(57)【要約】  本発明は、酸化LDL受容体LOX-1の酸化LDLへの結合様式の詳細を解明するためにはLOX-1が持つ酸化LDL結合ドメインの立体構造を解明することを課題とする。特に細胞表層上に存在するのと同じ形態を保つ二量体構造としてCTLD結合ドメインの立体構造の解明が最終的な課題となる。結晶化に用いたLOX-1の酸化LDL結合ドメイン（CTLD:C-type lectin-like domain)、および二量体として存在するLOX-1酸化LDL結合ドメインとNECKドメイン（膜貫通部とCTLDをつなぐ領域）を含むタンパク質は、本明細書において開示される方法（特に、酸性pHにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程、および該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンを加える工程を含むことが好ましい、あるいは二量体LOX-1に対しては中性ｐHにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程を含むことが好ましい）に従って大腸菌で大量発現させたタンパク質を巻き戻して得た試料を用いることによって得られた結晶を得、種々得られた結晶を解析することによって解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程；
ｂ）酸性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程；
ｃ）該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンを加える工程；および
ｄ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記緩衝液は、クエン酸緩衝液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イオンの供給源は、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
【請求項５】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
【請求項６】
前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
【請求項７】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項８】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項９】
前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項１０】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
を含む、プログラム。
【請求項１１】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１２】
前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１３】
前記アプリケーションは、
Ａ）前記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させる、請求項１０に記載のプログラム。
【請求項１４】
図７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【請求項１５】
前記タンパク質は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性を含む、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【請求項１６】
前記タンパク質は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を有する、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【請求項１７】
Ｐ２１２１２１斜方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
【請求項１８】
前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項１７に記載の結晶。
【請求項１９】
前記結晶は、ａ＝６２．８±０．２Å、ｂ＝６９．１±０．２Å、ｃ＝７９．３±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項１７に記載の結晶。
【請求項２０】
前記結晶は、非対称単位中に２分子を有し、カルシウムイオンまたは亜鉛イオンを有する、請求項１７に記載の結晶。
【請求項２１】
Ｐ４１２１２１正方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
【請求項２２】
前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項２１に記載の結晶。
【請求項２３】
前記結晶は、ａ＝６４．４±０．２Å、ｂ＝６４．４±０．２Å、ｃ＝７９．８±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項２１に記載の結晶。
【請求項２４】
前記結晶は、非対称単位中に１分子を有し、白金を含む、請求項２１に記載の結晶。
【請求項２５】
Ｐ２１２１２１斜方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
【請求項２６】
前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項２５に記載の結晶。
【請求項２７】
前記結晶は、ａ＝５６．８±０．２Å、ｂ＝６７．６±０．２Å、ｃ＝７９．０±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項２５に記載の結晶。
【請求項２８】
前記結晶は、非対称単位中に２分子を有する、請求項２５に記載の結晶。
【請求項２９】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質。
【請求項３０】
前記活性ポケットは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものである、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３１】
前記活性ポケットは、図８においてアセチル化ＬＤＬの有無の前後での変化に対応する配列番号１８におけるアミノ酸残基またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３２】
前記活性ポケットは、配列番号４の２０８位〜２３１位またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３３】
前記活性部位ポケットは、結合リガンドを含む、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３４】
前記タンパク質は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を有する、請求項２９に記載のタンパク質。
【請求項３５】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３９】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３５または３８に記載の方法によって同定される、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体。
【請求項４２】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記改変体は、ＬＯＸ−１活性が亢進されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記改変体は、ＬＯＸ−１活性が低減されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４２に記載の方法によって同定された、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体。
【請求項４８】
請求項３５もしくは３８に記載の方法によって同定されたＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体のアミノ酸配列、または請求項４２に記載の方法によって同定されたＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項４９】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程ａ）において決定された空間座標は、配列番号１８に示されるアミノ酸残基またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程ａ）において決定された空間座標は、アセチルＬＤＬの座標を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記工程ａ）において決定された空間座標は、図７に記載される結合リガンドの原子座標を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５８】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記候補化合物は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を阻害する活性を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記候補化合物は、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合活性を活性化する活性を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
請求項５７に記載の方法により同定された、化合物。
【請求項６５】
請求項５７に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
【請求項６６】
請求項５７に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項６７】
請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
【請求項６８】
請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
【請求項６９】
請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
【請求項７０】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントおよび該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとアセチル化ＬＤＬとの複合体を提供する工程；
ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＮＭＲと該複合体のＮＭＲとを比較する工程；
ｃ）変化がある原子を帰属する工程、
を包含する、方法。
【請求項７１】
請求項７０に記載の方法によって同定される、ファルマコフォアモデル。
【請求項７２】
請求項７１に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
【請求項７３】
請求項７１に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定される化合物またはその塩。
【請求項７４】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を阻害する活性を有する、請求項７３に記載の医薬候補分子。
【請求項７５】
請求項７３または７４に記載の化合物を含む、医薬組成物。
【請求項７６】
ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルと、該医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
Ｃ）該候補化合物のうち、該ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
Ｄ）該化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
を包含する、方法。
【請求項７７】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記化合物種を合成して該化合物種を製造する工程、をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記化合物種について、ＬＯＸ−１活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８３】
ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１の活性を調節する手段を同定する工程；および
Ｃ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項８４】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記相同体または改変体は、請求項３２、３５または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８７】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８８】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項８９】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項９０】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する手段、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項９１】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項９２】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項９３】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項９４】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項９５】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項９６】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項９７】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項９８】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項９９】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項１００】
候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項１０１】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項１０２】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項１０３】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体またはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体を発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程であって、該ＬＯＸ−１は、ジスルフィド結合に必要なシステイン残基を含む、工程および
ｂ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、
を包含する、方法。
【請求項１０４】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ＮＥＣＫ領域部またはその一部を含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ＣＴＬＤと、ＮＥＣＫ領域部１４残基（ＮＬＱＥＴＬＫＲＶＡＮＣＳＡ）とを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記タンパク質を含む溶液は、巻き戻し条件に供される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
【請求項１０８】
前記原子座標は、図１７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項１０７に記載のデータアレイ。
【請求項１０９】
二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
【請求項１１０】
二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
を含む、プログラム。
【請求項１１１】
二量体形態での、図１７記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
【請求項１１２】
Ｃ２単斜晶形、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
【請求項１１３】
前記結晶は、ａ＝７０．８６±０．２０Å、ｂ＝４９．５４±０．２０Å、ｃ＝７６．７３±０．２０Åの単位格子定数を有する、請求項１７に記載の結晶。
【請求項１１４】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体界面に存在するキャビティー構造を含む、タンパク質。
【請求項１１５】
前記タンパク質は、配列番号３６に示す配列を含む、請求項１１４に記載のタンパク質。
【請求項１１６】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体界面の原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
【請求項１１７】
前記二量体は、図１７記載の原子座標によって定義される構造を有する、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１１９】
前記二量体は、図１７記載の原子座標によって定義される構造を有する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１１６または１１８に記載の方法によって同定される、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体。
【請求項１２１】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の改変体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２２】
前記二量体は、図１７記載の原子座標によって定義される構造を有する、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１２１に記載の方法によって同定された、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体。
【請求項１２４】
請求項１１６もしくは１１８に記載の方法によって同定された、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体のアミノ酸配列、または請求項１２１に記載の方法によって同定された二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
【請求項１２５】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２６】
前記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記化合物はＬＯＸ−１活性を、亢進または低減させるものである、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号３６に示す配列を含む、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２９】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）が保存される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３０】
前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）を含むキャビティー形成部分が保存される、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１３１】
候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３２】
前記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
請求項１２５または１３１に記載の方法によって同定された化合物。
【請求項１３４】
請求項１２５または１３１に記載の方法によって同定された化合物を有効成分として含む、ＬＯＸ−１に関連する疾患を処置または予防するための医薬組成物。
【請求項１３５】
請求項１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
【請求項１３６】
請求項１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
【請求項１３７】
請求項１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
【請求項１３８】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、
ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体、および二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を提供する工程；
ｂ）該二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体のＮＭＲと該二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体のＮＭＲとを比較する工程；
ｃ）変化がある原子を帰属する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３９】
ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルと、該医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
Ｃ）該候補化合物のうち、該ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
Ｄ）該化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４０】
前記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１の活性を調節する手段を同定する工程；および
Ｃ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４２】
前記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項１４４】
ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項１４５】
ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【請求項１４６】
候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
【請求項１４７】
候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
【請求項１４８】
候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品および立体構造の分野に関する。より詳細には、本発明は、酸化ＬＤＬ（Ｌｏｗ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体ＬＯＸ−１の新規結晶および医薬探索におけるその利用に関する。【０００２】
より詳細には、本発明は、動脈硬化の予防または治療のための医薬開発に有用な酸化ＬＤＬ受容体タンパク質の酸化ＬＤＬ認識ドメインの結晶およびこの結晶を用いてＸ線結晶構造解析により得られた酸化ＬＤＬ認識ドメインの立体構造に関する。【０００３】
以下に本発明の詳細な説明を記載する。
【背景技術】
【０００４】
動脈硬化は、狭心症、心筋梗塞、閉塞性動脈硬化症、脳血管障害、腎不全を引き起こし、生命を危機にさらす血管病である。血管の動脈硬化性変化は年齢と共に漸次進行する血管の「老化」と言われるが、これは上記の様々な疾病の原因となるために老齢の人の生活の質を脅かす元凶であり、動脈硬化症の予防・治療法の開発は高齢化社会にある現代においては重要な課題である。動脈硬化発症には血液中の酸化ＬＤＬ（低密度リポタンパク質）が主要な原因物質であることが分かっている。血液中の酸化ＬＤＬ含量は動脈硬化罹患者では健常者よりも明らかに高いことが知られており、血液中の酸化ＬＤＬ含量は動脈硬化診断の際のリスクマーカーとされている（非特許文献４：Suzuki，T．et al.，Clinical Biochemistry 35，347-353 (2002)）。血液中の酸化ＬＤＬは血管内皮細胞上にある酸化ＬＤＬ受容体であるＬＯＸ−１に結合することで血管内皮細胞中にはＲＯＳ（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ）が増加し酸化ストレス応答反応が誘導される（非特許文献５：Cominacini，L．et al.，J．Biol．Chem．275，12633-12638 (2000)）。ＲＯＳによる酸化ストレス応答の結果、血管内皮細胞上にある細胞接着タンパク質（ＩＣＡＭ−１など）の発現量の増加が誘導される。細胞表層上に細胞接着タンパク質が増えることにより血液中の単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）の血管内皮細胞上への滞留が増加することになる（非特許文献６：Am J Physiol Cell Physiol．280，C719-C741 (2001)）。酸化ストレス応答は同時に血管壁を形成する血管内皮細胞間に介在するｃａｄｈｅｒｉｎを内在化させるために血管内皮細胞間のつながりが弱まり血管壁に間隙が生じることになる。細胞接着タンパク質の増産により血管壁上に大量に滞留している単球は、ｃａｄｈｅｒｉｎ内在化によって顕在化した血管壁の間隙を通して血管内皮組織に容易に侵入できるようになり血管内皮組織中での単球の滞留が増えることになる（非特許文献７：Khan BV et al.，J Clin Invest，95，1262-1270 (1995)）。同時に、この血管壁の間隙をとおして血液中のＬＤＬも血管内皮組織中に大量に侵入することになる。抗酸化物質が多く存在する血液中とは異なり、血管内皮組織に入り込んだＬＤＬは容易に酸化され酸化ＬＤＬが大量に血管内皮組織中に形成される。酸化ＬＤＬは血管内皮組織に進入した単球をマクロファージに分化させると同時に、マクロファージをさらに増殖させる働きを持つ  （非特許文献８：Martens，JS et al．J．Biol．Chem．274，10903-10910 (1999)）。マクロファージ表層にあるスカベンジャー受容体（ＣＤ３６，ＬＯＸ−１など）との結合を通してマクロファージは血管内皮組織中で形成された酸化ＬＤＬを再現なく取り込み、最終的にマクロファージは細胞中にコレステロールを大量に溜め込んだ泡沫化細胞となり、最終的には破裂して血管内皮組織中に炎症反応を誘導することになる（非特許文献９：Krieger，M．J．Biol．Chem．268，4569-4572 (1993)）。血管内皮細胞上にあるＬＯＸ−１は酸化ＬＤＬとの結合により同様の酸化ストレス応答を介して、血管内皮細胞上のＬＯＸ−１の発現も増加させることが知られており、酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１への結合に始まる上記の血管内皮細胞応答は自励的に進行する可能性があると考えられる。またＬＯＸ−１には細胞接着活性もあることが知られて��るので、血管内皮細胞上にＬＯＸ−１が多く提示されることで血液中の単球を血管壁への滞留をも促すことになり、血管内皮組織中への単球の侵入を促進することにもつながる。この点でもＬＯＸ−１は動脈硬化発症を自励的に促進する作用をもつということができる。【０００５】
ＬＯＸ−１は上記のように血管内皮細胞上およびマクロファージ上に大量に存在するだけではなく、血管平滑筋細胞上にも多く存在しており、血管内皮組織中で生じた酸化ＬＤＬは血管平滑筋上のＬＯＸ−１と結合することで血管平滑筋細胞に対してアポトーシスを誘導することが明らかにされている（非特許文献１０：Kataoka，H．et al.，Arteriosclear Thromb Vasc Biol．21，955-960 (2001)）。すなわち動脈硬化発症の初期過程の誘導からマクロファージの泡沫化、平滑筋細胞アポトーシス誘導までの全ての発症過程にＬＯＸ−１は関わっている。【０００６】
上記のような動脈硬化発症過程におけるＬＯＸ−１の役割を考えるに酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１に対する結合阻害剤は動脈硬化発症の予防あるいは動脈硬化初期症状に対する予防あるいは治療薬になることが期待される。酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１の阻害剤開発にはＬＯＸ−１がどのように酸化ＬＤＬを認識するかを原子座標レベルで解析する必要があるが、現在までのところＬＯＸ−１を含む酸化ＬＤＬ受容体の立体構造は明らかにされていない。【０００７】
そのような立体構造を明らかにするために、所望のタンパク質を大量に調製し、結晶を生成するための方法として、タンパク質の組換え発現法が周知である。組換え発現によって、天然の供給源からの大量調製が困難であるタンパク質についても、大量に調製することが可能となった。【０００８】
例えば、細胞表面に存在する受容体は、その受容体に対応するリガンドと特異的に結合し、種々のシグナルを細胞内に伝達するタンパク質であり、細胞あたりの発現量が少ないため、天然の供給源から大量に調製することが困難であるが、組換え発現法を用いれば大量に調製することが可能である。【０００９】
細胞表面に存在する受容体は多様であり、その対応するリガンドも異なることから、特定のリガンドの検出および／または定量を行うために、そのリガンドに特異的に結合する受容体を大量に調製して用いることは有用である。大量に調製した受容体または受容体フラグメントを固相に固定化して、異常細胞または疾患の診断マーカーをリガンドとする受容体チップを作製することにより、細胞集団中の異常細胞の存在の検出、または、疾患の診断のための有用なツールを提供できることが、予想される。例えば、生体内に蓄積した変性ＬＤＬやアポトーシス細胞や老化赤血球などの異常細胞、並びに生体内に侵入した細菌等を認識して結合する能力のある複数の受容体の存在が発見されている。このような受容体の中には、認識する対象（リガンド）の認識に必要な領域が予想されているものも多い。これらの受容体そのもの、あるいは認識に必要な領域のみを利用すれば、リガンドである変性ＬＤＬ、アポトーシス細胞などの異常な細胞、細菌を簡便に検出できる可能性がある。【００１０】
また、受容体とその対応するリガンドとの結合が特異的であることから、大量発現した受容体またはそのリガンド結合性フラグメントを固相に固定化し、リガンドを除去する材料を提供することが可能である。例えば、変性ＬＤＬに対する受容体を用いて、血中の変性ＬＤＬを除去することにより、変性ＬＤＬ動態異常に起因する動脈硬化症、高脂血症などの疾患を治療することが可能である。【００１１】
タンパク質を組換え発現するために用いる種々の宿主細胞およびベクターが周知である。組換え発現の宿主細胞としては、細菌細胞、動物細胞、植物細胞、真菌細胞などが挙げられる。なかでも、大腸菌のような細菌細胞は、その増殖速度が速く、かつ操作が比較的簡便であり、かつ調製コストが安いため、宿主細胞として広く利用されており、特に工業的規模での生産に適している。しかし、大腸菌において外来遺伝子を高発現した場合には、産物タンパク質が不溶性物質として細胞内に封入体として蓄積される場合が多い。この封入体は、不溶性であり、かつ封入体タンパク質の立体構造は天然の状態のタンパク質の立体構造とは異なるため、可溶化およびリフォールディングを必要とする。【００１２】
ところが、従来のリフォールディング方法は、例えば、受容体を樹脂に吸着させた後、吸着させた樹脂を変性剤を含有する緩衝溶液と接触させ、次いで変性剤の濃度を漸次低下させた緩衝溶液と接触させる（特許文献１：特開２００３−１６９６９３号）というように、いずれも煩雑な方法であった。さらに、固相に固定化された状態でリフォールディングした場合は、リフォールディング後に固相からの溶出や切り出しなどの工程を経る必要があり、煩雑さを増すと共に収率が低下するなどの問題があった。さらに、界面活性剤を用いる従来のリフォールディング方法（特許文献２：特開２００２−３０６１６３号）では、使用した界面活性剤をリフォールディングしたタンパク質から除去することが困難であるという問題も生じる。そのため、従来法では、可溶化およびリフォールディング工程において使用する物質がリフォールディングしたタンパク質中に混入することによる純度の低下、および不完全にリフォールディングされたタンパク質の存在による不均一さが問題となっている。【００１３】
この純度の低下および不均一さは、天然のタンパク質と比較した場合のリフォールディングしたタンパク質の比活性の低さとして検出することができる。実際に、従来法では、リフォールディングしたタンパク質が必ずしも１００％の比活性を示すことはない（非特許文献１〜３：Daugherty,D.L．et al.(1998)J.Biol.Chem.273、33961~33971；Sundari,C.S．et al.(1999)FEBS,Lett.、443、215~219；およびMachida,S．et al.(2000)FEBS,Lett.、486、131~135）。【００１４】
例えば、受容体のリガンド結合フラグメントをリフォールディングし、リガンド検出のための受容体チップとして利用する場合、従来のリフォールディング方法を用いると高純度かつ均質なリフォールディングタンパク質の調製ができないため、定性的検出および定量的検出における感度の低下を生じる。また、受容体のリガンド結合フラグメントをリフォールディングし、例えば、血中に存在するリガンドの除去のための材料として利用する際に、リフォールディングしたタンパク質の純度および均質性が低い場合には、血中の他の因子との相互作用によって、目的とするリガンド以外の物質を除去することとなる。【００１５】
従って、従来法と比較して、より高純度かつ均質なタンパク質を得るためのリフォールディング方法、特に、封入体からリフォールディングしたタンパク質を調製し、それによって、ＬＯＸ−１の結晶構造を解析する技術およびそれによって得られたＬＯＸ−１の結晶構造に対する需要が高まっている。
【特許文献１】特開２００３−１６９６９３号
【特許文献２】特開２００２−３０６１６３号
【非特許文献１】Daugherty,D.L．et al.(1998)J.Biol.Chem.273、33961~33971
【非特許文献２】Sundari,C.S．et al.(1999)FEBS,Lett.、443、215~219
【非特許文献３】Machida,S．et al.(2000)FEBS,Lett.、486、131~135
【非特許文献４】Suzuki，T．et al.，Clinical Biochemistry 35，347-353 (2002)
【非特許文献５】Cominacini，L．et al.，J．Biol．Chem．275，12633-12638 (2000)
【非特許文献６】Am J Physiol Cell Physiol．280，C719-C741 (2001)
【非特許文献７】Khan BV et al.，J Clin Invest，95，1262-1270 (1995)
【非特許文献８】Martens，JS et al．J．Biol．Chem．274，10903-10910 (1999)
【非特許文献９】Krieger，M．J．Biol．Chem．268，4569-4572 (1993)
【非特許文献１０】Kataoka，H．et al.，Arteriosclear Thromb Vasc Biol．21，955-960 (2001)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
（発明の要旨）
本発明は、酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬへの結合様式の詳細を解明するためにはＬＯＸ−１が持つ酸化ＬＤＬ結合ドメインの立体構造を解明することを課題とする。特に細胞表層上に存在するのと同じ形態を保つ二量体構造としてＣＴＬＤ結合ドメインの立体構造の解明が最終的な課題となる。結晶化に用いたＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン（ＣＴＬＤ：Ｃ−ｔｙｐｅ  ｌｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ）、および二量体として存在するＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインとＮＥＣＫドメイン（膜貫通部とＣＴＬＤをつなぐ領域）を含むタンパク質は、本明細書において開示される方法（特に、酸性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程、および該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンを加える工程を含むことが好ましい、あるいは二量体ＬＯＸ−１に対しては中性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程を含むことが好ましい）に従って大腸菌で大量発現させたタンパク質を巻き戻して得た試料を用いることによって得られた結晶を得、種々得られた結晶を解析することによって解決される。【００１７】
本発明の課題は、酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬへの結合様式の詳細を解明するためにはＬＯＸ−１がもつ酸化ＬＤＬ結合ドメインの立体構造を解明することにある。そのためにはＸ線結晶構造解析法の適用が必須である。この目的のためにＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインの高分解能回折像を与える結晶の作成が必要である。そこで本発明者らは、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合ドメインの大量調製を行い高分解能Ｘ線回折像を与える結晶形をもつＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメインの結晶化し原子レベルでのＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメインの立体構造を明らかにすることを課題とする。さらに、本発明は、ＬＯＸ−１に結合し、その活性を阻害または活性化することができる化合物をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、結晶化に用いたＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬ結合ドメイン（ＣＴＬＤ：Ｃ  Ｔｙｐｅ  Ｌｅｃｔｉｎ  ｌｉｋｅ  Ｄｏｍａｉｎ）は、本発明者らの特願２００３−３４２６４５において開示され本明細書において開示される方法に従って大腸菌で大量発現させたタンパク質をまき戻して得た試料を用いることによって得られた結晶を得、種々得られた結晶を解析することによって上記課題を解決した。本発明者らは、この方法を用いて、メチオニンがセレノメチオニンに置換されているＬＯＸ−１  ＣＴＬＤフラグメントのａ＝６２．８Å，ｂ＝６９．１Å，ｃ＝７９．３Åの単位格子をもつＰ２１２１２１斜方晶形をもつＬＯＸ−１酸化ＬＤＬ結合ドメイン（ＣＴＬＤ）がこのタンパク質巻き戻し技術により得られたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤの純度を示す実例として報告し、さらに、異なる結晶条件から得られた、天然のアミノ酸からなるＬＯＸ−１  ＣＴＬＤの結晶およびその立体構造を提供する。【００１９】
例示であり、限定されない形態として、ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程；  ｂ）酸性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程；ｃ）該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンの供給源を加える工程；およびｄ）蒸気拡散法により結晶を得る工程によって上記課題は解決される。【００２０】
さらに、細胞表層上に存在するのと同じ形態であるdisulfide結合による二量体構造を保持したLOX-1のリガンド結合ドメインの結晶および構造を提供することによって、上記課題を解決する。加えて、天然の二量体構造を保持するLOX-1結晶構造中の二量体界面に存在するキャビティー構造と、キャビティー近傍に存在するアミノ酸置換体が劇的なLOX-1の修飾LDLに対して結合能を失わせたという発見。このことから、二量体界面部に存在するキャビティーがLOX-1特異的阻害剤の標的部位になる可能性が示唆される。【００２１】
従って、本発明は以下を提供する。【００２２】
（１）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程；
ｂ）酸性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程；
ｃ）該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンを加える工程；および
ｄ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、
を包含する、方法。
（２）前記緩衝液は、クエン酸緩衝液である、請求項１に記載の方法。
（３）前記イオンの供給源は、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛である、請求項１に記載の方法。
（４）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
（５）前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
（６）前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項４に記載のデータアレイ。
（７）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
（８）前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
（９）前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項７に記載のコンピューター読み取り可能な記録媒体。
（１０）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
を含む、プログラム。
（１１）前記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
（１２）前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその相同体もしくは改変体である、請求項１０に記載のプログラム。
（１３）前記アプリケーションは、
Ａ）前記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させる、請求項１０に記載のプログラム。
（１４）図７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
（１５）前記タンパク質は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性を含む、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
（１６）前記タンパク質は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を有する、請求項１４に記載のタンパク質またはその相同体もしくは改変体。
（１７）Ｐ２１２１２１斜方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
（１８）前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項１７に記載の結晶。
（１９）前記結晶は、ａ＝６２．８±０．２Å、ｂ＝６９．１±０．２Å、ｃ＝７９．３±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項１７に記載の結晶。
（２０）前記結晶は、非対称単位中に２分子を有し、カルシウムイオンまたは亜鉛イオンを有する、請求項１７に記載の結晶。
（２１）Ｐ４１２１２１正方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
（２２）前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項２１に記載の結晶。
（２３）前記結晶は、ａ＝６４．４±０．２Å、ｂ＝６４．４±０．２Å、ｃ＝７９．８±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項２１に記載の結晶。
（２４）前記結晶は、非対称単位中に１分子を有し、白金を含む、請求項２１に記載の結晶。
（２５）Ｐ２１２１２１斜方晶形、および配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
（２６）前記結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項２５に記載の結晶。
（２７）前記結晶は、ａ＝５６．８±０．２Å、ｂ＝６７．６±０．２Å、ｃ＝７９．０±０．２Åの単位格子定数を有する、請求項２５に記載の結晶。
（２８）前記結晶は、非対称単位中に２分子を有する、請求項２５に記載の結晶。
（２９）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質。
（３０）前記活性ポケットは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものである、請求項２９に記載のタンパク質。
（３１）前記活性ポケットは、図８においてアセチル化ＬＤＬの有無の前後での変化に対応する配列番号１８におけるアミノ酸残基またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２９に記載のタンパク質。
（３２）前記活性ポケットは、配列番号４の２０８位〜２３１位またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項２９に記載のタンパク質。
（３３）前記活性部位ポケットは、結合リガンドを含む、請求項２９に記載のタンパク質。
（３４）前記タンパク質は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を有する、請求項２９に記載のタンパク質。
（３５）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
（３６）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項３５に記載の方法。
