(57)【要約】  本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用を対象とする。より特には、特定の実施形態は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させることを対象とし、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。【選択図】図１Ａ
2020516254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドを発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞であって、前記宿主細胞はパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性を低減又は消失させる遺伝子改変を含む宿主細胞。
【請求項２】
前記改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
前記改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の完全又は部分的欠失を含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
前記部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性部位アミノ酸のＳｅｒ１８９、Ｇｌｕ３１０及び／又はＨｉｓ３９９をコードする１つ以上のコドンの欠失を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
前記部分的欠失は、前記ｐ−ＮＢＥをコードする前記遺伝子におけるヌクレオチドフレームシフト欠失を含み、前記フレームシフト欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性を欠くそのコードされたタンパク質をもたらす、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】
ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、配列番号２のアミノ酸残基１〜１６３をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、配列番号２のアミノ酸残基１６４〜３２６をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、又は配列番号２のアミノ酸残基３２７〜４８９をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子によってコードされるアセチルエステラーゼ（ＡＥ）ドメインの欠失を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記ＡＥドメインは、配列番号２のアミノ酸残基８５〜２１１内に含まれる、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ基質結合ポケットをコードする遺伝子の１つ以上のコドンの欠失を含む、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
ｐ−ＮＢＥ遺伝子の破壊は、前記ｐ−ＮＢＥ遺伝子への選択可能マーカーの挿入を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
前記改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子のダウンレギュレーションである、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、前記宿主細胞において、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子に相補的なＲＮＡ分子を導入し発現させることを含む、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、（ａ）内在性ｐ−ＮＢＥプロモーター核酸配列の完全又は部分的欠失、（ｂ）内在性ｐ−ＮＢＥターミネーター核酸配列の完全又は部分的欠失、それらの組み合わせ、並びに、任意選択で、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子に関連する他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲ核酸配列の欠失を含む、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含む前記ポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６に対して９０％の配列同一性を含むビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ポリペプチド、配列番号１７に対して９０％の配列同一性を含むクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチド、配列番号１８に対して９０％の配列同一性を含むアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ポリペプチド、及び配列番号２６に対して９０％の配列同一性を含むラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ポリペプチドからなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含む前記ポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号２５に対して９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドによってコードされる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
検出可能なリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性が欠損するようにさらに改変されている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記発現ベクターは、前記宿主細胞のゲノムに組み込まれている、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトで形質転換されている、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載の宿主細胞によって産生されるβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１に記載の宿主細胞によって産生される精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドであって、前記精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは検出可能なｐ−ＮＢＥ副活性を含まない精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチド。
【請求項２６】
噴霧乾燥固体である、請求項２５に記載の精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチド。
【請求項２７】
ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性を含まない、請求項２５に記載の精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２５に記載の精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドを含む乳製品。
【請求項２９】
ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む乳製品の製造方法であって、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含む請求項２５に記載のポリペプチドを、ラクトースを含む乳製品に添加する工程を含む方法。
【請求項３０】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物を製造する方法であって、前記ポリペプチド組成物は検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性をその中に含まず、前記方法は、
（ａ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含み、発現する親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する工程、
（ｂ）配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートすることによって、工程（ａ）のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を改変する工程、
（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で工程（ｂ）の改変宿主細胞を培養する工程、及び
（ｄ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記ポリペプチドを単離する工程
を含み、
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記単離されたポリペプチド組成物は、検出可能なｐ−ＮＢＥ活性を含まない方法。
【請求項３１】
請求項３０に記載の方法によって製造されるβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチド。
【請求項３２】
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物を製造する方法であって、前記ポリペプチド組成物は検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性をその中に含まず、前記方法は、
（ａ）親バチルス宿主細胞を得、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートすることによって、前記バチルス宿主親細胞を改変する工程、
（ｂ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする発現コンストラクトを工程（ａ）の改変細胞に導入する工程、
（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記ポリペプチドを発現するのに好適な条件下で工程（ｂ）の宿主細胞を培養する工程、及び
（ｄ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記ポリペプチドを単離する工程
を含み、
β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有する前記単離されたポリペプチド組成物は、検出可能なｐ−ＮＢＥ活性を含まない方法。
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法によって製造されるβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、細菌学、微生物学、遺伝学、分子生物学、酵素学、プロバイオティクス、乳製品などの分野に関する。本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用を対象とする。より特には、特定の実施形態は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させることを対象とし、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。
【０００２】
関連出願の相互参照
本願は２０１７年４月０７日に出願された米国仮特許出願第６２／４８３，２３９号の優先権を主張し、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表の参照
「ＮＢ４１１３８−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１８年４月０２日に作成され、サイズは１３９ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
食品の化学的性質を増強及び／又は改善するための酵素の使用は、当該技術分野で広く使用され、受け入れられている。特に、牛乳及び他の動物由来の基質の処理は、これらの乳製品関連最終製品に有意な価値を付加する。例えば、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、ヒト（及び動物）において非消化性であり、グリコシド結合によって連結された２つ以上のガラクトース分子（一般的には９個まで）を含む炭水化物である。このようなガラクトオリゴ糖の特に有益な効果は、このようなＧＯＳ組成物の消費者に生理学的利益を提供する有益な（結腸）微生物（例えば、細菌）の増殖を選択的に刺激することによって、プレバイオティック化合物として作用するそれらの能力である。したがって、このようなＧＯＳ組成物の確立された健康上の利点は、種々のタイプの食品のための成分としてのガラクトオリゴ糖の関心の増大をもたらした。
【０００５】
酵素であるβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）は、一般に、ラクトースを単糖であるＤ−グルコース及びＤ−ガラクトースに加水分解する。β−ガラクトシダーゼの酵素反応では、酵素はラクトースを加水分解し、ガラクトース−酵素複合体の形でガラクトース単糖に一時的に結合する。続いて、水によって共有結合ガラクトース−酵素中間体が加水分解され、その結果、Ｄ−ガラクトース及びＤ−グルコースの遊離が生じる。しかし、ラクトース濃度が高い場合、一部のβ−ガラクトシダーゼは、それによってガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）が生成されるトランスガラクトシル化と呼ばれるプロセスにおいてガラクトースをＤ−ガラクトース若しくはＤ−グルコースの水酸基に移動させることができる。したがって、ラクトース濃度が高い場合、大半のβ−ガラクトシダーゼはガラクトースをラクトース及び／又は高次オリゴ糖の水酸基へ移動させることができる。
【０００６】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属は、乳業において一般的に使用されており、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）含有製品の摂取はさらに、健康増進効果を有する。この効果は、腸内容物のｐＨ低下によってだけではなく、さらに（例えば、抗生物質の摂取によって）腸内細菌叢が乱されている個体における腸内細菌叢をビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が再生する能力によって達成される。さらに、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、潜在的に有害な腸内微生物と競合しない可能性がある。
【０００７】
したがって、簡単に上述したように、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）などの有益な微生物の増殖を増強することが知られている。この効果は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）が炭素源としてガラクトオリゴ糖を活用する固有の能力を通して達成される可能性が高い。例えば、ガラクトオリゴ糖の栄養補助食品は、多くの長期にわたる疾患予防効果を有すると考えられている。したがって、栄養補助食品及び乳製品を改良する目的でこの産業界で使用するガラクトオリゴ糖を製造するための安価で効率的な方法を開発することに、当該技術分野で高い関心が寄せられている。
【０００８】
例えば、約５８０個のアミノ酸でトランケートされたビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼ（ＢＩＦ３−ｄ３）は、水中に溶解されたラクトースを含有する溶液中のトランスガラクトシル化酵素であると記載されている（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。国際公開第２００１／９０３１７号パンフレットはトランケーション多様体（ＯＬＧＡ３４７）がトランスガラクトシル化酵素であると記載し、国際公開第２０１２／０１０５９７号パンフレットは、トランケーション多様体ＯＬＧＡ３４７がガラクトース部分をＤ−フコース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン及びキシロースに移動させることを示している。米国特許出願公開第２０１２／００４００５１号明細書は、高ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）含量及び低ラクトース含量を有する容易に吸収可能な乳製品を調製する方法、並びに、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）由来のラクターゼを含む任意の起源由来のラクターゼを使用する方法で調製されたガラクトオリゴ糖強化乳製品を記載する。バチルス・サークランス（Ｂａｃｃｉｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）由来のβ−ガラクトシダーゼを用いたラクトース溶液又はスキムミルクからのガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）合成は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）により記載されている。国際公開第２００８／０３７８３９号パンフレットは、乳ベースの原料にフルクトース、及び任意選択によりラクトースを添加した後、のβ−ガラクトシダーゼで処理し、この反応混合物の酵素反応を停止させることにより、ガラクトオリゴ糖を含有する生成物の製造方法を開示している。欧州特許出願第０４５８３５８号明細書は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含有するスキムミルク粉末、及びその製造方法を開示しており、この方法は、β−ガラクトシダーゼを濃縮乳に添加して酵素反応を生じさせ、この反応混合物を７５〜８０℃に加熱して酵素反応を停止させ、続いて反応混合物をスプレー乾燥させることを含む。
【０００９】
したがって、一般に上で開示されているように、乳製品関連食品（例えば、ミルク、ヨーグルトなど）におけるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するための、このようなβ−ガラクトシダーゼ、ラクターゼ及びそれらのトランスガラクトシル化酵素の使用に、高い関心があり、研究が続けられている。例えば、国際公開第２０１５／０８６７４６号パンフレットには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（異種タンパク質を高レベルで産生できることが知られている）で発現し産生される６つのビフィドバクテリウムビフィズムβ−ガラクトシダーゼ切断多様体（全長Ｂ．ビフィズムβ−ガラクトシダーゼ由来）が記載されている。
【００１０】
しかし、乳製品関連食品及びその用途は、当該技術分野で「酵素（ｅｎｚｙｍｅ）副活性」又は「酵素（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ）副活性」とも呼ばれる、多数の「非標的」（すなわち、好ましくない／望ましくない）酵素活性に対して高い感受性がある。例えば、少量のセルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、マンナナーゼなどの酵素活性は、多くの乳製品がカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、グアー（ＧＵＡＲガム）、デンプン、カラゲナン、ペクチンなどの親水コロイドで調合／安定化されるので、ほとんどの乳製品において望ましくない（すなわち、好ましくない／望ましくない酵素副活性）。さらに、言及されるべき他の（好ましくない／望ましくない）酵素副活性はプロテアーゼ活性、リパーゼ活性、及びホスホリパーゼ活性であり、これらは、最終製品に不快な異臭又は臭いを生成し得る。さらに、これらの（好ましくない／望ましくない）酵素副活性は、発酵中に産生宿主細胞から副生物としてしばしば生じる。したがって、ＧＯＳ／乳製品開発サイクルの初期に、このような好ましくない／望ましくない酵素副活性を特定し、これらの好ましくない酵素副活性が最終製品に与える重度を評価することが非常に重要である。
【００１１】
したがって、以下の「発明を実施するための形態」に記載するように、本開示は、微生物宿主細胞において多量のβ−ガラクトシダーゼ及びラクターゼを効率的且つ安価に産生するという、当該技術分野における継続的な要求に対処しようとするものであり、微生物宿主細胞で産生されたそのようなβ−ガラクトシダーゼ及びラクターゼは乳製品に添加され、その中でガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成する。より特には、本開示は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞において多量のβ−ガラクトシダーゼ及びラクターゼを効率的且つ安価に産生するという、継続的で且つ未だ達成されていない要求に対処しようとするものであり、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞において産生され精製されたそのような酵素には、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、リパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などが含まれない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、概して、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用に関する。したがって、本開示の特定の実施形態は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させることを対象とし、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。
【００１３】
より特には、本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドを発現するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞に関し、ここで、宿主細胞はパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性を低減又は消失させる遺伝子改変を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変（すなわち、改変細胞におけるｐ−ＮＢＥ活性を低減又は消失させる）は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の完全又は部分的欠失を含む。特定の他の実施形態では、部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性部位アミノ酸であるＳｅｒ１８９、Ｇｌｕ３１０及び／又はＨｉｓ３９９をコードする１つ以上のコドンの欠失を含む。他の実施形態では、部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子におけるヌクレオチドフレームシフト欠失を含み、このフレームシフト欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性を欠くそのコードされたタンパク質をもたらす。別の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、配列番号２のアミノ酸残基１〜１６３をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、配列番号２のアミノ酸残基１６４〜３２６をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、配列番号２のアミノ酸残基３２７〜４８９をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、又はそれらの組み合わせを含む。特定の他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子によってコードされるアセチルエステラーゼ（ＡＥ）ドメインの欠失を含む。特定の他の実施形態では、ＡＥドメインは、配列番号２のアミノ酸残基８５〜２１１内に含まれる。別の実施形態では、ＡＥドメインは、配列番号２に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むポリペプチドのアミノ酸残基８５〜２１１内に含まれる。さらに他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ基質結合ポケットをコードする遺伝子の１つ以上のコドンの欠失を含む。
【００１４】
他の実施形態では、遺伝子改変（すなわち、改変細胞におけるｐ−ＮＢＥ活性を低減又は消失させる）は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態では、ｐ−ＮＢＥ遺伝子破壊は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子への選択マーカーの挿入を含み、それによってｐ−ＮＢＥ遺伝子コード配列を破壊する。特定の実施形態では、配列番号２に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子が、選択マーカーの挿入によって破壊される。特定の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする内在性遺伝子が、ｐ−ＮＢＥ基質結合ポケット残基、ｐ−ＮＢＥ活性部位触媒三残基をコードするヌクレオチド位置、ｐ−ＮＢＥ  ＡＥドメインの領域、−１、０、＋１転写開始部位、５’プロモーター領域などで（例えば、選択マーカーを含む破壊カセットによって）破壊される。
【００１５】
他の実施形態では、遺伝子改変（すなわち、改変細胞におけるｐ−ＮＢＥ活性を低減又は消失させる）は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子のダウンレギュレーションである。特定の実施形態では、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子に相補的なＲＮＡ分子を導入（及び発現）させることを含む。特定の他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、（ａ）内在性ｐ−ＮＢＥプロモーター核酸配列の完全又は部分的欠失、（ｂ）内在性ｐ−ＮＢＥターミネーター核酸配列の完全又は部分的欠失、それらの組み合わせ、並びに、任意選択で、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子に関連する他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲ核酸配列の欠失を含む。
【００１６】
したがって、本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用に関する。特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６に対して９０％の配列同一性を含むビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ポリペプチド、配列番号１７に対して９０％の配列同一性を含むクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチド、配列番号１８に対して９０％の配列同一性を含むアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ポリペプチド、又は配列番号２６に対して９０％の配列同一性を含むラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ポリペプチドからなる群から選択される。他の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号２５に対して９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００１７】
別の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。特定の他の実施形態では、宿主細胞は、検出可能なリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性が欠損するようにさらに改変されている。
【００１８】
したがって、特定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む。特定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内在性ｐ−ＮＢＥ活性を低減又は排除する遺伝子改変を行う前に発現ベクター／コンストラクトで形質転換され、一方、他の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、内在性ｐ−ＮＢＥ活性を低減又は消失させる遺伝子改変を行った後に／それに続いて発現ベクター／コンストラクトで形質転換される。
【００１９】
したがって、本開示の特定の他の実施形態は、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞によって産生されるβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチド（すなわち、酵素）に関する。特定の実施形態は、このような改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって産生される精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドを対象とし、ここで、精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、検出可能なｐ−ＮＢＥ副活性を含まない。特定の実施形態では、本開示のβ−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、液体組成物又は固体組成物である。特定の実施形態では、本開示のβ−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、噴霧乾燥固体である。
【００２０】
他の実施形態では、精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、検出可能なホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性を含まない。
【００２１】
他の実施形態では、本開示は、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞によって産生されたβ−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドを含む１つ以上の乳製品に関する。
【００２２】
したがって、本開示の特定の実施形態は、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む乳製品を製造する方法を対象とし、それから製造される乳製品は、好ましくない／望ましくないｐ−ＮＢＥ副活性を含まない。したがって、特定の実施形態では、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を含む乳製品を製造する方法は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性ポリペプチドを、ラクトースを含む乳製品に添加する工程を含む。
【００２３】
別の実施形態では、本開示は、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物を製造する方法であって、そのポリペプチド組成物は検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性をその中に含まない方法において、（ａ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトを含み、発現する親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を提供する工程、（ｂ）配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートすることによって、工程（ａ）のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を改変する工程、（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現するのに好適な条件下で工程（ｂ）の改変宿主細胞を培養する工程、及び（ｄ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを単離する工程（ここで、この単離されたβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物は、検出可能なｐ−ＮＢＥ活性を含まない）を含む方法に関する。
【００２４】
別の実施形態では、本開示は、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物を製造する方法（ここで、そのポリペプチド組成物は検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性を含まない）であって、（ａ）親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を得、この親細胞を配、列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートすることによって改変する工程、（ｂ）工程（ａ）の改変細胞にβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする発現コンストラクトを導入する工程、（ｃ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを発現するのに好適な条件下で工程（ｂ）の宿主細胞を培養する工程、及び（ｄ）β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを単離する工程（ここで、この単離されたβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド組成物は、検出可能なｐ−ＮＢＥ活性を含まない）を含む方法に関する。
