(57)【要約】  抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントをコードする導入遺伝子カセットを含む腫瘍溶解性ウイルス（例えば、複製可能なウイルス）であって、導入遺伝子カセットが、配列番号１２において付与されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも９５％同一の配列（例えば、９６、９７、９８または９９％同一）の配列、特に、配列番号１２のカセットを含む、腫瘍溶解性ウイルス；それを含む医薬組成物、当該腫瘍溶解性ウイルスおよび組成物を調製する方法、ならびに処置、特に、癌の処置における腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物の使用。本開示による療法を用いた、ＣＤ４０を発現している癌、特に、ＣＤ４０を過剰発現している癌を有すると特徴付けられた患者集団の処置がまた提供される。【選択図】図２９−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントをコードする導入遺伝子カセットを含む腫瘍溶解性ウイルス（例えば、複製可能なウイルス）であって、導入遺伝子カセットが、配列番号１２において付与されるアミノ酸配列またはそれに対して、特に、配列番号１２のカセットに対して少なくとも９５％同一（例えば、それに対して９６、９７、９８または９９％同一）の配列を含む、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２】
アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ＥＣＨＯエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、およびワクシニアウイルス、特に、アデノウイルスから選択される、請求項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３】
Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、タリモジーンラハーパレプベック、ＲＩＧＶＩＲ、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、Ｃａｖａｔａｋ（商標）、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、Ｇ２０７、ＨＦ１０、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、ＪＸ−５９４、ＭＧ１−ＭＡ３、ＭＶ−ＮＩＳ、ＯＢＰ−３０１、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｔｏｃａ  ５１１、特に、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖからなる群から選択される、請求項１または２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４】
配列番号１または配列番号１を含むような、それに対して少なくとも９５％同一（例えば、それに対して９６、９７、９８または９９％同一）の配列配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項５】
配列番号１からなる、請求項４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
処置における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
癌、インスリン抵抗性、肥満および／または免疫不全の処置における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ウイルスまたは組成物が、癌の処置における使用のため、例えば、ＣＤ４０を発現している癌（例えば、アップレギュレーションされた発現のＣＤ４０を伴う癌）の処置のためである、請求項６に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のウイルスまたは請求項６に記載の組成物およびさらなる抗癌療法を含む、併用療法（例えば、癌の処置における使用のため）。
【請求項１１】
前記さらなる抗癌療法が、化学療法である、請求項１０に記載の併用療法。
【請求項１２】
前記さらなる抗癌療法が、チェックポイント阻害剤である、請求項１０または１１に記載の併用療法。
【請求項１３】
前記抗癌療法が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）阻害剤、Ｂ７Ｈ７（ＨＨＬＡ２）阻害剤、ＣＤ９６阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、請求項１２に記載の併用療法。
【請求項１４】
前記阻害剤が、抗体またはその結合フラグメントである、請求項１３に記載の併用療法。
【請求項１５】
前記さらなる抗癌療法が、同時刺激経路アゴニストである、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の併用療法。
【請求項１６】
前記さらなる抗癌療法が、ＣＤ２７アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＴＭＩＧＤ２（ＩＧＰＲ−１／ＣＤ２８Ｈ）アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、４−１ＢＢアゴニスト、およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、請求項１５に記載の併用療法。
【請求項１７】
前記療法が、抗体またはその結合フラグメントである、請求項１４に記載の併用療法。
【請求項１８】
前記さらなる抗癌療法が、免疫応答を活性化するか、または免疫応答の抑制、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＤＯ阻害剤、およびその２つ以上の組み合わせから選択される免疫応答の抑制を逆転させる、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の併用療法。
【請求項１９】
前記さらなる癌療法が、腫瘍溶解性ウイルス、例えば、アデノウイルス、特に、群Ｂアデノウイルスのような、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスである、請求項１０〜１８のいずれか１項に記載の併用療法。
【請求項２０】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、ＲＮＡｉ配列、抗体またはその結合フラグメント、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節物質および酵素からなる群から選択される物質をコードする治療遺伝子をコードする、請求項１９に記載の併用療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アデノウイルスのような、腫瘍溶解性ウイルス、本開示の腫瘍溶解性ウイルスを含む組成物、当該腫瘍溶解性ウイルスおよび組成物を調製する方法ならびに処置における、特に、癌の処置における腫瘍溶解性ウイルスまたは組成物の使用に関する。本開示による療法を用いた、ＣＤ４０を発現している癌、特に、ＣＤ４０を過剰発現している癌を有すると特徴付けられた患者集団の処置がまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４０は、ＢおよびＴ細胞の活性化因子であり、例えば、抗原提示細胞上のＣＤ４０は、Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４としても知られる）に結合して、それを活性化する。ＣＤ４０はまた、多数の腫瘍細胞上に存在し、それらは、ＣＤ４０を使用して、周囲の細胞からサイトカインおよび成長因子を得て、癌の成長および拡大をサポートする。
【０００３】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体は、インビボで、免疫細胞上での作用に起因して抗腫瘍免疫応答を刺激することができ得る。これは、ＣＤ４０は、例えば、マクロファージを活性化して、および樹状細胞を「プレコンディショニングして」、それらが有効な細胞傷害性Ｔ細胞応答に備えることを可能にすることができるためである。
【０００４】
現在、免疫腫瘍療法および／または腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）に向けた療法における意味のある関心が存在する。これらの腫瘍関連マクロファージは、腫瘍を囲み、腫瘍成長および発生に寛容である微小環境の生成に関与する。この微小環境は、しばしば低酸素であり、腫瘍に接着し、除去するために送られた免疫細胞を無効化することができる。従って、微小環境は、腫瘍を物理的に保護する。さらに、これは、エネルギーおよび栄養素を供給して、腫瘍成長をサポートする。
【０００５】
しかしながら、有効であるには、療法は、この環境を実際に標的化して、免疫細胞、例えば、微小環境に既にトラップされた免疫細胞を再度活気付け、自由にし、動員し、再度活性化することを必要とする。時に、腫瘍は、治療を腫瘍環境の外側に移す活性な輸送機序のような、保護のための機序の発生を有するので、微小環境のこの標的化を行うのは容易ではない。これは、例えば、抵抗性に関与する機序の１つである。
