(57)【要約】硫酸抱合型胆汁酸の検知または検出方法として、次の方法が用いられる。 (1a) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼ〔BSS〕を作用させ、β-ヒドロキシステロイド〔B-HSD〕と共に生成した硫酸をpH発色試薬で検知する (1b) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料にBSSを作用させて生成したB-HSDを、B-HSDデヒドロゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、生成したNADHに電子伝達体を反応させた後、生成H2O2にペルオキシダーゼを作用させて発生した発生期の酸素で酸化還元系発色試薬を酸化し、発色させる (1c) 上記(1b)の方法において、生成NADHにジアホラーゼの作用下に酸化還元系発色試薬と反応させ、発色試薬を還元し、発色させる (1d) 前記(1b)の方法において、生成したNADHを、好ましくはさらに生成したNADHに電子伝達体またはNADHオキシダーゼを反応させた後、生成H2O2、還元型電子伝達体を酸化し、発生電流値を測定する【特許請求の範囲】
【請求項１】
硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分解し、β-ヒドロキシステロイドと共に生成した硫酸を発色試薬で検知することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項２】
発色試薬がpH発色試薬である請求項１記載の硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項３】
硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHに電子伝達体を反応させた後溶存酸素と反応させ、生成したH2O2にペルオキシダーゼを作用させて発生した発生期の酸素で酸化還元系発色試薬を酸化し、発色させて検知することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項４】
酸化還元系発色試薬がヨウ化カリウムまたはオルトトリジンである請求項３記載の硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項５】
硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHにジアホラーゼの作用の下に酸化還元系発色試薬と反応させ、NADHは酸化されてNAD+に変化すると共に発色試薬を還元し、発色させて検知することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項６】
酸化還元系発色試薬がテトラゾリウム塩である請求項５記載の硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項７】
硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHをアノード電極で酸化し、発生した電流値を測定することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項８】
硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHに電子伝達体およびNADHオキシダーゼの少くとも一種を反応させた後、生成したH2O2および／または還元型電子伝達体をアノード電極で酸化し、発生した電流値を測定することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項９】
電子伝達体が、フェリシアン化カリウムまたは1-メトキシフェナジンメソサルフェートである請求項８記載の硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項１０】
pH緩衝剤の存在下で加水分解以降の反応が行われる請求項３、５、７または８記載の硫酸抱合型胆汁酸の検出方法。
【請求項１１】
試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼおよびpH発色試薬が吸収配置されている硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙。
【請求項１２】
試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD+、電子伝達体、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬が吸収配置されている硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙。
【請求項１３】
試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD+、ジアホラーゼおよび酸化還元系発色試薬が吸収配置されている硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙。