（３７）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項３５に記載の方法。
（３８）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程
を包含する、方法。
（３９）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項３８に記載の方法。
（４０）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項３８に記載の方法。
（４１）請求項３５または３８に記載の方法によって同定される、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体。
（４２）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、方法。
（４３）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項４２に記載の方法。
（４４）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項４２に記載の方法。
（４５）前記改変体は、ＬＯＸ−１活性が亢進されている、請求項４２に記載の方法。
（４６）前記改変体は、ＬＯＸ−１活性が低減されている、請求項４２に記載の方法。
（４７）請求項４２に記載の方法によって同定された、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体。
（４８）請求項３５もしくは３８に記載の方法によって同定されたＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体のアミノ酸配列、または請求項４２に記載の方法によって同定されたＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
（４９）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
（５０）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項４９に記載の方法。
（５１）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項４９に記載の方法。
（５２）前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項４９に記載の方法。
（５３）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項４９に記載の方法。
（５４）前記工程ａ）において決定された空間座標は、配列番号１８に示されるアミノ酸残基またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される、請求項４９に記載の方法。
（５５）前記工程ａ）において決定された空間座標は、アセチルＬＤＬの座標を含む、請求項４９に記載の方法。
（５６）前記工程ａ）において決定された空間座標は、図７に記載される結合リガンドの原子座標を含む、請求項４９に記載の方法。
（５７）候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、方法。
（５８）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項５７に記載の方法。
（５９）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項５７に記載の方法。
（６０）前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項５７に記載の方法。
（６１）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項５７に記載の方法。
（６２）前記候補化合物は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を阻害する活性を有する、請求項５７に記載の方法。
（６３）前記候補化合物は、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合活性を活性化する活性を有する、請求項５７に記載の方法。
（６４）請求項５７に記載の方法により同定された、化合物。
（６５）請求項５７に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、医薬組成物。
（６６）請求項５７に記載の方法により同定された化合物を有効成分として含む、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物。
（６７）請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
（６８）請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
（６９）請求項５７に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
（７０）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントおよび該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとアセチル化ＬＤＬとの複合体を提供する工程；
ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＮＭＲと該複合体のＮＭＲとを比較する工程；
ｃ）変化がある原子を帰属する工程、
を包含する、方法。
（７１）請求項７０に記載の方法によって同定される、ファルマコフォアモデル。
（７２）請求項７１に記載のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用。
（７３）請求項７１に記載のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定される化合物またはその塩。
（７４）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＬＤＬ結合活性を阻害する活性を有する、請求項７３に記載の医薬候補分子。
（７５）請求項７３または７４に記載の化合物を含む、医薬組成物。
（７６）ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルと、該医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
Ｃ）該候補化合物のうち、該ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
Ｄ）該化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
を包含する、方法。
（７７）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項７６に記載の方法。
（７８）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項７６に記載の方法。
（７９）前記相同体または改変体は、請求項３５、３８または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項７６に記載の方法。
（８０）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項７６に記載の方法。
（８１）前記化合物種を合成して該化合物種を製造する工程、をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。
（８２）前記化合物種について、ＬＯＸ−１活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する、請求項７６に記載の方法。
（８３）ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１の活性を調節する手段を同定する工程；および
Ｃ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
（８４）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている、請求項８３に記載の方法。
（８５）前記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む、請求項８３に記載の方法。
（８６）前記相同体または改変体は、請求項３２、３５または４２に記載の方法によって得られたものである、請求項８３に記載の方法。
（８７）前記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒトのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む、請求項８３に記載の方法。
（８８）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程、
を包含する、
プログラム。
（８９）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程、
を包含する、記録媒体。
（９０）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する手段、
を包含する、
コンピュータ。
（９１）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、プログラム。
（９２）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、記録媒体。
（９３）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、
を包含する、コンピュータ。
（９４）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、プログラム。
（９５）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、
記録媒体。
（９６）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、コンピュータ。
（９７）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、プログラム。
（９８）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、記録媒体。
（９９）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；および
Ｂ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、コンピュータ。
（１００）候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、プログラム。
（１０１）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、記録媒体。
（１０２）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、コンピュータ。
（１０３）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体またはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、
ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体を発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程であって、上記ＬＯＸ−１は、ジスルフィド結合に必要なシステイン残基を含む、工程および
ｂ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、
を包含する、方法。
（１０４）  上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ＮＥＣＫ領域部を含む、項目１０３に記載の方法。
（１０５）  上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ＣＴＬＤと、ＮＥＣＫ領域部１４残基とを含む、項目１０３に記載の方法。
（１０６）  上記タンパク質を含む溶液は、巻き戻し条件に供される、項目１０３に記載の方法。
（１０７）  二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで上記データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイ。
（１０８）  上記原子座標は、図１７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である、項目１０７に記載のデータアレイ。
（１０９）  二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体。
（１１０）  二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；および
Ｂ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、
を含む、プログラム。
（１１１）  二量体形態での、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体。
（１１２）  Ｃ２単斜晶形、および配列番号３６に示されるアミノ酸配列、または上記アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは上記アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶。
（１１３）  上記結晶は、ａ＝７０．８６±０．２０Å、ｂ＝４９．５４±０．２０Å、ｃ＝７６．７３±０．２０Åを有する、項目１７に記載の結晶。
（１１４）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体界面に存在するキャビティー構造を含む、タンパク質。
（１１５）  上記タンパク質は、配列番号３６に示す配列を含む、項目１１４に記載のタンパク質。
（１１６）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、上記方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体界面の原子座標とを比較する工程を包含する、方法。
（１１７）  上記二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、項目１１６に記載の方法。
（１１８）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較する工程
を包含する、方法。
（１１９）  上記二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、項目１１８に記載の方法。
（１２０）  項目１１６または１１８に記載の方法によって同定される、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体。
（１２１）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の改変体を得る方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および
Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、
を包含する、方法。
（１２２）  上記二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、項目１２１に記載の方法。
（１２３）  項目１２１に記載の方法によって同定された、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体。
（１２４）  項目１１６もしくは１１８に記載の方法によって同定された、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体のアミノ酸配列、または項目１２１に記載の方法によって同定された二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子。
（１２５）  ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記ＬＯＸ−１の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、方法。
（１２６）  上記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、項目１２５に記載の方法。
（１２７）  上記化合物はＬＯＸ−１活性を、亢進または低減させるものである、項目１２５に記載の方法。
（１２８）  上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号３６に示す配列を含む、項目１２５に記載の方法。
（１２９）  上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）が保存される、項目１２５に記載の方法。
（１３０）  上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）を含むキャビティー形成部分が保存される、項目１２５に記載の方法。
（１３１）  候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する方法であって、上記方法は、以下の工程：
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、方法。
（１３２）  上記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、項目１３１に記載の方法。
（１３３）  項目１２５または１３１に記載の方法によって同定された化合物。
（１３４）  項目１２５または１３１に記載の方法によって同定された化合物を有効成分として含む、ＬＯＸ−１に関連する疾患を処置または予防するための医薬組成物。
（１３５）  項目１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベース。
（１３６）  項目１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体。
（１３７）  項目１２５または１３１に記載の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体。
（１３８）    ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、
ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体、および二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を提供する工程；
ｂ）上記二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体のＮＭＲと上記二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体のＮＭＲとを比較する工程；
ｃ）変化がある原子を帰属する工程、
を包含する、方法。
（１３９）    ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルと、上記医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；
Ｃ）上記候補化合物のうち、上記ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；および
Ｄ）上記化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、
を包含する、方法。
（１４０）    上記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、項目１３９に記載の方法。
（１４１）    ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１の活性を調節する手段を同定する工程；および
Ｃ）上記調節手段を上記疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、
を包含する、方法。
（１４２）    上記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む、項目１４１に記載の方法。
（１４３）    ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
（１４４）    ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
（１４５）    ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；および
Ｂ）上記ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。
（１４６）    候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
プログラム。
（１４７）    候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
記録媒体。
（１４８）    候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、上記方法は、
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；
Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；および
Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程、
を包含する、
コンピュータ。【００２３】
従って、本発明のこれらおよび他の利点は、添付の図面を参照して、以下の詳細な説明を読みかつ理解すれば、当業者には明白になることが理解される。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によって、特定のリフォールディング方法を使用したことによって、高解像度のＬＯＸ−１の結晶情報が得られ、その情報を医薬品開発に応用することにより循環器系の疾患が治療および予防ができるという効果が奏される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明のリフォールディング方法で得たタンパク質が、従来法の環状糖質サイクロアミロースによるリフォールディング方法よりも分子量の幅が狭く、従ってより高い純度で精製されていることを示す。
【図２】図２は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質が従来法の環状糖質サイクロアミロースによりリフォールディング方法よりも夾雑物が少なく高純度に精製されていることを示す。
【図３】図３は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質が単一の分子種としてリフォールディングしているのに対して、従来法で得たタンパク質は、不完全なリフォールディングタンパク質が混在していることが示される。
【図４】図４は、本発明のリフォールディング方法によって得たタンパク質には不完全なリフォールディングタンパク質の混在が無いことを示す。
【図５】図５は、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングされたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤが酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが示す。
【図６】図６は、ＬＯＸ−１の細胞外ドメイン全長を本発明のリフォールディング方法でリフォールディングした結果得られたタンパク質が、細胞表層にあるＬＯＸ−１の存在様式と同様に２量体であることを示す。図中、βＭｅ（＋）は、βメルカプトエタノールを添加したことを示す。βＭｅ（−）は、βメルカプトエタノールを添加しなかったことを示す。
【図７−１】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す。
【図７−２】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−３】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−４】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−５】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−６】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−７】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−８】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−９】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１０】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１１】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１２】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１３】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１４】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１５】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１６】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１７】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１８】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−１９】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−２０】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図７−２１】図７は、ＬＯＸ−１の原子座標を示す（つづき）。
【図８】図８は、アセチル化ＬＤＬの有無でのＬＯＸ−１のＮＭＲチャートを示す。
【図９】図９は、結晶化の最適化例を示す。
【図１０】図１０は、結晶化の結果えられた結果を示す。
【図１１】図１１は、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合ドメインを示す。
【図１２】図１２は、本発明のシステム構成例である。
【図１３】図１３は、本発明の記録媒体例である。
【図１４】図１４は、本発明の光学式記録媒体例である。
【図１５】図１５は、種々の由来のＬＯＸ−１のアラインメントを示す。
【図１６】図１６は、本発明の二量体を形成するＣＴＬＤ−ＮＥＣＫを用いた場合のモデル図である。二量体界面において、小さなキャビティが存在し、これが、二量体結合および活性化に重大な役割を果たしているようである。従って、この部位が、薬物の相互作用部位の従来な部位として使用されることが明らかになった。図１６ａ，ｂではＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫの二量体構造の界面部に観測されたキャビティーの存在を示す。このキャビティーを囲む主要なアミノ酸残基であるＷ１５０の変異体が顕著なＬＯＸ−１の酸化ＬＤＬに対する結合活性の低下を誘導したことから、このキャビティーに対して選択的に結合し、なおかつ二量体界面部の構造を乱す化合物はＬＯＸ−１選択的な酸化ＬＤＬ結合阻害剤になると考えられる。図下にはそのイメージ図を示す。なお、この際の結合阻害作用機作としては、二量体界面部の構造が乱れることにより、酸化ＬＤＬ認識面であるＬＯＸ−１の表面部にある塩基性スパイン構造（ｂａｓｉｃ  ｓｐｉｎｅ）（右図）が乱され、ＬＯＸ−１と酸化ＬＤＬとの十分な結合を妨げると考えられる。
【図１７−１】図１７−１は、ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫを用いた場合ＬＯＸ−１の原子座標をｐｄｂ形式で示す。
【図１７−２】図１７−２は、図１７−１の続きである。
【図１７−３】図１７−３は、図１７−２の続きである。
【図１７−４】図１７−４は、図１７−３の続きである。
【図１７−５】図１７−５は、図１７−４の続きである。
【図１７−６】図１７−６は、図１７−５の続きである。
【図１７−７】図１７−７は、図１７−６の続きである。
【図１７−８】図１７−８は、図１７−７の続きである。
【図１７−９】図１７−９は、図１７−８の続きである。
【図１７−１０】図１７−１０は、図１７−９の続きである。
【図１７−１１】図１７−１１は、図１７−１０の続きである。
【図１７−１２】図１７−１２は、図１７−１１の続きである。
【図１７−１３】図１７−１３は、図１７−１２の続きである。
【図１７−１４】図１７−１４は、図１７−１３の続きである。
【図１７−１５】図１７−１５は、図１７−１４の続きである。
【図１７−１６】図１７−１６は、図１７−１５の続きである。
【図１７−１７】図１７−１７は、図１７−１６の続きである。
【図１７−１８】図１７−１８は、図１７−１７の続きである。
【図１７−１９】図１７−１９は、図１７−１８の続きである。
【図１７−２０】図１７−２０は、図１７−１９の続きである。
【図１７−２１】図１７−２１は、図１７−２０の続きである。
【図１７−２２】図１７−２２は、図１７−２１の続きである。
【図１７−２３】図１７−２３は、図１７−２２の続きである。
【図１７−２４】図１７−２４は、図１７−２３の続きである。
【図１７−２５】図１７−２５は、図１７−２４の続きである。
【図１７−２６】図１７−２６は、図１７−２５の続きである。
【図１７−２７】図１７−２７は、図１７−２６の続きである。
【図１７−２８】図１７−２８は、図１７−２７の続きである。
【図１７−２９】図１７−２９は、図１７−２８の続きである。
【図１７−３０】図１７−３０は、図１７−２９の続きである。
【図１７−３１】図１７−３１は、図１７−３０の続きである。
【図１７−３２】図１７−３２は、図１７−３１の続きである。
【図１７−３３】図１７−３３は、図１７−３２の続きである。
【図１７−３４】図１７−３４は、図１７−３３の続きである。
【図１７−３５】図１７−３５は、図１７−３４の続きである。
【図１７−３６】図１７−３６は、図１７−３５の続きである。
【図１７−３７】図１７−３７は、図１７−３６の続きである。
【図１７−３８】図１７−３８は、図１７−３７の続きである。
【図１７−３９】図１７−３９は、図１７−３８の続きである。
【図１７−４０】図１７−４０は、図１７−３９の続きである。
【図１７−４１】図１７−４１は、図１７−４０の続きである。
【図１７−４２】図１７−４２は、図１７−４１の続きである。
【図１７−４３】図１７−４３は、図１７−４２の続きである。
【図１７−４４】図１７−４４は、図１７−４３の続きである。
【配列表フリーテキスト】
【００２６】
（配列表の説明）
配列番号１は、ヒトＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメント（ＣＴＬＤ）の核酸配列を示す。
配列番号２は、ヒトＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、ヒトＬＯＸ−１の核酸配列を示す。
配列番号４は、ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、ヒトＬＯＸ−１の細胞外領域の核酸配列を示す。
配列番号６は、ヒトＬＯＸ−１の細胞外領域のアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、ビオチン化モチーフのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、ビオチン化モチーフのアミノ酸配列の別の例である。
配列番号９は、ビオチン化モチーフのアミノ酸配列の別の例である。
配列番号１０は、ビオチン化モチーフのアミノ酸配列の別の例である。
配列番号１１は、ＦａｃｔｏｒＸａの認識配列のアミノ酸配列の例である。
配列番号１２は、エンテロキナーゼの認識配列のアミノ酸配列の例である。
配列番号１３は、セルロース結合ドメインタグの例である。
配列番号１４は、カルモジュリン結合ペプチドタグの例である。
配列番号１５は、Ｓタンパク質結合ペプチドタグの例である。
配列番号１６は、Ｔ７タグの例である。
配列番号１７は、ｈＬＯＸ−１の活性ポケットの核酸配列を示す。
配列番号１８は、ｈＬＯＸ−１の活性ポケット（配列番号４の１９１−２４０位）のアミノ酸配列を示す。
配列番号１９は、ウサギ（ラビット）の  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントの核酸配列を示す。
配列番号２０は、ウサギ（ラビット）の  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号２１は、ウサギ（ラビット）の  ＬＯＸ−１の核酸配列を示す。
配列番号２２は、ウサギ（ラビット）の  ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号２３は、ブタの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントの核酸配列を示す。
配列番号２４は、ブタの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号２５は、ブタの  ＬＯＸ−１の核酸配列を示す。
配列番号２６は、ブタの  ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号２７は、マウスの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントの核酸配列を示す。
配列番号２８は、マウスの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号２９は、マウスの  ＬＯＸ−１の核酸配列を示す。
配列番号３０は、マウスの  ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３１は、ラットの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントの核酸配列を示す。
配列番号３２は、ラットの  ＬＯＸ−１のリガンド結合フラグメントのアミノ酸配列を示す。
配列番号３３は、ラットの  ＬＯＸ−１の核酸配列を示す。
配列番号３４は、ラットの  ＬＯＸ−１のアミノ酸配列を示す。
配列番号３５は、ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫの核酸配列を示す。
配列番号３６は、ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫのアミノ酸配列（配列番号４のアミノ酸番号１２９〜２７３に該当する）を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。【００２８】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００２９】
本明細書において、「ＬＯＸ−１」とは、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体−１の略称をさし、スカベンジャー受容体の一種であるＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体を指す。ＬＯＸ−１は、非常に誘導のかかりやすい遺伝子であり、動脈硬化を促進するような高血圧、高脂血症、糖尿病などの条件下で発現が誘導される。また、酸化ＬＤＬがＬＯＸ−１を介して血管内皮細胞に働くと、活性酸素の産生や、それに伴うＮＯ活性の低下が引き起こされる。また細胞接着分子やケモカインの発現も誘導され、いわゆる内皮機能不全の状態が引き起こされるといわれている。ＬＤＬは血管内皮細胞や血管平滑筋細胞において酸化的変性をうける。酸化ＬＤＬは血管内皮細胞においてレクチン様酸化ＬＤＬ受容体ＬＯＸ−１により細胞内に取り込まれ分解される。また、酸化ＬＤＬシカベンジャー受容体によりマクロファージにとりこまれ、マクロファージを泡沫化させる。代表的な、ＬＯＸ−１の配列は、配列番号３および４（それぞれ、核酸配列およびアミノ酸配列；ヒト大動脈内皮細胞由来）に示されている。ＬＯＸ−１の代表的な他の動物由来のものとしては、例えば、配列番号２１および２２（それぞれ、ウサギ（ラビット）の核酸およびアミノ酸配列）、配列番号２５および２６（それぞれ、ブタの核酸およびアミノ酸配列）、配列番号２９および３０（それぞれ、マウスの核酸およびアミノ酸配列）、ならびに配列番号３３および３４（それぞれ、ラットの核酸およびアミノ酸配列）が挙げられるがそれらに限定されない。【００３０】
本明細書において「二量体」とは、同じ種または類似の分子が相互作用して複合体化してできる分子をいう。そのような相互作用としては、例えば、共有結合、水素結合などを挙げることができるが、本発明のＬＯＸ−１についてはジスルフィド結合を介した共有結合であることが好ましい。ＬＯＸ−１は、天然に存在するとき、細胞表層上に存在するときは、ジスルフィド結合により二量体構造をし、上記活性を発揮するとされている。従って、二量体を解析することは、ＬＯＸ−１の活性阻害または活性化において重要な役割を果たす。本発明において、ＬＯＸ−１の二量体化には、ＮＥＣＫ領域部（配列番号４のアミノ酸番号６０〜１４２）１４残基（配列番号４のうち１２９〜１４２）を含むことが好ましいことが見出された。ＮＥＣＫ領域に含まれるシステイン残基を介して分子間のジスルフィド結合を形成して、安定な二量体を形成することが本発明において見出された。【００３１】
本明細書において「二量体界面」とは、ＬＯＸ−１が二量体を形成する際に、他方のモノマーに対して相互作用する領域をいう。代表的には、ＮＥＣＫ領域を挙げることができるがそれらに限定されない。【００３２】
本明細書において「ＮＥＣＫ領域」とは、配列番号４（ヒトＬＯＸ−１のアミノ酸配列）のうち、二量体形成に必要なジスルフィド結合をになう領域であって、代表的にはアミノ酸番号６０〜１４２の領域をいう。本発明においては、特に、１４残基（配列番号４のうち１２９〜１４２）を含むを含むことが好ましく、この上に、ＣＴＬＤ領域のうち配列番号４のアミノ酸番号１５０のトリプトファンならびに１４４位および１５５位のシステインが保存されていることが望ましい。本発明において、天然の二量体構造を保持するＬＯＸ−１結晶構造中の二量体界面に存在するキャビティー構造と、キャビティー近傍に存在するアミノ酸置換体が劇的にＬＯＸ−１の修飾ＬＤＬに対する結合能を失わせたことが見出された。従って、ＬＯＸ−１の二量体界面部に存在するキャビティーがＬＯＸ−１特異的阻害剤の標的部位になり得ることが明らかになった。【００３３】
本明細書において、「ＬＤＬ」とは、低密度リポタンパク質をいい、動脈硬化の促進因子である血清タンパク質の一種をいう。血清中に約３００ｍｇ／ｄｌ含まれ、コレステロールを約５０％含み、アポＢとよばれるタンパク質を２０％含む。【００３４】
本明細書において、「ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害」とは、ＬＯＸ−１が要因となってＬＤＬの異常なレベルまたは性質、あるいは別の異常状態によって引き起こされる疾患または障害をいう。そのような疾患または障害としては、例えば、循環器系一般の疾患、例えば、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの動脈硬化が原因となる循環器系疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本発明では、ＬＯＸ−１自体の活性が通常であっても、ＬＤＬのレベルが異常である場合は、ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害の範囲内にある。【００３５】
本明細書において「ＬＯＸ−１の活性を調節する」とは、あるＬＯＸ−１について使用されるとき、通常そのタンパク質が有する活性を通常有しない活性に変更することをいう。従って、調節には、ＬＯＸ−１活性（例えば、ＬＤＬの結合能など）の増加（亢進）または減少が含まれる。【００３６】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。【００３７】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。【００３８】
本明細書において「候補化合物」とは、目的とする疾患または障害を処置するために使用され得る化合物の候補をいう。したがって、ある化合物は、目的とする疾患または障害について効果があると予測される場合は、候補化合物と呼ばれ得る。【００３９】
本明細書において「化合物種」とは、ある化合物の集合において、特定の目的とする活性を有するなど、所望の性質を有する１種の化合物についていう。例えば、ＬＯＸ−１の活性を調節する化合物の集合において、ＬＯＸ−１の活性を調節する化合物が特定される場合、そのような化合物は、化合物種と称され得る。本明細書では、単に化合物とも称される。【００４０】
本明細書において「ライブラリー」とは、スクリーニングをするための化合物などの一定の集合をいう。ライブラリーは、同様の性質を有する化合物の集合であっても、ランダムな化合物の集合であってもよい。好ましくは、同様の性質を有すると予測される化合物の集合が使用されるが、それに限定されない。【００４１】
本明細書において「相互作用」とは、２以上の分子が存在する場合、ある分子と別の分子との間の作用をいう。そのような相互作用としては、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、受容体リガンド相互作用、静電的相互作用およびホスト−ゲスト相互作用が挙げられるがそれらに限定されない。本発明のスクリーニングにおいては、特に水素結合が用いられ得る。【００４２】
本明細書において「評価」とは、スクリーニングにおいて用いられるとき、ある指標（例えば、医薬としての活性）に関して、候補化合物がそのような指標の要件を満たすかどうか決定することをいう。そのような評価は、当該分野において公知の方法を用いて行うことができ、例えば、ＬＯＸ−１の場合は、そのリガンドとなる酸化ＬＤＬなどを用いて、そのＬＯＸ−１活性が変化したかどうかを見ることによって行うことができる。【００４３】
本明細書においてタンパク質の「立体構造（コンピュータ）モデル」とは、コンピュータを用いて表現された、ある化合物の立体構造のモデルをいう。そのようなモデルは、当該分野において公知のコンピュータプログラムを用いて表示することができ、そのようなプログラムとしては、例えば、ＣＣＰ４でサポートされるプログラム、ＤＥＮＺＯ（ＨＫＬ２０００）、ＭｏｌＳｃｒｉｐｔ（Ａｖａｔａｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＡＢ）、Ｒａｓｔｅｒ３Ｄ、ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＵＲＢＯ−ＦＲＯＤＯ(ＡＦＭＢ−ＣＮＲＳ）、Ｏ（Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｓｗｅｄｅｎ）、ＩｍａｇｅＭａｇｉｃ（Ｊｏｈｎ  Ｃｈｒｙｓｔｙ）、ＲａｓＭｏｌ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ，Ａｍｈｅｒｓｔ  ＭＡ  ＵＳＡ）などがあるがそれらに限定されない。そのようなプログラムは、例えば、図７に示されるような原子座標のデータを用いてモデルを生成することができる。【００４４】
本明細書において「データアレイ」とは、原子座標を示す数列のような一連のデータを示す。【００４５】
本明細書において「記録媒体」は、データを記録することができる限り、どのような媒体でも用いることができる。そのような媒体としては、例えば、ハードディスク、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００４６】
本明細書において「伝送媒体」は、データを伝送することができる限り、どのような媒体でも用いることができる。そのような媒体としては、例えば、インターネット、イントラネット、ＬＡＮ、ＷＡＮなどが挙げられるがそれらに限定されない。【００４７】
本明細書において「アプリケーション」とは、コンピュータを利用するための，個々の使用目的に応じたプログラムをいう。【００４８】
本明細書において「ファルマコフォア」とは、原子と官能基との組み合わせ（およびそれらの三次元的な位置）をいい、これを用いることによって薬物が特定の方式で標的タンパク質と相互作用できるようにし、その薬理学的活性を示す。薬物分子の立体（物理的）および電場によって形成される三次元の「機能的形態」であり、これにより分子の薬理学的活性が生じる。医薬のリード化合物、および特定の標的に対するリード化合物の測定可能な活性を研究する様々なアプローチ法が開発され、一連の構造活性の関係からファルマコフォアが設計され得る。【００４９】
本明細書において「生物学的試験」とは、実際の生体反応を用いてある化合物がある活性を有するかどうかを判定することをいう。生物学的試験は、インビトロおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験を包含する。したがって、生物学的試験は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏとは対立する概念である。【００５０】
本明細書において「アンタゴニスト」とは、ある生体作用物質(またはアゴニスト)の受容体への結合に拮抗的に働き，それ自身はその受容体を介した生理作用を現わさない物質をいう。アンタゴニストは、インヒビターの範疇に入る。【００５１】
本明細書において「インヒビター」とは、ある生体作用物質の作用を阻害する分子をいう。【００５２】
本明細書において「アゴニスト」とは、ある生体作用物質の受容体に結合し、その物質のもつ作用と同じまたは類似の作用を現わす物質をいう。【００５３】
本明細書において「結合ポケット」とは、その形状の結果として、他の化学物質または化合物と会合する、分子または分子複合体の領域をいう。【００５４】
本明細書において「活性ポケット」とは、あるタンパク質について言及されるとき、その基質または補酵素と相互作用することができる部位を含む、分子または分子複合体の領域をいう。【００５５】
本明細書において「アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１活性部位結合ポケット」は、その形状が、一般的なリガンドと結合するために、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１の活性部位結合ポケットの全てまたは任意の部分と類似する、分子もしくは分子複合体の一部を意味する。この形状の共通性は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１における結合ポケットを構成するアミノ酸の骨格原子の構造座標（図７中に記載される）からの例えば３．０Å以下、好ましくは２．５Å未満の根二乗平均偏差により定義される。この計算を得る方法は、本明細書の別の場所に記載されるとおりである。【００５６】
アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１の「活性部位結合ポケット」または「活性部位」は、アセチル化ＬＤＬの結合領域を担うＬＯＸ−１の領域を意味する。アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１の結晶構造の解明において、例えば、図８のデータから結合部位アミノ酸残基を同定することができる。これらの各アミノ酸は、図７に示されるような構造座標のセットにより定義されることができる。【００５７】
