(57)【要約】本発明は、線維芽細胞から人工多能性幹細胞を生成するための方法に関する。本発明はまた、開示される方法によって使用される適切な培養培地；多能性幹細胞、上記多能性幹細胞の培養物、開示される方法によって単離された培養多能性幹細胞に由来する分化した細胞およびそれら細胞の使用（例えば、自家細胞療法手順のような治療的使用）に関する。本研究において、本発明者らは、ｉＰＳＣを線維芽細胞から生成するための効率的かつベクター不要の方法を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって、該方法は、
ａ）単離された線維芽細胞を提供する工程；
ｂ）線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で細胞を増殖させ、次いで、該線維芽細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む無血清培地（ＳＦＭ）中で処理し、；次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくは、コンフルエントになるまで増殖させる工程；
ｃ）１〜５サイクル、好ましくは２〜３サイクルの該細胞の凍結／融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、該細胞を増殖させる工程；
ｄ）該細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）用の増殖培地に移し、該細胞を、コロニーが形成するまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせる工程
を包含する方法。
【請求項２】
ｅ）前記形成されたｉＰＳＣの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
線維芽細胞をＩＬ−６で処理するための前記無血清培地（ＳＦＭ）は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清の最大血清含有量を有し、ここで該血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、請求項１〜２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）の処理は、２〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間の範囲で、より好ましくは１２時間〜４８時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３６時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３０時間の範囲で、さらにより好ましくは２０時間〜２８時間の範囲で、さらにより好ましくは２４時間継続する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｂ）の無血清培地は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み、そしてここで前記工程ｂ）における線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）は、１％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは１０％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、より好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充し、さらに０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、該インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−６であり、好ましくは以下の配列：
【化４】
2020521430.tif 000008
を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ，  好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌで、前記無血清培地（ＳＦＭ）中で使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｄ）における前記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記人工多能性幹細胞は、工程ａ）〜ｄ）の実行によって生成され、前記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下：ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現；そしてＣＤ２４、ならびにｐ１６およびｐ５３の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか；または該線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官。
【請求項１４】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法における使用のための、請求項１３に記載の人工多能性幹細胞またはその培養物であって、ここで該使用は、このような人工多能性幹細胞または該人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する、人工多能性幹細胞またはその培養物。
【請求項１５】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、請求項１２に記載の多能性幹細胞の使用。
【請求項１６】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置のための方法であって、該方法は、
−請求項１２に記載の多能性幹細胞を、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成し、該多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する／投与する工程
を包含する方法。
【請求項１７】
美容的方法であるかまたは医療的処置法である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法は、ベクター不要の方法である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わない、請求項１〜１１または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、インターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、および前記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない、請求項１〜１１または１８〜１９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、人工多能性幹細胞を線維芽細胞から生成するための方法に関する。本発明はまた、開示される方法によって使用される適切な培養培地；多能性幹細胞、上記多能性幹細胞の培養物、開示される方法によって単離される培養した多能性幹細胞に由来する分化した細胞およびそれら細胞の使用、例えば、自家細胞療法手順のような治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、４つの規定された因子（ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２およびｃ−ＭＹＣ）の異所性発現を通じて種々の体細胞から得られ得る。これは、無限の細胞供給源とともに再生医療のための潜在的使用を提供する。
【０００３】
外来遺伝子のゲノム組み込みを伴わないｉＰＳＣの生成は、非常に望ましい。この目的のために、Ｈｏｕらは、７種の低分子化合物の組み合わせを使用して、マウス体細胞からｉＰＳＣを生成した。ベクターベースの遺伝子移入を伴わない成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの直接トランスフェクションによって、マウスおよびヒト細胞を多能性へと再プログラムすることも可能であった。成熟ｍｉＲＮＡ（Ｍｉｙｏｓｈｉら，Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，８，６３３−６３８．）を使用して、マウスおよびヒト細胞を多能性へと再プログラムすることもまた可能であった。興味深いことに、ビタミンＣは、ｉＰＳＣの生成および質も同様に増強することが示された（Ｃｈｅｎら，Ｈ３Ｋ９  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｉＰＳＣｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１３，４５，３４−４２．；Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１２，４４，３６６−３６７．；Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，６，７１−７９．；Ｗａｎｇら，Ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ  Ｊｈｄｍ１ａ／１ｂ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｖｉｔａｍｉｎ−Ｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，９，５７５−５８７．）。
【０００４】
近年の研究において、Ｂｒａｄｙらは、ＩＬ−６に加えて、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４およびＳｏｘ２のみの異所性発現を使用して、異核共存体を再プログラムした。ＩＬ−６は、ｃ−Ｍｙｃの腫瘍形成機能を置き換え、再プログラミング効率をも増大させた（Ｂｒａｄｙら，Ｅａｒｌｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＩＬ−６  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，１５，１２４４−１２５２．）。がん細胞および間質線維芽細胞の両方から分泌されるそれらの可溶性因子の中には、インターロイキン−６（ＩＬ−６）がある。ＩＬ−６は、先天性および後天性の免疫応答の両方、造血、炎症において、ならびにがん細胞の増殖および分化の調節において、重要な役割を果たす多機能性サイトカインである（Ｋｎｕｐｆｅｒら，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ（ｒｅｖｉｅｗ）．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２００７，１０２，１２９−１３５．）。重要なことには、ＩＬ−６は、種々のがん細胞（乳がん細胞株が挙げられる）におけるシグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の活性化因子である（Ａｋｉｒａら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＡＰＲＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ｐ９１−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｐ１３０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ  １９９４，７７，６３−７１．；Ｄｅｔｈｌｅｆｓｅｎら，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＩＬ−６  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１３，１３８，６５７−６６４．；Ｇａｏら，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＳＴＡＴ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７，３８４６−３８５６．）。ＳＴＡＴ３活性化は、ＩＬ−６の自己分泌発現および間質からのＩＬ−６による傍分泌活性化の両方を通じて起こり得る（Ｌｉｅｂｌｅｉｎら，ＳＴＡＴ３  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ  ２００８，８，３０２．；Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６／ｇｐ１３０  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３，６３，２９４８−２９５６．）。ＳＴＡＴ３はまた、胚性幹細胞多能性に必須の役割を果たす（Ｒａｚら，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，９６，２８４６−２８５１．）。
【０００５】
線維芽細胞の再プログラミングは、複数工程プロセスであり、その開始は、細胞への上皮プログラムの誘導によって調整される間葉上皮転換（ＭＥＴ）を必然的に伴う（Ｌｉら，Ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，５１−６３．；Ｌｉｕら，Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｔｉｍｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ＥＭＴ−ＭＥＴ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，１５，８２９−８３８．；Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＢＭＰ−ｄｒｉｖｅｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，６４−７７．）。ＫＬＦ４は、Ｅ−カドヘリンおよび他の上皮マーカーを誘導する一方で、ＳＯＸ２およびＯＣＴ４は、ＳＮＡＩＬ１をダウンレギュレートする（Ｌｉら，Ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，５１−６３．）。
【０００６】
しかし、技術的に困難な技術、遺伝子操作、および臨床適用を制限する低収量に関する種々の問題が未だに存在する。
【０００７】
従って、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するためのさらなる方法を開発する必要がある。
【０００８】
ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣの培養物、培養したｉＰＳＣに由来する分化した細胞、組織および器官もまた、組織工学および細胞療法におけるそれらの適用可能性のために提供する必要もある。これはまた、科学者および研究者が幹細胞のよりよい理解を獲得する助けになり、自家細胞療法手順を含むよりよい治療を最終的にもたらす。
