(57)【要約】  溶液中の標的金属を結合する方法である。標的金属を結合する方法は、i)標的金属を含有する溶液を、ii)藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画、又はカプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画と接触させて、標的金属と、カプセル化滲出物若しくはその分画、又はカプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画との錯体を形成する工程、及び任意選択で錯体を溶液から分離する工程を含む。また本開示は、生物吸着剤要素、並びに溶液中の金属を結合することにおいてそれを使用する方法に関する。
2020516768.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的金属を結合する方法であって、
i)標的金属
を含有する溶液を、
ii)カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は
藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画
と接触させて、
前記標的金属と、前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記カプセル化滲出物若しくはその分画との錯体を形成する工程、及び
任意選択で錯体を前記溶液から分離する工程、
を含む方法。
【請求項２】
前記標的金属を結合することが、カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画を含有する溶液と接触させて、前記標的金属と前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画との錯体を形成する工程、及び任意選択で前記錯体を前記溶液から分離する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記藻類鞭毛虫が、クラミドモナス科、クリプト藻綱、渦鞭毛藻類、ユーグレナ科、ハプト植物門又はこれらの混合物である、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
前記藻類鞭毛虫が、クラミドモナス種、クリプト植物門種、渦鞭毛植物種、ユーグレナ種又はこれらの混合物である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記藻類鞭毛虫が、クラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・グラシリス、ユーグレナ・ムタビリス又はこれらの組合せである、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記藻類鞭毛虫がユーグレナ・グラシリスである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記金属が、銀、金、アルミニウム、ヒ素、バリウム、ベリリウム、ビスマス、カルシウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、カリウム、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ナトリウム、ニッケル、リン、白金、パラジウム、鉛、アンチモン、セレニウム、スズ、ストロンチウム、タリウム、チタン、ウラニウム、バナジウム、タングステン、イットリウム、亜鉛、スカンジウム、ランタン、希土類元素又は二価遷移金属を含み、任意選択で、前記方法により前述の少なくとも2つ以上を含む複数の金属を結合する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記溶液が、水、任意選択で廃水であり、前記方法が、除去されるべき1種以上の金属を有する水又は廃水の改善のためのものである、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記廃水が、家庭廃水、都市廃水、産業廃水又はこれらの組合せである、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記産業廃水が採掘作業による排水を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、除去されるべき前記金属を有する採掘処理水の改善のためのものであり、前記水が採掘処理水である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記分離が、前記錯体を微生物又は微生物材料と接触させて、前記錯体を封鎖することを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記藻類鞭毛虫培養物の滲出物が、グルタチオン、メタロチオネイン、フィトケラチン、ポリリン酸塩、多糖類又はこれらの組合せを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物、前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス又は前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマスが、球状化又はゲル化されている、請求項2〜13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記球状化又はゲル化の方法が、前記藻類鞭毛虫培養物の滲出物、前記乾燥ユーグレナバイオマス又は前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマスを固定化マトリックス中にカプセル化することを含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記固定化マトリックスが、樹脂、ポリマープラスチック又は薄膜中の拡散勾配(DGT)を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記固定化マトリックスが、寒天、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロース、キトサン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニル又はこれらの組合せを含む、請求項15又は16に記載の方法。
【請求項１８】
前記固定化マトリックスがアルギン酸ナトリウムを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
前記藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物、前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス又は前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマスが、閉じ込め要素に収容されている、請求項2〜18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記閉じ込め要素が半透過膜を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記半透過膜が一体型非対称膜又は薄膜複合膜を含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマスの活性物質の質量当たりの、封鎖される金属の量又は種類が、球状化又はゲル化される前の採取後処理によって改変される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記採取後処理が、前記バイオマス又はその分画を加熱することを含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
異なる金属結合選択性を持つ、前記藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物、前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス、前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス及び/又は前記採取後処理済みカプセル化乾燥ユーグレナバイオマスが、複数のカラムに収容され、前記カラムがカラム排出液を生成するように配置される、請求項22又は23に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のカラムが、少なくとも第1のカラム、第2のカラム及び第3のカラムを含んで直列に配置され、前記溶液が前記カラムの中を順番に流れて、前記カラム排出液を生成する、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記第1のカラムが銅に選択的に結合し、前記第2のカラムが銀に選択的に結合し、前記第3のカラムが金に選択的に結合する、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的金属を脱着する工程を更に含む、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記脱着が前記錯体を脱着剤と接触させることを含む、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記脱着剤が、酸性又は塩基性の溶液を含み、任意選択で塩酸、硝酸、硫酸及びクエン酸のうちの1つ以上を含み、任意選択で水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムのうちの1つ以上を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記脱着剤がシアン化カリウム又はチオ尿素を含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的金属が貴金属を含み、任意選択で金、銀、白金又はパラジウムを含む、請求項27〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的金属を前記錯体から脱着した後、前記藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画、前記カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画が、標的金属を含有する第2の溶液と接触する、請求項27〜31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
乾燥ユーグレナバイオマス、湿潤ユーグレナ若しくはユーグレナ滲出物又はそれらの分画を、中を通過する溶液から金属を吸着するのに十分な量で担持する基材を含む、生物吸着剤要素。
【請求項３４】
前記生物吸着剤要素が、複数の薄膜にわたる拡散勾配の生物吸着剤である、請求項33に記載の生物吸着剤要素。
【請求項３５】
前記生物吸着剤要素が、銀、金、アルミニウム、ヒ素、バリウム、ベリリウム、ビスマス、カルシウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、カリウム、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ナトリウム、ニッケル、リン、白金、パラジウム、鉛、アンチモン、セレニウム、スズ、ストロンチウム、タリウム、チタン、ウラニウム、バナジウム、タングステン、イットリウム、亜鉛、スカンジウム、ランタン、希土類元素及び二価遷移金属を含む金属を結合する、請求項33又は34に記載の生物吸着剤要素。
【請求項３６】
前記生物吸着剤要素が、除去されるべき前記金属を有する廃水の改善における使用のためのものであり、前記水が廃水であり、任意選択で前記廃水が活性炭と接触する前のものである、請求項33〜35のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素。
【請求項３７】
前記廃水が、家庭廃水、都市廃水、産業廃水又はこれらの組合せである、請求項36に記載の生物吸着剤要素。
【請求項３８】
前記産業廃水が採掘作業による排水を含む、請求項37に記載の生物吸着剤要素。
【請求項３９】
前記乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記ユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画が、グルタチオン、メタロチオネイン、フィトケラチン、ポリリン酸塩、多糖類又はこれらの組合せを含む、請求項34〜38のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４０】
前記乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記ユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画が、透析容器又は透析バッグに含有されている、請求項34〜39のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４１】
前記乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記ユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画が、複数の薄膜にわたって拡散勾配で埋封され、任意選択で拡散勾配技術(DGT)である、請求項34〜40のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４２】
前記乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記ユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画が、球状及び/又はゲル状である、請求項34〜41のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４３】
前記生物吸着剤要素が、前記乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は前記ユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画をカプセル化する固定化マトリックスを含む、請求項42に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４４】
前記固定化マトリックスが樹脂又はポリマープラスチックを含む、請求項43に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４５】
前記固定化マトリックスが、寒天、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロース、キトサン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニル又はこれらの組合せを含む、請求項43又は44に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４６】
前記固定化マトリックスがアルギン酸ナトリウムを含む、請求項45に記載の生物吸着剤要素。
【請求項４７】
標的金属を結合する方法であって、
標的金属を含有する溶液を、請求項33〜46のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素と接触させる工程、及び任意選択で前記錯体を前記溶液から分離する工程を含む、方法。
【請求項４８】
標的金属を結合するための、請求項33〜47のいずれか一項に記載の生物吸着剤要素の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年4月7日出願の米国特許仮出願第62/482,952号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、金属を結合する方法、生物吸着剤(biosorbent)要素、並びに金属の結合及び水質改善(water remediation)における生物吸着剤要素の使用方法に関する。例えば、本開示は、廃水又は採掘処理水等の水において金属を結合するための、方法及び藻類鞭毛虫培養物のカプセル化された滲出物若しくはその分画又はカプセル化された乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
金属めっき、採掘、肥料生産、皮なめし操作、電池製造、パルプ製紙並びに農薬製造及び使用によって生じる産業廃水は、環境への重金属放出の供給源であり、生態に対して脅威を生み出しているのみならず、ヒトの健康に対して重大な結果をもたらすこともある(Fu及びWang、2011年)。したがって、地表水及び地下水への潜在的な暴露の前に、産業排水から毒性金属を効率的に除去する必要性が存在する。
【０００４】
採掘作業は、歴史的に周囲環境における高い金属レベルの一因となってきた(Kellerら、2007年)。従来の金属除去方法は、化学沈殿、樹脂ベースイオン交換及び活性炭、並びに濾過、浮遊及び凝固を利用する物理的方法を含み得る(Fu及びWang、2011年)。しかし、これらの方法は、大きな資本及び運転費、相当なエネルギー必要量、並びに大量の毒性廃棄物質を生じる傾向があり得る(Wang及びChen、2009年)。加えて、これらの手法は、低い(<100mg/L)濃度で有効性を欠く傾向もあり、処理されるべき廃水の量に関して法外に高価になる可能性もある(Volesky、2001年)。
【０００５】
代替案としては、産業廃水を改善するための生物材料の使用は、一般的に生物吸着及び/又は生物蓄積と呼ばれ、従来の方法に対していくつかの利点をもたらし、これには、偏在性、化学及び/又は生物学的汚泥の最小化、広範囲の物理化学的条件における操作、比較的低い資本投資及び運転費、並びに希釈排水から汚染物質除去の効率増加が含まれる(Abbasら、2014年;Malik、2004年)。
【０００６】
生バイオマス(living biomass)及び非生バイオマス(non-living biomass)は両方とも金属除去への利用に成功しており、広範囲に研究されているが、非生バイオマスの使用が近年の大部分の金属除去研究において好まれる選択肢になっている(Fomina及びGadd、2014年;Doshiら、2007年;Kizilkayaら、2012年;Kumarら、2015年;Michalakら、2013年)。非生の生物材料の使用は、栄養必要量の排除、毒性閾値、脱着及び金属回収手順の許容、並びに面積に対する細胞表面の比の増加による吸着容量の潜在的な改善等、代謝的に活性な生物体の利用と比較していくつかの利点をもたらす(Donmezら、1999年;Kadukova及びVircikova、2005年)。藻類の生細胞も、イオンが細胞内に結合するので及び/又は代謝滲出物が細胞外の金属イオンと錯体を形成して、水性相中に金属を保持するように機能し得るので、金属回収に関して制限される。
【０００７】
非生の生物材料は、藻類の生細胞と比較したとき、溶液から同程度又はより多くの量の金属イオンを効率的に除去する潜在力を有する(Burdin及びBird、1994年;Tienら、2005年)。上記の非生藻類の特徴は、インフラストラクチャーの開発が物理的及び経済的な制限のために制約されている潜在的な遠隔地に、そのような物質を改善用途で使用する経済的な実現性において大きな部分で寄与する。加えて、金属の除去に生資源ではなく不活性藻類材料を使用することは、表面化学の変更をもたらし、カチオン吸着に影響を及ぼす可能性がある(Tienら、2005年)。藻類生物体の細胞表面は、多糖類、タンパク質及び脂質の種別からなり、全て、金属イオンに結合することができる官能基(例えば、カルボキシル、アミノ、チオール、スルフェート及びヒドロキシル基)を含む(Cristら、1981年)。細胞表面/構造の改質は、加熱乾燥、化学処理及び真空乾燥等の不活性化方法を利用したときに生じる可能性があり、これらによって、吸着容量の増加又は減少をもたらすことがあり、この点において、生物材料の起源及び前処理に依存する(Gardea-Torresdeyら、1990年;Winterら、1994年)。
【０００８】
ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)は、原生生物の浮遊性鞭毛単細胞種であり、重金属に耐容性があり蓄積することが見いだされている(Rodriguez-Zavalaら、2007年)。これは廃水のバイオレメディエーション(bioremediation)に使用する候補である(Mendoza-Cozatlら、2006年;Olaveson及びNalewajko、2000年)。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、本開示は、
標的金属を結合する方法であって、
i)標的金属
を含有する溶液を、
ii)藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画、又は
カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画
と接触させて、
