(57)【要約】  本発明は、膵臓癌関連病態を診断または判定するための方法であって、（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの、試験試料中の存在および／または量を測定することによって試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、を含むまたはそれらからなり、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、個体における膵臓癌関連疾患を示す、方法、膵臓癌関連病態を判定するための使用および方法、ならびにそれに使用するためのアレイおよびキットと一緒に、膵臓癌を治療する方法を提供する。
2020507760.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓癌関連病態を診断または判定するための方法であって、
（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、
（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量を測定するステップと、を含むまたはそれらからなり、
表Ａに定義される群から選択される前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量が、前記個体における前記膵臓癌関連病態を示す、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）における前記試料が、血液または血清である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）における前記試料が、以下のリスク群：
（ａ）膵臓癌の家族歴を有する個体、
（ｂ）初発ＩＩ型糖尿病（ｎｅｗ−ｏｎｓｅｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｙｐｅ  ＩＩ）と診断された個体、または
（ｃ）膵臓癌を示唆するもしくはそれと一致する症状を有する個体、のうちの１つに属する患者からのものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、表Ａ、パート（ｉ）および／またはパート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）の存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、
（ｉ）早期膵臓癌の診断および／または病期分類のため、
（ｉｉ）膵臓癌を有するもしくは発症するリスクのある個体を識別するため、
（ｉｉｉ）膵臓癌の診断および／または病期分類のため、
（ｉｖ）膵臓癌と慢性膵炎とを差別化するため、および／または
（ｖ）膵管内乳頭粘液性腫瘍の存在を検出するため、のものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記膵臓癌が、膵腺癌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、表Ａに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａに列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個全ての存在および／または量を測定することを含むまたはそれからなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａに列挙される前記バイオマーカーおよび補体Ｃ１ｑ（Ｃ１ｑ、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０２７４５、２７４６、および／または２７４７）、
（ｉｉ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）および／またはＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）を除く、表Ａに列挙される前記バイオマーカー、または
（ｉｉｉ）表Ａに列挙される前記バイオマーカー（ＩＬ−６およびＧＥＭを除く）およびＣ１ｑの存在および／または量、を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）が、以下のバイオマーカー：
ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、因子Ｐ、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑ（任意選択に表Ｂからの１つ以上のバイオマーカーおよび／またはＩＬ−６および／またはＧＥＭを含む）の存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｂ）が、表Ｂに列挙される１つ以上の追加のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ｂにおける前記バイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０個、または全ての存在および／または量を測定することを含むまたはそれからなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膵臓癌関連病態が、早期膵臓癌である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、Ｉ期および／またはＩＩ期膵臓癌の前記診断のためのものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙される前記バイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全て、の存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）が、表Ｃに列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ｃにおける前記バイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、または全ての存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記膵臓癌関連病態が、後期膵臓癌である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、ＩＩＩ期および／またはＩＶ期膵臓癌の前記診断のためのものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙される前記バイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全て、の存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｂ）が、表Ｄに列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ｄにおける前記バイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個、または全ての存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、膵臓癌と慢性膵炎とを差別化するためのものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙される前記バイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全ての存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）が、ＩＬ−４、Ｃ４、ＭＡＰＫ９、Ｃ１ＩＮＨ、ＶＥＧＦ、ＰＴＰＲＤ、ＫＣＣ４、ＴＮＦ−α、Ｃ１ｑ、およびＢＴＫからなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法が、膵管内乳頭粘液性腫瘍、例えば、悪性ＩＰＭＮの存在を検出するためのものである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）が、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙される前記バイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙される前記バイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全て、の存在および／または量を測定することを含むまたは測定することからなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）が、表Ａに列挙される前記バイオマーカー（例えば、タンパク質、ｍＲＮＡ、および／またはｃｔＤＮＡレベルで）の全ての存在および／または量を測定することを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）が、ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、因子Ｐ、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑの存在および／または量を測定することを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
（ｃ）１つ以上の対照試料を、
ｉ．膵臓癌に罹患していない個体、および／または
ｉｉ．膵臓癌に罹患している個体であって、試料が前記試験試料の病期と異なる病期のものであった、個体、および／または
ｉｉｉ．慢性膵炎に罹患している個体、から提供するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量を測定することによって、前記１つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、をさらに含むまたはさらにそれらからなり、
ステップ（ｂ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｄ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量と異なる場合には、前記膵臓癌関連病態が識別される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ｅ）１つ以上の対照試料を、
ｉ．膵臓癌に罹患している個体、および／または
ｉｉ．膵臓癌に罹患している個体であって、試料が前記試験試料の病期と同じ病期のものであった、個体、から提供するステップと、
（ｆ）ステップ（ｂ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量を測定することによって、前記対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、をさらに含むまたはさらにそれらからなり、
ステップ（ｂ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｆ）において測定される前記１つ以上のバイオマーカーの前記対照試料中の存在および／または量と対応する場合には、前記膵臓癌関連病態が識別される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
膵臓癌に罹患していない前記個体が、健康な個体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
膵臓癌に罹患している前記１つ以上の個体が、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭膵腺癌）、膵肉腫、悪性漿液性嚢胞腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝癌、コロイド癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌からなる群から選択される膵臓癌に罹患している、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記膵臓癌が、膵管腺癌である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、繰り返される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、使用された以前の試験試料（複数可）と異なる期間で同じ個体から採取された試験試料を用いて繰り返される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、使用された以前の試験試料（複数可）に対して１日から〜１０４週間の間、例えば、１週間から１００週間の間、１週間から〜９０週間の間、１週間から〜８０週間の間、１週間から７０週間の間、１週間から６０週間の間、１週間から５０週間の間、１週間から４０週間の間、１週間から３０週間の間、１週間から２０週間の間、１週間から１０週間の間、１週間から９週間の間、１週間から８週間の間、１週間から７週間の間、１週間から６週間の間、１週間から５週間の間、１週間から４週間の間、１週間から３週間の間、または１週間から２週間の間に採取された試験試料を用いて繰り返される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１５週、２０週、２５週、３０週、３５週、４０週、４５週、５０週、５５週、６０週、６５週、７０週、７５週、８０週、８５週、９０週、９５週、１００週、１０４週、１０５週、１１０週、１１５週、１２０週、１２５週、および１３０週からなる群からの期間毎に採取された試験試料を用いて繰り返される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記方法が、少なくとも１回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３、２４回、または２５回繰り返される、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、従来の臨床的方法を用いて前記個体において膵臓癌が診断されるまで繰り返される、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
ステップ（ｂ）が、前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）のタンパク質またはポリペプチドの発現を測定することを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、表Ａに列挙されるバイオマーカータンパク質またはポリペプチドに結合することができる１つ以上の第１の結合剤を用いて行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１の結合剤が、抗体またはその抗原結合断片を含むまたはそれからなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体またはその抗原結合断片が、組み換え抗体またはその抗原結合断片である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の結合剤が、表面上に固定される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記試験および／または対照試料（複数可）中の前記１つ以上のバイオマーカーが、検出可能部分で標識される、請求項２７〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記検出可能部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、酵素部分からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記検出可能部分が、ビオチンである、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、前記１つ以上のバイオマーカーに結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを用いて行われ、前記第２の結合剤が、検出可能部分を含む、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第２の結合剤が、抗体またはその抗原結合断片を含むまたはそれからなる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体またはその抗原結合断片が、組み換え抗体またはその抗原結合断片である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体またはその抗原結合断片が、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、免疫グロブリン分子の結合ドメインからなる群から選択される、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記検出可能部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、酵素部分からなる群から選択される、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記検出可能部分が、蛍光部分（例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、例えば、Ａｌｅｘａ６４７）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記方法が、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を含むまたはそれからなる、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）が、アレイを用いて行われる、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記アレイが、マクロアレイ、マイクロアレイ、ナノアレイからなる群から選択される、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記方法が、
（ｉ）前記試料中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
（ｉｉ）前記ビオチン標識タンパク質を、その表面上の離散した位置に固定化された複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させることであって、前記ｓｃＦｖが、表Ａにおけるタンパク質の１つ以上に対して特異性を有する、接触させることと、
（ｉｉｉ）（前記ｓｃＦｖ上に固定化された）前記ビオチン標識タンパク質を、蛍光色素を含むストレプトアビジン複合体と接触させることと、
（ｉｖ）前記アレイ表面上の離散した位置にある前記色素の存在を検出することと、を含み、
前記アレイ表面上の前記色素の発現が、前記試料における表Ａからのバイオマーカーの発現を示す、請求項３７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）が、前記１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸分子が、ｍＲＮＡ分子である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記核酸分子が、ＤＮＡ分子である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記核酸分子が、ｃＤＮＡまたはｃｔＤＮＡ分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することが、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を用いて行われる、請求項５６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
ステップ（ｂ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することが、ＤＮＡマイクロアレイを用いて判定される、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において前記１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することが、各々個別に表Ａに識別される前記バイオマーカーの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる１つ以上の結合部分を用いて行われる、請求項５６〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上の結合部分が、各々核酸分子を含むまたはそれからなる、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記１つ以上の結合部分が、各々ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯを含むまたはそれからなる、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記１つ以上の結合部分が、各々ＤＮＡを含むまたはそれからなる、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記１つ以上の結合部分が、５〜１００ヌクレオチド長、例えば、１５〜３５ヌクレオチド長である、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記結合部分が、検出可能部分を含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記検出可能部分が、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記検出可能部分が、放射性原子を含むまたはそれからなる、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記放射性原子が、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記結合部分の前記検出可能部分が、蛍光部分である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、乳汁、胆汁、および尿からなる群から選択される、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される前記試料が、未分画血液、血漿、および血清からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される前記試料が、血清である、請求項７２または７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって判定される、前記方法の予測精度が、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または少なくとも０．９９である、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって判定される、前記方法の予測精度が、少なくとも０．７０である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記診断を確認または確立するために、１つ以上のさらなる臨床調査（生検試料の試験および／または前記患者のインビボイメージングなど）をさらに含む、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記個体が膵臓癌と診断された場合には、前記方法が、前記個体に膵臓癌療法を提供するステップ（ｇ）を含む、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記膵臓癌療法が、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、化学免疫療法、熱化学療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記膵臓癌療法が、化学療法（例えば、ゲムシタビンおよび／または５−フルオロウラシル）と組み合わされた（例えば、膵頭部を切除するためのＷｈｉｐｐｌｅ法または膵全摘術を用いる）膵臓の全部または一部の外科的切除を含むまたはそれからなる、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
個体からの、表Ａに定義される１つ以上のバイオマーカーのタンパク質および／または核酸試料中の存在を検出するための１つ以上の薬剤を含む、個体における膵臓癌の存在またはそれを有するリスクを判定するためのアレイ。
【請求項８２】