【０００９】
また、疾患のまたは損傷した組織／器官を置き換えるために、インビボ組織／器官に移植可能な細胞の供給源がさらに必要である。
【００１０】
本研究において、本発明者らは、ｉＰＳＣを線維芽細胞から生成するための効率的かつベクター不要の方法を示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｍｉｙｏｓｈｉら，Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，８，６３３−６３８．
【非特許文献２】Ｃｈｅｎら，Ｈ３Ｋ９  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｉＰＳＣｓ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１３，４５，３４−４２．
【非特許文献３】Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１２，４４，３６６−３６７．
【非特許文献４】Ｅｓｔｅｂａｎら，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，６，７１−７９．
【非特許文献５】Ｗａｎｇら，Ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ  Ｊｈｄｍ１ａ／１ｂ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｖｉｔａｍｉｎ−Ｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，９，５７５−５８７．
【非特許文献６】Ｂｒａｄｙら，Ｅａｒｌｙ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＩＬ−６  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，１５，１２４４−１２５２．
【非特許文献７】Ｋｎｕｐｆｅｒら，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ（ｒｅｖｉｅｗ）．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２００７，１０２，１２９−１３５．
【非特許文献８】Ａｋｉｒａら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ＡＰＲＦ，ａ  ｎｏｖｅｌ  ＩＦＮ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｆａｃｔｏｒ  ３  ｐ９１−ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｐ１３０−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｃｅｌｌ  １９９４，７７，６３−７１．
【非特許文献９】Ｄｅｔｈｌｅｆｓｅｎら，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＩＬ−６  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２０１３，１３８，６５７−６６４．
【非特許文献１０】Ｇａｏら，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＳＴＡＴ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７，３８４６−３８５６．
【非特許文献１１】Ｌｉｅｂｌｅｉｎら，ＳＴＡＴ３  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ  ２００８，８，３０２．
【非特許文献１２】Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇら，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６／ｇｐ１３０  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３，６３，２９４８−２９５６．
【非特許文献１３】Ｒａｚら，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，９６，２８４６−２８５１．
【非特許文献１４】Ｌｉら，Ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，５１−６３．
【非特許文献１５】Ｌｉｕら，Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｔｉｍｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ＥＭＴ−ＭＥＴ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，１５，８２９−８３８．
【非特許文献１６】Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉら，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＢＭＰ−ｄｒｉｖｅｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，６４−７７．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
一局面において、本発明は、：
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって、上記方法は、
ａ）単離された線維芽細胞を提供する工程；
ｂ）線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で細胞を増殖させ、次いで、上記線維芽細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む無血清培地（ＳＦＭ）中で処理する工程；および次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくはコンフルエントになるまで増殖させる工程；
ｃ）上記細胞を凍結／融解させる工程を１〜５サイクル、好ましくは２〜３サイクル行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、上記細胞を増殖させる工程；
ｄ）上記細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）用の増殖培地に移し、上記細胞を、さらにコロニーが形成するまで増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせる工程
を包含する方法に関する。
【００１３】
一実施形態において、本発明に従う方法は、以下の工程をさらに包含する：
ｅ）上記形成されたｉＰＳＣの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程。
【００１４】
一実施形態において、線維芽細胞をＩＬ−６で処理するための上記無血清培地（ＳＦＭ）は、最大血清含有量  ０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清を有し、ここで上記血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である。工程ｂ）の一実施形態において、ＩＬ−６でのその後の処理の前に、上記線維芽細胞は、上記線維芽細胞がおよそ７０％〜８０％コンフルエントに達するまで、線維芽細胞増殖培地中で増殖される。
【００１５】
一実施形態において、工程ｂ）の処理は、２〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間の範囲で、より好ましくは１２時間〜４８時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３６時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３０時間の範囲で、さらにより好ましくは２０時間〜２８時間の範囲で、さらにより好ましくは２４時間継続する。
【００１６】
一実施形態において、上記工程ｂ）の無血清培地（ＳＦＭ）は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（上記抗生物質−抗真菌剤溶液は、１００００ユニット（ｕｎｔｉｌｓ）／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む）、好ましくは１％の上記抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み、そして上記工程ｂ）の線維芽細胞増殖培地は、１％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは１０％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、より好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（上記抗生物質−抗真菌剤溶液は、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む）、好ましくは１％の上記抗生物質−抗真菌剤溶液をさらに補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む。
【００１７】
一実施形態において、上記インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、上記インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−６であり、好ましくは以下のアミノ酸配列を有する：
【化１】
2020521430.tif 000002
【００１８】
一実施形態において、上記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌで、無血清培地中で使用される。
【００１９】
一実施形態において、上記工程ｄ）における細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる。
【００２０】
一実施形態において、上記人工多能性幹細胞は、工程ａ）〜ｄ）の実行によって生成され、上記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現によって；およびＣＤ２４、ならびにｐ１６およびｐ５３の発現が低減されるかまたは存在しないことよって特徴付けられる。
【００２１】
一実施形態において、本発明に従う方法は、上記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する。
【００２２】
一実施形態において、上記工程ａ）における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか；
または上記線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する。
【００２３】
一実施形態において、本発明に従う人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法は、インビトロ方法である。
【００２４】
一実施形態において、上記方法は、ベクター不要の方法である。
【００２５】
一実施形態において、上記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わない。
【００２６】
一実施形態において、上記方法は、インターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、および上記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない。
【００２７】
「処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、この文脈で使用される場合、故意のかつ意図された、インターロイキン含有培地への細胞の曝露に言及することが意味され、ここでこのようなインターロイキンは、上記細胞が培養されるかまたは上記細胞が曝露される培地に具体的に添加されている。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、本発明に従う人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法によって生成される、人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に関する。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、本発明に従う人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官に関する。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法において使用するための本発明に従う人工多能性幹細胞またはその培養物に関し、ここで上記使用は、このような人工多能性幹細胞または上記人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、本発明に従う多能性幹細胞の使用に関する。
【００３２】
さらなる局面において、本発明は、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法に関し、上記方法は、
−本発明に従う多能性幹細胞を、本発明に従う方法によって生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する／投与する工程
を包含する。
【００３３】
一実施形態において、このような方法は、美容的方法であるか、または別の実施形態において、それは、医療的処置法である。
【００３４】
用語「処理（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、この文脈において本明細書で使用される場合、インターロイキン−６への上記線維芽細胞の曝露に言及する。一実施形態において、このような処理は、インターロイキン−６を、上記線維芽細胞が培養されるかまたは上記細胞が曝露される培地へと添加することによって起こる。
【００３５】
一実施形態において、上記線維芽細胞（これから上記ｉＰＳＣが生成される）は、乳房線維芽細胞、皮膚線維芽細胞、マウス線維芽細胞、特に、マウス胚性線維芽細胞から選択される。
【００３６】
