(57)【要約】  本発明は、癌関連免疫抑制の処置における免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物に関する。本発明はさらに、この糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を少なくとも含む医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌関連免疫抑制の処置における免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項２】
ハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物からなる、請求項１に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項３】
配列番号７０の２つのアミノ酸鎖を有する、請求項１又は２に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項４】
糖鎖改変抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項５】
前記糖鎖改変抗体が、腫瘍抗原に対して向けられたものである、請求項４に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項６】
前記腫瘍抗原が、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＡＭＨＲＩＩからなる群から選択される、請求項５に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項７】
前記糖鎖改変抗体が、
（ｉ）下記を含む、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体：
ａ）配列番号２を含む軽鎖及び配列番号４を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  ＶＬ配列及びＶＨ配列）；
ｂ）配列番号６を含む軽鎖及び配列番号８を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  ＶＬ配列及びＶＨ配列）；
ｃ）配列番号１０を含む軽鎖及び配列番号１２を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  軽鎖及び重鎖）；
ｄ）配列番号１４を含む軽鎖及び配列番号１６を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  軽鎖及び重鎖）、
（ｉｉ）ｉ）配列番号６３の重鎖可変領域と（ｉｉ）配列番号６４の軽鎖可変領域とを含む抗ＨＥＲ３  ９Ｆ７Ｆ１１糖鎖改変抗体、
（ｉｉｉ）（ｉ）配列番号６５の重鎖可変領域と（ｉｉ）配列番号６６の軽鎖可変領域とを含む抗ＨＥＲ３  Ｈ４Ｂ１２１糖鎖改変抗体、並びに、
（ｉｖ）（ｉ）配列番号６７の重鎖可変領域と（ｉｉ）配列番号６８の軽鎖可変領域とを含む抗ＨＥＲ４  ＨＥ４Ｂ３３糖鎖改変抗体、
からなる群から選択される、請求項４〜６のいずれか１項に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項８】
前記癌処置が、個体に、抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤をさらに投与することを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項９】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３及びＶＩＳＴＡの阻害剤からなる群から選択される、請求項８に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項１０】
前記阻害剤が、前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質に対して向けられた抗体、又はその抗原結合性フラグメントからなる、請求項９に記載の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物。
【請求項１１】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載された、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、及び（ｉｉ）抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項１２】
前記糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物が、請求項６又は７に記載された、腫瘍抗原に対して向けられた、糖鎖改変抗体である、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３及びＶＩＳＴＡの阻害剤からなる群から選択される、請求項１１又は１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤が、前記抑制性免疫チェックポイントタンパク質に対して向けられた抗体、又はその抗原結合性フラグメントからなる、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌疾患の間に生じうる免疫抑制状態の処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌の免疫回避は、有効な抗癌治療戦略を設計する際の主要な障害である。癌が破壊性の免疫機構をどのようにすり抜けるかの仕組みの理解にはかなりの進展が見られたが、腫瘍が回避するのを阻止する手段は追いついていない。
【０００３】
患者の長期生存は、癌処置における成功の「最良基準（gold  standard）」と考えられているが、患者の視点からすれば、無病生存が究極の目標である。長期生存及び無病生存は、有効な抗腫瘍応答を引き起こす患者個体の免疫系の増強に概ね依存するという考え方が益々強くなっている。自己免疫症状を誘発するポイントまでさえの、治療に対する強い免疫応答の証拠は、癌患者における長期生存の好ましい指標であり得る（Burkholder等，2014年，Biochimica  et  Biophysica  Acta，Vol．1845：182-201）。
【０００４】
様々な薬剤がその抗腫瘍効果についてスクリーニングされ且つその選択された薬剤は癌患者の処置用として承認されているが、化学療法、放射線療法、及び手術が標準的な癌治療戦略の主流として存続している（Vinay等，2015年，Seminars  in  cancer  biology，Vol．35：5185-5198）。これらの療法の欠点は、一過性の免疫抑制を引き起こす為のその能力であり、それは感染症のリスクを増加させ、且つ癌の更なる発症を阻止する為の免疫系の能力をまた低下させるおそれのあることである。
【０００５】
適応された全体的な癌処置戦略を特定することは、免疫増強療法(immune-boosting  therapies)が標準的な抗癌療法を増強しうる程度を決定することを包含する。全てではないにしても、ほとんどの全体的な癌処置戦略は、使用される抗腫瘍処置の種類に関係なく、抗腫瘍免疫を高める関連手段を含むべきであることが、当技術分野において強く示唆されている。
【０００６】
免疫療法は、化学療法又は放射線療法とは異なる機構を通じて作用し、そして毒性スペクトルが完全に異なる非交差耐性処置を表すので、免疫療法は癌を処置する可能性を秘めている。Ｔ細胞及びＢ細胞のいずれも、それぞれの各受容体の遺伝的組み換えを通じて、多種多様な潜在的腫瘍抗原を認識する能力を有することができ、そしてより重要なことには、Ｔ細胞及びＢ細胞のいずれも、正常細胞と形質転換された細胞との間のわずかな抗原的差異を区別することができ、毒性を最低限に抑えながら特異性を提供する。
【０００７】
癌に対する免疫応答の重要性は、数十年にわたり知られてきていた。しかしながら、免疫腫瘍学における最近の進歩は、免疫系と癌との相互作用の理解を大幅に改善させた。免疫編集は、免疫系が腫瘍の進行を変化させることができるプロセスを云う。免疫編集は、腫瘍の量及び質の両方を調節する。癌を免疫編集するプロセスは、３つの異なる段階：すなわち除去、平衡、及び逃避段階、のそれぞれを有する。逃避段階は、腫瘍レベルにおいて、又は腫瘍微環境のレベルにおいて生じうる。微小環境レベルにおいては、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ：regulatory  T  cells）及び骨髄由来のサプレッサー細胞（ＭＤＳＣ：myeloid  derived  suppressor  cells）の導入、又は免疫浸潤におけるプログラム死１（ＰＤ−１：programmed  death-1）／プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１：programmed  death-ligand  1）の発現が、免疫抑制的な腫瘍微環境をもたらしうる。
【０００８】
腫瘍に関連付けられたマクロファージ（ＴＡＭ：Tumor-associated  macrophages）、腫瘍関連の線維芽細胞、Ｔｒｅｇ、及びサプレッサー細胞により産生される可溶性因子のいずれも、癌誘発性の免疫抑制に寄与する。ＴＡＭは、免疫抑制、血管新生、及び直接的な腫瘍増殖因子の分泌を含む、複数の腫瘍促進プロセスを駆動しうる。
【０００９】
従って、免疫系は、癌を制御及び根絶する際に重要な役割を果たす。それにもかかわらず、悪性腫瘍の状況では、有効な抗腫瘍免疫を阻止する免疫抑制の多重機構が存在しうる。
【００１０】
幾つかのネガティブな免疫調節因子（チェックポイント）に対して向けられた抗体療法は、今日かなりの成功を示しており、様々な悪性腫瘍を有する患者の為の処置の主要な要素になる可能性がある。
【００１１】
Ｔ細胞増殖及びＩＬ−２産生の両方を阻害することを示されているそのような分子の第１は、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４：cytotoxic  T-lymphocyte  associated  protein  4）であった。この発見によって、癌細胞に対して向けられた休眠Ｔ細胞を活性化させることを狙いとして、この阻害経路をブロックすることに努力が向けられるようになった。ＣＴＬＡ−４に対して向けられた最初の抗体であるイピリムマブは、臨床トライアルに迅速に導入され、転移性メラノーマの処置用として２０１１年に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。イピリムマブで成功した後、他の免疫チェックポイントが、標的候補として、阻害について試験された。１つのそのような相互作用は、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）Ｔ細胞受容体と多くの癌細胞上に見出されるそのリガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）との相互作用であった。
【００１２】
しかしながら、そのような抗体は、限られた種類の腫瘍（主にメラノーマ、肺癌、腎癌）において有効であり、また、感受性の腫瘍においても、患者のかなりの部分が耐性を維持している。
【００１３】
ほとんどの状況において、癌療法の奏功を実現する為に、（ｉ）免疫抑制因子／機構を除去することと、（ｉｉ）腫瘍殺傷活性を増強することとを模索するデュアルアプローチに従わなければならないことが抗癌治療戦略に関係する現在得られている知識から導かれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
従って、癌を処置する為の更なる治療戦略を提供する必要性が当技術分野にある。有望な新規抗癌処置戦略を定義する為に、癌患者に生じうる免疫抑制を低減させる又はブロックする為の新規手段の必要性が特にある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、癌関連免疫抑制（cancer-associated  immunosuppression）の処置における免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物（glyco-engineered  Fc  fragment-bearing  compound）に関する。
【００１６】
特に、本発明は、癌関連免疫抑制の処置におけるＴ細胞免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物に関する。
【００１７】
本発明は、癌関連免疫抑制の処置におけるＣＤ８＋Ｔ細胞免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を包含する。
【００１８】
幾つかの実施態様において、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、ハイポフコシル化（hypofucosylated）Ｆｃフラグメント担持化合物である。
【００１９】
幾つかの実施態様において、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．）７０の２つのアミノ酸鎖を含む。
【００２０】
幾つかの実施態様において、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変抗体、特にハイポフコシル化抗体、である。
【００２１】
幾つかの実施態様において、上記糖鎖改変抗体は、腫瘍関連抗原（tumor  associated  antigen）に対して向けられたものである。
【００２２】
幾つかの実施態様において、上記腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＡＭＨＲＩＩからなる群から選択される。
【００２３】
幾つかの実施態様において、上記抗体は、本明細書において開示されているところの、３Ｃ２３Ｋ、９Ｆ７Ｆ１１、Ｈ４Ｂ１２１、及びＨＥ４Ｂ３３と呼ばれる抗体、並びにその変異体からなる群から選択される。
【００２４】
幾つかの実施態様において、上記癌処置は、個体に、更なる抗癌剤を投与することを含む。
【００２５】
幾つかの実施態様において、上記癌処置は、上記個体に、抑制性免疫チェックポイント阻害剤、例えばＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、及びＢ７Ｓ１の阻害剤、を投与することを含む。
【００２６】
幾つかの実施態様において、上記阻害剤は、上記抑制性免疫チェックポイントに対して向けられた抗体、又はその抗原結合性フラグメントからなる。
【００２７】
本発明はまた、（ｉ）糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、及び（ｉｉ）抑制性免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】図１は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂ（ＧＭ１０２）がマクロファージ誘発性Ｔ細胞阻害を低減させることを示す図である。図１Ａ：ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ腫瘍細胞を標的とするＭＤＭ２マクロファージと共培養されたＰＢＴ増殖の尺度を示す。無関係のｍＡｂ  Ｒ５６５（アイソタイプ対照）、抗ＡＭＨＲＩＩ  ＦｃＫＯ、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ３Ｃ２３Ｋのいずれかを用いてオプソニン化されたＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ細胞株により、共培養前に４日間、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  事前に活性化された末梢血液Ｔ細胞（peripheral  blood  T  cells）（「ＰＢＴ」とも呼ばれる）と共に追加の４日間、ＭＤＭ２は誘発処理された。データは、事前に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の分裂指標値（Division  Index）（すなわち、初期集団内の細胞が経験した細胞分裂の平均数）±標準偏差を表す（データは、３回の独立した実験の代表値である。ｐ値＊＜０．０５）。横座標、左から右：（ｉ）ｎ．ａ．Ｔ細胞  対照、（ｉｉ）ａ．Ｔ細胞  対照、（ｉｉｉ）アイソタイプ  対照、（ｉｖ）ＦｃＫＯ、及び（ｖ）３Ｃ２３Ｋ。
【図１Ｂ】図１は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂ（ＧＭ１０２）がマクロファージ誘発性Ｔ細胞阻害を低減させることを示す図である。図１Ｂ：ｍＡｂ処置されたポリスチレンビーズを標的とするＭＤＭ２マクロファージと共培養されたＰＢＴ増殖の尺度を示す。対照としてコーティングされないポリスチレンビーズ、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ＦｃＫＯ若しくは抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋでコーティングされたポリスチレンビーズを用いて、共培養前の２４時間、事前に活性化されたセルトレースバイオレット（cell  trace  violet）が負荷されたＰＢＴと共に追加の４日間、ＭＤＭ２が誘発処理された。データは、事前に活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の分裂指標値（すなわち、初期集団内の細胞が経験した細胞分裂の平均数）±標準偏差を表す（データは、３回の独立した実験の代表値である。ｐ値＊＊＜０．０１）。ｎ．ａ．は、非活性化Ｔ細胞、ａ．は活性化Ｔ細胞を云う。横座標、左から右：（ｉ）ｎ．ａ．Ｔ細胞  対照、（ｉｉ）ａ．Ｔ細胞  対照、（ｉｉｉ）未処置ビーズ、（ｉｖ）ＦｃＫＯ、及び（ｖ）３Ｃ２３Ｋ。
【図２Ａ】図２は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体は、ヒトＴリンパ球の増殖に影響を及ぼさないことを示す図である。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔが負荷されたＴ細胞が、１０μｇ／ｍｌの抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂの存在下又は非存在下において、ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたビーズにより活性化された。３日後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの希釈物がフローサイトメトリーによって評価され、生データとして（図２Ａ）表された。
【図２Ｂ】図２は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体は、ヒトＴリンパ球の増殖に影響を及ぼさないことを示す図である。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔが負荷されたＴ細胞が、１０μｇ／ｍｌの抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂの存在下又は非存在下において、ＣＤ３／ＣＤ２８がコーティングされたビーズにより活性化された。３日後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔの希釈物がフローサイトメトリーによって評価され、１、２、３、又は４回分裂したＴ細胞の％として（図２Ｂ）表された。図２Ｂにおいて、縦座標は、各ピークにおけるパーセンテージ（％）を表す；下から上：（ｉ）分裂０回、（ｉｉ）分裂１回、（ｉｉｉ）分裂２回、（ｉｖ）分裂３回、及び（ｖ）分裂４回。
【図３Ａ−１】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ａは、Ｍ２表現型のマクロファージに関連付けられたマーカー、例えばＳｅｐｐ１（ｍＲＮＡ−図３Ａ−１）、の発現減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ａ−２】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ａは、Ｍ２表現型のマクロファージに関連付けられたマーカー、例えばＳｔａｂ１（ｍＲＮＡ−図３Ａ−２）、の発現減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ａ−３】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ａは、Ｍ２表現型のマクロファージに関連付けられたマーカー、例えばＦＯＬＦＲ２（ｍ−ＲＮＡ−図３Ａ−３）、の発現減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ａ−４】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ａは、Ｍ２表現型のマクロファージに関連付けられたマーカー、例えばＣＤ１６３（タンパク質−図３Ａ−４）、の発現減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｂ−１】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｂ−１（ｍＲＮＡ発現）は、ＣＤ１６の発現増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｂ−２】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｂ−２（タンパク質発現）は、ＣＤ１６の発現増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｃ−１】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｃ−１（ｍＲＮＡ発現）は、ＣＤ６４の発現増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｃ−２】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｃ−２（ｍＲＮＡ発現）は、ＣＤ６４の発現増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｃ−３】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｃ−３（タンパク質発現）は、ＣＤ６４の発現増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｄ−１】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｄは、Ｍ１マクロファージによって通常発現される炎症促進因子、例えばＴＮＦα（図３Ｄ−１）、の増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｄ−２】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｄは、Ｍ１マクロファージによって通常発現される炎症促進因子、例えばＩＬ１β（図３Ｄ−２）、の増加を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｅ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｅは、免疫抑制性の因子ＴＧＦβをコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルの減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｆ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｆは、免疫抑制性の因子ＩＤＯ１をコードする遺伝子のｍＲＮＡレベルの減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｇ−１】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｇ−１（ｍＲＮＡ発現）は、免疫抑制性の因子ＩＬ１０の減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｇ−２】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｇ−２（タンパク質発現）は、免疫抑制性の因子ＩＬ１０の減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｈ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｈ（ｍＲＮＡ発現）は、血管新生促進因子ＰＤＧＦαの減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｉ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｉ（ｍＲＮＡ発現）は、血管新生促進因子ＶＥＧＦβの減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｊ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｊ（ｍＲＮＡ発現）は、血管新生促進因子ＨＧＦの減少を例証する。左のボックスは、抗体無しにウェル中で増殖されたＭ２型マクロファージを例示する。中央のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。右のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図３Ｋ】図３は、Ｆｃを担持する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化を示す図である。図３Ｋは、Ｍ２マクロファージの表面でのＰＤＬ２発現を示す。白色のボックスは、ＦｃＫＯ抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。黒色のボックスは、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体有りのウェル中で培養されたＭ２型マクロファージを例示する。
