂで調製したハーセプチンＡＤＣは、腫瘍増殖の強力なインビボ阻害剤であった。３０日間の完全な腫瘍停滞（ｔｕｍｏｒ  ｓｔａｓｉｓ）が、３ｍｇ／ｋｇのＡＤＣ用量でのＮ８７皮下腫瘍モデルにおいて観察された。この結果により、ディールス−アルダー反応によって生じたＡＤＣは、治療効果を誘発するのにインビボで十分に安定していることが確認された。
【０４１７】
実施例１５．水性バッファ及び有機溶媒中でのディールス−アルダー反応速度定数の比較。
有機条件における小分子ジエン−マレイミド反応のカイネティクスを、水性条件における抗体ベースの反応との比較のために決定した。リンカー−修飾ｍＡｂ上のジエンとマレイミド間の反応速度定数を；ｍＡｂ−ＣＰ１ｂ−リンカー、ｍＡｂ−ＣＰ２−リンカー、ｍＡｂ−ＣＰ３−リンカー、及びｍＡｂ−Ｆ２−リンカーについて判定した。
【０４１８】
有機溶媒中でのジエン−マレイミド反応速度の判定：ＣＤＣｌ３中のジエン及びＮ−エチルマレイミドを、ＮＭＲチューブ内で組み合わせて（それぞれ０．０１Ｍの最終濃度）、１Ｈ  ＮＭＲによって室温にて監視した。出発材料［Ａ］の濃度を、Ｎ−エチルマレイミドのエチルピーク（３．５９又は１．２０ｐｐｍ）及びＤＡ−コンジュゲートのエチルピーク（典型的に４．４０又は１．０５ｐｐｍ）の積分を用いて算出した。
［Ａ］＝０．０１Ｍ×（出発材料の積分）／（出発材料＋生成物の積分）
【０４１９】
逆濃度（１／［Ａ］）を、時間（秒）に対してプロットした。二次反応速度（Ｍ−１秒−１）を、最良のフィット線から得た。３つの実験の平均速度及び標準偏差を用いた。
【０４２０】
ｍＡｂ−リンカーコンジュゲートの調製：実施例９及び実施例１４に記載するＮＨＳエステル含有リンカーＣＰ１ｂ−リンカー（化合物１９）、ＣＰ２−リンカー（化合物１２）、ＣＰ３−リンカー（化合物１３）、及びＦ２−リンカー（化合物１７）の反応によって、ジエン官能基を抗体中にランダムに組み込んだ。ｍＡｂとのＣＰ３−ＮＨＳの反応を、スキーム１５．１に示す。ｍＡｂ修飾の程度を、反応に用いるＮＨＳ−リンカーの量によって制御し、そして実験に応じて、様々なリンカー密度を目標とした。１ｍＡｂあたりのリンカー（そして、ゆえにジエン）の数を、実施例１に記載したインタクト脱グリコシル化質量分析によって判定した。
【化４８】
2020521735.tif 000073
【０４２１】
スキーム１５．１．ｍＡｂ−ＣＰ３−リンカーの調製。
マレイミド−ＭＭＡＥとのリンカー−修飾ｍＡｂの反応：リンカー−修飾ｍＡｂ内に含有されるジエンを、実施例１０に記載するように、水性バッファ中１モル当量のＡＭ−ＭＭＡＥ（ジエン：マレイミド）と反応させた。
【０４２２】
ｍＡｂ−リンカージエン−マレイミド反応速度定数の計算：ｍＡｂ−リンカー中のジエンとの、マレイミド−ＭＭＡＥの反応についての二次速度定数を、実施例１０に記載するように、脱グリコシル化還元質量スペクトルにおけるピーク強度から判定した。１サンプルについて、実施例４に記載するように、重鎖ピークのみを分析した。
【０４２３】
【表１８】
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【０４２４】
抗体／水性条件及び小分子／有機溶媒条件におけるマレイミド化合物とジエン化合物間の反応速度定数の比較は、生体コンジュゲーション用途についてのこの反応のいくつかの主要な特徴を実証する。第一に、非修飾フランは、典型的な生体コンジュゲーション条件下での抗体へのマレイミド化合物のコンジュゲーションについて、反応性が不十分である。これは、ＩｇＧ−フランへのＡＭ−ＭＭＡＥのコンジュゲーションの欠如によって明示され、これは、有機条件におけるマレイミドとの反応について、他のジエンと比較して、２０時間後の最小の反応を、そして又、約１００〜１０００倍の速度定数の低下を示した。第二に、抗体コンジュゲーションの文脈における水性条件でのディールス−アルダー反応の加速が確認された。有機条件速度定数のみが、ここで記載する全てのジエンにとってディールス−アルダー反応を非魅力的にすることとなることを考えると、反応速度の加速は、生体コンジュゲートの生成用のこの化学の実用的な用途にとって、重大である。例えば、ＣＰ１−リンカー内に含有されるシクロペンタジエンは、マレイミド（ＡＭ−ＭＭＡＥ）との水性抗体ベースの反応において、おおよそ１０分の反応半減期を示したが、対応する有機相の反応は、３．６日を必要とすることとなった。最後に、結果は、化学構造の修飾により、ジエノフィルとの反応速度を増減させることができ、ジエン反応性が調整可能であることを実証している。全体として、シクロペンタジエン官能基及び修飾フラン官能基は、約１〜２ｍｇ／ｍＬの範囲の抗体濃度でのマイルドな条件下で、抗体とマレイミド化合物との間の効率的な生体コンジュゲーション反応に調整可能であるが、単純な非修飾フランはそうではない。
【０４２５】
実施例１５．１Ｃ１−Ｋ２７４ＣＰ１  ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及びＡＺ１５０８薬物−リンカーによるＡＤＣ生成
ＡＺ１５０８薬物−リンカーを有する抗体の位置Ｋ２７４に組み込んだＣＰ１−ＮＮＡＡでＡＤＣを調製する実現可能性を評価した。
【０４２６】
抗体生成。実施例６に記載する方法を用いて、ＣＰ１−ＮＮＡＡを１Ｃ１抗体中に組み込んだ。
【０４２７】
ＡＺ１５０８との１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ｍＡｂのコンジュゲーション：Ｋ２７４ＣＰ１  ＮＮＡＡ−ｍＡｂ（０．４ｍｇ、２．７ｎｍｏｌ、１当量）を、ＰＢＳ（０．１３３ｍＬ）で３ｍｇ／ｍＬに調整した。ＤＭＳＯ（２７μＬ）及び１Ｍ第１リン酸ナトリウム（１３μＬ）を加えて、それぞれ約２０％及び１０％ｖ／ｖの溶液を得た。ＡＺ１５０８（５μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、１３ｎｍｏｌ、５当量）を、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ｍＡｂ溶液に加えて、混合物を簡単にボルテックスした。反応を、室温にて１７時間、連続混合しながら進めた。Ｎ−アセチルシステイン（１．１μＬの１００ｍＭ、１０８ｎｍｏｌ、４０当量）を加えて、溶液をさらに１５分間インキュベートして、未反応マレイミド基をクエンチした。次に、サンプルを、水で３倍に希釈して、ＣＨＴクロマトグラフィを用いて精製した。次に、実施例６及び１２に記載する還元質量分析及びＳＥＣによって、サンプルを分析した。
【化４９】
2020521735.tif 000075
【０４２８】
スキーム１５．１．Ａ）ＡＺ１５０８とのＫ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの反応。Ｂ）ＡＺ１５０８の構造。