【００２５】
本方法の特定の実施形態では、改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む。他の実施形態では、改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の完全又は部分的欠失を含む。他の実施形態では、部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性部位アミノ酸のＳｅｒ１８９、Ｇｌｕ３１０及び／又はＨｉｓ３９９をコードする１つ以上のコドンの欠失を含む。特定の他の実施形態では、部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子におけるヌクレオチドフレームシフト欠失を含み、このフレームシフト欠失は、ｐ−ＮＢＥ活性を欠くそのコードされたタンパク質をもたらす。別の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、配列番号２のアミノ酸残基１〜１６３をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、配列番号２のアミノ酸残基１６４〜３２６をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、配列番号２のアミノ酸残基３２７〜４８９をコードするｐ−ＮＢＥ遺伝子のヌクレオチドの欠失、又はそれらの組み合わせを含む。特定の他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子によってコードされるアセチルエステラーゼ（ＡＥ）ドメインの欠失を含む。特定の実施形態では、ＡＥドメインは、配列番号２のアミノ酸残基８５〜２１１内に含まれる。他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の部分的欠失は、ｐ−ＮＢＥ基質結合ポケットをコードする遺伝子の１つ以上のコドンの欠失を含む。別の実施形態では、改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子の破壊を含む。特定の実施形態では、ｐ−ＮＢＥ遺伝子破壊は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子への選択マーカーの挿入を含む。他の実施形態では、改変は、配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子のダウンレギュレーションである。特定の他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、宿主細胞において、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子に相補的なＲＮＡ分子を導入し発現させることを含む。他の実施形態では、ｐ−ＮＢＥをコードする遺伝子のダウンレギュレーションは、（ａ）内在性ｐ−ＮＢＥプロモーター核酸配列の完全又は部分的欠失、（ｂ）内在性ｐ−ＮＢＥターミネーター核酸配列の完全又は部分的欠失、それらの組み合わせ、並びに配列番号２のｐ−ＮＢＥポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ＮＢＥポリペプチドをコードする遺伝子に関連する他の５’ＵＴＲ及び／又は３’ＵＴＲ核酸配列の任意選択による欠失を含む。
【００２６】
別の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４又は配列番号１６に対して９０％の配列同一性を含むビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｉｆｉｄｕｍ）ポリペプチド、配列番号１７に対して９０％の配列同一性を含むクルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）ポリペプチド、配列番号１８に対して９０％の配列同一性を含むアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ポリペプチド、及び配列番号２６に対して９０％の配列同一性を含むラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ポリペプチドからなる群から選択される。
【００２７】
他の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５又は配列番号２５に対して９０％の配列同一性を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００２８】
他の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ソノレンシス（Ｂ．ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、Ｂ．ハロデュランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）、Ｂ．パブリ（Ｂ．ｐａｂｕｌｉ）、Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）、Ｂ．アガラドハエレンス（Ｂ．ａｇａｒａｄｈａｅｒｅｎｓ）、Ｂ．アキバイ（Ｂ  ａｋｉｂａｉ）、Ｂ．クラーキイ（Ｂ．ｃｌａｒｋｉｉ）、Ｂ．シュードファーマス（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｆｉｒｍｕｓ）、Ｂ．レヘンシス（Ｂ．ｌｅｈｅｎｓｉｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ギブソニイ（Ｂ．ｇｉｂｓｏｎｉｉ）、及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）からなる群から選択される。特定の実施形態では、宿主細胞は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００２９】
本方法の他の実施形態では、宿主細胞は、検出可能なリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性が欠損するようにさらに改変されている。
【００３０】
別の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって製造されるβ−ガラクトシダーゼ活性又はトランスガラクトシル化活性を含むポリペプチドを対象とする。
【００３１】
他の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって製造される精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドに関し、ここで、精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、検出可能なｐ−ＮＢＥ副活性を含まない。特定の他の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって製造される精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドを対象とし、これらの精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドは、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性及び／又はマンナナーゼ副活性を含まない。特定の他の実施形態では、本開示は、本開示の方法によって製造される精製β−ガラクトシダーゼ又はトランスガラクトシル化ポリペプチドを含む乳製品に関する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】図１は、リパーゼ及びホスホリパーゼ活性を検出するための寒天スポットプレートアッセイの結果を示し、ここで、黄色のハローはリパーゼ又はホスホリパーゼ基質が切断され、遊離脂肪酸及び等価のプロトン（Ｈ＋）を生じることによるｐＨの低下を表す。図１Ａは、ホスホリパーゼ基質（すなわち、レシチン基質）のみを用いたスポットプレートアッセイ結果を示す。図１Ｂは、リパーゼ基質（すなわち、トリブチリン基質）及びホスホリパーゼ基質（すなわち、レシチン基質）の両方を用いたスポットプレートアッセイ結果を示す。
【図２】図２は、リパーゼ／ホスホリパーゼザイモグラムを示す。図２のパネルＡは、リパーゼ活性が位置する「透明な」帯を示すザイモグラムゲルの写真である。図２のパネルＢ及び図２のパネルＣは、等電ゲル部分であり、パネルＢはパネルＡで覆われてインキュベートされ、パネルＣはクーマシーで染色された。パネルＢ及びパネルＣの矢印は、質量分析のために切り出されたリパーゼ活性の位置を示す。
【図３】図３  ＩＥＦゲルが基質を含む寒天ゲル上にまだ置かれている間の支持写真（図２、１時間後に一緒にしたパネルＢ及びパネルＣ）。透明な黄色のバンドはリパーゼ基質が切断され、遊離脂肪酸及び等価のＨ＋を生じたことによるｐＨの低下を表す。
【図４】図４は、粉末対照としてＣＰを示し、ｐ２０、ｐ４０及びｐ６０は、５３℃で２０、４０及び６０分間インキュベートした粉末である。ＣＢはＵＦＣ試料Ａであり、Ｂ２０、Ｂ４０及びＢ６０は、２０、４０及び６０分間インキュベートした試料Ａである。
【図５】図５は、混合基質スポットプレート上のハローサイズの評価によって半定量化したエステラーゼ活性を示す。ハローサイズを、図１Ｂに示す希釈列と比較し、４℃で保存した試料Ｃの活性と比較して示した。
【図６】図６は、熱処理後の残留ラクターゼ活性を示す。
【図７】図７は、試料Ｃで処理したヨーグルトの異臭プロファイルを示す。各成分のレベルは固相マイクロ抽出−ＧＣ／ＭＳ分析によって定量した。
【図８】図８は、試料Ｃで処理したＵＨＴミルクの異臭プロファイルを示す。各成分のレベルは固相マイクロ抽出−ＧＣ／ＭＳ分析によって定量した。
【図９】図９は、試料Ｃで処理したＵＨＴミルクの異臭発生を経時的に示す。
【図１０】図１０は、５３℃で２０分間インキュベートした試料Ａ、及びｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子をノックアウトした新しいバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中のβ−ガラクトシダーゼの小規模発酵からのＵＣＦ試料の結果を示すスポットプレートアッセイである。したがって、５３℃試料はリパーゼ活性が陽性であった。「新」と標識した全ての穴は、リパーゼ活性を有さず、したがってハローを有さないｐ−ニトロベンジルエステラーゼノックアウト試料に対応する。
【図１１】図１１は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子をノックアウトした新しいバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの小規模発酵からのＵＣＦ試料で処理したヨーグルトの異臭プロファイル（緑色及び紫色）対試料Ｃで処理したヨーグルトの異臭プロファイル（赤色）を示す。レベルは固相マイクロ抽出−ＧＣ／ＭＳ分析によって定量した。
【図１２】図１２は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子をノックアウトした新しいバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの小規模発酵からのＵＣＦ試料で処理したＵＨＴミルクの異臭プロファイル（緑色及び紫色）対試料Ｃで処理したヨーグルトの異臭プロファイル（赤色）を示す。レベルは固相マイクロ抽出−ＧＣ／ＭＳ分析によって定量した。
【図１３】図１３は、配列番号２のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）パラ−ニトロベンジルエステラーゼのアミノ酸配列を示し、二重下線を引いた残基８５〜２１１はＡＥドメインを示し、小文字太字体で示した残基（例えば、ｓ−１８９、ｅ−３１０及びｈ−３９９）は触媒三残基を示し、大文字太字体で示した残基は基質結合ポケット残基を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号２のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）パラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）をコードする核酸配列である。
【００３４】
配列番号２は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）パラ−ニトロベンジルエステラーゼのアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号３は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼをコードする核酸配列である。
【００３６】
配列番号４は、配列番号３によってコードされるＢ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＤＳＭ２０２１５由来の細胞外ラクターゼのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号５は、配列番号６のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿９１７」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００３８】
配列番号６は、配列番号５の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿９１７、すなわち配列番号４の８８７アミノ酸トランケート断片である。
【００３９】
配列番号７は、配列番号８のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿９５５」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００４０】
配列番号８は、配列番号７の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿９５５、すなわち配列番号４の９６５アミノ酸トランケート断片である。
【００４１】
配列番号９は、配列番号１０のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿１０６８」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００４２】
配列番号１０は、配列番号９の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿１０６８、すなわち配列番号４の１，０３８アミノ酸トランケート断片である。
【００４３】
配列番号１１は、配列番号１２のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿１１７２」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００４４】
配列番号１２は、配列番号１１の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿１１７２、すなわち配列番号４の１，１４２アミノ酸トランケート断片である。
【００４５】
配列番号１３は、配列番号１４のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿１２４１」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００４６】
配列番号１４は、配列番号１３の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿１２４１、すなわち配列番号４の１，２１１アミノ酸トランケート断片である。
【００４７】
配列番号１５は、配列番号１６のトランケート型Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ラクターゼ（本明細書では「ＢＩＦ＿１３２６」と呼ぶ）をコードする核酸配列である。
【００４８】
配列番号１６は、配列番号１５の核酸によってコードされるタンパク質ＢＩＦ＿１３２６、すなわち配列番号４の１，２９６アミノ酸トランケート断片である。
【００４９】
配列番号１７は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）由来のラクターゼのアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１８は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のラクターゼのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１９は、オリゴヌクレオチドプライマーＩ−ＳｃｅＩ−１である。
【００５２】
配列番号２０は、オリゴヌクレオチドプライマーＩ−ＳｃｅＩ−２である。
【００５３】
配列番号２１は、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号９８１である。
【００５４】
配列番号２２は、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号９８４である。
【００５５】
配列番号２３は、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号９８５である。
【００５６】
配列番号２４は、オリゴヌクレオチドプライマー配列番号９８３である。
【００５７】
配列番号２５は、配列番号２６のラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）トランスガラクトシル化ポリペプチドをコードする核酸配列である。
【００５８】
配列番号２６は、ラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）トランスガラクトシル化ポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００５９】
詳細な説明
特定の実施形態では、本開示は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用を対象とする。例えば、特定の酵素産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ産物）においては、少量の好ましくない酵素活性が主に産生宿主細胞から生じ、酵素副活性と呼ばれる。本明細書に記載されるように、本開示は、乳製品調合物／用途で使用するβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素の生成に使用する宿主細胞における好ましくない酵素副活性を低減／排除することを対象とする。
【００６０】
より特には、特定の実施形態では、本開示は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させることを対象とし、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。
【００６１】
したがって、本開示の特定の実施形態は、好ましくない酵素副活性の非存在下でβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を産生するためにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞の遺伝子を改変することに関する。特定の実施形態では、本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、好ましくない／望ましくないパラーニトロベンジルエステラーゼ副活性の非存在下でβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を産生するように遺伝子改変される。したがって、特定の実施形態では、本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、パラニトロベンジルエステラーゼ酵素をコードする内在性バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）遺伝子を欠失、破壊、又はダウンレギュレートすることによって遺伝子改変される。本明細書に記載されるように、このような遺伝子改変バチルス宿主細胞は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素の生成に特に有用であり、ここで、このようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素は、乳製品関連最終製品において使用される場合、非常に望ましくない異臭及び臭いを引き起こす、好ましくないパラ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素副活性を特に含まない。
【００６２】
特定の他の実施形態では、パラニトロベンジルエステラーゼ酵素をコードする、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた内在性遺伝子を含む、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、リパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などから選択される少なくとも１つのさらなる好ましくない／望ましくない酵素副活性をコードする欠失、破壊又はダウンレギュレートされた遺伝子をさらに含む。
【００６３】
したがって、特定の実施形態では、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、パラ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素をコードする内在性遺伝子を欠失、破壊、又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含む）は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチド（例えば、発現コンストラクト）で形質転換される。より特には、本明細書に記載されるように、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現／産生される、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素は乳製品用途において特に有用である。
【００６４】
より具体的には、以下の実施例の項に記載されるように、そのような遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現／産生されるβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素（これらのβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素はそれらの細胞から単離及び精製される）は、検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を含まない。より特には、本明細書の実施例に記載されるように、本開示の出願人は、このようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を用いて調合された乳製品の不快な異臭／味の原因となる酵素副活性として、パラ−ニトロベンジルエステラーゼを特定した。したがって、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、パラ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含む）は、そのような汚染（すなわち、好ましくない／望ましくない）パラニトロベンジルエステラーゼ副活性を含まないβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を生成するのに特に有用である。
【００６５】
Ｉ．定義
本明細書に記載の、好ましくないパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（以下、「ｐ−ＮＢＥ」）副活性の非存在下でβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼを発現／産生する改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種の宿主細胞及びその方法を考慮して、以下の用語及び句を定義する。本明細書中に定義されていない用語には、当該技術分野において使用されるそれらの通常の意味が与えられるべきである。
【００６６】
他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。本組成物及び本方法を実施又は試験する際、本明細書に記載のものに類似した、又は同等の方法及び材料もまた使用することができるが、ここで、説明に役立つ代表的な方法及び材料を記載する。本明細書で引用した刊行物及び特許は全て、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
特許請求の範囲が、任意選択の要素を排除するように記載されていることにもさらに留意されたい。したがって、この記述は、請求項の構成要素の列挙に関連して「唯一（ｓｏｌｅｌｙ）」、「ただ〜のみ（ｏｎｌｙ）」、「〜を除いて（ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を含まない（ｎｏｔ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの排他的な用語の使用、又はその「否定的な」限定若しくは条件の使用のための先行文として機能することを意図している。
【００６８】
本開示を読めば当業者には明らかなように、本明細書に記載及び例示する個々の実施形態のそれぞれは、本明細書に記載する本組成物及び方法の範囲又は精神から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離又は組み合わせることができる別個の構成要素及び特徴を有する。記載した方法はいずれも、記載した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「トランスガラクトシラーゼ」は、特に、ガラクトースをＤ−ガラクトース若しくはＤ−グルコースの水酸基に移動させることができ、それによってガラクトオリゴ糖が生成される酵素を意味している。１つの態様では、トランスガラクトシラーゼは、所与の時間に生成されるガラクトースの量が生成されるグルコースの量より少ないラクトース上の酵素反応によって同定される。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「トランスガラクトシル化活性」は、水（Ｈ２Ｏ）以外の分子へのガラクトース部分の移動を意味する。このトランスガラクトシル化活性は、反応中の所与の時間に生成された［グルコース］−［ガラクトース］として測定するか、又は反応中の所与の時間に生成されたガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の直接的定量により測定することができる。このような活性測定は、当該技術分野で知られた方法（例えば、ＨＰＬＣ法）によって実施し得る。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「β−ガラクトシダーゼ活性」は、β−ガラクトシド分子を加水分解する（例えば、ラクトース二糖を単糖グルコース及びガラクトースに加水分解する）酵素の能力を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「トランスガラクトシル化活性／β−ガラクトシダーゼ活性」（比）を計算すると、β−ガラクトシダーゼ活性は、反応中の所与の時間に生成された［ガラクトース］として測定される。このような活性比の測定は、当該技術分野で知られた方法（例えば、ＨＰＬＣ法）によって実施し得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「トランスガラクトシル化活性を有するβ−ガラクトシダーゼ」という句は、１０５％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％などを超えるなど、１００％を超えるトランスガラクトシル化活性の比を有するβ−ガラクトシダーゼを意味する。トランスガラクトシル化活性を有するβ−ガラクトシダーゼの例は、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）に由来し得るが、これらに限定されない（Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「［グルコース］」又は「グルコース濃度」は重量％でのグルコース濃度を意味し、用語「［ガラクトース］」又は「ガラクトース濃度」は、重量％でのガラクトース濃度を意味する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ラクトースがガラクトシル化されている」という句は、例えば、ラクトース分子中のいずれかの遊離水酸基に共役結合した、又は内部トランスガラクトシル化によって生成されたように、ガラクトース分子がラクトース分子に共役結合していることを意味する。
【００７６】
本発明との関連で、「そのポリペプチドは噴霧乾燥されている」という用語は、そのポリペプチドが、溶液若しくは懸濁液中のポリペプチドを水の除去に適切な温度及び適切な期間にわたって噴霧乾燥することによって得られていることを意味する。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「ミルク」は、本開示との関連で、ウシ、ヒツジ、ヤギ、バッファロー、ラクダなどの哺乳動物から得られる乳汁分泌物として理解されるべきである。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「ミルクベース基質」は、任意の生乳物質及び／又は加工乳物質又はミルク成分由来の物質を意味する。ミルクベース基質は、当該技術分野で知られた方法によって均質化及び／又は低温殺菌することができる。
【００７９】
本明細書で使用する「均質化」は、可溶性懸濁液又はエマルジョンを得るための集中的混合を意味する。均質化は、乳脂肪がもはやミルクから分離しないほど小さなサイズに破壊できるように実施することができる。これは、例えば、ミルクを小さい開口部に高圧で通過させることにより達成できる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「低温殺菌」は、ミルクベース基質中の微生物などの生菌の存在を減少又は排除することを意味する。低温殺菌は、特定の温度及び圧力を特定の時間維持することによって達成される。特定の温度は、通常、加熱することによって達成される。温度及び持続時間は、有害細菌などの所定の細菌を殺滅若しくは不活性化するため、及び／又はミルク中の酵素を不活性化するために選択することができる。その後に急速冷却工程を続けることができる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「乳製品」は、本開示との関連で、主要成分の１つがミルクベース基質である食品であり得る。好ましくは、主要成分は、ミルクベースである。本発明との関連で、「主要成分の１つ」は、乳製品の全乾燥物質の２０％超、好ましくは３０％超又は４０％超を構成する乾燥物質を有する構成成分を意味し、一方「主要成分」は、乳製品の全乾燥物質の５０％超、好ましくは６０％超又は７０％超を構成する乾燥物質を有する構成成分を意味する。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「発酵乳製品」は、本発明との関連で、任意のタイプの発酵が製造工程の一部を形成する任意の乳製品であると理解されるべきである。発酵乳製品の例としては、ヨーグルト、バターミルク、クレーム・フラーシュ、クォーク及びフロマージュ・フレが挙げられるが、これらに限定されない。発酵乳製品のまた別の例は、チーズである。特定の実施形態では、発酵ヨーグルト乳製品は、セットタイプヨーグルト、撹拌ヨーグルト又は飲用ヨーグルトである。他の実施形態では、発酵乳製品は、アシドフィラスミルク、レーベンミルク、アイランミルク、ケフィールミルク、又はサワーミルク（Ｓａｕｅｒｍｉｌｃｈ  ｍｉｌｋ）である。このような発酵乳製品は、当該技術分野で知られた任意の方法によって製造できる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」は、供給源から単離されたポリヌクレオチドを指す。本開示の特定の態様では、ポリヌクレオチドは、アガロース電気泳動による測定で、少なくとも１％純粋であり、好ましくは少なくとも５％純粋であり、より好ましくは少なくとも１０％純粋であり、より好ましくは少なくとも２０％純粋であり、より好ましくは少なくとも４０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％純粋であり、より一層好ましくは少なくとも８０％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリヌクレオチド」は、他の外来の又は好ましくないヌクレオチドを含まず、且つ遺伝子操作されたタンパク質産生系内での使用に適した形態のポリヌクレオチド調製物を指す。したがって、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、それが天然に又は組換え的に会合している他のポリヌクレオチド物質を、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有する。しかし、実質的に純粋なポリヌクレオチドは、プロモーター及びターミネーターなどの、天然に存在する５’及び３’非翻訳領域を含み得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、重量で、少なくとも９０％純粋であり、好ましくは少なくとも９２％純粋であり、より好ましくは少なくとも９４％純粋であり、より好ましくは少なくとも９５％純粋であり、より好ましくは少なくとも９６％純粋であり、より好ましくは少なくとも９７％純粋であり、より一層好ましくは少なくとも９８％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９９％純粋であり、さらに好ましくは少なくとも９９．５％純粋であることが好ましい。本発明のポリヌクレオチドは実質的に純粋な形態である（すなわち、ポリヌクレオチド調製物は、それが天然に又は組換え的に会合している他のポリヌクレオチド物質を実質的に含まない）ことが好ましい。ポリヌクレオチドは、ゲノム起源、ｃＤＮＡ起源、ＲＮＡ起源、半合成起源、合成起源、又はそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「単離ぺプチド」は、供給源から単離されたポリぺプチドを指す。好ましい態様では、ポリぺプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で、少なくとも１％純粋であり、好ましくは少なくとも５％純粋であり、より好ましくは少なくとも１０％純粋であり、より好ましくは少なくとも２０％純粋であり、より好ましくは少なくとも４０％純粋であり、より好ましくは少なくとも６０％純粋であり、より一層好ましくは少なくとも８０％純粋であり、最も好ましくは少なくとも９０％純粋である。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、それが天然に又は組換え的に会合している他のポリぺプチド物質を、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有するポリペプチド調製物を本明細書中では意味する。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の重量に比して少なくとも９２％純粋である、好ましくは少なくとも９４％純粋である、より好ましくは少なくとも９５％純粋である、より好ましくは少なくとも９６％純粋である、より好ましくは少なくとも９７％純粋である、より好ましくは少なくとも９８％純粋である、より一層好ましくは少なくとも９９％純粋である、最も好ましくは９９．５％純粋である、さらに好ましくは１００％純粋であることが好ましい。本発明のポリペプチドは実質的に純粋な形態である（すなわち、ポリペプチド調製物は、それが天然に又は組換え的に会合している他のポリペプチド物質を実質的に含まない）ことが好ましい。これは、例えば、よく知られた組換え法又は伝統的な精製方法によってポリペプチドを調製することによって達成できる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なβ−ガラクトシダーゼポリペプチド」及び「実質的に純粋なラクターゼポリペプチド」は、それが天然に又は組換え的に会合している他のポリぺプチド物質を、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、より好ましくは多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有するポリペプチド調製物を指す。したがって、実質的に純粋なポリペプチドは、調製物中に存在する全ポリペプチド物質の重量に比して少なくとも９２％純粋である、好ましくは少なくとも９４％純粋である、より好ましくは少なくとも９５％純粋である、より好ましくは少なくとも９６％純粋である、より好ましくは少なくとも９７％純粋である、より好ましくは少なくとも９８％純粋である、より一層好ましくは少なくとも９９％純粋である、最も好ましくは９９．５％純粋である、さらに好ましくは１００％純粋であることが好ましい。