【図４Ａ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ａ：抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共に、３７℃で４時間インキュベートされたＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ細胞上で、ＴＡＭ様マクロファージによって生成されたＡＤＣＣを示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｂ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｂ：抗ＡＭＨＲＩＩ抗体と共に４日間インキュベートされたＴＡＭ様マクロファージによるＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞の細胞溶解を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｃ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｃ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、ＣＤ８メモリー（ＣＤ８＋ＣＤ２５＋）マクロファージのパーセンテージ（％）を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｄ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｄ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＣＤ１８３＋）マクロファージのパーセンテージ（％）を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｅ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｅ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ＣＤ１８３−）マクロファージのパーセンテージ（％）を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｆ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｆ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＸＣＬ９の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｇ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｇ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＸＣＬ１０の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｈ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｈ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＣＬ２の検出を示す。各ドナーについてベースラインが異なることから、ドナー３例のデータ（三連）は個別処理された。左から右の各ドナー：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。
【図４Ｉ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｉ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ１βの検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｊ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｊ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ６の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｋ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｋ：ＴＡＭ様マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＣＬ５の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｌ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｌ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ１２の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｍ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｍ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ６の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｎ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｎ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ１βの検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｏ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｏ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＩＬ２３の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｐ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｐ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＸＣＬ９の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図４Ｑ】図４は、糖鎖改変された３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体が免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化を引き起こすことを示す図である。図４Ｑ：未分化マクロファージとＳＫＯＶ３−ＡＭＨＲＩＩ癌細胞及び抗ＡＭＨＲＩＩ抗体とを４日間共インキュベーションした後、培養培地中でのＣＸＣＬ１０の検出を示す。左から右：３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯ、３Ｃ２３Ｋ  ＣＨＯ、及び３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０（３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２／０を意味する）。三回テストされた、ドナー３例に由来する、マクロファージのデータが提示されている。
【図５Ａ】図５は、糖鎖改変抗体が投与された癌患者の腫瘍組織中に存在するマクロファージの活性化を示す図である。図５Ａ（ｃｄ１６）：３Ｃ２３Ｋ抗体が投与された癌患者の腫瘍組織において実施された、細胞マーカーの免疫蛍光アッセイの結果を示す。図５Ａ：処置前（ベースライン）及び処置中の患者０４−０１及び患者０１−０１におけるＣＤ１６陽性腫瘍組織のパーセンテージ（％）を示す。黒色のボックスは患者０４−０１を例示し、灰色のボックスは患者０１−０１を例示する。
【図５Ｂ】図５は、糖鎖改変抗体が投与された癌患者の腫瘍組織中に存在するマクロファージの活性化を示す図である。図５Ｂ（グランザイム）：３Ｃ２３Ｋ抗体が投与された癌患者の腫瘍組織において実施された、細胞マーカーの免疫蛍光アッセイの結果を示す。図５Ｂ：処置前（ベースライン）及び処置中の患者０１−０１における細胞のパーセンテージ（％）を示す。黒色のボックスは細胞ＣＤ８＋ＧＺＢ＋／ｍｍ２のパーセンテージ（％）を例示する；灰色のボックスは、細胞ＣＤ１６＋ＧＺＢ＋／ｍｍ２のパーセンテージ（％）を例示する；及び白色のボックスはＮＫｐ４６＋ＧＺＢ＋／ｍｍ２のパーセンテージ（％）を表す。
【図６Ａ】図６は、糖鎖改変抗体が投与された癌患者におけるＮＫ細胞、単球、及びＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図６Ａ：ＧＭ１０２（３Ｃ２３Ｋ）により処置された患者の血液サンプル中に存在するＣＤ４＋ＩＣＯＳ＋細胞のフローサイトメトリーによる定量化（平均フロー強度）を示す。ＧＭ１０２（３Ｃ２３Ｋ）の注射前（Ｃ１Ｊ０）及び注射期間中（Ｃ１Ｊ０＋４Ｈ）のサイクル１、次にサイクル２及びサイクル３の前（それぞれＣ２Ｊ１及びＣ３Ｊ１）に、サンプルが採取された。
【図６Ｂ】図６は、糖鎖改変抗体が投与された癌患者におけるＮＫ細胞、単球、及びＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。図６Ｂ：Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙにおいて、ＧＭ１０２  ３Ｃ２３Ｋにより処置された患者の血液サンプル中に存在するＣＤ８＋ＩＣＯＳ＋細胞のフローサイトメトリーによる定量化（平均フロー強度）を示す。ＧＭ１０２（３Ｃ２３Ｋ）の注射前（Ｃ１Ｊ０）及び注射期間中（Ｃ１Ｊ０＋４Ｈ）のサイクル１、次にサイクル２及びサイクル３の前（それぞれＣ２Ｊ１及びＣ３Ｊ１）に、サンプルが採取された。
【図７】図７は、処置後及び処置期間中の患者におけるＣＤ１４＋細胞内に存在する典型的な、中間的な、及び非典型的な単球サブセットのパーセンテージ（％）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
癌細胞及び免疫系細胞、例えばＴ細胞及びマクロファージ、を含む癌組織のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）モデルを使用して、本発明者等は、Ｔ細胞活性化の阻害が、Ｍ２腫瘍に関連付けられたマクロファージ（ＴＡＭ：tumor-associated  macrophages）により思いがけず誘発されうることを見出した。
【００３０】
更に、本発明者等は、そのようなＴ細胞活性化のＴＡＭ誘発性阻害が、糖鎖改変抗体をこのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）癌組織モデルに添加することによって低減又はブロックされうることを示した。糖鎖改変抗体、特にハイポフコシル化された抗体は、Ｆｃ受容体、特にマクロファージ膜に存在するＦｃ受容体、とりわけＦｃγＲＩＩＩａ（当技術分野において「ＣＤ１６ａ」とも呼ばれる）、と高い親和性を有して結合することが当技術分野において知られている。
【００３１】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者等は、マクロファージ膜に存在するＦｃ受容への、糖鎖改変抗体の結合が、可溶性因子の放出、例えばサイトカインの放出、を誘発し、腫瘍組織環境内に存在するＴ細胞に対して阻害ブロッキング効果、又は腫瘍組織環境内に存在するＴ細胞の活性化を惹起すると考える。従って、本発明者等は、糖鎖改変抗体が、Ｔ細胞阻害をブロックすること又はＴ細胞を活性化させることによって、癌に作用された特定の個体に生ずる、癌細胞に対する免疫応答の阻害を低減させる又はブロックすることができると考える。
【００３２】
本発明者等は、腫瘍細胞それ自体が、糖鎖改変抗体の存在下で得られる免疫活性化効果において、必ずしも必要でないことを本明細書中に更に示した。
【００３３】
なお更に、本発明者等は、ＴＡＭ様マクロファージのＦｃγ受容体と高い親和性を有して結合することが示されている上記糖鎖改変抗体が、免疫抑制的なサイトカイン、例えばＩＬ−１０、の同時低下と共に、同抗体は免疫抑制的Ｍ２表現型のＴＡＭ様マクロファージを非免疫抑制的Ｍ１表現型に向かうように誘発することを示した。本発明者等はまた、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の存在下で、上記ＴＡＭ様マクロファージが、腫瘤促進遺伝子、例えばＶＥＧＦアルファ、ＶＥＧＦベータ、ＰＤＧＦベータ、及び肝細胞増殖因子、の発現に有意な変化なしに、炎症促進サイトカイン、例えばＩＬ−１ベータ、をより多く発現させることを示した。
【００３４】
本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の投与は、癌患者のＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルの増加を誘発することがまた本明細書において示された。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者等は、糖鎖改変抗体が、マクロファージを誘発してＴ細胞活性化サイトカインを放出するようにするので、免疫抑制状態を経験している癌患者に生ずるＴ細胞阻害の除去を可能にし、従ってＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を引き起こすと考える。
【００３５】
なお更に、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体は、Ｔｈ１表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞の増加、及びＴｈ２表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞の減少を誘発することが、本明細書において示されている。Ｔｈ１  Ｔ細胞とＴｈ２  Ｔ細胞との間のバランスのそのような変化は、腫瘍細胞に対する免疫応答の増加を助成するものと期待される。
【００３６】
本発明者等はまた、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体が、サイトカイン、例えばＩＬ１ベータ、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、及びＩＬ２３、の発現を調節することも示した。
【００３７】
本明細書に記載されている糖鎖改変抗体は、ナイーブマクロファージ（naive  macrophages）を誘発して、その免疫抑制的サイトカイン、例えばＩＬ−１０、の産生を低下させることが本明細書においてまた示されている。
【００３８】
本発明者等は、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の癌患者への投与が、腫瘍組織内のＣＤ１６＋（ＦｃガンマＲＩＩＩ＋）細胞の数の増加を誘発することを更に示した。従って、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の癌患者への投与は、腫瘍組織内の抗腫瘍活性化マクロファージの増加を引き起こす。本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の癌患者への投与は、腫瘍組織内のグランザイムＢ産生活性化マクロファージのレベルを増加させ、その免疫抑制的状態の阻害は、腫瘍細胞の細胞溶解に寄与するはずであることが更に示された。なお更に、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の癌患者への投与は、腫瘍組織内のＮＫ細胞の数も増加させ、免疫抑制のその阻害は、腫瘍細胞の殺傷にも同様に寄与するはずである。
【００３９】
本発明者等はまた、本明細書に記載されている糖鎖改変抗体の癌患者への投与が、（ｉ）ＮＫ細胞によるＣＤ１６（ＦｃガンマＲＩＩＩ）の発現を増加させ、（ｉｉ）単球上でのＣＤ６９の発現を増加させ、及び（ｉｉｉ）Ｔ細胞上でのＩＣＯＳ（誘導可能なＴ細胞補助刺激分子）の発現を増加させること、それらは、癌患者により経験された免疫抑制状態の阻害を実現する他のパラメーターであることを示した。
【００４０】
総じて、本発明者等の知見は、糖鎖改変抗体が、Ｔ細胞抗腫瘍活性のマクロファージ誘発性の抑制を低減させる又はブロックすることができることを示す。
【００４１】
本発明者等の結果は、それらを糖鎖改変抗体の投与に基づく処置ツールとみなすことを可能にし、上記処置ツールは、癌に作用された個体に生じうる免疫抑制状態を低減させる又はブロックすることを目的とする。
【００４２】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者等は、糖鎖改変抗体により誘発された免疫刺激効果が、上記抗体が関連する抗原結合領域を有する又は有さないを問わず、細胞膜に存在するＦｃ受容体に対して有する、特にマクロファージ膜に存在するＦｃ受容体に対して有する、上記糖鎖改変抗体の高い親和性に起因すると考える。
【００４３】
本明細書の実施例に示されるように、免疫抑制状態を低減させること又はブロックすることは、腫瘍抗原発現細胞が存在しないモデルにおいてさえも得られ、それは、上記糖鎖改変抗体の腫瘍抗原との結合、及び食作用そのものにより誘発された腫瘍細胞量の低下は、その免疫活性化効果を誘発する為に要求されえないこと、特にマクロファージ誘発性のＴ細胞阻害を低減させる又はブロックする為に特に要求されえないこと、を意味しうる。言い換えれば、本発明者等は、上記糖鎖改変抗体によるＴ細胞阻害のブロッキングは、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物としてのこれらの抗体の挙動に関連すると考える。
【００４４】
本発明は、個体の癌処置における免疫抑制阻害剤としての使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物に関する。
【００４５】
本発明は、癌に作用された個体における免疫抑制状態を予防又は処置の使用の為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物に関係する。
【００４６】
本発明は、癌の処置の為の医薬を調製する為の、免疫抑制阻害剤としての、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用に関する。
【００４７】
本発明は、癌に作用された個体における免疫抑制状態の予防又は処置の為の医薬を調製する為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用に関する。
【００４８】
本発明は、癌を処置する方法であって、それを必要とする個体に、免疫抑制阻害剤としての、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を投与する工程を含む上記方法に関係する。
【００４９】
本発明は、癌に作用された個体における免疫抑制状態を予防又は処置する為の方法であって、それを必要とする個体に、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を投与する工程を含む上記方法に関わる。
【００５０】
本発明は、癌に作用された個体に生ずるマクロファージ誘発性Ｔ細胞阻害により引き起こされた免疫抑制状態を低減させる又はブロックする為の医薬品を調製する為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用に関する。
【００５１】
本発明は、癌に作用された個体に生ずるマクロファージ誘発性Ｔ細胞阻害により引き起こされた免疫抑制状態を低減させる又はブロックする為の医薬を調製する為の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用に関係する。
【００５２】
本発明はまた、癌に作用された個体に生ずるマクロファージ誘発性Ｔ細胞阻害によって引き起こされた免疫抑制状態を低減させる又はブロックする為の方法であって、それを必要とする個体に、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を投与する工程を含む上記方法に関わる。
【００５３】
先行する実施態様から、本発明により関係づけられる癌の個体は、免疫抑制にまた作用された個体であることが導かれる。
【００５４】
幾つかの実施態様において、本発明により関係づけられる癌の個体は、抗癌処置により引き起こされた免疫抑制にまたやはり作用された個体である。
【００５５】
定義
本発明に従うと、表現「を含む（comprising）」、例えば「の工程を含む（comprising  the  steps  of）」はまた、「からなる（consisting  of）」、例えば「の工程からなる（consisting  of  the  steps  of）」、として理解される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、語「癌関連免疫抑制」、「癌に関連する免疫抑制」、「免疫抑制状態」は、癌に作用された個体と関連する場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、活性化されるべきその能力を有し、その能力が低下している又はブロックされている、すなわち活性化されるべきその能力を有し、その能力の一部又は全部が阻害されている、ところの状況を包含する生理学的状態を意味する。
【００５７】
実例として、本発明に従うと、免疫抑制状態を経験する癌に作用された個体は、上記個体から予め集められたサンプルに含まれる末梢血液ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させる能力を測定する工程を含むイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験方法であって、上記末梢血液Ｔ細胞が、その増殖能力を測定する前に事前活性化の工程に付されているところの上記方法により決定されうる。
【００５８】
従って、幾つかの実施態様において、上記テストされた個体のＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させる為の能力が免疫抑制状態の欠如を示す基準ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力値よりも低い場合に、免疫抑制状態が上記テスト対象の個体において検出されうる。幾つかの実施態様において、上記参照ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力値は、免疫抑制されていない健康な個体に見出される平均ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力値でありうる。幾つかの他の実施態様において、上記基準値は、（ｉ）免疫抑制状態を示す閾値よりも低い（または使用される指標単位に応じて高い）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力値と、（ｉｉ）免疫抑制状態の欠如を示す閾値よりも高い（または使用される指標単位に応じて低い）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖能力値との間の区別を可能にする閾値でありうる。
【００５９】
幾つかの実施態様において、ＣＤ８Ｔ細胞増殖能力値は、本明細書の実施例に示されるように、ＣＤ８＋Ｔ細胞の分裂指標値である。
【００６０】
本明細書で使用される場合、語「を処置する（treat）」、「を処置すること（treating）」、「処置（treatment）」等は、障害及び／又はそれに関連付けられた症状を低下させる又は改善することを云う。除外されないものの、障害又は状態を処置することは、障害、それに関連付けられた状態又は症状が完全に取り除かれることを必要としないと認識されるだろう。
【００６１】
本明細書で使用される場合、語「を予防する（prevent）」、「を予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的処置（prophylactic  treatment）」等は、障害又は状態を有さないが、それを発症するリスクを有する又はそれを発症しやすい対象において、障害又は状態を発症する確率を低下させることを云う。
【００６２】
本明細書で使用される場合、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、高い親和性を有する上記Ｆｃフラグメントの、Ｆｃ受容体、特にマクロファージ膜に存在するＦｃ受容体（それは、腫瘍関連マクロファージのメンブレンに存在するＦｃ受容体を含む）、との結合を可能にする変更されたグリコシル化を有する抗体のＦｃフラグメントを含む任意の化合物を包含する。
【００６３】
幾つかの実施態様において、Ｆｃ含有タンパク質は、１以上のポリペプチドを含む。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃフラグメント担持タンパク質」は、少なくとも１つの他の異種タンパク質ユニット又はポリペプチドに融合されたＦｃフラグメントを含むタンパク質を云う。
【００６５】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、（ｉ）糖鎖改変されたＦｃフラグメントそれ自体、（ｉｉ）非タンパク質部分に共有結合されている、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含むハイブリッド化合物、及び（ｉｉｉ）タンパク質部分に結合されている、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含むタンパク質化合物を包含する。
【００６６】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有するタンパク質化合物はタンパク質を包含し、ここで、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントは、抗体の抗原結合ドメインに共有結合されており、例えば抗体の可変領域に共有結合されている。
【００６７】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有するタンパク質化合物はタンパク質を包含し、ここで、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントは、１以上の他のＦｃフラグメントに直接的又は間接的に共有結合されており、例えば１以上の他の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントに共有結合されている。そのような糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の実例は、例えばThiruppathi等（2014年，J  Autoimmun，Vol．52：64-73）により、Jain等（2012，Arthritis  Research  and  Therapy，Vol.  14：R192）により、又はZhou等（2017年，Blood  advances，Vol．1(n°6)：DOI  10.1182/biooadvances.2016001917）により記載されている「Ｆｃ多量体」として、当技術分野において知られている化合物を包含する。
【００６８】
幾つかの好ましい実施態様において、本発明に従う、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変抗体を包含する。
【００６９】
幾つかの好ましい実施態様において、糖鎖改変抗体は、腫瘍関連抗原向けられた抗体を包含する。
【００７０】
本明細書で使用される場合、語「抗体」は、関心のある抗原に対して有意で既知の特異的免疫反応活性、特に関心のある腫瘍関連抗原に対して免疫反応活性を有するアセンブリ（例えば、天然の抗体分子、抗体フラグメント、又はその変異体）を云う。抗体及び免疫グロブリンは軽鎖及び重鎖を含み、それらの間に鎖間共有結合を有する場合と有さない場合とがある。
【００７１】
免疫グロブリンの軽鎖は、カッパ又はラムダ（κ、λ）として分類される。各重鎖クラスはカッパ又はラムダ軽鎖のいずれかと結合されうる。一般的に、軽鎖及び重鎖は相互に共有結合されており、且つ免疫グロブリンがハイブリドーマ、Ｂ細胞、又は遺伝子工学的に操作された宿主細胞によって生成される場合、２本の重鎖の「テール」（tail）部分は、共有結合性ジスルフィド結合又は非共有結合性結合によって互いに結合されている。
【００７２】
軽鎖及び重鎖の両方は、構造的及び機能的相同性の領域に分けられる。語「領域」は、免疫グロブリン又は抗体鎖の一部又は部分を云い、定常領域又は可変領域、並びに上記領域のより別個の一部（discrete  parts）又は部分（portions）を含む。例えば、軽鎖可変領域は、本明細書で定義される「フレームワーク領域」（framework  regions）または「ＦＲ」に散在する「相補性決定領域」（complementarily  determining  regions）または「ＣＤＲ」を含む。
【００７３】
免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の領域は、「定常領域」（constant  region）の場合は、様々なクラスメンバーの領域内で配列変動の相対的欠如に、又は「可変領域」（variable  regions）の場合は、様々なクラスメンバーの領域内で有意な変動に基づき、「定常」（Ｃ）領域又は「可変」（Ｖ）領域として定義されうる。
【００７４】
慣用では、可変定常領域ドメインの番号付けは、免疫グロブリン又は抗体の抗原結合部位又はアミノ末端から遠ざかるほど増加する。免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖それぞれのＮ末端は可変領域であり、且つＣ末端は定常領域である；ＣＨ３及びＣＬドメインは、重鎖及び軽鎖のカルボキシ末端をそれぞれ含む。従って、軽鎖免疫グロブリンのドメインはＶＬ−ＣＬの方向で配置されており、一方、重鎖のドメインは、ＶＨ−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３の方向で配置されている。