「凍結／融解サイクル」とは、本明細書で使用される場合、細胞が、適切な凍結媒体中で液体窒素の中で凍結され、かつその後再度融解される手順をいう。このような適切な凍結媒体は、当業者に公知であり、広く市販されている。それらは代表的には、適切な凍結防止剤（例えば、ＤＭＳＯ、例えば、１０％  ＤＭＳＯ）の存在によって特徴付けられる。一例は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの「Ｒｅｃｏｖｅｒｙ（登録商標）」細胞培養物凍結媒体（カタログ番号１２６４８−０１０または１２６４８０１０）である。凍結後、細胞は、代表的には、＞３０℃、例えば、３７℃の温度の環境において再度融解される。これは、ウォーターバス、インキュベーター、ヒートブロックまたは他の適切なサーモスタット付きデバイスであり得る。一実施形態において、細胞は、２回の凍結／融解サイクルの間に再度増殖される；一実施形態において、このような増殖は、線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で行われる；一実施形態において、細胞は、２回の凍結／融解サイクルの間にコンフルエントになるまで増殖される。
【００３７】
一実施形態において、人工多能性幹細胞を生成するための方法は、ベクター不要の方法である。「ベクター不要の」方法とは、ベクターも他の遺伝子移入用機器も使用されない方法である。
【００３８】
一実施形態において、上記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わない。「異所性発現（ｅｃｔｏｐｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、本明細書で使用される場合、細胞または組織中での１遺伝子またはいくつかの遺伝子の発現であって、ここでこのような遺伝子が通常は発現されないものに言及するか、またはこのような遺伝子が通常は発現されない場合に、細胞周期の中のある点での、もしくは生物の発生における１またはいくつかの遺伝子の発現に言及する。
【００３９】
一実施形態において、本発明に従う方法は、インターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、上記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない。本明細書中で、ビタミンＣの文脈で使用される場合、用語「処理」とは、上記細胞へのそのままで単独の化合物としての、故意のかつ意図されたビタミンＣの添加または投与に言及する。
【００４０】
一実施形態において、ＩＬ−６での線維芽細胞の処理のための培地は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む無血清培地（ＳＦＭ）である。
【００４１】
一実施形態において、線維芽細胞を処理するために使用される無血清培地（ＳＦＭ）は、最大で、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを有する培地である。一実施形態において、ＩＬ−６で線維芽細胞を処理するための上記培地は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（上記抗生物質／抗真菌剤溶液は、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む）、好ましくは１％の上記抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むかまたはその混合物である。一実施形態において、このようなＳＦＭは、線維芽細胞をインターロイキン−６で処理するために使用され、無血清培地（ＳＦＭ）は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む。
【００４２】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の増殖培地は、当業者に公知であり、市販されている。例えば、広い範囲のこのような増殖培地は、種々の製造業者から入手可能である（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＧｉｂｃｏ）。このような培地の一例は、ＫｎｏｃｋＯｕｔ  ＤＭＥＭ  ＣＴＳ（登録商標）である。
【００４３】
一実施形態において、工程ｄ）において、ｉＰＳＣ増殖培地は、表１に列挙される組成を有する：
【表１】
2020521430.tif 000003
【００４４】
一実施形態において、上記インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、上記インターロイキン−６は、組換えヒトインターロイキン−６であり、より好ましくは以下のアミノ酸配列を有する：
【化２】
2020521430.tif 000004
【００４５】
ヒトＩＬ−６組換えタンパク質は、種々の供給元から市販されており、例えば、製品ｈＢＡ−１８４は、ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．から市販されている組換えヒトインターロイキンである。
一実施形態において、線維芽細胞を処理するために、上記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌにおいて使用される。
【００４６】
一実施形態において、工程ｄ）における上記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートまたはディッシュの中で起こる。
【００４７】
一実施形態において、ｉＰＳＣは胚様体を形成し、このように形成される胚様体は、５０〜３００ミクロンの範囲のサイズを有する。
【００４８】
一実施形態において、人工多能性幹細胞は、工程ａ）〜ｄ）の実施によって生成され、処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下のｉＰＳＣマーカー：ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１もしくはいくつか、好ましくは全ての発現の増大または過剰発現；ならびにＣＤ２４、ならびにｐ１６およびｐ５３の低い発現またはその発現がないことによって特徴付けられる。
【００４９】
一実施形態において、ｉＰＳＣは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ−２、Ｋｌｆ−４およびｃ−Ｍｙｃの発現の増大または過剰発現によって特徴付けられる。
【００５０】
一実施形態において、その方法はさらに、ピペッティングデバイスによって、好ましくは顕微鏡下で上記人工多能性幹細胞を単離する工程を包含する。例えば、それらは、光学顕微鏡下でピペッティングすることによって単離され得、次いで、同じもしくは他の適切なｉＰＳＣ培地中で再培養され得る。
【００５１】
一実施形態において、工程ａ）における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか；またはそれらは、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する。
【００５２】
さらなる局面において、本発明はまた、本発明に従う方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に関し、上記幹細胞は、神経細胞および上皮細胞のような異なる細胞タイプへと分化し得る。異なるマーカーが、これら細胞およびそれらの起源を特徴付けるために使用され得る：デスミン、α−ＳＭＡ、ビメンチン（中胚葉）；ＡＦＰ（内胚葉）；ＧＦＡＰおよびβＩＩＩ−チューブリン（外胚葉）。心筋細胞特異的培地またはニューロン特異的培地において、心筋細胞またはニューロン細胞を、それぞれ得た。これらの細胞は、心筋細胞に関してはＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５、ならびにニューロンに関してはＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂのような特異的マーカーで特徴付けられ得る。よって、ｉＰＳ細胞は、異なる細胞タイプにおいて分化され得、上記のように特徴付けられ得る。
【００５３】
本発明はまた、本発明に従う人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に由来する分化した細胞に関する。
【００５４】
本発明はまた、本発明に従う人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に由来する分化した細胞の組織もしくはその分化した細胞の器官に関する。
【００５５】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順および／または美容的手順の方法における使用のための本発明に従う人工多能性幹細胞または培養物に関する。本発明に従うｉＰＳＣは、異なる細胞タイプ、例えば、心筋細胞、ニューロン、インスリン生成β細胞などに分化され得、次いで、それぞれ、心疾患、神経変性疾患または糖尿病の結果として、細胞置換または組織置換（ｃｅｌｌｕａｒ  ｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ）において使用され得る。それらはまた、美容のために使用され得る。
【００５６】
一実施形態において、このような方法のための使用において、上記使用は、必要性のある患者へのこのような人工多能性幹細胞またはその人工多能性幹細胞に由来する分化した細胞の投与を包含する。
【００５７】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、および／または美容的手順の方法のための医薬の製造のための、本発明に従う多能性幹細胞の使用に関する。
【００５８】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、手術または美容的処置の方法に関し、上記方法は、
−本発明に従う多能性幹細胞を本発明に従う方法によって生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞をその必要性のある患者に適用／投与する工程、
を包含する。一実施形態において、分化した専門の細胞は、損傷した細胞または機能していない細胞を置き換えるためにそのｉＰＳＣを細胞特異的培地中で増殖させることによって、例えば、処置が意図されるそれぞれの器官へとそれらを注射することによって、得られ得る。
【００５９】
ｉＰＳＣの分化のための細胞特異的培地は、当業者に公知であり、また、多くの商業的製造業者（例えば、Ｃｅｌｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）などのような）から市販される。
【００６０】
一実施形態において、本発明に従う方法は、美容的方法または医療的処置法である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１ＡＢ】図１Ａは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣに由来する代表的なｉＰＳＣクローンの写真（図１Ａ）、イムノブロッティング分析（図１Ｂ）、５種の多能性マーカー（すなわち、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ）の発現（図１Ｃ）、ＤＮＡマイクロアレイ分析（図１Ｄ）および主成分分析（図１Ｅ）である。線維芽細胞（ＮＢＦ−６およびＨＳＦＮ１）を、ＩＬ−６（３５ｎｇ／ｍｌ）を含むＳＦＭ中で増殖させ、２回凍結／融解し、次いで、低付着プレートへと移し、ｉＰＳＣ培地中で増殖させた。ピックしたクローンをフィーダー細胞上で拡大し、ここでそれらは、代表的なｉＰＳＣクローンを形成し、そのクローンを、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣと称した（図１Ａ）。これらの細胞のｉＰＳＣの性質を確認するために、本発明者らはまず、いくつかの幹細胞マーカーの発現を評価したところ、胚性幹細胞２９３ＦＴのように、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣは幹細胞の特徴（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ／ＡＬＤＨｈｉｇｈ）を示すことが示された（図１Ｂ）。他方で、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）およびＳＦＭ（インターロイキン−６なし）処理したＮＢＦ−６細胞は、（ＣＤ４４ｌｏｗ／ＣＤ２４ｈｉｇｈ／ＡＬＤＨｌｏｗ）であった（図１Ｂ）。重要なことには、ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（しかし他の細胞ではそうでない）は、ＮａｎｏｇおよびＢＭＩ−１に加えて、４種のＹａｍａｎａｋａ多能性転写因子であるＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃに関して陽性であった（図１Ｂ）。図１Ｃは、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果である。ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（他の細胞ではそうでない）は、非常に低レベルのｐ１６およびｐ５３腫瘍抑制タンパク質を発現した。上記４種の多能性マーカーの発現の増大はまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで確認された。図１Ｄは、ＤＮＡマイクロアレイ分析を示し、これは、ＩＬ−６で生成されるｉＰＳＣ（ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ）とＡＴＣＣ−ｉＰＳＣまたは２９３ＦＴ胚性幹細胞との間で非常に類似のトランスクリプトームプロファイルを示す。同様に、図１Ｅは、主成分分析が、２９３ＦＴ細胞とＮＢＦ６−ＩＬ−６．ｉＰＳＣとの間で非常に類似のプロテオームプロファイルを示したが、それらの対応するコントロール細胞では示さなかったことを示す。
【図１ＣＤ】図１Ａは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣに由来する代表的なｉＰＳＣクローンの写真（図１Ａ）、イムノブロッティング分析（図１Ｂ）、５種の多能性マーカー（すなわち、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ）の発現（図１Ｃ）、ＤＮＡマイクロアレイ分析（図１Ｄ）および主成分分析（図１Ｅ）である。線維芽細胞（ＮＢＦ−６およびＨＳＦＮ１）を、ＩＬ−６（３５ｎｇ／ｍｌ）を含むＳＦＭ中で増殖させ、２回凍結／融解し、次いで、低付着プレートへと移し、ｉＰＳＣ培地中で増殖させた。ピックしたクローンをフィーダー細胞上で拡大し、ここでそれらは、代表的なｉＰＳＣクローンを形成し、そのクローンを、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣと称した（図１Ａ）。これらの細胞のｉＰＳＣの性質を確認するために、本発明者らはまず、いくつかの幹細胞マーカーの発現を評価したところ、胚性幹細胞２９３ＦＴのように、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣは幹細胞の特徴（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ／ＡＬＤＨｈｉｇｈ）を示すことが示された（図１Ｂ）。他方で、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）およびＳＦＭ（インターロイキン−６なし）処理したＮＢＦ−６細胞は、（ＣＤ４４ｌｏｗ／ＣＤ２４ｈｉｇｈ／ＡＬＤＨｌｏｗ）であった（図１Ｂ）。重要なことには、ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（しかし他の細胞ではそうでない）は、ＮａｎｏｇおよびＢＭＩ−１に加えて、４種のＹａｍａｎａｋａ多能性転写因子であるＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃに関して陽性であった（図１Ｂ）。図１Ｃは、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果である。ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（他の細胞ではそうでない）は、非常に低レベルのｐ１６およびｐ５３腫瘍抑制タンパク質を発現した。上記４種の多能性マーカーの発現の増大はまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで確認された。図１Ｄは、ＤＮＡマイクロアレイ分析を示し、これは、ＩＬ−６で生成されるｉＰＳＣ（ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ）とＡＴＣＣ−ｉＰＳＣまたは２９３ＦＴ胚性幹細胞との間で非常に類似のトランスクリプトームプロファイルを示す。同様に、図１Ｅは、主成分分析が、２９３ＦＴ細胞とＮＢＦ６−ＩＬ−６．ｉＰＳＣとの間で非常に類似のプロテオームプロファイルを示したが、それらの対応するコントロール細胞では示さなかったことを示す。
