(57)【要約】４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなるタンパク質ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含む前記タンパク質ライブラリー、及び、このタンパク質ライブラリーを準備し、該ライブラリーを構成するタンパク質の構造又は機能を分析し、構造又は機能を有するタンパク質を選択することを含む、構造又は機能を有するタンパク質のスクリーニング方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなるタンパク質ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含む前記タンパク質ライブラリー。
【請求項２】
４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸からなる核酸ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含む前記核酸ライブラリー。
【請求項３】
前記核酸にコードされるタンパク質が発現可能である、請求項２記載の核酸ライブラリー。
【請求項４】
請求項３記載の核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を、該タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡとをスペーサーを介して結合させた対応付け分子として発現させ、対応付け分子を構成するタンパク質の性質に基づいて対応付け分子を選択し、選択された対応付け分子を構成するｍＲＮＡから核酸を調製することを含む、核酸ライブラリーの製造方法。
【請求項５】
請求項３記載の核酸ライブラリー又は請求項４記載の製造方法により得られる核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を発現させることを含む、請求項１に記載のタンパク質ライブラリーの製造方法。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質ライブラリーを準備し、該ライブラリーを構成するタンパク質の構造又は機能を分析し、構造又は機能を有するタンパク質を選択することを含む、構造又は機能を有するタンパク質のスクリーニング方法。
【請求項７】
タンパク質ライブラリーが、請求項５記載の製造方法により得られるものである請求項６記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ランダム配列タンパク質ライブラリー及びそれを用いるスクリーニング方法に関する。
【背景技術】  天然のタンパク質は２０種類のアミノ酸から構成されており、これらの並び方でタンパク質の性質が決まっている。例えば、１００アミノ酸残基からなるタンパク質のアミノ酸配列は、２０１００≒１０５８通り存在する。現存する天然タンパク質は、１つの種がもつタンパク質の種類を１０４と仮定すると、地球上に存在する種の数が１０６程であるので、１０１０ほどしかない。従って、全配列の９９％以上は未知の配列であると言える。これら未知の配列を調べることにより、いまだ知られていない構造や機能をもったタンパク質を発見できる可能性がある。その際用いられるのがランダム配列タンパク質ライブラリーであり、通常には、２０種類のアミノ酸をコードする６４種のコドンがランダムに並んでいる。ここで、６４種のコドンのうちＵＡＡ、ＵＡＧ、ＵＧＡの３つは終止コドンといい、タンパク質の翻訳をそこで終結させてしまう。すなわち、６４種のコドンがランダムに並んでいると、３／６４の確率で終止コドンが出現してしまい、平均すると２０アミノ酸残基以上のタンパク質は作りにくいという問題が生じる。
Ｓｚｏｓｔａｋらは、終止コドンを用いずに、８０アミノ酸残基のタンパク質からなる、６×１０１２サイズのランダム配列ライブラリーを構築し、このライブラリーから、ＡＴＰに特異的に結合するタンパク質をスクリーニングすることに成功した。そして、ランダム配列タンパク質が機能をもつ確率が１０１１分の１程度であると推定している（非特許文献１参照）。また、Ｓａｕｅｒらは、親水性アミノ酸としてグルタミン、疎水性アミノ酸としてロイシン、タンパク質の水溶性を高める極性アミノ酸としてアルギニンの３種を選び、この３つのアミノ酸からなる７０〜９０残基をコードするランダム配列ＤＮＡライブラリーを構築し、得られるタンパク質の中に２次構造を形成するものが存在することを報告した（非特許文献２及び非特許文献３参照）。Ｒｉｄｄｌｅらは、ＳＨ３ドメインをコードするＤＮＡに変異を入れ、ＳＨ３ドメインを構成するアミノ酸をイソロイシン、リシン、グルタミン酸、アラニン、グリシンの５種類にまで減らして、構造や機能を保持できるかどうか調べた。その結果、ＳＨ３ドメインの機能を保持するタンパク質が得られ、そのタンパク質では、活性部位はほぼ保存されていたが、それ以外のアミノ酸はほとんど置換されていたことが報告された（非特許文献４参照）。以上から、ランダム配列タンパク質ライブラリーには、必ずしも２０種類のアミノ酸が含まれていなくてもよいと考えられているが、天然タンパク質と同程度の構造をもつタンパク質を得ることは未だできていない。
