【手続補正書】
【提出日】平成30年5月18日(2018.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的なＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ＰｔｃＣ）タンパク質を産生することが不可能なようにその内因性ｐｔｃＣ遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されており、前記ＰｔｃＣタンパク質が、配列番号８に少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を有する、乳酸菌（ＬＡＢ）およびビフィズス菌から選択される細菌であって、
前記細菌が（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）前記細菌が機能的なトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）タンパク質を産生することが不可能なように内因性ｔｒｅＰＰを遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている；
（ｂ）前記細菌が、トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する；および
（ｃ）前記細菌が、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ遺伝子を含む、
からなる群から選択される少なくとも一つの特徴をさらに有する、前記細菌。
【請求項２】
前記内因性ｐｔｃＣ遺伝子が、配列番号７に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一な核酸配列を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記ＰｔｃＣタンパク質が、配列番号８に少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の細菌。
【請求項４】
前記内因性ｐｔｃＣ遺伝子が、未成熟終始コドンを導入することにより不活性化される、請求項１に記載の細菌。
【請求項５】
前記内因性ｔｒｅＰＰ遺伝子が、部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、請求項１に記載の細菌。
【請求項６】
前記内因性ｔｒｅＰＰ遺伝子が、配列番号１に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一な核酸配列を有するか、前記ＴｒｅＰＰタンパク質が、配列番号２に少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の細菌。
【請求項７】
前記内因性ｔｒｅＰＰ遺伝子が、配列番号１の核酸配列を含むか、前記ＴｒｅＰＰタンパク質が、配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の細菌。
【請求項８】
前記細菌が、トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する、請求項１に記載の細菌。
【請求項９】
前記トレハローストランスポーターが、内因性ｔｒｅＰＴＣトランスポーターである、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
前記トレハローストランスポーターが、配列番号１０または１２に少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の細菌。
【請求項１１】
前記トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子が、ｈｌｌＡプロモーター（ＰｈｌｌＡ）の制御下にある、請求項８に記載の細菌。
【請求項１２】
前記ＰｈｌｌＡプロモーターが配列番号１３の核酸配列を有する、請求項１１に記載の細菌。
【請求項１３】
前記トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子が、前記細菌の染色体に導入される、請求項８に記載の細菌。
【請求項１４】
前記細菌が、１または複数の異種遺伝子産物をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項１５】
前記１または複数の異種遺伝子産物が、インスリン、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、ソマトスタチン、甲状腺刺激ホルモン、血管活性腸管ポリペプチド、ＩＬ−２〜ＩＬ−７、ＩＬ−９〜ＩＬ−３２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＦＮ、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＧＨ、ＰＲＬ、ＴＮＦα、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＦＡＳリガンド、サイトカインのＩＬ−１ファミリー、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、神経成長因子、上皮成長因子、インスリン関連サイトカイン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、トレフォイル因子（ＴＦＦ）、およびＰＹＹからなる群から選択される、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１６】
前記１または複数の異種遺伝子産物が、抗体またはその機能的フラグメントである、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１７】
前記抗体またはその機能的フラグメントが、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１２（及びそのサブユニットＩＬ−１２ｐ３５及びＩＬ１２ｐ４０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３（及びそのサブユニットＩＬ−２３ｐ１９）、ＩＬ−２７、ＩＬ−３２（及びそのスプライス変異体）、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、及びＴＮＦαからなる群から選択されるサイトカインの生物学的効果を阻害する中和抗体である、請求項１６に記載の細菌。
【請求項１８】
前記１または複数の異種遺伝子産物が：
i）抗ＴＮＦα抗体、抗ＴＮＦα抗体フラグメント、抗ＴＮＦα単一抗体可変領域、可溶性ＴＮＦ受容体、又はＴＮＦαのドミナントネガティブ変異体；
ii）抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１２抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２受容体、ＩＬ−１２又はＩＬ−１２  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
iii）抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体、抗ＩＬ−１２ｐ３５抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２ｐ３５単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２ｐ３５受容体、ＩＬ−１２ｐ３５又はＩＬ−１２ｐ３５  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
