(57)【要約】  いくつかの実施形態は、細菌代謝産物である４−エチルフェノール（4EP）およびその硫酸化型である４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の量を調節するための遺伝子組換え細菌株に関する。いくつかの実施形態において、前記細菌は、対象の腸における4EPまたは4EPSの産生を低減または抑制する。また、前記細菌は、対象において不安および／もしくは自閉スペクトラム症（ASD）に伴う１つ以上の症状を緩和するか、該症状の発症を遅延するか、または該症状を発症する可能性を低減することができる。
2020507627.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組成物または組み合わせ製品であって、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）を含む組成物または組み合わせ製品。
【請求項２】
哺乳動物対象への経口投与用または直腸投与用に製剤化されている、請求項１に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項３】
プロバイオティクス組成物またはプロバイオティクス製品の組み合わせ、医薬組成物または医薬製剤の組み合わせ、栄養補助食品および食品、ならびにこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項４】
ポリフェノールをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項５】
前記ポリフェノールがケルセチンおよび／またはクルクミンを含む、請求項４に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項６】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項７】
BO1194をコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異が、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む、請求項６に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項８】
前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項９】
PADをコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異が、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む、請求項８に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１０】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを単一の組成物中に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１１】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを別々の組成物中に含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１２】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスが、ｐ−クマル酸の産生を欠損している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１３】
前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムが、４−ビニルフェノールの産生を欠損している、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１４】
BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、１０６ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１５】
PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含む前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムと、１０６ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスとを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１６】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１７】
前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１８】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項１９】
バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）および／またはバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項２０】
対象における不安および／もしくは自閉スペクトラム症（ASD）に伴う症状の緩和、該症状の発症の遅延または該症状の発症の可能性の低減における使用のための、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項２１】
前記使用が、前記対象における４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、不安および／もしくはASDに伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む、請求項２０に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項２２】
前記使用が、不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む、請求項２０または２１に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項２３】
前記使用が、ASDに伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の組成物または組み合わせ製品。
【請求項２４】
前記対象が、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択された対象である、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記対象が不安を有していることが特定されているか、または前記対象に由来する試料中の4EPSの量が、不安を有していないコントロール対象もしくはASDを有していないコントロール対象よりも高いことから、前記対象が、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択される、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
対象における不安および／もしくはASDに伴う症状の緩和、該症状の発症の遅延または該症状の発症の可能性の低減における使用のための、ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む組成物。
【請求項２７】
前記使用が、前記対象における４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記対象が、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択された対象である、請求項２６または２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記対象が不安に伴う症状を有していることが特定されているか、または前記対象に由来する試料中の4EPSの量が、不安を有していないコントロール対象よりも高いことから、前記対象が、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減または抑制する方法であって、
BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与すること；ならびに
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを前記対象の消化管内で増殖させて、該対象における4EPおよび／または4EPSの産生を低減または抑制すること
を含む方法。
【請求項３１】
4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安および／もしくはASDに伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与の前に、前記組成物または前記組み合わせ製品の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を選択することをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記選択が、不安および／またはASDに伴う症状を有する対象として前記対象を特定することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記選択が、前記対象に由来する試料中の4EPの量および／または4EPSの量を検出することを含む、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象にポリフェノールを投与することをさらに含む、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ポリフェノールがケルセチンおよび／またはクルクミンを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含む、請求項３０〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
BO1194をコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異が、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含む、請求項３０〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、１０６ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムを含む、請求項３０〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む、請求項３０〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
PADをコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異が、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含む、請求項３０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、１０６ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスを含む、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物または前記組み合わせ製品が、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムが、単一の組成物の形態で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムが、別々の組成物の形態で投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムが、異なる時間または同時に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が無菌状態である、請求項３０〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物または前記組み合わせ製品を投与する前に、前記対象に抗生物質を投与することをさらに含み、該抗生物質によって、前記組成物の投与前に該対象の腸内細菌の総量が少なくとも８０％減少する、請求項３０〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減または抑制する方法であって、
前記対象に特定の量のポリフェノールを投与することを含む方法。
【請求項５２】
前記ポリフェノールがケルセチンおよび／またはクルクミンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安に伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記投与の前に、前記組成物の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を選択することをさらに含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記選択が、不安に伴う症状を有する対象として前記対象を特定することを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記選択が、前記対象に由来する試料中の4EPの量および／または4EPSの量を検出することを含む、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）を含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することをさらに含む、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による引用
本願とともに提出された出願データシートにおいて外国優先権または国内優先権の主張が認められるあらゆる出願は、37 CFR 1.57の下、引用によって本願に援用される。本出願は、2017年2月14日に出願された米国仮特許出願第62/458,716号に基づく利益を主張するものであり、この出願は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
連邦政府の助成による研究開発に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与された助成金第MH100556およびGM099535に基づく政府支援の下でなされたものである。米国政府は、本発明に関し一定の権利を保有する。
【０００３】
配列表の参照
本出願は、CALTE129WOSEQLIST.txtというファイル名で2018年2月13日に作成された20,975バイトの電子形式の配列表とともに出願されたものである。この電子形式の配列表に記載された情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００４】
