(57)【要約】本発明は、遺伝子中のＣｐＧ領域、特にｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便に識別できる方法、この方法に用いるためのプライマー、プライマーセット検査用試薬及び検査用試薬キットを提供する。  本発明の方法は、ｈＭＬＨ１遺伝子のような解析対象遺伝子（ＤＮＡ）中のいずれかのＣｐＧ領域のメチル化されたシトシンを特異的に認識するプライマーと、前記メチル化の有無によらず目的遺伝子中のいずれかの領域に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域の存在する領域で核酸増幅により増幅産物を形成するプライマーの少なくとも２種のプライマーを、これらの２種のプライマーと一緒になって前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅することができる別のメチル化非特異的プライマーとともに用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマー：
１）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）配列番号２〜７に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち２つ以上を選択する核酸増幅用プライマーセット：
１）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）配列番号２〜７に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある５’領域又はＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるプライマーセットであって、少なくとも１つのメチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度が、メチル化シトシン特異的プライマーの融解温度より１〜５℃高いことを特徴とする請求の範囲２記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項４】
組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にあるＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるプライマーセットであって、プライマー同士のＧＣ含有率の差が２０％以内であることを特徴とする請求の範囲２又は３記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項５】
配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする請求の範囲２又は３記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項６】
配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする請求の範囲２又は３記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項７】
配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする請求の範囲２から４のいずれか１項記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項８】
配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする請求の範囲２から４のいずれか１項記載の核酸増幅用プライマーセット。
【請求項９】
請求の範囲１記載の核酸増幅用プライマーを使用し、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を検査することを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法。
【請求項１０】
組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある５’領域又はＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を指標とすることを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法。
【請求項１１】
前記シトシンのメチル化の有無の検査を核酸増幅方法により行う請求の範囲９又は１０に記載の識別方法。
【請求項１２】
マイクロサテライト反復配列分析を組み合わせたことを特徴とする請求の範囲９から１１のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項１３】
ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析を組み合わせたことを特徴とする請求の範囲９から１２のいずれか１項に記載の識別方法。
【請求項１４】
請求の範囲１記載のプライマーを含む検査用試薬。
【請求項１５】
請求の範囲１記載のプライマーを含む検査用試薬キット。
【請求項１６】
以下の１）〜９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーであって、解析対象遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を検出するためのプライマー：
１）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
９）前記１）から８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
請求の範囲１６記載のプライマーを少なくとも３つ含む解析対象遺伝子中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を検出するための核酸増幅用プライマーセットであって、この少なくとも３つのプライマーが、
ａ）前記解析対象遺伝子中の少なくとも１つの検出対象ＣｐＧ領域を含む部分が増幅されるように選択され、かつＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結合する、１対のメチル化非特異的プライマー、及び
ｂ）前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンである場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にウラシル又はチミンに変換されれば前記解析対象遺伝子に結合しない、少なくとも１つのメチル化シトシン特異的プライマー
である、プライマーセット。
【請求項１８】
解析対象遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
（１）試料由来の核酸を修飾剤によって修飾し、
（２）前記核酸を鋳型として、以下のプライマー：
ａ）前記解析対象遺伝子中の少なくとも１つの検出対象ＣｐＧ領域を含む部分が増幅されるように選択され、かつＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結合する、１対のメチル化非特異的プライマー、及び
ｂ）前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンである場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にウラシル又はチミンに変換されれば前記解析対象遺伝子に結合しない、少なくとも１つのメチル化シトシン特異的プライマー
を用いて前記解析対象遺伝子核酸を増幅し、
（３）前記増幅産物を検出する
工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１９】
前記メチル化シトシン特異的プライマー及び前記メチル化シトシン非特異的プライマーが、それぞれ以下の１）〜９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択するプライマーである、請求の範囲１８記載の方法：
１）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
９）前記１）から８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
前記解析対象遺伝子が、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２を含むＤＮＡミスマッチ修復タンパク質をコードする遺伝子群及びその他の大腸癌関連遺伝子群から選択される、請求の範囲１８記載の方法。
【請求項２１】
前記解析対象遺伝子における検出対象ＣｐＧ領域におけるシトシンのメチルの有無を、試料の由来する個体における大腸癌の存在又は分類と関連づけるための、請求の範囲１８記載の方法。
【請求項２２】
前記検出対象ＣｐＧ領域が２ヵ所以上であり、前記ｂ）のメチル化シトシン特異的プライマーを２種類以上用いる、請求の範囲１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、遺伝子のＣｐＧ領域のメチル化の検出方法及びそれを利用した方法、これらの方法に使用するためのプライマー、プライマーセット、検査用試薬及び検査用試薬キットに関する。特に、本発明は、大腸癌の臨床検査の分野において、散発性大腸癌と遺伝性非腺腫性大腸癌とを識別（スクリーニング）する方法、これに用いるためのプライマー、プライマーセット、検査用試薬及び検査用試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  ヒトの大腸癌は、散発性（非遺伝性）大腸癌と遺伝性大腸癌の２種類に大別される。そして、遺伝性大腸癌には、家族性腺腫性大腸癌（以下適宜「ＦＡＰ」という。）と遺伝性非腺腫性大腸癌（以下「ＨＮＰＣＣ」という。）の２種類が存在する。【０００３】  ＦＡＰはＡＰＣ遺伝子の異常によるものであることが分かっており、多量のポリープを産生するという形質的特徴により診断は比較的容易である。【０００４】  一方、ＨＮＰＣＣはＦＡＰのような形質的特徴を示さないため、その診断は困難であった。これまでは、ＨＮＰＣＣの診断は、専ら家族歴を追跡することにより行われていたが、依然として信頼できる診断基準（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｃｒｉｔｅｒｉａ）が確立されていない。【０００５】  １９９３年にＨＮＰＣＣの原因が、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質（ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＭＲ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）をコードする遺伝子群（ＭＭＲ  ｇｅｎｅｓ；以下適宜「ＭＭＲ遺伝子」という。）に変異が起こって、その遺伝子修復タンパク質が機能しなくなり、その結果、ヒトの遺伝子修復機構が機能しなくなることであることが分かった。具体的には、ＨＮＰＣＣの病理検体においては、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２の５種のＭＭＲタンパク質をコードするＭＭＲ遺伝子のいずれか１つ以上に生殖細胞変異が認められ、通常は、前３種のタンパク質をコードする遺伝子のいずれか１つ以上に変異が認められる。このうち、ｈＭＳＨ２をコードする遺伝子（以下適宜「ｈＭＳＨ２遺伝子」という。）とｈＭＬＨ１をコードする遺伝子（以下適宜「ｈＭＬＨ１遺伝子」という。）の２つの遺伝子の変異が主因であることが明らかになった。【０００６】  また、免疫染色によるタンパク発現の検査において、この３種のうちｈＭＳＨ２とｈＭＳＨ６のタンパク質発現が陰性である場合は、まず、間違いなくＨＮＰＣＣであることが分かっている。