(57)【要約】  天然物由来の安全なフラボノイド化合物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療作用を有する医薬品、機能性食品又は健康食品として提供することを目的とする。  少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物を提供する。[化１]2005085223.tif 000025（式中、Ｒ1〜Ｒ6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、Ｒ1又はＲ3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、Ｒ1〜Ｒ6が同時に水素原子となることはない。）。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【化１】
2005085223.tif 000020
（式中、Ｒ1〜Ｒ6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、Ｒ1又はＲ3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。前記糖は、グルコース、アピオース−グルコース、及びグルコピラノシドウロン酸からなる群から選ばれる糖である。なお、Ｒ1〜Ｒ6が同時に水素原子となることはない。）
【請求項２】
下記式（II）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、
【化２】
2005085223.tif 000021
下記式（III）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、
【化３】
2005085223.tif 000022
下記式（IV）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、
【化４】
2005085223.tif 000023
及び下記式（V）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体
【化５】
2005085223.tif 000024
からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる、請求項１に記載の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤。
【請求項４】
請求項１に記載の化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる機能性食品。
【請求項５】
骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項４に記載の機能性食品。
【請求項６】
請求項１に記載の化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる健康食品。
【請求項７】
骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることを特徴とする、請求項６に記載の健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生薬成分由来のフラボノイドのうち、下記式（Ｉ）で表されるフラボン類の用途に関する。より詳細には、下記式（Ｉ）で表されるフラボン類、又は生理学的に許容されるこれらの塩若しくは水和物を少なくとも１種以上含有してなる健康食品、機能性食品、骨疾患の予防及び／又は治療効果を有する医薬組成物、並びに前記医薬組成物を有効成分として含有する医薬製剤に関する。【０００２】
【化１】
2005085223.tif 000002
【０００３】
（式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ水素原子又は水酸基を表し、Ｒ4は水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、Ｒ1〜Ｒ6が同時に水素原子となることはない。）。
【背景技術】
【０００４】
骨疾患は、外傷性骨折や疲労骨折等の外因性疾患と、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高副甲状腺ホルモン（以下、「PTH」ということがある。）血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳ガンの骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍その他の疾病に起因する骨組織の脆弱化、及び栄養障害による骨組織の脆弱化とに大別される。【０００５】
ヒトの骨は、骨芽細胞と破骨細胞とによる再形成と吸収とを絶えず繰り返している。このため、骨芽細胞による骨形成を破骨細胞による骨吸収が上回ったときに、骨組織の脆弱化が生じて上記のような骨多孔症や骨粗鬆症をはじめとする内因性の骨疾患が生じるといわれている。【０００６】
こうした内因性の骨疾患の中でも、骨多孔症や骨粗鬆症は高齢化社会の進展に伴って増加しつつある。また、食生活の変化と運動量の低下に伴って、カルシウムの摂取量の低下や骨組織への定着率の低下が生じ、骨組織の脆弱化が加速されている。【０００７】
骨折は、骨組織のある部分の連絡が外力によって断たれた状態をいい、骨折部位に著明な疼痛を伴う。健常人の場合には、例えば、交通事故等によってかなり大きな外力がかからない限り骨折は起こらないが、骨量が低下して骨組織が弱くなると、歩いたり走ったりしている最中にころんだ等、さほど大きくない外力がかかっただけでも骨折が起こる。また、上記のような骨粗鬆症や骨多孔症等の内因性の疾患に起因して骨量が低下している場合には、階段で躓いたり、咳込んだりしたときにかかるわずかな外力によっても骨折が生じるようになる。【０００８】
骨折が起こると、一般的には、ずれている骨の位置を牽引等によって修正し、ボルトやピンで固定できる場合には固定し、その後は患者の自然治癒力に委ねるという治療方法が採用されている。【０００９】
一方、骨多孔症や骨粗鬆症の内因性の疾患では骨の石灰質と骨基質とがともに減少しているため自然治癒が遅れ、高齢者の場合にはその間に骨折部位以外の関節が固まって動かなくなり、寝たきりになるといったケースも少なくない。【００１０】
【特許文献１】特許出願平１０−３７２８４２
【非特許文献１】Molteni, A., et al. : In vitro hormonal effects of soybean isoflavones, J. Nutr. 125, 3S, 751 (1995).
【非特許文献２】Anthony, M.S., et al. : Soybean isoflavones improve cardiovascular risk factors without affecting the reproductive system of peripubertal rhesus monkeys, J. Nutr. 126, 43 (1996).
