(57)【要約】  本発明は、筋肉のマイクロバイオプシーを収集し、サンプルを細胞培養培地に入れ、細胞を収集して成長させ、適切な分化培地でそれらを分化させることを含む、分化した哺乳動物細胞の調製方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
分化した哺乳動物細胞の調製方法であって、（ｉ）哺乳動物個体から筋肉マイクロバイオプシーサンプルを収集し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）にて収集した筋肉サンプルを適切な培地に入れ、（ｉｉｉ）前記マイクロバイオプシーから出現した細胞を成長させ、（ｉｖ）筋肉サンプルの周囲に十分な量の成長細胞が存在する場合に、前記マイクロバイオプシーと成長細胞を分離し、（ｖ）成長した細胞をほぼコンフルエンスまで継続し、（ｖｉ）特定の間葉系幹細胞を分離することを目的とした分離技術またはステップがない場合は、適切な分化培地中で、ステップ（ｖ）で得られた前記細胞を分化することを含む、方法。
【請求項２】
前記筋肉マイクロバイオプシーは骨格筋組織から採取される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マイクロバイオプシーは、約１０〜約３０ｍｇ、好ましくは約１２ｍｇ超、より好ましくは約１５ｍｇ超および／または約２５ｍｇ未満、好ましくは約２０ｍｇ未満を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
適切な脂肪生成、骨形成、軟骨形成、筋原、造血、内皮、神経、心臓、または肝細胞分化培地でそれぞれ培養することにより、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞に分化させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載された方法で取得された、分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞。
【請求項６】
請求項５の分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞を含む医薬組成物または獣医用組成物。
【請求項７】
少なくともその表面の一部に請求項５に記載の分化した細胞を含む基質。
【請求項８】
請求項５に記載の分化した細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、哺乳動物対象の治療方法。
【請求項９】
哺乳動物対象における、靭帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、蹄葉炎、腱および靭帯の炎症、骨折、および治癒不全の障害のうちの1つまたは複数の治療を含む、請求項8に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋肉由来の前駆細胞（ｍｄＰ細胞）から分化した細胞を得るための新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、自己再生と多系列の分化により特徴づけられる。多くのタイプの幹細胞がこれまでに発見されているが、幹細胞の胚葉と非中胚葉の誘導体へ分化する能力、免疫調節能、幅広い利用可能性、および内因性予備能の維持への貢献のため、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、最も注目を集めている（Ｋａｒａｎｔａｌｉｓ他  ２０１５）。
【０００３】
ＭＳＣは体全体に広く分散しているが、臨床研究では主に３つのソースが使用され、それらは骨髄、脂肪組織、そしてそれほどではないが臍帯である(Ｌｖ他  ２０１４；Ｋａｒａｎｔａｌｉｓ他  ２０１５)。骨髄由来の間葉系幹細胞は、痛みを伴うサンプリングと低い生産収率にもかかわらず、最も一般的に使用される幹細胞である。これらの欠点に対処するために、幹細胞の他の多くのソースが調査されている。骨格筋は、衛星細胞のように筋原性分化に限定されない、自己再生および複数の系統への分化が可能な細胞を含んでいる（Ｊａｎｋｏｗｓｋｉ他  ２００２；Ｗｕ他  ２０１０）。
【０００４】
２００６年に、ＭＳＣの多数のソースを考慮した均一性のため、国際細胞療法学会（ＩＳＣＴ）は、ヒトＭＳＣを定義するために、（１）ＭＳＣは標準的な培養条件でプラスチック接着性でなければならない、（２）ＭＳＣは、ＣＤ１０５、ＣＤ７３およびＣＤ９０を発現しなければならず、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ１４またはＣＤ１１ｂ、ＣＤ７９αまたはＣＤ１９およびＨＬＡ−ＤＲ表面分子の発現を欠損しなければならない、（３）ＭＳＣは、インビトロにて骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞に分化しなければならない、との最小限の基準を提案した（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ他、２００６）。
【０００５】
ウマ筋肉由来の幹細胞は、外植片培養に依存する特許取得済みの方法を使用して筋肉のマイクロバイオプシーから分離され、その後、異なる密度を有する幹細胞含有画分をソートするために不連続パーコール密度勾配に続く（ＳｅｒｔｅｙｎおよびＣｅｕｓｔｅｒｓ  ２０１５；ＷＯ２０１５／０９１２１０）。この技術により、ごく少量の筋肉（１５〜２０ｍｇ）から６週間で約６０００万個の幹細胞に到達することができた。フローサイトメトリーによる免疫表現タイプ検査は、これらの細胞がＣＤ１０５、ＣＤ９０およびＣＤ４４に対して陽性であり、ＣＤ４５およびＭＨＣ−ＩＩに対して陰性であることを示した。ウマ筋肉由来の幹細胞は、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞（ケラチノサイト）、肝細胞、心筋細胞、および内皮細胞への分化に成功したことから、その多能性を証明した。また、これらの細胞は免疫調節特性を示す。それゆえ、これらの筋肉由来の幹細胞は、骨髄由来の間葉系幹細胞に代わる優れた代替手段を提供する、微小侵襲方法において豊富にかつ容易に達成することができる、間葉系幹細胞（ｍｄＭＳＣ）の集団を代表することができる。
【０００６】
幹細胞は、インビトロ研究の貴重なツールである。実際、一度分化プロトコルが確立されると、それらは、非常に標準化された方法で機能することができ、不死化された細胞、死体に由来する細胞または標的とされた種以外の種に由来する細胞に基づくあまり適していないモデルを置き換える、再現性の高い細胞モデルを作成することができる（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他  ２０１３  ＭＳＣ  ｂｏｏｋ）。また、幹細胞は、単一の個人から、したがって単一のサンプリングから多くの異なる細胞タイプを提供する機会を提案し、これは、サンプリングが危険または安全ではない細胞タイプで行われる研究のための貴重なツールを構成する。さらに、幹細胞は、問題の患者の１つまたは複数の細胞タイプに対する異なる治療の有効性および／または毒性を評価するために最も重要な個々の治療アプローチを作成する必要性を満たす。現在までに、科学文献は、分離、培養、増殖の段階の後、骨髄、脂肪組織、血液、歯髄、臍帯に由来する間葉系幹細胞から分化した細胞を取得している。
