(57)【要約】本発明は、ｐ５３癌抑制遺伝子を活性化させて核に局在化させる方法、及びｐ５３癌抑制遺伝子の活性を促進する物質を含む医薬組成物に関する。さらに、配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを含む医薬組成物、及び前記ｓｉＲＮＡを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするｐ５３癌抑制遺伝子の活性化方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
【請求項２】
癌を治療するための請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするｐ５３癌抑制遺伝子の活性化方法。
【請求項４】
配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするｐ５３癌抑制遺伝子の核への局在化方法。
【請求項５】
核に局在化したｐ５３癌抑制遺伝子に、さらに放射線照射を行うことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
ｐ５３の第１５番目のセリン残基をリン酸化することを特徴とするｐ５３の活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ｐ５３癌抑制遺伝子を活性化させて核に局在化させる方法に関する。また、本発明は、ｐ５３癌抑制遺伝子の活性を促進する物質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】  シノビオリンは、リウマチ患者由来滑膜細胞で過剰発現している膜タンパク質として発見された新規タンパク質である（ＷＯ０２／０５２００７）。そして、遺伝子改変動物を用いた研究により、シノビオリンは関節リウマチの発症に必須の分子であることが判明した。
タンパク質構造予測システムにより、シノビオリンはＲＩＮＧ  ｆｉｎｇｅｒモチーフを有することが示唆されている。このモチーフはタンパク質のユビキチン化に重要な役割を果たすＥ３ユビキチンライゲースという酵素に多く見出されているが、実際、シオビオリンがＥ３ユビキチンライゲースの特徴のひとつである自己ユビキチン化活性を有することが証明されている（ＷＯ０２／０５２００７）。
ところで、ｐ５３は、第１７染色体ｐ１３に位置しており、癌細胞の発生及び増殖においてきわめて重要な癌抑制遺伝子である。ｐ５３は、ＤＮＡ上の特異的塩基配列［５’−（Ａ／Ｔ）ＧＰｙＰｙＰｙ−３’）］を認識し、ｗａｆ１／ｃｉｐ１、ＧＡＤＤ４５、ＢＡＸ等の特定の遺伝子の転写活性化を促す。また、（ｉ）その他の多くの遺伝子の転写を抑制すること、（ｉｉ）ＳＶ４０ラージＴ抗原、アデノウイルスＥＩＢタンパク質、パピローマウイルスＥ６などのウイルス性癌遺伝子、あるいはｍｄｍ２等の細胞性癌遺伝子と結合すること、（ｉｉｉ）ミスマッチを含むＤＮＡと特異的に結合すること等の生理機能が知られている。
従って、癌の抑制物質を見出すには、ｐ５３の機能を解析することが重要である。
【発明の開示】
本発明は、ｐ５３癌抑制遺伝子の活性化を促進する方法、及びｐ５３癌抑制遺伝子の活性化を促進する医薬組成物を提供することを目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を詳細に解析したところ、野生型に比し、アポトーシスを起こしている細胞が多数観察され、また、アポトーシスの誘導に深く関与しているｐ５３が核内に局在し、強く発現していることが判明した。そして、シノビオリンの機能を抑制することにより、ｐ５３が活性化され、癌細胞の増殖が阻止されることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを含む医薬組成物。
上記医薬組成物は、癌を治療するために使用される。
（２）配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするｐ５３癌抑制遺伝子の活性化方法。
（３）配列番号１に示される塩基配列のうち配列番号２〜１５に示す塩基配列からなる群から選択される少なくとも１つの配列を標的配列として設計されたｓｉＲＮＡを用いて、シノビオリンの発現を阻害することを特徴とするｐ５３癌抑制遺伝子の核への局在化方法。
上記局在化方法は、核に局在化したｐ５３癌抑制遺伝子に、さらに放射線照射を行うこともできる。
（４）ｐ５３の第１５番目のセリン残基をリン酸化することを特徴とするｐ５３の活性化方法。
【図面の簡単な説明】  図１は、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）における免疫組織染色の結果を示す写真である。
図２は、ｓｙｎｏ−／−の胚における抗ｐ５３抗体による免疫組織染色の結果を示す写真である。
図３は、アポトーシス関連タンパク質に関するウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