【請求項１４】
試料供給側に予めpH緩衝剤を吸収配置あるいは酵素および／または酵素以外の試薬とpH緩衝剤の混合液を吸収配置させた試験紙が用いられた請求項１２または１３記載の硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙。
【請求項１５】
作用極上またはその近傍に、(1)胆汁酸硫酸スルフェターゼ、(2)β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよび(3)NAD+を含有する乾燥試薬層を形成させてなる硫酸抱合型胆汁酸バイオセンサ。
【請求項１６】
作用極上またはその近傍に、(1)胆汁酸硫酸スルフェターゼ、(2)β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、(3)NAD+および(4)電子伝達体およびNADHオキシダーゼの少くとも一種を含有する乾燥試薬層を形成させてなる硫酸抱合型胆汁酸バイオセンサ。
【請求項１７】
電子伝達体が、フェリシアン化カリウムまたは1-メトキシフェナジンメソサルフェートである請求項１６記載の硫酸抱合型胆汁酸バイオセンサ。
【請求項１８】
請求項１５、１６または１７記載のバイオセンサ、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部、計測部における計測値を表示する表示部および計測値を保存するメモリー部を備えたバイオセンサ装置。
【請求項１９】
計測部における計測方法としてポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法が適用される請求項１８記載のバイオセンサ装置。
【請求項２０】
さらに、バイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段を備え、無線手段が非接触型ICカードまたは短距離無線通信である請求項１８または１９記載のバイオセンサ装置。
【請求項２１】
作用極上またはその近傍に、胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびNAD+の少くとも一種を含有する乾燥試薬層を形成させてなるセンサに、前記試薬のうち乾燥試薬層に用いられない試薬と検体の混合溶液を導入し、発生する電流値を測定することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸量の測定方法。
【請求項２２】
作用極上またはその近傍に、胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD+および電子伝達体の少くとも一種を含有する乾燥試薬層を形成させてなるセンサに、前記試薬のうち乾燥試薬層に用いられない試薬と検体の混合溶液を導入し、発生する電流値を測定することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸量の測定方法。
【請求項２３】
作用極上またはその近傍に、胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、NAD+、電子伝達体およびNADHオキシダーゼの少くとも一種を含有する乾燥試薬層を形成させてなるセンサに、前記試薬のうち乾燥試薬層に用いられない試薬と検体の混合溶液を導入し、発生する電流値を測定することを特徴とする硫酸抱合型胆汁酸量の測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、硫酸抱合型胆汁酸の検出方法、それに用いられる試験紙およびバイオセンサに関する。さらに詳しくは、発色法または電流値測定法による硫酸抱合型胆汁酸の検出方法、それに用いられる試験紙およびバイオセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】
尿は、タンパク質や核酸代謝の終末産物や中間代謝物などを含有し、それらの物質の出現状況をみることで、腎臓など諸器官の機能や病態を知ることができるので、尿検査は各種疾患の推定、判定の重要な指標となっている。特に、尿中の硫酸抱合型胆汁酸の測定は、肝機能を知る上で臨床上重要な意義がある。そして、一般に健常人の尿中の硫酸抱合型胆汁酸濃度は、ほぼ10μモル/gクレアチニン程度である。また、血中胆汁酸濃度は、10μモル/L以下である。【０００３】
胆汁酸は、複数の化合物から構成されており、肝臓でコレステロールより生合成される。肝胆道系の異常により、血中胆汁酸が増加すると、それに伴い尿中胆汁酸が増加する。その際、尿中胆汁酸中の最も多い成分が硫酸抱合型胆汁酸である。硫酸抱合型胆汁酸は、胆汁酸の水酸基が硫酸でエステル化されたものである。【０００４】
