(57)【要約】  本発明は、反射光顕微鏡における粒子懸濁液の顕微鏡画像取得及びラマン分光材料分析のための液体セル（１）に関し、液体セル（１）は少なくとも次の構成要素、即ち底部（３）、底部（３）と反対側の測定窓（５）及びシール（６）を含む測定室（２）を有する。底部（３）は少なくともシール（６）の支持部の領域で平坦にされており、底部（３）は反射表面（４）を有しており、この反射表面（４）は、測定窓（５）を通って入射するラマン励起光が反射表面（４）で方向付けられて反射されて、ラマン測定時にバックグラウンド信号が減少し、懸濁液中の粒子のラマン信号が増加する性状になっている。さらに、本発明は、そのような液体セルを有する顕微鏡に関する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
反射光顕微鏡における粒子懸濁液の顕微鏡画像取得及びラマン分光材料分析のための液体セル（１）であって、前記液体セル（１）は、底部（３）と、前記底部（３）の反対側の測定窓（５）と、シール（６）とを少なくとも含む、測定室（２）を有しており、前記底部（３）は少なくとも前記シール（６）の支持部の領域で平坦にされている、液体セル（１）において、
前記底部（３）は反射表面（４）を有しており、前記反射表面（４）は、前記測定窓（５）を通って入射するラマン励起光が前記反射表面（４）で方向付けられて反射されるようになっていて、粒子のラマン信号が特に２回の励起機会に基づいて増加することを特徴とする液体セル。
【請求項２】
前記底部（３）の前記反射表面（４）は金属又は金属合金を有し、特に前記底部（３）は金属又は金属合金からなることを特徴とする、請求項１に記載の液体セル。
【請求項３】
前記反射表面（４）は前記底部（３）上に配置された反射皮膜（４０）であり、前記反射皮膜（４０）は特に半透明であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の液体セル。
【請求項４】
前記底部（３）は、前記測定室（２）内で充填し、排出し、真空化し、及び／又は貫流を生成するための流入開口部（７１）と流出開口部（７２）を有しており、前記流入開口部及び／又は流出開口部（７１、７２）は特に前記測定室（２）の一部である底部（３）の領域に配置されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体セル。
【請求項５】
前記反射表面（４）は、３００ｎｍ〜８００ｎｍ、特に２１０ｎｍ〜１２００ｎｍの波長範囲で連続的に反射することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体セル。
【請求項６】
前記液体セル（１）は、スライドガイド内に前記液体セル（１）が導入され得るように構成された押圧部材（９）を有しており、前記押圧部材（９）はスライドガイドによって押し下げられて、前記押圧部材（９）は前記測定窓（５）と前記シール（６）と底部（３）と、特に下部（３０）とを押圧し、その結果として、測定室（２）が密閉され、前記押圧部材（９）はその第１の領域が前記測定窓（５）の上又は上方に配置されていて、その第２の領域が底部（３）の上又は上方に配置されていることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体セル。
【請求項７】
前記液体セルはスペーサ部材（２１）を有しており、前記スペーサ部材（２１）は前記液体セル（１）の底部（３）の上に、特に測定室（２）の外部で前記液体セル（１）の底部（３）の上に配置されており、前記押圧部材（９）は第２の領域でスペーサ部材（２１）の上に載っていて、前記測定窓（５）は前記押圧部材（９）により所定の距離まで底部（３）に押圧されることができ、その際に前記スペーサ部材（２１）の高さが前記測定窓（５）の底部（３）からの距離を指定することを特徴とする、請求項６に記載の液体セル。
【請求項８】
液体セル（１）を閉じて固定するための保持装置（２００）と、
請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体セル（１）と、を有するシステムであって、
前記保持装置（２００）は前記液体セル（１）を滑り込ませることができるスライドガイド（２０１）を有しており、前記スライドガイド（２０１）は、前記液体セル（１）が保持装置（２００）に受容されると前記測定窓（５）が前記シール（６）を押圧するように構成された押圧板（２０２）を有するシステム。
【請求項９】
粒子懸濁液の顕微鏡画像取得及びラマン分光材料測定のための手段を有する顕微鏡であって、前記顕微鏡は反射光顕微鏡であり、前記顕微鏡は請求項１から７のいずれか一項に記載の液体セル（１）、又は特に請求項８に記載のシステムを有する顕微鏡。
【請求項１０】
前記顕微鏡は暗視野照明用に構成されており、前記液体セル（１）の底部（３）の反射表面（４）は入射する暗視野照明の反射体として用いられることを特徴とする、請求項９に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、請求項１に記載の液体セル、請求項８に記載のシステム、及び請求項９に記載の顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの医薬品は、基準に従い異物粒子及び／又はタンパク質凝集体について検査される。それどころか多くの場合にこれは米国ＦＤＡなどの官庁の規則によって規定されている。そのような規則は、例えば種々のサイズ等級別の最大粒子数に関係する。限界値を超えないことを保証するために、粒子を特定して定量化しなければならない。これにはタンパク質溶液内の凝集体、異物粒子及び気泡を検出して区別することが含まれる。これは粒子の検出及びそのサイズと形状の決定を可能にするように構成された装置によって行われる。粒子の検出は種々の方法で行うことができる。しかしながら例えば光学顕微鏡などの撮像法が一般的である。
