(57)【要約】  本発明は、有利には腫瘍微小環境の標的化によって達成され得る、癌の治療における使用のための方法及び組成物を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種核酸分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、前記異種核酸分子は、
（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第１のポリヌクレオチドと、
（ｂ）治療物質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
【請求項２】
前記治療物質は、抗体試薬を含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３】
前記抗体試薬は、一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、請求項２に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項４】
前記抗体試薬は、二重特異性抗体試薬を含む、請求項２に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項５】
前記二重特異性抗体試薬は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）を含む、請求項４に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項６】
前記単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体を含む、請求項３に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項７】
前記治療物質は、サイトカインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項８】
前記ＣＡＲ及び前記治療物質は、別々のＣＡＲ及び治療物質分子を生成するために切断されるポリタンパク質の形態で作製される、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項９】
前記ポリタンパク質は、前記ＣＡＲと前記治療物質との間に切断可能部分を含む、請求項８に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１０】
前記切断可能部分は、２Ａペプチドを含む、請求項９に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１１】
前記２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａを含む、請求項１０に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１２】
前記ＣＡＲ及び前記治療物質は、それぞれ構成的に発現される、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１３】
前記ＣＡＲ及び前記治療物質の発現は、伸長因子１−α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動される、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１４】
前記治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１５】
前記誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターを含む、請求項１４に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１６】
前記ＣＡＲは、構成的プロモーターの制御下で発現され、且つ前記治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１７】
前記ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１８】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体又はリガンドを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項１９】
前記ＣＡＲの前記膜貫通ドメインは、任意選択的に配列番号４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８及び６６のいずれか１つの配列又はその変異体を含むＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、任意選択的に配列番号６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０及び６８のいずれか１つの配列又はその変異体を含むＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２１】
任意選択的に配列番号５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９及び６７のいずれか１つの配列又はその変異体を含む４−１ＢＢ同時刺激ドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２２】
前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質は、前記治療物質が抗体試薬を含むとき、腫瘍関連抗原に結合する、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２３】
前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質が結合する前記腫瘍関連抗原は、固形腫瘍関連抗原である、請求項２２に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２４】
前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質が結合する前記腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）又はＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒα２）を含み、且つ任意選択的に、前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質は、配列番号２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む、請求項２２に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２５】
前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質は、前記治療物質が抗体試薬を含むとき、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する、請求項１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２６】
前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質が結合する前記Ｔｒｅｇ関連抗原は、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、且つ任意選択的に、前記ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は前記治療物質は、配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む、請求項２５に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２７】
ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ  Ｔ細胞であって、前記ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ前記抗原結合ドメインは、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２８】
前記Ｔｒｅｇ関連抗原は、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、請求項２７に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項２９】
前記ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインをさらに含む、請求項２７に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３０】
前記ＣＡＲの前記抗原結合ドメインは、任意選択的に配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含むｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、請求項２７に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３１】
配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６１、配列番号１９、配列番号１、配列番号７及び配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３２】
配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６１、配列番号１９、配列番号１、配列番号７及び配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含む、請求項３１に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞。
【請求項３３】
請求項１に記載の（ｉ）ＣＡＲポリペプチド又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３４】
請求項１に記載のＣＡＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質。
【請求項３５】
請求項１に記載の１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド又はポリタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項３６】
癌を有する患者を治療する方法であって、請求項１に記載の１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞又はその核酸分子、ＣＡＲポリペプチド若しくはポリタンパク質を含む医薬組成物を前記患者に投与することを含む方法。
【請求項３７】
全身毒性は、腫瘍微小環境を標的にすることによって低下される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌は、１つ以上の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌は、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌は、神経膠芽腫である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
癌を有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞産物を前記患者に投与することを含み、全身毒性は、癌の毒性を腫瘍微小環境に局所的に誘導することによって低下される、方法。
【請求項４２】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ１５、ＣＳＦ１Ｒ若しくはＥＧＦＲに対する抗体又は前記腫瘍微小環境に対する二重特異性抗体を送達するように遺伝子組換えされる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に対して向けられる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
疾患又は病理を治療するために治療物質を患者における組織又は臓器に送達する方法であって、治療抗体、毒素又は作用剤を分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、前記治療抗体、毒素又は作用剤は、単独では前記組織又は臓器に侵入又は浸透することができないであろう、方法。
【請求項４５】
前記組織又は臓器は、神経系におけるものである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記神経系は、中枢神経系である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記中枢神経系は、脳である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患又は病理は、神経膠芽腫である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記治療抗体は、抗ＥＧＦＲ（抗上皮成長因子受容体）又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の技術は、免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、選択された標的抗原、最も多くは腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を発現する標的細胞に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を駆動するための方法を提供する。ＣＡＲは、抗原結合ドメインが誘導された標的抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインと置換される場合のＴ細胞受容体の適応である。Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲ（「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」）による標的細胞の表面上での標的抗原の会合により、標的細胞の殺滅が促進される。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、異種核酸分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を提供し、ここで、異種核酸分子は、（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第１のポリヌクレオチドと、（ｂ）治療物質をコードする第２のポリヌクレオチドとを含む。任意選択的に、第１及び第２のポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド分子内に含まれる。さらに、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ；下記も参照されたい）をさらに含む。
【０００４】
様々な実施形態では、治療物質は、抗体試薬（例えば、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科抗体）又は二重特異性抗体試薬（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体；下記も参照されたい）であるか又はそれを含む。他の実施形態では、治療物質は、サイトカインであるか又はそれを含む。
【０００５】
様々な実施形態では、ＣＡＲ及び治療物質は、別々のＣＡＲ及び治療物質分子を生成するために切断されるポリタンパク質の形態で作製される（したがって単一の核酸分子内にコードされ得る）。いくつかの実施形態では、ポリタンパク質は、ＣＡＲと治療物質との間に切断可能部分（例えば、２Ａペプチド、例えばＰ２Ａ又はＴ２Ａ；下記も参照されたい）を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び治療物質は、それぞれ構成的に発現される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ及び治療物質の発現は、伸長因子−１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動される。いくつかの実施形態では、治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）の制御下で発現される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、構成的プロモーターの制御下で発現され、且つ治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）の制御下で発現される。
【０００６】
様々な実施形態では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科抗体）又はリガンドであるか又はそれを含む。
【０００７】
様々な実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、任意選択的に配列番号４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８及び６６のいずれか１つの配列又はその変異体を含むＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む。
【０００８】
様々な実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、任意選択的に配列番号６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０及び６８のいずれか１つの配列又はその変異体を含むか又はそれからなるＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０００９】
様々な実施形態では、任意選択的に配列番号５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９及び６７のいずれか１つの配列又はその変異体を含むか又はそれからなる４−１ＢＢ同時刺激ドメインが含まれる。
【００１０】
様々な実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、治療物質が抗体試薬であるか又はそれを含むとき、腫瘍関連抗原に結合する（例えば、下記を参照されたい）。様々な実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合する腫瘍関連抗原は、固形腫瘍関連抗原である。様々な実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合する腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）又はＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒα２）を含み、且つ任意選択的に、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、配列番号２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む。
【００１１】
様々な実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、治療物質が抗体試薬であるか又はそれを含むとき、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する。様々な実施形態では、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合するＴｒｅｇ関連抗原は、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、且つ任意選択的に、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む。
【００１２】
本発明は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ  Ｔ細胞をさらに提供し、ここで、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン（例えば、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ；例えば追加例として下記を参照されたい）及び細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ｚ；例えば追加例として下記を参照されたい）を含み、且つ抗原結合ドメインは、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する。様々な実施形態では、Ｔｒｅｇ関連抗原は、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。様々な実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメイン（例えば、４−１ＢＢ；例えば追加例として下記を参照されたい）をさらに含む。様々な例では、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、任意選択的に配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含むｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む。
【００１３】
本発明は、配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６１、配列番号１９、配列番号１、配列番号７及び配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又は１００％）の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞をさらに提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本明細書に記載の通りの（ｉ）ＣＡＲポリペプチド又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質をコードする核酸分子を提供する。
【００１５】
本発明は、本明細書に記載の通りの（ｉ）ＣＡＲポリペプチド又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質をさらに提供する。
【００１６】
本発明は、本明細書に記載の通りの１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド又はポリタンパク質を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１７】
本発明には、疾患又は状態（例えば、癌（神経膠芽腫など）；下記も参照されたい）を有する患者（例えば、ヒト患者）を含む対象を治療する方法も含まれる。この方法は、１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物又は本明細書に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む。様々な実施形態では、方法は、腫瘍微小環境を標的にし、それにより例えば全身毒性が低下される。様々な実施形態では、癌は、１つ以上の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる。様々な実施形態では、癌は、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる。
【００１８】
本発明は、癌を有する対象（例えば、患者、例えばヒト患者）を治療する方法をさらに提供する。この方法は、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞産物を対象に投与することを含み、ここで、癌毒性を腫瘍微小環境に局所的に導くことによって全身毒性が低下される。様々な実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ１５、ＣＳＦ１Ｒ若しくはＥＧＦＲに対する抗体又は腫瘍微小環境に対する（例えば、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に特異的な）二重特異性抗体を送達するように遺伝子組換えされる。
【００１９】
本発明は、疾患又は病理を治療するために１つ以上の治療物質を患者における組織又は臓器に送達する方法をさらに提供する。この方法は、治療抗体、毒素又は薬剤を分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞を患者に投与することを含み、ここで、治療抗体、毒素又は薬剤は、単独では組織又は臓器に侵入又は貫通することができないであろう。様々な実施形態では、組織又は臓器は、神経系におけるものである。様々な実施形態では、神経系は、中枢神経系（例えば、脳）である。様々な実施形態では、疾患又は病理は、神経膠芽腫である。様々な実施形態では、治療抗体は、抗ＥＧＦＲ（抗上皮成長因子受容体）又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載の疾患又は状態を予防又は治療する上での使用又はそのための薬剤の調製の使用におけるＣＡＲ  Ｔ細胞、ポリペプチド、核酸分子、医薬組成物並びに他の組成物及び分子の使用も含む。
【００２１】
定義
便宜上、本明細書、実施例及び貼付の特許請求の範囲において用いられるいくつかの用語及び語句の意味は下記に提供される。特に断りのない限り又は文脈から示唆されるように、以下の用語及び語句は、以下に提供される意味を含む。技術の範囲があくまで特許請求の範囲によって限定されないことから、定義は、特定の実施形態の記述に役立つように提供され、特許請求される技術を限定することが意図されない。特段の定義がされていない限り、本明細書で用いられるすべての科学技術用語は、この技術が属する当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。当該技術分野における用語の使用と本明細書に提供されるその定義との間に明白な矛盾が存在する場合、本明細書中に提供される定義が採用されるものとする。
【００２２】
免疫学及び分子生物学における一般的用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．により発行，２０１１（ＩＳＢＮ９７８−０−９１１９１０−１９−３）；Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．により発行，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ９７８３５２７６００９０８）；及びＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．により発行，１９９５（ＩＳＢＮ１−５６０８１−５６９−８）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒにより発行，２００６；Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．）、Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）；Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにより発行，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）；Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ１９３６１１３４１４）；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ０４４４６０１４９Ｘ）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ０１２４１９９５４２）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ）、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ）、Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅ���  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）（これら各々の内容のすべては、それら全体が参照により本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【００２３】
用語「減少する」、「低下した」、「低下」又は「阻害する」は、すべて統計学的に有意な量の低下を意味するように本明細書で用いられる。いくつかの実施形態では、「低下する」、「低下」又は「減少する」又は「阻害する」は、典型的には、参照レベル（例えば、所与の治療又は薬剤の不在）と比べて少なくとも１０％の減少を意味し、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％又はそれを超える減少を含み得る。本明細書で用いられるとき、「低下」又は「阻害」は、参照レベルと比べての完全な阻害又は低下を包含しない。「完全阻害」は、参照レベルと比べての１００％の阻害である。適用可能である場合、減少は、好ましくは所与の障害を有しない個体において正常範囲内として認められたレベルまでの低下であり得る。
