(57)【要約】  本開示は、高スループットＤＮＡアセンブリのインビトロ反応のための方法、組成物、及びキットを記載する。本開示はさらに、予め確認されたＣＲＩＳＰＲプロトスペーサ／プロトスペーサ隣接モチーフ配列組合せを含むクローニングタグセグメントが側面に位置するモジュラー挿入ＤＮＡ部分を含むモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを記載する。
2020507312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトであって、前記マルチクローン部位は：
ａ）少なくとも２つの互いに異なるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、それぞれが：
ｉ）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内で固有である、１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、ｃＴＡＧと；
ｂ）１つ以上のＤＮＡ挿入部分であって、
ｉ）前記互いに異なるｃＴＡＧのそれぞれが、前記１つ以上のＤＮＡ挿入部分のそれぞれの周りのフランキング位置内に分布している、１つ以上のＤＮＡ挿入部分
を含む、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項２】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、環状である、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項３】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、直鎖状である、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項４】
前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、生物のゲノム中に組み込まれる、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項５】
前記互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも１つが、少なくとも２つの確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項６】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ用である、請求項５に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項７】
前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ用である、請求項６に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項８】
前記互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも１つが、稀な（≧８塩基長）制限酵素部位を含む、請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト。
【請求項９】
組換え核酸分子を調製する方法であって：
ａ）： 
ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ＤＮＡ挿入部分の側面に、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が位置しており、各ｃＴＡＧが：
１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含む、１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分と；
ｉｉ）複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおいて存在する前記ｃＴＡＧの少なくとも１つを標的とする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が：
１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
２）前記標的とされるｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡ
を含む、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体と；
を含む混合物を、
前記複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける前記標的とされるｃＴＡＧの消化を可能にして、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる条件下で
インキュベートすることと、
ｂ）（ａ）において生じたｃＴＡＧが消化された前記ＤＮＡ挿入部分を、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることと；
を含み、結果として生じた組換え核酸分子は、前記方法においてライゲーションされる元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、方法。
【請求項１０】
前記消化されたＤＮＡ末端は、前記消化された末端の共有結合に先立って互いにハイブリダイズすることができる突出配列を有する付着末端である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記消化されたＤＮＡ末端は、平滑末端である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記平滑末端はさらに、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼで消化されて、突出配列を有する付着末端が生じ、工程ｂ）はさらに、前記消化された末端の共有結合に先立って前記突出配列にハイブリダイズすることができる架橋ＤＮＡ配列を加えることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項９、１２、又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法はさらに：
ｉ）工程ｂ）に先立って、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体から、前記消化されたｃＴＡＧ配列を分離する工程、又は
ｉｉ）工程ｂ）に先立って、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化する工程
を含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離工程は、ＤＮＡ精製工程を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記不活化工程は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱又は化学物質による不活化を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のＤＮＡ挿入部分のそれぞれの前記２つのｃＴＡＧは、ｃＴＡＧ対を形成し、前記ｃＴＡＧ対は、前記方法においてライゲーションされる前記ＤＮＡ挿入部分の他の全てのｃＴＡＧ対に対して固有である、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
各ｃＴＡＧ対における前記ｃＴＡＧの少なくとも１つが、異なるｃＴＡＧ対における少なくとも１つの他のｃＴＡＧと同じである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＤＮＡ配列編集方法であって、前記方法は：
ａ）用意することであって、
ｉ）請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；
ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；
１）前記第１の挿入ｃＴＡＧは、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの前記互いに異なるｃＴＡＧの１つの前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含み、そして前記第２の挿入ｃＴＡＧは、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの別の異なるｃＴＡＧの前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、置換ＤＮＡ挿入部分と；
ｉｉｉ）前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧをそれぞれ標的とする第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体と
を用意し、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が：
１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
２）前記標的とされる挿入ｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡ；
を含み、
部分（ｉ）及び（ｉｉ）がそれぞれ、部分（ｉｉｉ）と、単一又は別個の反応でインキュベートされ；前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧを切断して、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる、用意することと：
ｂ）前記置換ＤＮＡ挿入部分、及び工程（ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることと；を含み、結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、前記方法によって共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、ＤＮＡ配列編集方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）の前記反応は、機能的リガーゼを含む、請求項２０に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項２２】
前記方法はさらに：
ｉ）工程（ｂ）に先立って、前記切断された第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧを前記ＣＲＩＳＰＲ複合体から分離する工程、又は
ｉｉ）工程（ｂ）に先立って前記ＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化する工程
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記分離工程は、ＤＮＡ精製工程を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記不活化工程は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱又は化学物質による不活化を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記消化されたＤＮＡ末端は、前記消化された末端の共有結合に先立って互いにハイブリダイズすることができる突出配列を有する付着末端である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記消化されたＤＮＡ末端は、平滑末端である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記平滑末端はさらに、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼで消化されて、突出配列を有する付着末端が生じ、工程ｂ）はさらに、前記消化された末端の共有結合に先立って前記突出配列にハイブリダイズすることができる架橋ＤＮＡ配列を加えることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項２０、２７、又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＤＮＡ配列編集方法であって、前記方法は：
ａ）第１の反応用に：
ｉ）請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト：
ｉｉ）前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも１つをそれぞれ標的とする少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ複合体
を用意することであって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体は：
１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び
２）前記標的とされる互いに異なるｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡ；
を含み；
前記第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の前記標的とされる互いに異なるｃＴＡＧを切断することによって、消化されたｃＴＡＧを生じさせる、用意することと、
ｂ）第２の反応用に：
ｉ）工程（ａ）において生じたｃＴＡＧが消化された前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト；及び
ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置している、置換ＤＮＡ挿入部分；
を用意することであって、
１）前記第１の挿入ｃＴＡＧは、工程（ａ）において切断される前記未消化の互いに異なるｃＴＡＧの１つと同じ、又は実質的に同じである配列を含み、前記第２の挿入ｃＴＡＧは、工程（ａ）において切断される前記未消化の互いに異なるｃＴＡＧのもう１つと同じ、又は実質的に同じである配列を含む；用意することとを
部分（ｉ）の前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び部分（ｉｉ）の前記置換ＤＮＡ挿入部分の前記結合を可能にして、編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを形成させる条件下で行い；結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、工程（ａ）において標的とされる前記未消化の互いに異なるｃＴＡＧと同じ、又は実質的に同じである再構成されたｃＴＡＧを含む、方法。
【請求項３１】
工程（ｂ）の前記結合は、ライゲーションであり、前記置換ＤＮＡ挿入部分はまた、ライゲーションに先立って前記ＣＲＩＳＰＲ複合体によって消化される、請求項３０に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３２】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である、請求項３０に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３３】
工程（ｂ）の前記結合は、相同組換えである、請求項３０に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３４】
前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である、請求項３０又は３３に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３５】
前記第１及び第２の反応は、別々でない、請求項３０に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡ挿入部分は、前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって消化されない、請求項３３又は３５に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３７】
ｃＴＡＧが消化された前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び前記未消化の置換ＤＮＡ挿入部分は双方とも、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）エキソヌクレアーゼで消化されることによって、互いにハイブリダイズすることができる適合する突出ＤＮＡ末端を形成する、請求項３３又は３５に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３８】
前記第２の反応はさらに、前記適合する突出ＤＮＡ末端の共有結合に先立って、あらゆる配列ギャップ内でファイルすることができるポリメラーゼ又はリガーゼを含む、請求項３７に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項３９】
前記挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ消化を妨げるように化学的に修飾されている、請求項３６に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項４０】
前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧは、それらの確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位内に、突然変異したＰＡＭ又は突然変異したプロトスペーサを含む、請求項３６に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項４１】
ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを含む宿主細胞ゲノムであって、前記マルチクローン部位は：
ａ）少なくとも２つの互いに異なるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、各ｃＴＡＧは：
ｉ）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内で固有である、ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、ｃＴＡＧと；
ｂ）１つ以上のＤＮＡ挿入部分であって、
ｉ）前記互いに異なるｃＴＡＧのそれぞれが、前記１つ以上のＤＮＡ挿入部分のそれぞれの周りのフランキング位置内に分布している、１つ以上のＤＮＡ挿入部分
を含む宿主細胞ゲノム。
【請求項４２】
組換え核酸分子を調製する方法であって、
ａ）インキュベートすることであって、
ｉ）２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が側面に位置する複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ｃＴＡＧは：
１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含む、ＣＲＩＳＰＲランディング部位；及び
２）稀な（≧８塩基）制限酵素認識部位であって、少なくとも２つの挿入部分の前記ｃＴＡＧの少なくとも１つが、同じ制限酵素部位を含む稀な（≧８塩基）制限酵素認識部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分と；
ｉｉ）前記複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける前記稀な制限酵素部位を標的とする１つ以上の制限酵素と：
を含む混合物を；
前記複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける、前記１つ以上の制限酵素による前記標的とされるｃＴＡＧの消化を可能にして、ＤＮＡ末端が消化された挿入部分を生じさせる条件下でインキュベートすることと；
ｂ）工程（ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化された前記ＤＮＡ挿入部分を、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることであって、結果として生じた組換え核酸分子は、前記方法において共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、インキュベートすることを含む方法。
【請求項４３】
ＤＮＡ配列編集方法であって、
ａ）用意することであって、
ｉ）請求項１に記載のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトであって、前記互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも２つが、稀な（≧８塩基）制限酵素認識部位を含む、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；
ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；
１）前記第１の挿入ｃＴＡＧは、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの前記互いに異なるｃＴＡＧの１つの前記稀な制限酵素認識部位を含み、そして前記第２の挿入ｃＴＡＧは、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの別の異なるｃＴＡＧの前記稀な制限酵素認識部位を含む、置換ＤＮＡ挿入部分と；
ｉｉｉ）前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ内の前記稀な制限酵素部位を標的とする１つ以上の制限酵素と
を用意し；
部分（ｉ）及び（ｉｉ）がそれぞれ、部分（ｉｉｉ）と、単一又は別個の反応でインキュベートされ；前記１つ以上の制限酵素は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧの前記稀な制限酵素認識部位を切断して、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる、用意することと：
ｂ）前記置換ＤＮＡ挿入部分、及び工程（ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化された前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを、前記消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることであって、結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、前記方法によって共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む、インキュベートすることを含むＤＮＡ配列編集方法。
【請求項４４】
前記第１及び第２の挿入ｃＴＡＧは、同じ稀な制限酵素部位を含む、請求項４３に記載のＤＮＡ配列編集方法。
【請求項４５】
組換え核酸分子を調製する方法であって、
ａ）インキュベートすることであって、
ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ＤＮＡ挿入部分は、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が側面に位置しており、各ｃＴＡＧは：
１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記ＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つが、同じｃＴＡＧを共有する、ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分；
ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）エキソヌクレアーゼ：
を含む混合物を；
前記少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分における前記共有されるｃＴＡＧの消化を可能にすることによって、前記少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分内に適合する突出ＤＮＡ末端を生じさせる条件下でインキュベートすることと、
ｂ）（ａ）において生じたｃＴＡＧが消化された前記ＤＮＡ挿入部分を、前記少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分の前記適合する突出ＤＮＡ末端のハイブリダイゼーション及び共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることであって、結果として生じた組換え核酸分子は、消化前の前記共有されるｃＴＡＧの完全なｃＴＡＧ配列を含む、インキュベートすることを含む組換え核酸分子を調製する方法。
【請求項４６】
工程（ａ）における前記混合物はさらに、前記適合する突出ＤＮＡ末端の共有結合に先立って、あらゆる配列ギャップ内でファイルすることができるポリメラーゼを含む、請求項４５に記載の組換え核酸分子を調製する方法。
【請求項４７】
前記複数のＤＮＡ挿入部分は、工程（ａ）の前に、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）エキソヌクレアーゼで消化される、請求項４５に記載の組換え核酸分子を調製する方法。
【請求項４８】
前記複数のＤＮＡ挿入部分の１つ以上が、工程（ａ）におけるインキュベーションに先立ってＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼで切断された、請求項４５に記載の組換え核酸分子を調製する方法。
【請求項４９】
前記ｃＴＡＧの１つ以上が、配列番号６５〜７４、７８〜８１、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の挿入部分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、２０１７年２月１０日出願の米国仮特許出願第６２／４５７，４９３号の優先権の利益を主張する。この出願は、全ての目的について、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
分野
[0002]  本開示は、インビトロ誘導性遺伝子配列編集に用いられる系、方法、及び組成物に関する。本開示は、とりわけ、ＤＮＡクローニング、オリゴヌクレオチドのアセンブリの向上のための、そして微生物の向上のための誘導性配列複合体編集を用いる方法を記載する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0003]  本出願と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取り可能なフォーマットコピー（ファイル名：ZYMR_010_01WO_SeqList_ST25.txt、記録日：２０１８年１月３０日；ファイルサイズ：ほぼ８００キロバイト）。
【０００４】
政府ライセンス権
[0004]  本発明は、ＤＡＲＰＡによる、契約第HR0011-15-9-0014号の政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
背景