【非特許文献３】奥田拓男：フラボノイド、天然物化学改訂第2版（三橋博他編）、p.203、（南江堂、1986）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、骨折の治療において治癒に要する期間を短縮することについては、強い社会的な要請がある。そして、医薬品として使用するためには、治療効果が高いものであると同時に、副作用が少ない等の安全性の高いものでなければならない。【００１２】
従来は、活性型ビタミンＤ3、カルシトニン及びその誘導体や、エストラジオールを初めとするホルモン剤、各種のカルシウム製剤等が臨床的に使用されてきた。【００１３】
しかし、こうした薬剤は吸収や代謝の関係から経口投与ができない場合もあり、また、受容体レベルの個人差が大きいために効果の予見性に欠けるといった問題もあった。このため、これらに代わる新たな治療剤が求められていた。【００１４】
一方、骨疾患の患者数を減少させる最も有効な手段は、骨疾患の予防である。一般的には、疾患の予防は、どの程度疾患の発症に近い段階にあるかによって、予防用医薬製剤の投与、機能性食品等の食品の摂取等が行われる。【００１５】
骨疾患においても、上述したように発症した患者に対する治療手段ばかりでなく、未発症者又は健常人が罹患しないようにするための有効な予防手段に対する社会的な要請がある。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、上記のような状況の下で、完成されたものである。すなわち、本発明の発明者らは、安全性の高さに留意しつつ、古くから生薬として使用されてきた植物に含まれる成分を中心として、骨吸収抑制作用を有する化合物のスクリーニングを進めた結果、公知の化合物に従来全く知られていなかった活性があることを見出し、本発明を完成したものである。【００１７】
こうしたスクリーニングの結果、カテキンとフラボノールに、破骨細胞の分化を阻害する活性があることが明らかになった。しかし、上記の化合物は阻害活性が低かったり、細胞のＤＮＡを損傷するといった問題点があり、医薬品や食品成分として使用することには適さないものであった。【００１８】
一方、ダイゼイン（Daidzein）、グリシチン（Glycitin）、及びゲニスチン（Genistein）等の大豆由来のイソフラボン類に女性ホルモン様作用があることが見出され、これらには心筋梗塞を予防する作用があることが報告されている（非特許文献１及び２）。【００１９】
また、フラボン類について見ると、生薬であるオウゴン（scutellariae radix）由来のフラボノイドであるバイカレイン（Baicalein）、オウゴニン（Wogonin）等には、培養細胞における血管平滑筋細胞の増殖抑制作用があることが知られている（特許文献１）。【００２０】
さらに、ルテオリン（luteolin）、アピゲニン（apigenin）等のフラボン類を食品成分として摂取すると、血液、循環器、消化器等の代謝性疾患を予防するということが報告されている（非特許文献３）。【００２１】
しかし、上記のようなフラボン類が破骨細胞の活性を抑制するや骨吸収抑制効果を有することについては、これまで報告されたものはない。【００２２】
本発明の発明者らは、以上のような状況の下で、破骨細胞による骨吸収を抑制する化合物のスクリーニングを進め、こうした作用を持ち、かつ安全性が高い、天然由来の化合物を見出し、本発明を完成したものである。【００２３】
すなわち、本発明は、少なくとも１種以上の下記式（Ｉ）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有してなる骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物である。【００２４】
【化２】
2005085223.tif 000003
【００２５】
式中、Ｒ1〜Ｒ6はそれぞれ水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる基を表す。ここで、Ｒ1又はＲ3には糖又はその誘導体が結合していてもよく、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。前記糖は、グルコース、アピオース−グルコース、及びグルコピラノシドウロン酸からなる群から選ばれる糖である。なお、Ｒ1〜Ｒ6が同時に水素原子となることはない。【００２６】
ここで、上記式（Ｉ）で表される化合物は、下記式（II）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、【００２７】
【化３】
2005085223.tif 000004
【００２８】
下記式（III）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、【００２９】
【化４】
2005085223.tif 000005
【００３０】
下記式（IV）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体、【００３１】
【化５】
2005085223.tif 000006
【００３２】
及び下記式（V）で表される化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体【００３３】
【化６】
2005085223.tif 000007
【００３４】
からなる群から選ばれる少なくとも１種以上の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を含有してなるものであることが好ましい。【００３５】
さらに、上述した化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を２種以上混合して組成物とする場合には、上記式（I）〜（V）の化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩若しくは水和物を含有するものとすることが好ましい。【００３６】
また、本発明は、上述した医薬組成物を有効成分とする骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤である。【００３７】
ここで、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤中における前記有効成分の含量は、製剤の１用量当たり０．１〜１００ｍｇであることが好ましく、０．１〜５０ｍｇであることがより好ましく、０．３〜１０ｍｇであることが特に好ましい。【００３８】
また、前記骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、錠剤、散剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、トローチ剤、及び液剤からなる群から選ばれるものであることが好ましい。【００３９】
ここで、前記骨疾患は、内因性骨疾患、外因性骨疾患、又は栄養障害のいずれに起因するものであってもよく、前記内因性骨疾患の場合には、骨多孔症、骨粗鬆症、高カルシウム血症、高PTH血症、骨ページェット病、関節炎、リウマチ、乳癌の骨転移、骨軟化症、悪性腫瘍、及び栄養障害からなる群から選ばれる疾患に起因する骨組織の脆弱化に起因するものである場合に、本発明の骨疾患の予防及び／又は治療用医薬製剤を好適に使用することができる。また、前記外因性骨疾患の場合には、外傷性骨折又は疲労骨折等の場合に好適に使用することができる。【００４０】