【０００７】
現在、特定のまたは異なる間葉系幹細胞集団を単離するための事前の分離技術を用いずに、筋肉のマイクロバイオプシーから分化細胞が取得されることが見いだされている。そのような分離技術は、一般に、酵素消化、プレプレーティング、密度勾配分離などを含む。
【発明の概要】
【０００８】
本発明によれば、分化した哺乳動物細胞の調製方法は、（ｉ）哺乳動物個体から筋肉マイクロバイオプシーサンプルを収集し、（ｉｉ）ステップ（ｉ）にて収集した筋肉サンプルを適切な培地に入れ、（ｉｉｉ）前記マイクロバイオプシーから出現した細胞を成長させ、（ｉｖ）筋肉サンプルの周囲に十分な量の成長細胞が存在する場合に、前記マイクロバイオプシーと成長した細胞を分離し、（ｖ）細胞をほぼコンフルエンスまで成長させることを継続し、（ｖｉ）特定の間葉系幹細胞を分離することを目的とした分離技術またはステップがない場合は、適切な分化培地中で、ステップ（ｖ）から細胞を分化することを含む。
【０００９】
本発明の好ましい形態によれば、前記筋肉マイクロバイオプシーは骨格筋組織から採取される。
【００１０】
マイクロバイオプシーの筋肉サンプルと、そこから出現し、その周囲で成長した細胞の分離は、組織サンプルを除去することによりもたらされるので、細胞を関連する培地中でさらに成長させるままにする。
【００１１】
培養培地は、有利には、約２０%のウシ胎児血清、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００Ｍｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンホテリシンＢ（２５０μｇ/ｍｌ）および約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２を含む。さらなる例は、ＣＴＳ（商業名）およびＴｈｅｒａｐｅａｋ（商業名）培地である。当業者は、他の適切な培地を見いだしてもよく、彼の共通の知識、経験、およびスキルを利用して、その培地をプロセスの要件に適合させることができる。
【００１２】
哺乳動物は、これらに限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、雌ウシ（ｃｏｗｓ）、ヒツジ、ウマ、ブタ、例えばサルや類人猿だけでなく、ヒトも含む霊長類を含む、家畜、動物園動物、スポーツ動物、ペット動物、愛玩動物、および実験動物をからなる群から選択される。
【００１３】
有利には、マイクロバイオプシーは、首、肩、胸、背中、尾、手足、後肢、前肢、後肢、後肢などの筋肉などの骨格筋組織から取得される。ウマのような哺乳動物の場合、マイクロバイオプシーは、好ましくは上腕三頭筋の筋肉組織から取得され、より好ましくは上腕三頭筋の長頭から採取される。ヒトの場合、マイクロバイオプシーは三角筋から取得される。当業者は、過度の負担なしに適切なソースを選択することができる。
【００１４】
ウマの場合、例えば、マイクロバイオプシーは、上腕三頭筋の長頭の深さ約５ｃｍで採取され、組織の約１０〜約３０ｍｇ、好ましくは約１２ｍｇ超、または約１５ｍｇ超、および／または約２５ｍｇ未満または約２０ｍｇ未満を含む。ヒトの場合、マイクロバイオプシーは、組織の約１０〜２０ｍｇを含む。ただし、明らかに、哺乳動物と骨格筋組織のソースに依存して、当業者は、一般的な知識に基づいて、および／または過度の負担のない日常的な実験により、抽出されるマイクロバイオプシーの深さおよび組織サンプルの量を適合させることができる。
【００１５】
分離された筋肉由来の前駆細胞は、適切な脂肪生成、骨形成、軟骨形成、筋形成、造血、内皮、神経、心臓、または肝細胞の分化培地でそれぞれ培養することにより、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞に分化する。関連する分化培地は、過度の負担なしに、共通の知識、経験、およびスキルに基づいて、適切な培地および培養条件を選択できる当業者に知られている。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書で使用される「筋肉由来前駆細胞」または「ｍｄＰ細胞」という用語は、例えば、不連続のパーコール密度勾配を使用することによる、異なる幹細胞含有画分を分離することなく、外植片培養によりマイクロバイオプシーから出現する全ての細胞を意味すると理解される。
【００１７】
細胞分化は、細胞が１つの細胞タイプから一般的により分化したタイプに変化するプロセスを意味すると理解される。このプロセスは、遺伝子発現を制御する適切な培地によって引き起こされる。本明細書で使用される「分化細胞」という用語は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞などの分化した細胞タイプを意味すると理解され、それらが由来する前駆細胞または幹細胞よりも分化している。
【００１８】
「幹細胞」という用語は、一般的に、分化されていないか、相対的に分化されていない増殖能のある細胞を指し、自己再生が可能である、すなわち、分化せずに増殖することができる、それ自体またはその子孫が、少なくとも１つの相対的により分化した細胞タイプを生じさせることができる。この用語は、実質的に無制限の自己再生が可能な幹細胞を包含し、幹細胞またはその少なくとも一部の子孫は、母体幹細胞の分化されていないか、相対的に分化されていない表現タイプ、分化能、および増殖能力、ならびに限られた自己再生を示す幹細胞を実質的に保持し、さらなる増殖および／または分化のための子孫またはその一部の能力は、母細胞と比較して明らかに低下している。限定されない例によれば、幹細胞は、１つ以上の系統に沿って分化し、次第に相対的により分化した細胞を生成できる子孫を産生し、そのような子孫および／または次第に相対的により分化した細胞は、それ自体が本明細書で定義される幹細胞であるか、または最終分化細胞、すなわち有糸分裂後の完全に分化された細胞を産生することもある。
【００１９】
