(57)【要約】【課題】  【解決手段】  遺伝子発現を抑制する二本鎖ＲＮＡに関し、特に前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効な低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡが提供される。また、前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを含有する薬剤組成物も提供される。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的なＲＮＡ配列であって、前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効なＲＮＡ配列を有することを特徴とする低分子干渉ＲＮＡ。
【請求項２】
ＶＥＧＦレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的なＲＮＡ配列であって、前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効なＲＮＡ配列を有することを特徴とする低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦレセプターはＶＥＧＦレセプター２であることを特徴とする、請求項１又は請求項２記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項４】
前記ＶＥＧＦレセプター２の３’−ＵＴＲ配列に同一又は相補的なＲＮＡ配列を有するものであることを特徴とする請求項３記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項５】
前記ＲＮＡ配列は配列番号１の配列を有するものであることを特徴とする請求項３記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項６】
前記３’−ＵＴＲ配列は、配列番号２のＤＮＡの４３７５〜５８３０塩基であることを特徴とする請求項４記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項７】
前記ＲＮＡ配列は二本鎖ＲＮＡであり、この二本鎖領域は１５塩基以上であることを特徴とする請求項１又は２記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項８】
前記ＲＮＡ配列は３’末端に突出した一本鎖領域を有するものであることを特徴とする請求項１〜３記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ。
【請求項９】
対象物におけるＶＥＧＦレセプターの発現を有効に抑制する量の請求項１又は２記載の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡと、
その薬学的に許容される担体と
を有することを特徴とする薬剤組成物。
【請求項１０】
前記薬剤組成物は、病的血管新生に関連した疾患を治療するためのものであることを特徴とする請求項９記載の薬剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子発現を抑制する二本鎖ＲＮＡに関し、特に前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効な低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡに関するものである。また本発明は、前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを含有する薬剤組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近、基礎研究の観点からも臨床応用の観点からも非常に注目されている研究課題として血管新生がある。【０００３】
この血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管から分岐を生じて血管内皮細胞が増殖し、平滑筋細胞に囲まれた強固な血管ネットワークを形成する組織形態反応である。血管新生は個体の発生、発育に必須の生命現象であるが、成熟した個体においては性周期に関連する卵巣などを除きほとんど見られない。【０００４】
これに対して、最近の研究から、癌などの様々な病気で病的血管新生が生じることが報告された。Ｆｏｌｋｍａｎらによって示されたように、直径数ｃｍ以上の固形癌の増殖には、腫瘍血管からの栄養と酸素の供給が極めて大きな役割を果たす。それだけでなく、固形癌はこの腫瘍血管を転移の経路として用い、転移先で再び血管新生を誘発する。さらにこの病的血管新生は、糖尿病性網膜症、リウマチ様関節炎など多くの疾患の進展・悪性化に深く関与していることが明らかにされている。従って、病的血管新生をコントロールすることは臨床上非常に重要と考えられてきたが、その分子メカニズムは長い間不明確であった。【０００５】
しかし、最近その基本的な機構として内皮細胞の増殖・分化に関わっていると考えられる、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とそのレセプターＶＥＧＦＲ（ＶＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ｆｌｔキナーゼ）が明らかにされた。【０００６】
