(57)【要約】本明細書中、がんを有するか、有する疑いがあるか、またはがんのリスクのある対象から得た生体試料などの試料を、がんの予後不良を表す上記試料におけるがん幹細胞の存在を評価するために、解析するための方法およびキットを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を解析するための方法であって、
（ｉ）がん幹細胞を含む疑いのある試料を準備するステップと、
（ｉｉ）前記試料におけるＣＤ１４のレベルを測定するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｉ）が、ＣＤ１４タンパク質のレベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｉ）を、可溶型であるかまたは細胞表面に発現した、ＣＤ１４タンパク質のレベルを測定するために行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＤ１４タンパク質のレベルを、免疫組織化学的アッセイ、イムノブロッティングアッセイ、またはフローサイトメトリーアッセイにより測定する、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｉｉ）が、ＣＤ１４をコードする核酸のレベルを測定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ１４をコードする核酸のレベルを、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイまたは核酸マイクロアレイアッセイにより、測定する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記試料におけるＣＤ４４のレベルを測定するステップをさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、がんを有するかまたはがんを有する疑いのあるヒトの患者の生体試料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が、体液の試料または組織の試料である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織の試料が、腫瘍部位または疑わしい腫瘍部位から得られている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＣＤ１４のレベル、またはＣＤ１４およびＣＤ４４のレベルに基づき、前記試料におけるがん幹細胞の存在を決定するステップであって、上昇したレベルのＣＤ１４または上昇したレベルのＣＤ１４およびＣＤ４４が、前記試料におけるがん幹細胞の存在を表す、ステップをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトの患者が、肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がんであるがんを有するか、または有する疑いがある、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ヒトの患者が、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒトの患者の生存率を決定するステップであって、上昇したレベルのＣＤ１４または上昇したレベルのＣＤ１４およびＣＤ４４が、不十分な生存率を表す、ステップをさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ヒトの患者をがんのための治療に供するステップをさらに含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
予後不良に関連するがんを検出するための方法であって、
（ｉ）がんを有する対象の試料を準備するステップと、
（ｉｉ）前記試料におけるＣＤ１４のレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）前記対象が予後不良に関連するがんを有するかどうかを決定するステップであって、前記試料におけるＣＤ１４のレベルが所定のレベルより高い場合に、前記対象を、予後不良に関連するがんを有すると識別する、ステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
前記試料におけるＣＤ４４のレベルを測定するステップであって、ＣＤ１４のレベルおよびＣＤ４４のレベルの両方が所定のレベルより高い場合に、前記対象を、予後不良に関連するがんを有すると識別する、ステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がんを有するヒトの患者である、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒトの患者が、非小細胞肺がんを有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
対象のがんの予後診断のための、ＣＤ１４のレベル、および任意選択でＣＤ４４のレベルを測定するための１つ以上の検出試薬の使用であって、前記がんの予後診断が、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法により行われる、使用。
【請求項２１】
がん幹細胞の濃度を高めるための方法であって、
（ｉ）がん幹細胞を含む疑いのある試料を準備するステップと、
（ｉｉ）前記試料から、ＣＤ１４＋細胞またはＣＤ１４＋／ＣＤ４４Ｈｉ細胞を単離するステップと
を含む、方法。
【請求項２２】
前記がん幹細胞が、肺がん幹細胞、肝臓がん幹細胞、結腸がん幹細胞、また膵臓がん幹細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記がん幹細胞が、非小細胞肺がん幹細胞である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１７年１月４日に出願の米国仮特許出願第６２／４４２，０７７号に対する優先権を主張する。この全内容は、本明細書中参照として組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは、世界的にみて最も一般的な致死性の悪性腫瘍であり、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、最も一般的な種類の肺がんである。ドライバー遺伝子の同定および具体的な標的療法の成功により、多くの肺がん患者は、治療に対して良好な初期応答を示す。しかしながら、大部分の患者は、最終的に、薬剤耐性を発症し、１年以内に再発する。
【０００３】
従来の抗がん治療の戦略は、種類が特定されていないがん細胞を標的としている。しかしながら肺がんなどの固形腫瘍は、多くの場合、組織化した異種の細胞の集団を含む。腫瘍の微小環境（またはニッチ）を形成する複雑な細胞間相互作用は、大部分の悪性腫瘍を引き起こし得る、がん幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれる細胞の小さな集団と結びついている。ＣＳＣおよび腫瘍のニッチは共に、がんの再発、転移、および薬剤耐性に、主要な役割を果たしている。
【０００４】
よって、がん（たとえば肺がん）、たとえば予後不良に関連するがんを有する対象を同定するために、ＣＳＣに関するバイオマーカーを同定すること、ならびに、信頼できる診断方法および予後方法を開発することに、強く関心が集まっている。また、このようなバイオマーカーは、肺がんの機構に関する研究に有用であり、肺がんに有効な新規の治療の開発を促進するであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、がん幹細胞（たとえば肺がん幹細胞）の新規のバイオマーカー、たとえばＣＤ１４、またはＣＤ１４およびＣＤ４４の組み合わせの同定に少なくとも部分的に基づくものである。ＣＤ１４およびＣＤ４４は、分化したがん細胞と比較して、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）と共培養した肺がん幹細胞に差次的に存在することが、トランスクリプトームおよびプロテオームの解析を介して見いだされている。さらに、ＣＤ１４およびＣＤ４４は、肺がん患者の予後不良に相関することが判明した。さらに、ＣＤ１４はまた、肝臓がん、結腸がん、および膵臓がんを含む様々な種類のがん細胞に存在することが判明した。
【０００６】
よって、本開示の一態様は、試料を解析するための方法であって、（ｉ）がん幹細胞を含む疑いのある試料を準備するステップと、（ｉｉ）上記試料における、ＣＤ１４のレベル、および同様に任意選択でＣＤ４４のレベルを測定するステップを含む、方法を提供する。
【０００７】
一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ１４タンパク質のレベル、ＣＤ４４タンパク質のレベル、またはその両方を測定するステップを含む。一部の例では、試料における膜結合型のＣＤ１４タンパク質のレベルおよび／または膜結合型のＣＤ４４のレベルを測定する。他の実施形態では、試料における循環性（可溶性）ＣＤ１４のレベルおよび／または循環性（可溶性）ＣＤ４４のレベルを測定する。ＣＤ１４および／またはＣＤ４４のタンパク質レベルは、免疫組織化学的アッセイ、イムノブロッティングアッセイ、ＥＬＩＳＡ、またはフローサイトメトリーアッセイにより、測定され得る。
【０００８】
一部の実施形態では、本方法は、ＣＤ１４をコードする核酸、ＣＤ４４をコードする核酸、またはその両方のレベルを測定するステップを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４をコードする核酸のレベル、ＣＤ４４をコードする核酸のレベル、またはその両方を、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイまたは核酸マイクロアレイアッセイにより、測定する。
【０００９】
本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかで解析される試料は、がん、たとえば肺がん（たとえば非小細胞肺がんまたはＮＳＣＬＣ）、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がんを有するか、または有する疑いのあるヒトの患者の生体試料であり得る。一部の実施形態では、生体試料は、本明細書中記載のヒトの患者から、たとえば腫瘍部位または疑わしい腫瘍部位から入手され得る、組織の試料である。他の実施形態では、生体試料は、本明細書中記載のヒトの患者由来の体液の試料である。
【００１０】
本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかは、さらに、ＣＤ１４のレベル、ＣＤ１４のレベル、またはＣＤ１４およびＣＤ４４の組み合わせに基づき、試料におけるがん幹細胞（たとえば肺がん幹細胞、肝臓がん幹細胞、結腸がん幹細胞、または膵臓がん幹細胞）の存在を決定するステップを含み得る。上昇したレベルのＣＤ１４、上昇したレベルのＣＤ４４、または上昇したレベルのＣＤ１４およびＣＤ４４は、試料におけるがん幹細胞の存在を表す。
【００１１】
あるいはまたはさらに、本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかは、生体試料を入手するヒトの患者の生存率を決定するステップをさらに含み得る。上昇したレベルのＣＤ１４、上昇したレベルのＣＤ４４、または上昇したレベルのＣＤ１４およびＣＤ４４は、不十分な生存率を表す。一部の実施形態では、さらに本方法は、がんに関する治療、たとえば肺がん（たとえばＮＳＣＬＣ）に関する治療、肝臓がんに関する治療、結腸がんに関する治療、または膵臓がんに関する治療に、上記ヒトの患者を供するステップを含む。
【００１２】
別の態様では、予後不良に関連するがんを検出するための方法であって、（ｉ）がんを有する対象の試料を準備するステップと、（ｉｉ）上記試料におけるＣＤ１４のレベル、および同様に任意選択でＣＤ４４のレベルを測定するステップと、（ｉｉｉ）上記試料におけるＣＤ１４のレベル、またはＣＤ１４およびＣＤ４４の両方のレベルに基づき、上記対象が予後不良に関連するがんを有するかどうかを決定するステップとを含む、方法を提供する。試料におけるＣＤ１４のレベル、またはＣＤ１４およびＣＤ４４の両方のレベルが所定のレベルよりも高い場合、対象は、予後不良に関連するがんを有すると同定される。一部の例では、がんは、肺がん（たとえばＮＳＣＬＣ）、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がんとすることができる。
【００１３】
別の態様では、がん幹細胞（たとえば本明細書中に記載のがん幹細胞）の濃度を高めるための方法であって、（ｉ）肺がん幹細胞を含む疑いのある試料を準備するステップと、（ｉｉ）上記試料から、ＣＤ１４＋細胞および任意選択でＣＤ１４＋／ＣＤ４４Ｈｉ細胞を単離するステップとを含む、方法を提供する。
【００１４】
また本明細書中において、対象のがんの予後診断のための、ＣＤ１４のレベル、および任意選択でＣＤ４４のレベルを測定するための１つ以上の検出試薬の使用が提供され、ここでがんの予後診断は、本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかにより行われ得る。
【００１５】
本開示の１つ以上の実施形態の詳細を、以下の説明で記載する。本開示の他の特性または利点は、以下の図面およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、同じく添付の特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。