本明細書において「構造座標」は、ＬＯＸ−１またはその複合体の原子（散乱中心）によりＸ線の単色ビームの回折上で得られるパターンに関する数式に由来する直交座標をいう。回折データを使用して結晶の反復単位の電子密度マップを計算する。次いで、電子密度マップを使用して、ＬＯＸ−１の個々の原子の位置を確定する。【００５８】
ＬＯＸ−１などの酵素または酵素複合体またはその一部についての構造座標のセットが、３次元における形状を定義する相対的な点のセットであることを当業者は容易に理解する。従って、座標の全体の異なるセットが類似のまたは同一の形状を定義することが可能である、さらに、個々の座標におけるわずかな変化は、全体の形状においてはほとんど影響はない。結合ポケットに関しては、これらの変化は、これらのポケットに会合し得るリガンドの性質を顕著に変化させるとは予測されない。【００５９】
本明細書において「会合する」は、化学物質または化合物、もしくはその一部と、ＬＯＸ−１分子またはその一部との間の近接の条件をいう。会合は、非共有結合であり得る（ここで、結合点は、エネルギー的に水素結合またはファンデルワールスもしくは静電気的相互作用により好都合である）か、または共有結合であり得る。【００６０】
上記の座標における変化は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１構造座標の数学的操作によって生成され得る。例えば、図７に示される構造座標は、構造座標の結晶学的な置換、構造座標の分割、構造座標のセットへの整数的加算または減算、もしくは任意の上記の組合せにより操作され得る。【００６１】
（遺伝子工学の一般的説明）
遺伝子工学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術は、例えば、Maniatis，T．et al．(1982)．Molecular Cloning : A Laboratory Manual，Cold Spring Harborならびにその第二版(1987)およびその第三版(2001); Ausubel，F．M．(1987)．Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience; Ausubel，F．M．(1989)．Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates and Wiley-Interscience; Sambrook，J．et al．(1989)．Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor; Innis，M．A．(1990)．PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications，Academic Press; Ausubel，F．M．(1992)．Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates; Ausubel，F．M．(1995)．Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub．Associates; Innis，M．A．et al．(1995)．PCR Strategies，Academic Press; Ausubel，F．M．(1999)．Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，and annual updates; Sninsky，J．J．et al．(1999)．PCR Applications: Protocols for Functional Genomics，Academic Pressなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【００６２】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。オリゴヌクレオチドは、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは一本鎖が使用されるが、本発明では一本鎖に限定されるわけではない。従って、本明細書においてオリゴヌクレオチドの「誘導体」とは、上述のようなヌクレオチドの誘導体を含むオリゴヌクレオチドをいう。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzerら、Nucleic Acid Res．19;   5081(1991);Ohtsukaら、J．Biol．Chem．260;   2605-2608(1985);Rossoliniら、Mol．Cell．Probes 8;   91-98(1994)）。【００６３】
本明細書において用いられる用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡの概念を包含する。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。【００６４】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされ得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。【００６５】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する構造遺伝子といい、その発現を左右する調節遺伝子という。本明細書では、特定の状況において、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。【００６６】
本明細書において遺伝子（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドなど）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。【００６７】
本明細書では配列の同一性、相同性および類似性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST 2.2.9 (2004.5.12 発行)を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。【００６８】
本発明のポリペプチドまたは核酸はまた、本明細書において具体的に野生型のアミノ酸配列または核酸配列が記載された配列（例えば、配列番号３および４など）に対して同一ではないが相同性のあるものものまた使用され得る。そのような野生型のポリペプチドまたは核酸に対して相同性を有する本発明のポリペプチドまたは核酸分子としては、核酸の場合、例えば、ＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて比較した場合に、比較対象の配列に対して、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有する核酸配列を含む核酸分子、またはポリペプチドの場合少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％の同一性または類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられるがそれらに限定されない。【００６９】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがｉｎ  ｖｉｖｏで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一形態であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。【００７０】
本明細書において、「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。【００７１】
本明細書において用いられる用語「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。【００７２】
本明細書において用いられる用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。【００７３】
本明細書において用いられる「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。【００７４】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。【００７５】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。そのような略号は、以下のとおりである。【００７６】
以下の略号は、本出願を通して用いられる：
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン                    Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン                      Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン                    Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン                Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン                    Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン            Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン              Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン                  Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン                    Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン                      Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン
Ｂ＝Ａｓｘ                              アスパラギンまたはアスパラギン酸
Ｚ＝Ｇｌｘ                              グルタミンまたはグルタミン酸
Ｘ＝Ｘａａ                              不明または他のアミノ酸。【００７７】
ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。【００７８】
塩基
記号  意味  
ａ    アデニン
ｇ    グアニン
ｃ    シトシン
ｔ    チミン
ｕ    ウラシル
ｒ    グアニンまたはアデニンプリン
ｙ    チミン／ウラシルまたはシトシンピリミジン
ｍ    アデニンまたはシトシンアミノ基
ｋ    グアニンまたはチミン／ウラシルケト基
ｓ    グアニンまたはシトシン
ｗ    アデニンまたはチミン／ウラシル
ｂ    グアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｄ    アデニンまたはグアニンまたはチミン／ウラシル
ｈ    アデニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル
ｖ    アデニンまたはグアニンまたはシトシン
ｎ    アデニンまたはグアニンまたはシトシンまたはチミン／ウラシル、不明、または他の塩基。【００７９】
本明細書において、「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸あるいはそれらのドメインと同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸あるいはそれらのドメインをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸あるいはそれらのドメインまたはそれをコードする核酸をいう。例えば、配列番号１および２に示されるヒト由来のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの配列に対応する核酸配列およびアミノ酸配列は、当業者に明らかである。また、そのような対応するアミノ酸は、立体構造解析をすることによって決定することもできる。そのような立体構造解析の技術は当業者に周知である。また、そのような対応するアミノ酸は、基質などの対象のポリペプチドと相互作用する物質との複合体を解析することによっても同定することができる。そのような同定方法もまた、当業者には周知であり、そのような方法の例示はLaube，H．et al．(1992)Biochemistry 31,2735-2748にも記載されている。【００８０】
本明細書において、「対応する」遺伝子（例えば、ＬＯＸ−１遺伝子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログあるいは種相同体であり得る。したがって、ヒトＬＯＸ−１などに対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、ヒトＬＯＸ−１など）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばマウス、ラット、イヌ、ネコ）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。このような対応する遺伝子は、ゲノムデータベースを利用すれば、当業者は容易に得ることができる。そのようなゲノム配列の入手方法は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所に記載される。本発明では、このような検索によって得られた配列も利用可能である。【００８１】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、それぞれ１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。本明細書において使用する場合、好ましくは、受容体「フラグメント」は、全長受容体が特異的に結合し得るリガンドに特異的に結合する。レクチン様酸化ＬＤＬ受容体の好ましいフラグメントは、Ｃ−タイプレクチン様領域（ＣＴＬＤ）を含むフラグメントである。【００８２】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が受容体（例えば、ＬＯＸ−１）である場合、その生物学的活性は、そのリガンド結合活性（例えば、ＬＯＸ−１活性）を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応する受容体への結合を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。また、ＬＯＸ−１活性が生物学的活性である場合は、そのような活性は、本明細書の記載にしたがって測定することができる。【００８３】
本発明のポリペプチドを製造する方法としては、例えば、そのポリペプチドを産生する原核生物である細菌を培養し、細菌中に組換え受容体タンパク質を封入体として蓄積させ、その宿主細菌を破壊することによって、そのポリペプチドを得る方法が挙げられる。【００８４】
大腸菌内でタンパク質をビオチン化するためのビオチン化モチーフのアミノ酸配列としては：
「ＭＫＬＫＶＴＶＮＧＴＡＹＤＶＤＶＤＶＤＫＳＨＥＮＰＭＧＴＩＬＦＧＧＧＴＧＧＡＰＡＰＡＡＧＧＡＧＡＧＫＡＧＥＧＥＩＰＡＰＬＡＧＴＶＳＫＩＬＶＫＥＧＤＴＶＫＡＧＱＴＶＬＶＬＥＡＭＫＭＥＴＥＩＮＡＰＴＤＧＫＶＥＫＶＬＶＫＥＲＤＡＶＱＧＧＱＧＬＩＫＩＧＤＬＥＬ」（配列番号７）が挙げられる。アミノ酸配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号８）もまたビオチン化モチーフとして利用可能である。これら配列において、実際にビオチン化を受けるＫ（リジン）残基以外に変異を導入しても、ビオチン化活性に大きな影響はないので、リジン残基以外を置換した配列もまた、ビオチン化モチーフとして使用することができる。また、実際にビオチン化を受けるＫを含んだ「ＫＩＧ，ＫＩ，ＫＩＡ，ＫＩＥ，ＫＩＧＤＰ（配列番号９），ＫＬＷＳＩ（配列番号１０），ＫＬＧ，ＫＶＧ」などをＣ末側に付加することによるビオチン化も可能である。【００８５】
また、エンドプロテイナーゼであるＦａｃｔｏｒＸａの認識配列「ＩＥＧＲ」（配列番号１１）やエンテロキナーゼの認識配列「ＤＤＤＤＫ」（配列番号１２）などをこれらビオチン化モチーフと発現される外来タンパク質との間に挿入し、ＦａｃｔｏｒＸａまたはエンテロキナーゼによる切断により外来タンパク質を精製することも可能である。例えば、ＣＴＬＤを発現する場合、これらビオチン化モチーフとＣＴＬＤとの間にアミノ酸配列「ＩＥＧＲ」を挿入し、ＣＴＬＤのみの精製をすることも可能である。【００８６】
本明細書において「形質転換体」とは、宿主細胞を形質転換することによって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞が例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。【００８７】
形質転換体を得るための宿主細菌細胞は、生理活性を保持するポリペプチドを発現するものであれば、特に限定されず、従来から遺伝子操作において利用される各種の宿主細菌細胞を用いることができる。原核細胞としては、エシェリヒア属、セラチア属、バチルス属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリウム属、シュードモナス属等に属する原核細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０などが例示される。【００８８】
あるタンパク質におけるあるアミノ酸は、本発明において目的とする改変を導入すること（例えば、アセチル化ＬＤＬとの相互作用領域における置換）に加え、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域またはエピトープ部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。【００８９】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。【００９０】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることは、当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。【００９１】
親水性指数もまた、改変を行う際に考慮され得る。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。【００９２】
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。【００９３】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものまたはその立体構造データ（または原子座標）をいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。原子座標の改変体の場合、一次配列が同じであっても、異なる原子座標を採る場合、このような改変体と呼ばれ得る。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体または相同体（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかであり、当該分野において公知のものをＤＤＢＪなどのデータベースから情報を取得することもできる。本明細書では、ヒトＬＯＸ−１が特に開示されているが、本発明ではこのような配列には限定されず、マウスなどの哺乳動物の同様の受容体もまた本発明の範囲内にある。【００９４】
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、癌マーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。【００９５】
本明細書において「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトαヘモグロビン遺伝子とマウスのαヘモグロビン遺伝子とはオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子のαヘモグロビン遺伝子とはパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のヒトＬＯＸ−１のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。【００９６】
本明細書においてＬＯＸ−１の「野生型」とは、天然に存在するＬＯＸ−１のうち、由来となる生物種においてもっとも広汎に存在するものをいう。通常、ある種において最初に同定されるＬＯＸ−１は野生型といえる。野生型はまた、「天然標準型」ともいう。そのような野生型ＬＯＸ−１は、配列番号３および４に示す配列を有するものである。【００９７】
本発明のＬＯＸ−１改変体は、本発明の目的とする改変が導入されていることが１つの特徴である。本明細書では、そのような「目的とする改変」とは、例えば、ＬＯＸ−１のアミノ酸配列において、ＬＯＸ−１のリガンドまたは基質（ＬＤＬなど）との相互作用をする部位またはアミノ酸残基における改変またはそのような相互作用する部位が変動するような改変をいう。【００９８】
したがって、そのような目的とする改変は、例えば、配列番号２に示されるＬＯＸ−１の図８に示される図において変化に起因するアミノ酸位からなる群より選択される少なくとも１つの残基に対応する、該野生型ＬＯＸ−１ポリペプチドの残基において、配列番号２において示されるそれぞれの位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有することを包含する。【００９９】
基質または補酵素などとの相互作用を担うドメインはまた、当該分野において周知のＸ線結晶構造解析の手法（例えば、ＢＷ７ｂビームライン（ＤＥＳＹ／ＥＭＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いたＸ線解析、ＭａｒＲｅｓｅａｃｈイメージングプレート検出器を用いたデータ測定、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＬＡＥＰＡＣＫなどのプログラムを用いたデータ処理）、およびコンピュータモデリングの手法（例えば、ＣＮＳプログラム、ＸＰＬＯ２Ｄプログラム、プログラムＯ、ＰＲＯＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＣＨＥＣＫ，ＷＨＡＴＩＦなどを用いた精密化など）を用いて同定することができる。したがって、任意のＬＯＸ−１は、上述の方法を用いて同定された基質または補酵素などとの相互作用ドメインにおいて改変を導入することによって本発明の目的の改変を導入することができる。そのような改変は、好ましくは、野生型におけるアミノ酸を他のアミノ酸に置換することを包含する。本発明のＬＯＸ−１は、リガンドとの相互作用ドメインにあるアミノ酸残基を改変することによって、酵素活性が高まり、副反応が減少し得る。このような相互作用ドメインは従来では不明であったことから、本発明は、従来の技術では予想不可能な効果を奏するといえる。【０１００】
本明細書において「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント改変を包含する。サイレント改変には、コードする核酸が変化しない「サイレント置換」と、そもそも核酸がアミノ酸をコードしない場合を包含する。ある核酸がアミノ酸をコードする場合、サイレント改変は、サイレント置換と同義である。本明細書において「サイレント置換」とは、核酸配列において、あるアミノ酸をコードする核酸配列を、同じアミノ酸をコードする別の核酸配列に置換することをいう。遺伝コード上の縮重という現象に基づき、あるアミノ酸をコードする核酸配列が複数ある場合（例えば、グリシンなど）、このようなサイレンと置換が可能である。したがって、サイレント置換により生成した核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、もとのポリペプチドと同じアミノ酸配列を有する。したがって、本発明のＬＯＸ−１において、本発明の目的とする改変（ＬＯＸ−１ポリペプチドの基質（たとえば、ＬＤＬ）と相互作用するアミノ酸残基の、野生型のアミノ酸残基以外のアミノ酸残基への置換（例えば、配列番号２に示されるＬＯＸ−１のリガンド結合部位の少なくとも１つの残基に対応する、該野生型ＬＯＸ−１ポリペプチドの残基において、配列番号２において示されるそれぞれの位置におけるアミノ酸以外のアミノ酸を有すること））に加えて、核酸配列レベルでは、サイレント置換を含ませることも可能である。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンをコードする唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンをコードする唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。【０１０１】
本明細書において、本発明のＬＯＸ−１改変体と機能的に等価なポリペプチドを作製するために、本発明の目的の改変に加えて、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。【０１０２】
本明細書において使用される用語「ペプチドアナログ」または「ポリペプチドアナログ」は互換可能に使用され、ペプチドまたはポリペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドまたはポリペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。本明細書において「ポリペプチド」は、特に言及しない限り、このペプチドアナログを包含する。【０１０３】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。【０１０４】
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【０１０５】
本明細書において「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。【０１０６】
原核細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓより市販）、ｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＱＥ−８（ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８−１１０６００）、ｐＫＹＰ２００（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４））、ｐＬＳＡ１（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９））、ｐＧＥＬ１（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＴｒｓ３０（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０７）、ｐＴｒｓ３２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−５４０８）、ｐＧＨＡ２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−４００）、ｐＧＫＡ２（ＦＥＲＭ  Ｂ−６７９８）、ｐＴｅｒｍ２（特開平３−２２９７９、ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＥＧ４００［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）］、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＴｒｘＦｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＡＬ−ｃ２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（宝酒造）、ｐＵＣ１１８（宝酒造）、ｐＰＡ１（特開昭６３−２３３７９８）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ  Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ＰＡＮ，ＰＡＣ（ａｖｉｄｉｔｙ社製）などが例示される。【０１０７】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。【０１０８】
本明細書において用いられる「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多い（がそれに限定されない）ので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。【０１０９】
本明細書において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。【０１１０】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【０１１１】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【０１１２】
従って、本発明において同定されたタンパク質は、上述のような方法を用いて生産することができる。【０１１３】
（免疫化学）
本発明のポリペプチドを認識する抗体の作製もまた当該分野において周知である。例えば、ポリクローナル抗体の作製は、取得したポリペプチドの全長または部分断片精製標品、あるいは本発明のタンパク質の一部のアミノ酸配列を有するペプチドを抗原として用い、動物に投与することにより行うことができる。【０１１４】
本発明では、立体構造が明らかになったことから、図７に示される原子座標を参考にしてエピトープとして適切な部位を選択することにより効率的な抗体の作製を行うことができる。【０１１５】
抗体を生産する場合、投与する動物として、ウサギ、ヤギ、ラット、マウス、ハムスター等を用いることができる。その抗原の投与量は動物１匹当たり５０〜１００μｇが好ましい。ペプチドを用いる場合は、ペプチドをスカシガイヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ）またはウシチログロブリン等のキャリアタンパク質に共有結合させたものを抗原とするのが望ましい。抗原とするペプチドは、ペプチド合成機で合成することができる。その抗原の投与は、１回目の投与の後１〜２週間おきに３〜１０回行う。各投与後、３〜７日目に眼底静脈叢より採血し、その血清が免疫に用いた抗原と反応することを酵素免疫測定法［酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）：医学書院刊  １９７６年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｖｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）］等で確認する。【０１１６】
免疫に用いた抗原に対し、その血清が充分な抗体価を示した非ヒト哺乳動物より血清を取得し、その血清より、周知技術を用いてポリクローナル抗体を分離、精製することができる。モノクローナル抗体の作製もまた当該分野において周知である。抗体産性細胞の調製のために、まず、免疫に用いた本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに対し、その血清が十分な抗体価を示したラットを抗体産生細胞の供給源として使用し、骨髄腫細胞との融合により、ハイブリドーマの作製を行う。その後、酵素免疫測定法になどより、本発明のポリペプチドの部分断片ポリペプチドに特異的に反応するハイブリドーマを選択する。このようにして得たハイブリドーマから産生されたモノクローナル抗体は種々の目的に使用することができる。【０１１７】
このような抗体は、例えば、本発明のポリペプチドの免疫学的検出方法に使用することができ、本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの免疫学的検出法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法・蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法等を挙げることができる。【０１１８】
また、本発明ポリペプチドの免疫学的定量方法にも使用することができる。本発明ポリペプチドの定量方法としては、液相中で本発明のポリペプチドと反応する抗体のうちエピトープが異なる２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法、１２６Ｉ等の放射性同位体で標識した本発明のタンパク質と本発明のタンパク質を認識する抗体とを用いるラジオイムノアッセイ法等を挙げることができる。【０１１９】
本発明ポリペプチドのｍＲＮＡの定量方法もまた、当該分野において周知である。例えば、本発明のポリヌクレオチドあるいはＤＮＡより調製した上記オリゴヌクレオチドを用い、ノーザンハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法により、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの発現量をｍＲＮＡレベルで定量することができる。このような技術は、当該分野において周知であり、本明細書において列挙した文献にも記載されている。【０１２０】
（アレイ技術）
本明細書において、アレイ技術を用いて、本発明において作製されたモデルと候補化合物のライブラリーとの相互作用をスクリーニングすることができる。以下に使用され得るアレイ技術を説明する。【０１２１】
本明細書において使用される「固相」とは、抗体のような分子が固定され得る支持体をいう。固相の形状は、平面状、球状、またはその他の形状であってもよい。また、本発明の固相は、ゲル状であってもよい。本発明において表面プラズモン共鳴の原理を用いて検出する場合、固相は、金、銀またはアルミニウムを含む金属薄膜を片面に持つガラス基板の基材であることが好ましい。本発明において水晶発振子マイクロバランスの原理を用いて検出する場合は、周波数変換素子（例えば水晶発振子、表面弾性波素子）を固相として用い、直接受容体を結合させる。水晶板の片面はシリコーンで被覆し、もう一方の面は金電極を施したものを固相として用いる。【０１２２】
本明細書において使用される「基板」とは平面状の固相であって、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板は固相の概念に包含される。基板の材料としては、共有結合かまたは非共有結合のいずれかで、本発明において使用される生体分子に結合する特性を有するかまたはそのような特性を有するように誘導体化され得る、任意の固体材料が挙げられる。【０１２３】
固相および基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコーン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）以下が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ナイロン膜、ニトロセルロース膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。高密度のものを解析する場合は、ガラスなど硬度のあるものを材料として使用することが好ましい。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。【０１２４】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。本明細書において、ビオチン化受容体を固定化した固相を、受容体チップおよび／または受容体マイクロチップと呼ぶ。【０１２５】
本明細書において「アレイ」とは、１以上（例えば、１０００以上）の受容体が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）そのものをいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０×１０ｍｍ上など）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望の受容体のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる受容体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの受容体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される受容体は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の受容体が固定され得る。【０１２６】
基板のような固相表面または膜には、上述のように任意の数の生体分子（例えば、受容体）が配置され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの個の生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える生体分子が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、生体分子である受容体のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小さくあり得る（これは、１−２ｎｍの桁であり得る）。最小限の基板の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞と特異的に結合する因子は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。【０１２７】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、生体分子の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある生体分子のスポットをある基板または固相に作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。本明細書において、生体分子は、受容体、受容体のフラグメント、または受容体の改変体である。【０１２８】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。【０１２９】
各々のアドレスを定める大きさは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、分析物の量および／または利用可能な試薬、微粒子の大きさおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。【０１３０】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の分析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。【０１３１】
マイクロアレイについては、秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」、Ｍ．Ｆ．Ｔｅｍｐｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ，７（１５），８１５−８２２（２００２）に広く概説されている。【０１３２】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。【０１３３】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【０１３４】
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。この場合、まず、片面に金薄膜を蒸着したガラス基板に、メチル基、フルオロメチル基のような疎水性官能基をもつアルカンチオールの単分子膜を形成させる。この単分子膜に、直径数μｍから１ｍｍ程度の多数の光透過性スポットを配列させたフォトマスクを重ね、紫外線を照射する。これによって、照射部のアルカンチオールをスポット状に分解除去することができる。スポット内に導入された反応性官能基を使ってストレプトアビジン、アビジンなどのビオチンと特異的に結合するタンパク質を固定化するか、またはタグと特異的に結合する因子を固定化する。最後に受容体タンパク質のビオチン化部位またはタグ部分を介して受容体タンパク質を固定化することにより、化学的処理を経ずに穏やかな条件下で方向性を保った状態での、受容体タンパク質の固定化が完了する。例えば、カルボキシル基含有スポットの場合には、カルボキシル基をＮ−ヒドロキシスクシンイミドを用いて活性エステルに変換し、アビジンやストレプトアビジンなどを固定化させた後、微量の生体分子含有溶液を各スポットに滴下することで、固定化を行うことができる。スポット周囲に形成させた疎水性の単分子膜は、溶液の拡散を抑えるために有効である。スポット周囲のバックグラウンド領域と分析物との非特異的な相互作用を抑えるため、ウシ血清アルブミンのような不活性タンパク質、ポリエチレングリコールのような親水性高分子でブロッキングを行う。【０１３５】
ＤＮＡマイクロアレイ、プロテインチップなどを使った分析技術の進歩を見ても明らかなように、マイクロアレイは、一枚の基板上で多数の検体に対してハイスループット分析が可能であるため、きわめて有効な分析手段である。本発明は、このようなマイクロアレイの考え方を、多種類の生体分子−細胞間相互作用を迅速に計測するために応用する。この場合、きわめて多くの検体を同時に分析したり、分析に必要な生体分子および細胞の量をできる限り少なくするためには、マイクロアレイの集積化が重要である。しかし一方で、マイクロアレイ上の細胞に関する情報を取得する場合、ある程度以上の細胞数からなる集団を対象とした測定を行わない限り、誤差の大きいデータしか得ることができない。このような観点から、マイクロアレイを構成する各スポットの大きさは、少なくとも数十〜数千個程度の細胞が相互作用することのできる大きさであることが望ましく、例えば、円形のスポットの場合、その直径はおおよそ数μｍから１ｍｍ程度である。【０１３６】
マイクロアレイの作製には、マイクロコンタクトプリンティング法、光リソグラフィー法などの種々の方法を用いることが可能であるが、望ましくは、アルカンチオール単分子膜のマイクロパターン化表面を利用する方法である。【０１３７】
（生体分子、結晶化方法および測定技術）
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生体に関連する分子をいう。本明細書において「生体」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、菌類、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。生体分子は、生体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生体に影響を与え得る分子であれば生体分子の定義に入る。そのような生体分子には、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルライブラリ化合物など）、これらの複合分子などが包含されるがそれらに限定されない。本明細書において好ましい生体分子は、受容体および受容体フラグメント、ならびにそれらのリガンドである。【０１３８】
本明細書において使用される用語「受容体」とは、１個以上のリガンドと可逆的、かつ特異的に複合体化する１個以上の結合ドメインを備える生物学的な構造であって、ここで、この複合体化は生物学的な構造を有する。受容体は、完全に細胞の外部（細胞外の受容体）、細胞膜の中（しかし、受容体の部分を細胞外部の環境および細胞質ゾルに向けている）、または完全に細胞の中（細胞内の受容体）に存在し得る。これらはまた、細胞と独立的に機能し得る。細胞膜中の受容体は、細胞を、その境界の外部の空間と連絡（例えば、シグナル伝達）させ、そして細胞の内側および外側への分子およびイオンの輸送において機能させることを可能とする。本明細書において使用する場合、受容体は、受容体全長であっても、受容体のフラグメントであってもよい。【０１３９】
受容体フラグメントを用いる場合には、受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位を用いる。受容体タンパク質のリガンド認識に関係する部位は、以下のように同定することができる。ホモロジーやドメイン検索により相同性や機能上の類似点の高いタンパク質の構造からリガンド認識領域を推定することができる。例えば、同一のリガンドに特異的に結合する、異なる受容体分子のアミノ酸配列をＢＬＡＳＴのデフォルトパラメータを用いて算出した場合、５０％以上、好ましくは５５％以上、より好ましくは６０％以上、さらに好ましくは６５％以上の相同性を示す領域が、リガンド認識領域として推定される。さらに欠損変異やアミノ酸置換などを導入した変異受容体をコードする遺伝子を動物細胞などに一過性発現させ、その機能に必須の領域を決定することも、当業者は容易になし得る。【０１４０】
本明細書において使用される用語「リガンド」とは、特異的な受容体または受容体のファミリーに対する結合パートナーである。リガンドは、受容体に対する内因性のリガンドであるか、またはその代わりに、薬剤、薬剤候補、もしくは薬理学的手段のような受容体に対する合成リガンドであり得る。【０１４１】
本明細書において使用される場合、「ビオチンと特異的に結合する因子」とは、ビオチンと特異的に結合し得る任意の因子をいう。ビオチンと特異的に結合する因子とビオチンとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。ビオチンと特異的に結合する因子としては、アビジン、およびストレプトアビジン、ならびにこれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。【０１４２】
本明細書において使用される場合、「タグと特異的に結合する因子」とは、タグと特異的に結合し得る任意の因子をいう。タグと特異的に結合する因子とタグとの結合は、可逆的であっても、不可逆的であってもよい。タグと特異的に結合する因子は、タグの種類に応じて異なり、当該分野において周知である。例えば、グルタチオンＳ‐トランスフェラーゼをタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、グルタチオンである；ｍｙｃタンパク質をタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、抗ｍｙｃ抗体である；６残基の連続するヒスチジン残基をタグとする場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、ニッケルキレートカラムである；配列番号１３のような、セルロース結合ドメインタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、セルロースである；配列番号１４のような、カルモジュリン結合ペプチドタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、カルモジュリンである；配列番号１５のような、Ｓタンパク質結合ペプチドタグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、Ｓタンパク質である；配列番号１６のような、Ｔ７タグを用いる場合、タグと特異的に結合する因子は、例えば、抗Ｔ７抗体である。【０１４３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、金属表面に生じた表面プラズモン（弾性波）と、全反射した電磁波によって発生するエバネッセント波（光波）との間で起こる相互作用である。プラズモン波とエバネッセント波の波数と波動ベクトルが近似的に一致する条件を与える光の入射角θにおいて共鳴が起こり、エバネッセント波が表面プラズモンの励起に使われるため反射光強度が低下する。表面プラズモン共鳴を得るためには、高屈折率媒体からなるプリズムを配置し（Ｋｒｅｔｓｃｈｍａｎｎ配置）、レーザー光およびＬＥＤ光を入射する方法がとられる。ここで、プリズムとは反対側の金属表面に接触する媒体の誘電率の変化によって、プラズモン波の波数が変化する。すなわち、金属表面上に物質が接近することによって、表面プラズモン共鳴を与える光の入射角がシフトする。このことを利用して、金属表面の物質による被覆をセンシングすることが可能となる。この測定法は、表面鉛直方向の分解能に優れており（０．１ｎｍのオーダー）、表面に存在する物質量をｎｇ〜ｐｇ／ｃｍ２のオーダーでリアルタイムに観測することが可能である。また、水媒体中で測定できることもタンパク質のような生体分子の挙動を調べる上で大きな利点である。これを利用した測定装置が生体分子間相互作用測定装置として開発され、タンパク質およびＤＮＡなどの相互作用の分析に応用されている。【０１４４】