【００７５】
ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬドメイン内のアミノ酸位置を含む、重鎖定常領域内のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔインデックス番号付けシステムに従って番号付けされうる（Kabat等，“Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest”，U.S．Dept．Health  and  Human  Services．，5th  edition，1991年を参照）。代替的には、抗体アミノ酸位置は、ＥＵインデックス番号付けシステムに従って番号付けされうる（Kabat等，同書、を参照）。
【００７６】
本明細書で使用される場合、語「Ｆｃ領域」は、パパイン切断部位のすぐ上流のヒンジ領域内（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４とすれば、ＩｇＧ内の残基２１６）で始まり、且つ抗体のＣ末端で終わる重鎖定常領域の部分として定義される。従って、完全なＦｃ領域は、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む。
【００７７】
本明細書で使用される場合、語「Ｆｃフラグメント」とは、単量体の形態又は多量体の形態に関わらず、抗体の消化に起因する又は他の手段によって生成される非抗原結合性フラグメントの配列を含み且つヒンジ領域を含むことができる分子を云う。Ｆｃフラグメントのオリジナルの免疫グロブリン供給源はヒト起源であることができ、且つ任意の免疫グロブリン、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ２、であることができる。Ｆｃフラグメントは、共有性の会合（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有性の会合により二量体の形態又は多量体の形態に結合されることができる単量体ポリペプチドからなる。Ｆｃフラグメントの単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、及びＩｇＧＡ２）に応じて１〜４個の範囲である。Ｆｃフラグメントの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化に起因するジスルフィド結合した二量体である。本明細書で使用される場合、語「Ｆｃフラグメント」は、単量体、二量体、及び多量体の形態であるのが一般的である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、語「Ｆｃフラグメント担持タンパク質」（Fc  fragment-bearing  protein）又は「Ｆｃフラグメント含有タンパク質」（Fc  fragment-containing  protein）は、Ｆｃドメイン又はそのＦｃ受容体結合フラグメント（Ｎ−グリカンを含む）を含むタンパク質を云う。特定の実施態様において、Ｎ−グリカンは、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）領域のＣＨ２ドメイン中に（例えば、ＥＵ位置２９７に）存在するＮ結合型二分岐（biantennary）グリカンである。「Ｎ−グリカン」は、Ｎ−アセチルグルコサミン残基を介して、タンパク質中のアスパラギン残基又はアルギニン残基のアミド窒素に連結している。これらの「Ｎ結合型グリコシル化部位」は例えば、アミノ酸配列：アスパラギン−Ｘ−セリン／トレオニンを含有するペプチド一次構造において生じ、ここで、Ｘは、プロリン及びアスパラギン酸を除く任意のアミノ酸残基である。そのようなＮ−グリカンは、例えば参照によってその全体を本明細書中に取り込まれる、Drickamer  K,  Taylor  ME  (2006年).  Introduction  to  Glycobiology,  2nd  ed.に十分に記載されている。
【００７９】
１つの実施態様において、「Ｎ−グリカン」は、免疫グロブリン定常（Ｆｃ）領域のＣＨ２ドメイン中に存在するＡｓｎ−２９７Ｎ結合型二分岐グリカンを云う。これらのオリゴ糖は、末端マンノース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ガラクトース、又はシアル酸を含みうる。
【００８０】
本明細書で使用される場合、語「糖鎖改変」（glycoengineering）は、結合タンパク質組成物のグリコフォームプロファイルを変化させる当該技術分野において認識されている任意の方法を云う。そのような方法は、異種のグリコシルトランスフェラーゼ又はグリコシダーゼを発現するように遺伝子工学によって操作された、遺伝子工学操作宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内での結合タンパク質組成物の発現を含む。他の実施態様において、糖鎖改変法は、特定のグリコフォームプロファイルに偏る条件下で宿主細胞を培養することを含む。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「糖鎖改変されたＦｃフラグメント」は、（ｉ）ハイパーガラクトシル化（hyper-galactosylated）Ｆｃフラグメント、（ｉｉ）アマンノシル化（amannosylated）Ｆｃフラグメントを包含するハイポマンノシル化（hypo  mannosylated）Ｆｃフラグメント、及び（ｉｉｉ）アフコシル化（afucosylated）Ｆｃフラグメントを包含するハイポフコシル化（hypo  fucosylated）Ｆｃフラグメントを包含する。本明細書で使用される場合、糖鎖改変されたフラグメントは、下記の変化したグリコシル化：（ｉ）ハイパーガラクトシル化、（ｉｉ）ハイポマンノシル化、及び（ｉｉｉ）ハイポフコシル化のうちの１以上からなる群内から選択される、変化したグリコシル化を有するＦｃフラグメントを包含する。従って、本発明に従い使用される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントは、ハイパーガラクトシル化、ハイポマンノシル化、及びハイポフコシル化Ｆｃフラグメントの例を包含する。
【００８２】
当業者は、非改変型Ｆｃフラグメントよりも高い親和性を伴いながらＦｃ受容体に結合することが公知である、ハイパーガラクトシル化Ｆｃフラグメント、ハイポマンノシル化Ｆｃフラグメント、及びハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを取得する為の周知技術を参照しうる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、語「ハイパーガラクトシル化された集団」は、同じアミノ酸配列を有するＦｃドメイン含有結合タンパク質の参照集団と比較して、Ｎ−グリカンのガラクトース含有量が増加しているＦｃドメイン含有結合タンパク質の集団を云う。ハイパーガラクトシル化された集団は、Ｆｃドメイン含有結合タンパク質の参照集団と比較して、Ｇ１及びＧ２グリコフォームの数が増加している集団として表現されることができる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、語「ハイポマンノシル化された集団」は、同じアミノ酸配列を有するＦｃドメイン含有結合タンパク質の参照集団と比較して、Ｎ−グリカンのマンノース含有量が減少しているＦｃドメイン含有結合タンパク質の集団を云う。ハイポマンノシル化された集団は、Ｆｃドメイン含有結合タンパク質の参照集団と比較して、オリゴマンノースグリコフォーム（例えば、Ｍ３−Ｍ９グリコフォーム）の数が減少している集団として表現されることができる。幾つかの実施態様において、マンノース含有量は、Ｍａｎ３、Ｍａｎ４、Ｍａｎ５、Ｍａｎ６、Ｍａｎ７、Ｍａｎ８、及びＭａｎ９からなる群から選択されるオリゴマンノースグリコフォームのうちの１以上の含有量を測定することによって決定される。他の実施態様において、オリゴマンノース含有量は、少なくともＭａｎ５、Ｍａｎ６、及びＭａｎ７を測定することによって決定される。或る実施態様において、オリゴマンノース含有量は、Ｍ３〜Ｍ９の全てのグリコフォームを測定することによって決定される。本明細書で使用される場合、語「Ｇ０グリコフォーム」、「Ｇ１グリコフォーム」、及び「Ｇ２グリコフォーム」は、０個、１個、又は２個の末端ガラクトース残基をそれぞれ有するＮ−グリカングリコフォームを云う。これらの語は、フコシル化されている、又は二分化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含むＧ０、Ｇ１、及びＧ２グリコフォームを含む。或る実施態様において、Ｇ１及びＧ２グリコフォームは、末端ガラクトース残基の一方又は両方と結合してＧ１Ｓ１、Ｇ２Ｓ１、及びＧ２Ｓ２グリコフォームを形成するシアル酸残基を更に含む。本明細書で使用される場合、語「Ｇ１Ｓ１グリコフォーム」、「Ｇ２Ｓ１グリコフォーム」、及び「Ｇ２Ｓ２グリコフォーム」は、Ｇ１グリコフォーム内の唯一の末端ガラクトース残基、Ｇ２グリコフォーム内の末端ガラクトース残基の一方、又はＧ２グリコフォーム内の末端ガラクトース残基の両方と結合したシアル酸残基をそれぞれ有するＮ−グリカングリコフォームを云う。これらの語は、フコシル化されている、又は二分化Ｎ−アセチルグルコサミン残基を含むＧ１Ｓ１、Ｇ２Ｓ１、及びＧ２Ｓ２グリコフォームを含む。特定の実施態様において、Ｇ１Ｓ１、Ｇ２Ｓ１、及びＧ２Ｓ２グリコフォームのシアル酸残基は、結合分子の抗炎症活性を高める為に、各グリコフォームの末端ガラクトース残基とアルファー−２，６−シアル酸結合によって結合されている（例えば、Anthony等，PNAS  105:  19571-19578，2008年を参照）。
【００８５】
下記の「ハイポフコシル化」又は「アフコシル化」の定義は、抗体からなる、糖鎖改変されたＦｃを有する化合物の特定の実施態様に適用されるように、関心のある、糖鎖改変されたＦｃを有する化合物の一般性に関連する。
【００８６】
「ハイポフコシル化」抗体調製物は、Ｎ結合型オリゴ糖鎖の５０％未満が、ＣＨ２ドメインに連結しているα１，６−フコースを含有する抗体調製物を云う。典型的に、Ｎ結合型オリゴ糖鎖の約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、又は５％未満、又は１％未満が、「ハイポフコシル化」抗体調製物内のＣＨ２ドメインに連結したα１，６−フコースを含有する。本明細書で使用される場合、Ｎ結合型オリゴ糖鎖の５０％未満がＣＨ２ドメインに連結しているα１，６−フコースを含有する抗体調製物は、Ｎ結合型オリゴ糖鎖の４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満、又は１％未満が、ＣＨ２ドメインに連結されたα１，６−フコースを含有するところの調製物を包含する。
【００８７】
従って、語「アフコシル化」及び「非フコシル化」は、本明細書において、交換可能に使用され、ＩｇＧ重鎖のＣＨ２ドメインに連結した炭水化物においてα１，６−フコースを欠く抗体を云う。Umana等，Nat.  Biotechnol  17:176-180，1999年は、１０倍のＡＤＣＣを引き起こす二分されたＧｌｃＮａｃを記載する。Ｕｍａｎａは、そのような二分された分子はより少ないフコシル化を引き起こすことを指摘する。Davies等，Biotechnol.  Bioeng.  74:288-294，2001年は、抗ＣＤ２０抗体のＡＤＣＣの増加を引き起こす、酵素β１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）が挿入された（二分されたＧｌｃＮａｃ構造を引き起こす）ＣＨＯ細胞を記載する。実例として、米国特許第６，６０２，６８４号明細書は、二分化ＧｌｃＮａｃ糖タンパク質を生成するように工学的に操作された細胞を記載する。
【００８８】
抗体調製物のフコシル化を低下させる為の方法の更なる例は、Shields等，J  Biol  Chem  277：26733-26740，2002年において提示されるが、同文献は、ＩｇＧ１を生成する為のフコシル化が欠損しているＣＨＯ細胞（Ｌｅｃ１３）を記載し、且つフコース欠損ＩｇＧ１のヒトＦｃγＲＩＩＩＡへの結合は最大５０倍まで改善され、ＡＤＣＣが高められたことを更に記載する。更に、Shinkawa等，J  Biol  Chem  278：3466-3473，2003年は、ＹＢ２／０及びＣＨＯ細胞内で産生されたＩｇＧを比較する。ＹＢ２／０細胞は、フコシル化を減少させ、且つ二分化ＧｌｃＮａｃ含有量を増加させた。Niwa等，Clinc．Cancer  Res．1-：6248-6255，2004年は、抗ＣＤ２０抗体とＹＢ２／０細胞（ハイポフコシル化）内で作成された抗体とを比較しており、後者において高められたＡＤＣＣが観測された。アフコシル化抗体を生成する為の技術の例は、例えばKanda等，Glycobiology  17:104-118,  2006年において提供されている。米国特許第６，９４６，２９２号明細書（Ｋａｎｄａ）は、アフコシル化抗体を生成する為のフコシルトランスフェラーゼノックアウト細胞を記載する。米国特許第７，２１４，７７５号明細書及びＰＣＴ出願である国際公開第００／６１７３９号は、抗体の１００％がアフコシル化されている抗体調製物を記載する。
【００８９】
グリコシル化を改変する為のなおも更なる技術がまた知られており、それらは、例えば米国特許出願第２００７／２４８６００号明細書；米国特許第２００７／１７８５５１号明細書（「ヒト」グリコシル化構造を生成する為の工学的に操作された下等真核細胞（酵母菌）を利用するＧｌｙｃｏＦｉ技法）；米国特許第２００８／０６００９２号明細書（「ヒト」グリコシル化構造を生成する為の工学的に操作された植物を利用するＢｉｏｌｅｘ技法）、及び米国特許第２００６／２５３９２８号明細書（「ヒト」抗体を生成する為の植物のエンジニアリングについても記載されている）に記載されている。
【００９０】
フコースを低下させる為の追加の技術は、ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ技法（von  Horsten等．Glycobiology，（advance  access  publication  Jul．23，2010年）；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（商標）技法（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．社，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；及びＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化エンジニアリング技法（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ社，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含む。
【００９１】
抗体のＮ結合型オリゴ糖含有量は、当技術分野において知られている方法によって分析されることができる。下記は、そのような方法の例である：抗体は酵素Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ社；ＴａＫａＲａ社）を用いた消化に付される。放出された炭水化物が、陽イオンモードを用いたマトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：matrix  assisted  laser  desorption/ionization  time-of-flight  mass  spectrometry）により分析される（Papac等，Glycobiol．8：445-454，1998年）。次に、単糖組成物が、改変された高性能陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって特徴付けられる（Shinkawa等，J．Biol．Chem．278：3466-3473，2003年）。
【００９２】
或る実施態様において、本発明の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、哺乳動物の培養宿主細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞株）内で産生される。或る実施態様において、宿主細胞株は、本発明のハイパーガラクトシル化及び／又はハイポマンノシル化結合タンパク質を産生する為に糖鎖改変によって操作されている。或る例示的な実施態様において、本発明の結合タンパク質は、糖鎖改変されたＣＨＯ細胞から得られる。１つの例示的な実施態様において、糖鎖改変されたＣＨＯ細胞は、異種のガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えば、マウス  ガラクトシルトランスフェラーゼ  ベータ−１，４）を含む。別の例示的な実施態様において、糖鎖改変されたＣＨＯ細胞は、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の対立遺伝子のうちの一つのノックダウンを含む。
【００９３】
本明細書の開示に従うと、語「３Ｃ２３Ｋ」は、抗ＡＭＨＲＩＩヒト化モノクロナール抗体３Ｃ２３Ｋを意味する。ＡＭＨＲＩＩはまた、ＭＳＲＩＩと呼ばれうる。
【００９４】
本明細書の開示に従うと、語「ＧＭ１０２」は、３Ｃ２３Ｋ抗体と同じアミノ酸配列を有する軽鎖及び重鎖を有する抗ＡＭＨＲＩＩヒト化抗体であって、しかし糖鎖改変によって操作されている、より特にはハイポフコシル化されている、抗ＡＭＨＲＩＩヒト化抗体を意味する。「ＧＭ１０２」はまた、本明細書において「Ｒ１８Ｈ２」と呼ばれうる。
【００９５】
本明細書の開示に従うと、「ＹＢ２／０細胞」（ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標））又は「ＹＢ２０」は、組み換えモノクロナールハイポフコシル化抗体を製造する為の細胞株を意味する。
【００９６】
本明細書の開示に従うと、３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯは、正常なグリコシル化を有する３Ｃ２３Ｋ抗体からなり、それはＣＨＯ細胞株によって産生された３Ｃ２３Ｋ抗体を包含する。
【００９７】
本明細書の開示に従うと、３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯは、Ｆｃフラグメントが欠損している３Ｃ２３Ｋ抗体からなる。
【００９８】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物
語「糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物」、「糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する分子」、「糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含有する化合物」、及び「糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含有する分子」は、変化したグリコシル化を有する抗体のＦｃフラグメントを含み、変化していないグリコシル化を有する同一のＦｃフラグメントと比較して、Ｆｃ受容体に対してより高い親和性を上記Ｆｃフラグメントに提供する化合物を意味する為に、本明細書において交換可能に使用されうる。
【００９９】
幾つかの好ましい実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変を経なかった同一のＦｃフラグメントよりも、ＦｃγＲＩＩＩａ（「ＣＤ１６ａ」とまた呼ばれる）に対してより高い親和性を有する。
【０１００】
これは、周知のＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）法を用いて測定されたときに、５０ｎＭ未満のＫｄの一定値を有する、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）に対して高い親和性を有する、「３Ｃ２３Ｋ」と呼ばれるハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物によって、本実施例において例示される。
【０１０１】
幾つかの好ましい実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変されたＦｃフラグメントそのもの、従って抗原結合領域を含まない化合物、からなる。
【０１０２】
幾つかの好ましい実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有するタンパク質からなり、ここで、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントは、（ｉ）抗原結合領域を含むタンパク質、又は（ｉｉ）抗原結合領域を含まないタンパク質のいずれかである別のタンパク質部分に共有結合されている。
【０１０３】
これらの好ましい実施態様の幾つかにおいて、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを１つのみ含む。
【０１０４】
従って、本発明は、（ｉ）糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含むポリペプチドモノマー単位、及び（ｉｉ）上記ポリペプチドモノマー単位と共有結合している別のポリペプチドを含む糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用を包含する。上記別のポリペプチドは、抗体の抗原結合領域、例えば抗体のＶＨ鎖及びＶＬ鎖、でありうる。上記別のポリペプチドは、受容体タンパク質等のリガンド結合タンパク質部分、例えばＶＥＧＦ受容体又はＶＥＧＦ受容体のＶＥＧＦ結合ドメイン等、又は例えばＴＮＦアルファ受容体又はＴＮＦアルファ受容体のＴＮＦ結合ドメイン等でありうる。
【０１０５】
これらの好ましい実施態様の幾つかにおいて、上記他のタンパク質部分は、別のＦｃフラグメント、特に、糖鎖改変された別のＦｃフラグメント、を含みうる。幾つかの実施態様において、糖鎖改変された２つのＦｃフラグメントは、同じアミノ酸配列を有する。幾つかの他の実施態様において、糖鎖改変された２つのＦｃフラグメントは、異なるアミノ酸配列を有する。幾つかの実施態様において、２つのＦｃフラグメントは、同じアミノ酸配列を有するが、しかし異なる変化したグリコシル化パターンを有する。幾つかの他の実施態様において、２つのＦｃフラグメントは、同じアミノ酸配列を有し、且つ同一の変化したグリコシル化パターンを有する。
【０１０６】
従って、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、１超のＦｃフラグメントを含むタンパク質化合物を包含し、但しその中に含まれるＦｃフラグメントの少なくとも１つは、糖鎖改変されている、例えばその中に含まれるＦｃフラグメントの少なくとも１つは、ハイポマンノシル化、ハイパーガラクトシル化、又はハイポフコシル化されている。
【０１０７】
本明細書で別途にすでに記載されているように、２つ以上のＦｃフラグメントを含む、例えば２、３、４、５、又は６つのＦｃフラグメントを含む、Ｆｃフラグメント担持化合物は、当技術分野において周知であり、且つ「Ｆｃ多量体」と呼ばれうる。そのようなＦｃ多量体コンストラクトは、特にＴｈｉｒｕｐｐａｔｈｉ等（2014年，J  Autoimmun，Vol．five2：64-73）により、Ｊａｉｎ等（2012年，Arthritis  Research  and  Therapy，Vol.  1four：R192）により、又はＺｈｏｕ等（2017年，Blood  advances，Vol．1(n°6) ：DOI  10.1182/biooadvances.2016001917）によって開示されている。
【０１０８】
従って、本発明に従って使用されうる、糖鎖改変されたＦｃを有する化合物は、２以上のポリペプチドモノマー単位を含む多量体融合タンパク質を包含し、（ｉ）ここで、各ポリペプチドモノマー単位がＦｃフラグメントを含み、且つ（ｉｉ）ここで、少なくとも１つのポリペプチドモノマー単位が、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含む、例えばハイポマンノシル化Ｆｃフラグメント、ハイパーガラクトシル化Ｆｃフラグメント、又はハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを含む。
【０１０９】
そのようなＦｃ多量体はまた、米国特許出願第２０１７／０８８０６３号明細書において開示されている。
【０１１０】
Ｆｃ多量体化合物の幾つかの実施態様において、上記化合物はまた、抗原結合ドメイン、例えばＺｈａｎｇ等（2016年，J  Immunol，Vol．196：1165-1176）により開示されている、抗原結合ドメインをその中に含んでいた。
【０１１１】
幾つかの他の好ましい実施態様において、本明細書の実施例において例示されるように、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は糖鎖改変抗体からなる。
【０１１２】
幾つかの好ましい実施態様において、本明細書の実施例において例示されるように、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、ハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、例えばハイポフコシル化抗体、からなる。
【０１１３】
幾つかの他の実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、より正確にはハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、は、アフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、例えばアフコシル化抗体、からなる。
【０１１４】
他の実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、ハイパーガラクトシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、例えばハイパーガラクトシル化抗体、からなる。
【０１１５】
なお他の実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、ハイポマンノシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、例えばハイポマンノシル化抗体、からなる。
【０１１６】
本明細書においてすでに別途記載されているように、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、例えば糖鎖改変抗体、により、癌疾患中に生ずる免疫抑制、例えばマクロファージ誘発性免疫抑制、を低減させる又はブロックすることは、腫瘍細胞の存在を必要とせず、従って上記抗体の標的腫瘍細胞への結合を必要としない。
【０１１７】
これは、本発明者等が、免疫抑制、特にＴ細胞活性化阻害を低減すること又はブロックすることは、抗原結合領域を含まない、例えば腫瘍関連抗原結合領域を含まない、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物によって得られるべきであると考える理由を説明する。
【０１１８】
しかしながら、免疫抑制を低減すること又はブロックすることは、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物として糖鎖改変抗体を使用したときに達成されることがまた、本明細書の実施例において例示されている。
【０１１９】
