(57)【要約】  本発明は、同じＴＮＦＲの細胞外部分に特異的に結合するタンパク質リガンド（ＰＬ）を１２個またはより多く含む腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体に関する。好ましくは、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分に結合する。好ましくは、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、２つ以上の重合ドメイン（ＰＤ）をさらに含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体であって、同じＴＮＦＲ、好ましくはＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合する１２個またはより多くのタンパク質リガンド（ＰＬ）を含む、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項２】
１２〜１８個、好ましくは１２個のＰＬを含む、請求項１に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項３】
２〜６個、好ましくは３個のＰＬが、以下の構造：
ＰＬ１−Ｌ１−ＰＬ２−Ｌ１−ＰＬ３−Ｌ１−ＰＬ４−Ｌ１−ＰＬ５−Ｌ１−ＰＬ６
を持つタンパク質リガンド群（ＰＬＧ）を形成し、
式中、ＰＬ４〜ＰＬ６のいずれかおよび／またはＬ１は、存在していなくてもよいし、または存在していてもよく、Ｌ１は、各場合で独立に、ペプチドリンカーを意味する、請求項１または２に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項４】
２〜６個のＰＬＧを含み、各ＰＬＧが２〜６個のＰＬを含む、請求項３に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項５】
前記ＰＬＧが、ペプチドリンカー２（Ｌ２）を介して互いに連結されて、ＰＬＧ多量体を形成する、請求項３または４に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項６】
２つ以上の重合ドメイン（ＰＤ）をさらに含み、好ましくは、該ＰＤが、適宜ペプチドリンカー３（Ｌ３）を介して、該ＰＤのＮ末端および／またはＣ末端でそれぞれＰＬＧまたはＰＬＧ多量体に連結されている、請求項３から５のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項７】
前記ＰＤが、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインからなる群から選択され、好ましくは、
（ｉ）二量体化ドメインが、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ロイシンジッパーモチーフ、バルナーゼ−バルスター二量体、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体からなる群から選択され；
（ｉｉ）三量体化ドメインが、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子およびＴｒｉＢｉ−ミニボディからなる群から選択され；または
（ｉｉｉ）四量体化ドメインが、ｐ５３の四量体化ドメイン、ジェネラルコントロールタンパク質４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、直列型ダイアボディおよびジダイアボディからなる群から選択される、請求項６に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項８】
各ＰＬが、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメイン、骨格−タンパク質およびペプチド模倣体からなる群から互いに独立に選択され、好ましくは前記ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質が、ＴＮＦ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬまたはＴＮＦＳＦ１０、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、ＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＥＤＡ；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＣＤ１５３（ＴＮＦＳＦ８）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、ＶＥＧＩ（ＴＮＦＳＦ１５）およびＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項９】
前記ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質が、ＴＮＦまたはＬＴＡであり、好ましくは前記ＴＮＦが、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ１４６Ｈ、Ｅ１４６Ｋ  Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｑ８８Ｎ／Ｔ８９Ｓ／Ａ１４５Ｓ／Ｅ１４６Ａ／Ｓ１４７Ｄ、Ｑ８８Ｎ／Ａ１４５Ｉ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｓ１４７Ｄ、Ｌ２９Ｖ／Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｎ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｑ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｋ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｔ、Ａ１４５Ｒ／Ｅ１４６Ｔ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｒ／／Ｓ１４７Ｔ、Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ｅ１４６Ｎ／Ｓ１４７、Ｋ６５Ｗ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｗ、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｖ、Ｄ１４３Ｖ／Ｆ１４４Ｌ／Ａ１４５Ｓ、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、Ｄ１４３Ｖ／Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＦおよびＡ１４５Ｗからなる群から選択される１つ以上のＴＮＦＲ２特異的突然変異を含む配列番号４３に記載の配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項１０】
前記Ｃ末端コンセンサス配列
−Ｓ／Ｔ／Ｖ−Ｆ／Ｙ／Ｓ−Ｆ−Ｇ−Ａ／Ｌ／Ｖ／Ｉ−Ｘ１（配列番号１）
で定義される前記第１のＴＨＤの前記Ｃ末端がそれぞれ、前記Ｎ末端コンセンサス配列
Ｘ２−Ｖ／Ａ／Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｙ（配列番号２）、
または
Ｘ３−Ｖ／Ｗ／Ｆ／Ｃ−Ａ／Ｌ−Ｅ／Ｙ／Ｑ／Ｈ−Ｌ（配列番号３）
で定義される前記第２のＴＨＤの前記Ｎ末端に、２〜２０アミノ酸、好ましくは２〜１５アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、最も好ましくは３〜５アミノ酸の長さを有するＬ１を介して連結され；
（式中、Ｘ１が、無極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｉ、ＬおよびＹからなる群から選択され；
Ｘ２が、Ｐ、Ｋ、Ｖ、ＩおよびＡからなる群から選択され；
Ｘ３が、Ｄ、Ｓ、ＭおよびＩからなる群から選択される）；
前記第１および第２のＴＨＤと同じ方法で互いにそれぞれ連続的に連結されたさらなるＴＨＤを１〜４個さらに含んでもよい、請求項８または９に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体またはそれに含まれるＰＬＧをコードする核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１３】
医薬としての使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体、請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体または請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターを活性薬剤として含む医薬組成物。
【請求項１５】
高増殖性障害もしくは炎症性障害、好ましくはがん、または血液学系の悪性病変、自己免疫性障害および神経変性疾患の診断、予防または処置における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体または請求項１１に記載の核酸または請求項１２に記載のベクターまたは請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、同じＴＮＦＲの細胞外部分に特異的に結合するタンパク質リガンド（ＰＬ）を１２個またはより多く含む腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体に関する。好ましくは、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、ＴＮＦＲ２の細胞外部分に結合する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＮＦＲスーパーファミリー（ＴＮＦＲ−ＳＦ）は、２７個ある公知のサイトカイン受容体のタンパク質スーパーファミリーである。ＴＮＦＲは、三量体Ｉ型膜貫通タンパク質として一般に発現される。一般的な特徴として、それらは、細胞外ドメイン内にシステインの豊富なドメイン（ＣＤＲ）を最高６個含有する。
【０００３】
生物学的機能は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドの結合およびＴＮＦＲの活性化によって発揮される。ＴＮＦスーパーファミリーは、その全てが細胞外ＴＮＦ相同ドメイン（ＴＨＤ）を共有する公知の１９個のリガンドから構成される。ＴＨＤは、非共有結合性ホモ三量体の形成を誘発する。ホモ三量体構造は、活性形態を表し、ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーに共通して保存されている。ＴＮＦリガンドは、ＩＩ型膜貫通タンパク質として一般に発現され、そのため大部分のリガンドにおいて細胞外ドメインは、可溶性リガンドへのタンパク質分解性切断に供され（subject）得る。
【０００４】
ＴＮＦリガンドならびにＴＮＦＲは、潜在的に危険および不要な細胞において細胞死の選択的誘導または共刺激シグナルの供給など多様な生物学的プロセスに関係し、それにより有効な免疫応答を引き起こす。免疫におけるこれらの多様で重要な調節上の役割のため、これらはＴＮＦＲ標的免疫治療法の開発における大きな対象となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、ＴＮＦＲの活性を効果的に調整することができるタンパク質複合体を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第１の態様において、本発明は、同じＴＮＦＲ、好ましくはＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合するタンパク質リガンド（ＰＬ）を１２個またはより多く含む、１２価の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体を提供する。
【０００７】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１の態様によるタンパク質複合体もしくはＰＬＧ（タンパク質リガンド群）をコードしている核酸分子を提供し、または本発明の第１の態様によるタンパク質複合体に含まれるＰＬＧを提供する。
【０００８】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様による核酸分子を含むベクターを提供する。
【０００９】
第４の態様において、本発明は、医薬として使用する、本発明の第１の態様による複合体、本発明の第２の態様による核酸分子および本発明の第３の態様によるベクターを提供する。
【００１０】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様による複合体または本発明の第２の態様による核酸分子または本発明の第３の態様によるベクターを活性薬剤として含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
第６の態様において、本発明は、高増殖性障害または炎症性障害または退行性障害の診断、予防または処置に使用するための本発明の第１の態様による複合体または本発明の第２の態様による核酸分子または本発明の第５の態様による医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１：本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の概略図。（ａ）リンカーＬ１を介して接続されて３価構造を形成する３つのＰＬ（ＰＬ１からＰＬ３）を含むタンパク質リガンドグループ（ＰＬＧ）；（ｂ）リンカーＬ２を介して接続された（ａ）の４つの３価ＰＬＧ（ＰＬＧ１からＰＬＧ４）を含む１２価複合体；（ｃ）（ａ）の４つの３価ＰＬＧ（２×ＰＬＧ１および２×ＰＬＧ２）および２つの二量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、ＰＬＧ１は、リンカーＬ３を介して各々の二量体化ドメインのＮ末端に融合し、ＰＬＧ２は、リンカーＬ４を介して各々の二量体化ドメインのＣ末端に融合する；（ｄ）（ａ）の４つのＰＬＧ（２×ＰＬＧ１および２×ＰＬＧ２）および２つの二量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、ＰＬＧ１およびＰＬＧ２は、リンカーＬ２を介して接続され、各ＰＬＧ２は、リンカーＬ３を介して各々の二量体化ドメインのＮ末端に融合する；（ｅ）（ａ）の４つのＰＬＧ（２×ＰＬＧ１および２×ＰＬＧ２）および２つの二量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、ＰＬＧ１およびＰＬＧ２は、リンカーＬ２を介して接続され、各ＰＬＧ２は、リンカーＬ３を介して各々の二量体化ドメインのＣ末端に融合する；（ｆ）４つの３価ＰＬＧ（４×ＰＬＧ１）および４つの四量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価（dodedecavalent）複合体、ここで、各ＰＬＧ１は、リンカーＬ３を介して各々の二量体化ドメインのＣ末端に融合する；（ｇ）４つの３価ＰＬＧ（４×ＰＬＧ１）および４つの四量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、各ＰＬＧ１は、リンカーＬ３を介して各々の二量体化ドメインのＮ末端に融合する；（ｈ）（ａ）の６つの３価ＰＬＧ（３×ＰＬＧ１および３×ＰＬＧ２）および３つの三量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１８価複合体、ここで、ＰＬＧ１は、リンカーＬ３を介して各々の三量体化ドメインのＮ末端に融合し、ＰＬＧ２は、リンカーＬ４を介して各々の三量体化ドメインのＣ末端に融合する。
【図２】図２：ＰＬとしてヒトＴＮＦ（Ａ）およびマウスＴＮＦ（Ｂ）を含むＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の概略図。（ａ）リンカーＬ１によって接続された３つのＰＬを含む３価タンパク質リガンドグループ（ＰＬＧ）；ＰＬは、ＴＮＦＲ２結合突然変異体（一本鎖ＴＮＦ（ｓｃＴＮＦＲ２（ヒト）およびｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス））のヒトＴＮＦ（Ａ）ではＤ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、マウスＴＮＦ（Ｂ）では（Ｄ２２１Ｎ／Ａ２２３Ｒ））である；（ｂ）（ａ）の２つの３価ＰＬＧ、およびＩｇＥ  ＣＨ２からの２つの二量体化ドメインＥＨＤ２で構成されるオリゴマー化された６価複合体、ここで、各々の３価ＰＬＧは、二量体化ドメイン（ＥＨＤ２−ｓｃ−ＴＮＦＲ２（ヒト）およびＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス））のＣ末端に融合される；（ｃ）（ａ）の４つの３価ＰＬＧおよびｐ５３からの４つの四量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、各々の３価ＰＬＧは、四量体化ドメイン（ｐ５３−ｓｃ−ＴＮＦＲ２（ヒト）およびｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス））のＣ末端に融合する；（ｄ）（ａ）の４つの３価ＰＬＧおよびＧＣＮ４からの４つの四量体化ドメインで構成されるオリゴマー化された１２価複合体、ここで、各々の３価ＰＬＧは、四量体化ドメイン（ＧＣＮ４−ｓｃ−ＴＮＦＲ２（ヒト）、ＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス））のＣ末端に融合する；
【図３】図３：ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞で産生され、アフィニティクロマトグラフィー、続くサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された。還元条件（２−メルカプトエタノールの存在下、＋２−ＭＥ）および非還元条件（２−メルカプトエタノールの非存在下、−２−ＭＥ）でのクーマシー染色（Ａ、Ｃ）および免疫ブロット染色（Ｂ、Ｄ）によるマウスタンパク質由来（Ａ、Ｂ）およびヒトタンパク質由来（Ｃ、Ｄ）の複合体の分析。
【図４】図４：ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の天然の構造。ＢｉｏＳｅｐ−Ｓｅｃ−２０００カラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーによって分析された複合体。使用された標準タンパク質の位置を示す。
【図５】図５：ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の特異的結合。ＥＬＩＳＡで決定した場合の、組換えマウスＴＮＦ（ｒｍＴＮＦ）およびマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体（Ａ、Ｂ）、ならびに組換えヒトＴＮＦ（ｒｈＴＮＦ）およびヒトＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体（Ｃ、Ｄ）のマウスＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Ａ）、ヒトＴＮＦＲ１−Ｆｃ（Ｃ）、マウスＴＮＦＲ２−Ｆｃ（Ｂ）、およびｈｕＴＮＦＲ２−Ｆｃ（Ｄ）への結合（ｎ＝３；±ＳＥＭ）。
【図６】図６：ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の親和性比較分析。マウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体のヒトＴＮＦＲ２への結合は、固定化されたヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃの高密度（Ａ；２７０Ｈｚ）および低密度（Ｂ；１３０Ｈｚ）でＱＣＭにより分析された。タンパク質は、各々の濃度について３回、３７℃で１〜３２ｎＭ（Ａ）または８〜２５６ｎＭ（Ｂ）の濃度で分析された（破線＝測定データ、実線＝適合曲線）。
【図７】図７：ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体によるＴＮＦＲ１の活性化の欠如。（Ａ）ＨｅＬａ細胞を異なる濃度またはｒｍＴＮＦ、ならびにマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体とともにインキュベートした。ＥＬＩＳＡを使用して、上清をＩＬ−６の存在について分析した（ｎ＝３；±ＳＥＭ）。（Ｂ）アクチノマイシンＤの存在下で、様々な濃度のｒｍＴＮＦならびにマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体とともにインキュベートしたＬ９２９細胞。細胞生存率は、クリスタルバイオレットアッセイにより決定された（ｎ＝３；±ＳＥＭ）。
【図８】図８：ＴＮＦＲ２誘導性細胞死。（Ａ）マウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体、および（Ｂ）ヒトＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体で刺激されたＫｙｍ−１細胞。細胞生存率は、クリスタルバイオレットアッセイによって決定された（ｎ＝３；±ＳＥＭ）。
【図９】図９：ＴＮＦＲ２誘導性細胞増殖。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離された初代胸腺細胞を様々な濃度のマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体とともに抗ＣＤ３被覆プレート上でインキュベートした。細胞数は、ＭＴＴアッセイによって決定された（ｎ＝５；±ＳＥＭ）。
