(57)【要約】  本発明は、細胞由来のマイクロフィラメントのネットワークを提供する。マトリックス支持体及び細胞培養培地中で細胞を培養することによりマイクロフィラメントのネットワークを作成する方法であって、前記細胞が増殖して凝集細胞塊を形成し、前記細胞塊は該細胞塊の外部及び周囲にマイクロフィラメントを生成し、前記細胞外マイクロフィラメントは連結して連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークを形成する前記方法、並びに治療を必要とする領域にマイクロフィラメントネットワークを適用することを含む、医学的状態を治療し、創傷修復及び組織再生を促進する方法も提供される。
2020516593.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のマイクロフィラメントソース領域の間の連続的な格子構造又はメッシュ構造で相互接続された細胞由来のマイクロフィラメントを含むネットワーク。
【請求項２】
前記マイクロフィラメントが細胞外マイクロフィラメントである、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項３】
前記マイクロフィラメントが膜で囲まれている、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項４】
前記マイクロフィラメントがアクチンを含む、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項５】
前記アクチンがβ−アクチンを含む、請求項４に記載のネットワーク。
【請求項６】
前記マイクロフィラメントの長さが約１〜１０００μｍである、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項７】
前記マイクロフィラメントが分岐している、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項８】
前記マイクロフィラメントが約２〜１０個の分枝を有する、請求項７に記載のネットワーク。
【請求項９】
複数のマイクロフィラメントが共に整列し、多様なアーキテクチャ構造の束を形成する、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１０】
前記マイクロフィラメントソース領域は、前記連続的な格子構造又はメッシュ構造についての連結ノードを形成する、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１１】
接着性材料をさらに含む、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１２】
前記接着性材料が前記マイクロフィラメントと会合し、前記マイクロフィラメントの直径を拡大する、請求項１１に記載のネットワーク。
【請求項１３】
前記ネットワークが、約１μｍ２〜約５００ｃｍ２の範囲内の面積及び約１ｎｍ〜約０．５ｃｍの範囲内の厚さを有する、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１４】
前記ネットワークは、単層又は多層である、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１５】
前記マイクロフィラメントの表面積が、細胞内細胞骨格マイクロフィラメントネットワークの表面積相当値より大きい、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１６】
前記ネットワークが多孔性である、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１７】
前記孔の大きさが直径約０．１〜５μｍの範囲内である、請求項１６に記載のネットワーク。
【請求項１８】
生物活性剤及び／又は生物不活性剤をさらに含む、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項１９】
前記生物活性剤が治療薬である、請求項１８に記載のネットワーク。
【請求項２０】
前記マイクロフィラメントソース領域が細胞を含む、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２１】
前記ネットワークがマトリックス支持体上に存在し、該マトリックス支持体が生分解性である、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２２】
前記ネットワークがマトリゲルマトリックス支持体上に存在する、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２３】
前記ネットワークが細胞由来の核を欠いている、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２４】
前記ネットワークが細胞を欠いている、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２５】
前記マイクロフィラメントソース領域が、遺伝子改変を伴うか又は伴わない真核細胞を含む、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項２６】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５に記載のネットワーク。
【請求項２７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項２６記載のネットワーク。
【請求項２８】
前記ヒト細胞がヒト乳腺上皮細胞である、請求項２７に記載のネットワーク。
【請求項２９】
前記マイクロフィラメントが前記マトリックス支持体の上面内に埋め込まれている、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項３０】
前記マトリックス支持体が細胞の付着及び移動を阻害する、請求項１に記載のネットワーク。
【請求項３１】
マトリックス支持体及び細胞培養培地中で細胞を培養する工程であって、前記細胞が増殖して凝集細胞塊を形成し、前記細胞塊は該細胞塊の外部及び周囲にマイクロフィラメントを生成し、前記細胞外マイクロフィラメントは連結して連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークを形成する前記工程、及び
前記ネットワークから前記細胞の核及び／又は前記細胞を除去する工程を含む、
マイクロフィラメントのネットワークを生成する方法。
【請求項３２】
前記細胞塊が前記マトリックス支持体上に形成される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記マイクロフィラメントが前記マトリックス支持体の上面内に埋め込まれている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記マトリックス支持体が細胞の付着及び移動を阻害する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロフィラメントが細胞外マイクロフィラメントである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロフィラメントが膜で囲まれている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記マイクロフィラメントがアクチンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
前記アクチンがβ−アクチンを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記マイクロフィラメントの長さが約１〜１０００μｍである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記マイクロフィラメントが分岐している、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記マイクロフィラメントが約２〜１０個の分枝を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
複数のマイクロフィラメントが共に整列し、多様なアーキテクチャ構造の束を形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
前記マイクロフィラメントソース領域は、前記連続的な格子構造又はメッシュ構造についての連結ノードを形成する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
接着性材料をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
前記接着性材料が前記マイクロフィラメントと会合し、前記マイクロフィラメントの直径を拡大する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ネットワークが、約１μｍ２〜約５００ｃｍ２の範囲内の面積及び約１ｎｍ〜約０．５ｃｍの範囲内の厚さを有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
前記ネットワークは、単層又は多層である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
前記マイクロフィラメントの表面積が、細胞内細胞骨格マイクロフィラメントネットワークの表面積相当値より大きい、請求項３１に記載の方法。
【請求項４９】
前記ネットワークが多孔性である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５０】
前記孔の大きさが直径約０．１〜５μｍの範囲内である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ネットワークが生物活性剤及び／又は生物不活性剤をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項５２】
前記生物活性剤が治療薬である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記マトリックスが生分解性である、請求項３１記載の方法。
【請求項５４】
前記マトリックスがマトリゲルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞が、遺伝子改変を伴うか又は伴わない真核細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５６】
前記真核細胞が哺乳動物細胞である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記ヒト細胞がヒト乳腺上皮細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項１に記載のマイクロフィラメントネットワークを治療を必要とする領域に適用することを含む、医学的状態を治療する方法。
【請求項６０】
前記マイクロフィラメントネットワークが前記マトリックスと共に適用される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記マイクロフィラメントネットワークが、マトリックスなしで適用される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記医学的状態が創傷又は損傷組織である、請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
前記マイクロフィラメントネットワークが、創傷又は損傷組織の感染を防ぎ、創傷治癒及び組織再生を促進する、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記医学的状態が火傷である、請求項５９記載の方法。
【請求項６５】
損傷した皮膚の再上皮化を増進又は促進することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療を必要とする領域に前記マイクロフィラメントネットワークを適用前、適用時、又は適用後に治療薬を投与することをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６７】
細胞クラスターが該細胞クラスターの外部及び周囲にマイクロフィラメントを生成する条件下で、マトリックス基体の表面上で複数の細胞クラスターを培養することを含み、前記細胞外マイクロフィラメントは連結して、前記マトリックス基体の表面上の前記細胞クラスター間でマイクロフィラメントの連続的な細胞外ネットワークを形成する、細胞由来のマイクロフィラメントの連続的なネットワークをインビトロで作成する方法。
【請求項６８】
前記細胞クラスターが、約１ミクロン〜約１０００ミクロンの平均距離の間隔で配置されている、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞クラスターを連結する前記マイクロフィラメントが、約１０ミクロン〜約１００ミクロンの平均長さを有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークが多層の格子である、請求項６７記載の方法。
【請求項７１】
前記マイクロフィラメントが分岐している、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークが、約１０ミクロン〜約１０００ミクロンの長さを有する長いマイクロフィラメント及び約１ミクロン〜約１０ミクロンの長さを有する短いマイクロフィラメントを含む多層の格子である、請求項６７記載の方法。
【請求項７３】
前記マイクロフィラメントの連続的な細胞外ネットワークが、約０．０１ｃｍ２〜５００ｃｍ２の表面積を有する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークがメッシュである、請求項６７記載の方法。
【請求項７５】
前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークが多孔性である、請求項６７記載の方法。
【請求項７６】
細胞が前記マトリックス基体の表面上に移植され、細胞が移動及び凝集してプレクラスターを形成し、増殖して前記細胞クラスターを形成する、請求項６７に記載の方法。
【請求項７７】
前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークから細胞核又は前記細胞クラスターを除去することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７８】
前記マトリックス基体が前記細胞の付着を阻害する、請求項６７記載の方法。
【請求項７９】
前記マトリックス基体を前記連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークから分離することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項８０】
請求項１に記載のマイクロフィラメントネットワークを、それを必要とする部位に適用することを含む、創傷修復及び／又は組織再生を促進する方法。
【請求項８１】
前記マイクロフィラメントネットワークが前記マトリックスと共に適用される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記マイクロフィラメントネットワークが、マトリックスなしで適用される、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
前記マイクロフィラメントネットワークは、平方フィート（ｆｔ２）スケールの超大型マイクロフィラメント格子（ＵＭＬ）を形成する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８４】
前記ＵＭＬが細胞移動のための環境を構築する、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記マイクロフィラメントネットワークが多層であり３次元（３Ｄ）である、請求項８０に記載の方法。
【請求項８６】
細胞塊を除去して無細胞超大型マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）を生成することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＡＵＭＬが創傷修復を促進する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記ＡＵＭＬを創傷部位に適用することを含む、請求項８６記載の方法。
【請求項８９】
前記ＡＵＭＬを適用することにより、ケラチノサイトが再上皮化された表皮に大きなトンネルを生成することが可能になる、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記大きなトンネルは、創傷修復部位への細胞及び栄養素の経路を提供する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記マイクロフィラメントネットワークが、前記創傷部位の感染を防止する、請求項８０に記載の方法。