図４は、ｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞におけるｐ５３のリン酸化部位を同定した結果を示す写真である。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、シノビオリンの機能を阻害してｐ５３癌抑制遺伝子（単にｐ５３ということもある）を核に局在化及び活性化させることにより、癌を抑制することを特徴とする。
１．ｐ５３の活性化
正常細胞を紫外線等にさらすと、細胞内のｐ５３が活性化して、その結果細胞増殖が阻止されることから、ｐ５３の濃度を上昇させることにより、癌細胞の増殖を止めることができる。つまり、ｐ５３が機能しない場合は、癌細胞の増殖が止められず、癌が進行することになる。事実、ｐ５３は正常な個体の細胞にはほとんど見られないが、癌患者由来の細胞の約半数においてはこのｐ５３の欠損変異が起こっている。また、このような変異が起こっていない場合でも、ｐ５３の制御機構に何らかの変異が生じて癌抑制機能が失われている。したがって、癌の進行を抑えるにはｐ５３を有効に機能させることが必要である。
本発明においては、ｐ５３の活性化を癌治療の有効な方法の一つとするため、シノビオリンの機能に着目した。そして、シノビオリンホモノックアウト動物を作製し、詳細に解析したところ、野生型に比してアポトーシスを起こしている細胞が多数観察された。すなわち、シノビオリンの機能を阻害すると、アポトーシスに深く関与しているｐ５３の活性化が促進され、シノビオリンの機能阻害が癌抑制につながることを見出した。
なお、アポトーシスとは、細胞が自ら引き起こすプログラムされた細胞死を意味し、細胞核の染色体凝集、細胞核の断片化、細胞表面微絨毛の消失、細胞質の凝集、カスパーゼの活性化、ミトコンドリア膜電位の消失等を特徴とする。細胞に上記特徴が生じたときに、アポトーシスが引き起こされたと判断する。
本発明において、胎児胚におけるｐ５３の免疫染色を行うと、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚では全身においてｐ５３が強く発現する。また、シノビオリンホモノックアウトマウス胎児胚から単離した胎仔線維芽細胞（ＭＥＦｓ）も、野生型から単離したものに比して強く発現しており、しかもｐ５３は核内に強く局在する。この核局在は野生型ではまったく観察されない。このことは、シノビオリンの発現を阻害することにより、ｐ５３を核内へ移行させることができることを意味する。さらに、シノビオリンホモノックアウトマウス胎仔ＭＥＦｓでは、高い放射線感受性を示す。従って、本発明において、シノビオリンの発現を阻害してｐ５３を核に移行させた後に放射線照射を行うと、癌細胞の増殖を効果的に抑制することができる。
さらに、本発明においては、ｐ５３（ｐ５３タンパク質）のアミノ酸の一部をリン酸化することによりｐ５３を活性化させることを特徴とする。ｐ５３のリン酸化の対象は、ｐ５３のアミノ酸配列のうちセリン残基であることが好ましく、第１５番目のセリン残基がさらに好ましい。
ｐ５３はＡＴＲおよびＡＴＭ等のキナーゼによりリン酸化されることが知られており、リン酸化は、シノビオリンを阻害することによりこれらのキナーゼ活性を上昇させることが考えられる。
２．シノビオリン発現阻害及び活性阻害
ｐ５３を活性化するためには、シノビオリンの発現を阻害する方法が採用される。
シノビオリンの発現阻害には、特に限定されるものではないが、例えばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を利用することができる。シノビオリン遺伝子に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）を設計及び合成し、これを細胞内に導入させることによって、ＲＮＡｉを引き起こすことができる。
ＲＮＡｉとは、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ）が標的遺伝子に特異的かつ選択的に結合し、当該標的遺伝子を切断することによりその発現を効率よく阻害する現象である。例えば、ｄｓＲＮＡを細胞内に導入すると、そのＲＮＡと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。
ｓｉＲＮＡの設計は、以下の通り行なうことができる。
（ａ）シノビオリンをコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全て候補にすることが可能である。例えば、ヒトの場合では、Ｇｅｎ  Ｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＢ０２４６９０（配列番号１）の任意の領域を候補にすることができる。
（ｂ）選択した領域から、ＡＡで始まる配列を選択し、その配列の長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。その配列のＧＣ含量は、例えば４０〜６０％となるものを選択するとよい。具体的には、配列番号１に示される塩基配列のうち、以下の塩基配列から選ばれる少なくとも１つの配列を含むＤＮＡをｓｉＲＮＡの標的配列として使用することができる。特に、（ｉ）（配列番号２）、（ｉｉ）（配列番号３）、（ｖｉ）（配列番号７）、（ｖｉｉ）（配列番号８）、（ｖｉｉｉ）（配列番号９）を標的とすることが好ましい。