【０００７】  一方、ｈＭＬＨ１タンパク質の異常は、ＨＮＰＣＣのみでなく、散発性（非遺伝性）大腸癌の場合にも認められ、この両者をｈＭＬＨ１タンパク質の免疫染色によって識別することは困難である。もし識別するとするならば、ｈＭＬＨ１タンパク質の免疫染色のみでなく、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子領域すべてをシーケンスするといった、ｈＭＬＨ１遺伝子の突然変異の確認を行わなければならない。しかし、現在のところ、ＨＮＰＣＣと臨床診断された患者のうち、遺伝子突然変異解析で遺伝子突然変異を検出できるのは約５０％程度であり、残りについては原因の変異が検出できない。また、この検出法には高い検出費用もかかる。ＨＮＰＣＣは遺伝性疾患であり、その診断には社会的・倫理的・法的に注意を必要とする。そのため、効率良く、低コストで、かつ、精度の高い検出方法が求められている。【０００８】  近年、ｈＭＬＨ１遺伝子等のＭＭＲ遺伝子の変異は、ＤＮＡ中のマイクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ）反復配列の異常と関連していることが分かってきた。即ち、ある種の癌細胞においてはＣＡの繰り返し配列等に代表されるマイクロサテライトの反復回数が、正常細胞のそれに比べて多くなったり、少なくなったりしている。こうしたＤＮＡ内の塩基配列の異常をマイクロサテライト不安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＩ＋，ＭＳＩ−Ｈ）と呼ぶ。一方、マイクロサテライト反復配列の異常を示さないことをマイクロサテライト安定性（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ＭＳＳ，ＭＳＩ−，ＭＳＩ−Ｌ）という。【０００９】  このＭＳＩ＋はＨＮＰＣＣに認められる特徴である。一方、ＨＮＰＣＣとは関係のない散発性の大腸癌、胃癌などの多くの腫瘍でＭＳＩ＋の性質を示す例が１２〜３０％の頻度で存在することが明らかになった（以下においてＭＳＩ＋を示す散発性大腸癌を適宜「散発性ＭＳＩ＋大腸癌」という）。これら非遺伝性のＭＳＩ＋腫瘍においては、ｈＭＬＨ１やｈＭＳＨ２遺伝子の突然変異の頻度が非常に低く、別の機序が考えられたが、近年、これらの腫瘍では７５〜９０％以上の頻度でｈＭＬＨ１遺伝子のプロモーター領域にメチル化が起こり、ｈＭＬＨ１タンパク質の発現が消失していることが明らかになった。【００１０】  また、散発性ＭＳＩ＋大腸癌細胞株においては、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域内にある、ｈＭＬＨ１を発現させるタンパク質であるＣＢＰ結合因子（ＣＢＰ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）であるＣＣＡＡＴ  ｂｏｘの上流のＣｐＧ領域のメチル化が多く見られることが分かった。一方、ＨＮＰＣＣの細胞株においては、この領域のメチル化は、低い割合で起こっていることも分かってきた。【００１１】  さらに、大腸癌の約１０〜２０％を占めるＣＩＭＰ（ＣｐＧ  Ｉｓｌａｎｄ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｏｒ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）癌においては、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子を含む特定の遺伝子又は遺伝子座（例えば、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１、及びｐ１６）において高頻度のメチル化が観察されることもわかっている。【００１２】  また、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域内にあるＣｐＧ領域の部位によっては正常細胞にもメチル化が存在することも分かってきた。【００１３】  一般に、遺伝子のメチル化を検出する方法としては、ＭＳＰ法（ＷＯ９７／４６７０５、特表２０００−５１１７７６）、ＭＣＡ法（ＷＯ００／２６４０１、特表２００２−５３３０６１）、ＣＯＢＲＡ法などが存在する。しかし、ＭＣＡ法は、メチル化感受性制限酵素で切断し、末端にリンカーを付加した遺伝子断片をランダムに増幅するものであり、「未知の」メチル化されている遺伝子を探索する目的に適しているが、特定の解析対象遺伝子について行うには不向きである。また、ＣＯＢＲＡ法は、制限酵素による切断の工程を必要とし、手間及びコストがかかり、使用する制限酵素の認識部位のみしか調べることができず、そのため、メチル化の有無を検討したいＣｐＧ領域を必ずしも解析できないという欠点を持つ。ＭＳＰ法は、制限酵素を用いないが、メチル化の解析を行う遺伝子領域ひとつにつき、メチル化特異的プライマーのみを用いたＰＣＲと非メチル化特異的プライマーのみを用いたＰＣＲという２回のＰＣＲを必要とする。また、そのメチル化の有無の判定は、そのＰＣＲ産物の有無によって行うため、ＰＣＲ自体のエラーを確認できないという欠点を持つ。
【発明の開示】
【００１４】  本発明者らは、そこで、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域のメチル化の有無、特にＣＣＡＡＴ  ｂｏｘ上流のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便に検出できる方法があれば、そのメチル化を検出することにより、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を識別することが可能と考え、また、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を除外することによりＨＮＰＣＣを効率よく識別することが可能と考えた。
【００１５】  そこで、本発明の目的は、制限酵素による切断の工程を必要とせず、遺伝子のメチル化状態、特にｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便に識別できる方法を提供することである。さらに、この検査方法に用いるためのプライマー、プライマーセット、検査用試薬及び検査用試薬キットを提供することである。
【００１６】  かかる実情において、本発明者らは、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ）のプロモーター領域中のいずれかのＣｐＧ領域のメチル化されたシトシンを特異的に認識するプライマーと、前記メチル化の有無によらずｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域中のいずれかの領域（前記いずれかのＣｐＧ領域以外の領域が好ましい。）に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域の存在する領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するプライマーの少なくとも２種のプライマーとを用いれば、前記ＣｐＧ領域のメチル化の有無を識別でき、これにより、ＭＳＩ＋大腸癌であるか、ＭＳＩ−大腸癌であるかを精度よく識別することができることを見出した。そして、この検出方法は、他のＨＮＰＣＣの遺伝子診断よりも簡便で、かつ、低コストである。
【００１７】  また、検出原理は基本的にあらゆる遺伝子に適応可能であって、メチル化状態を調べたい解析対象遺伝子は、何であってもよい。さらに、本発明の方法は、他の一般的な遺伝子のメチル化状態検出方法と異なり、制限酵素での切断の工程を含まないので、それらの方法と比較しても迅速・簡便であり、臨床検査において特に有利である。即ち、本発明の方法によれば、従来の検出技術の欠点をすべて補うことが可能であり、核酸増幅は１回のみでよく、メチル化の有無を検討したい任意のＣｐＧ領域の検討が可能であり、増幅過程自体のエラーはメチル化非特異的プライマーによるＰＣＲ産物によって確認することが可能である。ＣＯＢＲＡ法のように制限酵素を用いないため、手間及びコストもかからない。また、ＭＳＰ法よりも核酸増幅の回数が少なく、増幅過程自体のエラーの確認も可能なため、簡便かつ確実である。
【００１８】  また、この方法に、マイクロサテライト反復配列分析（以下適宜「ＭＳＩ分析」という。）を組み合わせることにより、散発性ＭＳＩ＋大腸癌であるか、ＨＮＰＣＣであるかをより精度よく識別することができることを見出した。
【００１９】  その上にまた、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ；以下適宜「ＩＨＣ」という。）を組み合わせることにより、散発性ＭＳＩ＋大腸癌であるか、ＨＮＰＣＣであるかを精度よく識別することができることを見出した。
【００２０】  また、前記プライマーを用いた検査用試薬及び検査用試薬キットと合わせて本発明を完成した。
【００２１】  即ち、（１）本発明の第１の態様は、以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーである：
１）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）配列番号２〜７に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【００２２】  （２）本発明の第２の態様は、以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち２つ以上を選択する核酸増幅用プライマーセットである：
１）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）配列番号２〜７に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
９）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【００２３】  （３）本発明の第３の態様は、組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある５’領域又はＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるプライマーセットであって、少なくとも１つのメチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度が、メチル化シトシン特異的プライマーの融解温度より１〜５℃高いことを特徴とする前記（２）記載の核酸増幅用プライマーセットである。
【００２４】  （４）本発明の第４の態様は、組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にあるＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるプライマーセットであって、プライマー同士のＧＣ含有率の差が２０％以内であることを特徴とする前記の（２）又は（３）記載の核酸増幅用プライマーセットである。
【００２５】  （５）本発明の第５の態様は、配列番号３に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（２）又は（３）記載の核酸増幅用プライマーセットである。
（６）本発明の第６の態様は、配列番号２に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号４に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（２）又は（３）記載の核酸増幅用プライマーセットである。
【００２６】  （７）本発明の第７の態様は、配列番号６に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（２）から（４）のいずれか１項記載の核酸増幅用プライマーセットである。
