(57)【要約】  本開示は、組織試料から細胞粒子を分離し、その後、その細胞粒子を２つ以上の細胞粒子集団に選別する方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、（ｉ）組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた試料を提供すること；ならびに（ｉｉ）ホモジナイズされた組織試料中の細胞粒子をサイズにより少なくとも第１の細胞粒子集団および第２の細胞粒子集団に選別することを含む方法。
【請求項２】
細胞粒子が細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞粒子が細胞核を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第２の細胞粒子集団が、腫瘍細胞に由来する細胞粒子を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍細胞に由来する細胞粒子が、約１２μｍから約５０μｍまで、または約８．５μｍから約３０μｍまでの範囲の平均直径を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍細胞が、腫瘍全体、部分的腫瘍、転移腫瘍、部分的転移腫瘍、またはリンパ節の少なくとも１つに由来する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
組織試料が、残存外科的材料または生検試料の少なくとも１つに由来する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組織試料が、架橋溶液中で固定されたものである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ホモジナイズされた組織試料が、選別前にさらに処理され、さらなる処理が、ホモジナイズされた試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、またはホモジナイズされた試料を濾過することの少なくとも１つを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ホモジナイズされた試料中の細胞粒子をサイズにより選別することが、細胞粒子を染色する工程を必要としない、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ホモジナイズされた組織試料内の細胞粒子がマイクロ流体デバイスで選別される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
約１２μｍ未満の臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞粒子が、決定論的横置換デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約１２μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
マイクロ流体デバイスが水力学的濾過デバイスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
マイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の１つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも第１または第２の集団内の細胞粒子を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
第１のバイオマーカーの存在ががんを示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、フローサイトメトリーを用いて分析される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
第１および第２の細胞粒子集団が、患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料を提供する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
マッチングした腫瘍試料と正常試料が、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
第１および第２の細胞粒子集団をＲＮＡバイオマーカーについて分析することをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
第１および第２の細胞粒子集団をタンパク質バイオマーカーについて分析することをさらに含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
組織試料から細胞を分別する方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた組織試料を提供すること；ホモジナイズされた組織試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が、少なくとも、１２μｍ未満の平均直径を有する細胞について濃縮された第１の細胞集団、および１２μｍより大きい平均直径を有する細胞について濃縮された第２の細胞集団に選別され、ホモジナイズされた組織試料内の細胞がマイクロ流体デバイスを用いて選別される、細胞を選別することを含む方法。
【請求項３０】
マイクロ流体デバイスが、決定論的横置換デバイス、流体泳動的濾過デバイス、水力学的濾過デバイス、曲線チャネルにおける慣性集束を利用するマイクロ流体デバイス、および直線チャネルにおける慣性集束を利用するマイクロ流体デバイスからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
マイクロ流体デバイスが選別前に細胞の染色を必要としない、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
第１または第２の細胞集団の少なくとも１つを、ＲＮＡバイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカーの１つについて分析することをさらに含む、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
第１または第２の細胞集団の少なくとも１つをシーケンシングすることをさらに含む、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第１または第２の細胞集団におけるシーケンシングに利用可能なゲノム材料の量が少なくとも０．０５マイクログラムである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ゲノム材料の量が少なくとも０．１マイクログラムである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
シーケンシング前に、多くても４回の増幅サイクルが行われる、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
シーケンシングが次世代シーケンシングを使用する、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
第１および第２の細胞集団が、患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料を提供する、請求項２９から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
第１の細胞集団が正常細胞について濃縮され、第２の細胞集団が腫瘍細胞について濃縮される、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
組織試料から少なくとも濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を取り出す方法であって、組織試料から腫瘍核および正常核を解離させること；ならびに腫瘍核および正常核をマイクロ流体選別デバイスでサイズにより選別することを含み、濃縮された正常核集団内の正常核が８．５μｍ未満の平均核サイズを有し、濃縮された腫瘍核集団内の腫瘍核が８．５μｍより大きい平均核サイズを有する、方法。
【請求項４１】
マイクロ流体選別デバイスが、選別前に、染色またはバイオマーカー分析の工程を必要としない、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
濃縮された腫瘍核集団または濃縮された集団もしくは正常核の少なくとも１つをＲＮＡバイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカーの１つについて分析することをさらに含む、請求項４０または請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
濃縮された腫瘍核集団または濃縮された集団もしくは正常核の少なくとも１つをシーケンシングすることをさらに含む、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
第１または第２の細胞集団におけるシーケンシングに利用可能なゲノム材料の量が少なくとも０．０５マイクログラムである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ゲノム材料の量が少なくとも０．１マイクログラムである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
濃縮された腫瘍核集団または濃縮された集団もしくは正常核の少なくとも１つを、フローサイトメトリーを用いて分析することをさらに含む、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
組織細胞が、腫瘍全体、部分的腫瘍、転移腫瘍、部分的転移腫瘍、またはリンパ節の少なくとも１つに由来する、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
組織試料が、残存外科的材料または生検試料の少なくとも１つに由来する、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
組織試料が、架橋溶液中で固定されたものである、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、請求項４０から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、（ｉ）組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた試料を提供すること；ならびに（ｉｉ）ホモジナイズされた組織試料内の細胞粒子を少なくとも第１の集団および第２の集団に選別することであって、細胞粒子がマイクロ流体デバイス内で選別され、選別前に染色が行われない、細胞粒子を選別することを含む方法。
【請求項５２】
細胞粒子が細胞であり、第１の集団が正常細胞を含み、第２の集団が腫瘍細胞を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
正常細胞が１２μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍細胞が１２μｍより大きい平均直径を有する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞粒子が核であり、第１の集団が正常核を含み、第２の集団が腫瘍核を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
正常核が８．５μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍核が８．５μｍより大きい平均直径を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、（ｉ）組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた試料を提供すること；ならびに（ｉｉ）ホモジナイズされた組織試料内の細胞粒子を少なくとも第１の集団および第２の集団に選別することであって、細胞粒子がマイクロ流体デバイス内で選別され、選別前に染色が行われる、細胞粒子を選別することを含む方法。
【請求項５７】
細胞粒子が細胞であり、第１の集団が正常細胞を含み、第２の集団が腫瘍細胞を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
正常細胞が１２μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍細胞が１２μｍより大きい平均直径を有する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
細胞粒子が核であり、第１の集団が正常核を含み、第２の集団が腫瘍核を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
正常核が８．５μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍核が８．５μｍより大きい平均直径を有する、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８５，５５０号の出願日の利益を主張し、その米国仮特許出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
がんは、異常な細胞の無制御な増殖を特徴とする疾患である。正常組織において、細胞は、周囲細胞からのシグナルに応答して、組織内で分裂および組織化し、その結果、組織の状況により注意深く指揮される正常な細胞挙動を生じる。がん細胞は、周囲組織からの増殖を制限するコンテキストキュー（contextual cue）に応答せず、増殖して多くの器官において腫瘍を形成するように駆り立てる遺伝子変化を有する場合が多い。腫瘍進行の発達として、遺伝子変化および表現型変化は、蓄積し続け、がん細胞集団が抗腫瘍免疫応答などの追加の「チェックポイント」を克服するのを可能にし、がん細胞のより侵襲性の高い増殖表現型として顕在化させる。処置しないまま放置すると、転移（リンパ系または血流による身体の遠位区域へのがん細胞のスプレッディング）が後に続く。転移は、複数の部位に二次腫瘍の形成を生じ、健康な組織を損傷する。たいていのがん死は、そのような二次腫瘍により引き起こされる。
【０００３】
数十年間にわたる、がん診断および治療の進歩にも関わらず、多くのがんは、それらの発生の末期まで検出されないままであり続ける。結果として、増殖の最初の部位における多くの固形腫瘍は、空間的に分別されている場合が多い、遺伝子的および／または表現型的に不均一な腫瘍細胞集団を含有する。原発性腫瘍内のこれらのがん細胞集団の１個または複数は、二次転移腫瘍を生じ得る。加えて、腫瘍塊は、支持的環境（例えば、血管）を形成するように腫瘍によりリクルートされているか、または宿主（例えば、免疫細胞）による防御機構として最初に腫瘍へ引き寄せられたが、後で、がんが進化するにつれて、克服されたかのいずれかである正常細胞からなる場合が多い。
【発明の概要】
【０００４】
本開示の一態様において、組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、（ｉ）組織試料をホモジナイズして、ホモジナイズ組織試料を得ること；（ｉｉ）ホモジナイズ試料を別個の細胞粒子へ解離させること；ならびに（ｉｉｉ）ホモジナイズ組織試料内の細胞粒子を少なくとも第１の細胞粒子集団および第２の細胞粒子集団に選別することであって、２つの集団のサイズ分布の差がそれらの分離のための根本的基礎を形成する、細胞粒子を選別することを含む方法である。いくつかの実施形態において、細胞粒子の選別は、マイクロ流体デバイスで達成される。いくつかの実施形態において、染色は、選別前に行われない。いくつかの実施形態において、染色は染色前に行われる（例えば、抗体を用い、その後、サイズ差を増強するビーズと連結された二次抗体を加えて染色すること）。いくつかの実施形態において、細胞粒子は、細胞であり、第１の細胞粒子集団が正常細胞を含み、第２の細胞粒子集団が腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態において、正常細胞は、１２μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍細胞は、１２μｍより大きい平均直径を有する。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、腫瘍全体、部分的腫瘍、転移腫瘍、部分的転移腫瘍、またはリンパ節の少なくとも１つに由来する。
【０００５】
いくつかの実施形態において、細胞粒子は、核であり、第１の細胞粒子集団が正常核を含み、第２の細胞粒子集団が腫瘍核を含む。いくつかの実施形態において、正常核は、８．５μｍ未満の平均直径を有し、腫瘍核は、８．５μｍより大きい平均直径を有する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、組織試料は、残存外科的材料または生検試料の少なくとも１つに由来する。いくつかの実施形態において、組織試料は、架橋溶液中に固定されたものである。いくつかの実施形態において、組織試料は、パラフィンに包埋された固定試料に由来する。いくつかの実施形態において、ホモジナイズ試料は、選別前にさらに処理され、そのさらなる処理が、ホモジナイズ試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、またはホモジナイズ試料を濾過することの少なくとも１つを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、細胞粒子の集団を分離するために用いられる。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、流体泳動的（hydrophoretic）濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、水力学的（hydrodynamic）濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、曲線チャネルにおける慣性集束を利用する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、直線チャネルにおける慣性集束を利用する。いくつかの実施形態において、直線チャネルにおける慣性集束は、ピンチドフロー分画（pinched flow fractionation）法または水力学的スプレッディング法の１つを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、方法は、第１または第２の細胞粒子集団内の細胞粒子を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のバイオマーカーの存在は、がんを示し、またはそうではなく、がん患者の臨床的進行に関する情報を与える。いくつかの実施形態において、第１のバイオマーカーは、免疫細胞マーカーである。いくつかの実施形態において、方法は、第１および第２の細胞粒子集団をＲＮＡバイオマーカーについて分析することをさらに含む。例えば、主に正常細胞を含む第１の細胞粒子集団のＲＮＡ発現分析は、浸潤性免疫細胞中に見出される免疫細胞集団の型を同定するために用いられ得る。いくつかの実施形態において、方法は、第１および第２の細胞粒子集団をタンパク質バイオマーカーについて分析することをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれは独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされる。いくつかの実施形態において、第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれは独立して、フローサイトメトリーを用いて分析される。いくつかの実施形態において、第１および第２の細胞粒子集団は、患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料を提供する。いくつかの実施形態において、マッチングした腫瘍試料と正常試料は、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析される。
【００１０】
本開示の別の態様において、組織試料から細胞を分別する方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；およびホモジナイズ試料中の細胞を、選別デバイスを用いてサイズにより選別することであって、細胞が、少なくとも第１の細胞集団および第２の細胞集団に選別され、第１の細胞集団が、約５μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第２の細胞集団が、約１２μｍから約５０μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む方法である。いくつかの実施形態において、第１の細胞集団は非腫瘍細胞に富み、第２の細胞集団は腫瘍細胞に富む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、第１の細胞集団における細胞の少なくとも８０％は、約５μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有し、第２の細胞集団における細胞の少なくとも８０％は、約１２μｍから約５０μｍまでの範囲の平均直径を有する（すなわち、デバイスによるその選別は、８０％の標的集団を含有する試料を生じる）。いくつかの実施形態において、第１の細胞集団における細胞の少なくとも９０％は、約５μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有し、第２の細胞集団における細胞の少なくとも９０％は、約１２μｍから約５０μｍまでの範囲の平均直径を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、第１または第２の細胞集団は、まれであり（１０％未満）、選別の成功した結果は、その集団の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％への濃縮である。いくつかの実施形態において、選別は、任意の標的集団のパーセンテージ量の倍加（例えば、標的集団を約２０％から約４０％へ濃縮すること）を促進する。
【００１３】
いくつかの実施形態において、少なくとも第１の細胞集団および第２の細胞集団のそれぞれは独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされる。いくつかの実施形態において、少なくとも第１の細胞集団および第２の細胞集団は、患者についてのマッチングした腫瘍細胞試料と正常細胞試料を提供する。いくつかの実施形態において、マッチングした腫瘍細胞と正常細胞は、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、組織試料は、腫瘍全体、部分的腫瘍、および／またはリンパ節に由来する。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、残存外科的材料または生検試料に由来する。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、パラフィンに包埋された試料に由来する。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織試料、新鮮な組織試料、またはそれらの任意の組合せである。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ホモジナイズ組織試料は、選別前にさらに処理される。いくつかの実施形態において、そのさらなる処理が、ホモジナイズ試料内のタンパク質を消化する工程、およびホモジナイズ試料を濾過する工程を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、マイクロ流体デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換デバイスである。いくつかの実施形態において、約１２μｍ未満の臨界直径を有する、ホモジナイズ組織試料内の細胞は、デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約１２μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ試料内の細胞は、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する。いくつかの実施形態において、約８．５μｍ未満の臨界直径を有するホモジナイズ組織試料内の核は、デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約８．５μｍより大きい臨界直径を有するホモジナイズ試料内の核は、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、流体泳動的濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、水力学的濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、曲線チャネルにおける慣性集束を使用する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、直線チャネルにおける慣性集束を使用する。いくつかの実施形態において、直線チャネルにおける慣性集束は、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の１つを含む。いくつかの実施形態において、選別デバイスは、細胞または核を染色する工程を必要としない。