また、原始地球の大気を模倣した放電実験では、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ及びＡｓｐが多く得られることが知られている。
【非特許文献１】  Ｎａｔｕｒｅ，４１０，７１５−７１８（２００１）
【非特許文献２】  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，２１４６−２１５０（１９９５）
【非特許文献３】  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，８５６−８６４（１９９５）
【非特許文献４】  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４，８０５−８０９（１９９７）
【発明の開示】
本発明の課題は、構造や機能を持つタンパク質を高効率で得ることのできるタンパク質ライブラリーを提供することである。
本発明者らは、タンパク質を構成するアミノ酸に関し、種類を減らすとともに、特定の種類のアミノ酸が含まれるようにすることによって、構造や機能を持つタンパク質を高効率で得ることのできるタンパク質ライブラリーが構築できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下のものを提供する。
（１）４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質からなるタンパク質ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含む前記タンパク質ライブラリー。
（２）４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸からなる核酸ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含む前記核酸ライブラリー。
（３）前記核酸にコードされるタンパク質が発現可能である、（２）記載の核酸ライブラリー。
（４）（３）記載の核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を、該タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡとをスペーサーを介して結合させた対応付け分子として発現させ、対応付け分子を構成するタンパク質の性質に基づいて対応付け分子を選択し、選択された対応付け分子を構成するｍＲＮＡから核酸を調製することを含む、核酸ライブラリーの製造方法。
（５）（３）記載の核酸ライブラリー又は（４）記載の製造方法により得られる核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を発現させることを含む、（１）記載のタンパク質ライブラリーの製造方法。
（６）（１）記載のタンパク質ライブラリーを準備し、該ライブラリーを構成するタンパク質の構造又は機能を分析し、構造又は機能を有するタンパク質を選択することを含む、構造又は機能を有するタンパク質のスクリーニング方法。
（７）タンパク質ライブラリーが、（５）記載の製造方法により得られるものである（６）記載のスクリーニング方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、鋳型ＤＮＡの説明図である。
図２は、鋳型ＤＮＡの連結法の説明図である。
図３は、鋳型ＤＮＡ及び連結されたＤＮＡの増幅産物のアガロースゲル電気泳動分析の結果（写真）を示す。矢印はそれぞれ各段階でのランダム配列ＤＮＡライブラリーの泳動パターンの位置を示す。
図４は、クローニングベクターの構造を示す。（上）発現抑制ベクターｐＥＯＲ−ＢＡＤ−ＧＦＰ、（下）発現誘導ベクターｐＥＴ２０−ＧＦＰ。
図５は、ランダム配列タンパク質の発現の確認結果（電気泳動写真）を示す。ｓｏｌｕｂｌｅ：可溶性、ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ：不溶性、ｅｌｕｔｅ：溶出液、ｆ．ｔ：通過液。
図６は、ランダム配列タンパク質のＣＤスペクトル及び２次構造含量を示す。
図７は、ランダム配列タンパク質の蛍光スペクトルを示す。
図８は、ＡＮＳのランダム配列タンパク質存在下での蛍光スペクトルを示す。
図９は、ランダム配列タンパク質のゲルろ過の結果を示す。
図１０は、プレスクリーニングの概要を示す。
図１１は、ＳＰ６−Ω２９−ＦＬＡＧ−Ｌ２−１６−ＨｉｓＡの確認結果（電気泳動写真）を示す。
図１２は、Ｌ２−１６  ＲＮＡの生成の確認結果（電気泳動写真）を示す。
図１３は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス形成の確認結果（電気泳動写真）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】  本明細書においては、塩基の一文字記号ならびにアミノ酸の三文字記号及び一文字記号は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５に定義された意味で用いる。