表Ａに定義される前記１つ以上のバイオマーカーの試料中の存在を検出するための前記１つ以上の薬剤が、請求項３９〜４２または６３〜７１のいずれか一項に定義される１つ以上の結合剤である、請求項８１に記載のアレイ。
【請求項８３】
前記アレイが、表Ａに定義される前記バイオマーカーの全てに結合することができる薬剤を含む、請求項８１または８２に記載のアレイ。
【請求項８４】
前記アレイが、以下のバイオマーカー：
ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、因子Ｐ、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑ
（任意選択に表Ｂからの１つ以上のバイオマーカーおよび／またはＩＬ−６および／またはＧＥＭを含む）に結合することができる薬剤を含む、請求項８１または８２に記載のアレイ。
【請求項８５】
前記アレイが、前記タンパク質レベルで前記バイオマーカーの全てに結合することができる抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項８６】
前記アレイが、表７に識別される前記抗体の１つ以上を含む、請求項８５記載のアレイ。
【請求項８７】
前記アレイが、表８における前記抗体の全てを含むまたは全てからなる、請求項８５に記載のアレイ。
【請求項８８】
前記アレイが、ｍＲＮＡおよび／またはＤＮＡレベルで前記バイオマーカーの全てに結合することができる薬剤を含む、請求項８１〜８４のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項８９】
陽性対照試料（ウシ血清アルブミンなど）をさらに含む、請求項８１〜８８のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項９０】
陰性対照試料（リン酸緩衝食塩水など）をさらに含む、請求項８１〜８９のいずれか一項に記載のアレイ。
【請求項９１】
個体における膵臓癌の存在またはそれを有するリスクを判定するためのバイオマーカーとしての、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの使用。
【請求項９２】
前記１つ以上のバイオマーカーが、以下のバイオマーカー：
ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、因子Ｐ、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑ
（任意選択に表Ｂからの１つ以上のバイオマーカーならびにＩＬ−６およびＧＥＭを含む）を含む、請求項９１に記載の使用。
【請求項９３】
表Ａに定義される前記バイオマーカーの全てが、個体における膵臓癌の存在を判定するための診断シグネチャーとして一緒に使用される、請求項９１または９２に記載の使用。
【請求項９４】
（ａ）請求項８１〜９０のいずれか一項に記載のアレイ、またはそれを作製するための構成要素と、
（ｂ）請求項１〜８０のいずれか一項に定義される前記方法を行うための指示と、を含む、膵臓癌の存在またはそれを有するリスクを判定するためのキット。
【請求項９５】
（ａ）請求項１〜８０のいずれか一項に定義される前記方法に従って膵臓癌を診断するステップと、
（ｂ）個体に膵臓癌療法を提供するステップと、を含む、前記個体における膵臓癌を治療する方法。
【請求項９６】
ステップ（ａ）が、前記診断を確認または確立するために、１つ以上のさらなる臨床試験（生検試料の試験および／または前記患者のインビボイメージングなど）をさらに含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記膵臓癌療法が、外科手術（例えば、切除）、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および熱化学療法からなる群から選択される、請求項９５または９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記膵臓癌療法が、化学療法（例えば、ゲムシタビンおよび／または５−フルオロウラシル）と組み合わされた（例えば、膵頭部を切除するためのＷｈｉｐｐｌｅ法または膵全摘術を用いる）膵臓の全部または一部の外科的切除を含む、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
実質的に本明細書に記載されるように個体における膵臓癌の存在を判定するための方法または使用。
【請求項１００】
実質的に本明細書に記載されるように個体における膵臓癌の存在を判定するためのアレイまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膵臓癌関連病態（膵臓癌の存在、膵臓癌のリスク、膵臓癌の病期、および／または膵管内乳頭粘液性腫瘍などの関連病変の存在など）を判定するためのインビトロ方法、ならびにそのような方法における使用のためのアレイおよびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の発生率は増加しており、世界中で３３０，４００人の患者の死因となっている１。ＰＤＡＣは、５年生存率が１０％未満の最も致命的な癌の１つである２−４。２０３０年に、ＰＤＡＣは癌の死因の第２位になると考えられている５。この悲惨な展開の裏にある１つの要因は、患者の約１５％のみが切除可能な腫瘍を呈するとき、診断遅延をもたらすびまん性症状である２−４、６、７。結果として、外科的切除がＰＤＡＣのための唯一の潜在的な治癒的治療であるので、より早期の検出が必要とされる。これと一致して、限局性腫瘍を切除することができる場合、５年生存率は４３％（ＩＩ期）から５０％超（Ｉ期）まで増加することが示されている８。膵臓腫瘍はさらに、臨床診断の６ヶ月前の無症候性期で切除可能であると報告されている９、１０。ＣＤＫＮ２Ａ突然変異を保有する無症候性高リスク患者の最近の監視研究は、７５％の切除率および２４％の５年生存率をもたらし、散発性ＰＤＡＣ患者と比較してはるかに改善されている１１。まとめると、より早期の診断はＰＤＡＣを有する患者の生存率の増加をもたらし１２、１３、無症候性高リスク患者は効果的な監視から恩恵を受ける１４と考えるのが合理的である。
【０００３】
これまでＰＤＡＣについて最も評価されているバイオマーカー、血清ＣＡ１９−９は、いくつかの他の徴候における上昇したレベルでの、不適切な特異性、および遺伝子型がルイスａ−ｂ−である患者（人口の５％）における完全な不在に悩まされている。結果として、単独でのＣＡ１９−９の使用は、スクリーニング１５に、または再発の証拠１６としては推奨されていないが、例えば、外科的切除１７後の疾患モニタリングには推奨されている。したがって、このアプローチは、ＣＡ１９−９との組み合わせ２４、２５においても、改善された感度および特異性をもたらすので、癌診断の分野は、診断２０、２１および診断前試料２２、２３の両方におけるマーカーのマルチパラメータ分析１８、１９にますます注目している。実際に、免疫調節および癌関連タンパク質バイオマーカーの組み合わせは、後期ＩＩＩ／ＩＶ期ＰＤＡＣ患者と健康な対照とを区別することができることが実証されている２６、２７。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｔｏｒｒｅ  ＬＡ，Ｂｒａｙ  Ｆ，Ｓｉｅｇｅｌ  ＲＬ，Ｆｅｒｌａｙ  Ｊ，Ｌｏｒｔｅｔ−Ｔｉｅｕｌｅｎｔ  Ｊ，Ｊｅｍａｌ  Ａ．Ｇｌｏｂａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１２．ＣＡ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ．２０１５；６５（２）：８７−１０８．
【非特許文献２】Ｋａｍｉｓａｗａ  Ｔ，Ｗｏｏｄ  ＬＤ，Ｉｔｏｉ  Ｔ，Ｔａｋａｏｒｉ  Ｋ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ．２０１６；３８８（１００３９）：７３−８５．
【非特許文献３】Ｒａｈｉｂ  Ｌ，Ｆｌｅｓｈｍａｎ  ＪＭ，Ｍａｔｒｉｓｉａｎ  ＬＭ，Ｂｅｒｌｉｎ  ＪＤ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  Ｍｅａｎｉｎｇｆｕｌ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｉａｌｓ：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ．ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６；２（９）：１２０９−１６．
【非特許文献４】Ｒｙａｎ  ＤＰ，Ｈｏｎｇ  ＴＳ，Ｂａｒｄｅｅｓｙ  Ｎ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４；３７１（２２）：２１４０−１．
【非特許文献５】Ｒａｈｉｂ  Ｌ，Ｓｍｉｔｈ  ＢＤ，Ａｉｚｅｎｂｅｒｇ  Ｒ，Ｒｏｓｅｎｚｗｅｉｇ  ＡＢ，Ｆｌｅｓｈｍａｎ  ＪＭ，Ｍａｔｒｉｓｉａｎ  ＬＭ．Ｐｒｏｊｅｃｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｄｅａｔｈｓ  ｔｏ  ２０３０：ｔｈｅ  ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ｔｈｙｒｏｉｄ，ｌｉｖｅｒ，ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｓ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１４；７４（１１）：２９１３−２１．
【非特許文献６】Ｓｏｈｎ  ＴＡ，Ｙｅｏ  ＣＪ，Ｃａｍｅｒｏｎ  ＪＬ，Ｋｏｎｉａｒｉｓ  Ｌ，Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ，Ａｂｒａｍｓ  ＲＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓｅｃｔｅｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ−６１６ｐａｔｉｅｎｔｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ，ｏｕｔｃｏｍｅｓ，ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｓｕｒｇ．２０００；４（６）：５６７−７９．
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ  Ｈ，Ｗｕ  Ｘ，Ｚｈｕ  Ｆ，Ｓｈｅｎ  Ｍ，Ｔｉａｎ  Ｒ，Ｓｈｉ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｖｅｒｓｕｓ  ｏｐｅｎ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｏｄｕｏｄｅｎｅｃｔｏｍｙ．Ｓｕｒｇ  Ｅｎｄｏｓｃ．２０１６；３０（１２）：５１７３−８４．
【非特許文献８】Ｍａｔｓｕｎｏ  Ｓ，Ｅｇａｗａ  Ｓ，Ｆｕｋｕｙａｍａ  Ｓ，Ｍｏｔｏｉ  Ｆ，Ｓｕｎａｍｕｒａ  Ｍ，Ｉｓａｊｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｊａｐａｎ：２０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ．Ｐａｎｃｒｅａｓ．２００４；２８（３）：２１９−３０．
【非特許文献９】Ｇａｎｇｉ  Ｓ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＪＧ，Ｎａｔｈａｎ  ＭＡ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ＪＡ，Ｈａｒｍｓｅｎ  ＷＳ，Ｃｒｏｗｎｈａｒｔ  ＢＳ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｍｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｓｅｅｎ  ｏｎ  ＣＴ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＴ  ｓｃａｎｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｅｆｏｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＡＪＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ．２００４；１８２（４）：８９７−９０３．
【非特許文献１０】Ｐｅｌａｅｚ−Ｌｕｎａ  Ｍ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  ＪＧ，Ｃｈａｒｉ  ＳＴ．Ｒｅｓｅｃｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｅｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ：ａ  ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ＣＴ  ｓｃａｎｓ  ａｎｄ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｖａｌｕｅｓ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００７；１０２（１０）：２１５７−６３．
【非特許文献１１】Ｖａｓｅｎ  Ｈ，Ｉｂｒａｈｉｍ  Ｉ，Ｐｏｎｃｅ  ＣＧ，Ｓｌａｔｅｒ  ＥＰ，Ｍａｔｔｈａｉ  Ｅ，Ｃａｒｒａｔｏ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｅｎｅｆｉｔ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  Ｈｉｇｈ−Ｒｉｓｋ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ：Ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｆｏｌｌｏｗ−Ｕｐ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｆｒｏｍ  Ｔｈｒｅｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｃｅｎｔｅｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６；３４（１７）：２０１０−９．
【非特許文献１２】Ｈａｎａｄａ  Ｋ，Ｏｋａｚａｋｉ  Ａ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｎ，Ｉｚｕｍｉ  Ｙ，Ｍｉｎａｍｉ  Ｔ，Ｉｋｅｍｏｔｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１５；２９（６）：９２９−３９．
【非特許文献１３】Ｃｈａｒｉ  ＳＴ，Ｋｅｌｌｙ  Ｋ，Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ  ＭＡ，Ｔｈａｙｅｒ  ＳＰ，Ａｈｌｑｕｉｓｔ  ＤＡ，Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ＤＫ，ｅｔ  ａｌ．Ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒａｄｉｃ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ：ｓｕｍｍａｔｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｐａｎｃｒｅａｓ．２０１５；４４（５）：６９３−７１２．
【非特許文献１４】Ｂｒｅｎｔｎａｌｌ  ＴＡ．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅａｒｌｉｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２０１６；３４（１７）：１９７３−４．
【非特許文献１５】Ｏｋａｎｏ  Ｋ，Ｓｕｚｕｋｉ  Ｙ．Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２０１４；２０（３２）：１１２３０−４０．
【非特許文献１６】Ｌｏｃｋｅｒ  ＧＹ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓ，Ｈａｒｒｉｓ  Ｊ，Ｊｅｓｓｕｐ  ＪＭ，Ｋｅｍｅｎｙ  Ｎ，Ｍａｃｄｏｎａｌｄ  ＪＳ，ｅｔ  ａｌ．ＡＳＣＯ２００６ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６；２４（３３）：５３１３−２７．
【非特許文献１７】Ｇａｌｌｉ  Ｃ，Ｂａｓｓｏ  Ｄ，Ｐｌｅｂａｎｉ  Ｍ．ＣＡ１９−９：ｈａｎｄｌｅ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｅ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ．２０１３；５１（７）：１３６９−８３．
【非特許文献１８】Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ：ｍｏｖｉｎｇ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１７；１７（３）：１９９−２０４．
【非特許文献１９】Ｈａｎａｓｈ  ＳＭ，Ｐｉｔｔｅｒｉ  ＳＪ，Ｆａｃａ  ＶＭ．Ｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ．２００８；４５２（７１８７）：５７１−９．
【非特許文献２０】Ｒａｄｏｎ  ＴＰ，Ｍａｓｓａｔ  ＮＪ，Ｊｏｎｅｓ  Ｒ，Ａｌｒａｗａｓｈｄｅｈ  Ｗ，Ｄｕｍａｒｔｉｎ  Ｌ，Ｅｎｎｉｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｐａｎｅｌ  ｉｎ  Ｕｒｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１５；２１（１５）：３５１２−２１．
【非特許文献２１】Ｓｈａｗ  ＶＥ，Ｌａｎｅ  Ｂ，Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ  Ｃ，Ｃｏｘ  Ｔ，Ｇｒｅｅｎｈａｌｆ  Ｗ，Ｈａｌｌｏｒａｎ  ＣＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１４；１３：１１４．
【非特許文献２２】Ｍａｙｅｒｓ  ＪＲ，Ｗｕ  Ｃ，Ｃｌｉｓｈ  ＣＢ，Ｋｒａｆｔ  Ｐ，Ｔｏｒｒｅｎｃｅ  ＭＥ，Ｆｉｓｋｅ  ＢＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｒａｎｃｈｅｄ−ｃｈａｉｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｓ  ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｖｅｎｔ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０１４；２０（１０）：１１９３−８．
【非特許文献２３】Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ  Ｃ，Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＶＬ，Ｅｖａｎｓ  Ａ，Ｏｌｄｆｉｅｌｄ  Ｌ，Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＲＥ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＤＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１Ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｕｐ  ｔｏ  ２４Ｍｏｎｔｈｓ  Ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ：Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｕｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６；２２（７）：１７３４−４３．
【非特許文献２４】Ｂｒａｎｄ  ＲＥ，Ｎｏｌｅｎ  ＢＭ，Ｚｅｈ  ＨＪ，Ａｌｌｅｎ  ＰＪ，Ｅｌｏｕｂｅｉｄｉ  ＭＡ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐａｎｅｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１１；１７（４）：８０５−１６．
【非特許文献２５】Ｋｉｍ  Ｊ，Ｂａｍｌｅｔ  ＷＲ，Ｏｂｅｒｇ  ＡＬ，Ｃｈａｆｆｅｅ  ＫＧ，Ｄｏｎａｈｕｅ  Ｇ，Ｃａｏ  ＸＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｒａｌｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−２  ａｎｄ  ＣＡ１９−９  ｂｌｏｏｄ  ｍａｒｋｅｒｓ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１７；１２；９（３９８）ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｈ５５８３
【非特許文献２６】Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ  ＡＳ，Ｍａｌａｔｓ  Ｎ，Ｓａｌｌ  Ａ，Ｒｅａｌ  ＦＸ，Ｐｏｒｔａ  Ｍ，Ｓｋｏｏｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｕｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．２０１５；２０１５：５８７２５０．
【非特許文献２７】Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ａ，Ｓｅｇｅｒｓｖａｒｄ  Ｒ，Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｒ，Ｌｏｈｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１２；７２（１０）：２４８１−９０．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特に疾患の初期において、ＰＤＡＣなどの膵臓癌を診断するための改善された方法に対する必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
したがって、本発明の第１の態様は、膵臓癌関連病態を診断または判定するための方法であって、
（ａ）試験される個体からの試料を提供するステップと、
（ｂ）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカー（複数可）の試験試料中の存在および／または量を測定することによって試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、を含むかまたはそれらからなり、
表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、個体における膵臓癌関連病態を示す、方法を提供する。
【０００７】
【表１−１】
2020507760.tif 000003
【表１−２】
2020507760.tif 000004
【０００８】
よって、一実施形態では、方法は、試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判定することを含み、それは試料が得られる個体に関して診断に達することを可能にする。
【０００９】
本発明の方法は、膵臓癌関連病態を有することが疑われる、または発症するリスクがある任意の個体からの試料を試験するのに適している。例えば、個体は、膵臓癌を有するまたは発症するリスクが高い以下の群：
（ｉ）膵臓癌の家族歴（例えば、母親または父親側いずれかの１または２世代以内）を有する個体、
（ｉｉ）初発糖尿病（例えば、ＩＩ型）と診断された個体、特に５０歳以上の個体、ならびに
（ｉｉｉ）膵臓癌を示唆するまたはそれと一致する症状、例えば、上腹部または上背部の疼痛、食欲不振、体重減少、黄疸（黄色の皮膚および目、ならびに暗色尿）、消化不良、悪心、嘔吐、および／または極度の疲労（倦怠感）を有する個体の１つからのものであり得る。
【００１０】
「膵臓癌関連病態」によって、我々は、膵臓癌の存在自体、膵臓癌を有するまたは発症するリスク、膵臓癌病期、および膵管内乳頭粘液性腫瘍（下記参照）などの関連病変の存在を含む。特に、我々は、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の存在および／または病期を含む。