標的金属と、カプセル化滲出物若しくはその分画、又はカプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画との錯体を形成する工程、及び
任意選択で錯体を溶液から分離する工程、
を含む方法を含む。
【００１０】
本開示は、乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又はユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画を、中を通過する水から金属を吸着するのに十分な量で担持する基材を含む、生物吸着剤要素、及び水中の金属を結合することにおける生物吸着剤要素の使用方法も含む。
【００１１】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な記載によって明白となる。しかし、詳細な記載及び具体的な例は、本開示の実施形態を示しているが、例示のためだけに提示されており、特許請求の範囲は、これらの実施形態によって制限されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることが理解されるべきである。
【００１２】
ここで本開示は、図を参照しながら、より詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】乾燥ユーグレナバイオマスのフーリエ変換赤外分光(FTIR)スペクトルを示す。
【図２】非生ユーグレナ・グラシリス(E. gracilis)に対するCu2+吸着動態を初期濃度の(A)20ug.L-1、(B)50ug.L-1、(C)1mg.L-1、(D)25mg.L-1で示す。(A)及び(C)は、擬一次(PFO)動態モデルを示す。(B)及び(D)は擬二次(PSO)動態モデルを示す。
【図３】非生ユーグレナ・グラシリスに対するNi2+吸着動態を初期濃度の(A)1mg.L-1、(B)2mg.L-1、(C)4mg.L-1、(D)20mg.L-1で示す。(A)及び(C)は、擬一次(PFO)動態モデルを示す。(B)及び(D)は、擬二次(PSO)動態モデルを示す。
【図４】非生ユーグレナ・グラシリスに対するCu2+吸着平衡示す。(A)はフロイントリッヒモデルを示し、(B)はラングミュアモデルを示す。
【図５】非生ユーグレナ・グラシリスに対するNi2+吸着平衡示す。(A)はフロイントリッヒモデルを示し、(B)はラングミュアモデルを示す。
【図６】二成分金属溶液における生ユーグレナ・グラシリスに対するCu2+及びNi2+吸着平衡示す。エラーバーは標準誤差(SE)を表す。Cu2+は中実円であり、Ni2+は中空円である。
【図７】試料の作業場所を示す。
【図８】アルギン酸塩ビーズを内部に有する(A)単一充填カラム及び(B)並列充填カラムを示す。
【図９】(A)作業場所A及び(B)作業場所KにおけるWBSビーズによる標的金属の除去を示す。
【図１０】前処理した後のAuの改善された吸着を示す。
【図１１】作業場所Aにおける(A)列1及び(B)列3での金属負荷の比較を示す。
【図１２】指数期及び定常期における、グルコース補充を有する又は有さない、(A)暗及び(B)明条件下でのユーグレナ・グラシリス増殖についてのFTIRスペクトルを示す。トレース(i):指数期のユーグレナ・グラシリス培地(EGM)。トレース(ii):指数期のEGM+グルコース。トレース(iii):定常期のEGM。トレース(iv):定常期のEGM+グルコース。
【図１３】ユーグレナ・グラシリスが(A)明及び(B)暗条件下で増殖するとき、異なる増殖期に見られる分子種を示す。
【図１４】異なる培養条件下で増殖させたユーグレナ・グラシリスにおける化合物クラスの存在度を示す。
【図１５】元素比による細胞組成の多変量変動(multivariate variation)を示す。ベクトルは分布全体に対する各変数の方向及び強さを示す。
【図１６】(●)指数期及び(◆)定常期における、明(中空)及び暗(中実)条件下で増殖させたユーグレナ・グラシリスに関わる化合物クラスの存在度による細胞組成の多変量変動を示す。ベクトルは分布全体に対する各変数の方向及び強さを示す。
【図１７】(A)明及び(B)暗増殖細胞の代表的なフラクトグラム(fractogram)を示す。複製1及び2は、それぞれ赤色線及び青色線で示されている。空試験は黒色線で示されている。
【図１８】(A)明及び(B)暗で増殖させた組合せ分画及び非分画上澄みのベン図表を示す。
【図１９】明及び暗条件下で増殖させた細胞における化合物クラスの存在度を示す。
【図２０】ユーグレナ・グラシリスの明暗組合せ分画及び非分画部分の分布m/zを示す。
【図２１】(A)明及び(B)暗増殖分画のm/z値についてのベン図表を示す。
【図２２】(A)明及び(B)暗条件下で増殖させた細胞から単離されたAF4分画に見いだされた化合物クラスの存在度を示す。
【図２３】明(中空)及び暗(中実)条件下での化合物クラスの存在度によるAF4分画における細胞組成の多変量変動を示す。組合せ試料及び非分画試料は、それぞれ上向き三角形及び下向き三角形で示されている。ベクトルは分布全体に対する各変数の方向及び強さを示す。
【図２４】250pMのHg(NO3)2に暴露された異なる非分画藻類の関数としての生物発光応答を示す。
【図２５】金属の受動的濃縮(passive concentration)及び除去のために、非生ユーグレナ細胞及び/又はユーグレナから遊離された滲出物を結合吸着剤として薄膜(DGT)アセンブリに拡散勾配で組み込むことを示す。
【図２６】小型の化合物(SRFA)、中型の化合物(ユーグレナ滲出物)及び大型の化合物(ユーグレナ細胞)を保持する透析バッグの機能を示す。
【図２７】ユーグレナ滲出物の透析物がSRFAと比較して僅かに多く濃縮されたことを示す。
【図２８】4日後の透析物バックには、ユーグレナ細胞が見当たらなかったことを示す(C)。4日後の透析物バックには、元の細胞(A)が全て保持された(B)。
【図２９】Hg適応ユーグレナ・グラシリス細胞に対する、正常(Nm)に増殖させた若い世代の細胞による金属吸着の変化を示す。
【図３０】Hg適応ユーグレナ・グラシリス細胞に対する、正常(Nm)に増殖させた古い世代の細胞による金属吸着の変化を示す。
【図３１】Hg適応ユーグレナ・グラシリス細胞の若い世代と古い世代の金属吸着比を示す。
【図３２】キレックス(実線)及びユーグレナ細胞(破線)のFTIRスペクトルを示す。
【図３３】非暴露DGT-キレックス及びDGT-ユーグレナ樹脂における蓄積金属質量を示す。
【図３４】20℃でのDGT-ユーグレナ結合樹脂の拡散係数を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
I.定義
特に指示のない限り、本セクション及び他のセクションに記載されている定義及び実施形態は、適切であれば本明細書に記載されている本開示の全ての実施形態及び態様に適用可能であることが意図され、このことは当業者に理解される。
【００１５】
本開示の範囲を理解するために、用語「含む(comprising)」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、記述された特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程の存在を特定する開放型用語であるが、記述されなかった他の特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程の存在を除外しないことが意図される。前述は、用語「含む(including)」、「有する(having)」及びこれらの派生語等と類似した意味を有する語句にも当てはまる。用語「からなる(consisting)」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、記述された特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程の存在を特定する閉鎖型用語であり、記述されなかった他の特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程の存在を除外することが意図される。用語「から実質的になる(consisting essentially of)」は、本明細書で使用されるとき、記述された特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程、並びに特質、要素、成分、群、整数及び/又は工程の基本的及び新規特徴に物質的に影響を与えないものの存在を特定することが意図される。
【００１６】
本開示に使用されるとき、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈から特に明示されない限り複数の参照を含む。実施形態において、「追加の」又は「第2の」成分を含む実施形態において、第2の成分は、本明細書で使用されるとき、他の成分又は第1の成分と異なる。「第3の」成分は、他、第1及び第2の成分と異なり、更に列挙される又は「追加の」成分も同様に異なる。
【００１７】
本開示に使用されるとき、用語「藻類」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、原核生物又は真核生物である光合成微生物を含む。光合成微生物には、混合栄養又は従属栄養増殖も可能である光合成微生物が含まれる。
【００１８】
本開示に使用されるとき、用語「藻類鞭毛虫」は、1つ以上の鞭毛を有する藻類微生物を含む。
【００１９】
II.系、方法及び使用
乾燥藻類鞭毛虫バイオマス若しくはその分画、又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物若しくはその分画は、水中の金属に結合することができる。乾燥藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物のカプセル化は、金属を結合するための、より大きく且つより密集した表面エリアを提供し、インキュベーション期間の後に乾燥藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物及び結合金属を除去する方法も提供する。本発明の例は、金属への結合における、球状化(spherificated)乾燥藻類鞭毛虫バイオマス、湿潤藻類鞭毛虫バイオマス若しくはそれらの分画又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物の有用性、並びに乾燥ユーグレナバイオマス、湿潤ユーグレナバイオマス若しくはユーグレナの滲出物又はそれらの分画を担持する基材を含有する生物吸着剤要素の有用性を実証した。
【００２０】
したがって、本開示は、
標的金属を結合する方法であって、
i)標的金属を含有する溶液を、
ii)藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画、又は
カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画と接触させて、
標的金属と、カプセル化滲出物若しくはその分画、又はカプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画との錯体を形成する工程、及び
任意選択で錯体を溶液から分離する工程、
を含む方法を含む。
【００２１】
用語「溶液」は、本明細書で使用されるとき、2種以上の物質から構成される均質混合物を含む。
【００２２】
用語「水」は、本明細書で使用されるとき、溶液、懸濁液又はスラリーの形態の水を含む。
【００２３】
用語「非生」は、本明細書で使用されるとき、微生物が死んでいる、生命を持たない又は代謝的に不活性であることを指し、電磁放射線及び粒子放射線を含む放射線、生物学的処理、化学処理、物理的な力、高い静水圧又は生存必需品の剥奪により任意選択で誘発される状態である。
【００２４】
用語「滲出物」は、本明細書で使用されるとき、微生物から微生物が生存している又はかつて生存していた培地又は任意の周囲液体への分泌及び/又は排出を指す。滲出物は、微生物の培養物を、遠心分離を使用した固液分離に付すことによって得ることができ、固液分離において、滲出物は培地液相から回収される。
【００２５】
藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物の分画は、藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物の、金属を結合することに適した任意の分画を含む。
【００２６】
用語「金属」は、本明細書で使用されるとき、金属イオン、アニオン性金属、カチオン性金属、メタロイド、合金、希土類元素、軽金属、重金属、遷移金属、卑金属、鉄系金属、貴金属(noble metal)及び貴金属(precious metal)を含む。
【００２７】
金属は、乾燥藻類鞭毛虫バイオマス若しくはその分画、湿潤藻類鞭毛虫バイオマス若しくはその分画、又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物若しくはその分画と錯体を形成する任意の適切な金属であり得る。藻類鞭毛虫、類鞭毛虫培養物の滲出物又はその分画と金属が「錯体を形成する」、及び藻類鞭毛虫、類鞭毛虫培養物の滲出物又はその分画と「錯体を形成する金属」という表現は、本明細書で使用されるとき、金属と、藻類鞭毛虫又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物の分画の成分である化合物の少なくとも1つとの間に錯体を形成することを指す。金属は、ヒ素、希土類元素及び放射性核種等のアニオン性又はカチオン性金属であり得る。非生藻類鞭毛虫若しくは藻類鞭毛虫培養物の滲出物、又はその分画は、窒素(N)、酸素(O)及び硫黄(S)等のヘテロ原子と混ざり合って適切な金属イオンに結合できることが、当業者によって理解される。非生藻類鞭毛虫、藻類鞭毛虫培養物の滲出物又はその分画は、特定の金属又はそのクラスに結合するように選択される。例えば、A型金属は、典型的にはO及びN含有リガンドとより安定した錯体を形成し、一方、B型金属は、典型的にはS含有リガンドとより安定した錯体を形成し、遷移金属は、A型とB型金属の中間の挙動を呈することが知られている。一部の実施形態において、金属は遷移金属である。例えば、一部の実施形態において、金属イオンは、二価遷移金属(すなわち、M2+)、任意選択でHg2+であり、又はZn2+、Co2+、Ni2+若しくはPb2+等のヘテロ原子(例えば、N、O及びS)への類似した結合を示す二価遷移金属である。別の実施形態において、金属イオンはHg2+である。一部の実施形態において、金属は金属シアノアニオン性錯体である。
【００２８】
用語「採掘」は、本明細書で使用されるとき、希土類元素、アルミニウム、コバルト、銅、金、モリブデン、ニッケル、パラジウム、白金、ロジウム、銀、ウラニウム及び/又は亜鉛を地中から抽出する作業を含む。
【００２９】
一部の実施形態において、滲出物は、任意の微生物の培養物から得ることができる。別の実施形態において、滲出物は、任意の藻類の培養物から得ることができる。
【００３０】
一実施形態において、金属は、銀、金、アルミニウム、ヒ素、バリウム、ベリリウム、ビスマス、カルシウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、カリウム、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ナトリウム、ニッケル、リン、白金、パラジウム、鉛、アンチモン、セレニウム、スズ、ストロンチウム、タリウム、チタン、ウラニウム、バナジウム、タングステン、イットリウム、亜鉛、スカンジウム、ランタン、希土類元素及び二価遷移金属であり、任意選択で、方法により前述の少なくとも2つ以上を含む複数の金属を結合する。
【００３１】
溶液中の金属イオンに結合する方法は、溶液中の金属イオンに結合することが望ましいあらゆる適切な使用にとって有用である。溶液は、水、任意選択で廃水であり得、方法は、除去されるべき1種以上の金属を有する水又は廃水の改善のためのものである。例えば、方法は、廃水又は採掘処理水の改善のため、並びに他の水処理及び水浄化用途のために使用され得る。実施形態において、方法は、除去されるべき金属イオンを有する廃水又は採掘処理水の改善のためであり、水は廃水又は採掘処理水である。廃水は、任意の適切な廃水であり得る。例えば、廃水は、家庭廃水、都市廃水、産業廃水又はこれらの組合せであり得る。採掘処理水は、任意の適切な採掘処理水であり得る。例えば、採掘処理水は、鉱物又は他の地質学的物質の抽出を伴う任意の採掘作業からのものであり得る。
【００３２】
用語「産業廃水」は、金属イオンを含有する任意の適切な水を含み、産業廃棄物である。例えば、産業廃水は、金属処理排水又は電気メッキ処理廃水を含み得る。例えば、鉱物及び堆積物を粉砕することによってもたらされる廃水は、二価金属、例えば、本開示の方法によって結合され得る水銀等の溶解金属を含み得る。したがって、実施形態において、産業廃水は採掘作業による排水を含む。
【００３３】
用語「採掘処理水」又は「採掘溶液」は、目的の金属を幾らかの濃度で含有する岩石若しくは鉱石から目的の金属を浸出させるために使用される任意の水、又は目的の金属を幾らかの濃度で含有する、採掘処理のある時点での水を含む。採掘処理水又は採掘溶液には、炭素誘引(carbon train)、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃(pregnant)池及び残滓(tailing)池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクからの水が含まれる。当業者は、採掘処理水の供給源を容易に認識する。実施形態において、本明細書に記載されている方法は、炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクから選択される採掘処理水から金属を、本明細書に記載されている生物吸着剤の使用により改善又は回収するためのものである。別の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクに入る又はから出る採掘処理水から金属を、本明細書に記載されている生物吸着剤の使用により改善又は回収するためのものである。特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクから選択される採掘処理水から、貴金属を、任意選択で金、銀、白金及びパラジウムを、本明細書に記載されている生物吸着剤の使用により回収するためのものである。別の特定の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクに入る又はから出る採掘処理水から、貴金属を、任意選択で金、銀、白金及びパラジウムを、本明細書に記載されている生物吸着剤の使用により回収するためのものである。
【００３４】
本開示の方法は、水から目的の金属イオンを捕捉するために使用することもできる。例えば、これによって金属イオンを金属に変換することができる。
【００３５】
実施形態において、採掘処理水は、0.1〜2000ppm、1〜1000ppm、5〜800ppm又は10〜600ppmの濃度で目的の金属を含む。別の実施形態において、採掘処理水は、2000、1500、1250、1200、1000、900、800、700、600、500、400、300、200及び100ppm以下の濃度で目的の金属を含む。
【００３６】
実施形態において、採掘処理水は、2〜13又は8〜11のpH範囲を含む。別の実施形態において、採掘処理水は、2、3、4、5、6、7、8、9及び10以上のpHを含む。別の実施形態において、採掘処理水は、13、12、11、10、9、8、7及び6以下のpHを含む。
【００３７】
実施形態において、採掘処理水はシアン化物(CN)が枯渇されたものである。別の実施形態において、採掘処理水は過酸化水素で処理されたものである。別の実施形態において、採掘処理水はCNを枯渇するために過酸化水素で処理されたものである。
【００３８】
実施形態において、錯体は溶液から分離される。分離方法は、任意の適切な分離手段を伴うことができ、例えば、溶液をカプセル化乾燥藻類鞭毛虫バイオマス若しくはその分画、又は乾燥機藻類鞭毛虫バイオマス若しくはその分画、又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物若しくはその分画と接触させる方法によって左右される。実施形態において、分離は、錯体を微生物又は微生物材料と接触させて、錯体を封鎖することを含む。微生物は、錯体を取り込むこと又は錯体を封鎖することができる任意の適切な微生物である。例えば、グラム陰性細菌E.coli及び任意の他の適切な微生物がこの点において有用である。微生物材料は、錯体を取り込むこと又は錯体を封鎖することができる任意の適切な微生物材料を含む。例えば、グラム陰性細菌E.coli及び任意の他の適切な微生物からの材料がこの点において有用である。
【００３９】
別の実施形態において、藻類鞭毛虫は、クラミドモナス科(Chlamydomonadaceae)、クリプト藻綱(Cryptophyceae)、渦鞭毛藻類(Dinoflagellate)、ユーグレナ科(Euglenaceae)、ハプト植物門(Haptophyta)又はこれらの混合物である。別の実施形態において、藻類鞭毛虫は、クラミドモナス種(Chlamydomonas sp.)、クリプト植物門種(Cryptophyta sp.)、渦鞭毛植物種(Dinophyta sp.)、ユーグレナ種(Euglena sp.)又はこれらの混合物である。別の実施形態において、藻類鞭毛虫は、クラミドモナス・レインハルドチイ(Chlamydomonas reinhardtii)、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)、ユーグレナ・ムタビリス(Euglena mutabilis)又はこれらの組合せである。別の実施形態において、藻類鞭毛虫は、ユーグレナ・グラシリスである。別の実施形態において、藻類鞭毛虫は、ユーグレナ・グラシリス、ユーグレナ・ムタビリス又はこれらの組合せである。更なる実施形態において、藻類鞭毛虫は、ユーグレナ・グラシリスを含む、から実質的になる又はからなる。