[0005]  生物学における主要な関心領域は、遺伝子配列のインビトロでの、そしてインビボでの標的修飾である。実際に、学術的な、そして商業的な遺伝的研究の最も大きな障壁の１つは、新規の遺伝的コンストラクトが、試験に先立って生成され得、又は後に修飾され得る速度であった。
【０００６】
[0006]  制限部位認識又はＤＮＡのハイブリダイゼーション及び増幅に頼る現在利用可能なクローニング技術は、後の修飾にとって、遅く、信頼できず、且つ扱いにくいことが判明した。クラスター化した規則的な配置の短い回文配列反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats（ＣＲＩＳＰＲ））遺伝子編集系の発見は、研究者に、遺伝的修飾の更なるアベニューを提供した。しかしながら、この新しいアプローチさえ、高スループットモジュラークローニング用途にとって、非実用的なままである。
【０００７】
[0007]  ＣＲＩＳＰＲ編集位置は、例えば、多くの場合、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置によって制限される。新規のＣＲＩＳＰＲ誘導ＲＮＡ設計及び遺伝子ターゲティングは、時間がかかって高価となり得、そしてまた低い効率の影響を受け易く、且つオフターゲット突然変異の可能性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
[0008]  ゆえに、遺伝子配列の標的変更のための組成物及び方法の向上が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
開示の概要
[0009]  一部の実施形態において、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを利用する、高スループットＤＮＡアセンブリのインビボ及びインビトロ反応のための方法、組成物、及びキットを教示する。
【００１０】
[0010]  ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、予め確認されたＣＲＩＳＰＲプロトスペーサ／プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列組合せを含むクローニングタグセグメントが側面に位置するモジュラー挿入ＤＮＡ部分を含むＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示する。一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することを教示する。一部の実施形態において、本開示は、ＩＩ型−クラス２  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）でＤＮＡを消化することを教示する。一部の実施形態において、本開示は、Ｖ型−クラス２  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼでＤＮＡを消化することを教示する。一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡをＣｐｆ１エンドヌクレアーゼで消化することを教示する。
【００１１】
[0011]  一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記マルチクローン部位は：ａ）少なくとも２つの互いに異なるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、各ｃＴＡＧが：ｉ）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内で固有である、１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、ｃＴＡＧと；ｂ）１つ以上のＤＮＡ挿入配列とを含み；ｉ）前記ｃＴＡＧのそれぞれが、１つ以上のＤＮＡ挿入配列のそれぞれの周りのフランキング位置内に分布しており；且つｉｉ）前記ＤＮＡ挿入配列の少なくとも１つが、選択マーカーを含む。
【００１２】
[0012]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、環状である。
【００１３】
[0013]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、直鎖状である。
【００１４】
[0014]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、生物のゲノム中に組み込まれる。
【００１５】
[0015]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも１つが、少なくとも２つの確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。
【００１６】
[0016]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、ＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ用である。
【００１７】
[0017]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、ＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ用である。
【００１８】
[0018]  一部の実施形態において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示し、前記互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも１つが、稀な（≧８塩基長）制限酵素部位を含む。
【００１９】
[0019]  一部の態様において、本開示は、組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを「ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ」コンストラクトと呼ぶ。
【００２０】
[0020]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、前記方法は：ａ）：ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ＤＮＡ挿入部分の側面に、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が位置しており、各ｃＴＡＧが：１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含む、１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分と；ｉｉ）複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおいて存在する前記ｃＴＡＧの少なくとも１つを標的とする１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体が；１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び２）前記標的とされるｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡを含む、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ複合体とを含む混合物を形成することであって；前記混合物は、複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける標的とされるｃＴＡＧの消化を可能にして、突出末端を生じさせる条件下でインキュベートされる、混合物を形成することと、ｂ）（ａ）において生じた消化生成物を、適合する突出末端のハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズされた末端の共有結合を可能にする条件でインキュベートすることと；を含み、結果として生じた組換え核酸分子は、前記方法においてライゲーションされる元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００２１】
[0021]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。
【００２２】
[0022]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００２３】
[0023]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、前記方法は：ｉ）ライゲーションに先立って、ＣＲＩＳＰＲ複合体から、消化されたｃＴＡＧ配列を分離する工程、又はｉｉ）ライゲーションに先立って、ＣＲＩＳＰＲ複合体を不活化する工程を含む。
【００２４】
[0024]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、分離工程は、ＤＮＡ精製工程を含む。
【００２５】
[0025]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、不活化工程は、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体の熱又は化学物質による不活化を含む。
【００２６】
[0026]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、複数のＤＮＡ挿入部分のそれぞれの２つのｃＴＡＧは、ｃＴＡＧ対を形成し、前記ｃＴＡＧ対は、前記方法においてライゲーションされるＤＮＡ挿入部分の他の全てのｃＴＡＧ対に対して固有である。
【００２７】
[0027]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を教示し、各ｃＴＡＧ対におけるｃＴＡＧの少なくとも１つが、異なるｃＴＡＧ対における少なくとも１つの他のｃＴＡＧと同じである。
【００２８】
[0028]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、前記方法は：ａ）反応に：ｉ）本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと：ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；１）第１の挿入ｃＴＡＧは、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの互いに異なるｃＴＡＧの１つの確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含み、第２の挿入ｃＴＡＧは、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの別の互いに異なるｃＴＡＧの確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、置換ＤＮＡ挿入部分と；ｉｉｉ）第１及び第２の挿入ｃＴＡＧをそれぞれ標的とする第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体とを導入することであって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体は：１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び２）前記標的とされる挿入ｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡを含み；第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧを切断して、突出末端を生じさせる、導入することと、ｂ）置換ＤＮＡ挿入部分及びｃＴＡＧが消化された生じたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを：（ａ）適合する突出末端のハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズされた末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることとを含み；結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、当該方法によってライゲーションされる元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００２９】
[0029]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、工程（ｂ）の反応は、機能的リガーゼを含む。
【００３０】
[0030]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、前記方法は：ａ）反応に：ｉ）本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；ｉｉ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の２つの互いに異なるｃＴＡＧを標的とする少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ複合体であって、各ＣＲＩＳＰＲ複合体は；１）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ、及び２）前記標的とされる互いに異なるｃＴＡＧの１つに前記ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを動員することができるガイドＲＮＡを含み；第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の２つの互いに異なるｃＴＡＧを切断し、結果として生じた互いに異なるｃＴＡＧは、突出末端を含む、少なくとも２つのＣＲＩＳＰＲ複合体とを導入することと、ｂ）第２の反応に：ｉ）（ａ）においてｃＴＡＧが消化された生じたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；１）第１の挿入ｃＴＡＧは、（ａ）において切断される、未消化の互いに異なるｃＴＡＧの１つのポリヌクレオチド配列を含み、そして第２の挿入ｃＴＡＧは、（ａ）において切断される別の未消化の異なるｃＴＡＧのポリヌクレオチド配列を含み；そして２）第１及び第２の挿入ｃＴＡＧは、（ａ）由来の互いに異なるｃＴＡＧの突出末端と適合する突出末端を含む、置換ＤＮＡ挿入部分とを；適合する突出末端のハイブリダイゼーション、及びハイブリダイズされた末端の共有結合を可能にする条件下で導入することとを含み；結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、（ａ）において標的とされる元の未消化の互いに異なるｃＴＡＧの完全な配列を含む。
【００３１】
[0031]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、工程（ｂ）の反応は、機能的リガーゼを含む。
【００３２】
[0032]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。
【００３３】
[0033]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、工程（ａ）はさらに、２つの切断された互いに異なるｃＴＡＧを一本鎖エキソヌクレアーゼで消化することによって、突出末端を有する互いに異なるｃＴＡＧを生成することを含む。一部の態様において、エキソヌクレアーゼ工程後に、リガーゼ及びポリメラーゼを加えて、ポリメラーゼ及びリガーゼにより接合部を修復することができる。一部の態様において、当該反応はまた、Ｃａｓ９消化による平滑末端切断によりなされてもよい。
【００３４】
[0034]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を教示し、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。
【００３５】
[0035]  一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲマルチクローン部位を含む組換えモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを含む宿主細胞ゲノムを提供し、前記マルチクローン部位は：ａ）少なくとも２つの互いに異なるクローニングタグ（ｃＴＡＧ）であって、各ｃＴＡＧは：ｉ）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；前記確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位の少なくとも１つが、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内で固有である、ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、ｃＴＡＧと；ｂ）１つ以上のＤＮＡ挿入部分とを含み；ｉ）前記互いに異なるｃＴＡＧのそれぞれが、１つ以上のＤＮＡ挿入部分のそれぞれの周りのフランキング位置内に分布している。
【００３６】
[0036]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を提供し、前記方法は：ａ）ｉ）２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が側面に位置する複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ｃＴＡＧは：１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含む、ＣＲＩＳＰＲランディング部位；及び２）稀な（≧８塩基）制限酵素認識部位を含み；少なくとも２つの挿入部分のｃＴＡＧの少なくとも１つが、同じ制限酵素部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分と；ｉｉ）複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける稀な制限酵素部位を標的とする１つ以上の制限酵素と：を含む混合物を；複数のＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つにおける、１つ以上の制限酵素による標的とされるｃＴＡＧの消化を可能にして、ＤＮＡ末端が消化された挿入部分を生じさせる条件下でインキュベートすることと；ｂ）工程（ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化されたＤＮＡ挿入部分を、消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることとを含み；結果として生じた組換え核酸分子は、前記方法において共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００３７】
[0037]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ配列編集方法を提供し、前記方法は：ａ）ｉ）請求項１のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトであって、互いに異なるｃＴＡＧの少なくとも２つが、稀な（≧８塩基）制限酵素認識部位を含む、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトと；ｉｉ）置換ＤＮＡ挿入部分であって、前記置換ＤＮＡ挿入部分は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧが側面に位置しており；１）第１の挿入ｃＴＡＧは、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの互いに異なるｃＴＡＧの１つの稀な制限酵素認識部位を含み、そして第２の挿入ｃＴＡＧは、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの別の異なるｃＴＡＧの稀な制限酵素認識部位を含む、置換ＤＮＡ挿入部分と；ｉｉｉ）第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ内の稀な制限酵素部位を標的とする１つ以上の制限酵素とを用意することであって；部分（ｉ）及び（ｉｉ）がそれぞれ、部分（ｉｉｉ）と、単一又は別個の反応でインキュベートされ；１つ以上の制限酵素は、第１及び第２の挿入ｃＴＡＧ、並びにそれらの対応する互いに異なるｃＴＡＧの稀な制限酵素認識部位を切断して、消化されたＤＮＡ末端を生じさせる、用意することと：ｂ）置換ＤＮＡ挿入部分、及び工程（ａ）において生じたＤＮＡ末端が消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを、消化されたＤＮＡ末端の共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることとを含み；結果として生じた編集されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、前記方法によって共有結合される元の挿入部分の完全なｃＴＡＧ配列を含む。
【００３８】
[0038]  一部の実施形態において、本開示は、組換え核酸分子を調製する方法を提供し、前記方法は：ａ）ｉ）複数のＤＮＡ挿入部分であって、各ＤＮＡ挿入部分は、２つのクローニングタグ（ｃＴＡＧ）が側面に位置しており、各ｃＴＡＧは：１）１つ以上の確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位であって、それぞれ、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に作動可能に連結されたプロトスペーサ配列を含み；ＤＮＡ挿入部分の少なくとも２つが、同じｃＴＡＧを共有する、ＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む、複数のＤＮＡ挿入部分；ｉｉ）一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）エキソヌクレアーゼ：を含む混合物を；少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分における共有されるｃＴＡＧの消化を可能にすることによって、少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分内に適合する突出ＤＮＡ末端を生じさせる条件下でインキュベートすることと、ｂ）（ａ）において生じたｃＴＡＧが消化されたＤＮＡ挿入部分を、少なくとも２つのＤＮＡ挿入部分の適合する突出ＤＮＡ末端のハイブリダイゼーション及び共有結合を可能にする条件下でインキュベートすることとを含み；結果として生じた組換え核酸分子は、消化前の共有されるｃＴＡＧの完全なｃＴＡＧ配列を含む。この反応は、ポリメラーゼで行われてもリガーゼで行われてもよく、これらは接合部を固定するのに用いられる。さらにこれは、予め消化されたベクターに実行され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
図面の簡単な説明
【図１Ａ−Ｂ】[0039]図１Ａ−Ｃは、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の比較を示す。図１Ａ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ複合体によってｄｓＤＮＡを標的とするように動員される。図１Ｂ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはまた、単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として知られている人工的に融合されたｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びｃｒＲＮＡ配列によってｄｓＤＮＡを標的とするように動員され得る。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、平滑末端を生じさせる。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の比較を示す。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡガイドポリリボヌクレオチドしか必要としない。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ切断は、５’突出部を有する二本鎖切断を生じさせる。
【図２Ａ】[0040]図２Ａ−Ｃは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。図２Ａは、本開示に従って、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ヌクレアーゼで容易に変更され得るモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドを図解する。前述のように、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、「ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ」コンストラクトと呼ばれ得る。数字によって表される互換可能なｐａｒｔ（部分）は、文字によって表される不変のｃＴＡＧ配列が側面に位置する。ｐａｒｔは、予めアセンブルされてあってもよいし、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてインビトロでアセンブルされてもよい。例となる挿入ｐａｒｔを、図２Ａの右側に示す。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ｂは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。いくつかの戦略、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、又は制限酵素によるｃＴＡＧでの切断を用いて、プラスミド全体を再びアセンブルする必要なく個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、以下に限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、制限、及び／又は組換え部位が挙げられる１つ以上のクローニング部位を含んでよい。図２Ｃは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。生物のゲノム中に組み込まれると、ｃＴＡＧは、予め確認された直交するｇＲＮＡ配列を有する、ゲノム組み込まれたＤＮＡの置換、挿入、又は除去を可能とする予め確認されたＣａｓ９ランディング部位又はＣｐｆ１ランディング部位として機能し続け得る。
【図３Ａ】[0041]図３Ａ−Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。図３Ａは、本開示に従って、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ヌクレアーゼで容易に変更され得るモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドを図解する。数字によって表される互換可能なｐａｒｔは、文字によって表される不変のｃＴＡＧ配列が側面に位置する。ｐａｒｔは、予めアセンブルされてあってもよいし、ｃＴＡＧ配列同一性に基づいてインビボ又はインビトロでアセンブルされてもよい。例となる挿入ｐａｒｔを、図３Ａの右側に示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。いくつかの戦略、例えばＣａｓ９、Ｃｐｆ１、又は制限酵素によるｃＴＡＧでの切断を用いて、プラスミド全体を再びアセンブルする必要なく個々の部分を置換することができる。ｃＴＡＧ配列は、以下に限定されないが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、制限、及び／又は組換え部位が挙げられる１つ以上のクローニング部位を含んでよい。