（８）本発明の第８の態様は、配列番号５に記載のオリゴヌクレオチド及び配列番号７に記載のオリゴヌクレオチドを選択することを特徴とする前記（２）から（４）のいずれか１項記載の核酸増幅用プライマーセットである。
【００２７】  （９）本発明の第９の態様は、前記（１）記載の核酸増幅用プライマーを使用し、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を検査することを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法である。
（１０）本発明の第１０の態様は、組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある５’領域又はＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を指標とすることを特徴とする散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の識別方法である。
【００２８】  （１１）本発明の第１１の態様は、前記シトシンのメチル化の有無の検査を核酸増幅方法により行う前記（９）又は（１０）に記載の識別方法である。
（１２）本発明の第１２の態様は、マイクロサテライト反復配列分析を組み合わせたことを特徴とする前記（９）から（１１）のいずれか１項に記載の識別方法である。
（１３）本発明の第１３の態様は、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質の免疫染色分析を組み合わせたことを特徴とする前記（９）から（１２）のいずれか１項に記載の識別方法である。
【００２９】  （１４）本発明の第１４の態様は、前記（１）記載のプライマーを含む検査用試薬である。
（１５）本発明の第１５の態様は、前記（１）記載のプライマーを含む検査用試薬キットである。
【００３０】  （１６）本発明の第１６の態様は、以下の１）〜９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーであって、解析対象遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無を検出するためのプライマーである：
１）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
９）前記１）から８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【００３１】  （１７）本発明の第１７の態様は、前記（１６）記載のプライマーを少なくとも３つ含む解析対象遺伝子中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を検出するための核酸増幅用プライマーセットであって、この少なくとも３つのプライマーが、
ａ）前記解析対象遺伝子中の少なくとも１つの検出対象ＣｐＧ領域を含む部分が増幅されるように選択され、かつＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結合する、１対のメチル化非特異的プライマー、及び
ｂ）前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンである場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にウラシル又はチミンに変換されれば前記解析対象遺伝子に結合しない、少なくとも１つのメチル化シトシン特異的プライマー
である、プライマーセットである。
【００３２】  （１８）本発明の第１８の態様は、解析対象遺伝子のＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化を検出する方法であって、
（１）試料由来の核酸を修飾剤によって修飾し、
（２）前記核酸を鋳型として、以下のプライマー：
ａ）前記解析対象遺伝子中の少なくとも１つの検出対象ＣｐＧ領域を含む部分が増幅されるように選択され、かつＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結合する、１対のメチル化非特異的プライマー、及び
ｂ）前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンである場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にウラシル又はチミンに変換されれば前記解析対象遺伝子に結合しない、少なくとも１つのメチル化シトシン特異的プライマー
を用いて前記解析対象遺伝子核酸を増幅し、
（３）前記増幅産物を検出する
工程を含むことを特徴とする方法である。
【００３３】  （１９）本発明の第１９の態様は、前記メチル化シトシン特異的プライマー及び前記メチル化シトシン非特異的プライマーが、それぞれ以下の１）〜９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択するプライマーである、前記（１８）記載の方法である：
１）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
２）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
３）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
４）前記解析対象遺伝子におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
５）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
６）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
７）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；
８）前記解析対象遺伝子の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド；及び
９）前記１）から８）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドの塩基配列中の１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列からなり、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。
【００３４】  （２０）本発明の第２０の態様は、前記解析対象遺伝子が、ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＭＳＨ６、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２を含むＤＮＡミスマッチ修復タンパク質をコードする遺伝子群及びその他の大腸癌関連遺伝子群から選択される、前記（１８）記載の方法である。
【００３５】  （２１）本発明の第２１の態様は、前記解析対象遺伝子における検出対象ＣｐＧ領域におけるシトシンのメチルの有無を、試料の由来する個体における大腸癌の存在又は分類と関連づけるための、前記（１８）記載の方法である。
【００３６】  （２２）本発明の第２２の態様は、前記検出対象ＣｐＧ領域が２ヵ所以上であり、前記ｂ）のメチル化シトシン特異的プライマーを２種類以上用いる、前記（１８）記載の方法である。
【図面の簡単な説明】
【００３７】［図１］は、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域においてメチル化されたシトシンの有無を示す塩基配列の例である。
［図２］は、本発明の検査方法の概要を示す模式図である。
［図３］は、ｈＭＬＨ１の免疫染色の実施例である。
［図４］は、本発明の実施に係る核酸増幅の産物の例を示す写真図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】  以下、ｈＭＬＨ１遺伝子を解析対象遺伝子とした場合について詳細に説明するが、本発明は任意の遺伝子に対して適用可能であり、本発明における解析対象遺伝子はｈＭＬＨ１遺伝子に限定されない。
（検出原理）
核酸を修飾剤によって修飾すると、メチル化されている塩基は修飾されない。【００３９】  例えば、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のプロモーター領域中のＣｐＧ領域においては、メチル化されたシトシンは重亜硫酸修飾によって脱アミノ化されにくく、シトシンのままで存在するとされる。一方、メチル化されていないシトシンは、そのすべて又はその殆んどが重亜硫酸修飾によって一旦ウラシルに転換され、この転換されたウラシルは、これを含む一本鎖ＤＮＡを増幅すると、チミンとして複製される。【００４０】  そこで、基本的に、いずれかのＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンである場合にのみ前記ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子に結合し、前記いずれかのＣｐＧ領域ＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にウラシルに変換されれば前記ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子に結合しなくなるプライマー（メチル化シトシン特異的プライマー、以下適宜「メチル化特異的プライマー」という。）と、前記いずれかのＣｐＧ領域ＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位（位置）にはチミンが置かれる。）に転換されても、前記ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子に結合し、前記シトシンの存在するＣｐＧ領域を含む領域で核酸増幅によりオリゴヌクレオチドを形成するプライマー（メチル化シトシン非特異的プライマー、以下適宜「メチル化非特異的プライマー」という。）との少なくとも２種を、これらの両方の各々と対になって前記ＣｐＧ領域を含む領域を増幅し得る別のメチル化非特異的プライマーとともに用いて、核酸増幅方法にて増幅した産物を検出すると、前記メチル化されたシトシンを含む遺伝子に対しては、メチル化特異的プライマーとメチル化非特異的プライマー由来の２種の増幅産物が検出されるが、メチル化されていないシトシンのみを含む遺伝子に対しては、メチル化非特異的プライマー由来の１種の増幅産物のみが検出される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記ＣｐＧ領域のメチル化の有無を識別することができる。【００４１】  本発明においては、メチル化特異的プライマーであれ、メチル化非特異的プライマーであれ、プライマーが少なくとも１つのＣｐＧ領域（そのＣｐＧ領域中にメチル化シトシンが存在する）を含むオリゴヌクレオチドを選択する。ここで、「プライマーが少なくとも１つのＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを選択する」とは、そのプライマーが核酸中の前記少なくとも１つのＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドの領域に結合し、前記少なくとも１つのＣｐＧ領域を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸を鋳型として、核酸増幅により前記ＣｐＧ領域に対応する領域（一般には前記ＣｐＧ領域に対して相補的である。）を含む核酸を形成することをいう。したがって、プライマーと、そのプライマーが選択する（即ち結合する）オリゴヌクレオチドとは、基本的に互いに相補的な配列を有する。