(57)【要約】  本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、そしてＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体を提供する。本発明はまた、前記抗体をコードするＤＮＡ、対応する発現ベクター、ならびに前記抗体を産生する方法および前記抗体を用いた治療法にも関する。
2020516323.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって：
−配列番号３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、重鎖可変ドメイン；
−配列番号７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、軽鎖可変ドメイン
を含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが配列番号３のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
軽鎖可変ドメインが配列番号７のアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
重鎖の重鎖可変ドメインが、配列番号１〜３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖可変ドメインが配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む、請求項４記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
軽鎖可変ドメインが、配列番号５〜７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
軽鎖可変ドメインが配列番号５〜７のアミノ酸配列を含む、請求項６記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
−重鎖可変ドメインが、配列番号１〜３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；
−軽鎖可変ドメインが、配列番号５〜７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
請求項８記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、
−重鎖可変ドメインが配列番号１〜３のアミノ酸配列を含み；
−軽鎖可変ドメインが配列番号５〜７のアミノ酸配列を含む
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
重鎖可変ドメインが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
重鎖可変ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１０記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
軽鎖可変ドメインが、配列番号８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
軽鎖可変ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１２記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
請求項１記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって
−重鎖可変ドメインが、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；
−軽鎖可変ドメインが、配列番号８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
請求項１４記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって
−重鎖可変ドメインが配列番号４のアミノ酸配列を含み；
−軽鎖可変ドメインが配列番号８のアミノ酸配列を含む
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
請求項１記載のモノクローナル抗体であって：
−配列番号９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖；
−配列番号１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、前記モノクローナル抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載のモノクローナル抗体であって：
−重鎖が配列番号９のアミノ酸配列を含み；
−軽鎖が配列番号１０のアミノ酸配列を含む
前記モノクローナル抗体。
【請求項１８】
ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体が全長ＩｇＧ抗体である、請求項１記載のモノクローナル抗体。
【請求項１９】
全長ＩｇＧ抗体が、ヒト抗体ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のアイソタイプである、請求項１８記載のモノクローナル抗体。
【請求項２０】
全長ＩｇＧ抗体が、ヒト抗体ＩｇＧ１のアイソタイプである、請求項１９記載のモノクローナル抗体。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項２２】
ＤＮＡである、請求項２１記載の核酸。
【請求項２３】
請求項２１または請求項２２の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片を産生するように適応されている宿主細胞を産生する方法であって、宿主細胞を請求項２３記載の発現ベクターで形質転換する工程を含む、前記方法。
【請求項２５】
請求項２１または請求項２２の核酸を含む、請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片を産生するための、宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片を産生するための方法であって、培地中で、抗体を得るために十分な条件下で、請求項２５記載の宿主細胞をインキュベーションし、そして所望により、得た抗体の単離および精製が続く、前記方法。
【請求項２７】
ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片、および１つまたはそれより多くの薬学的に許容されうる賦形剤を含む、前記薬学的組成物。
【請求項２８】
ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための請求項２７記載の薬学的組成物であって、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害が：ＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮癌）、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＭＳＩ−Ｈ  ＣＲＣ（高頻度マイクロサテライト不安定性を有する結腸直腸癌）の１つである、前記薬学的組成物。
【請求項２９】
ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組み合わせであって、請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片、および少なくとも１つの療法的抗腫瘍化合物を含む、前記薬学的組み合わせ。
【請求項３０】
ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための請求項２９記載の薬学的組み合わせであって、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害が：ＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮癌）、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＭＳＩ−Ｈ  ＣＲＣ（高頻度マイクロサテライト不安定性を有する結腸直腸癌）の１つである、前記薬学的組み合わせ。
【請求項３１】
請求項２９〜３０のいずれか一項記載の薬学的組み合わせであって、療法的抗腫瘍化合物が、化学療法剤、抗体または抗ホルモン剤からなる群より選択される、前記薬学的組み合わせ。
【請求項３２】
ＰＤ−Ｌ１の生物学的活性を阻害する必要がある被験体において、ＰＤ−Ｌ１の生物学的活性を阻害するための方法であって、該被験体に、請求項１〜２０のいずれか一項に定義するような抗体またはその抗原結合断片の療法的有効量を投与する工程を含む、前記方法。
【請求項３３】
ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害を治療する必要がある被験体において、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害を治療するための、請求項１〜２０のいずれか一項の抗体またはその抗原結合断片、あるいは請求項２７記載の薬学的組成物の使用。
【請求項３４】
疾患または障害が：ＳＣＣＨＮ（頭頸部の扁平上皮癌）、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＭＳＩ−Ｈ  ＣＲＣ（高頻度マイクロサテライト不安定性を有する結腸直腸癌）の１つである、請求項３３記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に、特に抗体またはその抗原結合断片およびその使用に関する。より具体的には、本発明は、ＰＤ−Ｌ１（ＣＤ２７４、Ｂ７−Ｈ１、プログラム細胞死リガンド−１）に特異的に結合するモノクローナル抗体に関する。本発明はまた、抗体またはその抗原結合断片をコードする核酸、発現ベクター、抗体を産生するための方法、および細胞仲介性免疫反応を上方制御し、そしてＴ細胞機能不全関連障害、例えば腫瘍免疫を治療し、そして癌を治療するために、Ｔ細胞機能を増進するための該抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リンパ球発生および活性化
ヒトにおけるリンパ球の２つの主要なタイプは、Ｔ（胸腺細胞）およびＢ（骨髄由来）である。これらの細胞は、骨髄および胎児肝臓において、リンパ発生経路にプログラミングされている、造血幹細胞に由来する。これらの幹細胞の子孫は、分岐する経路にしたがって、ＢまたはＴリンパ球のいずれかに成熟する。ヒトＢリンパ球発生は、完全に、骨髄内で行われる。一方、Ｔ細胞は、未成熟な前駆細胞から発生し、該前駆細胞は骨髄を離れ、そして血流を通じて胸腺に移動し、そこで増殖し、そして成熟Ｔリンパ球に分化する。
【０００３】
胸腺または骨髄から発生する成熟リンパ球は、静止または「休止」状態にあり、すなわちこれらは有糸分裂的に不活性である。血流内に分散した際、これらの「未使用の（ｖｉｒｇｉｎ）」または「ナイーブな」リンパ球は、多様な二次的または末梢リンパ臓器、例えば脾臓、リンパ節または扁桃腺に移動する。大部分の未使用リンパ球は、生得的に短い寿命によって特徴づけられ、そして骨髄または胸腺を離れた後、数日を待たずに死ぬ。しかし、こうした細胞が抗原の存在を示すシグナルを受け取った場合、細胞は活性化され、そして細胞分裂の連続周期を経ることも可能である。次いで、生じる子孫のある細胞は、休止状態に戻り、そして本質的に刺激性アレルゲンとの次の出会いのためにプライミングされているＢおよびＴ細胞である、メモリーリンパ球になる。活性化されたナイーブ・リンパ球の他の子孫は、数日間しか生存しないが、特異的防御活性を実行するエフェクター細胞である。
【０００４】
リンパ球活性化は、一連の秩序だった事象であり、休止リンパ球は、ひとたび刺激されると、該事象を経て、分裂し、そして子孫を産生し、該子孫のいくつかがエフェクター細胞となる。全反応には、細胞増殖（有糸分裂誘発）の誘導および免疫学的機能の発現の両方が含まれる。リンパ球は、特定のリガンドが該リンパ球の表面上の受容体に結合した際に活性化される。リガンドは、Ｔ細胞およびＢ細胞で異なるが、生じる細胞内生理学的機構は類似である。
【０００５】
ある種の（ｓｏｍｅ）外来性（ｆｏｒｅｉｇｎ）抗原、特に、Ｂ細胞上の表面免疫グロブリン、またはＴ細胞上の他の糖タンパク質を架橋する巨大ポリマー性抗原は、それ自体、リンパ球活性化を誘導可能である。しかし、大部分の抗原はポリマー性ではなく、そして多数のＢ細胞への直接結合でさえ、活性化を生じることに失敗する。これらのより一般的な抗原は、近傍の活性化されたヘルパーＴリンパ球で共刺激された際にＢ細胞を活性化する。こうした刺激は、Ｔ細胞によって分泌されるリンホカインから生じうるが、最も効率的には、特定のＢ細胞表面受容体と相互作用して二次シグナルを生じるＴ細胞表面タンパク質と、Ｂ細胞の直接接触によって伝達される。
【０００６】
Ｔ細胞
Ｔリンパ球は、免疫グロブリンを発現しないが、その代わり、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と称される表面タンパク質を通じて、外来性物質の存在を検出する。これらの受容体は、直接接触によって、または他の免疫細胞の活性に影響を及ぼすことを通じて、抗原を認識する。マクロファージとともに、Ｔ細胞は、細胞仲介性免疫に関与する主な細胞タイプである。
【０００７】
Ｂ細胞と異なり、Ｔ細胞は、特定の条件でのみ、外来性物質を検出可能である。特に、Ｔリンパ球は、外来性タンパク質が、まず、小さいペプチドに切断され、次いで抗原提示細胞（ＡＰＣ）と称される、第二の宿主細胞の表面上にディスプレイされた際にのみ、該タンパク質を認識する。宿主細胞の多くのタイプは、何らかの条件下で抗原を提示しうるが、特定のタイプは、このためにより特異的に適応し、そしてマクロファージおよび他のＢ細胞を含めて、Ｔ細胞活性の制御に特に重要である。抗原提示は、部分的に、提示細胞の表面上の、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）タンパク質と称される特定のタンパク質に依存する。したがって、細胞仲介性免疫を刺激するため、外来ペプチドは、ＭＨＣペプチドと組み合わせて、Ｔ細胞に提示されなければならず、そしてこの組み合わせがＴ細胞受容体によって認識されなければならない。
【０００８】
２つの重要なＴ細胞サブセット：細胞傷害性Ｔリンパ球（Ｔｃ細胞またはＣＴＬ）およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞があり、該細胞は大まかに、マーカーＣＤ８およびＣＤ４の細胞表面発現に基づいて同定されうる。Ｔｃ細胞は、ウイルス防御において重要であり、そして特定の細胞表面発現ウイルスペプチドを認識することによって、直接ウイルスを殺すことが可能である。ＴＨ細胞は、他の細胞タイプの増殖、成熟および免疫学的機能を促進し、例えばリンホカインを分泌して、Ｂ細胞、マクロファージおよび細胞傷害性Ｔ細胞の活性を制御する。ナイーブおよびメモリーＴリンパ球はどちらも、通常、休止状態にとどまり、そしてこの状態では、これらは有意なヘルパー活性または細胞傷害活性を示さない。活性化された状態で、これらの細胞は、数周期の有糸分裂を経て、娘細胞を産生する。これらの娘細胞のあるものは、メモリー細胞として休止状態に戻るが、他のものは、ヘルパー活性または細胞傷害活性を活発に示すエフェクター細胞になる。これらの娘細胞は、その親と類似であり：ＣＤ４＋細胞は、ＣＤ４＋子孫しか産生できず、そしてＣＤ８＋細胞は、ＣＤ８＋子孫のみを生じる。エフェクターＴ細胞は、休止Ｔ細胞上には発現されない細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ４０Ｌ、トランスフェリン受容体およびクラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質を発現する。活性化刺激なしでは、細胞傷害活性またはヘルパー活性は、エフェクター細胞が死ぬかまたは休止状態に戻るかするにつれて、数日間に渡って次第に鎮まる。
【０００９】
Ｂ細胞活性化と同様、大部分の抗原に対するＴリンパ球反応もまた、２つのタイプの同時刺激を必要とする。第一のものは、抗原提示細胞上のＭＨＣタンパク質によって適切にディスプレイされ、Ｔ細胞受容体によって認識されそして結合されることが可能な、抗原である。この抗原−ＭＨＣ複合体は、シグナルを細胞内部に送らず、通常、Ｔ細胞活性化を生じるには不十分である。完全な活性化、例えばヘルパーＴ細胞で起こるようなものは、抗原提示細胞の表面上で発現される、共刺激因子と称される他の特定のリガンドでの共刺激を必要とする。一方で、細胞傷害性Ｔ細胞活性化は、一般的に、活性化されたヘルパーＴ細胞によって分泌されるサイトカインであるＩＬ−２を必要とする。
【００１０】
ＰＤ−１経路
Ｔ細胞活性化を制御する、重要な負の共刺激シグナルは、プログラム細胞死−１受容体（ＰＤ−１、ＣＤ２７９）、ならびにそのリガンド結合パートナー、ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）によって提供される。ＰＤ−１の負の制御上の役割は、ＰＤ−１ノックアウト（Ｐｄｃｄ１−／−）によって明らかにされ、該ノックアウトは自己免疫の傾向があった（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＪＪ：  １４１−５１（１９９９）；  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：  ３１９−２２（２００１））。ＰＤ−１はＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に関連するが、ホモ二量体化を可能にする膜近位システインを欠く。ＰＤ−１の細胞質ドメインは、免疫受容体チロシン結合阻害モチーフ（ＩＴＩＭ、Ｖ／ＩｘＹｘｘＬ／Ｖ）を含有する。ＰＤ−１はＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２にしか結合しない（Ｆｒｅｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：  １−９（２０００）；  Ｄｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ５：  １３６５−１３６９（１９９９）；  Ｌａｔｃｈｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：  ２６１−２６８（２００１）；  Ｔｓｅｎｇら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９３：  ８３９−８４６（２００１））。
【００１１】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化された単球および樹状細胞（ＤＣ）上で発現されうる。ＰＤ−１は、活性化されたヒトＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞、Ｂ細胞および骨髄細胞によって発現されるが、未刺激のものによっては発現されない。これは、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４のより制限された発現とは区別される（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：  ７７３−８０（１９９６）；  Ｂｏｅｔｔｌｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  ３５３２−４０（２００６））。活性化されたヒトＴ細胞からクローニングされているＰＤ−１の少なくとも４つの変異体があり、これには（ｉ）エクソン２、（ｉｉ）エクソン３、（ｉｉｉ）エクソン２および３または（ｉｖ）エクソン２〜４を欠く転写物が含まれる（Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３５：  １０９−１６（２００５））。ＰＤ−１Δｅｘ３を例外として、すべての変異体は、休止末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において、全長ＰＤ−１と類似のレベルで発現される。すべての変異体の発現は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でヒトＴ細胞を活性化した際に、有意に誘導される。ＰＤ−１Δｅｘ３変異体は、膜貫通ドメインを欠き、そして自己免疫において重要な役割を果たす可溶性ＣＴＬＡ−４と類似である（Ｕｅｄａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：  ５０６−１１（２００３））。この変異体は、関節リウマチ患者の滑液および血清中で濃縮される（Ｗａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：  ８８４４−５０（２００６））。２つのＰＤ−１リガンドでは、発現パターンが異なる。ＰＤ−Ｌ１は、マウスＴおよびＢ細胞、ＣＤ、マクロファージ、間葉系幹細胞および骨髄由来マスト細胞上で恒常的に発現される。（Ｙａｍａｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：  ５５３８−４５（２００２））。ＰＤ−Ｌ１は、多数の非造血細胞（例えば角膜、肺、血管上皮、肝臓非実質細胞、間葉系幹細胞、膵島、胎盤合胞体栄養細胞、角化細胞等）上で発現され［Ｋｅｉｒら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：  ６７７−７０４（２００８）］、そして活性化後、多数の細胞タイプ上で上方制御される。Ｉ型およびＩＩ型インターフェロン、ＩＦＮはどちらも、ＰＤ−Ｌ１を上方制御する（Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒら，  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９：  １３３−４５（２００２））；  Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：  １７２−８２（２００４））。細胞株におけるＰＤ−Ｌ１発現は、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６およびＭＥＫが阻害されている場合、減少する（Ｌｉｕら，  Ｂｌｏｏｄ  ＨＯ：  ２９６−３０４（２００７））。ＪＡＫ２もまた、ＰＤ−Ｌ１誘導に関連づけられてきている（Ｌｅｅら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ５８０：  ７５５−６２（２００６）；  Ｌｉｕら，  Ｂｌｏｏｄ  ＨＯ：  ２９６−３０４（２００７））。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）およびＡｋｔシグナル伝達を修飾する細胞ホスファターゼである、ホスファターゼおよびテンシン相同体（ＰＴＥＮ）の喪失または阻害は、癌において、転写後ＰＤ−Ｌ１発現を増加させた（Ｐａｒｓａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １３：  ８４−８���（２００７））。
【００１２】
ＰＤ−Ｌ２発現は、ＰＤ−Ｌ１よりもより制限されている。ＰＤ−Ｌ２は、ＤＣ、マクロファージ、および骨髄由来マスト細胞上で、誘導可能に発現される。ＰＤ−Ｌ２はまた、休止腹腔Ｂ１細胞の約半数から３分の２で発現されるが、通常の（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ）Ｂ２  Ｂ細胞上では発現されない（Ｚｈｏｎｇら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：  ２４０５−１０（２００７））。ＰＤ−Ｌ２＋Ｂ１細胞は、ホスファチジルコリンに結合し、そして細菌抗原に対する生得的免疫反応に重要でありうる。ＩＦＮ−γによるＰＤ−Ｌ２の誘導は、部分的に、ＮＦ−ＫＢに依存する（Ｌｉａｎｇら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３＿：  ２７０６−１６（２００３））。ＰＤ−Ｌ２はまた、ＧＭ−ＣＦ、ＩＬ−４およびＩＦＮ−γによって、単球およびマクロファージ上で誘導されうる（Ｙａｍａｚａｋｉら．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：  ５５３８−４５（２００２）；  Ｌｏｋｅら，  ＰＮＡＳ  １００：  ５３３６−４１（２００３））。
【００１３】
ＰＤ−１シグナル伝達は、典型的には、細胞増殖に対してよりもサイトカイン産生に対してより大きな影響を有し、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２産生に有意な影響を有する。ＰＤ−１仲介性阻害性シグナル伝達はまた、ＴＣＲシグナル伝達の強度にも依存し、ＴＣＲ刺激が低レベルであれば、より大きな阻害が提供される。この減少は、ＣＤ２８を通じた共刺激［Ｆｒｅｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：  １０２７−３４（２０００）］またはＩＬ−２の存在［Ｃａｒｔｅｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：  ６３４−４３（２００２）］によって克服されうる。
【００１４】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を通じたシグナル伝達が二方向性でありうる証拠が増えてきている。すなわち、ＴＣＲまたはＢＣＲシグナル伝達の修飾に加えて、シグナルはまた、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２を発現する細胞にも戻って送達されうる。ワルデンストレームマクログロブリン血症患者から単離された天然のヒト抗ＰＤ−Ｌ２抗体で樹状細胞を処理すると、ＭＨＣ  ＩＩまたはＢ７共刺激分子の上方制御は見られない一方、こうした細胞は、より多量の炎症促進性サイトカイン、特にＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を産生し、そしてＴ細胞増殖を刺激した（Ｎｇｕｙｅｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９６：  １３９３−９８（２００２））。この抗体でのマウス処理はまた、（１）移植されたｂ１６黒色腫に対する耐性を増進し、そして腫瘍特異的ＣＴＬを迅速に誘導し（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：  １８３０−３８（２００３）；  Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：  ４９６５−７２（２００４）；  Ｈｅｃｋｍａｎら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：  １８２７−３５（２００７））；（２）アレルギー性喘息のマウスモデルにおいて、気道炎症性疾患の発展をブロックした（Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：  １３６０−６５（２００４）；  Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ＵＪｙ．  ６６８−７４（２００５））。
【００１５】
樹状細胞（「ＤＣ」）への逆シグナル伝達のもう１つの証拠は、可溶性ＰＤ−１（Ｉｇ定常領域に融合されたＰＤ−１  ＥＣドメイン−「ｓ−ＰＤ−１」）と培養した骨髄由来ＤＣの研究から得られた（Ｋｕｉｐｅｒｓら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：  ２４７２−８２（２００６））。このｓＰＤ−１は、抗ＰＤ−１投与を通じた可逆的方式で、ＤＣ活性化を阻害し、そしてＩＬ−１０産生を増加させた。さらに、いくつかの（ｓｏｍｅ）研究によって、ＰＤ−１とは独立に、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２に関する受容体が同定された。Ｂ７．１は、ＰＤ−Ｌ１に関する結合パートナーとすでに同定されている（Ｂｕｔｔｅら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：  １１１−２２（２００７））。化学的架橋研究は、ＰＤ−Ｌ１およびＢ７．１が、そのＩｇＶ様ドメインを通じて相互作用しうることを示している。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞への阻害性シグナル伝達を誘導しうる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１のＢ７．１による連結、またはＣＤ４＋  Ｔ細胞上のＢ７．１のＰＤ−Ｌ１による連結は、阻害性シグナルを提供する。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ３に加えてＢ７．１でコーティングされたビーズによって刺激した際、減少した増殖およびサイトカイン産生を示す。Ｂ７．１に関するすべての受容体（すなわちＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１）を欠くＴ細胞において、Ｔ細胞増殖およびサイトカイン産生は、もはや、抗ＣＤ３に加えてＢ７．１でコーティングされたビーズによっては阻害されなかった。これは、Ｂ７．１が、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の非存在下で、Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１を通じて特異的に作用することを示す。同様に、ＰＤ−１を欠くＴ細胞は、抗ＣＤ−３に加えてＰＤ−Ｌ１でコーティングされたビーズの存在下で刺激した際、減少した増殖およびサイトカイン産生を示し、Ｔ細胞上のＢ７．１に対するＰＤ−Ｌ１連結の阻害性効果を立証した。Ｔ細胞が、ＰＤ−Ｌ１に関するすべての既知の受容体を欠く（すなわちＰＤ−１およびＢ７．１がない）場合、Ｔ細胞増殖は、もはや、抗ＣＤ３に加えてＰＤ−Ｌ１でコーティングされたビーズによって損なわれなかった。したがって、ＰＤ−Ｌ１は、Ｂ７．１またはＰＤ−１のいずれかを通じて、Ｔ細胞に阻害性効果を発揮しうる。
【００１６】
Ｂ７．１およびＰＤ−Ｌ１の間の直接相互作用は、共刺激の現在の理解が不完全であることを示し、そしてＴ細胞上のこれらの分子の発現の重要性を強調する。ＰＤ−Ｌ１−／−  Ｔ細胞の研究によって、Ｔ細胞上のＰＤ−Ｌ１が、Ｔ細胞によるサイトカイン産生を下方制御しうることが示されている（Ｌａｔｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：  １０６９１−９６（２００４））。ＰＤ−Ｌ１およびＢ７．１の両方が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＤＣおよびマクロファージ上で発現されるため、これらの細胞タイプ上のＢ７．１およびＰＤ−Ｌ１の間の方向性相互作用の可能性がある。さらに、非造血細胞上のＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞上のＢ７．１ならびにＰＤ−１と相互作用可能であるため、ＰＤ−Ｌ１がその制御に関与するかどうかという疑問が生じる。Ｂ７．１：ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害性効果に関する１つのありうる説明は、Ｔ細胞ＰＤ−Ｌ１が、ＣＤ２８との相互作用から、ＡＰＣ  Ｂ７．１を捕捉するか、または分離しうることである。
【００１７】
その結果、ＰＤ−１、Ｂ７．１のいずれかまたは両方との相互作用からＰＤ−Ｌ１をブロッキングすることを含めて、ＰＤ−Ｌ１を通じたシグナル伝達と拮抗し、それによって、ＰＤ−Ｌ１がＴ細胞および他の抗原提示細胞への負の共刺激シグナルを送ることが妨げられ、それが感染（例えば急性および慢性）に反応した免疫および腫瘍免疫を増進するようである。さらに、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の他の構成要素のアンタゴニスト、例えば抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ２抗体のアンタゴニストと組み合わせてもよい。
【００１８】
特に、ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の阻害は、癌（例えば腫瘍免疫）、ならびに急性および慢性（例えば持続性）感染を含む感染の治療のために、Ｔ細胞免疫を増進させる手段として提唱されてきている。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１：ＰＤ−１相互作用をブロッキングする阻害剤は、とりわけ、ＷＯ２００１０１４５５７、ＷＯ２００２０８６０８３、ＷＯ２００７００５８７４、ＷＯ２０１００３６９５９、ＷＯ２０１００７７６３４、およびＷＯ２０１１０６６３８９から知られる。
【００２０】
現在、初期段階臨床試験において、抗ＰＤ−Ｌ１構成要素を含む、１０より多い単一および二重特異性薬剤がある。
１つの単一特異性抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（アテゾリズマブ、Ｒｏｃｈｅ）は、臨床試験（ＣＴ）を成功裡に通過して、そして臨床実施において用いられている。アテゾリズマブは、転移性尿路上皮性癌の患者における使用に関して、ＦＤＡによって認可されており；非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌、結腸直腸癌（ＣＲＣ）、および乳癌（ＢＣ）患者において、第ＩＩＩ相ＣＴが続けられている。調製物は、修飾Ｆｃ領域（ＡＤＣＣ効果を除去するため）を有するＩｇ１抗体である。アテゾリズマブは、ＷＯ２０１００７７６３４に記載される。
【００２１】
最終期ＣＴにある他の抗ＰＤ−Ｌ１調製物は、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ）およびデュルバルマブ（ＡＺ）調製物である。デュルバルマブ（ＭＥＤＩ−４７３６）は、ＷＯ２０１１０６６３８９に記載される。アベルマブは、ＷＯ２０１３０７９１７４に記載される。アベルマブ調製物の主な相違は、抗体におけるＡＤＣＣ効果が存在することであり、さらに、これは、ＩＦＮｇまたはＩＬ１２（ＮＣＴ０１７７２００４）で増進されうる。さらに、アベルマブ調製の安全性プロファイルは、他の抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１調製物のものに対応する（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；  ３（１０）  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５；  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｖｅｌｕｍａｂ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ；  Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２２】
【特許文献１】ＷＯ２００１０１４５５７
【特許文献２】ＷＯ２００２０８６０８３
【特許文献３】ＷＯ２００７００５８７４
【特許文献４】ＷＯ２０１００３６９５９
【特許文献５】ＷＯ２０１００７７６３４
【特許文献６】ＷＯ２０１１０６６３８９
【特許文献７】ＷＯ２０１００７７６３４
【特許文献８】ＷＯ２０１１０６６３８９
【特許文献９】ＷＯ２０１３０７９１７４
【非特許文献】
【００２３】
【非特許文献１】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ＪＪ：  １４１−５１（１９９９）