【００８８】
より特には、本開示に関して、「実質的に純粋なβ−ガラクトシダーゼポリペプチド」及び「実質的に純粋なラクターゼポリペプチド」は、検出可能な「ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性」を本質的に含まないこのようなポリペプチドを指す。より具体的には、本明細書に記載されるように、検出可能な「ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性」を完全に含まない、実質的に純粋なβ−ガラクトシダーゼポリペプチド組成物及び／又は実質的に純粋なラクターゼポリペプチド組成物は、このようなβ−ガラクトシダーゼポリペプチド及び／又はラクターゼポリペプチドを、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子（例えば、配列番号１）の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞）中で発現／産生させることによって得ることができる。特定の他の実施形態では、実質的に純粋な「β−ガラクトシダーゼポリペプチド」又は「実質的に純粋なラクターゼポリペプチド」は、検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を実質的に含まず、且つセルラーゼ活性、マンナナーゼ活性、ペクチナーゼ活性、アミラーゼ活性、プロテアーゼ活性などからなる群から選択される少なくとも１つのさらなる好ましくない副活性を実質的に含まない。
【００８９】
したがって、本明細書で使用される場合、「セルラーゼを実質的に含まない」という用語は、セルラーゼを、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有する調製物を意味する。したがって、本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、用語「単離ポリペプチド」及び「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「マンナナーゼを実質的に含まない」という用語は、マンナナーゼを、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有する調製物を本明細書では意味する。したがって、本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、用語「単離ポリペプチド」及び「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「ペクチナーゼを実質的に含まない」という用語は、ペクチナーゼを、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有する調製物を本明細書では意味する。したがって、本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、用語「単離ポリペプチド」及び「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【００９２】
本明細書で使用される場合、「アミラーゼを実質的に含まない」という用語は、アミラーゼを、多くとも１０重量％、好ましくは多くとも８重量％、より好ましくは多くとも６重量％、より好ましくは多くとも５重量％、より好ましくは多くとも４重量％、多くとも３重量％、より一層好ましくは多くとも２重量％、最も好ましくは多くとも１重量％、さらに好ましくは多くとも０．５重量％含有する調製物を本明細書では意味する。したがって、本明細書では、「実質的に含まない」という用語は、用語「単離ポリペプチド」及び「単離形態のポリペプチド」と同義であると見なすことができる。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「安定剤」は、ポリペプチドを安定化させる任意の安定化剤、例えば、グリセロール若しくはプロピレングリコールなどのポリオール、糖若しくは糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体（例えば、芳香族ホウ酸エステル）を意味する。１つの態様では、安定剤はポリオールではないか、又はポリオールは０．１重量％以下の濃度で存在する。
【００９４】
本明細書で定義する場合、「内在性遺伝子」は、生物のゲノム中の天然の位置に存在する遺伝子を指す。
【００９５】
本明細書で定義する場合、「異種の」遺伝子、「非内在性の」遺伝子、又は「外来の」遺伝子は、通常は宿主生物に存在せず、遺伝子導入によって宿主生物に導入される遺伝子（又はＯＲＦ）を指す。本明細書で使用される場合、「異種の」遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子（若しくはＯＲＦ）及び／又は天然若しくは非天然生物に挿入されたキメラ遺伝子を含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「外来ポリヌクレオチド」又は「異種ポリヌクレオチド」（及びそのバリエーション）は、（Ａ）宿主細胞に対して天然ではないポリヌクレオチド、（Ｂ）宿主細胞に対して天然であるが、宿主細胞から単離されたポリヌクレオチドと天然では会合しない遺伝子エレメント（例えば、異種プロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）の使用によって改変されたポリヌクレオチド、又は（Ｃ）宿主細胞において通常は生じない様式で機能するように操作された天然エレメントの使用と定義される。
【００９７】
本明細書で定義する場合、「異種の」核酸コンストラクト、又は「異種の」核酸配列は、それが発現する細胞から生じたものではない配列部分を有する。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「形質転換細胞」は、組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換された細菌細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞）を含む。形質転換は一般に、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、ポリヌクレオチド）の細胞への導入によって生じる。導入されたヌクレオチド配列はまた、異種ヌクレオチド配列（すなわち、細胞に対し内在性でない核酸配列）であり得る。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「核酸コンストラクト」は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、又はそうでなければ天然には存在することがない方法で核酸のセグメントを含むように改変されるか、又は合成された、一本鎖又は二本鎖の核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド分子）を指す。核酸コンストラクトという用語は、核酸コンストラクトがコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「制御配列」は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために必要であるか又は有利であるすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して天然であっても外来であってもよく、又は互いに天然であっても外来であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも、制御配列は、プロモーター、並びに転写及び翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコード領域との制御配列の連結を容易にする特定の制限部位を導入するためにリンカーを有し得る。
【０１０１】
本明細書で定義する場合、「異種制御配列」は、天然では、目的遺伝子の発現を調節（制御）する働きをしない遺伝子発現制御配列（例えば、プロモータ又はエンハンサー）を指す。一般に、異種核酸配列は、細胞、又はそれらの配列が存在するゲノムの一部に対して内在性（天然）ではなく、感染、形質移入、形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどによって細胞に付加されている。「異種」核酸コンストラクトは、天然宿主細胞内で見出される制御配列／ＤＮＡコード配列の組み合わせと同一、又は異なる制御配列／ＤＮＡコード（ＯＲＦ）配列の組み合わせを含有し得る。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そのポリメラーゼを、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの正しい下流転写開始部位に導くＤＮＡ配列と定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの組み立てを効果的に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始との間）、エンハンサーのようなシス作用性転写制御エレメント、及び／又は転写因子と相互作用し得る他のヌクレオチド配列を含むと理解される。プロモーターは、野生型、多様体、ハイブリッド、又はコンセンサスプロモーターであり得る。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター領域」は、１つ以上の（いくつかの）プロモーター配列（例えば、デュアルプロモーター、トリプルプロモーターなど）を含むヌクレオチド配列と定義される。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「作動可能に連結された」は、制御配列（例えば、プロモーター配列）がポリペプチドのコード配列の発現を指示するように、ポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置される構成を意味する。コード配列：本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドン、又はＧＴＧ及びＴＴＧなどの代替開始コドン（例えば、ＧＴＧ及びＴＴＧ）で始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡなどの終止コドンで終わる。コード配列は、ＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、合成配列、又は組換えヌクレオチド配列であり得る。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「多様体（ｖａｒｉａｎｔ）」又は「多様体（ｖａｒｉａｎｔｓ）」は、ポリペプチド又は核酸を指し得る。用語「多様体」は、用語「変異体」と互換的に使用され得る。多様体には、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の１つ以上の場所での挿入、置換、バリエーション、トランケーション、欠失及び／又は逆位が含まれる。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「発現」は、目的ポリペプチド（ＰＯＩ）の産生に関与する任意の工程を含み、その例としては、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾及び分泌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」及び「発現コンストラクト」は互換的に使用され、目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、且つその発現を提供するさらなるヌクレオチドに作動可能に連結されている線状又は環状のＤＮＡ分子を指す。
【０１０８】
本発明との関連で、「主要成分の１つ」は、乳製品の全乾燥物質の２０％超、好ましくは３０％超又は４０％超を構成する乾燥物質を有する成分を意味し、一方「主要成分」は、乳製品の全乾燥物質の５０％超、好ましくは６０％超又は７０％超を構成する乾燥物質を有する成分を意味する。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」は、ポリペプチドを発現するために、ポリペプチド産生用の組換え発現ベクターが導入され得る細胞又は細胞株を指す。例えば、特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素をコードする発現コンストラクトを含む。宿主細胞としては単一宿主細胞の子孫が挙げられ、この子孫は、天然の、偶発的な又は意図的な変異に起因して、元の親細胞と（形態学的に又は全ゲノムＤＮＡ補体で）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞としては、発現ベクターによりインビボで形質移入された又は形質転換された細胞が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「改変宿主細胞」、「変更宿主細胞」及び「遺伝子改変宿主細胞」という用語は、互換的に使用され、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートする改変を少なくとも含む組換え宿主細胞を指す。例えば、本開示の「遺伝子改変」宿主細胞はさらに、親宿主細胞に由来する「遺伝子改変（宿主）細胞」（ここで、改変（娘）細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートする改変を少なくとも含む）と定義することができる。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「非改変細胞」、「非変更細胞」、「非改変宿主細胞」及び「非変更宿主細胞」は、互換的に使用され、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼポリペプチドをコードする遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートする改変を含まない「非改変」（親）宿主細胞を指す。特定の実施形態では、「非改変」（親）宿主細胞は、特に、本開示の「改変」（娘）宿主細胞と比較する場合、又はそれと相対させる場合、「対照細胞」と呼び得る。
【０１１２】
本明細書では、「非改変」（親）細胞（すなわち、対照細胞）におけるＰＯＩの発現及び／又は産生が、「改変」（娘）細胞における同じＰＯＩの発現及び／又は産生と比較される場合、「改変」細胞及び「非改変」細胞は、実質的に同じ条件（すなわち、培地、温度、ｐＨなどの同じ条件）下で増殖／培養／発酵されると理解される。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、用語「改変」及び「遺伝子改変」は互換的に使用され、以下を含む：
（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節／制御エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的変異誘発、及び／又は（ｇ）本明細書に開示される任意の１つ以上の遺伝子のランダム変異誘発。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活性化」及び「遺伝子不活性化」は、互換的に使用され、宿主細胞が機能的遺伝子産物（例えば、タンパク質）を産生することを実質的に妨げる任意の遺伝子改変を広く指す。遺伝子破壊の例示的な方法には、ポリペプチドコード配列、プロモーター、エンハンサー、又は別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全又は部分的欠失、或いはそれらの変異誘発（ここで、変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活性化し、機能的遺伝子産物（すなわち、タンパク質）の産生を実質的に減少又は阻害する置換、挿入、欠失、逆位、並びにそれらの任意の組み合わせ及びバリエーションを包含する）が含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、遺伝子発現の「ダウンレギュレーション」という用語は、遺伝子のより低い（ダウンレギュレートされた）発現をもたらす任意の方法を含む。例えば、遺伝子のダウンレギュレーションは、ＲＮＡ誘導遺伝子サイレンシング、プロモーターなどの制御エレメントの遺伝子改変、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）／シャイン・ダルガノ配列、非翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化などによって達成することができる。したがって、特定の実施形態では、好ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ）活性をコードする遺伝子を含む本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（宿主）細胞は、ｐ−ＮＢＥ遺伝子の発現をダウンレギュレートするように遺伝子改変される。
【０１１６】
用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種の核酸若しくはタンパク質の導入又は天然の核酸若しくはタンパク質の改変により改変されていること、或いは細胞がそのように改変された細胞に由来することを示す。そのため、例えば、組換え細胞は、天然（非組換え）形態の細胞内には見出されない遺伝子を発現する、又は別の状況では異常に発現される、低く発現される、若しくは全く発現されない天然遺伝子を発現させる。
【０１１７】
用語「培養する」は、液体又は固体の培養培地中で、増殖に適した条件下にて微生物細胞の集団を増殖させることを指す。
【０１１８】
用語「培養培地」は、このプロセスで使用する培地を指す。
【０１１９】
核酸配列を細胞に挿入するという文脈での用語「導入される」は、「形質移入」、「形質転換」又は「形質導入」を含み、真核細胞又は原核細胞への核酸配列の組み込みを指し、これらの細胞では、核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアＤＮＡ）中に組み込まれ得る、自律レプリコンに変換され得る、又は一時的に発現され得る。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換された」及び「安定に形質転換された」は、そのゲノムに組み込まれた導入（外因性）核酸配列を有する細胞、又は複数の世代を通して維持されるエピソームプラスミドを指す。
【０１２１】
したがって、用語「遺伝子」、あるタンパク質のコード配列の全て又は一部を含む、ある特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを指し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する、プロモーター配列などの調節（非転写）ＤＮＡ配列を含み得る。遺伝子の転写領域は、イントロン、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）及び３’−ＵＴＲを含む非翻訳領域（ＵＴＲ）、並びにコード配列を含み得る。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、用語「コード配列」は、その（コードする）タンパク質産物のアミノ酸配列を直接特定するヌクレオチド配列を指す。コード配列の境界は、一般にオープンリーディングフレーム（以下「ＯＲＦ」）によって決定され、それは、通常、ＡＴＧ開始コドンで開始する。コード配列には、通常、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び組換えヌクレオチド配列が含まれる。
【０１２３】
本明細書で定義する場合、「オープンリーディングフレーム」（以下「ＯＲＦ」）という用語は、（ｉ）開始コドン、（ｉｉ）アミノ酸を示す一連の２以上のコドン、及び（ｉｉｉ）終止コドンからなる連続するリーディングフレームを含む核酸又は核酸配列（天然由来であるか、天然由来でないか、また合成であるかにかかわらず）を意味し、ＯＲＦは、５’から３’の方向に読まれる（又は、翻訳される）。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「ターゲティングベクター」は、形質転換する宿主細胞の染色体の領域に相同のポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組み換えを行わせることができるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組み換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、他の非相同的配列を含み、これは、例えば末端に付加される（すなわち、スタッファー配列又はフランキング配列）。末端は、例えば、ベクターへの挿入など、ターゲティングベクターが閉環するように閉じることができる。適切なベクターの選択及び／又は構成は、十分に当業者の知識の範囲内である。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「相同遺伝子」は、異なるものの、通常、関連する種の１対の遺伝子を指し、それらは、互いに対応し、且つ同一であるか、又は非常に類似している。この用語は、種形成（すなわち、新しい種の発生）によって分離された遺伝子（例えば、オルソログ遺伝子）、及び遺伝子の重複によって分離された遺伝子（例えば、パラログ遺伝子）を包含する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「オルソログ」及び「オルソログ遺伝子」は、種形成によって共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から生じた、異なる種の遺伝子を指す。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。オルソログの同定は、新しく配列が決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性の高い予測に使用される。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「パラログ」及び「パラログ遺伝子」は、ゲノム内での複製に関係する遺伝子を指す。オルソログは進化の過程を通して同じ機能を保持し、一方、パラログはいくつかの機能は多くは元の機能に関連するものの新しい機能を生じる。パラログ遺伝子の例としては、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ及びトロンビン（これらはいずれも、セリンプロテイナーゼであり、同じ種において同時に発生する）をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「相同性」は、配列の類似性又は同一性を指し、好ましくは同一性である。この相同性は、当該技術分野で知られた標準的な手法を用いて決定し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡなどのプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４を参照されたい）。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「アナログ配列」は、遺伝子の機能（例えば、パラ−ニトロベンジルエステラーゼ）が、本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に由来するパラ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子と実質的に同じであるものである。さらに、アナログ遺伝子は、配列番号１のパラ−ニトロベンジルエステラーゼ配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を含む。アナログ配列は、既知のシーケンスアライメント法で決定される。一般に使用されるアライメント法はＢＬＡＳＴであるが、上記及び下記に示すように、他の方法も配列のアライニングに使用される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、当該技術分野で知られているように、核酸鎖がその相補鎖と塩基対を形成するによって結合するプロセスを指す。核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は核酸結合複合体又はプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍを５℃下回る）程度で、「高ストリンジェンシー」はＴｍを約５〜１０℃下回って、「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍを約１０〜２０℃下回って；そして「低ストリンジェンシー」はＴｍを約２０〜２５℃下回って、起こる。機能上、最大ストリンジェンシー条件はハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性、又はほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために用いることができ、一方、中間又は低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションはポリヌクレオチド配列ホモログを同定又は検出するために用いることができる。中〜高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は当該技術分野でよく知られている。高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００ｐｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でハイブリダイゼーションし、続いて２×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、室温（ＲＴ）で２回洗浄し、さらに、０．１×ＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中、４２℃で２回洗浄することが挙げられる。中ストリンジェント条件の例としては、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン及び２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で終夜インキュベートし、続いて１×ＳＳＣ中、約３７〜５０℃でフィルタを洗浄することが挙げられる。プローブ長などの因子を適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節の仕方は、当業者であれば知っている。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「フランキング配列」は、対象配列の上流又は下流にある配列を指す（例えば、遺伝子Ａ−Ｂ−Ｃでは、遺伝子ＢがＡ及びＣ遺伝子配列にフランキングされている）。特定の実施形態では、入来配列は両側で相同ボックスにフランキングされている。別の実施形態では、入来配列及び相同ボックスは両側にスタッファー配列がフランキングしている単位を含む。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、好ましい実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。各相同ボックスの配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の配列に相同である。これらの配列は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体に新しいコンストラクトが組み込まれ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）染色体の一部が入来配列により置換されることを目的とする。他の実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端に、不活化染色体断片の一部を含むポリヌクレオチド配列がフランキングしている。いくつかの実施形態では、フランキング配列は一方の側（３’又は５’）にのみ存在するが、他の実施形態では、フランキングされている配列の両側に存在する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、用語「スタッファー配列」は、相同ボックス（代表的には、ベクター配列）にフランキングしている任意のエクストラＤＮＡを指す。しかし、この用語は、任意の非相同ＤＮＡ配列を包含する。いかなる理論によっても限定されるものではないが、スタッファー配列は細胞がＤＮＡ取り込みを開始するために重要ではない標的を提供する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、多くは、細胞の中央代謝には通常関与しない遺伝子を持ち、普通は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態の、染色体外エレメントを指す。このようなエレメントは、任意のソースに由来する、線状又は環状で、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡからなる自己複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であり得、それらにおいては、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を３’非翻訳配列と共に細胞に導入することができる固有の構成に、多くのヌクレオチド配列が結合又は再結合している。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」という用語は、宿主細胞で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指し、そのベクターを含む宿主の選択を容易にする。このような選択可能マーカーの例としては抗微生物剤が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、「選択可能マーカー」という用語は、宿主細胞が目的の入来ＤＮＡを取り込んだか、又は何らかの他の反応が起こったことを示す遺伝子を指す。通常、選択可能マーカーは、形質転換中に外来性の配列を受け取っていない細胞から外来性ＤＮＡを含む細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」という用語は、宿主細胞中で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が発現された遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与する、ヌクレオチド配列をいう。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属」には、当業者に知られる「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」属内の全ての菌株が含まれ、例えば、以下に限定はされないが、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．クラウシイ（Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ）、Ｂ．ハロドゥランス（Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属が分類学的再編成を受け続けていることは認識されている。したがって、この属は、再分類された種、例えば、限定はしないが、現在、「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」と称されている「Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）」などの生物を含むものとする。