本明細書で使用される「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、哺乳動物の成体の、中胚葉由来幹細胞として参照され、間葉系の系譜の細胞、例えば、骨細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）およびストロマジェニック（骨髄間質）系譜の、２つ、好ましくは３つ以上の間葉系の系譜、の典型的な細胞を発生することができる。一般的に、ただしこれに限定されないが、一般的に、ただしこれに限定されないが、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他  １９９９（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−７）またはＢａｒｂｅｒｉ他、２００５（ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２：ｅ１６１）、およびＵｓａｓ他、２０１１に記載されるように、標準的な、技術的に認められた分化条件および細胞表現タイプ評価方法を使用して、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞系のそれぞれの細胞を形成できる場合、細胞はＭＳＣとみなしてもよい。ＭＳＣという用語は、ＭＳＣの子孫、例えば、対象の生物学的サンプルから取得したＭＳＣのインビトロまたはエクスビボ増殖により取得した子孫も包含する。
【００２０】
ＩＳＣＴは、以下のような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として定義するために、細胞が持つべき品質を正確に決定した。すなわち、細胞は、プラスチック接着性であり、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０に対して陽性であり、マーカーＣＤ１４（またはＣＤ１１ｂ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７９Ａ（またはＣＤ１９）およびＭＨＣ−ＩＩに対して陰性でなければならず、また骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞などの中胚葉起源の細胞に分化する能力を示さなければならない（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ他、２００６）。ＣＤ２９またはＣＤ４４などの他のＭＳＣマーカーの使用も報告されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）。したがって、本発明に従って使用される哺乳動物ＭＳＣ細胞は、少なくとも間葉マーカーＣＤ１０５、および好ましくは以下のマーカー：ＣＤ４４およびＣＤ９０の１つ以上を発現または同時発現する（すなわち、陽性である）という点で定義される。本発明の哺乳動物ＭＳＣ細胞はまた、以下のマイクロＲＮＡ：ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、ｍｉＲ−２１８またはｍｉＲ−８０２の１つ以上を発現または同時発現する（すなわち、陽性である）というように定義される。本発明の哺乳動物ＭＳＣ細胞は、ｍｉＲ−６５６を発現しないというようにも定義される。
【００２１】
マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲまたはｅｃａ−ｍｉＲという用語は、本明細書で互換的に使用され、動物などの生物の内因性遺伝子に由来する１９〜２５のヌクレオチド成熟非コードＲＮＡ、またはその前駆体、またはその断片を指す。成熟したマイクロＲＮＡは、約７５のヌクレオチドの長さを有するプレ−マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲ）と呼ばれるより長いヘアピン様前駆体からプロセシングされる。
【００２２】
細胞が特定のマーカーまたはマイクロＲＮＡに対して陽性であると考えられる場合、これは、適切な対照と比較して、適切な測定を実行する際に、そのマーカーまたはマイクロＲＮＡに対して、例えば、抗体検出可能または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による検出などの、明確なシグナルの存在または証拠を当業者が結論付けることを意味する。本方法がマーカーまたはマイクロＲＮＡの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は、対照とは有意に異なり、対照よりもより高いまたはより強いシグナル、例えば、これに限定されないが、対照細胞によって発生するシグナルより少なくとも１．５倍高い、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、またはさらに高いシグナルを発生する。
【００２３】
細胞特異的マーカーの発現は、免疫細胞化学またはアフィニティ吸着、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の任意の適切な免疫学的技術を使用して、または酵素活性の任意の適切な生化学的アッセイにより、または例えばノーザンブロット、半定量的または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの、マーカーｍＲＮＡの量を測定する適切な技術により、検出される。
【００２４】
ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現は、例えば、グローバルな遺伝子発現のアッセイ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ発現プロファイリング分析のためのマイクロアレイアッセイ、既成のｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｑＰＣＲプレートまたはＲＮＡシーケンシングを使用）、または例えば、限定されないが、定量ＰＣＲ、定量逆転写（リアルタイム）ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）リアルタイムＰＣＲ、またはノーザンブロットなどの特異的検出アッセイにより決定される。特に、ｍｉｃｒｏＲＮＡの発現の測定は、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡの検出に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて行ってもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、ｍｉｃｒｏＲＮＡに直接および特異的に結合してもよく、または前記ｍｉｃｒｏＲＮＡを特異的に逆転写してもよい。あるいは、前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡから取得したｃＤＮＡに結合してもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記ｍｉｃｒｏＲＮＡから取得したｃＤＮＡを増幅してもよい。
【００２５】
本明細書で使用される「成長する」および「培養する」という用語は、細胞が一定レベルのコンフルエンスまで増殖することを意味すると理解される。
【００２６】
「マイクロバイオプシー周辺の十分な量の細胞」という用語は、筋肉サンプルから分離できるように筋肉サンプル上および／またはその近くで十分な細胞が成長したことを意味する。
【００２７】
