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　平成　２年特許願第５１１３１９号「普遍的なドナー細胞及びキメラ性哺乳類宿主のための相同性組換え」拒絶査定不服審判事件〔平成　３年　２月　７日国際公開、ＷＯ９１／０１１４０、平成　４年　３月１９日国内公表、特表平　４−５０１５１０〕について、次のとおり審決する。
【結　論】
　本件審判の請求は、成り立たない。
【理　由】
〔１〕手続の経緯・本願発明：
　本願は、平成2年7月25日（パリ条約による優先権主張1989年7月25日、米国（以下、「第１優先権」という。）、1989年11月6日、米国（以下、「第２優先権」という。））の出願であって、その請求項１〜１５に係る発明は、平成11年11月30日付けの手続補正書により補正された明細書の請求項１乃至１５により下記の如く特定されている（以下、「本願発明１乃至１５」という。）。
　
【請求項１】少なくとも１つのDNA 構造体による哺乳動物細胞の形質転換によるクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（MHC)抗原の１つのサブユニットの個々の遺伝子座での損傷の導入及び前記遺伝子座での前記構造体の組込みの結果として前記MHC 抗原を欠く哺乳動物細胞であって、前記DNA 構造体は前記遺伝子座及び前記損傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成ることを特徴とする哺乳動物細胞。
【請求項２】前記遺伝子座がβ2 −ミクログロブリン遺伝子座である請求項１に記載の細胞。                            
【請求項３】遺伝子座及び損傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成る少なくとも１つのDNA 構造体による哺乳動物細胞の形質転換によるクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体（MHC)抗原の１つのサブユニットの個々の遺伝子座での前記損傷の導入並びに前記遺伝子座での前記構造体の組込みの結果として少なくとも１つの前記MHC 抗原を欠く哺乳動物細胞の生産方法であって：
　前記DNA 構造体により宿主細胞を形質転換し、ここで前記構造体は前記DNAを含んで成る宿主細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含んで成り；
　前記遺伝子座の少なくとも一つにおける相同組込みのために前記構造体を含んで成る選択された細胞をスクリーニングし；
　前記構造体により、前記遺伝子座の少なくとも１つにおいて相同組込みを有する細胞を形質転換し；そして
　前記クラスＩMHC 抗原の欠如により表面上に前記MHC 抗原を欠く細胞を選択することを含んで成る方法。
【請求項４】前記遺伝子座がβ2 −ミクログロブリン遺伝子座である請求の範囲第３項記載の方法。
【請求項５】請求の範囲第１項記載の細胞を含んで成る組織。
【請求項６】前記細胞がケラチン細胞である請求の範囲第５項記載の組織。
【請求項７】DNA 構造体であって、哺乳動物宿主において発現できるマーカー遺伝子をコードする配列に隣接するβ2−ミクログロブリン遺伝子座と相同の配列の少なくとも100bp を含んで成るDNA 構造体。
【請求項８】β2−ミクログロブリン遺伝子中に挿入されるマーカー遺伝子を含んで成る胚の幹細胞。
【請求項９】機能的なクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体抗原を欠如する遺伝子操作された非ヒト哺乳動物を生産する方法であって：
　非ヒト哺乳動物の胚の幹細胞の染色体に存在する内因性β2−ミクログロブリン遺伝子の配列と相同なDNA 配列の少なくとも100bp 及びマーカー遺伝子を含んで成るDNA 構造体により前記胚の幹細胞を形質転換せしめ、ここで該構造体は相同組換えにより前記染色体に組み込まれ、それにより前記β2−ミクログロブリン遺伝子を不活性化し；
　選択された細胞を供するために前記不活性化β2−ミクログロブリン遺伝子を有する非ヒト哺乳動物の胚の幹細胞について選択し；
　発達中の非ヒト哺乳動物の胚盤胞に前記選択された細胞を導入し；
　前記胚を所定期間、発達させ；
　生殖細胞系において前記不活性化β2 ?ミクログロブリン遺伝子を有する各々の性の少なくとも１の子孫を同定し；そして
