(57)【要約】  本発明は、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する、生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属からの抽出物、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する、生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属からの抽出物を含む組成物、並びに炎症基盤を有する疾患もしくは状態の治療におけるおよび／または皮膚の疾患もしくは状態の治療におけるそのような組成物の使用であって、前記皮膚の疾患もしくは状態が微生物感染または侵入の結果でない組成物の使用に関する。【選択図】図１
2020521809.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属（Arthrospira）からの抽出物であって、抗炎症活性を有する抽出物。
【請求項２】
前記抗炎症活性が、IL-1αに対する阻害活性である、請求項１に記載の抽出物。
【請求項３】
新細胞の成長を刺激する能力を更に有する、請求項１または請求項２に記載の抽出物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項５】
対象において炎症性疾患を治療する方法であって、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項６】
対象において皮膚病変を治療する方法であって、前記皮膚病変が微生物感染または侵入の結果ではなく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項７】
対象において炎症性疾患および皮膚病変を治療する方法であって、前記皮膚病変が微生物感染または侵入の結果ではなく、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項８】
炎症性疾患を治療するための、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
微生物感染または侵入の結果でない皮膚病変を治療するための、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
炎症性疾患および、微生物感染または侵入の結果でない皮膚病変を治療するための、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物または請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物の使用。
【請求項１２】
微生物感染または侵入の結果でない皮膚病変を治療するための医薬の製造における、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の抽出物の使用。
【請求項１３】
炎症性疾患および、微生物感染または侵入の結果でない皮膚病変を治療するための医薬の製造における、治療有効量の請求項１〜３のいずれか一項に記載の生物抽出物の使用。
【請求項１４】
生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属の抽出物のスクリーニング方法であって、該抽出物のIL-1α阻害活性を評価することを含み、IL-1α阻害活性が抗炎症活性の指標である、スクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を含む組成物、炎症基盤を有する疾患もしくは状態の治療におけるおよび／または皮膚の疾患もしくは状態の治療におけるそのような組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−１受容体（IL-1R）は、炎症過程の重要なメディエーターであるサイトカイン受容体である。IL-1Rは２種類のサイトカイン、IL-1αとIL-1βにより活性化される。今日まで、２種のサイトカインのうちIL-1βは最も多く研究されており、従って最もよく解明されており、多数の薬物開発努力の焦点となっている。対比して、IL-1αはあまり良く理解されておらず、IL-1αの発現が病原体などの環境ストレスにより活性化され、炎症過程の活性化の原因であるインフラマソームに直接関連があることを提唱する研究が示された（Fettelschoss A他(2011) Inflammasome activation and IL-1 beta target IL-1 alpha for secretion as opposed to surface expression, PNAS 108(44): 18055-18060）。
【０００３】
IL-1αは、ニキビ（Tanghetti E (2013) The Role of Inflammation in the pathology of acne. Journal of Clinical Aesthetic Dermatology 6(9):27-35）、および抜け毛／脱毛症（Harmon CS & Nevins TD (1993) IL-1 alpha inhibits human hair follicle growth and hair fiber production in whole-organ cultures Lymphokine Cytokine Res 12(4):197-203）をはじめとする多様な状態において炎症の調節に関与することが知られている。IL-1αは、傷または皮膚の黒ずみ（Hirobe T & Ootaka H (2007) Interleukin-1α Stimulates the Differentiation of Melanocytes but Inhibits the Proliferation of Melanoblasts from Neonatal Mouse Epidermis.  Zoological Science, 24(10):959-970）、湿疹、乾癬、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫性皮膚疾患（Jensen LE (2010) Targeting the IL-1 family members in skin inflammation. Curr Opinion Investig Drugs 11(11):1211-1220）、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、アテローム硬化症（Tilg H他(2016) Interleukin-1 and Inflammasomes in Alcoholic Liver Disease/Acute Alcoholic Hepatitis and Nonalcoholic Fatty Liver Disease/Nonalcoholic Stearohepatitis. Hepatology 64(3): 955-965）、アテローム硬化症（Freigang, S. 