(57)【要約】  哺乳類対象のマイクロバイオームサンプルから単離した、異種ポリヌクレオチドを発現するように操作された共生細菌の集団を含む組成物、このような操作された共生細菌を含む組成物、及び例えば操作された共生/天然細菌を投与することによって哺乳動物に治療用ポリペプチドを送達するための使用方法が提供される。
2020516318.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用ポリペプチドをそれを必要とする哺乳類対象に送達する方法であって、
a)供与対象から、細菌細胞を含むマイクロバイオームサンプルを得る工程;
b)マイクロバイオームサンプルから細菌細胞を単離する工程であり、細菌細胞は、供与対象にとって共生的な/天然の菌株に由来する、工程;
c)単離された細菌細胞をインビトロで培養して、単離及び培養された細菌細胞の実質的に均一な集団を得る工程;
d)細菌細胞の集団を、細菌及び/又は供与対象にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換する工程であり、1つ又は複数のポリヌクレオチドは、1つ又は複数の治療用ポリペプチドをコードする、工程;及び
e)受容対象に単離及び培養された細菌細胞の実質的に均一な形質転換された集団の少なくとも一部を投与する、又はその投与を引き起こす工程であり、投与される細菌細胞は、哺乳類対象中又はその上に永久的に又は長期にわたり定着することが可能であり、1つ又は複数の治療用ポリペプチドを発現する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記哺乳類対象中又はその上における投与された細菌細胞の定着又は存在を決定及び/又は測定する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
マイクロバイオームサンプルが、身体からの排出物(例えば、便、唾液、粘液、尿、又は息)、表面の生検又はスワブ(例えば、胃腸(GI)管、口腔、咽頭、鼻腔、泌尿生殖路、皮膚、肛門/直腸、膣、又は目)、及び病理学的標本(例えば、がん組織、切断された手足、又は炎症を起こした臓器)からなる群から選択される生体サンプルから得られる、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
細菌細胞が、病原性の毒素をコードするポリヌクレオチドを含まない、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
細菌細胞が、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
細菌細胞が、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質感受性である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細菌細胞が、1種又は複数の臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
細菌細胞が、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、又はロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、又はリファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、又はポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、又はピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、又はトブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、又はセフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、又はタブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、又はチエナマイシン)、又はテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、又はチゲサイクリン)から選択される1種又は
複数の抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、mNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
酵素が、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、N-アシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、又はADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7-アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、又はコリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインが、哺乳類(例えばヒト)IL-10、哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及び/又はエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、又はTGF-βから選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドホルモンが、哺乳類グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。
【請求項１４】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラグメント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアスを含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、形質転換された集団の細菌細胞にエピソーム的に導入されたプラスミド中にある、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
形質転換した細菌細胞が、プラスミド保持又は維持システム、例えば、パーティション化システム又は毒素-抗毒素モジュール若しくはシステムを更に含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
異種ポリヌクレオチドが、構成的プロモーターの制御下で発現される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
異種ポリヌクレオチドが、誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
細菌細胞が、グラム陰性細菌株由来である、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
細菌細胞が、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
細菌細胞が、大腸菌由来である、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
投与された細菌細胞の検出可能な部分が、それが投与される組織又は表面に、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、対象の生命の継続期間中にわたり、若しくは上述の期間のうちいずれか2つによって定義される範囲内の期間にわたり、安定して定着する、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
投与された細菌細胞の検出可能な部分が、それが投与される組織又は表面に安定して永久的に定着する、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
投与された細菌細胞の少なくとも又は少なくとも約10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%が、それが投与される組織又は表面に安定して定着する、請求項1から27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細菌細胞が、
i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;
ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;
iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);
iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;
v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);
vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;
vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;
viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む
ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;
x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;
xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は
xii)二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現する、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
対象が、ヒトである、請求項1から29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも又は少なくとも約106、107、108、109、1010、1011、1012、1013個の細菌細胞が投与される、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
供与対象及び受容対象が、同じ個体であり、例えばマイクロバイオームサンプルが、対象にとって自己である、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
供与対象及び受容対象が、異なる個体である、請求項1から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
投与された細菌細胞が、マイクロバイオームサンプルを得たのと同じ組織又は表面に投与される、請求項1から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
マイクロバイオームサンプルが、皮膚又は目から得られ、投与された細菌細胞が、例えば緩衝化された懸濁剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、又は軟膏剤の形態で、対象に外用投与される、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
マイクロバイオームサンプルが、鼻腔から得られ、投与された細菌細胞が、経鼻の経管栄養を介して投与される、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
マイクロバイオームサンプルが、膣から得られ、投与された細菌細胞が、膣内に投与される、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
マイクロバイオームサンプルが、胃腸管から得られ、投与された細菌細胞が、対象に経口又は直腸投与される、請求項1から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
投与された細菌細胞が、胃管を介して、又は食用組成物の形態で対象に経口投与される、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
食用組成物が、投与された細菌細胞を含むゲルカプセルを含むか、又は投与された細菌細胞が、カプセル化されている、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
食用組成物が、ヨーグルト、乳汁、アイスクリーム、野菜ピューレ、フルーツピューレ、シャーベット、及びオートミールからなる群から選択される、請求項39に記載の方法。
【請求項４２】
食用組成物が、飲料である、請求項39に記載の方法。
【請求項４３】
飲料が、緩衝化溶液である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
投与された細菌細胞が、複数回、例えば、毎日、毎週、隔週又は毎月のインターバルで対象に投与される、請求項1から43のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
投与された細菌細胞が、毎日、毎週、隔週又は毎月のインターバルで対象に投与される、請求項1から44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
投与される形質転換した細菌細胞が、受容対象のマイクロバイオームを変更しない、請求項1から45のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に均一な集団であって、細菌の実質的に均一な集団は、哺乳動物及び/又は細菌にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドを発現するように形質転換される、細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項４８】
哺乳動物にとって共生的な細菌の集団が、哺乳動物中又はその上に、永久的に又は長期にわたり、定着することが可能であるか又は定着するように構成される、請求項47に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項４９】
細菌細胞の集団が、哺乳動物中又はその上に、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、哺乳動物の生命の継続期間中にわたり、定着することが可能であるか又は定着するように構成される、請求項47又は48に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５０】
細菌細胞が、
i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;
ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;
iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);
iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;
v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);
vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;
vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;
viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む
ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;
x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;
xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は
xii)二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現する、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない、請求項47から49のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５１】
細菌細胞の集団が、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない、請求項47から50のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５２】
細菌細胞の集団が、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質耐性である、請求項47から51のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５３】
細菌細胞の集団が、臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項47から52のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５４】
細菌細胞が、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、又はロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、又はリファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、又はポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、又はゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、又はピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、又はトブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、又はセフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、又はタブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、又はチエナマイシン)、又はテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、又はチゲサイクリン)から選択される1種
又は複数の臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項53に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５５】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、又はmNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする、請求項47から54のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５６】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする、請求項47から55のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５７】
酵素が、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、N-アシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、又はADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7-アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、又はコリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである、請求項56に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５８】
サイトカインが、哺乳類(例えばヒト)IL-10、哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及び/又はエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、及びTGF-βからなる群から選択される、請求項56に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項５９】
ペプチドホルモンが、哺乳類グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される、請求項56に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６０】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラグメント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする、請求項47から59のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６１】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアスを含む、請求項47から60のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６２】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている、請求項47から61のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６３】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている、請求項62に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６４】
異種ポリヌクレオチドが、細菌細胞中にエピソーム的に配置されたプラスミド中にある、請求項47から61のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６５】
細菌細胞の集団が、プラスミド保持又は維持システム、例えば、パーティション化システム又は毒素-抗毒素モジュール若しくはシステムを更に含む、請求項64に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６６】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される、請求項47から64のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６７】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、グラム陰性細菌株由来である、請求項47から66のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６８】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である、請求項47から67のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項６９】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、大腸菌由来である、請求項47から68のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項７０】
細菌細胞の集団が、凍結乾燥又は低温保存される、請求項47から69のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団。
【請求項７１】
哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に均一な集団を含む、哺乳動物への投与に好適な医薬組成物であって、細菌の集団は、哺乳動物及び/又は細菌にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドを発現するように形質転換される、医薬組成物。
【請求項７２】
哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に均一な集団を含む、哺乳動物が食べることができる組成物であって、細菌細胞の実質的に同種の集団が、哺乳動物及び/又は細菌にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドを発現するように形質転換される、組成物。
【請求項７３】
哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に同種の集団が、請求項1から44のいずれか一項に記載の方法に従って生産される、請求項71又は72に記載の組成物。
【請求項７４】
哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に同種の集団が、哺乳動物中又はその上に、永久的に又は長期にわたり、定着することが可能であるか又は定着するように構成される、請求項71から73のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
細菌細胞の集団が、哺乳動物中又はその上に、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、哺乳動物の生命の継続期間中にわたり、定着することが可能であるか又は定着するように構成される、請求項71から74のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７６】
細菌細胞が、