【００１６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成しており、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれており、本開示は、本明細書中提供されている特定の実施形態の詳細な説明と併用してこれら図面のうちの１つ以上を参照することにより、良好に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、ＣＤ１４およびＣＤ４４が、肺がん幹細胞（ＬＣＳＣ）の幹細胞性の維持に関与することを示している。Ａ：コロニーあたりのＮａｎｏｇ陽性幹細胞を、画像ベースのハイコンテント解析を介して解析した。ＣＬＳ１細胞は、ＣＡＦと共培養させたものと、ＣＡＦと共培養させないものを準備した（Ｎ＝４）。スケールバー、５０μＭ。上部のパネル：写真画像；下部のパネル：定量的な図。Ｂ：脂肪細胞への分化（ａｄｉｏｐｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）後に、油滴を染色するオイルレッドＯで陽性に染色されたＣＬＳ１／ＣＡＦ細胞（上部のパネル）。図面に表されるように異なる時点での、脂肪細胞の分化に供されたＣＬＳ１／ＣＡＦ細胞における、脂肪細胞のマーカーであるＰＰＡＲγおよびＬＰＬのＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ解析（下部パネル）。Ｃ：骨形成細胞への分化（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）後に、カルシウム沈着部を染色するアリザリンレッドＳで陽性に染色されたＣＬＳ１／ＣＡＦ細胞（上部のパネル）。図面に表されるように異なる時点での、骨芽細胞への分化（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）に供されたＣＬＳ１／ＣＡＦ細胞における、骨芽細胞のマーカーであるアルカリホスファターゼおよびオステオカルシンのＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ解析（下部パネル）。Ｄ：ＣＬＳ１／ＣＡＦ共培養物（Ｎ≧３匹のマウス）、分化したＣＬＳ１細胞（Ｎ≧３匹のマウス）由来のマウスの異種移植片腫瘍の発生率を、ＮＳＧマウスに異なる細胞数（１×１０４、１×１０３、１×１０２、および１０個の細胞）の皮下注射後に決定した。ＣＳＣの腫瘍をイニシエーションする頻度（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ：ＴＩＦ）を、Ｌ−ｃａｌｃｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して計算した。ＣＩ、信頼区間。Ｅ：がん幹細胞マーカーのスクリーニング戦略の概略的な図示。ＣＳＣ／ＣＡＦおよび分化したがん細胞（ＣＬＳ１  ｐ．６）に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  マイクロアレイおよび膜のプロテオミクスを行い、表面タンパク質が高度に発現したＣＳＣ／ＣＡＦを同定した。候補のマーカーは、公開されたコホートを介して、患者の生存と相関していた。Ｆ：患者は、高い（ｈｉｇｈ）または低い（ｌｏｗ）ＣＤ４４およびＣＤ１４の発現を有すると表した（カットオフ値＝リスクスコアの中央値）。結果は、高発現のグループと低発現のグループとの間の無再発生存率（ｒｅｌａｐｓｅ−ｆｒｅｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ）の有意差をカプランマイヤー法で示した。Ｐ値は、両側ログランク検定から得た。がん細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１４の発現レベルを組み合わせることにより、患者を、３つのグループ：高いＣＤ４４／高いＣＤ１４のグループ、低いＣＤ４４／低いＣＤ１４のグループ、およびその他に分けた。この結果は、全生存率および無再発生存率の有意差をカプランマイヤー法で示した。Ｐ値は、両側ログランク検定から得た。
【図２】図２は、ステージＩのＮＳＣＬＣ患者のがん細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１４の臨床上の有意性を示す。Ａ：外科的切除を受けたステージＩのＮＳＣＬＣを有する８０名の患者の臨床コホートから得た原発性腫瘍の検体の一連の解剖に由来するがん細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１４のＩＨＣ染色。がん細胞においてＣＤ４４の低い発現（スコア＜リスクスコアの中央値）および高い発現（スコア≧リスクスコアの中央値）を伴う異なる患者から、画像を得た（原寸の倍率、１００倍）。また、がん細胞においてＣＤ１４の負（スコア＝０）および正（スコア＞０）のグループの異なる患者から、画像を得た（原寸の倍率、１００倍）。ＢおよびＣ：患者は、高いまたは低いＣＤ４４の発現（カットオフ値＝リスクスコアの中央値）；負または正のＣＤ１４の発現を有すると表した。この結果は、高い発現グループと低い発現グループとの間における全生存率（パネルＢ）および無再発生存率（パネルＣ）の有意差をカプランマイヤー法で示した。Ｐ値は、両側ログランク検定から得た。がん細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１４の発現レベルを組み合わせることにより、患者を、３つのグループ：高いＣＤ４４／正のＣＤ１４のグループ、低いＣＤ４４／負のＣＤ１４のグループ、およびその他に分けた。この結果は、全生存率および無再発生存率の有意差をカプランマイヤー法で示した。Ｐ値は、両側ログランク検定から得た。
【図３】図３は、ＣＡＦフィーダー細胞と共培養したがん細胞の細胞表面上のＣＤ４４およびＣＤ１４の濃度の高さを示す。Ａ：ＣＤ４４およびＣＤ１４のＲＴ  Ｑ−ＰＣＲのバリデーション。ＣＬＳ１細胞は、ＣＬＳ１のスフィアに由来しており、スフィアから単一細胞に分離され、その後、異なる回数の継代（ｐ３、ｐ６、およびｐ１４）で、ＣＡＦを伴うことなく継代培養した。ＣＡＦは、フィーダー細胞の対照として作用した。データは、平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ（Ｎ＝３）を表す。Ｂ：患者（Ｎ＝４名の患者）から得たＣＡＦと共に培養するかまたは培養していないがん細胞（ＥＫＶＸ）におけるＣＤ４４、ＣＤ１４、およびＮａｎｏｇのＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ解析。この結果は、異なる患者のＮＦまたはＣＡＦ（Ｌ２、Ｌ５、およびＬ８）と共培養したがん細胞の有意差をＭＡＮＯＶＡ検定において示した。Ｃ：ＣＡＦと培養したＣＬＳ１細胞（ＣＬＳ１／ＣＡＦ）、またはＣＡＦを伴わずに培養したＣＬＳ１細胞（ＣＬＳ１ｐ．６）におけるＣＤ４４およびＣＤ１４のタンパク質発現を、免疫蛍光染色（パネル−左）およびウェスタンブロット解析（パネル−右）を介して推定した。Ｄ：ＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ解析を、原発性肺がん細胞（ＣＬ１５２細胞）から選別したＣＤ１４＋ＣＤ４４Ｈｉ、ＣＤ１４−ＣＤ４４Ｈｉ、およびＣＤ１４−ＣＤ４４ｌｏｗの集団における幹細胞性マーカーのＮａｎｏｇおよびＯｃｔ３／４の発現を評価するために行った（Ｎ＝３）。Ｅ：ＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｂＦＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）を含むＭＣＤＢ２０１培地で２１日間培養した後の原発性肺がん細胞（ＣＬ１５２細胞）から選別したＣＤ１４＋ＣＤ４４Ｈｉ、ＣＤ１４−ＣＤ４４ＨｉおよびＣＤ１４−ＣＤ４４ｌｏｗの集団のスフィアを形成する能力（下部パネル）および形態（上部のパネル）。スケールバー、１００μｍ。Ｆ：ＣＬＳ１肺がん細胞（Ｎ≧３匹のマウス）から選別したＣＤ１４＋ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ１４−ＣＤ４４ｈｉ、およびＣＤ１４−ＣＤ４４ｌｏｗの集団由来のマウスの異種移植片腫瘍の発生率を、ＮＳＧマウスへ異なる細胞数（１×１０２および１０個の細胞）の皮下注射の後に決定した。ＣＳＣの腫瘍をイニシエーションする頻度（ＴＩＦ）を、Ｌ−ｃａｌｃｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して計算した。ＣＩ、信頼区間。
【図４】図４は、原発性肺がん細胞から選別したＣＤ１４＋ＣＤ４４Ｈｉ集団が、高い腫瘍をイニシエーションする能力を有することを示す。上部パネル：異なる原発性肺がん細胞：ＣＬ１００（パネルＡ）、ＣＬ１４１（パネルＢ）、およびＣＬ１５２（パネルＣ）において二重染色したＣＤ４４およびＣＤ１４のフローサイトメトリー解析。異なる原発性肺がん細胞は、様々な二重陽性の集団（ＣＬ１００では５．８％、ＣＬ１４１では０．２％、およびＣＬ１５２細胞では３．５％）を示した。下部パネル：原発性肺がん細胞：ＣＬ１００（パネルＤ）、ＣＬ１４１（パネルＥ）、およびＣＬ１５２（パネルＦ）（Ｎ＝６匹のマウス）から選別したＣＤ１４＋ＣＤ４４Ｈｉ、ＣＤ４４ＨｉＣＤ１４−、およびＣＤ１４−ＣＤ４４ｌｏｗの集団由来のマウス異種移植片腫瘍の発生率を、ＳＣＩＤマウスへの異なる細胞数（１×１０４、１×１０３、および１×１０２個の細胞）の皮下注射の後に決定した。ＣＳＣの腫瘍をイニシエーションする頻度（ＴＩＦ）を、Ｌ−ｃａｌｃ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して計算した。ＣＩ、信頼区間。
【図５】図５は、ＣＡＦフィーダー細胞と共培養したがん細胞の細胞表面のＣＤ４４、ＣＤ１４、およびＮａｎｏｇの濃度の高さを示す。Ａ：患者（Ｎ＝３名の患者）から得たＣＡＦを伴うかまたは伴わずに培養したがん細胞（Ａ５４９）におけるＣＤ４４、ＣＤ１４、およびＮａｎｏｇのレーザーにより捕捉したコロニー細胞解析。Ｂ：ＣＡＦフィーダー細胞を伴うかまたは伴わずに培養したＣＬＳ１細胞におけるＣＤ４４およびＣＤ１４のフローサイトメトリー解析。
【図６】図６は、がん細胞の細胞表面のＣＤ４４およびＣＤ１４のフローサイトメトリー解析を示す。ＣＤ４４およびＣＤ１４は、異なる肺がん細胞株（Ａ５４９、ＥＫＶＸ、ＰＣ９、およびＨＣＣ８２７）および原発性肺がん細胞（ＣＬ２５、ＣＬ８３、ＣＬ９７、ＣＬ１００、ＣＬ１４１、およびＣＬ１５２）において二重染色されたＣＤ４４およびＣＤ１４の二重陽性の集団を、解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
がん幹細胞（ＣＳＣ）は、腫瘍原性幹細胞様の多能性細胞の亜集団を表す。ＣＳＣは、自己再生することができ、特定の細胞種に分化することができ、および／またはがんへと発達することができる。「がん幹細胞性」の表現型は、発がんの陰に隠れた駆動力であり得る。ＣＳＣは、化学療法耐性もしくは放射線耐性および／または転移の原因であることが示唆されている。ＣＳＣが、白血病、および肺がんを含む様々な固形腫瘍に存在することを示すエビデンスが増加している。「幹細胞性」を維持するために、大部分の幹細胞は、微小環境との直接的な接触または線維芽細胞などの「フィーダー細胞」とのクロストークに依存している。がんの状況下では、ＣＳＣは幹細胞性を維持するために、がん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）との直接的な接触に依存し得る。このような相互作用は、腫瘍の成長および／または転移のためのニッチを形成し得る。
【００１９】
本開示は、トランスクリプトームおよびプロテオームの解析を介して、ＣＡＦと共培養したＣＳＣで高度に発現しているＣＤ１４およびＣＤ４４を含むマーカーの同定に、少なくとも部分的に基づくものである。たとえばＣＤ１４は、ＣＳＣ（たとえば肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がんのＣＳＣ）の新規のバイオマーカーとして同定されている。ＣＳＣは、分化したがん細胞よりも高い発現レベルで、細胞表面にタンパク質のバイオマーカー（たとえばＣＤ１４およびＣＤ４４）を示すことが決定された。よって、このようなタンパク質バイオマーカー（たとえばＣＤ１４およびＣＤ４４）のレベルは、ＣＳＣの存在および／またはレベルと相関しており、よって、がん患者由来の腫瘍の検体における不十分な予後と相関している。
【００２０】
よって、本開示の一部の態様は、ＣＤ１４のレベル、および同様に任意選択でＣＤ４４のレベル（膜結合型の分子または循環性の分子（可溶性ＣＤ１４もしくは可溶性ＣＤ４４））に基づき、がん幹細胞を含む疑いのある生体試料などの試料を解析するための方法を提供する。このようなアッセイ方法は、臨床目的に有用であり得、たとえば、がんの予後不良を表し得る試料中のがん幹細胞の存在を決定するため、がん幹細胞の存在／レベルに基づき治療の候補を選択するため、がんの進行をモニタリングするため、がんに対する治療の有効性を評価するため、治療工程を決定するため、対象ががんの再発に関するリスクがあるかどうかを評価するために有用であり得る。また、本明細書中記載のアッセイ方法は、非臨床的な適用にも有用であり得、たとえば、例としてがんの発達および転移の機構、および／またはがんに関与する生物学的な経路／プロセスを研究することを含む研究目的のため、ならびに当該研究に基づきがんに関する新規の治療を開発するために、有用であり得る。
【００２１】
がん幹細胞（ＣＳＣ）バイオマーカーを決定するためのアッセイ方法
本明細書中、がん幹細胞に関連し得るバイオマーカーの存在および／またはレベルを決定するために試料を解析するためのアッセイ方法を提供する。
【００２２】
（ｉ）ＣＳＣに関するバイオマーカー
本明細書中使用される場合、特定の細胞（たとえばＣＳＣ）の集団を表す用語「バイオマーカー」または「バイオマーカーセット」は、当該特定の細胞の集団において、異なる細胞の集団における生物学的な分子（たとえばタンパク質）または生物学的な分子のセットのレベルから逸脱したレベルで存在する、同生物学的な分子（たとえばタンパク質）または生物学的な分子のセットを表す。たとえば、ＣＳＣを表すバイオマーカーは、ＣＳＣにおいて、同じ種類の分化したがん細胞または非がん細胞における同じマーカーのレベルと比較して上昇したレベルまたは低下したレベルを有し得る。本明細書中記載のＣＳＣバイオマーカーは、ＣＳＣにおいて、同じ種類の分化したがん細胞または非がん細胞における同じマーカーのレベルから、少なくとも２０％（たとえば３０％、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはそれ以上）逸脱（増大または低下）するレベルを有し得る。このようなバイオマーカー／バイオマーカーセットは、診断／予後での適用、および非臨床的な適用（たとえば研究目的のため）の両方で使用することが可能である。
【００２３】
一部の例では、本バイオマーカーは、ＣＤ１４を含む。ＣＤ１４は、糖タンパク質であり、細菌由来のリポ多糖（ＬＰＳ）の共受容体であり、リポ多糖結合タンパク質（ＬＢＰ）の存在下でＬＰＳに結合する。ＣＤ１４には、２つのアイソフォーム：膜結合型（ｍＣＤ１４）および可溶型（ｓＣＤ１４）が存在する。いずれかの型も、がん幹細胞のバイオマーカーとして作用することができる。ヒトのｍＣＤ１４およびｓＣＤ１４のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号ＮＰ＿００１１６７５７５．０、ＰＤＢ：４ＧＬＰ＿Ａ、ＵｎｉＧｅｎｅ：Ｈｓ．１６３８６７、およびＧｅｎｅＣａｒｄｓ  ＧＣＩＤ：ＧＣ０５Ｍ１４０５９４に提供されている。
【００２４】
あるいはまたはさらに、本バイオマーカーは、ＣＤ４４を含み得る。ＣＤ４４は、細胞間相互作用、細胞接着、および遊走に関与する細胞表面の糖タンパク質である。これは、ヒアルロン酸の受容体であり、また、他のリガンド、たとえばオステオポンチン、コラーゲン、およびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）と相互作用することもできる。ヒトのＣＤ４４のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋの寄託番号ＡＣＩ４６５９６．１に提供されている。
【００２５】
ＣＤ１４およびＣＤ４４に加えて、ＣＰおよびＡＢＣＡ８もまた、ＣＡＦと比較してがん幹細胞に差次的に存在することが見いだされており、よって、本明細書中記載のアッセイ方法におけるマーカーとして使用することができる。