他、Fatty acid-induced mitochondrial uncoupling elicits inflammasome-independent IL-1alpha and sterile vascular inflammation in atherosclerosis. Nat. Immunol. 14, 1045-1053 (2013)) および癌（Dinarello C. (2014). Interleukin-1α neutralisation in patients with cancer. The Lancet Oncology, 552-553）においても役割を果たす。例えば、アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネ（Propionibacterium acnes）はIL-1αの産生を刺激することが知られており、ニキビは高レベルのIL-1αを含み、そしてIL-1αは毛嚢脂腺の発生に関与していることが知られている（Tanghetti E (2013)）。ニキビの治療のための１つの選択肢としてIL-1αに対する抗体の開発が１つの現在進行中のアプローチである（Carrasco他、“An Open Label Phase 2 Study of MABp1 Monotherapy for the Treatment of Acne Vulgaris and Psychiatric Comorbidity”. J Drugs Dermatol. June 2015;14(6):560-564）。癌の治療に用いるためのIL-1αに対する抗体の開発も現在進行中である（Dinarello, C. (2014) Interleukin-1α neutralisation in patients with cancer. The Lancet Oncology, 552-553）。
【０００４】
IL-1αの活性を制御することで有益となりうる別の炎症状態としては、巻き爪などの肉芽腫を含む疾患が挙げられる。
【０００５】
国際公開第WO 2006/047830号として公開された本出願人の先行出願において、真菌および細菌感染または侵入の局所治療のための、生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属（Arthrospira）からの抽出物が開示された。本発明者らは、驚くべきことに、生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属からの抽出物を、細菌感染または侵入が存在しない疾患または状態を治療するのに利用できることを発見した。
【０００６】
特に、本発明者らは、生理的ストレスを受けたアルスロスピラからの抽出物が、IL-1α発現を調節する能力を持ち、従って炎症基盤を有する疾患または状態の治療に利用できることを発見した。
【０００７】
本明細書中のいずれの従来技術への言及も、オーストラリア国または他の任意の国における当該技術分野の一般的知識の一部を構成する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物に向けられる。本発明はまた、抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を含む組成物、並びに炎症基盤を有する疾患もしくは状態の治療におけるおよび／または皮膚の疾患もしくは状態の治療におけるそのような組成物の使用にも向けられる。
【０００９】
第一の態様では、本発明は、抗炎症活性を有する生物抽出物を提供する。
【００１０】
第二の態様では、本発明は、IL-1αに対する阻害活性を有する生物抽出物を提供する。
【００１１】
第三の態様では、本発明は、新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を提供する。
【００１２】
第四の態様では、本発明は、抗炎症活性および新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を提供する。
【００１３】
第五の態様では、本発明は、抗炎症活性を有する生物抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
第六の態様では、本発明は、IL-1αに対する阻害活性を有する生物抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
第七の態様では、本発明は、新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
第八の態様では、本発明は、抗炎症活性および新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
第九の態様では、本発明は、対象において炎症性疾患を治療する方法であって、第一、第二または第三の態様により提供される生物抽出物の治療有効量、または第五、第六または第七の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１８】
第十の態様では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない対象において炎症性疾患または皮膚病変を治療する方法であって、前記第一、第二または第三の態様により提供される生物抽出物の、または第五、第六または第七の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００１９】
第十一の態様では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない対象において炎症性疾患または皮膚病変を治療する方法であって、第四の態様により提供される生物抽出物の、または第八の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２０】
第十二の態様では、本発明は、炎症性疾患を治療するための、第一、第二または第三の態様により提供される生物抽出物の、または第五、第六または第七の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を提供する。