従来、硫酸抱合型胆汁酸の測定は、例えば化学発光法で次のようにして行われている。すなわち、硫酸抱合型胆汁酸は、酵素である胆汁酸硫酸スルフェターゼ(Bile acid sulfate sulfatase;BSS)の作用で加水分解して脱硫酸され、β-ヒドロキシステロイドに変わる。生成したβ-ヒドロキシステロイドは、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(β-HSD)の作用でNAD+と反応して、3-ケトステロイドとNADHを生成する。電子伝達体の役を果す1-メトキシフェナジンメソサルフェート(1-MPMS)は、このNADHと反応して1-MPMSH2となる。【０００５】
この1-MPMSH2は、共存する溶存酸素と反応してH2O2を生成する。生成したH2O2は、ペルオキシダーゼの作用でルミノールと反応して発光する。この発光強度を測定することにより、硫酸抱合型胆汁酸の濃度を決定することができる。また、GC、GC-MS、HPLCなどの高価な測定機器を用いる方法もある。しかしながら、このような一連の工程は、煩雑であるばかりではなく、特別の測定装置を必要としている。さらに、尿を測定試料とする肝機能検査としては、他にウロビリノーゲン、ビリルビン検査などがあるが、いずれも感度、特異性、安定性、信頼性の点で問題がある。
【非特許文献１】日本化学会第７２回春季年会要旨集、１９９７，２Ｂ１１５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、硫酸抱合型胆汁酸の発色法、電流値測定法などによる検出方法であって、煩雑な操作および特別の測定装置を必要としない測定方法ならびにそれに用いられる試験紙およびバイオセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
かかる本発明の目的は、次のような手段によって達成される。
(1a) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分
解し、β-ヒドロキシステロイドと共に生成した硫酸をpH発色試薬で検知する
方法
(1b) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分
解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHに
電子伝達体を反応させた後、生成したH2O2にペルオキシダーゼを作用させて発
生した発生期の酸素で酸化還元系発色試薬を酸化し、発色させて検知する方
法
(1c) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分
解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHに
ジアホラーゼの作用の下に酸化還元系発色試薬と反応させ、NADHは酸化され
てNAD+に変化すると共に発色試薬を還元し、発色させることにより検知する方
法
(1d) 硫酸抱合型胆汁酸含有試料に胆汁酸硫酸スルフェターゼを作用させて加水分
解し、生成したβ-ヒドロキシステロイドをβ-ヒドロキシステロイドデヒドロ
ゲナーゼの存在下にNAD+と反応させ、3-ケトステロイドと共に生成したNADHを
、好ましくはさらに生成したNADHに電子伝達体およびNADHオキシダーゼの少
くとも一種を反応させた後、生成したH2O2および／または還元型電子伝達体を
アノード電極で酸化し、発生した電流値を測定することにより検出する方法
のいずれかの方法によって行われ、(1b)、(1c)および(1d)の場合には、好ましくはpH緩衝剤の存在下で加水分解以降の反応が行われることにより硫酸抱合型胆汁酸が検知または検出され、検知または検出に際しては、
(2a) 試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼおよびpH発色試薬が吸収配置されている
硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙
(2b) 試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ、NAD+、電子伝達体、ペルオキシダーゼおよび酸化還元系発色試薬が吸
収配置されている硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙
(2c) 試験紙に胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナ
ーゼ、NAD+、ジアホラーゼおよび酸化還元系発色試薬が吸収配置されている
硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙
(2d) 作用極上に、(1)胆汁酸硫酸スルフェターゼ、(2)β-ヒドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ、(3)NAD+、好ましくはさらに(4)電子伝達体およびNADHオキシ
ダーゼの少くとも一種を含有する乾燥試薬層を形成させた硫酸抱合型胆汁酸
バイオセンサ
のいずれかの試験紙またはバイオセンサが用いられ、(2b)、(2c)の場合には、好ましくは試料供給側に予めpH緩衝剤を吸収配置あるいはpH緩衝剤が酵素および／または酵素以外の試薬と混合された状態で吸収配置された試験紙から作製された硫酸抱合型胆汁酸検出用試験紙が用いられ、(2d)の場合には試薬層の形成に際しては、好ましくはpH緩衝剤が用いられる。
