(57)【要約】本発明は、好気性細菌の電子伝達系においてプロトンポンプとして作用するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体のうち、電子１個あたり排出できるプロトン分子数がゼロであるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体を構成するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られる微生物および該微生物を用いることを特徴とする工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られる微生物を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
【請求項２】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項３】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アゾトバクター・ビネランディー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項４】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項５】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項６】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項７】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡにコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の製造法。
【請求項８】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項９】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１０】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１１】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１２】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・フラバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびコリネバクテリウム・エフィカシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃａｓｉｓ）に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１３】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、請求の範囲第１〜７項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１４】
アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、請求の範囲第１〜１３項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１５】
アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンおよびＬ−リジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、請求の範囲第１〜１３項いずれか１項に記載の製造法。
【請求項１６】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウム属に属する微生物。
【請求項１７】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物。
【請求項１８】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アゾトバクター属、サルモネラ属およびラクトバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求の範囲１６または１７記載の微生物。
【請求項１９】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジフテリア、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・フルオレッセンス、アゾトバクター・ビネランディー、サルモネラ・ティフィムリウムおよびラクトバチルス・プランタラムに属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求の範囲第１６または１７項記載の微生物。
【請求項２０】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、請求の範囲第１６または１７項記載の微生物。
【請求項２１】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、請求の範囲第１６または１７項記載の微生物。
【請求項２２】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドである、請求の範囲第１６または１７項記載の微生物。
【請求項２３】
エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする請求の範囲第１６または１７項記載の微生物。
【請求項２４】
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ、またはコリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ。
【請求項２５】
エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＢＲＭ  ＢＰ−０８６３３）。
【請求項２６】
エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、アミノ酸の製造法に関する。
【背景技術】  近年、微生物の電子伝達系に変異を施し、アミノ酸等の物質の生産性を向上させる試みが報告されている。
例えば、エシェリヒア・コリのエネルギー産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを増幅させるか、またはエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを欠損させることでアミノ酸の生産性が向上することが報告されている（特開２００２−１７３６３号）。
また、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において、エネルギー生成効率の高いチトクロムｂｃオキシダーゼをコードするＤＮＡを増幅することによってリボフラビンの生産性が向上することが報告されている（ＷＯ０３／０７２７８５号）。
電子伝達系における変異が微生物の生育に及ぼす影響について、Ｍｏｌｅｎａａｒらはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを破壊したが、生育等への影響はなかったことを報告している〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８２，ｐ．６８８４−６８９１（２０００）〕。
このように微生物の電子伝達系における変異が、該微生物による物質の生産性に影響を及ぼす可能性のあることが知られているが、どのように影響するかを予測することは難しい。
従来の方法に加えてさらに物質の生産性を向上させる方法の開発が望まれている。
【発明の開示】
本発明の目的は、工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２６）に関する。
（１）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られる微生物を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物よりアミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸の製造法。
（２）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属およびラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであることを特徴とする、上記（１）の製造法。
（３）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アゾトバクター・ビネランディー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであることを特徴とする、上記（１）の製造法。