本発明による方法は、例えば毒性アッセイの例、Ｏｒｇａｎ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐベースの実験、医薬品開発、個別化医療開発を含むインビトロ研究用に、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、および肝細胞を含むがこれらに限定されない、分化細胞の容易な供給ソースを提供する。後者は、前記哺乳動物分化細胞の陽性応答のレベルを評価することにより、患者による陽性応答の可能性を評価することを含んでもよい。
【００２８】
本発明は、文献に既に記載されている方法に対する効果的かつ有望な代替手段を提案し、低侵襲性の幹細胞収集により、生きている哺乳動物で実施される可能性を提供する。わかっているように、筋肉由来細胞は、異なる系統および異なる発達段階からの亜集団の混合物である。細胞培養は簡単な方法で開始され、筋肉のマイクロバイオプシーは外植片として使用され、前駆細胞がいずれ自発的に現れる。そうすることによって、筋肉のマイクロバイオプシー（外植片）によって自然に分泌される成長因子が十分なので、操作の回数が減り、潜在的な汚染源が回避され、外部の成長因子を追加する必要がない。
【００２９】
本発明は、高収率で分化細胞を発生するための単純化された効果的な方法を提供する。本発明の最初の出願日の知識の状態は、筋バイオプシー生検から分化細胞を直接発生できると結論付けることはできない。本発明のプロセスは、最初の出願日に当業者が利用可能な知識に基づく直感に反する。筋肉サンプルから細胞を、骨細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）およびストロマジェニック（骨髄間質）系統を含むいくつかの細胞系統に分化させることは期待できなかった。
【００３０】
本発明は、自家細胞の使用に特に適しており、遺伝的特異性または異常性にあまり依存しない、より信頼できる結果を意味する。
【００３１】
本発明は、分化細胞を必要とする対象に投与することによる治療方法も提供し、このフレーズは、所与の状態の治療から利益を得る対象（哺乳動物）を含む。そのような対象は、限定されるものではないが、前記状態と診断された対象、前記状態を発症しやすい対象、および／または前記状態が予防される対象を含んでいてもよい。分化細胞は、以下の障害の１つまたは複数の治療：哺乳動物対象の骨粗鬆症、骨折、治癒不全の治療のための骨細胞分化細胞；靭帯炎、骨軟骨症、関節炎、腱炎、蹄葉炎、腱および靭帯の炎症の治療のための軟骨細胞分化細胞；心機能の改善、梗塞した心臓組織の再建などの心疾患の治療のための筋原細胞および心臓細胞；自己免疫疾患、および多発性骨髄腫や白血病などの血液および骨髄のがんの治療のための造血器分化細胞; 内皮機能障害の治療のための内皮細胞；変性神経疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症の治療のための神経細胞；肝機能障害およびがんの治療のための肝細胞分化細胞に用いられる。
【００３２】
「治療する」または「治療」という用語は、既に発症した筋関節障害の治療などの既に発症した疾患の治療的治療、ならびに予防的または予防措置の両方を包含し、目的は、靭帯炎、骨軟骨症、関節炎、骨粗鬆症、腱炎、腱および靭帯の炎症、骨折、治癒の失敗などの筋関節障害の収縮および進行の可能性を防ぐなど、望ましくない苦痛の発生の可能性を防止または軽減することである。そのような治療の有益なまたは望ましい臨床結果は、これらに限定されないが、１つまたは複数の症状または１つまたは複数の生物学的マーカーの緩和、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち悪化しない）状態、疾患の遅延または緩徐化、病状の進行改善または緩和などが含まれる。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも意味する。
【００３３】
「予防的に有効な量」という用語は、研究者または獣医が求める障害の発症を対象において阻害または遅延させる、本発明による獣医学的組成物または医薬組成物の量を指す。本明細書で使用される「治療に有効な量」という用語は、とりわけ治療される疾患または障害の症状の緩和を含む、研究者または獣医が求める対象において生物学的または医学的応答を誘発する本発明による獣医学的または薬学的組成物の量を指す。治療的および予防的に有効な用量を決定する方法は、当技術分野で知られている。
【００３４】
治療は、自家（すなわち、治療される対象に由来する細胞）、治療される対象以外の同種（すなわち、治療される対象以外であるが、同種に属している対象に由来する細胞）、または異種（すなわち、治療される対象以外の種に属する対象由来の細胞）を使用してもよい。分化細胞または本明細書で定義されるそれぞれの細胞集団を使用する。
【００３５】
獣医学的組成物または医薬組成物は、典型的には、活性成分として本発明に従って取得した分化細胞または細胞集団、および１つまたは複数の薬学的に許容される担体／賦形剤を含む。ここで用いるように、「担体」または「賦形剤」には、あらゆる全ての溶媒、希釈剤、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アミノ酸（例えば、グリシンなど）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色料、香料、芳香剤、増粘剤、デポ効果を達成するための薬剤、コーティング剤、抗真菌剤、防腐剤、安定剤、抗酸化剤、張性調節剤、吸収遅延剤などを含む。獣医学的または薬学的活性物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野において周知である。そのような材料は無毒でなければならず、細胞の活動を妨げてはならない。獣医学的使用の場合、細胞は飼料サプリメントに配合するか、飼料サプリメントとして投与することもできる。
【００３６】
担体または賦形剤あるいは他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する。例えば、組成物は、非経口的に許容される水溶液の形態であってもよい。薬用製剤の一般原則のために、読者は細胞治療：幹細胞移植、遺伝子治療および細胞免疫法、Ｇ．ＭｏｒｓｔｙｎおよびＷ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ編、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６、および造血幹細胞治療、Ｅ．Ｄ.Ｂａｌｌ、Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  ｐ．Ｌａｗ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ、２０００を参照する。
【００３７】