【発明の効果】
【０００８】
本発明方法によれば、試験紙上に胆汁酸硫酸スルフェターゼと発色試薬を必須成分として吸収配置するという手段またはバイオセンサの作用極上に必要な試薬層を形成させるという手段を用いることにより、特別な測定装置を必要とはせず、コストのかからない方法で、硫酸抱合型胆汁酸の検知を可能とする。また、バイオセンサにあっては、検量性にもすぐれており、例えば硫酸抱合型胆汁酸の主成分であるグリコリトコール酸3硫酸について、1〜20μMの間の濃度と電流値との間に良好な直線関係が認められ、また変動係数からみた測定値の再現性の点でもすぐれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明に係る硫酸抱合型胆汁酸の第一の検出方法の原理は、次の如くである。硫酸抱合型胆汁酸は、酵素であるBSSの作用で加水分解し、β-ヒドロキシステロイドと硫酸とになること前述の如くである。本発明方法においては、そこに発生した硫酸をpH発色試薬(pH指示薬)の色調の変化で検知することにより、硫酸抱合型胆汁酸の存在の有無を間接的に検知することができる。【００１０】
pH指示薬としては、1：20以下、好ましくは1：4〜6の重量比で混合し、エタノールなどに溶解させたメチルレッド-ブロムチモールブルー混合指示薬が好んで用いられるが、特にこれに限定されるものではない。メチルレッドは、酸性で赤、pH4.2〜6.2で変色し、中性、アルカリ性では黄色となる。一方、ブロムチモールブルーは、酸性では黄色で、中性領域(pH6.0〜7.6)で変色し、アルカリ性では青くなる。混合試薬では、全体として酸性で赤、中性で黄色、アルカリ性で青色に変化する。【００１１】
検出に際しては、尿を試験紙に吸収し、試験紙中で上記の如き酵素反応と指示薬の反応を行うことにより、硫酸抱合型胆汁酸の尿中での存在の有無を色調の変化で判定でき、赤色なら陽性(硫酸抱合型胆汁酸あり)、黄色または青色ならば陰性(硫酸抱合型胆汁酸なし)とすることができる。【００１２】
このような硫酸抱合型胆汁酸の検出方法に用いられる検出用試験紙は、ペーパークロマイグラフィーの原理を応用し、試験紙(素材、構造は特に限定されず、例えば0.5×5cm程度の大きさ)上に、BSSとpH指示薬とを吸収配置することによって作製される。この場合、BSSとpH指示薬とを溶解混合して試験紙に吸収配置してもよいし、試料供給側からBSS、pH指示薬の順で吸収配置させてもよい。BSSとpH指示薬は、溶液状態で試験紙上の特定の位置に染み込まされ(吸収配置)、その後乾燥させて作製は終了する。吸収配置作業は、ピペットによる作業やオートデスペンサによる方法などによって行われ、その乾燥は、酵素を失活させない条件、具体的には0〜30℃、0〜760mmHg(0〜1Pa)で行われる。【００１３】
本発明に係る硫酸抱合型胆汁酸の第二の検出方法の原理は、次の如くである。硫酸抱合型胆汁酸は、BSSの作用で加水分解し、β-ヒドロキシステロイドを生成し、これはβ-HSDの作用でNAD+と反応して3-ケトステロイドとNADHを生成し、電子伝達体、例えば1-MPMSは、このNADHと反応して1-MPMSH2となり、1-MPMSH2は溶存酸素と反応してH2O2を生成すること前述の如くであり、生成したH2O2はペルオキシダーゼの作用で発生した発生期の酸素で発色試薬を酸化し、発色させるので、その発色具合で硫酸抱合型胆汁酸の有無を判定することができる。ここで発生期の酸素とは、酸素(O2)が発生する前の、O原子の状態の酸素をいい、このO原子の酸化力はO2の状態より、比較にならないほど強力である。【００１４】
電子伝達体としては、前記1-MPMSなどが用いられ、特にこれに限定されることはない。また、酸化還元系発色試薬としては、ヨウ化カリウム、オルトトリジンなどが用いられるが、特にこれらに限定されない。さらに、検出用試験紙の作製は、硫酸によるpH変化を検知するのに用いられる試験紙の場合と同様に、H2O2生成各成分および発色試薬を吸収配置することによって行われる。【００１５】
本発明に係る硫酸抱合型胆汁酸の第三の検出方法の原理は、次の如くである。上記した如く、硫酸抱合型胆汁酸から生成されたNADHは、ジアホラーゼの作用の下で発色試薬と反応して酸化され、NAD+に変化すると共に、発色試薬は還元されて発色する。ここで、酸化還元系発色試薬としてはテトラゾリウム塩などが用いられるが、特にこれに限定されない。また、検出用試験紙の作製は、硫酸によるpH変化を検出するのに用いられる試験紙の場合とほぼ同様に、NADH生成各成分および発色試薬を吸収配置することによって行われる。【００１６】
本発明に係る硫酸抱合型胆汁酸の第四の検出方法の原理は、次の如くである。硫酸抱合型胆汁酸の主成分であるグリコリトコール酸3硫酸は、BSSの作用で加水分解され、イソリトコール酸と硫酸とになる。このイソリトコール酸にNAD+をβ-HSDの存在下で反応させると、3-ケトステロイドと共に、NADHを生成させる。この時点において、NADHをアノード電極で酸化し、発生した電流値を計測することにより、グリコリトコール酸3硫酸の濃度を間接的に測定できる。【００１７】