【００４２】  本発明においては、メチル化特異的プライマーは、検出しようとするメチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するように設計される。一方、メチル化非特異的プラ���マーは、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合しないように設計されるが、前記メチル化シトシンの存在するＣｐＧ領域に結合するものとなってもよい。【００４３】  本発明においては、配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子（一本鎖ＤＮＡ）のプロモーター領域中で、塩基番号１０３１から１２１６の間の領域（以下、この領域を適宜「５’領域」若しくは「５’ｒｅｇｉｏｎ」という。）のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別できるプライマーセットと、塩基番号１３６９から１６００の間の領域（以下この領域を適宜「ＣＣＡＡＴ領域」若しくは「ＣＣＡＡＴ  ｒｅｇｉｏｎ」という。）のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別できるプライマーセットが見出された。特に、ＣＣＡＡＴ領域のシトシンのメチル化はｈＭＬＨ１の発現に深く関与している可能性があるので、後者のプライマーセットは、ＨＮＰＣＣの診断において重要であると考えられる。【００４４】  図１に、散発性大腸癌と診断された試料とＨＮＰＣＣと診断された試料についてＣＣＡＡＴ領域において重亜硫酸処理をして核酸増幅した部分の塩基配列を示す。図中、ＣＣＡＡＴ  ｂｏｘの上流の矢印で示される位置の塩基は、散発性ＭＳＩ＋大腸癌の試料では、いずれもシトシンとして検出されているのに対して、ＨＮＰＣＣの試料では、いずれもチミンとして検出されている。即ち、散発性大腸癌の試料では、いずれもこの部位のシトシンがメチル化されているため、重亜硫酸処理の後もシトシンのまま存在し、シトシンとして検出されるのに対して、ＨＮＰＣＣの試料では、いずれもこの部位のシトシンがメチル化されていないため、重亜硫酸処理の後に一旦ウラシルに転換され、核酸増幅の後にチミンとして検出されている。
（プライマーとプライマー用のオリゴヌクレオチド）
本発明においては、メチル化特異的プライマーは、メチル化解析の対象となるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域中のシトシンに対応する部位のみがシトシンに対応した塩基であり、前記プロモーター領域中のそれ以外のシトシンに対応する部位は、ウラシル若しくはチミンに対応するように設計される。メチル化特異的プライマーは、擬陽性を低減させるためには、好ましくは２ヵ所以上のＣｐＧ領域を含むように設計する。一方、メチル化非特異的プライマーは、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧ領域のシトシンがウラシル若しくはチミンに転換された配列、シトシンのままの配列の双方に対応するように設計される。【００４５】  一般に、メチル化特異的ＰＣＲでは、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列とが完全に相補的にアニーリングしたときにのみＤＮＡの増幅が起こり、プライマー配列と重亜硫酸修飾後のＤＮＡ配列との間に１塩基以上のミスマッチが存在するときにはＤＮＡの増幅がおこらないようにプライマー及びＰＣＲの反応系を設計する。このことによって、メチル化特異的ＰＣＲでは、１塩基のメチル化の有無も識別することができる。【００４６】  本発明においてプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、各種の核酸合成反応において必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる。【００４７】  具体的には、プライマーは、以下の１）〜１０）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち少なくとも１つを選択する核酸増幅用プライマーである。
１）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的プライマーであってもよい。
２）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、１）で表されるオリゴヌクレオチドを含む核酸を鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的プライマーであってもよい。
３）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの重亜硫酸修飾後による１本鎖ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされる。
４）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、３）で表されるオリゴヌクレオチドを含む核酸を鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列の一部と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされる。
５）配列番号２〜７に表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。プライマーが別のプライマーを認識して結合すれば、核酸増幅に好適である。
６）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの１）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的プライマーであってもよい。
７）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、６）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。メチル化特異的プライマーはこのオリゴヌクレオチドを選択し得るが、このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーは、メチル化特異的プライマーに限られず、メチル化非特異的プライマーであってもよい。
８）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、例えば、生体試料から採取した遺伝子の２本鎖ＤＮＡのうちの３）において示した１本鎖ＤＮＡに相補的に結合していた１本鎖（反対鎖）ＤＮＡ由来のものである。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされる。
９）配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の配列の相補鎖におけるＣｐＧ領域を１以上含み、前記ＣｐＧ領域中に存在するシトシン及びＣｐＧ領域以外のシトシンがチミン又はウラシルに変換された塩基配列に相補的な塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。このオリゴヌクレオチドは、８）で表されるオリゴヌクレオチドを鋳型として、核酸増幅したときに形成される増幅物の有する塩基配列と同じ塩基配列を有する。前記増幅物は、核酸増幅の次の段階で鋳型として用いられる。このオリゴヌクレオチドを選択するプライマーはメチル化非特異的プライマーとされる。
１０）前記１）から９）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドのうち１又は複数のオリゴヌクレオチドについて、１ないし複数個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異された塩基配列を含み、ＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出可能なプライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。【００４８】  より具体的には、ある実施態様においては、５’領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーは、５’領域中の少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンをウラシル又はチミンに変換した配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択するものである。【００４９】  詳しくは、このプライマーは、５’領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、５’領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にウラシルに変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。【００５０】  本実施形態においては、５’領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーとしては、配列番号３で表されるオリゴヌクレオチドがある。このプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１０９７から１１１８の部位を認識して、その遺伝子に結合する。【００５１】  ５’領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーは、５’領域中におけるＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無によらず、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するように設計されるものである。【００５２】  詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、５’領域中におけるＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無に影響を受けないように、すなわち、ＣｐＧ領域中のシトシンがウラシルに変換された場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計されることが好ましい。具体的には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンの部位に対応するメチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、又はイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチル化非特異的プライマーである。【００５３】  本実施形態においては、５’領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーとしては、配列番号２又は４で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号２で表されるプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１０３１から１０５５の部位を認識して、その遺伝子に結合する。また、配列番号４で表されるプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１１９１から１２１６の部位を認識して、その遺伝子に結合する。【００５４】  上記配列番号３で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号２で表されるメチル化非特異的プライマーと、配列番号４で表されるメチル化非特異的プライマーとの合計３種のプライマーセットを用いれば、５’領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別できる。