そのような獣医学的または医薬組成物は、（分化した）細胞または細胞集団の生存率を保証する成分をさらに含んでいてもよい。例えば、組成物は、望ましいｐＨ、より一般的には中性付近のｐＨを達成するために、適切な緩衝液系（例えば、リン酸または炭酸緩衝液系）を含んでいてもよく、浸透圧ストレスを防ぐための細胞の等浸透圧条件を確保するのに十分な塩を含んでいてもよい。例えば、これらの目的に適した溶液は、当技術分野で知られているように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンガー液または乳酸加リンガー液であってもよい。また、組成物は、細胞の生存率を増加させ得る、アルブミンなどの担体タンパク質を含んでいてもよい。
【００３８】
獣医学的または医薬組成物は、さらに、治療される関連組織または器官またはその機能性の修復または再生に有用な成分を含んでいてもよい。一例として、動物用または医薬組成物は、骨の傷および欠損の修復に有用な成分を含んでいてもよい。例えば、そのような成分は、骨形成タンパク質、骨基質（例えば、本発明の細胞または他の方法によりインビトロで産生される骨基質）、ヒドロキシアパタイト／リン酸三カルシウム粒子（ＨＡ／ＴＣＰ）、ゼラチン、ポリ乳酸、ポリ乳酸グリコール酸、ヒアルロン酸、キトサン、ポリ−Ｌ−リジン、およびコラーゲンを含む。例えば、骨芽細胞を脱灰骨マトリックス（ＤＢＭ）または他のマトリックスと組み合わせて、骨形成性（骨形成性）および骨誘導性の複合体を作成してもよい。
【００３９】
獣医用または医薬組成物は、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−7あるいはＢＭＰ−４などの骨形態形成タンパク質などの相補的生物活性因子、または他の任意の成長因子をさらに含むか、それらと併用することができる。他の潜在的な付随成分は、骨再生を支援するのに適したカルシウムまたはリン酸塩の無機ソースを含む（ＷＯ００/０７６３９）。必要に応じて、細胞調製物を担体マトリックスまたは材料に投与して、組織再生を改善することができる。例えば、材料は、粒状セラミック、またはゼラチン、コラーゲン、オステオネクチン、フィブリノーゲン、オステオカルシンなどの生体高分子である。多孔質マトリックスは、標準的な技術に従って合成できる（例えば、Ｍｉｋｏｓ他、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １４：３２３、１９９３）。
【００４０】
獣医用または薬学的組成物は、分化細胞の導入または投与部位での感染およびまたは炎症による合併症を避けるために、殺菌、抗菌、または抗生物質、または抗真菌および／または抗炎症剤など補完的な消毒、無菌、または微生物破壊剤をさらに含むか、または併用することができる。
【００４１】
分化した細胞または細胞集団は、それらが目的とされる組織部位に移植または移動し、機能的に欠損した領域を再構成または再生できるように投与することができる。組成物の投与は、修復される筋関節部位に依存する。例えば、分化した細胞または細胞集団は、病変部（腱や靭帯など）に直接、または滑膜関節（例えば、腱滑膜または関節滑膜など）に投与できる。
【００４２】
例えば、骨形成は、組織を改造する、または割れ目を挿入する、または人工装具を挿入する外科的処置と調和して促進することができる。その他の状況において、侵襲的手術は必要なく、組成物は超音波誘導注射などの注射によって、または誘導可能な内視鏡を使用して投与することができる。
【００４３】
また、別の実施形態では、本発明の分化細胞または細胞集団は、インプラントを提供するために適切な基質に移され、および／または基質で培養されてもよい。細胞を表面の少なくとも一部に適用して培養できる基質は、チタン、コバルト／クロム合金またはステンレス鋼などの金属、リン酸カルシウムなどの生物活性表面、ポリエチレンなどのポリマー表面などであり得る。あまり好ましくないが、ガラスセラミックスなどのケイ質材料も基質として使用できる。リン酸カルシウムは基質の必須成分ではないが、チタンなどの金属、およびリン酸カルシウムが最も好ましい。基質は、多孔性でも非多孔性でもよい。基質は、生分解性または生体吸収性であってもよい。
【００４４】
例えば、本発明に従って取得した分化細胞は、必要に応じて、本発明の液体栄養培地中で固体支持体をインキュベートすることにより、分化プロセスを増殖および／または継続させるために、三次元固体支持体に移すことができる。細胞は、例えば、前記細胞を含む液体懸濁液を前記支持体に含浸させることによって、三次元固体支持体に移すことができる。このようにして取得した含浸支持体は、対象に移植することができる。そのように含浸された支持体は、最終的に移植される前に、それらを液体培地に浸漬することにより再培養することもできる。
【００４５】
三次元固体支持体は、対象に移植できるように生体適合性である必要がある。三次元固体支持体は、円柱、球、平板、または任意の形状の一部など、任意の適切な形状にすることができる。生体適合性の三次元固体支持体に適した材料のうち、炭酸カルシウム、特にアラゴナイト、具体的にはサンゴ骨格の形、アルミナ、ジルコニア、リン酸三カルシウムおよび／またはハイドロキシアパタイトに基づく多孔性セラミック、炭酸カルシウムをハイドロキシアパタイトに変換できる水熱交換により得られた模造サンゴ骨格、またはアパタイト−ウォラストナイトガラスセラミック、Ｂｉｏｇｌａｓｓ（商標）ガラスなどの生物活性ガラスセラミックを特に言及することができる。
【００４６】
本明細書において、ここで用いられる「約」という用語は、パラメータ、量、一時的な継続時間などの測定可能な値を参照する場合に、特定の値、または特定の値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変量を包含することを意図し、このような変動は、本発明において実行される限り適切である。修飾語句「約」が帰する値が、それ自体具体的に、好ましくも、開示されていることを理解されるべきである。
【００４７】
本発明に関する一般的な方法に関し、参照により本明細書に組み込まれている、例えば「分子クローニング：実権マニュアル、第二版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）、動物細胞培養（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、酵素学方法シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、哺乳動物細胞の遺伝子導入ベクター（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「分子生物学における現行プロトコルおよび分子生物学における短期プロトコル、第３版」（Ｆ．  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、編集、１９８７および１９９５）；組み換えＤＮＡ方法論ＩＩ（Ｒ．Ｗｕ他、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を含む、既知の教科書により参照がなされる。