【０００６】
腫瘍細胞に向かい、癌細胞に選択的に感染し得る群Ｂ腫瘍溶解性アデノウイルスのような、腫瘍溶解性ウイルスを使用して、抗ＣＤ４０抗体が腫瘍の微小環境にデリバリーされ得る。腫瘍溶解性ウイルスは、抗癌特性を有し、それが、癌細胞の死および当該細胞の内容物の放出をもたらす。細胞の内容物は、腫瘍溶解性ウイルスにより作製された抗ＣＤ４０抗体を含む。従って、癌細胞の死は、抗体を腫瘍の微小環境に放出する。驚くべきことに、本発明者らは、抗ＣＤ４０抗体が、抗ＣＤ４０抗体をコードする導入遺伝子をかかるウイルスに取り込ませることにより、例えば、ウイルスを本開示の導入遺伝子カセットを用いて形質導入することにより、様々な異なる腫瘍溶解性ウイルスにより効率的にデリバリーされ得ることを見出した。
【０００７】
加えて、腫瘍は、保護のための複数の機序を発生させるので、将来的に最も有効な癌療法は、２つ以上の生物学的機序を介して癌を攻撃することを必要とすることが、今後考えられる。
【０００８】
アゴニスト抗ＣＤ４０抗体の利用は、抗体が、適当な濃度で腫瘍微小環境内にあると、それは、ＣＤ４０発現癌細胞と競合して、ＣＤ４０Ｌに結合し得るというさらなる利点を有し得る。これは、結局、癌細胞がＴ細胞上のＣＤ４０Ｌに結合する機会がほとんどないことを意味する。同様に、これは、腫瘍が利用可能なエネルギーおよび栄養素の量が、低減され得ることを意味し得る。
【０００９】
本発明者らは、安定なウイルスを作製するために使用することができる抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントをコードする導入遺伝子カセットを設計した。
【発明の概要】
【００１０】
本開示は、以下を提供する。
１．抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントをコードする導入遺伝子カセットを含む腫瘍溶解性ウイルス（例えば、複製可能なウイルス）であって、導入遺伝子カセットが、配列番号１２において付与されるアミノ酸配列またはそれに対して、特に、配列番号１２のカセットに対して少なくとも９５％同一（例えば、それに対して、特に、配列の全長に渡り９６、９７、９８または９９％同一）の配列を含む、腫瘍溶解性ウイルス。（代替の）項１：抗ＣＤ４０抗体またはその結合フラグメントをコードする腫瘍溶解性アデノウイルス（例えば、複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルス）であって、アデノウイルスが、配列番号１またはそれに対して少なくとも９５％同一（例えば、それに対して９６、９７、９８または９９％同一）の配列を含む、腫瘍溶解性アデノウイルス。
２．アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ＥＣＨＯエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、およびワクシニアウイルス、特に、アデノウイルスから選択される、項１に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
３．Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、タリモジーンラハーパレプベック、ＲＩＧＶＩＲ、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、Ｃａｖａｔａｋ（商標）、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、Ｇ２０７、ＨＦ１０、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、ＪＸ−５９４、ＭＧ１−ＭＡ３、ＭＶ−ＮＩＳ、ＯＢＰ−３０１、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｔｏｃａ  ５１１、特に、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖからなる群から選択される、項１または２に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
４．配列番号１を含む、項１〜３のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
５．配列番号１からなる、項４に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
６．項１〜５のいずれか１項に記載のウイルス、および医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
７．処置における使用のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは項６に記載の医薬組成物。
８．癌、インスリン抵抗性、肥満および／または免疫不全の処置における使用のための、項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは項６に記載の医薬組成物。
９．ウイルスまたは組成物が、癌の処置における使用のため、例えば、ＣＤ４０を発現している癌（例えば、アップレギュレーションされた発現のＣＤ４０を伴う癌）の処置のためである、項６に記載の使用。
１０．項１〜５のいずれか１項に記載のウイルスまたは項６に記載の組成物およびさらなる抗癌療法を含む、併用療法（例えば、癌の処置における使用のため）。
１１．さらなる抗癌療法が、化学療法である、項１０に記載の併用療法。
１２．さらなる抗癌療法が、チェックポイント阻害剤である、項１０または１１に記載の併用療法。
１３．抗癌療法が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）阻害剤、Ｂ７Ｈ７（ＨＨＬＡ２）阻害剤、ＣＤ９６阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、項１２に記載の併用療法。
１４．阻害剤が、抗体またはその結合フラグメントである、項１３に記載の併用療法。
１５．さらなる抗癌療法が、同時刺激経路アゴニストである、項１０〜１４のいずれか１項に記載の併用療法。
１６．さらなる抗癌療法が、ＣＤ２７アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＴＭＩＧＤ２（ＩＧＰＲ−１／ＣＤ２８Ｈ）アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、４−１ＢＢアゴニスト、およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、項１５に記載の併用療法。
１７．療法が、抗体またはその結合フラグメントである、項１６に記載の併用療法。
１８．さらなる抗癌療法が、免疫応答を活性化するか、または免疫応答の抑制、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＤＯ阻害剤、およびその２つ以上の組み合わせから選択される免疫応答の抑制を逆転させる、項１０〜１７のいずれか１項に記載の併用療法。
１９．さらなる癌療法が、腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）、例えば、アデノウイルス、特に、群Ｂアデノウイルスのような、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスである、項１０〜１８のいずれか１項に記載の併用療法。
２０．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、ＲＮＡｉ配列、抗体またはその結合フラグメント、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節物質および酵素からなる群から選択される物質をコードする治療遺伝子をコードする、項１９に記載の併用療法。
２１．抗体またはその結合フラグメントが、ＯＸ４０、ＯＸ４０リガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ７０、ＣＤ１３７、ＧＩＴＲ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳリガンド、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ１６０、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンドおよびその２つ以上の組み合わせに特異的である、項２０に記載の併用療法。
２２．サイトカインが、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、リンホトキシンα（ＬＴＡ）およびＧＭ−ＣＳＦ、例えば、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβおよびリンホトキシンα（ＬＴＡ）ならびにその２つ以上の組み合わせを含む群から独立して選択される、項２０または２１に記載の併用療法。