【図３Ｃ】[0041]図３Ｃは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。図３Ｃは、挿入部分を除去する、又は既存のモジュラープラスミドからスタッファ配列を加える本開示の方法を示す。
【図３Ｄ】[0041]図３Ｄは、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを利用する本クローニング方法の実施形態を示す。本開示のモジュラープラスミドの挿入部分は、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの一部又は全体の、宿主細胞のゲノム中へのゲノム組み込み用の配列として機能し得る。
【図４】[099]図４は、実施例１のワンポットインビトロモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニングを示す。具体的には、あるプラスミドから別のものへのワンポット反応での挿入物の移入によるプラスミド１３００１００９０８６の生成を示す。この反応の詳細を、実施例１で明らかにする。
【図５】[0042]図５は、実施例２のインビトロモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング方法の実施形態を示す。各パネルは、実施例２に記載する実験設計の実例を示す。クロラムフェニコール耐性遺伝子を、カナマイシン耐性骨格プラスミド中にクローニングして、デュアル耐性プラスミドを生じさせた。次に、デュアル耐性プラスミドを細菌に形質転換してから、カナマイシン及びクロラムフェニコール抗生物質を補った培地中で当該細菌を培養した。耐性コロニーは、Ｃｐｆ１クローニングアセンブリの成功を示した。
【図６】[0043]図６は、実施例２のインビトロモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング方法の結果を示す。ｙ軸は、カナマイシン及びクロラムフェニコールを補った培地中で増殖した、回収したコロニーの数を表す。耐性コロニーは、Ｃｐｆ１クローニングアセンブリの成功を示す。結果は、デュアル耐性プラスミドのリガーゼ依存性アセンブリを示した。
【図７】[0044]図７は、ｐＪＤＩ４２７のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｍ及びｃＴＡＧ  Ｎとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０２に見出すことができる。
【図８】[0045]図８は、ｐＪＤＩ４２９のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｎ及びｃＴＡＧ  Ｏとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０３に見出すことができる。
【図９】[0046]図９は、ｐＪＤＩ４３０のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｐ及びｃＴＡＧ  Ｎとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０４に見出すことができる。
【図１０】[0047]図１０は、ｐＪＤＩ４３１のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｐ及びｃＴＡＧ  Ｏとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０５に見出すことができる。
【図１１】[0048]図１１は、ｐＪＤＩ４３２のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｍ及びｃＴＡＧ  Ｎとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０６に見出すことができる。
【図１２】[0049]図１２は、ｐＪＤＩ４３４のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１Ｃアセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｎ及びｃＴＡＧ  Ｏとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０７に見出すことができる。
【図１３】[0050]図１３は、ｐＪＤＩ４３５のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｐ及びｃＴＡＧ  Ｎとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０８に見出すことができる。
【図１４】[0051]図１４は、ｐＪＤＩ４３６のベクターマップを示す。Ｃｐｆ１アセンブリに用いたＣＲＩＳＰＲランディング部位を、ｃＴＡＧ  Ｐ及びｃＴＡＧ  Ｏとしてラベル付けしている。関連する配列情報は、配列番号１０９に見出すことができる。
【図１５】[0052]図１５は、本開示の方法に従う、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトの例となる遺伝子編集を示す。具体的には、図１５は、実施例３のｍｅｇａｍｏｄｕｌａｒ設計を用いる制限酵素消化及びライゲーションによるプラスミドアセンブリを示す。図１５は、モジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミド骨格ｐ１３００２８３３９１及び適合するＧＦＰ含有挿入ＤＮＡ部分を、ＡｐａＩ及びＰｖｕＩ制限酵素でそれぞれ消化して、適合するクローニングタグ末端が生じることを示す。消化した骨格及び挿入物を、インビトロでライゲーションして、新しいモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトが生じる。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
定義
[0053]  以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本開示の主題の説明を容易にするために示される。
【００４１】
[0054]  用語「ａ」又は「ａｎ」は、その実体の１つ以上を指す、すなわち、複数の指示対象を指し得る。したがって、用語「ａ」又は「ａｎ」、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中で互換的に用いられる。加えて、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による「要素」への言及は、要素の１つが存在すること、そして要素の１つしか存在しないことを文脈が明らかに要求しない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
【００４２】
[0055]  用語「原核生物」は、当該技術で認識されており、核を含有しない細胞を指す。原核生物は通常、２つのドメイン、細菌（Bacteria）及び古細菌（Archaea）の１つに分類される。古細菌ドメインと細菌ドメインの決定的な生物間差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の根本的差異に基づく。
【００４３】
[0056]  「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核及び他の細胞小器官を含有するあらゆる生物である。真核生物は、分類群真核生物（Eukarya又はEukaryota）に属する。原核生物細胞（上述の細菌及び古細菌）とは別に真核細胞を設定する顕著な特徴は、真核細胞が、膜結合細胞小器官、とりわけ核を有することであり、核は、遺伝的材料を含有し、且つ核エンベロープによって囲まれている。
【００４４】
[0057]  用語「古細菌」は、メンドシクテス（Mendosicutes）門の生物のカテゴリ化を指し、これは典型的に、特殊な環境において見出され、且ついくつかの基準（リボソームタンパク質の数、及び細胞壁中のムラミン酸の欠乏が挙げられる）によって残りの原核生物から区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に異なる群：クレン古細菌（Crenarchaeota）及びユーリ古細菌（Euryarchaeota）からなる。その生理学に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを生成する原核生物）；極端な好塩菌（非常に高い塩（ＮａＣｌ）濃度にて生きる原核生物）；及び極端な（ハイパー）サーモフィルス（非常に高い温度にて生きる原核生物）に系統化され得る。細菌から識別される一体化した古細菌の特徴（すなわち、細胞壁中にムレインなし、エステル結合膜脂質その他）の他に、当該原核生物は、特定の生息地に適合する特有の構造的属性又は生化学的属性を示す。クレン古細菌は主に、超好熱性の硫黄依存性原核生物からなり、ユーリ古細菌は、メタン生成菌及び極端な好塩菌を含有する。
【００４５】
[0058]  「細菌」又は「真正細菌」は、原核生物のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の異なる群を含む：（１）グラム陽性（ｇｒａｍ＋）菌（２つの主要な亜門がある）：（１）高Ｇ＋Ｃ群（アクチノミセス（Actinomycetes）、マイコバクテリウム（Mycobacteria）、ミクロコッカス（Micrococcus）その他）；（２）低Ｇ＋Ｃ群（バチルス（Bacillus）、クロストリジウム（Clostridia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ブドウ球菌（Staphylococci）、連鎖球菌（Streptococci）、マイコプラズマ（Mycoplasmas））；（２）プロテオバクテリア（Proteobacteria）、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性菌（最も「一般的な」グラム陰性菌が挙げられる）；（３）シアノバクテリア、例えば酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータ及び近縁種；（５）プランクトミセス（Planctomyces）；（６）バクテロイデス（Bacteroides）、フラボバクテリア（Flavobacteria）；（７）クラミジア（Chlamydia）；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物）；（１０）放射線抵抗性の球状細菌及び近縁生物；（１１）サーモトーガ（Thermotoga）及びサーモシフォ・サーモフィルス（Thermosipho thermophiles）。
【００４６】
[0059]  用語「遺伝的に修飾された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、及び「組換え株」は、本明細書中で互換的に用いられており、本開示のクローニング方法及び形質転換方法によって遺伝的に修飾された宿主細胞を指す。ゆえに、当該用語は、由来した天然に存在する微生物と比較して、（例えば、遺伝的修飾が、微生物のコード核酸配列に影響を及ぼす場合に、）変更された、修飾された、又は異なる遺伝子型及び／又は表現型を示すように、遺伝的に変更され、修飾され、又は操作された宿主細胞（例えば、細菌、酵母細胞、真菌細胞、ＣＨＯ、ヒト細胞その他）を含む。当該用語は、問題の特定の組換え微生物だけでなく、そのような微生物の後代又は潜在的な後代をも指すことが理解される。
【００４７】
[0060]  用語「遺伝的に操作された」は、宿主細胞のゲノムのあらゆる操作（例えば、核酸の挿入又は欠失による）を指し得る。
【００４８】
[0061]  本明細書中で用いられる「選択マーカー」は、多くの場合、特定の条件下で、これを含有する分子（例えばレプリコン）又は細胞を選択させることができる核酸セグメントである。当該マーカーは、以下に限定されないが、ＲＮＡ、ペプチド、又はタンパク質の生成等の活性をコードすることもできるし、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、無機化合物又は無機組成物及び有機化合物又は有機組成物等のための結合部位を提供することもできる。選択マーカーの例として、限定されないが、以下が挙げられる：（１）普通であれば有毒な化合物に対して耐性をもたらす生成物（例えば抗生物質）をコードする核酸セグメント；（２）レシピエント細胞内で普通であれば欠如している生成物（例えば、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）をコードする核酸セグメント；（３）遺伝子生成物の活性を抑制する生成物をコードする核酸セグメント；（４）容易に同定され得る生成物（例えば、表現型マーカー、例えばβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、及び細胞表面タンパク質）をコードする核酸セグメント；（５）細胞の生存及び／又は機能に対して普通であれば有害である他の生成物に結合する生成物をコードする核酸セグメント；（６）核酸セグメントのいずれかの活性を別のやり方で阻害して、可視の、又は選択可能な表現型をもたらす核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）をコードする核酸セグメント；（７）基質を修飾する他の生成物（例えば制限酵素）に結合する生成物をコードする核酸セグメント；（８）所望の分子を単離又は同定するのに用いられ得る核酸セグメント（例えば特定のタンパク質結合部位）；（９）普通であれば機能し得ない特定のヌクレオチド配列を（例えば、分子の亜集団のＰＣＲ増幅用に）コードする核酸セグメント；並びに（１０）不在である場合に、特定の化合物に耐性又は感受性を直接的又は間接的に付与する核酸セグメント。
【００４９】
[0062]  本明細書中で用いられる「対抗選択マーカー」（counterselectable marker又はcounterselection marker）は、選択直後に宿主生物の成長を排除する、又は阻害する核酸セグメントである。一部の実施形態において、本開示の対抗選択マーカーは、細胞を、化学物質／増殖条件／遺伝的背景の１つ以上に対して感受性にさせる。一部の実施形態において、本開示の対抗選択マーカーは、毒性遺伝子である。一部の実施形態において、対抗選択マーカーは、誘導プロモータによって発現される。
【００５０】
[0063]  本明細書中で用いられる用語「核酸」は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形態（リボヌクレオチド若しくはデオキシリボヌクレオチド、又はその類似体）を指す。当該用語は、分子の一次構造を指すので、二本鎖ＤＮＡ及び一本鎖ＤＮＡ、並びに二本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＲＮＡを含む。また、修飾された核酸、例えばメチル化且つ／又はキャッピングされた核酸、修飾された塩基、骨格修飾等を含有する核酸も含む。用語「核酸」及び「ヌクレオチド配列」は、互換的に用いられる。
【００５１】
[0064]  本明細書中で用いられる用語「遺伝子」は、生体機能と関連するＤＮＡのあらゆるセグメントを指す。ゆえに、遺伝子は、以下に限定されないが、コード配列及び／又はその発現に必要とされる調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質のための認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含んでもよい。遺伝子は、注目のソースからのクローニング、又は知られている、若しくは予測される配列情報からの合成が挙げられる種々のソースから得られ得、所望のパラメータを有するように設計された配列を含んでよい。
【００５２】
[0065]  本明細書中で用いられる用語「相同」、「ホモログ」、又は「オルソログ」は、当該技術において知られており、そして、共通の祖先又はファミリーメンバーを共有し、且つ配列同一性の程度に基づいて決定される関連した配列を指す。用語「相同性」、「相同」、「実質的に類似」、及び「実質的に対応」は、本明細書中で互換的に用いられる。これらは、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介する、又は特定の表現型をもたらす核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない核酸フラグメントに言及する。当該用語はまた、最初の無修飾フラグメントに対する、結果として生じる核酸フラグメントの機能特性を実質的に変更しない１つ以上のヌクレオチドの欠失又は挿入等の、本開示の核酸フラグメントの修飾にも言及する。したがって、当業者が理解するように、本開示は、特定の例示的な配列を超えて包含することが理解される。当該用語は、１つの種、亜種、変種、品種、又は株に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、品種、又は株の対応する、又は相当する遺伝子との関係を説明する。本開示の目的上、相同配列同士が比較される。「相同配列」、「ホモログ」、又は「オルソログ」は、機能的に関連していると思われ、考えられ、又はそうであることが知られている。機能的関係は、限定されないが以下が挙げられるいくつかの方法のいずれか１つで示され得る：（ａ）配列同一性の程度、及び／又は（ｂ）同じ若しくは類似の生体機能。好ましくは、（ａ）及び（ｂ）の双方が示される。相同性は、当該技術において容易に入手可能なソフトウェアプログラムを用いて判定され得、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.718, Table 7.71において考察されるものがある。一部のアラインメントプログラムは、MacVector（Oxford Molecular Ltd, Oxford, U.K.）、ALIGN Plus（Scientific and Educational Software, Pennsylvania）、及びAlignX（Vector NTI, Invitrogen, Carlsbad, CA）である。別のアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを用いるSequencher（Gene Codes, Ann Arbor, Michigan）である。
【００５３】
[0066]  本明細書中で用いられる用語「ヌクレオチド変化」は、例えば、当該技術において十分に理解されるように、ヌクレオチド置換、欠失、及び／又は挿入を指す。例えば、突然変異は、サイレント置換、付加、又は欠失をもたらす変更を含有するが、コードされるタンパク質の特性若しくは活性、又はタンパク質が形成される方法を変更しない。
【００５４】
[0067]  本明細書中で用いられる用語「タンパク質修飾」は、例えば、当該技術において十分に理解されるように、アミノ酸置換、アミノ酸修飾、欠失、及び／又は挿入を指す。
【００５５】
[0068]  本明細書中で用いられる、核酸又はポリペプチドの用語「少なくとも一部」又は「フラグメント」は、そのような配列の最小のサイズ特性を有する部分、又は完全長分子のより大きなあらゆるフラグメント（最大、完全長分子を含む）を意味する。本開示のポリヌクレオチドのフラグメントは、遺伝的調節要素の生物学的に活性な部分をコードし得る。遺伝的調節要素の生物学的に活性な部分は、本明細書中で記載されるように、遺伝的調節要素を含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離して、活性を評価することによって、調製され得る。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸等であってよく、最大で完全長のポリペプチドに至ってよい。用いられることとなる部分の長さは、特定の用途によって決まることとなる。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドの短さであってもよい；一部の実施形態において、これは２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸の短さであってもよい。全長ポリペプチドの機能を実行するポリペプチドの部分は通常、４アミノ酸よりも長くなるであろう。
【００５６】
[0069]  本明細書中で開示されるポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーが、注目のあらゆる生物から抽出されたｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ由来の対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応に用いられるように設計され得る。ＰＣＲプライマーを設計する方法及びＰＣＲクローニング方法が、当該技術において通常知られており、Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)に開示されている。また、Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, New York)；Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York)；及びInnis and Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York)も参照。ＰＣＲの既知の方法として、以下に限定されないが、対形成されたプライマー、ネステッドプライマー、単一の特異的なプライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分的にミスマッチされるプライマー等を用いる方法が挙げられる。
【００５７】
[0070]  本明細書中で用いられる用語「プライマー」は、増幅標的にアニールして、ＤＮＡポリメラーゼを付着させることによって、プライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下、すなわち、重合のためのヌクレオチド及び剤、例えばＤＮＡポリメラーゼの存在下、そして適切な温度及びｐＨに置かれたときに、ＤＮＡ合成の開始点として機能することができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは好ましくは、増幅の効率を最大にするために、一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための剤の存在下で、伸長生成物の合成を開始させるほど十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度及びプライマーの組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含量）が挙げられる多く因子によって決まることとなる。ＰＣＲ増幅等のＤＮＡ増幅の当該技術において一般的に用いられるように、一対の双方向プライマーが、１つのフォワードプライマー及び１つのリバースプライマーからなる。
【００５８】
[0071]  用語「ストリンジェンシー」又は「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度等を指す。これらの条件は、プライマー又はプローブの、その標的核酸配列への特異的結合を最大にし、且つ非特異的結合を最小にするように、実験に基づいて最適化される。使用される用語は、プローブ又はプライマーが、その標的配列に、他の配列よりも検出可能となるように（例えばバックグラウンドに対して少なくとも２倍）ハイブリダイズすることとなる条件への言及を含む。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、状況が違えば異なることとなる。配列が長くなるほど、より高い温度にて特異的にハイブリダイズする。通常、ストリンジェント条件は、定義されたイオン強度及びｐＨにて、特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が、完全にマッチするプローブ又はプライマーにハイブリダイズする（定義されたイオン強度及びｐＨ下の）温度である。典型的には、ストリンジェント条件は、ｐＨ７．０〜８．３にて、塩濃度が約１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍ  Ｎａ＋イオン濃度（又は他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ又はプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃であり、長いプローブ又はプライマー（例えば５０ヌクレオチド超）について少なくとも約６０℃である。ストリンジェント条件はまた、ホルムアミド等の脱安定化剤（destabilizing agent）の付加により達成されてもよい。例示的な低ストリンジェント条件又は「ストリンジェンシー引下げ条件」として、３０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファ溶液による３７℃でのハイブリダイゼーション、及び２×ＳＳＣ中での４０℃での洗浄が挙げられる。例示的な高ストリンジェンシー条件として、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中での３７℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ中での６０℃での洗浄が挙げられる。ハイブリダイゼーション手順は、当該技術において周知であり、例えばAusubel et al., 1998及びSambrook et al., 2001に記載されている。一部の実施形態において、ストリンジェント条件は、１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％ドデシル硫酸ナトリウム（例えば、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％）を含有する０．２５Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４バッファ（ｐＨ７．２）中での４５℃でのハイブリダイゼーションに続く、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣ中での５５℃〜６５℃での洗浄である。
【００５９】
[0072]  本明細書中で用いられる用語「実質的に同じ」は、１、２、３、４、５、６、又は７以下のヌクレオチドが異なる２つのポリヌクレオチド配列を指す。ｃＴＡＧの文脈で用いられる場合、用語「実質的に同じ」は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲランディング部位においてＣＲＩＳＰＲ切断を排除するように設計されたｃＴＡＧの１つのＰＡＭ又はプロトスペーサ領域中の突然変異を除いて、同じであろう２つのｃＴＡＧを表す。用語「実質的に同じ」が、用語「部分的な」配列又はｃＴＡＧと共に用いられる場合、当該組合せは、先に述べたような、２つの実質的に同じｃＴＡＧ間の比較を指し、ここでｃＴＡＧの１つは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによって消化されている。ゆえに、当該用語は、ＰＡＭ又はプロトスペーサ領域内の突然変異を除いて、記載されているｃＴＡＧが、第２のｃＴＡＧと（その未消化の形態で）同じであることを示すのに用いられることとなる。
【００６０】
[0073]  本明細書中で用いられる用語「プロモータ」は、コード配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモータ配列は、近位の上流要素及びより遠位の上流要素からなり得、後者の要素は多くの場合、エンハンサと呼ばれる。したがって、「エンハンサ」は、プロモータ活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモータの固有の要素であっても、プロモータのレベル又は組織特異性を増強するために挿入された異種要素であってもよい。