【図１Ｅ】図１Ａは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣに由来する代表的なｉＰＳＣクローンの写真（図１Ａ）、イムノブロッティング分析（図１Ｂ）、５種の多能性マーカー（すなわち、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、Ｃ−ＭＹＣおよびＮＡＮＯＧ）の発現（図１Ｃ）、ＤＮＡマイクロアレイ分析（図１Ｄ）および主成分分析（図１Ｅ）である。線維芽細胞（ＮＢＦ−６およびＨＳＦＮ１）を、ＩＬ−６（３５ｎｇ／ｍｌ）を含むＳＦＭ中で増殖させ、２回凍結／融解し、次いで、低付着プレートへと移し、ｉＰＳＣ培地中で増殖させた。ピックしたクローンをフィーダー細胞上で拡大し、ここでそれらは、代表的なｉＰＳＣクローンを形成し、そのクローンを、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣと称した（図１Ａ）。これらの細胞のｉＰＳＣの性質を確認するために、本発明者らはまず、いくつかの幹細胞マーカーの発現を評価したところ、胚性幹細胞２９３ＦＴのように、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣは幹細胞の特徴（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ／ＡＬＤＨｈｉｇｈ）を示すことが示された（図１Ｂ）。他方で、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）およびＳＦＭ（インターロイキン−６なし）処理したＮＢＦ−６細胞は、（ＣＤ４４ｌｏｗ／ＣＤ２４ｈｉｇｈ／ＡＬＤＨｌｏｗ）であった（図１Ｂ）。重要なことには、ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（しかし他の細胞ではそうでない）は、ＮａｎｏｇおよびＢＭＩ−１に加えて、４種のＹａｍａｎａｋａ多能性転写因子であるＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃに関して陽性であった（図１Ｂ）。図１Ｃは、定量ＲＴ−ＰＣＲの結果である。ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（他の細胞ではそうでない）は、非常に低レベルのｐ１６およびｐ５３腫瘍抑制タンパク質を発現した。上記４種の多能性マーカーの発現の増大はまた、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで確認された。図１Ｄは、ＤＮＡマイクロアレイ分析を示し、これは、ＩＬ−６で生成されるｉＰＳＣ（ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ）とＡＴＣＣ−ｉＰＳＣまたは２９３ＦＴ胚性幹細胞との間で非常に類似のトランスクリプトームプロファイルを示す。同様に、図１Ｅは、主成分分析が、２９３ＦＴ細胞とＮＢＦ６−ＩＬ−６．ｉＰＳＣとの間で非常に類似のプロテオームプロファイルを示したが、それらの対応するコントロール細胞では示さなかったことを示す。
【００６２】
【図２】図２Ａは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞のテロメラーゼ活性を示す。そのテロメラーゼ活性を、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧテロメラーゼＰＣＲ  ＥＬＩＳＡアッセイによって評価したところ、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞が、それらそれぞれのコントロール細胞と比較して、有意に高いテロメラーゼ活性を有することを示した（図２Ａ）。図２Ｂは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣが２ヶ月間にわたって指数関数的増殖を示したことを示す。
【００６３】
【図３ＡＢ】図３Ａは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳＣの胚様体形成およびインビトロ分化を示す。図３Ａは、異なる形状を有する細胞（例えば、ニューロンおよび上皮）の生成を示す。図３Ｂおよび３Ｃは、免疫蛍光試験のグラフであり、異なる細胞タイプ（デスミン、α−ＳＭＡ、ビメンチンに関して陽性（中胚葉）；ＡＦＰに関して陽性（内胚葉）；ＧＦＡＰおよびβＩＩＩ−チューブリンに関して陽性（外胚葉））の存在を示した。デスミンは、ＤＥＳ遺伝子によってコードされる筋特異的タイプＩＩＩ中間フィラメントタンパク質である。ＡＦＰ：α−フェトタンパク質、ＧＦＡＰ：グリア原線維酸性タンパク質は、中枢神経系の多くの細胞タイプによって発現される。ＤＡＰＩ＝４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＴＲＩＴＣ＝テトラメチルローダミン、ＭＩＸ＝両方色素を一緒に。
【図３Ｃ】図３Ａは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳＣの胚様体形成およびインビトロ分化を示す。図３Ａは、異なる形状を有する細胞（例えば、ニューロンおよび上皮）の生成を示す。図３Ｂおよび３Ｃは、免疫蛍光試験のグラフであり、異なる細胞タイプ（デスミン、α−ＳＭＡ、ビメンチンに関して陽性（中胚葉）；ＡＦＰに関して陽性（内胚葉）；ＧＦＡＰおよびβＩＩＩ−チューブリンに関して陽性（外胚葉））の存在を示した。デスミンは、ＤＥＳ遺伝子によってコードされる筋特異的タイプＩＩＩ中間フィラメントタンパク質である。ＡＦＰ：α−フェトタンパク質、ＧＦＡＰ：グリア原線維酸性タンパク質は、中枢神経系の多くの細胞タイプによって発現される。ＤＡＰＩ＝４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ＴＲＩＴＣ＝テトラメチルローダミン、ＭＩＸ＝両方色素を一緒に。
【００６４】
【図４Ａ】図４Ａは、いくつかの心筋細胞構造を有する細胞を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングを使用して、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、心筋細胞培地中で増殖させた細胞が、この細部タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５）を高レベルで発現したことを示す結果である。他方で、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、これらの細胞において低減された（図４Ｂおよび４Ｃ）。図４Ｄは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、ニューロン培地中で増殖させた細胞が、Ｂ１０４ニューロン細胞に類似のいくつかのニューロン構造を示したことを示す写真である。図４Ｅおよび４Ｆは、ニューロン特異的培地中で増殖させた分化したＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞が、この細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂ）の高レベルを発現したことを示すグラフである。いくつかのタンパク質が、ニューロン細胞Ｂ１０４およびＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣにおいて同様に発現された（図４Ｆ）。図４Ｅおよび４Ｆはまた、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルが、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、分化したＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣ細胞においてひどく低減されたことを示す。これは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳ細胞がインビトロで異なる細胞タイプへと分化され得ることを示す。
【図４ＢＣ】図４Ａは、いくつかの心筋細胞構造を有する細胞を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングを使用して、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、心筋細胞培地中で増殖させた細胞が、この細部タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５）を高レベルで発現したことを示す結果である。他方で、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、これらの細胞において低減された（図４Ｂおよび４Ｃ）。図４Ｄは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、ニューロン培地中で増殖させた細胞が、Ｂ１０４ニューロン細胞に類似のいくつかのニューロン構造を示したことを示す写真である。図４Ｅおよび４Ｆは、ニューロン特異的培地中で増殖させた分化したＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞が、この細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂ）の高レベルを発現したことを示すグラフである。いくつかのタンパク質が、ニューロン細胞Ｂ１０４およびＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣにおいて同様に発現された（図４Ｆ）。図４Ｅおよび４Ｆはまた、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルが、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、分化したＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣ細胞においてひどく低減されたことを示す。これは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳ細胞がインビトロで異なる細胞タイプへと分化され得ることを示す。
【図４Ｄ】図４Ａは、いくつかの心筋細胞構造を有する細胞を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングを使用して、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、心筋細胞培地中で増殖させた細胞が、この細部タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５）を高レベルで発現したことを示す結果である。他方で、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、これらの細胞において低減された（図４Ｂおよび４Ｃ）。図４Ｄは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、ニューロン培地中で増殖させた細胞が、Ｂ１０４ニューロン細胞に類似のいくつかのニューロン構造を示したことを示す写真である。図４Ｅおよび４Ｆは、ニューロン特異的培地中で増殖させた分化したＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞が、この細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂ）の高レベルを発現したことを示すグラフである。いくつかのタンパク質が、ニューロン細胞Ｂ１０４およびＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣにおいて同様に発現された（図４Ｆ）。図４Ｅおよび４Ｆはまた、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルが、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、分化したＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣ細胞においてひどく低減されたことを示す。これは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳ細胞がインビトロで異なる細胞タイプへと分化され得ることを示す。
【図４Ｅ】図４Ａは、いくつかの心筋細胞構造を有する細胞を示す。図４Ｂおよび４Ｃは、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングを使用して、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、心筋細胞培地中で増殖させた細胞が、この細部タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５）を高レベルで発現したことを示す結果である。他方で、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、これらの細胞において低減された（図４Ｂおよび４Ｃ）。図４Ｄは、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、ニューロン培地中で増殖させた細胞が、Ｂ１０４ニューロン細胞に類似のいくつかのニューロン構造を示したことを示す写真である。図４Ｅおよび４Ｆは、ニューロン特異的培地中で増殖させた分化したＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞が、この細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂ）の高レベルを発現したことを示すグラフである。いくつかのタンパク質が、ニューロン細胞Ｂ１０４およびＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣにおいて同様に発現された（図４Ｆ）。図４Ｅおよび４Ｆはまた、多能性マーカーであるＮａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４のレベルが、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、分化したＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣ細胞においてひどく低減されたことを示す。これは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳ細胞がインビトロで異なる細胞タイプへと分化され得ることを示す。
