(57)【要約】  本発明は非免疫原性ＲＮＡに関する。このＲＮＡは、自己抗原に対する寛容を誘導するため、したがって自己免疫疾患の治療のための治療薬の開発の基礎を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において自己免疫疾患を治療する方法であって、自己抗原もしくはその断片、または前記自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項２】
前記自己免疫疾患がＴ細胞媒介性自己免疫疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
被験体において自己反応性Ｔ細胞に対する寛容を誘導する方法であって、自己抗原もしくはその断片、または前記自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを前記被験体に投与することを含む方法。
【請求項４】
前記被験体が自己免疫疾患を有する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記自己免疫疾患がＣＮＳの自己免疫疾患である、請求項１、２および４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記自己免疫疾患が多発性硬化症である、請求項１、２、４および５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記非免疫原性ＲＮＡが、投与されたとき、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ−αの分泌をもたらさない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記非免疫原性ＲＮＡが、修飾ヌクレオチドの組み込みおよびｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記修飾ヌクレオチドが、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記修飾ヌクレオチドが、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記修飾核酸塩基が修飾ウラシルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２'−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン��ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラ−ウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが１−メチル−プソイドウリジンである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非免疫原性ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記非免疫原性ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記自己抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記自己抗原がＴ細胞抗原である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記自己抗原がＣＮＳ由来である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記自己抗原がミエリン抗原である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記自己抗原がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
自己抗原もしくはその断片、または前記自己抗原もしくは断片の変異体を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記非免疫原性ＲＮＡが前記被験体の細胞において一過性に発現される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記非免疫原性ＲＮＡが樹状細胞に送達される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記非免疫原性ＲＮＡが送達ビヒクルに製剤化される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記送達ビヒクルが粒子を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記送達ビヒクルが脂質を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記脂質がカチオン性脂質を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂質が、前記非免疫原性ＲＮＡと複合体を形成するおよび／または前記非免疫原性ＲＮＡをカプセル化する、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記非免疫原性ＲＮＡがリポソームに製剤化される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
自己抗原もしくはその断片、または前記自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項３３】
前記非免疫原性ＲＮＡが、投与されたとき、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ−αの分泌をもたらさない、請求項３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
前記非免疫原性ＲＮＡが、修飾ヌクレオチドの組み込みおよびｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる、請求項３２または３３に記載の医薬組成物。
【請求項３５】
前記修飾ヌクレオチドが、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記修飾ヌクレオチドが、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む、請求項３４または３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
前記修飾核酸塩基が修飾ウラシルである、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２'−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン��ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラ−ウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される、請求項３６または３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
修飾核酸塩基を含む前記ヌクレオシドが１−メチル−プソイドウリジンである、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
前記非免疫原性ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項３２〜４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
前記非免疫原性ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
前記自己抗原が自己免疫疾患に関連する、請求項３２〜４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
前記自己抗原がＴ細胞抗原である、請求項３２〜４３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
前記自己抗原がＣＮＳ由来である、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記自己抗原がミエリン抗原である、請求項３２〜４５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記自己抗原がミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である、請求項３２〜４６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
自己抗原もしくはその断片、または前記自己抗原もしくは断片の変異体を含む前記ペプチドまたはポリペプチドが、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を含む、請求項３２〜４７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記非免疫原性ＲＮＡが、前記医薬組成物を投与された被験体の細胞において一過性に発現される、請求項３２〜４８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記非免疫原性ＲＮＡが、前記医薬組成物を投与された被験体の樹状細胞に送達される、請求項３２〜４９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項５０に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記非免疫原性ＲＮＡが送達ビヒクルに製剤化される、請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
前記送達ビヒクルが粒子を含む、請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記送達ビヒクルが脂質を含む、請求項５２または５３に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記脂質がカチオン性脂質を含む、請求項５４に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記脂質が、前記非免疫原性ＲＮＡと複合体を形成するおよび／または前記非免疫原性ＲＮＡをカプセル化する、請求項５４または５５に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記非免疫原性ＲＮＡがリポソームに製剤化される、請求項３２〜５６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法において使用するための、請求項３２〜５７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非免疫原性ＲＮＡを述べる。このＲＮＡは、自己抗原に対する寛容を誘導するため、したがって自己免疫疾患の治療のための治療薬の開発の基礎を形成する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の進化により、２つのタイプの防御：自然免疫および適応免疫に基づく非常に効果的なネットワークの脊椎動物がもたらされた。病原体に関連する一般的な分子パターンを認識する不変受容体に依存する進化的に古い自然免疫系とは対照的に、養子免疫は、Ｂ細胞（Ｂリンパ球）およびＴ細胞（Ｔリンパ球）上の高度に特異的な抗原受容体ならびにクローン選択に基づく。Ｂ細胞は抗体の分泌による体液性免疫応答を惹起するが、Ｔ細胞は、認識された細胞の破壊につながる細胞性免疫応答を媒介し、ヒトおよび動物の細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。
【０００３】
成熟Ｔ細胞は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用する抗原特異的受容体（ＴＣＲ）を介して抗原を認識し、抗原に応答する。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質に関連して提示される抗原に応答する。ヘルパーＴ細胞は、ＭＨＣ−ＩＩタンパク質上に提示される抗原を認識する。ＴＣＲ活性化の最も即時の結果は、Ｔ細胞のクローン拡大、細胞表面の活性化マーカーの上方調節、エフェクター細胞への分化、細胞傷害性またはサイトカイン分泌の誘導、およびアポトーシスの誘導をもたらすシグナル伝達経路の開始である。ＴＣＲは、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体複合体、共受容体ＣＤ４またはＣＤ８、およびＣＤ３シグナル伝達モジュールを含む複雑なシグナル伝達機構の一部である。ＣＤ３鎖は細胞内で活性化シグナルを伝達するが、ＴＣＲα／βヘテ二量体は抗原認識のみに関与する。
【０００４】
Ｔ細胞が免疫応答に果たす重要な役割に加えて、樹状細胞（ＤＣ）も同様に重要である。ＤＣは、自己抗原に対する寛容の維持ならびに外来抗原に対する自然免疫および適応免疫の活性化において重要な調節的役割を有する専門的な抗原提示細胞である。
【０００５】
免疫系は望ましくない作用も生じさせ得る。例えば、自己免疫疾患は、自己抗原に対する寛容の喪失、自己抗原に対して反応性のリンパ球の活性化、および標的器官の病理学的損傷を特徴とする。
【０００６】
自己免疫疾患の現在の治療法は、主に症候性応答および全体として免疫系を緩和することに集中している。抗原特異的治療法は、自己免疫疾患の潜在的治療法として最近浮上してきたが、適切な免疫応答を惹起するのは難しいことが判明しており、これらの治療法は限られた成功しか収めていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、自己免疫疾患の有効な治療法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
自己免疫疾患の治療法のための薬剤を提供することが本発明の目的であった。この目的は、特許請求の範囲の主題により本発明に従って達成される。
【０００９】
本発明は、自己抗原に対する寛容を誘導するための組成物、方法および使用を包含する。本発明によれば、それに対する免疫応答が自己免疫疾患の特徴である自己抗原を、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡの形態で投与する。好ましい一実施形態で投与されるＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介活性化を抑制するＲＮＡ修飾ヌクレオチドに組み込み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。非免疫原性ＲＮＡによるマウスの免疫化は自己免疫疾患の徴候を完全にブロックしたことが本発明に従って実証される。また、単一の疾患駆動エピトープの投与が十分であり得ることも実証される。
【００１０】
本発明の一態様は、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを被験体に投与することを含む、被験体において自己免疫疾患を治療する方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、自己免疫疾患はＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。
【００１２】
本発明の一態様は、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを被験体に投与することを含む、被験体において自己反応性Ｔ細胞に対する寛容を誘導する方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、被験体は自己免疫疾患を有する。一実施形態では、自己免疫疾患はＴ細胞媒介性自己免疫疾患である。一実施形態では、Ｔ細胞は、自己抗原と、または、自己抗原を発現し好ましくは提示する細胞と、自己反応性である。
【００１４】
本発明の方法の一実施形態では、自己免疫疾患はＣＮＳの自己免疫疾患である。本発明の方法の一実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【００１５】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、投与されたとき、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化、および／またはＩＦＮ−αの分泌をもたらさない。
【００１６】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオチドの組み込みおよびｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。一実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５��（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２'−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラ−ウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは１−メチル−プソイドウリジンである。
【００１７】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはｍＲＮＡである。本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
【００１８】
本発明の方法の一実施形態では、自己抗原は自己免疫疾患に関連する。本発明の方法の一実施形態では、自己抗原はＴ細胞抗原である。本発明の方法の一実施形態では、自己抗原はＣＮＳ由来である。本発明の方法の一実施形態では、自己抗原はミエリン抗原である。本発明の方法の一実施形態では、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。本発明の方法の一実施形態では、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を含む。
【００１９】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは被験体の細胞において一過性に発現される。
【００２０】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは樹状細胞に送達される。一実施形態では、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。
【００２１】
本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは送達ビヒクルに製剤化される。一実施形態では、送達ビヒクルは粒子を含む。一実施形態では、送達ビヒクルは脂質を含む。一実施形態では、脂質はカチオン性脂質を含む。一実施形態では、脂質は、非免疫原性ＲＮＡと複合体を形成し、および／または非免疫原性ＲＮＡをカプセル化する。本発明の方法の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはリポソームに製剤化される。
【００２２】
本発明の一態様は、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを含む医薬組成物に関する。
【００２３】
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、投与されたとき、樹状細胞の活性化、Ｔ細胞の活性化および／またはＩＦＮ−αの分泌をもたらさない。
【００２４】
一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、修飾ヌクレオチドの組み込みおよびｄｓＲＮＡの除去によって非免疫原性にされる。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。一実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイドウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテ��ルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２'−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラ−ウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）である。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは１−メチル−プソイドウリジンである。
【００２５】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはｍＲＮＡである。本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはインビトロ転写ＲＮＡである。
【００２６】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原は自己免疫疾患に関連する。本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原はＴ細胞抗原である。本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原はＣＮＳ由来である。本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原はミエリン抗原である。本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原はミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）である。本発明の医薬組成物の一実施形態では、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）のアミノ酸３５〜５５を含む。
【００２７】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、医薬組成物を投与された被験体の細胞において一過性に発現される。
【００２８】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、医薬組成物を投与された被験体の樹状細胞に送達される。一実施形態では、樹状細胞は未成熟樹状細胞である。
【００２９】
本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは送達ビヒクルに製剤化される。一実施形態では、送達ビヒクルは粒子を含む。一実施形態では、送達ビヒクルは脂質を含む。一実施形態では、脂質はカチオン性脂質を含む。一実施形態では、脂質は、非免疫原性ＲＮＡと複合体を形成し、および／または非免疫原性ＲＮＡをカプセル化する。本発明の医薬組成物の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡはリポソームに製剤化される。
【００３０】
本発明の一態様は、本発明の方法で使用するための本発明の医薬組成物に関する。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】Ｆ１２リポソームと複合体化したルシフェラーゼＲＮＡの投与後の脾臓免疫細胞の活性化、サイトカインの放出およびタンパク質の発現。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝７）に非免疫原性ＬＵＣ  ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  １０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に（Ａ）樹状細胞（ｎ＝３）（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、（Ｂ）ＩＦＮαの血清濃度を評価した。（Ｃ）インビボ生物発光イメージングによる、ルシフェラーゼＲＮＡのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）へのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６、２４、４８および７２時間後のインビボでのルシフェラーゼ活性測定。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＬＬＯＤ＝検出の下限。
【図２】セルロース処理またはＨＰＬＣ精製のいずれかによって精製した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡのドットブロット分析。曝露時間２０秒。
【図３】ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、セルロースまたはＨＰＬＣ法のいずれかによって精製した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６匹のマウス／群。
【図４】ＡＰＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示は、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する。ナイーブ、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）標識、Ｔｈｙ１．１＋２Ｄ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６対照マウスに養子移入した。翌日、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  １０、２０または４０μｇでマウスを免疫した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。２番目の対照群には、さらに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。４日後、マウスを犠死させ、脾臓をＴｈｙ１．１＋細胞の増殖について分析した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
【図５】誘導された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞によるＭＯＧ３５−５５  Ｔ細胞増殖のインビトロ抑制。（Ａ、Ｂ）２Ｄ２  Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰマウスを、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで４回（０日目、３日目、６日目、９日目）免疫した。対照マウスは、免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡまたは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡで処置した。３番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌをさらに投与した。最後のｍＲＮＡ処置の４日後、マウスを犠死させ、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋細胞をＦｏｘｐ３−ｅＧＦＰ発現について分析した（Ｃ）。各処置群の細胞（サプレッサー）を未処置のナイーブマウスのＣＴＶ標識２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞（レスポンダー細胞）と共培養し、ＭＯＧ３５−５５ペプチド負荷ＢＭＤＣによってインビトロで７２時間再刺激した。レスポンダー細胞の増殖をＦＡＣＳ（ＣＴＶ＋細胞でゲートした）によるＣＴＶ希釈によって決定した。サプレッサー細胞の抑制能力を、レスポンダー細胞に対して４つの異なる比率で測定した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の頻度の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊＊＊ｐ≦０．００１で評価した。
【図６】ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって決定した。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々なＥＡＥ疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【図７】ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示は、実際の治療環境でＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。マウスが１〜２のＥＡＥスコアに達した後、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜９匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々なＥＡＥ疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【図８】ＤＣによる抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡによる免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目と１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、ＥＡＥに罹患し、ｍＲＮＡ処置したマウスから器官を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間培養した。ＣＤ４０Ｌの発現をＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって調べた。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊ｐ≦０．０５で評価した。
【図９】ＭＯＧ３５−５５ペプチド特異的Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、治療的に処置したマウスにおいて有意に減少する（７日目／１０日目）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡによる免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目と１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。ＥＡＥ誘導後１６日目に脳および脊髄を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間、細胞をインビトロで再刺激した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγおよびＩＬ−１７Ａの発現について分析し、ＩＦＮγ＋およびＩＬ−１７Ａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を計算した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊ｐ≦０．０５で評価した。