i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;
ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;
iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);
iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;
v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);
vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;
vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;
viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む
ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;
x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;
xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は
xii)二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現する、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない、請求項71から75のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７７】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない、請求項71から76のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７８】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質耐性である、請求項71から77のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７９】
細菌細胞が、臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項71から78のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８０】
細菌細胞が、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、又はロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、又はリファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、又はポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、又はゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、又はピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、又はトブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、又はセフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、又はタブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、又はチエナマイシン)、又はテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、又はチゲサイクリン)から選択される1種
又は複数の臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない、請求項79に記載の組成物。
【請求項８１】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、又はmNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする、請求項71から80のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする、請求項71から81のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８３】
酵素が、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、N-アシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、又はADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7-アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、又はコリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである、請求項82に記載の組成物。
【請求項８４】
サイトカインが、哺乳類(例えばヒト)IL-10、哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及び/又はエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、及びTGF-βからなる群から選択される、請求項82に記載の組成物。
【請求項８５】
ペプチドホルモンが、哺乳類グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される、請求項82に記載の組成物。
【請求項８６】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラグメント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする、請求項71から81のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８７】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアスを含む、請求項71から86のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８８】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている、請求項71から87のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８９】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている、請求項88に記載の組成物。
【請求項９０】
異種ポリヌクレオチドが、細菌細胞中にエピソーム的に配置されたプラスミド中にある、請求項71から87のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９１】
1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドが、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される、請求項71から90のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９２】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、グラム陰性細菌株由来である、請求項71から91のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９３】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である、請求項71から92のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９４】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、大腸菌由来である、請求項71から93のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９５】
緩衝化溶液又は緩衝化された懸濁液を含む、請求項71から94のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９６】
食用組成物が、細菌細胞の実質的に同種の集団を含むゲルカプセルを含むか、又は投与された細菌細胞が、カプセル化されている、請求項72に記載の組成物。
【請求項９７】
食用組成物が、飲料を含む、請求項72に記載の組成物。
【請求項９８】
食用組成物が、ヨーグルト、乳汁、アイスクリーム、野菜ピューレ、フルーツピューレ、シャーベット、及びオートミールからなる群から選択される、請求項72に記載の組成物。
【請求項９９】
請求項71から98のいずれか一項に記載の1種又は複数の組成物を含む1つ又は複数の容器を含むキット。
【請求項１００】
細菌細胞の実質的に同種の集団が、凍結乾燥される、請求項99に記載のキット。
【請求項１０１】
医薬品として使用するための、請求項47から70のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団、請求項71に記載の医薬組成物、請求項72から98のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項99又は100に記載のキット。
【請求項１０２】
肥満症、糖尿病、がん、例えば口腔がん、食道がん、胃がん、結腸がん、若しくは直腸がん、潰瘍性大腸炎、クローン病、HIV、病原体の感染、例えばシュードモナス属、クロストリジウム属、若しくはサルモネラ属の感染、栄養不良、乳糖不耐症、フェニルケトン尿症、セリアック病、又は脳傷害、例えば外傷性脳傷害、ニューロパチー、認知症、卒中、若しくは脳症、高コレステロール血症、男性不妊症、女性不妊症又は慢性腎疾患の処置、緩和、予防、又は抑制において使用するための、請求項47から70のいずれか一項に記載の細菌細胞の実質的に均一な集団、請求項71に記載の医薬組成物、請求項72から98のいずれか一項に記載の組成物、又は請求項99又は100に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられる2017年4月17日付けで出願された米国仮出願第62/486,068号の合衆国法典第35巻119条(e)に基づく利益を主張する。
【０００２】
政府支援の陳述
この研究は、国立衛生研究所により授与されたDK102902及びDK114536の下での政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
近年のシーケンシング、質量分析及びバイオインフォマティクスにおける進歩により、マイクロバイオームが、これらに限定されないが代謝、炎症、行動及び神経疾患等の宿主の生理学的プロセスに果たす役割の理解が進みつつある(Vuongら、Annu Rev Neurosci. (2017) 40:21-49)[25271724も引用される]。生理学的プロセスをマイクロバイオームに関連付けることは、概念的には刺激的であるが、この分野はまだ生まれたばかりである。研究により、微生物叢と様々な生理学的プロセスとの間の強い関連性が示されているが、明確な機構的関係を示すものはほとんどない。例えば、消化管のマイクロバイオームによって調節される分析物の絶対的な量、加えて消化管上皮からのシグナル伝達分子が、神経行動学的なプロセスに寄与する可能性があるマイクロバイオームの機能の同定を難しくしている。よりよい機構的な理解とより有効なマイクロバイオーム媒介療法を開発するために、消化管のマイクロバイオームの機能的な調節に重点を置いた様々なアプローチが必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公開第2016/0367701号
【特許文献２】米国特許第6,242,194号
【特許文献３】米国特許第8,461,314号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Vuongら、Annu Rev Neurosci. (2017) 40:21-49
【非特許文献２】Rajilic-Stojanovicら、FEMS Microbiol Rev. 2014;38:996-1047
【非特許文献３】Human Microbiome Project Consortium in Nature. (2012)6月13日;486(7402):207-14
【非特許文献４】Lloyd-Price、Genome Med. 2016 Apr 27;8(1):51
【非特許文献５】Green及びSambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press;第4版(2012)
【非特許文献６】Medical Microbiology、第8版、Murray、Rosenthal、及びPfaller著、Elsevier、2015;
【非特許文献７】Medical Microbiology: A Guide to Microbial Infections: Pathogenesis, Immunity, Laboratory Investigation and Control、第19版、Barer、Irving、Swann及びPerera著、Elsevier、2018
【非特許文献８】kazusa.or.jp/codon/
【非特許文献９】Nafissiら、Appl Microbiol Biotechnol. 2014年4月;98(7):2841-51
【非特許文献１０】Yamaichiら、Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) 97(26):14656-61;
【非特許文献１１】Youngrenら、J Bacteriol. 2000年7月;182(14):3924-8;
【非特許文献１２】Dubarryら、J Bacteriol. 2006年2月;188(4):1489-96;
【非特許文献１３】Hanaiら、J. Biol. Chem. (1996) 271:17469-17475
【非特許文献１４】Fernandez-Garciaら、Toxins (Basel). (2016)7月20日;8(7). pii: E227
【非特許文献１５】Fangら、Appl. Environ. Microbiol. (2008) 74(10):3216-3228
【非特許文献１６】Lobato-Marquezら、Front Mol Biosci. 2016年10月17日;3:66
【非特許文献１７】Zielenkiewiczら、J. Bacteriol. (2005) 187(17):6094-6105
【非特許文献１８】Leplaeら、Nucleic Acids Research、(2011) 39(13) 5513-5525
【非特許文献１９】Gradyら、Molecular Microbiology (2003) 47(5):1419-1432
【非特許文献２０】Balzarら、Microbial Cell Factories 2013, 12:26
【非特許文献２１】Raibaudら(1984)Annu. Rev. Genet.18:173
【非特許文献２２】Lozuponeら、Genome Res (2012) 22:1974-1984
【非特許文献２３】Leathamら、Infect. Immun. (2005) 73(12):8039-8049
【非特許文献２４】Mirandaら、Infect. Immun. (2004) 72(3):1666-1676
【非特許文献２５】Leathamら、Infect. Immun. (2009) 77(7):2876-2886
【非特許文献２６】Goodmanら、Cell Host Microbe. 2009年9月17日; 6(3): 279-289
【非特許文献２７】Nougayredeら、Science (2006) 313(5788):848-851
【非特許文献２８】Olierら、Gut Microbes. (2012) 3(6): 501-509
【非特許文献２９】Joyceら、Proc Natl Acad Sci U S A. 2014年5月20日;111(20):7421-6
【非特許文献３０】Yoonら、J Microbiol. 2017年11月;55(11):892-899
【非特許文献３１】Wahlstromら、Cell Metab. 2016年7月12日;24(1):41-50
【非特許文献３２】Quinnら、Dig Liver Dis. 2014年7月;46(6):527-34
【非特許文献３３】Chenら、J Clin Invest. 2014年8月;124(8):3391-406
【非特許文献３４】Takiishiら、J Clin Invest. 2012年5月;122(5):1717-25
【非特許文献３５】Zhengら、Sci Transl Med. 2017年2月8日;9(376)
【非特許文献３６】Hansonら、Gastroenterology. 2014年1月;146(1):210-221
【非特許文献３７】Steidlerら、Science. 2000年8月25日;289(5483):1352-5
【非特許文献３８】Mottaら、Sci Transl Med. 2012年10月31日;4(158):158ra144
【非特許文献３９】Vandenbrouckeら、Gastroenterology. 2004年8月;127(2):502-13
【非特許文献４０】Vandenbrouckeら、Mucosal Immunol. 2010年1月;3(1):49-56
【非特許文献４１】Lagenaurら、Mucosal Immunol. 2011年11月;4(6):648-57
【非特許文献４２】Hwangら、Nat Commun. 2017年4月11日;8:15028;
【非特許文献４３】Itoh, Y.ら、J. Bacteriol. 2005 187:382-387
【非特許文献４４】Forkusら、Sci Rep. 2017年1月17日;7:40695
【非特許文献４５】Blond, A.ら、Eur. J. Biochem. 1999 259:747-755;
【非特許文献４６】Baekら、Biotechnol Bioeng. 2013年10月;110(10):2790-4
【非特許文献４７】Suhら、Nature. 2014年9月18日;513(7518):436-9
【非特許文献４８】Benoitら、Nat Med. 2017年8月;23(8):990-996
【非特許文献４９】Duanら、Diabetes. 2015年5月;64(5):1794-803
【非特許文献５０】Plovierら、Nat Med. 2017年1月;23(1):107-113
【非特許文献５１】Thevaranjanら、Cell Host Microbe. 2017年4月12日;21(4):455-466.e4
【非特許文献５２】Thanisseryら、Anaerobe. 2017年1月;45:86-100
【非特許文献５３】Martinezら、Biochem J. 1995年3月1日;306 (Pt2):589-97
【非特許文献５４】Nunesら、Mol Neurobiol. 2012年1月;45(3):440-54
【非特許文献５５】Yanguas-Casasら、J Cell Physiol. 2017年8月;232(8):2231-2245
【非特許文献５６】Zhengら、J Agric Food Chem. 2017年2月15日;65(6):1178-1185
【非特許文献５７】Shiら、J Ind Microbiol Biotechnol. 2017年7月;44(7):1073-1082
【非特許文献５８】Kaukinen及びLindfors、Dig Dis. 2015;33(2):277-81
【非特許文献５９】Konigら、Sci Rep. 2017年10月12日;7(1):13100
【非特許文献６０】Lloyd V. Allen, Jr.、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版、2012、Pharmaceutical Press
【非特許文献６１】Studier (2005) Protein Purification & Expression
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、治療用ポリペプチドをそれを必要とする哺乳類対象に送達する方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、
a)供与対象から、細菌細胞を含むマイクロバイオームサンプルを得る工程;
b)マイクロバイオームサンプルから細菌細胞を単離する工程であり、単離された細菌細胞は、供与対象にとって共生的な/天然の菌株に由来する、工程;
c)単離された細菌細胞をインビトロで培養して、単離及び培養された細菌細胞の実質的に均一な集団を得る工程;
d)実質的に均一な集団を、細菌及び/又は供与対象にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換する工程であり、1つ又は複数のポリヌクレオチドは、1つ又は複数の治療用ポリペプチドをコードする、工程;及び
e)例えば治療上十分な量で、受容対象に単離及び培養された細菌細胞の実質的に均一な形質転換された集団の少なくとも一部を投与する、又はその投与を引き起こす工程であり、投与される細菌細胞は、哺乳類対象中又はその上に永久的に又は長期にわたり定着するか又は定着するようになっていてもよく、1つ又は複数の治療用ポリペプチドを、例えば哺乳動物で治療作用を発揮するのに十分なレベルで発現する、工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、前記哺乳類対象中又はその上における投与された細菌細胞の定着又は存在を決定及び/又は測定する工程を更に含む。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、身体からの排出物(例えば、便、唾液、粘液、尿、息)、表面の生検又はスワブ(例えば、胃腸(GI)管、口腔、咽頭、鼻腔、泌尿生殖路、皮膚、肛門/直腸、膣、目)、及び病理学的標本(例えば、がん組織、切断された手足、炎症を起こした臓器)からなる群から選択される生体サンプルから得られる。一部の実施形態において、細菌細胞は、病原性の毒素をコードするポリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、細菌細胞又は細菌細胞の集団は、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素(Shiga-like t
oxin)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)のアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、細菌細胞又は細菌細胞の集団は、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質感受性である。一部の実施形態において、細菌細胞は、臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、細菌細胞又は細菌細胞の集団は、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、ロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、ポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン)、セフ
ァロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、セフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、タブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン)、及びテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、チゲサイクリン)から選択される1種又は複数の抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、又はmNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする。一部の実施形態において、酵素は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、Nアシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)のディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、コリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである。一部の実施形態において、サイトカインは、哺乳類(例えばヒト)IL-10及び哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及びエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、及びTGF-βからなる群から選択される。一部の実施形態において、ペプチドホルモンは、哺乳類グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、アッカーマンシア・ムシニフィラ(Akkermansia muciniphila)のAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラ���メント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラム(Nostoc elipsosporum)のシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアス及び/又はコドン最適化を含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、形質転換された集団の細菌細胞にエピソーム的に導入されたプラスミド中にある。一部の実施形態において、形質転換した細菌細胞は、プラスミド保持又は維持システム、例えば、パーティション化システム又は毒素-抗毒素モジュール若しくはシステムを更に含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、構成的プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態において、細菌細胞は、グラム陰性細菌株由来である。一部の実施形態において、細菌細胞は、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ(Eubacterium rectale)、大腸菌(Escherichia coli)、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である。一部の実施形態において、細菌細胞は、大腸菌由来である。一部の実施形態において、投与された細菌細胞の検出可能な部分は、それが投与される組織又は表面に、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、対象の生命の継続期間中にわたり、若しくは上述の期間のうちいずれか2つによって定義される範囲内の期間にわたり、安定して定着する。一部の実施形態において、投与された細菌細胞の検出可能な部分は、それが投与される組織又は表面に安定して永久的に定着する。一部の実施形態において、投与された細菌細胞の少なくとも又は少なくとも約10%、15%、20%、25%
、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%は、それが投与される組織又は表面に安定して定着する。一部の実施形態において、天然/共生宿主細胞は、(i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;(ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;(iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);(iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;(v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);(vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;(vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;(x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;(xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現しない、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない。一部の実施形態において、対象は、ヒトである。一部の実施形態において、少なくとも又は少なくとも約106、107、108、109、1010、1011、1012、1013個の細菌細胞が投与される。一部の実施形態において、供与対象及び受容対象は、同じ個体であり、例えばマイクロバイオームサンプルは、対象にとって自己である。一部の実施形態において、供与対象及び受容対象は、異なる個体である。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、対象と同じ種の哺乳動物由来である。一部の実施形態において、投与された細菌細胞は、マイクロバイオームサンプルを得たのと同じ組織又は表面に投与される。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、皮膚又は目から得られ、細菌細胞の集団は、例えば緩衝化された懸濁剤、ゲル剤、ローション剤、クリーム剤、又は軟膏剤の形態で、対象に外用投与される。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、鼻腔から得られ、投与された細菌細胞は、経鼻の経管栄養を介して投与される。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、膣から得られ、投与された細菌細胞は、膣内に投与される。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、胃腸管から得られ、投与された細菌細胞は、対象に経口又は直腸投与される。一部の実施形態において、投与された細菌細胞は、胃管を介して、又は食用組成物の形態で対象に経口投与される。一部の実施形態において、食用組成物は、投与された細菌細胞を含むゲルカプセルを含むか、又は投与された細菌細胞は、カプセル化されている。一部の実施形態において、食用組成物は、ヨーグルト、乳汁、アイスクリーム、野菜ピューレ、フルーツピューレ、シャーベット、及びオートミールからなる群から選択される。一部の実施形態において、食用組成物は、飲料である。一部の実施形態において、飲料は、緩衝化溶液である。一部の実施形態において、投与された細菌細胞は、複数回、例えば、毎日、毎週、隔週又は毎月のインターバルで対象に投与される。一部の実施形態において、投与された細菌細胞は、毎日、毎週、隔週又は毎月のインターバルで対象に投与される。一部の実施形態において、形質転換した細菌細胞の投与は、受容対象のマイクロバイオームを変更しない。
【０００７】
さらなる態様において、哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に均一な集団であって、細菌の集団は、哺乳動物及び/又は細菌にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドを発現するように形質転換される、集団が提供される。一部の実施形態において、哺乳動物にとって天然の又は共生的な細菌の集団は、哺乳動物中又はその上に、安定して永久的に又は長期にわたり、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、哺乳動物の生命の継続期間中にわたり、定着することが可能である。一部の実施形態において、天然/共生宿主細胞は、(i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;(ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;(iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);(iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;(v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);(vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;(vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;(x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;(xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現しない、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコ��カス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質耐性である。一部の実施形態において、細菌細胞は、臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、細菌細胞は、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマ
イシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、ロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、ポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、セフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、タブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン)、及びテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、チゲサイクリン)から選択される1種又は複数の臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mC
ardinal、又はmNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする。一部の実施形態において、酵素は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、Nアシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、コリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである。一部の実施形態において、サイトカインは、哺乳類(例えばヒト)IL-10及び哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及びエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、及びTGF-βからなる群から選択される。一部の実施形態において、ペプチドホルモンは、哺乳類グルカゴン、グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラグメント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアス及び/又はコドン最適化を含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、細菌細胞中にエピソーム的に配置されたプラスミド中にある。一部の実施形態において、形質転換した細菌細胞は、プラスミド保持又は維持システム、例えば、パーティション化システム又は毒素-抗毒素モジュール若しくはシステムを更に含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態に��いて、細菌細胞の実質的に同種の集団は、グラム陰性細菌株由来である。一部の実施形態において、細菌細胞の実質的に同種の集団は、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である。一部の実施形態において、細菌細胞の実質的に同種の集団は、大腸菌由来である。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、凍結乾燥又は低温保存される。
【０００８】
別の態様において、哺乳動物への投与に好適な、例えば哺乳動物への1つ又は複数の治療用ポリペプチドの送達に好適な医薬組成物が提供される。別の態様において、食用組成物が提供される。一部の実施形態において、上記及びここで記載されるように、組成物は、哺乳動物にとって共生的な細菌細胞の実質的に均一な集団を含み、細菌の集団は、哺乳動物及び/又は細菌にとって異種である1つ又は複数のポリヌクレオチドを発現するように形質転換される。一部の実施形態において、哺乳動物にとって天然の又は共生的な細菌の集団は、上記及びここで記載される方法に従って生産される。一部の実施形態において、哺乳動物にとって共生的な細菌の集団は、哺乳動物中又はその上に、永久的に又は長期にわたり、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、6、7日間、例えば、少なくとも又は少なくとも約1週間、例えば、少なくとも又は少なくとも約2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、哺乳動物の生命の継続期間中にわたり、定着することが可能であるか又は定着するように構成される。一部の実施形態において、天然/共生宿主細胞は、(i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;(ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;(iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);(iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;(v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);(vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;(vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;(x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;(xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現しない、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶��素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対して抗生物質耐性である。一部の実施形態において、細菌細胞又は細菌細胞の集団は、臨床上使用される抗生物質製
剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、細菌細胞又は細菌細胞の集団は、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、ロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、ポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、ゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、セフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、タブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、チエナマイシン)、及びテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、チゲサイクリン)から選択される1種又は複数の臨床上使用される抗生物質製剤に対して抗生物質耐性ではない。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質(mCherry、mEos2、mRuby2、mRuby3、mClover3、mApple、mKate2、mMaple、mCardinal、又はmNeptune)、mTurquoise、又はmVenusをコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、酵素、サイトカイン又はペプチドホルモンをコードする。一部の実施形態において、酵素は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えば乳酸桿菌属由来の胆汁酸塩ヒドロラーゼ、例えばbshA(遺伝子番号3251811)又はbshB(遺伝子番号3252955)、Nアシルホスファチジルエタノールアミン(NAPE)加水分解ホスホリパーゼD、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)、ラクターゼ(ベータ-ガラクトシダーゼ)、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(例えば、ADH1A、ADH1B、ADH1C、ADH2、ADH3、ADH4、ADH5、ADH6、ADH7)、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、ブチレート合成経路酵素、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)、7アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-アルファ-HSDH)、7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7-ベータ-HSDH)、コリルグリシンヒドロラーゼ及びコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼである。一部の実施形態において、サイトカインは、哺乳類(例えばヒト)IL-10及び哺乳類(例えばヒト)IL-27二量体(別々に又は融合タンパク質として発現されるIL27アルファサブユニット及びエプスタイン-バーウイルス誘導3(EBI3)サブユニット)、及びTGF-βからなる群から選択される。一部の実施形態において、ペプチドホルモンは、グルカゴン、哺乳類グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)、哺乳類グルカゴン様ペプチド2(GLP-2)、線維芽細胞増殖因子1(FGF1)、線維芽細胞増殖因子15(FGF15)、線維芽細胞増殖因子19(FGF19)、インスリン、及びプロインスリンからなる群から選択される。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンB、エラフィン、トレフォイル因子1(TFF1)、トレフォイル因子2(TFF2)、トレフォイル因子3(TFF3)、抗TNFα抗体/ナノボディ又はそのフラグメント若しくは単一鎖、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-N又はミクロシンJ25(MccJ25)をコードする。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、単離及び培養された細菌細胞の形質転換された集団における異種タンパク質の発現を改善又は強化するように構成されたコドンバイアス及び/又はコドン最適化を含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、形質転換された集団の細菌細胞の染色体に統合されている。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、細菌のゲノムのattB及び/又はyfgG遺伝子に統合されている。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、細菌細胞中にエピソーム的に配置されたプラスミド中にある。一部の実施形態において、形質転換した細菌細胞は、プラスミド保持又は維持システム、例えば、パーティション化システム又は毒素-抗毒素モジュール若しくはシステムを更に含む。一部の実施形態において、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドは、配列番号2に少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する、発現カセットに統合され、Ptrcプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態において、細菌細胞の実質的に同種の集団は、グラム陰性細菌株由来である。一部の実施形態において、細菌細胞の実質的に同種の集団は、バクテロイデス属(例えば、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属)、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、
コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属からなる群から選択される細菌属由来である。一部の実施形態において、細菌細胞の実質的に同種の集団は、大腸菌由来である。一部の実施形態において、組成物は、緩衝化溶液又は緩衝化された懸濁液を含む。一部の実施形態において、食用組成物は、投与された細菌細胞を含むゲルカプセルを含むか、又は投与された細菌細胞は、カプセル化されている。一部の実施形態において、食用組成物は、飲料を含む。一部の実施形態において、食用組成物は、ヨーグルト、乳汁、アイスクリーム、野菜ピューレ、フルーツピューレ、シャーベット、及びオートミールからなる群から選択される。
【０００９】
さらなる態様において、上記及びここで記載されるように、1種又は複数の組成物を含む1つ又は複数の容器を含むキットが提供される。一部の実施形態において、細菌細胞の集団は、凍結乾燥される。
【００１０】
定義
用語「共生細菌」又は「天然細菌」は、同義的に、哺乳動物のマイクロバイオームから得られ、それに適合又は構成された細菌細胞又は細胞の集団を指す。共生細菌は、定着するように適合されているか、又は哺乳動物の定着のために構成されており(例えば、身体からの排出物(例えば唾液、粘液、尿、又は便)、表面(例えば粘膜性の胃腸管、口/咽頭/鼻孔、泌尿生殖路、皮膚、肛門/直腸、頬/口、又は目)、実験環境での培養に適合又は構成されていない。
【００１１】
「投与すること」は、本明細書で使用される場合、局所及び全身投与、例えば、経腸、非経口、肺、及び外用/経皮投与等を指す。本明細書に記載される方法での使用が見出される操作された天然細菌(ENB)のための投与経路としては、例えば、対象への、経口(per os(P.O.))、直腸(例えば、坐剤としての投与)、膣、鼻又は吸入、外用での接触(例えば、皮膚又は目への)、又は病巣内投与が挙げられる。投与は、非経口及び/又は経粘膜(例えば、経口、鼻、膣、又は直腸)等のあらゆる経路によって行うことができる。投与は、医療従事者によって行ってもよいし、又は自己投与を含む場合もある。
【００１２】
用語「全身投与」及び「全身投与される」は、化合物又は組成物が、循環系を介して医薬作用の標的化部位等の体の部位に送達されるように、哺乳動物に化合物又は組成物を投与する方法を指す。全身投与としては、これらに限定されないが、経口、経鼻、及び/又は直腸内投与が挙げられる。
【００１３】
語句「投与される」は、問題となる薬剤/化合物の対象への投与を管理及び/又は許可する医療専門家(例えば、医師)、又は対象のメディカルケアを管理する人がとる動作を指す。投与されることは、対象ごとの適切な治療又は予防レジメンの診断及び/若しくは決定、並びに/又は特定の薬剤/化合物の処方を含んでいてもよい。このような処方は、例えば、処方フォームの起草、医療記録への注釈等を含んでいてもよい。
【００１４】
用語「共投与すること」又は「同時投与」は、複数のENB集団又は1つ若しくは複数のENB集団と別の活性薬剤を、両方が同時に生理学的作用を達成できるように投与することを指す。しかしながら、2種の薬剤は必ずしも一緒に投与されなくてもよい。ある特定の実施形態において、1種の薬剤の投与は、他方の投与の前に行うことができる。同時の生理学的作用は、循環中に両方の薬剤が同時に存在することを必ずしも必要としない。しかしながら、ある特定の実施形態において、共投与は、典型的には、両方の薬剤が、いずれの所与の用量においても、体内に(例えば血漿中に)、それらの最高血清中濃度のかなりの割合で(例えば、20%又はそれより多く、好ましくは30%又は40%又はそれより多く、より好ましくは50%又は60%又はそれより多く、最も好ましくは70%又は80%又は90%又はそれより多く)同時に存在する状態をもたらす。
【００１５】
用語「有効量」又は「医薬的に有効な量」は、所望の結果をもたらすのに必要な1種又は複数の化合物の量及び/若しくは投薬量、及び/又は投薬レジメン、例えば、哺乳動物において、対象が療法を受ける原因である疾患の状態に関連する1種又は複数の症状を軽減するのに十分な量、又は哺乳動物において重症度を小さくしたり、又は疾患の状態の進行を遅延させたりするのに十分な量(例えば、治療有効量)、哺乳動物において、リスクを低減したり若しくは発病を遅延させたりする、及び/又は疾患の状態の最終的な重症度を低減したりするのに十分な量(例えば、予防有効量)を指す。
【００１６】
用語「処置する」及び「処置」は、本明細書で使用される場合、この用語が適用される疾患若しくは状態のいずれか、又はこのような疾患若しくは状態の1種又は複数の症状の発病を遅延させること、その進行を遅くしたり若しくは逆転させたりすること、その重症度を低減させること、又はそれを緩和若しくは予防することを指す。
【００１７】
用語「軽減すること」は、その病理又は疾患の1種又は複数の症状の低減若しくは消失、及び/又は速度の低減、又はその病理又は疾患の1種又は複数の症状の発病又は重症化の遅延、及び/又はその病理又は疾患の予防を指す。
【００１８】
用語「対象」、「個体」、及び「患者」は、同義的に、哺乳動物、好ましくはヒト又は非ヒト霊長類を指すが、家畜哺乳類(例えば、イヌ又はネコ)、実験用哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット)及び/又は農業用哺乳動物(例えば、ウマ、ウシ、ブタ、又はヒツジ)も指す。様々な実施形態において、対象は、病院、精神科医療施設で医師又は他の医療従事者のケアのもとにある、外来患者としての、又は他の臨床的な状況における、ヒト(例えば、成人男性、成人女性、若年層の男性、若年層の女性、男児、又は女児)であってもよい。ある特定の実施形態において、対象は、医師又は他の医療従事者のケア又は処方が与えられないものであってもよい。
【００１９】
「細菌細胞の実質的に同種の集団」は、本明細書で使用される場合、例えば、全ゲノムシーケンシングによって、又はリボソームRNA16S DNAのシーケンシングによって決定した場合、遺伝学的に少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%同一であることである。
【００２０】