【００６５】
【図５】図５は、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳＣが、ヌードマウスにおいて奇形腫を形成したことを示す写真である。ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの多能性をインビボで試験するために、本発明者らは、これらの細胞をヌードマウスの背側側腹部に皮下移植した。腫瘍が、注射後８週間で形成され、その後切除し、組織学的検査に供したところ、腫瘍が種々の組織（例えば、消化管様上皮（内胚葉）、筋肉（中胚葉）および表皮（外胚葉））を含むことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
発明の詳細な説明
本発明は、人工多能性幹細胞を線維芽細胞（例えば、ヒトおよびマウスの線維芽細胞）から生成するためのベクター不要のＩＬ−６に依存した方法を成功裡に提供する。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」は、２つの特性：１．自己再生能力；２．１より多くのタイプの専門の細胞タイプに分化する能力、を有する多能性細胞である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「無血清培地」とは、血清を含まないか、または１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）に等しいかもしくはこれより低い血清濃度を有する培地である。用語「無血清」とは、本明細書で使用される場合、血清を実質的に全く含まないか、または最大で、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清を含む培地であって、ここで好ましくは、その血清は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である培地に言及することが意味される。一実施形態において、「無血清」培地は、本明細書で使用される場合、約０．２％  ウシ胎仔血清を含む。
【００６９】
一実施形態において、無血清培地（ＳＦＭ）は、血清を実質的に全く含まないか、または最大で、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≧０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清を含むという意味で「無血清」であるか、またはこのような「無血清培地」は、最大で、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）、もしくはこれ未満の血清、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）もしくはこれ未満のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したのみの培地である。一実施形態において、無血清培地（ＳＦＭ）は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≧０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、そしてさらに０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の抗生物質−抗真菌剤溶液（上記抗生物質／抗真菌剤溶液は、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む）、好ましくは１％の上記抗生物質／抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含むか、またはその混合物である。このような無血清培地（ＳＦＭ）は、インターロイキン−６をさらに含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。その無血清培地は、それらの実施形態において、インターロイキン−６を含み、ここでこのような無血清培地は、線維芽細胞の処理のために使用される。しかし、このような無血清培地は、インターロイキン−６を含まないようにもされ得、これらの場合には、このような血清培地は、コントロールとして使用される。例えば、インターロイキン−６を含まない無血清培地はまた、「ＳＦＭ」または「ＳＦＭ−」として本明細書でときおり省略される。このような無血清培地がインターロイキン−６をさらに含む場合、これはまた、「ＳＦＭ−ＩＬ６」または「単に」ＩＬ−６と本明細書でときおり省略される。
【００７０】
用語「ｘ％  血清を補充した・・・」とは、混合物または培地が最大ｘ％  血清を補充されているという筋書きに言及することが意味される。一実施形態において、このような用語はまた、その培地または混合物が、いかなる血清をも積極的にかつ故意に補充されておらず、従って、血清を実質的に含まないことを意味し得る。
【００７１】
一実施形態において、語句「・・・培地は、・・・を補充した・・・混合物を含む」とは、その培地が、「・・・を補充した・・・混合物である」ことを理解されることが意味される。
【００７２】
一実施形態において、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法は、インビトロ方法である。
本明細書で使用される場合、「幹細胞性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）」とは、幹細胞の特性を表す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語「患者」とは、ヒト、または非ヒト動物、例えば、非ヒト哺乳動物（イヌ、ネコ、ラット、サルまたは家畜動物（例えば、ウシ、ブタ、ヒツジまたはウマ）のような）を表す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、Ｅ−カドヘリンは、カドヘリンファミリーの公知のメンバーである。成体組織において、Ｅ−カドヘリンは、上皮組織において発現される。幹細胞では、Ｅ−カドヘリンのレベルは、分化した細胞と比較して低減される。
【００７５】
本明細書で使用される場合、Ｎ−カドヘリンは、ヒトでは、ＣＤＨ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｎ−カドヘリンは、複数の組織において発現される膜貫通タンパク質であり、細胞間接着を媒介するように機能する。幹細胞では、Ｎ−カドヘリンのレベルは、分化した細胞と比較して増大される。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「分化」とは、ある細胞タイプから別の細胞タイプへと細胞が変化するプロセスに言及する。成体の生物の全ての細胞タイプへと分化し得る細胞は、多能性として公知である。より具体的には、多能性幹細胞は、分化の際に、３種全ての初期（ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）胚葉の細胞を生じる。多能性幹細胞は、後に機能的細胞を生じる多能性前駆細胞（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）へとさらなる専門化（ｓｐｅｃｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）を受ける。
【００７７】
本明細書で使用される場合、インターロイキンは、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））によって発現されると最初に認められたサイトカイン（分泌タンパク質およびシグナル分子）のグループである。
【００７８】
ＩＬ−６は、先天性および後天性の両方の免疫応答、造血、炎症において、ならびにがん細胞の増殖および分化の調節において、重要な役割を果たす多機能性サイトカインである。がん細胞および間質線維芽細胞の両方から分泌される可溶性因子の中には、インターロイキン−６（ＩＬ−６）がある。
【００７９】
一実施形態において、ヒトＩＬ−６は、以下のアミノ酸配列を有する：
【化３】
2020521430.tif 000005
【００８０】
ヒトＩＬ−６組換えタンパク質（ｈＢＡ−１８４）（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」とは、身体外の天然に存在しない状態（例えば、身体から単離されているかまたは身体に由来する生物学的サンプル）での上皮細胞、幹細胞または娘幹細胞の集団のような細胞をいう。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「自家の」とは、本明細書で使用される場合、同じ被験体に由来する細胞に言及する。対照的に「異種の」とは、異なる被験体に由来する細胞に言及する。
【００８３】
本出願全体を通じて、種々の培地が言及され、使用されると記載される。例えば、培地であるＭ１９９、Ｆ１２およびＤＭＥＭは、本発明に従う方法において使用される培地の構成要素であるとして反復して言及される。Ｍ１９９は、周知の組織培養培地であり（Ｍｏｒｇａｎらによる原著の刊行物、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．７３，１（１９５０）を参照のこと）、Ｅａｒｌｅの塩、Ｌ−グルタミンおよび炭酸水素ナトリウムを含む。それは、種々の製造業者（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒなど）から市販されている。Ｆ１２培地は、周知でありかつ細胞培養で使用される別の培地であり、同様に種々の製造業者（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｌｏｎｚａなどが挙げられる）から市販されている。ＤＭＥＭは、ダルベッコ改変イーグル培地であり、同様に多くの製造業者（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈなどが挙げられる）から市販されている。Ｂ２７は、周知でありかつ種々の製造業者から市販されている培地補充物（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）である。
【００８４】
本発明の実施形態によれば、人工多能性幹細胞を生成するための方法が提供され、上記方法は、
ａ）単離された線維芽細胞を提供し、このような線維芽細胞を増殖培地中のインターロイキン−６で処理する工程
を包含する。
【００８５】
本発明者らは、このような線維芽細胞のインターロイキン−６での処理が、線維芽細胞のスイッチおよび脱分化を生じ、人工多能性幹細胞を生成させることを驚くべきことに見出した。よって、本発明はまた、人工多能性幹細胞を生成するためのインターロイキン−６の使用に関し、ここで上記使用は、線維芽細胞をインターロイキン−６で処理する工程を包含する。これは、実施するのが単純かつ容易な方法であり、多能性幹細胞の形成を生じる。一実施形態において、線維芽細胞をＩＬ−６で処理するための増殖培地は、上記で記載されるとおりの無血清培地である。一実施形態において、工程ｂ）において、細胞はまず、上記のように、線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で増殖される；好ましくは、それらは、７０％〜８０％コンフルエントに達するまで増殖される。その後、それらは、上記で定義されるように、無血清培地（これは、インターロイキン−６（ＩＬ−６）をさらに含む）に曝すことによってインターロイキン−６で処理される。一実施形態において、このような処理または曝露は、一定期間（上記でおよび下記でも定義されるとおり）にわたって、例えば、１２時間〜４８時間の範囲において起こる。処理後、そのように処理された細胞は、線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で再度、好ましくは、コンフルエントに達するまで増殖される。
【００８６】
一実施形態において、上記方法はさらに、工程：ｃ）１〜５サイクル、好ましくは２〜３サイクル、より好ましくは２サイクルの凍結／融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成されるまで細胞を増殖させる工程を包含する。
【００８７】
増殖がそのステージに一旦達すると、一実施形態において、上記方法はさらに、工程ｄ）細胞をｉＰＳＣ増殖培地に移し、それらを細胞のコロニーが形成されるまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大させて、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じる工程を包含する。一実施形態において、移して増殖させる工程ｄ）によって生成されるｉＰＳＣは、胚様体を形成し、その胚様体は、５０〜３００ミクロンの範囲のサイズを有する。
【００８８】
本発明の実施形態によれば、工程ａ）におけるインターロイキン−６での線維芽細胞の処理は、２〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間の範囲で、より好ましくは１２時間〜４８時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３６時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３０時間の範囲で、さらにより好ましくは２０時間〜２８時間の範囲で、さらにより好ましくは２４時間、継続する。
【００８９】
一実施形態において、上記方法はさらに、工程：ｅ）形成されたｉＰＳＣの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程を包含する。
【００９０】
本発明の実施形態に従って使用され得るインターロイキン−６は、その天然の環境（例えば、血液または細胞培養物）から単離されたインターロイキン−６であってもよいし、組換えインターロイキン−６であってもよい。
【００９１】
１つの好ましい実施形態において、インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、上記インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−６である。
【００９２】