【００５５】  即ち、図２の模式図に示されるように、５’領域において、メチル化特異的プライマーである配列番号３で表される５’−ＭＳプライマー（メチル化特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号２で表される５’−Ｓプライマー（メチル化非特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号４で表される５’−ＡＳプライマー（メチル化非特異的下流プライマー）の３種のプライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。そのとき、このＣｐＧ領域のシトシンがメチル化された試料においては、５’−ＭＳプライマーも含めた３種のプライマーがすべて遺伝子に結合する。そして、５’−ＭＳプライマーと５’−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される１１８塩基のメチル化断片と、５’−Ｓプライマーと５’−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される１８４塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される。一方、このＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない試料においては、５’−ＭＳプライマーを除いた２種のプライマーのみが遺伝子に結合するため、結果的に、５’−Ｓプライマーと５’−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される１８４塩基の非メチル化断片のみが形成される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記ＣｐＧ領域のメチル化の有無を識別することができる。【００５６】  また、別の実施態様によれば、ＣＣＡＡＴ領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーは、ＣＣＡＡＴ領域中の少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンをウラシル又はチミンに変換した配列を持ったオリゴヌクレオチドを選択する（即ち、前記オリゴヌクレオチドに結合する）ものである。【００５７】  詳しくは、このプライマーは、ＣＣＡＡＴ領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシンは重亜硫酸修飾後もシトシンのままで存在して、ＣＣＡＡＴ領域中の前記少なくとも１つのＣｐＧ領域中のシトシン以外のシトシンは、重亜硫酸修飾後にウラシルに変換されても（遺伝子増幅により増幅されたオリゴヌクレオチドにおいては、このウラシルの部位にはチミンが置かれる）、変換されずにシトシンのままで存在しても、その配列をもったオリゴヌクレオチドを選択するものである。【００５８】  本実施形態においては、ＣＣＡＡＴ領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化特異的プライマーとしては、配列番号６で表されるオリゴヌクレオチドがある。このプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１４７９から１５０２の部位を認識して、その遺伝子に結合する。【００５９】  ＣＣＡＡＴ領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーは、ＣＣＡＡＴ領域中におけるＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域を認識してその領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無によらず、前記ＣｐＧ領域を含む領域に結合するように設計されるものである。【００６０】  詳しくは、このメチル化非特異的プライマーは、ＣＣＡＡＴ領域中におけるＣｐＧ領域以外の領域に結合するように設計されることが好ましい。もし、ＣｐＧ領域を含む領域に結合するようにせざるを得ない場合には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンのメチル化の有無に影響を受けないように、すなわち、ＣｐＧ領域中のシトシンがウラシルに変換された場合、また、シトシンのまま変換されない場合の双方の配列を増幅するように設計されることが好ましい。具体的には、前記ＣｐＧ領域中のシトシンの部位に対応するメチル化非特異的プライマーの部位に混合塩基、又はイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）を配置した塩基配列からなるオリゴヌクレオチドがこの種のメチル化非特異的プライマーである。【００６１】  本実施形態においては、ＣＣＡＡＴ領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられるメチル化非特異的プライマーとしては、配列番号５又は７で表されるオリゴヌクレオチドがある。配列番号５で表されるプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１３６８から１３９４の部位を認識して、その遺伝子に結合する。また、配列番号７で表されるプライマーは、ｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列１５７５から１６００の部位を認識して、その遺伝子に結合する。【００６２】  上記配列番号６で表されるメチル化特異的プライマーと、配列番号５で表されるメチル化非特異的プライマーと、配列番号７で表されるメチル化非特異的プライマーとの合計３種のプライマーセットを用いれば、ＣＣＡＡＴ領域中のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別できる。【００６３】  即ち、図２の模式図に示されるように、ＣＣＡＡＴ領域において、メチル化特異的プライマーである配列番号６で表されるＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマー（メチル化特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号５で表されるＣＣＡＡＴ−Ｓプライマー（メチル化非特異的上流プライマー）と、メチル化非特異的プライマーである配列番号７で表されるＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマー（メチル化非特異的下流プライマー）の３種のプライマーを用いて、核酸増幅法にて核酸を増幅する。そのとき、このＣｐＧ領域のシトシンがメチル化された試料においては、ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマーも含めた３種のプライマーがすべて遺伝子に結合する。そして、ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマーとＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される１２２塩基のメチル化断片と、ＣＣＡＡＴ−ＳプライマーとＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される２３２塩基の非メチル化断片の２つのＤＮＡ断片が形成される。一方、このＣｐＧ領域のシトシンがメチル化されていない試料に���いては、ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマーを除いた２種のプライマーのみが遺伝子に結合するため、結果的に、ＣＣＡＡＴ−ＳプライマーとＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーから核酸増幅して形成される２３２塩基の非メチル化断片のみが形成される。よって、検出される増幅産物の違いに基づいて、前記ＣｐＧ領域のメチル化の有無を識別することができる。【００６４】  プライマーオリゴヌクレオチドは、公知の方法により製造することができ、例えば、リン酸トリエステル法や、リン酸アミダイト法、リン酸基部位無保護法といった固相化学的合成法を用いることができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  Ｍｏｄｅｌ  ８９０９）等を用いて合成することができる。また、１ないし複数個の塩基を置換、欠失、挿入若しくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドも公知の固相化学的合成法で合成することができる。
（プライマーセット）
本発明のプライマーセットは、上述の本発明のプライマーを２つ以上、好ましくは少なくとも３つ含む。この少なくとも３つのプライマーは、
ａ）解析対象遺伝子中の少なくとも１つの検出対象ＣｐＧ領域を含む部分が増幅されるように選択され、かつＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンのままであっても、ウラシル又はチミンに転換されても、前記解析対象遺伝子に結合する、１対のメチル化非特異的プライマー、及び
ｂ）前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にシトシンである場合にのみ前記解析対象遺伝子に結合し、前記検出対象ＣｐＧ領域中のシトシンが前記修飾剤による修飾の後にウラシル又はチミンに変換されれば前記解析対象遺伝子に結合しない、少なくとも１つのメチル化シトシン特異的プライマー
であると好都合である。【００６５】  解析対象遺伝子がｈＭＬＨ１である実施態様について説明すれば、本発明で組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にある５’領域又はＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、少なくとも１つのメチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度を、メチル化シトシン特異的プライマーの融解温度より１〜５℃高くなるようにプライマーを設計することが好ましい。また、いずれのメチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度も、いずれのメチル化シトシン特異的プライマーの融解温度より１〜５℃高くなるようにプライマーを設計するとより好ましい。ここに、プライマーの融解温度とは、プライマーがオリゴヌクレオチドに結合する至適温度のことをいう。このように、プライマーを設計した後、核酸増幅のアニーリング時の温度を、いずれかのメチル化シトシン非特異的プライマーの融解温度よりも低く、またメチル化シトシン特異的プライマーの融解温度より高くすれば、あるＣｐＧ領域中のシトシンが重亜硫酸修飾の後にシトシンでないにもかかわらず、メチル化特異的プライマーが鋳型のオリゴヌクレオチドと結合して、擬陽性の結果を生ずることを防止することができるからである。また、このようにプライマーを設計すればメチル化の有無を考慮しない、ＰＣＲにおけるコントロール産物（すなわち、２種類のメチル化非特異的プライマーにより合成される産物）を検出しやすくなる。【００６６】  本発明で組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の中にあるＣＣＡＡＴ領域におけるＣｐＧ領域におけるシトシンのメチル化の有無を識別するために用いられる核酸増幅用プライマーセットにおいては、プライマー同士のＧＣ含有率の差を２０％以内にすることが好ましい。ここに、プライマーのＧＣ含有率とは、プライマーの全塩基配列中グアニンとシトシンを合わせた塩基数の割合のことをいう。例えば、それぞれ１００塩基からなる２つのプライマーがあり、１つ目のプライマーのＧＣの数が４５で、もう１つのプライマーのＧＣの数が５０であればＧＣ含有率の差は５％であるとされる。このとき、プライマーのＧＣ含有率は、メチル化シトシン特異的プライマーを低くするとよい。このように、プライマーを設計すれば、擬陽性の結果を生ずることを防止することができ、かつ再現性のよい結果を得やすくなるので好ましい。