本明細書で使用される場合、操作された天然細菌(ENB)細胞が「安定して定着する」とは、それが投与された内腔又は組織で、又はその近くで、例えば少なくとも3、4、5又は6日、例えば少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、75、100、125週間、又はそれより長く、例えば、対象の生命の継続期間中にわたり、若しくは上述の期間のうちいずれか2つによって定義される範囲内の期間にわたりそれが留まるように、それ自体が定住し分裂する(例えば繁殖する)ことである。
【００２１】
用語「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、その配列が、同じ宿主細胞又は同じ宿主で天然に見出される別の核酸又はポリペプチドの配列と同一ではない核酸又はポリペプチドを指す。「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、細菌細胞及び/又は哺乳類宿主に対して異種であってもよい。
【００２２】
用語「形質転換する」又は「形質転換」は、本明細書で使用される場合、宿主細菌細胞への核酸フラグメントの移入とその結果としての遺伝学的に安定な遺伝を指す。形質転換した核酸フラグメントを含む宿主細菌細胞は、「組換え」又は「トランスジェニック」又は「形質転換した」生物と称される。
【００２３】
用語「治療用ポリペプチド」は、哺乳動物において治療的な薬理活性を有するポリペプチドを指す。
【００２４】
用語「同一な」又は「同一性」パーセントは、2つ又はそれより多くの核酸又はポリペプチド配列の状況において、2つ又はそれより多くの配列又は部分配列が、同じか、又は同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定されたパーセンテージを有することを指し、すなわち、以下の配列比較アルゴリズムの1つを使用して測定した場合、又は手作業でのアライメント及び目視検査によって、比較ウィンドウにわたり、又は指示された領域にわたり比較し、最大限一致するように並べたときに、参照配列、例えばTable 1(表1)に記載される異種ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に対して、特定された領域にわたり、少なくとも又は少なくとも約80%の同一性、例えば少なくとも又は少なくとも約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の同一性を有することを指す。次いでこのような配列は、「実質的に同一」と称される。この定義はまた、試験配列の相補性も指す。同一性は、好ましくは、少なくとも又は少なくとも約25アミノ酸又はヌクレオチドの長さの領域にわたり、例えば、50、100、200、300、400アミノ酸又はヌクレオチドの長さの領域にわたり、又は参照配列の全長にわたり存在する。
【００２５】
配列の比較のために、典型的には1つの配列は、試験配列と比較される参照配列として機能する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを使用してもよいし、又は代替パラメーターを指定してもよい。次いで配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づき参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。核酸及びタンパク質の配列を参照核酸及びタンパク質と比較するために、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズム並びにデフォルトパラメーターが使用される。
【００２６】
2つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという表現は、後述するように、第1の核酸によってコードされたポリペプチドは、第2の核酸によってコードされたポリペプチドに対して生じた抗体と免疫学的に交差反応性を有するということである。したがって、ポリペプチドが、例えば2つのペプチドが保存的置換でのみ異なっている場合、第2のポリペプチドに典型的には実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという別の表現は、後述するように、2つの分子又はそれらの相補物が、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。2つの核酸配列が実質的に同一であるという更に別の表現は、配列を増幅するのに同じプライマーを使用できるということである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】本明細書に記載される方法の概略図を例示する図である。天然(すなわち、共生)細菌は、通常通り発育した野生型宿主(例えばヒト)のマイクロバイオーム(例えば、消化管、皮膚)に新しい機能(例えば、治療用ポリペプチド、例えば胆汁酸塩ヒドロラーゼの送達)を導入するためのベクターとして使用することができる。
【図２】BSHを発現する操作された細菌がどのように神経炎症及び認知に影響を与えることができるかの略図を例示する。胆汁酸(BA)は、マイクロバイオーム-消化管-脳軸の主要な媒介物質である。食事誘発性肥満マウスにおいて、内腔のBA脱コンジュゲーションは、神経炎症及び認知能力に影響を与える。
【図３Ａ】タウロコール酸への胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BSH)の作用を示す図である。BSHは、胆汁酸を脱コンジュゲートし、例えばタウロコール酸(TCA)をコール酸(CA)に変換する。この作用により、胆汁酸は再吸収がより難しくなり、それを消化管のマイクロバイオーム中の他の細菌によって更にプロセシングすることを可能にする。
【図３Ｂ】PBS緩衝液中の細胞を用いたインビトロにおけるTCAのCAへの脱コンジュゲーションによって示した通り、天然大腸菌(ここではENBと特定される)は、BSHを発現するように遺伝子改変されていてもよいことを示す図である。
【図３Ｃ】天然大腸菌(左上)は、GFPを発現するように操作でき(右上)、TDCA(可溶性)をDCA(不溶性-白色のハロー)に脱コンジュゲートできる胆汁酸塩ヒドロラーゼを発現するように更に操作できる(下)ことを示す図である。
【図４Ａ】株AZ-39の遺伝子操作された誘導体でのマウスの定着を示す図である。異なる食事条件(例えば通常の固形食と高脂肪食の両方を供給する条件)での単回の経管栄養(100日までn=12〜16;追加の300日までn=3〜8)の後に、操作された天然大腸菌は1年より長くにわたり安定なレベルで残る。
【図４Ｂ】操作された天然細菌は、消化管全体、特に遠位消化管に定着することを示す図である。遺伝子操作された天然大腸菌は、消化管全体に定着し、大部分が回腸末端部及び盲腸で濃縮される(n=4〜6)。
【図４Ｃ】操作された天然細菌は、マウスにおける正常な体重の増加又は食事誘発性肥満に影響を与えないことを示す図である。遺伝子操作された天然大腸菌の定着は、高脂肪食条件と通常の固形食条件の両方においてマウスの体重に影響を与えなかった(n=12〜16)。ここで、免疫機能が低減した及び無菌マウスにおけるこの遺伝子の発現に関する以前の報告が、BSHは脂肪症に影響を与えると予想されるが、通常通り発育した野生型マウスではそうではないことを示唆したことに留意されたい。
【図４Ｄ】図4Fの要約グラフである。GFPを発現する組換え操作された天然細菌を無菌マウスに定着させたところ、糞の胆汁酸組成に影響はなかった。しかしながら、GFPとBSHの両方を発現する組換え操作された天然細菌は、それよりかなり高いレベルの脱コンジュゲートされた胆汁酸を示した(n=3)。
【図４Ｅ】図4Fの要約グラフである。GFPを発現する組換え操作された天然細菌を無菌マウスに定着させたところ、糞の胆汁酸組成に影響はなかった。しかしながら、GFPとBSHの両方を発現する組換え操作された天然細菌は、それよりかなり高いレベルの脱コンジュゲートされた胆汁酸を示した(n=3)。
【図４Ｆ】BSHを発現する操作された天然大腸菌は、無菌マウスにおいて胆汁酸を脱コンジュゲートすることを示す図である(青色:定着しなかったマウス;緑色:GFPを発現するAZ-39が定着したマウス;赤色:GFPとBSHを発現するAZ-39が定着したマウス)。GFPとBSHの両方を発現する操作された天然細菌(赤色)は、それよりかなり高いレベルの脱コンジュゲートされた胆汁酸、特にTCA及びTbMCAを示した(n=3)。他のコンジュゲートしていない/コンジュゲートした胆汁酸において、有意差はなかった。
【図５−１】図５Ａ〜Ｃ：操作された天然細菌は、消化管のマイクロバイオームの組成を変化させないことを示す図である。組換え操作された天然細菌(BSHを含むか又は含まないかに関係なく)の添加は、定着後の10週間、16Sのシーケンシング及び分析によって検出可能な方法で消化管のマイクロバイオームを変化させない(上のパネルは、加重PCoA、非加重PCoA、及びブレイ-カーティスの距離を示す)。しかしながら、相関的な分析において、バクテロイデス属に関する特定のOTUが、BSHを発現する大腸菌に高度な相関を示すようになったことから、全体的な組成が変化していないとしても、消化管内の細菌間の関係に変化があることが示唆される。  図５Ｂ〜Ｃ：操作された天然細菌は、糞及び血清の胆汁酸プールの両方に影響を与えることを示す図である。糞(上)及び血清(下)の胆汁酸のコレログラム。胆汁酸塩ヒドロラーゼを有する天然細菌の添加は、糞の胆汁酸にわずかな変化を引き起こした(例えば図6を参照)。しかしながら、BSHを有する天然細菌は、血清の胆汁酸において大きな変化を引き起こした。これらのマウスにおいて、血清BAは、コンジュゲートしたBAと脱コンジュゲートしたBAとの間に逆相関を示した。
【図５−２】図５Ａ〜Ｃ：操作された天然細菌は、消化管のマイクロバイオームの組成を変化させないことを示す図である。組換え操作された天然細菌(BSHを含むか又は含まないかに関係なく)の添加は、定着後の10週間、16Sのシーケンシング及び分析によって検出可能な方法で消化管のマイクロバイオームを変化させない(上のパネルは、加重PCoA、非加重PCoA、及びブレイ-カーティスの距離を示す)。しかしながら、相関的な分析において、バクテロイデス属に関する特定のOTUが、BSHを発現する大腸菌に高度な相関を示すようになったことから、全体的な組成が変化していないとしても、消化管内の細菌間の関係に変化があることが示唆される。  図５Ｂ〜Ｃ：操作された天然細菌は、糞及び血清の胆汁酸プールの両方に影響を与えることを示す図である。糞(上)及び血清(下)の胆汁酸のコレログラム。胆汁酸塩ヒドロラーゼを有する天然細菌の添加は、糞の胆汁酸にわずかな変化を引き起こした(例えば図6を参照)。しかしながら、BSHを有する天然細菌は、血清の胆汁酸において大きな変化を引き起こした。これらのマウスにおいて、血清BAは、コンジュゲートしたBAと脱コンジュゲートしたBAとの間に逆相関を示した。
【図６Ａ】操作された天然細菌は、糞の胆汁酸に影響を与えることを示す図である。本発明者らの操作された天然細菌によって影響を受けた糞の胆汁酸の例。BSHを発現するように組換え操作された天然細菌を受容したマウスにおいて、タウロ-ベータ-ムリコール酸(TbMCA;左)及びTCA(右)は、よりかなり低かった。これらのマウスにおいて、TDCA(中央)はよりかなり高かった。DCAは二次胆汁酸であり、DCAの微生物合成は、第1の工程として脱コンジュゲーションを必要とする。
【図６Ｂ】操作された天然細菌は、血清の胆汁酸に影響を与えることを示す図である。血清の胆汁酸では、便の胆汁酸より劇的な差があった。BSHを発現する操作された細菌を受容したマウスにおいて、ベータ-ムリコール酸(bMCA)、タウロ-bMCA、及びオメガ-ムリコール酸(oMCA)のレベルは低減した。
【図７Ａ】BSHを発現する操作された天然細菌(ENB)は、全体的な代謝を変更することを示す図である:BSHを発現する及びBSHを発現しない操作された細菌における呼吸商(VCO2/VO2;RER)の測定。BSHを発現する操作された天然細菌が定着したマウスは、BSHを発現しない操作された天然細菌が定着したマウスより有意に低いRERを有していた。これは、これらのマウスは、炭水化物より多くの脂肪酸をそれらの代謝に優先的に使用することを示唆する。
【図７Ｂ】操作された天然細菌は、宿主の生理機能を変更できることを示す図である。BSHを発現する天然細菌を受容したマウスは、正常な空腹時インスリンレベル(左)を有していた。しかしながら、それらの食後のインスリンレベル(右)は対照コホートより有意に低かったことから、より高いインスリン感受性が示唆される。
【図７Ｃ】BSHを発現する操作された天然細菌は、行動に影響を与えることを示す図である。BSHを発現する操作された天然細菌を含有するマウス(赤色)は、この細菌を有していないマウス(緑色)又はBSH遺伝子を含まない細菌を有するマウス(青色)よりおよそ50%多く運動した。
【図７Ｄ】BSHを発現する操作された天然細菌は、認知に影響を与えることを示す図である。新規物体認識試験において、通常の固形食の全てのマウスが、操作された細菌が定着しているか又は定着していないかに関係なく、新規の物体により長い時間を費やした。しかしながら、以前の研究からわかるように、高脂肪食で維持したマウスは新規の物体と古い物体とを区別できなかったことから、それらマウスの記憶に問題があったことが示唆される。しかしながら、BSHを発現する操作された天然細菌を受容したマウスは、新規の物体に対して正常な関心の増加を示したようであり、したがって記憶機能が回復した。
【図８】BSHを発現するように操作された天然細菌を投与することによって、本発明者らは宿主の生理機能に影響を与えたことを例示する図である。BSHを発現する操作された天然細菌を受容したマウスは、より低い空腹時グルカゴンレベルを有していた。
【図９Ａ】操作された天然細菌が定着した野生型の通常通り発育した通常の固形食のマウスの経口グルコース負荷試験を示す図である。BSHを発現する操作された天然細菌がより低い食後インスリンを引き起こしたが、細菌がBSHを発現するかどうかに関係なく、血清グルコースレベルにおいて差はなかった。
【図９Ｂ】操作された天然細菌が定着した通常通り発育した通常の固形食のob/obマウスの経口グルコース負荷試験を示す図である(青色:AZ51/BSH-、オレンジ色:AZ52/BSH+)。この肥満症/2型糖尿病の動物モデルにおいて、操作された細菌によるBSHの発現がインスリン感受性を有意に改善した。
【図１０】単回の経管栄養後の食物に関係なく操作された天然細菌がマウスに定着することを例示する図である。NFD:無脂肪食、VLFD:超低脂肪食、LFD:低脂肪食。
【図１１】経管栄養後22週間で、操作された天然細菌がBSH活性を保持することを例示する図である。
【図１２】経管栄養のX週間後におけるGFP及びBSH遺伝子発現の保持を例示する図である。BSH活性を有することが期待された単一の単離体のみが、BSH活性を有さなかった(太字)。
【図１３】操作された天然大腸菌の抗生物質感受性を例示する図である。これらの株はベータ-ラクタムに相同な遺伝子を含有しない。セファレキシンに対する同時耐性とカルベニシリンに対する感受性は、PBP突然変異による特異的な耐性を示唆する。
【図１４】定着したマウスからの糞ペレット中の総胆汁酸を例示する図である。BSH遺伝子(AZ-52)の存在は、BSH遺伝子の非存在の場合より有意に大きい便中における胆汁酸の損失を引き起こす(AZ-51;p<0.003)。
【図１５】導入遺伝子取り込みのための染色体のyfgG部位が、210個の全長大腸菌ゲノムのうち208個で保持されることを例示する図である(NCBI GenBank ntデータベース)。直線は無傷の挿入部位を示す;垂直にオフセットされた破線は、その部位での染色体再編成を示す。
【図１６】定着の6カ月後におけるBSHの存在又は非存在に関係なく、細菌の異常成長は、定着に関連しないことを例示する図である。回腸末端部組織を急速冷凍し、粉末化し、総DNAを抽出した。細菌の16Sコピー数と宿主のGAPDHコピー数を定量PCRによって評価し、16Sの発生量を宿主のGAPDHコピー数によって正規化した。
【図１７】操作された天然細菌は、BSHの存在/非存在に関係なく回腸末端部のマイクロバイオームを有意に変更しないことを例示する図である。
【図１８】操作された天然大腸菌は、定着の2カ月後における宿主の便生産を変更しないことを例示する図である。定着したマウスを単独で飼育し、48時間にわたり3時間ごとに便を収集した。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
1.導入
研究者が消化管のマイクロバイオームを機能的に操作し、宿主と微生物との関係のより優れた機構的な理解を達成するためのツールは、ほとんど入手できない。本発明者らは、それらの内腔の生態学への作用、代謝産物と栄養素の流れ、及び最終的には通常通り発育した野生型(CR-WT)マウス(例えば、無菌環境で生育したマウスとは対照的に)における生理機能を調査するための、消化管のマイクロバイオームへの「ノックイン」機能の技術を開発した。本発明者らは、内腔の環境で目的の遺伝子を発現するように扱いやすい天然細菌(実験株又は共生細菌と称されるものとは対照的に)を同定し操作することによってこれを達成することができる。
【００２９】
本明細書に記載される方法及び組成物は、治療的機能が提供されるように共生生物を再捜査することによって、従来のプロバイオティック微生物の問題を回避する。微生物の共生株は、まさにその定義によれば、安定で長期又は永続的な少なくとも1種の特定の哺乳類宿主の定着が可能な生物のリザーバーである。現在のプロバイオティクスは単一の株であり、複数の宿主では使用されているが、広範な集団では大きな成功を収めていない。
【００３０】
公知のプロバイオティック微生物を使用して新しい宿主に定着し、生理学的プロセスを変更することは、難問を提示した。それゆえに、本発明者らは、より大きい信頼度でヒト表面(例えば消化管又は皮膚)に定着させる方法を開発しようとした。本発明の方法は、マイクロバイオーム移植を確実に実行する技術の発見に基づく。簡単に言えば、ヒト対象から単離した共生菌株を培養し、異種ポリヌクレオチドで形質転換して、異種タンパク質を発現させて治療作用を有する株にし、次いで操作された形態で同じ又は異なるヒト対象に投与する(例えば、自己又は同種異系のマイクロバイオーム移植)。本明細書において、本発明者らは、消化管のマイクロバイオームにおける長期の定着と有効な機能的変化が、内腔の環境に新しい遺伝子と機能を導入するためのベクターとして宿主由来の天然細菌を使用することによって達成できることを実証する。これまでにこの方法を使用することに抵抗があったのは、天然細菌を培養及び改変することが困難であるという仮説によるものである。実験株の代わりに天然細菌を使用することによって、本発明者らは、宿主の内腔の環境にすでに適合させた宿主細胞を採用している。これにより、操作された天然細菌(ENB)が定着し、CR-WT宿主に機能的変化を誘導することが可能になる。
【００３１】
本発明者らは、CR-WT宿主由来の扱いやすい天然細菌を同定し、培養し、単離し、有益な機能を付与すると理論付けられた遺伝子でそれを遺伝学的に改変し、次いでCR-WT宿主にENBを再導入することを可能にした。したがって、ENBは、すでに内腔の環境に適合されている。本発明者らの予備的な研究において、本発明者らは、マウス便から単離した天然大腸菌を使用した。大腸菌の細菌操作は、ほとんど全ての実験室によって非常にわずかな資源で実行することができる。大腸菌は一般的な天然細菌であるが、多くの研究者が、実験株に相当な失望があったことからそれらは優れた定着物ではないと仮定していた。しかしながら、本明細書に記載される本発明者らのアプローチを使用して、本発明者らは、異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換され、哺乳動物に治療用ポリペプチドを送達できる操作された細菌宿主細胞を作り出すことに成功した。この戦略は、単一の特定の株が、多くの様々な宿主への定着において高度に変動する問題に対処する。本発明者らは、単一のマウスの便から単離した操作された共生細菌をマウスの消化管に安定して定着させることに成功したことを実証する。
【００３２】
CR-WTマウスでの本発明者らの研究において、本発明者らは、本発明者らの操作された天然細菌(ENB)を使用して内腔の胆汁及び血清胆汁酸を変更して、内腔の胆汁酸(BA)を脱コンジュゲートし、代謝等複数の宿主の生理学的プロセスに影響を与えると考えられる細菌の酵素である胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BSH)をノックインした。代謝に影響を及ぼすことに加えて、腸管内腔におけるBSHの活性化が行動と認知に更に影響を与えたことが発見されたことに本発明者らは驚いた。以前の研究は、BA、神経炎症、及び認知の間の関連を示しており、本明細書に記載される結果は、BAがマイクロバイオーム-消化管-脳軸の媒介物質であるという結論と一致する。
【００３３】
消化管のマイクロバイオームに遺伝子(例えば、胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BHS))をノックインすることによって、本発明者らは、神経炎症を軽減することができる。神経炎症を緩和することによって、本発明者らは、これらに限定されないが、肥満症、2型糖尿病、外傷性脳傷害、認知症、卒中、及び特定の脳症等の病態生理学的な問題を有する宿主を処置することができる。本発明者らは、本明細書において、本発明者らが食事誘発性肥満による神経炎症を有するマウスにおける認知を改善できることを示す。
【００３４】
1.操作された天然/共生細菌を調製する方法
異種ポリヌクレオチドでの形質転換のための治療上好適な操作された天然又は共生細菌を調製するための方法は容易である。
【００３５】
マイクロバイオームサンプルは患者から得られる。マイクロバイオームサンプルは、個体の表面上又は内腔中に安定して定着したあらゆる細菌集団由来であってもよい。安定して定着した細菌群集を有する微生物群集は、体の環境に露出したあらゆる部位、例えば皮膚、上咽頭、口腔、気道、消化管及び/又は女性生殖器官等の上で見出すことができる。したがって、一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、皮膚、鼻咽頭腔、又は口腔(例えば、頬、舌、歯茎、又は喉)、気道、消化管及び/若しくは尿生殖路の、スワブでの拭き取り、フラッシング又は生検採取により得られる。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、糞サンプルから得られる。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、組織生検から得られる(例えば、内視鏡検査、掻き取りによる生検、又はパンチ生検中に得られる)。一部の実施形態において、マイクロバイオームサンプルは、組織表面から得られる(例えば、スワブでの拭き取り又は溶液でのフラッシングによって)。必要に応じて、サンプルは、これらに限定されないが、体液(例えば唾液、粘液、尿、便、又は息)の培養、表面の生検(例えば胃腸管の粘膜生検、口/咽頭/鼻孔の生検、又は泌尿生殖路の生検、皮膚の生検)、スワブ(例えば皮膚、肛門/直腸、頬/口、又は目)、及び/又は病理学的標本(例えばがん組織、切断された手足、又は炎症を起こした臓器)等の一連の方法で収集することができる。マイクロバイオームサンプルは、単離のためにインビトロで1回又は複数の培養を開始するのに十分な数の細胞を含み、例えば、少なくとも又は少なくとも約1、10、100、1000、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、又は1×1015個の細菌細胞を含む。
【００３６】
マイクロバイオームサンプルをホモジナイズし、ホモジネートからの細菌細胞を固体寒天培養基上で培養して、細菌細胞を単離し、それから異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために天然又は共生細菌細胞の実質的に同種の集団を培養する。当業界において公知の技術を採用して、ホモジナイズされたサンプルを、単離及び培養しようとする共生又は天然細菌の種に応じて、選択的な又は指定された固体微生物用培地上に画線する。ヒトマイクロバイオームに見出され、単離して異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換することができる一般的な細菌属としては、例えば、バクテロイデス属、クロストリジウム属、連鎖球菌属、乳酸球菌属、ユーバクテリウム・レクタレ、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィドバクテリウム属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ベイヨネラ属、ヘモフィルス属、モラクセラ属、コリネバクテリウム属及びプロピオニバクテリウム属が挙げられる。これまでに消化管において最も一般的で豊富な細菌属とみなされているバクテロイデス属の種を、アリスティペス属、プレボテラ属、パラプレボテラ属、パラバクテロイデス属、又はオドリバクター属の5つの属に再分類した(Rajilic-Stojanovicら、FEMS Microbiol Rev. 2014;38:996-1047)。必要に応じて、MacConkeyラクトース寒天又はバイオレットレッド胆汁デキストロース寒天を使用して、大腸菌細胞を単離及び培養することができる。De Man-Rogosa-Sharpe寒天を使用して、乳酸桿菌属種の細胞を単離及び培養することができる。胆汁エスクリン寒天を使用して、エンテロコッカス属種の細胞を単離及び培養することができる。ウイルキンス-チャルグレン嫌気性菌寒天を使用して、バクテロイデス属種の細胞を単離及び培養することができる。TPY培地を使用して、ビフィドバクテリウム属種を単離及び培養することができる。乳酸球菌属種には、BM9又はGM17c培地を使用することができる。ヒトマイクロバイオームに一般的に定着する細菌種は、例えば、Human Microbiome Project Consortium in Nature. (2012)6月13日;486(7402):207-14及びLloyd-Price、Genome Med. 2016 Apr 27;8(1):51によって記載されている。
【００３７】