＜１＞タンパク質ライブラリー
本発明のタンパク質ライブラリーは、４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列（ランダムアミノ酸配列）を有するタンパク質からなるタンパク質ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含むことを特徴とする。
本発明のタンパク質ライブラリーの構成及び製造方法は、ランダムアミノ酸配列が４〜１２種のアミノ酸からなり、このアミノ酸にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐが含まれることの他は、通常のランダム配列タンパク質ライブラリーの構成及び製造方法と同様でよい。
ランダムアミノ酸配列は、好ましくは４〜１２種のアミノ酸、さらに好ましくは５〜６種のアミノ酸からなることが好ましい。各アミノ酸の比率は、適宜選択できるが、通常には、ランダムアミノ酸配列の全アミノ酸（残基数）に対して、Ｇｌｙ  １０〜３０％、Ａｌａ  １０〜３０％、Ｖａｌ  １０〜３０％、Ｇｌｕ又はＡｓｐ  １０〜３０％（両方を用いる場合には、通常、Ｇｌｕ  ５〜１５％及びＡｓｐ  ５〜１５％）である（ここで、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐの合計は１００％以下である）。
ランダムアミノ酸配列の長さは、通常には、１０〜２００残基、好ましくは８０〜１２０残基である。
ライブラリーを構成するタンパク質種の数は、ライブラリーの用途によるが、通常には１０６〜１０１５、好ましくは１０８〜１０１２である。
本発明のライブラリーを構成するタンパク質は、ランダムアミノ酸配列に加えて、別のアミノ酸配列を有していてもよい。別のアミノ酸配列が、ポリヒスチジンペプチドなどの親和性タグであれば、その親和性を利用した精製法により、ライブラリーを構成するタンパク質を容易に精製することができる。
また、本発明のライブラリーを構成するタンパク質は、ラベル化されていてもよいし（ＷＯ  ０２／４８３９５）、また、タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡとをスペーサーを介して結合させた対応付け分子とされていてもよい（ＷＯ  ０２／４８３９５）。
＜２＞核酸ライブラリー
本発明の核酸ライブラリーは、４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸からなる核酸ライブラリーであって、前記アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐを含むことを特徴とする。
本発明の核酸ライブラリーの構成及び製造方法は、ランダムアミノ酸配列が４〜１２種のアミノ酸からなり、このアミノ酸にＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、及び、Ｇｌｕ又はＡｓｐが含まれる、タンパク質を核酸がコードすることの他は、通常のランダム配列核酸ライブラリーの構成及び製造方法と同様でよい。
４〜１２種のアミノ酸がランダムに配列されたアミノ酸配列を有するタンパク質は、上記に説明したとおりである。
核酸は、ＤＮＡでもＲＮＡでもよい。または、一本鎖及び二本鎖のいずれでもよく、二本鎖の場合にはＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドでもよい。
ランダムアミノ酸配列をコードする核酸は、Ｇで始まるコドンの繰り返しにより作成することが、製造が容易な点で好ましく、２番目の塩基がＴ、Ｃ、Ａ又はＧ、３番目の塩基がＡ又はＴであるＧＮＷのコドンがさらに好ましい。２番目及び３番目の各塩基の割合は適宜選択できる。
本発明の核酸ライブラリーにおいては、核酸にコードされるタンパク質が発現可能であることが好ましい。通常には、タンパク質をコードする核酸の５’側に、転写プロモーター及び翻訳エンハンサーを含む５’非翻訳領域を結合させ、３’側に、ポリＡ配列を含む３’末端領域を結合させた核酸とすることで、核酸にコードされるタンパク質を発現可能にすることができる。
核酸ライブラリーは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法（ＷＯ  ０２／４８３４７）によるプレセレクションを施すことにより、より精度を高めることができる。すなわち、核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を、該タンパク質とそれをコードするｍＲＮＡとをスペーサーを介して結合させた対応付け分子として発現させ、対応付け分子を構成するタンパク質の性質に基づいて対応付け分子を選択し、選択された対応付け分子を構成するｍＲＮＡから核酸を調製することにより、核酸ライブラリーを製造することができる。
上記のような核酸ライブラリーを用いて、その核酸ライブラリーの核酸にコードされるタンパク質を発現させることにより、本発明のタンパク質ライブラリーを製造することができる。