【００４８】
本発明の実行において役立つ一般的な技術のさらなる精密化のため、実行者は、細胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な書籍およびレビューを参照することができる。これには、「奇形種および胚性幹細胞：実践的アプローチ」（Ｅ.Ｊ.Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ.１９８７）；「マウス発達における技術ガイド」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；「インビトロ胚性幹細胞分化」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，ＭＥＴＨ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；「胚性幹細胞の性質および利用：ヒト生物学および遺伝子治療への適用見通し」（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ他、１９９３）が含まれる。幹細胞の分化は、参照により本明細書に組み込まれる、例えばＲｏｂｅｒｔｓｏｎ．１９９７．ＭＥＴＨ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５：１７３；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ．１９９８．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  １０：３１、およびＬｉｓａｓ他、２０１１にレビューされている。本発明に関する一般的な方法について、例えば、「分子クローニング：実権マニュアル、第二版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）、動物細胞培養（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、酵素学方法シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、哺乳動物細胞の遺伝子導入ベクター（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「分子生物学における現行プロトコルおよび分子生物学における短期プロトコル、第３版」（Ｆ．  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、編集、１９８７および１９９５）；組み換えＤＮＡ方法論ＩＩ（Ｒ．Ｗｕ他、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を含む、既知の教科書により参照がなされる。
【００４９】
細胞培養および細胞収集における一般的な技術は、参照により本明細書に組み込まれる、大規模哺乳動物細胞培養（Ｈｕ他  １９９７．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：  １４８）；無血清培地（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７３）；大規模哺乳動物細胞培養（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３７５，１９９１），動物細胞の培養：基本的な技術のマニュアル、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．他  ２００５，５版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに概説される。
【００５０】
本明細書に列挙されるマーカータンパク質の核酸およびアミノ酸配列データは、一般的に知られており、とりわけＮＩＨ「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｅｂ」データベース（http：//mpr.nci.nih.gov/prow/）、ＮＩＨ「Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ」データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）またはＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（http：//www.expasy.org/）などの公開データベースから取得することができる。前記マーカーに適する検出試薬および方法は、そのような配列情報に基づいて設計することができ、より一般的には市販されている（例えば、標識モノクローナル抗体試薬）。
【００５１】
「ＣＤ１０５」という用語は、ＣＤ１０５として知られる抗原、またはエンドグリンなどの同義語を含む。ＣＤ１０５は、細胞表面にある膜糖タンパク質であり、間葉系幹細胞マーカーとして知られている。一例として、ウマＣＤ１０５抗原の部分アミノ酸配列は、受託番号ＡＧＷ１６３４５．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００５２】
「ＣＤ９０」という用語は、抗原ＣＤ９０、またはＴｈｙ−１膜糖タンパク質などの同義語を含む。一例として、ウマＣＤ９０抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＡＣＧ６１２２３．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００５３】
「ＣＤ４４」という用語は、一般的にＣＤ４４として知られる抗原、または細胞外マトリックス受容体ＩＩＩ、ＧＰ９０リンパ球ホーミング／接着受容体、ＨＵＴＣＨ−Ｉ、エルメス抗原、ヒアルロン酸受容体、貪食糖タンパク質１などの同義語を含む。一例として、ウマＣＤ４４抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＣＡＡ４７３３１．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００５４】
前記ＭＳＣマーカーの検出のための例示的な市販の抗体試薬は、とりわけモノクローナル抗体、抗ＣＤ１０５−ＲＰＥ（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、および抗ＣＤ９０（ＶＭＤＲ）を含む。ＣＤ１０５、ＣＤ４４、またはＣＤ９０に特異的に結合する代替抗体は、当業者によって同定されることができる。
【００５５】