また、このNADHは、NADHオキシダーゼの作用によりNAD+に酸化され、尿中の溶存酸素が電子伝達体となり、H2O2が生成するので、この過酸化水素をアノード電極で酸化し、発生した電流値を計測することにより、
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グリコリトコール酸3硫酸の濃度を間接的に測定できる。【００１８】
さらに、ここでは電子伝達体として尿中に存在する溶存酸素を用いているが、尿中の溶存酸素の濃度は一定しないことが多いので、予めNADHオキシダーゼを含有する乾燥試薬層中に電子伝達体として、例えばフェリシアン化カリウム、フェロセンまたはその誘導体、ニコチンアミド誘導体、フラビン誘導体、ベンゾキノン、キノン誘導体、1-メトキシフェナジンメソサルフェート(1-MPMS)などを加えておくこともできる。【００１９】
また、NADHオキシダーゼの代りに、電子伝達体の役を果すフェリシアン化カリウムK3〔Fe(CN)6〕または1-メトキシフェナジンメソサルフェート(1-MPMS)などの電子伝達体を単独で用いることもできる。【００２０】
このように電子伝達体を単独で用いる場合には、前述の如くグリコリトコール酸3硫酸に順次BSSおよびβ-HSDを順次作用させて生成したNADHに、フェリシアン化カリウムまたは1-MPMSを反応させ、フェリシアン化カリウムまたは1-MPMSをそれぞれ2Fe(CN)6----または1-MPMSH2とする。これらは、直接電極と反応させることができ、アノード電極で酸化して発生した電流値を計測することにより、グリコリトコール酸3硫酸の濃度を間接的に測定することができる。また、共存している尿中の溶存酸素と反応して過酸化水素を発生するので、上述の如きアノード電極およびカソード電極での反応により、過酸化水素をアノード電極で酸化して発生した電流値を計測することにより、グリコリトコール酸3硫酸の濃度を間接的に測定することができる。【００２１】
硫酸抱合型胆汁酸バイオセンサは、ポリエチレンテレフタレートなどのプラスチック製基板、ポリ乳酸などの生分解性基板、紙などのバイオセンサ用基板などの各種基板上に、カーボン製、白金製、白金黒製、パラジウム製などのアノード電極(作用極)、好ましくはカーボン製のアノード電極が、カソード電極および必要に応じて参照電極と共に設けることによって形成される。カーボン製電極材料としては、グラファイト、カーボンナノチューブ、カーボンマイクロコイル、カーボンナノホーン、フラーレン、デンドリマーおよびそれらの誘導体などが用いられる。【００２２】
作用極上に形成される乾燥試薬層は、(1)一般に胆汁酸硫酸スルフェターゼ(BSS)、(2)β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(β-HSD)、(3)NAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)および好ましくはさらに(4)電子伝達体およびNADHオキシダーゼの少くとも一種を含有したもののHEPES緩衝液から形成される。【００２３】
以上第二、第三の検出方法の如く、酸化還元系発色試薬を用いる場合または第四の検出方法の場合には、例えばpH緩衝剤が加水分解以降の反応において用いられる。pH緩衝剤としては、NaH2PO4(・2H2O)およびNa2HPO4(・12H2O)から構成されるリン酸緩衝剤、酢酸と酢酸ナトリウムとから構成される酢酸緩衝剤、HEPES緩衝剤などが好んで用いられるが、特に限定はされない。これらは、溶液状態、つまり緩衝液として試験紙上に吸収配置され、その後乾燥させて試験紙が作製され、またバイオセンサにあっては、各酵素や電子伝達体の混合試薬の緩衝剤として、試薬層形成または試薬と検体の混合溶液調製に用いられる。【００２４】
pH緩衝剤を用いる理由は、2つある。その1つは、酵素の最適pHを実現することにある。また、2つ目は、尿のpHを一定にするためである。このため試験紙を用いる場合にあっては、pH緩衝剤は試験紙上でBSSや他の酵素、NAD+、電子伝達体、酸化還元発色試薬より前段(試料供給側)に吸収配置されることが望ましいが、pH緩衝剤と酵素および／または酵素以外の試薬を混合した状態で吸収配置しても良い。実際には、試験紙の試料供給側から一定の間隔でpH緩衝剤、BSSや他の酵素、NAD+、電子伝達体、酸化還元発色試薬の順序で吸収配置されるか、pH緩衝剤と酵素および／または酵素以外の試薬をそれぞれ混合あるいはすべてを混合して吸収配置してもよい。【００２５】
以上の試薬は、試験紙1枚当りBSSが約0.01〜0.50U、好ましくは約0.05〜0.10U、β-HSDが約0.1〜1.0U、好ましくは約0.5〜0.8U、ジアホラーゼが約0.05〜1.0U、好ましくは約0.1〜0.5U、ペルオキシダーゼが約0.1〜10.0U、好ましくは約1.0〜4.0Uの範囲の量で用いられ、またNAD+、pH発色試薬、酸化還元系発色試薬、電子伝達体はそれぞれ約0.01〜1mg、好ましくは約0.05〜0.30mgの範囲の量で用いられる。【００２６】