【非特許文献２】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：  ３１９−２２（２００１）
【非特許文献３】Ｆｒｅｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：  １−９（２０００）
【非特許文献４】Ｄｏｎｇら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ５：  １３６５−１３６９（１９９９）
【非特許文献５】Ｌａｔｃｈｍａｎら，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：  ２６１−２６８（２００１）
【非特許文献６】Ｔｓｅｎｇら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９３：  ８３９−８４６（２００１）
【非特許文献７】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら，  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ８：  ７７３−８０（１９９６）
【非特許文献８】Ｂｏｅｔｔｌｅｒら，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８０：  ３５３２−４０（２００６）
【非特許文献９】Ｎｉｅｌｓｅｎら，  Ｃｅｌｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２３５：  １０９−１６（２００５）
【非特許文献１０】Ｕｅｄａら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４２３：  ５０６−１１（２００３）
【非特許文献１１】Ｗａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７７：  ８８４４−５０（２００６）
【非特許文献１２】Ｙａｍａｚａｋｉら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：  ５５３８−４５（２００２）
【非特許文献１３】Ｋｅｉｒら，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２６：  ６７７−７０４（２００８）
【非特許文献１４】Ｅｐｐｉｈｉｍｅｒら，  Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９：  １３３−４５（２００２）
【非特許文献１５】Ｓｃｈｒｅｉｎｅｒら，  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  １５５：  １７２−８２（２００４）
【非特許文献１６】Ｌｉｕら，  Ｂｌｏｏｄ  ＨＯ：  ２９６−３０４（２００７）
【非特許文献１７】Ｌｅｅら，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，  ５８０：  ７５５−６２（２００６）
【非特許文献１８】Ｌｉｕら，  Ｂｌｏｏｄ  ＨＯ：  ２９６−３０４（２００７）
【非特許文献１９】Ｐａｒｓａら，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １３：  ８４−８８（２００７）
【非特許文献２０】Ｚｈｏｎｇら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：  ２４０５−１０（２００７）
【非特許文献２１】Ｌｉａｎｇら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３３＿：  ２７０６−１６（２００３）
【非特許文献２２】Ｙａｍａｚａｋｉら．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６９：  ５５３８−４５（２００２）
【非特許文献２３】Ｌｏｋｅら，  ＰＮＡＳ  １００：  ５３３６−４１（２００３）
【非特許文献２４】Ｆｒｅｅｍａｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９２：  １０２７−３４（２０００）
【非特許文献２５】Ｃａｒｔｅｒら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３２：  ６３４−４３（２００２）
【非特許文献２６】Ｎｇｕｙｅｎら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９６：  １３９３−９８（２００２）
【非特許文献２７】Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：  １８３０−３８（２００３）
【非特許文献２８】Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６４：  ４９６５−７２（２００４）
【非特許文献２９】Ｈｅｃｋｍａｎら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３７：  １８２７−３５（２００７）
【非特許文献３０】Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：  １３６０−６５（２００４）
【非特許文献３１】Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎら，  Ｊ．  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ＵＪｙ．  ６６８−７４（２００５）
【非特許文献３２】Ｋｕｉｐｅｒｓら，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３６：  ２４７２−８２（２００６）
【非特許文献３３】Ｂｕｔｔｅら，  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２７：  １１１−２２（２００７）
【非特許文献３４】Ｌａｔｃｈｍａｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １０１：  １０６９１−９６（２００４）
【非特許文献３５】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；  ３（１０）  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
したがって、ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド−１）の有効な阻害剤を提供する必要性がある。
上記を参照すると、ＰＤ−Ｌ１に有効に結合する新規抗体を提供することが非常に重要である。
【００２５】
ＢＣＤ−１３５抗体は、ＰＤ−Ｌ１に選択的に結合し、そしてプログラム細胞死リガンド−１の有効な阻害剤である。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明は、結合分子、特にＰＤ−Ｌ１に結合するよう向けられた抗体に関する。こうした抗体を、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害を治療するために用いてもよい。
【００２７】
１つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であって、配列番号３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
【００２８】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００２９】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００３０】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５〜７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号５〜７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３１】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号５〜７に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３２】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号１〜３のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号５〜７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３３】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む。
【００３４】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３５】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号８に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３６】
ある態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
【００３７】
ある態様において、モノクローナル抗体は、配列番号９に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３８】
ある態様において、モノクローナル抗体は、配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１に特異的なモノクローナル抗体は、全長ＩｇＧ抗体である。
【００３９】
ある態様において、全長ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のアイソタイプである。
ある態様において、モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプである。
【００４０】
１つの側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれかをコードする、核酸に関する。
ある態様において、核酸はＤＮＡである。
【００４１】
１つの側面において、本発明は、任意の上記核酸を含む、発現ベクターに関する。
１つの側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれかを産生するように適応されている宿主細胞を産生する方法であって、細胞を上記ベクターで形質転換する工程を含む、前記方法に関する。
【００４２】
１つの側面において、本発明は、上記核酸いずれかを含む、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれかを産生するための、宿主細胞に関する。
１つの側面において、本発明は、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれかを産生するための方法であって、培地中で、前記抗体を得るために十分な条件下で、上記宿主細胞をインキュベーションし、そして所望により、得た抗体の単離および精製が続く、前記方法に関する。
【００４３】
１つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組成物であって、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれか、および１つまたはそれより多くの薬学的に許容されうる賦形剤を含む、前記薬学的組成物に関する。
【００４４】
ある態様において、薬学的組成物は：ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩの群より選択される、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のために意図される。
【００４５】
１つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１によって仲介される疾患または障害の防止または治療のための薬学的組み合わせであって、上記抗体またはその抗原結合断片、および少なくとも１つの療法的に活性である抗腫瘍化合物を含む、前記薬学的組み合わせに関する。
【００４６】
ある態様において、薬学的組み合わせは：ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩの群より選択される、ＰＤ−Ｌ１仲介性疾患または障害の防止または治療のために意図される。
【００４７】
ある態様において、薬学的組み合わせは、化学療法剤、抗体または抗ホルモン剤より選択される療法的に活性である抗腫瘍化合物を含む。
１つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１の生物学的活性を阻害する必要がある被験体において、ＰＤ−Ｌ１の生物学的活性を阻害するための方法であって、該被験体に、上記抗体またはその抗原結合断片のいずれかの有効量を投与する工程を含む、前記方法に関する。
【００４８】
１つの側面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１仲介性疾患または障害の治療の必要がある被験体における、ＰＤ−Ｌ１仲介性疾患または障害の治療のための、上記抗体またはその抗原結合断片、あるいは上記薬学的組成物のいずれかの使用に関する。
【００４９】
ある態様において、本発明は：ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩの群より選択される、ＰＤ−Ｌ１仲介性疾患または障害の治療のための上記抗体またはその抗原結合断片、あるいは上記薬学的組成物のいずれかの使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】ヒト・コンビナトリアル・ナイーブ・ライブラリー合成のためのスキーム。
【図２】Ｆａｂファージディスプレイライブラリークローニングのためのファージミドのマップ。
【図３】Ｆａｂ産生のための発現プラスミドのマップ。
【図４】還元条件下（４Ａ、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、非還元条件下（４Ｂ、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のＢＣＤ−１３５電気泳動図。
【図５】ＰＤ−Ｌ１および他の抗原とのＢＣＤ−１３５相互作用の酵素連結免疫吸着アッセイ。
【図６】Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ−１レポーター細胞株における、抗ＰＤ−Ｌ１抗体でのＮＦＡＴシグナル伝達再活性化。
【図７】Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６装置上での、ＦｃＲｎおよびＦｃγ受容体とのＢＣＤ−１３５相互作用の分析。
【図８】異なる種由来のＰＤ−Ｌ１とのＢＣＤ−１３５相互作用の免疫酵素的分析。
【図９】Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６装置上での、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙ）ＰＤ−Ｌ１とのＢＣＤ−１３５相互作用の分析。
【図１０】ＢＣＤ−１３５のコンホメーション安定性分析。
【図１１】ＢＣＤ−１３５のコロイド安定性分析。
【図１２】リン酸（Ａ）、酢酸（Ｂ）、およびヒスチジン（Ｂ）緩衝液中のＢＣＤ−１３５の熱安定性分析。ｘ軸は時間を示し、Ｙ軸は吸収を示す。
【図１３】ヒト血清中のＢＣＤ−１３５の安定性分析。Ａは、ウェルに添加されたＢＣＤ−１３５の濃度に対する光学密度依存性を示す検量線である。Ｂは、インキュベーション時間に対する、ヒト血清中でインキュベーションした際のＢＣＤ−１３５濃度の依存性を示す、要約表である。
【図１４】ＢＣＤ−１３５およびＰＤ−Ｌ１抗原のＮ末端Ｉｇドメインの間の複合体の三次元モデル。Ａは、３Ｄモデルの一般的な外観であり；Ｂは、直接抗原−抗体接触の領域における詳細なモデルである（実施例１８中の表を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
定義および一般的な方法
別に定義しない限り、本明細書で用いるすべての技術的および科学的用語は、一般の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するであろう。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料を、本発明の態様の実施または試験において用いてもよいが、例示的な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が本明細書に援用される。矛盾の場合は、定義を含めて本明細書が統制するであろう。多くの文書を本明細書に引用するが、この引用は、これらの文書のいずれかが、当該技術分野における共通の一般的な知識の一部を形成することの承認ではない。
【００５２】
さらに、背景が別に必要としない限り、単数形の用語には複数形の用語が含まれ、そして複数形の用語には単数形の用語が含まれる。典型的には、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、分析化学、有機合成化学、医学および薬学的化学、ならびに本明細書記載のタンパク質および核酸のハイブリダイゼーションおよび化学で用いる分類および方法は、当業者に周知であり、そしてこの分野で広く用いられる。酵素反応および精製技術を、製造者の特定にしたがって、または当該技術分野で一般的に達成されるように、または本明細書に記載するように、実行してもよい。
【００５３】
本説明および態様において、単語「有する（ｈａｖｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」またはその変形、例えば「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、示す整数または整数群を含むが、いかなる他の整数または整数群の排除も伴わないと理解されるものとする。
【００５４】
抗体に関連する定義
ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド−１）はまた、表面分類抗原２７４（ＣＤ２７４）または相同体Ｂ７（Ｂ７−Ｈ１）としても知られ、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質である。該タンパク質は、３つのドメイン：Ｉｇ  ＶおよびＣ様ドメインによって示される細胞外（２２０）、膜貫通（２１）および細胞内（３１）からなる。該タンパク質は、妊娠、外来組織の移植、ある種の疾患、例えば肝炎中に、免疫系抑制において重要な役割を果たす。通常の条件下では、自己抗原に反応して、特定の量の抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔエフェクター細胞がリンパ節および脾臓中に集積し、自己免疫プロセスを防止するため、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１またはＢ７−１／ＰＤ−Ｌ１複合体が形成され、リンパ節においてＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖を減少させる阻害性シグナル伝達を生じる。したがって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ相互作用は、免疫寛容の発展における重要な事象の１つである。
【００５５】
「機能不全」は、免疫機能不全の背景において、抗原刺激に対する免疫減少反応性の状態を指す。該用語には、抗原認識は起こりうるが、後に続く免疫反応が、感染または腫瘍増殖を制御するには不十分である、消耗および／またはアネルギーの両方の一般的な要素が含まれる。
【００５６】
「Ｔ細胞機能の増進」は、Ｔ細胞が、持続されたまたは増幅された生物学的機能を有するか、あるいは消耗したかまたは不活性なＴ細胞を再生するかまたは再活性化するように誘導するか、引き起こすかまたは刺激することを意味する。Ｔ細胞機能の増進の例には：介入前のこうしたレベルに比較して、ＣＤ８＋  Ｔ細胞からのγ−インターフェロンの分泌の増加、増殖増加、抗原反応性の増加（例えばウイルスまたは病原体クリアランス）が含まれる。１つの態様において、増進レベルは、少なくとも５０％、あるいは６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この増進を測定する方式は、一般の当業者に知られる。
【００５７】
「Ｔ細胞機能不全障害」は、抗原刺激に対する反応性の減少によって特徴づけられるＴ細胞の障害または状態である。特定の態様において、Ｔ細胞機能不全障害は、特に、ＰＤ−１を通じた、不適切に増加したシグナル伝達に関連する。別の態様において、Ｔ細胞機能不全障害は、Ｔ細胞がアネルギーであるか、あるいはサイトカインを分泌するか、増殖するかまたは細胞溶解活性を実行する能力が減少しているものである。特定の側面において、反応性減少は、免疫原を発現する病原体または腫瘍の無効な制御を生じる。Ｔ細胞機能不全障害によって特徴づけられるＴ細胞機能不全障害の例には、解決されない急性感染、慢性感染および腫瘍免疫が含まれる。
【００５８】
「腫瘍免疫」は、腫瘍が免疫認識およびクリアランスを逃れるプロセスを指す。したがって、療法的概念として、腫瘍免疫は、こうした回避を減弱させ、そして腫瘍が免疫系によって認識され、そして攻撃された際、「治療可能」である。腫瘍認識の例には、腫瘍結合、腫瘍縮小および腫瘍クリアランスが含まれる。
【００５９】
本明細書において使用される用語「ワクチン」には、宿主に接種された際に、特定の病原体に対して防御免疫を誘導する、任意の非病原性免疫原が含まれる。ワクチンは多くの形を取ってもよい。ワクチンは、病原体と抗原を共有するが、それ自体は病原性ではない生物全体であってもよい（例えば牛痘）。ワクチンはまた、殺された（例えばソーク・ポリオワクチン）または弱毒化された（疾患を生じる能力を失っている、例えばサビン・ポリオワクチン）病原体から調製されてもよい。ワクチンはまた、病原性生物から単離された精製巨大分子から調製されてもよい。例えば、可溶性細菌毒素の不活性型を含有し、そして損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細菌に対する免疫ではなく、抗毒素抗体の産生を生じる、トキソイドワクチン（例えば破傷風およびジフテリア）。サブユニットワクチン（例えばＢ型肝炎）は、関心対象の病原体から単離された単一の免疫原性タンパク質のみを含有する。ハプテンコンジュゲートワクチンは、関心対象の病原体から単離された特定の炭水化物またはポリペプチドエピトープを、免疫原性キャリアー、例えば破傷風トキソイドに付着させる。これらの戦略は、本質的に、ハプテンとしてエピトープを用いて、抗体産生を誘導し、該抗体が次いで、天然病原体において同じエピトープを認識する。しかし、最大限に有効であるためには、こうしたワクチンは、ＢおよびＴ細胞エピトープの両方を取り込まなければならず、そしてＴ細胞エピトープが宿主個体の免疫系によって認識され、提示され、そして反応されうることが確実になるように、該エピトープを選択しなければならない。ＤＮＡワクチンは、宿主細胞が、筋内注射された、病原性タンパク質をコードするＤＮＡを取り込み、そしてこれを発現する可能性を利用する。免疫原に対する宿主反応は、免疫原がアジュバントとの混合物として投与された場合、増進されうる。免疫アジュバントは、以下の方式の１つまたはそれより多くで機能する：（１）免疫原の保持の延長、（２）免疫原の有効サイズの増加（そしてしたがって、食作用およびマクロファージへの提示の促進）、（３）マクロファージまたは他の免疫細胞の注射部位への流入の刺激、あるいは（４）局所サイトカイン産生および他の免疫学的活性の促進。アジュバントの例には、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、アルミニウム塩、およびマイコバクテリア由来タンパク質、例えばムラミルジペプチドまたはトリペプチドが含まれる。
【００６０】
この遺伝子の増幅および／またはそのタンパク質の過剰発現は、ＨＮＳＣＣ、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩを含む、多くの癌において見出されてきている。
【００６１】
用語「結合分子」には、抗体および免疫グロブリンが含まれる。
用語「抗体」（Ａｂ）または「免疫グロブリン」（Ｉｇ）には、本明細書において、全抗体および任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）またはその個々の鎖が含まれる。用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、またはその抗原結合部分を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと略される）および重鎖定常領域を含有する。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、より保存されるフレームワーク領域（ＦＲ）と称される領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分されうる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の多様な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第一の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への、免疫グロブリンの結合を仲介しうる。
【００６２】
用語、抗体の「抗原結合タンパク質」（あるいは単に「抗体部分」または「抗体断片」）は、本明細書において、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つまたはそれより多い断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行されうることが示されてきている。用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれる結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（ｖ）ＶＨ／ＶＨＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子にコードされているが、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する、単一の連続鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）として作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて、これらを連結してもよい。こうした一本鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部分」内に含まれることも意図される。これらの抗体断片は、当業者に知られる慣用的技術を用いて得られ、そして該断片は、損なわれていない抗体と同じ方式でスクリーニングされる。
【００６３】
好ましくは、本発明の抗体の抗原結合領域のＣＤＲまたは全抗原結合部分は、マウス、ラマ（ｌｌａｍａ）またはドナーヒトライブラリーから得られるか、あるいは実質的にヒト起源であって、特定の抗体特性、例えばＫＤ、ｋｏｆｆ、ＩＣ５０、ＥＣ５０、ＥＤ５０が最適化されるように、特定のアミノ酸残基が修飾され、例えば異なるアミノ酸残基で置換されている。好ましくは、本発明にしたがった抗体フレームワーク領域は、ヒト起源であるか、または実質的にヒト起源である（少なくとも、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％ヒト起源）。
【００６４】
他の態様において、本発明の抗体抗原結合領域は、限定されるわけではないが、マウス、ラマ、ウサギ、ラットまたはハムスターを含む、他の非ヒト種に由来していてもよい。あるいは、抗原結合領域は、ヒト種に由来してもよい。
【００６５】
用語「可変」は、可変ドメインの特定のセグメントが、抗体間で、配列が広範に異なる事実を指す。Ｖドメインは、抗原結合を仲介し、そして特定の抗原に関する特定の抗体の特異性を定義する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０のアミノ酸スパンに渡って均一には分布しない。その代わり、Ｖ領域は、非常に可変性である「超可変領域」またはＣＤＲまたは「ＨＶＲ」または「ＨＶ」と称されるより短いストレッチによって分離される、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変の断片からなる。天然重鎖および軽鎖の各可変ドメインは、大部分ベータシートの立体配置を与えられる、４つのＦＲを含有し、ＦＲは３つの超可変領域によって連結され、該超可変領域は、ベータフォールド構造を結合し、そしてある場合には該構造の一部であるループを形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって非常に近接して一緒に保持され、そして他の鎖由来の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．  第５版  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  メリーランド州ベセスダ（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗原への抗体結合には直接関与せず、異なるエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における抗体関与を示す。
【００６６】
用語「超可変領域」（「ＨＶＲ」または「ＨＶ」）は、本明細書において、抗原結合に関与する、抗体のアミノ酸残基を指す。典型的には、超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」由来のこうした残基を含む。
【００６７】
ある場合（Ｉｎ  ｓｏｍｅ  ｃａｓｅｓ）、ＣＤＲ領域の１つまたはそれより多いアミノ酸残基を修飾して、ターゲットエピトープに対する結合アフィニティを増加させることが好ましい可能性もまたある。これは、「アフィニティ成熟」として知られ、そしてある場合、ヒト化と関連して実行されてもよく、例えば、抗体のヒト化が結合特異性またはアフィニティの減少を生じ、そして逆突然変異のみによる結合特異性またはアフィニティの十分な改善が不可能である場合である。多様なアフィニティ成熟法、例えば、Ｂｕｒｋｓら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９４：４１２−４１７（１９９７）によって記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏスキャニング飽和突然変異誘発法、およびＷｕら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：６０３７−６０４２（１９９８）に示唆される段階的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟法が当該技術分野に知られる。
【００６８】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは、典型的には、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４として同定される４つのＦＲを有する。ＫａｂａｔにしたがってＣＤＲが定義される場合、軽鎖ＦＲ残基は、ほぼ残基１〜２３（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８（ＬＣＦＲ３）、および９８〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして重鎖ＦＲ残基は、重鎖中、ほぼ残基１〜３０（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４（ＨＣＦＲ３）、および１０３〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ＣＤＲが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中、ほぼ残基１〜２５（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０（ＬＣＦＲ３）、および９７〜１０７（ＬＣＦＲ４）に位置し、そして重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中、ほぼ残基１〜２５（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５（ＨＣＦＲ３）、および１０２〜１１３（ＨＣＦＲ４）に位置する。ある例で、ＣＤＲがＫａｂａｔによって定義されるようなＣＤＲおよび超可変ループのものの両方のアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基はそれにしたがって調節される。例えば、ＣＤＲＨ１にアミノ酸Ｈ２６−Ｈ３５が含まれる場合、重鎖ＦＲ１残基は、１〜２５位であり、そしてＦＲ２残基は３６〜４９位である。
【００６９】
ターゲット抗原に「結合する」本発明の抗体は、タンパク質あるいは抗原発現細胞または組織をターゲティングした際に、診断および／または療法剤として抗体を使用可能であるように、十分なアフィニティで抗原に結合する抗体であり、そしてわずかに他のタンパク質と交差反応性である。分析法：蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、放射性免疫沈降（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡに基づいて、こうした態様において、抗体が非ターゲットタンパク質に（「オフターゲットタンパク質」に）結合する度合いは、特定のターゲットタンパク質への抗体結合の１０％未満である。ターゲット分子への抗体の結合に関して、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープへの「特異的結合」またはこれらに「特異的に結合する」またはこれらに「特異的である」は、非特異的相互作用とは検出可能に（測定可能に）異なる結合を意味する（例えば、ｂＨ１−４４またはｂＨ１−８１に関して、非特異的相互作用は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、ウシ胎児血清、またはニューラビジン（ｎｅｕｒａｖｉｄｉｎ）への結合である）。例えば、対照分子の結合に比較して、分子の結合を決定することによって、特異的結合を測定してもよい。例えば、ターゲットと類似の別の分子、例えば過剰な非標識ターゲットとの競合反応によって、特異的結合を決定してもよい。この場合、プローブへの標識ターゲットの結合が、過剰な非標識ターゲットによって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。本明細書において、例えば、少なくとも約２００ｎＭ、または少なくとも約１５０ｎＭ、または少なくとも約１００ｎＭ、または少なくとも約６０ｎＭ、または少なくとも約５０ｎＭ、または少なくとも約４０ｎＭ、または少なくとも約３０ｎＭ、または少なくとも約２０ｎＭ、または少なくとも約１０ｎＭ、または少なくとも約８ｎＭ、または少なくとも約６ｎＭ、または少なくとも約４ｎＭ、または少なくとも約２ｎＭ、または少なくとも約１ｎＭ、またはそれよりも大きい、ターゲットに関するＫｄを有する分子によって、用語、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチドターゲット上のエピトープへの「特異的結合」、あるいは句、これらに「特異的に結合する」またはこれらに「特異的である」が示されうる。１つの態様において、用語「特異的結合」は、分子が、他のいかなるポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに対しても実質的に結合せずに、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。