＜３＞スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質ライブラリーを準備し、該ライブラリーを構成するタンパク質の構造又は機能を分析し、構造又は機能を有するタンパク質を選択することを含む、構造又は機能を有するタンパク質のスクリーニング方法である。
本発明のタンパク質ライブラリーは、本発明の核酸配列を用いた製造方法により得られるものであることが好ましい。
本発明のスクリーニング方法は、タンパク質ライブラリーとして本発明のタンパク質ライブラリーを用いる他は、通常のランダム配列タンパク質ライブラリーを用いるスクリーニング方法と同様に実施できる。
スクリーニング方法の例としては、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法（ＷＯ  ０２／４８３４７）、ｍＲＮＡディスプレイ法（非特許文献１）、ファージディスプレイ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８，１３１５−１３１７（１９８５））、リボソームディスプレイ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，４９３７−４９４２（１９９７））、ポリソームディスプレイ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，９０２２−９０２６（１９９４））、プラスミドディスプレイ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１８６５−１８６９（１９９２））、細胞表面ディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５，２９−３４（１９９７））、エマルジョン法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６，６５２−６５６（１９９８））、ＳＴＡＢＬＥ法（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４５７，２２７−２３０（１９９９））などが挙げられる。これらの手法を用いて、標的分子と結合するタンパク質や酵素などの、構造又は機能を有するタンパク質をスクリーニングすることができる。
また、これらのスクリーニング方法で用いられる、構造又は機能の分析方法の例としては、以下の方法が挙げられる。
（１）ＣＤスペクトル測定
ＣＤスペクトルの測定によりα−ヘリックス及びβ−シート構造の情報及び２次構造含量を求めることができる。
（２）蛍光スペクトル測定
トリプトファンのような蛍光分析が可能なアミノ酸が含まれる場合、蛍光分光光度計を用いて、ランダム配列タンパク質の構造を測定できる。
（３）ＡＮＳ結合実験
ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）は、タンパク質中に疎水性コアのような構造があるとそこに入り込む性質があるので、これに伴い変化する、ＡＮＳ本来の蛍光強度及び波長のピークを測定することにより、タンパク質の構造を測定できる。
【実施例】  以下、具体的に本発明の実施例を記述するが、下記の実施例は本発明についての具体的認識を得る一助とみなすべきものであり、本発明の範囲は下記の実施例により何ら限定されるものでない。
実施例１  ライブラリーの構築及び構造を有するタンパク質のスクリーニング
（１）ランダム配列ＤＮＡの設計
ランダム配列に含まれるコドンを、１文字目はＧに固定し、２文字目はＡ，Ｔ，Ｃ，Ｇを等比率に、３文字目は、ランダム配列中のＧＣ含量を５０％にするためにＡとＴにした。ランダム配列の両端にはＴＧＧを入れ、ランダム配列がトリプトファン残基１分子を挟んで連結されるようにした。トリプトファンは、２８０ｎｍに吸収極大を示すので、ライブラリーからスクリーニングして得られるタンパク質の構造を測定するのに利用できる。トリプトファンの両側には、ランダム配列の連結に用いるＢｓａＩとＢｂｓＩサイト、及び、クローニングの際に用いるＢｇｌＩＩとＸｈｏＩを挿入した。また、ランダム配列のコドン２文字目と３文字目の塩基の比率を変えたＤＮＡライブラリー（Ｌ２）も合成した（図１）。鋳型ＤＮＡの塩基配列を配列番号１に示す。ライブラリー構築の鋳型となる合成ＤＮＡの配列は８８ｂｐで、ランダム配列内のＧＣ含量はＬ１が５０％、Ｌ２では５５％である。
（２）鋳型ＤＮＡの連結法
（２−１）鋳型ＤＮＡの増幅
０．５ｎＭの鋳型ＤＮＡ、１．２５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５μＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘ、ならびに、以下に示す塩基配列を有するそれぞれ０．４μＭのプライマーＧＮＷ−Ｆｗ及びＧＮＷ−Ｒｖを含む反応液５０μｌを用いて増幅を行った。ＰＣＲプログラムは、Ｌ１ではＫＫ２５−６０、Ｌ２ではＫＫ２０−７１（下記ＰＣＲプログラム参照）とした。
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（２−２）フェノール、クロロホルム処理