【請求項９２】
損傷を受けた皮膚の再上皮化を増進又は促進することを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項９３】
前記創傷がＩＩ度熱傷創傷である、請求項８０に記載の方法。
【請求項９４】
治療を必要とする領域に前記マイクロフィラメントネットワークを適用前、適用時、又は適用後に治療薬を投与することをさらに含む、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のデータ
本出願は、２０１７年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８５，４２２号の優先権を主張するものであり、全ての目的のためその内容全体が参照により本明細書に取り込まれる。
【０００２】
政府の利益に関する記述
本発明は、米国国立衛生研究所による助成金番号ＣＡ６８２６２の政府支援の下でなされた。米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、創傷治癒及び組織再生に有用な方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
創傷修復は複雑な生物学的プロセスを伴い、表面積が広い創傷の管理は大きな課題である（Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ．  Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３４１，７３８−７４６（１９９９），Ｐａｓｓｉｅｒ，Ｒ．，ｖａｎ  Ｌａａｋｅ，Ｌ．Ｗ．＆Ｍｕｍｍｅｒｙ，Ｃ．Ｌ．Ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，３２２−３２９（２００８））。先進国では毎年１億人超の患者が創傷を負っている（Ｔａｋｅｏ，Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｗ．＆Ｉｔｏ，Ｍ．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５，ａ０２３２６７（２０１５））。哺乳類の臓器では、損傷が発生した直後に、破壊された細胞及び／又は影響を受けた細胞が、免疫系、血液凝固カスケード、炎症経路、及び隣接する非損傷細胞内の多様な細胞内及び細胞間経路を誘導するさまざまな分子を放出する（Ｇｕｒｔｎｅｒ，Ｇ．Ｃ．，Ｗｅｒｎｅｒ，Ｓ．，Ｂａｒｒａｎｄｏｎ，Ｙ．＆Ｌｏｎｇａｋｅｒ，Ｍ．Ｔ．Ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，３１４−３２１（２００８））。損傷に対する通常の応答時、好中球、単球、リンパ球、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、幹細胞、及びそれらの誘導体を含む多くの種類の細胞は、シグナル伝達、遺伝子発現、及び表現型の著しい変化を受け、細胞の移動、増殖、及び分化が引き起こされる（Ｌａｎｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．Ａ．＆Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．  Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２，７９５−８０３（２０１４））。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）と細胞との動的且つ相互的な作用により、炎症、新組織形成、及びリモデリングの複雑なプロセス中の様々な経路の活性化及びシャットダウンが正確に統合される。一部の真核生物は、再生によって元の組織構造及び機能を完全に複製する能力を成体期を通じて保持しているが、このプロセスの理解は未だ乏しい。未知の理由により、ヒトは出生前の発達中にのみこの能力を発揮する（Ｚｉｅｌｉｎｓ，Ｅ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ９，８１７−８３０（２０１４））。病態生理により、難治性潰瘍に見られるような治癒障害、又は肥厚性瘢痕及びケロイドに見られるような「過剰治癒」が引き起こされ得る。さらに、不適切な介入は悪性化を引き起こす可能性がある（Ｃｈｉｄｇｅｙ，Ａ．Ｐ．，Ｌａｙｔｏｎ，Ｄ．，Ｔｒｏｕｎｓｏｎ，Ａ．＆Ｂｏｙｄ，Ｒ．Ｌ．Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，３３０−３３７（２００８））。トランスレーショナル研究における幹細胞の有望性にもかかわらず、臨床的な創傷治癒様式におけ���同種幹細胞療法及び自己幹細胞療法の使用は、依然として多くの規制上のハードルに直面している（Ｒｏｓｅ，Ｌ．Ｆ．＆Ｃｈａｎ，Ｒ．Ｋ．Ｔｈｅ  Ｂｕｒｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｃａｒｅ  ５，１０６−１１８（２０１６））。ヒトにおける複雑で慢性的な広範囲の傷の管理は依然として課題である。
【０００５】
創傷治療での使用に適していると見なされるには、材料／薬剤は、新生物の発生を誘発せずに再上皮化及び創傷治癒を促進し、痛みを最小限に抑え、感染のリスクを減らし、美容上の変形を抑える必要がある。そのような材料の選択は、現代の創傷管理及び再生医療の主要な要因である（Ｌｕｔｏｌｆ，Ｍ．Ｐ．＆Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，４７−５５（２００５））。現在利用可能な人工創傷治癒マトリックスは合成物であり、及び／又は様々な技術を用いて製造された天然の生体模倣材料を含んでいる。そのような材料としては、シリコーン、バイオブレン（Ｂｉｏｂｒａｎｅ）、ナノフィブリル（ｎａｎｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）、及び超分子材料、並びに個々の又は複数の生化学的ＥＣＭ由来シグナルを提示する足場が挙げられる（Ｗａｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｃｏｆｆｅｅ，Ｔ．Ｌ．＆Ｙｏｗｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ  ｂｕｒｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，８７９−８９２（２０１４）；Ｈｕｂｂｅｌｌ，Ｊ．Ａ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５６５−５７６（１９９５））。ＥＣＭは、細胞分泌タンパク質及びグリコサミノグリカンの連結メッシュで構成されている。天然のＥＣＭは、合図により誘導される（ｃｕｅ−ｇｕｉｄｅｄ）細胞の移動及び幹細胞の分化に重要な、表面トポロジー、バルク剛性、弾性、せん断力、及び孔径についての生物物理学的特性を備えている。さらに、ＥＣＭは、細胞運命に影響を与える多様な可溶性成長因子、シグナル受容体、及び接着分子も固定（ａｎｃｈｏｒ）する。再構成されたＥＣＭ及びＥＣＭ由来の材料は、天然のトポロジー情報、可溶性成長因子、及び固定された因子の濃度が不足している場合がある。現在の技術の持続可能な進歩にもかかわらず、創傷修復での使用に理想的な材料となる完全かつ天然のＥＣＭの生物物理的特性、生化学的特性、及び生体力学的特性を含む大面積（ｆｔ２スケール）の天然生体材料は、今のところ入手不可能である（Ｃｈｉｅｎ，Ｋ．Ｒ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，３０２−３０５（２００８））。
【０００６】
創傷感染は常に困難な課題であり、多大な医療負担となる。微生物汚染及びコロニー形成を防ぐための創傷の物理的バリアは、創傷感染予防に不可欠である。創傷（急性又は慢性）には通常、細菌、真菌、及びウイルスなどの微生物が含まれる（Ｓｏｏｄ，Ａ．，Ｇｒａｎｉｃｋ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ，Ｎ．Ｌ．（２０１４）Ｗｏｕｎｄ  Ｄｒｅｓｓｉｎｇｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  Ｄａｔａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｃａｒｅ  ３，５１１−５２９，Ｌａｌｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｗｏｎｇ，Ａ．Ｐ．，Ｌａｌｌ，Ｒ．Ｒ．，Ｌａｗｔｏｎ，Ｃ．Ｄ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｚ．Ａ．，ａｎｄ  Ｄａｈｄａｌｅｈ，Ｎ．Ｓ．（２０１４）Ｅｖｉｄｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｅｅｐ  ｗｏｕｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ，Ｍｉｓｉｃ，Ａ．Ｍ．，Ｇａｒｄｎｅｒ，Ｓ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｃｅ，Ｅ．Ａ．（２０１４）Ｔｈｅ  Ｗｏｕｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ：Ｍｏｄｅｒｎ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｅｘａｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  Ｉｍｐａｉｒｅｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｃａｒｅ  ３，５０２−５１０）。創傷内の細菌の存在は、創傷汚染、コロニー形成、及び感染につながり得る（Ａｄａｍ，Ｅ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ，Ｌ．Ｌ．（２００６）Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｔｒａｕｍａｔｉｃ  ｗｏｕｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ，ａｎｄ  ｍｙｏｓｉｔｉｓ  ｉｎ  ｈｏｒｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ．Ｅｑｕｉｎｅ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２２，３３５−３６１，ｖｉｉｉ）。創傷感染時、細菌増殖が起こり、治癒が妨げられ、創傷組織が損傷される（局所感染）（Ｇｏｍａｔｈｙｓａｎｋａｒ，Ｓ．，Ｈａｌｉｍ，Ａ．  Ｓ．，ａｎｄ  Ｙａａｃｏｂ，Ｎ．Ｓ．（２０１４）Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ａ  ｃｈｉｔｏｓａｎ  ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ，ａ  ｒｅｖｉｅｗ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  ｐｌａｓｔｉｃ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ４１，４５２−４５７，Ｇｒａｚｕｌ−Ｂｉｌｓｋａ，Ａ．Ｔ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｍ．Ｌ．，Ｂｉｌｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．，  Ｒｅｄｍｅｒ，Ｄ．Ａ．，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｌ．Ｐ．，Ａｂｄｕｌｌａｈ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｂｄｕｌｌａｈ，Ｋ．Ｍ．（２００３）Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｔｏｄａｙ  ３９，７８７−８００）。細菌は、近傍組織に感染を拡大するか、全身性疾患を呈する全身性感染症を引き起こす可能性がある。急性創傷としては、外科的創傷及び外傷性創傷、���びに火傷が挙げられる（Ｐａｌｍｉｅｒｉ，Ｔ．Ｌ．，Ｐｒｚｋｏｒａ，Ｒ．，Ｍｅｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．，  ３ｒｄ，ａｎｄ  Ｃａｒｒｏｕｇｈｅｒ，Ｇ．Ｊ．（２０１４）Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｂｕｒｎ  ｉｎｊｕｒｙ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ．Ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，９０９−９１６，Ｊｅｎｇ，Ｊ．，Ｇｉｂｒａｎ，Ｎ．，ａｎｄ  Ｐｅｃｋ，Ｍ．（２０１４）Ｂｕｒｎ  ｃａｒｅ  ｉｎ  ｄｉｓａｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ａｕｓｔｅｒｅ  ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，８９３−９０７）。例えば、米国だけでも毎年約５００，０００人が火傷の治療を要する（Ｈｅａｒｄ，Ｊ．Ｐ．，ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｋ．Ｍ．，Ｘｉｎｇ，Ｙ．，Ｋｌｕｅｓｎｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ｌｉａｏ，Ｊ．，ａｎｄ  Ｗｉｂｂｅｎｍｅｙｅｒ，Ｌ．Ａ．（２０１４）Ｒｅｇｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｗｉｔｈ  Ｂｕｒｎ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌｉｔｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｕｒｎ  ｃａｒｅ＆ｒｅｓｅａｒｃｈ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｕｒｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）。慢性創傷には、糖尿病性足部潰瘍、静脈性下肢潰瘍、動脈性下肢／足部潰瘍、及び褥瘡が含まれる（Ｍｏｒａｎ，Ｍ．Ｅ．（２０１４）Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ｎｏｎ−ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉｇｉｔａｌ  ｕｌｃｅｒｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｗｏｕｎｄ  ｃａｒｅ  ２３，５１０−５１６，Ｂａｌｔｚｉｓ，Ｄ．，Ｅｌｅｆｔｈｅｒｉａｄｏｕ，Ｉ．，ａｎｄ  Ｖｅｖｅｓ，Ａ．（２０１４）Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ：ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ３１，８１７−８３６）。効果的な創傷感染管理には集学的アプローチを要するが、損傷した組織を微生物から保護するための物理的バリアが最適な感染制御手段である（Ｃｈｅａｄｌｅ，Ｗ．Ｇ．（２００６）Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｓｉｔｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ７  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ７−１１）。
【０００７】