本発明の実施形態によれば、上記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは、２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌで、ＳＦＭ中で使用される。
【００９３】
一実施形態において、工程ｄ）における上記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境（例えば、低付着プレート）において起こる。
【００９４】
一実施形態において、人工多能性幹細胞は、工程ａ〜ｄ）の実施によって生成され、インターロイキン−６での処理を受けなかった同じタイプの細胞（すなわち、例えば、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）および／またはＳＦＭ処理したＮＢＦ−６細胞）と比較して、ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１つまたはいくつか、好ましくは全てのアップレギュレーション、そしてＣＤ２４ならびにｐ１６およびｐ５３の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる。
【００９５】
上記で記載されるとおりの本発明は、処理された細胞のうちの１．３％までの再プログラミングを可能にし、これは、以前に報告された方法のうちのいずれよりもかなりよい。本発明に従う方法は、ベクター不要のＩＬ−６に依存した方法である。
【００９６】
一実施形態において、本発明に従う多能性幹細胞を生成するための方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わず、そして／またはインターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、上記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない。
【００９７】
さらなる局面において、本発明はまた、本発明に従う方法によって作製された人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に関する。このような幹細胞は、例えば、図３に示されるように、種々の異なる細胞タイプへと分化し得る。細胞特異的培地中で分化および増殖された場合、それらは、これらの特異的に分化した細胞（例えば、筋細胞およびニューロン細胞）の特徴を示し、例えば、図４に示されるように特徴付けられ得る。
【００９８】
さらなる局面において、このような人工多能性幹細胞はまた、再度分化され得、本発明はまた、本発明に従う人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物に由来する分化した細胞に関する。
【００９９】
本発明はまた、本発明に従って生産または生成された人工多能性幹細胞に由来する分化した細胞の組織または分化した細胞の器官に関する。
【０１００】
本発明はまた、本発明に従って生産または生成された人工多能性幹細胞の培養物に関する。
【０１０１】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順の方法において使用するための本発明に従う人工多能性幹細胞または培養物に関し、ここで上記使用は、必要性のある患者へのこのような人工多能性幹細胞またはこの人工多能性幹細胞に由来する分化した細胞の投与を包含する。
【０１０２】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順の方法のための医薬の製造のための、本発明に従う多能性幹細胞の使用に関する。
【０１０３】
本発明はまた、組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順の方法に関し、
−本発明に従う方法によって本発明に従う多能性幹細胞を生成し、上記多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を、必要性のある患者へと適用／投与する工程
を包含する。例えば、このような分化した細胞は、自家治療置換または美容的介入のために使用され得る。
【０１０４】
一実施形態において、本発明に従う組織工学の方法は、美容的方法である。別の実施形態において、本発明に従う方法は、医療的処置法であり、好ましくは、自家細胞療法である。
【０１０５】
本発明はここで、本発明を限定しないように例証するために与えられる以下の実施例を参照することによってさらに記載される。
【実施例】
【０１０６】
材料および方法
乳房（ＮＢＦ−６）および皮膚（ＨＳＦＮ１）由来の線維芽細胞を、無血清培地中で組換えヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）で２４時間処理した。無血清培地（ＳＦＭ）、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）およびＳＦＭ処理したＮＢＦ−６細胞を、コントロールとして使用した。
【０１０７】
線維芽細胞、内腔細胞および筋上皮細胞のための増殖培地：
【０１０８】
線維芽細胞
１％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ、および０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の上記で規定されるとおりの抗生物質−抗真菌剤溶液（上記で規定されるとおりの種々の抗生物質および抗真菌剤溶液の１００×混合物（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２４０−０６２から購入））、好ましくは１％の上記抗生物質／抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）。
【０１０９】
内腔細胞
１％〜１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（好ましくは２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の上記で規定されるとおりの抗生物質−抗真菌剤溶液（上記で規定されるとおりの種々の抗生物質および抗真菌剤溶液の１００×混合物（Ｇｉｂｃｏカタログ番号１５２４０−０６２から購入））（好ましくは１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ））、ＨｕＭＥＣ補充物キット（ｇｉｐｃｏカタログ番号１２７５４−０１６から購入）、およびウシ下垂体抽出物（５μｇ／ｍｌ）を補充した、ＤＭＥＭ培地およびＦ１２培地の１：１混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）
【０１１０】
筋上皮細胞
この培地の組成は、表２に記載されるとおりである：
【表２】
2020521430.tif 000006
【０１１１】
結果
ＩＬ−６は、線維芽細胞において多能性を誘導する
線維芽細胞（ＮＢＦ−６およびＨＳＦＮ１）を、ＩＬ−６（３５ｎｇ／ｍＬ）を含むかまたは含まないＳＦＭ中で増殖させ、凍結／融解を２回行い、次いで、低付着プレートへと移し、ｉＰＳＣ培地中で増殖させた。ピックしたコロニーをフィーダー細胞上で拡大させると、そのコロニーは、代表的なｉＰＳＣクローンを形成し、これらを、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣと称した（図１Ａ）。
【０１１２】
これらの細胞のｉＰＳＣの性質を確認するために、本発明者らはまず、いくつかの幹細胞マーカーの発現を評価したところ、胚性幹細胞２９３ＦＴと同様に、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣは、幹細胞の特徴を示す（ＣＤ４４ｈｉｇｈ／ＣＤ２４ｌｏｗ／ＡＬＤＨｈｉｇｈ）ことが示された（図１Ｂ）。
【０１１３】
他方で、乳房間質線維芽細胞（ＮＢＦ８２）、内腔細胞（ＬＵＭ１６）、筋上皮細胞（ＭＹＯ）およびＳＦＭ処理ＮＢＦ−６細胞は、（ＣＤ４４ｌｏｗ／ＣＤ２４ｈｉｇｈ／ＡＬＤＨｌｏｗ）であった（図１Ｂ）。重要なことには、ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（しかし他の細胞ではそうでない）は、ＮａｎｏｇおよびＢＭＩ−１に加えて、４種のＹａｍａｎａｋａ多能性転写因子であるＯｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２およびｃ−Ｍｙｃに関して陽性であった（図１Ｂ）。他方で、ＩＬ６−ｉＰＳＣおよび２９３ＦＴ細胞（しかし他の細胞ではそうでない）は、非常に低レベルのｐ１６およびｐ５３腫瘍抑制タンパク質を発現した。その４種の多能性マーカーの発現の増大はまた、定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によってｍＲＮＡレベルで確認された（図１Ｃ）。
【０１１４】
ＲＮＡ精製およびｑＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、ＴＲＩ試薬（Ｓｉｇｍａ）を使用して、製造業者の説明書に従って精製し、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を使用するｃＤＮＡ合成の前に、ＲＮａｓｅ不含有ＤＮａｓｅで処理した。定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）のために、ＲＴ２  Ｒｅａｌ−ＴｉｍｅＴＭ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、増幅を、ライトサイクラー４８０（Ｒｏｃｈｅ，ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して行った。融解曲線データを集めて、ＰＣＲ特異性をチェックし、ＰＣＲ生成物の量を、サイクル閾値（Ｃｔ）値によって測定し、次いで、各サンプルに関するＧＡＰＤＨに対する特異的遺伝子の相対比を計算した。
【０１１５】
ＤＮＡマイクロアレイ分析によって、ＩＬ−６により生成されたｉＰＳＣ（ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ）とＡＴＣＣ−ｉＰＳＣまたは２９３ＦＴ胚性幹細胞との間で非常に類似のトランスクリプトームプロファイルが示された（図１Ｄ）。同様に、主成分分析によって、２９３ＦＴ細胞とＮＢＦ６−ＩＬ−６．ｉＰＳＣとの間で非常に類似のプロテオームプロファイルが示されたが、それらの対応するコントロール細胞では示されなかった（図１Ｅ）。
【０１１６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘエキソンアレイ実験
ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）  Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  １．０  ＳＴ  Ａｒｒａｙｓ（ＨＥ  １．０  ＳＴＡｓ）は、１エキソンあたりおよそ４個のプローブおよび１遺伝子あたりおよそ４０個のプローブを使用して、１００万個のエキソンクラスターにわたってインターロゲートする（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）、１４０万個のプローブセットへとグループ分けされた約５４０万の５μｍの特徴（プローブ）を含む。この高密度エキソンアプローチは、遺伝子およびエキソンレベルの発現分析を可能にし、エキソンスキッピング、イントロン保持、選択的スプライシング、および選択的プロモーター使用（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｕｓａｇｅ）に起因する最も複雑なトランスクリプトーム変化の検出を容易にする。遺伝子レベルでの発現変化を試験できるようにするために、本発明者らは、ＨＥ  １．０  ＳＴＡｓを本発明者らの研究において使用した。まず、全ＲＮＡを、標準プロトコルを使用して抽出した。全ＲＮＡの量および質を、それぞれ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ＵＶ−分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することによって決定した。全てのＨＥ  １．０  ＳＴＡ関連手順を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルおよびガイドラインに従って、全転写物センス標的標識アッセイを使用して行った。簡潔には、全ＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって提供されるＰｏｌｙ−Ａ  ＲＮＡコントロールでスパイクインし、ｒＲＮＡ低減を、ＲｉｂｏＭｉｎｕｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）を使用して行った。第１のサイクル、第１および第２のｃＤＮＡ合成、ならびにインビトロ転写を、抽出した全ＲＮＡに対して行った。次いで、新たに合成したｃＲＮＡを精製し、第２のサイクルの第１鎖ｃＤＮＡ合成に使用し、これに続いて、ｃＲＮＡ加水分解およびセンス鎖ＤＮＡクリーンアップを行った。フラグメント化、末端標識、および一晩のハイブリダイゼーションを、アッセイマニュアルに記載される標準のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルに従って行った。ＨＥ  １．０  ＳＴＡｓを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ’ｓ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０の中で洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．）でスキャンした。Ｅｘｏｎ  Ａｒｒａｙ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｔｏｏｌ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．）を使用して、質評価および初期分析を行った。
【０１１７】
網羅的遺伝子発現比較
網羅的遺伝子発現パターンを、ＩＬ−６で生成したｉＰＳＣ（ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ）とＡＴＣＣ−ｉＰＳＣとの間で比較した。連続データ間の相関を、ピアソンの相関係数（ｒ）によって予測し、関連ｐ値を、その相関を変換してｔ検定を与えることによって計算した。全ての統計分析を、ＭＡＴＬＡＢソフトウェアパッケージ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰＡＲＴＥＫ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ（Ｐａｒｔｅｋ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、およびＳＡＳ  ９．４（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，Ｃａｒｙ，ＮＣ，ＵＳＡ）で行った。＜０．０５のｐ値を、有意と見做した。
【０１１８】
標識不要のタンパク質溶液中消化のためのサンプル調製