バイオセンサの試薬層の形成は、各酵素や電子伝達体の混合試薬の水性溶液、例えばpH緩衝液を、デスペンサなどにより作用極またはその近傍に滴下し、乾燥させる方法が好んで用いられるが、溶液粘度を調節し、スクリーン印刷法を適用することもできる。【００２７】
混合試薬は、作用極1mm2当りBSSが約0.01〜5U、好ましくは0.05〜1U、β-HSDが約0.01〜5U、好ましくは0.05〜5U、NADHオキシダーゼが約0〜10U、好ましくは0〜5Uの割合で用いられ、またNAD+はその終濃度が測定試料滴下後約1〜1000mM、好ましくは10〜100mMとなるような濃度で用いられ、さらに電子伝達体またはNADHオキシダーゼが用いられる場合には、その終濃度が、測定試料滴下後1〜1000mM、好ましくは10〜100mMとなる割合で用いられる。これらの各試料の電極表面または基板との結合は、乾燥後での吸着法や共有結合法による。【００２８】
なお、以上の各試薬は必ずしもすべてを乾燥試薬層形成に用いなくとも足り、乾燥試薬層形成に用いられない試薬については、乾燥状態あるいは液状で、検体と反応させた上で、センサ電極上に導入することもできる。例えば
(1)β-HSD、BSS、好ましくはさらに電子伝達体を電極上に配置したセンサに、検体およびNAD+を含む溶液を導入する方法
(2)β-HSD、好ましくはさらに電子伝達体を電極上に配置したセンサに、検体にBSSおよびNAD+を反応させた溶液を導入する方法
(3)β-HSDおよびNAD+、好ましくはさらに電子伝達体を電極上に配置したセンサに、検体にBSSを反応させた溶液を導入する方法
などを適用することによっても、硫酸抱合型胆汁酸量を測定することができる。【００２９】
上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセンサを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示する表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法またはクーロメトリー法またはボルタンメトリー法などを用いることができる。【００３０】
また、この装置には計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、測定値を遠隔的に管理する場合には、バイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段、好ましくは非接触型ICカードまたは短距離無線通信(ブルートゥース；登録商標)などの無線手段を搭載することもできる。
【実施例】
【００３１】
次に、実施例について本発明を説明する。【００３２】
実施例１
胆汁酸硫酸スルフェターゼ(6U/mg)1mgを水1mlに溶解させ、pH指示薬のメチルレッド20mgおよびブロムチモールブルー20mgを混合してエタノール1mlに溶解させた。ろ紙(0.5×5cm)の片側1cmの所から5mm間隔で、ろ紙上に酵素を溶解させた水溶液およびpH指示薬混合溶液をそれぞれ0.01ml塗布した後、4℃で24時間乾燥した。塗布した溶液のろ紙１枚あたりの成分乾燥量は、それぞれ0.06U、0.2mgおよび0.2mgである。【００３３】
試料としては、水中にグリコリトコール酸3硫酸(硫酸抱合型胆汁酸の主成分)を50μMの濃度で溶解したものを用いた。ろ紙の片側(塗布面側)に試料溶液0.1mlを滴下し、色調の変化を観察すると、pH指示薬塗布部分が赤色となり、グリコリトコール酸3硫酸の存在が確認された。一方、単に水を滴下した場合には、色調の変化は観察されなかった。【００３４】
実施例２
胆汁酸硫酸スルフェターゼ(6U/mg)1mg、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(31U/mg)2mg、ペルオキシダーゼ(250U/mg)1mg、1-MPMS 10mg、NAD+ 10mgおよびオルトトリジン10mgを、それぞれ0.1Mリン酸緩衝液1mlに溶解させた。ろ紙(0.5×5cm)の片側から2cmの所に、ろ紙上にこれらを溶解させたリン酸緩衝液0.01mlを塗布した後、4℃で24時間乾燥した。塗布した溶液のろ紙１枚あたりの成分乾燥量は、それぞれ0.06U、0.62U、2.5U、0.1mg、0.1mgおよび0.1mgである。【００３５】
試料としては、水中にグリコリトコール酸3硫酸を50μMの濃度で溶解したものを用いた。ろ紙の片側(塗布面側)に試料溶液0.1mlを滴下し、色調の変化を観察すると、試薬塗布部分が青緑色となり、グリコリトコール酸3硫酸の存在が確認された。一方、単に水を滴下した場合には、色調の変化は観察されなかった。【００３６】
実施例３
