(57)【要約】  本発明は、工業関連条件下でのβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の不斉合成に有用な操作されたポリペプチドを提供する。本発明で開示される操作されたポリペプチドは、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の触媒合成の能力に基づく定向進化により開発された。本開示はまた、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、操作されたポリペプチドの発現が可能な宿主細胞、および操作されたポリペプチドを使用してβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸を産生する方法を提供する。他の調製プロセスと比較して、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸の調製に本発明の操作されたポリペプチドを使用することで、所望の立体異性体が高純度となり、穏やかな反応条件、低公害性および低エネルギー消費となる。このため、工業用途の見通しは良好である。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
好適な反応条件下において、ｐ−ニトロベンズアルデヒドをグリシンと縮合させて、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を産生することができる、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む操作されたアルドラーゼポリペプチド。
【請求項２】
前記好適な反応条件が、約４０ｇ／Ｌのｐ−ニトロベンズアルデヒド、約１７８ｇ／Ｌのグリシン、約５０μΜのピリドキサール５’−リン酸塩（ＰＬＰ）、約２５％（ｖ／ｖ）のエタノール、約３０℃を含む、請求項１に記載のアルドラーゼポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、１６、１７、１９、２６、３２、３３、３７、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、９１、９２、１１８、１３２、１３４、１５４、１６４、１６８、１７６、１８２、１８５、１８９、１９１、２１６、２１７、２１８、２２７、２３４、２３７、２４４、２４７、２６２、２８２、２８４、２８５、２８８、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、３０２、３０５、３１６、３１８、３１９、３２０、３２４、および３５２から選択される１つ以上のアミノ酸残基において、配列番号２の配列と異なるアミノ酸配列を含み、番号が配列番号２を指し、前記ポリペプチドが、アルドラーゼ活性を有する、請求項１または２に記載のアルドラーゼポリペプチド。
【請求項４】
前記アルドラーゼの前記アミノ酸配列が以下のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含み、
Ｘ１６は、Ｅであり、
Ｘ１７は、ＧまたはＥであり、
Ｘ１９は、ＷまたはＮであり、
Ｘ２６は、ＶまたはＬであり、
Ｘ３２は、Ｖであり、
Ｘ３３は、Ｎであり、
Ｘ３７は、Ｔ、Ｍ、またはＫであり、
Ｘ３８は、Ｄ、Ｐ、Ｓ、ＥまたはＡであり、
Ｘ３９は、ＬまたはＡであり、
Ｘ４１は、Ｙであり、
Ｘ４２は、Ｍであり、
Ｘ４３は、ＰまたはＹであり、
Ｘ４４は、Ｄであり、
Ｘ４５は、Ｉであり、
Ｘ４６は、Ｈであり、
Ｘ４７は、Ｈであり、
Ｘ４８は、Ｌであり、
Ｘ４９は、Ｓであり、
Ｘ９１は、Ｈ、Ｓ、Ｌ、ＫまたはＮであり、
Ｘ９２は、Ｗであり、
Ｘ１１８は、Ｒ、Ｉ、またはＧであり、
Ｘ１３２は、Ｓであり、
Ｘ１３４は、Ｑであり、
Ｘ１５４は、Ｇ、Ｓ、Ａ、ＦまたはＲであり、
Ｘ１６４は、Ｒであり、
Ｘ１６８は、Ｎであり、
Ｘ１７６は、Ｐであり、
Ｘ１８２は、Ａであり、
Ｘ１８５は、Ｔであり、
Ｘ１８９は、Ｓであり、
Ｘ１９１は、Ｈであり、
Ｘ２１６は、Ｃであり；
Ｘ２１７は、Ｗであり、
Ｘ２１８は、ＣまたはＳであり、
Ｘ２２７は、Ｐであり、
Ｘ２３４は、Ｒであり、
Ｘ２３７は、Ｔであり、
Ｘ２４４は、ＩまたはＶであり、
Ｘ２４７は、ＹまたはＨであり、
Ｘ２６２は、Ｉであり、
Ｘ２８２は、Ｒ、ＹまたはＫであり、
Ｘ２８４は、Ｋ、Ｆ、ＡまたはＶであり、
Ｘ２８５は、Ｐ、Ｓ、またはＫであり、
Ｘ２８８は、ＩまたはＴであり、
Ｘ２９１は、Ｆ、Ｖ、ＷまたはＹであり、
Ｘ２９２は、ＫまたはＶであり、
Ｘ２９３は、Ｐであり、
Ｘ２９４は、ＫまたはＭであり、
Ｘ２９５は、ＧまたはＱであり、
Ｘ３０２は、Ｍであり、
Ｘ３０５は、ＴまたはＰであり、
Ｘ３１６は、Ｋ、Ｓ、ＶまたはＲであり、
Ｘ３１８は、ＧまたはＬであり、
Ｘ３１９は、ＹまたはＶであり、
Ｘ３２０は、ＫまたはＥであり、
Ｘ３２４は、Ｌであり、または
Ｘ３５２は、Ｙ、Ｑ、またはＡであり、
前記番号は、配列番号２を指す、請求項３に記載のアルドラーゼポリペプチド。
【請求項５】
（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、および２３６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）アルドラーゼ活性を有するポリペプチドであって、（ｉ）（ａ）に記載された前記アミノ酸配列のうちの１つと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、および（ｉｉ）（ａ）に記載された前記１つのアミノ酸配列に対して１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、付加または挿入を有するアミノ酸配列、を含む、ポリペプチドである、操作されたポリペプチド。
【請求項６】
好適な反応条件下で、ｐ−ニトロベンズアルデヒドとグリシンを縮合させて、配列番号２よりも高い立体選択性および／または高い活性で、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロピオン酸を産生することができる操作されたアルドラーゼポリペプチド。
【請求項７】
化学結合または物理吸着法により固体材料上に固定化されたポリペプチドであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアルドラーゼポリペプチドから選択されるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、または２３５である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは大腸菌である、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養するステップ、および前記培養液からアルドラーゼポリペプチドを得るステップを含む、アルドラーゼポリペプチドの調製方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養することにより、または請求項１３に記載の方法により得られるアルドラーゼ触媒であって、前記アルドラーゼ触媒は、アルドラーゼポリペプチドを含む細胞もしくは培養液、またはそれらで処理された物品を含み、前記物品は、形質転換細胞の前記培養液から得られた抽出物、前記抽出物からアルドラーゼを単離もしくは精製することにより得られた単離生成物、または形質転換細胞、その抽出物、または前記抽出物の単離生成物を固定化することにより得られる固定産物を指す、アルドラーゼ触媒。
【請求項１５】
式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸を調製するプロセスであって：
【化１】
2020521509.tif 000076
式（Ｉ）の前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸は、＊でマークされたキラル中心に、示された立体化学配置を有し；
Ｒ１は、任意の置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリールであるか、または、任意の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ８ヒドロカルビルであり、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＳＣＨ３、または任意の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビルであり、
式（ＩＩ）のアルデヒド基質および式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質を、
【化２】
2020521509.tif 000077
前記アルデヒド基質および前記アミノ酸基質を変換させて、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸を生成するための好適な反応条件下で、請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作されたポリペプチドと接触させることを含み、
式（Ｉ）の前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸が、ジアステレオマー過剰で得られる、プロセス。
【請求項１６】
式（Ｉ）の前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸が、
【化３】
2020521509.tif 000078
（式中、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨまたは−ＣＨ２ＳＣＨ３であり、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、−ＣＦ３であり、各Ｒ’は、独立して−Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロカルビルから選択され；Ｒ３は、
【化４】
2020521509.tif 000079
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、または−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒまたは−ＳＯＲ、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、−ＣＦ３であり、各Ｒ’は、独立して−Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロカルビルから選択される）；式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、
【化５】
2020521509.tif 000080
請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
Ｒ３が、フェニル環のパラ位にあるか、もしくはＲ３が、前記フェニル環のメタ位にあるか、もしくはＲ３が、前記フェニル環のオルト位にあるか、またはＲ３が、前記フェニル環のパラ位およびメタ位の両方にあるか、もしくはＲ３が、前記フェニル環のパラ位およびオルト位の両方にあるか、もしくはＲ３が、前記フェニル環のメタ位およびオルト位の両方である、請求項１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
式（Ｉ）の前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸が：
【化６】
2020521509.tif 000081
2020521509.tif 000082
請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１９】
式Ａ２の化合物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロピオン酸を調製するためのプロセスであって、
【化７】
2020521509.tif 000083
グリシンの存在下で、好適な溶媒中、式Ａ１の化合物を
【化８】
2020521509.tif 000084
式Ａ２の化合物に変換させる好適な反応条件下で、式Ａ１のｐ−ニトロベンズアルデヒドを請求項１〜７のいずれか一項に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドと接触させることを含む、プロセス。
【請求項２０】
前記β−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物が、少なくとも６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記反応が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む溶媒中で実施される、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記反応条件が、１０℃〜６０℃の温度を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記反応条件が、ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記アルデヒド基質が、５ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌの負荷で存在する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、操作されたアルドラーゼポリペプチドおよび工業的生体触媒におけるそれらの用途に関する。
技術分野
【０００２】
β−ヒドロキシ−α−アミノ酸は、重要なアミノ酸の一種であり、様々な天然生成物および医薬品を構築するための重要な中間体である。これらの中間体は、多くの重要な生物学的活性を有する。これらの化合物の化学構造には一般に、複数の立体異性体を有する２つのキラル中心を有する（スキーム１）。（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（スキーム２に示す式Ａ２の化合物）は、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸であり、Ｄ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールの合成において、中間体として入手可能である。
現在、Ｄ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオール（またはレボアミン）の合成には、２つの経路があり、ｐ−ニトロベンズアルデヒドまたはｐ−ニトロ−アセトフェノンは、それぞれ出発材料として使用される。出発材料としてｐ−ニトロベンズアルデヒドを使用する場合には、必要とされる基質の数がより少なくなり、比較的簡易なプロセスである。しかし、複数の異性体構造が存在することにより、この経路には、過剰なｐ−ニトロベンズアルデヒドを必要とする。また、非常に高価な還元剤として水素化ホウ素カルシウムを必要とする。したがって、現在の工業的プロセスは、主に第２の経路である。Ｐ−ニトロアセトフェノンは、臭素化、アミノ化、アシル化、ホルムアルデヒド縮合、還元、加水分解を受けて、ラセミ生成物を生成し、次いで、酒石酸によって分割され、Ｄ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールを得る。このプロセスは、無水酢酸、塩化ベンジル、酢酸、臭素などの刺激性有機溶媒を大量に使用するため、過酷な環境影響を与え、産生現場の管理も非常に困難になる。また、この合成プロセスは、保護、脱保護、分割など、多くのステップで構成されており、時間を要し、全体的な収率が低下する。