様々な行動障害が知られている。不安障害は、正常な機能を妨げることもある様々な程度の心配、恐怖および苦痛を伴いうる障害の１種である。不安関連障害の例としては、うつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動性障害、慢性疼痛および線維筋痛症が挙げられる。自閉スペクトラム症（ASD）は、社会的コミュニケーション障害および社会的相互作用障害、ならびに反復的常同行動を含む広範囲な症状の発現を伴う一連の神経発達疾患である。米国におけるASDの有病率は、2012年において小児1000人あたり14.6人であり（Christensenら、2016）、現在の症例は100万件に達し、診断数が増加していることが示されている（Fombonne、2009；KingおよびBearman、2009）。ASDの遺伝率は83%と高率であると推定されており、17%が共通の環境要因を持たないとされている（Sandinら、2017）。
【０００５】
腸内細菌によって産生される代謝産物は、宿主の健康状態に大きな影響を及ぼす。様々な病態において、このような細菌由来分子の量およびその局在は様々に変動することがある。本明細書では、細菌代謝産物である４−エチルフェノール（4EP）とその硫酸化型である４−エチルフェニル硫酸（4EPS）が、ASDや不安などの行動障害の症状に対して直接影響を及ぼすことを実証した実験について述べており、さらに、例えば不安および／またはASDなどにおける行動機能を改善するための組成物、方法および使用に関する実施形態についても述べる。
【０００６】
技術分野
本明細書に記載の実施形態のいくつかは、細菌代謝産物である４−エチルフェノール（4EP）およびその硫酸化型である４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の量を調節するための遺伝子組換え細菌株に関する。いくつかの実施形態において、前記細菌は、対象の腸において4EPまたは4EPSの産生を低減または抑制することによって、該対象における不安および／もしくはASDに伴う１つ以上の症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
いくつかの実施形態は、組成物または組み合わせ製品であって、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）を含む組成物または組み合わせ製品を含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、哺乳動物対象への経口投与用または直腸投与用に製剤化されている。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、プロバイオティクス組成物またはプロバイオティクス製品の組み合わせ、医薬組成物または医薬製剤の組み合わせ、栄養補助食品および食品、ならびにこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、ポリフェノールをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールはケルセチンおよび／またはクルクミンを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、BO1194をコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、PADをコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを単一の組成物中に含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを別々の組成物中に含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスは、ｐ−クマル酸の産生を欠損している。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、４−ビニルフェノールの産生を欠損している。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、１０６ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムとを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、PADをコードする遺���子に機能喪失変異を含む前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムと、１０６ｃｆｕ以下、例えば１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下または１０３ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスとを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、例えば少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕまたは１０６ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、例えば少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕまたは１０６ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、例えば、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムをそれぞれ少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕおよび／または１０６ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）および／またはバクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品は、対象における不安および／もしくは自閉スペクトラム症（ASD）に伴う症状の緩和、該症状の発症の遅延または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものである。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記使用は、前記対象における４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、不安および／もしくはASDに伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記使用は、不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記使用は、ASDに伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記対象は、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択された対象である。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の組成物または組み合わせ製品において、前記対象は、不安を有していることが特定されているか、または前記対象に由来する試料中の4EPSの量が、不安を有していないコントロール対象もしくはASDを有していないコントロール��象よりも高いことから、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態は、対象における不安および／もしくはASDに伴う症状の緩和、該症状の発症の遅延または該症状の発症の可能性の低減における使用のための、ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の使用は、前記対象における４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減させることを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の（ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む）組成物において、前記対象は、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択された対象である。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の（ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む）組成物において、前記対象は、（ｉ）不安に伴う症状を有していることが特定されているか、または（ii）前記対象に由来する試料中の4EPSの量が、不安を有していないコントロール対象よりも高いことから、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態は、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減または抑制する方法を含む。該方法は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む組成物または組み合わせ製品（例えば、本明細書に記載の製品または組成物）を前記対象に投与することを含んでいてもよい。前記方法は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを前記対象の消化管で増殖させることを含んでいてもよい。このようにして、前記対象における4EPおよび／または4EPSの産生が低減または抑制される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安および／もしくはASDに伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の方法は、前記投与の前に、前記組成物または前記組み合わせ製品の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記選択は、不安および／またはASDに伴う症状を有する対象として前記対象を特定することを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記選択は、前記対象に由来する試料中の4EPの量および／または4EPSの量を検出することを含む。いくつかの実施形態において、前記または後記のいずれかに記載の方法は、前記対象にポリフェノールを投与することをさらに含む。例えば、前記ポリフェノールは、ケルセチンおよび／またはクルクミンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または前記組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、BO1194をコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、例えば少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕまたは１０６ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、例えば１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下または１０３ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス���プランタルムを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、PADをコードする前記遺伝子中の前記機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ含み、例えば少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕまたは１０６ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、１０６ｃｆｕ以下、例えば１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下または１０３ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムとを含む。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、単一の組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、別々の組成物の形態で投与される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、異なる時間に投与される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、同じ時間に投与される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、異なる時間または同じ時間に投与される。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記対象は無菌状態である。いくつかの実施形態では、前記または後記のいずれかに記載の方法において、前記方法は、前記組成物または前記組み合わせ製品の投与前に、前記対象に抗生物質を投与することをさらに含む。前記抗生物質は、前記組成物の投与前に前記対象の腸内細菌の総量を少なくとも８０％減少させることができ、例えば、前記対象の腸内細菌の総量を少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または９９．９％減少させることができる。
【００１０】
いくつかの実施形態は、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減または抑制する方法であって、前記対象に特定の量のポリフェノールを投与することを含む方法を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む。いくつかの実施形態において、前記特定の量のポリフェノールは、4EPおよび／または4EPSの硫酸化を効果的に低減および／または抑制する。いくつかの実施形態において、4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安に伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記投与の前に、前記組成物の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を選択することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記選択は、不安に伴う症状を有するとして前記対象を特定することを含む。いくつかの実施形態において、前記選択は、前記対象に由来する試料中の4EPの量および／または4EPSの量を検出することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の、4EPおよび／または4EPSの産生を低減または抑制する方法において、該方法は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む組成物または組み合わせ製品（例えば、本明細書に記載の組成物または製品組成物）を前記対象に投与することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ−Ｅ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる、4EPSの定量およびマウスに対する4EPSの効果を示した一連のグラフである。図１Ａは、GC/LC-MSによる検出により定量した4EPSの相対量を示す。生理食塩水または30mg/kgの4EPSカリウム塩を野生型マウスに３週齢から６週齢にかけて毎日腹腔内注射した。図１Ｂは中心滞在時間を示す。図１Ｃは中心からの距離を示す。図１Ｄは驚愕反応（Vmax）を示す。図１Ｅは、プレパルス抑制（PPI）（％）を示す。
