(57)【要約】リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳をモジュレートするための方法および組成物が提供される。いくつかの側面において、本開示は、細胞を、有効量の、ｅＩＦ２リン酸化のインヒビターまたはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のインヒビターに接触させることによる、ＲＡＮタンパク質翻訳を阻害する方法を提供する。いくつかの態様において、本開示によって記述される方法は、ある神経変性疾患などのＲＡＮタンパク質翻訳と関連する疾患を処置するために有用である。
2020516674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を阻害する方法であって、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を、有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤またはプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）モジュレート剤に接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
ＲＡＮタンパク質が、ポリ−アラニン、ポリ−ロイシン、ポリ−セリン、ポリ−システイン、ポリ−グルタミン、ポリ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ、ポリ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、またはポリ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、ポリ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＡＮタンパク質が、少なくとも３５のポリ−アミノ酸リピートを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＲＡＮタンパク質が、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜内皮ジストロフィー（例として、CTG181）と関連する遺伝子によってコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、ｅＩＦ２αのリン酸化を阻害するか、ｅＩＦ２Ａの発現もしくは活性を阻害するか、または、ｅＩＦ２αのリン酸化およびｅＩＦ２Ａの発現もしくは活性を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ｅｉＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）発現もしくは活性を阻害する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、タンパク質、核酸、または小分子である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、式（Ｉ）
【化１】
2020516674.tif 000021
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：
Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および、
Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
Ｒ１が、水素である、請求項８に記載された化合物。
【請求項１０】
Ｒ１が、非置換のＣ１〜６アルキルである、請求項８に記載された化合物。
【請求項１１】
Ｒ２が、非置換のＣ１〜６アルキルである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項１２】
Ｒ２が、非置換のｎ−ブチルである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２が、非置換のメチルである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ２が、置換されたＣ１〜６アルキルである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項１５】
Ｒ２が、式：
【化２】
2020516674.tif 000022
で表される、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ１およびＲ２が、両方とも、非置換のメチルである、請求項８〜１３のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項１７】
化合物が、式：
【化３】
2020516674.tif 000023
（メトホルミン）、
【化４】
2020516674.tif 000024
（ブホルミン）、
【化５】
2020516674.tif 000025
（フェンホルミン）、
で表されるものであるか、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグである、請求項８に記載された化合物。
【請求項１８】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、阻害性核酸である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
阻害性核酸が、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡおよび人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ−ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または核酸アプタマー、任意に、ＲＮＡアプタマーである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、タンパク質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
タンパク質が、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のドミナントネガティブバリアントである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ドミナントネガティブバリアントが、アミノ酸位置２９６での突然変異を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
突然変異が、K296Rである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｅｉＦ２モジュレート剤が、ベクターによって細胞へ送達される、請求項１〜７および１８〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ベクターが、ウイルスベクター、任意に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞が、対象の中に位置する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
細胞が、対象の脳中、任意に、脳の白質中に位置する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患のための追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
追加の治療剤が、抗体、任意に、ＲＡＮリピート伸長へ特異的に結合する抗体、またはリピート伸長に対してＣ末端であるＲＡＮタンパク質の固有の領域へ特異的に結合する抗体、あるいは、さらなる阻害性核酸である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法であって、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現している対象へ、有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤を投与することを含む、前記方法。
【請求項３３】
対象が、哺乳動物であり、任意に、対象はヒトである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＲＡＮタンパク質が、ポリ−アラニン、ポリ−ロイシン、ポリ−セリン、ポリ−システイン、ポリ−グルタミン、ポリ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ、ポリ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、またはポリ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、ポリ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＡＮタンパク質が、少なくとも３５のポリ−アミノ酸リピートを含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患が、 ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜内皮ジストロフィー（例として、CTG181）である、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、タンパク質、核酸、または小分子である、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、阻害性核酸である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
阻害性核酸が、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡおよび人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ−ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
阻害性核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または核酸アプタマー、任意に、ＲＮＡアプタマーである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、タンパク質である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質が、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のドミナントネガティブバリアントである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ドミナントネガティブバリアントが、アミノ酸位置２９６での突然変異を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
突然変異が、K296Rである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｅｉＦ２モジュレート剤が、ベクターによって細胞へ送達される、請求項３２〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
ベクターが、ウイルスベクター、任意に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ｒＡＡＶが、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、式（Ｉ）
【化６】
2020516674.tif 000026
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：
Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および
Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
Ｒ１が、水素である、請求項４８に記載された化合物。
【請求項５０】
Ｒ１が、非置換のＣ１〜６アルキルである、請求項４８に記載された化合物。
【請求項５１】
Ｒ２が、非置換のＣ１〜６アルキルである、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項５２】
Ｒ２が、非置換のｎ−ブチルである、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｒ２が、非置換のメチルである、請求項５１に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｒ２が、置換されたＣ１〜６アルキルである、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項５５】
Ｒ２が、式：
【化７】
2020516674.tif 000027
で表される、請求項５４に記載の化合物。
【請求項５６】
Ｒ１およびＲ２が、両方とも、非置換のメチルである、請求項４８〜５３のいずれか一項に記載された化合物。
【請求項５７】
化合物が、式：
【化８】
2020516674.tif 000028
（メトホルミン）、
【化９】
2020516674.tif 000029
（ブホルミン）、
【化１０】
2020516674.tif 000030
（フェンホルミン）、
で表されるものであるか、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグである、請求項４８に記載の化合物。
【請求項５８】
リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患のための追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項３２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
追加の治療剤が、抗体、任意に、ＲＡＮリピート伸長へ特異的に結合する抗体、またはリピート伸長に対してＣ末端であるＲＡＮタンパク質の固有の領域へ特異的に結合する抗体、あるいは、さらなる阻害性核酸である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、対象へ全身投与され、任意に、これが静脈注射などの注射による、請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤が、対象のＣＮＳへ投与され、任意に、これが脳室内（ＩＣＶ）注射などの注射による、請求項３２〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
（ｉ）カプシドタンパク質；および
（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結されたｅＩＦ２モジュレート剤をコードする導入遺伝子を含む核酸
を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）。
【請求項６３】
カプシドタンパク質が、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントである、請求項６２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６４】
ｅＩＦ２モジュレート剤が、タンパク質または阻害性核酸である、請求項６２または６３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６５】
導入遺伝子が、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のドミナントネガティブバリアントをコードする、請求項６２〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
ドミナントネガティブバリアントが、アミノ酸位置２９６での突然変異を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
突然変異が、K296Rである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
核酸が、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、任意に、ＡＡＶ２  ＩＴＲを、さらに含む、請求項６２〜６７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６９】
注射による送達のために製剤化されている、請求項６２〜６８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７０】
請求項６２〜６９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１７年４月１７日に出願された米国仮特許出願番号６２／４８６，４２４および２０１７年９月２６日に出願された米国仮特許出願番号６２／５６３，５８８の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、その各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
この発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＮＳ０９８８１９、ＮＳ０４０３８９、およびＮＳ０５８９０１の下、政府の支援によりなされた。政府は発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
リピート関連非ＡＴＧリピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳の最初の発見以来、ますます多くの疾患関連リピートが、ＲＡＮ翻訳を経ることが見出されている。RANタンパク質毒性は、トランスフェクトされた細胞およびモデル系において示されており、疾病病因へのＲＡＮ翻訳の関連性を暗示するものの、ＲＡＮ翻訳のメカニズムへの理解は、ＲＡＮ翻訳の最初の発見以来進歩していない。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本開示の側面は、細胞（例として、対象の細胞）中におけるリピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）タンパク質翻訳を低減または阻害するための方法および組成物に関する。いくつかの側面において、本開示は、真核生物開始因子２−アルファ（ｅＩＦ２α）リン酸化（例として、ｅＩＦ２α−Ｐの活性）および／または代替的な真核生物開始因子２Ａ（ｅＩＦ２Ａ）の発現もしくは活性を阻害することが、ＲＡＮタンパク質翻訳を阻害する、という認識に関する。いくつかの側面において、本開示は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）発現または活性を阻害することがＲＡＮタンパク質翻訳を阻害するという認識に関する。
【０００４】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を阻害する方法を提供し、方法は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を、有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤に接触させることを含む。いくつかの側面において、本開示は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を阻害する方法を提供し、方法は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を、有効量のプロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）モジュレート剤に接触させることを含む。
【０００５】
いくつかの側面において、本開示は、ｅＩＦ２αの阻害および／またはｅＩＦ２αの発現もしくは活性の阻害、またはＰＫＲの阻害（例として、ＰＫＲ経路の阻害）が、対象の、ある組織（例として、脳組織）におけるＲＡＮタンパク質翻訳および蓄積を減少させるという認識に関する。よって、いくつかの側面において、本開示は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法を提供し、方法は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現している対象へ、有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤（例として、ＰＫＲインヒビター）を投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、ヒトなどの哺乳動物である。
【０００６】
いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ポリ−アラニン、ポリ−ロイシン、ポリ−セリン、ポリ−システイン、ポリ−グルタミン、ポリ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ、ポリ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ａｌａ、またはポリ−Ｐｒｏ−Ａｌａ、ポリ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏである。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、少なくとも３５のポリ−アミノ酸リピートを含む。
いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜内皮ジストロフィー（例として、CTG181）と関連する遺伝子によってコードされる。
【０００７】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、ｅＩＦ２αのリン酸化を阻害するか、ｅＩＦ２Ａの発現もしくは活性を阻害するか、または、ｅＩＦ２αのリン酸化およびｅＩＦ２Ａの発現もしくは活性を阻害する。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）発現または活性を阻害する。
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、タンパク質、核酸、または小分子である。
【０００８】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、阻害性核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、および人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉ−ＲＮＡ）からなる群から選択される干渉ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）または核酸アプタマー、任意に、ＲＮＡアプタマーである。
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、タンパク質である。いくつかの態様において、タンパク質は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）のドミナントネガティブバリアントである。いくつかの態様において、ドミナントネガティブバリアントは、アミノ酸位置２９６での突然変異、例えばK296R突然変異を含む。
【０００９】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲインヒビターは、小分子である。いくつかの態様において、小分子は、式（Ｉ）
【化１】
2020516674.tif 000003
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および、Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。
【００１０】
いくつかの態様において、Ｒ１は、水素である。いくつかの態様において、Ｒ１は、非置換のＣ１〜６アルキルである。
いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のＣ１〜６アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のｎ−ブチルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のメチルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、置換されたＣ１〜６アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、式：
【化２】
2020516674.tif 000004
で表される。
【００１１】
いくつかの態様において、Ｒ１およびＲ２は、両方とも、非置換のメチルである。
いくつかの態様において、式（Ｉ）で表される化合物は、式：
【化３】
2020516674.tif 000005
（メトホルミン）、
【化４】
2020516674.tif 000006
