(57)【要約】  【解決手段】  液体中化合物を検出および定量化するキャピラリー液体クロマトグラフィーにおいて、紫外線発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いた吸光検出を行うシステムおよび方法。この簡略化されたシステムでは、安定した紫外線光源を使用することによりビームスプリッタおよび基準セルの必要性が排除され、また電力必要量が低減される。その結果、比較的低検出限界であるとともに携帯可能で実質的により小型システムが提供される。  【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャピラリー分離技法使用後のオンカラム検出のための蛍光検出器と吸光検出器とを有する統合システムであって、
紫外線を生成する発光ダイオード（ＬＥＤ）と、
前記発光ダイオードからの紫外線を集光する第１のレンズと、
前記紫外線を第１の方向に反射するダイクロイックミラーと、
前記第１の方向に紫外線を集光する第２のレンズと、
前記紫外線を受け取ってオンカラム検出を可能にするキャピラリーカラムと、
前記キャピラリーカラムを通過した紫外線を受け取って吸光検出を行う吸光検出器と、
を有し、
前記ダイクロイックミラーはまた、前記キャピラリーカラム内の１若しくはそれ以上の化合物からの蛍光により発光された光を通過させるものであり、当該蛍光は、前記第１の方向とは反対の第２の方向に移動するものであり、
前記システムは、さらに、
前記蛍光を前記第２の方向に集光させる第３のレンズと、
前記蛍光を受け取って蛍光検出を行う蛍光検出器と
を有する、システム。
【請求項２】
請求項１記載のシステムにおいて、さらに、
前記第１のレンズと前記ダイクロイックミラーとの間に配置され、前記紫外線をフィルタ処理する励起フィルタを有するものである、システム。
【請求項３】
請求項１記載のシステムにおいて、さらに、前記第２のレンズから受け取った紫外線を前記第１の方向に向かって通過させる少なくとも１つのスリットを有し、このスリットは迷光が前記キャピラリーカラムへ入射することを減少させるために配置されているものである、システム。
【請求項４】
請求項３記載のシステムにおいて、さらに、
前記ダイクロイックミラーと前記第３のレンズとの間に配置され、前記蛍光をフィルタ処理する発光フィルタを有するものである、システム。
【請求項５】
請求項４記載のシステムにおいて、さらに、前記第３のレンズから受け取った蛍光を前記第２の方向に向かって通過させる少なくとも１つのスリットまたはピンホールを有し、このスリットまたはピンホールは迷光の通過を減少させるために配置されているものである、システム。
【請求項６】
請求項５記載のシステムにおいて、前記吸光検出器は、さらに、前記キャピラリーカラム内に配置された少なくとも１つの化合物による紫外線の吸光度を当該検出器が受け取った紫外線を分析することによって分析するシステムを有するものである、システム。
【請求項７】
請求項６記載のシステムにおいて、前記吸光検出器は、さらに、
前記キャピラリーカラムから紫外線を受け取るフォトダイオードと、
前記フォトダイオードから電流を受け取って電圧値に変換する演算増幅器と、
前記演算増幅器から前記電圧値を受け取ってデジタル値に変換するアナログ−デジタル変換器と
を有するものである、システム。
【請求項８】
キャピラリー分離技法使用後にオンカラム検出を行うための検出システムにおいて、蛍光検出および吸光検出を統合させる方法であって、
発光ダイオード（ＬＥＤ）と、前記発光ダイオードから紫外線を受け取って集光する第１のレンズと、前記紫外線を第１の方向に反射するダイクロイックミラーと、前記第１の方向に紫外線を集光する第２のレンズと、前記第２のレンズから受け取った紫外線を前記第１の方向に向かって通過させる少なくとも１つのスリットと、前記紫外線を受け取とるキャピラリーカラムと、前記キャピラリーカラムを通過した紫外線を受け取って吸光検出を行う吸光検出器とを提供する工程と、
前記キャピラリーカラム内の１若しくはそれ以上の化合物からの蛍光により発光された光を通過させる前記ダイクロイックミラーであって、当該蛍光は、前記第１の方向とは反対の第２の方向に移動するものである、前記ダイクロイックミラーと、前記蛍光を前記第２の方向に集光させる第３のレンズと、前記蛍光を受け取って蛍光検出を行う蛍光検出器とを提供する工程と、
前記発光ダイオードから紫外線を生成する工程と、
前記吸光検出器を使用して前記キャピラリーカラムを通過する紫外線を測定する工程と、
前記キャピラリーカラム内に配置された少なくとも１つの化合物による紫外線の吸光度を前記吸光検出器が受け取った紫外線を分析することによって分析する工程と、
前記キャピラリーカラムからの前記蛍光を前記ダイクロイックミラーを通って通過させる工程と、
前記キャピラリーカラム内の前記少なくとも１つの化合物からの前記蛍光を測定する工程と、
前記キャピラリーカラム内に配置された前記少なくとも１つの化合物による蛍光の吸光度を前記蛍光検出器が受け取った蛍光を分析することによって分析する工程と、
を有する、方法。
【請求項９】
請求項８記載の方法において、さらに、
前記第１のレンズと前記ダイクロイックミラーとの間に励起フィルタを配置する工程と、
前記第１のレンズから伝搬された紫外線をフィルタ処理する工程と
を有する、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、さらに、
前記第２のレンズから受け取った紫外線を前記第１の方向に向かって通過させる少なくとも１つのスリットを提供する工程と、