ＶＥＧＦは、１９８３年に米国のＳｅｎｇｅｒらによって新しい血管透過性因子（ＶＰＦ：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ｆａｃｔｏｒ）として見出された。さらに同時期に、米国ジェネンティクのＦｅｒｒａｒａらは内皮細胞に特異的に作用する増殖因子を見出し、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）と命名した。後の研究により、ＶＰＦ及びＶＥＧＦは異なる生物活性を指標にして得られたにも関わらず、同じ遺伝子の産物であることが明らかになった。このＶＥＧＦは線維芽細胞や上皮細胞には全く増殖活性を示さず、一方臍帯静脈内皮細胞、大動脈由来内皮細胞など、あらゆる内皮細胞に増殖活性を示すものであった。このように内皮細胞に対して厳密な特異性を持つ増殖因子の発見は初めてであり、その構造や受容体に関して非常に興味が持たれた。【０００７】
その後の研究により、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプターファミリーのシグナルメカニズムが明らかにされてきた。例えば、腫瘍細胞では、低酸素に応答してＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現が誘導され、産生されたＶＥＧＦは内皮細胞にほぼ限局して発現する受容体型チロシンキナーゼＶＥＧＦレセプター（ＶＥＧＦＲ）−１、−２に結合してレセプターの自己リン酸化を誘導する。活性化されたレセプターのシグナルにより内皮細胞は細胞外基底膜を分解し、増殖・遊走する。こうしたＶＥＧＦ及びＶＥＧＦレセプターのシグナルによるパラクライン系は、血管新生のシグナルの中心に位置付けられている。ＶＥＧＦレセプターは３種類の遺伝子からなるが、中でも特にＶＥＧＦＲ−２が血管新生・血管内皮細胞の増殖・遊走に中心的な役割を果たしていることが、これまでに明らかにされている。【０００８】
以上のようにＶＥＧＦは病的血管新生で中心的な役割を果たすことから、ＶＥＧＦ及びその受容体（ＶＥＧＦＲ）は血管新生阻害の重要な標的と考えられてきた。これまでに抗ＶＥＧＦ抗体（Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，２３３５〜２３４２）、ＶＥＧＦＲ−２に対する中和抗体（Ｗｉｔｔｅ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  １７，１５５〜６１；Ｚｈｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｌｕｋｅｍｉａ  １７，６０４〜６１１）、ＶＥＧＦＲのチロシンキナーゼに対する特異的阻害剤（Ｆｏｎｇ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９，９９〜１０６)、遊離型ＶＥＧＦＲ−１によるＶＥＧＦのトラップ（Ｈｏｌａｓｈ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，１１３９３〜８）などについて臨床治験が行われている。しかし、作製・精製にコストがかかる、大量投与が必要である、特異性が低く副作用を生じる可能性があるなど、実用化には至っていないのが現状である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って、本発明はこのような課題に鑑みてなされたものであり、血管新生を有効に阻害するための新規組成物であって、作製・精製にコストがかからず、特異性が高い組成物を提供することを目的とするものである。【００１０】
本発明者らは、上記目的を達成するため、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術に着目した。すなわち、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術の（１）遺伝子発現の阻害特異性が極めて高い、（２）合成法や発現系が確立されており、投与量も少なくコストも安い、という特徴に着目し、ＶＥＧＦＲに対する低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡが、効果的な血管新生阻害作用を示すのではないかという知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、ＶＧＥＦレセプターの発現を抑制するのに有効なＲＮＡ配列の同定に成功し、この配列を有する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を得たものである。【００１１】
すなわち、本発明の第１の主要な観点によれば、ＶＥＧＦレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的なＲＮＡ配列であって、前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効なＲＮＡ配列を有することを特徴とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が提供される。特に前記ＶＥＧＦレセプターは、これに限定されるものではないが、ＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ−２）である。【００１２】
このような構成によれば、例えば対象物へ導入することにより、対象物のＶＥＧＦＲの発現を効果的に且つ特異的に抑制する低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを得ることができる。【００１３】
さらに、前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡのＲＮＡ配列は配列番号１の配列を有するものである。【００１４】