水晶発振子マイクロバランスは、周波数変換素子の電極上に化学的に結合対の一方を結合・固定化し、その周波数変換素子を水中に浸漬し、その結合対と対応する結合対との特異的に結合により生じる質量変化に伴う周波数変換素子の周波数変化を測定して、結合の有無を検出するものである（例えば、特開平６−９４５９１号公報）。この周波数変換素子としては、例えば水晶発振子、表面弾性波素子（ＳＡＷ）などが挙げられる。【０１４５】
本発明の受容体チップはまた、質量分析計のための質量分析チップとしても使用され得る。一般的に、質量分光測定による分析は、レーザービームを含む、レーザーなどの高エネルギー源を用いた少量のサンプルの気化およびイオン化を伴っている。物質はレーザービームによって、質量分析チップ先端の表面からガスあるいは気相に気化され、このプロセス中に、個々の分子の一部は陽子を取り込んで、イオン化される。これら正の電荷にイオン化された分子は、次に、短い高圧電界で加速され、高真空度チェンバーに導かれ（ドリフト）、その先で、感度の高い検出装置の表面に衝突する。飛行時間はイオン化された分子の質量の関数であるから、イオン化と衝突との間に経過する時間は、その分子の質量の判定に用いることができ、その分子質量は、次に特定の質量の既知の分子が存在しているかどうかの判定に用いることができる（飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ））。また、イオン化されたサンプルに含まれる特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）のイオンだけが安定な振動状態になることを利用して、直流成分と高周波の交流成分の電圧を加えることにより、特定の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を有するイオンのみを通過させる質量フィルターを用いて（必要であれば、フラグメントイオンを生成させて）、サンプル（またはサンプルのフラグメントイオン）の質量／電荷数（ｍ／Ｚ）を検出することもできる（タンデム質量分析法）。【０１４６】
気相イオンの生成方法としては、粒子のサンプルへの衝撃から得られる脱着／イオン化法などがある。この方法には、高速原子衝撃法（ＦＡＢ−揮発性マトリクスに懸濁したサンプルに中性粒子（ｎｅｕｔｒａｌ）を衝撃する）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ−ｋｅＶ一次イオンが表面に衝撃して二次イオンを発生する）、液体ＳＩＭＳ（ＬＳＩＭＳ−一次種がイオンであることを除いてＦＡＢと同様）、プラズマ脱着質量分析法（ＭｅＶ一次イオンを用いることを除いてＳＩＭＳと同様）、大量クラスタ衝撃法（ＭＣＩ−大きいクラスタの一次イオンを用いてＳＩＭＳと同様）、レーザ脱着／イオン化法（ＬＤＩ−レーザ光を用いて、表面から種を脱着／イオン化する）、マトリクス補助型レーザ脱着／イオン化法（ＭＡＬＤＩ−脱着およびイオン化の事象を補助することができるマトリクスから種を脱着／イオン化することを除いてＬＤＩと同様）などがある。代表的な質量分析法としては、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定（ＴＯＦ）を用いる方法が挙げられる。【０１４７】
質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を結合した質量分析チップを用いる測定方法は、例えば以下のように、特表平９−５０１４８９に開示される：
受容体を固定化した質量分析チップ面を、前記分析対象物分子（例えば、リガンドを含む混合物）の源にさらし、前記分析対象物分子が結合するようにするステップと；前記分析対象物分子が結合している質量分析チップ先端を、飛行時間質量分光測定器の一方の端に置き、真空および電場を与えて分光測定器内に加速電位を作るステップと；前記先端より前記分析対象物分子のイオンを脱着させるために、分光測定器内の、誘導された質量分析チップ先端面に結合している分析対象物の少なくとも一部分を、１つあるいはそれ以上のレーザーパルスを用いて、打つステップと；前記質量分光測定器内で、飛行時間によってイオンの質量を検出するステップと；このように検出された質量を表示するステップとから成る、方法。この方法において、質量分析チップに結合した分子（例えば、受容体に特異的に結合するリガンド）のイオンの質量を検出することができる。【０１４８】
上記の方法において、レーザー脱着／イオン化、飛行時間質量分光測定法により、分析対象物分子の質量を測定することが可能であり、この方法においては、分析対象物の脱着およびイオン化を容易にするために、前記分析対象物と一緒にエネルギー吸収物質（例えば、シナピン酸、シンナムアミド、シンナミル臭化物、２，５−ジヒドロキシ安息香酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸）を用いることができる。【０１４９】
質量分析計において、受容体のような親和性結合を行う分子を固定化した質量分析チップを用いるさらなる測定方法は、特表平１１−５１２５１８に開示される。この開示される方法においては、一般にヒドロゲル、およびさらに詳細には、カルボキシメチル化デキストランなどの多糖のヒドロゲルを有する支持体表面に受容体のような親和性結合分子をチップに固定化し、その分析物（例えば、リガンド）をその支持体と接触させた後、親和性結合分子に結合した分析物の有無およびその質量等について解析する。【０１５０】
本明細書において使用する受容体としては、レクチン様酸化ＬＤＬ受容体（ＬＯＸ−１）を含むスカベンジャー受容体、インスリン受容体ファミリーに属する受容体、ＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＰＤＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＶＥＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＦＧＦ受容体ファミリーに属する受容体、ＮＧＦ受容体ファミリーなどの増殖因子受容体、ならびに、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  受容体ファミリーの受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体、およびＧタンパク質共役型受容体ファミリーの受容体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい受容体は、ＬＤＬ受容体関連タンパク質ファミリーの受容体に属するＬＯＸ−１である。ヒトＬＯＸ−１（ｈＬＯＸ−１）の細胞外領域の塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号５および６に、ｈＬＯＸ−１のＣＴＬＤの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に、それぞれ示す。ｈＬＯＸ−１の全長配列を配列番号３および４に、それぞれ示す。【０１５１】
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングは、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下することによって、行われる。好ましくは、変性タンパク質およびリフォールディング緩衝液のいずれもが、界面活性剤を含有しない。【０１５２】
本明細書においてタンパク質に関して使用する場合、用語「変性」とは、タンパク質の一次構造は変化せずに、高次構造のみが破壊され、天然での状態と物性が変化することをいう。【０１５３】
本明細書において使用する場合、用語「変性剤」とは、タンパク質の変性を起こす薬剤をいう。変性剤としては、グアニジン塩酸塩、尿素、ジオキサン、アルコール、エチレングリコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。グアニジン塩酸塩を用いる濃度は、好ましくは、約４〜８Ｍ、より好ましくは、約６Ｍである。【０１５４】
本明細書において使用する場合、用語「リフォールディング」とは、変性したタンパク質から、もとの立体構造、生物活性などを回復したタンパク質を得ることをいう。受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントの場合、その生物活性とは、例えば、リガンド結合活性である。【０１５５】
本明細書において使用する場合、用語「封入体」とは、大腸菌のような細菌において外来遺伝子を大量に組換え発現する場合に生成される、タンパク質が不溶性物質として細胞内に蓄積した構造体をいう。【０１５６】
本明細書において使用する場合、封入体の「可溶化」とは、変性剤を用いて、不溶性の封入体を変性して、水溶液に溶解した形態を生じさせることをいう。【０１５７】
本明細書において使用する場合、用語「ＳＨ保護試薬」とは、タンパク質内のチオール基（ＳＨ基）が、ＳＨ基と反応性の物質と反応することを妨げる試薬をいう。ＳＨ保護試薬としては、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、グルタチオンが挙げられるが、これらに限定されない。【０１５８】
本明細書において、封入体として発現された受容体タンパク質のリフォールディングを、アルギニン、還元型グルタチオン、酸化型グルタチオンを含有するリフォールディング緩衝液中に、変性したタンパク質を滴下することによって行う場合、好ましくは、この滴下速度は、１０〜３００μｌ／分の速度であり、より好ましくは、２０〜３０μｌ／分の速度である。リフォールディング緩衝液のｐＨは、好ましくは、７．５〜９．５の範囲であり、より好ましくは、８．０〜８．５の範囲であるが、リフォールディングするタンパク質の性質に応じて、適切なｐＨを変化させることは、当該分野において周知である。１つの実施形態において、このリフォールディング緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含有し、好ましくは、このＴｒｉｓ−ＨＣｌの濃度は５〜２０ｍＭである。【０１５９】
リフォールディング緩衝液中に含まれるアルギニンの濃度は、好ましくは１００ｍＭ〜６００ｍＭであり、より好ましくは、３００ｍＭ〜４００ｍＭである。【０１６０】
本発明のリフォールディング方法において、好ましくは、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンとの比は、１：８〜１：１２、より好ましくは、１：９〜１：１１、最も好ましくは、１：１０である。さらに好ましくは、還元型グルタチオンの濃度は８〜１０ｍＭであり、酸化型グルタチオンの濃度は０．３〜１．０ｍＭである。【０１６１】
本発明のリフォールディング方法において、滴下する変性タンパク質溶液とリフォールディング緩衝液との容量の比は、好ましくは、１：５０〜１：１００である。また、好ましくは、滴下される変性タンパク質の濃度は、５〜８０μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、１０〜８０μｇ／ｍＬであり、なお好ましくは、２０〜８０μｇ／ｍＬである。【０１６２】
本発明のリフォールディング方法に用いられる変性タンパク質は、変性剤、熱、または紫外線照射、放射線照射のいずれかによって変性されたタンパク質であるが、好ましくは、変性剤によって変性されたタンパク質である。【０１６３】
本発明のリフォールディング方法に用いられる変性タンパク質は、好ましくは、細菌で発現した封入体タンパク質を、ＳＨ保護試薬および変性剤を含有する可溶化緩衝液を用いて可溶化することによって得られる変性タンパク質である。好ましくは、変性タンパク質を得るための可溶化は、１〜５ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を用いて行われる。より好ましくは、変性タンパク質を得るための可溶化は、２．０〜３．０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を用いて行われる。また、好ましくは、可溶化緩衝液のｐＨは７．０〜９．０であり、１つの局面において、可溶化緩衝液は、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液である。【０１６４】
本発明において、好ましくは、ＳＨ保護試薬はジチオトレイトールであり、さらに好ましくは、ジチオトレイトールの濃度は５〜２００ｍＭであり、なおより好ましくは、ジチオトレイトールの濃度は５０〜１００ｍＭである。【０１６５】
本発明のリフォールディング方法においては、好ましくは、変性タンパク質溶液をリフォールディング緩衝液に滴下した後に、溶液を攪拌する工程が行われる。より好ましくは、この攪拌工程は、１０〜４８時間行われ、なおより好ましくは、この攪拌工程は、１０〜１４時間行われる。この攪拌は、４℃〜室温で行うことができるが、好ましくは、４℃で行われる。【０１６６】
本発明のリフォールディング方法を用いることによって、従来のリフォールディング方法を用いて調製されたタンパク質よりも高純度かつ均質なタンパク質を得ることができる。例えば、本発明のリフォールディング方法を用いることによって、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の純度のタンパク質が得られる。また、本発明のリフォールディング方法を用いることによって得られたタンパク質を質量分析法によって分析した場合、ＭＳスペクトルによるｍ／ｚの幅が、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２０以下の純度のタンパク質を得ることができる。【０１６７】
また、本発明のリフォールディング方法を用いることによって得られたタンパク質を用いて、４．０オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．２オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、３．０オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、２．８オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、２．５オングストロームの分解能を与えるＸ線回折像を与える単結晶、が得られる。【０１６８】
さらに、本発明は、所望のリガンドに特異的に結合する受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントを高純度かつ均質な状態で調製し、そのフラグメントを固相に結合することによって、その所望のリガンドを高感度で検出する受容体チップを提供する。本発明はまた、そのような受容体チップを用いて、その所望のリガンドを検出する方法を提供する。【０１６９】
本発明は、所望のリガンドに特異的に結合する受容体タンパク質のリガンド結合フラグメントを高純度かつ均質な状態で調製し、そのフラグメントを固相に結合することによって、その所望のリガンドを特異的に除去するためのリガンド除去材料を提供する。本発明はまた、その所望のリガンドを血中から除去する方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する：
（１）被検体の血液を得る工程；および
（２）該血液を、血中の所望のリガンドとリガンド除去材料が特異的に結合する条件下で、リガンド除去材料と接触させる工程。【０１７０】
１つの局面において、上記方法で処理された血液は、被検体に戻される。【０１７１】
さらに、本発明においては、試料中の細菌および／またはウイルスなどの病原体を除去するための方法であって、以下の工程を包含する方法が提供される：
（１）病原体を除去するための試料を得る工程；および
（２）該試料を、試料中の病原体とリガンド除去材料が特異的に結合する条件下で、リガンド除去材料と接触させる工程。【０１７２】
１つの局面において、上記方法で処理された試料は、被検体に注入される。【０１７３】
さらに本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域を細胞内で発現させて得た組換えタンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。【０１７４】
また本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域をビオチン化タンパク質として細胞内で発現させた後、発現させたビオチン化タンパク質をアビジンまたはストレプトアビジンを介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるリガンドの検出方法を提供する。【０１７５】
また本発明は、受容体のリガンド認識に関係する領域をタグ化タンパク質として細胞内で発現させた後、発現させたタグ化タンパク質をそのタグと特異的に結合する因子を介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法によるリガンドの検出方法を提供する。【０１７６】
本発明はさらに、大腸菌内に蓄積した受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成して得た再構成タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。【０１７７】
また本発明は、大腸菌内に蓄積した受容体のビオチン化細胞外領域またはビオチン化リガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成した後、再構成したビオチン化タンパク質をアビジンまたはストレプトアビジンを介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。【０１７８】
また本発明は、大腸菌内に蓄積した受容体のタグ化細胞外領域またはタグ化リガンド認識領域を正しい立体構造にリフォールディングして再構成した後、再構成したタグ化タンパク質をタグと特異的に結合する因子を介して方向性を保って固相上に固定化し、当該固定化タンパク質を用いることを特徴とする分子間相互作用解析法による変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出方法を提供する。【０１７９】
本発明はまた、大腸菌内に凝集体として蓄積した受容体の細胞外領域またはリガンド認識領域を変性剤により構造を解きほぐした後、正しい立体構造にリフォールディングしたタンパク質を含む変性ＬＤＬ、異常細胞または細菌の検出用キットを提供する。【０１８０】
（ＮＭＲ構造解析）
本明細書において「ＮＭＲ」とは、核磁気共鳴を意味する。磁気モーメントを持つ核の集団を静磁場Ｂ０の中に置くと、核ゼーマン効果によって、磁気モーメントの大きさと磁場の強さに従った不連続なエネルギー準位に分布する。この準位の間隔に相当する周波数をもつ電磁波を照射すると共鳴吸収が観測される現象を核磁気共鳴という。【０１８１】
本明細書において「二次元ＮＭＲ」とは、核磁気共鳴スペクトルを２つの周波数軸に展開する方法をいう。この測定には複数のパルスを用い、その時間間隔と観測パルス後の時間とを二つの時間軸としてフーリエ変換を行う。シグナル強度は、通常、等高線によって表される。二次元ＮＭＲとしては、代表的には、ＴＲＯＳＹ（ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ−ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、ＣＯＳＹ（二次元シフト相関ＮＭＲ法）、ＳＥＣＳＹ（二次元スピンエコー相関分光法）、ＦＯＣＳＹ（二次元折り返し補正分光法）、ＨＯＨＡＨＡ（二次元同核ハートマン法）、ＮＯＥＳＹ（二次元ＮＯＥ法）、２Ｄ−Ｊ法（二次元Ｊ分解分光法）、リレーＣＯＳＹ（リレーコヒーレンス移動分光法）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましいＮＭＲはＴＲＯＳＹである。ＴＲＯＳＹとは、Ｗｕｔｈｒｉｃｈらによって開発された、超高磁場ＮＭＲに適した方法である（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４、１２３６６−１２３７１頁（１９９７））。分子量の大きな分子のＮＭＲにおいては、核磁気緩和を支配するのは、（１）磁気双極子相互作用と、（２）化学シフト異方性であるが、超高磁場では、化学シフト異方性が非常に大きくなるために、緩和時間が短くなり、線幅が広くなる。ＴＲＯＳＹは、これら２つの相互作用を相殺することによって、緩和時間を長くし、線幅を狭くする方法である。ＴＲＯＳＹによって高分子量のタンパク質（例えば、９００ｋＤａ以上）について、二次元ＮＭＲスペクトルを得ることが可能になった。【０１８２】
本明細書において二次元ＮＭＲを行う場合、タンパク質を標識するために使用される安定同位体の核種としては、１５Ｎ，１３Ｃ，２Ｈまたはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい標識に用いられる安定同位体核の種類としては１５Ｎ単標識、１３Ｃ単標識、１５Ｎ／２Ｈ二重標識、１３Ｃ／２Ｈ二重標識、１５Ｎ／１３Ｃ／２Ｈ三重標識である。【０１８３】
本発明でＮＭＲを使用する場合、ＮＭＲシグナルの軸方向の変化量を用いることができる。このような変化量は、安定同位体元素について展開された二次元ＮＭＲの周波数軸について、軸方向での分子配向依存的な変化量として定義され、例えば、１Ｈを用いる場合、１Ｈ軸方向での分子配向依存的な変化量であり、また、例えば、１３Ｃを用いる場合、１３Ｃ軸方向での分子配向依存的な変化量などを挙げることができる。【０１８４】
本明細書において用いられるＮＭＲによる高次構造解析に用いられるタンパク質試料は、通常、生合成により安定同位体標識することによって構造解析される。一般には、まず遺伝子操作した大腸菌等によって標的タンパク質の発現系を確立し、安定同位体標識した炭素源や窒素源（すべての炭素を13C ラベルしたグルコース、窒素を15N ラベルした塩化アンモニウムなど）を加えた培地で発現させることにより、すべての炭素および窒素を安定同位体標識したタンパク質を得ることができる。得られた標識タンパク質は、クロマトグラフィーなどで精製した後、限外濾過などで濃縮することによってＮＭＲ測定に供することができる。この際、以下のような条件に留意することが望ましい。【０１８５】
使用する容器については、タンパク質の粘度が高いことを考慮してガラス壁面に付着、分散を抑えるために、ＮＭＲ試料管を含めて、使用する器具にはシリコンなどでコーティング処理を施すことが好ましい。また、試料の扱いには、パスツールピペットなどを用いることが望ましい。【０１８６】
溶媒としては、通常、水溶液が用いられる。ただし、タンパク質は多くの交換性アミドプロトンを有しており、重水溶液にしてしまうと、スペクトルの解析で鍵となるアミドプロトンが重水素置換されることにより、多くの情報が失われることから、通常、軽水溶液で試料調製し、その後ＮＭＲロック用として10%程度の重水を添加することが行われている。必要に応じて、界面活性剤、還元剤などを加えていてもよい。【０１８７】
試料濃度は、通常、1mM 程度(例えば、0.4mM〜2mM)にする。試料の量に余裕があり、溶解度が高いのであれば、5mM〜10mM でも測定可能であるが、濃度を高くすると溶液中で会合が起こる危険性があるので留意する。会合による予期しない解析結果を防ぐためにも、低濃度と高濃度の試料で線形を比較して会合の有無を確認することが好ましい。【０１８８】
使用するｐＨとしては、通常、5〜7程度が好ましい。pH を下げることにより、アミドプロトンなどの交換可能プロトンの交換速度を遅くなるからである。ただし、pH が低いと高次構造に影響を与える懸念があるため、円二色性(CD)スペクトル等で確認しておくことが好ましい。【０１８９】
緩衝剤としては、スペクトル解析の障害となることを防ぐため、プロトンを持たないものを使用することが望ましい。そのようなものとしては、リン酸緩衝液、重水素化酢酸緩衝液などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１９０】
使用する温度としては、 生体内の温度に近付けるため、30〜40 ℃程度にすることが望ましい。温度を高めに設定して溶液の粘性を下げることにより、タンパク質分子のT2 が長くなることから、一般には温度が高い方が良好なスペクトルが得られる。【０１９１】
試料溶液に溶存酸素が含まれていると、常磁性緩和のために緩和時間が短くなり、感度の損失を招き、ＮＯＥ相関の検出の障害となる場合もあることから、このことを防ぐために脱気をおこない、溶存酸素を取り除くことが好ましい。脱気操作は減圧による脱気、不活性ガスのバブリングなどがあり、好ましくは減圧脱気が使用される。また、気泡を立てないことが望ましい。【０１９２】
溶液の保存のために、アジドを加えることが望ましい。【０１９３】
試料調製ののち、ＮＭＲのシム調整を行う。まず、ＮＭＲロックをかけて分解能調整を行う。タンパク質溶液ＮＭＲの測定は、原則として軽水溶液での測定であるため、巨大な水信号（標的タンパク質の数万倍〜数百万倍の１Ｈ  濃度）を消去することが好ましいからである。これは、分解能調整が目的であり、好ましくは、良質のスペクトルを得るため、測定試料ごとに充分な分解能調整を行うことが望ましい。タンパク質溶液ＮＭＲの測定で試料管は、通常回転させないことから、Ｚ  軸だけでなく、Ｘ、Ｙ軸および高次の項の調整も含めて分解能をしっかりと上げておくことが、良いスペクトルを得るために必要である。【０１９４】
次に、パルス幅の測定を行う。水溶液で測定するタンパク質溶液ＮＭＲは、塩強度の違いにより試料によってパルス幅が変化する場合があることから、原則として測定試料ごとにパルス幅の測定をおこなうことが必要である。【０１９５】
タンパク質溶液ＮＭＲで用いられるパルス・シーケンスは、数多くのＲＦ  パルスが配列されていることから、パルス幅のズレが全体ではかなり大きく影響してくるとされている。したがって、多次元ＮＭＲ測定を実行する前に、標的タンパク質の信号でパルス幅を測定し、その値を用いて多次元ＮＭＲ測定をおこなうことが望ましい。【０１９６】
次に、ＮＭＲによるサンプルの確認を行う。試料調整してからしばらく保管した後など、タンパク質が劣化している可能性があるときなどにはＮＭＲによる確認をおこなうことが望ましい。タンパク質の１次元ＮＭＲスペクトルでは数千におよぶ１Ｈ  由来の信号が重なり合って現れることから、構造解析はおろか測定試料の確認に使用することすらできない場合が多いからである。【０１９７】
そこで、通常１５Ｎ−１Ｈ  ＨＳＱＣ測定をおこない、２次元ＮＭＲスペクトルで確認する。信号のパターンがおかしいとき、位相が合わないようなときなどの不具合があるときは、標的タンパク質が壊れてしまっている可能性があることから、再度実験条件の調整が必要である。【０１９８】
次に、スペクトル解析（信号の帰属）を行う。ＮＭＲによって得られたＮＯＥ  由来の距離情報をもとに１Ｈ  信号の帰属を行い、高次構造を導き出すことができる。幾重にも重なり合った信号を、３次元・４次元といった測定を用いてことごとく分離し、既知のアミノ酸配列に割り当てていく。その原理には、スペクトルがアミノ酸ごとに特定のパターンを持っていること、化学シフトおよびスピン結合定数などに極めて特徴的な法則があることを利用する。このような特徴的な性質から、現在では帰属の自動化も行われている。以下に、タンパク質ＮＭＲスペクトルの特徴的な化学シフトを示す。【０１９９】
タンパク質の１Ｈの化学シフトはその環境ごとにおおよそ限定されている。すなわち、アミドプロトン由来の信号（８ｐｐｍ付近）、側鎖の芳香環由来の信号（７ｐｐｍ付近）、α位のプロトン由来の信号（４ｐｐｍ付近）、β位のプロトン由来の信号（２〜３ｐｐｍ付近）、メチル基由来の信号（１ｐｐｍ付近）が、それぞれ観測される。【０２００】
１３Ｃ  の化学シフトにも同様の相関があり、１３Ｃではそれぞれの領域を選択的に励起することで、α位やβ位の炭素、カルボニル炭素などをあたかも別核種のように取り扱うことにより、帰属のための様々な測定法のなかで活用される。【０２０１】
アミノ酸配列の帰属に加えて、高次構造に由来する化学シフトの変化が見られる。たとえば、α位のプロトン由来の信号はαヘリックス構造の中では高磁場シフトし、βシート構造の中では低磁場シフトする。その他にも、側鎖の芳香環との位置関係により±１ｐｐｍ  程度シフトすることがある。また金属結合タンパク質などでは、金属と結合した部位でかなり大きなシフトが見られる。【０２０２】
次に、同種核スピン結合も考慮すべきである。タンパク質を構成するアミノ酸は、ペプチド結合（アミド結合）で連結されていることから、カルボニル基によって１Ｈ−１Ｈ間のスピン結合が分断され、１Ｈ−１Ｈ間のスピン結合は同一アミノ酸残基内に限定される。したがって、１Ｈ−１Ｈ 間のスピン結合のパターンは、アミノ酸の種類ごとに特徴的であり、この事実を利用して、アミノ酸の同定をおこなう。また、α位のプロトンとアミドプロトンの３ＪＨαＨＮ スピン結合定数から導かれる二面角φは主鎖の2次構造の決定に役立つ。【０２０３】
また、異種核間スピン結合も考慮すべきである。主鎖に関連する１Ｈ−１Ｈ以外のスピン結合定数としては、例えば、Ｈ−Ｎ（９０−１００Ｈｚ）、Ｎ−Ｃα（１１Ｈｚ）、Ｃα−Ｈ（１４０Ｈｚ）、Ｃα−Ｃβ（３０−４０Ｈｚ）、Ｃα−Ｃ（＝Ｏ）（５５Ｈｚ）、Ｃα−Ｘ−Ｎ（７Ｈｚ）、１３Ｃ−１５Ｎ（１５Ｈｚ）などが挙げられる。【０２０４】
また、ＮＯＥ相関も考慮されるべきである。ＮＯＥ相関は、高次構造解析に用いられるが、アミドプロトンとα位のプロトンとのカルボニル基をはさんだ1Ｈ同種核ＮＯＥは、その二つのプロトンが、アミド結合を介して隣り合ったアミノ酸残基に由来することを示しており、1Ｈ同種核実験によるアミノ酸配列の帰属で用いられる。この手法を、スピン結合や化学シフトをもとに決定したアミノ酸の種別情報とあわせて、配列特異的連鎖帰属法という。【０２０５】
帰属作業が終わったら、必要に応じて、高次構造解析を行う。タンパク質の高次構造には、アミノ酸配列が立体的な規則性を持って形作るαヘリックス構造、β シート構造のような2次構造、いくつかの2次構造が空間的に配置された3次構造、3次構造で構築されたドメインが空間的に配置された4次構造があり、これらを明らかにすることがタンパク質溶液ＮＭＲ測定において構造解析において重要であり、目的に応じて種々行われる。【０２０６】
一次配列が既知のアミノ酸配列の場合、既知のポリペプチド鎖がどのように絡み合ってタンパク質を構築しているのかを、ＮＭＲから得られる情報を利用して解像する。この際利用されるのが、ディスタンス・ジオメトリー法、束縛条件付き分子動力学法と呼ばれる構造最適化計算アルゴリズムである。いずれの場合にも、ＮＭＲから得られる距離情報としてのNOE 信号を集められる限り集めに集め、それをパラメータとして計算プログラムに与えることによって高次構造を導き出す手法である。【０２０７】
本明細書において、「ディスタンス・ジオメトリー法」とは、距離情報と結合角(2面角)の集合とを空間的な位置情報としてみて、それをもとに構造を導き出す手法をいう。通常は、共有結合の結合長および結合角を一般的なタンパク質の標準値に固定し、2面角を変数として構造計算を進める。NOE 由来の距離の束縛条件を満たす方向に収束した構造をいくつか取り出し、最も適切と思われる構造を最終構造とする。この手法は、変数が少ないために計算も速く、コンピュータに対する負荷も小さいが、原子の接触によって構造変化が制限される（共有結合同士のすり抜けができない）ため、真の構造に収束することが難しく、次に述べる束縛条件付き分子動力学法などの初期構造を求めるために利用される。【０２０８】
本明細書において、「束縛条件付き分子動力学法」とは、分子運動をシミュレートするために一般的に用いられている手法として知られる分子動力学法（仮想的に分子を振動させ、構造を最適化する方法）の一つであり、NOE 由来の距離の束縛条件をポテンシャルとして加え、構造を最適化していく手法をいう。この手法は位置情報としてデカルト（Cartesian）座標を使用しており、また変数も多いために膨大な計算量が必要とされ、コンピュータに対する負荷も大きいが、現在ではコンピュータの計算能力の飛躍的な進歩により計算時間が短縮され、頻繁に利用されている。【０２０９】
本明細書において「シミュレーテッド・アニーリング法」とは、分子動力学計算の1手法であり、一般的な分子動力学計算と異なり、計算の初期段階で共有結合に寄与するパラメータを弱く設定し、系の温度を急激に上げることにより分子運動を激化させ、その後徐々に系の温度を下げて分子運動を遅くしつつ、それぞれのパラメータを強めて構造を収束させる手法をいう。これにより、原子の接触によって構造変化が妨げられることによる見かけの収束に構造が落ち着くことを防ぐことができる。【０２１０】
以上、本明細書において使用可能なＮＭＲ手法を説明したが、このような手法は、当該分野において公知であり、例えば、Ｋｕｒｔ  Ｗｕｔｈｒｉｃｈ  著，京極好正・小林祐次訳，タンパク質と核酸のＮＭＲ：二次元ＮＭＲによる構造解析，東京化学同人．（１９９１）；Ｍ．Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｊ．Ｓｃｈｌｅｕｃｈｅｒ，Ｃ．Ｇｒｉｅｓｉｎｇｅｒ，Ｐｒｏｇｒ．ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．３４，９３−１５８．（１９９９）；Ｊ．Ｃａｖａｎａｇｈ，Ｗ．Ｊ．Ｆａｉｒｂｒｏｔｈｅｒ，Ａ．Ｇ．Ｐａｌｍｅｒ  ＩＩＩ，Ｎ．Ｊ．Ｓｋｅｌｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．（１９９５）；Ｔ．Ｌ．Ｊａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｎ．Ｊ．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ．（１９９４）；荒田洋治，タンパク質のＮＭＲ：構造データの解釈と評価，共立出版．（１９９６）；  荒田洋治，ＮＭＲの書，丸善．（２０００）；  根本暢明，吉田卓也，小林祐次，科学と工業，６９（１０），４１９−４２５．（１９９５）；根本暢明，吉田卓也，小林祐次，科学と工業，７０（２），４８−５５．（１９９６）などに記載されており、本明細書においてその内容を参考として援用する。【０２１１】
（結晶構造解析）
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｔｈｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。【０２１２】
本明細書において「結晶構造解析」とは、Ｘ線、電子線または中性子線の結晶による回折を利用した結晶構造の解析をいう。ほぼ単色で平行な線束を単結晶に当てながら、結晶の方位を系統的に変えて、多くの結晶網平面からのブラッグ反射強度を，ワイセンベルク・カメラやプリセッションカメラでフィルムまたはイメージングプレートに記録して強度測定するか（回転結晶法）、計数管を備えた４軸回折計で反射強度を系統的に測定する方法などがある。こうして得た反射の消滅則から、それが属する空間群をきめることができる。対称中心の有無もまた、積分反射強度の統計から決定され得る。これらの空間群、対称中心などの情報を得た後、結晶の分子式および単位胞の大きさから、単位胞中に含まれる化学単位数（原子数または分子数）を決定することができる。重原子法では、次にパターソン関数を使って重原子（存在する場合）の位置を求め、その寄与を手掛りにして解析する。重原子が含まれていない場合でも、外因的に重原子を入れてそれを手掛りに同形置換法で構造を解くことができる。複雑なタンパク質分子などでは水銀のような重原子をある位置に入れ、特に別種の重原子を別の位置に入れることにより、反射の位相をかなりの数決定することができ、そのような情報をもとに構造を解析する。【０２１３】
このようなタンパク質の結晶構造解析は、当該分野において周知の方法を用いて行うことができる。そのような方法は、例えば、タンパク質のＸ線結晶構造解析（シュプリンガー・フェアラーク東京社）、生命科学のための結晶解析入門（丸善）などに記載されており、本明細書ではそのような方法を任意に用いることができる。【０２１４】
一般に、タンパク質の結晶は、Ｘ線によりかなり損傷を受けることが知られているので、Ｘ線結晶構造解析を成功させるためには、損傷を受け難い結晶を取得することが重要である。近年では、結晶を凍結させ、凍結状態のままで回折データを測定することで高品質、高分解能の回折データを取得することがよく行われている（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  第２７６巻、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ  Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｒｙｏｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｄ．Ｗ．Ｒｏｄｇｅｒｓ））。一般に、タンパク質結晶の凍結には、凍結による結晶の崩壊を防ぐ目的で、グリセロールなどの凍結安定化剤を含む溶液で処理するなどの工夫がなされる。本発明においては、ＬＯＸ−１のネイティブ結晶（必要に応じて補酵素であるアセチル化ＬＤＬと複合体化させる）および重原子誘導体の凍結結晶は、凍結安定化剤を添加することなく、結晶化小滴あるいは浸漬溶液中の結晶を取り出し、液体窒素に直接浸漬して瞬時に凍結させることで調製し得る。凍結結晶はまた、凍結安定化剤を添加した保存液に浸漬した結晶に対して上記瞬時に凍結させる操作を行うことによっても調製し得る。【０２１５】
本明細書において、重原子同型置換法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  第１１５巻、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｐｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、  Ｐａｒｔ  Ｂ、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ、Ｃ．Ｈ．Ｗ．Ｈｉｒｓ、およびＳ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  第２７６巻、  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ  Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）または多波長異常分散法（Ｓ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編、ならびにＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ  第２７６巻、  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｐａｒｔ  Ａ、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．およびＲ．Ｍ．Ｓｗｅｅｔ編）もまた利用して立体構造解析を行うことも可能である。ここでは、ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データ間の回折強度差、あるいは異なる波長で測定した回折データ間の回折強度差から、電子密度を計算するための初期位相を求めることにより立体構造を決定し得る。重原子同型置換法または多波長異常分散法を適用するＬＯＸ−１の立体構造決定においては、重金属原子として例えば水銀、金、白金、ウラン、セレン原子などを含有した重原子誘導体結晶を用い得る。例えば、水銀化合物ＥＭＴＳまたはカリウムジシアノ金（Ｉ）を利用した浸漬法により得られる重原子誘導体結晶が用いられる。【０２１６】
ネイティブ結晶および重原子誘導体結晶の回折データは、例えば、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＩｃ（理学電機）あるいはＳＰｒｉｎｇ−８（西播磨大型放射光施設）のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて測定し得る。多波長異常分散法を適用するための複数波長での回折データ測定は、例えば、ＳＰｒｉｎｇ−８のタンパク質結晶構造解析用ビームラインを用いて実施し得る。測定した回折画像データは、例えば、Ｒ−ＡＸＩＳ  ＩＩｃ付属のデータ処理プログラムまたはプログラムＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）または同様な画像処理プログラム（または単結晶解析用ソフトウェア）を用いて、反射強度データに処理される。ネイティブ結晶の反射強度データ、複数波長での重原子誘導体結晶の反射強度データ波長の測定により得られた反射強度データから、差Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ図を利用して結晶中のタンパク質に結合した重金属原子の位置を求めた後、例えば、プログラムＰＨＡＳＥＳ（Ｗ．Ｆｕｒｅｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａあるいはＣＣＰ４（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｓｉｌ、ＳＥＲＣ）または同様の回折データ解析プログラムを用いて重原子位置パラメータを精密化することにより初期位相が決定される。決定された初期位相は、例えば、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ）または同様な位相改良プログラム（電子密度改良プログラム）を用いた溶媒平滑化法およびヒストグラムマッチング法に従って、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント結晶中の溶媒領域を例えば３０〜５０％として、低分解能から高分解能まで徐々に位相拡張計算を行うことにより信頼性の高い位相へと改良される。タンパク質の結晶は、その体積の３０〜６０％がタンパク質以外の溶媒分子（主として水分子）で占有されている。本明細書において、溶液中の溶媒分子の占める体積を「溶媒領域」とする。一般に、得られたタンパク質結晶が非結晶学的な対称を有する場合には、非結晶学的対称（ＮＣＳ）平均化と呼ばれる電子密度の平均化を行うことにより、さらに位相の信頼性を高めることが可能である。特定のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結晶は、結晶の密度測定の結果から非対称単位中に２分子が含まれることが観察される。溶媒平滑化法を適用した後の位相を用いて計算した電子密度図および精密化した重原子座標から、並進および回転を含む非結晶学的対称マトリックスが算出される。同時に溶媒平滑化法で得られた電子密度図から、マスクと呼ばれるタンパク質の分子が存在する領域を同定し得る。非結晶学的対称マトリックスおよびマスクを用いて、プログラムＤＭなどによりＮＣＳ平均化計算を行うことにより、信頼性の高い位相に改良され、立体構造モデルの構築に用いる電子密度図が得られる。【０２１７】
ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの立体構造モデルは、例えば、プログラムＯ（オー）（Ａ．Ｊｏｎｅｓ、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｓｗｅｄｅｎ）などにより３次元グラフィックス上に表示した電子密度図から、以下の手順で構築し得る。まず、特徴的なアミノ酸配列を有する複数の領域（例えば、トリプトファン残基を含む部分配列など）を電子密度図上で探し出す。次に、見出した領域を起点にしてアミノ酸配列を参照しながら、電子密度に適合するアミノ酸残基の部分構造をプログラムＯを用いて３次元グラフィックス上で構築する。、順次この作業を繰り返すことにより、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのすべてのアミノ酸残基を相当する電子密度に適合させ、分子全体の初期立体構造モデルを構築する。構築された立体構造モデルは、それを出発モデル構造として、構造精密化プログラムであるＸＰＬＯＲ（Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の精密化プロトコルに従って、立体構造を記述する三次元座標が精密化される。また、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント（例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含むＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント）のネイティブ結晶の立体構造およびＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体（例えば、配列番号１に示される配列を有するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体）ネイティブ結晶の立体構造は、得られたＥＭＴＳ誘導体結晶の立体構造を用いた分子置換法により初期位相を求め、前記の電子密度改良、モデル構築、構造精密化手順に従うことにより各々の立体構造を決定し得る。このことにより、本発明のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの立体構造の決定が完成される。決定したＬＯＸ−１の立体構造について、トポロジーなどの観点から、タンパク質立体構造の公的データバンクであるプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に登録されている種々のタンパク質（ＬＯＸ−１と機能において類似するタンパク質のフラグメントを含む）の立体構造との比較を行い得る。【０２１８】
本明細書において、「トポロジー」とは、本明細書中において、タンパク質の二次構造単位の並びまたは空間配置のことをいう。【０２１９】
本明細書において、「αヘリックス」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、アミノ酸が３．６残基ごとに１回転したピッチが５．４Aの螺旋構造を有するエネルギー的に最も安定な構造の１つをいう。αヘリックスを形成しやすいアミノ酸としては、グルタミン酸、リジン、アラニン、およびロイシンなどが挙げられる。逆に、αヘリックスを形成しにくいアミノ酸としては、バリン、イソロイシン、プロリン、およびグリシンなどが挙げられる。また、本明細書において、「βシート」とは、タンパク質またはポリペプチドの二次構造の一つであり、ジグザグに伸びたコンフォメーションを有する二本以上のポリペプチド鎖が平行に並び、ペプチドのアミド基およびカルボニル基が、それぞれ隣接するペプチド鎖のカルボニル基およびアミド基との間に水素結合を形成することによりエネルギー的に安定なシート状により合わさった構造をいう。なお、「平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸配列の並び方が同じ方向のものをいい、「逆平行βシート」とは、βシートのうち、隣接するポリペプチド鎖のアミノ酸の並び方が逆方向のものをいう。さらに、本明細書において、「βストランド」とは、βシートを形成するジグザグに伸びたコンフォメーションを有する１本のペプチド鎖をいう。【０２２０】
従って、本発明のＬＯＸ−１改変体を作製する際には、上述のようなトポロジーを考慮してもよい。【０２２１】
タンパク質の「立体構造データ」または「原子座標データ」とは、そのタンパク質の三次元構造に関するデータをいう。タンパク質の立体構造データには、代表的に、原子座標データ、トポロジー、分子力場定数が挙げられる。原子座標データは、代表的に、Ｘ線結晶構造解析またはＮＭＲ構造解析から得られたデータであり、このような原子座標データは、新規にＸ線結晶構造解析またはＮＭＲ構造解析を行って得られ得るか、または公知のデータベース（例えば、プロテイン・データ・バンク（ＰＤＢ））から入手し得る。原子座標データはまた、モデリングまたは計算によって作成されたデータであり得る。【０２２２】
トポロジーは、市販もしくはフリーウェアのツールプログラムを用いて算出し得るが、自作プログラムを用いてもよい。また、市販の分子力場計算プログラム（例えば、ＰＲＥＳＴＯ、タンパク質工学研究所株式会社、に付属のｐｒｅｐａｒプログラム）に付属の分子トポロジー計算プログラムを使用し得る。分子力場定数（または分子力場ポテンシャル）もまた、市販もしくはフリーウェアのツールプログラムを用いて算出し得るが、自作データを用いてもよい。また、市販の分子力場計算プログラム（例えば、ＡＭＢＥＲ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に付属の分子力場定数データを使用し得る。【０２２３】