【００４０】
別の実施形態において、藻類は、クロレラ種(Chlorella sp.)、珪藻、藍藻類、原生生物又はこれらの混合物である。更なる実施形態において、藻類は、クロレラ・ブルガリス(Chlorella vulgaris)、クラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・グラシリス、ユーグレナ・ムタビリス、セネデスムス・オブリクス(Scenedesmus obliquus)、タラシオシラ・ウェイスフロギィ(Thalassiosira weissflogii)又はこれらの組合せである。
【００４１】
別の実施形態において、藻類鞭毛虫培養物の滲出物は、グルタチオン、メタロチオネイン、フィトケラチン、ポリリン酸塩、多糖類又はこれらの組合せを含む。藻類鞭毛虫培養物の滲出物又はカプセル化非生ユーグレナバイオマスが球状化又はゲル化されていることが、実施形態である。別の実施形態において、球状化又はゲル化の方法は、カプセル化固定化マトリックスを使用して、藻類鞭毛虫培養物の滲出物又は乾燥ユーグレナバイオマスを固定化マトリックでカプセル化することを含む。別の実施形態において、固定化マトリックスは樹脂又はポリマープラスチックを含む。別の実施形態において、固定化マトリックスは、寒天、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロース、キトサン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニル又はこれらの組合せを含む。別の実施形態において、固定化マトリックスはアルギン酸ナトリウムを含む。別の実施形態において、藻類鞭毛虫培養物の滲出物は、閉じ込め要素に収容される。別の実施形態において、閉じ込め要素は半透過膜を含む。更なる実施形態において、半透過膜は一体型非対称膜又は薄膜複合膜を含む。
【００４２】
用語「活性炭」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、任意選択で0.3〜3cm3/gの低容積小孔を有するように処理された炭素の形態を指し、そのことが金属吸着及び/又は化学反応に利用可能な表面積を増やす。活性炭は、堅果、ヤシ殻、泥炭、木材、コイア、亜炭、石炭及び/又は石油ピッチから得ることができる。
【００４３】
別の実施形態において、藻類鞭毛虫培養物の滲出物は、球状化又はゲル化され、更に活性炭と混合される。別の実施形態において、活性炭は、堅果、ヤシ殻、泥炭、木材、コイア、亜炭、石炭及び/又は石油ピッチを含む。
【００４４】
本開示に使用されているように、「カプセル化」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、物体がゲル状物質により囲まれている、例えば、実質的に囲まれている又は完全に囲まれている状態を指す。カプセル化の方法は、球状化又はゲル化を含む。
【００４５】
本開示に使用されているように、用語「非カプセル化」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、物体がカプセル化されていない状態を指す。
【００４６】
実施形態において、藻類鞭毛虫培養物の非カプセル化滲出物若しくはその分画、又は非カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は非カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画は、廃水又は採掘処理水等の水中の、本明細書に記載されている金属を結合する。別の実施形態において、藻類鞭毛虫培養物の非カプセル化滲出物若しくはその分画、又は非カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又は非カプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画は、除去されるべき本明細書に記載されている金属を有する廃水の改善に使用され、水は廃水又は採掘処理水であり、任意選択で廃水又は採掘処理水が活性炭と接触する前のものである。
【００４７】
本開示に使用されるとき、用語「生物吸着剤」及び「生物吸着剤要素」は、交換可能に使用される。
【００４８】
実施形態において、本明細書に記載されている生物吸着剤は、本明細書に記載されているカプセル化若しくは非カプセル化微生物又は微生物培養物の滲出物を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されている生物吸着剤は、カプセル化若しくは非カプセル化された微生物、水生微生物、藻類、藻類鞭毛虫、クラミドモナス種、クリプト植物門種、渦鞭毛植物種、ユーグレナ種、クラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・ムタビリス、ユーグレナ・グラシリス、これらの組合せ、その画分、若しくはその画分の組合せ、又は前記微生物、水生微生物、藻類、藻類鞭毛虫、クラミドモナス種、クリプト植物門種、渦鞭毛植物種、ユーグレナ種、クラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・ムタビリス、ユーグレナ・グラシリス、これらの組合せ、その画分、若しくはその画分の組合せの培養物の滲出物を含む。
【００４９】
実施形態において、本明細書に記載されている方法は、本明細書に記載されているカプセル化若しくは非カプセル化微生物又は微生物培養物の滲出物の使用を含む。別の実施形態において、本明細書に記載されている方法は、カプセル化若しくは非カプセル化された微生物、水生微生物、藻類、藻類鞭毛虫、クラミドモナス種、クリプト植物門種、渦鞭毛植物種、ユーグレナ種、クラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・ムタビリス、ユーグレナ・グラシリス、これらの組合せ、その画分、若しくはその画分の組合せ、又は前記微生物、水生微生物、藻類、藻類鞭毛虫、クラミドモナス種、クリプト植物門種、渦鞭毛植物種、ユーグレナ種、若しくはクラミドモナス・レインハルドチイ、ユーグレナ・ムタビリス、ユーグレナ・グラシリス、これらの組合せ、その画分、若しくはその画分の組合せの培養物の滲出物を含む。
【００５０】
本開示に使用されるとき、用語「ゲル化」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、物質をゲル状形態に変える方法と定義される。この方法は、液体物質をゲル化剤の助けにより固体に変換することを含む。一般的なゲル化剤は、天然源由来であり、寒天、ゼラチン、カラギーナン、ゲランガム、ペクチン及びメチルセルロースが含まれる。
【００５１】
本開示に使用されるとき、用語「ビーズ」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、カプセル化された藻類鞭毛虫若しくは藻類鞭毛虫培養物の滲出物又はその分画を指す。
【００５２】
別の実施形態において、ビーズのpHは、少なくとも2、3、4、5、6又は7である。別の実施形態において、ビーズのpHは、最大で6、7、8、9、10、11、12又は13である。別の実施形態において、ビーズのpHは、2〜13であり、任意選択で3〜10、任意選択で4〜7である。
【００５３】
別の実施形態において、ビーズの径は、少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1,5、2、2,5、3、3.5、4、4.5又は5mmである。別の実施形態において、ビーズの径は、最大で4、5、6、7、8、9又は10mmである。別の実施形態において、ビーズの径は、0.1〜10であり、任意選択で2〜6、任意選択で3〜5である。
【００５４】
本開示に使用されるとき、用語「乾燥バイオマス」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、バイオマスが最大で25%の含水量で構成されると定義される。
【００５５】
別の実施形態において、乾燥バイオマスの含水量は、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10及び5%以下である。別の実施形態において、乾燥バイオマスの含水量は、5〜25%又は10〜20%である。別の実施形態において、乾燥バイオマスの含水量は、10%を下回る又は5%を下回る。
【００５６】
本開示に使用されるとき、用語「湿潤バイオマス」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、バイオマスが25%を超える含水量で構成されると定義される。
【００５７】
別の実施形態において、湿潤バイオマスの含水量は、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85及び90%を超える。別の実施形態において、湿潤バイオマスの含水量は、少なくとも26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85及び90%である。別の実施形態において、湿潤バイオマスの含水量は、30〜90%、50〜85%又は70〜80%である。
【００５８】
別の実施形態において、藻類鞭毛虫バイオマスの活性物質の質量当たりの、封鎖される金属の量又は種類は、球状化される前の採取後処理によって改変される。別の実施形態において、採取後処理は、バイオマス又はその分画を乾燥することを含む。別の実施形態において、乾燥処理は、バイオマスを少なくとも45、50又は55℃の温度で処理することを含む。別の実施形態において、乾燥処理は、バイオマスを少なくとも24、36、48、60、72、84又は96時間にわたって乾燥することを含む。別の実施形態において、乾燥処理は、バイオマスを50℃で約72時間にわたって乾燥することを含む。
【００５９】
別の実施形態において、採取後処理は、バイオマス又はその分画を加熱することを含む。別の実施形態において、熱処理は、バイオマスを少なくとも56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、125、130、140、145、150、155又は160℃の温度で処理することを含む。別の実施形態において、熱処理は、バイオマスを少なくとも24、36、48、60、72、84又は96時間にわたって加熱することを含む。別の実施形態において、熱処理は、バイオマスを80又は120℃で約72時間にわたって加熱することを含む。別の実施形態において、熱処理は、バイオマスを80又は120℃で約72時間にわたって加熱することを含む。
【００６０】
別の実施形態において、異なる金属結合選択性を持つ、藻類鞭毛虫培養物の滲出物、カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス、採取後処理済みカプセル化乾燥ユーグレナバイオマス及び/又は湿潤ユーグレナバイオマスは、複数のカラムに収容され、カラムは、カラム排出液を生成するように配置される。別の実施形態において、複数のカラムは、第1のカラム、第2のカラム及び第3のカラムを含んで直列に配置され、溶液はカラムの中を順番に流れて、カラム排出液を生成する。別の実施形態において、第1のカラムは銅に選択的に結合し、第2のカラムは銀に選択的に結合し、第3のカラムは金に選択的に結合する。別の実施形態において、藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物は、鉛、銅、銀及び/又は金に対して選択性を持つ。別の実施形態において、藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物は、本明細書に記載されている金属に対して選択性を持つ。
【００６１】
別の実施形態において、溶液の前処理は、溶液を球状化藻類鞭毛虫バイオマス又は自由藻類鞭毛虫のいずれかの適切な量と混合し、続いて球状化藻類鞭毛虫バイオマス又は自由藻類鞭毛虫を除去することによって実施される。別の実施形態では、前処理溶液を、球状化藻類鞭毛虫バイオマス又は藻類鞭毛虫培養物の滲出物を含有するカラム又はカラム列に通過させる。
【００６２】
実施形態において、本明細書に記載されている生物吸着剤は、生物吸着剤1トン当たり少なくとも0.01、0.1、1、10、100、1000、1x104、1x105、1x106、2x106、3x106、4x106又は5x106グラムの本明細書に記載されている金属の負荷容量を有する。
【００６３】
本開示に使用されているように、「脱着剤」は、結合している構造体(例えば、カプセル化バイオマス、滲出物又はその分画)から物質(例えば、標的金属)を放出するために使用される溶液である。
【００６４】
脱着は、構造体の結合部位を遊離/反応させることによって実施され、このことは、溶液中の標的金属を収集することを可能にし、溶液中の、好ましくは新たな溶液中の標的金属にカプセル化滲出物/バイオマスが更に結合できること(すなわち、吸着)を可能にする。脱着又は脱着剤の成功は、前述の利益を達成することができ、同時に吸着構造体の安定性及び/又は一体性に対する影響を制限することができる。脱着剤には、任意選択で酸(例えば、硝酸、塩酸、硫酸、クエン酸)、塩基(例えば、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム)、キレート剤(例えば、EDTA)又は他の化合物(例えば、チオ尿素、シアン化カリウム、クエン酸ナトリウム、硝酸ナトリウム)が含まれ得る。本明細書に記載されている生物吸着剤は、任意選択で複数回又はサイクルの脱着及び吸着を受けることができ、同時に吸着構造体の安定性及び/又は一体性を保持することができる。当業者は、本明細書に記載されている生物吸着剤から標的金属を脱着させるのに適した代替的な脱着剤を容易に認識する。
【００６５】
実施形態において、本明細書に記載されている方法は、標的金属を脱着する工程を更に含む。別の実施形態において、標的金属を脱着することは、錯体を脱着剤と接触させることを含む。別の実施形態において、脱着剤は酸性又は塩基性の溶液を含む。別の実施形態において、脱着剤はシアン化カリウム又はチオ尿素を含む。別の実施形態において、酸性溶液は、塩酸、硝酸、硫酸及びクエン酸のうちの1つ以上を含む。別の実施形態において、塩基性溶液は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム及び重炭酸ナトリウムのうちの1つ以上を含む。別の実施形態において、標的金属は、貴金属であり、任意選択で金、銀、白金又はパラジウムである。実施形態において、本明細書に記載されている脱着剤は、本明細書に記載されている生物吸着剤から少なくとも50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の本明細書に記載されている標的金属を脱着する。別の実施形態において、本明細書に記載されている生物吸着剤は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45又は50回又はサイクルの脱着及び吸着の後、本明細書に記載されている標的金属に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の結合能力を保持する。別の実施形態において、本明細書に記載されている脱着方法は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、16、18、20、25、30、35、40、45又は50回又はサイクルの脱着及び吸着の後、本明細書に記載されている標的金属に対して、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%の結合能力を保持する。
【００６６】
本明細書で使用されるとき、用語「新たな」は、溶液の新しい又は異なるバッチを指し、溶液が供給源から新たに作製される、取得される、得られる又は回収されることを必ずしも意味しない。別の実施形態において、標的金属を錯体から脱着した後、藻類鞭毛虫培養物のカプセル化滲出物若しくはその分画、カプセル化乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又はカプセル化湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画は、標的金属を含有する新たな溶液と接触する。実施形態において、新たな溶液は採掘処理水又は採掘溶液を含む。
【００６７】
本開示に使用されているように、用語「選択的」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、1つの金属を他より優先することを指す。
【００６８】
実施形態において、藻類はグルコース補充の不在又は存在下で、明るいところで増殖させる。実施形態において、藻類はグルコース補充の不在又は存在下で、暗いところで増殖させる。別の実施形態において、藻類は、指数増殖期に達するまで、24、48又は72時間にわたって明るいところで増殖させる。別の実施形態において、藻類は、24、48又は72時間にわたって又は指数増殖期に達するまで、暗いところで増殖させる。なお別の実施形態において、グルコース補充は、0.1〜20g.L-1のグルコースの範囲を含む。
【００６９】
実施形態において、生物吸着剤要素は、乾燥ユーグレナバイオマス、又はユーグレナ培養物の滲出物、又はその分画を、中を通過する水から金属を吸着するのに十分な量で担持する基材を含有する。別の実施形態において、生物吸着剤要素は、複数の薄膜にわたる拡散勾配の生物吸着剤である。更なる実施形態において、生物吸着剤要素は、銀、金、アルミニウム、ヒ素、バリウム、ベリリウム、ビスマス、カルシウム、カドミウム、コバルト、クロム、銅、鉄、カリウム、リチウム、マグネシウム、マンガン、モリブデン、ナトリウム、ニッケル、リン、白金、パラジウム、鉛、アンチモン、セレニウム、スズ、ストロンチウム、タリウム、チタン、ウラニウム、バナジウム、タングステン、イットリウム、亜鉛、スカンジウム、ランタン、希土類元素及び二価遷移金属を含む金属を結合する。
【００７０】
別の実施形態において、生物吸着剤要素は、除去されるべき金属を有する廃水の改善における方法又は使用のためのものであり、水は廃水である。別の実施形態において、生物吸着剤要素は、除去されるべき金属を有する採掘処理水の改善における方法又は使用のためのものであり、水は採掘処理水である。別の実施形態において、廃水は、家庭廃水、都市廃水、産業廃水又はこれらの組合せである。更なる実施形態において、産業廃水は採掘作業による排水を含む。
【００７１】
別の実施形態において、生物吸着剤要素は、除去されるべき金属を有する廃水の改善における方法又は使用のためのものであり、水は廃水であり、任意選択で廃水が活性炭と接触する前である。
【００７２】
別の実施形態において、生物吸着剤要素は、除去されるべき金属を有する採掘処理水の改善における方法又は使用のためのものであり、水は採掘処理水である。別の実施形態において、廃水は、家庭廃水、都市廃水、産業廃水又はこれらの組合せである。更なる実施形態において、産業廃水は採掘作業による排水を含む。
【００７３】
実施形態において、生物吸着剤要素は、グルタチオン、メタロチオネイン、フィトケラチン、ポリリン酸塩、多糖類又はこれらの組合せを含む、乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又はユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画を含有する。別の実施形態において、生物吸着剤要素は、透析容器又は透析バッグに含有される。別の実施形態において、生物吸着剤要素は、複数の薄膜にわたって拡散勾配で埋封されており、任意選択で拡散勾配技術(DGT)である。別の実施形態において、乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又はユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画は、球状及び/又はゲル状である。別の実施形態において、生物吸着剤要素は、乾燥ユーグレナバイオマス若しくはその分画、湿潤ユーグレナバイオマス若しくはその分画、又はユーグレナ培養物の滲出物若しくはその分画をカプセル化する固定化マトリックスを含む。別の実施形態において、固定化マトリックスには、樹脂、ポリマープラスチック又は薄膜中の拡散勾配が含まれる。別の実施形態において、固定化マトリックスは、寒天、アガロース、アルギン酸塩、カラギーナン、セルロース、キトサン、ポリスチレン、ポリウレタン、ポリビニル又はこれらの組合せを含む。更なる実施形態において、固定化マトリックスはアルギン酸ナトリウムを含有する。
【００７４】
別の実施形態において、分画は、AF4分画法の分画A、B、C又はDであり、任意選択で分画Cである。別の実施形態において、分画Cは、AF4分画法から9〜10分間の保持時間での分画溶出液を含む。当業者は、分画Cに類似した生化学的特徴及び金属結合特性を有する分画を得るため、AF4分画法に対する代替案を容易に認識する。
