(57)【要約】  アユルベーダの封入された金ナノ粒子、製造方法及び処理方法が提供される。製造方法は、乾燥したグースベリー製品若しくはマンゴー皮製品又はそれらに含有される植物化学物質を液体媒体に混合して還元剤溶液を生成する。金塩が還元剤溶液に混合される。金塩の反応が他の還元剤の非存在下で行われ、安定化した、生体適合性の、アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子のナノ粒子溶液を生成する。アユルベーダ医薬は、クルクミン抽出物及びアラビアゴムとともに乾燥粉末又はカプセルの状態で、マンゴー皮又はグースベリーに含有される植物化学物質に封入された非放射性の金ナノ粒子からなる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥したグースベリー製品若しくはマンゴー皮製品又はそれらに含有される植物化学物質を液体媒体に混合して還元剤溶液を生成することと、
金塩を前記還元剤溶液に混合することと、
他の還元剤の非存在下で前記金塩を反応させて、安定化した、生体適合性の、アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子のナノ粒子溶液を生成することと、
を含む、アユルベーダの封入された金ナノ粒子を形成する方法。
【請求項２】
前記混合は、乾燥したグースベリー製品又はマンゴー皮製品を混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記液体媒体は、蒸留水（及び／又は脱イオン水）からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体媒体は、アルコール性媒体又は水とアルコールとの混合物からなる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記金塩は、非放射性のＡｕＣｌ４からなる、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記還元剤溶液におけるグースベリー製品の濃度は、１〜３又は１００〜２００ｍＭの範囲である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
６〜１０ｍｌの蒸留水における金塩の重量に関する濃度は、６〜１０ｍｇのグースベリー粉末に対して４〜８ｍｇの範囲である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記反応は、２５℃〜２８℃の試薬溶液温度で行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記還元剤溶液におけるマンゴー皮製品の濃度は、前記金塩の完全な消費を確保するのに十分である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応後、前記溶液から非反応物を除去することをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記混合は、グースベリー製品を混合し、前記混合は、前記液体媒体にアラビアゴムを混合することをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記反応後、（Ｂ）マンゴー皮植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、（Ｄ）アラビアゴムを加えることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記混合は、前記マンゴー皮製品を混合し、前記反応後、（Ｂ）グースベリー植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、（Ｄ）アラビアゴムを混合することをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マンゴー皮製品は、マンギフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法に従って生成した前記ナノ粒子溶液を、腹腔内投与、静脈内投与、又は経口投与することを含む、治療方法。
【請求項１６】
安定化した、生体適合性の、アユルベーダの封入された金ナノ粒子の前記ナノ粒子溶液を処理して、アユルベーダの封入された金ナノ粒子薬の乾燥粉末又は乾燥カプセルを形成することをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法に従って形成した前記乾燥粉末又は乾燥カプセルを経口投与することを含む、治療方法。
【請求項１８】
アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子の溶液、アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥粉末、又はアユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥カプセルを得ることと、癌又は炎症疾患を患う対象に前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の溶液、前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥粉末、又は前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥カプセルを腹腔内投与、静脈内投与、又は経口投与することと、を含む、癌又は炎症疾患の治療方法。
【請求項１９】
前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子は、非放射性の金ナノ粒子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
クルクミン抽出物及びアラビアゴムとともに乾燥粉末又はカプセルの状態で、マンゴー皮又はグースベリーに含有される植物化学物質に封入された非放射性の金ナノ粒子からなるアユルベータ医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の主張及び関連出願の参照）
本願は３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条の優先権、及び２０１７年２月１５日に出願された先行する仮出願番号６２／４５９，３８８に基づいて適用される法と条約とを主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明の分野は、金ナノ粒子、ナノ医薬及び癌治療を含む。本発明の適用例は、前立腺癌及び他の癌の治療のための免疫療法である。
【背景技術】
【０００３】
アユルベーダ医薬は、約５０００年前インドに起源のルーツを有する古代の治癒療法である。これは世界でもっとも古い医療システムであって、全体観察医学の原則を推奨しており、ヒトの体におけるバランスを修復するための予防の達成及び効果のある治療を目的として、長期間の病気を予防し、自然の健康を促進する。ほとんどの国では、アユルベーダ医薬は、いまだに“代替の”医学的治療法であると考えられている。しかし、米国、日本、ドイツ及び多くの国において、アユルベーダは、病気の主要因を同定することで、すべてにおいて毒性の副作用が最小限又は伴わず疾患を治療するためにヒトの体全体に対処する治癒機序をもたらすというその潜在的な力のために注目されている。既知のアユルベーダ医薬は、アユルベーダの文献で‘バスマ（Ｂｈａｓｍａ）’と言われる、灰の形態での多量のハーブ、金属及び金属イオンと組み合わせて投与される。ハーブのカクテルと混ぜ合わされた金の灰（スワルナバスマ）が、癌、関節炎（骨関節炎及び関節リウマチの両方）、様々な感染疾患の治療で、及び心血管治療において閉塞した動脈を開通させるのに広く使用されている。また、金の灰は様々な神経障害疾患の治療にも使用される。
【０００４】
金の灰の化学組成が決定されていないため、その調製ができない。再現性のない化学種があると、科学的に許容される定量された投与量で明確に定義された活性成分の投与がほとんどできない。これらの課題は、金属種の高い毒性に加え、生物学的な活性種の準最適な生体利用効率をもたらすことが多い。このため、米国又は欧州の食品医薬品局（ＦＤＡ）等の規制官庁によるアユルベーダ医薬の広い認可に対して大きな課題となっている。
【０００５】
限局性の前立腺癌を有する患者は、外科手術又は放射線治療で治療に成功することが多いが、転移状態の患者は、アンドロゲン遮断療法（ＡＤＴ）で治療される。非特許文献１を参照されたい。無症候の又は最小限の無症候の非転移疾患から症候のある又はかなりの転移状態までの疾患がある、去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ）の患者に対して現行の治療はあまり効果がないとの新たな意見で一致している（有意な患者間での変動を伴う診断の時期に依存する）。米国ＦＤＡは、上記患者の治療に関して、ドセタキセル、カバジタキセル、アビラテロン及びエンザルタミド等のいくつかの化学療法剤を承認した。骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）の調節に寄与し得る薬剤耐性が相当な割合で患者にみられる。非特許文献２を参照されたい。ＭＤＳＣは血管形成及び転移を支持する）免疫抑制微環境を誘導し、Ｍ２−分極腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を促進する。前立腺癌患者由来の組織及び血清エキソソームがマクロファージの分極を高い割合で選択的に活性化されたＭ２表現型に誘導したことが多くの研究で示された。非特許文献３を参照されたい。このため、Ｍ２マクロファージを標的とする免疫チェックポイント阻害を用いた精密医療による個別治療を重視する癌治療は、現在の使用における過多の”共通点”の治療アプローチと区別される。異なる免疫療法アプローチを組み合わせ、癌患者集団に関して相乗的な治療効果を得ることで満たされる、緊急で解決されていない臨床的必要性がある。薬剤耐性ＣＲＰＣの治療に関する新たな治療の開発では、ＴＡＭを効果的に標的とすることが中心に考えられている。前立腺癌患者において、ＴＡＭが、薬剤及び放射線に対する保護効果の主な原因であること、及びＴＡＭの数の増加とそのＭ２プロファイルとが治療の失敗及び予後不良に関連することとを実験結果が示している。非特許文献４を参照されたい。
【０００６】