（検査方法）
本発明における検査方法は、具体的には、試料の準備、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの修飾、プライマーを用いた遺伝子増幅、ＤＮＡの検出の過程を含む。【００６７】  （検査用試料・病理検体の準備）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料はｈＭＬＨ１タンパク質をコードする遺伝子を含むものであればよく、特に限定されない。具体的には、生体から採取した組織の他、血液、血清、糞便、精液、唾液、脳脊髄液等が挙げられる。生体から採取した組織としては、例えば、手術により切除した大腸癌の組織や、手術前の内視鏡検査等に用いる生体検査材料等が、試料の有効利用の点で好適に用いられる。【００６８】  （ＤＮＡの抽出）
本発明の検査方法に供される、ヒトの試料は、ブレンダーを用いて組織を破砕し、次いで、フェノール・クロロフォルム法等の公知の遺伝子抽出法により、ＤＮＡを抽出し、検査用試料として用いる。【００６９】  （ＤＮＡの修飾）
前記ＤＮＡは重亜硫酸塩によって修飾される。これにより、メチル化されたシトシンは、シトシンのまま存在するが、メチル化されていないシトシンは、一旦ウラシルに転換された後、チミンとして発現することになる。本発明に使用される重亜硫酸塩は特に限定されないが、重亜硫酸ナトリウムが好適に用いられる。また、上記のような重亜硫酸塩と同等の機能を有するものを修飾剤として用いることができる。【００７０】  さらに具体的には、例えば、まず、２００ｐｇから５０μｇのＤＮＡをアルカリ条件下にて変性させる。変性の条件は、ＰＣＲの測定系に適した条件であればよいが、例えば、０．２Ｍ〜０．３ＭのＮａＯＨ溶液中にて、３７℃で５〜３０分インキュベートする。次いで、ハイドロキノン溶液及びｐＨ５．０の重亜硫酸ナトリウム溶液を終濃度がそれぞれ０．５ｍＭ及び３．１ｍＭになるように添加し、５０〜５５℃にて１６〜４０時間インキュベートすることで、非メチル化シトシンが修飾される。さらに、段階的な透析を行うことで余剰の重亜硫酸を除去する。透析された試料は、真空オーブンによる濃縮又はエタノール沈殿の後、適当な緩衝液又は純水に溶解し、通常のＰＣＲ又はメチル化特異的ＰＣＲに用いることができる。【００７１】  （遺伝子・核酸増幅）
本発明において、遺伝子増幅方法としては、公知の方法を使用することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＡＭＰ法等が挙げられる。好ましくは、ＰＣＲ法が用いられる。【００７２】  ＰＣＲ法により増幅された産物の塩基配列を決定する方法としては、Ｆｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ．ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９，１８２７−１８３１（１９９２））及びＣｌａｒｋ  ｅｔ．ａｌ．（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２，２９９０−２９９７（１９９４））等の方法がある。【００７３】  （ＤＮＡの検出）
メチル化特異的ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡの検出は、例えば、一般的なアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル電気泳動の後、ＤＮＡの染色によって行われる。染色方法としては、銀染色による方法、エチジウムブロマイド、ＳＹＢＲＲ  Ｇｒｅｅｎ等の蛍光性染色剤等による方法がある。また、電気泳動以外の方法として、５’エキソヌクレアーゼアッセイや蛍光共鳴エネルギー転移を利用したホモジニアス検出も可能である。【００７４】  （ＭＳＩ分析）
本発明の検査方法は、まず、マイクロサテライト反復配列分析（ＭＳＩ分析）を行って、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ＋）を示す散発性ＭＳＩ＋大腸癌とＨＮＰＣＣの検体を識別（スクリーニング）した後に用いれば、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の変異に基づく前記ＭＳＩ＋が、散発性ＭＳＩ＋大腸癌であるか、ＨＮＰＣＣであるかを、より精度よく識別することできる。ＭＳＩ分析は、例えば、癌細胞の遺伝子と正常細胞の遺伝子とでマイクロサテライト領域を含む領域をＰＣＲ増幅し、電気泳動によって増幅産物の鎖長を調べることにより解析できる。即ち、癌細胞の遺伝子と正常細胞の遺伝子とでは、増幅産物の鎖長が異なるので、これを基に塩基配列を決定し、マイクロサテライトが不安定である（ＭＳＩ＋）か、安定である（ＭＳＩ−又はＭＳＳ）かを判定できる。【００７５】  （ｈＭＬＨ１の免疫染色）
本発明の検査方法は、前記ＭＳＩ分析に加えて、ｈＭＬＨ１の免疫染色分析（ＩＨＣ）を組み合わせることにより、前記ＣｐＧ領域のメチル化の有無を識別できて、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の変異が、散発性大腸癌であるか、ＨＮＰＣＣであるかをさらに精度よく識別することできる。図３に示すように、ｈＭＬＨ１の免疫染色分析においては、ＣｐＧ領域がメチル化されていれば、ｈＭＬＨ１が発現されにくくなり、免疫染色において陰性となる率が高くなる。一方、ＣｐＧ領域がメチル化されていなければ、ｈＭＬＨ１は発現されやすくなるので、免疫染色において陽性となる率が高くなる。ｈＭＬＨ１の免疫染色分析においては、抗体としてｈＭＬＨ１のモノクローナル抗体を用い、色素としてダイアミノベンチジン（ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）を用いるのが好適である。【００７６】  （生体試料の判定）
本発明において、メチル化特異的ＰＣＲ検査を実施すると、ＭＳＩ＋を示す散発性大腸癌の検体においては、５’領域とＣＣＡＡＴ領域の２箇所において、シトシンのメチル化が８０％以上の高い割合で検出されるのに対して、ＭＳＩ＋を示すＨＮＰＣＣの検体においては、５’領域とＣＣＡＡＴ領域の２箇所において、シトシンのメチル化が２０％以下の低い割合で検出される。よって、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を識別することで、散発性ＭＳＩ＋大腸癌とＨＮＰＣＣを識別することができる。【００７７】  （検査用試薬及び検査用試薬キット）
本発明はまた、組織中のｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧ領域におけるＣｐＧのシトシンのメチル化の有無を散発性大腸癌と遺伝性非腺腫大腸癌の判定のための指標とする検査方法に用いられる検査試薬及び検査試薬キットを含む。検査試薬としては、メチル化特異的核酸増幅用のプライマー、エキソヌクレア−ゼ、核酸検出用の標識等、本発明の方法に使用されるあらゆる試薬のいずれであってもよい。【００７８】  また、検査用試薬キットは、本発明の検査方法に使用されるあらゆる試薬のうち少なくとも２以上をキットとして使用するものであればよい。例えば、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子（ＤＮＡ）のプロモーター領域中のＣｐＧ領域のメチル化特異的プライマーとメチル化非特異的プライマーセット等が例示される。その他、蛍光標識をプローブしたＤＮＡも本キットに含めてもよい。
【実施例】
【００７９】  以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（実施例１）
採取された大腸癌２３４症例の組織試料について、ＭＳＩ分析を行い、ＭＳＩ＋とＭＳＩ−の２種類に大腸癌を分類した。ＭＳＩ分析は、公知の手法にしたがって行った。【００８０】  ＭＳＩ＋、ＭＳＩ−と診断された癌患者について、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域中及びＣＣＡＡＴ領域中の２箇所のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の有無を調べた。具体的には以下のようにして行った。この実施例の方法の概要、即ちこの実施例において使用したプライマー及び増幅産物の関係、及び結果の判定の概略を図２に示す。【００８１】  １．試料の用意
生体試料からＤＮＡを通常のフェノール・クロロホルム法で抽出した。生体試料より抽出したＤＮＡ  １００ｎｇに、ＤＮＡ修飾キット「ＣｐＧｅｎｏｍｅ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社）」を用いて重亜硫酸ナトリウムによる非メチル化シトシンの修飾を行った。【００８２】  ２−Ａ  ５’領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の検出
上記１．のように用意した重亜硫酸修飾済みのＤＮＡの一部に対してメチル化特異的ＰＣＲ及びメチル化非特異的ＰＣＲを実施した。重亜硫酸修飾済みのＤＮＡ（鋳型）を、１×ＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）、１．２５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ「ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）」、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、及び２μＭプライマー（後述）を含む５０μＬのＰＣＲ反応液に加え、５’領域のメチル化の検出のために、９５℃／０．５分、５４℃／０．５分、７２℃／０．５分、３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。【００８３】  本実施例においては、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するためのメチル化特異的なプライマーとしては、配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域のＣｐＧ領域以外にあるシトシン以外のすべてのシトシンをチミン又はウラシルに変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドを選択した（以下、塩基番号は配列番号１中の対応する塩基の番号を表す）。【００８４】  メチル化特異的上流プライマー（５’−ＭＳプライマー）
（塩基番号１０９７−１１１８）（配列番号３）
５’−ＣＧＴＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＴＴＡＴＡＴＡＴＣ−３’
また、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するためのメチル化非特異的なプライマーとしては、配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域のＣｐＧ領域にあるすべてのシトシンをチミン又はウラシルに変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドを選択した。【００８５】  メチル化非特異的上流プライマー（５’−Ｓプライマー）
（塩基番号１０３１−１０５５）（配列番号２）
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＡ−３’
メチル化非特異的下流プライマー（５’−ＡＳプライマー）
（塩基番号１１９１−１２１６）（配列番号４）