【００１２】
【図２Ａ−Ｄ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる、ヒトASDにおける4EPSの検出を示した一連のグラフである。図２Ａおよび図２Ｃは4EPSの標準曲線を示す。図２Ｂは、4EPSが検出可能な血漿試料の割合（％）を示す。図２Ｄは、最も低い濃度の標準品よりも血漿中4EPSの濃度が高かった試料の割合（％）を示す。「Gp」は一般集団を示し、「Au」はASD集団を示す。
【００１３】
【図３Ａ−Ｃ】いくつかの実施形態による4EPおよび4EPSの合成を示す一連の概略図およびグラフである。図３Ａは、検証した4EPの天然生合成経路を示す。図３Ｂは、インビトロにおける4EPの産生を示す。図３Ｃは、遺伝子組換え細菌ペアを使用した場合の尿中4EPS濃度を示す。
【００１４】
【図４Ａ−Ｉ】4EPS注射に対する反応についての実施形態を示す一連の概略図およびグラフである。図４Ａは、高架式十字迷路における運動の概要を示し、図４Ｂ〜Ｃは高架式十字迷路における反応を示すグラフである。図４Ｄは、明暗箱における運動の概要を示し、図４Ｅ〜Ｆは明暗箱における反応を示す。図４Ｇはオープンフィールドアリーナにおける運動の概要であり、図４Ｈ〜Ｉはオープンフィールドアリーナにおける反応を示すグラフである。
【００１５】
【図５Ａ−Ｂ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスのオープンフィールドアリーナにおける行動を示す一連のグラフである。図５Ａは、オープンフィールドアリーナの特定の区画への進入頻度およびそこでの総滞在時間を示す。図５Ｂは、総移動距離および総移動時間を示す。
【００１６】
【図６Ａ−Ｂ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの高架式十字迷路（EPM）における行動を示す一連のグラフである。図６Ａは、高架式十字迷路の特定の区画への進入頻度およびそこでの総滞在時間を示す一連のグラフである。図６Ｂは、総移動距離を示すグラフである。
【００１７】
【図７Ａ−Ｃ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの明暗箱における行動を示す一連のグラフである。明箱への進入頻度（図７Ａ）、明箱での総滞在時間（図７Ｂ）および初回の進入までに要した時間（図７Ｃ）を示す。
【００１８】
【図８Ａ−Ｃ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる4EPを欠失している遺伝子組換え細菌または4EPを産生する遺伝子組換え細菌を定着させたマウスの反復行動スコアを示す一連のグラフである。グルーミング行動（図８Ａ）、穴掘り行動（図８Ｂ）およびビー玉埋め行動（図８Ｃ）を示す。
【００１９】
【図９Ａ−Ｂ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる超音波発声アッセイの結果を示す一連のグラフである。4EPを欠失している細菌または4EPを産生する細菌を雄マウスに定着させた。超音波発声事象の頻度（図９Ａ）および超音波発声事象の持続時間（図９Ｂ）を示す。
【００２０】
【図１０】オープンフィールドアッセイにおいて、4EPを欠失している遺伝子組換え細菌または4EPを産生する遺伝子組換え細菌を定着させたマウスが排泄した糞粒数を示すグラフである。
【００２１】
【図１１Ａ−Ｅ】本明細書に記載の実施形態のいくつかによる４−エチルフェノール（4EP）またはｐ−クレゾール（PC）の硫酸化の分析を示す一連のグラフである。図１１Ａは、4EPおよびｐ−クレゾール（PC）の硫酸化の検出を示すグラフである。図１１Ｂは、LCMSによる硫酸化ドナーの検出を示すグラフである。図１１Ｃは、インビトロにおいてSULT1A1がケルセチンによって抑制されることを示すグラフである。図１１Ｄは、遺伝子組換え細菌を定着させたマウスの消化管においてSULT1A1（sulfotransferase family 1A member 1）が発現されることを示すグラフである。図１１Ｅは、様々な組織における4EPの硫酸化を示すグラフである。
【００２２】
【図１２Ａ−Ｃ】図１２Ａは、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるＢ．オバツス01194のコード配列（配列番号１）を示す概略図である。図１２Ｂは、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるラクトバチルス・プランタルムのフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）のコード配列（配列番号２）を示す概略図である。図１２Ｃは、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる枯草菌（Bacillus subtilis）のフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）のコード配列（配列番号５）を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、4EPS（または１種以上の4EPS前駆体、例えば、4EP、４−ビニルフェノールおよび／またはｐ−クマル酸など）の産生を低減または抑制することによって、不安および／もしくは自閉スペクトラム症（ASD）の症状の緩和、該症状の発症の遅延または該症状の発症の可能性の低減を必要とする哺乳動物において、該症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減することができる。本明細書において、不安および／または自閉スペクトラム症（ASD）に伴う症状（ASDの症状には不安およびその関連症状が含まれることがあることには留意されたい）を有する対象の血清中において、細菌代謝産物である4EPSが上昇していることが報告されており、このような対象の例として、不安障害および自閉スペクトラム症を呈する母体免疫活性化（MIA）マウスモデル（実施例１、図１Ａ）およびヒトASD患者（実施例２、図２Ａ〜Ｄ）が挙げられる。また、4EPSを野生型マウスに投与すると、不安行動が誘導される（実施例１および実施例４、図１Ｂ〜Ｄおよび図４Ｄ〜Ｉ）。4EPSは、腸内細菌などの細菌により産生され、本明細書では4EPSの合成経路の特性が評価されている。特に、4EPの合成（4EPは硫酸化されて4EPSになる）は、１種の細菌において行われるのではなく、それぞれが合成の一部を担う２種の細菌、すなわち、バクテロイデス・オバツスおよびラクトバチルス・プランタルムが関与している（実施例３、図３Ａ）。また、BO1194をコードする遺伝子の欠失を含む変異型Ｂ．オバツスを構築し、4EPSの産生を欠損させ、このＢ．オバツスをマウスに定着させると、4EPSの産生が抑制された（実施例３、図３Ｂおよび図３Ｃ）。さらに、Ｂ．オバツスにおいて、天然型BO1194と枯草菌（Bacillus subtilis）由来のフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）を過剰発現させると、4EPの産生が促された（実施例３、図３Ｂ）。また、BO1194をコードする遺伝子の欠失を含む細菌をマウスに定着させると、不安の測定値が改善され、例えば、オープンフィールドアリーナにおける中心への進入頻度および中心での総滞在時間が増加し、壁際での総滞在時間および壁際での平均滞在時間が減少した（実施例５、図５Ａ）。さらに、BO1194をコードする遺伝子の欠失を含む細菌を定着させたことによって、高架式十字迷路における中心での総滞在時間および中心での総滞在時間が増加し、壁際での総滞在時間および壁際での平均滞在時間が減少した（実施例６、図６Ａ）。さらに、BO1194をコードする遺伝子の欠失を含む細菌を定着させると、明箱での総滞在時間が減少し（実施例７、図７Ｂ）、グルーミング行動、穴掘り行動、ビー玉埋め行動などの反復行動が減少し（実施例８、図８Ａ〜Ｃ）、超音波発声の頻度およびその持続時間が増加し（実施例９、図９Ａおよび図９Ｂ）、糞便排泄が減少したことから（実施例１０、図１０）、（不安に加えて）ASDに伴う症状が緩和されたことが示された。したがって、例えば、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる、BO1194に機能喪失変異を含む遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／またはPADに機能喪失変異を含む遺伝子組換えＬ．プランタルムの培養により、腸内細菌における4EPの合成（したがって4EPSの合成）を抑制することによって、4EPSの産生の抑��を必要とする哺乳動物において4EPSの産生を抑制することができる（例えば、低減することができるか、または完全に阻止もしくは予防することができる）と考えられる。4EP（および4EPS）の合成を抑制することによって、哺乳動物においてASDおよび／もしくは不安に伴う１つ以上の症状を緩和するか、該症状の発症の可能性を低減するか、かつ／または該症状の発症を遅延させることができる。さらに、ポリフェノールであるケルセチンおよびクルクミンは、4EPの硫酸化を抑制し、これによって4EPSの産生を抑制することが示された（実施例１１、図１１Ａ〜Ｅ）。したがって、さらに、ケルセチンおよび／またはクルクミンを含む組成物は、4EPSの産生の抑制を必要とする対象において4EPSの産生を抑制するのに有用であると考えられる。
【００２４】
本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、4EPS（または4EPS前駆体のうちの１種、例えば、4EP、４−ビニルフェノールおよび／またはｐ−クマル酸など）の産生を低減または抑制することによって、不安および／もしくはASDに伴う症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減を必要とする哺乳動物（例えばヒト）において、該症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減することができると考えられる。4EPS前駆体の産生が低減または抑制されることによって、4EPSの産生が低減または抑制されるとも解釈できることから、本明細書において「4EPSの産生を欠損している」（またはこの用語から派生した変化形）とされる生物は、4EPS前駆体の産生および／またはEPS自体の産生を欠損している可能性があると認められる。さらに、EPS前駆体（例えば、ｐ−クマル酸、４−ビニルフェノールおよび／または4EP）の産生を欠損している生物は、4EPSの産生も欠損していると認められる。したがって、いくつかの実施形態において、4EPSの産生は、4EPSの合成経路に関与するＢ．オバツスの遺伝子および／またはＬ．プランタルムの遺伝子を変異させることによって抑制することができる。いくつかの実施形態において、4EPSの産生を欠損している遺伝子組換えＢ．オバツス細菌および／もしくは遺伝子組換えＬ．プランタルム細菌（例えば、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含むＢ．オバツスおよび／もしくはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失を含むＬ．プランタルム）を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品は、4EPSの産生の低減または抑制を必要とする対象に投与することによって4EPSの産生を低減または抑制するのに有用である。本明細書において「機能喪失」（またはこの用語から派生した変化形を含む）は、部分的機能喪失（例えば、低形質（hypomorphic）変異）、および完全な機能喪失（例えば、表現型null変異などのnull変異、または関連遺伝子の欠失）を包含する。したがって、本明細書に記載されている、4EPSの産生を「欠損している」（またはこの用語から派生した変化形）細菌は、4EPSを全く産生することができないか、または対応する野生型細菌と比べて4EPSの産生量および／もしくはその産生率が低下していると考えられる。さらに、いくつかの実施形態において、ケルセチンおよび／もしくはクルクミンなどのポリフェノールを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品は、4EPSの産生の抑制を必要とする対象において4EPSの産生を抑制するのに有用である。いくつかの実施形態において、組成物または組み合わせ製品は、4EPSの産生を欠損している（本明細書に記載の）遺伝子組換えＢ．オバツス細菌および／または遺伝子組換えＬ．プランタルム細菌と、ケルセチンおよび／またはクルクミンなどのポリフェノールとを含む。前記組成物または組み合わせ製品は、4EPSの産生の抑制を必要とする対象において4EPSの産生を抑制するために使用することができる。さらに、前記組成物または組み合わせ製品は、前記対象において不安および／もしくはASDに伴う１つ以上の症状を緩和し、該症状の発症を遅延させ、かつ／または該症状の発症の可能性を低減するのに有用である可能性がある。
【００２５】
遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（および／またはポリフェノール）を含む組成物および／または組み合わせ製品