【０００３】
アルドラーゼは、アルデヒドとアミノ酸を縮合してβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸を形成し得ることが報告されている。この酵素反応の条件は穏やかであり、汚染がほとんどないが、野生型アルドラーゼの立体選択性は、工業用途の要求を満たすには十分ではない。本発明は、高い立体選択性を有する一連の操作されたポリペプチドを提供する。これらの操作されたポリペプチドは、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の選択に向けた定向進化を介して開発された。本発明により開示される酵素プロセスによれば、ｐ−ニトロベンズアルデヒドおよびグリシンは、直接かつ選択的に（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸に縮合され、したがって１つのステップ内で２つのキラル中心を決定する。（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を単純にエステル化し、還元してＤ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールを得ることができる。このプロセス全体は、簡素で操作が容易であり、かつ化学的分割を必要としないため、生産コストが効率よく削減される。同時に、酵素触媒反応の条件は、穏やかであり、強酸、アルカリ、高温または高圧環境を必要とすることなく、産生設備の要件を緩和し、生成物の品質を効率よく保証し、経済的でかつ環境に優しい産生が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【化１】
2020521509.tif 000002
スキーム１は、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸を示す図である（＊はキラル中心を指す）。
【化２】
2020521509.tif 000003
スキーム２は、本発明の操作されたアルドラーゼポリペプチドによって触媒される不斉反応によるＡ２の合成を示す図である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
１．概要
本発明は、高い立体選択性、高い触媒活性および良好な安定性を有する操作されたポリペプチドを提供する。これにより、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸を不斉的に合成でき、特に（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を不斉合成できる。本発明はまた、操作されたポリペプチドの遺伝子配列、遺伝子を含む組換え発現ベクター、操作された株およびその効率的な産生方法、ならびに操作されたポリペプチドを使用したβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸の不斉合成のための反応プロセスも提供する。
【０００６】
第１の態様では、本発明は、改善された触媒特性を有する操作されたアルドラーゼポリペプチドを提供する。これらの操作されたポリペプチドは、複数のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失を介して、生成物に対して立体選択性が低い野生型アルドラーゼの定向進化に由来する。野生型アルドラーゼは、３５７個のアミノ酸からなり、配列番号２に示される配列を有するシュードモナス・プチダ由来である。野生型アルドラーゼは、生成物に対して低い立体選択性を示した。発明者らが測定したとおり、配列番号２を使用するスキーム２において、ｐ−ニトロベンズアルデヒド（すなわちＡ１）をグリシンと変換して、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（すなわちＡ２）を産生する反応において、Ａ２のジアステレオマー過剰率（すなわちｄｅ）は、４０％以下である。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドは、少なくとも配列番号２以上の立体選択性でＡ１およびグリシンをＡ２に変換することができる。示された反応条件下で、本開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドは、Ａ２について、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で、産生することができる。いくつかの実施形態では、反応条件は、２０％有機溶媒（これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド、エタノールまたはメタノール）および約３０℃の温度および約６．０のｐＨを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、示された反応条件下で、配列番号２のポリペプチドよりも高い立体選択性で、Ａ１およびグリシンをＡ２に変換することができる。操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【０００９】
２つのアミノ酸配列間または２つのヌクレオチド配列間の同一性は、当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムによって取得でき、ＮＣＢＩ  ＢｌａｓｔｐおよびＢｌａｓｔｎソフトウェアを使用するか、またはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２（２２）：４６７３−４６８０、１９９４年）を使用することによって、デフォルトのパラメータに従って算出できる。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用すると、配列番号２から配列番号１８４のアミノ酸配列同一性は、９３．３％である。
【００１０】
いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、残基位置Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１９、Ｘ２６、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ９１、Ｘ９２、Ｘ１１８、Ｘ１３２、Ｘ１３４、Ｘ１５４、Ｘ１６４、Ｘ１６８、Ｘ１７６、Ｘ１８２、Ｘ１８５、Ｘ１８９、Ｘ１９１、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、Ｘ２２７、Ｘ２３４、Ｘ２３７、Ｘ２４４、Ｘ２４７、Ｘ２６２、Ｘ２８２、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８８、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ２９５、Ｘ３０２、Ｘ３０５、Ｘ３１６、Ｘ３１８、Ｘ３１９、Ｘ３２０、Ｘ３２４、Ｘ３５２に、配列番号２の配列と比較して１つ以上の残基が異なるアミノ酸配列を含むことができる。より具体的には、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、以下の特徴の少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含む（これらの特徴は、配列番号２の参照配列によるアミノ酸残基の置換である）Ｄ１６Ｅ、Ｎ１７Ｇ、Ｎ１７Ｅ、Ａ１９Ｗ、Ａ１９Ｎ、Ａ２６Ｖ、Ａ２６Ｌ、Ｈ３２Ｖ、Ｓ３３Ｎ、Ａ３７Ｔ、Ａ３７Ｍ、Ａ３７Ｋ、Ｇ３８Ｄ、Ｇ３８Ｐ、Ｇ３８Ｓ、Ｇ３８Ｅ、Ｇ３８Ａ、Ｐ３９Ｌ、Ｐ３９Ａ、Ｇ４１Ｙ、Ｔ４２Ｍ、Ｄ４３Ｐ、Ｄ４３Ｙ、Ｅ４４Ｄ、Ｌ４５Ｉ、Ｔ４６Ｈ、Ａ４７Ｈ、Ｑ４８Ｌ、Ｖ４９Ｓ、Ｐ９１Ｈ、Ｐ９１Ｓ、Ｐ９１Ｌ、Ｐ９１Ｋ、Ｐ９１Ｎ、Ａ９２Ｗ、Ｐ１１８Ｒ、Ｐ１１８Ｉ、Ｐ１１８Ｇ、Ｒ１３２Ｓ、Ｋ１３４Ｑ、Ｖ１５４Ｇ、Ｖ１５４Ｓ、Ｖ１５４Ａ、Ｖ１５４Ｆ、Ｖ１５４Ｒ、Ｅ１６４Ｒ、Ｄ１６８Ｎ、Ｇ１７６Ｐ、Ｓ１８２Ａ、Ａ１８５Ｔ、Ｖ１８９Ｓ、Ｌ１９１Ｈ、Ｖ２１６Ｃ、Ｌ２１７Ｗ、Ａ２１８Ｃ、Ａ２１８Ｓ、Ｔ２２７Ｐ、Ｓ２３４Ｒ、Ｒ２３７Ｔ、Ｓ２４４Ｉ、Ｓ２４４Ｖ、Ｍ２４７Ｙ、Ｍ２４７Ｈ、Ｌ２６２Ｉ、Ｅ２８２Ｒ、Ｅ２８２Ｙ、Ｅ２８２Ｋ、Ｌ２８４Ｋ、Ｌ２８４Ｆ、Ｌ２８４Ａ、Ｌ２８４Ｖ、Ｇ２８５Ｐ、Ｇ２８５Ｓ、Ｇ２８５Ｋ、Ｅ２８８Ｉ、Ｅ２８８Ｔ、Ｇ２９１Ｆ、Ｇ２９１Ｖ、Ｇ２９１Ｗ、Ｇ２９１Ｙ、Ｇ２９２Ｋ、Ｇ２９２Ｖ、Ｔ２９３Ｐ、Ｅ２９４Ｋ、Ｅ２９４Ｍ、Ａ２９５Ｇ、Ａ２９５Ｑ、Ｌ３０２Ｍ、Ａ３０５Ｔ、Ａ３０５Ｐ、Ｇ３１６Ｋ、Ｇ３１６Ｓ、Ｇ３１６Ｖ、Ｇ３１６Ｒ、Ｙ３１８Ｇ、Ｙ３１８Ｌ、Ｈ３１９Ｙ、Ｈ３１９Ｖ、Ｄ３２０Ｋ、Ｄ３２０Ｅ、Ｐ３２４Ｌ、Ｄ３５２Ｙ、Ｄ３５２Ｑ、Ｄ３５２Ａ；または、上記の差異に加えて、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、もしくは３０のアミノ酸残基の挿入または欠失を含む。
【００１１】
より具体的には、いくつかの実施形態では、配列番号２より改善された操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６に対応する配列を含む。
【００１２】
別の態様では、本発明は、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、操作されたアルドラーゼポリペプチドを発現させるための１つ以上の制御配列を有する発現ベクターの一部であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５に対応する配列を含み得る。
【００１３】
当業者に公知であるように、ヌクレオチドコドンの縮重のために、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５に限定するものではない。本発明の操作されたポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６のアミノ酸配列をコードする任意の他のポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００１４】
別の態様では、本開示は、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、操作されたアルドラーゼポリペプチドを発現できる発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌などの細菌宿主細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書に記載の操作されたアルドラーゼを発現させ、単離するために使用でき、あるいは基質を生成物に変換するための反応に直接使用できる。
いくつかの実施形態では、全細胞、粗抽出物、単離酵素、または精製酵素の形態の操作されたアルドラーゼは、単独で、または樹脂への固定などの固定形態で使用することができる。
【００１５】
本開示はまた、本明細書に開示される操作されたアルドラーゼポリペプチドを使用するβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸化合物の不斉合成のプロセスを提供し、得られるβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、式（Ｉ）に示される構造を有する：
【化３】
2020521509.tif 000004
式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、示された立体化学配置を有し、これは、＊でマークされたキラル中心に示されている。式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、他の異性体よりも高いジアステレオマー過剰率であり、式中、
Ｒ１は、任意の置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリールであるか、または、任意の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ８ヒドロカルビルである。
Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＳＣＨ３、または任意の置換もしくは非置換のＣ１〜Ｃ４ヒドロカルビルであり、このプロセスは、好適な反応条件下で、アルデヒド基質とアミノ酸基質とを反応させて、β−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物を得ることを含み、式（ＩＩ）のアルデヒド基質、および式（ＩＩＩ）
【化４】
2020521509.tif 000005
のアミノ酸基質は、アルドラーゼポリペプチドと接触させる。アルドラーゼポリペプチドは、本明細書に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号２に対して、少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を有し、配列番号２と比較してより高い変換率またはより高い立体選択性で、式（ＩＩ）のアルデヒド基質および式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質を縮合して、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物を得ることができる。
【００１６】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【００１７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は
【化５】
2020521509.tif 000006
であり、式中、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、
また、Ｒ３は、
【化６】
2020521509.tif 000007
であり得、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨまたは−ＣＨ２ＳＣＨ３であり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、
【化７】
2020521509.tif 000008
【００１８】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のパラ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルト位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびメタの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびオルトの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してメタおよびオルトの両方である。
【００１９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は：
【化８】
2020521509.tif 000009
（式中、Ｒ４は、上記Ｒ３と同様に定義され、Ｒ３およびＲ２は、上記で定義したとおりである）であり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は：
【化９】
2020521509.tif 000010
【００２０】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルト位にある。
【００２１】
いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、ジアステレオマー過剰の式Ａ２の化合物、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸
【化１０】
2020521509.tif 000011
の産生プロセスで使用することができる。
【００２２】
これらの実施形態では、産生プロセスは、好適な有機溶媒中、グリシンの存在下で、式Ａ１の化合物を式Ａ２の化合物に変換するための好適な反応条件下において、式Ａ１の化合物：
【化１１】
2020521509.tif 000012
を本明細書に開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【００２３】
上記プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【００２４】
この方法で使用するための操作されたアルドラーゼポリペプチドの特定の実施形態は、詳細な説明でさらに提供される。上記プロセスで使用できる操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６に対応するアミノ酸配列から選択される１つ以上の配列を含むことができる。
【００２５】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドを使用して、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を産生するプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、本プロセスは、グリシンの存在下で、ｐ−ニトロベンズアルデヒドを（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸に変換するための好適な反応条件下で、ｐ−ニトロベンズアルデヒドは、本明細書に記載された操作されたアルドラーゼポリペプチドと接触させる。
【００２６】
本明細書に開示の操作されたポリペプチドを使用する式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物を調製するためのプロセスはいずれも、これらに限定されないが、アミノドナー、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷、圧力および反応時間範囲などの好適な反応条件下の範囲で実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物の調製を実施することができ、好適な反応条件としては以下が挙げられる：（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、化合物（ＩＩ）またはＡ１）；（ｂ）約０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの操作されたポリペプチド；（ｃ）約３０ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌのグリシン負荷；（ｄ）約０．１ｍＭ〜５ｍＭのＰＬＰ補因子；（ｅ）０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、プロパノール、またはイソプロパノール（ＩＰＡ）など）；（Ｆ）約４．０〜約８．０のｐＨ；および（ｇ）約１０℃〜約６０℃の温度。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも６０％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも７０％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも８０％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも８５％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも９０％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも９５％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本プロセスは、少なくとも９９％のジアステレオマー過剰率で生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸を形成することができる。
２．詳細
２．１定義
【００３４】
他に明確に定義されていない限り、本開示で使用される技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解されている意味を有する。
【００３５】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）に関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために本明細書で同義的に使用される。この定義には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物を含む。
【００３６】
「操作されたアルドラーゼ」、「操作されたアルドラーゼポリペプチド」、「アルドラーゼポリペプチド」、「改善されたアルドラーゼポリペプチド」、および「操作されたポリペプチド」は、本明細書で同義的に使用される。
【００３７】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書では同義的に使用される。
【００３８】
本明細書で使用される「補因子」は、触媒反応において酵素と連動して作用する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される「補因子」は、ビタミンＢ６ファミリー化合物ＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰを包含することを意図しており、これらは補酵素とも呼ばれる。
【００３９】
「ピリドキサールリン酸塩」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール５’−リン酸塩」、「ＰＹＰ」および「Ｐ５Ｐ」は、アルドラーゼ反応において補酵素として作用する化合物を指すために本明細書で同義的に使用される。
【００４０】
「コード配列」とは、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の一部分を指す。
【００４１】
「天然」または「野生型」とは、自然界に見られる形態を指す。例えば、天然または野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然の発生源から単離できる生物内に存在する配列であり、人力により意図的に改変されていないものである。
【００４２】
例えば、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「組換え」または「操作された」または「非天然」とは、天然または材料の天然の形態に対応する材料を指し、そうでなければ自然には存在しないか、またはそれと同一であるが、合成材料からおよび／または組換え技術を用いた操作によって産生または誘導される様式で改変されたものである。
【００４３】
「配列同一性」および「相同性」は、本明細書において同義的に使用され、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指し（「配列同一性」および「相同性」は、一般に割合（百分率）として表される）、比較ウィンドウにより２つの最適に整列した配列を比較することにより決定される。比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分は、２つの配列を最適に整列させるための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列で発生する位置の数を決定することによって算出できる。または、核酸塩基またはアミノ酸残基をギャップと整列させて、一致した位置の数を求め、一致した位置の数を、比較ウィンドウ内の位置の合計数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求める。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解するであろう。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、ローカルホモロジーアルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ、１９８１年、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２）、ホモロジーアライメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ、１９７０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３）、類似性の検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４）、これらのアルゴリズムのコンピューター化された実装（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ））、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＦＭ  Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．およびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５年Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ））により実行できる。パーセント配列同一性およびパーセント配列類似性を決定するのに好適であるアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、１９７７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センターのＷｅｂサイトより公的に入手可能である。アルゴリズムは、クエリシーケンス内の長さＷの短いワードを識別することによって、最初に高スコアシーケンスペア（ＨＳＰ）を識別することを伴う。これは、データベースシーケンス内の同じ長さのワードと整列させたときに、いくつかの正の値のしきい値スコアＴに一致するか、またはそれらを満たす。Ｔは、近隣ワードスコアしきい値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記）。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとして機能する。次いで、ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に伸長する。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一致残基ペアの報酬スコアは、常に＞０であり）およびＮ（不一致残基のペナルティスコアは、常に＜０である）を用いて算出される。アミノ酸配列の場合、スコア行列を使用して、累積スコアが算出される。各方向のワードヒットの拡張は、次の場合に停止する：累積アライメントスコアが、最大到達値から品質Ｘ分低下する；１つ以上の負のスコアの残基アライメントが累積することにより、累積スコアが０以下になる；または、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸにより、アライメントの感度および速度が決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワードレングス（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較をデフォルト値として使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトでワードレングス（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９８９年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照）。配列アライメントおよび％配列同一性の例示的な決定では、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを使用できる。
【００４４】
「参照配列」とは、配列を比較する基礎として使用される定義済みの配列を指す。参照配列は、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列の断片など、より大きい配列のサブセットであってもよい。一般に、参照配列は、長さが少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の一部分）を含む、および（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含む可能性があるため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」で２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定し、比較することにより実行される。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、野生型配列に限定されることを意図しておらず、操作された配列または改変された配列を含んでもよい。例えば、「配列番号２に基づくＸ３９に対応する残基にロイシンを有する参照配列」とは、プロリンである配列番号２のＸ３９位の対応する残基がロイシンに改変された参照配列を指す。
【００４５】
「比較ウィンドウ」とは、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念セグメントを指し、配列が、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウィンドウ内の配列の一部分は、２つの配列を最適に整列させるために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０を超える連続した残基より長くてもよく、任意により、３０、４０、５０、１００以上の残基が挙げられる。
【００４６】
与えられたアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号の文脈において、「に対応する」、「を参照する」または「に相対する」は、与えられたアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較する場合の、特定の参照の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与の配列の残基数または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的位置ではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたアルドラーゼなどの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基の一致を最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列に整列させ得る。これらの場合、ギャップがあるが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号は、それらが整列された参照配列に対して行われる。