【００２１】
第十三の態様では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない皮膚病変を治療するための、第四の態様により提供される生物抽出物の、または第八の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を提供する。
【００２２】
第十四の態様では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない炎症性疾患および皮膚病変を治療するための、第四の態様により提供される生物抽出物の、または第八の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を提供する。
【００２３】
第十五の態様では、本発明は、炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、第一、第二または第三の態様により提供される生物抽出物の治療有効量の使用を提供する。
【００２４】
第十六の態様では、微生物感染または侵入が存在しない皮膚病変を治療するための医薬の製造における、第一、第二または第三の態様により提供される生物抽出物の治療有効量の使用を提供する。
【００２５】
第十七の態様では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない炎症性疾患および皮膚病変を治療するための医薬の製造における、第四の態様により提供される生物抽出物の治療有効量の使用を提供する。
【００２６】
第十八の態様では、本発明は、抗炎症活性について生物抽出物をスクリーニングする方法であって、前記生物抽出物のIL-1α阻害活性をアッセイすることを含み、IL-１α阻害活性が抗炎症活性の指標である方法を提供する。
【００２７】
本明細書全体を通して、文脈が他のものを要求しない限り、「含む」、「含んでいる」および「含むもの」という用語は、言及した整数または整数の群の包含を意味するものであり、その他の任意の整数または整数の群の排除を意味するものではない。
【００２８】
本明細書に記載の特徴は、本発明の範囲内において、いずれも任意の組み合わせで、本明細書に記載の他の１つ以上の特徴と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、生理的ストレスを受けたアルスロスピラ属（Arthrospira）を含む製品（AMYCOT（登録商標））に６時間暴露した後の人工ヒト皮膚のモデルからのIL-1α産生を示すグラフである。
【００３０】
【図２】図２は、生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））による人工ヒト皮膚モデルにおける界面活性剤誘導IL-1α生産の阻害を示すグラフである。
【００３１】
【図３】図３は、様々に異なる期間において18％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））で処置した後の、形質転換ヒトケラチン生成細胞（HaCaT細胞）における細胞増殖を示すグラフである。
【００３２】
【図４】図４は、様々に異なる期間において８％の生理学的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））で処置した後の、HaCaT細胞における細胞増殖を示すグラフである。
【００３３】
【図５】図５は、様々な期間の後の18％生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の様々に異なる濃度で処置したHaCaT細胞における細胞増殖を示すグラフである。
【００３４】
【図６】図６は、様々な期間において未処置の細胞に比較した、18％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の様々に異なる濃度で処置したHaCaT細胞における総タンパク含有量の増加率を示すグラフである。
【００３５】
【図７】図７は、様々な期間の後の８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の様々に異なる濃度で処置したHaCaT細胞と未処置の細胞における総タンパク含有量を示すグラフである。
【００３６】
【図８】図８は、様々な期間における未処置の細胞に比較した、８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の様々に異なる濃度で処置したHaCaT細胞における総タンパク含有量の増加率を示すグラフである。
【００３７】
【図９Ａ】図９Ａは、８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での処置前の肉芽腫の画像である。
【００３８】
【図９Ｂ】図９Ｂは、８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での処置後の図９Ａの肉芽腫の画像である。
【００３９】
【図１０Ａ】図10Ａは、12％の生的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での処置前のニキビを患っている対象の画像である。
【図１０Ｂ】図10Ｂは、12％の生的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での処置前のニキビを患っている対象の画像である。
【００４０】
【図１０Ｃ】図10Ｃは、12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品での局所処置の４週間後の、それぞれ図10Ａと10Ｂの対象の画像である。
【図１０Ｄ】図10Ｄは、12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品での局所処置の４週間後の、それぞれ図10Ａと10Ｂの対象の画像である。
【００４１】
【図１１】図11は、湿疹（汗疱）を患っている対象の右手の一連の画像である。画像は、処置前と、12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤で処置した１日目、３日目、５日目、７日目および10日目に撮影した。
【００４２】
【図１２Ａ】図12Ａは、12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での処置前の皮膚の傷の画像である。
【００４３】