【０００３】
液体セル及び貫流セル中の粒子の撮像は、既に先行技術から知られている（特許文献１（米国特許第５４７１２９４号明細書）、特許文献２（欧州特許第１３２９７０６号明細書）及び特許文献３（米国特許第７６０５９１９号明細書））。例えばフローカムによってセルを貫流する際に粒子の画像を取得して分析できる（米国特許第７６０５９１９号明細書）。粒子の形状パラメーターと評価アルゴリズムを用いて粒子を種々の等級（例えばタンパク質凝集体、気泡、シリコン液滴）に割り当てることができる。ただし、粒子を構成する物質を正確に決定することはできない。そのような方法においては、液体中の粒子の撮像が、ラマン分光法により粒子材料を決定するのと同じ測定セル内で実施できる場合に有利であろう。そうすると、例えば種々のタンパク質又はポリマを識別若しくは区別することができよう。
【０００４】
撮像と標的化を組み合わせた、即ち撮影した画像に基づくラマン分光測定のためには、このように構成された顕微鏡は、広範な光学的及び機械的装置を備える必要があろう。その理由は特に、ラマン分光測定が通常ポイント測定であり、ラマン分光測定が正しい場所で実行されることが保証されなければならないことにある。そうしてのみ両測定法を組み合わせて相関性のある全体的な測定結果を得ることができる。
【０００５】
ラマン分光法のために、いわゆる「ウェットセル」内で粒子の移動を自動化する方法が知られている。振動分光法を実行することを目的として、懸濁液中の微粒子のサイズと形状及び場所の自動検出は、既にマルバーン（マルバーン・アプリケーションノート「形態学的ラマン分光法による懸濁液中及びフィル膜上のタンパク質凝集体の特性評価」によって記述されている。「薄いパスのウェットセル」で粒子の自動検出とラマン分光法を組み合わせることにより、１つのタンパク質溶液中で種々異なる粒子種を区別できることを示す結果が公開されている。試料の撮像は透過光で行われるため、測定セルの上側と下側の両方で石英製の透明な測定窓が使用される。
【０００６】
粒子のラマン分光法にも使用できる別の液体セルは、特許文献４（独国特許出願公開第１０２０１３０１５０３３号明細書）に記載されている。この貫流セルにおける撮像は、反射光ジオメトリで行われる。
【０００７】
前述した両測定セルの問題点は、基体のバックグラウンドが高いことである。一般的に使用されるガラス又は石英ガラスも測定中にラマン信号を発生し、この信号は試料の測定すべき信号と重なって、信号の品質が著しく劣化するために粒子状物質の識別が困難になることがある。これは特に微粒子の測定に該当する。なぜなら、ここでは励起光によって露光されるスポットが分析すべき粒子よりも著しく大きくなり、そのためにバックグラウンド信号の割合が非常に大きくなる可能性があるからである。
【０００８】
測定の高いバックグラウンドに加えて、そのような測定では次の問題も解決されなければならない。
【０００９】
測定室に充填する際に形成されることがある気泡は、測定アーチファクトにつながる可能性があるため回避されなければならない。気泡の形成は、特に高粘度の懸濁液で問題となる。
【００１０】
液体セルの可能な限り多様な使用可能性を保証するために、セルは不活性材料で作られなければならず、後続の試料の汚染を排除できるように特に簡単に洗浄できなければならない。
【００１１】
さらに、検査すべき懸濁液の層厚は非常に重要である。なぜなら層が厚すぎると粒子に最適な焦点を合わせることができないからである。逆に液体層が非常に薄いと、焦点に近い位置にある窓材料によって非常に高いバックグラウンド信号が生成される危険があるからである。このバックグラウンド信号がラマン信号に重なって、粒子状材料の分光測定を困難にする。
【００１２】
さらに、粒子数の少ない試料（かなり大きい体積が必要とされる）を検査できるとともに、少量しかない試料（少量の試料体積）も検査できるように、検査可能な試料体積は可変であるべきである。
【００１３】
公知の方法では往々にして画像コントラスト、即ち粒子と背景との間のコントラストは十分に高くない。これは測定においても測定データの評価においてもエラーにつながる。
【００１４】
ラマン分光法によって粒子状物質を決定する際の別の困難は、十分に高い信号品質を達成することである。例えばタンパク質凝集体は、しばしばラマン信号が周囲の液体の信号からほとんど区別されない高濃度タンパク質溶液で検査されなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５４７１２９４号明細書
【特許文献２】欧州特許第１３２９７０６号明細書
【特許文献３】米国特許第７６０５９１９号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第１０２０１３０１５０３３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって本発明の課題は、上記の多数の問題が有利な方法で解決される液体セルを提供することであり、特に画像支援ラマン分光測定に関して本発明による液体セルの測定における信号対雑音比が改善されるべきである。さらに、本発明の課題は、上記の目的を有利に実現できる顕微鏡を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係る問題は、請求項１に記載の液体セルによって解決される。本発明の有利な構成は従属請求項に記載されており、以下に説明する。
【００１８】