【００７０】
用語「Ｋａ」は、本明細書において、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指し、一方、用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。
「結合アフィニティ」は、一般的に、分子（例えば抗体）およびその結合パートナー（例えば抗原）の単一の結合部位の間の非共有相互作用の総計の強度を指す。別に示さない限り、「結合アフィニティ」は、結合対のメンバー（例えば抗体および抗原）の間の１：１相互作用を反映する、本質的な（生得的な、真の）結合アフィニティを指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに関するアフィニティは、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって示されうる。望ましくは、Ｋｄは、約２００ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、６ｎＭ、４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、またはそれ未満である。本明細書に記載するものを含めて、当該技術分野に知られる一般的な方法によって、アフィニティを測定してもよい。低アフィニティ抗体は、一般的に、抗原にゆっくりと結合し、そして容易に解離する傾向がある一方、高アフィニティ抗体は、一般的に、より迅速に抗原に結合し、そしてより長く結合したままである傾向がある。結合アフィニティを測定するための多様な方法が当該技術分野に知られ、本発明の目的のために、このうちのいずれを用いてもよい。
【００７１】
１つの態様において、〜１０反応単位（ＲＵ）で、固定抗原ＣＭ５チップを用い、２５℃で、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）上、表面プラズモン共鳴アッセイを用いることによって、本発明にしたがった「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」を測定する。簡潔には、製造者の指示にしたがって、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）濃度に希釈し、そして次いで、５μｌ／分の流速で、装填（注入）して、結合タンパク質のおよそ１０反応単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミン溶液を注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のため、Ｆａｂの２倍連続希釈（例えば０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、およそ２５μｌ／分の流速で、２５℃で、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で注入する。会合および解離センサグラムを同時にフィットさせることによって、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋоｎ）および解離速度（ｋоｆｆ）を計算する。比ｋоｆｆ／ｋоｎとして、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｙ．ら（１９９９）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによって、オン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えている場合、分光計、例えばストップフロー分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または攪拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて測定した際の、抗原濃度増加の存在下での、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、２０ｎＭ濃度の抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）溶液の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）における増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって、決定してもよい。
【００７２】
用語「ｋоｆｆ」は、結合分子および抗原の間の特定の相互作用の解離速度定数を指す。例えばＯｃｔｅｔＴＭ系を用いて、バイオレイヤー・インターフェロメトリーによって、解離速度定数ｋоｆｆ＋を測定してもよい。
【００７３】
〜１０反応単位（ＲＵ）で、固定抗原ＣＭ５チップを用い、２５℃で、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−２０００またはＢＩＡｃｏｒｅＴＭ−３０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いた、上記と同じ表面プラズモン共鳴技術を用いて、本発明にしたがった「会合速度」（「オン速度」）または「ｋоｎ」もまた、決定してもよい。簡潔には、製造者の指示にしたがって、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）を、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化する。抗原を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８で、５μｇ／ｍｌ（〜０．２μＭ）濃度に希釈し、そして次いで、５μｌ／分の流速で、装填（注入）して、結合タンパク質のおよそ１０反応単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注入後、１Ｍエタノールアミン溶液を注入して、未反応基をブロッキングする。動力学測定のため、Ｆａｂの２倍連続希釈（例えば０．７８ｎＭから５００ｎＭ）を、およそ２５μｌ／分の流速で、２５℃で、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中で注入する。会合および解離センサグラムを同時にフィットさせることによって、単純１対１ラングミュア結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ評価ソフトウェア、バージョン３．２）を用いて、会合速度（ｋоｎ）および解離速度（ｋоｆｆ）を計算する。比ｋоｆｆ／ｋоｎとして、平衡解離定数（Ｋｄ）を計算する。例えば、Ｃｈｅｎ，  Ｙ．ら（１９９９）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２９３：８６５−８８１を参照されたい。しかし、上記表面プラズモン共鳴アッセイによって、オン速度が１０６Ｍ−１ｓ−１を超えている場合、分光計、例えばストップフロー分光光度計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）または攪拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）を用いて測定した際の、抗原濃度増加の存在下での、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、２０ｎＭ濃度の抗−抗原抗体（Ｆａｂ型）溶液の２５℃での蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ；発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍバンドパス）における増加または減少を測定する蛍光消光技術を用いることによって、決定してもよい。
【００７４】
別に言及しない限り、本発明のポリペプチドに関する、句「生物学的に活性」および「生物学的活性」および「生物学的特性」は、生物学的分子に結合する能力を有することを意味する。
【００７５】
句「生物学的分子」は、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、およびその組み合わせを指す。１つの態様において、生物学的分子は、天然に存在する。
慣用法による、全抗体のペプシンまたはパパイン加水分解によって、抗体断片、例えばＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片を得てもよい。さらに、本明細書に記載するように、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて、抗体、抗体部分、および免疫接着分子を得てもよい。
【００７６】
用語「組換え抗体」は、抗体をコードするヌクレオチド配列（単数または複数）を含む細胞または細胞株から発現される抗体を指し、ここで前記ヌクレオチド配列（単数または複数）は、該細胞と天然には関連しない。
【００７７】
用語「変異体」抗体は、本明細書において、親抗体配列に比較して、１つまたはそれより多いアミノ酸残基を付加し、除去し、そして／または置換することによって、その「親」抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を有する抗体を指す。好ましい態様において、変異体抗体は、親抗体に比較して、アミノ酸の少なくとも１つまたはそれより多い（例えば１〜１２、例えば２、３、４、５、６、７、８または９、１０、１１または１２、そして本発明のある態様において１〜約１０の）付加、欠失および／または置換を含む。ある態様において、本発明の付加、欠失および／または置換は、ＣＤＲ変異体抗体部位で作製される。変異体抗体配列に関する同一性または相同性は、本明細書において、配列を整列させ、そして最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、親抗体残基と同一である変異体抗体配列中のアミノ酸残基の割合と定義される。変異体抗体は、親抗体に結合する同じ抗原、そして好ましくはエピトープに結合する能力を保持し、そしてある態様において、少なくとも１つの特性または生物活性は、親抗体の類似の特性より大きい。例えば、変異体抗体は、例えば、親抗体に比較して、発現される結合アフィニティ、より長い半減期、より低いＩＣ５０、または抗原の生物学的活性を阻害する能力の増進を有してもよい。本明細書において特に関心対象となるのは、親抗体の生物学的活性の少なくとも２倍（好ましくは少なくとも５倍、１０倍または２０倍）より大きい生物学的活性を示す変異体抗体である。
【００７８】
用語「二重特異性抗体」は、１つの生物学的分子上の２つの異なるエピトープに特異的に結合可能である、または２つの異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合可能である、単数または複数の抗原結合ドメインを含有する抗体を意味する。二重特異性抗体はまた、本明細書において、「二重特異性」を有すると称されるか、または「二重特異性」を持つ抗体であると称される。
【００７９】
用語「キメラ抗体」は、１つの抗体由来の１つまたはそれより多い領域、および１つまたはそれより多い他の抗体由来の１つまたはそれより多い領域を含有する抗体であって、典型的には、部分的にヒト起源および部分的に非ヒト起源の、すなわち、部分的に非ヒト動物、例えばマウス、ラット、または他の齧歯類、あるいはラクダ科、例えばラマまたはアルパカ（ａｌｐａｃａ）から得られた抗体を、広く指す。ヒト抗体に対して向けられる免疫反応、例えばネズミ抗体の場合、ヒトにおいてネズミ抗体に向けられる反応のリスクを減少させるために、非ヒト抗体よりも、キメラ抗体が好ましい。典型的なキメラ抗体の例は、可変領域配列がネズミである一方、定常領域配列がヒトであるものである。キメラ抗体の場合、抗体ヒト化のため、非ヒト部分をさらなる変化に供してもよい。
【００８０】
用語「ヒト化」は、抗体が完全にまたは部分的に非ヒト起源、例えば、関心対象の抗原での、それぞれマウスまたはラマの免疫によって得られたマウスまたはラマ抗体である場合、あるいはこうしたマウスまたはラマ抗体に基づくキメラ抗体である場合、ヒトにおける免疫反応を回避するかまたは最小限にするために、重鎖および軽鎖のいくつかのアミノ酸、特にフレームワーク領域および定常ドメイン中のアミノ酸を置換してもよいという事実を指す。抗体およびターゲット抗原の間の相互作用の特異性は、主に、６つの重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域に位置するアミノ酸残基に生得的である。したがって、ＣＤＲ領域内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ領域外の配列に比較して、異なる抗体間で、はるかにより多様である。ＣＤＲ領域配列は、ほとんどの抗体−抗原相互作用に関与するため、例えば、特定の抗体由来のＣＤＲ領域配列を、別の抗体のフレームワーク配列内で発現する発現ベクターを構築することによって、特定の天然に存在する抗体、またはより一般的には、所定のアミノ酸配列を有する任意の特定の抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である。その結果、非ヒト抗体を「ヒト化」し、そして親抗体の結合特異性およびアフィニティを実質的に保持することが可能である。ヒト抗体に対する免疫原性、そしてしたがって免疫反応を正確に予測することは不可能であるが、特定の抗体、非ヒト抗体は、一般的に、ヒト抗体よりもより免疫原性である。外来性（例えばラクダまたは齧歯類）定常領域がヒト起源の配列によって置換されているキメラ抗体は、一般的に、完全に外来性起源の抗体よりも、より低い免疫原性を示し、そして療法性抗体としてヒト化または完全ヒト抗体を用いる傾向がある。したがって、非ヒト起源のキメラ抗体または他の抗体をヒト化して、ヒトにおいて、抗体に対して向けられる免疫反応のリスクを減少させてもよい。
【００８１】
キメラ抗体に関して、ヒト化は、一般的に、可変領域配列のフレームワーク領域の修飾を伴う。相補性決定領域（ＣＤＲ領域）の一部であるアミノ酸残基は、ヒト化によって変化しない可能性が最も高いが、ある場合では、例えばグリコシル化部位、脱アミド化部位、アスパラギン異性化セクション、あるいは望ましくないシステインまたはメチオニン残基を取り除くため、ＣＤＲ領域中の個々のアミノ酸残基を変化させることが望ましい可能性もある。Ｎ連結グリコシル化は、トリペプチド配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ、式中、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸であってもよい、におけるアスパラギン残基へのオリゴ糖鎖付加によっておこる。Ｎ−グリコシル化部位の除去を、ＡｓｎまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ残基の別の残基での突然変異によって、好ましくは保存的置換によって、達成してもよい。アスパラギンおよびグルタミン残基の脱アミド化は、ｐＨおよび表面曝露などの要因に応じて起こりうる。アスパラギン残基は、脱アミド化を特に受けやすく、特に、これらがＡｓｎ−Ｇｌｙ配列中に存在する場合に受けやすく、そして他のジペプチド、例えばＡｓｎ−Ａｌａ中ではより低い度合いで受けやすい。こうした脱アミド化領域、特に、ＣＤＲ領域配列中のＡｓｎ−Ｇｌｙでは、関与する残基の１つを除去するために、一般的には保存的置換によって、この領域を取り除くことが好ましい可能性もある。
【００８２】
抗体配列をヒト化するための多くの方法が当該技術分野に知られる；例えばＡｌｍａｒｇｏ  ＆  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．  １３：１６１９−１６３３（２００８）による概説を参照されたい。最も一般的に用いられる方法の１つは、ＣＤＲ領域の移植であり、例えば、ネズミ起源のキメラ抗体が、ネズミ可変領域遺伝子に対するヒト生殖系列遺伝子同等物の同定およびこのフレームワーク内へのマウスＣＤＲ領域配列の移植を伴う場合である。ＣＤＲ領域移植は、ＫａｂａｔによるＣＤＲ領域定義に基づいてもよいが、より後の刊行物（Ｍａｇｄｅｌａｉｎｅ−Ｂｅｕｚｅｌｉｎら，  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．  Ｏｎｃｏｌ  Ｈｅｍａｔｏｌ．  ６４：２１０−２２５（２００７））は、ＩＧＭＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報系（登録商標）、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）による定義が、ヒト化結果を改善しうる（Ｌｅｆｒａｎｃら，  Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２７：５５−７７（２００３））と示唆する。ある場合、ＣＤＲ領域移植は、由来する親抗体ＣＤＲ領域に比較して、非ヒトＣＤＲ移植抗体における結合特異性およびアフィニティ、そしてしたがって生物学的活性を減少させる可能性がある。親抗体の結合アフィニティおよび特異性を回復するため、ＣＤＲ移植抗体中、通常フレームワーク領域中の選択した位に、逆突然変異（ときに、「フレームワーク領域修復」と称される）を適用してもよい。文献において、そして抗体データベースにおいて入手可能な情報を用いて、逆突然変異のためのありうる位の決定を行ってもよい。逆突然変異の候補であるアミノ酸残基は、典型的には、抗体分子の表面上に曝露される一方、深くに位置するかまたは表面曝露の度合いが低い残基は、通常変化しないであろう。ヒト化のＣＤＲ領域移植および逆突然変異法に対する代替法は、表面変化であり、この場合、非ヒト起源の非曝露残基が保持される一方、曝露される残基はヒト残基に置換される。
【００８３】
完全ヒト抗体を得るためには２つの技術がある：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築されたファージライブラリーを用いるもの、またはヒト化動物（マウス、ラット等）のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫である。
【００８４】
ファージディスプレイは、抗体同定のために、最初にそして最も広く用いられるｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術である。１９８５年、Ｓｍｉｔｈは、クローニングされた遺伝子配列が、融合タンパク質として、ファージ粒子表面上で発現されるように、外来性ＤＮＡ配列を糸状バクテリオファージＭ１３内にクローニングしうることを発見した（Ｓｍｉｔｈ  ＧＰ：  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｈａｇｅ：  ｎｏｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｃｌｏｎｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ．  Ｓｉｅｎｃｅ  １９８５，  ２２８：１３１５−１３１７）。したがって、他のタンパク質に結合する能力に基づいて、関心対象の融合タンパク質を選択してもよい。この発見は、免疫グロブリン遺伝子のｃＤＮＡレパートリーをクローニングして、ターゲット特異的モノクローナル抗体を迅速に検索するために使用可能な、可変ドメインを含有する多様なファージライブラリーを生成することを可能にするＰＣＲ増幅技術と組み合わされた。ファージライブラリーのレパートリーは、ライブラリーを生成するためにその血液を用いた各ヒトまたは動物のＢリンパ球抗体のレパートリーを反映する。１９９５年、２つの論文が、完全ヒト抗体を発現する遺伝子操作マウスを生成し、そのレパートリーはハイブリドーマ技術によって産生されたものとマッチング可能であったことを報告した（Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ，  Ｔａｙｌｏｒ  ＬＤ，  Ｈａｒｄｉｎｇ  ＦＡ，  Ｔｒｏｕｎｓｔｉｎｅ  Ｍ，  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＫＭ，  Ｓｃｈｒａｍｍ  ＳＲ，  Ｋｕｏ  ＣＣ，  Ｍａｓｈａｙｅｋｈ  Ｒ，  Ｗｙｍｏｒｅ  Ｋ，  ＭｃＣａｂｅ  ＪＧら：Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｆｏｕｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  １９９４，  ３６８：８５６−８５９；  Ｇｒｅｅｎ  ＬＬ，  Ｈａｒｄｙ  ＭＣ，  Ｍａｙｎａｒｄ−Ｃｕｒｒｉｅ  ＣＥ，  Ｔｓｕｄａ  Ｈ，  Ｌｏｕｉｅ  ＤＭ，  Ｍｅｎｄｅｚ  ＭＪ，  Ａｂｄｅｒｒａｈｉｍ  Ｈ，  Ｎｏｇｕｃｈｉ  Ｍ，  Ｓｍｉｔｈ  ＤＨ，  Ｚｅｎｇ  Ｙら：  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  Ｉｇ  ｈｅａｖｙ  ａｎｄ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＹＡＣｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９９４，  ７：１３−２１）。これらの動物は、動物自身の免疫グロブリンの内因性重鎖およびκ軽鎖の破壊されターゲティングされた遺伝子、ならびにヒト重鎖およびκ軽鎖遺伝子のセグメントに相当する導入された導入遺伝子を有する。ヒト遺伝子レパートリーは、マウス免疫系によって用いられて、より多様な抗原に対する高特異的および高アフィニティ抗体を生成することが見出された。ヒト免疫グロブリン・トランスジェニックマウスが、本質的にマウスおよびヒト構成要素のハイブリッド（例えばヒト免疫グロブリン、マウスＩｇαおよびＩｇβおよび他のシグナル伝達分子）である、Ｂ細胞受容体を発現するという事実にもかかわらず、そのＢ細胞は、正常に発生し、そして成熟する。ある場合、ターゲットエピトープに対する結合アフィニティを増加させるため、ＣＤＲ領域の１つまたはそれより多くのアミノ酸残基を修飾することもまた好ましい可能性がある。これは、「アフィニティ成熟」として知られ、そしてある場合、ヒト化と関連して実行されてもよく、例えば、抗体のヒト化が結合特異性またはアフィニティの減少を生じ、そして逆突然変異のみによる結合特異性またはアフィニティの十分な改善が不可能である場合である。多様なアフィニティ成熟法、例えば、Ｂｕｒｋｓら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ９４：４１２−４１７（１９９７）によって記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏスキャニング飽和突然変異誘発法、およびＷｕら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：６０３７−６０４２（１９９８）に示唆される段階的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアフィニティ成熟法が当該技術分野に知られる。
【００８５】
用語「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」は、細胞の個々のクローン集団によって合成されそして分泌される抗体を指す。クローン集団は、不死化細胞のクローン集団であってもよい。ある態様において、クローン集団中の不死化細胞は、典型的には、リンパ細胞性腫瘍由来の個々の細胞と、免疫された動物由来の個々のＢリンパ球の融合によって産生されるハイブリッド細胞、ハイブリドーマである。ハイブリドーマは、操作された細胞タイプであり、そして天然には存在しない。
【００８６】
「天然抗体」は、典型的には、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって、重鎖に連結される一方、重鎖間のジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプ間で多様である。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔が空いた鎖間ジスルフィド架橋も有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、これにいくつかの定常ドメインが続く。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を、そして他端に、定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、そして軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基が、軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられる。
【００８７】
本開示の多様な抗体を記載するために用いられる、「単離された」（「分離された」）の定義は、同定され、そして発現される細胞または細胞培養から単離されそして／または再生された抗体を指す。その天然環境の混入構成要素（混入物質）は、通常、ポリペプチドの診断的または療法的使用に干渉する物質であり、そしてこれには、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性種が含まれうる。好ましい態様において、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置（エドマン配列決定装置）の使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るために十分な度合いまで、あるいは（２）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた、還元または非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって均一になるまで、精製される。抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないため、単離抗体には、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が含まれる。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００８８】
「単離」核酸分子は、同定され、そして抗体核酸の天然供給源において、通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から分離されている核酸分子である。単離核酸分子は、天然にみられる型またはセッティングとは区別される。したがって、単離核酸分子は、天然細胞に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離核酸分子には、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なる染色体位置にある場合、抗体を通常発現する細胞に含有される核酸分子が含まれる。
【００８９】
用語「エピトープ」は、本明細書において、結合分子（例えば抗体または関連分子、例えば二重特異性結合分子）に特異的に結合する、抗原の部分（決定因子）を指す。エピトープ性決定因子は、通常、分子、例えばアミノ酸または糖側鎖の化学的に活性である表面グループからなり、そして通常、特異的三次元構造特性、ならびに特異的電荷特性を有する。エピトープは、「直鎖」または「コンホメーション性」であってもよい。直鎖エピトープにおいて、タンパク質（例えば抗原）および相互作用分子（例えば抗体）の間の相互作用点はすべて、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線形に存在する。コンホメーション・エピトープにおいて、相互作用点は、一次アミノ酸配列において、互いに分離されている、タンパク質上のアミノ酸残基に渡って存在する。望ましい抗原エピトープが同定されたならば、当該技術分野に周知の技術を用いて、このエピトープに対する抗体を生成してもよい。さらに、抗体または他の結合分子の生成および特徴づけは、望ましいエピトープに関する情報に光を当てうる。この情報に基づいて、次いで、結合分子を、同じまたは類似のエピトープに対する結合に関して、例えば抗原への結合に関して競合する結合分子を見出す競合研究によって、競合的にスクリーニングしてもよい。
【００９０】
用語「ペプチドリンカー」は、本明細書において、任意のアミノ酸配列を含有する、互いに結合するドメインに応じた長さで、ドメインを連結する能力を有する任意のペプチドを意味する。好ましくは、ペプチドリンカーは、５アミノ酸より長い長さを有し、そしてＧ、Ａ、Ｓ、Ｐ、Ｅ、Ｔ、Ｄ、Ｋより選択されるアミノ酸の任意のセットからなる。
【００９１】
用語、抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（Ｆｃ領域天然配列または変異体Ｆｃ領域アミノ酸配列）と会合し、そして抗体アイソタイプに応じて多様である、生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方制御およびＢ細胞活性化である。
【００９２】
「細胞の抗体依存性細胞仲介性細胞傷害性」、および「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、細胞、およびマクロファージ）が、ターゲット細胞上の結合した抗体を認識し、そして続いてターゲット細胞溶解を誘導する、細胞仲介性反応を指す。ＡＤＣＣを仲介する主な細胞、ＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩしか発現しない一方、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約される。関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイを行ってもよい。こうしたアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、関心対象の分子のＡＤＣＣ活性を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓら  ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるものなどの動物モデルにおいて評価してもよい。
【００９３】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたはそれより多いＦｃＲを発現し、そしてエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、そしてＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを仲介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれ；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。本明細書に記載するように、エフェクター細胞を、その天然供給源から、例えば血液またはＰＢＭＣから単離してもよい。
【００９４】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために用いられる。好ましいＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲ（受容体ガンマ）であり、好ましい受容体には受容体のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスが含まれ、これにはこれらの受容体のアレル変異体および選択的スプライシング型が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれ、これらは類似のアミノ酸配列を有し、主に細胞質ドメインが異なる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体のチロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインにおいて、免疫受容体のチロシンに基づく阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５：  ２０３−２３４  （１９９７）を参照されたい）。ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：  ４５７−９２  （１９９１）；  Ｃａｐｅｌら，  Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：  ２５−３４  （１９９４）；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら，  Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．  １２６：  ３３０−４１  （１９９５）において、ＦｃＲの概説が提供される。将来同定されるであろうＦｃＲを含む、他のＦｃＲが、本明細書において、用語「ＦｃＲ」内に含まれる。該用語にはまた、母性ＩｇＧの胎児への移入に関与する、新生受容体、ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １１７：  ５８７  （１９７６）、およびＫｉｍら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２４：  ２４９  （１９９４））。
【００９５】
「補体依存性細胞傷害性」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で、分子がターゲットを溶解する能力を指す。補体活性化経路は、その抗原と複合した分子（例えば抗体）と、補体系の第一の構成要素（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。補体活性化を評価するため、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：  １６３  （１９９６）に記載されるようにＣＤＣアッセイを行ってもよい。
【００９６】
用語「同一性」または「相同性」は、必要であれば、全配列の最大パーセント同一性を達成するため、そして配列同一性のいかなる部分も、保存されると考慮されるものに置換せず、配列を整列させ、そして「ギャップ」を導入した後、同じアミノ酸残基に比較して対応する配列を持つ候補配列中の残基の割合を意味すると解釈すべきである。ＮまたはＣ末端いずれかの伸長および挿入は、同一性または相同性を減少させるとは見なされないものとする。整列のための方法およびコンピュータプログラムが周知である。配列分析ソフトウェア（例えば配列分析ソフトウェアパッケージ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，  １７１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ  ５３７０５）を用いて、配列同一性を測定してもよい。このソフトウェアは、多様な置換、欠失（除去）、および他の修飾に関して、相同性の度合いを決定することによって、こうした配列に有用である。
【００９７】
用語、抗体ポリペプチド配列に関する「相同」は、ポリペプチド配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％の配列同一性を示す抗体と見なされなければならない。核酸配列と関連する該用語は、核酸配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、そして最も好ましくは９７％の配列同一性を示すヌクレオチド配列と見なされなければならない。