【０１３７】
本発明の実行は、別途指示しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学及び生化学の従来の技術を用いることができ、これらは当分野の技術範囲内である。このような技術は文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；ＰＧＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；及びＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，１９９０）において十分に説明されている。
【０１３８】
ＩＩ．β−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチド
酵素産物（例えば、β−ガラクトシダーゼ産物）においては、少量の好ましくない酵素活性が主に産生宿主細胞から生じ、酵素副活性と呼ばれる。本明細書に記載されるように、本開示は、乳製品調合物／用途で使用するβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素の生成に使用する宿主細胞における好ましくない酵素副活性を低減することを対象とする。したがって、好ましくは、乳製品用途での酵素活性をこの特定の用途に適したｐＨ及び温度で測定すべきである。例えば、ミルクでは、ｐＨは６．４から６．８まで変化し、ヨーグルトｐＨは約４であり、乳児用調製粉乳ｐＨは５．９〜７．３の範囲であり、モツァレラはｐＨ５．２〜５．５を有し、マヨネーズはｐＨ４を有する。最適には、望ましくない活性のレベルを、意図した用途それぞれでの適用試験によって決定することができる。
【０１３９】
したがって、本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素の使用を対象とする。より具体的には、特定の実施形態は、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させることを対象とし、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。
【０１４０】
特定の実施形態では、このようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素は遺伝子改変されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において産生され、そしてそこから精製され、このような精製された酵素は好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含まない。したがって、特定の実施形態では、検出可能な「ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性」を完全に含まない、実質的に純粋なβ−ガラクトシダーゼポリペプチド組成物及び／又は実質的に純粋なラクターゼポリペプチド組成物は、このようなβ−ガラクトシダーゼポリペプチド及び／又はラクターゼポリペプチドを、本開示の遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で発現／産生させることによって得ることができ、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子（例えば、配列番号１）の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む。例えば、以下の実施例の項で示されるように、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（娘）細胞（すなわち、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ（例えば、配列番号２）をコードする遺伝子（例えば、配列番号１）を含む）は、それから産生されるβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ産物から、好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を完全に消失させた。
【０１４１】
さらに、以下の実施例の項で記載されるように、好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性をコードする遺伝子の排除（例えば、欠失）（すなわち、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞における）は、このようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を含む／で調合される乳製品において検出される悪臭を完全に消失させた。
【０１４２】
したがって、本開示の特定の実施形態は、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子を含む改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼの発現／産生を対象とする。例えば、特定の実施形態では、本開示の改変されたバチルス宿主細胞（すなわち、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子を含む）は、β−ガラクトシダーゼ酵素又はラクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドで形質転換され、この宿主細胞は、コードされたβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼを発現／産生するような条件下で増殖／培養される。したがって、本明細書に記載の改変バチルス宿主細胞は、任意のβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼ酵素の発現／産生に好適であり、ここで、精製されたβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼ酵素組成物及びその生成物は、検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を含まない。
【０１４３】
例えば、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレット、国際公開第２０１６／０７１５００号パンフレット、国際公開第２０１５／０８６７４６号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１２０９９３号パンフレット（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、トランスガラクトシル化活性を有する様々なβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼ酵素（及びトランスガラクトシル化活性を有するその多様体）を開示する。したがって、本明細書に記載されるように、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレット、国際公開第２０１６／０７１５００号パンフレット、国際公開第２０１５／０８６７４６号パンフレット、及び国際公開第２０１１／１２０９９３に開示される酵素（すなわち、トランスガラクトシル化活性を有する）は、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞における発現／産生に特に好適である。別の言い方をすれば、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼ酵素（トランスガラクトシル化活性を有する）の発現／産生は、β−ガラクトシダーゼ又はラクターゼ酵素（トランスガラクトシル化活性を有する）が改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現／産生され得、そして検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含まない限り、特定のβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼアミノ酸配列（又は、それをコードする特定の遺伝子／ポリヌクレオチド配列）に限定されることを意図しない。
【０１４４】
特定の実施形態では、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現されるβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を含む。他の実施形態では、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現されるβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼポリペプチドは、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８及び配列番号２のいずれか１つに対して約８０％の配列同一性を含むアミノ酸配列を含む。特定の他の実施形態では、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において発現されるβ−ガラクトシダーゼ又はラクターゼポリペプチドは、配列番号４の部分的又はトランケートされたアミノ酸配列を含む。
【０１４５】
したがって、特定の実施形態では、本開示は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度以上の濃度で、少なくとも０．５、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１若しくは少なくとも１２のトランスガラクトシル化活性：β−ガラクトシダーゼ活性の比を有するポリペプチドを対象とする。
【０１４６】
特定の他の実施形態では、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドは、以下からなる群から選択される：
（ａ）配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、多くとも９８０個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号８と少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、多くとも９７５個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、（ｃ）配列番号１０と少なくとも９６．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、多くとも１．３００個のアミノ酸残基からなるポリペプチド、（ｄ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは２６のポリペプチドをコードする配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは２５に含まれる核酸配列、又はその相補鎖と少なくとも低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、（ｅ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは２６のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、又は成熟ポリペプチドをコードする配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は２５に含まれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、並びに（ｆ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６又は２６の１つ以上のアミノ酸残基の欠失、挿入及び／又は保存的置換を含むポリペプチド。
【０１４７】
特定の実施形態では、本開示のポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２６の成熟アミノ酸配列に対して少なくとも６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本開示は、配列番号６の成熟アミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１４９】
別の実施形態では、本開示は、配列番号８の成熟アミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５０】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１０の成熟アミノ酸配列に対して９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５１】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１２の成熟アミノ酸配列に対して９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５２】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１４の成熟アミノ酸配列に対して９６．５％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５３】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５４】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１７のアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５５】
別の実施形態では、本開示は、配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５６】
別の実施形態では、本開示は、配列番号２６のアミノ酸配列に対して９０％の配列同一性を有するポリペプチドを対象とする。
【０１５７】
別の実施形態では、本開示は、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）由来のトランスガラクトシル化ポリペプチドを対象とする。別の実施形態では、本開示は、ラクトバチルス・デルブレッキィ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）由来のトランスガラクトシル化ポリペプチドを対象とする。
【０１５８】
したがって、本明細書に開示のポリペプチドは、β（１−＞４）コンフォメーションを有する炭水化物結合に対して活性を有する。この活性は効果的に、これらの酵素をβ−ガラクトシダーゼのＩＵＭＢＭＢ  ＥＣ３．２．１．２３クラスに分類する。この活性は、例えば、ｐ−ニトロフェノール−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＰＮＰＧ）、オルト−ニトロフェノール−ｐ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、又は発色性アグリコンを有するβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＸＧａｌ）などの合成基質を利用することによって決定することができる。
【０１５９】
特定の酵素がβ−ガラクトシダーゼのＥＣ３．２．１．２３クラスに属するかどうかを決定する代替法としては、酵素をラクトースなどの基質とともにインキュベートし、酵素決定法、ＨＰＬＣ、ＴＬＣ又は当業者には知られた他の方法によってグルコースの遊離を測定することである。
【０１６０】
したがって、特定の実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドは、１５分、３０分又は１８０分の反応後の３７℃及び５重量／重量％のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合の、トランスガラクトシル化活性：ガラクトシダーゼ活性の比が、少なくとも１、少なくとも２．５、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１又は少なくとも１２である。
【０１６１】
他の実施形態では、本開示のポリペプチドは、１８０分等の１５分、３０分又は１８０分の反応後の３７℃及び５重量／重量％のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合に、初期のラクトースの２０％超、３０％超、４０％超、最大で５０％がトランスガラクトシル化されるようなトランスガラクトシル化活性を有する。
【０１６２】
さらなる態様では、ポリペプチドは、１８０分等の１５分、３０分又は１８０分の反応後の３７℃及び５重量／重量％のラクトースでのミルクベースのアッセイにおいて１００ｐｐｍの濃度で測定した場合に、ラクトースの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満が加水分解されているようなβ−ガラクトシダーゼ活性を有する。別の態様では、β−ガラクトシダーゼ活性及び／又はトランスガラクトシル化活性は、国際公開第２００３／１８６２８６号パンフレットの方法４に特定されるように、２．１３ＬＡＵに対応する１００ｐｐｍの濃度で測定される。
【０１６３】
特定の態様では、本明細書で使用されるポリペプチドは、４〜９、例えば５〜８、例えば５．５〜７．５、例えば６．５〜７．５などのｐＨ範囲にわたって有用なトランスガラクトシル化活性を有する。
【０１６４】
他の実施形態では、相同配列は、対象配列に対して少なくとも６６％、７０％、７５％、７８％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％も同一性を有し得るアミノ酸配列を含む。通常、相同体は、対象アミノ酸配列と同一の活性部位などを含むであろう。相同性は類似性（すなわち、類似の化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるが、本開示との関連では、配列同一性の観点から相同性を表現することが好ましい。
【０１６５】
したがって、本開示はまた、本明細書に定義したポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列、特に、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２６のアミノ酸配列の多様体、相同体及び誘導体の使用を包含する。
【０１６６】
好ましい実施形態では、本開示のトランスガラクトシル化ポリペプチドは、本開示の改変宿主細胞において発現／産生され、それから実質的に単離され、精製される。別の好ましい実施形態では、本開示の改変宿主細胞において発現／産生され、それから精製されるそのようなトランスガラクトシル化ポリペプチドは、検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を含まない（すなわち、精製／単離されたトランスガラクトシル化ポリペプチドは好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含まない）。
【０１６７】
本開示の改変宿主細胞における特定の野生型又は多様体トランスガラクトシル化ポリペプチド（例えば、β−ガラクトシダーゼ）の発現を評価するために、発現したタンパク質、対応するｍＲＮＡ、又はβ−ガラクトシダーゼ活性を測定するアッセイが容易に実施される。例えば、好適なアッセイとしては、適切に標識されたハイブリダイジングプローブを使用する、ノーザンブロッティング及びサザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）、並びにインサイチューでのハイブリダイゼーションが挙げられる。好適なアッセイとして、試料中の活性を測定することも挙げられる。ポリペプチド活性の好適なアッセイとしては、ＯＮＰＧベースのアッセイ、又は反応混合物中のグルコース濃度の決定が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
したがって、本開示の改変宿主細胞において発現／産生させる本明細書に記載のポリペプチドは、トランスガラクトシル化活性を含む。特定の実施形態では、トランスガラクトシル化活性／β−ガラクトシダーゼ活性の比は、３重量／重量％の初期ラクトース濃度を超える濃度などの３０分間の反応後には、少なくとも０．５、例えば少なくとも１、例えば少なくとも１．５又は例えば少なくとも２である。
【０１６９】
したがって、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチド（すなわち、トランスガラクトシル化活性を含む）及びその多様体は、微生物源、特に糸状菌、酵母、又は細菌に由来し得る。したがって、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチド（トランスガラクトシル化活性を含む）は、アガリクス（Ａｇａｒｉｃｕｓ）（例えば、Ａ．ビスポラス（Ａ．ｂｉｓｐｏｒｕｓ））、アスコバギノスポラ（Ａｓｃｏｖａｇｉｎｏｓｐｏｒａ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）（例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、Ａ．アワモン（Ａ．ａｗａｍｏｎ）、Ａ．フォエティダス（Ａ．ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、Ａ．ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ））、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）、ケトトマスティア（Ｃｈａｅｔｏｔｏｍａｓｔｉａ）、ディクチオステリウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ）（例えば、Ｄ．ディスコイデウム（Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ））；クルベロミセス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｋ．フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））ムコール（Ｍｕｃｏｒ）（例えば、Ｍ．ジャバニクス（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃｕｓ）、Ｍ．ムセド（Ｍ．ｍｕｃｅｄｏ）、Ｍ．スブチリシムス（Ｍ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｉｍｕｓ）ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）（例えば、Ｎ．クラッサ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ））、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）（例えば、Ｒ．アルヒザス（Ｒ．ａｒｒｈｉｚｕｓ）、Ｒ．ジャポニクス（Ｒ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ｒ．ストロニファー（Ｒ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ））、スクレロティニ（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉ）（Ｓ．リベルティアナ（Ｓ．ｌｉｂｅｒｔｉａｎａ））、トルラ（Ｔｏｒｕｌａ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）（例えば、Ｔ．ルブラム（Ｔ．ｒｕｂｒｕｍ））フェトゼリニア（Ｗｈｅｔｚｅｌｉｎｉａ）（例えば、Ｗ．スクレロティロウム（Ｗ．ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ））、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（例えば、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．メガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、Ｂ．ノバリス（Ｂ．ｎｏｖａｌｉｓ）、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．プミルス（Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ））ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）（例えば、Ｂ．ロングム（Ｂ．Ｉｏｎｇｕｍ）、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．アニマーリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ））、クリセオバクテヌム（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｎｕｍ）、サイトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｃ．フレウンディイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ））クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）（例えば、Ｃ．パーフリンゲンス（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））ディプロディア（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）（例えば、Ｄ．ゴシピナ（Ｄ��ｇｏｓｓｙｐｉｎａ））、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）（例えば、Ｅ．アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、Ｅ．クロアカエ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ））、エドワージエラ（Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａ）（例えば、Ｅ．タルダ（Ｅ．ｔａｒｄａ））、エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）（例えば、Ｅ．ヘルビコラ（Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ））、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）（例えば、Ｅ，コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）（例えば、Ｋ．ニューモニアエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ））、ミノコッカム（Ｍｉｎｏｃｏｃｃｕｍ）、ミロセシウム（Ｍｙｒｏｔｈｅｓｉｕｍ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）（例えば、Ｐ．ブルガリス（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ））、プロビデンシア（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）（例えば、Ｐ．スチュアルティイ（Ｐ．ｓｔｕａｒｔｉｉ））ピクノポラス（Ｐｙｃｎｏｐｏｒｕｓ）（例えば、Ｐ．シンナバンヌス（Ｐ．ｃｉｎｎａｂａｎｎｕｓ）、Ｐ．サングイネウス（Ｐ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ））ルミノコッカス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｒ．トルケス（Ｒ．ｔｏｒｑｕｅｓ））、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）（例えば、Ｓ．リケファシエンス（Ｓ．ｌｉｑｕｅｆａｓｃｉｅｎｓ）、Ｓ．マルセッセンス（Ｓ．ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ））シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）（例えば、Ｓ．フレクスネリ（Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ））、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）（例えば、Ｓ．アンチバイオティカス（Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）、Ｓ．カスタネオグロビスポルス（Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ）、Ｓ．ヴィオルセオルバ（Ｓ．ｖｉｏｌｅｃｅｏｒｕｂｅｒ））トラメテス（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）（例えば、Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）、Ｔ．ビリデ（Ｔ．ｖｉｒｉｄｅ））、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）（例えば、Ｙ．エンテリコリティカ（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ））などの菌株に由来し得る。
【０１７０】
β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチド及びその多様体は、それらの核酸配列及び／又は一次アミノ酸配列によって、三次元構造モデリングによって、且つ／又は比活性によって特徴付けることができる。本明細書で定義するポリペプチド又はポリペプチド多様体の追加の特徴には、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性及び熱安定性が含まれる。発現及び酵素活性のレベルは、当業者に知られた標準的アッセイを使用して評価することができる。
【０１７１】
したがって、特定の実施形態では、宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入として、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクティルによる高速衝突、並びにプロトプラスト融合などの技術が挙げられる。一般的な形質転換技術は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。同様に、形質転換体の選択には、当該技術分野において知られた方法を使用することができる。
【０１７２】
特定の他の実施形態では、当該技術当分野で知られた方法に従ってトランスガラクトシル化ポリペプチド組成物を調製することができ、この組成物は液体組成物の形態であっても乾燥組成物の形態であってもよい。例えば、ポリペプチド組成物は顆粒又は微小顆粒の形態であってもよく、組成物中のポリペプチドは当該技術分野でよく知られた方法に従って安定化することができる。
【０１７３】
ＩＩＩ．Ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性が欠損した遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞
上述したように、本開示の特定の実施形態は、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生する遺伝子改変宿主細胞、並びに１つ以上の乳製品関連最終製品においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物を生成するためのそのような酵素又はその細胞の使用を対象とする。より具体的には、特定の実施形態は、このようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞において発現／産生させることを対象とし、ここで、このような改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞で産生及び／又は精製された酵素は好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含まない。例えば、以下の実施例の項に示すように、本開示の出願人らは、β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を用いて調合された乳製品における不快な異臭及び味がｐ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素の好ましくない／望ましくない酵素副作用によって引き起こされることを実験により確認した。
【０１７４】