本発明のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの立体構造決定が完成することによって、酵素の触媒活性に関与する残基を推定し得、さらに酵素単独の立体構造だけでなく、酵素に補酵素、インヒビター、アゴニストまたは基質などを結合させた複合体の立体構造モデルを分子モデリングの手法（Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（前出）、Ａｕｔｏｄｏｃｋ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）、Ｇｕｅｘ、Ｎ．およびＰｅｉｔｓｃｈ，Ｍ．Ｃ．（１９９７）ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ：Ａｎ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８、２７１４−２７２３；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９：１６３９−１６６２、１９９８；Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｓｉｇｎ、１０、２９４−３０４、１９９６；Ｇｏｏｄｓｅｌｌ、Ｄ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ、９：１−５、１９９６）により容易に構築し得る。本立体構造および立体構造モデルから、活性部位に存在し、触媒反応群のアミノ酸残基に関する構造および活性部位における反応機構に関する知見を入手し得る。【０２２４】
ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位は、例えば、配列番号４に示されるＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのアミノ酸残基１９１位〜２４０位などを包含する。配列番号４の２０８位アルギニン、２０９位アルギニン、２２６位ヒスチジン、２２９位アルギニン、および２３１位アルギニンは、リガンドと密接に相互作用することが知られていることから、ある実施形態では、酵素活性を変更するために、本発明の目的とする改変は、この２０８位アルギニン、２０９位アルギニン、２２６位ヒスチジン、２２９位アルギニン、および２３１位アルギニンに対応する残基が他のアミノ酸に改変されていることが好ましい。【０２２５】
これら立体構造より得られた知見に基づいて、ＬＯＸ−１の安定性向上または受容体活性の向上を目的とした改変設計を行い得る。本明細書において、酵素の「熱安定性」とは、通常の生体環境よりも高い温度（例えば６０℃）でタンパク質を変性させた後でも、タンパク質活性（例えば、酵素活性、受容体活性など）が熱変性前と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは少なくとも９０％残存していることをいう。安定性の向上は、例えば、ΔＴｍ（変性温度の差分）で測定し得る。本明細書において「受容体活性」とは、特に言及しない場合「ＬＯＸ−１活性」と同義で用いられ、活性測定法としては、ＬＯＸ−１のＮ−末端部に導入したＨｉｓ−ｔａｇあるいは同じくＬＯＸ−１の末端部に導入したｂｉｏｔｉｎ化配列部をｂｉｏｔｉｎ化することで得られるｂｉｏｔｉｎ−ｔａｇ化されたＬＯＸ−１試料を用いてＳＰＲセンサーチップ上にＨｉｓ−ｔａｇあるいはｂｉｏｔｉｎ−ｔａｇを介して向きをそろえて固定化したセンサーをもちいて酸化ＬＤＬとの結合能をＳＰＲセンサーグラムの変化から検出することによって測定することができる。【０２２６】
本明細書において、改変体分子の設計は、変異前のタンパク質またはポリペプチド分子（例えば、野生型分子）のアミノ酸配列および立体構造を解析することによって、各アミノ酸がどのような特性（例えば、触媒活性、他の分子との相互作用など）を担うかを予測し、所望の特性の改変（例えば、触媒活性の向上、タンパク質の安定性の向上など）をもたらすために適切なアミノ酸変異を算出することにより行われる。設計の方法は、好ましくはコンピューターを用いて行われる。このような設計方法で用いられるコンピュータープログラムの例としては、本明細書において言及されるように、以下が挙げられる：構造を解析するプログラムとして、Ｘ線回折データの処理プログラムであるＤＥＮＺＯ（マックサイエンス）；位相を決定するための処理プログラムとして、ＰＨＡＳＥＳ（Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＰＡ、ＵＳＡ）；初期位相の改良のためのプログラムとして、プログラムＤＭ（ＣＣＰ４パッケージ、ＳＥＲＣ）；３次元グラフィックスを得るためのプログラムとしてプログラムＯ（Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｔ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）；立体構造精密化プログラムとして、ＸＰＬＯＲ（Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＣＴ、ＵＳＡ）；そして、変異導入モデリングのためのプログラムとして、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢＶｉｅｗｅｒ（前出）。【０２２７】
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物（例えば、インヒビター、活性化剤など）が提供されることも企図される。【０２２８】
（質量分析）
本発明において共有結合などの結合を測定するのに質量分析を利用することができる。【０２２９】
本明細書において「質量分析」とは、電磁気的相互作用を利用して原子・分子のイオンを質量の違いによって分析する任意の方法をいう。代表的には、質量分析は、２つの方法大別され、第１のものは、同時にイオンの軌道を分けて分析する方法であり、その装置を質量分析器（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｇｒａｐｈ）という。第２のものは、軌道は同じであるが、イオン運動の時間的相異または共鳴条件の相異によって質量の違いを測る方法であり、その装置を質量分析計（ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）という。【０２３０】
質量分析の方法は、当該分野において周知であり、例えば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦなどが挙げられるがそれらに限定されない。当業者はそのような方法を適宜改変して本発明に用いることができる。【０２３１】
本明細書において、質量分析により得られるような、タンパク質などの物質の構造の量的変化の情報を利用して結合を算出することができる。このようなタンパク質などの物質の構造の量的変化の情報は、その糖鎖自体の存否に関する情報として表示することもできるし、その糖鎖が含まれる分子（例えば、タンパク質）全体を情報として表示することもできる。量的変化の情報はまた、注目すべきタンパク質とリガンドとの割合の比として表現することができるがそれに限定されない。そのような量的変化の情報を構成するおのおのの糖鎖または糖鎖を含む分子の量（またはレベル）を示す単位としては、例えば、ｎｇ、μｍｏｌ、質量分析における信号強度、分光分析における信号強度、またはｍｇ／試料ｇ、ｍｍｏｌ／試料ｇ、あるいは相対蛍光強度などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明では、そのようなタンパク質構造の量的変化量の変化を分析（区間微分などによる）することも重要であり得る。【０２３２】
代表的な質量分析であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭＳ）は、Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  −  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）の略語である。ＭＡＬＤＩとは、田中らによって見いだされ、Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐらによって開発された技法である（Ｋａｒａｓ  Ｍ．，Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ，Ｆ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８，６０，２２９９−２３０１）。この方法では、試料とマトリクス溶液をモル比で（１０−２〜５×１０−４）：１に混合した後、混合溶液を標的上で乾固し、結晶状態にする。パルスレーザー照射により、大きなエネルギーがマトリクス上に与えられ、（Ｍ＋Ｈ）＋、（Ｍ＋Ｎａ）＋などの試料由来イオンとマトリクス由来イオンとが脱離する。微量のリン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、グアニジンなどで汚染されていても分析可能である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（ＭＳ）は、ＭＡＬＤＩを利用して飛行時間を元に質量を測定するものである。イオンが一定の加速電圧Ｖで加速される場合、イオンの質量をｍ、イオンの速度をｖ、イオンの電荷数をｚ、電気素量をｅ、イオンの飛行時間をｔとしたとき、イオンのｍ／ｚは、
ｍ／ｚ＝２ｅＶｔ２／Ｌ２
で表すことができる。このようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ測定には、島津／ＫｒａｔｏｓのＫＯＭＰＡＣＴ  ＭＡＬＤＩ  ＩＩ／ＩＩＩ／ＩＶなどを使用することができる。その測定の際には、製造業者が作成したパンフレットを参照することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの測定時に使用されるレーザー照射の照射エネルギーを解離エネルギーといい、解離エネルギーを用いて共有結合などの解析を行うことができる。【０２３３】
このような質量分析計は、製造業者が提供するマニュアルなどを参照して使用することができる。具体的には、試料をマトリクス（例えば、固体または液体）とともに質量分析計に付属のターゲットプローブ上に滴下し乾燥させ、分析器で質量を測定する。マトリクスは製造業者が提供するものを使用することができ、例えば、ジスラノール、ＨＡＢＡ、ＤＨＢＡ、ＩＡＡなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０２３４】
質量分析では、必要に応じて、プロトン付加体イオンを生じ易くするために、イオン化助剤（カチオン助剤）として、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＮａＴＦＡ（トリフルオロアセテート）、ＡｇＴＦＡなどの塩類を加えてイオン化効率を上げることも可能である。当業者は、各糖鎖における構造解析に際し、マトリクスおよびイオン化助剤の選択などの諸条件の選択を行うことができる。【０２３５】
（コンピュータモデリング）
本発明は、分子設計技術の使用により、ＬＯＸ−１（例えば、結合ポケット）に結合可能な化学物質（活性化剤、阻害化合物を含む）を同定、選択、および設計することを初めて可能にする。【０２３６】
本発明はまた、１つの局面において、本発明において決定された結合ポケットを含むポリペプチドも提供する。【０２３７】
ＬＯＸ−１上のアセチル化ＬＤＬの結合部位に関する本発明者らの解明は、ＬＯＸ−１結合ポケットのいずれかまたはその両方と相互作用し得る新規な化学物質および化合物を設計するために必要な情報を、全部または一部について提供する。この解明はまた、ＬＯＸ−１様結合ポケットまたは二量体界面に結合する他の化合物のアナログについての構造活性データの評価を可能にする。【０２３８】
モデリングでは、物質が、ＬＯＸ−１様結合ポケットまたは二量体界面に結合するか、これと会合するか、またはこれを阻害する能力に関する議論は、物質の特徴のみを議論する。化合物がＬＯＸ−１に結合するかどうかを決定するためのアッセイは、当該分野で周知であり、例えば、本明細書において記載され、Chen, M., Marumiya, S., Masaki, T., and Sawamura, T. Biochem. J. (2001) 355, 289-296；Chen., M., Inoue, K., Narumiya, S., Masaki, T., and Sawamura, T. FEBS Lett. (2001) 499, 215-219；およびShi, X., Niimi, S., Ohtani, T. and Machida, S. J.Cell.Sci. (2001) 114, 1273-1282などに記載されており、これらの内容は、本明細書において関連部分が参考として援用される。【０２３９】
本発明による、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント（例えば、結合ポケット）に結合するかまたはこれを阻害する化合物の設計は、一般的に２つの要件の考慮を伴う。第１に、この物質は、ＬＯＸ−１の一部または全部と物理的および構造的に会合し得なければならない。この会合において重要な非共有結合的分子相互作用は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用、および静電的相互作用を含む。【０２４０】
第２に、この物質は、それをＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントと直接会合可能にするコンフォメーションをとり得なければならない。この物質の特定の部分はこれらの会合に直接関与しないが、この物質のこれらの部分はなお、分子の全体のコンフォメーションに影響を及ぼし得る。次いで、これが効力に重大な影響を有し得る。このようなコンフォメーション要件は、結合ポケットの全部または一部に関連する化学物質の３次元構造全体および配向、あるいはＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体と直接相互作用するいくつかの化学物質を包含する物質の官能基間の空間的配置を含む。【０２４１】
ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに対する化学物質の阻害効果または結合効果の可能性は、その実際の合成および試験の前にコンピューターモデリング技術の使用により分析され得る。所与の物質の理論的構造が、その物質とＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとの間での不十分な相互作用および会合を示唆するのであれば、物質の試験は除外される。しかし、コンピューターモデリングが強い相互作用を示すのであれば、次いで、この分子が合成され、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントへの結合能力について試験され得る。【０２４２】
ＬＯＸ−１の調節因子の候補化合物は、その化学物質またはフラグメントをＬＯＸ−１とのそれらの会合能力についてスクリーニングする工程、およびポジティブ因子を選択する工程により計算的に評価され得る。【０２４３】
当業者は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントと会合する能力について化学物質またはフラグメントをスクリーニングするためのいくつかの方法のうちの１つを使用し得る。このプロセスは、例えば、図７のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの構造座標もしくはその改変体もしくは相同体またはコンピューター読み取り可能記録媒体から生じる同様の形状を定義する他の座標に基づく、コンピューター画面上でのＬＯＸ−１様結合ポケットの視覚的検査により開始され得る。次いで、選択されたフラグメントまたは化学物質を、上記に定義される結合ポケット内に、種々の配向で配置させ得るか、またはドッキングさせ得る。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェア、続いて、ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的な分子力学的力場によるエネルギー最小化および分子動力学を用いて達成され得る。【０２４４】
コンピュータモデリングを行うためのコンピュータープログラムもまた、フラグメントまたは化学物質を選択するプロセスにおいて使用され得る。このようなプログラムとしては、以下が挙げられる。【０２４５】
１．ＧＲＩＤ（Ｐ．Ｊ．Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，「Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８，８４９−８５７頁（１９８５））。ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である。【０２４６】
２．ＭＣＳＳ（Ａ．Ｍｉｒａｎｋｅｒら，「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ」  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１，２９−３４頁（１９９１））。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。【０２４７】
３．ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｄ．Ｓ．Ｇｏｏｄｓｅｌｌら，「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８，１９５−２０２頁（１９９０））。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能である。【０２４８】
４．ＤＯＣＫ（Ｉ．Ｄ．Ｋｕｎｔｚら，「Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１，２６９−２８８頁（１９８２））。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能である。【０２４９】
一旦、適切な化合物質またはフラグメント（化合物種）が選択されると、それらは、単一化合物または複合体にアセンブリすることができる。構築に先だって、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの構造座標に関連してコンピューター画面上に表示される３次元イメージ上で、互いのフラグメントの関連性の視覚的検査が行われ得る。これに続き、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌ［Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ］のようなソフトウェアを用いるマニュアルでのモデル構築が行われる。【０２５０】
個々の化学物質またはフラグメントを連結させる際に使用され得る有用なプログラムは、以下を含む。【０２５１】
１．ＣＡＶＥＡＴ（Ｐ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔら、「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，１８２−１９６頁（１９８９））；Ｇ，ＬａｕｒｉおよびＰ．Ａ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ，「ＣＡＶＥＡＴ：ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．，８，５１−６６頁（１９９４））。ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡから入手可能である。【０２５２】
２．ＩＳＩＳ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡ）のような３Ｄデータベースシステム。この分野は、Ｙ．Ｃ．Ｍａｒｔｉｎ，「３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，２１４５−２１５４頁（１９９２）において概説される。【０２５３】
３．ＨＯＯＫ（Ｍ．Ｂ．Ｅｉｓｅｎら，「ＨＯＯＫ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｆｉｎｄｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅｓ  ｔｈａｔ  Ｓａｔｉｓｆｙ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｃ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ａ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．，Ｆｕｎｃｔ．，Ｇｅｎｅｔ．，１９，１９９−２２１頁（１９９４））。ＨＯＯＫは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。【０２５４】
上記のように一度に１つのフラグメントまたは化学物質を段階的様式でＬＯＸ−１のインヒビターなどとして構築することを進める代わりに、阻害性または他のＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結合化合物は、空の結合部位を使用するか、または必要に応じていくつかの既知のインヒビターの部分を含めるかのいずれかで、全体的にまたはデノボで設計され得る。以下を含む、多くの新規リガンド設計方法が存在する。【０２５５】
１．ＬＵＤＩ（Ｈ．−Ｊ．Ｂｏｈｍ，「Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６  ６１−７８頁（１９９２））。ＬＵＤＩは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。【０２５６】
２．ＬＥＧＥＮＤ（Ｙ．Ｎｉｓｈｉｂａｔａら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７，８９８５頁（１９９１））。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能である。【０２５７】
３．ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手可能である）。【０２５８】
４．ＳＰＲＯＵＴ（Ｖ．Ｇｉｌｌｅｔら，「ＳＰＲＯＵＴ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ，７，１２７−１５３頁（１９９３））。ＳＰＲＯＵＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｌｅｅｄｓ，ＵＫから入手可能である。【０２５９】
他の分子モデリング技術もまた、本発明に従って使用され得る［例えば、Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３３，８８３−８９４頁（１９９０）を参照のこと；Ｍ．Ａ．ＮａｖｉａおよびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，２０２−２１０頁（１９９２）もまた参照のこと；Ｌ．Ｍ．Ｂａｌｂｅｓら，「Ａ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，（Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．５，Ｋ．Ｂ．ＬｉｐｋｏｗｉｔｚおよびＤ．Ｂ．Ｂｏｙｄ編，ＶＣＨ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，３３７−３８０頁（１９９４））；Ｗ．Ｃ．Ｇｕｉｄａ，「Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌｏｇｙ．，４，７７７−７８１頁（１９９４）］。【０２６０】
一旦上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、その物質がＬＯＸ-１結合ポケットまたは二量体界面に結合し得る効率が、計算による評価により試験され、そして最適化され得る。例えば、有効なＬＯＸ−１結合ポケットインヒビターは、好ましくは、その結合状態と遊離状態との間に相対的に小さなエネルギー差（すなわち、結合の小さな変形エネルギー）を示さなければならない。従って、最も効率的なＬＯＸ−１ンヒビターは、好ましくは、約１０ｋｃａｌ／モル以下（より好ましくは、７ｋｃａｌ／モル以下）結合の変形エネルギーを用いて設計されるべきである。ＬＯＸ−１インヒビターは、全結合エネルギーにおいて類似する２つ以上のコンフォメーションで結合ポケットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離物質のエネルギーとインヒビターがタンパク質に結合するとき観察されるこれらのコンフォメーションの平均エネルギーとの間の差であると考えられる。【０２６１】
ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに結合するとして設計または選択される物質は、その結合状態において、好ましくは、標的酵素および周囲の水分子との静電的斥力相互作用がないように、計算によりさらに最適化され得る。このような非相補的静電的相互作用は、電荷−電荷斥力相互作用、双極子−双極子斥力相互作用および電荷−双極子斥力相互作用を含む。【０２６２】
特定のコンピューターソフトウェアは、化合物変形エネルギーおよび静電的相互作用を評価する分野において入手可能である。このような使用のために設計されたプログラムの例として、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ  ９４，ｒｅｖｉｓｉｏｎ  Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ  １９９５）；ＡＭＢＥＲ，ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９５）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；Ｉｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ  １９９５）；およびＡＭＳＯＬ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ，Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓワークステーション（例えば、「ＩＭＰＡＣＴ」グラフィクスを備えるＩｎｄｉｇｏ２）を用いて実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージもまた、当業者に公知である。【０２６３】
本発明により可能な別のアプローチは、ＬＯＸ−１に全体または部分的に結合し得る化学物質または化合物についての低分子データベースの計算的なスクリーニングである。このスクリーニングにおいて、結合部位へのこのような物質の適合の質は、形状的相補性または見積もられた相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る［Ｅ．Ｃ．Ｍｅｎｇら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，１６，５０５−５２４頁（１９９２）］。【０２６４】
（コンビナトリアルケミストリ）
本発明で使用する化合物ライブラリは、例えば、コンビナトリアルケミストリー技術、醗酵方法、植物および細胞抽出手順などが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの手段により、作製することができるかまたは入手することができる。コンビナトリアルライブラリを作成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｅ．Ｒ．Ｆｅｌｄｅｒ，Ｃｈｉｍｉａ  １９９４，４８，５１２−５４１；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１２３３−１２５１；Ｒ．Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９３，９，２３５−２３９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４，８４−８６；Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９１，３５４，８２−８４；Ｃａｒｅｌｌら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９９５，３，１７１−１８３；Ｍａｄｄｅｎら、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ２，２６９−２８２；Ｃｗｉｒｌａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９０，８７，６３７８−６３８２；Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２，８９，５３８１−５３８３；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，１３８５−１４０１；Ｌｅｂｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  １９９５，３７  １７７−１９８；およびそれらで引用された参考文献を参照のこと。これらの参考文献は、その全体を、本明細書中で参考として援用する。【０２６５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本発明の例示であり、本発明の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。【０２６６】
本発明において、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとＬＤＬとの結合機構に関して研究するために、本発明者らは、アセチル化ＬＤＬと複合体化したヒトＬＯＸ−１（ＬＯＸ−１）リガンド結合フラグメントの三次元（３−Ｄ）結晶構造を決定した。本明細書では、このＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント−アセチル化ＬＤＬ二成分複合体の結晶構造を開示する。本明細書ではまた、この構造データから推測可能な他の構造データも開示する。このような結晶構造に関する情報は、従来達成不可能であった改造レベルのものであり、しかも、ネイティブレベルでのものであり、その上、従来達成できなかったレベルでのスクリーニングを可能にするものあるという点で優れた効果を奏する。【０２６７】
本発明ではさらに、細胞表層上に存在するのと同じ形態であるジスルフィド結合による二量体構造を保持したLOX-1のリガンド結合ドメインの結晶および構造が解明された。【０２６８】
本発明ではまた、天然の二量体構造を保持するLOX-1結晶構造中の二量体界面に存在するキャビティー構造と、キャビティー近傍に存在するアミノ酸置換体が劇的なLOX-1の修飾LDLに対して結合能を失わせたことが見出された。このことから、二量体界面部に存在するキャビティーがLOX-1特異的阻害剤の標的部位になり、このことを利用して阻害剤などの調節剤のスクリーニングを行うことができる。【０２６９】
１つの局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程；ｂ）酸性ｐＨにおいて緩衝領域を有する緩衝液を該溶液に加える工程；ｃ）該溶液にカルシウムまたは亜鉛のイオンの供給源を加える工程；およびｄ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、を包含する方法を提供する。【０２７０】
本発明はまた、別の局面において、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体またはその相同体もしくは改変体の結晶を生成するための方法であって、ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体を発現して得られたタンパク質を巻き戻して得られたタンパク質を含む溶液を提供する工程であって、該ＬＯＸ−１は、ジスルフィド結合に必要なシステイン残基を含む、工程およびｂ）蒸気拡散法により結晶を得る工程、を包含する方法を提供する。【０２７１】
この方法において、タンパク質の溶液の提供は、本明細書において開示されるとおりであり、当該分野において周知の技術を用いることも可能である。緩衝領域として酸性ｐＨを有する緩衝液は、当該分野において公知であり、例えば、クエン酸、酢酸などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくはクエン酸が用いられる。カルシウムまたは亜鉛のイオンの供給源もまた、当該分野において公知であり、例えば、塩化カルシウムまたは塩化亜鉛が用いられるがそれらに限定されない。蒸気拡散法もまた、当該分野において公知である。蒸気拡散法には１−１０μｌのタンパク質を含んだ溶液の液滴をその１００倍程度の容量の沈殿剤外液に対して平衡化させ、タンパク質溶液の液滴をカバーグラスに吊り下げる形にする方法をハンギングドロップ法および窪んだところに静置させる方法をシッティングドロップ法が汎用される。どちらの場合においてもタンパク質溶液と外液をある割合で混ぜた液滴を密閉系で外液に対して蒸気平衡させることによって、拡散される。これにより結晶化する。【０２７２】
二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを用いる本発明において、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ＮＥＣＫ領域部を含むことが好ましく、より好ましくはＣＴＬＤと、ＮＥＣＫ領域部１４残基とを含む（配列番号４の１２９〜２７３位）。【０２７３】
１つの局面において、本発明では、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標のデータで生成される、立体構造コンピュータモデルが提供される。好ましくは、この原子座標は、図７に記載のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその改変体であり得る。より好ましくは、前記原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその改変体であってもよい。【０２７４】
このような立体構造コンピュータモデル生成は、本明細書において上述されるような当該分野において周知の技術によって生成することができる。したがって、例えば、当業者は、図７に記載されるデータを入力することにより、本発明のモデルを容易に提供することができる。【０２７５】
別の局面において、本発明では、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標のデータで生成される、立体構造コンピュータモデルが提供される。好ましくは、この原子座標は、図１７に記載のＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその改変体であり得る。より好ましくは、前記原子座標は二量体化をになう部分の原子座標を含み、かつ、図１７に記載の二量体化されたＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその改変体であってもよい。【０２７６】
このような立体構造コンピュータモデル生成は、本明細書において上述されるような当該分野において周知の技術によって生成することができる。したがって、例えば、当業者は、図１７に記載されるデータを入力することにより、本発明のモデルを容易に提供することができる。【０２７７】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイを提供する。【０２７８】
好ましくは、この原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。別の実施形態において、この原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその改変体である。【０２７９】
別の局面において、本発明はまた、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標を含むデータアレイであって、ここで該データアレイは、三次元分子モデリングアルゴリズムを使用することにより三次元構造を提示し得る、データアレイを提供する。【０２８０】
好ましくは、この原子座標は、図１７に記載の原子座標であるかまたはその相同体もしくは改変体である
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。好ましくは、この原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。別の実施形態において、この原子座標はアセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント原子座標またはその改変体である。【０２８１】
別の局面において、本発明はまた、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードした、コンピューター読み取り可能な記録媒体を提供する。【０２８２】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標をコードしたデータ；およびＢ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、を含む、プログラムを提供する。このようなプログラムは、本明細書において上述したような、立体構造の精密化またはモデリングのような技法を実行させるものであり得る。好ましくは、上記原子座標は、図７に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。上記原子座標は、アセチル化ＬＤＬの原子座標を含み、かつ、図７に記載のアセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１原子座標またはその改変体である。【０２８３】
別の局面において、本発明は、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の立体構造解析方法を提供するためのプログラムであって、
Ａ）二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の原子座標をコードしたデータ；およびＢ）三次元立体構造の解析をコンピュータに実行させるアプリケーションのコード、を含む、プログラムを提供する。好ましくは、上記原子座標は、図１７に記載の原子座標であるかまたはその改変体である。【０２８４】
１つの好ましい実施形態において、上記アプリケーションは、Ａ）前記原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該三次元分子モデルと比較する工程をコンピュータに実行させるものであり得る。そのようなモデルを比較するようなアプリケーションは、当該分野において周知であり、本明細書において上述された説明により当業者は容易に実施することができる。【０２８５】
別の局面において、本発明は、図７に記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質を提供する。高分解能Ｘ線結晶解析を用いて、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの３次元構造を解明したのは、本発明者らは初めてである。ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは従来結晶化されておらず、構造解析も行われていなかった。したがって、図７に記載されるような結晶構造を保持したタンパク質は、従来になかった構造を有するものといえる。好ましくは、このようなタンパク質は、ＬＯＸ−１の活性を含む。このような活性は、当該分野において周知の技法を用いて測定することができる。そのような活性は、例えば、ＬＤＬ結合活性であり得る。【０２８６】
従って、本発明の１つの実施形態では、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結晶が提供される。この結晶は好ましくはアセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであり得る。好ましくは、結晶は、Ｐ２１２１２１斜方晶形を有する。より好ましくは、本発明の結晶は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する。ここで、好ましくは、この結晶は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されている。この結晶は、好ましくは、ａ＝６２．８±０．２Å、ｂ＝６９．１±０．２Å、ｃ＝７９．３±０．２Åの単位格子定数を有する。【０２８７】
より好ましくは、この結晶系の場合、本発明の結晶は、非対称単位中にカルシウムイオンまたは亜鉛イオンを有する。この結晶系の場合、本発明の結晶は、非対称単位中に、１分子含まれる。【０２８８】
別の実施形態において、本発明の結晶は、Ｐ４１２１２１正方晶形である。このＰ４１２１２１正方晶形の好ましい実施形態では、結晶がアセチル化ＬＤＬと複合体化されている。この結晶は、好ましくは、ａ＝６４．４±０．２Å、ｂ＝６４．４±０．２Å、ｃ＝７９．８±０．２Åの単位格子定数を有する。より好ましくは、この結晶は、非対称単位中に２分子を有し、好ましくは、白金を含む。【０２８９】
別の実施形態において、本発明の結晶系は、Ｐ２１２１２１斜方晶形であり得る。この結晶もまた、好ましい実施形態において、結晶がアセチル化ＬＤＬと複合体化されている。より好ましい実施形態では、この結晶は、ａ＝５６．８±０．２Å、ｂ＝６７．６±０．２Å、ｃ＝７９．０±０．２Åの単位格子定数を有する。より好ましい実施形態では、この結晶は、非対称単位中に２分子を有する。【０２９０】
既知の類似受容体との比較によって、この酵素とアセチル化ＬＤＬとの結合に影響を及ぼすと考えられるいくつかの固有の特徴が示された。Ｃ型レクチン様ドメインをもちリガンド結合部位が明らかにされているＣＤ６９，  Ｌｙ４９Ａ，  ＭＢＰ−Ａの立体構造とそのリガンド結合部位の位置からＬＯＸ−１のリガンド結合部位（明細書の中で活性ポケットとしている部位）が存在する部位が推定されることから、本発明において同定された構造は、リガンドに結合する部分を少なくとも一部担うと考えてよいといえる。【０２９１】
従って、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結合ポケットまたはその一部、あるいは類似の３次元形状を有するこれらの結合ポケットの相同体もしくは改変体を含む分子もしくは分子複合体を提供する。【０２９２】
本発明はまた、ＬＯＸ−１（例えば、ヒトＬＯＸ−１）リガンド結合フラグメントの構造座標または二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結語ウフラグメントの構造座標を含む、コンピューター読み取り可能な記録媒体（これは、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結合ポケットの全部または一部を含んでいる）を提供する。これらのデータでコード化されるこのような記録媒体は、コンピューター画面または同様の視覚装置上で、分子もしくは分子複合体（これは、このような結合ポケットまたは同様の形状である相同体性結合ポケットを含む）の３次元グラフィック表示を表示し得る。【０２９３】
本発明はまた、上記結合ポケットまたは二量体形成構造を含む全部または一部に結合する化合物を設計、評価、および同定するための方法を提供する。このような化合物は、ＬＯＸ−１またはその相同体のインヒビターの候補であり得る。【０２９４】
本発明はまた、ＬＯＸ−１またはその相同体あるいはその二量体形成のインヒビターとして有用な、新規なクラスの化合物およびそれらの医薬組成物を提供する。【０２９５】
本発明はまた、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに少なくともいくらか構造的に類似する特徴を含む分子もしくは分子複合体の３次元構造体の少なくとも一部を決定するための方法を提供する。これは、本発明によりＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントについて得られた構造座標の少なくともいくらかを用いることにより達成される。【０２９６】
本発明はまた、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントおよび関連する複合体を結晶化させるための方法を提供する。【０２９７】
そのような結晶は、従来の技術では全く提供することができなかった。本発明では、例えば、実施例に提供されるような条件を用いることによって初めて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの結晶化に成功し、その構造解析を行うことに成功した。従って、本発明のこのような結晶は、従来技術によっては得ることができなかったものであり、本発明は顕著な効果を奏するものといえる。なお、実施例に提供されるような条件を用いても、純度の問題からすべてが結晶化するとはいえなかった。本発明は、そのような条件を適宜改変することにより用いて、鋭意検討することにより、結晶化に成功したものである。【０２９８】
本発明者らは、Ｘ線結晶解析に適切な、アセチル化ＬＤＬと複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む結晶を提供した。【０２９９】
本発明者は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位結合ポケットの形状および構造についての情報を初めて提供した。【０３００】
結合ポケットは、薬物の発見などの分野において重要な用途を有する。天然のリガンドまたは基質と、それらの対応する受容体または酵素の結合ポケットとの会合は、多くの生物学的作用機構の基礎である。同様に、多くの薬物は、受容体または酵素の結合ポケットとの会合を通じてそれらの生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケットの全てまたは任意の部分で起こり得る。このような会合を理解することは、標的受容体または酵素とより好適に会合する薬物を設計し、それにより生物学的効果を改良することを導くための助けとなる。従って、この情報は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の結合ポケットのインヒビター候補を設計するのに有用である。【０３０１】
従って、１つの局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットを含む、タンパク質を提供する。ここで、この活性ポケットは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであってもよい。【０３０２】
好ましくは、上記活性ポケットは、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の１９１位〜２４０位またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。【０３０３】
より好ましくは、上記活性ポケットは、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の２００位〜２３５位またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。【０３０４】
より好ましくは、上記活性ポケットは、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の２０８位〜２３１位またはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。【０３０５】
好ましくは、上記活性部位ポケットは、結合リガンド（例えば、ＬＤＬまたはその改変体（例えばアセチルＬＤＬ）を含む。【０３０６】