本発明の１実施形態において、前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡは、前記ＶＥＧＦレセプター２の３’−ＵＴＲ配列に同一又は相補的なＲＮＡ配列を有するものである。ここで前記３’−ＵＴＲ配列は、これに限定するものではないが、配列番号２のＤＮＡの４３７５〜５８３０塩基であることが好ましい。【００１５】
前記ＲＮＡ配列は二本鎖ＲＮＡであり、これに限定されるものではないが、この二本鎖領域は１５塩基以上であることが好ましい。さらに前記ＲＮＡ配列は３’末端に突出した一本鎖領域を有するものである。【００１６】
また、本発明の第２の主要な観点によれば、対象物におけるＶＥＧＦレセプターの発現を有効に抑制する量の前記低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡと、その薬学的に許容される担体とからなる薬剤組成物が提供される。このようにして得られた薬剤組成物によれば、病的血管新生に関連した疾患を治療することが可能になる。【００１７】
この発明の更なる特徴及び顕著な効果は、次に記載する発明の実施の形態の項の記載から当業者にとって明らかになるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本明細書に参照されている参考資料及び科学文献は当業者の知識を確立するために参照され、それぞれ開示された内容はこの参照により組み込まれる。【００１９】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術
近年、新しい遺伝子機能解析としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術が、バイオ業界においてのみならず、医学業界においても注目されている。すなわちこのＲＮＡ干渉技術を、病気を引き起こす遺伝子の発現（並びにタンパク質合成）を阻止する新しいツールとして用いる試みがなされている。ＲＮＡ干渉とは、細胞内に二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を導入すると、これと同じ配列を有するｍＲＮＡが特異的に分解される現象であり、１９９８年に線虫で最初に報告された（Ｆｉｒｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，８０６〜８１１）。その後ＲＮＡ干渉は昆虫、植物などで保存された、核酸レベルの生体防御機構であることが示唆されている。【００２０】
線虫などにおいてｄｓＲＮＡはＤｉｃｅｒと呼ばれるタンパク質により３’末端側に２塩基のオーバーハングを持つ２１塩基の二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）にプロセッシングされ、この低分子干渉ＲＮＡは、ＲＮＡｉ実行タンパク質（ＲＮＡｉ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ：ＲＩＳＣ）と呼ばれる複合体に取り込まれる。二本鎖低分子干渉ＲＮＡはＲＩＳＣに取り込まれた後、一本鎖に解離すると考えられている。ＲＩＳＣは、この一本鎖に相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合し、これを分解すると考えられている。【００２１】
哺乳類細胞へのＲＮＡ干渉の応用は難しいと考えられてきたが、２００１年にＴｕｓｃｈｌらのグループにより、二本鎖低分子干渉ＲＮＡを細胞に導入することで、ＲＮＡ干渉が可能であることが明らかにされた（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，４９４〜４９８）。【００２２】
さらに、ＲＮＡｉを行うことを目的として、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写されるプロモーター系を利用して転写されるヘアピン構造を有する、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が開発されている。このｓｈＲＮＡはループ部分が細胞内で分解されて、ｓｉＲＮＡと同様の構造をとると考えられる。【００２３】
このＲＮＡ干渉はＲＮＡサイレンシングとも呼ばれており、標的ｍＲＮＡの特異的な分解を促進することにより標的タンパク質の発現を特異的に抑制することができるため、医療分野での応用に非常に期待されている。ただし実際の治療は現在まで報告されていない。【００２４】
しかしながら、本発明者らは、上述のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術の（１）遺伝子発現の阻害特異性が極めて高い、（２）合成法や発現系が確立されており、投与量も少なくコストも安い、という特徴に着目し、ＶＥＧＦＲに対する低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡが、効果的な血管新生阻害作用を示すのではないかという知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、以下に述べるいくつかの性質を併せ持つＲＮＡの作製に成功したものである。【００２５】
すなわち、本発明によれば、ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効なＲＮＡ配列を有することを特徴とする低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡが提供される。【００２６】
ＶＥＧＦレセプター低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡ
最近、多くの研究により、癌などの様々な疾患の進展・悪性化が、病的血管新生に依存していることが明らかになった。つまりこの病的血管新生を効果的に抑制することができれば、病的血管新生に関連した疾患の新しい治療方法を確立できるのではないかと期待されていた。【００２７】