（４）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、上記（１）の製造法。
（５）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、上記（１）の製造法。
（６）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記（１）の製造法。
（７）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡにコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記（１）の製造法。
（８）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属およびバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（９）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア属に属する微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（１０）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、エシェリヒア・コリに属する微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（１１）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム属に属する微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（１２）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・フラバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ）、コリネバクテリウム・ラクトファーメンタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）およびコリネバクテリウム・エフィカシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃａｓｉｓ）に属する微生物からなる群より選ばれる微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（１３）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入する微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物である、上記（１）〜（７）いずれか１つの製造法。
（１４）  アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−ヒスチジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（１）〜（１３）いずれか１つの製造法。
（１５）  アミノ酸が、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミンおよびＬ−リジンからなる群より選ばれるアミノ酸である、上記（１）〜（１３）いずれか１つの製造法。
（１６）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウムに属する微生物。
（１７）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡを導入して得られるコリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物。
（１８）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム属、エシェリヒア属、シュードモナス属、アゾトバクター属、サルモネラ属およびラクトバチルス属に属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、上記（１６）または（１７）の微生物。
（１９）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジフテリア、エシェリヒア・コリ、シュードモナス・フルオレッセンス、アゾトバクター・ビネランディー、サルモネラ・ティフィムリウムおよびラクトバチルス・プランタラムに属する微生物からなる群より選ばれる微生物由来のＤＮＡ、または該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、上記（１６）または（１７）の微生物。
（２０）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５で表される塩基配列からなる群より選ばれる塩基配列を有するＤＮＡ、または該塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡである、上記（１６）または（１７）の微生物。
（２１）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡまたは該ＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである、上記（１６）または（１７）の微生物。
（２２）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６で表されるアミノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドである、上記（１６）または（１７）の微生物。
（２３）  エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼが、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈの有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡによりコードされるポリペプチド、または該ポリペプチドの有するアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドであることを特徴とする上記（１６）または（１７）の微生物。
（２４）  コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ、またはコリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ。
（２５）  エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）。
（２６）  エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明に用いられるエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（以下、ＮＤＨポリペプチドともいう）は、好気性細菌の電子伝達系においてプロトンポンプとして作用するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体のうち、電子１個あたり排出できるプロトン分子数がゼロであるＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体を構成するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性（以下、エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性と略す）を有するポリペプチドであれば、いずれのポリペプチドであってもよい。
ＮＤＨポリペプチドとしては、例えば、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物等に由来する公知のＮＤＨポリペプチドをあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）に属する微生物等をあげることができる。
エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に属する微生物等をあげることができる。
シュードモナス属に属する微生物としては、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）に属する微生物等をあげることができる。
アゾトバクター属に属する微生物としては、アゾトバクター・ビネランディー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）に属する微生物をあげることができる。
サルモネラ属に属する微生物としては、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）に属する微生物をあげることができる。
ラクトバチルス属に属する微生物としては、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に属する微生物をあげることができる。