本発明はまた、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものを含む組成物を含有してなる機能性食品である。【００４１】
機能性食品に添加するものとしては、上述した化合物、それらの生理学的に許容される塩、それらの水和物及び配糖体のうち、それらの生理学的に許容される塩及び水和物からなる群から選ばれるものであることが好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、マグネシウム塩及びこれらの一水和物又は二水和物からなる群から選ばれるものであることがさらに好ましい。【００４２】
上記の機能性食品はまた、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。ここで、前記化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。【００４３】
上記健康食品は、骨疾患の予防及び／又は治療を補助するために使用されるものであることが好ましい。前記化合物、それらの生理学的に許容される塩、配糖体及び水和物からなる群から選ばれるものの含有量は、１００ｇ当たり０．１〜５ｍｇであることが好ましく、０．１〜３ｍｇであることがより好ましい。これらの含有量を０．３〜１ｍｇとすると、骨疾患の予防及び／又は治療を補助する効果が最も高くなる。
【発明の効果】
【００４４】
本発明によれば、優れた破骨細胞形成の抑制作用並びに骨吸収抑制作用を有する、機能性食品、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療用医薬組成物、健康食品、骨疾患の予防及び／又は治療剤が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）で刺激したMφRAW264細胞株に対するルテオリンの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果を示す図である。
【図２】図２は、50ng/mLのODF/RANKLで刺激したマウス骨髄由来M-CSF依存性細胞に対するルテオリンの濃度依存的破骨細胞分化抑制効果の結果を示す図である。
【図３Ａ】図３Ａは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン非存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン3μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン10μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、MφRAW264細胞株から形成されたアクチンリングをルテオリン30μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図４Ａ】図４Ａは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン非存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン3μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン10μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞から形成されたアクチンリングをルテオリン30μM存在下で１日培養後、TRAP染色法による確認と顕微鏡観察を行った結果を示す図面代用写真である。
【図５Ａ】図５Ａは、象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞をルテオリン非存在下で12時間培養した後の、骨吸収窩（ピット）の形成を示す図面代用写真である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞をルテオリン10μMの存在下で12時間培養した後の、骨吸収窩（ピット）の形成を示す図面代用写真である。
【図６】図６は、マウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞に対するルテオリンの濃度依存的ピット形成抑制効果の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下に、本発明をさらに詳細に説明する。本発明の骨疾患の予防及び/又は治療用医薬組成物に含まれる化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体は、フラボノイドに属し、下記式（Ｉ）で表される、フラボン類と称される化合物である。【００４７】
【化７】
2005085223.tif 000008
【００４８】
式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5及びＲ6はそれぞれ水素原子又は水酸基を表し、Ｒ4は水素原子、水酸基及びメトキシ基からなる群から選ばれる官能基を表す。ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ5が水酸基である場合には、それらのうちのいずれかに糖が結合して配糖体を形成していてもよい。なお、Ｒ1〜Ｒ6が同時に水素原子となることはない。【００４９】
フラボノイドは、植物界に広く分布する、フェニルクロマン環に近いＣ6−Ｃ3−Ｃ6炭素骨格を有する化合物群の総称である。代表的な化合物群としては、フラボン、イソフラボン、フラボノール、フラバノン、フラバン、フラバン−3,4−ジオール、フラバン−3−オール、アントシアニジン、ネオフラバノイド、オーロン、カルコン、ジヒドロカルコン等が知られている。【００５０】
フラボン類は、フラボンの骨格に、ヒドロキシル基、メトキシ基が結合した一群の化合物及びアルコキシ誘導体を含む物質群をいう。フラボン類は、その大部分が配糖体として高等植物及び下等植物のほぼ全組織に分布している。フラボン類は、それ以外のフラボノイドと異なり、Ｏ−グリコシドの他に、Ｃ−グリコシドが存在することが知られている。【００５１】
上記式（Ｉ）で表される化合物又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体としては、例えば、下記式（II）で表されるルテオリン、【００５２】
【化８】
2005085223.tif 000009
【００５３】
下記式（III）で表されるバイカレイン【００５４】
【化９】
2005085223.tif 000010
【００５５】
下記式（IV）で表されるアピゲニン【００５６】
【化１０】
2005085223.tif 000011
【００５７】
及び、下記式（V）で表されるオウゴニン【００５８】
【化１１】
2005085223.tif 000012
【００５９】
又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を挙げることができる。これら以外にも、下記表１に示す化合物を例示することができる。【００６０】
【表１】