【００４７】
「アミノ酸の差異」または「残基の差異」は、参照配列内の対応する位置でのアミノ酸残基に対するポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は、一般に、本明細書では「Ｘｎ」と称され、ｎは、残基の差異に基づく参照配列内の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較して、Ｘ３９位での残基の差異」は、配列番号２の３９位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが３９位にプロリンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ３９位での残基の差異」とは、配列番号２の３９位に対応するポリペプチドの位置でのプロリン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、位置での特定のアミノ酸残基の差異は「ＸｎＹ」として示され、「Ｘｎ」は、上記のとおり対応する位置に指定され、「Ｙ」は、操作されたポリペプチド（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）内で見つかったアミノ酸の１文字の識別子である。いくつかの例（例えば表１）では、本開示はまた、従来の表記「ＡｎＢ」で示される特定のアミノ酸の差異を提供する。Ａは、参照配列内の残基の１文字の識別子であり、「ｎ」は、参照配列内の残基位置の数であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の１文字の識別子である。いくつかの例では、本開示の操作されたポリペプチドは、参照配列と比較して１つ以上のアミノ酸残基の差異を含んでもよく、これは、参照配列と比較して、残基の差異が存在する特定の位置のリストによって示される。いくつかの実施形態では、２つ以上のアミノ酸残基を操作されたポリペプチドの特定の残基位置に使用することができ、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ３９Ｌ／Ｘ３９Ａ）。
【００４８】
「欠失」とは、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を指す。欠失には、１つ以上のアミノ酸、２つ以上のアミノ酸、５つ以上のアミノ酸、１０以上のアミノ酸、１５以上のアミノ酸、または２０以上のアミノ酸、アミノ酸の総数の１０％以下の酵素、または参照酵素を構成するアミノ酸の総数の２０％以下の除去が含まれ得、かつ操作されたアルドラーゼの酵素活性が保持され、かつ／または操作されたアルドラーゼの改善された特性が保持される。欠失には、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分が関与し得る。様々な実施形態では、欠失は、連続したセグメントを含んでもよく、または不連続であってもよい。
【００４９】
「挿入」とは、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を付加することによるポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、改善され、操作されたアルドラーゼは、天然アルドラーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、ならびに他の操作されたアルドラーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。アミノ酸は、ポリペプチドの内部部分に挿入するか、カルボキシルまたはアミノ末端に挿入することができる。本明細書で使用する場合、挿入としては、当技術分野で公知である融合タンパク質が挙げられる。挿入は、アミノ酸の連続したセグメントであるか、または天然に存在するポリペプチドもしくは操作されたポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸によって分離されている可能性がある。
【００５０】
本明細書で使用される「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長以上、およびアルドラーゼポリペプチドの全長の７０％、８０％、９０％、９５％、９８％および９９％以下であり得る。
【００５１】
「単離されたポリペプチド」とは、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドなど、天然に付随する他の物質から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されているポリペプチドを含む。操作されたアルドラーゼポリペプチドは、細胞中、細胞培養培地中に存在してもよく、または溶解物もしくは単離調製物などの様々な形態で調製されてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００５２】
「キラル中心」とは、４つの異なる基を接続する炭素原子を指す。
【００５３】
「立体選択性」とは、化学反応または酵素反応において、一方の立体異性体が他方よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は部分的であり得、一方の立体異性体の形成が他方の立体異性体よりも優先されるか、または一方のみの立体異性体が形成されている場合は完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性はエナンチオ選択性と呼ばれる。多くの場合、「エナンチオマー過剰率」（略してｅｅ）として報告される。立体異性体がジアステレオマーである場合、立体選択性はジアステレオ選択性と呼ばれる。多くの場合、「ジアステレオマー過剰率」（略してｄｅ）として報告される。分画、典型的には百分率は、一般に、次式に従って、そこから誘導されるジアステレオマー過剰率（すなわち、ｄｅ）として任意により報告され、当技術分野で報告される：［メジャージアステレオマー−マイナージアステレオマー］／［メジャージアステレオマー＋マイナージアステレオマー］。場合によっては、本開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドによって形成された生成物では、２つのジアステレオマーのみ：（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（すなわち、Ａ２）および（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（すなわち、Ａ３）検出され、生成物中のＡ２のｄｅ値は、次のように算出する：［Ａ２−Ａ３］／［Ａ２＋Ａ３］。
【００５４】
「立体異性体」、「立体異性形態」、および同様の表現は、本明細書では同義的に使用され、それらの空間内の原子の配向の違いのみから生じるすべての異性体を指す。これには、エナンチオマーと、２つ以上のキラル中心を有し、互いに鏡像ではない化合物（すなわち、ジアステレオマー）を含む。
【００５５】
「改善された酵素特性」とは、野生型アルドラーゼ、または別の改善され、操作されたアルドラーゼなどの参照アルドラーゼと比較して、特定の目的に対して、より良好であるか、またはより望ましい酵素特性を指す。改善された酵素特性は、本開示における操作されたアルドラーゼポリペプチドにより呈示される。改善が期待される酵素特性としては、これらに限定されないが、酵素活性（基質変換の割合として表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性特性、補因子要件、阻害剤に対する耐性（例：基質または生成物の阻害）、立体特異性および立体選択性（エナンチオ選択性またはジアステレオ選択性など）が挙げられる。
【００５６】
「変換」とは、対応する生成物への基質の酵素的変換を指す。「パーセント変換」または「変換」とは、指定された条件下で一定期間内に生成物に変換される基質の割合（パーセント）を指す。したがって、アルドラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質から生成物への「パーセント変換」として表現できる。
【００５７】
「熱安定性」とは、一定時間（０．５〜２４時間）、高温（３０〜８０℃）にさらされた後、同様の活性（例えば、５０％以上）を保持するアルドラーゼポリペプチドを意味する。
「溶媒安定性」とは、一定期間（例、０．５〜２４時間）、様々な溶媒（エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）にさらされた後、同様の活性（例えば、５０％〜８０％以上）を保持するアルドラーゼポリペプチドを指す。
【００５８】
「好適な反応条件」とは、生体触媒反応系における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒など）を指す。本開示のアルドラーゼポリペプチドは、これらの条件下において、基質を所望の生成物化合物に変換することができる。例示的な「好適な反応条件」は、本開示において提供され、実施例によって例示される。
【００５９】
「ヒドロカルビル」とは、直鎖または分岐鎖炭化水素基を指す。記号「Ｃ」の後ろの下付き文字の数は、特定の基に含まれ得る炭素原子の数を指定している。例えば、「Ｃ１〜Ｃ８」は、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。ヒドロカルビル基は、１つ以上の置換基で任意により置換されてもよい。「アリール」とは、６〜約２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」は、親芳香族環系の炭素原子のうちの１つ以上が、ヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）で置換されているアリール基を指す。「置換」とは、指定された基またはラジカルの修飾に使用される場合、指定された基またはラジカルの１つ以上の水素原子がそれぞれ同一のまたは異なる置換基によって互いに独立して置換されることを意味する。「置換ヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール」は、１つ以上の水素原子が他の置換基で置換されているヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール基を指す。「任意の」または「任意により」とは、記載されている事象または状況が発生する場合、または発生しない場合があり得ることを意味する。例えば、「任意により置換されたアリール」は、置換されている場合も、置換されていない場合もあり得るアリール基を指す。この説明には、置換アリール基および非置換アリール基の両方が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される「化合物」は、本明細書で開示される化合物で示される構造式および／または化学名に包含される任意の化合物を指す。化合物は、それらの化学構造および／または化学名によって識別され得る。化学構造と化学名とが矛盾する場合、化学構造によって化合物の同一性が決定される。特に明記されない限りまたは別に示されない限り、本明細書に記載の化学構造は、記載される化合物のすべての可能な異性体を包含する。
２．２操作されたアルドラーゼ
【００６１】
以下の表１は、本発明により開発された、操作されたアルドラーゼポリペプチドを示す。各行には、特定の操作されたアルドラーゼポリペプチドのポリヌクレオチド配列番号およびアミノ酸配列番号、ならびに配列番号２と比較させた残基の差異を示す。各々例示する、操作されたアルドラーゼポリペプチドの活性または立体選択性のレベルは「＋」として示し、特定の意味は表２に示す。
【表１】
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【表２】
2020521509.tif 000018
【００６２】
表１に列挙されたアミノ酸配列（すなわち、配列番号２〜２３０の偶数の配列識別子）は、それぞれ３５７個のアミノ酸残基を含む。配列番号２３２、２３４、または２３６は、配列番号２と比較して、異なる数のアミノ酸残基の欠失または置換を有する。配列番号２３２、２３４、２３６で表す操作されたアルドラーゼポリペプチドは、表２に示す＋、＋＋、＋＋＋、＋＋＋＋または＋＋＋＋＋の反応条件下で、配列番号２より高い立体選択性および／または活性を呈する。
２．３操作されたアルドラーゼポリペプチドの産生に使用できるポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクターおよび宿主細胞
【００６３】
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のアルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、遺伝子発現を制御して、操作されたポリペプチドを発現させることができる組換えポリヌクレオチドを産生する１つ以上の異種調節配列に連結できる。操作されたアルドラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物は、好適な宿主細胞に導入されて、対応する操作されたアルドラーゼポリペプチドを発現させることができる。
【００６４】
当業者には明らかであるように、タンパク質配列の入手可能性および様々なアミノ酸に対応するコドンの知見により、目的のタンパク質配列をコードするすべての可能なポリヌクレオチドの例示が提供される。同じアミノ酸が選択可能または同義のコドンによってコードされる遺伝子コードの縮重により、非常に多数のポリヌクレオチドの産生が可能になり、そのすべてが本明細書に開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列が決定されると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を改変しない様式で、１つ以上のコドンを修飾することのみにより、任意の数の異なるポリヌクレオチドを生成できる。この点に関して、本開示は、表１に列挙された例示的な操作されたポリペプチドのアミノ酸配列を含む、本明細書に開示のポリペプチドのいずれかについて、および参照により組み込まれた配列表の配列番号４〜２３６の偶数配列識別子として開示されたポリペプチドのいずれかについて、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製できるポリヌクレオチドのあらゆる考えられる改変が特に企図される。これらはすべて特に公開されていると考えられている。
【００６５】
様々な実施形態では、コドンは、組換えタンパク質が産生される宿主細胞を収容するように選択されることが好ましい。例えば、細菌にとって好ましいコドンは、細菌内で遺伝子を発現するために使用される。酵母にとって好ましいコドンは、酵母内で遺伝子を発現させるために使用される。哺乳類にとって好ましいコドンは、哺乳類細胞での遺伝子発現に使用される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４〜２３６の偶数配列識別子である参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、アルドラーゼ活性および本明細書に記載の改善された特性のうちの１つ以上（例えば、配列番号２のポリペプチドと比較して、化合物Ａ１を高い立体選択性を有する化合物Ａ２に変換する能力）を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、上記の同一性の割合を有し、配列番号２と比較して１つ以上のアミノ酸残基の差異を有するアミノ酸配列を含む操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本開示は、アルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドを提供し、操作されたポリペプチドは、以下の位置から選択される残基の差異を有する配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する組み合わせを含む。Ｘ１６、Ｘ１７、Ｘ１９、Ｘ２６、Ｘ３２、Ｘ３３、Ｘ３７、Ｘ３８、Ｘ３９、Ｘ４１、Ｘ４２、Ｘ４３、Ｘ４４、Ｘ４５、Ｘ４６、Ｘ４７、Ｘ４８、Ｘ４９、Ｘ９１、Ｘ９２、Ｘ１１８、Ｘ１３２、Ｘ１３４、Ｘ１５４、Ｘ１６４、Ｘ１６８、Ｘ１７６、Ｘ１８２、Ｘ１８５、Ｘ１８９、Ｘ１９１、Ｘ２１６、Ｘ２１７、Ｘ２１８、Ｘ２２７、Ｘ２３４、Ｘ２３７、Ｘ２４４、Ｘ２４７、Ｘ２６２、Ｘ２８２、Ｘ２８４、Ｘ２８５、Ｘ２８８、Ｘ２９１、Ｘ２９２、Ｘ２９３、Ｘ２９４、Ｘ２９５、Ｘ３０２、Ｘ３０５、Ｘ３１６、Ｘ３１８、Ｘ３１９、Ｘ３２０、Ｘ３２４、Ｘ３５２。