これらの微生物に由来するＮＤＨポリペプチドとしては、例えば、コリネバクテリウム属に属する微生物に由来する配列番号４または６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、エシェリヒア属に属する微生物に由来する配列番号８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、シュードモナス属に属する微生物に由来する配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、アゾトバクター属に属する微生物に由来する配列番号１２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、サルモネラ属に属する微生物に由来する配列番号１４で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、ラクトバチルス属に属する微生物に由来する配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド等の公知のＮＤＨポリペプチドをあげることができる。
また、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈが有する、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ（ｎｄｈ）によりコードされるポリペプチド（以下、ＮＤＨポリペプチドＡと略す）もＮＤＨポリペプチドとしてあげることができる。
さらに、本発明に用いられるＮＤＨポリペプチドは、エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有していれば、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドの有するアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよい。
ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドの有するアミノ酸配列に１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより、取得することができる。
欠失、置換若しくは付加されるアミノ酸の数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異法等の周知の方法により欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、１個から数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドの有するアミノ酸配列において１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたとは、同一配列中の任意かつ１もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、１または複数のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加があることを意味し、欠失、置換若しくは付加が同時に生じてもよい。
置換若しくは付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。
天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどがあげられる。
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
また、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドに１以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有するポリペプチドがエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するためには、欠失、置換若しくは付加前のポリペプチドと、少なくとも６０％以上、通常は８０％以上、特に９５％以上の相同性を有していることが好ましい。
アミノ酸配列や塩基配列の相同性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。
ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．）。
ＮＤＨポリペプチドのエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼの活性は、たとえばＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０４，２７１（２００１）の記載に準じて、エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、ユビキノン−１およびＮＡＤＨを含有する反応液における２７５ｎｍまたは３４０ｎｍでの吸光度の減少を測定することにより測定することができる。
ＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、エネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであれば、いずれのＤＮＡであってもよい。
ＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、ＮＤＨポリペプチドＡをコードする、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈが有するコリネバクテリウム・グルタミカム由来のＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ、配列番号４、６、８、１０、１２、１４および１６で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをそれぞれコードする、配列番号３、５、７、９、１１、１３および１５で表される塩基配列を有するＤＮＡ等の公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡ等をあげることができる。
本発明に用いられるＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡであってもよい。
ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡの一部、または全部をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。
具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ｌの塩化ナトリウム存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等に記載されている方法に準じて行うことができる。
ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとしては、上記ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡ等を用いて計算したときに、ＮＤＨポリペプチドＡまたは公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と７５％以上の相同性を有するＤＮＡ、好ましくは８０％以上の相同性を有するＤＮＡ、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するＤＮＡをあげることができる。
ＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡは、好気性細菌であって、電子伝達系にエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを有する微生物から下記の方法に準じて調製することができる。電子伝達系にエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを有する微生物としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）等のコリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物等のいわゆるコリネ型細菌、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等のシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物、アゾトバクター・ビネランディー（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉ）等のアゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属に属する微生物、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）等のラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物等をあげることができる。
