(57)【要約】菌体生産性に優れ、遺伝子操作の容易な、ある特定の遺伝子のみを破壊して栄養要求性を付加した酵母及びその形質転換体の作製法を提供する。また、遺伝子発現産物、特にポリヒドロキシアルカン酸の製造方法を提供する。本発明では、相同的組換えを利用して、複数の遺伝子が破壊された酵母を作製する。また、当該遺伝子破壊酵母に、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子やアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子といった、ポリヒドロキシアルカン酸の合成に関与する酵素遺伝子を複数導入して形質転換体を得る。さらに、当該形質転換体を培養し、効率的にポリヒドロキシアルカン酸よりなる共重合ポリエステルを菌体内に蓄積させ、その培養物よりポリマーを採取する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＵＲＡ３遺伝子が破壊されたウラシル要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項２】
ＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＨＩＳ５遺伝子が破壊されたヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項３】
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片及びＵＲＡ３ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子が破壊されたアデニン及びウラシル要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項４】
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたアデニン及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項５】
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたウラシル及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項６】
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片、ＵＲＡ３ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたアデニン、ウラシル及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母。
【請求項７】
酵母が、キャンディダ属、クラビスポラ属、クリプトコッカス属、デバリオマイセス属、ロデロマイセス属、メトシュニコウィア属、ピキア属、ロドスポリディウム属、ロドトルラ属、スポリディオボラス属、ステファノアスカス属、又はヤロウィア属のいずれかである請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子破壊酵母。
【請求項８】
酵母がキャンディダ属である請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子破壊酵母。
【請求項９】
酵母が、キャンディダ属のａｌｂｉｃａｎｓ種、ａｎｃｕｄｅｎｓｉｓ種、ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ種、ａｚｙｍａ種、ｂｅｒｔａｅ種、ｂｌａｎｋｉｉ種、ｂｕｔｙｒｉ種、ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ種、ｄｅｎｄｒｏｎｅｍａ種、ｅｒｇａｓｔｅｎｓｉｓ種、ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ種、ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｉｉ種、ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ種、ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ種、ｉｎｃｏｍｍｕｎｉｓ種、ｉｎｓｅｃｔｒｕｍ種、ｌａｕｒｅｌｉａｅ種、ｍａｌｔｏｓａ種、ｍｅｌｉｂｉｏｓｉｃａ種、ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ種、ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ種、ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ種、ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ種、ｐａｌｍｉｏｌｅｏｐｈｉｌａ種、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ種、ｐｓｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ種、ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ種、ｒｈａｇｉｉ種、ｒｕｇｏｓａ種、ｓａｉｔｏａｎａ種、ｓａｋｅ種、ｓｃｈａｔａｖｉｉ種、ｓｅｑｕａｎｅｎｓｉｓ種、ｓｈｅｈａｔａｅ種、ｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ種、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種、ｖａｌｄｉｖｉａｎａ種、又はｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ種のいずれかである請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子破壊酵母。
【請求項１０】
酵母がキャンディダ・マルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）である請求項１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子破壊酵母。
【請求項１１】
キャンディダ・マルトーサＵ−３５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３５）である請求項１記載のＵＲＡ３遺伝子破壊酵母。
【請求項１２】
キャンディダ・マルトーサＣＨ−Ｉ（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３４）である請求項２記載のＨＩＳ５遺伝子破壊酵母。
【請求項１３】
キャンディダ・マルトーサＵＡ−３５４（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３６）である請求項３記載のＡＤＥ１遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子破壊酵母。
【請求項１４】
キャンディダ・マルトーサＡＨ−Ｉ５（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３３）である請求項４記載のＡＤＥ１遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子破壊酵母。
【請求項１５】
キャンディダ・マルトーサＨＵ−５９１（ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４５）である請求項５記載のＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子破壊酵母。
【請求項１６】
キャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２０５）である請求項６記載のＡＤＥ１遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子破壊酵母。
【請求項１７】
同種又は異種の遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換された請求項１〜１６のいずれか１項に記載の遺伝子破壊酵母の形質転換体。
【請求項１８】
請求項１７に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、同種又は異種の遺伝子発現産物を採取することを特徴とする、遺伝子発現産物の製造方法。
【請求項１９】
遺伝子発現産物がポリエステルであることを特徴とする、請求項１８記載の遺伝子発現産物の製造方法。
【請求項２０】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子とが導入されている酵母形質転換体であって、これら遺伝子の両方又は何れかが２コピー以上導入されていることを特徴とする酵母形質転換体。
【請求項２１】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子に、ペルオキシソーム配向シグナルが付加されている請求項２０に記載の酵母形質転換体。
【請求項２２】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子に、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターが接続されている請求項２０又は２１記載の酵母形質転換体。
【請求項２３】
酵母が、キャンディダ属である請求項２０から２２のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【請求項２４】
酵母がキャンディダ属のａｌｂｉｃａｎｓ種、ａｎｃｕｄｅｎｓｉｓ種、ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ種、ａｚｙｍａ種、ｂｅｒｔａｅ種、ｂｌａｎｋｉｉ種、ｂｕｔｙｒｉ種、ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ種、ｄｅｎｄｒｏｎｅｍａ種、ｅｒｇａｓｔｅｎｓｉｓ種、ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ種、ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｉｉ種、ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ種、ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ種、ｉｎｃｏｍｍｕｎｉｓ種、ｉｎｓｅｃｔｒｕｍ種、ｌａｕｒｅｌｉａｅ種、ｍａｌｔｏｓａ種、ｍｅｌｉｂｉｏｓｉｃａ種、ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ種、ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ種、ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ種、ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ種、ｐａｌｍｉｏｌｅｏｐｈｉｌａ種、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ種、ｐｓｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ種、ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ種、ｒｈａｇｉｉ種、ｒｕｇｏｓａ種、ｓａｉｔｏａｎａ種、ｓａｋｅ種、ｓｃｈａｔａｖｉｉ種、ｓｅｑｕａｎｅｎｓｉｓ種、ｓｈｅｈａｔａｅ種、ｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ種、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種、ｖａｌｄｉｖｉａｎａ種又はｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ種のいずれかである請求項２０から２２のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【請求項２５】
酵母が、キャンディダ・マルトーサである請求項２０から２２のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【請求項２６】
ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来の酵素又は変異体をコードするものである請求項２０から２５のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【請求項２７】
アエロモナス・キャビエ由来のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子が、以下の（ａ）〜（ｈ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったポリヒドロキシアルカン酸合成酵素変異体をコードするものである請求項２６に記載の酵母形質転換体。
（ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒ
（ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙ
（ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒまたはＧｌｎ
（ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａ
（ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ
（ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌ
（ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓ
（ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅ
【請求項２８】
アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子が、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるラルストニア・ユートロファ由来の酵素又は変異体をコードするものである請求項２０〜２７のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【請求項２９】
ポリヒドロキシアルカン酸が、下記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合体である請求項２０〜２８記載のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【化１】
2005085415.tif 000007
（式中、Ｒは、炭素数１〜１３のアルキル基を表す。）
【請求項３０】
ポリヒドロキシアルカン酸が、下記一般式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記一般式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルである請求項２０〜２８記載のいずれか１項に記載の酵母形質転換体。
【化２】
2005085415.tif 000008
【化３】
2005085415.tif 000009
【請求項３１】
請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造方法であって、前記酵母形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法。
【請求項３２】
請求項２０から３０のいずれか１項に記載の酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の数を制御することによりポリエステルの分子量を制御する方法。
【請求項３３】
請求項２０から３０のいずれか１項に記載の酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の数を制御することによりポリエステルのヒドロキシアルカン酸組成を制御する方法。
【請求項３４】
選択マーカー遺伝子としてＡＤＥ１遺伝子を持つキャンディダ・マルトーサで分子内相同組換えを行うことにより、当該ＡＤＥ１遺伝子を除去することを特徴とする選択マーカーの回復方法。
【請求項３５】
ＡＤＥ１遺伝子の上流または下流にＡＤＥ１遺伝子の一部が連結されている請求項３４記載の選択マーカーの回復方法。
【請求項３６】
ＡＤＥ１遺伝子が、配列番号７で示される塩基配列からなるものである請求項３４又は３５記載の選択マーカーの回復方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵母のある特定の染色体ＤＮＡを相同的組換えの原理により破壊した遺伝子破壊株に関する。また、当該破壊株を用いた産業上有用な物質の生産に関する。
また、本発明は、共重合ポリエステルを酵素合成するために必要な遺伝子、同遺伝子を利用してポリエステルを発酵合成する微生物、及び、その微生物を用いたポリエステルの製造方法に関する。更に、同微生物の育種法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発展により、原核生物や真核生物を利用して産業上有用な物質を大量に製造することが可能となった。真核生物のうち酵母でもサッカロミセス属は、古くから酒類等発酵性食品の生産に利用されてきたほか、キャンディダ・マルトーサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ）では、かつて微生物蛋白質として利用されたことがあり、酵母自体の安全性も確かめられている。【０００３】
酵母は増殖が速く、一般に細菌よりも高い細胞密度で培養することができる。さらに、酵母は、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、生産物の抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。こうした特性を生かして、酵母は、組換えＤＮＡによる有用生産物の製造宿主として利用されており、その有用性が実証されている。【０００４】
種々の酵母のうち、キャンディダ属酵母はサッカロミセス属と異なり、好気的条件下での培養でエタノールを生成せず、それによる増殖阻害も受けないことから、高密度での連続培養による効率的な菌体製造及び物質生産が可能である。さらに、無胞子酵母キャンディダ・マルトーサは、炭素鎖Ｃ６〜Ｃ４０の直鎖炭化水素やパーム油、ヤシ油等の油脂を唯一の炭素源として資化・生育できるという特性を有している。この特性は、疎水性化学物質の変換による有用物質の生産や反応の場として実用上有利であることから、種々の化合物の生産への利用が期待されている（非特許文献１参照）。また、その特性を生かしてキャンディダ・マルトーサの遺伝子組換えによる有用物質の生産への利用も期待されており、そのための遺伝子発現系の開発が精力的に行われて来た（特許文献１、２参照）。最近では、キャンディダ・マルトーサは、遺伝子組換えにより直鎖ジカルボン酸の生産（特許文献３参照）や生分解性プラスチック（特許文献４参照）に利用できることが公開されている。【０００５】
このように、キャンディダ・マルトーサ用の宿主ベクター系は早くから開発され、また、突然変異誘起処理により栄養要求性が付加された変異株が多数取得されているにもかかわらず、組換え体を用いた新たな有用化学物質生産の工業化はされていない。この理由に、野生株と同等の増殖能や直鎖炭化水素鎖の資化性能を持つ適当な栄養要求性を持ったキャンディダ・マルトーサが取得されていないことが挙げられる。キャンディダ・マルトーサを突然変異処理することによって開発されたＣＨＡ１株は、ＡＤＥ１遺伝子とＨＩＳ５遺伝子に変異があることが確認されているが（非特許文献２参照）、増殖能が野生株より劣る。これは目的の箇所以外の変異によるものと考えられている。【０００６】
遺伝子組換えによる物質生産の宿主として酵母を用いる場合、大腸菌等を用いる場合と同様、目的遺伝子が導入されたことを確認することのできる選択マーカー（選択符号）を利用する。酵母の場合、薬剤耐性を付与する選択マーカー遺伝子としては、シクロヘキシミドやＧ４１８あるいはハイグロマイシンＢ等の耐性を付与する遺伝子等が用いられる。しかしながら、酵母に対して切れのよい薬剤がないため目的遺伝子の導入されていない菌も若干生育してしまう現象があること、徐々に薬剤耐性度が上昇すること等の問題が知られている。更に、酵母の菌株ごとにその薬剤耐性の程度は異なり、薬剤耐性を付与するために必要な薬剤耐性遺伝子の酵母中での発現量が異なってくる。そのため、個々の酵母に薬剤耐性を付与するためには、薬剤耐性遺伝子を発現させるためのプロモーターを適切に選択、あるいは作製しなければならない。特にキャンディダ・マルトーサにおいてはシクロヘキシミド耐性を初めから持っており（非特許文献３参照）、その他先に述べた様な各種薬剤に対する耐性の程度も知られていない。更にキャンディダ・マルトーサをはじめとして一部の酵母種は、コドンの翻訳のされ方が大腸菌やヒト等の一般的な様式とは異なることが知られている（非特許文献４参照）。即ち、薬剤耐性遺伝子を直接使用することができない可能性が高い。【０００７】