　該子孫を繁殖させて機能的なクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体抗原を欠如するホモ接合の非ヒト哺乳動物を生産する
　ことを含んで成る方法。
【請求項１０】前記選択が、マーカー遺伝子及びポリメラーゼ鎖反応の使用によって行われる請求の範囲第９項記載の方法。
【請求項１１】前記ポリメラーゼ鎖反応が、２つのプライマーを用い、ここで一方のプライマーは前記構造体内の配列に相補的であり、他方のプライマーは前記構造体外であるが前記β2−ミクログロブリン遺伝子内である配列に相補的である請求の範囲第１０項記載の方法。
【請求項１２】前記非ヒト哺乳動物がマウスである請求の範囲第９項〜第１１項記載の方法。
【請求項１３】β2 −ミクログロブリン遺伝子の不活性化及び機能的なクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体抗原の欠如を特徴とする遺伝子操作された非ヒト哺乳動物あって、非ヒト哺乳動物が：
　胚の幹細胞における相同組換えによりβ2−ミクログロブリン遺伝子を不活性化し；
　前記細胞を発達中の胚の胚盤胞に導入し；
　前記胚を所定期間、発達させ；
　生殖細胞系に前記不活性化β2 −ミクログロブリン遺伝子を有する各々の性の少なくとも１の子孫を同定し；そして
　該子孫を繁殖させて機能的なクラスＩ主要組織適合性遺伝子複合体抗原を欠如するホモ接合の非ヒト哺乳動物を生産する
　ことにより生産される非ヒト哺乳動物。
【請求項１４】前記不活性化がneo 遺伝子の挿入を含む請求の範囲第１３項記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】前記非ヒト哺乳動物がマウスである請求の範囲第１３項又は第１４項記載の非ヒト哺乳動物。
　
〔２〕優先権主張について：
１．優先権主張と明細書中の実施例との関係について：
　本件明細書中に記載される一応の「実施例」は、以下の(a)〜(c)の３段階に分かれる（以下「実施例(a)〜(c)」という。）が、「第１優先権」の明細書に記載されていたのは実施例(a)までであり、「第２優先権」の明細書に記載されていたのは実施例(b)までである。
　
(a)マウス（もしくはヒト）の上皮ケラチン細胞に対して、当該細胞中のマウス（もしくはヒト）のβ2 -ミクログロブリン（β2m）遺伝子を１コピーずつ２回不活性化することで、MHCクラスI（MHC-I）遺伝子発現を欠く細胞を得、当該ケラチン細胞を単層増殖させた後、マウス上に移植する、というストラテジーが記載されている。ただし、実際には１コピーのβ2m遺伝子すら不活性化したことを確認した実験例はない。（特表平4-501510号公報第6頁右下欄16行〜第7頁右下欄1行に対応。）
(b)相同組換え法によりβ2m遺伝子の１コピーを不活性化したマウスの胚の幹細胞（ES細胞）を得た後、胚盤胞に注入し偽妊娠中の雌に再移植するという常法どおりキメラマウスを得たことが記載されている。なお、当該実施例ではキメラマウスに対してMHC-Iの発現非発現は確認していないが、正常なβ2m遺伝子も残るES細胞を用いたキメラマウスでしかないから、明らかにMHC-I抗原を発現するマウスのはずである。（同第7頁右下欄2行〜第9頁左下欄5行）
(c)突然変異β2m遺伝子含有キメラマウス由来のES細胞を胚盤胞に導入してキメラマウス子孫を得る工程を繰り返し、β2m遺伝子に対してヘテロ接合性マウス（β2m＋/−マウス）を得た後、当該ヘテロ接合性の雌雄を掛け合わせて1/4の確率のホモ接合体マウスを得た。当該マウスはβ2m遺伝子が２コピー共に不活性化されており、細胞表面でMHC-I抗原を発現できないマウスであり、かつ「健康のように見え、同産児仲間と目に見えて区別され得なかった。」と記載されている。即ち、当該実施例(c)が「全ての細胞表面でのMHC-I抗原を欠如するが生存可能なマウス」である「β2m−／−マウス」を提供することに成功した実施例に相当する。さらに、当該「β2m−／−マウス」由来の胸腺細胞、末梢T-細胞等を用いMHC-I抗原の欠如によるT-細胞の成熟への影響等の観察実験を行い、MHC-I抗原に対する「TCR担持性CD4+8+、又はCD4+8-細胞への胸腺細胞の成熟に必要ない」などの各種知見が記載されている。（同第9頁左下欄6行〜第10頁左下欄23行）
　
２．本願発明１乃至１５の完成時期と優先権主張について：