それによると、顕微鏡画像の取得と、反射光顕微鏡での粒子懸濁液の画像支援ラマン分光材料分析のための液体セルは、少なくとも次の構成要素、即ち
底部と、底部の反対側の測定窓と、シールとを含む測定室を有しており、
底部は少なくともシールの支持面の領域で平坦にされており、
底部は特に平滑な、特に部分的に平滑な反射表面を有しており、この反射表面は、測定窓を通って入射する光、特にラマン励起光が反射表面で方向付けられて反射されるようになっているため、ラマン測定時のバックグラウンド信号が減少し、懸濁液に含まれている粒子のラマン信号が増加する。
【００１９】
この場合、反射表面は、電磁スペクトルの少なくとも広い範囲で、特に紫外、可視及び近赤外スペクトル範囲で、特に７０％以上の反射率を有する。表面は、衝突する光線が方向付けられて、しかも入射角にはほとんど依存せずに反射するようになっている。即ち、反射は特に全反射のための臨界角のみに制限されることはない。反射表面は有利には、特に励起レーザが反射に基づいて粒子を２回、即ち対物レンズから試料までの経路と反射表面で反射した後の経路で励起することによって、ラマン分光測定において信号対雑音比が改善されるようにする。加えて底部のバックグラウンド信号が抑制され、それによって試料信号がより良好に検出可能となる。底部は、十分方向付けられた反射に適した品質をもたらすために、そしてまた暗視野照明にも有利に使用可能であるようにするために、十分な程度に滑らかで平らな表面を有するべきである。滑らかさ又は粗さを特性評価するために、表面のいわゆるＲＺ数も援用できる。ＲＺ数は、特に面の平均粗さを表す。ＲＺ数の決定は、当業者にはよく知られている。ＲＺ数は特に０．１未満、好ましくは０．０１未満であるべきである。ラマン信号の増加は、特に例えば表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）で使用される試料表面効果の結果ではない。
【００２０】
特に、底部は平面に沿って延びている。
【００２１】
本発明は、有利には特に１ｍｍ未満の比較的小さい作動距離、したがって対応して大きい開口数を有する顕微鏡又若しくは対物レンズを使用することを可能にし、このことは特にラマン測定における改善された信号対雑音比に関して有利である。
【００２２】
湾曲した、例えば球形又は円筒形の底部ジオメトリ又は測定室ジオメトリによる解決策は、本発明による解決策より劣っている。なぜなら湾曲した測定室ジオメトリは作動距離の短い対物レンズの使用には適しておらず、より大きい、特に５ｍｍ以上の作動距離と、それに対応して測定室天井から底部までの距離の増加を補償するために小さい開口数を必要とするからである。
【００２３】
したがってそのような湾曲した測定室ジオメトリの開口数は、特に平坦な底部と非常に平坦な測定窓を備えた本発明による液体セルと比較して、同じレンズ径で３分の１以下であり、その結果ラマン信号の収集効率は９分の１以下に低下する。
【００２４】
さらに、湾曲した測定室ジオメトリは、特に励起光の光学的再焦点合わせのリスクを孕んでおり、このことは誤信号をもたらす可能性がある。
【００２５】
本発明によれば、液体セルの底部はシールの支持部の領域で平面であるか又は平面状に作製されており、したがって特に凹部はない。そのように成形された底部はシール支持部の領域では特に平坦であり、試料が塗布される又は測定室によって包含される底部の領域と形状結合的に成形されている。このように構成された底部では、非常に低いシールも使用できる。ここでは特に、例えばテフロン（登録商標）テ（即ちポリテトラフルオロエチレン、ＰＴＦＥ）からなるシール、特にテフロン（登録商標）フィルム、又は他の薄い封止材料、例えばポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネートからなるシールを有利に使用できることが分かった。そのようなフィルムの厚さ（及びその結果として生じるシールの高さ）は、特に数マイクロメートルの範囲、例えば５０μｍ〜５００μｍである。
【００２６】
特に凹部のない液体セルの利点は、特に液体セル若しくは底部の洗浄が簡単にできることである。なぜなら周知のように、縁部などのすべての凹部は不純物が堆積する領域を形成するからである。
【００２７】
また、平らなシールは凹部に挿入する必要がないので、厚いシールよりも著しく大きい支持面を有することができる。そのように拡大された支持面は、特にシールの厚さが小さい場合にシールの機械的安定性を高め、取り扱いやすさを向上させる。
【００２８】
これらの凹部のない若しくは平面状の液体セルのための平らなシールはさらに有利には、測定容積の平たい円筒形の構成から外れて、例えば平たい直方体の容積を使用することを可能にする。後者は液体セルを貫流セルとして使用する場合に、例えば平たい円筒形容積の場合のように、入口と出口の中間で流れ断面が広くなる構造よりも好ましい流動プロファイルを可能にする。
【００２９】
したがって本発明の別の実施形態によれば、液体セルは直方体の測定室を有するようにされている。
【００３０】
本発明による液体セルは、光線経路に関してエピジオメトリ又は反射光ジオメトリを有し、試料の照明と測定信号のいずれも同じレンズ若しくは対物レンズ（エピ構造）を通して行われる顕微鏡で有利に使用できる。このジオメトリは、例えば流入開口部及び流出開口部も底部に配置でき、液体セルの底部が顕微鏡の光学系に干渉することなく、例えば温度調整や貫流生成などのタスクに利用できるのでしばしば有利であることが分かっている。
【００３１】
本発明による液体セルは、反射光ジオメトリにおいて画像取得と画像支援ラマン分光法の両方を実行するように組み合わせた測定装置で有利に使用できる。本発明によるそのような液体セルは、構成要素から簡単に構成することができ、特に経済的に製造できる。液体セルの各構成要素は、特にモジュール式に交換可能である。