そのため、適当な栄養要求性の選択マーカーが好んで使用される。栄養要求性の選択マーカーを利用するためには、栄養要求性の付加された変異株を取得する必要がある。従来、栄養要求性の付加には、ニトロソグアジニンやエチルメタンスルホン酸等の変異源を用いたランダム変異誘起処理によって変異株を取得していた。しかし、この変異導入法では目的の栄養要求株が取得できるが、変異が目的の箇所以外にも入っている可能性が否定できない。この事が、先に述べたように酵母を宿主として開発する場合の障害となり、物質生産の場としての利用が、大腸菌等と比較して遅れている原因といえる。【０００８】
さらに、ランダム変異により取得された変異株のもう一つの問題点に、変異箇所の自然復帰がある。この場合、培養中に復帰株が優先的に増殖するため、組換え菌では物質生産性が低下することがある。また、復帰株は、自然界に流出した場合、生存・増殖する可能性が高く、安全規準の面から問題がある。従って、ランダム変異導入により取得した菌株を物質の生産の場として利用するのは適当でない。そこで、特定のアミノ酸やビタミン等の合成に関与する遺伝子のみが破壊された破壊株の取得が望まれており、ＡＤＥ１遺伝子のみを破壊することにより栄養要求性を付加したキャンディダ・マルトーサとして、ＡＣ１６株が作製された（特許文献５参照）。しかしながら、本菌株ではマーカーが１種類であることから導入できる遺伝子に限界があることが問題であった。【０００９】
酵母中に遺伝子を導入する方法には、プラスミドベクターを用いる方法と染色体遺伝子に組み込む方法がある。
酵母の菌体内で自律複製の可能な遺伝子であるプラスミドベクターは、１細胞に１コピー程度存在する型（ＹＣｐ型）と、多コピー存在しうる型（ＹＲｐ型）がそれぞれの酵母種に対して開発されつつある。後者のプラスミドベクターを用いる方が、目的遺伝子産物の発現量を増加させるのに有利であると考えられるが、一般的にはプラスミドベクターの安定性に問題があることが多く、産業上有利に利用することができない場合が多い。このような場合、ＹＣｐ型を用い、目的遺伝子を発現させるためのプロモーターを強力なものにしたり、導入する遺伝子の数（コピー数）を増加させることが検討される。酵母でもプラスミドベクターを用いて遺伝子を導入する場合には、導入遺伝子の大きさに制限を受けることが知られている。用いるプラスミドベクターの種類により異なるが、複数種の遺伝子を導入したい場合や、単一の遺伝子でも複数個導入したい場合等、あまりにも大きなサイズの遺伝子を含むベクターは、ベクター作製上の困難さ、酵母へのベクターの導入効率の低下、酵母中での目的遺伝子の欠失等の点で産業上有利とは言い難い。このような場合、染色体中に目的遺伝子を組み込むことにより解決することができる。また、染色体中に組み込んだ場合の方が、目的遺伝子が高発現する場合もある。しかしながら、選択マーカーが１種類しかない場合、１度その選択マーカーを用いてしまうと、もはやその遺伝子組換え株は選択マーカーが無く、複数回の遺伝子導入が不可能である。
これらのことから、栄養要求性マーカーを複数持つ遺伝子破壊酵母が望まれていた。【００１０】
先に述べたように、キャンディダ・マルトーサの変異株として、ＡＤＥ１遺伝子やヒスチジノール−ホスフェート−アミノトランスフェラーゼ（ＨＩＳ５遺伝子）、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシレース（ＵＲＡ３遺伝子）等の遺伝子変異株が多数取得されている（非特許文献１参照）。しかし、ある特定の遺伝子のみを特異的に破壊することにより複数の栄養要求性を付加したキャンディダ・マルトーサは、同酵母が部分二倍体を示すことから取得することが困難であった。このため、酵母の特性を利用し、かつ遺伝子組換えによる産業上有用な物質生産系を構築するためには、遺伝子破壊による複数の選択マーカーを有する宿主の開発が望まれていた。また、キャンディダ・マルトーサに限らず、そのような遺伝子破壊株が望まれている。
さらに、複数の選択マーカーを有するキャンディダ・マルトーサによる、直鎖炭化水素、パーム油、ヤシ油等の油脂を唯一の炭素源として資化・生育するという特性を生かした産業上有用な物質の生産が期待されている。【００１１】
また、現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡと略す）などのポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３−ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと略す）のホモポリマーであるポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と略す）であり、１９２５年にバシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）で最初に発見された（非特許文献５）。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されてきた。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いため、硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られる。この為、この性質の改良を目的とした研究がなされてきた。【００１２】
その中で、３−ヒドロキシ酪酸（３ＨＢ）と３−ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと略す）とからなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）という）の製造方法が開示されている（特許文献６、７）。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）はＰ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際のところＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）は３ＨＶモル分率を増加させても、それに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムなどに使用するのに要求される程、柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取っ手など硬質成型体の分野にしか利用されなかった。【００１３】
近年、３ＨＢと３−ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと略す）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）という）およびその製造方法について研究がなされた（たとえば、特許文献８、９参照）。これら特許文献のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたアエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）を用いてオレイン酸等の脂肪酸やオリーブオイル等の油脂から発酵生産するものであった。また、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の性質に関する研究もなされている（非特許文献６参照）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてＡ．ｃａｖｉａｅを培養し、３ＨＨが１１〜１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を発酵生産している。このＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。しかしながら、上記製造方法では菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量３０％でありポリマー生産性が低いことから、実用化に向け更に高い生産性が得られる方法が探索された。【００１４】
Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を生産するアエロモナス・キャビエ（Ａ．ｃａｖｉａｅ）より、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素（以下、ＰＨＡ合成酵素と略す）遺伝子がクローニングされた（特許文献１０、非特許文献７参照）。本遺伝子をラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、旧Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）に導入した形質転換株を用い、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、菌体含量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献８参照）。また、大腸菌等の細菌や植物を宿主としたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の製造方法も開示されているが、その生産性は記載されていない（例えば、特許文献１１参照）。【００１５】
上記ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）は３ＨＨモル分率を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで幅広い物性を持つため、テレビの筐体などのように硬さを要求されるものから糸やフィルムなどのような柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、先に述べた製造方法ではＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産性が依然として低く、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の実用化に向けた生産方法としては未だ不十分といわざるを得ない。【００１６】
菌体生産性の高い酵母を宿主とした生分解性ポリエステルの生産研究が幾つか報告されている。Ｌｅａｆらは、酵母の一種であるサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）にラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入して形質転換体を作製し、グルコースを炭素源として培養することによってＰ（３ＨＢ）の蓄積を確認している（非特許文献９参照）。しかし、上記研究で生産されるポリマー含量は０．５％に留まり、そのポリマーは硬くて脆い性質を有するＰ（３ＨＢ）であった。【００１７】
脂肪酸を炭素源として、酵母サッカロミセス・セレビシエにシュードモナス属（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を発現させ、炭素数５以上のモノマーを含む共重合ポリマーを生産する検討もなされた。この場合も生産されるポリマー含量は０．５％に留まった（非特許文献１０参照）。【００１８】
別の検討によれば、ＰＨＡ合成酵素遺伝子と共に、アセチル−ＣｏＡを二量化して３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを合成するβケトチオラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性還元酵素遺伝子を導入し、菌体重量当たり６．７％のポリマーの蓄積を確認している（非特許文献１１）。しかしながら、これらのポリマーは硬くて脆い性質を有するＰ（３ＨＢ）であった。【００１９】
更に、酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ）のペルオキソームに、シュードモナス属（Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を配向発現させ、オレイン酸を炭素源としてポリエステルを生産させる検討もなされている。この研究によれば乾燥菌体当たり１重量％のポリマーを蓄積することが示されている（非特許文献１２参照）。しかしこの程度のポリマー生産性では、工業的生産のためには全く不十分である。【００２０】
酵母は増殖が早く菌体生産性が高いことで知られている。その中でもキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する酵母は過去Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎとして注目され、ノルマルパラフィンを炭素源とした飼料用菌体生産が研究されてきた。また、近年キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の宿主ベクター系が開発され、遺伝子組換え技術を用いた物質生産が報告されている（非特許文献１３参照）。キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）を宿主としたαアミラーゼの生産性は約１２．３ｇ／Ｌと高く、このように高い物質生産能力を有するキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属は、ポリマー生産用宿主として期待される。さらに、細菌と比べて菌体と培養液との分離が容易であることから、ポリマーの抽出精製工程をより簡単にすることも可能である。
そこで、優れた物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）をキャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属酵母などを用いて生産する方法が開発されているが、ポリマー生産性の点で更に改良を加える必要があった（特許文献１１参照）。菌体当たりのポリマー生産量を向上させる方法の一つとして、ＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させる方法が想定された。【００２１】
酵母の菌体内で自律複製の可能な遺伝子であるベクターは、１細胞に１コピー程度存在する型（ＹＣｐ型）と、多コピー存在しうる型（ＹＲｐ型）がそれぞれの酵母種に対して開発されつつある。キャンディダ・マルトーサにおいてもＭ．Ｋａｗａｍｕｒａらにより自律的複製に関わる配列（Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ：以下ＡＲＳと略す）およびセントロメア配列（以下ＣＥＮと略す）を含む高効率形質転換の原因領域（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｂｉｌｉｔｙ：以下ＴＲＡと略す）が見出され（非特許文献１４参照）、ＴＲＡ全領域を有する安定性の高い低コピーベクターと、導入遺伝子高発現が期待できるＣＥＮ領域を除いた高コピー数ベクターが開発されている（非特許文献１５参照）。しかしながら、キャンディダ・マルトーサなどの高コピーベクターは安定性に問題があり、産業上有利に利用することができない。従って、高コピー数ベクターを利用してＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させることでポリマー生産性を向上させることは困難であった。【００２２】
また、ＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させる方法としては、当該遺伝子を発現させるプロモーターを強力なものにする方法が考えられる。キャンディダ・マルトーサにおいて種々のプロモーターがクローニングされている。解糖系の酵素として知られているホスホグリセリン酸キナーゼ（以下ＰＧＫと略す）のプロモーターは、グルコースの存在下で強力な遺伝子発現を誘導することが知られている。更に、ガラクトース存在下において強力な遺伝子発現誘導活性を有するＧＡＬプロモーターもクローニングされている（非特許文献１６参照）。しかしながら、一例としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産に好適な油脂・脂肪酸あるいはノルマルアルカン（ｎ−アルカン）を炭素源とした場合に、これらのプロモーターはほとんど機能しない。更にＧＡＬプロモーターはガラクトースを炭素源としたときにのみ誘導されることから、高価なガラクトースを利用しなければならない点で工業生産には適さないといえる。【００２３】
キャンディダ・マルトーサはｎ−アルカン酸化系の酵素をアルカンの存在下に高生産する。特に、アルカンの初発酸化を行うチトクロームＰ４５０をコードする遺伝子（以下ＡＬＫと略す）が強く誘導される（非特許文献１７参照）。しかしながら、これらのプロモーターでもＰＧＫやＧＡＬプロモーターと比較するとその活性は低い。更に、構成的に発現するアクチン合成酵素１遺伝子（以下ＡＣＴ１と略す）などのプロモーターは、活性として十分な強度を有しているとは言えない。一例としてＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の生産に好適な油脂・脂肪酸あるいはｎ−アルカンを炭素源とした場合、現在の所、ＡＬＫ２プロモーターの上流にＡＲＲ（アルカン  レスポンシブル  リージョン）配列を複数個付加することによりプロモーター活性を向上させたＡＲＲプロモーター（非特許文献１８参照）より強力なプロモーターは開発されておらず、従って、ＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させる方法として強力なプロモーターを利用することは現実的でない。【００２４】
これとは別に、ベクターにＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の発現ユニットを多数導入する方法なども考えられるが、酵母でもベクターを用いて遺伝子を導入する場合には、導入遺伝子の大きさに制限を受けることが知られており、あまりにも大きなサイズの遺伝子を含むベクターは、作製上の困難さ、酵母への導入効率、酵母中での安定性などの点で産業上現実的とは言い難い。【００２５】
また、遺伝子を増幅することにより、目的酵素活性を増加させる方法が報告されている（非特許文献１９参照）。これは、シクロヘキシミド感受性の酵母に対して、シクロヘキシミド耐性遺伝子と目的遺伝子を連結して導入し、シクロヘキシミド高濃度耐性株を取得することにより目的遺伝子高発現株を取得している。しかしながら、キャンディダ・マルトーサはシクロヘキシミド耐性を有していることが知られており、シクロヘキシミド耐性遺伝子を利用したこのような遺伝子増幅により、ＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させることは困難である。【００２６】
そこで、上記の問題を回避して、キャンディダ・マルトーサにおいてＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させ、生分解性ポリエステルを高生産させる方法の開発が望まれていた。【００２７】
更に、一般的にポリエステルの分子量が物性や加工性に大きな影響を与えることが知られている。微生物におけるＰＨＡ生産においては、菌体当たりの酵素の分子数を過度に増すと基質律速状態となり、生産されるポリマーの分子量低下が起こることが知られている（非特許文献２０、２１参照）。従って、菌体内に生産されるポリエステルの分子量を制御する方法の開発が望まれていた。また生産されるポリエステルが、共重合体である場合、モノマー組成が物性や加工性に大きく影響を与えることも知られている。このため、共重合ポリエステルのモノマー組成を制御する方法の開発も望まれていた。【００２８】
また、ＰＨＡ高生産株の育種のためにはＰＨＡ合成に関与する酵素遺伝子の菌体内発現量を増加させる必要があり、当該遺伝子群を導入した形質転換株の生産するＰＨＡの生産性及び物性を考慮しながら、更に同遺伝子群の導入が必要な場合がある。通常、形質転換株の取得においては、薬剤耐性や栄養要求性などのマーカーが利用されている。このため、遺伝子導入回数に応じたマーカーの種類が必要であるが、現在までに開発された複数の遺伝子マーカーを有するキャンディダ・マルトーサは、その生育速度において野性株と比較して大きく劣っており、ＰＨＡ生産株としての利用が困難であった（非特許文献２参照）。また、一種類の遺伝子マーカーを有する生育速度の改善されたキャンディダ・マルトーサも開発された（特許文献５参照）。しかしながら、本株に野性株と同等の生育速度を保持させながら、更に複数の遺伝子マーカーを付与することは、同酵母が２倍体のゲノムを有していることから困難と考えられた。【００２９】
【特許文献１】特開昭６２−７４２８７公報
【特許文献２】特開昭６２−７４２８８号公報
【特許文献３】国際公開第９９／０４０１４号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／８８１４４号パンフレット
【特許文献５】特開２００２−２０９５７４号公報
【特許文献６】特開昭５７−１５０３９３号公報
【特許文献７】特開昭５９−２２０１９２号公報
【特許文献８】特開平５−９３０４９号公報
【特許文献９】特開平７−２６５０６５号公報
【特許文献１０】特開平１０−１０８６８２公報