【００２６】
がん幹細胞（たとえば肺がん幹細胞、肝臓がん幹細胞、結腸がん幹細胞、または膵臓がん幹細胞）を表す例示的なバイオマーカーを、以下の表１に提供する。
【表１】
2020507081.tif 000002
【００２７】
また、単独または組み合わせて採取された、本明細書中記載のＣＳＣバイオマーカーのいずれか（たとえばＣＤ１４、またはＣＤ１４およびＣＤ４４の組み合わせ）は、肺がん幹細胞を含む疑いのある試料を解析するため、本明細書中記載のアッセイ方法に使用することができる。当該アッセイ方法から得られた結果は、限定するものではないが、本明細書中記載のものを含む臨床的または非臨床的な適用に使用することができる。
【００２８】
（ｉｉ）生体試料の解析
がん幹細胞（たとえば肺がん幹細胞、肝臓がん幹細胞、結腸がん幹細胞、または膵臓がん幹細胞）を含み得るいずれの試料も、当該分野で知られているアッセイ方法および／または本明細書中記載のアッセイ方法により、解析することができる。本明細書中記載の方法は、がん幹細胞を含む疑いのある試料を準備するステップを含む。一部の例では、試料は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ由来であってもよく、たとえばＣＳＣの事象および／または機構を研究するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける細胞培養物であってもよい。一部の例では、本明細書中記載のアッセイ方法により解析される試料は、生体試料とすることができる。本明細書中使用される場合、「生体試料」は、対象由来の組織、たとえば血液、血漿、またはタンパク質を含む組成物を表す。生体試料は、対象から採取した最初の未処理の試料、またはその後処理した試料、たとえば部分的に精製した形態もしくは保存した形態とすることができる。一部の実施形態では、生体試料は、体液の試料、たとえば血清、血漿、涙、尿、または唾液の試料とすることができる。あるいは、生体試料は、組織の試料、たとえば腫瘍部位または疑わしい腫瘍部位（がん細胞を含む疑いのある組織部位）から得られた組織の試料であり得る。一部の実施形態では、複数の（たとえば少なくとも２、３、４、５、またはそれ以上の）生体試料が、たとえば疾患の進行を評価するかまたは治療の有効性を評価するために、経時的または特定の時間間隔で、対象から回収され得る。
【００２９】
生体試料は、当該分野で知られているいずれかの手段を使用して、対象から得ることができる。たとえば、この試料は、対象から試料（たとえば腫瘍組織の試料）を除去することにより、たとえば外科的な手法（たとえば開胸）、生検の手法、針吸引、または胸腔穿刺を介して、得ることができる。
【００３０】
用語「患者」、「対象」、または「個体」は、互換可能に使用されてもよく、本明細書中記載の解析を必要とする対象を表す。一部の実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトの哺乳動物である。一部の実施形態では、対象は、たとえば肺がん、結腸がん、肝臓がん、または膵臓がんといった、がんを有する疑いがあるかまたはがんのリスクがあるヒトの対象である。このような対象は、がんに関連する１つ以上の症状を呈し得る。あるいはまたはさらに、このような対象は、がんに関する１つ以上のリスク因子、たとえばがんに関連する環境因子または遺伝的因子（たとえば汚染への曝露）を有し得る。
【００３１】
あるいは、本明細書中記載の解析を必要とする対象は、肺がん、結腸がん、肝臓がん、または膵臓がんなどのがんを有する患者であり得る。このような対象は、現在再発していてもよく、または過去に当該疾患を罹患していてもよい（たとえば現在は再発していなくてもよい）。一部の例では、対象は、がんの治療中、たとえば外科手術、化学療法、免疫療法、または放射線療法を含む治療中であり得るヒトの患者である。他の例では、このようなヒトの患者は、当該治療を受けていなくてもよい。
【００３２】
一部の例では、がんは肺がんである。肺がんの例として、限定するものではないが、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、腺がん、上皮内腺がん（ＡＩＳ）、微小浸潤腺がん（ＭＩＡ）、扁平上皮がん、大細胞がん、大細胞神経内分泌腫瘍、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、中皮腫、およびカルチノイド腫瘍が挙げられる。
【００３３】
本明細書中記載の試料のいずれかは、本明細書中記載の１つ以上のＣＳＣバイオマーカーのレベルを測定するステップを含む、本明細書中記載のアッセイ方法を使用する解析に供することができる。一部の例では、本バイオマーカーは、ＣＤ１４（膜結合型もしくは可溶性）またはＣＤ４４（膜結合型もしくは可溶性）である。他の例では、本バイオマーカーは、ＣＤ１４およびＣＤ４４の組み合わせである。本明細書中開示されるバイオマーカーのレベル（たとえば量）、または本バイオマーカーのレベルの変化は、従来のアッセイまたは本明細書中記載のアッセイを使用して評価することができる。
【００３４】
本明細書中使用される場合、用語「測定する（ｍｅａｓｕｒｉｎｇ）」もしくは「測定（ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）」、またはあるいは「検出する（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）」もしくは「検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）」は、試料の中のある物質の存在、不存在、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）（有効量であり得る）を評価することを意味する。これは、当該物質の定性的または定量的な濃度レベルの導出、または対象の値もしくは分類を評価することを含む。
【００３５】
一部の実施形態では、バイオマーカーのレベルは、生体試料などの試料におけるタンパク質を直接検出することにより、評価または測定される。あるいはまたはさらに、タンパク質のレベルは、生体試料において間接的に、たとえばタンパク質の活性のレベルを検出すること（酵素的アッセイ）により、評価または測定することができる。
【００３６】
タンパク質（ＣＤ１４および／またはＣＤ４４）のレベルは、イムノアッセイを使用して測定され得る。イムノアッセイの例として、限定するものではないが、イムノブロッティングアッセイ（たとえばウェスタンブロット）、免疫組織化学的アッセイ、フローサイトメトリーアッセイ、免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）（たとえばサンドイッチＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、電気化学発光法ベースの検出アッセイ、磁式イムノアッセイ（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ラテラルフローアッセイ、および関連技術が挙げられる。本明細書中提供されるバイオマーカーを検出するためのさらなる適切なイムノアッセイは、当業者に明らかである。
【００３７】
このようなイムノアッセイは、目的のバイオマーカー、たとえばＣＤ１４またはＣＤ４４に特異的な作用物質（たとえば抗体）の使用を含み得る。目的のバイオマーカーに「特異的に結合する」抗体などの検出試薬（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）は、当該分野で良好に理解されている用語であり、このような特異的な結合を判定するための方法も、当該分野でよく知られている。抗体は、別のバイオマーカーよりも、特定の目的のバイオマーカーと、高頻度に、迅速に、長い期間、かつ／または高い親和性で反応または結合する場合に、「特異的な結合」を呈すると言われている。また、この定義を読むことにより、たとえば、第１の目的のペプチドに特異的に結合する抗体は、第２の目的のペプチドに特異的または優先的に結合してもよく、または結合しなくてもよいことが理解される。よって「特異的な結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を（含み得るが）必要とするものではない。必ずしもというわけではないが、一般的に、結合に対する言及は、優先的な結合を意味する。一部の例では、目的のペプチドまたはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他のペプチドまたは同じ抗原の他のエピトープに結合しなくてもよい。
【００３８】
本明細書中使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも１つの免疫グロブリンの可変ドメインまたは免疫グロブリンの可変ドメイン配列を含むタンパク質を表す。たとえば、抗体は、重鎖（Ｈ）可変領域（本明細書中ＶＨと略される）および軽鎖（Ｌ）可変領域（本明細書中ＶＬと略される）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）可変領域および２つの軽鎖（Ｌ）可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（たとえば一本鎖抗体、ＦａｂおよびｓＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓｃＦｖ、およびドメイン抗体（ｄＡｂ）フラグメント（ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；２６（３）：６２９−３９．））、ならびに完全な抗体を包有する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ（およびそれらのサブタイプ）の構造上の特徴を有し得る。抗体は、任意の供給源由来であってもよいが、霊長類（ヒトおよび非ヒトの霊長類）の抗体または霊長類化抗体が好ましい。
【００３９】
一部の実施形態では、本明細書中記載の抗体は、検出可能な標識とコンジュゲートすることができ、目的のペプチドと検出試薬の結合を、検出可能な標識から放出されるシグナルの強度に基づき決定することができる。あるいは、検出試薬に特異的な二次抗体を使用することができる。１つ以上の抗体が、検出可能な標識に結合してもよい。当該分野で知られている任意の適切な標識を、本明細書中記載のアッセイ方法に使用することができる。一部の実施形態では、検出可能な標識は、フルオロフォアを含む。本明細書中使用される場合、用語「フルオロフォア」（「蛍光標識」または「蛍光色素」とも呼ばれる）は、所定の励起波長で光エネルギーを吸収し、異なる波長で光エネルギーを発する部分を表す。一部の実施形態では、検出部分は、酵素であるか、または酵素を含む。一部の実施形態では、酵素は、無色の基質から有色の産物を産生する酵素（たとえばβ−ガラクトシダーゼ）である。
【００４０】
一部の例では、本明細書中記載のアッセイ方法は、細胞表面のバイオマーカー、たとえば試料に含まれている細胞上にある膜結合型のＣＤ１４および／またはＣＤ４４のレベルを測定するために、使用される。このような細胞は、規定の実務を介して回収されてもよく、細胞表面のバイオマーカーのレベルは、従来の方法、たとえばＦＡＣＳを介して測定することができる。
【００４１】
他の例では、本明細書中記載のアッセイ方法は、血液の試料または血漿の試料であり得る、試料における循環性バイオマーカー（可溶性バイオマーカー）、たとえばＣＤ１４のレベルを測定するために使用される。当該分野で知られているアッセイのいずれか、たとえばイムノアッセイを、当該バイオマーカーのレベルを測定するために使用することができる。
【００４２】
本開示がイムノアッセイに限定されないことは、当業者に明らかである。質量分析などの抗体に基づくものではない検出アッセイもまた、本明細書中提供される肺のＣＳＣバイオマーカーの検出および／または定量化に有用である。発色性の物質に依存するアッセイもまた、本明細書中提供される肺のＣＳＣバイオマーカーの検出および／または定量化に有用であり得る。
【００４３】
あるいは、試料中のＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸のレベルを、従来の方法を介して測定することができる。一部の実施形態では、ＣＳＣバイオマーカーをコードする核酸の発現レベルを測定することは、ｍＲＮＡを測定することを含む。一部の実施形態では、ＣＳＣバイオマーカーをコードするｍＲＮＡの発現レベルは、リアルタイム逆転写（ＲＴ）Ｑ−ＰＣＲまたは核酸マイクロアレイを使用して、測定することができる。バイオマーカーの核酸配列を検出するための方法として、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕＰＣＲ、定量ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＲＴ  Ｑ−ＰＣＲ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザンブロット、ノーザンブロット、配列解析、マイクロアレイ解析、レポーター遺伝子の検出、または他のＤＮＡ／ＲＮＡハイブリダイゼーションのプラットフォームが挙げられる。
【００４４】
所望のバイオマーカーに特異的に結合するいずれかの結合試薬が、試料中のバイオマーカーのレベルを測定するために、本明細書中記載の方法およびキットで使用されてもよい。一部の実施形態では、この結合試薬は、所望のタンパク質バイオマーカーに特異的に結合する抗体またはアプタマーである。他の実施形態では、結合試薬は、コードされた核酸またはその一部に相補的な１つ以上のオリゴヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、試料は、異なるタンパク質バイオマーカーに結合する１超の結合試薬と、同時または連続して接触してもよい（たとえばマルチプレックス解析）。
【００４５】
目的のバイオマーカーのレベルを測定するために、試料を、適切な条件下で結合試薬（検出試薬）と接触させることができる。一般的に、用語「接触する（ｃｏｎｔａｃｔ）」は、存在する場合に、試料中の、結合試薬と目的のバイオマーカーとの間の複合体の形成に十分な適切な時間の間の、試料または試料から回収した細胞と結合試薬の曝露を表す。一部の実施形態では、接触は、試料を支持膜の表面を通すように移動させる毛細管現象により、行われる。
【００４６】
一部の実施形態では、アッセイは、単一のアッセイ形式を含む低スループットのプラットフォームで行われてもよい。たとえば、低スループットのプラットフォームは、診断方法、疾患および／もしくは治療の進行のモニタリング、ならびに／または疾患もしくは障害が特定の治療から利益を得ることができるかの予測のため、生体試料（たとえば生体組織、組織抽出物）中のタンパク質の存在および量を測定するために使用され得る。
【００４７】