（ブホルミン）、
【化５】
2020516674.tif 000007
（フェンホルミン）、
で表されるものであるか、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグである。
【００１２】
いくつかの態様において、ｅｉＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤（例として、ＰＫＲインヒビター）は、ベクターによって細胞へ送達される。いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクター、任意に、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントを含む。
いくつかの態様において、細胞は、対象の中に位置する。いくつかの態様において、細胞は、対象の脳中、任意に、脳の白質中に位置する。
【００１３】
幾つかの態様において、本開示によって記述される方法は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患のための追加の治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、追加の治療剤は、抗体、任意に、ＲＡＮリピート伸長へ特異的に結合する抗体、またはリピート伸長に対してＣ末端であるＲＡＮタンパク質の固有の領域へ特異的に結合する抗体、あるいは、さらなる阻害性核酸である。
【００１４】
幾つかの態様において本開示によって記述される方法では、ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤（例として、ＰＫＲインヒビター）は、対象へ全身投与され、これは任意に、静脈内注射などの注射による。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤（例として、ＰＫＲインヒビター）は、対象のＣＮＳへ投与され、これは任意に、脳室内（ＩＣＶ）注射などの注射による。
【００１５】
いくつかの側面において、本開示は、（ｉ）カプシドタンパク質；および（ｉｉ）プロモーターに作動可能に連結されたｅＩＦ２モジュレート剤をコードする導入遺伝子を含む核酸を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはそのバリアントである。いくつかの態様において、核酸は、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、任意に、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、注射による送達のために製剤化されている。いくつかの側面において、本開示は、本開示によって記述されるとおりのｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００１６】
いくつかの側面において、本開示は、対象におけるリピート伸長と関連する神経学的疾患を処置するおよび／または予防するための方法を提供し、方法は、治療有効量の、式（Ｉ）
【化６】
2020516674.tif 000008
で表される、ここで：Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；およびＲ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である、化合物、または、その薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグを、対象へ投与することを含む。
【００１７】
いくつかの態様において、Ｒ１は、水素である。いくつかの態様において、Ｒ１は、非置換のＣ１〜６アルキルである。
いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のＣ１〜６アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のｎ−ブチルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、非置換のメチルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、置換されたＣ１〜６アルキルである。いくつかの態様において、Ｒ２は、式：
【化７】
2020516674.tif 000009
【００１８】
いくつかの態様において、Ｒ１およびＲ２は、両方とも、非置換のメチルである。
いくつかの態様において、式（Ｉ）で表される化合物は、式：
【化８】
2020516674.tif 000010
（メトホルミン）、
【化９】
2020516674.tif 000011
（ブホルミン）、
【化１０】
2020516674.tif 000012
（フェンホルミン）、
で表されるものであるか、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグである。
【００１９】
いくつかの側面において、本開示は、対象、組織、または細胞における、リピート関連非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮ）の蓄積を低減させる方法に関し、方法は、有効量のメトホルミンまたはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグ、またはその医薬組成物を、対象へ投与するか、または、生体試料（例として、組織または細胞）と接触させることを含む。いくつかの態様において、メトホルミンの誘導体は、式（Ｉ）
【化１１】
2020516674.tif 000013
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および、Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。いくつかの態様において、メトホルミンの誘導体は、ブホルミンまたはフェンホルミンである。
【００２０】
本開示の別の側面は、本明細書に記載のとおりの、メトホルミン、薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体もしくはプロドラッグまたはその医薬組成物、を有する容器を含む、キットに関する。本明細書に記載のキットは、化合物または医薬組成物の単回用量またはまたは複数回用量を包含してもよい。キットは、本開示の方法において有用であり得る。ある態様において、キットは、化合物または組成物を使用するための指示を、さらに包含する。本明細書に記載のキットは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制機関によって要求されているとおりの情報（例として、処方情報）をもまた包含してもよい。
これらおよびその他の本願の側面は、本明細書においてより詳細に記載され、以下の非限定的な図面によって例示される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ−１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）がｅＩＦ２ａ−Ｐ経路を通じてＣＡＧ、ＣＣＴＧ、Ｇ４Ｃ２伸長のＲＡＮ翻訳を調節することを示す。図１Ａは、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳へのＰＫＲの影響を試験するのに使用したＣＡＧ、ＣＣＴＧおよびＧＧＧＣＣリピート伸長コンストラクトの図を示す。コンストラクトは、６×ストップコドンカセット、２つのストップを各リーディングフレーム中に、リピート伸長およびＣ末端エピトープタグの上流に有する。図１Ｂは、野生型（PKR-WT）、ＰＫＲのドミナントネガティブK296R突然変異形態（PKR-K296R）またはＣ末端のみのドメイン（ＰＫＲ−ＣＴ）を発現するＰＫＲベクターの図を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、PKR-WTがＣＡＧ伸長コンストラクトからのポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質を増加させ；ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず；ドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルを減少させるということを示唆する、トランスフェクトされたHEK293T細胞の代表的な免疫ブロットを示す。ｅＩＦ２α−Ｐのパネルは、ＰＫＲがｅＩＦ２α−Ｐのレベルを増加させること、PKR-CTは影響を有さないこと、および、PKR-K296RはｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルを減少させることを示す。
【００２２】
【図１Ｄ−１Ｅ】図１Ｄは、PKR-WTがＣＣＴＧ伸長コンストラクトからのポリＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質を増加させ；PKR-CTはＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず；ドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルを減少させるということを示唆する、トランスフェクトされたHEK293T細胞の代表的な免疫ブロットを示す。ｅＩＦ２α−Ｐのパネルは、ＰＫＲがｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルを増加させ；PKR-CTはｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルへの影響を有さず；PKR K296RはｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルを減少させるということを示唆する。図１Ｅは、ポリＧＰ  ＲＡＮタンパク質レベルを、PKR-WTは増加させ、PKR-CTはこれに影響を有さず、および突然変異体K296R PKRは減少させることを示す、ランスフェクトされたHEK293T細胞の代表的な免疫ブロットを示す。ｅＩＦ２α−Ｐのパネルは、ｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルを、ＰＫＲは増加させ、PKR-CTはこれに影響を有さず、およびPKR-K296Rは減少させることを示す。
【００２３】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｃは、ｅＩＦ２α−ＰがHEK293T細胞においてＲＡＮタンパク質レベルを増加させることを示す。図２Ａは、WTまたは突然変異型ｅＩＦ２αおよびＣＡＧ伸長タンパク質（CAGexp）を発現するプラスミドで共トランスフェクトされたHEK293T細胞の代表的なタンパク質ブロットを示し、これはリン酸化模倣型eIF2α-S51D突然変異を過剰発現する細胞において、eIF2α-WTまたはリン酸化可能でないeIF2α-S51Aと比較して、増加したポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＣＡＧ、ＣＴＧおよびＣＣＴＧリピート伸長からそれぞれ発現するポリＡｌａ、ポリＡｌａおよびＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質が、ｅＩＦ２α−Ｐのレベルを低減させるＰＫＲインヒビターの存在下において減少することを示した代表的なタンパク質ブロットを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ｅＩＦ２α−Ｐの下流効果を阻害するＩＳＩＲＢの存在下におけるポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベル減少を示した代表的なタンパク質ブロットを示す。
【００２４】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、C9-500 BACトランスジェニックマウスにおいて、ＰＫＲ経路の阻害が、ＲＡＮタンパク質集合体を減少させ、および行動的表現型を改善することを示す。図３Ａは、５００  Ｇ４Ｃ２リピートを含有するC9orf72 ＡＬＳ／ＦＴＤのBACトランスジェニックマウスモデル（C9-500 BAC）へのＡＡＶ注射のために使用したAAV2/9コンストラクトの概略図を示す。
【図３Ｂ−３Ｃ】図３Ｂは、C9-500 BACマウスからの脳梁膨大後部皮質の切片におけるＧＡ  ＲＡＮタンパク質の、代表的な免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色、およびＧＡ  ＲＡＮタンパク質集合体の定量を示す。図３Ｃは、ドミナントネガティブPKR(K296R)で処置されたC9-500 BAC動物は、EGFP対照動物と比較して、不安様行動を表す表現型である低減されたセンタータイムを示す、ということを示唆するオープンフィールド分析を示す。
【００２５】
【図４】図４は、代替的なｅＩＦ２Ａ開始因子がＲＡＮ翻訳を増加させることを示す。ｅＩＦ２Ａは、特定条件下でｅＩＦ２αの代替物として使用されることができる代替的な真核生物翻訳開始因子である。ＲＡＮタンパク質を発現させるのに使用したコンストラクトは、６×ストップコドン（各リーディングフレームにおける２つの上流のストップコドン）、リピート伸長変異（ＣＣＴＧ、ＣＡＧＧまたはＧＧＧＣＣ）、および各リーディングフレーム中のエピトープタグを伴う３’三重タグ、を伴って示される。これらのリピート伸長コンストラクトとの共トランスフェクションは、ｅＩＦ２Ａの過剰発現との組み合わせで、ＲＡＮタンパク質レベルを増加させ、ｅＩＦ２Ａが、伸長変異を引き起こす様々な疾患にわたるＲＡＮに対して代替的な真核生物開始因子として働くことを実証する。
【図５】図５は、グローバルな翻訳を下方制御し、増加したＲＡＮタンパク質レベルに至らせる、ｅＩＦ２αリン酸化を示した概略図を示す。
【００２６】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜６Ｇは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）が、ＰＫＲ経路を活性化させることによりＣＡＧ、ＣＣＴＧ、ＣＡＧＧ、Ｇ４Ｃ２伸長のＲＡＮ翻訳を調節するということを示唆するデータを示す。図６Ａは、HEK293Tトランスフェクションのために使用したリピート伸長コンストラクトを示す。コンストラクトは、６×ストップコドンカセット、２つのストップを各リーディングフレーム中に、リピート伸長およびＣ末端エピトープタグの上流に有する。図６Ｂは、ヘアピン形成伸長リピートＲＮＡによるＰＫＲの活性化を示す。タンパク質ブロットは、ＣＡＧ、ＣＣＵＧ、ＣＡＧＧおよびＧＧＧＧＣＣリピート伸長の発現が、ＰＫＲ活性化にとって重大であることが知られている部位（T446およびT451）でのＰＫＲのリン酸化を誘導するということを示す。
【図６Ｃ−６Ｄ】図６Ｃは、野生型（PKR-WT）、ＰＫＲのドミナントネガティブK296R突然変異形態（PKR-K296R）または不活性のＣ末端ドメイン（PKT-CT）を発現するＰＫＲベクターの図を示す。図６Ｄは、PKR-WTがＣＡＧ伸長コンストラクトからのポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質を増加させ、ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルを減少させることを示す、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。
【００２７】
【図６Ｅ】図６Ｅは、PKR-WTがＣＣＴＧ伸長コンストラクトからのポリＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質を増加させ、ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルを減少させることを示す、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、PKR-WTがＣＡＧＧ伸長コンストラクトからのポリＱＡＧＲ  ＲＡＮタンパク質を増加させ、ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＱＡＧＲ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＱＡＧＲ  ＲＡＮレベルを減少させることを示す、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは、PKR-WTがＧＧＧＧＣＣ伸長コンストラクトからのポリＧＰ  ＲＡＮタンパク質を増加させ、ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＧＰ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＧＰ  ＲＡＮレベルを減少させることを示す、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。
【００２８】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、ＰＫＲ活性化が３つのリーディングフレームにおいてＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質を減少させるが、ＡＴＧ開始のポリグルタミンタンパク質のレベルには影響しないことを示す。図７Ａは、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。ＡＴＧ開始ポリＧｌｎタンパク質のレベルは、PKR-WT、PKR-CTまたはPKR K296Rの過剰発現に影響されない。
【図７Ｂ】図７Ｂは、PKR-WTの過剰発現がＣＣＴＧ伸長コンストラクトからのポリＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質を増加させ、PKR-CTは影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体PKR K296Rは３つ全てのリーディングフレームにおいてポリＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルを減少させるということを示唆する、トランスフェクトされたHEK293T細胞の免疫ブロットを示す。
【００２９】
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、ＰＫＲ／ｅＩＦ２ａ経路によって調節されたＲＡＮタンパク質レベルを示す。図８Ａは、WTまたは突然変異型ｅＩＦ２αおよびＣＡＧexpを発現するプラスミドで共トランスフェクトされたHEK293T細胞のタンパク質ブロットを示し、これはリン酸化模倣型eIF2α-S51D突然変異を過剰発現する細胞において、eIF2α-WTまたはリン酸化可能でないeIF2α-S51Aと比較して、増加したポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを示す。
【図８Ｂ−８Ｃ】図８Ｂは、ＰＫＲインヒビターであるトランス活性化応答エレメントＲＮＡ結合タンパク質（ＴＡＲＢＰ２）が、ＣＡＧおよびＣＵＧ伸長ＲＮＡから発現したＲＡＮポリＡｌａおよびＣＣＵＧリピートから発現したポリＬＰＡＣのレベルを減少させることを示した、タンパク質ブロットを示す。加えて、ＴＡＲＢＰ２は、ｐ−ｅＩＦ２αのレベルを低減させる。図８Ｃは、PKR-WT過剰発現とともに上昇し、およびｐ−ｅＩＦ２αの下流効果を阻害する統合的ストレス応答インヒビター（ＩＳＲＩＢ）でも処置されたときにはまた減少する、ポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを示したタンパク質ブロットを示す。
【図９−１】図９は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＫＲのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトを示す。ＣＡＧ、ＣＣＴＧ、およびＣＡＧＧ伸長コンストラクトの一過性トランスフェクションは、ポリＡｌａ、ポリＬＰＡＣ、およびポリＱＡＧＲタンパク質の低減を示す。
【図９−２】図９は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＰＫＲのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ノックアウトを示す。ＣＡＧ、ＣＣＴＧ、およびＣＡＧＧ伸長コンストラクトの一過性トランスフェクションは、ポリＡｌａ、ポリＬＰＡＣ、およびポリＱＡＧＲタンパク質の低減を示す。
【００３０】
【図１０Ａ−１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｄは、C9-500 BACトランスジェニックマウスにおいて、ＰＫＲ経路の阻害が、ＲＡＮタンパク質集合体を減少させ、および行動的表現型を改善することを示す。図１０Ａは、５００  Ｇ４Ｃ２リピートを含有するBACトランスジェニックC9orf72 ＡＬＳ／ＦＴＤマウス（C9-500 BAC）への脳室内（ＩＣＶ）注射のために使用したEGFP対照およびPKR-K296R AAV2/9コンストラクトの概略図を示す。ＩＣＶ注射を、EGFPまたはPKR(K296R)のドミナントネガティブ形態のいずれかを発現するAAV2/9ウイルスを用いたＰ０での注射にて実施し、動物を、月齢３か月で分析のためにサクリファイスした。図１０Ｂは、脳溶解物のメソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイを示し、これは、PKR-K296Rで処置されたマウスがより低い可溶性ＧＰ  ＲＡＮタンパク質のレベルを有することを示す。図１０Ｃは、C9-500 BACマウスからの脳梁膨大後部皮質の切片におけるＧＡ  ＲＡＮタンパク質集合体の代表的な免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色（褐色）を、PKR-K296Rで処置されたマウスにおいて対照と比較してＧＡ  ＲＡＮタンパク質集合体が低減されることを示した定量化とともに示す。分析は、盲検式にて行った。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、PKR-K296Rで処置されたC9-500 BACマウスは、EGFP対照動物と比較して、不安様行動を表す表現型である低減されたセンタータイムを示す、ということを示したオープンフィールド分析を示す。
【００３１】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｊは、メトホルミンがＰＫＲを阻害し、およびＲＡＮタンパク質を低減させ、およびC9-BACマウスにおける疾患を和らげることを示す。図１１Ａは、メトホルミンが、ＣＡＧ、ＣＣＴＧ、ＣＡＧＧおよびＧ４Ｃ２伸長コンストラクトで一過的にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるＲＡＮタンパク質発現を低減させる、ということを示唆するタンパク質ブロットを示す。図１１Ｂは、メトホルミンが、リピート伸長コンストラクトでトランスフェクトされた細胞におけるｐ−ＰＫＲのレベル（T446およびT451）を低減させる、ということを示唆するデータを示す。
【図１１Ｃ−１１Ｅ】図１１Ｃは、月齢２〜５か月、または月齢６〜９か月で、５ｍＭメトホルミンでの処置がなされる、２つのメトホルミン処置群についての研究デザインを示した概略図である。図１１Ｄは、ＧＡ集合体を定量したデータを示し、および、２〜５か月から飲み水の中の５ｍＭメトホルミンで処置されたマウスにおける、未処置のC9-500マウスと比較したＧＡ集合体の低減を示唆する。図１１Ｅは、C9-500のメトホルミンで処置されたマウスにおいて、C9-500対照動物と比較して反応性神経膠症のレベルが減少したことを示唆する、ＧＦＡＰ染色の定量化を示す。
【００３２】
【図１１Ｆ−１１Ｇ】図１１Ｆは、未処置のC9-500とNT対照との間で異なっていた８つのパラメータについて、メトホルミンで処置されたC9-500動物では、これらのパラメータのうち６つが改善したということを示唆するDigiGait分析を示す。これらの８つのパラメータのうちの４つからの例のデータが示される。図１１Ｇは、C9-500動物における減少したセンタータイムが、メトホルミンで処置されたC9-500動物において正常化されることを示した、オープンフィールド分析を示す。
【図１１Ｈ−１１Ｉ】図１１Ｈは、メトホルミンで処置されたC9-500動物ではC9-500対照と比較して可溶性ＧＰレベルが低減されることを示唆する、ＭＳＤアッセイからのデータを示す。図１１Ｉは、メトホルミンで処置されたC9-500動物ではC9-500対照と比較してＧＡ集合体が低減されることを示す。
【図１１Ｊ】図１１Ｊリピート伸長ＲＮＡによるＰＫＡ経路の慢性的活性化が統合的ストレス応答およびｅＩＦ２αリン酸化を通じてＲＡＮ翻訳を優先するのを示した概略である。
【００３３】
【図１２】図１２は、メトホルミンおよび関連薬物フェンホルミンおよびブホルミンが、ＰＫＲを阻害し、および、ＧＰ  ＲＡＮタンパク質レベルを用量依存的な方式で低減させることを示す。上のパネル：メトホルミン、フェンホルミンおよびブホルミンが、Ｇ４Ｃ２伸長コンストラクトで一過的にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるＲＡＮ  ＧＰタンパク質レベルを用量依存的な方式で低減させることを示すタンパク質ブロット。下のパネル：メトホルミン、フェンホルミンおよびブホルミンは、Ｇ４Ｃ２リピート伸長コンストラクトでトランスフェクトされた細胞におけるｐ−ＰＫＲのレベル（T446およびT451）を低減させる。