より詳細には、配列番号１に示す核酸配列は配列番号２に示すｐ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素をコードし、このコードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素はポリ（エチレンテレフタレート；ＰＥＴ）を加水分解し得る酵素として、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）において最初に同定され、これはリサイクルされた材料中のＰＥＴポリマーの分解／加水分解に特定的な有用性を有し得る（例えば、Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１を参照されたい）。さらに、実施例２に示すように、本開示のβ−ガラクトシダーゼを発現／産生する（改変）バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（娘）宿主細胞におけるｐ−ニトロベンジルエステラーゼ（配列番号２）をコードする遺伝子の欠失は、改変されていない（親）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞によって産生されたβ−ガラクトシダーゼ組成物において同定された検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を完全に消失させた。
【０１７５】
したがって、特定の実施形態では、本開示のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする内在性遺伝子を欠失、破壊又はダウンレギュレートするように遺伝子改変される。特定の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードするバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種遺伝子は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも約６０％〜１００％のアミノ酸配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする。他の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードするバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種遺伝子は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする。別の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードするバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種遺伝子は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする。特定の他の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードするバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種遺伝子は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする。さらに他の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードするバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種遺伝子は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して約１００％のアミノ酸配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする。
【０１７６】
例えば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｎｂＡ遺伝子（配列番号１）は、約４．８のｐＩ及び約５３ｋＤａの分子量を含む、４８９個のアミノ酸からなるｐ−ニトロベンジルエステラーゼ（配列番号２、図１３；ＥＣ番号３．１．１．３）をコードする。より詳細には、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼの一次（１°）アミノ酸配列分析（例えば、図１３を参照されたい）は、この酵素をα／βヒドロラーゼスーパーファミリーのメンバーとして同定し、この触媒装置は、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）を含む触媒三残基を含み、且つ配列番号２のおよそ８５〜２１１位のアミノ酸残基由来のアセチルエステラーゼ（ＡＥＳ）ドメインをその中に含む。
【０１７７】
したがって、特定の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする改変内在性遺伝子を含み、このｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、コードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼの少なくともアセチルエステラーゼドメインを欠失、破壊又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含んでいる。特定の他の実施形態において、遺伝子改変バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする改変内在性遺伝子を含み、このｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）から選択される、触媒三残基アミノ酸の少なくとも１つを欠失、破壊又は置換する遺伝子改変を含んでいる。他の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、セリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）から選択される少なくとも２つの触媒三残基アミノ酸を欠失、破壊又は置換する遺伝子改変を含んでいる。さらに他の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、触媒三残基アミノ酸であるセリン（Ｓｅｒ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ）の３つ全てを欠失、破壊又は置換する遺伝子改変を含んでいる。例えば、配列番号２のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼは、Ｓｅｒ−１８９、Ｇｌｕ−３１０及び３９９−Ｈｉｓを含む触媒三残基を含む。
【０１７８】
他の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする改変内在性遺伝子を含み、このｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、コードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼのアセチルエステラーゼドメインを欠失、破壊又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含んでいる。したがって、特定の実施形態では、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、コードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼのアセチルエステラーゼ（ＡＥ）ドメインを欠失、破壊又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含み、そのＡＥドメインは配列番号２の８５〜２１１位のアミノ酸残基を含んでいる。例えば、特定の実施形態では、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼのＡＥドメインは、アンチセンスＲＮＡ方法論（例えば、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼのアミノ酸残基位置８５〜２１１（又はその部分配列）をコードする内在性遺伝子に相補的なＲＮＡ分子）によってダウンレギュレートされる（その相補的ＲＮＡ分子が、改変宿主細胞においてｐ−ニトロベンジルエステラーゼの発現／産生をダウンレギュレートする）。他の実施形態では、遺伝子改変されたＡＥドメインが欠失又は破壊され、この改変宿主細胞はそのｐ−ニトロベンジルエステラーゼの低減又は消失を示す。
【０１７９】
他の実施形態では、遺伝子改変バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする改変内在性遺伝子を含み、このｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする改変遺伝子は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ基質結合ポケットを欠失、破壊又はダウンレギュレートする遺伝子改変を含んでいる。例えば、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼは、１０５〜１０７、１８８〜１９０、１９３、３２６、３３０、３３１、３５８、４００及び４０３の位置に１３個のアミノ酸残基を含む基質結合ポケットを含む。特定の実施形態では、配列番号２のアミノ酸残基１０５〜１０７は、基質結合ポケットの一部を形成するモチーフ「ＧＧＡ」（Ｇ１０５；Ｇ１０６；Ａ１０７）を含む。他の実施形態では、配列番号２のアミノ酸残基１８８〜１９３は、基質結合ポケットの一部を形成するモチーフ「ＥＳＡＸＸＭ」（Ｅ１８８、Ｓ１８９、Ａ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９２、Ｍ１９３（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である））を含む。別の実施形態では、アミノ酸残基３２６は基質結合ポケットの一部を形成するトレオニン（Ｔ３２６）であり、アミノ酸残基３３０は基質結合ポケットの一部を形成するアラニン（Ａ３３０）であり、アミノ酸残基３３１は基質結合ポケットの一部を形成するロイシン（Ｔ３３１）であり、アミノ酸残基３５８は基質結合ポケットの一部を形成するメチオニン（Ｍ３５８）であり、アミノ酸残基４００は基質結合ポケットの一部を形成するアラニン（Ａ４００）であり、アミノ酸残基４０３は基質結合ポケットの一部を形成するロイシン（Ｔ４０３）である。
【０１８０】
したがって、特定の実施形態では、配列番号２のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする配列番号１の核酸配列（又はその部分配列）は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含むポリペプチドをコードする１つ以上の遺伝子の存在について、他のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）など）をスクリーニングするために使用される。例えば、特定の実施形態では、本開示は、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子を含む遺伝子改変バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞を対象とする。特定の他の実施形態では、本開示は、約４８３〜４８４のアミノ酸を含み、且つ配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して６２％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた遺伝子を含む遺伝子改変バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主細胞を対象とする。他の実施形態では、本開示は、約４９０〜４９２個のアミノ酸を含み、且つ配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼに対して５８％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする、欠失、破壊又はダウンレギュレートされた遺伝子を含む遺伝子改変バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞を対象とする。
【０１８１】
例えば、配列番号２のＢ．サブチリス（Ｂ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼは、ＮＣＢＩ非冗長性参照配列データベース（データは示さず）において検索されたＢＬＡＳＴ−Ｐであり、そのデータベースでは、配列番号２に対して１００％〜約８０％の範囲の配列同一性を有する、２８を超える相同Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼタンパク質が同定された。同様に、配列番号２に対して６２％〜約６５％の範囲の配列同一性を有し、コードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼが約４８３〜４８４個のアミノ酸を含む、１０を超える相同Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼタンパク質が同定された。さらに、配列番号２に対して６０％〜約６５％の範囲の配列同一性を有し、コードされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼが約４９０〜４９２個のアミノ酸を含む、８を超える相同Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐ−ニトロベンジルエステラーゼタンパク質が同定された。
【０１８２】
したがって、本開示の特定の実施形態は、配列番号２のｐ−ニトロベンジルエステラーゼアミノ酸配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を含む、欠失、破壊又はダウンレギュレートされたｐ−ニトロベンジルエステラーゼタンパク質を含む改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種宿主細胞を対象とする。したがって、関連する実施形態は、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞においてβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼを発現／産生させることに関し、ここで、それから発現／産生されるβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼは、検出可能なｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を含まず、それによって、そのようなｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性で汚染された乳製品で観察される不快な異臭及び味が排除される。
【０１８３】
したがって、本開示の特定の実施形態は、本開示の１つ以上のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼを発現／産生することができる遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞を対象とする。例えば、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレットには、種々のβ−ガラクトシダーゼをコードするポリヌクレオチドコンストラクト（例えば、発現コンストラクト）で形質転換された組換えバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞が開示されている。したがって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は発現宿主として当該技術分野でよく知られており、本開示の１つ以上のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼの発現／産生に特に好適な宿主細胞である。
【０１８４】
特定の実施形態では、本開示は、したがって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を遺伝子改変する方法を対象とし、その改変は、（ａ）遺伝子（若しくはそのＯＲＦ）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、又は遺伝子若しくはそのＯＲＦの転写若しくは翻訳に必要な調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換、若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）部位特異的変異誘発、及び／又は（ｇ）ランダム変異誘発を含む。
【０１８５】
したがって、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は当該技術分野でよく知られた方法、例えば、挿入、破壊、交換、欠失、トランケーション、置換、フレームシフト変異などを使用して、上記のｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の発現を低減又は排除することによって構築される。ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子を改変又は不活性化すべき部分は、例えば、コード領域、又はコード領域の発現に必要とされる調節／制御エレメントであり得る。このような調節又は制御配列の例は、プロモーター配列又はその機能的部分（すなわち、核酸配列の発現に十分に影響を及ぼし得る部分）であり得る。改変のための他の制御配列としては、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
特定の他の実施形態では、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の発現を消失又は低減させる遺伝子欠失によって構築される。遺伝子欠失技術は遺伝子の部分的又は完全な除去を可能にし、それによって、遺伝子の発現を排除するか、又は非機能性（若しくは、活性が低下した）タンパク質産物を発現する。このような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子にフランキングする５’及び３’領域が隣接して含まれるように構築されたプラスミドを使用する相同組換えによって達成され得る。隣接する５’及び３’領域は、例えば、ｐＥ１９４などの温度感受性プラスミド上で、このプラスミドが細胞内で定着できる許容温度で第２の選択可能マーカーと会合して、バチルス細胞に導入し得る。次いで、細胞を非許容温度にシフトさせて、相同フランキング領域の１つで染色体に組み込まれたプラスミドを有する細胞を選択する。プラスミドを組み込むための選択は、第２の選択可能マーカーによる選択によって達成される。組込み後、第２の相同フランキング領域での組換え事象を、細胞を選択せずに数世代にわたって許容温度にシフトさせることによって刺激する。細胞を平板培養して単一コロニーを得、これらのコロニーについて両方の選択可能マーカーの欠損の有無を調べる（例えば、Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３を参照されたい）。したがって、当業者であれば（例えば、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子（核酸）配列及びそのコードされたタンパク質配列を参照することによって）、完全又は部分的欠失に好適な遺伝子のコード配列及び／又は遺伝子の非コード配列中のヌクレオチド領域を容易に同定することができる。
【０１８７】
他の実施形態では、本開示の改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、遺伝子中の１つ以上のヌクレオチド、又はｐ−ニトロベンジルエステラーゼ転写若しくはその翻訳に必要な調節エレメントを導入、置換、又は除去することによって構築される。例えば、終止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトをもたらすように、ヌクレオチドを挿入又は除去することができる。このような改変は、当該技術分野で知られた方法に従い、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ生成変異誘発によって達成し得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ、１９８５；Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、及びＳａｒｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。したがって、特定の実施形態では、本開示のｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子は、完全な又は部分的な欠失によって不活性化される。
【０１８８】
別の実施形態において、改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞は遺伝子変換のプロセスによって構築される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ及びＴｒａｕｔｎｅｒ、１９８３を参照のこと）。例えば、遺伝子変換法では、遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異させて欠陥核酸配列を生成し、次いでこれを親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に形質転換して欠陥遺伝子を生成する。相同組換えにより、欠陥核酸配列は内因性遺伝子に代わる。欠陥遺伝子又は遺伝子断片はまた、欠陥遺伝子を含む形質転換体の選択に使用することができるマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥遺伝子は、選択マーカーと関連して、非複製又は温度感受性プラスミドに導入され得る。プラスミドを組み込むための選択は、プラスミドを複製させない条件下でのマーカー選択によって達成される。遺伝子置換をもたらす第２の組換え事象の選択は、選択可能マーカーの欠損及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調べることによって達成される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。或いは、欠陥核酸配列は、以下に記載されるように、遺伝子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換、又は欠失を含み得る。
【０１８９】
他の実施形態では、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より具体的には、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞によるｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の発現が、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することによって低減（ダウンレギュレート）又は消失され得、その相補的なヌクレオチド配列は細胞内で転写され得、そして細胞内で産生されたｐ−ニトロベンジルエステラーゼｍＲＮＡにハイブリダイズし得る。そのため、相補的アンチセンスヌクレオチド配列をｍＲＮＡにハイブリダイズさせることを可能にする条件下では、翻訳されるｐ−ニトロベンジルエステラーゼタンパク質の量は低減される、又はなくなる。このようなアンチセンス方法には、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどが含まれ、これらは全て当業者によく知られているが、これらに限定はされない。
【０１９０】
他の実施形態では、改変Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９編集により生成／構築される。例えば、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを補充するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）及びＣｐｆ１又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）に結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって破壊（又は欠失又はダウンレギュレート）され得、ここで、エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成し得る。この標的ＤＮＡ切断はＤＮＡ修復のための基質となり、提供された編集テンプレートと組換えて、遺伝子を破壊又は欠失させることができる。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼ（この目的のために、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９）をコードする遺伝子、又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子は、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞において活性なプロモーター及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において活性なターミネーターに作動可能に連結され、それによって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）Ｃａｓ９発現カセットを作製する。同様に、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者によって容易に同定される。例えば、目的遺伝子内の標的部位を指向したｇＲＮＡをコードするＤＮＡコンストラクトを構築するために、可変標的（ＶＴ）ドメインは（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合する。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組み合わせは、それによってｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。したがって、ｇＲＮＡのためのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）発現カセットは、ｇＲＮＡをコードするＤＮＡを、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において活性なプロモーター及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において活性なターミネーターに作動可能に連結することによって作製される。
【０１９１】
さらに他の実施形態では、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は、化学的変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ、１９７０を参照されたい）及び転位（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むが、これらに限定されない、当該技術分野でよく知られた方法を使用して、ランダム又は特異的変異誘発によって構築される。遺伝子の改変は、親細胞に変異を誘発させ、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の発現が低減又は消失された変異細胞をスクリーニングすることによって行うことができる。変異誘発は特異的であってもランダムであってもよく、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより実施することができる。さらに、変異誘発は、これらの変異誘発法の任意の組合せの使用により実施することができる。
【０１９２】
本目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外（ＵＶ）線、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。このような薬剤を使用する場合、変異誘発は、一般に、選択した変異誘発剤の存在下、好適な条件の下で、変異誘発させる親細胞をインキュベートし、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の発現の低下を示す、又は発現をしない変異細胞を選択することにより行われる。
【０１９３】
他の実施形態では、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は内在性ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子の破壊を含み、ポリヌクレオチド破壊カセットは、マーカー遺伝子を含む。
【０１９４】
国際公開第２００３／０８３１２５号パンフレットには、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を改変するための方法、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）をバイパスするためにＰＣＲ融合を使用するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）欠失株及びＤＮＡコンストラクトの作製が開示されている。
【０１９５】
国際公開第２００２／１４４９０号パンフレットには、（１）組み込みプラスミド（ｐＣｏｍＫ）の構築及び形質転換、（２）コード配列、シグナル配列及びプロペプチド配列のランダム変異誘発、（３）相同組換え、（４）形質転換ＤＮＡに非相同フランクを付加することによる形質転換効率の増加、（５）二重交差組み込みの最適化、（６）部位特異的変異誘発、及び（７）マーカーレス欠失を含む、バチルス細胞を改変するための方法が開示されている。
【０１９６】
当業者はポリヌクレオチド配列を細菌細胞（例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種）に導入する好適な方法をよく知っている（例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６７；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｈｏｌｕｂｏｖａ、１９８５；Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１及びＭｃＤｏｎａｌｄ，１９８４）。実際に、プロトプラスト形質変換及び会合、形質導入、並びにプロトプラスト融合を含む形質転換などの方法は知られており、本開示における使用に適している。形質転換の方法は、本開示のＤＮＡコンストラクトを宿主細胞に導入するために特に好ましい。
【０１９７】
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施形態では、宿主細胞を直接、形質転換する（すなわち、宿主細胞内に導入する前にＤＮＡコンストラクトを増幅させるために、又はさもなければプロセシングするために、中間細胞を使用しない）。ＤＮＡコンストラクトの宿主細胞内への導入には、プラスミド又はベクター内へ挿入することなくＤＮＡを宿主細胞内に導入するために当該技術分野において知られている物理的及び化学的方法が含まれる。このような方法としては、塩化カルシウム沈澱、エレクトロポレーション、裸ＤＮＡ、リポソームなどが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる実施形態では、ＤＮＡコンストラクトを、プラスミドに挿入せずに、プラスミドと共に同時形質転換させる。
さらなる実施形態では、選択マーカーは、当該技術分野で知られた方法（例えば、Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４及びＰａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）により、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）株から欠失されるか又は実質的に切除される。いくつかの実施形態では、宿主染色体からのベクターの分離は、染色体中のフランキング領域を残し、一方、固有の染色体領域を除去する。
【０１９８】
したがって、特定の実施形態では、本開示の好適なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞として、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｂ．レンツス（Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ）、Ｂ．ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．ステアロサーモフィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アルカロフィルス（Ｂ．ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂ．コアグランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、Ｂ．サークランス（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、Ｂ．ラウツス（Ｂ．ｌａｕｔｕｓ）及びＢ．チューリンギエンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）が挙げられる、これらに限定されない。１つの特定の実施形態では、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）宿主細胞又はＢ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主細胞である。
【０１９９】