本明細書に挙げられているマイクロＲＮＡは、一般に知られており、とりわけｍｉＲＢａｓｅデータベース（http://www.mirbase.org）などの公開データベースから取得できる。「ｍｉＲ−１２８」という用語は、ｍｉＲ−１２８として知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−１２８のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８２１にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。「ｍｉＲ−１３３Ｂ」という用語は、ｍｉＲ−１３３Ｂとして知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−１３３Ｂのヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８４４にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。「ｍｉＲ−６５６」という用語は、ｍｉＲ−６５６として知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−６５６のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２９１５にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。当業者は、マイクロＲＮＡが異なる名前または同義語で参照されることをよく知っている。
【００５６】
「細胞集団」という用語は一般に、細胞のグループ化を指す。細胞集団は、少なくとも共通のタイプの、または共通の特徴を有する細胞の画分からなるか、またはそれを含んでもよい。そのような特徴は、限定はされないが、形態学的特徴、分化の可能性（例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、単能性など、例えば、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または単能性の場合、特定の細胞タイプに分化する能力）、または１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の細胞関連マーカー、例えば表面抗原の存在および／またはレベルを含めてもよい。したがって、そのような特徴は、細胞集団またはその一部を定義し得る。好ましくは、そのような細胞集団は、間葉系幹細胞集団であり、より好ましくは間葉系幹細胞の実質的に均質な集団である。
【００５７】
「密度勾配遠心分離」という表現は、細胞の密度ベースの分離を含む、あらゆるタイプの細胞分離技術または製品を含む。非限定的な例は、ショ糖ポリマーまたはコロイドシリカの勾配における密度勾配遠心分離であり得る。市販の勾配の非限定的な例は、パーコール（ポリビニルピロリドンまたはシランでコーティングされたコロイドシリカ）、フィコール（高分子量スクロースポリマー）、フィコール−パック（フィコール＋ジアトリゾ酸ナトリウムおよびエデト酸カルシウム二ナトリウム）、浮力密度溶液（ＢＤＳ、コロイドシリカを含む）、リンホプレップ（ジアトリゾ酸ナトリウムおよび多糖類）などである。
【００５８】
所望の発現プロファイルを有する生細胞は、それぞれのマーカーに特異的な試薬（最も一般的には、例えばモノクローナル抗体などの免疫学的試薬）と結合することができ、前記試薬は、そのように結合されていない細胞から前記試薬によって結合された細胞の選択または捕捉を容易にするように、順番に（例えば、フルオロフォア、または磁性粒子あるいは別のタイプの固定相による固定化によって）修飾される。これらの方法に関する一般的なガイダンスについて、フローサイトメトリーおよび細胞分類、第２版、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  １９９９  （ＩＳＢＮ  ３５４０６５６３０８）；現実のままに：フローサイトメトリーおよび細胞分類におけるプロトコル、第１版、ＲＡ  ＤｉａｍｏｎｄおよびＳ  Ｄｅｍａｇｇｉｏ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２０００（ＩＳＢＮ  ３５４０６５１４９７）；フローサイトメトリープロトコル（分子生物学における方法）、第２版、ＴＳ  ＨａｗｌｅｙおよびＲＧ  Ｈａｗｌｅｙ（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４（ＩＳＢＮ  １５８８２９２３５５）；アフィニティ分離：実践的アプローチ、Ｐ  Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７（ＩＳＢＮ  ０１９９６３５５０１）；およびＤａｉｎｉａｋ他  ２００７．Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０６：１−１８を参照する。
【００５９】
「適切な培養培地」という表現は、細胞間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹細胞集団の生存および／または成長をサポートするすべての細胞培養培地を包含する。非限定的な例は、ＤＦ２０、ＤＭＥＭ−ＨａｍのＦ１２、ＤＭＥＭ、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭなどであり、必要に応じて抗真菌剤と緩衝液を追加する。一例としてのみ、次の培地：約２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンホテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）および約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含むＤＦ２０培地である。他の例は、ＣＴＳ（商業名）およびＴｈｅｒａｐｅａｋ（商業名）培地である。
【００６０】
例えば脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞への分化のため、前駆細胞は、適切な「分化培地」で培養される。前記分化培地は、例えば、脂肪生成分化用：ＮＨ  ＡｄｉｐｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、軟骨形成分化用：軟骨細胞分化培地（ＮＨ  ＣｈｏｎｄｒｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、骨形成分化用：骨形成培地（ＮＨ  ＯｓｔｅｏＤｉｆｆ  Ｍｅｄｉｕｍ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）である。本明細書に挙げられた培地は、例示的な培地として単に示されているだけであるが、当業者は、他の市販のまたは特別に開発された分化培地を使用することができる。筋原細胞、造血細胞、内皮細胞、神経細胞、心臓細胞、または肝細胞などの他の細胞に適した分化培地の他の例は、それぞれ適切な筋原、造血、内皮、ニューロン、心臓、または肝細胞分化培地中にて、前駆細胞を培養することにより行われ、その例は例えばＵｓａｓら、２０１１に記載されている。