【００１１】
よって、一実施形態では、本発明の方法は、ＰＤＡＣを発症する増加したリスクを有する個体における膵臓異常の検出についての定性的結果を提供する。
【００１２】
特定の実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）早期膵臓癌の診断および／または病期分類、ならびに
（ｂ）後期膵臓癌の診断および／または病期分類を可能にする。
【００１３】
有利には、本発明の方法はまた、個体における膵臓癌と慢性膵炎との区別を可能にする。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明の方法は、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）の個体における存在を検出するために使用され得る。そのような病変は、治療せず放置される場合、浸潤癌に進行し得る。結果として、これは前悪性病変を除去する機会を提供し得るので、これらの病変を検出することが重要である。一実施形態では、ＩＰＭＮ病変は悪性である。
【００１５】
「バイオマーカー」によって、我々は、その測定が膵臓癌の診断に有用な情報を提供することができる、任意の自然に発生する生物学的分子、またはその成分もしくは断片を含む。よって、表Ａの文脈において、バイオマーカーは、タンパク質、またはそのポリペプチド断片もしくは炭水化物部分（または、シアリルルイスｘの場合、炭水化物部分自体）であり得る。あるいは、バイオマーカーは、タンパク質またはその部分をコードするｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または循環腫瘍ＤＮＡ分子などの核酸分子であり得る。
【００１６】
「診断」によって、我々は、個体における病態の存在または不在を判定すること（例えば、個体が初期膵臓癌または後期膵臓癌に罹患しているか否かを判定すること）を含む。
【００１７】
「病期分類」によって、我々は、膵臓癌の病期を判定すること、例えば、膵臓癌がＩ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期、またはＩＶ期（例えば、Ｉ期、ＩＩ期、Ｉ−ＩＩ期、ＩＩＩ−ＩＶ期、またはＩ−ＩＶ期）であるかを判定することを含む。
【００１８】
「早期膵臓癌」（または「初期膵臓癌」）によって、我々は、例えば、米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）ＴＮＭシステムによって決定されるように、Ｉ期および／またはＩＩ期膵臓癌を含むかまたはそれらからなる膵臓癌を含むかまたは意味する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｏｒｇ／ｃａｎｃｅｒ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒ／ｄｅｔａｉｌｅｄｇｕｉｄｅ／ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ−ｃａｎｃｅｒ−ｓｔａｇｉｎｇおよびＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（７ｔｈ  ｅｄ．），２０１１，Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒを参照されたい）。
【００１９】
ＴＮＭ癌病期分類システムは、３つの重要な情報に基づく。
●Ｔは、主要（原発性）腫瘍のサイズならびにそれが膵臓の外側および近くの臓器に増殖したかを表す。
●Ｎは、近くの（局所的）リンパ節への拡散を表す。
●Ｍは、癌が体の他の臓器に転移（拡散）しているかを示す。（膵臓癌拡散の最も一般的な部位は、肝臓、肺、および腹膜−消化器周囲の空間である。）
【００２０】
数字または文字は、Ｔ、Ｎ、およびＭの後に現れ、これらの因子の各々についての詳細を提供する。
【００２１】
Ｔカテゴリー
ＴＸ：主な腫瘍は評価できない。
Ｔ０：原発性腫瘍の証拠はない。
Ｔｉｓ：上皮内癌（腫瘍は膵管細胞の最上層に限局している）。（膵臓腫瘍はこの病期ではほとんど見られない。）
Ｔ１：癌は依然として膵臓内にあり、幅２センチメートル（ｃｍ）（約３／４インチ）以下である。
Ｔ２：癌は依然として膵臓内にあるが、幅２ｃｍより大きい。
Ｔ３：癌は膵臓の外側に近くの周囲組織まで増殖しているが、大血管または神経まで増殖していない。
Ｔ４：癌は膵臓を越えて近くの大血管または神経まで増殖している。
【００２２】
Ｎカテゴリー
ＮＸ：近くの（局所）リンパ節は評価できない。
Ｎ０：癌は近くのリンパ節まで拡散していない。
Ｎ１：癌は近くのリンパ節まで拡散している。
【００２３】
Ｍカテゴリー
Ｍ０：癌は遠位リンパ節（膵臓近くのものを除く）までまたは肝臓、肺、脳などの遠位臓器まで拡散していない。
Ｍ１：癌は遠位リンパ節または遠位臓器まで拡散している。
【００２４】
Ｔ、Ｎ、およびＭカテゴリーが決定されると、この情報は、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶ（時には文字が続く）の全体的な病期に割り当てるために組み合わされる。このプロセスは、病期群分けと呼ばれる。
【００２５】
０（Ｔｉｓ、Ｎ０、Ｍ０）期：腫瘍は、膵管細胞の最上層に限局しており、より深部の組織に浸潤していない。それは膵臓の外側に拡散していない。これらの腫瘍は、上皮内膵臓癌と呼ばれることがある。
ＩＡ（Ｔ１、Ｎ０、Ｍ０）期：腫瘍は、膵臓に限局しており、幅２ｃｍ以下である（Ｔ１）。それは近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）まで拡散していない。
ＩＢ（Ｔ２、Ｎ０、Ｍ０）期：腫瘍は、膵臓に限局しており、幅２ｃｍより大きい（Ｔ２）。それは近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）まで拡散していない。
ＩＩＡ（Ｔ３、Ｎ０、Ｍ０）期：腫瘍は膵臓の外側に増殖しているが、大血管または神経まで増殖していない（Ｔ３）。それは近くのリンパ節（Ｎ０）または遠位部位（Ｍ０）まで拡散していない。
ＩＩＢ（Ｔ１−３、Ｎ１、Ｍ０）期：腫瘍は膵臓に限局しているか、または膵臓の外側に増殖しているが、大血管または神経まで増殖していない（Ｔ１−Ｔ３）。それは近くのリンパ節まで拡散している（Ｎ１）が、遠位部位まで拡散していない（Ｍ０）。
ＩＩＩ（Ｔ４、任意のＮ、Ｍ０）期：腫瘍は膵臓の外側に近くの大血管または神経まで増殖している（Ｔ４）。それは近くのリンパ節まで拡散していてもしていなくてもよい（任意のＮ）。それは遠位部位まで拡散していない（Ｍ０）。
ＩＶ（任意のＴ、任意のＮ、Ｍ１）期：癌は遠位部位まで拡散している（Ｍ１）。
【００２６】
あるいはまたは加えて、「早期膵臓癌」（または「初期膵臓癌」）によって、我々は、無症候性膵臓癌を含むかまたは意味する。膵臓癌の一般的な主症状は、（膵頭部の腫瘍についての）黄疸、腹痛、体重減少、脂肪便、および初発糖尿病を含む。例えば、膵臓癌は、症状（例えば、一般的な症状）が観察されるまたは観察可能になる少なくとも１週間前に、例えば、症状が観察されるまたは観察可能になる２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、１２ヶ月以上、１８ヶ月以上、２年以上、３年以上、４年以上、または５年以上前に存在し得る。
【００２７】
よって、「早期膵臓癌」（または「初期膵臓癌」）によって、我々は、従来の臨床方法によって診断されるには不十分なサイズおよび／または発達段階の膵臓癌を含む。例えば、「早期膵臓癌」または「初期膵臓癌」によって、我々は、膵臓癌が従来の臨床方法によって診断されるまたは診断可能になる少なくとも１週間前に、例えば、膵臓癌が従来臨床方法によって診断されるまたは診断可能になる２週間以上、３週間以上、４週間以上、５週間以上、６週間以上、７週間以上、８週間以上、３ヶ月以上、４ヶ月以上、５ヶ月以上、６ヶ月以上、７ヶ月以上、８ヶ月以上、９ヶ月以上、１０ヶ月以上、１１ヶ月以上、１２ヶ月以上、１８ヶ月以上、２年以上、３年以上、４年以上、または５年以上前に存在する膵臓癌を含むかまたは意味する。
【００２８】
臨床的な膵臓癌診断のための現代のベストプラクティスは、当業者には周知であろうが、詳細な説明については、本明細書に参照により組み込まれるＤｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，‘Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ’Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５）：ｖ５６−ｖ６８を参照されたい。
【００２９】
従来の臨床診断（例えば、「従来の臨床方法によって診断される」）とは、（例えば、腹部および場合によっては局所リンパ節の）ＣＴスキャン、超音波、内視鏡超音波、生検（組織病理学）、および／または身体検査を含む。一実施形態では、「従来の臨床診断」（および同様のもの）によって、我々は、Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５、上記に記載される膵臓癌診断手順を含む。
【００３０】
従来の臨床診断（および同様のもの）は、体液（血液、血清、間質液、リンパ液、尿、粘液、唾液、痰、汗など）および／または組織中に存在する分子バイオマーカーの使用を含むかまたは除外し得る。
【００３１】
早期膵臓癌が切除可能な膵臓癌であり得ることは当業者には理解されるであろう。
【００３２】
「切除可能な膵臓癌」によって、我々は、膵臓癌が外科手術により切除することができる（および／またはそう考えられる）（すなわち、切除可能である）腫瘍を含むかまたはそれからなることを含むかまたは意味する。例えば、膵臓癌は、膵臓に限定され得る（すなわち、それは膵臓を超えて拡大しない、および／または転移していない）。
【００３３】
一実施形態では、早期膵臓癌は、全寸法３０ｍｍ以下の、例えば、全寸法２９ｍｍ、２８ｍｍ、２７ｍｍ、２６ｍｍ、２５ｍｍ、２４ｍｍ、２２ｍｍ、２１ｍｍ、２０ｍｍ、１９ｍｍ、１８ｍｍ、１７ｍｍ、１６ｍｍ、１５ｍｍ、１４ｍｍ、１３ｍｍ、１２ｍｍ、１１ｍｍ、１０ｍｍ、９ｍｍ、８ｍｍ、７ｍｍ、６ｍｍ、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、１ｍｍ以下、または０．１ｍｍに等しい腫瘍を含む（すなわち、この実施形態では、早期膵臓癌を有する個体は、任意の寸法３０ｍｍ超の膵臓癌腫瘍を含まない）。あるいはまたは加えて、全寸法３０ｍｍ以下の膵臓癌腫瘍は、一寸法少なくとも２ｍｍである。あるいはまたは加えて、全寸法３０ｍｍ以下の膵臓癌腫瘍は、全寸法少なくとも２ｍｍである。
【００３４】
当業者によって、本発明の方法は、典型的には、初期診断を提供するために、例えば、膵臓癌を有するまたは発症するリスクのある個体を識別するために使用され、その後診断を確認するためにさらなる臨床調査（生検試験、インビボイメージングなど）が行われ得ることが理解されるであろう。
【００３５】
しかしながら、あるいは、本発明の方法は、独立型診断試験として使用され得る。
【００３６】
「試験される試料」、「試験試料」、または「対照試料」によって、我々は、個体から採取または誘導される組織または体液試料を含み、試料は、内因性タンパク質および／または核酸分子および／または炭水化物部分を含む。好ましくは試験される試料は、哺乳動物から提供される。哺乳動物は、任意の飼育または農用動物であり得る。好ましくは、哺乳動物は、ラット、マウス、モルモット、ネコ、イヌ、ウマ、または霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
【００３７】
本発明の方法で試験される試料は、血液（分画または未分画）、血漿、形質細胞、血清、組織細胞、または等しく好ましい、細胞もしくは組織試料由来のタンパク質もしくは核酸を含むかまたはそれからなる細胞、組織、または体液試料（またはその誘導体）であり得る。試験および対照試料は同じ種に由来するべきであることが理解されるであろう。好ましくは、試験および対照試料は、年齢、性別、および／または生活様式について適合される。
【００３８】
一実施形態では、試料は、膵臓組織試料である。代替または追加の実施形態では、試料は、膵臓細胞の試料である。
【００３９】
あるいは、試料は、血液または血清試料であり得る。
【００４０】
本発明の方法において、ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａに列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、または２９個全ての存在および／または量を測定することを含むかまたはそれからなる。
【００４１】
よって、ステップ（ｂ）は、ディスクスラージホモログ１（ＤＬＧ１）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外し得る。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、タンパク質キナーゼＣゼータ型（ＰＲＫＣＺ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、補体Ｃ３（Ｃ３）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤（Ｃ１ＩＮＨ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、インターロイキン−４（ＩＬ−４）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、インターロイキンガンマ（ＩＦＮγ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、補体Ｃ５（Ｃ５）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、タンパク質−チロシンキナーゼ６（ＰＴＫ６）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、カルシニューリンＢ相同タンパク質１（ＣＨＰ１）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、ＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、アプラタキシンおよびＰＮＫ様因子（ＡＰＬＦ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、カルシウム／カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＶ型（ＣＡＭＫ４）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、膜結合グアニル酸キナーゼ、ＷＷ、およびＰＤＺドメイン含有タンパク質１（ＭＡＧＩ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、セリン／トレオニン−タンパク質キナーゼＭＡＲＫ１（ＭＡＲＫ１）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、ドメインジンクフィンガータンパク質８（ＰＲＤＭ８）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ１）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、サイクリン依存性キナーゼ２（ＣＤＫ２）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、ＨＡＤＨ２タンパク質（ＨＡＤＨ２）の発現を測定することを含む、それからなる、また���それを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、補体Ｃ４（Ｃ４）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、視覚系ホメオボックス２（ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、インターロイキン−１３（ＩＬ−１３）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、ルイスｘ（ルイスｘ／ＣＤ１５）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、ミオメシン−２（ＭＹＯＭ２）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、プロペルジン（Ｐ因子）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、シアリルルイスｘ（シアリルルイスｘ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。あるいはまたは加えて、ステップ（ｂ）は、リンホトキシン−アルファ（ＴＮＦβ）の発現を測定することを含む、それからなる、またはそれを除外する。
【００４２】
よって、ステップ（ｂ）は、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙されるバイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００４３】
さらなる好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、以下のバイオマーカー（複数可）：
（ｉ）表Ａに列挙されるバイオマーカー、および補体Ｃ１ｑ（Ｃ１ｑ、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ  ＩＤ  Ｐ０２７４５、２７４６、および／または２７４７）、
（ｉｉ）インターロイキン−６（ＩＬ−６）および／またはＧＴＰ結合タンパク質ＧＥＭ（ＧＥＭ）を除く、表Ａに列挙されるバイオマーカー、または
（ｉｉｉ）表Ａに列挙されるバイオマーカー（ＩＬ−６およびＧＥＭを除く）およびＣ１ｑの１つ以上の存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００４４】
この意味では、補体Ｃ１ｑは、表Ａ、パート（ｉｖ）内の追加のバイオマーカーとみなされ得、および／またはＩＬ−６およびＧＥＭは、（表Ａではなく）表Ｂ内のバイオマーカーとみなされ得る。
【００４５】
よって、本発明の全ての態様の代替実施形態では、表Ａにおけるバイオマーカーへの本明細書における言及は、表Ａに列挙されるバイオマーカー（ＩＬ−６およびＧＥＭを除く）およびＣ１ｑへの言及であるとみなされ得る。同様に、表Ｂにおけるバイオマーカーへの本明細書における言及は、ＩＬ−６およびＧＥＭを含むがＣ１ｑを除く、表Ｂに列挙されるバイオマーカーへの言及であるとみなされ得る。
【００４６】
有利には、本発明の第１の態様の方法では、ステップ（ｂ）は、試験試料中の以下のバイオマーカー：
ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、Ｐ因子、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑ（任意選択に表Ｂからの１つ以上のバイオマーカーおよび／またはＩＬ−６および／またはＧＥＭを含む、下記を参照されたい）
の全ての試験試料中の存在および／または量を測定することによって試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判定することを含むかまたはそれからなり、そのバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量は、個体における膵臓癌関連病態を示す。
【００４７】
ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙されていない１つ以上のさらなるバイオマーカーの存在および／または量を測定することを追加で含み得、さらなるバイオマーカーは、追加の診断情報を提供し得ることが理解されるであろう。
【００４８】
例えば、ステップ（ｂ）は、表Ｂに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）の存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００４９】
【表２−１】
2020507760.tif 000005
【表２−２】
2020507760.tif 000006
【表２−３】
2020507760.tif 000007
【００５０】
例えば、ステップ（ｂ）は、表Ｂにおけるバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５１】
本発明の一実施形態では、方法は、初期膵臓癌（例えば、Ｉ期および／またはＩＩ期ＰＤＡＣ対健康）の診断のためのものである。
【００５２】
例えば、ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａにおけるバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８個、または全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５３】
あるいは、または加えて、ステップ（ｂ）は、表Ｃに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ｃにおけるバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４個、または全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【表３】
2020507760.tif 000008
【００５４】
本発明の代替実施形態では、方法は、後期膵臓癌（例えば、ＩＩＩ期および／またはＩＶ期ＰＤＡＣ対健康）の診断のためのものである。
【００５５】
例えば、ステップ（ｂ）は、表Ｄに列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ｄにおけるバイオマーカーの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３個、または全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５６】
【表４】
2020507760.tif 000009
【００５７】
本発明のさらなる実施形態では、方法は、膵臓癌と慢性膵炎とを差別化するためのものである。
【００５８】
例えば、ステップ（ｂ）は、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙されるバイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００５９】
ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙されていない１つ以上のさらなるバイオマーカーの存在および／または量を測定することを追加で含み得、さらなるバイオマーカーは、追加の診断情報を提供し得ることが理解されるであろう。
【００６０】
例えば、ステップ（ｂ）は、ＩＬ−４、Ｃ４、ＭＡＰＫ９、Ｃ１ＩＮＨ、ＶＥＧＦ、ＰＴＰＲＤ、ＫＣＣ４、ＴＮＦ−α、Ｃ１ｑ、およびＢＴＫからなる群から選択される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、方法は、個体における膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）を検出するためのものである。言い換えれば、方法は、ＩＰＭＮを有する患者をＩＰＭＮを有さない個体、例えば、健康な個体と区別することを可能にし得る。一実施形態では、ＩＰＭＮ病変は、悪性である。
【００６２】
例えば、ステップ（ｂ）は、
（ｉ）表Ａ、パート（ｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉ）に列挙されるバイオマーカーの両方、および／または
（ｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７個、もしくは全て、および／または
（ｉｉｉ）表Ａ、パート（ｉｉｉ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｉｉ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６個、もしくは全て、および／または
（ｉｖ）表Ａ、パート（ｉｖ）に列挙される１つ以上のバイオマーカー（複数可）、例えば、表Ａ（ｉｖ）に列挙されるバイオマーカーのうちの少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、もしくは全ての存在および／または量を測定することを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００６３】
ステップ（ｂ）は、表Ｂ、Ｃ、および／またはＤに列挙されるような、１つ以上のさらなるバイオマーカーの存在および／または量を測定することを追加で含み得、さらなるバイオマーカーは、追加の診断情報を提供し得ることが理解されるであろう。
【００６４】