【００２４】
用語「増加した」、「増加させる」、「増強する」又は「活性化する」は、すべて統計学的に有意な量の増加を意味する本明細書で用いられる。いくつかの実施形態では、用語「増加した」、「増加する」、「増強する」又は「活性化する」は、参照レベルと比べて少なくとも１０％の増加、例えば参照レベルと比べて、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％の増加、又は１００％までの増加、又は１０〜１００％の間の任意の増加、又は参照レベルと比べて、少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍若しくは少なくとも約１０倍の増加、又は２倍と１０倍以上との間の任意の増加を意味し得る。マーカー又は症状との関連で、「増加」は、かかるレベルにおける統計学的に有意な増加である。
【００２５】
本明細書で用いられるとき、「対象」は、ヒト又は動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜又は狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類は、例えば、チンパンジー、カニクイザル、クモザル及びマカク、例えばアカゲザルを含む。齧歯類は、例えば、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ及びハムスターを含む。家畜又は狩猟動物は、例えば、雌ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、水牛、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウ及び魚、例えばマス、ナマズ及びサケを含む。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。用語「個体」、「患者」及び「対象」は、本明細書で交換可能に用いられる。
【００２６】
好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ又は雌ウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、有利には、疾患、例えば癌の動物モデルを表す対象として用いることができる。対象は、雄又は雌であり得る。
【００２７】
対象は、治療を必要とする状態（例えば、特に神経膠芽腫、グリオーマ、白血病又は別タイプの癌）又はかかる状態に関連した１つ以上の合併症を患うか又は有すると以前に診断又は同定されている、任意選択的に状態又は状態に関連した１つ以上の合併症に対する治療を既に受けている対象であり得る。或いは、対象は、かかる状態又は関連合併症を有すると以前に診断されていない対象でもあり得る。例えば、対象は、状態又は状態に関連する１つ以上の合併症における１つ以上のリスク因子を呈する対象又はリスク因子を呈しない対象であり得る。
【００２８】
特定の状態に対する治療を「を必要とする対象」は、その状態を有するか、その状態を有すると診断されたか、又はその状態を発現するリスクがある対象であり得る。
【００２９】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持できず、疾患が寛解されない場合、動物の健康が悪化し続ける、動物、例えばヒトの健康状態である。それに対し、動物における「障害」は、動物がホメオスタシスを維持することができるが、動物の健康状態が障害の不在下で予想される状態よりも好ましくないような健康状態である。障害は、治療されないままで、動物の健康状態におけるさらなる低下を生じるとは限らない。
【００３０】
本明細書で用いられるとき、用語「腫瘍抗原」及び「癌抗原」は、癌細胞により別々に発現される抗原を指すように交換可能に用いられ、したがって癌細胞を標的にするために用いることができる。癌抗原は、潜在的には腫瘍特異的免疫応答を明らかに刺激し得る抗原である。これらの抗原の一部はコードされるが、必ずしも正常細胞によって発現されない。これらの抗原は、通常は正常細胞内でサイレントである（すなわち発現されない）もの、分化の特定ステージに限って発現されるもの並びに胚性及び胎児抗原などの一時的に発現されるものとして特徴付けることができる。他の癌抗原は、突然変異細胞遺伝子、例えば癌遺伝子（例えば、活性化ｒａｓ癌遺伝子）、サプレッサー遺伝子（例えば、突然変異体ｐ５３）及び内部欠失又は染色体転座から生じる融合タンパク質によってコードされる。さらに他の癌抗原は、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡ腫瘍ウイルス上で運ばれるようなウイルス遺伝子によってコードされ得る。多数の腫瘍抗原が、複数の固形腫瘍：免疫によって規定されるＭＡＧＥ１、２及び３；ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＨＥＲ２、ムチン（すなわちＭＵＣ−１）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及び前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）の観点から定義されている。さらに、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、エプスタイン・バー（ＥＢＶ）及びヒト乳頭腫（ＨＰＶ）によってコードされるものなどのウイルスタンパク質は、それぞれ肝細胞癌、リンパ腫及び子宮頸癌の発現において重要であることが示されている。腫瘍抗原の例が以下に提供され、例えばＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＰＳＭＡ、ＢＣＭＡ、ＩＬ１３Ｒａ２などを含む。
【００３１】
本明細書で用いられるとき、「Ｔｒｅｇ抗原」又は「Ｔｒｅｇ関連抗原」は、Ｔ制御（Ｔｒｅｇ）細胞によって発現される抗原を指すように交換可能に用いられる。これらの抗原は、任意選択的に、本発明の細胞及び方法によって標的にされ得る。Ｔｒｅｇ抗原の例が以下に提供され、例えばＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ４を含む。
【００３２】
本明細書で用いられるとき、用語「キメラ」は、少なくとも２つ以上の異なるポリヌクレオチド分子の部分間の融合の生成物を指す。一実施形態では、用語「キメラ」は、既知のエレメント又は他のポリヌクレオチド分子の操作を通じて生成される遺伝子発現エレメントを指す。
【００３３】
「二重特異性Ｔ細胞誘導抗体」、「ＢｉＴＥ抗体構築物」又はＢｉＴＥ」は、各々がタンデムに連結された一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含むポリペプチドを意味する。任意選択的に、ｓｃＦｖは、リンカー（例えば、グリシンリッチリンカー）によって連結される。ＢｉＴＥの一方のｓｃＦｖは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に（例えば、ＣＤ３εサブユニットに）結合し、且つ他方は、標的抗原（例えば、腫瘍関連抗原）に結合する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、「活性化」は、検出可能な細胞増殖を誘導するように十分に刺激されているＴ細胞の状態を指し得る。いくつかの実施形態では、活性化は、誘導されたサイトカイン産生を指し得る。他の実施形態では、活性化は、検出可能なエフェクター機能を指し得る。少なくとも、「活性化Ｔ細胞」は、本明細書で用いられるとき、増殖性Ｔ細胞である。
【００３５】
本明細書で用いられるとき、用語「特異的結合」及び「特異的に結合する」は、２つの分子、化合物、細胞及び／又は粒子の間での物理的相互作用であって、第１の実体が、標的である第２の実体に、非標的である第３の実体に結合するよりも高い特異性及び親和性で結合する場合を指す。いくつかの実施形態では、特異的結合は、第１の実体の第２の標的実体に対する、同じ条件下で第３の非標的実体に対する親和性よりも少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍又はそれを超える親和性を指し得る。所与の標的に対して特異的な試薬は、アッセイが利用されている条件下でその標的に対して特異的結合を示すものである。非限定例として、同族結合パートナー（例えば、Ｔ細胞上に存在する刺激及び／又は同時刺激分子）タンパク質を認識し、それと結合する、抗体又はリガンドが挙げられる。
【００３６】
「刺激リガンド」は、本明細書で用いられるとき、抗原提示細胞（ＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、人工ＡＰＣなど）上に存在するとき、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書で「刺激分子」又は「同時刺激分子」と称される）と特異的に結合し、それにより、限定はされないが、増殖、活性化、免疫応答の開始などを含む、Ｔ細胞による一次応答を媒介し得るリガンドを指す。刺激リガンドは、当該技術分野で周知であり、特に、ペプチドが負荷されたＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【００３７】
「刺激分子」は、用語が本明細書で用いられるとき、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【００３８】
「同時刺激リガンド」、用語が本明細書で用いられるとき、Ｔ細胞上の同族同時刺激分子に特異的に結合し、それにより、例えばＴＣＲ／ＣＤ３複合体とペプチドが負荷されたＭＨＣ分子との結合により提供される一次シグナルに加えて、限定はされないが、増殖、活性化、分化などを含むＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供するＡＰＣ上の分子を含む。同時刺激リガンドは、限定はされないが、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、誘導性同時刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する作動薬又は抗体及びＢ７−Ｈ３に特異的に結合するリガンドを含み得る。同時刺激リガンドは、限定はされないが、Ｔ細胞上に存在する同時刺激分子に特異的に結合する抗体、例えば限定はされないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３に特異的に結合するリガンドも含み得る。
【００３９】
「同時刺激分子」は、同時刺激リガンドに特異的に結合し、それによりＴ細胞による同時刺激応答、例えば限定はされないが増殖を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。同時刺激分子は、限定はされないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３及びＣＤ８３を含む。
【００４０】
一実施形態では、用語「改変される」及びその文法的等価物は、本明細書で用いられるとき、核酸、例えば生物のゲノム内の核酸の１つ以上のヒト向けに設計された変更を指し得る。別の実施形態では、改変されるは、遺伝子の変更、付加及び／又は欠失を指し得る。「改変された細胞」は、付加、欠失及び／又は変更された遺伝子を有する細胞を指し得る。用語「細胞」又は「改変された細胞」及びそれらの文法的等価物は、本明細書で用いられるとき、ヒト又は非ヒト動物由来の細胞を指し得る。
【００４１】
本明細書で用いられるとき、用語「作動可能に連結される」は、第１のポリヌクレオチド分子、例えばプロモーターが、第２の転写可能なポリヌクレオチド分子、例えば目的の遺伝子と接続されることを指し、この場合のポリヌクレオチド分子は、第１のポリヌクレオチド分子が第２のポリヌクレオチド分子の機能に影響するように配列される。２つのポリヌクレオチド分子は、単一の隣接ポリヌクレオチド分子の一部であってもなくてもよく、また隣接していてもしていなくてもよい。例えば、プロモーターが細胞内での目的の遺伝子の転写を制御又は媒介する場合、プロモーターは目的の遺伝子に作動可能に連結される。
【００４２】
本明細書に記載の様々な実施形態では、記載の特定ポリペプチドのいずれかの変異体（天然に存在するか又はそれ以外）、対立遺伝子、ホモログ、保存的に修飾された変異体及び／又は保存的置換変異体が包含されることがさらに検討される。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされた配列内の単一のアミノ酸又は低い百分率のアミノ酸を変更する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列に対する個別の置換、欠失又は付加が、改変がアミノ酸と化学的に類似したアミノ酸との置換をもたらし、ポリペプチドの所望される活性を保持する場合の「保存的に修飾された変異体」であることを理解するであろう。かかる保存的に修飾された変異体は、それに加えて、本開示に一致する多型変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子を除外しない。
【００４３】
所与のアミノ酸は、類似の生理化学的特徴を有する残基で置換され得るが、例えば１つの脂肪族残基を他のもの（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ又はＡｌａなどを相互に）置換すること又は１つの極性残基の他のものとの（ＬｙｓとＡｒｇ；ＧｌｕとＡｓｐ；又はＧｌｎとＡｓｎとの間での）置換が挙げられる。他のかかる保存的置換、例えば類似の疎水性特徴を有する全領域の置換は周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、本明細書に記載のアッセイのいずれか１つにおいて試験することで、所望される活性、例えば天然又は参照ポリペプチドのリガンド媒介受容体活性及び特異性が保持されることを確認することができる。
【００４４】
アミノ酸は、（Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７３−７５，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５）における）それらの側鎖の特性：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）における類似性に従ってグループ化され得る。或いは、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向性に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに基づいてグループ分けされ得る。非保存的置換は、これらのクラスの１メンバーを別クラスと交換することを伴うことになる。特定の保存的置換として、例えばＡｌａをＧｌｙ又はＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；ＡｓｎをＧｌｎ又はＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｕをＡｓｐへ；ＧｌｙをＡｌａ又はＰｒｏへ；ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎへ；ＩｌｅをＬｅｕ又はＶａｌへ；ＬｅｕをＩｌｅ又はＶａｌへ；ＬｙｓをＡｒｇ、Ｇｌｎ又はＧｌｕへ；ＭｅｔをＬｅｕ、Ｔｙｒ又はＩｌｅへ；ＰｈｅをＭｅｔ、Ｌｅｕ又はＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；及び／又はＰｈｅをＶａｌ、Ｉｌｅ又はＬｅｕへ、が挙げられる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド（又はかかるポリペプチドをコードする核酸）は、本明細書に記載のアミノ酸配列の１つの機能断片であり得る。本明細書で用いられるとき、「機能断片」は、当該技術分野で公知であるか又は本明細書中の以下に記載されるアッセイによると、野生型参照ポリペプチドの活性の少なくとも５０％を保持する、ペプチドの断片又はセグメントである。機能断片は、本明細書に開示される配列の保存的置換を含み得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、本明細書に記載のようなポリペプチド又は分子の変異体であり得る。いくつかの実施形態では、変異体は、保存的に修飾された変異体である。保存的置換変異体は、例えば、天然ヌクレオチド配列の突然変異によって得られ得る。「変異体」は、本明細書で参照されるとき、天然又は参照ポリペプチドに対して実質的に相同であるが、１つ又は複数の欠失、挿入又は置換が理由で天然又は参照ポリペプチドの場合と異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、天然又は参照ＤＮＡ配列と比べて、ヌクレオチドの１つ以上の付加、欠失又は置換を含むが、非変異体ポリペプチドの活性を保持する変異体タンパク質又はその断片をコードする、配列を包含する。多種多様なＰＣＲに基づく部位特異的変異原性手法は、当該技術分野で公知であり、当業者によって適用され得る。
【００４７】
変異体のアミノ酸又はＤＮＡ配列は、天然又は参照配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれを超えて同一であり得る。天然及び突然変異体配列の間の相同性（パーセント同一性）の程度は、例えば、一般にワールドワイドウェブ上でこの目的のために用いられる自由に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、デフォルト設定でのＢＬＡＳＴｐ又はＢＬＡＳＴｎ）を用いて２つの配列を比較することにより決定され得る。
【００４８】
天然アミノ酸配列の変更は、当業者に公知のいくつかの技術のいずれかにより達成され得る。突然変異は、例えば、天然配列の断片へのライゲーションを可能にする制限部位によって隣接される、突然変異体配列を有するオリゴヌクレオチドを合成することにより、特定の遺伝子座に導入され得る。ライゲーション後、得られる再構築された配列は、所望されるアミノ酸の挿入、置換又は欠失を有する類似体をコードする。或いは、オリゴヌクレオチドに誘導される部位特異的変異原性手法を用いて、要求される置換、欠失又は挿入に従って変更された特定コドンを有する変更されたヌクレオチド配列を提供することができる。かかる変更を設けるための技術は、十分に確立されており、例えばＷａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ４２：１３３，１９８６）；Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅ  ３７：７３，１９８５）；Ｃｒａｉｋ（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  １９８５，１２−１９）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；並びに米国特許第４，５１８，５８４号明細書及び米国特許第４，７３７，４６２号明細書（それら全体が参照により本明細書中に援用される）に開示されたものを含む。ポリペプチドの適切な立体構造を維持することに関与しない任意のシステイン残基は、一般にセリンと置換されることで、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を阻止することもできる。逆に、システイン結合をポリペプチドに付加することで、その安定性を改善し、オリゴマー形成を促進することができる。
【００４９】
本明細書で用いられるとき、用語「ＤＮＡ」は、デオキシリボ核酸と定義される。用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオシドのポリマーを示すため、「核酸」と交換可能に本明細書で用いられる。典型的には、ポリヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合によって接続されたＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）において天然に見出されるヌクレオシドから構成される。しかし、用語は、天然に存在する核酸中に見出されるか否かにかかわらず、化学的又は生物学的に修飾された塩基、修飾された骨格などを有するヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む分子を包含し、かかる分子は、特定用途にとって好ましいことがある。本願がポリヌクレオチドを指す場合、ＤＮＡ、ＲＮＡの両方並びに各場合における一本鎖及び二本鎖形態の両方（及び各一本鎖分子の相補鎖）が提供されることが理解される。「ポリヌクレオチド配列」は、本明細書で用いられるとき、ポリヌクレオチド材料自体及び／又は特定の核酸を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち塩基における略称として用いられる一連の文字）を指し得る。本明細書で提示されるポリヌクレオチド配列は、別段の指示がない限り、５’から３’方向で示される。
【００５０】
用語「ポリペプチド」は、本明細書で用いられるとき、アミノ酸のポリマーを指す。用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。ペプチドは、典型的には約２〜６０の間のアミノ酸長の比較的短いポリペプチドである。本明細書で用いられるポリペプチドは、典型的には、最も一般的にはタンパク質中に見出される２０Ｌのアミノ酸などのアミノ酸を有する。しかし、当該技術分野で公知の他のアミノ酸及び／又はアミノ酸類似体を用いることができる。ポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上が例えば炭水化物基、リン酸基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカー、機能分化などの化学的実体の付加により修飾され得る。それと共有結合的又は非共有結合的に会合された非ポリペプチド部分を有するポリペプチドは、やはり「ポリペプチド」と考えられる。例示的修飾は、グリコシル化及びパルミトイル化を含む。ポリペプチドは、例えば、天然供給源から精製され得るか、組換えＤＮＡ技術を用いて生成され得るか、又は通常の固相ペプチド合成などの化学的手段によって合成され得る。用語「ポリペプチド配列」又は「アミノ酸配列」は、本明細書で用いられるとき、ポリペプチド材料自体及び／又はポリペプチドを生化学的に特徴付ける配列情報（すなわちアミノ酸名における略称として用いられる一連の文字又は３文字コード）を指し得る。本明細書で提示されるポリペプチド配列は、別段の指示がない限り、Ｎ末端からＣ末端方向で示される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようなポリペプチド（例えば、ＣＡＲポリペプチド）をコードする核酸は、ベクターによって含まれる。本明細書に記載の態様の一部では、本明細書に記載のような所与のポリペプチドをコードする核酸配列又はその任意のモジュールは、ベクターに作動可能に連結される。用語「ベクター」は、本明細書で用いられるとき、宿主細胞への送達又は異なる宿主細胞間の導入向けに設計された核酸構築物を指す。本明細書で用いられるとき、ベクターは、ウイルス又は非ウイルスであり得る。用語「ベクター」は、適切な調節エレメントと会合する際に複製能力があり、且つ遺伝子配列を細胞に導入し得る任意の遺伝要素を包含する。ベクターは、限定はされないが、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、人工染色体、ウイルス、ビリオンなどを含み得る。
【００５２】
本明細書で用いられるとき、用語「発現ベクター」は、ベクター上の転写制御配列に連結された配列からＲＮＡ又はポリペプチドの発現を誘導するベクターを指す。発現される配列は、必然ではないが、細胞に対して異種となることが多い。発現ベクターは、追加的配列を含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、それにより２つの生物、例えば発現のためのヒト細胞並びにクローニング及び増幅のための原核生物宿主におけるその維持が可能になる。用語「発現」は、ＲＮＡ及びタンパク質の生成、また必要に応じて、タンパク質の分泌に関与する細胞プロセス、適用可能であれば、例えば限定はされないが、転写、転写物プロセシング、翻訳及びタンパク質のフォールディング、修飾及びプロセシングなどを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡ及び遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドを含む。用語「遺伝子」は、適切な制御配列に作動可能に連結されるとき、インビトロ又はインビボで（ＤＮＡから）ＲＮＡに転写される核酸配列を意味する。遺伝子は、コード領域に先行及び後続する領域、例えば５’非翻訳（５’ＵＴＲ）又は「リーダー」配列及び３’ＵＴＲ又は「トレーラー」配列並びに個別のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００５３】
本明細書で用いられるとき、用語「ウイルスベクター」は、ウイルス起源の少なくとも１つの配列を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージングされる能力を有する核酸ベクター構築物を指す。ウイルスベクターは、非必須なウイルス遺伝子の代わりに本明細書に記載のようなポリペプチドをコードする核酸を含有し得る。ベクター及び／又は粒子は、インビトロ又はインビボのいずれかで核酸を細胞に導入することを目的として利用され得る。極めて多数のウイルスベクターの形態は、当該技術分野で公知である。
【００５４】
「組換えベクター」は、インビボで発現する能力がある異種核酸配列又は「導入遺伝子」を含むベクターを意味する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のベクターを他の好適な組成物及び治療と組み合わせ可能であることが理解されるべきである。いくつかの実施形態では、ベクターはエピソームである。好適なエピソームベクターの使用により、高コピー数の染色体外ＤＮＡで対象における目的のヌクレオチドを維持し、それにより染色体組込みの潜在的影響を除去する手段が提供される。
【００５５】
本明細書で用いられるとき、用語「治療する」、「治療」、「治療すること」又は「寛解」は、対象が疾患又は障害、例えば神経膠芽腫、グリオーマ、急性リンパ性白血病若しくは他の癌、疾患又は障害に関連した状態の進行又は重症度に対する逆転、軽減、寛解、阻害、緩徐化又は停止に至るための治療的処置を指す。用語「治療する」は、状態、疾患又は障害の少なくとも１つの有害作用又は症状を低減又は軽減することを含む。治療は、１つ以上の症状又は臨床マーカーが低下する場合、一般に「有効」である。或いは、治療は、疾患の進行が低下又は停止する場合、「有効」である。すなわち、「治療」は、症状又はマーカーの改善だけでなく、治療の不在下で想定されることと比べての、症状の進行又は悪化の休止又は少なくとも緩徐化を含む。有利な又は所望される臨床結果として、限定はされないが、１つ以上の症状の軽減、疾患の程度の低下、疾患の安定化（すなわち悪化していない）状態、疾患進行の遅延又は緩徐化、病態の寛解又は緩和、寛解（部分又は完全と無関係に）及び／又は死亡率の低下（検出可能又は検出不能と無関係に）が挙げられる。疾患の用語「治療」は、疾患の症状又は副作用からの軽減（対症療法を含む）も提供することを含む。
【００５６】
本明細書で用いられるとき、用語「医薬組成物」は、薬学的に許容できる担体、例えば医薬品業界で一般に用いられる担体と組み合わせた活性薬剤を指す。語句「薬学的に許容できる」は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的なリスク・ベネフィット比に見合う、過剰な毒性、刺激作用、アレルギー反応又は他の課題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織との接触における使用に適した化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指すように本明細書で用いられる。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体は、水以外の担体であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体は、クリーム、乳剤、ゲル、リポソーム、ナノ粒子及び／又は軟膏であり得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、薬学的に許容できる担体は、人工的な又は改変された担体、例えば活性成分が天然に存在することが見出されないような担体であり得る。
【００５７】
本明細書で用いられるとき、用語「投与する」は、所望される部位への薬剤の少なくとも部分的な送達をもたらす方法又は経路による、本明細書で開示されるような治療又は医薬組成物の対象への配置を指す。本明細書で開示されるような薬剤を含む医薬組成物は、対象における効果的治療をもたらす任意の適切な経路により投与され得る。
【００５８】
用語「統計学的に有意な」又は「有意に」は、統計学的有意性を指し、一般に２標準偏差（２ＳＤ）又はより大きい差異を意味する。
【００５９】
実験実施例以外又は他の指示がある場合以外には、本明細書で用いられる成分の量又は反応条件を表すすべての数は、すべての例において用語「約」によって修飾されるように理解されるべきである。用語「約」は、百分率との関連で用いられるとき、±１％を意味し得る。
【００６０】
本明細書で用いられるとき、用語「〜を含む」は、提示される定義された要素に加えて、他の要素も存在し得ることを意味する。「〜を含む」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【００６１】
