(57)【要約】  本開示は、試料中の血小板を同定、分類、および／または定量化するために、生体試料を分析する方法を提供する。本開示はまた、試料中の血小板凝集塊の存在を判定するために、血液試料を分析するシステムおよび方法を提供する。また、開示された方法を実行するように構成されたシステム、および開示された方法のステップを実行するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体も提供される。
2020521950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フローサイトメータにおいて血小板イベントをノイズと区別するための方法であって、
前記フローサイトメータのフローセルを通して血小板を含む試料を流すこと、
前記フローセルを通して流れる前記試料を光学的に調査すること、
調査された前記試料から光信号を検出すること、
検出された信号を、赤血球（ＲＢＣ）イベントに対応する信号とＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号とに分離すること、
ＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号を、推定血小板イベントと推定ノイズとに分離すること、
推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を対数スケールに変換すること、
前記変換された信号を、ガウス混合モデルを使用してフィッティングし、推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成すること、及び、
前記フィッティング分布の位置および幅が血小板イベントの範囲内にある場合、前記推定血小板イベントを血小板イベントとして同定することを含む方法。
【請求項２】
前記同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較し、分布が許容範囲外の場合、ノイズに対して更に高い制約を有するガウス混合モデルでフィッティングすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、全血試料である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記全血試料が、溶解されていない全血試料である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
粒子を光学的に調査することが、レーザを使用して細胞を励起することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
コンピューティングデバイスによって実行されたとき、当該コンピューティングデバイスに以下を実行させる命令を記憶した非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令が、
調査される試料をフローサイトメータのフローセルを通して流し、流れる試料を光学的に調査することにより生成される光信号を検出すること、
検出された信号を、赤血球（ＲＢＣ）イベントに対応する信号とＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号とに分離すること、
ＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号を、推定血小板イベントと推定ノイズとに分離すること、
推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を対数スケールに変換すること、
前記変換された信号を、ガウス混合モデルを使用してフィッティングして、推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成すること、及び、
前記フィッティング分布の位置および幅が血小板イベントの範囲内にある場合に、前記推定血小板イベントを血小板イベントとして同定すること、を実行させる命令である、
非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項９】
前記命令が、前記コンピューティングデバイスに、
前記同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較し、当該分布が許容範囲外の場合に、ノイズに対して更に高い制約を有するガウス混合モデルでフィッティングすることを実行させる命令を含む、請求項８に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１０】
前記信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含む、請求項８から９のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１１】
前記信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１２】
前記試料が、全血試料である、請求項８から１１のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１３】
前記試料が、溶解されていない血液試料である、請求項１２に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項１４】
フローセル、
前記フローセルに光学的に結合された光学粒子調査システム、及び、
請求項８から１３のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体を備えるフローサイトメータ。
【請求項１５】
血小板凝集塊を含む試料を同定する方法であって、
試料を、細胞透過性蛍光色素および赤血球溶解剤を含む試薬とともに、赤血球を溶解して核を含む細胞を蛍光染色するのに十分な時間インキュベートすること、
前記フローサイトメータのフローセルを通して前記試料を流すこと、
前記フローセルを通して流れる前記試料を光学的に調査すること、
調査された前記試料から光信号を検出すること、
閾値を下回る蛍光信号に関連するイベントを同定することであって、当該同定されたイベントが、白血球（ＷＢＣ）からの蛍光信号を下回る蛍光信号を有すること、及び、
前記同定されたイベントのサイズを決定することであって、血小板よりも大きいサイズを有するイベントの存在が、前記試料が血小板凝集塊を含むことを示すこと、を含む方法。
【請求項１６】
血小板のサイズよりも大きいサイズの前記同定されたイベントを選択すること、
前記選択されたイベントに線をフィッティングすること、
前記線をＷＢＣに関連する信号に拡張すること、及び、
前記線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記信号が、蛍光（ＦＬ）、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記信号が、蛍光（ＦＬ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、全血試料である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
粒子を光学的に調査することが、レーザを使用して細胞を励起することを含む、請求項１５から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
コンピューティングデバイスによって実行されるとき、当該コンピューティングデバイスに以下を生じさせる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記命令が、
調査された試料から光信号を検出することであって、前記光信号が、フローサイトメータのフローセルを通して前記試料を流し、流れる試料を光学的に調査することにより生成される光信号であり、前記試料が、細胞透過性蛍光色素および赤血球溶解剤を含む試薬とともに、赤血球を溶解して核を含む細胞を蛍光染色するのに十分な時間インキュベートされた試料であること、
閾値を下回る蛍光信号に関連するイベントを同定することであって、当該同定されたイベントが、白血球（ＷＢＣ）からの蛍光信号を下回る蛍光信号を有すること、及び、
前記同定されたイベントのサイズを決定することであって、血小板よりも大きいサイズを有するイベントの存在が、前記試料が血小板凝集塊を含むことを示すことである、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２２】
前記命令が、前記コンピューティングデバイスに、
血小板のサイズよりも大きいサイズの前記同定されたイベントを選択すること、
前記選択されたイベントに線をフィッティングすること、
前記線をＷＢＣに関連付けられた信号に拡張すること、及び、
前記線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類すること、を実行させる命令を含む、請求項２１に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２３】
前記信号が、蛍光（ＦＬ）、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含む、請求項２１または２２に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２４】