【特許文献１１】ＷＯ００／４３５２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｗｏｌｆ  Ｋ．編  Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９６）ｐ４１１−５８０）
【非特許文献２】Ｋａｗａｉ  Ｓ．等、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、５５：５９−６５（１９９１）
【非特許文献３】Ｔａｋａｇｉ  等、Ｊ．Ｇｅｎ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３１：２６７−２７５（１９８５）
【非特許文献４】Ｏｈａｍａ  Ｔ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２１：４０３９４０４５（１９９３）
【非特許文献５】Ｍ．Ｌｅｍｏｉｇｎｅ，Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ，３９，１４４（１９２５）
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【非特許文献２１】Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ  Ｔ．Ｕ．，Ｍａｒｔｉｎ  Ｄ．Ｐ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９２，ｐｐ６２７９−６２８３（１９９５）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３０】
本発明は、上記現状に鑑み、酵母、特にキャンディダ属において、多重栄養要求性遺伝子破壊株を構築することにより、種々の遺伝子を多数導入することができ、高効率に有用物質生産を行うことができる、産業上有益な新規宿主を提供するものである。
本発明は、また、上記現状に鑑み、ＰＨＡ合成に関与する遺伝子の発現カセットを酵母に複数形質転換した形質転換体、および得られた形質転換体を培養することにより、生分解性かつ優れた物性を有するＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）等のポリエステルを製造する方法を提供するものである。また、同微生物の育種方法も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００３１】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手法を駆使することにより、酵母のホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキサミド合成酵素（ＥＣ６．３．２．６）をコードするＤＮＡ（ＡＤＥ１遺伝子）、ヒスチジノール−ホスフェート−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．９）をコードするＤＮＡ（ＨＩＳ５遺伝子）、及びオロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシレース（ＥＣ４．１．１．２３）をコードするＤＮＡ（ＵＲＡ３遺伝子）断片を用いた、染色体ＤＮＡとの相同的組換えの原理による、ＡＤＥ１遺伝子、ＨＩＳ５遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子破壊株の作製を行い、アデニン、ヒスチジン及びウラシル要求性の遺伝子破壊酵母の取得に成功した。そして、当該遺伝子破壊酵母の増殖能をキャンディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子破壊株のＡＣ１６と比較し、キャンディダ・マルトーサの突然変異処理によるＡＤＥ１遺伝子変異株のＣＨＡ１より増殖能が優れていることが明らかにされているＡＣ１６株と同等であることを示すことにより、本発明を完成するに至った。
本発明者等は、また、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組換えの手法を駆使することにより、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（以下、ｐｈａＣと略記する）とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＥＣ１．１．１．３６）（以下、ｐｈｂＢと略記する）をキャンディダ・マルトーサの遺伝子破壊株に複数導入した形質転換体を作製した。これにより、生分解性ポリエステルとして有用性のある３−ヒドロキシブチレート（以下、３ＨＢと略記する）と３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、３ＨＨと略記する）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略記する）を効率的に生産することに成功した。【００３２】
即ち、第一の本発明は、ＵＲＡ３ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＵＲＡ３遺伝子が破壊された酵母；ＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＨＩＳ５遺伝子が破壊された酵母に関する。同様に本発明は、ＡＤＥ１遺伝子とＵＲＡ３遺伝子が共に破壊された酵母；ＡＤＥ１遺伝子とＨＩＳ５遺伝子が共に破壊された酵母；ＵＲＡ３遺伝子とＨＩＳ５遺伝子が共に破壊された酵母；ＡＤＥ１遺伝子とＵＲＡ３遺伝子とＨＩＳ５遺伝子が共に破壊された酵母に関する。
また、本発明は、同種又は異種の遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換された上記遺伝子破壊酵母の形質転換体に関する。【００３３】
さらに、本発明は、当該遺伝子破壊株に、複数の異種遺伝子発現系を導入した形質転換体を取得することにより、産業上有用な物質の生産方法を提供する。具体的には、一例として、本発明の当該遺伝子破壊キャンディダ・マルトーサ株に、生分解性ポリエステルとして有用性のある３−ヒドロキシブチレート（以下、３ＨＢと略記する）と３−ヒドロキシヘキサノエート（以下、３ＨＨと略記する）との２成分共重合ポリエステル（以下、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）と略記する）を合成する酵素であるポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（以下、ｐｈａＣと略記する）と、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ＥＣ１．１．１．３６）（以下、ｐｈｂＢと略記する）を、好ましくは複数導入した当該形質転換体を用いて、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）を効率的に生産することに成功した。
即ち、本発明は、遺伝子破壊酵母を用いた遺伝子発現産物（特にポリエステル）の製造方法であると同時に、ポリエステル生合成に関与する遺伝子を複数導入した形質転換体を用いるポリエステルの製造方法でもあって、上記形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取するポリエステルの製造方法でもある。【００３４】
さらに、本発明は生産されるポリエステルの物性が制御されたポリエステルの製造方法である。また、本発明は遺伝子導入に使用する選択マーカーの効率的な回復方法にも関する。【００３５】
すなわち、第二の本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子とが導入されている酵母形質転換体であって、これらの遺伝子の両方又は何れかが２コピー以上導入されていることを特徴とする酵母形質転換体である。
本発明は、また、上記酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造方法であって、上記酵母形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするポリエステルの製造方法である。
本発明は、また、上記酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の数を制御することによりポリエステルの分子量を制御する方法である。
本発明は、また、上記酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の数を制御することによりポリエステルのヒドロキシアルカン酸組成を制御する方法である。
本発明は、また、選択マーカー遺伝子を持つキャンディダ・マルトーサで分子内相同組換えを行うことにより、当該選択マーカー遺伝子を除去することを特徴とする選択マーカーの回復方法である。【００３６】
以下、本発明について詳細に説明する。
まず、第一の本発明の遺伝子破壊酵母としては、以下のものが挙げられる。
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＵＲＡ３遺伝子が破壊されたウラシル要求性の遺伝子破壊酵母；
ＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＨＩＳ５遺伝子が破壊されたヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母；
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片及びＵＲＡ３ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子及びＵＲＡ３遺伝子が破壊されたアデニン及びウラシル要求性の遺伝子破壊酵母；
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたアデニン及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母；
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたウラシル及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母；
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片、ＵＲＡ３ＤＮＡ断片及びＨＩＳ５ＤＮＡ断片との相同的組換えにより、染色体ＤＮＡのＡＤＥ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子及びＨＩＳ５遺伝子が破壊されたアデニン、ウラシル及びヒスチジン要求性の遺伝子破壊酵母。【００３７】
相同的組換えによるＡＤＥ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ５遺伝子の破壊を行う酵母には特に制限はなく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている酵母を使用することができる。好ましくは、直鎖炭化水素等の疎水性物質等の資化性の点で、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属）、ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、メトシュニコウィア属（Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ロドスポリディウム属（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ属）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属）、スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属）、ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属）等の酵母を使用することができる。
これら酵母の中でも、特に、染色体遺伝子配列の解析が進んでおり、宿主−ベクター系も利用できること、また、直鎖炭化水素や油脂等の資化能力が高い点で、キャンディダ属がより好ましい。【００３８】
キャンディダ属の中でも、特に直鎖炭化水素や油脂等の資化能力が高い点で、ａｌｂｉｃａｎｓ種、ａｎｃｕｄｅｎｓｉｓ種、ａｔｍｏｓｐｈａｅｒｉｃａ種、ａｚｙｍａ種、ｂｅｒｔａｅ種、ｂｌａｎｋｉｉ種、ｂｕｔｙｒｉ種、ｃｏｎｇｌｏｂａｔａ種、ｄｅｎｄｒｏｎｅｍａ種、ｅｒｇａｓｔｅｎｓｉｓ種、ｆｌｕｖｉａｔｉｌｉｓ種、ｆｒｉｅｄｒｉｃｈｉｉ種、ｇｒｏｐｅｎｇｉｅｓｓｅｒｉ種、ｈａｅｍｕｌｏｎｉｉ種、ｉｎｃｏｍｍｕｎｉｓ種、ｉｎｓｅｃｔｒｕｍ種、ｌａｕｒｅｌｉａｅ種、ｍａｌｔｏｓａ種、ｍｅｌｉｂｉｏｓｉｃａ種、ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ種、ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ種、ｎａｔａｌｅｎｓｉｓ種、ｏｒｅｇｏｎｅｎｓｉｓ種、ｐａｌｍｉｏｌｅｏｐｈｉｌａ種、ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ種、ｐｓｕｄｏｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ種、ｑｕｅｒｃｉｔｒｕｓａ種、ｒｈａｇｉｉ種、ｒｕｇｏｓａ種、ｓａｉｔｏａｎａ種、ｓａｋｅ種、ｓｃｈａｔａｖｉｉ種、ｓｅｑｕａｎｅｎｓｉｓ種、ｓｈｅｈａｔａｅ種、ｓｏｒｂｏｐｈｉｌａ種、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ種、ｖａｌｄｉｖｉａｎａ種、ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ種等を用いることがさらに好ましい。
これらの種の中でも、直鎖炭化水素を炭素源としたときの増殖速度や、ａｌｂｉｃａｎｓ種等と異なり安全性が高いことから、特にマルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）種が好ましい。【００３９】
また、本発明のＡＤＥ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ５遺伝子破壊株の作製及びその利用に関して、酵母の好ましい１例として、キャンディダ・マルトーサを用いることができる。
本発明に用いるＡＤＥ１遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＡＣ１６株は、ＦＥＲＭ  ＢＰ−７３６６の受託番号で、平成１２年１１月１５日付けで、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。
また、後述のようにして本発明で得られた各遺伝子破壊酵母、つまり、
ＵＲＡ３遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＵ−３５株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３５、寄託日平成１５年７月１８日）、
ＨＩＳ５遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＣＨ−Ｉ株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３４、寄託日平成１５年７月１８日）、
ＡＤＥ１及びＵＲＡ３遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＵＡ−３５４株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３６、寄託日平成１５年７月１８日）、
ＡＤＥ１及びＨＩＳ５遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＡＨ−Ｉ５株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９４３３、寄託日平成１５年７月１８日）、
ＨＩＳ５及びＵＲＡ３遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＨＵ−５９１株（受託番号ＦＥＲＭ  Ｐ−１９５４５、寄託日平成１５年１０月１日）、
ＡＤＥ１及びＨＩＳ５及びＵＲＡ３遺伝子破壊酵母であるキャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０２０５、寄託日平成１５年８月１５日）、
はそれぞれ、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６にある独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。【００４０】
ここで、相同的組換えとは、ＤＮＡの塩基配列が類似の配列又は同じ配列（相同配列）を持つ部分で起こる組換えを示す。
遺伝子破壊とは、ある遺伝子の機能が発揮できないようにするために、その遺伝子の塩基配列に変異を入れる、別のＤＮＡを挿入する、あるいは、遺伝子のある部分を欠失させることを示す。遺伝子破壊の結果、その遺伝子がｍＲＮＡへ転写できなくなり、構造遺伝子が翻訳されない、あるいは、転写されたｍＲＮＡが不完全なため、翻訳された構造蛋白質のアミノ酸配列に変異又は欠失が生じ、本来の機能の発揮が不可能になる。【００４１】
ＡＤＥ１遺伝子とは、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域、ホスホリボシルアミノイミダゾール−サクシノカルボキサミド合成酵素（ＥＣ６．３．２．６）をコードする領域、並びにターミネーター領域を含む３’非翻訳領域からなる遺伝子断片を示す。キャンディダ・マルトーサのＡＤＥ１遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ００８５５に公開されている。【００４２】
ＵＲＡ３遺伝子とは、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域、オロチジン−５’−ホスフェートデカルボキシレース（ＥＣ４．１．１．２３）をコードする領域、並びにターミネーター領域を含む３’非翻訳領域からなる遺伝子断片を示す。キャンディダ・マルトーサのＵＲＡ３遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ１２７２０に公開されている。【００４３】
ＨＩＳ５遺伝子とは、プロモーター領域を含む５’非翻訳領域、ヒスチジノール−ホスフェート−アミノトランスフェラーゼ（ＥＣ２．６．１．９）をコードする領域、並びにターミネーター領域を含む３’非翻訳領域からなる遺伝子断片を示す。キャンディダ・マルトーサのＨＩＳ５遺伝子の塩基配列はＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ１７３１０に公開されている。【００４４】
ＡＤＥ１ＤＮＡ断片とは、微生物細胞内で染色体上のＡＤＥ１遺伝子と相同的組換えを起こすことができ、それによってＡＤＥ１遺伝子を破壊できるＤＮＡを示している。
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片とは、微生物細胞内で染色体上のＵＲＡ３遺伝子と相同的組換えを起こすことができ、それによってＵＲＡ３遺伝子を破壊できるＤＮＡを示している。
ＨＩＳ５ＤＮＡ断片とは、微生物細胞内で染色体上のＨＩＳ５遺伝子と相同的組換えを起こすことができ、それによってＨＩＳ５遺伝子を破壊できるＤＮＡを示している。【００４５】
次に、本発明の形質転換体としては、上記遺伝子破壊酵母を、同種又は異種の遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換したものである。【００４６】
同種遺伝子とは、宿主酵母の染色体上に存在している遺伝子又はその一部のＤＮＡを意味する。異種遺伝子とは、宿主酵母の染色体上に本来存在しない遺伝子又はその一部のＤＮＡを意味する。【００４７】
また、遺伝子発現カセットを用いることもできる。遺伝子発現カセットとは、転写プロモーターＤＮＡ配列、発現を目的とする遺伝子をコードするＤＮＡ、及び転写を終結するターミネーターを含むＤＮＡから構成される環状プラスミド状のもので、染色体外で機能するものと、染色体ＤＮＡに組み込むタイプがある。【００４８】
次に、本発明の遺伝子発現産物の製造方法としては、上記形質転換体を培養して得られる培養物から、同種又は異種の遺伝子発現産物を採取するものである。
また、当該遺伝子発現産物としては、特にポリエステルであることが好ましい。【００４９】
遺伝子発現産物とは、遺伝子によって発現される物質（遺伝子発現物）が所望の蛋白質や酵素の場合、それ自体が遺伝子発現産物である。また、遺伝子発現物が各種酵素類や補酵素類であり、該酵素類が宿主酵母内で触媒活性を発現することにより生産される、遺伝子発現物とは直接異なる物質も遺伝子発現産物である。【００５０】
ＰＨＡとは、ポリヒドロキシアルカノエートの略であり、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合した、生分解性ポリエステルを示す。
ｐｈａＣは、３−ヒドロキシアルカン酸の共重合した生分解性ポリエステルを合成する、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子を示す。