２３．ケモカインが、ＩＬ−８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５およびＣＲＴＨ２、例えば、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４およびＣＸＣＲ４、そのいずれか１つの受容体、およびその２つ以上の組み合わせを含む群から独立して選択される、項２０〜２２のいずれか１項に記載の併用療法。
２４．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、Ｂ７タンパク質、例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２の膜貫通型アンカード形態をコードする、項１９〜２３のいずれか１項に記載の併用療法。
２５．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）阻害剤、Ｂ７Ｈ７（ＨＨＬＡ２）阻害剤、ＣＤ９６阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択されるチェックポイント阻害剤をコードする、項１９〜２４のいずれか１項に記載の併用療法。
２６．阻害剤が、抗体またはその結合フラグメントである、項２５に記載の併用療法。
２７．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、同時刺激経路アゴニストをコードする、項１９〜２６のいずれか１項に記載の併用療法。
２８．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、ＣＤ２７アゴニスト、ＣＤ２８アゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＴＭＩＧＤ２（ＩＧＰＲ−１／ＣＤ２８Ｈ）アゴニスト、ＣＤ２２６アゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、４−１ＢＢアゴニストおよびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される同時刺激経路アゴニストをコードする、項２７に記載の併用療法。
２９．腫瘍溶解性ウイルス（さらなる腫瘍溶解性ウイルス）が、免疫応答を活性化するか、または免疫応答の抑制、例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦβ、ＩＤＯ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせから選択される免疫応答の抑制を逆転させる分子をコードする、項１９〜２８のいずれか１項に記載の併用療法。
３０．項１〜５のいずれか１項において定義される腫瘍溶解性アデノウイルスを含み、請求項１９〜２９のいずれか１項において定義されるさらなる腫瘍溶解性ウイルスを含む、医薬製剤。
３１．処置における使用のための、項１９〜２９のいずれか１項において定義される併用療法または請求項３０において定義される医薬組成物。
３２．癌、インスリン抵抗性、肥満、および／または免疫不全の処置のための医薬の製造における使用のための、項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性ウイルスまたは請求項６または３０に記載の医薬組成物。
３３．アデノウイルスまたは組成物が、癌の処置のための医薬の製造における使用のためである、項３２に記載の使用。
３４．処置の標的患者集団が、ＣＤ４０が、癌においてアップレギュレーションされている集団のような、ＣＤ４０を発現する癌を有する、項３３に記載の使用。
３５．項１〜５のいずれか１項に記載のウイルスまたは項６または３０に記載の組成物およびさらなる抗癌療法を含む、癌の処置のための医薬の製造における使用のための併用療法であって、例えば、処置の標的患者集団が、ＣＤ４０が、癌においてアップレギュレーションされている集団のような、ＣＤ４０を発現する癌を有する、併用療法。
３６．さらなる抗癌療法が、化学療法である、項３５に記載の併用療法。
３７．さらなる抗癌療法が、チェックポイント阻害剤である、項３５または３６に記載の併用療法。
３８．抗癌療法が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）阻害剤、Ｂ７Ｈ７（ＨＨＬＡ２）阻害剤、ＣＤ９６阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、項３７に記載の併用療法。
３９．さらなる癌療法が、腫瘍溶解性ウイルス、例えば、請求項１９〜２９のいずれか１項において定義されるような、複製可能な腫瘍溶解性ウイルスである、項３５〜３８のいずれか１項に記載の併用療法。
４０．治療上有効量の項１〜５のいずれか１項に記載の腫瘍溶解性アデノウイルスまたは項６または３０に記載の医薬組成物をそれを必要とする患者に投与する工程を含む、処置方法。
４１．癌、インスリン抵抗性、肥満、および／または免疫不全の処置のための、項４０に記載の方法。
４２．癌、例えば、ＣＤ４０を発現している癌（例えば、アップレギュレーションされたＣＤ４０発現を有する癌）の処置のための、項４１に記載の方法。
４３．処置が、追加の抗癌療法をさらに含む、項３７〜４２のいずれか１項に記載の方法。
４４．さらなる抗癌療法が、化学療法である、項４３に記載の併用療法。
４５．さらなる抗癌療法が、チェックポイント阻害剤である、項４２または４４に記載の併用療法。
４６．抗癌療法が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＬＡＧ−３阻害剤、ＴＩＧＩＴ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（Ｂ７Ｓ１）阻害剤、Ｂ７Ｈ７（ＨＨＬＡ２）阻害剤、ＣＤ９６阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤およびその２つ以上の組み合わせを含む群から選択される、項４５に記載の併用療法。
４７．さらなる癌療法が、腫瘍溶解性ウイルス、例えば、複製可能な腫瘍溶解性ウイルス、例えば、請求項１９〜２９のいずれか１項において定義されるウイルスである、項４２〜４６のいずれか１項に記載の併用療法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は抗ＣＤ４０導入遺伝子カセットの図を示す。
【図２】図２ＡおよびＢはトータルの粒子産生に関するＮＧ−３５０ウイルス活性（Ａ）および細胞上清におけるウイルス粒子産生（Ｂ）を示す。  図２ＣはＥＬＩＳＡを使用して測定された分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を示す。
【図３】図３は組み合わせＥｃｏＲｖ／ＮｈｅＩ（Ａ）または個々の酵素ＮｃｏＩもしくはＦｓｐＩ（Ｂ）を使用した、対照対ＮＧ−３５０ＤＮＡの制限酵素切断の結果を示す。
【図４】図４はプライマーが結合するＮＧ−３５０導入遺伝子カセットにおける場所を示す。
【図５】図５はゲル電気泳動を使用した、ＰＣＲ産物の分離を示す。
【図６】図６はプライマーセットＤ（Ａ）およびプライマーセットＫ（Ｂ）を使用したＰＣＲ産物の分離を示す。
【図７】図７ＡはＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａ（配列番号１のウイルス）についての様々な感染密度での％細胞生存の定量を示す。
【図８】図７および８はＮＧ−３５０ＡおよびＥｎＡｄについての１個の細胞当たりの検出されたウイルスゲノムの数の定量を示す。
【図９】図９ＡおよびＢはプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して測定されたプレートのそれぞれのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度および分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を示す。    図９ＣはＥｎＡｄ、ＮＧ−３５０Ａおよび陽性対照（図４Ｃ）についての４５０ｎｍにおける吸光度ならびにＮＧ−３５０Ａ感染細胞の上清に存在する分泌された抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０への特異的結合を示す。
【図１０】図１０はＮＧ−３５０Ａ、ＥｎＡｄまたはＮＧ−１６５感染細胞についての、プレートリーダーを使用したそれぞれの試料について測定された６２０ｎｍにおける吸光度を示す。
【図１１Ａ】図１１ＡおよびＢはプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して測定されたプレートのそれぞれのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度および分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を示す。
【図１１Ｂ】同上。
【図１２】図１２はＥＬＩＳＡを使用して測定された分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を示す。
【図１３】図１３はＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ５４（Ｂ）およびＨＬＡ−ＤＲ（Ｃ）活性化マーカーを発現しているｍｏＤＣのパーセンテージを示す。