用語「〜からなる」は、本明細書に記載のような組成物、方法及びその各構成要素を指し、実施形態のその記述の中に列挙されない任意の要素が除外される。
【００６２】
本明細書で用いられるとき、用語「本質的に〜からなる」は、所与の実施形態にとって必要とされる要素を指す。用語は、技術の実施形態の基本的且つ新規な又は機能的特徴に実質的に影響しない追加的要素の存在を許容する。
【００６３】
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかにそうでないことが示されなければ、複数の参照対象を含む。同様に、用語「ｏｒ」は、文脈から明らかにそうでないことが示されなければ、「ａｎｄ」を含むことが意図される。本明細書に記載の場合に類似又は相当する方法及び材料が本開示の実行又は試験において用いることができるが、好適な方法及び材料が以下に説明される。略称「ｅ．ｇ．」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、非限定例を示すために本明細書で用いられる。したがって、略称「ｅ．ｇ．」は、用語「ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ」と同義である。
【００６４】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、本明細書に記載の開示内容は、ヒトをクローン化するためのプロセス、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性を修飾するためのプロセス、産業若しくは商業目的でのヒト胚の使用又は罹患をもたらしやすく、ヒト若しくは動物に対して実質的な医学的恩恵を全く伴わない動物の遺伝的同一性を修飾するためのプロセス、ひいてはかかるプロセスから生じる動物に関連しない。
【００６５】
他の用語は、以下に示される技術の様々な態様及び実施形態の説明の範囲内で定義される。
【００６６】
本発明は、いくつかの利点を提供する。例えば、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、癌治療のために治療用分子を送達するために用いることができる。一例では、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、他に毒性抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ４又は抗ＣＤ２５（例えば、ダクリズマブ）又は他の分子（例えば、サイトカイン）を腫瘍微小環境に送達するために用いることができ、その場合、有利には、周囲の腫瘍浸潤リンパ球の活性化を可能にし、チェックポイント遮断をもたらし、且つ制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を枯渇させることができる。本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、さらに、Ｔｒｅｇ抗原に特異的であり、Ｔｒｅｇ細胞の標的化を促進し得る。さらに、遺伝的にコードされた分子（例えば、抗体又はサイトカイン）を、これら分子が本来であれば到達できない身体の領域（例えば、脳を含む中枢神経系）に送達するために本発明の特定のＣＡＲ  Ｔ細胞を用いることができる。一例では、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的にするＣＡＲ  Ｔ細胞は、脳腫瘍を標的にするために用いることができ、抗体（例えば、ＥＧＦＲに対する抗体、例えばセツキシマブ；下記も参照されたい）を腫瘍に送達し得る。そのため、本発明は、腫瘍微小環境下での遺伝的にコードされたＴｒｅｇの標的化を提供する。さらに、本発明は、特定組織内に達することができない抗体の遺伝的にコードされた送達を可能にし、抗腫瘍標的の特異性を広げることにより、Ｔ細胞療法の効力を増強することができる。したがって、本発明は、癌に対する遺伝子修飾されたＴ細胞治療を提供する。
【００６７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ：Ｕ８７ｖＩＩＩ標的細胞比の関数としてのＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞によるヒト神経膠腫標的細胞株Ｕ８７ｖＩＩＩの殺滅を示すグラフである。非形質導入細胞が陰性対照として標的細胞とともにインキュベートされた。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、ヒト神経膠腫の皮下モデルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）の位置を示す一連のＸ線オーバーレイである。図２Ａは、陰性対照として非形質導入細胞で処置されたマウスを示す。図２Ｂは、移植後４日目、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置されたマウス（上行）とともに、２１日目までの成功した処置（下行）を示す。
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、ヒト神経膠腫の頭蓋内モデルにおけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現腫瘍（Ｕ８７ｖＩＩＩ）の位置を示す一連のＸ線オーバーレイである。図２Ａは、５日目（Ｄ５；上部）及びＤ１１（下部）での陰性対照として非形質導入（ＵＴＤ）細胞で処置されたマウスを示す。図２Ｂは、移植後２日目、Ｄ５（上行）及びＤ２１（下行）でのＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩで処置されたマウスを示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩの注入から５日後の患者１名における腫瘍組織の免疫組織化学を示す顕微鏡写真である。図４Ａは、ＣＤ３に対して染色されたＴ細胞を示す。図４Ｂは、ＣＤ２５＋細胞を示す。ＣＤ２５は、活性化又は制御性Ｔ細胞のマーカーであるＩＬ−２受容体α鎖である。
【図５Ａ−５Ｃ】図５Ａ〜５Ｃは、インビトロでのヒトグリオーマ細胞（緑）とのコインキュベーションから１８時間後のＣＡＲ  Ｔ細胞（赤）抗腫瘍活性のＴｒｅｇ抑制を定性的に示す蛍光顕微鏡写真である。図５Ａは、グリオーマ細胞に対するＣＡＲＴ非特異的細胞の相対濃度を示す。図５Ｂは、培養物中にＴｒｅｇを有しないグリオーマ細胞に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の相対濃度を示す。図５Ｃは、培養物中にＴｒｅｇが含まれるグリオーマ細胞に対するＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の相対濃度を示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、時間の関数（最大４８時間）としてのグリオーマ細胞生存度の尺度として、緑色対象のコンフルエンスの定量的読み取りを示すグラフである。上の線は、図５Ａに示される結果（グリオーマ細胞増殖）を表し、下の線は、図５Ｂに示される結果（神経膠腫細胞死滅）を表し、また中間の線は、図５Ｃに示される結果（ＣＡＲＴ−殺滅に対して抵抗性があるグリオーマ細胞）を表す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、対照Ｔ細胞（図６Ａ）、非活性化Ｔｒｅｇ（図６Ｂ）及び活性化Ｔｒｅｇ（図６Ｃ）に対するＬＡＰ（ｘ軸）及びＧＡＲＰ（ｙ軸）の発現を示すフローサイトメトリープロットである。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−におけるロイコパックから選別され、ＩＬ−２の存在下でＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで７日間拡大された。１日目、それらは、発現されたＧＦＰに形質導入された。７日目に脱ビーズ化（ｄｅｂｅａｄｉｎｇ）後、拡大されたＴｒｅｇは、凍結前４日間静置された。解凍後、Ｔｒｅｇは、一晩静置（非活性化）又は抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８で一晩活性化された後、ＬＡＰ及びＧＡＲＰの発現のために染色された。同じドナーからの非形質導入Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）が発現に対する対照として用いられた（図６Ａ）。
【図７Ａ】図７Ａ及び７Ｂは、ＬＡＰの発現（図７Ａ）及びＧＡＲＰの発現（図７Ｂ）を示す、図６Ａ〜６Ｃに示される結果に対応するフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図７Ｂ】図７Ａ及び７Ｂは、ＬＡＰの発現（図７Ａ）及びＧＡＲＰの発現（図７Ｂ）を示す、図６Ａ〜６Ｃに示される結果に対応するフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔｒｅｇ関連抗原を標的にするためのＣＡＲ構築物の概略図である。図８Ａは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ）を示す。図８Ｂは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ）を示す。図８Ｃは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体結合ドメインを有するＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ）を示す。図８Ｄは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体を有するＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔｒｅｇ関連抗原を標的にするためのＣＡＲ構築物の概略図である。図８Ａは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ）を示す。図８Ｂは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ）を示す。図８Ｃは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体結合ドメインを有するＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ）を示す。図８Ｄは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体を有するＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔｒｅｇ関連抗原を標的にするためのＣＡＲ構築物の概略図である。図８Ａは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ）を示す。図８Ｂは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ）を示す。図８Ｃは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体結合ドメインを有するＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ）を示す。図８Ｄは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体を有するＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｄは、Ｔｒｅｇ関連抗原を標的にするためのＣＡＲ構築物の概略図である。図８Ａは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｈ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ）を示す。図８Ｂは、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖと、それぞれ５’→３’方向に配列されたその重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）を有するＬＡＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ）を示す。図８Ｃは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体結合ドメインを有するＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ）を示す。図８Ｄは、抗ＧＡＲＰラクダ科抗体を有するＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物を示す。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。Ｔｒｅｇは、ＧＦＰが形質導入され、細胞傷害性がＧＦＰ発現を監視することにより定量化された。図９Ａは、活性化Ｔｒｅｇの殺滅を示し、図９Ｂは、非活性化Ｔｒｅｇの殺滅を示す。非活性化Ｔｒｅｇの殺滅時、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈと比べてより有効であった。
【図９Ｂ】図９Ａ及び９Ｂは、標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。Ｔｒｅｇは、ＧＦＰが形質導入され、細胞傷害性がＧＦＰ発現を監視することにより定量化された。図９Ａは、活性化Ｔｒｅｇの殺滅を示し、図９Ｂは、非活性化Ｔｒｅｇの殺滅を示す。非活性化Ｔｒｅｇの殺滅時、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈと比べてより有効であった。
【図１０Ａ】図１０Ａ及び１０Ｂは、４日間の、様々な抗Ｔｒｅｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（すなわちＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ又は非形質導入対照細胞）による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの１：１比で示すグラフである。図１０Ａ及び１０Ｂは、２つの異なるドナーにおいて実施された同じ実験からの結果を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ及び１０Ｂは、４日間の、様々な抗Ｔｒｅｇ  ＣＡＲ  Ｔ細胞（すなわちＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ又は非形質導入対照細胞）による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対Ｔｒｅｇの１：１比で示すグラフである。図１０Ａ及び１０Ｂは、２つの異なるドナーにおいて実施された同じ実験からの結果を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｄは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。図１１Ａ及び１１Ｂは、フローサイトメトリーによる測定として、共培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１１Ａは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｂは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ｃ及び１１Ｄは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。図１１Ｃは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｄは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。１１Ａ〜１１Ｄの各々において、丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｄは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。図１１Ａ及び１１Ｂは、フローサイトメトリーによる測定として、共培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１１Ａは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｂは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ｃ及び１１Ｄは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。図１１Ｃは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｄは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。１１Ａ〜１１Ｄの各々において、丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｄは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。図１１Ａ及び１１Ｂは、フローサイトメトリーによる測定として、共培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１１Ａは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｂは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ｃ及び１１Ｄは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。図１１Ｃは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｄは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。１１Ａ〜１１Ｄの各々において、丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｄは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的Ｔｒｅｇの殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的Ｔｒｅｇ細胞比の関数として示すグラフである。図１１Ａ及び１１Ｂは、フローサイトメトリーによる測定として、共培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１１Ａは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｂは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。図１１Ｃ及び１１Ｄは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。図１１Ｃは、標的細胞としての非活性化Ｔｒｅｇを示す一方、図１１Ｄは、標的細胞としての活性化Ｔｒｅｇを示す。１１Ａ〜１１Ｄの各々において、丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１２Ａ】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＨＵＴ７８細胞によるＧＡＲＰの発現（図１２Ａ）及びＬＡＰの発現（図１２Ｂ）を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１２Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂは、ＨＵＴ７８細胞によるＧＡＲＰの発現（図１２Ａ）及びＬＡＰの発現（図１２Ｂ）を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１３Ａ】図１３Ａ及び１３Ｂは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的ＨＵＴ７８細胞の殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的細胞比の関数として示すグラフである。図１３Ａは、フローサイトメトリーによる測定として、３日後の培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１３Ｂは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１３Ｂ】図１３Ａ及び１３Ｂは、共培養の３日後、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的ＨＵＴ７８細胞の殺滅をＣＡＲ  Ｔ細胞対標的細胞比の関数として示すグラフである。図１３Ａは、フローサイトメトリーによる測定として、３日後の培養下で残存する標的細胞の数を示す。破線は、ＣＡＲ細胞を含有しない対照サンプル中の標的細胞の数を示す。図１３Ｂは、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定としてパーセント細胞傷害性を示す。丸は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、四角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈを表し、三角は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１４Ａ】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＳｅＡｘ細胞によるＧＡＲＰの発現（図１４Ａ）及びＬＡＰ発現（図１４Ｂ）を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１４Ｂ】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＳｅＡｘ細胞によるＧＡＲＰの発現（図１４Ａ）及びＬＡＰ発現（図１４Ｂ）を示すフローサイトメトリーヒストグラムである。
【図１５Ａ】図１５Ａ及び１５Ｂは、共培養の２４時間後（図１５Ａ）及び４８時間後（図１５Ｂ）、ＧＡＲＰ及びＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的ＳｅＡｘ細胞の殺滅を、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定として、ＣＡＲ  Ｔ細胞対標的細胞比の関数として示すグラフである。四角は、ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰを表し、上向き三角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、下向き三角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ細胞を表し、菱形は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ及び１５Ｂは、共培養の２４時間後（図１５Ａ）及び４８時間後（図１５Ｂ）、ＧＡＲＰ及びＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による標的ＳｅＡｘ細胞の殺滅を、標的細胞によるルシフェラーゼ発現による測定として、ＣＡＲ  Ｔ細胞対標的細胞比の関数として示すグラフである。四角は、ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰを表し、上向き三角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌを表し、下向き三角は、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ細胞を表し、菱形は、非形質導入ＣＡＲ細胞を表す。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ  Ｔ細胞の培養から得られる上清のタンパク質成分の存在を示すウエスタンブロットの写真である。図１６Ａ及び１６Ｂは、分子量基準ラダーを含む全ゲルを示す。図１６Ｃは、図１６Ｂに示されるゲルの下部領域のより長い曝露に相当し、ここでは、１０〜１５ｋＤ間のバンドが矢印を用いて同定されており、ラクダ科抗体の存在が示される。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ  Ｔ細胞の培養から得られる上清のタンパク質成分の存在を示すウエスタンブロットの写真である。図１６Ａ及び１６Ｂは、分子量基準ラダーを含む全ゲルを示す。図１６Ｃは、図１６Ｂに示されるゲルの下部領域のより長い曝露に相当し、ここでは、１０〜１５ｋＤ間のバンドが矢印を用いて同定されており、ラクダ科抗体の存在が示される。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ  Ｔ細胞の培養から得られる上清のタンパク質成分の存在を示すウエスタンブロットの写真である。図１６Ａ及び１６Ｂは、分子量基準ラダーを含む全ゲルを示す。図１６Ｃは、図１６Ｂに示されるゲルの下部領域のより長い曝露に相当し、ここでは、１０〜１５ｋＤ間のバンドが矢印を用いて同定されており、ラクダ科抗体の存在が示される。
【図１７】図１７は、ＣＡＲ及びＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の概略図である。
【図１８】図１８は、セツキシマブ由来の抗ＥＧＦＲドメイン及びブリナツモマブ由来の抗ＣＤ３ドメインを有するＢｉＴＥの概略図である。
【図１９】図１９は、レーン２におけるＢｉＴＥの存在を立証するウエスタンブロット実験を示す写真セットである。
【図２０Ａ】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２０Ａ）及びジャーカット細胞により発現されたＣＤ３（図２０Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２０Ｂ】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２０Ａ）及びジャーカット細胞により発現されたＣＤ３（図２０Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２１Ａ】図２１Ａ及び２１Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＳｕｐＴ１細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２１Ａ）及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＳｕｐＴ１細胞により発現されたＣＤ３（図２１Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２１Ｂ】図２１Ａ及び２１Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＳｕｐＴ１細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２１Ａ）及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＳｕｐＴ１細胞により発現されたＣＤ３（図２１Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２２Ａ】図２２Ａ及び２２Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＮＤ４細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２１Ａ）及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＮＤ４細胞により発現されたＣＤ３（図２１Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２２Ｂ】図２２Ａ及び２２Ｂは、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＮＤ４細胞により発現されたＢｉＴＥの、Ｋ５６２細胞により発現されたＥＧＦＲ（図２１Ａ）及びＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＮＤ４細胞により発現されたＣＤ３（図２１Ｂ）への結合を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。
【図２３】図２３は、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞により分泌されたＢｉＴＥとともにインキュベートされたＮＤ４細胞によるＵ８７ｖＩＩＩ細胞の殺滅をエフェクター（非形質導入ＮＤ４）対標的（Ｕ８７ｖＩＩＩ）細胞比の関数として示すグラフである。四角は、上清がＢｉＴＥを含有した場合の実験群を表し、丸は、ＢｉＴＥを含有しない陰性対照を表す。
【図２４】図２４は、ＥＦ１αプロモーターの制御下でのＣＡＲ及びＮＦＡＴプロモーターの制御下でのＧＦＰをコードする例示的な核酸分子の図面である。
【図２５Ａ】図２５Ａ及び２５Ｂは、図２４の構築物が形質導入された細胞によるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。赤色ヒストグラムは、非刺激細胞におけるＧＦＰ発現を示し；青色ヒストグラムは、ＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激された細胞におけるＧＦＰ発現を示し；オレンジ色ヒストグラムは、ＰＥＰｖＩＩＩでコーティングされた細胞におけるＧＦＰ発現を示す。