本明細書では、4EPの合成に関与する遺伝子を欠損しているバクテロイデス・オバツスが、不安および／またはASDを有する対象の腸に定着して、4EPSの産生量を低減させ、不安および／またはASDに伴う症状を緩和することができることが報告されている（実施例３および実施例５〜１０、ならびに図３Ｃおよび図５Ａ〜図１０参照）。さらに、ラクトバチルス・プランタルムも4EPの合成に関与するため、4EPの合成に関する遺伝子を欠損しているラクトバチルス・プランタルムも不安および／またはASDを有する対象の腸に定着して、4EPSの産生量を低減させ、不安および／またはASDに伴う症状を緩和することができると考えられる。いくつかの実施形態は、組成物または組み合わせ製品であって、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／もしくはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物に含まれる各成分は、「組み合わせ製品」として別個に提供することができる。この組み合わせ製品では、各成分が２つ以上の前駆組成物として提供され、これらの前駆組成物を組み合わせて最終組成物を形成してもよいし（例えば、特定の細菌と別の細菌および／または１種以上のポリフェノールとを混合して、細菌および／またはポリフェノールの混合物を含む最終組成物とする）、あるいは前駆組成物を併用することによって単一の組成物と類似の効果を達成してもよい（例えば、細菌と１種以上のポリフェノールとを対象に同時または連続して投与する）。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、哺乳動物対象の腸に定着し、4EPSの産生を低減または抑制するのに十分な量の遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、ケルセチンおよび／またはクルクミンなどのポリフェノールをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記対象において4EPSの産生を低減または抑制するのに十分な量のポリフェノールを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、Ｂ．フラジリス（B.fragilis）、Ｂ．テタイオタオミクロン（B.thetaiotaomicron）、またはＢ．フラジリスとＢ．テタイオタオミクロンの組み合わせなどの、（Ｂ．オバツス以外の）１種以上のバクテロイデス属細菌をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、不安もしくはASDを有する対象または不安もしくはASDのリスクがある対象における、不安および／もしくはASDに伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、不安を有する対象または不安のリスクがある対象における、不安に伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減におけ���使用のためのものである。いくつかの実施形態において、前記使用は、不安の緩和、不安の発症の遅延または不安の発症の可能性の低減のための使用である。いくつかの実施形態において、前記使用は、不安もしくは１つ以上の不安関連障害の緩和、これらの発症の遅延、またはこれらの発症の可能性の低減のための使用であり、１つ以上の不安関連障害としては、例えば、うつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動性障害、慢性疼痛および／もしくは線維筋痛症が挙げられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物または組み合わせ製品は、ASDを有する対象またはASDのリスクがある対象における、ASDに伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものである。ASDに伴う症状の例としては、反復行動、多動およびコミュニケーション障害が挙げられるが、これらに限定されない。ASDに伴って不安（およびその関連症状）が見られることもあり、場合によっては不安自体がASDの兆候であると見なされることもある。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、不安を有する対象または不安のリスクがある対象における不安の緩和、不安の発症の遅延、または不安の発症の可能性の低減における使用のためのものである。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記対象は、前記組成物または組み合わせ製品を投与すべき対象群に含まれるものとして特定および／または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、１つ以上の不安症状（例えば、過度の驚愕もしくは情動不安）もしくは不安関連障害（例えば、うつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動障害、慢性疼痛、線維筋痛症）、もしくは１つ以上のASD症状（例えば、反復行動、不安および／もしくはコミュニケーション行動の欠損）を有しているとして特定されるか、または前記対象に由来する試料中の4EPS量が、不安および／もしくはASDを有していない（適切な）コントロール対象よりも高いことから、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、ASD、不安、および／またはうつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動性障害、慢性疼痛および線維筋痛症のうちの１つ以上を有する。いくつかの実施形態において、前記対象に由来する試料は、尿もしくは血清を含むか、実質的に尿もしくは血清からなるか、または尿もしくは血清からなる。いくつかの実施形態において、前記組成物は、不安を有する対象または不安のリスクがある対象における、ASDおよび／もしくは不安に伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものである。前記使用は、前記対象における４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、ASDおよび／もしくは不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物は、不安を有する対象または不安のリスクがある対象における、不安に伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものであり、該使用は、前記対象において４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、不安に伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減することを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物は、ASDを有する対象またはASDのリスクがある対象における、ASDに伴う１つ以上の症状の緩和、該症状の発症の遅延、または該症状の発症の可能性の低減における使用のためのものであり、該使用は、前記対象において４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を抑制することによって、ASDに伴う症状を緩和するか、該症状の発症を遅延させるか、または該症状の発症の可能性を低減することを含む。いくつかの実施形態において、前記対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物はヒトである。
【００２７】
本明細書において、ケルセチンおよび／またはクルクミンなどのポリフェノールが4EPの硫酸化を抑制することによって、4EPSの産生を抑制または低減できることが示されている（実施例１１参照）。さらに、4EPSは不安を誘導することがあるが（例えば実施例４参照）、4EPSの産生を低減または抑制することによって、不安を緩和することができるか、不安の発症を遅延させることができるか、または不安の発症の可能性を低減することができることが本明細書において報告されている（実施例５〜１０参照）。したがって、いくつかの実施形態は、対象における不安および／もしくはASDの緩和、不安および／もしくはASDの発症の遅延または不安および／もしくはASDの発症の可能性の低減における使用のための、ケルセチンおよび／またはクルクミンなどのポリフェノールを含む組成物を含む。いくつかの実施形態において、前記使用は、前記対象において4EPSの産生を抑制または低減することによって、不安および／もしくはASDを緩和すること、これらの発症を遅延させること、またはこれらの発症の可能性を低減することを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記対象において4EPSの産生を低減または抑制するのに十分な量のポリフェノール（例えばケルセチンおよび／またはクルクミン）を含む。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択された対象である。例えば、いくつかの実施形態において、前記対象は、不安および／もしくはASDを有しているとして特定されることがあり、かつ／または前記対象に由来する試料中の4EPS量が、不安を有していないコントロール対象および／もしくはASDを有していないコントロール対象よりも高いことが特定されることがある。前述のいずれか（または前述の事項の２つ以上の組み合わせ）に基づくと、前記対象は、前記組成物を投与すべき対象群に含まれるものとして選択されることがある。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載されているBO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／または本明細書に記載されているフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムをさらに含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／もしくはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。「遺伝子組換え」という用語は、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有する。「遺伝子組換え」は、欠失、挿入、フレームシフトおよび／もしくは再編成などの１つ以上の誘発変異もしくは遺伝子改変を含み、かつ／または１つ以上の遺伝子構築物（プラスミド、アレイもしくは人工染色体など）を含むという点で、野生型とは異なる生物（細菌株など）を指す。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含むか、実質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、フェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含むか、実質的にこれからなるか、またはこれからなる。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、フェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムとを含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる。例えば、これらの一方または両方の遺伝子における機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、単一の組成物中に一緒に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、同一の組み合わせ製品の一部を構成する別々の組成物中に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含むバクテロイデス・オバツスを含み、該機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含むラクトバチルス・プランタルムを含み、該機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含むバクテロイデス・オバツスと、PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含むラクトバチルス・プランタルムとを含み、各機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。バクテロイデス・オバツスにおけるBO1194をコードする遺伝子の機能喪失変異とラクトバチルス・プランタルムにおけるPADをコードする遺伝子の機能喪失変異は、同じタイプのもの（例えば、各遺伝子の欠失）であってもよく、異なるタイプのもの（例えば、BO1194の欠失とPADにおけるフレームシフト）であってもよい。本明細書に記載の実施形態のいくつかに好適な（例えば、変異体を作製する元となる基準配列としての）バクテロイデス・オバツスのBO1194の野生型配列の一例を配列番号１として示すが、これに限定されない。本明細書に記載の実施形態のいくつかに好適な（例えば、変異体を作製する元となる基準配列としての）ラクトバチルス・プランタルムのPADの野生型配列の一例を配列番号２として示すが、これに限定されない。また、4EPの合成（実施例３参照）において機能することが実験的に立証されたＢ．オバツスのPADのオーソログである野生型枯草菌のPADを配列番号５として示す。本明細書に記載の実施形態のいくつかにおいて、PADをコードするＬ．プランタルム遺伝子は枯草菌のPADのオーソログであると考えられる。いくつかの実施形態において、変異型BO1194配列は、配列番号１に少なくとも１個のヌクレオチドの欠失を含んでおり、例えば配列番号１において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個または１５０個のヌクレオチドの欠失を含んでおり、欠失しているヌクレオチドの数は、これらの数値のいずれか２つの間にある範囲であってもよく、例えば１〜１５０個、２〜１５０個、５〜１５０個、１０〜１５０個、５０〜１５０個、１〜１００個、２〜１００個、５〜１００個、５０〜１００個、１〜５０個、２〜５０個、５〜５０個、１０〜５０個、１〜２０個、２〜２０個、５〜２０個、１０〜２０個、１〜１０個、２〜１０個または５〜１０個の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、変異型BO1194配列は、配列番号１に点突然変異を含み、例えば未熟停止コドンがインフレームに挿入されている。いくつかの実施形態において、変異型BO1194配列は、配列番号１に点突然変異を含み、例えば配列番号１にフレームシフト突然変異を含み、例えば３の倍数ではない数のヌクレオチドの挿入または欠失（例えば、１個、２個、４個、５個、７個、８個、１０個、１１個、１３個、１４個、１６個、１７個、１９個、２０個、２２個、２３個、２５個、２６個、２８個、２９個、３１個、３２個、３４個、３５個、３７個、３８個、４０個、４１個、４３個、４４個、４６個、４７個、４９個または５０個のヌクレオチドの挿入または欠失）を含む。いくつかの実施形態において、変異型PAD配列は、配列番号２に少なくとも１個のヌクレオチドの欠失を含んでおり、例えば配列番号２において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１０５個、１１０個、１１５個、１２０個、１２５個、１３０個、１３５個、１４０個、１４５個または１５０個のヌクレオチドの欠失を含んでおり、欠失しているヌクレオチドの数は、これらの数値のいずれか２つの間にある範囲であってもよく、例えば１〜１５０個、２〜１５０個、５〜１５０個、１０〜１５０個、５０〜１５０個、１〜１００個、２〜１００個、５〜１００個、５０〜１００個、１〜５０個、２〜５０個、５〜５０個、１０〜５０個、１〜２０個、２〜２０個、５〜２０個、１０〜２０個、１〜１０個、２〜１０個または５〜１０個の範囲であってもよい。いくつかの実施形態において、変異型PAD配列は、配列番号２に点突然変異を含み、例えば未熟停止コドンがインフレームに挿入されている。いくつかの実施形態において、変異型PAD配列は、配列番号２に点突然変異を含み、例えば配列番号２にフレームシフト突然変異を含み、例えば３の倍数ではない数のヌクレオチドの挿入または欠失（例えば、１個、２個、４個、５個、７個、８個、１０個、１１個、１３個、１４個、１６個、１７個、１９個、２０個、２２個、２３個、２５個、２６個、２８個、２９個、３１個、３２個、３４個、３５個、３７個、３８個、４０個、４１個、４３個、４４個、４６個、４７個、４９個または５０個のヌクレオチドの挿入または欠失）を含む。BO1194にこのような変異を含む遺伝子組換えＢ．オバツス、および／またはPADにこのような変異を含む遺伝子組換えＬ．プランタルムは、様々な分子生物学的技術を使用して作製することができ、このような分子生物学的技術として、例えば、変異型配列を含む構築物を使用した相同組換え、CRISPRシステムの使用、選択またはスクリーニングを併用した突然変異誘発が挙げられる。いくつかの実施形態による組み合わせ製品および／または組成物に含まれる遺伝子組換えＢ．オバツスおよび遺伝子組換えＬ．プランタルムは、必ずしも同じ技術を使用して構築する必要はないことには留意されたい。本明細書に記載の組成物および組み合わせ製品に応じた、遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または遺伝子組換えＬ．プランタルムなどの遺伝子組換え細菌の作製に好適な技術の例は、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., (4th Edition)(2012)（この文献は参照によってその全体が本明細書に援用される）に記載されている。いくつかの実施形態において、遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または遺伝子組換えＬ．プランタルムは、BO1194および／またはPADに、本発明に関連する１つ以上の変異を含む合成染色体またはその一部を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品に含まれる前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（および／またはＢ．オバツスとＬ．プランタルムの組み合わせ）は、4EP、4EPSまたは図３Ａに示す少なくとも１つの中間体（例えばｐ−クマル酸および／または４−ビニルフェノール）の産生を欠損している。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスは、ｐ−クマル酸の産生を欠損している。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（および／またはＢ．オバツスとＬ．プランタルムの組み合わせ）は、４−ビニルフェノールの産生を欠損している。