【００７５】
別の実施形態において、生物吸着剤要素は、Au、Ag、Cu及び/又はPbを除去するための廃水、任意選択で採掘処理水の改善における方法又は使用のためのものであり、任意選択で廃水はCNが枯渇しており、任意選択で廃水はCNが枯渇しており、任意選択で生物吸着剤要素は、非カプセル化ユーグレナバイオマス、カプセル化ユーグレナバイオマスビーズ、又はユーグレナ培養物の滲出物を含むビーズを含み、任意選択でユーグレナバイオマスは、少なくとも40、45、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、125、130、140、145、150、155又は160℃の温度で熱処理され、任意選択で熱処理は、バイオマスを少なくとも12、24、36、48、60、72、84又は96時間にわたって加熱することを含み、任意選択でビーズは、少なくとも0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、1,5、2、2,5、3、3.5、4、4.5又は5mmのビーズ径があり、任意選択でビーズは、最大で4、5、6、7、8、9又は10mmのビーズ径があり、任意選択でビーズのpHは、少なくとも2、3、4、5、6又は7であり、任意選択でビーズのpHは、最大で6、7、8、9、10、11、12又は13であり、任意選択でビーズは複数のカラムに収容され、任意選択で複数のカラムは、少なくとも第1のカラム、第2のカラム及び第3のカラムを含んで直列に配置され、溶液はカラムの中を順番に流れて、カラム排出液を生成し、任意選択で、第1のカラムはAu、Ag、Cu又はPbに選択的に結合し、第2のカラムはAu、Ag、Cu又はPbに選択的に結合し、第3のカラムはAu、Ag、Cu又はPbに選択的に結合し、任意選択で廃水が活性炭に接触する前である。
【００７６】
本開示に使用されるとき、用語「ゲル化」及びその派生語は、本明細書で使用されるとき、物質をゲル状形態に変える方法と定義される。この方法は、液体物質をゲル化剤の助けにより固体に変換することを含む。一般的なゲル化剤は、天然源由来であり、寒天-寒天、ゼラチン、カラギーナン、ゲランガム、ペクチン及びメチルセルロースが含まれる。
【００７７】
実施形態において、生物吸着剤要素は本明細書に記載されている方法に従って使用される。別の実施形態において、標的金属を結合することは、標的金属を含有する溶液を、本明細書に記載されている生物吸着剤要素と接触させること、及び任意選択で錯体を溶液から分離することを含む。
【００７８】
本開示は、本明細書に記載されている生物吸着剤要素及び活性炭を含む、標的金属を結合するための系を含む。
【００７９】
本明細書に開示されている系、方法、使用及び生物吸着剤を任意の微生物に適用することができる。本明細書に開示されている系、方法、使用及び生物吸着剤は、より大きな容量に規模を拡大することができる。
【００８０】
本開示の使用についての実施形態を本開示の方法のために本明細書に記載されているように変更できることが、当業者には理解される。
【実施例】
【００８１】
以下の非限定例は、本発明を例証するものである。
【００８２】
実施例1:非生ユーグレナ・グラシリスによるCu(II)及びNI(II)生物吸着の平衡及び動態研究
I.序論
乾燥ユーグレナ細胞の動態及び吸着特性を、廃水において典型的な金属濃度のモノメタル(Cu又はNi)及びバイメタル(Cu+Ni)溶液で評価した(Gopalapillaiら、2008年;Mahdaviら、2012年)。金属吸着の動態モデル化は、藻類金属除去方法の設計、最適化及び商業用途にとって助けとなる。動態データは、金属イオンが吸着剤により取り込まれる速度を記載し、したがって有効な除去に必要の滞留時間を決定する。
【００８３】
II.実験手順
A.試験生物体、培地及び培養条件
ユーグレナ・グラシリスKlebsは、Boreal Laboratory Supplies Ltd(St. Catharines、ON、Canada)から得た。非純粋培養物を、0.01g.L-1のCaCl2(Bishop Canada Ltd)、1.0 g.L-1のCH3COONa・3H2O(Caledon Ltd、Canada)、1.0g.L-1の「Lab-Lemco」、2.0g.L-1のトリプトン(Oxoid LDD、Basingstoke、Hampshire、England)及び2.0g.L-1の酵母抽出物(Oxoid LDD、Basingstoke、Hampshire、England)からなる培地で増殖させた。全ての培地は、Milli-Q水を使用して調製した。培地のpHは、1MのHCl又はNaOHを、オートクレーブの後に使用して調整し、Conviron(CMP5090)人工環境室(environmental chamber)(Controlled Environments Ltd.、Winnipeg、MB、Canada)において20℃でpH3〜5に維持した。ユーグレナ・グラシリスを210μmol.s-1の強度の18:6(明:暗)の光周下で増殖させた。非生ユーグレナを得るため、採取後ユーグレナバイオマスを少なくとも24時間にわたって-80℃で冷却し(Forma Scientific, USA)、続いて少なくとも48時間凍結乾燥し(LabConco、USA)、摩砕した。ガラス器を、使用する少なくとも24時間前に20%HNO3に浸け、Milli-Q水で3回すすいで、金属汚染を回避した。加えて、培養増殖に使用したあらゆるガラス器をオートクレーブにかけて、細菌汚染を軽減した。
【００８４】
B.フーリエ変換赤外分光(FTIR)分析
乾燥バイオマスを、4cm-1の空間分解能で32走査の吸着モード(範囲:4500〜500cm-1)によりATR-FTIR分光計(Nicolet 380、Thermo、USA)を使用して、減衰全反射法(ATR)により分析した。
【００８５】
C.金属溶液
Cu(II)及びNi(II)貯蔵溶液(0.01mol.L-1)を、CuSO4・5H2O(Caledon Laboratory Chemicals)及びNiSO4・6H2O(BDH Chemicals)により、それぞれ調製した。作業金属溶液のpHは、0.1mol.L-1のHCl及び0.1mol.L-1のNaOH(Accumet、XL15、USA)で調整した。金属濃度は、誘導結合プラズマ質量分析(ICP-MS)(X Series II、ThermoScientific、USA)を利用して決定した。ロジウムを内部標準として使用した。ICP-MS測定値の精度は、SLEW-3、SLR-4、SLR-5、1-BIS及び5-BI認証標準物質(National Research Council、Canada)を使用して評価した。
【００８６】
D.Cu2+及びNi2+の生物吸着
平衡でのCu2+及びNi2+吸着量q(μg.g-1)を以下の式により計算した。
【００８７】
【数１】
2020516768.tif 000003
【００８８】
式中、Ciは、吸着前の金属イオンの初期濃度(μg.L-1)であり、Ceqは、水性相中の金属イオンの平衡濃度である。Vは、水性相の容量(L)であり、mは、吸着剤の乾燥質量(g)である。各実験を二回実施し、結果を平均として表す。全ての生物吸着実験は、バッチ技術を利用して実施した。
【００８９】
E.吸着動態
動態実験は、Cu(II)及び/又はNi(II)のいずれかの金属溶液が添加されたMilli-Qに懸濁したユーグレナ・グラシリス(1g.L-1)を含有する50mLの遠心分離管(Fisher Scientific)において、一定温度(20℃)で二回実施した。動態研究は、pH5.0で実施し、70rpmで240分間撹拌した。動態研究は、各金属の4つの初期濃度(Cu2+=20及び50μg.L-1、1及び25mg.L-1;Ni2+=1、2、4及び20mg.L)によるpH5での非生ユーグレナ・グラシリスへの接触時間の関数として、Cu2+及びNi2+の吸着を実施した。アリコート(7mL)を実験の期間中に所定の間隔で溶液から取り出し、0.7μmで濾過し(GFF、Merck Millipore、Ireland)、酸性化して(超高純度のHNO3、70%)、pH2.0にし、金属濃度をICP-MSで測定した。吸着動態モデルを使用して、ユーグレナ-単一金属溶液からのCU(II)又は(Ni(II)の全体的な除去速度を評価した。試料を0、10、20、30、60、90、120及び240分の時間間隔で取り出した。2つの異なる非線型モデルを用いた。
擬一次動態式(PFO;Lagergren、1898年):
qt=qe(1-e-kt) (式2)
式中、qeは、平衡で吸着された金属量(μg g-1又はmg g-1)であり、qtは、t時点で吸着された金属量(μg g-1又はmg g-1)であり、k1は、PFO平衡速度定数(分-1)であり、tは、定時(分)である。
擬二次動態式(PSO;Hoら、1996年):
【００９０】
【数２】
2020516768.tif 000004
【００９１】
式中、qe及びqtは、それぞれ平衡及びt時点で吸着された金属であり、k2は、PSO平衡速度定数であり、tは定時(分)である。
【００９２】
F.吸着平衡
生ユーグレナ・グラシリスによるCu(II)及びNi(II)の吸着(1g.L-1)を、定温(20℃)で複製によりバッチ吸着平衡実験(120分)により検査し、70rpmで撹拌した。ユーグレナ細胞を有さない空試験及び金属溶液を添加しない試験を、それぞれの試験金属濃度で実施した。モノメタル及びバイメタル溶液の両方のpHレベルを、0.1MのHCl及び/又は0.1MのNaOHの添加により実験の間にわたって5.0に維持した。金属初期濃度の影響を、5μg.L-1〜1.5mg.L-1(Cu)及び5μg.L-1〜1mg.L-1(Ni)の範囲の値を有するモノメタル溶液によりpH5.0で研究した。バイメタル溶液を、それぞれ10μg.L-1〜6mg.L-1及び2μg.L-1〜200μg.L-1の範囲の初期Cu2+及びNi2+濃度により調製した。金属濃度は、ICP-MSを使用して決定した。ラングミュア及びフロイントリッヒ等温線モデルを使用して、生物吸着データを分析した。
【００９３】
G.統計:t-検定
対応のあるt検定(paired t-test)を使用して、異なる初期金属濃度を有する系における金属吸着の差を評価した。
【００９４】
III.結果及び考察
A.乾燥ユーグレナ細胞の特徴
乾燥ユーグレナ細胞のFTIRスペクトル(図1)は、異なる官能基を示した。3040及び1640cm-1での極めて強力なバンドは、芳香族炭化水素におけるC-H及びC=Cに関連する。O-H(1700cm-1)及びC-O(1380cm-1)の伸縮振動は、カルボキシル官能基が原因であった。アミドのC=Oは、1640〜1660cm-1に見いだされた。全体として、乾燥ユーグレナ細胞は金属結合のために主要な官能基(例えば、カルボキシル、アミノ及びチオール)を有した。
【００９５】
B.吸着動態
金属(Cu及びNi)は、両方とも、以前の非生バイオマス研究(Liuら、2009年;Raoら、2005年)と合致しているPFOモデルにより近似して付着することが見いだされた(表1)。PFOモデルとの強力な一致は、理論に束縛されるものではないが、金属イオンが細胞表面の官能基の電子を共有する化学吸着(Ho及びMcKay、1998年;Plazinski、2013年)の方法(例えば、PSOモデルと一致)に対して、吸着機構がバイオマスの非占有部位への金属イオンの物理的な引力によって制御されたことを支持した。ユーグレナへのCu及びNiの吸着は、10〜30分以内で比較的素早く発生し(図2及び図3)、このことは金属とバイオマスとの間の引力を示している。吸着剤と吸着物質との強い親和性は、金属担持排出液の改善における生物吸着のあらゆる用途にとって不可欠な構成要素である(Volesky、2003年)。生物材料を使用して、金属の除去を達成するには、相互引力(例えば、静電気、イオン交換)により駆動された、溶液からバイオマスへの金属イオンの大量移動が必要である。このユーグレナバイオマスと金属イオンとの親和性は、理論に束縛されるものではないが、曲線の初期急上昇により支持される(図2及び図3)。PFO動態速度(k1)は、金属の初期濃度が増加すると一般に増加した(表1及び表2)。以前の生物吸着研究は動態定数への類似した影響を報告しているが、他は、低い濃度で高い値を見いだしている(Corderoら、2004年;Jaikumar及びRamamurthi、2009年)。動態実験における吸着金属の量は、Cu及びNiの両方の初期金属濃度と共に増加することが見いだされた(p<0.05)。Cuの初期濃度が0.02mg.L-1から25mg.L-1に増加すると、金属負荷量も0.0066mg.g-1から8.40mg.g-1に増加した。同様に、Niの初期濃度が1から20mg.L-1に増加すると、負荷量は0.341mg.g-1から3.66mg.g-1に増加した(表1及び表2)。Cuの初期濃度の増加(約1250×)は、バイオマスに吸着されたCuの量にほぼ比例した増加をもたらした(約1270×)。対照的に、吸着されたNiの量は、初期濃度の20×の増加と同時に約12×に増加した。この結果について考えられる理由は、Cuへの高い親和性を有するリガンドが、N又はS供与原子(例えば、タンパク質、アミノ酸、チオール;図1)を含有する可能性があり、このことが他の基と比較してCuと強い結合を形成する傾向があるということであり得る(Kieferら、1997年)。藻類の他の種と比較して、ユーグレナは高い割合でタンパク質及びチオール構造を有し、このことがNiに優先してCuを吸着する原因であり得る。
【００９６】
【表１】
2020516768.tif 000005
【００９７】
【表２】
2020516768.tif 000006
【００９８】
C.吸着平衡
本開示において、Cu2+及びNi2+の生物吸着を産業関連(例えば、一次処理を受けた廃水)濃度(例えば、≦25mg.L-1)で評価した。単一金属溶液中のCu2+及びNi2+の生物吸着は、両方とも平衡濃度の増加と共に増加した(図3及び図4)。ラングミュア及びフロイントリッヒモデルの両方における当てはめ度(r2)は、非生ユーグレナ・グラシリスによるCu(それぞれ、0.995及び0.985)並びにNi(それぞれ、0.996及び0.985)の吸着がいずれのモデルによっても適切に記載できること示した(p<0.001;金属とモデルの両方;表3、表4、図4及び図5)。しかし、フロイントリッヒと比較してラングミュアで高いr2は、金属イオンがバイオマス表面の官能基の単層に吸着されたことを示した(Raoら、2005年)。フロイントリッヒモデルの比較的高い適用性は、吸着が細胞の異種表面においても生じ得ることを支持している。同等のラングミュアパラメータ(k及びqmax)が、両方の金属において見いだされた(p>0.05;表3)。生物吸着の最大容量は、Cu及びNiではそれぞれ89.6μg/g及び34.1μg/gであった。金属濃度に差があるにもかかわらず、ラングミュアパラメータ(例えば、qmax及びb)は、以前の研究(Chenら、2008年;Raoら、2005年)と類似していた。kの値は、Ni及びCuでは、それぞれ556及び625であり、金属間で有意な差はなかった(p>0.05)(表3)。
【００９９】
【表３】
2020516768.tif 000007
【０１００】
【表４】
2020516768.tif 000008
【０１０１】
Cu及びNiの生物吸着を二成分金属溶液によっても検査して、産業廃水の混合組成をより良好に模倣した(図6)。CuのNiに対する初期濃度の比の関数として、吸着を評価した。単一金属溶液を比較すると、Cu及びNiの総金属取り込みは、初期濃度の関数としての吸着容量に関して有意に異なっていなかった(p>0.05)。Cu:Ni<1では、Niの吸着はCuより大きかったが(p<0.05;図6)、Cu:Ni>1では、Cuの吸着が高かった(p<0.05)。これは生ユーグレナ細胞では対照的であり、Cu及びNiの取り込みは、Cu:Ni比の間で類似していた(p<0.05)(Wintersら、2016年)。Ni吸着は、高濃度のCu(Cu:Ni>1)で抑制されたが、比較的高いNiレベルで反対のことが起こり、このことは、理論に束縛されるものではないが、一般的に共有される結合部位でのCuとNiのイオン間の拮抗的吸着競合を支持している。Niの平衡取り込み(qe)は、Cuイオン量の増加に伴って減少した。平衡Ni取り込みに対するCuイオンの拮抗効果は、高いCu初期濃度で優勢であった。
【０１０２】
IV.結論
この実施例は、一次処理形態後の産業廃水において見いだされる典型的な濃度(<100mg.L-1)での金属吸着を評価した。我々が知る限り、これはユーグレナがこの目的で研究された最初の事例である。非生ユーグレナ・グラシリスは、水溶液からのCu及びNiの除去において他の真核生物と同等の生物吸着容量(34〜89μg g-1)を実証することを示した。FTIR分析は、金属生物吸着に重要な金属結合部位として既に確認されている官能基(例えば、カルボキシル、アミド)の存在を示した。吸着動態はPFOモデルに従い、理論に束縛されるものではないが、物理ベースの生物吸着の形態を支持している。吸着された金属の動態速度(k1)及び量は、両方とも初期濃度が増加すると上昇することが見いだされた。吸着は素早く(10〜30分)発生するが、CuはNiより効率的に溶液から取り出された。単一金属溶液において、Cu及びNiは両方ともラングミュアモデルに大きな程度で当てはまることを呈していることが見いだされ、このことは、理論に束縛されるものではないが、金属イオンが単層の細胞表面の同一部位に結合することを支持している。動態の結果と同様に、Cu吸着は、単一金属溶液においてNiより大きいことが見いだされたが、ユーグレナは両方の金属に対して類似した親和性を呈した。ラングミュアパラメータは、同様の生物体によるCu及びNiの吸着と同等であることが見いだされた。二成分金属系において、Cuの吸着は、比較的高濃度のNiで抑制され、逆に、Niの吸着は高いCu:Ni比(例えば、>10)で阻害された。実施例2において示されているように、非生ユーグレナの除去可能性については、乾燥又は湿潤のいずれにしても、採掘作業による実際の複数金属含有水を使用して行った。
【０１０３】
実施例2A:球状化湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス及びユーグレナ滲出物に結合する複数の金属
I.序論
採掘作業による水から金を回収することは、鉱山業にとって相当な関心事である。採掘作業は、多くの場合に炭素濾過系を利用して、作業の過程で金を回収する。この方法の問題点は、銅の存在により炭素フィルタの効率が低減されることであり、銅はフィルタに優先的に結合され、そのことが水からの金の回収を低減させる。この研究に用いられる戦略は、ユーグレナベースプラットフォームを使用して、炭素濾過する前に水から銅を除去し、それによって炭素濾過による金の収量を改善することであった。
【０１０４】
いくつかの異なる形態のユーグレナプラットフォームを、採掘処理水試料中の重金属を結合する能力について試験した。採掘処理は、露天CN浸出作業である。この実施例の採掘処理水は、9〜11のpHであり、100〜800ppmの全CNを含有する。ユーグレナ・グラシリスは、重金属ストレスに応答して溶解有機物質を分泌する能力を有する。これらの溶解有機物質は、潜在的に溶液中の重金属に結合し解毒することができる、滲出物の構成成分である。ユーグレナ又はユーグレナの滲出物の球状化は、金属を結合するための、より大きく且つより密集した表面エリアを提供し、インキュベーション期間の後にユーグレナ及び結合金属を除去する方法も提供する。この実施例では、採掘処理水内で細胞をインキュベートすることによって、生及び非生ユーグレナの両方を金属除去の能力について試験した。更に、ユーグレナの球状化滲出物を含む球状化ユーグレナベースプラットフォームも、金属を結合する能力について試験した。
【０１０５】
II.実験手順
A.湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス及びユーグレナ培養物の滲出物の調製
ユーグレナ・グラシリスを培地に増殖させ、遠心分離を使用して固液分離により採取し、湿潤固体バイオマスを保持し、培地を廃棄した。バイオマスを乾燥することによって、乾燥ユーグレナ細胞を得た。
【０１０６】
滲出物の収集には、上記のように培地を廃棄する代わりに、ユーグレナ培養物から取り出した培地から、滲出物を回収した。5mLの培地を使用して、滲出物を含有する50mgの乾燥質量の培地を得た。
【０１０７】
B.球状化方法
球状化方法は、アルギン酸ナトリウム溶液を使用して、ユーグレナバイオマス及びユーグレナ滲出物をカプセル化することを伴う。このことは、金属を結合するための、より大きく且つより密集した表面エリアを提供し、インキュベーション期間の後にユーグレナ及び結合金属を除去する方法も提供する。「球状」の湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス、及び滲出物、すなわちユーグレナが増殖した使用済培地を、この研究で球状化した。「自由」な湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス及びユーグレナ滲出物は、球状化されていない材料である。
【０１０８】
球状化方法は、湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス又はユーグレナ培養物の滲出物を含有する培地を、等量の4g.L-1のアルギン酸ナトリウム溶液と混合することを伴う。この混合物を、冷蔵した2g.L-1のCaCl2の穏やかに撹拌した溶液に滴下する。CaCl2溶液と接触すると、液滴は球体を形成する。カプセル化される混合物がなくなり、球体が形成されると、球状化材料をストレーナにより注いで、使用するまで密閉容器に保管する。