【００９８】
本明細書に記載する抗体のアミノ酸配列における修飾（単数または複数）を提供する。例えば、抗体の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが望ましい可能性もある。抗体核酸内に適切なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって、抗体のアミノ酸配列変異体を調製する。こうした修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／またはこうした配列内への残基の挿入、および／またはこうした配列内の残基の置換が含まれる。最終構築物が望ましい特性を所持するという条件で、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終構築物を得る。アミノ酸改変はまた、抗体における翻訳後プロセスも改変してもよく、例えば、グリコシル化部位の数または位置を変化させてもよい。
【００９９】
アミノ酸置換による抗体のアミノ酸配列を修飾するための変異。こうした変異は、抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基の別の残基での置換である。置換性突然変異誘発のための関心対象の部位には、超可変領域またはＣＤＲが含まれるが、置換はまた、ＦＲまたはＦｃ領域中でも意図される。保存的置換を、「好ましい置換」の見出し以下で、表１中に示す。こうした置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表Ａにおける例示的な置換と称される、またはアミノ酸クラスに関連して以下にさらに記載するように、より実質的な変化を導入してもよく、そして産物をスクリーニングしてもよい。
【０１００】
【表１】
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【０１０１】
用語「核酸」、「核配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、および「ヌクレオチド配列」は、交換可能に用いられ、修飾されたまたは修飾されないヌクレオチドの正確な配列を示し、非天然ヌクレオチドを含有するかまたは含有しない核酸断片または領域を決定し、そして二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡあるいは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡいずれかであるか、あるいは前記ＤＮＡの転写産物である。
【０１０２】
本発明が、その天然染色体環境、すなわち天然状態にある、該ヌクレオチド配列に関連しないことが理解されなければならない。本発明の配列は、単離されそして／または精製されており、すなわちこれらは、直接または例えばコピーによって間接的に収集されており、その環境は少なくとも部分的に修飾されている。したがって、遺伝子組換えによって、例えば細胞（宿主細胞）を受け取ることによって得られたか、または化学合成によって得られた単離核酸もまた、本明細書に意図されるものとする。
【０１０３】
ヌクレオチド配列に対する言及は、別に明記しない限り、その相補体を含む。したがって、特定の配列を有する核酸に対する言及は、その相補配列を有するその相補鎖を含むと理解されなければならない。
【０１０４】
表現「制御配列」は、特定の宿主生物において、機能可能であるように連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列には、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター、およびリボソーム結合部位が含まれる。真核細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーを利用することが知られる。
【０１０５】
核酸は、別の核酸配列と機能的関連にあるように配置される場合、「機能可能であるように連結されている」。例えば、プレ配列または分泌性リーダーＤＮＡ配列は、ポリペプチド分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドＤＮＡに機能可能であるように連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、配列転写に影響を及ぼすならば、コード配列に機能可能であるように連結されており；あるいはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されているならば、コード配列に機能可能であるように連結されている。一般的に、「機能可能であるように連結されている」は、連結されたＤＮＡ配列が連続性であり、そして分泌リーダーに関して、連続性であり、そしてリーディング相にあることを意味する。しかし、エンハンサーは連続性でなくてもよい。連結は、存在する制限部位での連結によって達成される。こうした部位が存在しない場合、慣用的実施にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを用いる。
【０１０６】
用語「ベクター」は、本明細書において、連結される別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を意味する。本発明のある態様において、ベクターは、プラスミド、すなわち、ＤＮＡの環状二重鎖片であって、この中にさらなるＤＮＡセグメントを連結可能な前記環状二重鎖片である。本発明のある態様において、ベクターは、ウイルスベクターであって、さらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノム内に連結可能である、前記ウイルスベクターである。本発明のある態様において、ベクターは、ベクターが導入された宿主細胞において、自律複製が可能である（例えば細菌複製起点を有する細菌ベクター、およびエピソーム哺乳動物ベクター）。本発明の他の態様において、ベクター（例えば非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞内に導入されると、宿主細胞ゲノム内に組み込まれることが可能であり、そしてそれによって、宿主遺伝子とともに複製される。さらに、特定のベクターは、機能可能であるように連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。こうしたベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。
【０１０７】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。本発明は、例えば、本発明にしたがった上記のベクターが含まれてもよい、宿主細胞に関する。本発明はまた、例えば重鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、軽鎖またはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列、あるいは本発明の三重特異的結合分子中の第一の結合ドメインおよび／または第二の結合ドメインの両方を含む、宿主細胞にも関する。「組換え宿主細胞」および「宿主細胞」は、特定の対象細胞を指すだけでなく、こうした細胞の子孫も指すよう意図されることを理解しなければならない。修飾は、突然変異または環境的影響のいずれかのため、続く世代でも保持されうるため、こうした子孫は、実際、親細胞と同一でない可能性もあるが、こうした細胞はなお、本明細書において、用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１０８】
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の化合物（単数または複数）以外の任意の成分を記載する。
「薬学的組成物」は、本発明の抗体、ならびに薬学的に許容されうるおよび薬理学的に適合するビヒクル、溶媒、希釈剤、キャリアー、補助剤、分配剤および受容（ｒｅｃｅｐｔｉｖｅ）剤、送達剤、例えば保存剤、安定化剤、充填剤、分散剤、保水剤、乳化剤、懸濁剤、増粘剤、甘味料、香料、フレーバー剤、抗細菌剤、殺真菌剤、潤滑剤、および延長送達調節剤からなる群より選択される構成要素の少なくとも１つを含む組成物を意味し、その選択および適切な比率は、投与および投薬の性質および方法に依存する。例示的な懸濁剤は、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレン、ソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、アガーおよびトラガカント、ならびにその混合物である。多様な抗細菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、ソルビン酸、および類似の化合物によって、微生物作用に対する保護を提供してもよい。組成物には、等張剤、例えば糖、塩化ナトリウム等も含まれてもよい。吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸およびゼラチンを用いることによって、組成物の作用延長を提供してもよい。適切なキャリアー、溶媒、希釈剤、または送達剤の例は、水、エタノール、ポリアルコールおよびその混合物、植物油（例えばオリーブ油）および注射可能有機エステル（例えばオレイン酸エチル）である。例示的な充填剤は、ラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム等である。分散剤および分配剤の例は、デンプン、アルギン酸およびその塩、ケイ酸塩である。潤滑剤の例は、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量のポリエチレングリコールである。剤の、単独でのまたは別の剤と組み合わせた、経口、舌下、経皮、筋内、静脈内、皮下、局所または直腸投与のための薬学的組成物を、慣用的薬学的キャリアーとの混合物として、標準投与型で、動物およびヒトに投与してもよい。適切な標準投与型には、経口型、例えば錠剤、ゼラチンカプセル、丸剤、粉末、顆粒、チューインガムおよび経口溶液または懸濁物、舌下および頬側投与型、エアロゾル、移植物、局所、経皮、皮下、筋内、静脈内、鼻内、または眼内投与型および直腸投与型が含まれる。
【０１０９】
「薬剤（医薬品）」は、ヒトおよび動物において、生理学的機能を回復するか、修正するかまたは修飾することが意図される、そしてまた、疾患の治療および防止、診断、麻酔、避妊、美容術、およびその他のための、錠剤、カプセル、注射剤、軟膏型および他のすぐ使用できる型の物質（または薬学的組成物型の物質混合物）を意味する。
【０１１０】
用語「ＰＤ−Ｌ１仲介性疾患または障害」は、疾患または障害の病因、発生、進行、持続または病理を含めて、ＰＤ−Ｌ１に直接または間接的のいずれかで関連するすべての疾患または障害を意図する。
【０１１１】
「治療する」、「治療」および「療法」は、生物学的障害および／またはその関連する症状の少なくとも１つを減弱させるかまたは排除する方法を指す。本明細書において、疾患、障害または状態を「緩和する」ことは、疾患、障害または状態の症状の重症度および／または発生を減少させることを意味する。さらに、本明細書における「治療」への言及には、治癒的、対症的および予防的療法への言及が含まれる。
【０１１２】
１つの側面において、治療の被験体または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。上記被験体は、任意の年齢の男性または女性であってもよい。
用語「障害」は、本発明の治療によって改善されうる任意の状態を意味する。この用語の定義には、慢性および急性障害または疾患が含まれ、これには、哺乳動物の障害顕在化に対する素因を引き起こす病理学的状態が含まれる。治療すべき疾患の限定されない例には、良性および悪性腫瘍；白血病およびリンパ悪性疾患、特に乳房、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、前立腺または膀胱癌；神経、グリア、星状細胞、視床下部および他の腺、マクロファージ、上皮、間質および胞胚腔（ｂｌａｓｔｏｃｏｅｌｉｃ）障害；炎症性、血管新生および免疫学的障害が含まれる。本発明にしたがって治療すべき好ましい障害は、癌である。
【０１１３】
用語「癌」および「癌性」は、典型的には、制御されない細胞成長／増殖によって特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すかまたは記載する。この定義に含まれるのは、良性および悪性癌である。癌の例には、限定されるわけではないが、癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病が含まれる。こうした癌のより特定の例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃（ｇａｓｔｒｉｃまたはｓｔｏｍａｃｈ）癌、膵臓癌、神経膠芽腫、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（例えば腎細胞癌）、前立腺癌、膣癌、甲状腺癌、肝臓癌、肛門癌、陰茎癌、黒色腫、および多様なタイプの頭頸部癌が含まれる。
【０１１４】
用語「免疫反応」、「自己免疫反応」、および「自己免疫炎症」は、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食作用細胞、顆粒球、およびこれらの細胞または肝細胞によって産生される可溶性巨大分子（侵襲性病原体、病原体に感染した細胞または組織、癌性細胞、あるいは自己免疫または病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織に対する選択的損傷、これらの破壊、あるいはヒト体内からのこれらの排除から生じる、抗体、サイトカイン、および補体を含む）の作用を指す。
【０１１５】
「療法的有効量」は、治療中の疾患の１つまたはそれより多い症状を、ある程度まで緩和するであろう、治療中に投与される療法剤の量と見なされる。
用語「長期の（ｃｈｒｏｎｉｃ）」適用は、長期間、初期の療法効果（活性）を維持するような、急性（短期）投与とは対照的な、剤（単数または複数）の連続（延長された）使用を指す。
【０１１６】
「断続的」使用は、中断を伴わずに一貫して実行するのではなく、事実上、周期的である治療を指す。
本明細書において、そして続く請求項において、背景が別に必要としない限り、単語「有する（ｈａｖｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」あるいはその変形、例えば「有する（ｈａｓ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、言及する整数または整数群を含むが、いかなる他の整数または整数群の排除も伴わないと理解されるものとする。
【０１１７】
発明の詳細な説明
抗体
本発明は、ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１タンパク質）に結合する抗体または抗原結合断片に関する。
【０１１８】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）ＡＰＬＬＬＡＭＴＦＧＶＧＳ（配列番号３）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）ＡＬＹＭＧＮＧＧＨＭ（配列番号７）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１１９】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）ＡＰＬＬＬＡＭＴＦＧＶＧＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）ＡＬＹＭＧＮＧＧＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１２０】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
（ｉ）ＤＹＡＭＳ（配列番号１）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＤＩＳＷＳＧＳＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）ＡＰＬＬＬＡＭＴＦＧＶＧＳ（配列番号３）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）
（ｉ）ＧＬＳＳＧＴＶＴＡＩＮＹＰＧ（配列番号５）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＮＴＮＴＲＨＳ（配列番号６）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）ＡＬＹＭＧＮＧＧＨＭ（配列番号７）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１２１】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
（ｉ）ＤＹＡＭＳ（配列番号１）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＤＩＳＷＳＧＳＮＴＮＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）ＡＰＬＬＬＡＭＴＦＧＶＧＳ（配列番号３）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３
を含む重鎖可変領域、および
（ｂ）
（ｉ）ＧＬＳＳＧＴＶＴＡＩＮＹＰＧ（配列番号５）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ１、
（ｉｉ）ＮＴＮＴＲＨＳ（配列番号６）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ２、
（ｉｉｉ）ＡＬＹＭＧＮＧＧＨＭ（配列番号７）のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３
を含む軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１２２】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
【０１２３】
【化１】
2020516323.tif 000004
【０１２４】
（配列番号４）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、および
（ｂ）
【０１２５】
【化２】
2020516323.tif 000005
【０１２６】
（配列番号８）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
【０１２７】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
【０１２８】
【化３】
2020516323.tif 000006
【０１２９】
（配列番号４）のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、および
（ｂ）
【０１３０】
【化４】
2020516323.tif 000007
【０１３１】
（配列番号８）のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域
を含む、単離抗体またはその抗原結合断片に関する。
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
【０１３２】
【化５】
2020516323.tif 000008
【０１３３】
（配列番号９）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、および
（ｂ）
【０１３４】
【化６】
2020516323.tif 000009
【０１３５】
（配列番号１０）の配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域
を含む、単離抗体に関する。
【０１３６】
１つの態様において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして：
（ａ）
【０１３７】
【化７】
2020516323.tif 000010
【０１３８】
（配列番号９）のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域；
（ｂ）
【０１３９】
【化８】
2020516323.tif 000011
【０１４０】
（配列番号１０）のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域
を含む、単離抗体を提供する。
本発明の１つの態様において、ＰＤ−Ｌ１に結合する単離抗体は、モノクローナル抗体である。
【０１４１】
本発明の１つの態様において、ＰＤ−Ｌ１に結合するモノクローナル抗体は、全長ＩｇＧ抗体である。
本発明の１つの態様において、全長ＩｇＧ抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４アイソタイプのものである。
【０１４２】
本発明の１つの態様において、全長ＩｇＧ抗体はヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。
本発明の１つの態様において、単離抗体は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして配列番号３のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、配列番号７のアミノ酸配列を持つＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含有する、ＢＣＤ−１３５抗体である。
【０１４３】
本発明の１つの態様において、単離抗体は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして配列番号１〜３の対応するアミノ酸配列を持つＣＤＲ１〜３を含む重鎖可変領域、および配列番号５〜７の対応するアミノ酸配列を持つＣＤＲ１〜３を含む軽鎖可変領域を含有する、ＢＣＤ−１３５抗体である。
【０１４４】
本発明の１つの態様において、単離抗体は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして配列番号４のアミノ酸配列を持つ重鎖可変領域、および配列番号８のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変領域を含有する、ＢＣＤ−１３５抗体である。
【０１４５】
本発明の１つの態様において、単離抗体は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、そして配列番号９のアミノ酸配列を持つ重鎖、および配列番号１０のアミノ酸配列を持つ軽鎖を含有する、ＢＣＤ−１３５抗体である。
【０１４６】
核酸分子
本発明はまた、本明細書に記載する本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする核酸分子および配列にも関する。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の第一のドメインおよび第二のドメインのアミノ酸配列は、多様な核酸分子によってコードされる。第一のドメインおよび／または第二のドメインが重鎖および軽鎖を含む場合、ある態様において、重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、多様な核酸によってコードされる。他の態様において、重鎖および軽鎖アミノ酸配列は、同じ核酸分子によってコードされる。特定の態様において、核酸分子は、第一および第二のドメインの任意の組み合わせのアミノ酸配列（例えば重鎖および軽鎖配列）をコードしてもよい。特定の態様において、核酸分子は、第一の結合ドメインのアミノ酸配列および第二の結合ドメインの軽鎖アミノ酸配列をコードしてもよく、所望により、それらを連結するペプチドリンカーの任意の配列を含んでもよい。ヌクレオチド配列に対する言及は、別に明記しない限り、その相補体を含む。したがって、特定の配列を有する核酸に対する言及は、その相補配列を有するその相補鎖を含むと理解しなければならない。用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において、長さ少なくとも１０塩基の、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかであるか、あるいはヌクレオチドのいずれかのタイプの修飾型の、ヌクレオチドのポリマー型を意味する。該用語には、一本鎖および二本鎖型が含まれる。
【０１４７】
本発明はまた、配列番号１〜３、５〜７からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする上記ヌクレオチド配列の１つまたはそれより多くに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列にも関する。特定の態様において、ヌクレオチド配列は、配列番号４または８からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。本発明はまた、配列番号９〜１０からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードする上記ヌクレオチド配列の１つまたはそれより多くに、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列にも関する。
【０１４８】
１つの側面において、本発明は、配列番号１〜１０より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。核酸分子はまた、これらのヌクレオチド配列の任意の組み合わせも含んでもよい。１つの態様において、核酸分子は、配列番号３のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列および配列番号７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、核酸分子は、配列番号１〜３のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列および配列番号５〜７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの態様において、核酸分子は、配列番号４のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列および配列番号８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。１つの態様において、核酸分子は、配列番号９のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列および配列番号１０のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１４９】
上記態様のいずれにおいても、核酸分子は単離されていてもよい。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその部分を産生する任意の供給源から、本発明の核酸分子を単離してもよい。特定の態様において、本発明の核酸分子を合成するが単離しなくてもよい。
【０１５０】
ある態様において、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームでカップリングした、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体由来の第一または第二のドメインのＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。同様に、本発明の核酸分子は、任意の供給源由来の軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列にインフレームで組み合わされた、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体由来の第一または第二のドメインのＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【０１５１】
本発明の別の側面において、第一または第二の結合ドメインの重（ＶＨ）鎖および軽（ＶＬ）鎖の可変ドメインをコードする核酸分子を、全長抗体遺伝子に「変換」してもよい。１つの態様において、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（単数または複数）に機能可能であるように連結され、そして／またはＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに機能可能であるように連結されるように、それぞれ、重鎖定常（ＣＨ）または軽鎖定常（ＣＬ）ドメインをすでにコードする発現ベクター内に挿入することによって、ＶＨまたはＶＬドメインをコードする核酸分子を全長抗体遺伝子に変換する。別の態様において、標準的分子生物学技術を用いて、ＣＨおよび／またはＣＬドメインをコードする核酸分子に、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を結びつける、例えば連結することによって、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸分子を、全長抗体遺伝子に変換する。次いで、全長重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子を、これらが導入されている細胞から発現させてもよい。
【０１５２】
核酸分子を用いて、多量の組換え抗ＰＤ−Ｌ１抗体を発現させてもよい。核酸分子を用いて、本明細書に記載するようなヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ディアボディ、突然変異抗体および抗体誘導体を産生してもよい。
【０１５３】
ベクター
さらに別の側面において、本発明は、本明細書記載の任意のヌクレオチド配列の発現に適したベクターに関する。
【０１５４】
本発明は、本明細書に記載するような抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその部分（例えば第一の結合ドメイン重鎖および第二の結合ドメイン重鎖および／または軽鎖配列）のアミノ酸配列いずれかをコードする核酸分子を含有するベクターに関する。本発明はさらに、融合タンパク質、修飾抗体、抗体断片をコードする核酸分子を含むベクターに関する。
【０１５５】
本発明の別の態様において、核酸分子およびベクターを用いて、突然変異抗ＰＤ−Ｌ１抗体を産生してもよい。第一および／または第二の結合ドメイン重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内で抗体を突然変異させて、例えば抗ＰＤ−Ｌ１抗体の結合アフィニティを改変してもよい。例えば、突然変異は１つまたはそれより多いＣＤＲ領域中で生じて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体のＫＤを増加させるかまたは減少させるか、ｋоｆｆを増加させるかまたは減少させるか、あるいはＰＤ−Ｌ１に対する抗体の結合特異性を修飾してもよい。別の態様において、１つまたはそれより多くの突然変異に供されるのは、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の第一または第二の結合ドメインに対応する抗体において、生殖系列に比較して改変されていることが知られるアミノ酸残基である。これらの突然変異を、可変ドメインまたは定常ドメイン内のＣＤＲ領域またはフレームワーク領域中で行ってもよい。本発明の好ましい態様において、可変ドメイン内で突然変異を産生する。本発明の別の態様において、１つまたはそれより多くの突然変異に供されるのは、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体中の可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域において、生殖系列に比較して改変されていることが知られるアミノ酸残基である。
【０１５６】
ある態様において、遺伝子が、必要な発現制御配列、例えば転写および翻訳制御配列に機能可能であるように連結されるように、発現ベクターにおいて、上述のように得られる、第一および第二の結合ドメインの配列（例えば結合ドメインが重鎖および軽鎖の配列を含む、重鎖および軽鎖の配列）を部分的にまたは完全にコードするＤＮＡを挿入することによって、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を発現する。発現ベクターには、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、植物ウイルス、例えばカリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルス、コスミド、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来エピソーム等が含まれる。ベクターにおける転写および翻訳を制御する配列が、ＤＮＡ転写および翻訳制御の意図される機能をもたらすように、ＤＮＡ分子をベクター内に連結してもよい。用いる発現宿主細胞と適合するように、発現ベクターおよび発現制御配列を選択してもよい。第一および第二の結合ドメインの部分または全長配列（例えば結合ドメインが重鎖および軽鎖の配列を含む、重鎖および軽鎖配列の配列）をコードするＤＮＡ分子を、別個のベクター内に挿入してもよい。本発明の１つの態様において、上記ＤＮＡ分子の任意の組み合わせを、同じ発現ベクター内に導入する。標準法（例えば抗体遺伝子断片およびベクター上の相補的制限部位の連結、または制限部位がない場合は平滑端連結）によって、ＤＮＡ分子を発現ベクター内に導入してもよい。
【０１５７】
適切なベクターは、上述のように、ヒトＣＨまたはＣＬ免疫グロブリンの機能的に完全な配列をコードして、任意のＶＨまたはＶＬ配列を容易に取り込み、そして発現することが可能であるように、適切な制限部位を設計するものである。こうしたベクター内のＮＡおよびＬＣコード遺伝子は、対応するｍＲＮＡを安定化させることによって、タンパク質抗体産物の全体の増加を導くイントロン配列を含有してもよい。イントロン配列は、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位に取り巻かれ、これらの部位は、どこでＲＮＡスプライシングが起こるかを決定する。いくつかのイントロンを用いる場合、イントロン配列は、抗体鎖の可変または定常領域内のいずれか、あるいは可変および定常領域の両方に位置してもよい。ポリアデニル化および転写終結は、天然染色体部位をコードする領域の下流であってもよい。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞による抗体鎖の産生を容易にするシグナルペプチドもコードしてもよい。免疫グロブリン鎖のリーディングフレームアミノ末端にシグナルペプチドが連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクター内にクローニングしてもよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち天然免疫グロブリンタンパク質のものではないシグナルペプチド）であってもよい。
【０１５８】