【図１２Ｂ】図12Ｂは、12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤での毎日の処置の２週間後の図12Ａの皮膚の傷の画像である。［発明を実施するための形態］［実施態様の記載］略号
【００４４】
次の略号を全体を通して使用する：
DMEM＝ダルベッコ改良イーグル培地
FCS＝ウシ胎仔血清
HaCaT＝形質転換ヒトケラチン生成細胞
IL-1α＝インターロイキン−１α
IL-1β＝インターロイキン−１β
IL-1R＝インターロイキン−１受容体
MTT＝臭化３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウム
NASH＝非アルコール性脂肪肝炎
OD＝光学濃度
PBS＝リン酸塩緩衝生理食塩水
SLS＝ラウリル硫酸ナトリウム
【００４５】
本発明は、一部は、生物抽出物中の分子の組み合わせがIL-1αに対して阻害活性を有し、そのため炎症基盤を有する疾患または状態の治療に利用できるという発見に基づく。そのような抽出物は、NASH、皮膚病または皮膚疾患、たとえばニキビ（アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネスに起因するものでないニキビを含む）、瘢痕、傷、湿疹といった全身性の疾患または状態の処置において並びに加齢の影響の処置において利用することができる。更に、生物抽出物中の分子の組み合わせは、組織の再生をもたらす細胞増殖を刺激するので、炎症性疾患または状態を治療しかつ同時に組織の再生を刺激するのに利用することができる。この同時効果は、炎症性成分を有し、従って抗炎症活性から恩恵を受けるが、組織の再生から有利であるような成分も有する、ニキビ（アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネスに起因するものでないニキビを含む）、湿疹、脱毛症または抜け毛およびNASHのような状態を治療するために特に有利である。
【００４６】
従って、第一の態様では、本発明は、抗炎症活性を有する生物抽出物を提供する。
【００４７】
用語「生物抽出物」は、本明細書中では、対象から得られた試料を指すために用いられ、ここで前記対象は動物、植物、真菌または細菌である。生物抽出物は粗製抽出物、部分精製抽出物、実質的に精製されたまたは精製された抽出物であることができる。生物抽出物が粗製抽出物である場合、それは複数の活性成分を含みうるが、１つの活性成分が抗炎症活性および／または新細胞の成長を刺激する能力を有する成分である。
【００４８】
粗製抽出物から精製抽出物まで精製の各レベルが進むにつれ、抽出物中の活性成分の数は減少していく。活性成分はタンパク質、ペプチド、小有機分子および脂肪酸を含む群の１つ以上から選択することができる。好ましくは、精製された生物抽出物は、少なくとも２つの活性成分を含む。更により好ましくは、精製された生物抽出物は、抗炎症活性を有する活性成分と、新細胞の成長を刺激する能力を有する活性成分とを含み、よって組み合わせ効果を有する抽出物を提供する。
【００４９】
好ましくは、生物抽出物は植物、真菌または細菌から得られる。特に好ましい実施形態では、生物抽出物はアルスロスピラ属からの１つ以上のシアノバクテリアから得られる。すなわち、生物抽出物は、限定されないが、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）を含むアルスロスピラ属の任意の適当な種より得ることができる。あるいは、生物抽出物はアルスロスピラ属の種の混合物から得ることができる。
【００５０】
好ましい実施形態では、生物抽出物は生理的ストレスを受けたＡ．マキシマから調製される。
【００５１】
好ましくは、生理的ストレスを受けたＡ．マキシマ（A. maxima）の粗製抽出物が、少なくとも１つの精製段階を受けて部分的に精製された抽出物、実質的に精製された抽出物または精製された抽出物を提供する。この少なくとも１つの精製段階は、好ましくは、粗製抽出物のアミノ酸含有量に比較して、少なくともアラニンの相対アミノ酸含有量の増加をもたらす。好ましくは、アラニン含有量は少なくとも１つの精製段階の結果として３〜４モル％分増加される。更により好ましくは、アラニン、システイン、グルタミン酸／グルタミン、グリシン、アスパラギン酸／アスパラギン、プロリン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリンおよびフェニルアラニンから成る群より選択された１つ以上のアミノ酸の相対アミノ酸含有量が、精製の結果として増加される。それらのアミノ酸の各々の含有量は、好ましくは、少なくとも１つの精製段階の結果として0.2〜４モル％の範囲内の任意値だけ独立に増加される。
【００５２】
精製段階は、好ましくは、粗製抽出物のアミノ酸含有量と比較して、少なくともリジンとトリプトファンの相対アミノ酸含有量の減少をもたらす。好ましくは、少なくとも１つの精製段階の結果としてリシン含有量が２〜３モル％減少し、トリプトファン含有量も２〜３モル％減少する。更により好ましくは、リジン、トリプトファン、メチオニン、チロシンおよびヒスチジンから成る群より選択された１以上のアミノ酸の相対アミノ酸含有量が、精製の結果として減少する。それらのアミノ酸の各々の含有量は独立に、少なくとも１つの精製段階の結果として0.3〜３モル％の範囲内の任意の数値だけ減少する。
【００５３】
精製段階は好ましくは、抽出物の脂肪酸含有量に対して影響を与える。特に、粗製抽出物の脂肪酸含有量に比較した時、ある脂肪酸の割合が増加する一方で、別の脂肪酸の割合は減少するだろう。好ましくは、精製段階は、粗製抽出物中の脂肪酸の割合に比較した時、パルミチン酸、パルミトレイン酸およびステアリン酸から成る群より選択された１以上の脂肪酸の割合の増加をもたらす。あるいは、精製段階は、粗製抽出物中の脂肪酸の割合に比較した時、オレイン酸、リノレイン酸およびγリノレイン酸から成る群より選択された１つ以上の脂肪酸の割合の減少を引き起こし得る。
【００５４】
特に好ましい実施態様では、精製段階は、粗製抽出物中の脂肪酸の割合に比較した時、パルミチン酸、パルミトレイン酸およびステアリン酸から成る群より選択された１つ以上の脂肪酸の割合の増加と、粗製抽出物中の脂肪酸の割合に比較した時、オレイン酸、リノレイン酸およびγ−リノレイン酸の割合の減少を引き起こす。
【００５５】
特定の実施形態では、精製段階は、抽出物中のパルミチン酸の量の20〜50％増加、パルミトレイン酸の量の１〜２％増加およびステアリン酸の量の0.1〜１％増加をもたらす。
【００５６】
更なる特定の実施形態では、精製段階は付加的に抽出物中のγリノレイン酸の量の12〜16％減少、リノレイン酸の量の8〜12％減少、およびオレイン酸の量の１〜２％減少をもたらす。