一部の実施形態では、支持部材に結合試薬を固定することが必要であり得る。結合試薬を固定するための方法は、結合試薬の性質および支持部材の材料などの要因に応じて決定され、特定のバッファーを必要とし得る。このような方法は、当業者にとって明らかである。たとえば、本明細書中記載の生体試料におけるバイオマーカーセットは、同様に本明細書中に記載されているキットおよび／または検出装置のいずれかを使用して、測定され得る。
【００４８】
本明細書中に提供されるものなどのがん幹細胞バイオマーカーの検出および／または定量化のために使用される検出アッセイの種類は、本アッセイを使用する特定の状況（たとえば臨床的適用または研究のための適用）、ならびに検出されるバイオマーカーの種類および数、ならびに／または並行して行われる患者の試料の種類および数により決定される。
【００４９】
本明細書中記載のアッセイ方法は、臨床上の目的および非臨床上の目的の両方のために、使用され得る。一部の例を、本明細書中に提供する。
【００５０】
診断および／または予後への適用
本明細書中記載のアッセイ方法により測定される、対象に由来する生体試料中の１つ以上のＣＳＣバイオマーカーのレベルは、様々な臨床目的のため、たとえば、対象（たとえばヒトの患者）由来の生体試料におけるがん細胞、特には肺がん幹細胞を検出するため、予後不良に関連するがんを有する対象を同定するため、対象におけるがんの発達の進行をモニタリングするため、対象のがんに関する治療の有効性を評価するため、特定の治療に適した患者を同定するため、対象におけるがんの再発を予測するため、ならびに／または疾患の発達、予後の結果、および／もしくは現在の治療の有効性に基づくがんの治療の調節のために、使用することができる。よって、本明細書中記載の１つ以上のＣＳＣバイオマーカー、たとえばＣＤ１４またはＣＤ１４およびＣＤ４４の組み合わせのレベルに基づく、がん、たとえば予後不良に関連するがんに関する診断方法および予後方法が、本明細書中に記載される。がんの例示的な種類として、肺がん（たとえばＮＳＣＬＣなどの本明細書中に記載される肺がん）、肝臓がん、結腸がん、および膵臓がんが挙げられる。
【００５１】
必要に応じて、本明細書中に記載のアッセイ方法により決定される試料中のバイオマーカーのレベルは、正規化した値を得るために、同じ試料における内部標準または標準試料（所定の量のバイオマーカーを有する）で、正規化され得る。次に、バイオマーカーの生の値または正規化した値を、参照試料または対照試料における値と比較することができる。参照試料または対照試料中のバイオマーカーの値と比較して上昇した値の、対象から得た試料中の同バイオマーカーの値は、試料におけるＣＳＣの存在を表す。対象がＣＳＣを保有することは、対象が、本明細書中記載の目的のがん、たとえば予後不良に関連するがんを有し得るか、またはがん発達のリスクがあるがんを有し得ることを表す。
【００５２】
一部の実施形態では、対象から得た試料中のバイオマーカーのレベルを、当該バイオマーカーに関する所定の閾値と比較することができ、この値より上昇していることは、対象がＣＳＣを保有し、よって目的のがん、たとえば予後不良に関連するか、またはがん発達および／もしくは転移のリスクがある目的のがんを有し得ることを、表し得る。
【００５３】
対照試料または参照試料は、解析のため試料を入手する対象と同じ民族、年齢、および／または性別であり得る、健常な個体から得た生体試料であり得る。あるいは、対照試料または参照試料は、既知の量の評価されるバイオマーカーを含む。一部の実施形態では、対照試料または参照試料は、対照の対象から得た生体試料である。
【００５４】
本明細書中使用される場合、対照の対象は、健常な個体、すなわち、タンパク質のレベルを測定する時点で目的のがん（たとえばＮＳＣＬＣなどの肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がん）を明らかに有さない個体、または当該疾患の病歴を有さない個体であり得る。また、対照の対象は、好ましくは、本明細書中記載のアッセイ方法により対象を解析する際に特徴（たとえば年齢、性別、または民族）が一致する健常な対象の集団を表し得る。
【００５５】
対照のレベルは、所定のレベルまたは閾値とすることができる。このような所定のレベルは、目的の疾患を有さないかまたは目的の疾患のリスクがない対象の集団におけるタンパク質のレベル（たとえば、健常な対象の集団における平均レベル）を表すことができる。またこれは、目的の疾患を有する対象の集団におけるタンパク質のレベルを表すこともできる。
【００５６】
所定のレベルは、様々な形態を取ることができる。たとえばこれは、中央値または平均値などの単一のカットオフ値とすることができる。一部の実施形態では、このような所定のレベルは、比較上のグループ、たとえば１つの定義したグループが目的のがんを有することが知られており、別の定義したグループが目的のがんを有さないことが知られているグループなどに基づき、確立することができる。あるいは、所定のレベルは、ある範囲、たとえば対照の集団におけるタンパク質のレベルを表す範囲とすることができる。
【００５７】
一部の例では、所定のレベルは、本明細書中記載される目的のがんに関連するリスクスコアの中央値とすることができる。リスクスコアの中央値は、１つ以上のバイオマーカーのレベルにより表される、低リスクの集団と高リスクの集団を区別するためのよく知られた基準点であり、よって、特定の状態（たとえばがんの発症、がんの予後、または治療有効性）の高リスク対低リスクを表す。たとえば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５６（１）：１１−２０（２００７）を参照されたい。これは、本明細書中記載の診断方法／予後方法のカットオフ値として使用することができる。一部の例では、リスクスコアの中央値は、以下のように決定することができる。バイオマーカーのレベルは、健常な患者（目的の疾患を有さない患者）および目的の疾患（たとえば本明細書中記載されるものなどのがん）を有する患者において、決定することができる。試験される患者におけるバイオマーカーのレベルの頻度の分布をプロットして、各患者に関するリスクスコアを決定することができ、これは、目的の疾患に関連した、試験した患者のリスクプロファイルを表す。その後、このリスクスコアは、高リスクまたは低リスクのグループに患者を分類するために使用される。トレーニングデータセットにおいて、極値の影響を回避するために、かつ２つのグループ（高リスクのグループｖｓ低リスクのグループ）の患者の数を等しくするために、５０パーセンタイル（リスクスコアの中央値）を、本明細書中記載の方法で使用される所定の値であり得る、カットオフ値として使用することができる。
【００５８】
本明細書中記載の対照のレベルは、規定の技術により決定することができる。一部の例では、対照のレベルは、本明細書中同様に記載される対照試料において従来の方法（たとえば本明細書中記載の試験試料におけるタンパク質のレベルを入手するための同じアッセイ）を行うことにより、得ることができる。他の例では、タンパク質のレベルは、対照の集団のメンバーから入手することができ、この結果は、対照の集団におけるタンパク質のレベルを表す対照のレベル（所定のレベル）を得るために、たとえばコンピュータプログラムにより解析することができる。
【００５９】
本明細書中記載の参照値と、候補対象から得た試料におけるバイオマーカーのレベルを比較することにより、候補対象が、予後不良に関連する目的のがんを有するか、またはリスクがあるかどうかを決定することができる。たとえば、候補対象の試料においてバイオマーカーのレベルが参照値と比較して増大していた場合、候補対象は、予後不良に関連する標的のがんを有するか、またはリスクがあると同定され得る。参照値が、がん幹細胞を保有する、かつ／または予後不良に関連するがんを有する対象の集団におけるバイオマーカーのレベルの値の範囲を表す場合、この範囲内にある候補者の試料におけるバイオマーカーの値は、候補対象が予後不良に関連する目的のがんを有するか、当該がんのリスクがあることを表している。
【００６０】
本明細書中使用される場合、「上昇したレベル」または「参照値を超えるレベル」は、バイオマーカーのレベルが、対照試料におけるバイオマーカーのレベルの所定の閾値などの参照値よりも高いことを意味する。対照レベルは、本明細書中に詳述されている。上昇したレベルのバイオマーカーは、たとえば、参照値を１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、またはそれ以上超えるバイオマーカーのレベルを含む。一部の実施形態では、試験試料におけるバイオマーカーのレベルは、参照試料におけるバイオマーカーのレベルよりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、１０００、１００００倍、または５超高い。
【００６１】
一部の例では、バイオマーカーは、ＣＤ１４を含む。ヒトの患者などの候補対象から得た試料におけるＣＤ１４の存在（膜結合型および／もしくは可溶性のＣＤ１４）、または対照の対象由来の同じ種類の試料と比較して上昇したレベルの当該試料におけるＣＤ１４は、候補対象におけるがん幹細胞の存在を表し、同様にがんの予後不良を表す。
【００６２】
一部の例では、本バイオマーカーは、さらにＣＤ４４を含み得る。候補対象から得た試料において高い発現レベルのＣＤ４４は、任意選択で本明細書中記載の上昇したレベルのＣＤ１４と組み合わせて、候補対象におけるがん幹細胞の存在を表し、同様にがんの予後不良を表す。一部の例では、高い発現レベルのＣＤ４４は、たとえば対応する目的のがんのリスクスコアの中央値以上の、所定のレベルよりも高い発現レベルを表す。
【００６３】
一部の実施形態では、候補対象は、目的のがん（たとえばＮＳＣＬＣなどの肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がん）の症状を有するヒトの患者である。たとえば、対象は、疲労感、咳、息切れ、胸痛、食欲不振、体重減少、嗄声、吐血、慢性気管支炎、慢性肺炎、喘鳴、またはそれらの組み合わせを有する。他の実施形態では、対象は、試料を回収する時点で目的のがんの症状を有していないか、目的のがんの症状の病歴を有していないか、または目的のがんの病歴を有していない。さらなる他の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、免疫療法、またはそれらの併用に耐性がある。
【００６４】
本明細書中記載される方法で、目的のがんのがん幹細胞を保有するか、または目的のがん（たとえば予後不良に関連する肺がん）を有すると同定された対象は、本明細書中記載されるように、化学療法での治療などの適切な治療に供され得る。
【００６５】
また、本明細書中記載のアッセイ方法およびキットは、バイオマーカーのレベルと本明細書中に記載されるがんなどの目的のがんとの間の相関関係を前提として、そのようながんに関する治療の有効性の評価のために使用することができる。たとえば、複数の生体試料（たとえば組織の試料または体液の試料）を、治療の前および後、または治療工程の間のいずれかで、治療を行う対象から回収することができる。バイオマーカーのレベルは、本明細書中記載のアッセイ方法のいずれかにより測定することができ、これによりバイオマーカーの値（たとえば量）を決定することができる。たとえば、上昇したレベルのバイオマーカーが、対象が肺がんを有することを表し、バイオマーカーのレベルが、治療の後または治療工程にわたり減少する（早期に回収した試料中のバイオマーカーと比較した、後に回収した試料中のバイオマーカーのレベル）場合、このことは治療が有効であることを表す。一部の例では、治療は、化学療法薬などの治療薬の有効量を含む。化学療法薬の例として、限定するものではないが、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）またはシスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｆｒｅｚ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）が挙げられる。
【００６６】
対象が治療に応答しないことが同定された場合、治療薬をより高い用量および／または高い投与頻度で、同定した対象に投与する。一部の実施形態では、治療に応答性があるか、またはさらなる治療が必要ないと同定された対象では、治療薬の用量または投与頻度は、維持、減少、または中止される。あるいは、異なる治療を、第１の治療に応答しないと見いだされた対象に使用することができる。
【００６７】
他の実施形態では、バイオマーカーまたはバイオマーカーセットの値は、同様に、たとえば化学療法薬により治療可能であり得る本明細書中記載されるがんなどの目的のがんを同定することに信頼性があり得る。この方法を行うために、目的のがんを有する対象から回収した試料（たとえば組織の試料または体液の試料）中のバイオマーカーのレベルは、適切な方法、たとえばウェスタンブロットまたはＲＴ  Ｑ−ＰＣＲアッセイなどの本明細書中記載の方法により測定することができる。バイオマーカーのレベルが参照値よりも上昇している場合、このことは、化学療法薬がこの疾患の治療に有効であり得ることを表す。疾患が化学療法薬に対して感受性がある（当該化学療法薬により治療できる）と同定された場合、本方法はさらに、有効量の化学療法薬、たとえばカルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ）またはシスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、ドセタキセル（Ｄｏｃｅｆｒｅｚ、Ｔａｘｏｔｅｒｅ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）、ペメトレキセド（Ａｌｉｍｔａ）、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ）を、当該疾患を有する対象に投与するステップを含むことができる。
【００６８】
同様に、本明細書中記載されるがんなどの目的のがんの重症度を評価する方法も、本開示の範囲内にある。たとえば、本明細書中に記載される場合、目的のがんは、休止状態（寛解）にあってもよく、この間、対象は、当該疾患の症状を感じない。たとえば、肺がんの再発は、通常、対象が、限定するものではないが、疲労感、咳、息切れ、胸痛、食欲不振、体重減少、嗄声、吐血、慢性気管支炎、慢性肺炎、喘鳴、またはそれらの組み合わせを含む肺がんの症状を感じ得る再発性のエピソードである。一部の実施形態では、１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対象が、目的のがんの再発（たとえば肺がんの再発）を将来経験するか、現在経験しているか、または近い将来経験するかどうかを表す。一部の実施形態では、本方法は、目的のがんを有する対象から得た試料中のバイオマーカーのレベルを、同じ対象由来の試料、たとえば寛解時に同じ対象から得た試料または再発の間に同じ対象から得た試料と比較するステップを含む。
【００６９】
非臨床的な適用
さらに、本明細書中記載のＣＳＣバイオマーカーのいずれかのレベルは、非臨床上の使用のため、たとえば研究目的のために使用され得る。一部の実施形態では、本明細書中記載の方法は、がん幹細胞の事象および／または機構を研究するため（たとえばがんの発達および／または転移においてがん幹細胞が関わる新規の生物学的な経路またはプロセスの発見のため）に、使用され得る。