【図１０】図１０：ＴＮＦＲ２誘導性Ｃｘｃｌ−２分泌。ＢＶ−２細胞をマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体とともに２４時間インキュベートした。次に、上清を採取し、分泌されたＣｘｃｌ−２の存在についてＥＬＩＳＡにより分析した（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【図１１】図１１：ＴＮＦＲ２誘導性ＴＮＦ／ＴＮＦＲ２クラスター形成。（Ａ）ＢＶ−２細胞を様々な濃度（０．１、０．３、１．０ｎＭ）でマウス由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体とともに１５分間インキュベートした。次に、細胞を固定し、ＴＮＦＲ２（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６）およびオリゴマー化ＴＮＦムテイン（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）の局在を免疫蛍光顕微鏡で視覚化した。ＴＮＦ／ＴＮＦＲ２クラスターは、細胞内の大きなドットとして視覚化される。ＤＡＰＩを使用して、細胞核を対比染色した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｄｉｓｃ顕微鏡を使用して、蛍光を分析した。１ｎＭのオリゴマー化ＴＮＦムテインによる刺激の代表的な写真を示す。（Ｂ）ＴＮＦ／ＴＮＦＲ２クラスタリングの定量化（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【図１２】図１２：ＴＮＦＲ２誘導性Ｔ細胞活性化。（Ａ）ヒトＰＢＭＣから単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、プレートに結合させた抗ＣＤ３抗体を使用して活性化され、ＩＬ−２およびマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の存在下でインキュベートされた。ＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲの発現は、フローサイトメトリーにより決定された。代表的なドナーを示す。組み合わせたデータは、３つの独立した実験からのものである（ｎ＝３±ＳＥＭ）。（Ｂ）ＣＤ３＋Ｔ細胞は、磁気分離によりマウス脾細胞から単離された。Ｔ細胞をプレートに結合させた抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）を使用して活性化し、インターロイキン２（ＩＬ−２）および０．３ｎＭのマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の存在下で４日間培養した。活性化されたＣＤ２５＋ＴＮＦＲ２＋Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって決定した。代表的なドナーを示す。組み合わせたデータは、３つの独立した実験からのものである（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【図１３】図１３：ＴｒｅｇのＴＮＦＲ２誘導性拡大。磁気分離によりマウス脾細胞から単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、プレートに結合させた抗ＣＤ３（５μｇ／ｍｌ）を使用して活性化され、ＩＬ−２および０．３ｎＭのマウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の存在下で４日間培養された。ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数をフローサイトメトリーによって決定した。代表的なドナーを示す。組み合わせたデータは、３つの独立した実験からのものである（ｎ＝３±ＳＥＭ）。
【図１４】図１４：インビボ（in vivo）でのＴｒｅｇのＴＮＦＲ２誘導性拡大。マウスＴＮＦ由来ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体（１ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７ＢＬ／６マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により投与した。４日目に注射を反復した。７日目に、脾臓細胞を単離し、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの数をフローサイトメトリーにより決定した（Ａ）。示された試薬の注射の２４時間および７２時間後に処置動物から血液を採取し、ＣＲＰ血清レベルをＥＬＩＳＡにより決定した（Ｂ）。
【図１５】図１５：二量体化ドメインとしてのＦｃまたはＶＡＳＰの四量体化ドメインに連結されたｓｃＴＮＦＲ２を含む１２価ＴＮＦＲ結合複合体。（Ａ）ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２（図１ｃによる）およびＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２（図１ｆによる）は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞で産生され、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ  ＩＭＡＣにより精製され、Ｔｏｓｏｈ  ＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ  ７．８×３００ｍｍカラム上のサイズ排除クロマトグラフィーにより天然緩衝条件下で分析された。球状標準タンパク質の保持時間は点線で示される。（Ｂ）複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いて還元条件（＋２−ＭＥ）および非還元条件（−２−ＭＥ）下でクーマシー染色を行った。（Ｃ）Ｋｙｍ−１細胞を１２価ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２、１２価ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２で刺激し、６価ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２と比較した。細胞生存率は、インキュベーションの１６時間後にクリスタルバイオレットアッセイによって決定された（ｎ＝３±ＳＤ）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明について以下で詳細に記述する前に、本明細書に記述される特定の方法、プロトコールおよび試薬は変更される可能性があるので、本発明はそれらに限定されないことを理解すべきである。本明細書に使用される用語は、特定の実施形態のみを記述することを目的とし、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることになる本発明の範囲を限定しないことも理解されるべきである。別段の規定がない限り、本明細書に使用される技術および科学用語の全ては、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１４】
好ましくは、本明細書に使用される用語は、「生物工学用語の多国語用語集：（IUPAC Recommendations）」、Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995)、Helvetica Chimica Acta、CH-4010 Basel、Switzerlandに記載の通り定義される。
【００１５】
いくつかの文書が、本明細書の本文の全体を通じて引用される。本明細書に引用される文書のそれぞれは（特許、特許出願、科学出版物、製造業者の仕様書、説明書、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号配列寄託、等の全てを含む）、前後を問わずその全体を参照により本明細書に組み込む。本明細書における何ものも、本発明が、先行発明によってそのような開示に先行する権利を持たないということの容認と解釈されるべきでない。
【００１６】
定義
本明細書の文脈に使用される用語「タンパク質」とは、二次および三次構造を回復する１つ以上のポリペプチドを含む分子のことを指し、さらにいくつかのポリペプチド、すなわちいくつかのサブユニットで構成されて、四次構造を形成するタンパク質のことを指す。タンパク質は、１つ以上の修飾、好ましくは翻訳後修飾をさらに含んでもよい。これらの修飾は、官能基の付加、化学修飾または構造的変化を含んでもよい。付加的な官能基には、脂質基、アシル基、グリコシド基などがあり得る。アミノ酸の化学修飾は、アルギニンからシトルリンの転換、グルタミンからグルタミン酸またはアスパラギンからアスパラギン酸の転換などでもよい。アミノ酸の構造的変化は、ジスルフィド架橋の形成、タンパク質分解性切断、ラセミ化、タンパク質スプライシングなどでもよい。
【００１７】
本明細書に使用される用語「タンパク質複合体」とは、２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質を、好ましくはヘッドトゥーテール、すなわちＮ末端をＣ末端もしくはその逆に共有結合的に結びつけることよって作製されるタンパク質コンストラクトのことを指し、元のタンパク質から得られる機能特性を持つ融合タンパク質を得る。本発明によると、用語「複合体」は、融合タンパク質の多量体、例えば二量体、三量体または四量体複合体も包含し、その融合タンパク質を本明細書において「サブユニット」と称する。好ましくは、タンパク質複合体のサブユニットは、非共有結合的に、または例えばジスルフィド結合を介して共有結合的に結合する。
【００１８】
本発明の文脈で言及される用語「Ｃ末端」（別名カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端尾部、Ｃ末端終端またはＣＯＯＨ末端）は、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終端であり、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって停止される。タンパク質は、メッセンジャーＲＮＡから翻訳される際、Ｎ末端からＣ末端に作製される。用語「Ｎ末端」（別名アミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ末端終端またはアミン末端）とは、遊離アミン基（−ＮＨ２）を持つアミノ酸によって停止されるタンパク質またはポリペプチドの出発点のことを指す。ペプチド配列を書く慣例は、左にＮ末端を置き、Ｎ末端からＣ末端へ配列を書くことになっている。
【００１９】
本発明の文脈において「ペプチドリンカー」とは、複合体の２つのパーツもしくは部分、例えば２つのペプチドまたはタンパク質を立体的に分離するアミノ酸配列のことを指す。一般に、そのようなリンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０アミノ酸の最小の長さおよび少なくとも１００、９５、９０、８５、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６もしくは１５またはより少ないアミノ酸の最大の長さを有する１〜１００アミノ酸からなる。本発明によるペプチドリンカーの指示される好ましい最小および最大長は組み合わせられてもよく、そのような組合せが、数学的意義をもたらす場合、例えば、そのようなリンカーは、１〜１５、６〜３０、１２〜４０、もしくは２５〜７５もしくは１〜１００アミノ酸からなり得る。ペプチドリンカーは、共に連結される２つのタンパク質の間の柔軟性も提供し得る。アミノ酸が小さい場合、そのような柔軟性は一般に増大される。したがって、柔軟性があるペプチドリンカーは、小さいアミノ酸、特にグリシンおよび／もしくはアラニンならびに／またはセリン、トレオニン、アスパラギンおよびグルタミンなどの親水性アミノ酸の含有量が増大している。好ましくは、ペプチドリンカーの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％より多く、またはより多くのアミノ酸が、小さいアミノ酸である。
【００２０】
本明細書内で使用される用語「コンセンサス配列」とは、２つ以上の配列の配列整列化において各位置に見出されるヌクレオチドまたはアミノ酸いずれかの最も高頻度の残基の算出された順序のことを指す。それは、関連する配列が互いに比較される複数配列整列化の結果を表し、類似の配列モチーフが算出される。保存配列モチーフは、コンセンサス配列として表され、その配列は、同一アミノ酸、すなわち比較した配列の間で同一のアミノ酸、保存アミノ酸、すなわち比較したアミノ酸配列間で変動するが、全てのアミノ酸が特定の官能または構造基、例えば極性もしくは中性のアミノ酸に属するアミノ酸、および様々なアミノ酸、すなわち比較した配列の間で明らかな関連を示さないアミノ酸を示す。
【００２１】
ＴＨＤのＣ末端およびＮ末端のコンセンサス配列は、それぞれＴＮＦ−リガンドファミリーメンバー配列内に位置する配列であり、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーの間で特に保存されている。これらの配列は、ＴＮＦ−リガンドの三量体化および対応する受容体との相互作用に関与するＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーの部分を正確に記述している。したがって、２つのコンセンサス配列は、所与のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバー内のＣ末端およびＮ末端参照点としての機能を果たし、そのコンセンサス配列は、他のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーに存在しない場合がある追加のＮ末端またはＣ末端アミノ酸を含んでもよい。したがって、コンセンサス配列を使用することにより、異なるＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーの、本発明のポリペプチドに存在するＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーの断片のＮ末端およびＣ末端終端と同じ領域を、特定の位置を参照することなく指すことが可能になる。異なるＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーのＮ末端コンセンサス配列の前にある異なる長さのＮ末端アミノ酸が、それぞれのＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーのＴＨＤの絶対位置から独立しているＣ末端およびＮ末端参照点の定義を必要とすることは、当業者にとって直ちに明らかである。
【００２２】
本明細書に使用される用語「重合ドメイン」または「ＰＤ」とは、タンパク質もしくはポリペプチド、タンパク質もしくはポリペプチドの断片もしくは部分のことを指し、これらは本発明の２つ以上の同一もしくは異なるタンパク質またはポリペプチド分子（単量体）間の近接性を媒介し、したがって、タンパク質−タンパク質相互作用を可能にし、その相互作用は、非共有結合または共有結合性結合によって結びつけられる２、３、４個それぞれ、もしくは構造的により類似のもしくは異なる単量体の二、三もしくは四量体化を可能にする。重合は、共有結合的または非共有結合的に結合している、タンパク質などの巨大分子２つ以上によって形成される巨大分子複合体の形成をもたらす。
【００２３】
本明細書に使用される用語「ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質のＴＮＦ相同ドメイン」または「ＴＨＤ」とは、全ての腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、かつてＴＮＦαまたはＴＮＦアルファとして公知であった）リガンドファミリーメンバーに共有されるタンパク質ドメインのことを指す。相同性は、共通の祖先からの進化系統を意味する。相同ドメインは、所与のタンパク質配列の保存部分であり、残りのタンパク質鎖とはそれぞれ独立に進化し、機能し、存在し得る（３次）構造である。その構造は、特定のタンパク質ファミリーのメンバー全てに共有される構造的な特徴である。各ドメインは、小さい３次元構造を形成し、しばしばそれぞれ独立に安定であり、フォールドされ、生物学的活性に極めて重要であり得る。
【００２４】
本発明の意味においてＴＨＤのＣ末端は、Ｃ末端コンセンサス配列：−Ｓ／Ｔ／Ｖ−Ｆ／Ｙ／Ｓ−Ｆ−Ｇ−Ａ／Ｌ／Ｖ／Ｉ−Ｘ１（配列番号１）によって定義され、Ｎ末端は、２つのＮ末端コンセンサス配列：Ｘ２−Ｖ／Ａ／Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｙ（配列番号２）またはＸ３−Ｖ／Ｗ／Ｆ／Ｃ−Ａ／Ｌ−Ｅ／Ｙ／Ｑ／Ｈ−Ｌ（配列番号３）のうちの１つによって定義され、Ｘ１は、無極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｉ、ＬおよびＹからなる群から選択され；Ｘ２は、Ｐ、Ｋ、Ｖ、ＩおよびＡからなる群から選択され；Ｘ３は、Ｄ、Ｓ、ＭおよびＩからなる群から選択される。
【００２５】
所与のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質配列に基づいてならびに上で定義されたＣ末端およびＮ末端相同配列を使用して、当業者は、所与のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質についてＴＨＤを決定することができる。ＴＮＦファミリーのメンバーに共通して、個々のＴＨＤの位置および長さはかなり変動するが、適切なソフトウェアツール（Bodmer et al.、2002）を使用する複数配列整列化によって同定される保存アミノ酸残基の存在によって定義され得る。より重要なことに、結晶構造から、例えば、ＴＮＦファミリーリガンドのホモ三量体化に関係するアミノ酸残基間の固有の相互作用が明らかになり得る。この種の情報は、Bodmer et al.、2002に記載の通りＴＮＦスーパーファミリーの所与のメンバーのＴＨＤを改良するのに役立ち得る。
【００２６】
さらに、操作されたタンパク質変異型のタンパク質可溶性または受容体結合および活性化などの生物活性のような機能的態様は、個々のＴＨＤの不可欠なアミノ酸残基または最小の長さに関する重要なヒントを提供し得る。用語ＴＨＤは、天然に存在するＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質配列およびその変異型に基づくポリペプチドを含み、そのポリペプチドはそれぞれのＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーの受容体に特異的に結合する能力を保持する。好ましくはそのようなＴＨＤ変異型は、野生型ＴＨＤの少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％および最も好ましくは少なくとも９９％の親和性を有する。
【００２７】
ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、例えばプログラム細胞死（アポトーシス）、分化、細胞生存および免疫調節を起こし得る多機能サイトカインの一群を含む。ＴＮＦは、例えば腫瘍退縮、炎症、感染性ショックおよび悪液質に関係したサイトカインであり、特異的受容体によって認識される。体内のいくつかの細胞は、ＴＮＦの産生が可能であり、単球がＴＮＦの主たる供給源である。１９個のタンパク質が、配列、機能および構造的類似性に基づいてＴＮＦ−リガンドファミリーの一部として同定されてきた。これらサイトカインの全てが、それらの特異的受容体によって認識されるホモ三量体（またはＬＴ−アルファ／ベータの場合はヘテロ三量体）複合体を形成すると思われる。
【００２８】
以下のタンパク質は、ＴＮＦリガンドスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のメンバーである：ＴＮＦ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ；ＴＮＦＳＦ１０）、アポトーシス誘導サイトカイン；ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５＝腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー５）、Ｂ細胞発生および活性化に重要になると思われるサイトカイン；ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、共刺激されたＴ細胞の増殖を誘導し、細胞溶解性Ｔ細胞の生成を増強するＴ細胞活性化に役割を果たすサイトカイン；ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、Ｔ細胞の増殖を誘導するサイトカイン；ＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）、細胞死に関係する細胞表面タンパク質；４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、Ｔ細胞刺激に寄与する誘導可能なＴ細胞表面分子；ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生を共刺激する細胞表面タンパク質。ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーのさらなるメンバーは、ＥＤＡ；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）；ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）；ＣＤ１５３（ＴＮＦＳＦ８）；ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１）；ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）；ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）；ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）；ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）；ＶＥＧＩ（ＴＮＦＳＦ１５）；ＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）を含む。