【図１４】図１４はＥｎＡｄウイルス、またはＥｎＡｄウイルスのみの存在下または不存在下でＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生された精製された抗ＣＤ４０抗体と共に培養されたｍｏＤＣによるＩＬ１２ｐ４０の分泌を示す。
【図１５−１】図１５はＣＤ８６（Ａ）、ＣＤ５４（Ｂ）、ＭＦＩ  ＨＬＡ−ＤＲ（Ｃ）およびＣＤ８０（Ｄ）を発現しているＣＤ１９＋細胞のパーセンテージを示す。
【図１５−２】同上。
【図１６】図１６は抗体またはウイルス処置単独と比較した、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞とＥｎＡｄウイルス一緒により産生された精製された抗ＣＤ４０抗体を用いた処置後の分裂しているＢ細胞のパーセンテージを示す。
【図１７】図１７はＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生されたウイルスを枯渇させた抗体調製物が、ヒトＭｏＤＣの表面上のＣＤ４０に結合することを示す。
【図１８Ａ】図１８は例としてのヒトＭｏＤＣ上の細胞表面マーカーアップレギュレーションに対するＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生されたウイルスを枯渇させた抗ＣＤ４０Ａｂの効果（Ａ）および４人の異なるＭｏＤＣドナーについての２４および４８時間における用量応答（Ｂ〜Ｅ）を示す。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【図１８Ｅ】同上。
【図１９Ａ】図１９は４人の異なるＭｏＤＣドナーについての２４および４８時間における用量応答としてのヒトＭｏＤＣによるサイトカイン分泌に対するＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生されたウイルスを枯渇させた抗ＣＤ４０Ａｂの効果を示す（Ｂ〜Ｄ）。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図１９Ｄ】同上。
【図２０】図２０はウイルスを枯渇させていない、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生された抗体調製が、ヒトＭｏＤＣの表面上のＣＤ４０に結合することを示す。
【図２１Ａ】図２１は２人の異なるドナー由来のヒトＭｏＤＣ上の２４および４８時間における細胞表面マーカーアップレギュレーションに対する、ウイルスを枯渇させていない、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生された抗ＣＤ４０Ａｂの効果を示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２２Ａ】図２２は２人の異なるドナーについての２４および４８時間における用量応答としてのヒトＭｏＤＣによるサイトカイン分泌に対する、ウイルスを枯渇させていない、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生された抗ＣＤ４０Ａｂの効果を示す。
【図２２Ｂ】同上。
【図２３Ａ】図２３は３人の異なるＢ細胞ドナーについての２４および４８時間における用量応答としてのヒトＢ細胞上での細胞表面マーカーアップレギュレーションに対するＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生されたウイルスを枯渇させた抗ＣＤ４０Ａｂの効果を示す。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２４Ａ】図２４は３人の異なるドナー由来のヒトＢ細胞上の２４および４８時間における細胞表面マーカーアップレギュレーションに対する、ウイルスを枯渇させていない、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞により産生された抗ＣＤ４０Ａｂの効果を示す。
【図２４Ｂ】同上。
【図２４Ｃ】同上。
【図２５Ａ】図２５はＥｎＡｄについてのものと比較して、ＮＧ−３５０Ａを感染させた１０の異なる腫瘍細胞株によるウイルスゲノム複製（ｑＰＣＲ）の時間経過を示す。
【図２５Ｂ】同上。
【図２５Ｃ】同上。
【図２５Ｄ】同上。
【図２５Ｅ】同上。
【図２５Ｆ】同上。
【図２６Ａ】図２６はＥｎＡｄについてのものと比較して、ＮＧ−３５０Ａを感染させた４つの例の腫瘍細胞株におけるウイルスにより誘導された腫瘍退縮（ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅアッセイ）の時間経過を示す。
【図２６Ｂ】同上。
【図２７−１】図２７はＮＧ−３５０Ａを感染させた１０の異なる腫瘍細胞株による抗ＣＤ４０抗体ｍＲＮＡ発現の時間経過を示す。
【図２７−２】同上。
【図２８】図２８は異なる腫瘍細胞株によるＩｇＧ２ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ４０導入遺伝子タンパク質発現の検出を示す。
【図２９−１】図２９はＥｎＡｄのものと比較したＮＧ−３５０Ａ粒子を用いたＩＶ投与後の実際の血漿サイトカイン応答の時間経過；ＭＣＰ−１（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）およびＴＮＦα（Ｃ）を示す。
【図２９−２】同上。
【図３０】図３０はＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａの単回静脈内投与後の血漿におけるアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）濃度の時間経過を示す。
【図３１Ａ】図３１はＥｎＡｄのものと比較した、ＮＧ−３５０Ａ粒子を用いた繰り返しＩＶ投与計画の第１および第３の投与後の実際の血漿サイトカイン応答；ＭＣＰ−１（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）を示す。
【図３１Ｂ】同上。
【図３２】図３２はＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａの３回の静脈内投与のそれぞれの後の末梢血におけるウイルス薬物動態を示す。
【図３３】図３３はＮＧ−３５０Ａウイルス粒子の単回静脈内投与後のマウス組織由来の生ウイルスの回復を示す。
【図３４】図３４はＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄの３回のＩＶ注射または単回の分画ＩＴ投与後の皮下Ａ５４９（ＡおよびＢ）ならびにＨＣＴ１１６（ＣおよびＤ）腫瘍におけるウイルスゲノム複製を示す。
【図３５】図３５はＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄの３回のＩＶ注射または単回の分画ＩＴ投与後の皮下Ａ５４９（ＡおよびＢ）またはＨＣＴ−１１６（ＣおよびＤ）腫瘍におけるウイルスＥ３ｍＲＮＡ発現を示す。
【図３６】図３６はＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄの３回のＩＶ注射または単回の分画ＩＴ投与後の皮下Ａ５４９（ＡおよびＢ）ならびにＨＣＴ−１１６（ＣおよびＤ）腫瘍における抗ＣＤ４０アゴニスト抗体導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を示す。
【図３７】図３７はＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄの３回のＩＶ注射または単回の分画ＩＴ投与後の皮下Ａ５４９腫瘍における抗ＣＤ４０抗体タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
ＣＤ４０は、例えば、抗原提示細胞上で見られる同時刺激タンパク質である。ＣＤ４０はまた、Ｂｐ５０、ＣＤＷ４０、ＴＮＦＲＳＦ５、ｐ５０、ＣＤ４０タンパク質、ＣＤ４０分子としても知られている。ヒトタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２５９４２を有する。マウスタンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ２７５１２を有する。
【００１３】
本明細書において利用される、癌細胞についての選択性を有する腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ウイルスが、癌細胞に優先的に感染し、および／またはウイルスライフサイクルが、癌細胞において脱制御されている、例えば、過剰発現されているｐ５３のような、遺伝子に依存するため、癌細胞を優先的に殺傷するウイルスを指す。１つの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞に優先的に感染し、そのゲノムを継続して複製し、カプシドタンパク質を産生して、新たなウイルス粒子、例えば、ＥｎＡｄ自体を生み出す。
【００１４】
癌細胞についての選択性（治療指数）は、参照により取り込まれる国際公開第２００５／１１８８２５号において記載される通り、試験することができる。
【００１５】
１つの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ＥＣＨＯエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、およびワクシニアウイルス、特に、アデノウイルスから選択される、ウイルスである。