前立腺癌及びほとんどの固形癌で、腫瘍微環境においてＭ２マクロファージによるサイトカインの放出によって上方制御されるＮＦ−κＢシグナリングが高まっている。一般には固形癌、特には前立腺癌の化学療法処理が癌の進展及び進行、そしてその結果として化学及び多剤治療への抵抗性の促進において重要な役割を担う鍵となる転写因子ＮＦ−κＢを活性化することを、有力な証拠が示している。上方制御されたＮＦ−κＢの活性はＢＣＬ−２等の生存促進のパスウェイを上方制御できる。マンギフェリン（ＭＧＦ）が経口投与された場合にＮＦ−κＢ及びＢＣＬ−２の療法を阻害することが独立した研究で示された。非特許文献５を参照されたい。著者は薬物動態特性を改良するために他の抗癌剤がカプセルに封入されたと述べている。また、１９ページにおいて、著者は腫瘍細胞へマンギフェリンを送達するための”高性能の媒体”の必要性を議論する一方で、このような媒体は存在せず、このような媒体はマンギフェリンに特有のものであるべきと指摘している。
【０００７】
最近の研究は、癌細胞の生存に対するＮＦ−κＢの存在及び癌細胞に対する免疫細胞の反応の関係を示している。非特許文献６。また、癌幹細胞は、活性されたＮＦ−κＢを示すことでアポトーシスの阻害につながる炎症性環境の促進に寄与する。活性されたＮＦ−κＢは、腫瘍成長を促進し、薬剤治療に対する抵抗性さえももたらすのに寄与する選択的に活性化されたＭ２表現型に向かってマクロファージを分極化させる。前立腺癌の血管形成、浸潤、転移、免疫抑制、及び化学療法処理抵抗性でのＭ２マクロファージの誘発とのＮＦ−κＢの直接の関連は、ＮＦ−κＢ−及びＴＡＭ−Ｍ２−マクロファージ標的薬の創出を、単独でも集合的にも切実な状況にしている。
【０００８】
臨床データからの証拠の増加によって、本願発明者は、ヒト前立腺癌患者におけるマクロファージが初期の腫瘍成長、及びそれに続く転移の進展の両方に寄与すると仮定した。グリソンスコア（ＧＳ）７〜１０及びｐＴ３ａステージの患者において、Ｍ２マクロファージの表現型のものと特徴づけられた、初期の前立腺腫瘍部位に高い密度のマクロファージが見られた。腫瘍微環境内でのＭ２マクロファージは、ＣＲＰＣａ及び予後不良の疾患状態への移行に最終的につながる血管形成、腫瘍成長及び転移を促進する。免疫治療剤による有効な免疫調節効果を得るためには、腫瘍微環境内に存在するＭ２マクロファージ等の免疫抑制エフェクター細胞に到達するように免疫治療剤の腫瘍内への送達技術を改良することが重要であると、いくつかの調査が結論づけた。実際には、免疫治療剤が全身よりはむしろ腫瘍内の免疫修飾によって送達された場合に、治療的で、全身性の抗腫瘍免疫応答が向上したことを示す前臨床及び臨床での証拠がある。非特許文献７を参照されたい。ＰＥＧ化薬剤の腫瘍内への継続的な送達又は遅い放出のためのカテーテル法のような古い方法がアプローチとしては有利に働いている。サイズに加え、活性があって（受容体媒介）、受動的な（強化された浸透と滞留（ＥＰＲ））標的指向性のために腫瘍血管系を超えて十分に浸透可能なナノ分子免疫治療プラットフォームが開発され、決定された最適な投与量の取り込みと滞留とが達成される。
【０００９】
発明者らは、タンパク質、ペプチド及び小分子を封入した、安定化した金ナノ粒子を以前開発した。非特許文献８及び非特許文献９を参照されたい。シンチグラフィー計数技術を用いてナノモル以下の濃度に至るまで腫瘍細胞／腫瘍組織内の金を正確に推定できるＡｕ−１９８封入ナノ粒子のガンマ放射の測定によって、上記ナノ粒子が腫瘍に留まることが示された。
【００１０】
また、発明者は、ポリフェノール−フラボノイドとともに封入された安定化した金ナノ粒子の効果を以前に実証した。特許文献１は、アラビアゴムで被覆された１９８Ａｕナノ粒子、それらの製造方法並びに治療剤及び造影剤としてのそれらの使用を開示する。Ｋａｔｔｉらの特許文献２は、紅茶、ターメリック、クルクミン又はシナモン、及び／又は同様の自然発生したポリフェノール−又はフラボノイドを豊富な植物物質を用いた還元を介した金ナノ粒子の形成を開示する。Ｋａｔｔｉらの特許文献３は、没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣｇ）由来の物質で安定化する安定化された生体適合性の金ナノ粒子を開示する上記特許文献は、ポリフェノール又はフラボノイドが豊富な植物物質が金塩を還元し、安定化した金ナノ粒子を製造するのに使用できることを示している。
【００１１】
マンギフェリン（１，３，６，７−テトラヒドロキシキサントン−Ｃ２−Ｄグルコシド）は糖が結合したキサントノイドである。それは、植物の種のうちのウルシ科（Ａｎａｃａｒｄｉａｃｅａｅ）及びリンドウ科（Ｇｅｎｔｉａｎａｃｅａｅ）、特にマンゴー皮及びハニーブッシュ茶に豊富に含まれる植物化学物質のポリフェノールで官能化されたＤ−グルコシド−キサントン類である。非特許文献５を参照されたい。マンゴーの葉は、何世紀にもわたって様々な文化で天然の薬として摂取されてきた。最近、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの幅広い観点でマンギフェリンの抗腫瘍研究によって、抗炎症、免疫調節、細胞周期停止、抗増殖、抗アポトーシス、抗酸化、抗遺伝毒性及び抗ウイルス等の多用途の特性が明らかとなっている。上記のＧｏｌｄ−Ｓｍｉｔｈらの非特許文献５。研究が比較可能な大きさで腫瘍体積をマンギフェリンが減少させたとみなし、癌治療に関してＤ−グルコシド−キサントン構造モチーフの可能性を見出した。Ｇｏｌｄ−Ｓｍｉｔｈらの非特許文献５。抗血管形成、プロアポトーシスの、及び累積する抗腫瘍特性が、腫瘍の進展と転移の原因になるＮＦκＢ、標的ＴＡＭ及びシグナリングパスウェイの下流を阻害する当該植物化学物質の免疫調節能力の結果から仮定された。上記のＧｏｌｄ−Ｓｍｉｔｈらの非特許文献５。マンギフェリンの摂取によって穏やかな副作用が出現するか、副作用がないことが示されている。マンギフェリンに関して可能性のある癌治療的有用性が認識されているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこの植物化学物質の速い代謝分解が有効な癌治療のために臨床的に関連のある水準を達成するのに大きな障害として残されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０１３４９１８号明細書
【特許文献２】米国特許第８，３３３，９９４号明細書
【特許文献３】米国特許第９，３５８，３１０号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】A. J. Chang, K. A. Autio, M. Roach, 3rd and H. I. Scher, “High-risk prostate cancer-classification and therapy,” Nat Rev Clin Oncol.11:308-23 (2014)
【非特許文献２】Y. Rong, C. H. Yuan, Z. Qu, H. Zhou, Q. Guan, N. Yang, et al., “Doxorubicin resistant cancer cells activate myeloid-derived suppressor cells by releasing PGE2,” Sci Rep.6:23824 (2016)
【非特許文献３】P. C. Chen, H. C. Cheng, J. Wang, S. W. Wang, H. C. Tai, C. W. Lin, et al., “Prostate cancer-derived CCN3 induces M2 macrophage infiltration and contributes to angiogenesis in prostate cancer microenvironment” Oncotarget, 5:1595-608 (2014)
【非特許文献４】B. Ruffell and L. M. Coussens, “Macrophages and therapeutic resistance in cancer,” Cancer Cell. 27:462-72 (2015)
【非特許文献５】F. Gold-Smith, A. Fernandez and K. Bishop, “Mangiferin and Cancer: Mechanisms of Action,” Nutrients. 8 (2016)
【非特許文献６】B. Kuhnemuth, L. Muhlberg, M. Schipper, H. Griesmann, A. Neesse, N. Milosevic, et al., “CUX1 modulates polarization of tumor-associated macrophages by antagonizing NF-kappaB signaling,” Oncogene. 34:177-87 (2015)
【非特許文献７】K. Van der Jeught, L. Bialkowski, L. Daszkiewicz, K. Broos, C. Goyvaerts, D. Renmans, et al., “Targeting the tumor microenvironment to enhance antitumor immune responses” Oncotarget 6:1359-81 (2015)
【非特許文献８】M. Khoobchandani, K. Katti, A. Maxwell, W. P. Fay and K. V. Katti, “Laminin Receptor-Avid Nanotherapeutic EGCg-AuNPs as a Potential Alternative Therapeutic Approach to Prevent Restenosis,” Int J Mol Sci. 17, (2016)
【非特許文献９】R. Shukla, N. Chanda, A. Zambre, A. Upendran, K. Katti, R. R. Kulkarni, et al., “Laminin receptor specific therapeutic gold nanoparticles (198AuNP-EGCg) show efficacy in treating prostate cancer,” Proc Natl Acad Sci U S A. 109:12426-3 (2012)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る実施の形態は、乾燥グースベリー製品、マンゴー皮製品、又はそれらに含有される植物化学物質を含む他の製品を、液体媒体に混合して、還元剤溶液を生成することを含む製造方法である。金塩が還元剤溶液に混合される。他の還元剤の非存在下で金塩の反応が進み、安定化された、生体適合性の、アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子のナノ粒子溶液を生成する。液体媒体はアルコール性の媒体又は水とアルコールの混合物、又は蒸留水（及び／又は脱イオン水）から成る。金塩は非放射性の金塩である。反応後、好ましい実施の形態は、さらにマンゴー皮又はグースベリーの植物化学物質のいずれかと、クルクミン抽出物と、アラビアゴムとを混合する。