　ところで、下記［３］において述べるように、本件第１優先日当時には、MHC-I形成にβ2m遺伝子が必須であることが既に周知であった（引用文献２など）のだから、相同組換え法（引用文献１）によりβ2mの１コピー変異ES細胞を作製し、周知の手法でヘテロ接合性の「β2m＋／−マウス」を作製し、両ヘテロの雌雄掛け合わせによりホモ接合体「β2m−／−マウス」を作製しようとするストラテジー自体を発想することまでは、当業者にとって当然の事柄であるとはいえる。
　しかしながら、それと同時に、免疫系に重要なMHC抗原であるMHC-Iを全て欠如させてしまった場合に、細胞レベルではともかく、個体としての「β2m−／−マウス」が果たして「生存可能」であるか否かは実際に作製してみなければ分からなかったとすることも、また本件第１優先日当時のみならず、第２優先日以後においてすら当業界の技術常識であったというべきである。
　この点については、本件第１，２優先日後、本件現実の出願日（1990年7月25日）前の文献である下記参考文献１第438頁右欄4〜9行にも同趣旨の記載がある。請求人自身は、個体レベルどころか細胞レベルまでも含めて、原審での平成11年11月30日付意見書において「クラスIMHC抗原は、哺乳動物の免疫系において内在性あるいは外来性抗原をTリンパ球に提示する重要な物質であり、
この抗原を生産できない細胞や個体は、一般的には生存できず、またこれにより普遍的なドナーとなり得ない
両方のコピーを破壊（不活性化）することによってはじめて
生存可能である
　そうしてみると、本願発明のうち少なくとも本願発明９乃至１５は、β2m遺伝子が両コピーとも不活性化したMHC-I抗原を欠如するホモ接合の非ヒト哺乳動物自体、及びその生産方法等に係る発明であるから、これらの発明が完成した時点は、実際に「β2m−／−マウス」作成に成功した実験例である上記実施例(c)が追加された時期、即ち本件の現実の出願日（1990年7月25日）であるとするのが相当である。
　また、本願発明１乃至８においても、例えば請求項１の「少なくとも１つの・・・」、「MHC抗原を欠く」等の表現などからみて、MHC-I抗原を欠如するホモ接合の哺乳動物（β2m−／−マウス）由来の細胞及び組織等も包含されており、そのような場合は同様である。
　
　そこで、まず、本願発明１乃至８のうち、第１優先権が享受できる範囲内の明細書の開示内容（即ち、上記実施例(a)のみ）に基づく発明について以下検討する。
　
〔３〕本願発明１について：
　ところで、請求項１には、「MHC抗原を欠く」哺乳動物細胞と記載されているが、当該「MHC抗原を欠く」という用語は、細胞表面に全くMHC抗原を欠如する場合のみを指すのか、「MHC抗原形成の抑制（一部欠損）」の場合を含むのかは明確ではなく、「少なくとも１つの」という表現からみて、本願発明１は「β2m遺伝子」の両方のコピーが破壊（不活性化）されている場合と共に、１つのβ2m遺伝子が不活性化された場合を包含する。
　そうしてみると、本願発明１は、上記したMHC-I抗原を欠如するホモ接合哺乳動物に由来する細胞の場合を除いても、以下の(1)乃至(3)の場合が考えられる。
(1)１つのβ2m遺伝子を相同組換えで不活性化したことに対応した程度に、細胞表面のMHC-I抗原の形成が抑制（一部を欠く）される場合。
(2)もともと「MHC抗原」を表面に持たない細胞（例えばES細胞）の１つのβ2m遺伝子を相同組換えで不活性化した場合。
(3)まず１つのβ2m遺伝子を相同組換えで不活性化した細胞を培養して、当該細胞を再度β2m遺伝子を相同組換え法などで不活性化してMHC-I抗原を全く形成できなくする場合。
　
  一方、原審の拒絶の理由に引用された本件第１優先日前に頒布された引用文献１（Nature,　1988,Vol.336,p.348-352)には、具体例として、ES細胞に対し、プロトオンコジーンint-2にneor遺伝子を相同組換えにより挿入し、対立遺伝子の一つのコピーを破壊したことが具体的に記載されており、さらに
「遺伝子の標的化した破壊を含むES細胞の豊富化に用いられるPNS方法。
ａ，遺伝子Ｘ置換ベクターは、遺伝子Ｘのエクソンへのneor遺伝子の挿入とHSV-tk遺伝子の結合を含み、遺伝子Ｘの染色体コピーと対合を示す。ターゲッティングベクターとゲノミックＸDNAの間の相同組換えは、遺伝子Ｘの１つのコピーの破壊とHSV-tk配列の欠失を生じる。」（図１の説明）、
「これは標的遺伝子Ｘに相同な10〜15キロベース（kb）のDNAを含む。」（第349頁左欄 Strategy 第８〜９行）及び
「我々は、この方法がどの遺伝子に対しても適用されることを信じる。」（第352頁右欄）
