(57)【要約】薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、及びその製造方法を提供する。  水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にヒドラジド基含む基を５５モル％以上導入することにより得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物は、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長できることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、反応試薬に含まれるヒドラジド基と脱水縮合反応させる工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項２】
カルボキシ基とヒドラジド基との脱水縮合反応により導入される基が、少なくとも１以上の官能基を含み、当該官能基が、置換されていてもよいヒドラジド基、置換されていてもよいアミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基から選択される、請求項１に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項３】
カルボキシ基とヒドラジド基との脱水縮合反応により導入される基が、１つの官能基を含み、当該官能基が、置換されていてもよいヒドラジド基、置換されていてもよいアミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基から選択される、請求項１に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項４】
カルボキシ基とヒドラジド基との脱水縮合反応により導入される基が、置換されていてもよいヒドラジド基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項５】
反応試薬が、式（Ｉ）
【化１】
2005054302.tif 000015
［式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、ｎは、０〜１２の整数である。］
で表される化合物である、請求項４に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項６】
前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が式（ＩＩ）
【化２】
2005054302.tif 000016
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−６アルキルカルボニル基であり、
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、
ｎは、０〜１２の整数である。］
で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項７】
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄが水素原子である、請求項５または６に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項８】
水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、５５モル％以上の修飾率で反応試薬のヒドラジド基と脱水縮合反応させる工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項９】
前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物であって、ヒアルロン酸をその構成ユニットの二糖にまで分解することができ且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和二糖を生成させるヒアルロニダーゼで該水溶性ヒアルロン酸修飾物を分解し、得られる分解産物の２３２ｎｍにおける吸収を観測した場合に、分解産物に由来する全ピークエリアに対して二糖に由来するピークエリアの分率が２３．４％以下である、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物。
【請求項１１】
前記水溶性ヒアルロン酸誘導体の哺乳動物における平均血中滞留時間が、１８時間以上である請求項１〜９のいずれか１項に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項１２】
水と極性有機溶媒との混合溶媒の混合比が、水：極性有機溶媒の容積比で９５：１〜２０：８０である、請求項１〜９および１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
極性有機溶媒が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、アセトン、ピリジン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはこれらの２種以上の混合溶媒から選択される請求項１２に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項１４】
極性有機溶媒が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）から選択される請求項１３に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜９、１１、１２、１３および１４のいずれか１項に記載の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物。
【請求項１６】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体。
【請求項１７】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体。
【請求項１８】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物と薬物とからなる水溶性ヒアルロン酸修飾物−薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む、治療用あるいは診断用の医療用デバイス。
【請求項２１】
請求項１０または１５に記載の水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施した、請求項２０の医療用デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、薬物担体として有用な水溶性ヒアルロン酸修飾物、及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  一般に、低分子薬物、ペプチド薬物、タンパク質薬物等の血中滞留性の向上、安定性の向上、溶解性の向上、抗原性の低減等を目的として、薬物と水溶性ポリマーとのコンジュゲーションが試みられている。特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、その不活性な性質と生体内でのタンパク質による薬物の吸着を防ぐ効果を有することから広く用いられており、ＰＥＧコンジュゲート化タンパク質は医薬品として既に実用化の段階に入っている。しかし、ＰＥＧは生分解性ポリマーではない為、長期投与により体内に蓄積した場合の安全性等の問題は明らかでない。更には、最近、ＰＥＧコンジュゲート化リポソームにおいて投与２回目のクリアランスが異常に早い現象（Ａｃｃｅｒｅｌａｔｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｌｅａｒａｎｃｅ現象、以下「ＡＢＣ現象」とも称す）が報告されており（非特許文献１および２を参照）、ＰＥＧコンジュゲート化医薬品の安全性、有効性は十分に確立されたとは言い難い。【０００３】  一方、ヒアルロン酸（以下、「ＨＡ」とも称す）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された多糖であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ヒアルロン酸は、その化学的および物理的構造に種差が無く、ヒトにおいてもヒアルロン酸の代謝系が存在する。さらに免疫性または毒性の点に関しても最も安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）ということができる。近年、細胞の接着、増殖、移動の誘導に関するヒアルロン酸の生理活性物質としての側面が報告され注目されてきている。また、微生物による高分子量のヒアルロン酸の大量生産が可能となり、関節疾患治療薬などの医薬として実用化されており、化粧品等の分野においても実用化が進んでいる。さらに、薬物をヒアルロン酸とコンジュゲートすることで、薬物の癌組織へのターゲティング（特許文献１を参照）、肝臓へのターゲティング（特許文献２を参照）、抗原性の低減（特許文献３を参照）、血中滞留時間の延長（特許文献４、５および６を参照）等を達成できるという報告がなされている。【０００４】  汎用されているＰＥＧと比べて、薬物のコンジュゲート担体としてヒアルロン酸を用いる際の利点は、生分解性を有する点、巨大サイズ化が可能な点、さらに、１分子中に多くの反応点を持つため、複数の薬物（同一薬物を複数、或いは２種類以上の薬物）を１分子中に担持できるということである。このような利点を有するヒアルロン酸を薬物コンジュゲート担体として用いることは、ターゲティング、徐放等、より高度な薬物動態制御機能を持つコンジュゲートを設計開発の手段となる。また、ヒアルロン酸は生分解性である上に、その化学的構造に種差が無いことから、安全性という点においてもＰＥＧよりも優れた担体であるといえる。【０００５】  一方で、ＨＡ自体の血中滞留時間は短く、静脈内注射（以下、「ｉｖ」とも称す）で半減期が２分であると報告されている（非特許文献３を参照）。本発明者の検討でも、ただ単にヒアルロン酸を薬物にコンジュゲートしただけでは、薬物の血中滞留時間の大きな延長や、薬効の持続性の向上は確認されなかった。【０００６】  ヒアルロン酸の主代謝部位は肝臓およびリンパ腺であり、その代謝は、���にＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ、ＨＡＲＥ等のヒアルロン酸に特異的に結合する細胞膜局在レセプターを介した細胞内への取り込みとそれに引き続くヒアルロニダーゼによる分解によるものである。これらの分子は共に、ヒアルロン酸の連続した遊離のカルボキシ基（６糖）を主な認識部位にしていることが報告されている（非特許文献４を参照）。【０００７】  血中滞留時間が短いというヒアルロン酸の問題点を克服すべく、ヒアルロン酸に置換基を導入したヒアルロン酸修飾物を薬物担体として利用する試みもある（特許文献４、５および６を参照）。一般に、ヒアルロン酸に置換基を導入すればその血中滞留時間は延長され、その程度は置換基の導入率と相関すると考えられる。ヒアルロン酸の様々な位置に置換基が導入されたヒアルロン酸修飾物が報告されているが、その中でも、ヒアルロン酸レセプターとの結合阻害に最も効果のあるグルクロン酸のカルボキシ基に、加水分解速度の遅いアミド結合を介して置換基が導入されたＨＡ修飾物が血中滞留時間の面から優れていると考えられる。しかしながら、本発明者の検討では、このようなヒアルロン酸修飾物を合成するに際し、一般的にヒアルロン酸修飾物の合成において汎用されている方法に従って、水中での脱水縮合反応によりヒアルロン酸に置換基を導入した場合、ヒアルロン酸のカルボキシ基の修飾率は最大でも約７０モル％程度である上、このヒアルロン酸のカルボキシ基を最大限修飾したヒアルロン酸修飾物であっても実用的な薬物担体としては不十分なものであった。例えば、薬物担体としては大きな分子量を有するヒアルロン酸（分子量６０万ダルトン）を用い、そのカルボキシ基の７３モル％を修飾したヒアルロン酸修飾物であっても、ラットにおける平均血中滞留時間（ＭＲＴ）は１６時間程度でしかなく、実用的な薬物担体としては不十分であった。【０００８】  一方、ヒアルロン酸をテトラブチルアンモニウム塩にし、ジメチルスルホキシド中での反応により置換基を導入することによって、ヒアルロン酸のカルボキシ基を最大６０モル％アミド化したヒアルロン酸修飾物が得られることも報告されている（特許文献７を参照）。しかしながら、当該ヒアルロン酸修飾物においては疎水性の高い置換基を導入しているため、導入率の上昇に伴ってヒアルロン酸修飾物の水溶性は低下しており、体内に投与することを目的とした水溶性の薬物担体としては適さない。【０００９】  上記報告以外にも、水と極性有機溶媒の混合溶媒中で、ヒアルロン酸のカルボキシ基に置換基を導入した例が報告されている（特許文献８を参照）。しかしながら、得られたヒアルロン酸修飾物について、血中滞留時間の延長が見られるかどうかにについては一切触れられておらず、また、この発明においては置換基の導入率は１０％以下であり、この程度の置換基の導入率では血中滞留時間の延長された実用的な薬物担体を得ることはできない。【００１０】  このように、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、特に血中滞留時間を実用的なレベルまで延長した水溶性ヒアルロン酸修飾物は知られておらず、その製造方法も知られていなかった。