【００１７】
いくつかの実施形態において、方法は、第１または第２の集団内の細胞を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のバイオマーカーは、存在するならば、がんを示すものである。いくつかの実施形態において、第１のバイオマーカーは、免疫細胞マーカーである。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１および第２の細胞粒子集団をＲＮＡバイオマーカーについて分析することを含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１および第２の細胞粒子集団をタンパク質バイオマーカーについて分析することを含む。
【００１８】
本開示の別の態様において、新鮮な組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；ホモジナイズ組織試料中の細胞を、選別デバイスを用いてサイズにより選別することであって、細胞が、少なくとも第１の細胞集団および第２の細胞集団に選別され、第１の細胞集団が、約６μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第２の細胞集団が、約１２μｍより大きい平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む、新鮮な組織試料から細胞を分別する方法である。いくつかの実施形態において、染色が、選別前に行われる。いくつかの実施形態において、染色は、選別前に行われない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、マイクロ流体デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換デバイスである。いくつかの実施形態において、約６μｍ未満の臨界直径を有する、ホモジナイズ試料内の細胞は、デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約６μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ試料内の細胞は、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、流体泳動的濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、水力学的濾過デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、曲線チャネルにおける慣性集束を利用する。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、直線チャネルにおける慣性集束を利用する。いくつかの実施形態において、直線チャネルにおける慣性集束は、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の１つを含む。いくつかの実施形態において、選別デバイスは、細胞を染色する工程を必要としない。
【００２０】
本開示の別の態様において、試料内のゲノム材料をシーケンシングする方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；および腫瘍細胞または腫瘍核に富むホモジナイズ組織試料に由来する細胞または細胞核の少なくとも第１の集団をシーケンシングすることを含む方法である。いくつかの実施形態において、ホモジナイズ腫瘍試料内の細胞または細胞核は、マイクロ流体デバイスで選別されて、細胞または細胞核の２つの集団を提供する。いくつかの実施形態において、第１の細胞集団内の細胞または細胞核の少なくとも７０％は腫瘍細胞である。いくつかの実施形態において、第１の細胞集団内の細胞または細胞核の少なくとも７０％は、１２μｍより大きい（細胞）または８．５μｍより大きい（核）サイズを有する。いくつかの実施形態において、第１の細胞集団内の細胞または細胞核の少なくとも８０％は腫瘍細胞または腫瘍核である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、ホモジナイズ組織試料に由来する細胞または細胞核は、それらの水力学的サイズに従って選別される。いくつかの実施形態において、細胞または細胞核は、マイクロ流体デバイスで選別される。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、選別前に細胞または細胞核の染色を必要としない。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１の細胞または細胞核の集団は、シーケンシングのために少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態において、第１の細胞または細胞核の集団は、シーケンシングのために少なくとも０．１マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態において、第１の細胞または細胞核の集団は、シーケンシングのために少なくとも０．５マイクログラムのゲノム材料を含む。いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、シーケンシング前に、多くても４回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、シーケンシング前に、多くても６回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態において、シーケンシング方法は、シーケンシング前に、多くても８回の増幅サイクルを含む。いくつかの実施形態において、シーケンシング前に、増幅サイクルは必要とされない。
【００２３】
本開示の別の態様において、腫瘍試料から、濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を取り出す方法であって、腫瘍試料から腫瘍核および正常核を解離させること；ならびに腫瘍核および正常核を、選別前に染色またはバイオマーカー分析の工程を必要としないマイクロ流体選別デバイスでサイズにより選別することを含む方法である。いくつかの実施形態において、濃縮された腫瘍核集団は、少なくとも８５％の腫瘍核を含み、濃縮された正常核集団は少なくとも８５％の正常核を含む。いくつかの実施形態において、濃縮された腫瘍核集団内の腫瘍核は、８．５μｍより大きい平均核サイズを含む。いくつかの実施形態において、濃縮された正常核集団内の正常核は、８．５μｍ未満の平均核サイズを含む。いくつかの実施形態において、選別は、任意の標的集団のパーセンテージ量の倍加（例えば、標的集団を約２０％から約４０％へ濃縮すること）を促進する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、方法はさらに、濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を別々にシーケンシングする工程を含む。いくつかの実施形態において、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化の少なくとも１つが、濃縮された腫瘍核集団において同定される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、腫瘍全体、部分的腫瘍、１つもしくは複数のリンパ節、および／またはパラフィンに包埋された試料に由来する。いくつかの実施形態において、腫瘍試料は、新鮮に解離した組織を含む。
【００２６】
本開示の別の態様において、特定の処置または医薬品有効成分に応答性のがんサブタイプを同定することによりがんを処置する方法であって、がんサブタイプが、腫瘍細胞について濃縮された試料をシーケンシングすることにより同定され、試料が、インプット組織（例えば、腫瘍、１つもしくは複数のリンパ節、または血液の少なくとも１つを含む試料）をホモジナイズし、ホモジナイズ試料において腫瘍細胞または腫瘍核を正常細胞または正常核から、サイズに基づいた選別デバイスで選別することにより腫瘍細胞または腫瘍核について濃縮されており、サイズに基づいた選別デバイスが、選別前に腫瘍細胞または腫瘍核を染色することを必要としない、がんを処置する方法である。いくつかの実施形態において、染色は、選別前に実施される。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞または腫瘍核について濃縮された細胞集団は、シーケンシング前に多くても４回の増幅サイクルが行われるような、十分な量のゲノム材料を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、シーケンシング前に多くても２回の増幅サイクルが行われる。いくつかの実施形態において、ゲノム材料の量は、少なくとも０．０１マイクログラムである。いくつかの実施形態において、ゲノム材料の量は、少なくとも０．１マイクログラムである。いくつかの実施形態において、ゲノム材料の量は、少なくとも０．２マイクログラムである。いくつかの実施形態において、ゲノム材料の量は、少なくとも０．５マイクログラムである。いくつかの実施形態において、がんサブタイプの同定後、その試料が由来した患者へ処置コースが提供される。いくつかの実施形態において、サイズに基づいた選別デバイスは、選別前に、いかなる染色工程も必要としない。いくつかの実施形態において、染色は、選別前に行われる。
【００２８】
本開示の別の態様において、患者に由来する組織試料をホモジナイズすること；ホモジナイズ組織試料内の細胞を解離させること；および解離した組織試料において腫瘍細胞または腫瘍核を正常細胞または正常核からマイクロ流体デバイスで分離して、約５μｍ〜約１２μｍ（細胞）または約４μｍ〜約８．５μｍ（核）の範囲の平均直径を有する腫瘍細胞または腫瘍核に富む第１の集団、および約１２μｍ〜約５０μｍ（細胞）または約８．５μｍ〜約２５μｍ（核）の範囲の平均直径を有する正常細胞または正常核に富む第２の集団を提供することであって、マイクロ流体デバイスが選別前に染色または標識を必要としない、分離することを含む、腫瘍細胞または腫瘍核において体細胞突然変異を同定することによりがんを処置する方法である。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、最初に細胞を染色することなく、濃縮される。
【００２９】
本開示の別の態様において、下流分析を促進するために、組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分別する方法であって、組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分離して、分離された試料を得ること；分離された試料中の細胞、核、または組織凝集物を、選別デバイスを用いてサイズにより選別することであって、細胞、核、組織凝集物が第１の集団および第２の集団に選別され、第１の集団が、第１の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有し、第２の集団が、第２の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有する、細胞、核、または組織凝集物を選別することを含む方法である。いくつかの実施形態において、選別デバイスはマイクロ流体デバイスである。いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスは、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１の集団または第２の集団の少なくとも１つにゲノム解析を実施する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１の集団または第２の集団の少なくとも１つにフローサイトメトリー分析を実施する工程を含む。いくつかの実施形態において、方法はさらに、第１の集団または第２の集団の少なくとも１つを少なくとも１つのバイオマーカーの存在について染色する工程を含む。
【００３０】
本開示の別の態様において、腫瘍細胞に富む組成物であって、腫瘍細胞が１２μｍより大きいサイズを有し、腫瘍細胞も正常細胞も最初に染色することなく、腫瘍細胞が正常細胞から分離された、組成物が提供される。本開示の別の態様において、腫瘍核に富む組成物であって、腫瘍核が８．５μｍより大きいサイズを有し、腫瘍核も正常核も最初に染色することなく、腫瘍核が正常核から分離された、組成物である。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも４０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも５０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも６０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも７０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも８０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも９０％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、組成物の少なくとも９５％が、腫瘍細胞または核を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍集団は、まれ（１０％未満）であり、選別後の組成物が、その集団の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも８０％への濃縮である。いくつかの実施形態において、濃縮された試料の組成物は、腫瘍集団の最初のパーセンテージの倍加である。
【００３１】
本開示の別の態様において、第１の細胞集団および第２の細胞集団を含むキットであって、第１の細胞集団が、１２μｍより大きいサイズを有する腫瘍細胞に実質的に富み、第２の細胞集団が、１２μｍ未満のサイズを有する正常細胞に実質的に富み、第１の細胞集団および第２の細胞集団が、同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍細胞および正常細胞が染色されていない、キットが提供される。本開示の別の態様において、第１の核集団および第２の核集団を含むキットであって、第１の核集団が、８．５μｍより大きいサイズを有する腫瘍核に実質的に富み、第２の核集団が、８．５μｍ未満のサイズを有する正常細胞に実質的に富み、第１の核集団および第２の核集団が同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍核および正常核が染色されていない、キットである。
【００３２】
現在の診断ツールは、主に、現在の腫瘍サンプリングスキームが、診断試験の全部について、各腫瘍の非常に少量の局在性画分のみを使用するため、腫瘍塊を含む、遺伝的に不均一ながん細胞および異なる細胞型を十分表現することにおいてかなりの困難に直面している。本出願人らは、サンプリングされた腫瘍から意味ある情報が引き出され得るように、腫瘍をサンプリングする新しい手法を開発している。本明細書に詳述されているように、この目標を達成することにより、がんを駆動させる変化のより正確なスナップショット、患者についてのより良い治療的手法、および治療抵抗性の可能性のある機構のより良い予測が可能になる。
【００３３】
複雑で不均一な混合物から細胞を単離および選別することは、生物学、バイオテクノロジー、および医学の多くの分野において重要なタスクを表すと考えられる。実際、異なる腫瘍は、様々なパーセンテージの腫瘍細胞と正常細胞を有すると考えられる。結果として、より高いパーセンテージの混入正常組織（例えば、免疫浸潤による）を含む腫瘍由来の代表試料は、シーケンシングすることがより費用がかかると考えられ、その読み取りの一部は、正常ＤＮＡには「無駄」であろうからである。本明細書で用いられる場合、「読み取り」は、シーケンシング過程の終了後に得られるクラスターの配列を指し、最終的には、断片化核酸配列の固有断片の一区画の配列である。ブロック由来の腫瘍組織カールからの現在の臨床的シーケンシングもまた、何の気なしに、混入正常組織に関する読み取りを無駄にしている（本明細書で用いられる場合、「組織カール」は、通常ミクロトームを用いた、ＦＦＰＥブロックから切断された規定厚さの組織の区画を指す）。したがって、代表試料とブロックからのアーカイブ組織試料の両方における腫瘍細胞および正常（免疫）細胞の混合物は、腫瘍組織をシーケンシングするために難題をもたらすと考えられる。
【００３４】
加えて、非悪性組織に存在する遺伝子多型は別にして、真の体細胞突然変異を定義するために、同じ患者由来の別個の非悪性組織源をシーケンシングすることが重要である場合が多い。アーカイブ腫瘍ブロックについて、これらの非悪性組織は、収集されていなかった場合がある。さらに、腫瘍組織から免疫成分を単離することが重大な意味をもつシーケンシング適用があり得る。これを考慮すれば、代表試料および組織ブロックから正常組織を濃縮する必要性が存在する。
【００３５】
解離した代表試料のフローサイトメトリーによる分析もまた、組織の各型に固有であるバイオマーカーを発現する場合が多い、腫瘍細胞と正常（免疫）細胞の混合物によってより困難になっている。下流分析の前に異なる細胞型を分離する能力は、解離した固定組織試料のフローサイトメトリーによるより直接的な分析を可能にするであろうと考えられる。
【００３６】
前述を考慮して、本出願人らは、研究、腫瘍分析、および他の下流処理タスク（例えば、ゲノムシーケンシング、ＦＡＣＳ分析、ＲＮＡまたはタンパク質バイオマーカー分析）における効率を増強するために、腫瘍細胞粒子および正常細胞粒子の不均一な混合物が１つまたは複数の十分定義された集団（例えば、腫瘍集団または正常細胞集団）へ濃縮または精製され得る、選別の方法を開発している。いくつかの実施形態において、本出願人らにより開発された方法は、選別前に細胞または核の染色または標識を必要とせず、したがって、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）または磁気活性化細胞ソーティングを使用する方法と比較して、より優れた選別方法を確立している（とはいえ、選別前に染色が使用されてもよい）。さらに、本開示による濃縮された細胞粒子（例えば、細胞または細胞核）集団を作製する方法は、ゲノムシーケンシングの費用の低減を可能にすると考えられる。本出願人らはまた、本明細書に開示された方法が、残存外科材料またはパラフィンブロックからの抽出されたアーカイブ試料からなどの単一の患者試料からマッチングした腫瘍細胞集団と正常細胞集団を作製するために用いられ得る。
【００３７】
本出願人らはまた、本明細書に記載された選別デバイスが、特に同じ患者由来の非悪性組織試料を欠くアーカイブ試料について、各患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料の提供を促進し、シーケンシングによる真の体細胞突然変異の同定を可能にすることを発見している。腫瘍集団および正常集団の濃縮はまた、シーケンシングの費用を低減し、潜在的に、フローサイトメトリーによる分析を単純化し得ると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】本開示の一実施形態による方法を図示するフローチャートを示す図である。
【図２】本開示の別の実施形態による方法を図示するフローチャートを示す図である。
【図３】本開示の別の実施形態による方法を図示するフローチャートを示す図である。
【図４】本開示の別の実施形態による方法を図示するフローチャートを示す図である。
【図５Ａ】代表的な結腸腺癌腫瘍試料から調製された核のサイズ分布を示す図であり、グラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示し、トレースは、移動平均を用いて滑らかにされている。粒子のサイズでの分類およびカウントのＣｏｕｌｔｅｒ方法は、電解液に懸濁した非導電粒子により生じた電気インピーダンスの測定可能な変化に基づいている。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターにおいて測定された粒子は、同じサイズのビン（サイズビン）へグループ化される。水平軸上に報告されたサイズビンの数は、増加する粒子直径を指す。顕微鏡画像を用いて、本発明者らは、約「５０」のサイズビンが、約６μｍ直径におおよそ相関し、約「１００」のサイズビンが、約９μｍ直径におおよそ相関し、約「１５０」のサイズビンが、約１４μｍ直径におおよそ相関することを経験的に推定している。
【図５Ｂ】代表的な肺扁平上皮癌腫瘍試料から調製された核のサイズ分布を示す図であり、グラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示し、トレースは、移動平均を用いて滑らかにされている。
【図６Ａ】結腸腫瘍代表試料から単離された核についてのフローサイトメトリーデータのヒストグラムを示す図であり、陽性サイトケラチン（ＣＫ）染色が、腫瘍核を正常から区別し得ることをさらに例証する。左パネル（ｉ）は、ＴＳＡ−ローダミン１０１により可視化されたＣＫ染色強度を表す。ゲートは、ＣＫ陽性核およびＣＫ陰性核について確立された。中央パネル（ｉｉおよびｉｉｉ）は、パネルｉにおけるゲートにより規定されたＣＫ陰性および陽性集団についてのＤＮＡ含有量の読み出しとしてのＤＡＰＩ染色強度を表す。パネル（ｉｉ）（ＣＫ陰性）におけるＤＡＰＩ染色強度の単一ピークおよびパネルｉｉｉ（ＣＫ陽性）における複数ピークに注目されたい。右パネル（ｉｖおよびｖ）は、パネル（ｉ）で決定されたゲートによりフロー選別されている核についてのＣＫ染色強度のヒストグラムを示す。パネルｉｖは、ＣＫ陰性として規定された濃縮粒子の分析を示し、パネルｖは、ＣＫ陽性として規定された粒子についての濃縮を示す。
【図６Ｂ】肺腫瘍代表試料から単離された核についてのフローサイトメトリーデータのヒストグラムを示す図であり、陽性サイトケラチン（ＣＫ）染色が、腫瘍核を正常から区別し得ることをさらに例証する。左パネル（ｉ）は、ＴＳＡ−ローダミン１０１により可視化されたＣＫ染色強度を表す。ゲートは、ＣＫ陽性核およびＣＫ陰性核について確立された。中央パネル（ｉｉおよびｉｉｉ）は、パネルｉにおけるゲートにより規定されたＣＫ陰性および陽性集団についてのＤＮＡ含有量の読み出しとしてのＤＡＰＩ染色強度を表す。パネル（ｉｉ）（ＣＫ陰性）におけるＤＡＰＩ染色強度の単一ピークおよびパネルｉｉｉ（ＣＫ陽性）における複数ピークに注目されたい。右パネル（ｉｖおよびｖ）は、パネル（ｉ）で決定されたゲートによりフロー選別されている核についてのＣＫ染色強度のヒストグラムを示す。パネルｉｖは、ＣＫ陰性として規定された濃縮粒子の分析を示し、パネルｖは、ＣＫ陽性として規定された粒子についての濃縮を示す。
【図７Ａ】代表的な結腸腺癌腫瘍試料由来の選別された核のサイズ分布を示す図である。グラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示し、トレースは、移動平均を用いて滑らかにされている。点線のトレースは、選別されていない核に対応する；破線のトレースはＦＡＣＳを用いて選別されたサイトケラチン（ＣＫ）陰性核に対応する；実線のトレースはＦＡＣＳを用いて選別されたサイトケラチン（ＣＫ）陽性核に対応する。
【図７Ｂ】代表的な肺扁平上皮癌腫瘍試料由来の選別された核のサイズ分布を示す図である。グラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示し、トレースは、移動平均を用いて滑らかにされている。点線のトレースは、選別されていない核に対応する；破線のトレースはＦＡＣＳを用いて選別されたサイトケラチン（ＣＫ）陰性核に対応する；黒色のトレースはＦＡＣＳを用いて選別されたサイトケラチン（ＣＫ）陽性核に対応する。
【図８】代表的な腫瘍試料からの抽出された単一細胞の分布を示す図である。グラフは、結腸腫瘍から解離した単一細胞（上方）、扁桃から解離した単一細胞（下方）、およびその後ＦＡＣＳで選別された、結腸腫瘍から解離したＥｐ−ＣＡＭ陽性細胞のＣｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示す。
【図９】ホルマリン固定扁桃（黒色トレース）およびホルマリン固定パラフィン包埋扁桃（灰色トレース）から解離した細胞のサイズ分布を示す図である。グラフは、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター分析を示し、トレースは、移動平均を用いて滑らかにされている。
【図１０】ピンチドフロー分画による細胞選別を示す図である。Ａ）ピンチド区分において、細胞は、最初、壁へと押され、その後、マイクロ流体チャネルの広がりでサイズにより分離される。Ｂ）細胞は、チャネルのピンチド区分において一列に並べられ、ピンチド区分を出た後、サイズによる選別として別々の流線をたどる。
