(57)【要約】  本発明は、ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性を簡便に評価できる方法を提供する。  少なくとも標的配列と前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、前記標的配列を含むＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給して、ＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を評価する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも標的配列と前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含むＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給し、
前記標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する、
ＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項２】
前記標的発現分子が、標的配列の上流および下流のそれぞれに、ＰＣＲプライマーがアニール可能な配列を有するＰＣＲプライマー対応領域を備え、
前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが前記発現系に供給されて生じた標的配列を含むＲＮＡを、ＰＣＲプライマー対応領域の配列にアニールする１対のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより定量し、
前記評価対象核酸分子を前記発現系に供給しない場合と比較して、前記標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する、請求の範囲１記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項３】
標的配列の上流および下流にあるＰＣＲプライマー対応領域の少なくとも一方の領域内部にイントロンが挟み込まれており、かつ、前記発現系がＲＮＡをスプライシング可能な発現系である、請求の範囲２記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項４】
前記標的発現分子が、前記標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置に、レポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を含み、
前記レポーターの発現を検出することによりＲＮＡが切断されたか否かを検出する、請求の範囲１記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項５】
前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、請求の範囲１から４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項６】
転写されるＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、請求の範囲１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項７】
前記標的発現分子に、転写されるＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列が組み込まれている、請求の範囲１から５のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項８】
前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有する、請求の範囲１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
【請求項９】
少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域と、前記標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含むＲＮＡに対してｍｉＲＮＡ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給し、
前記レポーターの発現が抑制されたか否かを検出する、
ｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【請求項１０】
前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、請求の範囲９記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【請求項１１】
評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、請求の範囲９または１０記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【請求項１２】
前記コントロール供給分子が、前記標的発現分子に組み込まれている、請求の範囲１１記載の、ｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【請求項１３】
前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有する、請求の範囲９から１２のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性の評価方法に関し、より詳しくは、簡便にＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性を評価することができる方法に関する。なお、本明細書において「ＲＮＡｉ」とはＲＮＡ干渉（RNA interference）ともいう。また、「ｍｉＲＮＡ」は、マイクロＲＮＡ（micro RNA）ともいう。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉は、機能阻害したい遺伝子の特定領域と相同なセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡとからなる二本鎖ＲＮＡ（double-stranded RNA；以下「ｄｓＲＮＡ」という）が標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの相同部分を干渉破壊するという現象で、１９９８年に線虫を用いた実験により初めて提唱された（非特許文献１）。この現象を利用して所望の遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ法が注目されている。しかし、哺乳類においては、約３０塩基対以上の長いｄｓＲＮＡを細胞内へ導入すると、インターフェロンレスポンスが誘導され、細胞がアポトーシスによって死んでしまうため、ＲＮＡｉ法を用いることが困難であった。【０００３】
一方、マウス初期胚や哺乳類培養細胞では、ＲＮＡ干渉が起こりえることが示され、ＲＮＡ干渉の誘導機構そのものは、哺乳類細胞にも存在することが明らかとなってきた。現在では、およそ２１〜２３塩基対の短い二本鎖ＲＮＡ（short interfering RNA、以下「ｓｉＲＮＡ」という）が、哺乳類細胞系でも細胞毒性を示さずにＲＮＡ干渉を誘導できることが示され、哺乳類においてもＲＮＡｉ法を利用することが可能となってきている（非特許文献２、非特許文献３）。【０００４】
また、最近、タンパク質に翻訳されない２０数塩基のＲＮＡが翻訳抑制あるいはｍＲＮＡの分解に関与していることが示唆されている。このような２０数塩基のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）と呼ばれている（非特許文献４、非特許文献５）。【０００５】
【非特許文献１】Fire, A. et al., Potent and specific genetic interference bydouble-stranded RNA in Caenorhabditis elegans, Nature, 391: 806-811, 1998
【非特許文献２】Zamore, P.D. et al., RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals. Cell, 101: 25-33, 2000
【非特許文献３】Elbashir, S. M. et al.,: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells, Nature, 411: 494-498, 2001
【非特許文献４】Grishok, A. et al., The rde-1 gene, RNA amplification in dsRNAinterference regulate expression of the small temporal RNAs that control C.elegans developmental timing. Cell, 110: 513-520, 2002
【非特許文献５】Rhoades, M. W. et al., Prediction of plant micro RNA targets, Cell,110: 513-520, 2002
【発明の開示】
【０００６】
ＲＮＡｉ法は様々な応用が期待される技術である。しかし、ショウジョウバエや線虫では、ある遺伝子の特定領域と相同なｄｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは、ほとんどの配列でＲＮＡ干渉効果を示すのに対して、哺乳類では無作為に選択した（２１塩基の）ｓｉＲＮＡの７０〜８０％はＲＮＡ干渉効果を示さない。これは、哺乳類においてＲＮＡｉ法を用いた遺伝子機能解析を行う際に大きな問題点となっている。さらに、内在性遺伝子を標的とした場合、遺伝子によってｍＲＮＡの発現量および安定性などが異なるため、ｓｉＲＮＡの有効性を評価することが困難な場合がある。また、ｍｉＲＮＡについては未だ機能的に解明されていない点も多く、ｍｉＲＮＡの活性について簡便に評価する方法が求められている。
【０００７】
上記のような状況の下、本発明は、ＲＮＡｉ活性およびｍｉＲＮＡ活性を簡便に評価できる方法を提供することを課題とする。
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは鋭意研究を進めたところ、評価対象となる分子と、標的となる配列を含むポリヌクレオチドとを発現系に導入し、評価対象となる分子が標的となる配列に対してＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を有するか否かを評価する簡便な手法を見いだした。すなわち、本発明は、下記ＲＮＡｉ活性の評価方法およびｍｉＲＮＡ活性の評価方法を提供するものである。
【０００９】
（１）  少なくとも標的配列と前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含むＲＮＡに対してＲＮＡｉ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給し、
前記標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する、
ＲＮＡｉ活性の評価方法。
（２）  前記標的発現分子が、標的配列の上流および下流のそれぞれに、ＰＣＲプライマーがアニール可能な配列を有するＰＣＲプライマー対応領域を備え、