【００２９】
ＴＮＦ−リガンドスーパーファミリーメンバーの配列に関するより多くの情報は、例えばＧｅｎｂａｎｋなど公的に利用可能なデータベースから得られてもよい。ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーは、その同種の受容体と相互作用する、例えばＴＮＦとＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２、ＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）およびＯＰＧ。リガンドは、オリゴマー形成およびそれぞれの受容体の活性化を媒介する。ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーとリガンドとの相互作用は、ＴＮＦの生物学的に活性な形態であるＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質ホモ三量体のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質単量体の３つのうち２つとＴＮＦ−リガンドファミリーの他のメンバーの間の空間における受容体の結合によって特徴付けられる。
【００３０】
用語「六量体」または「６価」は、６つのＴＨＤを持つＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーを定義する。用語「十二量体」または「１２価」は、１２個のＴＨＤを持つＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーを定義する。
【００３１】
本明細書の文脈で使用される用語「ペプチド模倣体」とは、抗原を特異的に結合でき、抗体と類似しているが、抗体と構造的に関係のない化合物のことを指す。通常、ペプチド模倣体は、抗原に特異的に結合する曝露されているドメインを１つ、２つまたはより多く含む約３〜２０ｋＤａのモル量を持つ人工ペプチドまたはタンパク質である。例には、とりわけＬＡＣＩ−Ｄ１（リポタンパク質関連凝固阻害因子）；アフィリン、例えばヒトγＢクリスタリン（crystalline）またはヒトユビキチン；シスタチン；スルホロブスアシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）由来Ｓａｃ７Ｄ；リポカリンに由来するリポカリンおよびアンチカリン；ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリン反復ドメイン）；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメイン；モノボディ、例えば第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン；アドネクチン：ノッチン（システインノットミニタンパク質）；アトリマー；エビボディ、例えばＣＴＬＡ４に基づく結合剤；アフィボディ、例えばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来プロテインＡのＺ−ドメインの３重ヘリックスバンドル；トランスボディ、例えばヒトトランスフェリン；テトラネクチン、例えば単量体または三量体ヒトＣ型レクチンドメイン；ミクロボディ、例えばトリプシン阻害因子ＩＩ；アフィリン；アルマジロ反復タンパク質がある。核酸および小分子は、（アプタマー）同様に熟慮されたペプチド模倣体である場合もあるが、人工抗体、抗体断片およびこれらから構成される融合タンパク質ではない。抗体に勝る一般的な利点は、より優れた可溶性、組織透過性、熱および酵素に対する安定性ならびに比較的低い生産費用である。
【００３２】
本明細書では、用語「変異型」は、長さもしくは配列における１つ以上の変化によって、それが得られるポリヌクレオチドまたはタンパク質と比較して異なるポリヌクレオチドまたはタンパク質と理解されるべきである。タンパク質または核酸変異型が得られるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親もしくは親ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドとしても公知である。用語「変異型」は、親分子の「断片」または「誘導体」を含む。一般に、「断片」は、長さまたはサイズにおいて親分子より小さく、「誘導体」は、親分子と比較して配列中に１つ以上の差異を呈する。限定されないが翻訳後修飾タンパク質（例えばグリコシル化、ビオチン化、リン酸化、ユビキチン化、パルミトイル化またはタンパク質分解性切断されたタンパク質）およびメチル化ＤＮＡなどの修飾核酸のような修飾分子も包含される。限定されないが、ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドのような異なる分子の混合物も「変異型」という用語に包含される。一般に、変異型は、好ましくは遺伝子技術的手段によって人工的に構築され、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、野生型タンパク質またはポリヌクレオチドである。しかしながら、天然に存在する変異型も、本明細書に使用される用語「変異型」に包含されると理解されるべきである。さらに、本発明に使用可能な変異型は、変異型が親分子の生物学的活性の少なくとも１つを呈する、すなわち機能的に活性があるならば、親分子のホモログ、オルソログもしくはパラログ、または人工的に構築された変異型から得られてもよい。
【００３３】
ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の交換、挿入、欠失、５’もしくは３’短縮、Ｎ末端もしくはＣ末端短縮、またはこれら変化の任意の組合せであってもよく、その変化は１つまたはいくつかの部位で起こってもよい。好ましい実施形態において、本発明に使用可能な変異型は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中に総数で最高２００個（最高１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０または２００個）の変化（すなわち交換、挿入、欠失および／または短縮）を呈する。アミノ酸交換は、保存的および／または非保存的でもよい。これとは別にまたは追加的に、本明細書に使用される「変異型」は、それが得られる親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドに対するある程度の配列同一性によって特徴付けられ得る。より正確には、本発明の文脈においてタンパク質変異型は、その親ポリペプチドに対して少なくとも７０％配列同一性を呈する。本発明の文脈においてポリヌクレオチド変異型は、その親ポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％配列同一性を呈する。好ましくは、タンパク質変異型の配列同一性は、２０、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００個またはより多くのアミノ酸の連続的な区間に及ぶ。好ましくは、ポリヌクレオチド変異型の配列同一性は、６０、９０、１２０、１３５、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００個またはより多くのヌクレオチドの連続的な区間に及ぶ。
【００３４】
用語「少なくとも７０％配列同一性」は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの配列比較に関して本明細書の全体を通じて使用される。この表現は、それぞれの参照ポリペプチド配列またはそれぞれの参照ポリヌクレオチド配列に対する少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性のことを好ましくは指す。
【００３５】
２つの配列が比較され、参照配列が、配列同一性パーセンテージが算出されるべき配列との比較において指定されていない場合、別途特に指示されなければ、配列同一性は、比較しようとする２つの配列のうちより長い方を参照して算出されるべきである。参照配列が指示される場合、別途特に指示されなければ、配列同一性は、配列番号によって具体的に指示される参照配列の完全長に基づいて決定される。例えば、ＩｇＧ分子のアミノ酸配列と比較して、３５８アミノ酸からなるペプチド配列は、８０．０９％（３５８／４４７）の最大配列同一性パーセンテージを呈することができ、一方２２４アミノ酸の長さの配列は、５０．１１％（２２４／４４７）の最大配列同一性パーセンテージを呈することができる。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは、配列整列化によって決定することができる。そのような整列化は、当業者に公知のいくつかのアルゴリズム、好ましくはKarlin and Altschul（Karlin & Altschul（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877）の数学的アルゴリズム、ｈｍｍａｌｉｇｎ（HMMER package、http://hmmer.wustl.edu/）、または例えばhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/もしくはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html、もしくはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.html上で入手可能なＣＬＵＳＴＡＬアルゴリズム（Thompson et al.（1994）Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）で実施することができる。使用される好ましいパラメータは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlにおいて設定される初期設定パラメータである。配列同一性の程度（配列一致）は、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＴまたはＢｌａｓｔＺ（またはＢｌａｓｔＸ）を使用して算出されてもよい。類似のアルゴリズムが、Altschul et al.（1990）J. Mol. Biol. 215:403-410のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴＮプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行される。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行される。比較目的のギャップあり整列化を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Altschul et al.（1997）Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載の通り活用される。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合、それぞれのプログラムの初期設定パラメータが使用される。配列一致分析は、Ｓｈｕｆｆｌｅ−ＬＡＧＡＮ（Brudno M.（2003b）Bioinformatics 19 Suppl 1:I54-I62）またはマルコフ確率場のような確立されている相同性マッピング技術によって補足されてもよい。配列同一性のパーセンテージが本出願において規定されている場合、別途特に指示されなければ、これらのパーセンテージは、より長い配列の完全長に対して算出される。「ハイブリダイゼーション」は、２つの核酸配列間の配列同一性または相同性の尺度として使用され得る。Ｆ、ＮもしくはＭ２−１またはこれらのいずれかの部分をコードしている核酸配列は、標準的なハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。ハイブリダイゼーション条件は当業技術者に公知であり、例えば、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N. Y.、6.3.1-6.3.6、1991に見出すことができる。「中等度のハイブリダイゼーション条件」は、２×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で３０℃のハイブリダイゼーション、その後に１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で５０℃の洗浄に相当すると定義される。「高度に厳しい条件」は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で４５℃のハイブリダイゼーション、その後に０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃の洗浄に相当すると定義される。
【００３６】
本明細書に使用される用語「核酸」は、生物の公知の形態の全てに必須であるポリマーもしくはオリゴマー巨大分子、または大きい生体分子を含む。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）を含めた核酸は、ヌクレオチドとして公知の単量体から作られる。最も天然に存在するＤＮＡ分子は、互いの周りに巻きついて二重らせんを形成する２本の相補的バイオポリマー鎖からなる。ＤＮＡ鎖は、ヌクレオチドからなるポリヌクレオチドとしても公知である。各ヌクレオチドは、含窒素核酸塩基ならびにデオキシリボースまたはリボースと呼ばれる単糖類糖およびリン酸基で構成される。天然に存在する核酸塩基は、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはシトシン（Ｃ）を含む。ヌクレオチドは、あるヌクレオチドの糖と次のヌクレオチドのリン酸の間の共有結合によって鎖内で互いに結びつけられており、糖−リン酸交互の骨格を生じる。糖がデオキシリボースである場合、ポリマーはＤＮＡである。糖がリボースである場合、ポリマーはＲＮＡである。
【００３７】
一般に、ポリヌクレオチドは、個々のヌクレオチド単量体間のホスホジエステル結合によって形成される。本発明の文脈において、用語「核酸」は、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、および例えばＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド（１つの鎖内）などそれらの混合物、ならびにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えＤＮＡ、ｃＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むが、これに限定されない。核酸は、遺伝子全体またはその部分からなってもよく、核酸は、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｐｉＲＮＡでもよい。
【００３８】
本明細書に使用される用語「ベクター」は、発現コンストラクトとも呼ばれ、通常は細胞内でのタンパク質発現用に設計されたプラスミドまたはウイルスである。ベクターは、標的細胞に特定の遺伝子を導入するために使用され、細胞の機序を使用してタンパク質合成し、それにより遺伝子にコードされているタンパク質を産生することができる。発現ベクターは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用し、発現ベクターに保有される遺伝子の効果的な転写を導く調節配列を含有するように操作される。うまく設計された発現ベクターの目標は、著しい量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、したがってタンパク質の産生である。適切なベクターの例には、それだけには限らないが、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体がある。一般的に使用される発現ベクターの例は、ｐＧＥＸ−４Ｔ２である。
【００３９】
本出願に使用される用語「医薬組成物」とは、組織状況もしくは疾患の同定、防止もしくは処置に使用される物質および／または物質の組合せのことを指す。医薬組成物は、疾患を防止および／または処置するために患者への投与に適するよう製剤化される。さらに、医薬組成物とは、活性薬剤と不活性または活性担体との組合せのことを指し、治療上の使用に適した組成物にされる。医薬組成物は、化学および物理的特性によって経口、非経口、局所、吸入、直腸、舌下、経皮、皮下または経腟適用経路用として製剤化され得る。医薬組成物は、固形、半固形、液体、経皮治療システム（ＴＴＳ）を含む。固形組成物は、錠剤、コーティングされた錠剤、散剤、粒剤、ペレット剤、カプセル剤、沸騰錠または経皮治療システムからなる群から選択される。液剤、シロップ剤、注入剤、抽出液、静脈適用用液剤、注入用液剤または本発明の搬送系の液剤からなる群から選択される液体組成物も含まれる。本発明の文脈に使用され得る半固形組成物は、乳剤、懸濁剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、滴剤、口腔錠および坐剤を含む。
【００４０】
用語「活性薬剤」とは、生物学的に活性である、すなわち医薬品の価値をもたらす医薬組成物または製剤中の物質のことを指す。医薬組成物は、１つ以上の活性薬剤を含んでもよく、その薬剤は、互いに組み合わさってまたは独立して作用し得る。活性薬剤は、中性または塩形態として製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから得られるような、遊離アミノ基と形成される塩、およびそれだけには限らないがナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインから得られるような、遊離カルボキシ基と形成される塩、等がある。
【００４１】
用語「疾患」および「障害」は、本明細書において互換的に使用され、異常な状態、特に疾病または傷害などの異常な病状のことを指し、細胞、組織、器官または個体は、その機能を効率的に果たすことがもはやできない。必ずしもそうではないが、疾患は、そのような疾患の存在を示す特定の症状または徴候と一般に関連付けられる。そのような症状または徴候の存在は、したがって疾患を患っている細胞、組織、器官もしくは個体の指標となり得る。これらの症状または徴候の変質は、そのような疾患の進行の指標となり得る。疾患の進行は、疾患の「悪化」または「改善」を示し得る症状もしくは徴候の増大もしくは減少によって一般に特徴付けられる。疾患の「悪化」は、細胞、組織、器官または個体／患者がその機能を効率的に果たす能力の減少によって特徴付けられ、一方疾患の「改善」は、細胞、組織、器官または個体／患者がその機能を効率的に果たす能力の増大によって一般に特徴付けられる。
【００４２】
本出願に使用される用語「高増殖性障害」とは、細胞の細胞分裂が、正常組織に対して増大される障害のことを指す。そのような障害は、異常な増殖（産生）、すなわち細胞の過剰産生によって特徴付けられる。高増殖性障害は、腫瘍疾患を含む。腫瘍疾患は、良性または悪性腫瘍を含み得、悪性腫瘍疾患は、がんと呼ばれる。用語高増殖性障害は、がんおよび前癌性障害を含む。がんは、間葉性起源、すなわち結合組織（肉腫）、および上皮組織（癌腫）の増殖性障害を含む。肉腫の一般的な例は、骨肉腫、軟骨性肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、血管肉腫および線維肉腫ならびに消化管の肉腫（ＧＩＳＴ）である。癌腫の例は、皮膚、精巣、肝臓、食道、胃、膵臓および結腸などの消化管、鼻咽頭、膀胱、頸部、卵巣、尿道、膀胱；前立腺ならびに他の尿生殖器癌腫、肺、腎臓、甲状腺および下垂体などの内分泌組織、奇形癌、脳の癌腫の癌腫である。血液学系の悪性病変は、リンパ腫または白血病に分類される。炎症は、腫瘍周辺の微環境を統合し、がん細胞の増殖、生存および遊走に寄与し、したがって悪性疾患を潜在的に促進する。
【００４３】
炎症は、原則的には免疫細胞、血管およびたくさんの分子メディエータを含む保護免疫脈管（immunovascular）応答である。炎症の目的は、細胞傷害の初期原因を排除し、壊死細胞ならびに元となる損傷および炎症過程からダメージを受けた組織を消去し、組織修復を開始することである。本発明の文脈に使用される用語「炎症性障害」とは、生理的炎症応答が、身体にとって潜在的に有害な効果に変わる状況のことを指す。正常組織にダメージを引き起こす炎症性障害は、それだけには限らないが自己免疫不全および神経変性疾患を含む。
【００４４】
本発明に使用される用語「神経変性障害」は、ニューロンの死を含めたニューロンの構造および機能の進行性消失を含む障害に関する。神経変性疾患は、神経変性過程の結果として一般に起こる。神経変性疾患は、運動（運動失調）または精神機能化（認知症）の問題を引き起こす。
【００４５】
本発明に使用される用語「感染性疾患」は、ウイルス、ウイロイド、プリオン、細菌、寄生性回虫および蟯虫などの線虫、チック、ダニ、ノミおよびシラミなどの節足動物、白癬などの真菌、ならびに条虫など他の大寄生虫および他の蠕虫を含めた感染因子によって引き起こされる障害に関する。哺乳動物宿主は、炎症に一般に関係する生得的応答によって感染に反応する。疾患は、宿主の保護免疫機序が損なわれ、生物が、宿主にダメージを与える場合に生じ得る。微生物および寄生虫は、様々な毒素または破壊酵素を放出することによって組織ダメージを引き起こし得る。
【００４６】
実施形態