ヒト結腸に一般的に見出され、異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できる細菌種としては、例えば、バクテロイデス・フラジリス(Bacteroides fragilis)、バクテロイデス・メラニノゲニカス(Bacteroides melaninogenicus)、バクテロイデス・オラリス(Bacteroides oralis)、エンテロコッカス・フェカーリス(Enterococcus faecalis)、大腸菌、エンテロバクター属種、クレブシエラ属種、ビフィズス菌(Bifidobacterium bifidum)、スタフィロコッカス・アウレウス、乳酸桿菌属、クロストリジウム・パーフリンジェンス、プロテウス・ミラビリス(Proteus mirabilis)、破傷風菌(Clostridium tetani)、クロストリジウム・セプチカム(Clostridium septicum)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、フィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ(Faecalibacterium prausnitzii)、ペプトストレプトコッカス属種及び/又はペプトコッカス属種が挙げられる。
【００３８】
ヒト便に一般的に見出され、異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できる細菌種としては、例えば、大腸菌、プレボテラ・コプリ(Prevotella copri)、アリスティペス・プトレデニス(Alistipes putredinis)及び/又はバクテロイデス・ブルガタス(Bacteroides vulgatus)が挙げられる。
【００３９】
皮膚部位には、主としてコリネバクテリウム属、プロピオニバクテリウム属、及び/又はスタフィロコッカス属の細菌属が定着し、これらは、単離して異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換することができる。ヒト皮膚上に一般的に見出され、異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できる細菌種としては、例えば、スタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・ワーネリ、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ミチス(Streptococcus mitis)、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)、コリネバクテリウム属種、アシネトバクター・ジョンソニイ(Acinetobacter johnsonii)、及び/又は緑膿菌が挙げられる。
【００４０】
ヒト口腔に一般的に見出され、異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できる細菌種としては、例えば、連鎖球菌属(例えば、ストレプトコッカス・ミチス)、ヘモフィルス属、プレボテラ属、ロチア・ムシラギノーザ(Rothia mucilaginosa)、及び/又はコリネバクテリウム・マツルショッティ(Corynebacterium matruchotii)が挙げられる。
【００４１】
胃の主要な定住細菌であって異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できるものとしては、連鎖球菌属、スタフィロコッカス属、乳酸桿菌属、ヘリコバクター属及び/又はペプトストレプトコッカス属が挙げられる。
【００４２】
ヒト膣に一般的に見出され、異種ポリヌクレオチドでの形質転換のために実質的に単離できる細菌種としては、例えば、乳酸桿菌属(例えば、L.クリスパタス(L.crispatus)、L.イナース(L.iners)、L.ジェンセニイ(L.jensenii)、又はL.ガセリ(L. gasseri)等)、ガードネレラ属及び/又はプレボテラ属が挙げられる。
【００４３】
乳児消化管のマイクロバイオームのバクテロイデス属、パラバクテロイデス属、クロストリジウム属、乳酸桿菌属、ビフィドバクテリウム属、及び/又はフィーカリバクテリウム・プラウスニッツイ等の共生生物の濃縮は、健康なマイクロバイオームの数々の決定要因をもたらす。このような細菌種は、異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換することができる。
【００４４】
候補コロニーを、少なくとも第2の固体寒天培養基上に再び画線して、それを汚染株から実質的に単離する。これらの精製した株の単離株は、低温ストックとして貯蔵することができる。精製した株は、その属/種の同一性、病原性毒素の非存在、及び臨床で使用される抗生物質に対する感受性を確認するための試験に供される。例えばリボソーム16S DNA配列の全て又は一部のPCR及びサンガーシーケンシングを実行して、属/種の同一性を確認することができる。
【００４５】
本方法は、病原性毒素を発現する共生又は天然細菌コロニーを排除するか、又はそれをなくすように選択する。一部の実施形態において、細菌細胞は、いかなる公知の病原性毒素又は選択された病原性毒素も発現しないことが確認される。一部の実施形態において、細菌細胞は、AB毒素、アルファ毒素、炭疽毒素、ボツリヌス毒素、セレウリド、コレステロール依存性細胞溶解素、クロストリジウム属の細胞毒素ファミリー、ボツリヌス菌のC3毒素、クロストリジウム・ディフィシルの毒素A、クロストリジウム・ディフィシルの毒素B、クロストリジウム属のエンテロトキシン、クロストリジウム・パーフリンジェンスのアルファ毒素、クロストリジウム・パーフリンジェンスのベータ毒素、Cry1Ac、Cry6Aa、Cry34Ab1、デルタエンドトキシン、ジフテリア毒素、エンテロトキシン、エンテロトキシンB型、発赤毒素、エクスフォリアチン、フラギリシン、溶血素E、易熱性エンテロトキシン、熱安定性エンテロトキシン、溶血素、HrpZファミリー、ロイコシジン、リステリオリジンO、パントン-バレンタイン型ロイコシジン、無傷の病原性アイランド、フェノール可溶性モジュリン、ニューモリシン、膜孔形成毒素、シュードモナス外毒素、ピオシアニン、抗真核性Rhs毒素、RTX毒素、志賀毒素、志賀毒素様毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのアルファ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのベータ毒素、スタフィロコッカス・アウレウスのデルタ毒素、ストレプトリジン、テタノリジン、テタノスパスミン、毒素性ショック症候群毒素、気管細胞毒素、及び/又はベロ細胞毒素からなる群から選択される1種又は複数の病原性毒素を発現しないことが確認される。
【００４６】
本方法は更に、臨床で使用される抗生物質に対する感度又は感受性(例えば、耐性の欠如)を実証する共生又は天然細菌コロニーを選択する。一部の実施形態において、細菌細胞は、マクロライド系抗生物質(例えば、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、フィダキソマイシン、テリスロマイシン、カルボマイシンA、ジョサマイシン、キタサマイシン、ミデカマイシン/酢酸ミデカマイシン、オレアンドマイシン、ソリスロマイシン、スピラマイシン、トロレアンドマイシン、タイロシン(tylosin/tylocine)、又はロキシスロマイシン)、リファマイシン(例えば、リファンピシン(又はリファンピン)、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、又はリファキシミン)、ポリミキシン(例えば、ポリミキシンB、又はポリミキシンE(コリスチン))、キノロン抗生物質(例えば、ナリジクス酸、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、グレパフロキサシン、トロバフロキサシン、スパルフロキサシン、テマフロキサシン、モキシフロキサシン、ガチフロキサシン、又はゲミフロキサシン)、ベータ-ラクタム(例えば、ペニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、テモシリン、アモキシリン、アンピシリン、メシリナム、カルベニシリン、チカルシリン、アズロシリン、メズロシリン、又はピペラシリン)、アミノグリコシド(例えば、アミカシン、ゲンタマイシン、ネオマイシン、ストレプトマイシン、又はトブラマイシン)、セファロスポリン(例えば、セファドロキシル、セファゾリン、セファレキシン、セファクロル、セフォキシチン、セフプロジル、セフロキシム、ロラカルベフ、セフィキシム、セフジニル、セフジトレン、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフェピム、又はセフトビプロール)、モノバクタム(例えば、アズトレオナム、チゲモナム、ノカルジシンA、又はタブトキシニンβ-ラクタム)、カルバペネム(例えば、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、ファロペネム、イミペネム、メロペネム、パニペネム、ラズペネム、テビペネム、又はチエナマイシン)、及び/又はテトラサイクリン(例えば、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサ
イクリン、デメクロサイクリン、ライムサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、ロリテトラサイクリン、又はチゲサイクリン)からなる群から選択される1種又は複数の抗生物質製剤に感度又は感受性を有すること(例えば、耐性の欠如)が確認される。一般的に、精製した天然細菌コロニーの異種ポリヌクレオチドでの形質転換は、形質転換した細菌細胞の選択に使用される1種又は複数の抗生物質製剤に対する抗生物質耐性、例えば、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン及び/又はトリメトプリムに対する耐性を付与する。
【００４７】
公知の病理学的毒素を発現せず、臨床で重要な抗生物質製剤に感受性を有さないことが確認された単離コロニーを、細菌及び/又は意図した宿主にとって異種の1種又は複数のタンパク質をコードする1つ又は複数のポリヌクレオチドで形質転換する。一部の実施形態において、異種タンパク質、例えば蛍光タンパク質は、検出のために使用される。一部の実施形態において、異種タンパク質は、以下で更に詳細に説明されるような治療用ポリペプチドである。
【００４８】
天然/共生細菌の単離された実質的に同種のコロニーは、当業界において公知の技術を使用して形質転換することができる。このような技術は、例えば、Green及びSambrook、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press;第4版(2012)に記載される。目的の細菌種の選択及び同定をガイドするための臨床微生物学分類マニュアルとしては、例えば、Medical Microbiology、第8版、Murray、Rosenthal、及びPfaller著、Elsevier、2015;及びMedical Microbiology: A Guide to Microbial Infections: Pathogenesis, Immunity, Laboratory Investigation and Control、第19版、Barer、Irving、Swann及びPerera著、Elsevier、2018が挙げられる。
【００４９】
天然/共生細菌の単離された集団を、形質転換、例えば遺伝子改変して、1つ又は複数の目的の異種ポリペプチド、例えば、Table 1(表1)に列挙した1種又は複数の治療用ポリペプチド及び/又は蛍光タンパク質等の検出可能なタンパク質を発現させる。
【００５０】
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ベクター、好ましくは発現ベクターに導入されていてもよい。「ベクター」は、連結させた別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。発現ベクターは、1つ又は複数の調節配列を含み、それが作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示する。「作動可能に連結した」は、ヌクレオチド配列の発現が可能になるように(例えば、インビトロでの転写/翻訳系で、又はベクターが宿主細胞に導入されている場合は宿主細胞で)目的のヌクレオチド配列が調節配列に連結されていることを意図する。用語「調節配列」は、制御可能な転写プロモーター、オペレーター、エンハンサー、転写ターミネーター、及び他の発現調節エレメント、例えば翻訳制御配列(例えば、シャイン-ダルガノコンセンサス配列、開始及び終止コドン)を含むことが意図される。これらの調節配列は、例えば使用される宿主細胞に応じて異なると予想される。
【００５１】
異種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、天然/共生細菌の宿主細胞における発現の改善のためにコドンバイアスがかかっていてもよい。単離及び形質転換された、本明細書に記載される共生又は天然細菌の宿主細胞の属及び種に好ましいコドン使用頻度は公知であり、利用可能なコドン使用頻度データベースで、例えばkazusa.or.jp/codon/に記載されている。
【００５２】
ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製することができ(エピソームのベクター)、又は宿主細胞のゲノムに統合され、宿主ゲノムと共に複製される場合もある(非エピソーム性哺乳類ベクター)。統合ベクターは、典型的には、ベクター中の相同なDNAと細菌染色体との間で組換えを起こすことができる、細菌染色体に相同な少なくとも1つの配列を含有する。また統合ベクターは、バクテリオファージ又はトランスポゾン配列を含んでいてもよい。エピソームのベクター又はプラスミドは、追加のDNAセグメントをライゲートできる環状の二本鎖DNAループである。組換えDNA技術を使用する場合、宿主中での安定な維持が可能なプラスミドは、一般的に、発現ベクターの好ましい形態である。有用な例示的なバクテリオファージ組換え系は、例えば、Nafissiら、Appl Microbiol Biotechnol. 2014年4月;98(7):2841-51に記載されている。さらなる有用なバクテリオファージ送達系は、例えば米国特許公開第2016/0367701号に記載される。共生成長は、プラスミド維持に有害な作用を有する場合がある。必要に応じて、形質転換した共生/天然細菌の宿主細胞中でのプラスミドの維持又は保持を容易にしたり又は促進したりすることは、当業界において公知の方法を使用して達成することができる。このようなプラスミドの保持又は維持戦略としては、これらに限定されないが、例えば、パーティション化システム(例えば、parABS;例えば、Yamaichiら、Proc Natl Acad Sci U S A. (2000) 97(26):14656-61; Youngrenら、J Bacteriol. 2000年7月;182(14):3924-8; Dubarryら、J Bacteriol. 2006年2月;188(4):1489-96;及びHanaiら、J. Biol. Chem. (1996) 271:17469-17475を参照)、又は毒素-抗毒素モジュール又はシステム(例えば、ccdAB、hok-sok;例えば、Fernandez-Garciaら、Toxins (Basel). (2016)7月20日;8(7). pii: E227); Fangら、Appl. Environ. Microbiol. (2008) 74(10):3216-3228; Lobato-Marquezら、Front Mol Biosci. 2016年10月17日;3:66; Zielenkiewiczら、J. Bacteriol. (2005) 187(17):6094-6105; Leplaeら、Nucleic Acids Research、(2011) 39(13) 5513-5525及びGradyら、Molecular Microbiology (2003) 47(5):1419-1432を参照)が挙げられる。
【００５３】
調節配列としては、ヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものに加えて、特定の環境条件下のみでのヌクレオチド配列の誘導性発現を指示するものが挙げられる。細菌プロモーターは、細菌RNAポリメラーゼを結合させ、コード配列(例えば、構造遺伝子)のmRNAへの下流(3')転写を開始させることが可能なあらゆるDNA配列である。プロモーターは、転写開始領域を有すると予想され、これは通常、コード配列の5'末端の近位に設置される。この転写開始領域は、典型的には、RNAポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第2のドメインを有していてもよく、これは、RNA合成が始まる隣接するRNAポリメラーゼ結合部位とオーバーラップしていてもよい。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターと結合し、それによって特異的な遺伝子の転写を阻害する可能性があるため、オペレーターは、負に制御された(誘導性)転写を許容する。構成的発現は、オペレーター等の負の調節エレメントの非存在下で起こる場合もある。加えて、正の制御は、遺伝子活性化タンパク質結合配列によって達成することができ、これは通常、存在する場合、RNAポリメラーゼ結合配列の近位(5')にある。形質転換した天然/共生細菌細胞中で異種ポリヌクレオチドを発現するための例示的な有用なレギュレーター/プロモーター系としては、これらに限定されないが、例えば、XylS/Pm(野生型)、XylS/PmML1-17(Pmバリアント)、LacI/PT7lac、LacI/Ptrc及び/又はAraC/PBADが挙げられる。Balzarら、Microbial Cell Factories 2013, 12:26を参照されたい。
【００５４】
遺伝子活性化タンパク質の例は、大腸菌におけるlacオペロンの転写開始を助けるカタボライト活性化タンパク質(CAP)である(Raibaudら(1984)Annu. Rev. Genet.18:173)。それゆえに発現の制御は正又は負のいずれかであり、そのため転写は強化されるか又は低減されるかのいずれかであり得る。正及び負の調節エレメントの他の例は当業界において周知である。タンパク質発現系に含めることができる様々なプロモーターとしては、これらに限定されないが、T7/LacOハイブリッドプロモーター、trpプロモーター、T7プロモーター、lacプロモーター、p6プロモーター、及びバクテリオファージラムダプロモーターが挙げられる。本発明を行うのに、天然のプロモーター又は異種プロモーターを含むあらゆる好適なプロモーターを使用することができる。異種プロモーターは、構成的に活性であってもよいし、又は誘導性であってもよい。異種プロモーターの非限定的な例は、Kullen及びKlaenhammerの米国特許第6,242,194号で示されている。
【００５５】
「構成的プロモーター」は、その制御下であるか及び/又はそれに作動可能に連結したコード配列又は遺伝子の連続的な転写を容易にすることが可能なプロモーターを指す。例示的な有用な構成的プロモーターとしては、これらに限定されないが、例えば、BBa_J23100、構成的大腸菌σSプロモーター(例えば、osmYプロモーター(International Genetically Engineered Machine (iGEM)レジストリの標準的な生物学的部分の名称は、BBa_J45992;BBa_J45993である))、構成的大腸菌σ32プロモーター(例えば、htpGヒートショックプロモーター(BBa_J45504))、構成的大腸菌σ70プロモーター(例えば、lacqプロモーター(BBa_J54200;BBa_J56015)、大腸菌CreABCDリン酸感知オペロンプロモーター(BBa_J64951)、GlnRSプロモーター(BBa_K088007)、lacZプロモーター(BBa_K119000;BBa_K119001);M13K07遺伝子Iプロモーター(BBa_M13101);M13K07遺伝子IIプロモーター(BBa_M13102)、M13K07遺伝子IIIプロモーター(BBa_M13103)、M13K07遺伝子IVプロモーター(BBa_M13104)、M13K07遺伝子Vプロモーター(BBa_M13105)、M13K07遺伝子VIプロモーター(BBa_M13106)、M13K07遺伝子VIIIプロモーター(BBa_M13108)、M13110(BBa_M13110))、構成的バチルス・ズブチリスσAプロモーター(例えば、プロモーターveg(BBa_K143013)、プロモーター43(BBa_K143013)、PliaG(BBa_K823000)、PlepA(BBa_K823002)、Pveg(BBa_K823003))、構成的バチルス・ズブチリスσBプロモーター(例えば、プロモーターctc(BBa_K143010)、プロモーターgsiB(BBa_K143011))、サルモネラ属プロモーター(例えば、サルモネラ属由来のPspv2(BBa_K112706)、サルモネラ属由来のPspv(BBa_K112707))、バクテリオファージT7プロモーター(例えば、T7プロモーター(BBa_I712074;BBa_I719005;BBa_J34814;BBa_J64997;BBa_K113010;BBa_K113011;BBa_K113012;BBa_R0085;BBa_R0180;BBa_R0181;BBa_R0182;BBa_R0183;BBa_Z0251;BBa_Z0252;BBa_Z0253))、及び/又はバクテリオファージSP6プロモーター(例えば、SP6プロモーター(BBa_J64998))が挙げられる。
【００５６】
有用な誘導性プロモーターの例としては、これらに限定されないが、FNRプロモーター、ParaCプロモーター、ParaBADプロモーター、プロピオン酸プロモーター、及び/又はPTetRプロモーターが挙げられる。
【００５７】
哺乳類支配の長期間にわたる又は永続的な定着の能力(例えば、哺乳類マイクロバイオームへの再導入を成功させる能力)を維持するために、1つ又は複数の異種ポリペプチドを発現するように形質転換された天然/共生細菌の集団は、実験室での又はインビトロでの培養環境に適合されていない。ENBは、可能な限り分裂を少なくするために、実験環境においてインビトロで培養される。一部の実施形態において、ENBは、供与対象の外部の実験環境において、受容対象への投与前に、30日又はそれ未満にわたり、例えば25、20、15、10日又はそれ未満にわたりインビトロで培養される。一部の実施形態において、ENBのインビトロにおける合計成長時間は、供与対象からの収集と受容対象への投与の間、約14日又はそれ未満、例えば13、12、11、10、9、8、7日又はそれ未満である。このようなインビトロでの成長時間又は培養時間の計算は、一般的に、細菌細胞が貯蔵される(例えば、低温保存又は凍結乾燥される)時間を含まず、1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドの形質転換又は導入にかかる時間を含む。
【００５８】
一部の実施形態において、天然/共生宿主細胞は、(i)スクロース、キシロース、d-マルトース、N-アセチル-d-グルコサミン、d-ガラクトース、及びd-リボースからなる群から選択される1種又は複数の炭水化物を代謝することが可能である;(ii)解糖系の基質と糖新生の基質の両方を利用する;(iii)非運動性である(例えば、機能しない鞭毛を有し、これは例えばflhDCオペロンの突然変異に起因する);(iv)リボース-5-リン酸を生産することが可能である;(v)ビタミンB12(シアノコバラミン)が欠失した規定培地中で成長することができる(例えばビタミンB12原栄養体が実証されている);(vi)UDP-グルコース-4-エピメラーゼ及び/又はグリコシルトランスフェラーゼを発現する;(vii)トリプトファンシンターゼ遺伝子のβサブユニットをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(viii)プロピオン酸CoA-トランスフェラーゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含む;(ix)莢膜多糖(CPS)4(CPS4)を発現する;(x)rnf様オキシドレダクターゼ複合体を発現する;(xi)トリプトファンを異化して、インドール及び他のインドール代謝産物、例えば、インドール-3-プロピオネート及びインドール-3-アルデヒドを生じる;並びに/又は二本鎖DNAの破断を誘導するいかなる物質も生産しない、例えば、巨大なモジュール式の非リボソームペプチド及びポリケチドシンターゼをコードするゲノムアイランドを有さない、ハイブリッドのペプチド-ポリケチド遺伝毒性物質を発現しない、及び/若しくは活性clbA遺伝子を有さない。哺乳動物上又はその中に安定して定着する共生細菌の能力に寄与する遺伝子型及び表現型は、例えば、Lozuponeら、Genome Res (2012) 22:1974-1984; Leathamら、Infect. Immun. (2005) 73(12):8039-8049;Mirandaら、Infect. Immun. (2004) 72(3):1666-1676; Leathamら、Infect. Immun. (2009) 77(7):2876-2886及びGoodmanら、Cell Host Microbe. 2009年9月17日; 6(3): 279-289に記載されている。他者は、実験室に適合した大腸菌株、例えば、Nissle 1917は、DNA二本鎖破断を誘導することを見出した。例えば、Nougayredeら、Science (2006) 313(5788):848-851;及びOlierら、Gut Microbes. (2012) 3(6): 501-509を参照されたい。1つ又は複数の異種ポリペプチドを発現するように形質転換された天然/共生細菌の集団は、長期間の貯蔵のために低温保存又は凍結乾燥することができる。
【００５９】
2.処置、緩和及び/又は予防に供される状態
ENBによって発現される異種ポリヌクレオチド及び投与経路に応じて、本明細書に記載されるENBは、Table 1(表1)に要約したような多数の疾患の状態を処置又は予防することにおいて用途がある。
【００６０】