前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが前記発現系に供給されて生じた標的配列を含むＲＮＡを、ＰＣＲプライマー対応領域の配列にアニールする１対のプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにより定量し、
前記評価対象核酸分子を前記発現系に供給しない場合と比較して、前記標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する、上記（１）に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（３）  標的配列の上流および下流にあるＰＣＲプライマー対応領域の少なくとも一方の領域内部にイントロンが挟み込まれており、かつ、前記発現系がＲＮＡをスプライシング可能な発現系である、上記（２）に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（４）  前記標的発現分子が、前記標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置に、レポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を含み、
前記レポーターの発現を検出することによりＲＮＡが切断されたか否かを検出する、上記（１）に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（５）  前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、上記（１）から（４）のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（６）  転写されるｍＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、上記（１）から（５）のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（７）  前記標的発現分子に、転写されるＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列が組み込まれている、上記（１）から（５）のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（８）  前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有する、上記（１）から（７）のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ活性の評価方法。
（９）  少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域と、前記標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、
前記標的配列を含むＲＮＡに対してｍｉＲＮＡ活性を有するか否か評価の対象とする評価対象核酸分子とを、
前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給し、
前記レポーターの発現が抑制されたか否かを検出する、
ｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
（１０）  前記発現系が、無細胞発現系または細胞発現系である、上記（９）に記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
（１１）  評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子を、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給する、上記（９）または（１０）に記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
（１２）  前記コントロール供給分子が、前記標的発現分子に組み込まれている、上記（１１）に記載の、ｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
（１３）  前記標的配列が、評価対象核酸分子が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有する、上記（９）から（１２）のいずれか一項に記載のｍｉＲＮＡ活性の評価方法。
【００１０】
本発明により、ＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性を簡便に評価することができる方法が提供される。本発明の方法は、特に、内在性遺伝子に由来する配列、人工的な配列など配列の由来、種類などを問わず、任意の配列を標的としてＲＮＡｉ活性またはｍｉＲＮＡ活性の評価を簡便に行うことができる点で優れている。本発明の評価方法は、簡便なものであるため大量の試験を短時間で行うことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】は、標的発現分子の一例を示す図である。
【図２】は、標的発現分子の一例；ＰＣＲフラグメント１を示す図である。
【図３】は、ＰＣＲフラグメント２の例を示す図である。
【図４】は、ＰＣＲサイクル数とＰＣＲ産物量との関係を示す図である。
【図５】は、レポーターとしてピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）が組み込まれた標的発現分子の例を示す図である。
【図６】は、レポーターとしてＥＧＦＰ（「ＥＧＦＰ」）が組み込まれた標的発現分子の例を示す図である。
【図７】は、レポーターとしてファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（「Ｆ．Ｌｕｃ」）が組み込まれた標的発現分子の例を示す図である。
【図８】は、標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構造を示す図である。
【図９】は、実施例１の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされていない場合のＰＣＲの結果を示す図である。
【図１０】は、実施例１の２．（２）におけるプライマーの一方がイントロンを挟む形でデザインされている場合のＰＣＲの結果を示す図である。
【図１１】は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ−３５の配列および構造を示す図である。
【図１２】は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＶＩＭ−８１２の配列および構造を示す図である。
【図１３】は、ｓｉＲＮＡ；ｓｉＣｏｎｔｒｏｌの配列および構造を示す図である。
【図１４】は、ｓｉＶＩＭ−８１２およびｓｉＶＩＭ−３５のルシフェラーゼ遺伝子に対するＲＮＡｉ活性を示す図である。
【図１５】は、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ−８１２およびｓｉＶＩＭ−３５のビメンチンに対するＲＮＡｉ活性を示す図である。
【図１６】は、抗体染色の結果を示す図である。
【００１２】
図中の符号の説明は、下記のとおりである。
「ｐｒｏ／ｅｎｈ」  プロモーター／エンハンサー
「ｉｎｔｒｏｎ」  イントロン
「ＰＡＲ」  プライマー対応領域
「ｔａｒｇｅｔ」  標的配列
「ＭＣＳ」  マルチクローニングサイト
「ｐｏｌｙ  Ａ」  ポリＡシグナル配列
「Ｋｏｚａｋ」  コザック配列
「Ｋｏｚａｋ＋ＡＴＧ」  コザック配列およびＡＴＧ配列
「ｎｅｏ」  ネオマイシン耐性遺伝子
「ｐｕｒｏ」  ピューロマイシン耐性遺伝子
「Ｆ．Ｌｕｃ」  ファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子
「Ｒ．Ｌｕｃ」  レニラルシフェラーゼ遺伝子
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、最良の形態に言及しつつ、
１．ＲＮＡｉ活性の評価方法、
２．ｍｉＲＮＡ活性の評価方法、
３．ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法、
４．ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、
５．二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法、
６．遺伝子の発現抑制方法、
の順に説明する。【００１４】
なお、分子生物学的な基本的手法については、BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986); Sambrookら、MOLECULAR
CLONING: A LABORATORY MANUAL、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold
Spring Harbor、N.Y. (1989)、細胞工学ハンドブック、黒木登志夫ら編、羊土社（1992）、新遺伝子工学ハンドブック改訂第３版、村松ら編、羊土社（1999）など、多くの標準的な実験マニュアルがあり、これらの文献の内容は本明細書に取り込まれるものとする。また、本明細書において塩基配列は、特に断らない限り、センス鎖、すなわち、ｍＲＮＡの配列を基準として示す。【００１５】
１．ＲＮＡｉ活性の評価方法
本発明のＲＮＡｉ活性の評価方法では、標的発現分子と評価対象核酸分子とを、ＲＮＡを発現させることが可能な発現系に供給して、標的発現分子から発現したＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されたか否かを検出する。【００１６】
標的発現分子は、ＲＮＡｉの標的となる配列（以下「標的配列」という場合がある）を有するＲＮＡを発現させる分子である。標的発現分子は、標的配列のＲＮＡを発現系に提供し得るポリヌクレオチドであればよいが、安定性、操作性などの観点からＤＮＡであることが好ましく、より具体的には発現ベクター等が好適なものとして用いられる。発現ベクターは市販されているものなど既に多数のものがある。発現ベクターによって発現させる場合、発現ベクターは、例えば培養細胞系の種類あるいは無細胞系の条件などに応じて、適宜選択することができる。標的配列を挿入させたり、その他所定の配列を挿入させたりするために、標的発現分子はマルチクローニングサイト（「ＭＣＳ」と略称する場合がある）を有するものであることが好ましい。ベクターとしては、具体的一例としては、例えばｐＣＩ−ｎｅｏなどが用いられる。【００１７】
標的配列を発現系に供給するため、標的発現分子は、少なくとも標的配列およびこの標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域とを含む。標的配列は任意であり、評価を行う者が所望の遺伝子等から任意に配列を選ぶことができる。一例として、標的配列は、下記「３．ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法」などによって検索された配列を選択することができ、検索された配列が実際にＲＮＡｉの対象となり得るかを実験系にて確認することになる。また、標的発現分子は、標的配列を含むＲＮＡを発現させるための発現調節領域を備える。発現調節領域は、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリＡ領域などによって構成される。プロモーター、エンハンサー等は、ベクターや宿主などの条件に応じて適宜選択される。また、標的発現分子には、ターミネーターなどベクターに組み込み得る他の配列を組み込んでもよい。【００１８】