特定の他の実施形態では、遺伝子改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞（すなわち、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞）においてこのようなβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ酵素を発現／産生させること、ここで、改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞から産生及び精製されるそのような酵素は、好ましくない／望ましくない酵素副活性、例えば、以下に限定されないが、好ましくない／望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性、好ましくない／望ましくないリパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性などを含まない。例えば、特定の実施形態では、本開示は、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ副活性から選択される少なくとも１つのさらなる好ましくない／望ましくない酵素活性をコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む遺伝子改変バチルス宿主細胞を対象とする。
【０２００】
例えば、これらの酵素が実質的に不活性である改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞は、ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ活性に関して上記に一般的に記載されるような組換え遺伝子操作技術を使用する遺伝子改変によって得ることができる。セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、及び／又はホスホリパーゼをコードする遺伝子の改変は、親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞に変異を誘発し、これらの酵素を発現する能力が親バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞との直接比較で低下している変異バチルス細胞を選択することによって生成することができる。変異誘発は特異的であってもランダムであってもよく、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用により、好適なオリゴヌクレオチドの使用により、ＣＲＳＩＰＲ／Ｃａｓ９編集の使用により、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることにより行うことができる。さらに、変異誘発は、これらの変異誘発剤の任意の組合せを使用することにより実施することができる。
【０２０１】
セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、及び／又はホスホリパーゼ欠損宿主細胞は、酵素の発現レベルをモニターすることによって選択され得る。任意選択により、セルラーゼ、マンナナーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ及び／又はホスホリパーゼ欠損宿主細胞は、その後、宿主細胞において発現されるべき所与の目的遺伝子（例えば、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼ酵素）の発現レベルを測定することによって選択され得る。酵素活性が低下している宿主細胞の選択は、培養ブロス中で、培養上清中で、透過細胞中で又は細胞溶解物中で酵素活性を直接測定することより行なってもよい。
【０２０２】
或いは、リパーゼ副活性、ホスホリパーゼ副活性、セルラーゼ副活性、ペクチナーゼ副活性、アミラーゼ副活性、プロテアーゼ副活性、マンナナーゼ副活性の量が減少している宿主細胞（又は、これらの酵素が実質的に不活性である宿主細胞）を、組換えＤＮＡ技術を使用して構築してもよい。遺伝子不活性化又は遺伝子破壊のためのいくつかの技術、例えば、一工程遺伝子破壊、マーカー挿入、部位特異的変異誘発、欠失、ＲＮＡ干渉、アンチセンスＲＮＡ、ＣＲＳＩＰＳ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）編集などは当該技術分野で記載されており、全て、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性が低減した工業生産株を得るために、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性の合成を抑制、阻害、妨害又は防止に使用され得る。また、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ遺伝子の発現を指示する制御配列を変化させることによる、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性の不活性化も、本発明の一部である。例えば、遺伝子破壊などの方法は容易に利用可能であり、プロモーター活性の低減又は排除に有用である。
【０２０３】
したがって、特定の実施形態では、本開示の宿主細胞のゲノムは、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性が（例えば、酵素活性をコードする遺伝子に「マーカー遺伝子」を挿入することによって）欠損するように改変される。したがって、特定の実施形態では、挿入されたマーカー遺伝子が、ゲノム由来の酵素をコードする遺伝子の一部（例えば、遺伝子の２５％、５０％若しくは７５％）、又はゲノム由来の酵素をコードする遺伝子の全てに取って代わる。
【０２０４】
そのような遺伝子不活性化を実施する方法は、多くの異なる微生物に関して説明されており、当業者に知られている。改変宿主細胞におけるリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼの発現は、それによって低減又は消失され得る。これらの技術を用いて改変される特定の宿主細胞に応じて、この手順は、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼをコードする配列の全て又は大部分を除去するために、数回繰り返され得る。
【０２０５】
リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼなどの宿主遺伝子の改変又は不活性化は、遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を使用する確立されたアンチセンス技術によって実施することができる。同様に、宿主細胞遺伝子の修飾は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術によって得ることができる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂ
Ｌｅｔｔ．２３７：３１７−３２４（２００４））。より具体的には、発現が影響を受けるヌクレオチド配列の同一のセンス部分及びアンチセンス部分を、間にヌクレオチドスペーサーを挟んで一列にクローニングし、発現ベクター中に挿入し、この発現ベクターを細胞（この細胞では、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が転写され、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる、より短いｓｉＲＮＡへとプロセシングされ得る）中に導入することにより、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞による遺伝子の発現を、低減又は消失させることができる。ｄｓＲＮＡが転写された後、小さい（２１〜２３個の）ヌクレオチドｓｉＲＮＡ断片の形成により、影響を受けるｍＲＮＡの標的分解が起こり得る。特定のｍＲＮＡの消失は様々な程度であり得る。国際公開第２００５／０５６７２号パンフレット、及び国際公開第２００５／０２６３５６号パンフレットに記載されているＲＮＡ干渉技術を、宿主遺伝子の改変のために使用することができる。
【０２０６】
したがって、特定の実施形態では、減少したリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を含む本開示の改変宿主細胞は、古典的な遺伝子操作技術又は組換えＤＮＡ技術によって構築される。特定の好ましい実施形態では、これらの改変宿主細胞は、トランスガラクトシル化活性を有する工業的に関連する酵素の産生のために使用される。より好ましくは、これらの改変宿主細胞を、食品工業で使用する酵素の製造に使用し、より一層好ましくは、これらの酵素を乳製品の加工で使用する。
最も好ましくは、減少したリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性を有するこのような工業生産宿主細胞はラクトース基質からのガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を生産するために使用される。
【０２０７】
したがって、特定の実施形態では、本発明のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損宿主細胞は、国際公開第２０１６／０７１５０４号に一般的に記載されているように、検出可能な細胞内又は細胞外リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性が５０％未満の改変宿主細胞である。より好ましくは、他の実施形態では、本開示のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損宿主細胞は、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性が５０％未満の改変宿主細胞である。別の実施形態では、本開示のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損宿主細胞は、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性が、改変されていない（親）宿主細胞のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性の２５％未満である改変宿主細胞である。別の実施形態では、本発明の欠損（すなわち、遺伝子改変）宿主細胞におけるリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性は１０％未満、より好ましくは５％未満、より好ましくは１％未満であり、最も好ましくは検出不能である。
【０２０８】
ポリペプチド／酵素を検出するための様々なシステム及び方法が当業者に知られている。検出システムとして、ポリペプチド又は酵素活性の検出用のあらゆる可能なアッセイが挙げられる。例えば、このようなアッセイシステムとして、比色分析、光測定、蛍光測定、比濁分析、粘度測定、免疫学、生物学、クロマトグラフに基づくアッセイ及びその他の利用可能なアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。特定の実施形態では、産生される活性酵素（例えば、活性リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ）の量は、モデル反応において、その活性を測定することによって決定される。
【０２０９】
特定の他の実施形態では、本開示のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損（すなわち、改変）宿主細胞は、改変された宿主細胞がトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現コンストラクトで形質転換された場合、改変されていない（親）宿主細胞が同じ培養条件下で、この未改変（親）宿主細胞もまた、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損改変宿主細胞と同じ発現コンストラクトで形質転換されている場合に、産生するポリペプチドと少なくとも同じ量のポリペプチドを産生するという事実によって特徴付けられる。好ましい実施形態では、本開示のリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損宿主細胞は、同じ培養条件下の未改変（親）宿主細胞と同量又はそれ以上のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドを産生する改変宿主細胞である。特定の実施形態では、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ欠損宿主細胞は、所与のポリペプチドを、同じ培養条件下の未改変（親）宿主細胞より多く産生する。
【０２１０】
ＩＶ．β−ガラクトシダーゼポリヌクレオチド及びそのベクター
特定の実施形態では、本開示は上記のようなトランスガラクトシル化活性を有する単離されたポリペプチドを使用し、このポリペプチドは、非常に低いストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中〜高ストリンジェンシー条件下、より一層好ましくは高ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号４、６、８、１０、１２、１５、１６又は２６の成熟ポリペプチドをコードする配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は２５に含まれる核酸配列、（ｉｉ）（ｉ）のｃＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の相補鎖にハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施形態では、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は２５の部分配列は、少なくとも１００個の連続ヌクレオチド又は少なくとも２００個の連続ヌクレオチドを含有する。さらに、部分配列は、ラクターゼ又はトランスガラクトシダーゼ活性を有するポリペプチド断片をコードし得る。
【０２１１】
配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは２５のヌクレオチド配列（又はその部分配列）、及び配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６若しくは２６のアミノ酸配列（又はその断片）は、当業者によく知られた方法に従って、様々な属若しくは種の菌株由来のトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを同定及びクローン化するための核酸プローブを設計するために使用することができる。
【０２１２】
特に、そのようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定及び単離するために、標準サザンブロット法に従って、目的の属又は種のゲノム又はｃＤＮＡとハイブリダイゼーションするために使用することができる。そのようなプローブは、全配列より相当に短い可能性があるが、長さが少なくとも１４ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３５ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも７０ヌクレオチドでなければならない。しかし、核酸プローブは、長さが少なくとも１００ヌクレオチドであることが好ましい。例えば、核酸プローブは、長さが少なくとも２００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド又は最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってよい。より一層長いプローブ（例えば、長さが少なくとも６００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも７００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも８００ヌクレオチド、又は最も好ましくは少なくとも９００ヌクレオチドである核酸プローブ）を使用してもよい。ＤＮＡプローブ及びＲＮＡプローブの両方を使用することができる。これらのプローブは、通常、対応する遺伝子を検出するために（例えば、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン又はアビジンを用いて）標識される。そのようなプローブは、本発明に包含される。
【０２１３】
このため、そのような生物から調製されたゲノムＤＮＡライブラリーは、上述したプローブとハイブリダイズし、且つラクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。そのような他の生物からのゲノム又は他のＤＮＡは、アガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、又は他の分離技術によって分離することができる。ライブラリー由来のＤＮＡ又は分離したＤＮＡは、ニトロセルロース又は他の好適な担体材料に移して固定化することができる。配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは２５（又はその部分配列）と相同性であるクローン若しくはＤＮＡを同定するためには、サザンブロット法の担体材料が使用される。
【０２１４】
本開示の目的のためには、ハイブリダイゼーションは、ヌクレオチド配列が配列番号３、５、７、９、１１、１３若しくは１５に示したヌクレオチド配列、その相補鎖又はその部分配列に、超低〜超高ストリンジェンシー条件下で、対応する標識核酸プローブにハイブリダイズすることを示している。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、Ｘ線フィルムを使用して検出することができる。
【０２１５】
核酸プローブは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５若しくは２５の成熟ポリペプチドをコードする領域であってよい。
【０２１６】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドである長いプローブに対しては、最適には１２〜２４時間の標準サザンブロッティング手順にしたがって、超低〜超高ストリンジェンシー条件は、５×のＳＳＰＥ、０．３％のＳＤＳ、２００ｇ／ｍＬの剪断及び変性サケ精液ＤＮＡ、並びに２５％のホルムアミド（超低及び低ストリンジェンシーの場合）、３５％のホルムアミド（中及び中〜高ストリンジェンシーの場合）又は５０％のホルムアミド（高及び超高ストリンジェンシーの場合）中、４２℃でのプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションと定義される。
【０２１７】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドである長いプローブに対しては、担体材料は、２×のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェンシー）、より一層好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で最終的にそれぞれ１５分間ずつ３回洗浄される。
【０２１８】
特定の実施形態では、洗浄は、０．２のＳＳＣ、０．２％のＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（超低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中−高ストリンジェンシー）、より一層好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、最も好ましくは少なくとも７０℃（超高ストリンジェンシー）で実施される。
【０２１９】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、ストリンジェンシー条件は、標準サザンブロッティング手順にしたがって、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ−４０、１×のデンハルト溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ及び０．２ｍｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ中で、Ｂｏｌｔｏｎ  ａｎｄ  ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９６２，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ４８：１３９０）による計算を使用して算出したＴｍより約５℃〜約１０℃下でのプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、及びハイブリダイゼーション後洗浄と定義される。
【０２２０】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドである短いプローブに対しては、担体材料は、１５分間にわたり６×のＳＣＣ＋０．１％のＳＤＳ中で１回、及び算出したＴｍより５℃〜１０℃下で６×のＳＳＣを使用してそれぞれ１５分間ずつ２回洗浄される。
【０２２１】
塩含有ハイブリダイゼーション条件下では、有効Ｔｍは、上首尾のハイブリダイゼーションのためにプローブとフィルタ結合ＤＮＡとの間に必要とされる同一性の程度を制御するものである。有効Ｔｍは、様々なストリンジェンシー条件下で２つのＤＮＡがハイブリダイズするために必要とされる同一性の程度を決定するために下記の式を使用して決定することができる。
【０２２２】
有効Ｔｍ＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ホルムアミド）
【０２２３】
したがって、本開示の変異核酸には、配列番号４、６、８、１０、１２、１５、１６又は２６をコードする核酸と所定のパーセント（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％）の配列同一性を有するポリヌクレオチドが含まれる。特定の態様では、本明細書に開示したポリペプチドをコード可能な核酸が提供される。他の実施形態では、本明細書に開示した核酸は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５又は２５と少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９９％同一である核酸配列を有する。
【０２２４】
特定の実施形態では、本開示は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドを提供する。特定の他の実施形態では、本開示は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
【０２２５】
したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチド（及びその多様体）が当該技術分野でよく知られた手順に従って、宿主細胞中での組換え発現によって産生される。より特には、特定の実施形態において、本明細書に記載のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼポリペプチド（及びその多様体）は、配列番号２に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子の少なくとも破壊又は欠失を含む改変バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で発現／産生される。
【０２２６】
ポリペプチドの遺伝子改変及び組換え生産の方法は、例えば、米国特許第７，３７１，５５２号明細書、同第７，１６６，４５３号明細書、同第６，８９０，５７２号明細書、及び同第６，６６７，０６５号明細書；並びに米国特許出願公開第２００７／０１４１６９３号明細書、同第２００７／００７２２７０号明細書、同第２００７／００２０７３１号明細書、同第２００７／００２０７２７号明細書、同第２００６／００７３５８３号明細書、同第２００６／００１９３４７号明細書、同第２００６／００１８９９７号明細書、同第２００６／０００８８９０号明細書、同第２００６／０００８８８８号明細書、及び同第２００５／０１３７１１１号明細書に記載されている。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、プライマー、ベクター、選択方法、宿主細胞、発現ポリペプチド多様体の精製及び再構成、並びに酵素アッセイのために有用なバッファー、ｐＨ範囲、Ｃａ２＋濃度、基質濃度及び酵素濃度を含む本明細書に定義したポリペプチド多様体の特性解析を含む、これらの開示の関連する教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２７】
特定の実施形態では、本開示は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを対象とする。特定の好ましい実施形態では、このような目的タンパク質には、β−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチド、例えば、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２６として記載のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドが含まれる。したがって、特定の他の実施形態では、本開示の組換え宿主細胞は、その中に導入された１つ以上のベクターを含む。特定の他の実施形態では、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド／ＤＮＡコンストラクトは、「発現ベクター」として宿主細胞に導入され、このベクターはβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼをコードする配列に作動可能に連結された調節配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）を含む。より特には、特定の実施形態において、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、遺伝子改変宿主細胞（例えば、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞）に導入され、この遺伝子改変宿主細胞は、配列番号２に対して少なくとも６０％の配列同一性を含むｐ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子の少なくとも欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む。
【０２２８】
例示的なベクターとしては、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において複製可能なｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１９、並びにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）において複製可能なｐＥ１９４が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２９】
特定の実施形態では、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞における転写を可能にする好適なプロモーターに作動可能に連結されている。例えば、プロモーターは、宿主細胞にとって同種又は異種のタンパク質をコードする遺伝子由来であってよい。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞における遺伝子、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）及び／又はその変異配列の発現に使用するためのプロモーター及びプロモーター配列領域は、当業者に一般に知られている。本開示のプロモーター配列は一般に、それらがバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞（例えば、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）細胞、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞など）において機能的であるように選択される。特定の例示的なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーター配列としては、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）プロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のα−アミラーゼプロモーター、Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のα−アミラーゼプロモーター、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の中性プロテアーゼ（ｎｐｒＥ）プロモーター、変異ａｐｒＥプロモーター（国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット）、又は関連するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｉ）由来の任意の他のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の他の実施形態では、プロモーターは米国特許出願公開第２０１４／０３２９３０９号明細書に開示されるリボソームタンパク質プロモーター又はリボソームＲＮＡプロモーター（例えば、ｒｒｎＩプロモーター）である。バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞において一連の活性（プロモーター強度）を有するプロモーターライブラリーをスクリーニング及び作製するための方法は、国際公開第２００３／０８９６０４号パンフレットに記載されている。特定の実施形態では、プロモーターはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して天然であるが、他の実施形態では、プロモーターはバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に対して異種（外来）である。
【０２３０】
他の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、ベクター／発現コンストラクトに含まれる）は、シグナル配列（シグナルペプチド）をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。したがって、特定の実施形態では、シグナル配列をコードする核酸配列は、Ｂ．ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来する。特定の他の実施形態では、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ａｐｒＥの天然シグナル配列が使用されるか、又はそれに代えて、他のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種分泌タンパク質由来のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列が使用される。したがって、特定の実施形態では、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列は、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのすぐ上流（５’）で、且つインフレームに位置する（すなわち、作動可能に連結される）。
【０２３１】
したがって、特定の他の実施形態では、本開示は、宿主細胞に導入するベクターに含まれるシグナル配列及びプロモーター配列を含む。他の実施形態では、発現ベクターはまた、終止配列を含む。特定の実施形態では、終止配列、シグナル配列及びプロモーター配列は、同じ供給源又は異なる供給源に由来する。
【０２３２】
特定の他の実施形態では、発現ベクターは選択可能マーカーを含む。適切な選択マーカーの例としては、抗微生物剤（例えば、ヒグロマイシン、フレオマイシンなど）に対する耐性を付与するもの、及び栄養選択（栄養要求性）マーカーが挙げられる。
【０２３３】
したがって、本開示のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドをコードするＤＮＡコンストラクトを含む好適な発現ベクターは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞において自己複製することができるか、又は宿主細胞のゲノムに組み込むことができる任意のベクターであり得る。
【０２３４】
ＶＩ．好ましくない酵素副活性を欠損した改変バチルス（ＢＡＣＩＬＬＵＳ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼの産生
特定の他の実施形態では、本開示は、（好ましくない／望ましくない）パラ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を欠損した改変宿主細胞においてヌクレオチド配列を転写する方法を対象とする。さらに他の実施形態では、本開示は、パラ−ニトロベンジルエステラーゼ活性が欠損した改変宿主細胞においてヌクレオチド配列を転写する方法を対象とし、その改変宿主細胞はリパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼ活性から選択される少なくとも１つのさらなる（好ましくない／望ましくない）酵素活性が欠損するようにさらに操作されており、その転写配列はトランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドをコードし、培養培地中で、本開示のトランスガラクトシル化ポリペプチドをコードする発現コンストラクトを含む、本開示の改変宿主細胞を培養することを含む。
【０２３５】
例えば、特定の実施形態では、パラ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を欠損した改変宿主細胞は、（１）（ａ）上流の、（ｂ）本開示のトランスガラクトシル化ポリペプチドをコードする下流ヌクレオチド配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結された５’プロモーター領域、及び（ｃ）３’であり、トランスガラクトシル化ポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結された翻訳停止シグナルを含み、且つ（２）改変宿主細胞においてトランスガラクトシル化ポリペプチドを発現する発現コンストラクトで形質転換される。別の実施形態では、本開示の改変宿主細胞において発現／産生されるトランスガラクトシル化ポリペプチドは培養培地から、又は改変宿主細胞から（例えば、細胞溶解を介して）回収される。