更に、本発明者等は、本明細書で定義される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の有益な効果は、関連する腫瘍関連抗原に対して向けられた糖鎖改変抗体からなる、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物（処置されるべき癌個体の腫瘍組織中又は体液中に存在する腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に対して向けられた糖鎖改変抗体を意味する）を使用するとき、更に高められうると考える。
【０１２０】
従って、幾つかの好ましい実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、処置されるべき癌個体の腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に対して向けられた糖鎖改変抗体からなる。
【０１２１】
幾つかの好ましい実施態様において、本明細書の実施例において例示されるように、上記の糖鎖改変抗体はハイポフコシル化抗体からなる。
【０１２２】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、本発明者等は、処置されるべき癌個体の腫瘍細胞によって発現される腫瘍関連抗原に対して向けられた糖鎖改変抗体を使用することは、（ｉ）免疫抑制、例えばＴ細胞活性の阻害、特にＣＤ８＋Ｔ細胞活性の阻害、例えばマクロファージ誘発性免疫抑制、を低減すること又はブロックすることを可能にし、且つ（ｉｉ）例えばＡＤＣＣ又はＡＤＣ活性によって、上記の糖鎖改変抗体が向けられている腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の破壊を可能にすると考える。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、語「腫瘍関連抗原」は、腫瘍細胞上又は腫瘍細胞内に位置する表面上に存在する又は提示されることができる抗原を云う。これらの抗原は、分子の膜貫通部分及び細胞質部分と組み合わされることが多い細胞外部分で、細胞表面上に提示されることができる。これらの抗原は、幾つかの実施態様において、腫瘍細胞によってのみ且つ正常細胞（すなわち非腫瘍細胞）によってでなく提示されることができる。腫瘍抗原は、腫瘍細胞上でもっぱら発現されることができる、又は非腫瘍細胞と比較して腫瘍特異的突然変異を表しうる。そのような実施態様において、個々の抗原は、腫瘍特異抗原又は腫瘍関連抗原（tumor-associated  antigen）（また「ＴＡＡ」とも呼ばれる）と呼ばれうる。腫瘍関連抗原とも呼ばれ得る幾つかの抗原が、腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方によって提示される。これらの腫瘍関連抗原は、非腫瘍細胞と比較された場合に、腫瘍細胞上で過剰発現されることができる、又は非腫瘍組織と比較して、腫瘍組織の構造はそれほどコンパクトではないために、腫瘍細胞内での抗体結合に関与しやすい。幾つかの実施態様において、腫瘍関連表面抗原は、腫瘍の脈管構造に位置する。
【０１２４】
腫瘍関連抗原のリストが、特にＬｉｕ等（2016年，European  Journal  of  Cancer  Care，doi：10/1111/ecc.12446）によって開示されており、当業者はそれを参照しうる。
【０１２５】
Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原のリストが、Ｒｅｎｋｖｉｓｔ等（2001年，Cancer  immunology  and  immunotherapy，Vol．50(n°1)  3-15）によって開示されており、当業者はそれを参照しうる。
【０１２６】
腫瘍関連表面抗原の実例は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３（Fms-like  tyrosine  kinase3），ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４（chondroitin  sulfate  proteoglycan  4）、メラノーマ関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ：Epidermal  growth  factor  receptor）、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ：fibroblast  activating  protein）、ＣＤＣＰ１、デルリン１、テネイシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１〜１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ−ａ（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ−β（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１−８、及びＴｉｅ２である。更なる例は、Ａ３３、ＣＡＭ  ＰＡＴＨ−１（ＣＤｗ５２）、癌胎児抗原（ＣＥＡ：Carcinoembryonic  antigen）、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ−ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ−３，ＣＤ１３５）、ｃ−Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ−２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（メラノーマ関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ：Prostate-specific  membrane  antigen）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ：Prostate  stem  cell  antigen）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ：Prostate  specific  antigen）、及びＴＡＧ−７２を含みうる。腫瘍の細胞外マトリックス上で発現する抗原の例は、テネイシン及び線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ：fibroblast  activating  protein）である。
【０１２７】
好ましい腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、ＣＤ４５、ＩＬ−３Ｒａ（ＣＤ１２３とも呼ばれる）、ＣＤ３３、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ１９、ＥｐＣＡＭ（「上皮細胞接着分子」（Epithelial  Cell  Adhesion  Molecule）とも呼ばれる）、ＨＥＲ２、ＴＲＯＰ−２（「栄養芽細胞表面抗原２」（Trophoblast  cell  surface  antigen2）とも呼ばれる）、ＧＮＭＢ（「糖タンパク質非転移性Ｂ」（Glyco-protein  non-metastatic  B）とも呼ばれる）、ＭＭＰ９、ＥＧＦＲ、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４）、ＣＴＬＡ４、ＧＭ３、メソテリン、葉酸受容体１、フィブロネクチンエキストラドメインＢ、エンドグリン、ＣＤ２２、ＩＬ−１アルファ、ＨＥＲ３、ｃＭｅｔ、ホスファチジルセリン、ＭＵＣ５ＡＣ、ＮｅｕＧｃガングリオシド、ＣＤ２、ＣＤ３８、ＥＧＦＲ、ＨＧＦ／ＳＦ、ＰＤ１、ＧＤ２、ＳＴ４、及び葉酸受容体アルファからなる群から選択されうる。
【０１２８】
本発明に従う最も好ましい腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＡＭＨＲＩＩを含む群から選択される抗原である。
【０１２９】
本発明に従い使用されうる糖鎖改変抗体の好ましい実施態様は、本明細書において３Ｃ２３Ｋ、９Ｆ７Ｆ１１、Ｈ４Ｂ１２１、及びＨＥ４Ｂ３３と呼ばれる、糖鎖改変された抗体を含む群から選択される。
【０１３０】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の例示的実施態様
Ｆｃフラグメント担持化合物の例示的実施態様は、本明細書に記載されている配列番号７０の２本のアミノ酸鎖を含む、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含む化合物を包含する。
【０１３１】
配列番号７０のアミノ酸鎖は、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメインを含む、ヒトＩｇＧ１抗体の重鎖定常領域からなる。
【０１３２】
実施例に開示されているように、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、特にハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物は、ＹＢ２／０細胞中で上記Ｆｃフラグメントをコードする核酸配列を発現させる工程を含む方法によって取得されうる。そのような方法は、実施例に記載されているＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）と呼ばれる周知の方法でありうる。
【０１３３】
幾つかの実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、特にハイポフコシル化Ｆｃフラグメント担持化合物、は、ＹＢ２／０細胞中で配列番号６９の核酸配列を発現させる工程を含む方法によって取得されうる。
【０１３４】
幾つかの実施態様において、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変抗体、特にハイポフコシル化抗体、からなり；配列番号７０の２本のアミノ酸鎖を含む、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含む。
【０１３５】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含む糖鎖改変抗体の実施態様が、本明細書の下記に記載されている。
【０１３６】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物としての抗体
従って、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の実施態様は、抗体、特に腫瘍関連抗原に対して向けられた糖鎖改変抗体、からなる。
【０１３７】
幾つかの実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、糖鎖改変された多重特異性抗体、特に糖鎖改変された二重特異性抗体、を包含する。実例として、これらの糖鎖改変抗体は、本明細書に記載されている、糖鎖改変されたＦｃフラグメントと、例えば（ｉ）腫瘍抗原発現細胞に対して向けられること且つ（ｉｉ）Ｔ細胞を活性化させることとを同時に行う観点から、（ｉ）腫瘍抗原と結合する第１の抗原結合領域、及び（ｉｉ）Ｔ細胞抗原、例えばＣＤ３、又は抑制性免疫チェックポイントタンパク質と結合する第２の抗原結合領域とを含む抗体を包含する。
【０１３８】
そのような糖鎖改変抗体の実例は、腫瘍関連抗原、例えばＡＭＨＲＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４、に対して向けられる抗体を包含する。
【０１３９】
そのような抗体は、それらの抗原結合領域、特にそれらの重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）、に関連付けて記載されうる。
【０１４０】
抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の例示的実施態様
ＰＣＴ出願番号であるＰＣＴ／ＦＲ２０１１／０５０７４５号（国際公開番号である国際公開第／２０１１／１４１６５３号）、及び米国特許第９，０１２，６０７号明細書（それらのそれぞれは、参照によって本明細書内に取り込まれる）は、マウス１２Ｇ４抗体に由来する新規のヒト化抗体について開示する。このヒト化抗体は、本発明の目的に照らし、ＡＭＨＲＩＩ結合性剤として使用されうる。ＰＣＴ出願である国際公開第／２０１１／１４１６５３号で開示されている特別な実施態様において、抗体は、３Ｃ２３及び３Ｃ２３Ｋとして識別される抗体である。これらの抗体の核酸配列及びポリペプチド配列は、本明細書において、配列番号１〜１６として提供される。本発明の幾つかの観点において、関心のある抗ＡＭＨＲＩＩ抗体は、「配列番号〜を含む軽鎖及び配列番号〜を含む重鎖を含む」と呼ばれうる。従って、様々な実施態様において、特に好ましい抗体は下記を含む：
ａ）配列番号２を含む軽鎖及び配列番号４を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  ＶＬ配列及びＶＨ配列）；
ｂ）配列番号６を含む軽鎖及び配列番号８を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  ＶＬ配列及びＶＨ配列）；
ｃ）配列番号１０を含む軽鎖及び配列番号１２を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３  軽鎖及び重鎖）；
ｄ）配列番号１４を含む軽鎖及び配列番号１６を含む重鎖（リーダーを有さない３Ｃ２３Ｋ  軽鎖及び重鎖）。
【０１４１】
他の抗体（例えば、ヒト化抗体又はキメラ抗体）は、本明細書に記載されている重鎖配列及び軽鎖配列に基づくことができる。
【０１４２】
下記の配列を含む（又はそれからなる）ＣＤＲを含む／含有する抗ＡＭＨＲＩＩ抗体の例示的実施態様は、下記の通りである：
ＣＤＲＬ−１：ＲＡＳＸ１Ｘ２ＶＸ３Ｘ４Ｘ５Ａ（配列番号７１）、ここで、Ｘ１及びＸ２は独立して、Ｓ又はＰであり、Ｘ３はＲ又はＷ又はＧであり、Ｘ４はＴ又はＤであり、及びＸ５はＩ又はＴであり；
ＣＤＲＬ−２は、ＰＴＳＳＬＸ６Ｓ（配列番号７２）であり、ここで、Ｘ６はＫ又はＥであり；並びに
ＣＤＲＬ−３は、ＬＱＷＳＳＹＰＷＴ（配列番号７３）であり；
ＣＤＲＨ−１は、ＫＡＳＧＹＸ７ＦＴＸ８Ｘ９ＨＩＨ（配列番号７４）であり、ここで、Ｘ７はＳ又はＴであり、Ｘ８はＳ又はＧであり、及びＸ９はＹ又はＮであり、
ＣＤＲＨ−２は、ＷＩＹＰＸ１０ＤＤＳＴＫＹＳＱＫＦＱＧ（配列番号７５）であり、ここで、Ｘ１０はＧ又はＥであり、並びに
ＣＤＲＨ−３は、ＧＤＲＦＡＹ（配列番号７６）。
【０１４３】
本出願の範囲内の抗体（例えば、キメラの又はヒト化）は、下記の表で開示される抗体を含む：３Ｃ２３Ｋ抗体は、
ＶＨアミノ酸配列について配列番号１７
ＶＬアミノ酸配列について配列番号３４
によって定義される。
【０１４４】
下記の表１は、本発明に従い使用されうる抗ＡＭＨＲＩＩヒト化抗体をリスト化する。
【０１４５】
【表１】
2020521780.tif 000002
2020521780.tif 000003
2020521780.tif 000004
【０１４６】
抗ＨＥＲ３抗体の例示的実施態様
糖鎖改変された抗ＨＥＲ３抗体の例示的実施態様は、本明細書において９Ｆ７Ｆ１１及びＨ４Ｂ１２１と呼ばれるものである。
【０１４７】
９Ｆ７Ｆ１１抗体は、（ｉ）配列番号６３の重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号６４の軽鎖可変領域を含む。
【０１４８】
Ｈ４Ｂ１２１抗体は、（ｉ）配列番号６５の重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号６６の軽鎖可変領域を含む。
【０１４９】
抗ＨＥＲ４抗体の例示的実施態様
抗ＨＥＲ４抗体の例示的実施態様は、本明細書においてＨＥ４Ｂ３３と呼ばれる抗体である。
【０１５０】
ＨＥ４Ｂ３３抗体は、（ｉ）配列番号６７の重鎖可変領域、及び（ｉｉ）配列番号６８の軽鎖可変領域を含む。
【０１５１】
明確化の為に、上記抗体の全ては、本明細書に記載されている、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを含み、特に本明細書に記載されているハイポフコシル化Ｆｃフラグメントを含む。
【０１５２】
幾つかの好ましい実施態様において、これらの抗体は、配列番号７０の、糖鎖改変された２本のアミノ酸鎖を有する、糖鎖改変されたＦｃフラグメント、特に配列番号７０の２本のハイポフコシル化アミノ酸鎖を有するハイポフコシル化Ｆｃフラグメント、を含む。
【０１５３】
糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物と１以上の他の活性な薬剤との組み合わせ
本明細書で定義される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、癌患者の免疫抑制状態を減少すること又はブロックすることを可能にするので、外科的処置、放射線療法処置、及び化学療法処置を含む、既知の抗癌処置の抗癌活性を強化するのに有用である。
【０１５４】
更に、本明細書で定義される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、癌患者の免疫抑制状態を減少すること又はブロックすることを可能にするので、免疫抑制をブロックすることを目的とする、又は免疫抑制された癌患者において免疫刺激若しくは免疫活性化を誘発することを目的とする他の化合物の有益な効果を高めるはずである活性な薬剤としておそらく作用すると考えられる。その上、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物はまた、免疫抑制阻害剤（チェックポイント阻害剤）又は免疫刺激性薬剤に対する癌細胞の耐性に作用するように寄与する可能性がある。
【０１５５】
従って、更なる観点において、本明細書で定義される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、別の抗癌処置と組み合わせて、特に抗癌剤からなる１以上の異なる化合物と組み合わせて、使用されうる。
【０１５６】
更なる観点において、本発明は、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、及び１以上の異なる抗癌剤と組み合わされる、個体の癌処置における免疫抑制阻害剤としてのその使用に関する。
【０１５７】
本発明はさらに、癌を処置する為の医薬を調製する為の、１以上の異なる抗癌剤と組み合わされる、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の使用に関する。
【０１５８】
本発明はまた、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を、１以上の異なる抗癌剤と組み合わせて、それを必要とする個体に投与する工程を含む、癌を処置する為の方法に関係する。
【０１５９】
抗癌剤は、抗癌活性、例えば抗増殖活性薬剤、を有する化合物を包含し、ここで、これらの多くは当業者に周知である。抗癌剤はまた、本明細書において別途詳述されているように、抑制性免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤を包含する。
【０１６０】
「抗癌剤」は、その通常の意味に従って使用され、且つ抗新生物特性又は細胞の成長若しくは増殖を阻害する能力を有する組成物（例えば、化合物、薬物、アンタゴニスト、阻害剤、モジュレーター）を云う。幾つかの実施態様において、抗癌剤は、化学療法剤である。幾つかの実施態様において、抗癌剤は、癌を処置する為の方法において有用性を有する、本明細書において識別される薬剤である。幾つかの実施態様において、抗癌剤は、癌を処置する為の、ＦＤＡ又は米国以外の国の類似した規制当局によって承認された薬剤である。
【０１６１】
幾つかの実施態様において、上記癌薬剤は、抗体由来の化合物、例えば抗体それ自体又はその抗原結合性フラグメント若しくは抗原結合フォーマット、から構成されない。
【０１６２】
抗体から構成されない抗癌剤の例として、ＭＥＫ（例えば、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、又はＭＥＫ１及びＭＥＫ２）阻害剤（例えば、ＸＬ５１８、ＣＩ−１０４０、ＰＤ０３５９０１、セルメチニブ／ＡＺＤ６２４４、ＧＳＫ１１２０２１２／トラメチニブ、ＧＤＣ−０９７３、ＡＲＲＹ−１６２、ＡＲＲＹ−３００、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ０３２５９０１、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＴＡＫ−７３３、ＰＤ３１８０８８、ＡＳ７０３０２６、ＢＡＹ８６９７６６）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ブスルファン、メルファラン、メクロレタミン（mechloroethamine）、ウラムスチン、チオテパ、ニトロソウレア、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン（meiphalan））、エチレンイミン及びメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン（hexamethlymelamine）、チオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、ロムスチン（lomusitne）、セムスチン、ストレプトゾシン）、トリアゼン（デカルバジン））、代謝抵抗物質（例えば、５−アザチオプリン、ロイコボリン、カペシタビン、フルダラビン、ゲムシタビン、ペメトレキセド、ラルチトレキセド、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、又はピリミジン類似物（例えば、フルオロウラシル、フロクスウリジン（floxouridine）、シタラビン）、プリン類似物（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン等）、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ポドフィロトキシン、パクリタキセル、ドセタキセル等）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、アムサクリン、エトポシド（ＶＰ１６）、リン酸エトポシド、テニポシド等）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ドキソルビシン、アドリアマイシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン等）、白金に基づく化合物又は白金含有薬剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン（oxaloplatin）、カルボプラチン）、アントラセンジオン（例えば、ミトキサントロン）、置換ウレア（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、副腎皮質抑制剤（例えば、ミトタン、アミノグルテチミド）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド）、抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼシグナリングの阻害剤（例えば、Ｕ０１２６、ＰＤ９８０５９、ＰＤ１８４３５２、ＰＤ０３２５９０１、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＳＢ２３９０６３、ＳＰ６００１２５、ＢＡＹ４３−９００６、ウォルトマンニン、又はＬＹ２９４００２、Ｓｙｋ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ゴシポール（gossyphol）、ゲナセンス、ポリフェノールＥ、クロロフシン、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、ブリオスタチン、腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、５−アザ−２’−デオキシシチジン、オールトランスレチノイン酸、ドキソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド、ゲムシタビン、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲルダナマイシン、１７−Ｎ−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７−ＡＡＧ）、フラボピリドール、ＬＹ２９４００２、ボルテゾミブ、トラスツズマブ、ＢＡＹ１１−７０８２、ＰＫＣ４１２、ＰＤ１８４３５２、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背面化形態発生タンパク質（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）−１；抗アンドロゲン物質、前立腺癌；抗エストロゲン薬；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィジコリングリシネート；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス制御因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；β−クラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビスアントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビセレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリア痘ＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミドアミノトリアゾール；カルボキサミドアミノトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼルシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリックス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス型ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェン類似体；クロトリマゾール；コリスマイシンＡ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチン類似体；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；キュラシンＡ；シクロペンタアントラキノン；シクロプラタム；シペマイシン；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチン類似体；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；ホルフェニメクス；ホルメスタン；ホストリエシン；ホテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン；ガニレリックス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫刺激性ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；イオベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール，４−；イロプラクト；イルソグラジン；イソベンガゾール；イソホモハリコンドリンＢ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリドＦ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；ロイプロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；ロイプロレリン；レバミソール；リアロゾール；直鎖状ポリアミン類似体；親油性二糖類ペプチド；親油性白金化合物；リソクリンアミド７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィルリン；細胞溶解性ペプチド；マイタシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリシン阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシン類似体；ミトナフィド；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン；モルグラモスチム；ヒト絨毛ゴナドトロフィン；モノホスホリルリピドＡ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多発性腫瘍抑制因子１−に基づく療法；マスタード抗癌剤；ミカペロキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換型ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；ニトロキシド酸化防止剤；ニトルリン；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン；経口サイトカイン誘導物質；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン；ペガスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；ペルフルブロン；ペルホスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニル；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター；白金複合体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、ミクロアルガール；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシ化ヘモグロビンポリオキシエチレン（polyoxyethylerie）コンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン；ロムルチド；ロキニメクス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣体；セムスチン；セネッセンス由来の阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；一本鎖抗原結合タンパク質；シゾフラン；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート；酢酸フェニルナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルホス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性型血管作用性小腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミノグリカ
ン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；タリブラスチン；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣体；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモン；錫エチルエチオプルプリン；チラパザミン；二塩化チタノセン；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；泌尿生殖洞由来の増殖阻害性因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；ジノスタチンスチマラマー、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、シスプラチン、アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；塩酸ビスアントレン；ビスナフィドジメシラート；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン；エダトレキサート；塩酸エフロルニチン；エルサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン（iimofosine）；インターロイキンＩＩ（組み換えインターロイキンＩＩ、又はｒＩＬ．ｓｕｂ．２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−１ａ；インターフェロンγ−１ｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸ロイプロリド；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン；ミトクロミン；ミトギリン；ミトマルシン；マイトマイシン；ミトスペル；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；マイコフェノール酸；ノコダゾール（nocodazoie）；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；硫酸ペプロマイシン；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシネート；硫酸ビンロイロシン；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシン、Ｇ２−Ｍ期内の細胞を阻止し、及び／又は微小管の形成又は安定性を調節する薬剤（例えば、Ｔａｘｏｌ（商標）（すなわち、パクリタキセル）、Ｔａｘｏｔｅｒｅ（商標））、タキサン骨格を含む化合物、エルブロゾール（すなわち、Ｒ−５５１０４）、ドラスタチン１０（すなわち、ＤＬＳ−１０及びＮＳＣ−３７６１２８）、イセチオン酸ミボブリン（すなわち、ＣＩ−９８０として）、ビンクリスチン、ＮＳＣ−６３９８２９、ディスコデルモリド（すなわち、ＮＶＰ−ＸＸ−Ａ−２９６として）、ＡＢＴ−７５１（Ａｂｂｏｔｔ社、すなわち、Ｅ−７０１０）、アルトリルチン（例えば、アルトリルチンＡ及びアルトリルチンＣ）、スポンジスタチン（例えば、スポンジスタチン１、スポンジスタチン２、スポンジスタチン３、スポンジスタチン４、スポンジスタチン５、スポンジスタチン６、スポンジスタチン７、スポンジスタチン８、及びスポンジスタチン９）、塩酸セマドチン（すなわち、ＬＵ−１０３７９３及びＮＳＣ−Ｄ−６６９３５６）、エポチロン（例えば、エポチロンＡ、エポチロンＢ、���ポチロンＣ（すなわち、デスオキシエポチロンＡ又はｄＥｐｏＡ）、エポチロンＤ（すなわち、ＫＯＳ−８６２、ｄＥｐｏＢ、及びデスオキシエポチロンＢ）、エポチロンＥ、エポチロンＦ、エポチロンＢ  Ｎ−酸化物、エポチロンＡ  Ｎ−酸化物、１６−アザ−エポチロンＢ、２１−アミノエポチロンＢ（すなわち、ＢＭＳ−３１０７０５）、２１−ヒドロキシエポチロンＤ（すなわち、デスオキシエポチロンＦ及びｄＥｐｏＦ）、２６−フルオロエポチロン、オーリスタチンＰＥ（すなわちＮＳＣ−６５４６６３）、ソブリドチン（すなわちＴＺＴ−１０２７）、ＬＳ−４５５９−Ｐ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、すなわちＬＳ−４５７７）、ＬＳ−４５７８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、すなわちＬＳ−４７７−Ｐ）、ＬＳ−４４７７（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ＬＳ−４５５９（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、ＲＰＲ−１１２３７８（Ａｖｅｎｔｉｓ社）、硫酸ビンクリスチン、ＤＺ−３３５８（Ｄａｉｉｃｈｉ社）、ＦＲ−１８２８７７（Ｆｕｊｉｓａｗａ社、すなわちＷＳ−９８８５Ｂ）、ＧＳ−１６４（Ｔａｋｅｄａ社）、ＧＳ−１９８（Ｔａｋｅｄａ社）、ＫＡＲ−２（Ｈｕｎｇａｒｉａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＢＳＦ−２２３６５１（ＢＡＳＦ社、すなわち、ＩＬＸ−６５１及びＬＵ−２２３６５１）、ＳＡＨ−４９９６０（Ｌｉｌｌｙ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、ＳＤＺ−２６８９７０（Ｌｉｌｌｙ／Ｎｏｖａｒｔｉｓ社）、ＡＭ−９７（Ａｒｍａｄ／Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ社）、ＡＭ−１３２（Ａｒｍａｄ社）、ＡＭ−１３８（Ａｒｍａｄ／Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ社）、ＩＤＮ−５００５（Ｉｎｄｅｎａ社）、クリプトフィシン５２（すなわちＬＹ−３５５７０３）、ＡＣ−７７３９（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社、すなわちＡＶＥ−８０６３Ａ及びＣＳ−３９．ＨＣｌ）、ＡＣ−７７００（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ社、すなわちＡＶＥ−８０６２、ＡＶＥ−８０６２Ａ、ＣＳ−３９−Ｌ−Ｓｅｒ．ＨＣｌ、及びＲＰＲ−２５８０６２Ａ）、ビチレブアミド、チューブリシンＡ、カナデンソル、センタウレイジン（すなわちＮＳＣ−１０６９６９）、Ｔ−１３８０６７（Ｔｕｌａｒｉｋ社、すなわちＴ−６７、ＴＬ−１３８０６７及びＴＩ−１３８０６７）、ＣＯＢＲＡ−１（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、すなわちＤＤＥ−２６１及びＷＨＩ−２６１）、Ｈ１０（カンザス州立大学）、Ｈ１６（カンザス州立大学）、オンコシジンＡ１（すなわちＢＴＯ−９５６及びＤＩＭＥ）、ＤＤＥ−３１３（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、フィジアノリドＢ、ラウリマリド、ＳＰＡ−２（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＳＰＡ−１（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、すなわちＳＰＩＫＥＴ−Ｐ）、３−ＩＡＡＢＵ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ／Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、すなわちＭＦ−５６９）、ナルコシン（ＮＳＣ−５３６６としても知られている）、ナスカピン、Ｄ−２４８５１（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ社）、Ａ−１０５９７２（Ａｂｂｏｔｔ社）、ヘミアステルリン、３−ＢＡＡＢＵ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ／Ｍｔ．Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、すなわちＭＦ−１９１）、ＴＭＰＮ（アリゾナ州立大学）、バナドセンアセチルアセトネート、Ｔ−１３８０２６（Ｔｕｌａｒｉｋ社）、モンサトロール、イナノシン（lnanocine）（すなわち、ＮＳＣ−６９８６６６）、３−ＩＡＡＢＥ（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ／Ｍｔ．  Ｓｉｎａｉ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、Ａ−２０４１９７（Ａｂｂｏｔｔ社）、Ｔ−６０７（Ｔｕｉａｒｉｋ社、すなわちＴ−９００６０７）、ＲＰＲ−１１５７８１（Ａｖｅｎｔｉｓ社）、エリュテロビン（例えばデスメチルエリュテロビン、デスアエチルエルュテロビン、イソエリュテロビンＡ、及びＺ−エリュテロビン）、カリバエオシド、カリバエオリン、ハリコンドリンＢ、Ｄ−６４１３１（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ社）、Ｄ−６８１４４（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ社）、ジアゾナミドＡ、Ａ−２９３６２０（Ａｂｂｏｔｔ社）、ＮＰＩ−２３５０（Ｎｅｒｅｕｓ社）、タッカロノリドＡ、ＴＵＢ−２４５（Ａｖｅｎｔｉｓ社）、Ａ−２５９７５４（Ａｂｂｏｔｔ社）、ジオゾスタチン、（−）−フェニルアヒスチン（すなわち、ＮＳＣＬ−９６Ｆ０３７）、Ｄ−６８８３８（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ社）、Ｄ−６８８３６（Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ社）、ミオセベリンＢ、Ｄ−４３４１１（Ｚｅｎｔａｒｉｓ社、すなわちＤ−８１８６２）、Ａ−２８９０９９（Ａｂｂｏｔｔ社）、Ａ−３１８３１５（Ａｂｂｏｔｔ社）、ＨＴＩ−２８６（すなわちＳＰＡ−１１０、トリフルオロ酢酸塩）（Ｗｙｅｔｈ社）、Ｄ−８２３１７（Ｚｅｎｔａｒｉｓ社）、Ｄ−８２３１８（Ｚｅｎｔａｒｉｓ社）、ＳＣ−１２９８３（ＮＣＩ）、リン酸レスベラスタチンナトリウム、ＢＰＲ−ＯＹ−００７（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ）、及びＳＳＲ−２５０４１１（Ｓａｎｏｆｉ社）、ステロイド（例えば、デキサメタゾン）、フィナステリド、アロマターゼ阻害剤、性腺刺激ホルモン放出ホルモンアゴニスト（ＧｎＲＨ）（例えばゴセレリン又はロイプロリド）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸メドロキシプロゲステロン）、エストロゲン（例えばジエチルスチルベストロール（diethlystilbestrol）、エチニルエストラジオール）、抗エストロゲン薬（例えばタモキシフェン）、アンドロゲン（例えばプロピオン酸
テストステロン、フルオキシメステロン）、抗アンドロゲン物質（例えばフルタミド）、免疫刺激薬（例えばカルメット・ゲラン桿菌（Bacillus  Calmette-Guerin）（ＢＣＧ）、レバミソール、インターロイキン−２、α−インターフェロン等）、トリプトリド、ホモハリントニン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、トポテカン、イトラコナゾール、ビンデシン、セリバスタチン、ビンクリスチン、デオキシアデノシン、セルトラリン、ピタバスタチン、イリノテカン、クロファジミン、５−ノニルオキシトリプタミン、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ＥＧＦＲ阻害剤、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）−標的療法又は治療薬（例えば、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ（商標））、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ（商標））、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標））、ラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（商標））、パニツムマブ（Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（商標）））、バンデタニブ（Ｃａｐｒｅｌｓａ（商標））、アファチニブ／ＢＩＢＷ２９９２、ＣＩ−１０３３／カネルチニブ、ネラチニブ／ＨＫＩ−２７２、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−２８５、ＡＳＴ−１３０６、ＡＲＲＹ３３４５４３、ＡＲＲＹ−３８０、ＡＧ−１４７８、ダコミチニブ／ＰＦ２９９８０４、ＯＳＩ−４２０／デスメチルエルロチニブ、ＡＺＤ８９３１、ＡＥＥ７８８、ペリチニブ／ＥＫＢ−５６９、ＣＵＤＣ−１０１、ＷＺ８０４０、ＷＺ４００２、ＷＺ３１４６、ＡＧ−４９０、ＸＬ６４７、ＰＤ１５３０３５、ＢＭＳ−５９９６２６）、ソラフェニブ、イマチニブ、スニチニブ、ダサチニブ、ホルモン療法等を含むが、但しこれらに限定されない。抗癌剤の投与経路、用量、及び治療レジメンの詳細は、例えば、「Cancer  Clinical  Pharmacology」  (2005年)  ed.  By  Jan  H.  M.  Schellens,  Howard  L.  McLeod  and  David  R.  Newell,  Oxford  University  Pressに記載されているように、当技術分野において知られている。
【０１６３】
幾つかの他の実施態様において、上記更なる抗癌剤は、癌関連免疫抑制を阻害する為に使用される１以上のＦｃ担持化合物とは異なる抗癌抗体からなる。抗癌抗体は、モノクロナール抗体（例えば、抗ＣＤ２０、抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ５２、抗ＨＬＡ−ＤＲ、及び抗ＶＥＧＦモノクロナール抗体）、免疫毒素（例えば、抗ＣＤ３３モノクロナール抗体−カリケアマイシンコンジュゲート、抗ＣＤ２２モノクロナール抗体−シュードモナス属（Pseudomonas）エキソトキシンコンジュゲート等）、放射線免疫療法（例えば、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、又は１３１Ｉにコンジュゲートした抗ＣＤ２０モノクロナール抗体等）を包含する。幾つかの実施態様において、これらの抗癌抗体は、それ自体糖鎖改変され得、例えばハイポフコシル化されうる。
【０１６４】
抗癌剤はまた、免疫系の抗癌活性を活性化又は再活性化させることが知られている薬剤を包含する。免疫系の抗癌活性を活性化又は再活性化させる薬剤は、抑制性免疫チェックポイントを阻害する薬剤であるのが好ましい薬剤を包含する。これらの薬剤は、本明細書において、「抑制性免疫チェックポイント阻害剤」又は「免疫チェックポイント阻害剤」と呼ばれうる。当技術分野において知られているように、免疫チェックポイント阻害剤は、抑制性免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害する薬剤からなる。
【０１６５】
語「免疫チェックポイントタンパク質」は、当技術分野において知られている。この語の既知の意味の範囲内で、「免疫チェックポイントタンパク質」のレベルで免疫系が、免疫反応をバランスさせる為に、そのコンポーネントに対して阻害性シグナルを提供するということが当業者にとって明らかである。既知の免疫チェックポイントタンパク質は、ＣＴＬＡ−４、ＰＤｌ及びそのリガンドのＰＤ−Ｌｌ及びＰＤ−Ｌ２、さらにＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、ＫＩＲを含む。ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、及びＫＩＲに関与する経路は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１依存経路と同様の免疫チェックポイント経路を構成することが当技術分野において認識されている（例えば、Pardoll，2012年．Nature  Rev  Cancer  12：252-264；Mellman等，2011年．Nature  480：480-489を参照）。
【０１６６】
本発明の範囲内で、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質の機能を阻害する任意の化合物である。阻害は、機能の低下及び完全なブロックを含む。特に、免疫チェックポイントタンパク質は、ヒト免疫チェックポイントタンパク質である。従って、免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は好ましくは、ヒト免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤である。免疫チェックポイントタンパク質は、先行技術文献に記載されている（例えばPardoll，2012年．Nature  Rev．cancer  12：252-264を参照）。免疫チェックポイントタンパク質という名称は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で免疫チェックポイントタンパク質を阻害することによって、抗原受容体が引き金となって引き起こされるＴリンパ球応答を刺激する実験的実証を含み、例えば免疫チェックポイントタンパク質の発現が欠損しているマウスは、抗原特異的Ｔリンパ球応答の強化又は自己免疫の兆候を示す（例えばWaterhouse等，1995年．Science  270:985-988；Nishimura等，1999年．Immunity  11：141-151で開示されている）。また、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）又はイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での免疫チェックポイントタンパク質の計画的な刺激に起因して、抗原−受容体が引き金となって引き起こされるＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞応答の阻害の実証も含みうる（例えば、Zhu等，2005年．Nature  Immunol．6：1245-1252）。好ましい免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を特異的に認識する抗体である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、ＰＤＬ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＴＩＭ３、及びＫＩＲ阻害剤のうちの幾つかが知られており、そしてこれらの既知の免疫チェックポイントタンパク質阻害剤と同様に、代替的な免疫チェックポイント阻害剤が（近い）将来的に開発されうる。例えば、イピリムマブは、Ｙｅｒｖｏｙ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ社）の名称で現在上市されている完全にヒトのＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体である。第２のＣＴＬＡ−４阻害剤はトレメリムマブである（Ribas等，2013年，J．Clin．Oncol．31：616-22で参照されている）。ＰＤ−１阻害剤の例として、ヒトＰＤ−１をブロックするヒト化抗体、例えばランブロリズマブ（例えば、国際公開第２００８／１５６７１２号；Hamid等，N．Engl．J．Med．369：134-144  2013年において、ｈＰＤ１０９Ａ及びそのヒト化誘導体ｈ４０９Ａ１１、ｈ４０９Ａ１６、及びｈ４０９Ａ１７として開示されている）、又はピディリズマブ（Rosenblatt等，2011年．J  Immunother．34：409-18で開示されている）、並びに完全にヒトの抗体、例えばニボルマブ（ＭＤＸ−１１０６又はＢＭＳ−９３６５５８としてこれまで知られている、Topalian等，2012．N．Eng．J．Med．366:2443-2454、米国特許第８００８４４９号明細書で開示されている）、を含むがこれらに限定されない。他のＰＤ−１阻害剤はまた、Ｂ７−ＤＣ−Ｉｇ又はＡＭＰ−２４４（Mkrtichyan  M等，J  Immunol．189：2338-47  2012年で開示されている）として知られているＰＤ−Ｌ２  Ｆｃ融合タンパク質、及び療法で使用する為に現在研究中及び／又は開発中の他のＰＤ−１阻害剤を含むがこれらに限定されない、可溶性ＰＤ−１リガンドの提示を含��うる。更に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−Ｌ１をブロックするヒト化抗体又は完全ヒト抗体、例えばＭＥＤＩ−４７３６（国際公開第２０１１０６６３８９号で開示されている）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（米国特許第８２１７１４９号明細書で開示されている）、及びＭＩＨ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社経由でＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社より入手可能（１６．５９８３．８２））、並びに現在研究中の他のＰＤ−Ｌ１阻害剤を含みうるがこれらに限定されない。本発明に従えば、免疫チェックポイント阻害剤は、好ましくはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１阻害剤から選択され、例えば上記された既知のＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、又はＰＤ−Ｌ１阻害剤（イピリムマブ、トレメリムマブ、ランブロリズマブ、ニボルマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２４４、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ、ＭＩＨ１）から選択される。これらの免疫チェックポイントタンパク質の既知の阻害剤はそのまま使用されうる、又は類似体、特にキメラ抗体、ヒト化抗体、若しくは抗体のヒトの形態、が使用されうる。
【０１６７】
当業者が知っているように、代替的及び／又は等価的な名称が、上記された或る抗体について使用されうる。そのような代替的及び／又は等価的な名称は、本発明の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはまた、代替的及び等価的な名称のＭＫ−３４７５及びペンブロリズマブとして既知であることが知られている。
【０１６８】
ＰＤ１阻害剤及びＰＤ−Ｌ１阻害剤、例えば上記された既知のＰＤ−１阻害剤又はＰＤ−Ｌ１阻害剤、から免疫チェックポイント阻害剤を選択することがより好ましく、ＰＤ−１阻害剤、例えば上記された既知のＰＤ１阻害剤、から選択されることが最も好ましい。好ましい実施態様において、ＰＤ１阻害剤は、ニボルマブ若しくはペンブロリズマブ、又はヒトＰＤ１に対する別のアンタゴニスト抗体である。
【０１６９】
本発明はまた、免疫応答を刺激することが当技術分野において知られている他の免疫チェックポイント阻害剤の選択を含む。これは、抗原特異的Ｔリンパ球を直接的又は間接的に刺激又は高める阻害剤を含む。これらの他の免疫チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質に対して向けられた薬剤、及びＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、Ｂ７Ｈ４、及びＴＩＭ３に関わる経路を含むがこれらに限定されない。例えば、当技術分野において知られているヒトＰＤ−Ｌ２阻害剤は、ＭＩＨ１８を含む（Pfistershammer等，2006年．Eur  J  Immunol．36：1104-13で開示されている）。別の例では、当技術分野において知られているＬＡＧ３阻害剤は、可溶性ＬＡＧ３（ＩＭＰ３２１、又は国際公開第２００９０４４２７３号及びBrignon等，2009年．Clin．Cancer  Res．15：6225-6231で開示されているＬＡＧ３−Ｉｇ）、並びにヒトＬＡＧ３をブロックするマウス又はヒト化抗体（例えば国際公開第２００８１３２６０１号で開示され、それに由来するＩＭＰ７０１）、又はヒトＬＡＧ３をブロックする完全ヒト抗体（例えば、欧州特許第２３２０９４０号明細書で開示されている）を含む。別の例は、ヒトＢＴＬＡとそのリガンドとの相互作用をブロックする抗体を含むがこれらに限定されない、ＢＴＬＡ対するブロッキング剤の使用により提供される（例えば、国際公開第２０１１０１４４３８号で開示されている４Ｃ７）。なお別の例は、ヒトＢ７Ｈ４に対する抗体（国際公開第２０１３０２５７７９Ａ１号、及び国際公開第２０１３０６７４９２号で開示されている）、又はＢ７Ｈ４の可溶性組み換え形態（例えば米国特許第２０１２０１７７６４５号明細書で開示されているもの、又は抗ヒトＢ７Ｈ４クローンＨ７４：ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ社＃１４−５９４８）を含むがこれらに限定されない、Ｂ７Ｈ４を中和する薬剤の使用により提供される。なおも別の例が、ヒトＢ７−Ｈ３を中和する抗体（例えば、ＢＲＣＡ８４Ｄとして開示されているＭＧＡ２７１、及び米国特許第２０１２０２９４７９６号明細書に記載の誘導体）を含むがこれらに限定されない、Ｂ７−Ｈ３を中和する薬剤により提供される。なお別の例は、ヒトＴＩＭ３に対して向けられた抗体（例えば、国際公開第２０１３／００６４９０号で開示されているもの、抗ヒトＴＩＭ３、又はJones等，J  Exp  Med．2008年  Nov  24；205(12)：2763-79により開示されているブロッキング抗体Ｆ３８−２Ｅ２）を含むがこれらに限定されない、ＴＩＭ３に対して向けられた薬剤により提供される。免疫チェックポイントタンパク質の既知の阻害剤は、その既知の形態で使用されうる、又は類似体、特に複数の抗体のキメラ形態、最も好ましくはヒト化形態、が使用されうる。