上記微生物を公知の方法〔例えば、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０，８３３（１９９６）に記載の方法〕により培養し、培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製する。
公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列をもとに合成したＤＮＡをプライマーとして用い、単離精製された上記微生物の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕を用いて目的とするＤＮＡを取得することができる。
プライマーとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列を有する、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物のｎｄｈの塩基配列をもとに設計した配列番号１および２で表される塩基配列を有するＤＮＡをあげることができる。
また、以下の方法によっても、目的とするＤＮＡを取得することができる。
単離精製した染色体ＤＮＡを用いて、モレキュラー・クローニング第３版やカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）等に記載された方法に準じてＤＮＡライブラリーを作製する。
ＤＮＡライブラリーを作製するためのクローニングベクターとしては、エシェリヒア・コリＫ１２株中で自立複製できるものであれば、ファージベクター、プラスミドベクター等いずれでも使用できる。具体的には、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８（１９９２）〕、λｚａｐ  ＩＩ（ストラタジーン社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１〔ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，１，４９（１９８５）〕、λ  ＴｒｉｐｌＥｘ（クローンテック社製）、λＥｘＣｅｌｌ（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）〔ストラタジーン社製、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４（１９８９）〕、ｐＵＣ１８〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕等をあげることができる。
ＤＮＡを組み込んだベクターをエシェリヒア・コリに属する微生物に導入する。
エシェリヒア・コリに属する微生物としては、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができる。具体的には、エシェリヒア・コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’〔ストラタジーン社製、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，８１（１９９２）〕、エシェリヒア・コリＣ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３９，４４０（１９５４））、エシェリヒア・コリＹ１０８８〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、エシェリヒア・コリＹ１０９０〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８（１９８３）〕、エシェリヒア・コリＮＭ５２２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，１（１９８３））、エシェリヒア・コリＫ８０２〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６，１１８（１９６６）〕、エシェリヒア・コリＪＭ１０９〔Ｇｅｎｅ，３８，２７５（１９８５）〕、エシェリヒア・コリＤＨ５α〔Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５７（１９８３）〕等をあげることができる。
モレキュラー・クローニング第３版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  １：Ｃｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９９５）等の実験書に記載されているコロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンハイブリダイゼーション法等により、得られたＤＮＡライブラリーから目的とするクローンを取得することができる。
ハイブリダイゼーションに用いるＤＮＡプローブとしては、公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列を有するＤＮＡまたはその一部、公知のＮＤＨポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列をもとに合成したＤＮＡなどの他、公知の塩基配列を利用して設計したＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲなどにより取得したＤＮＡ断片などをあげることができる。
例えば、配列番号３で表される塩基配列を有する、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物のｎｄｈの塩基配列をもとに設計した配列番号１および２で表される塩基配列を有するＤＮＡを、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成し、該合成ＤＮＡをプライマーとして、コリネバクテリウム・グルタミカムに属する微生物から取得したＤＮＡ断片などを例示することができる。
取得したＤＮＡをそのまま、あるいは適当な制限酵素などで切断後、常法によりベクターに組み込み、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばＡＢＩ３７７ＤＮＡシークエンサー（パーキン・エルマー社製）等を用いたジデオキシ法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７）〕により、該ＤＮＡの塩基配列を決定する。
さらに、決定された塩基配列に基づいたプライマーを調製し、単離精製された染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法〔ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）〕により、目的とするＤＮＡを取得することができる。
また、決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製８９０５型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することにより目的とするＤＮＡを調製することもできる。
上記のようにして取得される本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡとして、例えば、エシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈが有するエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡをあげることができる。該ＤＮＡは、ＮＤＨポリペプチドＡをコードするＤＮＡである。
得られた本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを宿主微生物に導入することにより、本発明のアミノ酸の製造法に用いられる微生物を作製することができる。
本発明に用いられるポリペプチドコードするＤＮＡを宿主微生物に導入する方法としては、該ＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入して組換え体ＤＮＡを作製し、該組換え体ＤＮＡを宿主微生物に導入する方法をあげることができる。
宿主微生物は、好気性細菌であれば特に限定されない。また、該微生物の電子伝達系は、特にエネルギー非産生型ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼを用いるものでなくてもよい。