【０１０９】
C.金属結合
「自由」ユーグレナの処理は、1.5g(乾燥重量)の湿潤ユーグレナバイオマス、乾燥ユーグレナバイオマス又はユーグレナ培養物の滲出物のいずれかの試料を使用して準備した。次に、この量を採掘処理水試料と24時間混合し、その後、試料を5μmフィルタに通して注ぎ、誘導結合プラズマ発光分光(ICP-OES)分析にかけた。
【０１１０】
「球状」ユーグレナの処理は、1.5g(乾燥重量)の湿潤ユーグレナバイオマス又は乾燥ユーグレナバイオマスのいずれかの試料を使用して準備し、これらは上記に記載されたように球状化された。球状滲出物では、ユーグレナが増殖した滲出物を含有する50mg(乾燥質量)の培地を、上記に記載された球状化の標準的な手順によりアルギン酸ナトリウムを使用して球状化した。生成された球体は、採掘処理水試料と24時間混合し、その後、試料を5μmフィルタに通して注ぎ、ICP-OES分析にかけた。
【０１１１】
D.ユーグレナ及びユーグレナ滲出物と錯体化される金属の準備及び決定
ユーグレナプラットフォームにより処理される試料中の複数の金属の準備及び決定は、Lakefield Laboratory of SGS Minerals Services Geochemistry(SGS)において実施された。水性CN処理溶液中の試料を、HCl、HNO3及びH2O2で酸性化し、次に20%塩酸で希釈した。希釈酸性溶液をVarian Vista ICP-OES系により分析した。品質コントロールは、1つの方法ブランク、1個の複製試料、及び24個以下の試料のバッチ毎に分析した2個の較正検査溶液を含んだ。
【０１１２】
E.ユーグレナ及びユーグレナ滲出物と錯体化されるAuの準備及び決定
ユーグレナプラットフォームにより処理される試料中の金の準備及び決定は、Lakefield Laboratory of SGS Minerals Services Geochemistryにおいて行った。CN又は酸ベースマトリックスに硝酸銀の追銀をプラスした試料溶液に存在する金を、Pbフラックスを使用して試金法にかけ、灰吹き皿で吹き分けて、ドーレビーズを生成する。ビーズをHCl及びHNO3の使用によって溶解し、得られた溶液を分析にかけた。金含有量は、酸マトリックス適合較正材料を使用するフレーム原子吸光分析(AAS)により分析した。品質コントロールは、試料7個当たり1つの方法ブランク、試料7個当たり1個の複製、バッチ1つ当たり消費を介して取り出した1つの試料スパイク、及び直線範囲を網羅する較正材料を含んだ。
【０１１３】
III.結果及び考察
A.球状化ユーグレナ滲出物による複数金属の結合
Table 5(表5)の結果は、未処理水(対照1及び2)と比較した、ユーグレナプラットフォームの異なる形態で処理された試料中の様々な金属の量を示す。値は、処理後の溶液中に残った金属の量を示している。平均して、対照試料中の金のレベルは0.136mg.L-1であった。このプラットフォームによる有望な結果は、金濃度がユーグレナプラットフォームの全ての変形にわたって僅か6%低減したことであった(平均0.128mg.L-1)。対照的に銅のレベルは、使用したプラットフォーム変形に関係なく、対照と比較して著しく低減する。平均して、ユーグレナ処理は水試料から約82%の銅を除去した。複数の金属を含有する実際の採掘作業から得た処理水における様々な形態のユーグレナプラットフォームの高い銅結合能力は、本明細書に記載されているユーグレナプラットフォームの実践的な用途を示す。
【０１１４】
【表５】
2020516768.tif 000009
【０１１５】
異なる処理の主要な性能的価値は、活性物質の質量の、除去された銅の質量に対する比を比較することである(Table 6(表6))。「自由」湿潤ユーグレナバイオマス又は乾燥ユーグレナバイオマスと、「球状」湿潤ユーグレナバイオマス又は乾燥ユーグレナバイオマスの両方とも、類似した関係性を示し、比の範囲は53.2:1〜54.9:1であった。
【０１１６】
【表６】
2020516768.tif 000010
【０１１７】
この比に関して最も成功した処理は、球状滲出物のものであり(Table 6(表6)に「球状培地」と標示されている)、1.7:1の比を示した。この結果は、球状滲出物が自由湿潤又は乾燥ユーグレナバイオマスと球状湿潤又は乾燥ユーグレナバイオマスより約31×良好に機能したことを実証した。
【０１１８】
全ての処理(Table 6(表6))は、82%〜84%の(銅の)除去率を示し、このことは、理論に束縛されるものではないが、球状化方法が銅(及びTable 5(表5)によると、他の金属)の除去に対して最小限の影響を有することを支持している。
【０１１９】
除去された注目される他の金属及びメタロイドは、アルミニウム(約98%)、ヒ素(約80%)、カドミウム(約95%)、クロム(約75%)、鉄(>99%)、マンガン(約96%)、鉛(>99%)及びセレニウム(約35%)である。
【０１２０】
IV.結論
処理水試料から銅を捕捉するために、「自由」湿潤若しくは乾燥ユーグレナバイオマス、又は「球状」湿潤若しくは乾燥ユーグレナバイオマスを使用すると、82〜84%の銅の除去をもたらす。活性物質の質量の、除去された銅の質量に対する比は、53.2:1〜54.9:1である。
【０１２１】
球状滲出物は、処理水試料中の銅を86%除去し、活性物質の質量の、除去された銅の質量に対する1.7:1の比において有用であり、これは、自由ユーグレナバイオマス又は球状ユーグレナバイオマスのいずれかの比と比較して約31×良好である。
【０１２２】
自由及び球状ユーグレナ滲出物の金属結合能力は同等である。球状ユーグレナ滲出物を使用する主な利点は、金属が材料に結合した後の錯体除去の容易さである。金属結合錯体を回収するため、取り扱う人が処理後の試料を遠心分離する必要がない。このことは時間やエネルギーを節約し、試料の取り扱い中に捕捉金属を偶発的に放出させる危険性を低減する。
【０１２３】
実施例2B:球状化する前に異なる採取後処理に付されたユーグレナ滲出物及びユーグレナバイオマスへの金属の選択的結合
I.序論
上記の実施例2Aに示されているように、ユーグレナの球状化は、金属回収に特定の利点を提供する。次に、Au、Ag、Pb及びCuへの結合剤として3つのシナリオで異なって生成されたビーズの機能性が開示される。第1のシナリオにおいて、試験は、ユーグレナビーズを含有するカラムが、炭素カラムを通過するAuを捕捉するため、炭素カラムの下流又は余剰池中で作動できるかを決定した。第2のシナリオは、ユーグレナビーズを含有するカラムが、Cu及びPbを除去するために上流で機能させることにより、炭素カラムの選択的Au結合特性を改善できるかを試験した。最後に試験は、ユーグレナビーズを含有するカラムが、主要なAu回収方法として機能することができ、炭素カラムに完全に取って代わることができるかを探求する。様々なビーズを様々な乾燥、加熱及びpHレベルで調製し、カラムに装填し、試験した。全体で50を超える試験を、異なる作業場所で実施した。
【０１２４】
球状化する前の採取後処理は、ユーグレナバイオマス又はユーグレナ培養物の滲出物の結合能力に任意選択で影響を与える。本開示では、ユーグレナバイオマスの異なる採取後処理は、異なる金属への結合における及び異なる金属の除去の程度における活性物質の能力に影響を与えることが見いだされる。
【０１２５】
II.実験手順
A.作業場所の選択及び試料の収集
採掘作業全体にわたって11の異なる作業場所(A〜K)を選択して、採掘作業に存在する可能性のある全ての水化学を表した(図7)。様々な試料を選択して、様々な水化学がビーズの性能にどのように影響を与えるかを決定した。
【０１２６】
B.ビーズの調製
この研究に使用した生化学物質は、標準的な発酵に基づいたユーグレナ・グラシリス由来であり、糖を炭素源として使用する。最大限の適応性を可能にし、規模拡大において他の材料との同時生成を可能にするため、「指向性発現(directed expression)」技術を使用することなく、生化学物質選択制を達成した。代わりに、抽出後の生化学物質の処理を試みた。
【０１２７】
生化学物質は、バイオマスの不溶性分画又は可溶性分泌材料(すなわち、滲出物)のいずれかに由来した。これらの材料を様々な技術によって単離し、次に処理して、特定の金属に優先的に結合する材料の創出を試みた。アルギン酸ナトリウムを選択して、金属を結合するときに生化学物質を保持するマトリックスを創出した。
【０１２８】
採取されたユーグレナ細胞により作製されたビーズでは、100gの加熱材料である100g当量(乾燥材料)のユーグレナバイオマスを、脱イオン水(DI水)で1Lにする。この混合物を十分ブレンドし、それに6gのアルギン酸ナトリウムを加える。再びこの混合物を5分間以上にわたって十分にブレンドする。
【０１２９】
次に得られた混合物を、2Lの4g.L-1冷蔵CaCl2溶液に撹拌しながら滴下する。CaCl2溶液と接触すると、ビーズが形成される。全てのスラリーがCaCl2混合物に滴下されると、得られたビーズは過剰溶液で膨張し、次に密閉容器に保存される。
【０１３０】
ユーグレナ細胞培養物の滲出物で作製されたビーズでは、1Lの液体中に含有された2.4g当量の乾燥材料を、6gのアルギン酸ナトリウムと5分間以上にわたって十分にブレンドする。次に、この混合物を上記に記載されたようにCaCl2溶液に滴下して、ビーズを形成する。ユーグレナ滲出物を濃縮するために、滲出物を含有する液体を、容積が2.5×に低減するまで、rotovapにより70℃で蒸発させる。この濃縮された滲出物で作製されたビーズでは、1Lの液体中に含有された6g当量の乾燥材料を、6gのアルギン酸ナトリウムと5分間以上にわたって十分にブレンドする。次に、この混合物を上記に記載されたようにCaCl2溶液に滴下して、ビーズを形成する。
【０１３１】
或いは、上記のいずれかの混合物は、金属担持溶液の拡散を可能にし、同時に材料がカプセル化されることを保持する材料で、球状化、ゲル化、カプセル化又は固定化されると考えられる。カプセル化材料の望ましい形態は、前記ビーズの表面積を最大化する球状である。
【０１３２】
合計で10個のビーズ変形を試験して、有効性について及びいずれかの金属への優先的選択制が呈されたかについて試験した(Table 7(表7))。ユーグレナバイオマス(EE)をカプセル化せず、対照として使用した。ビーズ径(3mm及び5mm)も、表面積が結合化学に影響を与えるかについて調べるために変えた。ユーグレナ細胞培養物の滲出物をカプセル化して、濃度について及び技術の性能に対する表面積の増加効果について検査した。次にバイオマス由来生化学物質を乾燥し(50℃)、熱処理して(80℃、120℃)、このことがAuへの結合優先に(活性炭と同様に)影響を及ぼすかについて探求した。またバイオマス由来生化学物質を様々なpH(4、6、7)で調製して、結合化学へのpHの影響を探求した。
【０１３３】
【表７】
2020516768.tif 000011
【０１３４】
C.標準的カラム操作
標準的な単一カラム操作は、およそ50mLのビーズ材料をカラムに装填することによって実施した(図8A)。脱イオン水をポンプによりカラムに送って、ビーズ材料を洗浄した。カラムを、試料がカラムの底部から上方へ移動し、最上部から出るように位置決めした。試料を、5分毎に1ベッドボリューム(bed volume、BV)の速度でカラムに送った。5分間隔毎に試料を取り出して、水の組成が方法の開始時からどのように変化したかを比較した。カラムを3BVで稼働させて、全体の除去率を調べた。
【０１３５】
単一カラム操作を、ビーズ型WBSにより全ての作業場所で実施して、水化学がビーズ性能に対してどのように影響を与えたかを調べ、全てのビーズ型を作業場所Kにおいても調べた。選択されたビーズ(WBS、WB6、DB50、DB120、SB)を作業場所A及びFで試験して、性能におけるビーズ型の影響を探求した。これらの作業場所は、炭素カラムの上流及び下流にあり、多様な金属及びCN濃度を有した。活性炭を、前処理として非カプセル化ユーグレナを伴って及び伴うことなく、作業場所A及びKにおいて試験した。
【０１３６】
D.CNの破壊及びpHの調整
処理水の試料を過剰量の過酸化水素(H2O2)で処理して、試料中のCNの破壊を促進した。金属イオンが溶液に沈殿し得るので、少量の酸を加えて、pHが4を上回るように保持した。
【０１３７】
最初に処理水を未変更状態で試験し、次にH2O2を添加し、最後に一定pHの4にした。これらの試験を行って、カラム性能を最大化する方法を決定した。pHを4に維持することによって、pHがカラムに対して肯定的な影響を及ぼすかを決定することができた。
【０１３８】
E.カラム列操作
カラム列操作は、単一カラム操作と同じ方法により行われるが、2本以上のカラムが直列で接続され、各カラムが異なる種類のビーズを含有し、別の変形では、活性炭のカラムが列に含まれる(Fig. 8B(表8B))。この系は、最初のベッドボリュームが、使用されるカラム数に5を掛けた後(BVを処理するのに各カラムが5分間)で得られる以外は、標準的なカラム操作と同じ方法で操作される。例えば、3本のカラムが直列で接続されている場合、系は系全体を通過した試料を収集するため15分間稼働しなければならない。
【０１３９】
複数列を異なるビーズ及び/又は炭素の組合せで作業場所A及びKにおいて試験した。ビーズを収集して、列における金属分布を検査した。目的は、列が炭素カラムの性能を増加できたか又は炭素カラムに取って代わることができるかを決定するためであった。
【０１４０】
F.水質分析
処理水試料をカラムに導入する前に、原子吸光分光光度計(AAS)により試験して目的の金属の濃度を決定した。池試料の各ベッドボリュームをカラムに通過させた後、試料を収集し、ここでもAASを使用して試験した。各試料の各ベッドボリュームの初期濃度と処理後の濃度との差を計算し、除去率として表した。試料の複数のベッドボリュームを処理した場合、平均除去率を報告した。
【０１４１】
G.ビーズ上の金属についてのアッセイ
実験のビーズ材料を収集し、分析のためにSGSへ送った。SGSは、ビーズを乾燥し、次に王水(非常に強い酸)に溶解した。得られた溶液をAASで分析して、乾燥ビーズ1kg当たりの金属の濃度を得た。これは、ビーズカラム及び炭素カラムの負荷及び選択性を試験するために実行した。
【０１４２】
III.結果及び考察
A.作業場所の選択及び分析
試料を採掘作業全体にわたって11の異なる作業場所から取り出して、様々な水化学がどのようにビーズ性能に影響を与えたかを決定した(図7)。予測されたように、各作業場所は、様々な濃度のAu、Ag、Cu及びPb、並びに様々なpH及びCNレベルを有した(Table 8(表8))。
【０１４３】
【表８】
2020516768.tif 000012
【０１４４】
最高濃度のAu及びAgが浸出パッド(A、B、C)から直接観察され、カラム誘引の前(D、E)に観察され、一方、最低濃度が炭素誘引(F、G)の後に観察された。肥沃池(H)において濃度は僅かに増加したが、余剰池(I、J、K)により量は再び低下した。
【０１４５】
Cu及びPbの濃度は、両方とも、方法の第1段階(A、B、C)から終了(J、K)にかけて有意に減少した。同じ現象がpHレベルで観察され、これらは開始から終了にかけて減少する傾向があった(11.9pHの高さで出発し、9.1の低さに下がった)。
【０１４６】
全CN及び遊離CNの量は異なる挙動を示した。両方とも方法の開始から中間地点で観察されたが、肥沃池において(追加のCNが方法に添加された後に)濃度が有意に増加した。全CN及び遊離CNの量は、徐々に減少して、作業場所J及びKにおいて最低レベルになった。
【０１４７】
作業場所Kは、低レベルのCN及び金属の両方を有し、ビーズ性能を潜在的により厳しい環境において試験することを可能にした。作業場所Kの試料を、特に、ビーズの表面積、生化学物質の含有量/種類、熱処理及びpHがビーズの性能に影響を与えるかを決定する試験場として選択した。
【０１４８】
B:カラム操作:ビーズ最適化
合計で23試験を実施して、様々なビーズが異なる作業場所でどのように反応するかを検査した(Table 9(表9))。
【０１４９】
【表９Ａ】
2020516768.tif 000013
【０１５０】
【表９Ｂ】
2020516768.tif 000014
【０１５１】
全てのビーズを作業場所Kで試験したとき、結果は、ビーズWBS(3mm)は、ビーズWB6(5mm)と比較して高いAu、Ag及びCu除去率を実証し、表面積が大きいほど高い結合能力をもたらしたことを実証していることを示した。この相違は、小さい(CSBS)及び大きい(CSBL)濃縮分泌生化学物質(すなわち、滲出物)ビーズを比較したときに更に大きかった。
【０１５２】
分泌され、バイオマス由来生化学物質が対比されると、有意な傾向は観察されなかった。更に、分泌された生化学物質(滲出物)がビーズ(SB対CSBL)に濃縮されると、金属除去は推定した通りに増加しなかった。
【０１５３】
分析した別の変数は、バイオマス由来生化学物質の熱処理技術である。この変数では、ビーズのWBS(湿潤)、DB50(50℃)、DB80(80℃)及びDB120(120℃)を比較した。ビーズWBSは、全体的に全ての金属で大きな除去率を示した。ビーズDB120は、ビーズDB80と比較したときAuに高い親和性を示し、これは、活性炭と類似した熱処理方法に起因し得る。Ag除去も、ビーズの更なる熱処理によって減少した。
【０１５４】
最後に、カプセル化過程で異なるpHレベルで調製されたビーズが金属結合能力に影響を与えたかを調査した。oHレベルがそれぞれ4、6及び7であるビーズWB4、WB6及びWB7を、pHが6の対照と共に比較した。結果は、全体的に、WB7がビーズWB4及びWB6と比較して最も良好な全体的金属除去を有したが、Ag除去が例外であり、これはビーズWB4の方が高かった。
【０１５５】
追加の研究を作業場所A及びFで実施して、ビーズの性能に対する表面積、生化学物質の種類及び熱処理方法の影響を更に探求した。浸出パッドからの直後に配置された作業場所Aは、最高の金属濃度及びCNの最低レベルの1つを有した。理論に束縛されるものではないが、これらの条件は、ビーズの最適な性能を達成するために好ましい。逆に、作業場所Fは低い金属濃度及び最高レベルのCNの両方を有した。これらの条件は、ビーズの性能に好ましくない影響を及ぼすと予測された。
【０１５６】
ビーズの表面積を作業場所A及びFで比較すると、作業場所Kにおいて実証されたものと同一の、小さなビーズ径による肯定的な作用が観察された。分泌されたバイオマス由来生化学物質のビーズを作業場所A、K及びFにおいて比較すると、ビーズはAgを除いて各金属に対して類似した性能を有し、このことはバイオマスビーズWBSによる高い除去率と一致していた。
【０１５７】
熱処理技術を異なる作業場所に比較すると、傾向はビーズ型及び作業場所により非常に異なっていた。作業場所Aでは、ビーズDB120はAu及びCuの最高の除去を有したが、作業場所Kでは有意な差はなかった。作業場所AでのビーズDB120へのAu負荷量は、他のいずれの作業場所における他の全てのビーズと比較して有意な増加を呈した。この負荷量の増加は、より高いAu濃度又はより低いCNレベルのいずれかに起因し得る。作業場所Fでは、WBSビーズは最良のAu除去を有した。このことによって、ビーズ型の結合優先性及び作業場所の水化学についての重要性を実証することができた。全ての作業場所において、WBSビーズは最も良好なAg除去を有した。
【０１５８】
この一連の試験は、ビーズ型及び調製方法が性能及び選択性に対する重要さを実証した。ビーズDB120を、方法の開始時(作業場所A)に使用される場合にはAu結合の候補として選択した。このビーズによるCu及びPbの高い除去も存在したので、これらの金属を除去するための前処理が選択性を達成するために必要である。標的金属と比較して比較的低いAu除去比のため、ビーズDB50をCu除去の候補として選択し、ビーズSBをPb除去の候補として選択した。これらの有望な結果を使用して、残りの試験の設定を最適化した。
【０１５９】
C.カラム操作:作業場所の最適化
作業場所の最適化は、ビーズWBSを使用して実施した(Table 10(表10))。このビーズを過程内の各作業場所Aで更に試験するために選択して、作業場所における性能及び選択性における傾向を求めた。ビーズWBSは、ビーズ最適化研究のために作業場所A、F及びKで試験したときに最も良好な一般的性能を有し、初期試験の際に実験室において広範囲に試験された最初の最適化ビーズであった。実験室処理は、全金属の総除去率の最適化に焦点を合わせ、それは、このことが一般的に金属除去に関して他のビーズより良好に機能する理由であり得るからである。次にWBSを異なる作業場所でどのように機能するかについて試験した。
【０１６０】
【表１０】
2020516768.tif 000015
【０１６１】
Auの最高の除去は作業場所E(53%)であり、Agは作業場所J(84%)であり、Cuは作業場所J及びK(35%)であり、Pbは作業場所A(95%)であった。時流CNの最低レベルを有する試料(作業場所J及びK)では、Cu及びAgの高い除去率が観察された。加えて、高い全CNレベルを有する作業場所は、不十分なCu及びAg除去(作業場所G)を呈したことが観察された。
【０１６２】
全体として、作業場所の位置によってビーズ性能に有意な差があった。これらの差は、水化学若しくは金属濃度、又は他の要因との組合せに関連し得る。作業場所最適化の結果は、ビーズ型のみならず、過程内の特定の作業場所も最適化する重要性を実証している。ビーズ性能に影響を及ぼしている要因を制限するため、CN及びpHの影響を単離する試みを、水化学最適化試験により行った。
【０１６３】
D.水化学の最適化
