【手続補正書】
【提出日】平成30年5月2日(2018.5.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体、又は組換えヒト抗体、又はこれらの抗原結合性断片、あるいは細胞傷害剤とコンジュゲートする、連結する、又は他の方法で会合する、抗体又はその抗原結合性断片を含む抗体コンジュゲートを含む１以上の容器を含むキットであって、抗体又はその抗原結合性断片がヒトＥＦＮＡ４（エフリンＡ４リガンド）に結合し、
（ａ）配列番号１５７として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び配列番号１５９として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
（ｂ）配列番号１６１として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び配列番号１６３として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ；又は
（ｃ）配列番号１３７として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲ及び配列番号１３９として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲ；
を含む、キット。
【請求項２】
抗体又はその抗原結合性断片が中和抗体、内在化抗体及び／又は枯渇性抗体である、請求項１記載のキット。
【請求項３】
抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１２、２５、及び３８として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、配列番号５１、７４、及び８７として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む、請求項１記載のキット。
【請求項４】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１５７の残基３１−３５、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１５７の残基５０−６５、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１５７の残基９５−１０２として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１５９の残基２４−３４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１５９の残基５０−５６、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１５９の残基８９−９７として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＫａｂａｔに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項５】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１５７の残基２６−３２、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１５７の残基５３−５５、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１５７の残基９６−１０１として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１５９の残基２６−３２、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１５９の残基５０−５２、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１５９の残基９１−９６として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＣｈｏｔｈｉａに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項６】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１５７の残基３０−３５、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１５７の残基４７−５８、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１５７の残基９３−１０１として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１５９の残基３０−３６、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１５９の残基４６−５５、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１５９の残基８９−９６として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＭａｃＣａｌｌｕｍに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項７】
抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１５７として示される重鎖可変領域及び配列番号１５９として示される軽鎖可変領域を含む、請求項１記載のキット。
【請求項８】
抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１４、２７、及び４０として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、配列番号５３、７６、及び８９として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む、請求項１記載のキット。
【請求項９】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１６１の残基３１−３５、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１６１の残基５０−６５、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１６１の残基９５−１０２として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１６３の残基２４−３４、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１６３の残基５０−５６、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１６３の残基８９−９７として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＫａｂａｔに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項１０】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１６１の残基２６−３２、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１６１の残基５３−５５、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１６１の残基９６−１０１として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１６３の残基２６−３２、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１６３の残基５０−５２、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１６３の残基９１−９６として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＣｈｏｔｈｉａに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項１１】
抗体又はその抗原結合性断片が、ＣＤＲ−Ｈ１について配列番号１６１の残基３０−３５、ＣＤＲ−Ｈ２について配列番号１６１の残基４７−５８、及びＣＤＲ−Ｈ３について配列番号１６１の残基９３−１０１として示される重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ−Ｌ１について配列番号１６３の残基３０−３６、ＣＤＲ−Ｌ２について配列番号１６３の残基４６−５５、及びＣＤＲ−Ｌ３について配列番号１６３の残基８９−９６として示される軽鎖可変領域の３つのＣＤＲを含み、当該残基がＭａｃＣａｌｌｕｍに従って番号付けされる、請求項１記載のキット。
【請求項１２】
抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１６１として示される重鎖可変領域及び配列番号１６３として示される軽鎖可変領域を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１３】
抗体又はその抗原結合性断片が、配列番号１３７として示される重鎖可変領域及び配列番号１３９として示される軽鎖可変領域を含む、請求項１記載のキット。
【請求項１４】
過剰増殖性障害の治療にキットを用いるための指示書を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【請求項１５】
過剰増殖性障害が新生物障害である、請求項１４記載のキット。
【請求項１６】
新生物障害が固形腫瘍を含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
新生物障害が、乳癌、卵巣癌、大腸癌、肝臓癌、又は肺癌である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
新生物障害が血液系腫瘍である、請求項１５に記載のキット。
【請求項１９】
血液系腫瘍が白血病である、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
腫瘍始原細胞のターゲッティングにキットを用いるための指示書を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
【図１−１】図面１Ａ〜Ｃは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ４をコードする核酸配列（配列番号１）、対応するヒトＥＦＮＡ４アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号２）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ４ａ、ｂ、及びｃアイソフォームの配列（配列番号２〜４）のアラインメントを図示し、一方、図面１Ｄ〜Ｆは、それぞれ、ヒトＥＦＮＡ１をコードする核酸配列（配列番号５）、対応するヒトＥＦＮＡ１アイソフォームａのアミノ酸配列（配列番号６）、及びアミノ酸の相違を示すヒトＥＦＮＡ１ａ及びｂアイソフォームの配列（配列番号６及び７）のアラインメントを示す；
【図１−２】同上
【図１−３】同上
【図１−４】同上
【図２】図面２Ａ及び２Ｂは、結直腸腫瘍標本全体の一部より入手した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）の集団の全トランスクリプトーム（transcriptome）配列決定法を使用して測定した、未処置（図面２Ａ）及びイリノテカン処置（図面２Ｂ）マウス中の選択したヒトエフリンＡリガンド及びエフリンＡ受容体の遺伝子発現レベルを図示するグラフ表示である；
【図３】図面３Ａ及び３Ｂは、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）集団又は腫瘍形成細胞（ＴＧ）及び非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）集団の全トランスクリプトーム配列決定法を使用して測定した、結直腸腫瘍試料（図面３Ａ）及び膵臓腫瘍試料（図面３Ｂ）中のヒトエフリンＡ４リガンドの遺伝子発現レベルを図示するグラフ表示である；
【図４】図面４は、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、４種の異なる非従来型異種移植片（ＮＴＸ）の結直腸又は膵臓腫瘍細胞株の１つを担うマウスより入手した、高度に濃縮された腫瘍始原細胞（ＴＰｒｏｇ）及び腫瘍永続化細胞（ＴＰＣ）集団と、非腫瘍形成細胞（ＮＴＧ）に対して正規化した濃縮細胞集団中のヒトＥＦＮＡ４の相対的な遺伝子発現レベルを示すグラフ表示である；
【図５】図面５Ａ及び５Ｂは、ステージＩ〜ＩＶの疾患の患者由来の全結直腸腫瘍標本においてＲＴ−ＰＣＲを使用して測定した、ヒトＥＦＮＡ４の相対的な遺伝子発現レベルを、正常な結腸及び直腸組織中の発現の平均に対して正規化して（図面５Ａ）、又は正常隣接組織と比べて（図面５Ｂ）示すグラフ表示である；
【図６−１】図面６Ａ〜６Ｅは、測定したヒトＥＦＮＡ遺伝子の遺伝子発現レベルを表し、図面６Ａ及び６Ｂでは、１８種の異なる固形腫瘍型の１つを有する患者由来の全腫瘍標本（灰色のドット）又は比較したＮＡＴ（白色のドット）中のＥＦＮＡ４をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、図面６Ｃ及び６Ｄでは、選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４及びＥＦＮＡ１をＲＴ−ＰＣＲによって測定し、そして図面６Ｅでは、正常な組織と選択したＮＴＸ腫瘍細胞株中のＥＦＮＡ４についてウェスタンブロット分析によって測定した；
【図６−２】同上
【図６−３】同上
【図７−１】図面７Ａ〜７Ｒは、いくつかのＥＦＮＡモジュレーターの配列を図示し、ここで図面７Ａは、本明細書に記載のように単離してクローン化した別々のＥＦＮＡモジュレーターの遺伝子配置と重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列（ＶＢＡＳＥ２分析に由来している）を示す表の表示であり、図面７Ｂ〜７Ｎは、図面７Ａに示したのと同じモジュレーターについての、マウスの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供し、図面７Ｏ〜７Ｒは、開示されるＥＦＮＡモジュレーターの例示のヒト化バージョンの重鎖及び軽鎖可変領域の核酸及びアミノ酸配列を提供する；
【図７−２】同上
【図７−３】同上
【図７−４】同上
【図７−５】同上
【図７−６】同上
【図７−７】同上
【図７−８】同上
【図７−９】同上
【図７−１０】同上
【図８−１】図面８Ａ〜８Ｄは、図面８Ａの表形式で表される例示モジュレーターの生化学的及び免疫学的特性を示す。図面８Ｂ及び８Ｃでは、一定量の抗体と系列希釈液の抗原との非標識相互作用分析を使用して決定されるようなマウスＳＣ４．４７とヒト化ＳＣ４．４７それぞれの親和性の比較を示し、図面８Ｄでは、選択したヒト化モジュレーターとマウスモジュレーターの特性の表形式の比較を示す；
【図８−２】同上
【図９】図面９は、本発明の５０種の例示のエフリンＡリガンドモジュレーターの、Ｊｕｒｋａｔ  Ｅ６細胞とＺ１３８細胞それぞれに関する細胞表面結合特性を例証する；
【図１０】図面１０Ａ及び１０Ｂは、エフリンＡ受容体を発現する細胞に対するエフリンＡリガンドの用量依存的な様式での結合（図面１０Ａ）と、例示の開示モジュレーターへの曝露によるエフリンＡリガンド細胞表面結合の阻害（図面１０Ｂ）を図示する；
【図１１】図面１１Ａ〜１１Ｄは、ヒト及びマウスのエフリンＡリガンドの細胞表面結合を阻害する開示モジュレーターの能力を例証するグラフ表示であって、ここで図面１１Ａは、陽性対照曲線を示して、図面１１Ｂ〜１１Ｄは、３種の例示ＥＦＮＡモジュレーターの、リガンド結合を低下させる能力を証明する；
【図１２−１】図面１２Ａ〜１２Ｅは、本発明のモジュレーターの、可溶性エフリンＡ受容体の細胞表面結合を阻害する能力を示すグラフ表示であり、ここで図面１２Ａは、受容体結合の標準曲線を提供し、図面１２Ｂは、可溶性受容体の濃度が変動するときの例示モジュレーターの特性を例証し、図面１２Ｃは、受容体の量を一定に保ちながらモジュレーターの濃度を変化させることの結果を証明し、そして図面１２Ｄ及び１２Ｅは、エフリンＡ受容体がエフリンＡ４とエフリンＡ１リガンドへそれぞれ結合することを阻害する、当該モジュレーターの能力を示す；
【図１２−２】同上
【図１３−１】図面１３Ａ〜１３Ｃは、本発明の選択したモジュレーターの、エフリンＡ４リガンドのマウス相同分子種（ortholog）と交差反応する能力を例証し、ここで図面１３Ａは、非反応性モジュレーターを例証して、図面１３Ｂ及び図面１３Ｃは、交差反応するマウスのモジュレーターとヒト化モジュレーターをそれぞれ例証する；
【図１３−２】同上
【図１４−１】図面１４Ａ〜１４Ｄは、エフリンＡリガンドの発現が、全結直腸腫瘍試料（図面１４Ａ）において、結直腸ＮＴＸ腫瘍細胞の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｂ）において、そして肺ＮＴＸ細胞株の腫瘍形成性亜集団（図面１４Ｄ）において上方調節されているが、正常な末梢血単核細胞（図面１４Ｃ）上では上方調節されていないことを証明する；
【図１４−２】同上
【図１５−１】図面１５Ａ〜１５Ｄは、本発明の選択したモジュレーターがエフリンＡリガンドとの結合時に内在化する能力を例証し、ここで図面１５Ａは、３種の例示モジュレーターに関連した蛍光シフトを示し、図面１５Ｂは、１９種の開示モジュレーターが内在化を示唆するデルタ平均蛍光強度を示すことを証明し、図面１５Ｃは、ＥＦＮＡ発現が低い細胞では、相対的に内在化がほとんど無いことを示し、そして図面１５Ｄは、高レベルのＥＦＮＡを発現する細胞に関連した実質的な内在化を示す；
【図１５−２】同上
【図１６−１】図面１６Ａ〜１６Ｆは、開示モジュレーターが、エフリンＡリガンドを発現している細胞へ細胞傷害性ペイロードを指向させる標的化部分として有効に使用し得る（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことの証拠を提供し、ここで図面１６Ａは、モジュレーターＳＣ４．５の殺傷効果を示し、図面１６Ｂは、肺及び皮膚のＮＴＸ腫瘍細胞株に内在化して殺傷する、選択したモジュレーターの能力を例証し、図面１６Ｃ及び１６Ｄは、モジュレーターが会合した細胞毒素をＨＥＫ２９３Ｔ細胞（図面１６Ｃ）とＨＥＫ−．ｈＥＦＮＡ４細胞（図面１６Ｄ）の中へ運ぶことを示し、図面１６Ｅは、ヒト化モジュレーターが同様に反応することを例証し、そして図面１６Ｆは、マウス又はヒトのエフリンＡリガンドを発現している標的細胞の殺傷を証明する（図面１６を通して、モジュレーターは、ＳＣ４よりむしろＥと呼称される場合があることに留意されたい）；
【図１６−２】同上
【図１６−３】同上
【図１６−４】同上
【図１７−１】図面１７Ａ〜１７Ｅは、分泌されたエフリンＡリガンドに指向する開示モジュレーターの能力を証明する生化学アッセイの様々な側面のグラフ表示であり、ここで図面１７Ａは、標準曲線を提供し、図面１７Ｂは、選択した血液系腫瘍より分泌されたＥＦＮＡのレベルを定量し、図面１７Ｃは、腫瘍量と分泌されたＥＦＮＡの相関性を提示し、図面１７Ｄは、健常成人中の循環エフリンＡリガンドの範囲を確定し、そして図面１７Ｅは、選択した固形腫瘍のある患者が有意により高いレベルの循環エフリンＡリガンドを有することを証明する；
【図１７−２】同上
【図１８】図面１８Ａ〜１８Ｃは、様々なエフリンＡリガンドモジュレーターが、細胞傷害性ペイロードを選択した細胞と会合させる標的化部分として使用することができる（ここでは、下方傾斜曲線により、内在化毒素を介した細胞殺傷が示唆される）ことを例証するグラフ表示であり、そしてここで図面１８Ａ〜１８Ｃは、エフリンＡ４リガンド（図面１８Ａ）、エフリンＡ３リガンド（図面１８Ｂ）、及びエフリンＡ１リガンド（図面１８Ｃ）を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結合サポリン（Saporin）存在下での殺傷に媒介する、モジュレーターＳＣ４．２．１（又はＥ２．１）とＳＣ９．６５（又は９Ｍ０６５）の能力を具体的に証明する；
【図１９】図面１９Ａ及び１９Ｂは、数多くのＥＰＨＡ受容体と選択的に相互作用するエフリンＡリガンドの能力を例証し、ここでＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、内因的に発現されるエフリンＡリガンドを介して、ＥＰＨＡ−ＥＣＤ−Ｆｃ受容体構築体へ限られた度合いでのみ結合し（図面１９Ａ）、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞は、結合しないＥＰＨＡ１以外は、試験したすべてのＥＰＨＡ受容体構築体へ様々な度合いで結合する（図面１９Ｂ）；及び
【図２０】図面２０Ａ及び２０Ｂは、ＥＰＨＢ受容体と選択的に相互作用するエフリンＡリガンドの能力を例証し、ここでＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、内因的に発現されるエフリンＡリガンドを介して、ＥＰＨＢ−ＥＣＤ−Ｆｃ受容体構築体へ限られた度合いでのみ結合し（図面２０Ａ）、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ．ｈＥＦＮＡ４細胞は、ＥｐｈＢ２受容体へ結合するが、ＥｐｈＢ３受容体とＥｐｈＢ４受容体へは結合しない（図面２０Ｂ）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
簡便性のために、図面７Ａに示すＣＤＲ（配列番号８〜５９及び７０〜９５）は、ＶＢＡＳＥ２分析に由来しているが、本出願の内容があれば、当業者は、それぞれの各重鎖及び軽鎖配列について、Kabat et al. 又は MacCallum et al. によって定義されるようにＣＤＲを容易に同定して列挙することができよう。この点に関して言えば、実施例７（ｂ）で説明するヒト化分析には、Kabat et al. によって定義されるようなＣＤＲを使用して、本発明に従ってヒト化抗体配列を図示する図面７Ｏ〜７Ｒ（配列番号１４８〜１６３）において下線を施している。従って、本発明の範囲内には、すべてのそのような命名法によって定義されるＣＤＲを含んでなる抗体が明白に含まれる。より概括的に言えば、「可変領域ＣＤＲアミノ酸残基」という用語には、上記に示したようなどの配列又は構造ベースの方法を使用しても同定されるようなＣＤＲ中のアミノ酸が含まれる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８５】
実施例７
エフリンＡリガンドモジュレーターの配列決定及びヒト化
７（ａ）配列決定：
上述したことに基づいて、固定化したヒトＥＦＮＡ４又はＥＦＮＡ１へ見かけ上高い親和性で結合する、いくつかの例示の別個のモノクローナル抗体を選択した。図面７Ａ中の表形式に示すように、実施例６からのｍＡｂをコードするＤＮＡの配列分析により、その多くが独自のＶＤＪ再配列を有して新規の相補性決定領域を示すことが確認された。図面７Ａに示す相補性決定領域（配列番号８〜５９及び７０〜９５）は、ＶＢＡＳＥ２分析に由来していることに留意されたい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
上記で簡潔に述べたように、いくつかの例示の抗ｈＥＦＮＡ４／ｈＥＦＮＡ１抗体の遺伝子配置と導かれたＣＤＲ（ＶＢＡＳＥ２分析に由来している）を図面７Ａ（配列番号８〜５９及び７０〜９５）において表形式で示す。さらに、同じ例示の抗体重鎖及び軽鎖可変領域の核酸配列とアミノ酸配列を図面７Ｂ〜７Ｎ（配列番号９６〜１４７）に示す。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
７（ｂ）ヒト化：
実施例６からのマウスの抗体のうち４つを、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植法を使用してヒト化した。機能性ヒト生殖細胞系遺伝子に関する配列及び構造の類似性に基づいて、重鎖及び軽鎖のヒトフレームワークを選択した。この点に関して言えば、ＶＢＡＳＥ２分析に由来しているように、マウスカノニカルＣＤＲ構造を同じカノニカル構造のあるヒト候補物と比較することによって、構造類似性を評価した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−９】
2018008949.tif 000001
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７−１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７−１０】
2018008949.tif 000002
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2018008949000001.app