宿主微生物としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アースロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クラビバクター（Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ）属、クルトバクテリウム（Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ピメロバクター（Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）属、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）属、クロマチウム（Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ）属、ロドバクター（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ）属、ロドシュードモナス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ロドスピリウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ザイモモナス（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）属等に属する微生物があげられる。
エシェリヒア属に属する微生物としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＤＨ５α、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＰ３４７、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＮＭ５２２等のエシェリヒア・コリに属する微生物をあげることができる。
コリネバクテリウム属に属する微生物としては、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ６８７２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ  ＡＴＣＣ２１１７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０等のＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍに属する微生物等をあげることができる。
ブレビバクテリウム属に属する微生物としては、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍに属する微生物等をあげることができる。
アースロバクター属に属する微生物としては、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓに属する微生物等をあげることができる。
オーレオバクテリウム属に属する微生物としては、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍｓａｐｅｒｄａｅ、Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔａｃｅｕｍに属する微生物等をあげることができる。
セルロモナス属に属する微生物としては、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ、Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｃａｒｔａに属する微生物等をあげることができる。
クラビバクター属に属する微生物としては、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒ ｍｉｃｈｉｇａｎｅｎｓｉｓ、Ｃｌａｖｉｂａｃｔｅｒｒａｔｈａｙｉに属する微生物等をあげることができる。
クルトバクテリウム属に属する微生物としては、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｌｂｉｄｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍｃｉｔｒｅｕｍ、Ｃｕｒｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｕｔｅｕｍに属する微生物等をあげることができる。
ミクロバクテリウム属に属する微生物としては、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４等のＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌａｃｔｉｃｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｐｅｒｉａｌｅに属する微生物等をあげることができる。
ピメロバクター属に属する微生物としては、Ｐｉｍｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｉｍｐｌｅｘに属する微生物等をあげることができる。
エンテロバクター属に属する微生物としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ  ＡＴＣＣ１２２８等のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｍｎｉｇｅｎｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｂｕｒｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｓｓｏｌｖｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｇｅｒｇｏｖｉａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｈｏｒｍａｅｃｈｅｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｎｉｍｉｐｒｅｓｓｕｒａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓａｋａｚａｋｉｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔａｙｌｏｒａｅに属する微生物等をあげることができる。
クレブシエラ属に属する微生物としては、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｌａｎｔｉｃｏｌａに属する微生物等をあげることができる。
セラチア属に属する微生物としては、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｒｕｂｉｄａｅａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓに属する微生物等をあげることができる。
エルビニア属に属する微生物としては、例えば、Ｅｒｗｉｎｉａ ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ａｎａｎａｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｔｅｒｒｅｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃａｃｔｉｃｉｄａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｍａｌｌｏｔｉｖｏｒａ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｅｒｓｉｃｉｎｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｐｓｉｄｉｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｑｕｅｒｃｉｎａ Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｕｂｒｉｆａｃｉｅｎｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ ｓａｌｉｃｉｓに属する微生物等をあげることができる。
バチルス属に属する微生物としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓに属する微生物等をあげることができる。
シュードモナス属に属する微生物としては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに属する微生物等をあげることができる。
アグロバクテリウム属に属する微生物としては、例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｂｉに属する微生物等をあげることができる。
アナベナ属に属する微生物としては、例えば、Ａｎａｂａｅｎａ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ ｄｏｌｉｏｌｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｆｌｏｓａｑｕａｅに属する微生物等をあげることができる。