ｐｈｂＢとは、アセトアセチルＣｏＡを還元して３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを合成する、アセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子を示す。【００５１】
以下に、ＡＤＥ１、ＵＲＡ３、ＨＩＳ５遺伝子破壊株の作製方法、該破壊株によるポリエステルの製造方法を具体的に説明する。
（１）ＵＲＡ３遺伝子破壊株、ＵＲＡ３・ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製方法
ＵＲＡ３遺伝子破壊株作製に関しては、ＵＲＡ３酵素が発現しない破壊株が得られればいかなる方法も用いることが可能である。遺伝子破壊の方法は種々の方法が報告されているが、ある特定の遺伝子のみ破壊できるという点で、相同的組換えによる遺伝子破壊が好ましい（Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ  Ｊ．Ａ．編  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、４７：２９１−３０２（１９９５）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ））。相同的組換えの中でも、自然復帰しない破壊株が取得でき、その結果、組換え体を取り扱う上で安全性が高い菌株が得られるという点で、遺伝子置換破壊が好ましい。【００５２】
使用するＵＲＡ３ＤＮＡ断片は、通常、遺伝子内部の部分ＤＮＡを除去し、残った両端部分を再度連結した形のＤＮＡ断片が用いられる。
除去する部分ＤＮＡは、除去によりＵＲＡ３遺伝子が酵素活性を発揮できなくなる部分であり、且つ自然復帰によりＵＲＡ３酵素活性が回復しない長さのＤＮＡである。このような部分ＤＮＡの鎖長は特に限定されないが、好ましくは５０塩基以上、より好ましくは１００塩基以上である。また、除去されたＤＮＡの部位にいかなる長さのＤＮＡが挿入されていてもかまわない。【００５３】
これらＤＮＡ断片は、例えば、ＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応法）や、ベクターからの制限酵素による切り出しと再連結等によって調製できる。
ＵＲＡ３ＤＮＡ断片の両端の相同性領域長は、１０塩基以上あればよく、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは３００塩基以上である。
また、両端それぞれの相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。【００５４】
ＵＲＡ３遺伝子は、キャンディダ・マルトーサ染色体中に２個以上存在することが予想されていた。目的破壊遺伝子が破壊されたことを検出できる手法が存在する場合には選択マーカーは不要であるが、通常染色体中に２個以上ある遺伝子を破壊する場合等では、選択マーカーを指標として酵母染色体中の破壊対象遺伝子の相同組換えを検出する必要がある。複数の選択マーカーを用いるか、あるいは１個目の遺伝子を破壊した後、用いた選択マーカー遺伝子を除去あるいは破壊した後に、２個目以降の遺伝子を破壊する作業が必要となる。【００５５】
従って、ＵＲＡ３ＤＮＡ断片の除去した遺伝子部分に、ＡＤＥ１等の選択マーカーとなり得る遺伝子を挿入する方法を用いることが出来る。挿入する選択マーカーの長さには特に制限はなく、酵母中で実質的に機能しうるプロモーター領域、構造遺伝子領域、ターミネーター領域を含んでいればよい。遺伝子マーカーが、目的酵母とは異なる生物由来でもかまわない。【００５６】
更に、選択マーカー遺伝子の両端に、ｈｉｓＧ遺伝子断片（サルモネラ菌ＡＴＰ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ遺伝子の断片、この遺伝子断片を含むプラスミドｐＮＫＹ１００９はＡＴＣＣより入手可能（ＡＴＣＣ：８７６２４））をそれぞれ挿入することで、遺伝子破壊を行った後に、分子内相同組換えにより挿入したマーカー遺伝子を除去可能にできる（Ａｌａｎｉ等  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６：５４１−５４５（１９８７））。このように選択マーカー遺伝子の除去に用いる遺伝子断片に特に制限はなく、選択マーカーの上・下流にいかなる遺伝子の相同断片を配置してもよい。従って、選択マーカーに含まれる配列を使用することも可能であり、本発明においては、マーカーとして用いるＡＤＥ１遺伝子の５’末端部分の遺伝子断片をＡＤＥ１遺伝子３’の末端に結合することで、分子内相同組換えによりマーカー遺伝子が極めて効率的に除去可能となった。マーカーの分子内相同組換えに用いる遺伝子断片に特に制限はなく、マーカー遺伝子が実質的に機能しない遺伝子断片を用いればよい。３’末端部分の遺伝子断片を用いることもできる。【００５７】
本発明では、３種類のＵＲＡ３破壊用ＤＮＡを用いた。
ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１は、約２２０ｂｐのＵＲＡ３酵素をコードするＤＮＡ断片を除去し、５’側約３５０ｂｐＤＮＡ断片と３’側約４６０ｂｐのＤＮＡ断片を連結したＤＮＡである（図１）。除去した部分はＵＲＡ３酵素蛋白質の約３０％にあたる。また、５’側及び３’側のＤＮＡ断片と元のＵＲＡ３遺伝子との相同性は両ＤＮＡとも１００％である。【００５８】
ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２は、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１の除去されたＵＲＡ３ＤＮＡ断片の代わりに、キャンディダ・マルトーサ由来ＡＤＥ１遺伝子を挿入した（図１）。
ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３は、分子内相同組換えを起こしアデニン要求性を回復させる為の配列として、ＡＤＥ１遺伝子の５’末端部分約６３０ｂｐを用いることとし、ＡＤＥ１遺伝子の下流に接続している（図１）。【００５９】
本発明に用いるＤＮＡ断片は、一般的なベクター上に構築することができる。
本発明においてはｐＵＣ−Ｎｘを用いて行った。ｐＵＣ−Ｎｘは、ｐＵＣ１９（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １．１３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））のＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩのサイトの間のＤＮＡを、配列番号１に記載のＤＮＡで置換し、制限酵素サイトを新規に構築したベクターである。
ｐＵＣ１１９−ＵＲＡ３（Ｏｈｋｕｍａ  Ｍ．等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、２３：２０５−２１０（１９９３））より、ＰＣＲを用いてＵＲＡ３遺伝子の５’側と３’側を別々に増幅し、ｐＵＣ−Ｎｘに順次連結し、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を含むベクターを作製した。
次に、同ベクター中に、ＰＣＲ法により増幅したＡＤＥ１遺伝子を挿入し、このようにしてＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を含むベクターを作製した。
更に、このベクター中のＡＤＥ１遺伝子３’末端に、ＰＣＲにより増幅したＡＤＥ１５’末端部分配列約６３０ｂｐを挿入することにより、マーカー遺伝子除去が可能なＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３を含むベクターが作製された。【００６０】
破壊用ＤＮＡを含むベクターは適当な大腸菌、例えばＪＭ１０９やＤＨ５αに導入し、該大腸菌を培養し、それより塩化セシウム超遠心法により高純度のプラスミドを大量調製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  １．４２−１．４７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。また、アルカリ法等を用いても可能である（Ｂｒｉｎｂｉｏｉｍ  Ｈ．Ｃ．，等  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ７：１５１３−１５２３（１９７９））。市販のプラスミド精製キット等を用いても十分可能である。このベクターを直接遺伝子破壊に用いることができるが、精製したベクターよりＵＲＡ３領域を含む相同性のある部分を適当な制限酵素で切り出し、それを破壊用ＤＮＡとして利用するのが望ましい。ＰＣＲ法を用いて増幅することも可能である。本発明では、制限酵素ＳｐｈＩ及びＳｗａＩで切断し、ＤＮＡ断片を精製することなく菌体内に導入することにより、相同的組換えによってＵＲＡ３遺伝子を破壊することができた。【００６１】
キャンディダ・マルトーサの形質転換法には、プロトプラスト法、酢酸リチウム法（Ｔａｋａｇｉ  Ｍ．等、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１６７：５５１−５（１９８６））、電気パルス法（Ｋａｓｕｓｋｅ  Ａ．等  Ｙｅａｓｔ  ８：６９１−６９７（１９９２））が知られているが、本発明では電気パルス法を用いて行った。電気パルス発生には市販の機器が利用できる。本発明では、ＢＴＸ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ＵＳＡ）製のＥＬＥＣＴＲＯ  ＣＥＬＬ  ＭＡＮＩＰＵＬＡＴＯＲ  ６００を用いた。キュベットはＢＩＯ  ＭＥＤＩＣＡＬ  ＣＯＲＰＯＲＡＴＩＯＮ  ＣＯ．ＬＴＤ（Ｔｏｋｙｏ  Ｊａｐａｎ）製のＢＭ６２００（２ｍｍ  ｇａｐ  ｂｌｕｅ  ｃａｐ）を用いた。
ＡＣ１６株よりコンピテント細胞を調製し、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２と共に電気パルス後、アデニンを含まない培地で培養し、出現するコロニーより目的のＵＲＡ３遺伝子にＡＤＥ１遺伝子が挿入された破壊株をスクリーニングする。【００６２】
目的遺伝子破壊株のスクリーニングは、得られたコロニーから、ＰＣＲ法やゲノミックサザンハイブリダイゼーション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ９．３１−９．５７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））により容易に行うことができる。ＰＣＲ法では、ＵＲＡ３遺伝子の両端をプライマーに用いると、アガロースゲル電気泳動において、野生株では正常な大きさのＤＮＡバンドが検出されるが、破壊株では挿入遺伝子分だけ大きいバンドも検出される。本発明では、約１ｋｂｐと２ｋｂｐのＤＮＡバンドが検出された。しかし、遺伝子破壊等の染色体ＤＮＡとの置換や組み込みの場合、遺伝子が目的以外の箇所、例えば相同性の高い未知の部分に挿入される可能性を想定すべきであり、その場合、ＰＣＲ法では確認できない場合がある。この場合、ゲノミックサザンハイブリダイゼーション法や、破壊対象遺伝子の相同組換えに用いた部分より外部に存在する遺伝子配列を用いてＰＣＲ法を行うことにより、確認することが出来る。【００６３】
ＵＲＡ３遺伝子は、キャンディダ・マルトーサ染色体に２個以上存在することが予想された。実際、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を形質転換して得られた株は、ウラシル要求性を示さず、２個目のＵＲＡ３遺伝子を破壊しなければ、ウラシル要求性を付与する事ができない。２個目のＵＲＡ３遺伝子を破壊するためには、挿入したＡＤＥ１遺伝子を破壊した後に、もう一度１個目のＵＲＡ３遺伝子を破壊した手法を用いるか、あるいは、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１等で形質転換後、ウリジンあるいはウラシルと５−ＦＯＡ（５−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｏｒｏｔｉｃ−Ａｃｉｄ）の共存下で生育してくるコロニーを選択することで達成される。本発明においては前者の手法を用いた。即ち、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を形質転換してアデニン非要求性となった株にＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を電気導入してもう一度１個目のＵＲＡ３遺伝子を破壊し、アデニンを含む最少培地に塗布し、出現する赤色コロニーを選択することで、アデニン要求性株が取得できる。ＡＤＥ１ＤＮＡ断片を用いることもできる（特開２００２−２０９５７４号公報）。その後、２個目のＵＲＡ３遺伝子を破壊する作業を行う。【００６４】
この際、スクリーニングを効率的に行うための濃縮工程を用いることが好ましい。例えば、ナイスタチン濃縮（Ｓｎｏｗ  Ｒ．Ｎａｔｕｒｅ  ２１１：２０６−２０７（１９６６））と呼ばれる方法を利用することができる。本法は、酵母からランダム変異により得られる変異株を効率的に選択するために開発された方法であるが、遺伝子破壊株にも応用できる。例えば、遺伝子導入後、培養した菌体をＹＭ培地等に植菌し培養する。菌を洗浄し、窒素源不含最少培地で培養後、窒素源含有最少培地で短時間培養する。この培養液に直接ナイスタチンを添加し、３０℃で１時間、好気的に培養することにより、野生株を優先的に殺傷できる。この菌液を、アデニンを含有する適当な寒天培地プレートに塗抹し、３０℃で２日間程度培養すると、赤色コロニーが得られる。【００６５】
得られたアデニン要求性株は、ＰＣＲ法により確認する事が出来る。ＵＲＡ３遺伝子の両端をプライマーに用いると、アガロースゲル電気泳動において、元株では正常な大きさのＤＮＡバンドが検出されるが、ＡＤＥ１破壊株では欠失部分だけ短いバンドも検出される。【００６６】
次に、このＵＲＡ３遺伝子が１個破壊され、アデニン要求性を回復した株に対して、上記の方法を繰り返すことで２個目のＵＲＡ３遺伝子が破壊され、ウラシル要求性となった株を取得することができる。その後再びＡＤＥ１遺伝子を破壊することで２重栄養要求性株を取得することができるが、本発明においては、２個目のＵＲＡ３遺伝子の破壊には、分子内相同組換えによるマーカー遺伝子除去が可能なＡＤＥ１遺伝子を含むＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３を用いた。この破壊用遺伝子を、本株に電気導入し、ウリジンあるいはウラシルを含む選択培地にてコロニーを形成させる。得られたコロニーをウリジンやウラシルを含まない培地にレプリカする事により、ウラシル要求性株を選択する。得られた要求性株の染色体遺伝子をＰＣＲ法等により解析し、正常なＵＲＡ３に相当する遺伝子が増幅せず、挿入遺伝子を含むサイズの遺伝子、及び、欠失を含むサイズの遺伝子のみを増幅する株を選択する。この段階でＵＲＡ３破壊株が完成する。【００６７】
次に、挿入したＡＤＥ１遺伝子を除去する。この方法として、分子内相同組換えによりＡＤＥ１遺伝子を自然欠失した株を、ナイスタチン濃縮法を応用することにより、簡便に作製することが可能である。本発明の好ましい態様によれば、培養した菌体をＹＭ培地等に植菌し培養後、菌を洗浄し、窒素源不含最少培地で培養後、窒素源含有最少培地で短時間培養する。この培養液に直接ナイスタチンを添加し、３０℃で１時間、好気的に培養することにより、ＡＤＥ１遺伝子を含む株を優先的に殺傷できる。この菌液をアデニンを含有する適当な寒天培地プレートに塗抹し、３０℃で２日間程度培養すると、赤色コロニーが得られる。【００６８】
得られたアデニン要求性株は、ＰＣＲ法等により確認する事が出来る。ＵＲＡ３遺伝子の両端をプライマーに用いると、アガロースゲル電気泳動において、元株では、ＡＤＥ１遺伝子とＡＤＥ１断片遺伝子の挿入された大きさのＤＮＡバンドと欠失を持つＵＲＡ３遺伝子の大きさのＤＮＡが検出されるが、ＡＤＥ１破壊株では、欠失を持つＵＲＡ３遺伝子の大きさのＤＮＡと欠失を持つＵＲＡ３遺伝子の大きさのＤＮＡにＡＤＥ１遺伝子断片の大きさを加えたサイズのＤＮＡバンドもが検出される。この段階でＡＤＥ１及びＵＲＡ３遺伝子破壊株が作製される。【００６９】
（２）ＨＩＳ５遺伝子破壊株、ＨＩＳ５・ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製方法
ＨＩＳ５遺伝子破壊酵母、及び、ＨＩＳ５・ＡＤＥ１遺伝子破壊酵母についても、上記（１）に記載の方法を用いてＡＣ１６株より作製することが出来る。
用いるＨＩＳ５遺伝子は、ｐＵＣ１１９−ＨＩＳ５（Ｈｉｋｉｊｉ．等、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１６：２６１−２６６（１９８９））より調製することが出来る。即ち、ＡＤＥ１遺伝子の３’側にＡＤＥ１遺伝子５’側断片を接続した遺伝子の両端に、ＨＩＳ５遺伝子の５’側ＤＮＡ断片と３’側のＤＮＡ断片を連結したＨＩＳ５遺伝子破壊用ＤＮＡ等を用いることができる（図１）。本発明においては、ＨＩＳ５遺伝子の５’側及び３’側の約５００ｂｐのＤＮＡ断片を用いたが、特に限定されるものではない。【００７０】
上記遺伝子をＡＣ１６株に電気導入し、得られたアデニン非要求性株よりＨＩＳ５遺伝子が破壊された株をＰＣＲ法等により選択し、その後、ナイスタチン濃縮法により、分子内相同組換えによりアデニン要求性を回復した株を簡便に取得することができる。ＨＩＳ５遺伝子が複数存在する場合には、本工程を繰り返し行うことで、アデニン、ヒスチジン２重栄養要求性株が取得できる。【００７１】
（３）ＵＲＡ３・ＨＩＳ５遺伝子破壊株、ＵＲＡ３・ＨＩＳ５・ＡＤＥ１遺伝子破壊株の作製方法
（１）で得られたＵＲＡ３・ＡＤＥ１破壊株を元にして、（２）に記載の方法で、ＵＲＡ３・ＨＩＳ５遺伝子破壊株、及びＵＲＡ３・ＨＩＳ５・ＡＤＥ１遺伝子破壊株を作製することが出来る。また、（２）で得られた株を元にして、（１）の方法を用いても作製可能である。【００７２】
（４）遺伝子破壊株による異種遺伝子発現
本発明で得た遺伝子破壊株を用いて、同種遺伝子あるいは異種遺伝子を、利用可能なマーカーの数に応じて複数回導入することや、マーカーを回復させることで何度でも導入することが可能となり、目的遺伝子を従来以上に導入でき多量に発現させることができる。
酵母は、大腸菌ではできない糖鎖付加蛋白質を培地中に分泌することができるため、遺伝子破壊株を用いてこのような蛋白質の生産が可能である。また、本発明の酵母は、遺伝子マーカーが複数存在するため、数種の蛋白質を発現させることができ、複数の酵素が関与するような複雑な反応を行うことも可能であり、化学品の製造にも有用である。
導入できる同種遺伝子は特に限定されないが、例えば、産業上有用な生産物の製造例として、ＷＯ９９／０４０１４に公開されているような、キャンディダ・マルトーサに同株由来のＰ４５０酵素遺伝子を導入することによる、ジカルボン酸の製造が挙げられる。
また、異種遺伝子も特に限定はされないが、例えば、抗体遺伝子、リパーゼ遺伝子、アミラーゼ遺伝子等の導入による、当該蛋白質の製造が挙げられる。ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子や、ポリヒドロキシアルカン酸合成の基質を合成する酵素遺伝子を導入することによる、ポリエステルの製造も挙げられる。【００７３】
酵母１細胞当たりの目的遺伝子の導入数は、目的遺伝子産物の性質と、用いるプロモーターの強さにより決定される。例えば、目的遺伝子産物が導入した発現カセットより翻訳される蛋白質の場合、単純蛋白質の場合は何個でもよいが、糖鎖を付加される蛋白質の場合、過剰な蛋白質の翻訳は糖鎖修飾が律速となり不均一な産物を与えることになる。従って、制限された数の発現カセットの導入が好ましい。【００７４】
本発明に用いたキャンディダ・マルトーサ等の一部のキャンディダ属酵母においては、ｍＲＮＡから蛋白質が翻訳される段階で、一部コドンの翻訳のされ方が他の生物と異なっていることが知られている。キャンディダ・マルトーサではロイシンコドンのＣＵＧがセリンに翻訳されるため（Ｏｈａｍａ  Ｔ．等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、２１：４０３９４０４５（１９９３））、大腸菌由来ｌａｃＺ遺伝子が、活性を持つβガラクトシダーゼに翻訳されない（Ｓｕｇｉｙａｍａ  Ｈ．等、Ｙｅａｓｔ  １１：４３−５２（１９９５））。このように異種遺伝子を発現させる場合には、それがキャンディダ・マルトーサ内で機能を持つ蛋白質に翻訳されるという保証はない。従って、キャンディダ・マルトーサを宿主として異種遺伝子を発現させる場合、原則としてロイシンコドンのみ変換すれば良いが、さらに効率よく発現させるため他のアミノ酸コドンをキャンディダ・マルトーサのものに合わせても良い。コドンの変換は、例えばＷｏｌｆ  Ｋ．編  Ｎｏｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  Ｙｅａｓｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．の中のＭａｕｅｒｓｂｅｒｇｅｒ  Ｓ．等著、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ  ｐ５２４−５２７を参考にして行えば良い。【００７５】
本発明の好ましい実施形態では、遺伝子発現産物として生分解性ポリエステルが生産される。以下、ポリエステルの生産方法について記述する。