迷光が前記キャピラリーカラムへ入射することを減少させる工程と
を有する、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、さらに、
前記ダイクロイックミラーと前記第３のレンズとの間に発光フィルタを配置する工程と、
前記ダイクロイックミラーから伝搬された前記蛍光をフィルタ処理する工程と
を有する、方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、さらに、
前記第３のレンズから受け取った蛍光を前記第２の方向に向かって通過させる少なくとも１つのスリットまたはピンホールを提供する工程と、
前記スリットまたは前記ピンホールを通過する迷光を減少させる工程と
を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、さらに、
前記キャピラリーカラム内に配置された前記少なくとも１つの化合物による紫外線の吸光度を前記吸光検出器が受け取った紫外線を分析することによって分析するシステムを提供する工程を有する、方法。
【請求項１４】
請求項８記載の方法において、さらに、
前記吸光検出器が受け取った紫外線量を少なくとも二桁増加させる工程を有する、方法。
【請求項１５】
請求項８記載の方法において、さらに、
前記発光ダイオードによって生成された紫外線の波長を選択する工程と、
前記発光ダイオードによって生成された紫外線の波長と一致する励起フィルタを選択して前記キャピラリーカラムに到達する迷光を減少させる工程と
を有する、方法。
【請求項１６】
請求項８記載の方法において、さらに、
前記第２のレンズからの紫外線の焦点が前記キャピラリーカラムの内径（ＩＤ）以下となるように前記第２のレンズを前記ダイクロイックミラーに対して位置決めする工程を有する、方法。
【請求項１７】
請求項６記載の方法において、さらに、
前記吸光検出器にフォトダイオードを提供する工程と、
前記フォトダイオードから電流を受け取って電圧値に変換する演算増幅器を提供する工程と、
前記演算増幅器から前記電圧値を受け取るアナログ−デジタル変換器を提供する工程と、
前記キャピラリーカラムから前記紫外線を前記フォトダイオードにおいて受け取る工程と、
前記演算増幅器を使用して前記紫外線を電圧値に変換する工程と、
前記電圧値をデジタル値に変換する工程と
を有する、方法。
【請求項１８】
請求項１０記載の方法において、さらに、直流電源を使用して前記発光ダイオード、前記吸光検出器、および前記蛍光検出器に電力を供給することにより、前記検出システムを携帯可能とする工程を有する、方法。
【請求項１９】
キャピラリー分離技法使用後のオンカラム検出のための蛍光検出器と吸光検出器とを有する統合システムであって、
紫外線を生成する発光ダイオード（ＬＥＤ）と、
前記紫外線を方向付けて集光させる、レンズ系、ミラー、およびスリットと、
前記紫外線を受け取ってオンカラム検出を可能にするキャピラリーカラムと、
前記キャピラリーカラムを通過した紫外線を受け取って吸光検出を行う吸光検出器と、
を有し、
前記ダイクロイックミラーはまた、前記キャピラリーカラム内の１若しくはそれ以上の化合物からの蛍光により発光された光を通過させるものであり、当該蛍光は、前記第１の方向とは反対の第２の方向に移動するものであり、
前記システムは、さらに、
前記蛍光を前記第２の方向に方向付けて集光させる第３のレンズおよびスリットと、
前記蛍光を受け取って蛍光検出を行う蛍光検出器と
を有する、システム。
【請求項２０】
キャピラリー分離技法使用後にオンカラム検出を行うための検出システムにおいて、蛍光検出および吸光検出を統合させる方法であって、
紫外線を第１の方向に方向付けるための、発光ダイオード（ＬＥＤ）、レンズ系、ダイクロイックミラー、およびスリットと、前記紫外線を受け取とるキャピラリーカラムと、前記キャピラリーカラムを通過した紫外線を受け取って吸光検出を行う吸光検出器とを提供する工程と、
前記キャピラリーカラム内の１若しくはそれ以上の化合物からの蛍光により発光された光を通過させる前記ダイクロイックミラーであって、当該蛍光は、前記第１の方向とは反対の第２の方向に移動するものである、前記ダイクロイックミラーを提供する工程と、
前記蛍光を前記第２の方向に方向付けて集光させる第３のレンズおよびスリットと、前記蛍光を受け取って蛍光検出を行う蛍光検出器とを提供する工程と、
前記発光ダイオードから紫外線を生成する工程と、
前記吸光検出器を使用して前記キャピラリーカラムを通過する紫外線を測定する工程と、
前記キャピラリーカラム内に配置された少なくとも１つの化合物による紫外線の吸光度を前記吸光検出器が受け取った紫外線を分析することによって分析する工程と、
前記キャピラリーカラムからの前記蛍光を前記ダイクロイックミラーを通って通過させる工程と、
前記キャピラリーカラム内の前記少なくとも１つの化合物からの前記蛍光を測定する工程と、
前記キャピラリーカラム内に配置された前記少なくとも１つの化合物による蛍光の吸光度を前記蛍光検出器が受け取った蛍光を分析することによって分析する工程と、
を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連技術の記載
混合化合物を分離する種々の技術は、チャネルまたはチューブ（カラムと呼ばれる）を通って移動する化合物の動向に依存しており、化合物はカラムの末端で一連のバンドとして現れる。分離カラムから現れるバンド中の化合物の検出および同定は、分離技法を成功させる上で重要な工程である。
【０００２】
効果的な検出スキームは、分離カラムで既に生じている分離を劣化させてはならない。特にキャピラリーサイズのカラムの場合に見られる不具合であるが、分離カラムにフローセルまたは他の付属部品を加えることにより分離が劣化するのが一般的である。したがって、分離カラム上の直接の検出がより望ましい方法である。
【０００３】
濃縮相における検出で効果的に使用されている２つの分光技術は、吸光光度分析法（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ）と蛍光分光分析法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）である。吸光光度分析法の利点は、ほとんど全ての分子が吸収を行うという事実に基づいており、したがって、この方法はほとんど全ての化合物に応答するほぼ汎用の検出器であると言える。
【０００４】
吸光検出器が提供する情報は１若しくはそれ以上の波長の光における吸収の大きさである。しかし、吸光検出器の欠点は特異性の欠如および感度が比較的乏しいことにある。
【０００５】
対照的に、蛍光分光分析法は、蛍光量子収率が化合物群によって様々に変化し、蛍光を発光しない化合物もあるので、吸光光度分析法よりも汎用性に乏しい。量子収率の大きい化合物に関しては、蛍光分光分析法は極めて感度が高く、単一の分子を検出することも可能である。
【０００６】
蛍光検出器が提供する情報は、分光光度検出器が提供する情報とは異なっている。蛍光の波長は分子構造に依存しており、信号の大きさは量子効率および濃度に依存している。
【０００７】
２つの検出モードは異なる情報を提供するので、この２つを組み合わせることにより、分子を同定するための特異性が大幅に追加されることになる。蛍光分光分析法と吸光光度分析法とを組み合わせる効果は、過去に研究者達によって認識され活用されている。二重モード検出器が１９７５年に記載され、異なるアプローチ方法が１９９９年に報告されている。しかし、斯かる検出器は、両方共、大型の放電灯を使用し、分離の終わりに追加物を必要としている。さらに、特にキャピラリーカラムを用いた分離法においては、いずれもオンカラム検出に適していない。
【０００８】
先行技術の液体クロマトグラフィ（ＬＣ）を斯かる両方のタイプの検出器を含むように改良してもよい。したがって、ＬＣ吸光システムを調査し、２つの検出器を含むようにシステムを改良する方法を決定するのも有益かもしれない。
【０００９】
液体クロマトグラフィ（ＬＣ）は、液体中の化学物質の内容を分析するのに使用される。図１は、本発明の一部として機能を改善可能な先行技術システムの主要素子を示す図である。
【００１０】
最初に、オンカラム検出とは、充填流動媒体がカラムの終点以前で終了する（したがって、カラムの最後の部分は実際には空である）場合を意味することは理解されるべきである。しかし、カラムの終点まで充填流動媒体が入っており、キャピラリー部分での検出を行うため、キャピラリーが追加されなければならない場合も存在する。
【００１１】
したがって、本発明の実施形態は、全実施形態内に、両方の構成、すなわち検出は充填流動媒体を含まないカラム領域内のオンカラムで生じる構成と、充填流動媒体が終了するカラムの末端に追加されたキャピラリー内で生じる構成とを含むものと考えられるべきである。
【００１２】
図１は、キャピラリー液体クロマトグラフィと共に使用される低検出限界の、ＬＥＤを用いた紫外線吸光検出器を示す。このシステムにおいて、ＬＥＤ出力波長は駆動電流および接合部温度の変化に合わせて変化させてもよい。したがって、ＬＥＤは一定の電流供給によって駆動されるべきであり、システムの加熱は回避されるべきである。
【００１３】
ＬＥＤ源の準単色光は斯かるシステムの迷光の原因となり、検出器の非線形をもたらす。検出器はいずれも、システム内にフィルタを用いることにより、望ましい吸光バンド外にあるＬＥＤ光から保護されてもよい。
【００１４】
オンカラムキャピラリー検出は、追加カラムバンド分散を排除することにより狭いピーク幅が得られ、ピーク分解能が維持されるので、キャピラリーカラムにとっては好ましいかもしれない。検出器の短期ノイズは検出限界を決定するであろうが、一般的に、統合や平滑を行うことにより、および／またはローパスＲＣフィルタを使用することによりそれを減少させてもよい。
【００１５】
図１は、検出器設計およびノイズレベルの削減のさらなる最適化が、小径のキャピラリーカラムの検出限界を改善するであろうことを示している。図１のシステムの素子は、紫外線ベースＬＥＤ４０、第１の球状レンズ４２、ＬＥＤ４０光源に同調させることができるバンドパスフィルタ４６、第２の球状レンズ４８、レーザーブレードを備えるスリット５０、キャピラリーカラム５２（約１５０μｍの内径（ＩＤ）および約３６５μｍの外径を有してもよい）、およびシリコンフォトダイオード検出器５４を有する。
【００１６】
図４は、発明における素子の原寸を示すものではない。第２の球状レンズ４８からの紫外線は、図示したものよりも鋭角の角度で収束する場合もある。さらに、第２の球状レンズ４８の直径は、キャピラリーカラム５２の内径１０倍より大きくてもよい。したがって、図４は、実物大ではなく、本発明の構成要素の物理的順番を示すものであることを理解されたい。
【００１７】
加えて、第１のおよび第２の球状レンズ４２、４８による紫外線の収束図はいずれも原寸に比例して図示されたものではなく、例示目的のためだけであることも理解されたい。
【００１８】
同じ機能を提供する他の構成要素で置き換えることにより、上記の検出システムの構成要素と同じ機能を提供することも可能である。例えば、図４には第１のおよび第２の球状レンズ４２、４８が示してあるが、異なるタイプのレンズで置き換えてもよく、それも第１の実施形態の範囲内にあると想定されるべきである。単一のレンズを用いて最初の２つの球状レンズの機能を提供し、望ましい集光効果を得ることも可能である。さらに、第１の実施形態の全態様で与えられる値は、第１の実施形態の望ましい機能性から逸脱することなく最高５０％変化させてよいことも理解されるべきである。
【００１９】
図２は図１に示すシステムの断面図であるが、構造面をさらに詳細に示したものである。図２に示されるシステムは限定的に見なされるべきではなく、設計原理を示すものとして考慮されるべきものである。したがって、サイズ、形状、重量、電力、感度、あるいは構成要素に関する他の任意の特徴に付与される特定の値は例示目的のみであり、斯かる値は変えることが可能である。
【００２０】
図２は第１の球状レンズ４２を有するＬＥＤ４０を示している。ＬＥＤ４０はＬＥＤ保持部４４内に配置してもよい。ＬＥＤ４０は第１の球状レンズ４２と一体的に製造してもよいし、あるいは製造後に第１の球状レンズ４２に取り付けたり、それに隣接して配置したりしてもよい。ＬＥＤ４０は、キャピラリーカラム５２内の分析対象の化合物に適した任意の望ましい帯域の紫外線から選択されてもよい。第１の実施形態は２６０ｎｍのＬＥＤ４０を使用するが、紫外線の波長は望みに合わせて変えてもよい。
【００２１】
この設計では、第１の球状レンズ４２を有する商業的に入手可能な２６０ｎｍの紫外線ベースＬＥＤ４０が光源として使用された。ＬＥＤ４０はＬＥＤ保持部４４上に取り付けられた。ＬＥＤ保持部４４はブラックレンズチューブに装着し、補強リングでしっかりと締められた。第１の球状レンズ４２の直径は６ｍｍであってもよいし、その他ＬＥＤ４０からの光を集光させるのに適した任意の大きさであってもよい。
【００２２】
図２は、第１の球状レンズ４２の後に配置されたバンドパスフィルタ４６を含む。バンドパスフィルタ４６は、ＬＥＤ４０および／または周囲の任意の光からやってくる迷光を減少させるのに使用される２６０ｎｍのバンドパスフィルタであってもよい。バンドパスフィルタの値は、ＬＥＤ４０光源用に最適化させるため、必要に応じて調整してよい。
【００２３】
第１の実施形態において、２６０ｎｍのバンドパスフィルタは、ＬＥＤ４０と、ブラック装着チューブ内の第２の球状レンズ４８との間に配置されてもよい。
【００２４】
本設計の別の素子は、バンドパスフィルタ４６の後に配置される第２の球状レンズ４８の使用である。第２の球状レンズ４８の機能は、第１の球状レンズ４２によって集光された紫外線を受け取り、当該紫外線をさらに集光することであってよい。キャピラリーカラム５２に送られる光が内径（ＩＤ）の幅以下になるように紫外線を集光するのが望ましい。確かにそれが好ましいが、第１の実施形態においては、紫外線光源の集光はキャピラリーカラム５２の内径以下でなくてもよい。
【００２５】
本設計において、溶融シリカ球状レンズが第２の球状レンズ４８用に３ｍｍの直径を有していてもよいし、それは３ｍｍの球状レンズディスク上に配置されてもよいし、ＬＥＤの焦点に配置されてもよい。第２の球状レンズマウントは、（ＬＥＤ４０およびバンドパスフィルタ４６を含むブラックレンズチューブ内に装着された）マウントの中心に配置されてよい。
【００２６】
キャピラリーカラム５２を通過し検出器により受け取られた光量が増大しているので、検出器に入射する光の強度は、先行技術のキャピラリーＬＣ設計よりも最高３桁多い強度であることが実験的に確認されている。
【００２７】
検出器５４に達する迷光を減少させるため、第２の球状レンズ４８の後でキャピラリーカラム５２の前に１若しくはそれ以上のスリット５０が配置されている。スリット５０はレーザーブレードあるいは他の任意の適切な装置によって提供される。スリットの幅は約１００μｍであってよい。
【００２８】
バンドパスフィルタ４６およびスリット５０の組み合わせにより、迷光は実験的に３．６％の値まで減少した。これは３０．５％の値まで迷光を減少させて操作される先行技術のシステムと比較すると極めて小さい値である。先行技術の設計は、高波長迷光排除用の特別な紫外線インデックスフォトダイオードを用いている（明らかに余り効果的ではない）か、商業用カラム（内径１ｍｍ）５２の末端に接続された内径２５０μｍのホローキャピラリの前にスリット（幅１００μｍ）を使用している。その結果、キャピラリーカラム５２を通過する光量が減少する。さらに、大きい直径のチューブと小さい直径のチューブとの間の接続によるバンド拡張により検出感度が損なわれる。
【００２９】
キャピラリーカラム５２を通過する紫外線は、紫外線検出器５４に入射するように配置されている。紫外線検出器５４は紫外線に感受性のある任意の装置であってよい。
【００３０】
本設計において、紫外線検出器５４はシリコンフォトダイオードであってもよい。フォトダイオード５４は雄ネジを有するダイオード保持部上に配置されてもよい。ダイオード保持部に装着するためにブラックキャップを構築してもよい。ブラックキャップは、中心にキャピラリーカラム５２を保持するためのＶ字形の溝（中央の穴が光の通過を可能にする）と、穴の反対側にスリットを適所に保持するための溝とを有する。調整可能なスリット（複数も可）５０を製造するのに一対のレーザーブレードが使用されてもよい。スリット５０は、中央の穴の反対側において、キャピラリーカラムの外形を縦にカバーするキャップ内に配置されてもよい。
【００３１】
検出器５４において、フォトダイオードからの電流を受け取りそれを電圧値に変換するのに演算増幅器が使用されてもよい。出力を記録するのに、アナログ−デジタル変換器がコンピュータまたは他の記録装置と共に使用されてもよい。アナログ−デジタル変換器への入力において、ローパスＲＣフィルタが使用されてもよいことは理解されたい。
【００３２】
以下の例は本設計の実験値を示すものであるが、それは本設計の限界性能と考えられるべきではない。データポイントは、１ＫＨｚ〜４２ＫＨｚのサンプリングレートで得られた。斯かるデータポイントは、検出システムのノイズレベルを下げるため、１０Ｈｚレートで平滑化された。斯かる値は限定的なものではなく、本発明の実施形態の原理を示すものと見なされるべきである。データポイントサンプリングレートおよびデータ平滑化レートは、使用される検出システムの結果を最適化するための調整が行われてもよい。
【００３３】
ＬＥＤ４０およびシリコンフォトダイオード検出器５４の操作には、それぞれ６Ｖおよび１２Ｖの直流電力が必要である。検出器５４は０．１３９アンペア電流を必要とし、４アンペア時１２Ｖの直流電池を用いて約２５時間操作可能であるし、ＡＣ／ＤＣアダプタを用いて送電線からも操作可能である。しかし、本設計の検出システムは直流電源を用いて操作できることが理解されるべきであり、したがって、直流電力要求だけでなく、検出システムのサイズが比較的小さい故に当該検出システムは携帯可能なのである。
【００３４】
別段の記載がない限り、斯かる実験においては、６０ｎＬの注入量を有する統合型ストップフローインジェクターが使用された。全ての実験において、内径１５０μｍｘ３６５μｍＯＤテフロン（登録商標）加工のキャピラリーカラム５２が使用された。報告された吸光値は、透過率の値の逆数の常用対数を得ることにより計算された。透過率は、サンプル信号を基準線を記録することにより得られる基準信号で割ることにより計算された。
【００３５】
検出器ノイズは１分間の基準線データ測定により決定した。溶融シリカでできた中空キャピラリーはナノフローポンピングシステムに接続され、水で満たされた。次に基準線が約１分間記録され、ピークツーピーク吸光度が計算された。その結果、ピークツーピーク（ｐ−ｐ）ノイズが得られた。短期ノイズ（ＲＭＳ）は、記録された基準線の標準偏差として計算された。暗ノイズ測定に関しては、ＬＥＤ４０をオフにし、暗ノイズを基準線の標準偏差として計算した。ディジタイザーノイズを決定するには、アナログ−デジタル変換器のプラスおよびマイナス端末を短絡させた。検出器ドリフトは、水を３００ｎＬ／分でキャピラリーを通して流し、基準線を１時間記録し、その後基準線の傾きを測定することにより決定した。
【００３６】
ノイズレベルを下げるためにソフトウェア平滑化を実行した。しかし、平滑化機能はハードウェアでより迅速に実行してもよく、ソフトウェア平滑化の代わりにそれを用いてもよいことは理解されたい。種々の平均化技法が使用可能であるが、第１の実施形態で使用される平均化技法は固定ウィンドウ平均化技法である。限定されるべきではないが、使用可能な他の平滑化技法には、固定幅のスライディングウィンドウの平均化による平滑化、指数型重みつき移動平均を用いた平滑化、および基準線ノイズプロセスを白色化するように構築された因果フィルタまたは非因果フィルタなどが含まれる。
【００３７】
内径１５０μｍのキャピラリーカラム５２およびウラシル５．３５ｐｍｏｌを注入した溶液を用いることにより様々な平滑化率でＳ／Ｎ比を決定し、その後の作業においてその中の最高平滑化率を用いた。短期ノイズに関するＲＣフィルタ（時定数０．５ｓおよび１ｓ）の効果を任意の平滑化を行ってあるいは平滑化を行うことなく調査した。システムの迷光評価には黒色インクを充填したキャピラリーを使用した。迷光レベルは、黒色インク条件で得られた電圧信号を水を充填したキャピラリーカラム５２で得られた電圧信号で除算し、その値に１００を掛けることにより決定した。
【００３８】
紫外線ＬＥＤを用いた吸光検出器５４は、先行技術のＨｇペンレイランプを用いた検出器よりもはるかに小型である。キャピラリーオンカラム検出では吸光値は小さいので、良好な検出限界を得るにはノイズ削減は重要である。明るい光源ＬＥＤ４０により、吸光度を計算するのに使用される光電流をノイズを比例して増加させることなく増加させることができる。検出システムの費用およびサイズを削減するため、複数波長検出器の代わりに単一波長（２６０ｎｍ）検出器が製造された。
【００３９】
ＬＥＤ４０は一体型の溶融シリカ第１の球状レンズ４２（直径６．３５ｍｍ）を有しており、焦点において１．５〜２．０ｍｍの点まで光線を集光させることができるが、それでもキャピラリーカラム５２の寸法（内径０．０７５〜０．２０ｍｍ）にとっては大き過ぎる。したがって、光の集光を改善するため、第２の溶融シリカ球状レンズ４８（直径３ｍｍ）をＬＥＤ４０の焦点に配置した。第１のおよび第２の球状レンズ４２、４８の製造には任意の適切な素材が使用可能である。
【００４０】
ＬＥＤ４０は、＋／−５ｎｍの帯域の光を放射するように選択された。しかし、ＬＥＤはそれよりも高波長の光も放射することが分光計を用いて確認された。光の追加波長は、システムの迷光に重大な影響を及ぼしたであろう。
【００４１】
実験中、ＦＷＩ−ＩＭ２０を有する２６０ｎｍバンドパスフィルタが使用された。図６の重なり合ったスペクトルは、フィルタを有するＬＥＤ４０およびフィルタを有さないそれからの光の出力を示しており、フィルタが高波長の光の排除に成功していることが確認された。ＬＥＤ４０の位置は、キャピラリーカラム５２の中心で最高の集光を得るように最適化された。
【００４２】
検出器５４の機能の一部である本設計の特徴は、検出データの処理を実行することである。第１の実施形態の実験的使用において、検出器５４の短期ＲＭＳノイズは、信号平滑化およびローパスフィルタを使用しない場合に８ｍＶであった。平滑化なしの暗ＲＭＳノイズは６．９５ｍＶであることが計算された。図７に示されるように、ソフトウェア平滑化により、暗ＲＭＳノイズは７４．４μＶまで減少した。暗電圧値は明るい部屋でも暗室でも同じであり、キャピラリーカラム５２は光ガイドとして機能していないことが確認された。ディジタイザーノイズは検出器で検出可能な最低ノイズに重大な影響を及ぼし得る。ディジタイザーＲＭＳおよびｐ−ｐノイズはそれぞれ２．４ｍＶおよび７．７ｍＶであった。図７に示されるようにディジタイザーノイズへのソフトウェア平滑化の効果を調査したが、得られた最低ＲＭＳおよびｐ−ｐノイズレベルはそれぞれ１５μＶおよび９５μＶであった。
【００４３】
Ｓ／Ｎ比へのソフトウェア平滑化の影響も調査され、クロマトグラムのピーク幅の信号強度における平滑化の効果は無視できるほど小さいことが判明したが、ＲＭＳノイズレベルは、フィルタなしで、入射光の強度（低）（５．７μＡＵ）に対応する電圧において、０．１８ｍＶレベルまで減少した。ＲＭＳノイズは、０．５ｓフィルタおよび０．１ｓ当たり４２００データポイントの平滑化において、さらに０．１４ｍＶまで減少した。したがって、ＬＥＤ検出器ＲＭＳノイズは、以前の検出器および他の紫外線ベースＬＥＤ検出器（約１０−５ＡＵ）よりも一桁低かった（約１０−６ＡＵ）。検出器５４ドリフトは極めて小さく（１０−５ＡＵ／時間）、ピーク幅に関しては無視できるほど小さく、通常のクロマトグラムの持続期間では何ら問題を生じないことが分かった。
【００４４】
吸光検出器の直線性は、光源がキャピラリーカラム５４の内径上に不適切に集光された場合、損なわれることがある。検出限界は、検出器５４短期ノイズおよび試験用分析物のモル吸収率に依存する。本実験では、試験用分析物の選択は、モル吸収率および関連性のある以前のＬＥＤ検出器作業結果に基づいて行われた。検出器５４は試験された最高濃度まで線形応答を与え、迷光はシステムにおいて低いことが確認された。線形ダイナミックレンジは全試験用分析物に関して３桁であった。Ｓ／Ｎ比３における検出限界は実験的に２４．６ｎＭ（７．６３ｐｐｂ）、あるいはＳＡＳに関しては１．５ｆｍｏｌであった。検出限界は先行技術のペンレイＨｇランプを用いた検出器よりも５倍低かった。
【００４５】
検出器５４はオンカラム検出用に特別に設計されているので、検出器性能はフェノールを用いてＬＣ条件下に試験され、表２に示されるフロースルー実験と比較された。検出器の直線性は両条件下で極めて良好であり、検出限界は同様であることが分かった。すなわち、実際のＬＣ条件下で使用された場合、検出器の性能は損なわれていなかった。
【００４６】
キャピラリーＬＣは図１に示されるシステムで実行された。したがって、検出システムには、検出器が受け取った紫外線を分析することによりキャピラリーカラム内の液体に含まれる少なくとも１つの化合物における紫外線の吸収を分析するシステムが含まれている。吸収を分析するシステムは検出器の一部であってもよいし、検出器からのデータを受信するために検出システムに接続されたコンピュータシステムであってもよい。
【００４７】
図１のシステムはモノリシックなキャピラリーカラムを用いるオンカラムＬＣ検出を示している。オンカラム検出の使用は追加カラムバンド分散を減少させるので、ピーク形状が改善され、検出感度が向上する。
【００４８】
キャピラリーＬＣシステムにおける良好な集光、少ない迷光、極めて少ないノイズの故に、図１のシステムにおいて、試験化合物の低い検出限界が達成可能である。１５０μｍ経路長を有するキャピラリーフォーマットにおけるＳＡＳの検出限界は、１ｃｍの経路長を有するＬＥＤを用いた検出器よりも３倍低い。ＡＭＰおよびＤＬＴに関しては、同じ経路長を有する検出器と比較してそれぞれ２３０倍および３０倍改善された。さらに、私達の検出器におけるフェノール検出限界も、フロースルー実験下並びに分離条件下において同じであった。したがって、検出器の性能は実際の液体クロマトグラフィにおいて損なわれていなかった。フェノール化合物の再生可能均一溶媒分離も証明された。
【００４９】
検出システムのノイズレベルを減少させるのにソフトウェア平滑化が使用されてもよい。平滑化なしでは、全二乗平均平方根は８ｍＶであった。０．１秒当たり４２００データポイントの平滑化おいてノイズレベルは０．１８ｍＶに減少し、アナログ−デジタル変換器の入力にローパスＲＣフィルタ（時定数２Ｈｚ）を使用した場合、ノイズはさらに０．１４ｍＶ（４．４μＡＵに相当）に低下した。これはキャピラリーを用いた検出器で今まで達成されたノイズレベルのうち最小レベルの１つである。ソフトウェア平滑化なしにＲＣフィルタのみを使用した場合、ノイズレベルは８ｍＶから２．４ｍＶに減少したに過ぎない。すなわち、ローパスフィルタ処理は検出システムから高周波数ノイズを効果的に排除するには明らかに十分ではない。５．３５ｐｍｏｌウラシルピークに関して、Ｓ／Ｎ比は１４から４０８に増大した。ノイズレベルは、先行技術（検出器の中にはローパスフィルタにのみ依存しているのもあった）よりも最高二桁低かった。
【００５０】
最後の記載として、図１のシステムのサイズ、重量、電力要求、および携帯性は、キャピラリーＬＣシステムの複雑でない設計の直接の結果としてもたらされる。典型的な商業用システムは１１ｘ１３ｘ２２ｃｍの寸法を有しており、重量は３．３ポンドであり、通常のＡＣ電線を必要とし、感度は約１ｍＡＵである。対照的に、図１のシステムは約５．２ｘ３ｘ３ｃｍの寸法を有し、重量は０．２ポンドであり、１２ＤＣ電源により動作可能で、１．６８Ｗを使用するに過ぎず、感度は約１０μＡＵである。斯かる値は近似値であり、第１の実施形態の特徴から逸脱することなく最高５０％まで変わり得ることは理解されるべきである。
【００５１】
図３および４は、本発明で使用可能な第２および第３の先行技術システムとして提供される。特に、第２および第３のシステムの全特徴および機能は、第１の球状レンズ４２、フィルタ４６、および第２の球状レンズ４８の順番に違いはあるが、第１のシステムと同じである。図３は、第１の球状レンズ４２を第２の球状レンズ４８に隣接して配置し、フィルタ４６を完全に排除することも可能であることを示している。
【００５２】
紫外線光源がより完全に単色となるならば、フィルタ４６は最終的には不必要になるかもしれない。フィルタ処理は迷光がキャピラリーカラム５４に達するのを防止するために実行される。紫外線源によって生成される迷光がほとんど存在しないならば、フィルタは不要となり、本発明の原理から逸脱することなく、システムから除去されてもよい。
【００５３】
対照的に、図４は、図３において、フィルタ４６をＬＥＤ４０と第１の球状レンズ４２との間に配置し、第２の球状レンズ４８を第１の球状レンズに隣接して配置することが可能であることを示している。換言すれば、フィルタ４６を両方の球状レンズ４２、４８の前、および球状レンズの間に配置するか、あるいはフィルタを完全に排除しても、望ましい集光およびＬＥＤ４０からの紫外線のフィルタ処理を達成することが可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００５４】
本発明は、液体中化合物を検出および定量化するキャピラリー液体クロマトグラフィーにおいて、紫外線発光ダイオード（ＬＥＤ）を用いた吸光検出を行うシステムおよび方法である。この簡略化されたシステムでは、安定した紫外線光源を使用することによりビームスプリッタおよび基準セルの必要性が排除され、また電力必要量が低減される。その結果、比較的低検出限界であるとともに携帯可能で実質的により小型システムが提供される。
【００５５】
当業者にとって、本発明のこれらおよびその他の実施形態は、添付の図面とともに以下の詳細な説明の考察により明らかとなると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、本発明の一部として機能するように変更可能な第１の先行技術システムの第１の図であり、キャピラリー液体クロマトグラフィ（ＬＣ）システムの主要ハードウェア素子を示す。
【図２】図２は、図１のシステムの第２の図であり、キャピラリー液体クロマトグラフィ（ＬＣ）システムの構造の詳細を示す。
【図３】図３は、図１のシステムの変更システムにおける構成要素を示す図である。
【図４】図４は、図１のシステムの別の変更システムにおける構成要素を示す図である。
【図５】図５は、本発明の第１の実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
ここで図面を参照すると、図において本発明の様々な実施形態に参照番号が付与されており、また、実施形態については当業者が本発明を製造し、使用できるように説明する。以下の説明は、本発明の実施形態についての説明であり、後述の特許請求の範囲を狭めるものではないとみなすべきであることを理解されたい。
【００５８】
図５は、本発明の第１の実施形態を示す図である。この第１の実施形態では、蛍光検出および分光光度（吸光）検出が、キャピラリーカラムを用いて分離が行われる、オンカラム検出に適した単一の小型システムに統合される。
【００５９】
このシステムには２つの検出経路がある。第１の検出経路は吸光経路（ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌ）であり、この経路には、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源から吸光検出器に至る、紫外線（ＵＶ）光路における全ての素子が含まれる。吸光経路は先行技術において示した設計に基づいている。しかしながら、吸光経路を変更してシステムに第２の検出経路を追加することが可能である。
【００６０】
第２の検出経路は蛍光経路（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｃｈａｎｎｅｌ）であり、この経路には、発光ダイオード（ＬＥＤ）光源から蛍光検出器に至る紫外線（ＵＶ）光路における全ての素子が含まれる。
【００６１】
ＬＥＤの選択と、ＬＥＤとキャピラリーカラムとの間に配置されたバンドパスフィルタとの組み合わせに応じて選択可能な波長域でのオンカラム吸光度に基づき、キャピラリーカラムにおいて少なくとも１つの化合物が検出される。
【００６２】
先行技術の吸光検出器に対して蛍光経路を追加することにより、従来の二重検出器の設計には存在しなかった独自の特徴が統合される。このような独自の特徴につい特定する前に、２つの検出経路について説明する。
【００６３】
第１の実施形態において先行技術の素子と同じ素子は、上述した先行技術の素子の特徴および特性と同じ特徴および特性を有する。図５におけるシステムの素子は、紫外線（ＵＶ）ベースＬＥＤ６０と、第１の球状レンズ６２と、ＬＥＤ光源と同調させることができる励起（バンドパス）フィルタ６４とを含む。第１の実施形態における新規の特徴は２つの検出経路を提供するうえで必要なものであるが、この新規の特徴とはダイクロイックミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ）６６である。このダイクロイックミラーは、当業者であれば理解するように、ロングパスダイクロイックミラー６６またはダイクロイックビームスプリッタとも呼ばれる。ダイクロイックミラー６６により、第１の実施形態において二重検出経路を同時に動作させることが可能となる。
【００６４】
ダイクロイックミラー６６は、紫外線ベースＬＥＤ６０からの全紫外線を、当該ＬＥＤ光源６０から伝搬される光路に対して略直角な第１の方向に実質的に反射する。吸光経路の光路は点線６８によって示されている。
【００６５】
紫外線はダイクロイックミラーで第２のレンズ７０の方向に反射する。第２のレンズ７０は、紫外線を集光させる目的で凸レンズであってもよい。
【００６６】
第２のレンズ７０の後方には、レーザーブレードを備えるスリット７２、約１５０μｍの内径（ＩＤ）および約３６５μｍの外径を有するキャピラリーカラム７４、およびシリコンフォトダイオード検出器７６が配置される。以上、本システムにおける吸光経路の全素子を説明した。
【００６７】
蛍光経路は、同一の紫外線ベースＬＥＤ６０、第１の球状レンズ６２、およびＬＥＤ光源と同調させることができる励起フィルタ６４を用いて開始される。また、紫外線が第１の方向に伝搬し、第２のレンズ７０およびスリット７２を通過してキャピラリーカラム７４に入射するようにダイクロイックミラー６６が使用される。
【００６８】
但し、キャピラリーカラム７４に入射した時点で光路は分岐する。キャピラリーカラム７２内の１若しくはそれ以上の化合物は蛍光物質であってもよく、以下「蛍光」と呼ばれる光を発する。測定中の蛍光は、第１の方向７８と反対の方向である第２の方向８０に伝搬する。
【００６９】
蛍光は、線８２によって示されるように、第２のレンズ７０によって集光され、ダイクロイックミラー６６を通過する。蛍光は、第３のレンズ８６を通過する前に発光フィルタ８４によってフィルタ処理されるが、この第３のレンズ８６は蛍光を集光してスリットまたはピンホール８８を通過させ、蛍光検出器９０に入射させるものである。
【００７０】
第１の実施形態の独自の特徴の一部は、両方の検出経路に同一の紫外線ベースＬＥＤ６０が用いられることにある。小型、低消費電力、高分光放射照度、低コスト、および安定した出力電力がＬＥＤ６０の望ましい特性である。ＬＥＤ６０の安定した出力電力によってシステムの吸光部分は基準経路なしで動作することが可能となる。また、蛍光信号は試料に入射する放射束に直接依存しているため、このような安定性は低ノイズの蛍光検出に必要不可欠である。
【００７１】
別の特徴は、ＬＥＤ６０からの光をキャピラリーカラム７４に集光させる第２のレンズ７０が、蛍光検出器９０の集光光学部品としても用いられることにある。落射照明機構により、吸光検出器７６に蛍光経路を追加したとしても、吸光検出器の性能が劣化することはない。
【００７２】
第１の実施形態の第３の特徴は、ＬＥＤ６０からキャピラリーカラム７４に入射する励起放射およびキャピラリーカラム７４内から出射する、１若しくはそれ以上の化合物からの蛍光がダイクロイックミラー６６によって分離されることにあり、このダイクロイックミラーはＬＥＤ６０の励起波長と蛍光の蛍光波長を反射するビームスプリッタとして機能する。
【００７３】
吸光経路および蛍光経路の２つの光路６８、８２を統合することによって、キャピラリーカラム７４の同一小容積に対する検出器７６、９０双方の応答が確実となる。
【００７４】
第４の特徴は、２つの光路６８、８２が分離された後、当該蛍光発光路８２に１若しくはそれ以上の光学フィルタ８４が配置されていることであり、これにより、残留励起光が区別され、またキャピラリーカラム７４内の選択された化合物群について特異度が高まる。ＬＥＤ６０からの励起放射と蛍光信号のピーク時との間の波長差は蛍光性分子の電子構造に依存するため、励起波長および発光フィルタの異なる組み合わせを使って特定の化合物群を標的とする。
【００７５】
本発明の代替実施形態においては、蛍光発光路８２における発光フィルタ８４および蛍光検出器９０を全蛍光スペクトルを記録することができる小型分光計に代替してもよい。
【００７６】
発光経路と吸光経路の双方は同時にかつ継続的に監視することが可能である。各経路は、被分析物の電子構造に応じて異なる感度で被分析物濃度の測定単位を提供する。蛍光と吸光の比率は濃度とは無関係であり、第１の近似値となる。むしろ、当該比率は蛍光量子収率の測定単位であり、単独の検出経路では取得できなかった分子署名を提供する。発光経路に分光計を含む本発明の第１の実施形態では、記録されたスペクトルは、被分析物の同定に有用な溶出した被分析物の情報を提供する。
【００７７】
いくつかの例示的な実施形態のみを上記で詳細に説明したが、当業者であれば、これらの実施形態において、本発明から実質的に逸脱することなく、多くの改良が可能であることが容易に理解するであろう。したがって、かかる改良はすべて、以下の特許請求の範囲の中で定義される本開示の範囲内に含むものとする。本出願人は、本願の請求項の何れかのいかなる限定についても、請求項の中で「〜のための手段」という用語をそれに関連する機能と共に明確に使用していないかぎり、合衆国法典第３５巻第１１２条第６項を発動しないことを明確に意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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