【００６８】
いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３〜２３５の奇数の配列遺伝子を有する配列を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドをコードする。しかし、ヌクレオチドレベルでは、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドに対して、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチドは、配列番号３〜２３５の奇数配列識別子を有する配列から選択される。
【００７０】
操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、発現を改善するためのコドン最適化による配列のさらなる修飾、追加の制御配列の有無にかかわらず好適な発現エレメントへの挿入、および操作されたポリペプチドの発現および産生に好適である宿主細胞への形質転換など、様々な様式で、操作されたポリペプチドの発現を可能にするために操作することができる。
【００７１】
発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を用いて、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当技術分野において周知である。ガイダンスは、以下に提供されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、１９９８年、２０１０年改定。
【００７２】
別の態様では、本開示は、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはその多様体、ならびにプロモーターおよびターミネーターなどの１つ以上の発現調節領域、複製起点など、導入される宿主の種類に応じて、組換え発現ベクターにも関する。あるいは、本開示の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することにより発現させ得る。発現ベクターの生成において、コーディング配列は、コーディング配列が発現に好適である制御配列に連結されるようにベクター内に配置される。
【００７３】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順において都合よく使用でき、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。一般に、ベクターの選択は、ベクターの、導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線形プラスミドまたは閉環状プラスミドであり得る。発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体などの複製が、染色体の複製に依存しない染色体外実体として存在するベクターであり得る。ベクターには、自己コピーを保証するための任意のツールが含まれ得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されるときに、ゲノムに組み込まれ、ベクターが組み込まれた染色体とともに複製するベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む単一のベクターもしくはプラスミド、または２つ以上のベクターもしくはプラスミドを使用してもよい。
【００７４】
本開示の実施形態に有用な多くの発現ベクターが市販されている。例示的な発現ベクターは、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することにより調製され得る。
【００７５】
別の態様では、本開示は、本開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドは、宿主細胞におけるアルドラーゼポリペプチドの発現のための１つ以上の制御配列に連結されている。本開示の発現ベクターによりコードされるポリペプチドを発現させるための宿主細胞は、これらに限定されるものではないが、大腸菌、アルスロバクターＫＮＫ１６８、ストレプトミセス、およびネズミチフス菌細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞（例えば、サッカロミセスセレビシエまたはピキアパストリス）；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；および植物細胞など、当技術分野において周知である。例示的な宿主細胞は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。上記の宿主細胞は、野生型であってもよく、または宿主細胞のゲノムで担持されている野生型アルドラーゼ遺伝子のノックアウトなどのゲノム編集により操作された細胞であってもよい。上記の宿主細胞に好適である培地および成長条件は、当技術分野において周知である。
【００７６】
操作されたアルドラーゼを発現させるために使用されるポリヌクレオチドは、当該分野において公知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術としては、特に、エレクトロポレーション、生体粒子衝撃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入する異なる方法は、当業者には明らかである。
２．４操作されたアルドラーゼポリペプチドの産生プロセス
【００７７】
操作されたアルドラーゼは、アルドラーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定方向進化に供することにより得ることができる。例示的な方向性進化技術は、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ、（２００９年Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ａｓｉａ（Ｐｔｅ）Ｌｔｄ．ＩＳＢＮ：９７８−０−４７０−８２３１４−９）に見出すことができる。
【００７８】
操作されたポリペプチドの配列が明らかである場合、コードするポリヌクレオチドは、公知である合成方法による標準的な固相法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、約１００塩基以下の断片を別々に合成し、次いでライゲートして（例えば、酵素的または化学的ライゲーション法またはポリメラーゼ媒介法により）、あらゆる所望の連続配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、例えば、古典的なホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年、Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ  ２２：１８５９−６９）またはＭａｔｔｈｅｓら、Ｐｅｏｐｌｅ、１９８４年、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−０５によって記載）を使用する化学合成により調製することができ、これは、典型的には、自動合成法で実施されている。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成され、精製され、アニーリングされ、ライゲートされ、例えば自動化されたＤＮＡ合成装置で好適なベクターにクローン化される。さらに、本質的に核酸はいずれも、様々な商業的供給源のいずれかから入手可能である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、本開示は、好適な反応条件下で、化合物Ａ１を化合物Ａ２に変換することができる操作されたアルドラーゼポリペプチドを調製または産生するためのプロセスも提供する。このプロセスには、ポリペプチドの発現に好適である培養条件下において、操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現できる宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを調製するプロセスは、ポリペプチドを単離することをさらに含む。操作されたポリペプチドは、好適な細胞内で発現させて、タンパク質精製のために周知である技術のいずれか１つ以上を使用して、宿主細胞および／または培地から単離（または回収）され得る。タンパク質精製技術としては、とりわけリゾチーム処理、超音波処理、ろ過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーが挙げられる。
２．５操作されたアルドラーゼおよびそれにより調製された化合物の使用方法
【００８０】
別の態様では、本明細書に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドは、アルデヒド基質およびアミノ酸基質を不斉縮合させることができる。本開示はまた、本明細書に開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドを使用して、広範囲の化合物（Ｉ）またはその構造類似体を調製するプロセスを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、構造式（Ｉ）の化合物を調製するプロセスにおいて使用することができる：
【化１２】
2020521509.tif 000019
式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、＊でマークされたキラル中心に、示された立体化学配置を有する。式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、他の異性体よりも高いジアステレオマー過剰率である
（式中、Ｒ１は、任意の置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール、または任意の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキルであり、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨ、−ＣＨ２ＳＣＨ３、または任意の置換もしくは非置換Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビルである）。本明細書のプロセスは、アルデヒド基質およびアミノ酸基質をβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物に変換するのに好適である反応条件下で、式（ＩＩ）のアルデヒド基質および式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質
【化１３】
2020521509.tif 000020
を、アルドラーゼポリペプチドと接触させることを含む。ここでは、アルドラーゼポリペプチドは、本明細書に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有し、式（ＩＩ）のアルデヒド基質および式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質を縮合して、配列番号２よりも高い変換率および／または高い立体選択性を有する式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物を形成することができる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【００８２】
上記のように、本開示のプロセスにおいて有用なアルドラーゼポリペプチドは、ｐ−ニトロベンズアルデヒドおよびグリシンの（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸へ縮合する能力によって特徴付けられ得る。したがって、本明細書に開示されるプロセスの実施形態のいずれにおいても、本プロセスを実施でき、アルドラーゼポリペプチドは、ｐ−ニトロベンズアルデヒドおよびグリシンを縮合させて、配列番号２よりも高い変換率および／または高い立体選択性を有し、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸にすることができる。
【００８３】
上記プロセスのいくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意の置換または非置換Ｃ１〜Ｃ８アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意の置換または非置換フェニルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意の置換または非置換ピリジルである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意の置換または非置換アリールまたはヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、任意の置換または非置換のフェニルであり、置換は、（オルト、メタまたはパラ）フェニル環、またはフェニル環上で同時に生じる置換のうちの任意の２つのいずれかで発生し、これらの置換基は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビル、ハロゲン（例えば、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３からなる群から選択され、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルから独立して選択される。いくつかの実施形態では、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルは、ハロゲン置換炭化水素である。
【００８４】
上記プロセスのいくつかの実施形態では、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨ、または−ＣＨ２ＳＣＨ３である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【００８６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−（＋）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−２，４−メチルペンタン酸であり：
【化１４】
2020521509.tif 000021
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はＬ−アラニンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はイソブチルアルデヒドである
【化１５】
2020521509.tif 000022
【００８７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−（＋）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−メチルペンタン酸であり：
【化１６】
2020521509.tif 000023
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はイソブチルアルデヒドである
【化１７】
2020521509.tif 000024
【００８８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシデカン酸であり：
【化１８】
2020521509.tif 000025
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はｎ−オクタナールである
【化１９】
2020521509.tif 000026
【００８９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−４−ヘキセン酸であり：
【化２０】
2020521509.tif 000027
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はクロトンアルデヒドである
【化２１】
2020521509.tif 000028
【００９０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−［（４Ｓ）３−ジオキソラン−４−イル］−３−ヒドロキシプロパン酸であり：
【化２２】
2020521509.tif 000029
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は（４Ｓ）−２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−カルバルデヒドである：
【化２３】
2020521509.tif 000030
【００９１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（１Ｈ−イミダゾール−２−イル）プロパン酸であり：
【化２４】
2020521509.tif 000031
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は１Ｈ−イミダゾール−２−カルボキシアルデヒドである
【化２５】
2020521509.tif 000032
【００９２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（ピリジン−３−イル）プロパン酸であり：
【化２６】
2020521509.tif 000033
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はピリジンカルボキシアルデヒドである
【化２７】
2020521509.tif 000034
【００９３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸であり：
【化２８】
2020521509.tif 000035
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は３−フェニルプロピオンアルデヒドである
【化２９】
2020521509.tif 000036
【００９４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−５−（ベンジルオキシ）−３−ヒドロキシ吉草酸であり：
【化３０】
2020521509.tif 000037
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は３−（ベンジルオキシ）プロパナールである：
【化３１】
2020521509.tif 000038
【００９５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−（１，３−１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−３−ヒドロキシプロパン酸であり：
【化３２】
2020521509.tif 000039
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はメチレンジオキシベンゼン−５−カルバルデヒドである：
【化３３】
2020521509.tif 000040
【００９６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−４−（２−アミノ−６−ヒドロキシ−９Ｈ−プリン−９−Ｙｌ）−３−ヒドロキシ酪酸であり：
【化３４】
2020521509.tif 000041
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は（２−アミノ−６−ヒドロキシ−９Ｈ−プリン−９−イル）アセトアルデヒドである：
【化３５】
2020521509.tif 000042
【００９７】
いくつかの実施形態では、上記プロセスで産生された式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は：
【化３６】
2020521509.tif 000043
であり、式中、Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒおよび−Ｉ）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され；
また、Ｒ３は、
【化３７】
2020521509.tif 000044
であり得、Ｒ２は、−Ｈ、−ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＳＨまたは−ＣＨ２ＳＣＨ３であり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は
【化３８】
2020521509.tif 000045
である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のパラ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルト位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびメタの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびオルトの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してメタおよびオルトの両方である。いくつかの実施形態では、上記プロセスで産生された式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【０１００】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は：
【化３９】
2020521509.tif 000046
であり、Ｒ４は、上記に定義されたＲ３であり、Ｒ３およびＲ２は、上記に定義されたとおりであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、
【化４０】
2020521509.tif 000047
【０１０１】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルト位にある。いくつかの実施形態では、上記プロセスで産生された式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【０１０２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−安息香酸であり：
【化４１】
2020521509.tif 000048
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質はベンズアルデヒドである：
【化４２】
2020521509.tif 000049
【０１０３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−メチルフェニル）プロパン酸であり：
【化４３】
2020521509.tif 000050
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、４−メチルベンズアルデヒドである：
【化４４】
2020521509.tif 000051
【０１０４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、構造式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−（２−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロパン酸であり：
【化４５】
2020521509.tif 000052
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、２−クロロベンズアルデヒドである：
【化４６】
2020521509.tif 000053
【０１０５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシベンゼン）−３−ヒドロキシプロパン酸であり：
【化４７】
2020521509.tif 000054
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドである：
【化４８】
2020521509.tif 000055
【０１０６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロパン酸であり：
【化４９】
2020521509.tif 000056
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は４−ヒドロキシベンズアルデヒドである：
【化５０】
2020521509.tif 000057
【０１０７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（３−ニトロフェニル）プロパン酸であり：
【化５１】
2020521509.tif 000058
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は３−ニトロベンズアルデヒドである：
【化５２】
2020521509.tif 000059
【０１０８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−（４−フルオロ−３−ニトロフェニル）−３−ヒドロキシプロパン酸であり：
【化５３】
2020521509.tif 000060
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、４−フルオロ−３−ニトロベンズアルデヒドである：
【化５４】
2020521509.tif 000061
【０１０９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−２−メチル−３−（３−ニトロフェニル）プロパン酸であり：
【化５５】
2020521509.tif 000062
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はＬ−アラニンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、３−ニトロベンズアルデヒドである：
【化５６】
2020521509.tif 000063
【０１１０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（２−ニトロフェニル）プロパン酸であり：
【化５７】
2020521509.tif 000064
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は２−ニトロベンズアルデヒドである：
【化５８】
2020521509.tif 000065
【０１１１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−３−［ｐ−（メチルスルホニル）フェニル］３−ヒドロキシ−２−アミノ−プロパン酸であり：
【化５９】
2020521509.tif 000066
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質は、グリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、ｐ−メチルスルホンベンズアルデヒドである
【化６０】
2020521509.tif 000067
【０１１２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸であり：
【化６１】
2020521509.tif 000068
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、４−メルカプトベンズアルデヒドである：
【化６２】
2020521509.tif 000069
【０１１３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−メルカプトメチルベンゼン）プロパン酸であり：
【化６３】
2020521509.tif 000070
式（ＩＩＩ）のアミノ酸基質はグリシンであり、式（ＩＩ）のアルデヒド基質は、４−メルカプトメチルベンズアルデヒドである：
【化６４】
2020521509.tif 000071
【０１１４】
いくつかの実施形態では、上記プロセスで産生された式（Ｉ）のβ−ヒドロキシ−α−アミノ酸生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、改善された、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、ジアステレオマー過剰率の式Ａ２（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の化合物：
【化６５】
2020521509.tif 000072
の調製に使用することができる。
【０１１６】
これらの実施形態では、本プロセスは、好適な有機溶媒中、グリシンの存在下で、式Ａ１の化合物を式Ａ２の化合物に変換するのに好適な反応条件下で、式Ａ１の化合物：
【化６６】
2020521509.tif 000073
を、本明細書に開示の操作されたアルドラーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【０１１７】
上記プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のジアステレオマー過剰率で存在する。
【０１１８】
上記プロセスで使用できる操作されたアルドラーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６から選択されアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
本明細書に記載され、実施例に例示されるように、本開示は、これらに限定されないが、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、生成物ジアステレオマーの混合物、ポリペプチド負荷、補因子負荷、圧力、および反応時間など、本明細書のプロセスで使用され得る好適な反応条件の範囲を企図する。本明細書に記載の操作されたアルドラーゼポリペプチドを使用して、生体触媒により、基質化合物を生成物化合物に変換する方法を実行するための追加の好適な反応条件は、これに限定されないが、操作されたアルドラーゼポリペプチドが、様々な濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験反応条件下で基質化合物と接触させることなどのルーチン実験により容易に最適化でき、生成物化合物は、例えば、本明細書で提供される実施例に記載の方法を使用して検出される。
【０１２０】
上記のとおり、本開示のプロセスで使用するためのアルドラーゼ活性を有する操作されたポリペプチドは、一般に、配列番号４〜２３６の偶数番号の配列のいずれか１つから選択された参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
反応混合物中の基質化合物は、例えば、所望の生成物化合物の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、本反応条件下での酵素の安定性、および基質から生成物への転換率を考慮して変化させることができる。プロセスのいくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、少なくとも約０．５〜約４００ｇ／Ｌ、約１〜約４００ｇ／Ｌ、約５〜約４００ｇ／Ｌ、約１０〜約４００ｇ／Ｌ、または約５０〜約４００ｇ／Ｌの基質（ＩＩ）または基質Ａ１の負荷が挙げられる。いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、少なくとも約０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｇ／Ｌ、少なくとも約３００ｇ／Ｌ、少なくとも約３５０ｇ／Ｌ、少なくとも約４００ｇ／Ｌまたはそれ以上の基質（ＩＩ）または基質Ａ１の負荷が挙げられる。本明細書で提供される基質負荷の値は、化合物（ＩＩ）またはＡ１の分子量に基づくが、本プロセスにおいては、化合物（ＩＩ）またはＡ１の様々な水和物および塩の等モル量を使用することも企図される。
本明細書に記載のプロセスでは、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、アミノ酸およびアルデヒド化合物を使用して生成物化合物を形成する。いくつかの実施形態では、反応条件のアミノ酸としては、グリシン、Ｄ、Ｌ−アラニン、Ｄ、Ｌ−セリン、Ｄ、Ｌ−システイン、Ｄ、Ｌ−ロイシン、Ｄ、Ｌ−イソロイシン、Ｄ、Ｌ−メチオニン、Ｄ、Ｌ−スレオニンまたはＤ、Ｌ−バリンから選択される化合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、アミノ酸はグリシンである。いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、基質（ＩＩ）のモル負荷の少なくとも約１倍の負荷で存在するアミノ酸が挙げられる。いくつかの実施形態では、グリシンは、基質（ＩＩ）のモル負荷の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０倍の負荷で存在する。
【０１２２】
プロセスの好適な反応条件としては、一般に、反応混合物中に補因子が存在することも挙げられる。操作されたアルドラーゼは、典型的には、ビタミンＢ６ファミリーのメンバーを使用するため、反応条件としては、ピリドキサール−５’−リン酸塩（ピリドキサールリン酸塩、ＰＬＰ、Ｐ５Ｐとしても知られる）、ピリドキシン（ＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、およびそれらのリン酸化対応物；ピリドキシンリン酸塩（ＰＮＰ）、およびピリドキサミンリン酸塩（ＰＭＰ）から選択される１つ以上の化合物を挙げることができる。いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度のＰＬＰ、ＰＮ、ＰＬ、ＰＭ、ＰＮＰおよびＰＭＰからなる群から選択される補因子を挙げることができる。いくつかの実施形態では、補因子は、ＰＬＰである。したがって、いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、約０．１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約０．２ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約０．５ｇ／Ｌ〜約２．５ｇ／Ｌの濃度の補因子ＰＬＰを挙げることができる。いくつかの実施形態では、反応条件としては、約１０ｇ／Ｌ以下、約５ｇ／Ｌ以下、約２．５ｇ／Ｌ以下、約１．０ｇ／Ｌ以下、約０．５ｇ／Ｌ以下、または約０．２ｇ／Ｌ以下のＰＬＰ濃度が挙げられる。
【０１２３】
プロセスのいくつかの実施形態（例えば、全細胞または溶解物が使用される場合）では、補因子は、細胞抽出物に自然に存在し、補充する必要はない。本プロセスのいくつかの実施形態では（例えば、部分的に精製された、または精製されたアルドラーゼを使用する）、本プロセスは、酵素反応混合物に補因子を添加するステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、反応の開始時に補因子が添加され、かつ／または反応中に追加の補因子が添加される。
【０１２４】
この反応の実施形態では、反応条件は、好適なｐＨを含み得る。上記のとおり、酸または塩基、好適な緩衝液、または緩衝液と添加された酸または塩基の組み合わせを使用することにより、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲を維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応前および／または反応中に制御することができる。いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、約４〜約８の溶液ｐＨ、約５〜約７のｐＨ、約６〜約７のｐＨが挙げられる。いくつかの実施形態では、反応条件としては、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５または８の溶液ｐＨが挙げられる。
【０１２５】
本明細書のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加、十分な反応期間中での酵素の活性を考慮して、好適な温度を反応条件に使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、約１０℃〜約６０℃、約２５℃〜約５０℃、約２５℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３０℃の温度が挙げられる。いくつかの実施形態では、好適な反応温度としては、約２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度が挙げられる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応全体を通して特定の温度に維持することができる。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応の過程中の温度プロファイルで調整され得る。
【０１２６】
操作されたアルドラーゼを使用するプロセスは、一般的に溶媒中で実行される。好適な溶媒としては、水、緩衝水溶液、有機溶媒、および／または共溶媒系が挙げられ、これらには一般に水性溶媒および有機溶媒が挙げられる。水溶液（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝または非緩衝であり得る。いくつかの実施形態では、操作されたアルドラーゼポリペプチドを使用するプロセスは、一般に、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール（ＩＰＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン液体（例えば、１−エチル４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロホスフェートなど）を含む水性共溶媒系で行われる。水性共溶媒系の有機溶媒成分は、単一の液相となる水性成分と混和性であるか、または２つの液相となる水性成分と部分的に混和性または非混和性であり得る。例示的な水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を含む。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、アルドラーゼを完全に不活性化しないように選択される。好適な共溶媒系は、本明細書に記載されているものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系内の定義された目的の基質で、特定の操作されたアルドラーゼの酵素活性を測定することにより容易に識別できる。プロセスのいくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、約１％〜約１００％（ｖ／ｖ）、約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約５０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールを含む水性共溶媒が挙げられる。プロセスのいくつかの実施形態では、好適な反応条件としては、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％（ｖ／ｖ）の濃度のエタノールを含む水性共溶媒が挙げられる。
【０１２７】
好適な反応条件としては、その対応する生成物化合物への基質化合物の生体触媒変換をもたらす反応パラメータの組み合わせを挙げることができる。したがって、本プロセスのいくつかの実施形態では、反応パラメータの組み合わせは、以下を含む：（ａ）基質Ａ１の負荷は、約１０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌである。（ｂ）グリシン負荷は、基質Ａ１のモル量の約３〜１０倍である。（ｃ）操作されたポリペプチド濃度が約０．５ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌである。（ｄ）ＰＬＰ補因子濃度が約０．１ｍＭ〜１０ｍＭである。（ｅ）ＤＭＳＯまたはエタノールの濃度が、約２０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）である。（ｆ）ｐＨが約４．０〜８．０である。および（ｇ）温度が約１０〜６０℃である。
【０１２８】
例示的な反応条件には、表２および実施例３に提供されるアッセイ条件が含まれる。
本明細書に記載の反応の実施において、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、部分精製形態または精製形態で、操作されたアルドラーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、ならびに／または細胞抽出物および／もしくはこうした細胞の溶解物として、反応混合物に添加され得る。操作されたアルドラーゼをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、または細胞抽出物、それらの溶解物、および単離された酵素は、固体（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）または半固体（例えば、粗ペースト）など幅広い範囲の異なる形態で使用され得る。細胞抽出物または細胞溶解物は、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、熱処理など）によって部分的に精製され、その後、凍結乾燥の前に脱塩手順（例えば、限外濾過、透析など）が行われ得る。酵素調製物はいずれも、グルタルアルデヒドなどの既知の架橋剤を使用した架橋、または固相材料（樹脂など）への固定化により安定化できる。
【０１２９】
本明細書に記載の反応のいくつかの実施形態では、反応は、本明細書に記載の好適な反応条件下で実施され、操作されたアルドラーゼポリペプチドは、固体支持体に固定化される。反応を行うために、操作されたアルドラーゼ酵素を固定化するのに有用な固体支持体としては、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートなどのビーズまたは樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な固体支持体としては、これらに限定されないが、以下の異なる種類のＳＥＰＡＢＥＡＤを含むキトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、およびＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）が挙げられる：ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０。
【０１３０】
操作されたポリペプチドが分泌されたポリペプチドの形態で発現されるいくつかの実施形態では、分泌されたポリペプチドを含む培養培地を本明細書のプロセスで使用することができる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、乳液、懸濁液など、様々な異なる形態で反応に提供され得る。反応物は、当業者に公知の方法および機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥させ得る。例えば、タンパク質溶液を少量のアリコットにして、−８０℃で凍結し、事前に冷却した凍結乾燥チャンバに加えて、真空を用いることができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、反応物の添加の順序は重要ではない。反応物は、同時に溶媒に一緒に加えられてもよい（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）、あるいは、いくつかの反応物は、別々に加えられてもよく、いくつかは、異なる時点で一緒に加えられてもよい。例えば、補因子、アルドラーゼ、および基質を最初に溶媒に加えてもよい。水性共溶媒系を使用する際の混合効率を改善するために、アルドラーゼおよび補因子を最初に水相に加えて混合することができる。次に、有機相を加えて混合し、その後、基質を加えることができる。あるいは、水相に添加する前に、有機相内で基質を予混合することができる。
【０１３３】
本開示の異なる特徴および実施形態は、以下の代表的な例において例示され、これらは例示的であり、限定的ではないことが意図される。
３．実施例
【０１３４】
以下の実施例は、本発明をさらに例解するが、本発明はそれらに限定するものではない。以下の実施例では、条件が指定されていない実験方法は、一般的に使用される条件で、または供給業者の提案に従って実施した。
実施例１：遺伝子クローニングおよび発現ベクターの構築
【０１３５】
シュードモナス・プチダ由来の野生型アルドラーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩから回収することができ、その後、その対応する核酸は、当技術分野の従来技術を使用してベンダーにより合成され、発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１にクローニングさせた。組換え発現プラスミドは、４２℃および９０秒間の熱ショックの条件下で、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換させた。クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに形質転換溶液を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。組換え形質転換体を得た。