【０１７０】
本発明はまた、本発明の様々な観点の範囲内で、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物と組み合わせる為の、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１又はＰＤＬ１阻害剤から選択される１超の免疫チェックポイント阻害剤の選択を含む。例えば、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）とニボルマブ（抗ＰＤｌ）との同時療法は、単剤療法で得られる活性とは異なると思われる臨床的活性を示した（Wolchok等，2013年，N．Eng．J ．Med.，369:122-33）。チェックポイント阻害剤の有効性を改善することが明らかにされている薬剤の組み合わせ、例えば、イピリムマブ（Rizvi等，ASCO  2013年，and  clinicaltrials.gov  NCT01750580）と組み合わせた、若しくはニボルマブ（Sanborn等，ASCO  2013年、及びclinicaltrials.gov  NCT01714739）と組み合わせたリリルマブ（米国特許第８１１９７７５号明細書、及びBenson等，Blood  120:4324-4333  (2012年)において開示されている抗ＫＩＲ、ＢＭＳ−９８６０１５又はＩＰＨ２１０２としても知られている）、抗ＰＤ−１（Woo等，2012年  Cancer  Res．72：917-27）若しくは抗ＰＤ−Ｌｌ（Butler  NS等，Nat  Immunol．2011年  13：188-95）と組み合わされたＬＡＧ３に対して向けられた薬剤、抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせたＩＣＯＳに対して向けられた薬剤（Fu等，Cancer  Res．2011年  71：5445-54）、又は抗ＣＴＬＡ−４と組み合わせた４−１ＢＢに対して向けられた薬剤（Curran等，PLoS  One．2011年  6(4)  el  9499）がまた含まれる。
【０１７１】
本発明に従うと、標的とされる好ましい抑制性免疫チェックポイントタンパク質は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡからなる群から選択されるものを包含する。
【０１７２】
本明細書において開示されている、関心のある抑制性免疫チェックポイントタンパク質の好ましい阻害剤は、上記関心のある抑制性免疫チェックポイントタンパク質に対して向けられた抗体からなり、且つ上記関心のある抑制性免疫チェックポイントタンパク質の活性を阻害する。
【０１７３】
従って、幾つかの好ましい実施態様において、本発明に従い使用されうる抑制性免疫チェックポイントタンパク質の阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡのうちの１つに対して向けられた抗体からなる群から選択されるものを包含する。
【０１７４】
本発明の範囲内の癌は、白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、骨髄芽球前骨髄球、骨髄単球性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、バーキットリンパ腫及び辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、真性多血症リンパ腫、ホジキン病、非ホジキン病、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖疾患、固形腫瘍、肉腫、及び癌腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成性肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（endotheliosarcoma）、リンパ肉腫、リンパ管内皮肉腫（lymphangioendotheliosarcoma）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、結腸直腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、希突起神経膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、鼻咽頭癌、食道癌、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）の癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織の癌、消化器の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎癌、喉頭癌、肝癌、肺癌（小細胞、大細胞型）、メラノーマ、神経芽細胞腫；口腔癌（例えば、口唇、舌、口腔、及び咽頭）、卵巣癌、膵癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌；呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、及び尿路系の癌を含むが、これらに限定されない。
【０１７５】
医薬組成物及び治療方法
本明細書において別途すでに記載されているように、本明細書で定義される、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、１以上の更なる抗癌療法との組み合わせ処置の過程、特に１以上の抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤との組み合わせ処置の過程、を含む、１以上の更なる抗癌剤との組み合わせ処置の過程において有利に使用されうる。
【０１７６】
これらの実施態様に従えば、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物及び上記更なる１以上の抗癌剤は、「同時投与」される。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、語「同時投与」は、免疫応答を調節する為に、少なくとも２つの異なる物質を十分に接近した時期において投与することを云う。好ましくは、同時投与は、少なくとも２つの異なる物質の同時投与を云う。
【０１７８】
従って、「同時投与」は、組み合わせの治療上の効果又は予防上の効果が、単独投与されるいずれかの成分の治療上の効果又は予防上の効果を上回ることができるように、２以上の成分が組み合わされて投与されることを云う。２つの成分は、同時期に又は順次に同時投与されうる。同時期に同時投与される成分は、１以上の医薬組成物内に提供されうる。２以上の成分の順次の同時投与は、各成分が処置部位に同時に存在することができるように、複数の成分が投与される場合を含む。代替的には、２つの成分の順次の同時投与は、少なくとも１つの成分が処置部位から除去されるが、しかし成分を投与したときの少なくとも１つの細胞効果（例えば、サイトカイン産生、特定の細胞集団の活性化等）が、１以上の追加の成分が処置部位に投与されるまで、該処置部位において存続する場合を含みうる。従って、同時投与される組み合わせは、或る状況において、互いに化学的混合物では決して存在しない成分を含むことができる。
【０１７９】
幾つかの実施態様において、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する選択された化合物、及び１以上の更なる１以上の抗癌剤は、処置されるべき癌個体に同時に投与され、そして２つの活性な薬剤が、同一の医薬組成物に含まれうる、又は個別の医薬組成物に含まれうる。これらの２つの個別の医薬組成物は、使用前に共に混合され、次に処置されるべき癌個体に投与されうる。他の実施態様において、これらの２つの個別の医薬組成物は、短い時間間隔、例えば２〜５分内の時間間隔、で、処置されるべき癌個体に投与されうる。
【０１８０】
本発明は更に、（ｉ）糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、及び（ｉｉ）１以上の異なる抗癌剤を含む医薬組成物に関する。
【０１８１】
本発明は、（ｉ）糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物、及び（ｉｉ）１以上の抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤を含む医薬組成物を包含する。
【０１８２】
幾つかの好ましい実施態様において、上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、腫瘍抗原に対して向けられた、糖鎖改変抗体である。
【０１８３】
幾つかの実施態様において、腫瘍抗原は、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、及びＡＭＨＲＩＩからなる群から選択される。
【０１８４】
幾つかの実施態様において、上記糖鎖改変抗体は、３Ｃ２３Ｋ（又はその変異体）、９Ｆ７Ｆ１１、Ｈ４Ｂ１２１、及びＨＥ４Ｂ３３と呼ばれる糖鎖改変抗体からなる群から選択され、それらは本明細書において別途詳細に開示されている。
【０１８５】
幾つかの実施態様において、上記抑制性免疫チェックポイントタンパク質阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、Ａ２ＡＲ、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、及びＶＩＳＴＡの阻害剤からなる群から選択される。
【０１８６】
幾つかの実施態様において、上記阻害剤は、上記抑制性免疫チェックポイントタンパク質に対して向けられた抗体、又はその抗原結合性フラグメントからなる。
【０１８７】
糖鎖改変されたＦｃを有する化合物、より一般的には、本明細書に開示のポリペプチド、を調製すること及びそれを対象に投与する方法は、当業者に周知であり、又は当業者によって容易に決定される。本明細書に開示のポリペプチドの投与経路は、経口的、非経口的、吸入式、又は局所的でありうる。本明細書で使用される場合、非経口という語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸、又は膣腔投与を含む。これらの投与形態は全て、本明細書に開示の範囲内にあるものと明確に企図されるが、投与形態は、注射用、特に静脈内又は動脈内注射用又は点滴用、の溶液である。通常、注射用の好適な医薬組成物は、バッファー（例えば、酢酸、リン酸、又はクエン酸バッファー）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意的に安定剤（例えば、ヒトアルブミン）等を含みうる。但し、本明細書の教示と整合する他の方法において、糖鎖改変されたＦｃを有する化合物が、有害な細胞集団の部位に対して直接送達されることができ、それによって罹患した組織の治療剤への曝露を増加させる。
【０１８８】
非経口投与の為の調製物は、無菌の水性溶液又は非水性溶液、懸濁物、及びエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブオイル、及び注射用の有機エステル、例えばエチルオレエート、である。水性担体は、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョン又は懸濁物を含み、例えば生理食塩水及び緩衝化された媒体を含む。本明細書に開示の組成物及び方法において、薬学的に許容される担体は、０．０１〜０．１Ｍ又は０．０５Ｍのリン酸バッファー、又は０．８％の生理食塩水を含むが、これらに限定されない。他の一般的な非経口ビヒクルは、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、又は不揮発性油を含む。静脈内ビヒクルは、液体及び栄養補充液、電解質補充液、例えばリンゲルデキストロースに基づく補充液等、を含む。防腐剤及び他の添加剤、例えば抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤、及び不活性気体等、がまた存在しうる。より具体的には、注射用途に好適な医薬組成物は、無菌の注射液又は分散物を即時調製する為の、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散物、及び無菌の粉末を含む。そのような場合には、該組成物は、無菌でなければならず、且つ容易に注射ができる程度まで液体であるべきである。該組成物は、製造及び保管の条件下で安定であるべきであり、且つ微生物、例えば細菌及び菌類、の汚染作用に対しても防御されるべきである。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体のポリエチレングリコール等）、及びその好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。適切な流動性が、例えばコーティング、例えばレシチン、の使用によって、分散物の場合は必要とされる粒径を維持することによって、及び界面活性剤の使用によって、維持されることができる。
【０１８９】
いかなる場合においても、活性化合物（例えば、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物そのもの又はその他の活性な薬剤との組み合わせ）を、本明細書に列挙されている配合物の１つ又は組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要とされる量で組み込むことにより、必要に応じてその後に濾過式滅菌処理により、無菌の注射液が調製されることができる。一般的に、分散物は、活性化合物を、基礎的分散媒体及び上記で列挙されたものに由来するその他の必要とされる配合物を含有する無菌のビヒクル中に組み込むことにより調製される。無菌の注射液を調製する為の無菌の粉末の場合、調製方法は、減圧乾燥及び凍結乾燥を一般的に含み、予め滅菌濾過されたその溶液から、有効成分に加え、任意の望ましい追加配合物を含む粉末をもたらす。注射用の調製物は、処理され、容器、例えばアンプル、バッグ、ボトル、シリンジ、又はバイアル、中に充填され、そして当技術分野において既知の方法に従って、滅菌条件下で密閉される。更に、該調製物は、キットの形態、例えば米国特許出願第０９／２５９，３３７号明細書及び同第０９／２５９，３３８号明細書（該文献のそれぞれは、参照によって本明細書内に取り込まれる）に記載されている形態、で包装及び販売されうる。
【０１９０】
上記条件の処置を行う為の、本明細書に開示の上記組成物の有効用量は、多くの異なる要因、例えば投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の薬物、及び処置が予防的であるか又は治療的であるかを含む該要因、に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、しかしヒト以外の哺乳動物、例えば遺伝子導入哺乳動物を含む該ヒト以外の哺乳動物、がまた処置されることができる。処置用量は、安全性及び有効性を最適化する為に、当業者に知られているルーチン法を使用して用量設定されうる。
【０１９１】
本明細書に開示の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、複数の機会において投与されることができる。単回投与間の間隔は、１週間、１カ月、又は１年でありうる。間隔はまた、患者内の上記の糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の血中レベルを測定することによって示されるように不規則である可能性がある。幾つかの方法において、投薬量は、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の血漿濃度、特に糖鎖改変抗体の血漿濃度として、１〜１０００μｇ／ｍｌ、及び幾つかの方法では２５〜３００μｇ／ｍｌを実現するように調整される。代替的には、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物は、徐放性製剤として投与されることができ、係る場合、より低頻度の投与が必要とされる。糖鎖改変抗体の場合、投薬量及び頻度は、患者内の抗体半減期に依存して変化する。一般的に、ヒト化抗体が最長半減期を示し、次いでキメラ抗体及び非ヒト抗体が続く。
【０１９２】
本明細書の開示に従う医薬組成物は、薬学的に許容される、無毒性、無菌の担体、例えば生理食塩水、無毒性バッファー、防腐剤等を一般的に含む。本出願の目的に照らせば、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の薬学的に十分な量が維持されなければならない、すなわち、例えば癌患者に生ずる免疫抑制状態を減少させる又はブロックする為の利益を達成する為に十分な量を意味する。もちろん、本明細書に開示の医薬組成物は、薬学的に有効な量の、糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物を提供する為に、単回又は多数回投与で投与されうる。
【実施例】
【０１９３】
実施例１：糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物の合成
Ａ．材料及び方法
キメラ１２Ｇ４、ヒト化１２Ｇ４及び３Ｃ２３Ｋのクローニング
本発明のキメラ１２Ｇ４（ｃｈ１２Ｇ４）に従う医薬組成物が、これまでの記載に従い（２７）、構築され、そして発現された。簡単に説明すると、ＶＬ及びＶＨＤＮＡ配列が、プロモーター、Ｋｏｚａｋ配列、及びヒトκ／ＩｇＧ１定常領域の配列を含む多シストロン性のＣＨＫ６２２−０８ベクター中に連続してサブクローニンングされた。
【０１９４】
ヒト化１２Ｇ４（ｈ１２Ｇ４）のＶＬ及びＶＨをコードするＤＮＡ配列が、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔを使用して合成され、次に上記記載に従って消化及びライゲーションすることによって、ＣＨＫ６２２−０８にクローニンングされ、ＨＫ６２２−１８ベクターが得られた。ＶＬＥ６８Ｋ突然変異を導入する為にファージクローン３Ｃ２３の狙いを定めた突然変異誘発を実施することにより、親和性成熟型の３Ｃ２３Ｋ  ＶＬ及びＶＨをコードするＤＮＡ配列が取得された。シグナルペプチドが、ｈ１２Ｇ４のヒト化可変領域をテンプレートとして使用するＰＣＲアセンブリにより付加され、次に上記のようにＨＫ６２２−１８中にクローニンングされた。ヒト化且つ親和性成熟型の３Ｃ２３Ｋ抗体を発現する結果として生じたベクターは、ＨＫ６２２−１８ＭＡＯ３Ｃ２３Ｋと呼ばれた。
【０１９５】
ｃｈ１２Ｇ４、ｈ１２Ｇ４、及び３Ｃ２３Ｋの生成及び精製
これまで記載されたように、異なる分子が安定的に発現された（Siberil等，2006年，Clin  Immunol  Orlando  Fla，Vol．118：170-179）。ＣＨＯ−Ｓ、ＨＥＫ２９３、又はＹＢ２／０細胞が、適切な線形化発現ベクターを用いて安定的にトランスフェクトされた。Ｃｈ１２Ｇ４、ｈ１２Ｇ４、及び３Ｃ２３Ｋ抗体がＥＭＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５％の超低（Ultra-low）ＩｇＧウシ胎仔血清（ＦＣＳ：fetal  calf  serum）（ＰＡＡ社）、及び０．５ｇ／ｌのＧ４１８を使用して、５〜７日間、ＹＢ２／０細胞中で産生された。３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ−Ｓが、ＰｒｏＣＨＯ４（Ｌｏｎｚａ社）、４ｍＭのグルタミン、及び１ｇ／ｌのＧ４１８を使用して、７日間、ＣＨＯ−Ｓ細胞中で産生された。
【０１９６】
ＭＡｂが、プロテインＡセファロース（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用する親和性クロマトグラフィーにより、培養上清から精製された。凝集物及びエンドトキシンのレベルが、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＨＲ／２００（ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上のゲル濾過によって及びＬＡＬテストによって、それぞれ決定された。抗体の品質及び純度が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシー染色によってモニタリングされた。加えて、各精製された抗体のグリコシル化パターン及びコアフコースパーセンテージ（％）が、高性能キャピラリー電気泳動レーザー誘起蛍光（ＨＰＣＥ−Ｌｉｆ：high  performance  capillary  electrophoresis  laser  induced  fluorescence）によって決定された（５１）。
【０１９７】
ＳＰＲ分析
ＳＰＲ分析が、ＨＢＳ−ＥＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）で、２５℃、Ｂｉａ３０００又はＴ２００装置上で実施された。親和性測定について、ＭＩＳＲＩＩが、製造業者の指示（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に従い、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化を使用して、ＣＭ５センサーチップ上に共有結合により固定化された（１０００ＲＵ）。種々の濃度（０．５〜１２８ｎＭ）の１２Ｇ４又は３Ｃ２３Ｋが、固定化された受容体上に１８０秒間注入された。泳動バッファー中で４００秒間解離させた後、センサーチップは、Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を使用して再生された。ＫＤ値が、親和性及びアビディティーを考慮しながら、ラングミュアの１：１フィッティングモデル（ＢｉａＥｖａｌｕａｔｉｏｎ３．２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して計算された。抗体−ＦｃγＲ測定が、４０００〜５０００ＲＵレベルで共有結合により固定化された抗Ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）上で捕捉されたＦｃγＲ（Ｓｉｇｍａ社）において、単一サイクル滴定により１００μｌ／分で実施された。γ受容体が２０ｎＭで６０秒間注入され、そして５つの漸増する濃度の抗体が注入された（注入時間＝６０秒）。泳動バッファー中での６００秒の解離工程後、センサー表面が５μｌのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を使用して再生された。動力学的パラメーターが、Ｔ２００評価ソフトウェア３．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）上の不均質なリガンドモデル又は定常状態フィッティングモデルを使用して、センサーグラムから評価された。全てのセンサーグラムは、フィッティング評価の前に、対照参照表面（固定化されたタンパク質を一切含まない）及びバッファーブランク注入からの低シグナルを引き算することによって修正された。
【０１９８】
抗体
マウス抗ＭＩＳＲＩＩ  ＭＡｂ  １２Ｇ４が、Ｓａｌｈｉ等及びＫｅｒｓｕａｌ等によって記載された（１７，２２）。抗イディオタイプ第ＶＩＩＩ因子キメラＩｇＧ１  Ｒ５６５  ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）ＭＡｂ及び抗ＣＥＡ  ＭＡｂ３５Ａ７（１７）が無関係の抗体として使用された。
【０１９９】
結果
キメラ化、ヒト化、及び親和性成熟
３Ｃ２３Ｋヒト化抗体は、マウス１２Ｇ４  ＭＡｂの可変領域にそもそも由来した（Sahli等，2004年，Biochem  J，Vol．37：785-793）。ヒト化手順は、ＣＤＲグラフティング（ＭＡｂ  ｈ１２Ｇ４）、及びランダム突然変異誘発による親和性成熟、及びファージディスプレーを含み、最終分子３Ｃ２３Ｋをもたらした。
【０２００】
第１の工程において、ＣＤＲグラフティングの為のヒトテンプレート候補が、ＩＭＧＴ／ＤｏｍａｉｎＧａｐＡｌｉｇｎ研究プログラム（２８）内のＶＬ及びＶＨドメインの配列を個別に入力すること、及びサーチをＩＭＧＴ／遺伝子−ＤＢ（２９）内のヒト配列に制限することによって識別された。最も近いヒトＶＨ遺伝子であるＩＧＨＶ１−３＊０１は、マウスカウンターパートと６７．３４％の同一性を示した。この同一性は、マウス１２Ｇ４  ＣＤＲ−ＩＭＧＴをヒトＦＲ−ＩＭＧＴにグラフティング後、９２．８５％まで上昇した。最も近いヒトＶＬ遺伝子、ＩＧＫ１−９＊０１は、マウスカウンターパートと６２．７６％の同一性を示した。但し、ＩＭＧＴ／ＧｅｎｅＦｒｅｑｕｅｎｃｙツール（２８）はＩＧＫ１−９＊０１は非常に頻繁には発現されないことを示唆したので、ＩＧＫＶ１−５＊０１が好ましかった。ＩＧＫＶ１−５＊０１は、１２Ｇ４のＶＬと５８．５１％の同一性を有し、グラフティング後、８８．２９％まで増加した。
【０２０１】
結合特性をより良好に定義する為に、クローン３Ｃ２３Ｋが、ＩｇＧ１抗体として再フォーマットされ、ＹＢ２／０細胞内で産生され、そして表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により分析された。３Ｃ２３Ｋ抗体は、マウス１２Ｇ４（ＫＤ＝７．９×１０−１０Ｍ）よりも高い結合親和性（ＫＤ＝５．５×１０−１１Ｍ）を示した。この後者の値は、ＭＡｂ１２Ｇ４の最初の記載において公開された数値に非常に近かった（ＫＤ＝８．６×１０−１０Ｍ）（２２）。結合親和性の増加はまた、ＣＯＶ４３４−ＭＩＳＲＩＩ細胞を使用するフローサイトメトリーによって確認された。
【０２０２】
ＹＢ２／０、ＣＨＯ、又はＨＥＫ２９３細胞における３Ｃ２３Ｋ生成、グリコシル化分析、及びＦｃγ受容体への結合に対する効果
ＹＢ２／０細胞（ＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）バージョン；３Ｃ２３Ｋ）（２７）、ＣＨＯ−Ｓ細胞（３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ）、又はＨＥＫ２９３（３Ｃ２３Ｋ−ＨＥＫ２９３）細胞（機能的アッセイ用のコンパレータとして使用された）内で発現された３Ｃ２３Ｋのオリゴ糖分析は、２つの明確に異なるグリコシル化パターンを示した。フコシル化、ガラクトシル化、及び二分化ＧｌｃＮＡｃアイソフォームのパーセンテージ（％）は、３Ｃ２３Ｋについてそれぞれ３３．０％、５７．２％、及び１．８％、並びに３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯについてそれぞれ９４．６％、５４．４％、及び２．０％であった。これらグリコシル化の差異がＦｃγＲｓへの結合に対する効果が、ＳＰＲにより分析された。ｈＦｃγＲＩＩＩａ及びｈＦｃγＲＩＩＩｂに対する結合親和性は、フコースが低下した後、明確に高まった（３Ｃ２３Ｋ−ＨＥＫ２９３について３１〜１６４ｎＭ及び３７８ｎＭと比較して、それぞれ、３Ｃ２３Ｋについて１〜１２ｎＭ及び８６．０ｎＭ）が、しかし他のＦｃγＲ（ｈＦｃγＲＩ、ｈＦｃγＲＩＩａ、ｈＦｃγＲＩＩｂ）については当てはまらなかった（下記の実施例２の表２をまた参照）。
【０２０３】