【００７０】
一部の実施形態では、バイオマーカーセットのレベルは、本明細書中記載されるように、肺がんのための新規の治療薬の開発に信頼性があり得る。たとえば、バイオマーカーのレベルは、新規の治療（たとえば臨床試験）を受けた対象から得た試料で測定され得る。一部の実施形態では、バイオマーカーセットのレベルは、新規治療の前、間、または後に、対象における新規治療の有効性またはがんの進行を表し得る。
【００７１】
さらに、本明細書中記載のＣＳＣバイオマーカーのうちの１つ以上は、がん幹細胞の濃度を高めるために使用されてもよく、これは、がん生物学に関する研究および目的のがん幹細胞を特異的に標的とする新規の抗がん剤の開発を含む様々な目的のために使用することができる。本明細書中に使用される場合、「肺がん幹細胞の濃度を高めること」との表現は、肺がん幹細胞が、生体試料に存在する他の物質を十分に含まないように、生体試料から肺がん幹細胞を単離または分離することを意味する。一部の実施形態では、肺がん幹細胞の濃度を高めることは、非幹細胞から肺がん幹細胞を分離することを含む。
【００７２】
タンパク質バイオマーカーを測定するためのキットおよび検出装置
また本開示は、本明細書中記載の１つ以上のバイオマーカーのレベルの測定に使用するためのキットおよび検出装置を提供する。このようなキットまたは検出装置は、表１に列挙されるものなどの目的のバイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の結合試薬を含み得る。たとえば、このようなキットまたは検出装置は、表１から選択される１つのタンパク質バイオマーカーに特異的な少なくとも１つの結合試薬を含み得る。場合により、キットまたは検出装置は、本明細書中記載のタンパク質バイオマーカーセットのうちの２つ以上のメンバーに特異的な結合試薬を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、結合試薬（たとえば検出試薬）のうちの１つ以上は、バイオマーカーセットのタンパク質に特異的に結合する抗体とすることができる。一部の実施形態では、１つ以上の結合試薬は、アプタマー、たとえばバイオマーカーセットのタンパク質に特異的に結合する、ペプチドアプタマーまたはオリゴヌクレオチドアプタマーである。
【００７４】
一部の実施形態では、キットはさらに、バイオマーカーセットのタンパク質に対する試薬の結合性を検出するための検出試薬（たとえば結合試薬に結合する抗体）を含む。検出試薬は、標識とコンジュゲートすることができる。一部の実施形態では、検出試薬は、結合試薬のうちの少なくとも１つに特異的に結合する抗体である。一部の実施形態では、結合試薬は、検出試薬により同定でき、検出試薬と直接的または間接的に結合できるタグを含む。
【００７５】
本キットまたは本検出装置では、結合試薬のうちの１つ以上は、支持部材、たとえば膜、ビーズ、スライド、またはマルチウェルプレートに固定化され得る。アッセイに適した支持部材の選択は、試料の数および試薬とコンジュゲートした標識から放出されるシグナルを検出する方法などの様々な要因に応じて決定される。
【００７６】
一部の実施形態では、支持部材は、ニトロセルロース膜、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜、またはセルロースアセテート膜などの膜である。一部の例では、本アッセイは、ウェスタンブロットアッセイ形式または核酸マイクロアレイアッセイ形式であり得る。
【００７７】
一部の実施形態では、支持部材は、ＥＬＩＳＡプレートなどのマルチウェルプレートである。一部の実施形態では、本明細書中記載のイムノアッセイは、高スループットプラットフォームで行うことができる。一部の実施形態では、マルチウェルプレート、たとえば２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、またはそれ以上の数のウェルプレートが、高スループットのイムノアッセイに使用され得る。個々のイムノアッセイを、並行して各ウェルで行うことができる。よって、一般的に、アッセイのスループットを増大させるため、並行して複数のマルチウェルを測定するようにプレートリーダーを使用することが望ましい。一部の実施形態では、並行してマルチウェル（たとえば４ウェル、１６ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、またはそれ以上のウェル）をイメージングできるプレートリーダーを、このプラットフォームに使用することができる。たとえば、市販のプレートリーダー（たとえばＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡから入手可能なプレートビジョンシステム（ｐｌａｔｅ  ｖｉｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ））が使用され得る。このプレートリーダーは、動力学ベースの蛍光解析を行うことができる。プレートビジョンシステムは、高い集光効率（ｈｉｇｈ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｐｔｉｃｓ）を有し、並行して行う９６ウェルプレートの解析に特化して設計された光学を有する。さらなる適切な並行プレートリーダーとして、限定するものではないが、ＳＡＦＩＲＥ（Ｔｅｃａｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）、ＦＬＩＰＲＴＥＴＲＡ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＦＤＳＳ７０００（Ｈａｍａｍａｔｓｕ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，ＮＪ）、およびＣｅｌｌＬｕｘ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）が挙げられる。
【００７８】
また本キットは、本明細書中記載されるように、限定するものではないが、コーティングバッファー、ブロッキングバッファー、ウォッシュバッファー、および／またはストッピングバッファーなどの１つ以上のバッファーを含むことができる。
【００７９】
一部の実施形態では、本キットは、本明細書中記載の方法のいずれかに従い使用するための説明書を含むことができる。含まれている説明書は、ヒトの患者などの対象から回収した生体試料中のバイオマーカーセット（たとえばタンパク質または核酸）のレベルを測定するため、キットに含まれている成分を使用する方法の説明を含むことができる。
【００８０】
本キットの使用に関連する説明書は、概して、本明細書中記載のアッセイ方法を行うための、各成分の量およびに適切な条件に関する情報を含む。本キット中の成分は、単位剤形、バルクパッケージ（たとえば複数回投与のパッケージ）、またはサブユニット用量にあってもよい。本開示のキットに供給される説明書は、通常はラベルまたは添付文書（たとえば本キットに含まれる紙のシート）上に記載された説明であるが、機械で可読な説明書（たとえば磁気記憶ディスクまたは光学記憶ディスク上に保有される説明）も同様に許容可能である。
【００８１】
ラベルまたは添付文書は、本キットが、バイオマーカーセットのレベルを評価するために使用されることを示すものである。説明書は、本明細書中記載の方法のいずれかを行うために提供され得る。
【００８２】
本開示のキットは、適切にパッケージングされている。適切なパッケージングとして、限定するものではないが、バイアル、ビン、ジャー、可撓性パッケージ（たとえば密閉されたマイラーバッグまたはプラスティックバッグ）などが挙げられる。同様に、ＰＣＲの機械、核酸アレイ、またはフローサイトメトリーシステムなどの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図されている。
【００８３】
キットは、任意に、対照試料および／または標準試料もしくは参照試料などの、解釈に必要な情報などの追加的な構成要素を提供してもよい。通常、本キットは、容器、および当該容器上にあるかまたは当該容器に関連したラベルまたは添付文書を含む。一部の実施形態では、本開示は、上述のキットの中身を含む製造物品を提供する。
【００８４】
がんの治療
本明細書中記載の方法を使用して同定される、本明細書中記載される目的のがん（たとえば、予後不良に関連し得る、肺がん、肝臓がん、結腸がん、または膵臓がん）のリスクがある対象または当該がんを罹患している対象は、いずれかの適切な治療薬で治療され得る。一部の実施形態では、記載の方法のアウトプット、たとえばバイオマーカーセットのレベルを測定することに基づき、対象に関する治療を選択するステップを含む方法が提供される。
【００８５】
一部の実施形態では、本方法は、アッセイのアウトプット、たとえばバイオマーカーの検出に基づく対象への投与のため、治療薬を選択または投与するステップ、たとえば化学療法、放射線療法、外科的療法、および／または免疫療法を選択するステップまたは行うステップのうちの１つまたは両方を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、治療薬は、対象へ１回以上投与される。治療薬、たとえば化学療法、放射線療法、外科的療法、および／または免疫療法が、肺がんの治療のための併用療法の一部として、別の療法と共に投与または行われてもよい。併用療法、たとえば化学療法および放射線療法は、複数の異なる構成で提供され得る。第１の療法は、他の療法の投与の前または後に行われ得る。一部の状況では、第１の療法および別の療法（たとえば治療薬）は、同時、または時間的に近い範囲で（たとえば同じ治療セッションの間などの、複数の療法の間が短い時間間隔で）、行われる。第１の薬および他の療法はまた、より大きな時間間隔で投与または行われてもよい。
【００８７】
一部の実施形態では、化学療法薬が、対象に投与される。化学療法薬の例として、限定するものではないが、カルボプラチンまたはシスプラチン、ドセタキセル、ゲムシタビン、Ｎａｂ−パクリタキセル、パクリタキセル、ペメトレキセド、およびビノレルビンが挙げられる。
【００８８】
一部の実施形態では、放射線療法が、対象に行われる。放射線療法の例として、限定するものではないが、電離放射線照射、ガンマ線照射、中性子線による放射線療法、電子線放射線療法、陽子線（ｐｒｏｔｏｎ）療法、小線源治療、全身性のラジオアイソトープおよび放射線増感剤が、挙げられる。
【００８９】
一部の実施形態では、外科的療法が、対象に行われる。外科的療法の例として、限定するものではないが、肺葉切除、楔状切除、区域切除、および肺切除術が挙げられる。
【００９０】
一部の実施形態では、免疫療法薬が、対象に投与される。一部の実施形態では、免疫療法薬は、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−Ｌ１阻害剤である。一部の実施形態では、免疫療法薬はニボルマブである。一部の実施形態では、免疫療法薬はペムブロリズマブである。
【００９１】
化学療法のさらなる例として、限定するものではないが、白金製剤、たとえばカルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、ロバプラチン、トリプラチン（Ｔｒｉｐｌａｔｉｎ）、四硝酸塩、ピコプラチン（Ｐｉｃｏｐｌａｔｉｎ）、プロリンダック（Ｐｒｏｌｉｎｄａｃ）、アロプラチン（Ａｒｏｐｌａｔｉｎ）および他の誘導体；トポイメソラーゼＩ阻害剤、たとえばカンプトテシン、トポテカン、イリノテカン／ＳＮ３８、ルビテカン、ベロテカン（Ｂｅｌｏｔｅｃａｎ）、および他の誘導体；トポイメソラーゼＩＩ阻害剤、たとえばエトポシド（ＶＰ−１６）、ダウノルビシン、ドキソルビシンの薬剤（たとえば、ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌ、ドキソルビシン類似体、またはリポソームにおけるドキソルビシンおよびその塩もしくは類似体）、ミトキサントロン、アクラルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、アムサクリン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン、テニポシドおよび他の誘導体；代謝拮抗薬、たとえば葉酸代謝拮抗薬ファミリー（Ｆｏｌｉｃ  ｆａｍｉｌｙ）（メトトレキサート、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、アミノプテリン、および類縁体）；プリン拮抗薬（チオグアニン、フルダラビン、クラドリビン、６−メルカプトプリン、ペントスタチン、クロファラビンおよび類縁体）およびピリミジン拮抗薬（シタラビン、フロクスウリジン、アザシチジン、テガフール、カルモフール、カペシタビン（Ｃａｐａｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、および類縁体）；アルキル化剤、たとえばナイトロジェンマスタード（たとえば、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、メクロレタミン、イホスファミド、メクロレタミン、トロホスファミド、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、エストラムスチン、および類縁体）；ニトロソウレア（たとえば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ホテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、および類縁体）；トリアゼン（たとえば、ダカルバジン、アルトレタミン、テモゾロミド、および類縁体）；スルホン酸アルキル（たとえば、ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファン、および類縁体）；プロカルバジン；ミトブロニトール、およびアジリジン（たとえば、カルボコン、トリアジコン、ＴｈｉｏＴＥＰＡ、トリエチレンメラミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｍａｌａｍｉｎｅ）、および類縁体）；抗菌薬、たとえばヒドロキシウレア、アントラサイクリン（たとえば、ドキソルビシンの薬剤、ダウノルビシン、エピルビシン、および他の誘導体）；アントラセンジオン（たとえば、ミトキサントロンおよび類縁体）；ストレプトマイセスファミリー（たとえば、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、プリカマイシン）；ならびに紫外線が、挙げられる。
【００９２】
さらに詳述することなく、当業者は、上記の説明に基づき、本開示を最も完全な度合で利用できると思われる。よって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、いかなる方法であっても残りの本開示を限定するものではない。本明細書中引用されるすべての刊行物は、本明細書中言及される目的または主題のために、参照として組み込まれている。
【００９３】
実施例
実施例１：原発性肺がん細胞と比較して肺がん幹細胞（ＣＳＣ）に差次的に存在するタンパク質の同定
材料および方法
肺がん細胞株
ヒトのＮＳＣＬＣ細胞株のＮＣＩ−Ａ５４９、ＥＫＶＸ、ＰＣ９、およびＨＣＣ８２７は、米国国立がん研究所（米国国立衛生研究所、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡ）またはアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から入手した。ヒトの肺がん細胞株（ＣＬＳ１、ＣＬ１００、ＣＬ１４１、およびＣＬ１５２）は、肺がん患者由来の初代培養を使用して確立した。これら細胞は、２０％のＯ２および５％のＣＯ２からなる湿潤した雰囲気下、３７℃で、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。
【００９４】
肺のＣＳＣおよびＣＡＦを培養するための共培養システム
ヒトの肺のＣＳＣおよびＣＡＦを、肺がん患者からすばやく切除した肺腫瘍組織から確立した。腫瘍および対となる正常な組織を、切除から３０分以内に回収して、初代の肺のＣＳＣ、ＣＡＦ、およびＮＦの培養物を、改変したプロトコルを使用して単離した。肺のＣＳＣを、ＮＳＣＬＣ患者から切除した組織のがん関連領域から単離し、フィーダー細胞、すなわち間質線維芽細胞と共に培養および維持した。これら試料は、ヒトの対象での研究に関して承認されたＩＲＢプロトコルに従い、調達し、利用した。全ての患者から、記載済みのインフォームドコンセントを入手した。がんではない関連の間質は、外科的な切除の時点での肉眼での検査およびその後の組織学的な解析により決定される際に、新生物の病変から少なくとも５ｃｍ離れた場所で、切除から３０分以内に、病理学者により（無菌条件下で）サンプリングされた。
【００９５】
これら組織を、改変を伴う以前に記載されたプロトコルに基づき処理した。簡潔に述べると、組織を細分化し、４℃のＳ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）において、デオキシリボヌクレアーゼ１（１ｍｇ／ｍｌ；Ｂｉｏｓｈｏｐ）およびプロテアーゼ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）の存在下で、６〜１２時間インキュベートした。消化させた後、細胞の塊を、４０μｍのセルストレーナー（Ｆａｌｃｏｎ）を介してふるいにかけ、単一細胞懸濁液を得た。回収した細胞を、２０％のＯ２および５％のＣＯ２を含む湿潤した雰囲気下、３７℃で、改変した培養条件の２４ウェルプレート中、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地において、異なる細胞密度（５×１０５）で培養した。３０日間の培養の後、スフィア様のコロニーを、周囲の間質細胞と共に同定することができた。スフィア様の細胞の継代培養を、以前に記載されるものに一部改変を加えて行った。このスフィアを、７〜１０日後に穏やかな遠心分離（５８ｇ）を介して回収し、酵素を用い（１０分間、０．０５％のトリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ４Ｎａにおいて；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、かつ熱処理したパスツールピペットを使用して機械的に、分離した。分離物から得た細胞を、４０μｍのふるいに通し、単一細胞の状態に関して顕微鏡を用いて解析した。１ｍｌあたり５，０００個の生細胞の密度の細胞を、フィーダーとしての間質細胞（５×１０５細胞／ウェル）をあらかじめ播種したプレートにプレーティングした。単一細胞／ウェルのクローンの実験のため、細胞を、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ  Ａｒｉｅｌ）の間セルソーターを使用して９６ウェルプレートにプレーティングした。このウェルは、フィーダー細胞（２，０００細胞／ウェル）をあらかじめ播種したものであった。肺のＣＳＣの継代培養を、以前に記載されたものに一部改変を加えて行った。簡潔に述べると、スフィアを、穏やかな遠心（８００ｒｐｍ）、酵素的消化（１０分間、０．２５％のトリプシン、１ｍＭのＥＤＴＡ含有；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、および機械的な破砕を介して回収した。この分離物から得た肺のＣＳＣを、１００μｍのストレーナーに通し、ふるいにかけた細胞を、顕微鏡を用いて解析した。１ｍｌあたり５，０００個の生細胞の密度の単一細胞を、ＣＡＦフィーダー細胞（５×１０５細胞／ウェル）をあらかじめ播種した１０ｃｍのディッシュにプレーティングした。
【００９６】
画像ベースのハイコンテントアッセイ
肺のＣＳＣまたはがん細胞（２００細胞／ウェル）を、ＣＡＦ（２，０００細胞／ウェル）をあらかじめ播種した９６ウェルプレートに添加し、一晩プレートに付着させた。異なる処理を行った後に、細胞を処理した後、Ｎａｎｏｇ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ；１：３００）一次抗体（がん幹細胞マーカーとして）およびマウス抗ヒトＣＤ９０  ＦＩＴＣコンジュゲート型（５Ｅ１０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；１：１００）抗体（ＣＡＦのマーカーとして）を用いた免疫蛍光プロトコルを、４℃で一晩行った。次に、一次抗体を、ＴＲＩＴＣコンジュゲート型二次抗体［ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）コンジュゲート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ］と共に、室温で２時間インキュベートした。この核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で対比染色した。二次抗体のバックグラウンド蛍光レベルを決定するために、各プレートは、二次抗体のみを含む対照のウェル（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２色素で染色）を備えていた。染色した細胞の画像を、オートメーション化された蛍光顕微鏡のプラットフォームを使用して、入手した。
【００９７】
画像の取得および解析
染色した細胞を、４倍の対物レンズを備えたハイコンテント解析プラットフォームを使用して、撮像した。各波長で、ウェルあたり１２の領域を撮像し、さらなる画像解析のために合成した。これら画像を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（登録商標）ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して解析した。第１に、がん細胞の核（ＦＩＴＣ染色を伴わない細胞、ＣＤ９０−）を、Ｍｕｌｔｉ−Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｏｒｉｎｇを使用して同定した。区分けしたがん細胞の核を、Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  Ｆｉｌｔｅｒを使用して、拡大し、平滑化することにより、細胞クラスターのマスク（ｃｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｍａｓｋ）を作製した。ＴｅｘＲｅｄで染色した陽性の細胞を、Ｎａｎｏｇ陽性の細胞として決定した。
【００９８】
リアルタイム逆転写（ＲＴ）Ｑ−ＰＣＲ
ＣＬＳ１／ＣＡＦおよびＣＬＳ１に関する、幹細胞性関連遺伝子の発現レベルおよびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイのデータのバリデーションを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＲＴ  Ｑ−ＰＣＲを介して行った。プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ３．０（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計されたものであった（表２）。βアクチンを、内部対照として使用した。発現レベルを、βアクチンに対して正規化し、−ΔＣＴ＝−［ＣＴ目的物質（ｔａｒｇｅｔ）−ＣＴβアクチン］として定義した。相対発現の比率を、対照と比較した倍数変化として計算した（２−ΔΔＣＴ）。実験は、三連で行った。
【表２】
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【００９９】
脂肪細胞への分化
がん幹細胞が脂肪細胞系列に分化し得るかどうかを試験するために、ＣＡＦと共培養したＣＬＳ１細胞、および陽性対照としての間葉系幹細胞を、Ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．  ＃  ＳＣＲ０２０）のプロトコルに従い試験した。簡潔に述べると、細胞を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地において、６×１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルプレートに播種した。コンフルエンスに達した後、脂肪細胞分化に関する細胞を、１μＭのデキサメタゾン、１０μｇ／ｍｌのインスリン、１００μＭのインドメタシン、および０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）を補充した基本的な増殖培地からなる脂肪細胞分化誘導培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．  ＃  ＳＣＲ０２０）において、２１日間培養した。この培地を、３日ごとに交換した。２１日間の培養後に、脂肪細胞の形成を、４％のＰＦＡで細胞を固定し、オイルレッドＯ色素を用いて室温で５０分間染色することにより、評価した。Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡を使用して、写真を撮影した。脂肪細胞への分化の間の遺伝子発現解析のため、総ｍＲＮＡを、分化の過程の間の０日目、７日目、または１４日目に、脂肪細胞分化培地で増殖させた細胞から回収した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、本明細書中記載されるようにこれら試料で、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体−γ（ＰＰＡＲ−γ）およびリポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）について行った。
【０１００】
骨芽細胞への分化
がん幹細胞が骨形成細胞系列へ分化し得るかどうかを試験するために、ＣＡＦと共培養したＣＬＳ１細胞、および陽性対照としての間葉系幹細胞を、０．１μＭのデキサメタゾン、０．２ｍＭのアスコルビン酸２−リン酸、および１０ｍＭのグリセロール２−リン酸を補充した基本的な増殖培地を使用したＯｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓａｙ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．  ＃  ＳＣＲ０２８）のプロトコルに従い、１４日間解析した。簡潔に述べると、細胞を、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ培地において６×１０４細胞／ウェルの密度で、ビトロネクチン／コラーゲンでコーティングした２４ウェル培養プレートに播種した。この培地を、３日ごとに交換した。１４日後に、細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、氷冷した７０％のエタノールにおいて、室温で１時間固定した。カルシウム沈着物を、アリザリンレッドＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ．  ＃２００３９９９）を用いて室温で３０分間染色することにより解析した。骨芽細胞への分化の間の遺伝子発現解析のため、総ｍＲＮＡを、分化の過程の間の０日目、３日目、または７日目に、骨芽細胞分化培地において増殖させた細胞から回収した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、これら試料で、ＡＰおよびオステオカルシン（ＯＣ）について行った。
【０１０１】
膜のプロテオームプロファイリング
膜タンパク質の試料を、ＣＡＦと共培養したＣＬＳ１細胞またはＣＡＦと共培養していないＣＬＳ１細胞から抽出し、試料を、内部標準物質の添加、ゲル支援型消化（ｇｅｌ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）、および三連のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析に供した。細胞株由来の三連のＬＣ−ＭＳ／ＭＳの実行を通した標識フリーの定量化を、中央研究院化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｃａｄｅｍｉａ  Ｓｉｎｉｃａ）のＹｕ−Ｊｕ  Ｃｈｅｎ博士の研究室により開発されたＩＤＥＡＬ−Ｑソフトウェアにより行った。ペプチドの比率を、正規化したペプチドの比率の加重平均により、決定した。
【０１０２】
遺伝子発現のプロファイリング
ＣＬＳ１／ＣＡＦおよびＣＬＳ１の遺伝子発現のプロファイリングマップを、製造社のプロトコルに従いＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して入手した。遺伝子発現のプロファイリングを、製造社のプロトコルに従いＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して行った。
【０１０３】
アレイのデータを、国立台湾大学のゲノム医薬のマイクロアレイのコア設備（Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）により処理した。簡潔に述べると、ＣＡＦ、肺のＣＳＣ、およびがん細胞から単離した総ＲＮＡを使用して、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーでｃＤＮＡを作製した（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＣｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。ビオチン標識したリボヌクレオチドを、ＢｉｏＡｒｒａｙ  ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔラベリングキット（ＥｎｚｏＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用して合成し、ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０  ｃｈｉｐ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用してハイブリダイゼーションを行った。
【０１０４】
結果
肺のＣＳＣは、ＣＡＦフィーダー細胞と共培養する場合に、がん幹細胞性および高い腫瘍原性を維持する。
持続性のＣＳＣ／ＣＡＦ共培養物のプラットフォームを、原発性肺がん細胞と比較して肺がん幹細胞（ＣＳＣ）に差次的に存在するタンパク質の同定のために使用した。ＣＡＦと共培養したＣＬＳ１細胞（ＣＬＳ１／ＣＡＦ）は、多くのＮａｎｏｇ＋細胞の集団を維持し（図１、パネルＡ）、脂肪細胞および骨芽細胞へ分化する能力を維持し（図１、パネルＢおよびＣ）、少ない数の細胞（１００個未満の細胞）を注入した際にマウスの異種移植片において腫瘍をもたらす性質を維持した（図１、パネルＤ）。しかしながら、ＣＡＦが継代培養の間に除去されると、このようながん幹細胞性の特徴は失われ、Ｎａｎｏｇ陽性の集団が減少し（図１、パネルＡ）、腫瘍をイニシエーションする頻度が１／１１から１／１７７４へと減少することが観察された（図１、パネルＤ）。よって、ＣＳＣ／ＣＡＦ共培養物のモデルは、がん幹細胞を培養するためおよびがん細胞の幹細胞性を維持するためのプラットフォームを提供する。
【０１０５】
高レベルのＣＤ１４およびＣＤ４４は、原発性肺がん細胞と比較してＣＳＣに存在する。
周辺のＣＡＦと相互作用するＣＳＣの細胞表面タンパク質を同定するために、本出願人らは、ＣＳＣ／ＣＡＦおよび分化したがん細胞のトランスクリプトームおよび膜のプロテオームのプロファイリングを行い、次に、ＣＳＣマーカーのスクリーニング戦略を行った（図１、パネルＥ）。この解析により、ＣＤ１４およびＣＤ４４の細胞表面タンパク質が、分化したがん細胞と比較してＣＳＣ／ＣＡＦにおいてアップレギュレートされていることが証明された。その後の解析は、プロファイリングデータ（上記の表１）の上部にあるＣＤ１４およびＣＤ４４のタンパク質に焦点を当てたものであった。
【０１０６】
候補のＣＳＣマーカーを調査するために、ＣＤ１４およびＣＤ４４の発現を、公開されている日本のコホート由来のステージＩの肺がん患者１５２名の臨床上のハザード比と相関させた。これら結果は、腫瘍細胞において高レベルのＣＤ１４の発現を伴う患者が、低レベルのＣＤ１４の発現を伴う患者と比較して、有意に不十分な無再発生存率を実証することを表した（Ｐ＜０．０５、カプランマイヤー分析；図１、パネルＦ）。患者の予後に関するＣＤ１４およびＣＤ４４の解析により、腫瘍細胞において高レベルのＣＤ１４およびＣＤ４４の発現を伴う患者は、腫瘍細胞において低レベルのＣＤ１４およびＣＤ４４の発現を伴う患者と比較して、より悪い無再発生存率を実証することが明らかとなった（ＣＤ１４＋ＣＤ４４、Ｐ＜０．０５、カプランマイヤー分析；図１、パネルＦ）。
【０１０７】
実施例２：予後不良と相関したＣＤ１４およびＣＤ４４
材料および方法
患者および腫瘍の検体
肺腫瘍組織の検体を、１９９５年１２月２８日〜２００５年１２月２６日の間に国立台湾大学病院（台湾、台北）で完全な外科手術を受けた、組織学的にＮＳＣＬＣが確認された患者（Ｎ＝８０）から入手した。この調査は、国立台湾大学病院の治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔａｉｗａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）により承認されたものであった（２０１１０３０２８ＲＣ）。登録された患者は、ステージＩと分類されており、以前に、ネオアジュバントの化学療法または放射線療法で治療されていなかった。全患者が、インフォームドコンセントを提供した。全ての検体は、ホルマリンで固定し、切片化し、Ｈ＆Ｅで染色し、顕微鏡を介して観察した。病理学的なステージ分類は、肺がんに関する国際的なステージ分類システムに従い、Ｙｉｈ−Ｌｅｏｎｇ  Ｃｈａｎｇ博士により行われた。
【０１０８】
肺がん患者由来の腫瘍の試料の免疫組織化学的解析
腫瘍の試料の免疫組織化学的解析を、標準的な手法に従い行い、本明細書中記載されるように改変した。ＣＤ１４（ｃｌｏｎｅ  ＥＰＲ３６５３；Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ；１：４００希釈）およびＣＤ４４（ｃｌｏｎｅ  ＤＦ１４８５；ＢｉｏＧｅｎｅｘ；１：２００希釈）に関して二重の免疫組織化学的染色を行った。脱パラフィンおよび再水和を行った後、厚さ５μｍの切片に、熱処理型の抗原賦活化（ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）を、１ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡバッファーを用いて、それぞれ１０分間行った。過酸化水素およびＵｌｔｒａ  Ｖ  Ｂｌｏｃｋでブロッキングした後に、検体を、室温で２時間、一次抗体と共にインキュベートした。ＴＢＳＴバッファー（Ｔｒｉｓバッファー［ＴＢＳ：５０ｍＭ、ｐＨ７．６］＋０．１％のＴｗｅｅｎ  ２０）を用いて、洗浄ステップを行った。二重染色を、ウサギ抗ヒト抗体（ＣＤ１４）に関するＨＲＰコンジュゲート型ポリマー、およびマウス抗ヒト抗体（ＣＤ４４）に関するアルカリホスファターゼコンジュゲート型ポリマーを使用することにより、ｍｕｌｔｉｖｉｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ＴＬ−０１２−ＭＡＲＨ）を用いて行った。Ｎａｎｏｇタンパク質発現のＩＨＣ解析のために使用される切片を、最初に、Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ＡＲ−１０  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）またはＡｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｃｉｔｒａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｉｏｇｅｎｅｘ）において１２１℃で１０分間オートクレーブした。次に、試料を、３％のＨ２Ｏ２−メタノールで処理し、順次、室温で、Ｕｌｔｒａ  Ｖ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）との１０分間のインキュベーション、およびウサギのモノクローナル抗Ｎａｎｏｇ（Ｄ７３Ｇ４，Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；１：３００）との２時間のインキュベーションに供した。免疫染色の検出を、製造社の説明に従いＳｕｐｅｒ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｎｏｎ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ＨＲＰ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＢｉｏＧｅｎｅｘ）を使用して行った。
【０１０９】
結果
腫瘍形成の早期におけるＣＤ１４およびＣＤ４４の臨床上の関連性および重要性を判定するために、ステージＩのＮＳＣＬＣを有する８０名の患者から腫瘍の検体を回収し、各検体の切片を、免疫組織化学的解析を介してＣＤ１４およびＣＤ４４に対する抗体で染色した。代表的な組織の切片を、図２のパネルＡに示す。これら患者の臨床上の特徴を、表３および表４に提供する。
【表３】
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【表４】
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【０１１０】
腫瘍細胞におけるＣＤ１４の発現レベルをスコア付けし、陽性または陰性のＣＤ１４タンパク質発現のカテゴリに二分した。腫瘍細胞におけるＣＤ４４の発現レベルをスコア付けし、ｈｉｇｈ（スコア≧リスクスコアの中央値）またはｌｏｗ（スコア＜リスクスコアの中央値）のＣＤ４４タンパク質の発現のカテゴリに二分した。多変量のＣｏｘ比例ハザード回帰分析を使用して、患者の生存と様々な独立した予後因子の関連を評価した（表５）。
【表５】
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【０１１１】
結果により、独立した予後因子は、ＣＤ１４の発現（ハザード比（ＨＲ）＝２．７９、９５％ＣＩ＝１．２９〜６．０３；Ｐ＝０．００９、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析）およびＣＤ４４の発現（ＨＲ＝９．２５、９５％ＣＩ＝３．７８〜２２．６４；Ｐ＜０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析）を含んでいたことが明らかとなった。転移に関連する独立した予後因子は、ＣＤ１４の発現（ＨＲ＝２．６３、９５％ＣＩ＝１．０９〜６．３５；Ｐ＝０．０３２、比例ハザード回帰分析）およびＣＤ４４の発現（ＨＲ＝５．８９、９５％ＣＩ＝２．１７〜１６．０１；Ｐ＜０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析、表６）であった。
【表６】
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【０１１２】
患者の予後に関するＣＤ４４およびＣＤ１４の発現レベルの個々の作用および組み合わせの作用の解析により、腫瘍細胞においてＣＤ４４およびＣＤ１４の両方の発現レベルが高い患者は、腫瘍細胞においてＣＤ４４およびＣＤ１４の発現レベルが低い患者と比較して、最も悪い全生存率（ＣＤ４４＋ＣＤ１４、Ｐ＜０．０００１、カプランマイヤー分析；図２のパネルＢ；ＨＲ＝３．３３、９５％ＣＩ＝２．１２〜５．２４；Ｐ＜０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析；表５）および無再発生存率（ＣＤ１４＋ＣＤ４４、Ｐ＜０．０５、カプランマイヤー分析；図２のパネルＣ；ＨＲ＝２．８８、９５％ＣＩ＝１．６８〜４．９４；Ｐ＝０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析；表６）を実証したことが明らかとなった。さらにこれらの結果は、ＣＤ４４および／またはＣＤ１４が、早期のＮＳＣＬＣ患者において転移（Ｐ＝０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析）および全生存率（Ｐ＜０．０００１、Ｃｏｘ比例ハザード回帰分析）を予測するための新規の予後指標を提供することを証明している（表５および表６）。
【０１１３】
これらの結果は、腫瘍細胞においてＣＤ１４および／またはＣＤ４４の発現レベルが高い患者は、発現レベルが低い患者と比較して有意に不十分な全生存率および無再発生存率を示すことを表した。
【０１１４】
実施例３：高濃度のＣＤ４４＋ＣＤ１４＋肺がん幹細胞をもたらすＣＡＦとの共培養
材料および方法
免疫蛍光顕微鏡
細胞を、室温でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において４％のパラホルムアルデヒドで固定した。標準的な免疫蛍光プロトコルに従った。ブロッキングおよびハイブリダイゼーションを、ＰＢＳ中３％（ｗｔ／ｖｏｌ）のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）において行った。Ｎａｎｏｇを標的とするモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ；１：３００）、ＣＤ９０  ＦＩＴＣコンジュゲート型（５Ｅ１０；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；１：１００）抗体、ＣＤ４４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（Ｇ４４−２６；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；１：１０）抗体、およびＣＤ１４  ＰＥコンジュゲート型（ＨＣＤ１４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１：２０）抗体を使用した。染色した細胞を、ＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を伴い、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃ１ｓｉ，Ｎｉｋｏｎ，Ｊａｐａｎ）を使用して観察した。
【０１１５】
ウェスタンブロット解析
具体的な手順は、標準的な手法に従い行われた。Ｎａｎｏｇに関する一次抗体（Ｄ７３Ｇ４；１：１０００）は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．から購入し、ＣＤ４４に関する一次抗体（ＭＡＢ４０７３；１：１０００）は、Ｃｅｌｌ  ｍａｒｑｕｅから購入し、ＣＤ１４に関する一次抗体（ＥＰＲ３６５３；１：１０００）は、Ｃｅｌｌ  ｍａｒｑｕｅから購入した。モノクローナルなマウスの抗βアクチン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；１：５０００）を、ローディングの対照として使用した。次に、膜をＴＢＳＴで３回洗浄し、次に、ＴＢＳＴ／２％のスキムミルクにおいて西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート型二次抗体（１：５，０００）と共にインキュベーションを行った。結合した抗体は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用して検出した。化学発光シグナルを、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ  ３０００システム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して撮像した。全ての実験は、二連で少なくとも３回行った。
【０１１６】
超低接着表面（Ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ）によるスフィア形成アッセイ
超低接着表面によるスフィア形成アッセイを、標準的な手法に従い行い、本明細書中記載されるように改変した。２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ）および２０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＭＣＤＢ２０１無血清培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における肺のＣＳＣの単一細胞懸濁液を、超低接着性（ｕｌｔｒａ−ｌｏｗ  ａｄｈｅｒｅｎｔ）の２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ；ウェルあたり２００個の生細胞）に播種した。この培地に、週に２回、新鮮な増殖因子を補充した。３週間後に、スフィアを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００顕微鏡下で観察した。