【００３２】
一実施形態によれば、底部は、測定室内で充填し、排出し、真空化し、及び／又は貫流を生成するための流入開口部と流出開口部を有しており、流入開口部及び／又は流出開口部は、特に測定室の一部である底部の領域に配置されている。これらの開口部は別の接続部を含むか、そのような接続部を備えることができる。
【００３３】
流入開口部と流出開口部は、特にかなり多量の液体を比較的高速でポンピング及び／又は圧送するように構成されている。ここで開口部は、特に毎分２０μｌ〜１００μｌの液体量のために設計されている。
【００３４】
流入開口部及び／又は流出開口部が、カニューレの先端がこれらの開口部と接続可能、取付け可能、又は液密に装着可能であるように構成されていると、有利である。これらの開口部は、特に１ミリメートルの直径を有する。
【００３５】
本発明の一実施形態によれば、底部の反射表面は金属又は金属合金を含み、特に底部は金属又は金属合金からなり、したがって表面と底部は一体的に形成されている。
【００３６】
例えば反射表面が鏡面研磨されたステンレス鋼製の底部が適している。そのような底部は、ほとんどの溶液に対して不活性であることが有利であり、容易に洗浄でき、特別に長寿命である。
【００３７】
必要に応じて反射する底部に、例えば懸濁液成分の堆積を防止し、又は反射表面を溶媒若しくは懸濁液の影響から保護する皮膜を塗布することができる。
【００３８】
本発明の代替実施形態によれば、反射表面は、底部に配置された、例えば電気的に塗布、蒸着又は接着された反射皮膜、例えば金、銀及び／又はニッケルである。
【００３９】
底部は、特にガラス、石英ガラス、又はガラス状基体を有するか、ガラス、石英ガラス、又は反射皮膜の基体として機能するガラス状基体からなることができる。
【００４０】
本発明の一実施形態によれば、反射表面は半透明であり、特に透明な基体上に配置されている。この基体は特に底部を形成する。
【００４１】
基体は、特にガラス、石英ガラス、又はガラス状基体を有するか、ガラス、石英ガラス、又はガラス状基体からなることができる。ガラス、石英ガラス、ガラス質物質の利点は、これらの材料が、高価な精製ステップを必要とすることなく分子的に平坦な、即ち非常に平らな表面を形成できるという特性を有することである。
【００４２】
反射表面の半透明性とは、与えられた光の波長で表面が入射光の一部を反射し、光の別の部分に対して透明であることに関係し、反射率は特に９５％未満、透過率は特に５％である。
【００４３】
本発明の一実施形態によれば、底部は、特に底部がガラス基体又は類事物を有する場合に下部に配置若しくは載置されている。ここで、下部は特に開口部又は凹部を特に中央部に有しているため、底部は開口部又は凹部を通して光学的及び／又は機械的に、特に顕微鏡対物レンズに取って接近可能である。
【００４４】
本発明の一実施形態によれば、半透明表面は、透明な基体上に配置された半透明皮膜である。
【００４５】
そのような皮膜は、例えば金属又は金属合金を含むことができ、その皮膜の厚さは特に１０ｎｍ〜２００ｎｍ、特に５０ｎｍ〜１５０ｎｍを有する。
【００４６】
半透明皮膜は、特にガラス又は石英ガラス製の基体上に塗布、蒸着又は接着された金皮膜、銀皮膜又はニッケル皮膜である。
【００４７】
そのような半透明皮膜は、特に透過光ベースの顕微鏡法とラマン分光法のいずれも、別の液体セルを使用する必要なく同じ試料で実施することを可能にする。
【００４８】
特に半透明皮膜の材料は、皮膜が光の第１の波長範囲で半透明であり、第２の波長範囲で主として又は完全に反射し、特に６０％を超える反射率を有するように選択できる。
【００４９】
特に半透明皮膜がラマン分光励起の範囲、特に第２の波長範囲で主として反射し、特に６０％を超える反射率を有し、特に第１の波長範囲で使用される透過光顕微鏡法の波長範囲で少なくとも３０％の透過率を有する。
【００５０】
したがって本発明による液体セルは、エピ構造のラマン分光測定も透過光顕微鏡法を可能にし、その結果粒子を背景から光学的に際立たせるための有利なコントラスト機構が得られる。
【００５１】
皮膜をベースとする実施形態では、底部に複数の皮膜が塗布されるように、例えばニッケル皮膜上に金皮膜が蒸着されるようにもなっている。このような複数の皮膜の最上層として、例えば機能性分子層を配置することができる。
【００５２】
さらに複数の皮膜は、ブラッグレフレクターを実現するために使用することもできる。
【００５３】
このことは既に上で説明したように、例えば懸濁液成分の堆積を防止し、又は場合により反射皮膜を懸濁液の有害な影響から保護する皮膜も包含する。
【００５４】
本発明の一実施形態によれば、反射表面は可視スペクトル範囲、特に３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長範囲、特に２１０ｎｍ〜１２００ｎｍの範囲で、特に７０％以上の反射率で連続的に反射する。
【００５５】
本発明のこの変化例は有利には、本発明による液体セルが、励起波長及び検出波長とは関係なく多くの用途で使用可能であることを保証する。
【００５６】
さらに、有利にはそのような反射表面を備えた暗視野照明を実現することができる。
【００５７】
本発明の別の実施形態によれば、液体セルは本発明を組み立てた状態で液体セルがスライドガイド内に導入され得るように構成された押圧部材を有しており、この押圧部材は液体セルがスライドガイドに導入されるとスライドガイドによって押し下げられて、押圧部材は測定窓とシールと底部とを押圧し、その結果測定室が密閉され、ここで、押圧部材はその第１の領域が測定窓の上又は上方に配置され、特にその第２の領域が底部の上又は上方に配置されている。