クロマチウム属に属する微生物としては、例えば、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｂｕｄｅｒｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｔｅｐｉｄｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｗａｒｍｉｎｇｉｉ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｆｌｕｖｉａｔｉｌｅに属する微生物等をあげることができる。
ロドバクター属に属する微生物としては、例えば、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓに属する微生物等をあげることができる。
ロドシュードモナス属に属する微生物としては、例えば、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｂｌａｓｔｉｃａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｒｉｎａ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓに属する微生物等をあげることができる。
ロドスピリウム属に属する微生物としては、例えば、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓａｌｉｎａｒｕｍに属する微生物等をあげることができる。
ストレプトマイセス属に属する微生物としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖｏｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒａｍｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｔａｎａｓｈｉｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓに属する微生物等をあげることができる。
ザイモモナス属に属する微生物としては、例えば、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓに属する微生物等をあげることができる。
上記宿主微生物のうち、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、アースロバクター属、オーレオバクテリウム属、セルロモナス属、クラビバクター属、クルトバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、ピメロバクター属、エシェリヒア属、またはバチルス属に属する微生物が好ましく用いられ、コリネバクテリウムまたはエシェリヒア属に属する微生物がより好ましく用いられ、コリネバクテリウム属に属する微生物がさらに好ましく用いられる。
宿主微生物への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、上記宿主微生物へＤＮＡを導入できる方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３−２４８３９４）、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）〕等をあげることができる。
発現ベクターとしては、宿主微生物において自立複製可能ないしは染色体中への組込が可能で、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。
例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社製）、ｐＨｅｌｉｘ１（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ｐＫＫ２３３−２（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−８（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）より調製〕、ｐＴｒＳ３２〔エシェリヒア・コリＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）より調製〕、ｐＰＡＣ３１（ＷＯ９８／１２３４３）、ｐＵＣ１９〔Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）〕、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）、ｐＵＣ１１８（宝酒造社製）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＧ１（特開平６−２７７０８２）、ｐＣＳ２９９Ｐ（ＷＯ  ００／６３３８８）等があげられる。
プロモーターとしては、宿主微生物中で機能するものであればいかなるものでもよい。例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター等の、エシェリヒア・コリに属する微生物やファージ等に由来するプロモーター、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等をあげることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔ  Ｉプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等も用いることができる。
また、宿主微生物がコリネバクテリウム属に属する微生物である場合、Ｐ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］もあげられる。バチルス属に属する微生物である場合、ｘｙｌＡプロモーター〔Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３５，５９４−５９９（１９９１）〕もあげられる。
組換え体ＤＮＡは宿主微生物中で自立複製可能であると同時に、上記プロモーター、リボソーム結合配列、本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡ、転写終結配列より構成された組換え体ＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。
リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間は、適当な距離（例えば６〜１８塩基）を有していることが好ましい。
転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
このような組換え体ＤＮＡとしては、例えばエシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３）の保有するプラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈをあげることができる。
上記方法によって得られる本発明の微生物としては、例えば実施例に示されるコリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ、コリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈをあげることができる。
宿主微生物に導入された本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡは、微生物中で組換え体ＤＮＡ上に存在していてもよいし、染色体上に組み込まれていてもよい。
該ＤＮＡを染色体上に組み込む方法としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、１９９６年、２３２５頁、２３３９頁、アメリカン・ソサエティー・フォー・マイクロバイオロジー等に記載のファージやトランスポゾンを用いる方法をあげることができる。
本発明に用いられるポリペプチドをコードするＤＮＡを導入して得られる微生物（以下、本発明の微生物と略す）を培地に培養し、培養物中にアミノ酸を生成、蓄積させ、該培養物からアミノ酸を採取することにより、アミノ酸を製造することができる。
アミノ酸に特に限定はなく、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン等の２−オキソグルタル酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン等のオキサロ酢酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−トレオニン等のアスパラギン酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−アルギニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−シトルリン等のＬ−グルタミン酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン等のピルビン酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、グリシン等の３−ホスホグリセリン酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン等のコリスミ酸から生合成されるアミノ酸、Ｌ−ヒスチジン等があげられる。