【００３４】
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｂは、メトホルミンが、ＣＡＧ、ＣＣＴＧまたはＧＧＧＧＣＣリピート伸長モチーフを含有するコンストラクトでトランスフェクトされた細胞において、マルチリーディングフレームにてＲＡＮ翻訳を阻害することを示す。図１３Ａに示された様々なリピート伸長コンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞からのタンパク質溶解物に対して、タンパク質ブロットを実行した。
【図１３Ｂ】図１３Ｂにおいて、ＫＭＱとラベル付けされたレーンは、ＣＡＧリピート伸長のすぐ５’側に、かつ、ポリＧｌｎリーディングフレーム内に位置した、メチオニンをコードするＡＴＧを有する。ＫＫＱベクターは、ＡＵＧ開始コドンなしのＣＡＧ伸長を含有し、以下を指し示す：Ｓｅｒ−Flag、Ａｌａ−ＨＡ、Ｇｌｎ−Ｍｙｃ。これらのコンストラクトは、ＡＴＧ開始のポリＧｌｎおよび非ＡＴＧ開始のＲＡＮタンパク質（ポリ−Ｇｌｎ、ポリ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓおよびポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の、これらのリピート伸長にわたって発現する、Ｃ末端領域に組み込まれるエピトープタグを含有する。ＣＣＴＧとラベル付けされたレーンは、以下のＲＡＮタンパク質を発現する：ＬＰＡＣ−Flag、ＬＰＡＣ−ＨＡ、ＬＰＡＣ−Ｍｙｃ。Ｇ４Ｃ２とラベル付けされたレーンは、以下のＲＡＮタンパク質を検出するように設計されている：ＧＰ−Flag、ＧＲ−ＨＡ、ＧＡ−Ｍｙｃ。トランスフェクトされたHEK293T細胞のメトホルミンでの処置は、３つ全てのリーディングフレームにおいて、ポリ−ＬＰＡＣ（ポリ−ロイシン−プロリン−アラニン−システイン）の以下のＲＡＮタンパク質、ポリ−Ａｌａ、およびポリ−ＧＰ（ポリグリシン−プロリン）の、低減されたＲＡＮタンパク質レベルを示す。
【００３５】
【図１４】図１４は、メトホルミンが、in vivoでC9ORF72の発現により産生されるＲＡＮタンパク質のレベルを低減させるということを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
詳細な説明
真核生物において、リボソーム、開始因子（ｅＩＦｓ）および具体的な翻訳開始および伸長（elongation）のステップを包含するタンパク質翻訳の機構は、よく保存されている。真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）は、真核生物タンパク質翻訳の開始フェーズに関与する多タンパク質複合体である。一般的に、ヒトにおいて、ｅＩＦ２は３つの非同一のサブユニット（例として、ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２β、およびｅＩＦ２γ）を含む。典型的には、ｅＩＦ２αは、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）およびイニシエーターメチオニル・イニシエータートランスファーＲＮＡと三重複合体を形成して、翻訳の開始に関与する。
【００３７】
ＲＡＮタンパク質翻訳
本願の側面は、リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）タンパク質の発現を低減させるための方法および組成物に関する。「ＲＡＮタンパク質（リピート関連非ＡＴＧ翻訳タンパク質）」は、ＡＵＧ開始コドンの非存在下でのヌクレオチド伸長を保有する双方向で転写されたセンスまたはアンチセンスＲＮＡ配列から翻訳されたポリペプチドである。一般的に、ＲＡＮタンパク質は、ポリアミノ酸リピートと呼ばれる、単一のアミノ酸、ジアミノ酸、トリアミノ酸、または四アミノ酸（例として、テトラアミノ酸）の伸長リピートを含む。例えば、「ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ」(ポリ−アラニン）（配列番号３）、「ＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬＬ」（ポリ−ロイシン）（配列番号４）、「ＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳＳ」（ポリ−セリン）（配列番号５）、または「ＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ」（ポリ−システイン）（配列番号６）は、それぞれ長さ２０アミノ酸残基のポリアミノ酸リピートである。
【００３８】
ジアミノ酸ＲＡＮタンパク質の例は、ＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰＧＰ（ポリ−ＧＰ）（配列番号７）、ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡ（ポリ−ＧＡ）（配列番号８）、ＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲＧＲ（ポリ−ＧＲ）（配列番号９）、ＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡＰＡ（ポリ−ＰＡ）（配列番号１０）、およびＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲＰＲ（ポリ−ＰＲ）（配列番号１１）を包含する。テトラアミノ酸リピートの例は、ＬＰＡＣＬＰＡＣＬＰＡＣ（例として、ポリ−ＬＰＡＣ）（配列番号１２）およびＱＡＧＲＱＡＧＲＱＡＧＲ（例として、ポリ−ＱＡＧＲ）（配列番号１３）を包含する。ＲＡＮタンパク質は、長さが少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、または少なくとも２００アミノ酸残基のポリアミノ酸リピートを有する可能性がある。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質は、長さが２００アミノ酸残基を超える ポリアミノ酸リピートを有する。
【００３９】
一般的に、ＲＡＮタンパク質は、ＤＮＡの異常なリピート伸長（例として、ＣＡＧリピート）から翻訳される。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ＲＡＮタンパク質蓄積（例として、細胞の核または細胞質中の）は、細胞機能を破壊し、および細胞毒性を誘導する。いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質の翻訳および蓄積は、疾患または障害、例えば、神経変性疾患または障害と関連する。ＲＡＮタンパク質翻訳および蓄積と関連する障害および疾患の例は、これらに限定されないが、脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、脆弱Ｘ振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、およびC9ORF72筋萎縮性側索硬化症／前頭側頭型認知症（ＡＬＳ／ＦＴＤ）を包含する。したがって、本願において記載される方法および組成物は、いくつかの態様においては、１つ以上のＲＡＮタンパク質関連疾患または状態の処置を、これを必要とする対象において行うために有用である。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物対象である。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。
【００４０】
ｅＩＦ２α−Ｐ、ｅＩＦ２Ａ、およびＰＫＲの阻害
本開示の側面は、ｅＩＦ２αリン酸化（例として、ｅＩＦ２α−Ｐ）の阻害が細胞中におけるＲＡＮタンパク質の翻訳および蓄積を低減させるという認識に関する。いくつかの側面において、本開示は、代替的な哺乳動物ｅＩＦ（例として、ｅＩＦ２Ａ）が、伸長変異を引き起こす様々な疾患にわたるＲＡＮに対して代替的な真核生物開始因子として働くことができるという認識に基づく。いくつかの側面において、本開示は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の阻害が、細胞中におけるＲＡＮタンパク質翻訳および蓄積を低減させるという認識に基づく。
【００４１】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳を阻害するための方法を提供し、方法は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現する細胞を、有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤に接触させることを含む。
本明細書で使用される「ｅＩＦ２のモジュレーター」は、直接的にまたは間接的に、ｅＩＦ２タンパク質複合体またはｅＩＦ２複合体サブユニット（例として、ｅＩＦ２α、ｅＩＦ２β、ｅＩＦ２γ等々）の発現レベルまたは活性に影響する剤を指す。モジュレーターは、ｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットのアクチベーター（例として、ｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットの発現または活性を増加させる）か、またはｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットのインヒビター（例として、ｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットの発現または活性を減少させる）とすることができる。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレーターは、細胞または対象におけるｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットの発現および／または活性を、ｅＩＦ２モジュレーターを投与されていない細胞または対象に対して相対的に、増加させるかまたは減少させる。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレーターは、タンパク質、核酸、または小分子である。
【００４２】
一般的に、直接的モジュレーターは、ｅＩＦ２（もしくはｅＩＦ２サブユニット）をコードする遺伝子、またはｅＩＦ２タンパク質複合体、またはｅＩＦ２サブユニットと、相互作用すること（例として、これと相互作用すること、またはこれと結合すること）によって機能する。一般的に、間接的モジュレーターは、ｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットの発現または活性を調節する遺伝子またはタンパク質と相互作用することによって機能する（例として、ｅＩＦ２もしくはｅＩＦ２サブユニットをコードする遺伝子またはタンパク質と直接的には相互作用しない）。
【００４３】
いくつかの側面において、本開示は、ｅＩＦ２αのリン酸化（例として、Ser 51でのｅＩＦ２αのリン酸化）を阻害することが、ＲＡＮタンパク質翻訳（例として、細胞中におけるＲＡＮタンパク質翻訳）を低減させる、という認識に関する。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、ｅＩＦ２αをリン酸化するあるセリンキナーゼ（例として、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）等々）のインヒビターは、いくつかの態様において、細胞（例として、対象の細胞）におけるＲＡＮタンパク質翻訳および／またはＲＡＮタンパク質蓄積を阻害するために有用である。よって、いくつかの態様において、ｅＩＦ２のモジュレーターは、セリン／スレオニンキナーゼのインヒビターである。セリン／スレオニンキナーゼの例は、これらに限定されないが、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、Ｍｏｓ／Ｒａｆキナーゼ、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴキナーゼ）等々を包含する。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）インヒビターである。
【００４４】
本明細書で使用される「ＰＫＲのモジュレーター」は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の発現レベルまたは活性に直接的にまたは間接的に影響を及ぼす剤を指す。モジュレーターは、ＰＫＲのアクチベーター（例として、ＰＫＲの発現または活性を増加させる）またはＰＫＲのインヒビター（例として、ＰＫＲの発現または活性を減少させる）であり得る。いくつかの態様において、ＰＫＲモジュレーターは、細胞または対照におけるＰＫＲの発現および／または活性を、ＰＫＲモジュレーターを投与されていない細胞または対象に対して相対的に、増加させるかまたは減少させる。いくつかの態様において、ＰＫＲインヒビターは、タンパク質、核酸、または小分子である。
一般的に、直接的モジュレーターは、ＰＫＲと相互作用すること（例として、これと相互作用すること、またはこれと結合すること）によって機能する。一般的に、間接的モジュレーターは、ＰＫＲの発現または活性を調節する遺伝子またはタンパク質と相互作用することによって機能する（例として、ＰＫＲをコードする遺伝子またはタンパク質と直接的には相互作用しない）。
【００４５】
本開示は、一部分において、ｅＩＦαのリン酸化を阻害するようにドミナントネガティブな方式で機能するあるプロテインキナーゼ（ＰＫＲ）のバリアントに関し、ゆえに、細胞中におけるＲＡＮタンパク質翻訳を低減させるために有用である。本明細書で使用される「プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）バリアント」は、野生型プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）（例として、GenBank Accession No. NP_002750.1）と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質を指し、ここで、バリアントタンパク質は、野生型ＰＫＲのアミノ酸配列に対して相対的に少なくとも１つのアミノ酸変異（時に「突然変異」とも称される）を含む。
【００４６】
いくつかの態様において、ＰＫＲバリアントのアミノ酸配列は、野生型ＰＫＲのアミノ酸配列と少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％同一である。いくつかの態様において、アミノ酸配列は、野生型ＰＫＲのアミノ酸配列と約９５〜９９．９％同一である。いくつかの態様において、タンパク質は、野生型ＰＫＲのアミノ酸配列に規定されたアミノ酸の配列と比較すると、少なくとも１つの、少なくとも２つの、少なくとも３つの、少なくとも４つの、少なくとも５つの、少なくとも６つの、少なくとも７つの、少なくとも８つの、少なくとも９つの、少なくとも１０の、少なくとも１１の、少なくとも１２の、少なくとも１３の、少なくとも１４の、または少なくとも１５の異なるアミノ酸配列変異を含む。いくつかの態様において、ＰＫＲバリアントは、位置２９６での突然変異（例として、ヒト野生型ＰＫＲの位置２９６）を含む。いくつかの態様において、位置２９６での突然変異は、K296Rである。
【００４７】
本開示は、一部分において、ある条件下でｅＩＦ２ＡがＲＡＮ翻訳のための代替的な翻訳開始因子として機能するという認識に関する。よって、いくつかの態様において、ｅＩＦ２のモジュレーターは、ｅＩＦ２Ａのインヒビターである。
いくつかの態様において、ｅＩＦ２またはＰＫＲのモジュレーターは、選択的モジュレーターである。「選択的モジュレーター」は、１つのタイプのｅＩＦ２サブユニットの活性または発現を、他のタイプのｅＩＦ２サブユニットと比べて、優先的にモジュレートするか、またはＰＫＲの活性または発現を、他のキナーゼと比較して優先的にモジュレートする、ｅＩＦ２またはＰＫＲのモジュレーターを指す。いくつかの態様において、ｅＩＦ２のモジュレーターは、ｅＩＦ２αの選択的モジュレーターである。いくつかの態様において、ｅＩＦ２のモジュレーターは、ｅＩＦ２Ａの選択的モジュレーターである。いくつかの態様において、ｅＩＦ２のモジュレーターは、選択的ＰＫＲインヒビターなどの、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）の選択的モジュレーターである。
【００４８】
ｅｉＦ２（例として、ｅＩＦ２サブユニット）を阻害するタンパク質の例は、これらに限定されないが、ポリクローナル抗ｅＩＦ２抗体、モノクローナル抗ｅＩＦ２抗体等々を包含する。ｅｉＦ２（例として、ｅＩＦ２サブユニット）を阻害する核酸分子の例は、これらに限定されないが、ｅＩＦ２サブユニットをコードする遺伝子（例として、GenBank受託番号NM_004094.4に規定されたｍＲＮＡをコードする遺伝子）を標的とするｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等々を包含する。ｅＩＦ２の小分子インヒビターの例は、これらに限定されないが、LY 364947、ｅＩＦ−２αインヒビターＩＩ Sal003等々を包含する。
【００４９】
ＰＫＲを阻害するタンパク質の例は、これらに限定されないが、あるドミナントネガティブＰＫＲバリアント（例として、K296R PKR突然変異）、ＴＡＲＢＰ２等々を包含する。ＰＫＲを阻害する核酸分子の例は、これらに限定されないが、ＰＫＲをコードする遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等々を包含する。ＰＫＲの小分子インヒビターの例は、これらに限定されないが、６−アミノ−３−メチル−２−オキソ−Ｎ−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−１−カルボキサミド、Ｎ−［２−（１Ｈ−インドール−３−イル）エチル］−４−（２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル）ピリミジン−２−アミン、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々を包含する。
【００５０】
ｅＩＦ２Ａを阻害する核酸分子の例は、これらに限定されないが、ｅＩＦ２Ａをコードする遺伝子（例として、GenBank受託番号NM_032025.4に規定されたｍＲＮＡをコードする遺伝子）を標的とするｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等々を包含する。ｅＩＦ２Ａの小分子インヒビターの例は、これらに限定されないが、サルブリナール、Sal003、ISRIB等々を包含する。
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤は、阻害性核酸である。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉ−ＲＮＡ、およびａｍｉ−ＲＮＡからなる群から選択される干渉ＲＮＡである。いくつかの態様において、阻害性核酸は、アンチセンス核酸（例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））または核酸アプタマー（例として、ＲＮＡアプタマー）である。一般的に、阻害性ＲＮＡ分子は、修飾されていないものか、または修飾されたものとすることができる。いくつかの態様において、阻害性ＲＮＡ分子は、１つ以上の修飾されたオリゴヌクレオチド、例として、ホスホチオアート−、２’−Ｏ−メチル−等々によって修飾されたオリゴヌクレオチドを含み、これは、かかる修飾が、当該技術分野において、in vivoでのオリゴヌクレオチドの安定性を改善するものとして認識されているためである。
【００５１】
いくつかの態様において、干渉ＲＮＡは、ｅＩＦ２サブユニットをコードする核酸配列（ＲＮＡ配列など）またはＰＫＲをコードする核酸配列（ＲＮＡ配列など）の５〜５０個の間の連続したヌクレオチド（例として、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、約３０、約３５、約４０、または約５０の連続したヌクレオチド）に相補的である配列を含む。
【００５２】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤またはＰＫＲモジュレート剤は、小分子（例として、化合物）式（Ｉ）、
【化１２】
2020516674.tif 000014
またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および、Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。
【００５３】
用語「薬学的に許容し得る塩」は、健全な医学的判断の範囲内で、不当な毒性、刺激、アレルギー反応等がなく、妥当な利益／リスク比に相応の、ヒトおよび下等動物の組織に接触させて使用するのに好適な塩を指す。薬学的に許容し得る塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Bergeらは、J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19において薬学的に許容し得る塩を詳細に記載しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
この発明の化合物の薬学的に許容し得る塩は、好適な無機および有機の酸および塩基に由来するものを包含する。薬学的に許容し得る、非毒性酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、および過塩素酸などの無機酸、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸、またはマロン酸などの有機酸と形成される、あるいはイオン交換などの当該技術分野において知られている他の方法を使用して形成される、アミノ基の塩である。
【００５５】
他の薬学的に許容し得る塩は、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩等を包含する。適切な塩基に由来する塩は、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４−塩を包含する。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩は、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等を包含する。さらなる薬学的に許容し得る塩は、適切な場合、ハロゲン化物、水酸化物、カルボン酸塩、硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、低級アルキルスルホン酸塩およびアリールスルホン酸塩などの対イオンを使用して形成された非毒性アンモニウムカチオン、四級アンモニウムカチオン、およびアミンカチオンを包含する。
【００５６】
用語「溶媒和物」は、通常は加溶媒分解反応によって、溶媒と会合している化合物の形態を指す。この物理的な会合は、水素結合を包含してもよい。慣用的な溶媒は、水、メタノール、エタノール、酢酸、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ジエチルエーテル等を包含する。メトホルミンは、例として、結晶形態で調製してもよく、溶媒和してもよい。好適な溶媒和物は、薬学的に許容し得る溶媒和物を包含し、および化学量論的溶媒和物および非化学量論的溶媒和物の両方をさらに包含する。場合によっては、溶媒和物は、例えば、１つ以上の溶媒分子が結晶性固体の結晶格子中に組み込まれるとき、単離されることが可能となる。「溶媒和物」は、溶液相と単離可能な溶媒和物との両方を網羅する。代表的な溶媒和物は、水和物、エタノール和物、およびメタノール和物を包含する。
【００５７】
用語「水和物」は、水と会合している化合物を指す。典型的には、化合物の水和物中に含有される水分子の数は、水和物中の化合物分子の数に対して一定割合となる。したがって、化合物の水和物は、例えば一般式Ｒ・ｘＨ２Ｏ（式中Ｒは、化合物であり、ｘは、０より大きい数である）により表現されてもよい。所与の化合物は、１つより多くのタイプの水和物を形成してもよく、例として、一水和物（ｘは１である）、より低い水和物（ｘは０より大きく１より小さい、例として、半水和物（Ｒ・０．５Ｈ２Ｏ））、および多水和物（ｘは1より大きい数であり、例として、二水和物（Ｒ・２Ｈ２Ｏ）および六水和物（Ｒ・６Ｈ２Ｏ））を包含する。
【００５８】
用語「互変異性体」または「互変異性体の」は、水素原子の少なくとも１つの形式移行および原子価内の少なくとも１つの変化（例として、単結合から二重結合へ、三重結合から単結合へ、またはそれらの逆）から生じる、２以上の相互変換可能な化合物を指す。互変異性体の正確な比率は、温度、溶媒、およびｐＨを包含する、数種の因子に依存する。互変異性体化（すなわち、互変異性体の対を提供する反応）は、酸または塩基によって触媒されてもよい。例示の互変異性化は、ケトからエノールへ、アミドからイミドへ、ラクタムからラクチムへ、エナミンからイミンへ、およびエナミンから異なるエナミンへの互変異性化を包含する。
【００５９】