【００３０】
本明細書において、バクテロイデス・オバツスとラクトバチルス・プランタルムは、4EPSの合成において一組のペアとして協働して機能することが示されている（例えば、実施例３参照）。したがって、いくつかの実施形態において、4EPSの産生を低減または抑制することを目的とする場合、前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載の遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含むが、ラクトバチルス・プランタルムを全く含んでいないか、または実質的に含んでいないと考えられる。また、いくつかの実施形態において、4EPSの産生を低減または抑制することを目的とする場合、前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載の遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含むが、バクテロイデス・オバツスを全く含んでいないか、または実質的に含んでいない。本明細書において「実質的に含んでいない」という用語、およびこの用語から派生した変化形は、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有する。「実質的に含んでいない」とは、微量以下の物質（例えばバクテロイデス・オバツスもしくはラクトバチルス・プランタルムなどの細菌）を含む組成物および／もしくは組み合わせ製品（本明細書に記載の使用もしくは方法のための組成物および／もしくは組み合わせ製品であってもよい）、ならびに／または対象に対して効果（例えば、行動に対する効果）が認められない量の物質もしくはその存在を指す。例えば、いくつかの実施形態において、特定の細菌を実質的に含んでいない組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、約１０６コロニー形成単位（ｃｆｕ）以下、例えば、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下の細菌しか実質的に含んでいない。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、本明細書に記載のBO1194に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含み、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムを含む。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、本明細書に記載のPADに機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含み、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、マイクロバイオーム移植、プロバイオティクス治療または同等の処置のための標準的な方法で投与された場合に、ヒト対象の腸内でコロニー（例えば、接種後少なくとも１週間、２週間、３週間、４週間またはこれ以上にわたって持続するコロニー）を確立するのに十分な量の細菌（例えば、本明細書に記載の遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム）を含む。このような量の細菌は、本明細書において「接種物」と呼ぶこともある。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用または方法における細菌の量としては、少なくとも１０４ｃｆｕが挙げられ、例えば、少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕ、１０８ｃｆｕ、１０９ｃｆｕ、１０１０ｃｆｕ、１０１１ｃｆｕ、１０１２ｃｆｕ、１０１３ｃｆｕ、またはこれらの数値のいずれかの間にある範囲の量であり、例えば、１０４〜１０８ｃｆｕ、１０４〜１０９ｃｆｕ、１０４〜１０１０ｃｆｕ、１０４〜１０１１ｃｆｕ、１０４〜１０１２ｃｆｕ、１０４〜１０１２ｃｆｕ、１０５〜１０８ｃｆｕ、１０５〜１０９ｃｆｕ、１０５〜１０１０ｃｆｕ、１０５〜１０１１ｃｆｕ、１０５〜１０１２ｃｆｕ、１０５〜１０１２ｃｆｕ、１０６〜１０８ｃｆｕ、１０６〜１０９ｃｆｕ、１０６〜１０１０ｃｆｕ、１０６〜１０１１ｃｆｕ、１０６〜１０１２ｃｆｕ、１０６〜１０１２ｃｆｕ、１０７〜１０８ｃｆｕ、１０７〜１０９ｃｆｕ、１０７〜１０１０ｃｆｕ、１０７〜１０１１ｃｆｕ、１０７〜１０１２ｃｆｕ、１０７〜１０１２ｃｆｕ、〜１０９ｃｆｕ、１０８〜１０１０ｃｆｕ、１０８〜１０１１ｃｆｕ、１０８〜１０１２ｃｆｕまたは１０８〜１０１２ｃｆｕが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、前記対象に投与するための対数増殖期（例えば３７℃）の細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法は、前記対象に投与するための静止期（例えば３７℃）の細菌を含む。いくつかの実施形態において、前記組成物、組み合わせ製品、使用および／または方法の細菌は、単離された細菌である。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを少なくとも１０４ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕまたは１０８ｃｆｕ含む。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、少なくとも１０４ｃｆｕの前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと、少なくとも１０４ｃｆｕの前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムとを含む（例えば、これらの一方または両方の細菌を少なくとも１０４ｃｆｕ、１０５ｃｆｕ、１０６ｃｆｕ、１０７ｃｆｕまたは１０８ｃｆｕ含む）。
【００３２】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物および／または組み合わせ製品（本明細書に記載の使用および／または方法のための組成物および／または組み合わせ製品を含む）は、薬学的に許容される担体または添加剤を含む。「薬学的に許容される」担体は、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有し、細胞または哺乳動物に使用される用量および濃度で細胞または哺乳動物に対して毒性を示さない担体を含む。本明細書に記載の方法、使用、組成物および組み合わせ製品における「薬学的に許容される」担体としては、経口適用および／または直腸投与などの選択した使用方法に適した有機もしくは無機の固体または液体の添加剤が挙げられるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される」担体は、慣用の医薬製剤の形態で投与され、慣用の医薬製剤としては、錠剤、粒剤、散剤、カプセル剤などの固体製剤、および液剤、乳剤、懸濁剤などの液体製剤が挙げられる。多くの場合、生理学的に許容される担体は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などのpH緩衝水溶液である。また、生理学的に許容される担体は、アスコルビン酸などの酸化防止剤；低分子（残基数約１０未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸；グルコース、マンノース、デキストリンなどの糖類；EDTAなどのキレート剤；マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；およびTweenTM界面活性剤、ポリエチレングリコール（PEG）、PluronicTM界面活性剤などの非イオン性界面活性剤のうちの１つ以上を含んでいてもよい。また、助剤、安定化剤、乳化剤、滑沢剤、結合剤、pH調整・制御剤、等張化剤などの慣用の添加剤を前記担体に添加してもよい。いくつかの実施形態において、前記組成物は、経口投与、直腸投与、または経口投与と直腸投与の両方を目的として製剤化される。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、プロバイオティクスを含むか、実質的にプロバイオティクスからなるか、またはプロバイオティクスからなる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、哺乳動物対象への経口投与用または直腸投与用に製剤化されている。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、プロバイオティクス組成物、医薬組成物、栄養補助食品および食品、ならびにこれらの２種以上の組み合わせからなる群から選択される。本明細書に記載の実施形態のいくつかによる前記組成物および／または組み合わせ製品は、食品および栄養補助食品の形態（例えば、カプセル剤、錠剤、粉末および液体が挙げられるが、これらに限定されない）で利用可能である。プロバイオティクスを含む食品の例としては、ヨーグルト、発酵乳および未発酵乳などの乳製品、スムージー、バター、クリーム、ホムス、紅茶キノコ、サラダドレッシング、味噌、テンペ、栄養バーならびに一部のジュースおよび大豆飲料が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記組成物または組み合わせ製品は、単一の微生物を含む。
【００３４】
対象における４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減および／または抑制する方法
いくつかの実施形態は、対象における４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減および／または抑制する方法を含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、4EPおよび／または4EPSの産生の低減および／または抑制を必要とする対象に、本明細書に記載の遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／もしくは遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムならびに／または本明細書に記載のポリフェノールを含む組成物または組み合わせ製品を特定の量で投与することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減および／または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェノール（4EP）および／または４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減および／または抑制する方法が記載されている。該方法は、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツス、および／またはフェノール酸脱炭酸酵素（PAD）をコードする遺伝子に機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む組成物または組み合わせ製品を前記対象に投与することを含んでいてもよい。前記方法は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを前記対象の消化管で増殖させることを含んでいてもよい。このようにして、4EPおよび／または4EPSの産生が前記対象において抑制される。本明細書に記載の実施形態によれば、本明細書に記載の遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／もしくは遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む（または実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる）組成物または組み合わせ製品はいずれも、前記方法において前記対象に投与することができると考えられる。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、単一の組成物（例えば共培養物）の形態で共投与される。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、別々に投与され、例えば異なる時間および／または別々の投与経路を介して投与される。
【００３６】