iv）抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体、抗ＩＬ−１２ｐ４０抗体フラグメント、抗ＩＬ−１２ｐ４０単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１２ｐ４０受容体、ＩＬ−１２ｐ４０又はＩＬ−１２ｐ４０  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
v）抗ＩＬ−２３抗体、抗ＩＬ−２３抗体フラグメント、抗ＩＬ−２３単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−２３受容体、ＩＬ−２３又はＩＬ−２３  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
vi）抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体、抗ＩＬ−２３ｐ１９抗体フラグメント、抗ＩＬ−２３ｐ１９単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−２３ｐ１９受容体、ＩＬ−２３ｐ１９又はＩＬ−２３ｐ１９  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；
vii）抗ＩＦＮγ抗体、抗ＩＦＮγ抗体フラグメント、抗ＩＦＮγ単一抗体可変領域、可溶性ＩＦＮγ受容体、又はＩＦＮγのドミナントネガティブ変異体；
viii）抗ＩＬ−１７抗体、抗ＩＬ−１７抗体フラグメント、抗ＩＬ−１７単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＩＬ−１７又はＩＬ−１７  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体；および
ix）抗ＭＣＰ−１抗体、抗ＭＣＰ−１抗体フラグメント、抗ＭＣＰ−１単一抗体可変領域、可溶性ＩＬ−１７受容体、ＭＣＰ−１又はＭＣＰ−１  ｄＡｂのドミナントネガティブ変異体
からなる群から選択される、請求項１４に記載の細菌。
【請求項１９】
前記１または複数の異種遺伝子産物が、ｔｈｙＡ遺伝子座に挿入される、請求項１４に記載の細菌。
【請求項２０】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス種またはラクトバシラス種である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の細菌。
【請求項２１】
前記ＬＡＢが、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）である、請求項２０に記載の細菌。
【請求項２２】
前記ラクトコッカス・ラクティスが、ラクトコッカス・ラクティス株ＭＧ１３６３である、請求項２１に記載の細菌。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細菌を含む、薬剤、食品添加物、プロバイオティック組成物又はスターター培養物。
【請求項２４】
被験体への予防的及び／又は治療的な遺伝子産物の送達のための、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の細菌の使用。
【請求項２５】
前記予防的及び／又は治療的な遺伝子産物が、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、アレルギー性疾、神経障害、がん、骨粗鬆症、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、血友病、変性肝疾患、肺疾患、肥満および感染からなる群から選択される状態を治療するために送達される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記予防的及び／又は治療的な遺伝子産物が、１型糖尿病、乾癬、喘息、食物アレルギーおよびセリアック病から選択される状態を治療するために送達される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２７】
乳酸菌（ＬＡＢ）およびビフィズス菌から選択される細菌のストレス抵抗性または保存特性の少なくとも１つを改善する方法であって、
当該細菌が機能的なＰｔｃＣタンパク質を産生することが不可能なように、当該細菌において内因性ｐｔｃＣ遺伝子を部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化することを含む、方法。
【請求項２８】
前記ＰｔｃＣタンパク質が、配列番号８に少なくとも７５％同一なアミノ酸配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌が、（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）前記細菌が機能的なＴｒｅＰＰタンパク質を産生することが不可能なように内因性ｔｒｅＰＰ遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている；
（ｂ）前記細菌が、トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する；および
（ｃ）前記細菌が、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ遺伝子を含む、
からなる群から選択される少なくとも一つの特徴をさらに有する、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ストレス抵抗性または保存特性が、酸性条件に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、乾燥、凍結若しくはフリーズドライに対する抵抗性、及び浸透圧抵抗性からなる群から選択される、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
乳酸菌（ＬＡＢ）およびビフィズス菌から選択される細菌を含む組成物を調製する方法であって、
ｉ）前記細菌を、前記細菌によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で培養し、それにより増殖させた細菌を形成する工程；および
ｉｉ）前記増殖させた細菌を、前記組成物に配合する工程と、
を含み、
前細菌がＰｔｃＣ活性を欠き、かつ、（ａ）〜（ｃ）：
（ａ）前記細菌が機能的なｔｒｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なようにトレハロース−６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）をコードする内因性遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている；
（ｂ）前記細菌が、トレハローストランスポーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を構成的に過剰発現する；および
（ｃ）前記細菌が、機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼ遺伝子を含む、
からなる群から選択される少なくとも一つの特徴をさらに有する、