（２−１）のＰＣＲ反応終了後に、反応液に、反応液と等量のフェノールを加えて混合し、１２，０００ｒｐｍで３分間遠心して水層を回収した。さらに回収した水層と等量のクロロホルムを加えて同様の操作を行い、反応液中のＤＮＡポリメラーゼを失活させた。回収したＤＮＡをさらにエタノール沈澱によって精製し、１０μｌの滅菌水に溶かした。
（２−３）制限酵素反応
（２−２）までの操作で得られた溶液の５μｌ、ＮＥＢｕｆｆｅｒ３の１μｌ、及び、ＢｓａＩの０．５μｌを混合し、滅菌水を加えて１０μｌとし、５０℃で１時間インキュベートした。残りの５μｌ、１μｌのＮＥＢｕｆｆｅｒ２、及び、０．５μｌのＢｂｓＩを混合して、滅菌水で１０μｌにメスアップし、３７℃で１時間インキュベートした。反応液を３％アガロースゲルで電気泳動し、ランダム配列が含まれる断片をレコチップを用いて回収した。
（２−４）ライゲーション
ＢｓａＩによる断片及びＢｂｓＩによる断片のそれぞれ５μｌ、ならびに、ライゲーションハイ（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ）の１０μｌを混合して１６℃で１時間インキュベートしてライゲーションした。ライゲーション反応終了後、再びＰＣＲプログラムＫＫ２５−６０またはＫＫ２０−７１のＰＣＲ反応を行ってＤＮＡを増幅した。（２−３）及び（２−４）の工程を３サイクル繰り返し、鋳型ＤＮＡを連結した（図２）。
（２−３）及び（２−４）の工程では、増幅した合成ＤＮＡをランダム配列の両端にあるＢｂｓＩ又はＢｓａＩサイトで切断することにより、どちらも５’末端にトリプトファン（ＴＧＧ）を含む相補的な４塩基が突出し、そして、この部分をライゲーションすることにより、間にトリプトファン残基を１個挟んで１５アミノ酸残基のランダム配列がが２個連結される。この操作を１サイクルとし、計３サイクル行って、１２０アミノ酸残基のランダム配列タンパク質ライブラリーが構築できる。３サイクル後にできるライブラリーのサイズは５１２０≒１０８３になる。
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上記の連結の操作で連結されたＤＮＡを増幅したものを２％アガロースゲル電気泳動で分析した結果を図３に示す。それぞれの段階でのＤＮＡの長さは、８８ｂｐ（鋳型）、１３６ｂｐ（１サイクル）、２３２ｂｐ（２サイクル）、４２４ｂｐ（３サイクル）であった。図中、矢印はそれぞれ各段階でのランダム配列ＤＮＡライブラリーの泳動パターンの位置を示す。サイクル数が増えるごとに非特異的増幅と思われるスメアなバンドが増えて来ているが、予想される位置にバンドが見られ、ライブラリーが構築できているのがわかる。
（４）ベクターの構築
（４−１）発現抑制ベクターの構築
ランダム配列ＤＮＡライブラリーをクローニングする際に、ランダム配列からつくられるタンパク質が大腸菌にとって有害であると、大腸菌の生育に支障をきたすので、ランダム配列がコードするタンパク質の発現を抑制するベクターを構築した。発現抑制には、グルコースを過剰に供給することで発現を抑制し、アラビノースを大量に加えることで発現を促進する作用をもつプロモーターであるＢＡＤプロモーターを用いた［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７，４１２１−４１３０（１９９５）］。ＧＦＰ遺伝子に、下表に示す塩基配列を有するプライマーＴ７−ＧＦＰ及びＧＦＰ−Ｈｉｓを用いてＰＣＲを行い、Ｎ末端にＴ７ｔａｇ、Ｃ末端にＨｉｓ  ｔａｇをつけたＴ７−ＧＦＰ−Ｈｉｓを構築した。ｐＥＯＲ−ＢＡＤ及びＴ７−ＧＦＰ−ＨｉｓをＮｈｅＩとＳａｃＩで切断し、それぞれアガロースゲルから回収した。回収したＤＮＡをｌｉｇａｔｏｎ  ｈｉｇｈを用いて１６℃で１時間インキュベートしてライゲーションし、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質転換した大腸菌をアンピシリン含有プレートにまき、３７℃で１晩インキュベートした。形成したコロニーの内、ＧＦＰが発現して緑色蛍光を発するものから、ＣＯＮＣＥＲＴ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ  ＫＩＴを用いてプラスミドを抽出し、ｐＥＯＲ−ＢＡＤ−ＧＦＰ（図４）を得た。
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（４−２）大量発現用ベクターの構築
構築したＤＮＡライブラリーを鋳型にしてタンパク質を大腸菌内で大量発現させるため、ｐＥＴ  ｓｙｓｔｅｍを用いたベクターを構築した。ｐＥＴ２０−ＳＴＡとｐＥＯＲ−ＢＡＤ−ＧＦＰをそれぞれＮｈｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＥＴ２０を含むＤＮＡとＧＦＰを含むＤＮＡをレコチップによって回収した。これらをｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈを用いてライゲーションし、ＤＨ５αに形質転換してアンピシリン含有プレートで１晩培養した。（４−１）と同様にコロニーからプラスミドを抽出し、ｐＥＴ２０−ＧＦＰを得た（図４）。
図４には、ライブラリーのクローニング時に用いるＢｇｌＩＩとＸｈｏＩの制限酵素サイトを示す。ｐＥＯＲ−ＢＡＤ−ＧＦＰ及びｐＥＴ２０−ＧＦＰのいずれもアンピシリン耐性遺伝子をもつ。
