(57)【要約】一部の実施形態では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者のＧＩバリアの試料を提供することと；ＧＩバリアの状態を決定するために試料を分析することと；患者のＧＩバリア状況を正常または異常と分類することとを含み、異常なＧＩバリア状況により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。一部の実施形態では、患者はヒトである。一局面では、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）上記患者の胃腸（ＧＩ）バリアの試料を提供することと、（ｂ）上記ＧＩバリアの状況を決定するために上記試料を分析することと、（ｃ）上記患者のＧＩバリア状況を正常または異常と分類することとを含み、異常なＧＩバリア状況により、上記患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される。
2020507062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、
（ａ）前記患者の胃腸（ＧＩ）バリアの試料を提供することと、
（ｂ）前記ＧＩバリアの状況を決定するために前記試料を分析することと、
（ｃ）前記患者のＧＩバリア状況を正常または異常と分類することと
を含み、異常なＧＩバリア状況により、前記患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法。
【請求項２】
前記患者が、メタボリック症候群、がん／新生物、特発性炎症状態、神経障害および代謝性骨疾患からなる群より選択される疾患を有しているか、または発症する可能性が高い、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者の前記ＧＩバリアの状況が、前記患者の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼの量を測定することによって分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
活性化されたカスパーゼが、前記患者のＧＩバリアの細胞を、カスパーゼ−１特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで、またはカスパーゼ−１阻害剤にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを含むプローブで染色することによって測定される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１、活性化されたカスパーゼ３、または活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組み合わせである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
１名または複数の健康な被験体の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼの量との比較での、前記患者における活性化されたカスパーゼの量の約２〜４倍の増加が、前記患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化されたカスパーゼが、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比として表される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
１．５：１より大きい、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比が、前記患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記患者の前記ＧＩバリアの状況が、腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色により視覚化されたギャップの数を数えることによって分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１名または複数の健康な被験体の腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数との比較での、前記患者におけるギャップの数の約２〜４倍の増加が、前記患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＩバリアの状況が、前記ＧＩバリアの共焦点レーザー内視鏡法または多光子共焦点顕微鏡法を使用して分析される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＩバリアが、頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腸管壁漏洩症候群が結腸直腸新生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、
ａ．前記患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することと、
ｂ．前記患者の染色された前記ＧＩ細胞を、前記患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能な抗体の存在について検査することと
を含み、
上昇したレベルのカスパーゼ−１により、前記患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法。
【請求項１５】
前記ＧＩバリアが、頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記染色することが、（ｉ）患者の腸管上皮細胞を前記患者から生検または吸引によって得るステップと、（ｉｉ）前記細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで染色するステップとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＧＩバリア細胞を、カスパーゼ−３特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出可能なマーカーが蛍光性であり、前記検査することが、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、共焦点レーザー内視鏡法、蛍光フローサイトメトリーにより、または蛍光プレートリーダーを使用することにより実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
染色することが、カスパーゼ−１抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを前記患者の腸管内の腸管上皮細胞に適用することを含み、検査することが、染色された細胞を内視鏡的に視覚化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
検出可能なマーカーが量子ドットである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記量子ドットが、６２５ｎｍ、または５２５ｎｍ〜８００ｎｍの範囲、または６０５ｎｍおよび６１２ｎｍの発光スペクトルを有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
死細胞または死につつある細胞を同定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
死細胞または死につつある細胞が、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して同定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
１名または複数の健康な被験体のＧＩバリアのＧＩバリア細胞におけるカスパーゼ−１の量との比較での、前記患者におけるカスパーゼ−１の量の約２〜４倍の増加が、前記患者が腸管壁漏洩症候群を有していることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記腸管壁漏洩症候群が結腸直腸新生物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が、メタボリック症候群、がん／新生物、特発性炎症状態、神経障害および代謝性骨疾患からなる群より選択される疾患を有しているか、または発症する可能性が高い、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、
ａ．前記患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１阻害剤にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することと、
ｂ．前記患者の染色された前記ＧＩ細胞を、前記患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能な抗体の存在について検査することと
を含み、
上昇したレベルのカスパーゼ−１により、前記患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本特許出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮出願第６２／４４０，５１４号の利益を主張し、その出願の全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
技術分野
本発明は、生物学および薬の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃腸（ＧＩ）管は、動物（例えばヒトなどの脊椎動物）の口から肛門までの長く曲がりくねったチューブとしてつながっている一連の中空器官である。胃腸（ＧＩ）管を構成する中空器官は、口、食道、胃、小腸、直腸を含む大腸（結腸としても公知）および肛門である。食物（固体および液体の両方）は口に入り、ＧＩ管の中空器官を介して肛門まで通過する。
【０００３】
消化は、ＧＩ管を介して食物を移動させることにより働く。食物は口に入り、咀嚼および消化液である唾液で分解される。次いで、それは飲み込まれ、食道を通って、胃酸が食物をさらに分解する胃へと移動する。次いで、消化された食物は小腸に進み、そこで消化液と混合されることにより、食物の大きい分子がより小さい分子へと分解される。次いで、身体はこれらのより小さい分子を小腸の壁を通して血流へと吸収し、血流は身体の残りの部分にそれらを送達する。消化の廃棄物は大腸を通過し、便または糞便と呼ばれる固形物として肛門を通って体外に出る。
【０００４】
腸内細菌叢またはマイクロバイオームとも呼ばれるＧＩ管内の細菌は、消化を助ける。神経系および循環系の部分も消化プロセスにおいて役割を果たす。一緒になって、神経、ホルモン、細菌、血液および消化器系器官の組み合わせは、動物が毎日摂取する食物（例えば固体および液体）を消化するという複雑な作業を完了する。
【０００５】