前記信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含む、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項２５】
フローセル、
前記フローセルに光学的に結合された光学粒子調査システム、及び、
請求項２１から２４のいずれか一項に記載の非一時的コンピュータ可読媒体を備えるフローサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／５１１，２３７号の利益を主張し、その出願は全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
序文
本開示は、血液学的システムおよび方法に関する。より具体的には、本開示は、血液試料などの生体試料中の血小板の検出に関する。本開示はまた、血液試料などの生体試料中の血小板凝集塊の検出に関する。
【０００３】
血小板（トロンボサイト：ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅ）とも呼ばれる血小板（プレートレット：ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）は、核のない小さな無色の円盤状の細胞片であり、血液中に多く見られ、凝固に関与している。非活性化血小板は、直径２〜３μｍのレンズ状の両凸円盤状構造であり、血液中の最小の細胞である。
【０００４】
血小板濃度の低下は血小板減少症であり、産生の低下または破壊の増加に起因する。血小板濃度の上昇は血小板増加症であり、先天性である、（サイトカインに対し）反応性である、または無秩序な産生、すなわち骨髄増殖性新生物または特定の他の骨髄性新生物の１つに起因する。血小板機能の障害は、血小板病症と呼ばれる。
【０００５】
多くの場合、血小板の検出は分析装置のノイズによって制限される。ノイズは、光源（レーザ出力の変動など）、増幅電子機器、またはその他の源によって発生し得る。本明細書に開示される方法は、血小板をノイズから分離する。
【０００６】
血小板凝集塊は、血液試料中に存在し得るが、多くの場合、採取した試料中に形成し得、細胞数の計測を妨害し得る。本明細書に開示される方法は、試料中の血小板凝集塊の存在を特定する。
【発明の概要】
【０００７】
本開示の態様は、フローサイトメータにおいて血小板イベントをノイズと区別するための方法を含む。この方法は、フローサイトメータのフローセルを通して血小板を含む試料を流すこと、フローセルを通して流れる試料を光学的に調査(interrogate)すること、調査された試料から光信号を検出すること、検出された信号を赤血球（ＲＢＣ）イベントおよびＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号に分離すること、ＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号を推定血小板イベントおよび推定ノイズに分離すること、推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を対数スケールに変換すること、変換された信号をガウス混合モデルを使用してフィッティングし推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成すること、及び、フィッティング分布の位置および幅が血小板イベントの範囲内にある場合に推定血小板イベントを血小板イベントとして同定することを含む。
【０００８】
他の態様において、方法は、同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較し、分布が許容範囲外の場合、ノイズに対するより高い制約を有するガウス混合モデルをフィッティングすることを含む
【０００９】
いくつかの態様において、変換された信号を、ガウス混合モデルを使用してフィッティングすることは、期待値最大化アルゴリズムを使用することを含み得る。例えば、推定血小板イベントと推定ノイズの対数（ｌｏｇ）をヒストグラムとしてプロットし、ガウス混合モデリングを使用してモデル化することができる。
【００１０】
いくつかの態様において、コンピュータ実装データ分析システムが、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを実行して、推定ＰＬＴイベントおよび推定ノイズの対数（ｌｏｇ）データのガウス混合モデル（ＧＭＭ）を作成してもよい。いくつかの態様において、ＧＭＭのソリューションを改善するために、ＥＭアルゴリズムを繰り返し実行してもよい。
【００１１】
いくつかの態様において、コンピュータ実装データ分析システムは、推定ＰＬＴイベントおよび推定ノイズ、ならびに推定ＷＢＣおよびＲＢＣイベントの対数（ｌｏｇ）データのガウス混合モデル（ＧＭＭ）を作成するために、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを実行し得る。そのような場合、ＧＭＭを使用して、ＷＢＣおよびＲＢＣよりも小さいイベントをフィッティングし得る。
【００１２】
他の態様において、この方法は、調査された試料からの信号の検出が、１００記録／秒、１０００記録／秒、１０，０００記録／秒、または１００，０００記録／秒の頻度で実行されることを含む。
【００１３】
他の態様において、この方法は、信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）のうちの１つ以上を含む場合もある。
【００１４】
他の態様において、この方法は、信号が中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含む場合もある。
【００１５】
いくつかの態様において、試料は、全血試料である。いくつかの態様において、試料は、無傷のＲＢＣを含む溶解されていない全血試料である。いくつかの態様において、試料は、核酸に結合しＲＢＣを含む細胞透過性蛍光色素で染色された全血試料である。他の態様において、試料は、核酸に結合し、無傷のＲＢＣを除去するために溶解される細胞透過性蛍光色素で染色された全血試料である。他の態様において、試料は、ＲＢＣ溶解試薬とともにインキュベートされており、核酸に結合する細胞透過性蛍光色素で染色されていない。
【００１６】
他の態様において、この方法は、粒子を光学的に調査することが、レーザを使用して細胞を励起することを含む場合もある。
【００１７】
他の態様において、本明細書に開示されるようなフローサイトメータにおいて血小板イベントをノイズと区別するための方法を実行するシステムが提供される。特定の態様において、システムは、フローサイトメータを備えてもよい。
【００１８】
本開示の態様は、本明細書で提供されるように、コンピューティングデバイス(computing device)によって実行されるとき、コンピューティングデバイスに、フローサイトメータにおける血小板イベントをノイズと区別するステップを実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含む。
【００１９】
本開示の態様は、試料が血小板凝集塊を含むものと同定するための方法を含む。この方法は、試料を、蛍光色素および赤血球溶解剤を含む試薬とともり、赤血球を溶解して核を含む細胞を蛍光染色するのに十分な時間インキュベートすること、フローサイトメータのフローセルを通して試料を流すこと、フローセルを通して流れる試料を光学的に調査すること、調査された試料から光信号を検出すること、
閾値を下回る蛍光信号に関連するイベントを同定することであって、当該同定されたイベントは白血球（ＷＢＣ）からの蛍光信号を下回る蛍光信号を有すること、及び、同定されたイベントのサイズを決定することであって、血小板よりも大きいサイズを有するイベントの存在が、当該試料が血小板凝集塊を含むことを示すこと、を含んでもよい。
【００２０】
他の態様において、この方法は、血小板のサイズよりも大きいサイズの同定されたイベントを選択すること、選択されたイベントに線(line)をフィッティングすること、線をＷＢＣに関連する信号に拡張すること、及び、線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類することを含む。再分類は、ＷＢＣイベントから血小板凝集塊イベントを除去して、正しいＷＢＣ数を提供する。
【００２１】
他の態様において、この方法は、信号が、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、軸方向光損失（ＡＬＬ）、または蛍光（ＦＬ）の１つ以上を含む場合もある。
【００２２】
他の態様において、この方法は、信号がＦＬおよびＰＳＳを含む場合もある。
【００２３】
いくつかの態様において、試料は全血試料である。他の態様において、試料は核酸に結合する蛍光色素で染色されている。他の態様において、試料はＲＢＣ溶解試薬とともにインキュベートされている。
【００２４】
他の態様において、この方法は、粒子を光学的に調査することが、レーザを使用して細胞を励起することを含む場合もある。
【００２５】
他の態様において、本明細書に開示されるような血小板凝集塊を含むものとして試料を同定する方法を実行するためのシステムが提供される。ある特定の態様において、システムは、フローサイトメータを備えてもよい。
【００２６】