【図１１】決定論的横置換による細胞選別を示す図である。大きい細胞（青色で描かれている）は、マイクロ流体チャネルにおけるマイクロポストの操作されたサイズおよびスペーシングにより最初の流線における小さい細胞（赤色で描かれている）から離れて移動する。
【図１２】水力学的濾過による細胞選別を示す図である。Ａ）細胞は、マイクロ流体デバイスへ注射され、出口へと押される。Ｂ）小さい細胞は、近位の枝路から出て行き、一方、Ｃ）大きい細胞は遠位の枝路から出て行く。
【図１３Ａ】主チャネルおよび複数の側方チャネルを含む水力学的濾過デバイスにおける幾何学的に方向づけられたローリングへの手法を示す図である。
【図１３Ｂ】主チャネルと側方チャネルの間の分岐点における流速分布のクローズアップ観察を示す図である。
【図１３Ｃ】本開示方法内での使用を企図された別のマイクロ流体デバイスを示す図である。本明細書で開示されたＶｏｒｔｅｘ  ＨＥデバイスは、直列に８個、および並列に８個のリザーバを有する。（ａ）最初、細胞は、チャネル横断面を通して分布される。（ｂ）所定の距離を移動した後、より高い慣性揚力を受けるより大きい細胞（例えば、腫瘍細胞）は、チャネル壁の方へ移動する。（ｃ）壁の近くに位置したより大きい細胞（例えば、腫瘍細胞）は、リザーバに入るのに十分な揚力を受け、安定的に捕捉されたままであり、一方、より小さい細胞（例えば、正常細胞）は、リザーバに入らないか、または捕捉されたままにはならず、主流へ戻るかのいずれかである。
【図１４】結腸腫瘍試料および肺腫瘍試料についての相対的細胞サイズの分布を示す図である。
【図１５Ａ】ＦＡＣＳ濃縮された腫瘍試料についてのシーケンシングデータを示す図であり、大きい細胞は、結腸腫瘍突然変異のアレル画分の増加に基づいて腫瘍細胞と同定される。この場合、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンタートレースは、結腸腺癌由来の選別されていない腫瘍核およびＦＡＣＳ濃縮された腫瘍核の相対的サイズを示す。
【図１５Ｂ】ＦＡＣＳ濃縮された腫瘍試料についてのシーケンシングデータを示す図であり、大きい細胞は、結腸腫瘍突然変異のアレル画分の増加に基づいて腫瘍細胞と同定される。この場合、棒グラフは、図１５Ａからの、結腸腫瘍の代表試料ホモジネート（選別されていない）およびＦＡＣＳ選別された腫瘍核（ＣＫ陽性）からのシーケンシングデータについての試料被覆度および腫瘍純度を示す。
【図１５Ｃ】ＦＡＣＳ濃縮された腫瘍試料についてのシーケンシングデータを示す図であり、大きい細胞は、結腸腫瘍突然変異のアレル画分の増加に基づいて腫瘍細胞と同定される。この場合、腫瘍突然変異は、バルクの代表試料ホモジネートとＦＡＣＳ選別された腫瘍核の両方（ｎ＝３５１）において検出されている。さらに、いくつかの腫瘍突然変異は、ＦＡＣＳ選別された核のみ（ｎ＝６８）およびホモジネートのみ（ｎ＝６）において検出されている。ＦＡＣＳ選別された核における腫瘍突然変異のより高い検出は、腫瘍核の濃縮によるゲノムアッセイの感度の増加を示す。
【図１５Ｄ】ＦＡＣＳ濃縮された腫瘍試料についてのシーケンシングデータを示す図であり、大きい細胞は、結腸腫瘍突然変異のアレル画分の増加に基づいて腫瘍細胞と同定される。チャートは、ホモジネート対ＦＡＣＳ選別された核における２つのクローナルドライバーのアレル頻度を示す。ＦＡＣＳ選別された腫瘍核について、突然変異体アレル頻度（ＭＡＦ％）は、ドミナントクローナルドライバー突然変異について予想される上限である５０％にほぼ等しいことに注目されたい。
【図１６Ａ】固定扁桃組織由来の解離した核の明視野画像を示す図である。図示された挿入画は、核の拡大倍率を示す。下方のパネルは、ＩｍａｇｅＪにおける面積計算に用いられたマスク（黒色アウトライン）を示す。スケールバーは１００μｍである。
【図１６Ｂ】扁桃核、および８０％より高い腫瘍含有量を含有する卵巣腫瘍由来の腫瘍核の、（Ａ）においてのように、画像を用いて計算されたサイズ範囲を示すグラフである。扁桃核の平均サイズは、６．７μｍと計算され、一方、腫瘍核の平均サイズは１３．０μｍであった。８．５μｍのカットオフは、その２つの集団の分離を可能にするであろう。
【図１６Ｃ】扁桃細胞、および約４０％の腫瘍細胞含有量（フローサイトメトリーにより測定、未呈示）を含有する結腸がん由来の腫瘍細胞の画像を用いて計算されたサイズ範囲を示すグラフである。扁桃細胞の平均サイズは８．７＋／−１．５μｍと計算され、一方、約４０％の腫瘍細胞、６０％の正常細胞からなる結腸腫瘍試料中の細胞の平均サイズは、１２．０＋／−４．２μｍである。正常細胞が扁桃細胞のサイズ分布に従うと仮定すれば、約１２μｍのカットオフが、腫瘍細胞の濃縮を可能にするであろう。これの裏付けとして、結腸腫瘍試料中の細胞の４０％は、１２μｍ以上である。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
概観
一般的に、本開示は、細胞粒子（例えば、細胞、核）および／または小さい組織凝集物を組織試料（例えば、腫瘍試料、リンパ節試料など）から分離または分別し（工程１００）、その後、細胞粒子および／または小さい組織凝集物を２つ以上の集団（例えば、腫瘍細胞粒子集団、正常細胞粒子集団）へ、例えば、サイズまたは水力学的サイズにより、選別し（工程１１０）、その結果、細胞粒子および／または小さい組織凝集物の各集団が分析され得る（工程１２０）方法を提供する（図１参照）。そのようなものとして、本開示は、シーケンシングおよび／またはタンパク質もしくはＲＮＡバイオマーカー分析の上流の、固定された解離組織の分画のための手法を可能にする。いくつかの実施形態において、各細胞粒子集団またはそれの選別された画分は、特定の型の、細胞粒子（例えば、腫瘍細胞、正常細胞、腫瘍核、正常核）または腫瘍組織凝集物もしくは正常組織凝集物に富む。
【００４０】
本開示はまた、デバイス、例えば、マイクロ流体デバイス、ならびに腫瘍細胞粒子および正常細胞粒子の亜集団（例えば、腫瘍細胞、正常細胞、腫瘍核、正常核）を濃縮および分析するためにそのようなデバイスを用いる方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示のデバイスは、所定サイズを有する細胞、核、または組織凝集物の変位を可能にし、それにより、細胞、核、または組織凝集物のある特定の集団について濃縮された試料を提供する機構を与える、障害物のアレイなどのアレイを組み込む。いくつかの実施形態において、アレイは、本明細書に開示されているような正常細胞または腫瘍細胞に典型的に関連したサイズに従って形成される。
【００４１】
本開示はさらに、対象由来の試料を分析する工程（工程１２０）であって、分析（工程１２０）の前に、試料が組織から分離され（工程１００）、その後、マイクロ流体選別デバイスなどで選別する工程（工程１１０）により、対象における状態、例えば、がんを診断する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、がん細胞または核を第１の方向に方向づけて、がん細胞または核について濃縮された第１のアウトプット試料を生じ、非がん性細胞または核を第２の方向に方向づけて、非がん性細胞または核について濃縮された第２のアウトプット試料を生じる構造を含む少なくとも１つのチャネルを有するデバイスへ細胞試料を導入し、がん細胞または核について濃縮された集団の分析、例えば、ゲノム解析を実施することにより、細胞試料においてがん細胞または核を分析する方法を提供する。いくつかの実施形態において、ゲノム解析は、がん性細胞または核集団と非がん性細胞または核集団の両方について実施される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、方法は、シーケンシング費用を低減し、バイオインフォマティクス分析を可能にするように、濃縮された正常組織とマッチングした腫瘍濃縮組織の提供を可能にする。
【００４３】
定義
明らかに反することが示されていない限り、１つより多い工程または行為を含む本明細書に主張された任意の方法において、本方法の工程または行為の順序は、本方法の工程または行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないこともまた、理解されるべきである。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうではないと明らかに示さない限り、複数の指示物を含む。同様に、語「または」は、文脈がそうではないと明らかに示さない限り、「および」を含むことが意図される。用語「含む」は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡとＢを含むことを意味するように、包含的に定義される。
【００４５】
本明細書および特許請求の範囲に用いられる場合、「または」は、上記で定義されているように、「および／または」と同じ意味をもつと理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を分ける時、「または」または「および／または」は、包含的であると解釈されるべきであり、すなわち、いくつかのまたはリストの要素、および任意で、追加のリストに載せられていない項目のうちの少なくとも１つの包含であるが、１つより多くも含む。「の１つのみ」または「の正確に１つ」または特許請求の範囲で用いられる時の「からなる」などの、そうではないと明らかに示されている用語のみが、いくつかの、またはリストの要素のうちの正確に１つの要素の包含を指す。一般的に、本明細書で用いられる場合、用語「または」は、「いずれか」、「の１つ」、「の１つのみ」、または「の正確に１つ」などの排他性の用語が先行する時、排他的な選択肢（すなわち、「一方または他方であるが、両方ではない」）を示すとのみ解釈されるべきである。特許請求の範囲で用いられる時の「から本質的になる」は、特許法の分野で用いられる場合のそれの通常の意味をもつものとする。
【００４６】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、１つまたは複数の要素のリストに関連しての句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける要素のうちの任意の１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素のリスト内に具体的に列挙されたありとあらゆる要素のうちの少なくとも１つを必ずしも含むとは限らず、要素のリストにおける要素の任意の組合せを排除しない。この定義はまた、要素のリスト内で具体的に同定された要素以外に要素が任意で存在し得ることを可能にし、それらの要素を、句「少なくとも１つ」は、具体的に同定された要素に関係しようがしまいが、指す。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または等価的に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または等価的に、「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態において、Ｂが存在せず、少なくとも１つの（任意で、１つより多い）Ａ（および任意で、Ｂ以外の要素を含む）を指し得、別の実施形態において、Ａが存在せず、少なくとも１つの（任意で、１つより多い）Ｂ（および任意で、Ａ以外の要素を含む）を指し得、さらに別の実施形態において、少なくとも１つの（任意で、１つより多い）Ａ、および少なくとも１つの（任意で、１つより多い）Ｂ（および任意で、他の要素を含む）を指し得るなど。
【００４７】
本明細書で用いられる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは交換可能に用いられ、同じ意味をもつ。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」などは交換可能に用いられ、同じ意味をもつ。具体的には、それらの用語のそれぞれは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の一般的な米国特許法定義と一致して定義され、それゆえに、「少なくとも以下」を意味するオープン用語であると解釈され、追加の特徴、限定、態様などを排除しないと解釈される。したがって、例えば、「成分ａ、ｂ、およびｃを有するデバイス」は、そのデバイスが、少なくとも成分ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。同様に、句「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」は、その方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程および過程は、本明細書で、特定の順序で概要を示され得るが、工程および過程の順序は変わり得ることは、当業者は認識しているであろう。本明細書で用いられる場合、用語「増幅」は、最初の核酸のより多い量を得るために、核酸鋳型の最初の量を増加する過程を指す。
【００４８】
同様に、用語「増幅する」は、核酸の一部分が、例えば、様々なプライマー伸長反応のいずれかを用いて、複製される過程を指す。例示的なプライマー伸長反応には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられるが、それに限定されない。特に述べられていない限り、「増幅する」は、単回の複製、または算術的、対数的、もしくは指数関数的増幅を指す。一般的に、ＰＣＲは、クローニングも精製もなしに、ゲノムＤＮＡの混合物における標的配列のセグメントの濃度を増加させるための方法である。標的配列を増幅するためのこの過程は、大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、所望の標的配列を含有するＤＮＡ混合物へ導入し、その後、ＤＮＡポリメラーゼの存在下でサーマルサイクリングの正確な配列が行われることからなる。２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、混合物は変性され、その後、プライマーが、標的分子内のそれらの相補的配列にアニールする。アニーリング後、プライマーは、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）で伸長されて、相補鎖の新しいペアを形成する。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長の工程は、何度も反復されて（すなわち、変性、アニーリング、および伸長は、１「サイクル」を構成する；多数の「サイクル」があり得る）、所望の標的配列の、高濃度の増幅されたセグメント（アンプリコン）を得ることができる。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、お互いに対してのプライマーの相対的位置により決定され、したがって、この長さは、コントロール可能なパラメータである。ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）は、例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；米国特許第４，６８３，１９５号；米国特許第４，０００，１５９号；米国特許第４，９６５，１８８号；米国特許第５，１７６，９９５号に記載されており、それぞれの米国特許の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００４９】
本明細書で用いられる場合、用語「生物学的試料」または「組織試料」は、ウイルスを含む任意の生物体から得られる生体分子（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖（炭水化物）、またはそれらの組合せ）を含む任意の試料を指す。生物体の他の例には、哺乳動物（例えば、ヒト；ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、およびブタのような獣医学的動物；ならびにマウス、ラット、および霊長類のような実験動物）、昆虫、環形動物、クモ類、有袋動物、爬虫類、両生類、細菌、および真菌が挙げられる。生物学的試料には、組織試料（例えば、組織切片および組織の針生検）、細胞試料（例えば、パップスメアもしくは血液スメアなどの細胞学的スメア、またはマイクロダイセクションにより得られる細胞の試料）、または細胞画分、断片、もしくはオルガネラ（例えば、細胞を溶解し、それらの成分を遠心分離または別の方法により分離することにより得られる）が挙げられる。生物学的試料の他の例には、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘液、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検により得られる）、乳頭吸引液、耳垢、乳、膣液、唾液、スワブ（例えば、頬側スワブ）、または最初の生物学的試料に由来する生体分子を含有する任意の材料が挙げられる。ある特定の実施形態において、本明細書で用いられる場合、用語「生物学的試料」は、対象から得られた腫瘍またはその一部分から調製された試料（例えば、ホモジナイズまたは液化試料）を指す。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、用語「バイオマーカー」は、正常もしくは異常な過程の、または状態もしくは疾患（例えば、がん）の徴候である、血液、他の体液、または組織に見出される生物学的分子を指す。バイオマーカーは、身体が、疾患もしくは状態についての処置にどれくらいよく応答するか、または対象が疾患もしくは状態に罹りやすいかどうかを決定するために用いられ得る。がんの関連において、バイオマーカーは、身体におけるがんの存在を示す生物学的物質を指す。バイオマーカーは、腫瘍により分泌される分子、またはがんの存在に対する身体の特異的な応答であり得る。遺伝的、後成的、プロテオミクスの、グライコミクスの、および画像診断のバイオマーカーが、がん診断、予後、および疫学に用いることができる。そのようなバイオマーカーは、血液または血清のような非侵襲的に収集された生物流体においてアッセイすることができる。いくつかの遺伝子およびタンパク質に基づいたバイオマーカーはすでに患者ケアにおいて用いられており、それには、ＡＦＰ（肝臓がん）、ＢＣＲ−ＡＢＬ（慢性骨髄性白血病）、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２（乳がん／卵巣がん）、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ（メラノーマ／結腸直腸がん）、ＣＡ−１２５（卵巣がん）、ＣＡ１９．９（膵臓がん）、ＣＥＡ（結腸直腸がん）、ＥＧＦＲ（非小細胞肺癌）、ＨＥＲ−２（乳がん）、ＫＩＴ（消化管間質腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺特異的抗原）、Ｓ１００（メラノーマ）、および多くの他のものが挙げられるが、それらに限定されない。バイオマーカーは、診断（初期がんを同定するために）および／または予後（がんが、どれくらい悪性度が高いか、および／または対象が特定の処置にどのように応答するであろうか、および／またはがんが再発する可能性はどれくらい高いかを予測するために）として有用であり得る。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、用語「濃縮された試料」は、典型的には試料中に存在する他の成分に対して、関心対象となる成分の相対的集団を増加させるように処理されている成分を含む試料を意味する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示された方法は、細胞型の混合物（例えば、腫瘍細胞と正常細胞）を含む流れにおいて細胞の少なくとも１つの型を他から濃縮または選別するためにデバイスを利用する。本明細書で用いられる場合、用語「濃縮する」（および類似して、用語「単離する」または「選別する」）は、濃縮された標的細胞、核、または組織凝集物が、他の非標的細胞、核、または組織凝集物から１００％単離されることを意味せず、単に、その混合物が、出発混合物と比較していくらかの量の濃縮を受けていることを意味する。例えば、試料は、関心対象となる細胞の相対的集団を、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、または少なくとも１０倍、１００倍、１，０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、もしくは１００，０００，０００倍にも、増加させることにより濃縮することができる。
【００５２】
本明細書で用いられる場合、用語「細胞粒子」は、個々の細胞、または細胞から放出されたオルガネラを指す。いくつかの実施形態において、細胞から放出されたオルガネラは細胞核である。他の実施形態において、細胞から放出されたオルガネラは、核の起源の細胞を同定するために用いられ得る細胞質材料のレムナントを含有する細胞核である。例えば、サイトケラチンは、核に付着したままであり得、腫瘍細胞が起源である核についてのタンパク質マーカーとして用いられ得る。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、用語「固定された」は、組織試料の細胞性および／または構造的完全性を保存することを目的として、架橋溶液においてインキュベートされた組織試料を指す。架橋溶液の一般的な例には、中性緩衝ホルマリン、メタノール、アルコール性ホルマリン、ブアンなどが挙げられる。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、用語「Ｈ＆Ｅ」は、一次染料のヘマトキシリンおよびエオシンでの染色を指す。
【００５５】
本明細書で用いられる場合、用語「水力学的サイズ」は、フロー、障害物、または他の粒子と相互作用する時の粒子の有効サイズを意味する。それは、フローにおける粒子体積、形、および変形性についての総括的な用語として用いられる。
【００５６】
本明細書で用いられる場合、用語「ホモジナイズする」は、生物学的試料が、試料の全画分が組成の点で等しいような状態へもたらされる過程を指す。本開示において、「ホモジナイズ」は、一般的に、試料内の細胞の大部分の完全性を保存し、例えば、試料中の細胞の少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、またはそれ以上のパーセンテージが、ホモジナイズ過程の結果として破壊も溶解もしない。ホモジネートは、実質的に個々の細胞（または細胞のクラスター）に解離し得、生じた１つまたは複数のホモジネートは、実質的に均一である（類似した要素からなる、もしくは類似した要素で構成される、または全体にわたって一様である）。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、用語「標識」または「染料」は、被分析物と結合し、内部に取り入れられ、または別なふうに吸収され、例えば、形、形態、色、蛍光、発光、リン光、吸光度、磁気性、または放射性放出を通して、検出される能力がある試薬を指す。
【００５８】
本明細書で用いられる場合、用語「リンパ節」は、腋窩および胃を含む身体を通して広く存在し、リンパ管によって連結された、リンパ系の卵形または腎臓形の器官を指す。リンパ節は、非限定的にＢ細胞およびＴ細胞を含む多様な免疫細胞を含有する。いくつかの実施形態において、リンパ節は、隠れた腫瘍細胞を含有する場合がある。
【００５９】
本明細書で用いられる場合、用語「マイクロ流体」は、１ｍｍ未満の少なくとも１つの寸法を有することを意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、用語「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」は、伝統的なサンガーおよびキャピラリー電気泳動に基づいた手法と比較して、ハイスループットのシーケンシングを有するシーケンシングテクノロジーであり、そのシーケンシング過程は、並行して、例えば、１度に、相対的に少量の配列読み取りの数千個または数百万個を生じて、実施される。次世代シーケンシング技術のいくつかの例には、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、およびハイブリダイゼーションによるシーケンシングが挙げられるが、それらに限定されない。これらのテクノロジーは、相対的に短い時間で、より短い読み取り（２５〜５００ｂｐの範囲）だが、多くの何十万個または何百万個という読み取りを生じる。用語「次世代シーケンシング」は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、およびＲｏｃｈｅなどにより現在使用されている、いわゆる並列化された合成によるシーケンシングまたはライゲーションによるシーケンシングのプラットフォームを指す。次世代シーケンシング方法はまた、ナノポアシーケンシング方法、またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより商業化されているＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔテクノロジーなどの電子検出に基づいた方法が挙げられ得る。
【００６１】