【００１６】
１つの実施形態において、アデノウイルスは、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ、タリモジーンラハーパレプベック、ＲＩＧＶＩＲ、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、Ｃａｖａｔａｋ（商標）、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、Ｇ２０７、ＨＦ１０、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、ＪＸ−５９４、ＭＧ１−ＭＡ３、ＭＶ−ＮＩＳ、ＯＢＰ−３０１、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｔｏｃａ  ５１１、特に、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖからなる群から選択される。
【００１７】
１つの実施形態において、本開示の併用療法において利用される腫瘍溶解性アデノウイルスは、複製可能である。
【００１８】
１つの実施形態において、本開示の組み合わせにおいて利用される腫瘍溶解性アデノウイルスは、複製欠損である。
【００１９】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、併用療法において利用される。
【００２０】
１つの実施形態において、本開示においてまたは本開示の併用療法における第２の成分として利用される腫瘍溶解性アデノウイルスは、例えば、式（Ｉ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＸ−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ  （Ｉ）
（式中、
Ｂ１は、結合であるか、または：Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ（特に、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢもしくはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ）を含み；
ＢＡは、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、またはＥ３または導入遺伝子を、例えば、内在性または外来プロモーター下に含み；
ＢＸは、結合、または制限酵素部位、１つもしくは複数の導入遺伝子または両方を含むＤＮＡ配列であり； 
ＢＢは、Ｌ５を含み；
ＢＹは、治療タンパク質またはその活性なフラグメント（特に、配列番号１２を含む）をコードする導入遺伝子カセットを含み；
Ｂ３は、結合であるか、またはＥ４を含む）
を有する。
１つの実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、式（Ｉａ）：
５’ＩＴＲ−Ｂ１−ＢＡ−Ｂ２−ＢＢ−ＢＹ−Ｂ３−３’ＩＴＲ  （Ｉａ）
（式中、
Ｂ１は、結合であるか、または：Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢまたはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ（特に、Ｅ１Ａ、Ｅ１ＢもしくはＥ１Ａ−Ｅ１Ｂ）を含み；
ＢＡは、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４であり；
Ｂ２は、結合であるか、またはＥ３を含み；
ＢＢは、Ｌ５を含み；
ＢＹは、治療タンパク質またはその活性なフラグメント（特に、配列番号１２を含む）をコードする導入遺伝子カセットを含み；
Ｂ３は、結合であるか、またはＥ４を含む）
を有する。
【００２１】
１つの実施形態において、式（Ｉ）および／または（Ｉａ）のコンストラクトにおけるウイルスゲノムは、Ａｄ１１またはＥｎＡｄ、特に、ＥｎＡｄ由来である。
【００２２】
１つの実施形態において、導入遺伝子カセットは、内在性プロモーター、例えば、主要後期プロモーターの制御下である。
【００２３】
治療タンパク質は、抗体または結合フラグメント（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＨＶＥＭ、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−３、ＩＬＴ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＬＩＧＨＴまたはＣＤ１６０、例えば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１および／またはＰＤ−Ｌ２に特異的な抗体またはフラグメントを含む群から選択される）、Ｂ−７タンパク質（例えば、Ｂ７−１および／またはＢ７−２）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−３５、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、リンホトキシンα（ＬＴＡ）およびＧＭ−ＣＳＦ）、ならびにケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５および／またはＣＲＴＨ２から選択される）、ならびにその２つ以上の組み合わせを含む。
【００２４】
本開示の療法は、２種以上の腫瘍溶解性ウイルスを含んでもよい。
【００２５】
調節エレメント
１つの実施形態において、ＢＹは、本開示による導入遺伝子カセットを含み、当該カセットは、チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１、および抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはそのいずれか１つの結合フラグメントならびに調節エレメントの組み合わせのような、調節エレメントをコードする導入遺伝子をさらに含む。
【００２６】
１つの実施形態において、調節エレメントは、スプライスアクセプター配列である。
【００２７】
１つの実施形態において、調節エレメントは、コザック配列である。
【００２８】
１つの実施形態において、例えば、導入遺伝子が、ポリシストロニックＲＮＡ分子をコードする場合、調節エレメントは、ＩＲＥＳ配列である。
【００２９】
１つの実施形態において、調節配列は、Ｐ２Ａ、Ｔ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａのような高い効率の自己切断可能なペプチド配列である。
【００３０】
１つの実施形態において、調節配列は、ポリＡテールである。
【００３１】
１つの実施形態において、少なくとも２つの調節配列、例えば、スプライスアクセプターおよびコザック配列またはスプライスアクセプターおよびポリＡテール、またはスプライスアクセプターおよびＩＲＥＳ配列、またはスプライスアクセプターおよびＰ２Ａ配列が存在する。
【００３２】
１つの実施形態において、少なくとも３つの制御因子配列、例えば、スプライスアクセプター配列、コザック配列およびポリＡテール、またはスプライスアクセプター配列およびＩＲＥＳもしくは２Ａ配列およびポリＡテール；またはスプライスアクセプター配列、コザック配列およびＩＲＥＳもしくは２Ａ配列が存在する。
【００３３】
１つの実施形態において、少なくとも４つの調節配列、例えば、スプライスアクセプター配列、コザック配列、ＩＲＥＳまたは２Ａ配列およびポリＡテール、特に、スプライスアクセプター配列、コザック配列、ＩＲＥＳまたは２Ａ配列およびポリＡテールの順でＬ５とＥ４の間に位置するスプライスアクセプター配列、コザック配列、ＩＲＥＳまたは２Ａ配列およびポリＡテールが存在する。
【００３４】
１つの実施形態において、導入遺伝子は、ＩＲＥＳと２Ａ調節配列の両方を含むポリシストロニックＲＮＡ分子をコードする。
【００３５】
１つの実施形態において、細胞膜発現のための導入遺伝子カセットにおいてコードされるタンパク質または複数のタンパク質はまた、膜貫通型ドメインまたはＧＰＩアンカーと細胞外リガンド結合ドメインの間にペプチドリンカーまたはスペーサーを含んでもよい。かかるリンカーまたはスペーサーは、タンパク質が、例えば、隣接細胞上のその標的分子と相互作用する能力を増強する細胞表面発現タンパク質に可動性を加えてもよい。かかるリンカーまたはスペーサーはまた、ジスルフィド結合形成またはタンパク質とタンパク質の相互作用を介して、細胞表面におけるタンパク質の二量体形成または三量体形成を促進するよう設計されるか、または選択されてもよい。例えば、免疫グロブリン分子またはＣＤ８のヒンジ領域を利用して、可動性と二量体形成の両方を増強してもよい。
【００３６】
１つの実施形態において、導入遺伝子カセットにおいてコードされるタンパク質または複数のタンパク質はまた、ペプチドタグを含んでもよい。
【００３７】
ペプチドタグは、ｃ−ｍｙｃ、ポリ−ヒスチジン、Ｖ５またはＦＬＡＧタグを含んでもよく、例えば、細胞内または細胞外で、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に位置することができるか、またはタンパク質、例えば、細胞外ループ内または膜貫通型ドメインと細胞外ドメインの間にコードされてもよい。ペプチドタグは、異なるタンパク質ドメイン、例えば、膜貫通型ドメインと細胞外ドメインの間のスペーサーまたはリンカーとして使用することができ、タンパク質、またはタンパク質を発現している細胞の検出または精製または検出のため使用することができる。