同じ分子式を有するが、それらの原子の結合の性質または順序、またはそれらの原子の空間内の配置において異なる化合物が、「異性体」と呼ばれることもまた理解されるべきである。それらの原子の空間内の配置において異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。
互いの鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオマー」と呼ばれ、互いに重ね合わせることができない鏡像であるものは、「鏡像異性体」と呼ばれる。化合物が、不斉中心を有する、例えば、それが、４つの異なる基へ結合されているとき、一対の鏡像異性体が存在し得る。鏡像異性体を、その不斉中心の絶対配置により特徴付けることができ、CahnとPrelogのＲ−およびＳ−順序付け規則によって、あるいは分子の偏光面に対する回転の方式によって、右旋性または左旋性として（すなわち、それぞれ（＋）または（−）異性体として）指定されて、記述される。キラル化合物は、個別の鏡像異性体またはそれらの混合物のいずれかとして存在することができる。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物は、「ラセミ混合物」と呼ばれる。
【００６０】
用語「プロドラッグ」は、開裂可能な基を有し、加溶媒分解によりまたは生理学的条件下で、本明細書に記載の化合物となる化合物を指し、これは、in vivoで薬学的に活性である。かかる例は、これらに限定されないが、コリンエステル誘導体等、Ｎ−アルキルモルホリンエステル等を包含する。本明細書に記載の化合物の他の誘導体は、それらの酸および酸誘導体の形態の両方において活性を有するが、酸感受性形態ではしばしば、哺乳類生物での溶解度、組織適合性、または遅延放出の利点を与える（Bundgard, H., Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985を参照）。
【００６１】
プロドラッグは、当業者に周知の酸誘導体を包含し、例えば、親の酸と好適なアルコールとの反応により調製されるエステル、または親の酸化合物と、置換されたかまたは非置換であるアミンとの反応により調製されるアミド、または酸無水物、または混合無水物などである。本明細書に記載の化合物上にペンダントした酸性基に由来する、単純な脂肪族または芳香族エステル、アミド、および無水物は、特定のプロドラッグである。いくつかの場合において、（アシルオキシ）アルキルエステルまたは（（アルコキシカルボニル）オキシ）アルキルエステルなどの二重エステル型プロドラッグを調製することが望ましい。本明細書に記載の化合物の、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、アリール、Ｃ７〜Ｃ１２置換アリール、およびＣ７〜Ｃ１２アリールアルキルエステルが、好ましいものとなり得る。
【００６２】
ある態様において、Ｒ１は、水素である。用語「任意に置換された」は、置換されたかまたは非置換である基を指す。例示の炭素原子置換基は、これらに限定されないが、ハロゲン、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｎ３、−ＳＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＯＨ、−ＮＨ２、Ｃ３〜１０カルボシクリル、３〜１４員ヘテロシクリル、Ｃ６〜１４アリール、および５〜１４員ヘテロアリールを包含する。「カルボシクリル」は、３〜１０個の環炭素原子（「Ｃ３〜１０カルボシクリル」）を有する非芳香族環式炭化水素基のラジカルであって、非芳香族環系中のヘテロ原子が０個であるものを指す。用語「ヘテロシクリル」または「複素環」は、環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子を有する、３〜１４員の非芳香族環系のラジカルを指し、ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される（３〜１４員ヘテロシクリル」）。
【００６３】
用語「アリール」は、芳香環系中に提供される６〜１４個の環炭素原子を有し、ヘテロ原子が０個である、単環式または多環式（例として、二環式または三環式）の、４ｎ＋２芳香族環系（例として、環状アレイ中で共有される６、１０、または１４個のπ電子を有する）のラジカルを指す（「Ｃ６〜１４アリール」）。用語「ヘテロアリール」は、芳香環系中に提供される環炭素原子および１〜４個の環ヘテロ原子を有する、５〜１４員の単環式または多環式（例として、二環式、三環式）の、４ｎ＋２芳香族環系（例として、環状アレイ中で共有される６、１０または１４個のπ電子を有する）のラジカルを指し、ここで各ヘテロ原子は、独立して、窒素、酸素、および硫黄から選択される（「５〜１４員ヘテロアリール」）。
【００６４】
ある態様において、Ｒ１は、任意に置換されたアルキルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のＣ１〜６アルキルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のメチル、非置換のエチル、非置換のプロピル、または非置換のブチルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のメチルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のｎ−ブチルである。ある態様において、Ｒ１は、窒素保護基（例として、アミド基、カルバマート基、またはスルホンアミド基（例として、ｔ−ブチルカルバマート（ＢＯＣ）、ベンジル、ベンジルカルバマート（Ｃｂｚ）、またはベンジルオキシメチル））である。
【００６５】
ある態様において、Ｒ２は、水素である。ある態様において、Ｒ２は、任意に置換されたアルキルである。ある態様において、Ｒ２は、任意に置換されたＣ１〜６アルキルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のメチル、非置換のエチル、非置換のプロピル、または非置換のブチルである。ある態様において、Ｒ１は、非置換のメチルである。ある態様において、Ｒ２は、置換されたＣ１〜６アルキルである。ある態様において、Ｒ２は、任意に置換されたメチルである。ある態様において、Ｒ２は、任意に置換されたエチルである。ある態様において、Ｒ２は、置換されたエチルである。ある態様において、Ｒ２は、式：
【化１３】
2020516674.tif 000015
で表される。ある態様において、Ｒ２は、置換されたプロピルである。ある態様において、Ｒ２は、置換されたブチルである。ある態様において、Ｒ１およびＲ２は、両方とも、非置換のメチルである。ある態様において、Ｒ２窒素保護基（例として、アミド基、カルバマート基、またはスルホンアミド基（例として、ｔ−ブチルカルバマート（ＢＯＣ）、ベンジル、ベンジルカルバマート（Ｃｂｚ）、またはベンジルオキシメチル））である。
【００６６】
いくつかの態様において、式（Ｉ）で表される化合物は、式：
【化１４】
2020516674.tif 000016
（メトホルミン）、
【化１５】
2020516674.tif 000017
（ブホルミン）、
【化１６】
2020516674.tif 000018
（フェンホルミン）、
で表されるものであるか、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグである。
【００６７】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２の１つ以上のサブユニットおよび／またはＰＫＲの１つ以上のモジュレーター（例として、１つ以上のアクチベーター、または１つ以上のインヒビター）は、核酸リピートの伸長と関連する（例として、リピート関連非ＡＴＧ翻訳と関連する)疾患を処置するために、対象へ投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、ｅＩＦ２の１つ以上のサブユニットの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のモジュレーター（例として、タンパク質、核酸、小分子等々）および／またはＰＫＲの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のモジュレーター（例として、タンパク質、核酸、小分子等々）を投与される。幾つかの態様において、対象は、ｅＩＦ２αのインヒビターおよびｅＩＦ２Ａのインヒビターを投与される。
【００６８】
医薬組成物
本開示は、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）、および任意に、薬学的に許容し得る賦形剤を含む、医薬組成物もまた提供する。ある態様において、医薬組成物は、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）またはその薬学的に許容し得る塩、および薬学的に許容し得る賦形剤を含む。
【００６９】
ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、医薬組成物中に有効量で提供される。ある態様において、有効量は、治療有効量である。ある態様において、有効量は、予防有効量である。ある態様において、治療有効量は、リピート伸長を低減させることにおいて有効な量である。ある態様において、治療有効量は、ＲＡＮタンパク質を生産するＲＮＡの転写を低減させることにおいて有効な量である。ある態様において、治療有効量は、ＲＡＮタンパク質の翻訳を低減させることにおいて有効な量である。
【００７０】
ある態様において、治療有効量は、対象において１つ以上のＲＡＮタンパク質のレベルを低減させることにおいて有効な量である。ある態様において、治療有効量は、リピート伸長と関連する神経学的疾患を処置するために有効な量である。ある態様において、治療有効量は、１つ以上のＲＡＮタンパク質のレベルを低減させてリピート伸長と関連する神経学的疾患を処置することにおいて有効な量である。ある態様において、治療有効量は、ＲＡＮタンパク質の蓄積を低減させることにおいて有効な量である。
【００７１】
ある態様において、有効量は、ＲＡＮタンパク質のレベルを、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％（例として、ｅＩＦ２モジュレーターまたはＰＫＲモジュレーターを投与されていない細胞または対象におけるＲＡＮタンパク質のレベルに対して相対的な、ＲＡＮタンパク質のレベル）、低減させることにおいて有効な量である。ある態様において、有効量は、ＲＡＮタンパク質の翻訳を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％（例として、ｅＩＦ２モジュレーターまたはＰＫＲモジュレーターを投与されていない細胞または対象におけるＲＡＮタンパク質のレベルに対して相対的な、ＲＡＮタンパク質のレベル）、低減させることにおいて有効な量である。
【００７２】
本明細書に記載の医薬組成物は、薬理学の技術分野において知られているあらゆる方法によって調製することができる。一般的に、かかる調製方法は、本明細書に記載の化合物（すなわち、「活性成分」）を、担体または賦形剤、および／または１つ以上の他の補助成分と会合させること、および次に、必要であれば、および／または望ましければ、製品を所望の単回または複数回の用量単位に成形すること、および／または包装すること、を包含する。
医薬組成物は、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として、大量に調製、包装および／または販売され得る。「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の、個別の量である。活性成分の量は、一般的に、対象へ投与されるであろう活性成分の投薬量と等しいか、および／または、かかる投薬量の２分の１または３分の１などの、かかる投薬量の都合の良い画分である。
【００７３】
本明細書に記載の医薬組成物中の、活性成分、薬学的に許容し得る賦形剤、および／またはあらゆる追加成分の相対量は、処置される対象の独自性、サイズ、および／または状態に応じて、およびさらに、組成物が投与されるべきルートに応じて、変動する。組成物は、０．１％と１００％（ｗ／ｗ）との間で活性成分を含んでもよい。
提供される医薬組成物の製造に使用される、薬学的に許容し得る賦形剤は、不活性希釈剤、分散剤および／または造粒剤、界面活性剤および／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、および／または油を包含する。ココアバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤、着色剤、コーティング剤、甘味料、香味料、および香料もまた、組成物中に存在していてもよい。
【００７４】
例示の希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム、ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉砂糖、およびこれらの混合物を包含する。
例示の造粒剤および／または分散剤は、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、クレー、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロース、および木製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリ（ビニル−ピロリドン）（クロスポビドン）、カルボキシメチルスターチナトリウム（デンプングリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム（クロスカルメロース）、メチルセルロース、アルファ化デンプン（デンプン１５００）、微晶質デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Veegum）、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物、およびこれらの混合物を包含する。
【００７５】
例示の界面活性剤および／または乳化剤は、天然の乳化剤（例として、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（chondrux）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイドクレー（例として、ベントナイト（ケイ酸アルミニウム）およびVeegum（ケイ酸アルミニウムマグネシウム））、長鎖アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例として、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアラート、エチレングリコールジステアラート、グリセリルモノステアラート、およびプロピレングリコールモノステアラート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例として、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース誘導体（例として、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル類（例として、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート（Tween（登録商標）20）、ポリオキシエチレンソルビタン（Tween（登録商標）60）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート（Tween（登録商標）80）、ソルビタンモノパルミタート（Span（登録商標）40）、ソルビタンモノステアラート（Span（登録商標）60）、ソルビタントリステアラート（Span（登録商標）65）、グリセリルモノオレアート、ソルビタンモノオレアート（Span（登録商標）80））、ポリオキシエチレンエステル（例として、ポリオキシエチレンモノステアラート（Myrj（登録商標）45）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアラート、およびSolutol（登録商標））、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例として、Cremophor（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例として、ポリオキシエチレンラウリルエーテル（Brij（登録商標）30））、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、Pluronic（登録商標）F-68、Poloxamer P-188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクサートナトリウム、および／またはこれらの混合物を包含する。
【００７６】
例示の結合剤は、デンプン（例として、コーンスターチおよびデンプン糊）、ゼラチン、糖（例として、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトールなど）、天然および合成ゴム（例として、アカシア、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュモスの抽出物、パンワルガム（panwar gum）、ガッチガム（ghatti gum）、オオバコエキス（isapol husk）の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶性セルロース、酢酸セルロース、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸アルミニウムマグネシウム（Veegum（登録商標））、および落葉松アラボガラクタン）、アルギン酸塩、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコール、無機カルシウム塩、ケイ酸、ポリメタクリラート、ワックス、水、アルコール、および／またはそれらの混合物を包含する。
【００７７】
例示の保存剤は、抗酸化剤、キレート剤、抗菌性保存剤、抗真菌性保存剤、抗原虫性保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および他の保存剤を包含する。ある態様において、保存剤は、抗酸化剤である。他の態様において、保存剤は、キレート剤である。
例示の酸化防止剤は、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、メタ重亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムを包含する。
【００７８】
例示のキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびその塩および水和物（例として、エデト酸ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸二カリウム等）、クエン酸およびその塩および水和物（例として、クエン酸一水和物）、フマル酸およびその塩および水和物、リンゴ酸塩およびその塩および水和物、リン酸およびその塩および水和物、および酒石酸およびその塩および水和物を包含する。例示の抗菌性保存剤は、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミド尿素、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、およびチメロサールを包含する。
【００７９】
例示の抗真菌性保存剤は、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、およびソルビン酸を包含する。
例示のアルコール保存剤は、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾアート、およびフェニルエチルアルコールを包含する。
例示の酸性保存剤は、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータカロチン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、およびフィチン酸を包含する。
【００８０】
他の保存剤は、トコフェロール、酢酸トコフェロール、メシル酸デテロキシム（deteroxime mesylate）、セトリミド、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、メタ重亜硫酸カリウム、Glydant（登録商標）Plus、Phenonip（登録商標）、メチルパラベン、Germall（登録商標）115、Germaben（登録商標）II、Neolone（登録商標）、Kathon（登録商標）、およびEuxyl（登録商標）を包含する。
【００８１】
例示の緩衝剤は、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ−グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、二塩基性リン酸カルシウム、リン酸、三塩基性リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム（calcium hydroxide phosphate）、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、二塩基性リン酸カリウム、一塩基性リン酸カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、発熱物質非含有水、等張食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコール、およびこれらの混合物を包含する。
【００８２】
例示の潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素化植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびこれらの混合物を包含する。
【００８３】
例示の天然油は、アーモンド、杏仁、アボカド、ババス、ベルガモット、ブラックカレント種子、ルリジサ、カデ、カモミール、キャノーラ、キャラウェイ、カルナバ、ヒマシ油、シナモン、ココアバター、ココナッツ、タラ肝臓、コーヒー、トウモロコシ、綿実、エミュー、ユーカリ、月見草、魚、アマニ、ゲラニオール、ヘチマ、ブドウ種子、ヘーゼルナッツ、ヒソップ、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ、ククイナッツ、ラバンジン、ラベンダー、レモン、リツェアクベバ、マカデミアナッツ、ゼニアオイ、マンゴー種子、メドウフォームシード、ミンク、ナツメグ、オリーブ、オレンジ、オレンジラフィー、ヤシ、オイルヤシの種、桃仁、ピーナッツ、ケシの実、カボチャの種、菜種、米ぬか、ローズマリー、ベニバナ、サンダルウッド、サザンカ、セイボリー、サジー、ゴマ、シアバター、シリコーン、大豆、ヒマワリ、ティーツリー、アザミ、ツバキ、ベチベル、クルミ、および小麦胚芽を包含する。例示の合成油は、これらに限定されないが、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコーン３６０、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、およびこれらの混合物を包含する。
【００８４】
経口および非経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容し得るエマルション、マイクロエマルション、溶液剤、懸濁液剤、シロップ剤およびエリキシル剤を包含する。活性成分に加えて、液体剤形は、当該技術分野において一般に使用されている不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤（エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミドなど）、油（例として、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれらの混合物を含んでもよい。
【００８５】
不活性希釈剤とは別に、経口組成物は、アジュバント（湿潤剤、乳化剤および懸濁剤、甘味料、香味料、および香料など）を包含することができる。非経口投与のためのある態様においては、本明細書に記載のコンジュゲートは、Cremophor（登録商標）、アルコール、油、変性油、グリコール、ポリソルバート、シクロデキストリン、ポリマー、およびこれらの混合物などの可溶化剤と混合される。ある態様における例示の液体剤形は、嚥下しやすくするために、または補給チューブを介した投与のために、製剤化される。
【００８６】
経口投与のための固体剤形は、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉末剤、および顆粒剤を包含する。かかる固体剤形において、活性成分は、少なくとも１つの不活性な、薬学的に許容し得る賦形剤または担体（クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなど）と、および／または（ａ）充填剤または増量剤（デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸など）、（ｂ）バインダー（カルボキシメチルセルロース、アルギナート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロース、およびアカシアなど）、（ｃ）湿潤剤（humectant）（グリセロールなど）、（ｄ）崩壊剤（寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、あるシリカート、および炭酸ナトリウムなど）、（ｅ）溶解遅延剤（パラフィンなど）、（ｆ）吸収促進剤（四級アンモニウム化合物など）、（ｇ）湿潤剤（wetting agent）（セチルアルコールおよびグリセロールモノステアラートなど）、（ｈ）吸収剤（カオリンおよびベントナイトクレーなど）、および（ｉ）滑剤（タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムなど）、およびこれらの混合物と、混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を包含してもよい。
【００８７】
類似のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用した軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用することができる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、および薬理学の技術分野において周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。それらは、任意に、不透明化剤を含んでもよく、それらが活性成分（単数または複数）のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延方式にて放出するような組成物のものとすることができる。使用することができるカプセル化組成物の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。類似のタイプの固体組成物を、ラクトースまたは乳糖ならびに高分子量ポリエチレングリコール等のような賦形剤を使用する、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中の充填剤として採用することができる。
【００８８】
活性成分は、上で触れたとおりの１つ以上の賦形剤を用いたマイクロカプセル化された形態とすることができる。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、腸溶コーティング、放出制御コーティング、および医薬製剤分野において周知の他のコーティングなどの、コーティングおよびシェルを用いて調製することができる。かかる固体剤形において、活性成分は、スクロース、ラクトース、またはデンプンなどの少なくとも１つの不活性希釈剤と混合されることができる。かかる固体剤形は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の追加物質、例として、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースなどの錠剤化潤滑剤および他の錠剤化補助剤を含んでもよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形は、緩衝剤を含んでもよい。それらは、任意に、不透明化剤を含んでもよく、それらが活性成分（単数または複数）のみを、またはこれを優先的に、腸管のある部分において、任意に遅延方式にて放出するような組成物のものとすることができる。使用することができるカプセル化剤の例は、ポリマー物質およびワックスを包含する。
【００８９】
本明細書で提供される医薬組成物の記載は、主に、ヒトへの投与のために好適である医薬組成物へ向けられているが、かかる組成物があらゆる種類の動物への投与のために一般的に好適であることが、当業者に理解される。組成物を様々な動物への投与のために好適なものにするための、ヒトへの投与のために好適な医薬組成物の改変は、よく理解されており、通常の知識を有する獣医薬理学者は、かかる改変を、通常の実験法を用いて設計および／または実施することができる。
【００９０】
本明細書で提供される式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、投与しやすくするために、および投薬量の均一性のために、投薬量単位形態で製剤化される。しかしながら、本明細書に記載の組成物の合計の１日使用量は、健全な医学的判断の範囲内で医師によって決定されるであろうということが理解される。あらゆる特定の対象または生物に対する具体的な治療有効用量レベルは、処置される疾患、および障害の重症度；採用される具体的な活性成分の活性；採用される具体的な組成物；対象の年齢、体重、全身健康状態、性別、および食事；投与の時間、投与経路、および採用される具体的な活性成分の排出速度；処置の期間；採用される具体的な活性成分との組み合わせでまたは同時に使用される薬物；および医学の技術分野において周知の同様の因子を包含する、様々な因子に依存する。
【００９１】
本明細書で提供される式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）および組成物は、経腸（例として、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所（粉末剤、軟膏剤、クリーム剤、および／または滴剤による、など）、粘膜、経鼻、口腔内、舌下を包含するあらゆるルートによって；気管内点滴注入、気管支点滴注入、および／または吸入によって；ならびに／あるいは経口スプレー、鼻腔スプレーおよび／またはエアロゾルとして、投与されることができる。
【００９２】
具体的に企図されるルートは、経口投与、静脈内投与（例として、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給を介する局部投与、および／または患部への直接投与である。一般的に、最も適切な投与経路は、剤の性質（例として、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例として、対象が、経口投与を忍容できるかどうか）を包含する様々な因子に依存する。ある態様において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与のために好適である。
【００９３】
有効量を達成するのに必要な式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の正確な量は、例えば、種、年齢、および対象の全身状態、副作用もしくは障害の重症度、特定の化合物の独自性、投与の様式等に依存して、対象ごとに変動する。有効量は、単回用量（例として、単回経口用量）または複数回用量（例として、複数回経口用量）に包含されてもよい。ある態様において、複数回用量が対象へ投与されるかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用されるとき、複数回用量のいずれか２回の用量は、異なる量かまたは実質的に同じ量の本明細書に記載の化合物を包含する。
【００９４】
ある態様において、複数回用量が対象へ投与されるかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用されるとき、複数回用量を対象へ投与するかまたは複数回用量を生体試料、組織、もしくは細胞へ適用する頻度は、１日３用量、１日２用量、１日１用量、隔日に１用量、３日おきに１用量、毎週１用量、２週間おきに１用量、３週間おきに１用量、または４週間おきに１用量である。ある態様において、複数回用量を対象へ投与するかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用する頻度は、１日あたり１用量である。ある態様において、複数回用量を対象へ投与するかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用する頻度は、１日あたり２用量である。ある態様において、複数回用量を対象へ投与するかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用する頻度は、１日あたり３用量である。
【００９５】
ある態様において、複数回用量が対象へ投与されるかまたは生体試料、組織、もしくは細胞へ適用されるとき、複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、１日、２日、４日、１週間、２週間、３週間、１か月、２か月、３か月、４か月、６か月、８か月、９か月、１年、２年、３年、４年、５年、７年、１０年、１５年、２０年、または対象、組織、もしくは細胞の一生である。ある態様において、複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、３か月、６か月、または１年である。ある態様において、ある態様において、複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、対象、組織、または細胞の一生である。
【００９６】
ある態様において、本明細書に記載の用量（例として、単回用量、または、複数回用量のいずれかの用量）は、独立して、０．１μｇと１μｇとの間、０．００１ｍｇと０．０１ｍｇとの間、０．０１ｍｇと０．１ｍｇとの間、０．１ｍｇと１ｍｇとの間、１ｍｇと３ｍｇとの間、３ｍｇと１０ｍｇとの間、１０ｍｇと３０ｍｇとの間、３０ｍｇと１００ｍｇとの間、１００ｍｇと３００ｍｇとの間、３００ｍｇと１，０００ｍｇとの間、または１ｇと１０ｇとの間の（両端の値も含む）、本明細書に記載の化合物を包含する。ある態様において、本明細書に記載の用量は、独立して、１ｍｇと３ｍｇとの間の（両端の値も含む）、本明細書に記載の化合物を包含する。ある態様において、本明細書に記載の用量は、独立して、３ｍｇと１０ｍｇとの間の（両端の値も含む）、本明細書に記載の化合物を包含する。ある態様において、本明細書に記載の用量は、独立して、１０ｍｇと３０ｍｇとの間の（両端の値も含む）、本明細書に記載の化合物を包含する。ある態様において、本明細書に記載の用量は、独立して、３０ｍｇと１００ｍｇとの間の（両端の値も含む）、本明細書に記載の化合物を包含する。
【００９７】
一側面において、方法は、治療有効量の、メトホルミン：
【化１７】
2020516674.tif 000019
またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグを、対象へ投与することを含む。ある態様において、メトホルミンは、メトホルミン塩酸塩錠として製剤化される。ある態様において、メトホルミンは、メトホルミン塩酸塩徐放錠として製剤化される。ある態様において、メトホルミンは、メトホルミンコハク酸塩またはメトホルミンフマル酸塩として製剤化される。メトホルミンおよびその組成物は、ある態様において、経腸（例として、経口）ルートを介して投与される。
【００９８】
ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、１日に２回の５００ｍｇのメトホルミンの用量で、または１日に１回の８５０ｍｇのメトホルミンの用量で投与される。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、１日に３回の少なくとも８２５ｍｇのメトホルミンの用量で投与される。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、１日に３回の８２５ｍｇのメトホルミンの用量で投与される。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、１日に１回の５００ｍｇのメトホルミンの用量で投与される。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）は、１日に１回の１０００ｍｇのメトホルミンの用量で投与される。
【００９９】
式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の用量は、ある態様において、食事とともに与えられる。ある態様において、方法は、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）を、１０日間から３０日間の間の期間にわたって対象へ投与することを含む。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、または３０日間である。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、少なくとも以下の日数である：１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、または３０日間。
【０１００】
ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、 １か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、複数月、少なくとも１年、複数年、少なくとも１０年、または数十年である。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の用量は、無期限に投与される。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の用量は、対象の一生にわたって投与される。ある態様において、本明細書に記載の用量は、少なくとも５００ｍｇ、６００ｍｇ、６５０ｍｇ、７５０ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、８２５ｍｇ、８５０ｍｇ、９００ｍｇ、９５０ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、２０００ｍｇ、２５００ｍｇ、３０００ｍｇ、３５００ｍｇ、４０００ｍｇ、５０００ｍｇ、８０００ｍｇ、９０００ｍｇ、または１０，０００ｍｇの、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）である。
【０１０１】
ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、 対象においてＲＡＮタンパク質の蓄積を防止するのに要する期間に基づく。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量の初回用量と終回用量との間の期間は、対象においてＲＡＮタンパク質のレベルを低減させるのに要する期間に基づく。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量は、対象においてＲＡＮタンパク質のレベルを低減させるための予防的処置として投与される。予防的処置は、ある態様において、長期間である。ある態様において、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）の複数回用量は、対象においてＲＡＮタンパク質のレベルを低減させるための長期間の治療的処置として投与される。
【０１０２】
対象は、ある態様において、これらに限定されないが、以下のものを引き起こす突然変異を包含するマイクロサテライト伸長変異を有する：C9orf72 ＡＬＳまたはC9orf72 ＦＴＤ、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）および筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）；脊髄小脳失調症１、２、３、６、７、８、１０、１２、１７、３１および３６型；球脊髄性筋萎縮症；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）；ハンチントン病（ＨＤ）；脆弱Ｘ振戦失調症候群（ＦＸＴＡＳ）；ハンチントン病類縁疾患２型（ＨＤＬ２）；脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）；7p11.2葉酸感受性脆弱部位FRA7Aに関連する障害；葉酸感受性脆弱部位2q11 FRA2Aに関連する障害；および脆弱ＸＥ症候群（ＦＲＡＸＥ）。
【０１０３】
本明細書に記載のとおりの用量範囲は、提供される医薬組成物の、成人への投与のための指針を提供する。例えば、小児または青年へ投与される量は、医師または当業者によって決定することができ、成人へ投与されるそれより低いか、または同じとすることができる。
本明細書に記載のとおりの、式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）またはその組成物は、１つ以上の追加の医薬剤（例として、治療的および／または予防的に活性な剤）と組み合わせて投与されることができる。
【０１０４】
化合物または組成物は、それらの活性（例として、疾患の処置を、これを必要とする対象において行うこと、疾患の予防を、これを必要とする対象において行うこと、対象、生体試料、組織、または細胞においてプロテインキナーゼ（例として、ＣＤＫ）の活性を阻害することにおける活性（例として、効力および／または有効性））を改善し、生物学的利用能を改善し、安全性を改善し、薬剤耐性を低減し、代謝を低減および／または改変し、排出を阻害し、および／または対象生体試料、組織、または細胞の中での分布を改変する、追加の医薬剤と組み合わせて投与されることができる。
【０１０５】
採用される治療法が、同じ障害に対して所望の効果を達成してもよく、および／またはそれが、異なる効果を達成してもよいこともまた、理解されるであろう。ある態様において、本明細書に記載の化合物および追加の医薬剤を包含する本明細書に記載の医薬組成物は、化合物と追加の医薬剤のうちの一方を包含するがその両方は包含しない医薬組成物には存在しない相乗効果を示す。
【０１０６】
式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）またはその組成物を、例として、併用療法として有用である１つ以上の追加の医薬材と同時に、これに先立って、またはこれに後続して、投与することができる。医薬剤は、治療的に活性な剤を包含する。医薬剤は、予防的に活性な剤をもまた包含する。医薬剤は、薬物化合物（例として、連邦規則集（ＣＦＲ）に規定のとおりの、米国食品医薬品局によってヒトまたは家畜への使用について認可された化合物）などの小有機分子、ペプチド、タンパク質、炭水化物、単糖類、オリゴ糖、多糖類、核タンパク質、ムコタンパク質、リポタンパク質、合成ポリペプチドもしくはタンパク質、タンパク質に連結した小分子、糖タンパク質、ステロイド、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ヌクレオチド、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、脂質、ホルモン、ビタミン、および細胞を包含する。
【０１０７】
ある態様において、追加の医薬剤は、疾患（例として、神経学的疾患）を処置および／または予防するために有用な医薬剤である。各追加の医薬剤は、その医薬剤について決定された用量でおよび／またはタイムスケジュールにて投与され得る。追加の医薬剤はまた、互いとともにおよび／または本明細書に記載の化合物または組成物とともに、単回用中で一緒に投与されてもよく、または異なる用量中で別々に投与されてもよい。レジメンにおいて採用すべき特定の組み合わせは、本明細書に記載の化合物の、追加の医薬剤（単数または複数）との適合性、および／または達成すべき所望の治療および／または予防効果を考慮に入れる。一般的に、組み合わせにおける追加の医薬剤（単数または複数）は、それらが個々に利用される場合のレベルを超えないレベルで利用されることが期待される。いくつかの態様において、組み合わせで利用されるレベルは、個別に利用されるレベルよりも低くなる。
【０１０８】
追加の医薬剤は、これらに限定されないが、抗増殖剤、抗がん剤、抗血管新生剤、抗炎症剤、免疫抑制剤、抗菌剤、抗ウイルス剤、心血管作動剤、コレステロール低下剤、抗糖尿病剤、抗アレルギー剤、避妊剤、鎮痛剤、およびそれらの組み合わせを包含する。いくつかの態様において、追加の医薬剤は、これらに限定されないが、心血管作動剤、抗糖尿病剤、神経学的疾患を処置するおよび／または予防するための剤を包含する。追加の医薬剤は、これらに限定されないが、抗炎症剤または化合物（例として、ターメリック）を包含する。いくつかの態様において、追加の医薬剤は、抗ＲＡＮ抗体、例えば、抗ポリＧＡ、抗ポリＧＰ、抗ポリＰＡ、抗ポリＰＲ、抗ポリＧＲ、抗ポリＡｌａ、抗ポリＳｅｒ、抗ポリＬｅｕ、抗ポリＬＰＡＣ、抗ポリＱＡＧＲ等々である。
【０１０９】
キット（例として、医薬パック）もまた、本開示によって網羅される。提供されるキットは、本明細書に記載の医薬組成物または化合物、および容器（例として、バイアル、アンプル、ボトル、シリンジ、および／またはディスペンサーぱっけージ、または他の好適な容器）を含み得る。いくつかの態様において、提供されるキットは、任意に、本明細書に記載の医薬組成物または化合物の希釈または懸濁のための医薬品賦形剤を含む第２の容器を、さらに包含してもよい。いくつかの態様において、第１の容器および第２の容器内に提供される、本明細書に記載の医薬組成物または化合物は、混合されて１つの単位投薬形態を形成する。
【０１１０】
よって、一側面において、本明細書に記載の式（Ｉ）で表される化合物（例として、メトホルミン、ブホルミン、フェンホルミン等々）またはその組成物を含む第１の容器を包含するキットが提供される。ある態様において、キットは、神経学的疾患の処置を、これを必要とする対象において行うことにおいて有用である。ある態様において、キットは、それを必要とする対象において神経学的疾患の予防を、これを必要とする対象において行うことにおいて有用である。ある態様において、キットは、対象、生体試料、組織、または細胞において1つ以上のＲＡＮタンパク質のレベルを低減させる（例として、ＲＡＮタンパク質の発現を低減させる）ために有用である。ある態様において、キットは、対象、生体試料、組織、または細胞においてＲＡＮタンパク質の蓄積を低減させるために有用である。ある態様において、キットは、対象、生体試料、組織、または細胞においてＲＡＮタンパク質翻訳をモジュレートする（例として、低減させるかまたは阻害する）ために有用である。
【０１１１】
ある態様において、本明細書に記載のキットは、キットに包含されるメトホルミンまたはその医薬組成物を使用するための指示をさらに包含する。本明細書に記載のキットは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などの規制機関によって要求されているとおりの情報をもまた包含していてもよい。ある態様において、キットに包含される情報は、処方情報である。ある態様において、キットおよび指示は、疾患（例として、神経学的疾患）を処置することを、これを必要とする対象において行うことを提供する。ある態様において、キットおよび指示は、疾患（例として、神経学的疾患）の予防を、これを必要とする対象において行うことを提供する。
【０１１２】
ある態様において、キットおよび指示は、対象、生体試料、組織、または細胞において１つ以上のＲＡＮタンパク質のレベルを低減させることを提供する。ある態様において、キットおよび指示は、対象、生体試料、組織、または細胞においてＲＡＮタンパク質の蓄積を低減させることを提供する。ある態様においてキットおよび指示は、対象、生体試料、組織、または細胞においてＲＡＮタンパク質翻訳をモジュレートすること（例として、低減または阻害すること）を提供する。本明細書に記載のキットは、本明細書に記載の１つ以上の追加の医薬剤を、別個の組成物として、包含してもよい。
【０１１３】
いくつかの態様において、他のｅＩＦ２、ｅＩＦ２Ａ、および／またはＰＫＲのモジュレーター（例として、タンパク質、小分子、核酸等々）は、上で記載されたとおりの医薬組成物として製剤化される。
【０１１４】
ＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積と関連する疾患および障害を処置する方法
いくつかの態様において、本開示によって記述されるとおりの組成物および方法は、細胞または対象（例として、ＲＡＮ翻訳と関連する障害または疾患を有する対象）においてＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積を低減させるかまたは阻害するために有用である。いくつかの態様において、細胞は、in vitroである。いくつかの態様において、対象は、哺乳動物対象である。いくつかの態様において、対象は、ヒト対象である。
いくつかの側面において、本開示は、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）を発現している対象へ有効量の真核生物開始因子２（ｅＩＦ２）モジュレート剤または有効量のＰＫＲモジュレート剤（例として、ＰＫＲインヒビター）を投与することにより、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置する方法を提供する。
【０１１５】
いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、ＰＫＲのインヒビターである。いくつかの態様において、ＰＫＲのインヒビターは、式（Ｉ）
【化１８】
2020516674.tif 000020
で表される化合物、またはその薬学的に許容し得る塩、溶媒和物、水和物、互変異性体、立体異性体、誘導体、またはプロドラッグであり、ここで：Ｒ１は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基であり；および、Ｒ２は、水素、任意に置換されたアルキル、または窒素保護基である。いくつかの態様において、式（Ｉ）で表される化合物は、メトホルミン、ブホルミン、またはフェンホルミンである.