天然細胞の細胞質膜は、リン、糖鎖などによって修飾された数千の膜タンパク質を含む二重脂質膜である。細胞の細胞質膜は、微生物感染に対する物理的バリアを効果的に形成し得る（Ｈａｈｌｅｒ，Ｂ．（２００６）Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｄｅｈｉｓｃｅｎｃｅ．Ｍｅｄｓｕｒｇ  ｎｕｒｓｉｎｇ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ−Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｎｕｒｓｅｓ  １５，２９６−３００；ｑｕｉｚ  ３０１）。しかし、単一細胞の細胞質膜の面積は、臨床での使用に適用するには小さ過ぎる（μｍ２レベル）。細胞膜の脆弱性及び僅かな厚さ（５〜１０ｎｍ）により、複数の細胞の細胞質膜を集めて、創傷治療に有用な膜に再編成することが困難となる。創傷修復並びに創傷感染の効果的な予防及び管理に有用な大面積の膜が依然として必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、この必要性に対処し、マトリックス支持体上で増殖させた天然初代ヒト上皮細胞が大面積のマイクロフィラメントネットワークを生成するという知見に基づいている。ある態様によれば、前記マイクロフィラメントネットワークは、慢性創傷及び急性創傷、火傷治療、急性創傷治療及び外科創傷治療を含む創傷感染の予防及び管理のための物理的バリアとして機能する。本明細書で提示されるように、細胞マトリックス上で培養された正常な初代ヒト上皮細胞は、大面積のマイクロフィラメントネットワークを生成する。別の態様によれば、前記マイクロフィラメントネットワークは、細胞又は核を除去するために処理される。ある態様によれば、前記マイクロフィラメントネットワークは創傷に適用可能であり、微生物による創傷感染を防ぐ物理的バリアとして機能する。人工の大面積マイクロフィラメントネットワークマトリックス複合層は、細菌、真菌、ウイルスなどの微生物による感染を効果的に防ぐことができる。
【０００９】
真核細胞の主な細胞骨格ポリマーであるマイクロフィラメントは、アクチンサブユニット及びアクチン結合タンパク質によって重合される。マイクロフィラメントは、細胞分裂、細胞質分裂、細胞形状の維持、小胞輸送、シグナル伝達、及び細胞運動に不可欠である。ほとんどの動物細胞はマイクロメートル（μｍ）スケールの細胞サイズを維持し、これにより細胞骨格マイクロフィラメントネットワークの面積は同じスケールに限定される。特定の態様によれば、マトリゲル上でインビトロ培養されたヒト上皮細胞塊は、超大型の細胞外マイクロフィラメントネットワーク（ＥＭＮ）を生成する。そのようなＥＭＮは細胞移動を促進する。ある態様によれば、こうしたＥＭＮは、平方フィート（ｆｔ２）サイズに成長可能である。別の態様によれば、これらのマイクロフィラメントネットワークは、一般的な創傷治癒療法に有用である。特定の態様によれば、ヒト上皮細胞塊によって生成されたＥＭＮは、膜に囲まれた広範なマイクロフィラメントを含む。ある態様によれば、マイクロフィラメントネットワークは、細胞塊を除去するために処理され、人工の無細胞かつｆｔ２スケールの超大型多層格子（ＵＭＬ）を生成する。別の態様によれば、これらのＵＭＬは再上皮化を促進するために使用できる。さらに別の態様によれば、これらのＵＭＬは、マウスのＩＩ度熱傷創傷の治癒に有用である。特定の態様によれば、ヒト上皮細胞によって生成されたＥＭＮは、細胞移動を増進／促進する。ある態様によれば、細胞除去後に得られたＵＭＬは、創傷治癒と組織再生を促進するために使用され得る。
【００１０】
ある態様では、本開示の実施形態は、複数のマイクロフィラメントソース領域の間の連続的な格子構造又はメッシュ構造で相互接続された細胞由来のマイクロフィラメントを含むネットワークに関する。
【００１１】
別の態様では、本開示の実施形態は、マイクロフィラメントのネットワークを生成する方法であって、マトリックス支持体及び細胞培養培地中で細胞を培養する工程を含み、前記細胞が増殖して凝集細胞塊を形成し、前記細胞塊は該細胞塊の外部及び周囲にマイクロフィラメントを生成し、前記細胞外マイクロフィラメントは連結して連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークを形成する、前記方法に関する。特定の実施形態では、マイクロフィラメントのネットワークは、該ネットワークから前記細胞の核及び／又は前記細胞を除去するために処理される。ある実施形態では、前記細胞塊が前記マトリックス支持体上に形成される。
【００１２】
ある実施形態では、ネットワークのマイクロフィラメントは、細胞外マイクロフィラメントである。別の実施形態では、マイクロフィラメントは膜で囲まれている。ある実施形態では、マイクロフィラメントはアクチンを含む。別の実施形態では、アクチンはβ−アクチンを含む。ある実施形態では、マイクロフィラメントの長さは約１〜１０００μｍである。別の実施形態では、前記マイクロフィラメントは分岐している。さらに別の実施形態では、マイクロフィラメントは約２〜１０個の分枝を有する。ある実施形態では、複数のマイクロフィラメントが共に整列し、多様なアーキテクチャ構造の束を形成する。別の実施形態では、マイクロフィラメントソース領域は、連続的な格子構造又はメッシュ構造についての連結ノードを形成する。ある実施形態では、ネットワークにはさらに接着性材料が含まれる。ある実施形態では、接着性材料はマイクロフィラメントと会合し、マイクロフィラメントの直径を拡大する。ある実施形態では、ネットワークは、約１μｍ２〜約５００ｃｍ２の範囲内の面積及び約１ｎｍ〜約０．５ｃｍの範囲内の厚さを有する。別の実施形態では、ネットワークは単層又は多層である。さらに別の実施形態では、マイクロフィラメントの表面積が、細胞内細胞骨格マイクロフィラメントネットワークの表面積相当値より大きい。
【００１３】
ある実施形態では、ネットワークは多孔性である。ある実施形態では、孔径は直径約０．１〜５μｍの範囲内である。ある実施形態では、ネットワークは、生物活性剤及び／又は生物不活性剤を含む。別の実施形態では、生物活性剤は治療薬である。ある実施形態では、マイクロフィラメントソース領域は細胞を含む。別の実施形態では、ネットワークはマトリックス支持体上に存在する。さらに別の実施形態では、マトリックス支持体は生分解性である。ある実施形態では、ネットワークはマトリゲルマトリックス支持体上に存在する。ある実施形態では、ネットワークは細胞由来の核を欠いている。別の実施形態では、ネットワークは細胞を欠いている。ある実施形態では、マイクロフィラメントソース領域は、遺伝子改変を伴うか又は伴わない真核細胞を含む。ある実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞である。別の実施形態では、前記哺乳動物細胞はヒト細胞である。さらに別の実施形態では、ヒト細胞はヒト乳腺上皮細胞である。ある実施形態では、マイクロフィラメントはマトリックス支持体の上面内に埋め込まれている。ある実施形態では、マトリックスはマトリゲルである。ある実施形態では、マトリックス支持体は細胞の付着及び移動を阻害する。
【００１４】
さらに別の実施形態では、本開示は、治療を必要とする領域にマイクロフィラメントネットワークを適用することにより病状を治療する方法を提供する。ある実施形態では、マイクロフィラメントネットワークはマトリックスと共に適用される。別の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークはマトリックスなしで適用される。ある実施形態では、医学的状態は創傷又は損傷組織である。別の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、治癒を促進し、及び／又は創傷又は損傷組織の感染を防ぐ。ある実施形態では、医学的状態は火傷である。ある実施形態では、前記方法は損傷した皮膚の再上皮化を増進又は促進することを含む。別の実施形態では、前記方法は、治療を必要とする領域にマイクロフィラメントネットワークを適用前、適用時、又は適用後に治療薬を投与することをさらに含む。
【００１５】
関連するある態様では、本開示は、インビトロで細胞由来のマイクロフィラメントの連続的なネットワークを生成する方法であって、細胞クラスターが該細胞クラスターの外部及び周囲にマイクロフィラメントを生成する条件下で、マトリックス基体の表面上で複数の細胞クラスターを培養することを含み、前記細胞外マイクロフィラメントは連結して、前記マトリックス基体の表面上の前記細胞クラスター間でマイクロフィラメントの連続的な細胞外ネットワークを形成する、前記方法を意図する。ある実施形態では、クラスターは、約１ミクロン〜約１０００ミクロンの平均距離の間隔で配置されている。別の実施形態では、クラスターを連結するマイクロフィラメントは、約１ミクロン〜約１０００ミクロンの平均長さを有する。ある実施形態では、連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークは多層の格子である。別の実施形態では、マイクロフィラメントは分岐している。ある実施形態では、連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークは、約１０ミクロン〜約１０００ミクロンの長さを有する長いマイクロフィラメント及び約１ミクロン〜約１０ミクロンの長さを有する短いマイクロフィラメントを含む多層の格子である。別の実施形態では、マイクロフィラメントの連続的な細胞外ネットワークは、約０．０１ｃｍ２〜５００ｃｍ２の表面積を有する。ある実施形態では、連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークはメッシュである。別の実施形態では、連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークは多孔性である。ある実施形態では、細胞がマトリックス基体の表面に植えられ、細胞が移動及び凝集してプレクラスターを形成し、増殖して細胞クラスターを形成する。別の実施形態では、前記方法は、連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークから細胞核又は細胞クラスターを除去することをさらに含む。ある実施形態では、マトリックス基体は細胞の付着及び／又は移動を阻害する。別の実施形態では、前記方法は、マトリックス基体を連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークから分離することをさらに含む。
【００１６】
別の態様によれば、マイクロフィラメントネットワークを、それを必要とする部位に適用することを含む、創傷修復及び／又は組織再生を促進する方法が提供される。特定の実施形態では、前記マイクロフィラメントネットワークはマトリックスと共に又はマトリックスなしで適用される。ある実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、平方フィート（ｆｔ２）スケールの超大型マイクロフィラメント格子（ＵＭＬ）を形成する。別の実施形態では、ＵＭＬにより、細胞移動のための環境が構築される。ある実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは多層かつ３次元（３Ｄ）である。別の実施形態では、前記方法は細胞塊を除去すること及び無細胞ＵＭＬ（ＡＵＭＬ）を生成することを含む。ある実施形態では、ＡＵＭＬは創傷修復を促進する。別の実施形態では、前記方法は、ＡＵＭＬを創傷部位に適用することを含む。ある実施形態では、ＡＵＭＬを適用することにより、ケラチノサイトが再上皮化表皮に大きなトンネルを生成することが可能になる。別の実施形態では、大きなトンネルにより、創傷修復部位への細胞及び栄養素の経路が提供される。特定の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークにより、創傷部位の感染が防止される。ある実施形態では、前記方法は損傷を受けた皮膚の再上皮化を増進又は促進することを含む。別の実施形態では、創傷はＩＩ度熱傷創傷である。さらに別の実施形態では、前記方法は、治療を必要とする領域にマイクロフィラメントネットワークを適用前、適用時、又は適用後に治療薬を投与することをさらに含む。
【００１７】
本開示並びに特に特許請求の範囲及び／又は段落において、「含む」、「含まれる」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法に起因する意味を持つ場合があることに留意されたい。たとえば、「含有する」、「含有される」、「含有している」などを意味する場合がある。また「本質的に〜からなる」及び「〜から本質的になる」などの用語は、米国特許法に起因する意味を持つ場合があることに留意されたい。例えば、これらの用語は明示的に列挙されていない要素を許可するが、先行技術に見られる又は発明の基礎となる若しくは新規な特徴に影響する要素を除外する。これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な説明により開示されるか明白であり、詳細な説明に包含される。
【００１８】
本特許又は出願書類には、カラーで作成された少なくとも１枚の図面が含まれる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開公報の写しは、特許庁へ申請し、必要な料金を支払うことで提供される。本実施形態の前述した特徴及びその他の特、並びに利点は、添付の図面と併せて例示的な実施形態についての以下の詳細な説明からより十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】マトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）マトリックス上で塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ａは、２Ｄ環境の個々のヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）が不規則な形状（左）で存在する一方で、３Ｄ（３次元）マトリゲル培養では一貫して球形（右）を示すことを示す図である。ＨＭＥＣは、低細胞密度（６ウェルプレート中で１ウェルあたり１×１０３個の細胞）で厚いマトリゲルマトリックス（深さ２０〜３０μｍ）上に移植した。逆位相コントラスト画像は、細胞移植後５時間（ｈ）の時点で撮影した。
【図１Ｂ】マトリゲルマトリックス上で塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ｂは、マトリゲルマトリックス（ＭＭ）に曝露された表面積が最小である球状ＨＭＥＣの断面を示す代表的なトルイジンブルー染色画像を示す図である。
【図１Ｃ】マトリゲルマトリックス上で塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ｃは、細胞群の断面の代表的なトルイジンブルー染色画像であり、２つの球状の積み重なったＨＭＥＣ（白いアスタリスク）がマトリゲルマトリックス（ＭＭ）と表面接触していないことを示す図である。
【図１Ｄ】マトリゲルマトリックス上に塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ｄは、複数の積み重なったＨＭＥＣ（白いアスタリスク）がマトリゲルマトリックス（ＭＭ）と接触していないことを示す、盛り上がった細胞塊の断面の代表的なトルイジンブルー染色画像を示す図である。
【図１Ｅ】マトリゲルマトリックス上に塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ｅは、ＨＭＥＣが細胞の移動、凝集、増殖、及び積層の後に多くの細胞塊を形成することを示す代表的な逆位相コントラスト画像を示す図である。
【図１Ｆ】マトリゲルマトリックス上で塊を形成するヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の画像を示す図である。図１Ｆは、細胞塊が該細胞塊の外側に、細胞塊を取り囲み、ウェル（６ウェルプレート）又は１０ｃｍのディッシュ内のマトリゲル表面全体を覆う超大型メッシュ（赤い矢印）を生成することを示す代表的なヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像を示す図である。超大型メッシュは、多数の大きな（直径４０μｍ以上）丸い穴（青い矢印）を有する。穴の端（緑の矢印）を示す。スケールバー＝１０μｍ。
【図２Ａ】ヒトの細胞塊が超大型で連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークを生成する蛍光画像を示す図である。図２Ａは、細胞外マイクロフィラメントネットワークの組成及び構築についての蛍光顕微鏡試験を示す図である。増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）標識細胞膜Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ２（ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２）をコードするプラスミドを、初代正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）に一過的にトランスフェクトした。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣをマトリゲルマトリックス表面に移植し、６４時間（ｈ）培養した。ＨＭＥＣは、マトリゲル層上で移動、凝集、及び増殖して細胞塊（ＣＭ）を形成した。左パネル：ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染色画像は、細胞塊の間及び周囲に細胞核物質がないことを示す。中央パネル：細胞塊は、細胞塊自身の外側に大量の膜で囲まれた長い分岐した細胞外マイクロファイバー（ＥＣＭＦ、白色矢印）を生成する。入れ子状のマイクロファイバーは、細胞塊を囲む大きなネットワークを形成する。長い細胞外マイクロファイバー（太字の白色矢印）は、２つの細胞塊（ＣＭ１とＣＭ２）を連結する。右パネル：重ね合わせ画像は、入れ子状の細胞外マイクロファイバーネットワークが、それらを生成する細胞塊の外側にあることを示す。