次に、ＮＫ細胞及びマクロファージ上で主に発現される低／中親和性Ｆｃ受容体ＣＤ１６との抗体相互作用を増加させる為に、３Ｃ２３ＫがＥＭＡＢｌｉｎｇ（登録商標）技法を使用してＹＢ２／０細胞内で発現された（Siberil等，2006年，Clin  Immunol  Orlando  Fla，Vol．118：170-179）。この特徴は、他の一般的に使用される細胞株、例えばＣＨＯ細胞、と比較して、ラットミエローマＹＢ２／０細胞内Ｆｕｔ８遺伝子発現が低いことに関連する（Siberil等，2006年，Clin  Immunol  Orlando  Fla，Vol．118：170-179）。
【０２０４】
予想された通りに、３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２／０は、高フコース含有３Ｃ２３ＫよりもＣＤ１６に対して高い結合親和性を示した。
【０２０５】
実施例２：３Ｃ２３Ｋ（ＧＭ１０２）抗体のグリカン分析
背景：
ＧＭ１０２は、クローン１８Ｈ２を使用して、ＹＢ２／０細胞（ラットハイブリドーマＹＢ２／３ＨＬ）内で産生されるヒト化モノクロナール抗体である。
【０２０６】
炭水化物部分は、重鎖のＡＳＮ２９５に位置する。
ａ）ＧＭ１０２についてのグリカン分析結果：表２
【０２０７】
【表２】
2020521780.tif 000005
【０２０８】
ｂ）ＰＢ０１参照標準の特徴付け
ＰＮＧａｓｅ  ＦによるＮ−脱グリコシル化、そして放出された炭水化物残基のタグ化後に、ＵＰＬＣ−ＨＩＬＩＣ−ＦＤによって、これらの炭水化物残基の分析が、６つの主要な炭水化物部分の存在を明らかにした：
１．非フコシル化（Ｇ０）  ５１．１％
２．フコシル化（Ｇ０Ｆ）  １２．８％
３．モノガラクトシル化非フコシル化（Ｇ１）  １０．２％
４．モノガラクトシル化フコシル化（Ｇ１Ｆ）  ４．３  ％
５．アグリコシル化非フコシル化（Ｇ０Ｂ）  ９．９％
６．二分化ＧｌｃＮＡｃを有するフコシル化（Ｇ０ＦＢ）  ３．４％
フコシル化された残基の合計は、２３％であった。
【０２０９】
【表３】
2020521780.tif 000006
【０２１０】
実施例３：糖鎖改変されたＦｃフラグメントを有する化合物のＦｃ受容体に対する高親和性
Ａ．材料及び方法
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface  Plasmon  Resonance）分析：
抗ヒスチジン抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が、製造業者の指示（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）に従って、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化を使用して、ＣＭ５センサーチップ上で、１０μｌ／分の流速、ＨＢＳ−ＥＰ中、２５℃でＴ２００装置上に固定された。該抗体は、フローセルＦｃ２上に、６９００ＲＵレベルにおいて共有結合的に固定化され、そして対照参照表面（フローセルＦｃ１）が、同一の化学処置を使用して、しかし抗Ｈｉｓ抗体無しに調製された。
【０２１１】
Ｆｃ１及びＦｃ２における全ての動力学的測定は、１００μｌ／分で、ＨＢＳ−ＥＰ内、２５℃、Ｔ２００装置上、単一サイクル滴定によって行われた。各ヒトガンマ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が、固定化された抗Ｈｉｓ抗体上で、６０秒間、２０ｎＭで捕捉された。５つの漸増する濃度の抗体が注入された（注入時間＝１２０秒）。ランニングバッファー中での６００秒の解離工程後、センサー表面が５μｌのグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ１．７）を使用して再生された。全てのセンサーグラムは、対照参照表面及びバッファーブランク注入に由来する低シグナルを引き算することにより修正された。動力学的パラメーターが、Ｔ２００評価ソフトウェアから異種リガンドモデル又は２ステートモデルを使用して、センサーグラムから評価された。
【０２１２】
Ｂ．結果
ハイポフコシル化抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ抗体のヒトＦｃ受容体の親和性定数（Ｋｄ）の測定の結果が、下記の表４に示されている。
【０２１３】
2020521780.tif 000007
【０２１４】
親和性定数は、ＫＤ（単位：ｎＭ）として表わされている。
＊ＫＤは、異種リガンドフィッティングモデルを使用して計算された。
＊＊フィッティングが異種リガンドモデルに当てはまらなかった場合には、ＫＤ値は、２ステート反応モデルを用いて決定された。
【０２１５】
実施例４：フコース低下型抗体（reduced  fucose  antibody）は、癌における、腫瘍に関連付けられたマクロファージ誘発性免疫抑制をブロックする
Ａ．材料及び方法
イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）免疫学アッセイ：
Ｔ細胞増殖アッセイが下記の通り行われた。要するに、ＣＭＦＤＡ染色されたＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩが、１０μｇ／ｍｌの無関係のｍＡｂ  Ｒ５６５、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ＦｃＫＯ、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂと共に、４℃で１時間処置され、そして染色されていないＭＤＭ２と共に４日間インキュベートされた後、ＭＤＭ２：Ｔ細胞として１：８の比で、ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄによって、事前に活性化された、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（商標））染色されたＴ細胞が添加された。４日間の追加のインキュベーション期間の後、細胞が採取され、そしてフローサイトメトリー分析前に、抗ＣＤ８  ＰｅｒＣＰ、ＣＤ１１ｂ  ＰＥ−Ｃｙ７、及びＣＤ４  ＡＦ６４７（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標））で染色された。抗体染色前に、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ（登録商標）５０６（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（登録商標））染色することによって、死細胞が除外された。Ｔ細胞増殖が、細胞分裂に対応するＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈物の指標により、ＣＤ８＋（ＣＤ１１ｂ−）Ｔゲート化細胞上で分析された。初期集団内の細胞が経験した細胞分裂の平均数に等しい分裂指標値が、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ、バージョン７．６．５）を用いて計算された。初期集団内の細胞が経験した細胞分裂の平均数に等しい分裂指標値が計算された。
【０２１６】
Ｂ．結果
腫瘍内のマクロファージはＴ細胞の抗腫瘍活性を抑制する、ということが明らかに確立される。マクロファージの３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ抗体との関与が、それらのＴ細胞抑制機能が変化させるという仮説を本発明者等は立てた。この仮説を裏付ける為に、ＣＯＶ４３４−ＡＭＨＲＩＩ標的細胞が、無関係のｍＡｂ  Ｒ５６５、抗ＡＭＨＲＩＩ  ＦｃＫＯ、又は抗ＡＭＨＲＩＩ  ３Ｃ２３Ｋ  ｍＡｂのいずれかを用いて処置され、そしてＭＤＭと共に４日間共培養された後、ＣＤ３／ＣＤ２８で事前に活性化されたＰＢＴが添加された。ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖が、フローサイトメトリーにより分析された。予想された通り、対照ｍＡｂ（無関係のアイソタイプ対照Ｒ５６５及びＦｃＫＯ抗ＡＭＨＲＩＩ  ｍＡｂｓ）の存在下で、又は処置の未実施下で、ＭＤＭはＴ細胞増殖に強い障害をもたらした。とりわけ、ＭＤＭを介したＴ細胞免疫抑制は、共培養された腫瘍細胞が３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ  ｍＡｂを用いて処置された場合に、ＣＤ８Ｔ細胞の分裂指標値が大きく増加することにより示されるように（図１Ａ）、有意に低下した。
【０２１７】
腫瘍細胞はＴ細胞抑制機能を直接発揮することが知られているので、腫瘍細胞数の減少は、この「免疫刺激」効果を部分的に説明することができる。３Ｃ２３Ｋ抗ＡＭＨＲＩＩ  ｍＡｂがＭＤＭに作用し、ＭＤＭをそれほど免疫抑制的でなくすることもできるかテストする為に、腫瘍細胞を用いない実験を設計した。Ｉｎｅｒｔ  Ｓｐｈｅｒｏ（登録商標）ポリスチレンビーズが、腫瘍標的細胞の代替として使用された。これらのビーズは、腫瘍細胞の条件と同一条件で、ｍＡｂを用いて処置された、つまり、ＭＤＭがｍＡｂ処置ビーズと共に最初に共培養された後、活性化したＰＢＴと共培養された。この条件では、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖は、ＭＤＭが３Ｃ２３ＫコーティングされたＳｐｈｅｒｏ（登録商標）ポリスチレンビーズと共培養された場合に、部分的に復元された（図１Ｂ）。対照として、本発明者等は、ＭＤＭの非存在下で観察されたＴ細胞増殖が、３Ｃ２３Ｋによって影響を受けないことをチェックした（図２）。これらの実験は、３Ｃ２３ＫがＭＤＭのＴ細胞抑制能力を直接変化させることを強く示唆している。
【０２１８】
総じて、これらの結果は、糖鎖改変されたヒト化モノクロナール抗ＡＭＨＲＩＩ抗体である３Ｃ２３Ｋは、抗原結合部位によって腫瘍細胞を効率的に標的とすること、及びＦｃドメインを認識することによって、腫瘍細胞に対してプロ腫瘍促進性マクロファージ(pro-tumormacrophages)を向けられることを示す。従って、ｍＡｂ活性化マクロファージは、腫瘍細胞に対してＡＤＣＣ及びＡＤＣＰをトリガーし、そしてＴ細胞に対するそれらの免疫抑制的挙動を低下させた。
【０２１９】
結果の議論
ＡＤＣＣ／ＡＤＣＰは、ｍＡｂでの処置に応じて、マクロファージによって誘発される唯一の機構ではないとかもしれない。腫瘍関連マクロファージは、Ｔ細胞の活性化を抑制することが記載されており（Biswas等，2010年，Nat.  Immunol.，Vol．11  (n°10)：889-896）、及びリンパ球とマクロファージとの間の接触を示す本発明者等のデータは、両方の細胞型間の直接的な相互干渉のアイディアを裏付ける。イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）アッセイを使用することによって、３Ｃ２３ＫによるＦｃＲの関与が、マクロファージの免疫抑制的表現型を低下させることを本発明者等は見出した。そのような条件では、事前に活性化されたＴ細胞は、３Ｃ２３Ｋが存在しない場合にはブロックされたその増殖能力を取り戻す。治療用ｍＡｂが、先天的免疫細胞だけでなく、適応性免疫細胞にも関与することができるという概念は、これまでの試験と整合する。マウス腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍抗原Ａｂを用いて処置すると、Ｔ細胞を含め、長期生存に必要とされた細胞性免疫応答を誘発することが実証された（Montalvao等，2013年，J  Clin  Invest，Vol．123：5098-5103；Gul等，2014年，J  clin  Invest，Vol．124：812-823）。しかしながら、抗腫瘍ｍＡｂで処置された癌患者を対象として適応性免疫応答を誘発することはまだ、広範囲にわたり研究されていない。
【０２２０】
３Ｃ２３Ｋがマクロファージの表現型を変化させてＴ細胞抑制を軽減する機構は、現時点では知られていない。しかしながら、種々の仮説が想定されることができる。抗体とマクロファージにより発現されたＦｃ受容体との相互作用は、これらの細胞の機能を調節する幾つかのシグナルカスケードをトリガーすることが示されている（Biswas等，2010年，Nat．Immunol.，Vol．11  (n°10)：889-896）。本発明者等の予備的なデータは、３Ｃ２３Ｋを用いてＦｃＲを介して活性化されたマクロファージは、Ｔ細胞に有益な効果を発揮することが記載されているＩＬ−１ベータ及びＩＬ−６を含む、幾つかの炎症性サイトカイン（pro-inflammatory  cytokine）を生成することを示す（Grugan等，2012年，J  Immunol.，Vol．189：5457-5466）。間接的な効果がまたありうる。特に、腫瘍細胞の死は、幾つかの危険関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）、例えば先天的免疫細胞及び適応性免疫細胞を次に活性化させるカルレティキュリン、の放出をもたらすことができる（Yatim等，2017年，Nat  Rev  Immunol，Vol．17(n°4) ：262-275）。この免疫原性細胞死を媒介する際の樹状細胞の役割は、十分に記載されている。細胞死の期間中に放出されたカルレティキュリンは、Ｔ細胞に対して有益な効果を発揮しやすいＩＬ−６及びＴＮＦ−αを産生するマクロファージを活性化させることを証拠はまた示唆している（Duo等，2014年，Int  J  Mol  Sci，Vol．15(n°2)：2916-2928）。
【０２２１】
実施例５：Ｆｃを有する糖鎖改変化合物によるＴＡＭ様マクロファージの活性化
Ａ．材料及び方法
ヒト単球由来マクロファージの調製
末梢血単核球（ＰＢＭＣ：Peripheral  blood  mononuclear  cells）は、健康な血液ドナーから得られた。
【０２２２】
ＰＢＭＣは、ＣＤ１４＋細胞のポジティブ磁気選択を使用して古典的に分離された。単球が、１０％のウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ中、３７℃、５％のＣＯ２で培養され、次に５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦを４日間添加することによって、Ｍ２型マクロファージに分化させた。変換されたＭ２型マクロファージの表現型は、ＣＤ１４高（high）ＣＤ１６３高（high）ＩＬ１０高（high）ＩＬ１２低（low）である。
【０２２３】
抗体によるマクロファージのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）活性化
抗体、すなわちＲ１８Ｈ２と命名されたハイポフコシル化抗ＡＭＨＲＩＩ、又はＦｃγ受容体との結合を一切含まないそのＦｃＫＯカウンターパート、の１０μｇ／ｍＬの溶液が、４℃で２４時間インキュベートすることによって、２４ウェルプレート上に吸着された。この実験条件は、抗体がその抗原を認識した状況を模倣した。コーティングされていない抗体は、ＰＢＳ溶液を用いて洗浄することによって廃棄された。次に、Ｍ２型マクロファージ（細胞１０６個／ｍＬの培養培地）が、抗体でコーティングされた（又は陰性対照の場合はされない）ウェル中、３７℃で、１〜３日間インキュベートされた。
【０２２４】
抗体による活性化後のマクロファージの分析
抗体と共にインキュベートされたマクロファージが、１００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳによって６又は２４時間刺激された後、ｑＲＴ−ＰＣＲ又はフローサイトメトリーによってそれぞれ分析された。ＰＤＧＦα、ＶＥＧＦβ、ＨＧＦ、ＴＧＦβ、ＩＤＯ１、ＩＬ１０、Ｓｅｐｐ１、Ｓｔａｂ１、ＦＯＬＲ２、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６４ｂ、及びＣＤ１６ａ遺伝子の転写が定量され、そしてＲＰＳ１８、Ｂ２Ｍ、及びＥＦ１ａ遺伝子を参照として使用することによって正規化された。
【０２２５】
発現の変化は、培養培地からのサンプルを用いて、マクロファージによって発現された膜性タンパク質についてフローサイトメトリーにより、且つ可溶性因子、例えばＩＬ１０、ＩＬ１β、又はＴＮＦα、について典型的なＥＬＩＳＡアッセイによって、タンパク質レベルで確認された。
【０２２６】
Ｂ．結果
マルチウェルプレート上に吸着された抗体は、マクロファージのＦｃγ受容体に結合するそれらの能力に依存して、Ｍ２型マクロファージを差動的に刺激した。全体として、Ｍ２型マクロファージが抗体を一切ないウェル中で培養された際、マーカーの有意な変化は認められなかった。ＦｃＫＯ抗体を用いた際、それらのタンパク質とマクロファージとの非特異的結合に対応する軽微な変化のみが観察された。対照的に、マクロファージがハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体と相互作用した場合に、図３Ａに示されているように、３日間のインキュベーション後に減少したＭ２型マクロファージの特定の典型的なマーカー、例えばＳｅｐｐ１、Ｓｔａｂ１、ＦＯＬＦＲ２、及びＣＤ１６３、の明白な減少が減少した。これらの変化は、マクロファージの型が、ハイポフコシル化抗体による刺激の下で変化する可能性があることを強く示唆する。これらの変化は、抗体に結合し且つＣＤ１６（図３Ｂ）及びＣＤ６４（図３Ｃ）のようにＡＤＣＣ及び食作用に関与するＦｃｇ受容体の増加が伴った。
【０２２７】
興味深いことに、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体との共存３日後に、Ｍ２マクロファージの培養培地において検出されたサイトカイン及び可溶性ペプチドのプロファイルは、Ｍ１マクロファージによって通常発現される炎症促進因子、例えばＴＮＦα、ＩＬ１β（図３Ｄ）、又はＩＬ６（データ図示せず）、の明らかな増加を明らかにした。その上、ＴＧＦβ、ＩＤＯ１、及びＩＬ１０のような免疫抑制因子の減少（図３Ｅ、図３Ｆ、図３Ｇ）、並びにＰＤＧＦα、ＶＥＧＦβ、及びＨＧＦのような血管新生促進因子の減少がまた観測された（図３Ｈ、図３Ｉ、図３Ｊ）。
【０２２８】
その上、ハイポフコシル化Ｒ１８Ｈ２抗体を用いて刺激した際のＭ２マクロファージの表面でのＰＤＬ２発現の減少（図３Ｋに示されているように）は、ＩＬ１０の減少と共に、これらの表現型改変型マクロファージの免疫抑制活性を減少させる傾向を示唆する。
【０２２９】
まとめると、これらの結果は、低フコース抗体のＭ２マクロファージへの結合は、Ｍ２とＭ１との間の中間的なマクロファージ表現型へのシフトをもたらし、且つ血管新生の阻害及び免疫系の刺激を介する非直接的な抗腫瘍効果を誘発する幾つかの因子の変化を引き起こすことを示した。
【０２３０】
実施例６：３Ｃ２３Ｋ抗体は免疫抑制をブロックし、それは免疫系の活性化をもたらす
Ａ．材料及び方法
ヒト単球由来マクロファージ（ＭＤＭ：Monocyte-Derived  Macrophages）の調製
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、健康な血液ドナーから得られた（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ  Ｆｒａｎｃａｉｓ  ｄｅ  Ｓａｎｇ社、ＥＦＳ）。
【０２３１】
ヒト単球が、製造業者のプロトコールにより推奨されるように、ネガティブセレクション単球分離キットＩＩ（Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用してＰＢＭＣから分離された。単球は、Ｌ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及びペニシリン／ストレプトマイシン（ＰＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）が補充されたマクロファージ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中、３７℃及び５％のＣＯ２で培養された。
【０２３２】
分離された単球は、未分化のまま保持され（ＮＳ、無刺激）、又はＩＦＮ−γ（Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、１００ＵＩ／ｍｌ）＋ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ社）、若しくはＭ−ＣＳＦ（Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、２００ＵＩ／ｍｌ）＋ＩＬ−１０（Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社、５０ＵＩ／ｍｌ）を用いてそれぞれ刺激することによって、３日間にわたって、抗腫瘍性のマクロファージ（Ｍ１様）又は腫瘤促進性のマクロファージ（ＴＭＡ様）に分化させられた。
【０２３３】
抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ：Antibody-Dependent  Cell-Mediated  Cytotoxicity）アッセイ
ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞が、１０μｇ／ｍＬの抗ＡＭＨＲＩＩ抗体：ＧＭ１０２（３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０とも命名される）、３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ、又は３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯと共に４℃で前処理された。標的ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞が、ＢＡＴＤＡ（ビス−アセトキシメチル−２，２’：６’，２’’−テルピリジン−６，６’’−ジカルボキシレートとともに負荷され、Ｌ−グルタミン、ＰＳ、及び１０％の熱失活されたＦＣＳが補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社）中で再懸濁され、そしてエフェクター細胞（ヒトマクロファージ）に１：１の比で、３７℃で４時間添加された。
【０２３４】
ＡＤＣＣは、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡに基づく細胞毒性アッセイ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用することによって測定された。標的細胞とエフェクター細胞との間で４時間インキュベートされた後、上清がＥｕ３＋溶液と共にインキュベートされ、そして蛍光が測定された（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）。データは、最高（トリトンで処理された標的細胞）及び最低（エフェクター細胞単独）の細胞溶解に対して正規化され、そしてシグモイド用量反応モデルに適合された。
【０２３５】
卵巣癌腫瘍細胞株（ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞）に対するマクロファージ＋抗体の細胞毒性効果のフローサイトメトリーによる評価
ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞が、ＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色され、Ｌ−グルタミン、ＰＳ、及び１０％の熱失活されたウシ胎仔血清（ＦＣＳ、Ｓｉｇｍａ社）が補充されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ社）中で再懸濁され、そして３つの抗ＡＭＨＲＩＩ抗体のそれぞれが存在する中、１：１の比で、各型のヒトマクロファージに添加された。
【０２３６】
ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞の数及び増殖を評価する為に、前処理された又は未処理のヒトマクロファージが、３、４、及び５日間、腫瘍細胞で攻撃された。ＳＫＯＶ−Ｒ２＋細胞数が、蛍光標識された細胞を検出することにより計算され、且つそれら増殖は、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈によって評価された。
【０２３７】
１００００個の細胞の集団が、各データポイントについて分析された。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈が、Ｍｏｄｆｉｔソフトウェアを使用して分析された場合を除き、全ての分析が、Ｄｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターにおいて行われた。
【０２３８】
ヒトマクロファージ上の受容体発現の検出によるマクロファージ分化の評価
受容体発現（ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６３、ＣＤ３６、ＣＤ２０６、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ２８２）が、（ｉ）分化させた後、及び（ｉｉ）分化させたヒトマクロファージとＳＫＯＶ−Ｒ２＋腫瘍細胞（異なる抗ＡＭＨＲＩＩ抗体を用いて処置された）との間で３日間共培養した後に、ヒトマクロファージの膜において、フローサイトメトリーによって評価された。
【０２３９】
受容体が、Ｃｄ１１ｂ−ＦＩＴＣ、ＣＤ１６３−ＰＥ、ＣＤ３６−ＰＥ、ＣＤ２０６−ＡＰＣ、ＣＤ１６−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ５１５、ＣＤ６４−ＰｅｒＣＰ−Ｖｉｏ７００、ＣＤ８０−ＰＥ、ＣＤ３２−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）−ＡＰＣ、ＣＤ１４−ＡＰＣ−Ｖｉｏ７７０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用して検出され、そして適切なアイソタイプ対照と比較された。
【０２４０】
１００００個の細胞の集団が、各データポイントについて分析された。死細胞（陽性細胞）は、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｄｙｅ（生死判別染色試薬）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を用いて標識した後、分析から除去された。分析は、ＣＤ１４又はＣｄ１１ｂ陽性細胞に絞られた。全ての分析は、Ｄｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターにおいて行われた。
【０２４１】
Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｔ−ＣＤ４の偏り（polarization）及びＴ−ＣＤ８活性化
ヒトＴ細胞が、製造業者のプロトコールにより推奨されるように、ネガティブセレクションＰａｎＴ細胞分離キット（Ｍａｃｓ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）を使用してＰＢＭＣから分離された。分離後、細胞はＣｅｌｌＴｒａｃｅＴＭ  Ｖｉｏｌｅｔ細胞増殖キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）で染色され、Ｌ−グルタミン、ＰＳ、及び１０％の熱失活されたＦＣＳが補充されたＲＰＭＩ１６４０媒体（Ｇｉｂｃｏ社）中で再懸濁され、そしてヒトマクロファージ＋ＳＫＯＶ−Ｒ２＋腫瘍細胞（上記の異なる抗ＡＭＨＲＩＩ抗体で処置された）の共培養物中に、１：８の比で、４日間添加された。
【０２４２】
Ｔｈ１／Ｔｈ２  Ｔ−ＣＤ４の偏りを評価する為に、Ｔ細胞が、ＣＤ１８３（ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）−ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で標識され、分析はＣＤ４陽性細胞に絞られた（ＣＤ４−ＶｉｏＢｒｉｇｈｔ  ＦＩＴＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）。
【０２４３】