（５）ライブラリーのクローニングならびにタンパク質の発現及び精製
構築したライブラリーをｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴＡクローニングを行った。アンピシリン含有ＬＢ培地で一晩培養することにより形成したコロニーからプラスミドを抽出してランダム配列部分の配列解析を行った。具体的には、形成したコロニーをコロニーＰＣＲに付し、ＰＣＲ産物をアガロースゲルで電気泳動し適切な長さのバンドが確認できたコロニーをアンピシリン含有ＬＢ液体培地で培養し、ＣＯＮＣＥＲＴ  ＭＩＮＩＰＲＥＰ  ＫＩＴによってプラスミドを抽出し、プライマーとして、ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙの場合はＴ７ＦＧとＰｓｐ６、ｐＥＯＲ−ＢＡＤ−ＧＦＰの場合はＮｃＴ７ｔａｇＦとｒｒｎＢＴｅｒ、ｐＥＴ２０−ＧＦＰの場合は、Ｔ７ＦとＴ７Ｒ（各プライマーの配列は下記表に示す）を用いて、ＣＥＱ２０００（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）でランダム配列の塩基配列解析を行った。
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塩基配列の解析の結果、ライブラリーＬ１中のアミノ酸組成は、Ｇｌｙ２４％、Ｖａｌ４１％、Ａｌａ１８％、Ｇｌｕ７％及びＡｓｐ１０％であり、ライブラリーＬ２中のアミノ酸組成は、Ｇｌｙ２９％、Ｖａｌ２０％、Ａｌａ２８％、Ｇｌｕ１２％及びＡｓｐ１１％であった。Ｌ２の方が、５種類のアミノ酸がバランスよく含まれていたため、以下の実験では、ライブラリーＬ２を用いた。
塩基配列の解析結果に基づき、得られたランダム配列中に終止コドンが出現していないサンプルを、発現ベクターｐＥＴ２０−ＧＦＰ（図４）にクローニングした。クローニングしたものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コドンプラス（ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ）に形質転換し、アンピシリン及びクロラムフェニコール含有ＬＢ寒天培地で培養した。さらに１晩液体培地中で培養し、３ｍｌの培地中で吸光度（６００ｎｍ）が０．６〜０．７になるまで培養した。吸光度が０．６を超えた時点でＩＰＴＧを最終濃度で０．１ｍＭ加えてさらに３時間培養することでランダム配列タンパク質を大量合成した。菌体をＢｕｇ  Ｂｕｓｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて破砕し、Ｔ７タグに対する抗体によるウェスタンブロッティング及びＣＢＢ染色によって大量合成を確認した。また、Ｃ末端のＨｉｓタグによるＮｉ−ＮＴＡアガロースへの吸着を同様に確認した。吸着が確認されたタンパク質を、坂口フラスコ１本（２５０ｍＬ）分大量合成して同様の操作によってランダム配列タンパク質を精製した。精製したランダム配列タンパク質を透析によって３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ８．０）にバッファー交換した後、ＣＤスペクトルや蛍光強度の測定に用いた。尚、ランダム配列タンパク質の精製に用いた条件を下記に示す。
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塩基配列解析の結果、計１６２種類のランダム配列を解析して、終止コドンを含まないサンプルを１０個得た。各ランダム配列（示したアミノ酸残基数はＷ以外の残基数である）を以下に示す。Ｌ２−６８は５種類のアミノ酸以外のアミノ酸も含んでいるが、配列中に終止コドンが出現していなかったので、サンプルに含めた。
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大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓを用いて、小スケールで大量発現させたランダム配列タンパク質を、Ｃ末端のＨｉｓタグを用いてＮｉ−ＮＴＡアガロース（ＱＩＡＧＥＮ）に吸着させてから溶出した結果を図５に示す。
（６）大量精製したランダム配列タンパク質の構造評価
（５）で得られたサンプルからＬ２−１３、１６、１８、１９、２９、６８、８５及び８８の８個をピックアップし、それらのタンパク質を大腸菌内で大量発現、精製した。
大腸菌内で大量発現、精製したランダム配列タンパク質は、可溶性タンパク質はイミダゾール、不溶性タンパク質は尿素で変性させた状態であるので、透析によってバッファーをリン酸バッファー（ｐＨ８．０）に交換するとともに、不溶性タンパク質を再度折り畳ませた。以下の測定においては、特記しない限り、ランダム配列タンパク質はこの状態で用いた。
（６−１）ＣＤスペクトル測定
各タンパク質のＣＤスペクトルを測定した。大量精製の際に各タンパク質で濃度に大きな差があったため、測定時のタンパク質濃度を、Ｌ２−１３、１８、６８及び８８は１μＭに、Ｌ２−１６、１９、２９及び８５は３μＭに調節した。スペクトル測定は４℃で行い、スペクトルの積算回数は４回とした。