５’−ＣＲＡＴＡＡＡＡＣＣＣＴＡＴＡＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣ−３’
なお、配列番号４中の２番目のＲは、アデニンＡ又はグアニンＧ（つまりプリン）を表す。【００８６】  例えば、５’−Ｓプライマー及び５’−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域のＤＮＡが増幅され、図２に示される１８４塩基のＤＮＡ断片（「Ｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」）が検出されるが、５’−ＭＳプライマー及び５’−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域のＤＮＡが増幅されず、図２に示される１１８塩基のＤＮＡ断片（「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」）が検出されない場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル化されたシトシンが存在しないか、存在しても検出限界を下回るほど微量であり、メチル化は陰性と判断した。【００８７】  一方、５’−Ｓプライマー及び５’−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域のＤＮＡが増幅され、図２に示される１８４塩基のＤＮＡ断片が検出され、５’−ＭＳプライマー及び５’−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域のＤＮＡも増幅され、図２に示される１１８塩基のＤＮＡ断片も検出される場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンが共存していると考えられ、この場合、メチル化は陽性と判断した。【００８８】  ２−Ｂ  ＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の検出
上記１．のように用意した重亜硫酸修飾済みのＤＮＡの一部に対してメチル化特異的ＰＣＲ及びメチル化非特異的ＰＣＲを実施した。重亜硫酸修飾済みのＤＮＡ（鋳型）を、１×ＰＣＲ緩衝液（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む）、１．２５ユニットのＤＮＡポリメラーゼ「ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社）」、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＣＴＰ、及び２μＭプライマー（後述）を含む５０μＬのＰＣＲ反応液に加え、ＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出のために、９５℃／０．５分、５８℃／０．５分、７２℃／０．５分、３５サイクルのＰＣＲ反応を実施した。【００８９】  本実施例においては、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するためのメチル化特異的なプライマーとしては、配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域以外にあるシトシン以外のすべてのシトシンをチミン又はウラシルに変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドをプライマーとして選択した。【００９０】  メチル化特異的上流プライマー（ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマー）
（塩基番号１４７９−１５０２）（配列番号６）
５’−ＹＧＴＡＴＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣ−３’
なお、配列番号６中の１番目のＹはシトシンＣ又はチミンＴ（つまりピリミジン）を表す。【００９１】  また、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化を検出するためのメチル化非特異的なプライマーとしては、配列番号１で表されるｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域のＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域にあるすべてのシトシンをチミン又はウラシルに変換した配列及びその相補鎖から、下記のオリゴヌクレオチドを選択した。【００９２】  メチル化非特異的上流プライマー（ＣＣＡＡＴ−Ｓプライマー）
（塩基番号１３６９−１３９４）（配列番号５）
５’−ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧＩＧＴＴＡＡＧＴ−３’
メチル化非特異的下流プライマー（ＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマー）
（塩基番号１５７５−１６００）（配列番号７）
５’−ＴＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＩＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣ−３’
なお、配列番号７中の１２番目のＩはイノシン３リン酸（ＩＴＰ）由来のイノシン（ヒポキサンチン）である。【００９３】  例えば、ＣＣＡＡＴ−Ｓプライマー及びＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のＣＣＡＡＴ領域のＤＮＡが増幅され、図２に示される２３２塩基のＤＮＡ断片（「Ｎｏ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」）が検出されるが、ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマー及びＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のＣＣＡＡＴ領域のＤＮＡが増幅されず、図２に示される１２２塩基のＤＮＡ断片（「Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ」）が検出されない場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル化されたシトシンが存在しないか、存在しても検出限界を下回るほど微量であり、メチル化は陰性と判断した。【００９４】  一方、ＣＣＡＡＴ−Ｓプライマー及びＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のＣＣＡＡＴ領域のＤＮＡが増幅され、図２に示される２３２塩基のＤＮＡ断片が検出され、ＣＣＡＡＴ−ＭＳプライマー及びＣＣＡＡＴ−ＡＳプライマーのペアによりｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のＣＣＡＡＴ領域のＤＮＡも増幅され、図２に示される１２２塩基のＤＮＡ断片も検出される場合には、前記プライマーで増幅される領域中にメチル化されたシトシンとメチル化されていないシトシンが共存していると考えられ、この場合、メチル化は陽性と判断した。【００９５】  ３．ｈＭＬＨ１タンパクの免疫染色法
免疫染色は、合計７５例の試料について行った。【００９６】  定法にしたがってホルマリン固定し、パラフィンに包埋した組織試料に、Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を使用した。【００９７】  ４．遺伝子修復タンパク質遺伝子の変異分析（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
ｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、及びｈＭＳＨ６の５個の遺伝子変異分析は、ＭＳＩ＋と診断された３５例の試料についてダイレクトシーケンス法及び免疫染色法によって行った。【００９８】  ５．結果
上記の手法により、２３４症例の大腸癌全体に対して検討を行った。ＭＳＩ分析の結果、２３４症例の大腸癌は、３５例のＭＳＩ＋癌（ＨＮＰＣＣを含む）及び１９９例のＭＳＩ−癌に分類された。すなわち、３５例のＭＳＩ＋癌（ＨＮＰＣＣを含む）及び１９９例のＭＳＩ−癌の生体試料についてｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域とＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化及び非メチル化を調べた。【００９９】  その結果を表１に示す。【０１００】
【表１】
2005021743.tif 000002
５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化は有為に（フィッシャーの正確検定ｐ＜０．０００１）ＭＳＩ＋癌に認められた。一方、５’領域のメチル化がＭＳＩ−癌においても認められたのに対し、ＣＣＡＡＴ領域のメチル化はＭＳＩ−癌においては一切認められなかった。【０１０１】  また、この５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化検出検査におけるＭＳＩ＋癌のＭＳＩ−癌に対する感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比も併せて表１に示す。５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化陽性の場合は共に感度は５０％から６０％である。これは後述するようにＭＳＩ＋癌にＨＮＰＣＣ及び散発性ＭＳＩ＋癌が含まれるためである。一方、特異度は、５’領域のメチル化検出では８５．９％であるのに対し、ＣＣＡＡＴ領域のメチル化検出では１００％であった。【０１０２】  このことよりＣＣＡＡＴ領域のメチル化検出検査を行うことは、ＭＳＩ＋癌を見逃す（ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）可能性が５’領域のメチル化検出よりもやや高いが、特異度が極めて高いため、誤診（ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）を避けることが可能であると考えられる。逆に、５’領域のメチル化検出検査を行うことは、ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅの可能性がＣＣＡＡＴ領域のメチル化検出よりもやや低いが、特異度がやや劣るため、わずかながらｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅが生じる可能性を有すると考えられる。いずれの検査も、ＭＳＩ＋癌の発見に有用であることが明らかになった。【０１０３】  また、ｈＭＬＨ１タンパクの免疫染色（ＩＨＣ）との関係を表２に示す。図３に、ｈＭＬＨ１タンパクの免疫染色（ＩＨＣ）の陽性例及び陰性例を示す。【０１０４】
【表２】
2005021743.tif 000003
免疫染色は合計７５症例に対して行われた。５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化はｈＭＬＨ１タンパク発現との間に強い相関関係を示した（フィッシャーの正確検定ｐ＜０．０００１）。しかし、５’領域にメチル化を認めた症例２５例のうち６症例にｈＭＬＨ１免疫染色陽性が認められたのに対し、ＣＣＡＡＴ領域にメチル化を認めた症例１８症例はすべて陰性であった。なお、この免疫染色陰性症例の中にはｈＭＬＨ１遺伝子に突然変異を持つＨＮＰＣＣ症例も含まれている。このため、５’領域にメチル化を認めない、かつ、ｈＭＬＨ１免疫染色陰性例６症例のうち２症例にｈＭＬＨ１遺伝子に突然変異を認めた。また、同様にＣＣＡＡＴ領域にメチル化を認めない、かつ、ｈＭＬＨ１免疫染色陰性例７症例のうち、２症例にｈＭＬＨ１遺伝子に突然変異を認めた（後出の表３、表４参照）。【０１０５】  次に、ＭＳＩ＋と診断された３５症例に対して検討を行った。ＭＳＩ＋と診断された３５症例のうち、散発性大腸癌と診断された１９症例と、家族歴の追跡等によりＨＮＰＣＣと診断された１６症例に対して、上記と同様の解析を行った。結果を表３及び表４の左側の欄にそれぞれ示す。【０１０６】