ビーズと作業場所最適化の両方の試験において、一般的な傾向は、高いCNレベルが存在すると低い性能に関連し、高い性能が低いpH条件に関連した。この一連の試験は、ビーズ性能に対するこれらのパラメータの影響を単離する目的であった。
【０１６４】
ビーズ性能に対するCN及びpHの影響を単離するため、作業場所A及びKの試料においてCNを破壊し、pHを調整した。過酸化水素(H2O2)を使用して、作業場所A及びKにおいてCNレベルを、334及び133ppm(合計)、並びに0及び90ppm(自由)のそれぞれから、ほぼ0ppmに低減した。pHも作業場所A及びKにおいて11.9及び9.1から4に調整した。次にビーズの性能を、未処理水、CN低減水及びpH低下CN低減水において比較した。
【０１６５】
【表１１】
2020516768.tif 000016
【０１６６】
両方の作業場所において、CNの破壊とビーズ性能に有意に肯定的な相互関係が存在した(図9)。作業場所Aでは、CNの破壊とpHの調整の組合せは、Ag及びCuの除去を有意に改善した。Au除去は、CN破壊をpH調整と組み合わせると僅かに改善した。作業場所Kでは、CN破壊は、単独で、Au、Cu及びPbの除去に最も良好な影響を有したが、Agの除去は、pH調整を伴う及び伴わないCN破壊の両方から利益を受けた。全体として、CNの破壊(pH調整を伴う又は伴わない)は、全ての金属の除去を改善した。これは、各作業場所におけるCN種が、どれほど著しく性能に影響を与え得るかの別の例である。
【０１６７】
処理される処理水はCN含有溶液であり、目的の金属イオンは、金属CNアニオン性錯体である可能性が最も高い。理論に束縛されるものではないが、ビーズの作用機構は、金属カチオンとビーズ材料との相互作用を伴うと考えられる。金属がアニオン性錯体状態を有することは、ビーズ材料の性能を妨げる可能性があり得る。これらの実験は、CNの破壊がビーズに性能に対して肯定的な影響を有したことを実証することができた。世界中の大部分の金鉱山は、放出する前に残滓中のCN及びCN錯体を破壊することが法令によって求められており、この処理の後にビーズを位置付けるす可能性がある。より費用効果的な方法は、最適な性能のためにプロセス内の最低CNレベルを有する作業場所を選択することである。
【０１６８】
E.炭素カラムの前処理
採掘作業の一部は、処理溶液においてAu/Agを選択的に吸着する過程に存在する炭素カラムを伴う。炭素はCu等の他の金属にも高い親和性を有するので、前処理工程がどのように炭素カラムの選択性及び負荷量を増加できるかを試験することは、重要である。これらの実験では、カラムに活性炭を充填し、負荷能力を、前処理済み及び前処理されていない処理溶液で比較した。
【０１６９】
この技術は、非カプセル化ユーグレナ(EE)を、炭素カラムの前に前処理として使用した。有望な結果がこの手法によって見いだされ、作業場所A及びKにおいて実証された(Table 11(表11))。Auの負荷量は劇的に増加し、作業場所Aでは15倍増加し、作業場所Kでは30倍を超えて増加した(図10)。作業場所A及びKでは、Cu負荷に無視できるほどの差しかなく、Auへの高い選択性を示した。両方の作業場所では、Agの負荷量も減少し、作業場所AではPb負荷量も減少した。全体として、EEによる前処理は、炭素のAu選択性を増加し、一方、他の金属は、(作業場所KにおけるPbを除いて)減少した又は変化しないままであった。
【０１７０】
F.カラム列:炭素の最適化
予備試験の結果は、一部のビーズが特定の金属に高い親和性を有することを示し、単に1種のビーズを含有するカラムに試料を通して処理するのではなく、溶液を直列させたカラムに通して、標的金属を選択的に除去することが有益であることを示している。この研究の目的は、これらのビーズを炭素フィルタの上流に使用して、金属を除去することが、Au選択性を減少させ、炭素カラムを増強させるかを探求することであった。
【０１７１】
ビーズDB50及びSBを、ビーズ最適化処理の結果に基づいて、これらの試験に選択した。ビーズDB50を、ビーズWBSと比較してAuへの低い親和性及び比較的類似したCuの除去に基づいて選択し、このビーズは列においてCu除去を標的にする。Pbの除去に最高の優先性を有したので、ビーズSBを選択し、このように、このビーズは列においてPb除去を標的にする。両方の作業場所A及びKでは、ビーズとの2つの組合せを使用し、ビーズDB50とSBの後に炭素(カラム列1)又はビーズSBの後に炭素(カラム列2)(Table 12(表12))であった。
【０１７２】
【表１２】
2020516768.tif 000017
【０１７３】
作業場所Aでは、カラム列1の炭素前ビーズは、標的金属のCu及びPbの極めて有意な除去を有し、単独より直列にした場合の炭素カラムに低い量のCu及びPbをもたらした。特定的に選択されていないが、これはAg結合にも当てはまり、ビーズにより除去の増加は、低い量の炭素をもたらした。しかし、予想より高いAuの除去も実証した。理論に束縛されるものではないが、これらの試験は固定量の処理水を使用したので、ビーズの容量が適応しなかった。これは、炭素よりビーズDB50の方にAuへの高い初期親和性があることを意味する。当業者は、飽和すると、大部分のAuが最終的には炭素カラムに収まることを容易に認識することができる。
【０１７４】
作業場所Aのカラム列2は、極めて有望な結果を有した。ビーズSBを有する第1のカラムは、有意にAg、Cu及びPbを除去し、炭素においてこれらの金属のレベルを減少した。このことは、炭素それ自体と比較して、より高いAu負荷量を炭素にもたらした(10倍を超える)。2つの列を比較すると、ビーズSBは、極めて類似したAu負荷結果を生じた。これは、ビーズSBが比較的低いAu負荷閾値を有することを潜在的に実証している。Cu及びPbを除去する実証済み能力と結びついた低いAu閾値は、ビーズSBが処理水の炭素前処理の手段として適切であり得ることを支持している。
【０１７５】
作業場所Kのカラム列1は、作業場所Aと類似した全体的な効果を有した(Table 13)(表13))。第1のカラムにより全ての金属が有意に除去され、このことは、Ag及びCuへの減少した結合、並びに炭素における低い量のPbをもたらした。大多数のAu及びAgは第1のカラムにより除去されたが、依然として炭素における総Au負荷量の増加をもたらした。
【０１７６】
【表１３】
2020516768.tif 000018
【０１７７】
カラム列2では、第1のカラムにより有意なレベルのAg、Cu及びPbが除去されたが、炭素へのこれらの金属の負荷量の減少はもたらさなかった。Agレベルは減少したが、類似したCu量及び高いPb量が炭素において観察された。しかし、炭素単独と比較して、依然として炭素においてAu負荷量の有意な増加があった(30倍を超える)。
【０１７８】
炭素の改善されたAu負荷が両方の作業場所においてカラム列2により観察されたが、Auの合計負荷量の差異がカラム列1と2の間に確立された。このことは、カラムを通る処理溶液の量を制限しない、更なる試験を実施する必要性を強調している。これは作業場所に近い条件をもたらし、次に、これらのカラム列がどのように機能するかについてのより良好な理解をもたらす。しかし全体として、炭素と共に列においてビーズを使用することは、有意にAuの炭素負荷量を増加し、Cu及びPbの負荷量を減少することができる。当業者は容易に上流ビーズカラムを改変して、Au除去を減少させ、炭素に結合される利用可能なAuの量を増加させることができる。
【０１７９】
G.カラム列:ビーズ最適化
上記に示されたように、ビーズDB120は、作業場所A及びKにおいて有利な量のAuを除去することができた。炭素と同様に、DB120も高い量のCuに結合する。したがって、溶液がカラムを通過する前にビーズを加えて、Cuを除去し、Au選択性を潜在的に増加させた。カラム前での結果に基づいて、ビーズDB50及びSBを再び試験することを決め、今回はDB120を用いた。作業場所A及びKの両方において、カラム列3(ビーズDB120の上流のビーズDB50、次にSB)及びカラム列4(ビーズDB120の上流のSB)を炭素に取って代わる可能性を試験した(Table 14(表14)及びTable 15(表15))。
【０１８０】
【表１４】
2020516768.tif 000019
【０１８１】
【表１５】
2020516768.tif 000020
【０１８２】
作業場所Aを観察すると、カラム列3はカラム列1と類似した全体的な効果を有した。第1及び2のカラムによるCu及びPbの有意な除去があり、ビーズDB120が両方の金属を劇的に減少した。上流のビーズが有意なAu負荷量の原因であり、ビーズDB120による比較的低いAu負荷量をもたらした。しかし、同じ上流ビーズを用いたこの作業場所での炭素と比較して、10倍多くのAuがビーズDB120により捕捉された(図11)。同じ作業場所でカラム列4とカラム列2を比較すると、同様の傾向が観察された。ここでも、ビーズDB120が同じ列において炭素より多くのAuを捕捉した。上流では、ビーズSBが高い量のAG、Cu及びPbに結合し、DB120によるこれらの金属の量をDB120単独と比較して減少させた。減少が確認されたが、DB120は、依然としてこれらの金属に比較的高い量で結合した。当業者は、これらのビーズの選択性を容易に改善することができる。
【０１８３】
作業場所Kでのカラム列3の結果は、作業場所Aで観察されたものと傾向が類似していた。ビーズDB50及びSBは、大量の全ての金属を除去したが、この作業場所では、ビーズDB120に最低量の金属をもたらさなかった。末端において、炭素単独よりも高いAu負荷量がビーズDB120において観察され、同じ列の炭素より僅かに高かった。カラム列4では、カラム列と比較してビーズDB120のAu負荷量は増加したが、同じ列の炭素より増加しなかった。列の全体にわたって、ビーズDB50は、Cuへの有意な結合(約7g/kg)を一貫して示した。本発明者たちは、溶液量の増加がビーズDB50によるCu結合容量を増加すると推定する。
【０１８４】
これらの結果は、ビーズDB120を炭素ベースの方法のAu捕捉の代替案として潜在的に使用できることを示している。これらのカラム列はビーズDB120が同じ列の炭素より非標的金属への高い結合を呈することを確立したが、依然として高いAu負荷能力を有していた。更に、直列されていない炭素とビーズDB120の負荷能力を比較すると、極めて大きな差が観察された(作業場所A及びKにおいて、それぞれ0.22対8.34、0.02対0.72(g/t))。この炭素と比較した高いAu負荷量は、カラム列1及び3の第1のカラムに使用されたとき、ビーズDB50においても観察された。ビーズDB50は、炭素より多くのCu及びPbも連続的に負荷して、Auに対して特定の選択性を示さなかった。当業者は、カラム列を容易に改変して、Au容量及び選択性を増加することができた。
【０１８５】
IV.結論
採掘作業における試験によって得られた結果は、以前の実験室試験に基づいた予想された結果に合致し、それを超えることができた。本開示の革新的なビーズ技術は、処理容積中の非標的金属の濃度を低減する有意な能力を実証した。これを、Auも捕捉するビーズの能力と組み合わせると、様々な潜在的な可能性を有する。多数の試験を実施して、ビーズの性能、選択性及び負荷量を決定した。
【０１８６】
金属及びCN濃度を錯体全体にわたって様々な作業場所において評価した。予測されたように、金属濃度は、方法の全体にわたって変わり、広範囲のCN濃度及びpHレベルが観察された。これらの結果から、作業場所Kは、全てのビーズに性能の差を試験するのに良好な環境を提供したことを決定した。
【０１８７】
全てのビーズ変形を試験すると、小さなビーズ(3mm)が大きなビーズ(5mm)より高い除去率を有したことが観察され、表面積の増加がより良好な結果を生じることが支持された。差は、ビーズ調製の熱処理技術を比較したとき、並びに様々なpHレベルで調製されたビーズを比較したときに検知された。これらの結果に基づいて、選択されたビーズを2つの追加の作業場所で更に試験した。作業場所A及びFは、互いに及び作業場所Kと異なる濃度の金属及びCNを有し、様々な条件を有する3つの作業場所を提供して、ビーズの性能における差を更に決定した。結果において同様の傾向が観察された。高い量のAu除去が作業場所Aにおいて発生した。この増加は、高濃度のAu及び低濃度のCNが原因であり、除去の増加を可能にした。これらの試験よって、ビーズWBSは最も良好な全体的な性能を呈することが決定され、これを全ての作業場所で試験して、性能又は選択性に作業場所の位置に基づいた傾向があるかを決定した。
【０１８８】
全ての作業場所を比較すると、ビーズWBSは、全ての金属において広範囲の除去を実証した。主に高い金属除去はCN濃度が低いときに発生し、逆に低い除去は高いときに発生した。理論に束縛されるものではないが、全ての作業場所でのビーズWBSの試験を通して、水化学及びCN濃度は、ビーズ型とほぼ同じ有意さで性能に影響を与えた。したがって、CN濃度及びpHレベルがビーズ性能に与えた影響を制御する試みがなされた。
【０１８９】
作業場所A及びKでは、溶液中のCNを破壊することによって、除去率が、とりわけAg及びCuの除去率が改善されたことが実証された。全ての金属が、CN破壊を有する両方の作業場所において除去の増加を示した。これらの水最適化試験は、ビーズの配置が、低いCNレベルが存在する作業場所に位置する場合に最も有効であることを示した。
【０１９０】
ビーズの代替案として、非カプセル化ユーグレナを溶液前処理技術として試験して、炭素のAu及びAg負荷能力の増強を試みた。溶液を炭素の前にユーグレナと接触させると、炭素へのAu負荷量の増加を実証した。これを同様にビーズにより試みて、炭素に接触する前に非標的金属を排除するように試み、最終的にAu吸着を改善した。
【０１９１】
カラム列1において、炭素に接触する前にビーズDB50及びSBを作業場所A及びKにおいて直列で使用し、有意な量のCu及びPbを除去した。これは炭素に低下した量をもたらした。作業場所Kでは、炭素負荷量は増加した(0.02対0.26g/t)。炭素接触の前にビーズSBそれ自体が使用されたとき、同様の結果がカラム列2において示された。炭素へのAu負荷量は、炭素単独よりも作業場所A(0.22対2.8g/t)及びK(0.02対0.74g/t)の両方において有意に改善された。ビーズDB50は、Auに対して所望より高い親和性を実証し、炭素に結合されるのに利用可能な量に影響を及ぼした。しかし、一貫して有意な量のCu(約7g/kg)に結合し、業界標準に近づいた。当業者は、Auへの親和性を容易に減少させることができ、同時に上流ビーズでの非標的金属への親和性を増加させることができ、このことは炭素結合能力を有意に改善すると推定される。
【０１９２】
実施例2C:人為的溶液によるバッチ試験
バッチ試験を人為的な金属溶液により実施して、ビーズWBS及びSBの金属除去能力を評価した。1.5%のアルギン酸ナトリウム溶液及び1.5%の塩化カルシウム溶液をカプセル化に使用した。WBSビーズでは、1.5%のアルギン酸ナトリウム溶液:湿潤バイオマス混合物の約4:1混合物を使用した。加えて、SBビーズでは、1.5%のアルギン酸ナトリウム溶液:使用済培地溶液の約1:1混合物を使用した。単一金属溶液及び多金属溶液を試験した。単一金属溶液の結果は、3回の試験の平均であり、多金属溶液では4回の試験の平均である。試験をフラスコ中において24時間実施し、その間、振とう台で撹拌した。溶液及び固体をICP-MSでアッセイした。人為的金属溶液を以下のように調製した(Table 16A(表16))。
【０１９３】
【表１６】
2020516768.tif 000021
【０１９４】
銅及び金の単一金属溶液の場合にはWBSビーズが僅かに高い率で除去することを除いて、一般的にWBS及びSBビーズは類似した除去率を招いた(Table 16B及びC(表17及び表18))。しかし、SBビーズは乾燥ビーズ質量に基づくと、一貫してより大量の金属を負荷した。
【０１９５】
【表１７】
2020516768.tif 000022
【０１９６】
【表１８】
2020516768.tif 000023
【０１９７】
実施例2D:脱着、再使用及び炭素前処理
脱着
商業的な金属除去用途に使用されるカプセル化ユーグレナ/ユーグレナ滲出物の能力の評価を助けるため、金属脱着試験を実施して、ビーズに結合した金属を除去する可能性を決定し、次にビーズが更なる金属の除去に使用され得る可能性を決定した。ビーズを実施例2Cと同様に調製した。最初に試験を、同じモル濃度の4つの異なる脱着剤:0.2Mの塩酸(HCl)、0.2Mの水酸化ナトリウム(NaOH)、0.2Mの硝酸(HNO3)及び0.2Mのリン酸(H2SO4)を有する人為的多金属溶液と接触させた後のビーズにおいて実施した。次に、これらの脱着剤を2つの異なる濃度で(僅か0.1MのNaOHを除いて)、採掘溶液と接触させた後のビーズで試験した。2つの他の脱着剤のシアン化カリウム(KCN)及びチオ尿素を、ビーズからの金の選択的除去について試験した。続いて金属間の脱着についての試験を実施して、金属を除去する能力が脱着後に新たなビーズを使用するのと同じ有効性であり得ることを実証した。これらの再使用試験では、HNO3を採掘溶液の接触毎に吸着剤として使用した。
【０１９８】
多金属溶液と接触した後の金属の脱着では、3種の酸(HCl、HNO3、H2SO4)がNaOHより全体的に有効であった(Table 16D(表19))。しかし、NaOHはAuの脱着において3種の酸より有意に良好であった。3種の酸全ては、WBS及びSBの両方からCu及びPbの脱着に同様に成功しており、一方、HClは、ビーズからAgを脱着する能力が増加した。両方のビーズの大部分が金属を同様に放出したが、いずれかの酸と接触した後でWBSと比較したSBビーズからのAgの脱着は、顕著に増加した。NaOHは、から全ての金属の脱着においてビーズSBよりビーズWBSの方が僅かに良好であった。
【０１９９】
【表１９】
2020516768.tif 000024
【０２００】
採掘溶液と接触した後のビーズWBS及びSBからの金属脱着では、0.1Mから0.25Mへの脱着剤濃度の増加が、ほぼ全ての場合において増加した量の金属を脱着することができた(Table 16E(表20))。多金属溶液と同様に、NaOHは、Auを除いて、酸脱着剤と比較して金属の脱着における有効性が小さかった。3種の酸は、Au及びAgよりCu及びPbの脱着の方に有効性があった。2種のビーズを比較すると、全ての脱着剤はビーズWBSよりビーズSBからの金属の脱着に成功していた。全体として、0.25MのHNO3は、ビーズSBに好ましい脱着性であることを示し、0.25MのHCl及び0.25MのHNO3は、ビーズWBSに好ましい脱着剤である。これらの結果は、排出溶液から金属を除去した後のカプセル化ユーグレナ及びユーグレナ滲出物から脱着された金属を示す。
【０２０１】
【表２０】
2020516768.tif 000025
【０２０２】
選択的Au脱着
Table 16F(表21)に示されているように、18時間の接触時間の後、KCNの濃度の増加は、ビーズからのAuの増加した脱着をもたらす。他の金属も脱着されたが、Cu及びPbの脱着は、KCNの濃度が増加すると僅かに減少した。Agの脱着は、KCNの濃度が変化しても実質的に同じままであった。チオ尿素の濃度が増加すると、Auの脱着も増加した。同じ濃度のチオ尿素による短時間の接触時間では、Auの脱着には有効性が小さく、また同時により多くのCU及びAgを脱着した。
【０２０３】
【表２１】
2020516768.tif 000026
【０２０４】
再使用
WBSビーズの金属除去能力は、金属を脱着した後に影響を受けなかった(Table 16G(表22))。このことは、NHO3等の脱着剤が結合金属を有効に除去することができ、溶液との少なくとも3回の連続接触にもビーズの有効性に影響することなく、続く金属除去のためにビーズの結合位置を開放できることを実証している。
【０２０５】
【表２２】
2020516768.tif 000027
【０２０６】
炭素の前処理試験
試験を実施して、炭素に接触する前の溶液前処理として、例えば、採掘処理水が炭素誘引に入る直前に取り出される誘引溶液を用いて、ビーズWBS及びSBを使用する利益を決定した。理論に束縛されるものではないが、ビーズは非標的金属(Cu及びPb)を除去し、炭素へのこれらの金属の負荷量を減少し、このことが炭素における標的金属(Ag、とりわけAu)の高い負荷量をもたらす。試験を、ビーズ前処理なし及び炭素接触のみと同時に実施して、ビーズ前処理の利益を評価した。ビーズ接触時間は6時間であり、一方、炭素接触時間は16時間であった。結果は、溶液の種類及びビーズ前処理による炭素への金属負荷1トン当たりのグラムで示した(Table 16H(表23))。
【０２０７】
【表２３】
2020516768.tif 000028
【０２０８】
いずれかのビーズによる前処理は、炭素に負荷された誘引溶液(作業場所Aの溶液に類似している)に少ないPbをもたらし、炭素に結合する非貴金属を、Au負荷に影響を及ぼすことなく排除するフィルタ様能力に使用される特性を有することを実証している。このことは、前処理として使用されたとき、炭素に負荷されたPbの量を、Au及びAg負荷量に有意に影響を与えることなく有意に減少するビーズSBにとりわけ当てはまる。誘引溶液を、炭素への接触の前にWBS又はSBビーズと接触させることは、Au又はCuの炭素負荷量に影響を及ぼさなかった。ビーズWBS及びSBによる池溶液(作業場所Kの溶液と類似している)の前処理では、このことは、炭素へのCu及びPbの結合の減少をもたらし、一方、金の負荷量を僅かに増加した。このことは、カプセル化ユーグレナ又はユーグレナ滲出物が、非標的金属を排除して炭素におけるAu純度を改善する前処理フィルタとして機能する特性を有することを示している。
【０２０９】