抗体鎖遺伝子に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する制御配列を所持してもよい。当業者は、制御配列の選択を含めて、発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル等の要因に応じる可能性もあることを認識するであろう。哺乳動物発現宿主細胞に好ましい制御配列には、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を確実にする、ウイルス要素、例えばレトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばラージ・アデノウイルス後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマウイルス由来のプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えば天然免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターが含まれる。ウイルス制御要素、およびその配列のさらなる説明に関しては、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号；第４，５１０，２４５号；および第４，９６８，６１５号を参照されたい。植物における結合分子、例えば抗体の発現のための方法は、プロモーターおよびベクターの説明、ならびに植物の形質転換を含めて、当該技術分野に知られる。例えば米国特許第、６，５１７，５２９号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞におけるポリペプチドの発現のための方法もまた、当該技術分野に周知である。
【０１５９】
抗体鎖遺伝子および制御配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、さらなる配列、例えば宿主細胞におけるベクターの複製を制御する配列（例えば複製起点）および選択可能マーカー遺伝子を所持してもよい。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば米国特許第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号；および第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に対して、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を与える。例えば、選択可能マーカー遺伝子には、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）（選択／ＭＴＸ増幅とともに、ｄｈｆｒ宿主細胞において使用するためのもの）、ｎｅо遺伝子（Ｇ４１８での選択のため）、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子が含まれる。
【０１６０】
用語「発現制御配列」は、本明細書において、これらが連結されるコード配列の発現およびプロセシングを達成するために必要なポリヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；効率的ＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を増進させる配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）；タンパク質安定性を増進させる配列；ならびに、所望により、タンパク質分泌を増進させる配列が含まれる。こうした制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なり；原核生物においては、こうした制御配列には、一般的に、プロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結配列が含まれ；真核生物においては、一般的に、こうした制御配列には、プロモーターおよび転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、その存在が、発現およびプロセシングに必須である少なくともすべての構成要素が含まれ、そしてまた、これにはその存在が有用であるさらなる構成要素、例えばリーダー配列および融合した細胞配列も含まれてもよい。
【０１６１】
宿主細胞
本発明のさらなる側面は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を産生するための方法に関する。本発明の１つの態様は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を発現可能な組換え宿主細胞を提供し、前記宿主細胞を、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の産生に適した条件下で培養し、そして産生された抗ＰＤ−Ｌ１抗体を回収する工程を含む、本明細書に定義するような抗ＰＤ−Ｌ１抗体を産生するための方法に関する。こうした組換え宿主細胞におけるこうした発現によって産生された抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、本明細書において、「組換え抗ＰＤ−Ｌ１抗体」と称される。本発明はまた、こうした宿主細胞の子孫細胞に、そして同じ方法によって得られた抗ＰＤ−Ｌ１抗体にも関する。
【０１６２】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする核酸分子、およびこれらの核酸分子を含むベクターを、適切な哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。変換は、宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための任意の既知の方法によって起こってもよい。異種ポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内に導入するための方法は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、デキストラン仲介性トランスフェクション、核酸および正荷電ポリマー複合体トランスフェクション、核酸およびリン酸カルシウム沈降トランスフェクション、ポリブレン仲介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中に被包されたポリヌクレオチドによるトランスフェクション、および核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションが含まれる。さらに、ウイルスベクターによって、核酸分子を哺乳動物細胞内に導入してもよい。細胞を形質転換するための方法は、当該技術分野に周知である。例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，９１２，０４０号；第４，７４０，４６１号；および第４，９５９，４５５号を参照されたい。植物細胞を形質転換するための方法が当該技術分野に周知であり、これには、例えばアグロバクテリウム仲介性形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーション、およびウイルス形質転換が含まれる。細菌および酵母細胞を形質転換するための方法もまた、当該技術分野において周知である。
【０１６３】
形質転換のための宿主として用いられる哺乳動物細胞株は、当該技術分野に周知であり、そしてこれには、多くの不死化された入手可能な細胞株が含まれる。これらには、特に、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＮＳ０細胞、ＳＰ２、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、アフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）、Ａ５４９細胞、および多くの他の細胞株が含まれる。細胞株は、どの細胞株が、産生されるタンパク質の高発現レベルを有し、そしてその望ましい特性を提供するかを決定することを通じて選択される。用いてもよい他の細胞株は、昆虫細胞株、例えばＳｆ９またはＳｆ２１細胞である。抗ＰＤ−Ｌ１抗体をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、宿主細胞における抗体の発現、またはより好ましくは、宿主細胞を増殖させる培地中での抗体の放出に十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体を産生する。標準的タンパク質精製法を用いて、培地から抗ＰＤ−Ｌ１抗体を回収してもよい。植物宿主細胞には、例えばタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、シロイヌナズナ属（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ウキクサ（ｄｕｃｋｗｅｅｄ）、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモ等が含まれる。細菌宿主細胞には、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が含まれる。酵母宿主細胞には、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。
【０１６４】
さらに、多くの既知の方法を用いて、産生細胞株からの本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の産生レベルを増進させてもよい。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（ＧＳ系）は、特定の条件下で、発現を増進させるために非常に一般的である。ＧＳ系は、一般的に、または部分的に、ＥＰ特許第０２１６８４６号、第０２５６０５５号、第０３２３９９７号、および第０３３８８４１号と関連して論じられる。
【０１６５】
異なる細胞株またはトランスジェニック動物由来の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、グリコシル化プロファイルが異なる可能性がある。しかし、本明細書記載の核酸分子によってコードされるか、または本明細書に示すアミノ酸配列を含む、すべての抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、結合分子グリコシル化状態にかかわらず、そして一般的に、翻訳後修飾の存在または非存在に関わらず、本発明の一部である。
【０１６６】
抗体調製
本発明はまた、抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその抗原結合断片を産生するための方法およびプロセスにも関する。
【０１６７】
モノクローナル抗体
Ｋｏｈｌｅｒら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６，  １９７５，  ｐ．  ４９５に最初に記載されたハイブリドーマに基づく方法を用いてモノクローナル抗体を作製してもよいし、または組換えＤＮＡ法によって作製してもよい（ＵＳ  ４，８１６，５６７）。
【０１６８】
ハイブリドーマに基づく方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物、例えばハムスターを、本明細書に上述するように免疫して、免疫に用いるタンパク質に特異的に結合することが可能な抗体を産生するかまたは産生することが可能なリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫してもよい。免疫後、リンパ球を単離し、そして適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、骨髄腫細胞株と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６，  ｐｐ．  ５９−１０３）。
【０１６９】
こうして調製したハイブリドーマ細胞を、融合していない親骨髄腫の増殖または生存を阻害する１つまたはそれより多い物質を好ましくは含有する、適切な培地中にプレーティングし、そして増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ培地）、すなわちＨＧＰＲＴ不全細胞の増殖を防止する物質を含むものとする。
【０１７０】
細胞融合の構成要素として用いることが好ましい骨髄腫細胞は、容易に融合し、選択した抗体産生細胞による安定な高レベルの抗体産生を維持し、そして未結合親細胞を選択する選択培地に感受性である細胞である。好ましい骨髄腫細胞株は、ネズミ骨髄腫細胞株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、米国カリフォルニア州サンディエゴから入手可能な、ＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍由来のもの、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国メリーランド州ロックビルから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生に関して記載されてきている（Ｋｏｚｂｏｒ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １３３，  １９８４，  ｐ．  ３００１；およびＢｒｏｄｅｕｒら，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７，  ｐｐ．  ５１−６３）。
【０１７１】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降によって、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、決定される。
【０１７２】
また、Ｍｕｎｓｏｎら，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １０７，  １９８０，  ｐ．  ２２０に記載されるスキャッチャード分析によって、モノクローナル抗体またはその一部の結合アフィニティを決定してもよい。
【０１７３】
所望の特異性、アフィニティ、および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定に際して、限界希釈法によってクローンをサブクローニングして、そして標準法によって増殖させてもよい（Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８６，  ｐｐ．  ５９−１０３）。この目的のために有用な培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が含まれる。さらに、例えばマウスへの細胞の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、動物における腹水腫瘍として、ハイブリドーマ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させてもよい。
【０１７４】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体を、慣用的免疫グロブリン精製法、例えばアフィニティクロマトグラフィ（例えばプロテインＡまたはプロテインＱ−セファロース）またはイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析等によって、培地、腹水、または血清から分離してもよい。
【０１７５】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣用的方法を用いて（例えばネズミ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）、容易に単離し、そして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、こうしたＤＮＡの好ましい供給源として働く。ひとたび単離されたら、ＤＮＡを発現ベクター内に入れてもよく、これを次いで、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞にトランスフェクションして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体合成を提供する。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え体発現に関する概説論文に関しては、Ｓｋｅｒｒａら，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｕｎｏｌ．，  ５，  １９９３，  ｐｐ．  ２５６−２６２、およびＰｌｉｉｃｋｔｈｕｎ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖｓ．  １３０，  １９９２，  ｐｐ．  １５１−１８８を参照されたい。
【０１７６】
本発明のさらなる態様において、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８，  １９９０，  ｐｐ．  ５５２−５５４に記載される技術を用いて生成される抗体ファージライブラリーから、モノクローナル抗体または抗体断片を単離してもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２，  １９９１，  ｐｐ．  ６２４−６２８およびＭａｒｋｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２，  １９９１，  ｐｐ．  ５８１−５９７は、ファージライブラリーを用いて、それぞれ、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載する。続く刊行物は、鎖シャフリングによる、高アフィニティ（ｎＭ範囲）のヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０，  １９９２，  ｐｐ．  ７７９−７８３）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ２１，  １９９１，  ｐｐ．  ２２６５−２２６６）を記載する。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマに基づく技術に対する有望な代替法である。
【０１７７】
また、例えば、重鎖および軽鎖（ＣＨおよびＣＬ）定常領域の配列を、相同ネズミ配列に対して置換することによって（ＵＳ  ４，８１６，５６７；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ：  ８１，  １９８４，  ｐ．  ６８５１）、あるいは非免疫グロブリンポリペプチド（異種ポリペプチド）をコードする配列のすべてまたは一部に対して免疫グロブリンコード配列を共有連結することによって、例えばキメラまたは融合抗体ポリペプチドが得られるように、抗体をコードするＤＮＡを修飾してもよい。非免疫グロブリンポリペプチド配列を、抗体定常領域で置換するか、または抗体抗原結合部位の可変領域で置換して、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位、および別の抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位を含有する、キメラ二価抗体を生成してもよい。
【０１７８】
ヒト化抗体
非ヒト動物において、「ヒト化」抗体を生成するための方法が当該技術分野に知られる。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒト供給源由来の本明細書に取り込まれる１つまたはそれより多いアミノ酸残基を有する。非ヒト供給源から得られるこれらのアミノ酸残基は、通常、「移入される（ｉｍｐｏｒｔｅｄ）」可変領域から得られるため、しばしば、「移入」残基と称される。超可変領域配列を、対応するヒト抗体の配列で置換することによって、Ｗｉｎｔｅｒおよび同僚ら（Ｊｏｎｅｓら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１，  １９８６，  ｐｐ．  ５２２−５２５；  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３２，  １９８８，  ｐｐ．  ３２３−３２７；  Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３９，  １９８８，  ｐｐ．  １５３４−１５３６）の方法にしたがって、ヒト化を本質的に実行してもよい。したがって、「ヒト化」抗体は、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）ヒト可変領域より実質的に少ない領域が、非ヒト種から対応する配列によって置換されているキメラ抗体である（ＵＳ  ４，８１６，５６７）。実際、ヒト化抗体は、典型的には、ある超可変領域残基、並びに、おそらくあるＦＲ残基が、齧歯類抗体中の類似領域由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１７９】
ヒト化抗体を作製する際に用いるべき軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインの選択は、抗体をヒト治療に意図する際、抗原性およびＨＡＭＡ反応（ヒト抗ネズミ抗体）を減少させるために非常に重要である。いわゆる「ベストフィット」法にしたがって、齧歯類抗体の可変領域の配列を、既知のヒト可変領域配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類のものに最も近いヒトＶ領域配列を同定し、そしてヒト化抗体で使用するために適したヒトフレームワーク（ＦＲ）をその中で選択する（Ｓｉｍｓら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１，  １９９３，  ｐ．  ２２９６）；  Ｃｈｏｔｈｉａら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １９６，  １９８７，  ｐ．  ９０１）。別の方法は、ヒト抗体軽鎖または重鎖すべての特定の下位群のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。いくつかの異なるヒト化抗体に関して、同じフレームワークを用いてもよい（Ｃａｒｔｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ：  ８９，  １９９２，  ｐ．  ４２８５；  Ｐｒｅｓｔａら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５１，  １９９３，  ｐ．  ２６２３）。
【０１８０】
抗原に対する高い結合アフィニティおよび他の好ましい生物学的特性を保持しながら、抗体をヒト化することがさらに重要である。この目的を達成するため、好ましい方法にしたがって、親およびヒト化配列の概念的三次元モデルを用いた、親配列および多様なヒト化産物の分析プロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、そして当業者によく知られる。選択された候補免疫グロブリン配列のありうる三次元コンホメーション構造を例示し、そしてディスプレイする、コンピュータプログラムが利用可能である。これらのディスプレイを検査することで、候補免疫グロブリン配列が機能する際の残基のありうる役割の分析、すなわち候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。この方法で、所望の抗体特性、例えばターゲット抗原（単数または複数）に対するアフィニティ増加が達成されるように、レシピエントおよび移入配列からＦＲ残基を選択し、そして組み合わせてもよい。一般的に、超可変領域残基は、抗原結合に影響を及ぼす際に、直接、そして最も実質的に関与する。
【０１８１】
ヒト化抗体は、所望により、１つまたはそれより多い細胞傷害剤（単数または複数）とコンジュゲート化して、免疫コンジュゲートを生成する、抗体断片、例えばＦａｂ断片であってもよい。あるいは、ヒト化抗体は、全長抗体、例えば全長ＩｇＧ１抗体であってもよい。
【０１８２】
ヒト抗体およびファージディスプレイライブラリー技術
ヒト化の代替物として、ヒト抗体を得てもよい。例えば、現在、免疫に際して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で、ヒト抗体の全範囲を産生することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を産生することが可能である。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおいて、抗体重鎖連結領域（ＪＨセグメント）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されてきている。こうした生殖系列突然変異体マウス内へのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイのトランスファーは、抗原曝露に際して、ヒト抗体の産生を生じる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ：  ９０，  １９９３，  ｐ．  ２５５１；  Ｊａｋｏｂｏｖｉｓら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３６２，  １９９３，  ｐｐ．  ２５−２５８；  Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら，  Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．，  ７，  １９９３，  ｐ．  ３３；  ＵＳ  ５，５４５，８０６；  ５，５６９，８２５；  ５，５９１，６６９  （すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；  ＵＳ  ５，５４５，８０７；およびＷＯ  ９７／１７８５２を参照されたい）。
【０１８３】
あるいは、免疫されたドナー由来の免疫グロブリン変異領域（Ｖ）範囲からｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を産生するため、ファージディスプレイ技術を用いてもよい（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４８，  １９９０，  ｐｐ．  ５５２−５５３）。この技術にしたがって、抗体Ｖ領域遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えばＭ１３またはｆｄのエンベロープタンパク質のメジャーまたはマイナーいずれかの遺伝子と同じリーディングフレームでクローニングして、そしてファージ粒子表面上で、機能性抗体断片として提示させる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡのコピーを含有するため、抗体の機能特性に基づく選択はまた、前記特性を有する抗体をコードする遺伝子の選択も生じる。したがって、ファージは、Ｂ細胞のある種の特性を模倣する。多様な形式で、ファージ提示を実行してもよい（概説に関しては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ  Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３，  １９９３，  ｐｐ．  ５６４−５７１を参照されたい）。ファージ提示のため、Ｖ遺伝子セグメントの異なる供給源を用いてもよい。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５２，  １９９１，  ｐｐ．  ６２４−６２８は、免疫マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さい恣意的コンビナトリアルライブラリーから、多様なセットの抗オキサゾロン抗体を単離した。免疫ヒトドナーから得られる多様なＶ遺伝子を設計することが可能であり、そして異なるセットの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、一般的に、Ｍａｒｋｓら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２２２，  １９９１，  ｐｐ．  ５８１−５９７、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １２，  １９９３，  ｐｐ．  ７２５−７３４に記載される方法にしたがって、単離してもよい（ＵＳ  ５，５６５，３２３；および５，５３７，９０５もまた参照されたい）。
【０１８４】
また、上述のように、活性化Ｂ細胞によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体を産生してもよい（ＵＳ  ５，５６７，６１０およびＵＳ  ５，２２９，２７５を参照されたい）。
抗体断片
特定の場合、全抗体よりも抗体断片を用いることが望ましい。より小さいサイズの断片は、迅速なクリアランスに寄与し、そして固形腫瘍内へのより優れた浸透に寄与しうる。
【０１８５】
抗体断片の産生のため、多様な技術が開発されてきている。伝統的には、これらの断片は、損なわれていない抗体のタンパク質分解的消化を通じて得られた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４，  １９９２，  ｐｐ．  １０７−１１７、およびＢｒｅｎｎａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９，  １９８５，  ｐ．  ８１を参照されたい）。しかし、現在は、これらの断片を、組換え宿主細胞によって直接産生してもよい。抗体のＦａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖ断片を、多量のこれらの断片の産生を容易にすることを可能にする大腸菌で発現させ、そして該大腸菌から分泌させてもよい。上記ファージ抗体ライブラリーから、抗体断片を単離してもよい。別の態様において、大腸菌から、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を直接単離し、そして化学的にカップリングして、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成してもよい（Ｃａｒｔｅｒら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０，  １９９２，  ｐｐ．  １６３−１６７）。別のアプローチにしたがって、組換え宿主細胞の培養から、Ｆ（ａｂ’）２断片を直接単離してもよい。エピトープ結合受容体の残基が保持されている、増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を持つＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が、ＵＳ  ５，８６９，０４６に記載される。抗体断片を調製する他の方法が、当業者に明らかであるはずである。他の態様において、選択する抗体は、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である（ＷＯ  ９３／１６１８５、ＵＳ  ５，５７１，８９４、およびＵＳ  ５，５８７，４５８を参照されたい）。ＦｖおよびｓＦｖのみが、定常領域を欠く、損なわれていない結合部位を持つ種である；その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏで用いる際、非特異的結合を減少させるために、これらを用いてもよい。ｓＦｖを所持する融合タンパク質を設計して、ｓＦｖのＮまたはＣ末端のいずれかでエフェクタータンパク質の融合を生じてもよい（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ監修、上記を参照されたい）。抗体断片はまた、例えばＵＳ  ５，６４１，８７０に記載されるように、「直鎖抗体」であってもよい。直鎖抗体のこうした断片は、単一特異性または二重特異性であってもよい。
【０１８６】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、２つの異なるエピトープに特異的に結合することが可能な抗体である。例えば、二重特異性抗体は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質の２つの異なるエピトープに結合しうる。他の二重特異性抗体は、別のタンパク質に関する結合部位と組み合わせて、ＰＤ−Ｌ１に関する結合部位を所持してもよい。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば二重特異性抗体のＦ（ａｂ’）２断片）として得られてもよい。
【０１８７】
二重特異性抗体を作製するための方法が、当該技術分野に周知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、両鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０５，  １９８３，  ｐｐ．  ５３７−５３９）。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな仕分けのため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０の異なる抗体分子の潜在的な混合物を産生し、このうち１つのみが正しい二重特異性構造を有する。通常、いくつかのアフィニティクロマトグラフィ工程によって行われる正しい分子の精製は、かなりやっかいで、そして産物収量は低い。類似の方法が、ＷＯ  ９３／０８８２９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０，  １９９１，  ｐｐ．  ３６５５−３６５９に開示される。
【０１８８】
異なるアプローチにしたがって、所望の結合特性を持つ抗体可変ドメイン（抗体抗原結合部位）を、免疫グロブリン定常領域配列に融合させる。融合は、好ましくは、ヒンジＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常領域で行われる。融合体の少なくとも１つに存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、および望ましい場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクター内に挿入し、そして適切な宿主生物内に同時トランスフェクションする。これは、最適な収量を提供するため、構築物中で３つのポリペプチド鎖の不均等な比率を用いる場合の態様において、３つのポリペプチド断片の相互の比率を調節する際に、大きな柔軟性を提供する。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高収量を生じるか、または比が特に重要でない場合、１つの発現ベクター中に、２つまたは３つすべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することも可能である。
【０１８９】
このアプローチの好ましい態様において、二重特異性抗体は、１つのアームにおける第一の結合特異性を持つハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）で構成される。分離を容易にするために、二重特異性分子の半分にのみ免疫グロブリン軽鎖が存在するため、この非対称構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組み合わせから、望ましい二重特異性分子の分離を容易にすることが見出された。このアプローチは、ＷＯ  ９４／０４６９０に開示される。二重特異性抗体を生成するさらなる詳細に関しては、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  １２１，  １９８６，  ｐ．  ２１０を参照されたい。