前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
結果
図１１に示されるように、マルトースはバイオマス産生中又はバイオマス産生後に細胞
内トレハロースへと変換されることができる。
本願発明は以下の態様を含み得る。
［１］
セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ＰｔｃＣ）活性を欠く、又は機能
的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＰｔｃＣをコードする遺
伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、非病原性グラム陽性菌。
［２］
ＰｔｃＣ遺伝子又はタンパク質が、それぞれ配列番号７又は配列番号８に少なくとも７
５％同一な核酸配列又はアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の非病原性グラム陽性菌
。
［３］
トレハロース６−リン酸ホスホリラーゼ（ＴｒｅＰＰ）活性を欠く、又は機能的なＴｒ
ｅＰＰ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子
が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されている、請求項１又は２に記載の非病原
性グラム陽性菌。
［４］
トレハローストランスポーター又は内因性トレハローストランスポーターをコードする
１つ又は複数の遺伝子を過剰発現する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非病原性グ
ラム陽性菌。
［５］
機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有する、請求項１〜４のいず
れか一項に記載の非病原性グラム陽性菌。
［６］
前記トレハロース６−リン酸ホスファターゼがｏｔｓＢ又は大腸菌に由来するｏｔｓＢ
である、請求項５に記載の非病原性グラム陽性菌。
［７］
１つ又は複数の異種遺伝子産物、又は１つ又は複数の予防的及び／又は治療的な遺伝子
産物を含有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非病原性グラム陽性菌。
［８］
乾燥、噴霧乾燥、凍結又はフリーズドライされている、請求項１〜７のいずれか一項に
記載の非病原性グラム陽性菌。
［９］
乳酸菌（ＬＡＢ）、又はラクトコッカス種若しくはラクトバシラス種である、請求項１
〜８のいずれか一項に記載の非病原性グラム陽性菌。
［１０］
ビフィドバクテリウム種である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非病原性グラム
陽性菌。
［１１］
薬剤として使用される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非病原性グラム陽性菌
。
［１２］
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非病原性グラム陽性菌を含む薬剤、食品添加物
、プロバイオティック組成物又はスターター培養物。
［１３］
食品の調製用のスターター培養物である、請求項１２に記載のスターター培養物。
［１４］
薬剤を調製する又は食品添加物を調製する又はスターター培養物を調製する又はプロバ
イオティック組成物を調製する方法であって、
ｉ）請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非病原性グラム陽性菌を、該グラム陽性菌
によって発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させる工程と、
ｉｉ）そのようにして増殖させた非病原性グラム陽性菌を、薬剤又は食品添加物又はス
ターター培養物又はプロバイオティック組成物のそれぞれに配合する工程と、
を含む、方法。
［１５］
セロビオース特異的ＰＴＳ系ＩＩＣコンポーネント（ＰｔｃＣ）活性を欠き、又は機能
的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性ＰｔｃＣをコードする遺
伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されているグラム陽性菌においてトレハ
ロースを内因的に蓄積させる方法であって、前記グラム陽性菌を、該グラム陽性菌によっ
て発酵させることが可能な基質材料を含む培地中で増殖させることを含む、方法。
［１６］
前記細菌が非病原性グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌である
、請求項１５に記載の方法。
［１７］
培養培地が炭素源、又は主要な若しくは唯一の炭素源としてマルトース若しくはグルコ
ース又はマルトース及びグルコースの組合せを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に
記載の方法。
［１８］
前記培養培地が実質的に外部から添加されたトレハロースを含有しない、請求項１４〜
１７のいずれか一項に記載の方法。
［１９］
グラム陽性菌、又は乳酸菌（ＬＡＢ）若しくはビフィズス菌のストレス抵抗性若しくは
保存特性、又は酸性条件に対する抵抗性、胆汁塩に対する抵抗性、乾燥、凍結若しくはフ
リーズドライに対する抵抗性、及び浸透圧抵抗性を含む群から選択される１つ又は複数の
ストレス抵抗性若しくは保存特性を改善する方法であって、前記グラム陽性菌を、Ｐｔｃ
Ｃ活性を欠き、又は機能的なｐｔｃＣ遺伝子産物を産生することが不可能なように内因性
ＰｔｃＣをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失、破壊又は不活性化されるように改
変することを含む、方法。
［２０］
前記細菌が非病原性グラム陽性菌である、請求項１９に記載の方法。
［２１］
前記グラム陽性菌がＴｒｅＰＰ活性を欠き、又は機能的なＴｒｅＰＰ遺伝子産物を産生
することが不可能なように内因性ＴｒｅＰＰをコードする遺伝子が部分的又は完全に欠失
、破壊又は不活性化されている、請求項１９又は２０に記載の方法。
［２２］
前記グラム陽性菌がトレハローストランスポーター又は内因性トレハローストランスポ
ーターをコードする１つ又は複数の遺伝子を過剰発現する、請求項１９〜２１のいずれか
一項に記載の方法。
［２３］
前記グラム陽性菌が機能的な異種トレハロース６−リン酸ホスファターゼを含有する、
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
前記トレハロース６−リン酸ホスファターゼがｏｔｓＢ又は大腸菌に由来するｏｔｓＢ
である、請求項２３に記載の方法。
［２５］
前記グラム陽性菌が１つ又は複数の異種遺伝子産物、又は１つ又は複数の予防的及び／
又は治療的な遺伝子産物又は抗原を発現する、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の
方法。
［２６］
前記グラム陽性菌、薬剤、食品添加物、又はスターター培養物を凍結又はフリーズドラ
イすることを更に含む、請求項１４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
［２７］
請求項１２又は１３に記載の食品添加物又はスターター培養物と、非病原性グラム陽性
菌によって発酵させることが可能な基質材料とを混合することを含み、任意に該基質材料
を発酵させる工程を更に含む、食品を調製する方法。
［２８］
請求項２７に記載の方法によって得ることができる食品。