例えば、一部の実施形態において、胆汁酸塩ヒドロラーゼ(例えば乳酸桿菌属又はビフィドバクテリウム属由来)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、肥満症/2型糖尿病、慢性腎疾患、認知機能低下/欠陥(例えば、外傷性脳傷害、認知症、卒中、肝性脳症、乳児の無酸素性脳傷害による)、高コレステロール血症、男性不妊症、女性不妊症、C.ディフィシル感染によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。一部の実施形態において、異種ポリヌクレオチドは、GenBank:ACL98194.1(ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)のBSH);NCBI参照配列:YP_193782.1(ラクトバチルス・アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)のbshA);NCBI参照配列:YP_193954.1(ラクトバチルス・アシドフィラスのbshB);又は遺伝子番号:31838777(ビフィドバクテリウム・テルモフィルム(Bifidobacterium thermophilum)のRBL67コンジュゲート胆汁酸塩ヒドロラーゼD805_RS01800)に、少なくとも又は少なくとも約80%、85%、90%、95%、97%、99%又は100%の配列同一性を有する胆汁酸塩ヒドロラーゼをコードする。
【００６１】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)スルホトランスフェラーゼファミリー2Aメンバー1(SULT2A1)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、肥満症/2型糖尿病、高コレステロール血症、非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD)及び認知症/認知機能低下によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)NAPE加水分解ホスホリパーゼD(NAPEPLD)、FGF1、FGF15、FGF19及び/又はグルカゴン(glucacon)(GLP-1)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、肥満症/2型糖尿病によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６３】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)IL-10、TGFβ、IL-27二量体及び/又は抗TNFα抗体を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の1つ又は複数の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、自己免疫疾患、例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、1型又は自己免疫性糖尿病によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６４】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)トレフォイル因子(例えば、TFF1、TFF2及び/又はTFF3)又はペプチダーゼ阻害剤3(PI3)又はエラフィン(Serpina1c)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、炎症性疾患、例えば、口腔粘膜炎、潰瘍性大腸炎、クローン病によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６５】
一部の実施形態において、ビブリオ・バルニフィカスのフラジェリンBを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、がん、例えば、消化管のがん、例えば、口腔がん、食道がん、胃がん、結腸がん、又は直腸がんによって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６６】
一部の実施形態において、ノストック・エリプソスポラムのシアノビリン-Nを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、及び/又は尿生殖路に投与して、HIVによって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６７】
一部の実施形態において、アクチノバチルス・アクチノミセテムコミタンスのディスパーシンB(DspB)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、緑膿菌感染によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６８】
一部の実施形態において、ミクロシンJ25(MccJ25)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、サルモネラ・エンテリカ感染によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００６９】
一部の実施形態において、コリルグリシンヒドロラーゼ及び/又はコール酸7アルファ-デヒドロキシラーゼを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、クロストリジウム・ディフィシル感染によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７０】
一部の実施形態において、アッカーマンシア・ムシニフィラのAmuc_1100*を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、非アルコール性脂肪性肝炎(NAFLD)及び/又は加齢/老化によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７１】
一部の実施形態において、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ(BAAT)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、栄養不良によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７２】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)ラクターゼを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、乳糖不耐症によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７３】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)フェニルアラニンヒドロキシラーゼを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、フェニルケトン尿症(phenylketouria)によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７４】
一部の実施形態において、哺乳類(例えばヒト)アルコールデヒドロゲナーゼを発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、アルコール不耐性/毒性によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７５】
一部の実施形態において、アスペルギルス・ニガー由来のプロリルエンドプロテアーゼ(AN-PEP)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、セリアック病によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７６】
一部の実施形態において、7-アルファ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(hdhA)及び/又は7ベータ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β-HSDH;EC1.1.1.201)を発現するように形質転換された天然/共生細菌細胞の集団は、消化管に、例えば経口投与及び/又は直腸投与して、外傷性脳傷害、認知症/認知機能低下、肝性脳症、乳児の無酸素性脳傷害によって引き起こされるか又はそれに関連する1種又は複数の症状を軽減する、緩和する、低減する、抑制する、回復させる、及び/又は予防することができる。
【００７７】
このような療法に供される哺乳動物は、症状を呈していてもよいし、又は無症状であってもよい。哺乳動物は、家族歴を有していてもよいし、又は疾患の状態に関する決定された遺伝学的リスクを有していてもよい。哺乳動物は、成体、若年、子供又は乳児であってもよい。
【００７８】
消化管に送達されると、操作された天然細菌(ENB)は、治療用ポリペプチドの存在又は非存在に関係なく、胃腸のマイクロバイオーム、例えば回腸末端部のマイクロバイオームを有意に変更しない。これは、例えばENB投与の前及び後に、分析、例えばマイクロバイオームのリボソーム16S DNAのシーケンシングによって確認することができる。したがって、一部の実施形態において、対象は、このような療法が必要な対象のクラス内の対象であると選択又は同定され、選択又は同定は、臨床的又は診断的な評価によって行うことができる。
【００７９】
【表１Ａ】
2020516318.tif 000003
【００８０】
【表１Ｂ】
2020516318.tif 000004
【００８１】
【表１Ｃ】
2020516318.tif 000005
【００８２】
【表１Ｄ】
2020516318.tif 000006
【００８３】
【表１Ｅ】
2020516318.tif 000007
【００８４】
【表１Ｆ】
2020516318.tif 000008
【００８５】
【表１Ｇ】
2020516318.tif 000009
【００８６】
【表１Ｈ】
2020516318.tif 000010
【００８７】
3.製剤及び投与
異種ポリヌクレオチド(ENB)を発現するように形質転換された天然/共生細菌は、それを必要とするヒト及び他の哺乳類対象への投与のための細菌組成物に製剤化することができる。一般的に、細菌組成物は、最終産物を生産するために、追加の活性物質及び/又は不活性材料と組み合わされ、このような最終産物は、単一の投薬量単位の形態であってもよいし、又は複数回投与の様式であってもよい。一部の実施形態において、細菌組成物は、本明細書に記載される1種又は複数のENB集団で構成される。一部の実施形態において、細菌組成物は、1種又は複数のENB集団及び1種又は複数のプレバイオティックで構成される。
【００８８】
組成物は、固体又は液体で投与されるかどうかに応じて異なるタイプの担体を含んでいてもよい。ENB組成物は、経口、膣内、直腸内、外用(例えば、目又は結膜等に)、腫瘍内、小胞点滴注入を介して(例えば、膀胱に)、病巣内、鼻腔内、外用、又は頬側に投与することができる。様々な実施形態において、組成物は、例えば、食物、ドリンク、カプセル、経管栄養、浣腸、坐剤、輸注、連続的な輸注、標的細胞を直接浸す局所的な灌流を介して、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物(例えば、リポソーム)中で、エアロゾルとして、又は当業者公知と予想される他の方法若しくは前述のもののあらゆる組合せによって送達することができる(例えば、その全体が参照により本明細書に明示的に組み入れられるLloyd V. Allen, Jr.、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第22版、2012、Pharmaceutical Pressを参照)。
【００８９】
一部の実施形態において、組成物は、少なくとも1種のプレバイオティック炭水化物を含む。「炭水化物」は、糖又は糖のポリマーを指す。用語「糖」、「多糖」、「炭水化物」、及び「オリゴ糖」は、同義的に使用することができる。ほとんどの炭水化物は、多くのヒドロキシル基を有するアルデヒド又はケトンであり、通常、分子の各炭素原子につき1個のヒドロキシル基を有する。炭水化物は、一般的に、分子式CnH2nOnを有する。炭水化物は、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、又は多糖であってもよい。ほとんどの基礎となる炭水化物は、グルコース、スクロース、ガラクトース、マンノース、リボース、アラビノース、キシロース、及びフルクトース等の単糖である。二糖は、2個の単糖が合体したものである。例示的な二糖としては、スクロース、マルトース、セロビオース、及びラクトースが挙げられる。典型的には、オリゴ糖は、3〜6個の単糖単位を含み(例えば、ラフィノース、又はスタキオース)、多糖は、6個又はそれより多くの単糖単位を含む。例示的な多糖としては、デンプン、グリコーゲン、及び/又はセルロースが挙げられる。炭水化物は、改変された糖単位、例えば、ヒドロキシル基が除去された2'-デオキシリボース、ヒドロキシル基がフッ素で置き換えられた2'-フルオロリボース、又はN-アセチルグルコサミン、グルコースの窒素含有形態(例えば、2'-フルオロリボース、デオキシリボース、及び/又はヘキソース)を含有していてもよい。炭水化物は、多くの様々な形態、例えば、配座異性体、環式形態、非環式形態、立体異性体、互変異性体、アノマー、及び/又は異性体で存在することができる。
【００９０】
一部の実施形態において、組成物は、少なくとも1種の脂質を含む。「脂質」は、本明細書で使用される場合、脂肪、油、トリグリセリド、コレステロール、リン脂質、遊離脂肪酸等のあらゆる形態の脂肪酸を含む。脂肪、油及び脂肪酸は、飽和、不飽和(シス又はトランス)又は部分的に不飽和(シス又はトランス)であってもよい。一部の実施形態において、脂質は、ラウリン酸(12:0)、ミリスチン酸(14:0)、パルミチン酸(16:0)、パルミトレイン酸(16:1)、マルガリン酸(17:0)、ヘプタデセン酸(17:1)、ステアリン酸(18:0)、オレイン酸(18:1)、リノール酸(18:2)、リノレン酸(18:3)、オクタデカテトラエン酸(18:4)、アラキジン酸(20:0)、エイコセン酸(20:1)、エイコサジエン酸(20:2)、エイコサテトラエン酸(20:4)、エイコサペンタエン酸(20:5)(EPA)、ドコサン酸(22:0)、ドコセン酸(22:1)、ドコサペンタエン酸(22:5)、ドコサヘキサ塩酸(22:6)(DHA)、及び/又はテトラコサン酸(24:0)から選択される少なくとも1種の脂肪酸を含む。他の実施形態において、組成物は、少なくとも1種の変性した脂質、例えば調理によって変性した脂質を含む。
【００９１】
一部の実施形態において、組成物は、少なくとも1種の補助的な無機物質又は無機物質源を含む。無機物質の例としては、これらに限定されないが、塩化物、ナトリウム、カルシウム、鉄、クロム、銅、ヨウ素、亜鉛、マグネシウム、マンガン、モリブデン、リン、カリウム、及び/又はセレニウムが挙げられる。前述の無機物質のいずれかの好適な形態としては、可溶性無機塩、わずかに可溶性の無機塩、不溶性無機塩、キレート化された無機物質、無機物質複合体、非反応性の無機物質、例えばカルボニル無機物質、及び/又は還元無機物質、並びにそれらの組合せが挙げられる。
【００９２】
ある特定の実施形態において、組成物は、少なくとも1種の補助的なビタミン及び/又は抗酸化剤を含む。少なくとも1種のビタミンは、脂溶性ビタミンであってもよいし、又は水溶性ビタミンであってもよい。好適なビタミンとしては、これらに限定されないが、ビタミンC、ビタミンA、ビタミンE、ビタミンB12、ビタミンK、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンD、ビタミンB6、葉酸、ピリドキシン、チアミン、パントテン酸、及び/又はビオチンが挙げられる。前述のもののいずれかの好適な形態は、ビタミンの塩、ビタミンの誘導体、ビタミンと同じ又は類似の活性を有する化合物、及びビタミンの代謝産物である。
【００９３】
他の実施形態において、組成物は、賦形剤を含む。好適な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定剤、結合剤、圧縮剤、潤滑剤、分散促進剤、崩壊剤、矯味剤、甘味料、及び/又は着色剤が挙げられる。
【００９４】
別の実施形態において、賦形剤は、緩衝剤である。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、及び/又は炭酸水素カルシウムが挙げられる。
【００９５】
一部の実施形態において、賦形剤は、保存剤を含む。好適な保存剤の非限定的な例としては、抗酸化剤、例えばアルファ-トコフェロール及びアスコルビン酸塩、並びに抗微生物剤、例えばパラベン、クロロブタノール、及び/又はフェノールが挙げられる。
【００９６】
製剤が嫌気性菌株を含有する場合、医薬製剤及び賦形剤は、酸素への菌株の曝露を防ぐように選択することができる。
【００９７】
他の実施形態において、組成物は、賦形剤として結合剤を含む。好適な結合剤の非限定的な例としては、デンプン、アルファ化デンプン、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルオキソアゾリドン(polyvinyloxoazolidone)、ポリビニルアルコール、C12〜C18脂肪酸アルコール、ポリエチレングリコール、ポリオール、糖、又はオリゴ糖、及びそれらの組合せが挙げられる。
【００９８】
別の実施形態において、組成物は、賦形剤として潤滑剤を含む。好適な潤滑剤の非限定的な例としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、硬化植物油、ステロテックス(Sterotex)、ポリオキシエチレンモノステアレート、タルク、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、及び/又は軽油が挙げられる。
【００９９】
他の実施形態において、組成物は、賦形剤として分散促進剤を含む。好適な分散剤の非限定的な例としては、デンプン、アルギン酸、ポリビニルピロリドン、グアールガム、カオリン、ベントナイト、精製木材セルロース、デンプングリコール酸ナトリウム、イソアモルファスシリケート(isoamorphous silicate)、及び/又は高HLB乳化剤界面活性剤としての微結晶性セルロースが挙げられる。
【０１００】
一部の実施形態において、組成物は、賦形剤として崩壊剤を含む。他の実施形態において、崩壊剤は、非発泡性崩壊剤である。好適な非発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、デンプン、例えばトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、それらのアルファ化及び/又は加工デンプン、甘味料、粘土、例えばベントナイト、微結晶性セルロース、アルギネート、デンプングリコール酸ナトリウム、又はゴム類、例えば寒天、グアール、ローカストビーン、カラヤ、ペクチン(pecitin)、及び/又はトラガカントが挙げられる。別の実施形態において、崩壊剤は、発泡性崩壊剤である。好適な発泡性崩壊剤の非限定的な例としては、重炭酸ナトリウムとクエン酸との組合せ、及び/又は重炭酸ナトリウムと酒石酸との組合せが挙げられる。
【０１０１】
別の実施形態において、賦形剤は、矯味剤を含む。矯味剤は、合成香油及び/又は芳香剤;天然油;植物、葉、花、及び/又は果物からの抽出物;並びにそれらの組合せから選択することができる。一部の実施形態において、矯味剤は、桂皮油;ウィンターグリーン油;ペパーミント油;チョウジ油(clover oil);ヘイオイル(hay oil);アニス油;ユーカリ;バニラ;柑橘類の油、例えばレモン油、オレンジ油、ブドウ及び/若しくはグレープフルーツ油;並びに/又はリンゴ、モモ、洋ナシ、イチゴ、ラズベリー、サクランボ、プラム、パイナップル、及び/若しくはアンズ等の果物のエッセンスから選択される。
【０１０２】
他の実施形態において、賦形剤は、甘味料を含む。好適な甘味料の非限定的な例としては、グルコース(コーンシロップ)、デキストロース、転化糖、フルクトース、及び/若しくはそれらの混合物(担体として使用されない場合);サッカリン及び/若しくはその様々な塩、例えばナトリウム塩;ジペプチド甘味料、例えばアスパルテーム;ジヒドロカルコン化合物、グリシルリジン;ステビア・レバウディアナ(Stevia Rebaudiana)(ステビオシド);スクロースのクロロ誘導体、例えばスクラロース;並びに/又は糖アルコール、例えばソルビトール、マンニトール、シリトール(sylitol)等が挙げられる。また、加水分解水添デンプン及び合成甘味料である、3,6-ジヒドロ-6-メチル-1,2,3-オキサチアジン-4-オン-2,2-二酸化物、特に、それらのカリウム塩(アセスルファム-K)、並びに/又はナトリウム及びカルシウム塩も企図される。
【０１０３】
一部の実施形態において、組成物は、着色剤を含む。好適な着色剤の非限定的な例としては、食品、薬物及び化粧用の色素(FD&C)、薬物及び化粧用の色素(D&C)、及び/又は外用薬物及び化粧用の色素(Ext.D&C)が挙げられる。着色剤は、色素又はその対応するレーキとして使用することができる。
【０１０４】
様々な実施形態において、製剤中の賦形剤又は賦形剤の組合せの質量分率は、通常、組成物の総質量の、約99%若しくは99%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、例えば、約95%若しくは95%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約90%若しくは90%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約85%若しくは85%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約80%若しくは80%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約75%若しくは75%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約70%若しくは70%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約65%若しくは65%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約60%若しくは60%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約55%若しくは55%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約50%若しくは50%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約45%若しくは45%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約40%若しくは40%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約35%若しくは35%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約30%若しくは30%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約25%若しくは25%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約20%若しくは20%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約15%若しくは15%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約10%若しくは10%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約5%若しくは5%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、約2%若しくは2%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)、又は約1%若しくは1%若しくはそれ未満(ただしゼロではない)である。
【０１０５】
経口投与のための固体剤形としては、カプセル剤、錠剤、カプレット剤、丸剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、粉剤、及び/又は顆粒剤が挙げられる。カプセルは、典型的には、細菌組成物を含むコア材料、及びコア材料をカプセル化するシェル壁を含む。一部の実施形態において、コア材料は、固体、液体、及び/又はエマルジョンの少なくとも1つを含む。他の実施形態において、シェル壁材料は、ソフトゼラチン、ハードゼラチン、及び/又はポリマーの少なくとも1つを含む。好適なポリマーとしては、これらに限定されないが、セルロース系ポリマー、例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、メチルセルロース、エチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、トリメリト酸酢酸セルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルローススクシネート及びカルボキシメチルセルロースナトリウム;アクリル酸ポリマー及び/又はコポリマー、例えばアクリル酸、メタクリル酸、アクリル酸メチル、アンモニオメチルアクリレート、アクリル酸エチル、メタクリル酸メチル及び/又はメタクリル酸エチルから形成されたもの(例えば、商標名「オイドラギット」で販売されているコポリマー);ビニルポリマー及び/又はコポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、酢酸フタル酸ポリビニル、酢酸ビニルクロトン酸コポリマー、及び/又はエチレン-酢酸ビニルコポリマー;及び/又はセラック(精製ラック)が挙げられる。更に他の実施形態において、少なくとも1種のポリマーは、味マスキング剤として機能する。
【０１０６】