本明細書で用いられる場合、用語「正常組織」は、疾患の、またはがん、悪性腫瘍の関連における発生率の増加に推定的に相関する検出可能な病変または異常を有しない組織を指す。これらの正常試料は、疾患（遺伝的またはそうでない）、がん、または悪性腫瘍の発生率の増加と相関する遺伝的突然変異または状態を有する患者に由来し得る。正常組織は、同じ個体もしくは異なる個体由来の病的組織に対応する同じ型の組織であり得る；または同じ個体由来かもしくは他の個体由来かのいずれかの病的組織に関係していない（例えば、身体の異なる場所由来か、または異なる組織学的型をもつかのいずれか）正常組織であり得る。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、用語「障害物」は、マイクロ流体デバイスにおけるフローチャネルなどのチャネルにおけるフローへの妨害物、例えば、１つの表面からの突起を指す。例えば、障害物は、底基板上に突出するポスト、または水性流体に対する疎水性バリアを指し得る。いくつかの実施形態において、障害物は、部分的に透過性であり得る。例えば、障害物は、多孔性材料でできたポストであり得、その細孔は、水性成分の透過を可能にするが、分離されることになっている粒子が侵入するには小さすぎる。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、用語「代表試料」および「代表的サンプリング」は、全体の成分を正確に反映する試料（または試料のサブセット）を指し、したがって、その試料は、集団全体の不偏性指標である。一般的に、これは、代表試料またはその一部分内の異なる型の細胞およびそれらの相対的割合またはパーセンテージが、組織標本全体、一般的には固形腫瘍またはその部分内のこれらの細胞型の相対的割合またはパーセンテージを本質的に正確に反映または模倣する。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「シーケンシング」または「ＤＮＡシーケンシング」は、ＤＮＡオリゴヌクレオチドにおいて、ヌクレオチド塩基、アデニン、グアニン、シトシン、およびチミンの順番を決定するための生化学的方法を指す。シーケンシングは、その用語が本明細書で用いられる場合、非限定的に、並列シーケンシング、または当業者に知られた任意の他のシーケンシング方法、例えば、チェーンターミネーション方法、高速ＤＮＡシーケンシング方法、遊走スポット分析、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔシーケンシング、ダイターミネーターシーケンシング、または任意の他の最新式自動ＤＮＡシーケンシング機器を用いることを含み得る。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、用語「実質的に」は、関心対象となる特性または性質の完全なまたはほぼ完全な程度または度合いを表す質的状態を意味する。生物学的および化学的現象は、もしあったとしても、まれにしか、終了まで行かず、および／もしくは完全へと進まず、または絶対的結果を達成もしくは回避しないことは、当業者は理解しているであろう。いくつかの実施形態において、「実質的な」は、約２０％以内を意味する。いくつかの実施形態において、「実質的な」は、約１５％以内を意味する。いくつかの実施形態において、「実質的な」は、約１０％以内を意味する。いくつかの実施形態において、「実質的な」は、約５％以内を意味する。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、用語「腫瘍」は、それ自体、通常、正常細胞より迅速に増殖する細胞の異常な新しい増殖として定義され、処置されなければ、増殖し続け、時々、隣接構造への損傷を生じる、腫瘤または新生物を指す。腫瘍サイズは幅広く様々であり得る。腫瘍は、固形であり得、または液体で満たされ得る。腫瘍は、良性（悪性ではない、一般的に無害）または悪性（転移の能力がある）の増殖を指し得る。いくつかの腫瘍は、良性である腫瘍性細胞（上皮内癌など）を含有し、同時に、悪性がん細胞（腺癌など）を含有し得る。これは、身体に渡って複数の場所に位置する新生物を含むと理解されるべきである。したがって、本開示の目的について、腫瘍は、原発性腫瘍、リンパ節、リンパ性組織、および転移腫瘍を含む。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、用語「腫瘍試料」は、腫瘍から、またはがん細胞を含む可能性がある、もしくは含むのではないかと疑われる試料から調製された試料、あるいはリンパ節などのがん細胞の潜在的な存在について試験されることになっている試料を包含する。
【００６８】
組織からの細胞粒子の分離
図１および２に関して、いくつかの実施形態において、細胞粒子（例えば、細胞、核、および／または小さい組織凝集物）が、組織試料をホモジナイズし（工程２００）、その後、ホモジナイズ試料に存在する細胞粒子を解離させる（工程２１０）ことによるなど、組織から分離される（工程１００）。その後、解離した細胞粒子は、選別され（工程２２０）、分析される（工程２３０）。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ホモジナイズ（工程２００）および解離（工程２１０）のための組織試料は、腫瘍（がん性または非がん性）、転移性病変、正常組織、全血、またはリンパ節に由来する。いくつかの実施形態において、組織試料は、残存外科的試料、生検試料、または組織学的試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は、新鮮な試料、すなわち、貯蔵されたことがないものである。いくつかの実施形態において、組織試料は、固定組織試料である。いくつかの実施形態において、組織試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックに由来する。いくつかの実施形態において、複数の組織源が組み合わされて、その後、細胞および／または核などの細胞粒子が、その集合的組織試料から分離される。いくつかの実施形態において、細胞粒子は、ホモジナイズ工程なしに組織試料から解離する。
【００７０】
組織をホモジナイズし、および／または組織から細胞粒子を解離させることについての特定の実施形態が、本明細書において実施例に示されている。
【００７１】
組織試料のホモジナイズ
いくつかの実施形態において、腫瘍試料、リンパ節試料、および／または他の組織試料が、その試料を機械的剪断装置、例えば、ブレンダーまたは超音波処理装置へ入れることにより、ホモジナイズされる（工程２００）。ホモジナイズは、様々な範囲の組織断片を生じる。ホモジナイズ腫瘍試料またはリンパ節試料を調製する方法が、同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８６１号（２０１６年１１月１日出願）に開示されており、そのＰＣＴ出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００７２】
いくつかの実施形態において、ホモジナイズ試料は、本明細書に定義されているような代表試料である。したがって、腫瘍、リンパ節、および／または他の組織試料を解離させるための十分な機械的剪断後、最初の試料内で元々空間的に分別されていた腫瘍細胞の亜集団の全部が、新しくホモジナイズされた試料中に分布する。すなわち、腫瘍、１つもしくは複数のリンパ節、またはそれらの任意の組合せをホモジナイズした結果として、腫瘍内の細胞のいかなる不均一性も、生じたホモジネートまたはその一部分もしくは画分内に実質的に均一に（一様に）分布し、その結果、ホモジネート（またはその任意の画分）は、インプット分である腫瘍および／またはリンパ節試料の不均一性を実質的に均一に表す。腫瘍および／またはリンパ節をホモジナイズして、完全に腫瘍を代表する試料（またはホモジネート）を生成することにより、いくつかの実施形態において、腫瘍のランドスケープ（例えば、不均一性）を特徴づけることが可能であり、例えば、異なる腫瘍亜集団、すなわち、異なるゲノムプロファイルを有する腫瘍亜集団を含む、全体を通して含有される異なる細胞集団または核集団のそれぞれをシーケンシングすること（工程２３０）が可能であり得る。
【００７３】
腫瘍からの細胞、核、および／または小さい組織凝集物の解離
（工程２００からの）ホモジナイズ試料はさらに、解離および／または処理されて、解離した細胞粒子（例えば、解離した細胞または核）および／または小さい組織凝集物を得ることができる（工程２１０）。一般的に、酵素的解離、化学的解離、および機械的解離を含む組織解離のための３つの主な方法、またはその任意の組合せがある。解離のための方法の選択は、通常、組織の型および組織の起源に基づいてなされる。
【００７４】
酵素的解離は、酵素を用いて組織小片を消化し、それにより組織から細胞を放出する過程である。多くの異なる型の酵素がこの過程に用いられ得、当業者が認識しているように、ある特定の酵素がある特定の組織型に関してより効果的である。当業者はまた、任意の酵素的解離過程が、１つもしくは複数の酵素をお互いに組み合わせて、または１つもしくは複数の酵素を他の化学的および／もしくは機械的解離方法と組み合わせて用い得ることを認識しているであろう。適切な酵素の例には、コラゲナーゼ、トリプシン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、パパイン、ＤＮａｓｅ  Ｉ、中性プロテアーゼ、およびトリプシン阻害剤が挙げられるが、それらに限定されない。
【００７５】
コラゲナーゼは、細胞外マトリックスに見出されるタンパク質を消化するために用いられるタンパク質分解酵素である。酵素のプロテアーゼに特有なこととして、コラゲナーゼは、一般的には結合組織に見出される三重らせん状の天然コラーゲン原線維を攻撃および分解することができる。４つの基本的なコラゲナーゼ型、すなわち、１型（上皮、肝臓、肺、脂肪、および副腎の組織細胞標本に用いるのに適している）；２型（それの高いタンパク質分解活性を考慮すれば、心臓、骨、筋肉、甲状腺、および軟骨の腫瘍起源組織に用いるのに適している）；３型（それの低いタンパク質分解活性を考慮すれば、哺乳動物細胞に用いるのに適している）；４型（それのトリプシン活性を考慮すれば、受容体完全性が重要である島および他の研究プロトコールに適している）が存在する。
【００７６】
トリプシンは、アルギニンおよびリジンアミノ酸のカルボキシル基を含むペプチド結合に対する特異性を有する膵臓セリン（アミノ酸）プロテアーゼとして記載されている。それは、最も特異性が高いプロテアーゼの１つと見なされている。トリプシン単独は、通常、組織解離に効果的ではなく、それは、細胞外タンパク質への最小の選択性しか示さないからである。それは、通常、コラゲナーゼまたはエラスターゼなどの他の酵素と組み合わされる。
【００７７】
エラスターゼは、別の膵臓セリンプロテアーゼであり、中性アミノ酸に隣接するペプチド結合に対する特異性を有する。それは、天然エラスチンを加水分解するそれの能力の点で、プロテアーゼの中でも独特である。エラスターゼはまた、血液成分および細菌に見出すことができる。いくつかの実施形態において、それは、肺組織由来のＩＩ型細胞の単離に適している。
【００７８】
ヒアルロニダーゼは、ポリサッカリダーゼであり、この酵素は、典型的にはコラゲナーゼなどのより粗雑なプロテアーゼと組み合わされた時、組織の解離に用いられる場合が多い。それは、ほとんど全ての結合組織に見出される結合に対する親和性を有する。
【００７９】
パパインは、スルフヒドリルプロテアーゼであり、それは、幅広い特異性を有し、それゆえに、膵臓プロテアーゼ、すなわち、トリプシンまたはエラスターゼより徹底的に、たいていのタンパク質基質を分解することができる。パパインは、組織から神経細胞材料を単離するために用いられることが多い。
【００８０】
デオキシリボヌクレアーゼＩ（ＤＮａｓｅ  Ｉ）は、解離培地へ漏れる核酸を消化するための酵素的細胞単離手順に含まれることが多く、粘度および回収問題を増加させ得る。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、ＤＮａｓｅ  Ｉは無傷細胞を損傷しないであろうと考えられる。
【００８１】
Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌから入手できる）などの中性プロテアーゼは、穏やかなタンパク質分解活性をもつ細菌酵素であり、Ｄｉｓｐａｓｅ（登録商標）は、細胞膜完全性を維持するそれの能力のゆえに、一次および二次細胞培養物を単離するために有用である。上皮様細胞と比較して線維芽細胞様細胞をより効率的に解離することが見出されている。それは、ＥＤＴＡにより阻害される。
【００８２】
トリプシン阻害剤は、主としてダイズに由来し、それは、トリプシンを不活性化し、それゆえに、時々、特定の細胞単離プロトコールに用いられる。
【００８３】
化学的解離は、陽イオンが細胞内結合の維持および細胞内マトリックスに寄与するという事実を利用する。これらの陽イオンを結合するＥＤＴＡまたはＥＧＴＡを導入することにより、細胞間結合が破壊され、それにより、組織構造の解離を可能にする。
【００８４】
最後に、機械的解離は、組織を小片へ、切断し、掻爬し、またはひっかくことを必要とし、その後、細かく刻まれた組織は、細胞を組織から分離するために培地中で洗浄され、時には、細胞をほぐすのを助けるために穏やかな撹拌を用いられることもある。他の実施形態において、機械的解離は、本明細書でさらに記載されているような、試料をホモジナイズすることを含み得る。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ホモジナイズ試料または濾過されたホモジナイズ試料内の細胞は、溶解されて、細胞成分を放出する。例えば、細胞は、フレンチプレスもしくは類似した型の溶解装置、マイクロ流動化装置、粉砕、微粉砕、化学的もしくは酵素的溶解（上で記載されたものを含む）を用いて、および／または当該技術分野において知られた他の技術を用いて、溶解され得る。いくつかの実施形態において、膜の脂質およびタンパク質（ヒストンを含む）が、細胞成分を含有する試料から（例えば、界面活性剤または酵素（プロテアーゼ）を加えることにより）除去される。
【００８６】
ホモジナイズされた、代表的な、または解離した試料の個々の核へのさらなる処理は、細胞膜の除去を必要とする。新鮮な細胞についての現在の核単離の方法は、核を遊離させるのに酵素を必要とせず、ホルマリン固定試料からの核単離は、一般的な方法ではない。正常核と腫瘍核の区別を可能にするであろう細胞骨格マーカーを維持しながら、個々の核を効率的に単離するために、酵素（例えば、プロナーゼ、プロテイナーゼＫ、ペプシン、トリプシン、Ａｃｃｕｍａｘ、コラゲナーゼＨ）が、処理された核からＤＮＡを遊離させるであろう過度の損傷なしに核を曝露するために用いられ得る。ホモジネートまたは代表試料から核を単離する特定の方法は、同時係属中のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８６１号に開示されており、そのＰＣＴ出願の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【００８７】
分離された細胞粒子の選別
組織試料からの細胞粒子（例えば、細胞または核）および／もしくは小さい組織凝集物の分離（工程１００）、またはより具体的には、細胞粒子および／もしくは小さい組織凝集物のホモジナイズ（工程２００）および解離（工程２１０）の後、細胞粒子および／もしくは小さい組織凝集物は選別される（工程１１０または２２０）。いくつかの実施形態において、分離された細胞粒子および／または小さい組織凝集物の選別は、その細胞粒子および／または小さい組織凝集物を染色する必要性なしに起こる。
【００８８】
いくつかの実施形態において、細胞粒子および／または小さい組織凝集物は、その細胞粒子および／または小さい組織凝集物のサイズに基づいて２つ以上の集団に選別される。いくつかの実施形態において、細胞粒子および／または小さい組織凝集物は、それらの水力学的サイズに基づいて選別される。例えば、腫瘍細胞、核、および／または腫瘍組織凝集物は、一般的に、正常細胞、正常核、および正常組織凝集物、それぞれよりサイズが大きいと考えられる。そのようなものとして、選別デバイスは、腫瘍細胞または核と正常細胞または核の両方を含む不均一な試料を、下流処理または分析（工程２３０）の前に、少なくとも２つの別個の集団へ再現性よく分配する（工程２２０）ために用いられ得ると考えられる。
【００８９】
本出願人らは、解離した固定腫瘍組織が、２つの異なるサイズ分布の粒子へ再現性よく分配されることを発見している（本明細書における実施例参照）。実際、試料を蛍光腫瘍マーカーについて染色し、「腫瘍」集団および「正常」集団をＦＡＣＳ選別することにより、本出願人らは、腫瘍材料と正常材料（細胞と核の両方）の間の有意かつ再現性のあるサイズ差が存在することを発見した。本出願人らは、より小さい画分における細胞粒子が、腫瘍マーカーが陰性であり、二倍体ＤＮＡを含有し、一方、より大きい画分における細胞粒子は、腫瘍マーカーが陽性であり、（それらが腫瘍細胞である可能性が高いことを確信させる）サイクリング細胞または異数体細胞を示す、より高いＤＮＡ含有量を有することを示している。（本明細書の実施例参照）。
【００９０】
いくつかの実施形態において、正常細胞は、当然のことながら、細胞の型またはその細胞が由来した組織の型、およびその細胞が由来した組織が貯蔵されていた、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋されていたかどうかに依存して、約４μｍから約１２μｍまでの範囲のサイズを有すると考えられる。いくつかの実施形態において、ホルマリン固定組織から単離された正常細胞は、約５μｍから約１２μｍまでの範囲であるサイズを有する。さらに他の実施形態において、固定組織からの正常細胞は、１２μｍ未満であるサイズを有する。
【００９１】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、当然のことながら、細胞の型またはその細胞が由来した組織の型、およびその細胞が由来した組織が貯蔵されていた、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋されていたかどうかに依存して、約９μｍから約１００μｍまでの範囲のサイズを有すると考えられる。いくつかの実施形態において、固定組織から単離された腫瘍細胞は、約９μｍから約２０μｍまでの範囲であるサイズを有する。他の実施形態において、固定組織から単離された腫瘍細胞は、約９μｍから約５０μｍまでの範囲であるサイズを有する。他の実施形態において、固定組織から単離された腫瘍細胞は、約１２μｍから約２５μｍまでの範囲であるサイズを有する。さらに他の実施形態において、固定組織から単離された腫瘍細胞は、１２μｍより大きいサイズを有する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約３０％大きい平均サイズを有し得る。他の実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約３５％大きい平均サイズを有し得る。さらに他の実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約４０％大きい平均サイズを有し得る。さらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約４５％大きい平均サイズを有し得る。なおさらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約５０％大きい平均サイズを有し得る。さらにさらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約５５％大きい平均サイズを有し得る。さらにさらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約７０％大きい平均サイズを有し得る。さらにさらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約９０％大きい平均サイズを有し得る。さらにさらなる実施形態において、腫瘍細胞は、対応する正常細胞より少なくとも約１００％大きい平均サイズを有し得る。
【００９３】
新鮮な固形腫瘍組織から単離された腫瘍細胞および正常細胞は、固定組織と同様に、異なる相対的サイズを有すると考えられる。新鮮に解離した組織は、身体から取り出され、所定の時間内に単一細胞へ処理されている組織、例えば、ホルマリン中に置かれることなく、いかなる固定過程にも先立って、２４時間以内、１８時間以内、１２時間以内、または６時間以内に処理されており、結果として、大部分、無傷の生細胞を生じている、組織を指す。解離後、新鮮な組織に由来する細胞は、分析前に、培養されるか、または簡単に固定される（典型的には、約３％パラホルムアルデヒド中）かのいずれかであり得る。新鮮な組織の解離は、典型的には（本明細書に開示されたような）機械的工程と酵素的工程の両方を含む、いくつかの前に記載されたプロトコールまたは市販のキットを用いて達成することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態において、固定組織から単離された正常核は、当然のことながら、細胞の型またはその核が由来した組織の型、およびその核が由来した組織が貯蔵されていた、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋されていたかどうかに依存して、約４．５μｍから約９μｍまでの範囲のサイズを有すると考えられる。他の実施形態において、正常核は、約５μｍから約８．５μｍまでの範囲であるサイズを有する。さらに他の実施形態において、正常細胞は、約８．５μｍ未満であるサイズを有する。新鮮な組織から単離された正常核は、固定組織から単離された核と類似した、またはそれよりわずかに大きいサイズ範囲を有し得ることは予想される。
【００９５】
固定組織から単離された腫瘍核は、当然のことながら、細胞の型またはその核が由来した組織の型、およびその核が由来した組織が貯蔵されていた、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋されていたかどうかに依存して、約７．５μｍから約２０μｍまでの範囲のサイズを有すると考えられる。他の実施形態において、腫瘍核は、約８．５μｍから約２０μｍまでの範囲であるサイズを有する。他の実施形態において、腫瘍核は、約９μｍから約１８μｍまでの範囲であるサイズを有する。他の実施形態において、腫瘍核は、約９．５μｍから約１５μｍまでの範囲であるサイズを有する。さらに他の実施形態において、腫瘍細胞は、８．５μｍより大きいサイズを有する。
【００９６】
いくつかの実施形態において、解離は、より容易に解離するシングレット正常細胞（例えば、免疫細胞）を生じ得、それほど容易には解離しない腫瘍細胞の凝集物を生成し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍細胞凝集物は、サイズによってシングレット正常細胞から区別され得る。いくつかの実施形態において、解離した固定正常細胞は、サイズが約４μｍから約８．５μｍまでの範囲である。腫瘍細胞凝集物は、組織の性質および用いられた解離方法に依存して、約２個から１００個を超える細胞からなり得る。腫瘍細胞凝集物は、集合的に、約２０μｍより大きく、約５０μｍより大きく、約１００μｍより大きく、約３００μｍより大きく、または約５００μｍより大きい細胞群で構成され得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、第１のサイズ範囲を有する細胞粒子（例えば、細胞または細胞核）は、第１の集団に選別され、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子（例えば、細胞または細胞核）は、第２の集団に選別され、第１の集団が、多くても３０％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても２５％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても２０％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても１５％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても１０％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても７．５％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても５％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても２．５％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、多くても１％の、第２のサイズ範囲を有する細胞粒子を含む。
【００９８】
選別デバイス