【図１０】Ｆ１２リポソームと複合体化した非免疫原性（ｍ１Ｙ）および免疫原性（Ｕ）ｍＲＮＡの異なるＭＯＧ３５−５５−ｍＲＮＡ混合物の投与後の脾臓免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  ２０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に樹状細胞（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、ＩＦＮαの血清濃度を評価した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
【図１１】非免疫原性および免疫原性ｍＲＮＡの異なるＭＯＧ３５−５５−ｍＲＮＡ混合物のドットブロット分析。曝露時間２０秒。破線は、ｄｓＲＮＡ  ３２０ｐｇのドット強度の１００％として設定している。
【図１２】非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡはＥＡＥに対する完全な寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、非免疫原性（ｍ１Ｙ）および免疫原性（Ｕ）ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡの異なる混合物を後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊＊ｐ≦０．０１で評価した。
【図１３】ヌクレオシド修飾のみでは認識の喪失を誘導しない。Ｆ１２リポソームと複合体化した様々なヌクレオシド修飾ｍＲＮＡの投与後の脾臓免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  １０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に樹状細胞（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、ＩＦＮαの血清濃度を評価した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
【図１４】非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置は抗原特異的ＣＤ４＋エフェクター細胞の拡大をもたらさない。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、０、３、７、および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。２番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。最初のｍＲＮＡ処置後１３日目に、マウスを犠死させ、脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ（Ａ）およびＭＯＧ３５−５５ペプチドで再刺激した細胞の上清中のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡによるサイトカインの検出（ＢおよびＣ）によって炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの分泌について分析した。データは、ｎ＝４〜５匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
【図１５】共阻害分子は、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸで処置すると上方調節される。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、０、３、７、および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。さらに、２番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。最初のｍＲＮＡ処置後１３日目に、マウスを犠死させ、脾臓からのＭＯＧ３５−５５  ＣＤ４＋Ｔ細胞を共阻害分子の上方調節についてフローサイトメトリで分析した。データは、ｎ＝４〜５匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
【図１６】非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、ＣＮＳへのリンパ球の浸潤を減少させる。ナイーブＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞を１日目にＴｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。ＥＡＥを、ＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、異なる処置を受けたマウスから器官を採取した。Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５特異的細胞の浸潤を調べ、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブを使用したフローサイトメトリによって浸潤細胞の総数を測定した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。浸潤したＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
【図１７】ＭＯＧ３５−５５特異的Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、治療的に処置したマウスにおいて有意に減少する（７日目／１０日目）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６においてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。ＥＡＥ誘導後１６日目に脳および脊髄を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間、細胞をインビトロで再刺激した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγおよびＩＬ−１７Ａの発現についてフローサイトメトリで分析し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ＋およびＩＬ−１７Ａ＋の割合を計算した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
【図１８】共阻害分子は、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置が成功すると、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞で上方調節される。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６においてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、異なる処置を受けた群から脾臓を切除した。ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞をテトラマー特異的ＭＡＣＳによって単離し、テトラマー染色によってフローサイトメトリで表現型解析した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
【図１９】ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４は、非免疫原性ｍＲＮＡ誘導の抗原特異的寛容の維持に必要である。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した（ｎ＝８匹のマウス／群）。ｍＲＮＡ処置マウスを、抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体または対応するＩｇＧ対照で同時に処置した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【図２０】非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡでの処置による抗原特異的寛容の誘導は、ＥＡＥ疾患モデルとは無関係である。（Ａ）非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１をコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、再発寛解型ＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、ＳＪＬマウスにおいてＰＬＰ１３９−１５１−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週に２回、非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１をコードするｍＲＮＡ  ２０μｇ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。（Ｂ）非免疫原性マルチエピトープをコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、複雑なＥＡＥにおいて寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６およびＳＪＬ／ＪＲｊのＦ１ハイブリッドマウスにおいてＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１、ＭＢＰ８４−１０４およびＭＯＢＰ１５−３６−ＣＦＡ（０日目）ならびに百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週に２回、非免疫原性マルチエピトープコードｍＲＮＡ  ４０μｇ、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２０μｇ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【図２１】非免疫原性ｍＲＮＡによるサイトカインの共送達は、ＥＡＥモデルでの非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置の寛容原性効力を改善する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、それぞれ非免疫原性ｍＩＬ−１０（Ａ）またはｍＩＬ−２７（Ｂ）ｍＲＮＡ  １５μｇと共に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇでマウスを処置した。対照マウスには、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇを非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  １５μｇ、非免疫原性のサイトカインコードｍＲＮＡ  １５μｇ、または非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇと共に投与した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３４】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、追加の実施形態を創製するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明示的に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明示的に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を支持し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組み合わせは、文脈上特に指示されない限り、本出願の説明によって開示されていると見なされるべきである。
【００３５】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，（１９９５）Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄに記載されているように定義される。
【００３６】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）で説明されている生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
【００３７】
本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈上特に必要とされない限り、「含む」という語および「含むこと」などの変形は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の排除も意味しないと理解され、しかしいくつかの実施形態では、そのような他の成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群が排除され得る、すなわち主題は、記述される成員、整数もしくは工程または成員、整数もしくは工程の群の包含に存する。本発明の説明に関連して（特に特許請求の範囲に関連して）使用される「１つの」および「その」という用語および同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【００３９】
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が先行発明のためにそのような開示に先行する権利を有さないことの承認と解釈されるべきではない。
【００４０】
本発明は、自己免疫疾患に関連する自己抗原に対する免疫系の寛容を誘導することによる自己免疫疾患の治療または予防を想定する。自己抗原に対する寛容は、非免疫原性ＲＮＡを投与することによって誘導される。非免疫原性ＲＮＡは、自己抗原もしくはその断片、または被験体に投与されたとき前記自己抗原に対する免疫応答を抑制する自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含む。
【００４１】
様々な実施形態では、本明細書に記載の非免疫原性ＲＮＡは、２００〜２００００ヌクレオチド、５００〜５０００ヌクレオチド、５００〜２５００ヌクレオチド、特に６００〜２５００ヌクレオチドまたは８００〜２０００ヌクレオチドの長さを有する。
【００４２】
本発明によれば、ナノ粒子製剤、特にリポプレックス製剤などの担体または送達ビヒクルに製剤化された本明細書に記載の非免疫原性ＲＮＡを投与することが好ましい。したがって、本明細書に記載の非免疫原性ＲＮＡ分子は、本明細書に記載のナノ粒子またはナノ粒子製剤、特にリポプレックス製剤などの担体または送達ビヒクルに製剤されて存在し得る。
【００４３】
一実施形態では、全身投与後に脾臓中の樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞に非免疫原性ＲＮＡ分子を送達する送達ビヒクルを使用し得る。例えば、ＲＮＡとリポソームからの電気的に中性のまたは負に帯電したリポプレックス、例えばＤＯＴＭＡとＤＯＰＥまたはＤＯＴＭＡとコレステロールを含むリポプレックスなどの、粒子の正味の電荷がゼロに近いかまたは負である既定の粒径を有するナノ粒子ＲＮＡ製剤は、全身投与後に脾臓ＤＣへのＲＮＡの実質的な送達をもたらす。ナノ粒子中の正電荷と負電荷の電荷比が１．４：１以下である、および／またはナノ粒子のゼータ電位が０以下であるナノ粒子ＲＮＡ製剤が本発明に従って特に好ましい。一実施形態では、ナノ粒子内の正電荷と負電荷の電荷比は、１．４：１〜１：８、好ましくは１．２：１〜１：４、例えば１：１〜１：３、例えば１：１．２〜１：２、１：１．２〜１：１．８、１：１．３〜１：１．７、特に１：１．４〜１：１．６、例えば約１：１．５である。一実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、−５以下、−１０以下、−１５以下、−２０以下または−２５以下である。様々な実施形態では、ナノ粒子のゼータ電位は、−３５以上、−３０以上または−２５以上である。一実施形態では、ナノ粒子は、０ｍＶ〜−５０ｍＶ、好ましくは０ｍＶ〜−４０ｍＶまたは−１０ｍＶ〜−３０ｍＶのゼータ電位を有する。一実施形態では、正電荷は、ナノ粒子中に存在する少なくとも１つのカチオン性脂質によって与えられ、負電荷はＲＮＡによって与えられる。一実施形態にでは、ナノ粒子は少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は、中性またはアニオン性脂質であり得る。
【００４４】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを１０：０〜１：９、好ましくは８：２〜３：７、より好ましくは７：３〜５：５のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２〜０．８：２、より好ましくは１．６：２〜１：２、さらにより好ましくは１．４：２〜１．１：２、さらにより好ましくは約１．２：２である。
【００４５】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとコレステロールを１０：０〜１：９、好ましくは８：２〜３：７、より好ましくは７：３〜５：５のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２〜０．８：２、より好ましくは１．６：２〜１：２、さらにより好ましくは１．４：２〜１．１：２、さらにより好ましくは約１．２：２である。
【００４６】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥを１０：０〜１：９、好ましくは８：２〜３：７、より好ましくは７：３〜５：５のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．８：２〜０．８：２、より好ましくは１．６：２〜１：２、さらにより好ましくは１．４：２〜１．１：２、さらにより好ましくは約１．２：２である。
【００４７】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを２：１〜１：２、好ましくは２：１〜１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．４：１以下である。
【００４８】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＭＡとコレステロールを２：１〜１：２、好ましくは２：１〜１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＭＡの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．４：１以下である。
【００４９】
一実施形態では、ナノ粒子は、ＤＯＴＡＰとＤＯＰＥを２：１〜１：２、好ましくは２：１〜１：１のモル比で含むリポプレックスであり、ここで、ＤＯＴＡＰの正電荷とＲＮＡの負電荷の電荷比は１．４：１以下である。
【００５０】
一実施形態では、本発明による非免疫原性ＲＮＡは、Ｆ１２またはＦ５リポソーム、好ましくはＦ１２リポソームに製剤化される。
【００５１】
本発明によれば、「Ｆ１２」という用語は、ＤＯＴＭＡとＤＯＰＥを２：１のモル比で含むリポソーム、およびそのようなリポソームを使用して形成される、ＲＮＡを含むリポプレックスを表す。
【００５２】
本発明によれば、「Ｆ５」という用語は、ＤＯＴＭＡとコレステロールを１：１のモル比で含むリポソーム、およびそのようなリポソームを使用して形成される、ＲＮＡを含むリポプレックスを表す。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を、特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する任意の粒子を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は６００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は４００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、約２００〜約７００ｎｍ、約２００〜約６００ｎｍ、好ましくは約２５０〜約５５０ｎｍ、特に約３００〜約５００ｎｍまたは約２００〜約４００ｎｍの範囲の直径を有する。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語または同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含有する任意の物質を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子製剤は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子製剤は分散液またはエマルジョンである。一般に、分散液またはエマルジョンは、少なくとも２つの不混和性材料が組み合わされた場合に形成される。
【００５５】
「リポプレックス」または「核酸リポプレックス」、特に「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と核酸、特にＲＮＡの複合体を指す。リポプレックスは、しばしば中性の「ヘルパー」脂質も含む、カチオン性リポソームが核酸と混合された場合に自発的に形成される。
【００５６】
本発明が正電荷、負電荷もしくは中性の電荷、またはカチオン性化合物、陰性化合物もしくは中性化合物などの電荷に言及する場合、これは一般に、言及される電荷が生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで存在することを意味する。例えば、「カチオン性脂質」という用語は、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正電荷を有する脂質を意味する。「中性脂質」という用語は、正味の正電荷も負電荷も有さない脂質を意味し、生理的ｐＨなどの選択されたｐＨで無電荷または中性両性イオンの形態で存在し得る。本明細書における「生理的ｐＨ」とは、約７．５のｐＨを意味する。
【００５７】
本発明での使用を企図される脂質担体などのナノ粒子担体には、ＲＮＡなどの核酸が、例えば核酸と複合体を形成することによって、または核酸が封入またはカプセル化された小胞を形成することによって会合することができる任意の物質またはビヒクルが含まれる。これは、裸の核酸と比較して核酸の安定性の増加をもたらし得る。特に、血液中の核酸の安定性が増加され得る。
【００５８】
カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよび正電荷を有する他の物質は、負に荷電した核酸と複合体を形成し得る。これらのカチオン性分子を使用して核酸を複合体化し、それによって、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスをそれぞれ形成することができ、これらの複合体は核酸を細胞に送達することが示されている。
【００５９】
本発明で使用するためのナノ粒子核酸調製物は、様々なプロトコルによって、および様々な核酸複合体化化合物から得ることができる。脂質、ポリマー、オリゴマー、または両親媒性物質は典型的な複合体化剤である。一実施形態では、複合体化化合物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニンまたはヒストンからなる群より選択される少なくとも１つの作用物質を含む。
【００６０】
本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、様々な動物（魚など）の精子細胞において体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、加水分解時に主にアルギニンを生成する、魚の精子に見出されるタンパク質を指す。精製形態では、それらは、インスリンの長時間作用型製剤において、ヘパリンの抗凝固作用を中和するために使用される。本発明によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、その断片を含む天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態を含むことを意味する。さらに、この用語は、人工的であり、特定の目的のために特別に設計され、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを包含する。本発明に従って使用されるプロタミンは、硫酸プロタミンまたはプロタミン塩酸塩であり得る。好ましい実施形態では、本明細書に記載のナノ粒子の製造のために使用されるプロタミン源は、等張塩溶液中に１０ｍｇ／ｍｌ（５０００ヘパリン中和単位／ｍｌ）を超えるプロタミンを含有するプロタミン５０００である。
【００６１】
リポソームは、リン脂質などの小胞形成脂質の１つ以上の二重層をしばしば有する微視的な脂質小胞であり、薬物をカプセル化することができる。多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞性小胞（ＭＶ）および大型多小胞性小胞（ＬＭＶ）、ならびに当技術分野で公知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない、様々な種類のリポソームを本発明に関連して使用し得る。リポソームのサイズおよびラメラリティは調製方法に依存し、使用される小胞の種類の選択は好ましい投与方式に依存する。超分子組織化には、ラメラ相、六方晶相および逆六方晶相、立方相、ミセル、単層からなる逆ミセルを含む脂質が水性媒体中に存在し得る、超分子構造のいくつかの他の形態が存在する。これらの相はＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせて得ることもでき、ＲＮＡおよびＤＮＡとの相互作用は相状態に実質的に影響を及ぼし得る。記載される相は、本発明のナノ粒子状核酸製剤に存在し得る。
【００６２】
核酸とリポソームから核酸リポプレックスを形成するために、想定される核酸リポプレックスを提供する限り、リポソームを形成する任意の適切な方法を使用し得る。リポソームは、逆相蒸散法（ＲＥＶ）、エタノール注入法、脱水−再水和法（ＤＲＶ）、超音波処理または他の適切な方法などの標準的な方法を用いて形成し得る。
【００６３】
リポソーム形成後に、リポソームをサイズ分類し、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。
【００６４】
二重層を形成する脂質は、典型的には２本の炭化水素鎖、特にアシル鎖、および極性または非極性のいずれかの頭部基を有する。二重層形成脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、およびスフィンゴミエリンなどのリン脂質を含む、天然に存在する脂質または合成起源の脂質のいずれかで構成され、ここで、２本の炭化水素鎖は、典型的には約１４〜２２炭素原子長であり、様々な不飽和度を有する。本発明の組成物に使用するための他の適切な脂質には、糖脂質およびステロール、例えばリポソームにも使用できるコレステロールおよびその様々な類似体が含まれる。
【００６５】
カチオン性脂質は、典型的にはステロール鎖、アシル鎖またはジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは１〜１０価の正電荷、より好ましくは１〜３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）；１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン；ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−１，３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、および２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＤＡＣ、およびＤＯＳＰＡが好ましい。ＤＯＴＭＡが最も好ましい。
【００６６】
加えて、本明細書に記載のナノ粒子は、好ましくは、構造安定性などを考慮して中性脂質をさらに含む。中性脂質は、核酸−脂質複合体の送達効率を考慮して適切に選択することができる。中性脂質の例には、１，２−ジ−（９Ｚ−オクタデセノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、ステロール、およびセレブロシドが含まれるが、これらに限定されない。ＤＯＰＥおよび／またはＤＯＰＣが好ましい。ＤＯＰＥが最も好ましい。カチオン性リポソームがカチオン性脂質と中性脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質と中性脂質のモル比は、リポソームの安定性などを考慮して適切に決定することができる。
【００６７】
一実施形態によれば、本明細書に記載されるナノ粒子はリン脂質を含み得る。リン脂質はグリセロリン脂質であり得る。グリセロリン脂質の例には、限定されることなく、以下の３種類の脂質が含まれる：（ｉ）例えばホスファチジルコリン（ＰＣ）、卵黄ホスファチジルコリン、天然、部分水素化または完全水素化形態の大豆由来ＰＣ、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）を含む、双性イオン性リン脂質；（ｉｉ）例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ジパルミトイルＰＧ、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）；メトキシ−ポリエチレングリコール−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）の場合のようにコンジュゲートが双性イオン性リン脂質を負に帯電させる合成誘導体を含む、負に帯電したリン脂質；および（ｉｉｉ）例えば、そのホスホモノエステルがＯ−メチル化されてカチオン性脂質を形成するホスファチジルコリンまたはスフィンゴミエリンを含む、カチオン性リン脂質。
【００６８】
脂質担体への核酸の会合は、例えば、担体が核酸を物理的に捕捉するように、担体の間隙空間を満たす核酸によって、または共有結合、イオン結合もしくは水素結合によって、または非特異的結合による吸着によって起こり得る。