本発明においては、例えば、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ）や、ポリエステルの合成の基質となる分子の合成に関与する酵素遺伝子等のポリエステル合成に関与する酵素遺伝子を、上記遺伝子破壊酵母に複数組み込んで形質転換体とし、当該形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取する。【００７６】
ポリエステル合成に関与する酵素遺伝子としては特に限定されないが、下記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子が好ましく、下記式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と下記式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の合成に関与する酵素遺伝子であることがより好ましい。【００７７】
【化１】
2005085415.tif 000002
【００７８】
【化２】
2005085415.tif 000003
【００７９】
【化３】
2005085415.tif 000004
【００８０】
例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているポリエステル合成酵素遺伝子を用いることができる。【００８１】
また、本ポリエステル合成酵素遺伝子と共に、ポリエステル合成の基質となる（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡや、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリヘキサノイル−ＣｏＡに関与する遺伝子を導入しても良い。
これらの遺伝子としては、例えば、β酸化経路の中間体のエノイル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する（Ｒ）体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｆｕｋｕｉ  Ｔ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７０：６９−７５（１９９９）、特開平１０−１０８６８２号公報）や、アセチル−ＣｏＡを二量化して３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを合成するβケトチオラーゼ、ＮＡＤＰＨ依存性リダクターゼ遺伝子（Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＯＰ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９））等が挙げられる。更に、３−ケトアシル−ＣｏＡ−アシルキャリアープロテイン還元酵素（Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｋ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７６：１８３−１９０（１９９９）を用いることも有用である。
これらの遺伝子は、実質的な酵素活性を有する限り、当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていても良いものとする。但し、異種遺伝子の場合、上記したようにキャンディダ・マルトーサ内で機能を持つ蛋白質に翻訳されるという保証はないため、アミノ酸コドンを変更することが望ましい。
より好ましくは、ポリエステル合成酵素遺伝子とアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を共に用いることができる。【００８２】
本発明では、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＣ（特開平１０−１０８６８２公報、Ｆｕｋｕｉ  Ｔ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７０：６９−７５（１９９９））と、ラルストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４９８７）を用いた。【００８３】
アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＣをコードする遺伝子を、キャンディダ・マルトーサで発現するように設計し、且つアミノ酸配列上アミノ末端より１４９番目に存在するアスパラギンをセリンに置換するように作製したＤＮＡ（ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ）の塩基配列を配列番号２に示した。
ラルストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＢをコードする遺伝子を、キャンディダ・マルトーサで発現するように設計したＤＮＡの塩基配列を配列番号３に示した。【００８４】
ただし、これらの配列番号に示した塩基配列は、これに限定されるものではなく、当該酵素のアミノ酸配列がキャンディダ・マルトーサ内で発現される塩基配列であれば、いかなる塩基配列でも用いることができる。より好ましくは、これらポリエステル合成に関与する遺伝子のカルボキシル末端にペルオキシソーム配向シグナルとして３つのアミノ酸配列から成る「（セリン／アラニン／システイン）−（リジン／アルギニン／ヒスチジン）−ロイシン」をコードする遺伝子を付加されているものを用いることができる。ここで、例えば、（セリン／アラニン／システイン）とはセリン、アラニン又はシステインのいずれかであるということを意味する（ＷＯ０３／０３３７０７）。【００８５】
酵母における遺伝子発現カセットは、当該遺伝子の５’側上流に、プロモーター、５’上流域活性化配列（ＵＡＳ）等のＤＮＡ配列を連結し、当該遺伝子の３’下流に、ポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ配列を連結して作製する。これらのＤＮＡ配列は、当該酵母で機能する配列であればどのような配列でも利用できる。【００８６】
使用するプロモーター、ターミネーターは、酵母で機能するものであればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターも用いてもよい。本発明においては、上記プロモーター、ターミネーターが、キャンディダ・マルトーサで機能するものであることが好ましく、上記プロモーター、ターミネーターが、キャンディダ・マルトーサ由来であることがより好ましい。さらに好ましくは、用いる炭素源で強い活性を持つプロモーターである。
例えば、油脂等を炭素源として用いる場合には、プロモーターとしては、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ００４８１）のプロモーターＡＬＫ１ｐ（ＷＯ０１／８８１４４）、ＡＬＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５５８８１）のプロモーターＡＬＫ２ｐ等を用いることができる。更に、これらのプロモーターの上流にＡＲＲ（アルカン  レスポンシブル  リージョン）配列を複数個付加することによりプロモーター活性を向上させたプロモーター（木暮ら、２００２年日本農芸化学大会講演要旨集、ｐ１９１）（配列番号４）を利用することもできる。また、ターミネーターとしては、キャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（ＷＯ０１／８８１４４）等を用いることができる。
なお、上記プロモーター及び／又はターミネーターの塩基配列は、キャンディダ・マルトーサで機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は、付加された塩基配列であってもよい。
上記プロモーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたポリエステル合成に関与する酵素をコードする遺伝子の５’上流に、ターミネーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたポリエステルの合成に関与する酵素をコードする遺伝子の３’下流に、それぞれ連結される。【００８７】
プロモーター及びターミネーターと構造遺伝子を連結し、本発明の遺伝子発現カセットを構築する方法は、特に限定されるものではない。本実施例の他にも制限酵素部位を作製するためにＰＣＲ法も利用できる。例えば、ＷＯ０１／８８１４４に記載の方法が使用できる。【００８８】
この発現カセットを酵母染色体に部位特異的に組み込むためには、発現カセットと選択マーカーとなる遺伝子を結合させたＤＮＡの両端に、導入する染色体遺伝子と相同な配列を持つ遺伝子断片を結合させたＤＮＡ（導入用ＤＮＡ）を用いることができる。選択マーカーとして、上記（１）に記載の分子内相同組換えにより自然欠失可能なＡＤＥ１遺伝子等を利用する事も可能である。導入用ＤＮＡ中の発現カセットの数には限定が無く、作製可能であればいくつでもよい。【００８９】
目的遺伝子を挿入させる場所としては、遺伝子配列の解明されている場所であればいかなる部位でも利用できる。遺伝子配列が未知であっても、遺伝子配列の知られた近縁種酵母の染色体遺伝子配列を元に遺伝子配列の解析が可能であるので、実質的に、全ての遺伝子部位への挿入が可能である。遺伝子配列の解析法としては、導入対象酵母染色体ＤＮＡライブラリーより、配列の解析されているサッカロミセス・セレビシエや、キャンディダ・アルビカンスの相同遺伝子断片をプローブとしてハイブリダイゼイション法を用いて取得することができる。プローブは、ＰＣＲ等を用いて作製できる。染色体ＤＮＡライブラリーは、当業者にとって公知の方法で作製できる。【００９０】
一例としては、（１）に記載のＵＲＡ３遺伝子破壊に用いたＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１中に、マーカー遺伝子としてＨＩＳ５遺伝子を挿入し、ＵＲＡ３遺伝子断片部位との間にポリエステル合成に関与する遺伝子の発現カセットを挿入すると、ヒスチジン要求性をマーカーとして、酵母染色体上の破壊されたＵＲＡ３部位に特異的に目的遺伝子を挿入させるＤＮＡを作製することができる。遺伝子の導入法としては、（１）に記載の電気導入法等が利用できる。【００９１】
本発明の菌株は、複数の選択マーカーを利用して、形質転換することにより、遺伝子発現カセットを複数導入した様々な株を作製することができる。分子内相同組換えにより自然欠失可能なＡＤＥ１遺伝子等を利用すれば、選択マーカーの回復が可能であるので何カ所にも遺伝子導入が可能である。また、酵母内において自律複製可能なプラスミドも共に利用することができる。【００９２】
ポリエステル合成に関与する遺伝子発現カセットで形質転換された酵母を培養することによるポリエステルの製造は、次のようにして行うことができる。
培養に用いる炭素源としては、酵母が資化できるものであればどのようなものでも良い。また、プロモーターの発現が誘導型である場合には、適時誘導物質を添加すれば良い。誘導物質が主要炭素源である場合もある。炭素源以外の栄養源としては、窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地が使用できる。培養温度はその菌の生育可能な温度であれば良いが、２０℃から４０℃が好ましい。培養時間には特に制限はないが、１〜７日程度で良い。その後、得られた培養菌体又は培養物からポリエステルを回収すれば良い。【００９３】
本発明の好ましい形態としては、炭素源として、油脂類、脂肪酸類、アルコール類さらにはｎ−アルカン等を用いることができる。油脂類としては、例えばナタネ油、ヤシ油、パーム油、パーム核油等が挙げられる。脂肪酸類としては、ブタン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸、またこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体等が挙げられる。これらを混合して使用することもできる。また、資化ができないか又は効率よく資化できない油脂の場合、培地中にリパーゼを添加することによって改善することもできる。さらに、リパーゼ遺伝子を形質転換することにより、油脂資化能を付与することもできる。【００９４】
窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。
無機塩類としては、例えばリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸類；ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビオチン、ニコチン酸アミド、パントテン酸、ビタミンＣ等のビタミン類等が挙げられる。
また、誘導物質としては、グルコースやガラクトース等が挙げられる。【００９５】
ポリエステルの菌体からの回収は多くの方法が報告されている。本発明においては、例えば、次のような方法が使用できる。培養終了後、培養液から、遠心分離器等で菌体を分離・回収し、その菌体を蒸留水及びメタノール等により洗浄した後、乾燥させる。この段階に菌体を破砕する工程を加えることもできる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いてポリエステルを抽出する。このポリエステルを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えてポリエステルを沈殿させる。次いで、濾過や遠心分離によってその上澄み液を除去し、沈殿したポリエステルを乾燥させて、ポリエステルを回収することができる。【００９６】
得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。【００９７】
次に第二の本発明である、新規酵母形質転換体について述べる。
第二の本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子とが導入されている酵母形質転換体であって、これら遺伝子の両方又は何れかが２コピー以上導入されていることを特徴とする酵母形質転換体である。
（Ｉ）宿主
第二の本発明でいう酵母としては、複数の遺伝子を導入・形質転換できればよく、菌株の寄託機関（例えばＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている酵母等を使用することができる。好ましくは、直鎖炭化水素の様な疎水性物資に耐性を有する点で、キャンディダ属（Ｃａｎｄｉｄａ属）、クラビスポラ属（Ｃｌａｖｉｓｐｏｒａ属）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属）、デバリオマイセス属（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ属）、ロデロマイセス属（Ｌｏｄｄｅｒｏｍｙｃｅｓ属）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ属）、ロドトルラ属（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属）、スポリディオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ属）、ステファノアスカス属（Ｓｔｅｐｈａｎｏａｓｃｕｓ属）、ヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ属）などの酵母を使用することができる。
これら酵母の中でも、特に、染色体遺伝子配列の解析が進んでおり、宿主−ベクター系も利用できること、また、直鎖炭化水素や油脂等の資化能力が高い点で、キャンディダ属が好ましい。【００９８】
キャンディダ属の中でも、特に直鎖炭化水素や油脂等の資化能力が高い点で、第一の本発明で例示した種を用いることが好ましい。
これらの種の中でも、増殖速度や感染性の点から特にマルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）種が好ましい。【００９９】
本発明の酵母形質転換体の作製において、形質転換する際に、薬剤耐性や栄養要求性等の性質を有する選択マーカー遺伝子も同時に宿主に導入しておけば、形質転換後にその選択マーカー遺伝子が発現することによる薬剤耐性や栄養要求性等を利用して形質転換株のみを選択することができる。
選択マーカー遺伝子としては、シクロヘキシミドやＧ４１８、ハイグロマイシンＢなどへの耐性を付与する遺伝子を用いることができる。また、栄養要求性を相補する遺伝子を選択マーカーとして用いることもできる。これらは、単独で使用してもよいし、組み合わせて使用することもできる。【０１００】
しかしながら、例えば、栄養要求性を相補する遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いる場合は、その選択マーカー遺伝子と同様の作用をする、宿主が元来有する遺伝子が実質的に機能しない栄養要求性破壊株が必要である。このような栄養要求性破壊株（変異株）は、ニトロソグアジニンやエチルメタンスルホン酸などの変異源を用いたランダム変異誘起処理によって取得することができるが、変異が目的の箇所以外にも入っている可能性が高く、その結果生育速度等に影響を受ける場合があることから、本発明においては、第一の本発明で述べた、相同的組換えによる遺伝子破壊法によって作製された宿主を用いる方が好ましい。
なお、複数回形質転換を行う場合は、その回数に応じたマーカーの種類が必要である。又は、後述のように、選択マーカー遺伝子を含む遺伝子導入用ＤＮＡを宿主に導入したのち、選択マーカー遺伝子を除去することにより、選択マーカーを回復する必要がある。本発明の実施例においては、多重栄養要求性遺伝子破壊株を用いた。
ここで、遺伝子導入用ＤＮＡとは、微生物細胞内で染色体上の遺伝子と相同的組換えを起こすことができ、それによって目的遺伝子を挿入できるＤＮＡを示す。【０１０１】
本発明の実施例で用いた、ＡＤＥ１、ＨＩＳ５及びＵＲＡ３遺伝子破壊株であるキャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株は、第一の本発明で作製されたものであり、キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株を使用し、後述の実施例３に記載の方法で作製した。
特に上記宿主において、複数回形質転換を行う際、栄養要求性等の遺伝子破壊を行わなくても初めから複数の選択マーカー遺伝子を利用できるものの場合は、効率的に本発明の酵母形質転換体を作製することができる。【０１０２】
（ＩＩ）ＰＨＡ合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子
ＰＨＡ合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、上記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなるポリエステルを合成する合成酵素遺伝子が好ましく、上記式（２）で示される３−ヒドロキシ酪酸と上記式（３）で示される３−ヒドロキシヘキサン酸とを共重合してなる共重合ポリエステルＰ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＨ）の合成酵素遺伝子であることがより好ましい。【０１０３】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子として、例えば、特開平１０−１０８６８２号公報に記載されているＰＨＡ合成酵素遺伝子を用いることができる。
また、第二の本発明においては、上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子と共に、アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子を用いる。アセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子としては、アセトアセチル−ＣｏＡを還元し、（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを合成する活性を有している酵素遺伝子であればよく、例えば、ラルストニア・ユートロファ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ２１９７３）、シュードモナスｓｐ．６１−３（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｔ４４３６１）、ズーグロエア・ラミゲラ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｐ２３２３８）、アルカリジェネス・ラタスＳＨ−６９（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＢ６５７８０）由来の酵素遺伝子などが利用できる。