培養に用いる培地としては、本発明の微生物が資化することのできる炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、該微生物が生育でき、かつ目的とするアミノ酸の生産が効率的に行なえる培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
炭素源としては、本発明の微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類等を用いることができる。
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、ならびにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕加水分解物、各種醗酵菌体、およびその消化物等を用いることができる。
無機塩としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。
培養は、通常、振とう培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行なう。培養温度は１５℃〜５０℃がよく、より好ましくは２０℃〜４５℃である。培養時間は通常５時間〜７日間、より好ましくは１２時間〜４日間である。培養中必要に応じてｐＨを３〜９に保持する。ｐＨの調整は、無機または有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行なう。
また培養中必要に応じて、ペニシリンやアンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡを用いてＤＮＡを導入した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡを用いてＤＮＡを導入した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた組換え体ＤＮＡを用いてＤＮＡを導入した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
培養終了後の培養液から、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の、通常アミノ酸の単離に用いられる方法を単独でまたは組み合わせて、アミノ酸を採取することができる。
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例１】（１）  コリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２株をＬＢ培地〔１０ｇ／Ｌバクトトリプトン（ディフコ社製）、５ｇ／Ｌイーストエキストラクト（ディフコ社製）および５ｇ／Ｌ塩化ナトリウムを含む培地〕に植菌し、３０℃で一晩培養した。培養後、Ｅｉｋｍａｎｎｓらの方法〔Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４０，１８１７（１９９４）〕に準じて、該微生物の染色体ＤＮＡを単離精製した。
配列番号３で表されるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のｎｄｈの塩基配列に基いて配列番号１および２で表される塩基配列を有するＤＮＡを合成した。
該ＤＮＡ（各０．５μｍｏｌ／Ｌ）をプライマーとし、上記染色体ＤＮＡ（０．１μｇ）を鋳型として、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン社製）２．５単位および各２００μｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ）を含む反応液４０μＬ中でＰＣＲを行なった。
反応終了後、得られた反応液のうち４μＬをアガロースゲル電気泳動に供し、公知のコリネバクテリウム・グルタミカムのｎｄｈに相当する１．９ｋｂの断片が増幅していることを確認した後、残りの反応液と等量のＴＥ〔１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸を含有する溶液〕飽和フェノール／クロロフォルム（１ｖｏｌ／１ｖｏｌ）溶液を混合した。該溶液を遠心分離して得られた上層に、２倍量の冷エタノールを加えて混合し、−８０℃で３０分間放置した。該溶液を遠心分離してＤＮＡを得、該ＤＮＡを２０μＬのＴＥに溶解した。
該ＤＮＡ溶解液５μＬとｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ社製）０．０６μｇをｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍのライゲーションキット（プロメガ社製）を用いて１６℃で１６時間反応させ、ｎｄｈを含むＤＮＡ断片とｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒを連結した。
連結反応後の反応液を用いてエシェリヒア・コリＤＨ５α株を、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７−６１４５（１９８８）〕によって形質転換した。
得られた形質転換体を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一晩培養した。該寒天培地上に生育したコロニーより常法により従ってプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析することにより、ｐＧＥＭＲ−Ｔ  Ｅａｓｙ  ｖｅｃｔｏｒにコリネバクテリウム・グルタミカムのｎｄｈを含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドであることを確認した。このプラスミドをｐＴ−ＣＧｎｄｈと命名した。
プラスミドｐＴ−ＣＧｎｄｈ  １μｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで切断し、得られたＤＮＡ断片を含む溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。
コリネ型細菌用の発現ベクターであるｐＣＳ２９９Ｐ（ＷＯ  ００／６３３８８）０．２μｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＳａｌＩで切断後、得られたＤＮＡ断片を含む溶液をアガロースゲル電気泳動に供し、約５．４ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。
上記で得られたｎｄｈを含む約２ｋｂのＤＮＡ断片とｐＣＳ２９９Ｐの切断断片（約５．４ｋｂ）をライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて、１６℃で１６時間反応させて連結した。
連結反応後の反応液を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２株を、エレクトロポレーション法〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７−６１４５（１９８８）〕を用いて形質転換した。
得られた形質転換体を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で一日間培養した。該寒天培地上に生育したコロニーより、常法によりプラスミドを抽出し、制限酵素を用いてその構造を解析して、該プラスミドが、ｐＣＳ２９９Ｐにｎｄｈを含むＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドであることを確認した。このプラスミドをｐＣＳ−ＣＧｎｄｈと命名した。
プラスミドｐＣＳ−ＣＧｎｄｈを含有するエシェリヒア・コリＤＨ５α／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈは、ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６３３として、平成１６年２月１９日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に寄託されている。
（２）  コリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２株およびコリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２株にｐＣＳ−ＣＧｎｄｈを導入したコリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株をそれぞれ、試験管中のＬＢ培地５ｍＬに植菌し、３０℃で一晩振とう培養した。