（６−２）蛍光スペクトル測定
蛍光分光光度計を用いて、ランダム配列タンパク質中に含まれるトリプトファンの蛍光強度を測定した。測定は全てタンパク質濃度１μＭで行った。
（６−３）ＡＮＳ結合実験
ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）は、タンパク質中に疎水性コアのような構造があるとそこに入り込む。これにより、ＡＮＳ本来の蛍光強度及び波長のピークが変化するという性質をもつ。ランダム配列タンパク質１μＭに対し、ＡＮＳを５０μＭ加えて測定した。
（６−４）ゲルろ過による分子量測定
各ランダムタンパク質が凝集しているかどうかを確認するために、ゲルろ過を行った。大腸菌から精製したランダムタンパク質を透析によって３０ｍＭ  リン酸バッファー（ｐＨ７．０）にバッファー交換した後、ゲルろ過を行った（カラム：Ｓｈｏｄｅｘ  ＫＷ−８０３、バッファー：３０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）＋１５０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、流速：１．０ｍｌ／ｍｉｎ）。同様の条件で、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈより購入したＬＭＷ  Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔｓを用いて検量線を作成した。
以上の測定による構造評価の結果を図６〜９に示す。
図６は、各ランダム配列タンパク質のＣＤスペクトル及び２次構造含量を示す。測定濃度が異なるものがあるが、値は全てθに直して表示している。２２２ｎｍの値を見ると、Ｌ２−１８及び２９はランダムコイルの波形であるが、それ以外はα−ヘリックスやβ−シートなどの二次構造をもつことが示唆される。Ｌ２−１３はβ−シート構造の波形に近い。
図７は、トリプトファンの蛍光スペクトルの測定結果を示す。
大部分のランダム配列タンパク質は極大波長が３５０ｎｍ付近にあり、トリプトファンが溶媒に露出して自由な環境におかれていることを示しているが、Ｌ２−１３では、波長が低波長側にシフトしており、トリプトファンが非対称な環境におかれていることから三次構造の存在が示唆される。
図８は、ＡＮＳ結合実験の測定結果を示す。Ｌ２−１３、１６、１８、８８では、ＡＮＳの蛍光強度が増大していることから、これらのタンパク質にはＡＮＳが結合できるような疎水性のクラスターが形成されていることが分かる。
図９は、ゲルろ過による分子量測定の結果を示す。Ｌ２−１６は２箇所のピークが見られたが、その小さいほうのピークも含めて、測定した全てのランダム配列タンパク質において、モノマーの分子量に近い位置にピークが見られた。したがって、Ｌ２−１６では一部のタンパク質が３〜４量体を形成しているが、他のタンパク質はすべて会合体や凝集などを起こすことなく、モノマーで存在していることがわかる。アミノ酸配列から予想されるモノマーの分子量と比べて１．３〜１．９倍大きくなっているのは、検量線を作成するのに用いた天然の球状タンパク質ほど構造がコンパクトではなく若干膨潤しているためであると考えられる。
以上の測定の結果をまとめて表７に示す。８個のランダム配列タンパク質のうちＬ２−２９以外は全て、二次構造ないし疎水性クラスター構造の存在を示しており（下線の数字）、このことは、ランダム配列ライブラリーのうち８０％以上が構造形成能をもつ可能性を強く示唆している。ゲルろ過の結果から、これらの構造形成の原因はランダム配列タンパク質が凝集を起こしているためではなく、それぞれのタンパク質が単独で構造形成能をもっていることがわかる。このような高い構造形成能からみて、機能を有するものの割合も高いことが推測される。
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実施例２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス法を用いたライブラリーのプレセレクション
実施例１で用いたランダム配列ライブラリーは、フレームシフトを含まないサンプルの確率が低い（インフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）のサンプルが得られる確率はおよそ７％）。そこで、ＤＮＡライブラリーを構築した時点でプレセレクションを行い、ライブラリーの精度を高めることにした。ここでは、ポジティブコントロールとして配列が確認されているＬ２−１６を用いることとした。
図１０にプレセレクションの概要を示す。ライブラリーＤＮＡにＰＣＲによってＮ末端にＳＰ６プロモーター、Ω２９、及びＦＬＡＧタグを、Ｃ末端にはＨｉｓタグとポリＡテイルを付加し、転写してＲＮＡとする。生成したＲＮＡの３’末端にＰＥＧスペーサーとピューロマイシンを連結し、小麦胚芽の系で無細胞翻訳させることによりｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスが形成される。これをＣ末端のＨｉｓタグを用いてＮｉビーズにより精製すると、ライブラリー中に終止コドンが入っていたり、フレームシフトが起きたりしてＨｉｓタグが発現していないＤＮＡは精製されない。この操作により、ライブラリーの精度を上げることができる。