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、最初に細胞または核を染色することなく、またはそれらをいかなる作用物質（例えば、磁気粒子など）でも標識することなく、第１のサイズを有する細胞または核を第１の方向に方向づけ、第２のサイズを有する細胞または核を第２の方向に方向づける機器または装置である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、選別デバイスはマイクロ流体デバイスである。マイクロ流体工学は、サイズによる細胞および／または核の選別が達成され得る一つの技術である。したがって、いくつかの実施形態において、選別は、マイクロ流体工学に基づいた技術を用いて達成される。いくつかの実施形態において、選別は、使い捨てのマイクロ流体デバイスなどのマイクロ流体デバイスを用いて達成される。マイクロ流体技術の非限定的例が本明細書に記載されている。本方法の一部として実行され得るマイクロ流体技術の追加の例は、以下の参考文献に開示されており、その参考文献のそれぞれは、全体として参照により本明細書に組み入れられている：（ｉ）Ｃ．Ｗｙａｔｔ  Ｓｈｉｅｌｄｓ  ＩＶ、Ｄｒ．Ｃａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｄ．Ｒｅｙｅｓ、およびＰｒｏｆ．Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｐ．Ｌｏｐｅｚ、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ  ｔｏ  Ｒａｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．２０１５年２月１６日；１５（５）：１２３０〜１２４９；ならびに（ｉｉ）Ｐ．ＳａｊｅｅｓｈおよびＡｓｈｉｓ  Ｋｕｍａｒ  Ｓｅｎ、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  Ｄｅｖｉｃｅｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄ（２０１４）１７：１〜５２。
【０１００】
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、ギャップのネットワークのアレイを使用するデバイスであり、ギャップを通過する流体が、不均等に次のギャップへ分けられる。「ギャップ」とは、流体または粒子が流れることができる隙間を意味する。例えば、ギャップは、流体が流れることができる、２つの障害物の間の空間であり得、またはその他が疎水性の表面上の親水性パターン（そこで水性流体が拘束される）であり得る。アレイは、ギャップの寸法が同一であったとしても、ギャップを通過する流体が、不均等に分けられるように配置されたギャップのネットワークを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ギャップのアレイを通して分離されるように、細胞を運ぶフローを利用する。いくつかの実施形態において、フローは、アレイの見通し線に対して小角度（フロー角度）に調整される。いくつかの実施形態において、臨界サイズより大きい水力学的サイズを有する細胞または核は、アレイの中を、見通し線に沿って、すなわち、横方向に、移動し、一方、臨界サイズより小さい水力学的サイズを有するものは、平均フロー方向をたどる。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、デバイスにおけるフローは、層流条件下で起こると考えられる。本開示のデバイスは、任意で、連続フローデバイスとして形成される。いくつかの実施形態において、臨界サイズは少なくとも８．５μｍである。他の実施形態において、臨界サイズは少なくとも９μｍである。さらに他の実施形態において、臨界サイズは少なくとも１０μｍである。さらなる実施形態において、臨界サイズは少なくとも１２μｍである。当然のことながら、臨界サイズは、細胞の異なる型、異なる起源由来の細胞、および固定化に対立するものとして新鮮である細胞に適応させるように改変され得ることを、当業者は認識しているであろう。臨界サイズが、収集される集団の純度または収量を向上させるように増加または減少され得ることもまた当業者は認識しているであろう。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、選別デバイスによる細胞の分離は、非標的細胞と比較して、少なくとも１個の標的細胞の示差的なローリング特性に基づき得る。ある特定の実施形態において、標的細胞は、３次元構造上にコーティングされた細胞接着実体により認識される共通の特性を共有する細胞である。一般的に、標的細胞は、細胞ローリングによりバルクフローの方向から逸れ、一方、細胞接着実体により認識されない非標的細胞は、ローリングせず、バルクフローの方向から逸れない。本開示は、一般的に、逸れた細胞を「標的細胞」と呼ぶが、これが恣意的な命名であること、およびある特定の実施形態において、細胞の分離は、真の「標的細胞」が実際、逸れていない細胞であるネガティブ選択様式で実施され得ることは、認識されているであろう。
【０１０２】
複数の選別デバイスが直列で用いられ得、例えば、細胞が、どちらも決定論的横変位を使用する第１のデバイスと第２のデバイスを通過し得、または細胞は、決定論的横変位を利用する第１のデバイスおよび異なるマイクロ流体技術を使用する第２のデバイスを通過し得ることを、当業者は認識しているであろう。いくつかの実施形態において、第１の選別デバイスは、インプット材料を第１および第２の集団に選別し、第２の選別デバイスはその選別をさらに精密にし、例えば、第１の集団を第１および第２の亜集団に選別する。いくつかの実施形態において、選別デバイスは、二次的濃縮技術と連結され得、その二次的濃縮技術は、任意で、分離された細胞または核の染色または標識を必要とする（例えば、フローサイトメトリー、磁気分離）。
【０１０３】
決定論的横変位
決定論的横変位（ＤＬＤ）は、障害物の周りの層流の非対称分岐を利用する連続分離の立体的方法である（図１１参照）。例えば、粒子サイズより大きいギャップを有する障害物のアレイを通って移動する粒子（本明細書では、細胞または核）は、それらのサイズおよび変形能に基づいて決定論的にそれらの経路を選択する。所定のサイズおよび変形能の粒子が、同等の移動経路をたどり、効率的な分離方法をもたらす。
【０１０４】
一般的に、分離のための臨界直径は、Ｄｃ＝２ηｄε（式中、ηは、単位のないパラメータであり、ｄは隣接障害物の縁の間の距離であり、εは列シフト率である）により記載される（例えば、Ｈｕａｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４、３０４（５６７３）、９８７〜９９０参照）。εはε＝Δｄ／Ｗ（式中、Ｗは、同じ列における２個の隣接した障害物の中心から中心までの距離であり、Δｄは、連続する列における２個の隣接した障害物の間の横方向シフトである）として定義される。Ｄｃより大きい粒子（例えば、細胞）は、障害物に対して繰り返し、衝突することにより、バルクフローの方向に対してある角度で移動するように強制される。繰り返し衝突は、細胞と、細胞接着実体でコーティングされている障害物の表面との間の相互作用を促進するために、本開示の関連において有利に用いることができる。
【０１０５】
アレイにおける障害物は、典型的には、選別チャネルの内側表面（例えば、下部表面、上部表面、側壁、またはそれらの組合せ）からの突起物である。ある特定の実施形態において、突起物は、選別チャネルの下部表面と上部表面の間の距離に渡る。障害物は、任意の形、例えば、非限定的に、正方形、長方形、三角形、台形、六角形、涙滴形、多角形、楕円形、円形、円弧形、波形、および／またはそれらの組合せを有し得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、デバイスは、平均直径Ｄを有する細胞と共に用いるために設計され、臨界直径Ｄｃは、Ｄ未満であるように設計される。いくつかの実施形態において、選別チャネルは、約７μｍ未満、約７．５μｍ未満、約８μｍ未満、約８．５μｍ未満、約９μｍ未満、約１０μｍ未満、または約１２μｍである臨界直径Ｄｃを有し得る。いくつかの実施形態において、選別チャネルは、約７μｍより大きく、約７．５μｍより大きく、約８μｍより大きく、約８．５μｍより大きく、約９μｍより大きく、約１０μｍより大きく、または約１２μｍより大きい臨界直径Ｄｃを有し得る。ある特定の実施形態において、選別チャネルは、これらの値の任意の２つの間である範囲内に臨界直径Ｄｃを有し得る。例えば、ある特定の実施形態において、選別チャネルは、約６μｍ〜約８．５μｍ、例えば、約７μｍ〜約９μｍ、約９μｍ〜約１２μｍなどの範囲内に臨界直径Ｄｃを有し得る。臨界直径が、収集される集団の純度または収量を向上させるように増加または減少され得ることを当業者は認識しているであろう。
【０１０７】
水力学的フォーカス
いくつかの実施形態において、選別チャネルは、細胞を分離するために水力学的フォーカスを利用する。一般的に、水力学的フォーカスに頼る選別チャネルは、狭窄領域および拡大領域を含む。水力学的フォーカスは、試料フローをシースフローで覆うことによって縦方向に沿って一列に並べるように細胞をフォーカスすることにより機能する。本開示のある特定の実施形態において、（細胞ローリングがない場合の）拡大領域における細胞の位置は、Ｗｐ＝｛Ｗ２／Ｗ１）ｄ（式中、ｄは細胞の直径であり、Ｗ１は狭窄領域の幅であり、Ｗ２は拡大領域の幅である）により決定され得る。典型的には、シースフローは、細胞を狭窄領域の側壁と接触するように強制し、本開示の関連において、これは、細胞と、細胞接着実体でコーティングされている側壁の表面との間の相互作用を促進するために用いることができる。図１３に示されているように、コーティングの存在は、そうでなければ、拡大領域の位置Ｗｐに到達するであろう細胞を、拡大領域の側壁に沿ってローリングして、拡大領域における異なる位置から出て行かせることができる。特定の寸法Ｗ１およびＷ２、ならびにシースフローおよび試料フローのフロー速度が、選別されることになっている細胞の性質およびコーティングの性質に依存して調整され得ることは認識されているであろう。
【０１０８】
音響泳動
標識を含まない音響流体システムは、一般的に、細胞を、それらのサイズの差に基づいて選別する。この細胞選別方法は、デバイスの作動での節への細胞の迅速な転置について、波節から離れた流線における細胞の最初の位置に頼り、それにより、異なるサイズまたは音響学的性質の細胞を分離する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、水力学的力は、細胞または核を音響流体デバイスの側壁へ方向づけるために用いられ、それにより、それらは、それらの体積に比例した速度で音響定常波の節へ移動する。より大きい細胞が、音響定常波において、より大きい力を受け、それゆえに、放射力より速く応答し、したがって、より大きい細胞を中央出口（例えば、節）へ、より小さい細胞を側面出口へ方向づける。音響泳動方法はさらに、少なくとも、（ｉ）Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  Ｆ、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ａ、Ｈｏｌｍ  Ｃ、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｈ、Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔ．  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ．  ２００４；１２９：９３８〜９４３．［ＰｕｂＭｅｄ：１５４５７３２７］；（ｉｉ）Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  Ｆ、Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ａ、Ｈｏｌｍ  Ｃ、Ｊｏｎｓｓｏｎ  Ｈ、Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００５；５：２０〜２２．［ＰｕｂＭｅｄ：１５６１６７３５］；（ｉｉｉ）Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ  Ｆ、Ａｂｅｒｇ  Ｌ、Ｓｗａｒｄ−Ｎｉｌｓｓｏｎ  ＡＭ、Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００７；７９：５１１７〜５１２３．［ＰｕｂＭｅｄ：１７５６９５０１］；（ｉｖ）Ｄｙｋｅｓ  Ｊ、Ｌｅｎｓｈｏｆ  Ａ、Ａｓｔｒａｎｄ−Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ  Ｉ、Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔ、Ｓｃｈｅｄｉｎｇ  Ｓ．  ＰｌｏＳ  ｏｎｅ．  ２０１１；  ６：ｅ２３０７４．［ＰｕｂＭｅｄ：２１８５７９９６］；（ｖ）Ａｕｇｕｓｔｓｓｏｎ  Ｐ、Ｍａｇｎｕｓｓｏｎ  Ｃ、Ｎｏｒｄｉｎ  Ｍ、Ｌｉｌｊａ  Ｈ、Ｌａｕｒｅｌｌ  Ｔ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２０１２；８４：７９５４〜７９６２．［ＰｕｂＭｅｄ：２２８９７６７０］；（ｖｉ）Ｙａｎｇ  ＡＨ、Ｓｏｈ  ＨＴ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１２；  ８４：１０７５６〜１０７６２．［ＰｕｂＭｅｄ：２３１５７４７８］；および（ｖｉｉ）Ｆｏｎｇ  ＥＪ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＡＣ、Ｎｏｔｔｏｎ  Ｔ、Ｊｕｎｇ  ＳＹ、Ｒｏｓｅ  ＫＡ、Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ＬＳ、Ｓｈｕｓｔｅｆｆ  Ｍ．  Ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｔ．  ２０１４；  １３９：１１９２〜１２００．［ＰｕｂＭｅｄ：２４４４８９２５］により記載されており、それらの開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１１０】
曲線チャネルにおける慣性集束
慣性力は、層流ストリームにおける流線を横切る細胞または粒子の誘導された移動を生じ得る。典型的には、慣性力は、マイクロ流体チャネルの壁に隣接した流体フローの境界効果から発し、揚力を引き起こす。曲線チャネルにおける慣性集束は、細胞分画のための明確な現象論的技術の一部を指し、その技術は、細胞順序付けおよび選別のための蛇行またはアルキメデスらせんパターンの使用を含む。
【０１１１】
曲線チャネルにおける慣性集束を実行するためのデバイスおよび技術はさらに、少なくとも以下の参考文献に記載されており、その参考文献の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている：（ｉ）Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｅｄｄ  ＪＦ、Ｉｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＲＧ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００８；８０：２２０４〜２２１１．［ＰｕｂＭｅｄ：１８２７５２２２］；（ｉｉ）Ｏａｋｅｙ  Ｊ、Ａｐｐｌｅｇａｔｅ  ＲＷ  Ｊｒ、Ａｒｅｌｌａｎｏ  Ｅ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｇｒａｖｅｓ  ＳＷ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１０；８２：３８６２〜３８６７．［ＰｕｂＭｅｄ：２０３７３７５５］；（ｉｉｉ）Ｒｕｓｓｏｍ  Ａ、Ｇｕｐｔａ  ＡＫ、Ｎａｇｒａｔｈ  Ｓ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｅｄｄ  ＪＦ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ｎｅｗ  Ｊ  Ｐｈｙｓ．  ２００９；１１：７５０２５；（ｉｖ）Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ  ＳＳ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡ、Ｋｕｍａｒ  Ｇ、Ｐａｐａｕｔｓｋｙ  Ｉ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００９；９：２９７３〜２９８０．［ＰｕｂＭｅｄ：１９７８９７５２］；（ｖ）Ｈｏｕ  ＨＷ、Ｗａｒｋｉａｎｉ  ＭＥ、Ｋｈｏｏ  ＢＬ、Ｌｉ  ＺＲ、Ｓｏｏ  ＲＡ、Ｔａｎ  ＤＳ−Ｗ、Ｌｉｍ  Ｗ−Ｔ、Ｈａｎ  Ｊ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡＳ、Ｌｉｍ  ＣＴ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１３；３：１〜８；（ｖｉ）Ｎｉｖｅｄｉｔａ  Ｎ、Ｐａｐａｕｔｓｋｙ  Ｉ．  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．  ２０１３；７：５４１０１．［ＰｕｂＭｅｄ：２４４０４０６４］；および（ｖ）Ｇｕａｎ  Ｇ、Ｗｕ  Ｌ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡ、Ｌｉ  Ｚ、Ｃｈｅｎ  ＰＣ、Ｃｈａｏ  Ｓ、Ｏｎｇ  ＣＪ、Ｈａｎ  Ｊ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１３；３：１４７５．［ＰｕｂＭｅｄ：２３５０２５２９］。
【０１１２】
ピンチドフローおよび水力学的スプレッディング
（上記で言及された）曲線チャネルに加えて、慣性力は、直線チャネルにおいて重要な役割を果たし得る。ピンチドフロー分画および水力学的スプレッディングは、慣性力が次の選別のための細胞の順序付けにおいて役割を果たしている２つの例である。ピンチドフロー分画は、細胞のフローストリームが、狭いチャネル横断面により狭められて、その結果、細胞が、圧迫されて、側壁に対して一列整列し、その後、チャネルが層流プロファイルによって広がったならば、サイズにより分離する時に起こる（図１０参照）。この一列整列効果は、典型的には、シース流体により増強され、そのシース流体は、細胞を壁に押しつけ、その結果、より大きい細胞の中心は、より小さい細胞の中心より壁表面から遠くにあり、したがって、チャネルの広がりにより、異なるサイズの細胞にわずかに異なるフロー軌道を与える。この選別のための方法は、より良い水力学的コントロールのための複数の非対称出口の追加により、加えて、異なるサイズおよび質量の細胞集団間の分離の重力による増強のためのマイクロ流体デバイスの空間的な再配向により、拡張されている。
【０１１３】
ピンチドフローおよび水力学的スプレッディングを実行するためのデバイスおよび技術はさらに、少なくとも以下に記載されており、その参考文献の開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている：（ｉ）Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００９；９：３０３８〜３０４６．［ＰｕｂＭｅｄ：１９８２３７１６］；（ｉｉ）Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｉｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＲＧ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  ２００７；１０４：１８８９２〜１８８９７．［ＰｕｂＭｅｄ：１８０２５４７７］；（ｉｉｉ）Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｅｄｄ  ＪＦ、Ｉｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｔｏｍｐｋｉｎｓ  ＲＧ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００８；８０：２２０４〜２２１１．［ＰｕｂＭｅｄ：１８２７５２２２］；（ｉｖ）Ｏａｋｅｙ  Ｊ、Ａｐｐｌｅｇａｔｅ  ＲＷ  Ｊｒ、Ａｒｅｌｌａｎｏ  Ｅ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｇｒａｖｅｓ  ＳＷ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１０；８２：３８６２〜３８６７．［ＰｕｂＭｅｄ：２０３７３７５５］；（ｖ）Ｒｕｓｓｏｍ  Ａ、Ｇｕｐｔａ  ＡＫ、Ｎａｇｒａｔｈ  Ｓ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｅｄｄ  ＪＦ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ｎｅｗ  Ｊ  Ｐｈｙｓ．  ２００９；１１：７５０２５；（ｖｉ）Ｋｕｎｔａｅｇｏｗｄａｎａｈａｌｌｉ  ＳＳ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡ、Ｋｕｍａｒ  Ｇ、Ｐａｐａｕｔｓｋｙ  Ｉ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００９；９：２９７３〜２９８０．［ＰｕｂＭｅｄ：１９７８９７５２］；（ｖｉｉ）Ｈｏｕ  ＨＷ、Ｗａｒｋｉａｎｉ  ＭＥ、Ｋｈｏｏ  ＢＬ、Ｌｉ  ＺＲ、Ｓｏｏ  ＲＡ、Ｔａｎ  ＤＳ−Ｗ、Ｌｉｍ  Ｗ−Ｔ、Ｈａｎ  Ｊ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡＳ、Ｌｉｍ  ＣＴ．  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．  ２０１３；３：１〜８；（ｖｉｉｉ）Ｎｉｖｅｄｉｔａ  Ｎ、Ｐａｐａｕｔｓｋｙ  Ｉ．  Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ．  ２０１３；７：５４１０１．［ＰｕｂＭｅｄ：２４４０４０６４］；（ｉｘ）Ｇｕａｎ  Ｇ、Ｗｕ  Ｌ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡ、Ｌｉ  Ｚ、Ｃｈｅｎ  ＰＣ、Ｃｈａｏ  Ｓ、Ｏｎｇ  ＣＪ、Ｈａｎ  Ｊ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．  ２０１３；３：１４７５．［ＰｕｂＭｅｄ：２３５０２５２９］；（ｘ）Ｗａｒｋｉａｎｉ  ＭＥ、Ｇｕａｎ  Ｇ、Ｌｕａｎ  ＫＢ、Ｌｅｅ  ＷＣ、Ｂｈａｇａｔ  ＡＡ、Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ＰＫ、Ｔａｎ  ＤＳ、Ｌｉｍ  ＷＴ、Ｌｅｅ  ＳＣ、Ｃｈｅｎ  ＰＣ、Ｌｉｍ  ＣＴ、Ｈａｎ  Ｊ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２０１４；１４：１２８〜１３７．［ＰｕｂＭｅｄ：２３９４９７９４］；（ｘｉ）Ｐａｒｉｃｈｅｈｒｅｈ  Ｖ、Ｍｅｄｅｐａｌｌａｉ  Ｋ、Ｂａｂｂａｒｗａｌ  Ｋ、Ｓｅｔｈｕ  Ｐ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２０１３；１３：８９２〜９００．［ＰｕｂＭｅｄ：２３３０７１７２］；および（ｘｉｉ）Ｙａｍａｄａ  Ｍ、Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｍ、Ｓｅｋｉ  Ｍ．  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２００４；７６：５４６５〜５４７１．［ＰｕｂＭｅｄ：１５３６２９０８］。
【０１１４】
流体泳動的濾過
隆起誘導性流体泳動的濾過は、フロー交代性マイクロパターンによるマイクロ流体チャネル内の側圧勾配の形成に頼る。マイクロチャネルの床および天井上の傾斜した障害物の連続アレイは、チャネルの幅に渡る圧力勾配を誘導して、細胞を、型に従って、発生した局所的圧力場内の正確な位置へフォーカスし、その後、それらの細胞を分離する。流体泳動的濾過のためのデバイスおよび技術はさらに、少なくとも以下の参考文献に記載されており、その参考文献の開示は全体として参照により本明細書に組み入れられている：（ｉ）Ｃｈｏｉ  Ｓ、Ｓｏｎｇ  Ｓ、Ｃｈｏｉ  Ｃ、Ｐａｒｋ  ＪＫ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００７；７：１５３２〜１５３８．［ＰｕｂＭｅｄ：１７９６０２８２］；（ｉｉ）Ｈｓｕ  ＣＨ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ、Ｃｈｅｎ  Ｃ、Ｉｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２００８；８：２１２８〜２１３４．［ＰｕｂＭｅｄ：１９０２３４７６］；（ｉｉｉ）Ｓｔｏｔｔ  ＳＬ、Ｈｓｕ  ＣＨ、Ｔｓｕｋｒｏｖ  ＤＩ、Ｙｕ  Ｍ、Ｍｉｙａｍｏｔｏ  ＤＴ、Ｗａｌｔｍａｎ  ＢＡ、Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ  ＳＭ、Ｓｈａｈ  ＡＭ、Ｓｍａｓ  ＭＥ、Ｋｏｒｉｒ  ＧＫ、Ｆｌｏｙｄ  ＦＰ  Ｊｒ、Ｇｉｌｍａｎ  ＡＪ、Ｌｏｒｄ  ＪＢ、Ｗｉｎｏｋｕｒ  Ｄ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｓ、Ｉｒｉｍｉａ  Ｄ、Ｎａｇｒａｔｈ  Ｓ、Ｓｅｑｕｉｓｔ  ＬＶ、Ｌｅｅ  ＲＪ、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ  ＫＪ、Ｍａｈｅｓｗａｒａｎ  Ｓ、Ｈａｂｅｒ  ＤＡ、Ｔｏｎｅｒ  Ｍ．  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．  ２０１０；１０７：１８３９２〜１８３９７．［ＰｕｂＭｅｄ：２０９３０１１９］；（ｉｖ）Ｓｏｌｌｉｅｒ  Ｅ、Ｇｏ  ＤＥ、Ｃｈｅ  Ｊ、Ｇｏｓｓｅｔｔ  ＤＲ、Ｏ’Ｂｙｒｎｅ  Ｓ、Ｗｅａｖｅｒ  ＷＭ、Ｋｕｍｍｅｒ  Ｎ、Ｒｅｔｔｉｇ  Ｍ、Ｇｏｌｄｍａｎ  Ｊ、Ｎｉｃｋｏｌｓ  Ｎ、ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ  Ｓ、Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ＲＰ、Ｄｉ  Ｃａｒｌｏ  Ｄ．  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．  ２０１４；１４：６３〜７７．［ＰｕｂＭｅｄ：２４０６１４１１］；および（ｖ）Ｈｙｕｎ  ＫＡ、Ｋｗｏｎ  Ｋ、Ｈａｎ  Ｈ、Ｋｉｍ  ＳＩ、Ｊｕｎｇ  ＨＩ．  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ．  ２０１３；４０：２０６〜２１２．［ＰｕｂＭｅｄ：２２８５７９９５］。