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ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、インビトロで合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。
また、本発明は、ＲＮＡｉ効果をもたらすためにｓｈＲＮＡを使用することもできる。ｓｈＲＮＡとは、ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。
ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループを構造を形成するように設計することができる。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順になるようにこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するようにし、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となるシノビオリン遺伝子（配列番号１）の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。
３．医薬組成物
本発明において作製されたｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡは、シノビオリンの発現を抑制する物質であり、ｐ５３を活性化させる医薬組成物（特に癌の遺伝子治療剤）として使用することができる。
本発明の医薬組成物を癌の遺伝子治療剤として使用する場合は、適用部位は特に限定されず、脳腫瘍、舌癌、咽頭癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、胆道癌、胆嚢癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、膀胱癌、横紋筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、皮膚癌、各種白血病（例えば急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、成人型Ｔ細胞白血病、悪性リンパ腫）、等を対象として適用される。
上記癌は、原発巣であっても、転移したものであっても、他の疾患と併発したものであってもよい。
本発明の医薬組成物を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の医薬組成物を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
また、本発明の医薬組成物をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ｓｉＲＮＡやｓｈＲＮＡを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等の全身投与する。脳等に局所投与することもできる。
本発明の医薬組成物の投与量は、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は１日１回あたり１０６〜１０１３個程度であり、１週〜８週間隔で投与される。
ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを目的の組織又は器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例１】  本実施例は、シノビオリンホモノックアウトマウス（ｓｙｎｏ−／−）胎児線維芽細胞（ＭＥＦｓ）におけるアポトーシス関連タンパク質をウェスタンブロッティングにより検出し、さらに細胞を免疫組織染色により確認した。
すなわち、免疫染色法は、ＭＥＦｓを常法に従いスライドガラス上に固定し、２種類の抗ｐ５３抗体（マウスモノクローナル抗体ＢＤ：Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社、ウサギポリクローナル抗体ＦＬ３９３：Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ社）を用いて免疫染色を行った。３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で３０分ブロッキングを行った標本に、０．３％ＢＳＡで希釈した抗ｐ５３抗体（ＢＤ：１０μｇ／ｍｌ、ＦＬ３９３：５μｇ／ｍｌ）を室温で６０分免疫反応させた。反応後の標本をＰＢＳで洗浄後、フルオレセインイソチオシアネート標識抗ウサギＩｇＧ抗体またはＴＲＩＴＣ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｄａｋｏ社）を２次抗体として免疫反応させた。抗ｐ５３抗体に免疫反応する抗原の確認は、蛍光顕微鏡で行った。
その結果、野生型に比し、ｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞ではｐ５３の活性化を起こしている細胞が多数確認された（図１）。
【実施例２】  本実施例は、ｓｙｎｏ−／−マウスにおけるｐ５３活性化の検討である。