【０２３６】
パラ−ニトロベンジルエステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼを欠損した改変宿主細胞は、本開示の方法に従って生産される。したがって、特定の実施形態では、欠損（改変）宿主細胞は、当該技術分野で知られた方法を使用して、所望のポリペプチドの産生に好適な栄養培地中で増殖又は維持される。例えば、好適な培地中で、且つポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下で、細胞を固体基質上に播種してもよく、フラスコ中で振盪してもよく、実験室用又は工業用の発酵槽で小規模又は大規模発酵（連続式、バッチ式、フェドバッチ式又は固体式の発酵など）で培養してもよい。
【０２３７】
培養は、炭素及び窒素源と、無機塩とを含む好適な栄養培地で、当該技術分野で知られた手順によって行われる。好適な培地は商業的供給業者から入手可能であり、又は（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中で）公開されている組成物を使用して調製してもよい。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、この培地からポリペプチドを直接回収することができる。ポリペプチドが分泌されない場合、細胞溶解物から回収することができる。
【０２３８】
得られたポリペプチドは、当該技術分野で知られた方法により単離することができる。例えば、ポリペプチドは、従来の手順、例えば、以下に限定されないが、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発又は沈殿により、栄養培地から単離することができる。次いで、単離したポリペプチドを、当該技術分野でよく知られた様々な方法、例えば、以下に限定されないが、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、アフィニティ、疎水性、クロマト分画若しくはサイズ排除）、電気泳動（例えば、予備等電点電気泳動）、溶解度差（例えば、アセトン若しくは硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出（例えば、カオトロープ、塩若しくはｐＨ）によりさらに精製することができる。
【０２３９】
このポリペプチドを、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドに特異的である当該技術分野で知られた方法を使用して検出することができる。これらの検出方法としては、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、酵素基質の消失又はＳＤＳ−ＰＡＧＥを挙げることができる。例えば、酵素アッセイを使用してポリペプチドの活性を測定することができる。多くの酵素に関して酵素活性を測定する手順は当該技術分野で知られている。より特には、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレット及び国際公開第２０１５／０８６７４６号パンフレットの開示は、トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチド（例えば、β−ガラクトシダーゼ／ラクターゼ）をアッセイするための特定の方法及びその組成物を提供しており、その方法は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。したがって、特定の実施形態では、トランスガラクトシル化活性を有する（すなわち、本開示の改変宿主細胞において産生されるような）ポリペプチドは、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレット及び国際公開第２０１５／０８６７４６号パンフレットに記載される方法及び組成物によってアッセイされる。
【０２４０】
したがって、特定の他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のトランスガラクトシル化ポリペプチドを発現させる組成物及び方法に関し、本開示の改変宿主細胞（すなわち、パラ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子の少なくとも欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む）を得ること、及び改変宿主細胞においてトランスガラクトシル化ポリペプチドを発現させること、及び任意選択によりトランスガラクトシル化ポリペプチドを精製することを含む。上記のように、本開示の改変宿主細胞において発現／産生されるこのようなトランスガラクトシル化ポリペプチドは、検出可能なパラ−ニトロベンジルエステラーゼ活性を有さず、それ自体、ラクトース基質によるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）組成物の生成に特に有用である。より特には、以下の実施例の項で示すように、本開示の改変宿主細胞（すなわち、配列番号２のパラ−ニトロベンジルエステラーゼをコードする遺伝子の欠失、破壊又はダウンレギュレーションを含む）における１つ以上のトランスガラクトシル化ポリペプチドの発現／産生は、汚染性パラ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性の非存在下でこのようなトランスガラクトシル化ポリペプチドを産生し、それによって、パラ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性を含む非改変（親）宿主細胞において発現／産生されるこのようなトランスガラクトシル化ポリペプチドを使用する場合に検出される、不快な異臭味及び臭いを排除する。同様に、他の実施形態では、本開示の改変宿主細胞は、リパーゼ、ホスホリパーゼ、セルラーゼ、ペクチナーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ及び／又はマンナナーゼから選択される少なくとも１つのさらなる好ましくない／望ましくない酵素副活性が欠損するようにさらに改変される（例えば、国際公開第２０１６／０７１５０４号パンフレットを参照されたい）。
【０２４１】
したがって、特定の実施形態では、宿主細胞への発現コンストラクト又はベクターの導入として、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクション媒介及びＤＥＡＥ−デキストリン媒介形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクティルによる高速衝突、並びにプロトプラスト融合などの技術が挙げられる。一般的な形質転換技術は当該技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６（１９８９）を参照されたい）。同様に、形質転換体選択には、当該技術分野において知られた方法を使用することができる。
【０２４２】
特定の実施形態では、本開示は、改変宿主細胞を発酵／培養することを含む、改変宿主細胞においてトランスガラクトシル化ポリペプチドを産生させる方法に関する。当該技術分野でよく知られている発酵方法を適用して、本開示の改変（娘）及び非改変（親）バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞を発酵させることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、バッチ又は連続発酵条件下で培養される。古典的なバッチ発酵は、クローズドシステムであり、培地の組成は発酵の開始時に設定され、発酵中に変更されない。発酵の開始時に、培地に所望の生物を接種する。この方法では、系にいかなる成分も添加することなく醗酵を行うことができる。一般に、バッチ発酵は、炭素源の添加に関して「バッチ」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度などの因子を制御することが頻繁に行われる。バッチシステムの代謝産物及びバイオマス組成は、発酵が停止される時まで絶えず変化する。典型的なバッチ培養では、細胞は静的誘導期を経由して高増殖対数期へ進行し、最終的には増殖率が減少若しくは停止する静止期に進む。未処理のまま放置すると、静止期にある細胞は最終的には死滅する。一般に、対数期の細胞は、生成物の大部分の産生を担っている。
【０２４３】
標準バッチ系に関する好適な変形形態は、「フェドバッチ発酵」系である。典型的なバッチ系のこの変形形態では、発酵の進行につれて基質が徐々に加えられる。フェドバッチシステムは、カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高い場合、及び培地中の基質量が限られた量であることが望ましい場合に有用である。フェドバッチシステムでは、実際の基質濃度の測定は困難であり、したがって、ｐＨ、溶存酸素、及びＣＯ２などの廃ガスの分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定される。バッチ及びフェドバッチ発酵は、当該技術分野において一般的であり、知られている。
【０２４４】
連続発酵は、定義された発酵培地がバイオリアクターに連続的に加えられ、処理のために等量の馴化培地が同時に除去される開放系である。連続発酵は、一般に、培養物を一定の高密度に維持し、細胞は主として対数増殖期にある。連続発酵は、細胞の増殖及び／又は産生物の濃度に影響する１つ以上の因子の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、炭素源又は窒素源などの制限栄養素は一定比率で維持され、他の全てのパラメータは調節することができる。他のシステムでは、培地の濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、増殖に影響する多くの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは、定常状態の増殖条件を維持しようとする。したがって、培地を取り出すことによる細胞損失は、発酵中の細胞増殖速度とバランスさせなければならない。連続発酵プロセスで栄養素及び増殖因子を調節する方法、並びに産生物形成速度を最大化するための手法は、工業微生物学の分野においてはよく知られている。
【０２４５】
したがって、特定の実施形態では、改変宿主細胞によって産生されたトランスガラクトシル化ポリペプチドは、従来の手順、例えば、宿主細胞を培地から遠心分離若しくは濾過によって分離する、又は、必要ならば、細胞を破壊し、上清を細胞破砕物及び残屑から取り除くことによって、培養培地から回収することができる。清浄化後、通常、上清又は濾液のタンパク質性成分を、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって沈澱させる。その後、沈澱させたタンパク質を可溶化し、様々なクロマトグラフ法、例えば、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過によって精製することができる。
【０２４６】
ＶＩ．適用例
下記に、本開示の宿主細胞、ポリペプチド又はポリペプチド組成物の好ましい使用例を示す。例えば、特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように、ラクトースを含む基質をトランスガラクトシル化ポリペプチド又はそのポリペプチド組成物で処理することによって食品を製造する方法を提供する。別の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるように、ラクトースを含むミルクベースの基質をトランスガラクトシル化ポリペプチド又はそのポリペプチド組成物で処理することによって乳製品を製造する方法を提供する。別の実施形態では、ラクトースを含む基質は、さらに加水分解性β−ガラクトシダーゼにより処理される。
【０２４７】
本開示に従って調製した食品成分の形態などの酵素調製物は、用途及び／又は適用の様式及び／又は投与の様式に応じて、溶液の形態であってもよいし固体としての形態であってもよい。固体形態は、乾燥酵素粉末としてであっても顆粒状酵素としてであってもよい。
【０２４８】
特定の実施形態では、酵素組成物は、組成物中のポリペプチドの総量に基づいて、本明細書に開示される１つ以上のトランスガラクトシル化ポリペプチドを、少なくとも５重量／重量％、例えば、１０重量／重量％、１５重量／重量％、２０重量／重量％、２５重量／重量％、３０重量／重量％、３５重量／重量％、４０重量／重量％、４５重量／重量％、５０重量／重量％含む。これは、当業者に知られている下記の技術を使用することによって評価することができる。評価対象の試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどのタンパク質定量に適した染料を使用して可視化する。次に、ゲルを、例えばＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎシステムなどの適切な密度計スキャナーを使用してスキャンし、得られた画像がダイナミックレンジ内にあるようにする。任意のトランスガラクトシル化ポリペプチドに対応するバンドを定量し、ポリペプチドのパーセンテージを以下のように計算する：対象ポリペプチドのパーセンテージ＝対象ポリペプチド／（トランスガラクトシル化活性を示す全てのポリペプチドの合計）×１００。ポリペプチドの総数は、当業者に知られた方法により、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８又は２６のβ−ガラクトシダーゼ／ラクターゼポリペプチドに対する特異性を有するポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロッティングによって決定することができる。
【０２４９】
したがって、特定の実施形態では、本開示による組成物は、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１７、１８及び２６からなる群から選択される１つ以上のポリペプチドを含む。
【０２５０】
別の態様では、本発明は、本発明による酵素錯体、酵素担体並びに任意選択的に安定剤及び／又は防腐剤を含む酵素錯体調製物を提供する。特定の実施形態では、酵素担体はグリセロール又は水からなる群から選択される。別の実施形態では、酵素担体はポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール又はソルビトール）を含まない。
【０２５１】
別の実施形態では、調製物／組成物は安定剤を含む。特定の実施形態では、安定剤は、無機塩、ポリオール、糖及びこれらの組合せからなる群から選択される。特定の実施形態では、安定剤は、例えば塩化カリウムなどの無機塩である。別の態様では、ポリオールは、グリセロール、プロピレングリコール又はソルビトールである。また別の実施形態では、安定剤は、グリセロール、プロピレングリコール又はソルビトールなどのポリオールではない。さらに別の実施形態では、安定剤は、低分子量炭水化物、特に、グルコース、ガラクトース、フルクトース及びサッカロースなどの数種の甘味物質のいずれかである。
【０２５２】
他の実施形態では、調製物は防腐剤を含む。一態様では、防腐剤は、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸塩、ソルビン酸塩若しくは他の食品用防腐剤、又はそれらの混合物である。
【０２５３】
特定の実施形態では、本開示の方法は、固定化酵素（例えば、固定化ラクターゼ又は他のＧＯＳ産生酵素）を用いて実施することができる。酵素は、任意の有機又は無機支持体に固定化することができる。例示的な無機支持体としては、アルミナ、ｃｅｌｉｔｅ、Ｄｏｗｅｘ−１−クロライド、ガラスビーズ及びシリカゲルが挙げられる。例示的な有機支持体としては、ＤＥＡＥ−セルロース、アルギン酸ヒドロゲル若しくはアルギン酸ビーズ、又は等価物が挙げられる。
【０２５４】
特定の実施形態では、β−ガラクトシダーゼ／ラクターゼの固定化は、無機支持体への物理的吸着によって最適化される。本開示の実施に使用する酵素は、水、トリス−ＨＣｌ緩衝液及びリン酸緩衝溶液などの様々な媒体中で固定化することができる。酵素は、任意のタイプの基材（例えば、フィルタ、線維、カラム、ビーズ、コロイド、ゲル、ヒドロゲル、メッシュなど）に固定化することができる。
【０２５５】
別の実施形態では、ラクトースを含むミルクベースの基質を本明細書に記載のポリペプチド又はポリペプチド組成物で処理することによって乳製品を製造する方法が提供される。さらなる態様では、ラクトースを含むミルクベースの基質を１５分の反応後に６０％超の、例えば７０％超、例えば７５％超の相対的トランスガラクトシル化活性を有するポリペプチドで処理することにより乳製品を製造する方法が提供される。一態様では、相対的トランスガラクトシル化活性は、３０分間の反応後に３より大きい。さらなる態様では、相対的トランスガラクトシル化活性は、３０分間の反応後に６より大きい。なおさらなる態様では、相対的トランスガラクトシル化活性は、３０分間の反応後に１２より大きい。
【０２５６】
別の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド又はポリペプチド組成物による処理を酵素の活性に最適な温度で行なう方法が提供される。さらなる態様では、ポリペプチド又はポリペプチド組成物を０．０１〜１０００ｐｐｍの濃度でミルクベースの基質に添加する。なおさらなる態様では、ポリペプチド又はポリペプチド組成物を０．１〜１００ｐｐｍの濃度でミルクベースの基質に添加する。さらなる態様では、ポリペプチド又はポリペプチド組成物を１〜１０ｐｐｍの濃度でミルクベースの基質に添加する。一態様では、乳製品などの基質を微生物により発酵させる工程をさらに含む方法が提供される。さらなる態様では、乳製品は、ヨーグルトである。さらなる態様では、ポリペプチド又はポリペプチド組成物及び微生物による処理を実質的に同時に行う。一態様では、ポリペプチド又はポリペプチド組成物及び微生物を、実質的に同時にミルクベースの基質に添加する。
【０２５７】
一態様では、本明細書に記載の細胞又はポリペプチド若しくはポリペプチド組成物を含む乳製品が提供される。一態様では、本明細書で定義するポリペプチド又はポリペプチド組成物を０．０１〜１０００ｐｐｍの濃度で添加する。
【０２５８】
一態様では、本明細書で定義するポリペプチド又はポリペプチド組成物によりインサイチューで形成されたＧＯＳを含む乳製品が提供される。一態様では、本明細書で定義する細胞を含む乳製品が提供される。
【０２５９】
本明細書に記載の乳製品は、例えば、スキムミルク、低脂肪乳、全乳、クリーム、ＵＨＴ乳、延長された貯蔵寿命を有するミルク、発酵乳製品、チーズ、ヨーグルト、バター、デイリースプレッド、バターミルク、酸性化ミルク飲料、サワークリーム、ホエイベース飲料、アイスクリーム、コンデンスミルク、加糖練乳若しくはフレーバードミルク飲料であり得る。乳製品は、当該技術分野で知られる任意の方法によって製造し得る。
【０２６０】
乳製品は、非ミルク成分（例えば、植物油、植物性タンパク質及び／又は植物性炭水化物などの植物性成分）をさらに含むことができる。乳製品はまた、さらなる添加物、例えば、酵素、矯味剤、プロバイオティクス培養物などの微生物培養物、塩、甘味料、糖、酸、果実、果汁、又は当該技術分野において乳製品の成分若しくは添加物として知られる任意の他の成分をさらに含むことができる。本発明の一実施形態では、１つ以上のミルク成分及び／又はミルク分画は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
【０２６１】
本発明の一実施形態では、トランスガラクトシル化活性を有する本明細書に定義する酵素を用いて処理されている１つ以上のミルクベース基質は、乳製品の少なくとも５０重量／重量％、例えば少なくとも７０重量／重量％、例えば少なくとも８０重量／重量％、好ましくは少なくとも９０重量／重量％を占める。
【０２６２】
本開示の別の実施形態では、乳製品は、予め製造されたガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の添加によって強化されていない乳製品である。
【０２６３】
本開示の別の実施形態では、ポリペプチド処理ミルクベース基質は、乳製品中の１つの成分として使用される前には乾燥されない。
【０２６４】
本開示の別の実施形態では、乳製品は、アイスクリームである。本発明との関連で、アイスクリームは、高脂肪アイスクリーム、低脂肪アイスクリーム、又はヨーグルト若しくは他の発酵乳製品をベースとするアイスクリームなどの、任意の種類のアイスクリームであってよい。アイスクリームは、当該技術分野で知られる任意の方法によって製造し得る。
【０２６５】
本開示の別の実施形態では、乳製品はミルク又はコンデンスミルクである。
【０２６６】
本開示のさらに別の実施形態では、乳製品は超高音殺菌（ＵＨＴ）ミルクである。本開示との関連で、ＵＨＴ乳は、細菌胞子を含む全微生物を殺滅することを意図した滅菌手順を受けているミルクである。したがって、ＵＨＴ処理には、１３０℃で３０秒間の熱処理、又は１４５℃で１秒間の熱処理が含まれる。
【０２６７】
本開示の別の実施形態では、乳製品はＥＳＬミルクである。本発明との関連で、ＥＳＬミルクは、精密濾過及び／又は熱処理のために貯蔵寿命が延長され、２〜５℃の貯蔵棚上で少なくとも１５日間、好ましくは少なくとも２０日間、新鮮さを維持することができるミルクである。本開示の別の実施形態では、乳製品は発酵乳製品（例えば、ヨーグルト）である。
【０２６８】
大多数の発酵乳製品で使用される微生物は、一般に「乳酸」菌と呼ばれる細菌の群から選択される。本明細書で使用される場合、用語「乳酸菌」は、糖を発酵させて、主として生成される酸としての乳酸、酢酸及びプロピオン酸を含む酸を生成するグラム陽性菌、微好気性菌又は嫌気性菌を示す。工業的に最も有用な乳酸菌は、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、シュードロイコノストック（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種、ペディオコッカス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種及びプロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種を含む「ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌａｌｅｓ）」目の中に見出される。さらに、単独で又は乳酸菌と組み合わせて食品培養物として頻繁に使用される嫌気性細菌のビフィズス菌（すなわち、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種）の群に属する乳酸産生菌が、乳酸菌の群に一般に含まれる。
【０２６９】
乳酸菌は、通常、バルクスターター増殖のための冷凍若しくはフリーズドライ培養物として、又は発酵乳製品を製造するための発酵容器内若しくはバット内へ直接接種することを企図した、いわゆる「Ｄｉｒｅｃｔ  Ｖａｔ  Ｓｅｔ」（ＤＶＳ）培養物として乳業に供給される。そのような培養物は、一般に、「スターター培養物」又は「スターター」と呼ばれる。
【０２７０】
よく使用されている乳酸菌のスターター培養株は、一般に、約３０℃に最適な成長温度を有する中温性生物と、約４０℃〜約４５℃の範囲に最適な成長温度を有する高温性生物とに分けられる。中温性の群に属する代表的な生物としては、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス亜種クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモンス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｎｓ）、シュードロイコノストック・メセンテロイデス亜種クレモリス（Ｐｓｅｕｄｏｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ペジオコッカス・ペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・カゼイ亜種カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｃａｓｅｉ）及びラクトバチルス・カゼイ亜種パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ  ｓｕｂｓｐ．ｐａｒａｃａｓｅｉ）が挙げられる。高温性乳酸菌種としては、例として、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ラクティス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）及びラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）が挙げられる。
【０２７１】
また、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）及びビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）を含むビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する嫌気性細菌も乳製品スターター培養物としてよく使用されており、一般に乳酸菌の群に含まれる。さらに、プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）の種は、特にチーズの製造における乳製品スターター培養物として使用される。さらに、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する生物は、食品スターター培養物としてよく使用される。
【０２７２】
微生物スターター培養物の別の群は、特に特定のタイプのチーズ及び飲料の製造において使用される酵母培養物及び糸状菌の培養物を含む真菌培養物である。真菌の例としては、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、ペニシリウム・カンディダム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、ゲオトリクム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｎｄｉｄｕｍ）、トルラ・ケフィア（Ｔｏｒｕｌａ  ｋｅｆｉｒ）、サッカロミセス・ケフィア（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｅｆｉｒ）及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が挙げられる。
【０２７３】
本発明の一実施形態では、ミルクベース基質の発酵に使用される微生物は、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、又はストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）及びラクトバチルス・デルブレッキイ亜種ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の混合物である。
【０２７４】
本開示の方法に使用される発酵工程は当技術分野においてよく知られており、当業者であれば、温度、酸素、微生物の量及び特性、炭水化物、香味料、ミネラル、酵素などの添加物、及び処理時間などの好適なプロセス条件を選択する方法を知っているであろう。明らかに、発酵条件は、本発明の達成を支持するように選択される。
【０２７５】
発酵の結果として、ミルクベース基質のｐＨは低下するであろう。本開示の発酵乳製品のｐＨは、３．５〜６の範囲内、例えば３．５〜５の範囲内、好ましくは３．８〜４．８の範囲内であり得る。
【０２７６】
したがって、本開示の特定の実施形態は、ポリペプチド又はポリペプチド組成物を使用する方法、又はオリゴ糖を産生するための上記の改変宿主細胞タイプのいずれか１つ以上を使用する方法に関する。オリゴ糖は、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、マルトオリゴ糖、乳果オリゴ糖及びキシロオリゴ糖を含むが、これらに限定されない。
【０２７７】
特定の実施形態では、オリゴ糖は、例えば、ラクツロース、トレハロース、ラムノース、マルトース、スクロース、ラクトース、又はセロビオースなどの二糖基質を含む培地中でポリペプチドを発現する本開示の改変宿主細胞をインキュベートすることによって産生される。このインキュベーションを、オリゴ糖が産生される条件下で行なう。細胞は、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品及びプロバイオティクス食品からなる群から選択される製品の一部であってよい。或いは、オリゴ糖を回収し、その後、目的製品の調製前後にこの製品に添加することができる。
【０２７８】
特定の実施形態では、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品及びプロバイオティクス食品からなる群から選択される製品を製造するための本明細書に開示した改変宿主細胞の使用が提供される。
【０２７９】
別の実施形態では、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチド若しくはポリペプチド組成物（又は、本明細書で開示する細胞）の使用が提供される。一態様では、ヨーグルト、チーズ、発酵乳製品、栄養補助食品及びプロバイオティクス食品からなる群から選択される製品の一部とするガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチド若しくはポリペプチド組成物、又は本明細書で開示する細胞の使用が提供される。特定の実施形態では、製品は、ヨーグルト、チーズ又は発酵乳製品である。別の態様では、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を増強するガラクトオリゴ糖を産生するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチド若しくはポリペプチド組成物（又は、改変宿主細胞）の使用が提供される。別の態様では、混合培養発酵でのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を増強するガラクトオリゴ糖を製造するための、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチド若しくはポリペプチド組成物、又は改変宿主細胞の使用が提供される。
【０２８０】
別の態様では、本明細書で開示するトランスガラクトシル化ポリペプチド又はポリペプチド組成物を製造する方法であって、ポリペプチドの発現を可能にする条件下、好適な培養培地中において本明細書で開示する改変宿主細胞を培養する工程、及びその結果生じるポリペプチドを培養物から回収することを含む方法が提供される。ガラクトオリゴ糖を製造する方法であって、本明細書で開示するポリペプチド若しくはポリペプチド組成物、又は本明細書で開示する細胞と、ラクトースを含むミルクベースの溶液とを接触させる工程を含む方法が提供される。
【０２８１】
オリゴ糖の添加により、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のみ、又は混合培養物中のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の増殖を増強することができる。
【０２８２】
他の実施形態では、トランスガラクトシル化ポリペプチド又はポリペプチド組成物を、キモシン又はレンニンなどのプロテアーゼ、ホスホリパーゼなどのリパーゼ、アミラーゼ、トランスフェラーゼ及びラクターゼなどの他の酵素とともに使用することができる。一態様では、本明細書に開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドは、ラクターゼとともに使用することができる。これは、特に低ラクトースレベルで本明細書に開示するトランスガラクトシル化ポリペプチドによる処理を行った後の残留ラクトースを減少させることが望ましい場合に特に有用であり得る。一実施形態では、酵素は、細菌由来の（例えば、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科由来の）、例えばビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のラクターゼであり、このラクターゼは国際公開第２００９／０７１５３９号パンフレット及び国際公開第２０１３／１８２６８６号パンフレットに記載されている。
【実施例】
【０２８３】
本発明のいくつかの態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができるが、それらの実施例は限定するものと解釈すべきでない。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
【０２８４】
実施例１
β−ガラクトシダーゼ及びラクターゼを産生するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞における、望ましくないｐ−ニトロベンジルエステラーゼ酵素副活性の同定
本開示の出願人らは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞中で産生されるβ−ガラクトシダーゼ酵素を用いてヨーグルト及びＵＨＴミルクを調合する場合の、これらの乳製品における不快な異臭が存在することを発見した。例えば、ヨーグルト製品又はＵＨＴミルク製品にβ−ガラクトシダーゼ酵素を添加した１日目に、４人のうち１人がヨーグルト中の異臭を検出することができ、この異臭は５日目までに著しく悪化した。異臭の特性評価は、製品中に短鎖遊離脂肪酸（例えば、酪酸）を与えるリパーゼ活性と一致した。
【０２８５】
したがって、これらのヨーグルト及びＵＨＴミルク製品において検出された異臭をさらに評価するために、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの小規模生産からの物質を、リパーゼ活性についてスクリーニングしたが、リパーゼ活性は検出されなかった。リパーゼ活性のスクリーニングは、概ね、以下のように行った：リパーゼ含有試料とともにトリオクタン酸グリセリル基質を３７℃で１０分間インキュベートした後、形成された遊離脂肪酸の量をＮＥＦＡ法によって測定する。ＮＥＦＡ  Ｃキット（ＭＥＧＡＺＹＭＥ）の原理は、遊離脂肪酸を補酵素Ａでエステル化し、次いで過酸化水素の形成下で酸化する３段階反応である。酵素反応により、過酸化水素は紫色のキノニミン着色を引き起こし、インキュベーション直後にＯＤ５２０ｎｍを読み取る。さらに、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主において産生された（すなわち、小規模食品グレード発酵によって産生され、噴霧乾燥された）β−ガラクトシダーゼの物質「Ｅ」はヨーグルトにおける官能分析に合格し、さらに、最終製品に異臭のリスクがないことを示した。