【０１１７】
結果
ＣＤ１４およびＣＤ４４の発現が、分化したがん細胞と比較してＣＳＣ／ＣＡＦ共培養モデルで高まることを検証するために、ＣＬＳ１／ＣＡＦの遺伝子発現プロファイルを、異なる継代を介し、フィーダー細胞を伴わずに培養したＣＬＳ１−分化したがん細胞の遺伝子発現プロファイルと比較した。この比較により、ＣＬＳ１細胞とＣＡＦの共培養物は、ＣＡＦを伴わずに継代培養したがん細胞と比較してＣＤ１４およびＣＤ４４の発現を誘導することが示された（図３、パネルＡ）。
【０１１８】
ＣＤ１４およびＣＤ４４が様々な腫瘍由来のＣＡＦと共培養した肺がん細胞において増大するかどうかをさらに評価するために、ＣＡＦを、異なる肺がん患者から単離した。異なるがん細胞株（Ａ５４９細胞およびＥＫＶＸ細胞）からレーザーにより捕捉したコロニー細胞は、高いＣＤ１４およびＣＤ４４の発現レベルを示した（図３、パネルＢおよび図５のパネルＡ）。患者から単離した１２個のＣＡＦの試料の特徴を、表７に示す。
【表７】
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【０１１９】
免疫蛍光染色およびウェスタンブロットにより、ＣＤ１４およびＣＤ４４が、分化したＣＬＳ１細胞よりも肺のＣＳＣ（ＣＬＳ１／ＣＡＦ）においてはるかに多く発現したことが確認された（図３のパネルＣ）。フローサイトメトリーの解析により、ＣＤ４４およびＣＤ１４が、肺のＣＳＣ（ＣＬＳ１／ＣＡＦ）においてより高いレベルで発現し（ＣＤ１４：５５％；ＣＤ４４：９８．１％）、分化後にＣＤ４４およびＣＤ１４の発現レベルが低減した（ＣＤ１４：１１％；ＣＤ４４：３０．３％）ことが示された（図５のパネルＢ）。異なる肺がん細胞株（Ａ５４９、ＥＫＶＸ、ＰＣ９、およびＨＣＣ８２７）ならびに原発性肺がん細胞（ＣＬ２５、ＣＬ８３、ＣＬ９７、ＣＬ１００、ＣＬ１４１、およびＣＬ１５２）においてＣＤ４４陽性の集団およびＣＤ１４／ＣＤ４４二重陽性の集団のパーセンテージを決定し、この結果は、ＣＤ４４陽性の集団が、異なる肺がん細胞において多く含まれていたことを証明した（７９．６±２９．７％、図６）。ＣＤ４４／ＣＤ１４二重陽性の集団のパーセンテージは、これらがん細胞において有意に低減していた（１９．０±２３．９％）。この解析により、ＣＤ４４およびＣＤ１４は、腫瘍のニッチにおけるがん幹細胞マーカーを十分表すことが明らかである。
【０１２０】
実施例４：ＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋がん細胞は、高い、腫瘍をイニシエーションする頻度を有する。
材料および方法
フローサイトメトリー
がん幹細胞マーカーの集合を解析し、フローサイトメトリーにより選別した。ヒト抗原ＣＤ４４  ＦＩＴＣコンジュゲート型（Ｇ４４−２６；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；１：１０）およびＣＤ１４  ＰＥコンジュゲート型（ＨＣＤ１４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；１：２０）の抗体は、商業的に購入された。肺がん細胞株および原発性肺がん細胞は、室温で３０分間、ＰＢＳにおけるＣＤ１４およびＣＤ４４の二重染色により染色した。３０分後に、染色した細胞を洗浄して過剰な未結合の抗体を洗い出し、ソーティングバッファー（ＰＢＳ中１ｍＭのＥＤＴＡおよび２％のＦＢＳ）に再懸濁した。フローソーティングを、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩＩセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行い、解析を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行った。ソーティングした試料の細胞に関して、単一細胞のソーティングを確保するために、細胞の凝集物を、前方散乱の高さ（ｆｏｒｗａｒｄ−ｓｃａｔｔｅｒ  ｈｅｉｇｈｔ）対前方散乱の幅（ｆｏｒｗａｒｄ−ｓｃａｔｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ）（ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ｗ）および側方散乱面積（ｓｉｄｅ−ｓｃａｔｔｅｒ  ａｒｅａ）対側方散乱の幅（ｓｉｄｅ−ｓｃａｔｔｅｒ  ｗｉｄｔｈ）（ＳＳＣ−Ａ対ＳＳＣ−Ｗ）により排除した。死細胞を、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、死細胞染色、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）（で染色した）細胞を除外することにより排除し、単一細胞実験のため、頑強な生細胞のソーティングの有効性を高めた。
【０１２１】
結果
肺がん細胞株および原発性肺がん細胞におけるＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋の集団の、がん幹細胞の作用上の定義を表す腫瘍をイニシエーションする能力を測定した。選別した肺がん細胞（ＣＬＳ１細胞）を、限定した希釈（１×１０４、１×１０３、および１×１０２細胞／マウス）で、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ２Ｒγ＿（ＮＳＧ）マウスに皮下注射した。肺がん細胞株（ＣＬＳ１）から選別したＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋集団は、ＣＤ４４ＨｉＣＤ１４−集団と比較して（１／２７８）高い、腫瘍をイニシエーションする頻度（１／１０）を示した。ＣＤ４４ｌｏｗＣＤ１４＋の集団は、判定されなかった。
【０１２２】
肺がん細胞株（ＣＬＳ１細胞およびＡ５４９細胞）ならびに原発性肺がん細胞（ＣＬ１００、ＣＬ１４１、およびＣＬ１５２）から選別したＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋の集団の腫瘍をイニシエーションする頻度も、同様に測定した。これら細胞集団を、限定した希釈（１×１０４、１×１０３、および１×１０２細胞／マウス）で、ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。ＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋集団は、ＣＤ４４ＨｉＣＤ１４−集団およびＣＤ４４ｌｏｗＣＤ１４−の集団由来のがん細胞と比較して、異種移植片において、高い腫瘍をイニシエーションする頻度を証明した（表８および図４のパネルＡ〜Ｆ）。これら結果から、肺がん細胞のＣＤ４４ＨｉＣＤ１４＋集団は、腫瘍原性幹様細胞であり得ることが示唆される。
【表８】
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【０１２３】
本明細書中記載されるトランスクリプトームおよびプロテオームの解析は、ＣＤ１４および／またはＣＤ４４が、ＣＡＦ培養物と比較してＣＳＣ／ＣＡＦ共培養物において高いレベルで存在することを同定した。本明細書中同定されたタンパク質のいずれかは、肺がん幹細胞に関するバイオマーカー（個別または組み合わせたバイオマーカー）として、たとえば、試料中の肺がん幹細胞の存在を決定するための方法、予後不良に関連する肺がんを有する患者を同定するための方法、治療の候補を選択するための方法、肺がんの進行をモニタリングするための方法、肺がんに対する治療の有効性を評価するための方法、治療工程を決定するための方法、対象に肺がんの再発のリスクがあるかどうかを評価するための方法において、ならびに／または、たとえば、新規治療の開発に関して信頼性があり得る、肺がんの機構および／もしくは肺がんに関与する生物学的な経路／プロセスを研究することを含む、研究目的のために、使用することが可能である。
【０１２４】
実施例５：様々な種類のがん幹細胞でのＣＤ１４の発現
肝臓がん細胞、結腸がん細胞、および膵臓がん細胞を含む様々な種類のがん細胞を、製造社のプロトコルに従いＰＥコンジュゲート型抗ＣＤ１４抗体（ＨＣＤ１４；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；ＰＢＳ中１：２０）を用いて、室温で３０分間染色した。アイソタイプ抗体を、非特異的な結合に対する陰性対照として使用した。次に、これら細胞をＰＢＳにより洗浄して未結合の抗体を除去し、ソーティングバッファーのＰＢＳ（ＰＢＳ中１ｍＭのＥＤＴＡおよび２％のＦＢＳ）に再懸濁し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｓｉａ（商標）Ｆｕｓｉｏｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のセルソーターを使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）解析に供した。
【０１２５】
以下の図９に示す通り、ＣＤ１４の発現が、様々な種類のがん細胞で観察された。
【表９】
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【０１２６】
この試験の結果は、ＣＤ１４が、様々な種類のがん細胞、たとえばがん幹細胞に関するバイオマーカーとして使用できることを表している。
【０１２７】
他の実施形態
本明細書中開示した全ての特性は、任意の組み合わせで組み合わせられ得る。本明細書中開示される各特性は、同じ目的、均等の目的、または類似の目的を供給する代わりの特性と置き換えられ得る。よって、他が明記されていない限り、開示される各特性は、包括的な一連の均等または類似の特性の単なる例である。上記の説明から、当業者は、本開示の本質的な特徴を容易に解明することができ、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な利用および条件に適合するように本開示の様々な変更および修正を行うことができる。よって、他の実施形態も同様に特許請求の範囲内にある。
【０１２８】
均等物および範囲
当業者は、単なる規定の実験を使用して、本明細書中記載される本開示の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または解明することができるであろう。本開示の範囲は、上記の説明に限定されると意図されてはおらず、むしろ、添付の特許請求の範囲に記載される通りである。
【０１２９】
特許請求の範囲において、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、文脈と反対または他の記載が明記されていない限り、１または１超を意味し得る。あるグループの１つ以上のメンバー間に「または（ｏｒ）」を含む特許請求の範囲または記載は、文脈と反対または他の記載が明記されていない限り、当該グループのメンバーのうちの１つ、１超、または全てが、所定の製品もしくはプロセスに存在している場合、所定の製品もしくはプロセスで使用される場合、または所定の製品もしくはプロセスに関連している場合を満たすと意図されている。本開示は、グループの正確に１つのメンバーが、所定の製品もしくはプロセスに存在する実施形態、所定の製品もしくはプロセスで使用される実施形態、または所定の製品もしくはプロセスに関連している実施形態を含む。本開示は、グループのメンバーの１超または全てが、所定の製品もしくはプロセスに存在する実施形態、所定の製品もしくはプロセスで使用される実施形態、または所定の製品もしくはプロセスに関連している実施形態を含む。
【０１３０】
さらに、本開示は、列挙した特許請求の範囲のうちの１つ以上に由来する１つ以上の限定、要素、項、および記述用語が別の特許請求の範囲に導入される、全てのバリエーション、組み合わせ、および並べ替えを包有する。たとえば、他の特許請求の範囲に従属するいずれの特許請求の範囲も、同じベースの特許請求の範囲に従属する他のいずれかの特許請求の範囲に見いだされる１つ以上の限定を含むように修正することができる。要素が、列挙として、たとえばマーカッシュ群の形式で提示されている場合、この要素の各下位群も同様に開示されており、いずれの要素も、当該群から除外される可能性がある。一般に、本開示または本開示の態様が特定の要素および／または特性を含むとみなされる場合、本開示の特定の実施形態または本開示の態様は、当該要素および／もしくは特性からなるか、または当該要素および／もしくは特性から本質的になることを理解すべきである。簡便性のため、これら実施形態は、本明細書中これらの言葉で（ｉｎ  ｈａｅｃ  ｖｅｒｂａ）具体的に記載されてはいない。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、オープンと意図されており、追加的な要素またはステップの包有を許容することに留意されたい。範囲が提供される場合、エンドポイントが含まれる。さらに、他の意味が記載されているかまたは文脈および当業者の理解から明らかではない限り、範囲として表されている値は、文脈が他の意味を明記しない限り、当該範囲の下限の単位の１０分の１までの、本開示の異なる実施形態に記載された範囲内のいずれかの特定の値または下位範囲を担うことができる。
【０１３１】
本願は、全てが参照として本明細書中に組み込まれている、様々な、発行済みの特許、公開済みの特許出願、学術論文、および他の刊行物に言及している。組み込まれた参照文献のいずれかと本明細書との間に矛盾が存在する場合、本明細書が統制を行う。さらに、従来技術の範囲内にある本開示のいずれかの特定の実施形態は、特許請求の範囲のいずれか１つ以上から明らかに除外され得る。このような実施形態は、当業者に知られているとみなされるため、当該実施形態は、この除外が本明細書中明らかに記載されていない場合であっても除外され得る。本開示のいずれかの特定の実施形態は、従来技術の存在に関連しないかどうかに関わらず、何等かの理由のため、いずれかの特許請求の範囲から除外され得る。
【０１３２】
当業者は、本明細書中記載の特定の実施形態に対する多くの均等物を、単なる規定の実験を使用して認識するか、または解明できるであろう。本明細書中記載される本実施形態の範囲は、上記の説明に限定されると意図されてはおらず、むしろ添付の特許請求の範囲に記載される通りである。当業者は、この説明に対する様々な変更および修正が、以下の特許請求の範囲に定義される限り、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解するものである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月3日(2019.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020507081000001.app
【国際調査報告】
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2020507081.tif 000027
2020507081.tif 000028
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