2005085223.tif 000013
【００６１】
ルテオリンはマメ科の針葉樹Aspalathus linealisの葉（ルイボス茶）と小枝、アピゲニンはイネ科コウリャン（高粱、Sorghum nervosum）の実もしくは殻、バイカレインとオウゴニンはコガネバナ（Labiatae Scutellaria baicalensis Georgi）の根に豊富に含まれるフラボン類である。また、アピインはパセリやセロリの葉中に、ガルテオリンはスギナの葉中に含まるフラボン類である。【００６２】
これらの生理学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩等を挙げることができる。水和物としては、例えば、一水和物、二水和物等を挙げることができる。また、配糖体を形成するために結合する糖としては、例えば、グルコース、マンノース、グルコピラノース、アピオース−グルコース（アピオシルグルコース）等を挙げることができ、配糖体としては、例えば、ルテオリン  ７−グルコシド及び上記表１及び２に示すアピゲニンの配糖体であるアピゲトリン（７−Ｄ−グリコシルアピゲニン）、アピイン（アピゲニン−７−アピオシルグルコシド）等を挙げることができる。【００６３】
上述した各種のフラボンは、単独で本発明の医薬組成物の製造に使用することもでき、必要に応じて２種以上を適宜組み合わせて使用してもよい。また、これらの化合物、又はこれらの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体を含有する生薬を、単独で又は２種以上を適宜組み合わせて使用することもできる。【００６４】
こうした生薬としては、例えば、オウゴン（scutellariae radix）、黄耆等を挙げることができる。【００６５】
上述した、式（II）で表されるルテオリン、式（III）で表されるバイカレイン、式（IV）で表されるアピゲニン、式（V）で表されるオウゴニン等のフラボン類は、公知の方法又はそれに準ずる方法によって製造し、入手してもよく、市販品を購入して使用してもよい。【００６６】
また、上記のフラボン類は、植物材料から抽出、単離することによって入手することもできる。例えば、植物材料からルテオリンを単離する方法の１例を示す。【００６７】
細切したマメ科の針葉樹Aspalathus linealis（ルイボス茶）の葉に含水メタノール又は含水エタノールを加えて抽出物を得る。得られた抽出物水に溶解したのち、石油エーテル、ベンゼン等の低極性溶媒を用いて脱脂する。ついで、ブタノールで抽出することにより、ブタノール相にルテオリン及びその類縁化合物が抽出される。ここで、ルテオリンの類縁化合物には、ルテオリンの生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体が含まれる。【００６８】
以上のようにして抽出されたルテオリン及びその類縁化合物は、粗精製物のまま使用することもできるが、必要に応じてさらに精製して精製標品を得ることもできる。この精製は常法によって行うことができる。例えば、シリカゲルを固定相とし、クロロホルム／メタノールを移動相とし、移動相中のメタノール含量を順次上げるステップグラジエントカラムクロマトグラフィーによって、ルテオリン及びその類縁化合物をそれぞれ溶出させ、精製し、黄色の針状結晶又は黄色の柱状結晶等として得ることができる。【００６９】
上述したバイカレイン、アピゲニン、オウゴニンその他の上記式（Ｉ）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体も同様にして抽出、精製することができる。【００７０】
以上のようにして得られた上記式（Ｉ）で表される化合物、又は生理学的に許容される塩、水和物若しくは配糖体は、以下のようにして医薬組成物とすることができる。【００７１】
ルテオリンを単独で医薬組成物とする場合には、上述したように得られた結晶を常法に従って処理し、後述する賦形剤等と混合し、医薬組成物とすればよい。【００７２】
また、ルテオリンとバイカレインとを組み合わせて使用する場合には、ルテオリン１に対してバイカレインを０．１〜１０の割合として適宜混合し、この混合物をルテオリン単独の場合と同様にして医薬組成物とすればよい。【００７３】
これらの医薬組成物を有効成分とする医薬製剤としては、注射剤、坐剤、エアゾール剤、経皮吸収剤その他の非経口剤、錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤、液剤その他の経口剤等を挙げることができる。ここで、上記の錠剤には、糖衣錠、コーティング錠、バッカル錠が含まれ、カプセル剤には、硬カプセル剤、軟カプセル剤の双方が含まれる。また、顆粒剤には、コーティングされた顆粒剤も含まれる。また、上記の液剤には、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、エリキシル剤等が含まれ、シロップ剤にはドライシロップも含まれる。【００７４】
なお、上述した各製剤には、徐放化されていないものばかりでなく、徐放化されたものも含まれる。【００７５】
こうした製剤は、公知の製剤学的製法に従い、製剤の製造に際して薬理学的に許容され得る日本薬局方に記載の担体、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤等を用いて製造することができる。【００７６】
こうした担体や賦形剤としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯デンプン、トウモロコシデンプン、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、カンゾウ末、ゲンチアナ末等を挙げることができる。【００７７】
結合剤としては、例えば、デンプン、トラガントゴム、ゼラチン、シロップ、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース等を挙げることができる。【００７８】
崩壊剤としては、例えば、デンプン、寒天、ゼラチン末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、アルギン酸ナトリウムなど、滑沢剤としては例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、水素添加植物油、マクロゴール等を使用することができる。【００７９】
着色剤、医薬品に添加することが許容されているものであれば使用することができ、特に限定されない。また、これら以外に、矯味剤、矯臭剤等も、必要に応じて適宜使用することができる。【００８０】
錠剤又は顆粒剤とする場合には、必要に応じて、白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、精製セラック、ゼラチン、グリセリン、ソルビトール、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、フタル酸セルロースアセテート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メチルメタクリレート、メタアクリル酸重合体等を用いてコーティングしても良く、複数層でコーティングすることもできる。【００８１】