生体内の血管新生シグナルにおいて、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子：ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）が中心的な役割を果たすことが明らかになり、そのレセプター（受容体）は血管新生阻害の重要な標的と考えられてきた。これまでに、抗体や特異的阻害剤など、ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦレセプターを標的とした血管新生阻害剤が開発・臨床治験が行われてきたが、コストが高い、特異性が低く副作用が生じる、などの問題があり、実用化にはまだ至っていない。一方、本発明者らは、最近報告されたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）技術に着目し、ＶＥＧＦレセプターに対する低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡは効果的な血管新生阻害作用を示すのではないかという知見を得、これに基づいて誠意検討、実験を重ねた結果、以下に述べるいくつかの性質を併せ持つＲＮＡの作製に成功した。【００２８】
これまでの研究により、ＶＥＧＦとその受容体であるＶＥＧＦレセプターの生物学的活性は、ほとんどが内皮細胞に限局していることが明らかにされている。
また内皮細胞上のＶＥＧＦ高親和性受容体として、ＶＥＧＦレセプター１（Ｆｌｔ−１）とＶＥＧＦレセプター２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）の２分子が同定されている。従って、ＶＥＧＦの基本的な作用はこれら２つの受容体型チロシンキナーゼの自己リン酸化を介して引き起こされていると考えられた。【００２９】
このＶＥＧＦレセプターファミリーの中では、ＶＥＧＦレセプター２が血管新生・血管内皮細胞の増殖・遊走において中心的な役割を果たしている。すなわちＶＥＧＦレセプター１のリン酸化は、ＶＥＧＦレセプター２に比べるとかなり弱く、血管内皮細胞の増殖・遊走へのシグナルの寄与は低いと考えられた。また、ＶＥＧＦレセプター３は主にリンパ管内皮細胞に発現し、生体における血管内皮細胞の増殖には関与しないとされている。【００３０】
そこで本発明者らは、ＲＮＡ干渉技術を用いてＶＥＧＦレセプター２の発現を抑制することによって、血管新生を効果的に阻害できるかを検証するために、ＶＥＧＦレセプター２の核酸配列の一部と同一又は相補的なＲＮＡ配列を有する低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピンＲＮＡを作成し、ヒト臍帯静脈血管内皮（ＨＵＶＥ：ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）細胞に導入した結果、前記ＶＥＧＦレセプター２の発現が有効に抑制されることを明らかにした。【００３１】
また、本発明の１実施例に従うと、前記低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡは、ＶＥＧＦレセプター２の発現の抑制に有効なＲＮＡ配列に同一又は相補的な配列を有しており、前記ＲＮＡ配列は前記ＶＥＧＦレセプター２の３’−ＵＴＲ（非翻訳領域）配列である。本発明において前記３’−ＵＴＲ配列を標的配列とすることは、対照実験の点からも有益である。すなわち、低分子干渉ＲＮＡを用いてＶＥＧＦレセプター２の発現を抑制し、生理的な効果を観察した場合、機能対照（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＶＥＧＦレセプター２をさらに導入したときに、この効果が打ち消されるかどうかを検討することが望ましい。本発明において３’−ＵＴＲを標的配列とすることにより、この３’−ＵＴＲを含まない翻訳領域だけのｃＤＮＡを発現させることで、機能対照実験を容易に行うことが可能になる。【００３２】
ただし、本発明において、前記ＲＮＡ配列は３’−ＵＴＲ配列に限定されるものではなく、対象物中でＶＥＧＦレセプター２の発現を有効に抑制できる配列であればよい。【００３３】
また本発明に従って作成された前記低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡは、点変異や欠損を導入したｃＤＮＡを導入することで、ＶＥＧＦレセプター２のどのアミノ酸が機能に重要であるかを解析することが可能である。さらに、本発明の前記低分子干渉ＲＮＡ又は低分子ヘアピンＲＮＡの配列は、他の多数の低分子干渉ＲＮＡと一緒にデータベース化することで、有用なｄｓＲＮＡを探索する指標となり得る。【００３４】
本発明において提供されるＶＥＧＦレセプター２の発現の抑制に有効な低分子干渉ＲＮＡを作成する方法としては、本発明の１実施例に従うと、化学合成で作製した一本鎖ＲＮＡをアニールさせる方法がある。これによって作成された前記低分子干渉ＲＮＡの構造は、３’末端に一本鎖の突出を有しており、好ましくは２塩基のオーバーハングである。さらに二本鎖部分は１５塩基以上、好ましくは１８塩基以上、最も好ましくは１９塩基である。【００３５】
さらに、本発明において前記低分子干渉ＲＮＡを対象物へ導入する方法は、例えば細胞へ導入する場合、ＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅやＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯなどの市販されている形質移入試薬を用いて行われる。また、動物への導入法としては、卵へのインジェクション、アテロコラーゲンを利用した生体投与、カチオニックリポソームを用いた投与などを用いて行われる。しかしこのような方法だけでなく、他の公知技術を用いて行われ得る。【００３６】