更に、上記遺伝子に加えて、他のＰＨＡ合成に関与する遺伝子を用いることができる。他のＰＨＡ合成に関与する遺伝子としては、たとえば、β酸化経路の中間体のエノイル−ＣｏＡを（Ｒ）−３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡに変換する（Ｒ）体特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（Ｆｕｋｕｉ  Ｔ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７０：６９−７５（１９９９）、特開平１０−１０８６８２号公報）や、アセチル−ＣｏＡを二量化して３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡを合成するβケトチオラーゼ（Ｐｅｏｐｌｅｓ  ＯＰ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１５２９８−１５３０３（１９８９））、３−ケトアシル−ＣｏＡ−アシルキャリアープロテイン還元酵素遺伝子（Ｔａｇｕｃｈｉ  Ｋ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７６：１８３−１９０（１９９９）などが挙げられる。特に、（Ｒ）−３−ヒドロキシヘキサノイル−ＣｏＡを合成する活性を有している酵素遺伝子が好ましい。【０１０４】
本発明は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子（ｐｈａＣ）とアセトアセチル−ＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈｂＢ）を同時に用いるものである。
本発明では、アエロモナス・キャビエ由来のｐｈａＣ（特開平１０−１０８６８２公報、Ｆｕｋｕｉ  Ｔ．等、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１７０：６９−７５（１９９９））とラロストニア・ユートロファ由来のｐｈｂＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｊ０４９８７）を用いることができ、上記ｐｈａＣとしては、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるアエロモナス・キャビエ由来の酵素又は変異体をコードするものが好ましく、上記ｐｈｂＢとしては、配列番号６で表されるアミノ酸配列からなるラルストニア・ユートロファ由来の酵素又は変異体をコードするものが好ましい。
これらの遺伝子は、実質的な酵素活性を有する限り、当該遺伝子の塩基配列に欠失、置換、挿入等の変異が生じていても良いものとする。但し、異種遺伝子の場合、宿主酵母内で機能を持つ蛋白質に効率的に翻訳されるという保証はないため、アミノ酸コドンを最適化することが望ましい。【０１０５】
なお、第一の本発明で上述したように、キャンディダ・マルトーサを宿主として異種遺伝子を発現させる場合、原則としてロイシンコドン（ＣＵＧ）のみ変換することが好ましく、さらに効率よく発現させるため他のアミノ酸コドンをキャンディダ・マルトーサのものに合わせても良い。【０１０６】
ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、アミノ酸配列を改変し、酵素活性・基質特異性・熱安定性などの性質の改良された変異体を取得・作製し利用することができる。有用な変異の方法は種々知られているが、特に分子進化工学的手法（特開２００２−１９９８９０号公報）などが、迅速に所望の変異体を得られることから有用性が高い。これらの手法を利用して、過去、いくつかの合成酵素変異体が見出され、大腸菌において野生型酵素より活性が向上することが確認されている（Ｔ．Ｋｉｃｈｉｓｅ等  Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８，２４１１−２４１９（２００２）、ＡｍａｒａＡ．Ａ．等  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５９，４７７−４８２（２００２））。【０１０７】
また、コンピュータ上で酵素遺伝子の立体構造、または予想される立体構造を基に、有用なアミノ酸変異を特定することも、例えばプログラムＳｈｒｉｋｅ（特開２００１−１８４８３１号公報）などを用いて可能である。本発明におけるｐｈａＣとしては、例えば、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子のアミノ酸配列に、これらの手法を利用して得られる、以下の（ａ）〜（ｈ）いずれかのアミノ酸置換を少なくとも一つ以上行ったＰＨＡ合成酵素変異体をコードするものを用いることができる。
（ａ）Ａｓｎ−１４９をＳｅｒ
（ｂ）Ａｓｐ−１７１をＧｌｙ
（ｃ）Ｐｈｅ−２４６をＳｅｒまたはＧｌｎ
（ｄ）Ｔｙｒ−３１８をＡｌａ
（ｅ）Ｉｌｅ−３２０をＳｅｒ、ＡｌａまたはＶａｌ
（ｆ）Ｌｅｕ−３５０をＶａｌ
（ｇ）Ｐｈｅ−３５３をＴｈｒ、ＳｅｒまたはＨｉｓ
（ｈ）Ｐｈｅ−５１８をＩｌｅ【０１０８】
ここで、例えば、「Ａｓｎ−１４９」というのは、配列番号５のアミノ酸配列において１４９番目のアスパラギンを意味し、（ａ）のアミノ酸置換は１４９番目のアスパラギンをセリンに変換することを意味する。【０１０９】
ｐｈａＣ、ｐｈｂＢとしては、第一の本発明で例示した配列番号２、３のものが挙げられるが、これらに限定されず、当該酵素遺伝子のアミノ酸配列がキャンディダ・マルトーサ内で発現される塩基配列であれば、いかなる塩基配列でも用いることができる。【０１１０】
ｐｈａＣ、ｐｈｂＢを細胞質基質（サイトゾル、ｃｙｔｏｓｏｌ）で発現させる場合にはこのまま用いるが、これらの遺伝子をペルオキシソームに局在させる遺伝子に改変して使用することもできる（ＷＯ０３／０３３７０７）。
ｐｈａＣ、ｐｈｂＢをペルオキシソームに局在させる方法しては、第一の本発明で記載した方法を用いることができる。【０１１１】
また、Ｎ末端付近に存在する９つのアミノ酸配列「（アルギニン／リジン）（ロイシン／バリン／イソロイシン）（５アミノ酸）（ヒスチジン／グルタミン）（ロイシン／アラニン）」もペルオキシソーム配向シグナルとして知られている。これらの配列をコードするＤＮＡをＰＨＡ合成に関与する遺伝子に挿入、付加することによっても、同酵素遺伝子をペルオキシソームに局在させることができる。【０１１２】
更に、ミトコンドリアでｐｈａＣ、ｐｈｂＢが発現するように、これらの遺伝子をミトコンドリアに配向させる遺伝子に改変し使用することもできる。これらの遺伝子をミトコンドリアに局在させるためには、アミノ末端にミトコンドリアに局在して発現している蛋白質を結合させればよい。例えばチトクロームオキシダーゼやＴＣＡサイクル関連酵素などが挙げられる。例えば、ミトコンドリアに局在して発現している蛋白質のアミノ末端から１５残基以上、望ましくは４０残基以上をコードする遺伝子を、ＰＨＡ合成に関与する遺伝子の５’側上流にフレームがずれないように結合させた遺伝子を用いればよい。この時付加する融合遺伝子とＰＨＡ合成に関与する遺伝子の間にアミノ酸残基の不必要な衝突を避けるためのリンカー配列を挿入することもできる。融合遺伝子に使用する遺伝子は、本発明の形質転換に用いる宿主酵母由来のものが好ましいが、特に限定されるものではない。【０１１３】
これら、サイトゾル、ペルオキシソーム、ミトコンドリアに配向するように設計された遺伝子は単独で用いることもできるが、二種以上を用いることもできる。ｐｈａＣ、ｐｈｂＢとしては、ペルオキシソーム配向シグナルが付加されているものが好ましい。【０１１４】
（ＩＩＩ）遺伝子発現カセット
本発明に用いるＰＨＡ合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の発現カセットは、当該遺伝子の５’側上流にプロモーター、５’上流域活性化配列（ＵＡＳ）等のＤＮＡ配列を連結し、当該遺伝子の３’下流にポリＡ付加シグナル、ターミネーター等のＤＮＡ配列を連結して作製することができる。
本発明においては、ＰＨＡ合成酵素遺伝子とアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子に、酵母で機能するプロモーター及びターミネーターが接続されていることが好ましい。【０１１５】
使用するプロモーター、ターミネーターは酵母で機能するものであればどのような配列でも利用できる。プロモーターには構成的に発現を行うものや誘導的に発現を行うものがあるが、いずれのプロモーターも用いてもよい。上記プロモーターとしては、形質転換体の培養に用いる炭素源に強い活性を持つプロモーターが好ましい。例えば、油脂などを炭素源として用いる場合にはプロモーターとしては、第一の本発明で記載したもの等を用いることができる。【０１１６】
また、ターミネーターとしてはキャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子のターミネーターＡＬＫ１ｔ（ＷＯ０１／８８１４４）等を用いることができる。なお、上記プロモーター及び／又はターミネーターの塩基配列は、使用宿主で機能する配列であれば、１つ若しくは複数個の塩基が欠失、置換及び／又は、付加された塩基配列であってもよい。
本発明においては、上記プロモーター、ターミネーターが、キャンディダ属で機能するものであることが好ましく、キャンディダ・マルトーサで機能するものであることがより好ましく、上記プロモーター、ターミネーターがキャンディダ・マルトーサ由来であることが更に好ましい。【０１１７】
本発明の好ましい形態において、上記プロモーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＰＨＡ合成酵素遺伝子、並びに、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の５’上流にそれぞれ連結され、ターミネーターは、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたＰＨＡ合成酵素遺伝子、並びに、ペルオキシソーム配向シグナルをコードするＤＮＡが付加されたアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の３’下流に、それぞれ連結される（ＷＯ０３／０３３７０７）。【０１１８】
プロモーターとターミネーターとをｐｈａＣ、ｐｈｂＢに連結し、本発明の遺伝子発現カセットを構築する方法は、特に限定されるものではなく、第一の本発明と同様の方法が使用できる。【０１１９】
（ＩＶ）形質転換体
上記発現カセットの酵母１細胞当たりの導入数は、本発明における望ましい形態において用いたＡＲＲプロモーターを利用した場合であっても、炭化水素や脂肪酸・油脂等の炭素源下で強く遺伝子発現が誘導されるものの１コピーでは不十分であり、ｐｈａＣの発現カセットの数とｐｈｂＢの発現カセットの数は、何れかが２コピー以上必要であることが本発明により示された。宿主のＰＨＡ合成の基質供給量が律速とならない限り導入する発現カセットの数に制限はなく、多い方が望ましい。好ましい発現カセット数は、用いるプロモーターの種類にもよるが、プロモーターＡＲＲｐを用いた場合、共に２コピー以上導入することが好ましく、共に３コピー以上導入することがより好ましい。
この発現カセットは、酵母内において自律複製可能なベクターに挿入して宿主酵母に導入することができる。また、宿主酵母染色体に挿入することもできる。両導入法は同時に用いることもできる。【０１２０】
ベクターを用いて宿主酵母に導入する場合は、例えば、キャンディダ・マルトーサにおいて自律増殖可能なｐＵＴＵ１（Ｍ．Ｏｈｋｕｍａ，ｅｔ
ａｌ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２７３，３９４８−３９５３（１９９８））などのベクター中に発現カセットを複数挿入した発現ベクターを作製すればよい。【０１２１】
発現カセットを染色体に挿入する方法を用いる場合は、例えば、相同的組換えが利用できる。相同的組換えの中でも、自然復帰しない導入株が取得できるという点で、遺伝子置換法が好ましい。遺伝子置換法による発現カセットの染色体への挿入には、まず発現カセットと選択マーカーとなる遺伝子を結合させ、次いで発現カセットと選択マーカーとなる遺伝子を結合させたＤＮＡの両端に、導入する染色体上の遺伝子と相同な配列を持つ遺伝子断片を結合させたＤＮＡ（遺伝子導入用ＤＮＡ）を用いることができる。【０１２２】
発現カセットなどを挿入させる染色体上の部位は、宿主に回復不可能な影響を与えない限り、特に制限はない。遺伝子導入用ＤＮＡの両端に結合させた、導入する染色体上の遺伝子との相同性領域長は、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、更に好ましくは３００塩基以上である。また、両端それぞれの相同性は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上である。即ち、遺伝子配列の解析されている部位においては、当該遺伝子をそのまま利用することができるし、遺伝子配列が未知であっても遺伝子配列の知られた近縁種酵母の染色体遺伝子配列を利用することができる。【０１２３】
相同性が低く相同組換えが起こりにくい場合には、染色体上の導入部位の遺伝子をクローニングして使用することができる。染色体上の導入部位の遺伝子をクローニングするためには、染色体遺伝子の全配列が解析されているサッカロミセス・セレビシエや、キャンディダ・アルビカンスの配列を元にＰＣＲ用プライマーを設計し遺伝子増幅を行えばよい。また、第一の本発明と同様に、導入対象酵母染色体ＤＮＡライブラリーを利用することもできる。
遺伝子導入用ＤＮＡ中の発現カセットの数には限定が無く、作製可能であればいくつでもよい。【０１２４】
遺伝子導入用ＤＮＡ中の選択マーカー遺伝子としては、上述のように栄養要求性を相補する遺伝子を選択マーカー遺伝子として用いることができる。また、シクロヘキシミドやＧ４１８あるいはハイグロマイシンＢなどの耐性を付与する遺伝子を用いることもできる。これらの選択マーカー遺伝子は、後述の分子内相同組換えにより自然欠失可能な形態にして利用する事も可能である。この場合、選択マーカー遺伝子の回復が可能であるので、何度でも同じ選択マーカー遺伝子を用いた遺伝子導入用ＤＮＡを導入することができ、形質転換株の作製を簡便に行うことができる。【０１２５】
これらの発現カセットを酵母宿主に導入するための遺伝子導入用ＤＮＡは、大腸菌などにおいて自律増殖するプラスミドなどを用いて、当業者に公知の方法で作製することができる。一例としては、後述の実施例１に記載のＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１中に選択マーカー遺伝子としてＨＩＳ５遺伝子を挿入し、ＵＲＡ３遺伝子断片部位との間にｐｈａＣの発現カセット及びｐｈｂＢの発現カセットを挿入すると、ヒスチジン要求性をマーカーとして、酵母染色体上のＵＲＡ３部位に特異的に目的遺伝子を挿入させる遺伝子導入用ＤＮＡを作製することができる。【０１２６】
遺伝子導入用ＤＮＡを含むプラスミドは、第一の本発明と同様な方法で調製することができる。このプラスミドを直接酵母の形質転換に用いることができるが、精製したベクターより染色体導入領域を含む相同性のある部分を適当な制限酵素で切り出し、それを遺伝子導入用ＤＮＡとして利用するのが望ましい。ＰＣＲ法を用いて増幅して使用することも可能である。【０１２７】
酵母の形質転換法には、第一の本発明で例示した方法が挙げられ、本発明では電気パルス法が好ましい。宿主株よりコンピテント細胞を調製し、遺伝子導入用ＤＮＡと共に電気パルス後、選択マーカー遺伝子を含まない形質転換体が増殖しない培地で培養し、出現するコロニーより目的の染色体部位に遺伝子導入用ＤＮＡが挿入された株をスクリーニングする。
目的遺伝子導入株のスクリーニングも、第一の本発明と同様の方法で行うことができる。【０１２８】
上記の方法を用いて、ｐｈａＣ発現カセット及びｐｈｂＢ発現カセットの導入を目的発現カセット数になるまで行うことにより、本発明の形質転換体が作製できる。【０１２９】
本発明の実施例で用いた多重栄養要求性遺伝子破壊株を使用する代わりに、野性株や栄養要求性を１つしか持たない株を用いても本発明のＰＨＡ合成に関与する遺伝子を複数回導入した酵母形質転換体を取得することができる。例えば、選択マーカー遺伝子として薬剤耐性マーカー遺伝子を用いて遺伝子導入用ＤＮＡを導入する場合、形質転換株の選択に用いる薬剤の濃度を、遺伝子導入用ＤＮＡで形質転換するごとに上昇させればよい。また、１回の形質転換後に染色体に導入された選択マーカー遺伝子を除去すれば、再び遺伝子導入のマーカーとして使用することができ、多数の遺伝子導入用ＤＮＡを導入することができる。この方法は、例えば特開２００２−２０９５７４号公報に記載の遺伝子破壊法などが利用できる。更に、選択マーカー遺伝子の両端にｈｉｓＧ遺伝子断片をそれぞれ挿入することで、遺伝子導入を行った後に、分子内相同組換えにより挿入したマーカー遺伝子を除去する事が出来る形に遺伝子導入用ＤＮＡ作製することもできる（Ａｌａｎｉ等  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１６：５４１−５４５（１９８７））。【０１３０】
本発明で得られたポリエステル生産株の１つであるＣＭ３１３−Ｘ２Ｂ株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２２）は、２００４年２月１３日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブダペスト条約に基づいて国際寄託されている。【０１３１】
（Ｖ）選択マーカーの回復方法
本発明の選択マーカーの回復方法は、選択マーカー遺伝子としてＡＤＥ１遺伝子を持つキャンディダ・マルトーサで分子内相同組換えを行うことにより、当該ＡＤＥ１遺伝子を除去することを特徴とするものである。当該ＡＤＥ１遺伝子を除去することにより、更に形質転換を行う場合、ＡＤＥ１遺伝子を再び選択マーカー遺伝子として用いることができる。
これまで、サッカロミセス・セレビシエなどで分子内相同組換えにより選択マーカー遺伝子を除去することは公知であったが、キャンディダ・マルトーサにおいて分子内相同組換えにより選択マーカー遺伝子を除去する方法は、知られていなかった。選択マーカー遺伝子としては、上述のように、薬剤耐性遺伝子や栄養要求性を相補する遺伝子を用いることができ、例えばＡＤＥ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ＨＩＳ５遺伝子等が挙げられるが、本発明においては、選択マーカー遺伝子の除去がカラー選択可能なＡＤＥ１遺伝子を用いる。
本発明の方法においては、ＡＤＥ１遺伝子に相同な遺伝子を結合させたものでも分子内相同組換えにより当該ＡＤＥ１遺伝子を除去することができるが、ＡＤＥ１遺伝子の上流または下流にＡＤＥ１遺伝子の一部分を結合させたものの方が、作製が容易であり、余分な遺伝子を酵母染色体に残さない点で好ましい。
選択マーカー遺伝子の分子内相同組換えに用いる遺伝子断片に特に制限はなく、選択マーカー遺伝子が実質的に機能しない遺伝子断片を用いればよい。本発明の実施例においてはＡＤＥ１遺伝子の５’末端部分の遺伝子断片を用いたが、３’末端部分の遺伝子断片を用いることもできる。選択マーカー遺伝子に連結させるマーカー遺伝子断片は、好ましくは１０塩基以上、より好ましくは２００塩基以上、更に好ましくは３００塩基以上である。即ち、上記（ＩＶ）に記載の、遺伝子導入用ＤＮＡ中の選択マーカー遺伝子の５’末端あるいは３’末端にマーカー遺伝子断片を挿入すればよい。本発明の方法において、ＡＤＥ１遺伝子は、配列番号７で示される塩基配列からなるものが好ましい。配列番号７で示される塩基配列は、ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ由来のものである。この方法は、ＡＤＥ１遺伝子以外のマーカー遺伝子にも応用できる。
図４に分子内相同組換えによるマーカーの回復の模式を示す。図４において、括弧内の数字は、ＡＤＥ１遺伝子のＧｅｎＢａｎｋに登録されている配列の５’末端からの番号を示している。【０１３２】
分子内相同組換えにより、挿入した選択マーカー遺伝子が除去された株は種々の方法で濃縮・選択することができる。例えば、ナイスタチン濃縮法を利用することができる。適当な培地にて培養した菌体を最少培地等に植菌し培養する。菌を洗浄し、窒素源不含最少培地で培養後、窒素源含有最少培地で短時間培養する。この培養液に直接ナイスタチンを添加し、１時間、３０℃で好気的に培養することにより、マーカー遺伝子を有する株を優先的に殺傷できる。この菌液を適当な寒天培地プレートに塗抹し、３０℃で２日間程度培養する。除去する選択マーカー遺伝子がアデニン要求性を示すＡＤＥ１遺伝子である場合は、ＡＤＥ１遺伝子を破壊すると前駆体物質が蓄積し、酵母が赤く染まるため、アデニン含有最小培地寒天プレートを用いれば赤色コロニーとして得られる。マーカー遺伝子がＵＲＡ３遺伝子の場合には、ウリジンあるいはウラシルと５−ＦＯＡ（５−Ｆｌｕｏｒｏ−Ｏｒｏｔｉｃ−Ａｃｉｄ）の共存下の培地で生育してくるコロニーを選択すればよい。このような選択法がない場合は、レプリカ法を用いることができる。【０１３３】
（ＶＩ）ポリエステルの物性コントロール法
また、本発明のポリエステルの分子量を制御する方法は、酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子の数を制御することを特徴とするものである。
また、本発明のポリエステルのヒドロキシアルカン酸組成を制御する方法は、酵母形質転換体を用いるポリエステルの製造において、酵母形質転換体のポリヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子の数を制御することを特徴とするものである。【０１３４】