さらに、顆粒剤や粉剤をエチルセルロースやゼラチンのようなカプセルに詰めてカプセル剤とすることもできる。【００８２】
上記の化合物、又はそれらの生理学的に許容される塩、水和物及び配糖体を用いて、注射剤を調製する場合は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加することもできる。【００８３】
上述したような骨疾患予防及び／又は治療剤を患者に投与する場合には、投与量は、患者の症状の重篤さ、年齢、体重、及び健康状態等の諸条件によって異なる。一般的には、成人１日当たり１mg/kg〜2,000mg/kg、好ましくは１mg/kg〜1,000mg/kg程度を、経口又は非経口的に、１日１回若しくはそれ以上の回数にわたって投与すればよい。上記のような諸条件に応じて、投与の回数及び量を適宜増減すればよい。【００８４】
ルテオリン単独、またはルテオリンと他のフラボン類、例えば、バイカレインとを含有する医薬組成物が有効成分として製剤中に含まれる場合には、当該組成物中におけるルテオリンの含有量は、0.1〜100mgであることが好ましく、より好ましくは0.1〜50mg、さらに好ましくは0.3〜10mgである。【００８５】
有効成分であるルテオリンや他のフラボン類の含有量が下限値未満では骨吸収抑制作用が十分に発揮されず、逆に上限値を越えて添加しても、添加量に見合う効果が発揮されない。また、上限値を越えると、投与時に細胞毒性が発揮されることがあり、生体に対して望ましくない副作用を惹起するおそれがあることによる。【００８６】
上述した本発明の組成物を必要に応じて適宜添加することにより、骨疾患の予防及び/又は治療効果を有する機能性食品、若しくは健康食品を提供することができる。【００８７】
本明細書において、「機能性食品」とは、その食品自体が本来含有している栄養素によって、その食品を摂取した者に供与できる以上の利益を与え得る成分を含有する食品をいう。【００８８】
また、「健康食品」とは、健康の維持・増進に役立つ成分を抽出し、製造した粗生成物又は精製物を主成分とする粉末、顆粒剤、錠剤、カプセル剤をいい、日頃不足しがちな栄養成分の摂取を補助するサプリメントも含むものとする。【００８９】
本発明の組成物は、例えば、パン、クッキー及びビスケット、米飯添加用麦及び雑穀、うどん、そば、パスタその他の麺類、チーズ、ヨーグルトその他の乳製品、ジャム、マヨネーズ、味噌、醤油その他の大豆製品、茶、コーヒー及びココア、清涼飲料、果実飲料その他の非アルコール性飲料、薬用酒その他のアルコール性飲料、キャンディー、チョコレートその他のスナック菓子、チューインガム、せんべい、羊羹その他の大豆を原料とする菓子等に添加して、機能性食品とすることができる。【００９０】
なお、上記のヨーグルト、醤油、飲料等に添加する場合には、これらの中で本発明の組成物が結晶化して沈殿しないようにするために、溶解助剤や安定化剤を適宜加えることもできる。【００９１】
また、本発明の組成物を単独で、又は２種以上を混合し、常法に従って粉剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤とすることにより、健康食品とすることができる。【００９２】
ここで、本発明の組成物を粉末とするためには、生成過程で得られた抽出物を濃縮し、凍結乾燥、スプレードライ、真空乾燥等の方法を用いて乾燥させ、サンプルミル、ブレンダー、ミキサー等によって乾燥固体を粉砕すればよい。また、必要に応じて、コーンスターチ、馬鈴薯デンプン、デキストリン、シクロデキストリン、牡蠣殻粉末などを添加してもよい。【００９３】
また、上記のようにして得た粉末に、適宜、上述した結合剤を加えて打錠し、錠剤とすることもできる。錠剤とした後に、上述した白糖又はゼラチン等のコーティング剤を用いて、糖衣錠としてもよく、他のコーティング剤を用いて腸溶剤等にすることもできる。【００９４】
さらに、上述のようにして得た粉末を常法に従って顆粒とし、顆粒剤を製造することもできる。また、上記の粉末や顆粒を上述したカプセルに適当量充填することによって、カプセル剤とすることもできる。
【実施例】
【００９５】
以下に、本発明について、実施例を挙げてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００９６】
（実施例１）
（１−１）破骨細胞形成試験
破骨細胞形成試験には、破骨細胞様細胞に分化する、マクロファージＲＡＷ２６４細胞株（理化学研究所、cell番号RCB0535、以下、「MφRAW264」ということがある。）を使用した。MφRAW264の培養には、10％のウシ胎児血清（旭テクノグラス株式会社（IWAKI）、カタログ番号IWK-500）を含むα-MEM（INVITROGEN社製、カタログ番号11900-024）を使用した。また、破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）はPEPRO TECH INC社製、カタログ番号 310-01を使用した。【００９７】
ルテオリンは、和光純薬工業株式会社製、カタログ番号129-04001を使用した。また、96ウェルマイクロプレート及び直径100mmのディッシュは、INVITROGEN社製、カタログ番号161093及び172958をそれぞれ使用した。【００９８】
エタノール、アセトン、ホルムアルデヒド、塩化ナトリウムは和光純薬工業（株）より購入して使用した。【００９９】
（１−２）破骨細胞形成試験Ｉ
骨吸収の抑制を評価するin vitro試験法として、MφRAW264細胞株からの破骨細胞形成試験を行った。破骨細胞試験の評価は、初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性の測定とTRAP染色とによって行った。これら２つの指標を用いることにより、MφRAW264細胞の破骨細胞への分化に対するフラボン類の活性を定量的に評価することができる。【０１００】
MφRAW264細胞株を10％のウシ胎児血清（FBS）を添加したα−MEM培地（以下、「10％FBS−MEM」ということがある。）に懸濁し、100mm径のディッシュに１×105 cells/10ｍLで接種し、５％CO2 存在下、37℃にて３日間培養し、ディッシュ内で当該細胞が集密的（confluent、コンフルエント）になっていることを確認して培養を終了した。ついで、その後、コンフレントになった細胞をディッシュから0.05%のトリプシン、0.53ｍMのEDTAを含むハンクスバッファー（0.05% Trypsin-0.53 mM EDTA/HBSS（INVITROGEN社製、カタログ番号25300-054）で処理してはがし、10％FBS-MEMに懸濁して、96ウェルマイクロプレートの各ウェルに0.4×104 cells/0.1ｍLで接種し、上記と同様の条件で１日間培養した。【０１０１】
破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)を10％FBS-MEMに溶解し、100ng/mLの溶液を調製した。また、ルテオリンを10mMの濃度でメタノールに溶解したものを、ストック溶液として調製し、−20℃で保管した。ルテオリンによる処理を行うに際して、ストック溶液を希釈し、処理濃度のそれぞれの100倍濃度（3mM、1mM、300μＭ、100μM、及び3μM）の溶液を調製し、溶媒の終濃度が１％未満になるように、各ウェルに（2μLずつ）添加した。対照群には、等量のメタノールを添加した。以下の実験で使用したルテオリンは、上記の各濃度の溶液を使用した。【０１０２】