本発明の第１の態様の１つの好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）は、表Ａに列挙されるバイオマーカーの全ての存在および／または量を、例えば、タンパク質レベルで、測定することを含む。この「完全」コンセンサスバイオマーカーシグネチャーの使用は、疾患の初期を含む、任意の病期の膵臓癌（例えば、ＰＤＡＣ）の診断を可能にする。
【００６５】
当業者によって、試験される個体からの試料中のバイオマーカーを測定することに加えて、本発明の方法は、１つ以上の対照試料中のそれらの同じバイオマーカーを測定することも含み得ることが理解されるであろう。
【００６６】
よって、一実施形態では、方法は、
（ｃ）
（ｉ）膵臓癌に罹患していない個体からの１つ以上の（陰性）対照試料、および／または
（ｉｉ）膵臓癌に罹患している個体からの１つ以上の（陰性）対照試料であって、試験試料のものと異なる病期のものであった、試料、および／または
（ｉｉｉ）慢性膵炎に罹患している個体からの１つ以上の（陰性）対照試料を提供するステップと、
（ｄ）ステップ（ｂ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量を測定することによって、１つ以上の対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、をさらに含むかまたはそれらからなり、
ステップ（ｂ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｄ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量と異なる事象において、膵臓癌関連病態が識別される。
【００６７】
「対照試料中の存在および／または量と異なる」とは、試験試料中の１つ以上のバイオマーカー（複数可）の存在および／または量が１つ以上の対照試料（複数可）のそれと（または同じものを表す予め定義された参照値に対して）異なることを含む。好ましくは、試験試料中の存在および／または量は、１つ以上の対照試料（複数可）中の存在および／または量（または対照試料の平均）と、１つ以上の対照試料（複数可）（例えば、陰性対照試料）の少なくとも±５％、例えば、少なくとも±６％、±７％、±８％、±９％、±１０％、±１１％、±１２％、±１３％、±１４％、±１５％、±１６％、±１７％、±１８％、±１９％、±２０％、±２１％、±２２％、±２３％、±２４％、±２５％、±２６％、±２７％、±２８％、±２９％、±３０％、±３１％、±３２％、±３３％、±３４％、±３５％、±３６％、±３７％、±３８％、±３９％、±４０％、±４１％、±４２％、±４３％、±４４％、±４５％、±４１％、±４２％、±４３％、±４４％、±５５％、±６０％、±６５％、±６６％、±６７％、±６８％、±６９％、±７０％、±７１％、±７２％、±７３％、±７４％、±７５％、±７６％、±７７％、±７８％、±７９％、±８０％、±８１％、±８２％、±８３％、±８４％、±８５％、±８６％、±８７％、±８８％、±８９％、±９０％、±９１％、±９２％、±９３％、±９４％、±９５％、±９６％、±９７％、±９８％、±９９％、±１００％、±１２５％、±１５０％、±１７５％、±２００％、±２２５％、±２５０％、±２７５％、±３００％、±３５０％、±４００％、±５００％、または少なくとも±１０００％異なる。
【００６８】
あるいはまたは加えて、試験試料中の存在または量は、対照試料中の平均存在または量と、対照試料中の平均存在または量からの少なくとも＞１標準偏差、例えば、対照試料中の平均存在または量からの≧１．５、≧２、≧３、≧４、≧５、≧６、≧７、≧８、≧９、≧１０、≧１１、≧１２、≧１３、≧１４、または≧１５標準偏差だけ異なる。標準偏差（例えば、直接、二乗和、Ｗｅｌｆｏｒｄ）を決定するために任意の適切な手段が使用され得るが、一実施形態では、直接法（すなわち、［試料の二乗和から平均を引き、試料数で割ったもの］の平方根）を使用して標準偏差が決定される。
【００６９】
あるいはまたは加えて、「対照試料中の存在および／または量と異なる」によって、我々は、試験試料中の存在または量が統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関しないことを含む。「統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関しない」によって、我々は、試験試料中の存在または量が対照試料のそれと、＞０．００１、例えば、＞０．００２、＞０．００３、＞０．００４、＞０．００５、＞０．０１、＞０．０２、＞０．０３、＞０．０４＞０．０５、＞０．０６、＞０．０７、＞０．０８、＞０．０９、または＞０．１のｐ値で相関することを意味するまたは含む。ｚ検定、ｔ検定、スチューデントのｔ検定、ｆ検定、マン−ホイットニーＵ検定、ウィルコクソン符号順位検定、およびピアソンのカイ二乗検定を含む、当業者に知られるｐ値を決定するための任意の適切な手段を使用することができる。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法は、
（ｅ）
（ｉ）膵臓癌に罹患している個体（すなわち、陽性対照）からの１つ以上の（陽性）対照試料、および／または
（ｉｉ）膵臓癌に罹患している個体からの１つ以上の（陽性）対照試料であって、試験試料のものと同じ病期のものであった、試料を提供するステップと、
（ｆ）ステップ（ｂ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量を測定することによって、対照試料のバイオマーカーシグネチャーを判定するステップと、
をさらに含み得るか、またはさらにそれらからなり得、ステップ（ｂ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量が、ステップ（ｆ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの対照試料中の存在および／または量と対応する事象において、膵臓癌関連病態が識別される。
【００７１】
よって、本発明の方法は、ステップ（ｃ）＋（ｄ）および／またはステップ（ｅ）＋（ｆ）を含み得る。
【００７２】
「対照試料中の存在および／または量と対応する」によって、我々は、存在および／または量が陽性対照試料のそれと同じであるか、または１つ以上の陰性対照試料よりも１つ以上の陽性対照試料のそれに（または同じものを表す予め定義された参照値に対して）より近いことを含む。好ましくは、存在および／または量は、１つ以上の対照試料のそれ（または対照試料の平均）の±４０％以内、例えば、１つ以上の対照試料（例えば、陽性対照試料）の±３９％、±３８％、±３７％、±３６％、±３５％、±３４％、±３３％、±３２％、±３１％、±３０％、±２９％、±２８％、±２７％、±２６％、±２５％、±２４％、±２３％、±２２％、±２１％、±２０％、±１９％、±１８％、±１７％、±１６％、±１５％、±１４％、±１３％、±１２％、±１１％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．０５％以内、または０％以内である。
【００７３】
あるいはまたは加えて、試験試料中の存在または量の差は、異なるおよび対応するバイオマーカー発現についての標準偏差範囲が重ならない（例えば、隣接するが重ならない）ことを条件として、対照試料中の平均存在または量からの≦５標準偏差、例えば、対照試料中の平均存在または量からの≦４．５、≦４、≦３．５、≦３、≦２．５、≦２、≦１．５、≦１．４、≦１．３、≦１．２、≦１．１、≦１、≦０．９、≦０．８、≦０．７、≦０．６、≦０．５、≦０．４、≦０．３、≦０．２、≦０．１、または０標準偏差である。
【００７４】
あるいはまたは加えて、「対照試料中の存在および／または量と対応する」によって、我々は、試験試料中の存在または量が統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関することを含む。「統計的に有意な方法で対照試料中の量と相関する」によって、我々は、試験試料中の存在または量が対照試料のそれと≦０．０５、例えば、≦０．０４、≦０．０３、≦０．０２、≦０．０１、≦０．００５、≦０．００４、≦０．００３、≦０．００２、≦０．００１、≦０．０００５、または≦０．０００１のｐ値で相関することを意味するまたは含む。
【００７５】
バイオマーカーの差次的発現（上方調節または下方調節）、またはその欠如は、当業者に知られる任意の適切な手段によって判定することができる。差次的発現は、少なくとも０．０５未満（ｐ＝＜０．０５）、例えば、少なくとも＜０．０４、＜０．０３、＜０．０２、＜０．０１、＜０．００９、＜０．００５、＜０．００１、＜０．０００１、＜０．００００１、または少なくとも＜０．０００００１のｐ値に対して判定される。例えば、差次的発現は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を用いて判定され得る。
【００７６】
一実施形態では、ＳＶＭは、下記の表６に記載されるＳＶＭであるか、またはそれから誘導される。
【００７７】
当業者によって、差次的発現が単一のバイオマーカーまたは組み合わされて（すなわち、バイオマーカーシグネチャーとして）考慮される複数のバイオマーカーに関連し得ることが理解されるであろう。よって、ｐ値は、単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーの群と関連し得る。実際に、個別に考慮される場合０．０５より大きい差次的発現ｐ値を有するタンパク質は、それにもかかわらず依然として、それらの発現レベルが１つ以上の他のバイオマーカーと組み合わされて考慮される場合、本発明によるバイオマーカーとして有用であり得る。
【００７８】
添付の実施例に例示されるように、組織、血液、血清、または血漿試験試料中の特定のタンパク質の発現は、個体における膵臓癌を示し得る。例えば、単一試験試料中の特定の血清タンパク質の相対発現は、個体における膵臓癌の存在を示し得る。
【００７９】
代替または追加の実施形態では、ステップ（ｂ）において測定される１つ以上のバイオマーカーの試験試料中の存在および／または量は、ステップ（ｄ）および／または（ｆ）における測定を表す所定の参照値、すなわち、参照陰性および／または陽性対照値に対して比較され得る。
【００８０】
上記で詳述されるように、本発明の方法は、ステップ（ｂ）において試験試料中で測定される１つ以上のバイオマーカーの存在および／または量を、１つ以上の陰性または陽性対照試料中で測定することも含み得る。
【００８１】
例えば、１つ以上の陰性対照試料は、試料が得られた時点で、
（ａ）膵臓癌、例えば、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭膵腺癌）、膵肉腫、悪性漿液性嚢胞腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝癌、コロイド癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、および／または
（ｂ）非癌性膵臓疾患もしくは状態、例えば、急性膵炎、慢性膵炎、および自己免疫性膵炎、および／または
（ｃ）任意の他の疾患もしくは状態を患っていなかった個体からのものであり得る。
【００８２】
よって、陰性対照試料は、健康な個体から得ることができる。
【００８３】
同様に、１つ以上の陽性対照試料は、試料が得られた時点で、膵臓癌、例えば、腺癌（例えば、膵管腺癌または管状乳頭膵腺癌）、膵肉腫、悪性漿液性嚢胞腺腫、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝癌、コロイド癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌、および／または非癌性膵臓疾患もしくは状態、例えば、急性膵炎、慢性膵炎、および自己免疫性膵炎、および／または任意の他の疾患もしくは状態に罹患していた個体からのものであり得る。
【００８４】
本発明の第１の態様の１つの好ましい実施形態では、方法は、個体に対して繰り返される。よって、ステップ（ａ）および（ｂ）は、試験された元の試料と異なる時間に採取された同じ個体（または以前の方法の繰り返し）からの試料を用いて繰り返され得る。そのような繰り返された試験は、例えば、選択された治療計画の有効性を判定するため、および（適切な場合に）採用される代替計画を選択するため、疾患進行を評価することを可能にし得る。
【００８５】
よって、一実施形態では、方法は、使用された以前の試験試料（複数可）に対して１日〜１０４週、例えば、１週〜１００週、１週〜９０週、１週〜８０週、１週〜７０週、１週〜６０週、１週〜５０週、１週〜４０週、１週〜３０週、１週〜２０週、１週〜１０週、１週〜９週、１週〜８週、１週〜７週、１週〜６週、１週〜５週、１週〜４週、１週〜３週、または１週〜２週に採取された試験試料を用いて繰り返される。
【００８６】
あるいはまたは加えて、方法は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１５週、２０週、２５週、３０週、３５週、４０週、４５週、５０週、５５週、６０週、６５週、７０週、７５週、８０週、８５週、９０週、９５週、１００週、１０４週、１０５週、１１０週、１１５週、１２０週、１２５週、および１３０週からなる群からの期間毎に採取された試験試料を用いて繰り返され得る。
【００８７】
あるいはまたは加えて、方法は、少なくとも１回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、２０回、２１回、２２回、２３、２４回、または２５回繰り返され得る。
【００８８】
あるいはまたは加えて、方法は、連続的に繰り返される。
【００８９】
一実施形態では、本発明の方法および／または従来の臨床的方法を使用して膵臓癌が個体において診断および／または病期分類されるまで（すなわち、診断の確認が行われるまで）、方法は繰り返される。
【００９０】
適切な従来の臨床方法は、当該技術分野において周知である。例えば、それらの方法は、本明細書に参照により組み込まれる、Ｄｕｃｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，‘Ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ：ＥＳＭＯ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ’Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２６（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ５）：ｖ５６−ｖ６８および／またはＦｒｅｅｌｏｖｅ＆Ｗａｌｌｉｎｇ，２００６，‘Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ’Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ，７３（３）：４８５−４９２に記載される。よって、膵臓癌診断は、コンピュータ断層撮影（好ましくは、二相螺旋コンピュータ断層撮影）、経腹壁的超音波検査、内視鏡的超音波検査ガイド下微細針吸引、内視鏡的逆行性胆道膵管造影、陽電子放射断層撮影、磁気共鳴イメージング、身体検査、および生検からなる群から選択される１つ以上の方法を使用して確認され得る。
【００９１】
あるいはおよび／または加えて、膵臓癌診断は、膵臓癌の診断のための既知のバイオマーカーシグネチャーを使用して確認され得る。例えば、膵臓癌は、ＷＯ２００８／１１７０６７Ａ９、ＷＯ２０１２／１２０２８８Ａ２、およびＷＯ２０１５／０６７９６９Ａ２からなる群に記載される１つ以上のバイオマーカーまたは診断方法で診断され得る。
【００９２】
本発明の方法の１つの好ましい実施形態では、ステップ（ａ）は、試験される個体からの血清試料を提供することを含み、および／またはステップ（ｂ）は、試料中で１つ以上のバイオマーカー（複数可）のタンパク質もしくはポリペプチドの発現を測定することを含む。よって、試料のバイオマーカーシグネチャーは、タンパク質レベルで判定され得る。
【００９３】
そのような実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、表Ａに列挙されるバイオマーカー（すなわち、タンパク質）に結合することができる１つ以上の第１の結合剤を用いて行われ得る。当業者によって、第１の結合剤が、タンパク質バイオマーカーの１つに対する特異性を有する単一の種または各々異なるタンパク質バイオマーカーに対する特異性を有する複数の異なる種を含み得るか、またはそれからなり得ることが理解されるであろう。
【００９４】
適切な結合剤（結合分子とも呼ばれる）は、後述のように、所与の標的分子に結合するそれらの能力に基づいて、ライブラリーから選択することができる。
【００９５】
１つの好ましい実施形態では、結合剤の少なくとも１種類、より典型的には全ての種類は、その抗体もしくは抗原結合断片、またはそのバリアントを含み得るか、またはそれからなり得る。
【００９６】
抗体の産生および使用方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８８，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９３１４５，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９８，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８７９６９５４４６  ａｎｄ  Ｍａｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２００６，Ｈｏｗａｒｄ＆Ｋａｓｅｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８４９３３５２８０（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００９７】
よって、断片は、可変重（ＶＨ）または可変軽（ＶＬ）ドメインの１つ以上を含有し得る。例えば、抗体断片という用語は、Ｆａｂ様分子（Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１０４１）、Ｆｖ分子（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０，１０３８）、ＶＨおよびＶＬパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドを介して連結している一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子（Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２，４２３；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，５８７９）、および単離Ｖドメインを含む単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１，５４４）を含む。
【００９８】
例えば、結合剤（複数可）は、ｓｃＦｖ分子であり得る。
【００９９】
「抗体バリアント」という用語は、これらに限定されないが、免疫グロブリン軽および／または重鎖可変領域および／または定常領域のファージディスプレイによって産生される単鎖抗体分子、または当業者に知られているイムノアッセイフォーマットで抗原に結合することができる他の免疫相互作用分子などの任意の合成抗体、組み換え抗体、または抗体ハイブリッドを含む。
【０１００】
それらの特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に含まれる技法の一般的な説明は、Ｗｉｎｔｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３４９，２９３−２９９に見出される。
【０１０１】
抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ３５２，６２４−６２８、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２２２（３）：５８１−９７）、ペプチドライブラリー（Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８（４７０５）：１３１５−７）、発現ｃＤＮＡライブラリー（Ｓａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２９６（２）：４９７−５０８）、アフィボディなどの抗体フレームワーク以外の他のスキャフォールド上のライブラリー（Ｇｕｎｎｅｒｉｕｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ６５（９）：４１３４−４０）、またはアプタマーに基づくライブラリー（Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ１１８，２１７−３１）などの分子ライブラリーが、所与のモチーフに特異的な結合分子が本発明の方法における使用について選択される供給源として使用され得る。
【０１０２】
便利には、結合剤（複数可）は、表面上（例えば、マルチウェルプレートまたはアレイ上）に固定化され得、例えば、下記の実施例を参照されたい。
【０１０３】
本発明の方法の一実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、１つ以上のバイオマーカーに結合することができる第２の結合剤を含むアッセイを用いて行われ、第２の結合剤は、検出可能部分を含む。例えば、固定化（第１の）結合剤は、最初にタンパク質バイオマーカーをマイクロアレイの表面上に「捕捉」するのに使用され得、次いで第２結合剤は、「捕捉」タンパク質を検出するのに使用され得る。
【０１０４】
第２の結合剤は、抗体またはその抗原結合断片などの（第１の）結合剤に関して上に記載される通りであり得る。
【０１０５】
当業者によって、試験試料中の１つ以上のバイオマーカー（例えば、タンパク質）が、ステップ（ｂ）を行う前に、検出可能部分で標識され得ることが理解されるであろう。同様に、対照試料（複数可）中の１つ以上のバイオマーカーは、検出可能部分で標識され得る。
【０１０６】
あるいは、または加えて、第１および／または第２の結合剤は、検出可能部分で標識され得る。
【０１０７】
「検出可能部分」によって、我々は、部分が検出され得るものであり、部分の相対量および／または位置（例えば、アレイ上の位置）が決定され得るという意味を含む。
【０１０８】
適切な検出可能部分は、当該技術分野において周知である。例えば、検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分、酵素部分からなる群から選択され得る。
【０１０９】
１つの好ましい実施形態では、検出可能部分は、ビオチンである。
【０１１０】
よって、検出可能部分は、特定の条件に曝露される場合に検出され得る、蛍光および／または発光および／または化学発光部分であり得る。例えば、蛍光部分は、蛍光部分の励起を引き起こすために特定の波長および強度で放射線（すなわち、光）に曝露される必要があり、それによって検出され得る特定の波長で検出可能な蛍光を放射することを可能にし得る。
【０１１１】
あるいは、検出可能部分は、（好ましくは検出不可能な）基質を可視化および／または検出することができる検出可能な生成物に変換することができる酵素であり得る。適切な酵素の例は、例えば、ＥＬＩＳＡアッセイに関して下記により詳細に論じられる。
【０１１２】
さらなる代替では、検出可能部分は、イメージングに有用である放射性原子であり得る。適切な放射性原子は、シンチグラフィー研究について９９ｍＴｃおよび１２３Ｉを含む。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、同様に１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１９Ｆ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、ガドリニウム、マンガン、または鉄などの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のためのスピン標識が挙げられる。明らかに、検出される薬剤（例えば、本明細書に記載の試験試料および／または対照試料中の１つ以上のバイオマーカー、および／または選択されたタンパク質の検出に使用される抗体分子など）は、検出可能部分が容易に検出可能となるために、適切な原子同位体を十分に有していなければならない。
【０１１３】
血清または血漿タンパク質を検出するための好ましいアッセイは、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を用いるサンドイッチアッセイを含む、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射アッセイ（ＩＲＭＡ）、および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含む。例示的なサンドイッチアッセイは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，３７６，１１０号および第４，４８６，５３０号にＤａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌによって記載されている。スライド上の細胞の抗体染色は、当業者には周知のように、細胞学検査室診断試験において周知の方法で使用され得る。