以下の節において、本発明の異なる態様が、より詳細に定義される。そのように定義される各態様は、それとは反対に明らかに指示されない限り、他の任意の態様（単数）または態様（複数）と組み合わせられてもよい。特に、好ましいもしくは有利であると示される任意の特色が、好ましいもしくは有利であると示される他の任意の特色（単数）または特色（複数）と組み合わせられてもよい。本発明に至る働きにおいて、本発明の複合体が、ＴＮＦＲの活性化に優れた活性を示すことが驚くべきことに示された。
【００４７】
これらの結果に基づいて、本発明は、第１の態様において、同じＴＮＦＲの細胞外部分に特異的に結合する１２個またはより多く、好ましくは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０個のタンパク質リガンド（ＰＬ）を含む腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体に関する。好ましくは、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体はＴＮＦＲ２に特異的に結合する。したがって、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の全てのＰＬが、ＴＮＦＲ２に特異的に結合することが好ましい。
【００４８】
本発明者らは、少なくとも１２個のＰＬを含む安定なＴＮＦＲ結合タンパク質複合体を成功裏に構築した。加えて、本発明者らは、驚いたことに、６個のＰＬを含む複合体と比較した場合に、１２個またはより多くのＰＬを含む複合体が、特異的結合の増大を示し、それにより６価ＰＬと比較して最大で＞１０倍高い特定の生物活性を発揮する有効なＴＮＦＲアゴニストであることを発見した。
【００４９】
治療的に効果的にするには非常に強力な化合物が必要である。これは、例えば神経変性疾患に特にふさわしいものであり、中枢神経系（ＣＮＳ）において作用する必要がある神経保護化合物であった。脳および脊髄からの血流を分離する堅固な障壁である血液脳関門は、ＣＮＳへの治療薬の輸送を限定する。ＣＮＳに運搬される薬物量が限定されるため、ニューロンまたは神経膠細胞に対して直接有益な効果を持つＴＮＦＲ２アゴニストなどの神経保護化合物は、治療効果を発揮するために非常に強力である必要がある。これは、本発明の複合体によって有望に達成され得る。
【００５０】
前述の通り、活性部位／結合部位は、ＴＮＦＲおよび対応するＴＮＦリガンドに共通して保存されている。したがって、同じＴＮＦＲの細胞外部分に特異的に結合する少なくとも１２個のＰＬを組み合わせる原則が、ＴＮＦリガンドファミリーの任意のメンバーに適用されてもよく、それから高いアゴニスト活性を持つ安定なリガンド複合体が得られてもよい。
【００５１】
本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、１２〜３０個、好ましくは１２〜１８個、より好ましくは１２〜１５個のＰＬを含むことが好ましい。本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、１５個のＰＬを含むことがより好ましい。本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、１２個のＰＬを含むことが特に好ましい。
【００５２】
本発明によるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体のＰＬは、互いに独立に選択されてもよく；例えば１２〜３０個、好ましくは１２〜１８個のＰＬは、同じ結合特異性を有する、すなわち同じ標的に結合してもよく、好ましくは同一であり、または異なっていてもよい。そうでない場合、全１２〜３０個、好ましくは１２〜１８個、より好ましくは１２〜１５個のＰＬ、最も好ましい１２個のＰＬは、同じ結合特異性を有し、好ましくは同一であることが特に好ましい。ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体が、ＴＮＦＲ２に特異的に結合する場合、その複合体は１２〜３０個、好ましくは１２〜１８個、より好ましくは１２〜１５個のＰＬ有してもよく、最も好ましい１２個のＰＬはＴＮＦＲ２結合特異性を有し、より好ましくは同一のＰＬである。
【００５３】
結合特異性がＴＮＦＲ２に向けられない場合、本発明によるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は１５個より多くのＰＬを含むことが好ましい。好ましくは１５〜３０個、好ましくは１５〜２４個、より好ましくは１５〜１８個のＰＬ。全てのＰＬが、同じ結合特異性を有することも好ましく、より好ましくは同一である。
【００５４】
言い換えれば、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体のＰＬは、非相同物でもよくまたは相同物でもよい。好ましくは、本発明のＴＮＦＲ結合複合体のＰＬは、相同物である。
【００５５】
本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体において、２〜６つのＰＬは、構造：
ＰＬ１−Ｌ１−ＰＬ２−Ｌ１−ＰＬ３−Ｌ１−ＰＬ４−Ｌ１−ＰＬ５−Ｌ１−ＰＬ６
を持つタンパク質リガンド群（ＰＬＧ）を形成することがさらに好ましく、ＰＬ４〜ＰＬ６、および／またはＬ１のいずれかは、存在しないもしくは存在してもよく、好ましくは、ＰＬ４〜ＰＬ６は存在せず、ＰＬ１とＰＬ２およびＰＬ２とＰＬ３の間に２つのＬ１がそれぞれ存在し；各場合においてＬ１は、ペプチドリンカーをそれぞれ独立に意味する。
【００５６】
３つのＰＬがＰＬＧを形成することが好ましい。本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体において、３つのＰＬは、構造：
ＰＬ１−Ｌ１−ＰＬ２−Ｌ１−ＰＬ３
を持つＰＬＧを形成することが特に好ましい。
【００５７】
本発明のタンパク質複合体のＰＬの総数が、１２個またはより多いという条件下で、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、２〜６つのＰＬＧを含み、各ＰＬＧが、２〜６つのＰＬを含むことがさらに好ましい。
【００５８】
ＰＬおよび本発明の複合体のリンカーＬ１は、共有結合によって接続されることが好ましい。
【００５９】
本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、４〜６つのＰＬＧを含み、各ＰＬＧが、３つのＰＬを含むことがより好ましい。本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、４または６つのＰＬＧを含み、各ＰＬＧが、３つのＰＬを含むことがさらにより好ましい。
【００６０】
本発明のＴＮＦＲ結合複合体において、ＰＬＧがペプチドリンカー２（Ｌ２）によって互いに連結されてＰＬＧ多量体を形成することがさらに好ましい。
【００６１】
本発明のＴＮＦＲ結合複合体において、２つのＰＬＧがペプチドリンカーＬ２によって互いに連結されて、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２
を形成することが好ましく、好ましくはＰＬＧ１およびＰＬＧ２は、３つのＰＬによってそれぞれ形成される。
【００６２】
本発明のＴＮＦＲ結合複合体において、３つのＰＬＧがペプチドリンカーＬ２によって互いに連結されて、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ２−ＰＬＧ３
を形成することが好ましく、ＰＬＧ１〜ＰＬＧ３は、３つのＰＬによってそれぞれ形成される。
【００６３】
本発明のＴＮＦＲ結合複合体において、４つのＰＬＧがペプチドリンカーＬ２によって互いに連結されて、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ２−ＰＬＧ３−Ｌ２−ＰＬＧ４
を形成することが好ましく、好ましくは、ＰＬＧ１〜ＰＬＧ４は３つのＰＬによってそれぞれ形成される。
【００６４】
ＰＬＧおよび本発明の複合体のリンカーＬ２は、共有結合によって接続されることが好ましい。
【００６５】
本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、２つ以上の重合ドメイン（ＰＤ）をさらに含むことが好ましい。
【００６６】
好ましくは、２、３、４つまたはより多くのＰＤのそれぞれが、そのＮ末端および／もしくはＣ末端を介してＰＬＧもしくはＰＬＧ多量体に連結され、ペプチドリンカー３（Ｌ３）によってもよい。それによって、本発明の複合体の２、３、４つまたはより多くのサブユニットが形成される。言い換えれば、各ＰＤに対して、本発明の複合体のサブユニットが形成される。異なるサブユニットのＰＬＧは、好ましくは互いに連結されておらず、特に共有結合で連結されていないことに留意されたい。
【００６７】
好ましくは、本発明の複合体のサブユニットは、構造：
ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ１、
または
ＰＬＧ１−Ｌ３−ＰＤ
を有してもよく、好ましくは、ＰＬＧ１は、３つのＰＬによって形成される。
【００６８】
好ましくは、本発明の複合体のサブユニットは、構造：
ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２、
または
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ３−ＰＤ
を有してもよく、好ましくはＰＬＧ１およびＰＬＧ２は、３つのＰＬによってそれぞれ形成される。
【００６９】
好ましくは、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体において、２、３、４つまたはより多くのＰＤが、２つのＰＬＧ間にそれぞれ挿入される。より好ましくは、２、３、４つまたはより多くのＰＤが、２つのＰＬＧ間にそれぞれ挿入され、ペプチドリンカーＬ３によってＰＧＬに連結される。好ましくは、ペプチドＬ３によって２つのＰＬＧ間に挿入されたＰＤを含む本発明の複合体のサブユニットは、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ３−ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ２
または
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ３−ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ３−Ｌ２−ＰＬＧ４
のうち一方を有してもよく、好ましくはＰＬＧ１、ＰＬＧ２、ＰＬＧ３およびＰＬＧ４は、３つのＰＬによってそれぞれ形成される。
【００７０】
より好ましくは、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体において、２、３、４つまたはより多くのＰＤが、それぞれペプチドリンカーＬ３およびＬ４を介して２つのＰＬＧ間にそれぞれ挿入される。好ましくは、Ｌ３およびＬ４は同一でない。好ましくは、Ｌ３およびＬ４は、同一である。
【００７１】
好ましくは、サブユニットにおいて２つのＰＬＧ間に挿入されたＰＤは、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ３−ＰＤ−Ｌ４−ＰＬＧ２、
または
ＰＬＧ１−Ｌ４−ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ２
のうち一方を有してもよく、好ましくはＰＬＧ１およびＰＬＧ２は、３つのＰＬによってそれぞれ形成され、好ましくはＬ３およびＬ４は同一でない。
【００７２】
好ましくは、サブユニットにおいて２つのＰＬＧ間に挿入されたＰＤは、構造：
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ３−ＰＤ−Ｌ４−ＰＬＧ３−Ｌ２−ＰＬＧ４、
または
ＰＬＧ１−Ｌ２−ＰＬＧ２−Ｌ４−ＰＤ−Ｌ３−ＰＬＧ３−Ｌ２−ＰＬＧ４
のうち一方を有してもよく、好ましくはＰＬＧ１、ＰＬＧ２、ＰＬＧ３およびＰＬＧ４は、３つのＰＬによってそれぞれ形成され、好ましくはＬ３およびＬ４は同一でない。
【００７３】
ＰＬＧおよびＰＤは、共有結合によって、本発明の複合体のリンカーＬ３およびＬ４で接続されることが好ましい。
【００７４】
好ましくは、ＰＤは、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインからなる群から選択される。本発明の複合体が２つ以上のＰＤを含む場合、ＰＬの総数は１２個またはより多いと理解される。
【００７５】
好ましくは、二量体化ドメインは、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ロイシンジッパーモチーフ、バルナーゼ−バルスター二量体、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体からなる群から選択される。好ましくは、二量体化ドメインは、ＥＨＤ２または免疫グロブリンＦｃ領域からなる群から選択される。好ましくは、二量体化ドメインは、ＥＨＤ２である。好ましくは、二量体化ドメインは、免疫グロブリンＦｃ領域である。免疫グロブリンＦｃ領域は、二量体形態で天然に存在するＩｇＧ抗体の定常部分であり、２つのジスルフィド結合によって共有結合的に安定化され、タンパク質の二量体化に使用され得る。この機能において、Ｆｃは、野生型形態、好ましくはＡＤＣＣ／ＣＤＣ（抗体依存性細胞介在性細胞傷害／補体依存性細胞傷害）機能性が無効化された突然変異体形態のいずれかで存在し得る。
【００７６】
好ましくは、三量体化ドメインは、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子およびＴｒｉＢｉ−ミニボディからなる群から選択される。好ましくは、三量体化ドメインは、Ｆａｂ３様分子である。
【００７７】
好ましくは、四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメイン、ジェネラルコントロールタンパク質４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、アクチン調節タンパク質のｅｎａ／ＶＡＳＰ（有効／血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）（enabled/vasodilator-stimulated phosphoprotein）ファミリーまたはそれから得られる合成変異型の四量体化ドメイン、直列型ダイアボディおよびジダイアボディからなる群から選択される。好ましくは、四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメイン、ジェネラルコントロールタンパク質４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメインまたはｅｎａ／ＶＡＳＰの四量体化ドメインからなる群から選択される。好ましくは、四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメインおよびジェネラルコントロールタンパク質４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメインからなる群から選択される。好ましくは、四量体化ドメインは、ｐ５３の四量体化ドメインである。好ましくは、四量体化ドメインは、ジェネラルコントロールタンパク質４（ＧＣＮ４）の四量体化ドメインである。好ましくは、四量体化ドメインは、ｅｎａ／ＶＡＳＰの四量体化ドメインである。
【００７８】
好ましくは、各二量体化ドメインおよび三量体化ドメインは、別のＰＤ中の少なくとも１つのアミノ酸残基と共有結合を形成可能な少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくはＣｙｓ残基を含む。
【００７９】
本発明のペプチドリンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ４は、好ましくはグリシン（Ｇ）の豊富なペプチドリンカーであり、すなわち５０％より高い；例えば少なくとも６０〜８０％、例えば約７５％の高グリシン含有量を持つアミノ酸配列である。ペプチドリンカー中に存在し得る他のアミノ酸は、例えばセリン残基、あまり好ましくないがアラニン残基またはグルタミン残基である。
【００８０】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ、互いに独立に選択されてもよく；例えば、２つ以上のリンカーＬ１は、同一の配列を有してもまたは異なる配列（配列長および／または配列アミノ酸の点で）を有してもよく、２つ以上のリンカーＬ２は、同一の配列を有してもまたは異なる配列（配列長および／または配列アミノ酸の点で）を有してもよい、等。しかしながら、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３またはＬ４は、それぞれ同一であることが好ましい。
【００８１】
Ｌ１は、２〜２０アミノ酸、好ましくは２〜１５アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、最も好ましくは３〜５アミノ酸の長さを有する。Ｌ１は、（ＧＧＳ）ｐ、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＳＧＧ）ｍからなる群から選択される１つ以上の反復単位を含んでもよく、ｐは、１〜６の整数であり、ｎは、１〜５の整数であり、ｍは、１〜４の整数である。Ｌ１は、配列番号４〜２０からなる群から選択されてもよい。好ましいリンカーＬ１は、配列番号１５を有する。
【００８２】
Ｌ２は、４〜３２アミノ酸、好ましくは８〜２８アミノ酸の長さを有する。Ｌ２は、（ＧＧＳ）ｐ、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＳＧＧ）ｍからなる群から選択される１つ以上の反復単位を含んでもよく、ｐは、１〜１０の整数であり、ｎは、１〜８の整数であり、ｍは、１〜６の整数である。特に好ましいリンカーＬ２は、配列番号２１〜４１からなる群から選択される。
【００８３】
Ｌ３は、４〜３２アミノ酸、好ましくは８〜２８アミノ酸の長さを有する。Ｌ３は、少なくとも１つのグリコシル化モチーフを含んでもよく、好ましくは少なくとも１つのモチーフは、グリコシル化されている。Ｌ３は、（ＧＧＳ）ｐ、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＳＧＧ）ｍからなる群から選択される１つ以上の反復単位を含んでもよく、ｐは、１〜１０の整数であり、ｎは、１〜８の整数であり、ｍは、１〜６の整数である。特に好ましいリンカーＬ３は、配列番号２１〜４１からなる群から選択される。
【００８４】
Ｌ４は、４〜３２アミノ酸、好ましくは８〜２８アミノ酸の長さを有する。Ｌ４は、少なくとも１つのグリコシル化モチーフを含んでもよく、好ましくは少なくとも１つのモチーフは、グリコシル化されている。好ましくは、Ｌ４は、（ＧＧＳ）ｐ、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＳＧＧ）ｍからなる群から選択される１つ以上の反復単位を含んでもよく、ｐは、１〜１０の整数であり、ｎは、１〜８の整数であり、ｍは、１〜６の整数である。特に好ましいリンカーＬ４は、配列番号２１〜４１からなる群から選択される。
【００８５】
実施形態において、本発明の複合体はＬ３およびＬ４を含み、Ｌ３およびＬ４は配列長および配列アミノ酸の点で同一でないことが好ましい。
【００８６】
好ましくは、各ＰＬは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメイン、骨格−タンパク質およびペプチド模倣体からなる群から互いに独立に選択され、好ましくは、ＴＮＦ相同ドメインは、ヒトＴＮＦ相同ドメインである。好ましくは、ＰＬは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメインであり、好ましくは、ＴＮＦ相同ドメインは、ヒトＴＮＦ相同ドメインである。好ましくは、各ＰＬは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメインである。好ましくは、各ＰＬは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメインであり、ＴＮＦ相同ドメインは、ヒトＴＮＦ相同ドメインである。
【００８７】
好ましくは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、ＴＮＦ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬまたはＴＮＦＳＦ１０、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、ＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＥＤＡ；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＣＤ１５３（ＴＮＦＳＦ８）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、ＶＥＧＩ（ＴＮＦＳＦ１５）およびＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）からなる群から選択される。好ましくは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、ＬＴ、ＴＮＦまたはＴＲＡＩＬからなる群から選択される。より好ましくは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、ＴＮＦまたはＬＴＡである。
【００８８】
好ましくは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、下の表１に示す配列番号４２〜７９による配列のうちの１つまたはその機能的変異型からなる。好ましくは、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質は、配列番号４２〜４８、５０〜５４および５６〜７９のヒト配列による配列のうちの１つおよびその機能的変異型からなる。変異型は、天然もしくはその人工バリエーションまたは他の種由来のそれぞれのオルソログを含む。チンパンジー、マウス、ラット、ブタ、等など他の哺乳動物種由来のオルソログが好ましい。