ＧＩ管はチューブであるので、ＧＩ管チューブの管腔は実際には動物の身体の外側であることに留意することが重要である。したがって、ＧＩ管を裏打ちする細胞は、実際には身体と外界の間にバリアを作っている。また身体と外界の間の別のバリアである皮膚の損傷または創傷は、物体（例えば細菌またはウイルスなどの病原体）が入る身体内への開口部となり得るのと同じように、ＧＩ管の損傷も感染につながり得る。
【０００６】
腸管壁漏洩症候群（ｌｅａｋｙ  ｇｕｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（また腸管透過性の増加としても公知）は、ＧＩ管の損傷によって引き起こされる。
【０００７】
多くの場合、腸管壁漏洩症候群は非常に小さい損傷から始まるので、容易にまたは迅速に検出されない。それが検出される時には、ＧＩ管の損傷が実質的であり得、動物において症状の進行に結びつき得る。
【０００８】
したがって、腸管壁漏洩症候群を迅速に検出する改良された方法および試薬が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者のＧＩバリアの試料を提供することと、ＧＩバリアの状況を決定するために試料を分析することと、患者のＧＩバリア状況を正常または異常と分類することとを含み、異常なＧＩバリア状況により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。
【００１０】
一部の実施形態では、患者は、メタボリック症候群、がん／新生物、特発性炎症状態、神経障害および代謝性骨疾患からなる群より選択される疾患を有しているか、または発症する可能性が高い。一部の実施形態では、患者はヒトである。
【００１１】
一部の実施形態では、患者のＧＩバリアの状況は、患者の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼの量を測定することによって分析される。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１、活性化されたカスパーゼ３、または活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組み合わせもしくは合計である。一部の実施形態では、１名または複数の健康なボランティアまたは被験体の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼの量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼの量の約２〜４倍の増加は、患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す。
【００１２】
一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比である。一部の実施形態では、１．５：１より大きい、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比は、患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す。
【００１３】
一部の実施形態では、患者のＧＩバリアの状況は、腸管バリアでの腸管表面の組織学的染色によりギャップの数を数えることによって分析される。一部の実施形態では、１名または複数の健康なボランティアの腸管バリアでの腸管表面におけるギャップの数との比較での、患者におけるギャップの数の約２〜４倍の増加は、患者のＧＩバリア状況が異常であることを示す。
【００１４】
一部の実施形態では、ＧＩバリアの状況は、ＧＩバリアの共焦点レーザー内視鏡法または多光子共焦点顕微鏡法を使用して分析される。一部の実施形態では、ＧＩバリアは、頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアからなる群より選択される。
【００１５】
胃腸管における微生物の不均衡によって生じる胃腸バリアの機能不全または「腸管壁漏洩」はディスバイオシス（ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）と呼ばれ、過敏性腸症候群および炎症性腸疾患などの疾患状況の発症をもたらし得る。我々の腸内マイクロバイオームと腸管との複雑な関係を調査することにより、微生物組成と腸管バリア機能における摂動が、全身性疾患、例えば、メタボリック症候群（１）、脂肪肝疾患（２）、肥満（３、４）、ポリープ、例えば腺腫様ポリープを含む新生物およびがん（５）、自己免疫または炎症状態（６）、神経障害（７）、ならびに骨疾患（８）に至る場合があることが明らかになった。本発明は、管腔洗浄、組織生検、擦過、ブラッシングまたは切除検体のいずれかにより患者から得られた組織試料を使用して、腸管バリア機能状況を検出するための方法を提供する。腸管壁漏洩関連症候群：メタボリック症候群（糖尿病／高血圧症／高脂血症を含むがこれらに限定されない）、がん、特発性炎症状態（例えば関節リウマチ）、神経障害（例えば多発性硬化症）および代謝性骨疾患（成人における骨粗鬆症および小児における一次成長不全を含むがこれらに限定されない）が疑われる患者から得られた試料は、バリア機能状況について下記に提供される方法を使用して分析することができる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、以前に報告されているように（特許番号ＷＯ２０１４／０３９６９９  Ａ１）、カスパーゼ−１阻害剤（ＦＬＩＣＡ）を使用し、新鮮なまたは凍結した組織を使用し、管腔洗浄／擦過／ブラッシングを使用してバリア機能不全を同定するための方法を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、パラフィン固定生検または切除試料において腸管バリア機能状況を同定する方法を提供する。
【００１８】
本発明の様々な態様の様々な実施形態では、腸管バリアの状況は、腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１発現の量を計算または測定することによって分析される（または決定される）。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ３である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組み合わせである。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１の発現の量の活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比である。
【００１９】
一部の実施形態では、健康なボランティアの腸管試料の腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１発現の量の約２倍の増加は、患者の状況が異常であるか、または患者が「腸管壁漏洩」を有していることを示す。一部の実施形態では、１名または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１と３の発現の合わせた量の約２〜４倍の間の増加は、患者の状況が上記の疾患状況について腸管壁漏洩を示していることを示す。
【００２０】
一部の実施形態では、腸管バリアの状況は、腸管表面の組織学的染色においてギャップまたは押出しゾーン（ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ  ｚｏｎｅ）の数を数えることにより分析または決定される。一部の実施形態では、１名または複数の健康なボランティアの腸管バリアの腸管表面におけるギャップの数との比較での、患者におけるギャップの数の約２倍の増加は、患者がバリア機能不全または腸管壁漏洩を有していることを示す。
【００２１】
本発明の様々な態様の一部の実施形態では、腸管バリアの状況は、腸管内層およびバリアの共焦点レーザー内視鏡法、多光子共焦点顕微鏡法または蛍光顕微鏡法を使用して分析または決定される。
【００２２】
一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、患者のＧＩバリアの細胞を、カスパーゼ−１特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで、またはカスパーゼ−１阻害剤にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを含むプローブで染色することによって測定される。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することと、患者の染色されたＧＩ細胞を、患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能な抗体の存在について検査することとを含み、健康な被験体の細胞との比較での、患者の細胞における上昇した／正常より高いレベルのカスパーゼ−１により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。
【００２４】
一部の実施形態では、カスパーゼ−１特異的抗体は、活性化されたカスパーゼ−１に結合する。
【００２５】
一部の実施形態では、ＧＩバリアは、頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアからなる群より選択される。
【００２６】
一部の実施形態では、染色することは、（ｉ）患者の腸管上皮細胞を患者から生検または吸引によって得るステップと、（ｉｉ）細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで染色するステップとを含む。
【００２７】
一部の実施形態では、方法は、カスパーゼ−３特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーでＧＩバリア細胞を染色することをさらに含む。
【００２８】
一部の実施形態では、抗体は、活性化されたカスパーゼ−３に結合する。
【００２９】
一部の実施形態では、１．５：１より大きい、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される。
【００３０】
一部の実施形態では、健康な被験体の腸管試料の腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１発現の量の約２倍の増加は、患者の状況が異常であるか、または患者が「腸管壁漏洩」を有していることを示す。一部の実施形態では、１名または複数の健康な被験体の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１と３の発現の合わせた量の約２〜４倍の間の増加により、上記のように、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される。
【００３１】
一部の実施形態では、検出可能なマーカーは蛍光性であり、検査することは、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、共焦点レーザー内視鏡法、蛍光フローサイトメトリーにより、または蛍光プレートリーダーを使用することにより実施される。
【００３２】