【０２８６】
最終製品（ヨーグルト及びＵＨＴミルク）における異臭の突然の検出を説明するために、いくつかのシナリオが考えられている。例えば、異臭は、β−ガラクトシダーゼ産生におけるＵＦＣのリパーゼ汚染、噴霧乾燥／ブレンド中のリパーゼ汚染、又は宿主生物（バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ））から発現されるリパーゼのバッチ間変動であり得る。
【０２８７】
エステラーゼ／リパーゼ副活性の定性的評価
上記のヨーグルト及びＵＨＴミルク製品中の異臭をさらに評価するために、噴霧乾燥したβ−ガラクトシダーゼのいくつかの試料（すなわち、β−ガラクトシダーゼの大規模産生に由来する）を、１％のトリブチリン、１．５％のレシチン、０．０１ＭのＣａＣｌ２を含む０．０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）及びフェノールレッドを含む新たに開発した寒天スポットプレート上に適用した。リパーゼ／ホスホリパーゼ活性が、ウェルの周りのプレート上の黄色のハローとして検出され、３つの試料の全てが、リパーゼ／ホスホリパーゼ活性について陽性と同定された。したがって、これらの試料中で検出されたリパーゼ／ホスホリパーゼ活性は、リパーゼ／ホスホリパーゼ活性がいくつかの独立したバッチ中に存在したので、噴霧乾燥中のリパーゼからの交差汚染の結果ではないことを示した。例えば、試料「Ｃ」中のリパーゼ活性を、ＬＩＰＵ−Ｋ（Ｅ１１７）分析を使用し、試料ブランク値を補正して０．４１  ＬＩＰＵ／ｇと定量された。
【０２８８】
しかし、ホスホリパーゼはしばしばリパーゼ活性を含み、上記アッセイはスポットプレート中にリパーゼ基質（すなわち、トリブチリン）及びホスホリパーゼ基質（すなわち、レシチン）の混合物を使用したので、試料がホスホリパーゼ基質のみのスポットプレートアッセイで陽性であるかどうかを試験することとした（図１Ａ）。試料「Ｃ」を適用した試料は、ホスホリパーゼ活性について陽性ではなかった（図１Ａ中、ウェル「Ａ」及び「Ｂ」の周りにハローは見られなかったので）。したがって、この結果は、副活性がリパーゼ／エステラーゼを加水分解するトリグリセリドであることを示した。
【０２８９】
さらに、噴霧乾燥した物質中に存在するこの特異的リパーゼ酵素活性に対する混合基質スポットプレートの感度を試験した。０．４１ＬＩＰＵ／ｇを有すると定量された試料「Ｃ」についていくつかの希釈を行い、各希釈物１０μＬを混合基質スポットプレートに適用した（例えば、表１及び図１Ｂを参照）。
【０２９０】
【表１】
2020516254.tif 000003
【０２９１】
驚くべきことに、試料はわずかに０．４１ＬＩＰＵ／ｇを保持しただけであったが、１６０倍に希釈されてもなお陽性ハローを検出することができ（図１Ｂを参照）、１０μＬをプレートに適用した場合に、溶液中わずか０．００２６ＬＩＰＵ／ｇ程度の検出が可能であることを示した。一般に、ＬＩＰＵ−ｋ  Ｅ１１７法では、０．１ＬＩＰＵ／ｇ未満を検出することは不可能である（データは示さず）。比較すると、これは、試料中に検出されたリパーゼ／エステラーゼ活性は中性ｐＨを好み、乳製品用途において「チーズ様」異臭を生じることも知られている短鎖脂肪酸に特異的であることを示し得た。
【０２９２】
発酵におけるエステラーゼ副活性
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主中で産生されたβ−ガラクトシダーゼ試料Ａ及びＢの２つの安定化限外濾過濃縮物（ＵＦＣ）中間体を試験して、リパーゼ活性がＵＦＣ試料中に存在し、したがって噴霧乾燥中の汚染経路に由来しないことを確認した。例えば、２つのＵＦＣ試料Ａ及びＢは同じ発酵に由来し、したがって、両試料は汚染事象が発酵後に生じない限り、リパーゼ活性を含むはずである。より特には、リパーゼ／エステラーゼ活性の試験結果が陽性であった粉末β−ガラクトシダーゼ物質は全て、試料Ａ物質に由来した。より具体的には、発酵物を２つに分け、使用を意図した用途に応じて、２つの異なる仕様後に安定化した。Ａ及びＢの仕様を以下の表２に示す。
【０２９３】
【表２】
2020516254.tif 000004
【０２９４】
リパーゼ活性（ＬＩＰＵ−ｋ、Ｅ１１７）の定量により、両ＵＦＣ物質がリパーゼ副活性を有することが確認され、リパーゼ副活性がバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）産生宿主細胞に由来することが示された。さらに、より低いｐＨ及びソルビン酸カリウムで安定化した材料（試料Ａ）は、１０００ＢＬＵ（表３を参照）に正規化してＵＦＣの希釈を補正した場合であっても、より高いｐＨ及び塩化ナトリウムで安定化した材料（試料Ｂ）よりもリパーゼ／エステラーゼ活性が低かった。
【０２９５】
【表３】
2020516254.tif 000005
【０２９６】
異臭が最初の官能試験で検出されなかった理由をより明確に理解するため、エステラーゼ活性を定量するための試料をいくつか選択した。これらの試料中のリパーゼレベルを、ＬＩＰＵ−ｋ（Ｅ１１７）を使用して定量し、試料ブランク値を補正し、且つ１０００ＢＬＵに正規化して、結果を比較した。比較した試料は、（Ａ）ＵＦＣ  Ａ（大規模発酵から）由来の粉末物質「Ｃ」、（Ｂ）噴霧乾燥物質Ｄ（小規模発酵から）である試料、及び（Ｃ）官能試験に使用した実際の試料Ｅ（小規模発酵から）であった。定量したリパーゼレベルを表４に示す。β−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化されたリパーゼ／エステラーゼレベルで見ると、試料Ｄ（小規模発酵）及び試料Ｅ（官能分析に使用）中のリパーゼがより少なかったことを示している。
【０２９７】
【表４】
2020516254.tif 000006
【０２９８】
より特には、小規模発酵由来の試料Ｄ及びＥは、大規模発酵試料Ｃ由来の物質と比較して、約半分のリパーゼレベルを示している。これは大規模（発酵）生産に入った場合にリパーゼ／エステラーゼレベルが増加したことを示す。上記を考慮すると、試料Ｃの大規模発酵は小規模発酵（すなわち、試料Ｄ及びＥ）よりも細胞倍加数（すなわち、世代数）が多いので、大規模（発酵）生産からの試料Ｃが小規模（発酵）生産からの試料Ｄ及びＥと比較して高いリパーゼ活性を示すことは、さほど驚くべきことではない。したがって、より高いレベルの（好ましくない）リパーゼ副活性についての最も可能性のある説明は、その活性がβ−ガラクトシダーゼ酵素を産生するために使用したバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞に由来することである。例えば、ヨーグルト中のこの異臭味の閾値限界は当初は知られていなかったが、本明細書で示すデータは、０．１１ＬＩＰＵ／１０００ＢＬＵから０．２５ＬＩＰＵ／１０００ＢＬＵになると、第１週以内の味見で、異臭が検出限界未満から検出限界を超えるまでにシフトしたことを示す。
【０２９９】
リパーゼ／エステラーゼザイモグラム
ナノＬＣ−ＭＳＭＳによる同定のための選択領域を狭めるために、リパーゼ／ホスホリパーゼザイモグラムを実施した。物質Ｃを（ｐＨ３〜１０）等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上に対称的に負荷した。その後、ゲルを２つに切断した。第１の部分（図２、パネルＢ）を、１％のトリブチリン、０．７５％のレシチン、０．２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）、０．０１ＭのＣａＣｌ２及びフェノールレッドを含有する寒天ゲル（図２、パネルＡ）上に置き、４０℃で２時間インキュベートした。第２の部分を固定し、クーマシーで染色した（図２、パネルＣ）。寒天ゲル（図２、パネルＡ）から、オーバーレイを介してリパーゼ／エステラーゼ（図２、パネルＢ）が基質を分解し、ゲル中に透明な孔を残した場所を見ることができる。上方矢印で示すクーマシーブルー染色ゲル上のバンド（図２、パネルＣ）は、ゲルの底部から１３〜１４ｍｍに位置し、寒天ゲルに示すように（図３を参照）、リパーゼ活性が位置したのと同様であった。図２、パネルＣに示すゲル中の矢印で示すバンドを、同定のために切り出した。
【０３００】
ナノＬＣ−ＭＳＭＳによる同定の結果は、上方バンド（図２、パネルＣの上方矢印）において、同定されたパラ−ニトロベンジルエステラーゼ（ｐ−ＮＢＥ；配列番号２）を示し、これは、リパーゼ活性を有するとして文献に記載されている（Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。結果はさらに、ｐ−ＮＢＥ酵素がバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞に由来することを示している（すなわち、交差汚染とは対照的に）。さらに、カルボキシエステラーゼが下方のバンド（図２、パネルＣの下方の矢印）で同定され、この同定されたカルボキシエステラーゼはｐ−ＮＢＥに対して高い配列相同性を有する。しかし、配列比較により、この同定されたカルボキシエステラーゼがパラ−ニトロベンジルエステラーゼのタンパク質分解による切断の人工産物であることが明らかになった。
【０３０１】
Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐ−ＮＢＥの生化学的特徴は文献に記載されている（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。この酵素は、短鎖ｐ−ニトロフェニルエステル及びトリアシルグリセロールに対して特異的である。さらに、このｐ−ＮＢＥは最適ｐＨが８であり、Ｃａ２＋によって刺激される。さらに、本開示において使用されるリパーゼ／エステラーゼスポットプレートはｐＨ７．４であり、Ｃａ２＋を含み、これらの特定のスポットプレートがｐ−ＮＢＥ酵素に対して非常に高い感受性を有する理由のさらなる証拠を提供する。例えば、ｐ−ＮＢＥ酵素はｐＨ５ではほとんど不活性（約１０％の残存活性）であるが、ｐＨ６．５ではその最適ｐＨ８に対して略５０％の活性を保持している（Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。したがって、ｐ−ＮＢＥは低ｐＨでより不安定であるので、ＵＦＣの異なるｐＨ仕様は、物質Ａと比較して物質Ｂにおいてより多くのリパーゼ活性が観察される理由を説明し得る。さらに、ｐ−ＮＢＥは５０℃まで安定であるが、５０℃を超える温度で急速且つ不可逆的に不活性化される。
【０３０２】
リパーゼ／エステラーゼ活性の不活性化の推定方法
５０℃を超えるが５５℃未満の熱処理がβ−ガラクトシダーゼ活性に影響を及ぼすことなく、リパーゼ／エステラーゼ活性を不活性化し得るかどうかを試験した（すなわち、５５℃を超える温度は、β−ガラクトシダーゼ活性を著しく損なうと考えられる）。したがって、物質Ａ及びＣを、５３℃で２０分間、４０分間及び６０分間インキュベートすることによって試験した。粉末物質Ｃには物理的変化は認められなかったが、ＵＦＣ試料Ａには激しい凝集が生じた。この凝集物を遠心分離（１２，０００ｒｐｍで５分間）により除去した。残留エステラーゼ活性を寒天スポットプレート上で半定量化した（図４を参照）。
【０３０３】
粉末を熱処理することによるハローの大きさの差は観察されなかった。リパーゼ／エステラーゼスポットプレートの感度を測定したときの実験におけるハローサイズを比較すると、ＵＦＣ  Ａの推定残留エステラーゼ活性は以下の通りである：
ＣＢ−１００％
Ｂ−２０分−５％
Ｂ−４０分−２．５％
【０３０４】
さらに、ラクターゼ活性を、無色の基質、２−ニトロフェリルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）の、黄色の２−ニトロフェノール（ＯＮＰ）及びガラクトースへの３０℃での１０分間の加水分解にしたがって定量した。７５０μＬの１０％炭酸ナトリウムで反応を停止させ、ＯＮＰをＯＤ４２０で測定した。活性は、試料Ｃの希釈によって調製した標準曲線に対して計算した。表５に示すのは試料の５３℃熱処理後のβ−ガラクトシダーゼ活性である。
【０３０５】
【表５】
2020516254.tif 000007
【０３０６】
これから、リパーゼ活性とβ−ガラクトシダーゼ活性との間の関係を計算することができる。表６に示すように、リパーゼ活性は２０分間のインキュベーション（すなわち、試料Ｂ２０；表６）直後に大きく減少しており、したがって、ヨーグルト及びＵＨＴミルク中の異臭の検出限界未満であるはずである。
【０３０７】
【表６】
2020516254.tif 000008
【０３０８】
４８℃、５１℃及び５３℃でのラクターゼ及びエステラーゼ活性の安定性をさらに評価することとした。試料をアリコートし、種々の温度及び時間でインキュベートした。その後、エステラーゼ（図５）及びラクターゼ（図６）活性を測定し、生成した凝集物を前記のように遠心分離によって除去した。
【０３０９】
図５に示すように、エステラーゼ活性は、４８℃のインキュベーションによって有意に低下せず、エステラーゼを不活性化するために１２９分間以上インキュベートする必要があろう。図５に示すように、５３℃のインキュベーションが最も有効な温度であり、２０分後に活性が約９５％低下した。図６に示すように、２０分間のインキュベーション後、使用した温度（すなわち、４８℃、５１℃及び５３℃）の間で回復にあまり差はなく、さらなるインキュベーション時間は、試験したすべての温度でラクターゼ活性のさらなる低下を単にもたらすだけである。したがって、エステラーゼ安定性に基づいて、５３℃の温度で２０分間が、ＵＦＣ試料Ａの推奨される処理であろう（しかし、より大きな容量にはより長いインキュベーション時間が必要となり得る）。
【０３１０】
用量依存適用試験
ＵＨＴミルク及びヨーグルトの両方における異臭の分析フィンガープリントを決定するために、種々の用量の物質を用いて試験した（物質は下記の表７及び８に示すように投与された）。ＵＨＴミルクを次のように処理した；間接管式加熱、下流ホモジナイゼーション  ２００バール、７５℃。
【０３１１】
【表７】
2020516254.tif 000009
【０３１２】
【表８】
2020516254.tif 000010
【０３１３】
５℃又は周囲温度で１週間貯蔵した後、試料を味見したところ、０．０３３％を超える投与はヨーグルト及びＵＨＴミルクの両方において異臭をもたらし、一方、０．０３３％以下の投与では１週間の貯蔵後に異臭を知覚することができないことがわかった（下記の表９及び１０を参照）。
【０３１４】
【表９】
2020516254.tif 000011
【０３１５】
【表１０】
2020516254.tif 000012
【０３１６】
さらに、ヨーグルト及びＵＨＴミルクを１週間貯蔵した後、試料をまた、主にケトン及び遊離脂肪酸を含む香味成分の分析のために送った。異臭プロファイルが２つの用途で異なることは明らかであった。ヨーグルトでは（図７）、β−ガラクトシダーゼ粉末物質Ｃの用量を増加させることによって増加したのは主に遊離脂肪酸レベルであり、ケトンの度合いはさほどではなかった。ＵＨＴミルクでは（図８）、遊離脂肪酸及びケトン（特に２−ヘプタノン）はいずれも用量に従って増加していた。
【０３１７】
したがって、間接管式加熱によってＵＨＴミルクを処理したことは、異臭をいくらか隠すようであった。例えば、ＵＨＴミルク（直接注入によって処理された）における別の試験は、異臭に対してより敏感であるようであった。例えば、図９に示すように、０．１３％投与した場合、貯蔵期間にわたって遊離脂肪酸（特に、２−ヘプタノン及び２−ノナノン）のレベルが増加していることが明らかにわかる。
【０３１８】
実施例２
ｐ−ニトロベンジルエステラーゼ副活性が欠損するように遺伝子改変されたバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主細胞
パラ−ニトロベンジルエステラーゼ（配列番号２）をコードするバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｎｂＡ遺伝子（配列番号１）を、Ｊａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｂｉｔｚ（２００６）によって記載されたマーカーレス法を用いて欠失させた。組込みプラスミドｐＫＳＶ−Ｉ−Ｓｃｅ−Ｋｍの構築を以下のように行った。２０ピコモルの２つの一本鎖オリゴマー、Ｉ−ＳｃｅＩ−１（ｃｇａｔＴＡＧＧＧＡＴＡＡＣＡＧＧＧＴＡＡＴａｔ；配列番号１９、下線を有する太字はＩ−ＳｃｅＩ制限酵素部位の相同配列である）及びＩ−ＳｃｅＩ−２（ｃｇａｔＡＴＴＡＣＣＣＴＧＴＴＡＴＣＣＣＴＡａｔ；配列番号２０）を、９８℃で７分間インキュベートし、次いで、５５℃で５分間保持して、オリゴマーをアニールした。アニールした断片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）でリン酸化し、次いで、ｐＫＳＶ７のＣｌａＩ部位とライゲートした（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，１９９２）。ｐＫＳＶ７に存在するクロラムフェニコール耐性遺伝子を排除するために、プラスミドをＮｃｏＩ及びＭｆｅＩで消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）で平滑化した。アガロースゲル電気泳動によってクロラムフェニコール耐性遺伝子断片からｒｅｐＦ及びｃｏｐ−６を含有する断片を分離し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、自己連結させて、ｐＫＳベクターを作製した。ｐＫＳベクターを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した後、プラスミドｐＤＧ７８０（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）に由来するカナマシン耐性遺伝子に連結した。ここで、得られたプラスミドは「ｐＫＳＶ−Ｉ−Ｓｃｅ  Ｋｍ」である。
【０３１９】
バチルス・サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８ゲノムＤＮＡ由来のｐｎｂＡ遺伝子の上流及び下流の遺伝子座を、以下のプライマーを使用して増幅した：
プライマー番号９８１：５’−ＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＧＧＴＣＧ−３’（配列番号２１）；プライマー番号９８４：５’−ＧＣＡＣＣＡＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＴＴＴＴＣＣＣＣＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＣＣＣＴＴＴＡＡＣＣＧＡＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’（配列番号２２）；プライマー番号９８５：５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号２３）及びプライマー番号９８３：５’−ＧＡＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＴＴＡＡＡＧＧＧＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＡＧＧ−３’（配列番号２４）。
【０３２０】
２つのＰＣＲ産物を、プライマー番号９８１：５’−ＡＡＣＣＡＧＣＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＡＣＧＣＣＴＧＧＴＡＧＧＣＧ−３’（配列番号２１）及びプライマー番号９８５：５’−ＡＴＡＴＧＧＡＴＣＣＧＴＴＣＴＡＣＴＡＧＡＣＡＴＴＴＡＴＧＡＡＧＴＡＣＡＧ−３’（配列番号２３）を使用し、融合ＰＣＲによって構築した。
【０３２１】
アンプリコンを制限部位ＳｐｅＩ及びＢａｍＨＩで消化し、制限酵素ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで線状化したｐＫＳＶ−Ｉ−Ｓｃｅ−Ｋｍベクターに連結し、得られたベクターをｐＫＳＶ−ＩＳｃｅ−ｐｎｂＡと命名した。
【０３２２】
ｐＫＳＶ−ＩＳｃｅ−ｐｎｂＡベクターを形質転換し、親Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞のゲノムに組み込んだ。制限酵素Ｉ−Ｓｃｅの発現コンストラクトを含むｐＫＢＪ２３３（Ｊａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｂｉｔｚ，２００６）と呼ばれる第２のベクターを使用して、親Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ｐｋｓＶ−ＩＳｃｅ−ｐｎｂＡ）宿主細胞を形質転換した。１２時間毎に培地を更新することによって、この株を７２時間増殖させ、次いで、ルリア寒天プレート上で再単離した。カナマイシン感受性クローンを選択し、ＰＣＲによってｐｎｂＡ遺伝子の欠失について試験した。得られたＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）娘細胞（すなわち、欠失ｐｎｂＡ遺伝子を含む）をＣＢ１０３と名付けた。
【０３２３】
実施例３
宿主株におけるＰ−ニトロベンジルエステラーゼ遺伝子のノックアウト後のＵＦＣ物質の評価
上記実施例２に記載したように、同定された好ましくないｐ−ＮＢＥ酵素活性（配列番号２）をコードするＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）遺伝子を、本開示のＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（β−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼ産生）宿主細胞において欠失させた。したがって、実施例２に記載される、得られたｐ−ＮＢＥ欠失Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞を、β−ガラクトシダーゼの発酵に使用した。本明細書において、特定の遺伝子の欠失（ノックアウト）は、問題の欠失遺伝子が宿主細胞に必須であるか、又は宿主細胞が類似の特徴を有する別の酵素を発現することによって補償する場合、特定のリスクを提供することに留意されたい。本明細書に記載されるように、ｐ−ＮＢＥ酵素をコードする遺伝子は、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞に必須ではなく、したがって、ｐ−ＮＢＥ欠失Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞の発酵から生じるＵＦＣ物質のエステラーゼ活性を、スポットプレート分析によって試験した。
【０３２４】
陽性対照として、２０μＬの５３℃で熱処理した試料を適用した。同様に、１０μＬ及び２０μＬの新しい物質（すなわち、ｐ−ＮＢＥ欠失Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞中で産生された）をスポットプレートに適用し、４０℃で２４時間インキュベートした。図１０に示すように、新しい物質においてエステラーゼ活性は検出されなかった。図１０に示すように、黄色のハローは、５３℃で処理した試料（図１０中、５３Ｃと表示）におけるリパーゼ活性を示す。対照的に、ｐ−ＮＢＥ酵素をコードする遺伝子が欠失したＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞から産生された試料（実施例２）に対応する、「新」（すなわち、黄色のハローを欠く）と表示した図１０のスポットプレートの穴は、検出可能なリパーゼ活性を有さなかった（図１０）。
【０３２５】
続いて、試料Ｃ（すなわち、ｐ−ＮＢＥ副活性を含む）及び新しいｐ−ＮＢＥを含まない物質（すなわち、Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Δｐ−ＮＢＥ宿主細胞から産生された）の両方を、ヨーグルト及びＵＨＴミルクの両方の適用試験において使用して（直接注入によって処理）、異臭が完全に消失したことを確認した。したがって、アッセイにおいて成分のわずかな変化も明確に検出可能であることを確実にするために、新しい物質を０．２０７％で過剰投与することとした。
【０３２６】
図１１（ヨーグルト）及び図１２（ＵＨＴミルク）に示すように、新しいＵＦＣ物質は対照（すなわち、図１１及び１２；レファレンス、酵素未添加）と同等で、したがって、新しいＵＦＣ物質は、特定の用途において異臭をもたらさないことが明らかに観察される。さらに、図１１及び図１２は、エステラーゼ含有物質（旧株）が他の物質（すなわち、新株）よりも高いレベルの遊離脂肪酸及びケトンを有し、ＵＨＴミルク中の２−ヘプタノンが、異臭の大きな原因になっていることを明確に示している。
【０３２７】
したがって、本明細書に記載されるように、本開示のβ−ガラクトシダーゼ及び／又はラクターゼを産生するために使用されるＢ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞（実施例２を参照）におけるｐ−ＮＢＥ酵素（配列番号２）をコードする遺伝子の欠失は、元の（親）Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞に存在するｐ−ＮＢＥ酵素副活性によって引き起こされる異臭を完全に消失させ、改変された（娘）Ｂ．サブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞においてはｐ−ＮＢＥ活性が消失している。
【０３２８】
参考文献
欧州特許出願第０４５８３５８号明細書
国際公開第２００１／５１６４３号パンフレット
国際公開第２００１／９０３１７号パンフレット
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Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  １９９４．
Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：４７１９，１９８５．
Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６，１９８９．
Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，  １６８：１１−１１５，１９７９．
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｐ−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１５：１０−１８，１９９５．
Ｆｅｒｒａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，”ｉｎ  Ｈａｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，１９８９．
Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ａｒｃｈ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  １３９：２１３−２１７，１９８１．
Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ”，Ｇｅｎｅ，１６７（１−２）：３３５−３３６，１９９５．
Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １６：７３５１，１９８８．
Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７７：６１，１９８９．
Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，９３：１９２５−１９３７，１９６７．
Ｈｏｌｕｂｏｖａ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３０：９７，１９８５．
Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ７７：６１，１９８９．
Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８９：７３−７６，１９８３．
Ｊａｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｉｂｉｔｚ，“Ｒｏｕｔｉｎｅ  Ｍａｒｋｅｒｌｅｓｓ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ”，Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．，７４（３）：１９４９−１９５３，２００６．
Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５７：６４７−６５２，２００１．
Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＲＲＬ  １７８９）：Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｚｙｍｅ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓ．Ｐｕｒｉｆ．，４５：２６２−２６８，２００６．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９０．
Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８１：２２８５，１９８５．
Ｍ．  Ｊ．  Ｇａｉｔ，ｅｄ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４．
Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３：１３１  −１３５，１９８６．
ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｊ．  Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１３０：２０３，１９８４．
Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，ＰＧＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，１９９４．
Ｏｌｉｖｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２９：６００−６０９，２０１１．
Ｐａｌｍｅｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２４７：２５５−２６４，２０００．
Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １５４：１５１−１５７，１９９７．
Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３，Ｉｎ  Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｎｅｓｈｅｉｎ，Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ，  ａｎｄ  Ｒ．  Ｌｏｓｉｃｋ，ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４２，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．
Ｒｉｂｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｔｅｒｅｐｈｔｈａｌａｔｅ  ｂｙ  ｐ−Ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｙｌｅｓｔｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，２７（４）：９５１−９６０，２０１１．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６０：６３９１−６３９８，２０１２．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９．
Ｓａｒｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：４０４，１９９０．
Ｓａｕｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５７：７１８−７２６，１９８４．
Ｓｈｉｍａｄａ，Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：１５７；  １９９６
Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇｍａｎ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｓｐｏＩＩＭ  ｇｅｎｅ”，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７４（７−８）：７０５−７１１，１９９２．
Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５１：６３４  １９８６．
Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １５８：４１１−４１８，１９８４．
Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７：２６１−２６３，１９８０．
【図１Ａ】
2020516254.tif 000013
【図１Ｂ】
2020516254.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020516254.tif 000020
【図８】
2020516254.tif 000021
【図９】
2020516254.tif 000022
【図１０】
2020516254.tif 000023
【図１１】
2020516254.tif 000024
【図１２】
2020516254.tif 000025
【図１３】
2020516254.tif 000026
【配列表】
2020516254000001.app
【国際調査報告】
2020516254.tif 000027
2020516254.tif 000028
2020516254.tif 000029