【特許文献１】国際公開ＷＯ９２／０６７１４号パンフレット
【特許文献２】特開２００１−８１１０３号公報
【特許文献３】特開平２−２７３１７６号公報
【特許文献４】特開平５−８５９４２号公報
【特許文献５】国際公開ＷＯ０１／０５４３４号パンフレット
【特許文献６】国際公開ＷＯ０１／６０４１２号パンフレット
【特許文献７】特表２００２−５１９４８１号公報
【特許文献８】国際公開ＷＯ９４／１９３７６号パンフレット
【非特許文献１】Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．第２５５巻、第１６７−１７４頁、２００３年
【非特許文献２】Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．第８８巻、第３５−４２頁、２００３年
【非特許文献３】Ｊ．Ｉｎｔｅｒ．Ｍｅｄ．第２４２巻、第２７−３３頁、１９９７年
【非特許文献４】Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．第２２８巻、第２１６−２２８頁、１９９６年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】  発明が解決しようとする課題は、薬物担体として実用的な水溶性ヒアルロン酸修飾物、及びその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】  本発明者は、かかる問題点を解決する為に鋭意研究を進めたところ、水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸のカルボキシ基にヒドラジド基を５５モル％以上導入することにより得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物が、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長できることを見出し、本発明を完成させた。【００１３】  すなわち本発明の一つの側面によれば、水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基を、反応試薬に含まれるヒドラジド基と脱水縮合反応させる工程を含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。【００１４】  本発明のこの側面における一つの態様において、カルボキシ基とヒドラジド基との脱水縮合反応により導入される基は、少なくとの１以上の官能基を含んでいてもよい。当該官能基は、例えば、置換されていてもよいヒドラジド基、置換されていてもよいアミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、およびアクリロイル基から選択され、好ましくは、置換されていてもよいヒドラジド基である。【００１５】  本発明のこの側面における一つの態様において、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分に含まれるカルボキシ基は、例えば３０％以上、好ましくは５５モル％以上の修飾率で反応試薬のヒドラジド基と脱水縮合反応してもよい。【００１６】  本発明の別の側面によれば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物が、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものである、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。ここで、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する水溶性ヒアルロン酸修飾物とは、例えば、当該ヒアルロン酸修飾物をその構成ユニットの二糖にまで分解でき且つ分解産物の非還元末端にΔ−４，５−グルクロン酸残基をもつ不飽和二糖を生成させるヒアルロニダーゼで分解させ、クロマトグラフィーにより分解液に含まれる成分の２３２ｎｍにおける吸収を観察したとき、分解産物に由来する全ピークエリアに対する二糖に由来するピークエリアの分率が、２３．４％以下、好ましくは１９．８％以下、さらに好ましくは１８．８％以下であるという特徴を有する。ここで、分解産物に由来する全ピークエリアに対する二糖に由来するピークエリアの分率は、以下の式：【００１７】
【化１】
2005054302.tif 000002
【００１８】で求めることができる。また、このようなヒアルロニダーゼとしては、例えばヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）等を使用することができる。【００１９】  本発明の別の側面によれば、水と極性有機溶媒との混合溶媒中で、ヒアルロン酸またはその誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシ基の３０モル％以上、好ましくは５５モル％以上にヒドラジド基を導入した、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。【００２０】  本発明のさらに別の側面によれば、当該製造方法により得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物が提供される。【００２１】  本発明のさらに別の側面によれば、当該水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体が提供される。この側面における一つの実施態様において、薬物担体は、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物により表面修飾された微粒子薬物担体である。【００２２】  本発明のさらに別の側面によれば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物を含む医薬組成物が提供される。【００２３】  本発明のさらに別の側面によれば、前記水溶性ヒアルロン酸修飾物と薬物を含む水溶性ヒアルロン酸修飾物−薬物コンジュゲートが提供される。【００２４】  本発明のさらに別の側面によれば、当該水溶性ヒアルロン酸修飾物で表面修飾を施した治療用または診断用の微粒子性薬物担体または医療用デバイスもまた提供される。【００２５】  本発明のさらに別の側面によれば、当該水溶性ヒアルロン酸を含む治療用あるいは診断用の微粒子薬物担体または医療用デバイスもまた提供される。【００２６】  以下、本発明を更に具体的に説明する。【００２７】  本発明に用いられるヒアルロン酸（ＨＡ）はヒアルロン酸骨格を有していれば特に限定されず、ヒアルロン酸の一部を誘導体化したヒアルロン酸誘導体や、ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体の塩（ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩、等）なども含まれる。【００２８】  本発明に用いられるヒアルロン酸は、どのような製造方法により得られたヒアルロン酸であってもよく、例えば、動物組織から抽出されたヒアルロン酸、発酵法で得られたヒアルロン酸、化学合成で得られたヒアルロン酸など、その由来は限定されない。【００２９】  水と極性有機溶媒との混合溶媒において、水と極性有機溶媒との混合体積比率は、９９／１〜２０／８０、好ましくは９５／５〜４０／６０である。使用される極性有機溶媒は水と上記比率で混和するものであれば特に限定されないが、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）、メタノール（ＭｅＯＨ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジオキサン、アセトン、ピリジン、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＩ）、スルホラン（ＳＦ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはこれらの２種以上の混合溶媒等が挙げられる。好ましくは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、エタノール（ＥｔＯＨ）またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。【００３０】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物において、置換アミド基またはエステル基に変換されているカルボキシ基の割合は、カルボキシ基修飾率（モル％）として以下の式：【００３１】
【化２】
2005054302.tif 000003
【００３２】により算出される。実用的な血中滞留時間を得るため、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物のカルボキシ基修飾率は５５モル％以上であることが好ましく、５７．３モル％以上であることがさらに好ましく、５７．９モル％以上であることがさらに好ましい。修飾率が１００％に近づく程、ＨＡとしての特性が実質上失われ、本発明の長所が活かされなくなることから、最大修飾率は９５モル％程度が好ましい。例えば当該ヒアルロン酸修飾物の修飾率は、５５モル％〜９５モル％、より具体的には５８モル％〜８０モル％である。【００３３】  ここで、カルボキシ基の修飾率は、プロトンＮＭＲで定量することができる。具体的には、プロトンＮＭＲで得られるヒドラジド化（以下、「ＨＺ化」とも称す）されたＨＡ誘導体中のヒドラジド化合物の量と、ＨＡ由来のピークとの比較から求めることができる。例えば、アジピン酸ジヒドラジド（以下、「ＡＤＨ」とも称す）でヒドラジド基を導入したヒアルロン酸誘導体（以下、「ＨＡ−ＨＺ」とも称す）のプロトンＮＭＲから得られるヒドラジド化合物由来のピーク（ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．５〜１．６５、２．１〜２．３５および２．２５〜２．５ｐｐｍの積分値：測定溶媒Ｄ２Ｏ）と、ＨＡ由来のピーク（Ｎ−アセチル基、１．８〜１．９５ｐｐｍ：測定溶媒Ｄ２Ｏ）の比を実測する。【００３４】  また、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の分子量も、その体内動態に大きく影響する。本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間は、一般にヒアルロン酸の分子量にも依存し、分子量の大きなヒアルロン酸ほどその血中滞留時間は遅い。従って、水溶性ヒアルロン酸修飾物の分子量およびカルボキシ基の修飾率を変化させることで、当該修飾物の血中滞留時間を制御することが可能である。本発明に用いられる原料のヒアルロン酸の分子量は特に制限されないが、余りに低分子量では得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間が短くなる。逆に、余りに高分子量になると得られた水溶性ヒアルロン酸修飾物の粘度が非常に高くなり、高濃度での投与が難しくなる。また、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間は分子量が一定以上大きくなるとほとんど変化しなくなるので、通常、原料のヒアルロン酸の分子量は粘度平均分子量で５０００ダルトン〜１００万ダルトンであることが好ましく、１万ダルトン〜３０万ダルトンであることがより好ましく、８万ダルトン〜３０万ダルトンであることがさらに好ましい。尚、ヒアルロン酸重量平均分子量の測定方法については、光散乱法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができる。【００３５】  本発明の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間は、原料ＨＡの血中滞留時間に比べて延長されているものであることが好ましい。ここで、血中滞留時間は、平均血中滞留時間（以下、「ＭＲＴ」とも称す）、血中半減期（以下、「ｔ１／２」とも称す）、血中クリアランス（以下、「Ｃｌ」とも称す）などの公知の代表的なパラメーターを利用して適宜比較することができる。本発明製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間は、実用面から平均血中滞留時間（ＭＲＴ）が１８時間以上のものであることが好ましく、２０時間以上のものであることがさらに好ましく、３０時間以上のものがさらに好ましい。測定の対象動物はラットが好ましい。血中滞留時間の測定方法は、例えば、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をＦＩＴＣ等で蛍光ラベル化するか、あるいは、ラジオアイソトープで放射線ラベル化したものを静脈注射し、経時的に採血し、血中のラベル化した水溶性ヒアルロン酸修飾物濃度を測定する方法が挙げられる。【００３６】  また、本発明の製造方法により得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物は、原料ＨＡに比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものであることが好ましい。ここで、「ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、原料ＨＡと本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をそれぞれヒアルロニダーゼにより酵素分解させた際に、原料ＨＡよりも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、一定時間ヒアルロニダーゼ処理した際に、原料ＨＡでは観察される二糖分解ピークが観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する）と判定することができる。なお、ＨＡの分解速度や分解状態はゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）などの常法を用いて観察することができる。【００３７】  ヒアルロン酸またはその誘導体に含まれるグルクロン酸のカルボキシ基に導入される基としては、当該基導入後に得られるヒアルロン酸修飾物が水溶性であれば特に制限されない。本発明のヒアルロン酸修飾物のカルボキシ基に導入される基はどのような基であってもよいが、得られたヒアルロン酸修飾物の水溶性を保持するために、親水性の基または疎水性の低い基であることが好ましい。【００３８】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物は、特に限定はされないが、例えば１０ｍｇ／ｍＬ〜１０００ｍｇ／ｍＬの水に対する溶解度を有する。実際に治療を目的として投与される時のヒアルロン酸修飾物の濃度は１０〜５００ｍｇ／ｍＬ程度であるので、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の溶解度は、好ましくは室温において生理食塩水に対して１０ｍｇ／ｍＬ以上である。【００３９】  本発明において、ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる反応試薬としては、一分子中に１つのヒドラジド基を有し、さらに１以上の官能基を有する化合物を用いることができる。ここで、官能基は、例えば、置換されていてもよいヒドラジド基、置換されていてもよいアミノ基、ヒドロキシ基、メルカプト基、カルボキシ基、アルデヒド基、メタクリロイル基、アクリロイル基から選択される。官能基の数は好ましくは２つである。好ましい反応試薬としては、例えば、２つのヒドラジド基を有する化合物（以下、「ジヒドラジド化合物」とも称す）；ヒドラジド基とヒドロキシ基を有する化合物；ヒドラジド基とメルカプト基を有する化合物；ヒドラジド基とカルボキシ基を有する化合物；ヒドラジド基とアルデヒド基を有する化合物、ヒドラジド基とメタクリロイル基を有する化合物；または、ヒドラジド基とアクリロイル基を有する化合物が挙げられる。さらに好ましくは、反応試薬はジヒドラジド化合物である。ここで、上記の反応試薬のヒドラジド基は、置換基を有していても���く、当該置換基には例えばＣ１−Ｃ６アルキル基などが含まれる。【００４０】  特定の実施態様において、ヒアルロン酸またはその誘導体と反応させる化合物の具体例は、分子量１万ダルトン以下のジヒドラジドＰＥＧや、式（Ｉ）：【００４１】
【化３】
2005054302.tif 000004
【００４２】［式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、ｎは、０〜１２の整数である。］
で表される化合物などが挙げられる。【００４３】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物の調製方法は、カルボキシ基を修飾するための既知の方法を用いることができる。具体的には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下、「ＥＤＣ」とも称す）等の縮合剤で、ＨＡのカルボキシ基と前記反応試薬のヒドラジド基を脱水縮合反応させることができる。また、例えば、ＨＡのカルボキシ基とアジピン酸ジヒドラジド（以下、「ＡＤＨ」とも称す）のヒドラジド基の１つとを縮合させ、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物、即ちヒドラジド基を含む基で修飾されたＨＡ（以下、「ＨＡ−ＨＺ」とも称す）を合成することができる。ここで、ヒアルロン酸のカルボキシ基にＥＤＣ等の縮合剤で、アジピン酸ジヒドラジド等の反応試薬を縮合させることによりヒアルロン酸を修飾する際に、縮合剤のヒアルロン酸に対する添加量、反応試薬の添加量、および反応溶液中ヒアルロン酸の濃度を調節することにより、ヒドラジド基を含む基の導入量を調節できる。例えば、ヒアルロン酸またはその誘導体に含まれるカルボキシ基に対して、ＥＤＣなどの縮合剤は０．１〜５モル倍、特に１〜４モル倍の量を用いることができ、反応試薬がＡＤＨなどのホモ２官能性試薬の場合は２０〜１００モル倍、特に２０〜４０モル倍の量を用いることができ、１官能性試薬またはヘテロに官能性試薬の場合は０．３〜２０モル倍、特に０．５〜５モル倍の量を用いることができる。【００４４】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物には、例えば式（ＩＩ）：【００４５】
【化４】
2005054302.tif 000005
【００４６】（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−６アルキルカルボニル基であり、
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素原子またはＣ１−６アルキル基であり、
ｎは、０〜１２の整数である。）
で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むヒアルロン酸修飾物；
式（ＩＩＩ）：【００４７】
【化５】
2005054302.tif 000006
【００４８】（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄおよびｎは、既に定義したとおりであり、
Ｑは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンまたはこれらの共重合体から選択されるポリマーであり、該ポリマーは末端のカルボキシ基で窒素原子と結合している。）
で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むヒアルロン酸修飾物；および式（ＩＶ）：【００４９】
【化６】
2005054302.tif 000007
【００５０】（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄおよびｎは、既に定義したとおりであり、
Ｘは、ＯまたはＮＨであり、
Ｒ１０は、Ｃ１−６アルケニル、メルカプトＣ１−６アルキルまたはカルボキシＣ１−６アルキルである。）
で表される繰り返し単位を分子内に少なくとも１以上含むヒアルロン酸修飾物が含まれる。ここで、上記式（Ｉ）〜（ＩＶ）において、Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは水素原子であるのが好ましい。【００５１】  また、置換基が導入された水溶性ヒアルロン酸修飾物の電荷に関しては、導入された置換基がカチオン性であった場合、トータルの電荷がプラス側に振れ、血中滞留時間の短縮に繋がるため、血中滞留時間を延長する場合には修飾電荷はノニオン性か、アニオン性であることが好ましい。従って、本発明の一つの側面によれば、ヒアルロン酸またはその誘導体と反応試薬の脱水縮合後の水溶性ヒアルロン酸修飾物に含まれるＨＺ基の末端のアミノ基をアミド化する工程をさらに含む、水溶性ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。ここで、末端アミノ基のアミド化は、例えば、無水酢酸、ラクチド等のカルボン酸誘導体、無水コハク酸、無水マレイン酸、イタコン酸無水物等のジカルボン酸誘導体で処理することにより行うことができ、好ましくは無水コハク酸が使用される。特に無水コハク酸などのジカルボン酸誘導体により処理した場合は、末端のアミノ基をアミド化とともに分子内にカルボキシ基が導入されるため、分子のトータル電荷がアニオン性となり、得られる水溶性ヒアルロン酸修飾物血中滞留時間の延長に好ましい。【００５２】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物は、薬物担体として用いることができる。担持される薬物は特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチド等を用いることが可能である。また、薬物を担持させるにおいては、公知の各種の方法を用いることができ、薬物を本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物中に封入してもよく、薬物と本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物とをコンジュゲートにしてもよい。【００５３】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物と薬物とからなるコンジュゲートの調製方法は、既知のポリマーとタンパク質のコンジュゲートで使用されている方法を用いることができる。例えば、上述のヒドラジド基修飾されたヒアルロン酸修飾物を合成し、この一部をＮ−スクシンイミジル  ３−［２−ピリジルジチオ］プロピオネート（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ３−［２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ］ｐｒｏｐｉｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）と反応させ、メルカプト基を導入したＨＡ（ＨＡ−ＳＨ）を調製する。この際、余剰のヒドラジド基は、上述したとおり、例えば無水コハク酸等で処理し、カルボキシ基を導入してトータル電荷をアニオン性にした方が好ましい。一方で、タンパク質にマレイミド基、ビニルスルホン基などのメルカプト基と特異的に反応する官能基を導入し、これをＨＡ−ＳＨと反応させコンジュゲートを調製すればよい。あるいは、上述のヒドラジド基修飾されたＨＡを合成し、この一部をＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ（同仁化学社、ＰＩＥＲＣＥ社等により販売）等のマレイミド基含有化合物と反応させマレイミド基を導入し、余剰のＨＺ基は、例えば無水コハク酸等で処理する。一方でタンパク質にシステインを導入したり、チオール基を有するリンカーを反応させておき、これをＨＡ−マレイミドと反応させコンジュゲートを調製してもよい。【００５４】  ここで、このコンジュゲートにおいて、コンジュゲートの生物活性を有効に保つために、タンパク質と水溶性ヒアルロン酸修飾物主鎖間のスペーサーの長さを調節したり、部位特異的なコンジュゲートとすることもできる。