一部の実施形態では、染色することは、カスパーゼ−１抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを患者の腸管内の腸管上皮細胞に適用することを含み、検査することは、染色された細胞を内視鏡的に視覚化することを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、検出可能なマーカーは量子ドットである。
【００３４】
一部の実施形態では、量子ドットは、６２５ｎｍ、または５２５ｎｍ〜８００ｎｍの範囲、または６０５ｎｍおよび６１２ｎｍの発光スペクトルを有する。
【００３５】
一部の実施形態では、方法は、死細胞または死につつある細胞を同定するステップをさらに含む。
【００３６】
一部の実施形態では、死細胞または死につつある細胞は、ＴＵＮＥＬアッセイを使用して同定される。
【００３７】
一部の実施形態では、１名または複数の健康な被験体のＧＩバリア細胞におけるカスパーゼ−１の量との比較での、患者のＧＩバリア細胞におけるカスパーゼ−１の量の約２〜４倍の増加は、患者が腸管壁漏洩症候群を有していることを示す。
【００３８】
一部の実施形態では、患者はヒトである。
【００３９】
一部の実施形態では、腸管壁漏洩症候群は新生物である。
【００４０】
一部の実施形態では、腸管壁漏洩症候群は結腸直腸新生物である。
【００４１】
一部の実施形態では、患者は、メタボリック症候群、がん／新生物、特発性炎症状態、神経障害および代謝性骨疾患からなる群より選択される疾患を有しているか、または発症する可能性が高い。
【００４２】
一部の実施形態では、方法は、活性化されたカスパーゼ−１および／または活性化されたカスパーゼ−３を検出する。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、パラフィン固定生検または切除試料を使用する。
【００４４】
第３の態様では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１阻害剤にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを含むプローブで染色することと、患者の染色されたＧＩ細胞を、患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能なプローブの存在について検査することとを含み、上昇したレベルのカスパーゼ−１により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。
【００４５】
一部の実施形態では、プローブは、カスパーゼ−１阻害剤と蛍光色素とのコンジュゲートである。
【００４６】
一部の実施形態では、カスパーゼ−１阻害剤はＦＬＩＣＡである。
【００４７】
一部の実施形態では、プローブは、テトラペプチドＹＶＡＤ（配列番号１）と蛍光色素とのコンジュゲートである。
【００４８】
一部の実施形態では、プローブは、Ａｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫ（配列番号１）を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、プローブは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫ（配列番号２）の構造を有する。
【００５０】
本特許のファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラーの図面を含む本特許のコピーは、請求し必要な料金を支払うことにより特許庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】図１は、腸管内層からのカスパーゼ−１活性化によって媒介される、上皮細胞のピロトーシスによる押出し（ｐｙｒｏｐｔｏｔｉｃ  ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）を示す概略図である。また細胞が押出された後に残った細胞間の上皮ギャップまたは押出しゾーンも示されている。ギャップは閉じられず、腸管管腔に対して開いたままであり、それによって、腸管壁漏洩をもたらす。
【００５２】
【図２】図２は、腸管上皮細胞（ＩＥＣ）における活性化されたカスパーゼ１の染色を示す写真画像である。白色矢頭は活性化されたカスパーゼ１に対して陽性に染色されたＩＥＣを指し、赤色矢頭はＣＤ３（Ｔ細胞マーカー）に対して陽性に染色された上皮内リンパ球を指す。
【００５３】
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、市販のＴＵＮＥＬ染色を使用した核断片化についての腸管上皮細胞（ＩＥＣ）の染色を示す写真画像であり（図３Ａ）、これは活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の両方を染色する（図３Ｂ）。図３Ａにおいて、白色矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわち、核断片化を有する細胞）を指す。図３Ｂにおいて、白色矢印は、活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞を指す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、市販のＴＵＮＥＬ染色を使用した核断片化についての腸管上皮細胞（ＩＥＣ）の染色を示す写真画像であり（図３Ａ）、これは活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の両方を染色する（図３Ｂ）。図３Ａにおいて、白色矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞（すなわち、核断片化を有する細胞）を指す。図３Ｂにおいて、白色矢印は、活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞を指す。
【００５４】
【図４】図４は、健康な被験体由来の、粘膜生検によって得られた活性化されたカスパーゼ−１陽性上皮細胞の、腸管壁漏洩および結腸直腸新生物を有する患者のものに対するパーセンテージを示すグラフである。
【００５５】
【図５Ａ】図５は、一次モノクローナル活性化カスパーゼ−１抗体を使用して染色した健康な患者（５Ａ）、結腸直腸がんを有する患者（５Ｂ）；ならびに量子ドットコンジュゲート型抗体（５Ｃ）を使用して染色した腸管壁漏洩および結腸直腸新生物を有する患者由来の腸管生検試料の代表的な画像を提示する。白色矢頭は、粘膜生検試料におけるカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞を示す。
【図５Ｂ】図５は、一次モノクローナル活性化カスパーゼ−１抗体を使用して染色した健康な患者（５Ａ）、結腸直腸がんを有する患者（５Ｂ）；ならびに量子ドットコンジュゲート型抗体（５Ｃ）を使用して染色した腸管壁漏洩および結腸直腸新生物を有する患者由来の腸管生検試料の代表的な画像を提示する。白色矢頭は、粘膜生検試料におけるカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞を示す。
【図５Ｃ】図５は、一次モノクローナル活性化カスパーゼ−１抗体を使用して染色した健康な患者（５Ａ）、結腸直腸がんを有する患者（５Ｂ）；ならびに量子ドットコンジュゲート型抗体（５Ｃ）を使用して染色した腸管壁漏洩および結腸直腸新生物を有する患者由来の腸管生検試料の代表的な画像を提示する。白色矢頭は、粘膜生検試料におけるカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明は、部分的に、腸管壁漏洩症候群が患者の胃腸上皮（食道、胃、および直腸を含む腸）、中咽頭、または頬粘膜から得られた試料を分析することによって同定することができるという発見に由来する。
【００５７】
本明細書で参照されている、公開された特許、特許出願、ウェブサイト、会社名、および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものであって、あたかもそれぞれが参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されているのと同程度に、参照によってそれら全体が本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されているあらゆる参考文献と、本明細書の具体的な教示との間のいかなる矛盾も、後者のほうを選択し解決するものとする。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲において定義または使用されている用語は、文脈上他に要求されない限り、示されている意味を有するものとする。本明細書において使用されている技術的および科学的用語は、他に定義されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。単語または句の技術分野で理解される定義と、本明細書で具体的に教示されている単語または句の定義との間のいかなる矛盾も、後者を選んで解決するものとする。本明細書で使用される場合、以下の用語は示されている意味を有する。本明細書において使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに他の意味を指示しない限り、それらが言及する用語の複数形も具体的に包含する。用語「約」とは、本明細書では、およそ、の付近、ほぼ、または前後を意味するのに使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、これは、明示した数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修飾する。一般に、用語「約」とは、本明細書では、記載した数値を２０％の分散で上下に数値を修飾するために使用される。
【００５９】
上述のように、胃腸（ＧＩ）管は、チューブの管腔に存在する、身体と外界環境との間のバリアとして機能する中空チューブである。口で始まり肛門で終わるチューブの管腔では、食物（固形および液体の食物を含む）が消化され、栄養素が腸管バリアを介して抽出され、糞便が形成されて肛門から排出される。
【００６０】
外界と身体との間の最初の表面は頬粘膜バリアであり、これは頬と唇の内部の内層である。同様に喉の裏側に粘膜に裏打ちされた表面があり、バリアとして機能する。これは、中咽頭バリアと呼ばれる。
【００６１】
胃腸（ＧＩ）バリアは、外部環境に対する最も大きく最も重要なバリアを構成する上皮細胞の単細胞層である。胃腸バリアは、選択的透過性バリアとして作用し、栄養素、電解質、および水の吸収を可能する一方、管腔内毒素、抗原、および腸内の細菌叢に対する有効な防御を維持する。上皮細胞を構成する胃腸管の内層は、連続的な生理学的再生を受ける：陰窩の基底部に位置する幹細胞は、成熟し、上皮表面の上方に移動する。成熟上皮細胞は、最終的には、腸管の表面または絨毛の先端で脱落する。ＧＩバリアの上皮細胞が分析される場合、ＧＩバリアの表面の上皮細胞のみが、上皮ギャップならびに活性化されたカスパーゼ１および／またはカスパーゼ３の発現について分析され、陰窩の細胞は分析されないことに留意されたい。
【００６２】
頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアはそれぞれ「ＧＩバリア（ＧＩ  ｂａｒｒｉｅｒ）」と呼ばれ、まとめて「ＧＩバリア（ＧＩ  ｂａｒｒｉｅｒｓ）」と呼ばれる。