【００６１】
[0074]  本明細書中で用いられる用語「異種」は、特定の生物において天然に見出されない核酸配列を指す。
【００６２】
[0075]  本明細書中で用いられる用語「内因性」、「内因性遺伝子」は、遺伝子の天然に存在するコピーを指す。
【００６３】
[0076]  本明細書中で用いられる用語「天然に存在する」は、天然に存在するソースに由来する遺伝子又は配列を指す。一部の実施形態において、天然に存在する遺伝子は、野生型遺伝子（非導入遺伝子）を指し、ソース生物内でのその内因性セッティング（endogenous setting）内に位置決めされているかも、異なる生物中に導入された場合に「異種」セッティング内に配置されるかも問わない。ゆえに、本開示の目的上、「天然に存在しない」配列は、合成された、突然変異させた、又はそれ以外では、既知の天然の配列とは異なる配列を有するように修飾された配列である。一部の実施形態において、修飾は、タンパク質レベルのもの（例えばアミノ酸置換）であってよい。他の実施形態において、修飾は、タンパク質配列に何ら影響を及ぼさないＤＮＡレベルのもの（例えばコドン最適化）であってよい。一部の実施形態において、天然に存在しない配列は、コンストラクトであってよい。
【００６４】
[0077]  本明細書中で用いられる用語「外因性」は、用語「異種」と互換的に用いられており、その天然のソース以外のいくつかのソースに由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」又は「外因性遺伝子」は、非天然のソース又は位置由来の、生体系に人工的に供給されたタンパク質又は遺伝子を指す。内因性の遺伝子の、人工的に突然変異させた変異体は、本開示の目的上、「外因性」とみなす。
【００６５】
[0078]  本明細書中で用いられるフレーズ「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、及び「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書中で互換的に用いられる。組換えコンストラクトは、核酸フラグメントの人工的な組合せ、例えば、自然界で一緒に見出されない調節配列及びコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なるソースに由来する調節配列及びコード配列を含んでもよいし、同じソースに由来するが、自然界で見出されるものとは異なる様式で配置される調節配列及びコード配列を含んでもよい。そのようなコンストラクトは、それ自体で用いられてもよいし、ベクターと共に用いられてもよい。ベクターが用いられるならば、ベクターの選択は、当業者にとって周知の、宿主細胞を形質転換するのに用いられることとなる方法次第である。例えば、プラスミドベクターが用いられ得る。当業者であれば、本開示の単離された核酸フラグメントのいずれかを含む宿主細胞を首尾よく形質転換し、選択し、且つ増殖させるのに、ベクター上に存在しなければならない遺伝的要素を十分知っている。また、当業者であれば、独立した様々な形質転換事象が、発現の様々なレベル及びパターンをもたらすこととなること（Jones et al., (1985) EMBO J. 4:2411-2418；De Almeida et al., (1989) Mol. Gen. Genetics 218:78-86）、ゆえに複数の事象が、所望の発現レベル及びパターンを提示する系統を得るのにスクリーニングされなければならないことを認識するであろう。そのようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、又は表現型分析によって達成され得る。ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体等であってよく、これらは自律的に複製し、又は宿主細胞の染色体中に組み込むことができる。ベクターはまた、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡ及びＲＮＡの双方で構成されるポリヌクレオチド、ポリ−リジン結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、ペプチド結合ＤＮＡ又はＲＮＡ、リポソーム結合ＤＮＡ等であってもよく、これらは自律的に複製しない。本明細書中で用いられる用語「発現」は、機能的最終生成物、例えば、ｍＲＮＡ又はタンパク質（前駆体又は成熟）の生成を指す。
【００６６】
[0079]  用語「作動可能に連結された」は、文脈において、本開示に従うプロモータポリヌクレオチドの、更なるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドとの、前記更なるポリヌクレオチドの転写をもたらす連続的な配置を意味する。一部の実施形態において、本開示のプロモータ配列は、遺伝子の５’ＵＴＲ、又はオープンリーディングフレームの直前に挿入される。他の実施形態において、本開示の作動可能に連結されたプロモータ配列及び遺伝子配列は、１つ以上のリンカーヌクレオチドによって分離されている。ＣＲＩＳＰＲプロトスペーサ及びプロスペーサ（prospacer）隣接モチーフ（ＰＡＭ）の文脈における用語「作動可能に連結された」は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ複合体によって高い効率にて切断され得る、近接して配置されたプロトスペーサ／ＰＡＭ組合せ配列を指す。
【００６７】
[0080]  用語「ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」は、標的ＤＮＡ配列とのハイブリダイズ、及びＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの動員を担うＲＮＡ鎖を指す。ｃｒＲＮＡは、天然に存在し得、又はＲＮＡを生成する既知のあらゆる方法に従って合成され得る。
【００６８】
[0081]  用語「ガイド配列」又は「スペーサ」は、標的ＤＮＡとのハイブリダイズを担うｃｒＲＮＡ又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の部分を指す。
【００６９】
[0082]  用語「プロトスペーサ」は、ｃｒＲＮＡ又はガイド鎖によって標的とされるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態において、プロトスペーサ配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のｃｒＲＮＡガイド配列とハイブリダイズする。
【００７０】
[0083]  用語「シード領域」は、ＤＮＡ配列ＣＲＩＳＰＲリボ核タンパク質複合体間の最初の複合体形成を担うリボ核配列（ribonucleic sequence）を指す。シード領域と標的ＤＮＡ配列間のミスマッチは、ｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ配列の残部よりも強い作用を、標的部位の認識及び切断に及ぼす。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ／ｇＲＮＡのシード領域における単一のミスマッチが、ＣＲＩＳＰＲ複合体をその結合部位にて不活性にすることができる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ用のシード領域は、ガイド配列の３’部分の最後の約１２ｎｔに沿って位置決めされ、これは、ＰＡＭに隣接するプロトスペーサ標的配列の部分に対応する（ハイブリダイズする）。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼ用のシード領域は、ガイド配列の５’部分の最初の約５ｎｔに沿って位置決めされ、これは、ＰＡＭに隣接するプロトスペーサ標的配列の部分に対応する（ハイブリダイズする）。
【００７１】
[0084]  用語「ｔｒａｃｒＲＮＡ」は、トランスコードされた（trans-encoded）小さなＲＮＡを指す。ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡと相補的であり、且つｃｒＲＮＡと塩基対形成して、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを形成し、これは、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを標的配列に動員することができる。
【００７２】
[0085]  本明細書中で用いられる用語「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを標的配列に動員することができるＲＮＡの配列又は配列の組合せを指す。ゆえに、本明細書中で用いられるガイドＲＮＡは、天然若しくは合成のｃｒＲＮＡ（例えば、Ｃｐｆ１について）、天然若しくは合成のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（例えば、Ｃａｓ９について）、又は単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であり得る。
【００７３】
[0086]  本明細書中で用いられる用語「ＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって標的とされ得るＤＮＡ配列を指す。ゆえに、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ複合体で切断され得る、近接して配置されたプロトスペーサ／プロトスペーサ隣接モチーフの組合せ配列を含む。用語「確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、前記配列の高い効率の切断を誘導することができるガイドＲＮＡが存在するＣＲＩＳＰＲランディング部位を指す。ゆえに、用語「確認された」は、配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって切断可能であることが以前に示されていることを意味すると解釈されるべきである。各「確認されたＣＲＩＳＰＲランディング部位」は、定義上、確認を伴う、試験されたガイドＲＮＡの存在を裏付けることとなる。
【００７４】
[0087]  用語「付着末端（sticky end）」は、配列突出部を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子の末端を指す。一部の実施形態において、付着末端は、５’又は３’の配列突出部を有するｄｓＤＮＡ分子の末端であり得る。一部の実施形態において、本開示の付着末端は、同じ、又は他の分子の適合する付着末端とハイブリダイズすることができる。ゆえに、一実施形態において、第１のＤＮＡフラグメントの３’上の付着末端は、第２のＤＮＡフラグメント上の適合する付着末端とハイブリダイズし得る。一部の実施形態において、これらのハイブリダイズされた付着末端は、リガーゼによって縫い合わされ（sewn together）得る。他の実施形態において、付着末端は、ライゲーションに先立って、ｄｓＤＮＡ分子を完成させるのに突出部の伸長を必要とする場合がある。用語「遺伝的スカー」は、ＤＮＡ操作方法によって核酸配列中に導入された、不所望のあらゆる配列を指す。例えば、一部の実施形態において、本開示は、制限酵素結合部位、配列アダプター、又はクローニングに対処するためのスペーサ、ＴＡ−部位、ＮＨＥＪから残されたスカー等の遺伝的スカーを教示する。一部の実施形態において、本開示は、スカーレスクローニング方法及び遺伝子編集方法を教示する。
【００７５】
[0088]  本明細書中で用いられる用語「標的とされる」は、１つの部材又は分子が、別の部材又は分子と、非標的部材又は分子を除外するような特異性の程度で相互作用するであろうという予想を指す。例えば、本開示に従う第２のポリヌクレオチドを標的とする第１のポリヌクレオチドは、第２のポリヌクレオチドと配列特異的に（例えば、ワトソン−クリック型塩基対形成を介して）ハイブリダイズするように設計されている。一部の実施形態において、ハイブリダイゼーションの選択された領域は、ハイブリダイゼーションを、１つ又は複数の標的領域に対して固有になるように設計される。第２のポリヌクレオチドは、その標的配列（ハイブリダイゼーションの領域）が突然変異し、又はそれ以外では第２のポリヌクレオチドから除去／分離されれば、第１のターゲティングポリヌクレオチドの標的であることが終わり得る。
【００７６】
[0089]  本開示は、「ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ」コンストラクト又は設計として教示且つ記載されるユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト又は設計を指す。
【００７７】
ＤＮＡヌクレアーゼ
[0090]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡヌクレアーゼを利用する遺伝子編集／クローニングのための方法及び組成物を教示する。ＣＲＩＳＰＲ複合体、転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及びＦｏｋＩ制限酵素が、遺伝子編集ツールとして用いられている配列特異的ヌクレアーゼの一部である。これらの酵素は、そのヌクレアーゼ活性を、注目の配列を認識するように操作されたガイド領域との相互作用を通して、所望の標的遺伝子座に標的化することができる。一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集方法を教示する。
【００７８】
[0091]  インビボＣＲＩＳＰＲベースの編集の原理は、大部分は、天然の細胞のＤＮＡ修復系に依存している。ヌクレアーゼによって導入される二本鎖ｄｓＤＮＡ切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）若しくは相同指向性修復（ＨＤＲ）、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、又はマイクロホモロジ末端結合（ＭＭＥＪ）によって修復される。
【００７９】
[0092]  ＨＤＲは、ＤＮＡ切断の標的部位を囲む領域と相同な配列を含有する鋳型ＤＮＡに依存する。細胞の修復タンパク質が、外来から供給された、又は内因性のＤＮＡ配列と、ＤＮＡ切断を囲む部位との相同性を用いて、切断を鋳型ＤＮＡ上の配列と置換することでｄｓＤＮＡ切断を修復する。しかしながら、鋳型ＤＮＡを組み込めないと、結果としてＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、又はＳＳＡとなり得る。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、及びＳＳＡは、標的部位でのヌクレオチドの挿入又は欠失（インデル）を多くの場合伴って、フレームシフト突然変異、又は未成熟終止コドンの挿入に起因するゲノムの標的領域の遺伝的ノックアウト（サイレンシング）をもたらす、エラーを起こしやすいプロセスである。また、Ｃｐｆ１媒介編集が、エンドヌクレアーゼによって生じる突出部の従来のハイブリダイゼーションに続くライゲーションを介して機能し得る。
【００８０】
[0093]  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼはまた、本開示の後の節で考察されるように、インビトロＤＮＡ操作に有用である。
【００８１】
ＣＲＩＳＰＲ系
[0094]  ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文配列反復：Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）及びＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）エンドヌクレアーゼは、元々、ウイルス及びプラスミドの侵入からの保護のために細菌及び古細菌によって進化した適応免疫系として発見された。細菌において天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、以前に直面したウイルス及びプラスミドから獲得されたゲノム−ターゲティング配列（スペーサと呼ばれる）によって分離される塩基配列の短い回文反復からなる１つ以上のＣａｓ遺伝子及び１つ以上のＣＲＩＳＰＲアレイで構成される（Wiedenheft, B., et. al. Nature. 2012; 482:331；Bhaya, D., et. al., Annu. Rev. Genet. 2011; 45:231；及びTerms, M.P. et. al., Curr. Opin. Microbiol. 2011; 14:321）。１つ以上のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を有する細菌及び古細菌は、ＣＲＩＳＰＲアレイの近位末端にて宿主染色体中に外来配列の短いフラグメント（プロトスペーサ）を組み込むことによって、ウイルス又はプラスミドのチャレンジに応答する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写は、以前に直面した侵入核酸と相補的な配列を含有するＣＲＩＳＰＲ由来ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）のライブラリを生成する（Haurwitz, R.E., et. al., Science. 2012:329; 1355；Gesner, E.M., et. al., Nat. Struct. Mol. Biol. 2001:18; 688；Jinek, M., et. al., Science. 2012:337; 816-21）。ｃｒＲＮＡによる標的認識は、標的ＤＮＡとの相補的塩基対形成を通して起こり、これは、Ｃａｓタンパク質による外来配列の切断を導く（Jinek et. al. 2012“A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.”Science. 2012:337; 816-821）。
【００８２】
[0095]  少なくとも５つの主要なＣＲＩＳＰＲ系型（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、及びＶ型）及び少なくとも１６個の異なったサブタイプが存在する（Makarova, K.S., et al., Nat Rev Microbiol. 2015. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736）。ＣＲＩＳＰＲ系はまた、そのエフェクタタンパク質に基づいて分類される。クラス１系は、多サブユニットｃｒＲＮＡ−エフェクタ複合体を有するが、クラス２系では、エフェクタ複合体の全ての機能が、単一のタンパク質（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）によって実行される。一部の実施形態において、本開示は、ＩＩ型及び／又はＶ型の単一サブユニットエフェクタ系の使用を教示する。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ系の使用を教示する。
【００８３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９
[0096]  一部の実施形態において、本開示は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系を用いた遺伝子編集方法を教示する。一部の実施形態において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、Ｃａｓ９酵素を用いる。ＩＩ型系は、ｉ）単一エンドヌクレアーゼタンパク質、ｉｉ）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、及びｉｉｉ）ｃｒＲＮＡの５’末端の約２０ヌクレオチド（ｎｔ）部分が標的核酸と相補的であるｃｒＲＮＡに依存している。ＣＲＩＳＰＲ  ｃｒＲＮＡ鎖の、その標的ＤＮＡプロトスペーサと相補的である領域は、本明細書でガイド配列と呼ぶ。
【００８４】
[0097]  一部の実施形態において、ＩＩ型系のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ成分は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）によって置換され得る。ｓｇＲＮＡは、例えば、標的ＤＮＡ配列（ガイド配列）と相補的な少なくとも１２〜２０ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を含んでよく、そしてその３’末端に共通のスカフォールドＲＮＡ配列を含んでよい。本明細書中で用いられる「共通のスカフォールドＲＮＡ」は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を模倣するあらゆるＲＮＡ配列、又はｔｒａｃｒＲＮＡとして機能するあらゆるＲＮＡ配列を指す。
【００８５】
[0098]  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、平滑末端ＤＮＡ切断を生じさせ、そしてｃｒＲＮＡオリゴ及びｔｒａｃｒＲＮＡオリゴの組合せによって標的ＤＮＡに動員され、これによりエンドヌクレアーゼは、ＲＮＡ  ＣＲＩＳＰＲ複合体の相補的ハイブリダイゼーションを介して、つなぎ留められる（tether）（図１Ａの塗り潰した三角矢印参照）。
【００８６】
[0099]  一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ／エンドヌクレアーゼ複合体によるＤＮＡ認識は、標的プロトスペーサから下流側の、標的ＤＮＡの３’部分に位置決めされたプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例えば、５’−ＮＧＧ−３’）との更なる相補的塩基対形成を必要とする（Jinek, M., et. al., Science. 2012:337; 816-821）。一部の実施形態において、Ｃａｓ９によって認識されるＰＡＭモチーフは、様々なＣａｓ９タンパク質について、変動する。
【００８７】
[0100]  一部の実施形態において、当業者であれば、本明細書中に開示されるＣａｓ９が、あらゆるソースに由来する、又はあらゆるソースから単離されるあらゆる変異体であってよいことを理解し得る。例えば、一部の実施形態において、本開示のＣａｓ９ペプチドとして、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６から選択される配列番号の１つ以上が挙げられ得る。他の実施形態において、本開示のＣａｓ９ペプチドは、文献中に記載される突然変異の１つ以上を含んでよく、限定されないが、以下に記載される機能突然変異が挙げられる：Fonfara et al. Nucleic Acids Res. 2014 Feb; 42(4): 2577-90；Nishimasu H. et al. Cell. 2014 Feb 27; 156(5): 935-49；Jinek M. et al. Science. 2012 337:816-21；及びJinek M. et al. Science. 2014 Mar 14; 343(6176)；また、米国特許出願第１３／８４２，８５９号、２０１３年３月１５日出願（この出願は、参照によって本明細書に組み込まれる）参照；さらに、米国特許第８，６９７，３５９号；米国特許第８，７７１，９４５号；米国特許第８，７９５，９６５号；米国特許第８，８６５，４０６号；米国特許第８，８７１，４４５号；米国特許第８，８８９，３５６号；米国特許第８，８９５，３０８号；米国特許第８，９０６，６１６号；米国特許第８，９３２，８１４号；米国特許第８，９４５，８３９号；米国特許第８，９９３，２３３号；及び米国特許第８，９９９，６４１号（これらの特許は全て、参照によって本明細書に組み込まれる）参照。ゆえに、一部の実施形態において、本明細書中で開示される系及び方法は、二本鎖ヌクレアーゼ活性を有する野生型Ｃａｓ９タンパク質、一本鎖ニッカーゼとして機能するＣａｓ９突然変異体、又はヌクレアーゼ活性が修飾された他の突然変異体により用いられ得る。
【００８８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１
[0101]  他の実施形態において、本開示は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系を用いた遺伝子編集方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、プレボテラ（Prevotella）属及びフランキセラ（Francisella）属由来のＣＲＩＳＰＲ  １（Ｃｐｆ１）を用いる方法を教示する。
【００８９】
[0102]  本開示のＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ系は、ｉ）単一のエンドヌクレアーゼタンパク質、及びｉｉ）ｃｒＲＮＡであって、３’末端の一部が標的核酸と相補的であるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む。当該系において、Ｃｐｆ１ヌクレアーゼは、ｃｒＲＮＡによって、標的ＤＮＡに直接動員される（図１Ｂの塗り潰した三角矢印参照）。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１用のガイド配列は、検出可能なＤＮＡ切断を達成するのに少なくとも１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、又は１６ｎｔでなければならず、そして効率的なＤＮＡ切断を達成するのに少なくとも１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、又は１８ｎｔでなければならない。
【００９０】
[0103]  本開示のＣｐｆ１系は、Ｃａｓ９と様々な形で異なる。第一に、Ｃａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、切断用の別個のｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。一部の実施形態において、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、約４２〜４４塩基長の短さであり得る（その２３〜２５ｎｔはガイド配列であり、１９ｎｔは構成的な直接反復配列である）。それに対して、組み合わされたＣａｓ９  ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ合成配列は、約１００塩基長であり得る。一部の実施形態において、本開示は、Ｃｐｆ１用のｃｒＲＮＡを「ガイドＲＮＡ」と呼ぶこととする。
【００９１】
[0104]  第二に、Ｃｐｆ１は、標的の５’上流側に位置決めされる「ＴＴＮ」ＰＡＭモチーフを選ぶ。これは、Ｃａｓ９系についての標的ＤＮＡの３’上に位置決めされる「ＮＧＧ」ＰＡＭモチーフと対照的である。一部の実施形態において、ガイド配列に直ぐ先行するウラシル塩基は、置換され得ない（Zetsche, B. et al. 2015.“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”Cell 163, 759-771、この文献は、全ての目的について、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００９２】
[0105]  第三に、Ｃｐｆ１について切られる部位は、約３〜５塩基単位で互い違いにされて（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）、これが「付着末端」を生じさせる（Kim et al., 2016.“Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells”、２０１６年６月６日にオンラインで公開）。約３〜５ｎｔの突出部を有する当該付着末端は、ＮＨＥＪ媒介ライゲーションを促進して、末端がマッチするＤＮＡフラグメントの遺伝子編集を向上させると思われる。切られる部位は、標的ＤＮＡの３’末端にあり、ＰＡＭがある５’末端に対して遠位である。切られる位置は通常、ｃｒＲＮＡにハイブリダイズされない鎖上の第１８塩基、及びハイブリダイズされる相補鎖上の対応する第２３塩基の後にくる（図１Ｂ）。