【０１１５】
サイズ排除濾過
細胞を選別するために均等に間隔を置いたポストのサイズおよびパターンを操作する代わりに、サイズ排除濾過は、細胞を選別するための距離の非バイナリー形式での関数として段階的（すなわち、徐々に減少していく）間隔でのポストの使用を指す。サイズ排除フィルターは、サイズおよび形により細胞を選択的にグループ化するピラーの一連の直線アレイからなる。
【０１１６】
クロスフロー濾過
細胞含有流体の濾過は、細胞集団を分画するために用いられる最も初期の方法の１つである。これらのフィルターの例には、大細胞を捕捉するための大きなバリアを含有する堰フィルター、大細胞を捕捉するための１列の同じサイズのマイクロポストを含有するピラーフィルター、および大細胞を捕捉するための床または天井上の細孔のアレイを含有する膜フィルターが挙げられる。
【０１１７】
時々、タンジェントフロー濾過と呼ばれるクロスフロー濾過は、細胞集団をサイズにより分画するためのフローの方向に整列した側面スリットのアレイを用いる。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、この濾過方法は、堰、ピラー、および膜などの初期の型のフィルターより大きな進歩であると考えられ、デッドエンドフィルターというより篩のようにふるまうため、目詰まりの可能性が減少しているからである。
【０１１８】
水力学的濾過
水力学的濾過において、細胞は、複数の分岐した出口により分離され、それにより、出口から排出される流体は、細胞を、それらのサイズに従って増加減少する速度で主チャネルの壁から引き寄せる（図１２参照）。より小さい細胞は、近位の出口から出て行き、それらの中心が、マイクロ流体チャネルの壁により近いからであり、それらのコントロールされた、より大きい細胞からの分路を可能にする。
【０１１９】
図１３Ａに示されているように、水力学的濾過に頼る選別チャネルは、主チャネルおよび複数の側面チャネルを含み得る。図１３Ｂに示されているように、主チャネルと側面チャネルの間の分岐点において、フロー速度比が、細胞（または核）が主チャネルを流れ続けるか、または側面チャネルへ出て行くかを決定する。一般的に、細胞ローリングがない場合、ある特定の幅より大きい細胞は、側壁に対して繰り返し一列整列させることにより、側面チャネルではなく、主チャネルを流れるように強制される。本開示の関連において、そのような繰り返しの一列整列は、細胞と、細胞接着実体でコーティングされているチャネル壁の表面との間の相互作用を促進するために用いることができる。有利なことには、通常主チャネルを下り続けるであろう細胞（または核）は、図１３Ａに示されているように、側面チャネルへローリングさせられ得る。ある特定の実施形態において、したがって、主チャネルの側壁は、標的細胞が側壁上に繋留して、ローリングすることができるように、細胞接着実体でコーティングされる。
【０１２０】
ボルテックス選別デバイス
いくつかの実施形態において、選別デバイスは、Ｖｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手できるＶｏｒｔｅｘ  ＨＥデバイスである。いくつかの実施形態において、Ｖｏｒｔｅｘ  ＨＥデバイスは、複数の拡大領域が続く、粒子フォーカスのために用いられる高アスペクト比マイクロ流体チャネルを用いる、マイクロ流体デバイスである（図１４参照）。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、狭いフォーカスチャネルに続く拡大領域への粒子（または細胞）の流入は、ずり勾配揚力により起こると考えられる。揚力は、粒子を壁から離すように押す壁揚力と、粒子の周りの流体速度プロファイルにより決定される横方向ずり勾配揚力との間のバランスである。小さい粒子（または細胞）は、十分なずり勾配揚力を受けず、チャネルの中央へフォーカスし、拡大領域へ入らない。上流フォーカスチャネルの断面積を減少させることにより揚力を増加させることは、より小さい粒子（または細胞）が主流を横切って移動し、拡大領域に入ることを可能にする（例えば、拡大領域における捕捉された細胞）。Ｖｏｒｔｅｘ  ＨＥデバイスはさらに、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３８２３０に記載されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。ボルテックス分離方法はまた、Ｍａｎｊｉｍａ  Ｄｈａｒら、「Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｖｏｒｔｅｘ  Ｔｒａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ」、Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  ９、０６４１１６（２０１５）に開示されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１２１】
追加の選別デバイス
分離された試料はまた、通常の濾過（例えば、細胞ストレーナーまたは篩を用いること）、タンジェント濾過、カラムに基づいた濾過、および遠心分離（密度勾配遠心分離）を含む他のデバイスまたは機器により選別され得る。
【０１２２】
マイクロ流体デバイス製造
一般的に、当業者に知られたリソグラフィー技術または他の技術が、マイクロ流体デバイスとして用いるのに実際に、任意の材料をパターン形成するために用いられ得る。適切なデバイスを調製するための例示的な方法は、米国第６，１９７，５７５号、米国特許公開第２０１０／０１１２０２６号、および米国特許公開第２０１０／０３０４４８５号に開示されており、それらの全内容は、参照により本明細書に組み入れられている。様々な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ガラス、二酸化珪素、またはフルオロポリマーから、全部または一部において製作され得る。ある特定の実施形態において、チャネルの壁は、親水性、タンパク質親和性、細胞親和性、またはこれらの任意の組合せを改変するための材料で処理され得る。例示的な処理材料には、ポリエチレングリコール類（例えば、ポリ（３−トリメトキシリル）−プロピルメタクリレート−ｒ−ポリ（エチレングリコール）メチルエーテル、またはＴＭＳＭＡ−ｒ−ＰＥＧＭＡ）、自己組織化単分子膜を形成するオルガノシラン、エタノールなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１２３】
さらなる分析
いくつかの実施形態において、細胞、核、および／または小さい組織凝集物の選別または濃縮された集団はさらに分析される（工程１２０、２３０、３３０、４３０、および４４０）。いくつかの実施形態において、選別デバイスは、検出器、顕微鏡、細胞カウンター（例えば、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンター）、質量分析計、ＦＡＣＳ、ＰＣＲデバイス、ＲＴ−ＰＣＲデバイス、ゲノムシーケンサー、画像化システムなどと流体連絡し得る。代替として、および他の実施形態において、選別デバイスは、後の分析のために貯蔵される細胞、核、または小さい組織凝集物のいくつかの集団を提供し得る。
【０１２４】
シーケンシング
いくつかの実施形態において、選別された細胞または核の集団（工程３２０または４２０）の少なくとも１つは、シーケンシングされる（工程３３０または４４０）。シーケンシングのための細胞および／または選別された核を調製する方法は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６０８３５に開示されており、その開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１２５】
シーケンシング（工程３３０または４４０）は、当業者に知られた任意の方法に従って実施され得る。いくつかの実施形態において、シーケンシング方法には、サンガーシーケンシングおよびダイターミネーターシーケンシング、加えて、次世代シーケンシングテクノロジー、例えば、パイロシーケンシング、ナノポアシーケンシング、マイクロポアに基づいたシーケンシング、ナノボールシーケンシング、ＭＰＳＳ、ＳＯＬｉＤ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｓｔａｒｌｉｔｅ、ＳＭＲＴ、ｔＳＭＳ、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、質量分析シーケンシング、ポリメラーゼシーケンシング、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）シーケンシング、顕微鏡法に基づいたシーケンシング、マイクロ流体サンガーシーケンシング、顕微鏡法に基づいたシーケンシング、ＲＮＡＰシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、およびインビトロウイルスシーケンシングが挙げられる。ＷＯ２０１４１４４４７８、ＷＯ２０１５０５８０９３、ＷＯ２０１４１０６０７６、およびＷＯ２０１３０６８５２８を参照されたい（それぞれ、全体として参照により本明細書に組み入れられている）。
【０１２６】
いくつかの実施形態において、シーケンシング（工程３３０または４４０）は、合成テクノロジーによるシーケンシングを使用することによるなど、いくつかの異なる方法により実施することができる。先行技術による合成によるシーケンシングは、シーケンシング反応中に特定のデオキシヌクレオシド三リン酸の取り込みにより副産物の生成をモニターする任意のシーケンシング方法として定義される（Ｈｙｍａｎ、１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １７４：４２３〜４３６；Ｒｈｏｎａｇｈｉら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：３６３〜３６５）。合成反応によるシーケンシングの１つの優れた実施形態は、ピロリン酸シーケンシング方法である。この場合、ヌクレオチド取り込み中のピロリン酸の生成は、化学発光シグナルの発生を生じる酵素カスケードによりモニターされる。合成による配列の例である、４５４  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅカタログＮｏ．０４  ７６０  ０８５  ００１）は、ピロリ酸シーケンシングテクノロジーに基づいている。４５４  ＧＳ２０または４５４  ＦＬＸ機器におけるシーケンシングについて、平均ゲノムＤＮＡ断片サイズは、商品パンフレットに記載されているように、それぞれ、２００ｂｐまたは６００ｂｐの範囲である。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、合成反応によるシーケンシングは、代替として、シーケンシング反応のターミネーター色素の型に基づき得る。この場合、新生ＤＮＡ鎖のさらなる伸長を阻止する、取り込まれた色素デオキシヌクレオ三リン酸（ｄｄＮＴＰ）ビルディングブロックは、検出可能な標識を含み、その標識は、好ましくは、蛍光標識である。その後、その標識は、例えば、３’−５’エキソヌクレアーゼまたはプルーフリーディング活性を含むＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、除去され、ｄｄＮＴＰビルディングブロックの鋳型／プライマー伸長ハイブリッドへの取り込みにより検出される。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、およびＧｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒワークフロー（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｃｉｅｎｃｅカタログＮｏ．０４  ８９６  ５４８  ００１）の場合において、第１の工程で、（クローナル）増殖がエマルジョンＰＣＲにより実施される。したがって、増幅の工程がエマルジョンＰＣＲ方法により実施されることもまた本開示の範囲内である。クローナルに増幅された標的核酸を有するビーズを、その後、任意で、製造会社のプロトコールに従ってピコタイタープレートへ移し、配列決定のためのピロリン酸シーケンシング反応に供してもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、シーケンシングは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．により提供された方法（「Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ」）などの次世代シーケンシング方法を用いて実施される。いかなる特定の理論にも縛られるつもりはないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代シーケンシングテクノロジーは、迅速で正確なシーケンシングを可能にするために、クローナル増幅および合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）の化学を用いている。その過程は、ＤＮＡ塩基を核酸鎖へ組み込むと同時に、それらのＤＮＡ塩基を同定する。各塩基は、それが成長鎖に付加された時、固有の蛍光シグナルを放射し、そのシグナルが、ＤＮＡ配列の順序を決定するために用いられる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、シーケンシングは、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．から入手できるＰａｃＢｉｏなどの単一分子リアルタイムシーケンシングを用いて実施される。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、選別された細胞は、特定のバイオマーカーについて染色および／または標識される。例えば、１つまたは両方の細胞集団が、特定の表面マーカーの存在について染色および／または標識され得る。
【０１３２】
フローサイトメトリー
いくつかの実施形態において、解離した細胞の選別（工程４２０）の後にフローサイトメトリー分析が行われる（工程４３０）（図４）。フローサイトメトリーは、光学的／電子工学的検出装置を流れる単一細胞の物理的および／または化学的特性の同時的多パラメータ分析を可能にする技術である。フローサイトメトリーおよびそれの使用は、当業者によく知られている（例えば、参照により本明細書に組み入れられている、Ｏｒｍｅｒｏｄ、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）参照）。そのような使用には、モノクローナル抗体を用いる細胞表面抗原の免疫蛍光標識が挙げられるが、それに限定されない。臨床適用には、白血病およびリンパ腫（lumphoma）の免疫表現性分析、微小残存病変の検出、幹細胞列挙、Ｔ細胞交差適合および術後モニタリングを含む、臓器移植、自己抗体、ＨＩＶ感染、胎児母体出血、免疫不全疾患、発作性夜間血色素尿症の検出、網状赤血球分析、細胞周期分析、細胞増殖、アポトーシス、ＲＮＡ含有量、タンパク質含有量、細胞内酵素の動態解析、膜透過性、膜電位、細胞内酸化種の生成、薬物取り込みの測定、リガンドの結合およびエンドサイトーシス、細胞内カルシウムイオン、細胞内ｐＨ、細胞内グルタチオン、染色体分析および選別、細胞のトラッキング、細胞生存率の測定、電気透過処理のモニタリング、細胞の融合またはクラスター形成のモニタリング、マイクロビーズテクノロジーなどが挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３３】
本出願人らは、解離した腫瘍試料のフローサイトメトリー分析が、異なる物理的特性を有する腫瘍における細胞の多様性のために、難題であることを見出している。ダブレット識別などのある特定の日常的手順は、かなり均一な特徴を有する細胞集団を有することに頼っている；例えば、混合集団において、正常細胞のダブレットは、腫瘍細胞から区別することは困難であり得る。解離した試料のサイズに基づいた分画は、それぞれ個々に染色および分析するのがより単純であろう、２つの細胞集団（腫瘍について濃縮された細胞集団、正常細胞について濃縮された細胞集団）を提供することにより、フローサイトメトリー分析を単純化するであろう。サイズに基づいた濃縮後、染色およびＦＡＣＳは、特定のマーカーが陽性である免疫集団、または特定のマーカーが陽性の腫瘍集団を容易に選別し、その特定の集団のゲノミクスまたはプロテオミクスを分析することを可能にする。特定のマーカーが陽性の腫瘍細胞または免疫細胞のパーセンテージの決定を、たとえその集団を収集し、さらに分析したいと思わなかったとしても、それは可能にするであろう。
【０１３４】
バイオマーカー分析
いくつかの実施形態において、濃縮された細胞、核、または小さい組織凝集物の集団は、特定の標的分子を同定するアッセイにおいて染色される。標的分子は、核酸配列またはタンパク質であり得る。標的タンパク質が、疾患と関連した（例えば、相関した、原因として関与したなど）標的核酸配列から産生され得ることを当業者は認識しているであろう。特定の非限定的例において、標的タンパク質は、新生物（例えば、がん）と関連した標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される。多数の染色体異常（転位置および他の再配置、増幅または欠失を含む）は、腫瘍性細胞、特にがん細胞、例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞白血病、リンパ腫、乳がん、結腸がん、神経系がんなどにおいて同定されている。したがって、いくつかの例において、標的分子の少なくとも一部分は、試料中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅された、または欠失した核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される。
【０１３５】
他の例において、標的タンパク質は、悪性細胞において欠失している（喪失している）腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例えば、染色体９ｐ２１上に位置するｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、およびＤ９Ｓ１７５２を含む）は、ある特定の膀胱がんにおいて欠失している。１番染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、およびＳＨＧＣ−１３２２を包含する）および１９番染色体の動原体周囲領域（例えば、１９ｐ１３〜１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、およびＧＬＴＳＣＲ１を包含する）に関わる染色体欠失は、中枢神経系の固形腫瘍のある特定の型の特徴的な分子構造である。
【０１３６】
腫瘍性形質転換および／または増殖と相関する多数の他の細胞遺伝学的異常は当業者に知られている。腫瘍性形質転換と相関しており、開示された方法において有用である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）により産生される標的タンパク質にはまた、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９〜５５２４２５２５）、Ｃ−ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８〜１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８〜１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２〜４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１７、相補体、ヌクレオチド７５１２４６４〜７５３１６４２））、Ｎ−ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００２、相補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１〜１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１２、相補体、ヌクレオチド５６１９６６３８〜５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４〜３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１３、相補体、ヌクレオチド４００２７８１７〜４０１３８７３４）、加えて、例えば、ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００２、相補体、ヌクレオチド２９２６９１４４〜２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１８、相補体、ヌクレオチド５８９４１５５９〜５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００３、相補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９〜１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２〜ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００１、相補体、ヌクレオチド５９０１９０５１〜５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１〜ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１７、相補体、ヌクレオチド３５７９８３２１〜３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００２１、相補体、ヌクレオチド４１７５８３５１〜４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００２１、相補体、ヌクレオチド３８６７５６７１〜３８９５５４８８）；  ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００７、相補体、ヌクレオチド１３８９７３７９〜１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１〜２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１〜ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９〜１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５〜ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００２、相補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１〜２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２〜ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７〜１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５〜８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１〜ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−００００１９、相補体、ヌクレオチド４５４３１５５６〜４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００１、相補体、ヌクレオチド４０１３３６８５〜４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３〜ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６〜６１００３６８２）、およびＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３〜ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ−０００００５、相補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１〜１４９４７３１２８）が挙げられる。