プロモーターは、遺伝子の発現に用いる培養細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーター、ＣＡＧプロモーターなどが挙げられる。【００１９】
評価対象核酸分子は、ＲＮＡｉ活性を評価しようとする対象となる配列を有する核酸分子である。核酸分子は、核酸を構成主体とする分子であり、主にＲＮＡからなるが、ＲＮＡとＤＮＡとのハイブリッド分子およびキメラ分子並びにこれらの変性分子などであってもよい。ここで、変性分子としては、二本鎖が完全な塩基対を形成していない変性分子のほか、ヌクレオチドの一部が修飾されたものも含む。より具体的には、例えば、上記の標的配列に対するＲＮＡｉ活性の程度を評価しようとするｓｉＲＮＡ候補分子、またはｓｉＲＮＡ候補分子を発現する核酸分子であり、偶然発見された分子や、ＲＮＡｉ活性を有するものと期待して設計された分子など様々なものも候補分子となり得る。【００２０】
ＲＮＡｉ活性を有する蓋然性が高い配列の設計方法としては、例えば、下記「４．ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法」などが挙げられる。すなわち、本発明の評価方法は、下記「４．ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法」および「５．二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法」に記載の方法に従って得られたｓｉＲＮＡ活性を有する蓋然性が高い分子のＲＮＡｉ活性を実験系で簡便に確認する手法としても好適に用いられる。【００２１】
また、評価対象核酸分子は、発現系にＲＮＡｉ候補分子を提供するものであり、ｓｉＲＮＡの形態そのものであってもよいし、またはｓｉＲＮＡの形態の分子を発現するベクターであってもよい。【００２２】
標的発現分子および評価対象核酸分子は、標的発現分子から標的配列を含むＲＮＡが発現可能な発現系に供給されることもできる。ＲＮＡが発現可能な発現系は、細胞系であっても無細胞系であってもよいが、少なくともｍＲＮＡの転写が行われる条件を備えていることを要する。したがって、発現系内には、ＲＮＡ分子を合成するための材料、および酵素等が含まれている。細胞系としては、適当な培養細胞内で標的発現分子を発現させることができる。培養細胞に標的対象核酸分子および評価対象核酸分子を供給する方法は、細胞内に分子を導入するトランスフェクションなどの一般的な方法であることができる。また無細胞系は、例えば、試験管内など細胞外で、所定の緩衝液などに細胞抽出液、リボ核酸、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰなどを加えた系である。【００２３】
細胞発現系として宿主細胞を用いる場合、宿主細胞の例としては、例えば、ドロソフィラＳ２（Drosophila S2）およびスポドプテラＳｆ９（Spodoptera Sf9）などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、ＮＩＨ３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、バウエス（Bowes）黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。【００２４】
発現系内に取り込まれた標的発現分子からは、標的配列を含むｍＲＮＡが転写される。そして、同じく発現系内に導入された評価対象核酸分子が、その評価対象配列を干渉するものであれば、標的配列を含むＲＮＡは切断され、干渉しないものであれば切断されない。したがって、ｍＲＮＡが切断されたか否かを検出することにより、評価対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を有するか否か、あるいはＲＮＡｉ活性の程度を評価することができる。ＲＮＡが切断されたか否かの検出方法としては、ＲＮＡの発現を定性的または定量的に測定する方法や、標的発現分子に、標的配列と共に転写される所定のレポーターを組み込んでおき、そのレポーターを定性的または定量的に測定する方法などが挙げられる。具体的な検出方法、およびそれに適した形態については下記にて別途詳説する。【００２５】
内在性遺伝子をターゲットとして、その内在性遺伝子を有する細胞または生体に、直接ＲＮＡｉ活性を有する候補分子を投与しても、そもそも内在性遺伝子の発現量が少ない場合やその遺伝子産物の安定性が低い場合には、ＲＮＡｉの効果について評価するのが困難である。また、トランスフェクション効率の低い培養細胞系では、ＲＮＡｉ活性を有していても、ｓｉＲＮＡによる内在性遺伝子の抑制の効果が見えにくい。さらに、例えばＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcribed-PCR）によってＲＮＡの発現量を測定しようとする場合には、標的とする内在性遺伝子に応じてプライマーの組み合わせ、ＰＣＲサイクルの条件など、プロトコルを大幅に調整する必要性がある。すなわち、例えば標的対象の内在性遺伝子が１０，０００種あったとすると、１０，０００種のプライマーの組み合わせ、およびＰＣＲサイクルの大幅な条件検討を要することになる。【００２６】
これに対して、本発明の評価方法は、クローニングや遺伝子発現系などの簡便な実験系を用いてＲＮＡｉ活性を測定することができる簡便な方法である。本発明の評価方法によれば、所望の標的配列を組み換える以外は、一定のプロトコルで多数の標的配列についてＲＮＡｉ活性を評価することができるという簡便さが提供される。また、発現ベクター−宿主系などの確立した実験系をベースとすることができるので、生体内では発現量の少ない内在性遺伝子であっても、ＲＮＡｉ活性の評価を適切に行うことができる。また、元来の生体内では標的配列を含む発現産物が早期に分解されてしまうような場合でも、本発明の方法によれば、そのような原因を除く細胞系または無細胞系を比較的容易に調製し得る。さらに、本発明の評価方法は、ｓｉＲＮＡとベクターとを発現系に同時に入れることが可能であり、そのため、トランスフェクションの効率が低い系であっても、アッセイ可能にすることができる。ＲＮＡｉは、遺伝子のノックアウト技術、医薬としての利用など、さまざまな利用が検討されており、今後めざましい発展を遂げる可能性を秘めた分野であり、本発明の評価方法は、ＲＮＡｉ関連技術の発展に大きく寄与するものである。【００２７】
次に、本発明の評価方法の好ましい実施形態の例について、さらに具体的に説明する。
１−１  ＰＣＲ方式
標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かをＲＴ−ＰＣＲを用いて検出する実施形態について説明する。この実施形態は、転写されたＲＮＡに対応するｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅するものであり、増幅されたＤＮＡを検出して、ＲＮＡが切断されたか否かを判別する。【００２８】
本ＰＣＲ方式の場合、標的発現分子は、標的配列の上流および下流のそれぞれに、ＰＣＲプライマーがアニール可能な配列を有するＰＣＲプライマー対応領域を備える。プライマーの配列には特に限定はなく、ＰＣＲの条件などに応じて適宜設定される。より好ましい形態として、標的配列の上流および下流にあるＰＣＲプライマー対応領域の少なくとも一方の領域内部にイントロンが挟み込まれるようにする。挟み込むというのは、ＰＣＲプライマー対応領域の端部に接続されるのではなく、ＰＣＲプライマー対応領域を分断するように組み込まれることを意味する。ＰＣＲプライマー対応領域にイントロンを挟み込ませることにより、発現ベクターを鋳型としてＤＮＡが増幅してしまうことが防止される。その結果、発現ベクターから転写され且つスプライシングされたＲＮＡ、すなわち、イントロンが除去されたＲＮＡを基にしてＰＣＲが行われるので、より正確な評価をすることができる。【００２９】
イントロンは、真核生物の遺伝子ＤＮＡ中に見出すことができる。本発明において用いられるイントロンは、アミノ酸配列情報を有さず、ｍＲＮＡのスプライシングにおいて除去される配列であれば特に限定はない。イントロンには多数の例があるが、一部具体例として例示すると、β−グロビン由来のイントロン、ＩｇＧ由来のイントロンなどが挙げられる。【００３０】
ＰＣＲプライマー対応領域にイントロンが挟み込まれる形態においては、発現系としてはＲＮＡをスプライシング可能な発現系を用いる。例えば、スプライシング可能な発現系としては、ＲＮＡのスプライシングが行われることが確認されている真核生物系の発現ベクター−宿主系を用いてもよい。また、無細胞系であれば少なくともスプライシングに要するスプライセオソームなどを含む系を構築すればよい。また、無細胞系としては、真核生物の細胞の破砕物を含む混合溶液を用いてもよい。【００３１】
図１に標的発現分子として発現ベクターを用いた場合の設計例を示す。発現調節領域としてプロモーター及びエンハンサー（「ｐｒｏ／ｅｎｈ」）が組み込まれている。発現調節領域の下流にはイントロン（「ｉｎｔｒｏｎ」）が挟み込まれたフォワードプライマーに対するプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」：primer annealing region (F)１）が組み込まれている。フォワードプライマーのプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」）の下流にはマルチクローニングサイト（「ＭＣＳ」）があり、マルチクローニングサイト（「ＭＣＳ」）を使って、所望の標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）が組み込まれる。さらに標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）の下流にはリバースプライマーに対応するプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｒ）１」：primer
annealing region (R)１）が組み込まれている。【００３２】
図２および図３に、標的発現分子としてのＰＣＲベースフラグメントの組み合わせを示す。図２および図３の組み合わせは、ＰＣＲ方式であると共に、検出シグナルを正規化するための内部標準コントロール（以下、「インターナルコントロール」；internal controlともいう）を備える。【００３３】
図２には、２３塩基からなる標的配列を含む標的発現分子であるＰＣＲフラグメント１（「ＰＣＲ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  １」）を示す。図３には、標的配列部位の発現量を相対的に定量する際にコントロールとして用いるＰＣＲフラグメント２（「ＰＣＲ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ２」）が示されている。コントロールを用いることにより、トランスフェクション効率のばらつき、ＲＮＡの収率のばらつき等、試料サンプル間の誤差を補正することなどが可能である。ＰＣＲフラグメント１および２は、二本鎖ＤＮＡにより構築されている。ＰＣＲフラグメント１はプロモーター及びエンハンサー（「ｐｒｏ／ｅｎｈ」）を有し、その下流にフォワードプライマーに対応するプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」）を有する。フォワードプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」）の内部には、イントロン（「ｉｎｔｒｏｎ」）が挟み込まれており、ＰＣＲフラグメント１そのものがＰＣＲの鋳型としては機能しないように設計されている。なお、図２に示す例では、イントロンはＰＡＲ（Ｆ）１に挟み込まれているが、ＰＡＲ（Ｒ）１に挟み込んでもよい。フォワードプライマーに対応するプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」）の下流には、標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）が組み込まれている。標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）の下流にはリバースプライマーに対応するプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｒ）１」）が組み込まれている。さらにその下流にはポリＡシグナル（「ｐｏｌｙ  Ａ」）配列を備える。図３に示すＰＣＲフラグメント２は、相対定量の際のコントロールとして用いるネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）が組み込まれている。ＰＣＲフラグメント１および２を用いる場合、両者を共にＲＮＡを発現可能な発現系に導入する。なお、検出シグナルを正規化する実施形態については、下記「１−３  インターナルコントロールによる検出シグナル正規化」にて別途詳説する。【００３４】