【００５７】
用語「抗炎症活性」は、本明細書中ではIL-1αの作用から生じる炎症のような炎症を減少させる性質を指すために用いられる。例えば、抗炎症活性は、肉芽腫に関連した炎症の減少であることができる。あるいは、抗炎症活性は、ニキビ（プロピオニバクテリウム・アクネスに由来するものではないニキビを含む）、瘢痕および湿疹といった皮膚疾患または状態に関連した炎症の減少であることができる。更に代わるものとして、抗炎症活性はNASHに関連した炎症の減少であることができる。皮膚の加齢および脱毛症／抜け毛は、IL-1αの過剰生産に起因する状態でもあり、従って抗炎症活性はフリーラジカルの生成に関連した炎症および毛包に関連した炎症の減少を含むこともできる。
【００５８】
第二の観点では、本発明はIL-1αに対する阻害活性を有する生物抽出物を提供する。
【００５９】
本明細書中で用いる場合、用語「IL-1αに対する阻害活性」は、IL-1αの放出または産生を減少させることを意味する。IL-1αは炎症に役割を果たすので、IL-1αの放出または産生を減少させることは炎症の減少をもたらすだろう。
【００６０】
第三の観点では、本発明は新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を提供する。
【００６１】
本明細書中で用いる時、「新細胞の増殖を刺激する」という用語は、組織の再生をもたらす刺激を意味する。組織の再生をもたらす刺激は、ニキビ（アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネスに起因しないニキビを含む）のような皮膚の疾患または状態の処置に有利である。組織再生は抜け毛および／または脱毛症の処置にも有利である。組織再生から恩恵を受ける他の疾患または状態にはNASHが含まれる。特に、この用語は細胞の補充から恩恵を受ける疾患または状態の処置の場合に用いられる。
【００６２】
従って、新細胞は任意のタイプの哺乳類細胞であることができる。好ましくは、新細胞は皮膚細胞、毛包細胞および肝臓細胞から成る群より選択される。特に好ましい実施形態では、新細胞は皮膚細胞である。
【００６３】
第四の観点では、本発明は抗炎症活性および新細胞の成長を刺激する能力を有する生物抽出物を提供する。
【００６４】
好ましくは、抗炎症活性は、新細胞の増殖を刺激する能力と共同して機能する。例えば、ニキビ（アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネスに起因しないニキビを含む）および炎症成分を有しかつ細胞損傷も引き起こす湿疹（例えば瘢痕または線維症）などの皮膚疾患または状態は、抗炎症活性と新細胞の成長の刺激との組み合わせから恩恵を受けるだろう。
【００６５】
第五の観点では、本発明は、抗炎症活性を有する生物抽出物と、薬学的に許容される担体、溶媒、基剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
本明細書中で用いる場合の「医薬組成物」という表現は、医薬組成物と獣医学組成物を包含する。
【００６７】
医薬組成物中の生物抽出物の濃度は、適用によって異なることができる。例えば、医薬組成物中の生物抽出物の濃度は、約0.01％〜約100％の任意数値であることができる。好ましくは、医薬組成物中の生物抽出物の濃度は、約５％〜約20％である。医薬組成物中の生物抽出物の濃度は、約5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19または約20％であることができる。
【００６８】
医薬組成物は任意の適当な形態で投与することができる。例えば、医薬組成物は経口投与に適当な剤形であることができる。経口投与に適当な剤形としては、固体として、例えばカプセル剤、錠剤、ピル、粉剤、および粒剤を挙げることができる。経口投与に適当な剤形としては、液体として、例えば乳剤、マイクロエマルション、液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を挙げることができる。
【００６９】
別の実施形態では、医薬組成物は局所または経皮投与に適した剤形であることができる。局所または経皮投与に適当な剤形としては、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、粉剤、液剤、スプレー剤、吸入剤およびパッチ剤が挙げられる。
【００７０】
第九の観点では、本発明は、対象における炎症性疾患の治療方法であって、前記対象に第一、第二または第三の観点により提供される生物抽出物の、または第五、第六または第七の観点により提供される医薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む方法を提供する。
【００７１】
治療の対象はヒト、哺乳類または動物であることができる。好ましくは対象はヒトまたは別の種類の哺乳類である。
【００７２】
「治療有効量」は、炎症性疾患を治療するのに有効である量である。炎症性疾患は、炎症基盤を有する任意の疾患または状態であることができる。従って、炎症性疾患は、ニキビ（アクネ菌Propionibacterium acnesに起因しないニキビを含む）、湿疹といった皮膚の疾患または状態であることができる。あるいは、炎症性疾患は、巻き爪のような肉芽腫を伴う疾患または状態であることができる。更なる選択肢としては、炎症性疾患または状態はNASHであることができる。
【００７３】
投与のステップは、任意の適当な手段により実施することができる。好ましくは、生物抽出物の治療有効量は経口的にまたは局所的に投与される。
【００７４】
第十の観点では、本発明は、微生物感染または侵入が存在しない対象の皮膚病変を治療する方法であって、第一、第二または第三の観点により提供される生物抽出物の、または第五、第六または第七の態様により提供される医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与するステップを含む方法を提供する。
【００７５】
皮膚病変は、微生物感染または侵入が存在しない皮膚の任意疾患または状態であることができる。好ましくは、皮膚病変は炎症基盤を有する。例えば、皮膚病変はニキビ（アクネ菌プロピオニバクテリウム・アクネスに起因しないニキビ）、湿疹、色素沈着、傷、瘢痕、肉芽腫または老化であることができる。
【００７６】
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を説明する目的で提供されていることが理解されるだろう。従って、本発明は実施例に記載されるような特徴にのみ限定されると解釈すべきではないと理解されよう。
【実施例】