全細胞溶解物サンプルを、プロテオーム分析に供した。各サンプルに関して、合計１００μｇのタンパク質を、以前に記載されるように溶液中トリプシン消化に供した。簡潔には、タンパク質を、０．１％  ＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ中、８０℃において１５分間変性させ、１０ｍＭ  ジチオスレイトール（ＤＴＴ）中、６０℃において３０分間還元し、１０ｍＭ  ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）（１．０μＬ  ＩＡＡ／１０μＬ）中で、遮光して４０分間、室温においてアルキル化した。ＬＣ／ＭＳ分析の前に、サンプルを、一晩３７℃においてトリプシン消化し、水性０．１％  ギ酸で希釈した。
【０１１９】
ＬＣ−ＭＳＥ  ＳｙｎａｐｔＧ２プラットフォームによるタンパク質同定
Ｓｙｎａｐｔ  Ｇ２（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）での標識不要の定量一次元Ｎａｎｏ  Ａｃｑｕｉｔｙ液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を使用して、サンプル群間の発現タンパク質プロファイルを生成した。その機器の検出器を、２ｎｇ／μＬ  ロイシンエンケファリンを使用して設定した。５００ｆｍｏｌ［Ｇｌｕ］１−フィブリノペプチドＢの別個の注入を、Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘ  ＩｎｔｅｌｌｉＳｔａｒｔ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で質量（ｍ／ｚ）較正のために使用した。全ての分析を、Ｔｒｉａｚａｉｃ  Ｎａｎｏ  ｓｏｕｒｃｅ、およびポジティブイオンモビリティーモードｎａｎｏＥＳＩ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）でのイオン化で行った。データ非依存性獲得（ＭＳＥ）／イオンモビリティー分離を行い、Ｍａｓｓ  Ｌｙｎｘプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ．４．１，ＳＣＮ８３３，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を使用して、ｍ／ｚ  ５０〜２０００Ｄａの範囲にわたってデータを獲得した。全サンプルを、三連の実行で分析し、自動化データ処理およびデータベース検索を、タンパク質同定プラットフォーム用のＰｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ（Ｗａｔｅｒｓ，ＵＫ  ａｎｄ  Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ，ＵＫ）上でＵｎｉｐｒｏｔヒト特異的タンパク質配列データベースを使用して行った。
【０１２０】
ＩＬ−６で生成したヒトｉＰＳＣは、高テロメラーゼ活性および指数関数的増殖を示す
次に、テロメラーゼ活性を、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡアッセイによって評価したところ、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣおよびＨＦＳＮ１−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞は、それらそれぞれのコントロール細胞と比較して、有意に高いテロメラーゼ活性を有することが示された（図２Ａ）。さらに、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣは、２ヶ月間にわたって指数関数的増殖を示した（図２Ｂ）。
【０１２１】
テロメラーゼ活性アッセイ
テロメラーゼ活性アッセイを、ＴｅｌｏＴＡＧＧＧ  Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造業者によって指示されるとおりに行った。簡潔には、２０μｇの熱処理または偽処理した細胞抽出物を、ＰＣＲ（９４℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、および７２℃で９０秒間）によって増幅した。このＰＣＲ生成物を、抗ジゴキシゲニン−ペルオキシダーゼにハイブリダイズさせ、次いで、ＥＬＩＳＡ反応を行い、標準のＥＬＩＳＡプレートリーダー（ｘ−Ｍａｒｋ，  ＢＩＯ−ＲＡＤ）で４５０ｎｍにおいてＯＤを測定した。８５℃で１０分間の加熱は、テロメラーゼ活性を破壊する目的にかない、陰性コントロールとして使用される。
【０１２２】
ＩＬ−６で生成したｉＰＳＣの胚様体形成およびインビトロ分化
ＩＬ−６で生成したｉＰＳＣをさらに特徴付けるために、本発明者らは、それらの分化能力をインビトロで調査した。この目的のために、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣ細胞を、胚様体が形成されるまで懸濁培養し（図３Ａ）、次いで、インビトロ分化のためにゼラチン被覆プレートに移した。図５Ａは、異なる形状を有する細胞（例えば、ニューロンおよび上皮）の生成を示す。次に、本発明者らは、これらの細胞を免疫蛍光によって特徴付け、デスミン、α−ＳＭＡ、ビメンチンに関して陽性（中胚葉）；ＡＦＰに関して陽性（内胚葉）；ＧＦＡＰおよびβＩＩＩ−チューブリンに関して陽性（外胚葉）の異なる細胞タイプの存在を示した（図３Ｂ）。
【０１２３】
胚様体分化
ＩＰＳ細胞を、ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｒａｓｅ（細胞解離試薬（ｇｉｐｃｏ）で処理することによって採取し、ｉＰＳＣ培地の存在下で５日間、低付着６ウェルプレートに移した。次いで、新たに形成された胚様体を、ゼラチン被覆プレートに移し、同じ培地中で８〜１０日間培養した。異なる形状を有するこの生成された細胞を、顕微鏡下でモニターした。
【０１２４】
ニューロンへの分化のために、胚様体を、ゼラチン被覆プレートへと、表３に示されるとおりのニューロン特異的培地の存在下で移した。
【表３】
2020521430.tif 000007
【０１２５】
心筋細胞へのｉＰＳＣ分化に関して、胚様体を、ゼラチン被覆プレートに移し、ＰＳＣ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｇｉｂｃｏカタログ番号Ａ２９２１２−０１）に従って、製造業者の指示に従って培養した。心筋細胞様の形状を有する細胞が、インキュベーションの５日後に出現した。
【０１２６】
図４Ａは、いくつかの心筋細胞構造を有する細胞を示す。ｑＲＴ−ＰＣＲおよびイムノブロッティングを使用して、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、心筋細胞培地中で増殖させた細胞が、高レベルのこの細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＹＨＣＢ、ＭＹＬ２Ａ、ＴｎＴｃおよびＮＫＸ２．５）を発現することが示された（図４Ｂおよび４Ｃ）。他方で、これらの細胞において、多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して低減された（図４Ｂおよび４Ｃ）。同様に、ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの分化に由来し、ニューロン培地中で増殖させた細胞は、Ｂ１０４ニューロン細胞に類似のいくつかのニューロン構造を示し（図４Ｄ）、高レベルのこの細胞タイプのいくつかのマーカー（例えば、ＡＡＤＣ、ＤＡＴ、ＭＡＰ−２、Ｃｈａｔ、ＧＦＡＰおよびＬＭＸ１Ｂ）もまた発現した（図４Ｅおよび４Ｆ）。いくつかのタンパク質は、ニューロン細胞Ｂ１０４およびＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣにおいて同様に発現された（図４Ｆ）。他方で、多能性マーカー（Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２およびＯｃｔ４）のレベルは、元の細胞または２９３ＦＴと比較して、ＮＢＦ６−ＩＬ−６−ｉＰＳＣ細胞においてひどく低減した（図４Ｆおよび４Ｆ）。これは、ＩＬ−６で生成されたｉＰＳ細胞が、インビトロで異なる細胞タイプへと分化され得ることを示す。
【０１２７】
ＩＬ−６で生成したｉＰＳＣからのテラトーマ形成
ＮＢＦ６−ＩＬ６−ｉＰＳＣの多能性をインビボで試験するために、本発明者らは、ヌードマウスの背側腹側部にこれらの細胞を皮下移植した。腫瘍を注射後８週間で形成させ、次いで切除し、組織学的検査に供したところ、腫瘍が種々の組織（例えば、消化管様上皮（内胚葉）、筋肉（中胚葉）および表皮（外胚葉））を含むことが示された（図５）。
【０１２８】
ｉＰＳ細胞を、細胞解離試薬（ｇｉｐｃｏ）によって解離し、遠心分離し、そのペレットを、ｉＰＳＣ増殖培地中で再懸濁した。２５００００個の細胞を、ヌードマウスの背側側腹部に皮下注射した。注射後８週間で、腫瘍を切除し、パラフィン包埋した組織をスライスし、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで、組織学的検査に供した。
【０１２９】
結論
まとめると、これらの結果は、２回の凍結／融解サイクルに付随するＩＬ−６処理が、線維芽細胞を多能性幹細胞へと脱分化させ得ることを示す。
【０１３０】
明細書、特許請求の範囲、および／または添付の図面において開示される本発明の特徴は、別個におよびこれらの任意の組み合わせの両方において、本発明をその種々の形態で実現するための資料であり得る。好ましい実施形態のさらなる改変は、特許請求の範囲によってのみ規定される発明の範囲から離れなければ可能である。
【０１３１】
参考文献
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Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１２，４４，３６６−３６７．
Ｅｓｔｅｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，６，７１−７９．
Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥＧＦＲ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ＳＴＡＴ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｖｉａ  ＩＬ−６  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００７，１１７，３８４６−３８５６．
Ｋｎｕｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ（ｒｅｖｉｅｗ）．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ２００７，１０２，１２９−１３５．
Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ａｎｄ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，５１−６３．
Ｌｉｅｂｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＴＡＴ３  ｃａｎ  ｂｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ  ２００８，８，３０２．
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｔｉｍｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ＥＭＴ−ＭＥＴ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２０１３，１５，８２９−８３８．
Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｍａｔｕｒｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，８，６３３−６３８．
Ｒａｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９９，９６，２８４６−２８５１．
Ｓａｍａｖａｒｃｈｉ−Ｔｅｈｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＢＭＰ−ｄｒｉｖｅｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ−ｔｏ−ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１０，７，６４−７７．
Ｓｒｉｕｒａｎｐｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＴＡＴ３  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｕｔｏｃｒｉｎｅ／ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ６／ｇｐ１３０  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００３，６３，２９４８−２９５６．
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅｓ  Ｊｈｄｍ１ａ／１ｂ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｖｉｔａｍｉｎ−Ｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ２０１１，９，５７５−５８７．
【図１ＡＢ】
2020521430.tif 000009
【図１ＣＤ】
2020521430.tif 000010
【図１Ｅ】
2020521430.tif 000011
【図２】
2020521430.tif 000012
【図３ＡＢ】
2020521430.tif 000013
【図３Ｃ】
2020521430.tif 000014
【図４Ａ】
2020521430.tif 000015
【図４ＢＣ】
2020521430.tif 000016
【図４Ｄ】
2020521430.tif 000017
【図４Ｅ】
2020521430.tif 000018
【図５】
2020521430.tif 000019
【配列表】
2020521430000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月13日(2020.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって、該方法は、
ａ）単離された線維芽細胞を提供する工程；
ｂ）線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で細胞を増殖させ、次いで、該線維芽細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む無血清培地（ＳＦＭ）中で処理し、；次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくは、コンフルエントになるまで増殖させる工程；