【００８９】
表１:考え得る成分A
【表１−１】
2020516251.tif 000002
【表１−２】
2020516251.tif 000003
【表１−３】
2020516251.tif 000004
【表１−４】
2020516251.tif 000005
【００９０】
ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバーは、その同種の受容体と相互作用する、例えばＴＮＦとＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２、ＴＲＡＩＬとＴＲＡＩＬＲ１（ＤＲ４）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＤＲ５）、ＴＲＡＩＬＲ３（ＤｃＲ１）、ＴＲＡＩＬＲ４（ＤｃＲ２）およびＯＰＧ、等。リガンドは、オリゴマー形成およびそれぞれの受容体の活性化を媒介する。ＴＮＦ受容体ファミリーのメンバーとリガンドとの相互作用は、ＴＮＦの生物学的に活性な形態であるＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質ホモ三量体のＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質単量体の３つのうち２つとＴＮＦ−リガンドファミリーの他のメンバーの間の空間における受容体の結合によって特徴付けられる。
【００９１】
したがって、ＴＮＦＲは、腫瘍壊死因子受容体１（１Ａ）、腫瘍壊死因子受容体２（１Ｂ）、リンホトキシンベータ受容体（３）、ＯＸ４０（４）、ＣＤ４０（５）、Ｆａｓ受容体（６）、デコイ受容体３（６Ｂ）、ＣＤ２７（７）、ＣＤ３０（８）、４−１ＢＢ（９）、死受容体４（１０Ａ）、死受容体５（１０Ｂ）、デコイ受容体１（１０Ｃ）、デコイ受容体２（１０Ｄ）、ＲＡＮＫ（１１Ａ）、オステオプロテゲリン（１１Ｂ）、ＴＷＥＡＫ受容体（１２Ａ）、ＴＡＣＩ（１３Ｂ）、ＢＡＦＦ受容体（１３Ｃ）、ヘルペスウイルス侵入メディエータ（１４）、神経成長因子受容体（１６）、Ｂ細胞成熟抗原（１７）、糖質コルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連（１８）、ＴＲＯＹ（１９）、死受容体６（２１）、死受容体３（２５）、エクトジスプラシンＡ２受容体（２７）からなる群から選択される。好ましくは、ＴＮＦＲはＴＮＦＲ２である。
【００９２】
治療標的としてのＴＮＦＲ２の適合性について、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方制御することによって免疫系を調整し、自己抗原に対する寛容を維持し、自己免疫性疾患を無効化するＴリンパ球のサブセットである。Ｔｒｅｇの抑制活性の増強は、移植、アレルギー、喘息、感染性疾患、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）および自己免疫において多様な臨床応用を有すると考えられる。
【００９３】
Ｔｒｅｇは、ＴＮＦＲ２を高レベルで発現し、ＴＮＦＲ２の発現は、非常に強力な抑制活性を持つＴｒｅｇの固有のサブタイプを定義する。ＴＮＦＲ２は、Ｔｒｅｇ活性を維持するのに必要でないと思われるが、最近の結果は、ＴＮＦＲ２がＴｒｅｇの活性化を媒介し、Ｔｒｅｇの拡大および安定化に機能的役割を果たすことを示唆している。
【００９４】
その免疫調節役割の次に、ＴＮＦＲ２は、ニューロンの生存および再生に大きく寄与する。ニューロン組織の破壊を促進するＴＮＦＲ１とは対照的に、網膜虚血のマウスモデルにおいてＴＮＦＲ２は、ＰＫＢ／Ａｋｔ経路の活性化により保護的であった。力学的に、ＴＮＦが、グルタミン酸誘導性興奮毒性に対してＴＮＦＲ１ノックアウトマウスの一次皮質ニューロンを保護し得ることが示されたが、ＴＮＦＲ２ノックアウトマウスのニューロンは保護されない。類似の結果が、脱髄および再ミエリン化のクプリゾン誘導マウスモデルにおいて観察され、ＴＮＦのゲノム除去は、再ミエリン化の遅延および増殖性オリゴデンドロサイト前駆体のプールの減少をもたらし、続いて成熟オリゴデンドロサイトの数を減少させる。ＴＮＦＲ１−／−およびＴＮＦＲ２−／−マウスの分析は、ＴＮＦＲ２が、ＴＮＦ媒介性オリゴデンドロサイト再生に極めて重要であることを示し、組織再生が、ＴＮＦＲ２を介するＴＮＦのシグナル伝達に依存的であることを実証した。さらなるインビトロ（in vitro）研究により、ドーパミン作動性神経が、毒性損傷後のＴＮＦＲ２の選択的活性化によってＨ２Ｏ２または６−ＯＨＤＡ誘導性細胞死から保護されることが明らかになった。
【００９５】
加えて、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）におけるＴＮＦＲ２活性化は、ＢＣＬ−２およびＳＯＤ２などの抗アポトーシスならびに抗酸化タンパク質の発現を増強し、その増強はミトコンドリア膜を安定化することができ、したがってＨ２Ｏ２誘導性細胞死に対して観察されたＯＰＣのＴＮＦＲ２媒介性保護に寄与する可能性がある。ＴＮＦＲ２活性化は、星状細胞からの抗炎症および神経組織栄養因子の放出も促進し、その因子はオリゴデンドロサイト分化を促進することができ、したがって再ミエリン化を支持する可能性がある。要約すると、ＴＮＦＲ２は、例えばＴｒｅｇの拡大による免疫調節ならびに組織保護および再生に関係する。
【００９６】
可溶性ＴＮＦは、膜貫通性ＴＮＦの細胞外ドメインｔｍＴＮＦのＴＡＣＥ媒介性タンパク質分解性切断によって天然に得られ、可溶性ならびに膜貫通性ＴＮＦは、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２を介するシグナル伝達を刺激する能力が異なる。ｓＴＮＦまたはｔｍＴＮＦのいずれかの結合は、ＴＮＦＲ１を活性化し得るが、ＴＮＦＲ２は、ｔｍＴＮＦによってのみ完全に活性化される。ｓＴＮＦは、ＴＮＦＲ１に対して著しく高い親和性を示す（ＫＤ＝１．９×１０−１１Ｍ）が、ＴＮＦＲ２に対する親和性は有意に低い（ＫＤ＝４．２×１０−１０Ｍ）。ＴＮＦＲ１に対する高親和性は、主にリガンド／受容体複合体の安定化によって引き起こされ、一方でＴＮＦＲ２に対するｓＴＮＦの一過性の結合は、細胞内シグナル伝達を誘導するには効果的でない場合がある一時的な複合体をもたらすと提唱された。結論として、ＴＮＦＲ２の効果的な活性化は、ＴＮＦの膜形態による安定な受容体複合体形成を必要とする。ｔｍＴＮＦによるＴＮＦＲ２の活性化は、例えばオリゴマー形成された可溶形態のｔｍＴＮＦによって模倣され得る。
【００９７】
ＴＮＦ配列における突然変異は、ＴＮＦＲ１との結合／親和性の消失を招き、それによってＴＮＦＲ２に対する選択性を生じる可能性がある。好ましくは、ＴＮＦは、配列番号４３に基づく配列を有し、その配列は、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ１４６Ｈ、Ｅ１４６Ｋ  Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｑ８８Ｎ／Ｔ８９Ｓ／Ａ１４５Ｓ／Ｅ１４６Ａ／Ｓ１４７Ｄ、Ｑ８８Ｎ／Ａ１４５Ｉ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｓ１４７Ｄ、Ｌ２９Ｖ／Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｎ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｑ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｋ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｔ、Ａ１４５Ｒ／Ｅ１４６Ｔ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ｅ１４６Ｎ／Ｓ１４７、Ｋ６５Ｗ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｗ、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｖ、Ｄ１４３Ｖ／Ｆ１４４Ｌ／Ａ１４５Ｓ、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、Ｄ１４３Ｖ／Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＦおよびＡ１４５Ｗからなる群から選択されるＴＮＦＲ２特異的突然変異を１つ以上さらに含む。
【００９８】
好ましくは、ＴＮＦは配列番号８０による配列を有し、その配列は配列番号４３に基づき、ＴＮＦＲ２特異的突然変異Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒを含む。
【００９９】
好ましくは、本発明によるＰＬＧは、配列番号８０によるＴＮＦタンパク質リガンドを３つ含む。好ましくは、３つのＴＮＦタンパク質リガンドは、ペプチドリンカー、好ましくは配列番号１５によるペプチドリンカーを介して共有結合的に融合される。好ましくは、本発明によるＰＬＧは、配列番号８１を有する。
【０１００】
好ましくは、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体において、Ｃ末端コンセンサス配列
−Ｓ／Ｔ／Ｖ−Ｆ／Ｙ／Ｓ−Ｆ−Ｇ−Ａ／Ｌ／Ｖ／Ｉ−Ｘ１（配列番号１）
で定義される第１のＴＨＤのＣ末端は、２〜２０アミノ酸、好ましくは２〜１５アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、最も好ましくは３〜５アミノ酸の長さを有するＬ１によってＮ末端コンセンサス配列
Ｘ２−Ｖ／Ａ／Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｙ（配列番号２）
または
Ｘ３−Ｖ／Ｗ／Ｆ／Ｃ−Ａ／Ｌ−Ｅ／Ｙ／Ｑ／Ｈ−Ｌ（配列番号３）
で定義される第２のＴＨＤのＮ末端にそれぞれ連結され、
Ｘ１が、無極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｉ、ＬおよびＹからなる群から選択され；
Ｘ２が、Ｐ、Ｋ、Ｖ、ＩおよびＡからなる群から選択され；
Ｘ３が、Ｄ、Ｓ、ＭおよびＩからなる群から選択され；
第１および第２のＴＨＤと同じ方法で互いにそれぞれ連続的に連結されたさらなるＴＨＤを１〜４個さらに含んでもよい。
【０１０１】
ペプチド模倣体は、リポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ−Ｄ１）；ヒトγＢクリスタリンまたはヒトユビキチンから選択されるアフィリン；シスタチン；スルホロブスアシドカルダリウス由来Ｓａｃ７Ｄ；リポカリンに由来するリポカリンおよびアンチカリン；設計されたアンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎ）；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメイン；第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから選択されるモノボディ；アドネクチン；システインノットミニタンパク質；アトリマー；ＣＴＬＡ４に基づく結合剤から選択されるエビボディ；スタフィロコッカス・アウレウス由来プロテインＡのＺ−ドメインの３重ヘリックスバンドルから選択されるアフィボディ；ヒトトランスフェリンから選択されるトランスボディ；単量体または三量体ヒトＣ型レクチンドメインから選択されるテトラネクチン；トリプシン阻害因子ＩＩから選択されるミクロボディ；アフィリン；アルマジロ反復タンパク質からなる群から選択される。
【０１０２】
免疫グロブリンＦｃ領域二量体化ドメインが、配列番号８２を有するヒト免疫グロブリンＦｃ領域二量体化ドメインである、または免疫グロブリンＦｃ領域二量体化ドメインが、配列番号８３を有するＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性が無効化されたヒトＦｃ突然変異体（Δａｂ；Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）であることがさらに好ましい。ｐ５３二量体化ドメインは、配列番号８４を有するヒトｐ５３二量体化ドメインであることがさらに好ましい。ＧＣＮ４四量体化ドメインは、配列番号８５を有する酵母ＧＣＮ４四量体化ドメインであることがさらに好ましい。ＶＡＳＰ四量体化ドメインは、配列番号８６を有するヒトｅｎａ／ＶＡＳＰ（有効／血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）であることがさらに好ましい。
【０１０３】
特に本発明の好ましい複合体は、配列番号８７〜９０の配列から選択されるサブユニットを含むかまたはからなる複合体であり、ＰＬはヒトＴＮＦである。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、配列番号８７のサブユニット（ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２）を２つ含むかまたはからなる。２つのサブユニットの二量体化により、４つの３価ＴＮＦＲ２  ＰＬＧおよび２つのＦｃ二量体化ドメインによって特徴付けられる１２価のＴＮＦ複合体を得られ、２つのＰＬＧは、リンカーＬ３によって各二量体化ドメインのＮ末端に融合され、２つのＰＬＧは、リンカーＬ４によって各二量体化ドメインのＣ末端に融合される。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、本発明のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、配列番号８８のサブユニット（ｐ５３−ｓｃＴＮＦＲ２）を４つ含むかまたはからなる。４つのサブユニットの四量体化により、４つの３価ＴＮＦＲ２  ＰＬＧおよび４つのｐ５３四量体化ドメインによって特徴付けられる１２価のＴＮＦ複合体を得られ、各ＰＬＧは、リンカーＬ３を介して四量体化ドメインのＣ末端に融合される。
【０１０６】
さらなる好ましい実施形態において、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、配列番号８９のサブユニット（ＧＣＮ４−ｓｃＴＮＦＲ２）を４つ含むかまたはからなる。４つのサブユニットの四量体化により、４つの３価ＴＮＦＲ２  ＰＬＧおよび４つのＧＣＮ４四量体化ドメインによって特徴付けられる１２価のＴＮＦ複合体を得られ、各ＰＬＧは、リンカーＬ３を介して四量体化ドメインのＣ末端に融合される。
【０１０７】
追加の好ましい実施形態において、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、配列番号９０のサブユニット（ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２）を４つ含むかまたはからなる。４つのサブユニットの四量体化により、４つの３価ＴＮＦＲ２  ＰＬＧおよび４つのＶＡＳＰ四量体化ドメインによって特徴付けられる１２価のＴＮＦ複合体を得られ、各ＰＬＧは、リンカーＬ３を介して四量体化ドメインのＣ末端に融合される。
【０１０８】
また、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体は、配列番号９１のサブユニット（ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）を含むかもしくはからなるまたは配列番号９２のサブユニット（ＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）を含むかもしくはからなると考えられ、ＰＬはマウスＴＮＦである。
【０１０９】
本発明者らは、本発明の複合体が、例えば、６価複合体と比較して、最大１０倍改善された活性を示すことを驚くことに見出した。これらのうち、ＧＣＮ４およびｓｃＴＮＦＲ２から構成される４つのサブユニットの複合体が、特に強力である。
【０１１０】
第２の態様において、本発明は、本発明の第１および第２の態様によるポリペプチドをコードしている核酸を提供する。核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはそのハイブリッドでもよい。好ましくは核酸は、適切な発現系における本発明の第１の態様によるポリペプチドの発現を可能にする配列も含む。核酸は、それぞれの発現系に最適化されたコドンであり得る。
【０１１１】
第３の態様において、本発明は、本発明の第２の態様の核酸を含むベクターを提供する。導入されるポリヌクレオチドにコードされる対象となる遺伝子は、ベクター（単数）またはベクター（複数）の導入により細胞内で発現されることが好ましい。好ましくは、ベクターは、適切な宿主細胞系において核酸にコードされるポリペプチドの転写および発現を提供する。好ましくは、発現ベクターは、細菌、酵母、バキュロウイルス、植物および哺乳動物発現ベクターからなる群から選択され、より好ましくは、発現ベクターは、細菌発現ベクターまたは無細胞発現ベクターである。
【０１１２】
第４の態様において、本発明は、医薬として使用する第１の態様のポリペプチド、第２の態様の核酸または第３の態様のベクターを提供する。
【０１１３】
第５の態様において、本発明は、本発明の第１の態様の複合体、または第２の態様の核酸、または第４の態様のベクターを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体および／または適切な賦形剤を好ましくはさらに含む。医薬組成物は、固形、液体、半固形または経皮治療システムからなる群から選択される。本発明の医薬組成物は、本発明の第１の態様の複合体を１つ以上含むと想定される。
【０１１４】
第６の態様において、本発明は、高増殖性障害もしくは炎症性障害、好ましくはがん、または血液学系の悪性病変、自己免疫性障害および変性疾患、好ましくは神経変性疾患の診断、予防または処置に使用する、第１または第２の態様のポリペプチド、第３の態様の核酸もしくは第４の態様のベクターもしくは第５の態様の医薬組成物に関する。
【０１１５】
好ましい高増殖性疾患は、前がん状態；異形成；化生；がん；および皮膚疾患からなる群から選択される。
【０１１６】
本発明のポリペプチドによって処置しようとする特定の好ましいがんは、消化管の癌腫、肝臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、卵巣、精巣、皮膚、浸潤口腔がん、小細胞および非小細胞肺癌、ホルモン依存的乳がん、ホルモン非依存的乳がん、移行および扁平上皮細胞がん、神経芽細胞腫、神経膠腫、星状細胞腫を含めた神経学的悪性病変、骨肉腫、軟部組織肉腫、血管腫、内分泌腫瘍、白血病、リンパ腫ならびに脊髄増殖性およびリンパ組織増殖性の他の疾患を含めた血液学的腫瘍形成、インサイチュ（in situ）癌腫、過形成病変、腺腫、線維腫、組織球増殖症、慢性炎症性増殖性疾患、脈管増殖性疾患およびウイルス誘導性増殖性疾患、ケラチン生成細胞および／またはＴ細胞の過剰増殖によって特徴付けられる皮膚疾患である。本発明の化合物で処置可能な特定の好ましい疾患は、固形腫瘍、特に、肺、乳、膵臓、結腸直腸、卵巣、前立腺および胃がんならびに腺癌である。
【０１１７】
本発明のポリペプチドで処置可能な前がん状態は、皮膚の前がん状態、特に光線性角化症、皮角、光線性口唇炎、タール角化症、砒素角化症、Ｘ線角化症、ボーエン病、ボーエン様丘疹症、悪性黒子、硬化性苔癬および苔癬ゴム粘膜（lichen rubber mucosae）；消化管の前がん状態、特に、紅板症、白斑症、バレット食道、プラマービンソン症候群、下腿潰瘍、巨大肥厚性胃炎、境界癌腫、腫瘍性腸管ポリープ、直腸ポリープ、石灰化胆嚢炎；婦人科の前がん状態、特に乳管内癌（ＣＤＩＳ）、頸部上皮内新生物（ＣＩＮ）、白斑症、子宮内膜増殖症（グレードＩＩＩ）、外陰ジストロフィー、外陰上皮内腫瘍形成（ＶＩＮ）、胞状奇胎；泌尿器科の前がん状態、特に膀胱乳頭腫症、ケイラー赤色肥厚症、精巣上皮内腫瘍形成（ＴＩＮ）、白斑症；上皮内癌（ＣＩＳ）；慢性炎症によって引き起こされる前がん状態、特に膿皮症、骨髄炎、集簇性座瘡、尋常性狼瘡および瘻孔からなる群から好ましくは選択される。
【０１１８】
形成異常は、しばしばがんの前身であり、上皮に主に見出され；非腫瘍性細胞成長の最も無秩序な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構造上の方向の消失を含む。形成異常細胞は、異常に大きくて強く染色される核をしばしば有し、多形態性を呈する。形成異常は、慢性刺激または炎症が存在する所に特徴的に起こる。本発明の化合物で処置され得る形成異常障害には、無汗性外胚葉骨髄異形成、前後異形成、窒息性胸郭異形成、心房指異形成、気管支肺異形成、終脳異形成、頸部異形成、軟骨外胚葉異形成、鎖骨頭蓋異形成、先天性外胚葉性異形成、頭蓋骨幹異形成、頭蓋手根足根骨異形成、頭蓋骨幹端異形成、象牙質異形成、骨幹異形成、外胚葉異形成、エナメル質異形成、脳眼異形成、半肢骨端異形成、多発性骨端異形成、点状骨端異形成、上皮異形成、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、繊維筋性異形成、線維性骨異形成、開花性骨性異形成、遺伝性腎網膜異形成、発汗性外胚葉異形成、無汗性外胚葉異形成、リンパ球減少性胸腺異形成、乳腺異形成、下顎顔面異形成、骨幹端異形成（metaphysical dysplasia）、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成、粘膜上皮異形成、重複骨端異形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指異形成、眼脊椎異形成、歯牙異形成、眼下顎四肢異形成、根尖性セメント質異形成、多骨性線維骨異形成、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、網膜異形成、中隔眼異形成、脊椎骨端異形成および心室橈骨異形成があるが、これに限定されない。
【０１１９】
化生は、ある型の成人または完全に分化した細胞が、別の型の成人細胞と置換される制御された細胞成長の形態である。処置可能な化生障害は、好ましくは、原因不明性骨髄様化生、アポクリン化生、異型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸上皮化生、化生性貧血、化生骨化、異形成性ポリープ、骨髄化生、原発性骨髄様化生、２次性骨髄様化生、扁平化生、羊膜の扁平上皮化生、症候性骨髄様化生および再生性化生からなる群から選択される。
【０１２０】
多くの皮膚疾患は、ケラチン生成細胞および／またはＴ細胞の過剰増殖によって特徴付けられる。本発明の化合物で処置可能なそのような疾患の例は、それだけには限らないが、乾癬、特に尋常乾癬、頭部乾癬、滴状乾癬、反対性乾癬；神経皮膚炎；魚鱗癬（ichtyosises）；円形脱毛症；全脱毛症；部分脱毛症；全身性脱毛症；びまん性脱毛症；アトピー性皮膚炎；皮膚の紅斑性狼瘡；皮膚の皮膚筋炎；アトピー性湿疹；限局性強皮症；硬皮症；蛇行型円形脱毛症；アンドロゲン性脱毛症；アレルギー性接触皮膚炎；刺激性接触皮膚炎；接触皮膚炎；尋常性天疱瘡；落葉状天疱瘡；増殖性天疱瘡；瘢痕性粘膜類天疱瘡；水疱性類天疱瘡；粘膜類天疱瘡；皮膚炎；ジューリング疱疹状皮膚炎；蕁麻疹；リポイド類壊死症；結節性紅斑；単純性痒疹；結節性痒疹；急性痒疹；線状ＩｇＡ皮膚炎；多形性光皮膚炎（polymorphic light dermatosis）；日光紅斑（erythema solaris）；皮膚の発疹；薬疹；慢性進行性紫斑病；異汗性湿疹（dihydrotic eczema）；湿疹；固定薬発疹；光線アレルギー性皮膚反応；および口囲皮膚炎を含む。
【０１２１】
本発明のポリペプチドで処置され得る炎症性障害には、それだけには限らないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリッグ疾患；運動ニューロン疾患ともいう）、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、アトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性腸疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性膵炎、自己免疫性末梢神経障害、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性血小板減少性紫斑、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病／バロー同心円性硬化症、ベーチェット病、バージャー病、ビッカースタッフ脳炎、ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、がん、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、慢性閉塞性肺疾患、慢性再発性多病巣性骨髄炎、チャーグストラウス症候群、良性粘膜類天疱瘡、コーガン症候群、寒冷凝集疾患、補体成分２欠損、接触皮膚炎、頭蓋動脈炎、クレスト症候群、クローン病、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、ドゴー病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、１型真性糖尿病、びまん性皮膚硬化型全身性強皮症、円板状紅斑性狼瘡、ドレスラー症候群、薬物誘導性狼瘡、湿疹、子宮内膜症、付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、好酸球性肺炎、後天性表皮水泡症、結節性紅斑、胎児赤芽球症、本態性混合性クリオグロブリン血症、エヴァンス症候群、進行性骨化性線維異形成、線維化性肺胞炎（または、特発性肺線維症）、胃炎、胃腸類天疱瘡、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、橋本脳症、橋本病、ヘノッホシェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、別名妊娠性類天疱瘡、汗腺膿瘍、ヒューズストービン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫性血小板減少性紫斑を参照のこと）、ＩｇＡ腎症、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性特発性関節炎、別名若年性関節炎、川崎病、ランバートイートン筋無力症候群、白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、紅斑性狼瘡、マジード症候群、顕微鏡的大腸炎、顕微鏡的多発血管炎、ミラーフィッシャー症候群、混合結合織疾患、限局性強皮症、ムッハハーベルマン病、別名急性痘瘡状苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、メニエール病、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック病ともいう）、神経ミオトニー、眼部瘢痕性類天疱瘡、眼球クローヌス、筋クローヌス症候群、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（レンサ球菌感染性小児自己免疫神経精神障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿（ＰＮＨ）、パリーロンベルグ症候群、扁平部炎、パーソネイジターナー症候群、尋常性天疱瘡、静脈周囲性脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、進行性炎症性神経障害、乾癬、乾癬性関節炎、赤芽球癆、壊疽性膿皮症、ラスムッセン脳炎、レイノー現象、ライター症候群、再発性多発軟骨炎、下肢不安症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、統合失調症、シュミット症候群ＡＰＳの別の形態、シュニッツラー症候群、強膜炎、硬皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症、スティッフパーソン症候群、スティル病、若年性関節炎を参照のこと、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、スイート症候群、シデナム舞踏病、交感性眼炎、全身性紅斑性狼瘡、紅斑性狼瘡を参照のこと、高安動脈炎、側頭動脈炎（別名「巨細胞性動脈炎」）、血小板減少症、トローザハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎（特発性炎症性腸疾患「ＩＢＤ」の２つの型のうちの１つ）、混合結合組織疾患とは異なる未分化結合組織疾患、未分化脊椎関節症、蕁麻疹様血管炎、脈管炎、白斑およびヴェゲナー肉芽腫症がある。
【０１２２】
過敏症には、喘息、アナフィラキシーまたはアトピーなどのアレルギー；自己免疫性溶血性貧血、血小板減少症、リウマチ性心疾患、胎児赤芽球症、グッドパスチャー症候群、膜性糸球体腎炎、グレーブス病、重症筋無力症などの細胞毒抗体依存的疾患；血清病、アルサス反応、関節リウマチ、レンサ球菌感染後糸球体腎炎、狼瘡腎炎、全身性紅斑性狼瘡、外因性アレルギー性肺胞炎（過敏性肺炎）などの免疫複合体病、接触皮膚炎、マントー試験、慢性移植拒絶反応および多発性硬化症などの細胞媒介性免疫応答があるが、これに限定されない。
【０１２３】
神経変性障害には、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、タウオパチー、ピック病、パーキンソン病、神経障害、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ハンチントン舞踏病、脊髄および延髄性筋萎縮、フリードライヒ運動失調症、脊髄小脳失調、クロイツフェルトヤコプ病、ゲルストマンストロイスラーシャインカー症候群、致死性家族性不眠症、クールー、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症およびバッテン病がある。
【０１２４】
本発明のポリペプチドで処置され得る感染性疾患には、それだけには限らないが、アナプラズマ症、炭疽菌、バベシア症、ボツリヌス菌中毒、ブルセラ病、鼻疽（バークホルデリア・マレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｍａｌｌｅｉ））、類鼻疽（バークホルデリア・シュードマレイ（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ））、カンピロバクター感染症（カンピロバクター属）、カルバペネム抵抗性腸内細菌科感染症、軟性下疳、チクングンヤ熱、クラミジア、シグアテラ、クロストリジウム・ディフィシール（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）感染症、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）感染症、コクシジオイデス真菌感染症（渓谷熱）、クロイツフェルトヤコプ病（伝達性海綿状）、クリプトスポリジウム症、シクロスポリア症、デング熱、ジフテリア、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）感染症、東部ウマ脳炎、エボラ出血熱、エールリヒア症、後感染またはアルボウイルス脳炎、エンテロウイルス感染、ジアルジア鞭毛虫症、淋病、鼠径部肉芽腫、ヘモフィルスインフルエンザ、ハンタウイルス肺症候群、溶血性尿毒症症候群、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス、ヒストプラスマ症、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、在郷軍人病、ハンセン病、レプトスピラ病、リスター異常状態、ライム病、マラリア、麻疹、ウイルス髄膜炎、細菌性髄膜炎、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、流行性耳下腺炎、ノロウイルス、麻痺型貝中毒、シラミ寄生症、骨盤内炎症性疾患、百日咳、腺ペスト、敗血症性ペスト、肺ペスト、肺炎球菌感染症、脊髄性小児麻痺、オウム病、ケジラミ症、天然痘、サル痘、牛痘、キュー熱、狂犬病、リケッチア症、風疹、サルモネラ症胃腸炎、疥癬、スコンブロイド食中毒、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、シゲラ症胃腸炎、メチシリン抵抗性ブドウ球菌感染症（ＭＲＳＡ）、梅毒、破傷風感染症、旋毛虫病、結核、野兎病、腸チフス、発疹チフス、細菌性膣炎、水痘、コレラ、腸炎ビブリオ、ラッサ出血熱、マールブルク出血熱、西ナイルウイルス、黄熱病およびジカ熱がある。
【実施例】
【０１２５】
実施例１
本発明の複合体の遺伝子操作
ヒトｐ５３（ａａ３２０−３５９）（配列番号８４）および酵母ＧＣＮ４（ａａ２４９−２８１）の四量体化ドメイン、具体的には突然変異体（Ｍ２５０Ｌ／Ｌ２５３Ｉ／Ｌ２６０Ｉ／Ｌ２６７Ｉ／Ｌ２７４Ｉ／Ｖ２５７Ｌ／Ｖ２７１Ｌ／Ｖ２７８Ｌ／Ｎ２６４Ｌ）（配列番号８５）は、ヒト一本鎖ＴＮＦ変異体（Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、ｓｃＴＮＦＲ２）（配列番号８１）のＮ末端またはマウス一本鎖ＴＮＦ変異体（Ｄ２２１Ｎ／Ａ２２３Ｒ、ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）（配列番号９３）に融合された。ＴＮＦＲ２選択的ヒトＴＮＦ変異体（ｓｃＴＮＦＲ２）およびＴＮＦＲ２選択的マウスＴＮＦ変異体（ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）は、本発明による３価ＰＬＧである。ヒトｓｃＴＮＦＲ２およびマウスｓｃ−ｍＴＮＦＲ２のＴＮＦドメインは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）からなるペプチドリンカーＬ１を介して接続される。３価ヒトおよびマウスＰＬＧは、それぞれＧＡＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＥＦＬＡ（配列番号４１）およびＧＡＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＩＲ（配列番号４０）からなるペプチドリンカーＬ３を介して、四量体化ドメインヒトｐ５３および酵母ＧＣＮ４に接続される。これらのコンストラクト（すなわち、サブユニット）に基づく複合体は、ｐ５３−ｓｃＴＮＦＲ２およびＧＣＮ４−ｓｃＴＮＦＲ２（ヒト）（配列番号８８および８９）、ならびにｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２およびＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス）（配列番号９１および９２）で示される（図１および２）。
【０１２６】
比較のために、ＩｇＥからのＥＨＤ２の二量体化ドメイン（ＣＨ２）（配列番号９４）は、それぞれ３価ヒト一本鎖ｓｃＴＮＦＲ２変異体（Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、ｓｃＴＮＦＲ２）のＮ末端（配列番号８１）および３価マウス一本鎖ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２変異体（Ｄ２２１Ｎ／Ａ２２３Ｒ、ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）（配列番号９３）に融合された。二量体化ドメインは、それぞれＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＥＦＬＡ（配列番号９５）およびＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＧＩＲ（配列番号９６）からなるペプチドリンカーＬ３を介して３価ｓｃＴＮＦＲ２およびｓｃ−ｍＴＮＦＲ２に接続される。ヒトｓｃＴＮＦＲ２およびマウスｓｃ−ｍＴＮＦＲ２のＴＮＦドメインは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）からなるペプチドリンカーＬ１を介して接続される。これらの複合体は、ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２（ヒト）（配列番号９７）およびＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（マウス）（配列番号９８）で示される（図１および２）。
【０１２７】
さらに比較するために、本発明の三量体ＰＬＧであるヒトｓｃＴＮＦＲ２およびマウスｓｃ−ｍＴＮＦＲ２を使用した。ヒトｓｃＴＮＦＲ２（配列番号８１）およびマウスｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（配列番号９３）のＴＮＦドメインは、ＧＧＧＧＳ（配列番号１５）からなるペプチドリンカーＬ１を介して接続される。
【０１２８】
コンストラクトの全体的なコドン使用頻度は、哺乳動物細胞における発現に適合された。精製を促進するために、Ｎ末端Ｈｉｓタグが全てのコンストラクトに導入された。
【０１２９】
実施例２
本発明の複合体の産生および精製
Ｆ１７培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させたＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞に、ポリエチレンイミン（Ｓｉｇｍａ）を使用して、実施例１によるＤＮＡコンストラクトを一過性にトランスフェクトした。翌日、トリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ、ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ、Ｔｅｒｒｅｂｏｎｎｅ、Ｃａｎａｄａ）を細胞培養に添加し、細胞をさらに４日間培養した。次に、上清を回収し、そこから組換えタンパク質を単離した。
【０１３０】
上清をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むカラムに装填し、固定化された金属イオンクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で精製し、ＩＭＡＣ洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５）を使用して未結合タンパク質を除去した。ＩＭＡＣ溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．５）で結合タンパク質を溶出し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対して一晩、４℃で透析した（メンブレンカットオフ４〜６ｋＤａ、Ｒｏｔｈ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。透析されたタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィーによりさらに精製された。これに、ＡＥＫＴＡ  ＦＰＬＣ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬまたはＨｉＬｏａｄ  ２６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇゲルろ過カラム（GE Healthcare、Freiburg、Germany）に装填した（およびＰＢＳ、ｐＨ７．４で溶出した）。
【０１３１】
タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定された。
【０１３２】
クーマシー染色について、実施例１による２μｇの精製タンパク質を、還元条件（メルカプトエタノールの存在下、＋２−ＭＥ）および非還元条件（メルカプトエタノールの非存在下、−２−ＭＥ）下で、レムリ（Laemmli）緩衝液（５０ｍＭ  ＴＲＩＳ  ｐＨ６．８、４Ｍ尿素、１％ＳＤＳ、１５％グリセロール、０．０１％ブロムフェノールブルー、５％２−メルカプトエタノール）中で変性させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１００Ｖ；９０分）で分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをクーマシー染色液（４０％メタノール、１０％酢酸、０．１％クーマシーブリリアントブルー）で６０分間、室温にてインキュベートし、クーマシー脱色液（４０％メタノール、１０％酢酸）で脱色した（図３Ａおよび３Ｃ）。あるいは、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ染色（Ｅｘｐｅｄｉｏｎ）を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでタンパク質を染色した（図３Ｂおよび３Ｃ）。
【０１３３】
イムノブロット分析について、１μｇタンパク質を還元条件（＋２−ＭＥ）および非還元条件（−２−ＭＥ）下、レムリ緩衝液中で変性させ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１００Ｖ；９０分）で分離した。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからニトロセルロースメンブレンに転写し（セミドライブロット；１．５ｍＡ／ｃｍ２ゲルで９０分間）、非特異的タンパク質結合をＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０中の５％脱脂粉乳溶液で３０分間、室温（ＲＴ）でブロックし、その後、特定の抗体を使用してメンブレンを４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰコンジュゲートした二次抗体とともに９０分間、室温でインキュベートした後、シグナルは、増大された化学発光により検出された（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ、Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）（図３Ｂおよび３Ｄ）。
【０１３４】
還元条件下で、ＴＮＦ変異体は、計算された分子量と一致する見かけの分子量を示した（表２）。
【０１３５】
表２: TNFR結合タンパク質複合体の計算された分子量
【表２】
2020516251.tif 000006
【０１３６】
実施例３
本発明のオリゴマー化複合体の純度
実施例１によるタンパク質複合体の純度およびオリゴマー化状態をＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィーによりさらに特徴付けた。約２０μｇのタンパク質を標準タンパク質とともに、ＰＢＳ緩衝液で平衡化させたＢｉｏＳｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ２０００  ７．８×３００ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＳｕｐｅｒＳＷ  ｍＡｂ  ＨＲ、７．８ｘ×３００ｍｍカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用し、０．５  ｍｌ／分の流速で溶出した。ｓｃＴＮＦＲ２および複合体は、タンパク質の完全性および高純度を示す単一の主要なピークとして、予想されたサイズで溶出された（図４）。
【０１３７】
実施例４
本発明の複合体の固定化されたＴＮＦ受容体への選択的結合
組換えマウスおよびヒトＴＮＦ（ｒｍＴＮＦおよびｒｈＴＮＦ、Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ）およびＴＮＦＲに対する実施例２によるタンパク質複合体の親和性は、固定化されたＴＮＦＲ１−ＦｃおよびＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質との結合研究により分析された。
【０１３８】
ＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌのｈｕＴＮＦＲ１−Ｆｃ、ｍＴＮＦＲ１−Ｆｃ、ｈｕＴＮＦＲ２−ＦｃまたはｍＴＮＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質で被覆され、４℃で一晩インキュベートされた。残留結合部位をＰＢＳ中の２％脱脂粉乳を用いて室温で２時間ブロックした。ｓｃＴＮＦＲ２および複合体をＰＢＳ中の２％脱脂粉乳で希釈し、１０−３〜１０ｎＭの範囲の濃度で添加し、１時間、室温でインキュベートした。各々のステップの間に、ＰＢＳ中の０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄することにより、非結合タンパク質を除去した。
【０１３９】
結合タンパク質は、ＴＮＦに対するマウスモノクローナル抗体（クローンＦ６Ｃ５；１μｇ／ｍｌ；１時間、室温でインキュベーション）、およびＨＲＰコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ抗体（１：１００００希釈；１時間、室温でインキュベーション）、続くテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液とのインキュベーションにより検出された。１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の添加により反応を停止させ、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ吸光度リーダー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で４５０ｎｍの吸光度を決定し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いてデータを分析した（図５）。表３では、ＥＬＩＳＡアッセイに基づいた、固定化ｈｕＴＮＦＲ２およびｍＴＮＦＲ２へのＴＮＦ、ｓｃＴＮＦＲ２および複合体の結合について計算されたＥＣ５０値を要約する。
【０１４０】
表３: TNFR結合タンパク質複合体のhuTNFR2およびmTNFR2への結合のEC50値(nM)
【表３】
2020516251.tif 000007
【０１４１】
明らかに、本発明の１２価複合体は、３価および６価タンパク質と比較して、ｈｕＴＮＦＲ２とｍＴＮＦＲ２の両方に対して優れた結合を示した（最大＞１０倍）。本発明の複合体のうち、ＧＣＮ４−ｓｃＴＮＦＲ２およびＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は最も好ましいＥＣ５０値を示す。
【０１４２】
ｓｃＴＮＦＲ２およびヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃの複合体の親和性は、Ａｔｔａｎａ  Ｃｅｌｌ  ２００（Ａｔｔａｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した水晶振動子マイクロバランス測定によってさらに決定された。製造業者のプロトコールに従って、ヒトＴＮＦＲ２−Ｆｃをそれぞれ高密度および低密度でカルボキシルセンサーチップに化学的に固定化した。結合実験は、２５ｍｌ／分の流速で３７℃にてＰＢＳＴ緩衝液（ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）で実施された。チップを１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０で再生した。各々の測定の前に、結合曲線から差し引かれたベースラインが測定された。特定の装置用にＡｔｔａｎａが提供するソフトウェアを使用してデータを回収し、Ａｔｔａｃｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（Ａｔｔａｎａ、Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ、Ｓｗｅｄｅｎ）およびＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ（Ｒｉｄｇｖｉｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｖａｎｇｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）で分析した（図６）。表４では、低密度チップ上での水晶振動子マイクロバランス測定に基づいて計算された、６価および１２価マウス複合体のＴＮＦＲ２への結合の結合値を要約する。表５では、ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２ならびに６価および１２価マウスタンパク質のＴＮＦＲ２への結合の結合値を要約する。これは、高密度チップ上での水晶振動子マイクロバランス測定に基づいて計算された。
【０１４３】
表４:低密度チップ上でのTNFR結合タンパク質複合体のTNFR2への結合(130Hz)
【表４】
2020516251.tif 000008
【０１４４】
表５:高密度チップ上でのTNFR結合タンパク質複合体のTNFR2への結合(270Hz)
【表５】
2020516251.tif 000009
【０１４５】
高い受容体密度では、６価と１２価ｓｃＴＮＦＲ２の両方が、３価ｓｃＴＮＦＲ２と比較して、ＴＮＦＲ２の見かけの約１０倍の親和性増加を示した。様々なタンパク質の見かけの親和性における明確な違いは、低密度チップで明らかになり、ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２、特にＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、３価（ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）と６価（ＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２）ｓｃＴＮＦＲ２変異体の両方と比較して、ＴＮＦＲ２に対してより高い見かけの親和性を示した（表４）。対照的に、ＴＮＦＲ１への結合は、試験したいずれの濃度でも観察されなかった（データを示さず）。
【０１４６】
実施例５
本発明の複合体によるＴＮＦＲ１の活性化の欠如
タンパク質複合体の選択性は、ＨｅＬａ細胞およびＬ９２９細胞を使用して決定された。例えば、組換えマウスｒｍＴＮＦを用いて、ＴＮＦＲ１を活性化すると、細胞はインターロイキン６（ＩＬ−６）を分泌する。結果として、ｒｍＴＮＦまたは様々な複合体とともにインキュベートされた細胞の上清は、ＥＬＩＳＡを使用してＩＬ−６の存在について分析された。
【０１４７】
Ｌ９２９細胞（１．５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルの平底細胞培養プレートで一晩増殖させた。Ｌ９２９細胞をアクチノマイシンＤ（１μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、その後、ｒｍＴＮＦまたは実施例１のマウス複合体を添加した。次に、細胞を異なるタンパク質濃度で２４時間、３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、生細胞を染色するためにクリスタルバイオレット（２０％メタノール、０．５％クリスタルバイオレット）とともに２０分間インキュベートした。色素をすすぎ水の下で除去し、細胞を風乾した。クリスタルバイオレットをメタノールで分解し、光学密度を５５０ｎｍで測定した。各々の試料を３回分析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してデータを分析した（図７Ａ）。
【０１４８】
ＨｅＬａ細胞（２．０×１０４細胞／ウェル）を上記のＬ９２９細胞について示したように刺激し、２４時間のインキュベーション後に上清を回収し、製造業者（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）の指示書に従ってＩＬ−６に特異的なＥＬＩＳＡにより分析した。４５０ｎｍでの吸光度を決定し、放出されたＩＬ−６の量を、提供された標準を用いて決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを使用して計算した（図７Ｂ）。
【０１４９】
ｒｍＴＮＦとは対照的に、試験されたタンパク質複合体はいずれも、Ｌ９２９においてＴＮＦＲ１依存性細胞死を活性化せず、ＴＮＦＲ１に対する親和性が突然変異Ｄ２２１Ｎ／Ａ２２３Ｒにより喪失したことを確認した。さらに、ｒｍＴＮＦとは対照的に、試験したタンパク質複合体はいずれも、ＨｅＬａ細胞においてＩＬ−６分泌を誘導しなかった。これはまた、試験した複合体が、ＴＮＦＲ１に対する親和性を有しなかったことを示す。
【０１５０】
実施例６
Ｋｙｍ−１細胞におけるＴＮＦＲ２誘導性細胞死
ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体の生物活性は、ＴＮＦ受容体の両方を内因的に発現し、ＴＮＦ誘導性細胞毒性に非常に感受性であるヒトＫｙｍ−１細胞を使用して試験された。
【０１５１】
Ｋｙｍ−１細胞（１．５×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルの平底細胞培養プレートで一晩増殖させた。Ｋｙｍ−１細胞を、様々な濃度の実施例１の精製されたヒトおよびマウス複合体とともに２４時間、３７℃でインキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、生細胞を染色するためにクリスタルバイオレット（２０％メタノール、０．５％クリスタルバイオレット）とともに２０分間インキュベートした。色素をすすぎ水の下で除去し、細胞を風乾した。クリスタルバイオレットをメタノールで分解し、光学密度を５５０ｎｍで測定した。各々の試料を３回分析し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してデータを分析した（図８）。表６では、ヒトおよびマウスのタンパク質の細胞死誘導について計算されたＥＣ５０値を要約する。
【０１５２】
表６: TNFR2結合タンパク質複合体によるKym-1細胞を用いた細胞死誘導のEC50価(nM)
【表６】
2020516251.tif 000010
【０１５３】
ＴＮＦＲ２を活性化すると、Ｋｙｍ−１細胞は細胞表面でＴＮＦを発現する。このＴＮＦはＴＮＦＲ１を活性化することができ、それに続いてＫｙｍ−１細胞がアポトーシスを起こすように細胞死経路を活性化する。オリゴマー化状態が高くなると、生物活性が上昇した。両方の四量体融合タンパク質は、二量体化されたＥＨＤ２タンパク質複合体と比較して明らかに高い生物活性を示す。予想外に、ＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、このバイオアッセイにおいてｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２よりも最大で１０倍高い生物活性を有した。ヒトｓｃＴＮＦＲ２変異体についても同様の結果が得られ、この場合、ＧＣＮ４−ｓｃＴＮＦＲ２はＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２およびｐ５３−ｓｃＴＮＦＲ２よりも約５倍高い最高の生物活性を示した。
【０１５４】
実施例７
胸腺細胞のＴＮＦＲ２誘導性増殖
実施例１のマウス複合体の生物活性は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離された胸腺細胞を使用して試験された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの胸腺を単離し、４０μｍのセルストレーナー（Ｆｌａｃｏｎ）で粉砕した。細胞を遠心分離（３００×ｇ、５分）し、培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＦＣＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、Ｐ／Ｓ）で１回洗浄した。次に、１．５×１０５個の細胞を、抗ＣＤ３（クローン１７Ａ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）被覆した（６時間、４℃にて、１μｇ／ｍｌ）９６ウェルプレートに播種し、実施例１のマウス複合体の存在下で４日間培養した。
【０１５５】
細胞増殖は、ＭＴＴアッセイにより細胞生存率を測定することによって決定された。細胞をＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍｌ）とともに２時間、３７℃でインキュベートした。次に、溶解緩衝液（１０％ＳＤＳ、２０ｎＭ  ＨＣｌ）を添加し、細胞を一晩溶解し、光学密度を５５０ｎｍで測定した。各々の試料を３回分析し、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＥｘｃｅｌおよびＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ４ソフトウェアを使用して分析した（図９）。表７は、ＭＴＴアッセイで決定された胸腺細胞増殖のＥＣ５０値を要約する。
【０１５６】
表７: TNFR2結合タンパク質複合体による胸腺細胞増殖誘導のEC50値(nM)
【表７】
2020516251.tif 000011
【０１５７】
４日間の培養後、ＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、ＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２と比較して、インビトロでの胸腺細胞増殖誘導におけるＥＣ５０値が低いことから明らかであるように、約３倍の生物活性の増加を示し、一方、ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、このバイオアッセイにおいてＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２に匹敵する活性を示した。
【０１５８】
実施例８
ＴＮＦＲ２により誘導されるＣｘｃｌ−２の分泌
実施例１のマウス複合体の生物活性は、ＢＶ−２細胞を使用して試験された。実施例１のマウス複合体の存在下でＢＶ−２細胞を刺激し、２４時間後に上清を回収し、製造業者の指示書に従ってＣｘｃｌ−２に特異的なＥＬＩＳＡ（ＢＶ−２、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ）により分析した。４５０ｎｍでの吸光度を決定し、放出されたＣｘｃｌ−２の量を提供された標準で決定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。表８に、ＥＬＩＳＡで決定したＣｘｃｌ−２分泌のＥＣ５０値を要約する（図１０）。
【０１５９】
表８:異なるTNFR2結合タンパク質複合体によって誘導されるCxcl-2分泌のEC50値(nM)
【表８】
2020516251.tif 000012
【０１６０】
ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２および特にＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、ＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２およびｓｃ−ｍＴＮＦＲ２と比較して３〜１０倍低いＥＣ５０値から明らかであるように、生物活性の有意な増加を示した。
【０１６１】
実施例９
ＴＮＦＲ２誘導性ＴＮＦ／ＴＮＦＲ２クラスタリング
実施例１のマウス複合体の生物活性は、ＢＶ−２細胞を使用して試験された。ＢＶ−２細胞を実施例１のマウス複合体で１５分間、３７℃で刺激した。次に、細胞をすぐに氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ溶液中の４％ＰＦＡで固定した。次に、非特異的結合部位をＰＢＳ中の４％ＢＳＡでブロックし、細胞をＴＮＦ（ＨＰ８００１、Ｈｂｔ）およびＴＮＦＲ２（ＡＦ−４２６−ＰＢ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に対する抗体とともにインキュベートし、続いて適切な蛍光標識抗体で検出した。核をＤＡＰＩで対比染色した。Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３ｘ／１．４油浸ＤＩＣ対物レンズおよびＡｘｉｏｃａｍ  ５０３モノＣＣＤカメラを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｓｐｉｎｎｉｎｇ  Ｄｉｓｃ顕微鏡で染色を分析した。次の励起レーザーおよび発光フィルターを使用した：ＤＡＰＩ：４０５ダイオードレーザー、４５０／５０ｎｍフィルター；ＧＦＰ、４８８ｎｍダイオードレーザー、５２５／５０ｎｍフィルター；ＲＦＰ、５６１ｎｍ（ＲＦＰ）ダイオードレーザー、６００／５０ｎｍフィルター。６×６の画像を含むタイル領域のＺスタックが取得され、最大強度の投影が計算された。画像処理はＺｅｎ  ｂｌｕｅ  ２．１ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で行われた。
【０１６２】
定量的画像分析をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒバージョン２．２．４９で行った。核をＤＡＰＩ染色によってセグメント化し、１２０ピクセル幅のリングマスクが、細胞マスクを表す各々の核の周囲に描かれた。ＴＮＦ小胞は、Ａ４８８染色を使用して細胞マスクの下でセグメント化され、各々の細胞で統一された。Ａ５４６染色を使用したＴＮＦＲ２シグナルの平均強度は、細胞あたりのＴＮＦＲ２とＴＮＦの間に共局在化する小胞のグレードを表す統一の小胞の下で測定された（図１１）。結果は、ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２とＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２の両方が、刺激された細胞内に大きな白い点として視認可能なシグナルコンピテントＴＮＦ／ＴＮＦＲ２クラスターの形成を誘導することを有利に示す。
【０１６３】
実施例１０
免疫細胞を使用した生物活性
ヒトＴ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５およびＨＬＡ−ＤＲ、ならびにマウスＴ細胞上のＣＤ２５およびＴＮＦＲ２の発現は、ＴＮＦＲ２選択的タンパク質の存在下で上方制御される。
【０１６４】
ボランティアのヒトドナーの血液をＲＰＭＩ培地で１：２に希釈した。次に、３０ｍｌの希釈血液を１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の上に重ね、ブレーキなしで２０分間、８００×ｇで遠心分離した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む中間期を取り除き、３０ｍｌのＲＰＭＩで洗浄した（３００×ｇ、５分間）。血小板を除去するために、細胞を４０ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁し、５分間、２００×ｇで遠心分離した。次に、ＣＤ３＋Ｔ細胞を、Ｐａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した磁気分離により単離した。精製したＴ細胞をＸ−Ｖｉｖｏ  １５培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁し、細胞をＴ細胞活性化のためにαＣＤ３被覆した（４℃で６時間）９６ウェル（Ｕフォーム）プレートに播種した。細胞をＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）および実施例１のマウス複合体の存在下で４日間培養した。次に、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＨＬＡ−ＤＲの表面発現を、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に従ってフローサイトメトリーで決定した（図１２Ａ）。
【０１６５】
Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスの脾臓を４０μｍのセルストレーナーで分離し、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に回収した。脾細胞を遠心分離し（３００ｇ、５分間）、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを使用してＣＤ３＋Ｔ細胞を単離し、Ｔ細胞活性化のために抗ＣＤ３被覆した（４℃で６時間）９６ウェル（Ｕフォーム）プレートに播種した。Ｔ細胞をＩＬ−２および実施例１のマウスタンパク質の存在下で４日間培養した。次に、ＣＤ２５およびＴＮＦＲ２の発現は、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ）に従ってフローサイトメトリーで決定された。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で分析した（図１２Ｂ）。
【０１６６】
特に、ＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２およびｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２は、ＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２と比較して優れた生物活性を示した。
【０１６７】
実施例１１
マウスＴ細胞を使用した生物活性
ＴＮＦＲ２は、Ｔｒｅｇの拡大に関与し、それによって、免疫調節および免疫抑制に貢献する。Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス由来の脾臓を４０μｍのセルストレーナーで分離し、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に回収した。脾細胞を遠心分離し（３００ｇ、５分間）、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄した。次に、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩを使用してＣＤ３＋  Ｔ細胞を単離し、Ｔ細胞活性化のために抗ＣＤ３被覆した（４℃で６時間）９６ウェル（Ｕフォーム）プレートに播種した。Ｔ細胞をＩＬ−２および実施例１の複合体の存在下で４日間培養した。次に、ＣＤ２５、ＴＮＦＲ２、およびＦｏｘＰ３の発現を、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ）に従ってフローサイトメトリーにより決定した。ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用してデータを取得し、ＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、ＬＬＣ）で分析した（図１３）。
【０１６８】
結果は、１２価複合体が６価複合体と比較して優れたＴｒｅｇ拡大を誘導することを示す。
【０１６９】
実施例１２
インビボ生物活性
実施例１のＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２、ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２およびＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２（１ｍｇ／ｋｇ）をＣ５７ＢＬ／６野生型マウスに腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。４日後、２回目の注射（１ｍｇ／ｋｇ）を適用した。７日後、脾臓を切除し、脾細胞を単離した。単離した脾臓を４０μｍのセルストレーナーで分離し、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）に回収した。脾細胞を遠心分離し（３００ｇ、５分）、脾臓あたり３ｍｌのＲＢＣ緩衝液（０．１５ＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ＭのＥＤＴＡ）中で５分間、室温でインキュベートし、赤血球を溶解した。次に、１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液を添加し、脾細胞を５分間、３００ｇで遠心分離した。細胞を１０ｍｌのＭＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し（５分、３００×ｇ）、その後、ＭＡＣＳ緩衝液に回収した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の亜集団内のマーカーＣＤ２５およびＦｏｘＰ３の発現は、製造業者の指示書（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ）に従ってフローサイトメトリーにより決定された（図１４Ａ）。
【０１７０】
インビボでは、ｐ５３−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２とＧＣＮ４−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２の両方はＥＨＤ２−ｓｃ−ｍＴＮＦＲ２よりも強力であり、処置マウスの脾臓における調節性Ｔ細胞の量が増加していることが示される。
【０１７１】
タンパク質の寛容は、実施例１のマウスタンパク質の投与（１ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）後の血液中のＣＲＰレベルを測定することにより決定された。したがって、注射後の２４時間および７２時間に全血を回収し、製造業者の指示書に従ってマウスＣＲＰに特異的なＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＣＲＰレベルを決定した。
【０１７２】
異なるタンパク質間の差異は観察されず、異なるオリゴマー変異体の寛容を示した（図１４Ｂ）。
【０１７３】
実施例１３
ＶＡＳＰを四量体化ドメインとして、またはＦｃを二量体化ドメインとして使用する１２価ＴＮＦＲ２選択的アゴニスト
ヒトＶＡＳＰ（ａａ３３６−３８０）（配列番号８６）の四量体化ドメインは、ＧＡＰＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳＥＦＬＡ（配列番号４１）からなるペプチドリンカーＬ３を介して、ヒト一本鎖ＴＮＦ変異体（ｓｃＴＮＦＲ２、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ）（配列番号８１）のＮ末端に融合され、ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２（配列番号９０）をもたらした。
【０１７４】
さらに、ヒトｓｃＴＮＦＲ２変異体（配列番号８１）は、Ｆｃ突然変異体Ｆｃγ１（Δａｂ；Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３５Ａ、ΔＧ２３６、Ａ３２７Ｇ、Ａ３３０Ｓ、Ｐ３３１Ｓ）の二量体化ドメインのＮ末端およびＣ末端に融合され、ＡＤＣＣ／ＣＤＣ機能性は無効化された（配列番号８３）。３価ＰＬＧは、ＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧ（配列番号９９）からなるペプチドリンカーＬ３を介してＦｃ（Δａｂ）二量体化ドメインのＮ末端に接続され、ＧＧＳＧＧＧＳＳＧＧ（配列番号１００）からなるペプチドリンカーＬ４を介してＣ末端に接続され、ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２（配列番号８７）を得る。
【０１７５】
コンストラクトの全体的なコドン使用頻度は、哺乳動物細胞における発現のために適合された。精製を促進するために、Ｎ末端のＨｉｓタグが全てのコンストラクトに導入された。
【０１７６】
複合体ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２およびｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２は、ＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞において産生され、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ  ＩＭＡＣにより精製され、サイズ排除クロマトグラフィーにより天然緩衝条件下で分析された（図１５Ａ）。ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２は、二量体アセンブリーに対応する主要なピークとして溶出され、ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２は、四量体アセンブリーに対応する主要なピークとして溶出された。予想される分子量のジスルフィド接続された二量体は、ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認された（図１５Ｂ、表９）。ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２は、ＶＡＳＰ四量体化ドメインの非共有結合アセンブリーに従って、還元条件および非還元条件で同様のサイズのＳＤＳ−ＰＡＧＥバンドにおいて示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、発現されたポリペプチド鎖の純度および完全性をさらに確認した。
【０１７７】
生物活性を調べるために、Ｋｙｍ−１細胞をｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２、ＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２、および対照としての６価ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２で刺激した。細胞生存率は、１６時間後にクリスタルバイオレットアッセイにより決定された。ここでは、６価ＥＨＤ２−ｓｃＴＮＦＲ２タンパク質のＥＣ５０値を３７ｐＭと決定した。対照的に、２つの１２価分子ｓｃＴＮＦＲ２−Ｆｃ−ｓｃＴＮＦＲ２およびＶＡＳＰ−ｓｃＴＮＦＲ２のＥＣ５０値は８．５および７．０ｐＭであった（図１５Ｃ）。したがって、１２価融合タンパク質の生物活性は、６価タンパク質と比較して約５倍増加した。
【０１７８】
表９:本発明のさらなるTNFR2結合タンパク質複合体の計算された分子量
【表９】
2020516251.tif 000013
【０１７９】
本発明は、以下の項目に関する：
１．腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）結合タンパク質複合体であって、同じＴＮＦＲ、好ましくはＴＮＦＲ２の細胞外部分に特異的に結合する１２個またはより多くのタンパク質リガンド（ＰＬ）を含む、ＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８０】
２．１２〜１８個、好ましくは１２個のＰＬを含む、項目１のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８１】
３．２〜６個、好ましくは３個のＰＬが、以下の構造：
ＰＬ１−Ｌ１−ＰＬ２−Ｌ１−ＰＬ３−Ｌ１−ＰＬ４−Ｌ１−ＰＬ５−Ｌ１−ＰＬ６
を持つタンパク質リガンド群（ＰＬＧ）を形成し、
式中、ＰＬ４〜ＰＬ６のいずれかおよび／またはＬ１は、存在していなくてもよいし、または存在していてもよく、Ｌ１は、各場合で独立に、ペプチドリンカーを意味する、項目１または２のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８２】
４．２〜６個のＰＬＧを含み、各ＰＬＧが２〜６個のＰＬを含む、項目３のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８３】
５．ＰＬＧが、ペプチドリンカー２（Ｌ２）を介して互いに連結されて、ＰＬＧ多量体を形成する、項目３または４のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８４】
６．２つ以上の重合ドメイン（ＰＤ）をさらに含み、好ましくは、該ＰＤが、適宜ペプチドリンカー３（Ｌ３）を介して、該ＰＤのＮ末端および／またはＣ末端でそれぞれＰＬＧまたはＰＬＧ多量体に連結されている、項目３から５のいずれか１つのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８５】
７．ＰＤが、二量体化ドメイン、三量体化ドメインまたは四量体化ドメインからなる群から選択される、項目６のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８６】
８．
（ｉ）二量体化ドメインが、ＩｇＭ（ＭＨＤ２）またはＩｇＥ（ＥＨＤ２）の重鎖ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧまたはＩｇＡの重鎖ドメイン３（ＣＨ３）、ＩｇＭまたはＩｇＥの重鎖ドメイン４（ＣＨ４）、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ロイシンジッパーモチーフ、バルナーゼ−バルスター二量体、ミニ抗体およびＺＩＰミニ抗体からなる群から選択され；
（ｉｉ）三量体化ドメインが、テネイシンＣ（ＴＮＣ）、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端非コラーゲン性ドメイン（ＮＣ１）の三量体化領域、Ｆａｂ３様分子およびＴｒｉＢｉ−ミニボディからなる群から選択され；または
（ｉｉｉ）四量体化ドメインが、ｐ５３の四量体化ドメイン、ジェネラルコントロールタンパク質４（general control protein 4）（ＧＣＮ４）の四量体化ドメイン、ＶＡＳＰ（血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質）の四量体化ドメイン、直列型ダイアボディおよびジダイアボディからなる群から選択される、項目７のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８７】
９．各ＰＤが、別のＰＤ中の少なくとも１つのアミノ酸残基と共有結合を形成可能な少なくとも１つのアミノ酸残基、好ましくはＣｙｓ残基を含む、項目６から８（ｉ）および（ｉｉ）のいずれかのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８８】
１０．Ｌ３が、４〜３２アミノ酸の長さを有し、Ｌ３が、少なくとも１つのグリコシル化モチーフを含んでもよく、好ましくは少なくとも１つのモチーフが、グリコシル化されている、項目６から９のいずれかのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１８９】
１１．Ｌ３が、（ＧＧＳ）ｐ、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＳＧＧ）ｍからなる群から選択される１つ以上の反復単位を含み、ｐが、１〜１０の整数であり、ｎが、１〜８の整数であり、ｍが、１〜６の整数である、項目１０のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９０】
１２．各ＰＬが、ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質（ＴＨＤ）のＴＮＦ相同ドメイン、骨格−タンパク質およびペプチド模倣体からなる群から互いに独立に選択される、項目１から１１のいずれかのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９１】
１３．ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質が、ＴＮＦ、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬまたはＴＮＦＳＦ１０、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー）、ＣＤ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ５）、ＣＤ２７Ｌ（ＴＮＦＳＦ７）、ＣＤ３０Ｌ（ＴＮＦＳＦ８）、ＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）、４−１ＢＢＬ（ＴＮＦＳＦ９）、ＯＸ４０Ｌ（ＴＮＦＳＦ４）、ＥＤＡ；ＬＴＡ（ＴＮＦＳＦ１）、ＬＴＢ（ＴＮＦＳＦ３）、ＣＤ１５３（ＴＮＦＳＦ８）、ＲＡＮＫＬ（ＴＮＦＳＦ１１）、ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦＳＦ１２）、ＡＰＲＩＬ（ＴＮＦＳＦ１３）、ＢＡＦＦ（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）、ＶＥＧＩ（ＴＮＦＳＦ１５）およびＧＩＴＲＬ（ＴＮＦＳＦ１８）からなる群から選択される、項目１２のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９２】
１４．ＴＮＦ−リガンドファミリーメンバータンパク質が、ＴＮＦまたはＬＴＡである、項目１から１２のいずれか１つのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９３】
１５．前記ＴＮＦが、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｎ、Ｅ１４６Ｑ、Ｅ１４６Ｈ、Ｅ１４６Ｋ  Ａ１４５Ｒ／Ｓ１４７Ｔ、Ｑ８８Ｎ／Ｔ８９Ｓ／Ａ１４５Ｓ／Ｅ１４６Ａ／Ｓ１４７Ｄ、Ｑ８８Ｎ／Ａ１４５Ｉ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｈ／Ｓ１４７Ｄ、Ｌ２９Ｖ／Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｎ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｓ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｑ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｔ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｅ１４６Ｇ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｋ／Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｔ、Ａ１４５Ｒ／Ｅ１４６Ｔ／Ｓ１４７Ｄ、Ａ１４５Ｒ／／Ｓ１４７Ｔ、Ｅ１４６Ｄ／Ｓ１４７Ｄ、Ｅ１４６Ｎ／Ｓ１４７、Ｋ６５Ｗ、Ｄ１４３Ｎ、Ｄ１４３Ｅ、Ｄ１４３Ｆ、Ｄ１４３Ｗ、Ｄ１４３Ｙ、Ｄ１４３Ｖ、Ｄ１４３Ｖ／Ｆ１４４Ｌ／Ａ１４５Ｓ、Ｄ１４３Ｎ／Ａ１４５Ｒ、Ｄ１４３Ｖ／Ａ１４５Ｓ、Ａ１４５Ｒ、Ａ１４５Ｈ、Ａ１４５Ｋ、Ａ１４５ＦおよびＡ１４５Ｗからなる群から選択される１つ以上のＴＮＦＲ２特異的突然変異を含む配列番号４３に記載の配列を含む、項目１４のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９４】
１６．Ｃ末端コンセンサス配列
−Ｓ／Ｔ／Ｖ−Ｆ／Ｙ／Ｓ−Ｆ−Ｇ−Ａ／Ｌ／Ｖ／Ｉ−Ｘ１（配列番号１）
で定義される第１のＴＨＤのＣ末端がそれぞれ、Ｎ末端コンセンサス配列
Ｘ２−Ｖ／Ａ／Ｆ−Ａ−Ｈ−Ｖ／Ｌ／Ｉ／Ｙ（配列番号２）、
または
Ｘ３−Ｖ／Ｗ／Ｆ／Ｃ−Ａ／Ｌ−Ｅ／Ｙ／Ｑ／Ｈ−Ｌ（配列番号３）
で定義される第２のＴＨＤのＮ末端に、２〜２０アミノ酸、好ましくは２〜１５アミノ酸、より好ましくは３〜１０アミノ酸、最も好ましくは３〜５アミノ酸の長さを有するＬ１を介して連結され；
（式中、Ｘ１は、無極性／疎水性または極性／中性アミノ酸であり、好ましくはＦ、Ｖ、Ｑ、Ａ、Ｉ、ＬおよびＹからなる群から選択され；
Ｘ２は、Ｐ、Ｋ、Ｖ、ＩおよびＡからなる群から選択され；
Ｘ３は、Ｄ、Ｓ、ＭおよびＩからなる群から選択される）；
第１および第２のＴＨＤと同じ方法で互いにそれぞれ連続的に連結されたさらなるＴＨＤを１〜４個さらに含んでもよい、項目１２〜１５のいずれかのＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９５】
１７．ペプチド模倣体が、リポタンパク質関連凝固阻害因子（ＬＡＣＩ−Ｄ１）；ヒトγＢクリスタリンまたはヒトユビキチンから選択されるアフィリン；シスタチン；スルホロブスアシドカルダリウス由来Ｓａｃ７Ｄ；リポカリンに由来するリポカリンおよびアンチカリン；設計されたアンキリン反復ドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）；ＦｙｎのＳＨ３ドメイン；プロテアーゼ阻害剤のクニッツドメイン；第１０フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインから選択されるモノボディ；アドネクチン；システインノットミニタンパク質；アトリマー；ＣＴＬＡ４に基づく結合剤から選択されるエビボディ；黄色ブドウ球菌由来プロテインＡのＺ−ドメイン由来３重ヘリックスバンドルから選択されるアフィボディ；ヒトトランスフェリンから選択されるトランスボディ；モノマーまたはトリマーヒトＣ型レクチンドメインから選択されるテトラネクチン；トリプシン阻害因子ＩＩから選択されるミクロボディ；アフィリン；アルマジロ反復タンパク質からなる群から選択される、項目１２のＴＮＦＲ結合タンパク質複合体。
【０１９６】
１８．項目１〜１７のいずれかによるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体またはそれに含まれるＰＬＧをコードする核酸。
【０１９７】
１９．項目１８による核酸を含むベクター。
【０１９８】
２０．医薬としての使用のための、項目１〜１７のいずれかによるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体、項目１８による核酸または項目１９によるベクター。
【０１９９】
２１．項目１〜１７のいずれかによるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体または項目１８による核酸または項目１９によるベクターを活性薬剤として含む医薬組成物。
【０２００】
２２．高増殖性障害もしくは炎症性障害、好ましくはがん、または血液学系の悪性病変、自己免疫性障害および神経変性疾患の診断、予防または処置における使用のための、項目１〜１７のいずれかによるＴＮＦＲ結合タンパク質複合体または項目１８による核酸または項目１９によるベクターまたは項目２１による医薬組成物。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
2020516251.tif 000020
【図６−１】
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【図６−２】
2020516251.tif 000022
【図７】
2020516251.tif 000023
【図８】
2020516251.tif 000024
【図９】
2020516251.tif 000025
【図１０】
2020516251.tif 000026
【図１１−１】
2020516251.tif 000027
【図１１−２】
2020516251.tif 000028
【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
2020516251.tif 000032
【図１５−１】
2020516251.tif 000033
【図１５−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020516251.tif 000036
2020516251.tif 000037
2020516251.tif 000038
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