【０１３７】
キット
いくつかの実施形態において、本開示は、インプット試料由来の細胞、核、または小さい組織凝集物をホモジナイズし、解離させ、および選別するために必要とされる成分を含むキットを提供する。例えば、キットは、特定の型の組織から細胞を解離させるのに必要とされる試薬を含み得、キットはまた、特定のサイズを有する細胞を選別するのに適切なマイクロ流体デバイスを含み得る。
【実施例】
【０１３８】
材料
機械的解離を、ＩＫＡ−Ｗｏｒｋｓ（０００４１８０００１；Ｓｔａｕｆｅｎ  ｉｍ  Ｂｒｅｉｓｇａｕ、Ｇｅｒｍａｎｙ）製のＩＫＡ  Ｗｏｒｋｓ  Ｔｕｂｅ  Ｍｉｌｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌシステムを用いて実施した。用いられた全てのフィルターは、Ｐｌｕｒｉｓｅｌｅｃｔ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）製であった。用いられたバッファーは、以下の会社製であった：ＣＣ１（９５０−１２４；Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）、ａｕｔｏＭＡＣＳバッファー（１３０−０９１−２２１、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ｄＰＢＳ（１４１９０、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）。Ｔｗｅｅｎ  ２０を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ（ＡＣ２３３３６２５００）から購入した。以下の試薬を、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡから購入した：四塩化スペルミン（Ｓ２８７６）、ＤＡＰＩ（Ｄ９５４２）、ペプシン（Ｐ７０１２）。プロテイナーゼＫをＶＷＲ、ＵＳＡ（０７０６）から購入した。チラミド−ローダミン１０１を、Ｓｉｇｍａから購入した化学物質を用いて社内合成した。マウス抗サイトケラチン８／１８抗体（７６０−４３４４）およびヤギ抗マウスＨＲＰコンジュゲート型抗体（７６０−４３１０）は、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製であった。Ａｌｅｘａ  ４８８またはＡｌｅｘａ  ６４７とコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ａ−１１００１）から購入した。
【０１３９】
組織モデルおよび臨床試料
全ての組織試料を、Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓにおいて、１０％中性緩衝ホルマリン中、２４時間、固定した。ヒト扁桃をＮｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）から入手した。腫瘍細胞をＧＬＡＳ／（Ｗｉｎｓｔｏｎ−Ｓａｌｅｍ、ＮＣ  ｈｔｔｐ：／／ｇｌａｓｗｐｃｏｐｙ．ｗｐｅｎｇｉｎｅ．ｃｏｍ／）から入手した。
【０１４０】
実施例１
固定組織解離
固定された扁桃組織を、ＩＫＡブレンダーにおいて、ＣＣ１バッファー（１：５）（８５℃に加熱され、８５℃で３０分間、インキュベートされている）中、機械的に解離させ、その後、再び、ＩＫＡブレンダーにおいて混ぜた（２分間、１０秒間の間隔）。混ぜられた材料を、１：１０  ＭＡＣＳバッファー（１：１０）へ交換し、４０μｍフィルターに通して濾過した。濾過された解離細胞を、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて収量およびサイズ分布について分析した。
【０１４１】
腫瘍組織について、まず、バルク機械的解離を、ＩＫＡブレンダーにおいて、ＭＡＣＳバッファー中、１：１の腫瘍：ＭＡＣＳ比で行った。全ホモジネートのアリコートをさらに、上記の扁桃について記載されているように、ＣＣ１バッファー中に混ぜた。混ぜられた材料を、１ｍｍ×１ｍｍの金属篩に通して濾過した。ＣＣ１バッファーを、卓上微量遠心機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）における３００ｘｇで１分間の遠心分離によりｄＰＢＳ（１：１０）と交換した；全てのその後の液体交換を、同じ方法で実施した。遠心分離後、ペレットを、１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫを含有するｄＰＢＳ中１：１に再懸濁し、５０℃で１０分間、インキュベートした。プロテイナーゼＫを消滅させるために、およびさらなる解離のために、試料を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ１．５中５ｍｇ／ｍｌペプシンへと交換した。溶液のｐＨを、ｐＨ試験紙で試験し、必要に応じて、５Ｍ  ＨＣｌを用いて１．５〜２に再調整した。試料を、１０分間ごとに穏やかに混合しながら、３７℃で３０分間、インキュベートした。５Ｍ  ＮａＯＨでｐＨを８より上に調整することにより、ペプシンを失活させ、その後、そのペプシンを含有する溶液を、ａｕｔｏＭＡＣＳバッファー、１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、および１．５ｍＭ  四塩化スペルミジン（ＭＡＣＳ−Ｔ−ＳＴＣ）と交換した。消化された試料を、１０ｍｌのＭＡＣＳ−Ｔ−ＳＴＣを用いて４０μｍフィルターに通して濾過し、遠心分離により収集し、下流適用の前の保存のために５００μｌ  ＭＡＣＳ−Ｔ−ＳＴＣ中に再懸濁した。
【０１４２】
実施例２
固定組織からの単一細胞の抽出
固定組織（扁桃または腫瘍）を、まず、ＩＫＡブレンダーにおいて、ＭＡＣＳバッファー中１：１の比で混ぜて、さらなる使用のために保存することができるホモジネートを作製した。無傷の単一細胞を抽出するために、以下の工程を実施した：
１．  ホモジネートを、ＣＣ１バッファー中１：５の比で懸濁し、８５Ｃで３０分間、加熱した。
２．  予熱された懸濁液を、ＩＫＡブレンダーにおいて混ぜた（１０秒間の間隔を以て、それぞれ２分間、２回）。
３．  混ぜられた懸濁液を、１ｍｍ金属篩で濾過した。
４．  濾液を２０ｕｍ細胞ストレーナーで再び、濾過した。
５．  濾液を１０ｕｍ細胞ストレーナーで濾過した。
６．  濾液は大部分、単一細胞を含有したが、残留物は異なるサイズの断片を含有した。
７．  単一細胞懸濁液を、５００ｇで遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１４３】
実施例３
パラフィンブロックからの組織の抽出
組織を含有するパラフィンブロックを、６５℃で３０分間、融解し、過剰なワックスを捨てた。温かい組織を、サイズが１ｍｍ２未満の小片へ切り、組織片を、メッシュの側面を有するカセット内へ置いた。カセットを、Ｌｅｉｃａ自動プロセッサー内に置き、キシレン中、撹拌しながら４２℃で２時間、インキュベートした。カセットをエタノール中へ交換し、撹拌しながら室温で１時間、インキュベートした。組織を、１．５Ｌ  ｄＨ２Ｏの２回の交換を用いて、撹拌しながら、室温で１時間、再水和させた。再水和した組織を、上記のように解離させた。
【０１４４】
実施例４
原発性ヒト腫瘍から単一細胞懸濁液を得るための試料手順（腫瘍試料からの細胞の解離）
１．  腫瘍コラゲナーゼでの消化の前に、原発性ヒト腫瘍を、解剖用メスを用いることにより、小片へと横に切り、ほぼ液体まで完全に細かく切り刻む；組織を切断するのであって、組織を引き裂くのではないことに気をつける。
２．  組織の量に基づいてコラゲナーゼを加える。コラゲナーゼ：１のコラゲナーゼ／ヒアルロニダーゼに対して９の培地１９９。１ｍＬの腫瘍あたり２００〜２５０ユニットのコラゲナーゼミックスを作製し、総体積は、腫瘍のサイズに適応させ、３〜４ｍＬを超えない。
３．  コラゲナーゼ溶液中の細かく切断された腫瘍を５０ｍＬコニカルチューブへ移す。
４．  ５０ｍＬコニカルチューブを３７℃振盪機またはウォーターバスへ入れる。振盪機内の場合、６５ｒｐｍで３０分間〜１時間に動作を設定し、その間の途中で混合する。さもなければ、ウォーターバス内で最大１時間、インキュベートし、１５分間ごとに混合する。
５．  １８ゲージ針かまたは２３ゲージ針のいずれかを有する５ｍＬシリンジを用いてその混合物を２０〜２５回、滴定する。その懸濁液はその針を通り抜けるはずである。
６．  加えられたコラゲナーゼミックスの少なくとも等量で２％ＦＢＳ／ＨＢＳＳミックスを加えることにより消化を停止させる
７．  その後、オルガノイドから単一細胞／線維芽細胞を分離するために、細胞を、４０ｇで３０秒間、遠心分離するか（上清は単一細胞を含有し、ペレットはオルガノイドを含有する）、または４０ｕＭナイロンメッシュ細胞ストレーナーに通して濾過し、その後、１０００ｒｐｍで５分間、遠心分離するかのいずれかであり、上清を吸引して除去し、ペレットを２％ＦＢＳ／ＨＢＳＳミックス中に再懸濁する。
８．  ２％ＦＢＳ／ＨＢＳＳミックスで２回、洗浄する。
９．  下記のような、細胞の凝集物を単一細胞から分離するための、任意の差別沈降工程：
９．１  Ｍ−１９９での１回目の洗浄後、１０ｍＬ  Ｍ−１９９中に細胞を再懸濁する。手による撹拌、その後、１５分間、おく。
９．２  慎重に、チューブの底に沈殿している細胞から液体を除去し、取っておく。
９．３  前の２つの工程を１回、繰り返して進める。必ず、上清とペレット化細胞の両方に対して細胞計数を行うこと。
１０．  最後の洗浄後、５〜１０ｍＬ培地中に細胞を再懸濁し、および／またはオルガノイドを凍結させる。Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔへ５０μＬのアリコートを取る。核をカウントする（ご存じであろうが、どれくらい多くの細胞が存在することか）。
１１．  細胞を５％ＩＨにおいて所望の密度で、通常、３５ｍｍプレートあたり１０６個の細胞で、蒔く。蒔かれない細胞を、凍結培地中アンプルあたり５〜１０×１０６個の細胞で凍結させる。
【０１４５】
実施例５
細胞サイズ分析
チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）を用いる染色
核（チューブあたり３×１０７個の粒子）を、０．３ｍｌ  ３％  Ｈ２Ｏ２中での再懸濁の前に、３００ｘ  ｇで２分間、遠心分離した。１５分間のインキュベーション後、細胞を、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＢＳＡで３回洗浄した。ＴＳＡブロッキングバッファー（０．３ｍｌ）を５分間、加え、その後、０．２ｍｌ一次抗体中、３７℃で３０分間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０、０．１％ＢＳＡで３回洗浄し、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたヤギ抗種抗体の０．２ｍｌ中、３７℃で３０分間、再懸濁した。細胞を、１．２ｍｌ  ２０μＭチラミド−ローダミン１０１中に希釈し、５分間、インキュベートし、その後、１．２ｍｌ  ＴＳＡ  Ｈ２Ｏ２中３０分間、インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ  ３×中０．５％デキストラン、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡで洗浄し、保存のためにＭＡＣＳ−Ｔ−ＳＴＣ中に再懸濁した。画像化またはフローサイトメトリーの前に、細胞を３μＭ  ＤＡＰＩで１０分間、染色した。
【０１４６】
フローサイトメトリー
試料を、分析前に４０μｍフィルターに通して濾過した。分析および選別を、Ｓｏｎｙ  ＳＨ８００セルソーターにおいて行った。ダブレット識別を、ＤＡＰＩパルス幅および面積を用いて行った。
【０１４７】
細胞／核の収量およびサイズ分布の測定
試料を、Ｉｓｏｔｏｎ  ＩＩ溶液（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）中に１：１０，０００希釈し、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ４ｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）において分析した。再現性を、同じ腫瘍についての異なるプレップ由来の粒子のサイズ分布をモニターすることにより評価した。サイズ分布を同様に、ＦＡＣＳ選別された細胞および核について測定した。
【０１４８】
画像からの細胞／核のサイズ分布の測定
核／細胞試料を、１ｍｌあたり約１０５個の粒子へ希釈し、スライドグラス上に置いた。明視野画像を、ピクセル：ミクロン変換が予め較正されているＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ顕微鏡上での複数の視野（１試料あたり少なくとも６つ）にわたる２０×倍率で取得した。画像を、ＩｍａｇｅＪにおいて閾値設定して、バイナリーマスクを作成し、その後、それを用いて、シングレット細胞の面積を決定した。面積測定値を用いて、各視野における全てのシングレット細胞または核についての直径を計算した。
【０１４９】
結果
解離した腫瘍核のサイズ分布の分析
Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて、組織解離方法の収量の再現性を決定すると同時に、本発明者らは、図５Ａおよび５Ｂに描かれているように、異なる型の腫瘍由来の核が、類似した相対的サイズ分布の２つの集団へ分配されたことを認めた。
【０１５０】
解離した腫瘍核のＦＡＣＳ選別
腫瘍核がフローサイトメトリーにより分析され、ＦＡＣＳを用いて選別され得るかどうかを決定するために、本発明者らは、同じ解離した腫瘍試料由来の核をサイトケラチンについて染色した。サイトケラチンは、核に付随したままであり、腫瘍起源の核についての「核表面マーカー」としての役割を果たす。本発明者らは、加えて、核をＤＡＰＩで染色し、それにより、ＤＮＡ含有量が明らかにされる。図６は、結腸がん試料と肺がん試料の両方について、本発明者らが、サイトケラチン陰性（正常）集団より高いＤＮＡ含有量を含有したサイトケラチン陽性集団を同定することができたことを示し（パネルｉ〜ｉｉｉ）、代表試料において、サイトケラチン陽性核が腫瘍細胞に由来する可能性が高く、サイトケラチン陰性核が正常細胞に由来する可能性が高いことを確認した。これらの核を、ＦＡＣＳを用いて選別した（選別の純度チェックはパネルｉｖ〜ｖに示されている）。この実験は、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターによる分析についてサイトケラチン陽性および陰性の核を提供した。
【０１５１】
選別された腫瘍核のサイズ分布の分析
本発明者らは、次に、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いてサイトケラチン陽性核およびサイトケラチン陰性核のサイズ分布を分析した。図７は、図４からの相対的サイズ分布上にオーバーレイされた、前の実験で得られた結腸腫瘍および肺腫瘍由来の選別された集団の分析を示す。サイトケラチン陰性核（破線のトレース）はより小さい集団と同調し、一方、サイトケラチン陽性核（実線のトレース）は、より大きい集団と同調した。これらのデータは、より小さい核が正常細胞に由来し、一方、より大きい核が腫瘍細胞に由来することを支持している。これらのデータは、組織学的Ｈ＆Ｅ染色スライド（未呈示）に見られた免疫核に対して腫瘍核のより大きいサイズと一致している。
【０１５２】
解離した腫瘍細胞のサイズ分布の分析
Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターによる固定腫瘍（結腸および肺）から解離した細胞のサイズに基づいた分析は、再現性よく、二峰性分布を生じた（図８）。分布の性質をより良く理解するために、固定化結腸腫瘍から解離したＥｐＣＡＭ陽性細胞を分析した。Ｅｐ−ＣＡＭ陽性細胞のサイズは、解離した腫瘍細胞内のより大きい細胞集団のサイズと同調した。固定扁桃もまた混ぜて、抽出された単一細胞のサイズを、腫瘍から解離した細胞のサイズと比較した。扁桃から解離した細胞のサイズは、解離した腫瘍細胞内のより小さい細胞集団のサイズと同調した（図８）。
【０１５３】
パラフィンから抽出された組織のサイズ分布の分析
本発明者らは、次に、パラフィンブロックから抽出された組織が、ワックスで包埋されていないホルマリン固定組織から単離された細胞とサイズが類似している細胞へ解離され得るかどうかを決定しようとした。この実験の目的は、粒子のサイズに基づいたいかなる識別も、アーカイブの腫瘍ブロック試料などのワックスから抽出されている組織へ適用され得るかどうかを決定することである。これを試験するために、本発明者らは、ワックスで包埋されていなかったホルマリン固定扁桃組織を機械的に解離させ、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて細胞を分析した（図９、黒色）。本発明者らはまた、パラフィンブロックから扁桃組織を抽出し（方法参照）、それを同様に解離および分析した（図９、灰色）。パラフィンから抽出されている組織と比較して、包埋されていない組織から単離された細胞の類似したサイズ分布があることをこれらのデータは示している。
【０１５４】
直交画像に基づいた方法を用いる、扁桃組織および腫瘍組織由来の核および細胞のサイズ分布の分析
核および細胞の正確なサイズを検証するために、本発明者らは、扁桃および腫瘍組織から単離された核および細胞の画像に基づいた分析を実施した（図１６）。これらのデータは、ｃｏｕｌｔｅｒ方法を用いて同定された腫瘍細胞粒子と正常細胞粒子のサイズ差を支持し、それらの集団を分離するために用いることができる正確な直径の推定を提供する。
【０１５５】
実施例６
次世代シーケンシング方法
ゲノムＤＮＡを、Ｒｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、製品Ｎｏ．：０６６５０７６７００１）を用いて、振盪インキュベーターにおける５６℃でのプロテイナーゼＫ消化時間を２時間に増加させる点を除いては製造会社の推奨手順に従って、各試料から精製した。精製されたｇＤＮＡの収量を、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）における分析により測定した。
【０１５６】
ライブラリーを、ＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  ＨｙｐｅｒＣａｐ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，ｖ１．０（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を用いて、１ｕｇの精製されたインプットｇＤＮＡから構築し、簡単な詳細は、ユーザーガイドから重要な工程を強調するためのみ、たどる。抽出されたｇＤＮＡを、ＫＡＰＡ  ＨｙｐｅｒＰｌｕｓライブラリープレップキットを製造会社の使用説明書（Ｒｏｃｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に従って用いることにより、酵素的に断片化し、修復し、標的濃縮のために準備した。具体的には、各試料から１ｕｇのｇＤＮＡを、３７℃で４０分間、断片化し、６５℃で３０分間、末端修復し、Ａテールを付与し、４５ピコモル濃度の最終アダプター濃度でＳｅｑＣａｐ  ｓｉｎｇｌｅ−ｉｎｄｅｘアダプター（Ｒｏｃｈｅ  ＳｅｑＣａｐ  Ａｄａｐｔｅｒ  Ｋｉｔ  ＡおよびＢ）を用いて１６℃で１６時間、アダプターライゲーションした。Ｐｒｅ−ｃａｐ  ＬＭ−ＰＣＲ増幅をライブラリーに実施しなかった。標的濃縮をＳｅｑＣａｐ  ＥＺ  ＭｅｄＥｘｏｍｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、上記で言及されたユーザーガイドに従って（具体的には、４７℃で１６時間）実施した。Ｐｏｓｔ−ｃａｐｔｕｒｅ  ＬＭ−ＰＣＲを、ユーザーガイドにおいて推奨されているような７〜９サイクルの代わりに、合計１４サイクルで実施した。
【０１５７】
ライブラリーをプールし、シーケンシングのために準備し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００機器において、ＨｉＳｅｑ  ＨＯ  Ｖ３キットを用いて、ＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｇｕｉｄｅ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ文書＃１５０３５７８６  ｖ０１）に従うことによりシーケンシングした。
【産業上の利用可能性】
【０１５８】
本開示は、医学および診断学の分野における産業上の利用を有する。
【０１５９】
この明細書で言及された、および／または出願データシートに列挙された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、全体として参照により本明細書に組み入れられている。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用して改変され、なおさらなる実施形態を提供することができる。
【０１６０】
本開示は、いくつかの例証的な実施形態を参照して記載されているが、この開示の精神内および範囲内に入るであろう多数の他の改変および実施形態が当業者により考え出され得ることは、理解されるべきである。より具体的には、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲の範囲内で、本組合せ配置の構成部分および／または配置において合理的なバリエーションおよび改変が可能である。構成部分および／または配置におけるバリエーションおよび改変に加えて、代替用途もまた当業者に明らかであろう。
【０１６１】
追加の実施形態
追加の実施形態１
組織試料から細胞を分別する方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が少なくとも第１および第２の細胞集団に選別され、第１の細胞集団が、約４μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第２の細胞集団が、約１２μｍから約５０μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む方法。
追加の実施形態２
第１の細胞集団における細胞の少なくとも９０％が約４μｍから１２μｍまでの範囲の平均直径を有し、第２の細胞集団における細胞の少なくとも９０％が１２μｍから５０μｍまでの範囲の平均直径を有する、追加の実施形態１に記載の方法。
追加の実施形態３
第１の細胞集団が非腫瘍細胞に富み、第２の細胞集団が腫瘍細胞に富む、追加の実施形態１および２のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態４
腫瘍細胞が約１２μｍから約５０μｍまでの範囲の平均直径を有する、追加の実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５
組織試料が腫瘍全体、部分的腫瘍、および／またはリンパ節に由来する、追加の実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態６
組織試料が残存外科的材料または生検試料に由来する、追加の実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態７
組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、追加の実施形態６に記載の方法。
追加の実施形態８
ホモジナイズ組織試料が選別前にさらに処理される、追加の実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態９
さらなる処理が、ホモジナイズ試料内のタンパク質を消化する工程およびホモジナイズ試料を濾過する工程を含む、追加の実施形態８に記載の方法。
追加の実施形態１０
ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別することが、細胞を染色する工程を必要としない、追加の実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態１１
マイクロ流体デバイスが、ホモジナイズ試料中の細胞をサイズにより選別するために利用される、追加の実施形態１０に記載の方法。
追加の実施形態１２
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１３
約１２μｍ未満の臨界直径を有する、ホモジナイズ組織試料内の細胞が、デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約１２μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ組織試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、追加の実施形態１２に記載の方法。