【０１１４】
便利には、アッセイは、典型的には、通常は固相アッセイにおいて、呈色反応生成物を与える酵素の使用を含む、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）である。西洋ワサビペルオキシダーゼおよびホスファターゼなどの酵素が広く用いられてきた。ホスファターゼ反応を増幅する方法は、ＮＡＤＰを基質として使用して、ここで第２の酵素システムの補酵素として作用するＮＡＤを生成することである。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のピロホスファターゼは、酵素が組織中に存在せず、安定であり、良好な反応色を与えるので、良好な複合体を提供する。ルシフェラーゼなどの酵素に基づく化学発光システムを使用することもできる。
【０１１５】
ＥＬＩＳＡ法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｔｈｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），２０００，Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ−１３：９７８−０８９６０３７２８１（その開示は参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。
【０１１６】
あるいは、ビタミンビオチンとの複合は、それが大きな特異性および親和性で結合する酵素結合アビジンまたはストレプトアビジンとのその反応によってこれを容易に検出することができるので、しばしば用いられる。
【０１１７】
１つの好ましい実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／またはステップ（ｆ）は、アレイを使用して行われ得る。
【０１１８】
アレイ自体は、当該技術分野において周知である。典型的には、それらは、各々固体支持体の表面上に形成された無限の面積を有する、間隔があいた（すなわち、離散）領域（「スポット」）を有する線形または二次元構造で形成される。アレイはまた、各ビーズを分子コードもしくはカラーコードによって識別または連続流において識別することができる、ビーズ構造とすることができる。分析はまた連続して行うことができ、試料は各々溶液から分子のクラスを吸着する一連のスポット上を通過させる。固体支持体は、典型的には、ガラスまたはポリマーであり、最も一般的に使用されるポリマーは、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、またはポリプロピレンである。固体支持体は、チューブ、ビーズ、ディスク、シリコンチップ、マイクロプレート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、他の多孔質膜、非多孔質膜（例えば、とりわけ、プラスチック、ポリマー、パースペックス、シリコン）、複数のポリマーピン、もしくは複数のマイクロタイターウェル、またはタンパク質、ポリヌクレオチド、および他の適切な分子を固定化するため、および／またはイムノアッセイを行うための任意の他の表面の形態であり得る。結合プロセスは、当該技術分野において周知であり、一般に、タンパク質分子、ポリヌクレオチドなどを固体支持体に共有結合または物理吸着する架橋からなる。接触もしくは非接触プリント、マスキング、またはフォトリソグラフィーなどの、周知の技法を使用することによって、各スポットの位置を定義することができる。説明については、Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｒ．Ｅ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．Ｒ．（２００１，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２，１３−２９）およびＬａｌ  ｅｔ  ａｌ（２００２，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ１５；７（１８Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ１４３−９）を参照されたい。
【０１１９】
典型的には、アレイは、マイクロアレイである。「マイクロアレイ」によって、我々は、少なくとも約１００／ｃｍ２、好ましくは少なくとも約１０００／ｃｍ２の離散領域の密度を有する領域のアレイの意味を含む。マイクロアレイ内の領域は、典型的な寸法、例えば、約１０〜２５０μｍの範囲の直径を有し、アレイ内の他の領域からほぼ同じ距離だけ離れている。アレイはまた、マクロアレイまたはナノアレイであり得る。
【０１２０】
（上記で論じられた）適切な結合分子が識別および単離されると、当業者は、分子生物学の分野で周知の方法を用いてアレイを製造することができる。
【０１２１】
アレイフォーマットの例は、下記で実施例およびその中で引用されている参考文献に記載されており、例えば、Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ａｎｄ  Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，２００８、Ｗｉｎｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５、Ｄｅｌｆａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１２２】
よって、例示的な実施形態では、方法は、
（ｉ）試料（例えば、血清）中に存在するバイオマーカーをビオチンで標識することと、
（ｉｉ）ビオチン標識タンパク質を、複数のｓｃＦｖを含むアレイと接触させることであって、複数のｓｃＦｖが、その表面上の離散した位置に固定化され、ｓｃＦｖが、表Ａにおけるタンパク質の１つ以上に対して特異性を有する、接触させることと、
（ｉｉｉ）（表面結合ｓｃＦｖ上に固定化された）ビオチン標識タンパク質を、蛍光色素を含むストレプトアビジン複合体と接触させることと、
（ｉｖ）アレイ表面上の離散した位置にある色素の存在を検出することと、を含み、
アレイ表面上の色素の発現は、試料における表Ａからのバイオマーカーの発現を示す。
【０１２３】
代替の実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）は、１つ以上のバイオマーカーをコードする核酸分子の発現を測定することを含む。
【０１２４】
核酸分子は、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡなどの、遺伝子発現中間体またはその誘導体であり得る。
【０１２５】
よって、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）において１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ナノアレイ、マイクロアレイ、マクロアレイ、オートラジオグラフィー、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法を用いて行われ得る。
【０１２６】
例えば、ステップ（ｂ）、（ｄ）、および／または（ｆ）における１つ以上のバイオマーカー（複数可）の発現を測定することは、各々個別に表Ａに識別されるバイオマーカーの１つをコードする核酸分子に選択的に結合することができる、１つ以上の結合部分を用いて行われ得る。
【０１２７】
便利には、１つ以上の結合部分は、各々ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＧＮＡ、ＴＮＡ、またはＰＭＯなどの、核酸分子を含むかまたはそれからなる。
【０１２８】
有利には、１つ以上の結合部分は、５〜１００ヌクレオチド長である。例えば、１５〜３５ヌクレオチド長。
【０１２９】
核酸ベースの結合部分は検出可能部分を含み得ることが理解されるであろう。
【０１３０】
よって、検出可能部分は、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、放射性部分（例えば、放射性原子）、または酵素部分からなる群から選択され得る。
【０１３１】
あるいはまたは加えて、検出可能部分は、例えば、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、リン−３２、硫黄−３５、重水素、トリチウム、レニウム−１８６、レニウム−１８８、およびイットリウム−９０からなる群から選択される、放射性原子を含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１３２】
あるいはまたは加えて、結合部分の検出可能部分は、蛍光部分であり得る。
【０１３３】
さらなる態様では、核酸分子は、循環腫瘍ＤＮＡ分子（ｃｔＤＮＡ）である。
【０１３４】
ｃｔＤＮＡを検出するのに適した方法は、現在十分に確立されており、例えば、Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２２（３２）：７１７５−７１８５、およびその中に引用される参考文献（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１３５】
上で詳述されるように、ステップ（ａ）（および／またはステップ（ｃ）および／または（ｅ））で提供される試料は、未分画血液、血漿、血清、組織液、膵臓組織、乳汁、胆汁、および尿からなる群から選択され得る。
【０１３６】
便利には、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料は、血清である。
【０１３７】
任意選択に１つ以上のさらなるバイオマーカーと併せた、表Ａにおけるバイオマーカーのいくつかまたは全ての適切な選択によって、本発明の方法は、膵臓癌の診断について高い予測精度を示す。
【０１３８】
よって、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって判定される、方法の予測精度は、少なくとも０．５０、例えば、少なくとも０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、または少なくとも０．９９であり得る。
【０１３９】
よって、一実施形態では、ＲＯＣ  ＡＵＣ値によって判定される、方法の予測精度は、少なくとも０．９０である。
【０１４０】
本発明の方法では、ステップ（ｂ）（および／またはステップ（ｄ）および／または（ｅ））で得られた「生」データは、診断に達する前に１つ以上の分析ステップを経験する。例えば、生データは、１つ以上の対照値に対して標準化される（すなわち、正規化される）必要があり得る。
【０１４１】
典型的には、診断は、ｈｔｔｐ：／／ｃｒａｎ．ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂ／ｐａｃｋａｇｅｓ／ｅ１０７１／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ（例えば、ｅ１０７１  １．５−２４）から入手可能なものなどの、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して行われる。しかしながら、任意の他の適切な手段もまた使用され得る。
【０１４２】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰に使用される一連の関連教師あり学習方法である。各々２つのカテゴリーのうちの１つに属するものとしてマークされた一連の訓練例を考慮して、ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新たな例が１つのカテゴリーまたは他方に該当するかを予測するモデルを構築する。直感的には、ＳＶＭモデルは、別々のカテゴリーの例ができるだけ広い明確なギャップで分かれるようにマッピングされた、空間における点としての例を示すものである。新たな例は次いで同じ空間にマッピングされ、それらがギャップのどちら側に該当するかに基づいてカテゴリーに属すると予測される。
【０１４３】
より形式的には、サポートベクターマシンは、高次元または無限次元の空間に超平面または超平面の集合を構築し、それは分類、回帰、または他のタスクに使用することができる。直感的には、一般にマージンが大きいほど分類器の汎化誤差が低くなるので、任意のクラスの最も近い訓練データポイント（いわゆる機能的マージン）まで最も大きな距離を有する超平面によって、良好な分離が達成される。ＳＶＭの詳細な情報については、例えば、Ｂｕｒｇｅｓ，１９９８，Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２：１２１−１６７を参照されたい。
【０１４４】
本発明の一実施形態では、ＳＶＭは、既知の疾患状態を有する個体（例えば、膵臓癌を有することが知られている個体、急性炎症性膵炎を有することが知られている個体、慢性膵炎を有することが知られている個体、または健康であることが知られている個体）からのバイオマーカープロファイルを用いて、本発明の方法を行う前に「訓練」される。そのような訓練試料をかけることによって、ＳＶＭは、どのバイオマーカープロファイルが膵臓癌と関連しているかを学習することができる。訓練プロセスが完了すると、ＳＶＭは次いで、試験されたバイオマーカー試料が膵臓癌を有する個体からのものであるかどうかを決定することができる。
【０１４５】
しかしながら、この訓練手順は、ＳＶＭを必要な訓練パラメータで予めプログラムすることによって回避することができる。例えば、診断は、表Ａに列挙されるバイオマーカーのいずれかまたは全ての測定に基づいて、表６に詳述されるＳＶＭアルゴリズムを使用して既知のＳＶＭパラメータに従って行われ得る。
【０１４６】
当業者によって、適切なＳＶＭパラメータは、ＳＶＭマシンを適切なデータの選択（すなわち、既知の膵臓癌状態を有する個体からのバイオマーカー測定値）で訓練することによって、表Ａに列挙されるバイオマーカーの任意の組み合わせについて決定することができることが理解されるであろう。あるいは、実施例および図のデータは、当該技術分野で知られる任意の他の適切な統計的方法に従って特定の膵臓癌関連病態を決定するために使用され得る。
【０１４７】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の精度、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％精度を有する。
【０１４８】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の感度、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％感度を有する。
【０１４９】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも６０％の特異性、例えば、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％特異性を有する。
【０１５０】
「精度」によって、我々は、方法の正確な結果の割合を意味し、「感度」によって、我々は、陽性として正確に分類される全ての膵臓癌陽性試料の割合を意味し、「特異性」によって、我々は、陰性として正確に分類される全ての膵臓癌陰性試料の割合を意味する。
【０１５１】
シグナル強度は、当業者に知られる任意の適切な手段を用いて、例えば、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を用いて定量化され得る。シグナル強度データは、（すなわち、技術的変動を調節するために）正規化され得る。正規化は、当業者に知られる任意の適切な方法を用いて行われ得る。あるいはまたは加えて、データは、経験的ベイズアルゴリズムＣｏｍＢａｔを用いて正規化される（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。
【０１５２】
ＰＣＡ、ＡＮＯＶＡによるｑ値計算、および／またはＱｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒにおける倍率変化計算などの当該技術分野で周知の方法を使用して、精製データのさらなる統計分析が行われ得る。
【０１５３】
上記のように、第１の（「トレーニング」）データセットは、膵臓癌の診断のためのバイオマーカーシグネチャーとして役立つ、例えば、表Ａからの、バイオマーカーの組み合わせを識別するために使用され得る。トレーニングデータセットの数学的分析は、最も適切なバイオマーカーシグネチャーを決定するために既知のアルゴリズム（後退消去、またはＢＥアルゴリズムなど）を使用して行われ得る。所与のバイオマーカーの組み合わせ（シグネチャー）の予測精度は、次に新しい（「検証」）データセットに対して検証することができる。そのような方法論は、実施例に詳細に記載される。
【０１５４】
当業者によって、試験された個体（複数可）は、任意の民族または地理的起源のものであり得ることが理解されるであろう。あるいは、試験された個体（複数可）は、例えば、民族および／または地理的起源に基づいて、定義された部分母集団のものであり得る。例えば、試験された個体（複数可）は、白人および／または中国人（例えば、漢民族）であり得る。
【０１５５】
典型的には、ステップ（ａ）、（ｃ）、および／または（ｅ）で提供される試料（複数可）は、膵臓癌の治療（例えば、切除、化学療法、放射線療法）の前に提供される。
【０１５６】
一実施形態では、試験される個体（複数可）は、慢性膵炎、遺伝性膵管腺癌、およびポイツ−ジェガース症候群からなる群から選択される１つ以上の状態を患っている。
【０１５７】
診断される膵臓癌は、腺癌、腺扁平上皮癌、印環細胞癌、肝癌、コロイド癌、未分化癌、および破骨細胞様巨細胞を伴う未分化癌からなる群から選択され得る。好ましくは、膵臓癌は、膵腺癌である。より好ましくは、膵臓癌は、膵外分泌癌としても知られる膵管腺癌である。
【０１５８】
本発明の第１の態様の１つの好ましい実施形態は、膵臓癌を有する個体の陽性診断後に、個体に膵臓癌療法を提供する追加ステップを含む。
【０１５９】
よって、本発明の関連態様は、以下のステップ：
（ａ）本発明の第１の態様による方法を用いて、個体を、膵臓癌を有すると診断することと、
（ｂ）そのように診断された個体を膵臓癌療法（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２８（１）：７０−４を参照されたい）で治療することと、を含む、膵臓癌を有する個体の治療方法を提供する。
【０１６０】
膵臓癌療法は、外科手術、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、熱化学療法、放射線療法、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され得る。例えば、膵臓癌療法は、ＡＣ化学療法、カペシタビンおよびドセタキセル化学療法（Ｔａｘｏｔｅｒｅ（登録商標））、ＣＭＦ化学療法、シクロホスファミド、ＥＣ化学療法、ＥＣＦ化学療法、Ｅ−ＣＭＦ化学療法（Ｅｐｉ−ＣＭＦ）、エリブリン（Ｈａｌａｖｅｎ（登録商標））、ＦＥＣ化学療法、ＦＥＣ−Ｔ化学療法、フルオロウラシル（５ＦＵ）、ＧｅｍＣａｒｂｏ化学療法、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））、ゲムシタビンおよびシスプラチン化学療法（ＧｅｍＣｉｓまたはＧｅｍＣｉｓｐｌａｔ）、ＧｅｍＴａｘｏｌ化学療法、イダルビシン（Ｚａｖｅｄｏｓ（登録商標））、リポソームドキソルビシン（ＤａｕｎｏＸｏｍｅ（登録商標））、マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ  Ｋｙｏｗａ（登録商標））、ミトキサントロン、ＭＭ化学療法、ＭＭＭ化学療法、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））、ＴＡＣ化学療法、タキソテールおよびシクロホスファミド（ＴＣ）化学療法、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂｅ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、ビンデシン（Ｅｌｄｉｓｉｎｅ（登録商標））、およびビノレルビン（Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ（登録商標））であり得る。
【０１６１】
したがって、本発明のさらなる態様は、その投与計画が本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される、膵臓癌の治療に使用するための抗腫瘍剤（またはその組み合わせ）を提供する。
【０１６２】
本発明の関連態様は、膵臓癌の治療における抗腫瘍剤（またはその組み合わせ）の使用を提供し、その投与計画は、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。
【０１６３】
本発明のさらなる関連態様は、膵臓癌を治療するための医薬品の製造における抗腫瘍剤（またはその組み合わせ）の使用を提供し、その投与計画は、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。
【０１６４】
よって、本発明はまた、患者に有効量の抗腫瘍剤（またはその組み合わせ）を投与することを含む、膵臓癌を治療する方法を提供し、膵臓癌を治療するのに有効な抗腫瘍剤（またはその組み合わせ）の量は、本発明の第１の態様の方法の結果に基づいて決定される。
【０１６５】
一実施形態では、抗腫瘍剤は、アルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａ）、代謝拮抗剤（ＡＴＣコードＬ０１ｂ）、植物アルカロイドもしくは他の天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃ）、細胞毒性抗生物質もしくは関連物質（ＡＴＣコードＬ０１ｄ）、または別の抗腫瘍剤（ＡＴＣコードＬ０１ｘ）を含むかまたはそれからなる。
【０１６６】
したがって、一実施形態では、抗腫瘍剤は、ナイトロジェンマスタード類似体（例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、メルファラン、クロルメチン、イホスファミド、トロホスファミド、プレドニムスチン、またはベンダムスチン）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、トレスルファン、またはマンノスルファン）、エチレンイミン（例えば、チオテパ、トリアジコン、またはカルボコン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、フォテムスチン、ニムスチン、またはラニムスチン）、エポキシド（例えば、エトグルシド）、または別のアルキル化剤（ＡＴＣコードＬ０１ａｘ、例えば、ミトブロニトール、ピポブロマン、テモゾロミド、またはダカルバジン）からなる群から選択されるアルキル化剤を含むかまたはそれからなる。
【０１６７】
別の実施形態では、抗腫瘍剤は、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート、ラルチトレキセド、ペメトレキセド、またはプララトレキセート）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、フルダラビン、クロファラビン、またはネララビン）、またはピリミジン類似体（例えば、シタラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、テガフール、カルモフール、ゲムシタビン、カペシタビン、アザシチジン、またはデシタビン）からなる群から選択される代謝拮抗剤を含むかまたはそれからなる。
【０１６８】
またさらなる実施形態では、抗腫瘍剤は、ビンカアルカロイドもしくはビンカアルカロイド類似体（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはビンフルニン）、ポドフィロトキシン誘導体（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、コルヒチン誘導体（例えば、デメコルシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、またはパクリタキセルポリグルメックス）、または別の植物アルカロイドもしくは天然産物（ＡＴＣコードＬ０１ｃｘ、例えば、トラベクテジン）からなる群から選択される植物アルカロイドまたは他の天然産物を含むかまたはそれからなる。
【０１６９】
一実施形態では、抗腫瘍剤は、アクチノマイシン（例えば、ダクチノマイシン）、アントラサイクリンもしくは関連物質（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ピラルビシン、バルルビシン、アムルビシン、またはピキサントロン）、または別のもの（ＡＴＣコードＬ０１ｄｃ、例えば、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、またはイクサベピロン）からなる群から選択される細胞毒性抗生物質または関連物質を含むかまたはそれからなる。