まとめると、これらの結果は、開示されたビーズ技術が有用であることを実証している。特に、本明細書に開示されている方法、使用及び生物吸着剤は、炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンク等からの採掘処理水からの、並びに炭素誘引、樹脂カラム、余剰池、中間池、肥沃池及び残滓池等の池、浸出パッド、電解採取セル、浮遊タンク、メリルクロウタンク、固相抽出タンク及び肥沃タンク等のタンクに入る又はから出る採掘処理水からの金属の改善又は回収に有用である。標的及び非標的金属の両方を捕捉する能力は有意である。これらのビーズは、金属回収に利用可能な現在の技術の代替案となる能力を有し、より効率的であり、より柔軟性があり、より費用対効果があるので、炭素カラム等の現在の技術を補って作用すると考えられ、更には取って代わると考えられる。当業者は、本開示のビーズ技術を容易に改変して、金属選択性及び負荷容量を増加させることができる。
【０２１０】
実施例3:凍結乾燥ユーグレナ・グラシリス細胞の構造及び分子の特徴決定
I.序論
実施例1及び2に示されたように、藻類鞭毛虫のユーグレナ・グラシリスは、効率的な生物吸着剤であり、構造及び分子レベルでの更なる調査を保証する。ユーグレナ・グラシリスは、光の存在下及び不在下で増殖することができ、好気性及び嫌気性条件下でも増殖することができる。ユーグレナ・グラシリスは、2.5〜8の広範囲のpH値で増殖することができ、淡水、海水及び汽水において天然に見いだされる。ユーグレナ・グラシリスは、金属、メタロイド及びREEの生物吸着に実現可能な生物吸着剤である可能性を有する。
【０２１１】
本開示において、フリーズドライ(すなわち、凍結乾燥)したユーグレナ・グラシリスの分子構造分析は、エレクトロスプレーイオン化高解像度フーリエ変換オービトラップ(orbitrap)質量分析(Q-Exactive ESI Orbitrap)により実施した。本研究は、分光技術(FTIR)及び質量分析技術(HR-MS)を組み合わせて使用して、ユーグレナ・グラシリス内の主要な化合物のクラス及び官能基の存在、並びに生物吸着の潜在力のために化合物クラスの増強に最適な増殖期及び条件を構造及び分子レベルで開示する。
【０２１２】
II.実験手順
A.藻類の培養物
ユーグレナ・グラシリスZを12時間の光(54,000lx)及び12時間の暗サイクルにより29℃で純粋培養し、また暗黒チャンバーにより24時間暗黒下において29℃で培養した(ThermoScientific)。ユーグレナ・グラシリスを、500mLの培養培地を有する1Lのエルレンマイヤーフラスコ中で、グルコース補充(20g.L-1)を有する及び有さないユーグレナ・グラシリス培地(又はEGM;Wintersら、2016年)において増殖させた。ユーグレナ・グラシリスを増殖の指数期及び定常期で収集した。細胞を4000rpmで6分間遠心分離し、Milli-Q水で十分に洗浄して、細胞からあらゆる培養培地を除去した。凍結乾燥細胞を、構造及び分子特徴決定の前に、大理石の乳鉢と乳棒を使用して均質化した。
【０２１３】
B.FTIR分析
凍結乾燥ユーグレナ・グラシリスのFTIRスペクトルは、EZ Omnic Spectraソフトウエアを備えたThermoNicolet 380 ATR FTIR分光光度計(ThermoScientific)を使用して得た。FTIRスペクトルは、4000cm-1〜400cm-1の範囲で記録した。32回の走査を、解像度4.000、絞り100.00及びミラー速度0.6329により得た。
【０２１４】
C.AF4分析
AF4系は、254nmで作動するオンラインShimadzu UV-Vis検出器(SPD-M30A)を備えたPostnova Analytics AF2000 Focus(Salt Lake City、UT、USA)であった。1キロダルトン(kDa)の再生セルロース及び350μmのスペーサーを使用した。溶出液(10.1mMのNaCl)を毎日調製した。担体液の空試料を各試料の前に実行して、復元効果がないことを確実にした。200μlの試料を、手動インジェクターバルブを介して注入した。分画A〜D(図17)を、それぞれ7.5〜8、8〜9、9〜10、10〜11分の保持時間で収集し、一方、組み合わせた分画を7.5〜11分で収集した。非分画上澄みも組み合わせた分画と比較した。収集した分画及び非分画試料を4℃で冷蔵し、4日以内に分析した。AF4分画の複製も2日以内行った(毎日1つの複製)。
【０２１５】
D.Q-Exactive Orbitrap分析
高解像度質量分析計による全ての分析は、Trent Water Quality Centre(Peterborough、Ontario、Canada)にあるQ-Exactive Orbitrap (ThermoFisher)によって実施した。凍結乾燥ユーグレナ・グラシリス(1mg.L-1)試料をMilli-Q水及びLC-MSグレードメタノールで希釈して、最終濃度の50:50のメタノール:水を得た。陽イオンモードの取得パラメータは、流速が25μl/分に設定された以外はMangalら、(2016年)に類似していた。全ての試料に、158.96403のロックマス(lock mass)を有する較正標準としてトリフルオロ酢酸ナトリウム(NaTFA)を陽イオンエレクトロスプレーモードで添加した。走査範囲は150〜2000m/zであった。
【０２１６】
van Krevelen分析は、所内のMatlabスクリプトを使用して完了した。異なる化合物クラスは、脂質(0.01≦O/C≦0.1;1.5≦H/C≦2.0)、不飽和炭化水素(0.01≦O/C≦0.1;0.75≦H/C≦1.5)、縮合芳香族構造(0.01≦O/C≦0.65;0.25≦H/C≦0.75)、タンパク質(0.1≦O/C≦0.65;1.5≦H/C≦2.3;N≧1)、リグニン(0.1≦O/C≦0.65;0.75≦H/C≦1.5)、タンニン(0.65≦O/C≦0.85;0.75≦H/C≦1.5)及び炭水化物(0.65≦O/C≦1.0;1.5≦H/C≦2.5)(Ohno及びOhno、2013年;Mangalら、2016年)として定義した。リグニン及びタンパク質の化合物クラスは、陰イオンエレクトロスプレーモードではなく陽イオンエレクトロスプレーモードにおいて同等であり、この研究にとって有利である。
【０２１７】
III.結果及び考察
A.増殖曲線
増殖速度は、異なる増殖及び培地条件下において指数期及び定常期の両方で異なっていた(Table 17(表24))。グルコースが補充された明増殖細胞は、増殖指数期及び定常期の両方において増殖速度が他の培地条件より勝っていた。グルコースが補充され明増殖細胞で見られた増殖速度は、予測されたように、グルコースが他のEGM構成成分より素早く代謝するためであった。
【０２１８】
【表２４】
2020516768.tif 000029
【０２１９】
B.官能基
ユーグレナ・グラシリス細胞のFTIRスペクトルは、5つの別個の吸着バンドを示し、波数は約950〜1700cm-1の範囲であった(図12)。これらのバンドは、特定の官能基(カルボキシル基、フェノール基及びアミド基)に帰属された。カルボキシル基(-COOH)は、1710±15cm-1領域でのC=O伸縮及び1265±55cm-1領域でのC-O伸縮によって特徴決定された。アミド1(C=O伸縮)は、約1650cm-1領域でのユーグレナ細胞において見いだされた。アミドII及びIIIは、それぞれ約1550及び1260±40cm-1の範囲で見いだされた。C-O結合の非対称伸縮を有するフェノール基によって示されたリグニンは、1230cm-1で見いだされた。同様のピークが、グルコース補充を有する及び有さない明及び暗条件の両方において見いだされた(図12)。理論に束縛されるものではないが、この知見は、増殖条件及び期に関わらず、類似した官能基が暗及び明条件下で増殖した細胞内存在することを提示している。
【０２２０】
C.構造分析
光周期の影響(明対暗増殖細胞)
指数増殖明増殖細胞EGM培地中のCHO及びCHON化合物の平均存在度は、それぞれ9.8及び28.1%であり(図13)、ユーグレナ・グラシリス溶解滲出物において見いだされたものと同等であった(それぞれ14及び21%;Mangalら、2016年)。硫黄含有化合物の存在度は、細胞代謝産物と滲出物代謝産物では有意に異なっていた。CHONS種は、滲出物より細胞において48%多く存在した(Mangalら、2016年)。高い率のCHO分子種は、増殖期及び培地条件に関わりなく、明増殖細胞(9.8〜12.2%)より暗増殖細胞(24.4〜30.9%)において見られた(図13)。明増殖細胞は、CHOS及びCHONで豊富化されていた。まとめると、これらの結果は、ヘテロ原子豊富代謝産物が明増殖細胞において優先的に見いだされたことを示した。パラミロン及び葉緑体等の明条件下で機能するように高度に分化されているオルガネラは、暗条件下では活性ではない又は不在である可能性がある。
【０２２１】
CHON1〜2分子種は、全ての培地条件下において暗増殖試料(14.0〜17.2%)より明増殖試料(25.1〜28.5%)において顕著であった(図13)。CHOS1〜2分子種は、全ての試料に存在し、暗増殖細胞がこれの種をより多く有した(明及び暗増殖試料において、それぞれ11.8〜15.5%対13.3〜18.9%;図13)。CHON1〜2S1〜2分子種は、分析された全ての試料に存在し(明及び暗増殖試料において、それぞれ40.3〜48.8%対37.9〜47.7%;図13)。明増殖細胞は、暗増殖細胞(p<0.05;Table 18(表25))より低いH/C及び高い二重結合構造(DBE)値を示し、明増殖細胞により多くの芳香族官能基の存在を示した。暗増殖細胞は高いO/C及びS/C比(p<0.05)を示し、これらの細胞がより酸素化され硫黄豊富であることを示した。芳香族指数(AI)における有意な差は、暗増殖細胞と明増殖細胞の間に見いだされなかった(p>0.05)。この著しい差は、理論に束縛されるものではないが、光が、培地条件又は増殖期に関わりなく、より多くのCHON1〜2分子種の形成を促進することを提示している。
【０２２２】
【表２５】
2020516768.tif 000030
【０２２３】
暗増殖及び明増殖試料内の化合物クラスの存在度において、著しい差が見いだされた(図14)。タンパク質及びリグニンの化合物クラスが、ユーグレナ・グラシリス細胞において優勢であった。タンパク質の化合物クラスは、ユーグレナ・グラシリス細胞の全帰属ピークの39〜50%を占めていた。リグニンは明増殖細胞より暗増殖細胞により多く存在した。理論に束縛されるものではないが、リグニンの存在度における1.43倍の差は、明増殖培養物におけるリグニン構造の光退色に起因する可能性があった(Opsahl及びBenner、1998年;Helmsら、2008年;Hernesら、2009年;Spencerら、2009年)。暗増殖細胞は、リグニン、炭水化物及び芳香族化合物の高い全体率を有した。明増殖細胞におけるリグニン及び芳香族化合物の低い率は、リグニン及び芳香族化合物の光変換に起因する可能性がある(Luら、2016年;Medeirosら、2015年)。暗増殖条件下の高い炭水化物の化合物クラスは、より多くのパラミロン形成に起因する可能性があった(Matsudaら、2011年)。ユーグレナ・グラシリスの暗増殖及び明増殖細胞における脂質の化合物クラスの率は類似していた(それぞれ、4.8〜16.4%及び12.8〜15.3%)。
【０２２４】
増殖期の影響
細胞代謝産物の組成は、増殖期依存性である(Table 18(表25);図14)。元素比及びAIに基づいた主成分分析(PCA)は、正常培地における指数増殖暗増殖細胞がO/C比により影響を受けることを示し(図15)、これらの細胞がより酸素化されていることを示した。暗増殖条件は、より酸素化され、スルホン化された基(高いO/C及びS/C比)を生成し、一方、明増殖条件は、芳香族及び不飽和構造を好んだ(図15)。指数期における暗増殖細胞は、明増殖細胞より20%多くのタンパク質を含有した。このことは定常期と対照的であり、より多くのタンパク質が暗増殖細胞より明増殖細胞と関連した(それぞれ、46.6〜47.7%対39〜42.9%;図15)。理論に束縛されるものではないが、このことは、光に暴露されたときのプロプラスチドと光合成プラスチドの差に起因する可能性があった(Schwartzbach及びShigeoka、2017年)。細胞溶解は、定常期における多くのタンパク質及び高いN%の存在を説明する1つである(Table 18(表25))。タンパク質の率は、指数期でグルコースを有した暗増殖ユーグレナ細胞において最も高く(50%)、補充培地における高いN%と合致していた(Table 18(表25))。暗増殖細胞は、定常期においてタンパク質の豊富化は少なく、一方、逆のことが明増殖細胞において見られた。理論に束縛されるものではないが、Fogg(1957年)は、指数期において、明増殖藻類が高い光合成率を有し、光合成の産物が主にタンパク質合成に使用されることを記述した。指数期の終了時までに光合成率は有意に低減され、光合成産物はタンパク質合成以外の経路に沿ってますます転用されて、脂質又は炭水化物の「貯蔵物」を形成する(Fogg、1957年)。この過程は、明増殖細胞の指数期と比較した定常期におけるタンパク質存在度の低減と合致した。官能性光合成器官へのプロプラスチドの分化も同様に、このことにおいて役割を果たすことがある。
【０２２５】
ユーグレナ滲出物の化合物クラスの存在率を比較すると、細胞は、炭水化物、タンパク質及びリグニンの類似した存在度を示したが、脂質、縮合芳香族構造及び不飽和炭水化物のはるかに高い存在度を示した。理論に束縛されるものではないが、細胞における炭水化物、タンパク質及びリグニンの高い存在度は、細胞内プロセスにおける及び/又は栄養源としてのこれらの役割に起因する可能性があった(すなわち、貯蔵又は膜機能のための脂質;構造整合性のための及び酵素反応に関与するタンパク質;ユーグレナ・グラシリスにおけるパラミロン貯蔵のための炭水化物)(Matsudaら、2011年;Santekら、2012年)。
【０２２６】
主成分分析は、異なる条件で増殖された細胞の化合物クラスの組成に有意な差があったことを明白にした(図16)。第1及び2の主成分(PC1及びPC2)が、説明された全ての差異の59及び30%を表した。陽性PC1は、飽和化合物(リグニン、芳香族化合物)を示し、一方、陰性PC2は、タンパク質性材料を示した。明増殖及び暗増殖試料を別々にクラスター形成させ、暗及び明増殖試料は、それぞれ陽性及び陰性PC1値を示した。明増殖細胞は、より多くの芳香族性があり、低いHC/及び低いH%と合致した(p<0.05;Table 18(表25))。暗増殖細胞における指数期から定常期へのPC2の増加は、タンパク質材料の減少及び脂質化合物の増加を示した。これは、明増殖細胞と対照的であり、タンパク質性材料の豊富化が指数期と比べて定常期において見いだされた。生理学的モードが、見られた差に影響を与え得る。この劇的変化は、エネルギー貯蔵における差に起因する可能性がある。独立栄養生物体はエネルギーを脂質として貯蔵できるが、暗増殖生物体はタンパク質貯蔵を好む(Schwartzbach及びShigeoka、2017年)。まとめると、これらの結果は、増殖条件が細胞有機化合物の構造組成に影響を及ぼすことを強調した。
【０２２７】
D.明及び暗増殖細胞における特有の化合物クラス及び分子種の比較
比較した全ての増殖期及び培地条件に特有の化合物クラスは、多数の特有のピークから構成されているリグニン及びタンパク質化合物のクラスで占められており、指数期及び定常期(グルコースを伴う)をリグニンについて比較したときの暗増殖試料を除いて、これらに有意な差はなかった(Table 19(表26))。明増殖試料は、比較した全ての培地条件において、暗増殖試料より高い率の不飽和炭化水素化合物クラス特有ピークを有した。暗増殖試料は、グルコース補充培地における指数期及び定常期を比較したとき、明増殖試料より高い率の炭水化物特有ピークを示した。特有の縮合芳香族化合物は、全ての培地条件において明増殖培養物より暗増殖培養物に依然として顕著であった。タンニンは、明増殖試料より暗増殖試料において顕著であったが、これらの条件が、指数期対グルコースを伴う指数期及び定常期対グルコースを伴う定常期で比較されたときだけであった。
【０２２８】
【表２６】
2020516768.tif 000031
【０２２９】
E.細胞分画のAF4分離
AF4フラクトグラムは、複製培養物間で比較的一定であり(図17)、増殖条件内で径分布が同等であることを示唆している。AF4フラクトグラムにおける有意な差は、明及び暗増殖細胞間で見いだされ、メタボロミクス(metabolomics)プロセスにおける差を示している。明増殖細胞は、分化に起因してより洗練された機構を有する(Schwartzbach及びShigeoka、2017年)。明増殖細胞フラクトグラム(図17;上側グラフ)は、7.8分における特徴的なピーク(分画A)、続いて9.3分に幅広のピーク(分画C)を示した。他方、暗増殖細胞フラクトグラム(図17;下側グラフ)は、8.3分に鋭角なピーク(分画B)及び9.5〜10.5分に非常に幅広のピーク(分画C)を示した。高い保持時間は、暗細胞から単離された高分子量の代謝産物を示唆しており、暗細胞の高い質量平均m/zと合致した。
【０２３０】
同等数のm/z帰属特質が暗細胞の非分画及びAF4組合せ分画(すなわち、分画A+分画B+分画C+分画D)において見いだされ、一方、総m/z特質の50%の低減が、非分化試料と比較したAF4組合せ明細胞試料において見いだされた(図18)。非分画及びAF4組合せ試料は、明及び暗試料において、それぞれ187個及び339個の共通特質を共有し、総帰属特質の14〜28%及び32〜35%を表した。明増殖細胞の組成は、暗増殖細胞よりAF4分画において有意に変更されていた(図19)。例えば、脂質存在度は、明増殖細胞のAF4分画の後に26から35%増加したが、暗増殖細胞では変化しないままであった。存在度はAF4分画の後に僅かに減少したが、リグニン配合物の数は、暗増殖細胞において比較的一定のままであった。AF4の手順は、目的の被分析物(すなわち、細胞材料)がAF4膜に濃縮されるが、溶媒及び小さな被分析物が排除される集束工程を含む。理論に束縛されるものではないが、この原因は、リグニン配合物が暗増殖細胞の高いm/zピークと優先的に会合し、1kDaのAF4膜を通して集束させる際に失われる可能性が少ないことを含む。このことは、タンパク質のm/z平均がAF4分画の後に増加した(473から918m/z)ことを意味し、分画の差異に低分子量の化合物が優先的に失われた結果である。およそ40%及び71%のタンパク質配合物が、それぞれ暗及び明条件下で失われた。
【０２３１】
大部分のm/z値が100〜1000m/zに見いだされたが(指定された全ての配合物の77.4〜92.1%)、明細胞の組合せ分画の特徴の存在度は、100〜700m/zの範囲で減少し、しかし非分画明細胞と比較して高いm/z(800〜1400m/z)で増加した(図20)。これは暗条件と対照的であり、m/z分布はAF4分画の後で劇的に変化しなかった。明条件における低m/zの代謝産物の損失は、AF4集束工程の差異に1kDa膜に保持されなかったからと思われる。
【０２３２】
934〜2648個の特質(Table 20(表27)に「帰属ピーク」と示されている)は、150〜1500m/zの範囲の細胞分画において検出された。349〜767個の特質(27.5〜72.7%)が、生物学的複製において一般に見いだされた。AF4分画の複製は、明及び暗条件に関連する特質の27〜73%(327〜715個の特質)及び46〜56%(501〜701個の特質)をそれぞれ共有した。同等の共通な特質が微生物研究において見いだされた(Beckerら、2014年)。共有特質において大きな変動が明細胞分画において見いだされ、増殖条件における制御不能な差及び/又は異種性を処理しているときの増殖段階における小さな変動に起因する可能性がある(Beckerら、2014年)。明細胞に提供される遺伝子機構は、より洗練されており(O'Neillら、2015年)、したがって、暗より明においてより異種性があることが示唆される。
【０２３３】
【表２７】
2020516768.tif 000032
【０２３４】
4つのAF4分画のベン図分析は、全ての明及び暗分画において、それぞれ僅か79個(11.7%)及び48個(6.3%)の共通特質を明らかにした(図21)。大部分の特質は、1つの特定のAF4分画に特有であり、AF4方法が特有の細胞特質の単離を可能にすることを示した。明分画は、暗分画より多くの特有な特質を示し(分画Bを除いて)、明分画Dが最も多くの特有な特質(312個)を示した。
【０２３５】
組成存在度に関して、タンパク質、脂質、リグニン、不飽和炭化水素及び炭水化物が、明及び暗条件下で増殖させた分画において特有なピークを持つ組成を占めた(図22)。明増殖細胞と比べた暗増殖細胞における低い脂質存在度(p<0.05;分画Bを除く)は、理論に束縛されるものではないが、細胞分化の際に光合成経路への脂質の転用によって説明することができる(Matsudaら、2011年;Schwartzbach及びShigeoka、2017年)。同等の結果が、以前の研究(Rosenberg及びPecker、1964年;Constantopoulos及びBloch、1967年)において見いだされており、ユーグレナの脂質含有量は光の増加と共に変化していた。高い低減状態、疎水性及び細胞に効率的に詰め込まれる能力、並びに酸化されると高いエネルギー量を発生する等の脂質の特徴は、このクラスが、ストレスが緩和された後に細胞を再建するための貯蔵物であることを示唆している(Moralez-Sanchezら、2016年)。理論に束縛されるものではないが、このことは、以前(Liら、2014年)に示されたように脂質の存在度がユーグレナの明分画より暗分画において高いことを説明することができる。明細胞における大きなタンパク質存在度は、活性光合成光系に関連することがあり、光化学系IIの集光性クロロフィルa/b(LHCPII)結合タンパク質の前駆体分子の合成が、光への暗増殖静止ユーグレナ細胞の暴露によって50〜100倍増加した(Kishore及びSchwartzbach、1992年)。