【００３８】
１つの実施形態において、例えば、式（Ｉ）または（Ｉａ）のウイルスにおける１つまたは複数の追加の導入遺伝子は、外来または内在性プロモーター、例えば、内在性プロモーターの制御下にある。１つの実施形態において、Ｅ３領域（Ｂ２）における導入遺伝子は、外来プロモーターの制御下にある。
【００３９】
１つの実施形態において、１つまたは複数の追加の導入遺伝子の遺伝子は、アデノウイルスゲノムにおいてＥ３領域とファイバーＬ５の間、例えば、式（Ｉ）の構築物における位置ＢＸ、特に、外来プロモーターの制御下にある。従って、１つの実施形態において、ＢＸにおける導入遺伝子は、外来プロモーターの制御下にある。
【００４０】
１つの実施形態において、１つまたは複数の追加の導入遺伝子の遺伝子は、アデノウイルスゲノムにおいてＥ４領域とファイバーＬ５の間、例えば、式（Ｉ）または（Ｉａ）の構築物における位置ＢＹ、特に、主要後期プロモーターのような、内在性プロモーターの制御下にある。これは、領域ＢＹにおいてコードされる治療タンパク質またはその活性なフラグメントに加えてであってもよい。
【００４１】
本明細書において利用される、導入遺伝子は、アデノウイルスのゲノム配列に挿入された遺伝子であって、遺伝子が、ウイルスにとって天然でない（外来）か、またはウイルスにおけるその特定の場所において通常見られない、遺伝子を指す。導入遺伝子の例は、本明細書において付与される。本明細書において利用される、導入遺伝子はまた、挿入されたとき、全長遺伝子の機能または機能の大部分、例えば、機能の５０％以上を遂行するのに適当である遺伝子の一部である、遺伝子の機能的フラグメントを含む。
【００４２】
導入遺伝子およびコード配列は、文脈が別段示さない限り、ウイルスゲノムへの挿入物の文脈において本明細書において互換的に使用される。本明細書において利用される、コード配列は、例えば、機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を意味する。典型的には、コード配列は、対象となる機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする導入遺伝子についてのｃＤＮＡである。対象となる機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質は、以下で記載される。
【００４３】
１つの実施形態において、本明細書において利用される、導入遺伝子は、異なる生物、すなわち、本開示のウイルスに導入される、１種の生物から単離された遺伝子またはｃＤＮＡ配列を含有するＤＮＡのセグメントを指す。１つの実施形態において、ＤＮＡのこの非天然のセグメントは、一般に、機能的ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を産生する能力を保持する。利用される導入遺伝子は、例えば、単一のタンパク質もしくはその活性なフラグメント、キメラタンパク質または融合タンパク質をコードしてもよい。
【００４４】
明らかに、ウイルスゲノムは、ＤＮＡのコード配列を含有する。ウイルスのゲノム配列における内在性（天然に存在する遺伝子）は、その後、それらは、それらが非天然の場所にあるか、または非天然の環境にあることのような、組換え技術により修飾されない限り、本明細書の文脈において、導入遺伝子とみなされない。
【００４５】
従って、１つの実施形態において、挿入される導入遺伝子（複数可）は、ヒトもしくはヒト化タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。導入遺伝子（複数可）は、導入遺伝子カセットなどに位置してもよい。
【００４６】
本明細書において利用される、ＧＰＩアンカーは、翻訳後修飾中にタンパク質のＣ末端に結合され得る糖脂質を指す。それは、成熟タンパク質のＣ末端アミノ酸に、炭水化物含有リンカー（イノシトール残基にグリコシド結合したグルコサミンおよびマンノース）を通じてならびにエタノールアミンリン酸塩（ＥｔＮＰ）への架橋を介して結合したホスファチジルイノシトール基を含む。疎水性ホスファチジル−イノシトール基内の２つの脂肪酸は、タンパク質を細胞膜に固定する。
【００４７】
ＧＰＩアンカー化された（Ｇｌｙｐｉａｔｅｄ）（ＧＰＩが結合した）タンパク質は、一般に、シグナルペプチドを含有し、これにより、小胞体（ＥＲ）内に誘導される。Ｃ末端は、ＥＲ膜に挿入されて留まる疎水性アミノ酸を含む。次に、疎水性末端が切断され、ＧＰＩアンカーによって置き換えられる。タンパク質が分泌経路を進むにつれ、それは、小胞を介してゴルジ体に、最終的に、細胞外空間に移され、そこで、それは、細胞膜の外膜に付着して留まる。ＧＰＩアンカー化（ｇｌｙｐｉａｔｉｏｎ）は、かかるタンパク質の膜への付着の唯一の手段であるので、ホスホリパーゼによる基の切断は、膜からのタンパク質の制御された解離をもたらす。後者の機序は、インビトロで使用される、すなわち、酵素アッセイにおいて膜から解離された膜タンパク質は、ＧＰＩアンカー化されたタンパク質である。
【００４８】
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、ＧＰＩにより固定されたタンパク質においてみられるホスホ−グリセロール結合を切断することが知られている酵素である。ＰＬＣを用いた処理は、外側の細胞膜からのＧＰＩ結合したタンパク質の解離を引き起こす。Ｔ細胞マーカーであるＴｈｙ−１およびアセチルコリンエステラーゼ、ならびに腸と胎盤のアルカリホスファターゼの両方が、ＧＰＩ結合していることが知られており、ＰＬＣを用いた処理により解離される。ＧＰＩ結合したタンパク質は、脂質ラフトに優先的に位置すると考えられており、これは、細胞膜マイクロドメイン内での高レベルの組織化を示唆している。
【００４９】
Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、ＫｉｎｏｓｈｉｔａおよびＨａｒｔにより書かれたＧＰＩアンカーの総説が、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２編の第１１章において入手可能である。
【００５０】
ウイルス
本明細書の文脈における複製可能は、インビトロおよびインビボの細胞において、すなわち、パッケージング細胞株の補助なしで、複製するのに必要な機構全てを有するウイルスを指す。ウイルスベクター、例えば、少なくともＥ１Ａ領域が欠損し、補完的なパッケージング細胞株において複製する能力があるウイルスは、本文脈における複製可能なウイルスではない。
【００５１】
ウイルスベクターは、複製するのにパッケージング細胞株（補完的な導入遺伝子を含む）を必要とする、複製欠損ウイルスである。
【００５２】
本明細書において利用される、複製する能力があるウイルスは、複製可能なウイルスまたは複製が癌細胞における因子、例えば、ｐ５３または類似のもののような、アップレギュレーションされた因子に依存するウイルスを指す。
【００５３】
１つの実施形態において、アデノウイルスは、ヒトアデノウイルスである。本明細書において利用される、「アデノウイルス」、「血清型」または「アデノウイルス血清型」は、Ａ〜Ｆ亜群に分類される、５０を超える現在公知のアデノウイルス血清型のいずれかに割り振られ得る任意のアデノウイルスを指し、さらに、未だ同定されていないか、または分類されていないアデノウイルス血清型まで及ぶ。例えば、以下に示される、Ｔｈｅ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ、Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、ｅａ．、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、４５１〜５９６頁（１９８４年）におけるＳｔｒａｕｓｓ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」およびＦｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、第４編、Ｋｎｉｐｅ、３５ｅａ．、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、２２６５〜２２６７頁（２００１年）におけるＳｈｅｎｋ、「Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ」を参照されたい。
【表１】
2020521496.tif 000003
【００５４】
アデノウイルスは、それらのカプシドに基づきグループ化される。
【００５５】
１つの実施形態において、アデノウイルスは、亜群Ｂ、例えば、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４およびＡｄ５１、例えば、Ａｄ１１、特に、Ａｄ１１ｐ（Ｓｌｏｂｉｔｓｋｉ株）を含むか、またはからなる群から独立して選択されるＢ亜群である。１つの実施形態において、本発明のアデノウイルスは、Ａｄ１１、特に、Ａｄ１１ｐのような、Ｂ亜群アデノウイルスのヘキソンおよび／またはファイバーのようなカプシドを有する。１つの実施形態において、アデノウイルスは、Ａｄ１１であるか、またはＡｄ１１ｐのような、Ａｄ１１のファイバーおよび／またはヘキソンおよび／またはペントンを有する。