【０１７０】
さらなる実施形態では、抗腫瘍剤は、白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、またはポリプラチレン）、メチルヒドラジン（例えば、プロカルバジン）、モノクローナル抗体（例えば、エドレコロマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、セツキシマブ、ベバシズマブ、パニツムマブ、カツマキソマブ、またはオファツムマブ）、光線力学／放射線療法に使用される増感剤（例えば、ポルフィマーナトリウム、アミノレブリン酸メチル、アミノレブリン酸、テモポルフィン、またはエファプロキシラル）、またはタンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、ラパチニブ、ニロチニブ、テムシロリムス、エベロリムス、パゾパニブ、バンデタニブ、アファチニブ、マシチニブ、またはトセラニブ）からなる群から選択される抗腫瘍剤を含むかまたはそれからなる。
【０１７１】
またさらなる実施形態では、抗腫瘍剤は、アムサクリン、アスパラギナーゼ、アルトレタミン、ヒドロキシカルバミド、ロニダミン、ペントスタチン、ミルテフォシン、マソプロコール、エストラムスチン、トレチノイン、ミトグアゾン、トポテカン、チアゾフリン、イリノテカン（カンプトサール）、アリトレチノイン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ベキサロテン、三酸化ヒ素、デニロイキンジフチトックス、ボルテゾミブ、セレコキシブ、アナグレリド、オブリメルセン、シチマジーンセラデノベック、ボリノスタット、ロミデプシン、オマセタキシンメペスクシナート、エリブリン、またはフォリン酸からなる群から選択される抗腫瘍剤を含むかまたはそれからなる。
【０１７２】
一実施形態では、抗腫瘍剤は、１つ以上の抗腫瘍剤、例えば、本明細書で定義される１つ以上の抗腫瘍剤の組み合わせを含むかまたはそれからなる。膵臓癌の治療に使用される併用療法の一例は、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸであり、これは下記の４つの薬剤：
●ＦＯＬ−フォリン酸（ロイコボリン）、
●Ｆ−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、
●ＩＲＩＮ−イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、および
●ＯＸ−オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）からなる。
【０１７３】
よって、上記の方法からの特定の任意の実施形態を組み合わせることによって、本発明は、個体において膵腺癌（例えば、ＩまたはＩＩ期）を診断および治療するための方法を提供し得、その方法は、
（ａ）ヒト患者についての血清または血漿試料を入手または提供することと、
（ｂ）（例えば、試料を、各々バイオマーカーの１つに対して特異性を有する、１つ以上の抗体、またはその抗原結合断片と接触させ、そのバイオマーカーへのその抗体または断片への結合を検出することによって）表Ａからのタンパク質バイオマーカーの１つ以上（例えば、全て）が試料中に存在するかを検出することと、
（ｃ）試料中の１つ以上のタンパク質バイオマーカーの量に基づいて患者を膵腺癌（例えば、ＩまたはＩＩ期）と診断することと、
（ｄ）有効量の化学療法剤（例えば、ゲムシタビン）を診断された患者に投与、および／または膵臓の全部または一部を外科的に切除、および／または放射線療法を実施することと、を含む。
【０１７４】
ステップ（ｂ）は、例えば、Ｃ１ｑと共に表Ａに列挙される全てのバイオマーカー（ＩＬ−６およびＧＥＭを除く）の試料中の存在および／または量を判定することを含み得ることが理解されるであろう。このステップは、本明細書に記載されるように、例えば、アレイプレートの表面上に固定されたバイオマーカーに対して特異性を有する複数のｓｃＦｖを含む、アレイの使用を含み得る。
【０１７５】
ステップ（ｃ）は、診断を確認または確立するために、１つ以上のさらなる臨床調査（生検試料の試験および／または患者のインビボイメージングなど）をさらに含み得ることが理解されるであろう。
【０１７６】
ステップ（ｄ）は化学療法剤および／または外科手術および／または放射線療法の組み合わせの投与を含み得ることが理解されるであろう。
【０１７７】
１つの好ましい実施形態では、患者は、切除可能な膵腺癌（例えば、ＩまたはＩＩ期）と診断され、ステップ（ｄ）は、化学療法（例えば、ゲムシタビンおよび／または５−フルオロウラシル）と組み合わされた（例えば、膵頭部を切除するためのＷｈｉｐｐｌｅ法または膵全摘術を用いる）膵臓の全部または一部の外科的切除を含む。化学療法は外科手術の前および／または後に実施され得ることが理解されるであろう。
【０１７８】
一実施形態では、そのような方法は、疾患の表現型の提示の前に（すなわち、観察可能な臨床症状が発症する前に）初期膵腺癌の診断を可能にする。よって、方法は、無症候性患者、特に、疾患の家族歴を有するもの、タバコ喫煙者、肥満個体、糖尿病、ならびに慢性膵炎、慢性Ｂ型肝炎感染症、胆石症、および／または関連遺伝的素因（例えば、ポイツ−ジェガース症候群、家族性異型多発母斑黒色腫症候群、リンチ症候群、ＢＲＣＡ１突然変異、および／またはＢＲＣＡ２突然変異）を有する個体などの膵臓癌を発症するリスクが高いものにおける膵腺癌を診断するのに使用され得る。そのような高リスクの個体の効果的なモニタリングは、膵腺癌の早期診断を可能にし、よって生存の可能性を大幅に増加させることができる。
【０１７９】
本発明の別の態様は、膵臓癌療法を対象に投与することを含むかまたはそれからなる、対象における膵臓癌関連病態を治療するための方法であって、対象が、対象における膵臓癌関連病態の存在を示す本発明のバイオマーカーシグネチャーを有する、方法を提供する。膵臓癌療法は、切除、化学療法、および／または放射線療法であり得る。一実施形態では、膵臓癌療法は、本明細書において上記のように、少なくとも１つの抗腫瘍剤の投与を含む。
【０１８０】
方法は、（例えば、治療する前に）表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカー（複数可）（例えば、表Ａにおける全てのバイオマーカー）の試験試料中の存在および／または量を測定することをさらに含み得る。方法は、本明細書において上記のように、（例えば、治療する前に）対象からの試験試料のバイオマーカーシグネチャーを判定することを含み得る。
【０１８１】
本発明の別の態様は、生物学的試料（例えば、血清試料）におけるまたはその臨床的有意性を有する（例えば、診断および／または予後価値を有する）バイオマーカーシグネチャーを検出するための方法を提供し、方法は、本発明の第１の態様に関して上記で定義されるステップ（ａ）および（ｂ）を含む。好ましくは、バイオマーカーシグネチャーは、表Ａにおけるバイオマーカーの全てを含むかまたはそれらからなる。
【０１８２】
本発明のさらなる態様は、表Ａに定義されるバイオマーカーの１つ以上の試料中の存在を検出するための１つ以上の薬剤（上記の結合剤のいずれかなど）を含む、個体における膵臓癌関連病態を診断または判定するためのアレイを提供する。
【０１８３】
よって、アレイは、本発明の第１の態様による方法を行うのに適している。
【０１８４】
アレイは、タンパク質レベルまたは核酸レベルのいずれかで、表Ａに定義されるバイオマーカーの１つ以上に（個別にまたは集合的に）結合することができる１つ以上の結合剤を含む。
【０１８５】
１つの好ましい実施形態では、アレイは、タンパク質レベルで表Ａに定義されるバイオマーカーの１つ以上に（個別にまたは集合的に）結合することができる、１つ以上の抗体、またはその抗原結合断片を含む。例えば、アレイは、タンパク質レベルで表Ａに定義されるバイオマーカーの全てに（集合的に）結合することができるｓｃＦｖ分子を含み得る。
【０１８６】
代替の実施形態では、アレイは、以下のバイオマーカー：
ＤＬＧ１、ＰＲＫＣＺ、ＶＥＧＦ、Ｃ３、Ｃ１ＩＮＨ、ＩＬ−４、ＩＦＮγ、Ｃ５、ＰＴＫ６、ＣＨＰ１、ＡＰＬＦ、ＣＡＭＫ４、ＭＡＧＩ、ＭＡＲＫ１、ＰＲＤＭ８、ＡＰＯＡ１、ＣＤＫ２、ＨＡＤＨ２、Ｃ４、ＶＳＸ２／ＣＨＸ１０、ＩＣＡＭ−１、ＩＬ−１３、ルイスｘ／ＣＤ１５、ＭＹＯＭ２、Ｐ因子、シアリルルイスｘ、ＴＮＦβ、および補体Ｃ１ｑ
（任意選択に表Ｂからの１つ以上のバイオマーカーおよび／またはＩＬ−６および／またはＧＥＭを含む）に（個別にまたは集合的に）結合することができる、１つ以上の抗体、またはその抗原結合断片を含む。
【０１８７】
アレイは１つ以上の陽性および／または陰性対照試料を含み得ることが理解されるであろう。例えば、便利には、アレイは、陽性対照試料としてウシ血清アルブミン、および／または陰性対照試料としてリン酸緩衝食塩水を含む。
【０１８８】
便利には、アレイは、表７における抗体の１つ以上、例えば、全てを含む。
【０１８９】
有利には、アレイは、表８における抗体の１つ以上、例えば、全てを含む。
【０１９０】
本発明のさらなる態様は、個体における膵臓癌関連病態を判定するためのバイオマーカーとしての、表Ａに定義される群から選択される１つ以上のバイオマーカーの使用を提供する。
【０１９１】
例えば、表Ａに定義されるバイオマーカー（例えば、タンパク質）の全ては、個体における膵臓癌の存在を判定するための診断シグネチャーとして一緒に使用され得る。
【０１９２】
本発明のさらなる態様は、
（ａ）本発明によるアレイ、またはそれを作製するための構成要素と、
（ｂ）上記に定義される（例えば、本発明の第１の態様における）方法を行うための指示と、を含む、個体における膵臓癌関連病態を診断または判定するためのキットを提供する。
【０１９３】
本発明のさらなる態様は、個体における膵臓癌関連病態を診断または判定するためのキットの調製における、本明細書に（例えば、表Ａに）記載されるバイオマーカーへの１つ以上の結合部分の使用を提供する。よって、キットなどの調製において、各々異なるバイオマーカーを標的とする、複数の異なる結合部分が使用され得る。一実施形態では、結合部分は、本明細書に記載される、抗体またはその抗原結合断片（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【０１９４】
本発明のさらなる態様は、
（ａ）本発明の第１の態様のいずれかに定義される方法に従って膵臓癌関連病態を判定するステップと、
（ｂ）個体に膵臓癌療法を提供するステップと、を含む、個体における膵臓癌を治療する方法を提供する。
【０１９５】
例えば、膵臓癌療法は、外科手術（例えば、切除）、化学療法、免疫療法、化学免疫療法、および熱化学療法（上記参照）からなる群から選択され得る。
【０１９６】
本発明のさらなる態様は、例えば、ステップ（ｃ）（およびその後の発現測定ステップ）の発現データを解釈し、それによって膵臓癌関連病態を診断または判定するための、本発明の方法を行うためのコンピュータプログラムを提供する。コンピュータプログラムは、プログラム化ＳＶＭであり得る。コンピュータプログラムは、当業者に知られる適切なコンピュータ可読キャリアに記録され得る。適切なコンピュータ可読キャリアは、コンパクトディスク（ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−ｒａｙ（登録商標）などを含む）、フロッピーディスク、フラッシュメモリドライブ、ＲＯＭ、またはハードディスクドライブを含み得る。コンピュータプログラムは、コンピュータプログラムを実行するのに適したコンピュータにインストールされ得る。
【０１９７】
本発明の特定の態様を具体化する好ましい非限定的な実施例を、以下の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１Ａ】スカンジナビアコホートにおける個別のＰＤＡＣ病期の分類  示されるデータは、ＳＶＭ  ＬＯＯ交差検証を使用して、３４９個全ての抗体を用いて異なるＰＤＡＣ病期の患者試料からＮＣを分類した場合に誘導される。結果は、（Ａ）Ｉ期、（Ｂ）ＩＩ期、（Ｃ）ＩＩＩ期、および（Ｄ）ＩＶ期ＰＤＡＣについてのＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値と共に提示される。
【図１Ｂ】スカンジナビアコホートにおける個別のＰＤＡＣ病期の分類  示されるデータは、ＳＶＭ  ＬＯＯ交差検証を使用して、３４９個全ての抗体を用いて異なるＰＤＡＣ病期の患者試料からＮＣを分類した場合に誘導される。結果は、（Ａ）Ｉ期、（Ｂ）ＩＩ期、（Ｃ）ＩＩＩ期、および（Ｄ）ＩＶ期ＰＤＡＣについてのＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値と共に提示される。
【図１Ｃ】スカンジナビアコホートにおける個別のＰＤＡＣ病期の分類  示されるデータは、ＳＶＭ  ＬＯＯ交差検証を使用して、３４９個全ての抗体を用いて異なるＰＤＡＣ病期の患者試料からＮＣを分類した場合に誘導される。結果は、（Ａ）Ｉ期、（Ｂ）ＩＩ期、（Ｃ）ＩＩＩ期、および（Ｄ）ＩＶ期ＰＤＡＣについてのＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値と共に提示される。
【図１Ｄ】スカンジナビアコホートにおける個別のＰＤＡＣ病期の分類  示されるデータは、ＳＶＭ  ＬＯＯ交差検証を使用して、３４９個全ての抗体を用いて異なるＰＤＡＣ病期の患者試料からＮＣを分類した場合に誘導される。結果は、（Ａ）Ｉ期、（Ｂ）ＩＩ期、（Ｃ）ＩＩＩ期、および（Ｄ）ＩＶ期ＰＤＡＣについてのＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値と共に提示される。
【図２Ａ】バイオマーカーシグネチャーを用いる、スカンジナビアコホートにおけるＰＤＡＣ病期の分類  スカンジナビア研究からのデータを利用して、凍結ＳＶＭに基づく予測モデルを構築した。それぞれ（Ａ）Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣからのＮＣ試料、および（Ｂ）ＩＩＩ／ＩＶ期ＰＤＡＣの分類のために、後退消去アルゴリズムを使用して、２つのバイオマーカーシグネチャーを定義した。結果は、ＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値として提示される。
【図２Ｂ】バイオマーカーシグネチャーを用いる、スカンジナビアコホートにおけるＰＤＡＣ病期の分類  スカンジナビア研究からのデータを利用して、凍結ＳＶＭに基づく予測モデルを構築した。それぞれ（Ａ）Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣからのＮＣ試料、および（Ｂ）ＩＩＩ／ＩＶ期ＰＤＡＣの分類のために、後退消去アルゴリズムを使用して、２つのバイオマーカーシグネチャーを定義した。結果は、ＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値として提示される。
【図３Ａ】米国コホートからのＩ／ＩＩ期ＰＤＡＣにおけるコンセンサスシグネチャーの検証  スカンジナビアコホートから生成されたコンセンサスシグネチャーを、（Ａ）ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者、および（Ｂ）Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者対慢性膵炎患者を分類することによって、独立した米国コホートにおいて検証した。結果は、代表的なＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値として提示される。
【図３Ｂ】米国コホートからのＩ／ＩＩ期ＰＤＡＣにおけるコンセンサスシグネチャーの検証  スカンジナビアコホートから生成されたコンセンサスシグネチャーを、（Ａ）ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者、および（Ｂ）Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者対慢性膵炎患者を分類することによって、独立した米国コホートにおいて検証した。結果は、代表的なＲＯＣ曲線およびそれらの対応するＡＵＣ値として提示される。
【図４−１】図４。異なるＰＤＡＣ病期間で差次的に発現する血清マーカー  Ｉ期からＩＶ期への進行にわたって差次的に発現した血清マーカーを、多群ＡＮＯＶＡによって識別した。最も有意なマーカーが提示される。ローマ数字は、ＰＤＡＣ病期を示す。＊：ｐ＜０．０５、ｑ＞０．０５、および＊＊：ｐ＜０．０５、ｑ＜０．０５
【図４−２】図４の続き。
【図４−３】図４の続き。
【図４−４】図４の続き。
【図４−５】図４の続き。
【図４−６】図４の続き。
【図５】ＮＣ対ＰＤＡＣ分類精度に対する糖尿病の影響  ＮＣ対ＰＤＡＣで訓練されたＳＶＭモデルからの決定値を用いて、発見コホートにおける糖尿病および非糖尿病ＰＤＡＣ試料の間の差を分析した。ウィルコクソン符号順位検定を使用して、有意性値を計算した。
【図６】ＮＣ試料からのＩＰＭＮ病期の分類  コンセンサスシグネチャーを使用して、ＮＣ対異なるＩＰＭＮ病期を分類した。米国コホートからの全てのＩＰＭＮ試料を、ＮＣ対ＰＤＡＣで訓練されたＳＶＭモデルに入れた。ウィルコクソン符号順位検定を使用して、有意性値を計算した。生成されたｐ値は：ＮＣ対ＰＤＡＣ：２．２３×１０−１８、ＰＤＡＣ対良性ＩＰＭＮ：０．０２９、ＰＤＡＣ対ボーダーラインＩＰＭＮ：０．２８４、ＰＤＡＣ対悪性ＩＰＭＮ：０．４０１であった。
【発明を実施するための形態】
【０１９９】
（実施例）
要約
背景
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、後期診断につながるびまん性症状のため、１０％未満の５年生存率で予後不良である。限局性腫瘍をより早く検出することができれば、生存率は有意に増加し得る。血液試料のマルチパラメータ分析を使用して、初期ＰＤＡＣの新規バイオマーカーシグネチャーを誘導した。シグネチャーは、十分に定義された初期（Ｉ／ＩＩ）ＰＤＡＣ患者の大規模コホートから開発され、その後独立した患者コホートにおいて検証された。
【０２００】
方法
ＰＤＡＣに関連するバイオマーカー血清シグネチャーを解読するために、組み換え抗体マイクロアレイプラットフォームを利用した。発見研究は、１６人のＩ期、１３２人のＩＩ期、６５人のＩＩＩ期、２３０人のＩＶ期患者、および８８８人の対照からなる、スカンジナビアからの症例／対照研究であった。識別されたバイオマーカーシグネチャーはその後、１５人のＩ期、７５人のＩＩ期、１５人のＩＩＩ期、３８人のＩＶ期患者、および２１９人の対照を含む独立した米国症例／対照研究コホートにおいて検証した。
【０２０１】
結果
スカンジナビア症例／対照研究を使用して、それぞれ０．９６および０．９８のＲＯＣ−ＡＵＣ値でＩ／ＩＩ期およびＩＩＩ／ＩＶ期患者対対照由来の試料を区別するシグネチャーを作成した。その後、２９個のバイオマーカーからなるコンセンサスシグネチャーを、全てのＰＤＡＣ病期および対照試料に基づいて生成した。このシグネチャーは次いで、独立した米国症例／対照研究で検証し、ＰＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ期患者から収集された試料を使用して０．９６のＲＯＣ−ＡＵＣ値を生成した。
【０２０２】
結論
検証された血清シグネチャーは、高い感度および特異性で初期限局性ＰＤＡＣを検出し、よってより早期の診断への道を開く。
【０２０３】
略語
ＡＮＯＶＡ、分散分析、ＡＵＣ、曲線下面積、ＢＥ、後退消去、ＣＰ、慢性膵炎、ＣＶ、分散係数、ＧＯ、遺伝子オントロジー、ＩＰＭＮ、膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、ＬＯＯ、一個抜き、ＭＴ−ＰＢＳ、１％乳および１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水、ＮＣ、正常対照、ＰＢＳ、リン酸緩衝食塩水、ＮＰＶ、陰性適中率、ＰＰＶ、陽性適中率、ＰＢＳＴ、１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝食塩水、ＰＣＡ、主成分分析、ＰＤＡＣ、膵管腺癌、ＲＯＣ、受信者操作特性、ＲＴ、室温、ｓｃＦｖ、一本鎖断片変数、ＳＶＭ、サポートベクターマシン
【０２０４】
概論
この研究では、ＰＤＡＣ  Ｉ〜ＩＶ期患者を大規模な後向きスカンジナビアコホートにおいて分析し、続いて独立した米国コホートにおける検証を行い、単純血液試料においてＩ／ＩＩ期関連ＰＤＡＣバイオマーカーを識別しようとした。
【０２０５】
方法
研究デザイン
スカンジナビアおよび米国において収集されたＰＤＡＣ血清試料に対して行われた２つの後向き研究は、診断精度研究報告基準（ＳＴＡＲＤ）２８に従って行われた。ＰＤＡＣ病期分類は、米国癌合同委員会（ＡＪＣＣ）ガイドラインに従って行った。膵臓癌を有する患者からの血液試料は、診断時、手術前、または化学療法開始時に収集および処理した。正常対照（ＮＣ）からの血液試料は、同じ標準操作手順（ＳＯＰ）を用いて収集した。両方の症例において、５μｌの血清試料をその後、１５６個の抗原に対する３４９個のヒト組み換えｓｃＦｖからなる組み換え抗体マイクロアレイプラットフォーム（表５）（下記の補足方法参照）を利用して、分析に使用した。理論的根拠は、疾患に対する全身性応答および腫瘍セクレトームを標的とすることであった。結果として、選択されたバイオマーカーは、主に免疫調節に関与した。
【０２０６】
研究コホートのデモグラフィック
スカンジナビアコホートは、４４３個のＰＤＡＣ症例、８８８個のＮＣ、および８個の膵管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）を含んだ（表１）。症例は診断的であり、全体的な切除率は約１５％であった。１６個のＰＤＡＣ試料がＩ期から、１３２個がＩＩ期から、６５個がＩＩＩ期から、２３０個がＩＶ期患者からのものであった（表１）。８個のＩＰＭＮ試料のうち、５個は良性であり、３個は悪性であった。
【０２０７】
米国コホートは、１４３個のＰＤＡＣ、５７個の慢性膵炎（ＣＰ）、および２０個のＩＰＭＮ症例、ならびに２１９個のＮＣを含んだ（表１）。１５個のＰＤＡＣ試料がＩ期から、７５個がＩＩ期から、１５個がＩＩＩ期から、３８個がＩＶ期患者からのものであった（表１）。２０個のＩＰＭＮ症例のうち、８個が良性であり、５個がボーダーラインであり、７個が悪性であった。症例は診断的であり、全体的な切除率は約１８〜２０％であった。
【０２０８】
結果
親和性プロテオミクスは、微量の試料を用いて高感度のアッセイを提供などの、いくつかの魅力的な特徴を提供する。本アプローチは、１５６個の抗原に対する３４９個のヒト組み換えｓｃＦｖからなる組み換え抗体マイクロアレイプラットフォームに基づいた（表５）。焦点はＰＤＡＣに対する全身性応答およびそのセクレトームを調査することであったので、選択された抗体は主に、免疫調節に関与する抗原を標的とした。十分に定義された初期ＰＤＡＣを含む２つの患者コホート（１つはスカンジナビア、１つは北米人）を利用して、Ｉ／ＩＩ期癌の検出のためのバイオマーカーシグネチャーを識別および検証した。
【０２０９】
まず、スカンジナビア症例／対照発見研究におけるデータセットのロバスト性を調査するために、異なるＰＤＡＣ病期を有する患者由来の血清試料を、ＬＯＯ交差検証戦略を用いて、マッチさせた健康な対照と比較した。結果は、異なるＰＤＡＣ病期が高精度で区別され得ることを実証した。ＮＣ対ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩ、およびＩＶ期のＡＵＣ値は、それぞれ０．９１、１．０、０．９９、０．９８、０．９９、および０．９８であった（図１）。注目すべきことに、アレイ上の全ての抗体に由来する情報を使用する場合、得られたＡＵＣレベルは、ＩＡ期を除いて、０．９８以上に達した。
【０２１０】
定義されたバイオマーカーシグネチャーでのＰＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ期の分類
最小バイオマーカーシグネチャーを識別し、最適な予測力でＩ／ＩＩ期ＰＤＡＣとＮＣとを区別するために、ＳＶＭベースの後退消去アルゴリズムをスカンジナビア試料コホートに適用した２６、２９。このアプローチを使用して、分類を改善しないバイオマーカーを排除し、Ｉ／ＩＩ期対ＮＣを分離する可能な限り高い予測力を提供するシグネチャーの識別をもたらす。この分析は、最高ランクの個別のバイオマーカーのみを含むシグネチャーをもたらし（表４）、Ｉ／ＩＩ期対ＮＣについて得られたＡＵＣ値は０．９６であり（図２Ａ）、ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期について９４／９５％の特異性／感度の組み合わせと相関した。比較の理由で、ＩＩＩ／ＩＶ期対ＮＣについて得られたＡＵＣ値は、０．９８であった（図２Ｂ）。これらの値は、統計的ロバスト性および分類モデル安定性の調査に基づいており、４つのランダムに生成された訓練／試験セットを使用し、ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣの分類について０．９６３（０．９４〜０．９８の範囲）の平均ＡＵＣ値を得た。ＮＣ対ＩＩＩ／ＩＶ期の対応する値は、０．９８５（０．９８〜０．９９の範囲）であった。注目すべきことに、それは十分な直交情報に寄与しなかったので、最も高い予測シグネチャーは、例えば、ＣＡ１９−９、ＰＤＡＣの分析に一般的に関与するシアリルルイスＡ抗原を含まなかった。