【０１１６】
いくつかの態様において、リピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患は、ハンチントン病（ＨＤ、ＨＤＬ２）、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）、球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）、脊髄小脳失調症１（ＳＣＡ１）、脊髄小脳失調症２（ＳＣＡ２）、脊髄小脳失調症３（ＳＣＡ３）、脊髄小脳失調症６（ＳＣＡ６）、脊髄小脳失調症７（ＳＣＡ７）、脊髄小脳失調症８（ＳＣＡ８）、脊髄小脳失調症１２（ＳＣＡ１２）または脊髄小脳失調症１７（ＳＣＡ１７）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄小脳失調症３６型（ＳＣＡ３６）、脊髄小脳失調症２９型（ＳＣＡ２９）、脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）、筋強直性ジストロフィー１型（ＤＭ１）、筋強直性ジストロフィー２型（ＤＭ２）、またはフックス角膜内皮ジストロフィー（例として、CTG181）である。
【０１１７】
本明細書で使用される「有効量」は、ＲＡＮタンパク質翻訳または蓄積と関連する疾患または障害（例として、神経変性疾患）によって引き起こされる１つ以上の兆候または症状の処置または向上などの医学的に望ましい結果を提供するのに十分な、治療剤の投薬量を指す。有効量は、処置される対象の年齢および健康状態、対象における疾患または障害（例として、ＲＡＮタンパク質蓄積の量、またはかかる蓄積によって引き起こされる細胞毒性）の重症度、処置の期間、あらゆる併用療法の性質、具体的な投与経路、および医療従事者の知識および専門知識の範囲内の同様の因子とともに変動する。いくつかの態様において、有効量は、ｅＩＦ２αのリン酸化、ｅＩＦ２Ａの発現もしくは活性、またはこれらのいずれかの組み合わせを、低減させるのに十分なｅＩＦ２αインヒビター、ｅＩＦ２Ａインヒビター、またはＰＫＲインヒビターの量である。
【０１１８】
いくつかの態様において、本開示によって記述されるとおりのリピート非ＡＴＧタンパク質（ＲＡＮタンパク質）翻訳と関連する疾患を処置するための方法は、１つ以上の追加の治療剤を対象へ投与することをさらに含む。適切な追加の治療剤の同定および選択は、当業者の能力の範囲内であり、対象が罹患している疾患に依存する。例えば、いくつかの態様においては、ハンチントン病（例として、テトラベナジン、アマンタジン、クロルプロマジン等々）、脆弱Ｘ症候群（例として、選択的セロトニン再取り込み阻害剤、カルバマゼピン、メチルフェニデート、トラゾドン等々）、脊髄小脳失調症（例として、バクロフェン、リルゾール、アマンタジン、バレニクリン等々）、または、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（例として、リルゾール等々）、筋強直性ジストロフィー１型（タイドグロブス、メキシレチン等々）、のための１つ以上の治療剤が、対象へ投与される。
【０１１９】
いくつかの態様において、追加の治療剤は、ＲＡＮリピート伸長へ特異的に結合する抗体、またはリピート伸長に対してＣ末端であるＲＡＮタンパク質の固有の領域へ特異的に結合する抗体である。例えば、いくつかの態様において、抗体は、ポリ−ＳｅｒＲＡＮリピート伸長へ特異的に結合する。いくつかの態様において、抗体は、ポリ−ＳｅｒＲＡＮリピート伸長を含むタンパク質のＣ末端領域へ結合する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、細胞内ＲＡＮタンパク質へ結合する。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、細胞外ＲＡＮタンパク質へ結合する。
【０１２０】
抗ＲＡＮ抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体とすることができる。典型的には、ポリクローナル抗体は、マウス、ウサギまたはヤギなどの好適な哺乳動物への接種によって生産されるより大きな哺乳動物が、しばしば、回収できる血清の量がより多いことから好まれる。典型的には、抗原（例として、ポリ−Ｓｅｒリピート領域を含む抗原）が、哺乳動物に注射される。これは、Ｂリンパ球が抗原に対して特異的なＩｇＧ免疫グロブリンを生産するように誘導する。このポリクローナルＩｇＧが、哺乳動物の血清から精製される。モノクローナル抗体は、一般的に、単一の細胞株（例として、ハイブリドーマ細胞株）から生産される。いくつかの態様において、抗ＲＡＮ抗体は、精製されている（例として、血清から単離されている）。
【０１２１】
数多くの方法が、抗ＲＡＮ抗体を得るために使用され得る。例えば、抗体を、組換えＤＮＡ法を使用して生産することができる。モノクローナル抗体はまた、知られている方法に従い、ハイブリドーマの産生（例として、KohlerおよびMilstein (1975) Nature, 256: 495-499を参照）によって生産してもよい。この方式で形成されたハイブリドーマは、次に、指定された抗原と特異的に結合する抗体を生産する１つ以上のハイブリドーマを同定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および表面プラズモン共鳴（例として、OCTETまたはBIACORE）分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングされる。
【０１２２】
指定された抗原（例として、ＲＡＮタンパク質）のあらゆる形態が、免疫原として使用されてもよく、例として、組換え抗原、自然発生形態、あらゆるバリアントまたはそれらのフラグメントである。抗原を作る１つの例示の方法は、抗原またはそのフラグメント（例として、ｓｃＦＶ）を発現するタンパク質発現ライブラリ、例として、ファージもしくはリボソームディスプレイライブラリを、スクリーニングすることを包含する。ファージディスプレイは、例えば、Ladner et al., 米国特許第５，２２３，４０９号；Smith (1985) Science 228:1315-1317；Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628；Marks et al. (1991) J.  Mol.  Biol., 222: 581-597、ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；およびＷＯ９０／０２８０９において記載されている。
【０１２３】
処置の投与は、当該技術分野において知られているいずれかの方法によって成し遂げられ得る（例として、Harrison’s Principle of Internal Medicine, McGraw Hill Inc.を参照）。投与は、局所的または全身的であり得る。投与は、非経口（例として、静脈内、皮下、または皮内）または経口であり得る。異なる投与経路のための組成物は、当該技術分野において周知である（例として、E. W. MartinによるRemington's Pharmaceutical Sciencesを参照）。投薬量は、対象および投与経路に依存する。投薬量は、当業者によって決定されることができる。
【０１２４】
投与経路は、これらに限定されないが、経口、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、鼻腔内、舌下、気管内、吸入、皮下、眼内、膣内、および直腸内を包含する。全身経路は、経口および非経口を包含する。数種のタイプのデバイスが、吸入による投与のために常用される。これらのタイプのデバイスには、計量用量吸入器（ＭＤＩ）、呼吸作動ＭＤＩ、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）、ＭＤＩと組合せたスペーサー／保持チャンバー、およびネブライザーを包含する。
【０１２５】
いくつかの態様において、ＲＡＮタンパク質発現と関連する疾患のための処置は、これを必要とする対象の中枢神経系（ＣＮＳ）へ投与される。本明細書で使用される「中枢神経系（ＣＮＳ）」は、神経細胞、グリア細胞、星状膠細胞、脳脊髄液等々を包含するがこれらに限定されない、対象の脳および脊髄の全ての細胞および組織を指す。対象のＣＮＳへ治療剤を投与する様式は、脳内への直接注入（例として、脳内注射、脳室内注射、実質内注射等々）、対象の脊髄内への直接注入（例として、髄腔内注射、腰椎注射等々）、またはそれらのいずれかの組み合わせを包含する。
【０１２６】
いくつかの態様において、本開示によって記述されるとおりの処置は、対象へ全身投与され、例えば、静脈内注射による。全身投与される治療用分子（例として、ｅＩＦ２モジュレート剤、ＰＫＲインヒビター等々）は、いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの分子の送達を改善するために、修飾されることができる。治療用分子のＣＮＳ送達を改善する修飾の例は、これらに限定されないが、血液脳関門標的化剤（例えば、Georgieva et al. Pharmaceuticals 6(4): 557-583 (2014)によって開示されているとおりの、トランスフェリン、メラノトランスフェリン、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、アンギオペップ（angiopeps）、ＲＶＧペプチド等々）との共投与またはコンジュゲーション、ＢＢＢ破壊剤（例えばブラジキニン）との共投与、および投与に先立ったＢＢＢの物理的破壊（例として、ＭＲＩガイド集束超音波による）等々を包含する。
【０１２７】
ｅＩＦ２モジュレート剤は、当該技術分野において知られているいずれかの好適な様式によって送達され得る。いくつかの態様において、ｅＩＦ２モジュレート剤は、ウイルスベクター（例として、アデノウイルスベクター、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶベクター）、レンチウイルスベクター等々）またはプラスミドベースのベクターなどのベクターによって、対象へ送達される。
いくつかの側面において、本開示は、いくつかの態様において、ｅＩＦ２αモジュレート剤をコードする導入遺伝子を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）の、対象（例として、ＲＡＮタンパク質の翻訳および蓄積によって特徴付けられる疾患を有する対象）への投与が、対象においてＲＡＮタンパク質翻訳およびＲＡＮタンパク質蓄積を低減させる、という発見に基づく。
【０１２８】
いくつかの態様において、組換えｒＡＡＶ粒子は、一本鎖（ｓｓ）または自己相補（ｓｃ）ＡＡＶ核酸ベクターなどの核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、核酸ベクターは、本明細書に記載のｅＩＦ２モジュレート剤をコードする導入遺伝子、および、発現コンストラクトに隣接する、逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列（例として、野生型ITR配列または 改変ITR配列)を含む１つ以上の領域を含む。いくつかの態様において、核酸は、ウイルスカプシドによってカプシド化されている。いくつかの態様において、導入遺伝子は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的（例として、ＣＮＳ特異的）プロモーターである。
【０１２９】
したがって、いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、ウイルスカプシド、および、ウイルスカプシドによってカプシド化された本明細書に記載のとおりの核酸ベクターを含む。いくつかの態様において、ウイルスカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を含む６０のカプシドタンパク質サブユニットを含む。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３サブユニットは、それぞれ、およそ１：１：１０の比率でカプシド中に存在する。
【０１３０】
本明細書に記載の核酸または核酸ベクターのＩＴＲ配列は、いずれかのＡＡＶ血清型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来する可能性があるか、または１つより多い血清型に由来する可能性がある。本明細書で提供される核酸または核酸ベクターのいくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２に由来する。ＩＴＲ配列、およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは、当該技術分野において知られており、市販されている（例として、Vector Biolabs, Philadelphia, PA；Cellbiolabs, San Diego, CA；Agilent Technologies, Santa Clara, Ca；およびAddgene, Cambridge, MAから入手可能な商品およびサービス；ならびに「Gene delivery to skeletal muscle results in sustained expression and systemic delivery of a therapeutic protein.」Kessler PD, Podsakoff GM, Chen X, McQuiston SA, Colosi PC, Matelis LA, Kurtzman GJ, Byrne BJ. Proc Natl Acad Sci U S A. 1996 Nov 26;93(24):14082-7；およびCurtis A. Machida. 「Methods in Molecular MedicineTM.」 「Viral Vectors for Gene Therapy Methods and Protocols.」 10.1385/1-59259-304-6:201 (C) Humana Press Inc. 2003. 第１０章「Targeted Integration by Adeno-Associated Virus.」 Matthew D. Weitzman, Samuel M. Young Jr., Toni CathomenおよびRichard Jude Samulski；米国特許第５，１３９，９４１号および５，９６２，３１３号を参照、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。）。
【０１３１】
例示のＡＡＶ２  ＩＴＲ配列は、下記に示される：
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ  （配列番号１４）
いくつかの態様において、発現コンストラクトは、サイズが７キロベース以下、６キロベース以下、５キロベース以下、４キロベース以下、または３キロベース以下である。いくつかの態様において、発現コンストラクトは、サイズが４〜７キロベースの間である。
【０１３２】
ｒＡＡＶ粒子は、あらゆる派生型（血清型の自然発生でないバリアントを包含する）または偽型を包含する、あらゆるＡＡＶ血清型（例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）のものであり得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ９粒子である。追加のＡＡＶ血清型および派生型／偽型、およびかかる派生型／偽型を生産する方法は、当該技術分野において知られている（例として、Mol Ther. 2012 Apr;20(4):699-708. doi: 10.1038/mt.2011.287. Epub 2012 Jan 24.「The AAV vector toolkit: poised at the clinical crossroads.」Asokan A1, Schaffer DV, Samulski RJ.を参照）。
これらおよびその他の本願の側面は、以下の非限定的な例によって例示される。
【実施例】
【０１３３】
例
例１．プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）は、ｅＩＦ２ａ−Ｐ経路を通じてＣＡＧ、ＣＣＴＧ、Ｇ４Ｃ２伸長のＲＡＮ翻訳を調節する。
リピート関連非ＡＴＧ（ＲＡＮ）翻訳へのＰＫＲの影響を試験するのに使用したＣＡＧ、ＣＣＴＧおよびＧＧＧＣＣリピート伸長コンストラクの図が、図１Ａに示される。手短に言うと、コンストラクトは、６×ストップコドンカセットを有する（例として、各リーディングフレーム中の２つのストップ、リピート伸長およびＣ末端エピトープタグの上流）。野生型（PKR-WT）、ＰＫＲのドミナントネガティブK296R突然変異形態（PKR-K296R）、またはＣ末端のみのドメイン（ＰＫＲ−ＣＴ）、を発現するＰＫＲベクターの図が、図１Ｂに示される。
【０１３４】
HEK293T細胞を、ＲＡＮタンパク質発現およびＰＫＲ発現コンストラクトでトランスフェクトした。免疫ブロット分析は、PKR-WTがＣＡＧ伸長コンストラクトからのポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質を増加させること、ＲＲＭモチーフを欠いたPKR-CTはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルに影響を有さないこと、および、ドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＡｌａ  ＲＡＮレベルを減少させるということを示唆した（図１Ｃ）。免疫ブロットは、ＰＫＲがｅＩＦ２α−Ｐのレベルを増加させること、PKR-CTは影響を有さないこと、および、PKR-K296RはｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルを減少させるということもまた示唆した。
【０１３５】
免疫ブロット分析は、PKR-WTがＣＣＴＧ伸長コンストラクトからのポリＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓ（ポリＬＰＡＣ）ＲＡＮタンパク質を増加させ、PKR-CTはＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルへの影響を有さず、およびドミナントネガティブ突然変異体K296R PKRはポリＬＰＡＣ  ＲＡＮレベルを減少させるということを示唆した（図１Ｄ）。ｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルにPKR-CTは影響を有さず、およびPKR-K296Rはこれを減少させるということもまた観察された。
免疫ブロット分析は、ポリＧＰ  ＲＡＮタンパク質レベルをPKR-WTは増加させ、PKR-CTはこれに影響を有さず、および突然変異体K296R PKRは減少させるということ、および、ｅＩＦ２α−Ｐの定常状態レベルをＰＫＲは増加させ、PKR-CTはこれに影響を有さず、およびPKR-K296Rは減少させるということを示唆した（図１Ｅ）。
【０１３６】
ｅＩＦ２α−ＰはHEK293T細胞におけるＲＡＮタンパク質レベルを増加させる。
ｅＩＦ２αリン酸化の、ＲＡＮタンパク質翻訳への影響を調査した。WTまたは突然変異型ｅＩＦ２αおよびＣＡＧ伸長（ＣＡＧexp）を発現するプラスミドで共トランスフェクトされたHEK293T細胞のタンパク質ブロットは、リン酸化模倣型eIF2α-S51D突然変異を過剰発現する細胞において、eIF2α-WTまたはリン酸化可能でないeIF2α-S51Aと比較して、増加したポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを示す（図２Ａ）。ＣＡＧ、ＣＴＧ、およびＣＣＴＧリピート伸長からそれぞれ発現するポリＡｌａ、ポリＡｌａおよびＬＰＡＣ  ＲＡＮタンパク質は、ｅＩＦ２α−Ｐのレベルを低減させるＰＫＲインヒビター（ＴＡＲＢＰ２）の存在下において減少するということが観察された（図２Ｂ）。ｅＩＦ２α−Ｐの下流効果を阻害するＩＳＩＲＢの存在下において、ポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルが減少するということもまた観察された（図２Ｃ）。
【０１３７】
ＰＫＲ経路の阻害は、ＲＡＮタンパク質集合体を減少させ、およびC9-500 BACトランスジェニックマウスにおける行動的表現型を改善する。
５００  Ｇ４Ｃ２リピートを含有するC9orf72 ＡＬＳ／ＦＴＤのBACトランスジェニックマウスモデル（C9-500 BAC）へのＡＡＶ注射のために使用したAAV2/9コンストラクトの概略図が、図３Ａに示される。手短に言うと、EGFPまたはPKR(K296R)のドミナントネガティブ形態のいずれかを発現するAAV2/9ウイルスを用いた、出生後第１日（Ｐ１）での脳室内（ＩＣＶ）注射の後に、動物を、月齢３か月で分析のためにサクリファイスした。
【０１３８】
C9-500 BACマウスからの脳梁膨大後部皮質の切片におけるＧＡ  ＲＡＮタンパク質の、代表的な免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色（図３Ｂ、左）。ＧＡ  ＲＡＮタンパク質集合体の定量もまた実施した（図３Ｂ、右）。分析は、盲検式にて行った。データは、ドミナントネガティブ変異体PKR(K296R)を用いて処置された動物は、年齢をマッチさせたEGFP対照動物と比較してより少数のＧＡ  ＲＡＮタンパク質集合体を有するということを示唆していた。オープンフィールド分析もまた実施したところ（図３Ｃ）、ドミナントネガティブPKR(K296R)を用いて処置されたC9-500 BAC動物は、EGFP対照動物と比較して、不安様行動を表す表現型である低減されたセンタータイムを示す、ということを示唆していた。
【０１３９】
代替的なｅＩＦ２Ａ開始因子はＲＡＮ翻訳を増加させる。
ｅＩＦ２Ａは、代替的な真核生物翻訳開始因子であり、いくつかの態様において、特定条件下でｅＩＦ２αの代替として使用されることができる。典型的には、ｅＩＦ２αのリン酸化は、転写開始におけるその使用を防止し、および、ＲＡＮ翻訳は、ｅＩＦ２α−Ｐを優先する条件下で増加する。ゆえに、ｅＩＦ２Ａが、ＲＡＮ翻訳のための代替的な開始因子として働くことができるかどうかを調査した。ＲＡＮタンパク質を発現させるのに使用したコンストラクトが示される（図４）。リピート伸長コンストラクトを用いた共トランスフェクションは、eIF2Aの過剰発現との組み合わせにおいて、ＲＡＮタンパク質レベルを増加させており、これは、ｅＩＦ２Ａが、伸長変異を引き起こす様々な疾患にわたってＲＡＮについての代替的な真核生物開始因子として働くことができるということを示唆する。これらのデータは、ＲＡＮタンパク質レベルをモジュレートするための新規な薬物標的としても、ｅＩＦ２Ａを同定している。
【０１４０】
グローバルな翻訳を下方調節するｅＩＦ２αリン酸化は、増加したＲＡＮタンパク質レベルに至らせる。
一般的に、４つの主要なストレス経路（ＰＫＲ、ヘム調節インヒビター（ＨＲＩ）、一般制御非脱抑制（general control nonderepressible）（ＧＣＮ）、およびプロテインキナーゼＲＮＡ様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ））が、ｅＩＦ２αリン酸化（ｅＩＦ２α−Ｐ）、およびグローバルなタンパク質合成を抑制することに至らせる。驚くべきことに、ｅＩＦ２α−Ｐを優先する条件は、リピートの複数のタイプにわたってＲＡＮ翻訳を上方調節に至らせるということが観察された。
【０１４１】
いくつかの態様において、リピート伸長変異を引き起こす疾患が発現するとき、ヘアピンを形成する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）および／またはセンスおよびアンチセンスの転写産物の発現からのｄｓＲＮＡが生産される。いくつかの態様において、これらの突然変異型ｄｓＲＮＡは、ＰＫＲ経路を慢性的な過剰活性化に至らせる。いくつかの態様において、ＰＫＲ経路の慢性的な活性化は、ｅＩＦ２αリン酸化、代替的な開始因子ｅＩＦ２Ａの使用、および増加したＲＡＮ翻訳に至らせる。
【０１４２】
上記の例に記載されたとおり、ＲＡＮ翻訳は、ＰＫＲ過剰発現によって上方調節され、ＰＫＲ経路からｅＩＦ２α−Ｐをブロックするドミナントネガティブ形態のＰＫＲの過剰発現によって実質的に低減される、ということが観察された。ＲＡＮタンパク質レベルが、ｅＩＦ２αリン酸化のレベルの増加に伴って増加し、ＴＡＲＤＢＰ２を包含するｅＩＦ２αリン酸化のインヒビターで減少するということもまた観察された。代替的な開始因子ｅＩＦ２Ａが、ＲＡＮタンパク質レベルを増加させるということもまた観察された。いくつかの態様において、この代替的な真核生物開始因子（例として、ｅＩＦ２Ａ）は、ｅＩＦ２αリン酸化がｅＩＦ２αでの正規の翻訳開始を防止するストレス条件下で使用することができる。いくつかの態様において、ｅＩＦ２ＡはＡＵＧ開始コドンを要しないので、ＲＡＮ翻訳の特徴である非ＡＵＧ開始コドンの複数のタイプで翻訳開始を可能にする。
【０１４３】
要約すると、ストレス経路は、ＲＡＮ翻訳の重要なドライバーとして、および、これらに限定されないがC9orf72 ＡＬＳ／ＦＴＤ（Ｇ４Ｃ２およびＧ２Ｃ４リピート）、筋強直性ジストロフィー１型、ハンチントン病および複数の形態の脊髄小脳失調症（ＣＡＧおよびＣＴＧリピート）、および筋強直性ジストロフィー２型（ＣＣＴＧおよびＣＡＧＧリピート）を包含する疾患においてＲＡＮ翻訳をモジュレートするために使用することができるドラッガブル（druggable）な標的として、同定されている。データは、ＰＫＲまたはｅＩＦ２α経路の阻害がＲＡＮタンパク質の蓄積を減少させることを示唆する。ｅＩＦ２Ａはまた、代替的な真核生物開始因子としても同定されている。図５は、グローバルな翻訳を下方制御し、増加したＲＡＮタンパク質レベルに至らせる、ｅＩＦ２αリン酸化を示した概略図を示す。
【０１４４】
例２：メトホルミンはＰＫＲ経路を通じてＲＡＮ翻訳を阻害し、およびC9orf72マウスモデルにおける表現型を向上させる
この例は、構造化されたＲＡＮポジティブのリピート伸長ＲＮＡによるＰＫＲ経路の活性化について記載する。いくつかの態様において、活性化は、増加したホスホｅＩＦ２α（ｐ−ｅＩＦ２α）および増加したＲＡＮタンパク質レベルに至らせる。ＰＫＲの阻害は、細胞培養およびC9orf72 ＡＬＳ／ＦＴＤのBACトランスジェニックマウスモデル(C9-BAC)においてＲＡＮタンパク質レベルを低減させたことが観察された。メトホルミン（およびあるメトホルミン誘導体、例えば、ブホルミンおよびフェンホルミン）は、ホスホ−ＰＫＲ活性化を阻害し、ＲＡＮタンパク質レベルを低減させ、およびC9-BACマウスにおける表現型を改善するということもまた観察された。
【０１４５】
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
HEK293T細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地中で培養し、５％ＣＯ２を含有する湿った環境において３７℃でインキュベートした。Lipofectamine 2000 Reagent（Invitrogen）を使用して、製造者の指示に従ってＤＮＡトランスフェクションを実施した。
【０１４６】
ＡＡＶ構築および調製
サイトメガロウイルスエンハンス／ニワトリベータアクチン（ＣＡＧ）プロモーターの制御下でＰＫＲを発現するＡＡＶベクター、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、およびウシ成長ホルモンのポリＡを、でのHEK293T細胞へのトランスフェクションによって産生した。細胞を、ＡＡＶヘルパープラスミドpDP8.apeで共トランスフェクトしたことで、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターrAAV2/8を生産した。
【０１４７】
脳室内（ＩＣＶ）注射
新生仔に、生後０〜１２時間以内に注射を行った。ナイーブな新生仔を、アルミニウム箔で覆い、３〜４分間完全に氷で取り囲み、これは＜０℃まで低下した体温をもたらした。仔は、全ての動きが止まり、皮膚の色がピンクから紫色に変化したときに、完全に冷凍麻酔されたものとみなした。１０μｌシリンジ（３０度面取りしたもの）を使用して、２μｌのウイルス（１０１３ウイルスゲノム／ｍｌ）をゆっくりと脳室へ注射した。注射後、仔を加温ブランケット上で完全に回復させ、ホームケージに戻した。
【０１４８】
免疫蛍光染色
高分子タンパク質の細胞内分布を、免疫蛍光染色によって、トランスフェクトされたHEK293T細胞において評価した。細胞を、８ウェル細胞培養チャンバ上にプレーティングし、および翌日にプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）にて３０分間固定し、および、１５分間氷上で、ＰＢＳ中の０．５％  triton X-100にて透過処理した。細胞を、ＰＢＳ中の１％  ヤギ正常血清（ＮＧＳ）にて３０分間ブロッキングした。ブロッキング後、ウサギ抗Ｍｙｃ（Abcam）、マウス抗ＨＡ（Covance）、マウス抗Flag（Sigma）、ウサギα−ＧＲおよびウサギα−ＧＲ−ＣＴの一次抗体を希釈率１：４００で含有するブロッキング溶液中で、細胞を１時間室温でインキュベートした。スライドを３回ＰＢＳ中で洗浄し、および、Cy3（Jackson ImmunoResearch, PA）にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギおよびAlexa Fluor 488（Invitrogen）にコンジュゲートされたヤギ抗マウスの二次抗体を希釈率１：２００で含有するブロッキング溶液中で、１時間室温でインキュベートした。
【０１４９】
スライドを３回ＰＢＳ中で洗浄し、ＤＡＰＩ（Invitrogen）を含有する封入媒体を用いて標本化した。患者の海馬組織における免疫蛍光染色を、６μｍの新鮮凍結切片に対して実施した。ＮＧＳをブロッキング緩衝液として使用した点および、より高い希釈率の抗体（マウスα−ＧＰ  １：１０００およびウサギα−ＧＰ−ＣＴ  １：５０００）を使用した点以外ではトランスフェクトされた細胞に使用したものと類似のプロトコルを使用した。
【０１５０】
ウエスタンブロッティング
６ウェル組織培養プレートの各ウェル中のトランスフェクトされた細胞をＰＢＳですすぎ、および、４５分間氷上で、プロテアーゼインヒビターカクテルを用いて３００μＬのRIPA緩衝液中に溶解させた。２１ゲージ針への通過を通じて、ＤＮＡをせん断した。細胞溶解物を１６，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離し、および上清を回収した。タンパク質アッセイ試薬（Bio-Rad）を使用して、細胞溶解物のタンパク質濃度を決定した。タンパク質２０μｇを、４−１２％ ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）中で分離させ、および、ニトロセルロース膜（Amersham）へ転写した。膜を、０．０５％  Tween-20を含有するＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）中の５％の粉乳中でブロックし、ブロッキング溶液中の抗Flag（１：２０００）、抗Ｍｙｃ（１：１０００）、抗ＨＡ（１：１０００）、またはウサギポリクローナル抗体（１：１０００）でプローブした。抗ウサギまたは抗マウスＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Amersham）を用いて膜をインキュベートした後、ECL plus Western Blotting Detection System （Amersham）によってバンドを可視化させた。
【０１５１】
患者の前頭皮質解剖組織の連続抽出を、以下のとおり実施した：組織を、１％  Triton-X100、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ  Ｉおよびプロテアーゼインヒビターカクテルを含有するＰＢＳ中においてホモジナイズし、および、１６，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。上清を回収した。ペレットを２％  ＳＤＳ中に再懸濁させ、室温で１時間インキュベートし、次に１６，０００×ｇにて１５分間４℃で遠心分離した。上清を回収し、および２％  ＳＤＳに不溶性のペレットを、８％  ＳＤＳ、６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、１０％グリセロールおよび２０％  ２−メルカプトエタノール、の中にタンパク質ブロッティングのために再懸濁させた。
【０１５２】
伸長ＲＮＡによるＰＫＲの活性化はＲＡＮ翻訳を誘導する
リピート伸長は、ＲＡＮ翻訳を受けることが観察されている。ＣＵＧリピートは、ＰＫＲを活性化させることが観察されている。ゆえに、他のＲＡＮポジティブリピート伸長の、ＰＫＲを活性化させる能力、およびＲＡＮ翻訳上のＰＫＲの役割を試験した。ＣＡＧ、ＣＣＵＧ、ＣＡＧＧおよびＧＧＧＧＣＣ伸長ＲＮＡ（図６Ａ）を発現するHEK293T細胞は、ＰＫＲ活性化にとって重要である部位（T446およびT451）でのホスホ−ＰＫＲのレベルを増加させていたことが観察された（図６Ｂ）。
【０１５３】
次に、リピート伸長の数種のタイプにわたる、ＲＡＮタンパク質蓄積へのＰＫＲ過剰発現および阻害の影響を試験した。ＣＡＧ、ＣＣＵＧ、ＣＡＧＧまたはＧＧＧＧＣＣリピート伸長を発現するプラスミドを、全長ＰＫＲ、酵素のドミナントネガティブ形態（PKR-K296R）、または結合ドメインを欠いた不活性ＰＫＲ（PKR-Cter）のいずれかを発現するコンストラクトとともに共トランスフェクトした（図６Ｃ）。 CAGEXPを発現する細胞については、PKR-WT過剰発現が、増加したｐ−ＰＫＲおよびｐ−ｅＩＦ２α、および増加したＲＡＮポリＡｌａタンパク質レベルに至らせた。対照的に、ドミナントネガティブPKR-K296R突然変異体の発現は、ポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを減少させた。酵素の不活性な形態の発現は、影響を有さなかった（図６Ｄ）。ＡＵＧ開始コドンを含有するポリＧｌｎリーディングフレームは、ＰＫＲによって影響されない（図７Ａ）。
【０１５４】
ＣＣＵＧ、ＣＡＧＧおよびＧＧＧＧＣＣリピートにわたって発現したＲＡＮポリＬＰＡＣ、ポリＱＡＧＲおよびポリＧＰタンパク質は、PKR-WT過剰発現で増加し、およびPKR-K296Rで減少した（図６Ｅ〜６Ｇおよび図７Ｂ）。これらのデータは、マイクロサテライト伸長変異の数種のタイプがＰＫＲ経路を活性化するということ、および、ＰＫＲがＲＡＮタンパク質蓄積を調節するということを示唆した。
【０１５５】
ＰＫＲに媒介されるｅＩＦ２αのリン酸化を通じたＲＡＮ翻訳の上方調節。
ＰＫＲは、ＴＡＲ  ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰまたはＴＡＲＢＰ２ともまた称される）を過剰発現させることによって阻害された。共トランスフェクション実験は、ＴＡＲＢＰ２過剰発現が、ＣＡＧおよびＣＵＧ伸長ＲＮＡから発現したＲＡＮポリＡｌａおよびＣＣＵＧ転写産物から発現したポリＬＰＡＣのレベルを減少させるということを示唆する（図８Ａ〜８Ｂ）。いくつかの態様において、三元（terinary）複合体［ｅＩＦ２α−ＧＴＰ／Ｍｅｔ−ｔＲＮＡｉＭｅｔ］の形成が、ＡＵＧにて開始される翻訳のために要求される。いくつかの態様において、ｅＩＦ２αのリン酸化は、ストレスの条件下で全体的な翻訳を減少させる重要な調節メカニズムである。統合的ストレス応答経路におけるＰＫＲの役割に合致して、ＴＡＲＢＰ２によるＰＫＲ阻害は、ｐ−ｅＩＦ２αを減少させることが観察された（図８Ｂ）。これらのデータは、ＲＡＮ翻訳の調節が、伸長に誘導されるＰＫＲ活性化によって、ｅＩＦ２α経路を通じて上方調節されるということを示唆する。
【０１５６】
ｅＩＦ２α経路がＲＡＮ翻訳に影響するかどうかを直接試験するため、HEK293T細胞を、ｅＩＦ２αのWT、リン酸化模倣型（S51D）、またはリン酸化可能でないS51A突然変異の形態 を発現するＣＡＧ伸長コンストラクトで共トランスフェクトした。ｅＩＦ２αのリン酸化模倣型の形態（eIF2α-S51D）の発現は、ポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質の定常状態レベルを増加させることが観察されたが、一方、リン酸化可能でないeIF2α-S51A突然変異は、WTのｅＩＦ２αを発現する細胞と比較して効果を有さなかった（図８Ａ）。
ＩＳＲＩＢは、ｅＩＦ２αリン酸化の効果を減少させてＰＫＲを包含する全てのｅＩＦ２αキナーゼの下流効果をブロックするＩＳＲ経路インヒビターの強力なインヒビターとして同定されている。ここでは、伸長ＣＡＧおよびPKR-WTのコンストラクトでトランスフェクトされたHEK293TにおけるポリＡｌａ  ＲＡＮタンパク質レベルを、ＩＳＲＩＢが低減させるということが観察された（図８Ｃ）。
【０１５７】
ＲＡＮ翻訳におけるＰＫＲの役割を独立に試験するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してHEK293T  ＰＫＲノックアウト細胞株を生産した。いくつかの態様において、PKR KO細胞は、ＣＡＧ伸長（例として、ＤＭ１、ＳＣＡ１、２、３、６、７、８、１７、ＤＲＰＬＡ、ＨＤ、ＨＤＬ２、ＳＢＭＡ等々に関連性がある）から発現したポリＡｌａの、ならびにＣＣＵＧおよびＣＡＧＧリピート伸長ＲＮＡ（例として、筋強直性ジストロフィー２型に関連性がある）の低減したレベルを示す。ＣＡＧ、ＣＣＴＧ、ＣＡＧＧ伸長コンストラクトを使用した一過性のトランスフェクトは、ポリＡｌａ、ポリＬＰＡＣおよびポリＱＡＧＲタンパク質の劇的な低減を示す（図９）。
まとめると、これらの結果は、いくつかの態様において、リピート伸長ＲＮＡによる活性化を包含するＰＫＲ活性化が、ｅＩＦ２αリン酸化経路を通じてＲＡＮタンパク質レベルを増加させるということを示唆する。
【０１５８】
C9-500マウスモデルにおけるＲＡＮ翻訳へのＰＫＲの影響。
ドミナントネガティブPKR-K296R、または対照としてのEGFPの、ｒＡＡＶに媒介される送達を、C9orf72 ALS/FTD BACトランスジェニックマウス（C9-BAC）および非トランスジェニック（NT）の同腹子対照において、Ｐ０での脳室内（ＩＣＶ）注射を使用して実施した。各コンストラクトの概略描写が、図１０Ａに記載されている。動物の４つの群（EGFP／C9、EGFP／NT、PKR-K296R／C9およびPKR-K296R／NT）は、月齢３ヶ月までであった。遺伝子型決定は、ＰＣＲおよびサザンブロット分析の両方によって行われ、これは、C9処置群と対照群とが同等なリピート伸長サイズを有していたということを示唆した。モノクローナルＧＡ抗体を使用した免疫組織化学法（ＩＨＣ）は、PKR-K296Rを用いて処置したC9マウスが、C9 EGFP対照と比較して減少した数の、脳梁膨大後部皮質中のＧＡ集合体を有していたということを示唆した（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。