胆汁酸硫酸スルフェターゼ(6U/mg)1mg、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(31U/mg)2mg、ジアホラーゼ(10U/mg)3mgおよびNAD+(ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド)10mgを、それぞれ0.1Mリン酸緩衝液1mlに溶解させ、また酸化還元系発色試薬のテトラゾリウム塩20mgは水1mlに溶解させた。ろ紙(0.5×5cm)の片側から1cmの所から5mm間隔で上記順に従い、ろ紙上に各酵素またはNAD+を溶解させたリン酸緩衝液および発色試薬溶液をそれぞれ0.01ml塗布した後、4℃で24時間乾燥した。塗布した溶液のろ紙１枚あたりの成分乾燥量は、それぞれ0.06U、0.62U、0.3U、0.1mgおよび0.2mgである。【００３７】
試料としては、水中にグリコリトコール酸3硫酸(硫酸抱合型胆汁酸の主成分)を50μMの濃度で溶解したものを用いた。ろ紙の片側(塗布面側)に試料溶液0.1mlを滴下し、色調の変化を観察すると、発色試薬塗布部分が赤紫色となり、グリコリトコール酸3硫酸の存在が確認された。一方、単に水を滴下した場合には、色調の変化は観察されなかった。【００３８】
実施例４
胆汁酸硫酸スルフェターゼ(マルキンバイオ提供)20Uおよびソルビトール(和光純薬製品)1.6gを50mM HEPES緩衝液(pH7.5)8ml中に溶解した溶液200μlに、50mM HEPES緩衝液(pH7.5)を用いて所定濃度としたグリコリトコール酸3硫酸(シグマ社製品)溶液50μlを加え、室温で10分間反応させた。その後、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(マルキンバイオ提供)20U、β-NAD+(オリエンタル酵母製品)33.18mg(5mM)およびソルビトール1.5gを50mM HEPES緩衝液(pH7.5)10ml中に溶解した溶液250μlを加え、さらに10分間反応させ、NADHの吸収波長である340nmにおける吸光度を測定したところ、図１に示される如くグリコリトコール酸3硫酸20〜1000μMの間の濃度と吸光度の間に良好な直線関係が認められた。【００３９】
実施例５
ポリエチレンテレフタレート製基板上に、アノード電極(作用極)およびカソード電極の2本のカーボン電極をスクリーン印刷法によって形成させた。胆汁酸硫酸スルフェターゼ(マルキンバイオ提供)0.05U、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(同提供)0.15Uおよびフェリシアン化カリウム(関東化学製品)0.02mgを超純水2μlに溶解した酵素・電子伝達体溶液を作用電極上に塗布し、4℃で24時間乾燥させた。【００４０】
このようにして作製した硫酸抱合型胆汁酸測定用バイオセンサをポテンショスタットに設置し、室温条件下で測定に供した。測定試料としては、50mM HEPES緩衝液(pH7.5)中にNAD+(オリエンタル酵母製品)を20mMになるよう溶解し、さらにグリコリトコール酸3硫酸(シグマ社製品)を所定濃度に溶解したものが5μl用いられた。【００４１】
測定は、ポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法を用い、測定試料を作用電極上に滴下後90秒間静置し、その後300mVの電圧を両極間に印加し、印加30秒後の電流値を測定値とした。測定結果は図２に示される。グリコリトコール酸3硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に良好な直線関係が認められた。また、濃度10μMでの変動変数は13.0％(n＝5)であり、再現性も良好であった。【００４２】
実施例６
実施例5において、さらにNADHオキシダーゼ(マルキンバイオ提供)0.5Uを加えた酵素・電子伝達体溶液を用いて硫酸抱合型胆汁酸測定用バイオセンサを製作した。測定結果は、図３に示される。グリコリトコール酸3硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に直線関係が認められ、また変動変数も18.5％(n＝5)であった。【００４３】
実施例７
実施例5において、酵素・電子伝達体溶液の代りに、胆汁酸硫酸スルフェターゼ1Uおよびβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1Uを超純水2μlに溶解した酵素溶液を作用電極上に塗布し、4℃で24時間乾燥させた。このようにして作製した硫酸抱合型胆汁酸測定用バイオセンサを用い、実施例5と同様の条件（ただし、印加電圧は＋700ｍV）でセンサを評価した結果、図４に示されたような結果が得られた。グリコリトコール酸3硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に直線関係が認められ、また変動係数も5μMのとき17.2%(n=5)であった。【００４４】
実施例８
実施例5において、胆汁酸硫酸スルフェターゼ1U、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1Uおよびフェリシアン化カリウム0.1mgを超純水2μlに溶解した酵素・電子伝達体溶液を作用電極上に塗布し、さらに100mMのβ-NAD+を1μl塗布して、4℃で24時間乾燥させた。測定試料としては、50ｍM  HEPES緩衝液（pH7.5）中にグリコリトコール酸3硫酸を所定濃度に溶解したものが5μl用いられた。このバイオセンサを用いて、実施例5と同様の条件でセンサを評価した結果、図５に示されたような結果が得られた。グリコリトコール酸3硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に直線関係が認められ、また変動係数も5μMのとき18.4%(n=5)であった。【００４５】