【０２１１】
独立した患者コホートにおける初期Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣの検出の検証
検証研究において最高の予測精度を得るために、最高ランクのバイオマーカー（表４）を組み合わせて、２９個のバイオマーカー（表２）からなるコンセンサスシグネチャーを得た。初期Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者の検出のためのコンセンサスシグネチャーを検証するために、このシグネチャーを、完全に独立した米国コホート由来の試料を使用して、連続検証研究において試験した。この検証分析は、３つの訓練セットに基づいて、０．９６３（０．９４〜０．９８の範囲）のＲＯＣ−ＡＵＣ値で、ＰＤＡＣ  Ｉ／ＩＩ期対ＮＣの非常に正確な区別を実証した（図３Ａ）。これは、Ｉ／ＩＩ期についての９５／９３％の最適な特異性／感度の組み合わせに相関する。対応する最適なＲＯＣ−ＡＵＣ値は、ＩＩＩ／ＩＶ期について０．９７であり、Ｉ−ＩＶ期について９１／９１％であった。
【０２１２】
膵炎対ＰＤＡＣの鑑別診断は潜在的な交絡臨床因子であるので、慢性膵炎とＰＤＡＣとを区別する能力も分析した。Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ試料からの慢性膵炎の分類分析は、０．８４の最適なＲＯＣ−ＡＵＣ値をもたらした（図３Ｂ）。
【０２１３】
初期ＰＤＡＣの分類に対する糖尿病および黄疸の影響
分類精度に対する糖尿病の影響も調査した。試料収集時に、スカンジナビアコホートでは１０３人（２３．３％）のＰＤＡＣ患者が糖尿病であったのに対し（表３）、米国コホートでは３８人（２６．６％）のＰＤＡＣ患者が糖尿病を有した（表３）。両方のコホートにおいて、初発糖尿病（ＮＯＤ）は、糖尿病患者（ｎ＝３７）の２６．２％を構成した。ＳＶＭモデルからの決定値を用いて、発見コホートにおける糖尿病および非糖尿病ＰＤＡＣ試料の間の任意の有意差を分析した。この分析は、ＮＯＤを含む糖尿病がＮＣ対ＰＤＡＣの分類における交絡因子ではないことを示した（それぞれｐ＝０．４７および０．９６）（図３）。検証コホートに適用された同じアプローチは、黄疸が交絡因子に対するものではないことを示した（ｐ＝０．２１）。
【０２１４】
異なるＰＤＡＣ病期に関連する個別の血清マーカー
Ｉ期からＩＶ期への進行に関連する一時的発現パターンを示す個別のバイオマーカーも分析した。データを多群ＡＮＯＶＡで調査することによって、初期対後期ＰＤＡＣ患者において差次的に発現したいくつかのバイオマーカーを識別した。これらには、ディスクスラージホモログ１、ＰＲＤＭ８、およびＭＡＧＩ−１が含まれ、全て後期に発現の増加を示したが、プロペルジン、リンホトキシン−アルファ、およびＩＬ−２は、ＰＤＡＣの初期により高度に発現した（図４）。注目すべきことに、全てのこれらのバイオマーカーは、ＩＬ−２を除き、コンセンサスシグネチャーにも存在した（表２）。
【０２１５】
検証されたバイオマーカーシグネチャーでの膵管内乳頭粘液性腫瘍の分類
ＩＰＭＮは、治療せず放置される場合、しばしば浸潤癌に進行する。結果として、これは前悪性病変の早期切除の機会を提供し得るので、そのような病変をイメージングによって監視することができるように検出することは、臨床的に興味深い。結果として、コンセンサスシグネチャーは、異なる病期のＩＰＭＮ対ＮＣを区別するためのその適用性について試験した。米国患者コホートに由来する２０個のＩＰＭＮ試料（表１）を、検証されたバイオマーカーシグネチャーを用いて分類した。注目すべきことに、シグネチャーは、ボーダーラインおよび悪性ＩＰＭＮを癌プロファイルを有するものとして分類し、良性ＩＰＭＮが非ＰＤＡＣとして分類された（ｐ＝０．０２９）（図６）。
【０２１６】
考察
この研究における重要な発見は、微量の血清を用いるプロテオミクスマルチパラメータ分析が、初期Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣを有する患者と対照とを高精度で区別することができることである。そのような診断アプローチの臨床的有用性および意図される使用、例えば、（ｉ）遺伝性ＰＤＡＣ、慢性膵炎、およびポイツ−ジェガース症候群患者などの、高リスク患者、（ｉｉ）糖尿病の最初の３年以内にＰＤＡＣを発症する最大８倍増加したリスクを有する、５０歳を超えた年齢の遅発型糖尿病患者３０、３１、ならびに（ｉｉｉ）漠然とした腹部症状、腰痛、および体重減少を有する患者の監視は、潜在的に数倍であろう。
【０２１７】
ＷＨＯは、何百万人もの癌患者がより早期に診断および治療されれば早死を免れ得ることを提示した。これを達成するためには、より先進的な診断アプローチを開発し、ＰＤＡＣなどの特に致命的な癌の早期検出に適用しなければならない。ＰＤＡＣ疾患進行の展開の軌跡が議論されているという事実にもかかわらず３２−３４、今日入手可能な臨床データは、切除可能な腫瘍の頻度の増加のために、早期診断が無症候性患者の全生存利益につながるという結論を支持する４、８−１１、３５。ＰＤＡＣの早期診断についての臨床的有用性を実証するためには、これはそうでなければ必然的に不安、過剰治療、および費用の増加を含む患者にとって望ましくない結果を招くので、試験は低頻度の偽陽性を示さなければならない。このリスクを念頭に置いて、我々は、１７００個超の症例／対照試料を含む、ＰＤＡＣに関する大規模プロテオミクス研究を実施し、腫瘍セクレトームまたは全身性免疫応答のいずれかから誘導された１５６個の血清タンパク質を分析した。集団におけるバイオマーカーシグネチャーの臨床的有用性を判定するために、ＰＤＡＣの有病率は、陽性適中率（ＰＰＶ）（陽性試験が疾患を示す確率）と陰性適中率（ＮＰＶ）（陰性試験が疾患の不在を示す確率）の両方に影響を与える。我々の米国検証コホートでは、結果は、９９％もの高い特異性で、ＰＤＡＣについて一般大衆よりも高いリスクを有する患者、例えば、第１度近親者（有病率３．７５％）、および５５歳を超える年齢の初発糖尿病患者（有病率１．０％）３６において、ＰＰＶ／ＮＰＶがそれぞれ０．７５／０．９９および０．４６／１．０であろうことを示す。Ｉ／ＩＩ期と対照とを区別するための最高の特異性／感度をもたらす、このシグネチャーは、単独または他のマーカーとの組み合わせのいずれかでの、ＣＡ１９−９、ＰＤＡＣの分析に一般的に関与する抗原を含まなかった１８。実際に、ＣＡ１９−９は、後退消去プロセス中に十分な直交情報に寄与しなかったので、抗体マイクロアレイ上で分析されたが選択されなかった。
【０２１８】
５５歳を超える年齢の患者における初発糖尿病はＰＤＡＣを発症する有意に増加したリスクを有するので３７、これは癌の早期指標と考えることができ、無症候性の初期ＰＤＡＣの早期検出につながり得る３８。ＰＤＡＣを有する糖尿病患者の診断は、これらの患者における切除可能性の増加および生存率の増加に寄与することになるので、結果として重要であろう。結果として、我々は、てコンセンサスバイオマーカーシグネチャーを糖尿病のＰＤＡＣ患者と診断された糖尿病を有さないＰＤＡＣとを区別する能力につい試験した。そのうち２６．２％が初発糖尿病を示した両方のコホートからの合計１４１人のＰＤＡＣを有する糖尿病患者に基づくサポートベクターマシン分析は、糖尿病対非糖尿病ＰＤＡＣ患者に由来する試料間に有意差を示さなかった（図５）。これは、検証されたバイオマーカーシグネチャーが、糖尿病患者における臨床的に除外されたＰＤＡＣに潜在的に寄与し得ることを意味するが、これは糖尿病患者に焦点を当てた臨床研究において実証されなければならない。
【０２１９】
ＰＤＡＣ対膵炎の鑑別診断は時に困難であるが、以前の研究において、我々は、後期ＰＤＡＣと異なる膵炎の徴候とを区別することができることを実証した２７。追跡研究は、急性、慢性、および自己免疫性膵炎などの様々な膵炎サブタイプについて以前に行われており、これらのサブタイプに関連するバイオマーカーを識別し、ＰＤＡＣと区別することができた３９。現在の研究では慢性膵炎試料の数が限られているが、我々は、ここで０．８４のＲＯＣ−ＡＵＣ（図３Ｂ）で、慢性膵炎を初期Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣと区別することができることを実証することができた。さらに、膵臓の前悪性病変（ＩＰＭＮ）の正確な分類は、かなりの臨床的価値を示す。本コンセンサスバイオマーカーシグネチャーは、病理学的に病期分類された良性ＩＰＭＮを有する患者由来の試料をＩ／ＩＩ期ＰＤＡＣを有する患者と区別することができたが（図６）、ボーダーラインおよび悪性に病期分類されたＩＰＭＮは、癌関連と分類され、よってＰＤＡＣと区別することができなかった。限界はこれらの結果がかなり少ない数の臨床試料に基づいていることであるが、より大規模なＩＰＭＮ症例／対照研究において検証される場合、これらの診断が困難な病変の検出に潜在的に寄与し得る。
【０２２０】
癌の進行に関連しているのは、血液中のバイオマーカー含有量を振り返ることができる腫瘍微小環境の段階的な変化である。結果として、ここで取得したデータを用いて、その発現パターンが病期進行と共に変化する、すなわち、初期または後期ＰＤＡＣ患者由来の試料において異なるレベルを示すマーカーを識別した。興味深いことに、図４に表示される全てのタンパク質は、ＩＬ−２を除き、コンセンサスシグネチャーに存在した（表２）。とりわけＰＤＡＣ初期から後期へと最も有意に増加した発現を示したマーカーは、ＤＬＧ１（ディスクスラージホモログ１）、例えば、ＡＰＣ、β−カテニン、およびＰＴＥＮと相互作用して細胞増殖、細胞質分裂、遊走、および接着を調節する多機能性足場タンパク質であった。候補腫瘍抑制因子ＤＬＧ１は発癌機能を示すことが報告されているが４０、後期ＰＤＡＣにおけるこの上方制御によって潜在的に支持されている。ＭＡＧＩ−１（膜結合グアニル酸キナーゼ、ＷＷ、およびＰＤＺドメイン含有タンパク質１）もまた、後期ＰＤＡＣ患者由来の試料において発現の増加を示し、上皮細胞間接着において提示された機能を有する足場タンパク質である。文献中の癌関連情報は乏しいが、ＭＡＧＩ−１は、ＨＰＶ誘発性悪性腫瘍においてアポトーシスを阻害し、細胞増殖を刺激することが報告されている４１。ＢＬＩＭＰ−１としても知られるＰＲＤＭ８（ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質８）は、後期患者からの試料において増加した。このＤＮＡ結合タンパク質は、例えば、神経およびステロイド関連転写を調節し、腫瘍浸潤性の増加に寄与している可能性が最も高い４２、下垂体腺腫における腫瘍形成の調節因子である。これは、後期患者試料におけるその増加した発現の我々の観察と一致している。さらに、リンホトキシン−アルファは、後期試料においてより低い発現を示した。リンホトキシン−アルファは、食細胞が内皮細胞に結合するのを誘導するためにＴＨ１型Ｔ細胞によって産生される。このタンパク質のいくつかの多型は、マッピングが膵臓癌における低いタンパク質発現、我々の研究におけるＰＤＡＣ進行中のその減少した発現を説明することができる所見を以前に示したが４４、腺癌を発症する増加したリスクの一因となる４３。正の補体調節因子プロペルジンはまた、後期ＰＤＡＣ患者からの試料における発現の減少を示した。プロペルジンは、補体の代替経路の増強を介して炎症および食作用を支持する。本質的に複雑ではあるが、補体活性化は、一般的には癌に対する防護として認識されている。補体活性化の阻害は、典型的には癌細胞免疫回避を促進するだけでなく、癌免疫療法の有効性を妨げることも示されている４５、４６。プロペルジンの発現の減少は、ＰＤＡＣにおいて観察される免疫回避と一致している。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、後期患者からの試料における発現の減少を示した。ＩＬ−２は、活性化Ｔ細胞の増殖および応答を刺激し、例えば、腎癌および悪性黒色腫に対する免疫療法において使用される。いくつかの研究は、従来療法と組み合わされたＩＬ−２治療が膵臓癌の進行を弱めることができることを示す４７、４８。ＰＤＡＣ進行と関連する血清タンパク質のさらなる研究は、潜在的に疾患進行の生���学に関する機構的情報を明らかにし得る。
【０２２１】
要約すると、この研究は、ＰＤＡＣ患者の２つの大規模症例／対照研究に基づいてバイオマーカーシグネチャーを識別および検証することに成功した。研究結果は、このバイオマーカーシグネチャーが、病期Ｉ／ＩＩのＰＤＡＣ患者由来の試料を高精度で検出することができることを示し、血清バイオマーカーシグネチャーを用いて、膵臓癌をより早期に診断する可能性を示している。
【０２２２】
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３８．Ｐａｎｎａｌａ  Ｒ，Ｂａｓｕ  Ａ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＧＭ，Ｃｈａｒｉ  ＳＴ．Ｎｅｗ−ｏｎｓｅｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ：Ａ  ｐｏｔｅｎｉａｌ  ｃｌｕｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２００９，１０（１）８８−９５．
３９．Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ  Ａ，Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｒ，Ｓｅｇｅｒｓｖａｒｄ  Ｒ，Ｌｏｈｒ  Ｍ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ．Ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｔｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ．２０１２；６（９−１０）：４８６−９６．
４０．Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｓ，Ｄｅｌｕｒｙ  Ｃ，Ｍａｒｓｈ  Ｅ．Ｔｈｅ  ＰＤＺ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ（ＤＬＧ）：ｔｈｅ’Ｊｅｋｙｌｌ  ａｎｄ  Ｈｙｄｅ’  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＦＥＢＳＪ．２０１２；２７９（１９）：３５４９−５８．
４１．Ｋｒａｎｊｅｃ  Ｃ，Ｍａｓｓｉｍｉ  Ｐ，Ｂａｎｋｓ  Ｌ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＡＧＩ−１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｒｒｅｓｔ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１４；８８（１３）：７１５５−６９．
４２．Ｌａｎ  Ｘ，Ｇａｏ  Ｈ，Ｗａｎｇ  Ｆ，Ｆｅｎｇ  Ｊ，Ｂａｉ  Ｊ，Ｚｈａｏ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｗｈｏｌｅ−ｅｘｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ａｄｅｎｏｍａｓ．Ｏｎｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．２０１６；１２（４）：２３１９−２８．
４３．Ｈｕａｎｇ  Ｙ，Ｙｕ  Ｘ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｚｈｏｕ  Ｓ，Ｓｕｎ  Ｊ，Ｆｅｎｇ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｕｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｉｓｋ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（１２）：ｅ８２５１９．
４４．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＬＴＡ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ−Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ２０１７［Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｔｅｉｎａｔｌａｓ．ｏｒｇ／ＥＮＳＧ０００００２２６９７９−ＬＴＡ／ｃａｎｃｅｒ．］
４５．Ｍａｍｉｄｉ  Ｓ，Ｈｏｎｅ  Ｓ，Ｋｉｒｓｃｈｆｉｎｋ  Ｍ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：Ａｍｂｉｖａｌｅｎｃｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１７；２２２（１）：４５−５４．
４６．Ｐｉｏ  Ｒ，Ｃｏｒｒａｌｅｓ  Ｌ，Ｌａｍｂｒｉｓ  ＪＤ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ．Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ．２０１４；７７２：２２９−６２．
４７．Ｇｒａｎｄｅ  Ｃ，Ｆｉｒｖｉｄａ  ＪＬ，Ｎａｖａｓ  Ｖ，ＣａｓａｌＪ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ．２００６；１７（１）：１−１２．
４８．Ｎｏｂｉｌｉ  Ｃ，Ｄｅｇｒａｔｅ  Ｌ，Ｃａｐｒｏｔｔｉ  Ｒ，Ｆｒａｎｃｉｏｓｉ  Ｃ，Ｌｅｏｎｅ  ＢＥ，Ｔｒｅｚｚｉ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ａｆｆｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓｉｖｅ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｃａｓｅ．Ｔｕｍｏｒｉ．２００８；９４（３）：４２６−３０．
【０２２３】
【表５−１】
2020507760.tif 000010
【表５−２】
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【表６】
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【０２２４】
補足情報
方法
研究コホートのデモグラフィック
スカンジナビアコホートの対照は、コペンハーゲン一般集団研究から入手し、性別、年齢、喫煙習慣、アルコール摂取、および採血日についてマッチさせた。症例につき２つの対照をマッチさせた。いずれの対照も５年間の追跡調査中に膵臓癌を発症しなかった。性別バランスは、ＰＤＡＣ患者において５７：４３（％）男性対女性、ＮＣにおいて５８：４２（％）男性対女性であった。ＰＤＡＣおよびＮＣ対象の年齢中央値は両方とも６８歳であった。タバコ使用は現在または過去の常用と定義され、アルコール乱用は現在または過去の乱用と定義された。デンマーク保健当局のガイドラインに基づいて、アルコール乱用のカットオフは、女性および男性についてそれぞれ週１６８ｇおよび２５２ｇのアルコールに設定された。ＰＤＡＣ群、対照群、および全対象におけるタバコ使用者の割合は、それぞれ６６％、６０％、および６２％であった。アルコール乱用についての対応する値は、それぞれ２２％、２４％、および２３％であった（表１）。スカンジナビアコホートにおける全てのＰＤＡＣ患者のうち、２３．３％が試料収集時に糖尿病に罹患していたのに対し、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期ＰＤＡＣ患者のそれぞれ２５．０％、２８．７％、２６．２％、および１９．１％が採血時に既知の糖尿病を有していた（表３）。糖尿病の状況にかかわらず、腫瘍の７０％が頭部に、２０％が体部に、１０％が膵尾部に位置していた（表３）。これらの割合は、腫瘍局在化に関する一般的に報告されているデータとよく対応する１。肝臓値および血球タイプ計数を含む、全ての他のパラメータは、病期間で同程度であった（表３）。スカンジナビアコホートについての病期分類は、切除患者における切除された腫瘍およびリンパ節の病理学的状態およびＣＴスキャン（腹部および胸部）ならびに非切除患者に対する生検およびＣＴスキャンに基づいた。
【０２２５】
米国コホートの対照は、健康な非癌対照を対象とした献血運動中または非癌個体の外来診療中のいずれかに収集し、試料収集時の性別および年齢に関してＰＤＡＣ患者とマッチさせた。いずれの対照も５年間の追跡調査中に膵臓癌を発症しなかった。性別バランスは、ＰＤＡＣ患者において５６：４４（％）男性対女性、ＮＣにおいて５３：４７（％）男性対女性、慢性膵炎（ＣＰ）患者において４８：５２（％）、ＩＰＭＮ患者において４０：６０（％）男性対女性であった。ＰＤＡＣ、ＮＣ、ＣＰ、およびＩＰＭＮ対象の年齢中央値は、それぞれ６７、６３、５６、および６９歳であった。米国コホートの病期分類は、切除がなかった症例、すなわち、典型的には後期疾患を除いて、病理学的状態に基づいていた。それらの患者について、病期分類は、臨床経過に応じて生検またはイメージングに基づいていた。米国コホートにおける全てのＰＤＡＣ患者のうち、２６．６％が試料収集時に糖尿病に罹患していたのに対し、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶ期ＰＤＡＣ患者のそれぞれ２６．７％、２６．７％、２０．０％、および２８．９％が採血時に既知の糖尿病を有していた（表３）。両コホートにおけるＩＰＭＮ診断は、外科的に得られた病理に基づいていた。さらに、慢性膵炎の診断は、１）症状、すなわち、疼痛および／または膵エラスターゼによって判定される膵機能不全、アミラーゼおよびリパーゼ判定で生化学的に確認され、膵臓および膵臓周囲の炎症を示すＣＴスキャンでの腹部イメージングを受けたその後の急性膵炎のエピソード、ならびに２）イメージングによって行い、全ての患者は慢性膵炎と一致する膵管変化を示すＥＲＣＰを受け、全てＣＴおよび／またはＭＲＩイメージングを受けた。全ての患者は、ドレナージ術の外科手術を受けた。
【０２２６】
試料収集
スカンジナビア研究は、ＢＩＯＰＡＣ  Ｓｔｕｄｙ“ＢＩＯｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＰＡｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ−ｃａｎ  ｔｈｅｙ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ｎｅｗ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”を意味し、コペンハーゲン地域倫理委員会（ＶＥＫ  ｒｅｆ．ＫＡ−２００６−０１１３）およびデンマークデータ保護庁（ｊｒ．ｎｏ．２００６−４１−６８４８、ｊｒ．ｎｏ．２０１２−５８−００４、およびＨＧＨ−２０１５−０２７，Ｉ−ｓｕｉｔｅ０３９６０）によって承認された。血清試料は、２００８年〜２０１４年の間に、デンマークのコペンハーゲンにあるＨｅｒｌｅｖ  ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＲｉｇｓｈｏｓｐｉｔａｌｅｔにて収集された。診断時に、血液を収集し、少なくとも３０分間凝固させ、次いで４℃で１０分間２３３０ｇで遠心分離した。血清を等分し、さらなる分析まで−８０℃で保存した。全ての試料は、同じＳＯＰを使用して収集および処理し、血清ＣＡ１９−９、肝臓酵素、および血球数について分析した。臨床データは試料収集時に集めた。
【０２２７】
米国研究は、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの治験審査委員会によって承認された。血液は、任意の治療前に収集し、少なくとも３０分間凝固させ、４℃で１０分間１５００ｇで遠心分離した。全ての試料は、同じＳＯＰを使用して、収集および処理した。血清を等分し、さらなる分析まで−８０℃で保存した。
【０２２８】
データ取得、品質管理、および前処理
抗体マイクロアレイからのシグナル強度を、Ａｒｒａｙ−Ｐｒｏ  Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて定量化した。局所的バックグラウンド値を差し引き、調整された強度値を次いでデその後のータ分析に使用した。データ取得は、サンプル分類および臨床データを知らされていない研究チームの訓練されたメンバーによって行われた。レプリケート分散係数（ＣＶ）が１５％を超えない限り、各データ点は、抗体クローンあたり３つのレプリケートスポットのバックグラウンドを差し引いたシグナル平均を表した。そのような場合、平均値から最も遠いレプリケートスポットが省略され、２つの残ったレプリケートの平均シグナルが使用された。レプリケートの平均ＣＶは、スカンジナビアおよび米国研究においてそれぞれ８．４％および６．７％であった。
【０２２９】