ODF/RANKLを96ウェルすべてに0.1mLずつ添加（RANKLの終濃度50ng/mL）するとともに、ルテオリン溶液をウェルに添加した（ルテオリンの終濃度は、それぞれ、0.3μM、1μM、3μM、10μM及び30μM）。対照群となるウェルには、ルテオリンを含まないメタノールを等量添加した。【０１０３】
５％CO2 存在下、37℃にて３日間培養した後に、酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性を以下のようにして測定した。
96ウェルマイクロプレートの各ウェルの培養液を捨て、このプレートをリン酸緩衝生理食塩水溶液（PBS）で洗浄したのち、10％ホルムアルデヒドを含有するPBS（以下、「10％HCHO-PBS」ということがある。）を各ウェルに満たし、細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用いて室温で１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェル内における細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性の測定（以下、「TRAPアッセイ」ということがある。）と、染色とを行った。【０１０４】
培養細胞内のTRAP活性の測定は、3.7mMのｐ−ニトロフェノール−リン酸水素二ナトリウム及び10mMの酒石酸を含有する50mMのクエン酸緩衝液（pH4.6）を用いて行った。この緩衝液を各ウェル当たり、0.1mLずつ添加し、37℃で30分間反応させた。30分後に、0.1ＭのNaOHを0.1mLずつ添加することにより反応を停止させ、遊離したｐ−ニトロフェノールを分光光度計（大日本製薬（株）製）を用いて、測定波長405nmで測定した。【０１０５】
尚、破骨細胞形成試験の結果は、対照群（コントロール）のTRAP活性を100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。【０１０６】
さらに、細胞内の酒石酸耐性酸ホスファターゼの状態をTRAP染色法により確認した。TRAP染色液は基質としてNaphtol AS-MX phosphate(SIGMA社製、カタログ番号N-4875)5 mgを0.5 mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶解し、さらに、色素としてFast red violet LB salt(SIGMA社製、カタログ番号F-1625)30 mgを50 mlの50 mM 酒石酸ナトリウム/0.1 M 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)に溶解したものを合わせて使用した。すなわち、TRAPアッセイの場合と同様に、培養後、培地を除去した。PBSで細胞層を洗浄したのち、10％HCHO-PBSを用いて細胞を室温で15分間固定した。ついで、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用いて室温でさらに１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、TRAP染色液（を加え、室温にて20〜30分間染色した。染色後、染色液を捨て、流水により洗浄し、乾燥させた後、顕微鏡で観察した。結果を図１に示す。【０１０７】
図１中、破骨細胞形成試験 Ｉの結果で得られた細胞内のTRAP活性の測定結果を、黒い棒グラフとして示した。図１から明らかなように、ルテオリンの添加によって濃度依存的にTRAP活性が抑制されることが示された。このことから、ルテオリンによってMφRAW264細胞からの破骨細胞形成が抑制されることが明らかになった。【０１０８】
（実施例２）増殖細胞数測定試験
（２−１）材料等
細胞株、培地、血清、96ウェルマイクロプレート、直径100mmのディッシュ、ルテオリン等は、実施例１で使用したのと同様のものを使用した。破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10％FBS-MEM溶液、及びルテオリンのメタノール溶液も実施例１と同様に調整した。【０１０９】
（２−２）増殖細胞数測定実験
細胞増殖および細胞の生存率を定量化するためのnon−RI法としてXTTによる呈色反応を用いた。MφRAW264細胞株を10％FBS-MEM培地に懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.4×104 cells/0.1mLで接種し１日間培養した。この後、破骨細胞分化誘導因子(ODF/RANKL)の10％FBS-MEM溶液（100ng/mL）を各ウェルに0.1mLずつ添加した（RANKLの終濃度50ng/mL）。これと同時に、ルテオリンの各濃度の溶液をウェルに添加した。なお、対照群には、ルテオリンを含有しないメタノールのみを等量添加した。【０１１０】
培養開始３日後に、市販のCell Proliferation Kit II（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、カタログ番号 1 465 015）を用いて細胞増殖を定量し、細胞生存率を求めた。操作は、添付の取扱説明書に従って実施したが、その概要は以下の通りである。【０１１１】
キットに含まれているXTT標識試薬と電子カップリング試薬とを50：１で混ぜ、各ウェルに添加されている培地0.1mL当たり50μLずつを加えて、37℃にて４時間反応させた。反応終了後、ELISAプレートリーダー（大日本製薬（株）製）を用いて、690nmを対照波長として、波長492nmにおける吸光度を測定した。【０１１２】
測定結果は、各濃度のルテオリン処理群の細胞生存率を、対照群の細胞生存率を100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。結果を図１に示す。【０１１３】
図１中、増殖細胞数測定実験の結果得られた細胞生存率の測定結果を、白抜きの棒グラフとして示した。図１から明らかなように、ルテオリンの濃度が100倍に増加しても細胞生存率は約50％までしか低下しなかった。このことから、ルテオリンはMφRAW264細胞に対して非特異的な細胞毒性は示さないこと、及びMφRAW264細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが明らかにされた（IC50＝１μＭ）。【０１１４】
（実施例３）破骨細胞形成試験II
（３−１）材料等
実施例３においては、実施例１及び２で使用したMφRAW264細胞に代えて、in vitroにおける骨吸収の抑制を評価するために、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞を使用した。マウス骨髄由来細胞は、６〜９週齢のddYマウス（雄）（中部科学資材（株））から摘出した脛骨および大腿骨より採取した。【０１１５】
硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンＧナトリウム（INVITROGEN社製、カタログ番号15140-122）、腫瘍増殖因子β（TGF-β、SIGMA社製、カタログ番号T-7039）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF、PEPRO TECH INC社製、カタログ番号300-25）以外は、実施例１と同様のものを使用した。実施例１と同様に細胞内のTRAP活性の測定とTRAP染色とを指標として、ルテオリンによる破骨細胞への分化に対する活性の評価を行った。【０１１６】
（３−２）破骨細胞形成試験II
６〜９週齢のddYマウスから脛骨及び大腿骨を摘出した。これらの脛骨及び大腿骨から、22Ｇ×1と1/4の注射針をつけた注射器で押し出すことにより、骨髄細胞を採取した。【０１１７】
得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンＧナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び１ng/mLのTGF-βを含む10％FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに、１×106 cells/0.1mL/ウェルで播種し、５％CO2、37℃の条件下で培養した。【０１１８】
培養開始３日後、50ng/mLのM-CSF及び50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）を含む培地に交換すると同時に、実施例１と同じ濃度に調整したルテオリンを添加した。なお、対照群としては、M-CSF及びODF/RANKLは含有しているが、ルテオリンを含有していない上記の培地に交換した。５％CO2、37℃の条件下でさらに培養した。【０１１９】
培地交換の後、１．５日後に、破骨細胞初期分化マーカーである酒石酸耐性酸ホスファターゼ活性を測定した。各ウェルの培養液を捨て、プレートをPBSで洗浄したのち、10％HCHO/PBSを用いて、ウェル内の細胞を室温で15分間固定した。さらに、エタノール−アセトン溶液（１：１）を用い、室温で１分間固定した。固定終了後、固定液を捨て、室温で乾燥させた。乾燥後、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）活性の測定と染色とを、実施例１と同様に行った。結果を図２に示す。【０１２０】
図２中、ルテオリンを添加した培地中で培養した骨髄細胞内のTRAP活性の測定結果を黒塗りの棒グラフとして示した。【０１２１】
また、マウスの骨髄細胞を用いた増殖細胞数測定実験も実施例２と同様に行い、細胞生存率を測定した。結果を図２に示す。図２中、細胞の生存率を白抜きの棒グラフとして示した。TRAP活性及び増殖細胞数測定実験の結果は、いずれも、対照群のこれらを100としたときの対照群に対する相対値（％）で表した。【０１２２】
図２に示されるように、ルテオリンの添加によって、濃度依存的にTRAP活性が抑制された。このことは、破骨細胞の形成がルテオリンによって濃度依存的に阻害されることを示す。また、XTTアッセイ（増殖細胞数測定実験）の結果から、ルテオリンが非特異的な細胞毒性を示さないことも明らかになった。以上より、ルテオリンは、非特異的な細胞毒性は示さず、マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞のRANKLによる破骨細胞への分化を濃度に依存して顕著に抑制することが示された（IC50＝3μM）。【０１２３】
（実施例４）破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成試験Ｉ
（４−１）材料等
MφRAW264細胞、ウシ胎児血清、α―MEM、ODF/RANKL、96ウェルマイクロプレート、ルテオリンは、実施例１と同様のものを使用し、同様に調製して使用した。PD98059は（CALBIOCHEM社製、カタログ番号153000）を使用した。【０１２４】
（４−２）アクチンリングの形成試験Ｉ
MφRAW264細胞株を、10％FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに0.8×10５ cells/0.1mL/ウェルで接種し、５％CO2、37℃の条件で１日間培養した。この後、100ng/mLのODF/RANKLと20μMのPD98059とを含む上記の培地0.1mLを添加し、さらに同じ条件で培養した（RANKLの終濃度50ng/mL、PD98059の終濃度10μM）。【０１２５】
活性化破骨細胞まで分化を進行させるため、ODF/RANKLとPD98059添加してから２日後に50ng/mLのODF/RANKLを含む上記の培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されたところで、実施例１と同様に調製したルテオリン溶液を添加し、さらに１日間培養した。なお、対照群のウェルには化合物を含まないメタノールのみを加えて、さらに１日培養を続けた。【０１２６】
ルテオリンを添加して１日培養した後に、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色を実施例１と同様に行った。結果を図３Ａ〜Ｄに示す。【０１２７】
図３Ａ〜Ｄに示されるように、対照群ではアクチンリング形成が認められたが（図３Ａ）、ルテオリン処理群では３μＭ以上の濃度で処理した場合には、アクチンリングが濃度依存的に破壊されていることが示された（図３Ｂ〜Ｄ）。【０１２８】
アクチンリングはODF/RANKL及びPD98059で処理したMφRAW264細胞株の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体であることから、ルテオリンは、破骨細胞の分化だけでなく、活性化構造体の維持を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。【０１２９】
（実施例５）破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成試験II
（５−１）材料等
硫酸ストレプトマイシン及びペニシシンＧナトリウム、TGF-β、M-CSF以外のものは実施例１と同様のものを使用し、これらについては実施例３と同様のものを使用した。【０１３０】
（５−２）アクチンリングの形成試験II
また、実施例３と同様にして、６〜９週齢のddYマウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を採取した。【０１３１】
得られた骨髄細胞を、100U/mLのペニシリンＧナトリウム塩、100μg/mLの硫酸ストレプトマイシン、50ng/mLのM-CSF、及び１ng/mLのTGF-βを含む10％FBS-MEMに懸濁し、96ウェルマイクロプレートに、１×10６ cells/0.1mL/ウェルで播種し、５％CO2、37℃の条件下で培養した。【０１３２】
培養開始３日後、50ng/mLのM-CSF及び50ng/mLの破骨細胞分化誘導因子（ODF/RANKL）を含む培地に交換して、破骨細胞活性化構造体であるアクチンリングの形成が確認されるまで、同様の条件で培養を続けた。アクチンリングが形成されたところで、実施例１と同様に調製したルテオリン溶液を添加し、さらに１日間培養した。なお、対照群としては、交換した上記の培地に溶媒だけを添加した。【０１３３】