Ｔ−ＣＤ８活性化を評価する為に、Ｔ細胞がＣＤ１８３（ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）−ＡＰＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）及びＣＤ２５（ＣＤ２５−ＰＥ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）で標識され、そして分析がＣＤ８陽性細胞に絞られた（ＣＤ８−ＰＥ−Ｖｉｏ７７０、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ社）。
【０２４４】
Ｔ−ＣＤ４及びＴ−ＣＤ８細胞の増殖が、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈によって評価され、そして分析はＣＤ４陽性細胞又はＣＤ８陽性細胞に絞られた。
【０２４５】
１００００個の細胞の集団が、各データポイントについて分析された。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ希釈が、Ｍｏｄｆｉｔソフトウェアを使用して分析された場合を除き、全ての分析が、Ｄｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターにおいて行われた。
【０２４６】
サイトカイン及びケモカインの生成
サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、及びＴＧＦ−β）、及びケモカイン（ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、及びＣＸＣＬ１０）の放出が、（ｉ）分化したヒトマクロファージの上清、（ｉｉ）分化したヒトマクロファージ及びＳＫＯＶ−Ｒ２＋腫瘍細胞（異なる抗ＡＭＨＲＩＩ抗体で処置された）との３日間の共培養後の上清、及び（ｉｉｉ）この共培養物＋Ｔ細胞の追加の４日間後の上清において数値化された。
【０２４７】
サイトカイン及びケモカイン放出の定量化は、製造業者の指示に従い（ＡｌｐｈａＬｉｓａキット、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）、ＡｌｐｈａＬｉｓａイムノアッセイによって測定された。
【０２４８】
Ｂ．結果
全ての実験が、３人の異なる独立した健常ドナーからのＰＢＭＣを用いて行われた。（Ｍ−ＣＳＦ及びＩＬ−１０の添加による）未分化マクロファージ又はＴＡＭ様に分化したマクロファージの存在下で測定されたＡＤＣＣは、不活性な対照として使用された３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ又は３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯと比較して、３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０低フコース抗体において明らかにより高いことがわかった。ＴＡＭ様におけるデータが図４Ａに提示されている。この細胞溶解活性は、ＴＡＭ様マクロファージと４日間共インキュベーションした後の腫瘍細胞の減少を、少なくとも部分的に説明しうる。この減少はまた、図４Ｂに示されているように、３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯよりも３Ｃ２３Ｋ  ＹＢ２０において高かった。
【０２４９】
Ｔ細胞が、ＴＡＭ様マクロファージ及び腫瘍細胞の共培養物に添加された場合に、メモリーＣＤ８＋リンパ球のパーセンテージ（％）の増加が観察された（図４Ｃ）。Ｔｈ１  ＣＤ４調節性Ｔ細胞の増加傾向はまた、Ｔｈ２  ＣＤ４＋Ｔ細胞の減少（図４Ｅ）と並行して、同一の実験条件下で見られた（図４Ｄ）。これら全ての調節は、長期的なＴ細胞媒介式の抗腫瘍活性の増加に基づく。これらの全ての変化は、３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ及び３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯよりも３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０において高かった。
【０２５０】
興味深いことに、抗ＡＭＨＲＩＩ３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０抗体の存在下で、ＴＡＭ様＋腫瘍細胞の共培養を行い、その媒体において検出されたサイトカイン及びケモカインのプロファイルは、Ｔ細胞の導入に関与する２つの因子であるＣＸＣＬ９（図４Ｆ）及びＣＸＣＬ１０（図４Ｇ）の明らかな増加、及びマクロファージ導入に関与するＣＣＬ２の明らかな増加を明らかにし、一方、ＣＣＬ２の基底レベルは各ドナーにおいて異なった（図４Ｈ）。その上、Ｔ細胞がこの共培養物に添加された場合、２つの炎症促進性サイトカイン、ＩＬ６（図４Ｉ）及びＩＬ１ｂ（図４Ｊ）の増加、並びにＴ細胞浸潤に関連付けられた因子であるＣＣＬ５（図４Ｋ）の増加が３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０で検出され、また３Ｃ２３Ｋ−ＣＨＯ及び３Ｃ２３Ｋ−ＦｃＫＯよりも高かった。
【０２５１】
まとめると、これらの結果は、腫瘍細胞＋ＴＡＭ様マクロファージの共培養物への３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０の添加、次にＴ細胞の添加、すなわち腫瘍内の病理学的状況を模倣する条件、は、直接的な腫瘍細胞溶解及び抗腫瘍Ｔ細胞応答の活性化をもたらすことを示した。これら全ての観察所見は、試験された他の抗ＡＭＨＲＩＩ抗体よりも３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０において高かった。
【０２５２】
興味深いことに、３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０の好ましい効果は、ＴＭＡ様マクロファージを用いた条件に限定されない。腫瘍細胞及び抗体と共培養された非刺激の（ＮＳ：non-stimulated）マクロファージを用いた類似実験がまた、炎症促進因子、例えばＩＬ１２（図４Ｌ）、ＩＬ６（図４Ｍ）、及びＩＬ１ｂ（図４Ｎ）の増加を、腫瘤促進性及び血管新生促進性のサイトカインであるＩＬ２３の減少（図４Ｏ）と並行して示すことを可能にした。その上、ＴＡＭ様マクロファージについて上記したように、Ｔ細胞導入に関与する２つの抗血管新生ケモカインであるＣＸＣＬ９（図４Ｐ）及びＣＸＣＬ１０（図４Ｑ）の増加がまた観測された。これら全ての変化は、他の抗体よりも３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０低フコース抗体において有意であった。これらの結果は、３Ｃ２３Ｋ−ＹＢ２０が、未分化マクロファージを介して並びにＴＡＭ様マクロファージを介してＴ細胞抗腫瘍活性に影響を及ぼす可能性があることを強く示唆する。
【０２５３】
実施例７：糖鎖改変抗体を投与された癌患者の腫瘍組織中に存在するマクロファージの活性化
Ａ．材料及び方法
同じ組織切片における複数の標的を識別する為に、ＴＳＡに基づくマルチプレックス免疫蛍光検査法が、この試験で使用される。チラミドシグナル増幅法（ＴＳＡ：Tyramide  Signal  Amplification）は、誘導体化されたチラミドを使用する、特許取得済の触媒式レポーター沈着（ＣＡＲＤ：catalyzed  reporter  deposition）技術に基づく。少量の過酸化水素の存在下で、固定化ＨＲＰは、標識された基質（チラミド）を短命で極めて反応性の中間体に変換する。次に、活性化された基質分子は、隣接するタンパク質の電子の豊富な領域と非常に急速に反応し、そしてその領域と共有結合する。活性化されたチラミド分子のこの結合は、活性性ＨＲＰ酵素が結合する部位のすぐ隣でのみ生ずる。標識されたチラミドの複数の沈着が非常に短時間の（一般的に３〜１０分内）うちに生ずる。標識のその後の検出が、シグナルの効率的に大規模な増幅をもたらす。この技法の長所は、同じ種内で生成された複数の一次抗体が、同一の組織スライド上で検出可能である点である。ＴＳＡ−蛍光色素が析出した場合に、各反応が停止される。これは、５つの標的に達するまで反復可能である。本発明者等の研究室では、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＵＬＴＲＡ自動スライド染色装置が、該手順を自動化する為に利用可能である。この装置は、ＦＦＰＥ組織スライドの効率的で再現性のあるウォークアウェイ染色（walk-away  staining）を可能にする。
【０２５４】
マルチプレックスアプリケーションにおいて、下記の表５に開示されている下記の蛍光物質が使用される：
【０２５５】
【表５】
2020521780.tif 000008
【０２５６】
これらの蛍光物質、二次抗体システム、及び一次抗体は、アッセイ特異的試薬を表す。染色を行う為に使用される他の全ての付随的な試薬（前処理、洗浄、及び変性バッファー）は、汎用試薬とみなされる。アッセイの制限は、入手可能な且つ使用される画像化プラットフォームによって決定される。全てのスライド画像は、使用される蛍光物質（Ｒｈｏｄａｍｉｎ６Ｇ、ＲＥＤ６１０、ＤＣＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ５）を分離する為の好適なフィルターを備えた、３ＤＨｉｓｔｅｃｈ社製Ｐ２５０  Ｐａｎｏｒａｍｉｃスキャナーを使用して生成される。しかしながら、スペクトル特性のために、ＤＡＰＩ及びＤＣＣシグナルは、これまでに分離されることができない。従って、核の対比染色は除かれる。
【０２５７】
マルチプレックス免疫蛍光検査法の開発が、下記のマーカー／目的の為に必要とされる：
リンパ球の為の、サイトケラチン（ＣＫ）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦｏｘＰ３
マクロファージの為の、ＣＫ、ＣＤ１４、ＨＬＡＤＲ、ＣＤ２０６、及び／又はＣＤ１６３
樹状細胞、多形核細胞、ナチュラルキラー細胞の為の、ＣＫ、ＣＤ５６、ＣＤ１５、グランザイム、ＤＣランプ
免疫細胞に対するエフェクター細胞の為の、ＣＫ、ＣＤ４５、ＣＤ１６、ＣＤ３２、及びＣＤ６４。
【０２５８】
これら４つのマルチプレックスアッセイは、下記のラベル付で検証された：
１．抗ＣＤ３クローン２ＧＶ６、抗ＣＤ４クローンＳＰ３５、抗ＣＤ８クローンＣ８／１４４Ｂ、抗ＦｏｘＰ３クローンＤ２Ｗ８Ｅ、及び抗ＣＫクローンカクテルＡＥ１／ＡＥ３
２．抗ＣＤ１４クローンＥＰＲ３６５３、抗ＣＤ６８クローンＫＰ−１、抗ＣＤ１６３クローンＭＲＱ−２６、抗ＭＨＣ−ＩＩクローンＥＰＲ１１２２６、及び抗ＣＫクローンカクテルＡＥ１／ＡＥ３
３．抗ＣＤ１６クローンＳＰ１７５、ポリクロナール抗グランザイムＢ、抗ＣＤ８クローンＣ８／１４４Ｂ、及び抗ＮＫｐ４６
４．抗ＣＤ１５クローンＭＭＡ、抗ＣＤ６４クローン３Ｄ３、ポリクロナール抗ＣＤ２０６、及び抗ＬＡＭＰ３クローン１３Ａ２０５。
【０２５９】
Ｂ．結果
ＧＭ１０２の第Ｉ相試験の間、幾つかの細胞型の存在が、マルチプレックス蛍光染色法及びＦＦＰＥペア化及びベースライン卵巣癌生検分析法を使用して調査された。該マルチプレックス染色は、免疫浸潤物、及び単球／マクロファージ分化の評価、及び食細胞活性を対象とした。ベースラインサンプルが、ＧＭ１０２の７〜１５日前に生検採取され、そして第２の生検が、処置の１．５カ月後に行われた。
【０２６０】
２例のペアの生検のみが試験された為に、ＧＭ１０２処置の効果は、記述式で評価されたに過ぎず、観測された現象についての統計分析は行われなかった。最初のベースラインサンプルが、免疫浸潤物の存在の変化によって特徴付けられた。この試験の最も顕著な観察所見は、ＧＭ１０２の単球様ＣＤ１６＋細胞集団（ベースライン時にすでに豊富に存在した細胞型）に対する効果である（図５Ａ）。ＧＭ１０２処置の下では、ＣＤ１６＋染色エリアは、試験された患者において顕著に増加したが、しかしながら、それはＧＭ１０２処置した際に、ＣＤ１６＋細胞がＣＤ１６でチャージされたかのようなＣＤ１６＋細胞密度の増加によって反映されなかった。この観察所見は、ＣＤ１６＋細胞（エフェクター細胞（主にマクロファージ））の活性化がＧＭ１０２の抗腫瘍活性に関与したことを示唆する。
【０２６１】
更に、ＧＭ１０２処置の下でグランザイム（Granzyme）Ｂ発現の増加が観察された（図５Ｂ）。グランザイムＢは、特にＮＫ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞内に蓄えられた顆粒セリンプロテアーゼファミリーの２９ｋＤａメンバーである。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ：Cytolytic  T  lymphocytes）及びナチュラルキラー（ＮＫ：natural  killer）細胞は、特定の標的細胞を認識し、それと結合し、及びそれを溶解する能力を共有する。それらの細胞は、細胞内病原体による感染に起因する「非自己」抗原、通常ペプチド又はタンパク質、をその表面上に有する細胞を溶解することによって、その宿主を保護すると考えられている。グランザイムＢは、細胞媒介式の免疫応答において、ＣＴＬによる標的細胞アポトーシスを迅速に誘発する為に重要である（Rousalova  &  Krepela，2010年，Int．J.  Oncol．37：1361-1378；Vaskoboinik等，2015年，Nat．rev．Immunol．15：388-400）。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、腫瘍性のウィルス感染細胞の除去における主役である。しかしながら、これらの生検において、ナチュラルキラー細胞は、ＮＫｐ４６により可視化されるように、散発的に認められたに過ぎないＣＤ８＋リンパ球であった。この観察所見は、ＧＭ１０２の処置がＣＤ８＋Ｔリンパ球の細胞溶解活性を誘発した臨床サンプルにおいて確認された。
【０２６２】
実施例８：糖鎖改変抗体を投与された癌患者内のＮＫ細胞、単球、及びＩＣＯＳ＋Ｔ細胞の活性化
Ａ．材料及び方法
ＧＭ１０２の第Ｉ相試験において、４時点での５ｍＬの血液のサンプリングが、漸増コホートの各患者について計画された。該時点は、１日目の初回ＧＭ１０２注入の前（Ｃ１Ｊ１−ＳＯＩと命名される）、及び初回ＧＭ１０２注入終了時（Ｃ１Ｊ１−ＥＯ１と命名される）、１５日目の第２回ＧＭ１０２注入前（Ｃ１Ｊ１５−ＳＯＩ）、及び定常状態、すなわち５７日目の第２回２８日サイクルの終了時（Ｃ３Ｊ１−ＳＯＩ）である。
【０２６３】
科学的探索の目的の為に、幾つかの異なるマーカーが、本試験の各臨床現場でモニタリングされた。
【０２６４】
Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙでは、５人の患者が含まれた。ＬＩＯ（Laboratoire  d’Immunomonitoring  en  Oncologie）が、下記の表６に詳述されるように、合計１５のサンプルを受領した。
【０２６５】
【表６】
2020521780.tif 000009
【０２６６】
SOI（Start  Of  Infusion）：注入の開始；EOI（End  Of  Infusion）：注入の終了
*サンプルは、2017年2月9日にEOIにおいて採取され、そして翌日、ＬＩＯにて受領された。
**サンプルは、2017年5月29日にEOIにおいて採取され、そして翌日、ＬＩＯにて受領された。
【０２６７】
全ての受領サンプルが分析された。ＰＢＭＣが全てのサンプルから分離され、そして液体窒素タンク中のＧａｍａｍａｂｓ−ＧＭ１０２試験専用ボックス内に保管され、アクセスは承認された職員に限定された。使用された全ての材料が下記の表７、８、及び９に詳述されている：
【０２６８】
【表７】
2020521780.tif 000010
【０２６９】
【表８】
2020521780.tif 000011
【０２７０】
【表９】
2020521780.tif 000012
【０２７１】
ＰＢＭＣが、下記の手順に従って分離された：
１．  Ａｎｉｏｓを用いて血液チューブを拭き取ることによって、該血液チューブを殺菌する。
２．  １５ｍＬのフィコールを事前充填された５０ｍＬチューブを取り出し、３５ｍＬの希釈された血液を、フィコール上に混合しないようにゆっくりと積層する−２層は明確に分離されていること。（それ以外の体積の場合、希釈血液：フィコールの比を約２／３に維持する）。
３．  チューブを密閉し、４００ｇ、室温（ＲＴ）で２０分間、遠心分離する、ブレーキはＯＦＦ。
４．  無菌の単回使用の１０ｍＬピペットを使用して単核球層（リング）を回復させ、新しい５０ｍＬチューブに移す（任意的に：上部相は、リングを回復させる前に廃棄されることができる）。
５．  ＰＢＳを最大５０ｍＬ添加し、そして８００ＲＰＭ、１５℃で１５分間、遠心分離する。
６．  ピペットを使用して速やかに上清を取り出し、底部に至る前の３ｍＬで停止する。
７．  衝撃を与えてペレットを再懸濁する。
８．  ５０ｍｌのＰＢＳを残りの細胞ペレット上に添加し、混合して完全に再懸濁する。
９．  ３００ｇ、１５℃で１０分間遠心分離する。
１０．チューブを外して、１又は２ｍＬのＰＢＳを添加して細胞をカウントする。
【０２７２】
ＰＢＭＣは、下記の手順に従って保管された：
１．  ９６ウェルプレート内に９０μＬのＢｌｕｅ  Ｈａｙｅｍを配置し、１０μＬの予め再懸濁されたペレットを添加して、ＰＢＭＣのみをカウントする。
２．  ９６ウェルプレート内に９０μＬのＢｌｕｅ  Ｔｒｙｐａｎを配置し、１０μＬの予め再懸濁されたペレットを添加して、生存細胞のみをカウントする。
３．  Ｍａｌａｓｓｅｚのスライド上で細胞をカウントし、５〜１０百万個の生存細胞をハイクローン中で凍結する（１ｍＬ／クライオチューブ（cryotubes））。
４．  クライオチューブを「Ｍｒ  Ｆｒｅｅｚｅ」ボックス内に配置し、それを少なくとも２４時間、−８０℃に置いた後、それをＧａｍａｍａｂｓ−ＧＭ１０２のボックス内の窒素タンク中に移す。
【０２７３】
血液免疫表現型の決定が、下記の表１０〜表１７に記載されている下記の手順及びマーカーを用いてフローサイトメトリーによって行われた。
【０２７４】
【表１０】
2020521780.tif 000013
【０２７５】
【表１１】
2020521780.tif 000014
【０２７６】
【表１２】
2020521780.tif 000015
【０２７７】
【表１３】
2020521780.tif 000016
【０２７８】
【表１４】
2020521780.tif 000017
【０２７９】
【表１５】
2020521780.tif 000018
【０２８０】
【表１６】
2020521780.tif 000019
【０２８１】
【表１７】
2020521780.tif 000020
【０２８２】
Ｂ．結果
上記の各マーカーが、処置に沿って測定及び分析された。テストされた５人の患者において、循環細胞（Ｎｃｅｌｌ、単球、好中球、好酸球、及びＴ細胞ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、及びＴｒｅｇ）の主要な免疫集団について有意な変化は識別されなかった。
【０２８３】
幾つかのマーカーが、単球及びＮＫ細胞の活性化を示唆した。ＧＭ１０２の注入の間に減少した後、ＣＤ１６発現の有意な増加が、Ｃ１Ｊ１−ＥＯＩ〜Ｃ１Ｊ１５でＮＫ細胞で観察された（図：６Ａ）。統計的に有意でない増加傾向がまた、単球上でのＣＤ６９発現で観測された（図：６Ｂ）。その免疫調節的な役割は不明なままであるが、ＣＤ６９発現は、免疫細胞活性化後に増加することが知られている（Sancho等，2005年，Trends  in  Immunology，Vol．26(3)：137-140）。これらの増加は、単球及びＮＫ細胞の活性化の兆候として解釈されうる。
【０２８４】
興味深いことに、主要且つ有意な変化は、Ｃ１Ｊ１−ＥＯＩ〜Ｃ１Ｊ１５において、Ｔ細胞上でのＩＣＯＳ発現が増加したことであった（図：６Ｃ）。ＩＣＯＳは、Ｔ細胞の活性化に関与する受容体であり（Yao等，2013年，Nature  Reviews，Vol．12：130-146；Mahoney等，2015年，Nature  Reviews，Vol.14：561-584）、且つそれは、免疫学的チェックポイントの阻害剤である抗ＣＴＬＡ４抗体（イピリムマブ）の薬力学的マーカーとして知られている（Tang等，2013年，American  association  for  cancer  Research  Journal，Vol．1(4)：229-234）。それ故に、この増加は、ＧＭ１０２が免疫抑制を逆転させることができることを患者で確認する。
【０２８５】
実施例９：循環性単球に対するＧＭ１０２の効果
Ａ．材料及び方法
ＧＭ１０２の第Ｉ相試験において、４時点での５ｍＬの血液のサンプリングが、漸増コホートの各患者について計画された。該時点は、１日目の初回ＧＭ１０２注入の前（Ｃ１Ｊ１−ＳＯＩと命名される）、及び初回ＧＭ１０２注入終了時（Ｃ１Ｊ１−ＥＯ１と命名される）、１５日目の第２回ＧＭ１０２注入前（Ｃ１Ｊ１５−ＳＯＩ）、及び定常状態、すなわち５７日目の第２回２８日サイクルの終了時（Ｃ３Ｊ１−ＳＯＩ）である。
【０２８６】
科学的探索を目的の為に、幾つかの異なるマーカーが、本試験の各臨床現場でモニタリングされた。
【０２８７】
ヒトＰＢＭＣが、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｂｃｙｓ社）上で、密度勾配遠心分離法によって血液から分離された。リンパ球集団の浸潤及びその活性化について、ＰＢＭＣが下記の抗体で標識された：ＣＤ４５−ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＣＤ３−ＶｉｏＢｌｕｅ、ＣＤ４−ＡＰＣＶｉｏ７７０、ＣＤ８−ＰｅｒＣＰ、ＣＤ２５−ＰＥ、ＣＤ５６−ＡＰＣ、ＣＤ１９−ＰＥＶｉｏ７７０、及びＣＤ６９−ＦＩＴＣ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）。
【０２８８】
血中単球について、典型的、中間的、及び非典型的集団が、下記の抗体を用いて評価された：ＣＤ４５−ＶｉｏＧｒｅｅｎ、ＣＤ１６−ＰＥ、及びＣＤ１４−ＰｅｒＣＰＶｉｏ７００（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）。適切な蛍光色素適合アイソタイプ抗体が、非特異的なバックグラウンド染色を決定する為に使用された。全ての染色は、１００μＬのＰＢＳ−／−１％の熱失活されたウシ胎仔血清において行われた。１００００個の細胞の集団が、各データポイントについて分析された。全ての分析が、Ｄｉｖａソフトウェアを用いたＢＤ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターにおいて行われた。
【０２８９】
Ｂ．結果
３Ｃ２３Ｋの第１回注入前のＴ細胞、ＮＫ細胞、及び単球のパーセンテージ（％）は患者間で異なることがわかり、患者間の様々な免疫能力を示す。処置の期間中及びその後に、Ｔ細胞及びＮＫ細胞集団において顕著な変化は観察されなかった。対照的に、単球サブセットにおいて変化が観察された。
【０２９０】
ヒト血中単球は不均質であり、ＣＤ１４及びＣＤ１６発現に基づき慣用的に３つのサブセットに細分化される。《典型的単球》（ＣＤ１４高（high）ＣＤ１６−）は、健常ドナーの全単球の９０〜９５％を占める一方、《非典型的》（ＣＤ１４低（low）ＣＤ１６＋）、及び《中間的》（ＣＤ１４高（high）ＣＤ１６＋）集団が占める割合はそれよりも低い（５〜１０％）。
【０２９１】
卵巣腺癌の患者４人のうち３人において、該患者における「典型的単球」の割合が健康な患者と比較して、第１回注入前に大きく減少した（平均値＝３７．５％）。この現象は卵巣癌を有する患者において通常認められた。その結果、第１回注入前の中間的単球の割合は、健常ドナーと比較して、卵巣腺癌を有する患者において増加した（平均値＝４６．５％）。
【０２９２】
興味深いことに、図７における患者０４−０６において例示されているように、３Ｃ２３Ｋを用いた処置の間及びその後のパーセンテージ（％）尺度は、患者における中間的単球サブセットの割合の減少を伴う典型的単球サブセットの大幅な増加を明らかにした（平均値はそれぞれ５４．６％及び３０．５％）。単球サブセットのそのような変化はまた、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｂｏｒｄｅｔにおいて、同一のプロトコールに基づいて試験された４人の患者の血液サンプルにおいて観察された。これらの変化は、単球の表現型の改変の兆候である。免疫チェックポイント阻害剤に応じて、単球部分集団が変化し、リンパ球の活性化をもたらすこと（阻害性シグナルのブロックによる）（Krieg  C.，Nowicka  M.，Guglietta  S.，Schindler  S.，Hartmann  F．J.，Weber  L.．M等，(2018年).  High-dimensional  single-cell  analysis  predicts  response  to  anti-PD-1  immunotherapy．Nat  Med．24，144-153）が最近記載された。本発明者等のデータは、３Ｃ２３Ｋがまた、免疫チェックポイントに一切結合することなしに、単球サブセットの割合を改変することができ、従ってリンパ球を活性化させることができることを示す。
【０２９３】
【表１８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020521780.tif 000026
【図２Ａ】
2020521780.tif 000027
【図２Ｂ】
2020521780.tif 000028
【図３Ａ−１】
2020521780.tif 000029
【図３Ａ−２】
2020521780.tif 000030
【図３Ａ−３】
2020521780.tif 000031
【図３Ａ−４】
2020521780.tif 000032
【図３Ｂ−１】
2020521780.tif 000033
【図３Ｂ−２】
2020521780.tif 000034
【図３Ｃ−１】
2020521780.tif 000035
【図３Ｃ−２】
2020521780.tif 000036
【図３Ｃ−３】
2020521780.tif 000037
【図３Ｄ−１】
2020521780.tif 000038
【図３Ｄ−２】
2020521780.tif 000039
【図３Ｅ】
2020521780.tif 000040
【図３Ｆ】
2020521780.tif 000041
【図３Ｇ−１】
2020521780.tif 000042
【図３Ｇ−２】
2020521780.tif 000043
【図３Ｈ】
2020521780.tif 000044
【図３Ｉ】
2020521780.tif 000045
【図３Ｊ】
2020521780.tif 000046
【図３Ｋ】
2020521780.tif 000047
【図４Ａ】
2020521780.tif 000048
【図４Ｂ】
2020521780.tif 000049
【図４Ｃ】
2020521780.tif 000050
【図４Ｄ】
2020521780.tif 000051
【図４Ｅ】
2020521780.tif 000052
【図４Ｆ】
2020521780.tif 000053
【図４Ｇ】
2020521780.tif 000054
【図４Ｈ】
2020521780.tif 000055
【図４Ｉ】
2020521780.tif 000056
【図４Ｊ】
2020521780.tif 000057
【図４Ｋ】
2020521780.tif 000058
【図４Ｌ】
2020521780.tif 000059
【図４Ｍ】
2020521780.tif 000060
【図４Ｎ】
2020521780.tif 000061
【図４Ｏ】
2020521780.tif 000062
【図４Ｐ】
2020521780.tif 000063
【図４Ｑ】
2020521780.tif 000064
【図５Ａ】
2020521780.tif 000065
【図５Ｂ】
2020521780.tif 000066
【図６Ａ】
2020521780.tif 000067
【図６Ｂ】
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【図７】
2020521780.tif 000069
【配列表】
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【国際調査報告】
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