すなわち、本発明の目的産物であるポリエステルのヒドロキシアルカン酸組成と分子量は、ｐｈａＣとｐｈｂＢの発現量を調節することによってコントロールすることができる。それぞれ同じプロモーターを用いたｐｈａＣの発現カセット及びｐｈｂＢの発現カセットを用いた場合、ヒドロキシヘキサン酸の組成を高くするためには、ｐｈｂＢの発現カセットの導入数に対して、ｐｈａＣの発現カセットの導入数を高くすることによって行うことができる。また、分子量を増加させるためには、ｐｈａＣの発現カセットの導入数に対して、ｐｈｂＢの発現カセットの導入数を高くすることによって行うことができる。
このような特性を持つ形質転換体は、上述の（ＩＶ）に記載の方法により作製することができる。また、発現カセットの導入数が同じ場合でも、用いるプロモーターの強さを変えることによって、ヒドロキシアルカン酸組成と分子量の制御を達成できる。【０１３５】
（ＶＩＩ）培養精製
本発明のポリエステルの製造方法は、上記酵母形質転換体を培養して得られる培養物から、ポリエステルを採取することを特徴とするものである。
ＰＨＡ合成酵素遺伝子及びｐｈｂＢの発現カセットで形質転換された酵母の培養は、第一の本発明で述べた、形質転換された酵母を培養方法と同様に行うことができる。【０１３６】
ポリエステルの菌体からの回収は、多くの方法が報告されており、例えば、第一の本発明で述べた方法を用いることができる。【０１３７】
得られたポリエステルの分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法などにより行うことができる。重量平均分子量の測定には、ＧＰＣ法が利用できる。例えば、回収した乾燥ポリマーを、クロロホルム溶解したのち、この溶液をＳｈｏｄｅｘ  Ｋ８０５Ｌ（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析する事が出来る。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンなどが使用できる。
【発明の効果】
【０１３８】
本発明の遺伝子破壊によって作製された複数のマーカーを有する酵母は、遺伝子組換え用宿主として、高効率な遺伝子発現や遺伝子の発現産物の製造に用いることが期待できる。更に、遺伝子破壊によるマーカーを付加することも可能であり、より優れた宿主の開発に繋がる。また、本発明により、生分解性かつ優れた物性を有する、３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを酵母において効率的に生産することが可能になった。更に、共重合ポリエステルの物性を制御することも可能となった。また、酵母において複数回の遺伝子導入を効率的に行うことが可能となった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１３９】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例にその技術範囲を限定するものではない。
なお、酵母菌の培養用に使用した試薬は、特に断らない限り和光純薬から販売されているものを用いた。
また、本発明の実施において、多くの市販のキットを用いたが、特に断らない限り添付の使用説明書に従って行った。【０１４０】
（培地組成）
ＬＢ培地：１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ食塩。ＬＢプレートの場合は、寒天を１６ｇ／Ｌになるように加える。
ＹＰＤ培地：１０ｇ／Ｌ酵母エキス、２０ｇ／Ｌポリペプトン、２０ｇ／Ｌグルコース。ＹＰＤプレートの場合は、寒天を２０ｇ／Ｌになるように加える。アデニン含有ＹＰＤ培地の場合は、アデニンを０．１ｇ／Ｌ加える。
ＹＭ培地：３ｇ／Ｌ酵母エキス、３ｇ／Ｌマルトエキス、５ｇ／Ｌバクトペプトン、１０ｇ／Ｌグルコース。
ＳＤ培地：６．７ｇ／Ｌアミノ酸不含イーストニトロジェンベース（ＹＮＢ）、２０ｇ／Ｌグルコース。アデニン含有培地の場合はアデニンを２４ｍｇ／Ｌ添加する。ウリジン含有培地の場合はウリジンを０．１ｇ／Ｌ添加する。ヒスチジン含有培地の場合はヒスチジンを５０ｍｇ／Ｌ添加する。ＳＤプレートの場合は寒天を２０ｇ／Ｌになるように加える。【０１４１】
Ｍ培地：０．５ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム、０．１ｇ／Ｌ食塩、０．４ｍｇ／Ｌチアミン、０．４ｍｇ／Ｌピリドキシン、０．４ｍｇ／Ｌパントテン酸カルシウム、２ｍｇ／Ｌイノシトール、０．００２ｍｇ／Ｌビオチン、０．０５ｍｇ／Ｌ塩化鉄、０．０７ｍｇ／Ｌ硫酸亜鉛、０．０１ｍｇ／Ｌホウ酸、０．０１ｍｇ／Ｌ硫酸銅、０．０１ｍｇ／Ｌヨウ化カリウム、８７．５ｍｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、１２．５ｍｇ／Ｌリン酸１水素２カリウム、０．１ｇ／Ｌ塩化カルシウム、２０ｇ／Ｌグルコース。硫酸アンモニウム含有Ｍ培地の場合は、１ｇ／Ｌ硫酸アンモニウムを加える。硫酸アンモニウム及びアデニン含有Ｍ培地の場合は、Ｍ培地に１ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと２４ｍｇ／Ｌのアデニンを加える。硫酸アンモニウム及びアデニン・ウリジン含有Ｍ培地の場合は、Ｍ培地に１ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと２４ｍｇ／Ｌのアデニンと０．１ｇ／Ｌのウリジンを加える。硫酸アンモニウム及びアデニン・ヒスチジン含有Ｍ培地の場合は、Ｍ培地に１ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと２４ｍｇ／Ｌのアデニンと５０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを加える。硫酸アンモニウム及びアデニン・ウリジン・ヒスチジン含有Ｍ培地の場合は、Ｍ培地に１ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムと２４ｍｇ／Ｌのアデニンと０．１ｇ／Ｌのウリジンと５０ｍｇ／Ｌのヒスチジンを加える。【０１４２】
Ｍ２培地（１２．７５ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム、１．５６ｇ／Ｌリン酸２水素カリウム、０．３３ｇ／Ｌリン酸１水素カリウム・３水和物、０．０８ｇ／Ｌ塩化カリウム、０．５ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、０．４１ｇ／Ｌ硫酸マグネシウム・７水和物、０．４ｇ／Ｌ硝酸カルシウム・７水和物、０．０１ｇ／Ｌ塩化鉄（ＩＩＩ）・４水和物）に、２ｗ／ｖ％パームオイルと塩酸に溶解したトレースエレメント（１ｇ／ｍＬ硫酸鉄（ＩＩ）・７水和物、８ｇ／ｍＬ硫酸亜鉛（ＩＩ）・７水和物、６．４ｇ／ｍＬ硫酸マンガン（ＩＩ）・４水和物、０．８ｇ／ｍＬ硫酸銅（ＩＩ）・５水和物）０．４５ｍｌ／Ｌを添加する。炭素源として、油脂を２０ｇ／Ｌ添加する。【０１４３】
酵母の液体培養は、５０ｍｌ試験管、５００ｍｌ坂口フラスコ、２Ｌ坂口フラスコあるいはミニジャーを用いて行った。５０ｍｌ試験管の場合３００ｒｐｍ、５００ｍｌ坂口フラスコの場合１００〜１１０ｒｐｍ、２Ｌ坂口フラスコの場合９０〜１００ｒｐｍで振とう培養した。培養温度は、液体培養とプレート培養ともに３０℃である。【０１４４】
（制限酵素処理）
制限酵素処理は、メーカーの推奨する反応条件、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋ等編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載の方法に従って行った。【０１４５】
（実施例１）相補ベクター、破壊用遺伝子及びマーカー回復型破壊用遺伝子の作製
東京大学より分与されたＵＲＡ３遺伝子をマーカーとして持つキャンディダ・マルトーサ用ベクターであるｐＵＴＵ−１を、配列番号８及び９に記載のプライマー（ｄｅｌ−ｓａｌ−５，ｄｅｌ−ｓａｌ−３）を用いて、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製クイックチエンジキットにより、ＵＲＡ３遺伝子中のＳａｌＩ制限酵素サイトを破壊したベクターｐＵＴＵ−ｄｅｌｓａｌを作製した。このｐＵＴＵ−ｄｅｌｓａｌから、ＳａｌＩとＸｈｏＩでＵＲＡ３遺伝子を切り出し、切り出した断片を再びｐＵＴＵ−１のＸｈｏＩサイトに導入したプラスミドｐＵＴＵ−２を作製した。ｐＵＴＡ−１（ＷＯ０１／８８１４４に記載）上のＡＤＥ１遺伝子を、ｐＵＴＵ−２のＸｈｏＩサイトにクローニングし、ｐＵＴＵ−２−Ａｄｅを作製した。ｐＵＴＵ−１のマルチクローニングサイトのＳａｌＩサイトに、ｐＵＣ１１９にクローニングされていたＨＩＳ５遺伝子をクローニングし、ｐＵＴＵ１−Ｈｉｓを作製した。更に、ｐＵＴＵ−２−ＡｄｅのマルチクローニングサイトのＳａｌＩサイトに、ＨＩＳ５遺伝子をクローニングし、ｐＵＴＵ−２−Ａｄｅ−Ｈｉｓを作製した。【０１４６】
ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトをＮｏｔＩ−ＳｐｈＩ−ＳａｌＩ−ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ＳｗａＩ−ＥｃｏＲＩに変更したプラスミドｐＵＣ−ＮｘのＳｐｈＩ−ＳａｌＩサイトに、ＵＲＡ３遺伝子の５’末端部分約３５０ｂａｓｅを、配列番号１０及び１１に記載のプライマー（ｕｒａ−ｓｐｈ−５，ｕｒａ−ｓａｌ−３）を用いて、プラスミドｐＵＴＵ−ｄｅｌｓａｌより増幅しクローニングした。このベクターのＮｈｅＩ−ＳｗａＩサイトに、ＵＲＡ３遺伝子の３’末端部分約４６０ｂａｓｅを、配列番号１２及び１３に記載のプライマー（ｕｒａ−ｎｈｅ−５，ｕｒａ−ｓｗａ−３）を用いて、ＰＣＲ増幅しクローニングした。このようにして、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を含むプラスミドを作製した。【０１４７】
次に、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を含むプラスミドのＳａｌＩ−ＸｈｏＩサイトに、ｐＵＴＡ−１のＡＤＥ１遺伝子全長を、配列番号１４及び１５に記載のプライマー（ａｄｅ−ｓａｌ−５，ａｄｅ−ｘｈｏ−３）を用いてＰＣＲ増幅・挿入して、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を含むプラスミドを作製した。【０１４８】
ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３（マーカー回復型）を含むプラスミドは、ＡＤＥ１遺伝子の５’末端部分約６３０ｂａｓｅを、配列番号１６及び１７に記載のプライマー（ａｄｅ−ｘｈｏ−５，ａｄｅ−ｎｈｅ−３）を用いてＰＣＲ増幅し、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を含むプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｈｅＩサイトにクローニングして完成させた。【０１４９】
ＨＩＳ５破壊用ＤＮＡ（マーカー回復型）を含むプラスミドは、ｐＵＣ１１９にクローニングされているＨＩＳ５遺伝子の５’末端部分約５００ｂａｓｅを配列番号１８及び１９に記載のプライマー（ｈｉｓ−ｓｐｈ−５，ｈｉｓ−ｓａｌ−３）を用いて、ＨＩＳ５遺伝子の３’末端部分約５６０ｂａｓｅを配列番号２０及び２１に記載のプライマー（ｈｉｓ−ｎｈｅ−５，ｈｉｓ−ｓｗａ−３）を用いて、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３を含むプラスミドのＳｐｈＩ−ＳａｌＩサイト、ＮｈｅＩ−ＳｗａＩサイトを入れ替える形で、それぞれ順次クローニングする事により作製した。【０１５０】
（実施例２）ＡＣ１６株のＵＲＡ３遺伝子破壊
ＡＣ１６株を１０ｍｌの大試験管でＹＰＤ培地で終夜培養した。この前培養した酵母を１ｍｌ／１００ｍｌ坂口フラスコとなるようＹＭ培地に植菌し、６時間培養後、集菌した。菌を２０ｍｌの１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌに懸濁し、３回洗浄した。最後に菌体を１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌ  ０．５ｍｌに懸濁し、コンピテント細胞とした。このコンピテント細胞０．１ｍｌに、実施例１のＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を含むプラスミドをＳｐｈＩとＳｗａＩで制限酵素処理したＤＮＡを０．１ｍｇ加え、電気パルス法による遺伝子導入を行った。電気パルスをかけた後、キュベットに１Ｍ  Ｓｏｒｂｉｔｏｌを１ｍｌ入れ、氷冷下１時間放置し、ＳＤプレートに蒔いた。出現したコロニーより、染色体抽出キットのジェントルくん（宝酒造社製）を用いて染色体ＤＮＡを抽出した。得られた染色体ＤＮＡ５μｇずつを、３種類の方法ＳｃａＩ、ＥｃｏＴ１４Ｉ、ＳｃａＩ＋ＥｃｏＴ１４Ｉで制限酵素処理して切断し、０．８％アガロースゲルで電気泳動を行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ９．３１−９．５７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に従って、ゲルからハイボンドＮ＋フィルター（アマシャム社製）に１晩トランスファーした。サザンブロット検出用プローブは、ＵＲＡ３遺伝子内の配列であるＳｃａＩ−ＮｄｅＩ断片（３４０ｂｐ）を、ＧｅｎｅＩｍａｇｅラベリング・検出キット（アマシャム社製）で酵素標識したものを用いた。ハイブリダイズ後、洗浄し、同キットの蛍光発色試薬でＤＮＡバンドを検出した。検出バンドを野生株ＩＡＭ１２２４７のものと比較したところ、野性株では約５７０ｂｐのバンドを示すＳｃａＩ＋ＥｃｏＴ１４Ｉ処理したＤＮＡが新たにＡＤＥ１遺伝子のＵＲＡ３遺伝子中への挿入を示す１８４０ｂｐのバンドも示す株を選択した。この株は、ＳｃａＩやＥｃｏＴ１４Ｉ処理のバンドでも理論値を示し、ＵＲＡ３遺伝子の一つがＡＤＥ１遺伝子により正確に破壊されたと確認された。【０１５１】
次に、この株より上記と同様に調製したコンピテント細胞に、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−２を含むプラスミドを配列番号１０及び１３に記載のプライマーでＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを０．５ｍｇ加え、上記と同様に電気パルス法による遺伝子導入を行った。パルスをかけた後にＹＭ培地１００ｍｌに植菌し、１晩培養した。菌体を回収し、Ｍ培地（硫酸アンモニウムなし）で１晩培養した。菌体回収後、Ｍ培地（硫酸アンモニウム有り）に移し、６時間晩培養後に、ナイスタチンを終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌになるように加え、更に１時間培養した。菌体を洗浄し、菌体をアデニン入りＳＤプレートにスプレッドした。出現した赤色コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出した。ここで得られたアデニン要求性株のゲノムは、配列番号２２及び２３に記載のプライマーｕｒａ３−５とｕｒａ３−３を用いて増幅を行ったところ、元株でインタクトなＵＲＡ３遺伝子の０．９ｋｂｐの増幅と共に増幅する２．３ｋｂｐのＤＮＡが消失し、代わりに０．７ｋｂｐのＤＮＡが増幅した。配列番号２４及び２５に記載のプライマーａｄｅＹ１１０−５とａｄｅＹ１６７０−３を用いて増幅を行ったところ、１．０ｋｂｐのＤＮＡのみが増幅した。これらのことから、部位特異的に１つ目のＵＲＡ３遺伝子破壊に用いたＡＤＥ１遺伝子全領域が特異的に除去されていると判断した。このアデニン要求性株の内の一株をＵ−１株と命名し、以下の実験に用いた。【０１５２】
次に、Ｕ−１株を用いて得られたクローンを用いて、コンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞０．１ｍｌに、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３を含むプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩとＳｗａＩで処理し精製したＤＮＡを０．０４ｍｇ加え、電気パルス法による遺伝子導入を行った。この菌体を、ウリジンを含むＳＤプレートにスプレッドし、３０℃でインキュベートした。出現したコロニーを、ＳＤプレートとウリジンを含むＳＤプレートにレプリカし、ウラシル要求性株を選択した。これより染色体ＤＮＡを回収し、配列番号２２及び２３に記載のプライマーｕｒａ３−５とｕｒａ３−３を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、インタクトなＵＲＡ３遺伝子の０．９ｋｂｐのバンドが消失し、代わりにＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３のサイズである２．９ｋｂｐが増幅していた。配列番号２４及び２５に記載のプライマーａｄｅＹ１１０−５とａｄｅＹ１６７０−３を用いて増幅を行ったところ、元株では増幅しないＡＤＥ１遺伝子１．５ｋｂｐが増幅した。これらのことから、ＵＲＡ３遺伝子特異的に破壊用遺伝子３が導入され、ＵＲＡ３遺伝子が全て破壊され、ウラシル要求性を獲得したものと判断した。得られた株の栄養要求性は、ベクターｐＵＴＵ−２で相補されることを確認した。このウラシル要求性株をキャンディダ・マルトーサＵ−３５と命名した。【０１５３】
次に、キャンディダ・マルトーサＵ−３５株をＹＰＤ培地１０ｍｌで終夜培養した。集菌後、Ｍ培地（硫酸アンモニウムなし）で１晩培養した。菌体回収後、ウリジン含有Ｍ培地（硫酸アンモニウムあり）に移し、７時間晩培養後にナイスタチンを終濃度０．０１ｍｇ／ｍｌになるように加え、更に１時間培養した。菌体を洗浄後、アデニン及びウリジン含有Ｍ培地（硫酸アンモニウムあり）で１晩培養した。菌体を回収し、Ｍ培地（硫酸アンモニウムなし）で１晩培養後、ウリジン含有Ｍ培地（硫酸アンモニウムあり）に移して７時間培養し、先ほどと同様にナイスタチン処理を行い、アデニン及びウリジンを含むＳＤプレートにスプレッドした。培養後、得られた赤色コロニーを、ＳＤプレート、ウリジンを含むＳＤプレート、並びにアデニン及びウリジンを含むＳＤプレートにレプリカし、アデニンとウラシルの両栄養要求性を示すクローンであることを確認した。この株よりゲノムＤＮＡを抽出し、配列番号２２及び２３に記載のプライマーｕｒａ３−５とｕｒａ３−３を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、ＵＲＡ３遺伝子にＡＤＥ１遺伝子が導入された２．９ｋｂｐのバンドが消失し、代わりにＵＲＡ３遺伝子中にＡＤＥ１遺伝子断片が残ったサイズである１．２ｋｂｐが増幅していた。配列番号２４及び２５に記載のプライマーａｄｅＹ１１０−５とａｄｅＹ１６７０−３を用いて増幅を行ったところ、親株では増幅するＡＤＥ１遺伝子１．５ｋｂｐが増幅したが、得られた栄養要求性株は、元々のＡＤＥ１破壊遺伝子のサイズである１．０ｋｂｐのバンドのみを認めた。これらのことから、ＵＲＡ３遺伝子中のＡＤＥ１遺伝子とＡＤＥ１遺伝子断片が同一遺伝子内で相同組換えにより自然にＡＤＥ１遺伝子を失ったものであり、簡便に遺伝子マーカーが回復されることが示された。このアデニン・ウラシルの２重栄養要求性株をキャンディダ・マルトーサＵＡ−３５４と命名した。【０１５４】
（実施例３）ＡＣ１６株のＨＩＳ５遺伝子破壊とマーカーの回復法
実施例２で作製したＵ−１株よりコンピテント細胞を調製し、ＨＩＳ５破壊用ＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩとＳｗａＩで処理し精製したＤＮＡ０．０４ｍｇを加え、電気パルス法による遺伝子導入を行った。条件は実施例２と同じである。この菌体を、ヒスチジン含有ＳＤプレートにスプレッドし、３０℃でインキュベートした。出現したコロニーよりゲノムＤＮＡを回収した。ＨＩＳ５遺伝子中の破壊用遺伝子のＨＩＳ５遺伝子と相同性のある部分のフランキング部位のプライマー、即ち破壊用遺伝子には含まれていないＨＩＳ５遺伝子のプライマーであるｈｉｓ−ｓａｌ２とｈｉｓ−１９００（配列番号２６及び２７）を用いてゲノムＤＮＡ増幅を行ったところ、インタクトなＨＩＳ５遺伝子のサイズである１．９ｋｂｐのバンドと共にＨＩＳ５破壊用ＤＮＡのサイズである３．４ｋｂｐが増幅する株を選択した。【０１５５】
この株を用い、実施例２に示した方法と同様の方法でナイスタチン濃縮を行った。アデニン含有ＳＤプレートにスプレッドし、得られた赤色コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーｈｉｓ−ｓａｌ２とｈｉｓ−１９００（配列番号２６及び２７）を用いてゲノムＤＮＡ増幅を行ったところ、インタクトなＨＩＳ５遺伝子のサイズである１．９ｋｂｐのバンドのみの増幅を認め、破壊用遺伝子を含んだサイズである３．４ｋｂｐは増幅しなかった。プライマーａｄｅ−ｘｈｏ−５とｈｉｓ−ｓｗａ−３（配列番号１６及び２１）を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、ＨＩＳ５遺伝子にＡＤＥ１遺伝子断片が結合した１．２ｋｂｐのバンドが増幅していた。このことから、得られたアデニン要求性株は、リバータントではなく、分子内相同組換えの結果得られたものであると確認された。【０１５６】