１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＤＣの特性評価：実施例６及び１２に記載する還元質量分析及びＳＥＣによって、サンプルを分析した。ＰＣ３細胞におけるインビトロ活性を、実施例１２に記載するように実行した。
【０４２９】
図１５．１．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ａ）非還元、Ｂ）還元。
【０４３０】
図１５．２．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ  ＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物の還元グリコシル化質量分析。Ａ）未反応ｍＡｂ、Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物。スペクトルにズームして、抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４３１】
図１５．３．高単量体生成物が得られたことを示す、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＥＣ分析。高分子量固体（ＨＭＷＳ）を示している。
【０４３２】
【表１９】
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【０４３３】
１Ｃ１抗体の位置Ｋ２７４での組込みの後のＡＺ１５０８に向けたＣＰ１−ＮＮＡＡジエンの反応性を確認した。ＡＤＣ生成物は、質が高く、コンジュゲーションは＞９５％であり、非常に限られた凝集体しかなかった。生じたＡＤＣは、受容体陽性ＰＣ３細胞に対して活性であった。
【０４３４】
実施例１６．ＡＺ１５０８薬物−リンカーにより１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ、及び１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ抗体を有するＡＤＣの生成、並びに類似システイン結合部位特異的ＡＺ１５０８  ＡＤＣとの比較。
発現プラスミド内のアンバー終止コドンへの天然アミノ酸コドンの突然変異によって、ＣＰ２−ＮＮＡＡを位置Ｓ２３９、Ｋ２７４、及びＮ２９７にて組み込んだ１Ｃ１抗体で、ＡＺ１５０８薬物−リンカーを有するＡＤＣを調製した。ＣＰ２−ＮＮＡＡを、別々の抗体上の各位置に組み込んだ。
【０４３５】
抗体生成：実施例６に記載する方法を用いて、ＣＰ２−ＮＮＡＡを１Ｃ１抗体中に組み込んで、発現させた。標準的な分子生物学の技術を用いた部位特異的突然変異誘発によって、システインを１Ｃ１抗体中に組み込んだ。
【０４３６】
ＡＺ１５０８との１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのコンジュゲーション：ＡＭ−ＭＭＡＥをＡＺ１５０８で置換したことが唯一の差異である、実施例１２に記載する手順を用いた同じコンジュゲーション方法を、３つのＣＰ２−ＮＮＡＡ抗体構築体の全てに実行した。なお、ＡＺ１５０８をＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂと簡単に混合してから混合することによって、薬物−リンカーコンジュゲーションを達成する。
【化５０】
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【０４３７】
スキーム１６．１．Ａ）ＡＺ１５０８とのＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの反応。ＡＺ１５０８の構造について、スキーム１５．１参照。
ＡＺ１５０８との１Ｃ１システイン操作ｍＡｂのコンジュゲーション。ＡＭ−ＭＭＡＥをＡＺ１５０８で置換したことが唯一の差異である、実施例１２に記載する同じ方法を用いて、部位特異的システイン結合ＡＺ１５０８  ＡＤＣを調製した。なお、ＡＺ１５０８の付加に先立って、システイン−ｍＡｂを還元して、透析して、酸化しなければならない。
【０４３８】
１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及び１Ｃ１システイン操作ＡＤＣの特性評価。サンプルを、実施例６及び１２に記載するＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元質量分析、ＨＩＣ、ｒＲＰ−ＨＰＬＣ、及びＳＥＣによって分析した。培養したＰＣ３細胞におけるインビトロ活性を、実施例１２に記載するように実行した。
【０４３９】
図１６．１．１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣ及び１Ｃ１システインＡＺ１５０８  ＡＤＣのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。Ａ）非還元サンプル、Ｂ）還元サンプル。
【０４４０】
図１６．２．１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４１】
図１６．３．１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４２】
図１６．４．１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４３】
図１６．５．１Ｃ１  Ｓ２３９Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４４】
図１６．６．１Ｃ１  Ｋ２７４Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４５】
図１６．７．１Ｃ１  Ｎ２９７Ｃ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析。Ａ）未反応ｍＡｂの還元グリコシル化質量分析。Ｂ）ＡＺ１５０８反応生成物の還元グリコシル化質量分析。Ｃ）未反応抗体及びＡＺ１５０８コンジュゲーション生成物のＨＩＣ分析。Ｄ）ＡＺ１５０８反応生成物のＳＥＣ分析。スペクトルにズームして、（Ａ）及び（Ｂ）における抗体の重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の双方を示している。
【０４４６】
【表２０】
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【０４４７】
ＣＰ２−ＮＮＡＡを、１Ｃ１抗体の３つの位置に組み込んで、ＡＺ１５０８に向けた反応性を確認した。なお、ＣＰ２−ＮＮＡＡを、別々の抗体上の各位置に組み込んだ。ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂで調製したＡＤＣは、質が高く、コンジュゲーションは＞９５％であり、非常に限られた凝集体しかなかった。生じたＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣは、受容体陽性ＰＣ３細胞に対して活性であった。
【０４４８】
対応するシステイン操作抗体とのＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣの比較により、位置Ｎ２９７が、システインではなくＣＰ２−ＮＮＡＡによる突然変異に適用可能であることが明らかとなった。この位置でのシステインの導入は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果によって明示されるように、コンジュゲーション手順の間にジスルフィドスクランブリング（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｃｒａｍｂｌｉｎｇ）をもたらす。ジスルフィドスクランブリングは、Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣについて観察されなかった。これは、ＣＰ２−ＮＮＡＡが、システインの組込みに適していない位置に導入され得ることを実証しており、そこではシステインが、抗体フレームワーク内の天然ジスルフィドに影響を与え得る。
【０４４９】
実施例１７．マウス及びラット血清中でのＣＰ１−ＮＮＡＡ及びＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの安定性
ディールス−アルダーコンジュゲーションによって調製したＡＺ１５０８  ＡＤＣの血清安定性を評価した。ＡＤＣの安定性を、抗体とペイロード（すなわちディールス−アルダー付加物）間の化学結合に対して評価した。類似システイン結合（チオスクシンイミド）ＡＤＣの安定性も又、比較のために示す。
【０４５０】
方法：１Ｃ１  ＡＺ１５０８  ＡＤＣを、マウス血清又はラット血清中で３７℃にて７日間、エクスビボでインキュベートして、免疫捕獲によって回収して、実施例７に記載する質量分析によって分析した。コンジュゲート抗体及び非コンジュゲート抗体の相対量を、実施例７に記載する質量スペクトル内のピーク高さによって判定した。マウス血清インキュベートサンプルについて、ＡＺ１５０８の脱アセチル化を観察した。脱アセチル化ＡＺ１５０８を、ＤＡＲの算出用のコンジュゲート種と考えた。
【０４５１】
図１７．１．ラット血清中でのインキュベーションの前後の、１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＤＣ及び１Ｃ１システイン−ＡＺ１５０８  ＡＤＣの代表的な還元グリコシル化質量スペクトル。天然のアミノ酸は、（Ａ）位置Ｓ２３９、（Ｂ）位置Ｋ２７４、（Ｃ）位置Ｎ２９７にて、示すように、ＣＰ２−ＮＮＡＡ又はシステインに突然変異した。非コンジュゲート種及びコンジュゲート種を示す。
【０４５２】
図１７．２．ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の、ＣＰ２−ＮＮＡＡ又はシステイン操作抗体に取り付けられたままのＡＺ１５０８の定量化。薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、還元グリコシル化質量スペクトルから算出した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【０４５３】
図１７．３．マウス血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の、ＣＰ２−ＮＮＡＡ又はシステイン操作抗体に取り付けられたままのＡＺ１５０８の定量化。薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、還元グリコシル化質量スペクトルから算出した。脱アセチル化ＡＺ１５０８を、分析用のコンジュゲート種と考えた。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【０４５４】
図１７．４．ラット血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の、ＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体に取り付けられたままのＡＺ１５０８の定量化。薬物：抗体比（ＤＡＲ）を、還元グリコシル化質量スペクトルから算出した。データは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【０４５５】
ラット又はマウス血清中での３７℃にて７日間のインキュベーション後の１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの分析により、ディールス−アルダー付加物は、薬物喪失が観察されなかったことで、安定していることが実証された。位置Ｋ２７４にて調製した１Ｃ１  ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８も又、ラット血清中で、３７℃にて７日間のインキュベーション後に、薬物喪失を示さなかった。しかしながら、著しい薬物喪失が、同じ条件に曝した、類似システイン結合ＡＤＣについて観察された。システイン結合ＡＤＣ安定性は、位置依存的であり、位置Ｓ２３９は安定しており、位置Ｋ２７４及びＮ２９７はそうではなかった。システイン結合ＡＤＣの場合、ＡＺ１５０８は、チオスクシンイミド結合を介して抗体に連結されており、これは、レトロ−マイケル脱コンジュゲーション反応を経て、薬物喪失に至り得る。このプロセスは、埋没した（ｂｕｒｉｅｄ）位置だけではなく露出した位置にも影響を与えるので、位置依存的安定性は、システイン結合ＡＤＣについて観察される。他方、ディールス−アルダー付加物は、ＣＰ１ジエン及びＣＰ２ジエンの双方について、チオスクシンイミドについて不安定な位置にて、安定していた。ゆえに、シクロペンタジエンＮＮＡＡへのディールス−アルダーコンジュゲーションは、コンジュゲート安定性に関して、チオールベースのコンジュゲーション戦略に勝る利点を表す。
【０４５６】
実施例１８．ＡＺ１５０８との、ＣＰ１−ＮＮＡＡ又はＣＰ２−ＮＮＡＡを含有する１Ｃ１  ｍＡｂの反応カイネティクス。
ジエンＮＮＡＡの反応性を、１Ｃ１抗体フレームワーク内の位置Ｓ２３９、Ｋ２７４、又はＮ２９７への組込み後に評価した。
【０４５７】
方法：１Ｃ１  ＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体又はＣＰ２−ＮＮＡＡ抗体（３ｍｇ、１．３ｍｇ／ｍＬ  ｍＡｂ、１７．４μＭジエン、１当量）を、ＡＺ１５０８（４μＬのＤＭＳＯ中１０ｍＭストック、４０ｎｍｏｌ、１当量）と、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２０％  ＤＭＳＯ、ｐＨ５．５中で２２℃にて反応させた。アリコート（１００μＬ）を、所定の時点にて反応混合物から取り出して、Ｎ−アセチルシステイン（３μＬの水中１００ｍＭ、８当量）を加えてから、室温にて１５分間インキュベーションして、未反応マレイミドをクエンチした。次に、サンプルを、ＰＤ  Ｓｐｉｎｔｒａｐ  Ｇ−２５装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製して、混合物から小分子構成要素を取り出してから、還元グリコシル化質量分析によって分析した。質量分析手順及びカイネティック定数計算を、実施例５及び１０に記載している。
【０４５８】
図１８．１．還元グリコシル化質量分析によって測定した、ＡＺ１５０８との１Ｃ１  ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及び１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂのコンジュゲーションカイネティクス。データを、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ、及び１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡについて、平均±絶対誤差（ｎ＝２）として、そして１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡについて平均±標準偏差（ｎ＝３）としてプロットしている。
【０４５９】
図１８．２．ＡＺ１５０８とのＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及びＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの反応後直ぐのジエンの消費を示す逆濃度プロット。（Ａ）１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、（Ｂ）１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ、及びＮ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ。データを、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ、１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ２−ＮＮＡＡ、及び１Ｃ１  Ｎ２９７ＣＰ２−ＮＮＡＡについて、平均±絶対誤差（ｎ＝２）として、そして１Ｃ１  Ｓ２３９ＣＰ２−ＮＮＡＡについて平均±標準偏差（ｎ＝３）としてプロットしている。
【０４６０】
【表２１】
2020521735.tif 000079
【０４６１】
ＣＰ１−ＮＮＡＡ又はＣＰ２−ＮＮＡＡを有する抗体を、ジエン：マレイミドの１：１モル当量にて、マレイミド含有薬物−リンカーＡＺ１５０８と反応させた。反応半減期は、ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂについて１２分、そしてＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂについて３〜１０時間であった。４８時間の測定期間の後に達成された最終変換は、８７〜１００％に及んだ。
【０４６２】
実施例１９．ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ及びＡＺ１５０８で調製したＡＤＣの抗腫瘍活性。
１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ及びＡＺ１５０８薬物−リンカーで調製したＡＤＣを、マウスにおけるＰＣ３異種移植の腫瘍増殖を阻害する能力について評価した。
【０４６３】
ＡＤＣ調製：ＡＤＣを、実施例１６に記載する１Ｃ１  ｍＡｂで調製した。非−ＥｐｈＡ２結合ＡＤＣを、アイソタイプ対照抗体で調製した（Ｒ３４７と呼ぶ）。ＣＰ２−ＮＮＡＡを、１Ｃ１  ｍＡｂについて位置Ｓ２３９及びＮ２９７に、そしてＲ３４７  ｍＡｂについて位置Ｓ２３９に組み込んだ。
【０４６４】
インビボ方法：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＣＲ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）にて、制約、管理、外科的手順、補給及び補液調節（ｆｅｅｄ  ａｎｄ  ｆｌｕｉｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、並びに獣医学的治療に関して、Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に従って、腫瘍増殖阻害研究を実行した。８〜９週齢の雌胸腺欠損ヌードマウスの皮下中へのＰＣ３細胞（５０％マトリゲル中１，０００万細胞）の接種によって、ＰＣ３異種移植腫瘍モデルをマウスにおいて確立した。１７日後（研究の１日目に指定した）に、腫瘍容量が約１５０〜２００ｍｍ３に達し、そしてマウスを、群（１群あたり８頭のマウス）に無作為に割り付けた。研究の１日目に、投薬を開始して、尾静脈注射を介してＡＤＣを３ｍｇ／ｋｇにて投与した。ＡＤＣを、３週にわたって合計３用量について、１週間に１回３ｍｇ／ｋｇにて投薬した。その後、腫瘍寸法（長軸及び短軸）を、キャリパで週に２回測定した。腫瘍容量を、実施例１４の式を用いて算出した。
【０４６５】
図１９．１．ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣの投与後のマウスにおけるＰＣ３異種移植の腫瘍増殖阻害。オンターゲット１Ｃ１  ｍＡｂ  ＡＤＣを、位置Ｓ２３９又はＮ２９７にて組み込んだＣＰ２−ＮＮＡＡで調製した一方、非ターゲティングアイソタイプ対照Ｒ３４７  ｍＡｂ  ＡＤＣを、位置Ｓ２３９にて組み込んだＣＰ２で調製した。ＡＤＣを、０、７、及び１４日目（矢印で示す）に、３ｍｇ／ｋｇにて静脈内に投薬した。データを、平均±標準偏差（Ｎ＝８）として表す。
【０４６６】
１Ｃ１  ＣＰ２−ＮＮＡＡ  ＡＺ１５０８  ＡＤＣは、ＡＤＣの第１の注射後、マウスにおいて少なくとも６０日間、マウスのＥｐｈＡ２−陽性ＰＣ３異種移植モデルにおける腫瘍増殖の阻害に有効であった。非結合Ｒ３４７  ｍＡｂで調製したオフターゲットＡＤＣは、オンターゲットＡＤＣほど強力でなかった。
【０４６７】
実施例２０．マレイミド官能化ナノ粒子へのＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体のコンジュゲーション。
１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体を、６０ｎｍマレイミド官能化金ナノ粒子と反応させた。