【００９３】
[0106]  第四に、Ｃｐｆ１複合体において、「シード」領域は、ガイド配列の最初の５ｎｔ以内に位置決めされる。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡシード領域は、突然変異に高度に敏感であり、この領域中の単一の塩基置換でさえ、切断活性を大幅に引き下げ得る（Zetsche B. et al. 2015“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”Cell 163, 759-771参照）。批評的に、Ｃａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ標的とは異なり、Ｃｐｆ１系の切断部位とシード領域は、重ならない。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡターゲティングオリゴの設計に関する更なるガイダンスが、Zetsche B. et al. 2015.“Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System”Cell 163, 759-771に掲載されている。
【００９４】
[0107]  当業者であれば、本明細書中で開示されるＣｐｆ１が、あらゆるソースに由来する、又はあらゆるソースから単離されるあらゆる変異体であってよいことが理解されよう。例えば、一部の実施形態において、本開示のＣｐｆ１ペプチドとして、配列番号７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４から選択される配列番号の１つ以上、又はそれらのあらゆる変異体が挙げられ得る。
【００９５】
リガーゼ
[0108]  一部の実施形態において、本開示は、標的とされるＣｐｆ１複合体を介して標的ＤＮＡを切断してから、生じた付着末端をＤＮＡ挿入物とライゲーションする方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、標的ＤＮＡを切断するためのＣｐｆ１複合体、及びＤＮＡを「縫い」合わせ返すためのリガーゼを用意する方法を教示する。他の実施形態において、本開示は、つなぎ留められるリガーゼ酵素を含む、修飾されたＣｐｆ１複合体を教示する。
【００９６】
[0109]  本明細書中で用いられる用語「リガーゼ」は、任意の数の酵素的試薬又は非酵素的試薬を含んでよい。例えば、リガーゼは、適切な条件下で、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、又はハイブリッド中の隣接するヌクレオチドの３’−ＯＨと５’−リン酸との間でリン酸ジエステル結合を形成する、酵素的ライゲーション試薬又は触媒である。
【００９７】
[0110]  一部の実施形態において、本開示は、酵素リガーゼの使用を教示する。適合する温度感受性酵素リガーゼとして、以下に限定されないが、バクテリオファージＴ４リガーゼ及び大腸菌（E. coli）リガーゼが挙げられる。熱安定リガーゼとして、以下に限定されないが、Ａｆｕリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ｔｆｌリガーゼ、Ｔｔｈリガーゼ、Ｔｔｈ  ＨＢ８リガーゼ、サームス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属種ＡＫ１６Ｄリガーゼ、及びｐｆｕリガーゼが挙げられる（例えば、国際公開第２０００／０２６３８１号、Wu et al., Gene, 76(2): 245-254, (1989)、及びLuo et al., Nucleic Acids Research, 24(15): 3071-3078 (1996)参照）。当業者であれば、任意の数の熱安定リガーゼが、好熱性の生物又は超好熱性の生物、例えば、真正細菌及び古細菌の特定の種から得られ得ること；そしてそのようなリガーゼは、開示される方法及びキットに使用され得ることが理解されよう。一部の実施形態において、可逆的に不活化された酵素（例えば米国特許第５，７７３，２５８号参照）が、本教示の一部の実施形態に使用されてよい。
【００９８】
[0111]  他の実施形態において、本開示は、化学ライゲーション剤の使用を教示する。化学ライゲーション剤として、以下に限定されないが、活性化剤、濃縮剤、及び還元剤、例えばカルボジイミド、臭化シアン（ＢｒＣＮ）、Ｎ−シアノイミダゾール、イミダゾール、１−メチルイミダゾール／カルボジイミド／シスタミン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び紫外線光が挙げられる。自動ライゲーション、すなわち、ライゲーティング剤の不在下での自発的ライゲーションもまた、本明細書中で本教示の範囲内である。化学ライゲーション方法の詳細なプロトコル及び適切な反応基の説明が、特に、Xu et al., Nucleic Acid Res., 27:875-81 (1999)；Gryaznov and Letsinger, Nucleic Acid Res. 21: 1403-08 (1993)；Gryaznov et al., Nucleic Acid Res. 22: 2366-69 (1994)；Kanaya and Yanagawa, Biochemistry 25:7423-30 (1986)；Luebke and Dervan, Nucleic Acids Res. 20: 3005-09 (1992)；Sievers and von Kiedrowski, Nature 369:221-24 (1994)；Liu and Taylor, Nucleic Acids Res. 26: 3300-04 (1999)；Wang and Kool, Nucleic Acids Res. 22: 2326-33 (1994)；Purmal et al., Nucleic Acids Res. 20: 3713-19 (1992)；Ashley and Kushlan, Biochemistry 30:2927-33 (1991)；Chu and Orgel, Nucleic Acids Res. 16: 3671-91 (1988)；Sokolova et al., FEBS Letters 232:153-55 (1988)；Naylor and Gilham, Biochemistry 5:2722-28 (1966)；及び米国特許第５，４７６，９３０号において見出され得る。
【００９９】
[0112]  一部の実施形態において、本開示の方法、キット、及び組成物は、フォトライゲーション反応とも適合する。ライゲーション剤として適切な波長の光を用いるフォトライゲーションもまた、本教示の範囲内である。一部の実施形態において、フォトライゲーションは、以下に限定されないが、４−チオチミジン、５−ビニルウラシル及びその派生物、又はそれらの組合せが挙げられるヌクレオチド類似体を含むプローブを含む。一部の実施形態において、ライゲーション剤は：（ａ）ＵＶ−Ａ範囲（約３２０ｎｍ〜約４００ｎｍ）、ＵＶ−Ｂ範囲（約２９０ｎｍ〜約３２０ｎｍ）、又はそれらの組合せ内の光、（ｂ）約３００ｎｍ〜約３７５ｎｍの波長の光、（ｃ）約３６０ｎｍ〜約３７０ｎｍの波長の光；（ｄ）約３６４ｎｍ〜約３６８ｎｍの波長の光、又は（ｅ）約３６６ｎｍの波長の光を含む。一部の実施形態において、フォトライゲーションは、可逆的である。フォトライゲーションの説明は、特に、Fujimoto et al., Nucl. Acid Symp. Ser. 42: 39-40 (1999)；Fujimoto et al., Nucl. Acid Res. Suppl. 1:185-86 (2001)；Fujimoto et al., Nucl. Acid Suppl., 2:155-56 (2002)；Liu and Taylor, Nucl. Acid Res. 26: 3300-04 (1998)中で、そしてワールド・ワイド・ウェブ：sbchem.kyoto-u.ac.jp/saito-lab上で見出され得る。
【０１００】
ユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及びその使用
[0113]  一部の実施形態において、本発明は、ＤＮＡコンストラクトのモジュラーアセンブリの戦略を説明する。一部の実施形態において、本開示のＤＮＡアセンブリ方法は、プラスミド、小さな直鎖状ＤＮＡ、及び形質転換された染色体遺伝子座が挙げられるあらゆるコンストラクトに適用可能である。
【０１０１】
[0114]  態様において、発明者らは、「ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ」設計のようなユニバーサルモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトに言及する。
【０１０２】
従来のＤＮＡ編集及びアセンブリ技術の欠点
[0115]  従来の多成分ＤＮＡクローニング戦略は、配列が複雑な多成分ＤＮＡコンストラクトを効果的にアセンブルして修飾する能力に限界がある。例えば、制限酵素クローニングが、各ＤＮＡ挿入物のクローニング接合部にて適切に位置決めされている固有の制限酵素認識部位、及びその、最終のベクター内でのデスティネーション部位のアベイラビリティによって、制限される。ゲートウェイクローニング技術が、同様に、多成分アセンブリに対応する比較的少ない数の固有の組換え部位によって制限される。
【０１０３】
[0116]  従来のＤＮＡアセンブリ技術の別のマイナス面は、配列を編集する能力が、多くの場合、構築の時間に制限されることである。例えば、効率的なアセンブリ戦略、例えばリガーゼサイクリング反応（ＬＣＲ）の生成物は、初期アセンブリが完了すると、容易に修飾されない（Kok, S, et al., 2014“Rapid and Reliable DNA assembly via Ligase Cycling Reaction”ACS Synth. Biol., 3 (2): 97-106）。類似の懸念が、従来の制限酵素クローニングで生じ、その共通の制限認識部位は、制限部位を含有するポリヌクレオチドが、アセンブルされることとなるコンストラクト中に挿入されると、又は前記コンストラクトが、前記部位で満ちている染色体中に組み込まれた場合に、固有のクローニング点として機能しなくなる。ゆえに、シーケンシャルな制限クローニングを通して生じたベクターは、クローニングプロセスが順調に進行中であると、配列を固定又は更新するための提供される選択肢が、非常に少なくなる。
【０１０４】
[0117]  より新しい技術、例えば従来のＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡアセンブリ技術ですら、類似の複雑性、以前のアセンブルされたコンストラクト／ベクター設計を繰り返す容易性、及び速度限界に直面し続けている（Wang, JW. et al., 2015“CRISPR/Cas9 nuclease combined with Gibson assembly for seamless cloning”BioTechniques, Vol 58, No. 4: 161-170）。ＣＲＩＳＰＲクローニングは、適合するプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する、標的とされる機能ガイドＲＮＡの設計を必要とする。標的部位内での適切なＰＡＭ配列のアベイラビリティが、ゲノム又はコンストラクト内の可能性があるＤＮＡ挿入位置の数に対する設計上の大きな制限となる。
【０１０５】
[0118]  さらに、ガイドＲＮＡ配列の設計及び試験は、多成分アセンブリについて大きな技術的課題を課す。当業者であれば、例えば、全てのｇＲＮＡ配列が機能的であるわけではないこと、そしてＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡアセンブリの有効な実施が時折、複数のｇＲＮＡ配列変異体の設計及び確認を必要とする場合があることを認識するであろう。これらの制限は、特に、多成分アセンブリにおいて扱い難く、所望の修飾を首尾よくもたらす単一のｇＲＮＡ配列の失敗が、元のクローニングプランにもはや納まらない以降のアセンブリ成分を再設計する必要を引き起こす虞がある。ゆえに、多成分アセンブリの接合部毎に複数のカスタムガイドＲＮＡを必要とする技術を用いることもまた、非常に高価で、扱い難く、且つ非実用的となる虞がある。
【０１０６】
モジュラーＣＲＩＳＰＲタグアセンブリベクター及びそれを用いる方法
[0119]  一部の実施形態において、本開示は、先で記載される上述の従来技術と関連する多くの制限を克服するＤＮＡアセンブリ方法を教示する。一部の実施形態において、本開示はまた、本発明の方法に用いられるモジュラーＣＲＩＳＰＲアセンブリコンストラクト、組成物、及びキットを教示する。
【０１０７】
[0120]  一部の実施形態において、本開示は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲマルチクローナル部位（ｃＭＣＳ）を含むＤＮＡコンストラクトを教示する。一部の実施形態において、本開示のｃＭＣＳは、記載されるＤＮＡコンストラクトの一部のみを表す（すなわち、コンストラクトの一部のみが、本開示の方法に従って容易に編集可能である）。他の実施形態において、本開示のｃＭＣＳは、ＤＮＡコンストラクト全体が容易に編集可能であるように、コンストラクト全体の内部の重要な位置上に位置決めされている。ゆえに、一部の実施形態において、モジュラーｃＴＡＧベクターの全ての機能部分（例えば、アセンブリに必要とされる全ての起源、マーカー、カーゴ、要素）が、挿入ＤＮＡ部分の内部に含まれており、そして本開示の遺伝子編集方法を介して容易に交換され得る。
【０１０８】
[0121]  一部の実施形態において、本開示のｃＭＣＳは、１つ以上のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）を含み、これらはそれぞれ、少なくとも１つの確認されたＣＲＩＳＰＲターゲティング部位を含む。一部の実施形態において、本開示のｃＭＣＳはさらに、ＤＮＡ挿入部分を含み、各ＤＮＡ挿入部分には、一対のｃＴＡＧが側面に位置しており、１つ以上のｃＴＡＧを標的とする１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによるｃＭＣＳの消化が、前記側面に位置する挿入部分を解放して、適合するドナーＤＮＡ部分の挿入を可能とすることとなる。
【０１０９】
[0122]  本明細書の図２及び図３は、本開示の方法に従う、モジュラーＣＲＩＳＰＲアセンブリプラスミドコンストラクトの実施形態を示す。開示される例示のプラスミドは、一連のＤＮＡ挿入物（図２ＡのＰａｒｔ１〜８）を含有し、これらにはそれぞれ、図２Ａにおいて、一対のｃＴＡＧ（タグＡ〜Ｈ）が側面に位置する。適切なＣＲＩＳＰＲ／ガイド配列複合体によるこの例のｃＴＡＧ  Ａ及びＢの消化が、プラスミドのＰａｒｔ２を解放して、所望の特性を有する置換Ｐａｒｔ２挿入物の挿入を可能とすることとなる。
【０１１０】
[0123]  当業者であれば、インビボでの、そしてインビトロでのベクターの配列特異的モジュラークローニング／編集を可能とする、本記載のベクター系の利点を直ちに認識するであろう。以下の節では、開示されるモジュラークローニングベクターの種々の態様、並びにそれらの、分子生物学、遺伝子治療、及び遺伝子編集への種々の用途を概説することとする。
【０１１１】
モジュラーＣＲＩＳＰＲベクター挿入部分
[0124]  一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ消化後の相同組換え挿入用のドナーＤＮＡ配列である。ゆえに、一部の実施形態において、本開示の挿入部分配列は、消化されるモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトの末端に対する相同性が、注目する挿入配列であって、当該配列の相同組換え、ハイブリダイゼーション、及び挿入をトリガーするのに十分である配列が側面に位置する挿入配列を含む。
【０１１２】
[0125]  他の実施形態において、本開示の挿入部分は、付着末端を介したハイブリダイゼーション及びライゲーション（例えば、Ｃｐｆ１消化、制限酵素消化、Gibsonアセンブリ、又は他のハイブリダイゼーションベースのアセンブリの後に、ＬＣＲを含む）が可能なドナーＤＮＡ配列である。ゆえに、一部の実施形態において、本開示の挿入部分配列は、注目する挿入配列であって、消化されるモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトの末端に対する相同性が、付着末端のハイブリダイゼーションを可能にするのに十分である配列が側面に位置する挿入配列を含む。
【０１１３】
[0126]  他の更なる実施形態において、本開示の挿入部分は、平滑末端ライゲーション用のドナーＤＮＡ配列である。
【０１１４】
[0127]  一部の実施形態において、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、あらゆる挿入部分配列と適合する。ゆえに、本ベクターの部分は、以下に限定されないが、選択マーカー、複製起点、プロモータ、ターミネータ配列、他の調節配列、バーコード、組換え部位、又は使用者が注目する他の配列を含んでよい。一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、１つ以上の遺伝子座中への相同組換え及び挿入をトリガーするための相同配列を含んでよい。一部の実施形態において、前記相同組換え挿入部分は、同じく組換え事象を介してゲノム中に挿入されることとなる他の挿入部分に前後することとなる。
【０１１５】
[0128]  一部の実施形態において、本開示は、各挿入部分が、単一の配列（例えば、注目するプロモータのみ又は遺伝子のみ、図２Ａ、Ｐａｒｔ８参照）を含むことを教示する。他の実施形態において、本開示は、１つ以上の挿入部分が、複数の要素、例えばプロモータ−注目する遺伝子（ＧＯＩ）の組合せ、マルチサブユニットキメラタンパク質融合を、又はコンストラクト全体（プロモータ−ＧＯＩ−ターミネータの組合せを含む、図２Ａ、Ｐａｒｔ５参照）さえも含有してよいことを教示する。
【０１１６】
[0129]  一部の実施形態において、本開示は、結合してない個々の挿入部分を教示する。すなわち、一部の実施形態において、本開示は、１つ又は複数の連結されていない挿入部分（図２Ａ、結合してない挿入部分のリストを示す右側参照）を教示する。一部の実施形態において、本開示は、前記複数の部分を、１つ以上のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトにアセンブルする方法を教示する。一部の態様において、本開示は、ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒコンストラクトをアセンブルするためのキットを教示する。
【０１１７】
[0130]  他の実施形態において、本開示は、部分的に、又は完全にアセンブルされたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示する。例えば、一部の実施形態において、本開示は、１、２、３、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、又はそれ以上、及びそれらの間のあらゆる範囲のアセンブルされた挿入部分を含むモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを教示する。本開示はまた、前記挿入部分を含むキットを教示する。
【０１１８】
[0131]  一部の実施形態において、前記アセンブルされた、又は部分的にアセンブルされたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、直鎖状である。一部の実施形態において、前記アセンブルされた、又は部分的にアセンブルされたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、環状（例えばプラスミド）である。一部の実施形態において、前記アセンブルされた、又は部分的にアセンブルされたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトは、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれる。
【０１１９】
[0132]  一部の実施形態において、本開示のコンストラクトは最初に、更なるクローニング用のプレースホルダとして、短いスペーサ配列のみを含有することとなる（図３Ｃの「スタッファ」配列参照）。一部の実施形態において、挿入部分プレースホルダは、小さな、ランダム化された配列である。他の実施形態において、本開示のベクターは最初に、１つ以上のプレ選択された挿入ＤＮＡ部分を含むこととなる。例えば、一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは最初に、少なくとも１つの選択マーカー及び／又は少なくとも１つの複製起点を含むこととなる。
【０１２０】
[0133]  適切な選択マーカーとして、以下に限定されないが、抗生物質耐性を付与する遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、ｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー、毒性遺伝子、表現型マーカー、アンチセンスオリゴヌクレオチド、制限酵素、制限酵素切断部位、酵素切断部位、タンパク質結合部位、及びＰＣＲプライマー配列と相補的な配列が挙げられる。
【０１２１】
[0134]  適切な抗生物質耐性遺伝子として、以下に限定されないが、クロラムフェニコール耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、及びカナマイシン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１２２】
[0135]  本発明の特定の実施形態において、対抗選択マーカーは、毒性遺伝子である。適切な毒性遺伝子として、以下に限定されないが、ｃｃｄＢ遺伝子、１つ又は複数のｔｅｒ部位に結合するｔｕｓタンパク質をコードする遺伝子、ｋｉｃＢ遺伝子、ｓａｃＢ遺伝子、ＡＳＫ１遺伝子、ΦＸ１７４Ｅ遺伝子、及びＤｐｎＩ遺伝子が挙げられる。一部の実施形態において、毒性選択マーカーの存在は、挿入が行われなかった、又は不成功であったことの指標として機能する。毒性選択マーカーはまた、毒性遺伝子により未だ適所で修飾されていないベクターを有する細胞に死を引き起こすことによって、陽性細胞の非修飾親ベクターのバックグラウンドを低下させるように機能し得る。
【０１２３】
[0136]  本発明の方法の更なる実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、１つ以上の毒性遺伝子及び１つ以上の抗生物質耐性遺伝子の双方を含んでよい。
【０１２４】
[0137]  一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは最初に、少なくとも１つの調節配列を含むこととなる。一部の実施形態において、本開示は、以下に限定されないが、マトリックス付着領域、発現インシュレータ配列、発現エンハンサ配列、プロモータ、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、ターミネータ配列、終止コドン、開始コドンその他を含むベクターを教示する。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは最初に、前記コンストラクトの染色体挿入を促進する配列（例えば、ｔ−ＤＮＡボーダー、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ、又は染色体配列に対して相同性の末端）を含むこととなる。一部の実施形態において、染色体挿入用の配列は、生物のゲノム中にモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト全体を挿入するように配置される。他の実施形態において、染色体挿入用の配列は、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトの一部のみを挿入するように配置される（図３Ｄ参照）。
【０１２５】
[0138]  一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、更なるｃＴＡＧを含むことさえできる。挿入部分を通したｃＴＡＧの付加は、利用可能なクローニングスキームの複雑性を増大させることができ、そしてまた、置換され得る利用可能な挿入部分の数を拡大することによって、コンストラクトのサイズを拡大することもできる。
【０１２６】
[0139]  一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、従来のクローニング部位を含み得る。例えば、一部の実施形態において、本開示は、ゲートウェイ組換え部位、制限部位、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ部位、又は他の従来のクローニング部位を含む挿入部分を教示する。
【０１２７】
[0140]  一部の実施形態において、本開示は、従来のＤＮＡコンストラクトから挿入部分を生じさせる方法を教示する。すなわち、一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧを従来のＤＮＡコンストラクトに（例えば、オリゴ、ＰＣＲフラグメント、プラスミド、又は他の利用可能なＤＮＡセグメントに）加える方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧを、単一の成分、例えば、注目する遺伝子（ＧＯＩ）、プロモータに加える方法を教示する。他の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧを多要素コンストラクトに加える方法を教示する。
【０１２８】
[0141]  当業者であれば、挿入部分を構築する方法を認識するであろう。例えば、一部の実施形態において、ｃＴＡＧは、前記ｃＴＡＧを含むプライマーによるＰＣＲ増幅を介してＤＮＡ分子中に組み込まれ得る。他の実施形態において、ｃＴＡＧは、従来のクローン技術（例えば、制限酵素、Gibson、又は他のアセンブリ方法）を介して組み込まれ得る。さらに他の実施形態において、ｃＴＡＧは、平滑末端ライゲーションを介して組み込まれ得る。
【０１２９】
[0142]  一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、広い種適合スペクトルを有し得る（例えば、マーカーが、原核生物及び真核生物の双方の発現配列を含有して、複数の生物において効力を発揮し得る）。他の実施形態において、本開示の挿入部分は、単一の種／属／科／目／綱／門／界又はドメイン内の生物への適用性が制限されるように設計される。一部の実施形態において、例えば、複製起点部分が、単一の種内でのみ、又は種の一群内でのみプラスミドを維持することができるようにすることができる。他の実施形態において、蛍光マーカーは、原核生物ドメイン及び真核生物ドメインの双方にわたって機能するようにコドン最適化され得る。
【０１３０】
[0143]  一部の実施形態において、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的配列のＰＡＭから３〜４ヌクレオチド上流を切断する。ゆえに、Ｃａｓ９複合体によるｃＴＡＧ消化は、ＰＡＭ配列、又は標的のプロトスペーサ配列の喪失を通して、ｃＴＡＧ機能の喪失をもたらし得る。一部の実施形態において、本開示は、ドナー挿入配列を、挿入直後にｃＴＡＧ配列を（例えば、以前に失われたＰＡＭ又はプロトスペーサ配列の挿入を通して）再構成するように設計することによって、前記ｃＴＡＧ配列の機能を維持する方法を教示する。類似の対策が、Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼを通して切断される配列について想定される。