【００６３】
したがって、第１の態様では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出するための方法であって、患者のＧＩバリアの試料を提供することと、ＧＩバリアの状況を決定するために試料を分析することと、患者のＧＩバリア状況を正常または異常と分類することとを含み、異常なＧＩバリア状況により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「患者」とは、単に、ＧＩバリア試料が採取される任意の患者または被験体を意味する。一部の実施形態では、患者は症状を全く有していなくてもよく、日常的な健康チェック、毎年の身体検査、または日常的な結腸鏡検査中に試料を提出していてもよい。一部の実施形態では、患者は、腸障害と関係する一部の症状、例えば過敏性腸症候群または炎症性腸疾患の症状を有し得る。炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の最も一般的な種類は、潰瘍性大腸炎、クローン病、および不定型大腸炎である。最近記載されたＩＢＤ様炎症性大腸炎のサブセットは化学療法誘発性大腸炎であり、これもまた、ある種の炎症性腸疾患として本明細書に含まれる。
【００６５】
「試料」とは、単に患者からの細胞を含有する任意の試料を意味する。例えば、頬粘膜バリア試料または中咽頭バリア試料については、それぞれ、頬内部または咽喉後部からの擦過を試料として使用することができる。腸管バリアからの試料については、結腸鏡検査または内視鏡検査の際に採取された任意の生検組織を試料として使用することができる。また試料は、以前に報告されているように、カスパーゼ−１阻害剤（ＦＬＩＣＡ）を使用して、新鮮なまたは凍結した組織試料を使用する管腔洗浄／擦過／ブラッシングも含む（その全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開番号ＷＯ２０１４／０３９６９９を参照されたい）。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「腸管壁漏洩症候群」または単に「腸管壁漏洩」とは、ＧＩバリア内に損傷が生じ、それによりＧＩ管の管腔に存在する外的環境に身体の内部が曝露される状態を意味する。また腸管壁漏洩症候群は、腸管透過性の増加として、およびＧＩ管の損傷の結果としても公知であり、ＧＩ管を介して身体内に吸収されるとは思われない物が、実際には、身体内へと入り得る。これらの異物は、消化が不完全な食物分子などの単一分子であり得るか、または細菌もしくはウイルスなどの病原体と同様の大きさであり得る。
【００６７】
腸管壁漏洩症候群では、損傷は非常に小さい（例えば、単糖などのより大きい分子のみがＧＩ管の管腔から身体内に入ることが可能な）場合も、より大きい（例えば、細菌および細胞がＧＩ管の管腔から身体内に入ることが可能な）場合もあることに留意されたい。腸管壁漏洩症候群は、損傷がまだ非常に小さい間に、そして損傷が、ウイルスまたは細菌などの大きい異物が入ることが可能なほど十分な大きさになる前に検出されるのが理想的である。
【００６８】
腸管壁漏洩症候群は、例えば、腸管透過性の増加または腸管過剰透過性によって起こり得る。
【００６９】
腸管壁漏洩症候群の患者は、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不定型大腸炎および化学療法誘発性大腸炎）、セリアック病、アレルギー（例えば食物アレルギー）、喘息、自閉症、慢性疲労症候群、狼瘡、メタボリック症候群（糖尿病、高血圧症および高脂血症を含むがこれらに限定されない）、新生物またはがん、特発性炎症状態（例えば関節リウマチ）、神経障害（例えば多発性硬化症）、片頭痛、乾癬性関節炎（ｐｓｏｒｉａｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｃ）、自己免疫疾患、例えば関節リウマチおよび乾癬、代謝性骨疾患（成人における骨粗鬆症および小児における一次成長不全を含むがこれらに限定されない）、ならびに全身性またはＧＩ管に関連する他の疾患適応症の症状を既に有している場合も、発症する場合もある。また腸管壁漏洩は、高齢の患者または小児などの患者においても起こる場合があり、摂取した食物から栄養素を吸収する患者の能力が損なわれる。
【００７０】
一部の実施形態では、ＧＩバリアの個々の細胞間の接着結合が緩くなり、粒子および場合によっては微生物が管腔から接合を介して身体内に通過するようになると、腸管壁漏洩が生じる。接着結合の緩みは、例えば、細胞の円鋸歯状形成または収縮に起因し得、それによって円鋸歯状形成された細胞とその隣接した細胞との間の接合が広がる。
【００７１】
一部の実施形態では、腸管壁漏洩は、ＧＩバリアでの別の種類の細胞への損傷に起因する。例えば、バリアの細胞は、炎症を起こし得るか、またはプログラム細胞死（例えばアポトーシス、ピロトーシスおよびネクロトーシス）に関与するタンパク質を発現し始め得る。
【００７２】
一部の実施形態では、患者試料のＧＩバリアの状況は、ＧＩバリアの腸管表面の上皮細胞において発現される活性化されたカスパーゼの量の測定または計算することにより分析することができる。例えば、活性化されたカスパーゼの量は、活性化されたカスパーゼ分子（例えば、活性化されたカスパーゼ１または活性化されたカスパーゼ３）に特異的に結合する検出可能に標識した抗体で患者由来の試料（例えば生検試料）を染色することによって決定することができる。また活性化されたカスパーゼの量は、活性化されたカスパーゼに結合する検出可能に標識したペプチドで患者由来の試料を染色することによっても決定することができる。検出可能に標識することによって、ペプチドまたは抗体は（例えば蛍光標識または発色性タグ（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｅｎｉｃ  ｔａｇ）で）直接標識され得るか、または二次染色の間に検出可能に標識した二次抗体と結合させることによって検出され得る（例えば、抗カスパーゼ抗体はマウスモノクローナル抗体であり、二次抗体は蛍光標識したウサギ抗マウス抗体である）ことに留意するべきである。
【００７３】
一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ３である。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼ１および活性化されたカスパーゼ３の組み合わせである。一部の実施形態では、活性化されたカスパーゼは、活性化されたカスパーゼの発現の量の活性化されたカスパーゼ３の発現の量に対する比である。例えば、通常の健康なボランティアでは、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比は１：１である。しかし、異常なＧＩバリアを有する患者では、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比は１．５：１であるか、または１．５：１よりも大きい。すなわち、活性化されたカスパーゼ１の発現は、異常なＧＩバリアを有する患者において、活性化されたカスパーゼ３の発現の１．５倍であるか、または１．５倍よりも大きい。
【００７４】
典型的には、炎症性腸疾患を有していない（例えば、ＩＢＤ症候を有していない）人々の腸管バリアの上皮細胞は、ある特定のレベルの活性化されたカスパーゼを発現する（例えば、活性化されたカスパーゼ１または活性化されたカスパーゼ３を０．５〜１％の間で発現する）。胃腸症状を有していないそのような人々は、健康なボランティアと呼ぶことができる。したがって、一部の実施形態では、１名または複数の健康なボランティアのＧＩバリアの上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量よりも２〜４倍高い、患者における活性化されたカスパーゼ発現の量は、患者のＧＩバリアの状況が異常であり、患者が腸管壁漏洩を有していることを示す。
【００７５】
健康なボランティアによって発現される、活性化されたカスパーゼの量は、活性化されたカスパーゼを検出するために使用される試薬（例えば、活性化されたカスパーゼ１を阻害する以下に記載のＥｎｚｏ製のペプチド阻害剤、Ａｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫ（配列番号１）、または活性化されたカスパーゼ１に特異的に結合する抗体、例えば、以下に記載のＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．製の抗体）を含むいくつかの因子に依存することに留意されたい。
【００７６】
一部の実施形態では、健康なボランティアのＧＩバリアの上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量は１％である。したがって、患者が２％の活性化されたカスパーゼ１発現を有する（すなわち、１００個の上皮細胞のうち２個が活性化されたカスパーゼ１を発現する）場合、健康なボランティアよりも２〜４倍高い活性化されたカスパーゼ１の発現を有するので、その患者は異常なＧＩ状況を有していると、したがって、腸管壁漏洩を有していると分類される。
【００７７】
一部の実施形態では、健康なボランティアのＧＩバリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量はおよそ０．５％である。したがって、患者が１％を超える活性化されたカスパーゼ１発現を有する（すなわち、１００個の上皮細胞のうち１個が活性化されたカスパーゼ１を発現する）場合、その患者は異常なＧＩ状況を有していると、したがって、患者は、健康なボランティアよりも２〜４倍高い活性化されたカスパーゼ１の発現を有するので、腸管壁漏洩を有していると分類される。
【００７８】
「１名または複数の健康なボランティアのＧＩバリアの上皮細胞における活性化されたカスパーゼ発現の量」に関して利用可能な数値もパーセンテージ値もない場合、その量は、個別にカスパーゼ−１およびカスパーゼ−３については１００個の細胞のうち約０．５〜１．０個、または０．５％〜１．０％の発現、ならびに全カスパーゼ陽性細胞については１％〜２％の発現の範囲であると理解するものとする。
【００７９】
「１名または複数の健康なボランティアのＧＩバリアの上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１発現の量」に関して利用可能な数値もパーセンテージ値もない場合、その量は、活性化されたカスパーゼ−１について１００個の細胞のうち約０．５個、または０．５％の発現（または０．００５）の範囲であると理解するものとする。
【００８０】
一部の実施形態では、患者試料のＧＩバリアの状況は、腸管内層の日常的な組織学的染色においてギャップの数を測定または計算することによって分析することができる。例えば、押出しゾーンとも呼ばれる、上皮細胞の押出し後に腸管表面の細胞間に残された残りの空間を、十分保存された腸管標本で数え、上皮細胞の総数に対して正規化してバリア状況を反映することができる。試料は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色、アルシアンブルーおよびヌクレアファストレッドを含むがこれらに限定されない従来の組織学的染色技術を使用し、染色することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、ＧＩバリアの状況は、ＧＩ表面の共焦点内視鏡法を使用して、ギャップ密度（すなわちギャップの数）を測定することによって決定する。例えば、患者試料（例えば、内視鏡検査の際に回収された腸管試料）を、核（例えばＤＡＰＩ）染色および細胞骨格（例えばアクチン）染色で染色し、ｅｘ−ｖｉｖｏで多光子共焦点顕微鏡法を使用して画像化することができる。