【００１５】
他の好ましい実施の形態は、クルクミン抽出物及びアラビアゴムとともにマンゴー皮又はグースベリーに含有される植物化学物質に封入された非放射性の金ナノ粒子から成るアユルベーダ医薬である。
【００１６】
好ましい治療方法は、アユルベーダの封入された金ナノ粒子の溶液を得ること、及び癌を患う対象に溶液を腹腔内注射、静脈内注射又は経口投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】実験的なグースベリー製品金ナノ粒子のＵＶ−可視分光光度分析に係るデータを示す。
【図１Ｂ】実験的なグースベリー製品金ナノ粒子のＴＥＭ（透過電子顕微鏡法）画像を示す。
【図１Ｃ】実験的なグースベリー製品金ナノ粒子のコアサイズ（ｃｏｒｅ  ｓｉｚｅ）分布を示す。
【図２Ａ】実験的なアユルベーダの封入された金ナノ粒子複合体（グースベリー製品／アラビアゴム金ナノ粒子）ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰ）のＵＶ−可視分光光度分析に係るデータを示す。
【図２Ｂ】実験的なアユルベーダの封入された金ナノ粒子複合体（グースベリー製品／アラビアゴム金ナノ粒子）ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰ）のＴＥＭ画像を示す。
【図２Ｃ】実験的なアユルベーダの封入された金ナノ粒子複合体（グースベリー製品／アラビアゴム金ナノ粒子）ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰ）のコアサイズ分布を示す。
【図３】実験的なアユルベーダの封入された金ナノ粒子複合体（グースベリー製品／マンゴー製品／クルクミン抽出物／アラビアゴム金ナノ粒子）（ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）のコアサイズ分布の画像データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４】２４時間のインキュベーション後の水溶液でのＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を示すＵＶ−Ｖｉｓスペクトルデータである。
【図５】様々な希釈におけるＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性を示すＵＶ−Ｖｉｓスペクトルデータである。
【図６Ａ】ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（エンドサイトーシス）分析における暗視野でのｃｙｔｏｖｉｖａ顕微鏡画像である。Ａ＝グースベリー。
【図６Ｂ】ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（エンドサイトーシス）分析における暗視野でのｃｙｔｏｖｉｖａ顕微鏡画像である。Ｂ＝マンゴー皮。
【図６Ｃ】ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（エンドサイトーシス）分析における暗視野でのｃｙｔｏｖｉｖａ顕微鏡画像である。Ｃ＝クルクミン。
【図６Ｄ】ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（エンドサイトーシス）分析における暗視野でのｃｙｔｏｖｉｖａ顕微鏡画像である。Ｄ＝アラビアゴム。
【図７】ＧＢ−ＡｕＮＰの細胞内在化分析におけるＴＥＭ画像である。
【図８Ａ】乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図８Ｂ】乳癌細胞（ＭＣＦ−７）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図９Ａ】膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図９Ｂ】膵癌細胞（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１０Ａ】ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１０Ｂ】ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１１】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１２】ヒト結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）細胞に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１３Ａ】乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１３Ｂ】乳癌細胞（ＭＣＦ−７）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１４Ａ】膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１４Ｂ】膵癌細胞（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１５Ａ】ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１５Ｂ】ヒト前立腺癌細胞（ＬＮＣａＰ）に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１６】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞生存に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１７】ヒト結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）細胞に対するＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図１８】マンゴー皮（Ｍａｎｇｏ  ｐｅｅｌ）の植物化学物質が結合した金ナノ粒子（ＭＰ−ＡｕＮＰ）からのマンギフェリン（Ｍａｎｇｉｆｅｒｉｎ）の合成方法を示す。
【図１９】ＭＰ−ＡｕＮＰのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルデータである。
【図２０Ａ】ＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルデータである。
【図２０Ｂ】ＴＥＭ画像で示されるコアサイズ分布である。
【図２１Ａ】ＭＰ−ＡｕＮＰ  Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋ＤのＴＥＭコアサイズ分布画像のデータである。
【図２１Ｂ】ＭＰ−ＡｕＮＰの格子構造を示すＴＥＭ画像のデータである。
【図２１Ｃ】ＥＥＬＳ（電子エネルギー損失分光法）によるＭＰ−ＡｕＮＰ  Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの存在を示すグラフのデータである。これは混合から調製された薬製剤全体に金メタルが存在することを裏付ける。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２２Ａ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ  １×の有効性データである。
【図２２Ｂ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ  １×の有効性データである。
【図２３Ａ】ＰＣ−３細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×の有効性データである。
【図２３Ｂ】ＰＣ−３細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×の有効性データである。
【図２４Ａ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したマンギフェリン（ＭＧＦ）の有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２４Ｂ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したマンギフェリン（ＭＧＦ）の有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２５Ａ】前立腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２５Ｂ】前立腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２６Ａ】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２６Ｂ】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２７Ａ】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２７Ｂ】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２８Ａ】乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２８Ｂ】乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２９Ａ】膵癌（ＰＡＮＣ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図２９Ｂ】膵癌（ＰＡＮＣ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３０Ａ】膵癌（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３０Ｂ】膵癌（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３１Ａ】結腸癌（ＳＷ−４８０）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３１Ｂ】結腸癌（ＳＷ−４８０）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３２Ａ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３２Ｂ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３２Ｃ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３３Ａ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３３Ｂ】前立腺癌（ＰＣ−３）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３４Ａ】前立腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３４Ｂ】前立腺癌（ＬＮＣａＰ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３５Ａ】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３５Ｂ】イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３６Ａ】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３６Ｂ】乳癌（ＭＣＦ−７）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３７Ａ】乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３７Ｂ】乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３８Ａ】膵癌（ＰＡＮＣ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３８Ｂ】膵癌（ＰＡＮＣ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３９Ａ】膵癌（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図３９Ｂ】膵癌（ＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４０Ａ】結腸癌（ＳＷ−４８０）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４０Ｂ】結腸癌（ＳＷ−４８０）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４１Ａ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４１Ｂ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４１Ｃ】健常の内皮細胞（ＨＡＥＣ）細胞生存に対するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ｇ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ及び対照としての独立したＭＧＦの有効性データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【図４２Ａ】非処理（ｕｎｔｒｅａｔｅｄ）のＰＣ−３細胞の画像である。
【図４２Ｂ】ＭＰ−ＡｕＮＰで処理されたＰＣ−３細胞の画像である。
【図４２Ｃ】非処理のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の画像である。
【図４２Ｄ】ＭＰ−ＡｕＮＰで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の画像である。
【図４３】ヒト前立腺腫瘍を有するマウスの腹腔内に注射した場合のＭＧＦ（マンギフェリン）ＡｕＮＰの治療効果を示す。
【図４４】ヒト前立腺腫瘍を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍サイズの制御又は減少に関するＭＰ−ＡｕＮＰ  Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの有効性を示す試験データである。Ａ＝グースベリー、Ｂ＝マンゴー皮、Ｃ＝クルクミン、Ｄ＝アラビアゴム。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、“アユルベーダの原則”（いかなる毒性の又は人工の化学物質も使用しない）を利用する製造方法を介して達成される、草木で開始された、環境に優しいナノ技術に基づく製造方法で得られる再現可能な封入された金ナノ粒子を提供する。単体の封入された金ナノ粒子及び複合体の封入された金ナノ粒子が形成され得る。好ましくは、単体のアユルベーダの封入粒子及び好ましい治療薬は、患者に送達するための溶液中又は乾燥薬物物質中のグースベリー製品に封入された金ナノ粒子から成る。追加の好ましい単体のアユルベーダの封入粒子は、マンギフェリン封入粒子を含む。好ましくは、複合体のアユルベーダの封入金粒子及び好ましい治療薬は、患者に送達するための溶液中又は乾燥薬物物質中のグースベリー製品、マンゴー製品、クルクミン製品、アラビアゴム及び封入された金ナノ粒子から成る。グースベリー製品又はマンゴー製品は、グースベリー又はマンゴー皮由来の植物化学物質のカクテルである。当然、グースベリー又はマンゴー皮に含有される植物化学物質のカクテル、及びグースベリー又はマンゴー皮から得られる、含有される複数の植物化学物質のカクテルのいくつかの組み合わせを有する１種以上の同様の他の植物由来の植物化学物質のカクテルであってもよい。追加の好ましい単体のアユルベーダの封入粒子及び好ましい治療薬は、患者に送達するための溶液中又は乾燥薬物物質中のマンゴー皮製品及びグースベリー製品に封入された金ナノ粒子から成る。好ましくは、複合体のアユルベーダの封入された金ナノ粒子及び好ましい治療薬は、患者に送達するための溶液中又は乾燥薬物物質中のマンゴー皮製品、グースベリー製品、クルクミン製品、アラビアゴム及び金ナノ粒子から成る。アユルベーダの封入された金ナノ粒子を形成する反応は、他の還元剤の非存在下で行われ、安定化した、生体適合性の、単体の又は複合体のいずれかのアユルベーダの封入された金ナノ粒子のナノ粒子溶液を生成する。金ナノ粒子は非放射性であって、単体及び複合体両方のアユルベーダの封入粒子の好ましい投与方法は、経口投与、静脈内投与及び／又は腹腔内投与を含む。
【００１９】
グースベリー製品に封入された金ナノ粒子の好ましい製造方法は、自家製の乾燥グースベリー粉末を水中で金塩と混合することを含む。グースベリー由来の電子が豊富な植物化学物質のカクテルは金塩を還元し、１００％再現可能な形態で金ナノ粒子を形成する。この方法は、商業生産の規模にできる。患者に送達するための溶液中のグースベリー製品に封入された金ナノ粒子は、伝統的なアユルベーダ医薬によってよく対処される疾患及び障害を含む多種多様なヒトの疾患及び障害を治療するために適用されることが予期される。
【００２０】
複合体のアユルベーダの被覆金ナノ粒子の好ましい製造方法は、自家製の乾燥グースベリー粉末を水中で金塩と混合し、続いてアラビアゴム又はマンゴー皮の植物化学物質、クルクミン抽出物及びアラビアゴムの組み合わせを添加することを含む。これらの成分が混合される。乾燥された薬剤物質は余分な水を、例えば凍結乾燥によって除去することで得られる。
【００２１】
実験は、本発明に係る薬物質がヒトの癌の治療に有効であることを実証した。本薬剤物質の効果は、乳癌細胞、膵癌細胞、前立腺癌細胞（ヒト及びイヌ）、及び結腸癌細胞で試験された。
【００２２】
金塩を還元し、対応する金ナノ粒子を形成する傾向を有する没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣｇ）及びフラボノイドが豊富な植物物質のようなポリフェノールを用いた本発明者らの事前の研究を考慮すると、本発明は驚くべき結果をもたらす。キサントノイド（ｘａｎｔｈａｎｏｉｄ）及びグルコース化学官能性を有するマンギフェリンが違った働きを示すことが予期される。キサントノイドのように、マンギフェリンのグルコース末端が金塩を還元することが予期される。キサントノイド及びグルコース単位両方の組み合わされた還元力は強く、当該化学反応によって、金塩が対応する金メタルに完全に転換されることが予期される。この期待に反して、本発明は、マンギフェリンのキサントノイド及びグルコース単位が相乗して働き、金塩が対応する金ナノ粒子に変換され、続いて金ナノ粒子が安定化されることを実験において示した。溶液中のマンギフェリンは、他の還元剤の非存在下で還元剤として機能する。刺激の強い化学物質は必要とされない。グースベリーは、アスコルビン酸、アルカロイド、ベンゼノイド、フラボノイド、テルペン、炭水化物、没食子酸、エンブリカニンＡ、エンブリカニンＢ、ケブラジン酸、コリラギン、粘液酸、ペドゥンクラジン（ｐｅｄｕｎｃｕｌａｇｉｎ）、ケルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、ケンペロール及びステロール等の様々な植物化学物質の貯蔵庫である。グースベリーにおける植物化学物質の組み合わせは、癌に加え、様々な炎症疾患及び障害を含む多くの疾患の治療での使用のための累積した高度な抗酸化（ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ）能力を提供する。グースベリー中に多量のビタミンＣが存在することは独特で、実験での証拠は、この強い抗酸化の効果が植物化学物質溶液のカクテルの煮沸後でも長時間の抽出物の保管によっても失われないことを示唆している。これは、チャノキ由来の没食子酸エピガロカテキン（ＥＧＣＧ）、及び他の植物資源由来の植物化学物質の高度に不安定な抗酸化作用とは際立って対照的である。これらの物質は、室温で保管された場合に溶液中で迅速に分解する。このため、ＥＧＣｇは、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、及びグルタチオンペルオキシダーゼ等のいくつかの抗酸化酸素系を刺激するために、ヒドロキシルラジカル及びスーパーオキシドラジカルを除去するための信頼できる資源ではない。これらの系は、重要な抗腫瘍作用に加え、解熱作用、鎮痛作用、鎮咳作用、抗動脈硬化作用、適応力を高める作用、心臓保護作用、胃保護作用、抗貧血作用、抗高コレステロール作用、創傷治癒作用、下痢止め作用、抗アテローム性動脈硬化作用、肝臓保護作用、腎保護作用、及び神経保護作用の要求に有用である。さらに、グースベリー由来の没食子酸、エラグ酸、ピロガロール、ノルセスキテルペノイド、コリラギン、ゲラニイン、エラエオカルプシン及びプロデルフィニジンＢ１及びＢ２のような植物化学物質の高度な抗酸化作用は、抗新生物作用をもたらす。グースベリーの植物化学物質の抗酸化作用及び細胞シグナル伝達作用は、他のいかなる植物化学物質と比較して顕著に異なるため、放射線調節の、化学調節の及び化学的予防の用途を含む新たな医学的用途を提供する。全体として、グースベリー及びマンゴー皮由来の植物化学物質のカクテルの強い抗酸化能力は、本技術分野の専門家／非専門家でもまったく予期できない。カクテルのフリーラジカル除去、抗酸化の、抗炎症性の、抗突然変異性及び免疫調節の活性は、癌の治療及び予防におけるナノのアユルベーダ薬の開発のために、上記植物化学物質を金ナノ粒子に封入することで増幅され得る。