【０４６８】
方法：マレイミド官能化６０ｎｍ金ナノ粒子を、商業的キット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ＃９００９４６５）から、メーカーの使用説明書に従って調製した。最初に、凍結乾燥したマレイミド官能化金ナノ粒子製品を、キット内に提供される１００μＬの反応バッファ中に再懸濁させた。次に、野生型（ＷＴ）抗体又はＫ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  １Ｃ１抗体の溶液を、ＰＢＳ中に０．５ｍｇ／ｍＬにて調製した。ナノ粒子溶液（１０μＬ）及び抗体溶液（１０μＬ）を組み合わせて、数回ピペッティングすることによって混合した。コンジュゲーション反応を２５℃にて２時間続けてから、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ−Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）を用いて光散乱分析を行った。各コンジュゲーション反応を三反復で実行した。
【化５１】
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【０４６９】
スキーム２０．１．マレイミド官能化金ナノ粒子との１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂの反応。
図２０．１．  １Ｃ１野生型（ＷＴ）又は１Ｃ１  Ｋ２７４ＣＰ１−ＮＮＡＡ抗体（ＣＰ１−ＮＮＡＡ  ｍＡｂ）との２５℃にて２時間のインキュベーションの前後の、６０ｎｍマレイミド官能化金ナノ粒子の動的光散乱分析（ＤＬＳ）。
【０４７０】
【表２２】
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【０４７１】
ＣＰ１−ＮＮＡＡを組み込んだ抗体を、ディールス−アルダー反応を介して、マレイミド官能化ナノ粒子にコンジュゲートさせた。
【図１．１】
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【図１．２】
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【図１．３】
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【図２．１】
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【図３．１】
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【図３．２】
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【図３．３】
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【図３．４】
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【図４．１】
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【図４．２】
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【図４．３】
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【図５．１】
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【図５．２】
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【図５．３】
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【図６．１】
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【図６．２】
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【図６．３】
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【図６．４】
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【図６．５】
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【図６．６】
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【図６．７】
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【図６．８】
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【図６．９】
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【図６．１０】
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【図７．１】
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【図７．２】
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【図７．３】
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【図７．４】
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【図７．５】
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【図７．６】
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【図７．７】
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【図８．１】
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【図９．１】
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【図９．２】
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【図９．３】
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【図１０．１】
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【図１０．２】
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【図１０．３】
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【図１１．１】
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【図１１．２】
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【図１１．３】
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【図１１．４】
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【図１１．５】
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【図１１．６】
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【図１１．７】
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【図１２．１】
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【図１２．２−１】
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【図１２．２−２】
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【図１２．３−１】
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【図１２．３−２】
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【図１２．４】
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【図１２．５】
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【図１２．６】
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【図１２．７−１】
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【図１２．７−２】
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【図１２．８】
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【図１２．９】
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【図１３．１】
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【図１４．１】
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【図１４．２】
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【図１４．３】
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【図１４．４】
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【図１４．５】
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【図１４．６】
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【図１４．７】
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【図１４．８】
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【図１５．１】
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【図１５．２】
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【図１５．３】
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【図１６．１】
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【図１６．２】
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【図１６．３】
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【図１６．４】
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【図１６．５】
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【図１６．６】
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【図１６．７】
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【図１７．１】
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【図１７．２】
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【図１７．３】
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【図１７．４】
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【図１８．１】
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【図１８．２】
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【図１９．１】
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【図２０．１】
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【国際調査報告】
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