【０１９０】
ＵＳ  ５７３１１６８に記載される別のアプローチにしたがって、抗体分子対の間の界面を操作して、組換え細胞培養から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にしてもよい。好ましい界面は、ＣＨ３領域の少なくとも部分を含む。この方法において、第一の抗体分子の界面に由来する１つまたはそれより多い小分子アミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）で置換される。大きなアミノ酸側鎖をより小さいもの（例えばアラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第二の抗体分子の界面で、大きい側鎖（単数または複数）に対する同一のまたは類似のサイズの代償性「空洞」を生成する。これは、他の望ましくない最終産物、例えばホモ二量体よりもヘテロ二量体の収量を増加させるための機構を提供する。
【０１９１】
二重特異性抗体には、架橋された抗体または「ヘテロコンジュゲート」が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の１つをアビジンにカップリングし、他方をビオチンにカップリングしてもよい。例えば、こうした抗体を用いて、望ましくない細胞に対して免疫系細胞をターゲティングしてもよく（ＵＳ  ４，６７６，９８０）、そしてＨＩＶ感染の治療のために用いてもよい（ＷＯ  ９１／００３６０、ＷＯ  ９２／２００３７３およびＥＰ  ０３０８９）。任意の好適な架橋法を用いて、ヘテロコンジュゲート抗体を作製してもよい。適切な架橋剤が当該技術分野に周知であり、そして多くの架橋技術とともに、ＵＳ  ４，６７６，９８０に記載される。
【０１９２】
抗体断片から二重特異性抗体を生成するための技術もまた、文献に記載されてきている。例えば、化学的連結を用いて、二重特異性抗体を調製してもよい。Ｂｒｅｎｎａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９，  １９８５，  ｐ．  ８１は、損なわれていない抗体をタンパク質分解的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を生成する方法を記載する。これらの断片は、ジチオール錯化剤、例えばヒ酸ナトリウムの存在下で還元されて、近接するジチオールを安定化させ、そして分子間ジスルフィド結合形成を防止する。次いで、生成されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、メルカプトエチルアミンで還元することによって、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の１つをＦａｂ’−チオールに再変換して、そして等モル量の他方のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を生成する。産生した二重特異性抗体を、酵素の選択的固定のための剤として用いてもよい。
【０１９３】
現在の進歩は、Ｆａｂ’−ＳＨ断片を大腸菌から直接回収することを促進することが可能であり、これを化学的にカップリングして二重特異性抗体を形成してもよい。Ｓｈａｌａｂｙら，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７５，  １９９２，  ｐｐ．  ２１７−２２５は、完全ヒト化二重特異性抗体分子Ｆ（ａｂ’）２断片の産生を記載した。各Ｆａｂ’断片を大腸菌から別個に分離し、そしてｉｎ  ｖｉｔｒｏで直接化学的カップリングに供して、二重特異性抗体を形成した。こうして得た二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体の過剰発現によって特徴づけられる細胞、および正常ヒトＴ細胞に結合する能力を有するとともに、ヒト乳房腫瘍によってターゲティングされるヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を刺激する能力を有した。
【０１９４】
組換え細胞培養から直接、二重特異性抗体断片を作製し、そして単離するための多様な技術もまた記載されてきている。例えば、ロイシン「ジッパー」を用いて、二重特異性抗体を産生してもよい（Ｋｏｓｔｅｌｎｙら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８（５），  １９９２，  ｐｐ．  １５４７−１５５３）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシン「ジッパー」ペプチドを、遺伝子融合によって、２つの異なる抗体のＦａｂ’断片に連結した。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して、単量体を形成し、そして次いで、再度酸化して抗体ヘテロ二量体を形成した。この方法はまた、抗体ホモ二量体を産生するために用いてもよい。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０，  １９９３，  ｐｐ．  ６４４４−６４４８に記載される「ディアボディ」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構である。該断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーによって、軽鎖可変（ＶＬ）領域に連結された、重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬ領域は、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨ領域と対形成するように強いられ、それによって、２つの抗原結合部位が形成される。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用に基づいて、二重特異性抗体断片を作製するための別の戦略もまた、報告されてきている（Ｇｒｕｂｅｒら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  １５２，  １９９４，  ｐ．  ５３６８を参照されたい）。
【０１９５】
２より多い価数を有する抗体もまた、本発明の範囲内に属する。例えば、三重抗体を調製してもよい（Ｔｕｔｔら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４７，  １９９１，  ｐ．  ６０）。
【０１９６】
多価抗体
抗原を発現する細胞によって、多価抗体は内在化（そして／または異化）可能であり、該抗原に該抗体は二価抗体よりも迅速に結合する。本発明の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって容易に調製可能である、３つまたはそれより多い抗原結合部位（例えば四価抗体）を含む多価抗体（非ＩｇＭクラス）であってもよい。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つまたはそれより多い抗原結合部位を含んでもよい。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ断片またはヒンジ領域を含む（またはそれらからなる）。こうした場合、抗体は、Ｆｃ断片、およびＦｃ断片に対してＮ末端に位置する３つまたはそれより多い抗原結合部位を含有するはずである。本明細書において、好ましい多価抗体は、３つ〜約８つであるが、好ましくは４つの抗原結合部位を含む（またはそれらからなる）。多価抗体は、少なくとも１つのポリペプチド鎖（および好ましくは２つのポリペプチド鎖）を含み、ここで、ポリペプチド鎖（単数または複数）は、２つまたはそれより多い可変領域を含む。例えば、ポリペプチド鎖（単数または複数）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでもよく、ここで、ＶＤ１は第一の可変ドメインであり、ＶＤ２は第二の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１つのポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを示し、そしてｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（単数または複数）は、以下の鎖：ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域を含んでもよい。本明細書に提供する多価抗体は、好ましくは、少なくとも２つ（および好ましくは４つ）の軽鎖可変領域ポリペプチドをさらに含む。本明細書に提供する多価抗体は、例えば、約２つ〜約８つの軽鎖可変領域ポリペプチドを含む。本明細書において、軽鎖可変領域ポリペプチドは、軽鎖可変領域を含み、そして所望により、ＣＬ領域をさらに含む。
【０１９７】
薬学的組成物
本発明の別の側面は、活性成分として（または単一活性成分として）ＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体を含む、薬学的組成物である。薬学的組成物には、本明細書に記載するような任意の抗ＰＤ−Ｌ１抗体が含まれてもよい。本発明のある態様において、組成物は、ＰＤ−Ｌ１活性に関連しうる障害を改善するか、予防するか、または治療するためのものである。
【０１９８】
一般的に、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、例えば、本明細書で以下に記載するような、１つまたはそれより多い薬学的に許容されうる賦形剤と組み合わせて、投薬型として使用するために適している。
【０１９９】
本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および１つまたはそれより多いそれぞれの表面受容体をターゲティングする、１つまたはそれより多いさらなる結合分子（例えば抗体）を含有してもよい。
【０２００】
薬学的組成物は、無菌である（ａｓｅｐｔｉｃ）、すなわち生存微生物およびその胞子を含まない場合、「滅菌された（ｓｔｅｒｉｌｅ）」ものである。
薬学的組成物は、活性剤が、保存温度、例えば２〜８℃の温度で、その保存可能期間に渡って、その物理的安定性および／または化学的安定性および／または生物学的活性を保持するならば、「安定な」ものである。活性剤が、その物理的および化学的安定性、ならびにその生物学的活性を保持することが望ましい。保存期間は、加速されたおよび天然の保存条件下での安定性研究の結果に基づいて選択される。
【０２０１】
用語「賦形剤」は、本明細書において、本発明の化合物（単数または複数）以外の任意の成分を記載する。不活性賦形剤の選択は、大部分、投与の特定の様式、溶解度および安定性に対する賦形剤の影響、ならびに投薬型の性質などの要因に応じる。本明細書において、「薬学的に許容されうる賦形剤」には、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、および類似の生理学的に適合する物質が含まれる。薬学的に許容されうる賦形剤のある例は、水、生理食塩水、リン酸緩衝剤、デキストロース、グリセロール、エタノール等、およびその組み合わせである。多くの場合、等張剤、例えば糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物内に含むことが好ましい。薬学的に許容されうる物質のさらなる例は、抗体の保存可能期間または有効性を増進させる、湿潤剤または微量の補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、保存剤または緩衝剤である。
【０２０２】
「緩衝剤」によって、その組成物を構成する、酸性およびアルカリ性構成要素の間の相互作用により、ｐＨ値を維持することが可能な溶液を意味する。一般的に、薬学的組成物のｐＨは、好ましくは４．５〜７．０の間である。当業者に知られ、そして文献に見出されうる緩衝剤の例には、限定されるわけではないが、ヒスチジン、クエン酸、コハク酸、酢酸、リン酸、リン酸−塩、クエン酸−リン酸緩衝剤、およびトロメタミンに基づく緩衝剤等、または適切な混合物が含まれる。
【０２０３】
「等張剤」によって、溶液の等張浸透圧を提供する、補助物質、あるいは２つまたはそれより多い補助物質の混合物を意味する。「等張」は、約２５０〜３５０ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を生成する溶液と見なされる。等張剤として、ポリオール、単糖または二糖、アミノ酸、金属塩、例えば塩化ナトリウム等を用いてもよいが、これらに限定されない。用語「低張」は、ヒト血液のものより低い浸透圧を持つ組成物を記載する。対応して、用語「高張」は、ヒト血液のものより高い浸透圧を持つ組成物を記載する。
【０２０４】
用語「表面活性剤」（界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）または表面活性剤またはＳＡＳとも称される）は、本明細書において、液体抗体調製物の表面張力を変化させうる賦形剤を指す。特定の態様において、表面活性剤は、液体抗体調製物の表面張力を減少させる。他の態様において、「表面活性剤」は、調製物中の任意の抗体のコロイド安定性または溶解度における改善にも寄与しうる。表面活性剤は、産生された抗体調製物の凝集を減少させ、そして／または調製物中の微粒子の形成を最小限にし、そして／または吸着を減少させることも可能である。表面活性剤はまた、凍結／融解周期中またはその後、および振盪中の抗体の安定性も改善しうる。表面活性剤は、イオン性または非イオン性であってもよい。本発明の配合物中に含まれうる例示的な非イオン性表面活性剤には、例えば、アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルポリグルコシド（例えばオクチルグルコシドおよびデシルマルトシド）、脂肪アルコール、例えばセチルアルコールおよびオレイルアルコール、コカミドＭＥＡ、コカミドＤＥＡ、およびコカミドＴＥＡが含まれる。本発明の配合物中に含まれうる特定の非イオン性表面活性剤には、例えばポリソルベート、例えばポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリソルベート８１、およびポリソルベート８５；ポロキサマー、例えばポロキサマー１８８（Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ  Ｐ１８８）、ポロキサマー４０７；ポリエチレン−ポリプロピレングリコール；またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレンおよびプロピレングリコールコポリマー（例えばプルロニックＰＦ６８等）が含まれる。
【０２０５】
「安定化剤」によって、活性剤の物理的および／または化学的安定性を提供する、補助物質あるいは２つまたはそれより多い補助物質の混合物を意味する。安定化剤として、アミノ酸を用いてもよく、これには、例えば、限定されるわけではないが、アルギニン、ヒスチジン、グリシン、リジン、グルタミン、プロリン；表面活性剤、例えば限定されるわけではないが、ポリソルベート２０（商標名Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート８０（商標名Ｔｗｅｅｎ８０）、ポリエチレン−ポリプロピレングリコールおよびそのコポリマー（商標名ポロキサマー）、プルロニック、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；酸化防止剤、例えば限定されるわけではないが、メチオニン、アセチルシステイン、アスコルビン酸、モノチオグリセロール、硫酸の塩等；キレート剤、例えば限定されるわけではないが、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、クエン酸ナトリウム等がある。
【０２０６】
「薬学的に許容されうる酸」には、配合される濃度および型で非毒性である、無機および有機酸が含まれる。例えば、適切な無機酸には、塩酸、過塩素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、スルホン酸、硫酸、スルファニル酸、リン酸、炭酸等が含まれる。適切な有機酸には、直鎖および分枝鎖アルキル、芳香族、環状、環状脂肪酸、アリール脂肪酸、複素環酸、飽和、不飽和、モノ、ジ、およびトリカルボン酸が含まれ、例えばギ酸、酢酸、２−ヒドロキシ酢酸、トリフルオロ酢酸、フェニル酢酸、トリメチル酢酸、ｔ−ブチル酢酸、アントラニル酸、プロパン酸、２−ヒドロキシプロパン酸、２−オキソプロパン酸、プロパン二酸、シクロペンタンプロピオン酸、シクロペンタンプロピオン酸、３−フェニルプロピオン酸、ブタン酸、ブタン二酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、２−アセトキシ−安息香酸、アスコルビン酸、桂皮酸、ラウリル硫酸、ステアリン酸、ムコン酸、マンデル酸、コハク酸、エンボン酸、フマル酸、リンゴ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、マロン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、グリコール酸、グリコン酸、グルコン酸、ピルビン酸、グリオキサル酸、シュウ酸、メシル酸、コハク酸、サリチル酸、フタル酸、パルモン（ｐａｌｍｏｉｃ）酸、パルメン（ｐａｌｍｅｉｃ）酸、チオシアン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、４−コロベンゼンスルホン（ｃｈｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ）酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、４−メチルビシクロ［２．２．２］−オクト−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−３−（ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、ヒドロキシナフトエ酸が含まれる。
【０２０７】
「薬学的に許容されうる塩基」には、配合される濃度および型で非毒性である、無機および有機塩基が含まれる。例えば適切な塩基には、無機塩基形成金属、例えばリチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アンモニウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム、Ｎ−メチルグルカミン、モルホリン、ピぺリジン、ならびに、一級、二級および三級アミン、置換アミン、環状アミンを含む有機非毒性塩基および塩基性イオン交換樹脂［例えば、Ｎ（Ｒ’）４＋（式中、Ｒ’は、独立にＨまたはＣ１−４アルキルである、例えばアンモニウム、Ｔｒｉｓ）］、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、ポリアミン樹脂等が含まれる。特に好ましい有機非毒性塩基は、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、コリン、およびカフェインである。本発明で有用なさらなる薬学的に許容されうる塩および塩基には、アミノ酸、例えばヒスチジン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、およびアスパラギンに由来するものが含まれる。
【０２０８】
本明細書において、関心対象の「希釈剤」は、薬学的に許容可能であり（ヒトへの投与のために安全でそして非毒性である）、そして液体組成物の調製、例えば凍結乾燥後に再構成される組成物に有用であるものである。例示的な希釈剤には、水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、無菌生理食塩水溶液、リンゲル溶液またはデキストロース溶液が含まれる。代替態様において、希釈剤には、塩および／または緩衝剤の水溶液が含まれてもよい。
【０２０９】
「保存剤」は、細菌活性を減少させるために、本明細書に提供する組成物に添加してもよい化合物である。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（ｍｕｌｔｉ−ｕｓｅ）（多数用量）組成物の産生を容易にしうる。潜在的な保存剤の例には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム（アルキル基が長鎖化合物である、塩化アルキルベンジルジメチルアンモニウムの混合物）、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。他のタイプの保存剤には、芳香族アルコール、例えばフェノール、ブチルおよびベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールが含まれる。本明細書で提供する最も好ましい保存剤はベンジルアルコールである。
【０２１０】
用語「凍結乾燥された」は、本明細書において、調製物の凍結、および次いで、凍結内容物からの氷の昇華を含む、フリーズドライとして当該技術分野に知られるプロセスに供されている調製物を指す。
【０２１１】
用語「アミノ酸」は、本明細書において、アミノ酸（遊離アミノ酸、すなわちペプチドまたはタンパク質配列中のアミノ酸ではない）を示す。アミノ酸は、本明細書において、限定されるわけではないが、例えば、アルギニン、グリシン、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、イソロイシン、ロイシン、アラニン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、メチオニンおよびプロリンを含む。
【０２１２】
本発明の薬学的組成物およびその調製法は、当業者には疑いなく明らかである。こうした組成物およびその調製法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  第２１版，  Ｔｒｏｙ，  Ｂｅｒｉｎｇｅｒ．，  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ．，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ  ２００６に見出されうる。薬学的組成物の産生は、好ましくは、ＧＭＰ（製造管理および品質管理に関する基準）を満たす。
【０２１３】
本発明の薬学的組成物を、単一単位用量、または複数の単一単位用量として、製造し、パッケージングし、または一般的に流通させてもよい。用語「単一単位用量」は、本明細書において、あらかじめ決定した量の活性成分を含む、薬学的組成物の別個の量を意味する。活性成分の量は、一般的に、被験体に投与するであろう活性成分の投薬量と等しいか、あるいは投薬量の好適な部分、例えばこうした投薬量の半量または１／３量である。
【０２１４】
当該技術分野に許容されるペプチド、タンパク質または抗体を投与するための任意の方法を、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体に関して適切に用いてもよい。
本発明の薬学的組成物は、一般的に、非経口投与のために適している。本明細書において、用語、薬学的組成物の「非経口投与」には、被験体組織の完全性の物理的攪乱および組織の破損を通じた組織内への薬学的組成物の投与によって特徴づけられる任意の投与経路が含まれ、一般的に該投与は血流、筋内、または内部臓器への直接接触を生じる。したがって、非経口投与には、限定されるわけではないが、組成物の注射による薬学的組成物の投与によるもの、外科的切開を通じた組成物の投与によるもの、組織貫通性非外科的創傷を通じた組成物の適用によるもの等が含まれる。特に、非経口投与には、限定されるわけではないが、皮下、腹腔内、筋内、静脈内、動脈内、クモ膜下腔内、心室内、尿道内、頭蓋内、関節内注射または注入；ならびに腎臓透析および注入技術が含まれると想定される。腫瘍内送達、例えば腫瘍内注射もまた有用でありうる。また、局所灌流が意図される。好ましい態様には、静脈内および皮下経路が含まれる。
【０２１５】
非経口投与に適した薬学的組成物の投薬型は、好適に、薬学的に許容されうるキャリアー／賦形剤、例えば滅菌水または滅菌等張生理食塩水と関連する活性成分を含む。こうした投薬型を、ボーラス投与または連続投与に適した型で、調製するか、パッケージングするか、または流通させてもよい。注射投薬型を、単位投薬型で、例えば保存剤を含有するアンプルまたは多数用量容器中で、調製するか、パッケージングするか、または流通させてもよい。非経口投与のための投薬型には、限定されるわけではないが、懸濁物、溶液、油性または水性基剤中のエマルジョン、ペースト等が含まれる。こうした投薬型はまた、限定されるわけではないが、懸濁剤、安定化剤、または分散剤を含む、１つまたはそれより多いさらなる成分も含有してもよい。非経口投与のための本発明の組成物の１つの態様において、活性成分を、再構成された配合物の非経口投与前に、適切な基剤（例えば滅菌発熱物質不含水）に溶解するための乾燥型（すなわち粉末または顆粒）で提供する。非経口投薬型にはまた、充填剤、例えば塩、炭水化物および緩衝剤（好ましくは、３〜９のｐＨ、そしてより好ましくは４．５〜７のｐＨ）を含有してもよい水溶液が含まれるが、ある種の適用に関しては、より適切な投薬型は、滅菌非水性溶液、または適切な基剤、例えば滅菌発熱物質不含水と組み合わせて使用するための乾燥型であってもよい。非経口投与型の例には、滅菌水性溶液、例えば水性プロピレングリコールまたはデキストロース溶液中の溶液または懸濁物が含まれる。こうした投薬型は所望により緩衝されていてもよい。非経口投与のための他の適切な投薬型には、微結晶型でまたはリポソーム調製物中に活性成分を含むものが含まれてもよい。非経口投与のための投薬型は即時および／または修飾放出のために作製されてもよい。修飾放出を伴う投薬型には、遅延、持続、パルス、制御、ターゲティング化およびプログラム放出が含まれる。
【０２１６】
例えば、１つの側面において、必要に応じて、上に列挙する成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な溶媒中に、必要な量の三重特異的抗ＰＤ−Ｌ１抗体を取り込み、その後、フィルター滅菌することによって、滅菌注射溶液を調製してもよい。一般的に、基本分散媒体および上に列挙するものから必要な他の成分を含有する滅菌溶媒内に、活性化合物を取り込むことによって、分散物を調製する。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製のための方法は、活性成分の粉末に加えて、以前に滅菌濾過されたその溶液に由来する任意のさらなる望ましい成分を生じる、フリーズドライ（凍結乾燥）である。例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用によって、分散物の場合、必要な粒子サイズの維持によって、そして表面活性剤を用いて、溶液の適切な流動性を維持してもよい。組成物内に吸収遅延剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含むことによって、そして／または修飾放出コーティング（例えば緩慢放出コーティング）によって、注射組成物の吸収延長を達成してもよい。
【０２１７】
また、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、鼻内投与または吸入によって、典型的には、乾燥粉末吸入器、例えばエアロゾル加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー（好ましくは細かいミストを産生するために、電気水力学の原理を用いるアトマイザー）またはネブライザーから、適切な噴霧剤を使用してまたは使用せず、あるいは点鼻薬として、乾燥粉末の形で（単独で、混合物として、または混合構成要素の粒子の形で、例えば適切な薬学的に許容されうる充填剤と混合して）、投与してもよい。
【０２１８】
加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、またはネブライザーは、一般的に、例えば活性剤を分散させるか、溶解するかまたはその放出を延長するために適切な剤、溶媒としての噴霧剤を含む、本発明の結合分子の溶液または懸濁物を含有する。
【０２１９】
乾燥粉末または懸濁剤で使用する前に、薬剤は、通常、吸入による送達のために適したサイズ（典型的には５ミクロン未満）に微粒子化される。これは、任意の適切な粉砕（ｃｏｍｍｉｎｕｔｉｎｇ）法、例えばスパイラルジェットミルにおける製粉、ジェットミル流体化ベッド、ナノ粒子を形成するための超臨界流体処理、高圧ホモジナイズ、またはスプレー乾燥によって達成されてもよい。
【０２２０】
吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌｏａｔｏｒ）で使用するためのカプセル、ブリスターおよびカートリッジが、本発明の化合物および適切な粉末基剤および活性修飾剤の粉末混合物を含有するように設定してもよい。
【０２２１】
電気水力学原理を用いて、細かいミストを産生するアトマイザーにおいて使用するための溶液の適切な配合物は、作動あたりの本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適切な用量を含有してもよく、そして加圧あたりの体積は、例えば１μｌ〜２００μｌ、より好ましくは１μｌ〜１００μｌで、多様であってもよい。
【０２２２】
吸入／鼻内投与に意図される本発明の投薬型に対して、適切なフレーバー剤、例えばメントールおよびレボメントール、あるいは甘味料、例えばサッカリンまたはサッカリンナトリウムを添加してもよい。
【０２２３】
即時および／または修飾放出のため、非経口投与のための投薬型を作製してもよい。修飾放出を伴う投薬型には、遅延、持続、パルス、制御、ターゲティング化およびプログラム放出が含まれる。
【０２２４】
乾燥粉末吸入器およびエアロゾルの場合、投薬単位は、測定される量を送達するバルブによって確立される。本発明にしたがった単位は、通常、本発明の結合分子の測定される用量または「注射」を投与するよう設定される。１日総用量は、一般的に、単回用量で、または１日に渡って分割された用量として、より頻繁に投与されるであろう。
【０２２５】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体はまた、経口投与のための投薬型で設定されてもよい。経口投与は、化合物が胃腸管に入るように、嚥下を伴ってもよく、そして／または頬側、舌または舌下投与は口から直接血流に進入する。
【０２２６】
経口投与に適した投薬型には、固形、半固形および液体系、例えば錠剤；マルチまたはナノ粒子、液体、または粉末を含有する、軟または硬カプセル；ロゼンジ（液体充填を含む）；チュアブル型；ゲル；迅速溶解投薬型；フィルム；座薬；スプレー；および頬側／粘膜付着パッチが含まれる。
【０２２７】
液体投薬型には、懸濁物、溶液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。こうした配合物を軟または硬カプセル（例えばゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース製）中で充填剤として使用してもよく、そして該配合物は、典型的には、キャリアー、例えば水、エタノール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、メチルセルロース、または適切な油、および１つまたはそれより多い乳化剤および／または懸濁剤を含む。液体投薬型はまた、例えばサシェからの固形物の還元（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）によって調製されてもよい。
【０２２８】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の療法的使用
１つの側面において、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、ＰＤ−Ｌ１活性と関連する疾患および障害、例えば：ＨＮＳＣＣ（頭頸部扁平上皮癌）、子宮頸癌、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ（トリプルネガティブ乳癌）、ＣＲＣ（結腸直腸癌）、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩ（高頻度マイクロサテライト不安定性を有する結腸直腸癌）の群より選択される疾患または障害の治療に用いる。
【０２２９】
１つの側面において、治療の被験体または患者は、哺乳動物、好ましくはヒト被験体である。上記被験体は、任意の年齢の男性または女性であってもよい。
腫瘍（例えば癌）の場合、抗体または抗体断片（例えばＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体または抗体断片）の療法的有効量は、癌細胞の数を減少させ；腫瘍サイズを減少させ；癌細胞が末梢臓器内に浸潤することを阻害し（すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し）；腫瘍転移を阻害し（すなわちある程度遅延させ、そして好ましくは停止し）；腫瘍増殖をある程度阻害し；そして／または障害と関連する症状の１つまたはそれより多くを、ある程度軽減することも可能である。抗体または抗体断片は、存在する癌細胞の増殖をある程度防止し、そして／または該癌細胞を殺し、細胞分裂停止および／または細胞傷害性効果を提供することも可能である。癌療法のため、有効性は、例えば、寿命、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）、反応速度（ＲＲ）、反応期間および／または生活の質によって測定することも可能である。
【０２３０】
本明細書において、用語、抗ＰＤ−Ｌ１抗体と１つまたはそれより多い他の療法剤を指す「併用処方」、「併用処方する」および「組み合わせて」は、以下を意味するか、指すかまたは含むと見なされる：
１）本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への同時投与であって、こうした構成要素が、前記構成要素が実質的に同時に前記患者に放出される１つの投薬型に一緒に配合される、前記同時投与；
２）本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への同時投与であって、こうした構成要素を異なる投薬型に別個に配合し、前記患者へのその導入がほぼ同時に行われた際、前記構成要素が、前記患者に実質的に同時に放出される、前記同時投与；
３）本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への連続投与であって、こうした構成要素が、互いに別々に、別個の投薬型に配合され、この投薬型が、前記患者によって、各投与の間の十分な時間間隔で連続して摂取された際、前記構成要素が、前記患者に実質的に異なる時点で放出される、前記連続投与；および
４）本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体および療法剤のこうした組み合わせの、治療を必要とする患者への連続投与であって、こうした構成要素が、単一の投薬型に一緒に配合され、ここから、これらの構成要素の放出が、制御された方式で行われた際、これらが、前記患者に、同じ時点および／または異なる時点で同時に、連続してまたは一緒に放出され、各部分が、１つの経路によってまたは異なる経路によって投与されうる、前記連続投与。
【０２３１】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、さらなる療法的治療を伴わずに、すなわち個別療法として処方してもよい。さらに、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の治療には、少なくとも１つのさらなる療法的治療（併用療法）が含まれてもよい。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、癌治療のための別の薬物／薬物療法とともに投与してもよいし、または配合してもよい。
【０２３２】