実施例２：アルドラーゼポリペプチドの組換え発現
【０１３６】
組換え大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）など実施例１から得られた形質転換体を、クロラムフェニコールを含むＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０）に播種し、３０℃、２５０ｒｐｍで、振盪インキュベーターにより一晩培養した。一晩培養したものを、２５０ｍＬのＴＢ培地（トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、グリセロール４ｍＬ／Ｌ、ＰＢＳ）を含む１Ｌフラスコに入れ、３０℃、２５０ｒｐｍの振盪インキュベーターで継代培養した。継代培養液のＯＤ６００が０．６〜０．８に達すると、ＩＰＴＧを添加して、最終濃度０．１ｍｍｏｌ／Ｌで、組換えアルドラーゼの発現を誘導した。一晩発現させた後、培養液を遠心分離して静止細胞を得た。ペレット化された静止細胞をｐＨ７．４緩衝液に懸濁し、次いで、氷浴で超音波処理して細胞溶解物を得た。細胞溶解物の上清を、組換えアルドラーゼの粗酵素溶液として遠心分離により回収し、凍結乾燥装置を使用して上清をさらに凍結乾燥させて、粗酵素粉末を得た。
【０１３７】
上記の振盪フラスコを使用する組換え発現プロセスに従って、９６ウェルプレートでの小規模発現プロセスは、スケールを比例的に縮小することにより実行した。粗酵素溶液は、超音波処理ではなく化学溶解によって得た。
実施例３：アルドラーゼポリペプチドの活性および立体選択性を測定するための反応条件および分析方法
【０１３８】
９６ウェルプレートに、ｐ−ニトロベンズアルデヒドを最終濃度７．５ｇ／Ｌで添加した。添加前にｐ−ニトロベンズアルデヒドをエタノール（ＥｔＯＨ）に溶解した。系内のエタノールの最終濃度は、４０％（ｖ／ｖ）であったが、グリシンは、ｐ−ニトロベンゼンアルデヒドのモル量の１０倍（すなわち３７．４／Ｌ）で加え、ピリドキサールリン酸塩（ＰＬＰ）は、最終濃度０．０５ｍｍｏｌ／Ｌで添加し、最後に粗酵素溶液を添加した。反応物の総容量は、２００μｌであった。反応を４時間実行した後、５０％アセトニトリルで反応をクエンチさせ、アルドラーゼポリペプチドを不活性化した。クエンチさせた反応物を遠心分離し、得られた上清を希釈し、次いでＨＰＬＣ分析に供して、基質変換率および生成物Ａ２のｄｅ値を求めた。
【０１３９】
酵素反応は、上記の９６ウェルマイクロプレート反応に基づいて、反応物総容量５ｍＬまでスケールアップさせた。ｐ−ニトロベンズアルデヒドの負荷は、４０ｇ／Ｌ、グリシンの負荷は１９９．２ｇ／Ｌ、ＰＬＰの最終濃度は０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ、系内のエタノールの濃度は、３０％（ｖ／ｖ）、粗酵素粉末負荷は、４ｇ／Ｌであった。
【０１４０】
生成物の変換率およびｄｅ値を決定するための分析方法は以下のとおりであった：反応溶液を遠心分離し、上清を５０％アセトニトリルで希釈して生成物濃度１ｇ／Ｌ未満とした。この希釈サンプル１０μｌをＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣに注入して、変換を分析した。カラムは、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃｈｉｒｅｘ３１２６（Ｄ）−ペニシラミン１５０＊４．６ｍｍ、移動相は３ｍＭ硫酸銅：メタノール＝９０：１０、流速１ｍＬ／分、カラム温度５０℃、および検出波長は２３５ｎｍであった。（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の保持時間は、２２．５３分であった。（２Ｒ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の保持時間は、２４．１７分であった。ｐ−ニトロベンズアルデヒドの保持時間は、２８．６５分であった。（２Ｓ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸および（２Ｒ，３Ｓ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の保持時間は、６４．１９分であった。合計分析時間は、７０分であった。
実施例４：アルドラーゼ突然変異体ライブラリーの構築
【０１４１】
本明細書では、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（供給業者：Ａｇｉｌｅｎｔ）が好ましい。突然変異誘発プライマーの配列設計は、キットの指示に従って実施した。ＰＣＲシステムは、１０μｌの５ｘ緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μｌのプラスミドＤＮＡ鋳型（５０ｎｇ／μｌ）、それぞれ０．７５μｌ（１０μＭ）の上流および下流プライマー、０．５μｌの高忠実度酵素、および３６μｌのｄｄＨ２Ｏから構成され、ＰＣＲプライマーは、突然変異位置にＮＮＫコドンを有する。
【０１４２】
ＰＣＲ増幅ステップ：（１）９８℃、前変性３分、（２）９８℃、変性１０秒、（３）７２℃で３分間のアニーリングおよび伸長（ステップ（２）〜（３）を２５回繰り返す）、（５）７２℃で１０分間伸長、（６）４℃まで冷却。２μｌのＤｐｎＩをＰＣＲ産物に添加し、３７℃で一晩消化することによりプラスミド鋳型を消失させた。消化されたＰＣＲ産物は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、クロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレートに播種して、部位飽和突然変異誘発ライブラリーを得た。
実施例５：アルドラーゼ突然変異体ライブラリーのハイスループットスクリーニング
【０１４３】
突然変異体コロニーをＬＢ寒天プレートから採取し、浅い９６ウェルプレートで２００μｌのＬＢ培地（クロラムフェニコールを含む）に播種し、３０℃で一晩培養した。上記の培養液２０μｌを使用して、深ウェルプレートにＴＢ培地（クロラムフェニコールを含む）４００μｌを播種した。深ウェル培養液のＯＤ６００が、０．６〜０．８に達したら、最終濃度１ｍＭで発現を誘導するためにＩＰＴＧを添加し、３０℃で一晩発現させた。一晩の発現の終了後、培養液を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、細胞ペレットを得て、それに細胞溶解用試薬（１ｇ／Ｌリゾチーム、０．５ｇ／Ｌ  ＰＭＢＳ）２００μｌを加えて、細胞を破壊した。次いで、細胞溶解物を１０分間４０００ＲＰＭで遠心分離し、その後６０μｌ／ウェルの上清を、実施例３に記載した反応物を含む深ウェルプレートに移した。反応物を３０〜５０℃で所望の時間振盪し、最後に５０％アセトニトリルでクエンチさせた。分析のためにサンプルを採取した。
実施例６：操作されたアルドラーゼの発現のための発酵プロセス
【０１４４】
標的アルドラーゼ遺伝子を担持するプラスミドを含む大腸菌の単一微生物コロニーを、３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含む５０ｍＬ  ＬＢブロス（５．０ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌトリプトン、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に播種した。細胞は、３０℃の振盪装置で、２５０ｒｐｍで振盪しながら、一晩（少なくとも１６時間）インキュベートした。培養液のＯＤ６００が１．６〜２．２に達したとき、培養液を使用して発酵槽に培地を播種した。
【０１４５】
２．０Ｌの成長培地を含む５Ｌの発酵槽を１２１℃のオートクレーブで３０分間滅菌した。上記の培養液は、発酵槽に播種した。発酵槽の温度を３７℃に維持した。発酵槽内の成長培地を２００〜８００ｒｐｍで撹拌し、２〜８Ｌ／分で発酵容器に空気を供給して、溶存酸素レベルを３０％飽和以上に維持した。培養液は、２５〜２８％ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加によりｐＨ７．０に維持した。細胞の成長は、５００ｇ／Ｌのブドウ糖グルコース一水和物、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含むフィード溶液を供給することにより、維持した。培養液のＯＤ６００が２５±５に達した後、発酵槽の温度を低下させて、３０℃で維持し、最終濃度１ｍＭまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、アルドラーゼポリペプチドの発現を誘導した。その後、発酵プロセスを、さらに１８時間継続させた。発酵プロセス完了後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心分離機を使用して、８０００ｒｐｍ、４℃で、１０分間、細胞を収穫した。収穫した細胞は、下流回収プロセスにおいて直接使用するか、−２０℃で凍結保存した。
【０１４６】
６ｇの細胞ペレットを、２５０μＭピリドキサール５’−リン酸塩（ＰＬＰ）を含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液３０ｍＭ（ｐＨ７．５、４℃）に再懸濁した。次いで、ホモジナイザーを使用して、細胞を細胞溶解物に均質化した。細胞溶解物は、４℃、８０００ｒｐｍで、１０分間、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心分離機を使用して清澄化した。清澄化した上清を浅い容器に分注し、−２０℃で凍結させ、凍結乾燥させて酵素粉末とした。アルドラーゼ酵素粉末は、−２０℃で凍結保存した。
実施例７：アルドラーゼポリペプチドにより触媒されるアルデヒドおよびアミノ酸からの（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸の不斉合成
【０１４７】
一例として、総容量１．０Ｌを取り、次のものを反応容器に添加した：グリシン１７８ｇ、ｐ−ニトロベンズアルデヒド３０ｇ、２５％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液９４２ｍＬ、配列番号６の酵素粉末４ｇ、ＰＬＰストック溶液５ｍＬ（１０ｍＭ）。反応温度は３０℃に設定し、撹拌速度は、４００ｒｐｍであった。８時間の反応後、基質の総変換率が２０％以上、生成物Ａ２のｄｅが９５％以上であった。反応物のろ過により上清を得て、上清を濃縮して、固体粗生成物を沈殿させた。粗固体を２５℃で撹拌することにより３０分間純水３００ｍＬで洗浄した。ろ過を適用し、ろ過ケークを真空乾燥させて、純粋な生成物（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸（化学純度９９．５％、ｄｅ≧９９％）を得た。
実施例８：（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸からのＤ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールの調製
【０１４８】
無水メタノール１０００ｍＬは、氷浴を伴う反応容器に加え、１時間撹拌した。反応容器の温度を５℃に維持し、１時間以内に塩化チオニル１２８ｍＬを反応容器にゆっくり滴下した。塩化チオニルの添加が完了した後、反応混合物を１時間氷浴中で撹拌した。次に、（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−（４−ニトロフェニル）プロパン酸１００ｇを反応物に加えた後、反応温度を２５℃まで上げ、３時間撹拌した。次に、反応温度をゆっくりと６５℃まで上昇させた（還流）。還流反応を約２４時間実施した。エーテル化の完了後、いずれの液体も流出しなくなるまで、４０℃で減圧することにより、ＳＯ２、ＨＣｌ、およびメタノールを除去した。次に、反応物を冷却するために１０００ｍＬの氷水を添加した。同時に、ＫＯＨ溶液を滴下して反応物のｐＨを約８．０に調整し、反応物を１時間撹拌した。最後に、反応物をろ過し、ろ過ケークを水で洗浄した。エステル生成物であるろ過ケークを乾燥させた後、８０ｇの白色固体物質を得た。
【０１４９】
エステル生成物を還元することによりＤ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールを得るために、ＴＨＦ１２００ｍＬ、エステル生成物７５ｇを反応容器に加え、３０分間撹拌した。次いで、ＮａＢＨ４１２ｇをゆっくりと反応物に加え、１時間の撹拌後、加熱還流（５０〜５５℃）させた。続いて、メタノール１６０ｍＬを３０分以内にゆっくりと反応物に滴下し、その後３時間撹拌して反応を終了させた。濃塩酸を使用して、終了した反応物のｐＨを２以下に調整し、一晩撹拌した。反応物をろ過し、ろ液からＴＨＦおよびメタノールを減圧除去した。次いで、５００ｍＬの純水をろ液に添加して、ＫＯＨを添加して、ｐＨ１０以上に調整した。ろ液を４℃に維持して、結晶化が生じるようにした。結晶化した物質をろ過により回収し、ろ過ケークを乾燥させて約５５ｇのＤ−（−）−スレオ−２−アミノ−１−（４−ニトロフェニル）−１，３−プロパンジオールを得た。
実施例９アルドラーゼポリペプチドにより触媒される（２Ｓ，３Ｒ）−３−［ｐ−（メチルスルホニル）フェニル］−３−ヒドロキシ−２−アミノ−プロパン酸の不斉合成
【化６７】
2020521509.tif 000074
【０１５０】
一例として、総容量１．０Ｌを取り、次のものを反応容器に添加した：１７８ｇのグリシン、４０ｇのｐ−メチルスルホニルベンズアルデヒド、９５８ｍＬの４０％（ｖ／ｖ）エタノール水溶液、４ｇの配列番号１８の酵素粉末、５ｍＬのＰＬＰストック溶液（１０ｍＭ）。反応温度は３０℃に設定し、撹拌速度は、４００ｒｐｍであった。６時間反応させた後、ｐ−メチルスルホニルベンズアルデヒドの変換率は、４０％以上であった。生成物（２Ｓ，３Ｒ）−３−［ｐ−（メチルスルホニル）フェニル］−ヒドロキシ−２−アミノ−プロパン酸のｄｅは、９０％以上であった。
実施例１０アルドラーゼポリペプチドにより触媒される（２Ｓ，３Ｒ）−２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシベンゼン）−３−ヒドロキシプロパン酸の不斉合成
【化６８】
2020521509.tif 000075
【０１５１】
例えば、反応物総容量１．０Ｌを取り、次のものを反応容器に添加した：グリシン５５ｇ、３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒド１０ｇ、脱イオン水９６０ｍＬ、配列番号４４の酵素粉末１０ｇ、ＰＬＰストック溶液５ｍＬ（１０ｍＭ）。反応温度を３０℃に設定し、撹拌速度は４００ｒｐｍであった。２時間反応させた後、基質３，４−ジヒドロキシベンズアルデヒドの総変換率は、４０％以上であった。
【０１５２】
本発明の上記内容を読了後、当業者は、本発明に様々な修正または変更を加え得ることを理解されたい。これらの同等の形態も、本発明の添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【配列表】
2020521509000001.app
【国際調査報告】
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2020521509.tif 000086
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