【００５６】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、Ａ群ウイルスではない。
【００５７】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、アデノデスタンパク質（ＡＤＰ）を含まない。
【００５８】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、Ｃ群ウイルスではない。
【００５９】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、Ａｄ５ウイルスのもう１つのフラグメントを含まない。
【００６０】
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、Ａｄ５ではない。
【００６１】
Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）は、以前はＣｏｌｏＡｄ１（国際公開第２００５／１１８８２５号）として知られたキメラ腫瘍溶解性アデノウイルスであり、Ａｄ１１ｐ由来のファイバー、ペントンおよびヘキソンを有することから、Ｂ亜群ウイルスである。それは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３由来のＤＮＡを含む、キメラＥ２Ｂ領域を有する。Ｅ３領域のほぼ全ておよびＥ４領域の一部は、ＥｎＡｄにおいて欠損している。それ故、それは、生存可能性を維持しながら、追加の遺伝子物質を収容するための重要なスペースをゲノム中に有する。さらに、ＥｎＡｄは、Ｂ亜群アデノウイルスであるので、ヒトにおいて既に免疫が存在することは、例えば、Ａｄ５よりあまり一般的でない。Ａｄ１１ファイバー、ペントンおよびヘキソンを有するキメラ腫瘍溶解性ウイルスの他の例は、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２を含む（国際公開第２００６／０６０３１４号を参照）。
【００６２】
ＥｎＡｄは、腫瘍細胞に優先的に感染するように思われ、これらの細胞において容易に複製し、細胞溶解を引き起こす。これは、順に、炎症性免疫応答を生み出し、これにより、身体を刺激し癌とも戦うことができる。ＥｎＡｄの成功の一部は、インビボでのウイルスの迅速な複製に関係すると仮定される。
【００６３】
重要なことは、ＥｎＡｄが、全身投与され（例えば、静脈内または腹腔内注射もしくは注入により）、次に、続いて選択的に感染し、腫瘍細胞内でタンパク質を発現し得ることが、臨床的に示されている。ＥｎＡｄのこの特性は、Ａｄ１１ｐおよび他のＢ群アデノウイルス、特に、Ａｄ１１ｐのカプシドタンパク質を発現しているもの（例えば、本明細書において記載されるもの）に共通し得、腫瘍および／または腫瘍微小環境においてコードされるタンパク質を発現することを可能にする。
【００６４】
ＥｎＡｄは、腫瘍細胞を選択的に溶解すると同時に、さらなる有益な特性、例えば、ウイルスの治療活性を増大させること、あるいは細胞シグナル伝達タンパク質もしくは抗体をコードする導入遺伝子のような、導入遺伝子、または細胞シグナル伝達タンパク質（複数可）を刺激する実体をコードする導入遺伝子を用いて備えることにより、ウイルスの副作用を低減することを導入することが可能であり得る。
【００６５】
癌細胞内部で発現され得るある特定のタンパク質をコードするＤＮＡを用いてウイルスに有利に備えることは、例えば、細胞を免疫系により見えるようにすることにより、または治療遺伝子／タンパク質を標的腫瘍細胞に優先的にデリバリーすることにより、身体自体の防御が、腫瘍細胞とより有効に戦うために利用されることを可能にし得る。
【００６６】
１つの実施形態において、本開示の腫瘍溶解性アデノウイルスは、患者の免疫系を刺激して、例えば、免疫応答を抑制する癌の能力を低減することにより、腫瘍と戦う。
【００６７】
１つの実施形態において、本開示のウイルスによりコードされる抗ＣＤ４０抗体または結合フラグメントは、腫瘍微小環境において、および／または腫瘍の近傍において免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を活性化する能力を有する。
【００６８】
１つの実施形態において、腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、ヌクレオチド位置が、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ２１７３０７３９９（受託番号ＧＣ６８９２０８）と比べて、後者のゲノム配列の位置３０８１２〜３１７８９、１８２５４〜２１１００および１３６８２〜１５３６７においてみられる、同じ血清型、例えば、Ａｄ１１、特に、Ａｄ１１ｐ由来のファイバー、ヘキソンおよびペントンタンパク質を有する。
【００６９】
１つの実施形態において、アデノウイルスは、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄとしておよび以前はＣｏｌｏＡｄ１として知られていた）である。本明細書において利用される、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示され、参照により取り込まれる配列番号２１のキメラアデノウイルスを指す。それは、野生型アデノウイルスと比較して、増強された治療特性を有する複製可能な腫瘍溶解性キメラアデノウイルスである（国際公開第２００５／１１８８２５号を参照）。ＥｎＡｄは、Ａｄ１１ｐおよびＡｄ３由来のＤＮＡ、ならびにＥ３／Ｅ４における欠損を特徴とする、キメラＥ２Ｂ領域を有する。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖにおける構造の変化は、Ａｄ１１ｐより小さいおよそ３．５ｋｂであるゲノムをもたらし、これにより、導入遺伝子の挿入に追加の「空間」をもたらす。
【００７０】
１つの実施形態において、本開示によるカセットは、Ｂ群アデノウイルスのようなアデノウイルスにおいてＬ５とＥ４領域の間、特に、主要後期プロモーターの制御下に位置する。
【００７１】
１つの実施形態において、利用されるウイルスは、ＥｎＡｄではない。
【００７２】
本発明において利用され得る他のウイルスは、単純ヘルペスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、セネカバレーウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、ＥＣＨＯエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、およびワクシニアウイルス、特に、例えば、タリモジーンラハーパレプベック、ＲＩＧＶＩＲ、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２、Ｃａｖａｔａｋ（商標）、ＣＧ００７０、ＤＮＸ−２４０１、Ｇ２０７、ＨＦ１０、Ｉｍｌｙｇｉｃ（登録商標）、ＪＸ−５９４、ＭＧ１−ＭＡ３、ＭＶ−ＮＩＳ、ＯＢＰ−３０１、Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）、Ｔｏｃａ  ５１１からなる群から選択されるアデノウイルスを含む。
【００７３】
抗体または抗体フラグメント
１つの実施形態において、本開示のウイルスは、全長抗ＣＤ４０抗体をコードする。
【００７４】
本明細書において使用される用語、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも１つの抗原認識部位（本明細書において結合部位としても言及される）を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド、ペプチドなどのような、標的抗原に特異的に結合する能力がある免疫グロブリン分子を指す。
【００７５】
本明細書において使用される、抗体分子は、抗体およびその結合フラグメント、ならびにその１つまたは複数を含む分子を含む。
【００７６】
本明細書において利用される、抗原結合部位は、１対の可変領域、特に、標的抗原と特異的に相互作用する同族の対を含む、分子の一部を指す。
【００７７】
本明細書において利用される、抗体結合フラグメントは、標的抗原に特異的に結合する能力が依然としてある、全体未満の抗体を指す。
【００７８】
本明細書において利用される、特異的には、それが特異的である抗原、または特異的でない抗原への親和性と比較して、特異的である抗原に対して有意に高い結合親和性、例えば、５、６、７、８、９、１０倍高い結合親和性を有する結合部位のみを認識する結合部位を指すことが意図される。
【００７９】