【００２３】
本発明に係る好ましい治療方法は、癌又は炎症疾患を患う対象にアユルベーダの封入された金ナノ粒子の静脈内投与である。このため、本発明は、革新的なナノ技術の植物性医薬の直接投与を介した前立腺癌治療のための新規の手法を提供する。
【００２４】
本発明者は、前立腺癌に対する新たな治療手法を構築する際、腫瘍微環境におけるＮＦ−κＢ転写因子とマクロファージとの間のクロストークが最も重要であることを認識し、アユルベーダの封入された金ナノ粒子が特には腹腔内投与で、経口摂取及び静脈内投与のモデルでも、このクロストークの抑制に関して有効な方法であることを見出した。実験は有効性の証拠を与える。
【００２５】
アユルベーダの封入された金ナノ粒子と複合体化する実施例は、免疫調節αｖβ３−インテグリン及びラミニン受容体標的ナノ粒子等である。本アユルベーダの封入された金ナノ粒子は、（ｉ）腫瘍細胞特異的細胞毒性、（ｉｉ）ＮＦ−κＢ活性化の免疫調節抑制、及び（ｉｉｉ）腫瘍関連選択的活性化Ｍ２マクロファージに対する標的指向性を増幅する臨床で重要なパスウェイを提供する。
【００２６】
ここで、本発明の好ましい実施の形態が実験に関して説明される。当業者は実験から本発明のより広い態様を認識するであろう。
【００２７】
理論又は本発明の実施に必要な理論に縛られることなく、発明者は、マンギフェリン官能性の金ナノ粒子が少なくとも３つの異なる機序を介して腫瘍細胞／腫瘍組織に進むと考える。第１の機序は、これらのナノ粒子のサイズと電荷に起因し、これは浸透と滞留効果を促す。第２の機序は、腫瘍細胞への糖の代謝が高いことに起因する。マンギフェリンは糖構造を含む。第３の機序は、マンギフェリンのキサントノイド単位が腫瘍細胞に対するＭＧＦ−ＡｕＮＰの親和性を高める付加的な装備一式を与えるという事実に起因する。発明者は、これら３つの機序が協力して働き、ＭＧＦ−ＡｕＮＰに腫瘍細胞内に対する前例のない親和性と腫瘍細胞内での前例のない滞留をもたらすと考えており、これらが実験を介して実証された。
【００２８】
実施例の実験的なグースベリー製品に封入された金ナノ粒子（ＧＢ−ＡｕＮＰ）が合成され、特徴づけられた。ＧＢ−ＡｕＮＰは、ＵＶ−可視分光光度法及びＴＥＭ（透過電子顕微鏡法）を含む技術の組み合わせによって特徴づけられた。ＵＶ−可視分光光度法分析は、５３０±３ｎｍでＧＢ−ＡｕＮＰの表面プラズモン（ｐｌａｓｍｏｎ）共鳴（ＳＰＲ）を確認し、それが図１Ａに示されており、図１Ｂ、１Ｃは、それぞれＴＥＭ画像及びコアサイズ分布ヒストグラムを示す。
【００２９】
実施例の複合体のアユルベーダの封入された金ナノ粒子を含むグースベリー製品／アラビアゴム金ナノ粒子（ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰ）がＵＶ−可視分光光度法及びＴＥＭを含むことが複数の技術によって特徴づけられた。ＵＶ−可視分光光度法分析は、５３０±３ｎｍでＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰのＳＰＲを確認し、それが図２Ａに示されており、図２Ｂ−２Ｃは、ＴＥＭ画像及びコアサイズ分布ヒストグラムを示す。動的光散乱機器で得られた結果は、ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰが１３７±５ｎｍの流体力学的サイズを示すことを明らかにした  
【００３０】
【表１】
2020507631.tif 000003
【００３１】
図３は、試験的な複合体のアユルベーダの封入された金ナノ粒子（ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベータ薬）のコアサイズ分布を示す。この好ましい処方では、次の添加物（Ａ）グースベリー植物化学物質、（Ｂ）マンゴー皮の植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、（Ｄ）アラビアゴムをＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰ−に加えた。ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベータ薬が、薬製剤におけるＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰの定性分析のためのＴＥＭ技術で特徴づけられた。図３に示されたように、ＴＥＭによって集められたデータから得られたＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰのコアサイズは、ナノ粒子が２６±５ｎｍのコアサイズで、球状、単分散かつ均質であることを示す。
【００３２】
１ｍｌの金ナノ粒子を、１％ＮａＣｌ、０．５％システイン（ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、０．２Ｍヒスチジンの、それぞれｐＨ７及びｐＨ９の０．５ｍｌの水溶液に混合することで、ＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの安定性が確認された。複合体の安定性が１時間、４時間、２４時間、４８時間及び１週間の期間に渡ってＵＶ吸光度を測定することで評価された。図４に示されるように、ＵＶ−ｖｉｓプラズモンバンドにおける無視できるほど小さい変化によって、すべての混合物においてナノ粒子組成物が保持されたことが確認された。また、異なる希釈でのＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰの安定性が図５に示されたようにＵＶ−可視分光光度法で評価された。この後者の安定特性は様々な希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）／濃度が要求される生物医学用途に関してかなり重要である。図５のデータは、吸光度強度（Ａｂｓ）がＧＡ−ＧＢ−ＡｕＮＰの濃度（Ｃｏｎｃ）にＲ２＝０．９９で線形に比例することを示す。
【００３３】
実験では暗視野顕微鏡検査によってｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞内在化（エンドサイトーシス）分析が行われた。１つの実験では、ＧＢ−ＡｕＮＰが暗視野でのｃｙｔｏｖｉｖａ顕微鏡技術で分析された。超清浄な殺菌したカバースリップが６ウェルプレートで保持された。ＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１（５×１０５細胞）が６ウェルプレートのＲＰＭＩ及びＤＭＥＭ培地それぞれの中に播種され、３７℃で２４時間、ＣＯ２インキュベーターでインキュベートされた。溶液中のＧＢ−ＡｕＮＰ（１００μＬ／ｍＬ）が細胞に添加され、３７℃で４時間及び２４時間インキュベートされた。画像がＤａｇｅイメージングソフトウェアを介して保存された。図６Ａ〜６Ｄに示されたように、ＧＢ−ＡｕＮＰが４時間及び２４時間のインキュベーション時間内にＰＣ−３及びＰＡＮＣ−１細胞内において効率よく内在化することを暗視野顕微鏡画像が明白に抽出した。
【００３４】
ＰＣ−３細胞（５×１０５細胞）が６ウェルプレートのＲＰＭＩ培地に播種され、３７℃で２４時間、ＣＯ２インキュベーターで付着させられた。培地が、培地を含む溶液中のＧＢ−ＡｕＮＰ（１００μＬ／ｍＬ）で置換され、３７℃で２時間、インキュベートされた。ＪＥＯＬ  １４００  ＴＥＭ顕微鏡でＧＢ−ＡｕＮＰのエンドサイトーシスに関して細胞試料が試験された。図７の画像に示されたように、ＴＥＭ画像は、これらナノ粒子が２４時間以内ＰＣ−３細胞株の小胞及びリソソーム内に内在化することを明確に示唆した。
【００３５】
ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍効果を試験するために、１ｍＬのＤＩ水に４ｍｇの乾燥粉末薬物質を混合することで原液が調製された。混合物を室温で１８〜２０時間撹拌し、ＤＩ水中に所望の植物化学物質を得た。次に溶液が３０℃で５分間、８０００ｒｐｍで遠心され、薬溶液と沈殿物を得た。薬溶液は、アスコルビン酸、アルカロイド、ベンゼノイド、フラボノイド、テルペン、炭水化物、没食子酸、エンブリカニンＡ、エンブリカニンＢ、ケブラジン酸、コリラギン、粘液酸、ペドゥンクラジン、ケルセチン、ケンペロール及びステロールの組み合わせを含む。薬混合物における放出された植物化学物質の量を見積もるために、さらに沈殿物が噴霧乾燥機を用いて乾燥され、乾燥重量が測定され２ｍｇであった。放出された植物化学物質の重量は２ｍｇである。薬混合物は、グースベリーにおける植物化学物質：アスコルビン酸、アルカロイド、ベンゼノイド、フラボノイド、テルペン、炭水化物、没食子酸、エンブリカニンＡ及びＢ、ケブラジン酸、コリラギン、粘液酸、ペドゥンクラジン、ケルセチン、ケンペロール及びステロールの様々な混合物を含む。
【００３６】
薬溶液における植物化学物質の量を検証するために、水抽出物が回転蒸発を用いて乾燥された。植物化学物質の重量が測定され、２ｍｇであったことは、４ｍｇの薬混合物が２ｍｇの植物化学物質をもたらすことを示唆している。
【００３７】
段階希釈物がＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ培地で調製され、各細胞が処理された。ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬の細胞生存（ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）プロファイルがＭＴＴアッセイによって、前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＬＮＣａｐ、ＡＣＥ−１）、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）、膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１及びＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）、及び結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）に関して評価された。細胞生存プロファイルは、ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が癌細胞の細胞死において用量依存的な有効性を示すことを実証した。これは図８Ａ〜１７に示されており、４８及び７２時間の期間にわたってＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬の濃度が増加するにつれて癌細胞の生存能力が減少したことを実証した。すべての濃度で細胞生存能力が対照と比較して低下し、かなりの低下が５０〜１００μｇ／ｍＬの間で示され、９０〜ほぼ１００％の細胞致死率が１００〜２００μｇ／ｍＬの濃度で達成された。