と記載されていることからみて、引用文献１には、一般的な哺乳動物細胞における相同組換え法ともいうべき、マーカー遺伝子を含む遺伝子Ｘ置換ベクターを用いた遺伝子Ｘの破壊方法が記載されているということができる。
　ここで、引用文献１における「遺伝子Ｘ置換ベクター」は、本願発明１における前記遺伝子座及び前記損傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成ることを特徴とする「DNA構造体」に相当するといえるから、引用文献１にはまさに、本願発明における「少なくとも１つのDNA構造体による哺乳動物細胞の形質転換による遺伝子座での損傷の導入及び前記遺伝子座での前記構造体の組込みの結果として得られる哺乳動物細胞であって、前記DNA構造体は前記遺伝子座及び前記損傷の少なくとも一部と相同である配列を含んで成ることを特徴とする哺乳動物細胞」が記載されているということができる。
　ところで、臓器移植においてクラスＩMHC抗原が引き金となって拒絶反応が起きることが広く知られている（例えば、Med.Immunol., 1989, Vol.11, p.767-771等参照）ことから、従来から、移植しても拒絶反応を起こさない細胞としてのクラスＩMHC抗原を発現しない細胞を得ようとする技術的課題自体は周知であったといえる。
　そして、同引用文献２（Ann.Rev.Immunol., 1983, Vol.1, p.529-568）に、「最も良くキャラクタライズされたクラスＩ分子は、マウス移植抗原である。これらの分子は、45,000ダルトンで、マウスの第２染色体上に位置する遺伝子にコードされる12,000ダルトンのポリペプチドであるβ２−ミクログロブリンと非共有結合的に会合している、内在性膜タンパク質である、クラスＩポリペプチドからなる」（第533頁 Class I Polypeptides 第１−５行）と記載されているように、クラスＩMHC抗原の発現にはβ２ｍ遺伝子の発現が必須であることも本件優先日前に公知であり、そもそもβ２ｍ遺伝子はその塩基配列自体、及びゲノムDNA中でのエクソン領域の構造的特徴なども古くから広く研究されていた遺伝子である（必要であれば、Cell, 1982, Vol.29, p.661-669等参照）。
　そうであるから、MHC-I抗原を発現しない細胞を得ようとするときにゲノムDNA中のβ２ｍ遺伝子を破壊しようとすることは当業者にとって自然の発想にすぎず、その具体的手段として引用文献１に記載の方法を適用し、引用文献１における遺伝子Ｘとしてβ２ｍ遺伝子を選択して、当該遺伝子の少なくとも１コピーに損傷が導入された哺乳動物細胞を得ることは、当業者が容易に想到し得るものと認められる。
　また、タンパク質の発現を全て欠失させるためには、当然に対立遺伝子上の両方の遺伝子座を破壊しなければならないはずであるから、表面上に全くMHC-I抗原を欠如した細胞を得るために、β2m遺伝子の両方の遺伝子座を共に破壊しようとして、まず細胞の片方のβ2m遺伝子座を相同組換え法で不活性化した後、再度もう片方のβ2m遺伝子座を相同組換え法で不活性化することも、当業者であれば容易に想到し得ることでしかない。
　そうしてみると、本願発明１は、上記(1)(2)の場合はもちろんのこと、上記(3)の場合についても、本件第１優先権主張日当時の技術常識を勘案すれば、上記各引用文献の記載に接した当業者が自然に想起する範囲内の事柄である。
　そして、本件明細書中の第１および第２優先権が主張できる上記実施例(a)には、ケラチン細胞中のβ2m遺伝子を１コピーずつ不活性化させるストラテジーが記載されているのみであって、実際にβ2m遺伝子座を両方不活性化して細胞表面に全くMHC-I抗原を欠如したケラチン細胞どころか、β2m遺伝子の１コピーすら不活性化したケラチン細胞でさえ提供できていない。そうであるから、仮に当該ストラテジーに従うことで、少なくとも１コピーのβ2m遺伝子が不活性化された細胞であれば容易に得られるとしても、そのような細胞に対して予測される効果は、まさに本件第１優先権主張日前の技術常識から予測される範囲内の効果でしかない。（なお、細胞中の特定の遺伝子座において「相同組換え」が起こる確率が極めて低いことを考慮すれば、同一細胞に対して２度にわたる「相同組換え」を起こさせることが、本件第１優先権主張日前どころか現実の出願日の時点でも技術的に可能であったとは言い難い。即ち、「ケラチン細胞」中のβ2m遺伝子座に対して２度に亘る相同組換え法を適用するためには、極めて低い割合で得られるはずの１回目の形質転換ケラチン細胞を、次の相同組換えに供する程度に十分に長い寿命で十分な量増殖できる継代培養技術が必須であるが、その当時にこのような技術があったとはいえない。結局、上記(3)の場合というのは、現実の出願時点でも本来「未完成発明」とするべきアイデア発明でしかないから、引用文献との対比において「効果」は検討するまでもない。）