利用される、抗体分子は、全長の重鎖および軽鎖を有する完全な抗体分子、全長抗体またはＦａｂ、改変Ｆａｂ、Ｆａｂ’、改変Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨもしくはＶＬもしくはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価もしくは四価抗体、ビス−ｓｃＦｖ、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体および上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むが、これらに限定されない、そのいずれか１つのフラグメントを含む二重特異性抗体フォーマットを含み得る（例えば、ＨｏｌｌｉｇｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６〜１１３６頁；ＡｄａｉｒおよびＬａｗｓｏｎ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｏｎｌｉｎｅ、２（３）、２０９〜２１７頁を参照）。これらの抗体フラグメントを作製する方法及び製造する方法は、当該技術分野において周知である（例えば、Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６、１６５〜１８１頁を参照）。本発明における使用のための他の抗体フラグメントは、国際特許出願公開第２００５／００３１６９号、公開第２００５／００３１７０号及び公開第２００５／００３１７１号において記載されるＦａｂ並びにＦａｂ’フラグメントを含む。多価の抗体は、複数の特異性、例えば、二重特異性であり得るか、又は単一特異性であり得る（例えば、国際公開第９２／２２８５３号、国際公開第０５／１１３６０５号、国際公開第２００９／０４０５６２号及び国際公開第２０１０／０３５０１２号を参照）。
【００８０】
１つの実施形態において、本開示のウイルスにおいて利用される抗体分子は、ヒト化、キメラまたは非ヒトである。
【００８１】
本明細書において利用される、ヒト化（ＣＤＲグラフト抗体を含む）は、非ヒト種由来の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する分子を指す（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号；国際公開第９１／０９９６７号を参照）。ＣＤＲ全体よりむしろＣＤＲの特異性決定残基を移すことがただ必要であり得ることが、理解される（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５年、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４頁を参照）。ヒト化抗体は、場合により、ＣＤＲがもたらされた非ヒト種からもたらされた１つ又は複数のフレームワーク残基を含み得んでもよい。
【００８２】
ＣＤＲ又は特異性決定残基が移植されるとき、マウス、霊長類及びヒトフレームワーク領域を含む、ＣＤＲがもたらされるドナー抗体のクラス／タイプに関して有する、任意の適当なアクセプター可変領域フレームワーク配列が、使用され得る。適当には、本開示によるヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域を含む可変ドメインならびに本明細書において提供されるＣＤＲの１つまたは複数を含む。
【００８３】
本開示において使用され得る、ヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹおよびＰＯＭである（Ｋａｂａｔら、上記）。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭは、重鎖について使用することができ、ＲＥＩは、軽鎖について使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ及びＰＯＭは、重鎖と軽鎖の両方について使用することができる。或いは、ヒト生殖系統配列が使用されてもよく；これらは、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／において入手可能である。
【００８４】
本開示のヒト化抗体において、アクセプター重鎖および軽鎖は、必ずしも、同じ抗体からもたらされることを必要とせず、所望されるなら、異なる鎖からもたらされたフレームワーク領域を有する複合鎖を含んでもよい。
【００８５】
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のものと正確に同じ配列を有する必要はない。例えば、普通でない残基は、そのアクセプター鎖クラス又はタイプについてより頻繁に生じる残基に変えられてもよい。或いは、アクセプターフレームワーク領域における選択された残基は、それらが、ドナー抗体において同じ位置にて見られる残基に対応するように変えられてもよい（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４頁を参照）。かかる変化は、ドナー抗体の親和性を回復させるための最小の必要性を維持すべきである。変えられるのを必要とし得るアクセプターフレームワーク領域における残基を選択するプロトコールは、国際公開第９１／０９９６７号において記載される。
【００８６】
キメラ抗体は、一般に、非ヒト可変領域およびヒト定常領域を含有する。
【００８７】
１つの実施形態において、本開示の抗体分子は、完全にヒトであり、特に、可変ドメインの１つまたは複数は、完全にヒトである。
【００８８】
完全なヒト分子は、重鎖と軽鎖の両方の可変領域および定常領域（存在する場合）が、必ずしも同じ抗体由来ではなく、全てヒト起源であるか、またはヒト起源の配列と実質的に同一であるものである。完全なヒト抗体の例は、例えば、上記のファージディスプレイ方法により、産生される抗体、およびマウス免疫グロブリン可変および場合により、定常領域遺伝子が、例えば、欧州特許第０５４６０７３号、米国特許第５，５４５，８０６号、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第５，６２５，１２６号、米国特許第５，６３３，４２５号、米国特許第５，６６１，０１６号、米国特許第５，７７０，４２９号、欧州特許第０４３８４７４号および欧州特許第０４６３１５１号において一般的な用語で記載される通り、それらのヒト対応物により置き換えられた、マウスにより産生される抗体を含んでもよい。
【００８９】
式（Ｉ）および（Ｉａ）に関する定義
結合は、一方のＤＮＡ配列を別のＤＮＡ配列に結び付ける、例えば、ウイルスゲノムの一方のセクションを別のものに結び付ける共有結合を指す。従って、本明細書における式（Ｉ）および（Ｉａ）における可変のものが、結合を表すとき、結合により表される特性またはエレメントは、存在しない、すなわち、欠失されている。
【００９０】
アデノウイルスの構造は、一般に、類似するので、以下のエレメントは、構造エレメントおよび当業者に知られている、それらに言及する命名法に関して考察される。エレメントが、本明細書において言及されるとき、次に、本発明者らは、エレメントをコードするＤＮＡ配列またはアデノウイルスにおけるエレメントの同じ構造タンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。後者は、ＤＮＡコードの重複性のため、関連性がある。コドン利用についてのウイルスの優先度は、最適化された結果とみなされる必要があり得る。
【００９１】
本開示のウイルスにおいて利用されるアデノウイルス由来の任意の構造エレメントは、天然の配列を含むか、またはからなってもよいか、または９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のような、少なくとも９５％の所定の長さに渡り類似性を有してもよい。元の配列は、遺伝子物質の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％を除くよう変更されるか、または修飾されてもよい。しかしながら、１つの実施形態において、少なくとも９５％類似または同一であるＤＮＡ配列は、同じ遺伝子産物、すなわち、ＲＮＡおよび／またはタンパク質をコードする。当業者は、変更するとき、ウイルスのリーディングフレームは、構造タンパク質の発現が破壊されるように、破壊され得ないことを認識する。本開示はまた、本明細書において開示される配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列まで拡大する。
【００９２】
１つの実施形態において、所定のエレメントは、全長配列、すなわち、全長遺伝子である。本明細書において利用される、全長遺伝子は、少なくとも、遺伝子のコード配列の全体を指すが、特に、それらが遺伝子の機能と関連性があるなら、任意の関連する非コード領域を含んでもよい。
【００９３】
１つの実施形態において、所定のエレメントは、全長配列に満たず、全長配列と同じまたは対応する機能を保持する。
【００９４】
１つの実施形態において、本開示の構築物において任意である所定のエレメントについて、ＤＮＡ配列は、全長に満たず、機能性を有さなくてもよく、例えば、Ｅ３領域は、全体的または部分的に欠損されていてもよい。しかしながら、本質的に全てのＥ３領域を欠損させることは、これが、導入遺伝子を挿入するのに利用可能な空間を最適化するので、有用であり得る。
【００９５】
アデノウイルスの構造または機能的タンパク質をコードする構造遺伝子は、ＤＮＡの非コード領域により一般的に結合される。従って、本開示のウイルスに導入遺伝子を挿入する目的のため、対象となる構造エレメント（特に、その非コード領域における）のゲノム配列を「切断する」場所について幾分かの可動性が存在する。従って、本明細書の目的のため、エレメントは、目的に合致し、外来性の物質をコードしない限り、参照の構造エレメントとみなされる。従って、必要に応じて、遺伝子は、適当な非コード領域、例えば、ウイルスの天然の構造においてみられる適当な非コード領域を伴う。
【００９６】
従って、１つの実施形態において、導入遺伝子をコードするＤＮＡのような、挿入物は、イントロンまたは遺伝子間配列のような、ゲノムウイルスