(57)【要約】本明細書では、重合誘発体を使用して、制御された手法で相補的な樹状核酸モノマーの対から樹状生体適合性ポリマーを生成する方法が記載されている。樹状モノマーは、自己組織化可能な核酸及び有機ポリマーから構成される。各ポリマーは、標識を結合させる、及び生物学的適合性シグナル増幅技術を構成するために使用され得るおよそ２００個の樹状突起を含有する。状況に応じて、この技術は、特定の核酸分子、小分子、タンパク質、及びペプチドなどの多種多様な分析物の存在を明らかにするために使用され得る。【選択図】図１
2020516319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つの分子であって、各分子が、
ａ）核酸ヘアピン、
ｂ）核酸ステム、
ｃ）結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに
ｄ）有機ポリマー
を含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列が、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、前記少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列が、前記少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、前記少なくとも２つの分子；ならびに
分析物結合物質に連結された少なくとも１つの核酸誘発体であって、核ステム及び結合樹状突起に相補的である、前記少なくとも１つの核酸誘発体
を含む、集合体。
【請求項２】
前記ヘアピン配列及び結合樹状突起配列が、約６〜１０ヌクレオチドである、請求項１に記載の集合体。
【請求項３】
前記ヘアピン配列及び結合樹状突起配列が、約１１〜１３ヌクレオチドである、請求項１に記載の集合体。
【請求項４】
前記伸長樹状突起が、約１３〜１６ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項５】
前記伸長樹状突起が、約１０〜２５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項６】
前記核酸誘発体が、約１２〜４８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項７】
前記核酸誘発体が、約３４〜３８ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項８】
前記核酸ステムが、約６〜１５ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項９】
前記核酸ステムが、約２２〜２６ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１０】
前記有機ポリマーが、ポリエチレングリコールを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１１】
ポリエチレングリコールが、約１６〜２０炭素長を含む、請求項１０に記載の集合体。
【請求項１２】
前記分析物結合物質が、ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１３】
前記分析物結合物質が、ペプチドまたはタンパク質を含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１４】
前記分析物結合物質が、抗体を含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１５】
伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１６】
前記標識ポリヌクレオチドが、フルオロフォア、発色団、色素原、量子ドット、蛍光ミクロスフェア、ナノ粒子、元素標識、金属キレート化ポリマー、バーコード及び／または連続バーコードを含む、請求項１５に記載の集合体。
【請求項１７】
少なくとも２つの追加の分子であって、前記追加の分子の各々が、
ａ）核酸ヘアピン、
ｂ）核酸ステム、
ｃ）結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに
ｄ）有機ポリマー
を含み、さらに、少なくとも１つの追加の第１の分子の核酸ヘアピン配列が、少なくとも１つの第２の追加の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、前記少なくとも１つの追加の第２の分子の核酸ヘアピン配列が、前記少なくとも２つの追加の第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、前記少なくとも２つの追加の分子；ならびに
前記少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な核酸アドレスと、少なくとも２つの追加の分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的な第２の誘発体とを含む、リンカー
をさらに含む、請求項１に記載の集合体。
【請求項１８】
前記少なくとも２つの追加の分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１７に記載の集合体。
【請求項１９】
前記標識ポリヌクレオチドが、フルオロフォア、発色団、色素原、量子ドット、蛍光ミクロスフェア、ナノ粒子、元素標識、金属キレート化ポリマー、バーコード及び／または連続バーコードを含む、請求項１７に記載の集合体。
【請求項２０】
各々が核酸及び有機ポリマーを含む少なくとも２つの分子を加えることと、
核酸を含む誘発体分子をさらに加えることと、
自己組織化重合を誘発することと
を含み、各分子が、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む、重合方法。
【請求項２１】
前記少なくとも２つの分子がそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸誘発体が、分析物結合物質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、前記標識ポリヌクレオチドが標識物質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも２つの分子がそれぞれ、
ａ）核酸ヘアピン、
ｂ）核酸ステム
ｃ）結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに
ｄ）有機ポリマー
を含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列が、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、前記少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列が、前記少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、
前記少なくとも１つの核酸誘発体が、分析物結合物質に連結されており、前記核酸誘発体が、核ステム及び前記結合樹状突起に相補的である、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
標識ポリヌクレオチドを伸長樹状突起に結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、前記標識ポリヌクレオチドが標識物質を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも２つの追加の分子であって、前記追加の分子の各々が、
ａ）核酸ヘアピン、
ｂ）核酸ステム、
ｃ）結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに
ｄ）有機ポリマー
を含み、さらに、少なくとも１つの追加の第１の分子の核酸ヘアピン配列が、少なくとも１つの第２の追加の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、前記少なくとも１つの追加の第２の分子の核酸ヘアピン配列が、前記少なくとも２つの追加の第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、前記少なくとも２つの追加の分子；ならびに
ｅ）前記少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な核酸アドレスと、少なくとも２つの追加の分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的な第２の誘発体とを含む、リンカー
をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府によって出資された研究または開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＨＤ０７５６０５の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において所定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本明細書では、分析物を標識及び検出するための樹状モノマーに関連する方法及び組成物が記載されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
複雑な混合物中の関連する分析物を検出するための革新的な解決策が必要である。ほとんどの分析物は、検出標識として使用されるべき固有のシグナルを有しない。それ故、色素原またはフルオロフォアなどの容易に検出可能なマーカーで分析物を標識するための新しい技術が非常に必要とされている。さらに、シグナル増幅を可能にする技術は一般に、直接標識法より好ましいが、その理由は、それらは、シグナル対ノイズ比を増強し、それによって検出の容易性及び精度を増大させるからである。その上、用いるのに最も適した標識は、例えば、サンプル、分析物の性質、または分析の背景に依存し得る特定の場合に応じて変化し得る。よって、使用することができ、かつシグナルが増幅される標識の種類における柔軟性は、別の所望の特徴を構成する。理想的な分析物検出方法は、標識の柔軟性及びシグナル増幅能力を提供しつつ、分析物を検出する容易な方法を組み合わせるであろう。よって、検出の感度、精度及び信頼性を向上させるために高いシグナル対ノイズ比を生成するためシグナル増幅を付与しつつ、異なる生物学的部分に結合することが可能な標識物質に対する大きな必要性が当該技術分野に存在する。
【０００４】
本明細書では、これらの基準を満たす方法及び組成物が記載されている。具体的には、樹状生体適合性ポリマーは、重合誘発体の存在によって開始されるように、制御された手法で相補的な樹状核酸モノマーの対から生成される。樹状モノマーは、核酸及び有機ポリマーから構成される。各ポリマーは、標識を結合させ、かつ生物学的適合性シグナル増幅技術を構成するために使用され得るよそ２００個の樹状突起を含有する。
【発明の概要】
【０００５】
本明細書では、少なくとも２つの分子であって、各分子が、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、少なくとも２つの分子と、分析物結合物質に連結された少なくとも１つの核酸誘発体であって、その核酸誘発体が、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である、少なくとも１つの核酸誘発体と、を含む集合体が記載されている。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約１０〜２４ヌクレオチドである。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約６〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約１１〜１３ヌクレオチドである。他の実施形態では、伸長樹状突起は、約１０〜２０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、伸長樹状突起は、約１３〜１６ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、伸長樹状突起は、約１０〜２５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、約１２〜４８ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、約３４〜３８ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸ステムは、約１２〜３０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸ステムは、約６〜１５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸ステムは、約２２〜２６ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、有機ポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約１６〜２０炭素長を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ペプチドまたはタンパク質を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、抗体を含む。他の実施形態では、方法は、伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドをさらに含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、フルオロフォア、発色団、色素原、量子ドット、蛍光ミクロスフェア、ナノ粒子、元素標識、金属キレート化ポリマー、バーコード及び／または連続バーコードを含む。
【０００６】
本明細書ではさらに、各々が核酸及び有機ポリマーを含む少なくとも２つの分子を加えることと、核酸を含む誘発体分子をさらに加えることと、自己組織化重合を誘発することと、を含み、各分子が、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む、重合方法が記載されている。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、分析物結合物質を含む。他の実施形態では、方法は、別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、少なくとも１つの核酸誘発体は、分析物結合物質に連結されており、その核酸誘発体は、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である。他の実施形態では、方法は、伸長樹状突起に標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】系の成分。２つの相補的な樹状モノマーが示されており、それぞれ、有機ポリマースペーサーと共に、ヘアピンループ、ステム、ならびに核酸樹状突起、結合及び伸長樹状突起の三部分構造を含有する（図１Ａ及び図１Ｂ）。核酸誘発体が示されている（図１Ｃ）。核酸ドメイン結合樹状突起１−ヘアピンループ１’、ステム２−ステム２’、及び結合樹状突起３−ヘアピンループ３’は相補的である（すなわち、１−１’、２−２’及び３−３’は相補的であり、ハイブリダイズし得る）。ドメイン５〜６は伸長樹状突起である。ドメイン４（赤）は、モノマー安定性を維持し、樹状突起の機能を促進するために重要な有機ポリマーから構成されるスペーサー要素である。誘発体（図１Ｃ）は、領域１に結合し、図１Ａにおける第１の分子のヘアピンループを分枝点移動によって開口させる（配列３’−２’の同様のヘアピンも、図１Ｂの第２の分子を開口させるために用いられ得る）。ヘアピンＡが開口すると、これは、配列１’−２’の露出を導くヘアピンＢのための誘発体として作用し得る配列３’−２’を露出させる。このようにして、樹状ポリマーは、モノマー単位の誘発された自己組織化によって形成される。
【図２】集合したときの成分。誘発体（１）と相補的な樹状モノマー（２）との間の化学的相互作用によって生成された樹状ポリマー（４）。ポリマー（３）から伸長する伸長樹状突起に留意されたい。
【図３】自己組織化メカニズム。核酸誘発体は、直接使用され得るか（図３Ａ）、または別の核酸オリゴヌクレオチドに結合され得る／それによって伸長され得るか（図３Ｂ）、またはビーズもしくはタンパク質／ペプチドなどの固体の基材に結合され得る（図３Ｃ）。誘発体は、分析物結合物質を含有し得、そのような結合物質は、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、抗体に特異的であり得、それによって、図１及び２の増幅、重合プロセスが、分析物が分析物結合物質に結合される基礎となる「検出」技術と分離された別個の構成工程となることを可能にする。
【図４】多様式樹状突起結合。伸長樹状突起（３）へのハイブリダイゼーションによる樹状ポリマー（４）への標識（５）の直接結合の例。各々の樹状突起が最終的に標識されるであろうが、ここでは明確化のために１つのみが示されていることに留意されたい。標識は、フルオロフォア、量子ドット、色素原、オリゴヌクレオチドなどを含み得る。この場合もまた、ここでの「標識」工程は、図１及び２の増幅、重合プロセスから分離されることが強調される。
【図５】コストを削減するための一般的標識戦略。標識アプローチの類型では、リンカーオリゴヌクレオチド（５）は、「アドレス」（分枝に対する相補的配列）及び標識結合配列（緑色）から構成される。この戦略は、多数の系について、１種類の標識オリゴ（６）のみが必要になるため、大幅なコスト節約をもたらす。
【図６】二次増幅戦略の例。「アドレス」及び二次誘発体配列（５における青）を含有するリンカーオリゴ（５）は、第２の重合事象及びそれ故、追加ラウンドの増幅をもたらすために使用される。これは、二次増幅（すなわち、ｎ個の分析物分子の２乗乗数）をもたらす。
【図７】アガロースゲル電気泳動。左から：ｄｎａラダー、モノマーのみ、モノマー 対 開始因子（すなわち、誘発体）比１／１０、モノマー 対 開始因子比１／５０、モノマー 対 開始因子比１／１００、ｄｎａラダー。ゲルの上部においてレーン４〜５に豊富な高分子量の分子が存在し、下部にモノマーが存在しない（もはや全てのモノマーがポリマーに組み込まれている）ことに留意されたい。対照的に、レーン２（モノマーのみ）では、バックグラウンドシグナルの増幅のみが発生し、ほとんどのモノマーはゲルの下部にある。
【図８】インビトロ標識。図８Ａ：樹状ポリマー（二次標識としてａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアを含有する）で標識されたショウジョウバエ胚であり、分節遺伝子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄの発現ドメインを明らかにしている。図８Ｂ：二次増幅によって生成された蛍光ビーコン（ａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアを含有する）で標識されたショウジョウバエ胚であり、分節遺伝子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄの発現ドメインを明らかにしている。
【図９】インビトロ標識。樹状ポリマー（ユーロピウム１５１を含有する二次標識を有する）で標識されたショウジョウバエ胚であり、分節遺伝子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄの発現ドメインを明らかにしている。
【図１０】抗体に基づく検出。別の実施形態では、ここで、重合誘発体／開始因子にコンジュゲートした抗体に由来する樹状ポリマーを生成することができることが実証されている。コンジュゲートしていない抗体のレーンでは重合（高分子量バンド）は見られないが、低分子量モノマーのみが見られるため、増幅は特異的である。
【図１１Ａ】バーコード検出スキーム。図１１Ａ．標識−消去−標識アプローチは、ＭＵＳＥ樹状突起（３）に相補的であり、かつ付加的な６〜１０ヌクレオチド長のオーバーハングを含有する標識オリゴヌクレオチド（６）を交替させることで機能する。標識オリゴヌクレオチド配列に完全に相補的な消去体オリゴヌクレオチド（６’）を使用して、分枝点移動によって標識オリゴヌクレオチドを除去することができる。これにより、異なるフルオロフォア（７）を有する新しい標識オリゴヌクレオチドの付加が可能になる。
【図１１Ｂ】バーコード検出スキーム。図１１Ｂ．標識−消光−標識技術では、追加の１５ヌクレオチドの「オーバーハング」配列を含有する、標識する樹状ポリマー上の樹状突起配列に相補的な第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバーコード標識を構成する。「オーバーハング」は、２つのオーバーハングを含有するｄｓＤＮＡ「クエンチャー」標識を固定する働きをし、１つ目は第１の標識のオーバーハングに相補的であり、２つ目は次の標識を固定する働きをする。「クエンチャー」標識オリゴヌクレオチドは、ダブシルなどの短距離クエンチャー及びフルオロフォアを含有する。前の標識のオーバーハングへのクエンチャー標識のハイブリダイゼーションにより、クエンチャー及び前のフルオロフォアが非常に近い距離に配置され、これにより最初のフルオロフォアの蛍光が消光され、「クエンチャー」標識に含まれるフルオロフォアのみがシグナルを放射し得る。このようにして、後続の「クエンチャー」標識は、互いにｎ回ハイブリダイズされてバーコードを生成し得る。
【図１２】標識−消光−標識の例。対照は、「クエンチャー」標識が存在しない場合、ここで樹状ポリマーで標識された転写産物を検出するために３％のレーザー出力が必要とされることを示している。消光された結果は、消光されたシグナルを検出するためにレーザー出力が３０％に増大されなければならないことを示している。Ａｌｅｘａ６４７の結果は、クエンチャーに加えて、第２のフルオロフォアが構造に加えられたことを確認するものである。
【図１３】イムノｍｕｓｅ。図１３Ａ：ＭＵＳＥ誘発体にコンジュゲートされた抗ＧＦＰ抗体で検出されたＧＦＰ融合タンパク質。図１３Ｂ．樹状ポリマー（二次標識としてａｌｅｘａ−４８８フルオロフォアを含有する）で標識されたショウジョウバエ胚であり、ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄエクソンを明らかにしている。
【図１４】量子ドット標識。樹状ポリマー（ＱＤｏｔ６５５標識を含有する）で標識されたショウジョウバエ胚であり、分節遺伝子ｅｖｅｎ−ｓｋｉｐｐｅｄの発現ドメインを明らかにしている。
【図１５】イムノＭＵＳＥ。図１５Ａ．ＧＦＰ融合タンパク質（緑色で示されている）を発現するショウジョウバエ胚。図１５Ｂ．ａｌｅｘａ−５９４フルオロフォア（赤色で示されている）を用い、ＧＦＰに対する抗体及びＭＵＳＥ増幅を用いる免疫蛍光アッセイ。ヘアピン安定性の立体障害。
【図１６】立体障害。ＭＣＰコンジュゲートヘアピン。（レーン１）開始因子の非存在下で増幅する一方で、コンジュゲートしていないヘアピンは安定したままである（レーン３）。これは、ＭＣＰがヘアピンの準安定性を強く乱すことを示している。さらに、開始因子の非存在下（レーン１）または存在下（レーン２）にかかわらず、増幅は、コンジュゲートしていないヘアピン（レーン４）と比較して非効果的である。
【図１７】非常に短いＭＵＳＥヘアピンの並外れた安定性の証拠。非常に短いＭＵＳＥヘアピン（ここでは６ヌクレオチドの足がかり、１０ヌクレオチドのステム、１６ヌクレオチドの樹状突起）は、保存条件ではそれらのヘアピン形態のままであり、これにより、簡易冷却の非存在下において、それらは開始因子の非存在下では増幅されず（レーン１）、開始因子の存在下では完全に増幅される（レーン２）。対照的に、ＨＣＲヘアピンは、実際には保存中はヘアピンではなく、それらは、実験が実施される直前にヘアピン形態に簡易冷却されない場合、非特異的に（レーン３）及び不十分に（レーン４）増幅する。
【図１８】ＭＵＳＥヘアピンの迅速な増幅。短いＭＵＳＥヘアピン（（ここでは１０ヌクレオチドの足がかり、１５ヌクレオチドのステム、１２ヌクレオチドの樹状突起）は、４５分で完全に増幅する（レーン２）が、開始因子の非存在下では増幅しない（レーン１）。
【図１９】ＭＵＳＥヘアピンの非常に迅速な増幅。非常に短いＭＵＳＥヘアピン（ここでは６ヌクレオチドの足がかり、８ヌクレオチドのステム、１０ヌクレオチドの樹状突起）は、４分で完全に増幅する（レーン２）が、開始因子の非存在下では増幅しない（レーン１）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
記載したように、ＭＵＳＥ（多様式普遍的シグナル増強（Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ））は、対象となる分析物の検出後にシグナル増幅を可能にするナノテクノロジーである。当該技術分野における他の検出及び標識技術と比較して、ＭＵＳＥは非常に汎用的である。第１に、ＭＵＳＥは、様々な分析物を検出することができ、検出スキームにほとんど完全に無関係である。検出は、問題となる分析物にとって慣例的に（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ分析物の場合はインサイチューハイブリダイゼーション、タンパク質及びペプチドの場合は免疫組織化学）実施される。第２に、ＭＵＳＥは、フルオロフォア、量子ドット及び元素標識のような異なる標識と広く適合する。これらの２つの特徴は、多数の最適な標識を介してシグナルが出力される、事実上全ての種類の生物学的高分子の検出を可能にする。ＭＵＳＥは、検出、増幅及び標識という３つの構成工程によってこの汎用性を達成する。伝統的な分析物検出スキームは、これらの構成工程の不都合な重複を含む。例えば、ＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーションは、しばしば線状様式で、標識出力に直接接続される検出を含む。ＰＣＲは、検出のためのハイブリダイゼーション間の重複を含み、繰り返されるハイブリダイゼーションは増幅を与え、繰り返されるハイブリダイゼーション工程を介する増幅は、出力シグナルに直接関係する。対照的に、ＭＵＳＥは、自己組織化核酸ポリマーの特性を利用することによって、検出、増幅、及び標識の構成工程を分離する。増幅は、モノマーが自己組織化して樹状ポリマーとなる設計された能力によって達成される。結果として、出力シグナルの生成及び伝搬は、伝統的な分析物検出スキームによって達成できない手法で増幅から分離される。
【０００９】
樹状ポリマーに依存する記載された組成物及び方法を使用して、特異的核酸分子、小分子、タンパク質、及びペプチドを含む多種多様な分析物の存在を明らかにすることができ、それによって異なる生物学的部分を検出する際の柔軟性を提供する。組成物及び方法は、ｉ）図１に示されるように、核酸ヘアピンループ、ステム、及び核酸樹状突起からなる三部分分子（有機ポリマー「スペーサー」をさらに含む）；ｉｉ）一本鎖核酸オリゴヌクレオチドを含む重合誘発体；ｉｉｉ）分析物検出に使用される親和性リガンド（すなわち、分析物結合物質）であって、その組成が核酸オリゴヌクレオチド、タンパク質、ペプチドなどの間で変化し得るもの、を含む。
【００１０】
その三部分モノマーは、モノマー機能を保持しながら標識柔軟性を可能にするこの技術の重要な革新である。モノマーからの核酸ポリマーの生成は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を介して以前に達成されている。しかしながら、分枝モノマーは、二次増幅（すなわち、ｎ個の分析物分子の二乗乗数）を達成する手段として構想されたが、既存のモノマー検出系は核酸のみから構成されていた。核酸ヘアピンは、足がかり−枝相互作用に基づいて潜在的に不安定化または拘束される。この理由から、ＨＣＲアプローチは、基礎となる核酸化学によって厳しく制限されて足がかり−枝相互作用を制限する。
【００１１】
本発明者らの知る限りでは、核酸分枝ヘアピンを用いた二次増幅の成功は達成されていない。また、二次標識結合のために両方の樹状ポリマーを利用する既存の形式はなく、よって、多様式検出を容易に可能にすることはできない。記載された組成物及び方法の開発において、本発明者らはまた、核酸主鎖の剛性が二次標識ハイブリダイゼーションの効率を低下させることを発見し、核酸分枝ポリマーの別の限界を強調した。
【００１２】
分枝核酸ポリマーの限界を補正するために、重要な革新は、核酸ヘアピンのステムと核酸樹状突起との間の有機ポリマー「スペーサー」の開発であった。スペーサーは、足がかりと樹状突起との間の相互作用を最小化し、ヘアピンの安定性を最適化し、ハイブリダイゼーション中の立体障害を最小化し、モノマーの化学的特性を変化させ、（例えば、光開裂性または親水性スペーサーを選択することによって）さらに官能化され得る。さらに、スペーサーは、より多くの柔軟性及び運動の自由度を樹状突起に提供することによって樹状突起から樹状ポリマーのステムを隔離し、よって、立体障害及びポリマーステムと標識間の他の潜在的な相互作用を制限する。ＭＵＳＥの設計上の利点は、ＨＣＲと比較して非常に優れたアプローチを提供する。
【００１３】
変動する試薬純度の堅固な許容
例えば、ＨＣＲのような分枝核酸戦略は、典型的には、切断されたモノマーが反応を終結させ得るので、ＤＮＡオリゴがほぼ１００％純粋であることを必要とする。１／１０のモノマーが切断されると、これは、平均して１０単位後にポリマー成長の中断につながるであろう。非常に精緻な変性ＰＡＧＥ電気泳動のみが１００％近い純度のレベルを可能にする。しかしながら、電気泳動精製は、どの分子がモノマーオリゴに結合され得るかである。ある特定のａｌｅｘａフルオロフォア結合化学物質（アミノ、チオール）は、変性ＰＡＧＥ中に使用される試薬（尿素、過硫酸アンモニウム）によって強く影響を受け、これにより、１００％純粋なオリゴ及び１００％コンジュゲートした（標識された）オリゴの両方を有することは不可能となる。これは、既存の分枝核酸技術の欠点であり、オリゴへの標識結合が増幅工程から分離されない場合の直接的な結果である。
【００１４】
ＭＵＳＥは、増幅及び標識を分離することによって解決策を提供する。樹状モノマーは、変性ＰＡＧＥによって容易に精製され得る。本発明者らが標識として使用するオリゴは、ＨＰＬＣを介して約８０％の純度でオーダーすることができる。ほとんどの場合、切断された標識は、全長のものによって打ち負かされ、それによって試薬についての変動する純度の堅固な許容を可能にする。また、ＭＵＳＥ標識オリゴは、既に最小の長さであるため、切断されたものは全くハイブリダイズしない可能性が高く、それによって分枝反応の早計な終結を防止する。よって、切断された標識オリゴは、切断されたモノマーほど劇的にシグナル増幅に影響を及ぼさない。
【００１５】
標識コストの削減
ＭＵＳＥの別の利点は、それが標識のコストからモノマーのコストを分離することである。ＨＣＲのような伝統的な分枝核酸技術は、長くて高価なモノマーを含む。ＰＡＧＥ精製の必要性はさらに収率に影響を及ぼす。このアプローチの重大な欠点は、必要とされる結合化学修飾及び標識分子の達成が、それでもなお、その後に必要とされる厳しい精製工程のために失われることである。モノマー及び標識合成の分離はまた、より高い収率に寄与し、これはまた総コストを削減する。
【００１６】
伝統的な分枝ＤＮＡ技術の欠点は、標識または多重化標識のセットが研究のために必要とされるときに複雑化する。ＨＣＲなどの伝統的な分枝ＤＮＡ技術は、採用したい任意のａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒに対して完全な検出−増幅−標識系を必要とする。対照的に、ＭＵＳＥは、結合化学改変及び標識のコストをヘアピンのコストから分離することによってコストを制御する。増幅系を一定に維持することによって、標識または多重化標識のセットは、標識交換によって達成され得る。これは、開始因子提示分子に関連する余分なコストを考慮すると、特に有利である。ＭＵＳＥの場合、開始因子提示分子は、１つの増幅系に関連する。ＨＣＲなどの伝統的な分枝ＤＮＡ技術を用いると、ａｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒの色（または最終的には、使用される標識の化学的性質）の変更は、完全な新しい検出−増幅−標識系を必要とする。
【００１７】
ＰＥＧスペーサーの利点
ポリマー性ＰＥＧスペーサーはさらに、ＤＮＡホスフェート骨格の連続性を切断することによって増幅及び標識を分離する働きをする。これは、樹状突起−ヘアピン屈曲点での柔軟性を増大させ、足がかりと樹状突起との間の潜在的な塩基対形成相互作用を最小化する。利用可能な核酸設計スペースによって制約されるであろうＤＮＡのみからなる樹状ヘアピンを設計する試みの代わりに、ヘアピン配列を改変することなくＭＵＳＥ樹状突起を変更することができ、またはその逆も可能である。これは、並行して作用する数百の系を有することを本発明者らが構想可能であるように、ＭＵＳＥ系の設計を大幅に簡略化する。さらに、それは、最適なヘアピン及び最適な樹状突起を設計することができるように、互いに独立してヘアピン及び樹状突起の配列の最適化を可能にする。スペーサーの非存在下では、これは必ずしも可能ではない。
【００１８】
標識交換
増幅後の標識交換の実現性は、伝統的な分枝ＤＮＡ技術と比較して、ＭＵＳＥの重要な利点である。ｓｅｑＦＩＳＨまたはＭＥＲＦＩＳＨなどの連続バーコード化スキームは、数千の標的の同時分析を可能にすることから、ますます普及している。ＳｅｑＦＩＳＨでは、シグナル増幅を提供するためにＨＣＲが用いられる。各ＨＣＲポリマーは、各バーコード化ラウンド間にＤＮＡｓｅで消化されなければならない。それ故、各ラウンドはおよそ２４時間かかる。
【００１９】
対照的に、ＭＵＳＥ標識は、例えば、本発明者らの標識−消去−標識アプローチを用いて、また、緩衝液中の塩濃度を低下させるか、または温度を上昇させるか、またはホルムアミドなどのハイブリダイゼーションエネルギーを低下させる試薬の使用によって、樹状突起から除去され得る。ＭＵＳＥ標識は、１サイクル当たりおよそ２時間で除去され、交換され得る。バーコード化スキームは、多くのラウンド（最大３０）を必要とするので、これは大幅に短い手順をもたらす。標識交換の別の場合は、多様式の標識交換の場合を含むであろう。ここで、使用者は、蛍光標識を用いて実験を開始してサンプルの高解像度画像を得、次いで、それらをＭＣＰと迅速に交換して同じサンプルで高度に多重化されたデータを得ることができるであろう。
【００２０】
準安定性
ＭＵＳＥヘアピンは、ＨＣＲを含む他の分枝ＤＮＡ技術に対して意義のある熱安定性の利点を有する。ＨＣＲモノマーは、「準安定性」（すなわち、それらが使用される濃度の溶液中で、比較的長い時間、それらのヘアピン構造を維持することができる）として記載される。しかしながら、しばらくすると、特に保存及び輸送中に、それらはヘアピン二次構造から外れ、一層より安定で熱力学的に有利なホモダイマー構造をとる。
【００２１】
本発明者らは、非常に短いＭＳＵＥヘアピン（６〜１０ヌクレオチドの足がかり、１５ヌクレオチド未満のステム）を含む短いＭＵＳＥヘアピンが、異なる優れた化学的特徴を示すことを発見した。これらのＭＵＳＥヘアピンは、それらが採用する唯一の構造がヘアピン形態であるため、準安定を超えている。ＨＣＲなどのいくつかの分枝ＤＮＡ技術は、形成を確実にするために、実験前にヘアピンを簡易冷却することを必要とする。これは、ホモダイマーを９５°で２〜５分間変性させ、次いで３０分間室温に冷却することによって達成される。最新のＭＵＳＥヘアピンは、保存から直接用いられ得る。次に記載する増幅速度の向上と組み合わせると、この変化は、ＨＣＲ反応から１８時間を超える時間を節約する。これはまた、ＭＵＳＥを１営業日で用いられ得る技術にするため、使用者にとって重要である。
【００２２】
増幅速度
ＨＣＲポリマーは、それらの最終的なサイズに達するまでにおよそ１２時間を要する。現在のＭＵＳＥ系は１時間〜１５分を要する。
【００２３】
本明細書では、各々が核酸及び有機ポリマーを含む少なくとも２つの分子と、核酸を含む誘発体分子とを含む集合体であって、少なくとも２つの分子及び誘発体分子は、自己組織化重合のために構成されており、さらに、各分子は、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む、集合体が記載されている。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、分析物結合物質を含む。
【００２４】
本明細書ではさらに、少なくとも２つの分子であって、各分子が、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、少なくとも２つの分子と、分析物結合物質に連結された少なくとも１つの核酸誘発体であって、その核酸誘発体が、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である、少なくとも１つの核酸誘発体と、を含む集合体が記載されている。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約６〜１０ヌクレオチドである。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約１０〜２４ヌクレオチドである。例えば、ヘアピン配列及び結合樹状突起は、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ヘアピン配列及び結合樹状突起配列は、約１１〜１３ヌクレオチドである。他の実施形態では、伸長樹状突起は、１６〜２５ヌクレオチドを含む１０〜２５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、伸長樹状突起は、約１０〜２０ヌクレオチドを含む。例えば、伸長樹状突起は、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、伸長樹状突起は、約１３〜１６ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、約１２〜４８ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、約３４〜３８ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ステムは、約６〜１５ヌクレオチドである。他の実施形態では、核酸ステムは、約１２〜３０ヌクレオチドを含む。例えば、核酸ステムは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、核酸ステムは、約２４ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、有機ポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。自己組織化重合のために構成された上記配列の集合体の例は、少なくとも２つの分子を含み、その各々が、６ヌクレオチドの結合樹状突起及びヘアピン配列、１０ヌクレオチドの核酸ステム、及び１６ヌクレオチドの伸長樹状突起を含み、各分子は、別のものに対して１つ以上の相補的配列を含む。自己組織化重合のために構成された上記配列の集合体の別の例は、少なくとも２つの分子を含み、その各々が、８ヌクレオチドの結合樹状突起及びヘアピン配列、１０ヌクレオチドの核酸ステム、及び１８ヌクレオチドの伸長樹状突起を含み、各分子は、別のものに対して１つ以上の相補的配列を含む。自己組織化重合のために構成された上記配列の集合体のさらなる例は、少なくとも２つの分子を含み、その各々が、１０ヌクレオチドの結合樹状突起及びヘアピン配列、１５ヌクレオチドの核酸ステム、及び２５ヌクレオチドの伸長樹状突起を含み、各分子は、別のものに対して１つ以上の相補的配列を含む。
【００２５】
他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約１６〜２０炭素長を含む。他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約２ｎｍの長さを含む。他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約３〜８塩基対の長さを含む。他の実施形態では、ポリエチレングリコールは、約４塩基対の長さを含む。様々な実施形態では、そのポリマーは、核酸ステムを樹状突起に接続させる。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、約６〜１０ヌクレオチドのヘアピン配列、約６〜１５ヌクレオチドの核酸ステム、約６〜１０ヌクレオチドの結合樹状突起、１６〜２５を含む約１０〜２５ヌクレオチドの伸長樹状突起、及び約１６〜２０炭素長のポリマーを含むモノマーである。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、約１１〜１３ヌクレオチドのヘアピン配列、約２２〜２６ヌクレオチドの核酸ステム、約１１〜１３ヌクレオチドの結合樹状突起、約１３〜１６ヌクレオチドの伸長樹状突起、及び約１６〜２０炭素長のポリマーを含むモノマーである。他の実施形態では、対象となる分析物は、核酸を含む。他の実施形態では、対象となる分析物は、小分子を含む。他の実施形態では、対象となる分析物は、ポリマーを含む。他の実施形態では、対象となる分析物は、ペプチドまたはタンパク質を含む。
【００２６】
他の実施形態では、分析物結合物質は、ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ペプチドまたはタンパク質を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、抗体を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ペプチドまたはタンパク質を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ペプチド核酸を含む。他の実施形態では、分析物結合物質は、ロックト核酸を含む。
【００２７】
他の実施形態では、集合体は、伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、標識ポリヌクレオチドは、フルオロフォア、発色団、色素原、量子ドット、蛍光ミクロスフェア、ナノ粒子、元素標識、金属キレート化ポリマー、バーコード及び／または連続バーコード（当業者に知られている多数の他の標識物質を含む）を含む。
【００２８】
様々な実施形態では、フルオロフォアは、フルオレセイン、ローダミン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ｆｌｕｏｒ、ＡＴＴＯ色素、またはそれらの任意のアナログもしくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の標識は、フルオレセイン及びフルオレセインの化学的誘導体；エオシン；カルボキシフルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；フルオレセインアミダイト（ＦＡＭ）；エリトロシン；ローズベンガル；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａから分泌されるフルオレセイン；メチレンブルー；レーザー色素；ローダミン色素（例えば、ローダミン、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３、オーラミンＯ、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ、及びテキサスレッド）を含むがこれらに限定されない。様々な実施形態では、本発明の標識は、Ａｌｅｘａ−３５０、Ａｌｅｘａ−４０５、Ａｌｅｘａ−４３０、Ａｌｅｘａ−４８８、Ａｌｅｘａ−５００、Ａｌｅｘａ−５１４、Ａｌｅｘａ−５３２、Ａｌｅｘａ−５４６、Ａｌｅｘａ−５５５、Ａｌｅｘａ−５６８、Ａｌｅｘａ−５９４、Ａｌｅｘａ−６１０、Ａｌｅｘａ−６３３、Ａｌｅｘａ−６４７、Ａｌｅｘａ−６６０、Ａｌｅｘａ−６８０、Ａｌｅｘａ−７００、またはＡｌｅｘａ−７５０を含む蛍光染料のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒファミリーを含む。
【００２９】
様々な実施形態では、量子ドットは、半導体ナノ結晶を含む。様々な実施形態では、半導体は、周期表のＩＩ〜ＶＩ、ＩＩＩ〜Ｖ及びＩＶ族の元素から構成される。様々な実施形態では、量子ドットは、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＳ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、及びＳｉならびにそれらの３元及び４元混合物を含む。様々な実施形態では、量子ドットは、より大きなバンドギャップを有する半導体のオーバーコート層を含む。様々な実施形態では、半導体ナノ結晶は、それらの均一なナノメートルサイズによって特徴付けられる。「ナノメートル」サイズとは、約１５０オングストローム（Å）未満、好ましくは１２〜１５０Åの範囲内を意味する。
【００３０】
様々な実施形態では、集合体はさらに、追加の少なくとも２つの分子と、最初の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的な核酸配列アドレス及び追加の少なくとも２つの分子のための二次誘発体を含むリンカーと、を含み、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子は、自己組織化重合のために構成されている。様々な実施形態では、最初の少なくとも２つの分子及び誘発体は、第１の自己組織化重合であり、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子は、第２の自己組織化重合である。様々な実施形態では、第１及び第２の自己組織化重合は、二次増幅である。他の実施形態では、集合体は、追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書ではさらに、少なくとも２つの分子であって、各分子が、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的である、少なくとも２つの分子と、分析物結合物質に連結された少なくとも１つの核酸誘発体であって、その核酸誘発体が、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である、少なくとも１つの核酸誘発体と、を含む集合体、及びキットの使用のための指示書のキットが記載されている。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子、及び誘発体は、自己組織化重合のために構成されている。様々な実施形態では、集合体は、２５〜５０単位の第１、第２の分子及び核酸誘発体サブ集合体、約５０〜１００単位の第１、第２の分子及び核酸誘発体サブ集合体、約１００〜１５０単位の第１、第２の分子及び核酸誘発体サブ集合体、約１５０〜２００単位の第１、第２の分子及び核酸誘発体サブ集合体、または２００単位以上の第１、第２の分子及び核酸誘発体サブ集合体を含むポリマーを生成することが可能である。
【００３２】
様々な実施形態では、キットはさらに、追加の少なくとも２つの分子と、最初の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的な核酸配列アドレス及び追加の少なくとも２つの分子のための二次誘発体を含むリンカーとを導入することを含み、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子は、自己組織化重合のために構成されている。様々な実施形態では、集合体は、２５〜５０単位の追加の第１、第２の分子及びリンカーサブ集合体、約５０〜１００単位の追加の第１、第２の分子及びリンカーサブ集合体、約１００〜１５０単位の追加の第１、第２の分子及びリンカーサブ集合体、約１５０〜２００単位の追加の第１、第２の分子及びリンカー誘発体サブ集合体、または２００単位以上の追加の第１、第２の分子及びリンカー誘発体サブ集合体を含むポリマーを生成することが可能である。
【００３３】
他の実施形態では、キットは、最初の少なくとも２つの分子、及び／または追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、キットは、２つ以上の標識ポリヌクレオチドを含み、その各々が、最初の少なくとも２つの分子及び／または追加の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的である。
【００３４】
本明細書では、各々が核酸及び有機ポリマーを含む少なくとも２つの分子を加えることと、核酸を含む誘発体分子をさらに加えることと、自己組織化重合を誘発することと、を含み、各分子が、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む、重合方法が記載されている。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む。他の実施形態では、核酸誘発体は、分析物結合物質を含む。他の実施形態では、別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成し、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、少なくとも１つの核酸誘発体は、分析物結合物質に連結されており、その核酸誘発体が、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である。他の実施形態では、検出可能なシグナルを生成することは、伸長樹状突起に標識ポリヌクレオチドを結合させることを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、標識物質は、フルオロフォア、発色団、色素原、量子ドット、蛍光ミクロスフェア、ナノ粒子、元素標識、金属キレート化ポリマー、バーコード及び／または連続バーコード（当業者に知られている多数の他の標識物質を含む）を含む。様々な実施形態では、ポリマーは、核酸ステムを樹状突起に接続させる。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、約６〜１０ヌクレオチドのヘアピン配列、約６〜１５ヌクレオチドの核酸ステム、約６〜１０ヌクレオチドの結合樹状突起、１６〜２５ヌクレオチドを含む約１０〜２５ヌクレオチドの伸長樹状突起、及び約１６〜２０炭素長のポリマーを含むモノマーである。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、約１１〜１３ヌクレオチドのヘアピン配列、約１２〜３０ヌクレオチドの核酸ステム、約１１〜１３ヌクレオチドの結合樹状突起、約１３〜１６ヌクレオチドの伸長樹状突起、及び約１６〜２０炭素長のポリマーを含むモノマーである。他の実施形態では、核酸誘発体は、約１２〜４８ヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、ポリマーは、核酸ステムを樹状突起に接続させる。様々な実施形態では、少なくとも２つの分子は、約１：２５、１：５０、１：１００、１：２００及びその間の全ての範囲である、核酸誘発体に対する比で、加えられる。
【００３５】
例えば、図１に図示されるように、図１Ａにおける第１の分子の結合デンドリマー１は、図１Ｂにおける第２の分子のヘアピン１’に相補的である。第１及び第２の分子はそれぞれ、相補的な核酸配列２−２’を含むステムを含有する。図１Ａにおける第１の分子のヘアピン配列３は、図１Ｂにおける第２の分子の結合樹状突起３’に相補的である。図１Ａにおける第１の分子は、伸長樹状突起５を含み；１Ｂにおける第２の分子は、別の伸長樹状突起６を含む。図１Ａ及び１Ｂの第１及び分子の両方は、それぞれ、有機ポリマーを含み得るスペーサードメイン４を含む。第３の分子である図１Ｃの核酸誘発体は、図１Ａの第１の分子の結合樹状突起１に結合し、第１の分子を開口させることができる（配列３’−２’の同様のヘアピンも用いられ得る）。図１Ａの第１の分子の開口は、配列ヘアピン３’及びステム２’を露出し、これは、図１Ｂの第２の分子のヘアピン３及びステム２’のための誘発体として作用する。第２の分子のヘアピン１’及びステム２’の露出は、最初の核酸誘発体と同様に作用し、再び別の第１の分子を開口させ、別の第２の分子の開口を導く。このようにして、樹状ポリマーは、誘発された自己組織化体によって形成される。集合した第１及び第２の分子、ならびに誘発体の、結果として生じたポリマーが、図２に示されている。伸長樹状突起５及び／または６は、それぞれ、または両方が、分析物、標識、または追加のポリマーに直接結合し得る。
【００３６】
様々な実施形態では、方法はさらに、追加の少なくとも２つの分子と、最初の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的な核酸配列アドレス及び追加の少なくとも２つの分子のための二次誘発体を含むリンカーとを導入することを含み、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子は、自己組織化重合のために構成されている。様々な実施形態では、最初の少なくとも２つの分子及び誘発体は、第１の自己組織化重合であり、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子の導入は、第２の自己組織化重合である。様々な実施形態では、第１及び第２の自己組織化重合は、二次増幅である。他の実施形態では、集合体は、追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。例えば、図６に図示されるように、追加のポリマーをもたらすための伸長樹状突起５及び／または６の使用は、二次増幅を支援する。
【００３７】
様々な実施形態では、自己組織化重合は、１分〜６０分間、１時間〜１２時間、１２〜２４時間、２４時間以上の、少なくとも２つの分子、及び誘発体分子のインキュベートを含む。様々な実施形態では、これは、１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜３０、３０〜６０、１〜２時間または２時間以上のインキュベートを含む。様々な実施形態では、インキュベートは２〜２４時間である。さらなるリンカー分子が、１つ以上の伸長樹状突起に相補的なアドレス及びさらに加えられる少なくとも２つの分子のための誘発体を含む様々な実施形態では、リンカー分子、及びさらに加えられる少なくとも２つの分子のための二次インキュベートは、１分〜６０分、１時間〜１２時間、１２〜２４時間、２４時間以上である。様々な実施形態では、これは、１、２、３、４、５、５〜１０、１０〜３０、３０〜６０、１〜２時間または２時間以上のインキュベートを含む。様々な実施形態では、インキュベートは２〜２４時間である。
【００３８】
本明細書では、各々が核酸及び有機ポリマーを含む少なくとも２つの分子を、核酸を含む少なくとも１つの誘発体分子を含む材料に加えることと、自己組織化重合を誘発することと、を含み、各分子が、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む、重合方法が記載されている。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む。他の実施形態では、少なくとも１つの核酸誘発体分子は、分析物結合物質を含む。他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起及び伸長樹状突起を含む核酸樹状突起、ならびに有機ポリマーを含み、さらに、少なくとも１つの第１の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第２の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、また、少なくとも１つの第２の分子の核酸ヘアピン配列は、少なくとも１つの第１の分子の核酸結合樹状突起配列に相補的であり、少なくとも１つの核酸誘発体は、分析物結合物質に連結されており、その核酸誘発体は、少なくとも第１の１つの分子の核ステム及び結合樹状突起に相補的である。
【００３９】
様々な実施形態では、前記材料は、固体または液体の基材などの基材を含む。様々な実施形態では、固体の基材は、ガラス、組織培養物表面、または当業者に知られている任意の同様の基材を含む。様々な実施形態では、少なくとも１つの誘発体分子は固体表面に結合され、例えば、表面上に堆積される複数の１つ以上の誘発体分子（アレイ）である。様々な実施形態では、少なくとも１つの誘発体分子は、液体の基材中に分散される。
【００４０】
様々な実施形態では、前記材料は、対象となる分析物を含む。様々な実施形態では、前記材料は、ホールマウント、組織スライス、１つ以上の組織及び細胞などを含む生物学的試料である。様々な実施形態では、対象となる分析物は、誘発体分子の分析物結合物質に結合される。様々な実施形態では、生物学的試料は、固体の基材の表面上に堆積される。様々な実施形態では、生物学的試料は、液体の基材中に分散される。
【００４１】
他の実施形態では、方法は、別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、検出可能なシグナルを生成することは、伸長樹状突起に標識ポリヌクレオチドを結合させることを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、方法は、最初の少なくとも２つの分子、及び／または追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、方法は、２つ以上の標識ポリヌクレオチドを含み、その各々が、最初の少なくとも２つの分子及び／または追加の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的である。
【００４２】
様々な実施形態では、方法は、溶液中の核酸配列の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、固相中（ＩＳＨ）の核酸配列の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、溶液中の小分子の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、固相中の小分子の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、溶液中のペプチド及びタンパク質の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、固相中のペプチド及びタンパク質の検出及び／またはシグナル増幅、またはその両方と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、ＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光などの、一次抗体からのシグナル増幅と組み合わせて使用される。様々な実施形態では、方法は、ＥＬＩＳＡ及び免疫蛍光などの、二次抗体からのシグナル増幅と組み合わせて使用される。
【００４３】
また、本明細書では、対象となる分析物を含有するサンプルを提供することを含む方法が記載されている。様々な実施形態では、方法は、少なくとも２つの分子を加えることと（各分子は、核酸及び有機ポリマーを含む）、核酸を含む誘発体分子をさらに加えることと、重合を誘発することと、を含み、各分子は、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む。他の実施形態では、方法は、誘発体に結合したサンプル、ならびに少なくとも２つの分子を加えることと（各分子は、核酸及び有機ポリマーを含む）、核酸を含む誘発体分子をさらに加えることと、重合を誘発することと、を含み、各分子は、別の分子に対する１つ以上の相補的配列を含む。
【００４４】
他の実施形態では、少なくとも２つの分子はそれぞれ、核酸ヘアピン、核酸ステム、結合樹状突起、伸長樹状突起を含む。様々な実施形態では、ポリマーは、核酸ステムを樹状突起に接続させる。他の実施形態では、核酸誘発体は、分析物結合物質を含む。他の実施形態では、方法は、別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。
【００４５】
様々な実施形態では、方法はさらに、追加の少なくとも２つの分子と、最初の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的な核酸配列アドレス及び追加の少なくとも２つの分子のための二次誘発体を含むリンカーとを導入することを含み、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子は、自己組織化重合のために構成されている。様々な実施形態では、最初の少なくとも２つの分子及び誘発体は、第１の自己組織化重合であり、追加の少なくとも２つの分子及びリンカー分子の導入は、第２の自己組織化重合である。様々な実施形態では、第１及び第２の自己組織化重合は、二次増幅である。他の実施形態では、集合体は、追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。
【００４６】
他の実施形態では、方法は、別の分子に相補的な標識ポリヌクレオチドを結合させることによって検出可能なシグナルを生成することを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、検出可能なシグナルを生成することは、伸長樹状突起に標識ポリヌクレオチドを結合させることを含み、その標識ポリヌクレオチドは、標識物質を含む。他の実施形態では、方法は、最初の少なくとも２つの分子、及び／または追加の少なくとも２つの分子の伸長樹状突起に相補的な標識ポリヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、方法は、２つ以上の標識ポリヌクレオチドを含み、その各々が、最初の少なくとも２つの分子及び／または追加の少なくとも２つの分子の１つ以上の伸長樹状突起に相補的である。
【００４７】
様々な実施形態では、方法は、バーコード配列の生成を含む。様々な実施形態では、方法は、オーバーハング配列、シグナル標識、及び伸長樹状突起に相補的な配列を含む第１のオリゴヌクレオチドを加えることと、２つのオーバーハング、すなわち、第１のオリゴヌクレオチドのオーバーハングに相補的な第１のｄｓＤＮＡオーバーハング及び第２のｄｓＤＮＡオーバーハングを含有するクエンチャー標識を含むｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを導入することと、を含む。様々な実施形態では、ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドクエンチャー標識は、ダブシルなどの短距離クエンチャー及びフルオロフォアを含む。様々な実施形態では、１つ以上のｄｓＤＮＡクエンチャー標識は、互いにｎ回ハイブリダイズされてバーコードを生成し得る。
【００４８】
様々な実施形態では、方法は、標識オリゴヌクレオチド及び消去体オリゴヌクレオチドを含む少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、標識オリゴヌクレオチドは、伸長樹状突起に相補的な第１のオーバーハング配列及び第２のオーバーハング配列を含む。様々な実施形態では、消去体オリゴヌクレオチドは、標識オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有する。様々な実施形態では、方法は、標識オリゴヌクレオチドで標識された分析物に消去体オリゴヌクレオチドを導入することによって消去すること、消去−標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマーを洗い流すこと、及び追加の標識オリゴヌクレオチドを加えることを含む。様々な実施形態では、標識−消去−標識サイクルは、バーコードを生成するためにｎ回繰り返される。
【実施例】
【００４９】
実施例１
分子メカニズム
本発明者らのアプローチは、次のように機能する：樹状モノマーの相補的な対を使用して、核酸ハイブリダイゼーション及び分枝点移動の連鎖反応によって、重合誘発体の存在下で、制御可能な手法で、自己組織化によって樹状ポリマーを生成し得る（図１及び図２）。誘発体は、直接的に、または親和性リガンドと組み合わせてのいずれかで使用され得る（図３及び図４）。親和性リガンドの性質は、検出されるべき分析物の種類を定義する。ポリマーの各樹状突起は、例えば、フルオロフォア、量子ドットまたは金属キレート化ポリマーなどの最適な標識を結合させるのに使用され得る（図５）。各樹状ポリマーは、およそ２００個の樹状突起を含有する。それ故、多数の標識を対象となる標的に最終的に連結し、そのシグナルを劇的に増加させ、その検出を迅速にし、明確にすることができる。重合の後、核酸モノマーを樹状突起に直接ハイブリダイズさせることによって（増幅の前または後のいずれかで）または標的樹状突起に相補的な独自の配列及び標識された核酸モノマーを含む核酸二重鎖を形成することによってのいずれかで標識が行われ得る（図６）。第２のアプローチは、多重化標識のコストを劇的に削減するという追加的な利点を有し、その理由は、必要とされる高価な部分の数を、同時に標識される要素の数によって割ることができるように、単一の標識核酸モノマーを任意の特定の相補的標識に結合させることができるからである（図６）。比較的低コストで多数のリガンドのシグナルを同時に標識及び増幅する潜在性は、ＨＣＲなどの同様の技術と比較して、このアプローチの重要な利点である。二次標識はまた、別個の系のための誘発体配列を隣接させることによって二次増幅を実施するために用いられ得る。前記アプローチの重要な利点は、分析物結合／標識及びシグナル増幅に関与するプロセスの分離である。なぜなら、従来の技術が２つの工程を統合するか、または２つの工程に密接に依存するからである。
【００５０】
実施例２
利点