【００７７】
実施例１−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の抗炎症活性のインビトロ評価
総合的な三次元細胞培養モデルとして増殖させた、正常なヒト表皮ケラチン生成細胞を含む再構成人工ヒト皮膚モデル（Skinethic社、フランス国ニース）を、ヒト皮膚のインビトロ模倣物として使用した。このモデルは、分化した角質層の存在のため正常なバリヤー機能を示す。正常なヒト表皮ケラチン生成細胞をコラーゲンマトリックス上に播種し、無血清培地中で増殖させ、表面に分化した角質層を有する多層構造を形成させた。直径0.5 cm2を有する表皮ユニットを、培養16日目にSkinethic社から直接購入した。表皮層を多孔質膜上にのせてトランスウェルチャンバー中に置いた。試験すべき製品の未希釈の正副二通りのサンプル（10〜15 mg）を、0.5％SLSでの前処理（30分間）を伴ってまたは伴わずに、皮膚の上側角質化層に塗布した。5％CO2下で37℃で16時間後、サンプルを除去し、皮膚をPBSで２回洗浄した。次いでMTTアッセイを行い、細胞の生存を評価し、それによりサンプルの潜在的刺激力（irritation potential）を評価した。
【００７８】
試験した２つのサンプルは18％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラ（「Amycot 18％」）の皮膚薬用クリームと８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラ（「Amycot 8％」）の皮膚薬用ローションであった。
【００７９】
MTTアッセイの主要成分は臭化３−〔４，５−ジメチルチアゾール−２−イル〕−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（MTT）であり、これは溶液中で黄色を呈する。生存細胞のミトコンドリア・デヒドロゲナーゼは、このテトラゾリウム環を開裂し、水溶液に不溶である紫色の結晶の形成をもたらす。この結晶を酸性化イソプロパノール中に再溶解し、生じた紫色溶液を分光光度測定する。細胞数の増加または減少は、形成するホルマザンの量の同時変化をもたらし、これは試験物質により引き起こされる細胞毒性の程度を示す。
【００８０】
本アッセイでは、試験物質への細胞の暴露後、細胞をダルベッコのPBSで洗浄した。PBSの除去後、MTT-培地を各培養ウェルに添加し、細胞を37℃で４時間インキュベートした。インキュベーション後、MTT培地を除去し、各ウェルにMTT可溶化溶液（酸性化イソプロパノール）を加えた。培養プレートを旋回プレート振盪器上で20〜30分間振盪し、確実に全ての結晶が溶解して均一溶液を形成するようにした。各溶液の吸光度を、バックグラウンドを差し引いてマイクロプレートリーダー上で測定した。結果は表１に示され、式１に従って生存率の形で表した：
【００８１】
％生存率＝処置した培養物のOD×100／未処置の対照培養物のOD  （式１）
【００８２】
【表１】
2020521809.tif 000003
【００８３】
上記データは、SLS（0.5％）への16時間暴露後、細胞生存率に95％減少が見られることを示す。SLS処置をしない試験物質は、16時間で細胞死を示さない。従って、これらの結果は、サンプルが良好な皮膚生体適合性を有することを示し、従って、サンプルからの皮膚への細胞毒性および／または炎症効果が存在しないことを示す。
【００８４】
市販のELISA試験キットを使って、皮膚炎症の指標としてIL-1αの放出の阻害を測定した。サイトカインIL-1αを用いて作図した標準プロットは、抗体に基づいた比色反応による特異的な同定の後、一定の波長での吸光度を読むことにより、細胞培地中の力価測定を可能にする。このアッセイには、ウェルの下側の区画に、６時間目と16時間目に培地200μLを収集した。SLS（0.5％）の溶液をポジティブコントロールとして使用した。
【００８５】
結果を表２に示す。
【００８６】
【表２】
2020521809.tif 000004
【００８７】
サンプルへの６時間暴露後の結果は図１にも示される。
【００８８】
試験品によるSLS誘導IL-1α放出の阻害も試験した。その結果は表３に示される。
【００８９】
【表３】
2020521809.tif 000005
【００９０】
試験品での処置後６時間目のSLS誘導IL-1α放出の阻害を示す結果は、図２にも示される。
【００９１】
これらの結果は、Amycot 18％とAmycot 8％の両方とも、処置後６時間目にSLS誘導IL-1α放出を阻害することができることを示す。しかし、この効果は処置16時間目には消失していた。両製品とも未処置の細胞ではIL-1α放出にわずかな増加を引き起こすが、この増加は、0.5％SLSの炎症効果に起因するものよりもずっと小さい。
実施例２−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の細胞増殖とタンパク質合成に対する効果のインビトロ評価
【００９２】
培養ケラチン生成細胞を使った細胞生存アッセイを利用し、試験サンプルへの暴露後の細胞増殖を調べた。細胞生存アッセイにはMTTアッセイを用いた。加えて、試験サンプルの系列希釈液への暴露後に様々な時点で、Bradford試験を使ってケラチン生成細胞において全細胞タンパク含有量測定を行った。試験した２つのサンプルは、18％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラ（AMYCOT（登録商標））皮膚薬用クリームと、８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラ（AMYCOT（登録商標））皮膚薬用クリームであった。
【００９３】
成人ヒト皮膚からの確立細胞株（HaCaT）を使用した。細胞株は形質転換ヒトケラチン生成細胞から成り、十分な表皮分化能を有する。
【００９４】
HaCaT細胞を、ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）と10％ウシ胎仔血清（FCS）中で96ウェルプレートに24時間播種した（2,500細胞／ウェル）。次いで、５％FCSのみが補足された新鮮な培地を添加し、その培地に２つのサンプル、Amycot 18％とAmycot 8％のスカラー希釈液を溶解させた。未処置の細胞をネガティブコントロールとして使用した。各希釈には、正副二通りの試験を実施し、２回繰り返した。24時間、48時間および72時間後、細胞の生存をMTTアッセイを使って試験し、Bradfordアッセイを使って総タンパク含有量を試験した。
【００９５】