前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給された発現系からＲＮＡを回収して逆転写を行い、ＰＣＲプライマー対応領域の配列にアニールする１対のプライマーを供給してＲＴ−ＰＣＲを行い、標的配列を含むポリヌクレオチドを定量する。発現系は、無細胞発現系であっても細胞系発現系であってもよい。ＲＴ−ＰＣＲを行うために、逆転写酵素およびオリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムヘキサマーを用いてｃＤＮＡが生成される。生成されたｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲによりＤＮＡが増幅され、増幅を速度論的に評価することによりｍＲＮＡの定量を行うことが可能である。温度やサイクルなどＲＴ−ＰＣＲの他の条件は適宜調整してよい。【００３５】
評価対象核酸分子を供給する系と同様に、評価対象核酸分子を供給しない系についてもＲＴ−ＰＣＲを行う。そして、評価対象核酸分子を前記発現系に供給しない場合と比較して、前記標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する。評価対象核酸分子を供給しない系には、例えばコントロールとして、標的配列に対しＲＮＡｉ活性を有しないことが判明している分子（例えば評価対象核酸分子と類似した分子）を供給して比較するという実施形態も含まれる。【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲを用いてＲＮＡｉ活性を検出する方法は特に限定されない。例えば、評価対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を十分に発揮する場合、標的配列を含むＤＮＡの増幅の遅れとなって現れることが多いので、増幅されたＤＮＡ量の時系列的な変化を測定してＲＮＡｉ活性を評価することができる。評価の方法の例を図４に示す。図４は、例示的に、増幅されたＤＮＡ量の経時的変化を示したものであり、横軸がＰＣＲサイクル数、縦軸がＤＮＡ量（ＰＣＲ産物量）を示す。図４において、（Ｉ）に示す曲線は評価対象核酸分子を供給しない系の結果を示し、（II）に示す曲線はＲＮＡｉ活性がある分子を供給した場合の結果である。図４（Ｉ）の曲線とは異なって、ＲＮＡｉ活性を有する分子が発現系に供給されると、図４（II）に示す曲線のようにＤＮＡの増幅が遅れて現れる。評価対象核酸分子が、標的発現分子から転写されるＲＮＡを切断し、ＲＴ−ＰＣＲの鋳型が減少したためである。したがって、この遅れの程度はＲＮＡｉ活性の程度を表す１つの指標となり得る。ＲＮＡｉ活性があるにもかかわらず、ＤＮＡ量が増えてくる場合があるのは、活性の程度などにより、ＲＮＡｉを免れ得る分子が現れ、１つの鋳型ができてしまえばＰＣＲによって容易に増幅されてしまうためである。【００３７】
また、経時的にＤＮＡの量を測定せずとも、図４の（Ｉ）と（II）のような差が現れやすい時点（またはＰＣＲサイクル数）を予め知っておけば、その時点でのみＤＮＡ量を測定し、ＤＮＡ量の差からＲＮＡｉ活性を評価することもできる。【００３８】
１−２  レポーター方式
次に、標的配列を含むＲＮＡが切断されたか否かを検出する方法として、レポーターを用いる実施形態について説明する。本レポーター方式の場合には、標的発現分子に、標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を組み込んでおき、レポーターの発現を検出することによりＲＮＡが切断されたか否かを検出する。レポーター方式においても、発現系は無細胞発現系であっても細胞発現系であってもよい。【００３９】
レポーターは、その発現が検出可能なものであれば特に限定はなく、例えば、各種の蛍光タンパク質、発光タンパク質、生成酵素、分解酵素、耐性遺伝子などが挙げられる。より具体的には、レポーターとして例えば、ＥＧＦＰ（Enhanced Green Fluorescent Protein；強化緑色蛍光タンパク質）などのオワンクラゲ由来緑色蛍光タンパク質遺伝子、Discoma
sp.由来の赤色蛍光タンパク質遺伝子（ＤｓＲｅｄ）、Heteractis crispa由来の近赤外蛍光タンパク質遺伝子（ＨｃＲｅｄ）、ファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（Firefly
luciferase gene）、レニラルシフェラーゼ遺伝子（Renilla Luciferase gene）、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、アルカリフォスファターゼ遺伝子およびこれらの変異体などの他、多数のものを好適なものとして用いることができる。レポーターは、標的発現分子内において標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置に備えられる。したがって、標的配列をコードするｍＲＮＡが切断された場合、レポーターの配列について翻訳が阻害され、レポーターの発現産物が検出されない、あるいは抑制されるという現象となって現れる。【００４０】
レポーターの検出は、レポーターの種類に応じて適宜選択される。例えば、レポーターが蛍光タンパク質等であれば、その蛍光強度を測定することによりレポーターの発現を検出することができる。また、レポーターが耐性遺伝子であれば、耐性遺伝子が導入された細胞の耐性をアッセイすることにより、レポーターの発現を検出することができる。生成酵素や分解酵素をレポーターとする場合には、これらの酵素が触媒する反応によって生じる産物を定量することによりレポーターの発現を検出することができる。何れの場合であっても定量的あるいは定性的に測定が可能である。また、定量的な測定の場合は、量の違いがＲＮＡｉ活性の程度として反映されるようにすることが好ましい。【００４１】
図５から図７に、標的発現分子として、レポーターを組み込んだ発現ベクターの構築例を示す。図５は、レポーターとしてピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）を組み込んだ発現ベクターである。上流から、プロモーターおよびエンハンサー（「ｐｒｏ／ｅｎｈ」）、翻訳を円滑に行わせるためのＫｏｚａｋ配列およびＡＴＧ（「Ｋｏｚａｋ＋ＡＴＧ」）、さらにはマルチクローニングサイト（「ＭＣＳ」）を有し、マルチクローニングサイト（「ＭＣＳ」）を利用して、標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）およびピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）が組み込まれている。ピューロマイシン耐性遺伝子の下流にはポリＡシグナル（「ｐｏｌｙ  Ａ」）が組み込まれている。さらに、ネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）が組み込まれている。【００４２】
図５に示す発現ベクターと評価対象核酸分子とを、培養細胞系に導入し、細胞がピューロマイシン耐性を有するかどうかを判定する。評価対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を有しない場合には、ピューロマイシン耐性遺伝子が発現し、細胞はピューロマイシン耐性を有するためピューロマイシン含有培地で生育が可能である。これに対し、評価対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を有する場合には、標的配列部でｍＲＮＡが切断されてしまうためピューロマイシン耐性遺伝子がコードするタンパク質は翻訳されない。そのため、宿主細胞はピューロマイシン耐性を有さず、細胞が生存できないかあるいは増殖が抑制されるという現象が現れる。この生育の差により、ＲＮＡｉ活性の有無を判別することができる。図５に示す発現ベクターには、ネオマイシン耐性遺伝子（「ｎｅｏ」）が組み込まれている。【００４３】
図６に示す発現ベクターは、レポーターとしてＥＧＦＰ遺伝子が組み込まれたものである。すなわち、標的配列と共に一体として転写される位置にＥＧＦＰ遺伝子（「ＥＧＦＰ」）が挿入されている。ＲＮＡｉ活性の検出は、ＥＧＦＰの蛍光量を検出することにより行うことができる。蛍光量の測定は、通常の方法に従って行うことができる。また、ＥＧＦＰ遺伝子とは別の発現調節領域支配下に耐性遺伝子としてピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）が組み込まれており、トランスフェクトされた細胞のピューロマイシンによる選択（濃縮）が可能である。【００４４】
図６に示す発現ベクターには、イントロン（「ｉｎｔｒｏｎ」）が挟み込まれたフォワードプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｆ）１」）、リバースプライマー対応領域（「ＰＡＲ（Ｒ）１」）が組み込まれている。すなわち、図６の発現ベクターを用いて、上記ＲＴ−ＰＣＲによる検出を行うこともできる。ピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）には、イントロンが挟み込まれたＰＡＲ（Ｆ）３およびＰＡＲ（Ｒ）３が含まれており、ピューロマイシン耐性遺伝子内のプライマー対応領域を利用してピューロマイシン耐性遺伝子のＲＮＡを定量し、インターナルコントロールとして用いることができる。また、ピューロマイシン耐性について細胞の選択を行うことにより、発現ベクター等が導入された細胞の割合を高めることができる。他の点は、図５の例の場合と同様である。【００４５】
図７に示す発現ベクターは、レポーターとしてファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（「Ｆ．Ｌｕｃ」：Firefly Luciferase gene）が組み込まれている。すなわち、標的配列（「ｔａｒｇｅｔ」）と共に一体として転写される位置にファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子（「Ｆ．Ｌｕｃ」）が組み込まれている。また、これとは別の発現調節領域支配下にレニラルシフェラーゼ遺伝子（「Ｒ．Ｌｕｃ」：
Renilla Luciferase gene）が組み込まれている。ＲＮＡｉ活性は、ルシフェラーゼアッセイ法によりルミノメーターなどを用いて発光の測定を行うことで判別することができる。ファイヤーフライルシフェラーゼの発光が検出されればＲＮＡｉ活性がないと判別される。ファイヤーフライルシフェラーゼの発光が抑制あるいは検出されない場合には、ＲＮＡｉ活性があると判別される。レニラルシフェラーゼの発光はインターナルコントロールとして用いることができる。また、現時点においてであるが、ルシフェラーゼアッセイはＲＴ−ＰＣＲよりも簡便なアッセイ法であり、よりハイスループットな評価方法とすることができる。他の点は図５または図６と同様である。【００４６】