好ましくは、上記タンパク質は、酸化ＬＤＬ、アセチル化ＬＤＬ、ポリイノシン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、アポトーシス細胞、バクテリアおよび血小板からなる群より選択される少なくとも１つまたは２以上の分子に対する結合活性を有する。【０３０７】
別の局面において、本発明は、二量体形態での、図１７記載の原子座標によって定義される構造を有する、単離および精製された、タンパク質またはその相同体もしくは改変体を提供する。【０３０８】
本発明は、さらに別の局面において、Ｃ２単斜晶形であり、および配列番号３６（配列番号４のアミノ酸番号１２９〜２７３）に示されるアミノ酸配列、または該アミノ酸配列に１以上の置換、付加もしくは欠失を含む配列、もしくは該アミノ酸配列と少なくとも約３０％以上の相同性を有する、二量体形態でのＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の結晶を提供する。好ましくは、この結晶は、結晶は、ａ＝７０．８６±０．２０Å、ｂ＝４９．５４±０．２０Å、ｃ＝７６．７３±０．２０Åの単位格子定数を有する。【０３０９】
本発明はまた、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体界面に存在するキャビティー構造を含む、タンパク質を提供する。このタンパク質は、配列番号３５および３６に示す配列を含む。【０３１０】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の活性ポケットまたは二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体を含む、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子、およびその情報を記録した記録媒体を提供する。当業者であれば、いったんタンパク質のアミノ酸配列を知ったならば、そのような配列をコードする核酸配列を有する核酸分子を得ることは容易に行うことができる。【０３１１】
１つの局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程を包含する、方法を提供する。好ましくは、このＬＯＸ−１は、アセチル化ＬＤＬと複合体化されているものであり得る。より好ましくは、この原子座標は、図７に記載の原子座標を含むが、図７に記載の原子座標から合理的にモデリング可能なものであればどのような原子座標であっても使用可能である。  【０３１２】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、該方法は、候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体界面の原子座標とを比較する工程を包含する、方法を提供する。好ましくは、この二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する。【０３１３】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程を包含する。三次元分子モデルを得る方法は、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。上記比較工程もまた、当該分野において周知であり、そのような技術もまた、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。好ましくは、このＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものである。別の実施形態において、上記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む。【０３１４】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の相同体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；および  Ｂ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較する工程を包含する、方法を提供する。好ましくは、この二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する。【０３１５】
１つの実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体、あるいは二量体を形成するか形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体を提供する。【０３１６】
別の実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体、あるいは二量体を形成するか形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント相同体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。【０３１７】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、を包含する。三次元分子モデルを得る方法は、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。上記比較工程もまた、当該分野において周知であり、そのような技術もまた、本明細書において上述されるような技術を用いることができる。ここで、所定のパラメータとしては、タンパク質の物性に関連するパラメータを挙げることができ、例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用などの相互作用が挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、このＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものである。別の実施形態において、上記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む。【０３１８】
他の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の改変体を得る方法であって、該方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程、を包含する、方法を提供する。好ましくは、この二量体は、図１７に記載の原子座標によって定義される構造を有する。【０３１９】
１つの好ましい実施形態において、上記改変体は、ＬＯＸ−１活性が亢進されている。ここで、ＬＯＸ−１活性が亢進されているかどうかは、例えば、ＬＤＬをリガンドとしてそのような改変体が結合活性を野生型のＬＯＸ−１よりも有意に上昇させるかどうかを見ることによって判定することができる。本明細書では、そのような判定の際には、ＬＯＸ−１活性は、野生型ＬＯＸ−１と同様のアッセイ条件を用いることができる。【０３２０】
１つの好ましい実施形態において、上記改変体は、ＬＯＸ−１活性が低減されている。ここで、ＬＯＸ−１活性が低減されているかどうかは、例えば、アセチルＬＤＬをリガンドとしてそのような改変体がＬＤＬの結合を野生型のＬＯＸ−１よりも有意に減少させるかどうかを見ることによって判定することができる。【０３２１】
別の実施形態において、本発明は、本発明の方法によって同定された、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体あるいは二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体を提供する。【０３２２】
別の実施形態において、本発明は、上記本発明の方法によって同定された、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体あるいは二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント改変体のアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。【０３２３】
上記のような相同体または改変体において、アミノ酸の変異、付加、置換および／または欠損に起因する結晶構造における改変、あるいは結晶を構成する任意の成分における他の変化はまた、構造座標における変化の原因であり得る。このような変化が、元の座標に比較して受容可能な標準誤差の範囲内である場合、得られる３次元形状は同じであるとみなされる。従って、例えば、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位結合ポケットまたは二量体界面に結合するリガンドはまた、別の結合ポケットまたは二量体界面に結合すると予測される。この結合ポケットの結合座標は、受容可能な誤差の範囲内におちつくような形状で定義した。このような改変複合体またはその結合ポケットはまた、本発明の範囲内である。【０３２４】
このようなことを確認するために、分子またはその結合ポケット部分が、上記のＬＯＸ−１結合ポケットのすべてまたは一部に十分に類似しているかどうかを決定するコンピューター分析が必要となり得る。このような分析は、現在のソフトウェアアプリケーション（例えば、ＱＵＡＮＴＡバージョン４．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  アプリケーション）において、添付のユーザーズガイドに記載されるように実施され得る。【０３２５】
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙアプリケーションは、異なる構造、同じ構造の異なるコンフォメーション、および同じ構造の異なる部分の間の比較を可能にする。構造を比較するためにＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙにおいて使用される手順は、４つの工程に分割される：１）比較される構造をロードする；２）これらの構造における原子当量を定義する；３）適合操作を実施する；および４）結果を分析する。【０３２６】
各構造は、名称で特定される。１つの構造は、標的として特定される（すなわち、固定構造）；すべての残りの構造は、作業構造である（すなわち、可変構造）。原子当量は、ＱＵＡＮＴＡ内でユーザーインプットにより定義されるので、本発明の目的のために、比較される２つの構造間の保存残基のすべてについて等価な原子を、タンパク質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ，およびＯ）として本発明者らは定義する。本発明者らはまた、強固な適合操作のみを考慮する。【０３２７】
強固な適合操作が使用される場合、作業構造は翻訳され、そして回転されて、標的構造との最適適合を得る。適合作業は、可変構造に適用される最適な翻訳および回転を計算するアルゴリズムを使用し、その結果、等価な原子の特定の対についての適合の根二乗平均差は絶対最低である。この数は、オングストロームで与えられ、ＱＵＡＮＴＡによって報告される。【０３２８】
本発明の目的のために、図７などにリストされる構造座標により記載される関連する骨格原子に重ね合わせた場合に３．０Å未満の保存された残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ，Ｏ）の根二乗平均偏差を有する任意の分子もしくは分子複合体、もしくはそれらの結合ポケットは、同一であるとみなされる。より好ましくは、根二乗平均偏差は、２．５Å未満である。【０３２９】
用語「根二乗平均偏差」は、平均からの偏差の二乗の算術的平均の二乗根を意味する。これは、傾向または目的からの偏差（ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）または偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を表現する方法である。本発明の目的のために、「根二乗平均偏差」は、ＬＯＸ−１またはその結合ポケット部分の骨格からのタンパク質の骨格における偏差を、本明細書に記載のＬＯＸ−１の構造座標により定義されるように、定義する。【０３３０】
１つの実施形態において、本発明は、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の１９１位〜２４０位の結合ポケットのすべてまたは一部を含む、分子もしくは分子複合体、または３．０Å以下、好ましくは２．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む該分子もしくは分子複合体の相同体を提供する。代替のより好ましい本発明の実施形態は、アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１分子である。【０３３１】
アセチル化ＬＤＬ複合体化ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその結合ポケットもしくはその相同体について生成された構造座標を使用するために、それらを３次元形状に変換することがときに必要である。これは、市販のソフトウェアの使用により達成される。このソフトウェアは、構造座標のセットから分子またはその一部の３次元グラフィック表示をし得る。【０３３２】
それゆえ、本発明の別の実施形態によれば、前記のデータを使用するための命令がプログラムされた機械を使用する場合、上記の本発明の分子もしくは分子複合体のいずれかのグラフィック３次元表示を表し得る、コンピューター読み取り可能なデータでコードされるデータ記憶物質を含むコンピューター読み取り可能記録媒体が提供される。【０３３３】
別の実施形態によれば、本発明は、コンピューター読み取り可能データを用いてコードされたデータ記録材料を含むコンピューター読み取り可能データ記録媒体を提供し、該データを使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該コンピューター読み取り可能データ記録媒体は、分子もしくは分子複合体のグラフィック３次元表示を表示し得、該分子もしくは分子複合体は、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の１９１位〜２４０位の、または該分子もしくは分子複合体の相同体の構造座標により定義される結合ポケットの全てのもしくは任意の部分を含み、ここで、該相同体は、２．５Å以下の該アミノ酸の骨格原子からの根二乗平均偏差を有する結合ポケットを含む。【０３３４】
別の実施形態によれば、コンピューター読み取り可能データ記録媒体は、図７に記載の構造座標のフーリエ変換を含むコンピューター読み取り可能データの第一のセットを用いてコードされるデータ記憶物質を含み、該データを使用するための命令を用いてプログラムされた機械を使用する場合、該第一のセットは、コンピューター読み取り可能データの第二のセットと対応する構造座標の少なくとも一部を決定するために、分子もしくは分子複合体のＸ線回折パターンを含むコンピューター読み取り可能データの第二のセットと組み合わせられ得る。【０３３５】
ここで、図１２を用いて、本発明のひとつの実施形態を示す。システム１０は、中央演算処理装置（「ＣＰＵ」）２０を含むコンピューター１１、作業メモリ２２（例えば、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）または「コア」メモリであり得る）、大容量記憶メモリ２４（例えば、１つ以上のディスクドライブまたはＣＤ−ＲＯＭドライブ）、１つ以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレイ端末２６、１つ以上のキーボード２８、１つ以上の入力ライン３０、１つ以上の出力ライン４０を含み、これらの全ては従来の双方向システムバス５０により相互に接続される。【０３３６】
入力ライン３０によりコンピューター１１に接続された入力ハードウェア３６は、種々の方法で実行され得る。本発明のコンピューター読み取り可能データは、電話回線または専用データ回線３４により接続されたモデム３２の使用を介して入力され得る。あるいはまたはさらに、入力ハードウェア３６は、ＣＤ−ＲＯＭドライブまたはディスクドライブ２４を含み得る。ディスプレイ端末２６と共に、キーボード２８もまた、入力装置として使用され得る。【０３３７】
出力ライン４０によりコンピューター１１に接続された出力ハードウェア４６は、通常の装置により同様に実行され得る。例として、出力ハードウェア４６は、本明細書中で記載されるＱＵＡＮＴＡのようなプログラムを使用して本発明の結合ポケットのグラフィック表示を表示するために、ＣＲＴディスプレイ端末２６を含み得る。出力ハードウェアはまた、後の使用のためにシステム出力を保存するために、ハードコピー出力を行い得るようにプリンター４２を、またはディスクドライブ２４を含み得る。【０３３８】
操作において、ＣＰＵ  ２０は、種々の入力および出力装置３６、４６と連係し、大容量記憶装置２４からデータアクセスならびに作業メモリ２２へのおよびここからのアクセスと連係し、そして配列のデータ処理ステップを決定する。多数のプログラムが、本発明のコンピューター読み取り可能データを処理するために使用され得る。このようなプログラムは、本明細書中に記載されるように薬物発見のコンピューター利用方法を参照して設計される。データ記録媒体の以下の記載の全体にわたって適切であるような、ハードウェアシステム１０の構成装置もまた本発明の範囲内にある。【０３３９】
図１３は、図１２のシステム１０のようなシステムにより実行され得るコンピューター読み取り可能データを用いてコードされ得た、磁気データ記録媒体１００の横断面を示す。媒体１００は、片面または両面に、従来のものであり得る適切な基材１０１および従来のものであり得る適切なコーティング１０２を有する、従来のフロッピー（登録商標）ディスケットまたはハードディスクであり得る。これは、その極性または配向が磁気的に変化され得る磁区（目に見えない）を含む。媒体１００はまた、ディスクドライブまたは他のデータ記憶装置２４の軸を受けるための開口部（示さない）を有し得る。【０３４０】
媒体１００のコーティング１０２の磁区は、図１２のシステム１０のようなシステムによる実行のために、従来の様式で、本明細書中に記載されるようなコンピューター読み取り可能データをコードするように、極性化されるかまたは配向化される。【０３４１】
図１４は、図１２のシステム１１のようなシステムにより実行され得る、このようなコンピューター読み取り可能データまたは命令のセットを用いてまたコードされ得る光学的読み取り可能データ記録媒体１１０の横断面を示す。媒体１１０は、従来のコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）、または光学的に読み取り可能でありそして光磁気的に書き込み可能である光磁気ディスクのような再書き込み可能媒体であり得る。媒体１００は、好ましくは、従来のものであり得る適切な基材１１１、および通常は基材１１１の片面に従来のものであり得る適切なコーティング１１２を有する。【０３４２】
周知であるようなＣＤ−ＲＯＭの場合において、コーティング１１２は、反射的でありそしてコンピューター読み取り可能データをコードするために複数のピット１１３で押印される（ｉｍｐｒｅｓｓ）。ピットの配列は、レーザー光をコーティング１１２の表面に反射させる（ｒｅｆｌｅｃｔ  ｏｆｆ）ことにより読まれる。好ましくは実質的に透明である保護コーティング１１４が、コーティング１１２の表面上に提供される。【０３４３】
周知であるような光磁気ディスクの場合において、コーティング１１２は、ピット１１３を有さないが、レーザ（図示しない）により一定の温度を超えて加熱された場合にその極性または配向が磁気的に変化され得る、複数の磁区を有する。この区の配向は、コーティング１１２から反射されたレーザー光の偏光を測定することにより読み取られ得る。この区の配列は、上記のようにデータをコードする。【０３４４】
本発明に従って、ＬＯＸ−１の全部またはその一部（例えば、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメント）ならびにそれらの構造的に類似の相同体の３次元構造を表示し得るデータは、構造のグラフィック３次元表示を表示し得る機械読み取り記録媒体中に保存される。このようなデータは、薬物発見のような種々の目的のために使用され得る。【０３４５】
例えば、データによりコードされる構造は、化学物質と会合するその能力について、計算的に評価され得る。ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントと会合する化学物質は、ＬＯＸ−１を阻害し得る。このような物質は候補薬物である。あるいは、データによりコードされる構造は、コンピューター画面上にグラフィック３次元表示で表示され得る。このことは、構造の視覚的検査、ならびに化学物質との構造の会合の視覚的検査を可能にする。【０３４６】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、化学物質が上記の任意の分子もしくは分子複合体と会合する能力を評価するための方法に関する。本方法は以下の工程を包含する：ａ）計算手段を用いて、化学物質と分子もしくは分子複合体の結合ポケットとの間の適合操作を行う工程：およびｂ）この適合操作の結果を分析して、化学物質と結合ポケットとの間の会合を定量化する工程。本明細書中で使用される用語「化学物質」は、化合物、少なくとも２つの化合物の複合体、およびこのような化合物または複合体のフラグメントを意味する。【０３４７】
（医薬および治療・予防）
本発明は、本発明の方法によって同定された医薬ならびにそれを用いた治療および予防法を提供する。【０３４８】
本明細書において「予防」（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓまたはｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）とは、ある疾患または障害について、そのような状態が引き起こされる前に、そのような状態が起こらないように処置することをいう。【０３４９】
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。【０３５０】
本発明の医薬組成物は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントおよび／または本発明のスクリーニング方法により得られる相同体および／またはインヒビター；ならびに必要に応じて、任意の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントまたはビヒクルを含有する。このような組成物は、必要に応じて、他の追加薬剤を含有できる。【０３５１】
医薬組成物を作製する場合には、好ましくは、当該分野において公知のＬｉｐｉｎｓｋｉ因子（「Ｌｉｐｉｎｓｋｉの５原則」としても公知）を考慮する。Ｌｉｐｉｎｓｋｉ因子とは、良好な生体内吸収プロフィールを有する化合物を識別するための指標である。良好な生体内吸収プロフィールを有する化合物を選択するためには、Ｌｉｐｉｎｓｋｉの５原則に従い、例えば、水素供与原子数５以下、水素結合許容原子数１０以下、分子量５００以下、およびｌｏｇＰの計算値が５以下の化合物が選択される（詳細には、Ｌｉｐｉｎｓｋｉ，ＣＡら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２００１  Ｍａｒ  １；４６（１−３）：３−２６を参照のこと）。【０３５２】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬または動物薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバントが挙げられるがそれらに限定されない。【０３５３】
本発明の医薬組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、幹部への局所投与、皮膚投与、動脈内投与、滑膜内投与、胸骨内投与、胞膜内投与、病変内局注投与、および頭蓋内注射投与または注入技術など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払う限り、当業者の技術範囲内にある。【０３５４】
本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。【０３５５】
本発明は、医薬組成物として処方される場合、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。【０３５６】
そのような適切な薬学的に受容可能な薬剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬は、本発明の活性成分を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。そのような受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。【０３５７】
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、本発明の活性成分の相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。【０３５８】
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべきポリペプチド量および細胞量を決定することができる。【０３５９】
１つの実施形態において、本発明において同定される化合物は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。【０３６０】
本発明の医薬を被検体に投与する場合、そのような医薬の有効成分は、例えば１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重と約１００ｍｇ／ｋｇ体重との間、好ましくは１日当たり約０．５ｍｇ／ｋｇ体重と約７５ｍｇ／ｋｇ体重との間で投与され得る。そのような投与量は、対象とするＬＯＸ−１に関連する疾患または障害、予防または治療の別、被検体の年齢、サイズ、性別、病歴、併用する医薬などによって変動するが、当業者はそのような変動因子を考慮して適宜適切な投与量を決定することができる。代表的には、本発明の医薬組成物を投与する頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。例えば、１日当たり約１回〜約５回投与されるか、あるいは連続的な注入方法により投与され得る。このような投与は、慢性治療または急性治療で用いられ得る。単一の投与形態を与えるためにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分量は、治療される宿主および特定の投与方法に応じて変化する。代表的な調製物は、約５％〜約９５％（ｗ／ｗ）の活性化合物を含有する。好ましくは、このような調製物は、約２０％〜約８０％の活性化合物を含有する。【０３６１】
本発明の組成物が、医薬の有効成分として１種以上の追加の医薬組成物または予防剤の組合せを含有する場合、本発明において同定された化合物種および追加薬剤の両方は、単一療法レジメンで通常投与される投薬量の約１０〜１００％の間、さらに好ましくは、約１０〜８０％の間の投薬量レベルで、与えられるべきである。【０３６２】
（別の分子への応用）
図７または図１７（二量体形態）で示した構造座標はまた、特に同じサブファミリーに属する他の結晶化分子（例えば、ＮＫ細胞受容体、リンパ球ＩＧＥ受容体、樹状細胞受容体ＣＬＥＣ−１およびＣＬＥＣ−２など）もしくは分子複合体についての構造的な情報を得る際に、補助するのに使用することができる。これは、任意の多くの分子置換を含む周知技術により、達成できる。【０３６３】
従って、他の実施形態では、本発明は、構造が未知の分子もしくは分子複合体についての構造的な情報を得るために、分子置換を利用する方法を提供する。該方法は、以下の工程を包含する：ａ）未知の構造の上記分子もしくは分子複合体を結晶化する工程；ｂ）上記結晶化分子もしくは分子複合体から、Ｘ線回折パターンを得る工程；およびｃ）  図７で示した構造座標の少なくとも一部を、上記Ｘ線回折パターンに適用して、構造が未知の上記分子もしくは分子複合体の３次元電子密度マップを得る工程。【０３６４】
分子置換を使用することにより、本発明で提供される（そして図７で示す）ようなＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの複合体の構造座標の全部または一部は、このような情報をａｂ  ｉｎｉｔｉｏ法で決定する試みよりも迅速かつ効率的に、構造が未知の結晶化分子もしくは分子複合体の構造を決定するのに使用され得る。【０３６５】
分子置換は、未知の構造の位相の正確な見積もりを提供する。位相は、直接決定できない結晶構造を解明するのに使用する式の因子である。分子置換以外の方法によって、位相の正確な値を得ることは、概算および洗練（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）の反復サイクルを含む多くの時間を要するプロセスであり、そして結晶構造の解明を非常に妨げる。しかしながら、少なくとも相同部分を含むタンパク質の結晶構造が解明されたとき、既知構造の位相は、未知構造の位相の予測の基礎を提供する。【０３６６】
この方法は、構造が未知の分子もしくは分子複合体の結晶の観察されたＸ線回折パターンを最もよく説明するよう、未知の分子もしくは分子複合体の結晶の単位格子内に、図７に記載のＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの関連部分を配向し位置を決めることによって、構造座標が未知の分子もしくは分子複合体の予備モデルを作成することを包含する。次いで、位相がこのモデルから計算され、そして観察されたＸ線回折パターン振幅と組み合わせて、座標が未知の構造の電子密度マップを作成し得る。今度は、これは、任意の周知のモデル構築および構造洗練技術に供され、未知の結晶化分子もしくは分子複合体の最終的で正確な構造を提供し得る［Ｅ．Ｌａｔｔｍａｎ、「Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ」、ｉｎ  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１５、５５〜７７頁（１９８５）；Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編、「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｓｅｒ．、Ｎｏ．１３、Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７２）］。【０３６７】
ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいは二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの任意の部分と充分に相同である任意の結晶化分子もしくは分子複合体の任意の部分の構造は、この方法により解明され得る。【０３６８】
好ましい実施形態では、分子置換方法は、分子もしくは分子複合体についての構造的な情報を得るのに使用され、ここで、この複合体は、少なくとも１個のＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいは相同体を含有する。【０３６９】
本発明により提供されるＬＯＸ−１の構造座標は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはＬＯＸ−１複合体の他の結晶形態の構造および／または二量体の形成機構を解明するのに、特に有用である。【０３７０】
さらに、本発明により提供されるＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの構造座標は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの変異体の構造（これは、必要に応じて、化学物質との複合体として結晶化されていてもよい）を解明するのに有用である。次いで、一連のこのような複合体の結晶構造は、分子置換により解明され、そして野生型ＬＯＸ−１の結晶構造と比較され得る。この酵素の種々の結合部位内での修飾部位の候補が、このように同定され得る。この情報は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントと化学物質または化合物との間の最も効率的な結合相互作用（例えば、増大した疎水性相互作用）を決定するさらなる手段を提供する。【０３７１】
この構造座標はまた、種々の化学物質と共複合体化したＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１相同体の結晶構造を解明するのに、特に有用である。このアプローチは、ＬＯＸ−１のインヒビター候補を含む化学物質とＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとの間の相互作用のための最適部位の決定を可能とする。例えば、異なるタイプの溶媒に曝露した結晶から回収した高分解能Ｘ線回折データは、各タイプの溶媒分子が存在する場所の決定を可能とする。次いで、これらの部位に堅く結合する小分子が設計および合成され、そしてそれらのＬＯＸ−１阻害活性について試験され得る。【０３７２】
上で述べた全ての複合体は、周知のＸ線回折技術を用いて研究され得、そしてコンピューターソフトウェア（例えば、Ｘ−ＰＬＯＲ［Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、１９９２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ．により配布；例えば、Ｂｌｕｎｄｅｌｌ  および  Ｊｏｈｎｓｏｎ、上記；Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１４  および  １１５巻、Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆら著、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）を参照のこと］）を用いて、Ｒ値約０．２０以下までの分解能１．５〜３ÅのＸ線データと対比して、洗練（精密化）され得る。それゆえ、この情報は、既知のＬＯＸ−１インヒビターを最適化するのに、そしてより重要には、新規のＬＯＸ−１インヒビターを設計するのに、使用され得る。【０３７３】
したがって、１つの局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体に結合し得る化合物を同定する方法を提供する。このような方法は、以下の工程：ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；およびｂ）上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程、を包含する。活性部位ポケットは、本発明に記載の方法によって同定することができる。そのような活性ポケットの例は、本明細書において上述したとおりである。上述の結合し得る化合物の同定もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。そのような方法は、本明細書において上述されている。結合は、タンパク質の一部であれば、どこでもよいが、好ましくは活性部位ポケットであり得る。あるタンパク質に結合し得るかどうかは、相互作用（例えば、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用など）を計算することによって行うことができる。【０３７４】
上記結合し得る化合物を同定する方法において、好ましくは、上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、上記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む。【０３７５】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体の原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；およびＢ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する工程、を包含する、方法を提供する。好ましくは、この原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む。ここで提示される化合物はＬＯＸ−１活性を、亢進または低減させるものであり得る。好ましくは、このＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号３５に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列および／または配列番号３６に示すアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）が保存されることが有利である。このトリプトファンが変異を受けると、二量体形成能が著しく低下することが示されたからであるが、それに限定されない。より好ましくは、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成するポリペプチドは、配列番号４に示す配列のうち、１５０位のトリプトファン（Ｗ）を含むキャビティー形成部分が保存されることが有利である。理論に束縛されることを望まないが、このようなキャビティ形成部分は二量体形成のために必要であるようであるからである。【０３７６】
別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものであり得る。【０３７７】
より好ましくは、上述のＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒト、ウシ、ヒツジなどの哺乳動物、またはヒトのＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む。【０３７８】
上記結合し得る化合物を同定する方法の１つの実施形態において、上記工程ａ）において決定された空間座標は、図７に記載されるアミノ酸残基または配列番号４の１９１位〜２４０位のまたはそれに対応するアミノ酸残基の原子座標によって定義される。別の実施形態において、この空間座標は、図７に記載される塩化物イオン（Ｃｌ−）、リン酸イオン、結合リガンド（ＬＤＬまたはその改変体など）の原子座標を含む。【０３７９】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を提供する。この方法は、以下の工程：Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、上記三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程、を包含する。このようなモデルを得る工程および原子間の距離を検索する工程、および候補化合物種を同定する工程は、当該分野において周知であり、本明細書において上述のコンピュータによる解析を適宜用いて行うことができる。【０３８０】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面に結合し得る化合物を同定する方法であって、該方法は、以下の工程：
Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程を包含する、方法を提供する。【０３８１】
別の実施形態において、このＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであり得る。好ましくは、上記原子座標は、図７または図１７（二量体形成）に記載の原子座標を含む。【０３８２】
別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものである。【０３８３】
好ましい実施形態において、使用されるＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウスなどの哺乳動物またはヒトのＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む。【０３８４】
好ましくは、上記候補化合物は、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合活性を阻害する活性を有する。【０３８５】
ある実施形態において、上記候補化合物は、ＬＯＸ−１のＬＤＬ結合活性を活性化する活性を有する。【０３８６】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物に関する。そのような化合物は、ＬＯＸ−１のアンタゴニストまたはアゴニスト、あるいはインヒビターであり得る。そのような化合物は、いったん原子座標が決まったならば、当業者は適宜、当該分野において公知の方法を応用して合成することができる。【０３８７】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物を有効成分として含む医薬組成物に関する。医薬組成物の製造法は、当該分野において周知であり、本明細書において上述されたとおりである。本発明の医薬組成物は、ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するためのものであり得る。そのような疾患または障害は、当該分野において公知であり、例えば、動脈硬化、狭心症、心筋梗塞、脳梗塞などの動脈硬化が原因となる循環器系疾患などに関する疾患などが挙げられるがそれらに限定されない。【０３８８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを提供する。このようなデータをコードするデータベースの生成法は当該分野において周知であり、本明細書において上述されるような方法を用いて実行され得る。【０３８９】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む記録媒体を提供する。このような記録媒体は、どのような形態でもよく、例えば、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードであってもよい。【０３９０】
別の局面において、本発明は、本発明の方法により同定された化合物の名称および構造を含むデータをコードした、データベースを含む伝送媒体を提供する。そのような伝送媒体は、当該分野において周知のものが使用され得、例えば、インターネット、イントラネット、ＬＡＮ、ＷＡＮなどが挙げられるがそれに限定されない。【０３９１】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、ａ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントおよび該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントとアセチル化ＬＤＬとの複合体を提供する工程；  ｂ）ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのＮＭＲと該複合体のＮＭＲとを比較する工程；ｃ）変化がある原子（好ましくはアミノ酸位）を帰属する工程、を包含する、方法を提供する。単独のＮＭＲおよび複合体のＮＭＲを提供する技術は、当該分野において公知の方法を利用することができ、本明細書の開示に従って行うことができる。ＮＭＲの原子帰属もまた、当該分野において周知であり、本明細書において概説されている方法を用いることができる。【０３９２】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントのリガンドのファルマコフォアモデルの作成方法であって、ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体、および二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を提供する工程；ｂ）該二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその改変体のＮＭＲと該二量体を形成しないＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体のＮＭＲとを比較する工程；ｃ）変化がある原子を帰属する工程を包含する、方法を提供する。単独のＮＭＲおよび複合体のＮＭＲを提供する技術は、当該分野において公知の方法を利用することができ、本明細書の開示に従って行うことができる。ＮＭＲの原子帰属もまた、当該分野において周知であり、本明細書において概説されている方法を用いることができる。【０３９３】
別の局面において、本発明は、本発明の方法によって同定される、ファルマコフォアモデルを提供する。このようなファルマコフォアモデルは、本明細書において提示されるＮＭＲの比較によって得られた原子帰属を用いて作成することができる。【０３９４】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用を提供する。【０３９５】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定される化合物またはその塩を提供する。そのような化合物は、いったんファルマコフォアモデルが決まれば、当業者は、合成可能なものを適宜選択して合成することができる。【０３９６】
別の局面において、本発明は、本発明において同定されたファルマコフォアで規定された化合物を提供する。このような化合物は、本発明で同定されたファルマコフォアのデータを当該分野において周知の技術に適用して用いて、同定することができる。【０３９７】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルの、医薬候補分子のスクリーニングにおける使用を提供する。このようなファルマコフォアを上記スクリーニングで使用する場合、本明細書において記載されるようなコンピュータ解析技術を用いることができる。【０３９８】
別の局面において、本発明は、本発明のファルマコフォアモデルを使用したスクリーニングによって同定された医薬候補分子を提供する。好ましくは、この分子は、ＬＯＸ−１のＬＯＸ−１活性を阻害する活性を有する。別の好ましい実施形態では、本発明は、この医薬候補分子を含む、医薬組成物を提供する。【０３９９】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法を提供する。この方法は、Ａ）ＬＯＸ−１の原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルと、上記医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；Ｃ）上記候補化合物のうち、上記ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；およびＤ）上記化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、を包含する。ここで、上記Ａ）〜Ｃ）までは、本明細書において別の箇所において記載されるような技術を用いて行うことができる。Ｄ）混合する工程もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、そのような方法は、日本薬局方において記載されるような技術を用いて実施することができる。好ましくは、上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、上記原子座標は、図７に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものを利用することができる。【０４００】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための医薬組成物を調製する方法であって、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルと、該医薬組成物に含まれるべき候補化合物のライブラリーとの相互作用を評価する工程；Ｃ）該候補化合物のうち、該ＬＯＸ−１の活性を調節する作用を有する化合物種を選択する工程；およびＤ）該化合物種と、薬学的に受容可能なキャリアとを混合する工程、を包含する、方法を提供する。ここで、上記Ａ）〜Ｃ）までは、本明細書において別の箇所において記載されるような技術を用いて行うことができる。Ｄ）混合する工程もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができ、例えば、そのような方法は、日本薬局方において記載されるような技術を用いて実施することができる。好ましくは、上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、二量体化されたものかその能力を有するものであり得る。より好ましくは、上記原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものを利用することができる。【０４０１】