【表３】
2005021743.tif 000004
散発性大腸癌１９症例の解析【０１０７】
【表４】
2005021743.tif 000005
ＨＮＰＣＣ１６症例の解析
表３及び表４において、「Ｍ」＝メチル化検出、「Ｕ」＝メチル化検出せず、「ｎ」＝陰性、「ｐ」＝陽性を表す。【０１０８】  表３に示す散発性ＭＳＩ＋大腸癌の１９症例においては、５’領域のシトシンのメチル化（「Ｍ」）が１８症例で見られ、ＣＣＡＡＴ領域のシトシンのメチル化（「Ｍ」）が１６症例で見られた。一方、表４に示すＨＮＰＣＣの１６症例においては、５’領域のシトシンのメチル化は３症例でしか見られず、ＣＣＡＡＴ領域のシトシンのメチル化（「Ｍ」）も２症例でしか見られなかった。このことから、散発性ＭＳＩ＋大腸癌と５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のシトシンのメチル化（「Ｍ」）との間には有為な相関関係が認められた（フィッシャーの正確検定ｐ＜０．０００１）。一方、ＨＮＰＣＣと５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のシトシンの非メチル化（「Ｕ」）との間にも有為な相関関係が認められることが分かった（フィッシャーの正確検定ｐ＜０．０００１）。【０１０９】  また、表３における散発性ＭＳＩ＋大腸癌の症例Ｎｏ．１からＮｏ．７までの７例の５’領域及びＣＣＡＡＴ領域の核酸増幅の産物を図４（ａ）に示す。これは、散発性ＭＳＩ＋大腸癌の症例Ｎｏ．１からＮｏ．７までの７例がすべて、５’領域及びＣＣＡＡＴ領域においてメチル化されたシトシンを有したことを示すものである。なお、図４（ａ）において、「５’ｒｅｇｉｏｎ」及び「ＣＣＡＡＴ  ｂｏｘ」の各々について、最上段の「１」〜「７」はぞれぞれ表３における症例Ｎｏ．を示し、その下の段の「Ｔ」は腫瘍部分から抽出されたＤＮＡを、「Ｎ」はその正常粘膜部分から抽出されたＤＮＡより得られた解析結果を示す。右端の「Ｍ」はメチル化ＤＮＡのコントロールを、「Ｕ」は非メチル化ＤＮＡのコントロールを示す。写真の下の「Ｍ」は、メチル化シトシンが検出されたことを示す。【０１１０】  また、表４におけるＨＮＰＣＣ大腸癌の症例Ｎｏ．３からＮｏ．９までの７例の５’領域及びＣＣＡＡＴ領域の核酸増幅の産物を図４（ｂ）に示す。これは、ＨＮＰＣＣ大腸癌の症例Ｎｏ．４と５の２例の５’領域、及びＮｏ．４の１例のＣＣＡＡＴ領域においてメチル化されたシトシンを有したことを示すものである。図４（ｂ）中の記号については上記と同様である。【０１１１】  また、上記３５症例について、遺伝子修復（ＭＭＲ）タンパク質であるｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、及びｈＭＳＨ６の５個について、遺伝子の変異分析（ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ）及びタンパク質の免疫染色分析（ＩＨＣ）を行った。表３の中央（「Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」の欄及び「ＩＨＣ  ｏｆ  ＭＭＲ」の欄）に示すように、散発性ＭＳＩ＋大腸癌の１９症例においては、遺伝子の変異及びｈＭＬＨ１以外の遺伝子修復タンパク質の消失を示すデータは現れなかった（空欄は変異又はタンパク質の消失が検出されなかったことを示す）。一方、表４に示すように、ＨＮＰＣＣの１６症例においては、比較的多くの症例において、遺伝子の変異とそれによる遺伝子修復タンパク質の消失が見られた。【０１１２】  さらに、上記３５症例について、大腸癌と関連する他の６種の遺伝子又は遺伝子座、即ち、ＭＩＮＴ２、ｐ１６、ＭＩＮＴ３１、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、���ＩＮＴ１、ｐ１４をコードする遺伝子又は遺伝子座のメチル化の状態を調べた。表３の右側（「Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ」）の欄に示すように、散発性ＭＳＩ＋大腸癌の１９症例においては、どの遺伝子又は遺伝子座においても高い割合でメチル化（「Ｍ」）が検出された（表中、「Ｕ」は非メチル化を示す）。一方、表４に示すように、ＨＮＰＣＣの１６症例においては、どの遺伝子又は遺伝子座においてもメチル化の検出された割合は低かった。【０１１３】  この３５症例の検査結果のもとに、ＭＳＩ＋大腸癌症例に対してｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査におけるＭＳＩ＋癌のＨＮＰＣＣに対する感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表５の上２段に示す。【０１１４】
【表５】
2005021743.tif 000006
表５に示すように、ＭＳＩ＋大腸癌において、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を見逃さずに検出する場合は、５’領域のメチル化検出検査の方がＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査よりも優れていることが感度より示された。一方、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を誤診せずに検出する場合は、ＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査の方が５’領域のメチル化検出検査よりも優れていることが特異度より示された。【０１１５】  以上から、目的に応じていずれか一方の検査でも充分有用であるが、双方の検査を行うことにより、ＭＳＩ＋大腸癌患者から散発性ＭＳＩ＋大腸癌患者を精度よく検出することが可能であり、そしてこのＭＳＩ＋大腸癌患者から散発性ＭＳＩ＋大腸癌患者を識別することによりＨＮＰＣＣ患者を精度よく識別できることが確認された。【０１１６】  また、遺伝子修復タンパク質であるｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、及びｈＭＳＨ６の５個についての免疫染色分析（ＭＭＲ  ＩＨＣ）において、どれかに陰性（−）を示す症例において、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子の５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査におけるＭＳＩ＋癌のＨＮＰＣＣに対する感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表５の下２段に示す。【０１１７】  表５に示すように、ＭＭＲ  ＩＨＣ（−）大腸癌において、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を見逃さずに検出する場合は、５’領域のメチル化検出検査の方がＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査よりも優れていることが感度より示された。一方、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を誤診せずに検出する場合は、ＣＣＡＡＴ領域のメチル化の検出検査の方が５’領域のメチル化検出検査よりも優れていることが特異度より示された。【０１１８】  以上から、遺伝子修復タンパク質であるｈＭＬＨ１、ｈＭＳＨ２、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、及びｈＭＳＨ６の５個の免疫染色分析（ＭＭＲ  ＩＨＣ）を行った際においても、５’領域及びＣＣＡＡＴ領域のメチル化検出検査を行うことによって、ＭＳＩ＋大腸癌患者から散発性ＭＳＩ＋大腸癌患者を精度よく検出することが可能であり、そしてこのＭＳＩ＋大腸癌患者から散発性ＭＳＩ＋大腸癌患者を識別することによりＨＮＰＣＣ患者を精度よく識別できることが確認された。
２−Ｃ  他の遺伝子のメチル化状態の検出
さらに、ＭＳＩ＋大腸癌症例に対してＭＩＮＴ２、ｐ１６、ＭＩＮＴ３１、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＭＩＮＴ１、ｐ１４をコードする遺伝子座及び遺伝子のメチル化の検出感度及び特異度、陽性尤度比及び陰性尤度比を求めた。結果を表６に示す。【０１１９】  この例においても散発性ＭＳＩ＋大腸癌患者のＨＮＰＣＣ患者に対するＭＩＮＴ２、ｐ１６、ＭＩＮＴ３１、ＣＡＣＮＡ１Ｇ、ＭＩＮＴ１、ｐ１４をコードする遺伝子座及び遺伝子のメチル化の検出感度及び特異度は高いことが分かった。【０１２０】
【表６】
2005021743.tif 000007
上記の各実施例に於ける陽性尤度比及び陰性尤度比であるが、陽性尤度比は、感度／（１００％−特異度）で算出され、陰性尤度比は（１００％−感度）／特異度で算出される。例えばある疾患を検出する検査方法を行うとした場合、その検査前におけるその疾患である可能性（検査前確率）があるとすると、尤度比により、その検査を行った後のその疾患である可能性（検査後確率）を求めることが可能である。よって、陽性尤度比の数値は大きければ大きい程、陰性尤度比の数値は小さければ小さい程、その検査を行った後の診断に誤りがなくなる。上記の各実施例における陽性尤度比はすべて比較的高い値を示し、陰性尤度比はすべて比較的低い値を示した。【０１２１】  このように、本実施例によれば、ＭＳＩ＋という表現型を持つ、又はＭＭＲ  ＩＨＣ（−）が認められる大腸癌の検体に対し、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域の５’領域とＣＣＡＡＴ領域のＣｐＧ領域のシトシンのメチル化の検出を行うことにより、散発性ＭＳＩ＋大腸癌を精度よく識別することによって、ＭＳＩ＋という表現型を持つ、又はＭＭＲ  ＩＨＣ（−）が認められる大腸癌症例から散発性ＭＳＩ＋大腸癌を除外することにより、ＨＮＰＣＣ症例を精度よく識別することができることが確認された。【０１２２】  以上説明したように、本発明に係る核酸増幅用プライマー及びこれを用いた遺伝子のメチル化検出方法によれば、解析対象遺伝子中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便・迅速に検出することができる。特に、大腸癌の検査方法としての態様においては、ｈＭＬＨ１をコードする遺伝子のプロモーター領域中のＣｐＧ領域のメチル化の有無を簡便に識別でき、それに基づいて、ｈＭＬＨ１タンパク質の失活がメチル化によるものなのかどうかを判定することが可能である。この判定を行うことにより、散発性ＭＳＩ＋大腸癌であるか、ＨＮＰＣＣであるかを精度よく識別することができる。【０１２３】  この出願は、平成１５年８月２９日出願の日本特許出願、特願２００３−２０９８３８に基づくものであり、特願２００３−２０９８３８の明細書及び特許請求の範囲に記載された内容は、すべてこの出願明細書に包含される。
【図１】
2005021743.tif 000008
【図２】
2005021743.tif 000009
【図３】
2005021743.tif 000010
【図４】
2005021743.tif 000011
【国際調査報告】
2005021743.tif 000012
2005021743.tif 000013
2005021743.tif 000014
2005021743.tif 000015
2005021743.tif 000016
2005021743.tif 000017
2005021743.tif 000018
2005021743.tif 000019