【０１３１】
[0144]  図２Ｂは、本開示のｃＴＡＧ修復の概念を示す。Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼによる挿入ｐａｒｔ２の切断もまた、ｃＴＡＧ  Ａ及びＢの一部の喪失をもたらす。相同組換えを介した挿入ｐａｒｔ２ａ〜２ｄのいずれか１つの以降の挿入により、全ｃＴＡＧ配列の回復がもたらされる。
【０１３２】
[0145]  当業者であれば、挿入部分についてほぼ無限の選択肢を認識するであろう。挿入の上述のリストは、説明のためのものであることが意図されており、本開示の方法、キット、及びコンストラクトの適用性を制限するものとして決して解釈されるべきでない。
【０１３３】
モジュラーＣＲＩＳＰＲクローニングタグ
[0146]  一部の実施形態において、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、１つ以上のクローニングタグ（ｃＴＡＧ）を含む。一部の実施形態において、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００個、又はそれ以上のｃＴＡＧを含む。
【０１３４】
[0147]  一部の実施形態において、本開示は、各ｃＴＡＧが、少なくとも１つの確認されたＣＲＩＳＰＲプロトスペーサ／ＰＡＭの組合せ配列（「ＣＲＩＳＰＲランディング部位」）を含むことを教示する。すなわち、一部の実施形態において、ｃＴＡＧは、少なくとも１つの実験的に確認された、高い効率のＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。一部の実施形態において、本開示のｃＴＡＧは、ウェットベンチ実験（例えば、前記ＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体によるｃＴＡＧ配列のインビトロ切断）によって確認され得る。他の実施形態において、ｃＴＡＧ確認は、査読を受けた雑誌における切断の報告から想定されてもよい。
【０１３５】
[0148]  一部の実施形態において、本開示のｃＴＡＧは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上のＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、互いに重なる。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、ｃＴＡＧ内の互いに異なる、重ならない領域を占有する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ切断又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ切断のいずれかに特異的であり得る。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、他のあらゆる現行の、又は今のところ発見されているＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに特異的であり得る。
【０１３６】
[0149]  他の実施形態において、本開示は、単一のｃＴＡＧ内のマルチクローニング部位が、様々な生物全体にわたって機能するように設計され得ることを教示する。ゆえに、一部の実施形態において、ｃＴＡＧ  Ｃｐｆ１ランディング部位は、ＨＲ機構を欠く、又は下方制御する生物において好まれ得る。他の実施形態において、ｃＴＡＧの制限部位が、最初のインビトロクローニングに好まれ得る一方、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１ランディング部位が、選択された真核生物においてインビボで起こるより複雑な編集に好まれ得る。
【０１３７】
[0150]  一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧが、１つ以上の非ＣＲＩＳＰＲクローニング配列を含み得ることを教示する。例えば、一部の実施形態において、本開示のｃＴＡＧは、制限酵素部位、組換え部位、トポイソメラーゼ部位、スプライシング部位、及びＣｒｅ−Ｌｏｘ部位からなる群から選択される１つ以上の要素を含んでよい。
【０１３８】
[0151]  一部の実施形態において、適切な制限酵素部位として、以下に限定されないが、ＡａＩＩ、ＡａｒＩ、ＡａｓＩ、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＢ７Ｉ、ＡｃｃＩ、ＡｃｃＩＩＩ、ＡｃｉＩ、ＡｃｌＩ、ＡｃｕＩ、ＡｄｅＩ、ＡｆｅＩ、ＡｆｌＩＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＡｇｅＩ、ＡｈｄＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｏＩ、ＡｌｕＩ、Ａｌｗ２１Ｉ、Ａｌｗ２６Ｉ、Ａｌｗ４４Ｉ、ＡｌｗＩ、ＡｌｗＮＩ、ＡｐａＩ、ＡｐａＬＩ、ＡｐｅＫＩ、ＡｐｏＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｅＩ、ＡｓｉＳＩ、ＡｖａＩ、ＡｖａＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｌＩ、ＢａｍＨＩ、ＢａｎＩ、ＢａｎＩＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｕＩ、ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｌＩ、ＢｃｎＩ、ＢｃｕＩ、ＢｆａＩ、ＢｆｉＩ、ＢｆｍＩ、ＢｆｒＢＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｆｕＩ、ＢｇｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢｌｐＩ、Ｂｍｅ１３９０Ｉ、Ｂｍｅ１５８０Ｉ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｍｔＩ、ＢｏｘＩ、ＢｐｉＩ、ＢｐｌＩ、ＢｐｍＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｐｕ１１０２Ｉ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＪＩ、ＢｓａＭＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＤＩ、ＢｓｅＧＩ、ＢｓｅＪＩ、ＢｓｅＬＩ、ＢｓｅＭＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＮＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｅＳＩ、ＢｓｅＸＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、Ｂｓｈ１２８５Ｉ、ＢｓｈＮＩ、ＢｓｈＴＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｏＢＩ、Ｂｓｐ１９Ｉ、Ｂｓｐ１２０Ｉ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｂｓｐ１４０７Ｉ、Ｂｓｐ１４３Ｉ、Ｂｓｐ１４３ＩＩ、Ｂｓｐ６８Ｉ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｐＥＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＬＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＰＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｐＴＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｒＧＩ、ＢｓｒＩ、ＢｓｒＳＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｓＳＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、Ｂｓｔ９８Ｉ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＢｓｔＦ５Ｉ、ＢｓｔＮＩ、ＢｓｔＯＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢｓｔＹＩ、ＢｓｔＺＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｂｓｕ１５Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＢｓｕＲＩ、ＢｔｇＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＢｖｅＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣａｉＩ、ＣｆｏＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、Ｃｆｒ１３Ｉ、Ｃｆｒ４２Ｉ、Ｃｆｒ９Ｉ、ＣｆｒＩ、ＣｌａＩ、ＣｐｏＩ、Ｃｓｐ４５Ｉ、Ｃｓｐ６Ｉ、ＣｓｐＩ、ＣｓｐＣＩ、ＣｖｉａＩＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＣｖｉＱＩ、ＤｄｅＩ、ＤｐｎＩ、ＤｐｎＩＩ、ＤｒａＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｍ１１０４Ｉ、Ｅａｍ１１０５Ｉ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、ＥｃｌＨＫＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ、Ｅｃｏ１３０Ｉ、Ｅｃｏ１４７Ｉ、Ｅｃｏ２４Ｉ、Ｅｃｏ３１Ｉ、Ｅｃｏ３２Ｉ、Ｅｃｏ４７Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５２Ｉ、Ｅｃｏ５７Ｉ、Ｅｃｏ５７ＭＩ、Ｅｃｏ７２Ｉ、Ｅｃｏ８１Ｉ、Ｅｃｏ８８Ｉ、Ｅｃｏ９１Ｉ、ＥｃｏｌＣＲＩ、ＥｃｏＮＩ、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｈｅＩ、Ｅｓｐ３Ｉ、ＦａｔＩ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｏｋＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＦｓｐＡＩ、ＧｓｕＩ、ＨａｅＩＩ、ＨａｅＩＩＩ、���ｇａＩ、ＨｈａＩ、Ｈｉｎ１Ｉ、Ｈｉｎ４Ｉ、Ｈｉｎ６Ｉ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｆＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｈＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｈｐｙ８Ｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＡＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＨｐｙＦ１０ＶＩ、Ｈｓｐ９２Ｉ、Ｈｓｐ９２ＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＫａｓＩ、Ｋｐｎ２Ｉ、ＫｐｎＩ、ＫｓｐＡＩ、ＬｗｅＩ、ＭｂｉＩ、ＭｂｏＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｆｅＩ、ＭｉｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、Ｍｐｈ１１０３Ｉ、ＭｓｃＩ、ＭｓｅＩ、ＭｓｌＩ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＩ、ＭｓｓＩ、ＭｕｎＩ、Ｍｖａ１２６９Ｉ、ＭｖａＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｒＩ、ＮｃｉＩ、ＮｃｏＩ、ＮｄｅＩ、ＮｄｅＩＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＮｈｅＩ、ＮｈｅＩ−ＨＦ、ＮｌａＩＩＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮｍｕＣＩ、ＮｏｔＩ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＮｓｉＩ、ＮｓｐＩ、ＯｌｉＩ、ＰａｃＩ、ＰａｅＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰａｇＩ、ＰａｕＩ、ＰｃｉＩ、ＰｄｉＩ、ＰｄｍＩ、Ｐｆｌ２３ＩＩ、ＰｆｌＦＩ、ＰｆｌＭＩ、ＰｆｏＩ、ＰｈｏＩ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｐｉＩ、ＰｐｕＭＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、Ｐｓｐ１４０６Ｉ、Ｐｓｐ５ＩＩ、ＰｓｐＧＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｓｐＸＩ、ＰｓｔＩ、ＰｓｕＩ、ＰｓｙＩ、ＰｖｕＩ、ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩＩ−ＨＦ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩ、ＳａｃＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｌＩ−ＨＦ、ＳａｐＩ、ＳａｔＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｂｆＩ、ＳｃａＩ、ＳｃａＩ−ＨＦ、ＳｃｈＩ、ＳｃｒＦＩ、ＳｄａＩ、ＳｄｕＩ、ＳｅｘＡＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｆｃＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｉｎＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｍｌＩ、ＳｍｕＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｐｅＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｈＩ−ＨＦ、ＳｓｐＩ、ＳｔｕＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＳｔｙＩ、ＳｗａＩ、ＴａａＩ、ＴａｉＩ、ＴａｑαＩ、ＴａｑＩ、ＴａｓＩ、ＴａｔＩ、ＴａｕＩ、ＴｆｉＩ、ＴｌｉＩ、Ｔｒｕ１Ｉ、Ｔｒｕ９１、ＴｓｅＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＴｓｐＭＩ、ＴｓｐＲＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ、ＴｕｒｂｏＮａｅＩ、ＴｕｒｂｏＮａｒＩ、Ｖａｎ９１Ｉ、ＶｓｐＩ、ＸａｇＩ、ＸａｐＩ、ＸｂａＩ、ＸｃｅＩ、ＸｃｍＩ、ＸｈｏＩ、ＸｈｏＩＩ、ＸｍａＩ、ＸｍａＪＩ、ＸｍｉＩ、ＸｍｎＩ、及びＺｒａＩからなる群から選択される制限酵素によって認識される部位が挙げられる。また、態様として、ホーミングエンドヌクレアーゼ、例えば：Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、及びＰＩ−ＰｓｐＩが挙げられる。これらの酵素についての対応する切断部位は、当該技術において知られている。
【０１３９】
[0152]  一部の実施形態において、本開示は、８ヌクレオチド長以上の部位を認識する稀な制限酵素（≧８制限酵素）の使用を教示する。一部の実施形態において、本開示は、各ｃＴＡＧにおける単一の稀な制限部位の使用を教示する。他の実施形態において、本開示のｃＴＡＧは、２つ以上の制限部位を含んでよい。以下の表１は、本発明に従うｃＴＡＧのリストを記載しており、それぞれ、稀な制限酵素部位を太字で示す。
【０１４０】
【表１】
2020507312.tif 000003
【０１４１】
[0153]  一部の実施形態において、本発明に用いられる適切な組換え部位として、限定されないが、以下が挙げられる：ａｔｔＢ部位、ａｔｔＰ部位、ａｔｔＬ部位、ａｔｔＲ部位、ｌｏｘ部位、ｐｓｉ部位、ｔｎｐＩ部位、ｄｉｆ部位、ｃｅｒ部位、ｆｒｔ部位、並びにそれらの突然変異体、変異体、及び派生物。本発明の特定の実施形態において、トポイソメラーゼ認識部位は、存在するならば、Ｉ型トポイソメラーゼによって認識されて結合され、これは、ＩＢ型トポイソメラーゼであってよい。ＩＢ型トポイソメラーゼの適切なタイプとして、以下に限定されないが、真核生物核Ｉ型トポイソメラーゼ及びポックスウイルストポイソメラーゼが挙げられる。一部の実施形態において、ポックスウイルストポイソメラーゼの適切なタイプとして、以下に限定されないが、ワクシニアウイルス、ショープ線維腫ウイルス、ＯＲＦウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、及びアムサクタ・モーリエ・エントモポックスウイルス（Amsacta morreientomopoxvirus）等のウイルスによって生成される、又はこれらから単離されるポックスウイルストポイソメラーゼが挙げられる。
【０１４２】
[0154]  一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲクローニング部位及び非ＣＲＩＳＰＲクローニング部位のｃＴＡＧ配置は、使用者の選択に従ってオーダーされ得る。一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ結合部位が、挿入部分から最も遠く離れるようにオーダーされるべきであることを教示する。実例となる一実施形態において、ｃＴＡＧは、以下のように５’〜３’に配置され得る：(Part I)[R1-A1-C1-C2]-(Part II)、式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、及びＣ＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位。一部の実施形態において、Ｃは、複数の重複する、又は連続するＣＲＩＳＰＲ及び／又は制限ランディング部位を含んでよい。一部の実施形態において、本開示のｃＴＡＧ上のクローニング部位の配置は、対称形となる（すなわち、クローニング部位のタイプの対称的順序を提供する）こととなる。
【０１４３】
[0155]  他の実施形態において、本開示のｃＴＡＧ上のクローニング部位の配置は、非対称的であってもよい。例えば、実例となる別の実施形態において、ｃＴＡＧは、以下のように５’〜３’に配置され得る：(Part I)-[R1-A1-C1-C2]-(Part II)、式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、及びＣ１〜２＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位。他の更なる実施形態において、ｃＴＡＧは、以下のように５’〜３’に配置され得る：ｉ）(Part I)-[R1-C1-C2]-(Part II)、ｉｉ）(Part I)-[R1-C1]-(Part II)、ｉｉｉ）(Part I)-[C1-C2]-(Part II)、又はそれらの逆順、式中、Ｒ＝制限部位、Ａ＝リコンビナーゼ部位、及びＣ１〜２＝ＣＲＩＳＰＲランディング部位。
【０１４４】
[0156]  当業者であれば、種々のｃＴＡＧ配置の利点及び用途を認識するであろう。例えば、単一タグの実施形態において、モジュラーコンストラクトは、単一のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの消化による挿入を可能にするであろうが、第２のフランキングｃＴＡＧ部位の欠如に起因して、前記挿入の除去又は置換を（より多くの、例えば更なるｃＴＡＧの更なる消化なしに）可能にしないであろう。一部の実施形態において、本開示は、挿入された部分が、それ自体で、更なるｃＴＡＧを含有して、ｃＭＣＳ内の可能性がある挿入部分位置の数を拡大することができることを教示する。
【０１４５】
[0157]  他の実施形態において、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトから１つ以上の挿入部分を除去する方法を教示する。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトのｃＴＡＧの２つ以上が、適合する末端を生じさせることができる制限酵素結合部位を含む。一部の実施形態において、制限酵素部位は、互いに同じである。他の実施形態において、制限酵素部位は、互いに異なるが、前記部位の結果として生じる消化は、ハイブリダイゼーション及びライゲーションに適合する末端を生じさせる。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトの部分の削除用の制限部位は、２つ以上のｃＴＡＧの他の末端に、結果として生じるライゲーション済みコンストラクトが、挿入部分の、ｃＴＡＧに対する同じ比率をなお維持することとなるように配置される。
【０１４６】
[0158]  一部の実施形態において、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト内の削除に用いられる制限酵素部位が、適合する末端をもたらすあらゆる制限酵素であってよいことを教示する。他の実施形態において、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト内の削除に用いられる制限酵素部位が、適合する末端をもたらすあらゆる稀な８≧塩基制限酵素であってよいことを教示する。選択された実施形態において、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト内の削除に用いられる制限酵素部位が、Ｉ−ＳｃｅＩ及びＰＩ−ＰｓｐＩであってよいことを教示する。
【０１４７】
[0159]  一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧ対を生じさせるように２つのｃＴＡＧが各挿入部分の側面に位置するモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトを教示する。一部の実施形態において、上述のｃＴＡＧ対は、挿入部分の選択的切断／置換を可能にする。例えば、図２Ｂに示されるように、ｃＴＡＧ  Ａ及びＢを標的とするエンドヌクレアーゼによるモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミドの消化は、挿入ｐａｒｔ２を特異的に除去することとなる。
【０１４８】
[0160]  先で考察されるように、本開示の選択された実施形態は、エンドヌクレアーゼ切断後にｃＴＡＧ機能を回復する置換挿入部分を提供する。ゆえに、図２Ｂに示されるように、置換挿入ｐａｒｔ２ａ〜２ｄは、モジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミド中への挿入後直ぐにｃＴＡＧ  Ａ及びＢの機能を回復することとなる配列を含む。
【０１４９】
[0161]  一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧが挿入部分の指向性をも制御し得ることを教示する。挿入部分中のｃＴＡＧ末端とモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト中の切断されたｃＴＡＧとの配列相同性が、相同組換え又はハイブリダイゼーション（例えば、Gibsonアプローチによる）のいずれかを通して、Ｃａｓ９切断配列についての挿入指向性を決定することとなる。Ｃｐｆ１配列中の挿入指向性はまた、いずれかのｃＴＡＧ上のＣｐｆ１付着末端のワトソン−クリック型ハイブリダイゼーションを介しても制御され得る。
【０１５０】
[0162]  一部の実施形態において、本開示はまた、代替のｃＴＡＧ配置を提供する。例えば、一部の実施形態において、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトは、例えば、ネストｃＴＡＧに用いられる機能を提供するように設計されてよい。
【０１５１】
[0163]  一部の実施形態において、本開示は、インビトロ及びインビボでの多成分アセンブリを可能にする、共有された重複「タグ」領域に基づく成分ベースのＣＲＩＳＰＲアセンブリを教示する。一部の実施形態において、本開示のタグは、ＤＮＡコンストラクトからの未来のクローニング又はインビトロＤＮＡアセンブリを促進するためのＣＲＩＳＰＲランディング部位を含む。ＤＮＡコンストラクトが宿主生物のゲノム中に組み込まれるならば、予め選択されたＣａｓ９又はＣｐｆ１ランディング部位が、容易な遺伝的変更を促進し得る。一組の実験において、アセンブリ戦略は、複数の数及びタイプのＤＮＡ成分を含有する、複数の生物に用いられ得るＤＮＡプラスミドの構築を可能にする。
【０１５２】
[0164]  一部の実施形態において、このアセンブリ戦略は、所望のあらゆるＤＮＡ成分のセットをコードするプラスミドをアセンブル且つ急速に再アセンブルするのに用いられ得、代謝経路が挙げられる。他の実施形態において、組込みプラスミドへのｃＴＡＧの設計もまた、ＤＮＡ成分を、宿主生物のゲノム内に、そしてそこから直接的にスワップするのに用いられ得、未来のプラスミドをクローニングする必要を回避する。
【０１５３】
ｃＴＡＧ配列設計アルゴリズム
[0165]  一部の実施形態において、本開示は、ｃＴＡＧ内のＣＲＩＳＰＲランディング部位を促進するように設計されたアルゴリズムを教示する。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲランディング部位は、既存の配列から同定される配列である。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、ソフトウェアプログラムの使用が、所望のガイド配列長に基づくインプットＤＮＡ配列、及び指定されたＣＲＩＳＰＲ酵素用のＣＲＩＳＰＲモチーフ配列（ＰＡＭ、プロトスペーサ隣接モチーフ）の双方の鎖上に、候補ＣＲＩＳＰＲ標的配列を同定するように設計されることを教示する。例えば、ＰＡＭ配列ＴＴＮを有する、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）Ｕ１１２由来のＣｐｆ１用の標的部位が、インプット配列上、そしてインプットの逆相補体上の双方で、５’−ＴＴＮ−３’を検索することによって同定され得る。ＰＡＭ配列ＴＴＴＮを有する、ラクノスピラ科の細菌（Lachnospiraceae bacterium）及びアシダミノコッカス（Acidaminococcus）属種由来のＣｐｆ１用の標的部位が、インプット配列上、そしてインプットの逆相補体上の双方で、５’−ＴＴＴＮ−３’を検索することによって同定され得る。同様に、ＰＡＭ配列ＮＮＡＧＡＡＷを有する、Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus）ＣＲＩＳＰＲ１のＣａｓ９用の標的部位が、インプット配列上、そしてインプットの逆相補体上の双方で、５’−Ｎｘ−ＮＮＡＧＡＡＷ−３’を検索することによって同定され得る。化膿連鎖球菌（S. pyogenes）のＣａｓ９用のＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ−３’である。
【０１５４】
[0166]  同様に、ＰＡＭ配列ＮＧＧＮＧを有する、Ｓ．サーモフィルス（S. thermophilus）ＣＲＩＳＰＲのＣａｓ９用の標的部位が、インプット配列上、そしてインプットの逆相補体上の双方で、５’−Ｎ，−ＮＧＧＮＧ−３’を検索することによって同定され得る。
【０１５５】