【００５８】
そのような液体セルは、挿入された状態では液密及び／又は気密になる。
【００５９】
したがってスライドガイドは、特に押圧部材及び底部と相互作用して、液体セルが一緒に保持されるようにする。
【００６０】
押圧部材は、液体セルが迅速かつ複雑でなく組み立て得ることを有利な方法で実現する。構成要素を単純にサンドイッチ状に挟み込み、次にスライドガイドに挿入することによって、機能的な液体セルを得ることができる。
【００６１】
押圧部材は、特に保持リングとして実施可能であり、さらに液体セルが組み立てられた状態でも顕微鏡下での測定が可能である。なぜなら測定窓の中央領域で励起及び検出が行われることができ、押圧部材は保持リングとしてリング状に構成されていて反射光顕微鏡の光学系と干渉しないからである。
【００６２】
本発明の別の実施形態によれば、液体セルはスペーサ部材を有しており、スペーサ部材は液体セルの底部の上に、特に測定室の外部で液体セルの底部の上に配置されており、押圧部材は第２の領域でスペーサ部材上に載っていて、測定窓は押圧部材により所定の距離まで底部に押圧されることができ、その際にスペーサ部材の高さが測定窓の底部からの距離を指定する。
【００６３】
特にスペーサ部材により、特に測定室の高さと容積、特に測定窓の測定室の底部までの距離が、特にスペーサ部材の高さによって調整可能である。
【００６４】
例えばワッシャ若しくは座金であってよいスペーサ部材により、液体セルのモジュール原理が有利に実装される。スペーサは特に底部と固定して接続されていない。そのため異なる高さの測定室を実現するために、種々の高さのスペーサ部材を使用できる。
【００６５】
本発明の別の実施形態によれば、液体セルは挿入部材を有しており、この挿入部材は底部とシールとの間の凹部に配置されていて、その結果シールは凹部内で挿入部材の高さだけ上方にずれて配置されており、その結果として特にスペーサ部材によって事前に定義された測定窓の底部からの距離において、既に測定窓は測定室が密閉されるようにシール上に載っており、挿入部材は特に、挿入部材の高さがスペーサ部材の高さに対応するか、スペーサ部材の高さと固定した量だけ異なるように寸法設計されている。
【００６６】
挿入部材は、特に種々異なる高さのスペーサ部材に対しても密閉性が達成されるように働く。
【００６７】
挿入部材は、例えばインサートディスクであってよい。挿入部材は特に底部と固定して接続されており、本発明のモジュール性に寄与する。
【００６８】
特に、液体セルの他に必要に応じて使用される複数の異なる挿入部材やスペーサ部材も含むシステムが考えられる。それによって測定室の高さと容積が異なる複数の液体セルを実現できる。
【００６９】
特に種々異なるスペーサ部材と挿入部材を使用することにより、一方では測定室内の液体層の厚さをそれぞれの試料に合わせて設定でき、他方では測定室の容積も十分に大きく又は小さく形成することができる。
【００７０】
挿入部材とスペーサ部材は、特に測定窓の外縁部の圧力による破損を防ぎながら、測定室の圧密性が保証されているように互いに適合されている。両要素が具体的にどれほどの高さでなければならないかは当業者に知られており、とりわけ凹部の深さ、シールの高さ、及び測定窓の厚さに応じて決まる。
【００７１】
本発明の別の実施形態によれば、測定窓は少なくとも２１０ｎｍ〜１２００ｎｍのスペクトル範囲、好ましくは５３２ｎｍ〜７８５ｎｍのスペクトル範囲の光に対して８０％を超える透過率を有しており、測定窓は特に石英ガラスを含んでいる。
【００７２】
そのような測定窓により、例えばトリプトファン蛍光を励起して検出することが可能である。
【００７３】
本発明に係る問題はさらに次の特徴、即ち
液体セルを閉じて固定するための保持装置と、
本発明による液体セルとを有するシステムであって、
保持装置は液体セルを滑り込ませることができるスライドガイドを有しており、このスライドガイドは、液体セルが保持装置に受容されると測定窓がシールを押圧するように構成された押圧板を有するシステムによって解決される。
【００７４】
本発明に係る問題はさらに次の特徴を有する顕微鏡によってさらに解決される。
【００７５】
そのような顕微鏡は、粒子懸濁液の顕微鏡画像取得及びラマン分光材料測定のための手段を有する顕微鏡であって、顕微鏡は光学的反射光顕微鏡であり、この顕微鏡は本発明による液体セルと、特に保持装置又は特にシステムを有する。
【００７６】
本発明による顕微鏡を用いて、反射光ジオメトリにおいて粒子懸濁液で上記の検査を行い、有利には信号対雑音比が特に反射しない基体を有する液体セルと比較して、本発明による液体セルを使用することによって改善されている。
【００７７】
本発明でいう顕微鏡は、特に２００ｎｍ〜１２００ｎｍの使用に適した光学系を有する光学顕微鏡である。
【００７８】
顕微鏡画像取得の手段は、例えば対物レンズ、カメラなどの検出器、及び／又はレーザ、ハロゲンランプ、又はダイオードやアークランプなどの他の種類の光源を含む。
【００７９】
ラマン分光測定の手段は、例えば励起レーザ、点検出器、及びラマン測定に適したフィルタを含む。
【００８０】
本発明の一実施形態において、顕微鏡は、液体セル内の試料の暗視野照明を可能にする手段を有し、液体セルの反射する底部は入射する暗視野照明に対する反射体として機能する。
【００８１】
暗視野照明のためのそのような手段は、例えばそのような暗視野照明を反射光ジオメトリで実行できる特別な暗視野レンズを有する。
【００８２】
この場合、暗視野照明は、特定の試料及び粒子懸濁液に対してより高い画像コントラストを達成できるという利点がある。特に屈折率が溶媒と少ししか異ならない試料を、暗視野照明と本発明による液体セルの助けを借りて有利に検出及び測定できる。
【００８３】
ここで、暗視野照明と液体セルの底部の反射表面との組み合わせは、特に有利である。なぜなら底部の反射表面は暗視野照明を反射するため、底部から対物レンズに戻って散乱するの迷光が可能な限り少なくなり、その結果として画像コントラストが高くなるとともに、懸濁液中の粒子をより良好に特定できるようになる。
【００８４】
暗視野照明において表面品質は非常に重要である。なぜならわずかな凹凸でも表面にある粒子が生成する信号と必ずしも区別されない信号を生み出すからである。
【００８５】
構造／粒子を良好に捕捉するために、表面粗さは粒子自体と同じオーダーであるべきではない。本発明による粒子はサブマイクロメートル範囲又はマイクロメートル範囲で分光測定されるので、表面粗さはそれに応じてより小さい、特にナノメートル又はサブナノメートル範囲にある。
【００８６】
以下に本発明の別の特徴と利点は、例示的な実施形態の図面の説明を参照して説明する。図面の説明は、幾つかの実施形態の例示にすぎず、本発明のすべての可能な実施形態の最終的な開示として解釈されるべきではない。しかしながら実施形態に関連してのみ開示されている個々の特徴は、特許請求の範囲の他の特徴と矛盾しない限り、例示的な開示を通じて特許請求の範囲の特徴として使用できる。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、本発明による液体セルの断面の概略図を示す。
【図２】図２は、本発明による液体セルの変形例の断面の概略図を示す。
【図３】図３は、液体セルを備えた保持装置の異なる表現を示す。
【図４】図４は、ラマン信号に対する反射表面の影響の図を示す。
【図５】図５は、挿入部材のない液体セルの実施形態を示す。
【図６】図６は、本発明による液体セルの組立を表す一連の画像を示す。
【図７】図７は、本発明による液体セルの変形例の断面の概略図を示す。
【図８】図８は、透過光顕微鏡法に適した本発明による液体セルの種々の図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
図１及び図２には、本発明による液体セル１のｚ軸ｚ高さ及びラマン励起の方向）に沿った断面が示されている。液体セル１は、反射表面４、４０を備えた底部３を有しており、底部３は凹部８を備えていて、ここではＯリングの形態のシール６が挿入されている。シール６と凹部８との間には、ここではインサートディスクの形態の挿入部材２０が配置されている。凹部８は、この例では溝の形で形成されている。シール６の上には、測定窓５が配置されている。シール６、測定窓５、及び底部３によって囲まれた空間が、測定室２を形成する。
【００８９】
座金の形態のスペーサ部材２１が測定室２の外部に配置されており、スペーサ部材２１は高さ（すなわちｚ軸に沿った）が、一方では測定窓５の押圧を介してシール６に対する密閉効果が保証され、他方ではスライドガイド２０１と組み合わせた押圧部材９によって測定窓５に加えられる圧力が測定窓５の破損をもたらさないことが保証されるように寸法設定される。言い換えると、ｚ軸に関する押圧部材９の最低位置はスペーサ２１によって規定される。測定室２の底部３はさらに流入開口部及び流出開口部７１、７２も有する。これらの開口部７１、７２を通して、液体セル１を分解することなく試料液を交換したり、測定室２を洗浄したりすることができる。
【００９０】
液体セル１は少数の構成要素のみからなり、モジュール式に構成されている（図６を参照）。即ち、液体セル１は簡単に洗浄できる。さらにモジュール構造により個々の構成要素を簡単に交換でき、特定の用途に適合させることができる。液体セル１は、検査すべき試料溶液又は懸濁液の層厚が、タンパク質製剤中の粒子の認識及び画像支援ラマン分析に最適になるように設計されている。さらに記載された例では、液体セルはｘ−ｚ面に沿って円形に作製されている。しかし他の基本形状も問題なく考えられ、ここで除外されるものではない。
【００９１】
液体セル１の底部３は、ステンレス鋼でできている。したがって底部３は錆びず、耐久性があり、試料と相互作用しない（不活性）。ステンレス製の底部３は、特に洗浄が簡単である。
【００９２】
図１では、底部３のステンレス鋼表面４は研削及び／又は研磨されている。これによりナノメートルレベルで高度に平滑な反射表面４が提供される。ここで、粗さはいわゆるＲＺ数によって特性評価できる。ＲＺ数は０．１未満、好ましくは０．０１未満であることが有利である。
【００９３】
図２には、液体セル１の変形例が示されている。ここでは底部３は測定室２の側に、反射皮膜４０を反射表面４として有しており、皮膜４０は底部３とは異なる材料で作られている。これは、例えば基体上に蒸着された金、銀又はニッケルの薄層であることができる。したがって励起波長と測定すべき試料に応じて、別の反射材料を使用できる。加えて底部３の廉価な使い捨ての変形例を提供することができる。ここでもＲＺ数は０．１未満である。
【００９４】
液体セルの別の変形例が図５に、完全な断面図及び半断面図として示されている。構成要素の参照番号及び配置は、図１及び図２の変形例と実質的に同じである。しかしながら図１及び図２とは異なり、図５の液体セルは挿入部材２０を有していない。この変形例では、スペーサ部材２１、シール６の厚さ、及び溝の深さ（凹部８）は、挿入部材２０を省くことができるように正確に選択されている。
【００９５】
図７には、本発明による液体セル１のｚ軸ｚ（高さ及びラマン励起の方向）に沿った断面が示されている。液体セル１は、反射表面４０を備えた底部３を有しており、底部３は透明な基体、即ちガラスで作られ、反射表面は半透明であり、即ちわずか５０ｎｍの金属皮膜を有する。図１及び図２の例とは異なり、底部はシール６が挿入される凹部を有しておらず、シール６の支持面の領域で平坦である。シール６はテフロン（登録商標）フィルムで作られ、高さはわずか１００μｍであるため凹部は不要である。この液体セルにより透明な底部３と半透明の金属皮膜に基づき、ラマン分光法のための反射型液体セルの利点が著しく損なわれるようなことはなく、エピ構造のラマン分光法も透過光顕微鏡法も実行できる。
【００９６】
図８には、本発明の別の実施形態が種々の図で示されている。具体的には、Ａ）には液体セル１の断面図、Ｂ）には断面図Ａ）の拡大詳細図、Ｃ）には液体セル１の下方からの斜視断面図、Ｄ）には液体セル１の斜め上方からの斜視断面図が示されている。
【００９７】
この実施形態は底部３を有しており、これはガラス基体上に厚さ５０ｎｍの、したがって半透明の金皮膜を有する。底部は下部３０の上に配置されており、下部は金属製で中央に凹部３１を有するので、底部は特に顕微鏡対物レンズのために下方から光学的及び機械的に接近可能である。したがってこの実施形態は、液体セル１を透過光でも顕微鏡で観察するのに特別適している。
【００９８】
測定窓５は、図示された他の実施形態におけるように、押圧部材９によって下部及び底部と接続されるが、これは特に液体セルが専用に設けられた保持装置に挿入されて、この保持装置が押圧部材と底部を互いに押し付けることで行われる。
【００９９】
測定窓５と底部との間には縁部に薄いテフロン（登録商標）フィルムが端部に配置され、液体セル１のシール６として機能する。
【０１００】
さらに、液体セルには流入開口部と流出開口部（図示せず）を配置することができ、これらは例えば底部内の開口部として実現することができる。
【０１０１】
以下の論述は、液体セル１のすべての実施形態に従い、それぞれの実施形態で実現可能である限りにおいて該当する。
【０１０２】
反射表面４、４０の鏡効果により、励起光、例えば、励起レーザの光は試料を２回通過するので、理想的には２倍強いラマン信号になる。さらに反射表面は、ガラスなどの他の多くの材料とは異なりバックグラウンド信号を引き起こさない（図１及び図２）。
【０１０３】
撮像は、少なくともスペクトルの可視範囲で透明な測定窓５によって行われ、透明な範囲は近赤外範囲（最大約１０００ｎｍ）及び紫外範囲（最大約２１０ｎｍ）に及び得る。種々の測定窓５のセットを液体セル１に挿入することができるので、各測定ごとに最適な厚さと透過率を備えた測定窓５を提供することができる。
【０１０４】
測定窓５として、例えば直径約５０ｍｍの石英ガラス、ゴリラガラス、ロータスガラス又はウィローガラス製の透明ディスクが使用される。測定窓５の厚さは約５００μｍであり、したがって、一方で圧力による変形及び破損に耐えるのに十分安定しており、他方では光学収差、ひいては撮像と分光法の劣化を最小限に抑えるために十分薄い。
【０１０５】
２６６ｎｍのトリプトファン自家蛍光を励起するために、ＵＶでも可視スペクトル範囲でも透明である石英製の測定窓５が使用されることが好ましい。
【０１０６】
懸濁液の層厚は、底部３から測定窓５までの距離によって５０μｍ〜５００μｍの間で調整できる。この範囲では、一方では試料粒子への良好な焦点合わせが可能であり、他方では窓材料のラマン励起によるバックグラウンド信号が少ない。
【０１０７】
測定室２を形成する材料は、すべて非常に不活性である。
【０１０８】
環状溝（この例では凹部８に対応する）の外径は４５ｍｍであり、それにより測定室２の撮像面が画定されている。溝の深さは１．７ｍｍである。溝には、最初に挿入部材２０としてインサートディスクが挿入され、その上にシール６が配置される。検査すべき液体の層厚は５０μｍ（インサートディスクがあいか又は高さが非常に小さい）〜５００μｍ（インサートディスクの高さ５００μｍ）で、スペーサ部材２１の高さによって決定される。この場合、挿入部材２０、ここではインサートディスクの高さは相応に調整されて測定室は密になる。したがって検査すべき試料の体積は、スペーサ部材２１の高さによっても決まり、したがって８０μｌ〜８００μｌである。Ｏリング６は、耐溶剤性に優れ検査すべき液体と相互作用しないＰＴＦＥ又はバイトンを含んでいる。Ｏリングのコードの太さ（高さ）は２ｍｍである。溝の深さとＯリングの厚さは、実質的に同じままである。挿入部材２０は、高さがスペーサ部材２１の高さに適合されている。
【０１０９】
液体セルの組立
図６には、本発明による液体セルの組立が一連の画像として示されている。組立の手順はＡ）から始まり、Ｆ）まで実行されて組み立てられた液体セルになる。
Ａ）モジュール式液体セルのすべての個別部材はまだ組み合わされておらず、ばらばらに存在している。この例では個別部材は底部３、測定窓５（ここでは破線の境界線で示されている）、挿入部材２０としてのインサートディスク、スペーサ部材２１としてのワッシャ、シール６、及び押圧部材９である。この例では底部３に流入開口部と流出開口部がない。しかしながら代替としてこれらの開口部７１、７２を備えた底部３も考えられる。
Ｂ）挿入ディスク２０が底部３の凹部８に挿入される。
Ｃ）次にシール６が底部３の凹部８内のインサートディスク上に置かれる。
Ｄ）続いてスペーサ部材２１が底部３の上に置かれる。
Ｅ）次に測定窓５がシール６上に置かれる。
Ｆ）そして押圧部材９が測定窓５と距離要素２１の上に置かれる。
【０１１０】
この組み立てられた状態で液体セル１は、スライドガイド２０１を備えた保持装置２００内に滑り込ませることが可能である。保持装置２００は、顕微鏡ステージ２０３上に配置されている。さらに、保持装置２００はスライドガイド２０１の領域に押圧板２０２を有しており、押圧板２０２はスライドガイド２０１に滑り込ませた液体セル１の側面に圧力を加えるように構成されている。これらの両構成要素が本発明によるシステムを構成する。
【０１１１】
図３には、液体セル１を滑り込ませた保持装置２００からなるシステムが示されている。スライドガイド２０１は、押圧部材９を部分的に囲んで把持している。底部３は押圧板２０２によりスライドガイド２０１内で上方（ｚ軸方向）に押し上げられて上側ガイドに押し付けられるので、押圧部材９が液体セル１を密封し、液体セル１は安定して組み立てられたままである。
【０１１２】
図３では、底部３は流入開口部及び流出開口部７１、７２を有している。
【０１１３】
液体セルの取り扱い／充填
液体セル１への試料液の充填は、開いた液体セル１（測定窓５が開いているか、測定窓５がない）、又は閉じた液体セル１（測定窓５が閉じている）で行うことができる。閉じた液体セル１では、試料液は流入開口部７１と流出開口部７２を通して導入又は排出可能である。
【０１１４】
この場合、流入開口部７１と出口開口７２は液体セル１の底部３に、測定室２の充填及び排気が可能であるように配置されている。排出開口部７２を通して測定室２内に負圧を発生させることができ、これにより測定室２の気泡のない充填が可能になる。そうすることによって懸濁液中の空気又は気泡が自動粒子認識を誤らせることが回避される。測定室２の充填は、例えばピペット／ピペットチップで、又はルアーシステムを介してホースを接続することにより行われる。
【０１１５】
この場合、撮像は顕微鏡の反射光ジオメトリで行われる。測定室２の全表体を撮像することができる。その際に粒子認識は、例えばアルゴリズムによって自動的に行われる。
【０１１６】
顕微鏡
適切な顕微鏡は、画像取得と粒子認識のために１０倍（通常ＮＡ０．２５）又は２０倍（通常ＮＡ０．４５）の対物レンズを備えている。対応する被写界深度は、約２０μｍ又は約５μｍである。この場合、画像取得は好ましくは暗視野照明で実行されるが、これは底部３の反射表面４が平滑であるために可能である。これにより粒子と背景のコントラストが高くなり、自動のコンピュータ支援粒子認識が改善される。
【０１１７】
特に、可変の層厚を有する液体セル１の実施形態では、サイズが異なる粒子に対する条件を最適化することができる。小さい粒子に対しては小さい層厚が調整されて２０倍の対物レンズが使用され、大きい粒子に対しては大きい層厚が調整されて１０倍の対物レンズが使用される。
【０１１８】
使用される対物レンズに関係なく、ＵＶ透過測定窓５を使用すると画像取得は自家蛍光によって行うことができる。
【０１１９】
粒子は、自動化された画像支援ラマン分光法によって分析される。この目的のために、タンパク質によって強く散乱される波長５３２ｎｍのレーザが使用される。レーザ光の入射及びラマン信号の検出は５０倍又は１００倍の対物レンズによって行うことができる。
【０１２０】
図４には、測定されたラマン信号１０３、１０４に対する反射ニッケル表面１０１の影響がゴリラガラス製の基体１０２と比較して示されている。
【０１２１】
図の左上隅には、ニッケル表面１０１の顕微鏡画像とゴリラガラス表面の図が差し込まれている。これらの画像はコントラストがほぼ同じであるため、画像取得における違いは確認されない。液体セル内の明視野で撮影された画像はそれぞれ、各ラマンスペクトルが記録された比較可能な粒子の位置を示している。
【０１２２】
しかしタンパク質のラマン測定１０３、１０４は明らかに違いを示している。ゴリラインレット基体で測定されたラマン信号１０４は、反射ニッケル表面１０３上の同じ懸濁液の同等の測定値よりも明らかに低いタンパク質信号レベル１００を有する。ニッケル表面におけるバックグラウンド（破線）も増加しているが、これは信号１０３から簡単に差し引いて修正信号を得ることができる。ニッケル表面１０３におけるタンパク質の信号レベル１００は、ゴリラガラス１０４上で測定した場合よりも著しく高い。
【０１２３】
さらにニッケル表面１０１、１０３では基体自体のラマン信号は検出されない。しかしゴリラガラス基体１０２、１０４では、試料と関係ない信号１０５が認識される。
【０１２４】
したがって本明細書で開示された本発明による液体セル、液体セルと保持装置２００からなるシステム、及び本発明による顕微鏡は、反射光顕微鏡におけるタンパク質懸濁液の画像支援ラマン分光分析の改善に著しく寄与する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ）】
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【図６Ｂ）】
2020516912.tif 000009
【図６Ｃ）】
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【図６Ｄ）】
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【図６Ｅ）】
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【図６Ｆ）】
2020516912.tif 000013
【図７】
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【図８】
2020516912.tif 000015
【国際調査報告】
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2020516912.tif 000017
2020516912.tif 000018
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