【０２３６】
AF4分画を比較すると、明条件下のタンパク質化合物の存在度は、分画AからDに減少し(すなわち、保持時間が増加し、したがって分子量も増加した;Schimpfら、2000年)、逆のことが脂質化合物において見いだされた(p<0.05;図22A)。異なる細胞分画(A〜D)における脂質割合の増加は、大きな径の細胞材料が脂質に富んでいることを示した。異なる細胞分画(A〜D)におけるタンパク質化合物割合の減少は、低いタンパク質含有量を呈している高分子量のオルガネラに起因する可能性がある。AF4暗分画において、タンパク質及び脂質の有意な変化は見られなかった(p<0.05;図22B)。暗及び明細胞分画(A〜D)は、二重結合構造(DBE)又はO/C比において有意な差を示さず、同等なレベルの芳香族化合物及び酸素化化合物を示した。m/z値において有意な差が見いだされ(p<0.05)、暗分画のm/z値が高かった。この実施例は、暗増殖細胞の分画Cがリグニン+タンパク質+炭水化物によって最も豊富化されている(p<0.05)ことを示し、これらは金属結合に関連する化合物クラスである。
【０２３７】
元素比(O/C、H/C、N/C及びS/C)、AI変更、二重結合構造(DBE)、並びに分画A〜Dのm/zのPCA分析は、明及び暗分画の間に特有のパターンを明らかにした(図23)。最初の2つの主成分(PC)は、それぞれ全変形の52.4%及び23.4%を表した。明及び暗分画は、主にPC2軸に沿って分離された。暗分画(分画Aを除く)は、明分画より高いm/z及び低いAI変更によって特徴決定され、明及び暗条件下で増殖させた細胞の分子組成に有意な差を示した。明分画B及びCの陽性PC1及びPC2スコアは、暗分画B及びCと比較して、O-、N-及びS-豊富化合物の偏在性を示した。明分画A及びDは、四分円弧の左側に強くシフトし、明分画B及びCと比較して、DBEの大きな存在度を示した。
【０２３８】
IV.結論
遷移金属及び希土類金属(REE)の結合に典型的に関与する官能基であるカルボキシル及びタンパク質の存在は、暗及び明増殖培養物の指数及び定常増殖期におけるFTIR分光法によって確認した。増殖期の間に、FTIRベース構造組成に大きな差はなかった。Orbitrap Q-Exactiveに基づいたユーグレナ・グラシリス細胞の構造組成は、リグニン、炭水化物及び芳香族化合物が、グルコース補充を有する暗増殖条件において最も存在度が高かったことを示した。これは、異なる増殖及び培養条件下における細胞の生理学的状態の差を確認する。示された結果に基づいて、最も効率的な、特にREEのための金属除去を潜在的に促進する条件は、指数増殖期にグルコース補充を有する暗増殖ユーグレナ・グラシリス細胞である。化合物のクラス(脂質、タンパク質、タンニン、炭水化物、芳香族化合物及び不飽和炭化水素)を確認するために制約を使用することは、藻類細胞において異なる化合物ファミリーを決定するための新規な方法である。リグニン、芳香族化合物、タンパク質及び炭水化物の化合物クラスは、生物吸着を解するREE除去に可能性のあるものである。
【０２３９】
分子組成はAF4分画の間で異なっており、芳香族の特徴が一部のAF4分解において増強されている。分画細胞の組成に基づいて、暗増殖細胞の分画Cは、金属結合のため、したがって金属除去及び抽出のために最も好ましい分画であった。
【０２４０】
明条件下で増殖させた細胞のAF4分画により共有された特質における大きなばらつきが、見いだされた。暗条件は、明条件と比較して芳香族+タンパク質+炭水化物の化合物の細胞存在度に関して優れており、この条件で培養されたユーグレナが金属の抽出に最も有用であることを示した。
【０２４１】
実施例4:水中の金属改善のための、薄膜(DGT)技術における拡散勾配の使用、透析藻類細胞又は滲出物
I.序論
ユーグレナ滲出物の径は、大腸菌(E. coli)細胞膜を通して拡散するほど小さいことがある。大腸菌細胞はHg動員のバイオセンサとして使用されてきた(Chiasson-Gouldら、2014年)。図24は、大腸菌バイオセンサにおける250pMの自由Hg又は250pMのユーグレナ滲出物暴露Hgにより誘導された生物発光が同等であったことを示す。したがって、ユーグレナ滲出物が濾過機器に使用されて金属除去する場合、系は、滲出物が機器の外に拡散しないことを確実にするように配置されるべきである。このことに留意しながら、透析バッグの使用を調査して、滲出物の拡散を防止できるかを決定した。本開示において、透析バッグ研究は、透析バッグ内に滲出物を保持することが実現可能であってことを示した。
ユーグレナ滲出物の径は、大腸菌細胞膜を通して拡散するほど小さいことがある。大腸菌細胞はHg動員のバイオセンサとして使用されてきた(Chiasson-Gouldら、2014年)。図24は、大腸菌バイオセンサにおける250pMの自由Hg又は250pMのユーグレナ滲出物暴露Hgにより誘導された生物発光が同等であったことを示す。したがって、ユーグレナ滲出物が濾過装置に使用されて金属除去する場合、系は、滲出物が装置の外に拡散しないことを確実にするように配置されるべきである。このことに留意しながら、透析バッグの使用を調査して、滲出物の拡散を防止できるかを決定した。本開示において、透析バッグ研究は、透析バッグ内に滲出物を保持することが実現可能であってことを示した。
【０２４２】
II.実験手順
A.藻類培養物及び試料の調製
ユーグレナ・グラシリス細胞を500mLのオートクレーブ改変Hutner培地(ユーグレナ・グラシリス培地又はEGM;Dunstaffnage Marine Laboratory Culture Collection of Algae and Protozoa)中において18:6時間の明:暗(500mL中での2000〜2500lux)サイクル下、29℃で培養した。細胞(106細胞/mL)を指数増殖期で採取し、予備燃焼された0.2μmニトロセルロースフィルタを使用して、これらの滲出物を単離した。International Humic Substances Society(IHSS)から得たスワニー川フルビン酸(SRFA)標準を、Milli-Q水で希釈して、最終濃度の7mg.L-1にした。
【０２４３】
金属吸着に対する増殖条件の影響を決定するため、ユーグレナ・グラシリス細胞を、正常又はHg修正(0.5ppb)オートクレーブEGMにおいてpH3.60で上記のように培養した。Hg修正培地で培養された細胞(すなわち、Hg適応細胞)では、培地に、新たにオートクレーブした培地中の0.5ppbのHgを各指数期の終了時に添加した。2〜4サイクル(若い世代)及び11サイクル(古い世代)後の正常及びHg適応細胞を透析バッグに入れ、金属を添加した正常なオートクレーブ培地に浸け、3日間連続して撹拌した。細胞中の金属濃度は、トリプル四重極ICP-MS(Agilent 8800、Trent Water Quality Centre)を使用して測定した。
【０２４４】
B.透析バッグ
5ミリリットルの膜チューブ(0.1〜0.5kDa Biotech Cellulose Ester;Spectrum Labs)を、ロッキングナイロン膜クランプ(locking nylon membrane clamp)を使用して閉じた。使用する前、透析膜をMilli-Q水中に一晩放置した。透析バッグの実際のカットオフを評価するため、既知の分子量の一連の高分子(ローダミン-B、ビタミンB-12、チトクロム、リゾチーム及びアルブミン)を使用した5ミリリットルの各高分子溶液(約1g.L-1;n=2〜4)を透析バッグに装填し、600rpmで3〜5日間連続して撹拌した。高分子供給溶液中の吸光度(a初期)及び3〜5日後の透析物中の吸光度(a透析物)を、10cmの石英セルを備えた2550 UV〜可視ダイオードアレイ分光光度計(Shimadzu)により測定した。拒否率を以下のように計算した。
【０２４５】
【数３】
2020516768.tif 000033
【０２４６】
5ミリリットルの試料(すなわち、ユーグレナ細胞若しくは滲出物、又はSRFA)を、0.1〜0.5kDaの名目カットオフを有する透析バックに装填した。バッグを、新たにオートクレーブされた(細胞及び滲出物)又はMilli-Q水(SRFA)を含有する連続的に撹拌した500mLのビーカーに入れた。ビーカーを室温で3〜5日間連続して撹拌した。
【０２４７】
C.Hg修正増殖条件
金属吸着ユーグレナ・グラシリス細胞に対する増殖条件の影響を、正常又はHg修正(0.5ppb)オートクレーブEGMにおいてpH3.60で上記のように細胞を培養して決定した。Hg修正培地で培養された細胞では、培地に、新たにオートクレーブした培地中の0.5ppbのHgを各指数期の終了時に添加した。2〜4サイクル(若い世代)及び11サイクル(古い世代)後の正常及びHg適応細胞を透析バッグに入れ、金属を添加した正常なオートクレーブ培地に浸け、3日間連続して撹拌した。細胞中の金属濃度は、トリプル四重極ICP-MS(Agilent 8800、Trent Water Quality Centre)を使用して測定した。金属吸着率は以下のように計算される。
【０２４８】
【数４】
2020516768.tif 000034
【０２４９】
D.非対称流フィールドフローフラクショネーション(Asymmetrical flow field-flow fractionation)
300Daのポリエーテルスルホネート(PES)膜を備えた非対称流フィールドフローフラクショネーション(AF4)及びUV〜可視ダイオードアレイ検出器を利用した(Gueguen及びCuss、2011年)。分子量(MW)の較正は高分子により実施し、レーザーグレードローダミンB(479Da;Acros Organics)、トリパンブルー(961Da;Sigma-Aldrich)、ビタミンB12(1330Da;Sigma-Aldrich)、ウシ心臓チトクロC(12,400Da;Sigma-Aldrich)及び鶏卵白リゾチーム(14,000Da;Fluka)を担体溶液で調製した。保持時間対MW較正の対数-対数曲線をプロットし、続いて試料のMWの計算に使用した。
【０２５０】
E.薄膜(DGT)技術における拡散勾配
薄膜(DGT)技術における拡散勾配は、溶解水性相において金属を濃縮する受動的試料採取器として機能する(Davison及びZhang、1994年)。現在、合成キレックス結合ゲルは、金属相互作用及び濃縮の部位として機能しているが、キレックスゲルの製造は、多くの化学薬品を必要とし、時間がかかる可能性がある。これに対して、本開示は、金属の受動的濃縮及び除去のために、非生ユーグレナ細胞及び/又はユーグレナから遊離された滲出物を結合吸着剤として組み込むことを示す(図25A及びB)。DGT試料採取器は、結合ゲル層(固定化ユーグレナ細胞又はキレックス樹脂)、0.5mmの拡散アクリルアミドベースゲル層及び0.45umの硝酸セルロースフィルタから構成された。ユーグレナ細胞を固定化マトリックスに埋封することによって、本開示は合成キレックスゲルの必要性が省かれることを示す。本開示は、全ての有機溶液に金属除去を提供する。この生物吸着剤DGTは、汚染場所をモニターすること、汚染された水源から金属を蓄積し、最終的には除去すこるとに有用である。
【０２５１】
ユーグレナ・グラシリス細胞を指数期で採取し、4000〜5000rpmで6分間遠心分離し、脱イオン水で3回洗浄して、細胞から任意の残留培養培地を除去した。細胞を一晩凍結乾燥し、乳鉢及び乳棒を介して機械的に均質化した。
【０２５２】
DGTの調製は、無金属10,000クラス(ISO7)のクリーンルームで実施して、金属汚染を最小限にした。DGT樹脂結合ゲルを調製するため、3gのユーグレナ細胞又はキレックス-100樹脂を、予備洗浄したポリプロピレン管中の10mLのポリアクリルアミドゲル(15%アクリルアミド-FisherScientific、0.3%DGT架橋剤-DGTResearch)に加えた。50μLの10%(w/w)APS(>98%、FisherScientific)及び15μLのTEMED(FisherScientific)を加え、十分に混合した。直後に、厚さが0.25mmの酸浴済ポリスチレンスペーサーにより間隔を開けたガラスプレートの間に、ゲルを流し込んだ。重合(40〜45℃で60分間)した後、ゲルをMilli-Q水で少なくとも24時間にわたって水和した。Milli-Q水を数回交換して、あらゆる不純物及び未反応試薬を除去した。ゲルを0.1M NaNO3溶液中に保存した。
【０２５３】
DGT装置を、撹拌した多元素溶液(50ppb)に沈め、異なる期間(例えば、1、2、3、4及び5日)にわたって25℃で保持した。それぞれの試料採取間隔で、2個のDGTユニットを溶液から取り出した。結合ゲルを、ICPMS分析(Agilent 8800、Trent Water Quality Centre)の前に、1Mの二重希釈硝酸により24時間かけて溶出した。インジウム及びロジウムを内部標準として使用した。ICP-MS測定の精度は、SLRS-5基準水(National Research Council、Canada)を使用して評価した。測定された金属濃度は、認証値の5%以内であった。空濃度を、結合ゲルに存在する金属の質量を測定することによって評価した。
【０２５４】
III.結果及び考察
A.高分子の透析
透析バッグの保持特徴は、操作条件によって変わることがある。したがって、拒否率(R%)は、既知の分子量MWを有する高分子に基づいた整合性試験によって決定した(Table 21(表28))。拒否率は、平均して全ての高分子において99〜100%であり、小さいMWの高分子(すなわち、ローダミン-B)より大きなMWを有する化合物が透析バッグに保持されることを支持している。SRFA(1.1kDa)及びユーグレナ滲出物(1.6kDa)がローダミン-Bより高いMWを有するので、これらは透析バッグに優先的に保持されるはずである。
【０２５５】
【表２８】
2020516768.tif 000035
【０２５６】
B.ユーグレナ及びSRFAの透析
小型の化合物(SRFA)、中型の化合物(ユーグレナ滲出物)及び大型の化合物(ユーグレナ細胞)を保持する透析バッグの機能を、実験室設定により評価した。>99%のSRFA及びユーグレナ滲出物が、5日後の透析バッグの中に留まっており(図26)、MWの結果と合致した。透析バッグの中に含有されていた元の材料の僅か0.1〜1.2%が、4日後に透析物の中に見いだされた(図26)。ユーグレナ滲出物の透析物は、SRFAと比較するとMW分布の差に起因して僅かに多く濃縮されていた(図27)。<0.5KDaの分画には、SRFAよりユーグレナ滲出物において存在度が僅かに多く、透析物において報告された高いシグナルによって確認された(図27)。
【０２５７】
同様に、4日後の透析物にユーグレナ細胞は見当たらなかった(図28C)。まとめると、これらの結果は、透析バッグ中のユーグレナ細胞及び滲出物は、廃水又は採掘処理水に効率的に配置されて、汚染物質を除去することを示した。
【０２５８】
次に、透析バッグに含有されたユーグレナ細胞を使用して、金属吸着に対するHg適応の効果を評価した。若い世代の細胞(2〜4サイクル)では、Pb及びCdの高い吸着がHg適応細胞において見られたが、Ni及びCuでは見られなかった(図29)。吸着率はCdでは相対的に異なっており、Hg適応細胞は、正常細胞と比較しておよそ10倍高い吸着率を示した。吸着は以下のように増加した。
正常細胞    Ni=Cu<Cd<Pb
Hg適応細胞    Ni=Cu<Pb<Cd
【０２５９】
対照的に、古い世代の細胞(11サイクル)では、正常及びHg適応ユーグレナ細胞の間に金属吸着において有意な変化は見いだされなかった(図30)。両方の培養条件下の古い世代の細胞では、傾向は以下の通りであった。Ni≒Cu<Pb<Cd
【０２６０】
若い世代と古い世代のHg適応細胞の比較は、若い世代の細胞が古い世代の細胞と比べてPbの吸着に4.5倍の増加を示したことが見いだされた(図31)。対照的に、Hg適応細胞において、Cdでは、より大きな金属吸着が古い世代と関連した。若い世代及び古い世代のHg適応細胞では、Ni及びCuの吸着に有意な差は見いだされなかった。
【０２６１】
C.ユーグレナ-DGT
凍結乾燥したユーグレナ・グラシリスのFTIRスペクトルは、1900〜500cm-1範囲に数個のバンドを示し(図32)、官能基を示した。1310(COO-)、1394(COO対称)及び1450cm-1(O-H結合)でのバンドは、ユーグレナと比較してキレックス-100において良好に定義され、カルボキシル官能基がキレックス-100において優勢であることを確認している。これらのカルボキシルバンドの吸光度はユーグレナにおいて低減されており、これらがユーグレナにおいて見いだされるが、キレックス-100と同じ程度の存在度がないことを示した。1044、1110及び1197cm-1(C-O非対称)でのバンドは、炭水化物を表し、ユーグレナにのみ見られた。炭水化物の存在は、藻類代謝プロセスと合致した。アミドIII及びAr-OH(1232cm-1)もユーグレナに特有である。これらのFTIRの結果は、ユーグレナが、金属結合に必要な全ての官能基(すなわち、カルボキシル、フェノール、アミド及び硫黄)を有することを示した。
【０２６２】
50ug L-1で72時間にわたって配置された三重DGTユニットは、全ての金属がユーグレナ及びキレックス結合ゲルの両方に蓄積したことを示した(Table 22(表29))。B型金属(Cd及びPb)は、両方の結合ゲルに等しく蓄積したが、中間金属(Co及びNI)は、DGT-キレックスユニットに優先的に蓄積した。CuはDGT-ユーグレナユニットにより多く蓄積し、理論に束縛されるものではないが、このことは、O-、N-及びS-含有官能基との錯体化に起因する可能性がある。NoN-及びS-含有官能基は、キレックス樹脂には見いだされなかった(図 22)。
【０２６３】
【表２９】
2020516768.tif 000036
【０２６４】
拡散特性に基づいて、ユーグレナ樹脂に蓄積された金属質量(M)は、暴露時間に比例しており(0.71<r2<0.98、図24)、暴露時間の増加が金属抽出を増加させることを示唆している。金属の拡散係数値は、21℃で1.32x10-6〜1.97x10-5の範囲であった(図25)。Al及びCuの拡散係数は、DGT-キレックスよりDGT-ユーグレナの方が有意に大きかった。DGT-キレックスと異なり、DGT-ユーグレナは、As及びVを含むメタロイドの線形蓄積を示し、DGT-ユーグレナがメタロイド抽出に適していることを示した。
【０２６５】
IV.結論
Hg適応実験は、金属吸着が増殖条件、細胞発生及び金属に依存していることを示した。Pb及びCdの吸着は、Ni及びCuの吸着と異なり、Hg適応細胞により増強され、Hg誘導ストレスが細胞吸着特性を変えることを支持している。吸着の増強は、Hgの存在下で最近増殖された細胞と主に関連しており、Hg適応後のユーグレナ細胞の金属吸着能力における一時的な要因を示している。
【０２６６】
本方法の用途は、汚染水における金属イオンのイオン封鎖及び固定化に最終的に適用することができる。多孔性透析バッグ内の溶存態有機物(DOM)の閉じ込めは、環境からの金属イオンの内在化を可能にし、バッグ内に閉じ込められた滲出物及び藻類細胞への続いての結合を可能にする。この手法は、分子量カットオフより大きな任意の微生物由来DOM源に有用である。透析バッグ内に細胞及び/又は藻類滲出物を閉じ込めることによって、二重改善効果を生じさせることができ、1)バッグ中に留まっている大きな分子量の汚染物質-DOM錯体の固定化及び2)藻類細胞による汚染物質-DOM錯体の取り込み/吸着である。
【０２６７】
ユーグレナ細胞の固定化は、環境から金属及びメタロイドの抽出及び金属イオン封鎖を可能にする。この手法は、微生物からの任意の細胞分画又は代謝産物に有用である。当業者は、DGT-ユーグレナが、細胞及び代謝産物に存在するO-、N-及びS-基に結合することができる任意の金属及びメタロイドに有料であることを容易に理解する。
【０２６８】
本開示は実施例を参照して記載されてきたが、特許請求の範囲の範囲は実施例に記載された実施形態によって制限されるべきではなく、本記載全体と一致する最も広い解釈が与えられるべきであることが理解されるべきである。
【０２６９】
全ての出版物、特許及び特許出願は、あたかもそれぞれ個別の出版物、特許又は特許出願が、参照としてその全体が特定的及び個別に組み込まれるように示されるのと同じ程度に、参照としてその全体が本明細書に組み込まれる。本開示における用語が、参照として本明細書に組み込まれる文書と異なって定義されていることが見いだされる場合、本明細書において提供される定義が用語の定義として機能する。
(参考文献)
本明細書において参照された文献の完全な引用
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８（Ａ）】
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【図２８（Ｂ）】
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【図２８（Ｃ）】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【国際調査報告】
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