【００６９】
「免疫応答」という用語は、免疫系の反応、好ましくは抗原に関するものであり、好ましくは細胞性免疫応答、体液性免疫応答、またはその両方を指す。本発明によれば、抗原、細胞または組織などの標的に関する「への免疫応答」または「に対する免疫応答」という用語は、標的に対して向けられる免疫応答に関する。
【００７０】
免疫系は、自然免疫系と適応免疫系の２つの部分に分けられる。適応免疫応答は、特定の抗原に特異的なＢおよびＴリンパ球に依存する。自然免疫系は、大多数の脅威が共有する共通の構造に応答する。これらの共通の構造は、病原体関連分子パターンまたはＰＡＭＰと呼ばれ、ｔｏｌｌ様受容体またはＴＬＲによって認識される。細胞ＴＬＲに加えて、自然免疫系の重要な部分は、ＰＡＭＰ認識機構を介して病原体をオプソニン化し、死滅させる体液性補体系である。これらの高度に保存された可溶性の膜結合タンパク質は、集合的にパターン認識受容体（ＰＲＲ）と呼ばれ、自然免疫系を始動させるのはＰＡＭＰ／ＰＲＲ相互作用である。
【００７１】
ＴＬＲは自然免疫系の細胞によって発現される膜貫通タンパク質であり、侵入微生物を認識し、免疫および炎症応答を開始させるシグナル伝達経路を活性化して侵入物を破壊する。種々のＴＬＲが、細菌の細胞壁成分、ウイルスの二本鎖ＲＮＡおよび小分子抗ウイルス化合物または免疫調節化合物を含む、多様なリガンドに対する受容体としての機能を果たす。ヒトでは、ＴＬＲ３、７、８、および９は、主にウイルスおよび細菌由来の核酸ベースのＰＡＭＰに応答する。
【００７２】
「細胞性免疫応答」、「細胞性応答」、「細胞媒介性免疫」または同様の用語は、抗原の発現および／またはクラスＩもしくはクラスＩＩ  ＭＨＣを用いた抗原の提示によって特徴付けられる、細胞に対する細胞性応答を含むことを意味する。細胞性応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして作用するＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される。）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される。）は、疾患細胞などの細胞を死滅させる。
【００７３】
「体液性免疫応答」という用語は、作用物質および生物に応答して抗体が産生され、最終的にそれらを中和および／または排除する、生存生物における過程を指す。抗体応答の特異性は、単一特異性の抗原に結合する膜結合受容体を介してＴおよび／またはＢ細胞によって媒介される。適切な抗原の結合および様々な他の活性化シグナルの受け取り後、Ｂリンパ球が分裂し、記憶Ｂ細胞および抗体分泌形質細胞クローンを産生し、それぞれが、その抗原受容体によって認識されたのと同一の抗原エピトープを認識する抗体を産生する。記憶Ｂリンパ球は、その後それらの特異的抗原によって活性化されるまで休眠状態のままである。これらのリンパ球は記憶の細胞基盤を提供し、特異的抗原に再曝露されたときに抗体応答の増大を生じさせる。
【００７４】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原上のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。特に、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および前記のいずれかの組み合わせが含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。可変領域および定常領域は、本明細書ではそれぞれ可変ドメインおよび定常ドメインとも称される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。ＶＨのＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称され、ＶＬのＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は重鎖定常領域（ＣＨ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含み、ＣＨは、定常ドメインＣＨ１、ヒンジ領域、ならびに定常ドメインＣＨ２およびＣＨ３（以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置されている：ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）にさらに細分化することができる。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。抗体は、天然源または組換え供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は、典型的には免疫グロブリン分子の四量体である。抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、ならびに一本鎖抗体およびヒト化抗体を含む様々な形態で存在し得る。
【００７５】
本明細書に記載の抗体には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１、カッパまたはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
【００７６】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも称され、一般にＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは一般に抗体と称される。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、主に、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン、ならびにＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインで構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つの種類、すなわちα、δ、ε、γおよびμがあり、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、膜貫通ドメインおよびそのカルボキシ末端に短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちラムダとカッパがある。免疫グロブリン鎖は可変領域と定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は高度に多様であり、抗原認識を構成する。
【００７７】
本発明によれば、「抗原」または「免疫原」という用語は、免疫応答の標的であるおよび／または免疫応答を惹起する任意の物質、好ましくはペプチドまたはタンパク質を包含する。特に、「抗原」は、抗体またはＴリンパ球（Ｔ細胞）と特異的に反応する任意の物質に関する。本発明によれば、「抗原」という用語は、Ｂ細胞またはＴ細胞エピトープなどの少なくとも１つのエピトープを含有する任意の分子を含む。好ましくは、本発明に関連して抗原は、場合によりプロセシング後に、好ましくは抗原または抗原を発現する細胞に特異的な免疫反応を誘導する分子である。抗原は、アレルゲン、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物ならびに他の感染因子および病原体を含んでもよくもしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。
【００７８】
「自己抗原」は、通常の状況ではその生物の免疫系によって認識されないが、免疫攻撃の標的となり得、自己免疫疾患を生じさせ得る生物に由来する抗原である。
【００７９】
好ましい実施形態では、自己抗原は自己免疫疾患に関連する。「自己免疫疾患に関連する自己抗原」という用語は、自己免疫疾患にとって病理学的に重要な自己抗原を指す。一実施形態では、自己免疫疾患に関連する自己抗原は、自己免疫疾患を有する患者において免疫反応が向けられる少なくとも１つのエピトープを含む分子である。
【００８０】
自己抗原もしくはその断片、または本発明に従って被験体に提供される自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、前記ペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを投与することによって、自己抗原に対する免疫応答の低下をもたらすはずである。したがって、自己抗原もしくはその断片、または本発明に従って提供される自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、自己免疫疾患に関連する自己抗原、またはその変異体（自己抗原およびその変異体の断片を含む）に対応し得るまたはそれを含み得る。一実施形態では、そのような断片または変異体は、自己抗原と同様に、その提供が、自己抗原または自己抗原を発現し、場合によりＭＨＣ分子に関連して自己抗原を提示する細胞を標的とする自己反応性Ｔ細胞に対する寛容をもたらすという点で、自己免疫疾患に関連する自己抗原と免疫学的に等価である。したがって、自己抗原もしくはその断片、または本発明に従って提供される自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、自己免疫疾患に関連する自己抗原と同一であってもよく、自己免疫疾患に関連する自己抗原またはその部分もしくは断片を含んでもよく、または自己免疫疾患に関連する自己抗原またはその部分もしくは断片に相同な抗原を含んでもよい。自己抗原もしくはその断片、または本発明に従って提供される自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドが、自己免疫疾患に関連する自己抗原の部分もしくは断片、または自己免疫疾患に関連する自己抗原に相同な抗原の部分もしくは断片を含む場合、前記部分または断片は、自己免疫疾患に関連する自己抗原のエピトープ、特に自己反応性Ｔ細胞が標的とする自己免疫疾患に関連する自己抗原のエピトープを含み得る。したがって、本発明によれば、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、自己免疫疾患に関連する自己抗原のペプチド断片などの、自己免疫疾患に関連する自己抗原の免疫原性断片を含み得る。本発明による「自己抗原の免疫原性断片」は、好ましくはＴ細胞応答を刺激することができる自己抗原の部分または断片に関する。本発明に従って提供される場合、前記部分または断片はまた、自己反応性Ｔ細胞に対する寛容性を誘導することも可能であり得る。自己抗原もしくはその断片、または本発明に従って提供される自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドは、組換えペプチドまたはポリペプチドあってもよく、および／または本発明に従ってそれらをコードする非免疫原性ＲＮＡは、組換えＲＮＡであってもよい。
【００８１】
「免疫学的に等価」という用語は、免疫学的に等価なアミノ酸配列などの免疫学的に等価な分子が、同じもしくは本質的に同じ免疫学的特性を示し、および／または、例えば免疫学的作用の種類に関して、同じもしくは本質的に同じ免疫学的作用を及ぼすことを意味する。本発明に関連して、「免疫学的に等価」という用語は、好ましくは抗原または抗原変異体の免疫学的作用または特性に関して使用される。
【００８２】
本発明の一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡの投与により本発明に従って提供されるペプチドまたはポリペプチドは、好ましくは本明細書に記載の自己免疫疾患状態などの自己免疫疾患状態において認識される自己抗原である自己抗原からの少なくとも１つのエピトープを含む。一実施形態では、本発明に従って提供されるペプチドまたはポリペプチドは、被験体が自己反応性であるエピトープを含む。
【００８３】
「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、すなわち結合される、例えば抗体またはＴ細胞受容体によって認識される分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別個の三次元部位である。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。好ましくは、この用語は、エピトープを含む抗原の免疫原性部分に関する。タンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。本発明に関連してエピトープは、Ｔ細胞エピトープであることが好ましい。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞エピトープ」という用語は、Ｔ細胞受容体によって認識される立体配置でＭＨＣ分子に結合するペプチドを指す。典型的には、Ｔ細胞エピトープは抗原提示細胞の表面に提示される。好ましくは、Ｔ細胞エピトープはＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。好ましくは、Ｔ細胞エピトープは、抗原の断片のアミノ酸配列に実質的に対応するアミノ酸配列を含む。好ましくは、抗原の前記断片は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ提示ペプチドである。ＭＨＣ分子、特にクラスＩ  ＭＨＣ分子への結合に適したペプチドは、好ましくは７〜２０アミノ酸長、より好ましくは７〜１２アミノ酸長、より好ましくは８〜１１アミノ酸長、特に９または１０アミノ酸長である。一実施形態では、抗原提示細胞のＭＨＣなどのＭＨＣに関連して提示される場合のＴ細胞エピトープは、Ｔ細胞受容体によって認識される。Ｔ細胞受容体によって認識される場合、Ｔ細胞エピトープは、適切な共刺激シグナルの存在下で、Ｔ細胞エピトープを特異的に認識するＴ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローン拡大を誘導することが可能であり得る。
【００８５】
本発明によれば、自己抗原のＴ細胞エピトープなどのエピトープは、非免疫原性ＲＮＡを、エピトープのみよりも自己抗原のより多くを含む配列、および／または１つもしくは複数の自己抗原の複数のエピトープを含むポリペプチドなどの、より大きな実体の一部として投与することによって本発明に従って提供されるペプチドまたはポリペプチド中に存在し得る。提示されるペプチドまたはＴ細胞エピトープは、適切なプロセシング後に生成される。また、Ｔ細胞エピトープは、ＴＣＲ認識またはＭＨＣへの結合に必須ではない１つ以上の残基で修飾され得る。そのような修飾されたＴ細胞エピトープは、免疫学的に等価と見なされ得る。
【００８６】
本明細書に記載される非免疫原性ＲＮＡは、自己免疫疾患などの免疫寛容を必要とする様々な疾患に対してカスタマイズすることができ、また個々の患者に対してカスタマイズすることもできる。所与の患者の血液中を循環する免疫細胞が、試験される特定のペプチドに対する免疫応答を発現するかどうかを判定するために、様々なイムノアッセイが存在する。あるいは、選択される抗原またはエピトープは、患者のクラスで見られる最も一般的な反応性に基づくことができる。
【００８７】
「細胞表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがってタンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、それが前記細胞の表面に位置し、例えば細胞に加えられた抗原特異的抗体による結合にアクセス可能である場合、細胞の表面で発現される。一実施形態では、細胞の表面に発現される抗原は、細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。
【００８８】
本発明に関連して「細胞外部分」または「エキソドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。
【００８９】
「部分」または「パート」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アミノ酸配列などの構造の連続的または不連続的エレメントを指す。「断片」という用語は、アミノ酸配列などの構造の連続的エレメントを指す。構造の部分、パートまたは断片は、好ましくは１つ以上の機能的特性、例えば前記構造の抗原性、免疫学的および／または結合特性を含む。タンパク質配列の部分またはパートは、好ましくはタンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するおよび／また不連続なアミノ酸を含む。タンパク質配列の断片は、好ましくはタンパク質配列の少なくとも６、特に少なくとも８、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも５０、または少なくとも１００個の連続するアミノ酸を含む。
【００９０】
「免疫原性」という用語は、免疫反応を誘導する抗原の相対的有効性に関する。
【００９１】
「免疫刺激性」という用語は、本明細書では全体的な免疫応答の増加を指すために使用される。
【００９２】
「免疫寛容」、「免疫学的寛容」、または単に「寛容」とは、免疫応答を惹起する能力を有する物質または組織に対する免疫系の不応答性の状態を表す。自己認識時に免疫原性応答が発現するのを防ぐ免疫寛容は、主に、さもなければ自己抗原の供給源である細胞および組織を潜在的に攻撃し、ならびに／またはこれらの自己抗原に対して反応する抗体のＢ細胞による産生を支持する自己反応性Ｔ細胞の排除、阻害、または変換をもたらす方法での、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞への「自己」ペプチドの提示を含む、いくつかの機構によって媒介される。寛容が確立される機構は異なるが、結果として生じる作用は同様である。特定の組織からの自己抗原に対する寛容の不十分な誘導は、組織特異的な自己免疫疾患の主要な原因である。通常の条件下では、組織特異的自己抗原は寛容誘導（寛容原性）細胞によって提示され、この細胞は、反応性Ｔ細胞が細胞死、不応答性、またはＴｒｅｇ型への変換を受けるようにプログラムする。自己免疫疾患では、これらの同じ自己抗原が、十分に提示されず、指示に対する自己反応性Ｔ細胞の関与を制限するか、または不適切に提示されて、抗原を自己として寛容する代わりに免疫応答を開始するように特定のＴ細胞に指示する。これらの自己抗原を全身的にまたは粘膜を介して強力な寛容原性細胞に送達する抗原特異的療法は、一部には、不適切に活性化された病原性Ｔ細胞に対抗することができるサプレッサーＴ細胞の生成を介して、部分的に寛容を回復させることができる。
【００９３】
「標的」という用語は、免疫応答の標的である細胞などの作用因子を意味する。標的には、抗原または抗原エピトープ、すなわち抗原プロセシングを通して抗原に由来するペプチド断片を提示する細胞が含まれる。
【００９４】
「抗原プロセシング」とは、抗原の断片であるプロセシング産物への抗原の分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、ならびに細胞による、好ましくは抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
【００９５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に関連して抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識し得る。抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、Ｔ細胞に提示する。抗原提示細胞には、単球／マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）が含まれるが、これらに限定されない。本発明によれば、「抗原提示細胞」という用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞およびノンプロフェッショナル抗原提示細胞を含む。
【００９６】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体媒介エンドサイトーシスのいずれかによって抗原を内部移行し、次いでクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片をその膜上に表示することにおいて非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ  ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。
【００９７】
プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は樹状細胞であり、これらは最も広範囲の抗原提示を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。
【００９８】
ノンプロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的には発現せず、これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによってノンプロフェッショナル抗原提示細胞が刺激されたときにのみ発現される。
【００９９】
樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩの両方の抗原提示経路を介して、周辺組織で捕捉された抗原をＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞は免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が免疫誘導の重要な工程であることは周知である。
【０１００】
樹状細胞は、好都合には「未成熟」細胞および「成熟」細胞として分類され、これらは、よく特徴付けられた２つの表現型を区別する簡単な方法として使用することができる。しかし、この命名法は、分化のすべての可能な中間段階を除外すると解釈されるべきではない。
【０１０１】
未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原取り込みおよびプロセシングの高い能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的にはこれらのマーカーのより低い発現、しかしクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１  ＢＢ）などのＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子の高発現を特徴とする。
【０１０２】
樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングを引き起こす樹状細胞活性化の状態と称され、一方未成熟樹状細胞による提示は寛容をもたらす。樹状細胞の成熟は、主に、生得的受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシン等）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面のＣＤ４０の連結、およびストレスによる細胞死を受けている細胞から放出される物質によって引き起こされる。樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子αなどのサイトカインと共にインビトロで骨髄細胞を培養することによって得ることができる。
【０１０３】
「抗原の提示を特徴とする細胞」または「抗原を提示する細胞」または同様の表現は、ＭＨＣ分子、特にＭＨＣクラスＩ分子に関連して、例えば抗原のプロセシングによって抗原または前記抗原に由来する断片を提示する抗原提示細胞などの細胞を意味する。同様に、「抗原の提示を特徴とする疾患」という用語は、特にクラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞が関与する疾患を意味する。
【０１０４】
本発明に関連して「免疫反応性細胞」または「エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、抗原、または抗原もしくはエピトープの発現および／もしくは提示を特徴とし、免疫応答を媒介する細胞に結合することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌性細胞を認識し、場合によりそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。
【０１０５】
好ましくは、「免疫反応性細胞」は、特に抗原提示細胞の表面などにＭＨＣ分子に関連して提示される場合、ある程度の特異性で抗原またはエピトープを認識する。好ましくは、前記認識は、抗原またはエピトープを認識する細胞が応答性または反応性になることを可能にする。細胞が、ＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して抗原またはエピトープを認識する受容体を担持するヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示される細胞、すなわちクラスＩ  ＭＨＣと共に抗原を提示することを特徴とする細胞の除去を含み得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性は、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解死滅を含み得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して判定し得る。抗原またはエピトープを認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。細胞がＢ細胞である場合、そのような応答性は免疫グロブリンの放出を含み得る。
【０１０６】
「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は、様々な細胞性免疫反応に関与する胸腺由来細胞に関連し、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。
【０１０７】
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。それぞれ別個の機能を有する、Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
【０１０８】
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的過程において他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【０１０９】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってその標的を認識する。
【０１１０】
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２本の別々のペプチド鎖からなる。γδ  Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ  Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ  Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
【０１１１】
Ｔ細胞受容体の構造は、抗体の腕の軽鎖と重鎖の組み合わせとして定義される領域である、免疫グロブリンＦａｂ断片に非常に類似する。ＴＣＲのそれぞれの鎖は免疫グロブリンスーパーファミリーの成員であり、１つのＮ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン、１つのＩｇ定常（Ｃ）ドメイン、膜貫通／細胞膜貫通領域、およびＣ末端に短い細胞質尾部を有する。ＴＣＲ  α鎖とβ鎖の両方の可変ドメインは３つの超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を有し、一方β鎖の可変領域は、通常は抗原と接触せず、したがってＣＤＲとは見なされない追加の超可変領域（ＨＶ４）を有する。ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原の認識に関与する主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１は抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されており、一方β鎖のＣＤＲ１はペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２はＭＨＣを認識すると考えられている。β鎖のＣＤＲ４は、抗原認識には関与しないと考えられているが、スーパー抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２本の鎖の間にリンクを形成する短い連結配列からなる。
【０１１２】
「Ｂ細胞」または「Ｂリンパ球」という用語は、抗体を分泌することによって体液性免疫において機能するリンパ球サブタイプの白血球の一種に関する。さらに、Ｂ細胞は、抗原を提示し、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）として分類され、サイトカインを分泌する。Ｂ細胞は、その細胞膜上にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）を発現する。ＢＣＲは、Ｂ細胞が特定の抗原に結合することを可能にし、それに対して抗体応答を開始する。Ｂ細胞受容体は、２つの部分、すなわち内在性膜ドメインの存在を除いて分泌型と同一である１つのアイソタイプの膜結合免疫グロブリン分子（ＩｇＤ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、またはＩｇＥ）、およびジスルフィド架橋によって一緒に結合されたＩｇ−α／Ｉｇ−βと呼ばれるヘテロ二量体であるシグナル伝達部分（ＣＤ７９）で構成される。二量体の各成員は原形質膜にまたがっており、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を担持する細胞質尾部を有する。
【０１１３】
Ｂ細胞の活性化は、脾臓およびリンパ節などの二次リンパ器官で起こる。Ｂ細胞は、骨髄で成熟した後、血液を介して二次リンパ器官に移動し、循環リンパを介して絶えず抗原の供給を受ける。Ｂ細胞がそのＢＣＲを介して抗原に結合した場合、Ｂ細胞の活性化が始まる。異なるＢ細胞サブセットは、Ｔ細胞依存性活性化またはＴ細胞非依存性活性化を受ける。
【０１１４】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物で生じる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応においてリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。
【０１１５】
ＭＨＣ領域は、クラスＩ、クラスＩＩ、およびクラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖およびβ２ミクログロブリン（１５番染色体によってコードされるＭＨＣの一部ではない）を含む。それらは、抗原断片を細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。ほとんどの免疫系細胞、特に抗原提示細胞では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖とβ鎖を含み、抗原断片をＴヘルパー細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分やサイトカインをコードするものなどの他の免疫成分をコードする。
【０１１６】
ヒトでは、細胞表面の抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域の遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と称される。しかし、ＭＨＣという略語は、しばしばＨＬＡ遺伝子産物を指すために使用される。ＨＬＡ遺伝子には、９つのいわゆる古典的ＭＨＣ遺伝子：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１が含まれる。
【０１１７】
本発明のすべての態様の好ましい一実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０１１８】
本発明に関連して「免疫エフェクター機能」または「エフェクター機能」という用語は、例えば細胞の死滅をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明に関連して免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩＩ分子に関連した抗原または抗原由来の抗原ペプチドの認識、サイトカインの放出、ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合は、Ｔ細胞受容体によるＭＨＣクラスＩ分子に関連した抗原または抗原由来の抗原ペプチドの認識、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、ＭＨＣクラスＩ分子に関連して提示された細胞の除去、すなわちクラスＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞の除去、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解性死滅を含む。
【０１１９】
「ｔｏｌｌ様受容体」または「ＴＬＲ」という用語は、自然免疫系において重要な役割を果たすタンパク質のクラスに関する。それらは、微生物由来の構造的に保存された分子を認識する、通常はマクロファージおよび樹状細胞などのセンチネル細胞で発現される単一の膜貫通非触媒受容体である。ひとたびこれらの微生物が皮膚または腸管粘膜などの物理的障壁を突破すると、免疫細胞応答を活性化するＴＬＲによって認識される。
【０１２０】
本発明の一実施形態では、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを被験体に投与する。ＲＮＡの翻訳産物は、被験体の細胞内で形成され得、自己抗原を標的とする自己反応性Ｔ細胞に対する寛容を誘導するために免疫系に対して表示され得る。
【０１２１】
あるいは、本発明は、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドを発現する非免疫原性ＲＮＡを、エクスビボで抗原提示細胞などの細胞に導入する実施形態、例えば患者から採取した抗原提示細胞、および場合によりエクスビボでクローン拡大した細胞を同じ患者に移植する実施形態を想定する。トランスフェクトされた細胞を、当技術分野で公知の任意の手段を使用して、好ましくは静脈内、腔内、または腹腔内投与によって滅菌形態で、患者に再導入し得る。適切な細胞には、抗原提示細胞が含まれる。抗原提示細胞は、好ましくは樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、間葉系間質細胞、上皮細胞、内皮細胞および線維芽細胞であり、最も好ましくは樹状細胞である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の非免疫原性ＲＮＡを発現する単離された抗原提示細胞を必要とする被験体に投与することを含む、自己免疫疾患を治療する方法も含む。細胞は、被験体に対して自己、同種異系、同系または異種であり得る。
【０１２２】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、組換え生産された分子および化学合成された分子などのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことが意図されている。核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。本発明によれば、ＲＮＡは、インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ  ＲＮＡ）または合成ＲＮＡを含む。本発明によれば、核酸は、好ましくは単離された核酸である。さらに、本明細書に記載の核酸は組換え分子であり得る。
【０１２３】
「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動による分離によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。核酸は、例えばＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって調製され得るＲＮＡの形態で、細胞への導入、すなわち細胞のトランスフェクションのために使用することができる。ＲＮＡは、適用の前に配列の安定化、キャッピング、およびポリアデニル化によってさらに修飾することができる。
【０１２４】
本発明に関連して、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にデオキシリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「デオキシリボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位のヒドロキシル基を欠くヌクレオチドに関する。「ＤＮＡ」という用語は、部分的または完全に精製されたＤＮＡ、本質的に純粋なＤＮＡ、合成ＤＮＡ、および組換え生成されたＤＮＡなどの単離されたＤＮＡを含み、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＤＮＡとは異なる修飾ＤＮＡを含む。そのような改変は、例えばＤＮＡの１つ以上のヌクレオチドでのＤＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部などへの非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＤＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＤＮＡは、類似体または天然に存在するＤＮＡの類似体と称され得る。
【０１２５】
本発明に関連して、「ＲＮＡ」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。この用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、組換え生産されたＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドでのＲＮＡの末端（一方もしくは両方）または内部などへの非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学的に合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体または天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。本発明によれば、「ＲＮＡ」という用語は、「メッセンジャーＲＮＡ」を意味する「ｍＲＮＡ」を含み、好ましくはこれに関し、およびＤＮＡを鋳型として使用して生成され得、ペプチドまたはタンパク質をコードする転写物に関する。ｍＲＮＡは、典型的には５'非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）、タンパク質またはペプチドコード領域、および３'非翻訳領域（３'−ＵＴＲ）を含む。ｍＲＮＡは、細胞中およびインビトロで限られた半減期を有する。好ましくは、ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型を使用したインビトロ転写によって生成される。本発明の一実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写または化学合成によって得られる。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【０１２６】
本発明によれば、ＲＮＡの安定性および翻訳効率は、必要に応じて改変し得る。例えば、安定化作用を有するおよび／またはＲＮＡの翻訳効率を高める１つ以上の修飾によってＲＮＡを安定化し、その翻訳を増加させ得る。本発明に従って使用されるＲＮＡの発現を増加させるために、コード領域内、すなわち発現されるペプチドまたはタンパク質をコードする配列内で、好ましくは発現されるペプチドまたはタンパク質の配列を変化させずに、ＧＣ含量を増加させてｍＲＮＡの安定性を高め、コドン最適化を実施し、したがって細胞中での翻訳を増強するようにＲＮＡを修飾し得る。
【０１２７】
本発明で使用されるＲＮＡに関連して「修飾」という用語は、前記ＲＮＡ中に天然には存在しないＲＮＡの任意の修飾を含む。
【０１２８】
本発明の一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡは、キャップされていない５'−三リン酸を有さない。そのようなキャップされていない５'−三リン酸の除去は、ＲＮＡをホスファターゼで処理することによって達成できる。
【０１２９】
本発明によるＲＮＡは、その安定性を高めるおよび／または細胞毒性を低下させるために修飾リボヌクレオチドを有し得る。例えば、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、シチジンを５−メチルシチジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。あるいはまたは加えて、一実施形態では、本発明に従って使用されるＲＮＡにおいて、ウリジンをプソイドウリジンで部分的または完全に、好ましくは完全に置換する。
【０１３０】
一実施形態では、「修飾」という用語は、ＲＮＡに５'−キャップまたは５'−キャップ類似体を提供することに関する。「５'−キャップ」という用語は、ｍＲＮＡ分子の５'末端に認められるキャップ構造を指し、一般に独特の５'−５'三リン酸結合によってｍＲＮＡに連結されたグアノシンヌクレオチドからなる。一実施形態では、このグアノシンは７位でメチル化されている。「従来の５'−キャップ」という用語は、天然に存在するＲＮＡの５'−キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップ（ｍ７Ｇ）を指す。本発明に関連して、「５'−キャップ」という用語には、ＲＮＡキャップ構造に類似し、好ましくはインビボおよび／または細胞中で、ＲＮＡに結合した場合ＲＮＡを安定化するおよび／またはＲＮＡの翻訳を増強する能力を有するように修飾されている５'−キャップ類似体が含まれる。
【０１３１】
ＲＮＡはさらなる修飾を含み得る。例えば、本発明で使用されるＲＮＡのさらなる修飾は、天然のポリ（Ａ）尾部の伸長もしくは切断、または前記ＲＮＡのコード領域に関連しない非翻訳領域（ＵＴＲ）の導入などの５'−ＵＴＲまたは３'−ＵＴＲの改変、例えばα２グロビン、α１グロビン、βグロビン、好ましくはβグロビン、より好ましくはヒトβグロビンなどのグロビン遺伝子に由来する１コピー以上、好ましくは２コピーの３'−ＵＴＲと既存の３'−ＵＴＲとの交換、またはグロビン遺伝子由来の１コピー以上、好ましくは２コピーの３'ＵＴＲの挿入であり得る。
【０１３２】
マスクされていないポリＡ配列を有するＲＮＡは、マスクされたポリＡ配列を有するＲＮＡよりも効率的に翻訳される。「ポリ（Ａ）尾部」または「ポリＡ配列」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル（Ａ）残基の配列に関し、「マスクされていないポリＡ配列」は、ＲＮＡ分子の３'末端のポリＡ配列がポリＡ配列のＡで終了し、ポリＡ配列の３'末端、すなわち下流に位置するＡ以外のヌクレオチドが後続していないことを意味する。さらに、約１２０塩基対の長いポリＡ配列は、ＲＮＡの最適な転写産物安定性および翻訳効率をもたらす。
【０１３３】
したがって、本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現を増加させるために、好ましくは１０〜５００、より好ましくは３０〜３００、さらにより好ましくは６５〜２００、特に１００〜１５０個のアデノシン残基の長さを有するポリＡ配列と共に存在するようにＲＮＡを修飾し得る。特に好ましい実施形態では、ポリＡ配列は約１２０個のアデノシン残基の長さを有する。本発明に従って使用されるＲＮＡの安定性および／または発現をさらに増加させるために、ポリＡ配列を脱マスク化することができる。
【０１３４】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明に関連して、ＲＮＡの半減期は、前記ＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続時間」に影響を及ぼし得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間発現されると予想することができる。
【０１３５】
言うまでもなく、本発明に従ってＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を低下させることが望ましい場合、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高める上記の要素の機能を妨げるようにＲＮＡを修飾することが可能である。
【０１３６】
本発明に従って投与されるＲＮＡは非免疫原性である。本明細書で使用される「非免疫原性ＲＮＡ」という用語は、例えば哺乳動物に投与したとき免疫系による応答を誘導しない、または非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にする修飾および処理に供されていないという点においてのみ異なる同じＲＮＡによって誘導されるよりも弱い応答を誘導するＲＮＡを指す。好ましい一実施形態では、非免疫原性ＲＮＡは、自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオチドをＲＮＡに組み込み、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を除去することによって非免疫原性にされる。
【０１３７】
修飾ヌクレオチドの組み込みによって非免疫原性ＲＮＡを非免疫原性にするために、ＲＮＡの免疫原性を低下させるまたは抑制する限り、任意の修飾ヌクレオチドを使用し得る。自然免疫受容体のＲＮＡ媒介性活性化を抑制する修飾ヌクレオチドが特に好ましい。一実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換を含む。一実施形態では、修飾核酸塩基は修飾ウラシルである。一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、３−メチル−ウリジン（ｍ３Ｕ）、５−メトキシ−ウリジン（ｍｏ５Ｕ）、５−アザ−ウリジン、６−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオ−ウリジン（ｓ２Ｕ）、４−チオ−ウリジン（ｓ４Ｕ）、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシ−ウリジン（ｈｏ５Ｕ）、５−アミノアリル−ウリジン、５−ハロ−ウリジン（例えば５−ヨード−ウリジンまたは５−ブロモ−ウリジン）、ウリジン５−オキシ酢酸（ｃｍｏ５Ｕ）、ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル（ｍｃｍｏ５Ｕ）、５−カルボキシメチル−ウリジン（ｃｍ５Ｕ）、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジン（ｃｈｍ５Ｕ）、５−カルボキシヒドロキシメチル−ウリジンメチルエステル（ｍｃｈｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕ）、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｃｍ５ｓ２Ｕ）、５−アミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−ウリジン（ｍｎｍ５Ｕ）、１−エチル−プソイドウリジン、５−メチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−メチルアミノメチル−２−セレノ−ウリジン（ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ）、５−カルバモイルメチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオ−ウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ）、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−ウリジン（τｍ５Ｕ）、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン（τｍ５ｓ２Ｕ）、１−タウリノメチル−４−チオ−プソイドウリジン、５−メチル−２−チオ−ウリジン（ｍ５ｓ２Ｕ）、１−メチル−４−チオ−プソイドウリジン（ｍ１ｓ４Ψ）、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、３−メチル−プソイドウリジン（ｍ３Ψ）、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン（Ｄ）、ジヒドロプソイドウリジン、５，６−ジヒドロウリジン、５−メチル−ジヒドロウリジン（ｍ５Ｄ）、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロプソイドウリジン、２−メトキシ−ウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン、４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン（ａｃｐ３Ｕ）、１−メチル−３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）プソイ���ウリジン（ａｃｐ３Ψ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）ウリジン（ｉｎｍ５Ｕ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２−チオ−ウリジン（ｉｎｍ５ｓ２Ｕ）、α−チオ−ウリジン、２'−Ｏ−メチル−ウリジン（Ｕｍ）、５，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ５Ｕｍ）、２'−Ｏ−メチル−プソイドウリジン（Ψｍ）、２−チオ−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｓ２Ｕｍ）、５−メトキシカルボニルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｍｃｍ５Ｕｍ）、５−カルバモイルメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５−カルボキシメチルアミノメチル−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｃｍｎｍ５Ｕｍ）、３，２'−Ｏ−ジメチル−ウリジン（ｍ３Ｕｍ）、５−（イソペンテニルアミノメチル）−２'−Ｏ−メチル−ウリジン（ｉｎｍ５Ｕｍ）、１−チオ−ウリジン、デオキシチミジン、２'−Ｆ−アラ−ウリジン、２'−Ｆ−ウリジン、２'−ＯＨ−アラ−ウリジン、５−（２−カルボメトキシビニル）ウリジン、および５−［３−（１−Ｅ−プロペニルアミノ）ウリジンからなる群より選択される。特に好ましい一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドは、プソイドウリジン（Ψ）、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン（ｍ１Ψ）または５−メチル−ウリジン（ｍ５Ｕ）、特に１−メチル−プソイドウリジンである。
【０１３８】
修飾核酸塩基を含む例示的なヌクレオシドの構造は、１−メチルプソイドウリジンｍ１Ψ：
【化１】
2020516658.tif 000002
である。
【０１３９】
一実施形態では、修飾核酸塩基を含むヌクレオシドによる１つ以上のウリジンの置換は、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％のウリジンの置換を含む。
【０１４０】
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを使用したインビトロ転写（ＩＶＴ）によるｍＲＮＡの合成中に、酵素の異常な活性のために二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む有意の量の異常な産物が生成される。ｄｓＲＮＡは、炎症性サイトカインを誘導し、エフェクター酵素を活性化して、タンパク質合成の阻害をもたらす。ｄｓＲＮＡは、例えば非多孔性または多孔性のＣ−１８ポリスチレン−ジビニルベンゼン（ＰＳ−ＤＶＢ）マトリックスを使用したイオン対逆相ＨＰＬＣによって、ＩＶＴ  ＲＮＡなどのＲＮＡから除去することができる。あるいは、ｓｓＲＮＡではなくｄｓＲＮＡを特異的に加水分解し、それによってＩＶＴ  ＲＮＡ調製物からｄｓＲＮＡ混入物を除去する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＲＮａｓｅＩＩＩを用いた酵素ベースの方法を使用することができる。さらに、セルロース材料を使用することによってｄｓＲＮＡをｓｓＲＮＡから分離することができる。一実施形態では、ＲＮＡ調製物をセルロース材料と接触させ、ｄｓＲＮＡのセルロース材料への結合を可能にし、ｓｓＲＮＡのセルロース材料への結合を許容しない条件下で、ｓｓＲＮＡをセルロース材料から分離する。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「除去する」または「除去」という用語は、ｄｓＲＮＡなどの第２の物質の集団の近傍から分離されている、非免疫原性ＲＮＡなどの第１の物質の集団の特徴を指し、ここで、第１物質の集団は必ずしも第２物質を欠くわけではなく、第２物質の集団は必ずしも第１物質を欠くわけではない。しかしながら、第２物質の集団の除去を特徴とする第１物質の集団は、第１物質と第２物質の分離されていない混合物と比較して第２物質の含有量が測定可能なほど低い。
【０１４２】
核酸は、物理的、化学的または生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。
【０１４３】
核酸を宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれる。
【０１４４】
関心対象の核酸を宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス等に由来し得る。
【０１４５】
核酸を宿主細胞に導入する化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、ならびに水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームなどの脂質ベースの系が含まれる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当技術分野で周知である。
【０１４６】
「コードする」とは、定義されたヌクレオチドの配列または定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的過程における他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する、核酸中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、核酸の発現（翻訳および場合により転写）が細胞または他の生体系でタンパク質を産生する場合、核酸はタンパク質をコードする。
【０１４７】
「発現」という用語は、本発明に従ってその最も一般的な意味で使用され、例えば転写および／または翻訳による、ＲＮＡおよび／またはペプチドもしくはポリペプチドの産生を含む。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、特にペプチドまたはポリペプチドの産生に関する。また、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。
【０１４８】
本発明に関連して、「転写」という用語は、ＤＮＡ配列中の遺伝暗号がＲＮＡに転写される過程に関する。その後、ＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが、好ましくは適切な細胞抽出物を使用して、無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターを転写産物の生成に適用する。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。本発明によれば、本発明で使用されるＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモータであり得る。ＲＮＡポリメラーゼの特定の例は、Ｔ７、Ｔ３、およびＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼである。好ましくは、本発明によるインビトロ転写は、Ｔ７またはＳＰ６プロモータによって制御される。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
【０１４９】
本発明による「翻訳」という用語は、メッセンジャーＲＮＡの鎖が、ペプチドまたはポリペプチドを作製するようにアミノ酸の配列のアセンブリを指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１５０】
本発明によれば、ペプチドまたはタンパク質をコードするＲＮＡなどの核酸は、インビトロまたは被験体内に存在し得る細胞に取り込まれるまたは導入される、すなわちトランスフェクトまたは形質導入されると、前記ペプチドまたはタンパク質の発現をもたらすことが好ましい。細胞は、コードされたペプチドまたはタンパク質を細胞内で（例えば細胞質および／または核内で）発現してもよく、コードされたペプチドまたはタンパク質を分泌してもよく、またはそれを表面で発現してもよい。
【０１５１】
本発明によれば、「発現する核酸」および「コードする核酸」などの用語または同様の用語は、本明細書では互換的に使用され、特定のペプチドまたはポリペプチドに関して、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、発現されて前記ペプチドまたはポリペプチドを生成できることを意味する。
【０１５２】
「移入する」、「導入する」、「トランスフェクトする」または「形質導入する」などの用語は、本明細書では互換的に使用され、核酸、特にＲＮＡなどの外因性または異種核酸の細胞への導入に関する。本発明によれば、細胞はインビトロまたはインビボで存在することができ、例えば細胞は器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの適用では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性に発現されるだけで十分である。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞株は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
【０１５３】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって共有結合で連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２１個以上、および好ましくは８、１０、２０、３０、４０または５０個、特に１００個までのアミノ酸を含む物質を指す。
【０１５４】
「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、すなわちポリペプチド、好ましくは１００個を超えるアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般に「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は同義語であり、本明細書では互換的に使用される。
【０１５５】
本発明は、本明細書に記載の自己抗原などのペプチド、タンパク質、またはアミノ酸配列の「変異体」も含む。
【０１５６】
本発明の目的のために、アミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸付加変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１５７】
アミノ酸挿入変異体は、特定のアミノ酸配列における１個または２個以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、１個以上のアミノ酸残基がアミノ酸配列の特定の部位に挿入されるが、結果として生じる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【０１５８】
アミノ酸付加変異体は、１個以上のアミノ酸、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上のアミノ酸のアミノ末端および／またはカルボキシ末端融合物を含む。
【０１５９】
アミノ酸欠失変異体は、配列からの１個以上のアミノ酸の除去、例えば１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上のアミノ酸の除去を特徴とする。欠失はタンパク質の任意の位置にあってよい。タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に欠失を含むアミノ酸欠失変異体は、Ｎ末端および／またはＣ末端切断変異体とも呼ばれる。
【０１６０】
アミノ酸置換変異体は、配列内の少なくとも１個の残基が除去され、別の残基がその位置に挿入されていることを特徴とする。相同なタンパク質もしくはペプチド間で保存されていないアミノ酸配列の位置にある修飾、および／またはアミノ酸を類似の性質を有する他のアミノ酸で置換することが好ましい。好ましくは、タンパク質変異体におけるアミノ酸変化は、保存的アミノ酸変化、すなわち同様に荷電したアミノ酸または非荷電アミノ酸の置換である。保存的アミノ酸変化には、その側鎖が関連するアミノ酸のファミリーの１つの置換が含まれる。天然に存在するアミノ酸は一般に、酸性（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性（リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、および非荷電極性（グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン）アミノ酸の４つのファミリーに分類される。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時に芳香族アミノ酸として一緒に分類されることがある。
【０１６１】
好ましくは、所与のアミノ酸配列と前記所与のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも約６０％、６５％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。類似性または同一性の程度は、好ましくは、参照アミノ酸配列の全長の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％であるアミノ酸領域に関して与えられる。例えば、参照アミノ酸配列が２００個のアミノ酸からなる場合、類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約２０、少なくとも約４０、少なくとも約６０、少なくとも約８０、少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、または約２００個のアミノ酸、好ましくは連続するアミノ酸に関して与えられる。類似性または同一性の程度は、好ましくは、少なくとも８０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００または少なくとも２５０個のアミノ酸のセグメントに関して与えられる。好ましい実施形態では、類似性または同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長に関して与えられる。配列類似性、好ましくは配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野で公知のツールを用いて、好ましくは最良配列アラインメントを使用して、例えばＡｌｉｇｎを使用して、標準的な設定、好ましくはＥＭＢＯＳＳ：：ｎｅｅｄｌｅ、マトリックス：Ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップオープン１０．０、ギャップ伸長０．５を用いて行うことができる。
【０１６２】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」は、これらの配列間で同一であるアミノ酸の割合を示す。
【０１６３】
「同一性パーセント」という用語は、特に、比較する２つの配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるアミノ酸残基の割合を指すことが意図されており、前記割合は純粋に統計的であって、２つの配列間の相違は配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、比較する配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアラインメントは、手操作によって、またはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。
【０１６４】
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
【０１６５】
相同なアミノ酸配列は、本発明によれば、アミノ酸残基の少なくとも４０％、特に少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の同一性を示す。
【０１６６】
本発明によれば、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、断片、パートまたは部分は、好ましくは、それぞれ、それが由来するアミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の機能的特性を有する、すなわち機能的に等価である。一実施形態では、アミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質の変異体、断片、パートまたは部分は、それぞれ、それが由来するアミノ酸配列、ペプチドまたはタンパク質と免疫学的に等価である。一実施形態では、機能的特性は免疫学的特性である。
【０１６７】
本発明は、「ペプチド」および「タンパク質」という用語に含まれる本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質の誘導体を含む。本発明によれば、タンパク質およびペプチドの「誘導体」は、タンパク質およびペプチドの修飾形態である。そのような修飾には、任意の化学修飾が含まれ、ならびに炭水化物、脂質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの、タンパク質またはペプチドに関連する任意の分子の単一または複数の置換、欠失および／または付加が含まれる。一実施形態では、タンパク質またはペプチドの「誘導体」には、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、パルミトイル化、ミリストイル化、イソプレニル化、脂質化、アルキル化、誘導体化、保護基／ブロッキング基の導入、タンパク質分解切断、または抗体もしくは別の細胞リガンドへの結合から生じる修飾類似体が含まれる。「誘導体」という用語はまた、前記タンパク質およびペプチドのすべての機能的な化学的等価物に及ぶ。好ましくは、修飾ペプチドは、増加した安定性および／または増加した免疫原性を有する。
【０１６８】
「由来する」という用語は、本発明によれば、特定の実体、特に特定の配列が、それが由来する物体、特に生物または分子中に存在することを意味する。アミノ酸または核酸配列、特に特定の配列領域の場合、「由来する」は、特に、関連するアミノ酸配列または核酸配列が、それが存在するアミノ酸配列または核酸配列に由来することを意味する。
【０１６９】
「細胞」または「宿主細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその通常の細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその通常の代謝機能を実施することができる生細胞である。好ましくは、前記用語は、本発明によれば、外因性核酸で形質転換またはトランスフェクトすることができる任意の細胞に関する。「細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えば樹状細胞、Ｂ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＬＡ細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。外因性核酸は、（ｉ）それ自体で自由に分散して、（ｉｉ）組換えベクターに組み込まれて、または（ｉｉｉ）宿主細胞のゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡに組み込まれて、細胞の内部で見出され得る。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ヤギ、および霊長動物からの細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来し、一次細胞および細胞株を含み得る。
【０１７０】
例えば核酸でトランスフェクトされた、核酸を含む細胞は、好ましくは核酸によってコードされるペプチドまたはタンパク質を発現する。
【０１７１】
「拡大」という用語は、特定の実体が増加する過程を指す。本発明の一実施形態では、この用語は、リンパ球が抗原によって刺激され、増殖し、前記抗原を認識する特定のリンパ球が増幅される免疫学的応答に関連して使用される。好ましくは、クローン拡大はリンパ球の分化をもたらす。
【０１７２】
本明細書で使用される「単離された」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図されている。
【０１７３】
本発明に関連して「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明に関連して組換え細胞または核酸などの「組換え物体」は、天然には存在しない。
【０１７４】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。
【０１７５】
「低減する」、「阻害する」または「減少させる」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力に関する。これらの用語には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
【０１７６】
「増加させる」、「増強する」、「促進する」、「刺激する」、または「誘導する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、５０％以上、７５％以上、１００％以上、２００％以上、または５００％以上のレベルの全体的な増加を生じさせる能力に関する。これらの用語は、ゼロまたは測定不能もしくは検出不能なレベルから、ゼロ超または測定可能もしくは検出可能なレベルへの増加、増強、促進、刺激、または誘導に関連し得る。あるいは、これらの用語はまた、増加、増強、促進、刺激、または誘発の前に特定のレベルが存在し、増加、増強、促進、刺激、または誘導後にレベルがより高いことも意味し得る。
【０１７７】
本明細書に記載の薬剤および組成物は、自己免疫疾患の治療または予防のために哺乳動物の免疫応答を抑制する方法に有用である。特に、本明細書に記載の薬剤および組成物は、自己抗原に対する免疫反応の存在を特徴とする自己免疫疾患を有する被験体を治療するために使用できる。本発明によれば、自己抗原もしくはその断片、または自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチドをコードする非免疫原性ＲＮＡを被験体に投与する。
【０１７８】
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、困難、社会的問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型のバリエーションを含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーと見なされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。本発明によれば、「疾患」という用語は自己免疫疾患を含む。
【０１７９】
本発明に従って治療される疾患は、好ましくは自己抗原が関与する疾患または自己抗原に関連する疾患である。
【０１８０】
「自己免疫疾患」または「自己免疫障害」という用語は、身体が自らの組織の何らかの成分に対して免疫原性（すなわち免疫系）応答を生じる任意の疾患／障害を指す。言い換えると、免疫系は、体内の何らかの組織または系を自己として認識するその能力を喪失し、それが異物であるかのごとくに標的とし、攻撃する。自己免疫疾患は、主に１つの器官が侵されるもの（例えば溶血性貧血および自己免疫性甲状腺炎）と、自己免疫疾患の過程が多くの組織を介して拡散するもの（例えば全身性エリテマトーデス）に分類することができる。例えば、多発性硬化症は、脳および脊髄の神経線維を取り囲む鞘を攻撃するＴ細胞によって引き起こされると考えられている。これは、協調の喪失、衰弱、および視朦をもたらす。自己免疫疾患の例には、とりわけ、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン−バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節炎、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎、およびＩ型糖尿病が含まれるが、これらに限定されない。
【０１８１】
以下は、特定の自己免疫疾患に関連することが公知の抗原のリストである。これらの抗原からのエピトープは、自己抗原もしくはその断片、または本発明による自己抗原もしくは断片の変異体を含むペプチドまたはポリペプチド中に含まれ得る。
【０１８２】
多発性硬化症（ＭＳ）／（＋動物モデルＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎））
ＭＳの可能性のある候補自己抗原には、ミエリン抗原、ニューロン抗原および星状細胞由来抗原が含まれる。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（例えばＭＢＰ８４−１０２、ＭＢＰ８３−９９、ＭＢＰ１３−３２、ＭＢＰ１４４−１６３、ＭＢＰ１４３−１６８、ＭＢＰ１５１−１７０）、プロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）（例えばＰＬＰ１３９−１５１）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、ＣＮＰアーゼ（２'，３'−環状ヌクレオチド３'−ホスホジエステラーゼ）、Ｓ１００βタンパク質、およびトランスアルドラーゼＨなどのミエリンタンパク質のタンパク質成分は、本発明に従って使用するのに特に興味深い。
【０１８３】
関節リウマチ（ＲＡ）
ＲＡの可能性のある候補自己抗原には、ＩＩ型コラーゲン、ヒト軟骨糖タンパク質３９、およびアグリカンＧ１が含まれる。
【０１８４】
１型糖尿病
１型糖尿病の可能性のある候補自己抗原には、インスリン、プロインスリン、グルタミン酸脱炭酸酵素６５（ＧＡＤ６５）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、インスリノーマ関連タンパク質２ベータ（ＩＡ−２β）、膵島細胞自己抗原（ＨＳＰ）、グリマ３８、膵島細胞自己抗原（ＩＣＡ６９）、ｐ５２、亜鉛輸送体８（ＺｎＴ８）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、およびクロモグラニンＡが含まれる。
【０１８５】
重症筋無力症
重症筋無力症の可能性のある自己抗原候補には、ｎＡＣｈＲ、ＭｕＳＫ、およびＬＲＰ４が含まれる。
【０１８６】
ＭＳ、ＲＡ、１型糖尿病、重症筋無力症、ＩＢＤ、および乾癬などの疾患における他の自己抗原は、その一部が本明細書に記載されており、その他も当技術分野において公知であるが、本発明での使用が企図される。公知の自己抗原および自己免疫エピトープの数は増加しつつある。今後公知となるそのような抗原およびエピトープも、本発明での使用が企図される。
【０１８７】
「自己抗原に関連する疾患」または「自己抗原が関与する疾患」という用語は、自己抗原に関係する任意の疾患、例えば自己抗原または自己抗原を発現する細胞に対する免疫反応の存在を特徴とする疾患を指す。
【０１８８】
「治療」または「治療的処置」という用語は、個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長させる（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体の疾患を除去し、個体の疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体の疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体の症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個人の再発を減少させ得る。
【０１８９】
「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、個体、特に疾患の危険性がある個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図された任意の治療に関する。「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０１９０】
「危険性がある」とは、一般集団と比較して疾患を発症する可能性が通常よりも高いと特定された被験体、すなわち患者を意味する。加えて、疾患を有していたことがある、または現在有している被験体は、引き続き疾患を発症する可能性があるため、疾患を発症する危険性が高い被験体である。
【０１９１】
「インビボ」という用語は、被験体における状況に関する。
【０１９２】
「個体」または「被験体」という用語は、脊椎動物、特に哺乳動物に関する。例えば、本発明に関連して哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ブタ、ウマ等のような飼いならされた哺乳動物、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のような実験動物、ならびに動物園の動物などの飼育下の動物である。「被験体」という用語は、鳥類（特にニワトリ、アヒル、ガチョウ、七面鳥などの飼いならされた鳥）、および魚類（特に養殖魚、例えばサケまたはナマズ）などの非哺乳類脊椎動物にも関連する。本明細書で使用される「動物」という用語には、ヒトも含まれる。好ましくは、「患者」という用語は罹患した個体に関する。
【０１９３】
「自家」という用語は、同じ被験体に由来するものを表すために使用される。例えば、「自家移植」は、同じ被験体に由来する組織または器官の移植を指す。そのような手順は、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。
【０１９４】
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。
【０１９５】
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち同じ近交系の同一の双生児もしくは動物、またはそれらの組織に由来するものを表すために使用される。
【０１９６】
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の骨髄の異なる個体への移入は、異種移植を構成する。異種遺伝子は、被験体以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０１９７】
本明細書に記載される薬剤は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与し得る。「医薬組成物」という用語は、治療上有効な薬剤またはその塩を、好ましくは緩衝剤、防腐剤および張性調整剤などの医薬賦形剤と共に含む製剤に関する。前記医薬組成物は、前記医薬組成物を個体に投与することによって疾患または障害を治療または予防するのに有用である。医薬組成物は、当技術分野では医薬製剤としても知られる。医薬組成物は、局所的または全身的に投与することができる。
【０１９８】
「全身投与」という用語は、薬剤が個体の体内に有意の量で広く分布するようになり、生物学的作用を発現するような治療上有効な薬剤の投与を指す。本発明によれば、投与は非経口投与によることが好ましい。
【０１９９】
「非経口投与」という用語は、薬剤が腸を通過しないような治療上有効な薬剤の投与を指す。「非経口投与」という用語には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０２００】
本発明の方法はまた、好ましくは被験体に免疫抑制化合物を提供することをさらに含む。免疫抑制化合物がペプチドまたはポリペプチドである場合、免疫抑制化合物またはＲＮＡなどの核酸、特に、免疫抑制化合物をコードする本明細書に記載のＲＮＡなどの非免疫原性ＲＮＡを投与することによって被験体に提供することができる。免疫抑制化合物は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン１受容体拮抗薬（ＩＬ−１ＲＡ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン２７（ＩＬ−２７）、インターロイキン３５（ＩＬ−３５）、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、誘導性Ｔ細胞共刺激リガンド（ＩＣＯＳＬ）、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＦＡＳ、ＦＡＳ−ＩＬ、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ１）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ２（ＩＤＯ２）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）／レチナールアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＲＡＬＤＨ）、アルギナーゼ１（ＡＲＧ１）、アルギナーゼ２（ＡＲＧ２）、亜酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ２）、ガレクチン−１、ガレクチン−９、セマフォリン４Ａ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択することができる。さらに、本明細書に記載の組成物は、そのような免疫抑制化合物またはそのような免疫抑制化合物をコードするＲＮＡなどの核酸を含み得る。
【０２０１】
本発明による医薬組成物は、一般に「薬学的に有効な量」および「薬学的に許容される製剤」で適用される。
【０２０２】
「薬学的に有効な量」という用語は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。本明細書に記載の組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに類似の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の組成物の投与量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
【０２０３】
「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０２０４】
本発明の医薬組成物は、塩、緩衝剤、防腐剤、担体および場合により他の治療薬を含み得る。好ましくは、本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤を含む。
【０２０５】
「賦形剤」という用語は、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤などの、活性成分ではない医薬組成物中のすべての物質を示すことが意図されている。
【０２０６】
「希釈剤」という用語は、希釈するおよび／または希薄にする作用物質に関する。さらに、「希釈剤」という用語には、流体、液体または固体の懸濁液および／または混合媒体のいずれか１つ以上が含まれる。
【０２０７】
「担体」という用語は、ヒトへの投与に適した１つ以上の適合性の固体または液体の充填剤または希釈剤に関する。「担体」という用語は、活性成分の適用を容易にするために活性成分と組み合わせる天然または合成の有機または無機成分に関する。好ましくは、担体成分は、鉱油、動物、または植物、例えば落花生油、大豆油、ゴマ油、ヒマワリ油等に由来するものを含む、水または油などの滅菌液体である。塩溶液および水性デキストロースおよびグリセリン溶液も、水性担体化合物として使用し得る。
【０２０８】
治療的使用のための薬学的に許容される担体または希釈剤は、製薬分野で周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ  Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。適切な担体の例には、例えば炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバターなどが含まれる。適切な希釈剤の例には、エタノール、グリセロールおよび水が含まれる。
【０２０９】
医薬担体、賦形剤または希釈剤は、意図される投与経路および標準的な薬務に関して選択することができる。本発明の医薬組成物は、担体（１つまたは複数）、賦形剤（１つまたは複数）または希釈剤（１つまたは複数）として、またはそれらに加えて、任意の適切な結合剤（１つまたは複数）、潤滑剤（１つまたは複数）、懸濁剤（１つまたは複数）、コーティング剤（１つまたは複数）および／または可溶化剤（１つまたは複数）を含み得る。適切な結合剤の例には、デンプン、ゼラチン、グルコースなどの天然糖、無水ラクトース、自由流動性ラクトース、βラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカントまたはアルギン酸ナトリウムなどの天然および合成ゴム、カルボキシメチルセルロースならびにポリエチレングリコールが含まれる。適切な潤滑剤の例には、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが含まれる。防腐剤、安定剤、染料、さらには香味剤を医薬組成物に提供してもよい。防腐剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが含まれる。酸化防止剤および懸濁剤も使用し得る。
【０２１０】
一実施形態では、組成物は水性組成物である。水性組成物は、場合により溶質、例えば塩を含んでもよい。一実施形態では、組成物は凍結乾燥組成物の形態である。凍結乾燥組成物は、それぞれの水性組成物を凍結乾燥することによって得られる。
【０２１１】
本発明を以下の図面および実施例によってさらに説明するが、これらは本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０２１２】
図面
図１：Ｆ１２リポソームと複合体化したルシフェラーゼＲＮＡの投与後の脾臓免疫細胞の活性化、サイトカインの放出およびタンパク質の発現。ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝７）に非免疫原性ＬＵＣ  ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  １０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に（Ａ）樹状細胞（ｎ＝３）（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。ＢＡＬＢ／ｃマウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、（Ｂ）ＩＦＮαの血清濃度を評価した。（Ｃ）インビボ生物発光イメージングによる、ルシフェラーゼＲＮＡのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝４）へのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６、２４、４８および７２時間後のインビボでのルシフェラーゼ活性測定。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＬＬＯＤ＝検出の下限。
図２：セルロース処理またはＨＰＬＣ精製のいずれかによって精製した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡのドットブロット分析。曝露時間２０秒。
図３：ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、セルロースまたはＨＰＬＣ法のいずれかによって精製した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６匹のマウス／群。
図４：ＡＰＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示は、抗原特異的Ｔ細胞増殖を誘導する。ナイーブ、細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）標識、Ｔｈｙ１．１＋２Ｄ２＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｔｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６対照マウスに養子移入した。翌日、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  １０、２０または４０μｇでマウスを免疫した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。２番目の対照群には、さらに１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。４日後、マウスを犠死させ、脾臓をＴｈｙ１．１＋細胞の増殖について分析した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
図５：誘導された抗原特異的Ｔｒｅｇ細胞によるＭＯＧ３５−５５  Ｔ細胞増殖のインビトロ抑制。（Ａ、Ｂ）２Ｄ２  Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰマウスを、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで４回（０日目、３日目、６日目、９日目）免疫した。対照マウスは、免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡまたは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡで処置した。３番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌをさらに投与した。最後のｍＲＮＡ処置の４日後、マウスを犠死させ、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋細胞をＦｏｘｐ３−ｅＧＦＰ発現について分析した（Ｃ）。各処置群の細胞（サプレッサー）を未処置のナイーブマウスのＣＴＶ標識２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞（レスポンダー細胞）と共培養し、ＭＯＧ３５−５５ペプチド負荷ＢＭＤＣによってインビトロで７２時間再刺激した。レスポンダー細胞の増殖をＦＡＣＳ（ＣＴＶ＋細胞でゲートした）によるＣＴＶ希釈によって決定した。サプレッサー細胞の抑制能力を、レスポンダー細胞に対して４つの異なる比率で測定した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の頻度の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊＊＊ｐ≦０．００１で評価した。
図６：ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって決定した。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々なＥＡＥ疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
図７：ＤＣによるＭＯＧ３５−５５抗原提示は、実際の治療環境でＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。マウスが１〜２のＥＡＥスコアに達した後、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜９匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々なＥＡＥ疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
図８：ＤＣによる抗原提示はＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡによる免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目と１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、ＥＡＥに罹患し、ｍＲＮＡ処置したマウスから器官を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間培養した。ＣＤ４０Ｌの発現をＣＤ４＋ＣＤ４４＋Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色によって調べた。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊ｐ≦０．０５で評価した。
図９：ＭＯＧ３５−５５ペプチド特異的Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、治療的に処置したマウスにおいて有意に減少する（７日目／１０日目）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡによる免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目と１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。ＥＡＥ誘導後１６日目に脳および脊髄を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間、細胞をインビトロで再刺激した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγおよびＩＬ−１７Ａの発現について分析し、ＩＦＮγ＋およびＩＬ−１７Ａ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を計算した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊ｐ≦０．０５で評価した。
図１０：Ｆ１２リポソームと複合体化した非免疫原性（ｍ１Ｙ）および免疫原性（Ｕ）ｍＲＮＡの異なるＭＯＧ３５−５５−ｍＲＮＡ混合物の投与後の脾臓免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  ２０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に樹状細胞（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、ＩＦＮαの血清濃度を評価した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
図１１：非免疫原性および免疫原性ｍＲＮＡの異なるＭＯＧ３５−５５−ｍＲＮＡ混合物のドットブロット分析。曝露時間２０秒。破線は、ｄｓＲＮＡ  ３２０ｐｇのドット強度の１００％として設定している。
図１２：非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡはＥＡＥに対する完全な寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、非免疫原性（ｍ１Ｙ）および免疫原性（Ｕ）ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡの異なる混合物を後眼窩神経叢に静脈内注射した。対照マウスには１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。群ごとの各マウスの最大ＥＡＥスコアの統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって、＊＊ｐ≦０．０１で評価した。
図１３：ヌクレオシド修飾のみでは認識の喪失を誘導しない。Ｆ１２リポソームと複合体化した様々なヌクレオシド修飾ｍＲＮＡの投与後の脾臓免疫細胞の活性化およびサイトカイン放出。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに全ｍＲＮＡ−ＬＰＸ  １０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射し、２４時間後に樹状細胞（ＣＤ８６の上方調節によって明らかになった）、Ｔ細胞およびＮＫ細胞（ＣＤ６９の上方調節によって明らかになった）の成熟状態を調べた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスへのｍＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６時間後、ＩＦＮαの血清濃度を評価した。データは、ｎ＝３匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
図１４：非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置は抗原特異的ＣＤ４＋エフェクター細胞の拡大をもたらさない。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、０、３、７、および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。２番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。最初のｍＲＮＡ処置後１３日目に、マウスを犠死させ、脾細胞を、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ（Ａ）およびＭＯＧ３５−５５ペプチドで再刺激した細胞の上清中のＭｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＥＬＩＳＡによるサイトカインの検出（ＢおよびＣ）によって炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの分泌について分析した。データは、ｎ＝４〜５匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。
図１５：共阻害分子は、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸで処置すると上方調節される。ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを、０、３、７、および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。対照マウスは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。さらに、２番目の対照群には１５０ｍＭ  ＮａＣｌを投与した。最初のｍＲＮＡ処置後１３日目に、マウスを犠死させ、脾臓からのＭＯＧ３５−５５  ＣＤ４＋Ｔ細胞を共阻害分子の上方調節についてフローサイトメトリで分析した。データは、ｎ＝４〜５匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
図１６：非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、ＣＮＳへのリンパ球の浸潤を減少させる。ナイーブＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞を１日目にＴｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスに養子移入した。ＥＡＥを、ＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、異なる処置を受けたマウスから器官を採取した。Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５特異的細胞の浸潤を調べ、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブを使用したフローサイトメトリによって浸潤細胞の総数を測定した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。浸潤したＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
図１７：ＭＯＧ３５−５５特異的Ｔｈ１およびＴｈ１７細胞は、治療的に処置したマウスにおいて有意に減少する（７日目／１０日目）。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６においてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。ＥＡＥ誘導後１６日目に脳および脊髄を採取し、ブレフェルジンＡの存在下に、ＭＯＧ３５−５５ペプチドの存在下で６時間、細胞をインビトロで再刺激した。次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を細胞内サイトカイン染色によってＩＦＮγおよびＩＬ−１７Ａの発現についてフローサイトメトリで分析し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＩＦＮγ＋およびＩＬ−１７Ａ＋の割合を計算した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
図１８：共阻害分子は、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置が成功すると、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞で上方調節される。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６においてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは１５０ｍＭ  ＮａＣｌで処置した。疾患誘導後１６日目に、異なる処置を受けた群から脾臓を切除した。ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞をテトラマー特異的ＭＡＣＳによって単離し、テトラマー染色によってフローサイトメトリで表現型解析した。データは、ｎ＝４匹のマウス／群からの平均値±標準偏差として示している。統計分析は、一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって評価した。
図１９：ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４は、非免疫原性ｍＲＮＡ誘導の抗原特異的寛容の維持に必要である。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目にマウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇまたは非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した（ｎ＝８匹のマウス／群）。ｍＲＮＡ処置マウスを、抗ＰＤ−１もしくは抗ＣＴＬＡ−４遮断抗体または対応するＩｇＧ対照で同時に処置した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
図２０：非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡでの処置による抗原特異的寛容の誘導は、ＥＡＥ疾患モデルとは無関係である。（Ａ）非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１をコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、再発寛解型ＥＡＥに対する寛容を誘導する。ＥＡＥを、ＳＪＬマウスにおいてＰＬＰ１３９−１５１−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週に２回、非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１をコードするｍＲＮＡ  ２０μｇ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡを後眼窩神経叢に静脈内注射した。（Ｂ）非免疫原性マルチエピトープをコードするｍＲＮＡ−ＬＰＸでの治療的ワクチン接種は、複雑なＥＡＥにおいて寛容を誘導する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６およびＳＪＬ／ＪＲｊのＦ１ハイブリッドマウスにおいてＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１、ＭＢＰ８４−１０４およびＭＯＢＰ１５−３６−ＣＦＡ（０日目）ならびに百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導した。ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週に２回、非免疫原性マルチエピトープコードｍＲＮＡ  ４０μｇ、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２０μｇ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇを後眼窩神経叢に静脈内注射した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
図２１：非免疫原性ｍＲＮＡによるサイトカインの共送達は、ＥＡＥモデルでの非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置の寛容原性効力を改善する。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＭＯＧ３５−５５−ＣＦＡ（０日目）および百日咳毒素（０日目および２日目）による免疫化によって積極的に誘導し、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に、それぞれ非免疫原性ｍＩＬ−１０（Ａ）またはｍＩＬ−２７（Ｂ）ｍＲＮＡ  １５μｇと共に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇでマウスを処置した。対照マウスには、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇを非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  １５μｇ、非免疫原性のサイトカインコードｍＲＮＡ  １５μｇ、または非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇと共に投与した。ＥＡＥの発症を毎日の健康モニタリングによって評価した。データは平均値として示している。ｎ＝６〜８匹のマウス／群。ＥＡＥ曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して、様々な疾患発症曲線の一方向ＡＮＯＶＡおよびテューキーの多重比較検定によって統計的有意性を決定した。
【実施例】
【０２１３】
（実施例１）
材料および方法
動物
Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ、ＳＪＬ／ＪＲｊ野生型マウスおよびＣ５７ＢＬ／６およびＳＪＬ／ＪＲｊのＦ１ハイブリッドマウスは、それぞれＥＮＶＩＧＯ  ＲＭＳ  ｇｍｂＨ，ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＪａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅから購入した。ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａｂ）に関連してＭＯＧ３５−５５を認識するＴ細胞受容体を発現するＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＴＣＲ  ＭＯＧトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス、およびノックインＦｏｘｐ３−ｅＧＦＰをさらに含むＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰ  ＴＣＲ  ＭＯＧトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｐｒｏｆ．Ｄｒ．Ａｒｉ  Ｗａｉｓｍａｎの研究室の好意で提供された。年齢と性別が一致する動物を実験全体で使用し、ＢｉｏＮＴｅｃｈ  ＡＧ  Ｍａｉｎｚの動物施設において特定病原体フリー（ＳＰＦ）条件下でマウスを維持した。
【０２１４】
ＲＮＡ構築物およびインビトロ転写
ＬＵＣ−ｍＲＮＡのインビトロ転写は、５'ヒトαグロビンＵＴＲ（ｈＡｇ）、３'ＦＩエレメントおよび１００ヌクレオチドのポリ（Ａ）尾部を含み、３０ヌクレオチド後にリンカーを有する、ｐＳＴ１−ｈＡｇ−ＣＤＳ−ＦＩ−Ａ３０ＬＡ７０プラスミド骨格に基づいた。ＬＵＣ構築物はホタルルシフェラーゼ遺伝子を含む。ＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１およびＭＢＰ８４−１０４構築物は、同じプラスミド骨格（ｐＳＴ１−ｈＡｇ−ＣＤＳ−ＦＩ−Ａ３０ＬＡ７０）に基づいて設計し、それぞれＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１およびＭＢＰ８４−１０４コード配列の前後にｍｍｓｅｃ（任意）およびｍｍＭＩＴＤ（任意）をさらに含んだ（ｐＳＴ１−ｈＡｇ−ｍｍｓｅｃ（任意）−ＣＤＳ−ｍｍＭＩＴＤ（任意）−Ａ３０ＬＡ７０）。リーダーペプチドとＭＨＣ輸送シグナル（ＭＩＴＤ）の追加は、ＡＰＣによる抗原提示を強力に改善する（Ｋｒｅｉｔｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０，３０９−３１８）。すべての抗原配列は、抗原提示を促進するために疾患関連エピトープの前後に７つの隣接アミノ酸をさらに含む。抗原配列、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）は、ペプチド配列：ＭＯＧ２７−６３：ＳＰＧＫＮＡＴＧＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫＤＱＤＡＥＡＱＰを有する。マウスミエリンペプチド、プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１３９−１５１の場合は、より良好なペプチド提示のためにやはり７つの隣接アミノ酸を追加した（ＰＬＰ１３１−１５９：ＡＨＳＬＥＲＶＣＨＣＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦＶＧＩＴＹＡＬＴ）。プロテオリピドタンパク質ＰＬＰ１７８−１９１は、アミノ酸ＰＬＰ１７０−１９９：ＡＶＰＶＹＩＹＦＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫＴＳＡＳＩＧＳＬを含み、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）８４−１０４は、アミノ酸ＭＢＰ７６−１１２：ＲＴＱＤＥＮＰＶＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰＰＳＱＧＫＧＲＧＬＳＬＳＲＦＳを含む。ｍＲＮＡによる対照免疫のために、特定の抗原配列をコードしない空のベクターを使用した（ｐＳＴ２−ｈＡｇ−ｍｍｓｅｃ（任意）−空−ｍｍＭＩＴＤ（任意）−２ｈＢｇ−Ａ３０ＬＡ７０）。マウスインターロイキン１０（ｍＩＬ−１０）およびマウスインターロイキン２７（ｍＩＬ−２７）のｍＲＮＡをコードするサイトカインも、プラスミド骨格ｐＳＴ１−ｈＡｇ−ＣＤＳ−ＦＩ−Ａ３０ＬＡ７０に基づいて合成した。Ｋｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５６，１５７７−８７）に記載されているように、ＲＮＡをインビトロ転写によって生成した。精製したｍＲＮＡをＨ２Ｏで溶出し、さらに使用するまで−８０℃で保存した。記載されているすべてのｍＲＮＡ構築物のインビトロ転写は、ＢｉｏＮＴｅｃｈ  ＲＮＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ＧｍｂＨによって行われた。
【０２１５】
非免疫原性ｍＲＮＡの生成
使用する非免疫原性ｍＲＮＡを生成するために、通常のヌクレオシドのウリジンの代わりに１−メチルプソイドウリジンをインビトロ転写中に使用し、ｍＲＮＡをＨＰＬＣまたはセルロース処理によってさらに精製した。ＨＰＬＣ精製には、Ｗｅｉｓｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ．９６９，４３−４３）のプロトコルを採用し、緩衝液Ｂの３８％〜７０％の勾配でｍＲＮＡの溶出を実施した。生成されたすべてのｍＲＮＡから、ｍＲＮＡの純度と完全性を保証するために品質管理（バイオアナライザおよびドットブロット分析）を実施した。
【０２１６】
使用する免疫原性ｍＲＮＡを生成するために、通常のヌクレオシドのウリジンをインビトロ転写に使用し、ｍＲＮＡはＨＰＬＣまたはセルロース処理によってさらに精製しなかった。
【０２１７】
脾細胞の活性化に対するＨＰＬＣ精製またはセルロース処理の影響を検討するために、追加のＨＰＬＣ精製を受けたか（ｐＵ−ＨＰＬＣ  ｍＲＮＡ）、または受けなかったプソイドウリジン修飾ｍＲＮＡ（ｐＵ−ｍＲＮＡ）を使用した。対応するｍＲＮＡは、既に述べたように生成した。
【０２１８】
ＩＶＴ  ｍＲＮＡの品質管理のためのドットブロット分析
インビトロで転写し、修飾およびＨＰＬＣ精製したｍＲＮＡを、ドットブロットによって二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）について分析した。様々なｍＲＮＡ構築物１μｇをＮＹＴＲＡＮ  ＳＰＣ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に負荷し、ブロックし、次いでｄｓＲＮＡの検出のためにＪ２抗体（ＳＣＩＣＯＮＳ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）と共にインキュベートした。二次抗体として抗マウスＨＲＰ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を使用し、膜をＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃで分析した。
【０２１９】
ＲＮＡリポプレックスの調製および注入
ＲＮＡ−リポプレックス（ＲＮＡ−ＬＰＸ）を滅菌およびＲＮアーゼフリーの条件下で調製した。ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ）／ＥＤＴＡ（０．１ｍＭ）を使用して、ＲＮＡを１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。１．５Ｍ  ＮａＣｌ（５Ｍ  ＮａＣｌストック；Ａｍｂｉｏｎ）を特定の量のＲＮＡに添加して、１５０ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度を得た。短時間ボルテックスした後、指定量のＦ１２リポソームを添加し、ＲＮＡリポソーム混合物（ＲＮＡ−ＬＰＸ）を再度短時間ボルテックスし、最後にＲＮＡ−ＬＰＸの形成を可能にするために室温で１０分間インキュベートした（Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１６，Ｎａｔｕｒｅ．１６，３９６−４０１）。マウスごとにＲＮＡ−ＬＰＸ溶液２００μｌをマウスの後眼窩神経叢に静脈内注射した。
【０２２０】
フローサイトメトリ分析
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）表面および細胞内抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入し、製造元のプロトコルに従って使用した。使用した抗体は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ４４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ６９、ＣＤ８、ＣＤ８６、ＣＤ９０．１、Ｆｏｘｐ３、ＩＣＯＳ、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７Ａ、Ｌａｇ−３、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴおよびＴｉｍ−３であった。
【０２２１】
異なる器官からの単一細胞懸濁液を細胞外マーカーについて４℃で３０分間染色した。ＩＦＮγ、ＩＬ−１７ＡおよびＣＤ４０Ｌの細胞内サイトカイン染色のために、細胞を記載したように単離し、ＭＯＧ３５−５５ペプチド（濃度１５μｇ／ｍｌ）、モネンシン（ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ、ＢＤ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびブレフェルジンＡを含む培地中、３７℃、５％ＣＯ２で６時間さらに刺激した。生細胞／死細胞染色（生存率染料ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）５０６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および細胞表面マーカーの染色を行った後、ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＣｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍおよびＰｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液を使用して、製造元のプロトコルに従って細胞を固定し、透過処理した。細胞を細胞内抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ分析の前にＰｅｒｍ／Ｗａｓｈで２回洗浄した。試料は、ＢＤ  ＬＳＲ  ＦｏｒｔｅｓｓａまたはＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩで取得し、ＦｌｏｗＪｏ  ７．６．５またはＦｌｏｗＪｏ  １０．４（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）ソフトウェアを使用して分析した。
【０２２２】
細胞内Ｆｏｘｐ３染色では、固定および透過処理のためにＦｏｘｐ３転写因子染色緩衝液セット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。すべての工程は、細胞外染色後に製造元の推奨に従って実施した。
【０２２３】
ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞をテトラマー染色によって検出した。ＭＯＧ３５−５５特異的ＡＰＣ結合ｐＭＨＣクラスＩＩテトラマーは、国立衛生研究所のテトラマーコア施設から入手した。マウス脾細胞の単一細胞懸濁液を、完全ＤＣ培地（培地組成については「骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の生成」を参照）中、室温で１時間、ＭＯＧ３５−５５  ＡＰＣ結合テトラマーと共にインキュベートした。細胞を洗浄し、抗ＡＰＣ染色とその後のＭＡＣＳを実施した。上記のように、細胞を細胞外抗体または細胞内抗体と共にインキュベートした。
【０２２４】
脾臓、脳、脊髄中の絶対ＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５特異的細胞数（Ｔｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞）の測定のために、Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）Ｔｕｂｅｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した。単一細胞懸濁液を上記のように染色し、その後Ｔｒｕｃｏｕｎｔ（商標）チューブに移し、フローサイトメトリによって絶対細胞数を測定した。
【０２２５】
インビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）
脾臓細胞における非免疫原性ｍＲＮＡの翻訳効率を、Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍインビボイメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して検討した。非免疫原性ＬＵＣ−ｍＲＮＡのＲＮＡ−ＬＰＸ免疫化の６時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後に、マウスにＤ−ルシフェリンの水溶液（２５０μｌ、ＰＢＳ中１．６ｍｇ）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を腹腔内注射した。５分後、脾臓からのシグナル強度を定義し、関心領域（ＲＯＩ）のインビボ生物発光によって測定し、ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  ４．０ソフトウェアを使用して総光束（光子／秒）として定量化した。取得時間は、ビニング４で１分であった。生存マウスの生物発光イメージング中に、マウスを２．５％イソフルラン／酸素混合物の用量で麻酔した。生存動物の放出された光子のＬＵＣシグナル強度はグレースケール画像として表し、黒色は最も弱く、白色は最も強い生物発光シグナルである。ＩＶＩＳ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してマウスの画像を分析した。
【０２２６】
磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）
Ｔｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＴＣＲ  ＭＯＧトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスまたはＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰ  ＴＣＲ  ＭＯＧトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスのＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を製造元の指示に従って使用した陽性選択によって脾臓およびリンパ節から単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズを使用して精製した。
【０２２７】
ＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５特異的Ｔ細胞を、ＭＯＧ３５−５５特異的ＡＰＣ結合ｐＭＨＣクラスＩＩテトラマー染色後に、抗ＡＰＣマイクロビーズを使用してＭＡＣＳ濃縮した。製造元のプロトコルに従って濃縮を行った。
【０２２８】
骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の生成
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨および脛骨から骨髄（ＢＭ）細胞を抽出し、組織培養フラスコ中３７℃で、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、１％ピルビン酸ナトリウム１００ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ＭＥＭ  ＮＥＡＡ  １００ｘ（Ｇｉｂｃｏ）、０．５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０００Ｕ／ｍｌ樹状細胞（ＤＣ）分化因子、顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＲＰＭＩ  １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。６日目に、２ｘ１０６ＤＣ／ｍｌをＭＯＧ３５−５５ペプチド（１５μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３時間プレインキュベートし、次いで９６ウェルプレート中、総量２００μｌの培地でＴ細胞と共培養した。
【０２２９】
インビトロＴｒｅｇ抑制アッセイ
インビトロ  Ｔｒｅｇ抑制試験のために、ＣＴＶ標識（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ナイーブＣＤ４＋２Ｄ２トランスジェニック（Ｔｈｙ１．１＋）Ｔ細胞（３ｘ１０４細胞／ウェル）を、サプレッサーとレスポンダー２Ｄ２  Ｔ細胞の異なる比率（１：１、２：１、４：１、８：１）で繰り返しｍＲＮＡ免疫したマウスの、単離およびＣＦＳＥ標識（５μＭ）したＣＤ４＋２Ｄ２−Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰトランスジェニック細胞と共培養した。２Ｄ２−Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰマウスに、非免疫原性および免疫原性のＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ、ならびに非免疫原性の無関係なｍＲＮＡおよび生理食塩水を０日目、３日目、６日目および９日目に後眼窩神経叢に静脈内注射した。ＣＴＶ標識レスポンダー２Ｄ２  Ｔ細胞の増殖を、ＭＯＧ３５−５５ペプチド負荷ＢＭＤＣ（最終濃度１５μｇ／ｍｌ  ＭＯＧ３５−５５ペプチド）による再刺激の７２時間後にフローサイトメトリで分析した。
【０２３０】
養子Ｔ細胞移入およびインビボ増殖アッセイ
増殖試験のために、濃縮ＣＤ４＋２Ｄ２トランスジェニック（Ｔｈｙ１．１＋）Ｔ細胞を製造元の指示に従ってＣＴＶ標識（ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）し、計数し、７ｘ１０６細胞をＰＢＳ  ２００μｌ中で麻酔下のナイーブＣ５７ＢＬ／６（Ｔｈｙ１．２＋）レシピエントマウスの後眼窩神経叢に静脈内注射した。翌日、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＭＯＧ３５−５５エピトープをコードする非免疫原性ｍＲＮＡ  １０、２０または４０μｇで免疫した。対照マウスには、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水を投与した。Ｔ細胞移入の４日後、マウスを犠死させ、細胞の増殖をフローサイトメトリによって分析した。
【０２３１】
ＥＡＥマウスの７日目および１０日目のｍＲＮＡ処置の成功後の脾臓、脳および脊髄におけるＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５特異的Ｔ細胞の絶対細胞数の決定、ならびにこれらの細胞の表現型分析のために、ＣＤ４＋２Ｄ２トランスジェニック（Ｔｈｙ１．１＋）Ｔ細胞を、ＭＡＣＳによってＣＤ４細胞を濃縮したＴｈｙ１．１＋２Ｄ２  ＴＣＲ  ＭＯＧトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスから単離し、ＰＢＳ  ２００μｌ中の７〜１０ｘ１０６細胞を、酸素−イソフルラン気化器（２．５％イソフルラン／酸素）を使用した麻酔下のナイーブＣ５７ＢＬ／６（Ｔｈｙ１．２＋）レシピエントマウスの後眼窩神経叢に静脈内注射した。翌日、ＥＡＥをＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて積極的に誘導した。
【０２３２】
ＥＬＩＳＡ
マウスＩＦＮ−αの検出を、製造元の指示に従って標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、マウス血清でのＲＮＡ免疫の６時間後にＥＬＩＳＡ（ＰＢＬ）によって実施した。
【０２３３】
ｍＲＮＡで繰り返し処置したマウスの再刺激脾細胞の細胞培養上清中に存在するＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ９／Ｔｈ１７／Ｔｈ２２およびＴｒｅｇサイトカインを、１７プレックスマウスＥＬＩＳＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化した。マウスから単離した脾細胞（５ｘ１０５細胞）の単一細胞懸濁液を０、５、１０、２０または１００μｇ／ｍｌのＭＯＧ３５−５５ペプチドで７２時間刺激し、上清のサイトカイン含量を分析した。
【０２３４】
ＩＦＮγ酵素結合免疫スポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ）
ＭＯＧ３５−５５応答性Ｔ細胞の頻度をインターフェロンγ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳｐｏｔで調べた。マウスを０、３、７および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡまたは生理食塩水で処置した。最初の処置後１３日目に、異なる処置群の脾臓を単離し、単一細胞懸濁液を調製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズを使用してＭＡＣＳによって精製した。ＥＬＩＳｐｏｔキットを使用して、ＭＯＧ３５−５５ペプチドでの再刺激後にＩＦＮγ応答性の抗原特異的Ｔ細胞の定量化を実施した。９６ウェルＥＬＩＳｐｏｔプレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＨＴＳ  ＩＰ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｔｅ、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＩＦＮγ特異的捕捉抗体（抗マウスＩＦＮγ抗体、Ｍａｂｔｅｃｈ）で一晩被覆した。完全培地でブロッキングした後、プレートを洗浄し、５ｘ１０５ＣＤ４＋Ｔ細胞を１ｘ１０５ＭＯＧ３５−５５ペプチド負荷ＢＭＤＣ（ペプチド濃度１５μｇ／ｍｌ）と共にプレートした。対照として、ＣＤ４＋Ｔ細胞を無関係なペプチド負荷ＢＭＤＣと共にインキュベートした。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿インキュベータで１６時間培養した。細胞を洗浄し、ビオチン化抗ＩＦＮγ検出抗体（抗マウスＩＦＮγビオチン化抗体、Ｍａｂｔｅｃｈ）と共に３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。この二次抗体を、ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって視覚化し、１時間のインキュベーション後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ液体基質（Ｓｉｇｍａ）を添加し、水道水を流しながらプレートをすすぐことによって１〜３分後に反応を停止させた。ＥＬＩＳｐｏｔ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｓ６  Ｍａｃｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒ；ＣＴＬ）でスポットの定量化を行った。
【０２３５】
ＥＡＥの誘導およびｍＲＮＡによるマウスの処置
ＥＡＥを、８〜１０週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、１０ｍｇ／ｍｌの熱不活性化ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加したＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に乳化したＭＯＧ３５−５５ペプチド（アミノ酸配列：ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ）５０μｇを尾の基部に皮下（ｓ．ｃ．）注射して積極的に誘導した。免疫の日および２日後に、マウスに百日咳毒素（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）１５０ｎｇを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。マウスの体重を測定し、次の基準に従って、免疫後１０日目から開始して毎日採点した：０、疾患なし；１、尾の緊張の低下；２、立ち直り反射の障害；３、部分的な後肢麻痺；４、完全な後肢麻痺；５、部分的な前肢麻痺を伴う後肢麻痺；および６、瀕死または死亡。
【０２３６】
さらに、雌性ＳＪＬ／ＪＲｊマウス（８−１０週齢）において、１０ｍｇ／ｍｌの熱不活性化ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＡを添加したＣＦＡに乳化したＰＬＰ１３９−１５１ペプチド（アミノ酸配列：ＨＳＬＧＫＷＬＧＨＰＤＫＦ）２００μｇを尾の基部に皮下注射してＥＡＥを積極的に誘導した。免疫の日および２日後に、マウスにＰＴＸ  ２００ｎｇを腹腔内投与した。マウスの体重を測定し、既に述べた採点基準に従って、免疫後８日目から開始して毎日採点した。
【０２３７】
複雑なＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６およびＳＪＬ／ＪＲｊの雌性Ｆ１ハイブリッドマウス（８〜１０週齢）においてペプチド混合物（ＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１（アミノ酸配列：ＮＴＷＴＴＣＱＳＩＡＦＰＳＫ）、ＭＢＰ８４−１０４（アミノ酸配列：ＶＨＦＦＫＮＩＶＴＰＲＴＰＰＰＳＱＧＫＧＲ）、ＭＯＢＰ１５−３６（アミノ酸配列：ＱＫＦＳＥＨＦＳＩＨＣＣＰＰＦＴＦＬＮＳＫＲ））２５０μｇで積極的に誘導した。各ペプチドのうち５０μｇを使用した。ペプチド混合物を、１０ｍｇ／ｍｌの熱不活性化ヒト型結核菌Ｈ３７ＲＡを添加したＣＦＡに乳化し、尾の基部に皮下注射した。免疫の日および２日後に、マウスにＰＴＸ  ２００ｎｇを腹腔内投与した。マウスの体重を測定し、既に述べた採点基準に従って、免疫後８日目から開始して毎日採点した。
【０２３８】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける防御免疫を測定するために、疾患誘導後７日目および１０日目に、または１〜２のＥＡＥスコア時に、マウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水で処置した。
【０２３９】
ＳＪＬマウスにおける再発寛解型ＥＡＥの治療的処置を、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週に２回、非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１  ｍＲＮＡ  ２０μｇを用いて行った。対照マウスには、非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇを投与した。
【０２４０】
非免疫原性単一エピトープｍＲＮＡ処置と非免疫原性マルチエピトープ処置を比較する実験では、複雑なＥＡＥマウスを、非免疫原性マルチエピトープコードｍＲＮＡ  ４０μｇ（各非免疫原性エピトープコードｍＲＮＡ（ＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１、ＭＢＰ８４−１０４）１０μｇを使用した）、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２０μｇまたは非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡ  ２０μｇで処置した。ｍＲＮＡを、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始して週２回注射した。
【０２４１】
サイトカインをコードするｍＲＮＡと抗原特異的ｍＲＮＡ処置の組み合わせ効果を試験するために、ＥＡＥ誘導後７日目および１０日目に非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡ  ５μｇを非免疫原性ｍＩＬ−１０またはｍＩＬ−２７をコードするｍＲＮＡ  １５μｇと共に注射した。対照マウスには、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇを非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  １５μｇ、非免疫原性のサイトカインコードｍＲＮＡ  １５μｇ、または非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇと共に投与した。
【０２４２】
すべての実験について、ｍＲＮＡを、酸素−イソフルラン気化器（２．５％イソフルラン／酸素）を使用した麻酔下で後眼窩神経叢に静脈内注射した。
【０２４３】
抗体処置
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、ＥＡＥ誘導後７、１０、１４および１７日目に、ＰＤ−１（最初の処置５００μｇ、その後の処置２５０μｇ、クローンＲＭＰ１−１４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）またはＣＴＬＡ−４（最初の処置５００μｇ、その後の処置２５０μｇ、クローン９Ｈ１０、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）ブロッキング抗体またはアイソタイプが一致する対照抗体（ラットＩｇＧ２ａおよびゴールデンハムスターＩｇＧ、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）で処置した。抗体をＰＢＳで希釈し、腹腔内に適用した。
【０２４４】
脾臓、ＬＮおよびＣＮＳ浸潤物の単離
すべての細胞ベースの分析は、脾臓、リンパ節およびＣＮＳ器官の単一細胞懸濁液で実施した。簡単に説明すると、脾臓およびＬＮを１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＤおよび０．１ｍｇ／ｍｌ  ＤＮアーゼＩと共に１５分間インキュベートし、次いで、ＰＢＳで洗浄しながら７０μｍのセルストレーナに通した。脾細胞の単一細胞懸濁液で、赤血球溶解（低張溶解緩衝液：Ｈ２Ｏ  １ｌおよび０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ２００μｌに溶解したＫＨＣＯ３  １ｇおよびＮＨ４Ｃｌ  ８．２５ｇ）を実施した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、Ｖｉ−Ｃｅｌｌセルカウンタ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で細胞を計数した。
【０２４５】
脳および脊髄からＣＮＳ浸潤物を単離するために、マウスをケタミン−ロンプンで麻酔し、０．９％ＮａＣｌを使用して左心室を灌流した。脳と脊髄を手操作で除去し、小片に切断し、コラゲナーゼＤ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＤＮアーゼＩ（０．１ｍｇ／ｍｌ）を含むＰＢＳ＋＋（カルシウムとマグネシウムを含むＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃で２０分間消化した。次に、消化した組織を、手操作で組織片をシリンジに吸い上げ、再び１５ｍｌのファルコンチューブの壁に押し付けてホモジナイズした。これを、断片が見えなくなるまで最大１０回実施した。単一細胞懸濁液を７０％パーコールに再懸濁し、３０：３７のパーコール勾配下で層にした。最終的なパーコール勾配は３０：３７：７０％であり、室温で４０分間、３００ｇで遠心分離した。さらなる分析の前に、７０％と３７％パーコールの相間にある単核細胞層を２％ＦＣＳ／ＰＢＳで洗浄した。
【０２４６】
統計分析
統計的有意性は、２つより多い群を比較する場合、テューキーの比較検定係数で補正した一方向ＡＮＯＶＡを用いるＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７ソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を使用して評価した。単一マウスの疾患発症曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することによってＥＡＥ発症曲線を比較した。ｐ≦０．０５の値を統計的に有意であると見なした；＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１、＊＊＊＊ｐ≦０．０００１。使用した検定は、それぞれの図の凡例で言及している。
【０２４７】
（実施例２）
脾細胞の活性化に関する非免疫原性ｍＲＮＡの検査
脾細胞の活性化および使用した非免疫原性ｍＲＮＡの翻訳効率を分析するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、Ｆ１２リポソームと複合体化したルシフェラーゼ−ｍＲＮＡ（１０μｇ）を後眼窩神経叢に静脈内注射した。ルシフェラーゼ活性を、ＲＮＡ−ＬＰＸ注射の６、２４、４８、７２時間後のインビボイメージングによって評価し、代表的なマウスを図１Ｃに示す。非免疫原性ｍＲＮＡによるマウスの免疫化は、ＬＵＣ−ｍＲＮＡの持続的な高翻訳をもたらした。その結果、ｍＲＮＡ免疫後７２時間までＬＵＣタンパク質発現を検出することができた。
【０２４８】
さらに、図１Ａに見られるように、非免疫原性ｍＲＮＡによるマウスの免疫化は、未処置対照マウスにおけるようにＤＣ上の活性化マーカーＣＤ８６およびリンパ球上のＣＤ６９の上方調節をもたらさなかった。非免疫原性ＬＵＣ−ｍＲＮＡで免疫したマウスでは、ｍＲＮＡ免疫の６時間後にＩＦＮαも血液中で検出することができなかった（図１Ｂ）。
【０２４９】
（実施例３）
非免疫原性ｍＲＮＡの特性付け
非免疫原性ｍＲＮＡを使用して、治療用途で特定の疾患関連抗原を樹状細胞に送達し、免疫活性化を伴わずに抗原提示を保証する。１−メチルプソイドウリジンのｍＲＮＡへの組み込みは、細胞内のタンパク質発現を高め、哺乳動物細胞株およびマウスのインビボでのｍＲＮＡの免疫原性を低下させることが示されている（Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ．２１７，３３７−３４４）。この作用は、エンドソームのＴｏｌｌ様受容体および下流の自然免疫シグナル伝達の活性化を回避するｍＲＮＡの能力の増加に依存する可能性が最も高い（Ａｎｄｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。インビトロ転写中のｍＲＮＡへの組み込みにヌクレオシドウリジンの代わりに１−メチルプソイドウリジンを使用することに加えて、合成ｍＲＮＡのＨＰＬＣ精製は、免疫活性化をさらに排除し、ヌクレオシド修飾されたタンパク質コードｍＲＮＡの翻訳を改善する（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３９，ｅ１４２）。ＨＰＬＣ精製によって、ｍＲＮＡのインビトロ転写後に残存する二本鎖ｍＲＮＡ混入物が除去され、インターフェロンシグナル伝達および炎症性サイトカインを誘導しないｍＲＮＡが生じる（Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ヌクレオシド精製されたｍＲＮＡを精製する別の方法は、セルロース精製である（ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０５９０５６）。
【０２５０】
治療用途に使用されるｍＲＮＡが本当に非免疫原性であるかどうかを調べるために、バイオアナライザおよびドットブロット分析を行って、ｍＲＮＡの完全性と純度を確認した。図２は、セルロース処理またはＨＰＬＣ精製のいずれかによって精製した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡのドットブロット分析を示す。ｄｓＲＮＡに特異的なＪ２抗体は、分析したＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡのセルロースまたはＨＰＬＣ精製後、使用したｍＲＮＡの４０ｎｇ〜１μｇの範囲でシグナルを示さなかった。この品質管理は、両方のｍＲＮＡバッチについて非免疫原性ｍＲＮＡ特性を保証し、ＥＡＥ治療において有益な治療効果を達成することができる。ＥＡＥを、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて積極的に誘導し、疾患誘導後７日目および１０日目に、セルロースまたはＨＰＬＣ法のいずれかで精製した抗原特異的ＭＯＧ３５−５５をコードする非免疫原性ｍＲＮＡでマウスを処置した。両方の群は、ＥＡＥ誘導に対して完全に耐性であった（図３）。非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによる治療的ワクチン接種についてのより詳細な説明を以下の実施例で述べる。
【０２５１】
（実施例４）
抗原特異的Ｔ細胞の増殖に対する非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡの免疫の効果
非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ−ＬＰＸの免疫がＤＣによるＴ細胞へのＭＯＧ３５−５５抗原の提示をもたらすかどうかを検討するために、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）特異的Ｔ細胞受容体を保有する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋２Ｄ２  Ｔ細胞）の増殖を調べた。Ｃｅｌｌ−Ｔｒａｃｅ−Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）標識Ｔｈｙ１．１＋ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋２Ｄ２  Ｔ細胞をＴｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移入した。２４時間後、レシピエントマウスを異なる濃度（１０、２０または４０μｇのｍＲＮＡ）のＭＯＧ３５−５５エピトープをコードする非免疫原性ｍＲＮＡで免疫し、さらに４日後にＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋２Ｄ２  Ｔ細胞の増殖を分析した。対照マウスには、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水を投与した。２Ｄ２  Ｔ細胞は、対照マウスと比較して非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡでマウスを処置した場合に増殖し（図４）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）が抗原をコードする非免疫原性ｍＲＮＡを正しく翻訳し、プロセシングして、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを提示することを示した。さらに、用量を１０μｇから４０μｇに増加した非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡによるマウスの免疫化は、抗原特異的Ｔ細胞集団の増加も示した。
【０２５２】
（実施例５）
抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡによる免疫化は、ナイーブマウスにおいて制御性Ｔ細胞の発生を誘導する
Ｔｒｅｇは、様々な免疫応答を制御するうえでの基礎であり、寛容の誘導と維持に重要である。動物モデルでの前臨床試験は、Ｔｒｅｇの養子移入が、自己抗原に対する免疫寛容を回復することによって、自己免疫疾患を含むいくつかのＴ細胞媒介疾患を予防または治療できることを示している。いくつかのＣＤ４＋制御性Ｔ細胞が記述されており（Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，２００６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５，１９５−２０１）、２つの主要なサブグループ：天然Ｔｒｅｇおよび様々な寛容原性条件下で末梢において生成される誘導性Ｔｒｅｇに分類されている。Ｔｒｅｇ細胞は、自己反応性Ｔ細胞の拡大と分化を制限することによってそのプライミングを制御する（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ  １３３，７７５−８７）。
【０２５３】
対応するＴ細胞表現型に対する抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡによる免疫の効果をさらに調べるために、２Ｄ２−Ｆｏｘｐ３−ｅＧＦＰ融合タンパク質をＴｈ１．１陽性マウスのＴ細胞にトランスフェクトした。これらのマウスを非免疫原性および免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ、ならびに非免疫原性の無関係なｍＲＮＡまたは生理食塩水で繰り返し免疫した（０日目、３日目、６日目および９日目）。非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡによるマウスの免疫化は、最後のｍＲＮＡ処置の４日後（１３日目）に分析すると、マウスにおいてＦｏｘｐ３＋細胞の発生をもたらした。免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡまたは無関係な非免疫原性ｍＲＮＡで処置したマウスは、Ｆｏｘｐ３細胞集団の増加を示さず、生理食塩水で処置した対照マウスと同様のＦｏｘｐ３陽性細胞の頻度を有していた（図５ＡおよびＢ）。
【０２５４】
誘導されたＦｏｘｐ３＋細胞が抑制的に作用するかどうかをインビトロ抑制アッセイによって評価した（図５Ｃ）。そのため、免疫マウスの全ＣＤ４＋細胞をＣＦＳＥで標識し、ＣＴＶでさらに標識したナイーブＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋２Ｄ２  Ｔ細胞と共に異なるサプレッサー対レスポンダー比で７２時間共培養した。重要な点として、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡで免疫したマウスからの誘導された制御性細胞は、ＭＯＧ３５−５５ペプチド負荷ＢＭＤＣの存在下で２Ｄ２エフェクターＴ細胞増殖の用量依存的抑制を媒介した。対照的に、他のすべての群は抑制作用を及ぼさなかった。
【０２５５】
合わせると、これらの結果は、非炎症性条件下でのＡＰＣ特異的抗原提示が機能的制御性Ｔ細胞の発生を媒介したことを示す。
【０２５６】
（実施例６）
疾患モデルＥＡＥにおける非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡによる治療的ワクチン接種の影響
疾患モデルにおける抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡによるｍＲＮＡ免疫の寛容原性作用を解明するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＥＡＥを積極的に誘導し、疾患誘導後７日目および１０日目にマウスを抗原特異的ＭＯＧ３５−５５コード非免疫原性ｍＲＮＡ、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡで処置した。処置は、強力なＤＣ活性化および成熟シグナルならびに最初のＴ細胞プライミングが既に起こった時点で開始した。非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによるＲＮＡ免疫はＥＡＥの徴候を完全にブロックし（図６）、６匹のｍＲＮＡ免疫マウスのうち１匹も疾患を発症しなかった。
【０２５７】
同時に、無関係なエピトープをコードする非免疫原性ｍＲＮＡによるマウスの処置は、マウスを疾患から保護せず、６匹のマウスのうち５匹がＥＡＥを発症した（図６）。これらの所見は、未成熟ＤＣによるＭＯＧ提示がＥＡＥを下方調節することができ、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡで処置した動物のみがＥＡＥ誘導に完全に耐性であることを示す。
【０２５８】
さらに、疾患の症状が目に見え、マウスが１〜２の疾患スコアに達した、疾患進行のより後の時点でＥＡＥを治療することができるかどうかを調べた。意外にも、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡによるＲＮＡ免疫後、スコア１で処置した場合、ＥＡＥマウスは重度のＥＡＥを発症せず、症状を軽減できることが示された（図７）。マウスをスコア２で処置した場合でも、急速な疾患進行を止めることができた。マウスは２〜３の最大疾患スコアを示しただけであったが、未処置対照マウスのほぼすべてが最大スコア４の完全なＥＡＥを発症した。非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置したＥＡＥマウスと比較して、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡでの治療的処置は、疾患の進行に有益な作用を及ぼさず、動物は未処置対照マウスと同様のＥＡＥを発症した。
【０２５９】
ｍＲＮＡ処置が誘導する寛容の分子機構を検討し、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによるｍＲＮＡ免疫およびそれによるＤＣによるＭＯＧ３５−５５の提示がエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）に直接影響するかどうかを確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて再びＥＡＥを誘導し、疾患誘導後７日目と１０日目および最後のｍＲＮＡ処置の６日後に、動物を非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置し、脾臓、ＬＮ、脳および脊髄を単離した。様々な器官からの細胞を、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いて６時間、インビトロで再活性化し、次いでＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）Ｔｅｆｆ細胞でゲートした。ＣＤ４０Ｌは、活性化後にＴ細胞上で迅速に発現されるため、ＭＯＧ特異的Ｔｅｆｆ細胞のマーカーとして使用した。図８に見られるように、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡの投与は、脳および脊髄において非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡで処置した群の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の有意な減少をもたらす。機能レベルでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、未処置対照マウスと比較して非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置したマウスでは、脳におけるインターフェロンγ（ＩＦＮγ）および脊髄におけるインターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）の分泌が有意に少ないことが示された（図９）。これらのデータは、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡによるｍＲＮＡ処置が記憶Ｔ細胞およびＴｅｆｆ細胞を不活性化することができ、これらの細胞の減少をもたらすことを示す。
【０２６０】
（実施例７）
ＥＡＥの治療効率に対するｍＲＮＡ純度の影響
ウリジンを含む免疫原性ｍＲＮＡ（Ｕ）と、１−メチルプソイドウリジンを含み、セルロース精製で精製した非免疫原性ｍＲＮＡ（ｍ１Ｙ）との組み合わせによる実験は、脾細胞の活性化（ＤＣ上の活性化マーカーＣＤ８６およびリンパ球上のＣＤ６９の上方調節によって検査した）ならびにＩＦＮα分泌が、使用された免疫原性ｍＲＮＡの量と相関することを明らかにした。非免疫原性ｍＲＮＡ（ｍ１Ｙ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２０μｇ）では活性化がほとんど達成されず、免疫原性ｍＲＮＡ（Ｕ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ）の添加によって活性化は着実に増加した（図１０）。Ｕ  ｍＲＮＡ  ５μｇ＋ｍ１Ｙ  ｍＲＮＡ  １５μｇは、Ｕ  ｍＲＮＡ  ２０μｇよりもわずかに低い活性化を示したが、ｍ１Ｙ  ｍＲＮＡ  ２０μｇはやはり免疫系を全く活性化しなかった。異なるｍＲＮＡ混合物の対応するドットブロット分析も、１００％の非免疫原性（ｍ１Ｙ）ｍＲＮＡのみがｄｓＲＮＡのシグナルを示さないことを明らかにした（図１１）。
【０２６１】
ＥＡＥの治療効果に対する使用したｍＲＮＡの純度の影響をさらに調べるために、同じｍＲＮＡ混合物を進行中のＥＡＥを治療するために使用した。再び、ＥＡＥをＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて積極的に誘導し、疾患誘導後７日目および１０日目にマウスを抗原特異的ｍＲＮＡで処置した。この実験では、非免疫原性および免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡの同じｍＲＮＡ混合物を、先の「活性化」実験と同じように使用した。１００％非免疫原性（ｍ１Ｙ）ｍＲＮＡとは異なり、非免疫原性ｍＲＮＡと免疫原性ｍＲＮＡの混合物（Ｕ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２．５μｇ＋ｍ１Ｙ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  １７．５μｇおよびＵ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ５μｇ＋ｍ１Ｙ  ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  １５μｇ）は疾患発症を完全には予防することができず、一部のマウスは１００％免疫原性ｍＲＮＡで処置したマウスと同様の疾患を発症し始める（図１２）。これらの結果は、ＥＡＥの効果的な治療のためには、純粋な非免疫原性（ｍ１Ｙ）ｍＲＮＡが必要であることを示す。
【０２６２】
ＨＰＬＣによって精製したまたは精製しなかった未修飾および修飾ｍＲＮＡの脾細胞活性化に関するさらなる比較を行った。図１３に示すように、プソイドウリジン（ｐＵ）などのヌクレオシド修飾のみでは、免疫系によるｍＲＮＡの認識の喪失を誘導しないが、精製工程が違いを生じさせる。非精製ｐＵ−ｍＲＮＡは依然として免疫原性であり、脾細胞の活性化（ＤＣ上のＣＤ８６の強力な上方調節、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上のＣＤ６９の上方調節）ならびにＩＦＮα分泌に関して通常のｍＲＮＡ（Ｕ−ｍＲＮＡ）のように機能する。対照的に、ｄｓＲＮＡ（ｐＵ−ＨＰＬＣ  ｍＲＮＡ）を除去するためにＨＰＬＣでさらに精製したｐＵ−ｍＲＮＡは、未処置対照マウスと同様にＤＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性化ならびにその結果としてＩＦＮαの分泌を防ぐ。これらの結果は、ウリジン修飾とＩＶＴ  ｍＲＮＡのさらなる精製の組み合わせのみが、ナイーブマウスで観察されたように、ｍＲＮＡの免疫原性をゼロに、すなわち寛容が誘導され得るレベルに最小化することを強調する。したがって、非免疫原性ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ精製と組み合わせたウリジン修飾）は、寛容誘導の目的のために最適なｍＲＮＡである。
【０２６３】
（実施例８）
非免疫原性ＭＯＧ３５−５５特異的ｍＲＮＡによる処置は、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の新規プライミングを誘導しないが、ナイーブマウスにおけるアネルギーＴ細胞の拡大をもたらす
末梢性寛容の維持と誘導は、表面上にＣＤ８６またはＣＤ４０のような低レベルの共刺激分子を発現するＡＰＣによる自己抗原の提示に依存する。非免疫原性ｍＲＮＡによる処置の際に、ＡＰＣによる共刺激分子の発現およびサイトカイン産生がないことが実施例２、図１に示されている。その結果、ｍＲＮＡ処置時に、ＡＰＣは、活性化刺激の非存在下で非免疫原性ｍＲＮＡによってコードされるエピトープをプロセシングして提示する。共刺激シグナルの非存在下でのＴＣＲの関与は、エフェクターＴ細胞の拡大をもたらさず、むしろアポトーシスまたはＴ細胞アネルギーを生じさせる（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１，２１−７）。対照的に、エフェクターＴ細胞のプライミング中、ＤＣは特定のサイトカインを放出し、これは、抗原提示および共刺激分子の発現と共に、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１、Ｔｈ２またはＴｈ１７細胞への分化を促進することによってエフェクター免疫応答を分極する。実際に、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ処置時のエフェクターＴ細胞の生成は、より多くのエフェクターＴ細胞が治療的処置ではなく疾患のより重度の経過につながる可能性さえあるので、自己免疫疾患では意図されない。
【０２６４】
抗原に対するＴ細胞応答の生成を調べるため、ナイーブＣ５７ＢＬ／６マウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水で繰り返し処置した（０、３、７、および１０日目）。４回のｍＲＮＡ免疫後、１３日目に脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔを実施した。図１４Ａは、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５をコードするｍＲＮＡで処置したマウスが、抗原特異的ｍＲＮＡ処置時に抗原認識に応答するＩＦＮγ＋ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞を発生しなかったことを示す。
【０２６５】
これらの結果によれば、様々な濃度のＭＯＧ３５−５５ペプチド（０、５、１０、２０、１００μｇ）による４８時間の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞の再刺激も、ＥＬＩＳＡによって上清で測定した場合、ＴＮＦαおよびＧＭ−ＣＳＦなどの他の炎症性サイトカインの分泌を生じさせなかった（図１４Ｂ）。抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の分泌のみが、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡで処置したマウスで検出されたが、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ処置マウスでは検出されなかった（図１４Ｃ）。さらに、この群においてのみ、ＩＬ−４およびＩＬ−５のようなＴｈ２サイトカインの分泌を検出することができた（データは示していない）。非免疫原性の抗原特異的ｍＲＮＡに応答したＩＬ−１０の産生は、抗原特異的制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）が処置に応答して活性化されることの証拠を提供する。Ｔｒｅｇは、様々な免疫応答を制御するうえで重要である。誘導性Ｔｒｅｇの多くの異なるサブセットが報告されており、特にＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋およびＴｒ１細胞は高レベルのＩＬ−１０の産生を特徴とする。これらの制御性Ｔ細胞は、自己反応性Ｔ細胞の拡大と分化を制限することによってそのプライミングを制御する。
【０２６６】
非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ処置後のＣＤ４表現型を調べるために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０、３、７および１０日目に非免疫原性抗原特異的ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水で繰り返し免疫した。非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置したマウスからのＣＤ４＋ＭＯＧ３５−５５テトラマー＋細胞上のＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ−３、ＰＤ−１およびＬａｇ−３の発現を、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ処置マウスおよび未処置対照マウスの全ＣＤ４＋細胞と比較した。非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによる反復免疫は、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡで処置したマウスと比較してＴＩＧＩＴ、Ｔｉｍ−３、ＰＤ−１およびＬａｇ−３の上方調節をもたらす（図１５）。
【０２６７】
これらのマーカーの上方調節は、アネルギーＴ細胞の表現型と相関する。アネルギーは、機能的不応答性の獲得状態であり、ＣＤ２８を介した共刺激を伴わないＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の関与の結果である（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４，５４０９−１３；Ｑｕｉｌｌ，Ｈ．＆  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｒ．Ｈ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８，３７０４−３７１２；Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，１６−２２）。さらに、それは末梢性寛容を与える１つの手段を構成する。アネルギーＴ細胞は機能的に不活性であり、完全な共刺激の存在下で抗原に遭遇した場合でも、生産的な免疫応答を開始することはできない。明確な表現型および遺伝子発現プログラムを備えたアネルギーＣＤ４＋Ｔ細胞は、制御性Ｔ細胞に変換することもでき、これが次に、病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞のアネルギーを促進し、自己免疫を抑制することができる（Ｋａｌｅｋａｒ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，３０４−１４）。Ｌａｇ−３、Ｔｉｍ−３、ＩＣＯＳおよびＴＩＧＩＴはエフェクターＴ細胞に対する共抑制機能を媒介し、これらの分子の過剰発現はＴ細胞の枯渇に関連する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４４，９８９−１００４）。Ｔ細胞の表面上の複数の共抑制性受容体の蓄積は、機能障害の増加にさえも関連する（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，２９−３７）。ＴＩＧＩＴ自体は、Ｔ細胞の増殖を直接下方調節するだけでなく、ＤＣの成熟を防ぎ、ＩＬ−１２分泌を低下させ、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生を誘導することによって、共抑制分子として作用する（Ｙｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０，４８−５７；Ｊｏｌｌｅｒ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８６，１３３８−１３４２）。Ｌａｇ−３は、Ｔ細胞の恒常性とエフェクターＴ細胞の応答の調節において役割を果たす（Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９，５３９２−５３９５；Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｃ．Ｊ．＆Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．Ａ．，２００３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３３，９７０−９７９；Ｗｏｒｋｍａｎ，Ｃ．Ｊ．＆Ｖｉｇｎａｌｉ，Ｄ．Ａ．Ａ．，２００５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４，６８８−６９５）。
【０２６８】
さらに、プログラム死１受容体（ＰＤ−１）および細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）のような免疫チェックポイント分子は、免疫応答の負の調節に関与し、結果として末梢性自己寛容の維持に関与する共抑制分子である。共抑制分子は一般に、Ｔ細胞の活性化時に上方調節され、フィードバック抑制によってエフェクター応答を抑制する。ＰＤ−１およびそのリガンド、例えばＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞の活性化と寛容のバランスを調節する抑制シグナルを伝達する（Ｋｅｉｒ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６，６７７−７０４）。自己抗原に対する免疫応答は、寛容を維持するために特定のバランスの取れた応答を必要とし、これは、様々な共抑制性受容体およびそのリガンドによって媒介される。ＰＤ−１エフェクターの上方調節によって、Ｔ細胞応答は遮断され、次に組織が免疫細胞を介した損傷から保護される。
【０２６９】
これらの共抑制性受容体はすべて、自己免疫疾患の調節において中心的な役割を果たしており、これらの分子のいくつかの欠損でさえも自己免疫につながる。
【０２７０】
（実施例９）
疾患モデルＥＡＥにおける非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ処置時のＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のより詳細な特性付け
実施例６、図８および９に示す結果によれば、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の養子細胞移入実験も同じ結果を示した。２Ｄ２  ＴＣＲトランスジェニックマウスのＭＯＧ３５−５５特異的Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈｙ１．２＋Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移入し、２４時間後にレシピエントマウスにおいてＥＡＥを誘導した。疾患誘導後７日目および１０日目に、マウスを非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水で処置した。最後のｍＲＮＡ処置の６日後に、脳と脊髄を単離した。これらの組織からの細胞を、ＭＯＧ３５−５５ペプチドを用いてインビトロで６時間再活性化し、Ｔｈｙ１．１＋ＣＤ４＋Ｔ細胞でゲートした。図１６に示すように、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡの投与は、脳および脊髄におけるＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の有意の減少をもたらした。機能レベルでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、対照マウスと比較して非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置したマウスの脳および脊髄では、ＩＦＮγおよびインターロイキン１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）の分泌が有意に少ない（図１７）。これらのデータは、再び、非免疫原性ＭＯＧ３５−５５  ｍＲＮＡによるｍＲＮＡ処置がＴｅｆｆ細胞を不活性化することができ、脳および脊髄へのこれらの細胞の浸潤の減少をもたらすことを示す。
【０２７１】
処置の成功後の抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞の表現型を調べるために、ＥＡＥを積極的に誘導し、疾患誘導後７日目および１０日目に、動物を非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇ、非免疫原性の無関係なｍＲＮＡ  ２０μｇまたは生理食塩水で処置した。疾患のピーク時（疾患誘導後１６日目）に、脾臓のＣＤ４  Ｔ細胞表現型をＭＯＧ３５−５５テトラマー染色によって調べた。実施例５および８に示した実験によれば、ＥＡＥ疾患設定においても、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによって誘導される抗原特異的寛容は、脾臓のＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞上の共抑制分子Ｌａｇ−３、ＩＣＯＳ、ＴＩＧＩＴおよびＴｉｍ−３の上方調節によって媒介される（図１８Ａ）。アネルギーおよび負の共刺激のような免疫寛容を媒介する細胞内因性機構に加えて、細胞外因性（Ｔｒｅｇ細胞媒介寛容）機構も非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡの治療効果を媒介することができる。既に論じたように、Ｔｒｅｇは抗原特異的寛容において重要な役割を果たす（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６１，７２−８７）。さらに、ＭＯＧ３５−５５特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析は、Ｔｒｅｇ集団の有意な拡大を示した（図１８Ｂ）。加えて、抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡで処置したマウスの脾臓のＴｒｅｇは高レベルのＣＤ６９を発現し、非常に活性化されていることを示す。
【０２７２】
負の共刺激分子の発現が寛容の誘導と維持に必要であるかどうかを判定するために、ＥＡＥのｍＲＮＡ治療中にＰＤ−１またはＣＴＬＡ−４をブロックした。抗ＰＤ−１または抗ＣＴＬＡ−４抗体と組み合わせた非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡによる疾患誘導後７日目および１０日目のＥＡＥの治療は、ＩｇＧ対照と組み合わせた非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡで処置したマウスと比較してＥＡＥからの保護の逆転をもたらした（図１９）。これは、ｍＲＮＡ治療と並行したＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４の抗体遮断が、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ処置によって媒介される寛容誘導の有効性の著しい低下をもたらしたので、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４が非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによって誘導される抗原特異的寛容の長期的な維持に重要であることを明らかにする。
【０２７３】
合わせると、示した実験は、抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡでの処置による抗原特異的寛容誘導のこの新しい治療アプローチの作用機序を検討した。結果は、抗原特異的非免疫原性ｍＲＮＡ処置が、自己免疫における有害な免疫応答を変化させて保護を与える有効な方法であることを示す。ナイーブマウスおよび疾患に罹患したマウスで示した実験は、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡによる処置が末梢の寛容を媒介するアネルギーおよび制御性Ｔ細胞の誘導をもたらし、進行中の自己免疫疾患の治療の成功につながることを明らかにする。治療効果は、各実施例で論じた文献に記載されているように、寛容誘導のための既に十分に説明された機構に依存することが示された。これらの機構は、自己免疫疾患の種類に依存しない寛容誘導のために重要で基本的なものである。したがって、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ治療によって媒介される寛容の機構は、他の任意の種類の自己免疫疾患に移行することができる。
【０２７４】
（実施例１０）
非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡでの処置による抗原特異的寛容誘導はＥＡＥ疾患モデルとは無関係である
前述のすべてのＥＡＥ実験は、単相型の疾患進行をもたらすＭＯＧ３５−５５ペプチドで誘導したＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて実施した。ＥＡＥの別のモデルは、ＳＪＬマウスにおいて再発寛解型の疾患経過を導く、異なる関連エピトープ（ＰＬＰ１３９−１５１）に起因する再発性疾患を特徴とする。より臨床的に関連のある疾患設定での寛容誘導を実証するためにこのモデルを採用した。図２０Ａは、再発寛解型疾患モデルにおける非免疫原性ＰＬＰ１３９−１５１コードｍＲＮＡによるＥＡＥ誘導後７日目および１０日目から開始した週２回のｍＲＮＡ処置が、これらのマウスが非免疫原性の無関係な対照ｍＲＮＡで処置したマウスよりもはるかに弱い疾患進行を示したため、ＥＡＥ発症にプラスの作用を及ぼすことを示す。
【０２７５】
ＭＳの状況をさらにより良くシミュレートするために、複数の病原性自己反応性Ｔ細胞クローンに関連する複雑なＥＡＥを使用した。ＭＳの確定診断時には、「エピトープの広がり」のために、この疾患が既に複雑な抗ミエリン自己反応性と関連している可能性が高いので、マルチエピトープ治療アプローチの有効性を検討した。図２０Ｂに示すように、複雑なＥＡＥは、ＭＯＧ３５−５５、ＰＬＰ１３９−１５１、ＰＬＰ１７８−１９１およびＭＢＰ８４−１０４をコードする４つの異なる非免疫原性疾患エピトープコードｍＲＮＡの混合物によって成功裏に治療された。各非免疫原性疾患エピトープコードｍＲＮＡについて１０μｇを使用し、効率的な治療のために４０μｇを得た。非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ  ２０μｇについて示したように、単一エピトープ処置はいずれも同様の治療結果をもたらすことができなかった。
【０２７６】
これらの結果は、様々な実験で観察された抗原特異的寛容誘導が特定のエピトープに依存せず、様々な疾患関連エピトープによって媒介され得ることを示す。さらに、データは、複雑な病原性自己免疫過程を伴う複雑な進行中の疾患でさえも、複数の非免疫原性ミエリン特異的ｍＲＮＡ構築物の投与によって成功裏に治療できることを強調する。
【０２７７】
（実施例１１）
免疫調節性サイトカインの共送達は、非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ治療の寛容原性作用を改善する
ＩＬ−１０などのいくつかの免疫調節分子は、Ｔｒｅｇ機能を支持することができる。さらに、抗炎症性サイトカインＩＬ−１０は、寛容原性ＤＣを誘導し（Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｇｕｉｌａｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１０，８−１７；Ｔｏｒｒｅｓ−Ａｇｕｉｌａｒ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，１７６５−１７７５；Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ  Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９，４７７２−４７８０）、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン応答を抑制する（Ｇｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８，１８０７−１８１３；Ｇｕｏ，Ｂ．，２０１６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，１−１６）ことが公知である。また、ＩＬ−２７は抗炎症特性を有することが公知のサイトカインであり、ＥＡＥの試験において、このサイトカインが疾患の重症度を軽減することが示されている（Ｍａｓｃａｎｆｒｏｎｉ，Ｉ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４，１０５４−６３；Ｔｈｏｍ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８，１−１４）。ＥＡＥ実験のセットでは、非免疫原性ｍＲＮＡによってコードされるＩＬ−１０およびＩＬ−２７のような免疫調節性サイトカインと非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡの共送達を、免疫応答の調節および寛容誘導の効率の改善に関して検討すべきである。
【０２７８】
単一抗原特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置の寛容原性を高める免疫調節性サイトカインの共送達の能力を、ＥＡＥマウスの「治療量以下」の処置を使用して評価した。非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡ−ＬＰＸ処置は、以前の実験で堅固な寛容誘導を実証したため、治療への寄与を特定するために、追加の非免疫原性サイトカインコードｍＲＮＡ処置の組み合わせアプローチをＥＡＥモデルにおいて治療量以下の用量で検討した。
【０２７９】
疾患モデルでの非免疫原性抗原特異的ｍＲＮＡに対する非免疫原性サイトカインコードｍＲＮＡ処置の有益な作用を調べるために、ＥＡＥをＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて積極的に誘導し、マウスを疾患誘導後７日目と１０日目に非免疫原性抗原特異的ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ、非免疫原性ｍＩＬ−１０（図２１Ａ）またはｍＩＬ−２７（図２１Ｂ）コードｍＲＮＡと組み合わせた非免疫原性ＭＯＧ３５−５５コードｍＲＮＡ、非免疫原性サイトカインコードｍＲＮＡ単独、および非免疫原性の無関係なｍＲＮＡで処置した。
【０２８０】
図２１に示す結果は、非免疫原性ｍＲＮＡによってコードされる免疫調節性サイトカインの共送達が抗原特異的状況における寛容を増強することを示唆する。さらに、単一のサイトカインをコードするｍＲＮＡ処置は、対照マウスと比較してＥＡＥの進行に変化を示さなかったため、免疫応答を広く抑制しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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