前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルム（または前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスと前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムの組み合わせ）は、4EPSの合成経路（図３Ａ参照）における生成物をコードする１つ以上の遺伝子が欠損していてもよく、例えば本明細書に記載のバクテロイデス・オバツスのBO1194および／またはラクトバチルス・プランタルムのPADに機能喪失変異を含んでいてもよい。特定の理論に制限されるものではないが、4EP（および4EPS）の産生を欠損している遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを増殖させることによって、4EPおよび／または4EPSの産生を抑制することができるため（例えば実施例３、図３Ｂ参照）、宿主において4EP量および／もしくは4EPS量が低下するか、または宿主において4EPおよび／もしくは4EPSが実質的に除去されるか、もしくは完全に除去されると考えられる。さらに、4EP（したがって4EPS）の合成経路における欠損を集合的に有する遺伝子組換えＢ．オバツス株および遺伝子組換えＬ．プランタルム株を共培養することによって、不安の症状が軽減され（実施例５〜７、図５Ａ〜図７Ｃ参照）、さらにASDに伴う症状が軽減され、例えばグルーミング行動、穴掘り行動、ビー玉埋め行動などの反復行動が低減され（実施例８、図８Ａ〜Ｃ）、また、例えば超音波発声の頻度およびその持続時間の増加などコミュニケーション行動が改善した（実施例９、図９Ａおよび図９Ｂ）。さらに、Ｂ．オバツスおよびＬ．プランタルムにおける4EP（および4EPS）の生合成経路が本明細書において述べられていることから（例えば実施例３参照）、本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、4EP（および4EPS）の生合成経路に変異を含むその他のＢ．オバツス、Ｌ．プランタルムおよび／またはこれらの組み合わせを培養することによって、ASDおよび／もしくは不安の症状の緩和、該症状の発症の可能性の低減、ならびに／または該症状の発症の遅延において同様の効果が得られると考えられる。したがって、いくつかの実施形態において、前記方法によって、不安および／もしくはASDに伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、該症状が抑制されるか、または該症状の発症の可能性が低減される。したがって、いくつかの実施形態において、前記方法によって、ASD、不安および／もしくは本明細書に記載の不安関連障害が緩和されるか、これらの発症が遅延するか、これらが抑制されるか、またはこれらの発症の可能性が低減される。いくつかの実施形態において、4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安が緩和するか、その発症が遅延するか、またはその発症の可能性が低減する。
【００３７】
いくつかの実施形態は、４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生の低減または抑制を必要とする対象において、４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の産生を低減または抑制する方法を含む。該方法は、前記対象にポリフェノールを投与することを含んでいてもよい。本明細書において、ポリフェノールは、4EPから4EPSへの硫酸化を抑制できることが示されている（実施例１１参照）。したがって、このような量のポリフェノールは、前記対象において4EPSの産生を低減または抑制するのに有効である可能性がある。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、ケルセチンおよび／もしくはクルクミンを含むか、実質的にケルセチンおよび／もしくはクルクミンからなるか、またはケルセチンおよび／もしくはクルクミンからなる。いくつかの実施形態において、4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安に伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する。いくつかの実施形態において、4EPの量および／または4EPSの量を低減させることによって、前記対象における不安および／もしくはASDに伴う症状が緩和するか、該症状の発症が遅延するか、または該症状の発症の可能性が低減する。いくつかの実施形態において、前記方法は、前記投与の前に、前記組成物の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を選択することをさらに含む。前記選択は、本明細書に記載された通りであってもよい。いくつかの実施形態において、前記選択は、本明細書に記載の不安および／またはASDに伴う１つ以上の症状を有するとして前記対象を特定することを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ASDまたはASD行動、例えばコミュニケーション障害、発声、感覚運動、不安および／もしくは反復行動、またはこれらの２つ以上の組み合わせは、標準的な診断基準、例えば、精神障害の診断・統計マニュアル第４版（DSM-4）または第５版（DSM-5）に記載の診断基準を用いて特定される。いくつかの実施形態において、前記対象におけるASDの有無は、行動試験を用いて特定され、例えば自閉症行動チェックリスト（ABC）、自閉症診断面接改訂版（ADI-R）、小児自閉症評価尺度（CARS）および／または前言語期自閉症診断観察スケジュール（PL-ADOS）のうちの少なくとも１つを用いて特定される。前記行動試験は、１）集中度または焦点づけが異常に強く、常同的で限定的な１つ以上の興味への没頭、２）特定の非機能的な常同行動または儀式的行動に対する融通の利かない執着、ｃ）常同的で反復的な運動動作への固執（例えば、手や指をひらひらさせるなど）、および／またはｄ）物体の一部分に対する持続的な執着の有無を検出し、かつ／またはその程度を評価することを含みうるが、これらに限定されない。行動試験に含めることができ、かつ行動試験を受けている対象の行動機能を改善する必要性を示唆することができる行動としては、ａ）感覚行動：学習時に視覚的識別をあまり用いないこと、音が聞こえないように見えることから難聴を疑うこと、大きな音に対して時折「驚愕反応」を示さないこと、打撲傷、切り傷、注射などの痛みを伴う刺激に対して時折反応を示さないこと、明るい光が目に直接入っても滅多に瞬きをしないこと、様々な音で耳を塞ぐこと、太陽光に目を細めたり、顔をしかめたり、目を覆ったりすること、「見知らぬ」人に対して滅多に視覚的反応を示さないこと、何もない空間を長時間じっと見つめることなど；ｂ）対人行動：社会的刺激／環境刺激に滅多に反応しないこと、社交的微笑を示さないこと、手を差し出されたときに手を伸ばさないこと、他者の表情／感情に無反応であること、自発的にアイコンタクトを避けること、触られたり、掴まれたりすると抵抗すること、抱っこしたときに体に力が入らないこと、筋緊張により抱っこすることが難しいこと、一緒に遊んでいる他の子供のまねをしないこと、交友関係を築いたことがないこと、恐怖や強い不安を頻繁に感じること、人を「凝視」することなど；ｃ）運動動作および物体の使用に関する行動：長時間にわたって体を回転させること、玩具を適切に使用できないこと、特定の物体を持ったまま離そうとしないこと、長時間にわたって体を揺らすこと、突進や疾走を何度も繰り返すこと、手をバタバタさせること、つま先で歩くこと、頭をぶつけることによって自傷行為を行うこと、手を噛むこと、物体をクルクル回したり、回転させたり、ぶつけたりすることを繰り返すこと、周囲の物に触れたり、においを嗅いたり、かつ／または味を確認したりすること、物を並べるなどの複雑な「儀式」を行うこと、非常に破壊的な行動をとることなど；ならびにｄ）言語行動：一度だけ与えられた簡単な指示を実行できないこと、代名詞を逆に使用すること、会話が単調であること、他者が２名いるときに名前を呼ばれても反応しないこと、「はい」または「私」とは滅多に言わないこと、前置詞を含む簡単な���示を実行できないこと、自分のほしい物を身振りで伝えようとすること、同じ語句を何度も繰り返すこと、名前の付いた物の指差しが５つ以下に留まること、欲しい物や必要な物を伝えるために１日当たり０〜５個の単語を自発的に使用すること、特定の音や単語を何度も繰り返すこと、相手の質問または発言をオウム返しすること、コミュニケーションを取るために１日当たり１５個以上３０個未満の語句を自発的に使用すること、簡単な作業を学習するが、すぐに「忘れる」こと、日常動作／環境における変化に対して強い反応を示すこと、発達の一領域において、精神遅滞とは思えない「特殊な能力」を有すること、重度の癇癪および／または軽度の頻繁な癇癪を起こすこと、噛んだり、たたいたり、かつ／または蹴ったりすることによって他人を傷つけること、要求が満たされるまで待てないこと、トイレでの排泄が困難であること、頻繁に介助しないと一人で着衣できないこと、周囲に無関心であり、危険な状況に置かれても気がつかないことがあること、無生物を操作することを好み、それに没頭することを好むこと、および／または３０月齢もしくはそれ以前に特定された発達遅延を示すことなどが挙げられるが、これらに限定されない。当業者であれば、主治医は、本明細書に開示された治療を必要とする対象を特定する方法を熟知していることを容易に理解するであろう。
【００３９】
いくつかの実施形態において、4EPおよび／または4EPSの産生の低減および／または抑制を必要とする前記対象は、不安および／またはASDに伴う１つ以上の症状を有する。不安に伴う症状としては、情動不安および過度の驚愕が挙げられる。ASDに伴う症状としては、反復行動、多動、不安およびコミュニケーション障害が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、4EPおよび／または4EPSの産生の低減および／または抑制を必要とする前記対象は不安を有する。いくつかの実施形態において、4EPおよび／または4EPSの産生の低減および／または抑制を必要とする前記対象は、不安または不安関連障害、例えば、うつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動性障害、慢性疼痛および線維筋痛症を有する。いくつかの実施形態において、4EPおよび／または4EPSの産生の低減および／または抑制を必要とする前記対象はASDを有する。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記投与の前に、前記組成物の投与を必要とする対象群に含まれるものとして前記対象を特定および／または選択することをさらに含む。例えば、いくつかの実施形態において、前記対象は、不安を有することが特定されたことから、前記対象群に含まれるものとして選択される。いくつかの実施形態において、前記対象は、前記対象に由来する試料中の4EPの量および／または4EPSの量が検出されることによって、前記対象群に含まれるものとして選択される。前記対象に由来する試料（例えば血清試料および／または尿試料）中の4EPおよび／または4EPSの量が非ASD／非不安コントロール試料よりも多い場合、前記対象が治療を必要としていることが示される場合がある。4EPの量および／または4EPSの量は、様々な方法によって検出することができ、例えば、質量分析法（例えば、液体クロマトグラフィー質量分析法、ガスクロマトグラフィー質量分析法）またはイムノアッセイ（例えば、ELISA、ラテラルフローアッセイ）により検出することができる。
【００４１】
さらに、本明細書において、ポリフェノールが4EPSの産生を抑制できることが観察されている（実施例９、図９Ａおよび図９Ｂ参照）。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法または使用は、前記対象にポリフェノールを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、ケルセチンおよび／もしくはクルクミンを含むか、実質的にケルセチンおよび／もしくはクルクミンからなるか、またはケルセチンおよび／もしくはクルクミンからなる。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、本明細書に記載の遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または遺伝子組換えＬ．プランタルムを含む前記組成物または前記組み合わせ製品の一部を構成する。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、本明細書に記載の遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または遺伝子組換えＬ．プランタルムおよび前記ポリフェノールを含む単一の組成物の一部を構成する。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、前記遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または前記遺伝子組換えＬ．プランタルムと共に投与される。いくつかの実施形態において、前記ポリフェノールは、前記遺伝子組換えＢ．オバツスおよび／または前記遺伝子組換えＬ．プランタルムとは別々に投与され、例えば異なる時間および／または別々の投与経路を介して投与される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスは、BO1194をコードする遺伝子に機能喪失変異を含み、該機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。いくつかの実施形態において、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムは、PADをコードする遺伝子に機能喪失変異を含み、該機能喪失変異は、欠失、挿入、置換、再編成またはフレームシフトを含む。
【００４３】
バクテロイデス・オバツスおよびラクトバチルス・プランタルムは、一組のペアとして4EP(S)の合成に寄与することに注目されたい（実施例３参照）。したがって、4EP(S)の合成を低減または抑制するためには、ラクトバチルス・プランタルムの非存在下で本明細書に記載の変異型バクテロイデス・オバツスのみを投与し、かつ／またはバクテロイデス・オバツスの非存在下で本明細書に記載の変異型ラクトバチルス・プランタルムのみを投与することが有利である場合がある。本明細書に記載の方法または使用の実施形態のいくつかにおいて、前記対象に投与される前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含んでいるが、実質的にラクトバチルス・プランタルムを含んでいない。いくつかの実施形態において、前記方法または使用における前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載のBO1194に機能喪失変異を含む遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスを含み、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のラクトバチルス・プランタルムを含む。本明細書に記載の方法または使用の実施形態のいくつかにおいて、前記対象に投与される前記組成物または組み合わせ製品は、前記遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含んでいるが、実質的にバクテロイデス・オバツスを含んでいない。いくつかの実施形態において、前記方法または使用における前記組成物または組み合わせ製品は、本明細書に記載のPADに機能喪失変異を含む遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含み、１０６ｃｆｕ以下、１０５ｃｆｕ以下、１０４ｃｆｕ以下、１０３ｃｆｕ以下、１０２ｃｆｕ以下または１０ｃｆｕ以下のバクテロイデス・オバツスを含む。
【００４４】