実施例９
実施例５において、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ1Uおよびフェリシアン化カリウム0.02mgを超純水2μlに溶解した酵素・電子伝達体溶液を作用電極上に塗布し、4℃で24時間乾燥させた。これとは別に、胆汁酸硫酸スルフェターゼ1U、ソルビトール50mgおよび20ｍM  NAD+を含む50ｍM  HEPES緩衝液（ｐH7.5）を調製し、その緩衝液10μl中に実施例8で用いた測定試料10μlを添加し、10分間反応させた。反応液5μlを、このバイオセンサの作用電極上に滴下し、実施例５と同様の条件でセンサを評価した。得られた結果は、図６に示される。グリコリトコール酸3-硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に直線関係が認められ、また変動係数も5μMのとき8.6%(n=5)であった。【００４６】
実施例１０
実施例6において、カーボン電極の代わりに2本の白金電極をスパッタリング法によって形成し、またフェリシアン化カリウムを除いた酵素・電子伝達体溶液を用いて硫酸抱合型胆汁酸測定用バイオセンサが製作され、さらに測定は、印加電圧を700mVに変更して行われた。測定結果は図７に示される。グリコリトコール酸3硫酸1〜20μMの間の濃度と電流値の間に直線関係が認められた。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびNAD+存在下における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と吸光度の関係を示すグラフである(実施例4)。
【図２】胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化カリウムからなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用い、NAD+存在下における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と酸化電流値の関係を示すグラフである(実施例5)。
【図３】胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、フェリシアン化カリウムおよびNADHオキシダーゼからなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用い、NAD+存在下における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と電流値の関係を示すグラフである(実施例6)。
【図４】胆汁酸硫酸スルフェターゼおよびβ-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼからなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用い、NAD+存在下における生成NADHを測定することにより、グリコリトコール酸3硫酸濃度と電流値の関係を示すグラフである(実施例7)。
【図５】胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、フェリシアン化カリウムおよびNAD+からなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用いた場合における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と電流値の関係を示すグラフである(実施例8)。
【図６】β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化カリウムからなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用い、胆汁酸硫酸スルフェターゼおよびNAD+存在下における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と電流値の関係を示すグラフである(実施例9)。
【図７】胆汁酸硫酸スルフェターゼ、β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼおよびNADHオキシダーゼからなる乾燥試薬層を有するバイオセンサを用い、NAD+存在下における、グリコリトコール酸3硫酸濃度と電流値の関係を示すグラフである(実施例10)。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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