【００８２】
通常、健康なボランティアは、ＧＩバリアギャップが非常に限定されるため、健康なボランティアにおけるギャップの数は、通常、１００個の腸管上皮細胞当たり１ギャップ未満である。
【００８３】
しかし、１名または複数の健康なボランティアのギャップの数またはギャップ密度について利用可能な数値もパーセンテージ値もない場合、その量は、１００個の腸管細胞当たりおよそ１ギャップ、またはおよそ１％であると理解するものとする。
【００８４】
一部の実施形態では、粘膜（または上皮）バリア状況またはＧＩバリア機能不全の程度は、腸管上皮細胞の活性化されたカスパーゼ−１および／または活性化されたカスパーゼ−３、ならびに上皮内リンパ球の抗ＣＤ３についての組み合わせ染色によって特徴付けることができる。腸管上皮細胞の総数は、核染色（例えばＤＡＰＩ）を使用して定量化することができる。染色方法は、以下の実施例２の「パラフィン包埋粘膜生検試料の染色プロトコール」に詳述されている。
【００８５】
ＧＩバリア機能不全の程度は、腸管上皮細胞の総数（例えば、核染色によって決定される）に対して正規化された、活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞の総数；または腸管上皮細胞の総数に対して正規化された、活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞の活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞もしくは活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞および活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞の組み合わせに対する相対比によって導かれ得る。
【００８６】
またＧＩバリア状況またはバリア機能不全の程度は、上皮内リンパ球と腸管上皮細胞とを区別するための抗ＣＤ３染色を伴ってまたはそれを伴わずに、活性化されたカスパーゼ−１上皮細胞および活性化されたカスパーゼ−３上皮細胞の両方について陽性染色するＴＵＮＥＬ染色から、活性化されたカスパーゼ−３陽性染色された細胞を差し引くことを含む組み合わせ染色によって特徴付けることができる。腸管上皮細胞の総数は、核染色、例えばＤＡＰＩを使用して定量化することができる。染色方法は、以下の実施例３の「市販の染色キットを使用したパラフィン包埋粘膜生検試料についてのＴＵＮＥＬ染色プロトコール」に詳述されている。
【００８７】
一部の実施形態では、ＧＩ（例えば、上皮または粘膜）バリア機能不全は、代わりに、活性インターロイキン１−ベータ（ＩＬ−１β）および／またはＩＬ−１８について染色することによって特徴付けることができ、これらは両方とも、活性化されたカスパーゼ−１の代用マーカーである。活性な（すなわち成熟した）インターロイキン１−ベータ（ＩＬ−１β）に特異的に結合する抗体、およびＩＬ−１８に特異的に結合する抗体（例えば、切断型ＩＬ−１β（Ａｓｐ１１６）（Ｄ３Ａ３Ｚ）ウサギｍＡｂ  ＃８３１８６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ、および抗ＩＬ１８抗体（ａｂ７１４９５）、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡを参照されたい）は公知である。
【００８８】
ｉｎ  ｖｉｖｏで、核染色（例えばアクリフラビン）を伴ってまたはそれを伴わずに、静脈内色素（例えばフルオレセイン）でＧＩ表面を染色し、共焦点レーザー内視鏡法を使用して画像化することができる。共焦点レーザー内視鏡法におけるギャップ密度は、押出しゾーンの検証された尺度である。
【００８９】
ＧＩバリアの状況は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）患者においては、胃腸症状を有さない健康なボランティア（例えば、１８〜７０歳までの人）由来の腸管バリアの状況と比較して、大幅に損なわれている。
【００９０】
また本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することと、患者の染色されたＧＩバリア細胞を、患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能な抗体の存在について検査することとを含み、健康な被験体の細胞との比較での、患者の細胞における上昇した／正常より高いレベルのカスパーゼ−１により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。カスパーゼ−１特異的抗体は、活性化されたカスパーゼ−１を認識する。
【００９１】
一部の実施形態では、ＧＩバリアは、頬粘膜バリア、中咽頭バリアおよび腸管バリアのうちのいずれか１つであり得る。
【００９２】
一部の実施形態では、染色することは、（ｉ）患者の腸管上皮細胞を患者から生検または吸引によって得るステップと、（ｉｉ）細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで染色するステップとを含む。一部の実施形態では、方法は、ＧＩバリア細胞を、カスパーゼ−３特異的抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーで染色することをさらに含み、抗体は活性化されたカスパーゼ−３を検出する。
【００９３】
正常で健康な被験体において、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比は１：１である。しかし、異常なＧＩバリアおよび腸管壁漏洩症候群を有している患者において、活性化されたカスパーゼ１の活性化されたカスパーゼ３に対する比は１．５：１であるか、または１．５：１より大きい。すなわち、活性化されたカスパーゼ１の発現は、異常なＧＩバリアまたは腸管壁漏洩症候群を有している患者において、活性化されたカスパーゼ３の発現の１．５倍であるか、または１．５倍よりも大きい。
【００９４】
一部の実施形態では、健康な被験体の腸管試料の腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１発現の量の約２倍の増加は、患者の状況が異常であるか、または患者が「腸管壁漏洩」を有していることを示す。一部の実施形態では、１名または複数の健康な被験体の腸管バリアの腸管上皮細胞における活性化されたカスパーゼ１および３の発現の量との比較での、患者における活性化されたカスパーゼ１と３の発現の合わせた量の約２〜４倍の間の増加により、上記のように、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される。
【００９５】
一部の実施形態では、検出可能なマーカーは蛍光性であり、検査することは、蛍光顕微鏡法、多光子顕微鏡法、共焦点レーザー内視鏡法、蛍光フローサイトメトリーにより、または蛍光プレートリーダーを使用することより実施される。
【００９６】
一部の実施形態では、染色することは、カスパーゼ−１抗体にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを患者の腸管内の腸管上皮細胞に適用することを含み、検査することは、染色された細胞を内視鏡的に視覚化することを含む。一部の実施形態では、検出可能なマーカーは、例えば６２５ｎｍ、または５２５ｎｍ〜８００ｎｍの範囲、または６０５ｎｍおよび６１２ｎｍの発光スペクトルを有する量子ドットである。
【００９７】
一部の実施形態では、方法は、例えばＴＵＮＥＬアッセイを使用して、死細胞または死につつある細胞を同定するステップをさらに含む。ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化）染色は、核酸の末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出するための方法である。アポトーシスはＤＮＡの断片化を引き起こすので、ＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスシグナル伝達カスケードから生じるＤＮＡ断片化に関する一般的な方法である。アッセイは、マーカーで二次的に標識されたｄＵＴＰの付加を触媒する酵素である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはＴｄＴによって同定することができる、ＤＮＡ中のニックの存在に依拠する。
【００９８】
一部の実施形態では、１名または複数の健康な被験体のＧＩバリア細胞におけるカスパーゼ−１の量との比較での、患者のＧＩバリア細胞におけるカスパーゼ−１の量の約２〜４倍の増加は、患者が腸管壁漏洩症候群を有していることを示す。
【００９９】
一部の実施形態では、患者は哺乳動物、例えばヒトである。
【０１００】
一部の実施形態では、腸管壁漏洩症候群は、新生物、例えば結腸直腸新生物である。一部の実施形態では、患者は、メタボリック症候群、がん、新生物、特発性炎症状態、神経障害および代謝性骨疾患からなる群より選択される疾患を有しているか、または発症する可能性が高い。
【０１０１】
一部の実施形態では、方法は、活性化されたカスパーゼ−１および活性化されたカスパーゼ−３を検出する。
【０１０２】
一部の実施形態では、方法は、パラフィン固定生検または切除試料を使用する。
【０１０３】
第３の態様では、本発明は、患者の腸管壁漏洩症候群を検出または同定するための方法であって、患者の胃腸（ＧＩ）細胞を、カスパーゼ−１阻害剤にコンジュゲートされた検出可能なマーカーを含むプローブで染色することと、患者の染色されたＧＩ細胞を、患者のＧＩバリア細胞に付随する正常より高いレベルのカスパーゼ−１の証拠としての、健康な個体由来の同様に染色されたＧＩ細胞と比べ上昇したレベルの結合した検出可能なプローブの存在について検査することとを含み、上昇したレベルのカスパーゼ−１により、患者が腸管壁漏洩症候群を有していると同定される、方法を提供する。一部の実施形態では、プローブは、カスパーゼ−１阻害剤と蛍光色素とのコンジュゲートである。一部の実施形態では、カスパーゼ−１阻害剤は、ＦＬＩＣＡである。一部の実施形態では、プローブは、テトラペプチドＹＶＡＤと蛍光色素とのコンジュゲートである。一部の実施形態では、プローブは、Ａｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫを含む。一部の実施形態では、プローブは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−ＧＧＧＧ−ＹＶＡＤ−ＦＭＫの構造を有する。
【０１０４】
以下の実施例は、決して本発明を限定することを意味するものではない。
【０１０５】
本発明およびその利点を詳細に記載してきたが、本明細書中、様々な変更、置換および修正を添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができることを理解すべきである。
【０１０６】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは単なる説明を目的としているだけであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１：パラフィン包埋粘膜生検試料の調製）
パラフィン包埋ヒト組織ブロックを５μｍに切片化し、組織切片をスライドガラスに載せた。
【０１０８】
（実施例２：パラフィン包埋粘膜生検試料の染色プロトコール）
以下に記載しているのは、パラフィン包埋粘膜生検試料を染色するための３ステップのプロトコールである。
【０１０９】
ステップＩ．脱パラフィン
試料は、実施例１に記載したように得て、スライドに載せた。
【０１１０】
スライドをラックに入れ、以下の逐次的洗浄をＣｏｐｌｉｎジャーまたは他の適切な容器内で実施した：
・  洗浄１．キシレン：２×５分
・  洗浄２および３．  １００％エタノール：２×５分
・  洗浄４．  ９５％エタノール：３分
・  洗浄５．  ７０％エタノール：３分
・  洗浄６．  ５０％エタノール：３分
・  洗浄７．  蒸留Ｈ２Ｏ：２×３分
【０１１１】
抗原回復を実施する準備ができるまで、スライドを蒸留水中に維持した。一部の実施形態では、乾燥が非特異的な抗体結合を引き起こし、そのために組織上のバックグラウンド染色が高くなる可能性があるので、スライドはこの時点から先は乾燥させなかった。
【０１１２】
ステップＩＩ．抗原回復
１．水浴および抗原回復溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を９５℃に予熱した。１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０であり、以下のようにして作製した：クエン酸三ナトリウム（二水和物）２．９４ｇを１０００ｍｌの蒸留水と合わせ、混合して溶解させた。１ＮのＨＣｌでｐＨを６．０に調整した。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を溶液に添加し、溶液をよく混合し、４℃で保存した。
【０１１３】
２．スライドを、容器内の予熱した抗原回復溶液（スライドを約１〜約８センチメートル覆うのに十分な）に入れた。ガラス容器は熱で割れる場合があるので、ガラス容器は好ましくない。一部の実施形態では、蒸発を防止するための蓋付きのプラスチックタッパーウェア容器または他の種類のプラスチック容器を使用した。一部の実施形態では、蓋付きの空のボックス（例えば、マイクロピペッター用のピペットチップを保持するために使用されるボックス）を使用した。一部の実施形態では、容器のカバーに重りを加えて、容器が抗原回復溶液中で浮遊する／動き回るのを防止した。
【０１１４】
３．スライドを９５℃で２０分間インキュベートした。
【０１１５】
４．２０分が経過したら、容器およびスライドを水浴から取り出した。スライドは、抗原回復溶液中に浸漬したまま、室温に冷却した後、容器から取り出した。
【０１１６】
次いで、下記の免疫組織化学的染色プロトコール（すなわち、ステップＩＩＩ）を実施した。
【０１１７】
ステップＩＩＩ．免疫染色
すべてのインキュベーションを加湿チャンバー中で実施し、組織の乾燥を回避した。
【０１１８】
蓋が密閉され底に湿ったティッシュペーパーを入れた浅いプラスチックボックスを、免疫染色に使用した。スライドをペーパーから離し、試薬が流れ出さないように平らに置いた。
【０１１９】
１．スライドを、０．０２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中で５分間、穏やかに撹拌しながら洗浄した。２回目の洗浄は、合計２回の洗浄を実施した。
【０１２０】
２．スライドを洗浄緩衝液から取り出し、糸くずが少なく静電放電が小さいキムワイプまたは他の繊細なタスクワイプ（ｔａｓｋ  ｗｉｐｅ）を使用し、スライドから過剰な液体を乾燥させた。ＰＡＰペンまたは他の類似のペンを使用し、組織の周囲に円を描いて、試料の周囲に疎水性バリアを作った。
【０１２１】
３．およそ１００μＬのブロッキング溶液を組織上にピペットで移し、確実に組織切片を完全に覆い、組織を室温で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液は：１０％の正常ヤギ血清および１％のＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１×ＰＢＳを含有した。
【０１２２】
４．キムワイプを使用し、組織からあらゆる過剰なブロッキング溶液を拭き取り、およそ１００μＬの一次抗体溶液を各スライドに添加した。スライドを４℃で一晩インキュベートした。一次抗体溶液は、１％ＢＳＡおよび１：２５０希釈のカスパーゼ−１  ｐ２０抗体（例えば、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｄａｎｖｅｒｓ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能な切断型カスパーゼ−１（Ａｓｐ２９７）（Ｄ５７Ａ２）ウサギｍＡｂ、カタログ番号４１９９）を含む、ならびに１：１００希釈のＣＤ３ｅ抗体（例えば、マウスで産生させたＣＤ３ｅ／ＣＤ３イプシロンヒト抗体（ＳＰＶ−Ｔ３ｂ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）カタログ番号０７−０３０３を使用）を含む１×ＰＢＳを含有していた。
【０１２３】
ある特定の実施形態では、活性化されたカスパーゼ１の染色は、ペプチド阻害剤、例えばＥｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋから市販されており、ＰＣＴ公報番号ＷＯ２０１４／０３９６９９および米国特許出願公開第２０１５／０２０２３２９号（両方ともそれらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている、Ａｃ−ＹＶＡＤ（ｔｙｒ−ｖａｌ−ａｌａ−ａｓｐ）−ＣＭＫ（配列番号１）阻害剤を用いた免疫ブロッティングによって達成した。ペプチドＡｃ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ（Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−クロロメチルケトン）（配列番号１）は、カスパーゼ−１の細胞透過性の不可逆的阻害剤である。
【０１２４】
５．過剰な一次抗体溶液をスライドから排出し、スライドを５分間、１×ＰＢＳ中で穏やかに撹拌しながら洗浄した。このステップを２回繰り返し、合計３回洗浄した。
【０１２５】
６．およそ１００μＬの二次抗体溶液を組織上にピペットで移し、組織を暗所で１時間、室温（例えば２５℃）にてインキュベートした。二次抗体溶液は、１％ＢＳＡおよび１：３０００希釈のヤギ抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８（例えば、ヤギ抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）Ｓｕｐｅｒｃｌｏｎａｌ二次抗体、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ４８８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＩＡ２７０３４を使用）を含む、ならびに１：３０００希釈のヤギ抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ５５５（例えば、ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ５５５；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１４２４を使用）を含む１×ＰＢＳを含有していた。
【０１２６】
７．過剰な抗体溶液をスライドから吸い取り、スライドを５分間、１×ＰＢＳ中で穏やかに撹拌しながら洗浄した。このステップを１回繰り返し、合計２回洗浄した。洗浄は暗所で実施した。
【０１２７】
８．スライドは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓからカタログ番号Ｄ３５７１で市販されている、０．３μｇ／ｍＬ（０．６５４ｎＭ）のＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジラクテート）を含有する１×ＰＢＳ中で１０分間、暗所で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。例えば、２００ｍＬのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩストック１２μＬを、１ステップの最終洗浄および染色に使用した。
【０１２８】
９．過剰な液体を排出し、ティッシュペーパーを使用して切片の周囲を拭き、カバーガラスを組織に載せた。これは、封入剤、例えばＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）、カタログ番号Ｐ３６９７０）を使用することによって行った。スライドを室温で一晩、暗所にて硬化させ（すなわち、封入剤で組織を固め、時間とともに硬くさせる）、その後、画像化した。
【０１２９】
スライドは、多光子顕微鏡法または蛍光顕微鏡法のいずれかを使用し、使用する蛍光色素に対応する波長を使用して画像化した。ある特定の実施形態では、共焦点レーザー内視鏡法を、内視鏡検査時の患者試料に対して実施した。
【０１３０】
上記のステップで使用した抗体について、色素の発光スペクトルは以下の通りであった：ＤＡＰＩは４５５ｎｍで画像化し、抗ＣＤ３は５５５ｎｍで画像化し、抗カスパーゼ１は４８８ｎｍで画像化した。図２は、活性化されたカスパーゼ１について染色した（すなわち免疫染色した）腸管上皮細胞の代表的な画像を示す。スライドに存在するＴ細胞は、Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体と会合する細胞表面分子であるＣＤ３に特異的に結合する抗体と共染色することによって同定した。図２において、白色矢印は、カスパーゼ１の発現について陽性染色された、緑色に染色された腸管上皮細胞を指し、白色矢頭（すなわち三角形）は、ＣＤ３およびカスパーゼ１の両方の発現について陽性染色された、赤色に染色されたＴ細胞（上皮内リンパ球、またはＩＥＬ）を指す。
【０１３１】
（実施例３：市販の染色キットを使用したパラフィン包埋粘膜生検試料についてのＴＵＮＥＬ染色プロトコール）
ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化）染色は、核酸の末端を標識することによってＤＮＡ断片化を検出するための方法である。アポトーシスはＤＮＡの断片化を引き起こすので、ＴＵＮＥＬアッセイは、アポトーシスシグナル伝達カスケードから生じるＤＮＡ断片化に関する一般的な方法である。アッセイは、マーカーで二次的に標識されたｄＵＴＰの付加を触媒する酵素である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼまたはＴｄＴによって同定することができる、ＤＮＡ中のニックの存在に依拠する。以下に記載しているのは、市販の染色キットを使用する粘膜生検試料のＴＵＮＥＬ染色の３ステップのプロトコールである。
【０１３２】
ステップＩ．脱パラフィン
【０１３３】