別の考慮事項：いくつかのフルオロフォア及び他のシグナル標識は、立体障害などの二次構造効果のためにヘアピンオリゴヌクレオチドと適合しない。相補的プローブ標識は、これらの効果を排除し、二次構造をとり得る長いオリゴヌクレオチドへの直接結合に対して合成収率を増加させる。同様の目標を実現する他の方法と比較すると、本発明者らのアプローチはいくつかの利点を有する：
−  むき出しの直接標識された構造（例えば、ＨＣＲにおけるもの）の代わりに樹状ポリマーを生成することによって、本発明者らのアプローチは、使用可能でありそのシグナルが増幅される標識の性質において、はるかに高い柔軟性及びモジュール性を提供する。これにより、使用者は、特定の場合に応じて最も適切な標識を選択することが可能になる。これは、本明細書に記載の方法に対して直交的に使用して相補的な情報を提供し得る様々な検出方法のように、使用者に柔軟性を提供する。
−  ＨＣＲと比較して、本発明者らの方法は、ヘアピンの複雑性を低く維持すること、及び標識された核酸モノマーを組み合わせて使用して多種多様なビーコンを標識することを可能にすることによって、コストを大幅に削減する。
−  分枝ＤＮＡアプローチと比較して、本発明者らの方法は、樹状ＤＮＡ構造を自律的に生成し、これにより使用者は、数ラウンドの核酸ハイブリダイゼーションを実施しなければならないことから解放される。
−  伝統的なアプローチは面倒でエラーが発生しやすく、この技術をユーザーフレンドリーではないものとしている。
−  分枝ＤＮＡと比較して、本発明者らの方法は、成分を合成するのがより容易であり、これは、有意な節約及び収率の増加をもたらす。いくつかの場合では、ホールマウントサンプル検出のように、利用される比較的小さなヘアピン構造は、より大きな構造と比較して拡散能力に優れており、それによってシグナル発生の利点を提供する。
−  色素原／チラミドアプローチと比較して、この技術は、より大きな程度の多重化を可能にする。さらに、この技術は核酸化学に依存しているので、生体適合性であり、対象となるサンプルに対する影響が最小である。それ故、それはより簡易であり、免疫組織化学、免疫蛍光、及び核酸配列決定などの同一サンプルの並行したまたは連続した研究をより許容する。
【００５１】
実施例３
樹状増幅剤の設計考慮事項
記載されるアプローチは、組み合わせを標識するのに非常に多数の配列設計を可能にする。例えば、１２ヌクレオチド長の足がかり／ループ、２４ヌクレオチド長のステム及び１５ヌクレオチド長の樹状突起を有する系の場合：４１２＊４２４＊４１２＊４＊１５＝４６３＝８．５＊１０３７個の可能性のある配列が存在する。この驚くべき程に大きな設計空間は、非常に多数のまたは直交的な系を生成する可能性を提供する。本発明者らは、最適に増幅する系を生成するための設計基準を確立した。
【００５２】
例えば、理想的な配列の組み合わせは、好ましいヘアピン二次構造に対する代替的形態の最小化、足がかりと樹状突起との間の相互作用の最小化、及びステムの安定性の最大化を含む所定の設計基準を満たす。より詳細には、配列は、足がかりの前端、足がかりの最後の位置及びステムの最初の２つの位置（通常はステム内）、及び樹状突起の前端などの重要な位置における塩基スタッキング相互作用を最大化するように選択される。これらの設計基準を満たす様々な例示的配列を示す。
【００５３】
実施例４
自己組織化樹状重合系のための例示的配列
2020516319.tif 000003
2020516319.tif 000004
2020516319.tif 000005
2020516319.tif 000006
【００５４】
実施例５
例示的標識技術：ショウジョウバエ胚プロトコル
ショウジョウバエ胚を標識するための例示的な技術を本明細書に記載する。４％ＰＦＡ中で固定され、−２０°のメタノール中で保存された胚から開始し、サンプルを以下のように操作する。
【００５５】
１．再水和する
ａ．ＰＢＳ中８０％のメタノール、５分
ｂ．ＰＢＳ中５０％のメタノール、５分
ｃ．ＰＢＳ中２５％のメタノール、５分
２．ＰｒｏＫ処理
ａ．ＰＢＳＴ中３μｇ／ｍｌのＰｒｏＫ中で１３分インキュベートする。
ｂ．氷上に１時間移す。
ｃ．２ｍｇ／ｍｌのグリシンでｐｒｏＫを２分間ブロックする。
ｄ．グリシンによるブロックを繰り返す。
ｅ．ＰＢＳＴで２回すすぐ
ｆ．ＰＢＳＴ中で３×５分洗浄する
３．後固定
ａ．振盪しながらＰＢＳＴ中の４％ＰＦＡ中で２０分固定する。
ｂ．ＰＢＳＴ中で３×５分洗浄する
４．プローブハイブリダイゼーション
ａ．１００μｌの予備加熱した（４５°）ハイブリダイゼーション緩衝液を加える
ｂ．４５°で３０分間インキュベートする
ｃ．０．１μｌ（０．５ｐＭ）の各１μＭプローブストックを１００μｌの予備加熱した（４５°）ハイブリダイゼーション緩衝液に加えることによってプローブ溶液を調製する。
ｄ．「予備ハイブリダイゼーション」緩衝液を除去する
ｅ．−サンプルはここで保存され得る（１〜２週間）。
ｆ．上記で調製された１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液＋プローブを加える
ｇ．４５°で４時間または一晩インキュベートする
ｈ．予備加熱した（４５°）洗浄緩衝液で洗浄する
ｉ．４×１５分
５．樹状ポリマーの生成
ａ．上記の最後の洗浄工程中で、簡易冷却を開始する
ｉ．２μｌの各ヘアピン溶液を別々のｅｐｐｉに入れる。
ｉｉ．９５度で９０秒溶融させる
ｉｉｉ．室温で３０分間引き出しに入れる
ｉｖ．この時間中に、洗浄緩衝液を１００μｌの増幅緩衝液と交換する。室温で維持する
ｖ．（少なくとも１０分後に）「予備増幅」緩衝液を除去する
ｖｉ．１００μｌの室温の増幅緩衝液をＨ１に加え、次いでＨ２に移し、最後にサンプルに移す。
ｖｉｉ．室温で１時間または最大で一晩インキュベートし、光から保護する
ｖｉｉｉ．５ＸＳＳＣＴで洗浄する
１．２×５分
２．２×３０分
６．標識
ｉ．１００μｌの５ＸＳＳＣＴ中１ピコモルの標識を加える。
ｉｉ．室温で１時間ハイブリダイズさせる
ｉｉｉ．５ＸＳＳＣＴ中で４×１５分洗浄する
７．マウントし、撮像する。
【００５６】
ＩＩ．ＦＦＰＥスライドプロトコル
１．パラフィン除去
５００μｌのキシレンを加える、３分
５００μｌのキシレンを加える、３分
５００μｌの１：１のキシレンエタノールを加える、３分
５００μｌのエタノールで洗浄する、３分
５００μｌのエタノールで洗浄する、３分
２．再水和
９５％のエタノール、３分
７０％のエタノール、３分
５０％のエタノール、３分
ＰＢＳＴ３分
ＰＢＳＴ３分
３．プロテインキナーゼＫ消化
スライドを１０μｇ／ｍＬのプロテインキナーゼＫ溶液中で３７°で４０分間浸漬する。
スライドをＰＢＳＴ中で室温で２×３分洗浄する。
４．予備ハイブリダイゼーション
２つの加湿されたチャンバーを、一方は４５°で他方は６５°で事前に温める。
キムワイプ上の拭き取り端によってスライドを乾燥させる。
４００μＬのプローブハイブリダイゼーション緩衝液を組織サンプルの上部に加える。
６５°の加湿されたチャンバー内で１０分間予備ハイブリダイズさせる。
０．２ｐｍｏｌの各プローブ（プローブ当たり１μＬの１μＭのストック）を４５°の１００μＬのプローブハイブリダイゼーション緩衝液に加えることによってプローブ溶液を調製する。
予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、キムワイプ上の拭き取り端によってスライド上の余剰の緩衝液を取り除く。
４００μＬのプローブ溶液を組織サンプルの上部に加える。
組織サンプル上にカバースリップを置き、４５°の加湿されたチャンバー内で２〜４時間または一晩インキュベートする。
４５°の洗浄緩衝液１ｍｌ中で４回洗浄する
５．洗浄プローブ
４５°で事前に温めた洗浄緩衝液で４×１５分洗浄する
５ＸＳＳＣＴで２回洗浄する
６．モノマーを調製する：
１００ｕｌの反応体積当たり２ｕｌのヘアピン１及び２が必要とされる。
簡易冷却：９５°で３分→氷上で３分→室温で２５分
７．予備増幅
４００μｌの増幅緩衝液を室温で１０分で加える
予備増幅緩衝液を拭き取る。
ヘアピンを増幅緩衝液に加える
室温で１時間から最大で一晩インキュベートする。
８．モノマーを洗浄する
室温で５ＸＳＳＣＴで４×１５分洗浄する。
１ピコモルの標識を加える。
１時間ハイブリダイズさせる。
室温で５ＸＳＳＣＴで４×１５分洗浄する。
９．マウントし、撮像する
【００５７】
ＩＩＩ．抗体増幅プロトコル
ＰＢＳＴ中での一次抗体の洗浄後まで通常の抗体染色プロトコルを進行させる。
１．モノマーを調製する：
１００ｕｌの反応体積当たり２ｕｌのモノマー１及び２が必要とされる。
各２μｌのモノマーを別々に簡易冷却する。
簡易冷却：９５°で３分→氷上で３分→室温で２５分
２．増幅
モノマーを適切な量の５ＸＳＳＣＴと混合する。
適切な量の５ＸＳＳＣＴ中の事前に調製されたモノマーをサンプルに加える。
室温で１時間から最大で一晩インキュベートする。
３．モノマーを洗浄する
室温で５ＸＳＳＣＴで４×１５分洗浄する。
１ピコモルの標識を加える。
１時間ハイブリダイズさせる。
室温で５ＸＳＳＣＴで４×１５分洗浄する。
４．マウントし、撮像する
緩衝液：
５Ｘ  ＳＳＣＴ−７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、１リットルの二重に蒸留した水。
緩衝液：
５Ｘ  ＳＳＣ−７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸三ナトリウム、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、１リットルの二重に蒸留した水。
５Ｘ  ＳＳＣＴ
５Ｘ  ＳＳＣ−０．１％のＴｗｅｅｎ２０
ハイブリダイゼーション緩衝液−５０％のホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、９ｍＭのクエン酸（ｐＨ６）、５０μｇ／ｍＬのヘパリン、１Ｘデンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、０．１％のＴｗｅｅｎ２０。
洗浄緩衝液−５０％のホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ、９ｍＭのクエン酸（ｐＨ６）、５０μｇ／ｍＬのヘパリン、０．１％のＴｗｅｅｎ２０。
増幅緩衝液−５Ｘ  ＳＳＣＴ、１０％の硫酸デキストラン。
【００５８】
実施例６
バーコード標識アプローチ
多様式設計は、組み合わせアプローチをそれ自体組み込む標識技術のさらなる類型を含む、異なる標識物質の利用を可能にする。例えば、連続バーコード化アプローチは、バーコード化されたＳｎ（Ｓは、異なるシグナル種（例えば、異なる波長で放射するフルオロフォア）の数であり、ｎは、連続標識実行数である）の生成を可能にする。
【００５９】
樹状ポリマーは、バーコード配列を生成するために使用され得る。本発明者らは、研究されているサンプルに優しい、緩衝液中での蛍光標識の迅速かつ周囲温度での交換を可能にすることによって伝統的な方法を改善する２つのアプローチを考案した。標識−消光−標識技術では、追加の１５ヌクレオチドの「オーバーハング」配列を含有する、標識する樹状ポリマー上の樹状突起配列に相補的な第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバーコード標識を構成する。「オーバーハング」は、２つのオーバーハングを含有するｄｓＤＮＡ「クエンチャー」標識を固定する働きをし、１つ目は第１の標識のオーバーハングに相補的であり、２つ目は次の標識を固定する働きをする。「クエンチャー」標識オリゴヌクレオチドは、ダブシルなどの短距離クエンチャー及びフルオロフォアを含有する。前の標識のオーバーハングへのクエンチャー標識のハイブリダイゼーションにより、クエンチャー及び前のフルオロフォアが非常に近い距離に配置され、これにより最初のフルオロフォアの蛍光が消光され、「クエンチャー」標識に含まれるフルオロフォアのみがシグナルを放射し得る。このようにして、後続の「クエンチャー」標識は、互いにｎ回ハイブリダイズされてバーコードを生成し得る。
【００６０】
標識−消去−標識アプローチは、２つのオリゴヌクレオチド種を必要とする。標識は、樹状突起に相補的であり、１２塩基対のオーバーハングを含む。消去体は、１２塩基対のオーバーハングを含む標識に十分に相補的である。標識置換を開始するために、消去体オリゴヌクレオチドが、予め標識されたサンプルに加えられる。標識のオーバーハングに対する消去体のハイブリダイゼーションは分枝点移動事象を誘発し、これにより消去体−標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマーが樹状突起から切り離された標識として生成される。次いで消去体−標識ダイマーは洗い流され得る。最後に、新しい標識がサンプルに加えられる。これらの標識−消去−標識サイクルは、ｎ回繰り返されてバーコードを生成し得る。標識−消光−標識アプローチと比較して、この方法は、より簡易かつより安価である。
【００６１】
実施例７
追加のプロトコル
記載したように、ＭＵＳＥは、検出、増幅及び標識という３つの構成工程を含む。検出は通常、問題となる分析物及び研究されているサンプルの種類にとって慣例的に（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ分析物の場合はインサイチューハイブリダイゼーション、タンパク質及びペプチドの場合は免疫組織化学）実施される。分析物の検出の後に、核酸モノマーの自己組織化を含む一般的な増幅プロセスが続く。ＭＵＳＥは、最適な異なる標識と適合し；そのため、標識プロトコルは、使用されている標識の種類によって変化する。以下に追加の検出、増幅及び標識プロトコル、ならびに代表的結果。