また、本発明のＶＥＧＦレセプター２の発現の抑制に有効な低分子ヘアピンＲＮＡを作成する方法としては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩにより転写されるプロモーターを利用して転写する方法がある。本発明の１実施例に従うと、例えばプロモーターとしてはＨ１プロモーター、Ｕ６プロモーター、ＣＭＶプロモーターが用いられる。さらにベクターの種類としては、プラスミド、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスが用いられる。またこれらの作製に際して、制限酵素によるライゲーション（連結）反応の他に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰを使用した組換え反応なども使用可能である。これらのベクターのうち、プラスミドはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅなど、市販されている形質移入試薬を用いて、細胞に導入することが可能である。その他のウイルスベクターは、本発明分野では標準的な感染操作によって細胞へ導入することができる。また、これらのベクターは、局所投与、静脈注射などにより生体への投与が可能である。【００３７】
さらに、本発明で得られた、対象物におけるＶＥＧＦレセプターの発現を有効に抑制する量の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡと、薬学的に許容される担体とを有することを特徴とする薬剤組成物が提供される。前記薬剤組成物は、癌、糖尿病性網膜症、リウマチ性関節炎など、病的血管新生に関連した疾患を治療するために用いてもよい。【００３８】
１実施例において、本発明の１実施形態で得られた低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＫＤＲ）発現ベクターを検討した。本発明者らは、このウイルスベクターが、線維芽細胞との共培養システムにおいてヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞の、血管新生の指標の１つである２次元管腔形成を阻害することを明らかにした。この結果は、本発明の１実施形態で得られた低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡが、抗血管新生療法においてＲＮＡ干渉技術を導入するための有用であるということを強く示唆している。【００３９】
薬剤組成物という観点に関し、本発明の低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡは以下の：（１）標的が厳密に遺伝子配列に依存するため、特異性が高く作用すること、（２）細胞内に取り込まれた低分子干渉ＲＮＡは遺伝子発現抑制の効果を一週間程度持続するため、投与回数当たりの効果が高いと期待される、（３）他の既存のＶＥＧＦレセプター２阻害剤とは異なる作用機序のため、併用による相乗的な効果が高いと考えられる、（４）ベクターを用いた低分子ヘアピンＲＮＡとして使用した場合、コストが安く済む、という点で、有益な効果を有すると考えられる。【００４０】
また、本発明の１実施形態で得られたＶＥＧＦレセプター２の発現を有効に抑制する低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡを用いて、（１）ＶＥＧＦレセプター２は造血性幹細胞において発現しているので、これら幹細胞から血球系細胞への分化を抑制する、（２）ＶＥＧＦレセプター２は神経系で機能する可能性が示唆されており、こうした機能を制御することも可能であると推測される。【００４１】
次に、以下の実施例において本発明に係る、ＶＥＧＦレセプターの核酸配列の一部と同一又は相補的なＲＮＡ配列であって、前記ＶＥＧＦレセプターの発現の抑制に有効なＲＮＡ配列を有することを特徴とする低分子干渉ＲＮＡ／低分子ヘアピンＲＮＡの作成とその効果の一例を説明する。
【実施例１】
【００４２】
ｄｓＲＮＡ、形質移入
本発明の好ましい実施形態で用いられるｄｓＲＮＡは、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅから購入した。このｄｓＲＮＡの標識化（ラベリング）にはＬａｂｅｌｌＴ  ｓｉＲＮＡ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｃｙ３キット（Ｍｕｒｕｓ）を用いた。ｄｓＲＮＡの形質移入は、使用説明書に従ってＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ）を用いて行った。【００４３】
ＲＮＡ単離及びＲＴ−ＰＣＲ
ヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）は日常的にＨｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２（Ｋｕｒａｂｏ）中で維持された。ＨＵＶＥＣは１．６ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／３．５ｃｍ  ｐｌａｔｅで播種され、ｓｉＲＮＡ形質移入は翌日実行された。４８時間後、総ＲＮＡをグアニジンチオシアネートフェノールクロロホルムを用いた標準プロトコール手段によって単離された。使用説明書に従って１μｇＲＮＡからＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に以下に記載されているプライマーを用いてＰＣＲを行った：
ＶＥＧＦＲ‐２の翻訳領域