【００５５】  また、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物は薬物とのコンジュゲート以外にも、高分子ミセル、リポソーム、ナノ微粒子等の微粒子性薬物キャリアーにおいて、そのステルス化のための表面修飾に用いることもできる。ここで「表面修飾」とは他の合成高分子、天然高分子、脂質、金属、セラミックスあるいはそれらの複合体などからなる物質の表面に、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を化学的に結合または物理的に吸着させ、当該物質の最表面に本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物が存在している状態を指す。例えば、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物とＰＬＧＡ等の疎水性高分子を結合させた化合物を含む高分子ミセルや、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物をリン脂質に結合させたリポソーム、あるいは、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物に疎水性分子を結合させ、疎水性相互作用で疎水性微粒子表面をコートした微粒子等が挙げられる。【００５６】  本発明における「微粒子薬物担体」とは、疾患の治療または診断のために用いられる微粒子状の薬物担体をいう。当該担体の粒径は特に限定はされないが、例えば１ｎｍ〜２００μｍである。【００５７】  また、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物自体を、多価官能性化合物を架橋剤に用いてゲル化させ生理活性物質を内包した薬物担体、あるいは外科手術後の癒着防止剤などの医療用デバイスの成分とすることもできる。本発明における「医療用デバイス」とは、疾患の治療または診断、あるいはそれらの補助に用いられるデバイスであれば特に限定されず、例えば人工臓器、インプラント、カテーテル、薬物内包ゲル、薬物内包ペレットなどが含まれる。【００５８】  なお、前述の薬剤（低分子化合物、タンパク質、ペプチド）の例としては、以下のものを挙げることができる。【００５９】  低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等）などを挙げることができる。【００６０】  タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（Ｓ��Ｆ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等を挙げることができる。
【発明の効果】
【００６１】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いることで、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長することが可能である。従って、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を担体に用い、薬物をコンジュゲート化することで、従来の技術では達成できなかった、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】実施例２−１において得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図２】実施例２−２において得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図３】実施例２−３において得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図４−１】比較例１−１で得られたＨＡ−ＨＺについてのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図４−２】実施例１−６で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図４−３】実施例１−５で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図４−４】実施例１−４で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図５−１】実施例２−１および比較例２−１で得られたＨＡ−ＨＺについてヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。
【図５−２】実施例２−２および比較例２−２で得られたＨＡ−ＨＺについてヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。
【図５−３】実施例２−３および比較例２−３で得られたＨＡ−ＨＺについてヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。
【図５−４】未修飾のヒアルロン酸についてヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。
【図６−１】比較例４−１、４−２および４−３で得られた蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度の推移を示すグラフである。
【図６−２】比較例４−４、４−５および４−６で得られた蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度の推移を示すグラフである。
【図６−３】比較例４−７、４−８および４−９で得られた蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度の推移を示すグラフである。
【図７】実施例３−１、３−２および３−３、ならびに比較例４−３、４−６および４−９で得られた蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度の推移を示すグラフである。
【図８−１】実施例４−１で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図８−２】比較例５−１で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図８−３】比較例５−２で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図８−４】比較例５−３で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図８−５】比較例５−４で得られたＨＡ−ＨＺのヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図８−６】未修飾のヒアルロニダーゼＳＤに対する酵素分解性試験の結果の一例である。図中の右列のチャートはヒアルロニダーゼＳＤによる酵素分解後のＨＡ−ＨＺのゲル浸透クロマトグラフィー分析結果を示し、左列のチャートは当該酵素を含まない系についての分析結果を示すものである。
【図９−１】実施例４−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図９−２】比較例５−５で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図９−３】比較例５−６で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図９−４】比較例５−７で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図９−５】比較例５−８で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果の一例である。
【図１０】実施例４−２および比較例５−５〜５−８で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺの血中濃度の推移を示すグラフである。
【図１１】実施例４−１および比較例５−１〜５−４ならびに実施例３−２で得られたＨＡ−ＨＺのＨＺ導入率とそれらをヒアルロニダーゼＳＤ処理したときの分解産物のうちの二糖分率、および実施例４−１および比較例５−１〜５−４ならびに実施例３−２で得られたＨＡ−ＨＺのＨＺ導入率と実施例４−２および比較例５−５〜５−８ならびに実施例３−２で得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺのＭＲＴの関係を示すグラフである。
【図１２】実施例５−３、比較例６−１〜６−２およびＥＰＯの血中濃度推移を示すグラフである。
【実施例】
【００６３】  以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕混合溶媒中でのヒアルロン酸修飾物の合成
混合溶媒でヒアルロン酸修飾物を合成する際に用いる有機溶媒および混合比率の変化させた場合の、得られるヒアルロン酸修飾物の酵素分解性を確認するために、以下の手順によりヒアルロン酸修飾物を合成した。なお、以下特に断らない場合は、溶媒の混合比は容積比で表示するものである。また、ヒアルロン酸修飾物中に残存するヒドラジド基の定量は、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基の定量法（以下、「ＴＮＢＳ法」とも称す）により行なった。ＴＮＢＳ法の具体的手順は、「学会出版センター  生物化学実験法１２  蛋白質の化学修飾＜上＞初版」３７ページに記載の方法（ＴＮＢＳ法）に従った。ただし、既知濃度の酢酸ヒドラジド溶液を標準物質とし、ＴＮＢＳ溶液は０．５Ｍに調製し、ヒドラジド基を定量するために５００ｎｍの吸光度を測定した。
（実施例１−１）
分子量２．５×１０４ダルトンのヒアルロン酸ナトリウム（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）１４．０ｍｇを、０．１％濃度で蒸留水／ＥｔＯＨ＝５０／５０に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１／５／４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基（ＨＺ基）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１１．５ｍｇを得た。
（実施例１−２）
混合溶媒として蒸留水／ＥｔＯＨ＝８０／２０を用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１３．２ｍｇを得た。
（実施例１−３）
混合溶媒として蒸留水／ＥｔＯＨ＝９５／５を用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１４．１ｍｇを得た。
（実施例１−４）
混合溶媒として蒸留水／ＤＭＡｃ＝５０／５０を用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１２．８ｍｇを得た。
（実施例１−５）
混合溶媒として蒸留水／ＤＭＡｃ＝８０／２０を用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１３．８ｍｇを得た。
（実施例１−６）
混合溶媒として蒸留水／ＤＭＡｃ＝９５／５を用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１４．０ｍｇを得た。
（比較例１−１）
溶媒として蒸留水のみを用いたほかは実施例１−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１３．１ｍｇを得た。【００６４】  実施例１−１〜１−６、比較例１−１で得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．８５ｐｐｍ、ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．５、２．１および２．２５ｐｐｍ）。結果を表１に示す。【００６５】
【表１】
2005054302.tif 000008
【００６６】  なお、ＮＭＲの測定はＮＭＲ分光計としてＪＮＭ−ＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ分光計）を使用し、溶媒としてＤ２Ｏを用い、以下の条件（パラメーター）で行なった：
Ｄａｔａ  ｐｏｉｎｔｓ（Ｘ  ｐｏｉｎｔ）：１６３８４
Ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｗｉｄｔｈ（Ｘ  ｓｗｅｅｐ）：１５ｐｐｍ
Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ（Ｘ  ａｃｑ  ｔｉｍｅ）：１．７４９秒
Ｐｕｌｓｅ  ｄｅｌａｙ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｄｅｌａｙ）：３０秒
Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ（Ｓｃａｎｓ）：６４
温度：周囲温度
〔実施例２〕薬物動態試験用ヒアルロン酸修飾物の合成
（実施例２−１）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．５×１０４ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）８４．０ｍｇを、０．１％濃度で蒸留水／ＥｔＯＨ＝５０／５０に溶解した。ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：４：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）８６．６ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果を図１に示す。
（実施例２−２）
分子量２×１０５ダルトンのＨＡ  ７６．０ｍｇを用いたほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）５７．０ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果を図２に示す。
（実施例２−３）
分子量６×１０５ダルトンのＨＡ  ７６．０ｍｇを用いたほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）７３．６ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトル測定結果を図３に示す。
（比較例２−１）
分子量２．５×１０４ダルトンのＨＡを１％の濃度で蒸留水に溶解したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例２−２）
分子量２×１０５ダルトンのＨＡを０．５％の濃度で蒸留水に溶解したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例２−３）
分子量６×１０５ダルトンのＨＡを０．２５％の濃度で蒸留水に溶解したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。【００６７】  実施例２−１〜２−３、比較例２−１〜２−３で得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．８５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．５、２．１および２．２５ｐｐｍの積分値から算出）。結果を表２に示す。【００６８】
【表２】
2005054302.tif 000009
【００６９】〔実施例３〕薬物動態試験用の蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
（実施例３−１）
実施例２−１で得られたＨＡ−ＨＺ（３８．９ｍｇ）を、２ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。ＨＡのユニット（１ユニット＝繰り返し単位であるＮ−アセチルグルコサミン−グルクロン酸）に対して０．１５モル倍のフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣとも称す）をＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯとも称す）溶液として加えて室温で１時間撹拌した。脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス株式会社製）で未反応のＦＩＴＣを除去した後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸をＰＤ−１０で粗精製した溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えた。室温で１時間撹拌して反応させた後、大過剰量の水に対して透析して精製し、凍結乾燥して実施例２−１のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（実施例３−１：３８．０ｍｇ）を得た。
（実施例３−２）
実施例２−２で得られたＨＡ−ＨＺ  ４０．９ｍｇを用いたほかは実施例３−１と同様の方法で、実施例２−２のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（実施例３−２：４０．２ｍｇ）を得た。
（実施例３−３）
実施例２−３で得られたＨＡ−ＨＺ  ４１．１ｍｇを用いたほかは実施例３−１と同様の方法で、実施例２−３のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（実施例３−３：４２．５ｍｇ）を得た。【００７０】  実施例３−１〜３−３で得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の式に従って各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。
未修飾ＨＡユニット：ｘ  ｎｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＳＵＣユニット：ｙ  ｎｍｏｌ／ｍＬ（残存ＨＺが無水コハク酸処理されたユニット）
式１：（３７９．３×ｘ）＋（６３５．５７×ｙ）＋（９２４．８８×（ＦＩＴＣ  ｃｏｎｃ．））＝２５０ｍｇ
式２：ｘ／（ｙ＋（ＦＩＴＣ  ｃｏｎｃ．））＝（１００−ＨＺ（％））／ＨＺ（％）
得られた結果を表３に示す。【００７１】
【表３】
2005054302.tif 000010
【００７２】（比較例３−１）
分子量２．５×１０４ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）を１．０％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調整した。１−エチル−３−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）を、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．１：４０のモル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−２）
反応に用いたＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨの比を１：１：４０としたほかは比較例３−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−３）
反応に用いたＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨの比を１：５：４０としたほかは比較例３−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−４）
分子量１．９×１０５ダルトンのＨＡを０．５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−５）
分子量１．９×１０５ダルトンのＨＡを０．５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−２と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−６）
分子量１．９×１０５ダルトンのＨＡを０．５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−３と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−７）
分子量５．８×１０５ダルトンのＨＡを０．２５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−８）
分子量５．８×１０５ダルトンのＨＡを０．２５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−２と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。
（比較例３−９）
分子量５．８×１０５ダルトンのＨＡを０．２５％濃度で蒸留水に溶解したほかは比較例３−３と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。【００７３】  比較例３−１〜３−９で得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量したところ、それぞれＨＡのカルボキシ基の３％（比較例３−１）、４２％（比較例３−２）、５９％（比較例３−３）、６％（比較例３−４）、４９％（比較例３−５）、７１％（比較例３−６）、８％（比較例３−７）、５６％（比較例３−８）、７３％（比較例３−９）にＨＺ基が導入されていた。
（比較例４−１）比較例３−１のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−１で得られたＨＡ−ＨＺ（２５．６ｍｇ）を水に溶解させた後、等量の１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて終濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。これにＦＩＴＣ／ＨＡのユニット＝３．０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯに溶解させたＦＩＴＣを添加し、室温、遮光下に１時間反応させた。反応溶液２５ｍＬを予め５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１０本）に投入し、未反応のＦＩＴＣを除去した。ＴＮＢＳ法で、ＨＺ基の残存量を確認した後、精製した溶液に無水コハク酸／ＨＺ＝２５０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、３．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた無水コハク酸を添加し同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の水に対して透析精製し、凍結乾燥して比較例３−１のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−１；１８．３ｍｇ）を得た。
（比較例４−２）比較例３−２のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−２で得られたＨＡ−ＨＺ  ２４．０ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−２のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−２；１８．９ｍｇ）を得た。
（比較例４−３）比較例３−３のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−３で得られたＨＡ−ＨＺ  ２３．２ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−３のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−３；１８．４ｍｇ）を得た。
（比較例４−４）比較例３−４のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−４で得られたＨＡ−ＨＺ（２５．０ｍｇ）を水に溶解させた後、等量の１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて終濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。これにＦＩＴＣ／ＨＡのユニット＝０．５ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯに溶解させたＦＩＴＣを添加し、室温、遮光下に１時間反応させた。反応溶液２５ｍＬを予め５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１０本）に投入し、未反応のＦＩＴＣを除去した。ＴＮＢＳ法でＨＺ基の残存量を確認した後、精製した溶液に無水コハク酸／ＨＺ＝８０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、３．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた無水コハク酸を添加し同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の水に対して透析精製し、凍結乾燥して比較例３−４のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−４；１９．２ｍｇ）を得た。