【００３８】
段階希釈用量がＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄに含まれる金の量に基づいて決定された。金の量はＡＡＳ（原子吸光分光分析）技術によって分析された。細胞生存プロファイルは、ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が癌細胞の細胞死において用量依存的な有効性を示すことを実証した。これらの粒子は封入及び付着両方の組み合わせから形成される。すべての成分は金ナノ金属表面に直接付着又は相互作用する必要はない。付着／封入は、少なくとも２つの異なる経路で起こる。はじめに、ＭＰ又はＧＢが金ナノ粒子表面に付着する。続いてＡ、Ｂ、Ｃ及びＤが混合された際、金メタル表面との水素結合又は直接の相互作用を介して、それらがすでに金表面に結合していたＧＢ（又はＭＰ）に相互作用し得る。
【００３９】
材料と追加の実験詳細
【００４０】
金ナノ粒子の合成及び細胞培養で用いられたすべての化学物質、例えば四塩化金（ＩＩＩ）酸ナトリウム二水和物、ＲＰＭＩ（一般にＲＰＭＩ培地を呼ばれるロズウェルパーク記念研究所培地は、細胞培養及び組織培養に使用される培地の形態である）及びＭＥＭ（すべての人工の細胞培養培地でもっとも広く使用される１つである最小必須培地（ＭＥＭ））、トリパンブルー、及びＭＴＴ［３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）染料はシグマ（米国ミズーリ州セントルイス）から得た。ウシ胎仔血清及びＴｒｙｐＩＥは米国ライフインビトロジェンから得た。ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ−３及びＬＮＣａｐ）、イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）、乳癌細胞（ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１及びＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）、及び結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）は、ミズーリ大学コロンビア校の細胞学コア施設から得た。実験を通して２回蒸留水が用いられた。自家製グースベリー乾燥粉末がすべての製剤で使用された。グースベリー粉末は、冷水及び温水で洗浄した生のグースベリーから調製した。ベリーの中身から種を除いた後、ベリーが小さいかけらに切り分けられた。かけらが砕けやすい固形物になるまでかけらが日陰で乾燥された。乾燥したグースベリーのかけらが製造業で使用される偏光子を用いて粉末にされた。品質管理で、粒径１００〜１５０マイクロメートルが示された。生成物はプレート全体のカウントで１０００／グラム未満のエンドトキシン、１０／グラム未満の酵母及び菌しか含まず、大腸菌を含有していなかった。
【００４１】
ＴＥＭ画像は、ＪＥＯＬ  １４００  ＴＥＭ（ＪＥＯＬ、ＬＴＥ、東京、日本）で得られた。吸収測定はＶａｒｉａｎ  Ｃｒａｙ  ５０  ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用いて行われた。流体力学直径及びゼータ電位はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、米国）を用いて得られた。金メタルの濃度は原子吸光分析法によって算出された。
【００４２】
ＧＢ−ＡｕＮＰ及びＧＢ−ＧＡ−ＡｕＮＰが次の手順で形成された。２０ｍｌのバイアルに、２回脱イオン（ＤＩ）水が加えられ、続いて自家製グースベリー乾燥粉末（ＧＢ粉末）（１０ｍｇ）がアラビアゴム（１２ｍｇ）とともに、及びアラビアゴム無しで加えられ、室温で１時間、撹拌された。６ｍｌのＤＩ水に対して、８〜１５ｍｇの範囲のＧＢ及びアラビアゴムが適している。１００マイクロリットルのＮａＡｕＣｌ４溶液（０．１Ｍ）が反応混合物に加えられ、室温でさらに３時間撹拌された。５分以内にルビー色に変色したことでナノ粒子の形成を確認した。溶液が３分間、３０００ｒｐｍで遠心され、未反応の物質を除去することで純粋なＡｕＮＰ溶液が得られた。変更例として、２倍の体積、例えば、２００マイクロリットルの０．１ｍのＮａＡｕＣｌ４溶液（０．１Ｍ）が使用されてもよい。ＮａＡｕＣｌ４の体積が２倍の場合、ＧＢの量が比例して増加する。また、比例効果が予期されるのであれば、例示の範囲内又は範囲を外れて体積が変更されてもよい。
【００４３】
ＧＢ−ＡｕＮＰを形成するために用いられたのと同じ方法でＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が製剤化された。薬の製剤化に関して次の添加物（Ａ）グースベリー植物化学物質（２ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮植物化学物質（４ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１ｇｍ）及び（Ｄ）アラビアゴム（０．５ｇｍ）が２０ｍＬのＧＢ−ＡｕＮＰに加えられた。２０ｍＬのＧＢ−ＡｕＮＰに対して、グースベリー植物化学物質（２〜２．５ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮植物化学物質（４〜５ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１〜１．５ｇｍ）及び（Ｄ）アラビアゴム（０．５〜１．０ｇｍ）が適した量である。すべての添加物がＧＢ−ＡｕＮＰに加えられ、室温で３０〜４５分間混合された。混合物が凍結乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られ、収量は６ｇｍであった。試料が４〜８℃で気密容器に保管され、さらなる抗腫瘍細胞生物学試験に使用された。混合物が凍結乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られた。収量は６．５〜７．５ｇｍであった。試料が４℃で気密容器に保管され、さらなる抗腫瘍細胞生物学試験に使用された。
【００４４】
グースベリーがｐ−クマル酸、イソラムネチングリコシド、ケンペロール及びケルセチンを含むいくつかの強い抗酸化植物化学物質の貯蔵庫であることを研究が示している。このため、これら植物化学物質のカクテルの組み合わされた抗酸化作用は、金塩の金ナノ粒子への変化の原因である。アユルベーダ医薬製剤は植物化学物質のカクテル効果に基づく。発明者は、金塩の金ナノ粒子への完全な変化を達成するための金塩の特定の重量に要するグースベリー粉末の重量を最適化した。４〜８ｍｇの範囲の金重量に関して、２５〜２８℃で６〜１０ｍｌの蒸留水中で完全な反応を行うのに、６〜１０ｍｇのグースベリー粉末が最適である。
【００４５】
１％ＮａＣｌ、０．５％システイン、０．２Ｍヒスチジンの、それぞれｐＨ７の水溶液のような種々の生物学的溶液と金ナノ粒子を混合することで、ＧＢ−ＡｕＮＰの安定性試験が行われた。複合体の安定性が１週間の間、いくつかの時点でＳＰＲを測定することで評価された。ＳＰＲバンドにおける無視できるほど小さい変化によって、すべての混合物におけるナノ粒子組成物が保持されたことが確認された。また、ＧＢ−ＡｕＮＰが水での異なる濃度での安定性が試験され、安定性がＵＶ−可視分光光度法で評価された。
【００４６】
単体の及び複合体のアユルベーダのＡｕＮＰを前立腺癌及び膵癌細胞株とインキュベートすることで、エンドサイトーシスの状態が調べられた。最適な用量とインキュベーション時間がいくつかの時点について異なる希釈物で決定された。濃度が図に示されている。試料は次の技術を用いて調製された。
【００４７】
暗視野データが以下のように取得された。インキュベーションの後、細胞が１×ＰＢＳで１０回洗浄され、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定された。さらに、細胞が１×ＰＢＳで２回洗浄され、スライドがＤＡＰＩ核染料を用いて調製され、デュアルモード蛍光と組み合わせたＣｙｔｏｖｉｖａ暗視野顕微鏡で観察された。細胞の形態がまず観察され、続いてナノ粒子の取り込みが行われた。画像がＤａｇｅイメージングソフトウェアを介して保存された。
【００４８】
ＴＥＭ画像が以下のように得られた。インキュベーションの後、細胞がＰＢＳで１０回洗浄され、遠心で沈殿物とされ、カコジル酸ナトリウム緩衝液（０．１Ｍ）中の２％グルタルアルデヒド、２％パラホルムアルデヒドで固定された。さらに細胞が２−メルカプトエタノール緩衝液中の緩衝化した１％四酸化オスミウムで固定され、続いて段階的なアセトン系列で脱水され、Ｅｐｏｎ−Ｓｐｕｒｒエポキシ樹脂で包埋された。ダイヤモンドナイフ（Ｄｉａｔｏｍｅ、ペンシルベニア州ハットフィールド）で切片が８５ｎｍに切られた。細胞小器官の可視化のために、切片がＳａｔｏのトリプルリード染色及び５％含水酢酸ウラニルで染色された。調製された試料が、ミズーリ大学電子顕微鏡コア施設において８０ｋＶで操作されたＪＥＯＬ  １４００  ＴＥＭ顕微鏡（ＪＥＯＬ、マサチューセッツ州ピーボディ）で評価された。
【００４９】
前立腺癌細胞（ＰＣ−３及びＬＮＣａｐ）、イヌ前立腺癌（ＡＣＥ−１）、乳癌細胞（ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１及びＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）、及び結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）の細胞生存に対する、ＧＢ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬の効果に関して、細胞生存アッセイがＭＴＴアッセイ（シグマアルドリッチ）を用いて評価された。発色の強度が波長（ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ）５７０ｎｍで操作されたマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅ、米国）で測定された。パーセント細胞生存が次の式を用いて算出された。（Ｔ／Ｃ）×１００、ここでＣ＝対照の吸光度でＴ＝処理の吸光度である。ＩＣ−５０値がＯｒｉｇｉｎソフトウェアを用いて算出された。