培養液１ｍＬを１００ｍＬのＭＧ培地〔１０ｇ／Ｌグルコース、３ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、３ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、２ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、２ｇ／Ｌ尿素、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・１０水和物、１ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・７水和物、３０ｍｇ／Ｌビオチン、１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩、２０ｍｇ／Ｌシステイン塩酸塩、０．５ｇ／Ｌカザミノ酸、および１ｍＬ／Ｌメタルミックス（９９０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・７水和物、８８０ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、３９３ｍｇ／Ｌ硫酸銅・５水和物、７２ｍｇ／Ｌ塩化マンガン・４水和物、８８ｍｇ／Ｌ四ホウ酸ナトリウム・１０水和物および３７ｍｇ／Ｌパラモリブデン酸アンモニウム・４水和物を含有する溶液）を含有する培地〕の入った５００ｍＬ容三角フラスコに添加し、３０℃で８０時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養後、培養上清のグルタミン酸濃度をＨＰＬＣにて定量した。
ＨＰＬＣ分析は、培養上清を４０℃でカラムＡＱ−３１２（ＹＭＣ社製）に供し（移動相：２．９４ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、１．４２ｇ／Ｌ硫酸ナトリウム、１７ｍＬ／Ｌ  ｎ−プロパノールおよび３ｇ／Ｌラウリル硫酸ナトリウムを含有するｐＨ２．４の溶液）、反応液（１８．５ｇ／Ｌホウ酸、１１ｇ／Ｌ  ＮａＯＨ、０．６ｇ／Ｌオルトフタルアルデヒド、２ｍｌ／Ｌメルカプトエタノールおよび３ｍＬ／Ｌ  Ｂｒｉｇｅ−３５を含有する溶液）と混合し、励起波長３４５ｎｍ、吸収波長４５５ｎｍの蛍光分析に供して行った。
その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２株が培養液中に１．５ｇ／Ｌのグルタミン酸を蓄積していたのに対し、コリネバクテリウム・グルタミカムＬＳ−２２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株は２．３ｇ／Ｌのグルタミン酸を蓄積していた。
【実施例２】  実施例１と同様に、エレクトロポレーション法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２株にｐＣＳ−ＣＧｎｄｈを導入し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２株およびコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株を、それぞれＧＳ培地〔７０ｇ／Ｌグルコース、１０ｇ／Ｌコーンスティープリカー、１０ｇ／Ｌ肉エキス、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、０．５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、１．５ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・１０水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・７水和物、０．８ｍｇ／Ｌ硫酸銅・５水和物、８．３ｇ／Ｌ尿素、５μｇ／Ｌビオチン、および１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩を含有し、ｐＨ７．２の培地〕５ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
この培養液２．５ｍＬを２５ｍＬのＧＰ培地〔１１６ｇ／Ｌグルコース、４ｇ／Ｌフラクトース、５０ｇ／Ｌ塩化アンモニウム、１０ｍｇ／Ｌニコチン酸、０．７ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．７ｇ／Ｌリン酸水素二カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・１０水和物、２０ｍｇ／Ｌ硫酸マンガン・７水和物、０．８ｍｇ／Ｌ硫酸銅・５水和物、５ｇ／Ｌ尿素、０．５μｇ／Ｌビオチン、１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩および５０ｇ／Ｌ炭酸カルシウムを含有し、ｐＨ７．２の培地〕の入った三角フラスコに添加し、３０℃で７２時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。
培養後、培養上清中のグルタミンの蓄積量を実施例１に記載したＨＰＬＣ条件で定量した。
その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２株のグルタミンの蓄積量は３２．２ｇ／Ｌであるのに対し、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４７５２／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株のグルタミンの蓄積量は３３．３ｇ／Ｌであった。
【実施例３】  実施例１と同様に、エレクトロポレーション法を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９株にｐＣＳ−ＣＧｎｄｈを導入し、コリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株を得た。
コリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９株およびコリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株を、それぞれ、ＬＳ培地〔５０ｇ／Ｌシュクロース、３０ｇ／Ｌコーンスティープリカー、２０ｇ／Ｌ肉エキス、２０ｇ／Ｌカザミノ酸、８ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、２ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、３ｇ／Ｌ尿素、２０ｇ／Ｌペプトン、１０ｍｇ／Ｌ硫酸鉄・１０水和物、１０ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛・７水和物、２０ｍｇ／Ｌニコチン酸、１０ｍｇ／Ｌパントテン酸カルシウム、０．１ｍｇ／Ｌビオチン、１ｍｇ／Ｌチアミン塩酸塩および１０ｇ／Ｌ炭酸カルシウムを含有し、ｐＨ７．２の培地〕５ｍＬの入った試験管に植菌し、３０℃で２４時間振とう培養した。
この培養液０．５ｍＬをＬＰ培地〔１００ｇ／Ｌ糖蜜（糖分として）、４５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、３ｇ／Ｌ尿素、０．５ｇ／Ｌリン酸二水素カリウム、０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．３ｍｇ／Ｌビオチンおよび３０ｇ／Ｌ炭酸カルシウムを含有し、ｐＨ７．０の培地〕５ｍＬの入った試験管に添加し、３０℃で７２時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養終了後、培養上清のリジン濃度をＨＰＬＣにて定量した。
ＨＰＬＣ分析は、培養上清を、４０℃でカラムＯＤＳ−８０ＴＳ（ＴＯＳＯＨ社製）に供し（移動相：２．９４ｇ／Ｌクエン酸ナトリウム、１．４２ｇ／Ｌ硫酸ナトリウム、３００ｍＬ／Ｌアセトニトリル、および３ｇ／Ｌラウリル硫酸ナトリウムを含有するｐＨ６．０の溶液）、反応液（１８．５ｇ／Ｌホウ酸、１１ｇ／Ｌ水酸化ナトリウム、０．６ｇ／Ｌオルトフタルアルデヒド、２ｍｌ／Ｌメルカプトエタノールおよび３ｍＬ／Ｌ  Ｂｒｉｇｅ−３５を含有する溶液）と混合し、励起波長３４５ｎｍ、吸収波長４５５ｎｍの蛍光分析に供して行った。
その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９株のリジンの蓄積量は２４．８ｇ／Ｌであったのに対し、コリネバクテリウム・グルタミカムＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６９／ｐＣＳ−ＣＧｎｄｈ株のリジンの蓄積竃は２８．６ｇ／Ｌであった。
【産業上の利用可能性】  本発明により、工業的に有利なアミノ酸の製造法を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】配列番号１−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
配列番号２−人工配列の説明：合成ＤＮＡ
【配列表】
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【国際調査報告】
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