（１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスに用いるコンストラクトの作成
Ｌ２−１６のＤＮＡに、ＰＣＲ（プライマーＦＬＡＧ−ＦとＨｉｓＡ−Ｒ）によってＮ末端にＦＬＡＧタグを、Ｃ末端にＨｉｓタグとアデニンを６個付加し、さらにＰＣＲ（プライマーＳＰ６０ＦとＨｉｓＡ−Ｒ）反応を行って、ＦＬＡＧタグの前にＳＰ６、Ω２９を付加した。プライマー配列を以下に示す。
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ＤＮＡポリメラーゼはＫＯＤ  ｄａｓｈを用い、プログラムは、ＦＬＡＧ付加の場合は｛９４℃→９４℃２’→｛９４℃３０”→５８℃３０”→７３℃４５”｝×２５→７３℃５’→４℃｝、ＳＰ６付加では｛９４℃→９４℃２’→｛９４℃３０”→５８℃３０”→７３℃４５”｝×３０→７３℃５’→４℃｝とした。また、ＳＰ６付加のＰＣＲは１００μｌスケールを２本反応した。このＰＣＲ産物をＱＩＡ  ｑｕｉｃｋによって１本にまとめて３０μｌスケールに濃縮して以降の操作に用いた。
ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで電気泳動した結果を図１１に示す。コンストラクトの全長は４５８ｂｐである。
（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写
（１）で調製したＰＣＲ産物の濃度を測定し、Ｒｉｂｏｍａｘ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて転写した。反応条件は、２．５μｇ  ＤＮＡ、５ｍＭ  ｒＮＴＰ（ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＵＴＰ）、０．４ｍＭ  ＧＴＰ、１．６ｍＭ  ｃａｐ、及び付属の５×バッファーとＳＰ６  ｅｎｚｙｍｅ  ｍｉｘを混合し、ＤＥＰＣ処理水で２５μｌに合わせた。反応液を３７℃で３時間インキュベートして転写反応を行った。反応後、反応液１μｌを回収し、残りにＤＮａｓｅ  Ｉを２．５μｌ加えて３７℃で１５分インキュベートしてＤＮＡを分解した。ＤＮａｓｅ処理後の反応液を１μｌ回収し、ＤＮａｓｅ処理前の反応液とともにアガロースゲルで電気泳動してＲＮＡの生成とＤＮＡの分解を確認した。反応液を、ＲＮｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて精製した。
Ｌ２−１６  ＲＮＡの生成を２％アガロースゲルでの電気泳動により確認した結果を図１２に示す。レーン１は転写直後のサンプル。レーン２は転写産物にＤＮａｓｅ  Ｉを加えてＤＮＡを除去したサンプル。濃いバンドがＲＮＡ、ＲＮＡバンドの上の薄いスメア部分がＤＮＡ。ＲＮＡの生成及びＤＮＡの除去が確認できる。
（３）ＰＥＧスペーサー及びピューロマイシンのライゲーション
精製したＲＮＡの濃度を測定し、ＰＥＧスペーサー及びピューロマイシンをライゲーションした。反応条件は１５℃で２０ｈｒインキュベート、反応液組成は、０．２μＭ  ＰＥＧ−ｐｕｒｏ、０．２μＭ  ＰＥＧ２０００、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．８ｍＭ  ＡＴＰ、２％  ＢＳＡ、１０％  ＤＭＳＯで、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて行った。ライゲーション産物を、ＲＮｅａｓｙを用いて精製し、吸光度から濃度を求めた。
（４）ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス形成
ライゲーション産物を小麦胚芽（Ｐｒｏｍｅｇａ）の系を用いて無細胞翻訳し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスを形成させた。反応条件は２５℃、１時間で行い、反応液組成は、小麦胚芽液１０μｌ、２ｐｍｏｌ  ＲＮＡ、１ｍＭ  アミノ酸ｍｉｘ１．６μｌ、ＲＮａｓｅインヒビター０．４μｌを混合し、ＤＥＰＣ処理水で２０μｌとした。反応終了後、反応液を８Ｍ  尿素／８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動してｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルスの形成を確認するとともに、ピューロマイシンの蛍光をもとに、蛍光イメージャーを用いて対応付け効率を求めた。その結果、対応付け効率は３５％であった（図１３）。図中、矢印で示した上のバンドがｉｎ  ｖｉｔｒｏウイルス、下のバンドがＲＮＡとＰＥＧ−ピューロマイシンのライゲーション産物をあらわしている。
【産業上の利用可能性】  本発明によれば、構造や機能を持つタンパク質を高効率で得ることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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