１−３  インターナルコントロールによる検出シグナル正規化
本発明の他の好ましい実施形態として、インターナルコントロールを用い、各試験サンプル間の各種の誤差、具体的には、標的発現分子および評価対象核酸分子のトランスフェクション効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつき、ＲＮＡ抽出後のＲＮＡ収量（ＲＮＡ収率）のばらつき、ＰＣＲのテンプレートとして加えるｃＤＮＡ量のばらつきなどを是正することができる実施形態について説明する。【００４７】
本発明の評価方法においては、細胞発現系であっても、無細胞発現系であっても、標的発現分子および評価対象核酸分子を発現系に供給し、標的発現分子から所定のＲＮＡを発現させる。ところで、ＲＮＡｉ活性がある場合、ＲＮＡが切断されるため、ＲＮＡｉ活性があることは、所定のＤＮＡの増幅が抑制される、あるいは、発現産物が検出されないなどの現象として判別される。しかしながら、何らかの理由でもともと標的発現分子等が発現系に適切に供給されていない場合あるいは発現系が適切に機能していない場合にも、所定のＤＮＡの増幅抑制、または発現産物の不検出などの現象が現れる。また、各試料サンプル間で標的発現分子および評価対象核酸分子のトランスフェクション効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつき、ＲＮＡ抽出後のＲＮＡ収量（ＲＮＡ収率）のばらつき、ＰＣＲのテンプレートとして加えるｃＤＮＡ量のばらつきなどを生じる可能性もある。そこで、このような問題を是正する手段が設けられることがより好ましい。【００４８】
本検出シグナルの正規化を含む実施形態では、転写されるＲＮＡが評価対象核酸分子によって切断されない配列からなり、かつ検出可能な発現産物をコードするコントロール配列を含むコントロール供給分子が、前記標的発現分子と前記評価対象核酸分子とが供給される発現系内に供給される。【００４９】
コントロール供給分子は、コントロール配列を含むポリヌクレオチドである。コントロール配列は検出可能な発現産物をコードしている。発現産物としては、例えばＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質などが含まれる。また、コントロール配列は、同じく発現系に供給される評価対象核酸分子によって少なくともｍＲＮＡが切断されないものである。すなわち、本導入確認系の実施形態は、評価対象核酸分子によってＲＮＡｉを受けない分子を供給するものである。評価対象核酸分子によってｍＲＮＡが切断されないという条件を満たす限り、例えば、上記「１−２」で例示したレポーターを用いることができる。発現産物の検出は、発現産物の種類に応じて適宜選択される。【００５０】
評価対象核酸分子によって切断されない配列は、実験により確認されたものであってもよい。例えば、本発明の評価方法により、評価対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を示さない配列も容易に検出することができるため、本発明の評価方法で予めＲＮＡｉ活性を示さないことを確認した配列を用いることができる。標的対象核酸分子がＲＮＡｉ活性を示さないことは、ＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＡの増幅、発現産物の検出という現象で把握できるため、偽陽性の問題は生じず、判別は容易である。【００５１】
具体例としては、例えば図２および図３の組み合わせなどによる方式が含まれる。この場合、図３に示すＰＣＲフラグメント２がコントロール供給分子として用いられる。例えば、ＰＡＲ（Ｆ）１およびＰＡＲ（Ｒ）１を利用した標的配列に係るＰＣＲとは別に、コントロール配列部位に係るＰＡＲ（Ｆ）２およびＰＡＲ（Ｒ）２の組み合わせによるＰＣＲを行い、標的配列に係るＰＣＲの測定値をコントロール配列部位に係るＰＣＲの測定値で割った値を各試料サンプルについて求めることにより、各サンプル間での誤差を正規化して、より的確に比較することができる。具体的には、例えば、標的発現分子および評価対象核酸分子のトランスフェクション効率のばらつき、回収時の細胞数のばらつき、ＲＮＡ抽出後のＲＮＡ収量（ＲＮＡ収率）のばらつき、ＰＣＲのテンプレートとして加えるｃＤＮＡ量のばらつきなどの各サンプル間の誤差について正規化することができる。【００５２】
ＰＣＲフラグメント２はネオマイシン耐性遺伝子を有している。図３に示す例では、ＰＡＲ（Ｆ）２およびＰＡＲ（Ｒ）２はネオマイシン耐性遺伝子中の配列をそのまま利用して、ＰＣＲプライマーが設計される。【００５３】
上記のようにコントロール供給分子を標的発現分子とは別個に作製して発現系に供給しても良いが、他の形態として、コントロール配列を標的発現分子に組み込んでもよい。標的発現分子に組み込むには、コントロール配列およびコントロール配列を発現させるための発現調節領域を標的発現分子内に備えるようにすればよい。コントロール配列は、上記コントロール供給分子に含まれるコントロール配列と同様である。【００５４】
コントロール配列を標的発現分子に組み込んで発現系に導入する場合、コントロール供給分子と共に必ず標的配列部分も発現系内に導入される。したがって、コントロール配列を標的発現分子内に組み込むことにより、コントロール供給分子と標的発現分子についてトランスフェクション効率の差を考慮することを要しないという点でメリットがある。他方、標的発現分子にコントロール供給分子を組み込まない場合、一般にトランスフェクション効率は分子サイズが小さいほど良くなる傾向があるため、標的発現分子のトランスフェクション効率を良くすることができる。また、図２および３に示すＰＣＲフラグメントからなる標的発現分子は、ベクターをコンストラクションすることなくＰＣＲにより簡便に作製できる点でメリットがある。【００５５】
標的発現分子の具体例としては、例えば、図６および７に示す形態などが示される。図６に示す例では、標的発現分子中にピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）が組み込まれており、このピューロマイシン耐性遺伝子（「ｐｕｒｏ」）中にイントロン（「ｉｎｔｒｏｎ」）、ＰＡＲ（Ｆ）３およびＰＡＲ（Ｒ）３が設けられており、インターナルコントロールとして用いることができる。図６に示す例では、ＰＡＲ（Ｆ）３中にイントロンが組み込まれている。インターナルコントロールによる正規化の手法における他の点は、上記図２および３の例における正規化の説明と同様である。【００５６】
図７に示す例では、標的発現分子にレニラルシフェラーゼ遺伝子（「Ｒ．Ｌｕｃ」）が組み込まれている。レニラルシフェラーゼ遺伝子は、ファイヤーフライルシフェラーゼ遺伝子のインターナルコントロールである。標的発現分子に組み込まれたレニラルシフェラーゼ遺伝子中には、ＰＡＲ（Ｆ）４、ＰＡＲ（Ｒ）４およびイントロンが設けられている。「ファイヤーフライルシフェラーゼの発光度値／レニラルシフェラーゼの発光度値」を算出することによりルシフェラーゼの相対活性を求めることもできる。正規化された値に基づき、より正確なデータの比較が可能である。【００５７】
１−４  副作用確認系
ＲＮＡｉ活性を有するｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡを発現するＲＮＡｉベクターなどは所定の遺伝子の発現を抑制することができるため、遺伝子治療薬等としての用途が考えられる。しかし、治療薬とするためには、ある特定のｓｉＲＮＡが、生体内の他の遺伝子等にも作用して、副作用を生じさせないことが求められる。【００５８】
ところで、ＲＮＡｉを受ける配列とｓｉＲＮＡの配列とは、同じ塩基配列を有する。しかし、類似した配列どうしの場合でもＲＮＡｉが生じることがある。したがって、どのような類似範囲でＲＮＡｉが生じるのかを評価することは上記のような副作用防止の観点から重要である。【００５９】
本副作用確認系の実施形態は、上記本発明の評価方法において、評価対象核酸分子として、標的配列が有する塩基配列とは異なる塩基配列を有するものを用いる。あえて標的配列とは異なる塩基配列を評価対象として用いることにより、その評価対象核酸分子が有するＲＮＡｉ活性の作用範囲を明らかにすることができる。【００６０】
２．ｍｉＲＮＡ活性の評価方法
また、本発明は、ｍｉＲＮＡ活性の評価法も提供する。本発明のｍｉＲＮＡ活性の評価方法は、上記ＲＮＡｉ活性の評価方法における評価対象核酸分子として、ｍｉＲＮＡ活性を測定しようとする分子を用いる。すなわち、本発明のｍｉＲＮＡ活性の評価方法では、少なくとも、標的配列と、前記標的配列を含むＲＮＡの発現を調節する発現調節領域と、前記標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列とを含むポリヌクレオチドである標的発現分子と、前記標的配列を含むＲＮＡに対してｍｉＲＮＡ活性を有するか否かを評価の対象とする評価対象核酸分子とを、前記標的発現分子が標的配列を含むＲＮＡを発現可能な発現系内に供給し、前記レポーターの発現が抑制されたか否かを検出する。【００６１】
ｍｉＲＮＡは、タンパク質に翻訳されない２０数塩基のＲＮＡとして知られている。したがって、評価対象核酸分子としては、タンパク質に翻訳されない２０数塩基のＲＮＡまたはヘアピン構造を有するｍｉＲＮＡ前駆体などが用いられる。なお、このようなＲＮＡを発現する発現ベクターを用いて、標的配列発現分子を供給する発現系へ供給してもよい。【００６２】
ｍｉＲＮＡは主に翻訳抑制として作用するものと考えられているため、ｍｉＲＮＡ活性の評価としては、標的配列を含むＲＮＡがコードするタンパク質の発現が抑制されたか否かを検出することが、より正確な評価を行う上で好適である。すなわち、標的配列と一体のｍＲＮＡとして転写される位置にレポーターとして検出可能な発現産物をコードする配列を、標的発現分子中に組み込む。ｍｉＲＮＡ活性の検出手法は、上記ＲＮＡｉ活性の評価方法における「１−２  レポーター方式」の欄に説明した方法と同様にして行うことができる。ｍｉＲＮＡ活性がある場合には、レポーターが検出されない、またはレポーターの発現が抑制されるという形態で判別される。【００６３】
標的発現分子等が供給される発現系は、無細胞発現系でもあっても、細胞発現系であってもよい。また、ｍｉＲＮＡ活性の評価方法においても、ＲＮＡｉ活性の評価方法の場合と同様に、インターナルコントロールによる検出シグナル正規化（上記「１−３」参照）の実験系を構築することができる。ただし、ｍｉＲＮＡ活性の評価の場合には、コントロール配列は、評価対象核酸分子によって発現抑制されない配列からなり、かつ、検出可能な発現産物をコードする。さらに、ＲＮＡｉ活性の評価方法と同様に、副作用確認系（上記「１−４」参照）の実験系を構築することもできる。【００６４】
３．ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法
本ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法（以下「本検索方法」という場合がある）は、標的とする遺伝子の塩基配列中から、ＲＮＡ干渉の起因となる塩基配列を探し出す方法である。具体的には、本検索方法では、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列から、下記（ａ）から（ｄ）の規則に従う配列部位を検索する。
（ａ）３’末端の塩基が、アデニン、チミンまたはウラシルである。
（ｂ）５’末端の塩基が、グアニンまたはシトシンである。
（ｃ）３’末端の７塩基の配列において、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上の塩基がリッチである。
（ｄ）塩基数が、細胞毒性を生じさせずにＲＮＡ干渉を生じさせ得る数である。【００６５】
「標的遺伝子」における「遺伝子」とは、遺伝情報をコードする媒体のことをいう。「遺伝子」はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡの複合体など遺伝情報をコードする物質により構成されるが、遺伝情報としては、物質そのものではなく塩基配列を電子データ化したものをコンピュータ上などで扱うことが可能である。「標的遺伝子」は、１つのコード領域としてもよいし、複数のコード領域にわたっていてもよいし、また、配列が判明したすべてのポリヌクレオチドを標的としてもよい。特定の機能を有する遺伝子について検索したい場合には、その特定遺伝子のみを標的とすることにより、当該特定遺伝子に特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる塩基配列を効率よく検索することができる。すなわち、ＲＮＡ干渉はｍＲＮＡを干渉破壊する現象として知られており、特定のコード領域を選択することにより検索負荷を軽減できる。また、転写領域のひとまとまりを標的遺伝子として検索してもよい。なお、本明細書中では上記（ａ）から（ｄ）の規則を満たす塩基配列のことを「規定配列」という。上記規則においては、塩基配列がＤＮＡの配列であればチミンが、ＲＮＡの配列であればウラシルが対応する。【００６６】
規則（ｃ）は、３'末端近傍の配列にアデニン、チミン、およびウラシルからなる群より選ばれる塩基がリッチに含まれていることを規定しており、具体的に検索を行う際の一指標として３'末端部から７塩基の範囲内において、アデニン、チミン、およびウラシルから選ばれる塩基がリッチな配列であることを規定している。【００６７】
規則（ｃ）において、「リッチな配列」とは特定の塩基が現れる頻度が高いことを意味し、割合を概略的に示すと、規定配列における３’末端側の５〜１０塩基、好ましくは７塩基の配列中にアデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、少なくとも４０％以上、より好ましくは５０％以上含まれることを意味する。より具体的には、例えば約１９塩基程度の規定配列の場合を例に挙げると、３’末端側の７塩基のうち好ましくは少なくとも３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上が、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上である。【００６８】
規則（ｃ）に該当するか否かを確認する手段は特に制限されず、７塩基中の好ましくは３塩基以上、より好ましくは４塩基以上、特に好ましくは５塩基以上がアデニン、チミンまたはウラシルであることを確認できればよい。例えば、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群より選ばれる１種または２種以上が、３'末端側の７塩基の配列中に３つ以上含まれることをリッチであると定義した場合を例として説明すると、３'末端の第１番目の塩基から逐次上記３種の塩基のいずれかであるか否かを照合し、第７番目の塩基に至るまでに３つ現れた場合に、規則（ｃ）に適合すると判断することができる。例えば、第３番目までに３つ現れれば、３つの塩基を調べれば足りる。すなわち、規則（ｃ）について検索する場合、必ずしも３'末端側の７塩基についてすべて照合することは要しない。逆に第７番目までに３つ以上現れなければリッチではなく、規則（ｃ）を満たさないと判断される。【００６９】
二本鎖ポリヌクレオチドにおいてはアデニンとチミンまたはウラシルとが相補的に水素結合することは周知である。また、グアニンとシトシンとの相補的な水素結合（Ｇ−Ｃ水素結合）においては３つの水素結合部位が形成されるのに対し、アデニンとチミンまたはウラシルとの相補的水素結合（Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合）においては２つの水素結合部位があり、一般的にいって、Ｇ−Ｃ水素結合に対し、Ａ−（Ｔ／Ｕ）水素結合のほうが結合力は弱い。【００７０】
規則（ｄ）においては、検索する塩基配列の塩基数を規定している。検索する塩基配列の塩基数は、ＲＮＡ干渉を生じさせ得る塩基数である。また、生物の種類などの条件により、塩基数があまりに大きすぎるｓｉＲＮＡでは細胞毒性を生じてしまうことが知られている。塩基数の上限は、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする生物の種類などにより異なるが、ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の塩基数はいずれの種にせよ３０以下であることが好ましい。また、哺乳動物の場合には、塩基数は、好ましくは２４以下、より好ましくは２２以下である。また、下限はＲＮＡ干渉を生じさせる限りにおいて特に制限されるものではないが、好ましくは１５以上、より好ましくは１８以上、さらに好ましくは２０以上である。ｓｉＲＮＡを構成する一本鎖としての塩基数は、２１で検索することが特に好ましい。【００７１】
なお、以下においても説明するが、ｓｉＲＮＡには、規定配列の３’末端にオーバーハング部が設けられる。オーバーハング部は塩基数２であることが好適である。したがって、オーバーハング部を含めず、規定配列のみの塩基数の上限としては、好ましくは２８以下、より好ましくは２２以下、さらに好ましくは２０以下であり、下限としては、好ましくは１３以上、より好ましくは１６以上、さらに好ましくは１８以上である。規定配列の最も好ましい塩基数は１９である。ＲＮＡｉの標的塩基配列の検索は、オーバーハング部を含める場合および含めない場合のいずれで検索してもよい。【００７２】
規定配列に従う塩基配列は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率が極めて高い。したがって、本検索方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる配列を極めて高い確率で検出することが可能であり、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの設計を簡便化することができる。【００７３】
なお、規定配列は、塩基数を定めた上で上記の（ａ）から（ｃ）の規則に従う部分を検索するようなプログラムを搭載するコンピュータを用いて効率的に検出可能である。【００７４】
４．ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法
本塩基配列設計方法は、上記の検索方法により検索された塩基配列に基づいてＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）の塩基配列を設計するものである。ｓｉＲＮＡは主としてＲＮＡからなるが、一部にＤＮＡが含まれている混成ポリヌクレオチドも含まれる。本塩基配列設計方法では、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基配列を標的遺伝子の塩基配列から検索し、検索された塩基配列と相同な塩基配列を設計する。（ａ）から（ｄ）の規則および検索の手法については、上記検索方法について説明したとおりである。【００７５】
「相同な配列」とは、同一の配列およびＲＮＡ干渉を生じさせるという機能を失わない範囲で前記同一配列に対し欠失、置換、挿入などの変異を含む配列のことをいう。標的遺伝子の種類、配列などの条件にもよるが、許容される変異を相同性（ホモロジー）で例示すると、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％である。許容される変異の程度としての相同性を算出する場合、同一の検索アルゴリズムを用いて算出された数値どうしを比較することが望ましい。検索アルゴリズムは特に限定されないが、局所的な配列の検索に適したもの、より具体的にはＢＬＡＳＴ、ＳＳｅａｒｃｈなどを好適に用いることができる。【００７６】
上記のように、検索された配列は若干の改変が許容されるが、設計される塩基配列の塩基数は、検索された配列と同一とすることが特に好ましい。塩基数を同一とした場合について改変の許容度を例示すると、設計される塩基配列の塩基が、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上検索された配列と一致することが好適である。例えば、塩基数１９の塩基配列を設計する場合であれば、好ましくは１６塩基以上、より好ましくは１８塩基以上が、検索された塩基配列と一致することが好ましい。また、検索された塩基配列と相同な配列を設計する場合、検索された塩基配列の３’末端の塩基と設計される塩基配列の３’末端の塩基とは同一であることが望ましく、また、検索された塩基配列の５’末端の塩基と設計される塩基配列の５’末端の塩基とが同一であることが望ましい。【００７７】
通常ｓｉＲＮＡ分子には、オーバーハング部が設けられる。オーバーハング部とは、二本鎖のｓｉＲＮＡ分子において、各鎖の３’末端に設けられた、一本鎖の状態で突出した部分である。オーバーハング部は、生物の種類などにもよるが、塩基数は２が特に好適である。オーバーハング部の塩基配列は、基本的には任意であるが、検索元の標的遺伝子と同一の塩基配列、ＴＴ、あるいはＵＵなどが好適に用いられる場合がある。上記のように検索された塩基配列と相同な配列となるように設計された規定配列の３’末端に、オーバーハング部を設けることにより、ｓｉＲＮＡを構成するセンス鎖が設計される。【００７８】
また、最初から規定配列およびオーバーハング部を含めて検索を行い、設計することもできる。オーバーハング部の好ましい塩基数は２である。したがって、例えば、塩基数１９の規定配列および塩基数２のオーバーハング部からなるｓｉＲＮＡを構成する一本鎖の設計をする場合には、オーバーハング部を含めたｓｉＲＮＡの塩基数としては塩基数２１の配列を標的遺伝子から検索すればよく、また二本鎖の状態について検索する場合には、塩基数２３の配列を検索してもよい。【００７９】
本塩基配列設計方法では、上記のように所望の標的遺伝子から所定の配列を検索してくるが、ＲＮＡ干渉を生じさせようとする対象は、標的遺伝子の由来と必ずしも一致せずともよく、類縁種などに適用可能である。例えば、第１の種から単離された遺伝子を標的遺伝子とし、第１の種の類縁種である第２の種に用いるｓｉＲＮＡを設計することもできる。さらに、例えば複数種の哺乳類から共通配列を検索し、この共通配列から上記規定配列を検索して設計することにより、哺乳類に幅広く適用可能なｓｉＲＮＡの設計が可能である。複数の哺乳類に共通する配列は、他の哺乳類においても保存されている確率が高いと考えられるためである。【００８０】
標的遺伝子と関係のない遺伝子についてまでＲＮＡ干渉を生じさせないようにするためには、設計した配列と同一または類似の配列が他の遺伝子に含まれていないか検索することが好ましい。設計した配列と同一または類似の配列の検索は、一般的なホモロジー検索を行うことができるソフトウエア等を用いて行えばよい。このような同一／類似配列を除外することにより、標的とする遺伝子のみに特異的にＲＮＡ干渉を生じさせる配列を設計することができる。【００８１】
本塩基配列設計方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせるＲＮＡ分子を、高い確率でしかも容易に設計することができる。ＲＮＡの合成は、未だ労力、時間、費用を要するが、本塩基配列設計方法によりそれらを大幅に軽減することが可能である。【００８２】
５．二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法
本二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法は、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高い二本鎖ポリヌクレオチドを作製する方法である。本二本鎖ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの塩基配列が上記塩基配列設計方法に従って設計され、その配列設計に従うように二本鎖ポリヌクレオチドが合成される。配列の設計における好ましい形態は、上記塩基配列設計方法についての説明と同様である。【００８３】
二本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡ干渉を生じさせる二本鎖ポリヌクレオチドを構成するものであり、このような二本鎖ポリヌクレオチドとしてｓｉＲＮＡが知られている。なお、本二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により製造される二本鎖ポリヌクレオチドはＲＮＡにより構成されることが好ましいが、一部にＤＮＡを含む混成ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書では一部にＤＮＡを含むものもｓｉＲＮＡの概念に含める。また、本発明者らの研究によれば、ｓｉＲＮＡは構造的または機能的にアシンメトリー性（非対称性）を有する傾向が認められ、ＲＮＡ干渉を生じさせるという目的からすると、センス鎖の５’末端側の半分、アンチセンス鎖の３’末端側の半分はＲＮＡで構成されることが望ましい。【００８４】
二本鎖ポリヌクレオチドは、一方の鎖が標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成される。各鎖の塩基数はオーバーハング部を含め１８〜２４であり、より好ましくは２０〜２２、特に好ましくは２１である。また、オーバーハング部の塩基数は２であることが好ましい。全体の塩基数が２１、そのうちオーバーハング部が塩基数２で構成されるｓｉＲＮＡは、哺乳類でも細胞毒性を生じさせずに高確率でＲＮＡ干渉を生じさせるｓｉＲＮＡとして好適である。【００８５】
ＲＮＡの合成は、例えば、化学合成によって行ってもよいし、また、通常のバイオテクノロジー等の手法に従って行うこともできる。例えば、所定の配列を有するＤＮＡ鎖を作製し、これを鋳型として転写酵素を用いて一本鎖ＲＮＡを合成し、一本鎖ＲＮＡを二本鎖化するなどの手法により合成することができる。【００８６】
上記本二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により得られるポリヌクレオチドとして好ましい形態としては、ＲＮＡ干渉の標的遺伝子の塩基配列中から上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う塩基数１３〜２８の配列部位を検索し、一方の鎖が、標的遺伝子の塩基配列中に含まれる、上記（ａ）から（ｄ）の規則に従う規定配列と相同な塩基配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、他方の鎖が、前記規定配列と相同な塩基配列と相補的な配列の３’末端にオーバーハング部を設けて形成され、各鎖の塩基数が１５〜３０であるように合成された、二本鎖ポリヌクレオチドが例示される。当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ干渉を生じさせる確率の高いポリヌクレオチドである。【００８７】
また、ｓｉＲＮＡを発現するような発現ベクターを調製することもできる。規定配列を含む配列を発現するベクターを、発現が行われ得る無細胞系または細胞系の条件下におくことで、発現ベクターを用いて所定のｓｉＲＮＡを供給することができる。【００８８】
従来、ｓｉＲＮＡの設計は、試験者の経験や勘に依存していたため、試行錯誤を繰り返すことが多かった。しかし、本二本鎖ポリヌクレオチド作製方法により、ＲＮＡ干渉を生じさせる二本鎖ポリヌクレオチドを高い確率で製造することが可能である。上記標的塩基配列検索方法、配列設計方法または二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法によれば、ＲＮＡ干渉を利用した各種の試験や製造等に要する労力、時間、コストを大幅に削減することが可能である。すなわち、上記標的塩基配列検索方法、塩基配列設計方法および二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法は、遺伝子解析、創薬ターゲットの探索、創薬、遺伝子治療、生物種間の差の研究などのＲＮＡ干渉を利用する様々な試験、研究、開発、製造等を大幅に簡便にし、効率の向上を図ることができる。【００８９】
６．遺伝子の発現抑制方法
本遺伝子発現抑制方法は、所定の塩基配列を検索する工程と、検索された塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡの塩基配列を設計して合成する工程と、得られたｓｉＲＮＡを標的遺伝子を含む発現系に導入する工程とを含む。
所定の塩基配列を検索する工程は、上記ＲＮＡ干渉の標的塩基配列検索方法に従う。好ましい態様も上記のとおりである。また、検索された塩基配列に基づいてｓｉＲＮＡの塩基配列を設計して合成する工程は、上記、ＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、二本鎖ポリヌクレオチドの作製方法に従って行うことができ、好ましい形態も同様である。【００９０】
得られた二本鎖ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の発現系に添加されて標的遺伝子の発現を抑制する。標的遺伝子の発現系とは、標的遺伝子が発現している系のことであり、より具体的には、少なくとも標的遺伝子のｍＲＮＡが形成される反応系を備える系である。標的遺伝子の発現系としては、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｉｎ  ｖｉｖｏのいずれのものも含まれる。標的遺伝子の発現系として、培養細胞、培養組織、生体などのほか、無細胞系を用いることも可能である。発現抑制をしようとする標的遺伝子（抑制標的遺伝子）は必ずしも検索された配列の由来と一致する生物種のものに限らずともよいが、検索対象遺伝子と抑制対象遺伝子との由来が近縁であればあるほど、特異的かつ効果的に特定遺伝子の抑制を行うことができる。【００９１】
「標的遺伝子の発現系に導入する」とは、導入対象を標的遺伝子の発現反応系の中に取り込ませるということである。具体的に例を挙げると、標的遺伝子を有する培養細胞に二本鎖ポリヌクレオチドをトランスフェクトし、細胞内に取り込ませる、規定配列およびオーバーハング部からなる塩基配列を有する発現ベクターを作製し、標的遺伝子を有する細胞内に導入するなどの手法が挙げられる。【００９２】
本遺伝子抑制方法によれば、効率よくＲＮＡ干渉を生じさせるポリヌクレオチドを得られるため、効率よく、また簡便に遺伝子を抑制することが可能である。【００９３】
以下、本発明の実施例を示し、本発明についてより詳細に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００９４】
実施例１
１．標的発現ベクターｐＴＲＥＣの構築
ｐＣＩ−ｎｅｏ（GenBank Accession No. U47120、プロメガ社製）のＣＭＶエンハンサー／プロモーター下流に標的ｍＲＮＡ配列を構築した（図８）。すなわち、コザック配列（「Ｋｏｚａｋ」）、標的となる２３塩基対配列（「ｔａｒｇｅｔ」）及び組み換えのための制限酵素（ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩ）認識配列を有する下記の二本鎖オリゴマーを合成した。この二本鎖オリゴマーは配列表の配列番号１に示す配列とその相補的な配列とからなる。合成した二本鎖オリゴマーをｐＣＩ−ｎｅｏのＮｈｅＩ、ＸｂａＩサイトに挿入し、標的発現ベクターｐＴＲＥＣを構築した（図８）。なお、イントロンは、ｐＣＩ−ｎｅｏに当初から組み込まれているβ−グロビン由来のイントロン部位を用いた。
5'-gctagccaccatggaattcacgcgtctcgagtctaga-3'  （配列番号１）【００９５】
２．標的ｍＲＮＡ検出用プライマーの効果
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０6ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣベクターをトランスフェクトした。【００９６】
（２）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Trizol(Invitrogen社製)を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ  １００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄT）をプライマーとし、SuperScript
II RT(Invitrogen社製)により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行った。コントロールとして、逆転写酵素を加えないものを用意した。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、SYBR
Green PCR Master Mix(Applied Biosystems社製)を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、標的ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および、内部コントロールとしてｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ABI PRIZM 7000(Applied Biosystems社製)を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２および３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４および５）をそれぞれ使用した。【００９７】
プライマー対Ｔ：
aggcactgggcaggtgtc          （配列番号２）
tgctcgaagcattaaccctcacta    （配列番号３）【００９８】
プライマー対Ｃ
atcaggatgatctggacgaag      （配列番号４）
ctcttcagcaatatcacgggt      （配列番号５）【００９９】
図９および図１０に、ＰＣＲの結果を示す。図９および１０は、縦軸にそれぞれのＰＣＲ産物量を、横軸にＰＣＲのサイクル回数をとり、グラフに表したものである。ネオマイシン耐性遺伝子の場合、逆転写酵素によりｃＤＮＡを合成したもの（＋ＲＴ）と、逆転写酵素を加えないコントロール（−ＲＴ）で、得られたＰＣＲ産物の増幅の差は小さかった（図９）。これは、ｃＤＮＡのみならず、細胞内に残っているベクターもＰＣＲの鋳型となって増幅されたことを示す。他方、標的配列ｍＲＮＡでは、逆転写酵素を添加した場合（＋ＲＴ）と添加しない場合（−ＲＴ）とによる差が大きかった（図１０）。この結果は、プライマー対Ｔのうち一方がイントロンを挟む形でデザインされているため、イントロンが除去されたｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡが効率的に増幅される一方、イントロンを有する残存ベクターが鋳型となりにくくなっていることを示している。【０１００】
３．ｓｉＲＮＡによる標的ｍＲＮＡの発現抑制
（１）ターゲット発現ベクターへの評価配列のクローニング
ヒトビメンチン（ＶＩＭ）遺伝子(Ref Seq ID: NM_003380)コード領域の８１２−８３４、３５−５７に相当する配列を評価の対象とした。これらの配列およびＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩの認識配列を有する下記配列表配列番号６および７の合成オリゴヌクレオチド（評価配列フラグメント）を作製した。
評価配列ＶＩＭ−３５（ＶＩＭの３５−５７に相当）
5'-gaattcgcaggatgttcggcggcccgggcctcgag-3'      （配列番号６）【０１０１】
評価配列ＶＩＭ−８１２（ＶＩＭの８１２−８３４に相当）
5'-gaattcacgtacgtcagcaatatgaaagtctcgag-3'      （配列番号７）【０１０２】
得られた評価配列フラグメントを、その両端にあるＥｃｈｏＲＩサイトおよびＸｈｏＩサイトを利用して、ｐＴＲＥＣのＥｃｏＲＩ、ＸｈｏＩサイト間に、新たな標的配列としてクローニングし、ｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５、ｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２を構築した。【０１０３】
（２）ｓｉＲＮＡの作製
評価配列ＶＩＭ−３５（配列表の配列番号８、図１１）、評価配列ＶＩＭ−８１２（配列番号９、図１２）、およびコントロール配列（ｓｉＣｏｎｔｏｒｏｌ、配列番号１０、図１３）にそれぞれ相当するｓｉＲＮＡフラグメントを合成し、アニーリングした。下記ｓｉＲＮＡの各配列においては、３’末端にオーバーハング部を設けてある。【０１０４】
ｓｉＶＩＭ−３５      5'-aggauguucggcggcccgggc-3'  （配列番号８）【０１０５】
ｓｉＶＩＭ−８１２      5'-guacgucagcaauaugaaagu-3' （配列番号９）【０１０６】
コントロールとして、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡを用いた。【０１０７】
ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ      5'-cauucuauccgcuggaagaug-3'（配列番号１０）【０１０８】
（３）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０6ｃｅｌｌｓのＨｅＬａ細胞をまき、１日後にLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって０．５μｇのｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２と、それぞれのＶＩＭ由来配列に相当するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ−３５、ｓｉＶＩＭ−８１２、それぞれ終濃度１００ｎＭ）を同時にトランスフェクトした。コントロール細胞には、０．５μｇのｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ３５またはｐＴＲＥＣ−ＶＩＭ８１２とルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、終濃度１００ｎＭ）とを同時にトランスフェクトした。【０１０９】
（４）細胞の回収およびｍＲＮＡの定量
トランスフェクションの１日後、細胞を回収し、Trizol(Invitrogen)を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ  １００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、SuperScript
II RT（Invitrogen社製）により逆転写してｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡの３２０分の１量をＰＣＲテンプレートとし、SYBR Green PCR
Master Mix(Applied Biosystems社製)を用いて、５０μｌの反応系で定量的ＰＣＲを行い、評価しようとするＶＩＭ由来の配列を含むｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｔ）と称する）および内部コントロールとして、ｐＴＲＥＣ上のネオマイシン耐性遺伝子に由来するｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ（Ｃ）と称する）を定量した。【０１１０】
定量的ＰＣＲにはリアルタイムモニタリング装置ABI PRIZM 7000(Applied Biosystems社製)を用い、ｍＲＮＡ（Ｔ）の定量にはプライマー対Ｔ（配列表配列番号２および３）、ｍＲＮＡ（Ｃ）の定量にはプライマー対Ｃ（配列表配列番号４および５）をそれぞれ使用した。得られたそれぞれのｍＲＮＡの値の比（Ｔ／Ｃ）を縦軸（標的ｍＲＮＡ相対量（％））としてグラフに表した（図１４）。【０１１１】
コントロール細胞の場合、ルシフェラーゼ遺伝子に対するｓｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡに効果を及ぼさないため、Ｔ／Ｃ比はほぼ１になった。ＶＩＭ−８１２  ｓｉＲＮＡでは、Ｔ／Ｃ比が著しく下がった。これは、ＶＩＭ−８１２  ｓｉＲＮＡが、相当する配列を有するｍＲＮＡを切断したためであり、ＶＩＭ−８１２  ｓｉＲＮＡがＲＮＡｉ効果を有することが示された。一方、ＶＩＭ−３５  ｓｉＲＮＡの場合、Ｔ／Ｃ比はコントロールとほぼ同じ値であったことから、ＶＩＭ−３５の配列にはＲＮＡｉ効果がほとんどないことが示された。【０１１２】
実施例２
１．ｓｉＲＮＡによる内在性ビメンチンの発現抑制
（１）培養細胞へのトランスフェクション
２４穴プレートの１穴あたりに０．２〜０．３×１０6ｃｅｌｌｓ  のＨｅＬａ細胞をまき、１日後にLipofectamine 2000（Invitrogen社製）を用いて、マニュアルにしたがって、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＶＩＭ−３５またはｓｉＶＩＭ−８１２）またはコントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）１００ｎＭ、トランスフェクション効率のコントロールとして０．５μｇのｐＥＧＦＰ（Clontech社製）を同時にトランスフェクトした。ｐＥＧＦＰにはＥＧＦＰが組み込まれている。【０１１３】
（２）内在性ビメンチンｍＲＮＡの測定
トランスフェクションの３日後、細胞を回収し、Trizol(Invitrogen社製)を用いて全ＲＮＡを抽出した。このＲＮＡ１００ｎｇを用いて、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとし、SuperScript
II RT(Invitrogen社製)により逆転写してｃＤＮＡ合成反応を行なった。得られたｃＤＮＡ産物を鋳型として、ビメンチンに対するプライマーＶＩＭ−Ｆ３−８４、ＶＩＭ−Ｒ３−２７４（配列番号１１および１２）を用いてＰＣＲを行った。【０１１４】
ＶＩＭ−Ｆ３−８４；  
gagctacgtgactacgtcca    （配列番号１１）
ＶＩＭ−Ｒ３−２７４；  gttcttgaactcggtgttgat   （配列番号１２）【０１１５】
また、コントロールとして、β−アクチンに対するプライマーＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１、ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４（配列番号１３および１４）を用いてＰＣＲを行い、各サンプル間のβ−アクチンの定量値を合わせたうえで、ビメンチンの発現量を評価した。【０１１６】
ＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１；  cacactgtgcccatctacga（配列番号１３）
ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４；  gccatctcttgctcgaagtc（配列番号１４）【０１１７】
結果を図１５に示す。図１５では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ（すなわち、標的とは無関係な配列のｓｉＲＮＡ）を入れた場合を１００％として比較し、ＶＩＭに対するｓｉＲＮＡを入れた場合に、ＶＩＭのｍＲＮＡがどの程度減少したかを表している。ｓｉＶＩＭ−８１２は効果的にＶＩＭ  ｍＲＮＡを抑制できたのに対して、ｓｉＶＩＭ−３５を用いた場合はほとんどＲＮＡｉ効果を示さなかった。
（３）細胞の抗体染色
トランスフェクションの３日後、細胞を３．７％のホルムアルデヒドにより固定し、定法によりブロッキングを行った。その後、ウサギ抗ビメンチン抗体（α−ＶＩＭ）または内部コントロールとしてウサギ抗Ｙｅｓ抗体（α−Ｙｅｓ）を加え、室温で反応させた。その後、細胞表面をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline；リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、二次抗体として蛍光標識抗ウサギＩｇＧ抗体を加え、室温で反応させた。細胞表面をＰＢＳで洗浄の後、蛍光顕微鏡による観察を行った。【０１１８】
蛍光顕微鏡観察の結果を図１６に示す。図１６中、９つの各枠内において、白く表示されている部分が蛍光が現れている部分である。ＥＧＦＰおよびＹｅｓについては、何れの細胞でも同程度の発現が確認された。ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ−３５を導入した細胞では、ビメンチンの抗体染色による蛍光が観察され、内在性ビメンチンの存在が確認された。一方、ｓｉＶＩＭ−８１２を導入した細胞では、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ、ｓｉＶＩＭ−３５を導入した細胞に比べて蛍光が著しく弱かった。この結果は、ｓｉＶＩＭ−８１２により内在性のビメンチンｍＲＮＡが干渉を受けた結果、ビメンチンの蛋白質の発現量が減少したことを示すものであり、ｓｉＶＩＭ−８１２は内在性ビメンチンｍＲＮＡにもＲＮＡｉ効果を有することが明らかになった。
本発明のアッセイ系で得られた結果（実施例１）は、実際に内在性遺伝子に対してそれぞれのｓｉＲＮＡを用いた結果（実施例２）とよく一致していたため、このアッセイ系は任意のｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ活性を評価する方法として有効なものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明は、バイオテクノロジーの実験、研究、開発、さらには医薬開発などに好適に用いることができる。【０１２０】
この出願は、平成１５年１１月２１日出願の日本特許出願、特願２００３−３９２３０４に基づくものであり、特願２００３−３９２３０４の明細書および特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【配列表フリーテキスト】
【０１２１】
配列番号１；ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限サイトを含むオリゴマー
配列番号２；ＰＣＲプライマーＴ
配列番号３；ＰＣＲプライマーＴ
配列番号４；ＰＣＲプライマーＣ
配列番号５；ＰＣＲプライマーＣ
配列番号６；標的配列ＶＩＭ３５
配列番号７；標的配列ＶＩＭ８１２
配列番号８；評価対象ｓｉＲＮＡ、ｓｉＶＩＭ−３５
配列番号９；評価対象ｓｉＲＮＡ、ｓｉＶＩＭ−８１２
配列番号１０；コントロールｓｉＲＮＡ、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ
配列番号１１；ＰＣＲプライマーＶＩＭ−Ｆ３−８４
配列番号１２；ＰＣＲプライマーＶＩＭ−Ｒ３−２７４
配列番号１３；ＰＣＲプライマー  ＡＣＴＢ−Ｆ２−４８１
配列番号１４；ＰＣＲプライマー  ＡＣＴＢ−Ｒ２−６６４
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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