【図２Ｂ】ヒトの細胞塊が超大型で連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークを生成する蛍光画像を示す図である。図２Ｂは、アクチンで構成されたマイクロフィラメントの蛍光画像を示す図である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２及びｍＣｈｅｒｒｙ標識β−アクチン（ｍＣｈｅｒｒｙ−β−ａｃｔｉｎ）をコードするプラスミドを、一過的にＨＭＥＣに同時トランスフェクトした。細胞塊（ＣＭ）で生成されたマイクロファイバーは、アクチンベースの膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメント（ＥＣＭＦ、白色矢印）である。細胞外マイクロフィラメントはネットワーク及び束を形成する（黄色矢印）。細胞外マイクロフィラメント連結ノード（ＥＭＣＮ、紫色矢印）、細胞外マイクロフィラメント集合ネットワーク空間（ＥＭＮＳ、白色アスタリスク）、及びマイクロフィラメント接着性材料（ＡＭ）を示す。スケールバー＝２０μｍ。
【図３】細胞外マイクロフィラメントの長さの分布を示す図である。ランダムに選択された合計３８５個のＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントの長さの分布は、約５１％が１〜５μｍの範囲内であり、２２．６％が５〜１０μｍの範囲内であり、８．９％が１０〜２０μｍの範囲内であり、５．２％が２０〜４０μｍの範囲内であり、２％が４０〜１００μｍの範囲内であり、１％が１００〜３００μｍの範囲内であり、２％が１０００μｍの範囲内であった。
【図４Ａ】細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す蛍光画像及び棒グラフを示す図である。経時的ＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す代表的な蛍光画像である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣはマトリゲルマトリックス表面に移植され、一定期間培養された。図４Ａ〜図４Ｄは、細胞外マイクロフィラメント及びマイクロフィラメント連結ノードの数が急速に増加し、多層３Ｄ細胞外マイクロフィラメントネットワークを迅速に形成することを示す画像を示す図である。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｂ】細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す蛍光画像及び棒グラフを示す図である。経時的ＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す代表的な蛍光画像である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣはマトリゲルマトリックス表面に移植され、一定期間培養された。図４Ａ〜図４Ｄは、細胞外マイクロフィラメント及びマイクロフィラメント連結ノードの数が急速に増加し、多層３Ｄ細胞外マイクロフィラメントネットワークを迅速に形成することを示す画像を示す図である。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｃ】細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す蛍光画像及び棒グラフを示す図である。経時的ＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す代表的な蛍光画像である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣはマトリゲルマトリックス表面に移植され、一定期間培養された。図４Ａ〜図４Ｄは、細胞外マイクロフィラメント及びマイクロフィラメント連結ノードの数が急速に増加し、多層３Ｄ細胞外マイクロフィラメントネットワークを迅速に形成することを示す画像を示す図である。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｄ】細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す蛍光画像及び棒グラフを示す図である。経時的ＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントネットワークの発達を示す代表的な蛍光画像である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣはマトリゲルマトリックス表面に移植され、一定期間培養された。図４Ａ〜図４Ｄは、細胞外マイクロフィラメント及びマイクロフィラメント連結ノードの数が急速に増加し、多層３Ｄ細胞外マイクロフィラメントネットワークを迅速に形成することを示す画像を示す図である。スケールバー＝２０μｍ。
【図４Ｅ】発達中の細胞外マイクロフィラメントの増加についての定量分析（平均±標準偏差、各時点でｎ＝５つの領域、各領域は２つのＨＭＥＣ塊間に直接位置している）を示す図である。
【図５Ａ】細胞外マイクロフィラメントネットワークのアーキテクチャ構造の画像を示す図である。図５Ａは、細胞外マイクロフィラメント（ＥＣＭＦ、赤色矢印）が細胞外マイクロフィラメント連結ノード（ＥＭＣＮ、紫色矢印）を介して規則的及び不規則な形状の間隙（アスタリスク）と連結している重ね合わせ蛍光画像を示す図である。細胞外マイクロフィラメントネットワークにおける三角形（白色アスタリスク）、四角形（紫色アスタリスク）、及び五角形（黄色アスタリスク）の間隙が示されている。大きな束（水色矢印）は、いくつかの長く、平行で、ねじれた細胞外マイクロフィラメントによって形成される。白色破線で囲んだ領域の拡大図を図５Ｂに示す。
【図５Ｂ】細胞外マイクロフィラメントネットワークのアーキテクチャ構造の画像を示す図である。図５Ｂは、２つの細胞外マイクロフィラメントがねじれ、２つのリングを有するねじれた束を形成する（青色矢印）ことを示す図である。
【図５Ｃ】細胞外マイクロフィラメントネットワークのアーキテクチャ構造の画像を示す図である。図５Ｃは、図５Ｂにおけるリングを有するねじれた束を描画した図である。スケールバー＝１０μｍ。
【図６Ａ】超大型、多孔性、多層かつ高密度のネットワークを形成する細胞外マイクロフィラメントの蛍光画像を示す図である。図６Ａは、１０ｃｍディッシュ内の複数のネットワークで構成された超大型の連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークの一部の蛍光画像を示す図である。ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２が過剰発現されたＨＭＥＣをマトリゲルマトリックス表面に移植し、８０時間培養した。２つの細胞塊とそれらを囲む細胞外マイクロフィラメントネットワークが示されている。超大型ネットワークには、核物質のないいくつかの未知の膜で囲まれた球状体（白色矢印）が散在している。重ね合わせ画像の白枠の領域の拡大図を図６Ｂに示す。
【図６Ｂ】超大型、多孔性、多層かつ高密度のネットワークを形成する細胞外マイクロフィラメントの蛍光画像を示す図である。図６Ｂは、図６Ａの白枠部分の拡大画像を示す図である。２つの細胞塊の細胞外マイクロフィラメントネットワークは広く連結し、途切れることなく連続した超大型ネットワーク複合体を形成する。同じ超大型ネットワーク内の焦点が合った最上層と焦点が合っていない下層が示されている。多層細胞外マイクロフィラメントネットワーク全体に、大量の小さな細孔（白色アスタリスク、孔径範囲：０．１〜５μｍ）が存在する。スケールバー＝２０μｍ。
【図７】超大型細胞外マイクロフィラメントメッシュの表面上を移動する細胞の画像を示す図である。ＨＭＥＣをマトリゲルマトリックス表面上に移植し、１１０時間培養した。ＨＥ染色画像は、いくつかのＨＭＥＣ細胞塊が分解されていることを示す（青色矢印、ＤＣＭ、分解された細胞塊）。切り離され移動して細胞塊部位を離れた個々の細胞（赤色矢印で表示）は、超大型細胞外マイクロフィラメントネットワークの表面上を移動する（ただし、マトリゲル表面が露出している大きな穴の内を除く）。これらの可動性の細胞は様々な形態であるが、球体の形態を有するものはない。白色矢印：分解されていない細胞塊。スケールバー＝１０μｍ。
【図８Ａ】５００ｃｍ２の超大型で無細胞の細胞外マイクロフィラメント集合ネットワーク複合体の生成の概略図及び画像を示す図である。図８Ａは、ＨＭＥＣ塊から生じた人工の５００ｃｍ２の超大型マイクロフィラメントネットワーク複合体の生成の概略図を示す図である。ＨＭＥＣは、細胞培養培地のマトリゲルマトリックス層上に植えられる。ＨＭＥＣは移動、凝集、及び増殖して細胞塊を形成する。その後、細胞塊は、長く、分岐した、膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメントを生成する。入れ子状の細胞外マイクロフィラメントは、細胞塊の外側及び周囲にネットワークを形成する。細胞外マイクロフィラメントネットワークは連結し、マトリゲル表面全体を覆う５００ｃｍ２の連続的な超大型格子を形成する。人工的な脱細胞化の後、５００ｃｍ２の超大型で無細胞の細胞外マイクロフィラメントネットワーク（ＥＭＮ、赤色矢印）が生成される。
【図８Ｂ】５００ｃｍ２の超大型で無細胞の細胞外マイクロフィラメント集合ネットワーク複合体の生成の概略図及び画像を示す図である。図８Ｂは、５００ｃｍ２のプレートのマトリゲルマトリックス表面上の細胞塊（ＣＭ、青色矢印）を有する超大型の連続的なＨＭＥＣ細胞外マイクロフィラメントネットワーク（ＥＭＮ、赤色矢印）の一部のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色画像を示す図である。この段階では、細胞外マイクロフィラメントネットワークの分解により生じる大きな（直径２０μｍ以上）丸い穴は見られない。スケールバー＝１０μｍ。
【図８Ｃ】５００ｃｍ２の超大型で無細胞の細胞外マイクロフィラメント集合ネットワーク複合体の生成の概略図及び画像を示す図である。図８Ｃは、人工脱細胞化後の５００ｃｍ２の無細胞の超大型細胞外マイクロフィラメントＥＭＮ（赤色矢印）の一部を示すＨＥ染色画像を示す図である。スケールバー＝１０μｍ。
【図９Ａ】無細胞の超大型マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）が、深度ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒、並びに再上皮化表皮におけるケラチノサイトトンネル及びＥＭＮの生成を促進することを示す図である。図９Ａは、火傷後１４日目（ｄａｙ  ｐｏｓｔ−ｂｕｒｎ（ｄｐｂ））の深度ＩＩ度熱傷創傷治癒に対するＡＵＭＬの効果の統計分析を示す図である。スチューデントｔ検定、両側、ｎ＝各グループ５匹のマウス。
【図９Ｂ】無細胞の超大型マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）が、深度ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒、並びに再上皮化表皮におけるケラチノサイトトンネル及びＥＭＮの生成を促進することを示す図である。図９Ｂは、再上皮化した表皮（ｒｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｉｚｅｄ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ（ＲＥ−ＥＤ））に大きなトンネルを形成するケラチノサイトを示す図である。代表的な免疫蛍光画像は、ＡＵＭＬで治療した創傷のＲＥ−ＥＤに複数のケラチノサイトトンネル（ＫＴ）があることを示す。大きいＫＴ１の内腔には、さまざまな種類の細胞が多く含まれている。ＫＴ２の内腔にはケラチノサイトＥＭＮが含まれている。枠で囲んだＫＴ１領域及びＫＴ２領域の拡大図を図１１Ｂ及び図１１Ｃにそれぞれ示す。真皮（ＤＭ）及び毛包（ＨＦ）が示されている。スケールバー＝１０μｍ。
【図９Ｃ】無細胞の超大型マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）が、深度ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒、並びに再上皮化表皮におけるケラチノサイトトンネル及びＥＭＮの生成を促進することを示す図である。図９Ｃは、５つの創傷切片標本におけるケラチノサイトトンネルの全発生の散布図（各標本はマウスの創傷標本からランダムに選択され、ｎ＝各グループ５匹のマウス、ボンフェローニ補正後のウィルコクソン順位和検定、Ｐ＜１０−１５）を示す図である。各黒色点は、ケラチノサイトトンネルを表す。
【図９Ｄ】無細胞の超大型マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）が、深度ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒、並びに再上皮化表皮におけるケラチノサイトトンネル及びＥＭＮの生成を促進することを示す図である。図９Ｄは、図１４Ｂの拡大領域を示す図である。代表的な免疫蛍光画像は、大きなケラチノサイトトンネル（ＫＴ、紫色破線で表示）の内腔に、細胞の移動及び挙動に対する足場及び環境を供給する大きなケラチノサイトＥＭＮ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ＥＭＮ（ＫＥＭＮ））が含まれていることを示す。ケラチノサイトＥＭＮの分解によって生じるケラチノサイトＥＭＮ（オレンジ色矢印）及び不規則な穴（紫色アスタリスク）が示されている。
【図１０Ａ】ＡＵＭＬがＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒を促進し、ケラチノサイトトンネルの生成を可能にすることを示す図である。図１０Ａは、異なる火傷後日数（ｄｐｂ）におけるマウスでのＭｅｐｉｆｏｒｍ（メピフォーム）又はＡＵＭＬによる治療有り／無しにおけるＩＩ度皮膚熱傷の代表的な画像を示す図である。
【図１０Ｂ】ＡＵＭＬがＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒を促進し、ケラチノサイトトンネルの生成を可能にすることを示す図である。図１０Ｂは、１４ｄｐｂでの各マウス群からの熱傷切片標本の代表的なＨＥ染色画像を示す図である。ＡＵＭＬ治療による創傷の再上皮化表皮（ＲＥ−ＥＤ）に複数の細胞を有する２つの大きなケラチノサイトトンネル（ＫＴ）が認められるが、治療なしまたはメピフォームによる治療を受けた群の創傷には認められない。青枠で囲んだ領域を、図１１Ａに示す。再上皮化表皮（ＲＥ−ＥＤ）及び真皮（ＤＥ）を示す。
【図１１Ａ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送のための手段を提供することを示す図である。図１１Ａは、図１０Ｂの枠で囲んだ領域の拡大領域を示す図である。ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮には、２つの大きなケラチノサイトトンネルが認められる。ケラチノサイトトンネル１（ＫＴ１）の内腔内には、複数の赤血球（ＲＢＣ、黒色矢印）及びケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ）断片（青色矢印）が認められる。ＫＴ２の内腔内には、ケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ、青色矢印）が認められ、赤血球及び有核細胞（青緑色矢印）を含む様々な種類の細胞がケラチノサイトＥＭＮ中／上で移動している。
【図１１Ｂ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送のための手段を提供することを示す図である。図１１Ｂは、図９Ｂの枠で囲んだ領域（白色）の拡大領域を示す図である。ケラチノサイトトンネル１（ＫＴ１）の内腔内では、赤血球（紫色矢印）、並びに完全に成熟した細胞質及び小さくコンパクトな濃縮核を含む正染性正赤芽球（ＯＮ）を含む複数の異なる種類の細胞が移動している（白色矢印）。