品質管理試料からの生データを、ＣＶ値分析、ボックスプロッティング、および分散分析（ＡＮＯＶＡ）フィルタリング（Ｑｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ，Ｑｌｕｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）での３Ｄ主成分分析（ＰＣＡ）によって、スライド間および日間分散の個別の抗体レベルについて評価した。データセット均一性が確認されたら、品質管理試料をさらなる分析から除去した。ＰＤＡＣおよび対照試料からのデータは、ｌｏｇ２によって変換し、続いて日数およびスライド間の技術的変動を低減するために２段階で調整および正規化した。第１のステップでは、ＣｏｍＢａｔ（統計ソフトウェア環境ＲにおけるＳＶＡパッケージ）、バッチ共変量が知られている経験的ベイズフレームワークを使用して、バッチ効果を調整する方法を適用することによって、日間変動に対処した２、３。使用された共変量は、マイクロアレイアッセイの日であった。第２のステップでは、各アレイのスケーリング因子を計算することによって、アレイ間の変動を最小限にした。この因子は、全試料中で最も低い標準偏差を有する抗体の２０％に基づいており、各アレイ上のこれらの抗体の強度合計を全アレイにわたる平均合計で割ることによって計算された４。データは、要求に応じて対応する作成者から入手可能である。
【０２３０】
データ分析
２群分類を、Ｒにおけるサポートベクターマシン（ＳＶＭ）分析を用いて行った。ＰＣＡ、ＡＮＯＶＡによるｑ値計算、および倍率変化計算を、Ｑｌｕｃｏｒｅ  Ｏｍｉｃｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒを用いて行った。多群ＡＮＯＶＡを使用して、スカンジナビアコホートに含まれる様々なＰＤＡＣ病期からの試料における個別のタンパク質マーカーの差次的発現を分析した。個別のマーカーの性能は、スチューデントのｔ検定、偽発見率制御のためのＢｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ法（ｑ値）、および倍率変化で評価した。感度、特異性は、ＳＶＭ決定値から計算した。５５歳を超えた年齢の初発糖尿病（ＮＯＤ）患者およびＰＤＡＣ患者の第一度近親者などのリスク群の有病率および生涯リスクに関連して、陽性適中率（ＰＰＶ）および陰性適中率（ＮＰＶ）を計算した。
【０２３１】
ＮＣとＩ／ＩＩ期ＰＤＡＣとを区別するバイオマーカーシグネチャーを定義する前に、全ての抗体に基づくＲにおける一個抜き（ＬＯＯ）交差検証アプローチを使用して、個別のＰＤＡＣ病期を分類する力を評価した５。要するに、１つのデータポイントを別のサブセット（試験セット）に分配し、残ったデータポイントを訓練セットとして使用するＳＶＭを設計した。プロセスを一度に１つの試料で繰り返し、結果を使用して受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成し、対応する曲線下面積（ＡＵＣ）値を計算した。
【０２３２】
次に、凝縮バイオマーカーシグネチャーを解読するために、データを、試料の３／４（約１０００個の試料）を含む訓練セットおよび試料の１／４（約３４０個の試料）を含む試験セットに分けた。データセット内の症例対対照試料の比は保持したが、それ以外セットは無作為に生成した。このアプローチを使用して、４つのユニークな試験／訓練セットを生成した。個別の試料は、試料セットに一度だけ含めた。バイオマーカーシグネチャーを識別するために、後退消去（ＢＥ）アルゴリズムをＲにおける各訓練セットに適用し、一度に１つの抗体を除外した。各ＢＥ反復について、分類分析において得られた最高のカルバック−ライブラー（ＫＬ）ダイバージェンス値を有する抗体を消去した。ＫＬダイバージェンス値分析に基づいて、最低値を示す抗体の組み合わせを使用して、予測バイオマーカーシグネチャーを設計した。結果として、ＢＥは、他のバイオマーカーと比較して、直交情報に寄与するマーカーの不偏選択を可能する６。注目すべきことに、ＢＥプロセスは、ＰＤＡＣの場合にはＣＡ１９−９およびシアリルルイスＡなどの以前に定義された腫瘍マーカーが、十分な直交情報に寄与しないので、シグネチャーに含まれない結果となることがある。識別されたバイオマーカーシグネチャーを次いで、訓練データセットのみを使用して、Ｒにおける凍結ＳＶＭによる予測モデルを構築するために使用した５。さらに、過剰適合を避けるために、モデルを、対応する試験セットで試験し、その性能を、ＲＯＣ曲線およびＡＵＣ値を用いて評価した。過剰解釈をさらに最小限に抑え、ロバスト性を確保するために、このプロセスを４つ全ての訓練および試験セットについて行った。この方法で、ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者を分類する予測モデルを構築し、その性能を、ＲＯＣ曲線およびＡＵＣ値を用いて評価した。比較として、これをＮＣ対ＩＩＩ／ＩＶ期ＰＤＡＣ患者由来の試料についても繰り返した。
【０２３３】
最後に、最高の予測分類精度を有するコンセンサスシグネチャーを得るために、ＮＣ対Ｉ／ＩＩ期ＰＤＡＣ患者およびＮＣ対ＩＩＩ／ＩＶ期ＰＤＡＣの全ての分類からのデータを組み合わせた。コンセンサスシグネチャーの予測精度は次いで、独立した米国試料コホートにおいて検証した。
【０２３４】
検証に使用された米国研究では、データは、約２８０個の試料（訓練）および約１４０個の試料（試験）の３つの訓練／試験セットに分けた。データセット内の症例対対照試料の比は保持したが、それ以外セットは無作為に生成した。スカンジナビア研究からのコンセンサスシグネチャーを、米国訓練セットのみを使用して、予測モデルを構築するために使用した。モデルを次に、対応する米国試験セットについて試験し、性能を、ＲＯＣ曲線およびＡＵＣ値を用いて評価した。過剰解釈をさらに最小限に抑え、ロバスト性を確保するために、このプロセスを３つ全ての訓練および試験セットについて行った。凍結ＳＶＭを使用して、慢性膵炎対ＰＤＡＣ試料の分類に同じアプローチを使用し、ＲＯＣ−ＡＵＣ値を計算した。最後に、コンセンサスシグネチャーを使用して、ＮＣ対ＩＰＭＮ患者を分類した。検証コホートにおける全てのＩＰＭＮ試料を、ＮＣ対ＰＤＡＣで訓練されたＳＶＭモデルに入れた。抗体マイクロアレイ分析においてビリルビンレベルまたは糖尿病が交絡因子であるかを調査するために、黄疸（４９．７％）および糖尿病（２６．６％）を有する患者を、それぞれ黄疸を有さないまたは糖尿病を有さない患者と比較した。
【０２３５】
試料標識
両方の研究において、血清プロテオームに最適化されたプロトコルを用いて、血清試料をビオチンで標識した６〜８。簡単に、５μｌの血清試料を、ＰＢＳ中で約２ｍｇタンパク質／ｍｌまで１：４５に希釈し、０．６ｍＭのＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で標識した。３．５ｋＤａのＭＷＣＯ透析膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用い、２４時間毎にバッファーを交換しながら７２時間ＰＢＳに対して透析することによって、未結合ビオチンを除去した。標識された血清試料を等分し、−２０℃で保存した。標識品質を管理するために、参照血清試料（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）を各ビオチン化ラウンド中に患者試料と共に標識した。これらの品質管理（ＱＣ）試料からのシグナルを、同一の以前に標識された参照血清のバッチからのシグナル（マイクロアレイアッセイのセクション参照）と比較して、プロセスが意図した通りに機能したことを検証した。
【０２３６】
抗体マイクロアレイ作製
同一の抗体マイクロアレイを両方の研究で利用した。アレイは、１５６個の既知の抗原に対する３３９個のヒト組み換えｓｃＦｖを含んだ（表５）。ファージディスプレイライブラリーから選択および生成されたｓｃＦｖは、ロバストなオンチップ機能性を示すことが以前に示されている７、９〜１２。ｓｃＦｖと共に、ＣＡ１９−９に対する２つの全長モノクローナル抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，ＴＮ，ＵＳＡ）をスライド上にプリントした。抗体の大部分は以前にアレイ用途で試験されており１０〜１２、それらの特異性は十分に特徴付けられた対照血清を用いて検証されている。さらに、質量分析、ＥＬＩＳＡ、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙサイトカインアッセイ、サイトメトリービーズアッセイ、ならびにスパイキングおよびブロッキングＥＬＩＳＡなどの直交法が、抗体特異性を評価するために利用されている１３〜１５。選択されたｓｃＦｖは、主に免疫調節および／または癌生物学に関与する血清タンパク質に対するものであった。
【０２３７】
Ｈｉｓタグ付きｓｃＦｖを、Ｅ．ｃｏｌｉで産生し、磁性Ｎｉ粒子タンパク質精製システム（ＭａｇｎｅＨｉｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）を用いて、ペリプラズムから精製した。Ｚｅｂａ９６ウェルスピンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用いて、溶出バッファーをＰＢＳと交換した。タンパク質収率は、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して測定した。タンパク質の純度は、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）によって確認した。抗体マイクロアレイを、非接触プリンター（ＳｃｉＦｌｅｘａｒｒａｙｅｒ  Ｓ１１、Ｓｃｉｅｎｉｏｎ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、黒色のＭａｘｉＳｏｒｐスライド（ＮＵＮＣ、Ｒｏｓｋｉｌｄｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）上に作製した。プリント前に、各ｓｃＦｖクローンについて最適なプリント濃度を定義した９。その後のＱＣ機能を可能にするために、０．１ｍｇ／ｍｌのＣａｄａｖｅｒｉｎｅ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）をプリントバッファーに添加した。１４個の同一のアレイを、各スライド上に７個のアレイの２列でプリントした。各アレイは、２００μｍのスポット間中心距離および１４０μｍのスポット直径を有する３４×３６のスポットからなっていた。各アレイは、ＢＳＡ−ビオチンスポットの列によって分離された３つの同一のセグメントからなっていた。各抗体を、各セグメントに１つのレプリケートで３つレプリケートにプリントした。ビオチン−ＢＳＡスポットの２つの追加列が各サブアレイに、１つはサブアレイの上、１つはその下に隣接した。９個の陰性対照スポット（ＰＢＳ）を各レプリケートセグメントにプリントした。各分析ラウンドについて、１０枚のスライド（１４０個のマイクロアレイ）をプリントした。スカンジナビア発見研究では、合計１５２枚のスライドを１６プリント日にわたってプリントした。検証研究では、合計４８枚のスライドを５プリント日にわたってプリントした。スライドをマイクロアレイアッセイの前に室温（ＲＴ）で８日間保存した。
【０２３８】
マイクロアレイアッセイ
各スライド上で１０個の試料を分析した。試料の配置は無作為化したが、各スライド上の健康およびＰＤＡＣ試料の比は全体としてコホートについてほぼ同じであった。各スライド上の４つの位置をＱＣ試料に、３つを参照血清（２つはＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ，ＵＫから、１つはＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡから）、１つを研究に含まれる健康および癌試料からのアリコートの混合物を含有する試料に使用した。各マイクロアレイスライドをハイブリダイゼーションガスケット（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に載置し、滅菌Ｄ−ＰＢＳ（ＭＴ−ＰＢＳ）中の１重量／体積％乳、１体積／体積％Ｔｗｅｅｎ−２０で室温で１時間絶えず撹拌しながらブロックした。その間、標識血清試料のアリコートを氷上で解凍し、その後ＭＴ−ＰＢＳで１：１０に希釈した。スライドを滅菌Ｄ−ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、続いてガスケットのウェルに希釈血清試料を添加した。試料をスライド上で室温で２時間絶えず撹拌しながらインキュベートした。次に、スライドをＰＢＳＴで４回洗浄し、ＭＴ−ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌストレプトアビジンＡｌｅｘａ−６４７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）で室温で１時間絶えず撹拌しながらインキュベートし、再度ＰＢＳＴで４回洗浄した。最後に、スライドをハイブリダイゼーションガスケットから取り外し、ｄＨ２Ｏに浸漬し、Ｎ２流下で乾燥させた。スライドを直ちに共焦点マイクロアレイスキャナー（ＬＳ  Ｒｅｌｏａｄｅｄ、Ｔｅｃａｎ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で１０μｍ解像度で、最初は６３５ｎｍで、次は５３２ｎｍでスキャンした。第１のスキャン画像はＡｌｅｘａ−６４７（ストレプトアビジン）シグナルを検出し、スポットシグナル強度の定量化に使用した。第２のスキャン画像はＡｌｅｘａ−５５５（カダベリン）シグナルを測定し、品質管理目的に使用した。
【０２３９】
（補足情報の）参考文献
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２．Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＷＥ，Ｌｉ  Ｃ，Ｒａｂｉｎｏｖｉｃ  Ａ．Ａｄｊｕｓｔｉｎｇ  ｂａｔｃｈ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  Ｂａｙｅｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．２００７；８（１）：１１８−２７．
３．Ｌｅｅｋ  ＪＴ，Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＷＥ，Ｐａｒｋｅｒ  ＨＳ，Ｆｅｒｔｉｇ  ＥＪ，Ｊａｆｆｅ  ＡＥ，Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ．ｓｖａ：Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ３．２２．０．２０１６．
４．Ｄｅｌｆａｎｉ  Ｐ，Ｄｅｘｌｉｎ  Ｍｅｌｌｂｙ  Ｌ，Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  Ｍ，Ｈｏｌｍｅｒ  Ａ，Ｏｈｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１６；１１（７）：ｅ０１５９１３８．
５．Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｋｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ  Ｍ，Ｒｏｓｅ  Ｃ，Ｆｅｒｎｏ  Ｍ，Ｏｌｓｓｏｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｅｒｕｍ  ｐｏｒｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１１；１０８（３４）：１４２５２−７．
６．Ｃａｒｌｓｓｏｎ  Ａ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｏ，Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｓｍａ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ２０１０；４：５９１−６０２．
７．Ｇｅｒｄｔｓｓｏｎ  ＡＳ，Ｍａｌａｔｓ  Ｎ，Ｓａｌｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  Ｔｒｉａｌ  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ａ  Ｓｅｒｕｍ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｄｕｃｔａｌ  Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ２０１５；２０１５：５８７２５０．
８．Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  Ｊ，Ｄｅｘｌｉｎ  Ｌ，Ｓｚｕｌ  Ｄ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ｃｈｏｉｃｅ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ−ｔａｇ  ａｎｄ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ２００７；７：３０５５−６５．
９．Ｄｅｌｆａｎｉ  Ｐ，Ｄｅｘｌｉｎ  Ｍｅｌｌｂｙ  Ｌ，Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ２０１６；１１：ｅ０１５９１３８．
１０．Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ  Ｃ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｈａｇｅｒ  ＡＣ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ｓｉｎｇｌｅ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２００２；Ｓｕｐｐｌ：３８−４５．
１１．Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００８；１９：５５−６１．
１２．Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ，Ｓｔｅｉｎｈａｕｅｒ  Ｃ，Ｉｎｇｖａｒｓｓｏｎ  Ｊ，Ｐｅｒｓｓｏｎ  Ｅ，Ｌａｒｓｓｏｎ  Ｋ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｔａｇｇｅｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎａｌｙｔｅ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｏｍｅｓ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ２００５；５：１２８１−９１．
１３．Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｒｒａｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ２０１１；７８５：２４７−６２．
１４．Ｏｌｓｓｏｎ  Ｎ，Ｗａｌｌｉｎ  Ｓ，Ｊａｍｅｓ  Ｐ，Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  ＣＡ，Ｗｉｎｇｒｅｎ  Ｃ．Ｅｐｉｔｏｐｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ２０１２；２１：１８９７−９１０．
１５．Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ  Ｅ，Ｓｔｒａｎｄｂｅｒｇ  Ｌ，Ｊｉｒｈｏｌｔ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＣＤＲ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｉｎｇｌｅ−ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０００；１８：８５２−６．
【０２４０】
【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１２−４】
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【表１２−５】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１５−１１】
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【表１５−１２】
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【表１５−１３】
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【表１５−１４】
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【表１５−１５】
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【表１５−１６】
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【表１５−１７】
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【表１５−１８】
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【表１５−１９】
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【表１５−２０】
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【表１５−２１】
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【表１５−２２】
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【表１５−２３】
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【表１５−２４】
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【表１５−２５】
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【表１５−２６】
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【表１５−２７】
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【表１５−２８】
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【表１５−２９】
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【表１５−３０】
2020507760.tif 000063
【表１５−３１】
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【表１５−３２】
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【表１５−３３】
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【表１５−３４】
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【表１６−１】
2020507760.tif 000068
【表１６−２】
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【図１Ａ】
2020507760.tif 000070
【図１Ｂ】
2020507760.tif 000071
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
2020507760.tif 000073
【図２Ａ】
2020507760.tif 000074
【図２Ｂ】
2020507760.tif 000075
【図３Ａ】
2020507760.tif 000076
【図３Ｂ】
2020507760.tif 000077
【図４−１】
2020507760.tif 000078
【図４−２】
2020507760.tif 000079
【図４−３】
2020507760.tif 000080
【図４−４】
2020507760.tif 000081
【図４−５】
2020507760.tif 000082
【図４−６】
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【図５】
2020507760.tif 000084
【図６】
2020507760.tif 000085
【配列表】
2020507760000001.app
【国際調査報告】
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