本明細書に記載の方法または使用の実施形態のいくつかにおいて、前記対象は無菌状態である。「無菌」という用語は、本開示に基づく当業者に公知の従来の通常の意味を有する。「無菌」は、実質的に腸に細菌を持たない対象を指してもよい。例えば、前記対象は、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムを含む組成物または組み合わせ製品が腸に再定着することを促すために、無菌状態であってもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、前記方法は、前記組成物の投与前に前記対象に抗生物質を投与することをさらに含む。該抗生物質によって、前記組成物の投与前に前記対象の腸内細菌の総量を少なくとも８０％減少させることができ、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．９％減少させることができ、これらの数値のいずれかの間にある範囲（例えば、８０％〜９９．９％、８０〜９５％、８５％〜９９．９％および８５％〜９５％）で減少させることができる。投与可能な抗生物質の例としては、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（アモキシシリン＋クラブラン酸）、アンピシリン、ベンザチンベンジルペニシリン、ベンジルペニシリン、セファレキシン、セファゾリン、セフィキシム、セフォタキシム、セフトリアキソン、クロキサシリン、ペニシリン、フェノキシメチルペニシリン（ペニシリンＶ）、ピペラシリン／タゾバクタム、プロカインベンジルペニシリン、セフタジジム、メロペネム、アズトレオナム、イミペネム／シラスタチン、アミカシン、アジスロマイシン、クロラムフェニコール、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、クリンダマイシン、ドキシサイクリン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、ニトロフラントイン、スペクチノマイシン、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、トリメトプリム、バンコマイシン、クロファジミン、ダプソン、リファンピシン、エタンブトール／イソニアジド、エタンブトール／イソニアジド／ピラジナミド／リファンピシン、エタンブトール／イソニアジド／リファンピシン、イソニアジド、イソニアジド／ピラジナミド／リファンピシン、イソニアジド／リファンピシン、ピラジナミド、リファブチン、リファンピシン、リファペンチン、アミカシン、ベダキリン、カプレオマイシン、クロファジミン、シクロセリン、デラマニド、エチオナミド、カナマイシン、レボフロキサシン、リネゾリド、モキシフロキサシン、ｐ−アミノサリチル酸、リファブチン、リファペンチン、リファラジル、リファキシミン、ストレプトマイシン、およびこれらの抗生物質の２種以上の組み合わせからなる群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
さらなる実施形態
本明細書では、4EPの生合成に関与する遺伝子および4EPを産生することができる細菌種について述べている。特定の１種の生物が4EPの合成経路全体を備えているのではなく、インビトロおよびインビボにおいて協働して4EPを産生する生物の組み合わせ（ペア）が特定されている。インビボ実験を行うために4EPを高い濃度で持続させるため、4EPを産生する天然型のバクテロイデス・オバツスとラクトバチルス・プランタルムの組み合わせを遺伝子操作して、4EP合成経路を過剰発現させた（実施例３参照）。（１）4EP生合成経路において重要な遺伝子であるBO1194を過剰発現するＢ．オバツスと、（２）野生型Ｌ．プランタルムとを無菌マウスに定着させると、このマウスは、Ｂ．オバツスBO1194変異体との細菌ペアを使用した場合と比べて、同じ行動試験において不安の表現型を示す。
【００４７】
いくつかの実施形態は、4EPを産生する酵素を標的とした薬剤の開発を含む。
【００４８】
いくつかの実施形態は、4EPの産生および／または制御に関与する細菌を特異的な標的とした抗生物質の開発を含む。
【００４９】
いくつかの実施形態は、その他の種により産生された4EPを代謝／分解するための細菌工学を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態は、健康な細菌叢に侵入して、4EP産生株を駆逐することが可能な細菌株を開発するための細菌工学を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態は、4EP／4EPSを直接不活化するための薬剤の開発を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態は、4EP／4EPSに対する応答に関与する宿主経路を標的とすることを含む。
【００５３】
いくつかの実施形態は、うつ病、慢性疾患、摂食障害、頭痛、ホーディング障害、過敏性腸症候群、睡眠障害、物質使用障害、注意欠陥障害／多動性障害、慢性疼痛および／または線維筋痛症などの、不安に関連した疾患または障害を治療するための本明細書に記載の技術を用いて、これらの治療を必要とする対象を治療することを含む。
【実施例】
【００５４】
実施例１：マウスにおける４−エチルフェニル硫酸（4EPS）の量およびその効果
不安障害および自閉スペクトラム症（ASD）を呈する母体免疫活性化（MIA）マウスモデルと野生型マウスにおける4EPSの量を測定した。
【００５５】
MIAマウスモデルでは、免疫活性化した母マウスから産まれた仔マウスにおいて、腸上皮を透過することによる腸内副産物の漏出が亢進している。この宿主マウスは4EPを産生することはできないが、4EPが腸管バリアを通過して宿主の循環系に入ると、4EPは硫酸基による修飾を
受ける。
【００５６】
GC/LC-MSで4EPSを検出することによってその相対量を測定したところ、自閉スペクトラム症を呈するMIAマウスモデルでは4EPSの量が有意な変化を示したが（「P」）、Ｂ．フラジリスで処置すると回復することが示された（「P+BF」）。各群n=8で実験を行った（図１Ａ）。この分析の結果、MIA仔マウスにおける4EPSの量はコントロールの４６倍であることが示された。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかに従って、Ｂ．フラジリスを投与することにより、対象における4EPSの量を低下させることができる。
【００５７】
野生型マウスに対する4EPSの効果を測定するため、生理食塩水または30mg/kgの4EPSカリウム塩を野生型マウスに３週齢から６週齢にかけて毎日腹腔内（i.p.）注射した。オープンフィールド探索アッセイにおいて、中心滞在時間から不安様行動を測定し（図１Ｂ参照）、運動行動を測定した（図１Ｃ参照）。各群n=10で実験を行った。さらに、プレパルス抑制（PPI）アッセイにおいて驚愕反射の増強を測定し、測定結果から驚愕反応（Vmax）（図１Ｃ）とPPI（％）（図１Ｄ）を求めた。各群n=10で実験を行った。これらのデータから、4EPSの投与によって野生型マウスにおける不安行動が有意に増加したことが示された。
【００５８】
実施例２：ヒト小児試料におけるEPS量およびその効果
ASD小児および一般集団から選抜した神経学的定型小児からヒト血漿を採取し、液体クロマトグラフィー質量分析（LC/MS）により4EPSを分析した。4EPS標準曲線から4EPS濃度を定量し、図２Ａに示した。図２Ｂは、ASD集団の小児由来の全試料および一般集団の小児由来の全試料のうち、4EPSが検出可能であった試料の割合（％）を示す。さらに、標準曲線において最も低い濃度の標準品よりも濃度が高かった試料をプロットしたところ、ASD集団における血漿中4EPS濃度は一般集団よりも高かった（図２Ｃ）。別の分析として、全試料のうち、最も低い濃度の標準品よりも4EPS濃度が高かった試料の割合（％）を求めた（図２Ｄ）。ASD集団では、最も低い濃度の標準品を上回った試料の割合（％）が高かった（図２Ｄ）。AU＝自閉症集団、GP＝一般集団を示す。
【００５９】
実施例３：4EP(S)の生合成および細菌の遺伝子組換え
本明細書においてバクテロイデス・オバツス（Bacteroides ovatus）およびラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）における4EPの生合成経路を特定した。図３Ａに概要を示す。4EPの生合成経路には、２種の細菌、すなわち、バクテロイデス・オバツスとラクトバチルス・プランタルムが関与する合成段階が含まれ、これらの細菌は協働して4EPを産生する。バクテロイデス・オバツスにおいて、BO119によってチロシンがｐ−クマル酸に変換される。次いで、ラクトバチルス・プランタルムにおいて、フェノール酸脱炭酸酵素（PAD）によってｐ−クマル酸が４−ビニルフェノールに変換される。さらに、ラクトバチルス・プランタルムにおいて、４−ビニルフェノールが4EPに変換される。
【００６０】
作製したＢ．オバツスとＬ．プランタルムを共培養すると、インビトロでもインビボでも4EPが産生されることが示された。4EPSの産生を調節し、前記生合成経路に対する個々の遺伝子の関与を確認するために、遺伝子組換えＢ．オバツスを作製した。
【００６１】
PADは、ｐ−クマル酸を脱炭酸して、４−ビニルフェノールを生成する。BACOVA_01194はｐ−クマル酸の生合成に関与する。これらの遺伝子を4EPの生合成に関与する候補と見なし、機能喪失変異体および過剰発現構築物を構築して、他の候補とともに試験した。さらに、約20種のＬ．プランタルム変異体を構築し、前記生合成経路の最終段階である４−ビニルフェノールから4EPへの変換（図３Ａ参照）に関与するＬ．プランタルム遺伝子を見出そうとしたが、本願の出願時において、この最終段階に関与するＬ．プランタルム遺伝子を特定することはできていない。
【００６２】
変異型Ｂ．オバツス細菌を構築するため、Ｂ．オバツスATCC 8483 ΔBAVOVA_03071（tdk）を親株として使用した。
【００６３】
過剰発現を調べるため、天然のBACOVA_01194遺伝子（配列番号１）と枯草菌（Bacillus subtilis）由来のPAD酵素を発現する遺伝子（配列番号５）を使用して染色体挿入体を作製した。これらの遺伝子（BCAOVA_1194およびPAD）を同じpNBU2プラスミド（配列番号３）にタンデムに挿入した。この構築物はエリスロマイシン耐性も付与する。
【００６４】
以下のプロトコルを用いてBO1194欠失変異型Ｂ．オバツスを構築した。PCR増幅はいずれも、メーカーの使用説明書に従ってPrimeSTAR Max DNAポリメラーゼ（タカラバイオ）を使用して行った。プライマーの配列を表１に示した。過去の報告に従って二重交差組換え法を使用した（Koropatkinら、2008）。簡潔に説明すると、標的遺伝子の上流領域に相当する約１kbのDNA断片と下流領域に相当する約１kbのDNA断片をそれぞれ増幅し、制限消化を行った。これらの消化断片を、T4 DNAリガーゼ（ニュー・イングランド・バイオラボ）を用いて自殺プラスミドpExchange-tdkにライゲーションする。ライゲーションしたプラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌S17-1 λ pirコンピテントセルに導入して形質転換し、PCRにより形質転換体を確認した。ライゲーションしたプラスミドを有する陽性クローンを培養してプラスミドを調製した。このプラスミドを配列決定によりさらに確認した。前記プラスミドを導入した大腸菌S17-1 λ pirとＢ．オバツスΔtdkをそれぞれ培養し、細胞を回収した。各細胞ペレットをPBSで洗浄して、残留抗生物質を除去し、TYG培地中で混合した。得られた懸濁液を、抗生物質を含まないBHI血液寒天培地に播種し、３７℃の好気条件下で１日培養した。増殖した菌体を掻き取り、TYG培地に再懸濁した。この懸濁液を、エリスロマイシンとゲンタマイシンを添加したBHI血液寒天培地に播種し、一重交差組換えによる組み込み体を選択した。これらの株をTYG培地で一晩培養し、FUdRを添加したBHI血液寒天培地に播種した。PCR増幅により欠失変異体をスクリーニングし、さらに配列決定により検証した。このようにして、本明細書に記載の実施形態のいくつかによる機能喪失変異を含むＢ．オバツスを構築した。
【００６５】
共培養を行うため、Ｂ．オバツス株をTYG（トリプトン−酵母エキス−グルコース）液体培地に播種し、Ｌ．プランタルム株をMRS液体培地（BD）に播種し、それぞれ３７℃の嫌気条件下で一晩培養した。各細胞を回収した後、最小培地（MM）で洗浄した。0.5mg/mlのチロシンを含む最小培地（MM）に各細胞ペレットを再懸濁してOD600＝1.0に調整し、２種の菌株を同じ試験管で混合した。１日培養した後、HPLC分析用に試料を調製した。
【００６６】
複数回にわたって遺伝子組換えを行うことによって、4EPの産生収率を高めた。例えば、Ｌ．プランタルムBAA-793株とＢ．オバツス＋1194＋PAD株を共培養した場合では、PADを挿入していないＢ．オバツス＋1194株とＬ．プランタルム株を共培養した場合よりも4EPの産生量が増加した。
【００６７】
図３Ｂは、BO1194とPADを過剰発現する遺伝子組換えＢ．オバツス（過剰発現させたBO1194とPADの染色体挿入；「遺伝子組換えBO」）またはBO1194欠失変異体（「変異型BO」）とＬ．プランタルムとをインビトロで共培養した場合の4EPの検出を示す。図３Ｂに示すように、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194欠失変異型Ｂ．オバツスを使用した共培養では、4EPは産生されなかった。一方、BO1194とPADを過剰発現するＢ．オバツスを使用した共培養では大量の4EPが産生された。
【００６８】
図３Ｃは、BO株とLP株のペアを共定着させた無菌マウス（n=5）の尿中4EPSの定量を示す。図３Ｃに示すように、BO1194欠失変異体を共定着させたマウスでは、尿中に検出可能な4EPSは認められなかった。一方、BO1194を過剰発現するＢ．オバツスを共定着させたマウスの尿では大量の4EPSが検出された。
【００６９】
これらの実験から、BO1194に機能喪失変異を含むＢ．オバツスを哺乳動物宿主の腸に定着させると、該哺乳動物宿主における4EPSの産生が低下することが分かる。さらに、これらの実験から、BO1194を過剰発現するＢ．オバツスを哺乳動物宿主の腸に定着させると、4EPSが高発現することが分かる。
【００７０】
実施例４：4EPSを注射したマウスの不安行動
生理食塩水または30mg/kgの4EPSカリウム塩を野生型マウスに３週齢から６週齢にかけて毎日腹腔内（i.p.）注射し、高架式十字迷路アッセイ（図４Ａ〜Ｃ）、明暗箱アッセイ（図４Ｄ〜Ｆ）およびオープンフィールドアリーナアッセイ（図４Ｇ〜Ｉ）において不安を試験した。
【００７１】
図４Ａ〜Ｃに示すように、4EPSを注射したマウスでは、壁のないアームでの総滞在時間が減少し、壁のないアームの先端部での総滞在時間も減少した。また、図４Ｄ〜Ｆに示すように、4EPSを注射したマウスでは、明箱への進入頻度および明箱での総滞在時間が減少した。さらに、図４Ｇ〜Ｉに示すように、4EPSを注射したマウスでは、中心における総滞在時間が減少した。移動距離は、生理食塩水注射マウスと同等であった。
【００７２】
これらの結果から、マウスにおいて4EPS量が増加すると、不安に伴う症状が誘導されることが分かる。
【００７３】
実施例５：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスのオープンフィールドアリーナにおける行動
4EP生合成経路を持つＢ．オバツスまたは4EP生合成経路を持たないＢ．オバツス108CFUとＬ．プランタルムを３週齢の無菌マウスに強制経口投与することによって共定着させた（変異体は実施例３と同様にして作製した）。７〜８週齢において、オープンフィールド試験でマウスの不安様行動（およびASD様行動）を試験した。オープンフィールドアリーナの特定の区画への進入頻度およびそこでの総滞在時間を図５Ａに示す。総移動距離および総移動時間を図５Ｂに示す。中心＝アリーナの最も内側の区画。中心２＝壁と中心の間の区画。