【００６２】
実施例８
検出プロトコル
検出プロトコルは、ＭＵＳＥ増幅及び標識工程から独立している。適合性について、唯一の要件は、ＭＵＳＥ増幅工程の前にサンプルが適合性緩衝液（例えば、５ＸＳＳＣＴ、ＰＢＳ）中にあることである。
【００６３】
以下は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質検出のための検出プロトコルの例である。
【００６４】
実施例９
ＦＦＰＥスライドでのＤＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション
１．２Ｘ  ＳＳＣＴ＋５０％のホルムアミド中で９２℃で３分間インキュベートする
２．６０℃で２Ｘ  ＳＳＣＴ＋５０％のホルムアミドを有するコプリンジャーに移す。
３．２０分間インキュベートする。
４．スライドを除去し、室温に冷却する。
５．２Ｘ  ＳＳＣＴ、５０％のホルムアミド、１０％（ｗ／ｖ）の硫酸デキストラン、１０μｇのＲＮａｓｅＡ、及び１０〜２０ピコモルのプローブから構成される２５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液を加える
６．カバースリップでカバーし、ゴムセメントで密閉する。
７．室温で５分間ゴムセメントを空気乾燥させる
８．９２℃で３分間変性させる。
９．スライドを加湿されたチャンバーに移す。３７℃で一晩ハイブリダイズする。
１０．カバースリップを除去し、２Ｘ  ＳＳＣＴを有する事前に温めたコプリンジャー内で６０℃で１５分間スライドを洗浄する。
１１．室温で２Ｘ  ＳＳＣＴを含有するコプリンジャーに移し、
１２．１０分間インキュベートする。
１３．室温で０．２Ｘ  ＳＳＣを含有するコプリンジャーにスライドを移し、
１４．１０分間インキュベートする。
１５．スライドの端をろ過紙で拭き取ってほとんどの緩衝液を除去する。スライドを乾燥させない。
１６．マウント媒体を加え、マウントする。
【００６５】
実施例１０
ショウジョウバエ胚でのＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション
１．ＰＢＳ中８０％のメタノール、５分
２．ＰＢＳ中５０％のメタノール、５分
３．ＰＢＳ中２５％のメタノール、５分
４．ＰＢＳＴ中３μｇ／ｍｌのＰｒｏＫ中で１３分インキュベートする
５．氷上に１時間移す
６．２ｍｇ／ｍｌのグリシンでｐｒｏＫを２分間ブロックする
７．繰り返す
８．ＰＢＳＴで２回すすぐ
９．ＰＢＳＴ中で３×５分洗浄する
１０．後固定
１１．振盪しながらＰＢＳＴ中の４％ＰＦＡ中で２０分固定する
１２．ＰＢＳＴ中で３×５分洗浄する
１３．１００μｌの予備加熱した（４５℃）ハイブリダイゼーション緩衝液を加える
１４．４５℃で３０分間インキュベートする
１５．０．１μｌ（０．５ｐＭ）の各１μＭプローブストックを１００μｌの予備加熱した（４５℃）ハイブリダイゼーション緩衝液に加えることによってプローブ溶液を調製する
１６．「予備ハイブリダイゼーション」緩衝液を除去する
１７．上記で調製された１００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液＋プローブを加える
１８．４５℃で一晩インキュベートする
１９．予備加熱した（４５℃）洗浄緩衝液で４回洗浄する
２０．１ｍＬの５ＸＳＳＣＴを加える
【００６６】
実施例１１
ＦｆｐｅスライドでのＲＮＡのインサイチューハイブリダイゼーション
１．５００μｌのキシレンを加える、３分
２．５００μｌのキシレンを加える、３分
３．５００μｌの１：１のキシレンエタノールを加える、３分
４．５００μｌのエタノールで洗浄する、３分
５．５００μｌのエタノールで洗浄する、３分
６．５００μｌの９５％のエタノールで洗浄する、３分
７．５００μｌの７０％のエタノールで洗浄する、３分
８．５００μｌの５０％のエタノールで洗浄する、３分
９．５００μｌのＰＢＳＴで洗浄する、３分
１０．５００μｌのＰＢＳＴで洗浄する、３分
１１．スライドを２μｇ／ｍＬのプロテインキナーゼＫ溶液中で３７℃で４０分間浸漬する
１２．スライドをＰＢＳＴ中で室温で２×３分洗浄する
１３．キムワイプ上の拭き取り端によってスライドを乾燥させる
１４．４００μＬのプローブハイブリダイゼーション緩衝液を組織サンプルの上部に加える
１５．４５℃の加湿されたチャンバー内で１０分間予備ハイブリダイズさせる。
１６．プローブ溶液を調製する（１μｌの１μＭのプローブミックスを使用する）
１７．予備ハイブリダイゼーション溶液を除去し、キムワイプ上の拭き取り端によってスライド上の余剰の緩衝液を取り除く
１８．１００μＬのプローブ溶液を組織サンプルの上部に加える。
１９．組織サンプル上にカバースリップを置き、４５℃の加湿されたチャンバー内で４時間インキュベートする。
２０．４５℃で事前に温めた洗浄緩衝液で４×１５分洗浄する
２１．５ＸＳＳＣＴで２回洗浄する
【００６７】
実施例１２
免疫蛍光コンジュゲーション戦略
抗体／親和性リガンドは、例えば、アミノ、マレイミド及びビススルホン架橋剤を含む様々な方法でｓｓＤＮＡ  ＭＵＳＥ誘発体にコンジュゲートされ得る。
コンジュゲーションプロトコル（例えば、ビス−スルホン−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ）
１．ＰＢＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡを調製する
２．２００μｇのＰａｎ  Ｒａｓ抗体を１００ＫＤＡカラム内のＰＢＳ−ＥＤＴＡ  ２Ｘに緩衝液交換する
３．７０μｌのＰＢＳ＋ＥＤＴＡに再懸濁する
４．対照の場合は１０μｌを維持する
５．１０倍過剰のＴＣＥＰを使用する
６．適切な量のＴＣＥＰ１ｍＭを抗体に加える。
７．抗体を室温で１時間還元させる
８．抗体をＰＢＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡ中のアミコン５０で２回緩衝液交換する。
９．６０μｌのＰＢＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁する
１０．５倍モル過剰のビス−スルホン−ＰＥＧ４−ＤＢＣＯ試薬を加える
１１．ピペット操作でよく混合する。
１２．室温で一晩インキュベートする。
１３．３０ＫＤａのカラム内のＰＢＳ  ３Ｘに緩衝液交換する
１４．５０μｌのＰＢＳに再懸濁する。
１５．対照の場合は２５μｌを維持する。
１６．ＰＢＳ中の２倍過剰のオリゴ−アジドを使用する。
１７．４℃で一晩インキュベートする。
１８．３０ＫＤａカラム内のＰＢＳ  ３Ｘで緩衝液交換する。
１９．１００μｌのＰＢＳ中で回収する
【００６８】
実施例１３
免疫染色プロトコル
免疫染色は、最終的な洗浄がＰＢＳにおけるものである限り、使用者によって任意の好ましい方法で実施され得る。
１．一次抗体を適切に希釈して室温で２時間（または４℃で一晩）サンプルをインキュベートする。
２．ＰＢＳ＋０．１％のＴｗｅｅｎ−２０中で３×１０分洗浄する。
３．３％の加熱不活化ヤギ血清中で３０分ブロックする
４．適切な濃度の二次抗体（通常１／５００）を用いて室温で１時間インキュベートする。
５．ＰＢＳ中で３×１０分洗浄する。
【００６９】
実施例１４
増幅プロトコル
記載された理由により、核酸モノマーの自己組織化を含む一般的な増幅プロセスを利用する。
１．ＭＵＳＥヘアピン（２μｌ／１００μｌの反応溶液）を９５℃で３分間変性させる。
２．氷上に１０分置く。
３．室温で２０分置く
４．ヘアピンを増幅ミックスと混合する。
５．事前にハイブリダイズした免疫染色されたサンプル上に置く。
６．室温で一晩増幅させる
７．５ＸＳＳＣＴ中で４×１５分洗浄する
【００７０】
実施例１５
標識プロトコル−蛍光
蛍光標識コンジュゲーション戦略
フルオロフォアは、アミノ、マレイミドまたはクリック媒介コンジュゲーションを含む（網羅的ではない）様々な方法でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。例示的なコンジュゲーションプロトコルを提供する：
【００７１】
標識可能性
標識としてフルオロフォアにコンジュゲートしたｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドを使用することができる。しかしながら、シグナルをさらに増強するために、最大で４つのフルオロフォアを（各５’３’末端に）含有するｄｓＤＮＡ標識を使用することも可能である。
【００７２】
フルオロフォア標識プロトコル
ＩＳＨまたはＩＦから開始：
１．ハイブリダイゼーション溶液１００μｌ当たり２μｌのフルオロフォア標識を加える。
２．ハイブリダイゼーション緩衝液中で室温で２時間ハイブリダイズさせる。
３．５ＸＳＳＣＴ中で２×１５分洗浄する。
４．ＰＢＳ中で２×１５分洗浄する。
５．マウントし、撮像する。
【００７３】
実施例１６
標識プロトコル−量子ドット
量子ドットコンジュゲーション戦略
量子ドットは、様々な方法でオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。例示的なコンジュゲーションプロトコルを提供する：
【００７４】
量子ドット標識プロトコル
１．ＩＳＨまたはＩＦから開始：
２．ハイブリダイゼーション溶液１００μｌ当たり２μｌの量子ドット標識を加える。
３．室温で２時間ハイブリダイズさせる。
４．５ＸＳＳＣＴ中で２×１５分洗浄する。
５．ＰＢＳ中で２×１５分洗浄する。
６．マウントし、撮像する。
【００７５】
実施例１７
標識プロトコル−元素
元素標識コンジュゲーション戦略
元素標識は、マレイミド化学を介してチオールまたはジチオール部分を含有するオリゴヌクレオチドに金属キレート化ポリマー（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ．Ｃｏｒｐ．）をコンジュゲートすることよって生成される。コンジュゲーションのためのプロトコルは以下で見ることができる。
元素標識生成プロトコル
１．ＴＥ緩衝液中でオリゴを２００μＭまで再懸濁する
２．５０μＬ（２００μＭ）のオリゴを２０μｌのＴＥ緩衝液に混合する
３．３０μｌの０．５ＭのＴＣＥＰを加える
４．室温で少なくとも２時間放置する。
５．−ＭＣＰに純粋な同位体を予備投入する−
６．工程ＩＩの後に３０分待つ。
７．１０秒間ポリマーチューブを迅速に遠沈させる。
８．９５μＬのＬ−緩衝液でポリマーを再懸濁する。
９．ピペット操作でよく混合する。
１０．５μＬの同位体溶液（合計２ｍＭ）を加える。
１１．ピペット操作でよく混合する。
１２．３７℃で３０〜４０分間インキュベートする。
１３．３５分後：
１４．３Ｋ  ＵＦカラムに２００μＬのＬ−緩衝液を加える。
１５．同位体が投入されたＭＣＰ溶液をＬ−緩衝液を含有する３Ｋ  ＵＦカラムに加える。
１６．室温で最高速度で２５分間回転させる。
１７．３Ｋ  ＵＦカラムに３００μＬのＣ−緩衝液を加える。
１８．室温で最高速度で３０分間回転させる。
１９．−還元されたジチオール−オリゴを回収する−
２０．工程１５と同時に１つの遠心分離機を使用する
２１．３Ｋ  ＵＦカラムに３００μＬのＣ−緩衝液を加える。
２２．ＴＣＥＰ中の還元されたジチオール−オリゴを３Ｋ  ＵＦカラムに加える。
２３．室温で最高速度で１５分間回転させる。
２４．３Ｋ  ＵＦカラムに３００μＬのＣ−緩衝液を加える。
２５．室温で最高速度で２０分間回転させる。
−投入されたＭＣＰ及び還元されたジチオール−オリゴを回収する−
２６．精製された同位体が投入されたＭＣＰを含有する３Ｋ  ＵＦカラムを回収する。
２７．精製された還元されたジチオール−オリゴを含有する３Ｋ  ＵＦカラムを回収する。
−投入されたＭＣＰを還元されたジチオール−オリゴにコンジュゲートさせる−
２８．３Ｋ  ＵＦカラム内の投入されたＭＣＰを６０μＬのＣ−Ｂｕｆｆｅｒに再懸濁する。
２９．ピペット操作でよく混合する。
３０．Ｃ−緩衝液中の投入されたＭＣＰを、還元されたジチオール−オリゴを含有する３Ｋ  ＵＦカラムに移す。
３１．３７°で２時間インキュベートする。
３２．５ｍＭのＴＣＥＰ（１ｕｌの０．５ＭのＴＣＥＰ）を加える。
３３．さらに３０分インキュベートする。
３４．Ｃ−緩衝液中の投入されたＭＣＰ及び還元されたジチオール−オリゴを還元されたジチオール−オリゴを含有する１０Ｋ  ＵＦカラムに移す。
−同位体がコンジュゲートされたオリゴを洗浄する−
３５．ＭＣＰを含有する１０Ｋ  ＵＦカラムに３００μＬのＷ−緩衝液を加える。
３６．室温で最高速度で１０分間回転させる。
３７．５００ｕｌの超純水で４回洗浄する。
−ＭＣＰを回収する−
３８．ＭＣＰを含有する１０Ｋ  ＵＦカラムに３０μＬの５ＸＳＳＣＴを加える。
３９．ＵＦカラムの壁をすすぐ。
４０．ＵＦカラムを新しい収集チューブ内にひっくり返す。
４１．１０００Ｇｓで２分間回転させる。
４２．１回繰り返す。
４３．Ｑｕｂｉｔ  ｓｓＤＮＡキットで測定する
４４．１ｕＭのストックを調製する
【００７６】
元素標識プロトコル
１．ＩＳＨまたはＩＨＣから開始する、
２．ハイブリダイゼーション溶液１００μｌ当たり２μｌの元素標識を加える。
３．室温で２時間ハイブリダイズさせる。
４．５ＸＳＳＣＴ中で２×１５分洗浄する。
５．ＰＢＳ中で２×１５分洗浄する。
６．ｄｄＨ２Ｏ中で迅速にすすぐ
７．空気乾燥させる
８．Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ＨｙｐｅｒｉｏｎユニットまたはＭＩＢＩに適合されたｎａｎｏＳＩＭＳセットアップで撮像する。