ルテオリンを添加して１日培養した後に、各ウェルの細胞の酒石酸耐性酸ホスファターゼ（TRAP）染色を実施例１と同様に行った。結果を図４Ａ〜Ｄに示す。【０１３４】
図４Ａ〜Ｄに示されるように、対照群ではアクチンリング形成が認められたが（図４Ａ）、ルテオリン処理群では３μＭ以上の濃度で処理した場合には、アクチンリングが濃度依存的に破壊されていることが示された（図４Ｂ〜Ｄ）。【０１３５】
アクチンリングは、M-CSF及びTGF-β又はODF/RANKLの処理マウス骨髄由来M-CSF依存性細胞の培養によって形成された破骨細胞の活性化構造体であることから、ルテオリンは、破骨細胞の分化だけでなく、活性化構造体の維持を阻害することによって骨吸収を抑制するものと考えられた。【０１３６】
以上より、ルテオリンは、マクロファージ由来の株化細胞を培養した場合、及びマウスの骨髄細胞を培養した場合のいずれにおいても、それ自身がこれらの細胞に対して非特異的な細胞毒性は示すことなく、濃度依存的にRANKLによる破骨細胞への分化を強く抑制することが証明された。また、ルテオリンが濃度依存的にアクチンリングの維持を阻害したことから、活性化された破骨細胞による骨吸収を顕著に抑制することも示された。【０１３７】
（実施例６）共存培養による破骨細胞形成及び骨吸収窩形成法
共存培養は、オブライエンらの方法（Charles A. O'Brien et al.; J. Biol. Chem. 274(27), 19301-19308 (1999)）で樹立した細胞UAMS-32とマウスの大腿骨由来の骨髄細胞を用いて行った。【０１３８】
前記実施例３の方法で調製したマウス骨髄細胞（200×104 cells/ディッシュ）と骨芽細胞UAMS-32（100×104 cells/dish）を活性型ビタミンD3（和光純薬工業（株）製、カタログ番号 031−14281）10nM、プロスタグランジンE2（和光純薬工業（株）製、カタログ番号 163−10814）１mMを含むα-MEM培地(20ml)で懸濁した。その後、直径10cmのコラーゲンゲルコート培養ディッシュ上に５％CO2、37℃の条件下で6日間培養することによって破骨細胞分化を誘導させた。【０１３９】
6日間培養後にコラゲナーゼ（和光純薬工業（株）製、カタログ番号 032−10534）を終濃度が0.1%になるように溶解させることによって破骨細胞を回収した。【０１４０】
象牙切片（厚さ：約0.2m、直径：約4mm）を96穴のプレートに設置し、終濃度が10μMになるようにルテオリンを含んだα-MEM培地（100μl）を添加した。【０１４１】
上記共存培養系で得られた破骨細胞をα-MEM培地で適度に希釈し（約10ml/ディッシュ）、よく懸濁した。この破骨細胞懸濁液を100μl/wellずつ、細胞が象牙切片上に接着するように各ウェルに丁寧に添加した。12時間培養後、象牙切片上の骨吸収窩をトルイジンブル（toluidine blue溶液）（シグマ社製、カタログ番号 T3260-5G）で染色し、その吸収窩（ピット）をカウントした。【０１４２】
象牙切片上にマウス骨髄細胞と骨芽細胞との共存培養から調製した破骨細胞を培養すると、培養12時間後に図５Ａに示すように多数の骨吸収窩（ピット）を形成した。10μMのルテオリンの存在下で培養すると、図５Ｂのようにピット数が著しく減少した。【０１４３】
また、添加したルテオリンの濃度とピット数との関係を表したグラフを図６に示した。なお、培養細胞のルテオリンの添加方法及び添加量は、上記実施例１と同様の条件で行った。図６に示すとおり、ルテオリンが濃度依存的に破骨細胞によるピットの形成を抑制し、10μMの添加では95%以上の阻害活性を示した。【０１４４】
上記より、ルテオリンは破骨細胞の初期分化を阻害するのみではなく成熟破骨細胞の骨吸収機能を直接的に抑制することが明らかとなり、骨吸収抑制剤として骨粗鬆症などの骨疾患の予防や改善効果が期待できる。【０１４５】
ルテオリンは従来から生薬として使用されてきたフラボノイドの一種であることから、フラボン類を骨疾患の予防及び／又は抑制のための機能性食品、医薬組成物、及び医薬として有用であることが示された。【０１４６】
（製剤例）
次に、本発明の組成物を含有する製剤例を示すが、本発明はこれらに限定されるものではない。【０１４７】
（製剤例１  錠剤）
2005085223.tif 000014
【０１４８】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後に圧縮打錠して重量300mgの錠剤を製造することができる。【０１４９】
（製剤例２  硬カプセル剤）
2005085223.tif 000015
【０１５０】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、硬カプセルに300mgずつ充填することにより、硬カプセル剤を製造することができる。ここで、組成物１は、ルテオリンと乳糖とを１：１で混合したものである。なお、製剤例３〜６で使用する組成物１は上記と同じものである。【０１５１】
（製剤例３  軟カプセル剤）
2005085223.tif 000016
【０１５２】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、軟カプセルに100mgずつ充填することにより、軟カプセル剤を製造することができる。【０１５３】
（製剤例４  顆粒剤）
2005085223.tif 000017
【０１５４】
上記の成分をそれぞれ秤量し、均一に混合した後、常法に従って顆粒剤を製造することができる。【０１５５】
（製剤例５  シロップ剤）
2005085223.tif 000018
【０１５６】
上記の成分をそれぞれ秤量し、糖及びサッカリンを注射用蒸留水60ｍLに溶解した後、グリセリン及びエタノールに溶解された組成物２及び調味料の溶液を加える。この混合物に精製水を加えて、最終容量を100ｍLにすることにより、経口投与用のシロップ剤を製造することができる。【０１５７】
（製剤例６  顆粒剤）
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【０１５８】
上記の成分をそれぞれ秤量し、組成物３を常法によって珪酸カルシウムに吸着させて微粒子とし、散剤を製造することができる。
【産業上の利用可能性】
【０１５９】
式（Ｉ）の化合物を有効成分として含有する医薬組成物、医薬製剤、健康食品、機能性食品等の分野において有用である。
【図１】
2005085223.tif 000026
【図２】
2005085223.tif 000027
【図６】
2005085223.tif 000028
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2005085223.tif 000031
【図３Ｄ】
2005085223.tif 000032
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2005085223.tif 000034
【図４Ｃ】
2005085223.tif 000035
【図４Ｄ】
2005085223.tif 000036
【図５Ａ】
2005085223.tif 000037
【図５Ｂ】
2005085223.tif 000038
【国際調査報告】
2005085223.tif 000039
2005085223.tif 000040