【００５０】
マンゴー皮の植物化学物質複合体化金ナノ粒子（ＭＰ−ＡｕＮＰ）がマンゴー皮における強電子が豊富な抗酸化植物化学物質の最適な還元能力を用いて合成された。方法が図１８に示されている。ＭＰ−ＡｕＮＰの形成は、淡黄色から赤い反応混合物への溶液の変色を観察することで確認した。マンゴー皮に含まれる植物化学物質は強力な電子入射器である。また、これら植物化学物質は金ナノ粒子表面上に被覆を形成するため、植物化学物質は金ナノ粒子の形成と安定化に重要な役割を担う。ＡｕＮＰはＵＶ−可視分光光度法、ＤＬＳ及びＴＥＭを含む技術の組み合わせによって特徴づけられた。図１９に示さるように、ＵＶ−可視分光光度分析は、ＭＰ−ＡｕＮＰのＳＰＲが５３５±２ｎｍであったことを確認した。これによって、ＭＰ−ＡｕＮＰの合成の成功が判断された。ＴＥＭで得られたＭＰ−ＡｕＮＰのコアサイズは、ナノ粒子が３５±５ｎｍのコアサイズの、球状、単分散かつ均質であることを示唆した。動的光散乱機器で得られた結果は、ＭＰ−ＡｕＮＰが６５±５ｎｍの流体力学的サイズと−２０±２ｍＶのゼータ電位（ζ）を示すことを明らかにした。負のゼータ電位は、ナノ粒子が溶液中で安定に保持されるのに必要な必須の反発力をもたらす。ＭＰ−ＡｕＮＰは３年間にわたって溶液中で安定である。マンゴー皮における植物化学物質の構成は、グルコース、キサントン、マンギフェリン、ケルセチン、ケンペロール、カテキン、ラムネチン及び多くの植物性栄養素を含む。マンギフェリン、Ｃ−グルコシルキサントン（１，３，６，７−テトラヒドロキシキサントン−Ｃ２−ベータ−Ｄ−グルコシド）は、マンゴーフルーツの皮に豊富に含まれるグルコース官能性キサントノイドである。
【００５１】
図２１Ａ〜２１Ｃは、ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬を特徴づけるデータを示す。ＴＥＭ、ＳＴＥＭ及びＥＥＬＳ（電子エネルギー損失分光法）で得られたＭＰ−ＡｕＮＰのコアサイズは、ナノ粒子が３５±５ｎｍのコアサイズの、球状、単分散かつ均質であることを示す。薬製剤に関して、次の添加物（Ａ）グースベリー植物化学物質、（Ｂ）マンゴー皮の植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、及び（Ｄ）アラビアゴムがＭＰ−ＡｕＮＰ  １×に加えられた。
【００５２】
ＭＰ−ＡｕＮＰ  １×及び２×の細胞生存プロファイルがＭＴＴアッセイによって前立腺癌（ＰＣ−３）及び膵臓細胞（ＰＡＮＣ−１）に対して評価された。それぞれ細胞がＭＰ−ＡｕＮＰのいくつかの希釈物及びマンゴー皮の遊離した植物化学物質（ＭＰ抽出物）で処理された。細胞生存の測定が図２２Ａ〜２３Ｂに表されている。細胞生存プロファイルは、ＭＰ−ＡｕＮＰがＰＣ−３細胞の細胞死において用量依存的な有効性を有することを示した。ＭＰ−ＡｕＮＰ  １×と２×との間で（１倍と２倍のＭＰの濃度）、ＭＰ−ＡｕＮＰの合成の間用いられた２×の能力は、前立腺癌細胞の生存に対するより強い阻害効果を示したことが、図２２Ａ及び２２Ｂのデータを図２３Ａ及び２３Ｂのデータと比較することで明らかである。ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が様々な癌細胞で試験された。ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗腫瘍有効性を試験するために、１ｍＬのＤＩ水に４ｍｇの乾燥粉末薬物質を混合することで原液が調製された。原液は１ｍＬのＤＩ水にＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ薬物質の乾燥粉末４ｍｇを混合することで得られた溶液である。薬物質は、ＭＰ−ＡｕＮＰとＡ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄとの混合物である。混合物が室温で１８時間の一晩撹拌され、ＤＩ水中に所望の植物化学物質を得た。溶液が３０℃で５分間、８０００ｒｐｍで遠心され、薬溶液及び沈殿物を得た。薬混合物における放出された植物化学物質の量を見積もるために、さらに沈殿物が噴霧乾燥機を用いて乾燥され、乾燥重量が測定され２ｍｇであった。放出された植物化学物質の重量は２ｍｇである。製剤に使用された薬の当初の総重量は４ｍｇであった。この溶液（合計４ｍｇ）が遠心された際、２ｍｇの重量の沈殿物が生成した。残った上清の液体には残りの２ｍｇを含んでいるはずである。それはまさしく上清から水を蒸発させた際に得られたもので、残ったものの乾燥重量は２ｍｇであることがわかった。これは薬が失われていないことを示す。示される実験によって、４ｍｇの薬混合物から２ｍｇが得られることが確認される。
【００５３】
薬の水抽出物における植物化学物質の量を検証するために、水抽出物が回転蒸発を用いて乾燥された。植物化学物質の重量が測定され、２ｍｇであった。これ  は、４ｍｇの薬混合物が２ｍｇの植物化学物質をもたらすことを示唆している。
【００５４】
段階希釈物がＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ培地で調製され、各細胞が処理された。ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬の細胞生存プロファイルが前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＬＮＣａｐ、ＡＣＥ−１）、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）、膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１及びＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）、結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）及び健常な内皮細胞（ＨＡＥＣ）に対してＭＴＴアッセイで評価された（図２４〜３２）。細胞生存プロファイルは、ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が癌細胞の細胞死において用量依存的な有効性を有することを示した。この結果によってＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が健常な細胞株に対して最小限の毒性、又は無毒性であることが確認された（図３２）。
【００５５】
ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬の細胞生存プロファイルが前立腺癌細胞（ＰＣ−３、ＬＮＣａｐ、ＡＣＥ−１）、乳癌細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）、膵癌細胞（ＰＡＮＣ−１及びＭＩＡ−ＰＡＣＡ−１）、結腸癌細胞（ＳＷ−４８０）及び健常な内皮細胞株（ＨＡＥＣ）に対してＭＴＴアッセイで評価された（図３３Ａ〜４１Ｂ）。段階希釈用量がＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄに含まれる金の量に基づいて決定された。金の量はＡＡＳ技術によって分析された。
【００５６】
細胞生存プロファイルは、ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬が癌細胞の細胞死において用量依存的有効性を有することを示した。
【００５７】
ＰＣ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がＭＰ−ＡｕＮＰとインキュベートされた。暗視野画像化が行われ、ＭＰ−ＡｕＮＰが４時間のインキュベーション時間内にＰＣ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に内在化したことを結果は示した（図４２Ａ〜４２Ｄ）。
【００５８】
単体の（ＭＰ−ＡｕＮＰ）及び複合体の（ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ）ナノ粒子についてのデータは、遊離のＭＧＦよりもかなり高い有効性を示す。さらに試験は、前立腺、膵臓、乳、肺、及び結腸等の様々な癌種に加え、健常な細胞に関して、金含量についての濃度が０．０３マイクログラム／ｍｌから０．４０マイクログラム／ｍｌまでの範囲であることを示す。これは、薬の総合的な濃度範囲にすると１２．５〜２００マイクログラム／ｍｌである。
【００５９】
単体の及び複合体のＭＰナノ粒子の調製のために、地元の食料品店で購入したマンゴー（Ｍａｎｇｉｆｅｒａ  ｉｎｄｉｃａ）がすべての実験で使用された。マンゴー皮がマンゴーから採取され、２回脱イオン水で洗浄され、あらゆる混入物質又はちり粒子が除去され、５０℃（４０〜６０℃）で４時間インキュベートされ、続いて乾燥粉末を得るためにひかれた。粉末が室温で保存され、続く金ナノ粒子合成に使用された。
【００６０】
ＭＰ−ＡｕＮＰを合成するために、重量３０ｍｇのマンゴー皮粉末が２０ｍｌバイアル中の６ｍｌのＤＩ水に加えられ、室温で１０分間撹拌され、均質な懸濁液が調製された。次に、１００μｌの０．１Ｍ  ＮａＡｕＣｌ４溶液が加えられ、溶液の色が２分以内にルビー色に変化することで金ナノ粒子の形成が示された。一般に、２５〜３０ｍｇについて、皮粉末と６〜１０ｍｌのＤＩ水が１０〜２０分間撹拌され、８０〜１００μｌの０．１Ｍ  ＮａＡｕＣｌ４が使用された。溶液が濾過されて残存する溶解しないマンゴー皮粉末が除去された。より一般的には、ナノ粒が５〜−２０℃で保管され得るが、この温度は、調整後、治療での使用前の保管で推奨される。
【００６１】
２×濃度のＭＰ−ＡｕＮＰが６ｍＬのＤＩ水に溶解された２倍の量のマンゴー皮粉末（６０ｍｇ）を用いて調製された。室温で１８時間、磁石撹拌機で反応混合物が撹拌された。０．１Ｍ  ＮａＡｕＣｌ４（１００μＬ）が反応混合物に加えられた。黄色からルビー色への混合物の変色がＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×の形成を示す。
【００６２】
ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ  ナノ−アユルベーダ薬製剤の調製が次のように行われた。ＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×が上述されたように調製された。薬製剤に関して、次の添加物（Ａ）グースベリー植物化学物質（２ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮植物化学物質（４ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１ｇｍ）及び（Ｄ）アラビアゴム（０．５ｇｍ）が２０ｍＬのＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×−に加えられた。すべての添加物がＭＰ−ＡｕＮＰに加えられ、室温で３０分間混合された。混合物が凍結乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られた。収量は６ｇｍであった。試料が４℃で気密容器に保管された。より一般的には、２０ｍＬのＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×に適した範囲は、グースベリー植物化学物質（２〜２．５ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮の植物化学物質（４〜５ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１〜１．５ｇｍ）、（Ｄ）アラビアゴム（０．５〜１．０ｇｍ）を含む。実験では、すべての添加物がＭＰ−ＡｕＮＰに加えられ、室温で３０〜４５分間混合された。混合物が凍結乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られ、収量は６ｇｍであった。試料が４〜８℃で気密容器に保管され、さらなる抗腫瘍細胞生物学試験に使用された。
【００６３】
図４３は、ヒト前立腺癌を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ  ｓｉｚｅ）を制御する又は抑制するＭＧＦ−ＡｕＮＰの治療効果を示すデータである。動物が無作為に分けられ、０日目に腹腔内に処理された。処理は、１週間あたり２回腹腔内に行われた；ｎ＝５；平均±ＳＴＥ。統計的比較が異なる群間でなされた。ｐ＝０．０７の生理食塩水（ｓａｌｉｎｅ）処理  ｖｓ  ＭＧＦ−ＡｕＮＰ  ０．２７ｍｇ／ｋｇ  ｂｗが統計的に有意でない結果となった。ｐ＝０．０２１の生理食塩水処理  ｖｓ  ＭＧＦ−ＡｕＮＰ  ０．５３ｍｇ／ｋｇ  ｂｗが統計的にかなり有意である結果となった。ｐ＝０．０００９の生理食塩水処理  ｖｓ  ＭＧＦ  ０．８ｍｇ／ｋｇ  ｂｗが統計的に極めて有意である結果となった。
【００６４】
具体的な実施の形態は、ヒトが摂取するためのカプセルの調製に最適化された薬調製物を含む。薬製剤ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの全体の好ましい方法が以下に説明される。ＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×が段落００６１に記載されたように調製された。薬製剤に関して、次の添加物（Ａ）グースベリー植物化学物質（５ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮の植物化学物質（１０ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１ｇｍ）、及び（Ｄ）アラビアゴム（２．５ｇｍ）が１０ｍＬのＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×に加えられた。すべての添加物がＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×に加えられ、室温で３０分間混合された。混合物が４０℃で乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られた。収量は１７ｇｍであった。試料が４℃で気密容器に保管された。より一般的には、１０ｍＬのＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×を含む混合物の適切な範囲は、（Ａ）グースベリー植物化学物質（５〜６ｇｍ）、（Ｂ）マンゴー皮の植物化学物質（１０〜１２ｇｍ）、（Ｃ）クルクミン抽出物（１〜１．５ｇｍ）、及び（Ｄ）アラビアゴム（２．５〜３．０ｇｍ）を含む。実験では、添加物がＭＰ−ＡｕＮＰ  ２×に加えられ、室温で３０〜４５分間混合された。混合物が４０℃で乾燥され、余分な水が除かれ、乾燥薬物質が得られ、収量は１６〜１７ｇｍであった。試料が４〜８℃で気密容器に保管され、さらなる抗腫瘍ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験に使用された。
【００６５】
図４４は、ヒト前立腺癌を有するＳＣＩＤマウスにおける腫瘍サイズを制御する又は抑制するＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄの治療効果を示すデータである。動物が無作為に分けられ、０日目に経口処理された。処理は、１週間あたり２回行われた；ｎ＝５、ＭＰＤ＝ＭＰ−ＡｕＮＰ−Ａ＋Ｂ＋Ｃ＋Ｄ薬。
【００６６】
本発明に係る具体的な実施の形態が示され、説明されたが、他の変更、置換及び代替が当業者にとって明らかであることが理解されるべきである。添付の特許請求の範囲で定められるべき本発明の精神と範囲から逸脱することなく、このような変更、置換及び代替が行われ得る。
【００６７】
本発明の様々な特徴が添付の特許請求の範囲に明記される。
【００６８】
（付記）
（付記１）
乾燥したグースベリー製品若しくはマンゴー皮製品又はそれらに含有される植物化学物質を液体媒体に混合して還元剤溶液を生成することと、
金塩を前記還元剤溶液に混合することと、
他の還元剤の非存在下で前記金塩を反応させて、安定化した、生体適合性の、アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子のナノ粒子溶液を生成することと、
を含む、アユルベーダの封入された金ナノ粒子を形成する方法。
【００６９】
（付記２）
前記混合は、乾燥したグースベリー製品又はマンゴー皮製品を混合することを含む、付記１に記載の方法。
【００７０】
（付記３）
前記液体媒体は、蒸留水（及び／又は脱イオン水）からなる、付記１又は２に記載の方法。
【００７１】
（付記４）
前記液体媒体は、アルコール性媒体又は水とアルコールとの混合物からなる、付記１又は２に記載の方法。
【００７２】
（付記５）
前記金塩は、非放射性のＡｕＣｌ４からなる、付記１から４のいずれか一つに記載の方法。
【００７３】
（付記６）
前記還元剤溶液におけるグースベリー製品の濃度は、１〜３又は１００〜２００ｍＭの範囲である、付記１から５のいずれか一つに記載の方法。
【００７４】
（付記７）
６〜１０ｍｌの蒸留水における金塩の重量に関する濃度は、６〜１０ｍｇのグースベリー粉末に対して４〜８ｍｇの範囲である、付記６に記載の方法。
【００７５】
（付記８）
前記反応は、２５℃〜２８℃の試薬溶液温度で行われる、付記７に記載の方法。
【００７６】
（付記９）
前記還元剤溶液におけるマンゴー皮製品の濃度は、前記金塩の完全な消費を確保するのに十分である、付記１から８のいずれか一つに記載の方法。
【００７７】
（付記１０）
前記反応後、前記溶液から非反応物を除去することをさらに含む、付記１から８のいずれか一つに記載の方法。
【００７８】
（付記１１）
前記混合は、グースベリー製品を混合し、前記混合は、前記液体媒体にアラビアゴムを混合することをさらに含む、付記１から８のいずれか一つに記載の方法。
【００７９】
（付記１２）
前記反応後、（Ｂ）マンゴー皮植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、（Ｄ）アラビアゴムを加えることをさらに含む、付記１１に記載の方法。
【００８０】
（付記１３）
前記混合は、前記マンゴー皮製品を混合し、前記反応後、（Ｂ）グースベリー植物化学物質、（Ｃ）クルクミン抽出物、（Ｄ）アラビアゴムを混合することをさらに含む、付記１から８のいずれか一つに記載の方法。
【００８１】
（付記１４）
前記マンゴー皮製品は、マンギフェリンである、付記１に記載の方法。
【００８２】
（付記１５）
付記１から１４のいずれか一つに記載の方法に従って生成した前記ナノ粒子溶液を、腹腔内投与、静脈内投与、又は経口投与することを含む、治療方法。
【００８３】
（付記１６）
安定化した、生体適合性の、アユルベーダの封入された金ナノ粒子の前記ナノ粒子溶液を処理して、アユルベーダの封入された金ナノ粒子薬の乾燥粉末又は乾燥カプセルを形成することをさらに含む、付記１から１４のいずれか一つに記載の方法。
【００８４】
（付記１７）
付記１６に記載の方法に従って形成した前記乾燥粉末又は乾燥カプセルを経口投与することを含む、治療方法。
【００８５】
（付記１８）
アユルベーダの（Ａｙｕｒｖｅｄｉｃ）封入された金ナノ粒子の溶液、アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥粉末、又はアユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥カプセルを得ることと、癌又は炎症疾患を患う対象に前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の溶液、前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥粉末、又は前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子の乾燥カプセルを腹腔内投与、静脈内投与、又は経口投与することと、を含む、癌又は炎症疾患の治療方法。
【００８６】
（付記１９）
前記アユルベーダの封入された金ナノ粒子は、非放射性の金ナノ粒子である、付記１６に記載の方法。
【００８７】
（付記２０）
クルクミン抽出物及びアラビアゴムとともに乾燥粉末又はカプセルの状態で、マンゴー皮又はグースベリーに含有される植物化学物質に封入された非放射性の金ナノ粒子からなるアユルベータ医薬。
【図１Ａ】
2020507631.tif 000004
【図１Ｂ】
2020507631.tif 000005
【図１Ｃ】
2020507631.tif 000006
【図２Ａ】
2020507631.tif 000007
【図２Ｂ】
2020507631.tif 000008
【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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