【図１１Ｃ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送のための手段を提供することを示す図である。図１１Ｃは、図９Ｂの枠で囲んだ領域（オレンジ色）の拡大領域を示す図である。ケラチノサイトトンネル２（ＫＴ２）の内腔内にはケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ）が認められる。ケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ、オレンジ色矢印）で構成される膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメントを示す。有核細胞（白色矢印）はケラチノサイトＥＭＮ中を移動する。スケールバーは図１１Ａで２０μｍ、図１１Ｂ及び図１１Ｃで１０μｍである。
【図１２Ａ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送及び移動のための経路を提供することを示す図である。図１２Ａは、代表的なＨＥ染色画像であり、ＡＵＭＬ治療した創傷の再上皮化表皮において２つのケラチノサイトトンネル（ＫＴ１及びＫＴ２）が認められることを示す図である。枠で囲んだ領域（ＫＴ１及びＫＴ２）の拡大図を、図１２Ｂ及び図１２Ｃにそれぞれ示す。再上皮化表皮（ＲＥ−ＥＤ）及び真皮（ＤＥ）を示す。
【図１２Ｂ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送及び移動のための経路を提供することを示す図である。図１２Ｂは、多くの成熟した除核赤血球（ＲＢＣ、黒色矢印）がＫＴ１の内腔の大きなケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ）中を移動することを示す図である。
【図１２Ｃ】ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮における細胞輸送及び移動のための経路を提供することを示す図である。図１２Ｃは、２つの有核細胞が大きなケラチノサイトトンネル２（ＫＴ２）中を移動することを示す図である。
【図１３Ａ】ケラチノサイトＥＭＮは、ケラチノサイトのトンネル内腔における細胞移動及び細胞挙動のための足場を供給し、ケラチノサイトＥＭＮは分解することを示す図である。図１３Ａは、代表的なＨＥ染色画像であり、ケラチノサイトＥＭＮ複合体は、ＡＵＭＬで治療した創傷の再上皮化表皮の大きなケラチノサイトトンネル内腔内に形成されることを示す図である。再上皮化表皮（ＲＥ−ＥＤ）及び真皮（ＤＥ）を示す。枠で囲んだ領域の拡大図を図１３Ｂに示す。
【図１３Ｂ】ケラチノサイトＥＭＮは、ケラチノサイトのトンネル内腔における細胞移動及び細胞挙動のための足場を供給し、ケラチノサイトＥＭＮは分解することを示す図である。図１３Ｂは、図１３Ａの拡大図を示す図である。多くの細胞（青色矢印）は、大きなケラチノサイトトンネル（ＫＴ）の内腔内で分解する際、ケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ）複合体に位置している。黒い矢印はケラチノサイトＥＭＮフラグメントを示し、黒いアスタリスクはケラチノサイトＥＭＮ複合体の分解によって生じた大きな穴（または大きなチャネルの断面）を示す。枠で囲んだ領域の拡大図を図１３Ｃに示す。
【図１３Ｃ】ケラチノサイトＥＭＮは、ケラチノサイトのトンネル内腔における細胞移動及び細胞挙動のための足場を供給し、ケラチノサイトＥＭＮは分解することを示す図である。図１３Ｃは、ケラチノサイトＥＭＮのアーケオロジーを示す図である。ＥＭＮ（ＫＥＭＮ、黒色矢印）で構成されるケラチノサイト細胞外マイクロフィラメントには、さまざまなサイズの不規則な形状の細孔（緑色矢印）が大量に含まれている。ケラチノサイトＥＭＮの分解により、ケラチノサイトＥＭＮ内に多くのチャネル（黒色アスタリスク）がもたらされる。ケラチノサイトＥＭＮ内のチャネルの端（青色矢印）を示す。
【図１４Ａ】ケラチノサイトＥＭＮ複合体により細胞の環境が構築され、ケラチノサイトＥＣＭＦの分解によりケラチノサイトＥＭＮの分解がもたらされることを示す図である。図１４Ａは、代表的な免疫蛍光画像であり、ＡＵＭＬは再上皮化表皮が異なる段階でケラチノサイトＥＭＮを有するケラチノサイトトンネル複合体を形成することを可能にすることを示す図である。再上皮化表皮（ＲＥ−ＥＤ）、真皮（ＤＥ）、及び毛包（ＨＦ）が示されている。枠で囲んだ領域を図１４Ｂに示す。
【図１４Ｂ】ケラチノサイトＥＭＮ複合体により細胞の環境が構築され、ケラチノサイトＥＣＭＦの分解によりケラチノサイトＥＭＮの分解がもたらされることを示す図である。図１４Ｂは、３つの隣接するケラチノサイトトンネル（ＫＴ１、ＫＴ２、及びＫＴ３）を含むケラチノサイトトンネル複合体が認められることを示す図である。ＫＴ１の内腔内のケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ）は、残存ケラチノサイトＥＭＮ内の小さなチャネル（白色アスタリスク）で大部分が分解される。ＫＴ２の内腔内のケラチノサイトＥＭＮの大部分は完全な状態であり、２つのチャネル（青緑色アスタリスク）がこのＥＭＮに存在する。ＫＴ３の内腔内の大きなケラチノサイトＥＭＮは分解され、いくつかの大きな又は小さなＥＭＮ断片に分割される。複数の細胞（白色矢印）がＫＴ３の内腔内のケラチノサイトＥＭＮ内に位置する。白色枠とオレンジ色枠で囲んだ領域を、補足図１２ｃ及び図３にそれぞれ示す。
【図１４Ｃ】ケラチノサイトＥＭＮ複合体により細胞の環境が構築され、ケラチノサイトＥＣＭＦの分解によりケラチノサイトＥＭＮの分解がもたらされることを示す図である。図１４Ｃは、ケラチノサイト膜に囲まれたマイクロフィラメントの分解によりケラチノサイトＥＭＮ（ＫＥＭＮ、オレンジ色矢印）の分解がもたらされ、ＥＭＮ内にチャネル（青緑色の矢印）が形成されることを示す代表的な蛍光画像を示す図である。
【図１５Ａ】大面積の初代正常ヒト細胞膜の生成を示す図である。図１４Ａは、大面積の初代正常ヒト細胞膜生成の模式図を示す図である。細胞膜層の深さは約４０ｎｍである。
【図１５Ｂ】大面積の初代正常ヒト細胞膜の生成を示す図である。図１４Ｂは、１０ｃｍ（直径）ディッシュのマトリゲルマトリックス上の天然初代正常ヒト細胞膜（エオシン染色）の一部の代表的な画像を示す図である。スケールバー＝１００μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示の態様は、マトリックス支持体中で増殖させた天然初代ヒト上皮細胞が大面積のマイクロフィラメントネットワークを生成するという知見に基づいている。ある態様によれば、マイクロフィラメントネットワークは、創傷感染の予防及び管理のための物理的バリアとして機能し得る。本開示の特定の実施形態は、細胞由来のマイクロフィラメントの連続的なネットワーク、及び大面積マイクロフィラメントネットワークを生成するための組織工学的方法を対象とする。本明細書に開示される条件下で形成される細胞外マイクロフィラメントは、多細胞生物には存在しない。そのようなマイクロフィラメントネットワークは、例えば、熱傷治療、急性及び外科的創傷治療を含む創傷感染の予防を含む創傷治癒において有用性を有する。特定の態様によれば、マイクロフィラメントネットワークは細胞移動を増進し、組織再生を促進する。ある態様によれば、細胞マトリックス上で培養された正常な初代ヒト上皮細胞は、大面積のマイクロフィラメントネットワークを生成する。ある実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、細胞の核又はＤＮＡを除去するために処理される。別の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、細胞を除去するために物理的、化学的、及び／又は機械的に処理される。別の態様によれば、マイクロフィラメントネットワークは、創傷治癒において、例えば物理的バリアとして有用であり、微生物に誘発される創傷感染を防ぐために創傷に適用される。特定の実施形態では、生物工学的手法により、大面積（最大５００ｃｍ２）のマイクロフィラメントネットワークが生成される。このようなネットワークは、創傷の感染予防に有用である。ある実施形態では、細胞由来のマイクロフィラメントのネットワークは生分解性であり、患者の組織と生物学的に適合する。別の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、創傷部位から微生物を排除可能である。さらに別の実施形態では、マイクロフィラメントネットワークは、組織修復及び／又は組織再生に関与する異種細胞の機能を支持する微小環境を構築するために半透過性である。ある実施形態では、大面積の細胞由来のマイクロフィラメントの連続的なネットワークは、大面積のＩＩ度（又はＩＩＩ度）の熱傷創傷を認める患者の治療及び治癒における主要な障害の１つを克服する。
【００２１】
ある態様によれば、創傷修復を促進するための超大型で、多孔性、高密度、多層、かつ３次元（３Ｄ）の細胞外マイクロフィラメントメッシュを生成する信頼性の高い方法が提供される。ヒト上皮細胞塊は、長い、膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメント（ＥＣＭＦ）を生成することが見出された。ある実施形態では、入れ子状のＥＣＭＦにより、超大型の細胞外マイクロフィラメントネットワーク（ＥＭＮ）が形成される。別の実施形態では、これらのＥＭＮは連結し、平方フィート（ｆｔ２）規模の超大型マイクロフィラメント格子（ＵＭＬ）を形成可能である。特定の実施形態では、これらのＵＭＬは、細胞移動のための環境を構築する。ある実施形態では、細胞塊の除去により、創傷修復を促進するために使用され得る無細胞ＵＭＬ（ＡＵＭＬ）が生成される。例示的な実施形態では、マウスのＩＩ度熱傷創傷に適用される場合、ＡＵＭＬは、ケラチノサイトが再上皮化表皮に大きなトンネルを生じさせることを可能にし、これにより創傷修復部位への細胞及び栄養素の経路を提供する。これらの大きなＡＵＭＬの特性としては、生分解性、生体適合性、及び半透過性が挙げられる。特定の実施形態では、ＡＵＭＬは、創傷修復及び組織再生での幅広い使用に適した天然の生化学的、生物物理学的、及び生体力学的成分を含む。
【００２２】
真核細胞の主な細胞骨格ポリマーであるマイクロフィラメントは、アクチンサブユニット及びアクチン結合タンパク質によって重合される。マイクロフィラメントは、細胞分裂、細胞質分裂、細胞形状の維持、小胞輸送、シグナル伝達、センシング、及び細胞運動性に不可欠である（Ｇｕｎｎｉｎｇ，Ｐ．Ｗ．，Ｇｈｏｓｈｄａｓｔｉｄｅｒ，Ｕ．，Ｗｈｉｔａｋｅｒ，Ｓ．，Ｐｏｐｐ，Ｄ．＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌｌｙ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １２８，２００９−２０１９（２０１５））。細胞骨格アクチン（βアクチン及びγアクチンを含む）の会合及び解離により、マイクロフィラメントネットワークのリモデリングが行われる（Ｈｅｒｍａｎ，Ｉ．Ｍ．Ａｃｔｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，４８−５５（１９９３））。μｍスケールの成体動物細胞サイズにより、単一細胞の細胞骨格マイクロフィラメントネットワークの可能な領域はμｍ２スケールに制限される（Ｌｌｏｙｄ，Ａ．Ｃ．Ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｉｚｅ．  Ｃｅｌｌ  １５４，１１９４−１２０５（２０１３），Ｇｉｎｚｂｅｒｇ，Ｍ．Ｂ．，Ｋａｆｒｉ，Ｒ．＆Ｋｉｒｓｃｈｎｅｒ，Ｍ．Ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｏｎ  ｂｅｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｇｈｔ（ｃｅｌｌ）ｓｉｚｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，１２４５０７５（２０１５））。ある態様によれば、ヒト上皮細胞塊は、細胞移動を促進する超大型の細胞外マイクロフィラメントネットワークを生成する。別の態様によれば、本開示は、平方フィート（ｆｔ２）レベルで人工の超大型細胞外マイクロフィラメントネットワークを生み出す一般的戦略を提供する。ある態様によれば、ヒトの細胞塊は、膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメントによって構築された超大型（ｆｔ２）スケールのメッシュ構造を生成する。ある実施形態では、これらのメッシュ構造は、細胞の移動を促進する機能的なＥＣＭとして細胞によって使用される。別の態様によれば、これら天然のメッシュは、マウスの熱傷創傷治癒の増進に効果的である。特定の実施形態では、これらのメッシュは、簡便で信頼性が高く、超大型の３Ｄ細胞外マイクロフィラメントメッシュ（ｆｔ２以上）である。さらに別の実施形態では、これらのメッシュは、多孔性、天然、高密度、又は無細胞である。ある態様によれば、これらのメッシュは、創傷修復及び組織再生を促進するために使用され得る。特定の態様によれば、ヒト上皮細胞塊は、細胞外に長い（長さ１０００μｍまでの）アクチン重合マイクロフィラメントを生成する。ある態様によれば、マイクロフィラメントは膜で囲まれている。ある実施形態では、細胞及び細胞由来の細胞外マイクロフィラメントは、細胞移動のための経路を開く超大型の連続的なネットワークを形成する。別の実施形態では、脱細胞化により、人工の無細胞超大型（５００平方センチメートル（ｃｍ２））格子が生成され、マイクロフィラメントネットワーク領域が、同等のサイズの単一ヒト上皮細胞の細胞骨格マイクロ��ィラメントネットワーク領域と比較して、最大約１０億倍（１×１０９倍）増加する。特定の実施形態では、超大型で多孔性の細胞外マイクロフィラメントメッシュは、マウスのＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒を促進する。特定の態様によれば、本開示の方法により、細胞移動を促進し、組織再生及び創傷治癒に有用な超大型細胞外マイクロフィラメントネットワークが生成する。
【００２３】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指すために本明細書で互換的に使用される。哺乳類には、ネズミ、サル、人間、家畜、スポーツ動物、及びペットが含まれるが、これらに限定されない。インビボで得られたかインビトロで培養された生物学的実体としての組織、細胞、及びそれらの子孫も含まれる。
【００２４】
「治療薬」、「治療可能な薬剤」、又は「治療用薬」という用語は互換的に使用され、対象への投与時に何らかの有益な効果を付与する分子又は化合物を指す。有益な効果としては、診断決定の実施可能性、疾患、症状、障害、又は病的状態の改善、病気、症状、障害、又は症状の発症の低減又は予防、及び病気、症状、障害、又は病的状態の一般的な解消が挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」、「緩和する」、又は「回復させる」は互換的に使用される。これらの用語は、治療上の利益及び／又は予防上の利益を含むがこれらに限定されない有益な又は望ましい結果を得るためのアプローチを指す。治療上の利益とは、治療中の１又は複数の疾患、状態、又は症状の治療に関連する改善又は効果を意味する。予防上の利益のために、組成物は、特定の疾患、状態、又は症状を発症するリスクがある対象、又は疾患、状態、又は症状を呈していない可能性があっても、疾患の生理学的症状の１又は複数を訴える対象に投与され得る。
【００２６】
「有効量」又は「治療有効量」という用語は、有益又は望ましい効果をもたらすのに十分な薬剤の量を指す。治療的有効量は、治療される対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、及び投与方法などのうちの１又は複数に応じて異なり、これらは当業者によって容易に決定され得る。これらの用語は、本明細書に記載の画像化方法のいずれかによる検出のための画像をもたらすであろう用量にも適用される。具体的な用量は、選択した特定の薬剤、遵守する投与計画、他の化合物と組み合わせて投与するかどうか、投与のタイミング、画像化される組織、及び薬剤が運搬される物理的送達システムの１又は複数に応じて異なる。
【００２７】
ある態様によれば、マイクロフィラメントのネットワークを生成する方法は、マトリックス支持体及び細胞培養培地中で細胞を培養することによるものである。ある実施形態では、細胞塊がマトリックス支持体上に形成される。別の実施形態では、マトリックスは細胞培養培地であるマトリゲルである。
【００２８】
ある実施形態では、ネットワークのマイクロフィラメントには、β−アクチン、γ−アクチン、及びアクチン相互作用タンパク質などのアクチンが含まれる。ある実施形態では、マイクロフィラメントの長さは、約１〜１０００μｍ、約１０〜９００μｍ、約２０〜８００μｍ、約３０〜７００μｍ、約４０〜６００μｍ、約５０〜５００μｍ、約６０〜４００μｍ、約７０〜３００μｍ、約８０〜２００μｍ、及び約９０〜１００μｍである。別の実施形態では、マイクロフィラメントは分岐している。さらに別の実施形態では、マイクロフィラメントには約２〜１０、３〜９、４〜８、５〜７の分枝がある。ある実施形態では、ネットワークにはさらに接着性材料が含まれる。ある実施形態では、接着性材料はマイクロフィラメントと会合し、マイクロフィラメントの直径を拡大する。ある実施形態では、ネットワークの面積は約１μｍ２〜約５００ｃｍ２の範囲である。別の実施形態では、ネットワークは、約１０μｍ２〜約４００ｃｍ２、約１００μｍ２〜約３００ｃｍ２、約２００μｍ２〜約２００ｃｍ２、約１０００μｍ２〜約１００ｃｍ２、及び約１ｃｍ２〜約１０ｃｍ２の面積を有する。別の実施形態では、ネットワークは、約１ｎｍ〜約１ｃｍ、約１０ｎｍ〜約０．１ｃｍ、約１００ｎｍ〜約０．０１ｃｍ、及び約１０００ｎｍ〜約０．００１ｃｍの範囲内の厚さを有する。ある実施形態では、ネットワークは、治療を必要とする領域に単一層として適用される。別の実施形態では、多層のネットワークが、治療が必要な領域に適用され得る。