好ましい実施形態において、本発明において用いられるＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウスなどの哺乳動物、またはヒトのＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む。【０４０２】
好ましくは、化合物種を合成して大量に該化合物種を製造する工程、をさらに包含する。そのような大量合成方法は、いったんその化合物種の合成方法が分かれば、当業者は当該分野において周知の方法を用いて実施することができる。【０４０３】
より好ましい実施形態において、本発明の上記医薬組成物において含有される化合物種について、ＬＯＸ−１活性に関する生物学的試験を行う工程をさらに包含する。そのような生物学的試験は、インビトロまたはインビボあるいは動物実験であってもよい。そのような生物学的試験を行う方法は、当該分野において周知である。【０４０４】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントに関連する疾患または障害を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）上記三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性を調節する手段を同定する工程；およびＣ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程、を包含する。好ましくは、このＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、アセチル化ＬＤＬと複合体化されたものであり得る。より好ましくは、この原子座標は、図７に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものであってもよい。【０４０５】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１に関連する疾患または障害を処置または予防するための方法であって、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルに基づいて、ＬＯＸ−１の活性を調節する手段を同定する工程；およびＣ）該調節手段を該疾患または障害に罹患するかまたはその可能性のある被検体に投与する工程を包含する、方法を提供する。好ましくは、このＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、二量体化されているかその能力を有するものであり得る。より好ましくは、この原子座標は、図１７に記載の原子座標を含む。別の実施形態において、上記相同体または改変体は、本発明の方法によって得られたものであってもよい。【０４０６】
好ましい実施形態において、上記ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントは、ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物、またはヒトのＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントを含む。ヒト、ウシ、ヒツジ、マウス、ラットなどの哺乳動物、であれば、自己に由来するＬＯＸ−１の活性を調節することによってＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの異常に起因する疾患または障害を処置することができるからである。また、ヒトのＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの場合もまた、循環器系疾患（例えば、動脈硬化）の病因であることが分かっていることから、その活性を調節することは、そのような病因を抑制または除去するのに有用であるからである。【０４０７】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの相同体を得る方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）候補化合物の原子座標と、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標とを比較する工程、を包含する。別の実施形態において、このプログラムを実行させる方法は、Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較する工程、を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術および比較工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。【０４０８】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの改変体を得る方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１の改変体を得る方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；およびＢ）候補化合物の三次元分子モデルを、該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルと比較し、所定のパラメータに基づき変異を導入する工程を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術および変異導入工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。ここで、所定のパラメータには、例えば、極性、疎水性、親水性、化学的性質、化学構造、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、受容体リガンド相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。【０４０９】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、ＬＯＸ−１またはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの活性部位ポケットの空間座標を決定する工程；およびＢ）該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体の活性部位ポケットの空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する工程を包含する。このような空間座標を決定する技術および電子的なスクリーニング工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。【０４１０】
別の局面において、本発明は、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；およびＢ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程を包含する、プログラムを提供する。このような三次元分子モデルを得る技術および比較工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。あるいは、本発明は、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；およびＢ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程を包含する、記録媒体を提供する。あるいは、本発明は、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に対して三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの二量体を形成する二量体界面の空間座標を決定する工程；およびＢ）該ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体もしくは改変体の二量体を形成する二量体界面の空間座標に対して、電子的に候補化合物のセットの空間座標をスクリーニングして、該ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する工程を包含する、コンピュータを提供する。このような三次元分子モデルを得る技術および変異導入工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。ここで、所定のパラメータには、例えば、極性、疎水性、親水性、化学的性質、化学構造、分子量、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、錯体形成能、受容体リガンド相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。【０４１１】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを提供する。他の実施形態において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供する。他の実施形態において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントあるいはその相同体もしくは改変体に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータを提供する。１つの実施形態において、このプログラムが実行させる方法は、Ａ）ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１またはＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程を包含する。このような三次元分子モデルを得る技術、原子間の距離の検索、および活性部位ポケットと安定な複合体を理論上形成する候補化合物種を同定する工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。【０４１２】
別の局面において、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムであって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程を包含する、プログラムを提供する。あるいは、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法をコンピュータに実行させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体であって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およ  Ｃ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程を包含する、記録媒体を提供する。あるいは、本発明は、候補化合物の三次元分子モデルを、二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントまたはその相同体の三次元分子モデルと比較することによって、ＬＯＸ−１に結合し得る化合物を同定する方法を実行するコンピュータであって、該方法は、Ａ）二量体を形成するＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子座標またはその相同体もしくは改変体の原子座標に三次元分子モデリングアルゴリズムを適用して、三次元分子モデルを得る工程；Ｂ）該三次元分子モデルの座標データをデータ構造に入力して、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの原子間の距離を検索する工程；およびＣ）候補化合物において水素結合を形成するヘテロ原子と、該三次元分子モデルにおいて活性部位ポケットを形成するヘテロ原子との間の距離を比較して、２つの構造の間での最適な水素結合に基づいて、ＬＯＸ−１リガンド結合フラグメントの三次元分子モデルの二量体を形成する二量体界面と理論上結合する候補化合物種を同定する工程を包���する、コンピュータを提供する。このような空間座標を決定する技術および電子的なスクリーニング工程をコンピュータに実行させる技術は、当該分野において周知であり、本明細書において他の場所において引用したプログラムを利用することもできる。【０４１３】
上述の記録媒体は、上記プログラムを記録することができるものであれば、どのようなものでもよく、例えば、そのような媒体としては、例えば、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＡＭ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＷ、ＤＶＤ＋ＲＷ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、メモリーカードなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０４１４】
使用されるコンピュータも、上記プログラムが実行され得る限り、どのようなものでもよく、例えば、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ベース、ＵＮＩＸ（登録商標）ベース、Ｍａｃ  ＯＳベース、ＬＩＮＵＸベースなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０４１５】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されるべきである。
【実施例１】
【０４１６】
（ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質を発現した大腸菌の培養
以下の配列を有するヒトＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ（１４３−２７３）をＮｏｖａｇｅｎ社製ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に組み込んだものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し大量発現を行なった：
ＰＣＰＱＤＷＩＷＨＧＥＮＣＹＬＦＳＳＧＳＦＮＷＥＫＳＱＥＫＣＬＳＬＤＡＫＬＬＫＩＮＳＴＡＤＬＤＦＩＱＱＡＩＳＹＳＳＦＰＦＷＭＧＬＳＲＲＮＰＳＹＰＷＬＷＥＤＧＳＰＬＭＰＨＬＦＲＶＲＧＡＶＳＱＴＹＰＳＧＴＣＡＹＩＱＲＧＡＶＹＡＥＮＣＩＬＡＡＦＳＩＣＱＫＫＡＮＬＲＡＱ（配列番号２）。【０４１７】
ＬＯＸ−１発現ベクターで形質転換を行った大腸菌は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９最小培地８Ｌにて３７℃で培養を行い、６６０ｎｍのＯＤ値が０．５になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えてさらに３７℃で４時間培養を続け、３，５００×ｇで３０分間遠心を行なって菌体を回収した。【０４１８】
（２）ＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の不溶性封入体の回収
回収した菌体を、菌体１ｇあたり５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），４００ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁し、ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉプロテアーゼインヒビター（ロシュ社製、菌体１ｇあたり０．５タブレット使用）を加えて、４℃にてアストラソン社製超音波破砕機を用いて菌体を破砕し、遠心（１０，０００×ｇ，３０分，４℃）にてペレットを回収した。得られたペレットを溶解緩衝液で再懸濁、超音波処理、遠心操作を２回繰り返してよく洗浄し、不溶性封入体として回収し、次の可溶化操作を行なうまで−８０℃で保存した。【０４１９】
（３）ＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
不溶性封入体を、３０ｍｇ（ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質量として）を１０ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６Ｍ  グアニジン塩酸塩、５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し（タンパク質終濃度３ｍｇ／ｍｌ）、遠心して沈殿を除去し、室温にて４時間静置した。【０４２０】
その後、ＤＴＴを終濃度  ５０ｍＭになるよう加え、１Ｌのリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）に攪拌しながらＦＰＬＣ送液ポンプを使用して２０−３０μｌ／ｍｉｎの速度で４℃でゆっくり滴下した。滴下終了後、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加え、さらに４℃で１２時間攪拌し、タンパク質のリフォールディングを行なった。【０４２１】
（４）リフォールディングしたＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の回収、精製
リフォールディングしたタンパク質溶液  １Ｌについて、０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、１０Ｌの透析緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に４℃で２４時間透析し、緩衝液を交換してさらに２４  時間透析し、変性剤、アルギニン、グルタチオンを除去した。透析した溶液は０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、Ｎｉ−キレーティングセファロースカラム（ファルマシア社製）に通し、タンパク質をカラムに吸着させた。その後カラム平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄し、イミダゾール濃度を５００ｍＭまで直線的勾配で上昇させてタンパク質を溶出させた。溶出させたタンパク質溶液はセントリコン−１０（ミリポア社製）で２ｍｌまで濃縮し、１ｍｇタンパク質あたり１０切断単位の牛スロンビンプロテアーゼを加えて４℃で５時間反応させてヒスチジンタグを切断し、その後ベンザミジンセファロースカラム（ファルマシア社製）に通してスロンビンを除去し、終濃度０．１ｍＭ  になるようＰＭＳＦを加えてプロテアーゼ反応を停止させた。タンパク質溶液は次にゲル濾過カラム平衡化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ５０ｍＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、正しい分子量のフラクションを分取した。
【実施例２】
【０４２２】
（ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメイン封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質を発現した大腸菌の培養
ヒトＬＯＸ−１細胞外ドメイン（６１−２７３）（配列番号６）をＮｏｖａｇｅｎ社製ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に組み込んだものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し大量発現を行なった。以降の培養に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。【０４２３】
（２）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の不溶性封入体の回収
不溶性封入体の回収に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。【０４２４】
（３）ＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
可溶化、リフォールディング操作に関してはＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。【０４２５】
（４）リフォールディングしたＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の回収、精製
リフォールディングしたＬＯＸ−１細胞外ドメインタンパク質の回収、精製に関しては、透析緩衝液の組成を２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  （ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌに、ゲル濾過カラム平衡化緩衝液の組成を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ４００ｍＭに、さらにＮｉ−キレーティングセファロースカラムから溶出させたタンパク質溶液を濃縮する際に終濃度４００ｍＭになるようにＮａＣｌを加えてから行なうことを除いては、ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤと同様に行なった。
【実施例３】
【０４２６】
（ｈＬＯＸ−１のビオチン化細胞外領域封入体、並びにビオチン化ＣＴＬＤ封入体の発現、可溶化、およびリフォールディング）
（１）ビオチン化ポリペプチドとｈＬＯＸ−１の細胞外領域、もしくはＣＴＬＤとの融合タンパク質発現系の構築
ｈＬＯＸ−１の細胞外領域、もしくはＣＴＬＤをコードするＤＮＡ断片はＰＣＲ法による常法により調製した。それらの両端には、５’側にＮｒｕＩ、３’側にＥｃｏＲＶの制限酵素サイトを付加した。ＰＣＲ産物を抽出後、両制限酵素により処理した後、クローニング用ベクターであるｐＢＳに挿入し、遺伝子配列に誤りがないかＤＮＡシークーエンサーにより確認した。ｈＬＯＸ−１の細胞外領域の塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号５および６に、ｈＬＯＸ−１のＣＴＬＤの塩基配列およびアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２に、それぞれ示す。配列を確認した当該タンパク質をコードした遺伝子を、制限酵素により切り出し、大腸菌内においてビオチン化を受けることが知られているポリペプチドをコードしているプラスミドベクターＰｉｎＰｏｉｎｔ  Ｘａ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）の上記制限酵素サイトに挿入した。次いで、発現宿主である大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した後、正しく目的遺伝子を取り込んだ形質転換体を選抜した。【０４２７】
（２）ビオチン化タンパク質の誘導方法
目的プラスミドにより形質転換された大腸菌ＪＭ１０９のコロニーを最終濃度でで１００μｇ／ｍ１のアンピシリン、並びに２μＭのビオチンを含むＬＢ培地５ｍ１に接種し、３７℃で一晩撹拝しながら培養した。続いて、この培養液を最終濃度で１００μｇ／ｍ１のアンピシリン、並びに２μＭのビオチンを含む５０ｍｌのＬＢ培地に１：１００（容量比）の割合で接種し、１時間培養した後、最終濃度で１００μＭになるようにＩＰＴＧを添加し、目的融合タンパク質の発現を誘導し、さらに４時間撹拝しながら培養した。【０４２８】
（３）ビオチン化細胞外領域、ピオチン化ＣＴＬＤの検出と発現状態の確認
上記誘導処理後の培養液１００μ１を１．５ｍ１の遠心チューブに入れ、１５，０００ｒｐｍで数分間遠心し、菌体を回収した。回収した菌体を超音波処理にて破砕後、２０，０００ｇで３０分間遠心して得られた上清（可溶性面分）と沈殿（不溶性面分）をそれぞれＳＤＳサンプルバッファーに懸濁し、９５℃で４分間処理した。次いで、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにてタンパク質を分離した後、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。【０４２９】
転写後のニトロセルロース膜は、ポンソーＳによる染色で、タンパク質バンドの位置を確認した後、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．６、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）中にて室温で穏やかに６０分間攪拌した。次に、ストレプトアビジン標識アルカリフォスファターゼ中にて室温で３０分間反応させた。続いて、反応後のニトロセルロース膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｅｎにて洗浄した後、アルカリフォスファターゼの基質であるＮＢＴ／ＢＣＩＰ溶液を添加し、ビオチン化タンパク質のバンドが検出されるまで室温で反応させた。その結果、不溶性画分には、ビオチン化細胞外領域、およびビオチン化ＣＴＬＤの分子量に相当する位置にビオチン化タンパク質の顕著なバンドが検出された。【０４３０】
（４）ＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
不溶性封入体を、３０ｍｇ（ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質量として）を１０ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），６Ｍ  グアニジン塩酸塩，５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し（タンパク質終濃度３ｍｇ／ｍｌ）、遠心して沈殿を除去し、室温にて４時間静置した。【０４３１】
その後、ＤＴＴを終濃度  ５０ｍＭになるよう加え、１Ｌのリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）に攪拌しながらＦＰＬＣ送液ポンプを使用して２０−３０μｌ／ｍｉｎの速度で４℃でゆっくり滴下した。滴下終了後、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加え、さらに４℃で１２時間攪拌し、タンパク質のリフォールディングを行なった。【０４３２】
（５）リフォールディングしたビオチン化タンパク質の回収、精製
リフォールディングしたタンパク質溶液  １Ｌについて、０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、１０Ｌの透析緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に４℃で２４時間透析し、緩衝液を交換してさらに２４  時間透析し、変性剤、アルギニン、グルタチオンを除去した。透析した溶液は０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除いた。タンパク質溶液をセントリコン−１０（ミリポア社製）で２ｍｌまで濃縮した。タンパク質溶液は次にゲル濾過カラム平衡化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），ＮａＣｌ  ５０ｍＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、正しい分子量のフラクションを分取した。【０４３３】
（参考例１）
本発明と比較検討する対象として、従来法である、環状糖質サイクロアミロースと界面活性剤を用いるリフォールディング方法によってリフォールディングしたタンパク質を、以下のとおり調製した。【０４３４】
（１）ビオチン化細胞外領域、ビオチン化ＣＴＬＤの可溶性タンパク質への再構成
封入体を最終濃度４０ｍＭのＤＴＴを含む６Ｍのグアニジン塩酸塩溶液で室温にて１時間処理し、間違った構造を完全に解きほぐした。続いて、７０倍容量の界面活性剤溶液（０．１％ＣＴＡＢもしくはＳＢ３−１４、最終濃度で２ｍＭのＤＬ−ｃｙｓｔｉｎｅを含むＰＢＳ（−）溶液）を添加し、室温で１時間反応させた後、反応液２４ｍ１を取り出し、３％ＣＡ溶液６ｍ１を加えさらに１時間室温で反応させた。【０４３５】
この溶液を２０，０００ｇで１０分間遠心し、得られた上清（可溶性画分）をリフォールディング溶液とした。リフォールディングされたタンパク質の存在を確認したところ、８０％以上が可溶性面分に回収されていることが確認され、効率的にリフォールディングされていることが示された。【０４３６】
リフォールドされたビオチン化細胞外領域、ビオチン化ＣＴＬＤをストレプトアビジンビーズ上に固定化し、リガンドの一つであるアセチル化ＬＤＬを蛍光標識したＤｉＩＡｃＬＤＬの結合を確認したところ、リフォールディングしたビオチン化細胞外領域、もしくはビオチン化ＣＴＬＤ領域を固定化したビーズ上に蛍光が観察され、どちらもリガンド結合能を回復していることが示された。
【実施例４】
【０４３７】
（リフォールディングしたタンパク質のゲルろ過による純度検定）
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに同じ緩衝液に溶解したＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。【０４３８】
本発明のリフォールディング方法を用い実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質から、実施例１（４）に記載した手順でタグを取り除いたタンパク質の純度をゲルろ過によって確認したところ、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法によって調製したタンパク質よりも分子量の幅が狭かった。この結果は、本発明のリフォールディング方法が従来法よりも高い純度のタンパク質を調製する方法であることを示している（図１）。【０４３９】
ゲルろ過による純度検定の結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥでの純度検定の結果（データ示さず）を考慮すると、本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質の純度が約９９％以上であることを示す。【０４４０】
（２）質量分析法による純度検定
上記（１）と同様に、ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質からタグを取り除いたタンパク質を、０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解し、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を添加して混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。【０４４１】
リフォールディングしたＬＯＸ−１のＣＴＬＤの質量分析によるタンパク質純度の検定結果。本発明のリフォールディング方法によって得た、タグを除去したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質は、約５０のｍ／ｚ比（質量／荷電）という狭い幅の質量分析スペクトルを与えた。この狭い幅の結果は、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法よりも夾雑物が少なく高純度に精製されていることを示す（図２）。【０４４２】
（３）ＮＭＲ分析法による純度検定
実施例１で得られたタンパク質からタグを除去し、０．１ｍＭの濃度になるように２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌに可溶化し、６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器により１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）２次元相関スペクトルの測定を、２５℃で行った。【０４４３】
本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ２次元相関スペクトル上にてタンパク質の主鎖に由来する１Ｈシグナルが７ｐｐｍから１１ｐｐｍの広い範囲に分布しているのに対し、シクロアミロースを利用してリフォールディングしたタンパク質では、７ｐｐｍ〜８．５ｐｐｍの狭い範囲で、お互いのシグナルが重なるように分布しており、かつ個々のシグナルの線幅が適正にリフォールディングされたタンパク質よりも広かった。【０４４４】
主鎖１Ｈシグナル分布の以上の結果から、本発明のリフォールディング方法でリフォールディングしたタンパク質は、適切なタンパク質構造を形成していることが理解できる。これに対して、従来法（シクロアミロース法）を用いたリフォールディングでは、不完全にリフォールディングされた構造を有するタンパク質が混入していることが理解できる。
【実施例５】
【０４４５】
（リフォールディングしたタンパク質の結晶化）
タンパク質を結晶化するためには、非常に高純度のタンパク質を調製する必要があることは周知である。本発明のリフォールディング方法を用いて調製されたタンパク質が、結晶化が可能な程度の純度を有することを、実証した。【０４４６】
試料としてＣＴＬＤを用いた。ＣＴＬＤの結晶化は、１μＬの８ｍｇ／ｍＬのＣＴＬＤ溶液（タンパク質を溶解する緩衝液として、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ酢酸亜鉛を用いた）に対して、１μＬの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜４．０）を添加し、この溶液を０．１Ｍ  クエン酸緩衝液（ｐＨ３．０〜４．０）に対して、２〜４日間蒸気拡散することによって、得られた。【０４４７】
得られた結晶は、ａ＝６．２ｎｍ、ｂ＝６．９ｎｍ、およびｃ＝７．９ｎｍの単位格子定数を有する、Ｐ２１２１２１斜方晶形であった。また、この結晶から、約２．５オングストロームの分解能を持つＸ線回折像が得られた（図４）。【０４４８】
以上の結果が示すように、本発明のリフォールディング方法で得られたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは結晶化が可能な程度の高純度であった。
【実施例６】
【０４４９】
（リフォールディングしたタンパク質の機能測定）
本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングした、ヒスチジンタグ化タンパク質およびビオチンタグ化タンパク質の各々について、リガンド結合能を確認した。【０４５０】
（１）リフォールディングしたヒスチジンタグ化タンパク質のリガンド結合能の確認
リフォールディングに成功したヒスチジンタグ化細胞外領域、もしくはヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを変性ＬＤＬなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へ各ヒスチジンタグ化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を検討した。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡｃｏｒｅ杜製のＢＩＡｃｏｒｅを使用した。【０４５１】
（１．１）実施例１で調製した、リフォールディングしたヒスチジン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化した。具体的には、ＮＴＡセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）表面を、０．３５Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄後、５００μＭ  ＮｉＣｌ２をインジェクトして、センサーチップ上にタンパク質を固定化した。このチップ上に、実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを固定化した。なお、固定化量は、１０００ＲＵ以下になるように、インジェクトするタンパク質量を調整した。【０４５２】
（１．２）変性ＬＤＬとして、アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを以下のように調製した。【０４５３】
酸化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬおよび硫酸銅の濃度がそれぞれ３ｍｇ／ｍＬおよび７５μＭとなる様に調製した溶液をＣＯ２インキュベーター内で２０時間インキュベートした。ついでＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液にて透析し、酸化ＬＤＬを得た。【０４５４】
アセチル化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬに対して最終濃度が５０％になるように酢酸ナトリウム溶液を加え、０℃に冷却した。このとき全量を１ｍＬにした。氷上で攪拌しながら無水酢酸１μＬを１０分間隔で５回加えさらに３０分間冷却攪拌を続け反応を完結させた。【０４５５】
（１．３）受容体チップに対する各種ＬＤＬの結合を、以下のとおりに検出した。流速２０μＬ／分で、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬ）を２分間インジェクトして、センサーグラムの変化を記録した。表面プラズモン共鳴の原理を利用した機器の場合、リガンドの結合をレゾナンスユニット：ＲＵの増加を示すセンサーグラムの変化として検出することになる。その後、１Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を３０秒間インジェクトし、結合したＬＤＬを剥離することによって、センサーチップを再生した。このサイクルを５回繰り返し、センサーチップのベースラインおよびセンサーグラムの応答レベルが再現性よく安定していることを確認したうえで、センサーグラムの変化から、結合定数および結合量を算出した。【０４５６】
その結果、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングされたヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して、天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが確認された（図５）。なお、リフォールディングされたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは、ＬＤＬに対して、変性ＬＤＬの場合よりも２桁低い結合能を示した（データ示さず）。【０４５７】
（２）リフォールディングしたビオチンタグ化タンパク質のリガンド結合能の確認
リフォールディングに成功したビオチンタグ化細胞外領域、もしくはビオチンタグ化ＣＴＬＤを変性ＬＤＬなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へ各ビオチンタグ化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を検討した。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡｃｏｒｅ杜製のＢＩＡｃｏｒｅを使用した。【０４５８】
（２．１）実施例３で調製した、リフォールディングしたビオチン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化した。具体的には、センサーチップＳＡ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）表面を、固定化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で平衡化した後、固定化緩衝液中に調製した７０μｇ／ｍＬのビオチン化ＬＯＸ−１タンパク質を、１０μＬ／分でインジェクトした。５０μＬのビオチン化ＬＯＸ−１をインジェクトした時点で、約３０００ＲＵを与える量のタンパク質が固定化されたことを確認して、タンパク質の固定化を終了した。その後、固定化緩衝液を２０μＬ／分で流して、チップに結合しなかったタンパク質を洗浄して取り除いた。６００分間の洗浄を行っても、ＲＵ値の低下は、５％以下であった。このセンサーチップを用いて、上記（１．２）および（１．３）と同様にして、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬの結合について試験した。【０４５９】
その結果、ビオチン化ＣＴＬＤの場合も、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して、天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが確認された。
【実施例７】
【０４６０】
（リフォールディングしたタンパク質は二量体を形成する）
天然のＬＯＸ−１タンパク質は、二量体を形成する。そこで、本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングしたＬＯＸ−１が二量体を形成するか否かについて、ゲルろ過、ＰＡＧＥ，および質量分析を用いて確認した。この実施例では、実施例２の方法に従って得た細胞外ドメイン全長（６１−２７３）にヒスチジンタグを付けて発現した後リフォールディングを行い、その後に、ヒスチジンタグを除いたタンパク質を使用した。【０４６１】
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより、分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに、平衡化に使用した緩衝液と同一の緩衝液に溶解した、実施例２で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。【０４６２】
（２）質量分析による純度検定
０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解した実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインに、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。【０４６３】
（３）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明のリフォールディング方法によって得られたＬＯＸ−１タンパク質に２０％  β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））を加え、１００℃で５分間煮沸した試料を、還元状態の試料とした。一方、上記の試料緩衝液からβ−メルカプトエタノールを除いた試料緩衝液を加えて、３０分間室温において反応させた試料を、非還元状態の試料とした。各々の試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて染色した。【０４６４】
（化学架橋実験）
リフォールディング方法によって得られたＬＯＸ−１タンパク質溶液（３００μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、化学架橋剤ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を、０．２、０．４、０．８、１．６、３．２ｍＭとなるように添加し、室温で３０分間架橋反応を行った。反応後すぐに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、２０％  β−メルカプトエタノール）を添加して、１００℃で５分間過熱し、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色して、添加した化学架橋の量に依存して増加する２量体タンパク質の変化量を観測した。【０４６５】
（二量体実験のまとめ）
以上の実験の結果、ＬＯＸ−１の細胞外ドメイン全長を本発明のリフォールディング方法でリフォールディングした結果得られたタンパク質が、細胞表層にあるＬＯＸ−１の存在様式と同様に２量体であることが示された（図６）。
【実施例８】
【０４６６】
（蛍光サンドイッチ法による変性ＬＤＬの検出）
実施例３で調製したビオチン化タグをＮ末端に付けたＬＯＸ−１を、ストレプトアビジンでコートされたマイクロプレート（バイオコート（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｃｅ社）上に、ビオチンを介して固定化する。不要な血液凝固を避けるためにヘパリンを含んだ試験管に採血を行って（ヘパリン採血）得られたヒト血漿から遠心分離によって得られたＬＤＬ分画を分注して、４℃で１時間放置する。その後、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ  ７．５  ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して、ストレプトアビジン化された量子ドット（登録商標）（Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、住商バイオサイエンス株式会社）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間放置後、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０  ＴＢＳで３回洗浄する。その後、ウェルからの５２５ｎｍの蛍光を観測して、蛍光強度に基づいて、血液中に存在する結合したＬＤＬの量を算出する。
【実施例９】
【０４６７】
（蛍光磁器トラップ法による変性ＬＤＬの検出）
実施例３で調製したビオチン化タグをＮ末端に付けたＬＯＸ−１を、ストレプトアビジンでコートされた磁器ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０  ストレプトアビジン、株式会社ベリタス）上に結合させる。ヘパリン採血で得られたヒト血漿から遠心分離によって得られたＬＤＬ分画を１００μＬに対して、磁器ビーズと結合したＬＯＸ−１タンパク質を１０μＬ添加して、１時間４℃で放置する。磁器ビーズを磁石で固定化し、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２．７ｍＭ、２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ  ７．５  ｐＨ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して、ストレプトアビジン化された量子ドット（登録商標）（Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、住商バイオサイエンス株式会社）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間放置後、再度０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０  ＴＢＳで３回洗浄する。洗浄後の磁器ビーズからの５２５ｎｍの蛍光を観測して、蛍光強度に基づいて、血液中に存在する結合したＬＤＬの量を算出する。
【実施例１０】
【０４６８】
（結晶化条件での最適化）
実施例５で行った結晶化では、メチオニンがセレノメチオニンに置換されているLOX-1 CTLDフラグメントを用いることによって、a=62Å，b=69Å，c=79Åの単位格子をもつP212121斜方晶形をもつLOX-1酸化LDL結合ドメイン（CTLD）が得られたが、本実施例では、さらなる解像度アップを目指した。本発明では、異なる結晶条件から得られた、天然のアミノ酸からなるLOX-1 CTLDの結晶およびその立体構造を提供する。結晶化の最適化例は図９に示す。【０４６９】
実施例５の記載されるの巻き戻し法により大腸菌中で不溶性封入体として発現されたタンパク質をまき戻して得られたLOX-1 CTLDの8mg/mL溶液（10mM TrisHCl，pH 7.5，50mM NaCl）１μＬに対して１μＬの0.1M クエン酸緩衝液(pH 3.0 - 4.0)溶液を添加した。このとき塩化カルシウム、あるいは塩化亜鉛が最終濃度1mMになるようにイオン強度を調整した。1mM 塩化カルシウムあるいは1mM塩化亜鉛を含んだ0.1M クエン酸緩衝溶液（pH3.0 -4.0）に対して2-4日間蒸気拡散法により結晶を得た。得られた結晶に対してプラチナ2量体を浸潤させて結晶構造解析を行った。この調製法により得られた結晶はP412121の結晶型を与え、2.4Aの分解能を示すＸ線回折像を与えた。格子定数はa=64.4A，b=64.4A，c=79.8Aであった。原子座標結果は図７に示す。結果は、図１０にまとめる。