MTTアッセイについては、細胞が生存しているなら、細胞内のミトコンドリアデヒドロゲナーゼがMTTのテトラゾリウム環を開裂させ、水溶液に不溶である紫色結晶を生成しうる。この結晶を酸性化イソプロパノールに溶かし、生じた紫色溶液を分光光度測定した。サンプルへのHaCaT細胞の暴露後、細胞をダルベッコのPBSで洗浄した。各培養液にMTT培地を添加し、細胞を37℃でインキュベートした。インキュベーション後、MTT培地を除去し、細胞をMTT可溶化溶液で処理した。次いでプレートを旋回プレート振盪器上で振盪し、確実に全ての結晶が細胞から溶解して均一溶液を形成するようにした。マイクロプレートリーダー上でバックグラウンドを除去して（clearing）吸光度を測定した。Amycot 18％とAmycot 8％に関する結果をそれぞれ表４と表５に示し、下記の式１に従った生存率の形で表した。
【００９６】
【数１】
2020521809.tif 000006
【００９７】
【表４】
2020521809.tif 000007
【００９８】
このデータは、未処置の細胞に比較して0.001 mg/mLで24時間の暴露後に細胞増殖が増加することを示した。Amycot 18％への暴露後の細胞増殖結果は、図３にも描写される。
【００９９】
【表５】
2020521809.tif 000008
【０１００】
このデータは、未処置の細胞に比較した、様々な濃度での24時間および72時間暴露後に細胞増殖が増加することを示す。最高活性は、0.1 mg/mLの濃度で24時間後に観察される。Amycot 8％への暴露後の細胞増殖の結果は図４にも描写される。
【０１０１】
総タンパク含有量についてのBradfordアッセイは、Bio−Radタンパク質アッセイキットを使って実施した。細胞を0.1Ｎ NaOHで溶解し、次いでハンクス溶液で希釈し、特殊な色素でタンパク質を染色した。吸光度測定値は595 nmで読み、アルブミンを用いた滴定曲線に比較して、測定された光学濃度（OD）に基づいてタンパク力価を算出した。同じ細胞数についての総タンパク量をAmycot 18％の濃度に対してプロットし、そして図５に示すように、ネガティブコントロール（未処置細胞）と比較した。未処置の細胞に比較した増加率が図６に示される。
【０１０２】
Amycot 8％で処置した細胞についての対応するデータを図７と図８に示す。
【０１０３】
データは、48時間暴露後の0.1 mg/mLのAmycot 18％について、および24時間後の0.001 mg/mLのAmycot 18％についての、未処置細胞に比較したタンパク質合成の増加を示す。対照的に、Amycot 8％の使用は、特に0.001 mg/mLの濃度で、24時間、48時間および72時間暴露後にタンパク質合成の増加をもたらした。
【０１０４】
要約すれば、それらの結果は、Amycot 8％が24時間、48時間および72時間暴露後にケラチン生成細胞のような皮膚由来細胞の増殖を刺激するのに効果的であり、そしてAmycot 18％が24時間暴露後に細胞増殖を増加させることを示す。更に、Amycot 8％とAmycot 18％がタンパク含有量の増加をもたらす一方で、Amycot 8％の方がAmycot 18％よりもケラチン生成細胞におけるタンパク新合成を刺激するのにより効果的であり、最大効果は0.001 mg/mLの濃度で48時間暴露後に得られた。
実施例３−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT登録商標）の抗炎症効果
【０１０５】
８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT登録商標）の抗炎症活性を、巻き爪から生じた肉芽腫に対して試験した。対照は年齢16歳の女性であり、肉芽腫が激痛を引き起こしていた。図９Ａに、治療前の肉芽腫の画像が示される。肉芽腫を８％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤で処置した。初回処置の12時間以内に、対象は痛みが弱くなったことを報告した。処置24時間後の肉芽腫は図９Ｂに示される。
実施例４−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT登録商標）のニキビに対する効果
【０１０６】
12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品の効果を、ニキビを有する対象に対して試験した。図10Ａと図10Ｂに、ニキビを有する対象が示される。面皰（comedone）が顕著であり、発赤があり、炎症の存在を示す。12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤（AMYCOT登録商標）を各対象の患部に適用した。局所処置の４週間後の対象が図10Ｃと10Ｄに示される。面皰が目立たなくなり、赤みが引き、外用剤が抗炎症効果を有したことを示す。
実施例５−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の湿疹（汗疱性）に対する効果
【０１０７】
12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の効果を、湿疹（汗疱性湿疹）を有する対象に対して試験した。対象は年齢42歳の女性であり、湿疹は赤く、かゆみを伴い、８年間に渡り症状を呈していた。市販の湿疹治療は、湿疹をきれいにするのに効果がなかった。湿疹を12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤で処置した。図11には、処置前から処置後１日目、３日目、５日目、７日目および10日目の、対象の右手の一連の画像が示される。初回処置の24時間以内（１日目）に赤みがひき、10日目までに湿疹が消失し、このことは該外用剤が抗炎症効果を有したことを示す。
実施例６−生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOTU（登録商標））の皮膚の傷に対する効果
【０１０８】
12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む製品（AMYCOT（登録商標））の、対象の皮膚の傷に対する効果を試験した。対象は年齢55歳の女性であった。図12Ａに、処置前の皮膚の傷の画像が示される。12％の生理的ストレスを受けたアルスロスピラを含む外用剤を２週間に渡り皮膚の傷に毎日塗布した。毎日処置の２週間後の皮膚の傷の部分が図12Ｂに示される。皮膚の傷はもはや検知できず、微生物感染または侵入がなかったにもかかわらず、この外用剤が皮膚の傷に対して効果があったことを示す。
実施例７−加工処理したアルスロスピラ・マキシマ（AMYCOT（登録商標））のタンパク質分析
【０１０９】
加工処理したアルスロスピラ・マキシマ（AMYCOT（登録商標））をWO 2006/047830に記載された通りに調製した。AMYCOT（登録商標）の量は、出発のアルスロスピラ・マキシマの生物量の少なくとも80％に相当した。
【０１１０】
加工処理したアルスロスピラ・マキシマ（AMYCOT登録商標）を定量的アミノ酸分析にかけ、ここでシステイン分析とトリプトファン分析は別々に行った。未処理の原料アルスロスピラ・マキシマも、加工処理済アルスロスピラ・マキシマとの比較用に、定量的アミノ酸分析、システイン分析およびトリプトファン分析に供した。
【０１１１】
定量的アミノ酸分析には、加工処理済のものと原料のアルスロスピラ・マキシマのサンプルを、110℃で24時間の６Ｍ塩酸中での液体加水分解にかけた。システイン分析は、過ギ酸酸化に続いて110℃で24時間の酸加水分解を使って行った。トリプトファン分析は、110℃で24時間のアルカリ加水分解（hydroxide hydrolysis）を使って行った。
【０１１２】
加水分解後、アミノ酸含有量をAccQ−Tag化学（Waters Corporation）を使って分析した。サンプルは正副二通りで分析し、平均値として表した結果が表６〜９に示される。
【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
【表７】
2020521809.tif 000010
【０１１５】
【表８】
2020521809.tif 000011
【０１１６】
【表９】
2020521809.tif 000012
【０１１７】
比較参照の容易さのため、原料のアルスロスピラ・マキシマと加工処理済のアルスロスピラ・マキシマについてのモル％アミノ酸分析結果を表６〜９から抽出し、そして表10と11にまとめて記載した。
【０１１８】
【表１０】
2020521809.tif 000013
【０１１９】
【表１１】
2020521809.tif 000014
【０１２０】
このデータは、粗製原料のアルスロスピラ・マキシマの加工処理ステップが、原料のアルスロスピラ・マキシマの相対アミノ酸含有量に比較した時、加工処理したアルスロスピラ・マキシマにおいてアラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、グリシン、プロリン、システイン、アスパラギン酸／アスパラギン、グルタミン酸／グルタミン、セリンおよびフェニルアラニンの相対アミノ酸含有量の増加をもたらすことを示している。同時に、原料のアルスロスピラ・マキシマの相対アミノ酸含有量に比較した時、加工処理したアルスロスピラ・マキシマにおいてリシン、アルギニン、ヒスチジン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンの相対アミノ酸含有量の減少が認められる。
【０１２１】
実施例８−加工処理したアルスロスピラ・マキシマ（AMYCOT登録商標）の脂肪酸分析
【０１２２】
加工処理したアルスロスピラ・マキシマを脂肪酸分析に供した。未処理の原料アルスロスピラ・マキシマも加工処理済アルスロスピラ・マキシマとの比較のために脂肪酸分析にかけた。
【０１２３】
サンプルの脂肪酸プロファイルは、ガスクロマトグラフ−フレームイオン化検出器（GC-FID）によりDB-WAXカラム（Agilent Technologies社製）を使って測定した。結果は表12に示される。
【０１２４】
【表１２】
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【０１２５】
データは、粗製の原料アルスロスピラ・マキシマの加工処理ステップが、原料のアルスロスピラ・マキシマにおける各脂肪酸の割合に比較した時、加工処理後のアルスロスピラ・マキシマにおいてパルミチン酸、パルミトレイン酸およびステアリン酸の割合の増加をもたらし、そしてオレイン酸、リノレイン酸およびγ−リノレイン酸の割合の減少をもたらすことを示す。
【０１２６】
本明細書全体を通して「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造または性質が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書の全体の様々な箇所にある「一実施形態において」または「ある実施形態において」という表現は、必ずしも常にその同一の実施形態に言及するというわけではない。更に、特定の特徴、構造または性質は、１または複数の組み合わせにおいて任意の適当な方法で組み合わせることが可能である。
【０１２７】
法律に従って、本発明を構造的または方法的特徴に対して多かれ少なかれ特別な言葉で説明してきた。本明細書中に記載される意味は本発明を実行するのに好ましい形態を含むため、本発明は指摘されたまたは記載された特定の特徴に限定されないと理解すべきである。従って、本発明は、当業者により適切に解釈されるような添付の特許請求の範囲の正確な範囲内でそれの任意形式または変形（もしあれば）においてクレームされる。
【図１】
2020521809.tif 000016
【図２】
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【図３】
2020521809.tif 000018
【図４】
2020521809.tif 000019
【図５】
2020521809.tif 000020
【図６】
2020521809.tif 000021
【図７】
2020521809.tif 000022
【図８】
2020521809.tif 000023
【図９Ａ】
2020521809.tif 000024
【図９Ｂ】
2020521809.tif 000025
【図１０Ａ】
2020521809.tif 000026
【図１０Ｂ】
2020521809.tif 000027
【図１０Ｃ】
2020521809.tif 000028
【図１０Ｄ】
2020521809.tif 000029
【図１１】
2020521809.tif 000030
【図１２Ａ】
2020521809.tif 000031
【図１２Ｂ】
2020521809.tif 000032
【国際調査報告】
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2020521809.tif 000034
2020521809.tif 000035
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