ｓｙｎｏ−／−マウスにおけるｐ５３活性化の検討を、胚を用いて免疫染色により行った。
すなわち、ｓｙｎｏ−／−の胎仔における免疫染色は、常法に従い組織をスライドガラス上に固定し、ベクタステインＡＢＣキット（ＶＥＣＴＯＲ社）を用いて行った。ブロッキング試薬で３０分ブロッキングした標本に対して、５μｇ／ｍｌに希釈した抗ｐ５３抗体ＦＬ３９３を室温で６０分間免疫反応させた。反応後の標本をＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として免疫反応させた。抗ｐ５３抗体に免疫反応する抗原は、ＨＲＰ活性に基づく３，３’−ジアミノベンジジン四塩酸塩の発色により確認した。対比染色としてメチルグリーン染色を行った。
この結果、ｓｙｎｏ−／−の胚におけるｐ５３が活性化していることが確認された（図２）。
【実施例３】  本実施例では、ｐ５３に対するシノビオリンの効果を検討した。
ｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞におけるアポトーシス関連タンパク質をウェスタンブロッティングにより検出した。
すなわち、各種細胞を細胞破砕液（１５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＮＰ４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２μｇ／ｍｌロイペプチン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌペプスタチン）を用いて細胞破砕画分を調製した。その後、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により細胞破砕画分を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、細胞由来タンパク質は、エレクトロブロッティング法によりニトロセルロース（ＮＣ）膜に転写した。このＮＣ膜に対し、５％スキムミルクを加えたトリス塩酸（ＴＢＳ）で室温、１時間ブロッキングした後、抗ｐ５３抗体Ｃ−ｔａｒｍｉｎａｌ  ａａ；１９５−３９３またはＦＬ３９３を５％スキムミルクを加えたＴＢＳで希釈して室温、１時間免疫反応させた。反応後のＮＣ膜を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで洗浄し、ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識抗ウサギＩｇＧ抗体を２次抗体として室温、１時間免疫反応させ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳで洗浄し、ＨＲＰ活性を検出することにより目的抗原を検出した。ＨＲＰ活性の検出にはＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いた（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２５，ｐ１５３１，１９７９）。
その結果、ウェスタンブロッティングによりｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞におけるｐ５３発現量が増加していることが確認された（図３）。
【実施例４】  本実施例は、ｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞におけるｐ５３のリン酸化部位を同定した。
抗ｐ５３抗体を用いたウェスタンブロッティングによりｐ５３のリン酸化部位の同定を行った。
すなわち、ｐ５３（配列番号１６）の異なるセリン残基のリン酸化を認識する４種の抗リン酸化ｐ５３モノクローナル抗体（Ｐ５３ｓｅｒ１５−Ｐ、Ｐ５３ｓｅｒ２０−Ｐ、Ｐ５３ｓｅｒ３７−ＰおよびＰ５３ｓｅｒ４６−Ｐ；Ｂｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）を用いて、ＭＥＦ細胞の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタンブロッティング法を行った。ウェスタンブロッティング法の操作は、一次抗体として抗リン酸化ｐ５３モノクローナル抗体を、そして標識抗体として抗マウスＩｇＧヒツジ−ＨＲＰを用いる他は実施例３に記載のとおりである。図４において、左上のパネルが第１５番目のセリン残基がリン酸化されたものである。５３ｋＤａ付近のバンドが顕著に濃く表れている。
その結果、ｓｙｎｏ−／−のＭＥＦ培養細胞において、ｐ５３のアミノ酸配列（配列番号１６）中、第１５番目のセリン残基のリン酸化が顕著であった（図４）。
【産業上の利用可能性】  本発明により、ｐ５３癌抑制遺伝子の活性を促進する物質が提供される。この物質は、ｐ５３を活性化してｐ５３を核に移行させることができるため、癌の治療用医薬組成物として有用である。また、本発明によりシノビオリンの機能を抑制することにより、癌の治療が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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