実施例１のように調製した、粘膜生検試料を含有するスライドをラックに入れ、以下の逐次的洗浄をＣｏｐｌｉｎジャーまたは別の容器で実施した：
・  洗浄１．キシレン：２×５分
・  洗浄２および３．  １００％エタノール：２×５分
・  洗浄４．  ９５％エタノール：３分
・  洗浄５．  ７０％エタノール：３分
・  洗浄６．  ５０％エタノール：３分
・  洗浄７．  蒸留Ｈ２Ｏ：２×３分
【０１３４】
抗原回復を実施する準備ができるまで、スライドを蒸留水中に維持した。スライドはこの時点から先は乾燥させなかった。乾燥が非特異的な抗体結合を引き起こし、そのために組織上のバックグラウンド染色が高くなる可能性がある。
【０１３５】
ステップＩＩ．抗原回復
【０１３６】
１．水浴および抗原回復溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を９５℃に予熱した。クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）は以下のように作製した：クエン酸三ナトリウム（二水和物）２．９４ｇおよび１０００ｍｌの蒸留水を混合して、クエン酸三ナトリウムを溶解させた。１ＮのＨＣｌでｐＨを６．０に調整した。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を溶液に添加し、溶液をよく混合し、４℃で保存した。
【０１３７】
２．スライドを、容器内の予熱した抗原回復溶液（スライドを数センチメートル覆うのに十分な）に入れた。ガラス容器の使用は、熱で割れる場合があるので避けた。蒸発を防止する蓋付きのタッパーウェア容器もしくはプラスチック容器、またはピペットチップを保存するために使用される、蓋の付いた空のボックスを効果的に使用した。ある特定の実施形態では、カバーに重りを置き、容器が浮遊するのを防いだ。
【０１３８】
３．スライドを９５℃で２０分間インキュベートした。
【０１３９】
４．２０分が経過したら、容器およびスライドを水浴から取り出した。スライドは、抗原回復溶液中に浸漬したまま、室温に冷却した後、容器から取り出した。
【０１４０】
ステップＩＩ．核染色
【０１４１】
一実施形態では、染色のための市販キットによって提供されたプロトコールに従った。例えば、Ｔｒｅｖｉｇｅｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）からカタログ番号：４８１２−３０−Ｋで市販されているＴｒｅｖｉｇｅｎ  ＴＡＣＳ（登録商標）２  ＴｄＴ−Ｆｌｕｏｒ  Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔについての簡略化され適合されたプロトコールを使用した。
【０１４２】
１．実施例１のように調製した粘膜生検試料を含有するスライドガラスを、１×ＰＢＳ中に１０分間、穏やかに撹拌しながら浸漬した。
【０１４３】
２．試料を５０μｌのプロテイナーゼＫ溶液で１５分間覆った。プロテイナーゼＫ溶液（１試料当たり）は、以下：５０μｌのＡｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｇｒａｄｅ（商標）水および１μｌのプロテイナーゼＫを含有した。
【０１４４】
３．試料を脱イオン水中で２分間洗浄した。この洗浄を再度繰り返した。
【０１４５】
４．試料を１×ＴｄＴ標識化緩衝液に５分間浸漬した。ＴｄＴ標識化緩衝液は、４５ｍｌの脱イオン水および５ｍｌの１０×ＴｄＴ標識化緩衝液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキットから）を含有していた。
【０１４６】
５．試料を５０μｌの標識化反応ミックス（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキットから）で覆い、加湿チャンバー内で３７℃にて６０分間インキュベートした。１試料当たりの標識化反応ミックスは、１μｌのＴｄＴ  ｄＮＴＰ、１μｌの５０×カチオン（Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、またはＣｏ２＋）、１μｌのＴｄＴ酵素、および５０μｌの１×ＴｄＴ標識化緩衝液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキットから）を含有していた。ＴｄＴ酵素の凍結および融解の繰り返しサイクルは回避した。
【０１４７】
６．試料を１×ＴｄＴ停止緩衝液中に５分間浸漬した。ＴｄＴ停止緩衝液は、４５ｍｌの脱イオン水および５ｍｌの１０×ＴｄＴ停止緩衝液（Ｔｒｅｖｉｇｅｎキットから）を含有していた。
【０１４８】
７．試料を１×ＰＢＳ中で２回洗浄した。各洗浄は２分であった。
【０１４９】
８．試料を５０μｌのＳｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒ溶液で覆い、２０分間暗所でインキュベートした。Ｓｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒ溶液は、２００μｌの１×ＰＢＳＴ（すなわち、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ）および１μｌのＳｔｒｅｐ−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎを含有していた。
【０１５０】
９．試料を１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。各洗浄は２分であった。
【０１５１】
１０．カバーガラスを、９０％グリセロールを使用して載せ、４９５ｎｍフィルターを使用して蛍光顕微鏡下で観察した。
【０１５２】
図３Ａおよび３Ｂは、（例えば、上の実施例３に記載の方法を使用して）ＴＵＮＥＬ（図３Ａ）、および（例えば、上の実施例２に記載の方法を使用して）活性化されたカスパーゼ３（図３Ｂ）について染色した（すなわち、免疫染色した）、腸管上皮細胞の代表的な画像を示す。図３Ａにおいて、矢印は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞染色の市販キットを使用して、核断片化について陽性染色された腸管上皮細胞を指す。図３Ｂにおいて、矢印は、カスパーゼ３の発現について陽性染色された腸管上皮細胞を指す。
【０１５３】
一部の実施形態では、（死細胞または死につつある細胞を検出するための）ＴＵＮＥＬ染色で染色した後に活性化されたカスパーゼ−３について染色し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の総数からカスパーゼ−３陽性細胞の数を引くことによって活性化されたカスパーゼ−１陽性細胞の数を決定した。
【０１５４】
一部の実施形態では、（死細胞または死につつある細胞を検出するための）ＴＵＮＥＬ染色で染色した後に活性化されたカスパーゼ−１について染色し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞の総数からカスパーゼ−１陽性細胞の数を引くことによって活性化されたカスパーゼ−３陽性細胞の数を決定した。
【０１５５】
（実施例４：量子ドットコンジュゲート型抗体を使用する染色）
以下に記載しているのは、量子ドットコンジュゲート型抗体を使用する３ステップの染色プロトコールである。スライドは実施例１に記載のように調製した。
【０１５６】
ステップＩ．脱パラフィン
スライドをラックに入れ、以下の逐次的洗浄をＣｏｐｌｉｎジャーまたは別の容器で実施した：
・  洗浄１．キシレン：２×５分
・  洗浄２および３．  １００％エタノール：２×５分
・  洗浄４．  ９５％エタノール：３分
・  洗浄５．  ７０％エタノール：３分
・  洗浄６．  ５０％エタノール：３分
・  洗浄７．  蒸留Ｈ２Ｏ：２×３分
【０１５７】
抗原回復を実施する準備ができるまで、スライドを蒸留水中に維持した。乾燥が非特異的な抗体結合を引き起こし、そのために組織上のバックグラウンド染色が高くなるので、スライドはこの時点から先は乾燥させなかった。
【０１５８】
ステップＩＩ．抗原回復
１．水浴および抗原回復溶液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液）を９５℃に予熱した。
【０１５９】
クエン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭクエン酸ナトリウム、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ６．０）は、クエン酸三ナトリウム（二水和物）（２．９４ｇ）を蒸留水１０００ｍｌ中に溶解させることにより調製した。溶液を混合してクエン酸三ナトリウムを溶解させ、１ＮのＨＣｌでｐＨを６．０に調整した。
【０１６０】
０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を溶液に添加し、溶液をよく混合し、４℃で保存した。
【０１６１】
２．スライドを、容器内の予熱した抗原回復溶液（スライドを数センチメートル覆うのに十分な）に入れた。ガラス容器の使用は、熱で割れる場合があるので避けることが好ましい。蒸発を防止するために蓋付きのプラスチック容器もしくはタッパーウェア容器を使用した。あるいは、マイクロピペットチップを保存するために使用される蓋付きの空のボックスを使用した。ある特定の実施形態では、容器のカバーに重りを置いて、容器が抗原回復溶液中で動く／浮遊するのを防止した。
【０１６２】
３．スライドを９５℃で２０分間インキュベートした。
【０１６３】
４．２０分が経過したら、スライドおよび容器を水浴から取り出した。スライドは、抗原回復溶液中に浸漬したまま、室温に冷却した後、容器から取り出した。
【０１６４】
５．最後のステップは、免疫組織化学的染色プロトコールを続けることであった。
【０１６５】
ステップＩＩＩ．免疫染色
すべてのインキュベーションを加湿チャンバー内で実施し、組織の乾燥を回避した。
【０１６６】
蓋が密閉され底に湿ったティッシュペーパーを入れた浅いプラスチックボックスを使用した。スライドをペーパーから離し、試薬が流れ出さないように平らに置いた。
【０１６７】
１．スライドを０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１×ＰＢＳ中で、５分間、穏やかに撹拌しながら洗浄した。洗浄を繰り返し合計２回洗浄した。
【０１６８】
２．スライドを洗浄緩衝液から取り出し、過剰な液体を、キムワイプを使用してスライドから除去しスライドを乾燥させた。ＰＡＰペンまたは他の同様のペンを使用して組織の周囲に円を描き、試料の周囲に疎水性バリアを作った。
【０１６９】
３．およそ１００μＬのブロッキング溶液を組織上にピペットで移し、確実に組織切片が完全に覆われるようにし、組織を室温で２時間インキュベートした。ブロッキング溶液は、１×ＰＢＳ、１０％正常ヤギ血清および１％ＢＳＡであった。
【０１７０】
４．キムワイプを使用し、組織からあらゆる過剰なブロッキング溶液を拭き取り、１００μＬの一次抗体溶液を各スライドに添加した。スライドを遮光しながら４℃で一晩インキュベートした。一次抗体溶液は、１：２５０の希釈で量子ドット標識したカスパーゼ−１  ｐ２０抗体を含有する１％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳであった。
【０１７１】