【０１５９】
同様に、メソスケール検出（ＭＳＤ）アッセイによって検出された可溶性ＧＰレベルは、C9のPKR-K296Rで処置された動物からの脳溶解物において、C9のEGFP対照と比較して低減していた。PKR-K296Rで処置された動物は、オープンフィールド試験において、C9のEGFP対照動物と比較して増加したセンタータイムを伴った改善を示した（図１０Ｄ）。加えて、DigiGait分析は、１２週での未処置のC9-500とNTのEGFP注射された対照との間で異なった１５のパラメータのうち、これらの９つのパラメータがC9のPKR-K296Rで処置された動物において改善されたことを示唆した。加えて、C9のPKR-K296R処置群からの動物は、１５のパラメータのうちの２つのみがC9のPKR-K296RとNTの処置群間で有意に異なる、類似したDigiGaitによるパフォーマンスを示した。
【０１６０】
メトホルミンはＲＡＮ翻訳を低減させ、およびリピートに誘導されるＰＫＲアクチベーションを軽減する
いくつかの態様において、メトホルミンは、ＣＡＧ、ＣＣＵＧまたはＧ４Ｃ２伸長ＲＮＡを発現する細胞においてＲＡＮタンパク質レベルを減少させるということが観察された（図１１Ａ）。メトホルミンによるＲＡＮタンパク質阻害は、PKR-K296Rでの阻害に類似し、リピート伸長ＲＮＡによって誘導されるＰＫＲ活性化をメトホルミンが軽減するということを示唆する。メトホルミンありまたはなしで処置した伸長コンストラクトの一過性トランスフェクションを実施した。タンパク質ブロットは、メトホルミンが、ＰＫＲ活性化のために要求されることが観察されている部位であるT446およびT451でのＰＫＲリン酸化を減少させるということを示唆する（図１１Ｂ）。
【０１６１】
加えて、メトホルミンおよび関連薬物フェンホルミンおよびブホルミンは、Ｇ４Ｃ２リピート伸長に誘導されるｐ−ＰＫＲレベルおよびＲＡＮポリＧＰレベルについての、類似した用量依存的阻害を媒介する（図１２）。
要約すると、メトホルミンは、哺乳動物細胞において数種のタイプのＲＡＮタンパク質のレベルを低減しており、ＰＫＲは、ＰＫＲ活性化およびｅＩＦ２αリン酸化を阻害するメトホルミン標的として同定された。
【０１６２】
メトホルミンはC9-500マウスモデルにおける神経病理学的および行動的表現型を向上させる
C9orf72マウス、C9-500 BACおよびNTマウスを、飲み水の中にメトホルミン（５ｍｇ／ｍｌ）を含むかまたは含まないものにて３ヶ月間処置した。群Ａの動物において、処置は月齢２ヶ月で、顕性の行動的または病的表現型の発症の前に始めた。群Ｂにおいては、動物のより小さなコホート（ｎ＝８／群）を、行動的表現型が明白となる月齢である６ヶ月に処置し始めた。
【０１６３】
処置レジメンを描いた模式図が、図１１Ｃにおいて示されている。群Ａマウスの５か月でのDigiGait分析は、未処置のC9とNTのコホートの間で異なった８つのDigiGaitパラメータを同定した。C9のメトホルミンで処置されたマウスでは、これらのパラメータのうちの６つが、C9の水処置群と比較して改善した（図１１Ｅ〜１１Ｇ）。同様に、群Ａのメトホルミンで処置されたC9マウスは、未処置のC9マウスと比較して、オープンフィールド試験によるセンタータイムの増加を示した。これらのデータは、この不安様行動がメトホルミン処置によって改善されたことを示唆する（図１１Ｇ）。
【０１６４】
我々のC9-BACマウスにおいて先に報告された神経炎症のマーカーであるグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）についての群Ａ動物のＩＨＣ染色は、C9のメトホルミンで処置されたものにおいて、未処置のC9動物と比較して有意に低減された（図１１Ｅ）。加えて、C9のメトホルミンで処置された動物は、発症前（８週、群Ａ）または症状のある齢（６か月、群Ｂ）に処置を始めたコホートにおけるC9対照と比較して、脳梁膨大後部皮質中のＧＡ集合体の減少した数を示した（図１１Ｄ）。C9のメトホルミンで処置された動物では、より高齢の群ＢにおいてはC9対照と比較して可溶性ＧＰレベルの減少が観察されたが、より若い群Ａの処置コホートにおいては観察されなかった（図１１Ｈ〜１１Ｉ）。
【０１６５】
まとめると、データは、メトホルミンがＲＡＮタンパク質レベルをin vitroおよびin vivoにおいて低減させ、および、メトホルミン処置がC9 BACトランスジェニックマウスにおいて行動を改善させ、かつ神経炎症を減少させるということを示唆する。いくつかの態様において、この例に記載のデータは、リピート伸長ＲＮＡが、ｐ−ｅＩＦ２ａのレベルの増加、グローバルなタンパク質合成の減少およびＲＡＮ翻訳の上方調節をもたらす状態であるＰＫＲ経路の慢性的な活性化に至らせるというモデルに合致する（図１１Ｊ）。
【０１６６】
例３：
メトホルミンを、ＣＡＧ、ＣＣＴＧまたはＧＧＧＧＣＣリピート伸長モチーフを含有するコンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるＲＡＮタンパク質翻訳に対する影響について評価した。トランスフェクトされたHEK293T細胞を、メトホルミンで処置した。図１３Ａに示された様々なリピート伸長コンストラクトでトランスフェクトされたHEK293T細胞からのタンパク質溶解物に対して、タンパク質ブロットを実行した。図１３Ｂにおいて、ＫＭＱとラベル付けされたレーンは、以下を示す：ＲＡＮポリ−Ｓｅｒ−Flag、ＲＡＮポリ−Ａｌａ−ＨＡ、ＡＴＧ開始のポリＧｌｎ−Ｍｙｃ。図１３Ｂにおいて、ＫＭＱとラベル付けされたレーンは、ＣＡＧリピート伸長のすぐ５’側に、かつ、ポリＧｌｎリーディングフレーム内に位置した、メチオニンをコードするＡＴＧを有する。
【０１６７】
ＫＫＱとラベル付けされたレーンは、ＡＵＧ開始コドンなしのＣＡＧ伸長を含有するＫＫＱベクターを指し示し、および、以下を指し示す：ＲＡＮポリＳｅｒ−Flag、ＲＡＮポリＡｌａ−ＨＡ、ＲＡＮポリＧｌｎ−Ｍｙｃ。これらのコンストラクトは、ＡＴＧ開始のポリＧｌｎおよび非ＡＴＧ開始のＲＡＮタンパク質（ポリ−Ｇｌｎ、ポリ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｃｙｓおよびポリ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）の、これらのリピート伸長にわたって発現する、Ｃ末端領域に組み込まれるエピトープタグを含有する。ＣＣＴＧとラベル付けされたレーンは、以下のＲＡＮタンパク質を発現する：ＲＡＮポリＬＰＡＣ−Flag、ＲＡＮポリＬＰＡＣ−ＨＡ、ＲＡＮポリＬＰＡＣ−Ｍｙｃ。
【０１６８】
Ｇ４Ｃ２とラベル付けされたレーンは、以下のＲＡＮタンパク質を検出するように設計されている：ＲＡＮポリＧＰ−Flag、ＲＡＮポリＧＲ−ＨＡ、ＲＡＮポリＧＡ−Ｍｙｃ。図１３Ｂにおけるタンパク質ブロットは、３つ全てのリーディングフレームにおいて、ポリ−ＬＰＡＣ（ポリ−ロイシン−プロリン−アラニン−システイン）の以下のＲＡＮタンパク質、ポリ−Ａｌａ、およびポリ−ＧＰ（ポリグリシン−プロリン）の、低減されたＲＡＮタンパク質レベルを示す。図１３Ｂは、メトホルミンが、例示のリピート伸長コンストラクトでトランスフェクトされた細胞においてＲＡＮタンパク質蓄積を阻害するということを示す。
【０１６９】
メトホルミンを、C9ORF72での処置前および後のC9ORF72伸長ポジティブである研究対象末梢血から抽出されたタンパク質における、in vivoで検出されたグリシン−プロリン（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質の定常状態レベルへの影響について評価した。これらのレベルは、ヒト研究対象において、メトホルミン（１日あたり５００ｍｇまたは１０００ｍｇのメトホルミン塩酸塩徐放錠）を、対象の医師によって処方されたとおりの異なる用量で、対象へ投与する前および投与した後に測定した。
【０１７０】
C9ORF72リピート伸長を有する単一のヒト対象から取られた血液試料において、処置前のレベルと比較したグリシン−プロリン（ＧＰ）ＲＡＮタンパク質レベルの用量依存的な低減が観察された。ＧＰレベルは、５００または１０００ｍｇ／日でのメトホルミン処置後１０〜３０日の間の複数の時点で、末梢血から単離した白血球からのタンパク質溶解物中において測定した。多重比較のための修正後、* ｐ＜０．０５、*** ｐ＜０．００１。図１４は、メトホルミンが、in vivoでC9ORF72の発現により産生されるＲＡＮタンパク質のレベルを低減させるということを示す。
【０１７１】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または類似の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられてもよい。よって、他に明示的に述べられていない限り、開示された各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の一例にすぎない。
上記の説明から、当業者は本開示の本質的な特徴を容易に確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合させるために開示の様々な変更および修正をすることができる。よって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
【０１７２】
均等物
本明細書ではいくつかの発明の態様が説明され、例示されたが、当業者は、機能を実行し、および／または結果を得るための様々な他の手段および／または構造および／または本明細書に説明した利点のうちの１つ以上を容易に想到するであろう。かかる変形および／または修正の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は発明の教示が使用されている特定の用途（単数または複数）に依存することを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の態様は具体的に説明および特許請求の範囲に記載されるもの以外の方法で実施され得ることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載されている個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法のそれぞれに関する。さらに、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が互いに矛盾していない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２つ以上の任意の組み合わせも本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１７３】
本明細書で定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書中の定義、および／または定義された用語の通常の意味を支配すると理解されるべきである。
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合によっては文書の全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、そうでないことが明確に示されていない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
【０１７４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」なる句は、そのように結合された要素、すなわち場合によっては結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」で列挙された複数の要素は、同じように、すなわち、そのように結合された要素の「１つ以上」であるものと解釈されるべきである。具体的に識別された要素に関連しているかどうかにかかわらず、「および／または」なる節によって具体的に識別された要素以外の他の要素が任意に存在してもよい。よって、非限定的な例として、「含む」などのオープンエンド言語と共に使用されるときの「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）を、別の態様では、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）を、さらに別の態様では、ＡとＢの両方（任意に他の要素を含む）等を指し得る。
【０１７５】
本明細書および特許請求の範囲で使用されるように、「または」は、上記で定義されたような「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するとき、「または」または「および／または」は包括的、すなわち、少なくとも１つを含むが、複数の数またはリストの要素も含み、任意にリストに含まれていない追加の項目も含むものとして解釈されるものとする。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または、特許請求の範囲で使用される場合「からなる」などの反対に明確に示された用語のみが、正確に１つの数の要素または要素のリストの包含を指すであろう。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「どちらか」、「の１つ（one of）」、「の１つのみ（only one of）」、または「の正確に１つ（exactly one of）」などの排他性の用語が先行するときに排他的な選択肢（すなわち「一方または他方、両方ではない」）を示すと解釈されるに過ぎない。「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲において使用されるとき、特許法の分野において使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１７６】
明細書および特許請求の範囲で使用されるように、１つ以上の要素のリストに関する句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的に列挙された各要素の少なくとも1つおよびすべての要素を含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が指す要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別されたそれらの要素に関係するか関係しないかに関わらず、任意に存在し得ることを可能にする。よって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ（Ｂは存在しない（そして、任意にＢ以外の要素を含む））を、別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（Ａは存在しない（そして、任意にＡ以外の要素を含む））を、さらに別の態様において、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＡ、および、少なくとも１つ（任意に１つより多いものを含む）のＢ（そして、任意に他の要素を含む）等を指し得る。
【０１７７】
反対に明確に示されていない限り、１つより多いステップまたは行為を含む特許請求の範囲の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が列挙されている順序に限定されないことも理解されるべきである。
特許請求の範囲ならびに上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「もつ（carrying）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）などのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、限定するものではないが含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる（consisting of）」および「から本質的になる（consisting essentially of）」という移行句のみが、それぞれ、米国特許庁の特許審査手続、第2111.03節に記載されているように、クローズまたはセミクローズの移行句であるものとする。オープンエンドの移行句（例えば、「含む」）を使用してこの文書に記載されている態様もまた、代替的な態様において、オープンエンドの移行句によって記述された特徴「からなる」および「から本質的になる」ものとして企図される。例えば、開示が「ＡおよびＢを含む組成物」を記載する場合、開示はまた、代替的な態様「ＡおよびＢからなる組成物」および「ＡおよびＢから本質的になる組成物」も企図する。
【図１Ａ−１Ｂ】
2020516674.tif 000031
【図１Ｃ】
2020516674.tif 000032
【図１Ｄ−１Ｅ】
2020516674.tif 000033
【図２Ａ】
2020516674.tif 000034
【図２Ｂ】
2020516674.tif 000035
【図２Ｃ】
2020516674.tif 000036
【図３Ａ】
2020516674.tif 000037
【図３Ｂ−３Ｃ】
2020516674.tif 000038
【図４】
2020516674.tif 000039
【図５】
2020516674.tif 000040
【図６Ａ−６Ｂ】
2020516674.tif 000041
【図６Ｃ−６Ｄ】
2020516674.tif 000042
【図６Ｅ】
2020516674.tif 000043
【図６Ｆ】
2020516674.tif 000044
【図６Ｇ】
2020516674.tif 000045
【図７Ａ】
2020516674.tif 000046
【図７Ｂ】
2020516674.tif 000047
【図８Ａ】
2020516674.tif 000048
【図８Ｂ−８Ｃ】
2020516674.tif 000049
【図９−１】
2020516674.tif 000050
【図９−２】
2020516674.tif 000051
【図１０Ａ−１０Ｃ】
2020516674.tif 000052
【図１０Ｄ】
2020516674.tif 000053
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2020516674.tif 000054
【図１１Ｃ−１１Ｅ】
2020516674.tif 000055
【図１１Ｆ−１１Ｇ】
2020516674.tif 000056
【図１１Ｈ−１１Ｉ】
2020516674.tif 000057
【図１１Ｊ】
2020516674.tif 000058
【図１２】
2020516674.tif 000059
【図１３Ａ】
2020516674.tif 000060
【図１３Ｂ】
2020516674.tif 000061
【図１４】
2020516674.tif 000062
【配列表】
2020516674000001.app
【国際調査報告】
2020516674.tif 000063
2020516674.tif 000064
2020516674.tif 000065