【図２５Ｂ】図２５Ａ及び２５Ｂは、図２４の構築物が形質導入された細胞によるＧＦＰ発現を示すフローサイトメトリーグラフのセットである。赤色ヒストグラムは、非刺激細胞におけるＧＦＰ発現を示し；青色ヒストグラムは、ＰＭＡ及びイオノマイシンで刺激された細胞におけるＧＦＰ発現を示し；オレンジ色ヒストグラムは、ＰＥＰｖＩＩＩでコーティングされた細胞におけるＧＦＰ発現を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＣＡＲ及び構成的に発現されたＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＧＦＰ−ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の概略図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＣＡＲ及び構成的に発現されたＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＧＦＰ−ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）の概略図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＣＡＲ及び誘導的に発現されたＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）−ＣＡＲ−ＥＧＦＲの概略図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、ＣＡＲ及び誘導的に発現されたＢｉＴＥをコードする例示的な核酸分子であるＢｉＴＥ−（ＣＤ１９−ＣＤ３）−ＣＡＲ−ＥＧＦＲの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本発明は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（「ＣＡＲ  Ｔ細胞」）に基づく治療法に対する改善された手法を提供する。一般に、改善は、抗腫瘍療法における標的化、例えば腫瘍微小環境の標的化の異なる態様に関する。
【００７０】
以下にさらに説明される通り、本発明者らは、制御性Ｔ細胞（本明細書中では「Ｔｒｅｇ」とも称される）が、腫瘍（例えば、腫瘍微小環境下）に対する対象の免疫応答の抑制における役割を担い、ＣＡＲ  Ｔ細胞を用いて標的にされ得ることを示している。したがって、本発明は、ＣＡＲがＴｒｅｇ抗原又はマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＴＬＡ４又はＣＤ２５；下記も参照されたい）に特異的である場合のＣＡＲ  Ｔ細胞を提供する。他の例では、本発明は、１つ以上のＴｒｅｇ抗原又はマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＴＬＡ４及びＣＤ２５；下記も参照されたい）に対する抗体（例えば、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科抗体）又は二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体））を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞を提供する。Ｔｒｅｇの標的化に加えて、本発明は、他の治療物質（例えば、抗体及び関連分子）を腫瘍に送達するためのＣＡＲ  Ｔ細胞及び関連の方法を提供する。一例では、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）を標的にするため、ＥＧＦＲｖＩＩＩに特異的なＣＡＲを有するＣＡＲ  Ｔ細胞が用いられる。かかるＣＡＲ  Ｔ細胞は、治療用分子、例えば抗体試薬（例えば、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科抗体）又は二重特異性抗体（例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体））をこれらの腫瘍に送達するためにも用いられ得る。これらの方法は、抗体が通常通過しない血液脳関門に対して、事実上、脳への抗体投与を容易にするために特に有利である。これらの手法並びに関連の方法及び組成物は、以下の通りにさらに説明される。
【００７１】
キメラ抗原受容体
本明細書に記載の技術は、免疫療法における使用を意図した改善されたＣＡＲを提供する。以下、ＣＡＲ及び様々な改善について論じる。
【００７２】
用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」は、本明細書で用いられるとき、リガンド又は抗原特異性をＴ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞又はそれらの組み合わせ）に移植する、改変されたＴ細胞受容体を指す。ＣＡＲは、人工的Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体又はキメラ免疫受容体としても知られる。
【００７３】
ＣＡＲは、細胞の表面上に発現される標的、例えばポリペプチドに特異的に結合するキメラ細胞外標的結合ドメインを、Ｔ細胞受容体分子の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを含む構築物に対するＴ細胞応答における標的になるように配置する。一実施形態では、キメラ細胞外標的結合ドメインは、Ｔ細胞応答における標的になるように細胞上に発現される抗原に特異的に結合する抗体の抗原結合ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインの特性は、当該技術分野で公知の通り、また本明細書で開示される通り、変化し得るが、キメラ標的／抗原結合ドメインは、キメラ標的／抗原結合ドメインが標的細胞の表面上の標的／抗原に結合するとき、受容体をシグナル伝達活性化に対して感受性にする。
【００７４】
細胞内シグナル伝達ドメインに関して、いわゆる「第一世代」ＣＡＲは、抗原結合時にＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナルを単独で提供するものを含む。いわゆる「第二世代」ＣＡＲは、同時刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）ドメインの両方を提供するものを含み、またいわゆる「第三世代」ＣＡＲは、複数の同時刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）ドメイン及び活性化ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ）を提供するものを含む。様々な実施形態では、ＣＡＲは、標的／抗原に対して高い親和性又は結合活性を有するように選択され、例えば、抗体由来の標的又は抗原結合ドメインは、一般に、天然に存在するＴ細胞受容体の場合よりも標的抗原に対する高い親和性及び／又は結合活性を有することになる。この特性は、抗体についての選択を可能にする高い特異性と組み合わせて、ＣＡＲ  Ｔ細胞により高度に特異的なＴ細胞標的化をもたらす。
【００７５】
本明細書で用いられるとき、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」又は「ＣＡＲ−Ｔ」は、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指す。Ｔ細胞内で発現されるとき、ＣＡＲは、Ｔ細胞の特異性及び反応性を非ＭＨＣ制限様式で選択された標的の方へ再誘導し、モノクローナル抗体の抗原結合特性を利用する能力を有する。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングと独立に抗原を認識し、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする能力を与える。
【００７６】
本明細書で用いられるとき、用語「細胞外標的結合ドメイン」は、標的への結合を促進するのに十分である、細胞の外側に見出されるポリペプチドを指す。細胞外標的結合ドメインは、その結合パートナー、すなわち標的に特異的に結合することになる。非限定例として、細胞外標的結合ドメインは、同族結合パートナータンパク質を認識し、それと結合する、抗体若しくは抗体試薬の抗原結合ドメイン又はリガンドを含み得る。これに関連して、リガンドは、タンパク質及び／又は受容体の一部に特異的に結合する分子である。本明細書に記載の方法及び組成物において有用なリガンドの同族結合パートナーは、一般に細胞の表面上に見出され得る。リガンド：同族パートナー結合は、リガンドを有する受容体の改変をもたらすか、又は生理学的応答を活性化、例えばシグナル伝達経路を活性化する可能性がある。一実施形態では、リガンドは、ゲノムに対して非天然であり得る。任意選択的に、リガンドは、少なくとも２つの種にわたる保存された機能を有する。
【００７７】
抗体試薬
様々な実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲは、抗体試薬又はその抗原結合ドメインを細胞外標的結合ドメインとして含む。
【００７８】
本明細書で用いられるとき、用語「抗体試薬」は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン又は免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、且つ所与の抗原に特異的に結合するポリペプチドを指す。抗体試薬は、抗体又は抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、抗体試薬は、モノクローナル抗体又はモノクローナル抗体の抗原結合ドメインを含むポリペプチドを含み得る。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書でＶＨと略記）及び軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書でＶＬと略記）を含み得る。別の例では、抗体は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域及び２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体試薬」は、抗体の抗原結合断片（例えば、一本鎖抗体、Ｆａｂ及びｓＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ＣＤＲｓ及びドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（例えば、ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（３）：６２９−６３９，１９９６を参照されたい；その全体が参照により本明細書中に援用される））並びに完全抗体を包含する。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭ（並びにサブタイプ及びそれらの組み合わせ）の構造的特徴を有し得る。抗体は、マウス、ウサギ、ブタ、ラット及び霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類）を含む任意の供給源に由来し、且つ霊長類化抗体であり得る。抗体は、ミディボディ、ヒト化抗体、キメラ抗体なども含む。完全ヒト抗体結合ドメインは、当業者に公知の方法を用いて、例えばファージディスプレイライブラリーから選択され得る。さらに、抗体試薬は、単一ドメイン抗体、例えばラクダ科抗体を含む。
【００７９】
ＶＨ及びＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）と称されるより保存された領域が散在した「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域にさらに細分化され得る。フレームワーク領域及びＣＤＲの範囲は、以前に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７を参照されたい；その各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される）。ＶＨ及びＶＬの各々は、典型的には、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配列された、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成される。
【００８０】
一実施形態では、抗体又は抗体試薬は、ヒト抗体又は抗体試薬でない（すなわち抗体又は抗体試薬はマウスである）が、ヒト化されている。「ヒト化抗体又は抗体試薬」は、ヒトにおいて天然に産生された抗体又は抗体試薬の変異体に対するその類似性を高めるためにタンパク質配列レベルで修飾されている非ヒト抗体又は抗体試薬を指す。抗体をヒト化するための一手法では、マウス又は他の非ヒトＣＤＲのヒト抗体フレームワークへの移植が利用される。
【００８１】
一実施形態では、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、フレキシブルリンカーペプチドを介して、抗体、一般にモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬドメインを融合することによって作出される一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片を含むか又は本質的にそれからなる。様々な実施形態では、ｓｃＦｖは、膜貫通ドメイン及びＴ細胞受容体細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば本明細書に記載のような改変された細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。別の実施形態では、ＣＡＲの細胞外標的結合ドメインは、ラクダ科抗体を含む。
【００８２】
それらを選択し、クローン化するための抗体結合ドメイン及び方法は、当業者に周知である。一実施形態では、抗体試薬は、抗ＧＡＲＰ抗体試薬であり、配列番号３若しくは２５の配列を含むか、又は配列番号３若しくは２５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、抗体試薬は、抗ＬＡＰ抗体試薬であり、配列番号９若しくは１５の配列を含むか、又は配列番号９若しくは１５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、抗体試薬は、抗ＥＧＦＲ又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体試薬であり、配列番号２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７若しくは６５の配列を含むか、又は配列番号２１、２７、３３、３６、４２、４５、５５、５７若しくは６５の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、抗体試薬は、抗ＣＤ１９抗体試薬であり、配列番号５１若しくは６３の配列を含むか、又は配列番号５１若しくは６３の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。別の実施形態では、抗体試薬は、抗ＣＤ３抗体試薬であり、配列番号３４、４３、５２、５６若しくは６４の配列を含むか、又は配列番号３４、４３、５２、５６若しくは６４の配列に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％若しくはそれを超える配列同一性を有する配列を含む。様々な例では、抗体は、Ｃ２２５、３Ｃ１０、セツキシマブ及び２１７３から選択され得る。
【００８３】
一実施形態では、本明細書に記載の技術において有用なＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的化領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。かかる実施形態では、２つ以上の抗原特異的標的化領域は、少なくとも２つの異なる抗原を標的にし、タンデムに配列され、リンカー配列によって分離され得る。別の実施形態では、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的である。
【００８４】
標的／抗原
任意の細胞表面部分は、ＣＡＲにより標的にされ得る。多くの場合、標的は、Ｔ細胞応答について標的にすることが所望される細胞上で差次的に又は優先的に発現され得る細胞表面ポリペプチドとなる。Ｔｒｅｇを標的にするため、抗体試薬は、例えば、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲ２、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ及びＬＡＧ−３に対して標的にされ得る。腫瘍又は癌細胞を標的にするため、本明細書に記載の通り、抗体ドメインは、例えば、ＥＧＦＲ又はＥＧＦＲｖＩＩＩに対して標的にされ得る。腫瘍に対して特異的である腫瘍抗原又は腫瘍関連抗原を標的にすることにより、腫瘍細胞を標的にする一方、非腫瘍細胞又は組織に対するコラテラルダメージを回避するか又は少なくとも制限するための手段が得られ得る。さらなる腫瘍抗原、腫瘍関連抗原又は目的の他の抗原の非限定例として、ＣＤ１９、ＣＤ３７、ＢＣＭＡ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６０８；ＮＣＢＩ参照配列  ＮＰ＿００１１８３．２）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９２．２）、ＣＥＡ、未熟ラミニン受容体、ＴＡＧ−７２、ＨＰＶ  Ｅ６及びＥ７、ＢＩＮＧ−４、カルシウム活性化塩化物チャネル２、サイクリンＢ１、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、ｈｅｒ２／ｎｅｕ、テロメラーゼ、メソテリン、ＳＡＰ−１、サバイビン、ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー、ＮＹ−ＥＳＯ−１／ＬＡＧＥ−１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ−２、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１／−２、ＭＣ１Ｒ、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＭＡＲＴ−２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＭＵＣ１、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＩＬ−１５、ＩＬ１３Ｒａ２及びＣＳＦ１Ｒが挙げられる。
【００８５】
膜貫通ドメイン
本明細書に記載のような各ＣＡＲは、細胞外標的結合ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに連結する膜貫通ドメインを含む。
【００８６】
本明細書で用いられるとき、「膜貫通ドメイン」（ＴＭドメイン）は、細胞の原形質膜を横切る、ＣＡＲの一般的に疎水性の領域を指す。ＴＭドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質又は他の膜貫通タンパク質）、人工的疎水性配列又はそれらの組み合わせの膜貫通領域又はその断片であり得る。具体例が本明細書中で提示され、実施例中で用いられる一方、他の膜貫通ドメインは、当業者にとって明白なものとなり、技術の代替的実施形態に関連して用いることができる。選択された膜貫通領域又はその断片であれば、好ましくはＣＡＲの意図される機能に干渉しないであろう。「その断片」は、タンパク質又はポリペプチドの膜貫通ドメインに関連して用いられるとき、タンパク質を細胞表面に固着又は付着させるのに十分である膜貫通ドメインの一部を指す。
【００８７】
一実施形態では、ＣＡＲの膜貫通ドメイン又はその断片は、ＣＤ８の膜貫通ドメイン（例えば、配列番号４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８若しくは６６のいずれか１つ又はその変異体）に由来するか又はそれを含む。代替的実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲの膜貫通ドメイン又はその断片は、Ｔ細胞受容体のα、β若しくはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤｌ  ｌａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、４−１ＢＢＬ、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦＩ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ及び／又はＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。
【００８８】
ＣＤ８は、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞表面上に優先的に見出される抗原である。ＣＤ８は、免疫系内部の細胞−細胞相互作用を媒介し、Ｔ細胞共受容体として作用する。ＣＤ８は、α（ＣＤ８α）及びβ（ＣＤ８β）鎖から構成される。ＣＤ８ａ配列は、いくつかの種において公知であり、例えばヒトＣＤ８ａ、（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：９２５）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００１１３９３４５．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿０００００２．１２）が挙げられる。ＣＤ８は、天然に存在する変異体、分子及びその対立遺伝子を含むヒトＣＤ８を指し得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、例えば獣医学適用では、ＣＤ８は、例えば、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ブタなどのＣＤ８を指し得る。ヒトＣＤ８のホモログ及び／又はオルソログは、かかる種について、当業者が例えばＮＣＢＩオルソログ探索機能を用いるか、又は所与の種における利用可能な配列データを参照ＣＤ８配列に類似した配列について探索することにより容易に同定される。
【００８９】
４−１ＢＢＬは、ＴＮＦスーパーファミリーに属するタイプ２膜貫通糖タンパク質である。４−１ＢＢＬは、活性化Ｔリンパ球上に発現される。４−１ＢＢＬ配列は、いくつかの種において公知であり、例えばＴＮＦＳＦ９としても公知のヒト４−１ＢＢＬ（ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８７４４）ポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＰ＿００３８０２．１）及びｍＲＮＡ（例えば、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ  Ｓｅｑ  ＮＭ＿００３８１１．３）が挙げられる。４−１ＢＢＬは、天然に存在する変異体、分子及びその対立遺伝子を含むヒト４−１ＢＢＬを指し得る。態様のいずれかのいくつかの実施形態では、例えば獣医学適用では、４−１ＢＢＬは、例えば、イヌ、ネコ、雌ウシ、ウマ、ブタなどの４−１ＢＢＬを指し得る。ヒト４−１ＢＢＬのホモログ及び／又はオルソログは、かかる種について、当業者が例えばＮＣＢＩオルソログ探索機能を用いるか、又は所与の種における利用可能な配列データを参照４−１ＢＢＬ配列に類似した配列について探索することにより容易に同定される。
【００９０】
同時刺激ドメイン
本明細書に記載の各ＣＡＲは、任意選択的に、１つ以上の同時刺激分子又は同時刺激ドメインの細胞内ドメインを含む。本明細書で用いられるとき、用語「同時刺激ドメイン」は、同時刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインを指す。同時刺激分子は、抗原への結合時、Ｔリンパ球の効率的な活性化及び機能にとって要求される第２のシグナルをもたらす抗原受容体又はＦｃ受容体以外の細胞表面分子である。一例では、４−１ＢＢ細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を用いることができる（例えば、下記及び配列番号５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９、６７又はその変異体を参照されたい）。かかる同時刺激分子のさらなる実例として、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ）、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭＦ１）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ４）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＤＡＰ１０、ＬＡＴ、ＮＫＤ２Ｃ  ＳＬＰ７６、ＴＲＩＭ及びＺＡＰ７０が挙げられる。一実施形態では、細胞内ドメインは、４−１ＢＢの細胞内ドメインである。４−１ＢＢ（ＣＤ１３７；ＴＮＦＲＳ９）は、活性化誘導同時刺激分子であり、且つ免疫応答の重要な制御分子である。
【００９１】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本明細書に記載のようなＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、標的抗原への有効なＣＡＲの結合のメッセージを免疫エフェクター細胞の内部に形質導入し、エフェクター細胞機能を誘導すること、例えば活性化、サイトカイン産生、増殖及び細胞傷害性活性、例えば細胞傷害性因子のＣＡＲ結合標的細胞への放出又は細胞外ＣＡＲドメインへの抗原結合後に誘発される他の細胞応答などに関与するＣＡＲポリペプチドの一部を指す。様々な例では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζから得られる（例えば、下記及び配列番号６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０、６８又はその変異体を参照されたい）。技術において特に用いられるＩＴＡＭ含有細胞内シグナル伝達ドメインの追加的な非限定例として、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３θ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【００９２】
ＣＤ３は、適切な同時刺激と同時に会合されるとき（例えば、同時刺激分子の結合）、Ｔリンパ球活性化を促進するＴ細胞共受容体である。ＣＤ３複合体は、４つの異なる鎖からなり；哺乳動物ＣＤ３は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖及び２つのＣＤ３ε鎖からなる。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ３ζとして知られる分子と会合し、Ｔリンパ球における活性化シグナルを生成する。完全ＴＣＲ複合体は、ＴＣＲ、ＣＤ３ζ及び完全ＣＤ３複合体を含む。
【００９３】
任意の態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）からの免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフすなわちＩＴＡＭを含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。任意の態様のいくつかの実施形態では、ＩＴＡＭは、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフ（ＩＴＡＭ３）を含む。任意の態様のいくつかの実施形態では、ＣＤ３ζのＩＴＡＭの３つのモチーフは、突然変異されないことから、天然又は野生型配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ配列は、本明細書で提供される配列に示される通り、ＣＤ３ζの配列を含む。
【００９４】
本明細書に記載のような個別のＣＡＲ及び他の構築物成分は、当業者により判定可能であるように、相互に用いられて、本明細書に記載の様々な構築物の内外で交換され得る。これらの各成分は、本明細書に示される対応する配列のいずれか又はその変異体を含むか又はそれらからなり得る。
【００９５】
ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞のより詳細な説明は、Ｍａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２３：２６２４−２６３５，２０１４；Ｒｅａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １６：１４４１−１４５８，２０１４；Ｈｏｙｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９７：１６２２，２０１２；Ｂｙｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．３２：３０３９−３０４７，２０１４；Ｍａｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：４５５９−４５６２，２００９；及びＴａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１８：６４３６−６４４５，２０１２（これらの各々は、その全体が参照により本明細書中に援用される）に見出すことができる。