【００６１】
細胞を「分離する」、「分散する」、「解離する」または「切り離す」適切な方法は、当技術分野で一般的に知られており、本発明で使用することができる。これらは、例えば、タンパク質分解酵素による処理、二価イオンのキレート化、機械的解離、または上記のいずれかの組み合わせを含む。好ましくは、前記細胞解離は、酵素消化、好ましくはトリプシンを使用して（例えば、上記のように）、任意に二価イオンのキレート化と組み合わせて、好ましくはＥＤＴＡを使用して（例えば、上記のように）、および／またはそのように処理した細胞の機械的解離を含んでいてもよい。後者は、例えば、小口径ピペット（例えば、１０００μｌのマイクロピペットチップ）に細胞を繰り返し通過させること、および／または細胞を含む懸濁液の流れを固体表面（例えば、細胞壁に対して）でピペッティングすることを含んでいてもよい。この方法において本発明のＭＳＣを含有する細胞懸濁液を取得することができる。
【００６２】
本発明は、筋肉由来前駆細胞からの分化した軟骨細胞または骨細胞の調製に関してより詳細に説明する。
【実施例】
【００６３】
実施例
【００６４】
ｍｄＰ細胞の分化から分化した軟骨細胞または骨細胞を取得することは、骨疾患に罹患している可能性のある患者の侵襲的で痛みを伴う骨バイオプシーを回避する。
【００６５】
材料および方法
【００６６】
ウマの骨格筋のサンプリング
【００６７】
ウマの骨格筋は、リエージュ大学のウマクリニックの健康なドナーから収集した。実験プロトコルは、リエージュ大学の動物倫理委員会によってレビューおよび承認されている（契約番号ｌ  １６２）。筋肉のマイクロバイオプシーは、ＳｅｒｔｅｙｎおよびＣｅｕｓｔｅｒｓ（２０１５）が報告したように実施した。マイクロバイオプシーの標本は、鎮静剤を使用しない立っている馬の上腕三頭筋（長頭、後頭頂から伸びる垂直線と肩甲骨と上腕骨の関節間の線の交点）から得た。サンプルを、１４ゲージのマイクロバイオプシーニードルとマイクロバイオプシーピストルを用いて取集した。サンプリング部位を剃毛し（１ｃｍ２で十分）、無菌的に調整された、２ｍｌのリドカム２%（キシロカイン、アストラゼネカ、スウェーデン）を皮下注射した。メスの刃Ｎｏ１５の先端を用いて皮膚を切開し、深さ５ｃｍでマイクロバイオプシーのニードルを進めた。不要と思われるので皮膚切開は閉じず、手順全体が１５分以内に完了した。収集後、すぐに、サンプル（筋肉組織１５−２０ｍｇ）を、２０%のウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ；１０５００−０６４）、ペニシリン（１００ＵＩ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー; ＤＥ１７−６０２Ｅ）およびアンホテリシンＢ（１．２５μｇ/ｍｌ）（Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー；１７−８３６Ｅ）を補足したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ダルベッコの改変イーグル培地/ハムのＦ１２（１：１ミックス）、Ｌ−グルタミンを含む１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ；Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー; ＢＥ１２−７１９Ｆ）を含む１０ｍｌの培地に置いた。サンプルは４℃にて培地に保たれ、使用前の制限時間は７２時間を超えていない。
【００６８】
外植片培養を使用したｍｄＰ細胞の分離
【００６９】
筋肉組織の損傷を防ぐために、生検標本は非常に慎重に取り扱わなければならない。無菌装置を使用し、層流フードの下で作業する無菌条件下で、培養の調製を行った。サンプルは、ＰＢＳ中で慎重に解剖して、可能な限り非筋肉組織を除去する前に、３７℃に予熱された５ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＤＰＢＳ、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水０．００９５Ｍ（Ｐ０４）、Ｃａなし、Ｍｇなし、Ｌｏｎｚａ、Ｖｅｒｖｉｅｒｓ、ベルギー；ＢＥ１７−５１２Ｆ）で２回リンスした。その後、残りの筋肉組織を約１ｍｍの長さの辺の非常に小さな断片に分割した。断片を、６ウェルプレートの４ウェルにウェルあたり６または７の割合で分配した。次に、３７℃に予熱した培養液を慎重に１滴ずつ、量が十分と考えられるまで（約１ｍｌ）、ピースをカバーをするために必要とされるまで添加した。実際、培地の欠如は、外植片の乾燥を妨げず、出現する細胞に十分な栄養素を提供しないが、過剰は外植片の付着を防ぎ、したがって浮遊したままである。空のままの２つのウェルは、外植片を含むウェルの乾燥を防ぐために１ｍｌのＰＢＳで満たされている。最終的に、６ウェルプレートを、制御された雰囲気（５%のＣＯ２および２１%のＯ２）で下にて３７℃でインキュベートした。外植片を含むウェルを、毎日モニタリングし、必要に応じて培地を追加した。ウェル内に分泌された成長因子を保持するために、培地は変更しなかった。ＰＢＳを含むウェルは、必要に応じて補充した。
【００７０】
新しく出現した細胞が筋肉組織片の周りにハローを形成すると（約１０日）、壊死を防ぐために外植片を取り除き、細胞に８０%のコンフルエンスに達するまでの時間を追加した（約１０日）。
【００７１】
直接分離されたｍｄＰ細胞の骨形成または軟骨形成分化
【００７２】
細胞が８０%コンフルエンスに達すると、培地を完全に除去し、骨形成または軟骨形成の分化を行った。細胞は、骨形成または軟骨形成分化培地で７〜２１日間維持した。各ウェルには２ｍｌの分化培地を充填し、培地は週に１回完全に交換した。制御された雰囲気（５%のＣＯ２および２１%のＯ２）下で、細胞を３７℃にてインキュベートした。７日後、骨形成分化細胞をＰＢＳにて洗浄し、室温の７０%エタノールで５分間固定した後、Ｈ２Ｏで数回洗浄した。その後、細胞を４０ｍＭ  Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｒｅｄ（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ  ４．２にて室温で１５分間染色し、Ｈ２Ｏでリンスした後、風乾した。赤色染色を光学顕微鏡で調べた。２１日後、軟骨形成分化細胞を７０%エタノールにて室温で５分間固定した後、Ｈ２Ｏで数回洗浄した。その後、細胞をアルシアンブルーで染色し、Ｈ２Ｏでリンスし、風乾した。青色の染色を光学顕微鏡で調べた。
【００７３】
本発明の方法は、骨疾患を潜在的に患っている患者の痛みを伴う生検を回避し、従来技術と比較して増加した量の軟骨形成細胞または骨形成細胞の産生をさらに可能にする。
【国際調査報告】
2020516241.tif 000002
2020516241.tif 000003
2020516241.tif 000004
2020516241.tif 000005