【実施例１１】
【０４７０】
（他のＬＯＸ−１のモデル）
次に、上述で得られた情報をもとに、配列番号２２、２６、３０および３４に記載される、それぞれ、ヒト以外のラット、マウス、ブタおよびウサギの配列を基にして、ホモロジーモデリングによる方法を行い、他のＬＯＸ−１の構造をモデリングした。具体的には、ＡｕｔｏＤｏｃｋ  ３．０（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｇ．Ｍ．，Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．，Ｈａｌｌｉｄａｙ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｕｅｙ，Ｒ．，Ｈａｒｔ，Ｗ．Ｅ．，Ｂｅｌｅｗ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｊ．（１９９８），Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９：１６３９−１６６２）というプログラムを使用した。【０４７１】
このプログラムにおいて、配列番号２２、２６、３０および３４に記載されるアミノ酸配列の相同性を考慮し（図１５を参照）、他に類似する構造または本発明のヒトの構造のアミノ酸配列から変更しながらモデリングした。その際、エネルギーの最小化により構造を決定した。構造は、ＬＯＸ−１に類似する。
【実施例１２】
【０４７２】
（バーチャルスクリーニング）
市販の化合物のデータベース（FCD（Fine Chemical Directory）という商業ベースの化学薬品データベース ）より１つずつ化合物を取り出し、コンピュータグラフィクス上で活性部位の位置へ自動で近づけた。エネルギーの最小化により、最適な方位で化合物を酵素に結合させた。このときの安定化エネルギーΔＧを計算し、最もΔＧのマイナス値が大きな化合物を選定すると、インヒビターとして好ましい化合物を選定することができる。
【実施例１３】
【０４７３】
（インビトロスクリーニング）
次に、実施例１２のバーチャルスクリーニングでインヒビターとして適切なものと判断された化合物を実際にインビトロ系で実験することによってその活性を確認する。ＬＯＸ−１アッセイは以下のとおり行う。【０４７４】
（ＬＯＸ−１アッセイ）
ＬＯＸ−１の活性を以下のようにアッセイする。【０４７５】
実施例８と同様にビオチン化タグをＮ末端部分につけたＬＯＸ−１をストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上に固定化する。ヘパリン採血により得られた血漿から得られたＬＤＬ分画をそれぞれのウェルに分注して、阻害剤として適切なものと判断された化合物を各ウェルに添加した後に４℃で１時間放置する。その後０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ，ＫＣｌ，２．７ｍＭ，２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して量子ドット（Ｑ−ｄｏｔ  ５２５，住商バイオサイエンス株）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間４℃で放置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで３回洗浄した後にウェルからの５２５ｎｍの蛍光を観測して蛍光強度の強さから、添加した化合物がもつ酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１への結合阻害能をモニターする。【０４７６】
（結果）
上記のアッセイの結果、実際に特定の物質がインヒビターとしてより好ましいことが判明する。【０４７７】
このように、本発明を用いて、実際に、ＬＯＸ−１の活性を調節する分子を得ることができる。従って、本発明は、ＬＯＸ−１の活性調節剤のスクリーニングのほか、その実際の調製にも使用することができることが実証される。
【実施例１４】
【０４７８】
（動物モデルでの実証）
実施例１３において同定されたＬＯＸ−１の活性を調節する因子が動物モデルにおいて、有効であるかどうかを実証する。【０４７９】
動脈硬化モデルマウスとして、（ａｐｏＥ−／−）マウスを作製し、このモデルマウスにおいて、上記因子が有効であるかどうかを検証する。検証方法は、経口投与または静脈投与によって、上記因子をマウスに量を振りながら投与し、その後動脈硬化が改善したかどうかを、両手・両足の４箇所の血圧を同時に測定し、四肢の動脈硬化（血管の硬さ、詰まり）の指標とすることによって確認する。【０４８０】
このような手法によって、本発明の因子によって動脈硬化が改善されるかどうかが確認される。
【実施例１５】
【０４８１】
（ＮＭＲ解析）
アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）は酸化ＬＤＬ同様にＬＯＸ−１を介してマクロファージに取り込まれるなど、酸化ＬＤＬと同様の生理作用を持つことが知られている。酸化ＬＤＬが脂質部位のみならずＬＤＬ粒子の表面を取り囲むａｐｏＢ１００タンパク質も酸化され、かつ、多様な酸化状態にあるために物理化学的な測定に用いるには、その化学的な不均一性のために問題が多い。一方同様な生理活性を示すアセチル化ＬＤＬはＬＤＬ粒子表面にあるａｐｏＢ１００タンパク質のＬｙｓ残基のみを選択にアセチル化することが知られているために、物理化学的な計測には酸化ＬＤＬのモデルとして良く用いられる。【０４８２】
そこで、ＬＯＸ−１をさらに解析するために、ＮＭＲ解析を行った。ＮＭＲの解析は以下のとおりに行った。【０４８３】
測定に用いたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは１５ＮＨ４Ｃｌを窒素源とするＭ９最小培地で培養されたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤを発現する大腸菌から、上記実施例において記載した巻き戻し法により得たものである。得られた１５Ｎ標識  ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌの組成を持つ緩衝液に透析後０．１ｍＭの濃度になるように濃縮してＮＭＲ試料とした。ａｃＬＤＬは市販（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のａｃＬＤＬを１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌに透析後タンパク質定量によりａｃＬＤＬの濃度検定を行いＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ溶液に添加してＮＭＲ測定を行なった。測定は、７５０ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器を用いて、測定温度は２５oＣで行なった。【０４８４】
結果を図８に示す。図８に示す一連のＮＭＲデータは、１５Ｎで均一に標識したＬＯＸ−１のリガンド結合ドメイン（ＣＴＬＤ）に対してアセチルＬＤＬを滴定した際のＮＭＲシグナル変化の様子を示す。解析にもちいている２次元スペクトルは１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル（ＨＳＱＣ、Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）であり、２次元スペクトル上に観測されるシグナルはタンパク質中の１つ１つのアミノ酸残基の主鎖アミド基に由来する。ここで観測されている個々のＮＭＲシグナルは全てタンパク質中のどのアミノ酸に由来するか帰属がついているので、例えば、タンパク質に結合する化合物をＮＭＲ試料溶液中に入れることで変化が誘導されるＮＭＲシグナルから、どのアミノ酸残基が化合物と結合したかを同定することができる。ここで示す実験では、ａｃＬＤＬが巨大な粒子であるためにＬＯＸ−１がａｃＬＤＬと結合することにより、結合部位に存在するＮＭＲシグナルには大きな強度の低下が観測された。ａｃＬＤＬ滴定に伴うＨＳＱＣスペクトル上のＮＭＲシグナル変化からＬＯＸ−１のａｃＬＤＬへの結合に関与する部位（結合に関与しているアミノ酸残基）を同定することが可能である。
【実施例１６】
【０４８５】
（ファルマコフォアモデルの構築）
酸化ＬＤＬの添加により１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル上で変化が誘導されるＮＭＲシグナルからＬＯＸ−１のどのアミノ酸残基が酸化ＬＤＬの結合に関与しているかを特定することができる。ＮＭＲ解析の結果特定されたアミノ酸残基からなる結合ポケットを形成する化学的特定を図７に示すＬＯＸ−１の立体構造から抽出することができる。ＬＯＸ−１のもつ活性ポケットが示す立体構造および化学的特性の空間的な配置に対して相補的な相互作用をする表面を持つリガンド表面特性をファルマコフォアという。ＬＯＸ−１の活性ポケットの立体構造から特定されるリガンドが持つべき表面特性（ファルマコフォア）は例えばＭＯＥのＡｌｐｈａ  Ｓｉｔｅ  Ｆｉｎｄｅｒというソフトウエアを利用してモデル化できる。Ａｌｐｈａ  Ｓｉｔｅ  Ｆｉｎｄｅｒにより立体構造上に特定された活性ポケット上にダミー原子を配置して、各ダミー原子が受容体の活性ポケット全体からどのような静電相互作用を受けるかを解析することで、各ダミー原子の位置がａｃｃｅｐｔｏｒあるいはｄｏｎｏｒのいずれが存在するかを判定することができる。ここで算定されたポテンシャルをもとにしてａｌｐｈａ  ｓｉｔｅをａｃｃｅｐｔｏｒ／ｄｏｎｏｒ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃの３つの領域に分けてそれぞれのダミー原子をクラスタリングする。それぞれの化学的特性を共通として持つクラスターの中心にｆｅａｔｕｒｅを定義する。この中心の位置からの排除体積を定義しファルマコフォアをモデル化する。
【実施例１７】
【０４８６】
（ファルマコフォアモデルを利用した化合物のスクリーニング）
実施例１６で構築されたファルマコフォアモデルで特定される化学的特定に一部でも合致する化合物をデータベースから抽出する。抽出された化合物は例えば生物分子工学研究所で開発された分子動力学プログラムＰＲＥＳＴを用いてマルチカノニカル分子動力学計算（ＭＤ）によりＬＯＸ−１活性ポケット側の立体構造変化およびリガンド側の立体構造変化も考慮した形で複合体構造を計算する。高温状態での分子動力学計算に続いて徐冷法により３００Ｋにおける安定なリガンドタンパク質複合体構造を計算する。ここで得られる複合体の安定構造エネルギーの大きさによりＬＯＸ−１の活性ポケットに強く結合する化合物の構造を決定する。同様なスクリーニングはＭＯＥ−Ｐｈ４＿Ｄｏｃｋなどのプログラムを用いても実行できる。
【実施例１８】
【０４８７】
（ファルマコフォアモデルを利用した化合物を用いた疾患の処置）
実施例１６において得られたファルマコフォアモデルによって構築された化合物を用いて、実施例１４において示されるような実験モデルを用いて疾患を治療できるかどうかを実証する。動脈硬化モデルマウスとして、（ａｐｏＥ−／−）マウスを作製し、このモデルマウスにおいて、上記因子が有効であるかどうかを検証する。検証方法は、経口投与または静脈投与によって、上記因子をマウスに量を振りながら投与し、その後動脈硬化が改善したかどうかを、両手・両足の４箇所の血圧を同時に測定し、四肢の動脈硬化（血管の硬さ、詰まり）の指標とすることによって確認する。【０４８８】
このような手法によって、本発明の因子によって動脈硬化が改善されるかどうかが確認される。
【実施例１９】
【０４８９】
次にＬＯＸ−１の二量体化モデルを作製した。その詳細は以下の通りである。【０４９０】
（１）リガンド結合ドメインであるＣＴＬＤにＮＥＣＫ領域部１４残基を含むＬＯＸ−１フラグメント（ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫ１４）を調製した。【０４９１】
ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫ１４タンパク質を発現した大腸菌の培養
以下の配列を有するヒトＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫ１４（配列番号４に示されるアミノ酸番号１２９〜１４２）をＮｏｖａｇｅｎ社製ヒスチジンタグ融合タンパク質発現ベクターｐＥＴ２８ａのマルチクローニングサイト（ＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）に組み込んだものを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し大量発現を行なった：
核酸配列：
AATCTCCAAGAAACACTGAAGAGAGTAGCAAATTGTTCAGCTCCTTGTCCGCAAGACTGGATCTGGCATGGAGAAAACTGTTACCTATTTTCCTCGGGCTCATTTAACTGGGAAAAGAGCCAAGAGAAGTGCTTGTCTTTGGATGCCAAGTTGCTGAAAATTAATAGCACAGCTGATCTGGACTTCATCCAGCAAGCAATTTCCTATTCCAGTTTTCCATTCTGGATGGGGCTGTCTCGGAGGAACCCCAGCTACCCATGGCTCTGGGAGGACGGTTCTCCTTTGATGCCCCACTTATTTAGAGTCCGAGGCGCTGTCTCCCAGACATACCCTTCAGGTACCTGTGCATATATACAACGAGGAGCTGTTTATGCGGAAAACTGCATTTTAGCTGCCTTCAGTATATGTCAGAAGAAGGCAAACCTAAGAGCACAG（配列番号３５）
コードされるアミノ酸配列（下線部はＮＥＣＫ領域に由来する部位）：
NLQETLKRVANCSAPCPQDWIWHGENCYLFSSGSFNWEKSQEKCLSLDAKLLKINSTADLDFIQQAISYSSFPFWMGLSRRNPSYPWLWEDGSPLMPHLFRVRGAVSQTYPSGTCAYIQRGAVYAENCILAAFSICQKKANLRAQ（配列番号３６）
ＬＯＸ−１発現ベクターで形質転換を行った大腸菌は５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＭ９最小培地８Ｌにて３７℃で培養を行い、６６０ｎｍのＯＤ値が０．５になったところでＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように加えてさらに３７℃で４時間培養を続け、３，５００×ｇで３０分間遠心を行なって菌体を回収した。【０４９２】
（２）ＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の不溶性封入体の回収
回収した菌体を、菌体１ｇあたり５ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０），４００ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で懸濁し、ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉプロテアーゼインヒビター（ロシュ社製、菌体１ｇあたり０．５タブレット使用）を加えて、４℃にてアストラソン社製超音波破砕機を用いて菌体を破砕し、遠心（１０，０００×ｇ，３０分，４℃）にてペレットを回収した。得られたペレットを溶解緩衝液で再懸濁、超音波処理、遠心操作を２回繰り返してよく洗浄し、不溶性封入体として回収し、次の可溶化操作を行なうまで−８０℃で保存した。【０４９３】
（３）ＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の可溶化、リフォールディング操作
不溶性封入体を、３０ｍｇ（ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質量として）を１０ｍｌの可溶化緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６Ｍ  グアニジン塩酸塩、５ｍＭ  ＤＴＴ）に懸濁し（タンパク質終濃度３ｍｇ／ｍｌ）、遠心して沈殿を除去し、室温にて４時間静置した。【０４９４】
その後、ＤＴＴを終濃度  ５０ｍＭになるよう加え、１Ｌのリフォールディング緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、４００ｍＭ  アルギニン、５ｍＭ  還元型グルタチオン、０．５ｍＭ  酸化型グルタチオン）に攪拌しながらＦＰＬＣ送液ポンプを使用して２０−３０μｌ／ｍｉｎの速度で４℃でゆっくり滴下した。滴下終了後、終濃度０．１ｍＭになるようＰＭＳＦを加え、さらに４℃で１２時間攪拌し、タンパク質のリフォールディングを行なった。【０４９５】
（４）リフォールディングしたＬＯＸ−１ＣＴＬＤタンパク質の回収、精製
リフォールディングしたタンパク質溶液  １Ｌについて、０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、１０Ｌの透析緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に４℃で２４時間透析し、緩衝液を交換してさらに２４  時間透析し、変性剤、アルギニン、グルタチオンを除去した。透析した溶液は０．４５μｍメンブレンフィルターで沈殿を除き、Ｎｉ−キレーティングセファロースカラム（ファルマシア社製）に通し、タンパク質をカラムに吸着させた。その後カラム平衡化緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ，１０ｍＭイミダゾール）でカラムを洗浄し、イミダゾール濃度を５００ｍＭまで直線的勾配で上昇させてタンパク質を溶出させた。溶出させたタンパク質溶液はセントリコン−１０（ミリポア社製）で２ｍｌまで濃縮し、１ｍｇタンパク質あたり１０切断単位の牛スロンビンプロテアーゼを加えて４℃で５時間反応させてヒスチジンタグを切断し、その後ベンザミジンセファロースカラム（ファルマシア社製）に通してスロンビンを除去し、終濃度０．１ｍＭ  になるようＰＭＳＦを加えてプロテアーゼ反応を停止させた。タンパク質溶液は次にゲル濾過カラム平衡化緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５），ＮａＣｌ  ５０ｍＭ）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ゲル濾過カラム（ファルマシア社製）に供し、正しい分子量のフラクションを分取した。
【実施例２０】
【０４９６】
（リフォールディングしたタンパク質のゲルろ過による純度検定）
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに同じ緩衝液に溶解したＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。【０４９７】
本発明のリフォールディング方法を用い実施例１９で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質から、実施例１９（４）に記載した手順でタグを取り除いたタンパク質の純度をゲルろ過によって確認したところ、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法によって調製したタンパク質よりも分子量の幅が狭かった。この結果は、本発明のリフォールディング方法が従来法よりも高い純度のタンパク質を調製する方法であることを示している。【０４９８】
ゲルろ過による純度検定の結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥでの純度検定の結果（データ示さず）を考慮すると、本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質の純度が約９９％以上であることを示す。【０４９９】
（２）質量分析法による純度検定
上記（１）と同様に、ヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質からタグを取り除いたタンパク質を、０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解し、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を添加して混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。【０５００】
リフォールディングしたＬＯＸ−１のＣＴＬＤの質量分析によるタンパク質純度の検定結果。本発明のリフォールディング方法によって得た、タグを除去したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質は、約５０のｍ／ｚ比（質量／荷電）という狭い幅の質量分析スペクトルを与えた。この狭い幅の結果は、従来法の環状糖質サイクロアミロースを用いるリフォールディング方法よりも夾雑物が少なく高純度に精製されていることを示す。【０５０１】
（３）ＮＭＲ分析法による純度検定
実施例１で得られたタンパク質からタグを除去し、０．１ｍＭの濃度になるように２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌに可溶化し、６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器により１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）２次元相関スペクトルの測定を、２５℃で行った。【０５０２】
本発明のリフォールディング方法によって調製したタンパク質は、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ２次元相関スペクトル上にてタンパク質の主鎖に由来する１Ｈシグナルが７ｐｐｍから１１ｐｐｍの広い範囲に分布しているのに対し、シクロアミロースを利用してリフォールディングしたタンパク質では、７ｐｐｍ〜８．５ｐｐｍの狭い範囲で、お互いのシグナルが重なるように分布しており、かつ個々のシグナルの線幅が適正にリフォールディングされたタンパク質よりも広かった。【０５０３】
主鎖１Ｈシグナル分布の以上の結果から、本発明のリフォールディング方法でリフォールディングしたタンパク質は、適切なタンパク質構造を形成していることが理解できる。これに対して、従来法（シクロアミロース法）を用いたリフォールディングでは、不完全にリフォールディングされた構造を有するタンパク質が混入していることが理解できる。
【実施例２１】
【０５０４】
（二量体化されたＬＯＸ−１フラグメントの調製）
実施例１９において調製された蛋白質は、ＣＴＬＤに付加したＮＥＣＫ領域に含まれるシステイン残基を介して分子間のジスルフィド結合を形成して安定なホモ二量体を形成した。以下に示す条件により当該蛋白質を結晶化した。【０５０５】
タンパク質を結晶化するためには、非常に高純度のタンパク質を調製する必要があることは周知である。本発明のリフォールディング方法を用いて調製されたタンパク質が、結晶化が可能な程度の純度を有することを、実証した。【０５０６】
結晶化に用いたＣＴＬＤ−ＮＥＣ１４はＣＴＬＤの場合と同様の巻き戻し条件を用いて調製された。ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫ１４の結晶化条件は以下の通りである：  ４．６ｍｇ／ｍＬの蛋白質溶液（１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，  ｐＨ  ７．５，  ４００ｍＭ  ＮａＣｌ）を同じ容積の１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，  ｐＨ  ７．５，  ２０％  ＰＥＧ  １０Ｋ溶液と混ぜ、２７７Ｋ（４oＣ）で蒸気拡散法によって結晶化を行った。
【実施例２２】
【０５０７】
（リフォールディングしたタンパク質の機能測定）
実施例１９において調製し本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングした、ヒスチジンタグ化タンパク質およびビオチンタグ化タンパク質の各々について、リガンド結合能を確認した。【０５０８】
（１）リフォールディングしたヒスチジンタグ化タンパク質のリガンド結合能の確認
リフォールディングに成功したヒスチジンタグ化細胞外領域、もしくはヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを変性ＬＤＬなどを検出するセンサーとして使用する目的で、表面プラズモン共鳴により検出が可能な機器のセンサー部位へ各ヒスチジンタグ化タンパク質を固定化し、実際のリガンドの結合を検討した。表面プラズモン共鳴装置としては、ＢＩＡｃｏｒｅ杜製のＢＩＡｃｏｒｅを使用した。【０５０９】
（１．１）実施例１９で調製した、リフォールディングしたヒスチジン化細胞外領域をＢＩＡＣＯＲＥのセンサーチップ上に、リガンド認識に関わる部分が外側を向くように固定化した。具体的には、ＮＴＡセンサーチップ（ＢＩＡｃｏｒｅ社製）表面を、０．３５Ｍ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）で洗浄後、５００μＭ  ＮｉＣｌ２をインジェクトして、センサーチップ上にタンパク質を固定化した。このチップ上に、実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＣＴＬＤを固定化した。なお、固定化量は、１０００ＲＵ以下になるように、インジェクトするタンパク質量を調整した。【０５１０】
（１．２）変性ＬＤＬとして、アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬを以下のように調製した。【０５１１】
酸化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬおよび硫酸銅の濃度がそれぞれ３ｍｇ／ｍＬおよび７５μＭとなる様に調製した溶液をＣＯ２インキュベーター内で２０時間インキュベートした。ついでＥＤＴＡを含有する０．１５Ｍの塩化ナトリウム溶液にて透析し、酸化ＬＤＬを得た。【０５１２】
アセチル化ＬＤＬの調製：精製したＬＤＬに対して最終濃度が５０％になるように酢酸ナトリウム溶液を加え、０℃に冷却した。このとき全量を１ｍＬにした。氷上で攪拌しながら無水酢酸１μＬを１０分間隔で５回加えさらに３０分間冷却攪拌を続け反応を完結させた。【０５１３】
（１．３）受容体チップに対する各種ＬＤＬの結合を、以下のとおりに検出した。流速２０μＬ／分で、ＬＤＬおよび変性ＬＤＬ（アセチル化ＬＤＬおよび酸化ＬＤＬ）を２分間インジェクトして、センサーグラムの変化を記録した。表面プラズモン共鳴の原理を利用した機器の場合、リガンドの結合をレゾナンスユニット：ＲＵの増加を示すセンサーグラムの変化として検出することになる。その後、１Ｍ  ＮａＣｌ  ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を３０秒間インジェクトし、結合したＬＤＬを剥離することによって、センサーチップを再生した。このサイクルを５回繰り返し、センサーチップのベースラインおよびセンサーグラムの応答レベルが再現性よく安定していることを確認したうえで、センサーグラムの変化から、結合定数および結合量を算出した。【０５１４】
その結果、本発明のリフォールディング方法を用いてリフォールディングされたヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤは、酸化ＬＤＬおよびアセチル化ＬＤＬに対して、天然のＬＯＸ−１と同程度の親和性を有することが確認された。なお、リフォールディングされたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ二量体は、ＬＤＬに対して、変性ＬＤＬの場合よりも２桁低い結合能を示した。
【実施例２３】
【０５１５】
（リフォールディングしたタンパク質は二量体を形成する）
天然のＬＯＸ−１タンパク質は、二量体を形成する。そこで、本発明のリフォールディング方法によってリフォールディングしたＬＯＸ−１およびその改変体が二量体を形成するか否かについて、ゲルろ過、ＰＡＧＥ，および質量分析を用いて確認した。【０５１６】
（１）ゲルろ過による純度検定
微量精製用ＨＰＬＣ（ＳＭＡＲＴシステム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ１２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）ゲルろ過カラムにより、分子量および純度の検定を行った。２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、４００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムに、平衡化に使用した緩衝液と同一の緩衝液に溶解した、実施例２で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインをアプライし、流速２０μＬ／分での溶出パターンを２８０ｎｍのＵＶ吸収によってモニターした。【０５１７】
（２）質量分析による純度検定
０．１％  ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液に溶解した実施例１で調製したヒスチジンタグ化ＬＯＸ−１細胞外ドメインに、０．１ＴＦＡを含む３０％アセトニトリル溶液中に溶解させたシナピン酸溶液を混合した。その溶解した試料に対して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｅｌｉｔｅ，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）による分析を行った。【０５１８】
（３）還元および非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
本発明のリフォールディング方法によって得られたＬＯＸ−１タンパク質に２０％  β−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ））を加え、１００℃で５分間煮沸した試料を、還元状態の試料とした。一方、上記の試料緩衝液からβ−メルカプトエタノールを除いた試料緩衝液を加えて、３０分間室温において反応させた試料を、非還元状態の試料とした。各々の試料を、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ）を用いて染色した。【０５１９】
（化学架橋実験）
リフォールディング方法によって得られたＬＯＸ―１タンパク質溶液（３００μｇ／ｍＬ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ）に対して、化学架橋剤ＢＳ３（Ｐｉｅｒｃｅ社製）を、０．２、０．４、０．８、１．６、３．２ｍＭとなるように添加し、室温で３０分間架橋反応を行った。反応後すぐに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用の試料緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ６．８、８％  ＳＤＳ、２０％  スクロース、０．０２％  ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、２０％  β−メルカプトエタノール）を添加して、１００℃で５分間過熱し、１５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った後、ＣＢＢ染色して、添加した化学架橋の量に依存して増加する２量体タンパク質の変化量を観測した。【０５２０】
この条件を、実施例１９に従って調製されたタンパク質において適用し、ＣＴＬＤ−ＮＥＣＫ１４の二量体界面部に存在するキャビティー構造を明らかにした（図１６）。【０５２１】
上記の条件で得られた結晶構造は、細胞表層上に存在する形を保持しているためにＬＯＸ−１の二量体界面構造がもつ構造機能相関について詳細な議論が可能である。本発明者らは、細胞表層に発現されたＬＯＸ−１変異体の修飾ＬＤＬに対する結合活性を調べた結果、二量体界面部にあるＷ１５０をＡｌａに置換した変異体が、修飾ＬＤＬに対する結合活性をほとんど失うことを見出した。Ｗ１５０が二量体構造を規定する分子間の水素結合ネットワークの中心に位置することからＷ１５０Ａ変異体では二量体界面構造が崩れ、その結果二量体中のサブユニット間の相対位置が変化し結合活性の低下につながったものと考えている。結晶構造中で、Ｗ１５０の近傍にはアミノ酸ひとつが入る程度の大きさをもつキャビティーが存在していることがわかった。Ｗ１５０Ａが修飾ＬＤＬに対する活性を失ったことから、このキャビティーに結合し、二量体界面構造を崩すことを機作とするＬＯＸ−１特異的な修飾ＬＤＬ結合阻害剤をデザインすることが可能と考えられる。すなわち、二量体界面部に存在するキャビティーはＬＯＸ−１阻害剤開発のための標的部位になると考えられる（図１６）。
【実施例２４】
【０５２２】
（バーチャルスクリーニング）
市販の化合物のデータベース（FCD（Fine Chemical Directory）という商業ベースの化学薬品データベース ）より１つずつ化合物を取り出し、コンピュータグラフィクス上で実施例１９において調製した二量体ＬＯＸ−１の活性部位の位置へ自動で近づけた。エネルギーの最小化により、最適な方位で化合物を酵素に結合させた。このときの安定化エネルギーΔＧを計算し、最もΔＧのマイナス値が大きな化合物を選定すると、インヒビターとして好ましい化合物を選定することができる。
【実施例２５】
【０５２３】
（インビトロスクリーニング）
次に、実施例１３のバーチャルスクリーニングでインヒビターとして適切なものと判断された化合物を実際にインビトロ系で実験することによってその活性を確認する。ＬＯＸ−１アッセイは以下のとおり行う。【０５２４】
（ＬＯＸ−１アッセイ）
ＬＯＸ−１の活性を以下のようにアッセイする。【０５２５】
実施例８と同様にビオチン化タグをＮ末端部分につけた実施例１９において示される配列を有するＬＯＸ−１をストレプトアビジンでコートされたマイクロタイタープレート上に固定化する。ヘパリン採血により得られた血漿から得られたＬＤＬ分画をそれぞれのウェルに分注して、阻害剤として適切なものと判断された化合物を各ウェルに添加した後に４℃で１時間放置する。その後０．０５％のＴｗｅｅｎ２０−ＴＢＳ（ＮａＣｌ  １４０ｍＭ，ＫＣｌ，２．７ｍＭ，２５ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．４）で３回洗浄した後、ビオチン化したＬＯＸ−１に対して量子ドット（Ｑ−ｄｏｔ  ５２５，住商バイオサイエンス株）で蛍光標識したＬＯＸ−１を加えて１時間４℃で放置した後に０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０−ＴＢＳで３回洗浄した後にウェルからの５２５ｎｍの蛍光を観測して蛍光強度の強さから、添加した化合物がもつ酸化ＬＤＬのＬＯＸ−１への結合阻害能をモニターする。【０５２６】
（結果）
上記のアッセイの結果、実際に特定の物質がインヒビターとしてより好ましいことが判明する。【０５２７】
このように、本発明を用いて、実際に、二量体を形成するＬＯＸ−１の活性を調節する分子を得ることができる。従って、本発明は、ＬＯＸ−１の活性調節剤のスクリーニングのほか、その実際の調製にも使用することができることが実証される。
【実施例２６】
【０５２８】
（動物モデルでの実証）
実施例２５において同定されたＬＯＸ−１の活性を調節する因子が動物モデルにおいて、有効であるかどうかを実証する。【０５２９】
動脈硬化モデルマウスとして、（ａｐｏＥ−／−）マウスを作製し、このモデルマウスにおいて、上記因子が有効であるかどうかを検証する。検証方法は、経口投与または静脈投与によって、上記因子をマウスに量を振りながら投与し、その後動脈硬化が改善したかどうかを、両手・両足の４箇所の血圧を同時に測定し、四肢の動脈硬化（血管の硬さ、詰まり）の指標とすることによって確認する。【０５３０】
このような手法によって、二量体を形成するかしないモデルを用いて本発明の因子によって動脈硬化が改善されるかどうかが確認される。
【実施例２７】
【０５３１】
（ＮＭＲ解析）
アセチル化ＬＤＬ（ａｃＬＤＬ）は酸化ＬＤＬ同様にＬＯＸ−１を介してマクロファージに取り込まれるなど、酸化ＬＤＬと同様の生理作用を持つことが知られている。酸化ＬＤＬが脂質部位のみならずＬＤＬ粒子の表面を取り囲むａｐｏＢ１００タンパク質も酸化され、かつ、多様な酸化状態にあるために物理化学的な測定に用いるには、その化学的な不均一性のために問題が多い。一方同様な生理活性を示すアセチル化ＬＤＬはＬＤＬ粒子表面にあるａｐｏＢ１００タンパク質のＬｙｓ残基のみを選択にアセチル化することが知られているために、物理化学的な計測には酸化ＬＤＬのモデルとして良く用いられる。【０５３２】
そこで、ＬＯＸ−１をさらに解析するために、ＮＭＲ解析を行った。ＮＭＲの解析は以下のとおりに行った。【０５３３】
測定に用いたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤまたはＣＴＬＤ−ＮＥＣＫは１５ＮＨ４Ｃｌを窒素源とするＭ９最小培地で培養されたＬＯＸ−１  ＣＴＬＤを発現する大腸菌から、上記実施例において記載した巻き戻し法により得たものである。得られた１５Ｎ標識  ＬＯＸ−１  ＣＴＬＤタンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ，ｐＨ  ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌの組成を持つ緩衝液に透析後０．１ｍＭの濃度になるように濃縮してＮＭＲ試料とした。ａｃＬＤＬは市販（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）のａｃＬＤＬを１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ  ７．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌに透析後タンパク質定量によりａｃＬＤＬの濃度検定を行いＬＯＸ−１  ＣＴＬＤ溶液に添加してＮＭＲ測定を行なった。測定は、７５０ＭＨｚ  ＮＭＲ分光器を用いて、測定温度は２５℃で行なった。【０５３４】
１５Ｎで均一に標識したＬＯＸ−１のリガンド結合ドメイン（ＣＴＬＤ）に対してアセチルＬＤＬを滴定した際のＮＭＲシグナル変化の様子を示す。解析にもちいている２次元スペクトルは１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル（ＨＳＱＣ、Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）であり、２次元スペクトル上に観測されるシグナルはタンパク質中の１つ１つのアミノ酸残基の主鎖アミド基に由来する。ここで観測されている個々のＮＭＲシグナルは全てタンパク質中のどのアミノ酸に由来するか帰属がついているので、例えば、タンパク質に結合する化合物をＮＭＲ試料溶液中に入れることで変化が誘導されるＮＭＲシグナルから、どのアミノ酸残基が化合物と結合したかを同定することができる。ここで示す実験では、ａｃＬＤＬが巨大な粒子であるためにＬＯＸ−１がａｃＬＤＬと結合することにより、結合部位に存在するＮＭＲシグナルには大きな強度の低下が観測された。ａｃＬＤＬ滴定に伴うＨＳＱＣスペクトル上のＮＭＲシグナル変化からＬＯＸ−１のａｃＬＤＬへの結合に関与する部位（結合に関与しているアミノ酸残基）を同定することが可能である。
【実施例２８】
【０５３５】
（ファルマコフォアモデルの構築）
酸化ＬＤＬの添加により１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトル上で変化が誘導されるＮＭＲシグナルからＬＯＸ−１のどのアミノ酸残基が酸化ＬＤＬの結合に関与しているかを特定することができる。ＮＭＲ解析の結果特定されたアミノ酸残基からなる結合ポケットを形成する化学的特定を図７に示すＬＯＸ−１の立体構造から抽出することができる。ＬＯＸ−１のもつ活性ポケットが示す立体構造および化学的特性の空間的な配置に対して相補的な相互作用をする表面を持つリガンド表面特性をファルマコフォアという。ＬＯＸ−１の活性ポケットの立体構造から特定されるリガンドが持つべき表面特性（ファルマコフォア）は例えばＭＯＥのＡｌｐｈａ  Ｓｉｔｅ  Ｆｉｎｄｅｒというソフトウエアを利用してモデル化できる。Ａｌｐｈａ  Ｓｉｔｅ  Ｆｉｎｄｅｒにより立体構造上に特定された活性ポケット上にダミー原子を配置して、各ダミー原子が受容体の活性ポケット全体からどのような静電相互作用を受けるかを解析することで、各ダミー原子の位置がａｃｃｅｐｔｏｒあるいはｄｏｎｏｒのいずれが存在するかを判定することができる。ここで算定されたポテンシャルをもとにしてａｌｐｈａ  ｓｉｔｅをａｃｃｅｐｔｏｒ／ｄｏｎｏｒ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃの３つの領域に分けてそれぞれのダミー原子をクラスタリングする。それぞれの化学的特性を共通として持つクラスターの中心にｆｅａｔｕｒｅを定義する。この中心の位置からの排除体積を定義しファルマコフォアをモデル化する。
【実施例２９】
【０５３６】
（ファルマコフォアモデルを利用した化合物のスクリーニング）
実施例２８で構築されたファルマコフォアモデルで特定される化学的特定に一部でも合致する化合物をデータベースから抽出する。抽出された化合物は例えば生物分子工学研究所で開発された分子動力学プログラムＰＲＥＳＴを用いてマルチカノニカル分子動力学計算（ＭＤ）によりＬＯＸ−１活性ポケット側の立体構造変化およびリガンド側の立体構造変化も考慮した形で複合体構造を計算する。高温状態での分子動力学計算に続いて徐冷法により３００Ｋにおける安定なリガンドタンパク質複合体構造を計算する。ここで得られる複合体の安定構造エネルギーの大きさによりＬＯＸ−１の活性ポケットに強く結合する化合物の構造を決定する。同様なスクリーニングはＭＯＥ−Ｐｈ４＿Ｄｏｃｋなどのプログラムを用いても実行できる。
【実施例３０】
【０５３７】
（ファルマコフォアモデルを利用した化合物を用いた疾患の処置）
実施例２８において得られたファルマコフォアモデルによって構築された化合物を用いて、実施例２６において示されるような実験モデルを用いて疾患を治療できるかどうかを実証する。動脈硬化モデルマウスとして、（ａｐｏＥ−／−）マウスを作製し、このモデルマウスにおいて、上記因子が有効であるかどうかを検証する。検証方法は、経口投与または静脈投与によって、上記因子をマウスに量を振りながら投与し、その後動脈硬化が改善したかどうかを、両手・両足の４箇所の血圧を同時に測定し、四肢の動脈硬化（血管の硬さ、詰まり）の指標とすることによって確認する。【０５３８】
このような手法によって、本発明の因子によって動脈硬化が改善されるかどうかが確認される。【０５３９】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０５４０】
本発明の方法によって得られた高解像度の結晶を解析することによって、ＬＯＸ−１の活性の調節を行うことができる化合物をスクリーニングすることができ、その結果、循環器系疾患のための治療剤を設計することが可能になる。
【図７−１】
2005054460.tif 000002
【図７−２】
2005054460.tif 000003
【図７−３】
2005054460.tif 000004
【図７−４】
2005054460.tif 000005
【図７−５】
2005054460.tif 000006
【図７−６】
2005054460.tif 000007
【図７−７】
2005054460.tif 000008
【図７−８】
2005054460.tif 000009
【図７−９】
2005054460.tif 000010
【図７−１０】
2005054460.tif 000011
【図７−１１】
2005054460.tif 000012
【図７−１２】
2005054460.tif 000013
【図７−１３】
2005054460.tif 000014
【図７−１４】
2005054460.tif 000015
【図７−１５】
2005054460.tif 000016
【図７−１６】
2005054460.tif 000017
【図７−１７】
2005054460.tif 000018
【図７−１８】
2005054460.tif 000019
【図７−１９】
2005054460.tif 000020
【図７−２０】
2005054460.tif 000021
【図７−２１】
2005054460.tif 000022
【図１２】
2005054460.tif 000023
【図１３】
2005054460.tif 000024
【図１４】
2005054460.tif 000025
【図１７−１】
2005054460.tif 000026
【図１７−２】
2005054460.tif 000027
【図１７−３】
2005054460.tif 000028
【図１７−４】
2005054460.tif 000029
【図１７−５】
2005054460.tif 000030
【図１７−６】
2005054460.tif 000031
【図１７−７】
2005054460.tif 000032
【図１７−８】
2005054460.tif 000033
【図１７−９】
2005054460.tif 000034
【図１７−１０】
2005054460.tif 000035
【図１７−１１】
2005054460.tif 000036
【図１７−１２】
2005054460.tif 000037
【図１７−１３】
2005054460.tif 000038
【図１７−１４】
2005054460.tif 000039
【図１７−１５】
2005054460.tif 000040
【図１７−１６】
2005054460.tif 000041
【図１７−１７】
2005054460.tif 000042
【図１７−１８】
2005054460.tif 000043
【図１７−１９】
2005054460.tif 000044
【図１７−２０】
2005054460.tif 000045
【図１７−２１】
2005054460.tif 000046
【図１７−２２】
2005054460.tif 000047
【図１７−２３】
2005054460.tif 000048
【図１７−２４】
2005054460.tif 000049
【図１７−２５】
2005054460.tif 000050
【図１７−２６】
2005054460.tif 000051
【図１７−２７】
2005054460.tif 000052
【図１７−２８】
2005054460.tif 000053
【図１７−２９】
2005054460.tif 000054
【図１７−３０】
2005054460.tif 000055
【図１７−３１】
2005054460.tif 000056
【図１７−３２】
2005054460.tif 000057
【図１７−３３】
2005054460.tif 000058
【図１７−３４】
2005054460.tif 000059
【図１７−３５】
2005054460.tif 000060
【図１７−３６】
2005054460.tif 000061
【図１７−３７】
2005054460.tif 000062
【図１７−３８】
2005054460.tif 000063
【図１７−３９】
2005054460.tif 000064
【図１７−４０】
2005054460.tif 000065
【図１７−４１】
2005054460.tif 000066
【図１７−４２】
2005054460.tif 000067
【図１７−４３】
2005054460.tif 000068
【図１７−４４】
2005054460.tif 000069
【図１】
2005054460.tif 000070
【図２】
2005054460.tif 000071
【図３】
2005054460.tif 000072
【図４】
2005054460.tif 000073
【図５】
2005054460.tif 000074
【図６】
2005054460.tif 000075
【図８】
2005054460.tif 000076
【図９】
2005054460.tif 000077
【図１０】
2005054460.tif 000078
【図１１】
2005054460.tif 000079
【図１５】
2005054460.tif 000080
【図１６】
2005054460.tif 000081
【配列表】
2005054460000001.app
【国際調査報告】
2005054460.tif 000082
2005054460.tif 000083
2005054460.tif 000084
2005054460.tif 000085
2005054460.tif 000086
2005054460.tif 000087
2005054460.tif 000088
2005054460.tif 000089
2005054460.tif 000090