次に、得られたアデニン要求性株よりコンピテント細胞を調製し、ＨＩＳ５破壊用ＤＮＡを含むプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩとＳｗａＩで処理し精製したＤＮＡ０．０５ｍｇを加え、電気パルス法による遺伝子導入を行った。この菌体を、ヒスチジンを含むＳＤプレートにスプレッドし、３０℃でインキュベートした。出現コロニーを、ＳＤプレートとヒスチジンを含むＳＤプレートにレプリカし、ヒスチジン要求性株を得た。得られたヒスチジン要求性株よりゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーｈｉｓ−ｓａｌ２とｈｉｓ−１９００（配列番号２６及び２７）を用いてゲノムＤＮＡ増幅を行ったところ、親株で増幅する破壊されたＨＩＳ５遺伝子のサイズである１．９ｋｂｐのバンド以外に破壊用遺伝子を含んだサイズである３．４ｋｂｐが増幅する株を選択した。この株は、プライマーｈｉｓ−ｓａｌ２とａｄｅ−ｘｈｏ−３（配列番号２６及び１５）を用いたＰＣＲにより、ＨＩＳ５遺伝子中にＡＤＥ１遺伝子が組み込まれたことを確かめた。このヒスチジン要求性株をキャンディダ・マルトーサＣＨ−Ｉ株と命名した。【０１５７】
ＣＨ−Ｉ株を用い、実施例２に示した方法と同様の方法でナイスタチン濃縮を行った。アデニン及びヒスチジン含有ＳＤプレートにスプレッドし、得られた赤色コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出した。このゲノムＤＮＡをプライマーｈｉｓ−ｓａｌ２とｈｉｓ−１９００（配列番号２６及び２７）を用いてゲノムＤＮＡ増幅を行ったところ、すべての株で親株の破壊されたＨＩＳ５遺伝子のサイズである１．９ｋｂｐのバンドのみの増幅を認め、破壊用遺伝子を含んだサイズである３．４ｋｂｐは増幅しなかった。ヒスチジン及びアデニン要求性を、ＳＤプレート、ヒスチジン含有ＳＤプレート、並びにアデニン及びヒスチジン含有ＳＤプレートにレプリカする事で確認し、アデニン・ヒスチジンの２重栄養要求性株の完成とした。この内の１株をキャンディダ・マルトーサＡＨ−Ｉ５株と命名した。【０１５８】
次に、ＡＨ−Ｉ５株よりコンピテント細胞を調製し、ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−３を含むプラスミドを制限酵素ＳｐｈＩとＳｗａＩで処理し精製したＤＮＡを０．０２５ｍｇ加え、電気パルス法による遺伝子導入を行った。この菌体を、ウリジンとヒスチジンを含むＳＤプレートにスプレッドし、３０℃で２日間インキュベートした。出現コロニーを、ヒスチジンを含むＳＤプレートと、ウリジンとヒスチジンを含むＳＤプレートにレプリカし、ウラシル要求性株を選択した。これより染色体ＤＮＡを回収し、プライマーｕｒａ３−５とｕｒａ３−３（配列番号２２及び２３）を用いてＰＣＲ増幅を行ったところ、インタクトなＵＲＡ３遺伝子の０．９ｋｂｐのバンドが消失し、代わりに破壊用遺伝子のサイズである２．９ｋｂｐの増幅を確認した。このヒスチジン・ウラシル２重要求性株の内の１つを、キャンディダ・マルトーサＨＵ−５９１と命名した。【０１５９】
ＨＵ−５９１株を用い、実施例２に示した方法と同様の方法でナイスタチン濃縮を行った。アデニン、ヒスチジン及びウリジン含有ＳＤプレートにスプレッドし、得られた赤色コロニーよりゲノムＤＮＡを抽出した。プライマーｕｒａ３−５とｕｒａ３−３（配列番号２２及び２３）を用いてＰＣＲ増幅を行い、ＵＲＡ３遺伝子にＡＤＥ１遺伝子が導入された２．９ｋｂｐのバンドが消失し、代わりにＵＲＡ３遺伝子にＡＤＥ１遺伝子断片が残ったサイズである１．２ｋｂｐが増幅している株を選択した。ウラシル、ヒスチジン及びアデニン要求性を、アデニン、ヒスチジン及びウリジン含有ＳＤプレート、ヒスチジン及びウリジン含有ＳＤプレート、アデニン及びウリジン含有ＳＤプレート、アデニン及びヒスチジン含有ＳＤプレート、アデニン含有ＳＤプレート、ヒスチジン含有ＳＤプレート、ウリジン含有ＳＤプレート、及びＳＤプレートにレプリカする事で確認し、アデニン・ヒスチジン・ウラシルの３重栄養要求性株を完成した。この株をキャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１と命名した。【０１６０】
マーカー回復型破壊用遺伝子を用いた場合、アデニン要求性株の出現頻度は、アデニン破壊用ＤＮＡを用いた場合と同程度であるが、目的株取得までに要する時間は約半分に短縮することができた。更に、破壊遺伝子の導入時の目的外部位への挿入を考えなくても良く、解析も容易であった。【０１６１】
この実施例に示されるように、分子内相同組換えを用いて簡便にマーカー遺伝子を回復することができることが示された。【０１６２】
（実施例４）油脂資化能の確認
最終的に完成した３重栄養要求性株であるＡＨＵ−７１株を用いて、油脂を炭素源としたときの生育に問題がないことを確認するために、ジャー培養を実施した。ＡＨＵ−７１株にプラスミドｐＵＴＵ２−Ａｄｅ−Ｈｉｓを形質転換し、ＳＤプレートにコロニーを形成させた。対照としてはＡＣ１６株にプラスミドｐＵＴＡ−１を形質転換したものを用いた。種母は、１５０ｍｌのＳＤ培地を用い、坂口フラスコで培養し、調製した。ジャー培養は、マルビシ社製３Ｌジャーファーメンターに１．８ＬのＭ２培地を仕込んで行った。温度は３２℃、攪拌数は５００ｒｐｍとし、通気量は１ｖｖｍとした。炭素源はパーム核オイルを、培養開始より１１時間目までは１．９ｍｌ／ｈで、２４時間目までは３．８ｍｌ／ｈで、それ以降は５．７ｍｌ／ｈでフィードした。経時的に１０ｍｌの培養液をサンプリングし、メタノールで洗浄後、乾燥させ、ドライ菌体量を測定した。図２に示すように、ＡＨＵ−７１株は、ＡＣ１６株と同様の生育を示した。このことより、本株が油脂資化能を損なうことなく遺伝子破壊が出来ていることが確認された。【０１６３】
（実施例５）ポリエステルの合成に関与する酵素遺伝子発現カセットの構築
キャンディダ・マルトーサでポリエステル合成酵素を発現させるために、それぞれの５’上流にキャンディダ・マルトーサ由来プロモーターを、３’下流にターミネーターを連結した。プロモーターとしては、ＡＬＫ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｘ５５８８１）のプロモーターの上流にＡＲＲ配列を付加したプロモーターＡＲＲｐを、３’下流には共にキャンディダ・マルトーサのＡＬＫ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：Ｄ００４８１）のターミネーターＡＬＫ１ｔを連結した。ＡＲＲｐは、東京大学より分与された遺伝子（配列番号４）のＰｓｔＩサイトにＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩリンカーを結合させ、ＥｃｏＴ１４Ｉサイトに配列番号２８に示した合成ＤＮＡを結合させることにより、ＸｈｏＩ及びＮｄｅＩで切り出すことの出来る形に変換した。ｐＵＡＬ１（ＷＯ０１／８８１４４）をＥｃｏＲＩで切断後、平滑末端化しライゲーションを行うことにより、ＥｃｏＲＩ切断部位を除去したｐＵＡＬ２を作製した。ｐＵＡＬ２をＰｕｖＩＩ／ＰｕｖＩで切断し、ｐＳＴＶ２８（宝酒造社製）のＳｍａＩ／ＰｕｖＩＩサイトに結合させ、ｐＳＴＡＬ１を作製した。このｐＳＴＡＬ１をＥｃｏＲＩ／ＮｄｅＩで切断し、先に述べたＡＲＲｐと結合させ、ｐＳＴＡＲＲを作製した。【０１６４】
配列番号２に記載のｐｈａＣａｃ１４９ＮＳがペルオキシソームに配向するように、カルボキシ末端にペルオキシソーム配向シグナルを付加した。付加したペルオキシソーム配向シグナルとしては、カルボキシ末端にＳｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ（ＳＫＬ）のアミノ酸を使用した。次に、ｐＵＣＮＴにクローニングされていたｐｈａＣａｃ１４９ＮＳを鋳型にして、配列番号２９と３０のプライマーを用いて遺伝子増幅し、ｐＳＴＡＲＲのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトに結合させ、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳを構築した。配列番号３１から３５のプライマーを使用し、塩基配列を確認した。塩基配列決定は、ＰＥＲＩＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いた。【０１６５】
次に、化学合成したキャンディダ・マルトーサ用にコドンを変換した配列番号３に記載のラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ、Ｈ１６株、ＡＴＣＣ１７６９９）由来のアセトアセチルＣｏＡ還元酵素遺伝子（ｐｈｂＢ）のカルボキシ末端に、ペルオキシソーム配向シグナルを配列番号３６及び３７に記載のプライマーで増幅することにより付加し、次に、上記のｐＳＴＡＲＲのＮｄｅＩ、ＰｓｔＩサイトに結合させ、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈｂＢを構築した。塩基配列は、上記と同様の方法で確認した。【０１６６】
キャンディダ・マルトーサ用ベクターであるｐＵＴＡ−１のＳａｌＩサイトに、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳよりＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出した合成酵素発現カセットを２個導入し、ｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２を作製した。
更に、このベクターのＳａｌＩサイトに、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈｂＢよりＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出したｐｈｂＢ発現カセットを１個導入し、ｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２−ｐｈｂＢを作製した。【０１６７】
キャンディダ・マルトーサの染色体上の破壊されたＨＩＳ５遺伝子部分に、異種遺伝子を導入するための導入用ＤＮＡを、実施例１に記載のＨＩＳ５破壊用ＤＮＡを用いて作製した。ＨＩＳ５破壊用ＤＮＡをＳａｌＩとＸｈｏＩで切断し、ＡＤＥ１遺伝子を除去し、代わりにｐＵＴＵ−ｄｅｌｓａｌからＳａｌＩとＸｈｏＩで切断したＵＲＡ３遺伝子を導入したプラスミドを作製した。このベクターのＳａｌＩサイトに、上記のｐＳＴＡＲＲ−ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳよりＳａｌＩとＸｈｏＩで発現カセットを切り出し、結合させた。次に、このプラスミドのＸｈｏＩサイトに、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳよりＳａｌＩとＸｈｏＩで発現カセットを切り出し結合させ、導入用ＤＮＡ−１を含むプラスミドを作製した。
さらにｐＳＴＡＲＲ−ｐｈｂＢよりＳａｌＩとＸｈｏＩで切り出したｐｈｂＢ発現カセットを、導入用ＤＮＡ−１を含むプラスミドのＸｈｏＩサイトに結合させ、導入用ＤＮＡ−２を含むプラスミドを作製した。【０１６８】
キャンディダ・マルトーサの染色体上の破壊されたＵＲＡ３遺伝子部分に、異種遺伝子を導入するための導入用ＤＮＡを、実施例１に記載のＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を含むプラスミドを用いて作製した。ＵＲＡ３破壊用ＤＮＡ−１を含むプラスミドのＳａｌＩ−ＸｈｏＩサイトに、配列番号３８及び３９に記載のプライマーでＰＣＲ増幅したＨＩＳ５遺伝子を導入したプラスミドを作製した。このプラスミドのＳａｌＩサイトに、上記のｐＳＴＡＲＲ−ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳよりＳａｌＩとＸｈｏＩで発現カセットを切り出し、結合させた。次に、このベクターのＸｈｏＩサイトに、ｐＳＴＡＲＲ−ｐｈｂＢよりＳａｌＩとＸｈｏＩで発現カセットを切り出し、結合させ、導入用ＤＮＡ−３含むプラスミドを作製した。このＳａｌＩサイトに、ｐｈａＣ発現カセットの代わりに、ｐｈｂＢの発現カセットを結合させた導入用ＤＮＡ−４を含むプラスミドも作製した。
作製した、遺伝子導入用ＤＮＡ−１〜４の略図を図３に示した。図３において、括弧内の数字は、それぞれ用いた遺伝子断片のＧｅｎＢａｎｋに登録されている遺伝子の５’末端からの番号を示している。ＡＤＥ１遺伝子：Ｄ００８５５、ＵＲＡ３遺伝子：Ｄ１２７２０、ＨＩＳ５遺伝子：Ｘ１７３１０である。太枠部位は、染色体ＤＮＡとの相同部位を示している。【０１６９】
（実施例６）組換え株の構築
実施例３において作製したキャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株を用い、実施例２に記載の方法で電気導入用コンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞に、制限酵素ＮｏｔＩとＳｗａＩで処理した０．０５ｍｇの導入用ＤＮＡ−１及び２を電気導入し、アデニン及びヒスチジン含有ＳＤプレートにスプレッドした。出現したコロニーより染色体ＤＮＡを調製し、配列番号２６及び２７で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。破壊されたＨＩＳ５遺伝子に相当する１．９ｋｂｐの遺伝子の他に、導入用ＤＮＡ−１及び２に相当する大きさの遺伝子が増幅するコロニーをＨＩＳ５遺伝子部位に導入された株として選択した。更に、種々のプライマーを用いたＰＣＲにより、これら導入した遺伝子に欠失がないことなどを確認した。
次に、これらの株より、同様に電気導入用コンピテント細胞を調製した。このコンピテント細胞に、制限酵素ＮｏｔＩとＳｗａＩで処理した０．０５ｍｇの導入用ＤＮＡ−３及び４を電気導入し、アデニン含有ＳＤプレートにスプレッドした。出現したコロニーより染色体ＤＮＡを調製し、配列番号２２及び２３で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。破壊されたＵＲＡ３遺伝子に相当する０．７ｋｂｐ及び１．２ｋｂｐの遺伝子の内、どちらかの遺伝子の増幅を認めず、代わりに導入用ＤＮＡ−３及び４に相当する大きさの遺伝子が増幅するコロニーをＵＲＡ３遺伝子部位に導入された株として選択した。更に、種々のプライマーを用いたＰＣＲにより、これら導入した遺伝子に欠失がないこと等を確認した。【０１７０】
キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株に、実施例５で作製したｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２−ｐｈｂＢを形質転換し、ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが２コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが１コピー挿入された株をＡ株とした。キャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株に、導入用ＤＮＡ−１と４を用いて作製した、染色体上にｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが２コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが２コピー挿入された株をＢ株とした。キャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株に、導入用ＤＮＡ−１と３を用いて作製した、染色体上にｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが３コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが１コピー挿入された株をＣ株とした。キャンディダ・マルトーサＡＨＵ−７１株に、導入用ＤＮＡ−２と３を用いて、染色体上にｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが３コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが２コピー挿入された株をＤ株とした。Ｃ株にｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２−ｐｈｂＢを形質転換し、ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが５コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが２コピー導入されたＥ株を作製した。Ｄ株にｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２−ｐｈｂＢを形質転換し、ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが５コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが３コピー導入された株されたＦ株を作製した。導入用ＤＮＡ−２と４を用いて作製した染色体上にｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが２コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが３コピー挿入された株にｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２−ｐｈｂＢを形質転換し、ｐｈａＣａｃ１４９ＮＳ発現カセットが４コピー、ｐｈｂＢ発現カセットが４コピー導入された株されたＧ株を作製した。このＧ株をＣＭ３１３−Ｘ２Ｂと命名し国際寄託（ＦＥＲＭ  ＢＰ−０８６２２）した。同様にコントロールとして、キャンディダ・マルトーサＡＣ１６株にｐＵＴＡ−１を形質転換した株（ｃｏｎｔｒｏｌ−１）、ｐＡＲＲ−１４９ＮＳｘ２を形質転換した株（ｃｏｎｔｒｏｌ−２）も作製した。作製した株の概要を表１に示した。【０１７１】
【表１】
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【０１７２】
（実施例７）組換え株を使用したポリマー生産
ポリマー生産に必要な遺伝子を導入したキャンディダ・マルトーサ組換え株を次のように培養した。培地はＳＤ培地を前培養に、炭素源としてパーム核油を含むＭ２培地を生産培地として使用した。各組換え株のグリセロールストック５００μｌを、５０ｍｌの前培地が入った５００ｍｌ坂口フラスコに接種して、２０時間培養し、３００ｍＬの生産培地を入れた２Ｌ坂口フラスコに１０ｖ／ｖ％接種した。これを培養温度３０℃、振盪速度９０ｒｐｍ、２日間培養という条件で培養した。培養液から、遠心分離によって菌体を回収し、８０ｍｌの蒸留水に懸濁して超高圧ホモジナイザー（ＡＰＶ社製、Ｒａｎｎｉｅ２０００、１５０００Ｐｓｉで１５分間）で破砕した後、遠心分離を行い、得られた沈殿物をメタノールで洗浄した後、凍結乾燥した。得られた乾燥菌体を粉砕し、１ｇを秤量した。これに、クロロホルムを１００ｍｌ添加し、一晩攪拌して抽出した。濾過して菌体を除去し、ろ液をエバポレーターで１０ｍｌにまで濃縮し、濃縮液に約５０ｍｌのヘキサンを添加して、ポリマーを析出させ乾燥させた。得られたポリマーは、ＮＭＲ分析（ＪＥＯＬ、ＪＮＭ−ＥＸ４００）にて組成分析を行った。重量平均分子量の測定は、回収した乾燥ポリマー１０ｍｇを、クロロホルム５ｍｌに溶解したのち、この溶液をＳｈｏｄｅｘ  Ｋ８０５Ｌ（３００ｘ８ｍｍ、２本連結）（昭和電工社製）を装着した島津製作所製ＧＰＣシステムを用いクロロホルムを移動相として分析した。分子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。結果を表２に示した。【０１７３】
【表２】
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【０１７４】
上記結果より、本発明の新規遺伝子破壊酵母、新規変異株を用いることにより、極めて効率的にＰＨＡを生産できることが明らかとなった。また、ポリエステル生合成に関与する遺伝子のいずれかを２コピー以上導入することが、ポリエステルの効率的な生産に極めて重要であること、発現カセットの導入数により分子量や組成が制御可能であることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１７５】
本発明の遺伝子破壊によって作製された複数のマーカーを有する酵母は、遺伝子組換え用宿主として、高効率な遺伝子発現や遺伝子の発現産物の製造に用いることが期待できる。また、本発明により、生分解性かつ優れた物性を有する３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。さらに、遺伝子破壊によるマーカーを付加することも可能であり、より優れた宿主の開発に繋がる。
本発明により、生分解性かつ優れた物性を有する上記一般式（１）で示される３−ヒドロキシアルカン酸を共重合してなる共重合ポリエステルを、酵母において効率的に生産することが可能になった。また、酵母において複数回の遺伝子導入を効率的に行うことが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】実施例において作製した破壊用ＤＮＡの簡単な模式図である。
【図２】新規遺伝子破壊酵母の増殖性を比較した図である。
【図３】実施例４において作製し、用いた遺伝子導入用ＤＮＡ−１〜４の模式図である。
【図４】分子内相同組換えの模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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