[0167]  他の実施形態において、本開示は、無からＣＲＩＳＰＲランディング部位を設計する方法を教示する。当業者であれば、ＣＲＩＳＰＲランディング部位を本開示のガイドＲＮＡと共に設計することが容易にできよう。そこで生じたプロトスペーサ配列は、先に述べたような所望のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに適したＰＡＭのモチーフと組み合わされる。
【０１５６】
[0168]  一部の実施形態において、本開示は：配列番号６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７８、７９、８０、８１、及びそれらの組合せからなる群から選択される配列を含むｃＴＡＧを教示する。
【０１５７】
[0169]  ＤＮＡ標的部位のゲノム中での複数の出現が、全ての潜在的部位を同定した後に、非特異的ゲノム編集に至り得るので、本開示は、一部の実施形態において、関連する参照ゲノム又はモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト中で現れる回数に基づいて、配列をフィルタリングすることを教示する。配列特異性が「シード」配列（例えば、Ｃｐｆ１媒介切断のためのガイド配列の最初の５ｎｔ）によって決定されるＣＲＩＳＰＲ酵素について、フィルタリング工程はまた、シードが同じ様々な配列をフィルタリングし得る。
【０１５８】
[0170]  一部の実施形態において、アルゴリズムのツールは、特定のガイド配列について、潜在的なオフ標的部位を同定することもできる。例えば、一部の実施形態において、Ｃａｓ−Ｏｆｆｉｎｄｅｒが、Ｃｐｆ１について潜在的なオフ標的部位を同定するのに用いられ得る（Kim et al., 2016.“Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells”（２０１６年６月６日にオンラインで公開）参照）。他の公に利用可能なあらゆるＣＲＩＳＰＲ設計／同定ツールが用いられてもよく、例えば、Zhang lab’s crispr.mit.edu tool（Hsu, et al. 2013“DNA targeting specificity of RNA_guided Cas9 nucleases”Nature Biotech 31, 827-832参照）が挙げられる。
【０１５９】
[0171]  一部の実施形態において、使用者は、シード配列の長さを選択することができてよい。使用者はまた、フィルタを通すためにゲノム中のシード：ＰＡＭ配列の出現数を指定することができてよい。デフォルトは、ユニーク配列をスクリーニングすることである。フィルタリングレベルは、シード配列の長さ及びゲノム中での配列の出現数の双方を変えることによって変更される。プログラムは、加えて、又は代わりに、同定された標的配列の逆の相補体を提供することによって、報告される標的配列と相補的なガイド配列の配列を提供し得る。
【０１６０】
モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトクローニング
[0172]  一部の実施形態において、本開示は、本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを用いて、新しい組換え核酸分子を調製する方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ部分アセンブリ方法を教示する。各方法の説明が、以下に記載される。
【０１６１】
ＤＮＡアセンブリ方法
[0173]  一部の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ部分のモジュラーアセンブリ方法を教示する。一部の実施形態において、本開示のＤＮＡアセンブリ方法は、インビトロで行われる。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、ｉ）少なくとも２つの挿入部分ＤＮＡを、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ複合体と一緒に含む混合物を形成する工程と、ｉｉ）前記混合物を、挿入ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲ消化用の条件でインキュベートする工程と、ｉｉｉ）続いて、２つの挿入部分ＤＮＡのそれぞれの消化由来の、適合する付着末端をハイブリダイズさせる工程と、ｉｖ）前記互いにハイブリダイズした末端をライゲーションして、新しい組換え核酸を生じさせる工程とを教示する。ゆえに、一部の実施形態において、本開示の挿入部分ＤＮＡは、一緒に消化される。他の実施形態において、本開示は、各挿入部分ＤＮＡを個々に、同じ又は異なるＣＲＩＳＰＲ複合体で消化する方法を教示する。一部の実施形態において、少なくとも１つの挿入部分が、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって消化されない。一部の実施形態において、本開示は、エキソヌクレアーゼ処理が、（後の節に記載されるデュアルＣＲＩＳＰＲ消化のために）工程ｉｉｉ）のハイブリダイゼーションに先立って行われることを教示する。
【０１６２】
[0174]  他の更なる実施形態において、本開示は、挿入部分末端をｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼに曝すこと、そして、生じた付着末端のハイブリダイゼーションに続く、ポリメラーゼによる任意選択の充填、及びライゲーションによる、挿入部分のGibson様結合を教示する。一部の実施形態において、１つ以上の挿入部分が、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ処理に先立って、ｄｓＤＮＡエキソヌクレアーゼに曝される。一部の実施形態において、本開示は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼ（例えば、後の節に記載されるデュアルＣＲＩＳＰＲ消化）によって消化された挿入部分又はモジュラーＣＲＩＳＰＲベクターのGibson様結合を教示する。
【０１６３】
[0175]  以下の節は、挿入部分及び本開示のモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクトがアセンブルされて編集され得る種々の方法を確認する一連の実例を提供する。以下に記載される技術のリストは、本開示の配列の実用性を強調する一連の実例を提供するが、限定となることは意図されていない。当業者であれば、本開示に従う挿入部分のアセンブリ及び編集を可能にする他の技術を認識するであろう。
【０１６４】
[0176]  一部の実施形態において、本開示は、Ｃｐｆ１及び／又はＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを包含する方法を記載する。これらの具体的なＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼへの言及は、特許請求の範囲において明記されない限り、実例であり、限定となることは意図されていない。当業者であれば、他の既存の、又はこれまで発見されていないＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの、本開示のコンストラクト及び方法への利用を直ちに認識するであろう。Ｃｐｆ１への言及は、スタガードＤＮＡ切断を触媒して付着ＤＮＡ末端を生じさせることができる、現在知られている、又は発見されていないあらゆるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの使用を包含するものと解釈され得る。Ｃａｓ９への言及も同様に、ｄｓＤＮＡの平滑末端切断を触媒することができる、現在知られている、又は発見されていないあらゆるＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの使用を包含するものと解釈され得る。
【０１６５】
インビトロＣｐｆ１
[0177]  一部の実施形態において、本開示のインビトロＤＮＡアセンブリは、下記のようにＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体により行われる。第一に、２つ以上の挿入部分が、少なくとも２つの挿入部分間で共通するｃＴＡＧを標的とするＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートされる。一部の実施形態において、挿入部分は、単一の混合物中で一緒にインキュベートされる。他の実施形態において、挿入部分は、異なる混合物中でインキュベートされる。
【０１６６】
[0178]  第二に、一部の実施形態において、消化された生成物は精製されて、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが除去される。一部の実施形態において、精製は、消化された挿入部分からの活性Ｃｐｆ１複合体の分離を包含する。一部の実施形態において、これは、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、Ｃｐｆ１不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１６７】
[0179]  第三に、消化された挿入部分は、Ｃｐｆ１複合体によって生じた適合する付着末端のハイブリダイゼーションに適した条件でインキュベートされる。次に、ハイブリダイズされた末端が、本開示の以前の部分において記載されたものが挙げられる、既知のあらゆるライゲーション方法に従ってライゲーションされる。
【０１６８】
インビトロＣａｓ９
[0180]  他の実施形態において、本開示のインビトロＤＮＡアセンブリは、下記のようにＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体により行われる。第一に、２つ以上の挿入部分が、少なくとも２つの挿入部分間で共通するｃＴＡＧを標的とするＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートされる。一部の実施形態において、挿入部分は、単一の混合物中で一緒にインキュベートされる。他の実施形態において、挿入部分は、様々な混合物中でインキュベートされる。
【０１６９】
[0181]  第二に、一部の実施形態において、消化された生成物は精製されて、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが除去される。一部の実施形態において、精製は、消化された挿入部分からの活性Ｃａｓ９複合体の分離を包含する。一部の実施形態において、これは、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、Ｃａｓ９不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１７０】
[0182]  一部の実施形態において、Ｃａｓ９消化された生成物についての第３の工程は、平滑末端−ライゲーションに適した条件で挿入部分をインキュベートするものである。
【０１７１】
デュアルＣＲＩＳＰＲアセンブリ
[0183]  他の実施形態において、本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲ消化された挿入部分のピースを、少なくとも１つの共有されるｃＴＡＧ配列とアセンブルするGibsonアセンブリ型の方法（例えば、異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位にて消化された、適合するｃＴＡＧのアセンブリ）を教示する。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、下記のように、デュアルＣＲＩＳＰＲ消化アセンブリを教示する。
【０１７２】
[0184]  第一に、２つ以上の挿入部分が、少なくとも２つの挿入部分間で共通する上述のｃＴＡＧ内の、各部分の側面に位置する２つの異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的とする２つのＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートされる。
【０１７３】
[0185]  一部の実施形態において、２つの異なるＣＲＩＳＰＲランディング部位は、一緒に消化される。他の実施形態において、一方の挿入部分ＤＮＡが、あるＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体で消化され、そして他方の挿入部分ＤＮＡが、第２のＣＲＩＳＰＲランディング標的部位を標的とする異なるＣＲＩＳＰＲ複合体で、別個の容器内で消化される。それぞれの場合において、これらの消化の結果は、２つの挿入ＤＮＡ  ｃＴＡＧのそれぞれにおいて共有されるｃＴＡＧが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０ｂｐの、互いとの配列重なりを含むこととなるということであろう。
【０１７４】
[0186]  例えば、実例となる実施形態において、２つの挿入ＤＮＡ部分間で共有されるｃＴＡＧは、以下のように５’〜３’に配置されることとなる：(Part I)-[R1-C1-C2]-(Part II)、式中、Ｒ＝制限部位、Ｃ１＝第１のＣＲＩＳＰＲランディング部位、及びＣ２＝第２のＣＲＩＳＰＲランディング部位。この実例となる実施形態において、３’に共有されるｃＴＡＧを有する第１の挿入ＤＮＡ部分は、Ｃ２を標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体で消化されることとなり、そして５’に共有されるｃＴＡＧを有する第２の挿入ＤＮＡ部分は、Ｃ１を標的とするＣＲＩＳＰＲ複合体で消化されることとなる。これにより、重なる配列がＣ１〜Ｃ２にまたがる２つのＤＮＡ挿入部分が生じることとなる。
【０１７５】
[0187]  第二に、一部の実施形態において、消化された生成物は精製されて、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが除去される。一部の実施形態において、精製は、消化された挿入部分からの活性Ｃａｓ９複合体の分離を包含する。一部の実施形態において、これは、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、ＣＲＩＳＰＲ不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１７６】
[0188]  第三に、一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ消化された挿入部分は、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼとインキュベートされて、２つの挿入ＤＮＡ部分間で重なる付着末端が生じる。
【０１７７】
[0189]  第四に、消化された挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体／エキソヌクレアーゼ消化によって生じた適合する付着末端のハイブリダイゼーションに適した条件でインキュベートされる。次に、ハイブリダイズされた末端が、本開示の以前の部分で記載されたものが挙げられる、既知のあらゆるライゲーション方法に従ってライゲーションされる。一部の実施形態において、ハイブリダイズされた部分は、ライゲーションに先立って、ポリメラーゼとインキュベートされて、欠けているあらゆる配列ギャップが満たされる。
【０１７８】
架橋アセンブリ
[0190]  他の実施形態において、本開示は、挿入部分の消化されたｃＴＡＧ配列と重なる架橋配列を含む第３のＤＮＡ配列の付加を通した、Ｃａｓ９消化部分のGibsonアセンブリを教示する。
【０１７９】
[0191]  この実例において、双方の挿入部分が、同じＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的とする同じＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体で消化される。この実施形態において、消化されて生じたｃＴＡＧは、配列重なりを有することはない。ゆえに、一部の実施形態において、第３の工程は、Ｃａｓ９消化された挿入部分が、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼでさらに消化されて、３’突出部又は５’突出部のいずれかを生じさせるものである。次に、エキソヌクレアーゼ消化された挿入部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体及びエキソヌクレアーゼ消化の組合せによって生じた適合する付着末端の、架橋配列とのハイブリダイゼーションに適した条件でインキュベートされる。次に、ハイブリダイズされた末端が、本開示の以前の部分で記載されたものが挙げられる、既知のあらゆるライゲーション方法に従ってライゲーションされる。一部の実施形態において、本開示のエキソヌクレアーゼ消化は、第２の工程の前に行われる。
【０１８０】
インビトロＨＤＲ
[0192]  他の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼによって消化された挿入部分ＤＮＡの末端をＨＤＲ複合体とアセンブルすることによって、前記消化された挿入部分の組換えをトリガーするインビトロ方法を教示する。
【０１８１】
インビトロ相同組換え
[0193]  一部の実施形態において、本開示のインビボＤＮＡアセンブリは、下記のようにＣｐｆ１又はＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体により行われる。一実施形態において、少なくとも１つのｃＴＡＧを共有する２つ以上の挿入部分が、宿主細胞中に導入される。一部の実施形態において、相同なｃＴＡＧ配列を共有するＤＮＡ挿入部分の存在は、相同組換えアセンブリ（例えば、酵母の相同組換え）をトリガーするのに十分であろう。
【０１８２】
[0194]  例えば、一部の実施形態において、２つの挿入ＤＮＡ部分間の少なくとも１つの共有されるｃＴＡＧ配列は、アセンブルされて直鎖状のコンストラクトを生じさせ得る。また、この実例となる実施形態において、２つの残りの外側のｃＴＡＧは、細胞内の別のベクターのｃＴＡＧと組み換えられる（例えば、既存のプラスミド又は染色体中に挿入される）ように設計され得る。他の実施形態において、２つの部分はさらに、２つの挿入ＤＮＡ部分間での、第２の共有されるｃＴＡＧの組換えを通して、環状のコンストラクト中にアセンブルされ得る。アセンブルされたコンストラクトは、アセンブリに用いられた生物に用いられてもよいし、一部の実施形態において、精製されて第２の生物に形質転換されてもよい（例えば、酵母中でのアセンブリ、及び以降の細菌への形質転換）。
【０１８３】
[0195]  他の実施形態において、ｃＴＡＧが共有される１つ以上の挿入部分が、宿主細胞中への導入に先立って消化されてよい。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、解放される部分のインビボアセンブリに先立つ、より大きなベクターから挿入部分を解放するＣＲＩＳＰＲ消化を教示する。一部の実施形態において、消化はＣａｓ９により実行される。他の実施形態において、消化はＣｐｆ１により実行される。他の実施形態において、消化は制限酵素により実行される。一部の実施形態において、挿入部分のＣＲＩＳＰＲ消化は、インビトロで行われる。一部の実施形態において、消化された生成物は、アセンブリ宿主細胞中への挿入部分の形質転換に先立って、活性ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼを除去するように精製される。
【０１８４】
[0196]  一部の実施形態において、精製工程は、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、ＣＲＩＳＰＲ不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１８５】
インビトロライゲーション
[0197]  一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼによる再切断から挿入部分を保護する方法を教示する。一部の実施形態において、本開示の挿入部分は、ＤＮＡ配列の化学修飾を介して、エンドヌクレアーゼ切断から保護され得る。例えば、一部の実施形態において、本開示は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを教示する。
【０１８６】
[0198]  一部の実施形態において、本開示の方法はとりわけ、マルチ部分ＤＮＡアセンブリに有用である。
【０１８７】
[0199]  本明細書の図２Ａは、本開示の方法に従う、マルチ部分ＤＮＡアセンブリの実例を示す。この例において、一連の８つのＤＮＡ部分（ｐａｒｔ１〜８）（それぞれ２つのｃＴＡＧ（タグＡ〜Ｈ）を有する）が、インビトロで組み合わされてから、（インビボでの相同組換えを介して、又は先に述べるライゲーションを介して）セルフアセンブルすることができる。
【０１８８】
ＤＮＡ編集方法
[0200]  一部の実施形態において、本開示は、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトの編集方法を教示する。一部の実施形態において、本開示のＤＮＡ編集方法は、先に記載されるＤＮＡアセンブリ方法の同じ原理を使用するが、１つ以上の既存のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトを編集する目的でそうする。
【０１８９】
[0201]  一部の実施形態において、本開示のＤＮＡ編集方法は、インビトロで行われる。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、ｉ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト、及び少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分を、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲ複合体と一緒に含む混合物を形成する工程と、ｉｉ）前記混合物を、挿入ＤＮＡのｃＴＡＧ、及びその対応するモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトｃＴＡＧのＣＲＩＳＰＲ消化用の条件でインキュベートする工程と、続いてｉｉｉ）上述の各ｃＴＡＧの消化によって生じた適合する付着末端（Ｃｐｆ１の場合）をハイブリダイズさせる工程と、ｉｖ）前記ハイブリダイズされた末端（又はＣａｓ９が用いられるならば、平滑末端）を互いにライゲーションして、新しい組換え核酸を生じさせる工程を教示する。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼ処理が、（後の節に記載されるデュアルＣＲＩＳＰＲ消化のために）工程ｉｉｉ）のハイブリダイゼーションに先立って行われる。一部の実施形態において、本開示の消化は、挿入部分ＤＮＡ及びモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトについて、別々に行われる。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトのみが、ＣＲＩＳＰＲ複合体で消化される。
【０１９０】
インビトロＣｐｆ１
[0202]  一部の実施形態において、本開示のインビトロＤＮＡ編集方法は、下記のようにＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体により行われる。第一に、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分が、挿入部分のｃＴＡＧ、及びそれらの、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の対応するタグを標的とするＣｐｆ１  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートされる。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ及び挿入部分ＤＮＡの消化は、別個の反応で行われる。
【０１９１】
[0203]  第二に、一部の実施形態において、消化された生成物は精製されて、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが除去される。一部の実施形態において、精製は、消化されたヌクレオチドからの活性Ｃｐｆ１複合体の分離を包含する。一部の実施形態において、これは、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、Ｃｐｆ１不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１９２】
[0204]  第三に、消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び挿入部分は、Ｃｐｆ１複合体によって生じた適合する付着末端のハイブリダイゼーションに適した条件でインキュベートされる。次に、ハイブリダイズされた末端が、本開示の以前の部分で記載されたものが挙げられる、既知のあらゆるライゲーション方法に従ってライゲーションされる。
【０１９３】
インビトロＣａｓ９
[0205]  他の実施形態において、本開示のインビトロＤＮＡ編集方法は、下記のようにＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体により行われる。第一に、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分が、挿入部分のｃＴＡＧ、及びその、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内の対応するタグを標的とするＣａｓ９  ＣＲＩＳＰＲ複合体とインキュベートされる。一部の実施形態において、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡ及び挿入部分ＤＮＡの消化は、別個の反応で行われる。
【０１９４】
[0206]  第二に、一部の実施形態において、消化された生成物は精製されて、活性ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが除去される。一部の実施形態において、精製は、消化されたヌクレオチドからの活性Ｃａｓ９複合体の分離を包含する。一部の実施形態において、これは、ＤＮＡ精製、例えばゲル精製又はカラム精製を通して達成され得る。他の実施形態において、精製は、Ｃａｓ９不活化によって、例えば熱又は化学物質による不活化を通して達成され得る。
【０１９５】
[0207]  一部の実施形態において、Ｃａｓ９消化された生成物についての第３の工程は、平滑末端ライゲーションに適した条件で挿入部分をインキュベートするものである。
【０１９６】
Gibson編集
[0208]  他の実施形態において、本開示はまた、ＣＲＩＳＰＲ消化されたコンストラクトの配列及び／又は無傷の重なるｃＴＡＧ配列を含有する未消化挿入部分を編集するGibsonアセンブリ型の方法を教示する。ゆえに、一部の実施形態において、第３の工程は、Ｃａｓ９消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び挿入部分が、ｓｓＤＮＡエキソヌクレアーゼでさらに消化されて、３’突出部又は５’突出部のいずれかを生じさせるものである。一部の実施形態において、本開示は、ｓｓＤＮＡ消化に先立つ、非ＣＲＩＳＰＲ消化挿入部分を短くするためのｄｓＤＮＡエキソヌクレアーゼ消化を教示する。
【０１９７】
[0209]  次に、エキソヌクレアーゼ消化されたＤＮＡ部分は、ＣＲＩＳＰＲ複合体及びエキソヌクレアーゼ消化の組合せによって生じた適合する付着末端のハイブリダイゼーションに適した条件下でインキュベートされる。次に、ハイブリダイズされた末端が、本開示の以前の部分で記載されたものが挙げられる、既知のあらゆるライゲーション方法に従ってライゲーションされる。一部の実施形態において、ハイブリダイズされたＤＮＡは、ライゲーションに先立って、ポリメラーゼとインキュベートされて、欠けているＤＮＡ部分が満たされる。一部の実施形態において、本開示のエキソヌクレアーゼ消化は、ＣＲＩＳＰＲ不活化工程の前に行われる。
【０１９８】