用語「細胞傷害剤」は、本明細書において、細胞の機能を阻害するかまたは防止し、そして／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。該用語は、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、ならびにその断片および／または変異体を含めて、細菌、真菌、植物または動物起源の毒素、例えば小分子毒素または酵素的に活性である毒素を含むと意図される。
【０２３３】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えばチオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））；スルホン酸アルキル、例えばブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボクオン、メツレドパ、およびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラルニン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｒｎｉｎｅ）を含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅｓ）；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＥＮＯＬ（登録商標））；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類似体、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ（登録商標））、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン（ｓｃｏｐｏｌｅｃｔｉｎ）、および９−アミノカンプトテシン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えばクロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、酸化メクロレタミン塩酸塩、メルファラン、ノヴェムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン；抗生物質、例えばエンジイン抗生物質（例えばカリケアマイシン、特にカリケアマイシン・ガンマＩＩおよびカリケアマイシン・オメガＩＩ（例えばＡｎｇｅｗ，  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔｌ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  ３３：  １８３−１８６  （１９９４）））；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２−ピロリノドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射剤（ＤＯＸＩＬ（登録商標））、リポソームドキソルビシンＴＬＣ  Ｄ−９９（ＭＹＯＣＥＴ（登録商標��）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン（ＣＡＥＬＹＸ（登録商標））、およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、テガファー（ＵＦＴＯＲＡＬ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、エポチロン、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えばフロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えばメイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）多糖複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、オレゴン州ユージーン）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロフェルマライウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子配合物（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））；クロラムブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトリオトレキセート；白金剤、例えばシスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、ビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標））、ＦＩＬＤＥＳＩＮ（登録商標）、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））を含む、チューブリン重合が微小管を形成することを妨げるビンカ類；エトポシド（ＶＰ���１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ロイコボリン；ノヴァントロン；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（登録商標））を含むレチノイド、例えばレチノイン酸；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えばＢＥＮＥＦＯＳ（登録商標）またはＯＳＴＡＣ（登録商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（登録商標））、ＮＥ−５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（登録商標））。アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＪＸ（登録商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（登録商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（登録商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（登録商標））；トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子、例えばＰＫＣ−アルファ、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓ、および上皮増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）などの発現を阻害するもの；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（登録商標）ワクチンおよび遺伝子治療ワクチン、例えばＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標））；ｒｍＲＨ（例えばＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標））；ＢＡＹ４３９００６（ソラフェニブ；Ｂａｙｅｒ）；ＳＵ−１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ペリフォシン、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；ＣＣＩ−７７９；ティピファルニブ（８１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ−２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（登録商標））；ピキサントロン；ＥＧＦＲ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；チロシンキナーゼ阻害剤（以下の定義を参照されたい）；および上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸または誘導体；ならびに上記の２つまたはそれより多くの組み合わせ、例えばシクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせたオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）を用いた治療スケジュールの略語であるＦＯＬＦＯＸが含まれる。
【０２３４】
この定義にやはり含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を制御するかまたは阻害するよう作用する抗ホルモン剤、例えば混合アゴニスト／アンタゴニストプロファイルを持つ抗エストロゲンであり、これには、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ（登録商標））、イドキシフェン、ドロロキシフェン、ラロキシフェン（ＥＶＩＳＴＡ（登録商標））、トリオキシフェン、ケオキシフェン、および選択的エストロゲン受容体調節剤（ＳＥＲＭ）、例えばＳＥＲＭ３；アゴニスト特性を伴わない純粋抗エストロゲン、例えばフルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標））、およびＥＭ８００（こうした剤は、エストロゲン受容体（ＥＲ）二量体化を遮断し、ＤＮＡ結合を阻害し、ＥＲ代謝回転を増加させ、そして／またはＥＲレベルを抑制することも可能である）；ステロイド性アロマターゼ阻害剤を含むアロマターゼ阻害剤、例えばフォルメスタンおよびエキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標））、および非ステロイド性アロマターゼ阻害剤、例えばアナストラゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標））およびアミノグルテチミド、およびボロゾール（ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標））、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＳＥ（登録商標））、ファドロゾール、イミダゾールを含む他のアロマターゼ阻害剤；リュープロリド（ＬＵＰＲＯＮ（登録商標）およびＥＬＩＧＡＲＤ（登録商標））、ゴセレリン、ブセレリン、およびトリプテレリンを含む、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト；プロゲスチン、例えば酢酸メゲストロールおよび酢酸メドロキシプロゲステロン、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびプレマリン、およびアンドロゲン／レチノイド、例えばフルオキシメステロン、オールトランスレチノイン酸およびフェンレチニドを含む性ステロイド；オナプリストン；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御剤（ＥＲＤ）；抗アンドロゲン、例えばフルタミド、ニルタミドおよびビカルタミド；テストラクトン；および上記いずれかの薬学的に許容されうる塩、酸、または誘導体；ならびに上記の２つまたはそれより多くの組み合わせが含まれる。
【０２３５】
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体と組み合わせて用いてもよい他の療法剤は、増殖因子機能阻害剤であってもよく、例えばこうした阻害剤には、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体（例えば抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［ハーセプチン］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ［エルビタックス、Ｃ２２５］ならびに、Ｓｔｅｒｎら  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ／ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，  ２００５，  Ｖｏｌ．  ５４，  ｐｐ１１−２９に開示される任意の増殖因子または増殖因子受容体抗体）；抗血管新生剤、例えば血管内皮増殖因子の阻害効果［例えば抗血管内皮細胞増殖因子抗体、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ）］、抗血管内皮増殖因子受容体抗体、例えば抗ＫＤＲ抗体および抗ｆｌｔ１抗体；アンチセンス療法、例えば上記ターゲットに向けられるもの、例えばＩＳＩＳ  ２５０３、抗ｒａｓアンチセンス剤またはＧ３１３９（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ）、抗ｂｃｌ２アンチセンス剤；例えば異常なｐ５３あるいは異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常な遺伝子の置換を含むアプローチ、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼまたは細菌ニトロレダクターゼ酵素を用いたＧＤＥＰＴ（遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法）アプローチ、および化学療法または放射療法に対する患者の寛容性を増加させることを目的とするアプローチ、例えば多剤耐性遺伝子治療を含む、遺伝子治療アプローチ;例えばＣＤ５２に向けられるモノクローナル抗体、アレムツズマブ（キャンパス−１Ｈ）での治療、またはＣＤ２２に向けられる抗体での治療、患者の腫瘍細胞の免疫原性を増加させるｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアプローチ、インターロイキン２、インターロイキン４または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子などのサイトカインでのトランスフェクション、Ｔ細胞アネルギーを減少させることを目的とするアプローチ、例えばＣＴＬＡ−４を阻害するモノクローナル抗体での治療、トランスフェクションされた免疫細胞、例えばサイトカインでトランスフェクションされた樹状細胞を用いたアプローチ、サイトカインでトランスフェクションされた腫瘍細胞株を用いたアプローチ、および抗イディオタイプ抗体を用いたアプローチ、ｅｘ  ｖｉｖｏで非特異的活性化に曝露されたかまたは関心対象の特定の抗原にターゲティング化されたＴ細胞を用いたＴ細胞の養子移入を含む、免疫療法アプローチ；タンパク質分解阻害剤、例えばプロテアソーム阻害剤、例えばベルケード（ボルテゾミド）；例えばリガンド受容体を隔離するか、受容体へのリガンド結合を遮断するか、または受容体シグナル伝達を弱める（例えば受容体分解増加または発現レベル減少による）ペプチドまたはタンパク質（例えば抗体または外部受容体ドメインの可溶性構築物）を用いた、生体療法的療法アプローチが含まれる。
【０２３６】
投与用量および経路
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を、被験体の状態を治療するために有効な量で、すなわち、所望の結果を達成するために必要な用量および期間、投与する。療法的有効量は、治療しようとする患者の特定の状態、年齢、性別および体重、ならびに抗ＰＤ−Ｌ１抗体の投与が、個別の治療であるか、あるいは１つまたはそれより多くのさらなる抗自己免疫または抗炎症治療法と組み合わせて実行されるかなどの要因に応じて多様でありうる。
【０２３７】
投薬スケジュールを調節して、最適な所望の反応を提供してもよい。例えば、１つのボーラスを投与してもよいし、ある期間に渡って、いくつかの別個の用量を投与してもよいし、あるいは療法的状況の急性の度合いに応じて、用量を比例的に減少させるかまたは増加させてもよい。特に有用であるのは、投与および投薬の均一性を単純にするための、単位投薬型での非経口組成物産生である。本明細書において、単位投薬型は、治療しようとする患者／被験体のための単位用量として適切な、物理的に別個の単位に関し：各単位は、望ましい薬学的キャリアーと組み合わせて、望ましい療法効果を産生するように計算された、あらかじめ決定された量の活性化合物を含む。典型的には、本発明の単位投薬型の明細が定義され、そしてこれは、（ａ）化学療法剤のユニークな特性、および達成しようとする特定の療法的または予防的効果、ならびに（ｂ）被験体における感受性を治療するためのこうした活性化合物に関する配合技術に本質的な限界に直接依存する。
【０２３８】
したがって、当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、用量および投薬スケジュールが、療法技術において周知の方法にしたがって調節されることを認識するであろう。すなわち、最大許容用量は、容易に確立可能であり、そして患者に対して検出可能な療法的利益を提供する有効量もまた決定可能であり、患者に対する検出可能な療法的利益を提供する各剤の投与に関する時間的な必要性も同様である。したがって、いくつかの用量および投薬スケジュールを、例として本明細書に提供するが、これらの例は、いかなる意味でも、本発明を実施する際に、患者に関して必要とされうる用量および投薬スケジュールを限定しない。
【０２３９】
投薬の価値は、軽減しようとする状態のタイプおよび重症度に応じて多様である可能性もあり、そしてこれには、１つまたはそれより多い用量が含まれてもよいことが注目される。さらに、任意の特定の患者に関して、個々の必要性にしたがった時間に渡って、そして組成物の投与を実行するかまたは管理する医師の裁量で、特定の投薬スケジュールを調節すべきであり、そして本明細書の濃度範囲は例としてのみ提供され、そして請求する組成物の範囲または実施を制限するようには意図されないことが理解されるものとする。さらに、本発明の組成物での投薬スケジュールは、疾患のタイプ、年齢、体重、性別、患者の健康状態、状態の重症度、投与経路、および使用する特定の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む、異なる要因に基づいてもよい。したがって、投薬措置は、非常に多様であってもよいが、標準法を用いて、規則通りに決定可能である。例えば、臨床効果、例えば毒性効果または実験室の値を含んでもよい、薬物動態学的および薬力学的パラメータに基づいて、用量を決定してもよい。したがって、本発明は、当業者によって決定されるような、個々の用量増大を含む。必要な用量および措置の決定は、関連する業に周知であり、そして本明細書の開示を洞察した際、当業者によって認識されるであろう。
【０２４０】
投与の適切な経路の例を上に提供する。
本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の適切な用量は、０．１〜２００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり、約０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば約１〜２０ｍｇ／ｋｇを含むことが意図される。例えば少なくとも０．２５ｍｇ／ｋｇ、例えば少なくとも０．５ｍｇ／ｋｇで、少なくとも１ｍｇ／ｋｇを含めて、例えば少なくとも１．５ｍｇ／ｋｇで、例えばならびに少なくとも２ｍｇ／ｋｇで、例えば少なくとも３ｍｇ／ｋｇで、少なくとも４ｍｇ／ｋｇを含めて、例えば少なくとも５ｍｇ／ｋｇで；そして例えば最大で５０ｍｇ／ｋｇまでで、最大で３０ｍｇ／ｋｇまでを含めて、例えば最大で２０ｍｇ／ｋｇまでで、最大で１５ｍｇ／ｋｇまでを含めて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与してもよい。投与は通常、適切な時間間隔で、例えば週1回、２週に１回、３週ごとに１回または４週ごとに１回、そして医師が推奨できると判断する限り長く反復され、そして必要であれば、用量は、医師によって所望により増加されるかまたは減少されてもよい。
【０２４１】
物品（製品）およびキット
本発明のさらなる態様は、癌、特にＨＮＳＣＣ、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩの治療のための製品を含む物品である。製品は、容器および容器上に配置されてもまたは容器内に挿入されてもよいラベルまたはパッケージ挿入物である。許容されうる容器は、例えば、缶、バイアル、シリンジ等である。容器は、多様な材料、例えばガラスまたはプラスチックで作製されていてもよい。容器は、特定の状態を治療するために有効な組成物を含有し、そして滅菌入口チャネルを有してもよい（例えば、容器は、皮下注射用の針で穿刺可能な栓を提供された、静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性物質は、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、特定の状態を治療するために組成物を用いることを示す。ラベルまたはパッケージ挿入物は、さらに、患者に抗体組成物を投与するための使用説明書を含有すべきである。
【０２４２】
パッケージ挿入物は、販売のために提供される療法製品のパッケージを含む通常の使用説明書を含有し、これには、こうした療法製品の使用に関する、適応症、使用、用量、投与経路、禁忌および／または注意の例示的な情報が含まれる。本発明の１つの態様において、パッケージリーフレットは、組成物を、癌、特にＨＮＳＣＣ、原発不明癌、神経膠芽腫、食道癌、膀胱癌、ＴＮＢＣ、ＣＲＣ、肝細胞癌、黒色腫、ＮＳＣＬＣ、腎臓癌、卵巣癌、ホジキンリンパ腫、ＣＲＣ  ＭＳＩの治療に用いることを示す。
【０２４３】
さらに、物品は、薬学的に許容されうる緩衝剤、例えば注射用静菌水（ＢＷＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む第二の容器をさらに含んでもよい。さらに、これには、商業的および使用者の観点から必要な他の産物、特に、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針およびシリンジが含まれてもよい。
【０２４４】
本発明はまた、多様な目的のために、例えば哺乳動物臓器の組織、細胞または体液中で、ＰＤ−Ｌ１を検出するために用いてもよいキットにも関する。こうしたキットは、ＰＤ−Ｌ１疾患に関するスクリーニングに適しているであろう。キットには、本発明の特異的結合剤または抗体、ならびに存在する場合、ＰＤ−Ｌ１と特異的結合剤または抗体の反応上のふるまいを示す手段が含まれる。１つの態様において、抗体は、モノクローナル抗体である。１つの態様において、ＰＤ−Ｌ１結合抗体は標識される。別の態様において、抗体は、非標識一次抗体であり、そしてキットはさらに、一次抗体検出剤を含む。１つの態様において、検出剤は、抗免疫グロブリンである標識二次抗体を含む。抗体は、蛍光色素、酵素、放射性核種物質および放射線乳白剤からなる群より選択されるマーカーで標識されていてもよい。キットは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばＥＬＩＳＡまたはウェスタンブロッティングにおいて、ＰＤ−Ｌ１を検出し、そして定量化するための抗体を含むキットであってもよい。また、物品と同様に、キットは、容器および容器上にまたは容器内に配置されるラベルまたはパッケージ挿入物を含む。容器は、本発明にしたがった少なくとも１つの抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む組成物を含有する。さらなる容器は、例えば、希釈剤および緩衝剤、対照抗体を含有してもよい。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物の説明、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたは診断目的のための使用のための使用説明書を含んでもよい。
【０２４５】
診断使用および組成物
また、本発明の抗ＰＤ−Ｌ１抗体を診断プロセスで用いてもよい（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ）。例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体を用いて、患者から得た試料（例えば組織試料または体液試料、例えば炎症性滲出物、血液、血清、腸液、唾液または尿）中のＰＤ−Ｌ１を検出するかまたはそのレベルを測定してもよい。適切な検出および測定技術には、免疫学的技術、例えばフローサイトメトリー、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光分析、ラジオイムノアッセイ、および免疫組織学が含まれる。本発明はさらに、本明細書に記載するような抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含むキット（例えば診断キット）を提供する。
【０２４６】
本発明を最適に理解するため、以下の実施例を提供する。以下の実施例は例示目的のためのみに提供され、そしていかなる意味でも、本発明の適用範囲を限定するとは見なされないものとする。
【０２４７】
本明細書に引用するすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書に援用される。前述の発明は、多義性の解釈を排除する目的のため、例示および例によってある程度詳細に記載されてきているが、当業者は、本明細書に開示する概念に基づいて、本発明の基本的な原理および付随する態様の範囲から逸脱することなく、特定の改変および修飾を行ってもよいことを明らかに認識するであろう。
【実施例】
【０２４８】
実施例１
懸濁哺乳動物細胞培養における組換え抗原および抗体の産生
公表されるプロトコルにしたがって、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）から得た樹立された細胞株において、抗体および抗原を産生した［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００５  Ｓｅｐ  ２０；  ９１（６）：６７０−６７７、Ｌｉａｏ  Ｍｅｔａｌ．，  ２００４；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．  ２００６  Ｊｕｎ；２８（１１）：８４３−８４８；  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００３  Ｎｏｖ  ５；８４（３）：３３２−３４２］。ＥＢＮＡ１タンパク質（エプスタイン・バーウイルス核抗原１）の遺伝子を恒常的に発現する細胞を用いた。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社の血清不含培地を用い、そして製造者の指針にしたがって、軌道振盪装置上のフラスコ中で、懸濁培養を行った。一過性発現のため、直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ  ＭＡＸ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｅｃｓ）を用いて、２＊１０６／ｍｌの濃度で、細胞をトランスフェクションした。ＤＮＡ／ＰＥＩ比は、１：３／１：１０であった。トランスフェクションの５〜７日後、細胞培養を２０００ｇで２０分間遠心分離して、そして０．２２μｍフィルターを通じて濾過した。アフィニティクロマトグラフィによって、培養液からターゲットタンパク質を単離した。
【０２４９】
タンパク質のＣ末端にＥＰＥＡタグ（グルタミン酸−プロリン−グルタミン酸−アラニン）を含有する組換えＰＤ−Ｌ１タンパク質を単離し、そしてＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｃタグアフィニティマトリックス吸着剤を用いて、培養液から精製した。５ｍｌのＣ−タグ吸着剤をあらかじめ充填したクロマトグラフィカラムに培養液を通過させ、次いで、カラムを２５ｍｌのＰＢＳで洗浄して、非特異的結合構成要素を洗い流した。結合した抗原を、２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２Ｍ  ＭｇＣｌ２  ｐＨ  ７．０〜７．４の穏やかな条件で溶出させた。次いで、半透性透析膜を用いて、タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に透析し、濾過し（０．２２μｍ）、チューブに移して、そして−７０℃で保存した。
【０２５０】
プロテインＡアフィニティ（ａｆｆｉｎｅ）ＨＰＬＣカラムを用いて、培養液から組換えタンパク質ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを単離し、そして精製した。清浄化した培養液を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化した５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  ＡセファロースＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過させた。次いで、５体積のＰＢＳでカラムを洗浄して、非特異的に結合した構成要素を除去した。結合した抗原を０．１Ｍグリシン緩衝液ｐＨ３で溶出させた。主要タンパク質溶出ピークを収集し、そして１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）で中性ｐＨにした。すべての段階を、１１０ｃｍ／ｈの流速で行った。次いで、半透性透析膜を用いて、単離したタンパク質をＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）に透析し、濾過し（０．２２μｍ）、チューブに移して、そして−７０℃で保存した。
【０２５１】
抗原に関して上述した方法にしたがって、ＩｇＧ１抗体を１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、得たタンパク質溶液の純度を評価した（図４Ａおよび４Ｂ）。
【０２５２】
実施例２
ナイーブヒト抗体Ｆａｂライブラリー、ＭｅｇａｎＬｉｂＴＭの生成
提供されるプロトコルにしたがって、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、１０００を超えるヒトドナーから収集した血液試料由来の総Ｂリンパ球ＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｖｕｅキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＲＮＡ濃度アッセイを行い、そして単離したＲＮＡの品質を、１．５％アガロースゲル電気泳動によって試験した。
【０２５３】
ＭＭｕＬＶ逆転写酵素およびプライマーとしてランダム六量体オリゴヌクレオチドを用いて、推奨されるプロトコルにしたがって、ＭＭＬＶ  ＲＴキット（Ｅｖｒｏｇｅｎ）を用いて、逆転写反応を行った。
【０２５４】
２段階ポリメラーゼ連鎖反応において、逆転写産物をテンプレートとして用いて、著者のプロトコルにしたがって、オリゴヌクレオチドセットを用いて、制限部位が隣接した可変ドメイン遺伝子を産生した［Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １９９９  Ｊｕｎ  ２５；  ２７４（２６）：  １８２１８−３０］。
【０２５５】
得たＤＮＡ調製物ＶＬ−ＣＫ−ＶＨ（図１）を、制限酵素ＮｈｅＩ／Ｅｃｏ９１Ｉで処理し、そして元来のファージミドｐＨ５に連結した（図２）。連結産物を、［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０００；３２８：  ３３３−６３．］に記載されるプロトコルにしたがって調製したエレクトロコンピテントＳＳ３２０細胞に形質転換した。コンビナトリアルファージＦａｂディスプレイライブラリーＭｅｇａｎＬｉｂＴＭのレパートリーは、１０１１形質転換体であった。Ｆａｂライブラリーからのファージ調製物を、上述の方法［Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：  ５８１−９７］にしたがって調製した。
【０２５６】
実施例３
ファージ抗体Ｆａｂライブラリーの選択
コンビナトリアルファージＦａｂディスプレイライブラリーＭｅｇａｎＬｉｂＴＭから、特異的ファージヒト抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂ抗体を得た。ファージディスプレイ法［Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９９６  Ｍａｒ；１４（３）：３０９−１４；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：  ５８１−９７］によって、ヒトＰＤ−Ｌ１に対して選択を行ったが、磁気粒子およびＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ  Ｆｌｅｘ装置を用い、これはこの技術の使用が、バイオパニングの最大９６の異なるスキームおよび変形を並行して行うことを可能にするためである。
【０２５７】
バイオパニング選択において、回転装置上、室温で１時間、タンパク質と粒子をインキュベーションすることによって、ストレプトアビジン磁気粒子の表面上に、１０μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃを固定した。次いで、粒子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）上で１時間、粒子を２％スキムミルク溶液でブロッキングした。次いで、２％スキムミルクを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のファージ溶液を、抗原が結合した磁気粒子に添加し、ファージ粒子の濃度は２．５＊１０１２／ｍｌであった。混合物を攪拌しながら４０分間インキュベーションした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で磁気粒子を数回洗浄する間、未結合ファージが取り除かれた。洗浄の回数を周期ごとに増加させた（第一周期では１０回、第二周期では２０回、そして第三周期では３０回）。磁気粒子表面上の抗原と結合したままであったファージを、攪拌しながら、１５分間、１００ｍＭ  Ｇｌｙ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ２．２）で粒子から溶出させ、そして次いで、１Ｍ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で中和した。得たファージで大腸菌ＴＧ１細菌を感染させ；ファージが該大腸菌で産生され、そしてこれを単離し、そして次の選択周期で用いた。２〜３周期後、ＤＮＡ（ファージミド）をファージから単離し、そして大腸菌細胞においてＦａｂを産生するため、抗体可変ドメイン遺伝子を発現ベクター（図３）内にクローニングした。
【０２５８】
実施例４
ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するＦａｂのスクリーニング