追加の実施形態１４
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスである、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１５
マイクロ流体デバイスが水力学的濾過デバイスである、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１６
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１７
マイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態１１に記載の方法。
追加の実施形態１８
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の１つを含む、追加の実施形態１７に記載の方法。
追加の実施形態１９
第１または第２の集団内の細胞を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、追加の実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態２０
第１のバイオマーカーの存在ががんを示す、追加の実施形態１９に記載の方法。
追加の実施形態２１
第１のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、追加の実施形態１９に記載の方法。
追加の実施形態２２
第１および第２の細胞集団のそれぞれが独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされる、追加の実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態２３
第１および第２の細胞集団が、患者についてのマッチングした腫瘍細胞試料と正常細胞試料を提供する、追加の実施形態１〜６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態２４
マッチングした腫瘍細胞と正常細胞が、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析される、追加の実施形態２３に記載の方法。
追加の実施形態２５
試料内のゲノム材料をシーケンシングする方法であって、組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；および腫瘍細胞に富む、少なくとも第１の細胞集団をシーケンシングすることを含む方法。
追加の実施形態２６
ホモジナイズ試料内の細胞が、マイクロ流体デバイスで選別されて、少なくとも２つの細胞集団を提供し、選別後の第１の細胞集団内の細胞の少なくとも８０％が腫瘍細胞である、追加の実施形態２５に記載の方法。
追加の実施形態２７
第１の細胞集団内の細胞の少なくとも８０％が、１２μｍより大きいサイズを有する、追加の実施形態２５〜２６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態２８
細胞がそれらの水力学的サイズに従って選別される、追加の実施形態２５〜２７のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態２９
腫瘍試料が外科的切除に由来する、追加の実施形態２５〜２８のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３０
マイクロ流体デバイスが選別前に細胞の染色を必要としない、追加の実施形態２６〜２９のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３１
マイクロ流体が、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する、追加の実施形態２６〜３０のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３２
第１の細胞集団が、全重量の第１の細胞集団によるシーケンシングのために、少なくとも０．０５マイクログラムのゲノム材料を含む、追加の実施形態２５〜３１のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３３
第１の細胞集団が、全重量の第１の細胞集団によるシーケンシングのために、少なくとも０．１マイクログラムのゲノム材料を含む、追加の実施形態２５〜３１のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３４
シーケンシング前に多くても４回の増幅サイクルを含む、追加の実施形態２５〜３３のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３５
腫瘍試料から、濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を取り出す方法であって、腫瘍試料から腫瘍核および正常核を解離させること、腫瘍核および正常核を、選別前に染色またはバイオマーカー分析の工程を必要としないマイクロ流体選別デバイスでサイズにより選別することを含む方法。
追加の実施形態３６
濃縮された腫瘍核集団が、少なくとも８５％の腫瘍核を含み、濃縮された正常核集団が少なくとも８５％の正常核を含む、追加の実施形態３５に記載の方法。
追加の実施形態３７
濃縮された腫瘍核集団内の腫瘍核が、８．５μｍより大きい平均核サイズを有する、追加の実施形態３５〜３６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３８
濃縮された正常核集団内の正常核が、８．５μｍ未満の平均核サイズを含む、追加の実施形態３５〜３７のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態３９
濃縮された腫瘍核集団および濃縮された正常核集団を別々にシーケンシングする工程をさらに含む、追加の実施形態３５〜３８のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態４０
体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化の少なくとも１つが、濃縮された腫瘍細胞集団において同定される、追加の実施形態３９に記載の方法。
追加の実施形態４１
腫瘍試料が、腫瘍全体、部分的腫瘍、１つもしくは複数のリンパ節、および／またはパラフィンに包埋された試料に由来する、追加の実施形態３５〜４０のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態４２
腫瘍試料が新鮮に解離した組織を含む、追加の実施形態３５〜４１のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態４３
特定の処置または医薬品有効成分に応答性のがんサブタイプを同定することによりがんを処置する方法であって、がんサブタイプが、腫瘍細胞について濃縮された試料をシーケンシングすることにより同定され、方法が、（ｉ）腫瘍、１つもしくは複数のリンパ節、または血液の少なくとも１つを含むインプット組織試料をホモジナイズすること；および（ｉｉ）腫瘍細胞を正常細胞から、サイズに基づいた選別デバイスで選別することであって、サイズに基づいた選別デバイスが、選別前に腫瘍細胞を染色することを必要としない、腫瘍細胞を正常細胞から選別することにより、試料を腫瘍細胞で富ませることを含む方法。
追加の実施形態４４
腫瘍細胞について濃縮された細胞集団が、シーケンシング前に多くても４回の増幅サイクルが行われるような、十分な量のゲノム材料を含む、追加の実施形態４３に記載の方法。
追加の実施形態４５
シーケンシング前に多くても２回の増幅サイクルが行われる、追加の実施形態４４に記載の方法。
追加の実施形態４６
ゲノム材料の量が、少なくとも０．０１マイクログラムである、追加の実施形態４４に記載の方法。
追加の実施形態４７
ゲノム材料の量が、少なくとも０．１マイクログラムである、追加の実施形態４４に記載の方法。
追加の実施形態４８
ゲノム材料の量が、少なくとも０．２マイクログラムである、追加の実施形態４４に記載の方法。
追加の実施形態４９
ゲノム材料の量が、少なくとも０．５マイクログラムである、追加の実施形態４４に記載の方法。
追加の実施形態５０
がんサブタイプの同定後、その試料が由来した患者へ処置コースが提供される、追加の実施形態４３〜４９のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５１
腫瘍細胞において体細胞突然変異を同定することによりがんを処置する方法であって、（ｉ）患者に由来する組織試料をホモジナイズすること；ならびに（ｉｉ）ホモジナイズ組織試料内の細胞を解離させること；ならびに（ｉｉ）解離した組織試料において腫瘍細胞を正常細胞からマイクロ流体デバイスで分離して、（ａ）腫瘍細胞に富む第１の集団であって、第１の集団内の腫瘍細胞が１２μｍより大きい平均直径を有する、第１の集団、および（ｂ）正常細部に富む第２の集団であって、第２の集団内の正常細胞が１２μｍ未満の平均直径を有する、第２の集団を提供することを含み、マイクロ流体デバイスが選別前に染色または標識を必要としない、方法。
追加の実施形態５２
マイクロ流体デバイスが、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する、追加の実施形態５１に記載の方法。
追加の実施形態５３
下流分析を促進するために、組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分別する方法であって、
組織試料から細胞、核、または組織凝集物を分離して分離された試料を得ること；
分離された試料中の細胞、核、または組織凝集物を、選別デバイスを用いてサイズにより選別することであって、細胞、核、または組織凝集物が第１の集団および第２の集団に選別され、第１の集団が、第１の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有し、第２の集団が、第２の細胞、核、または組織凝集物の平均直径を有する、細胞、核、または組織凝集物を選別すること
を含む方法。
追加の実施形態５４
第１の集団が腫瘍の細胞、核、または組織凝集物に富み、第２の集団が正常な細胞、核、または組織凝集物に富み、第１の集団の平均直径が第２の集団の平均直径より大きい、追加の実施形態５３に記載の方法。
追加の実施形態５５
選別デバイスが、決定論的横置換、流体泳動的濾過、水力学的濾過、曲線チャネルにおける慣性集束、および直線チャネルにおける慣性集束の１つを使用する、追加の実施形態５３〜５４のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５６
第１の集団または第２の集団の少なくとも１つにゲノム解析を実施する工程をさらに含む、追加の実施形態５３〜５５のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５７
第１の集団または第２の集団の少なくとも１つにフローサイトメトリー分析を実施する工程をさらに含む、追加の実施形態５３〜５６のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５８
第１の集団または第２の集団の少なくとも１つを少なくとも１つのバイオマーカーの存在について染色する工程をさらに含む、追加の実施形態５３〜５７のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態５９
新鮮な組織試料から細胞を分別する方法であって、
新鮮な組織試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；
ホモジナイズ新鮮腫瘍試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が第１および第２の細胞集団に選別され、第１の細胞集団が、約６μｍから約１２μｍまでの範囲の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第２の細胞集団が、約１２μｍより大きい平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別すること
を含む方法。
追加の実施形態６０
第１の細胞集団が非腫瘍細胞に富み、第２の細胞集団が腫瘍細胞に富む、追加の実施形態５９に記載の方法。
追加の実施形態６１
新鮮な腫瘍試料が新鮮な腫瘍全体、新鮮な部分的腫瘍、および／または新鮮なリンパ節に由来する、追加の実施形態５９〜６０のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態６２
新鮮な腫瘍試料が新鮮な残存外科的材料または新鮮な生検試料に由来する、追加の実施形態５９〜６０のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態６３
選別デバイスが細胞を染色する工程を必要としない、追加の実施形態５９〜６２のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態６４
選別デバイスがマイクロ流体デバイスである、追加の実施形態６３に記載の方法。
追加の実施形態６５
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、追加の実施形態６４に記載の方法。
追加の実施形態６６
約１２μｍ未満の直径を有する、ホモジナイズ新鮮腫瘍試料内の細胞が、決定論的横置換デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、１２μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズ試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、追加の実施形態６５に記載の方法。
追加の実施形態６７
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスである、追加の実施形態６４に記載の方法。
追加の実施形態６８
マイクロ流体デバイスが水力学的濾過デバイスである、追加の実施形態６４に記載の方法。
追加の実施形態６９
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態６４に記載の方法。
追加の実施形態７０
マイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、追加の実施形態６４に記載の方法。
追加の実施形態７１
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画法または水力学的スプレッディング法の１つを含む、追加の実施形態７０に記載の方法。
追加の実施形態７２
第１または第２の集団内の細胞を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、追加の実施形態５９〜６２のいずれかに記載の方法。
追加の実施形態７３
第１のバイオマーカーの存在ががんを示す、追加の実施形態７２に記載の方法。
追加の実施形態７４
第１のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、追加の実施形態７２に記載の方法。
追加の実施形態７５
組織試料から細胞を分別する方法であって、腫瘍試料をホモジナイズしてホモジナイズ組織試料を得ること；ホモジナイズ組織試料中の細胞をサイズにより選別することであって、細胞が第１および第２の細胞集団に選別され、第１の細胞集団が、１２μｍ未満の平均直径を有する細胞について濃縮されており、第２の細胞集団が、１２μｍより大きい平均直径を有する細胞について濃縮されている、細胞を選別することを含む方法。
追加の実施形態７６
１２μｍより大きいサイズを有する腫瘍細胞に富む組成物であって、腫瘍細胞が、腫瘍細胞も正常細胞も最初に染色することなく、正常細胞から分離された、組成物。
追加の実施形態７７
組成物の少なくとも５０％が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態７６に記載の組成物。
追加の実施形態７８
組成物の少なくとも６５％が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態７６に記載の組成物。
追加の実施形態７９
組成物の少なくとも８０％が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態７６に記載の組成物。
追加の実施形態８０
組成物の少なくとも９５％が腫瘍細胞を含む、追加の実施形態７６に記載の組成物。
追加の実施形態８１
第１の細胞集団および第２の細胞集団を含むキットであって、第１の細胞集団が、１２μｍより大きいサイズを有する腫瘍細胞に実質的に富み、第２の細胞集団が、１２μｍ未満のサイズを有する正常細胞に実質的に富み、第１および第２の細胞集団が、同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍細胞および正常細胞が染色されていない、キット。
追加の実施形態８２
追加の実施形態８１に記載の細胞集団のそれぞれにゲノム解析を実施することを含む、遺伝子異常について試験する方法。
追加の実施形態８３
追加の実施形態８１の細胞集団の少なくとも１つにおけるバイオマーカーを同定する工程をさらに含む、追加の実施形態８２に記載の方法。
追加の実施形態８４
１２μｍ未満のサイズを有する細胞が第１の方向に流れ、一方、１２μｍより大きいサイズを有する細胞が第２の方向に流れるように、１つまたは複数のポスト、閉塞物、または障害物を含む、組織試料に由来する細胞を分離するためのデバイス。
追加の実施形態８５
８．５μｍより大きいサイズを有する腫瘍核に富む組成物であって、腫瘍核が、腫瘍核も正常核も最初に染色することなく、正常核から分離された、組成物。
追加の実施形態８６
組成物の少なくとも５０％が腫瘍核を含む、追加の実施形態８５に記載の組成物。
追加の実施形態８７
組成物の少なくとも６５％が腫瘍核を含む、追加の実施形態８５に記載の組成物。
追加の実施形態８８
組成物の少なくとも８０％が腫瘍核を含む、追加の実施形態８５に記載の組成物。
追加の実施形態８９
組成物の少なくとも９５％が腫瘍核を含む、追加の実施形態８５に記載の組成物。
追加の実施形態９０
第１の核集団および第２の核集団を含むキットであって、第１の核集団が、８．５μｍより大きいサイズを有する腫瘍核に実質的に富み、第２の核集団が、８．５μｍ未満のサイズを有する正常核に実質的に富み、第１および第２の核集団が、同じ腫瘍試料に由来し、腫瘍核および正常核が染色されていない、キット。
追加の実施形態９１
追加の実施形態９０に記載の細胞集団のそれぞれにゲノム解析を実施することを含む、遺伝子異常について試験する方法。
追加の実施形態９２
腫瘍試料に由来する核を分離するためのデバイスであって、８．５μｍ未満のサイズを有する核が第１の方向に流れ、一方、８．５μｍより大きいサイズを有する核が第２の方向に流れるように、１つまたは複数のポスト、閉塞物、または障害物を含むデバイス。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2020516890.tif 000005
【図４】
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【図５Ａ】
2020516890.tif 000007
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020516890.tif 000015
【図１１】
2020516890.tif 000016
【図１２】
2020516890.tif 000017
【図１３Ａ】
2020516890.tif 000018
【図１３Ｂ】
2020516890.tif 000019
【図１３Ｃ】
2020516890.tif 000020
【図１４】
2020516890.tif 000021
【図１５Ａ】
2020516890.tif 000022
【図１５Ｂ】
2020516890.tif 000023
【図１５Ｃ】
2020516890.tif 000024
【図１５Ｄ】
2020516890.tif 000025
【図１６Ａ】
2020516890.tif 000026
【図１６Ｂ】
2020516890.tif 000027
【図１６Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月4日(2020.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料から細胞粒子を分別する方法であって、（ｉ）組織試料をホモジナイズしてホモジナイズされた試料を提供すること；ならびに（ｉｉ）ホモジナイズされた組織試料中の細胞粒子をサイズにより少なくとも第１の細胞粒子集団および第２の細胞粒子集団に選別することを含み、ホモジナイズされた組織試料内の細胞粒子がマイクロ流体デバイスで選別される、方法。
【請求項２】
細胞粒子が細胞または細胞核を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第２の細胞粒子集団が、腫瘍細胞に由来する細胞粒子を含み、腫瘍細胞に由来する細胞粒子が、約１２μｍから約５０μｍまで、または約８．５μｍから約３０μｍまでの範囲の平均直径を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍細胞が、腫瘍全体、部分的腫瘍、転移腫瘍、部分的転移腫瘍、またはリンパ節の少なくとも１つに由来する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組織試料が、残存外科的材料または生検試料の少なくとも１つに由来するか、組織試料が、架橋溶液中で固定されたものであるか、または組織試料が、パラフィンに包埋された試料に由来する、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ホモジナイズされた組織試料が、選別前にさらに処理され、さらなる処理が、ホモジナイズされた試料内のタンパク質を消化すること、試料を加熱すること、またはホモジナイズされた試料を濾過することの少なくとも１つを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ホモジナイズされた試料中の細胞粒子をサイズにより選別することが、細胞粒子を染色する工程を必要としない、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
マイクロ流体デバイスが決定論的横置換デバイスである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
約１２μｍ未満の臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞粒子が、決定論的横置換デバイスを通過する流体の対流と共に移動し、一方、約１２μｍより大きい臨界直径を有する、ホモジナイズされた試料内の細胞が、アレイの配置により決定づけられた方向に移動する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロ流体デバイスが流体泳動的濾過デバイスまたは水力学的濾過デバイスである、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
マイクロ流体デバイスが曲線チャネルにおける慣性集束を利用するか、またはマイクロ流体デバイスが直線チャネルにおける慣性集束を利用する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
直線チャネルにおける慣性集束が、ピンチドフロー分画プロセスまたは水力学的スプレッディングプロセスの１つを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも第１または第２の集団内の細胞粒子を第１のバイオマーカーについてアッセイする工程をさらに含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
第１のバイオマーカーの存在ががんを示すか、または第１のバイオマーカーが免疫細胞マーカーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、次世代シーケンシングを用いてシーケンシングされるか、または第１および第２の細胞粒子集団のそれぞれが独立して、フローサイトメトリーを用いて分析される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
第１および第２の細胞粒子集団が、患者についてのマッチングした腫瘍試料と正常試料を提供し、マッチングした腫瘍試料と正常試料が、体細胞突然変異、コピー数多型、または他の遺伝子変化を同定するために分析されてもよい、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
第１および第２の細胞粒子集団を、ＲＮＡバイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカーについて分析することをさらに含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
2020516890.tif 000029
2020516890.tif 000030
2020516890.tif 000031
2020516890.tif 000032
2020516890.tif 000033