５．過剰な抗体溶液を吸い取り、穏やかに撹拌しながらスライドを５分間、１×ＰＢＳ中で洗浄した。洗浄を繰り返し合計２回洗浄した。洗浄は暗所で実施した。
【０１７２】
６．スライドを、０．３μｇ／ｍＬ（０．６５４ｎＭ）ＤＡＰＩを含有する１×ＰＢＳ中で、１０分間穏やかに撹拌しながら暗所でインキュベートした。一実施形態では、２００ｍＬのＰＢＳ中の５ｍｇ／ｍＬ  ＤＡＰＩストック１２μＬを最後の単一ステップの洗浄および染色に使用した。
【０１７３】
７．過剰な液体を排出し、キムワイプまたは他の糸くずのないティッシュを使用して切片の周囲を拭き、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｐ３６９７０）を使用して、カバーガラスを組織に載せた。スライドを室温で暗所にて一晩硬化させた後、画像化した。
【０１７４】
（実施例５：モノクローナル抗体と量子ドットのコンジュゲーション）
本発明に有用な抗体を、下記のように半導体量子ドットにコンジュゲートさせた。
【０１７５】
すべての試薬および必要な成分は、市販のものを購入した。例えば、モノクローナル抗体：切断型カスパーゼ−１（Ａｓｐ２９７）（Ｄ５７Ａ２）ウサギｍＡｂ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４１９９、濃度：１８２μｇ／ｍＬ；およびコンジュゲーションのために選択した量子ドット：６０５ｎｍ〜６１２ｎｍの間の発光スペクトルを有するＱｄｏｔ（登録商標）６２５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１０４５２。また５２５ｎｍ〜８００ｎｍの範囲の発光スペクトルを有する量子ドットも利用可能であり、ある特定の実施形態では、目的のモノクローナル抗体をコンジュゲートするために使用した。
【０１７６】
ステップＡ：抗体濃縮および緩衝液交換
【０１７７】
２ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有する抗体を、量子ドットとのコンジュゲーション前に濃縮した。さらに、市販の抗体緩衝液にはアジ化ナトリウムが含有されているが、これを適切なコンジュゲーションが起こるように除去した。
【０１７８】
４５０μＬのｄＨ２Ｏを、溶液中の抗体および他のタンパク質の濃縮、脱塩、および緩衝液交換に使用されるポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を含有するインサートを有する１．５ｍＬの使い捨て限外濾過遠心分離微量遠心チューブ（「小型抗体濃縮器チューブ」）に添加し、チューブにキャップをした。小型抗体濃縮器を６分間５０００×ｇで遠心分離した。濃縮器のキャップおよび膜は遠心分離機のローターの中心に向いており、それにより膜を適切に洗浄することができた。遠心分離後、フロースルーは廃棄した。
【０１７９】
コンジュゲートさせるための１００〜１２５μｇの抗体、この場合は、切断型カスパーゼ−１（Ａｓｐ２９７）（Ｄ５７Ａ２）ウサギｍＡｂ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号４１９９を含有する十分な体積を、小型抗体濃縮器にロードした。切断型カスパーゼ−１抗体については、６９０μＬの最低量が必要であった。
【０１８０】
濃縮器にロードされる抗体体積が５００μＬ未満であった場合、キット（Ｑｄｏｔ（登録商標）６２５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｓ１０４５２）で提供された抗体調製緩衝液を添加することによって、抗体を５００μＬに希釈した。
【０１８１】
抗体を６分間５０００×ｇで遠心分離し、確実に小型抗体濃縮器の膜がローターの中心を向くようにし、膜上へ抗体が最適に回収されるようにした。フロースルーは遠心分離後に廃棄した。
【０１８２】
４５０μＬの抗体調製緩衝液を小型抗体濃縮器に添加し、６分間５０００×ｇで遠心分離した。
【０１８３】
濃縮した抗体を小型抗体濃縮器の上半分から回収し、提供された微量遠心回収チューブに入れた。およそ５０μＬの抗体を回収した。この体積が５０μＬより大きい場合、３分間５０００×ｇで追加の遠心分離を実施し、抗体をさらに５０μＬの体積に濃縮した。
【０１８４】
ステップＢ：抗体の結晶化可能断片（ＦＣ）領域からの末端ガラクトース残基の除去。
【０１８５】
１０μＬのβ−ガラクトシダーゼ酵素をステップＡの抗体溶液５０μＬに添加し、混合物を含有するチューブをパラフィルムでしっかりと包んだ。試料を３７℃で４時間インキュベートした。
【０１８６】
ステップＣ：抗体の炭水化物ドメインを修飾するためのアジド部分の付加
【０１８７】
アジド修飾溶液は、Ｑｄｏｔ（登録商標）６２５キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で提供されたＵＤＰ−ＧａｌＮＡｚを含有する微量遠心チューブに以下の成分を添加することによって調製した。
７５μＬのｄＨ２Ｏ；
１０μＬの２０×Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．０；
２５μＬの緩衝添加剤；および
８０μＬのＧａｌＴ酵素
【０１８８】
アジド修飾溶液を短時間ボルテックスし、５０μＬの濃縮抗体を添加した。チューブの短時間遠心分離を実施し、確実に溶液が微量遠心チューブの底にあるようにした。チューブをパラフィルムで包み、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１８９】
ステップＤ：アジド修飾抗体の精製。
【０１９０】
１５ｍＬの遠心分離チューブ中、９．５ｍＬのｄＨ２Ｏに、５００μＬの２０×Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．０）を添加し、穏やかにボルテックスし混合することによって、１×Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を調製した。
【０１９１】
１ｍＬの１×Ｔｒｉｓ緩衝液を、溶液中の抗体および他のタンパク質の濃縮、脱塩、および緩衝液交換に使用されるポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を含有するインサートを有する大型の１５ｍＬの使い捨て限外濾過遠心分離コニカルチューブ（「大型抗体濃縮器チューブ」）に入れた。チューブおよびインサートを１０分間１２００×ｇで遠心分離し、確実に濃縮器の膜がローターの中心を向くようにし、膜を最適に洗浄できるようにした。フロースルーは遠心分離後に廃棄した。
【０１９２】
１．７５ｍＬの１×Ｔｒｉｓ緩衝液および上記パラグラフ００１８８の濃縮抗体２５０μＬを大型抗体濃縮器チューブに添加した。抗体混合物を６分間１２００×ｇで遠心分離し、確実に濃縮器の膜がローターの中心を向くようにし、抗体を膜上に最適に回収できるようにした。フロースルーは遠心分離後に廃棄した。
【０１９３】
１．８ｍＬの１×Ｔｒｉｓ緩衝液を大型抗体濃縮器に添加し、混合物を１０分間１２００×ｇで遠心分離した。フロースルーは遠心分離後に廃棄した。
【０１９４】
ステップＤを一度繰り返した。
【０１９５】
ステップＥ：抗体濃縮
【０１９６】
１．８ｍＬの１×Ｔｒｉｓ緩衝液を大型抗体濃縮器チューブに添加し、１０分間１４００×ｇで遠心分離した。フロースルーは遠心分離後に廃棄した。およそ８０〜１２０μＬの液体が大型抗体濃縮器チューブの上部に残っていた。
【０１９７】
抗体を回収するため、抗体濃縮器チューブをきれいな１５ｍＬのコニカル回収チューブに反対にして入れ、３分間１０００×ｇで遠心分離した。
【０１９８】
抗体を滅菌済みのきれいな１．５ｍＬ微量遠心チューブに移した。回収した抗体の最終体積が１００μＬ未満である場合、２０×Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて抗体を１００μＬの最終体積に希釈した。
【０１９９】
ステップＦ：量子ドットの修飾抗体へのコンジュゲーション
【０２００】
Ｑｄｏｔ（登録商標）６２５キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で提供された５０μＬのＤＩＢＯ修飾量子ドットナノ結晶を、回収されたアジド修飾回収濃縮抗体に添加し（上記パラグラフ００１９８を参照）、穏やかにボルテックスした。混合物を短時間遠心分離し、２５℃で一晩インキュベートした。
【０２０１】
インキュベーション後、抗体−量子ドットコンジュゲートを２〜８℃で保存し、光から保護した。抗体は凍結しなかった。長期保存のため、０．０２％ｗ／ｖのアジ化ナトリウムを抗体溶液に添加した。
【０２０２】
（実施例６：カスパーゼ−１活性化によって引き起こされる腸管壁漏洩症候群と結腸直腸新生物との相関関係）
カスパーゼ−１活性化によって引き起こされる腸管壁漏洩症候群と結腸直腸新生物との相関関係は、下記のように決定した。
【０２０３】
実験は、活性化されたカスパーゼ−１または活性化されたカスパーゼ−３を対象とした一次モノクローナル抗体を用いて実施し、抗体は特定波長を有する量子ドットにコンジュゲートされていた。活性化されたカスパーゼ−１抗体にコンジュゲートされた６２０ｎｍのＱ−ドットを使用した。
【０２０４】
結腸鏡検査のスクリーニングを受けている１６名の患者のコホートにおいて、１０名の患者は病変を有さず、健康な対照として役立て、そして６名の患者は結腸直腸新生物（結腸直腸新生物または腺腫様ポリープ）を示した。結腸直腸新生物を有する６名の患者（男性３名および女性３名）のメジアン年齢は５９歳であった。この患者の集団において、粘膜生検によって得られた活性化されたカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞は、数えた上皮細胞１０００個当たり１８．６個、すなわち１．８６％であった（図４）。結腸鏡検査のスクリーニング時にいかなる病変も発見されなかった１０名の健康な対照の個体（男性３名および女性７名）の集団は、メジアン年齢が５４歳であった。この集団において粘膜生検によって得られた活性化されたカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞は、数えた上皮細胞１０００個当たり５．９個、すなわち０．５９％であり、これは結腸がんまたは腺腫様ポリープを有する患者よりも有意に低かった（Ｐ＜０．００１）（図４）。これらのデータは、カスパーゼ−１活性化によって引き起こされる腸管壁漏洩症候群と結腸直腸新生物との間に相関関係があることを実証する。
【０２０５】
図５Ａは、健康な患者由来の腸管生検試料の代表的な画像を提示する。図５Ｂおよび５Ｃは、一次モノクローナル活性化カスパーゼ−１抗体（図５Ｂ）を使用して染色した；および量子ドットコンジュゲート型抗体（図Ｃ）を使用して染色した結腸直腸新生物を有する患者由来の腸管生検試料の代表的な画像である。白色矢頭は、生検試料中のカスパーゼ−１陽性腸管上皮細胞を示す。
【０２０６】
上記の本発明の実施形態は、単なる例示を意図しており、多くの変形および変更は、当業者には明白であろう。そのようなすべての変形および変更は、あらゆる添付の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲内にあることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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