ＥＬＩＳＡを用いて、ヒトＰＤ−Ｌ１へのＦａｂ結合に関して検索した。陽性対照として、公表された配列を持つＦａｂ、アテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を用いた。特異的結合アッセイのため、ＥＬＩＳＡプレートウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅ、中程度結合（ｍｅｄｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ））を５０μｌのＰＤ−Ｌ１−ＦＥ（１ｘ炭酸緩衝液中、０．２μｇ／ｍｌ）でコーティングし、気密性に密封し、そして４℃で一晩インキュベーションした。続くすべての工程を、ＧｅｎｅｔｉｘＱ−Ｑｐｉｘ２ｘｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）およびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ）ロボット系に基づくハイスループット自動化プラットホームを用いて、標準的ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがって、実行した。非特異的結合をブロッキングするため、ブロッキング緩衝液ＢＢ（ＰＢＳ中、０．５％スキムミルク、２００μＬ）を添加した。プレートを振盪装置上、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、等体積のＢＢと混合した試験Ｆａｂを含有する試験細胞上清をウェルあたり５０μｌ添加した。再び、プレートをインキュベーションし、室温で１時間振盪し、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｉｎ緩衝液で各プレートウェルを３回洗浄した。洗浄したら、（５０μＬ／ウェル）抗ヒトＦａｂ  ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１：５０００の比で添加した。プレートを回転振盪装置上で振盪し（５０分間、室温）、そしてＦＳＢ−Ｔｗｉｎ緩衝液で上述のように３回洗浄した。飽和するまでＴＭＢ（５０μＬ／ウェル）を添加することによって、比色シグナルを発展させ（平均３〜５分）、次いで、停止溶液（３０μＬ／ウェル、１０％硫酸）を添加することによって、発色を停止した。適切なＴｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ）を用いて、４５０ｎｍの波長で色シグナルを測定した。抗体結合レベルは、生じる色シグナルと比例した。対照抗体からのシグナルよりも大きい色シグナルを有するクローンを、非特異的結合に関して、ＥＬＩＳＡで試験した。
【０２５９】
実施例５
選択したＦａｂの他の抗原との非特異的結合の分析
ＥＬＩＳＡを用いて、研究したＦａｂ断片の他の抗原との非特異的結合を測定する。上述のように、しかし、ＩＬ６Ｒ−Ｆｃ、ＩＮＦα２ｂ、ＰＣＳＫ９−ＶＧ−ＦＥ、ＰＤ−１−Ｆｃ（１ｘ炭酸緩衝剤中、２．５μｇ／ｍｌ）を固定のための抗原として用いて、該研究を行った。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（１ｘ炭酸緩衝液中、０．２μｇ／ｍｌ）を特異的結合に関する対照として用いた。すべてのさらなる段階を、ＧｅｎｅｔｉｘＱ−Ｑｐｉｘ２ｘｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）およびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ）ロボット系に基づくハイスループット自動化プラットホームを用いて、標準的ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがって、実行した。特異的結合からのシグナルよりも大きくない非特異的結合の色シグナルを有するクローンを、リガンドおよび受容体の間の相互作用を遮断するアンタゴニストＦａｂを同定するため、競合ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
【０２６０】
実施例６
ＰＤ−Ｌ１およびそのＰＤ−１受容体の間の相互作用を遮断する競合ＥＬＩＳＡ
競合ＥＬＩＳＡを用いて、ＰＤ−１受容体との相互作用を遮断する能力に関して、あらかじめ選択した抗ヒトＰＤ−Ｌ１特異的Ｆａｂを試験した。陽性対照アンタゴニストとして、公表される配列を持つＦａｂ、アテゾリズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を用いた。
【０２６１】
ＰＤ−１−Ｆｃを、１ｘ炭酸緩衝液中、１μｇ／ｍｌの濃度の５０μｌで、ＥＬＩＳＡプレートウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅの中程度結合）に固定し、そして４℃で一晩インキュベーションした。続くすべての工程を、ＧｅｎｅｔｉｘＱ−Ｑｐｉｘ２ｘｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）およびＴｅｃａｎ  Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯ  ２００（Ｔｅｃａｎ）ロボット系に基づくハイスループット自動化プラットホームを用いて、標準的ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがって、実行した。非特異的結合をブロッキングするため、ブロッキング緩衝液ＢＢ（ＰＢＳ中、０．５％スキムミルク、２００μＬ）を添加した。プレートを振盪装置上、室温で１時間インキュベーションした。
【０２６２】
平行して、試験ＦａｂおよびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（ＰＢＳ−Ｔｗｉｎ中、２μｇ／ｍｌの最終濃度で）を含有する細胞上清を、非吸着プレート中で、１：１の比で混合し、室温でそして５００ｒｐｍで振盪しながら４５分間インキュベーションした。
【０２６３】
ＰＤ−１受容体を含有するプレートからＢＢ洗浄した後、ＦａｂおよびＰＤ−Ｌ１の混合物をそこに添加し、室温でそして５００ｒｐｍで振盪しながら４５分間インキュベーションした。その後、各プレートウェルをＰＢＳ−Ｔｗｉｎ緩衝液で３回洗浄し、５０μｌ／ウェルの抗ヒトＦａｂ  ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｃ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１：５０００の比で添加した。これらを室温でそして５００ｒｐｍで振盪しながら４５分間インキュベーションし、その後、各プレートウェルをＰＢＳ−Ｔｗｉｎ緩衝液で上述のように３回洗浄した。飽和するまでＴＭＢ（５０μＬ／ウェル）を添加することによって、比色シグナルを発展させ（平均３〜５分）、次いで、停止溶液（３０μＬ／ウェル、１０％硫酸）を添加することによって、発色を停止した。適切なＴｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ）を用いて、４５０ｎｍの波長で色シグナルを測定した。Ｆａｂ結合レベルは、生じる色シグナルと反比例した。対照Ｆａｂ抗体、アテゾリズマブのレベルでブロッキングを示すクローンを、陽性と記録し、そしてさらなる分析に用いた。陽性クローン由来の可変ドメイン遺伝子を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で、標準プロトコルにしたがって配列決定し、そして分析した。
【０２６４】
実施例７
Ｋｏｆｆに基づくヒト抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆａｂ候補の比較スクリーニング
Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６装置を用いて、Ｋｏｆｆスクリーニングを行った。抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサー（ＳＡ）を、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡを含有する反応緩衝液中で、３０分間再水和した。反応緩衝液を、１ｘの最終濃度まで、研究大腸菌上清試料に添加した。次いで、抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサーを、候補抗体のＦａｂ断片を含有する大腸菌上清に４℃で１２時間浸した。表面に固定されたＦａｂ断片を含むセンサーを、反応緩衝液を含むウェル内に移し、ここでベースラインを記録した（６０秒間）。次に、センサーを、抗原−抗体複合体と会合させるため（３００ｓ）、分析物溶液（ＰＤ−Ｌ１、３０μｇ／ｍＬ）を含むウェルに移した。次いで、センサーを、次の解離工程のため、反応緩衝液を含有するウェルに戻した（６００ｓ）。各実験後、再生緩衝液（Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ１．７）に３回入れることによって、用いたセンサーを再生し、その後、これらを次の実験に用いた。１：１相互作用モデルを用い、標準法にしたがって、Ｏｃｔｅｔデータ分析（バージョン７．０）ソフトウェアを用いて、得られる曲線分析を行った。
【０２６５】
実施例８
ＰＤ−Ｌ１および他の抗原との抗ＰＤ−Ｌ１抗体相互作用の酵素イムノアッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体および他の抗原の相対アフィニティを測定した。結合アッセイのため、ＥＬＩＳＡプレートウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅの中程度結合）を、５０μｌのＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｆＰＣＳＫ９−ＥＰＥＡ、Ａｎｇ２−Ｈ６Ｆ、ＧＭ−ＣＳＦ−ＦＥ、ＣＤ３−ＥＤ−Ｆｃ、ＩＬ１７ａ、ＣＤ３８−Ｆｃ、ＩＬ６Ｒ−Ｆｃ（１ｘ炭酸緩衝液中、１μｇ／ｍｌ）でコーティングし、気密性に密封し、そして４℃で一晩インキュベーションした。続くすべての段階を、標準的ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがって、実行した。非特異的結合をブロッキングするため、緩衝液ＢＢ（ＰＢＳ中、０．５％スキムミルク、２００μＬ）を添加した。プレートを振盪装置上、室温で１時間インキュベーションした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１回洗浄し、ＰＢＳ−Ｔｗｉｎ中、５μｇ／ｍｌの濃度の試験ＢＣＤ−１３５抗体をウェルあたり５０μｌ添加した。再び、プレートをインキュベーションし、室温で１時間振盪し、その後、ＰＢＳ−Ｔｗｉｎ緩衝液で各プレートウェルを３回洗浄した。洗浄したら、（５０μＬ／ウェル）抗ヒトＦａｂ  ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ−ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中、１：５０００の比で添加した。プレートを回転振盪装置上で振盪し（５０分間、室温）、そしてＦＳＢ−Ｔｗｉｎ緩衝液で上述のように３回洗浄した。飽和するまでＴＭＢ（５０μＬ／ウェル）を添加することによって、比色シグナルを発展させ（平均３〜５分）、次いで、停止溶液（３０μＬ／ウェル、１０％硫酸）を添加することによって、発色を停止した。適切なＴｅｃａｎ−Ｓｕｎｒｉｓｅプレート読み取り装置（Ｔｅｃａｎ）を用いて、４５０ｎｍの波長で色シグナルを測定した。抗体結合比は、生じる色シグナルと比例した（図５）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、そして研究した他の抗原には結合しない。
【０２６６】
実施例９
Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ−１レポーター細胞株における、抗ＰＤ−Ｌ１抗体でのＮＦＡＴシグナル伝達再活性化
ゲノム内に２つの遺伝子構築物を導入することによって、ヒトＴ細胞由来株Ｊｕｒｋａｔの操作を行った。一方の構築物は、ヒトＰＤ−１受容体遺伝子をコードした。もう一方の構築物は、ＮＦＡＴ感受性遺伝子要素の制御下で、ルシフェラーゼ遺伝子をコードした。その結果、表面膜上にＰＤ−１受容体を発現し、そしてルシフェラーゼ遺伝子転写を指示するＮＦＡＴ依存性プロモーターを含有する、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ−１レポーター細胞株を得た。この株の細胞におけるルシフェラーゼ酵素の合成は、ＮＦＡＴ活性のレベルに比例し、これは次に、Ｔ−リンパ球活性化の全体のレベルを反映する。
【０２６７】
以下のように、この細胞株を用いて、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の活性を分析した：抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体によるＴＣＲ受容体の活性化は、細胞内カスケードを誘発して、ＮＦＡＴプロモーター活性化を導いた。ＰＤ−Ｌ１は、インターフェロンによって活性化されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の表面上に提示される。ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の間の相互作用は、ＴＣＲ受容体からＮＦＡＴプロモーターへのシグナル伝達を阻害した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１−ＰＤ−１の相互作用を切断し、そして細胞内シグナル伝達を再活性化した。
【０２６８】
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＰＤ−Ｌ１産生のため、インターフェロン−ガンマ溶液で活性化し、この目的のため、アッセイの７２時間前、インターフェロンガンマを２０ｎｇ／ｍｌの濃度まで細胞懸濁物に添加し、次いで、細胞を１０，０００細胞／ウェルの率で９６ウェル培養プレート中にプレーティングした。
【０２６９】
活性化７２時間後、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を含むプレートから増殖培地を除去し、そして１０μｇ／ｍｌ〜０．００１μｇ／ｍｌの細胞増殖培地中で、分析する抗体、対照抗体およびアイソタイプ対照の希釈物を添加し、室温で３０分間インキュベーションした。
【０２７０】
さらに、Ｊｕｒｋａｔ−ＮＦＡＴ−ＰＤ−１細胞の懸濁物および活性化抗体ａＣＤ３／ａＣＤ２８／ａ−マウスＩｇＧの溶液を各ウェルに添加した。プレートをＣＯ２インキュベーター中に６時間入れた。
【０２７１】
ルシフェラーゼＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）のため、あらかじめ調製した基質をＶ細胞／Ｖ基質に添加した。Ｆｌｕｏｒｏｓｃａｎ  Ａｓｃｅｎｔ上で、発光レベルを測定した（図６）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、Ｊｕｒｋａｔ−ＰＤ−１−ＮＦＡＴレポーター株における発光レベルを再活性化した。
【０２７２】
実施例１０
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６を用いたＦｃＲｎおよびＦｃγ受容体との抗ＰＤ−Ｌ１抗体相互作用のアッセイ
ＦｃｇＲＩＩＩａＶ、ＦｃｇＲＩａ、ＦｃＲｎ受容体との抗体相互作用をアッセイするため、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６装置を用いた。Ｃ末端ビオチン化受容体およびストレプトアビジンコーティングバイオセンサー（ＳＡ−ストレプトアビジン）を用いた。
【０２７３】
ビオチン化受容体をセンサーの表面上に固定した。さらに、会合段階を実行した：結合した抗原を伴うセンサーを、異なる濃度の抗体溶液内に浸した（あらかじめ、作業緩衝液中の一連の抗体希釈を調製し、そして９６ウェルプレートの適切なウェル内に入れた）。この後、解離段階を行った：抗体溶液から作業緩衝液を含むウェルにセンサーを移した。
【０２７４】
ＦｃｇＲＩＩＩａＶ、およびＦｃｇＲＩａに対する抗体アフィニティ定数をアッセイするため、リン酸緩衝液ｐＨ７．４を用い、ＦｃＲｎに関しては、リン酸緩衝液ｐＨ６．０を用いた。
【０２７５】
Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏデータ分析８．２ソフトウェアおよび１：１結合モデルを用いて、得られた曲線の分析を行った。結果を図７に示す。修飾ＩｇＧ１抗体のＦｃｇ受容体に対する結合は、野生型変異体に比較して検出されず、これは分析した抗体にエフェクター機能が存在しないことを示唆した。分析した抗ＰＤ−Ｌ１抗体におけるＦｃＲｎのアフィニティ定数は、１．６９Ｅ−０８  １／Ｍであった。
【０２７６】
実施例１１
異なる生物由来の抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびＰＤ−Ｌ１の間の相互作用の酵素連結免疫吸着アッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、異なる生物由来の抗ＰＤ−Ｌ１抗体の相対アフィニティを測定した。結合アッセイのため、ＥＬＩＳＡプレートウェル（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ  ｏｎｅの中程度結合）を、５０μｌのヒト、カニクイザル、ネズミ、ラット、イヌ、ウサギＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（１ｘ炭酸緩衝液中の０．５μｇ／ｍｌ）でコーティングし、気密性に密封し、そして４℃で一晩インキュベーションした。続くすべての工程を、上述の標準的ＥＬＩＳＡプロトコルにしたがって、実行した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、そして研究した他の受容体には結合しなかった（図８）。
【０２７７】
実施例１２
Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ９６装置上のヒトおよびカニクイザルＰＤ−Ｌ１との抗ＰＤ−Ｌ１抗体相互作用の分析
ヒトおよびカニクイザルＰＤ−Ｌ１への抗体結合アフィニティの定数をＯｃｔｅｔＲｅｄ  ９６装置（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で測定した。ＡＲ２Ｇセンサー調製および固定に関する製造者の指示にしたがい、標準プロトコルにしたがって、３０μｇ／ｍｌの濃度のＢＣＤ−１３５抗体を、第二世代アミノ反応性バイオセンサー（ＦｏｒｅｔＢｉｏ、ＡＲ２Ｇ）の表面上に非特異的に固定した。反応緩衝液として、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳを用いて、３０℃でアッセイを行った。センサーに結合した抗体に対するヒトおよびサルＰＤ−Ｌ１溶液の結合を、１０μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの抗原濃度を含む作業緩衝液中で分析した。
【０２７８】
１：１相互作用モデルを用いた標準法にしたがって、Ｏｃｔｅｔデータ分析（バージョン８．２）ソフトウェアを用いて、参照シグナルを減じた結合曲線を分析した。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、特異的にそしてアフィニティをもって（ａｆｆｉｎｅｌｙ）、それぞれ＜１．０Ｅ−１２および５．５５Ｅ−１０  １＼Ｍの定数で、ヒトおよびカニクイザルＰＤ−Ｌ１抗原に結合する（図９）。
【０２７９】
実施例１３
抗ＰＤ−Ｌ１抗体安定性決定
動的光散乱技術（ＤＬＳ）を用いて、タンパク質凝集点に基づいて、ＢＣＤ−１３５のコンホメーション安定性を評価した。ＺｅｔａｓｉｚｅｒナノＺＳＰ装置を用いて、研究タンパク質（１ｍｇ／ｍｌ）のタンパク質凝集点決定を行った。この目的のため、０．５ｍｌの溶液を無塵水晶キュベット内に入れ、装置中で、散乱光強度を持続して測定しながら、該キュベットを次第に５０℃から９０℃に加熱した。ＢＣＤ−１３５抗体は、２０ｍＭ酢酸緩衝液中で、高いコンホメーション安定性を示し、融点は８０℃より高かった（図１０）。
【０２８０】
ＰＥＧ−タンパク質凝集法によって、候補のコロイド安定性を評価した。実験のため、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を持つ試料を用いた。ＵＶ分光プレートに対して、計算した量の試料、プラセボ溶液、およびＰＥＧ６０００溶液を添加した。ウェル中のすべての溶液をピペッティングによってよく混合した。さらに、溶液濁度を視覚的に評価し、そしてλ＝３２０ｎｍの溶液光学密度もまた測定した。ＢＣＤ−１３５抗体は、高いコロイド安定性を示した（図１１）。
【０２８１】
３つの異なる緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０（図１２Ａ）、２０ｍＭ酢酸緩衝液、ｐＨ５．０（図１２Ｂ）および２０ｍＭヒスチジン緩衝液、ｐＨ５．５（図１２Ｃ）中、５０℃で４８時間、熱ストレスによって、抗体熱安定性を評価した。ＨＰＬＣ法（ＳＥＣ  ＨＰＬＣ）によって、均一性管理を行った。
【０２８２】
【表２】
2020516323.tif 000012
【０２８３】
〜５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度の試験試料を、２つの部分に分け、そして別個のチューブに入れた：各配合物に関して１つのチューブを４℃の冷蔵庫に保存し、残りをサーモスタット中に入れ、そして５０℃で７２時間インキュベーションした。ウォームアップが終わったら、チューブをサーモスタットから取り除き、そして分析のために移した（図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃ、赤は＋４℃で維持した対照を示し、青は熱ストレス後の試料を示す）。抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、３つの緩衝液すべてで高い熱安定性を示した（熱ストレス前および後の溶液中の凝集物の内容量の間の相違は、５％を超えなかった）：
正常ヒト血清におけるＢＣＤ−１３５の安定性もまた、３７℃で７日間評価した。この目的のため、組換えＰＤＬ１（１００μｌ、１ｘ炭酸緩衝液中、２．５μｇ／ｍｌ）を９６ウェル高吸収ＥＬＩＳＡプレートのウェル内に添加した。これを４℃で１８時間インキュベーションした。さらに、ウェルの内容物を除去し、そしてブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ中、０．５％スキムミルクの２００μｌ）を添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、ＴＢＳＴ溶液で２回洗浄した。
【０２８４】
検量線をプロットするため、ブロッキング緩衝液中で希釈した、０；７．８；１５．６；３１．２５；６２．５；１２５．０；２５０．０ｎｇ／ｍｌの濃度で、ＢＣＤ−１３５を含有する１００μｌの溶液を、第一の縦の列のウェルに添加した。
【０２８５】
プレートを３７℃で３０分間インキュベーションし、次いで、プレートをＴＢＳＴ溶液で３回洗浄した。さらに、１００μｌ溶液のセイヨウワサビ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼとコンジュゲート化した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片ヤギポリクローナル抗体を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。次いで、プレートをＴＢＳＴ溶液で４〜５回洗浄した。洗浄し、そして乾燥させたウェルに、１００μｌのＴＭＢ溶液を添加して、発色させた。プレートを適所に置き、遮光して、そして発色のため、２２℃の温度で２０〜２５分間インキュベーションした。ウェルに５０μｌの０．９Ｍ硫酸の停止溶液を添加することによって、反応を停止した。４５０ｎｍの波長で、マイクロプレート読み取り装置上、ウェル中の溶液光学密度を測定した。
【０２８６】
得たデータに基づいて、ウェルに添加したＢＣＤ−１３５の濃度に対する光学密度依存を示す、検量線をプロットした（図１３Ａ）。曲線をプロットするため、溶液光学密度算術平均を用いた。検量線に基づいて、試料中のＢＣＤ−１３５濃度値は、実験で得られた光学密度の値に対応することが見出された。
【０２８７】
研究結果に基づいて、ヒト血清中、３７℃で７日間保存した後、決定したＢＣＤ−１３５濃度は、分析直前に調製した血清試料中で決定した濃度と有意には異ならず（図１３Ｂ）、抗体の安定性が示された。
【０２８８】
実施例１４
ＰＤ−Ｌ１に特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体抗体のライブラリー構築
ＰＤ−Ｌ１に特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体抗体を構築するため、ＢＩＯＣＡＤのＹＬａｂソフトウェアパッケージおよびＰＤ−Ｌ１モデル（ＰＤＢ  ４ＺＱＫ、ＰＤＢ  ４Ｚ１８）を用いて、３Ｄモデリングに基づく構造分析を行った（実施例１８もまた参照されたい）。計算モデルに基づいて、部分的に縮重したコドンを持つＢＣＤ−１３５遺伝子のライブラリー（ＦＵＨ  Ｇら，  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．，  ２００９，  ５２５，  ３５３−３７６）を、配列番号４の重鎖可変ドメインの第一および第三のＣＤＲ領域中、ならびに配列番号８の軽鎖可変ドメインの第三のＣＤＲ中の位で合成した。ランダム化遺伝子の生じたＤＮＡを、実施例２に記載するプロトコルにしたがって、ファージディスプレイプラスミドｐＨ５（図２）内にクローニングした。ＳＳ３２０株へのこれらの構築物の形質転換は、方法［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２０００；３２８：  ３３３−６３］にしたがったライブラリーのための５＊１０ｅ７の独立の形質転換体を生じた。以前記載された方法［Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：  ５８１−９７］にしたがって、突然変異体ＶＨ  ＢＣＤ−１３５ライブラリーのファージ調製物を調製した。
【０２８９】
上述のもの（実施例３）と類似の条件下で、得たファージ突然変異体ＢＣＤ−１３５  Ｆａｂライブラリーの選択を行った。
ヒト組換えＰＤ−Ｌ１産物に対する上述のライブラリーの選択の第三周期後、ポリクローナルファージ産物で行ったＥＬＩＳＡアッセイによって、有意な濃縮、および非特異的結合バックグラウンドの１０倍過剰より多い結合が明らかになった。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃに特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体Ｆａｂ抗体の濃縮ファージライブラリーからの遺伝子プールを、ＥＬＩＳＡ検出のため、Ｃ末端にｍｙｃタグペプチドを含有する発現プラスミドｐＬＬ（図３）内に再クローニングした。
【０２９０】
実施例１５
ＰＤ−Ｌ１に特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体Ｆａｂ抗体の比較ＥＬＩＳＡアッセイ
ＥＬＩＳＡを用いて、実施例４に記載するものと同様に、ヒトＰＤ−Ｌ１への試験突然変異体Ｆａｂ抗体の結合を測定する。ＢＣＤ−１３５突然変異体Ｆａｂ抗体を産生する試験クローンの数は、４００単位であった。配列番号４および配列番号８の配列を持つＢＣＤ−１３５  Ｆａｂ抗体の野生型を、陽性対照として用いた。
【０２９１】
その結果、対照野生型ＢＣＤ−１３５  Ｆａｂ抗体より高いかまたはそれと類似のシグナルを生じる８５の陽性クローンを選択した（０．７〜１．２相対単位の範囲の値）。
実施例１６
ＰＤ−Ｌ１に対して特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体Ｆａｂ抗体の特徴づけ
対照野生型ＢＣＤ−１３５  Ｆａｂ抗体より高いかまたはそれと類似のシグナルを生じる８５のＥＬＩＳＡスクリーニング（実施例１５）陽性クローン候補を、製造者によって推奨されるプロトコルにしたがって、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ３１３０配列決定装置上で配列決定した。その結果、２５の配列がユニークなクローンを得た。実施例７記載のＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６装置上で、動力学解離定数を定量化することによって、ユニークなクローンの８つの突然変異体Ｆａｂ抗体をさらに分析した。
【０２９２】
実施例７に示すものと同様に、Ｐａｌｌ  Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６装置を用いて、Ｋｏｆｆスクリーニングを行った。抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサー（ＳＡ）を、１０ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．２〜７．４、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．１％ＢＳＡを含有する反応緩衝液中で、３０分間再水和した。反応緩衝液を、１ｘの最終濃度まで、研究大腸菌上清試料に添加した。次いで、抗ＦＡＢＣＨ１バイオセンサーを、候補抗体のＦａｂ断片を含有する大腸菌上清に４℃で１２時間浸した。表面に固定されたＦａｂ断片を含むセンサーを、反応緩衝液を含むウェル内に移し、ここでベースラインを記録した（６０秒間）。次に、センサーを、抗原−抗体複合体と会合させるため（３００ｓ）、分析物溶液（ＰＤ−Ｌ１、３０μｇ／ｍＬ）を含むウェルに移した。次いで、センサーを、次の解離工程のため、反応緩衝液を含有するウェルに戻した（６００ｓ）。各実験後、再生緩衝液（Ｇｌｙ−ＨＣｌ、ｐＨ１．７）に３回入れることによって、用いたセンサーを再生し、その後、これらを次の実験に用いた。１：１相互作用モデルを用い、標準法にしたがって、Ｏｃｔｅｔデータ分析（バージョン７．０）ソフトウェアを用いて、得られる曲線分析を行った。
【０２９３】
その結果、突然変異体Ｆａｂ抗体の動力学解離定数を得て、これは、ＢＣＤ−１３５  Ｆａｂの野生型と匹敵する特性を、そしてしたがって、可変ドメインの３つのＣＤＲに関する置換の最大８％の寛容性を示した。
【０２９４】
ＢＣＤ−１３５の抗ＰＤＬ１  ＶＨ
【０２９５】
【化９】
2020516323.tif 000013
【０２９６】
【表３】
2020516323.tif 000014
【０２９７】
実施例１７
安定細胞株の生成、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の産生および精製
親懸濁細胞株ＣＨＯ−Ｓを、最適化された比で抗体の軽鎖および重鎖を含有するベクター構築物で、Ｎｅｏｎトランスフェクション系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）デバイスを用いてエレクトロポレーションすることによって、モノクローナル抗体ＢＣＤ−１３５を産生する安定細胞株を得た。ＣｌｏｎｅＰｉｘロボット化プラットホーム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、および異なる培養形式で抗生物質を用いたミニプール選択の予備的段階を用いて、高レベルの生産性（１０００ｍｇ／Ｌより高い）を持つクローン株を作製した。Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６分析系（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、生産性アッセイを行った。Ｂｉｏｍｅｋ  ＦＸロボット工学コンピュータに基づく系（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、基本培地選択およびインキュベーションスケジュールのＤＯＥを行った。産生細胞をインキュベーションするため、血清不含培地および動物タンパク質を含まないフィーディングを用いた。５０ｌの作業体積を有する、ＨｙＬｏｎｅ使い捨てバイオリアクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）発酵装置中で、前臨床研究のためのＢＣＤ−１３５調製を行った。
【０２９８】
Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ  Ｃ０ＨＣデプスフィルター（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上で培養液を清澄化した。プロテインＡを含むアフィニティ吸着剤上で、清澄化したＣＬから抗体の一次精製を行った。グリシン緩衝液中、ｐＨ３．３〜３．８の酸性条件下で、ターゲットタンパク質の特異的溶出を行った。生じた溶出物を、酸性ｐＨで３０〜６０分間維持して、ウイルスを不活性化し、そして次いで、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＯＨ溶液で、ｐＨ６．５〜７．０に中和した。ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ吸着剤（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ  ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）上、ブレークスルーモードで、最終クロマトグラフィ精製を行って、残渣ＤＮＡ、産生細胞タンパク質、アフィニティ吸着剤の切断されたリガンド、抗体凝集体および断片を取り除いた。この目的のため、６．５〜７．０のｐＨ、低伝導度（＜３ｍＳ／ｃｍ２）で、タンパク質溶液を、調製した吸着剤に通過させた。精製タンパク質を、Ｖｉｒｅｓｏｌｖｅ  ＰＲＯフィルターセット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、濃縮、ならびに酢酸緩衝剤（ｐＨ５．０〜５．５）およびトレハロースを含有する最終緩衝液に対するダイアフィルトレーションを用いて、抗ウイルス濾過に供した。生じたタンパク質の濃度は、５０ｍｇ／ｍｌまたはそれより高かった。
【０２９９】
実施例１８
ＢＣＤ−１３５抗体およびヒトＰＤ−Ｌ１複合体のインシリコモデリング
ＰＤ−Ｌ１に特異的なＢＣＤ−１３５突然変異体抗体を生成するため、ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒのＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  ＳｕｉｔｅソフトウェアおよびＢＩＯＣＡＤのＹＬＡＢパッケージを用いて、３Ｄモデリングに基づく構造分析を行った。ターゲットの結晶構造として、ＰＤ−１に重点を置いた際、古典的４ＺＱＫ構造よりも、より結晶化されたアミノ酸を有するため、ＰＤＢ  ５Ｃ３Ｔを選択した。ＨＥＤＧＥ装置（ＢＩＯＣＡＤのＹＬａｂパッケージの一部）を用いて、ドッキングを行った。１０ナノ秒分子動力学間隔での自由エネルギーを概算することによって、最適位の選択を行った（Ｄｅｓｍｏｎｄ装置、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｓｕｉｔｅパッケージの一部）。ＳｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒのＰｙＭＯＬ装置を用いて、生じた構造の視覚化を生成した。可変ドメインＢＣＤ−１３５を含むモデルを図１４Ａに示し、一方、図１４Ｂは、緊密なタンパク質間接触を形成する、単離されたアミノ酸残基との抗原および抗体相互作用の領域を示す。
【０３００】
表Ｂは、密なタンパク質間相互作用を引き起こす、抗体および抗原両方の重要なアミノ酸残基を提示する。
【０３０１】
【表４】
2020516323.tif 000015
【０３０２】
表Ｂ．  中央列は、ヒトＰＤ−Ｌ１と相互作用するＢＣＤ−１３５抗体のアミノ酸残基を示す。右列は、ＢＣＤ−１３５抗体と相互作用する、ＰＤ−Ｌ１抗原の対応するアミノ酸残基を列挙する。
【図１】
2020516323.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020516323.tif 000024
【図１０】
2020516323.tif 000025
【図１１】
2020516323.tif 000026
【図１２】
2020516323.tif 000027
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020516323.tif 000035
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