[0210]  一部の実施形態において、消化された配列のライゲーションは、インビトロで起こってよい。
【０１９９】
[0211]  他の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１エンドヌクレアーゼによって消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト、及び少なくとも１つの未消化挿入部の末端を、ＨＤＲ複合体とアセンブルすることによって、前記消化されたモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト及び少なくとも１つの挿入ＤＮＡ部分の組換えをトリガーするインビトロ方法を教示する。
【０２００】
[0212]  本開示のＤＮＡ編集方法の一部の実施形態において、ＤＮＡ挿入部分は、第２のモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト内に含まれる。ゆえに、一部の実施形態において、本開示のＤＮＡ編集方法は、あるモジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクトから別のものへのＤＮＡ挿入部分の移入を含む。
【０２０１】
発現、精製、及び送達
[0213]  一部の実施形態において、本開示は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をコードするベクター、コンストラクト、及び核酸配列の方法及び組成物を教示する。一部の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質のトランスジェニック発現又は一過性発現用のプラスミドを教示する。一部の実施形態において、本開示は、以下に限定されないが、リガーゼ、リンカー、及びＮＬＳが挙げられる、本明細書中に記載される他のポリペプチドの１つ以上のタンパク質融合のためのインフレーム配列を含むキメラＣａｓ９又はＣｐｆ１タンパク質をコードするプラスミドを教示する。
【０２０２】
[0214]  一部の実施形態において、本開示のプラスミド及びベクターは、Ｃａｓ９／Ｃｐｆ１タンパク質をコードし、そしてまたｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ、及び／又は本開示のドナー挿入配列をコードすることとなる。他の実施形態において、操作された複合体の異なる成分は、１つ以上の異なるプラスミド中にコードされてよい。
【０２０３】
[0215]  一部の実施形態において、本開示のプラスミドは、複数の種にわたって用いられ得る。他の実施形態において、本開示のプラスミドは、形質転換されることとなる生物に合わせて調整される。一部の実施形態において、本開示の配列は、遺伝子が編集されることとなる生物において発現するようにコドン最適化されることとなる。当業者であれば、遺伝子編集に十分な発現をもたらすプロモータを用いることの重要性を認識するであろう。一部の実施形態において、異なる種用のプラスミドは、異なるプロモータを必要とすることとなる。
【０２０４】
[0216]  一部の実施形態において、本開示のプラスミド及びベクターは、注目する細胞において選択的に発現される。ゆえに、一部の実施形態において、本出願は、異所性プロモータ（ectopic promoter）、組織特異的プロモータ、発生調節プロモータ（developmentally-regulated promoter）、又は誘導プロモータの使用を教示する。一部の実施形態において、本開示はまた、ターミネータ配列の使用を教示する。
【０２０５】
[0217]  一部の実施形態において、本開示はまた、Ｃｐｆ１及び／又はＣａｓ９エンドヌクレアーゼタンパク質を発現させて精製する方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、本開示のタンパク質が、市販のいかなるタンパク質生成精製キット又はサービスによって生成されてもよいことを教示する。例えば、一部の実施形態において、本開示は、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ）、グルタチオンｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、又は他の精製タグキメラ融合によるベクター中へのＣａｓ９及び／又はＣｐｆ１のクローニング方法を教示する。一部の実施形態において、本開示は、種々の原核生物及び真核生物、並びに無細胞のタンパク質生成系を教示する。例えば、一部の実施形態において、本開示は、大腸菌（E. coli）BL21中でのタンパク質発現プラスミドの発現を教示する。一部の実施形態において、タンパク質生成系は、タンパク質毒性の影響を和らげるように誘導可能であろう。例えば、一部の実施形態において、本開示は、ＩＰＴＧ又はアラビノース誘導系を用いる方法を教示する。
【０２０６】
[0218]  一部の実施形態において、本開示はまた、親和性タグ（Ｈｉｓ−ニッケル、ＧＳＴ−グルタチオンその他）を含む、種々のタンパク質精製スキームを教示する。一部の実施形態において、本開示は、タンパク質精製のための未変性条件及び変性条件の双方を教示する。
【０２０７】
[0219]  他の実施形態において、本開示は、以下に限定されないが、GenScript（登録商標）、ThermoFisher（登録商標）、及びNovoProtein（登録商標）が挙げられる１つ以上のタンパク質生成サービスを介した、Ｃａｓ９及び／又はＣｐｆ１の生成を教示する。
【０２０８】
形質転換
[0220]  一部の実施形態において、本開示は、本明細書中で開示されるプラスミド及びベクターの形質転換の使用を教示する。当業者であれば、本開示のプラスミドが、本明細書の他の部分において記載される既知のあらゆる系を通して細胞に形質転換され得ると認識するであろう。例えば、一部の実施形態において、本開示は、粒子砲撃による形質転換、化学的形質転換、アグロバクテリウム形質転換、ナノスパイク形質転換、エレクトロポレーション、及びウイルス形質転換を教示する。
【０２０９】
[0221]  一部の実施形態において、本開示のベクターは、形質転換、形質移入、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、又はＴｉ媒介遺伝子移入が挙げられる種々の技術のいずれを用いて宿主細胞中に導入されてもよい。特定の方法として、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥデキストラン媒介形質移入、リポフェクション、又はエレクトロポレーションが挙げられる（Davis, L., Dibner, M., Battey, I., 1986“Basic Methods in Molecular Biology”）。形質転換の他の方法として、例えば、酢酸リチウム形質転換及びエレクトロポレーションが挙げられる（例えば、Gietz et al., Nucleic Acids Res. 27: 69-74 (1992)；Ito et al., J. Bacterol. 153:163-168 (1983)；及びBecker and Guarente, Methods in Enzymology 194:182-187 (1991)参照）。一部の実施形態において、形質転換された宿主細胞は、組換え宿主株と呼ばれる。
【０２１０】
[0222]  一部の実施形態において、本開示は、本開示の９６ウェルプレートロボット工学プラットフォーム及び液体ハンドリングマシンを用いる細胞の高スループット形質転換を教示する。
【０２１１】
[0223]  一部の実施形態において、本開示は、外因性タンパク質（Ｃｐｆ１／Ｃａｓ９及びＤＮＡリガーゼ）、ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃＲＮＡ／ＧｕｉｄｅＲＮＡ）、及びＤＮＡ（挿入ＤＮＡ部分又はモジュラーＣＲＩＳＰＲコンストラクト）を細胞中に入れる方法を教示する。これを達成する種々の方法が、以前に記載されており、タンパク質／ＲＮＡ／ＤＮＡの直接的な形質移入又はＤＮＡ形質転換に続くＲＮＡ及びタンパク質の細胞内発現が挙げられる（Dicarlo, J. E. et al.“Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems.”Nucleic Acids Res (2013). doi: 10.1093/nar/gkt135；Ren, Z. J., Baumann, R. G. & Black, L. W.“Cloning of linear DNAs in vivo by overexpressed T4 DNA ligase: construction of a T4 phage hoc gene display vector.”Gene 195, 303-311 (1997)；Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K. & Doudna, J. A.“Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.”Elife 3, e04766 (2014)）。
【０２１２】
[0224]  一部の実施形態において、本開示は、先に記載される１つ以上の選択マーカーによる形質転換細胞のスクリーニングを教示する。そのような一実施形態において、カナマイシン耐性マーカー（ＫａｎＲ）を含むベクターで形質転換された細胞が、有効な量のカナマイシン抗生物質を含有する培地上にプレーティングされる。カナマイシン入りの培地上で認識できるコロニー形成単位により、ベクターカセットのゲノム中への組込みが推定される。所望の配列の挿入が、関連する挿入部位のＰＣＲ、制限酵素分析、及び／又は配列決定を介して裏付けられ得る。
【０２１３】
[0225]  他の実施形態において、本開示の複合体の一部又は全体が、細胞に直接送達され得る。ゆえに、一部の実施形態において、本開示は、本開示のポリペプチド及び核酸の発現及び精製を教示する。当業者であれば、タンパク質及び核酸を精製するための多くの方法を認識するであろう。一部の実施形態において、ポリペプチドは、誘導可能なタンパク質生成系又は構成的タンパク質生成系、例えば細菌系、酵母系、植物細胞系、又は動物細胞系を介して発現され得る。一部の実施形態において、本開示はまた、親和性タグを介したタンパク質及び／若しくはポリペプチドの精製、又はカスタム抗体精製を教示する。他の実施形態において、本開示はまた、ポリヌクレオチドの化学合成方法を教示する。
【０２１４】
[0226]  一部の実施形態において、当業者であれば、遺伝子発現用のウイルスベクター又はプラスミドが、本明細書中で開示される複合体を送達するのに用いられ得ることを認識するであろう。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）が、リボ核タンパク質複合体をカプセルに入れるのに用いられ得る。そして、本明細書中で開示される精製されたリボ核タンパク複合体が精製されて、エレクトロポレーション又はエレクトロインジェクションを介して細胞に送達され得る。
【０２１５】
キット
[0227]  一部の実施形態において、本開示は、上述の方法及び組成物に開示される要素のいずれか１つ以上を含有するキットを提供する。一部の実施形態において、キットは、モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト、並びにキット及び必須のあらゆる試薬又は反応物質を用いるための使用説明書を含む。一部の実施形態において、ベクター系は、（ａ）モジュラーＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡコンストラクト、（ｂ）ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼタンパク質及び必須の標的ガイドＲＮＡ（又は前記部材をコードする配列）を含むＣＲＩＳＰＲ複合体、並びに、場合によっては（ｃ）本明細書中に記載される前掲の挿入ＤＮＡ部分を含む。
【０２１６】
[0228]  要素は、適切なあらゆるコンテナ、例えばバイアル、ボトル、若しくはチューブ、又は宿主細胞若しくはプラスミド中に、個々に提供されても組み合わせて提供されてもよい。一部の実施形態において、キットは、１つ以上の言語、例えば複数の言語の使用説明書を含む。
【０２１７】
[0229]  一部の実施形態において、キットは、本明細書中に記載される要素（例えば、精製されたＣｐｆ１エンドヌクレアーゼ）の１つ以上を利用するプロセスに用いられる１つ以上の試薬を含む。試薬は、適切ないかなるコンテナ内に提供されてもよい。例えば、キットは、１つ以上の反応バッファ又は貯蔵バッファを提供してよい。試薬は、特定のアッセイに使用可能である形態で提供されてもよいし、使用前に１つ以上の他の成分の付加を必要とする形態（例えば、濃縮した形態又は凍結乾燥された形態）で提供されてもよい。バッファは、いかなるバッファであってもよく、以下に限定されないが、炭酸ナトリウムバッファ、重炭酸ナトリウムバッファ、ホウ酸バッファ、トリスバッファ、ＭＯＰＳバッファ、ＨＥＰＥＳバッファ、及びそれらの組合せが挙げられる。一部の実施形態において、バッファはアルカリ性である。一部の実施形態において、バッファは、ｐＨが約７から約１０である。一部の実施形態において、キットは、ｃｒＲＮＡ配列及び調節要素を作動可能に連結するような、ベクター中への挿入用のｃｒＲＮＡ配列に対応する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【実施例】
【０２１８】
実施例
[0230]  以下の実施例は、本開示の種々の実施形態を具体的に説明する目的で与えられており、いかなる形であれ本開示を限定することを意味しない。本開示中での変更、及び特許請求の範囲によって定義される本開示の精神に包含される他の用途が、当業者に思い浮かぶであろう。
【０２１９】
実施例１：ワンポットインビトロモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング
[0231]  本実施例は、ワンポット反応における、あるプラスミドから別のものへの挿入物の移入による、プラスミド１３００１００９０８６（配列番号８２）の生成を記載する。図４参照。
【０２２０】
[0232]  双方のプラスミドが、注目する領域の側面に位置するクローニングタグ（ｃＴＡＧ  Ｋ［配列番号７８］／ｃＴＡＧ  Ｌ［配列番号７９］及びｃＴＡＧ  Ｋ’［配列番号８０］／ｃＴＡＧ  Ｌ’［配列番号８１］）を有する。編集されたプラスミドに向けてクローニング反応を駆動するために、Ｃｐｆ１スペーサは、レシピエントプラスミド及びドナープラスミド（それぞれＫ／Ｋ’及びＬ／Ｌ’）上で相対する向きにある。このインサイドアウト／アウトサイドイン消化により、最終生成物中のＣｐｆ１スペーサを除去して、所望の生成物の再切断を除外する（図４中の、‘４８５プラスミドにおけるインサイドアウト消化及び‘７８４プラスミドにおけるアウトサイドイン消化を示す湾曲した矢印参照）。Ｃａｓ９スペーサは残って、この部位での反復編集（iterative editing）が可能となる。ゆえに、ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒコンストラクトは、反復編集を可能にする迅速な単一ポット反応スキームを可能にする。
【０２２１】
[0233]  Ｃｐｆ１タンパク質をGenscriptによって、そしてｃｒＲＮＡをSynthegoによって合成した。ワンポット切断／ライゲーション反応のために、ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ１及びｃｒＲＮＡ３）と複合体形成したＣｐｆ１タンパク質を、ＡＴＰを含有するバッファ中のプラスミド（１３０００７８９４８５−配列番号８３及び１３０００８２３７８４−配列番号８４）及びＤＮＡリガーゼに加えた。これらの成分を、切断及びライゲーション用に最適化した温度にて循環させた。
【０２２２】
[0234]  反応物を、大腸菌（E. coli）に形質転換して、陽性クローンを配列決定して、新しい挿入物の挿入及びＣｐｆ１スペーサの喪失を裏付けた。
【０２２３】
[0235]  欠失のために、用いたクローニングタグ内のＣｐｆ１部位は、プラスミドクロージャを可能にするような適合する突出部を生成しなければならない。ｃＴＡＧ  Ｌ’を、２つのＣｐｆ１スペーサ（１つは、突出部がｃＴＡＧ  Ｋ’と適合しない挿入用の、そして第２のものは、突出部がｃＴＡＧ  Ｋ’と適合する欠失用のものである）を含有するように設計した。
【０２２４】
実施例２：インビトロモジュラーＣＲＩＳＰＲクローニング
[0236]  本実施例を、ＣＲＩＳＰＲクローニングの柔軟性を確認するために設計した。最初の工程として、カナマイシン耐性遺伝子又はクロラムフェニコール耐性遺伝子をコードするいくつかの耐性プラスミドを、ソースベクターｐｚＨＲ０３９（配列番号１００）及び１３０００２２３３７０（配列番号１０１）からそれぞれ作出した。カナマイシン耐性プラスミドをそれぞれ、ＧＦＰ遺伝子の側面に位置する種々のＣｐｆ１ランディング部位を含むように設計した（消化したときに、当該プラスミドは「カナマイシン耐性プラスミド骨格」を生成する）。クロラムフェニコール耐性プラスミドをそれぞれ、クロラムフェニコール耐性遺伝子の側面に位置する種々のＣｐｆ１ランディング部位を含むように設計した（消化したときに、当該プラスミドは「クロラムフェニコール耐性挿入物」を生成する）。本実施例で用いた各プラスミドについての配列及びベクターマップを、表２に開示する。
【０２２５】
[0237]  各カナマイシン耐性プラスミド及びクロラムフェニコール耐性プラスミドを、最初に、ＩＩ型制限酵素ＫｐｎＩ−ＨＦ及びＰｖｕＩ−ＨＦ（双方ともNEBから市販されている）でそれぞれ線状化した。各プラスミド上のＫｐｎＩ制限部位及びＰｖｕＩ制限部位の位置を、図７〜図１４に記載するベクターマップ中に示す。線状化の後、耐性プラスミドはもはや、細菌宿主系において自己複製できなかった。
【０２２６】
[0238]  次に、線状化した耐性プラスミドを、１５ｕｇ（１．５８ｕＭの最終濃度）のＣｐｆ１酵素及び２ｕＬの以下に記載する５ｕＭ各ガイドＲＮＡ（０．１６７ｕＭの最終濃度）のプレインキュベートした混合物と６０ｕＬの反応で混合して、活性ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成した。
【０２２７】
[0239]  本実施例で用いたＣｐｆ１酵素は、IDTから商業的に得た。Ｃｐｆ１は、アシダミノコッカス（Acidaminococcus）属種Ｃｐｆ１（ＡｓＣｐｆ１）から得た。酵素をさらに、１つのＮ末端核局在配列（ＮＬＳ）及び１つのＣ末端ＮＬＳ、並びに３つのＮ末端ＦＬＡＧタグ及び１つのＣ末端６−Ｈｉｓタグを含むように修飾した。
【０２２８】
[0240]  本実施例で用いたガイドＲＮＡは、IDTから特注した。各ガイドＲＮＡを、線状化された耐性プラスミド内に位置決めした様々なＣＲＩＳＰＲランディング部位を標的とするように設計した。本実施例において、骨格プラスミドのＣｐｆ１ランディング部位を切り出したが、挿入物のライゲーション直後に回復させた。表２は、用いた各ガイドＲＮＡのガイド配列部分を示す。このように、ＧＦＰ遺伝子を各カナマイシン耐性プラスミドから切り出して、カナマイシン耐性プラスミド骨格を生成するように、混合物中のＣＲＩＳＰＲ複合体を設計した（図５、第２のパネル参照）。また、クロラムフェニコール耐性遺伝子をクロラムフェニコール耐性プラスミドから切り出して、クロラムフェニコール耐性挿入物を生成するように、混合物中のＣＲＩＳＰＲ複合体を設計した（図５、第２のパネル参照）。同様に、末端のハイブリダイゼーションが生じて、カナマイシン及びクロラムフェニコール「デュアル耐性」プラスミドを生成することとなる適合する突出部が生じるように、各反応のカナマイシン耐性プラスミド骨格及びクロラムフェニコール耐性挿入物を設計した。
【０２２９】
[0241]  Ｃｐｆ１及びガイドＲＮＡを含む線状化耐性プラスミド混合物を、メーカーの推奨するＣｐｆ１バッファ中で摂氏３７度にて３時間インキュベートした。選択した反応物をアガロースゲル上でランさせて、生じたフラグメントを、標準的なＤＮＡ抽出キット（Zymo Researchキット、メーカーの使用説明書に従って用いた）を用いて精製した。精製（対照）及び未精製（試験）。
【０２３０】
[0242]  カナマイシン耐性プラスミド骨格及びクロラムフェニコール耐性挿入物（それぞれ２つの適合するＣｐｆ１付着末端を含む）を含むＤＮＡフラグメントを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（NEBから市販されている）を有する、又は有していない新しい反応内で組み合わせて、ＮＥＢ１０−Ｂ細胞（NEBから市販されている）に形質転換した。形質転換細胞を、機能耐性プラスミドを含有しないあらゆる細胞の増殖を妨げるように設計した、カナマイシン及びクロラムフェニコールの双方を補った培地上にプレーティングした。
【０２３１】
[0243]  個々のコロニーを、配列決定のために送って、Ｃｐｆ１クローニングの接合部を裏付けた。また、回収したコロニーを、表２に記載するプライマーを用いるＰＣＲを介して確認した。図５は、先で記載した一般的な実験設計を示すが、プラスミドを、先で記載したように、Ｃｐｆ１消化に先立って線状化した。
【０２３２】
【表２】
2020507312.tif 000004
【０２３３】
【表３】
2020507312.tif 000005
【０２３４】
【表４】
2020507312.tif 000006
【０２３５】
【表５】
2020507312.tif 000007
【０２３６】
[0244]  本実験の結果を、表３及び図６に示す。各形質転換についての反応番号を、最上部の行に沿って示しており、用いたガイドＲＮＡを、表３の左側の欄に沿って一覧にしている。リガーゼを有する、又は有していない同じＣｐｆ１反応の比較は、リガーゼ酵素の存在下で、形質転換体において９．９倍の増大を示した。このことは、コロニー成長が、Ｃｐｆ１消化後のカナマイシン及びクロラムフェニコールの二重耐性プラスミドの形成に起因したことを示す。リガーゼなし反応は、反応が特異的であることを確立するために設計した対応対照であり、未消化の耐性プラスミドの汚染レベルの存在に単純に起因しなかった。
【０２３７】
[0245]  個々の１６コロニーをサンガー配列決定して、上流側及び下流側のクローニング接合部の双方を確認した。７つの上流側で配列決定した接合部のうち７つ、そして９つの下流側の接合部のうち８つにおいて、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによる反応由来のＣｐｆ１媒介クローンは、正確な消化及びライゲーションを示した。
【０２３８】
[0246]  反応物７１及び７２を、ＤＮＡゲル精製工程にかけなかったＣｐｆ１消化プラスミドで形質転換した。しかしながら、Ｃｐｆ１酵素を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの付加前に、供給者の使用説明書に従って熱不活化した（反応７２）。反応７１及び７２は、同じリガーゼ依存性を示した。
【０２３９】
【表６】
2020507312.tif 000008
【０２４０】
[0247]  ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４２２４５（国際公開第２０１８／０１３９９０号、米国仮特許出願第６２／３６２，９０９号の優先権を主張）の開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０２４１】
実施例３：ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ設計を用いる、制限酵素消化及びライゲーションによるプラスミドアセンブリ
[0248]  本実施例は、本開示の方法に従う、モジュラーＣＲＩＳＰＲベクターの遺伝的編集を記載する。図１５は、本実施例に記載するモジュラーＣＲＩＳＰＲプラスミド１３０００４４４５９１の遺伝的編集を示す。第一に、以前に構築したプラスミドから「スタッファ」挿入ＤＮＡ部分を除去することによって、プラスミド骨格を調製した。スタッファ部分の側面に位置するクローニングタグ（ｃＴＡＧ）Ｄ（配列番号６８）及びＥ（配列番号６９）を制限酵素ＡｐａＩ及びＰｖｕＩで消化することによって、スタッファ挿入ＤＮＡ部分を除去した。生じたフラグメントを、ゲル電気泳動を介して分離して、プラスミド骨格に対応する所望の８．３ｋｂのフラグメントをゲルから切り出して、標準的なシリカ膜カラムを用いて抽出した。
【０２４２】
[0249]  モジュラーＣＲＩＳＰＲベクター用の新しい挿入部を生成するために、ｃＴＡＧ  Ｄ及びｃＴＡＧ  Ｅが側面に位置する所望の挿入ＤＮＡ部分を、ユニバーサルｃＴＡＧオリゴｔａｇＤ＿ＦＷＤ（配列番号７５）及びｔａｇＥ＿ＲＥＶ（配列番号７６）を用いてＰＣＲ増幅した。生じた挿入物は、ｃＴＡＧ  Ｄ及びｃＴＡＧ  Ｅが側面に位置するＧＦＰマーカー遺伝子を含有した。生じたＰＣＲフラグメントを、ｃＴＡＧ  Ｄ内を切るＡｐａＩ酵素及びｃＴＡＧ  Ｅ配列内を切るＰｖｕＩ酵素で消化した。消化した挿入ＤＮＡ部分を、標準的なシリカ膜カラムを用いて精製した。
【０２４３】
[0250]  精製したモジュラーＣＲＩＳＰＲベクター骨格及び挿入ＤＮＡ部分を、リガーゼにより単一の反応物に組み合わせて、環状プラスミドを生成した。生じた編集ＧＦＰ含有プラスミド１３０００４４４５９１の配列を、配列番号７７に記載する。
【０２４４】
実施例４：ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒ設計を用いる、酵母相同組換えによるプラスミドアセンブリ
[0251]  ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒタグが側面に位置するＰＣＲフラグメントの酵母相同組換えによって、プラスミド１３０００２８３３９９（配列番号８５）をアセンブルした。アセンブリに所望されるコンストラクトを、特異的なＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒタグが側面に位置するように、ＰＣＲによって増幅した。当該タグにより、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）におけるフラグメントの指向性アセンブリが可能となった。というのも、タグそれ自体が、相同組換え用の重なる相同領域として機能したからである。具体的には、５つのフラグメントを、以下のように、ＭｅｇａＭｏｄｕｌａｒタグが側面に位置するＰＣＲを介して増幅した：タグＡ−フラグメント１−タグＢ；タグＢ−フラグメント２−タグＣ；タグＣ−フラグメント３−タグＤ；タグＤ−フラグメント４−タグＥ；及びタグＥ−フラグメント５−タグＦ。これらのフラグメントを、酵母の複製起点及びＴＲＰ栄養要求性選択マーカーを含有する線状化アセンブリベクター、並びに一方の端部のタグＡ及び他方のタグＦと共に、出芽酵母（S. cerevisiae）に形質転換した。アセンブルした環状プラスミドを、トリプトファンを欠く培地中での出芽酵母（S. cerevisiae）増殖によって選択した。当該プラスミドを回収して、大腸菌中で増幅させて、正確な高次構造を配列決定によって裏付けた。
【０２４５】
参照による組込み
[0252]  本明細書中で引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願は、全ての目的について、その全体が参照によって組み込まれる。しかしながら、本明細書中で引用されるいずれの参考文献、記事、刊行物、特許、特許公報、及び特許出願への言及も、これらが有効な先行技術を構成するという示唆の容認でもいかなる形態でもないし、且つそうとられるべきでないし、世界中のいずれの国においても共通の一般的知識の一部を形成しないし、且つそうするべきでない。
【図１Ａ−Ｂ】
2020507312.tif 000009
【図１Ｃ】
2020507312.tif 000010
【図２Ａ】
2020507312.tif 000011
【図２Ｂ−Ｃ】
2020507312.tif 000012
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
2020507312.tif 000018
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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