ｃ）１〜５サイクル、好ましくは２〜３サイクルの該細胞の凍結／融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、該細胞を増殖させる工程；
ｄ）該細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）用の増殖培地に移し、該細胞を、コロニーが形成するまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせる工程
を包含する方法。
【請求項２】
ｅ）前記形成されたｉＰＳＣの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
線維芽細胞をＩＬ−６で処理するための前記無血清培地（ＳＦＭ）は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清の最大血清含有量を有し、ここで該血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ｂ）の処理は、２〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間の範囲で、より好ましくは１２時間〜４８時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３６時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３０時間の範囲で、さらにより好ましくは２０時間〜２８時間の範囲で、さらにより好ましくは２４時間継続する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記工程ｂ）の無血清培地は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み、そしてここで前記工程ｂ）における線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）は、１％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは１０％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、より好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充し、さらに０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、該インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−６であり、好ましくは以下の配列：
【化４】
2020521430.tif 000020
を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ，
好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌで、前記無血清培地（ＳＦＭ）中で使用される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｄ）における前記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記人工多能性幹細胞は、工程ａ）〜ｄ）の実行によって生成され、前記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下：ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現；そしてＣＤ２４、ならびにｐ１６およびｐ５３の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記工程ａ）における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか；または該線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官。
【請求項１４】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法における使用のための、請求項１３に記載の人工多能性幹細胞またはその培養物を含む組成物であって、ここで該方法は、このような人工多能性幹細胞または該人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する、組成物。
【請求項１５】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、請求項１２に記載の多能性幹細胞の使用。
【請求項１６】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置のための方法において使用するための、請求項１２に記載の多能性幹細胞から分化した細胞を含む組成物であって、該方法は、
−請求項１２に記載の多能性幹細胞を、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成し、該多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する／投与する工程
を包含する、組成物。
【請求項１７】
前記方法が、美容的方法であるかまたは医療的処置法である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記方法は、ベクター不要の方法である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わない、請求項１〜１１または１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、インターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、および前記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない、請求項１〜１１または１８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法において使用するための、請求項１２に記載の多能性幹細胞を含む組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
一実施形態において、本発明に従う方法は、美容的方法または医療的処置法である。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生成するための方法であって、該方法は、
ａ）単離された線維芽細胞を提供する工程；
ｂ）線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）中で細胞を増殖させ、次いで、該線維芽細胞を、インターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む無血清培地（ＳＦＭ）中で処理し、；次いで、そのようにして処理された線維芽細胞を、線維芽細胞増殖培地中で再度、好ましくは、コンフルエントになるまで増殖させる工程；
ｃ）１〜５サイクル、好ましくは２〜３サイクルの該細胞の凍結／融解を行い、次いで、細胞浮遊凝集物が形成するまで、該細胞を増殖させる工程；
ｄ）該細胞を人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）用の増殖培地に移し、該細胞を、コロニーが形成するまでさらに増殖させ、このようなコロニーをフィーダー細胞上でさらに拡大して、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を生じさせる工程
を包含する方法。
（項目２）
ｅ）前記形成されたｉＰＳＣの分子および細胞の特徴を特徴付ける工程
をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（項目３）
線維芽細胞をＩＬ−６で処理するための前記無血清培地（ＳＦＭ）は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清の最大血清含有量を有し、ここで該血清は、より好ましくは、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）である、項目１〜２のいずれかに記載の方法。
（項目４）
前記工程ｂ）の処理は、２〜１００時間、好ましくは１２時間〜７２時間の範囲で、より好ましくは１２時間〜４８時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３６時間の範囲で、さらにより好ましくは１２時間〜３０時間の範囲で、さらにより好ましくは２０時間〜２８時間の範囲で、さらにより好ましくは２４時間継続する、項目１〜３のいずれかに記載の方法。
（項目５）
前記工程ｂ）の無血清培地は、０％〜１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは≦０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、好ましくは約０．２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳを補充し、０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含み、そしてここで前記工程ｂ）における線維芽細胞増殖培地（ＦＧＭ）は、１％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは１０％〜２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、好ましくは２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）血清、より好ましくはウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充し、さらに０．１％〜２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の、１００００ユニット／ｍｌ  ペニシリン、１００００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンおよび２５μｇ／ｍｌ  アンホテリシンＢを含む抗生物質−抗真菌剤溶液、好ましくは１％の該抗生物質−抗真菌剤溶液を補充した、Ｍ１９９培地およびＦ１２培地の１：１−混合物（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む、項目１〜４のいずれかに記載の方法。
（項目６）
前記インターロイキン−６は、ヒトインターロイキン−６であり、ここで好ましくは、該インターロイキンは、組換えヒトインターロイキン−６であり、好ましくは以下の配列：
【化４】
2020521430.tif 000021
を有する、項目１〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記インターロイキン−６は、工程ｂ）において、１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ，
好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌの範囲の濃度で、さらにより好ましくは約３５ｎｇ／ｍｌで、前記無血清培地（ＳＦＭ）中で使用される、項目１〜６のいずれかに記載の方法。
（項目８）
前記工程ｄ）における前記細胞の増殖は、懸濁細胞培養に都合の良い環境、例えば、低付着プレートにおいて起こる、項目１〜７のいずれかに記載の方法。
（項目９）
前記人工多能性幹細胞は、工程ａ）〜ｄ）の実行によって生成され、前記処理を受けなかった同じタイプの細胞、すなわち、線維芽細胞と比較して、以下：ＣＤ４４、ＡＬＤＨ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、ＢＭＩ−１のうちの１もしくはいくつか、好ましくは全てのより高い発現；そしてＣＤ２４、ならびにｐ１６およびｐ５３の発現が低減しているかまたは存在しないことによって特徴付けられる、項目１〜８のいずれかに記載の方法。
（項目１０）
前記人工多能性幹細胞を、好ましくはピペッティングデバイス（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）によって、好ましくは顕微鏡下で単離する工程をさらに包含する、項目１〜９のいずれかに記載の方法。
（項目１１）
前記工程ａ）における線維芽細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましくは霊長類に由来し、より好ましくはヒトに由来するか；または該線維芽細胞は、齧歯類細胞であり、より好ましくはマウスに由来する、項目１〜１０のいずれかに記載の方法。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成される人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞の培養物。
（項目１３）
項目１２に記載の人工多能性幹細胞もしくはその培養物に由来する分化した細胞、またはこのような分化した細胞の組織もしくは器官。
（項目１４）
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、外科的手順、美容的手順の方法における使用のための、項目１３に記載の人工多能性幹細胞またはその培養物であって、ここで該使用は、このような人工多能性幹細胞または該人工多能性幹細胞から分化した細胞の、必要性のある患者への投与を包含する、人工多能性幹細胞またはその培養物。
（項目１５）
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置の方法のための医薬の製造のための、項目１２に記載の多能性幹細胞の使用。
（項目１６）
組織工学、移植、組織再構築、細胞療法手順、特に、自家細胞療法手順、手術または美容的処置のための方法であって、該方法は、
−項目１２に記載の多能性幹細胞を、項目１〜１１のいずれかに記載の方法によって生成し、該多能性幹細胞を所望の細胞タイプへと分化させる工程、
−このような分化した細胞を必要性のある患者に適用する／投与する工程
を包含する方法。
（項目１７）
美容的方法であるかまたは医療的処置法である、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記方法は、ベクター不要の方法である、項目１〜１１のいずれかに記載の方法。
（項目１９）
前記方法は、遺伝子の異所性発現、例えば、ＫＬＦ４、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２および／またはｃ−ＭＹＣの異所性発現を伴わない、項目１〜１１または１８のいずれかに記載の方法。
（項目２０）
前記方法は、インターロイキン−６以外のいかなるインターロイキンでの細胞の処理も、ビタミンＣでのいかなる処理も、および前記細胞へのｍｉｃｒｏＲＮＡのいかなるトランスフェクションも伴わない、項目１〜１１または１８〜１９のいずれかに記載の方法。
【国際調査報告】
2020521430.tif 000022
2020521430.tif 000023
2020521430.tif 000024