【００２９】
特定の実施形態では、ネットワークの孔径は、直径が約０．１〜５μｍ、約０．２〜４μｍ、約０．３〜３μｍ、約０．４〜２μｍ、及び約０．１〜１μｍの範囲内である。ある実施形態では、ネットワークは、生物活性剤及び／又は生物不活性剤を含むことができる。いくつかの実施形態では、生物活性剤及び／又は生物不活性剤としては、インテグリン、接着受容体、及び膜タンパク質が挙げられる。別の実施形態では、生物活性剤は、抗体及び微生物阻害剤を含む治療薬である。ある実施形態では、ネットワークはマトリックス支持体上に存在する。特定の実施形態では、マトリックス支持体は生分解性である。ある実施形態では、ネットワークはマトリゲルマトリックス支持体上に存在する。ある実施形態では、マイクロフィラメントソース領域は、遺伝子改変を伴うか又は伴わない真核細胞を含む。
【００３０】
別の態様によれば、本発明は、治療を必要とする領域にマイクロフィラメントネットワークを適用することにより病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、医学的状態は、創傷、急性創傷及び慢性創傷、火傷、熱傷、化学熱傷、及び電気熱傷を含むがこれらに限定されず、当業者に知られている多くの種類の創傷に関する。ある実施形態では、マイクロフィラメントネットワークはマトリックスと共に適用される。別の実施形態では、前記方法はさらに、マトリックス基体を連続的な細胞外マイクロフィラメントネットワークから分離することを含み、マイクロフィラメントネットワークはマトリックスなしで適用される。
【００３１】
本発明の様々な方法による本明細書に記載の薬剤及び組成物の投与は、様々な方法に従って達成し得る。例えば、本発明の薬剤及び組成物は、任意の適切な手段、例えば、非経口、静脈内、皮下、筋肉内、眼窩内、眼内、脳室内、頭蓋内、関節内、脊髄内、大槽内、腹腔内、頬内、直腸内、膣内、鼻腔内又はエアロゾル投与によって投与される。投与は、局所投与、すなわち特定の部位を対象としたもの、又は全身投与であってもよい。投与はまた、外科的移植、内視鏡、カテーテル挿入、又は洗浄によって直接的に実行され得るが、これらに限定されない。手術中に適用される場合、本発明の組成物は、組織上に流入されてもよく、組織上に噴霧されてもよく、組織上に塗布されてもよく、又は当技術分野の範囲内の他の手段で適用されてもよい。あるいは、手術中に適用される本発明の組成物は、適切なマトリックスに組み込まれてもよい。さらに、手術中に適用される本発明の組成物は、患者の再上皮化が望まれる創傷部位に移植されてもよい。
【００３２】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、ゴマ油などの生体適合性油、ヒアルロン酸、シクロデキストリン、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、熱応答性ゲル又は化学応答性ゲル、スクロース酢酸イソブチルを含む適切な担体又は増量剤に含ませるか又は併用して投与されてもよい。当業者には理解されるように、本発明の組成物において記載される薬物／化合物の濃度は、限定されるものではないが、投与される薬物の投与量、使用される化合物の化学的特性（例えば、疎水性）、および投与経路を含む多数の要因によって異なることになる。投与される薬剤の好ましい投与量もまた、限定されるものではないが、疾患の種類及び程度、組織の喪失又は欠損、特定の患者の全体的な健康状態、選択された化合物の相対的な生物学的有効性、化合物の剤型、製剤中の賦形剤の存在及び種類、並びに投与経路を含む変動に依存する可能性がある。本発明の治療用分子は、典型的な用量が、１日あたり体重１ｋｇあたり約１０ｎｇ〜約１ｇの範囲内である個体に提供され得る。好ましい用量範囲は体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜１００ｍｇであり、より特に好ましい用量範囲は１用量あたり１０〜１０００μｇである。熟練した臨床医は、本発明の有効用量が、限定されるものではないが、適応症、疾患／創傷の病態、及び個体の身体的特徴を含む多数の要因に照らして修正され得ることを理解するであろう。また、前述の要因のいずれか又は全てを考慮して、用量を変更、修正、又は最適化することも明らかに当技術分野の範囲内である。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示する目的で与えられ、本発明をいかなる形式によっても限定することを意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在好ましい実施形態を代表するものであり、例示であり、本発明の範囲に対する制限として意図されていない。当業者は、それらにおける変更、及び特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨に包含される他の用途に想到し得るであろう。
【００３４】
実施例Ｉ
実験手順
細胞、培地、プラスミド、試薬、及びマウス
正常初代ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＰＣＳ−６００−０１０（商標））はＡＴＣＣに注文した。本研究で使用したすべての細胞は試験され、マイコプラズマ汚染がないことが判明した。ＭＥＧＭ（商標）Ｍａｍｍａｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（商標）ＭＥＧＭ（商標）Ｍａｍｍａｒｙ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｐｌｕｓ  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（商標）Ｋｉｔパッケージ）はＬｏｎｚａ社（ＣＣ−３１５０）に注文した。ＨＭＥＣは、加湿５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で、マトリゲルマトリックス層有り／無しでＭＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）で培養した。ＥＧＦＰ−ｈＰＭＣＡ２ｚ／ｂ（品番４７５８４）及びｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチン（品番５４９６７）プラスミドはＡｄｄｇｅｎｅ社に注文した。抗γ−アクチン抗体（γアクチン、モノクローナル、ａｂ１２３０３４）及び抗ｐａｎ−カドヘリン抗体（ポリクローナル、ａｂ１４０３３８）はＡｂｃａｍ社に注文した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＣＢ−４０２３４）及びＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ、フェノールレッドフリー、＊ＬＤＥＶフリー（製品番号３５６２３７）はＣｏｒｎｉｎｇ社から購入した。Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  ５００ｃｍ２  Ｓｑｕａｒｅ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ（製品番号４３１１１０）はＣｏｒｎｉｎｇ社に注文した。Ｍｅｐｉｆｏｒｍ（登録商標）（メピフォーム）（創傷治療用シリコン膜）（Ｗａｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｃｏｆｆｅｅ，Ｔ．Ｌ．＆Ｙｏｗｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ  ｂｕｒｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，８７９−８９２（２０１４））はＭＯｌｎｌｙｃｋｅ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社に注文した。６週齢の雌マウス（系統名：ＢＡＬＢ／ｃＪ）は、ジャクソン研究所に注文した。動物実験は、ハーバード大学医学校（Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）の施設内動物実験委員会の承認を得て実施した。
【００３５】
細胞外マイクロフィラメントの発達及び一過性トランスフェクション
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘを４℃で一晩解凍した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ層（深さ２０〜３０μｍ）は、事前に冷却した６ウェルプレート、１０ｃｍディッシュ、又は５００ｃｍ２正方形ディッシュ中に調製し、その後、２５℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気で２０分間ゲル化した。蛍光イメージングのために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ層は、６ウェルプレート中のＶＷＲ−Ｍｉｃｒｏカバー上にフェノールレッドフリーＭａｔｒｉｇｅｌを用いて調製した。ＨＭＥＣをＭａｔｒｉｇｅｌ層に播種し、ＭＥＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）培地中で３７℃、加湿５％ＣＯ２雰囲気で培養した。細胞外マイクロフィラメントは、細胞培養後４８〜１１０時間で発達させた。ＥＧＦＰ−ｈＰＭＣＡ２ｚ／ｂプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社、品番４７５８４）及びｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチンプラスミド（品番５４９６７）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｔｉｎｅ（登録商標）２０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、品番１１６６８０２７）を使用して、マニュアルに従ってＨＭＥＣにトランスフェクトした。抗γ−アクチン抗体（ガンマアクチン、モノクローナル、ａｂ１２３０３４）及び抗ｐａｎ−カドヘリン抗体（ポリクローナル、ａｂ１４０３３８）はＡｂｃａｍ社に注文した。トランスフェクションの２日後、トランスフェクトされた細胞を指定培地中のＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス層（６ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３個の細胞）上に播種した。指定時間の培養期間後、細胞及びマトリゲルを４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。細胞のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色は、細胞固定後に行った。ＶＷＲ−Ｍｉｃｒｏカバー付きの試料をスライドガラスに移し、画像を取得した。
【００３６】
画像取得
位相コントラスト画像は、Ｎｉｋｏｎ社製ＴＭＳ倒立位相差顕微鏡及びＮｉｋｏｎ社製Ｃｏｏｌｐｉｘ  オート４３００デジタルカメラで撮影した。固定細胞の蛍光画像は、８０ｉ正立顕微鏡、並びに２０倍又は４０倍レンズ及びＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像取得ソフトウェアを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ社製ＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤデジタルカメラで撮影した。固定細胞又は組織切片のヘマトキシリン・エオジン染色画像を、８０ｉ正立顕微鏡並びに２０倍又は４０倍レンズ及びＮＩＳ−Ｅｌｅｍｅｎｔｓ取得ソフトウェアを備えたＨａｍａｍａｔｓｕ社製ＯＲＣＡ−ＥＲ冷却ＣＣＤデジタルカメラで撮影した。
【００３７】
トルイジンブルー染色
ＨＭＥＣは、６ウェルプレート中のプラスチックディスク上のＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス層（深さ約６０μｍ）上に播種した。ＨＭＥＣは、ホルムアルデヒド−グルタルアルデヒド−ピクリン酸−固定液（２．５％パラホルムアルデヒド、５．０％グルタルアルデヒド、及び０．０６％ピクリン酸含有０．２Ｍ  カコジル酸緩衝液）：細胞培養培地＝１：１の固定液混合物を使用して固定した。次に、固定したＨＭＥＣを１％四酸化オスミウム（ＯｓＯ４）／１．５％フェロシアン化カリウム（ＫＦｅＣＮ６）中で３０分間後固定し、水で３回洗浄し、１％酢酸ウラニル水溶液中で３０分間インキュベートした。これに続いて、水で２回洗浄し、アルコールの勾配で脱水した（５０％、７０％、９５％、２×１００％を各５分）（Ｂａｓｌｅｒ，Ｍ．，Ｐｉｌｈｏｆｅｒ，Ｍ．，Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｇ．Ｐ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｇ．Ｊ．＆Ｍｅｋａｌａｎｏｓ，Ｊ．Ｊ．Ｔｙｐｅ  ＶＩ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｐｈａｇｅ  ｔａｉｌ−ｌｉｋｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ４８３，１８２−１８６（２０１２））。細胞を、プロピレンオキシド及びＴＡＡＢ  Ｅｐｏｎの１：１混合物（Ｍａｒｉｖａｃ  Ｃａｎａｄａ社、カナダ、サン・ローラン）に２時間から一晩浸透させた。その後、試料をＴＡＡＢ  Ｅｐｏｎに埋め込み、６０℃で４８時間重合した。Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ−Ｓミクロトームを使用して、超薄切片（約６０ｎｍ）を切り出した。次に、超薄切片標本をトルイジンブルーで染色した（３０秒間）。画像は、８０ｉ正立顕微鏡（２０倍レンズ、４０倍レンズ）で撮影した。
【００３８】
脱細胞化
指定期間の細胞培養（５００ｃｍ２ディッシュ中のＭａｔｒｉｇｅｌ層上に６×１０４個のＨＭＥＣ）後、５００ｃｍ２ディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  ５００ｃｍ２  Ｓｑｕａｒｅ  ＴＣ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ）中のＨＭＥＣ及び超大型細胞外マイクロフィラメントネットワークを４％パラホルムアルデヒドで１０分間固定した後、１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＨＥ染色を行った。細胞塊及び細胞をピペットチップ（１ｍＬ又は１００μＬ）及びＮｉｋｏｎ  ＴＭＳ倒立位相差顕微鏡を用いて除去した後、１×ＰＢＳで３回洗浄した。指定時間の細胞培養後、細胞及び超大型細胞外マイクロフィラメントネットワークを、０．５％ＫＭｎＯ４（１×ＰＢＳ（ｐＨ７．１）中で脂質安定化（Ｚｈａｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｘａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ  ｏｎ  ｓｐｒｅａｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｖｅｒｓｅｌｙ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ４，５−ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．ＦＥＢＳ  Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏ  ４，１９０−１９９（２０１４））で１時間、続いて１０％中性緩衝ホルマリン固定液で１５分間固定した。その後、１×ＰＢＳで３回洗浄して、遊離化学残留物を除去した。細胞塊及び細胞をピペットチップ（１ｍＬ又は１００μＬ）及びＮｉｋｏｎ  ＴＭＳ倒立位相差顕微鏡を用いて除去した後、１×ＰＢＳで３回洗浄して剥離細胞を除去した。ＡＵＭＬを調整し、Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックスから分離した。Ｍａｔｒｉｇｅｌを含まないＡＵＭＬは、熱傷創傷治癒分析用の自作ＡＵＭＬ特異的移植装置により、ＡＵＭＬ層の上側が創傷表面と接触した状態で創傷表面に移植された。