（比較例４−５）比較例３−５のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−５で得られたＨＡ−ＨＺ  ２３．７ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−５のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−５；２０．０ｍｇ）を得た。
（比較例４−６）比較例３−６のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−６で得られたＨＡ−ＨＺ  ２５．０ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−６のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−６；１９．０ｍｇ）を得た。
（比較例４−７）比較例３−７のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−７で得られたＨＡ−ＨＺ（２３．５ｍｇ）を水に溶解させた後、等量の１００ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）を加えて終濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整した。これにＦＩＴＣ／ＨＡ  ｕｎｉｔ＝０．３ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、ＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のＤＭＳＯに溶解させたＦＩＴＣを添加し、室温、遮光下に１時間反応させた。反応溶液２５ｍＬを予め５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で平衡化したＰＤ−１０カラム（１０本）に投入し、未反応のＦＩＴＣを除去した。ＴＮＢＳ法で、ＨＺ基の残存量を確認した後、精製した溶液に無水コハク酸／ＨＺ＝４０ｍｏｌ／ｍｏｌの仕込比で、３．５ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた無水コハク酸を添加し同様に反応させた。反応混合物を大過剰量の水に対して透析精製し、凍結乾燥して比較例３−４のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−７；２０．７ｍｇ）を得た。
（比較例４−８）比較例３−８のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−８で得られたＨＡ−ＨＺ  ２５．０ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−８のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−８；２２．６ｍｇ）を得た。
（比較例４−９）比較例３−９のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺの合成
比較例３−９で得られたＨＡ−ＨＺ  ２５．３ｍｇを用いたほかは比較例４−１と同様の方法で、比較例３−９のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（比較例４−９；１９．２ｍｇ）を得た。【００７４】  比較例４−１〜４−９で得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．２５ｍｇ／ｍＬ濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、以下、実施例３と同様に分析、評価した。得られた結果を表４に示す。【００７５】
【表４】
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【００７６】〔試験例１〕混合溶媒中で調製したＨＡ−ＨＺの酵素分解性評価
実施例１−４、１−５および１−６、ならびに比較例１−１で得られたＨＡ−ＨＺを０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に溶解した。この溶液８０μＬにヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）０．５Ｕ／ｍＬ溶液３２μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。対象として酵素非添加群も同様に行った。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、「ＧＰＣ」とも称す）に供してＨＡ−ＨＺの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した。【００７７】  酵素分解産物のＧＰＣプロファイルを図４−１〜図４−４に示す。【００７８】  ＤＭＡｃ混合率が増大するにつれて分解産物の低分子化は著しく抑制された。この傾向はＥｔＯＨを混合させた場合にも観察された。ヒアルロニダーゼＳＤは最終産物として不飽和二糖を生成することが知られているため、基質の認識は未修飾な連続する４糖であると考えられる。従って、有機溶媒の混合により連続する未修飾連鎖が減少するものと考えられた。
〔試験例２〕混合溶媒中で調製したＨＡ−ＨＺの酵素分解性評価（その２）
実施例２−１〜２−３、比較例２−１〜２−３で得られたＨＡ−ＨＺをそれぞれ試験例１−２）と同様にヒアルロニダーゼＳＤによる分解性を評価した。【００７９】  酵素分解産物のＧＰＣプロファイルを図５−１〜図５−３に示す。【００８０】  それぞれ反応溶媒が異なるだけのほぼ同等のＨＺ基修飾率を有するＨＡ−ＨＺであるが、混合溶媒（５０％ＥｔＯＨ）を反応溶媒としたＨＡ−ＨＺ（実施例２−１〜２−３）は、酵素分解による分子量の低下が著しく抑制されたことが示された。
〔試験例３〕血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例３−１〜３−３の蛍光標識ＨＡ修飾物、比較例４−１〜４−９の蛍光標識ＨＡ修飾物を１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後０．２５、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３０、５４時間（３０、５４時間は実施例３−１〜３−３の蛍光標識ＨＡ修飾物のみ）に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。【００８１】 測定方法
ＧＰＣにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行う。以下に条件を示す。【００８２】  ＧＰＣ  Ｃｏｌｕｍｎ：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ６０００ＰＷＸＬ
Ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ：ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ：Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ：４０ｕＬ
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４９０，ＥＭ：５１８）
測定試料の調製
・検量線用試料；
各蛍光標識ＨＡ修飾物をＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて希釈し、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製した。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製；
ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出；
解析ソフトＭｉｌｌｅｎｉｕｍを用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。【００８３】 薬物動態データ
実施例３−１〜３−３の蛍光標識ＨＡ修飾物、比較例４−１〜４−９の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｖｅｒ  ３．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点３点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期（ｔ１／２）、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。比較例４−１〜４−９の蛍光標識ＨＡ修飾物の血中濃度推移を図６−１〜図６−３に示し、算出した薬物動態学的パラメーターを表５に示す。【００８４】
【表５】
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【００８５】  蛍光標識ＨＡ修飾物を用いた薬物動態試験により、混合溶媒中で合成した本発明ＨＡ修飾物（実施例３−１〜３−３）は、水中で合成したＨＡ修飾物のうち、各分子量で最も血中滞留時間の長かったＨＡ修飾物（比較例４−３、４−６、４−９）と比較して、ラット単回静脈内投与後の血中滞留時間が改善されることが確認された。水中で合成したＨＡ修飾物の中で血中半減期（ｔ１／２）が２．４０±０．５５（時間）と最も短かった分子量２５ＫＤａのＨＡ修飾物は、混合溶媒中で合成することで血中半減期が２５．２±２．０（時間）となり、１０倍以上の血中滞留期間の延長効果が認められた。分子量２００ＫＤａ、６００ＫＤａの各ＨＡ修飾物でも、混合溶媒中で合成することにより、３〜５倍に血中半減期が延長された。水中で合成したＨＡ修飾物では、ＨＡの分子量に応じて血中滞留期間が延長しており、比較例４−９（６００ＫＤａ）の血中半減期は、比較例４−３（２５ＫＤａ）の血中半減期の４．７倍となっていた。混合溶媒中で合成したＨＡ修飾物でも、ＨＡの分子量に応じた血中滞留期間の延長効果が認められ、実施例３−３（６００ＫＤａ）の血中半減期は、実施例３−１（２５ＫＤａ）の血中半減期の１．４倍となっていた。平均血中滞留時間（ＭＲＴ）および血中クリアランス（Ｃｌ）についても同様の傾向が見られた。
［実施例４］薬物動態試験用ヒアルロン酸修飾物の合成（修飾率依存性）
（実施例４−１）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．０×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１４５．０ｍｇを用い、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：１：４０モル比になるよう添加したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１０２．９ｍｇを得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．９５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．６５、２．３５および２．５０ｐｐｍの積分値から算出）。ＨＺ導入率は５５モル％だった。
（実施例４−２）蛍光標識ＨＡ−ＨＺの調製
実施例４−１で得られたＨＡ−ＨＺ（３４．６ｍｇ）を蒸留水で２０．０ｍｇ／ｍＬに溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０、１．３８４ｍＬ）および５．０６ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（３４６μＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに震盪した。１９３．２２ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸のＤＭＳＯ溶液（３４６μＬ）を加えて同様に１時間震盪した後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３５．７９ｍｇ）を得た。
［比較例５］
（比較例５−１）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．０×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１４５．０ｍｇを、用い、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．１５：４０モル比になるよう添加したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１０７．７ｍｇを得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．９５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．６５、２．３５および２．５０ｐｐｍの積分値から算出）。ＨＺ導入率は２０モル％だった。
（比較例５−２）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．０×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１４５．０ｍｇを用い、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．２５：４０モル比になるよう添加したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１０９．６ｍｇを得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．９５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．６５、２．３５および２．５０ｐｐｍの積分値から算出）。ＨＺ導入率は３０モル％だった。
（比較例５−３）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．０×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１４５．０ｍｇを用い、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．３：４０モル比になるよう添加したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）６０．４ｍｇを得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．９５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．６５、２．３５および２．５０ｐｐｍの積分値から算出）。ＨＺ導入率は３４モル％だった。
（比較例５−４）ＨＡ−ＨＺの調製
分子量２．０×１０５ダルトンのＨＡ（電気化学工業株式会社製）１４５．０ｍｇを用い、ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．５：４０モル比になるよう添加したほかは実施例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）１０５．０ｍｇを得た。ＨＡ−ＨＺ中のＨＺ基導入率をプロトンＮＭＲ法で定量した（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．９５ｐｐｍ；ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレン、１．６５、２．３５および２．５０ｐｐｍの積分値から算出）。ＨＺ導入率は４６モル％だった。
（比較例５−５）蛍光標識ＨＡ−ＨＺの調製
比較例５−１で得られたＨＡ−ＨＺ（３３．８ｍｇ）を蒸留水で２０．０ｍｇ／ｍＬに溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０、１．３５２ｍＬ）および５．０６ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（３３８μＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに震盪した。１９３．２２ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸のＤＭＳＯ溶液（３３８μＬ）を加えて同様に１時間震盪した後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３２．５８ｍｇ）を得た。
（比較例５−６）蛍光標識ＨＡ−ＨＺの調製
比較例５−２で得られたＨＡ−ＨＺ（３３．９ｍｇ）を蒸留水で２０．０ｍｇ／ｍＬに溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０、１．３５６ｍＬ）および５．０６ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（３３９μＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに震盪した。１９３．２２ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸のＤＭＳＯ溶液（３３９μＬ）を加えて同様に１時間震盪した後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３３．６３ｍｇ）を得た。
（比較例５−７）蛍光標識ＨＡ−ＨＺの調製
比較例５−３で得られたＨＡ−ＨＺ（３３．６ｍｇ）を蒸留水で２０．０ｍｇ／ｍＬに溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０、１．３４４ｍＬ）および５．０６ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（３３６μＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに震盪した。１９３．２２ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸のＤＭＳＯ溶液（３３６μＬ）を加えて同様に１時間震盪した後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３２．６５ｍｇ）を得た。
（比較例５−８）蛍光標識ＨＡ−ＨＺの調製
比較例５−４で得られたＨＡ−ＨＺ（３４．９ｍｇ）を蒸留水で２０．０ｍｇ／ｍＬに溶解し、これに０．２５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０、１．３９６ｍＬ）および５．０６ｍｇ／ｍＬのＦＩＴＣのＤＭＳＯ溶液（３４９μＬ）を加えて遮光下、室温で１時間、穏やかに震盪した。１９３．２２ｍｇ／ｍＬの無水コハク酸のＤＭＳＯ溶液（３４９μＬ）を加えて同様に１時間震盪した後、大過剰量のＰＢＳに対して透析精製した。透析外液を蒸留水に置換してさらに透析精製し、得られた水溶液を凍結乾燥して蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３５．４８ｍｇ）を得た。
〔試験例４〕酵素分解性評価
実施例４−１、比較例５−１〜５−４、およびヒアルロン酸ナトリウムをＨＡユニット換算４．９８ｍＭ（ヒアルロン酸ナトリウム２．０ｍｇ／ｍＬ相当）に蒸留水に溶解した。この溶液５５μＬに蒸留水７７μＬおよび０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３２μＬを加えた。この溶液にヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１．０Ｕ／ｍＬ溶液４４μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。対照として酵素非添加群も同様に行った。それぞれＧＰＣに供してＨＡ−ＨＺの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した。さらに、ＧＰＣプロファイルは分解産物が強い吸収を持つことが知られている２３２ｎｍで観察し、分解産物のうちの二糖分率として溶媒由来のピークを除いた範囲で１００×（二糖のピークエリア）／（全ピークエリア−酵素非添加時全ピークエリア）（％）を算出した。【００８６】  ＧＰＣプロファイルを図８−１〜図８−６に示す。
〔試験例５〕蛍光標識ＨＡ−ＨＺの分析
実施例４−２および比較例５−５〜５−８で得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．０５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）で０．２ｍｇ／ｍＬに溶解した。この溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量した。【００８７】  実施例４−２および比較例５−５〜５−８で得られた各蛍光標識ＨＡ−ＨＺを重水で約３．５ｍｇ／ｍＬに溶解し、プロトンＮＭＲを測定した。得られたスペクトルにおけるＮ−アセチルグルコサミンのメチルプロトン（１．８５ｐｐｍ付近）、ＡＤＨのメチレンプロトン（１．５５および２．２５ｐｐｍ付近）およびコハク酸アミドのメチレンプロトン（２．４ｐｐｍ付近）のシグナル強度比からＨＺ導入率、コハク酸導入率および残存ＨＺ率を算出した。さらに、以下の式に従ってＦＩＴＣ導入率およびＨＡ由来の重量分率算出を行った。【００８８】  未修飾ＨＡユニット：ｘ（ｎｍｏｌ／ｍＬ）
ＨＡ−ＳＵＣユニット：ｙ（ｎｍｏｌ／ｍＬ）
残存ＨＡ−ＨＺユニット：ａ×ｘ／ｂ（ｎｍｏｌ／ｍＬ）［ここで、ａ＝残存ＨＺ（％）、ｂ＝（１００−ＨＺ導入率）（％）である］
式３：（３７９．３×ｘ）＋（６３５．５７×ｙ）＋（５３５．５×（残存ＨＡ−ＨＺユニット濃度））＋（９２４．８８×（ＦＩＴＣ濃度））＝２００．０μｇ
式４：ｘ／（ｙ＋（残存ＨＡ−ＨＺユニット濃度）＋（ＦＩＴＣ濃度））＝（１００−（ＨＺ導入率））／（ＨＺ導入率）
得られたＮＭＲスペクトルを図９−１〜図９−５に、計算結果を表６に示す。【００８９】
【表６】
2005054302.tif 000013
【００９０】〔試験例６〕蛍光標識ＨＡ−ＨＺの血中滞留時間評価
ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例４−２の蛍光標識ＨＡ−ＨＺ、比較例５−５〜５−８の蛍光標識ＨＡ−ＨＺを１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１週間経過時に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下に設定された冷凍庫で凍結保存した。【００９１】  測定方法：以下に示すプレートリーダーにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行った。【００９２】  ＳＰＥＣＴＲＡ  ＭＡＸ  ＧＥＭＩＮＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＸ：４８５、ＥＭ：５３８）
測定試料の調製：
・検量線用試料：各蛍光標識ＨＡ−ＨＺをＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて稀釈し、１，５，１０，５０，１００，５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製する。この標準液に等用量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製：蛍光標識ＨＡ−ＨＺ投与ラット血漿サンプルに等用量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中の蛍光標識ＨＡ−ＨＺ濃度の算出：解析ソフトＳＯＦＴ  ｍａｘ  ＰＲＯ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．１．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて各標準試料の蛍光強度から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。【００９３】 薬物動態データ