【００９６】
一実施形態では、ＣＡＲは、リンカードメインをさらに含む。本明細書で用いられるとき、「リンカードメイン」は、本明細書に記載のようにＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約２〜１００アミノ酸長のオリゴ又はポリペプチド領域を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、隣接タンパク質ドメインが相互に関連して自由に動くように、グリシン及びセリンなどの可動性残基を含み得るか又はそれらから構成され得る。２つの隣接ドメインが立体的に相互に干渉しないことを保証することが望ましいとき、より長いリンカーを用い得る。リンカーは、切断可能であっても切断不能であり得る。切断可能なリンカーの例として、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的等価物及びそれらの組み合わせが挙げられる。様々な例では、本明細書に示されるような配列を有するリンカー又はその変異体が用いられる。特定の位置における構築物中の特定のリンカーの表示は、そのリンカーのみがそこで使用可能であることを意味しないことが理解されるべきである。むしろ、当業者によって判定可能であるように、異なるリンカー配列（例えば、Ｐ２Ａ及びＴ２Ａ）は、（例えば、本発明の構築物との関連では）相互に交換可能である。一実施形態では、リンカー領域は、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス由来のＴ２Ａである。この技術において使用可能なリンカーの非限定例として、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ及びＢｍＩＦＶ２Ａが挙げられる。これらなどのリンカーは、ポリタンパク質、例えば下記のものとの関連で使用可能である。例えば、それらは、ポリタンパク質のＣＡＲ成分をポリタンパク質の治療物質（例えば、抗体、例えばｓｃＦｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ科抗体）又は二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥ））成分から分離するために使用可能である（以下を参照されたい）。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のようなＣＡＲは、任意選択的に、例えば非浸潤性イメージング（例えば、陽電子放射断層撮影ＰＥＴスキャン）を可能にするため、レポーター分子をさらに含む。レポーター分子を含む二重特異性ＣＡＲでは、第１の細胞外結合ドメイン及び第２の細胞外結合ドメインは、異なる又は同じレポーター分子を含み得る。二重特異性ＣＡＲ  Ｔ細胞では、第１のＣＡＲ及び第２のＣＡＲは、異なる又は同じレポーター分子を発現し得る。別の実施形態では、本明細書に記載のようなＣＡＲは、単独で又は基質又は化学物質（例えば、９−［４−［１８Ｆ］フルオロ−３−（ヒドロキシメチル）ブチル］グアニン（［１８Ｆ］ＦＨＢＧ））と組み合わせて画像化可能であるレポーター分子（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｈｐｈ））をさらに含む。別の実施形態では、本明細書に記載のようなＣＡＲは、非浸潤性技術を用いて容易に画像化可能であるナノ粒子（例えば、６４Ｃｕ２＋で官能化された金ナノ粒子（ＧＮＰ））をさらに含む。非浸潤性イメージングのためのＣＡＲ  Ｔ細胞の標識は、例えば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｇｒ．Ｂｉｏｌ．（Ｃａｍｂ）．５（１）：２３１−２３８，２０１３及びＫｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１８；９（３７３）、２０１７（それらの全体が参照により本明細書中に援用される）にレビューされている。
【００９８】
ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙは、Ｔ細胞上に発現されるＣＡＲ（例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞）を画像化するのに有用な蛍光タグとして本明細書で示される。この目的のための蛍光タグとして、当該技術分野で公知の本質的に任意の蛍光タンパク質が使用可能であることが想定されている。臨床用途において、ＣＡＲは、蛍光タグ又は蛍光タンパク質を含む必要はない。したがって、本明細書に提供される特定の構築物の各例において、構築物中に存在する任意のマーカーは、除去され得る。本発明は、マーカーの有無にかかわらず構築物を含む。したがって、特定の構築物が本明細書で参照されるとき、任意のマーカー又はタグ（例えば、ヒスチジンタグを含む）の有無にかかわらず、それは、本発明中に含まれているものとして検討され得る。
【００９９】
一実施形態では、ＣＡＲポリペプチド配列は、配列番号１、７若しくは１３又は配列番号２１〜２４、２７〜３０、３６〜３９、４５〜４８、５７〜６０若しくは６５〜６８の組み合わせから選択される配列の、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又はそれを超える配列同一性を有する配列に対応するか又はそれを含む。当業者によって判定可能であるように、これらのＣＡＲの様々な機能的に類似又は対応する成分は、相互に並びに当該技術分野で公知であるか又は本明細書中に列挙される他の類似する又は機能的に対応する成分と交換又は置換され得る。
【０１００】
ＣＡＲ  Ｔ細胞によって送達される抗体及び関連分子
上記の通り、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、任意選択的に、抗体試薬（又は他の治療用分子、例えばサイトカイン）を腫瘍、例えば腫瘍微小環境に送達するために使用可能である。様々な実施形態では、抗体試薬は、ＣＡＲと同じ核酸分子によってコードされ、したがって細胞（例えば、Ｔ細胞）の形質導入を容易にし、ＣＡＲ及び抗体試薬の両方を発現する。かかる例では、抗体試薬は、例えば、それが切断可能なリンカー配列（例えば、２Ａリンカー、例えばＰ２Ａ又はＴ２Ａなど；上記を参照されたい）によってＣＡＲ（且つ任意選択的に他のタンパク質、例えばマーカー）から分離されるように発現され得る。抗体試薬は、ＣＡＲと同じプロモーターの制御下で（例えば、ＥＦ１αプロモーターにより）発現され得るとともに、構成的に発現され得る。他の例では、抗体試薬は、誘導性プロモーター、例えばＴ細胞活性化時に発現されるプロモーター（例えば、ＮＦＡＴプロモーター）の制御下で発現される。かかる誘導性プロモーターは、例えば、抗体がＴ細胞活性化時に限り、したがって例えばＣＡＲ  Ｔ細胞が腫瘍微小環境内に含まれるときに限り（その場所では抗体産生を制限させるのに有利であることがある）、発現されることを保証するために使用可能である。当該技術分野で理解されるように、本発明中の様々なベクター設計では、ＣＡＲコード配列は、抗体試薬コード配列に対して５’又は３’側であり得る。
【０１０１】
様々な例では、（例えば、ＣＡＲと同じ核酸分子からの）ＣＡＲ  Ｔ細胞内で発現される抗体は、本明細書に記載のような一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体（ｓｃＦＶ又はラクダ科）である。一本鎖抗体の場合、鎖は、Ｌ−Ｈ又はＨ−Ｌの順序であり得、且つ任意選択的にリンカー（例えば、グリシンに基づくリンカー）により互いから分離され得る。
【０１０２】
様々な例では、抗体は、例えば、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）を含む二重特異性抗体である。かかる分子は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３に結合することによる）とともに腫瘍抗原（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ又はＣＤ１９；上記も参照されたい）を標的にすることができ、また例えば腫瘍微小環境下でＴ細胞応答を増強するために使用可能である。ＢｉＴＥの２つの成分は、任意選択的に、リンカー（例えば、グリシンに基づくリンカー）によって互いから分離され得る。
【０１０３】
抗体試薬は、例えば、腫瘍抗原又はＴｒｅｇ抗原、例えば本明細書に記載のもの又は他の抗原（例えば、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１９、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ−１５、ＩＬ１３Ｒａ２、ＣＳＦ１Ｒなど）に対して標的にされ得る。
【０１０４】
任意選択的に、本明細書に記載のように抗体試薬を送達することに加えて、本発明のＣＡＲ  Ｔ細胞は、例えば、サイトカイン及び毒素を含む他の治療用分子を送達するために使用可能である。
【０１０５】
本明細書に記載の通り、ＣＡＲの他の成分及び関連の構築物（又はその変異体）、例えばＩｇκ（例えば、配列番号３２、４１、５０、５４、６２又はその変異体）、ＣＤ８リーダー（例えば、配列番号２、１４、２０又はその変異体）及び関連の配列は、当業者に明白となるように、本発明の構築物の作製における使用を意図して選択され得る。
【０１０６】
細胞及び治療
本明細書に記載の技術の一態様は、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかを（任意選択的に別の治療用分子、例えば抗体試薬（例えば、ｓｃＦｖ、ラクダ科抗体又はＢｉＴＥ）又はサイトカインと一緒に）、又は本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかをコードする核酸を（任意選択的に別の治療用分子、例えば抗体試薬（例えば、ｓｃＦｖ、ラクダ科抗体又はサイトカイン）と一緒に含む哺乳動物細胞に関する。一実施形態では、哺乳動物細胞は、抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか若しくはサイトカイン又はかかる抗体、抗体試薬、その抗原結合部分、本明細書に記載のＣＡＲのいずれか若しくはサイトカインをコードする核酸を含む。哺乳動物細胞又は組織は、ヒト、霊長類、ハムスター、ウサギ、齧歯類、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、イヌ又はネコ由来であり得るが、任意の他の哺乳動物細胞を用い得る。任意の態様の好ましい実施形態では、哺乳動物細胞はヒトである。
【０１０７】
一実施形態では、細胞はＴ細胞である。任意の態様の代替的実施形態では、細胞は免疫細胞である。本明細書で用いられるとき、「免疫細胞」は、免疫応答における役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血由来であり、リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄系細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球及び顆粒球を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞；ＮＫ細胞；ＮＫＴ細胞；リンパ球、例えばＢ細胞及びＴ細胞；並びに骨髄系細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球及び顆粒球である。
【０１０８】
一実施形態では、細胞は、癌、形質細胞障害又は自己免疫疾患を有する又は有すると診断された個体から得られる。
【０１０９】
「癌」は、本明細書で用いられるとき、特有の形質、正常な細胞制御の減少が、制御されない増殖、分化の欠如、局所組織浸潤及び転移をもたらす場合の細胞の過剰増殖を指す可能性があり、神経膠芽腫、グリオーマ、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫又は固形腫瘍であり得る。白血病の非限定例として、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられる。一実施形態では、癌は、ＡＬＬ又はＣＬＬである。リンパ腫の非限定例として、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病（ＨＣＬ）及びＴ細胞リンパ腫（例えば、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）及び未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）を含む末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ））が挙げられる。一実施形態では、癌は、ＤＬＢＣＬ又は濾胞性リンパ腫である。固形腫瘍の非限定例として、副腎皮質腫瘍、胞状軟部肉腫、癌、軟骨肉腫、結腸直腸癌、類腱腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、内分泌腫瘍、卵黄嚢腫瘍、類上皮血管内皮腫、ユーイング肉腫、胚細胞腫瘍（固形腫瘍）、骨及び軟部組織の巨細胞腫、肝芽腫、肝細胞癌、メラノーマ、腎腫瘍、神経芽細胞腫、非横紋筋肉腫軟部肉腫（ＮＲＳＴＳ）、骨肉腫、傍脊椎肉腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫及びウィルムス腫瘍が挙げられる。固形腫瘍は、骨、筋肉又は臓器に見出すことができ、肉腫又は癌であり得る。本明細書に記載の技術の任意の態様が、本願中に列挙されない癌を含む癌のあらゆるタイプを治療するのに使用可能であると考察される。本明細書で用いられるとき、用語「腫瘍」は、例えば、悪性タイプ又は良性タイプの細胞又は組織の異常な増殖を指す。
【０１１０】
本明細書で用いられるとき、「自己免疫疾患又は障害」は、自らの免疫系が外来細胞と健常細胞とを識別できないことによって特徴付けられる。この結果、自らの免疫系がプログラム細胞死として自らの健常細胞を標的にする。自己免疫疾患又は障害の非限定例として、炎症性関節炎、１型糖尿病、多発性硬化症、乾癬、炎症性腸疾患、ＳＬＥ及び血管炎、アレルギー性炎症、例えばアレルギー性喘息、アトピー性皮膚炎及び接触過敏症が挙げられる。自己免疫関連疾患又は障害の他の例として、限定されるものとして解釈されるべきでないが、関節リウマチ、多発性硬化症（ＭＳ）、全身性エリテマトーデス、グレーブス病（過活動性甲状腺）、橋本甲状腺炎（低活動性甲状腺）、セリアック病、クローン病及び潰瘍性大腸炎、ギラン・バレー症候群、原発性胆汁性硬化症／硬変、硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎、レイノー現象、強皮症、シェーグレン症候群、グッドパスツール病、ウェゲナー肉芽腫症、リウマチ性多発筋痛症、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、慢性疲労症候群ＣＦＳ）、乾癬、自己免疫アジソン病、強直性脊椎炎、急性散在性脳脊髄炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、重症筋無力症、眼球クローヌス・ミオクローヌス症候群、視神経炎、オード甲状腺炎、天疱瘡、悪性貧血、犬の多発性関節炎、ライター症候群、高安動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症及び線維筋痛症（ＦＭ）が挙げられる。
【０１１１】
一実施形態では、哺乳動物細胞は、外来物質（例えば、ウイルス又は細菌細胞）に対処する自らの能力を阻害する、免疫系における異常に低い活性又は免疫不全障害をもたらす免疫系障害を有する患者において得られる。
【０１１２】
形質細胞は、感染に対処するために必要な抗体を産生及び放出するように機能するＢリンパ球から産生する白血球である。本明細書で用いられるとき、「形質細胞障害又は疾患」は、形質細胞の異常な増殖によって特徴付けられる。異常な形質細胞は、健常な形質細胞を「押し出す」能力があり、それにより外来性対象、例えばウイルス又は細菌細胞に対処する能力の低下をもたらす。形質細胞障害の非限定例として、アミロイドーシス、ワルデンストレームマクログロブリン血症、骨硬化性骨髄腫（ＰＯＥＭＳ症候群）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）及び形質細胞骨髄腫が挙げられる。
【０１１３】
Ｔ細胞は、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて対象から得ることができる。例えば、Ｔ細胞は、ドナー又は患者から採取される末梢血から単離され得る。Ｔ細胞は、哺乳動物から単離され得る。好ましくは、Ｔ細胞は、ヒトから単離される。
【０１１４】
細胞、例えばＴ細胞は、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（本明細書に記載のように、抗体試薬又はサイトカインに切断可能に連結されたＣＡＲポリペプチドを含む）、又は本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（且つ任意選択的に、さらに遺伝的にコードされた抗体試薬又はサイトカイン）をコードする核酸を含むように改変され得る。一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれかは、（任意選択的に、本明細書に記載のような抗体試薬又はサイトカインと一緒に）レンチウイルスベクターから発現される。レンチウイルスベクターは、感染における標準技術を用いて、ＣＡＲポリペプチド（且つ任意選択的にまた抗体試薬又はサイトカイン）を細胞内で発現させるために用いられる。
【０１１５】
レトロウイルス、例えばレンチウイルスは、遺伝子、すなわち目的のキメラ遺伝子をコードする核酸配列を送達するための便宜的なプラットフォームを提供する。選択された核酸配列は、当該技術分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され、レトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次に、組換えウイルスは、例えば、インビトロ又は生体外で単離され、細胞に送達され得る。レトロウイルス系は、当該技術分野で周知であり、例えば米国特許第５，２１９，７４０号明細書；Ｋｕｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂａｎｎｅｒｔ（２０１０）“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ”Ｃａｌｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（ＩＳＢＮ：９７８−１−９０４５５−５５−４）；及びＨｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５２：４９３−５１２，２０００（これらは、それぞれそれらの全体が参照により本明細書中に援用される）に記載されている。効率的なＤＮＡ送達のためのレンチウイルス系は、ＯｒｉＧｅｎｅ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入することができる。他の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのいずれかのＣＡＲポリペプチド（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）は、ＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターのトランスフェクション又はエレクトロポレーションを介して哺乳動物細胞において発現される。トランスフェクション又はエレクトロポレーション法は、当該技術分野で公知である。
【０１１６】
本明細書に記載のポリペプチドのいずれかのＣＡＲポリペプチド（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）の効率的発現は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ又はＣＡＲ（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）をコードする核酸の遺伝子産物を検出する標準的アッセイを用いて評価され得る。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＦＡＣＳ、ノーザンブロッティング、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又は免疫組織化学が挙げられる。
【０１１７】
一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチド（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）は、構成的に発現される。一実施形態では、ＣＡＲポリペプチドは、構成的に発現され、且つ任意選択的な抗体試薬又はサイトカインは、誘導的に発現される。一実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチド（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）は、組換え核酸配列によってコードされる。
【０１１８】
本明細書に記載の技術の一態様は、癌、形質細胞障害又は自己免疫性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、Ｔ細胞表面上に本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）を含むようにＴ細胞を改変することと、改変されたＴ細胞を対象に投与することとを含む方法に関する。癌の場合、方法は、診断された癌を治療するか、癌の再発を予防するか、又はアジュバント若しくはネオアジュバントセッティングにおいて用いるためのものであり得る。
【０１１９】
本明細書に記載の技術の一態様は、癌、形質細胞障害又は自己免疫性疾患の治療を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）を含む哺乳動物細胞のいずれかの細胞を投与することを含む方法に関する。
【０１２０】
クラスター分化（ＣＤ）分子は、白血球上に存在する細胞表面マーカーである。白血球が分化し、成熟するとき、そのＣＤ特性が変化する。白血球が癌細胞（すなわちリンパ腫）に変化する場合、そのＣＤ特性は、疾患を診断する上で重要である。特定タイプの癌の治療及び予後は、癌細胞のＣＤ特性の決定に依存する。「ＣＤＸ＋」（式中、「Ｘ」は、ＣＤマーカーである）が、ＣＤマーカーが癌細胞内に存在することを示す一方、「ＣＤＸ−」は、マーカーが存在しないことを示す。当業者は、標準的技術を用いて、例えば免疫蛍光を用いて癌細胞上に存在するＣＤ分子を評価し、ＣＤ分子に結合された市販抗体を検出できることになる。
【０１２１】
態様のいずれかのいくつかの実施形態では、改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、対象への投与前に刺激及び／又は活性化される。
【０１２２】
投与
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、癌、形質細胞疾患若しくは障害又は自己免疫性疾患若しくは障害を有するか又は有すると診断された対象を、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）又は本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（及び任意選択的な抗体試薬又はサイトカイン）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を用いて治療することに関する。本明細書で用いられるとき、「本明細書に記載のようなＣＡＲ  Ｔ細胞」は、本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）又は本明細書に記載のＣＡＲポリペプチドのいずれか（且つ任意選択的に抗体試薬又はサイトカイン）をコードする核酸を含む哺乳動物細胞を指す。本明細書で用いられるとき、「状態」は、癌、形質細胞疾患若しくは障害又は自己免疫疾患若しくは障害を指す。状態を有する対象は、医師により状態を診断する現行の方法を用いて同定され得る。状態の症状及び／又は合併症は、これらの状態を特徴付け、診断を補助するものであり、当該技術分野で周知であり、限定はされないが、疲労、持続性感染及び持続性出血を含む。例えば、状態の診断を補助することがある試験は、限定はされないが、血液スクリーニング及び骨髄検査が挙げられ、所与の状態にとって当該技術分野で公知である。状態における家族歴又は状態におけるリスク因子への曝露も、対象が状態を有する可能性が高いか否かを判定するか又は状態の診断を行うことを補助し得る。
【０１２３】
本明細書に記載の組成物は、状態を有する又は有すると診断された対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、状態の症状を軽減するため、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を有効量で対象に投与することを含む。本明細書で用いられるとき、「状態の症状を軽減すること」は、状態に関連した任意の状態又は症状を寛解することである。対応する未治療対照と比較されるとき、かかる低減は、任意の標準的技術による測定として、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％、９５％、９９％又はそれを超える。本明細書に記載の組成物を対象に投与するための種々の手段は、当業者に公知である。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、全身的又は局所的に投与される。好ましい実施形態では、本明細書に記載の組成物は、静脈内に投与される。別の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、腫瘍部位に投与される。
【０１２４】
用語「有効量」は、本明細書で用いられるとき、疾患又は障害の少なくとも１つ以上の症状を軽減するのに必要な活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の量を指し、細胞調製物又は組成物が所望される効果をもたらすのに十分な量に関する。したがって、用語「治療有効量」は、典型的対象に投与されるとき、特定の抵抗状態効果をもたらすのに十分な活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の量を指す。有効量は、本明細書で用いられるとき、様々な状況下で、疾患の症状の発現を遅延させる、症状・疾患の経過を変更する（例えば、限定はされないが、状態の進行を緩徐化する）か、又は状態の症状を逆転させるための十分な量も含むことになる。したがって、一般には正確な「有効量」を特定することは実行可能でない。しかし、特定の場合、適切な「有効量」は、専ら通常の実験を用いて当業者により決定され得る。
【０１２５】
有効量、毒性及び治療効果は、細胞培養物又は実験動物において標準医薬品手順により評価され得る。用量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じて変動し得る。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。大きい治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療有効量は、最初に細胞培養アッセイから評価され得る。また、用量は、細胞培養又は適切な動物モデルにおいて決定されるように、ＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量阻害を達成する活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するため、動物モデルにおいて配合され得る。血漿におけるレベルは、例えば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定され得る。任意の特定用量の効果は、特に、好適なバイオアッセイ、例えば骨髄検査のためのアッセイにより監視され得る。用量は、医師により決定され、必要に応じて、治療の観察される効果に適するように調節され得る。
【０１２６】
技術の一態様では、本明細書に記載の技術は、本明細書に記載のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞及び任意選択的に薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物に関する。医薬組成物の活性成分は、少なくとも本明細書に記載のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物の活性成分は、本質的に本明細書に記載のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞からなる。いくつかの実施形態では、医薬組成物の活性成分は、本明細書に記載のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞からなる。細胞に基づく治療製剤のための薬学的に許容できる担体は、生理食塩水及び水性緩衝液、リンゲル液及び血清成分、例えば血清アルブミン、ＨＤＬ及びＬＤＬを含む。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容できる担体」などの用語は、本明細書で交換可能に用いられる。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物は、非経口投与形態であり得る。非経口剤形の投与が典型的には汚染物質に対する患者の天然防御をバイパスすることから、ＣＡＲ  Ｔ細胞自体以外の成分は、患者への投与前、好ましくは無菌状態であるか又は無菌化され得る。非経口剤形の例として、限定はされないが、注射用溶液、注射のための薬学的に許容できる媒体に容易に溶解又は懸濁される乾燥生成物、注射用懸濁液及び乳濁液が挙げられる。これらのいずれかは、投与前、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞調製物に添加され得る。
【０１２８】
中に開示のような活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の非経口剤形を提供するために使用可能な好適な媒体は、当業者に周知である。例として、限定はされないが、生理食塩水；グルコース溶液；水性媒体、例えば限定はされないが、塩化ナトリウム注射剤、リンゲル注射剤、ブドウ糖注射剤、ブドウ糖及び塩化ナトリウム注射剤及び乳酸リンゲル注射剤；水混和性媒体、例えば限定はされないが、エチルアルコール、ポリエチレングリコール及びプロピレングリコール；並びに非水性媒体、例えば限定はされないが、トウモロコシ油、綿実油、ピーナッツ油、ゴマ油、オレイン酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル及び安息香酸ベンジルが挙げられる。
【０１２９】
用量
「単位剤形」は、用語が本明細書で用いられるとき、好適な単回投与のための用量を指す。例として、単位剤形は、送達装置、例えばシリンジ又は静脈内点滴バッグで処理される治療薬の量であり得る。一実施形態では、単位剤形は、単回投与で投与される。別の実施形態では、２以上の単位剤形が同時に投与され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単独療法として投与される、すなわち状態に対する他の治療薬は、対象に同時に投与されない。
【０１３１】
本明細書に記載のＴ細胞を含む医薬組成物は、一般に、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、場合によっては１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重の用量（それら範囲内のすべての整数値を含む）で投与され得る。必要であれば、Ｔ細胞組成物はまた、これらの用量で複数回投与され得る。細胞は、免疫療法において一般に知られる注入技術を用いることにより投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
【０１３２】
特定の態様では、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与し、次にその後に血液を再採取し（又はアフェレーシスを実施し）、本明細書に記載のようなそれからのＴ細胞を活性化し、これらの活性化及び拡大されたＴ細胞を患者に再注入することが所望されることがある。このプロセスは、数週ごとに複数回実施され得る。特定の態様では、Ｔ細胞は、ｌ０ｃｃ〜４００ｃｃの血液採取物から活性化され得る。特定の態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ又はｌ００ｃｃの血液採取物から活性化される。
【０１３３】
投与モードは、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）注射又は注入を含み得る。本明細書に記載の組成物は、患者の経動脈的、腫瘍内、節内又は髄内に投与され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節又は感染部位に直接的に注射され得る。一実施形態では、本明細書に記載の組成物は、体腔又は体液（例えば、腹水症、胸水、腹水又は脳脊髄液）に投与される。
【０１３４】
特定の例示的態様では、対象は、白血球除去を受け得、ここで、白血球は、収集されるか、濃縮されるか又は生体外枯渇がなされ、目的の細胞、例えばＴ細胞が選択及び／又は単離される。これらＴ細胞単離物は、人工ＡＰＣ、例えば抗ＣＤ２８及び抗ＣＤ３  ＣＤＲを発現するＡＰＣと接触させることにより拡大され、技術の１つ以上のＣＡＲ構築物が導入され、それによりＣＡＲ  Ｔ細胞が生成され得るように処理され得る。それを必要とする対象は、その後に高用量化学療法を用いる標準的治療、その後に末梢血幹細胞移植を受け得る。移植後又は移植と同時に、対象は、拡大されたＣＡＲ  Ｔ細胞の注入を受け得る。一実施形態では、拡大された細胞は、手術前又は手術後に投与される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、対象に対して、本明細書に記載のような１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与する前、リンパ球枯渇がなされる。かかる実施形態では、リンパ球枯渇は、メルファラン、シトキサン、シクロホスファミド及びフルダラビンの１つ以上を投与することを含み得る。
【０１３６】
患者に投与されるべき上記治療薬の用量は、治療中の状態及び治療のレシピエントの正確な性質に応じて変化することになる。ヒト投与のための用量のスケーリングは、当該技術分野で認められた慣習に従って実施され得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、単一の治療計画が必要とされる。他には、１以上の後続用量の投与又は治療計画が実施され得る。例えば、隔週で３か月にわたる治療後、治療は、１か月、６か月又は１年又はそれを超える期間につき１回で反復され得る。いくつかの実施形態では、初期治療後、追加的治療が実施されない。
【０１３８】
本明細書に記載のような組成物の用量は、医師により決定され、必要に応じて、治療の観察される効果に適するように調節され得る。治療の持続時間及び頻度に関連して、治療が治療効果をもたらしているときを判定し、またさらなる細胞を投与するべきか否か、治療を中断するべきか否か、治療を再開するべきか否か、又はその治療計画以外で変更を行うべきか否かを判定するため、熟練臨床医が対象を監視することは典型的である。用量は、有害な副作用、例えばサイトカイン放出症候群を引き起こす程に高用量であるべきではない。一般に、用量は、患者の年齢、状態及び性別に応じて変化することになり、当業者により決定され得る。用量はまた、何らかの合併症が生じる場合、個別医師により調節され得る。
【０１３９】
併用療法
本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、任意選択的に、当業者によって適切と判定され得る通り、互いに且つ他の公知の作用剤及び治療法と組み合わせて使用可能である。一例では、異なるＴｒｅｇマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰなど）を標的にする２つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞が組み合わせ投与可能である。別の例では、異なる癌抗原を標的にする２つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞が組み合わせ投与される。さらなる例では、Ｔｒｅｇマーカー（例えば、ＧＡＲＰ、ＬＡＰなど）を標的にする１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞及び１つ以上の腫瘍抗原を標的にする１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞が組み合わせ投与される。
【０１４０】
「組み合わせ」投与は、本明細書で用いられるとき、障害による対象の苦悩の過程において２（又は３以上）の異なる治療薬が対象に送達され、例えば対象が障害を有すると診断されてから、また障害が治癒又は除去されているか、又は他の理由で治療が終了している以前に２つ以上の治療薬が送達される。いくつかの実施形態では、一方の治療薬の送達が、第２の送達が開始するとき、依然として行われていることで、投与については重複がある。これは、ときとして本明細書中で「同時」又は「併用送達」と称される。他の実施形態では、一方の治療薬の送達は、他方の治療薬の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの実施形態では、治療薬は、組み合わせ投与が理由でより有効である。例えば、第２の治療薬がより有効であり、例えば等価な効果が第２の治療薬の低減とともに見られるか、又は第２の治療薬が、第２の治療薬が第１の治療薬の不在下で投与された場合に見られるよりも広範囲に症状を低減するか、又は類似の状況が第１の治療薬の存在下で見られる。いくつかの実施形態では、送達は、症状における低減又は障害に関する他のパラメータの程度が、一方の治療薬が他方の不在下で送達される場合に認められる場合よりも大きいようになされる。２つの治療薬の効果は、部分的に相加的、完全に相加的又は相加的以上であり得る。送達は、送達される第１の治療薬の効果が、第２の治療薬が送達されるときに依然として検出可能であるようになされ得る。本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞及び少なくとも１つの追加的治療薬は、同時に、同じ組成物中で、又は別々の組成物中で、又は逐次的に投与され得る。逐次投与では、本明細書に記載のＣＡＲを発現する細胞が最初に投与可能であり、追加的薬剤が２番目に投与可能であるか、又は投与順序が逆転可能である。ＣＡＲ  Ｔ療法及び／又は他の治療薬、手順又は様式は、活動的な障害の期間中又は寛解若しくはあまり活動的でない疾患の期間中に実施することができる。ＣＡＲ  Ｔ療法は、別の治療前、治療と並行して、治療後又は障害の寛解中に施すことができる。
【０１４１】
組み合わせて投与されるとき、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞及び追加的薬剤（例えば、第２又は第３の薬剤）又は全部が、例えば単独療法として、個別に用いられる各薬剤の量又は用量よりも高い、それよりも低い又はそれと同じ量又は用量で投与され得る。特定の実施形態では、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞、追加的薬剤（例えば、第２又は第３の薬剤）又は全部の投与量又は用量は、個別に用いられる各薬剤の量又は用量よりも（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％）低い。他の実施形態では、所望される効果（例えば、癌の治療）をもたらす、活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞、追加的薬剤（例えば、第２又は第３の薬剤）又は全部の量又は用量は、同じ治療効果を達成するために個別に要求される各薬剤の量又は用量よりも低い（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％又は少なくとも５０％低い）。さらなる実施形態では、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、手術、化学療法、放射線、ｍＴＯＲ経路阻害剤、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸塩及びＦＫ５０６、抗体又は他の免疫除去剤、例えばＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体若しくは他の抗体治療薬、シトキシン、フルダラビン、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン又はペプチドワクチン、例えばＩｚｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．１０８：９６３−９７１，２００８に記載のものと組み合わせた治療計画の中で用いることができる。
【０１４２】
一実施形態では、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、チェックポイント阻害剤と併用され得る。例示的なチェックポイント阻害剤として、抗ＰＤ−１阻害剤（ニボルマブ、ＭＫ−３４７５、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４）、抗ＣＴＬＡ４阻害剤（イピリムマブ及びトレメリムマブ）、抗ＰＤＬ１阻害剤（アテゾリズマブ、アベルマブ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ、ＭＥＤＩ４７３６、及びＭＰＤＬ３２８０Ａ）、及び抗ＴＩＭ３阻害剤が挙げられる。
【０１４３】
一実施形態では、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、化学療法剤と併用され得る。例示的化学療法剤として、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソームドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、ダカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗剤（例えば、葉酸拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）作動薬、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシン又はボルテゾミブ）、免疫調節薬、例えばサリドマイド又はサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）が挙げられる。併用療法における使用について検討される一般的化学療法剤は、アナストロゾール（Ａｒｉｍｉｄｅｘ（登録商標））、ビカルタミド（Ｃａｓｏｄｅｘ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（Ｂｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））、ブスルファン（Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、ブスルファン注射剤（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標））、カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））、クラドリビン（Ｌｅｕｓｔａｔｉｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）又はＮｅｏｓａｒ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓａｒ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射剤（ＤｅｐｏＣｙｔ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、Ｃｏｓｍｅｇａｎ）、ダウノルビシン塩酸塩（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射液（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（アドリアマイシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）（登録商標）、Ｒｕｂｅｘ（登録商標））、エトポシド（Ｖｅｐｅｓｉｄ（登録商標））、リン酸フルダラビン（Ｆｌｕｄａｒａ（登録商標））、５−フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標）、Ｅｆｕｄｅｘ（登録商標））、フルタミド（Ｅｕｌｅｘｉｎ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、６−メルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、���トトレキサート（Ｆｏｌｅｘ（登録商標））、ミトキサントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））、マイロターグ（ｍｙｌｏｔａｒｇ）、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、フェニックス（Ｙｔｔｒｉｕｍ９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロサン２０（Ｇｌｉａｄｅｌ（登録商標））、タモキシフェンクエン酸塩（Ｎｏｌｖａｄｅｘ（登録商標））、テニポシド（Ｖｕｍｏｎ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（Ｔｉｒａｚｏｎｅ（登録商標））、注射用トポテカン塩酸塩（Ｈｙｃａｍｐｔｉｎ（登録商標））、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））を含む。例示的アルキル化剤として、限定はされないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア及びトリアゼン）：ウラシルマスタード（Ａｍｉｎｏｕｒａｃｉｌ  Ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｃｈｌｏｒｅｔｈａｍｉｎａｃｉｌ（登録商標）、Ｄｅｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｄｅｓｍｅｔｈｙｌｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｈａｅｍａｎｔｈａｍｉｎｅ（登録商標）、Ｎｏｒｄｏｐａｎ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｍｕｓｔａｒｄ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｌｏｓｔ（登録商標）、Ｕｒａｃｉｌｍｏｓｔａｚａ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎ（登録商標）、Ｕｒａｍｕｓｔｉｎｅ（登録商標））、クロルメチン（Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標））、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｃｌａｆｅｎ（登録商標）、Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（商標））、イホスファミド（Ｍｉｔｏｘａｎａ（登録商標））、メルファラン（Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標））、クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））、ピポブロマン（Ａｍｅｄｅｌ（登録商標）、Ｖｅｒｃｙｔｅ（登録商標））、トリエチレンメラミン（Ｈｅｍｅｌ（登録商標）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）、Ｈｅｘａｓｔａｔ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標））、チオテパ（Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標））、ブスルファン（Ｂｕｓｉｌｖｅｘ（登録商標）、Ｍｙｌｅｒａｎ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））及びダカルバジン（ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標））が挙げられる。追加的な例示的アルキル化剤として、限定はされないが、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標））；テモゾロミド（Ｔｅｍｏｄａｒ（登録商標）及びＴｅｍｏｄａｌ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、Ｃｏｓｍｅｇｅｎ（登録商標）としても公知）；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン及びフェニルアラニンマスタード、Ａｌｋｅｒａｎ（登録商標）としても公知）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても公知）；カルムスチン（ＢｉＣＮ���（登録商標））；ベンダムスチン（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））；ブスルファン（Ｂｕｓｕｌｆｅｘ（登録商標）及びＭｙｌｅｒａｎ（登録商標））；カルボプラチン（Ｐａｒａｐｌａｔｉｎ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣｅｅＮＵ（登録商標）としても公知）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）及びＰｌａｔｉｎｏｌ（登録商標）−ＡＱとしても公知）；クロラムブシル（Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標））；シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）及びＮｅｏｓａｒ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣ及びイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−Ｄｏｍｅ（登録商標）としても公知）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、Ｈｅｘａｌｅｎ（登録商標）としても公知）；イホスファミド（Ｉｆｅｘ（登録商標））；プレドヌムスチン；プロカルバジン（Ｍａｔｕｌａｎｅ（登録商標））；メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード、ムスチン及びメクロレタミン塩酸塩、Ｍｕｓｔａｒｇｅｎ（登録商標）としても公知）；ストレプトゾシン（Ｚａｎｏｓａｒ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡ及びＴＳＰＡ、Ｔｈｉｏｐｌｅｘ（登録商標）としても公知）；シクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎ（登録商標）、Ｃｙｔｏｘａｎ（登録商標）、Ｎｅｏｓａｒ（登録商標）、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ（登録商標）、Ｒｅｖｉｍｍｕｎｅ（登録商標））；及びベンダムスチンＨＣ１（Ｔｒｅａｎｄａ（登録商標））が挙げられる。例示的なｍＴＯＲ阻害剤として、例えばテムシロリムス；リダフォロリムス（以前はデフェロリムスとして公知、（ｌＲ，２Ｒ，４５）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９５，１２５，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３５，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０５，３２５，３５Ｒ）−ｌ，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−ｌｌ，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４’９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして公知であり、ＡＰ２３５７３及びＭＫ８６６９としても公知、またＰＣＴ公開の国際公開第０３／０６４３８３号パンフレットに記載）；エベロリムス（Ａｆｉｎｉｔｏｒ（登録商標）又はＲＡＤＯＯｌ）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、Ｓｉｒｏｌｉｍｕｓ（登録商標））；シマピモド（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；エムシロリムス（ｅｍｓｉｒｏｌｉｍｕｓ）、（５−｛２，４−ビス［（３５，）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−（ｉ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［ｉｒａｗ５，−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ＪＪピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２，ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；及びＮ２−［ｌ，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−ｌ−ベンゾピラン−２−イル）���ルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−ａ−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ９３６４８７−６７−１）及びＸＬ７６５が挙げられる。例示的な免疫調節薬として、例えばアフツズマブ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（Ｎｅｕｌａｓｔａ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標））；サリドマイド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；及びＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２及びインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  
Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）が挙げられる。例示的なアントラサイクリンとして、例えばドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）及びＲｕｂｅｘ（登録商標））；ブレオマイシン（ｌｅｎｏｘａｎｅ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン及びルビドマイシン塩酸塩、Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、Ｎｏｖａｎｔｒｏｎｅ（登録商標））；エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））；イダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（登録商標）、Ｉｄａｍｙｃｉｎ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（Ｍｕｔａｍｙｃｉｎ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン；及びデアセチルラビドマイシンが挙げられる。例示的なビンカアルカロイドとして、例えばビノレルビン酒石酸塩（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））及びビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標）））；ビンブラスチン（ビンブラスチン硫酸塩、ビンカロイコブラスチン及びＶＬＢ、Ａｌｋａｂａｎ−ＡＱ（登録商標）及びＶｅｌｂａｎ（登録商標）としても公知）；及びビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））が挙げられる。例示的なプロテオソーム阻害剤として、ボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））；カルフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（５）−４−メチル−Ｎ−（（５）−ｌ−（（（５）−４−メチル−ｌ−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−ｌ−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−ｌ−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（５，）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＴ００５２）；イキサゾミブクエン酸塩（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；及びＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（ｌｌＳ’）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−ｌ−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリナミド（ＯＮＸ−０９１２）が挙げられる。
【０１４４】
当業者は、使用する化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｄｒｕｇ  Ｍａｎｕａｌ  ２０１４，Ｅｄｗａｒｄ  Ｃｈｕ，Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  Ｊｒ．，Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８５  ｉｎ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ｅｒａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒｓ．２８−２９  ｉｎ  Ａｂｅｌｏｆｆ’ｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１３  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＦｉｓｃｈｅｒ  ＤＳ（ｅｄ．）：Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，４ｔｈ  ｅｄ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ，２００３を参照されたい）。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書に記載の活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＧＩＴＲを標的にし且つ／又はＧＩＴＲ機能を調節する分子のレベル及び／又は活性を低下させる分子、Ｔｒｅｇ細胞集団を減少させる分子、ｍＴＯＲ阻害剤、ＧＩＴＲ作動薬、キナーゼ阻害剤、非受容体チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤及び／又はＢＴＫ阻害剤と組み合わせて対象に投与される。
【０１４６】
有効性
例えば、本明細書に記載の状態の治療における又は本明細書に記載のような応答（例えば、癌細胞における減少）を誘導するための活性化ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性は、熟練した臨床医により判定され得る。しかし、治療は、用語が本明細書で用いられ、本明細書に記載の状態の徴候又は症状の１つ以上が有利な様式で改変される場合、他の臨床的に認められた症状が改善されるか、又はさらに寛解されるか、又は所望される応答が誘導されるとき（例えば、本明細書に記載の方法に従う治療後に少なくとも１０％）、「有効な治療」と考えられる。有効性は、例えば、本明細書に記載の方法に従って治療される状態のマーカー、指標、症状及び／若しくは発生率又は任意の他の測定可能な適切なパラメータを測定することにより評価され得る。本明細書に記載の方法に従う治療は、状態のマーカー又は症状のレベルを例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％若しくは少なくとも９０％又はそれを超えて低下させ得る。
【０１４７】
有効性は、入院による評価として個体が悪化しないこと又は医学的介入についての必要性（すなわち疾患の進行が停止する）によっても評価され得る。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、且つ／又は本明細書に記載される。
【０１４８】
治療は、個体又は動物（いくつかの非限定例として、ヒト又は動物が挙げられる）における疾患の任意の治療を含み、（１）疾患を阻害する、例えば症状（例えば、疼痛又は炎症）の悪化を予防すること；又は（２）疾患の重症度を軽減する、例えば症状の回復を引き起こすことを含む。疾患の治療における有効量は、それを必要とする対象に投与されるとき、疾患に対する、本明細書で定義される通りの有効な治療をもたらすのに十分である量を意味する。薬剤の有効性は、状態又は所望される応答の身体的指標を評価することによって判定され得る。かかるパラメータのいずれか１つ又はパラメータの任意の組み合わせを測定することにより、投与及び／又は治療の有効性を監視することは、十分に当業者の能力の範囲内にある。所与の手法の有効性は、本明細書に記載の状態の動物モデルにおいて評価され得る。実験動物モデルを用いるとき、治療の有効性は、マーカーにおける統計学的に有意な変化が認められるとき、証明される。
【０１４９】
本願全体を通じて引用される、すべての特許及び他の刊行物、例えば参考文献、交付済み特許、特許出願公開及び同時係属特許出願は、例えば、本明細書に記載の技術と関連して用い得るような刊行物中に記載される方法を説明及び開示することを目的として、明確に参照により本明細書中に援用される。これらの刊行物は、あくまで本願の出願日に先行するそれらの開示を意図して提供される。これに関連して、本発明者らが先行技術の理由で又は任意の他の理由でかかる開示に先行する権限が与えられないことの承認として解釈されるべきではない。これらの文書の内容に関する日付又は表現についてのすべての記載内容は、出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文書の日付又は内容の正確性についての承認を示すものでは決してない。
【０１５０】
本開示の実施形態の記載内容は、本開示を開示される正確な形態にまで厳密化又は限定することは意図されない。本開示における具体的な実施形態及び実施例が例示目的で本明細書に記載される一方、様々な等価な修飾が、当業者が理解する通り、本開示の範囲内で可能である。例えば、方法ステップ又は機能が所与の順序で提示される一方、代替的実施形態では異なる順序で機能を実施し得るか又は実質的に同時に機能を実施し得る。本明細書に提供される開示の教示内容は、必要に応じて他の手順又は方法に適用され得る。本明細書に記載の様々な実施形態を組み合わせることで、さらなる実施形態を提示することができる。本開示の態様は、必要があれば修飾し、上記の参考文献及び出願の組成物、機能及び概念を活用することで、本開示のさらなる実施形態をさらに提示することができる。さらに、生物学的・機能的な同等性を考察することにより、タンパク質構造において、種類又は量における生物学的又は化学的作用に影響することなく、いくらかの変更を行うことができる。詳細な説明のおかげで、本開示にこれら及び他の変更を行うことができる。すべてのかかる修飾は、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることは意図されない。
【０１５１】
前述の実施形態のいずれかの具体的要素は、他の実施形態における要素と組み合わせるか又は置き換えることができる。さらに、本開示の特定の実施形態に関連した利点がこれらの実施形態との関連で記載されている一方、他の実施形態もかかる利点を示し得、実施形態のすべてが、かかる利点が本開示の範囲内に含まれることを必ずしも示す必要はない。
【０１５２】
本明細書に記載の技術は、以下の実施例によりさらに例示されるが、さらに限定するものとして解釈されるべきでは決してない。
【実施例】
【０１５３】
実施例１．ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞
ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗原結合部分を有するＣＡＲ  Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞）は、一部にはＥＧＦＲｖＩＩＩが腫瘍組織上に特異的に発現される一方、一般に健常組織から不在であることから、腫瘍微小環境に対する細胞溶解性細胞の特異的標的化を意図した有望な細胞治療を表す。本実施例では、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞を２つの動物モデルにおいてインビトロ及びインビボで試験した。
【０１５４】
非特定化された健常ドナーから得た白血球除去産物からのＴ細胞をＤｙｎａｂｅａｄｓ（ヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８）で３：１のビーズ対細胞比において刺激し、完全ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。刺激及びレンチウイルス形質導入から１０日後、機能的アッセイにおける使用のため、細胞を凍結及び貯蔵した。
【０１５５】
図１に示す２０時間のルシフェラーゼに基づくアッセイにおいて、ＣＡＲ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞が非形質導入対照細胞と比べて腫瘍細胞を優先的に殺滅する能力を特徴付けるため、初期試験をインビトロで実施した。ヒトグリオーマ細胞系のＵ８７ｖＩＩＩを標的細胞として用いた。インビトロ特徴付けによると、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｕ８７ｖＩＩＩ細胞に対する有意且つ特異的な細胞傷害性を媒介することが示される（図１）。
【０１５６】
インビボ実験では、Ｕ８７ｖＩＩＩ腫瘍細胞を対数増殖期において収集し、洗浄し、マウスに対し、ヒト神経膠芽腫の異種移植片モデルでは皮下に（図２Ａ及び２Ｂ）又はヒト神経膠腫のモデルでは頭蓋内に投与した（図３Ａ及び３Ｂ）。頭蓋内投与では、５０μＬのハミルトンシリンジの針を、定位フレームを用いて十字縫合の右側２ｍｍに、また冠状縫合の頭蓋骨の表面下４ｍｍに位置付けた。治療として、マウスに尾静脈を介してＣＡＲ  Ｔ細胞を１回注入した（１×１０６個のＣＡＲ形質導入Ｔ細胞／マウス）。
【０１５７】
インビトロで認められた強力な抗腫瘍効果をヒト神経膠芽腫のインビボ皮下異種移植片モデルにおいて再現した（図２Ａ及び２Ｂ）。このモデルでは、樹立した巨大腫瘍（上列）は、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩに応答した一方（図２Ｂ）、非形質導入細胞は、腫瘍増殖を阻止しなかった（図２Ａ）。頭蓋内ヒト神経膠腫のマウスモデルでは、ＥＧＦＲｖＩＩＩ  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、非形質導入細胞（図３Ａ）と比べて腫瘍の増殖を緩徐化し、生存延長をもたらした（図３Ｂ）。腫瘍増殖が抑制されたが、皮下腫瘍に対して認められた場合ほど効果は明白でなかった。
【０１５８】
ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞での治療後、ヒト患者腫瘍組織において制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の存在が認められた（図４Ａ及び４Ｂ）。脳浸潤性ＴｒｅｇがＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の抑制における機能的役割を有するか否かを判定するため、インビトロＴｒｅｇ抑制アッセイを実施し、そこでは、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞（赤）及びグリオーマ細胞（緑）をＴｒｅｇの存在下で１８時間インキュベートした。結果は、図５Ａ〜５Ｃに示す通り、ＩｎｃｙＣｙｔｅ生細胞分析により得られた。非特異的なＣＡＲ細胞は、グリオーマ細胞の増殖を可能にした一方（図５Ａ及び５Ｄ、上線）、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞は、グリオーマ細胞を殺滅した（図５Ｂ及び５Ｄ、下線）。しかし、共培養下でのＴｒｅｇの添加により、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞が標的のグリオーマ細胞を殺滅する能力は、有意に低下した（図５Ｃ及び５Ｄ、中線）。
【０１５９】
実施例２．Ｔｒｅｇ関連抗原に対して標的にされるＣＡＲ  Ｔ細胞の設計及び特徴付け
図６Ａ〜６Ｃ、７Ａ及び７Ｂは、実験の結果を示し、そこでは、ＬＡＰ及びＧＡＲＰがヒト末梢血液細胞に対するＴｒｅｇ関連マーカーとして同定された。特に、生体外で活性化されなかったヒトＴｒｅｇの中で、約２７％がＬＡＰを発現し、約４％がＬＡＰ及びＧＡＲＰについて二重陽性であった（図６Ｂ）。抗ＣＤ３、抗ＣＤ８及びＩＬ−２を用いて生体外で一旦活性化されると、約３０％がＬＡＰを発現し、ＬＡＰ／ＧＡＲＰ二重陽性Ｔｒｅｇの数が１２．３％に増加した（図６Ｃ）。
【０１６０】
次いで、ＬＡＰ及びＧＡＲＰを標的にするＣＡＲをコードするＣＡＲ構築物を設計した。これら構築物の概略図を図８Ａ〜８Ｄに示す。Ｔｒｅｇ標的化構築物は、２つのＬＡＰ標的化ＣＡＲ（ＣＡＲ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ（図８Ａ）及びＣＡＲ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ（図８Ｂ）；ここで、各抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖは、重（Ｈ）及び軽（Ｌ）鎖配置において反転を有する）、ＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲ−ＧＡＲＰ；図８Ｃ）及び抗ＧＡＲＰラクダ科抗体をさらにコードするＥＧＦＲ標的化ＣＡＲ構築物（ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ；図８Ｄ）を含む。各構築物の形質導入効率を、フローサイトメトリーを用いてｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の百分率を測定することにより評価したものを下記に提示する。
【０１６１】
2020516276.tif 000003
【０１６２】
抗ＬＡＰ  ＣＡＲＴ細胞を試験するため、ＣＡＲ  Ｔ細胞を同じドナーから拡大した単離Ｔｒｅｇと共培養し、ＴｒｅｇマーカーとしてＧＦＰを発現するように形質導入した。殺滅アッセイ前、Ｔｒｅｇを抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８を用いて一晩活性化するか（図９Ｂ）又は一晩静置した（図９Ａ）。６２，５００個のＴｒｅｇ／ウェルを蒔いた。ＣＡＲをＴｒｅｇに対する指定比で添加した。培養物を３００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２の存在下で３日間インキュベートした。３日目、３０，０００イベント／ウェルを収集することにより、フローサイトメトリーを実施した。パーセント細胞傷害性を、ＧＦＰ陽性細胞における、Ｔｒｅｇを有する非形質導入Ｔ細胞培養物と比べてのパーセント低下として算出した。ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは、非活性化Ｔｒｅｇの殺滅時、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈと比べてより有効であった。次に、１：１のＣＡＲ  Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ比での２つの異なるドナーを通じた４日間の類似のＴｒｅｇ殺滅アッセイにおいて、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞をＧＡＲＰ標的化ＣＡＲＴ細胞と比較した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。図１１Ａ及び１１Ｂは、ＬＡＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞による非活性化及び活性化Ｔｒｅｇの殺滅を、非形質導入対照と比べて、ＣＡＲ  Ｔ細胞対Ｔｒｅｇ細胞比の関数として３日共培養の終了時に残存する標的Ｔｒｅｇの数により特徴付ける。図１１Ｃ及び１１Ｄは、同じドナーからの類似データを示し、ここで、細胞傷害性は、ルシフェラーゼ発現により測定する。
【０１６３】
ＬＡＰ及びＧＡＲＰ標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の機能に対する抗原発現の効果をさらに特徴付けるため、不死化細胞株をＬＡＰ及びＧＡＲＰ抗原発現についてスクリーニングし、各ＣＡＲ  Ｔ細胞による細胞傷害性効果を評価した。最初に、ＨＵＴ７８細胞、ＩＬ−２を発現する皮膚ヒトＣＤ４  Ｔ細胞リンパ球由来細胞株を、ＧＡＲＰ及びＬＡＰについて染色し（それぞれ図１２Ａ及び１２Ｂ）、ＨＵＴ７８細胞によるＬＡＰ発現を確認した。次に、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ及びＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ細胞は、細胞傷害性アッセイにより、ＨＵＴ７８細胞に対する細胞傷害性を媒介した（図１３Ａ及び１３Ｂ）。次に、ＳｅＡｘ、ＩＬ−２依存性ヒトセザリー症候群由来細胞をＧＡＲＰ及びＬＡＰについて染色し（それぞれ図１４Ａ及び１４Ｂ）、両抗原の発現を確認した。ＳｅＡｘ細胞をＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ細胞、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌ細胞、ＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｌ細胞及び非形質導入細胞と共培養し、２４時間後（図１５Ａ）及び４８時間後（図１５Ｂ）、ＣＡＲ  Ｔ細胞媒介性殺滅を定量化した。各ＣＡＲ  Ｔは、２４時間後、優位なＳｅＡｘ標的細胞の死滅とともに、４８時間後、より明白な効果を示した。ＣＡＲＴ−ＧＡＲＰ及びＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｈ−Ｌは標的ＳｅＡｘ細胞を殺滅し、４８時間まではＣＡＲＴ−ＬＡＰ−Ｌ−Ｈ細胞よりも効率が高かった。
【０１６４】
次に、ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ細胞による抗ＧＡＲＰラクダ科抗体の分泌をウエスタンブロットによって特徴付けた（図１６Ａ〜１６Ｃ）。ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＧＡＲＰ細胞を含有する培養物から上清を収集し、還元及び非還元条件下で処置し、１０〜１５ｋＤの間のバンドの存在を、非還元サンプルを有するレーン内に認め（図１６Ｃ）、ラクダ科抗体の存在が確認された。
【０１６５】
実施例３．ＢｉＴＥを分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞の設計及び特徴付け
（例えば、Ｔｒｅｇによる免疫調節を克服するため）腫瘍微小環境内でのＣＡＲ  Ｔ細胞活性の有効性を増強するための本明細書に提供した別の機構は、免疫調節抗体、例えばＢｉＴＥを分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞を介する。理論によって拘束されることを望まないが、本発明者らは、免疫調節抗体（例えば、ＢｉＴＥ）のＣＡＲもコードする構築物からの発現により、抗腫瘍効果がさらに増幅され得ることを発見している。
【０１６６】
図１７に概略的に示す１つの例示的核酸構築物のＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）は、ＢｉＴＥをコードするポリヌクレオチドの５’側に作動可能に連結されたＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。ＣＡＲは、ＣＡＲ  Ｔ細胞をＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍の微小環境に誘導する、ＥＧＦＲｖＩＩＩに結合する腫瘍抗原結合ドメインを特徴とする。ＢｉＴＥは、図１８に示すように、一方のドメインでＥＧＦＲに、また他方のドメインでＣＤ３に結合し、（ａ）宿主ＣＡＲ  Ｔ細胞の腫瘍細胞への結合活性をさらに増強することができるか、又は（ｂ）腫瘍に対する隣接（例えば、内因性）Ｔ細胞に備えることができる。ＢｉＴＥは、ＢｉＴＥの分泌を分離可能にするため、切断可能なリンカーＰ２Ａ及びＴ２Ａによって隣接される一方、ＣＡＲは、細胞表面に標的化される。他の例示的なＢｉＴＥをコードするＣＡＲ構築物（例えば、ＢｉＴＥ標的化ＣＤ１９をコードする）を図２６Ａ及び２６Ｂに示す。
【０１６７】
ＣＡＲＴ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）細胞によるＢｉＴＥ分泌を、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）が形質導入されたＳｕｐＴ１細胞を含有する培養物から上清を単離し、上清中のＢｉＴＥの濃度をＯＤ４５０に基づいて計算し、ウエスタンブロット解析を実施することにより確認した。上清中のＢｉＴＥの濃度は、０．６０４ｎｇ／ｍＬであった。ウエスタンブロット実験の結果を図１９に示す。約５０〜６０ｋＤでレーン２におけるバンドが認められ、上清中でのＢｉＴＥ分子の存在が示された。
【０１６８】
次に、ＢｉＴＥ分子の結合をフローサイトメトリーにより評価した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を形質導入し、分泌されたＢｉＴＥを含有する上清を収集し、Ｋ５６２細胞（図２０Ａ）及びジャーカット細胞（図２０Ｂ）とともにインキュベートした。図２０Ａに示す通り、ＢｉＴＥは、ＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞に結合せず、ＢｉＴＥのＥＧＦＲ結合ドメインの機能が確認された。図２０Ｂに示す通り、ＣＤ３を発現するジャーカット細胞は、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清とのインキュベーション後のＢｉＴＥに対する染色が非形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの上清とのインキュベーション後のＢｉＴＥに対する染色と比べてより強力であることを示し、ＢｉＴＥがまたＣＤ３に機能的に結合することが示された。
【０１６９】
ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）に対する形質導入宿主としてＳｕｐＴ１細胞を用いて類似の実験を実施した。図２１Ａは、ＢｉＴＥがＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞に結合しなかったことを示し、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞によって発現されたＢｉＴＥのＥＧＦＲ結合ドメインの機能が確認された。ＢｉＴＥが宿主ＳｕｐＴ１細胞の表面上に発現されたＣＤ３に結合したことを確認するため、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞をＢｉＴＥについて染色した。図２１Ｂに示す結果により、形質導入されたＳｕｐＴ１細胞がＢｉＴＥに対して陽性染色であることが確認される。ＮＤ４細胞も、ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）の形質導入時に機能的ＢｉＴＥを分泌する能力について評価した。図２２Ａは、形質導入されたＮＤ４細胞によって分泌されたＢｉＴＥが、ＥＧＦＲを発現するＫ５６２細胞に結合し、ＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞に結合しなかったことを示す。図２２Ｂに示す通り、ＢｉＴＥは、その分泌元である形質導入されたＮＤ４細胞上に発現されたＣＤ３に結合した。
【０１７０】
次に、形質導入されたＣＡＲ  Ｔ細胞から分泌されたＢｉＴＥの能力をインビトロで特徴付けた。ＣＡＲ−ＥＧＦＲ−ＢｉＴＥ−（ＥＧＦＲ−ＣＤ３）を形質導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から分泌されたＢｉＴＥを含有する上清を非形質導入ＮＤ４細胞及びＵ８７ｖＩＩＩ標的細胞の様々な比での共培養物とともにインキュベートした。図２３に示す通り、ＮＤ４細胞を用量依存的様式でＢｉＴＥとともにインキュベートしたとき、ＢｉＴＥがＮＤ４に発現されたＣＤ３とＵ８７ｖＩＩＩに発現されたＥＧＦＲとの両方に、ＮＤ４細胞により殺滅を誘導するのに十分な程度まで結合していることが示された。
【０１７１】
Ｔ細胞活性化時にＢｉＴＥの誘導発現を可能にするため、ＮＦＡＴプロモーターを有する構築物を設計し、合成した。図２４に示す通り、ＮＦＡＴプロモーターは、ＧＦＰをコードするポリヌクレオチドに先行し、構築物は、構成的プロモーターＥＦ１αによって駆動される、下流ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。ＧＦＰの誘導発現を確認するため、ＧＦＰの発現を、ＰＭＡ／イオノマイシンによるＴＣＲ刺激に応答して、ＦＡＣＳにより評価した。図２５Ａ及び２５Ｂに示す通り、刺激によりＧＦＰの発現がもたらされた。この誘導発現は、ＰＥＰｖＩＩＩとのインキュベーションにより阻害された。ＣＡＲをコードする誘導性ＢｉＴＥ構築物は、図２７Ａ及び２７Ｂに示す通り、ＢｉＴＥを誘導性プロモーター、例えばＮＦＡＴプロモーターの下流に位置付けることにより設計する。
【０１７２】
実施例４．配列情報
ＣＤ８リーダー配列（配列番号１のアミノ酸１〜２１；配列番号２）；抗ＧＡＲＰラクダ科（配列番号１のアミノ酸２２〜１２８；配列番号３）；ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号１のアミノ酸１２９〜１９７；配列番号４）；４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号１のアミノ酸１９８〜２３９；配列番号５）；及びＣＤ３ζ（配列番号１のアミノ酸２４０〜３５１；配列番号６）を含む抗ＧＡＲＰ  ＣＡＲ−ｐＭＧＨ９７：ＣＤ８リーダー−抗ＧＡＲＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ（配列番号１）
2020516276.tif 000004
ＣＤ８リーダー配列（配列番号１のアミノ酸１〜２１；配列番号２）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
抗ＧＡＲＰラクダ科（配列番号１のアミノ酸２２〜１２８；配列番号３）
2020516276.tif 000005
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号１のアミノ酸１２９〜１９７；配列番号４）
2020516276.tif 000006
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号１のアミノ酸１９８〜２３９；配列番号５）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ζ（配列番号１のアミノ酸２４０〜３５１；配列番号６）
2020516276.tif 000007
【０１７３】
ＣＤ８リーダー配列（配列番号７のアミノ酸１〜２１；配列番号８）、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号７のアミノ酸２２〜３０７；配列番号９）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号７のアミノ酸３０８〜３７６；配列番号１０）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号７のアミノ酸３７７〜４１８；配列番号１１）及びＣＤ３ζ（配列番号７のアミノ酸４１９〜５３０；配列番号１２）を含む抗ＬＡＰ  ＣＡＲ（Ｈ−Ｌ）−ｐＭＧＨ９９：ＣＤ８リーダー−抗ＬＡＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ（配列番号７）
2020516276.tif 000008
ＣＤ８リーダー配列（配列番号７のアミノ酸１〜２１；配列番号８）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖ（Ｈ−Ｌ）（配列番号７のアミノ酸２２〜３０７；配列番号９）
2020516276.tif 000009
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭドメイン（配列番号７のアミノ酸３０８〜３７６；配列番号１０）
2020516276.tif 000010
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号７のアミノ酸３７７〜４１８；配列番号１１）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ζ（配列番号７のアミノ酸４１９〜５３０；配列番号１２）。
2020516276.tif 000011
【０１７４】
ＣＤ８リーダー（配列番号１３のアミノ酸１〜２１；配列番号１４）、抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号１３のアミノ酸２２〜３０７；配列番号１５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号１３のアミノ酸３０８〜３７６；配列番号１６）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号１３のアミノ酸３７７〜４１８；配列番号１７）及びＣＤ３ｚ（配列番号１３のアミノ酸４１９〜５３０；配列番号１８）を含む抗ＬＡＰ  ＣＡＲ（Ｌ−Ｈ）−ｐＭＧＨ１００：ＣＤ８リーダー−抗ＬＡＰ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ（配列番号１３）
2020516276.tif 000012
ＣＤ８リーダー（配列番号１３のアミノ酸１〜２１；配列番号１４）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
抗ＬＡＰ  ｓｃＦｖ（Ｌ−Ｈ）（配列番号１３のアミノ酸２２〜３０７；配列番号１５）
2020516276.tif 000013
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号１３のアミノ酸３０８〜３７６；配列番号１６）
2020516276.tif 000014
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号１３のアミノ酸３７７〜４１８；配列番号１７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号１３のアミノ酸４１９〜５３０；配列番号１８）
2020516276.tif 000015
【０１７５】