【００７７】
実施例１８
二次増幅
二次増幅は、核酸のインサイチューハイブリダイゼーション及び免疫組織化学アッセイのシグナルをさらに増幅するために実施され得る。
【００７８】
二次増幅プロトコル
１．ＭＵＳＥヘアピン（２μｌ／１００μｌの反応溶液）を９５℃で３分間変性させる。
２．氷上に１０分置く。
３．室温で２０分置く。
４．ヘアピンを増幅ミックスと混合する。
５．事前にハイブリダイズした免疫染色されたサンプル上に置く。
６．室温で一晩増幅させる
７．５ＸＳＳＣＴ中で４×１５分洗浄する
８．２μｌの二次アダプターを１００μｌのハイブリダイゼーション溶液と混合する。
９．室温で２時間ハイブリダイズさせる
１０．５ＸＳＳＣＴ中で４×１５分洗浄する
１１．洗浄中に、二次増幅系のためのヘアピン形成（工程１〜４）を繰り返す。
１２．室温で一晩増幅させる
１３．５ＸＳＳＣＴ中で４×１５分洗浄する
１４．２μｌの標識を１００μｌのハイブリダイゼーション溶液と混合する。
１５．室温で２時間ハイブリダイズさせる
１６．５ＸＳＳＣＴ中で２×１５分洗浄する
１７．ＰＢＳ中で２×１５分洗浄する。
１８．マウントし、撮像する。
【００７９】
実施例１９
バーコード
スペクトルバーコード
スペクトルバーコードは、増幅系毎に２つの異なる標識（例えば：Ｍｕｓｅ１Ａ  ａｌｅｘａ４８８＋Ｍｕｓｅ１Ｂ  ａｌｅｘａ５９４）を用いて、例えば、５つのフルオロフォアと５２種の組み合わせを生成する。スペクトルバーコードについては、（前述した）フルオロフォア標識と同様に進める必要がある。
【００８０】
連続バーコード
連続バーコード化アプローチは、バーコード化されたＳｎ（Ｓは、異なるシグナル種（例えば、異なる波長で放射するフルオロフォア）の数であり、ｎは、連続標識実行数である）の生成を可能にする。
【００８１】
樹状ポリマーは、バーコード配列を生成するために使用され得る。本発明者らは、研究されているサンプルに優しい、緩衝液中での蛍光標識の迅速かつ周囲温度での交換を可能にすることによって公表された方法を改善する２つのアプローチを考案した。
【００８２】
標識−消光−標識技術では、追加の１５ヌクレオチドの「オーバーハング」配列を含有する、標識する樹状ポリマー上の樹状突起配列に相補的な第１のオリゴヌクレオチドが、第１のバーコード標識を構成する。「オーバーハング」は、２つのオーバーハングを含有するｄｓＤＮＡ「クエンチャー」標識を固定する働きをし、１つ目は第１の標識のオーバーハングに相補的であり、２つ目は次の標識を固定する働きをする。「クエンチャー」標識オリゴヌクレオチドは、ダブシルなどの短距離クエンチャー及びフルオロフォアを含有する。前の標識のオーバーハングへのクエンチャー標識のハイブリダイゼーションにより、クエンチャー及び前のフルオロフォアが非常に近い距離に配置され、これにより最初のフルオロフォアの蛍光が消光され、「クエンチャー」標識に含まれるフルオロフォアのみがシグナルを放射し得る。このようにして、後続の「クエンチャー」標識は、互いにｎ回ハイブリダイズされてバーコードを生成し得る。
【００８３】
標識−消去−標識アプローチは、２つのオリゴヌクレオチド種を必要とする。標識は、樹状突起に相補的であり、１２塩基対のオーバーハングを含む。消去体は、１２塩基対のオーバーハングを含む標識に十分に相補的である。標識置換を開始するために、消去体オリゴヌクレオチドが、予め標識されたサンプルに加えられる。標識のオーバーハングに対する消去体のハイブリダイゼーションは分枝点移動事象を誘発し、これにより消去体−標識ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドダイマーが樹状突起から切り離された標識として生成される。次いで消去体−標識ダイマーは洗い流され得る。最後に、新しい標識がサンプルに加えられる。これらの標識−消去−標識サイクルは、ｎ回繰り返されてバーコードを生成し得る。標識−消光−標識アプローチと比較して、この方法は、より簡易かつより安価である。
【００８４】
標識−消光−標識プロトコル
サンプルが５ＸＳＳＣＴ中にあると想定する
１．１００μｌ当たり２μｌの１μＭの標識１を加える
２．室温で２時間ハイブリダイズさせる
３．５ＸＳＳＣＴ中で３×１０分洗浄する
４．撮像する
５．１００μｌ当たり２μｌの１μＭの標識２を加える
６．室温で２時間ハイブリダイズさせる
７．５ＸＳＳＣＴ中で３×１０分洗浄する
８．撮像する
【００８５】
標識−消去−標識プロトコル
サンプルが５ＸＳＳＣＴ中にあると想定する
１．１００μｌ当たり２μｌの１μＭの標識１を加える
２．室温で２時間ハイブリダイズさせる
３．５ＸＳＳＣＴ中で３×１０分洗浄する。
４．撮像する
５．１００μｌ当たり２μｌの１μＭの標識２及び消去体を加える
６．室温で２時間ハイブリダイズさせる
７．５ＸＳＳＣＴ中で３×１０分洗浄する
８．撮像する
【００８６】
上述の様々な方法及び技術は、本発明を実施するための多数の方法を提供する。当然ながら、本明細書に記載される任意の特定の実施形態に従って、記載される目的または利点の必ずしも全てが達成され得るわけではないことを理解されたい。よって、例えば、当業者は、本明細書で教示または示唆され得る他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書で教示される１つの利点または利点群を達成または最適化する手法で方法が実施され得ることを認識する。様々な有利な及び不利な代替物が本明細書に記述されている。いくつかの好ましい実施形態は、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含むが、他のものは、１つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外するが、さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴の包含によって、現在の不利な特徴を具体的に軽減することを理解されたい。
【００８７】
さらに、当業者は、異なる実施形態から様々な特徴の適用性を認識する。同様に、上記で論述した様々な要素、特徴及び工程、ならびにそのような各要素、特徴または工程の他の既知の均等物は、本明細書に記載の原理に従って方法を実施するために当業者によって組み合わされ、適合され得る。様々な要素、特徴、及び工程の中には、多様な実施形態では、具体的に含まれるものもあれば、具体的に除外されるものもある。
【００８８】
本発明は、所定の実施形態及び実施例に関連して開示されてきたが、本発明の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて他の代替的な実施形態及び／またはその使用及び改変及び均等物に拡張されることが当業者によって理解される。
【００８９】
多くの類型及び代替的要素が本発明の実施形態で開示されてきた。またさらなる類型及び代替的要素が当業者に明らかである。これらの類型の中には、限定されるものではないが、卵管上皮、細胞、オルガノイド、及びそれらの組織生成物、卵管上皮を生成する方法、卵巣癌などのがんに関連する核酸、ペプチド及びタンパク質配列を含む予後及び／または診断パネル、ならびに本発明の教示を介して生成される生成物の特定の使用に関連する技術がある。本発明の様々な実施形態は、これらの類型または要素のいずれかを具体的に含むか、または除外することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、本発明の所定の実施形態を記載し、特許請求するために使用される、成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、いくつかの場合では、用語「約」によって修飾されるものと理解されたい。したがって、いくつかの実施形態では、明細書及び添付の特許請求の範囲に記載された数値パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、かつ通常の丸め技術を適用することによって解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータは近似であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実行可能な限り正確に報告されている。本発明のいくつかの実施形態において提示される数値は、それらのそれぞれの試験測定において見出される標準偏差から必然的に生じる所定の誤差を含有し得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに本発明の特定の実施形態を説明する文脈において（特に以下の特許請求の範囲のいくつかの文脈において）使用される同様の言及は、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈され得る。本明細書における値の範囲の記述は、その範囲内に入る各々の別個の値を個々に言及する簡潔な方法としての働きをすることが意図されているにすぎない。本明細書に別段示されていない限り、各々の個々の値は、それが本明細書に個々に記述されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の全ての方法は、本明細書に別段示されていない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書の所定の実施形態に関して提供される任意の及び全ての実施例、または例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく明らかにすることが意図されているにすぎず、別段特許請求されている発明の範囲に対する制限を有しない。明細書における文言は、発明の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【００９２】
本明細書に開示された本発明の代替的な要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個々に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて言及され、特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーは、利便性及び／または特許性の理由から、グループに含められ得るか、またはグループから削除され得る。任意のそのような包含または削除が生じた場合、明細書は、添付の特許請求の範囲で使用される全てのマーカッシュグループの文章を満たすように改変されたグループを含有するものと本明細書ではみなされる。
【００９３】
本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載されている。それらの好ましい実施形態に対する類型は、前述の説明を読む当業者に明らかになる。当業者は、そのような類型を適宜用いることができ、本発明は、本明細書に具体的に記載されるものとは異なって実施され得ることが企図される。したがって、本発明の多くの実施形態は、適用可能な法律によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に記述された主題の全ての改変及び均等物を含む。その上、本明細書に別段示されていない限りまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、上述の要素のその全ての可能な類型における任意の組み合わせが本発明に包含される。
【００９４】
さらに、本明細書を通して特許及び印刷された刊行物に対して多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に個々に組み込まれる。
【００９５】
最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものであることを理解されたい。用いられ得る他の改変は、本発明の範囲内であり得る。よって、限定ではなく例として、本発明の代替的構成が本明細書の教示に従って利用され得る。したがって、本発明の実施形態は、示され、記載された正確なものに限定されない。
【図１】
2020516319.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020516319.tif 000013
【図８】
2020516319.tif 000014
【図９】
2020516319.tif 000015
【図１０】
2020516319.tif 000016
【図１１Ａ】
2020516319.tif 000017
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2020516319.tif 000019
【図１３】
2020516319.tif 000020
【図１４】
2020516319.tif 000021
【図１５】
2020516319.tif 000022
【図１６】
2020516319.tif 000023
【図１７】
2020516319.tif 000024
【図１８】
2020516319.tif 000025
【図１９】
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【配列表】
2020516319000001.app
【国際調査報告】
2020516319.tif 000027