錠剤、丸剤等は、圧縮、多重圧縮、多重積層、及び/又はコーティングされていてもよい。コーティングは、単一でもよいし、又は複数でもよい。一実施形態において、コーティング材料は、植物、真菌及び/又は微生物の少なくとも1種から抽出される糖、多糖、及び/又は糖タンパク質の少なくとも1種を含む。非限定的な例としては、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、ジャガイモデンプン、タピオカデンプン、セルロース、ヘミセルロース、デキストラン、マルトデキストリン、シクロデキストリン、イヌリン、ペクチン、マンナン、アラビアゴム、ローカストビーンガム、メスキートゴム、グアールガム、カラヤガム、ガティガム、トラガカントゴム、ふのり、カラギーナン、寒天、アルギネート、キトサン、又はジェランガムが挙げられる。一部の実施形態において、コーティング材料は、タンパク質を含む。別の実施形態において、コーティング材料は、脂肪及び油の少なくとも1種を含む。他の実施形態において、脂肪及び油の少なくとも1種は、高温で融解するものである。更に別の実施形態において、脂肪及び油の少なくとも1種は、水素化又は部分的に水素化されている。一実施形態において、脂肪及び油の少なくとも1種は、植物由来である。他の実施形態において、脂肪及び油の少なくとも1種は、グリセリド、遊離脂肪酸、及び/又は脂肪酸エステルの少なくとも1種を含む。一部の実施形態において、コーティング材料は、少なくとも1種の食用ワックスを含む。食用ワックスは、動物、昆虫、又は植物由来であってもよい。非限定的な例としては、蜜蝋、ラノリン、ベイベリーワックス、カルナウバワックス、及び/又はコメヌカワックスが挙げられる。錠剤及び丸剤は、腸溶コーティングを用いて更に調製することができる。
【０１０７】
代替として、本明細書で開示された細菌組成物を具体化する粉剤又は顆粒剤は、食品に取り込むことができる。一部の実施形態において、食品は、経口投与のためのドリンクである。好適なドリンクの非限定的な例としては、フルーツジュース、フルーツドリンク、人工的にフレーバーを付けたドリンク、人工的に加糖したドリンク、炭酸飲料、スポーツドリンク、液体乳製品、シェイク、アルコール性飲料、カフェイン添加飲料、又は乳児用調整粉乳が挙げられる。他の好適な経口投与のための製品としては、好適な溶媒、保存剤、乳化剤、懸濁化剤、希釈剤、甘味料、着色剤、及び/又は矯味剤の少なくとも1種を含有する、水性及び非水性の溶液、エマルジョン、懸濁液、及び/若しくは溶液、並びに/又は非発泡性顆粒から再構成した懸濁液が挙げられる。
【０１０８】
一部の実施形態において、食品は、固体食材であってもよい。固体食材の好適な例としては、これらに限定されないが、フードバー、スナックバー、クッキー、ブラウニー、マフィン、クラッカー、アイスクリーム又はアイスクリームバー、ヨーグルト又はフローズンヨーグルトバーが挙げられる。
【０１０９】
他の実施形態において、本明細書で開示される組成物は、治療用食物に取り込まれる。一部の実施形態において、治療用食物は、任意選択で一部又は全ての必須の主要栄養素及び微量栄養素を含有する、すぐ食べられる食物である。別の実施形態において、本明細書で開示される組成物は、既存の食事にブレンドされるように設計された補助的な食物に取り込まれる。一実施形態において、補助的な食物又は栄養補助食品は、一部又は全ての必須の主要栄養素及び微量栄養素を含有する。別の実施形態において、本明細書で開示される細菌組成物は、食物のタンパク質栄養を強化するために、既存の食物と共にブレンドされるか又は既存の食物に添加される。その例としては、主食(穀物、塩、糖、食用油、又はマーガリン)、飲料(コーヒー、茶、ソーダ、水、ビール、リカー、又はスポーツドリンク)、スナック、又は菓子及び他の食物が挙げられる。
【０１１０】
一実施形態において、製剤は、経口投与のためのゼラチンカプセルに充填される。適切なカプセルの例は、10(最大100mg)の凍結乾燥粉末(例えば、108から1011個の細菌細胞)、160mgの微結晶性セルロース、77.5mgのゼラチン、及び2.5mgのステアリン酸マグネシウムを含有する250mgゼラチンカプセルである。代替の実施形態において、105から1012個の細菌細胞、例えば、105から107、106から107、又は108から1010個の細菌細胞を使用することができ、必要に応じて賦形剤により付随的な調整を行う。代替の実施形態において、腸溶性コーティングされたカプセル若しくは錠剤又は緩衝化若しくは保護組成物を使用することができる。
【０１１１】
1種又は複数のプレバイオティックを含む、又は含まない細菌組成物は、一般的に、典型的には哺乳類対象への経口投与又は胃への投与のために製剤化される。特定の実施形態において、組成物は、経口投与のために、固体、半固体、ゲル、又は液体形態として、例えば丸剤、錠剤、カプセル剤、又はロゼンジ剤の形態で製剤化される。一部の実施形態において、胞子は一般的に胃及び小腸に耐性であるが、胃から小腸にわたり細菌を保護するために、このような製剤は、腸溶コーティングを含有するか又はそれによりコーティングされる。他の実施形態において、1種又は複数のプレバイオティックを含む、又は含まない細菌組成物は、生着又は効能を強化するために、発芽剤(germinant)と共に製剤化されてもよい。更に他の実施形態において、細菌組成物は、生着又は効能を強化するために、プレバイオティック物質と共に製剤化されるか又はそれと共に投与されてもよい。一部の実施形態において、細菌組成物は、生着又は効能を強化するために、プレバイオティック物質と共に製剤化されるか又はそれと共に投与されてもよい。
【０１１２】
1種又は複数のプレバイオティックを含む、又は含まない細菌組成物は、所与の哺乳類対象において、単回投与で、又は複数回投与にわたり有効であるように製剤化されてもよい。例えば、単回投与は、標的化された疾患の状態のモニターされる症状又はバイオマーカーの低減又は増加、例えば、組成物が投与される哺乳類対象における、インスリンの増加、代謝の増加、認知能力の増加、炎症性及び/又は自己免疫応答の低減のために実質的に有効である。実質的に有効とは、モニターされる症状又はバイオマーカーの対象における存在が、組成物の投与後、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%又は99%より大きく低減又は増加することを意味する。
【０１１３】
一部の実施形態において、組成物は、単回経口用量が、少なくとも又は少なくとも約1×104コロニー形成単位の細菌実体及び/又は真菌実体を含有するように製剤化され、単回経口用量は、典型的には、約1×104又は1×104、約1×105又は1×105、約1×106又は1×106、約1×107又は1×107、約1×108又は1×108、約1×109又は1×109、約1×1010又は1×1010、約1×1011又は1×1011、約1×1012又は1×1012、約1×1013又は1×1013、約1×1014又は1×1014、約1×1015又は1×1015CFUの細菌実体、又は1×1015CFUより多くの細菌実体を含有すると予想される。例えば、所与の株又は全ての株の集合体の細胞の濃度は、わかっている場合、組成物1グラム当たり又は投与される1用量当たり、例えば、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015個、又は1×1015個より多くの生存可能な細菌実体(例えば、CFU)である。
【０１１４】
一部の製剤において、組成物は、質量に基づき、少なくとも又は少なくとも約0.5%、1%、2%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は90%より多くの細菌細胞を含有する。一部の製剤において、投与される用量は、質量で、200、300、400、500、600、700、800、900ミリグラム又は1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、又は1.9グラムを超えない。
【０１１５】
4.キット
更に、本明細書に記載される操作された天然細菌(ENB)の1種又は複数の単離された集団、又は操作された天然細菌の1種又は複数の単離された集団を含む1種又は複数の組成物を含む1つ又は複数の容器を含むキットを提供する。様々な実施形態において、容器は、同じ1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されたENBの集団を含む組成物の、複数の一体化された部分又は用量を含んでいてもよい。様々な実施形態において、容器は、異なる1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されたENBの集団を含む組成物の、複数の一体化された部分又は用量を含んでいてもよい。様々な実施形態において、容器は、食用組成物、例えば、食品、飲料、又はカプセルを含有する。様々な実施形態において、容器は、ENBの集団を含む、例えば、同じ1つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを発現するように形質転換されたENBの集団を含む、一体化された体積の緩衝化溶液又は懸濁液を含有する。様々な実施形態において、容器は、例えば一体化された用量の凍結乾燥されたENB、及び再構成のための緩衝化溶液を含有する。
【実施例】
【０１１６】
以下の実施例は、例示するために提供され、特許請求された発明を限定するものではない。
【０１１７】
(実施例1)
操作された共生細菌調製の例示的な方法
サンプル収集。ヒト患者の場合、内視鏡検査中に十二指腸、回腸、及び結腸の粘膜生検を採取し、室温で、15mLのコニカルチューブ中で、1.8mLの1×PBSに懸濁した。8時間以内に、サンプルを滅菌した2mLスクリュートップマイクロ遠沈管に移し、滅菌した直径1.5mmのクロムでコーティングした鋼ビーズを添加した。
【０１１８】
マウスの場合、2〜5個の糞粒全体を排泄するまで滅菌した1Lポリプロピレンカップに入れることによって、便を収集した。マウスをホームケージに戻し、滅菌鉗子を使用して糞粒を収集し、事前に計量した滅菌した2mLスクリュートップマイクロ遠沈管に入れた。二酸化炭素及び頸部脱臼による安楽死後に組織サンプルを収集し、事前に計量した滅菌した2mLスクリュートップマイクロ遠沈管に入れた。組織と便の両方について、以下のワークアップは同じであった。2時間以内に、遠沈管を再び計量し、各遠沈管に1mLの滅菌脱イオン水を添加し、続いて滅菌した直径1.5mmのクロムビーズを添加した。
【０１１９】
サンプルの加工。これらのサンプルをBioSpec Bead Beater Mini 24を用いて3800RPMで1分ホモジナイズし、氷上でおよそ1分冷却し、3800RPMで更に1分ホモジナイズし、再度、氷上でおよそ1分冷却した。希土類磁石をチューブ側面に這わせてビーズを除去することによって、クロム-鋼ビーズを除去した。
【０１２０】
ヒト組織サンプルの場合、得られたホモジネートをエッペンドルフ5430R遠心分離機に14,000RPMで1分間入れ、細胞及び組織をペレット化した。得られた上清のうち1.5mLを新しい清潔なスクリュートップマイクロ遠沈管に移し、室温で貯蔵した。マイクロ遠沈管を30〜60秒ボルテックスすることによって、ペレットを残りの上清に再懸濁した。
【０１２１】
マウスサンプルの場合、その後、ホモジナイズされたサンプルを直接使用した。
【０１２２】
株の単離。得られたホモジナイズされたサンプルのそれぞれにつき、25mLの硬化した選択的寒天培地を含有する使い捨ての10cmペトリ皿上に200μLを分配し、水分が蒸発するか又は培地に吸収されるまで、10〜50個の滅菌した直径1mmのガラスビーズを使用して塗り広げた。その後サンプルを10倍に希釈し、その後、同じプレート上に100μLの希釈サンプルを平板培養した。このような希釈平板培養を、1000倍希釈まで実行した。
【０１２３】
大腸菌株の単離の場合、選択的寒天培地は、マコンキーラクトース寒天(「マコンキー」)又はエオシン-メチレンブルーラクトース寒天(「EMB」)のいずれかであった。乳酸桿菌属株の単離の場合、選択的寒天培地は、De Man-Rogosa-Sharpe寒天(「MRS」)であった。
【０１２４】
大腸菌の単離の場合、得られた寒天プレートを、37℃、加湿した室内気(すなわち好気性)環境下でインキュベートした。乳酸桿菌属種の単離の場合、得られた寒天プレートを、37℃で、AnaeroPack(三菱ガス化学アメリカ社)を含有する密封したジャー中でインキュベートした。およそ12〜24時間後にコロニー(及びマコンキー寒天上のハローのようなその培地特異的な表現型)が見えるようになったら、候補コロニーを選び、源プレートと同じ寒天培地上での単離のために手作業で画線した。元のプレートと同じ条件下でこれらの寒天プレートをインキュベートした後、少なくとも成長がない3mmのゾーンによって単離されたコロニーを選び、1mLの液体増殖培地を含有する滅菌した16mm×160mmガラス培養チューブ中で成長させた。大腸菌の場合、液状培地は、0.2%w/vのグルコース及び5g/LのNaClを含有するリソゲン液体培地であった。乳酸桿菌属株の場合、液状培地はDe Man-Rogosa-Sharpe培地であり、チューブをゴムストッパーでシールした。それが濁るまで37℃のオービタルシェーカー中で振盪することにより培養物を成長させ、その時点で0.5mLの培養物を、グリセロール(乳酸桿菌属の場合は0.05mL、大腸菌の場合は0.1mL)を含有するスクリュートップ冷凍保存バイアルに移し、粉砕することによって混合し、80℃で貯蔵した。
【０１２５】
株の同定。残りの液体培養物中の細胞を滅菌した1.7mLマイクロ遠沈管に移し、14,000RPMで1分間の遠心分離によって収集した。上清を吸引し、捨て、細胞ペレットを50μLの滅菌脱イオン水に再懸濁した。
【０１２６】
リボソーム16S DNAを、V3-V4領域に特異的なプライマーを使用したPCRによって、Phusion DNAポリメラーゼ(New England Biolabs社)を使用して増幅した。濃縮した細胞スラリーから開始した10倍希釈のテンプレート材料として、水に懸濁した細胞を直接使用した。総反応物体積は25μLであった。サイクリング後、5μLの各反応物を、SYBR Safe DNA染色(Invitrogen社)を用いた1%w/vの0.5×TAEアガロースゲル上での溶出によって分析した。およそ450bpの生成物を示し、実質的なプライマー二量体又は非特異的な生成物バンドがない反応物を同定し、残りの20μLのPCR溶液を、シリカ回転カラムキット(Invitrogen社又はNew England Biolabs社)を使用して精製した。得られたDNAを紫外可視分光光度法によって定量化し、サービスプロバイダー(Eton社)によって、サンガージデオキシーケンシングでシーケンシングした。
【０１２７】
シーケンシング結果を受け取ったら、クロマトグラムを強く十分分離した蛍光ピークに関して手作業で検査した。これらのクロマトグラムからのDNAベースコールをコンパイルし、BLASTを使用してNCBIの非冗長(「nr」)データベースに対して並べた。サンプル配列に対して97%以上の同一性を有する属/種のゲノムの優位性によって株を仮に同定した。
【０１２８】
株の同一性を確認し、互いに株を独特に同定するために、16Sのシーケンシングによって割り振られた同一性に特異的な高度に可変性の遺伝子の領域を増幅し、シーケンシングした。大腸菌の場合、gyrB及びfumC配列対立遺伝子を使用した。Table 2(表2)は、本発明者らが単離した異なる大腸菌株の株の同一性を要約する。
【０１２９】
【表２】
2020516318.tif 000011
【０１３０】
前駆株の操作。大腸菌MG1655(実験室に適合した株)を、pSIM18で形質転換した。pSIM18は、42℃誘導性プロモーターの制御下にラムダ-レッド組換え遺伝子bet、exo、及びgamをコードし、ハイグロマイシンに対する耐性を付与し、37℃又はそれより高温での非選択的な成長によって、含有する株から排除できる。この株、MG1655(pSIM18)を使用して、多数のさらなる誘導株を作り出した。
【０１３１】
マーカー遺伝子である緑色蛍光タンパク質(GFP)の構成的発現を付与するために、本発明者らは、Zaslaverら、Nat Methods. 2006年8月;3(8):623-8によって記載された、大腸菌遺伝子rplNのためにgfpmut2遺伝子をプロモーター領域に融合させ、プラスミド収集のためにaphカナマイシン耐性付与遺伝子を含有する配列を使用した。この配列を、バクテリオファージラムダ付着部位であるattBに相同なPCRで取り込んだ30〜40ヌクレオチドのオーバーハングによって増幅した。このPCRフラグメントを、MG1655(pSIM18)との組換えに使用し、株MG1655attB::[aph PrplN-gfpmut2]KmRを生産した。この株は、青色光照射で緑色蛍光を発し、その配列をサンガージデオキシーケンシングによって確認した(配列番号1)。これらの細胞の培養物をバクテリオファージP1virで溶解させ、形質導入ファージP1vir(attB::[aph PrplN-gfpmut2]KmR)を生産した。
【０１３２】
異種遺伝子の発現を付与するために、本発明者らは、ハイブリッドPtrcプロモーター配列、[aph PrhaB-ccdB]対抗選択カセット、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(cat)遺伝子を含有する発現カセットを構築した。必要に応じて、後続の切り出しのために、cat遺伝子を2つのFRT組換え部位によって隣接させた。このカセットをPCRによって増幅して、yfgG-yfgH遺伝子間領域に相同な30〜40ヌクレオチドのオーバーハングを取り込み、MG1655(pSIM18)に導入し、続いてプラスミドを除去し、サンガージデオキシーケンシングを行い、MG1655(yfgG::[Ptrc-[aph Prha-ccdB]FRT-cat-FRT])(配列番号2)を生産した。次いでこの株を、pSIM18、並びにラクトバチルス・サリバリウスJCM1046(GenBank ACL98194.1)の予測された配列のコドン最適化バリアント及びPtrc発現領域のORF配置に相同な伸長部分を含有するPCR産物で再び形質転換した。それに続く株からpSIM18を除去し、配列をPCR及びサンガージデオキシーケンシングによって確認し、その後MG1655(yfgG::[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT])(配列番号3)として貯蔵した。CaCl2及びタウロデオキシコール酸ナトリウムを含有するレノックスLB寒天培地上で、単一の単離体として培養することにより、BSH遺伝子の活性を確認し、それにより、寒天中、白色のハローで囲まれたコロニーを得て、加えて、-20℃での凍結融解サイクリングによって部分的に溶解した同じ株の細胞を含有する、インビトロでのタウロコール酸ナトリウムの脱コンジュゲーション反応の薄層クロマトグラフィーを行った。これらの細胞の培養物をバクテリオファージP1virで溶解させて、形質導入ファージP1vir(yfgG::[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT]CmR)を生産した。
【０１３３】
M-ACT株への遺伝学的ブロックの移入。上述した方法によって、UCSDの飼育施設で維持した通常通り発育した雄野生型C57B6マウスの糞サンプルから株AZ-39を単離した。この株は、カナマイシン、クロラムフェニコール、カルベニシリン、ハイグロマイシン、トリメトプリム及びシプロフロキサシンに対して感受性であった。AZ-39のゲノム配列を、ロングリードのハイスループットシーケンシング機器(Pacific Biosciences社)でその抽出されたDNAから獲得したデータから決定した。AZ-39は、そのゲノム配列中に、溶血素又は他の公知の毒素遺伝子(例えば、志賀毒素様毒素、フラギリシン)を示さなかった。
【０１３４】
AZ-39をその後、P1vir(attB::[aph PrplN-gfpmut2]KmR)を使用してカナマイシン耐性及びクロラムフェニコール耐性を形質導入して、株AZ-51(AZ39 GFP+)を生産し、その後P1vir(yfgG::[Ptrc-BSH FRT-cat-FRT]CmR)を使用して、株AZ-52(AZ-39 GFP+BSH+)を生産した。AZ-51とAZ-52はどちらも、青色光照射下で緑色蛍光を発し、タウロデオキシコール酸ナトリウムを含有する固体寒天培地上で単一の単離株ごとに成長させたところ、AZ-52はハローを生産したが、AZ-51は生産しなかった。
【０１３５】
通常通り発育した野生型マウスの定着。株AZ-51及びAZ-52を、それらそれぞれのグリセロールストックから、単一の単離株ごとに画線した。これらの画線からの個々のコロニーを正しいBSH活性表現型に関して試験し、その後、AZ-51の場合はカナマイシン(25μg/mL)及びAZ-52の場合クロラムフェニコール(10μg/mL)を含むレノックスLB+1mMのMgCl2の1mLの培養物に植え付けた。これらの培養物を215RPMで振盪しながら37℃で12時間成長させた。その後、Studier (2005) Protein Purification & Expressionによって記載されるように、各培養物を1000倍希釈して、1mMのMgCl2及び0.5×M緩衝液が追加で補充された500mLのバッフル付き培養フラスコ中の50mLの同じ培地に戻した。これらの培養物を215RPMで振盪しながら37℃で更に12時間成長させた。成長期間の最後に、1cmパス長での600nmにおける培養物の吸光度は、慣例的に10.0から20.0の間とした(測定前の希釈を考慮して)。測定された体積の液体培養物から細胞を収集し、元の培養液体が細胞1×109個/mL/OD600の細胞密度と仮定して5×1010/mLの細胞密度まで、冷やした滅菌1×PBSに再懸濁した。この溶液をその後氷上で維持した。1時間以内に、0.2mLのこの細胞懸濁液を、通常通り発育した野生型C57B6マウスに経口経管栄養法によって送達した。マウスをその後、それらの囲いに戻した。経管栄養後の最初の週は1週間当たり2回ケージを交換し、それに続く2週間は週1回、その後は2週に1度交換した。
【０１３６】
新鮮な糞サンプルを収集し、ホモジナイズし、上述したように平板培養を行って、ただし一旦ホモジナイズしたら、糞サンプルを更に、カナマイシン(25μg/mL)又はクロラムフェニコール(10μg/mL)のいずれかを含有するレノックスLB寒天培地上で平板培養を行って、定着のステータスをモニターした。青色光の透照による増生後に得られたプレートを撮影することによって、画像化データを記録した。抗生物質非含有プレート(例えばEMBスクロース、マコンキーラクトース)からクローンをCaCl2及びTDCAを含有するレノックスLB寒天培地上に再び画線することによって、BSH活性の保持を試験した。
【０１３７】
(実施例2)
再導入され操作された共生細菌でのマウス消化管の定着
この実施例では、大腸菌の株をC57Bl/6マウスから単離し、乳酸桿菌属からGFP及び胆汁酸塩ヒドロラーゼ遺伝子を発現するように操作し、次いでC57Bl/6マウスに再導入した。
【０１３８】
導入
ディスバイオシスは、マウスモデルにおける社会的、コミュニケーション的、ストレス関連、及び認知行動の変化に関連する(11、12)。ヒトでの研究は、消化管のマイクロバイオームにおける摂動と、自閉症スペクトラム障害(13)、大うつ病(14)、及びパーキンソン病(12)とを関連付けている。マイクロバイオームと神経免疫の相互作用が、具体的には脳トランスクリプトームの全体的な変化、小グリア細胞の成熟と機能の変更、及び血液脳関門(BBB)の完全性を介して、マウスモデルで観察された行動及び生理学的な異常を媒介する可能性があることを示す証拠が増えつつある(1、15)。しかしながら、どのような薬剤が、どのようなメカニズムを介して、これらの作用を媒介するのかは明らかではない。以下、本発明者らは、消化管のマイクロバイオーム、胆汁酸(BA)、神経炎症、及び行動機能不全間の関連について総論する。
【０１３９】
マイクロバイオーム及び胆汁酸代謝:胆汁酸塩ヒドロラーゼ(BSH)によるBAの微生物の脱コンジュゲーション(すなわちグリシン又はタウリンの除去;図3A)は、宿主の生理機能において重要な役割を果たす。脱コンジュゲーションは、小腸からのBAの再取り込みを防ぎ、結腸におけるその二次BAへの変換をもたらす(16)。この二次BAの疎水性プールの多くが排出されるが、血清BAプールを変化させ、シグナル伝達分子として作用するのに十分な程度に受動拡散を介して吸収される(17)。BAシグナル伝達は、2つの公知の受容体:ファルネソイドX受容体(FXRα)(18)及びGタンパク質共役BA受容体1(TGR5)によって媒介される(19)。ヒト集団及びマウスモデルのメタゲノム研究において、BSHは、肥満症、代謝異常、及び他の生理学的機能異常の宿主からの保護作用がある可能性があると同定されている(20)。
【０１４０】
胆汁酸及び神経炎症:BAは、神経炎症を調節することができる。FXRα及びTGR5受容体はどちらも、小グリア細胞及びニューロンを含む脳組織に見出される。ウルソデオキシコール酸(UDCA)、細菌によって生成する二次BA、及びその肝臓タウリンコンジュゲート(TUDCA)は、小グリア細胞に影響を与える免疫調節剤である。UDCAは、炎症促進性サイトカインIL-1β及び酸化窒素(NO)の生産を阻害し、インビトロでのニューロンの死及びシナプス変化における神経毒の作用を中和することができる(21、22)。神経病理を有するマウスモデルにおいて、TUDCAは、小グリア細胞の活性化を低減し、炎症性サイトカインを減少させ、ニューロンの完全性を保った(2、23)。BA及び神経炎症に対するほとんどの研究はUDCA又はそのコンジュゲートを使用したが、他のBAが類似の作用を有するかどうかは明らかではない。UDCAの免疫調節作用は、TGR5受容体を介して媒介される(5)。実際に、TGR5アゴニストも小グリア細胞の活性化と増殖を低減させ、炎症促進性サイトカインを低減させた(10)。しかしながら、BAが神経炎症に影響を与えることができる他の受容体も提唱されている(4)。
【０１４１】
高脂肪食、肥満症、及び神経炎症:高脂肪食(HFD)の消費は、ニューロンのレプチン及びインスリン耐性を引き起こし、恒常性のシグナルを崩壊させ、正のエネルギーバランスを作り出す(24、25)。末梢代謝組織(例えば肝臓、脂肪組織)と同様に、これらのシグナルに対するニューロン耐性は、炎症性シグナル伝達カスケードの活性化と関連している(26〜28)。脳において、HFDの供給は、炎症促進性サイトカインの発現、神経膠症、血管構造の変化、及びBBB透過性の破壊を伴う(29)。特に海馬では、IL-1β、IL-6、及びTNF-αのmRNA及びタンパク質発現の増加、加えて小膠細胞症の増加がみられる(29〜32)。
【０１４２】