【００３９】
動物の熱傷創傷治癒アッセイ
６週齢の成体ＢＡＬＢ／ｃＪ雌マウスの体重を測定し（体重、２０〜２４ｇ）、腹腔内（ＩＰ）注射により１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン（ＡｎａＳｅｄ（登録商標）注射剤、キシラジン滅菌溶液）で麻酔した。麻酔したマウスの背中から毛を刈り取り、市販の脱毛剤でその範囲を露出させた。皮膚を９８℃の蒸気に４秒間曝すことにより、深度ＩＩ度熱傷創傷（直径１．５ｃｍ）を１５匹のマウスに誘発した（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９０ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨａＣａＴ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｅｐ  ｓｅｃｏｎｄ−ｄｅｇｒｅｅ  ｂｕｒｎ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ１０３７２３（２０１４））。深度ＩＩ度熱傷創傷を有する１５匹のマウスをランダムに３群に分けた（１群あたり５匹のマウス）。創傷は、１日おきにＭｅｐｉｆｏｒｍ（登録商標））又はテーラーメイドＡＵＭＬを用いた治療有リ／無しで管理した。創傷の画像を、Ｎｉｋｏｎ社製のカメラで撮影した。火傷後１４日目に、マウスを屠殺し、ＨＥ染色分析による組織学的評価のために創傷を切除した（切片標本、深さ５μｍ）。
【００４０】
二重免疫組織染色分析
皮膚の創傷を切除し、ＨｉｓｔｏＣｈｏｉｃｅ（登録商標）ＭＢ固定液（Ａｍｒｅｓｃｏ社）で固定し、パラフィンに包埋した。切片標本（深さ５μｍ）は、抗ｐａｎ−カドヘリン抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１４０３３８、１：２００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、品番９８２４２５、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、１：１０００）、抗γ−アクチン抗体（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１２３０３４、１：２００、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ａｌｅｘ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８  ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体、１：１０００）、及び４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、１：１０００）による二重免疫組織化学染色に供した。蛍光画像は、２０倍レンズ／４０倍レンズ／６０倍レンズを備えたＮｉｋｏｎ社製８０ｉ正立顕微鏡で撮影した。全ての画像は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像取得ソフトウェアを使用して取得した。
【００４１】
統計分析
以前に記載されたように統計分析を実施した（Ｙｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．ｅＩＦ１Ａ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  Ａｇｏ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｉｃｅｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｉＲＮＡ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６，７１９４（２０１５））。データ（エラーバー）は、平均値＋ＳＤ（ｎ＝３以上）として表示される。スチューデントのｔ検定を使用してＰ値を決定した（ｔａｉｌ＝２）＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【００４２】
正常初代ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）を、指定の厚さの（３Ｄ）Ｍａｔｒｉｇｅｌマトリックス−培養培地混合ゲル層上に播種した。２Ｄ培養とは対照的に、個々のＨＭＥＣは不規則な形状を呈していなかったが、常に最小限の表面積がＭａｔｒｉｇｅｌと接触している状態の球状形態を示した（図１Ａ〜図１Ｂ）。このことは、Ｍａｔｒｉｇｅｌが細胞の接着、付着、及び伸展にとって好ましくない環境であることを示している。しかし、より長い間、ＨＭＥＣは移動、凝集、及び増殖して、複数の積み重ねられた細胞がＭａｔｒｉｇｅｌマトリックスと接触していない状態のコンパクトな細胞塊を形成した（図１Ｃ〜図１Ｄ）。細胞移植後２４時間又は３６時間（ｈ）では、細胞塊を取り囲む細胞生成物質は認められなかった（図１Ｃ〜図１Ｄ）。しかし、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色イメージングにより、移植後１０２時間で、細胞塊が該細胞塊の外部及び周囲に超大型メッシュ構造を生成し、ウェル（６ウェルプレート）又は１０ｃｍディッシュ内のＭａｔｒｉｇｅｌ表面全体を覆っていることがわかった（図１Ｅ〜図１Ｆ）。
【００４３】
超大型メッシュが膜で囲まれたユニットで構成されているかどうかを調べるために、膜関連分子マーカーを検出した。細胞膜のカルシウム輸送ＡＴＰａｓｅ−２（ＰＭＣＡ２）は、細胞からＣａ２＋を除去するカルシウム押出ポンプとして機能し（Ｓｔｒｅｅｔ，Ｖ．Ａ．，ＭｃＫｅｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．，Ｆｏｎｓｅｃａ，Ｒ．Ｃ．，Ｔｅｍｐｅｌ，Ｂ．Ｌ．＆Ｎｏｂｅｎ−Ｔｒａｕｔｈ，Ｋ．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｃａｕｓｅ  ｄｅａｆｎｅｓｓ  ｉｎ  ｄｅａｆｗａｄｄｌｅｒ  ｍｉｃｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９，３９０−３９４（１９９８）を参照）、乳腺上皮細胞を含む種々の細胞タイプのＣａ２＋含有量を調節する（ＶａｎＨｏｕｔｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＰＭＣＡ２  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄ  ｉｎｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １０７，１１４０５−１１４１０（２０１０）を参照）。したがって、ＨＭＥＣは、増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）標識ＰＭＣＡ２（ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２）をコードするプラスミドで一過的に同時トランスフェクトされた。蛍光イメージングにより、ＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２は細胞の細胞膜全体、及び細胞塊を取り囲む入れ子状のマイクロファイバーの大部分の表面に沿って分布していることがわかった。これは、細胞塊が、細胞塊を連結する、膜で囲まれた大量の細胞外マイクロファイバー（図２Ａ）を活発に生成することを示唆している。長い細胞外マイクロファイバー及び短い細胞外マイクロファイバーは密に連結されており、したがって連続的なネットワークを構成している（図２Ａ）。
【００４４】
２種類の非筋肉型の高度に保存されたイソアクチンであるβ−アクチン及びγ−アクチンはともにマイクロフィラメント成分であり、細胞質分裂（Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔｉｎ  ａｎｄ  ｍｙｏｓｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５８２，１２０−１３０（１９９０）を参照）、オルガネラ輸送（Ｂｒｅｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．Ｇｅｔｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｌｏｗ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ｔｏ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｉｎ  ｍｏｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ８７，６０１−６０６（１９９６）を参照）、シグナル伝達（Ｊａｎｍｅｙ，Ｐ．Ａ．Ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ７８，７６３−７８１（１９９８）を参照）、細胞移動（Ｔｈｅｒｉｏｔ，Ｊ．Ａ．＆Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．Ａｃｔｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５２，１２６−１３１（１９９１）；Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．＆Ｃｒａｍｅｒ，Ｌ．Ｐ．Ａｃｔｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ  ８４，３７１−３７９（１９９６）；Ｐｏｌｌａｒｄ，Ｔ．Ｄ．＆Ｂｏｒｉｓｙ，Ｇ．Ｇ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｙ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｎ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ．Ｃｅｌｌ  １１２，４５３−４６５（２００３）を参照）、及び細胞形状の維持と変化（Ｇａｒｄｅｌ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｌａｓｔｉｃ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｏｆ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｎｄ  ｂｕｎｄｌｅｄ  ａｃｔｉｎ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０４，１３０１−１３０５（２００４）；Ｈｅｒｍａｎ，Ｉ．Ｍ．Ａｃｔｉｎ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ５，４８−５５（１９９３）；Ｋｅｒｅｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｈａｐｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｔｉｌｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ４５３，４７５−４８０（２００８）を参照）において複数の役割を果たす。さらに、β−アクチンが細胞外マイクロファイバーの組成に関与しているかどうかを調べた。ｍＣｈｅｒｒｙ標識β−アクチン（ｍＣｈｅｒｒｙ−β−アクチン）及びＥＧＦＰ−ＰＭＣＡ２をコードする２種類のプラスミドを、一過的にＨＭＥＣに同時トランスフェクトした後、β−アクチンが細胞質全体及び全ての細胞外マイクロファイバーに沿って分布していることがわかった（図２Ｂ）。これは、マイクロフィラメントが膜で囲まれた細胞外マイクロファイバーの構造成分であることを示す（図２Ａ〜図２Ｂ）。入れ子状の細胞外マイクロフィラメントは、マイクロフィラメント連結ノードを介してネットワークを形成し、それらの間に様々なサイズの大きな多角形の間���を残す（図２Ｂ）。次に多孔性（多角形の細孔）の細胞外マイクロフィラメント集合ネットワークが連結して、細胞塊を囲む超大型の連続的な多孔性細胞外マイクロフィラメントネットワークを形成する（図２Ａ〜図２Ｂ）。細胞外マイクロフィラメントは、形態形成を分岐させる強力な能力を有している（図２Ａ〜図２Ｂ及び図３）。細胞外マイクロフィラメントの数は急速に増加し、密なネットワークを迅速に形成した（図４Ａ〜図４Ｅ）。上記のデータは、我々の現在の知識では多細胞生物には存在しない、これらの持続性の長い、高度に分岐した、膜で囲まれた細胞外マイクロフィラメントの超大型メッシュが、本発明において初めて作成されたことを示唆している。以前は評価されていなかったこれらの構造は、ネットワーク形成能力が高く、細胞骨格マイクロフィラメント及びストレスファイバー（Ｔｏｊｋａｎｄｅｒ，Ｓ．，Ｇａｔｅｖａ，Ｇ．＆Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｐ．Ａｃｔｉｎ  ｓｔｒｅｓｓ  ｆｉｂｅｒｓ−−ａｓｓｅｍｂｌｙ，ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １２５，１８５５−１８６４（２０１２）を参照）、基底膜（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｄ．Ａ．＆Ｌａｒｓｅｎ，Ｍ．Ｈｅｔｅｒｏｔｙｐｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０１，１０３−１０９（２０１５）を参照）、非分岐上皮ブリッジ（Ｚａｎｉ，Ｂ．Ｇ．，Ｉｎｄｏｌｆｉ，Ｌ．＆Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｅ．Ｒ．Ｔｕｂｕｌａｒ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ５，ｅ８９３０（２０１０）を参照）、短い及び／又は一過性の糸状仮足（Ｍａｔｔｉｌａ，Ｐ．Ｋ．＆Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎ，Ｐ．Ｆｉｌｏｐｏｄｉａ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ９，４４６−４５４（２００８）を参照）、繊毛、微絨毛（Ｃｕｔｚ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｕｓ  ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａｎ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  ｂｒｕｓｈ−ｂｏｒｄｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２０，６４６−６５１（１９８９）を参照）、ポドソーム、及び浸潤突起（ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ）（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｄ．Ａ．＆Ｃｏｕｒｔｎｅｉｄｇｅ，Ｓ．Ａ．Ｔｈｅ  ’ｉｎｓ’  ａｎｄ  ’ｏｕｔｓ’  ｏｆ  ｐｏｄｏｓｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｖａｄｏｐｏｄｉａ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １２，４１３−４２６（２０１１）を参照）とは異なっている。
【００４５】
複数の長い細胞外マイクロフィラメントが整列して太い束を形成する。２本以上の細胞外マイクロフィラメントが互いにねじれて、リングを有するねじれた束が作成され得る（図２Ｂ及び図５Ａ〜図５Ｃ）。これらの観察結果は、組織化された細胞外マイクロフィラメントネットワーク（ＥＭＳ）のアーキテクチャ構造が非常に多様であることを示している。上記の結果は、ＨＭＥＣ細胞塊の主要な特性の１つが、細胞外膜で囲まれたマイクロフィラメントの生成であり、それを介して超大型で連続的な多孔性ＥＭＮを堅固に作成することを示している（図２Ａ〜図２Ｂ、図４Ａ〜図４Ｅ、及び図５Ａ〜図５Ｃ）。
【００４６】
時間経過と共に（８０時間）、複数のＥＭＮ複合体が連結して組み合わさり、細胞塊を取り囲む超大型で連続的な多孔性の多層の格子になり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ表面全体に広がる（図６Ａ〜図６Ｂ）。これらの超大型３次元ＥＭＮ全体に散在する様々なサイズの未確認の膜で囲まれた丸い点が認められる（図６Ａ〜図６Ｂ）。
【００４７】