【００７４】
これらのデータにおいて、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスを共定着させたマウスをオープンフィールドアリーナ試験で測定すると、例えば、中心への進入頻度および中心での総滞在時間が増加し、壁際での総滞在時間および壁際での平均滞在時間が減少したことから、マウスの不安（例えばASDに伴う不安など）が緩和されたことが分かる。
【００７５】
実施例６：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの高架式十字迷路（EPM）における行動
108CFUのＢ．オバツス（BO1194＋またはBO1194−）とＬ．プランタルムを３週齢の無菌マウスに強制経口投与することによって共定着させ、７〜８週齢において、高架式十字迷路試験で不安様行動およびASD様行動を試験した。高架式十字迷路の特定の区画への進入頻度およびそこでの総滞在時間を図６Ａに示す。総移動距離を図６Ｂに示す。中央付近までの部分＝壁のないアームの、中心から２／３までの部分。先端部＝壁のないアームの、中心から最も離れた１／３の部分。壁のあるアーム＝壁のあるアーム全体。壁のないアーム＝壁のないアーム全体。
【００７６】
これらのデータにおいて、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスを共定着させたマウスを高架式十字迷路試験で測定すると、例えば、中心での総滞在時間および中心での総滞在時間が増加し、壁際での総滞在時間および壁際での平均滞在時間が減少したことから、マウスの不安（例えばASDに伴う不安など）が緩和されたことが分かる。
【００７７】
実施例７：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの明暗箱における行動
108CFUのＢ．オバツス（BO1194＋またはBO1194−）とＬ．プランタルムを３週齢の無菌マウスに強制経口投与することによって共定着させ、７〜８週齢において、明暗箱試験で不安様行動を試験した。明箱への進入頻度、明箱での総滞在時間、および明箱に初めて進入するまでに要した時間を図７Ａ〜Ｃに示す。明箱への進入頻度は、BO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスを共定着させたマウスと野生型マウスとで同程度であり（図７Ａ）、初回の進入までに要した時間に統計的有意差は全く観察されなかった（図７Ｃ）。一方、変異型（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスを共定着させたマウスでは、明箱での総滞在時間が有意に短かった（図７Ｂ）。
【００７８】
これらのデータから、明暗箱試験における明箱での総滞在時間により測定したところ、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスのマウスへの共定着は、マウスにおける不安に伴う症状（例えばASDに伴う不安など）の緩和に有効であったことが分かる。
【００７９】
実施例８：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの反復行動
4EPを欠失している遺伝子組換え細菌または4EPを産生する遺伝子組換え細菌を定着させたマウスの反復行動スコアを求めた。馴染みのないマウスとの社会的相互作用についてマウスを１０分間にわたってビデオ撮影した。ビデオ動画を手動で解析することによってセルフグルーミング行動を記録し、結果を図８Ａに示した。4EPSの産生を欠損している変異型細菌を定着させたマウスでは、グルーミング行動は有意に少なかった（図８Ａ）。
【００８０】
１インチの厚さの床敷を入れたケージにマウスを単独で入れ、１０分間にわたってビデオ撮影を行った。ビデオ動画を手動で解析することによって穴掘り行動を記録し、結果を図８Ｂに示した。4EPSの産生を欠損している変異型細菌を定着させたマウスでは、穴掘り行動が有意に少なかった（図８Ｂ）。
【００８１】
20個のビー玉を格子状に配置した新しいケージにマウスを慣れさせた。マウスが床敷に埋めたビー玉の数を１０分後に記録し、結果を図８Ｃに示した。EPSの産生を欠損している変異型細菌を定着させたマウスでは、ビー玉埋め行動が有意に少なかった（図８Ｃ）。
【００８２】
これらのデータから、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスをマウスに共定着させると、例えばグルーミング行動、穴掘り行動およびビー玉埋め行動により測定される反復行動などの、マウスの不安およびASDに伴う症状が緩和されたことが分かる。
【００８３】
実施例９：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスの超音波発声アッセイにおける行動
コミュニケーション行動のアッセイとして、超音波発声アッセイを実施した。4EPを欠損している遺伝子組換え細菌または4EPを産生する遺伝子組換え細菌を定着させた雄マウスを雌マウスに毎日１５分間接触させ、これを５日間行った。６日目に、各雄マウスを、馴染みのない雌マウスに出会わせ、超音波発声の頻度およびその持続時間を３分間記録した。結果を図９Ａおよび図９Ｂに示す。BO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスで処置したマウスの超音波発声の頻度（図９Ａ）は、4EPSを産生する細菌で処置したコントロールよりも有意に多く、その持続時間（図９Ｂ）も、4EPSを産生する細菌で処置したコントロールよりも有意に長かった。
【００８４】
これらのデータから、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスをマウスに共定着させると、超音波発声試験により測定されるコミュニケーション行動などが改善され、マウスにおける不安およびASDに伴う症状が緩和されたことが分かる。
【００８５】
実施例１０：4EP＋細菌または4EP−細菌との細菌ペアを定着したマウスのオープンフィールドアッセイにおける行動
オープンフィールドアッセイを実施した際に、4EPを欠失している遺伝子組換え細菌または4EPを産生する遺伝子組換え細菌を定着させたマウスの糞粒を数えた。4EPを欠損している（「4EP−」）雄マウスによる糞便排泄は、野生型コントロールの雄マウスよりも有意に少なかった（図１０）。
【００８６】
これらのデータから、本明細書に記載の実施形態のいくつかによるBO1194に欠失変異を含む（したがって4EPSの産生を欠損している）Ｂ．オバツスをマウスに共定着させると、糞便排泄が低下したことが分かる。
【００８７】
実施例１１：4EPの硫酸化およびその調節
Ｒ＆Ｄシステムズ社のUniversal Sulfotransferase Assay kitTMを用いて、４−エチルフェノール（4EP）またはｐ−クレゾール（PC）の硫酸化を比色分析法により測定した（図１１Ａ）。また、このアッセイで使用した試料をプールし、液体クロマトグラフィー質量分析法（LCMS）で分析して、4EPSとｐ−クレゾール硫酸（PCS）の存在を確認した（図１１Ｂ）。これらの実験から、本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、硫酸化された4EPおよび硫酸化されたｐ−クレゾール（PC）を検出可能であることが分かる。
【００８８】
Ｒ＆Ｄシステムズ社の別のアッセイを用いて、Sult1A1（sulfotransferase family 1A member 1；硫酸化を触媒する酵素）の修飾による4EPから4EPSへの変換が、ケルセチンおよびクルクミンによって抑制できるかどうかを検討した（図１１Ｃ）。これらのデータから、ケルセチンおよびクルクミンがインビトロにおいて4EPの硫酸化を抑制することが分かる。したがって、本明細書に記載の実施形態のいくつかによれば、4EPSの産生の抑制を必要とする対象において、ケルセチンおよびクルクミンにより4EPSの産生を抑制することができると考えられる。
【００８９】
4EPSの産生を欠損している遺伝子組換え細菌を定着させたマウスの様々な組織において、SULT1a1遺伝子の発現を測定した（図１１Ｄ）。SULT1a1は、前記細菌を定着させたマウスの消化管において発現されることが観察された。
【００９０】
細菌を定着させたマウスの様々な組織に由来する細胞質画分において、4EPから4EPSへの変換を測定した（図１１Ｅ）。大腸および肝臓において4EPから4EPSへの変換が大量に起こっていることが観察された。
【００９１】
前述の実施形態の少なくともいくつかにおいて、これらの実施形態において使用された１つ以上の構成要素は、技術的に不可能な場合を除き、別の実施形態の構成要素と入れ替えて使用することができる。請求項に記載された主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法、組成物、キットおよび使用にその他の様々な省略、付加および改変を行ってもよいことは、当業者であれば容易に理解できるであろう。このような改変や変更はいずれも、添付の請求項で定義されている本発明の主題の範囲内にあると見なされる。
【００９２】
本明細書で使用されている実質的に複数形および／または単数形の用語は、当業者であれば、本明細書の記載および／または用途に適するように、複数形の用語を単数のものとして、かつ／または単数形の用語を複数のものとして解釈することができる。本発明を明確なものとするために、様々な単数形／複数形の用語が意図的に使い分けられている。
【００９３】
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（例えば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（例えば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、例えば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「１つ（aまたはan）」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「１つ（aまたはan）」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（例えば、「１つ（aおよび／またはan）」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解するであろう（例えば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（例えば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（例えば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解するであろう。例えば「Ａ��たはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【００９４】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
【００９５】
詳細な説明の提供などの何らかの目的で本明細書に記載された範囲はいずれも、あらゆる可能な部分範囲およびその組み合わせも包含することを、当業者であれば理解できるであろう。前記範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも等分、３等分、４等分、５等分、１０等分などに分割したものも十分に記載されており、このような分割された範囲で本発明を実施可能であることを容易に理解できるであろう。例えば、本明細書に記載の範囲はいずれも、容易に、低域、中域、高域といった３等分などにすることができるが、これに限定されない。また、「以下」、「少なくとも」、「よりも大きい」、「未満」といった用語はいずれも、記載された数値を含むとともに、前述したように、部分範囲に分割可能な範囲も指すことを当業者であれば理解できるであろう。さらに、当業者であれば、本明細書に記載の範囲は各メンバーを含むことを理解できるであろう。したがって、例えば、１〜３つのメンバーからなる群は、１つのメンバーからなる群、２つのメンバーからなる群または３つのメンバーからなる群を指す。同様に、１〜５つのメンバーからなる群は、１つのメンバーからなる群、２つのメンバーからなる群、３つのメンバーからなる群、４つのメンバーからなる群、または５つのメンバーからなる群などを指す。
【００９６】
組成物または組み合わせ製品（例えば、細菌および／もしくは抗生物質を含むか、実質的にこれらからなるか、またはこれらからなる組成物または組み合わせ製品）を使用する方法が本明細書に開示されている場合、この方法において使用される対応する組成物も明確に意図されているものとする。例えば、選択された対象における不安および／またはASDの症状を低減または予防する方法であって、遺伝子組換えバクテロイデス・オバツスおよび／または遺伝子組換えラクトバチルス・プランタルムおよび／またはポリフェノールを含む組成物の一定量を前記対象に投与することを含むことを含む方法が開示されている場合、不安および／もしくはASDに伴う１つ以上の症状を発症する可能性の低減、該症状の発症の遅延または該症状の緩和において使用するための、バクテロイデス・オバツスおよび／またはラクトバチルス・プランタルムおよび／またはポリフェノールを含む対応する組成物も意図されているものとする。
【００９７】
本明細書において様々な態様および実施形態を述べてきたが、当業者であればその他の態様および実施形態も容易に理解できるであろう。本明細書において開示された様々な態様および実施形態は本発明を説明することを目的としたものであり、本発明をなんら限定するものではなく、本発明の範囲および要旨は以下の請求項によって示される。
【図１】
2020507627.tif 000003
【図２Ａ−Ｂ】
2020507627.tif 000004
【図２Ｃ−Ｄ】
2020507627.tif 000005
【図３Ａ−Ｂ】
2020507627.tif 000006
【図３Ｃ】
2020507627.tif 000007
【図４】
2020507627.tif 000008
【図５Ａ】
2020507627.tif 000009
【図５Ｂ】
2020507627.tif 000010
【図６Ａ−１】
2020507627.tif 000011
【図６Ａ−２】
2020507627.tif 000012
【図６Ｂ】
2020507627.tif 000013
【図７Ａ−Ｂ】
2020507627.tif 000014
【図７Ｃ】
2020507627.tif 000015
【図８Ａ−Ｂ】
2020507627.tif 000016
【図８Ｃ】
2020507627.tif 000017
【図９】
2020507627.tif 000018
【図１０】
2020507627.tif 000019
【図１１Ａ】
2020507627.tif 000020
【図１１Ｂ−Ｃ】
2020507627.tif 000021
【図１１Ｄ−Ｅ】
2020507627.tif 000022
【図１２Ａ−Ｂ】
2020507627.tif 000023
【図１２Ｃ】
2020507627.tif 000024
【配列表】
2020507627000001.app
【国際調査報告】
2020507627.tif 000025
2020507627.tif 000026
2020507627.tif 000027