５’‐ＴＴＧＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＴＣＴＧＴＴＡＣＡＧＣ‐３'
５’‐ＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡＴＡＣＣＡＣ‐３'
ＶＥＧＦＲ‐２の３'非翻訳領域
５’‐ＧＧＡＧＣＣＡＧＴＣＴＴＣＴＡＧＧＣＡＴＡ‐３'
５’‐ＣＣＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＣＡＧＡＣＡＴ‐３'
ＶＥＧＦＲ−１
５’‐ＡＧＣＴＧＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＴＴＡＣＣ‐３'
５’‐ＧＡＧＴＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＧＧＴ‐３'
ＶＥＧＦＲ−３
５'‐ＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＡＣＣＧＴＧＧＣ‐３'
５’‐ＧＴＣＴＣＴＣＡＣＧＣＧＣＴＧＧＣＡＧＡ‐３'
ＧＡＰＤＨ
５’‐ＴＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＧＡ‐３'
５’‐ＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＴＣＡＧ‐３'
ＰＣＲ条件としては、９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で９０秒を２５サイクルである。ＶＥＧＦＲ−１の場合は９４℃で１５秒、５５℃で３０秒、７２℃で６０秒を４０サイクル行った。【００４４】
ＶＥＧＦ刺激及び細胞抽出
１．６ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／３．５ｃｍ  ｐｌａｔｅのＨＵＶＥＣは上述と同条件で形質移入された。４８時間後、細胞は増殖因子非含有の培地（ＥＧＭ２、０．４％ウシ胎児血清）で１４時間培養された。ＶＥＧＦＲ−２を刺激するためにｈｒ−ＶＥＧＦ−Ａ１６５（Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｔｅｃｈｎｅ）を最終濃度５０ｎｇ／ｍｌで５分間細胞へ添加され、ＰＢＳで２回洗浄した後、可溶化された。総細胞可溶化液はＨＮＴＧバッファー（５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％  グリセロール、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭ  バナジン酸、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１％  Ｔｒａｓｙｌｏｌ）を用いて準備され、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）へ移し、ウエスタンブロットに供した。ＶＥＧＦＲ２に対する抗体は以前記載された（Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０ｐｐ  ２７６８〜２７７８）抗体を使用した。抗ＰＬＣγ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗リン酸ＭＡＰＫ、及び抗ＭＡＰＫ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）は購入した。タンパク質はウエスタンブロティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｌｕｍｉｎｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）手段を用いた化学発光によって検出された。【００４５】
ＭＴＳアッセイ
５ｘ１０３のＨＵＶＥＣは９５ウェルプレートに播種され、ｓｉＲＮＡで形質移入された。４時間後、培地を１０ｎｇ／ｍｌ  ｈｒ−ＶＥＧＦ−Ａ１６５若しくは同濃度のＢＳＡを含む０．１％ウシ胎児血清含有ＥＧＭ２に交換した。４８時間後、生細胞をＡｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって定量化された。４９２ｎｍで吸光度を測定した。【００４６】
結果
ｓｉＫＤＲによるＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡ発現の阻害
ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）システムは血管新生のシグナル伝達に重要であると知られている（図１）。ＲＮＡ干渉によって内皮細胞中のＶＥＧＦＲ２遺伝子発現を抑制するために、本発明者らはヒトＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域を特異的標的としたｓｉＫＤＲ  ｄｓＲＮＡを設計した（図２、図４）。前記ｓｉＫＤＲをヒト臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥ）細胞に導入し、４８時間後、ＶＥＧＦＲ２遺伝子をサイレンシングする能力を有したｓｉＫＤＲとして働くかどうかを解析するためにＲＴ−ＰＣＲによって遺伝子発現を解析した。いくつかの商業的に利用可能な形質移入試薬を用いて、本発明者らはｄｓＲＮＡを運搬する能力を試験し、続く実験においてＨＵＶＥ細胞の形質移入効率が９０％を超えるようにＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯを用いた。コード化配列中のプライマーによって検出されたＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの８００ｂｐＲＴ−ＰＣＲ産物の量は、ｍｏｃｋ処理細胞と比較して９０％以上減少された（図３）。【００４７】
３’ＵＴＲ領域中のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析も同様な結果を示し、これによってｓｉＫＤＲによる下方制御を確認した。このサイレンシング効果はＲＮＡｉの独特な配列特異性によって仲介されていることを確認するために、本発明者らは、ｓｉＫＤＲに対して整合性はあるが、その中心領域内に２つの変異を有する別のｄｓＲＮＡ（ｓｉＫＤＲｍｕｔ）を設計した（図４）。このｓｉＫＤＲｍｕｔはＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡレベルに対して影響を及ぼさないと予想された。ＶＥＧＦレセプターファミリーの２つの他のメンバーであるＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ３と、ハウスキーピング遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現は、ｓｉＫＤＲで処理しても変化はなく、さらにＲＮＡｉの配列特異性を確認した。これらの結果によって、ｓｉＫＤＲはＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡを特異的標的にしており、内皮細胞中のその発現を効果的に減少することができると証明された。【００４８】
ｓｉＫＤＲによるＶＥＧＦＲ２タンパク質及び下流シグナル伝達のノックダウン
本発明者らは次にＶＥＧＦＲ２タンパク質及びその下流シグナル伝達の発現を解析し、ｓｉＫＤＲ処理細胞中のＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの著しい減少と一致していた。ｓｉＫＤＲ形質移入ＨＵＶＥ細胞可溶化液において、２３０ｋＤ及び２００ｋＤバンドとして検出されるＶＥＧＦＲ２の量は抗体で検出可能なレベル以下まで減少した。一方、他のタンパク質であるＰＬＣγ及びＭＡＰキナーゼの発現レベルは変化しなかった（図５）。対照としてｓｉＫＤＲｍｕｔをＨＵＶＥ細胞へ導入した場合、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の減少は観察されなかった。ＶＥＧＦ−Ａ１６５で刺激した結果、ｓｉＫＤＲ処理細胞中でＭＡＰキナーゼの弱い活性化が見られたが、ｍｏｃｋ若しくはｓｉＫＤＲｍｕｔ処理ＨＵＶＥ細胞でも関連する活性化が観察された。この結果は、内皮細胞へのｓｉＫＤＲの導入はＶＥＧＦＲ２仲介シグナル伝達を阻害するための効果的な手段になり得ることを意味している。【００４９】
ｓｉＫＤＲによる内皮細胞増殖及び／若しくはアポトーシスの阻害
ｓｉＫＤＲの内皮細胞への影響に関する生物学的因果関係を解決するために、本発明者らはｓｉＲＮＡ導入後の前記ＶＥＧＦ依存性増殖及び／若しくはＨＵＶＥ細胞の生存を検討した。ＭＴＳアッセイを用いて、ＶＥＧＦ−Ａ存在下でｓｉＫＤＲ若しくはｓｉＫＤＲｍｕｔの形質移入４８時間後に生細胞を定量化した。ｍｏｃｋ若しくはｓｉＫＤＲｍｕｔ処理細胞の数はＶＥＧＦ存在下で１．８倍多く、ｓｉＫＤＲ処理細胞の数は１．２倍であり（図６）、ｓｉＫＤＲによって仲介されたＶＥＧＦＲ２のＲＮＡｉは、内皮細胞の増殖及び／若しくは生存を阻害することができることが証明された。【００５０】
ｓｉＫＤＲによる血管新生阻害作用
アデノウイルスの作製
ｓｉＫＤＲに一致する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するために、本発明者らは以下に記載のオリゴヌクレオチドを合成し、
配列番号１；
５'‐ｇａｔｃｃｇｔａｇａｇｔｔｃｇｔｔｇｔｇｃｔｇｔｔｔｃａａｇａｇａａｃａｇｃａｃａａｃｇａａｃｔｃｔａｃｔｔｔｔｔｔｇｇａａａ‐３’
５’‐ａｇｃｔｔｔｔｃｃａａａａａａｇｔａｇａｇｔｔｃｇｔｔｇｔｇｃｔｇｔｔｃｔｃｔｔｇａａａｃａｇｃａｃａａｃｇａａｃｔｃｔａｃ‐３’
二本鎖ＤＮＡを産生するためにアニーリングし、前記ｓｈＲＮＡの発現を促進するｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２.１‐Ｕ６  ｈｙｇｒｏ（Ａｍｂｉｏｎ）へ連結した。【００５１】
ｓｉＫＤＲｍｕｔに一致する前記オリゴヌクレオチドは以下のように合成し、
５'‐ｇａｔｃｃｇｔａｇａｇｔｔＧｇｔｔＣｔｇｃｔｇｔｔｔｃａａｇａｇａａｃａｇｃａＧａａｃＣａａｃｔｃｔａｃｔｔｔｔｔｔｇｇａａａ‐３'
５'‐ａｇｃｔｔｔｔｃｃａａａａａａｇｔａｇａｇｔｔＧｇｔｔＣｔｇｃｔｇｔｔｃｔｃｔｔｇａａａｃａｇｃａＧａａｃＣａａｃｔｃｔａｃ‐３'
上記と同様の方法でｐＳｉｌｅｎｃｅｒ２.１‐Ｕ６  ｈｙｇｒｏへ導入した。【００５２】
両ｓｈＲＮＡ発現カセットはＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで切断され、５’、３’末端を平滑末端（ブラントエンド）にし、ｐＡｘｃｗ（アデノウイルス発現ベクターキット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ））のＳｗａＩ部位に連結した。このコスミドベクターはＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＤＮＡ−ＴＰＣと共に２９３細胞へ同時形質移入された。前記ｓｈＲＮＡ発現カセットを有したこの組換えアデノウイルスは製造説明書に従ってスクリーニングされ、Ｕ６プロモーターからｓｉＫＤＲとＫＤＲｍｕｔをそれぞれ発現するアデノｓｉＫＤＲとアデノｓｉＫＤＲｍｕｔを作製した。【００５３】
ＨＵＶＥ細胞へのアデノウイルスの感染はアデノウイルス発現ベクターキットの説明書に記載された方法に従って行った。簡潔には、６ウェル培養プレート中でサブコンフルエントのＨＵＶＥ細胞を、アデノウイルスを含む５％ＦＢＳ含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１時間インキュベートし、さらにＨｕｍｅｄｉａ  ＥＧ２で指示された時間インキュベートした。時間経過実験のため、ＨＵＶＥ細胞はＭＯＩ＝４０でウイルスに感染され、細胞は図中の指示された時間で総可溶化液にされた。前記ＶＥＧＦＲ−２発現のサイレンスに対する効果的なＭＯＩ（感染効率）を評価するために、前記アデノウイルス溶液は５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで希釈され、図中に指示されたＭＯＩでＨＵＶＥ細胞に対する感染用に使用された。感染４８時間後、細胞はＲＮＡ調整された。【００５４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生アッセイ
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管新生は、ヒト二倍体線維芽細胞と共培養されたＨＵＶＥ細胞の毛細血管様構造の形成で評価された。この実験手順はＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｋｕｒａｂｏ）に付属する説明書に従った。簡潔には、ＨＵＶＥ細胞はｓｈＲＮＡ発現アデノウイルスに３〜７日感染され、固定された。続いてキットに従ったプロトコールによってＨＵＶＥ細胞は抗ヒトＣＤ３１抗体（Ｋｕｒａｂｏ）を用いて染色された。毛細血管様ネットワークの形成を測定するために、ＣＤ３１染色の顕微鏡画像はＡｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェアによって解析された。【００５５】
結果
ｓｉＫＤＲはＨＵＶＥ細胞の毛細形成を阻害する
血管新生におけるｓｉＫＤＲの生物学的効果を評価するために、発明者らはｓｉＫＤＲが、二倍体線維芽支持細胞との共培養システムで内皮細胞の管腔形成を阻止するかどうか検討した。まず本発明者らは、ｓｉＫＤＲ若しくはｓｉＫＤＲｍｕｔに一致する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するアデノウイルスを作成した。感染後２日目から、アデノｓｉＫＤＲはＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡの発現をノックダウンできたが、一方アデノｓｉＫＤＲｍｕｔの場合ＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡレベルは変化しなかった（図７）。アデノｓｉＫＤＲのこの効果は感染後少なくとも４日まで続き、ＭＯＩ＝０．２の場合でも明らかであった（図８）。【００５６】
本発明者らは次に、ｓｉＫＤＲ若しくはｓｉＫＤＲｍｕｔを、内皮細胞と線維芽細胞の共培養システムへ添加し、前記実験手順に記載されたように、毛細ネットワークの接合部分（ｊｏｉｎｔｓ）と枝分かれ部分（ｐａｔｈｓ）の数を測定した。アデノｓｉＫＤＲ感染ＨＵＶＥ細胞の接合部分と枝分かれ部分の数は、ｓｉＫＤＲｍｕｔの場合と比較して、有意に減少した（図９、１０）。これはアデノｓｉＫＤＲは内皮細胞の管腔形成を阻害するのに効果的であることを意味している。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦレセプターシステム、特に、ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）システムの血管新生のシグナル伝達を示した図。
【図２】本発明に係る、好ましいヒトＶＥＧＦＲ２  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲ領域におけるｓｉＫＤＲ  ｄｓＲＮＡの部位と、実験で用いたプライマーの部位を示した図。
【図３】本発明に係るｓｉＫＤＲ、対照のｓｉＫＤＲ−ｍｕｔ、及びｍｏｃｋによる、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−３遺伝子の発現に対する影響をＲＴ−ＰＣＲにより解析した図。
【図４】本発明に係るｓｉＫＤＲと、その中心領域内に２つの変異を有する別のｄｓＲＮＡ（ｓｉＫＤＲｍｕｔ）のｉＲＮＡ配列を示した図。
【図５】本発明に係るｓｉＫＤＲ、対照のｓｉＫＤＲ−ｍｕｔ、及びｍｏｃｋによる、ＶＥＧＦＲ−２タンパク質及びその下流シグナル伝達の発現を解析した図。
【図６】ｓｉＲＮＡ（ｓｉＫＤＲ、ｓｉＫＤＲ−ｍｕｔ、及びｍｏｃｋ）導入後のＶＥＧＦ依存性増殖及び／若しくはＨＵＶＥ細胞の生存をＭＴＳアッセイを用いて検討した図。
【図７】アデノｓｉＫＤＲ及びアデノｓｉＫＤＲｍｕｔのＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡの発現への影響を、感染後２、３、４日目で検討した図である。
【図８】アデノｓｉＫＤＲ及びアデノｓｉＫＤＲｍｕｔのＶＥＧＦＲ−２発現のサイレンスに対する効果的なＭＯＩ（感染効率）を評価した図。
【図９】アデノアデノｓｉＫＤＲ及びアデノｓｉＫＤＲｍｕｔの、ヒト二倍体線維芽細胞と共培養されたＨＵＶＥ細胞の毛細血管様構造の形成に対する影響を評価した図。
【図１０】アデノｓｉＫＤＲ感染及びアデノｓｉＫＤＲｍｕｔ感染ＨＵＶＥ細胞における、毛細血管様構造の接合部分（ｊｏｉｎｔｓ）（上図）と枝分かれ部分（ｐａｔｈｓ）（下図）の数を測定した図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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