  したがって、本願発明１は、上記(1)乃至(3)のいずれの場合についても、本件第１優先権主張日前の技術常識からみて、当業者であれば引用文献１及び２の記載に基づいて容易に発明できたものである。
　
〔４〕本願発明２乃至８について
　上記〔３〕で摘記した引用文献１の記載事項からみて、引用文献１には標的遺伝子Xに相同な10〜15kbのDNAとマーカー遺伝子（neor遺伝子）とを有する遺伝子X置換ベクターを用いる、一般的な哺乳動物細胞における相同組換え方法が記載されているということができる。
　そして、当該細胞としてケラチン細胞を選択することにも格別の困難性が見出せないから、本願発明２乃至８のいずれの発明も、本願発明１と同様の理由で当業者が引用文献１及び２の記載に基づいて容易に発明できたものである。
  なお、特に請求項９乃至１５に記載された発明など、「β2ｍ−／−マウス」の裏付けがあってはじめて成立する発明については、上述の如く、第１優先権どころか第２優先権も享受できないから、第１優先日、第２優先日以降であって現実の出願日前に頒布された下記参考文献３及び４に記載された発明であるか、もしくは下記参考文献１乃至４の記載事項に基づいて当業者が容易に想到できた発明であることになり、いずれにしても特許を受けることはできない。
　
参考文献１：　Nature　Vol.342,　p.435-438　（23Nov.1989）
参考文献２：　Nature　Vol.344,　p.742-746　（19Apr.1990） 
参考文献３：　Proc.Natl.Acad.Sci.USA　Vol.86,　p.8932-8935  (Nov.1989)
参考文献４：　Science　Vol.248,　p.1227-1230　（8June1990）
　
〔５〕むすび：
　したがって、本願発明１乃至８は上記引用文献１及び２に記載された発明に基いて当業者が容易に発明をすることができたものと認められるから、他の請求項に記載された発明については検討するまでもなく、この出願の発明は特許法第２９条第２項の規定により特許を受けることができない。
　　
〔６〕付記：
　平成16年5月21日にファクシミリで送信された上申書に記載された補正案については、平成16年6月3日付けファクシミリによる上申書において第１優先権の有効性を主張しているので、以下の通り判断する。
　
　上記補正案の請求項１に記載された発明（以下、「補正案発明１」という）は、本願発明１において「遺伝子座及び損傷の少なくとも一部と相同である配列」の長さが「100bp以上で5kbp未満」に限定され、また「前記損傷の導入」及び「前記構造体の組込み」が「遺伝子座の両方のコピー」で生じることが明記されたものである。
　なるほど、請求人が主張する如く、引用文献１において、実際に標的遺伝子の「一部と相同である配列」として用いられたDNAの長さは10〜15kbである（p.349 Strategy 第８〜９行）とはいえるが、哺乳動物細胞の「相同組換え法」において、標的遺伝子と相同組換えを生じさせるための相同配列の長さは、当業者が必要に応じて適宜設定できる範囲の事項でしかないとするのが相当である。
　例えば、下記参考文献５及び６等において用いられている標的遺伝子の相同領域の長さはせいぜい1kbp程度の短いものである。そして、本願明細書中の実施例（ａ）の記載は単なるストラテジーであって実際の成功例ではないから、「100bp以上で5kbp未満」という特定の数値範囲を設定したことによる、予測し得ない顕著な効果は主張できない。
　また、「前記損傷の導入」及び「前記構造体の組込み」が「遺伝子座の両方のコピー」で生じる点については、上記［３］において請求項１の「MHC-I抗原を欠く」という用語が(3)に相当する場合として既に述べた通りである。
　したがって、補正案発明１についても特許性は見い出せないから、当該補正案どおりに補正する機会を与える必要を認めない。
　
　なお同請求項２に記載された発明は、明らかに第１優先権のみならず第２優先権も主張できないため、上記参考文献２および４の記載に基づき特許性が否定される。
　
　参考文献５：　Mol.Cell.Biol.  Vol.8, p.5350-5357 (1988)
　参考文献６：  Naure, Vol.338  p.150-153 (1989)