高脂肪食及び行動機能不全:げっ歯類では、HFDによって誘発された神経炎症は、特により長い時間曝露されると、記憶機能不全や不安を引き起こす可能性があるという十分な証拠がある。少なくとも16週間HFD(脂肪から60%kcal)を与えたマウスは、明らかに認識記憶障害を示したが(新規物体の認識試験によって評価した場合)、5週間HFDに曝露されたマウスはそうではなかった(33〜35)。持続的なHFDへの曝露(すなわち>20週間)も、ガラス玉覆い隠し試験、高架式十字迷路、及びオープンフィールド試験によって評価したところ、空間記憶及び学習の障害を引き起こし(29、31、36〜38)、不安レベルを増加させた(33、35、39)。これらの失認は、IL-6及びTNF-αのレベル増加、並びに小グリア細胞活性化によって決定されたように、神経炎症を伴っていた。
【０１４３】
消化管のマイクロバイオームの機能的操作における制限:消化管のマイクロバイオームは様々な宿主生理学的プロセスを調節することができるが、どのようにその作用が媒介されるかは明らかではない。更に、マイクロバイオーム組成物(例えばプロバイオティクス、すなわち健康上の利益を提供すると考えられている生細菌)を標的化するほとんどの介入が、消化管のマイクロバイオームに対して検出可能な影響を有するかどうか(40)、又は通常通り発育した野生型(CR-WT)宿主(例えばヒト)におけるマイクロバイオームの対人関係の多様性と柔軟性に対して強健であるかどうか(41)は不明瞭である。より優れた機構的な理解及びより有効なマイクロバイオーム媒介療法を開発するために、消化管のマイクロバイオームの機能的な調節に重点を置いた異なるアプローチが必要である。この問題に取り組む現在の戦略は、実験室に適合した菌株から操作された細菌を作り出すことに焦点を当てたものであった。しかしながら、これらの細菌はCR-WT宿主に定着しないため、これらの努力は労働集約的であり、費用がかかり、残念なものである(41)。
【０１４４】
本明細書において、本発明者らは、消化管のマイクロバイオームへの「ノックイン」機能を採用する方法及び組成物を提供し、CR-WT宿主における内腔の生態学、代謝産物と栄養素の流れ、及び生理機能に対するその作用を調査する。このツールを使用して宿主代謝に対する内腔のBA生体内変換の作用を調査する間、本発明者らは、BSHがノックインされたマウスは、それらの行動において驚くべき明らかな差を有していたことに留意した。
【０１４５】
現在のパラダイム及びその限定:メタゲノム、メタボロミクス、及び/又はメタトランスクリプトミクスによって決定した生化学的機能が表現型を伝達又は破壊できるかどうかを理解するための新しいツールが必要である。消化管ミクロフローラは、内腔の環境を感知し操作できるため、それは操作された細胞ベースの治療法のための魅力的な手段になりつつある。しかしながら、操作された実験室に適合した細菌が、有用な数で、及び/又は有意義な期間にわたりCR-WT宿主に定着できないこと、及び/又はCR-WT哺乳動物における生理学的な変化を達成できないことが、これまで機構的及び治療的研究におけるその使用を限定してきた(41)。操作された細菌を用いたCR-WT宿主の消化管のマイクロバイオームの長期の機能的な操作はとらえどころのないままである。宿主に適合されていないプロバイオティクスにとって(操作されたか又は操作されていないかに関係なく)、内腔中にすでに存在するミクロフローラと競合することは極めて困難である。宿主からのバリア(例えば蠕動、自然及び適応免疫)及び他の天然の微生物からのバリア(例えば競合、ニッシェの利用可能性)等の、内腔の環境でのその生存に対する複数のバリアがある(42)。
【０１４６】
実験株が機能送達のための好適なベクターではないことは、よく認識されている。この問題に対処するため、一部の調査グループは、消化管のマイクロバイオームに一般的に見出される細菌のファミリー、具体的にはビフィドバクテリウム属、ラクトコッカス属、及び乳酸杆菌属を操作するためのツールを開発した。何百もの推測の共生種を操作し、それらをCR-WTマウスに系統的に供給することによって、これらの実験室は、長期間の定着物を検索してきた。莫大な資源の使用にもかかわらず、この方法は、CR-WT宿主における定着物を生じてこなかった。更に、この方法で定着する細菌を開発することは、新しい宿主(例えばトランスジェニックマウス、ヒト宿主)及び新しい遺伝学的機能ごとに同様の桁外れの資源を必要とする可能性が予想されることから、これらの方法は資源が限られた実験室にとって手が届かないものである。
【０１４７】
本発明者らの新しいパラダイム:本発明者らは、操作された細菌を使用してCR-WT宿主において生理機能を効果的に変化させる本発明者らの能力を進化させた技術を開発した。本発明者らは、CR-WT宿主由来の扱いやすい天然/共生細菌を同定し、それを有益な機能を付与する遺伝子で遺伝学的に改変し、次いでCR-WT宿主に操作された天然細菌(ENB)を再導入することによってこれを達成することを可能にした。したがって、ENBは、すでに内腔の環境に適合されている。これまでにこの方法を使用することに抵抗があったのは、天然細菌を培養及び改変することが困難であるという仮説によるものである。本発明者らは、マウス便から単離した天然大腸菌を使用した。大腸菌の細菌操作は、ほとんど全ての実験室によって非常にわずかな資源で実行することができる。大腸菌は一般的な天然細菌であるが、多くの研究者が、実験適合株で失望を経験してきたことからそれは不良な定着物であると仮定していた。しかしながら、本発明者らは、
(1)単回の経管栄養後、様々な食物で維持した宿主に数カ月定着することができる(例えば、少なくとも140日安定な定着)、
(2)消化管中で内腔のBAを変更できる遺伝子(例えば、「ノックイン」BSH)を発現することができる、
(3)予測可能な様式で血清代謝産物を変化させる(例えば血清コンジュゲートBAを減少させる)ことができる、
(4)宿主のコアの代謝プロセスを変化させることができる、
(5)動物の行動を変化させることができる
操作された細菌(大腸菌等)を作り出すことに成功した。
【０１４８】
ENBは、消化管のマイクロバイオームを機能的に操作し、マイクロバイオーム-消化管-脳軸の媒介物質の同定等のより機構的なマイクロバイオーム研究を実行する本発明者らの能力を発展させる。具体的には、本発明者らは、BA脱コンジュゲーションが宿主の行動及び認知に影響を与え得るかどうかを決定することができる。更に、ENBは、ヒト等のCR-WT宿主における治療剤として使用することができる。
【０１４９】
結果
ENBを使用したインビトロでの代謝産物の改変:天然のミクロフローラは、扱いやすく、宿主に定着できるベクターの豊富なリザーバーを提供する。C57BL/6マウスの便を培養することによって、本発明者らは、遺伝学的に扱いやすい大腸菌であるEcAZを同定した。本発明者らは、この株の染色体に2つの遺伝子、すなわちPrplN-GFPmut2カセットと単一工程での異種遺伝子導入部位を含有するPtrcカセットを導入することによって、EcAZをBSHを発現するENBに変換した(43)。EcAZを、コドン最適化L.サリバリウス(L. sallivarius)のBSHを発現するように改変した(EcAZBSH+)。BSHは、BAコアステロールの側鎖からタウリンを切断する(図3A)。この新しいENBは、インビトロでの反応でタウロコール酸(TCA)をコール酸(CA)に加水分解する(薄層クロマトグラフィー;図3B)。10mMのTCAを含有する寒天プレート上で成長させると、BSH陽性株の周りに低い可溶性の加水分解生成物(CA)の白色のハローが形成されるが、親のBSH陰性株の周りには形成されない(図3C)。
【０１５０】
ENBは、単回の経管栄養後にCR-WTマウスの消化管に定着することができる:10週齢のCR-WT C57BL/6マウスに、GFP+EcAZ(EcAZBSH+/EcAZBSH-)の固定相培養物の単回の経管栄養を与えた。各マウスから独立して便サンプルを収集し、寒天培地上で平板培養した。便1グラム当たりのGFP+コロニー形成単位数は、通常の固形食(NCD)とHFD供給条件の両方において、20週間より長い期間にわたり約106で安定なままであった(15週間までのデータを示す;図4A)。BSH遺伝子の付加は、ENBの消化管に定着する能力に影響を与えなかった(図4A)。8週間後、マウスの数匹を安楽死させ、臓器を収集し、平板培養して、定着の程度を決定した。EcAZは、回腸末端部及び盲腸を最大濃度で処置したマウスの胃腸管全体に定着した(図4B)。マウスの脾臓、肺、心臓、又は肝臓には定着しなかった。全てのマウスが健康そうに見え、互いに区別できなかった。EcAZBSH+又はEcAZBSH-のいずれかの定着も、体重に影響を与えなかった(図4C)。無菌(GF)マウスにおいて、EcAZBSH+はBAを脱コンジュゲートしたが、EcAZBSH-は脱コンジュゲートしなかった(図4D、4E)。
【０１５１】
ENBは消化管中でBAの生体内変換を実行し、血清BAプールに影響を与えることができる:便の分析から、ENBの添加はマイクロバイオーム組成に大きなシフトを引き起こさなかったことが示された(図5A)。標的化メタボロミクスから、EcAZBSH+は一次BAを脱コンジュゲートしたことが確認され、これは、内腔中のBAプールにおいてメタメタボロミクスの変化を引き起こした(図5B)。多くの糞のBAがグループ間で異なっていたが、その変化は予測不可能であった。しかしながら、血清BA組成の変化は、それよりはるかに予測可能であった。コンジュゲートしたBAにおいて全体的な減少が見られたことから(図5C)、ENBは、宿主のBA組成を変化させるのに使用することができる。
【０１５２】
ENBは生理学的及び行動に関する変化を誘導できる:EcAZBSH+マウスの代謝ケージ評価から、低い呼吸商(RER)を特徴とする別個の代謝プロファイルが解明されたことから、脂肪酸酸化の増加が示唆される(図7A)。BAシグナル伝達はグルコースホメオスタシスにも影響を与える;EcAZBSH+で処置したマウスは、より有意に低い食後のインスリンレベルを有していた(図7B、右)。本発明者らによるこれらの条件下におけるマウス間の行動に関する差の観察を定量するために、本発明者らは行動実験及び認知実験を実行した。EcAZBSH+マウスは、2つの対照と比較して、ランニングホイールで、50%より長い時間を費やした(図7C)。パイロットの新規物体認識試験において、EcAZBSH+も、それよりわずかに優れた性能を発揮した(図7D)。この認知試験において、20週間後、HFDが与えられたマウスの性能は不十分であったが、EcAZBSH+処置HFDマウスはまったく困難さがなかった(図7D)。したがって、マイクロバイオームにおける単一の遺伝子であるBSHの発現は、CR-WT宿主において代謝、行動、場合によっては認知の変化を誘導する。
【０１５３】
実験的方法及び設計
ENBによる内腔のBA改変は、CR-WTマウスにおいて認知に影響を与える
本発明者らのデータは、高脂肪食(HFD)消費が新規物体認識を損なう原因になることを示す。しかしながら、EcAZBSH+で処置したHFDマウスは、通常の固形食(NCD)のマウスと同様に性能を発揮したことから、細菌のBA脱コンジュゲーションが宿主の認知に影響を与えることが示唆される。
【０１５４】
手法:ENB定着及びインビボでの評価。この実験に、8週齢のWT雄C57BL/6マウス(合計72匹のマウス)を使用する。雄マウスは食事誘発性肥満への感受性を有するが、それに対して雌C57BL/6マウスはHFDを与えても肥満にならないため、雄マウスのみを使用する(44)。実験の継続期間中にわたり体重及び食物消費をモニターする。2週間後、10週齢のマウスに、PBS、EcAZGFP+/BSH-、又はEcAZGFP+/BSH+の単回の経管栄養を与える(1グループ当たり24匹のマウス)。実験中、便培養物を使用して、定着及びBSH活性をモニターする。2週間後、各グループの半分をNCDからHFDに切り替える(1つの条件当たり12匹のマウス;LabDiet 58Y1;18%タンパク質、61%脂肪、21%炭水化物)。20週間後、HFDに関連する失認がみられた場合、行動試験を始める(34)。
【０１５５】
内腔及び血清BAプロファイルのインビボでの評価。経管栄養の22週間後(食物変更の20週間後)、標的化BAメタボロミクスに使用するために、全てのマウスから血液(下顎下)を収集する。標的化された糞及び血清BAプールに対するENBの作用を、液体クロマトグラフィーと質量分析との組合せ(LC-MS/MS)によって評価する。
【０１５６】
行動試験:行動試験に使用される器具は、オートクレーブ可能であり、高バリア施設に好適である。これは、マイクロバイオームの組成に影響を与える可能性がある環境因子を最小化するためである。加えて、試験の順番は、試験進行に伴う混乱を最小化するために設計される。尾懸垂等のより大きい一次的な痛み又は苦痛を引き起こす可能性がある試験の前に、より穏やかな試験を実行する。3〜5日の間隔をあけて以下の順番で試験を実行する。
【０１５７】
オープンフィールド試験。これは、「感情」の試験であり、ストレスの多い環境の刺激(明るく照らされたオープンスペース)に曝露されたげっ歯類の不安様応答を測定し、加えて自発的な活性の尺度を捕獲するのに使用される。各動物をオープンアリーナの中央に置き(45)、30分の観察期間中に数種の行動に関するパラメーター(移動距離、速度、中心にいる時間、中心にいる頻度、立ち上がり行動、グルーミング)を記録し、分析する。
【０１５８】
ハンギングワイヤー試験。ハンギングワイヤー試験はグリップ強度及び運動調整の評価を可能にする(46)。前肢だけを、大きいリングスタンドによってテーブルと平行に保持された上昇した金属棒と接触させるようにマウスを保持し、そのまま吊り下げる。落ちるまでの時間と吊り下げ戦略に基づくスコアを割り当てる。
【０１５９】
新規物体認識試験。この試験は、物体の空間的な配置をそのままにしながら認識記憶をアッセイするものである(47〜49)。基礎的な原理は、動物は、新規の環境を探索するが、繰り返し曝露すると、探索量の減少が起こり(すなわち馴化)、次いで新規物体は、動物が覚えていたものと異なっているため、それが優先的に探索されること(脱馴化)である(50〜52)。行動をビデオで記録し、次いで接触(鼻が触れること、又は物体に向かって物体の0.5cm以内の範囲で鼻が向くこと)に関してスコア付けする。
【０１６０】
ガラス玉覆い隠し試験。ガラス玉覆い隠し試験を使用して、種に典型的な穴掘り行動(55)を利用して不安様行動(53)及び強迫観念のような行動(54)を評価する。マウスを個々に、20個の均一に間隔を開けたガラス玉を有する深さ5cmの土台を含有する標準的なマウスケージに30分置き、その後マウスを取り出し、覆い隠されたガラス玉の数(少なくとも2/3が土台で被覆された)を決定する。
【０１６１】
空間記憶のバーンズ迷路試験。バーンズ迷路試験は、空間学習及び記憶の試験であり、これは、明るく照らされた円形のフィールドを避けるために遠位の視覚的手がかりを使用することを含む(56〜58)。各セッションをビデオ録画し、マウスの実験条件を知らない実験者によってスコア付けし、移動距離、運動の速度及び経路分析を評価するために分析する。
【０１６２】
尾懸垂試験。尾懸垂試験は、マウスの無力感/抑うつ様行動を検査するための典型的な試験である(59、60)。平坦な表面の30cm上に配置された金属棒上に粘着テープを使用して各マウスをその尾部から6分間吊り下げる。全身運動が観察されない時間を測定することによって不動性を定量化する。不動に費やした時間の増加が、抑うつ様行動増加の指標である。
【０１６３】
統計分析。StatView(バージョン5.0.1;SAS Institute Inc.社)を使用する。試験に応じて対象内因子グループ及び対象内因子時間又は試行を用いた反復測定ANOVAを使用して、各行動試験からのデータを評価する。有意な主要な作用又はこれらの作用間の有意な相互作用によって保証される場合、フィッシャーの保護最小有意差(PLSD)事後検定を使用する。
【０１６４】
BAシグナル伝達の検死評価。行動に関する表現型解析の後、空腹時血清及び便を各マウスから収集する。マウスをCO2窒息とそれに続く断頭を使用して致死させる。脳、肺、心臓、肝臓、脾臓、及び消化管の様々なセグメントをPBS中でホモジナイズし、次いでEcAZ特異的ゲノムアイランドのmRNA(61)、GFPmut2、及びBSH、加えて培養組織についてqPCRを実行して、EcAZ定着の部位を決定する。血清、便、肝臓、脳、並びに回腸末端部及び盲腸の内容物においてBA及び短鎖脂肪酸を測定する。宿主RNAを、回腸末端部、盲腸、肝臓、及び海馬から抽出する。マウスの半分(条件1つ当たり6匹)につき、RNA-seq(Illumina HiSeq SE50)を実行する。マウスの他方の半分(条件1つ当たり6匹)において、主要な遺伝子のトランスクリプトームの結果をqRT-PCRで確認する。
【０１６５】
腸管内腔における細菌のBA脱コンジュゲーションの増加は、回腸末端部のBAプール回腸末端部のBAプールの変化をもたらす。これは、FXR経路とTGR5経路の両方を活性化する。行動試験は、EcAZGFP+/BSH+マウスとPBS及びEcAZGFP+/BSH-グループからのマウスとの間に認知の差があることを示す。これは、例えば、神経炎症の低減、血液脳関門透過性の変化、ニューロンそれ自体へのBAの直接的な作用、又は因子の組合せによる可能性がある。
【０１６６】
ENBによる内腔のBA改変はCR-WTマウスにおける小グリア細胞の遺伝子発現に影響を与える。
HFD消費は、BBB透過性の破壊、神経炎症の増加、又はニューロンのトランスクリプトームの変化を含む複数のメカニズムを介して行動に関する機能不全を引き起こす可能性がある。BAは神経炎症を調節できることから、本発明者らは、ENBが血清BAプールを変化させることによって小グリア細胞の活性化に影響を与えるかどうかを決定した。本発明者らはここで、BSH活性は、小グリア細胞の活性化の変化の非存在下で認知の変化を誘導する可能性があり、同様に認知の変化を誘導せずに小グリア細胞の活性化において変化を引き起こす可能性があることに留意している。
【０１６７】
手法:ENB定着、インビボでの評価、及びBAシグナル伝達の検死評価。8週齢のWT雄C57BL/6マウス(合計で48匹のマウス)を使用する。6つの条件のそれぞれにおいて8匹のマウスを用いたことを除き、具体的な目的1(SA1)に記載したように動物を維持し、評価し、定着させる。これらのマウスに、SA1で採用される定着及びBSH活性を評価するのに使用される全ての方法を同様に使用する。
【０１６８】
小グリア細胞の単離。マウスをHFDで24週間維持した後、これまでに公開されたようにして(62)、小グリア細胞を単離する。簡単に言えば、6時間の絶食後、マウスをCO2で深く麻酔し、次いで氷冷したDPBSで心内膜にすばやく灌流する。脳全体を取り除き、海馬を解剖し、半分を免疫染色と小グリア細胞の再構築に使用し(下記参照)、残りの半分を小グリア細胞の分離とRNA-Seqに使用する。海馬組織を穏やかにホモジナイズし、ろ過し、遠心分離する。次いでペレット化したホモジネートを37%等張パーコールに再懸濁し、次いで70%等張パーコールで覆う。次いでチューブを遠心分離し、37〜70%パーコールの中間相のものを回収し、HBSSで洗浄する。次いで細胞を氷上での染色緩衝液中でCD16/CD32ブロッキング抗体と共にインキュベートし、次いで抗マウスCD11b-PE及びCD45-Alexa488抗体と共にインキュベートする。ソーティングを実行したところ、小グリア細胞は、CD11b+CD45Lowイベントであるシングレットとして同定され、これが全てのCD11b+イベントの>95%を包含していた。次いで単離された小グリア細胞をペレット化し、下流プロトコールのために-80℃で貯蔵する。
【０１６９】
RNAの単離、シーケンシング、及び分析:全RNAをTRIzolによって小グリア細胞ホモジネートから単離する。ライブラリーの調製及びシーケンシングをUCSDシーケンシングコアによって実行する。RNA-Seq実験からのFastqファイルを、STARを使用して起源のマウス株につき個々のゲノムにマッピングする。
【０１７０】
免疫染色及び小グリア細胞の再構築。小グリア細胞を単離し、これまでに公開されたプロトコールを使用して免疫染色する(12)。解剖した海馬組織を4%(w/v)パラホルムアルデヒド中で固定する。ビブラトームを使用して、50mmの矢状断片を作成する。浮遊断片をマウス抗FXR NR1H4、ウサギ抗GPCR TGR5、及びヤギ抗Iba1で染色し、その後、抗マウスIgG-AF647及び抗ウサギIgG-AF546、及び抗ヤギIgG-AF488で染色する。断片を共焦点顕微鏡に載せ、画像化する。小グリア細胞の細胞本体と突起の半自動的な再構築を実行する。動物1匹当たり20〜60個の細胞を分析する。
【０１７１】
サイトカインの定量化。組織ホモジネート及び血清中のTNF-α、IL-6、及び他のサイトカインをマルチプレックスプラットフォームを使用して評価する。
【０１７２】
腸管内腔における細菌のBA脱コンジュゲーションの増加は、形態学(例えば、突起の直径、分岐点の数、総ブランチ長さ)及びサイトカイン生産(マルチプレックス/ELISA又は転写のいずれかによって)によって決定される神経炎症の減少をもたらす。EcAZGFP+/BSH+で処置したマウスでは、NCD対照マウスにより類似したトランスクリプトームプログラムであるが、それに対してEcAZGFP+/BSH-で処置したマウスは、ビヒクルで処置したHFDコホートと区別できない。最終的に、トランスクリプトーム経路は、BA脱コンジュゲーション増加により誘導された変化が、公知のBA受容体又は他のいくつかの定義されていないメカニズムによって媒介されるのかどうかを示す。
【０１７３】
ほとんどのプロバイオティクスの宿主への定着を阻むバリアを迂回する効率的な消化管定着物を使用することによって、ENBは、どのように本発明者らが消化管のマイクロバイオームを分析してそれを理解し、マイクロバイオームが媒介する疾患を処置することに莫大な効果がある。本明細書において、本発明者らは、ENBを使用してマイクロバイオーム-消化管-脳軸の媒介物質を決定するための基礎を提供する。
(参考文献)
2020516318.tif 000012
2020516318.tif 000013
2020516318.tif 000014
2020516318.tif 000015
2020516318.tif 000016
【０１７４】
(実施例3)
ヒト消化管へ再導入され操作された共生細菌の定着
健康なヒト対象は、滅菌スワブに便のサンプルを提供し、これを実験室で培養する。便サンプルからの共生細菌細胞を、蛍光タンパク質等のマーカーを発現するように操作する。その後、異種ポリヌクレオチドで形質転換した細菌を、生きた生物の濃縮溶液として、例えば、食物(例えば、オートミール、ヨーグルト)に混合するか、又は消費の直前に大きいゲルカプセルにパックした強く緩衝化した溶液中の懸濁液としてのいずれかで対象に戻す。ヒト対象に、予め決定されたインターバルで、例えば2カ月にわたり週2回、便サンプルを収集し提出するための滅菌スワブを提供し、対象の消化管における操作された菌株の再定着の成功を追跡する。
【０１７５】
本明細書に記載される実施例及び実施形態は単に例示の目的のためであり、それらに照らした様々な改変又は変更は、当業者に示唆されており、本出願の本質及び範囲並びに添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されることになることが理解される。本明細書において引用された全ての公報、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【表３−１】
2020516318.tif 000017
【表３−２】
2020516318.tif 000018
【表３−３】
2020516318.tif 000019
【表３−４】
2020516318.tif 000020
【表３−５】
2020516318.tif 000021
【表３−６】
2020516318.tif 000022
【表３−７】
2020516318.tif 000023
【表３−８】
2020516318.tif 000024
【表３−９】
2020516318.tif 000025
【表３−１０】
2020516318.tif 000026
【表３−１１】
2020516318.tif 000027
【表３−１２】
2020516318.tif 000028
【表３−１３】
2020516318.tif 000029
【表３−１４】
2020516318.tif 000030
【表３−１５】
2020516318.tif 000031
【表３−１６】
2020516318.tif 000032
【表３−１７】
2020516318.tif 000033
【表３−１８】
2020516318.tif 000034
【表３−１９】
2020516318.tif 000035
【図１】
2020516318.tif 000036
【図２】
2020516318.tif 000037
【図３Ａ】
2020516318.tif 000038
【図３Ｂ】
2020516318.tif 000039
【図３Ｃ】
2020516318.tif 000040
【図４Ａ】
2020516318.tif 000041
【図４Ｂ】
2020516318.tif 000042
【図４Ｃ】
2020516318.tif 000043
【図４Ｄ−Ｅ】
2020516318.tif 000044
【図４Ｆ】
2020516318.tif 000045
【図５−１】
2020516318.tif 000046
【図５−２】
2020516318.tif 000047
【図６Ａ】
2020516318.tif 000048
【図６Ｂ】
2020516318.tif 000049
【図７Ａ】
2020516318.tif 000050
【図７Ｂ】
2020516318.tif 000051
【図７Ｃ】
2020516318.tif 000052
【図７Ｄ】
2020516318.tif 000053
【図８】
2020516318.tif 000054
【図９Ａ】
2020516318.tif 000055
【図９Ｂ】
2020516318.tif 000056
【図１０】
2020516318.tif 000057
【図１１】
2020516318.tif 000058
【図１２】
2020516318.tif 000059
【図１３】
2020516318.tif 000060
【図１４】
2020516318.tif 000061
【図１５】
2020516318.tif 000062
【図１６】
2020516318.tif 000063
【図１７】
2020516318.tif 000064
【図１８】
2020516318.tif 000065
【配列表】
2020516318000001.xml
【国際調査報告】
2020516318.tif 000085
2020516318.tif 000086