これらの超大型ＥＭＮの潜在的な機能を特定するために、ＨＭＥＣを、Ｍａｔｒｉｇｅｌ層に細胞を移植してから１１０時間連続して培養した。１１０時間で、細胞塊は分解され始め、個々の細胞は分離、移動し、細胞塊部位を離れ、ＥＭＮの分解により生じた大きな丸い穴のＭａｔｒｉｇｅｌ表面を避けながら、超大型ＥＭＮの表面上にとどまるか、または表面に沿って移動した（図７）。さらに、分解した細胞塊に由来する個々の細胞は不規則な形態を有し、球状の細胞は観察されなかった（図７）。これらの結果は、超大型ＥＭＮの表面が細胞の接着、付着、拡散、移動、及びその他の挙動を促進することを示している。まとめると、上記データは、細胞塊が超大型連続ＥＭＮを生成して、細胞活動に有利な環境を作り出し、細胞移動のための新たな道を開くことを実証した（図１Ａ〜図１Ｆ、図２Ａ〜図２Ｂ、図３、図４Ａ〜図４Ｅ、図５Ａ〜図５Ｃ、図６Ａ〜図６Ｂ、及び図７）。
【００４８】
細胞塊がｆｔ２スケールのＥＭＮを効果的に発達させることができるかどうかを調べるために、５００ｃｍ２培養プレートのＭａｔｒｉｇｅｌ層にＨＭＥＣを移植した。細胞塊は、５００ｃｍ２のＭａｔｒｉｇｅｌ表面全体を覆う非常に大きなＥＭＮを生成し（図８Ａ〜図８Ｂ）、細胞塊が超大型ＥＭＮを生成する並外れた能力が実証され、細胞が除去された場合の創傷治癒の潜在的な用途が示唆された。脱細胞化を介した異種及び同種の細胞遺伝物質の除去により、組織再生に使用するための免疫原性が最小限の天然構造が生成される２６。これを達成するために、固定後に細胞塊及び細胞を除去し、５００ｃｍ２（ｆｔ２レベル）の超大型で無細胞の人工細胞外マイクロフィラメントメッシュを生成した（図８Ｃ）。これらのデータは、これらの無細胞超大型細胞外マイクロフィラメント格子（ＡＵＭＬ）の可能なサイズが、如何なる構造の固有の特性によっても制限されないことを示す。
【００４９】
世界中で毎年６６０万人以上が様々な火傷に苦しんでおり、世界全体の致命的な火傷の年間件数は、１９９０年の２８０，０００から２０１０年には３３８，０００に増加したと推定される（Ｌｏｚａｎｏ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ａｎｄ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ２３５  ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｆｏｒ  ２０  ａｇｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  １９９０  ａｎｄ  ２０１０：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ２０１０．Ｌａｎｃｅｔ  ３８０，２０９５−２１２８（２０１２））。再上皮化及び創傷治癒は、大面積のＩＩ度（又はＩＩＩ度）熱傷創傷を有する患者にとって課題である。治療及び治癒の主な障害の１つは、必要な特徴を備えた大面積の連続材料が存在しないことであり、そうした材料は、分解可能で、患者の組織と生物学的に適合し、創傷部位から微生物を排除可能で、微小環境を構築するために半透過性である必要があり（Ｓｅｅ，Ｈｅｎｇ，Ｍ．Ｃ．Ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ａｄｕｌｔ  ｓｋｉｎ：ａｉｍｉｎｇ  ｆｏｒ  ｐｅｒｆｅｃｔ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ５０，１０５８−１０６６（２０１１））、異種細胞の機能をサポートし（Ｔａｙｌｏｒ，Ｇ．，Ｌｅｈｒｅｒ，Ｍ．Ｓ．，Ｊｅｎｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．，Ｓｕｎ，Ｔ．Ｔ．＆Ｌａｖｋｅｒ，Ｒ．  Ｍ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｎｏｔ  ｏｎｌｙ  ｔｈｅ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｂｕｔ  ａｌｓｏ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ．Ｃｅｌｌ  １０２，４５１−４６１（２０００）；Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｌｏ  Ｃｅｌｓｏ，Ｃ．＆Ｓｉｌｖａ−Ｖａｒｇａｓ，Ｖ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １６，５１８−５２４（２００６）；Ｗａｔｔ，Ｆ．Ｍ．＆Ｊｅｎｓｅｎ，Ｋ．Ｂ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ．ＥＭＢＯ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １，２６０−２６７（２００９）を参照）、組織の修復に関与する（Ｂｒａｕｎ，Ｋ．Ｍ．＆Ｐｒｏｗｓｅ，Ｄ．Ｍ．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ａｒｅ  ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎｉｃｈｅ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２，２２１−２３１（２００６）；Ｓｏｌａｎａｓ，Ｇ．＆Ｂｅｎｉｔａｈ，Ｓ．Ａ．Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｋｉｎ：ａ  ｔａｓｋ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｏｏｌ  ａｎｄ  ｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇ  ｎｉｃｈｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １４，７３７−７４８（２０１３）；Ｎｏｗａｋ，Ｊ．Ａ．，Ｐｏｌａｋ，Ｌ．，Ｐａｓｏｌｌｉ，Ｈ．Ａ．＆Ｆｕｃｈｓ，Ｅ．Ｈａｉｒ  ｆｏｌｌｉｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｓｐｅ���ｉｆｉｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｋｉｎ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ３，３３−４３（２００８）を参照）。
【００５０】
超大型で、連続的な、多孔性の多層天然ＡＵＭＬが火傷の治癒を促進する環境を作り出すことができるかどうかを調べるために、Ｍａｐｉｆｏｒｍ（Ｗａｒｎｅｒ，Ｐ．Ｍ．，Ｃｏｆｆｅｅ，Ｔ．Ｌ．＆Ｙｏｗｌｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ  ｂｕｒｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．  Ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９４，８７９−８９２（２０１４））又はＡＵＭＬの治療有／無しで、マウスでＩＩ度の皮膚熱傷を処置した。火傷後１４日目に、ＡＵＭＬは、治療無し又はＭｅｐｉｆｏｒｍによる治療のいずれかよりも、ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒をより効果的に促進したことがわかった（図９Ａ及び図１０Ａ）。
【００５１】
表皮は無血管であるが、真皮はその血管網を介して無血管表皮に栄養素を供給する（Ｒｅｉｎｋｅ，Ｊ．Ｍ．＆Ｓｏｒｇ，Ｈ．Ｗｏｕｎｄ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｕｒｇｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｕｒｏｐａｉｓｃｈｅ  ｃｈｉｒｕｒｇｉｓｃｈｅ  Ｆｏｒｓｃｈｕｎｇ．Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅｓ  ｃｈｉｒｕｒｇｉｃａｌｅｓ  ｅｕｒｏｐｅｅｎｎｅｓ  ４９，３５−４３（２０１２）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．＆Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，Ｋ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ：ａｎ  ｕｐｄａｔｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ２８，５２１−５３４（２００１））。カドヘリンは膜貫通タンパク質であり、ケラチノサイトの接着や移動を含む広範な機能を実行する（Ｌｅｃｕｉｔ，Ｔ．＆Ｙａｐ，Ａ．Ｓ．Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １７，５３３−５３９（２０１５））。興味深いことに、ＡＵＭＬ治療により再上皮化表皮内で多数の大きなトンネルの生成が著しく促進されることがわかった（図９Ｂ〜図９Ｃ、図１０Ｂ、図１２Ａ、及び図１３Ａ）。組織化学染色分析及び免疫組織化学染色分析により、これらのケラチノサイトトンネルには赤血球を含む多くの異なるタイプの細胞が含まれることが示され、これらのケラチノサイトトンネルが細胞、可溶性成長因子、及び栄養素の経路を機能的に提供することが示唆された（図９Ｂ、図１１Ａ〜図１１Ｃ、図１２Ａ〜図１２Ｃ、及び図１３Ａ〜図１３Ｃ）。さらに重要なことに、ケラチノサイトがケラチノサイトトンネルの内腔にＥＭＮを生成し、（赤血球を含む）多様な細胞がケラチノサイトＥＭＮ内を移動することがわかり、ケラチノサイトが細胞移動及びその他の挙動のための足場を供給するＥＭＮをインビボで生成することが実証された（図９Ｄ、図１１Ａ〜図１１Ｃ、図１２Ａ〜図１２Ｃ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、及び図１４Ａ〜図１４Ｃ）。ケラチノサイトＥＭＮが分解され、細胞がケラチノサイトトンネルを満たした。これは、ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮが後期の再上皮化表皮で消失したという事実と一致し、ＡＵＭＬによりケラチノサイトトンネル及びＥＭＮの組織化された生成及び分解に適切な環境が作成されることが示唆される（図９Ｄ、図１０Ｂ、図１１Ａ〜図１１Ｃ、図１２Ａ〜図１２Ｃ、図１３Ａ〜図１３Ｃ、及び図１４Ａ〜図１４Ｃ）。まとめると、これらのデータにより、ＡＵＭＬが適切な環境を構築し、ケラチノサイトが細胞、可溶性成長因子、及び栄養素の経路として作用する大きなケラチノサイトトンネルを生成すること、並びに細胞移動及びその他の挙動のための足場を供給する大きなケラチノサイトＥＭＮをインビボで生成して創傷修復を促進することを可能にすることが実証された。
【００５２】
ヒトの細胞によって完全に生成されるｆｔ２スケールのＡＵＭＬは、細胞の移動及びその他の挙動のための足場及び環境として細胞に自然に利用され、本来の生物物理的、生化学的、及び生体力学的シグナルをそのままに保ちながら脱細胞化され、創傷修復の促進のためのＡＵＭＬの適用を可能にした。細胞膜に囲まれた細胞外マイクロフィラメントの特徴により、ＡＵＭＬは、創傷修復及び組織再生を促進するための生分解性、生体適合性、半透過性であり、最小免疫原性が最小である生体材料として使用可能になる。非常に大きな面積のＡＵＭＬを作成する能力により、あらゆるサイズの創傷に合わせて簡単に調整されることが可能になる。ＡＵＭＬは、細胞及び栄養素の経路を提供する大きなケラチノサイトトンネルの生成、並びにインビボでの細胞の移動及び挙動の足場を供給するケラチノサイトＥＭＮの生産を促進する。このように、ケラチノサイトトンネル及びＥＭＮは、組織修復中に細胞の移動、増殖、分化、及び層形成が行われている表皮の領域で、細胞、可溶性成長因子、及び栄養素に対する高い需要を満たす。
【００５３】
本来の生物物理学的シグナル、生化学的シグナル、及び生体力学的シグナルを有するこれらの生分解性、生体適合性、半透過性、かつ無限のＡＵＭＬは、大面積の天然のメッシュが高度に組織化された組織の発達における合図誘導性の細胞の移動、増殖、及び分化を促進するため、広範囲の創傷を治療し、組織再生を促進する方法として適用されることが期待される。
【００５４】
本明細書で提供されるデータは、マトリゲル中で培養された細胞から生成された、これまで認識されていなかった細胞外マイクロフィラメントネットワークが細胞移動を促進することを示している。本開示は、ＩＩ度熱傷創傷の再上皮化及び治癒を促進する無細胞の超大型（ｆｔ２スケール）細胞外マイクロフィラメントネットワークを意図している。
【００５５】
実施例ＩＩ
火傷治療、急性創傷治療及び外科的創傷治療を含む、創傷感染の予防及び管理のための大面積の天然初代正常ヒト細胞膜を生成する新規の組織工学的方法について説明する。細胞マトリックス上で培養された正常初代ヒト上皮細胞は、核又はＤＮＡを有していない大面積（最大５００ｃｍ２）の初代正常ヒト細胞膜を生成し、この膜は創傷に適用されて微生物による創傷感染を防ぐための物理的バリアとして機能し得る。人工の大面積細胞膜−マトリックス複合層は、細菌、真菌、及びウイルスを含む微生物による感染を効果的に防ぐことができる。
【００５６】
材料及び方法
大型初代正常ヒト細胞膜の増殖
様々なサイズ（７５ｃｍ２、３００ｃｍ２、５００ｃｍ２、又はそれ以上）のディッシュ中のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）マトリックス層（Ｙｉ，Ｔ．，Ｋａｂｈａ，Ｅ．，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ，Ｅ．，ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ．（２０１４）４ＥＧＩ−１  ｔａｒｇｅｔｓ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｐｅｒｓｉｓｔｓ  ｉｎ  ＣＳＣ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ５，６０２８−６０３７）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘ（ＣＢ−４０２３４、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を使用して薄いプラスチック膜上に調製し、ディッシュをあらかじめ冷却した後、３７℃のインキュベーターで２０分間インキュベートした。初代正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）（Ｓｃｈｅｅｌ，Ｃ．，Ｅａｔｏｎ，Ｅ．Ｎ．，Ｌｉ，Ｓ．Ｈ．，Ｃｈａｆｆｅｒ，Ｃ．Ｌ．，Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ，Ｆ．，Ｋａｈ，Ｋ．Ｊ．，Ｂｅｌｌ，Ｇ．，Ｇｕｏ，Ｗ．，Ｒｕｂｉｎ，Ｊ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（２０１１）Ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ａｎｄ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒｅａｓｔ．Ｃｅｌｌ  １４５，９２６−９４０）は、ＤＭＥＭ培地のＭａｔｒｉｇｅｌマトリックス層上で培養した。哺乳類細胞は５％ＣＯ２、３７℃で培養した。５０時間の培養後、ＨＭＥＣは細胞塊及び大面積の初代正常ヒト細胞膜を形成する。細胞塊をチップで除去し、核の遺伝物質を有していない大面積の初代正常ヒト細胞膜を生成した。ＤＭＥＭ培地を除去した後、細胞膜を１×ＰＢＳで３回洗浄した。
【００５７】
結果
この方法により生成された大面積の天然初代正常ヒト細胞膜（図１５Ａ〜図１５Ｂ）は、１）単一細胞の面積と比較して、面積が１０億倍（１０１０倍）増大している、超大面積（最大５００ｃｍ２以上）の核を有していない天然細胞膜である、２）天然の初代正常ヒト細胞膜の二重層である、３）ＤＮＡの遺伝物質を含まない、４）天然膜タンパク質を含む天然脂質膜である、５）細胞膜及びマトリゲルマトリックスが容易に分解する、及び６）創傷感染を予防することを含む特徴を有する。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。本発明から逸脱することなく、当業者は多くの変形、変更、及び置換を想到するであろう。本明細書に記載された本発明の実施形態に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に使用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法及び構造並びにそれらの均等物が本発明の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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