本開示の態様は、コンピューティングデバイスによって実行されるとき、本明細書で提供されるように、コンピューティングデバイスに、試料が血小板凝集塊を含むと同定するためのステップを実行させる命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】血小板を血液分析器で検出されたノイズ信号と区別する例示的な方法を示す。
【図２】血液分析器で分析された試料中の血小板（ＰＬＴ）凝集塊の存在を検出するための例示的な方法を示す。
【図３】最初の試料について血液分析器から検出されたＰＳＳおよびＩＡＳ信号から得られた対数偏光側方散乱（ｌｏｇＰＳＳ）および対数中間角散乱３（ｌｏｇＩＡＳ３）のプロットを示す。
【図４】図３に示すノイズおよび血小板関連データのヒストグラムを示す。
【図５】２番目の試料について血液分析器から検出されたＰＳＳおよびＩＡＳ信号から得られた、対数偏光側方散乱（ｌｏｇＰＳＳ）および対数中間角散乱３（ｌｏｇＩＡＳ３）のプロットを示す。
【図６】図５に示すノイズおよび血小板関連データのヒストグラムを示す。
【図７Ａ】フローサイトメータで記録したＰＳＳ（Ｘ軸）およびＦＬ（Ｙ軸）のプロットを示す。ＦＬ信号がＷＢＣの信号より低いイベントは、「＋」で示されている。
【図７Ｂ】同定されたＰＬＴ凝集塊にフィッティングされた線をＷＢＣの信号に拡張することによる、追加のＰＬＴ凝集塊の分類を示す。
【図８Ａ】フローサイトメータで記録されたＰＳＳ（Ｘ軸）およびＦＬ（Ｙ軸）のプロットを示す。ＦＬ信号がＷＢＣの信号より低いイベントは、「＋」で示されている。
【図８Ｂ】同定されたＰＬＴ凝集塊にフィッティングされた３Ｄ線をＷＢＣの信号に拡張することによる、追加のＰＬＴ凝集塊の分類を示す。
【００２８】
定義
「評価」という用語には、あらゆる形式の測定が含まれ、要素が存在するかどうかの判断も含まれる。「決定する」、「測定する」、「判断する」、「評価する」および「分析する」は互換的に使用され、定量的および定性的決定を含む。評価は、相対的または絶対的であってもよい。
【００２９】
「体液」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、個体または個体集団から得られ、診断、モニタリングまたはスクリーニングアッセイで使用され得るさまざまな種類の試料を包含する「生体試料」に由来する液体を指す。この定義には、血液および生物学的起源の他の液体試料が包含される。また、この定義には、個々の試料の混合もしくはプール、試薬による処理、可溶化、または有核細胞、非有核細胞、病原体などの特定の成分の濃縮など、調達後に何らかの方法で操作された試料も含まれる。
【００３０】
「生体試料」という用語は、臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、および組織試料も含む。「生体試料」という用語は、尿、唾液、脳脊髄液、間質液、眼液、滑液、全血、血漿および血清などの血液画分などを含む。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「イベント」という用語は、例えばＩＡＳ検出器などの少なくとも１つの検出器をトリガするのに十分な信号を生成する粒子を意味し、それにより少なくとも１つの検出器は、分析器、例えばＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、およびＤＳＳにおいて有効化された検出器のすべてにおけるその粒子の測定値を収集するように分析器に信号を送る。粒子は、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、赤血球片、血小板（ＰＬＴ）、脂質、および血小板（ＰＬＴ）凝集塊を含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「希釈剤」、「シース」、および「希釈剤／シース」などの用語および語句は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）Ｓａｐｐｈｉｒｅ（商標）、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）Ｒｕｂｙ（商標）、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）３０００シリーズ、およびＣＥＬＬ−ＤＹＮ（登録商標）４０００シリーズの血液分析器での使用に適した種類のシース希釈剤を意味し、このシース希釈剤は、カリフォルニア州サンタクララのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」という用語は、生細胞核の高分子染色体構成要素であるデオキシリボ核酸を意味する。本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸を意味する。
【００３４】
詳細な説明
本開示は、方法を含む。また、開示された方法を実行するように構成されたシステム、および開示された方法のステップを実行するための命令を記憶するコンピュータ可読媒体も提供される。
【００３５】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、したがって、当然のことながら変更され得ることを理解されたい。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲のみによって限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのものであり、限定的であることは意図されないこともまた理解されたい。
【００３６】
値の範囲が提供される場合、文脈上明確に指示されていない限り、下限の単位の１０分の１まで、それぞれの介在値は、その範囲の上限と下限との間であり、その記載された範囲内の記載された他の値または介在値は、本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限および下限は、独立して、より小さい範囲に含めてもよく、また本発明に包含され、記載された範囲内で特に除外されたいかなる制限も受ける。記載された範囲が一方または両方の制限を含む場合、それらの含まれる制限のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００３７】
ある特定の範囲は、数値の前に用語「約」が付された状態で本明細書に提示される。「約」という用語は、それが先行する正確な数字、およびその用語が先行する数字に近接または近似する数字に逐語的支持を提供するために本明細書において使用される。数が特定の列挙された数に近接しているか近似しているかを決定するにあたり、近接または近似の列挙されていない数は、それが提示されている文脈において、具体的に列挙された数と実質的に等価であることを示す数であり得る。
【００３８】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料はまた、本発明の実施または試験においても使用することができるが、代表的で例示的な方法および材料をここで説明する。
【００３９】
本明細書に引用されるすべての刊行物および特許は、それぞれ個々の刊行物または特許が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用される関連する方法および／または材料を開示かつ記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであり、本発明が先行発明のためにその刊行物に先行する権限を有しないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提示された公開日は実際の公開日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上他に明確に指示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。特許請求の範囲は任意の要素を排除するように作成されてもよいことにさらに留意されたい。このように、この記述は、特許請求の要素の列挙に関連して「専ら」、「唯一の」などのような排他的な用語の使用または「否定的な」制限の使用のための先行基準としての役割を果たすことを意図している。
【００４１】
本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に説明され例証される個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、または組み合わせられ得る個別の要素および特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序で、または論理的に可能な他の順序で実施することができる。
【００４２】
方法
血小板イベントをノイズと区別するための方法
本開示は、フローサイトメータにおいて血小板イベントをノイズと区別するための方法を含む。本方法は、ノイズによって隠されている可能性のある血小板（ＰＬＴ）集団を明らかにするのに有用であり、したがって従来技術の方法よりも正確なＰＬＴ数を提供する。
【００４３】
ＰＬＴイベントをノイズと区別するための方法の態様は、フローサイトメータのフローセルを通して血小板を含む試料を流すこと、フローセルを通して流れる試料を光学的に調査すること、調査された試料から光信号を検出すること、検出された信号を、赤血球（ＲＢＣ）イベントおよびＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号に分離すること、ＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号を推定血小板イベントおよび推定ノイズに分離すること、推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を対数スケールに変換すること、変換された信号をガウス混合モデルを使用してフィッティングし推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成すること、及び、フィッティング分布の位置および幅が血小板イベントの範囲内にある場合に推定血小板イベントを血小板イベントとして同定することを含む。
【００４４】
本方法は、従来の方法よりも低い閾値を使用することを含み、このより低い閾値は、ノイズも含み得るＰＬＴデータの包含を可能にする。次いで、本方法は、ノイズにより隠されていたこれらのＰＬＴを検出するために、ノイズからＰＬＴデータを解析する。いくつかの態様において、検出された信号は、１センチリットルのサイズ閾値を超える信号である。対照的に、従来技術の方法はより高い閾値を有し、これはノイズを減少させると同時にＰＬＴ数も誤って減少させる。
【００４５】
ＰＬＴイベントをノイズと区別するための本方法は、ＲＢＣに対応する信号を、ＲＢＣより小さいイベントに対応する信号から分離する第１の閾値を含んでもよく、このより小さいイベントは、血小板だけでなく、細胞片、破片、およびノイズを含む。
【００４６】
ＲＢＣより小さいイベントに対応する信号は、さらなる閾値、すなわち第１の閾値よりも低い第２の閾値に供される。第２の閾値は、ノイズに対応し得るいくつかの信号も含まれるように設定される。このより低い閾値は、より高い閾値が使用された場合に破棄された可能性のある、より小さいＰＬＴからのより弱い信号を含めることを可能にする。いくつかの実施形態において、第２の閾値は、１センチリットル未満のサイズを有するイベントまたはノイズに対応するデータを選別するように設定されてもよい。いくつかの場合には、６μｍ以上の最大直径を有するイベントに対応するデータがより小さなイベントから分離されるように、第１の閾値を設定してもよい。６μｍ未満の最大直径を有するイベントのデータは、１μｍ未満の最大直径を有するイベントのデータを１μｍ〜６μｍ未満の最大直径を有するイベントから分離する第２の閾値に供されてもよい。次いで、１μｍ〜６μｍ未満の最大直径を有するイベントに対応するこのデータを分析して、これらのイベントのＰＬＴを同定し、それらをノイズと区別してもよい。
【００４７】
ＰＬＴをノイズと同定して区別するステップは、推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を、対数スケールに変換することを含み得る。
【００４８】
本方法は、少なくとも１００イベント／秒、例えば少なくとも１０００−２５０，０００イベント／秒、１０，０００−２５０，０００イベント／秒、１０，０００−２５０，０００イベント／秒、１００，０００−２５０，０００イベント／秒など、例えば１００，０００イベント／秒または２５０，０００イベント／秒の速度で収集された信号に対して実行されてもよい。
【００４９】
ある特定の態様において、収集された生データは、対数（ｌｏｇ）スケールに変換され得る。変換は、アナログデータをデジタルデータに変換するステップを含んでもよい。アナログデータからデジタルデータへの変換は、第１の閾値を適用する前、第２の閾値を適用する前、または第２の閾値を適用した後に実行されてもよい。いくつかの場合では、対数（ｌｏｇ）データを生成するためのアナログデータからデジタルデータへの変換は、第１の閾値が適用され、ＲＢＣイベントより小さいイベントがＲＢＣイベントから分離された後、および明らかなノイズ信号である信号（例えば、１センチリットル未満のサイズを有する粒子に対応する信号）を分離する第２の閾値を適用する前に実行されてもよい。
【００５０】
本方法は、ガウス混合モデルを変換されたデータに適用して、推定ＰＬＴイベントをノイズから分離することをさらに含んでもよい。ある特定の場合では、方法は、変換された信号をガウス混合モデルを使用してフィッティングし、推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成することを含み得る。ある特定の実施形態において、推定ＰＬＴイベントのフィッティング分布の位置および幅がＰＬＴイベントの範囲内にある場合、推定ＰＬＴイベントは血小板として同定される。
【００５１】
ある特定の場合において、本方法は、同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較することを含んでもよく、分布が許容範囲外の場合、変換された日付は別の方法でフィッティングされ得る。例えば、変換されたデータは、ノイズに対するより高い制約を有するガウス混合モデルを使用してフィッティングされ、続いてＰＬＴイベントおよびノイズが同定されてもよい。
【００５２】
ある特定の場合では、フローサイトメータによって検出され、本方法によって分析される信号は、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含み得る。他の場合では、フローサイトメータによって検出され、本方法によって分析される信号は、中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含み得る。
【００５３】
ある特定の場合では、本方法は、全血試料中のＷＢＣ、ＲＢＣ、および血小板を検出および列挙することにより、完全な血液分析を実行する方法と併せて実行されてもよい。全血試料は、溶解および染色されていなくてもよい（例えば、核酸に結合する細胞透過性蛍光色素で染色されていない）。
【００５４】
図１は、血液試料中のＰＬＴの同定に関与する例示的なプロセスを示している。第１のステップとして、生データが収集され、大小のイベントのデータに分離される。大きいベントは最終的にＲＢＣ（またはＷＢＣ）として分類され、小さいイベントはＰＬＴおよびノイズの両方を表す。明らかにノイズであるデータ（例えば、１センチリットル未満の粒子サイズに対応するデータ）を省くために、閾値が適用される。データの残りは対数（ｌｏｇ）に変換される。いくつかの場合では、ＩＡＳ３チャネルを使用してイベントピークが対数（ｌｏｇ）に転換され、小さいイベント（すなわちＷＢＣおよびＲＢＣより小さいイベント）にＧＭＭ（ガウス混合モデリング）を使用してフィッティングされる。次に、フィッティングＰＬＴおよびノイズ分布の位置および幅が分析され、これらが許容範囲内にあるかどうかが決定される。モデルがフィットする場合、小さいイベントはＰＬＴおよびノイズに分離される。モデルがフィットしない場合、より大きいイベント（例えば、ＷＢＣおよびＲＢＣより小さく、３センチリットル、２センチリットル、または１センチリットルより大きい）に限定されたＧＭＭが適用され、ＰＬＴおよびノイズが分類される。本明細書に記載されるように、このプロセスは、全血試料の完全な血球数の決定と併せて実行されてもよく、したがってＲＢＣの溶解を伴わなくてもよい。ある特定の場合では、本方法は、血液試料中の細胞の核を蛍光色素で染色することを含まなくてもよい。
【００５５】
血小板凝集塊を検出する方法
場合によっては、分析のために試料が血小板計数機器（例えば血液分析器）に送られる前に、試験試料中に血小板凝集塊が形成し得る。その結果、得られる血小板（ＰＬＴ）数は人為的に低くなる可能性がある。さらに、ＰＬＴ凝集塊は、ＷＢＣとして計数され得る。本開示の態様は、血小板凝集塊を含むものとして試料を同定するための方法を含む。本方法は、ＰＬＴ凝集塊から信号を差し引いた後、補正されたＷＢＣ濃度を提供することをさらに含んでもよい。ある特定の態様において、ＰＬＴ凝集塊の数がＰＬＴ凝集塊の許容数の閾値よりも高い場合、試料にフラグを立て、試料について得られた細胞数を無視してもよい。システムは、失敗した試験を使用者にさらに中継してもよい。
【００５６】
ある特定の実施形態において、血小板凝集塊を含むものとして試料を同定する方法は、赤血球を溶解し、核を含む細胞を蛍光染色するのに十分な時間、細胞透過性蛍光色素および赤血球溶解剤を含む試薬と試料をインキュベートすることと、フローサイトメータのフローセルを通して試料を流すことと、フローセルを通って流れる試料を光学的に調査することと、調査された試料から光信号を検出することと、閾値を下回る蛍光信号に関連するイベントを同定することであって、同定されたイベントは、白血球（ＷＢＣ）からの蛍光信号を下回る蛍光信号を有する、同定することと、同定されたイベントのサイズを決定することであって、血小板よりも大きいサイズを有するイベントの存在は、試料が血小板凝集塊を含むことを示す、決定することとを含んでもよい。
【００５７】
ある特定の場合では、サイズの閾値は、８μｍを超える最大直径を有し、ＷＢＣの閾値よりも小さいＦＬ信号を有する粒子がＰＬＴ凝集塊として同定され得るように設定されてもよい。
【００５８】
ある特定の態様では、本方法は、血小板のサイズよりも大きいサイズの同定されたイベントを選択することと、選択されたイベントに線をフィッティングすることと、線をＷＢＣに関連する信号に拡張することと、線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類することとをさらに含んでもよい。ＷＢＣをＰＬＴ凝集塊に再分類すると、ＷＢＣ数が補正される。
【００５９】
ある特定の態様において、ＰＬＴ凝集塊の数は閾値より高くなり得る。そのような場合、試料には許容され得るよりも多くのＰＬＴ凝集塊が含まれているとしてフラグが立てられてもよく、この方法は、この試料に対して決定された細胞数を破棄することを含んでもよい。
【００６０】
ある特定の態様において、ＰＬＴ凝集塊を同定する方法は、３次元（３Ｄ）線を使用して凝集塊を分類することを含んでもよい。例えば、選択されたイベントに線をフィッティングする代わりに、ＷＢＣのＦＬ信号の閾値を下回るＦＬ信号を有するイベントに３Ｄ線がフィッティングされてもよい。ＰＬＴ数の５％超がＰＬＴ凝集塊である場合、３Ｄ線フィッティングが使用され得る。換言すれば、線フィッティングを使用して同定されたＰＬＴ凝集塊の数が血液試料中のＰＬＴの数の５％を超える場合、ＷＢＣを同定するための閾値よりも低い閾値を有するイベントが３Ｄ線を使用してフィッティングされ、３Ｄ線をＷＢＣに関連する信号に拡張し、線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類することにより、この方法が繰り返される。ＷＢＣをＰＬＴ凝集塊に再分類すると、ＷＢＣ数が補正される。
【００６１】
ある特定の場合では、ＰＬＴ凝集塊を同定するために分析される信号は、蛍光（ＦＬ）、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上であってもよい。いくつかの態様において、ＰＬＴ凝集塊を同定するために分析される信号は、蛍光（ＦＬ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）であってもよい。
【００６２】
いくつかの態様において、試料は、細胞透過性であり、核酸に結合する蛍光色素で染色されてもよい。そのような蛍光色素を使用すると、通常のＲＢＣおよび血小板の標識化ではなくＷＢＣの標識化が保証される。いくつかの場合では、試料を溶解してＲＢＣを除去してもよい。
【００６３】
図２は、血液試料中のＰＬＴ凝集塊の同定および分類に関与する例示的なプロセスを示している。第１のステップとして、低い蛍光性（すなわち、ＷＢＣなどの有核血球に設定された閾値未満）を有する粒子を選択するためにデータが分析される。これらの粒子は、非ＦＬ粒子として示される。ＰＬＴ凝集塊は低い蛍光性を有するが、ＷＢＣと同様のサイズを有する。線がＰＬＴ凝集塊にフィッティングされ、線は蛍光（ＦＬ）粒子に拡張されて、線の近くの粒子の数が決定される。線の近くに粒子がほとんどない場合、これらは（ＷＢＣではなく）ＰＬＴ凝集塊として再分類される。線の近くに多数の粒子が存在することは、３Ｄ線のフィットがより正確になることを示し、３Ｄ線が上記で定義された低い蛍光性を有する粒子にフィッティングされる。フィッティングされた３Ｄ線はＦＬ粒子まで拡張され、線付近の粒子の数が決定され、これらは（ＷＢＣではなく）ＰＬＴ凝集塊として再分類される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「トリガ」という用語は、信号の測定値が有効と見なされるために超えなければならない信号の最小値を意味する。トリガ値を超える信号値を提供するイベントが分析される。トリガ値より低い信号値を提供するイベントは、データ分析に含まれない。検出の各チャネルには、０〜５０００のスケールまたは０〜６０００のスケールが使用されます。スケール上の各値は、信号の強度のグラデーションを表し、０の値が最低の強度であり、５０００（または６０００）の値が最高の強度である。本明細書で説明されるように、ＰＬＴをノイズと区別する方法において、より低い信号が検出器をトリガするようにトリガを設定してもよく、これによってより多くのノイズを検出しながらＰＬＴからの信号を検出することが保証される。
【００６５】
いくつかの態様において、本明細書で開示される方法で血液分析のために収集され得る生データは、時間タグおよびその他の関連情報とともに、少なくとも５つの次元の情報、すなわちＡＬＬ、ＩＡＳ、ＰＳＳ、ＤＳＳ、およびＦＬ１を有するイベントを含み得る。いくつかの態様において、これらの種類の生データのうちの２つまたは３つのみが、本明細書で開示される方法で使用され得る。例えば、ＰＬＴをノイズと区別する方法において、ＰＳＳおよびＡＬＬに対応する生データが使用され得る。ＰＬＴ凝集塊を同定する方法など、他の態様において、ＦＬおよびＰＳＳならびにＦＬおよびＡＬＬが使用され得る。
【００６６】
検体が取得され得る対象は、人間対象、哺乳類対象（例えば霊長類（類人猿、ゴリラ、サル、ヒヒ、オランウータンなど）、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ラクダ、ブタなど）、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラットなど）などを含むがこれらに限定されない。検体は、例えば希釈、溶解など評価前に処理され得る生体液試料および生体試料（例えば血液学的試料、例えば血液試料）、例えば米国特許第９，０１１，７７３号および同第９，０２８，７７８号に記載されているものを含んでもよく、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６７】
ＷＢＣは、その核内に比較的高濃度のＤＮＡを含む。適切に設計されている場合、蛍光色素を使用して、ＷＢＣの異なる亜集団を区別し、ＷＢＣを非有核細胞と区別することができる。例えば、リンパ球および好塩基球は、同様の光散乱特性を有するにもかかわらず、異なる蛍光特性を有する。さらに、成熟ＲＢＣは、ＤＮＡを含まない。したがって、蛍光色素を選択して、血球集団を区別することができる。色素の目的は、生細胞に容易に浸透し、ＤＮＡに高い親和性で結合し、色素が適切な光源で励起されたときに適切なストークスシフトで強い蛍光を発することである。色素を適切に励起し、最適な結果を得るために、可視帯域における色素のピーク吸収は、光源の波長に実質的に一致する（光源の波長の５０ｎｍ以内、より好ましくは光源の波長の２５ｎｍ以内）。
【００６８】
選択される蛍光色素は、１）核酸に結合することができる、２）ＷＢＣおよび有核赤血球（ｎＲＢＣ）の細胞膜を透過することができる、３）光源に曝露されたときに選択された波長で励起され得る、４）光源による励起時に蛍光を発する、ならびに５）生体安定性があり、液体に可溶であるような蛍光色素である。色素は、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲ１１、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎシリーズ色素、ヨウ化ヘキシジウム、ＳＹＴＯ１１、ＳＹＴＯ１２、ＳＹＴＯ１３、ＳＹＴＯ１４、ＳＹＴＯ１６、ＳＹＴＯ２１、ＳＹＴＯ  ＲＮＡ  Ｓｅｌｅｃｔ、ＳＹＴＯ２４、ＳＹＴＯ２５およびそれらの任意の同等物からなる群から選択され得る。色素は、ＷＢＣおよびｎＲＢＣを標識化し、血液分析器において構成された蛍光トリガに基づいて未溶解のＲＢＣならびにＲＢＣおよび血小板の断片を「スクリーニング」し、またＷＢＣの亜集団を区別するために使用される。色素は、典型的には、約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。さまざまな色素が利用可能であるが、選択された色素は、一般に、血液分析器の励起源と組み合わされているため、単一の排他的な色素を使用して、同定、定量化、および／または分析が意図されるｎＲＢＣおよびすべてのＷＢＣ亜集団が染色され、その蛍光発光が励起される。したがって、単一の（すなわち排他的な）色素を使用して、ＷＢＣの亜集団を一度に同定、定量化、および分析することができる。
【００６９】
一実施形態において、蛍光色素は、マイクロリットル当たり最大１，０００×１０３個の細胞の染色および活性化を行うのに十分な量で、１）少なくとも１種の界面活性剤、２）少なくとも１種の緩衝剤、３）少なくとも１種の塩、および／または４）少なくとも抗菌剤の組み合わせとともに試薬中に提供される。「ＴＲＩＴＯＮ」Ｘ−１００またはサポニンなどの少なくとも１種の界面活性剤は、ＲＢＣの膜を破壊し、ＲＢＣの断片のサイズを小さくするために使用される。少なくとも１種の界面活性剤は、典型的には約０．００１％〜約５％の濃度で存在する。「ＴＲＩＡＤＩＮＥ」または「ＰＲＯＣＬＩＮ」ファミリーのものなどの少なくとも１種の抗菌剤は、微生物による試薬の汚染を防止するために使用される。少なくとも１種の抗菌剤の濃度は、必要な保存期間の間試薬を保存するのに十分である。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）などの少なくとも１種の緩衝剤は、反応混合物のｐＨを調整して、ＲＢＣの溶解を制御し、ＷＢＣを保存するために使用される。少なくとも１種の緩衝剤は、典型的には、約０．０１％〜約３％の濃度で存在する。ｐＨは、典型的には約３〜約１２の範囲である。ＮａＣｌまたはＮａ２ＳＯ４などの少なくとも１種の塩は、浸透圧を調整して、溶解の効果を高める、および／またはＷＢＣの保存を最適化するために使用される。少なくとも１種の塩は、約０．０１％〜約３％の濃度で存在してもよい。ある特定の場合では、少なくとも１種の緩衝剤が少なくとも１種の塩として機能することができ、または少なくとも１種の塩が少なくとも１種の緩衝剤として機能することができる。
【００７０】
一般に、より低い浸透圧、または低張性が、ＲＢＣの溶解を促進するために使用される。浸透圧は通常、約２０〜約２５０ｍＯｓｍの範囲である。ＲＢＣの溶解は、血液試料および試薬を約１体積部の試料対約３５体積部の試薬の比率で混合した後、比較的短時間（例えば約２５秒未満、約１７秒未満、または更に約９秒未満）にわたって室温より高い温度（例えば約３０℃〜約５０℃の間、約４０℃など）で生じるようにすることができる。
【００７１】
分析のための散乱および蛍光データは、一般に、上述のように複数の光学チャネルおよび少なくとも１つの蛍光チャネルで収集される。
【００７２】
ある特定の態様において、蛍光（ＦＬ）トリガが使用されてもよい。ＦＬトリガは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，０９１，６２５号に詳細に記載されている。
【００７３】
したがって、本明細書に提示されるシステムおよび方法の態様は、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団を収集および分析するために蛍光トリガを使用する。一実施形態において、血小板（ＰＬＴ）凝集塊の検出の前に、ＲＢＣからの信号とＷＢＣ（および存在する場合はｎＲＢＣ）からの信号との間に蛍光トリガが設定される。次いで、収集された光学情報および蛍光情報は、ＷＢＣおよびＷＢＣ亜集団をＰＬＣ凝集塊と見分ける（または区別する）ために使用され得る。例えば、二次元サイトグラムを使用して、粒子を同定および見分けることができる。本明細書で述べるように、いくつかの態様において、血小板とノイズとの間の重複について分析されるデータについて、ＦＬトリガをより低く設定してもよい。他の場合では、血小板とノイズとの間の重複を分析するための方法において、蛍光信号は使用されず、したがってＦＬトリガは使用されなくてもよい。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「蛍光情報」という表現は、血液分析器の蛍光チャネルから収集されたデータを意味する。本明細書で使用される場合、「蛍光チャネル」という表現は、試料から放出される蛍光の量を測定するために適切な波長帯域に設定された光電子増倍管などの検出デバイスを意味する。
【００７５】
本明細書に記載の方法は、例えば血液などの液体中の白血球分画、赤芽球、赤血球、ならびに血小板およびＰＬＴ凝集塊の同時分析のための自動化された方法を含み得る。例えば、脳脊髄液、腹水、胸膜液、腹膜液、心膜液、滑液、透析液、およびドレナージ液などの他の生体液を使用して、これらの液体のさまざまなパラメータを決定することができる。
【００７６】
システム
本開示は、フローサイトメータで血小板イベントをノイズと区別するためのシステムを含む。本開示のシステムは、フローサイトメータで血小板イベントをノイズと区別するための方法を実行するように構成されたコンポーネントを含む。
【００７７】
本開示はまた、血小板凝集塊を含むものとして試料を同定し、ＰＬＴ凝集塊の検出数に基づいてＷＢＣ数を任意選択で補正し、および／またはＰＬＴ凝集塊の数が正確な細胞分析を妨げる場合、試料にフラグを立てるためのシステムを含む。
【００７８】
ある特定の実施形態において、システムは、フローセルを含むフローサイトメータ、フローセルに光学的に結合された光学粒子調査システム、および本明細書でさらに説明される非一時的コンピュータ可読媒体を含んでもよい。そのようなシステムは、本明細書に記載の方法のステップの１つ以上を実行するように構成された回路を含んでもよい。
【００７９】
本システムのコンポーネントは、単一のデバイスに組み立てられてもよく、または２つ以上のデバイスに分離されたコンポーネントのシステムとして組み立てられてもよい。いくつかの場合では、機能を実行するデバイス、システム、またはそのコンポーネントは、試料を処理する血液分析器の外部にあってもよいがその近くにあってもよい（すなわち、同じ作業面の、もしくはその上の、または同じ部屋もしくは建物内などの外部筐体に取り付けられてもい）。他の例では、機能を実行するデバイス、システムまたはそのコンポーネントは、検体を処理するおよび／またはデータを取得する血液分析器の内部（すなわちその中、内側、または中に収容されている）に配置されてもよい。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「データ処理ユニット」とは、それに必要な機能を実行するハードウェアおよび／またはソフトウェアの組み合わせを意味する。例えば、本明細書における任意のデータ処理ユニットは、例えば電子制御装置、メインフレーム、サーバーまたはパーソナルコンピュータ（デスクトップもしくはポータブル）などの形態で利用可能なプログラム可能なデジタルマイクロプロセッサであってもよい。データ処理ユニットがプログラム可能である場合、適切なプログラミングが遠隔地からデータ処理ユニットに伝達されてもよい、またはコンピュータプログラム製品（ポータブルもしくは固定コンピュータ可読記憶媒体など、磁気、光学、もしくはソリッドステートデバイスベースであるかを問わない）に事前に保存されてもよい。
【００８１】
本明細書で開示される方法を実行するためのデバイスおよびシステム内で、実質的に任意の回路が機能的な配置に構成され得る。例えば特別に構成されたコンピュータを含むそのような回路のハードウェアアーキテクチャは、当業者に周知であり、１つ以上のプロセッサ（ＣＰＵ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、内部または外部のデータ記憶媒体（ハードディスクドライブなど）を含むハードウェアコンポーネントを含み得る。そのような回路はまた、グラフィック情報を処理して表示手段に出力するための１以上のグラフィックボードを含み得る。上記のコンポーネントは、回路内、例えば特定用途コンピュータ内のバスを介して適切に相互接続され得る。回路は、モニタ、キーボード、マウス、ネットワークなどの汎用外部コンポーネントと通信するための適切なインターフェースをさらに備えてもよい。いくつかの実施形態において、回路は、本発明の方法およびプログラムの処理能力を高めるために、並列処理が可能であってもよく、または並列もしくは分散コンピューティング用に構成されたネットワークの一部であってもよい。いくつかの実施形態において、記憶媒体から読み出されたプログラムコードは、回路に挿入された拡張ボード、または回路に接続された拡張ユニットに設けられたメモリに書き込み可能であり、拡張ボードまたは拡張ユニットに設けられたＣＰＵなどは、説明された機能を達成するために、プログラミングの命令に従って実際に操作の一部またはすべてを実行し得る。
【００８２】
本開示のシステムは、情報が後日コンピュータによってアクセス可能および検索可能になるように情報を記憶することができる「メモリ」をさらに含んでもよい。記憶された情報へのアクセスに使用される手段に基づいて、任意の便利なデータ記憶構造が選択され得る。ある特定の態様において、情報は、「永久メモリ」（すなわち、コンピュータまたはプロセッサへの電力供給の終了によって消去されないメモリ）または「非永久メモリ」に記憶されてもよい。コンピュータハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、フロッピーディスク、ポータブルフラッシュドライブおよびＤＶＤはすべて、永久メモリの例である。ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）は、非永久メモリの例である。永久メモリ内のファイルは、編集および再書き込み可能である。
【００８３】
本開示のデバイスおよびシステムのコンポーネントに加えて、例えば上述したように、本開示のシステムは、データ出力デバイス、例えばモニタおよび／またはスピーカ、データ入力デバイス、例えばインターフェースポート、キーボードなど、流体ハンドリングコンポーネント、スライドハンドリングコンポーネント、電源などのいくつかの追加のコンポーネントを含んでもよい。
【００８４】
血液分析器のフローセルを通って流れる試料からの信号を検出するための血液分析器は、血液分析（フローサイトメトリーを含む）に適した装置の照明および検出光学系を含んでもよい。
【００８５】
一実施形態において、血液試料分析は、蛍光情報によって任意選択的に強化された多重角度偏光散乱分離技術（ＭＡＰＳＳ）を用いて行われる。少なくとも１つのフォトダイオード、または少なくとも１つの光電子増倍管、または少なくとも１つのフォトダイオードおよび少なくとも１つの光電子増倍管の両方を使用して、フローセルを通過する各血球によって散乱される光を検出する。約０°散乱（例えば０°〜１°）を測定する軸方向光損失（ＡＬＬ）信号、および低角度（例えば約３°〜約１５°）散乱を測定する中間角散乱（ＩＡＳ）信号を測定するために、２つ以上のフォトダイオードが使用される。９０°偏光側方散乱（ＰＳＳ）信号および９０°偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）信号を検出するために、２つ以上の光電子増倍管が使用される。光源の波長の選択に応じて、追加の光電子増倍管が適切な波長範囲内の蛍光（ＦＬ１）測定に使用される。したがって、システムで捕捉された各イベントは、ＡＬＬ、ＩＡＳ（１つ以上のチャネル、２つまたは３つのチャネルなど）、ＰＳＳ、ＤＳＳ、および蛍光（１つ以上のチャネル、２つのチャネルなど）などの複数の次元の情報を示す。これらの検出チャネルからの情報は、血球のさらなる分析に使用される。ある特定の態様において、血液分析に適した装置の照明および検出光学系は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０９１，６２５号の図１に示されるコンポーネントを含んでもよい。米国特許第９，０９１，６２５号の図１を参照すると、装置１０は、光源１２、ビーム曲げ用のフロントミラー１４およびリアミラー１６、第１のシリンドリカルレンズ２０および第２のシリンドリカルレンズ２２を含むビームエキスパンダモジュール１８、集束レンズ２４、微細ビーム調整器２６、フローセル２８、前方散乱レンズ３０、ブルズアイ検出器３２、第１の光電子増倍管３４、第２の光電子増倍管３６、ならびに第３の光電子増倍管３８を備える。
【００８６】
光源は、レーザであってもよい。代替の実施形態において、約３５０ｎｍ〜約７００ｎｍの間の波長の光を放出するレーザが選択され、例えば、一実施形態において、約４８８ｎｍで光を放出するレーザが使用される。光源１２は、カリフォルニア州サンタクララのＣｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．から市販されている垂直偏光空冷式コヒーレントキューブレーザであってもよい。３５０ｎｍ〜７００ｎｍの範囲の波長を有するレーザが使用され得る。レーザの動作条件は、「ＣＥＬＬ−ＤＹＮ」自動血液分析器で現在使用されているレーザの動作条件と実質的に同様である。しかしながら、他の光源、例えばランプ（例えば水銀、キセノン）なども同様に使用され得る。
【００８７】
フローセル、レンズ、集束レンズ、微細ビーム調整機構、およびレーザ集束レンズに関する追加の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，６３１，１６５号、特にカラム４１、３２行目からカラム４３、１１行目に見出すことができる。米国特許第５，６３１，１６５号の図１に示される前方光路システムは、球面平凸レンズ３０と、レンズの後焦点面に配置された２素子フォトダイオード検出器３２とを含む。この構成では、２素子フォトダイオード検出器３２内のそれぞれの点は、フローセル２８を通って移動する細胞からの光の特定の収集角度にマッピングされる。検出器３２は、軸方向光損失（ＡＬＬ）および中間角前方散乱（ＩＡＳ）を検出することができるブルズアイ検出器であってもよい。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３の１２〜５２行目にこの検出器のさまざまな代替を記載している。
【００８８】
第１の光電子増倍管３４（ＰＭＴ１）は、偏光解消側方散乱（ＤＳＳ）を測定する。第２の光電子増倍管３６（ＰＭＴ２）は偏光側方散乱（ＰＳＳ）を測定し、第３の光電子増倍管３８（ＰＭＴ３）は、選択された蛍光色素および使用される光源に応じて、約３６０ｎｍ〜約７５０ｎｍの蛍光発光を測定する。一実施形態において、ＰＭＴ３は、約４４０ｎｍ〜約６８０ｎｍ、またはより具体的には約５００ｎｍ〜約５５０ｎｍの蛍光発光を測定する。光電子増倍管は、信号の強度を高めるために、広範囲の波長の蛍光信号を収集する。側面散乱および蛍光発光は、二色性ビームスプリッタ４０および４２によってこれらの光電子増倍管に向けられ、効率的な検出を可能にするために必要な波長で効率的に透過および反射する。米国特許第５，６３１，１６５号は、カラム４３、５３行目からカラム４４、４行目までの光電子増倍管に関するさまざまな追加の詳細を記載している。
【００８９】
蛍光を測定する場合、液浸収集システムを使用することにより、光電子増倍管３４、３６、および３８での感度が向上する。液浸収集システムは、屈折率整合層により第１のレンズ３０をフローセル２８に光学的に結合し、広角にわたる光の収集を可能にするシステムである。米国特許第５，６３１，１６５号は、この光学システムのさまざまな追加の詳細を、カラム４４、５〜３１行目に記載している。
【００９０】
光電子増倍管３４、３６、および３８は、側方散乱（入射レーザビームにほぼ垂直な軸を持つ円錐で散乱した光）または蛍光（入射レーザビームの波長とは異なる波長で細胞から放出された光）を検出する。
【００９１】
米国特許第５，６３１，１６５号の選択された部分が上記で参照されているが、米国特許第５，６３１，１６５号は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９２】
コンピュータ可読媒体
本開示は、フローサイトメータで血小板イベントをノイズと区別するための命令を記憶する非一時的コンピュータ可読媒体を含むコンピュータ可読媒体を含む。本開示の態様は、コンピューティングデバイスによって実行されると、コンピューティングデバイスに、フローサイトメータで血小板イベントをノイズと区別するためのステップの１つ以上を実行させる命令を記憶するコンピュータ可読媒体を含む。
【００９３】
ある特定の態様において、非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピューティングデバイスによって実行されると、コンピューティングデバイスに、調査された試料からの光信号を検出することであって、フローサイトメータのフローセルを通して試料を流し、流れる試料を光学的に調査することにより生成される光学信号を検出することと、検出された信号を、赤血球（ＲＢＣ）イベントおよびＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号に分離することと、ＲＢＣイベントより小さいイベントに対応する信号を、推定血小板イベントおよび推定ノイズに分離することと、推定血小板イベントおよび推定ノイズに対応する信号を、対数スケールに変換することと、変換された信号を、ガウス混合モデルを使用してフィッティングし、推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成することと、フィッティング分布の位置および幅が血小板イベントの範囲内にある場合、推定血小板イベントを血小板イベントとして同定することとを実行させる命令を記憶する。
【００９４】
いくつかの例では、命令は、コンピューティングデバイスに、同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較し、分布が許容範囲外の場合、ノイズに対するより高い制約を有するガウス混合モデルをフィッティングすることを実行させる命令を含む。
【００９５】
ある特定の態様において、命令は、収集された生データを対数（ｌｏｇ）スケールに変換するための命令を含む。変換は、アナログデータをデジタルデータに変換するステップを含んでもよい。アナログデータからデジタルデータへの変換は、第１の閾値を適用する前、第２の閾値を適用する前、または第２の閾値を適用した後に実行されてもよい。いくつかの場合では、対数（ｌｏｇ）データを生成するためのアナログデータからデジタルデータへの変換は、第１の閾値が適用され、ＲＢＣイベントより小さいイベントがＲＢＣイベントから分離された後、および明らかなノイズ信号である信号（例えば、１センチリットル未満のサイズを有する粒子に対応する信号）を分離する第２の閾値を適用する前に実行されてもよい。
【００９６】
ある特定の態様において、命令は、ガウス混合モデルを変換されたデータに適用して、推定ＰＬＴイベントをノイズから分離するための命令を含む。ある特定の場合では、命令は、変換された信号を、ガウス混合モデルを使用してフィッティングし、推定血小板イベントおよび推定ノイズのフィッティング分布を生成することを含むための命令を含む。ある特定の実施形態において、推定ＰＬＴイベントのフィッティング分布の位置および幅がＰＬＴイベントの範囲内にある場合、推定ＰＬＴイベントは血小板として同定される。
【００９７】
ある特定の場合には、命令は、同定の前に、推定血小板イベントのフィッティング分布の位置および幅を推定ノイズのフィッティング分布の位置および幅と比較するための命令を含み、分布が許容範囲外の場合、変換された日付は別の方法でフィッティングされ得る。例えば、変換されたデータは、ノイズに対してより高い制約を有するガウス混合モデルを使用してフィッティングされ、続いてＰＬＴイベントおよびノイズが同定されてもよい。
【００９８】
ある特定の場合では、フローサイトメータによって検出され、本方法によって分析される信号は、中間角散乱（ＩＡＳ）、偏光側方散乱（ＰＳＳ）、または軸方向光損失（ＡＬＬ）の１つ以上を含み得る。他の場合では、フローサイトメータによって検出され、本方法によって分析される信号は、中間角散乱（ＩＡＳ）および偏光側方散乱（ＰＳＳ）を含み得る。
【００９９】
いくつかの場合では、本開示のコンピュータ可読媒体は、コンピューティングデバイスに、血小板凝集塊を含むものとして試料を同定し、ＰＬＴ凝集塊の検出数に基づいてＷＢＣ数を任意選択で補正し、および／またはＰＬＴ凝集塊の数が正確な細胞分析を妨げる場合、試料にフラグを立てるためのステップを実行させる命令を記憶する。
【０１００】
いくつかの態様において、非一時的コンピュータ可読媒体は、コンピューティングデバイスによって実行されると、コンピューティングデバイスに、調査された試料からの光信号を検出することであって、光信号は、フローサイトメータのフローセルを通して試料を流し、流れる試料を光学的に調査することにより生成され、試料は、赤血球を溶解し、核を含む細胞を蛍光染色するのに十分な時間、細胞透過性蛍光色素および赤血球溶解剤を含む試薬とインキュベートされる、検出することと、閾値を下回る蛍光信号に関連するイベントを同定することであって、同定されたイベントは、白血球（ＷＢＣ）からの蛍光信号を下回る蛍光信号を有する、同定することと、同定されたイベントのサイズを決定することであって、血小板よりも大きいサイズを有するイベントの存在は、試料が血小板凝集塊を含むことを示す、決定することとを実行させる命令を記憶する
【０１０１】
特定の実施形態では、命令は、コンピューティングデバイスに、血小板のサイズよりも大きいサイズの同定されたイベントを選択することと、選択されたイベントに線をフィッティングすることと、線をＷＢＣに関連付けられた信号に拡張することと、線の近くのＷＢＣを血小板凝集塊として再分類することとを実行させる命令を含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態において、本明細書に記載の方法による命令は、「プログラミング」の形態でコンピュータ可読媒体にコード化することができ、「コンピュータ可読媒体」という用語は、本明細書で使用される場合、実行および／または処理のためにコンピュータに命令および／またはデータを提供することに関与する任意の記憶または伝送媒体を指す。記憶媒体の例は、フロッピーディスク、ハードディスク、光ディスク、光磁気ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、磁気テープ、不揮発性メモリカード、ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ブルーレイディスク、ソリッドステートディスク、およびネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）（そのようなデバイスがコンピュータの内部または外部にあるかどうかを問わない）を含む。情報を含むファイルは、コンピュータ可読媒体に「記憶」され得る、「記憶」とは、後日コンピュータによってアクセス可能および検索可能になるように情報を記録することを意味する。
【０１０３】
本明細書に記載のコンピュータ実装方法は、任意の数のコンピュータプログラミング言語のうちの１つ以上で記述され得るプログラミングを使用して実行され得る。そのような言語は、例えば、Ｊａｖａ（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ）、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐ．、ワシントン州レドモンド）、およびＣ＋＋（ＡＴ＆Ｔ  Ｃｏｒｐ．、ニュージャージー州ベドミンスター）、ならびに多くの他の言語も含む。
【０１０４】
以下の実施例は、限定ではなく例示として提供される。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：血液分析器を使用して血小板をノイズと区別するための方法
血小板は、血液中の最小の細胞であり、その検出は多くの場合分析装置のノイズによって制限される。ノイズは、光源（レーザ出力の１％の変動）、増幅電子機器、またはその他の源によって発生し得る。ここでは、少数のノイズイベント、およびノイズを超えるすべての血小板について光散乱情報を収集した。このデータでは、ＥＭ（期待値最大化）アルゴリズムを使用して、ノイズおよび血小板の最も可能性の高い分布を見つけ出した。このアルゴリズムは、ノイズによって隠された血小板の数を推定できるため、このアルゴリズムにより血小板列挙の精度が改善される。
【０１０６】
フローセル、前方および側方散乱検出器、ならびにノイズの存在下で血液検体中の血小板数を推定するソフトウェアアルゴリズムを備えた血液分析器が使用される。
【０１０７】
血液分析器は、トリガチャネルに低い閾値が設定されている。閾値は非常に低く設定されているため、血小板分布の下端で大きなノイズスパイクが見られる。データはまず対数（ｌｏｇ）変換され、次いでガウス分布をノイズおよび血小板にフィッティングするＥＭアルゴリズムにより分析される。アルゴリズムの出力は、データ収集で捕捉されたイベント全体の血小板の割合である。次いで、血液量、希釈、流速およびデータ収集時間を使用して、血小板イベント数が血液中の血小板濃度に変換される。
【０１０８】
ＰＳＳでトリガされ、ＩＡＳ３およびＰＳＳで対数（ｌｏｇ）変換されて表示されたデータを、図３に示す。図３に見られるように、最初の明らかなノイズは、２本の平行線によって除去される。２つの平行線の間にあるイベントのみがさらに考慮される。
【０１０９】
２本の平行線の間にあるイベントは、ヒストグラムとしてプロットされ、ＥＭアルゴリズムを使用して、最も可能性の高いノイズ（グラフの左側の曲線）および血小板（グラフの右側の曲線）分布が得られる（図４を参照されたい）。
【０１１０】
図４は、ノイズピーク内の血小板の存在を示している。グラフの左側の曲線はノイズに関連し、グラフの右側の曲線は血小板に対応する。ＥＭアルゴリズムは、観測データにフィットする最も可能性の高いノイズおよび血小板分布を見つけ出す。この場合の最終結果は、フィルタリングされたイベントの２５．５％がノイズであり、フィルタリングされたイベントの７４．５％が血小板である。これらの数値を用いて、総血小板イベント数および血小板の血中濃度を容易に導出することができる。
【０１１１】
図５および図６は、図３および図４よりも低い血小板濃度を有する試料において、血小板をノイズと区別するための別の例を示している。図５は、最も明白なノイズを除去するための２本の平行線の使用を示す。２本の平行線の間にあるイベントは、ヒストグラムとしてプロットされ、ＥＭアルゴリズムを使用して、最も可能性の高いノイズ（グラフの左側の曲線）および血小板（グラフの右側の曲線）分布が得られる（図６を参照されたい）。
【０１１２】
図６に見られるように、グラフの左側の曲線はノイズ分布であり、グラフの右側の曲線は血小板分布である。血小板数のほぼ半分が、ノイズピークの下に隠れている。しかしながら、ＥＭアルゴリズムは、この測定における血小板イベントの良好な推定値を提供する。この場合の最終結果は、フィルタリングされたイベントの７２％がノイズであり、フィルタリングされたイベントの２８％が血小板である。
【０１１３】
したがって、より低い閾値を使用すると、ノイズが同定されてフィルタリングにより除去された後、閾値を下回る血小板を計数することができる。
【０１１４】
実施例２：血液分析器を使用してＰＬＴ凝集塊を分類するための方法
図７Ａは、フローサイトメータから記録されたＰＳＳ（Ｘ軸）およびＦＬ（Ｙ軸）のプロットを示す。ＷＢＣの信号よりも低いＦＬ信号を有するイベントは、ＰＬＴ凝集塊として選択され、「＋」で示される。図７Ｂは、図７Ａにおける同定されたＰＬＴ凝集塊にフィッティングされた線をＷＢＣの信号に拡張することによる、追加のＰＬＴ凝集塊の分類を示す。ＰＬＴ凝集塊として再分類されたＷＢＣは、「＋」で表される。
【０１１５】
図８Ａは、フローサイトメータから記録されたＰＳＳ（Ｘ軸）およびＦＬ（Ｙ軸）のプロットを示す。ＷＢＣの信号よりも低いＦＬ信号を有するイベントは、ＰＬＴ凝集塊として選択され、「＋」で示される。図８Ｂは、同定されたＰＬＴ凝集塊にフィッティングされた３Ｄ線をＷＢＣの信号に拡張することによる、追加のＰＬＴ凝集塊の分類を示す。ＰＬＴ凝集塊として再分類されたＷＢＣは、「＋」で示される。
【０１１６】
上記の発明は、理解を明確にするために、例示および実施例によってある程度詳細に記載されているが、本発明の教示に照らして当業者には、特定の変更および修正が、添付の特許請求の主旨または範囲から逸脱することなく、本発明に対し実施され得ることは容易に明らかである。
【０１１７】
したがって、上記の説明は単に本発明の原理を例示するに過ぎない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または図示していないが、本発明の原理を具現化し、その主旨および範囲内に含まれるさまざまな構成を考案できることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されたすべての例および条件的文言は、主として本発明の原理および発明者らにより当該技術の促進のために寄与された概念を理解する上で読者を助けることを意図しており、このような具体的に列挙された例および条件への限定ではないと解釈されるべきである。また、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにその具体的な例を列挙する本明細書におけるすべての記述は、その構造的および機能的等価物の両方を包含することを意図している。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および将来開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいかなる開発要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲は、本明細書に図示および記載の例示的な実施形態に限定されることを意図していない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具現化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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