ＣＤ８リーダー（配列番号１９のアミノ酸１〜２１；配列番号２０）、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（配列番号１９のアミノ酸２２〜２６７；配列番号２１）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号１９のアミノ酸２６８〜３３６；配列番号２２）、４−１ＢＢ（配列番号１９のアミノ酸３３７〜３７８；配列番号２３）、ＣＤ３ｚ（配列番号１９のアミノ酸３７９〜４９０；配列番号２４）、２Ａ切断配列（配列番号１９のアミノ酸４９４〜５１５；配列番号３１）、ＩｇＫリーダー（配列番号１９のアミノ酸５１９〜５３９；配列番号３２）及び抗ＧＡＲＰラクダ科（配列番号１９のアミノ酸５４０〜６４６；配列番号２５）を含む抗ＧＡＲＰラクダ科−ｐＭＧＨ１０５：ＣＤ８リーダー−抗ＥＧＦＲ−ＣＤ８ヒンジ＋ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ−抗ＧＡＲＰラクダ科（配列番号１９）を分泌する抗ＥＧＦＲ  ＣＡＲ
2020516276.tif 000016
ＣＤ８リーダー（配列番号１９のアミノ酸１〜２１；配列番号２０）
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ（配列番号１９のアミノ酸２２〜２６７；配列番号２１）
2020516276.tif 000017
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号１９のアミノ酸２６８〜３３６；配列番号２２）
2020516276.tif 000018
４−１ＢＢ（配列番号１９のアミノ酸３３７〜３７８；配列番号２３）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号１９のアミノ酸３７９〜４９０；配列番号２４）
2020516276.tif 000019
２Ａ切断配列（配列番号１９のアミノ酸４９４〜５１５；配列番号３１）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
ＩｇＫリーダー（配列番号１９のアミノ酸５１９〜５３９；配列番号３２）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
抗ＧＡＲＰラクダ科（配列番号１９のアミノ酸５４０〜６４６；配列番号２５）。
2020516276.tif 000020
【０１７６】
３Ｃ１０  ｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸１〜２４３；配列番号２７）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号２６のアミノ酸２４４〜３１２；配列番号２８）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号２６のアミノ酸３１３〜３５４；配列番号２９）、ＣＤ３ｚ（配列番号２６のアミノ酸３５５〜４６６；配列番号３０）、Ｐ２Ａ（配列番号２６のアミノ酸４６７〜４８８；配列番号３１）、ＩｇＫリーダー（配列番号２６のアミノ酸４９１〜５１１；配列番号３２）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸５１２〜７５２；配列番号３３）、ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸７５８〜１０００；配列番号３４）を含むｐＭＧＨ１１３−３Ｃ１０  ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ  ＩＣＤ−ＣＤ３ｚ−Ｐ２Ａ−ＩｇＫリーダー−セツキシマブｓｃＦｖ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ（配列番号２６）
2020516276.tif 000021
３Ｃ１０  ｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸１〜２４３；配列番号２７）
2020516276.tif 000022
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号２６のアミノ酸２４４〜３１２；配列番号２８）
2020516276.tif 000023
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号２６のアミノ酸３１３〜３５４；配列番号２９）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号２６のアミノ酸３５５〜４６６；配列番号３０）
2020516276.tif 000024
Ｐ２Ａ（配列番号２６のアミノ酸４６７〜４８８；配列番号３１）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
ＩｇＫリーダー（配列番号２６のアミノ酸４９１〜５１１；配列番号３２）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸５１２〜７５２；配列番号３３）
2020516276.tif 000025
ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号２６のアミノ酸７５８〜１０００；配列番号３４）
2020516276.tif 000026
【０１７７】
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸１〜２４６；配列番号３６）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号３５のアミノ酸２４７〜３１５；配列番号３７）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号３６のアミノ酸３１６〜３５７；配列番号３８）、ＣＤ３ｚ（配列番号３５のアミノ酸３５８〜４６９；配列番号３９）、Ｐ２Ａ（配列番号３５のアミノ酸４７０〜４９１；配列番号４０）、ＩｇＫリーダー（配列番号３５のアミノ酸４９４〜５１４；配列番号４１）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸５１５〜７５５；配列番号４２）及びＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸７６１〜１００３；配列番号４３）を含むｐＭＧＨ１３３−２１７３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ  ＩＣＤ−ＣＤ３ｚ−Ｐ２Ａ−ＩｇＫリーダー−セツキシマブｓｃＦｖ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ（配列番号３５）
2020516276.tif 000027
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸１〜２４６；配列番号３６）
2020516276.tif 000028
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号３５のアミノ酸２４７〜３１５；配列番号３７）
2020516276.tif 000029
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号３５のアミノ酸３１６〜３５７；配列番号３８）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号３５のアミノ酸３５８〜４６９；配列番号３９）
2020516276.tif 000030
Ｐ２Ａ（配列番号３５のアミノ酸４７０〜４９１；配列番号４０）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
ＩｇＫリーダー（配列番号３５のアミノ酸４９４〜５１４；配列番号４１）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸５１５〜７５５；配列番号４２）
2020516276.tif 000031
ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号３５のアミノ酸７６１〜１００３；配列番号４３）
2020516276.tif 000032
【０１７８】
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸１〜２４６；配列番号４５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号４４のアミノ酸２４７〜３１５；配列番号４６）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号４４のアミノ酸３１６〜３５７；配列番号４７）、ＣＤ３ｚ（配列番号４４のアミノ酸３５８〜４６９；配列番号４８）、Ｐ２Ａ（配列番号４４のアミノ酸４７０〜４９１；配列番号４９）、ＩｇＫリーダー（配列番号４４のアミノ酸４９４〜５１４；配列番号５０）、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸５１５〜７６４；配列番号５１）、ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸７７０〜１０１２；配列番号５２）を含むｐＭＧＨ１３４−２１７３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ  ＩＣＤ−ＣＤ３ｚ−Ｐ２Ａ−ＩｇＫリーダー−ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ（配列番号４４）
2020516276.tif 000033
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸１〜２４６；配列番号４５）
2020516276.tif 000034
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号４４のアミノ酸２４７〜３１５；配列番号４６）
2020516276.tif 000035
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号４４のアミノ酸３１６〜３５７；配列番号４７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号４４のアミノ酸３５８〜４６９；配列番号４８）
2020516276.tif 000036
Ｐ２Ａ（配列番号４４のアミノ酸４７０〜４９１；配列番号４９）
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
ＩｇＫリーダー（配列番号４４のアミノ酸４９４〜５１４；配列番号５０）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸５１５〜７６４；配列番号５１）
2020516276.tif 000037
ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号４４のアミノ酸７７０〜１０１２；配列番号５２）
2020516276.tif 000038
【０１７９】
ＩｇＫリーダー（配列番号５３のアミノ酸１〜２１；配列番号５４）、セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸２２〜２６２；配列番号５５）、ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸２６８〜５１０；配列番号５６）、２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸５１７〜７６２；配列番号５７）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号５３のアミノ７６３〜８３１；配列番号５８）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号５３のアミノ酸８３２〜８７３；配列番号５９）、ＣＤ３ｚ（配列番号５３のアミノ酸８７４〜９８５；配列番号６０）を含むｐＭＧＨ１３５−（ＮＦＡＴ応答要素）−ＩｇＫリーダー−セツキシマブｓｃＦｖ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ−（ＥＦ１ａプロモーター）−２１７３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ  ＩＣＤ−ＣＤ３ｚ（配列番号５３）
（ＮＦＡＴ応答要素）
2020516276.tif 000039
（ＥＦ１ａプロモーター）
2020516276.tif 000040
（注：上記の２つのポリペプチドは、便宜上、単一の配列識別子とともに表されるが、ＣＡＲ及びＢｉＴＥ成分が２つの別々のプロモーターにより別々に作製可能であることが理解される必要がある；上記を参照されたい）
ＩｇＫリーダー（配列番号５３のアミノ酸１〜２１；配列番号５４）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
セツキシマブｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸２２〜２６２；配列番号５５）
2020516276.tif 000041
ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸２６８〜５１０；配列番号５６）
2020516276.tif 000042
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号５３のアミノ酸５１７〜７６２；配列番号５７）
2020516276.tif 000043
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号５３のアミノ酸７６３〜８３１；配列番号５８）
2020516276.tif 000044
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号５３のアミノ酸８３２〜８７３；配列番号５９）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号５３のアミノ酸８７４〜９８５；配列番号６０）
2020516276.tif 000045
【０１８０】
（ＮＦＡＴ応答要素）、ＩｇＫリーダー（配列番号６１のアミノ酸１〜２１；配列番号６２）、ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸２２〜２７１；配列番号６３）、ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸２７７〜５１９；配列番号６４）、２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸５２６〜７７１；配列番号６５）、ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号６１のアミノ酸７７２〜８４０；配列番号６６）、４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号６１のアミノ酸８４１〜８８２；配列番号６７）、ＣＤ３ｚ（配列番号６１のアミノ酸８８３〜９９４；配列番号６８）を含むｐＭＧＨ１３６−（ＮＦＡＴ応答要素）−ＩｇＫリーダー−ＣＤ１９  ｓｃＦｖ−ＣＤ３  ｓｃＦｖ−Ｈｉｓタグ−（ＥＦ１ａプロモーター）−２１７３  ｓｃＦｖ−ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ−４−１ＢＢ  ＩＣＤ−ＣＤ３ｚ（配列番号６１）
2020516276.tif 000046
（ＥＦ１ａプロモーター）
2020516276.tif 000047
（注：上記の２つのポリペプチドは、便宜上、単一の配列識別子とともに表されるが、ＣＡＲ及びＢｉＴＥ成分が２つの別々のプロモーターにより別々に作製可能であることが理解される必要がある；上記を参照されたい）
ＩｇＫリーダー（配列番号６１のアミノ酸１〜２１；配列番号６２）
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＤ
ＣＤ１９  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸２２〜２７１；配列番号６３）
2020516276.tif 000048
ＣＤ３  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸２７７〜５１９；配列番号６４）
2020516276.tif 000049
２１７３  ｓｃＦｖ（配列番号６１のアミノ酸５２６〜７７１；配列番号６５）
2020516276.tif 000050
ＣＤ８ヒンジ／ＴＭ（配列番号６１のアミノ酸７７２〜８４０；配列番号６６）
2020516276.tif 000051
４−１ＢＢ  ＩＣＤ（配列番号６１のアミノ酸８４１〜８８２；配列番号６７）
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ
ＣＤ３ｚ（配列番号６１のアミノ酸８８３〜９９４；配列番号６８）
2020516276.tif 000052
【０１８１】
本発明の他の態様は、以下の番号付けられたパラグラフの範囲内に含まれる。
１．異種核酸分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞であって、異種核酸分子は、
（ａ）抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲをコードする第１のポリヌクレオチドと、
（ｂ）治療物質をコードする第２のポリヌクレオチドと
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞。
２．治療物質は、抗体試薬を含む、パラグラフ１のＣＡＲ  Ｔ細胞。
３．抗体試薬は、一本鎖抗体又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ２のＣＡＲ  Ｔ細胞。
４．抗体試薬は、二重特異性抗体試薬を含む、パラグラフ２又は３のＣＡＲ  Ｔ細胞。
５．二重特異性抗体試薬は、二重特異性Ｔ細胞誘導抗体（ＢｉＴＥ）を含む、パラグラフ４のＣＡＲ  Ｔ細胞。
６．単一ドメイン抗体は、ラクダ科抗体を含む、パラグラフ３のＣＡＲ  Ｔ細胞。
７．治療物質は、サイトカインを含む、パラグラフ１のＣＡＲ  Ｔ細胞。
８．ＣＡＲ及び治療物質は、別々のＣＡＲ及び治療物質分子を生成するために切断されるポリタンパク質の形態で作製される、パラグラフ１〜７のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
９．ポリタンパク質は、ＣＡＲと治療物質との間の切断可能部分を含む、パラグラフ８のＣＡＲ  Ｔ細胞。
１０．切断可能部分は、２Ａペプチドを含む、パラグラフ９のＣＡＲ  Ｔ細胞。
１１．２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ又はＴ２Ａを含む、パラグラフ１０のＣＡＲ  Ｔ細胞。
１２．ＣＡＲ及び治療物質は、それぞれ構成的に発現される、パラグラフ１〜１１のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１３．ＣＡＲ及び治療物質の発現は、伸長因子−１α（ＥＦ１α）プロモーターによって駆動される、パラグラフ１〜１２のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１４．治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ１〜１１のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１５．誘導性プロモーターは、ＮＦＡＴプロモーターを含む、パラグラフ１４のＣＡＲ  Ｔ細胞。
１６．ＣＡＲは、構成的プロモーターの制御下で発現され、且つ治療物質は、任意選択的にＴ細胞受容体又はＣＡＲシグナル伝達によって誘導可能である誘導性プロモーターの制御下で発現される、パラグラフ１〜１１のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１７．ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインをさらに含む、パラグラフ１〜１６のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１８．ＣＡＲの抗原結合ドメインは、抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体又はリガンドを含む、パラグラフ１〜１７のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
１９．ＣＡＲの膜貫通ドメインは、任意選択的に配列番号４、１０、１６、２２、２８、３７、４６、５８及び６６のいずれか１つの配列又はその変異体を含むＣＤ８ヒンジ／膜貫通ドメインを含む、パラグラフ１〜１８のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
２０．細胞内シグナル伝達ドメインは、任意選択的に配列番号６、１２、１８、２４、３０、３９、４８、６０及び６８のいずれか１つの配列又はその変異体を含むＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、パラグラフ１〜１９のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
２１．任意選択的に、配列番号５、１１、１７、２３、２９、３８、４７、５９及び６７のいずれか１つの配列又はその変異体を含む４−１ＢＢ同時刺激ドメインを含む、パラグラフ１〜２０のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
２２．ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、治療物質が抗体試薬を含むとき、腫瘍関連抗原に結合する、パラグラフ１〜２１のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
２３．ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合する腫瘍関連抗原は、固形腫瘍関連抗原である、パラグラフ２２のＣＡＲ  Ｔ細胞。
２４．ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合する腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体変異体ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、ＥＧＦＲ、ＣＤ１９、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）又はＩＬ−１３受容体α２（ＩＬ−１３Ｒα２）を含み、且つ任意選択的に、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、配列番号２１、２７、３３、３６、４２、４５、５１、５５、５７、６３、６５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ２２又は２３のＣＡＲ  Ｔ細胞。
２５．ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、治療物質が抗体試薬を含むとき、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する、パラグラフ１〜２１のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
２６．ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質が結合するＴｒｅｇ関連抗原は、反復優位糖タンパク質Ａ（ＧＡＲＰ）、潜在関連ペプチド（ＬＡＰ）、ＣＤ２５及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原−４（ＣＴＬＡ−４）からなる群から選択され、且つ任意選択的に、ＣＡＲ抗原結合ドメイン又は治療物質は、配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含む、パラグラフ２５のＣＡＲ  Ｔ細胞。
２７．ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含むＣＡＲ  Ｔ細胞であって、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、且つ抗原結合ドメインは、Ｔｒｅｇ関連抗原に結合する、ＣＡＲ  Ｔ細胞。
２８．Ｔｒｅｇ関連抗原は、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＣＤ２５及びＣＴＬＡ−４からなる群から選択される、パラグラフ２７のＣＡＲ  Ｔ細胞。
２９．ＣＡＲは、１つ以上の同時刺激ドメインをさらに含む、パラグラフ２７又は２８のＣＡＲ  Ｔ細胞。
３０．ＣＡＲの抗原結合ドメインは、任意選択的に配列番号３、９、１５、２５及びその変異体からなる群から選択される配列を含むｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、パラグラフ２７〜２９のいずれか１つのＣＡＲ  Ｔ細胞。
３１．配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６１、配列番号１９、配列番号１、配列番号７及び配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含むＣＡＲ  Ｔ細胞。
３２．配列番号２６、配列番号３５、配列番号４４、配列番号５３、配列番号６１、配列番号１９、配列番号１、配列番号７及び配列番号１３のいずれか１つのアミノ酸配列をコードする異種核酸分子を含む、パラグラフ３１のＣＡＲ  Ｔ細胞。
３３．パラグラフ１〜３２のいずれか１つの（ｉ）ＣＡＲポリペプチド又は（ｉｉ）ＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質をコードする核酸分子。
３４．パラグラフ１〜３２のいずれか１つのＣＡＲポリペプチド又はＣＡＲポリペプチド及び治療物質を含むポリタンパク質。
３５．パラグラフ１〜３４のいずれか１つの１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞、核酸分子、ＣＡＲポリペプチド又はポリタンパク質を含む医薬組成物。
３６．癌を有する患者を治療する方法であって、パラグラフ１〜３２のいずれか１つの１つ以上のＣＡＲ  Ｔ細胞を含む医薬組成物又はパラグラフ３５の医薬組成物を患者に投与することを含む方法。
３７．全身毒性は、腫瘍微小環境を標的にすることによって低下される、パラグラフ３６の方法。
３８．癌は、１つ以上の固形腫瘍の存在によって特徴付けられる、パラグラフ３６又は３７の方法。
３９．癌は、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇによって特徴付けられる、パラグラフ３６〜３８のいずれか１つの方法。
４０．癌は、神経膠芽腫である、パラグラフ３６〜３９のいずれか１つの方法。
４１．癌を有する患者を治療する方法であって、腫瘍毒性抗体又はサイトカインを分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞産物を患者に投与することを含み、全身毒性は、癌の毒性を腫瘍微小環境に局所的に誘導することによって低下される、方法。
４２．ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＧＡＲＰ、ＬＡＰ、ＩＬ１５、ＣＳＦ１Ｒ若しくはＥＧＦＲに対する抗体又は腫瘍微小環境に対する二重特異性抗体を送達するように遺伝子組換えされる、パラグラフ４１の方法。
４３．二重特異性抗体は、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に特異的である、パラグラフ４２の方法。
４４．疾患又は病理を治療するために治療物質を患者における組織又は臓器に送達する方法であって、治療抗体、毒素又は作用剤を分泌するように遺伝子組換えされたＣＡＲ  Ｔ細胞を前記患者に投与することを含み、治療抗体、毒素又は作用剤は、単独では組織又は臓器に侵入又は浸透することができないであろう、方法。
４５．組織又は臓器は、神経系におけるものである、パラグラフ４４の方法。
４６．神経系は、中枢神経系である、パラグラフ４５の方法。
４７．中枢神経系は、脳である、パラグラフ４６の方法。
４８．疾患又は病理は、神経膠芽腫である、パラグラフ４４〜４７のいずれか１つの方法。
４９．治療抗体は、抗ＥＧＦＲ（抗上皮成長因子受容体）又は抗ＥＧＦＲｖＩＩＩである、パラグラフ４４の方法。
【０１８２】
以下の特許請求の範囲は、あくまで代表的なものであり、開示される本発明の範囲を限定しないことを意味する。少なくとも１つの態様において、本発明者らは、以下のように特許請求する。
【図１】
2020516276.tif 000053
【図２Ａ】
2020516276.tif 000054
【図２Ｂ】
2020516276.tif 000055
【図３Ａ−３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2020516276.tif 000059
【図５Ｂ】
2020516276.tif 000060
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020516276.tif 000069
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【配列表】
2020516276000001.app
【国際調査報告】
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2020516276.tif 000110
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