実施例４−２の蛍光標識ＨＡ−ＨＺ、比較例５−５〜５−８の蛍光標識ＨＡ−ＨＺの血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｖｅｒ３．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈ社）でモデル非依存的解析を行い、薬物動態学的パラメーター（半減期ｔ１／２）、平均血中滞留時間（ＭＲＴ））を算出した。但し、血漿中濃度推移で明らかにＣｍａｘが観察される個体は投与ミスと判断し、データからはずした。また、それ以外の個体で投与５分の血漿中濃度に関してスミルノフの棄却検定を行い有意（Ｐ＝０．０５）に低い個体も投与ミスと判断し、データからはずした。【００９４】  実施例４−２および比較例５−５〜５−８の血中濃度推移を図１０に示した。算出した薬物動態パラメーターは、実施例３−２から算出した値も含めて表７にまとめた。【００９５】
【表７】
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【００９６】  さらに、ここで得られた値と実施例３−２を用いて得られた値をまとめて、ＨＺ導入率とＭＲＴの関係、および蛍光標識前のＨＡ−ＨＺをヒアルロニダーゼＳＤで処理したときの分解産物のうちの二糖分率とＨＺ導入率の関係を図１１に示す。さらに、図１１には比較例２−２で得られたＨＡ−ＨＺをヒアルロニダーゼＳＤ処理したときの分解産物のうちの二糖分率とＨＺ導入率の関係を示す。【００９７】  蛍光標識ＨＡ−ＨＺを用いた薬物動態試験とヒアルロニダーゼＳＤを用いた酵素分解性評価より、血中滞留性が改善された本発明ＨＡ修飾物はヒアルロニダーゼＳＤ処理による分解産物のうち二糖の分率が低い傾向が見られた。【００９８】  図１１において、ヒアルロン酸修飾物が実用面から好ましい１８時間以上のＭＲＴであるにはヒアルロニダーゼＳＤ処理による分解産物のうち二糖の分率が１９．８％以下であり、さらに好ましいＭＲＴ２０時間以上であるには同じく１８．８％以下であることが示された。このことより、本発明ＨＡ修飾物はヒアルロニダーゼＳＤ処理による分解産物のうちで二糖分率が１９．８％以下であることをひとつの特徴とするものである。
［実施例５］エリスロポエチン（ＥＰＯ）−ヒアルロン酸修飾物コンジュゲートの合成
（実施例５−１）ＨＡ−ＰＤＰ／ＳＵＣの調製
実施例２−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺの５ｍｇ／ｍＬ水溶液（９００μＬ）に、５．７１ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰのＤＭＳＯ溶液（４５μＬ）を加えた（ＳＰＤＰ／ＨＺ＝０．０８（ｍｏｌ／ｍｏｌ））。室温下に１時間撹拌して反応させた後、３５０μＬを分取し、ＰＤ−１０で水に溶媒置換し凍結乾燥してＨＡ−ＰＤＰを得た。残る反応溶液に０．２Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０）および水を加えて０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ９．０、４．７５ｍＬ）に調整した。これに７６．６ｍｇ／ｍＬのコハク酸無水物のＤＭＳＯ溶液（２５０μＬ）を加えて（コハク酸／ＨＺ＝５０（ｍｏｌ／ｍｏｌ））室温下に更に２時間撹拌し、ＨＡ−ＰＤＰ／ＳＵＣ溶液を得た。この溶液は４℃で保存した。【００９９】  途中で分取回収したＨＡ−ＰＤＰについて１００ｍＭリン酸ナトリウム溶液（ｐＨ８．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに溶解した。この溶液１．０ｍＬに、４８．０ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ（２５０μＬ）を加えて室温下に３０分間撹拌して側鎖のジスルフィド結合を還元した。３４３ｎｍにおける吸光度から遊離したピリジン−２−チオン（ｐｙｒｉｄｉｎ−２−ｔｈｉｏｎｅ）を定量した。この定量値からＨＡ−ＨＺへのチオール導入率を算出した結果、ＳＨ導入率は２．５モル％であった。
（実施例５−２）ＥＰＯ−マレイミド（ＥＰＯ−ＭＡＬ）の調製
エリスロポエチン（ＥＰＯ）原体（中外製薬株式会社製）７．６ｍＬ（ＥＰＯ７．７５２ｍｇ）に、１．０６ｍｇ／ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＫＭＵＳのＤＭＳＯ溶液（３８０μＬ）を加え（ＫＭＵＳ／ＥＰＯ＝２（ｍｏｌ／ｍｏｌ））、室温下に３０分間撹拌した。ＰＤ−１０で低分子量成分を除去すると共にｐＨ６．５のＰＢに溶媒置換した。得られた試料溶液およびコントロールＥＰＯ溶液についてＰｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ）でＥＰＯ濃度を求め，ＴＮＢＳ法によりアミノ基量を定量し，それぞれの比からＭａｌｅｉｍｉｄｅ導入率を算出した結果、マレイミド導入率は１．３個／ＥＰＯであった。【０１００】  なお、ＴＮＢＳ法の具体的手順は「学会出版センター  生物化学実験法１２  蛋白質の化学修飾＜上＞初版」第３７頁に記載の方法に従った。
（実施例５−３）ＨＡ−ＥＰＯコンジュゲートの調製
実施例５−１のＨＡ−ＰＤＰ／ＳＵＣ溶液４．０ｍＬに、４８ｍｇ／ｍＬのＤＴＴ溶液２．０ｍＬを加え、室温下に３０分間撹拌した。ＰＤ−１０で低分子量成分を除去し、得られたＨＡ−ＳＨ／ＳＵＣをＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０で８５０μＬまで濃縮した。濃縮ＨＡ−ＳＨ／ＳＵＣ溶液０．６ｍＬ（ＨＡ誘導体の回収率を１００％として１．３３ｍｇ相当）にＥＰＯ−ＭＡＬ溶液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−３０で２．４ｍＬ（ＥＰＯ換算で２．８ｍｇ／ｍＬ）まで濃縮した溶液０．７ｍＬを加えた。室温下に２２時間穏かに震盪した後、１．０ｍｇ／ｍＬのエチルマレイミド溶液（１００μＬ）を加え、更に２時間震盪した。精製までの間は４℃で保存した。反応混合物を下記の条件によるＧＰＣに供してコンジュゲートと思われる画分を分取した。対照としてＥＰＯ−ＭＡＬ非添加のＨＡ−ＳＨ／ＳＵＣ溶液も同様に行って同じ画分を分取した。分取画分をそれぞれＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−５０で濃縮し、２８１ｎｍにおける吸光度を測定した。グルクロノラクトン（Ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ（Ｇｌｃｌａｃ））４５４．２ｎｍｏｌ／ｍＬを最高値に２倍稀釈列計５点をスタンダードとし、コンジュゲート溶液および対照として回収したＨＡ−ＳＨ／ＳＵＣそれぞれについて稀釈した後、カルバゾール−硫酸法を行いウロン酸を定量した。試料溶液の２８１ｎｍにおける吸光度のＥＰＯに拠らない分はグルクロン酸（ＧｌｃＡ）濃度すなわちＨＡ誘導体濃度に比例すると仮定して２８１ｎｍにおける吸光度を補正し、ＥＰＯ濃度およびＧｌｃＡ濃度、ＥＰＯ濃度比からコンジュゲート当りのＥＰＯ導入率を算出した結果、ＥＰＯ導入率は２．２個／ＨＡであった。【０１０１】  精製（ＧＰＣ）条件
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ：ＦＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｃｏｌｕｍｎ：ＨｉＬｏａｄ  １６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  ＰｒｅｐＧｒａｄｅ（１．６×６０ｃｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｅｌｕｅｎｔ：ＰＢＳ
Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１．０ｍＬ／ｍｉｎ．
Ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＵＶ（Ａｂｓ．ａｔ  ２８０ｎｍ）
カルバゾール−硫酸法による定量は、以下の方法により行った。氷冷した濃度既知の標準物質（グルクロノラクトン）溶液あるいは試料溶液０．２ｍＬに、２５ｍＭのＮａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ濃硫酸溶液１．０ｍＬを加えて撹拌した。熱水浴（９０℃以上）中に約２０分間浸して加熱した。室温まで冷却させた後にカルバゾールの０．１２５％ＥｔＯＨ溶液４０μＬを加え，再度熱水浴中に３０分間浸して加熱した。室温まで冷却した後に５３０ｎｍの吸光度を測定し、標準物質で作成した検量線から試料溶液中ウロン酸を定量した。
［比較例６］
（比較例６−１）
比較例２−１と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。これを原料にして実施例５と同じ方法でＨＡ−ＥＰＯコンジュゲートを調製した。
（比較例６−２）
比較例２−２と同様の方法で、ヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）を得た。これを原料にして実施例５と同じ方法でＨＡ−ＥＰＯコンジュゲートを調製した。
［実施例６］ＨＡ−ＥＰＯコンジュゲートＰＫ試験
実施例５−３、比較例６−１および６−２のＨＡ−ＥＰＯコンジュゲート、ならびにＥＰＯを２ｍｇ／ｋｇの用量でＳＤラット（オス、投与時１２週齢）静脈内に単回投与し、投与前および投与後１時間、３時間、６時間、１日、２日、３日、６日、９日、１４日経過時に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。血漿中のＥＰＯ濃度をＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ社）で定量した。【０１０２】  試験結果を図１２に示す。本発明のＨＡ修飾物を用いたＨＡ−ＥＰＯコンジュゲート実施例５−３はＭＲＴで４２．２時間を示し、比較例６−１：１５．５時間、比較例６−２：１８．３時間に比較し、大幅に血中滞留性が延長された。【０１０３】  これらの結果から、ＨＡのカルボキシ基の修飾率を上げていけば、相対的に血中滞留時間は延長されるが、水と極性有機溶媒との混合溶媒中で修飾したＨＡ修飾物においては、水中で修飾した場合と比較して、同程度の修飾率で、極めて顕著な血中滞留時間延長効果を示すことが確認された。この理由は次のように予想される。ＨＡは水中で分子内水素結合と、分子内、外の疎水性相互作用により、２次構造、３次構造を形成していることが知られており（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ．Ｃｈｉｂａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  １４３，６−１４（１９８９））、均一な化学修飾が難しくなっていると考えられる。このため、水中でＨＡのカルボキシ基の多くを修飾しても、ＨＡレセプターに認識されうる連続した４−６糖の未修飾ドメインが一部残存しており、ここが体内のＨＡレセプターに結合してしまうことで比較的短期間に血中からクリアされてしまうと予想される。【０１０４】  水と極性有機溶媒との混合溶媒中ではＨＡの水素結合、疎水性相互作用が減弱されることでＨＡの高次構造が壊され、高次構造形成に基づくカルボキシ基周辺環境の不均一性が解消され、より均一な化学修飾が達成されるものと考えられる。【０１０５】  ヒアルロン酸修飾物の酵素分解性試験に用いたヒアルロニダーゼは基質認識性が高く、ＨＡを二糖に分解することが知られている。つまり、未修飾４糖が最小の基質であり、分解産物としての二糖は未修飾ユニットが連続するほど生産量が増大する。本発明により得られるヒアルロン酸修飾物がヒアルロニダーゼＳＤに分解耐性を示すことは、ＨＡレセプターに認識されうる連続した未修飾ドメインが従来の水中での反応で得られる修飾物に比して低減していることを支持している。
【産業上の利用可能性】
【０１０６】  本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を用いることで、従来の水溶性ヒアルロン酸修飾物では得られない実用的なレベルまでその血中滞留時間を延長することが可能である。従って、本発明の水溶性ヒアルロン酸修飾物を担体に用い、薬物をコンジュゲート化することで、従来の技術では達成できなかった、実用的でかつ安全な医薬組成物を提供することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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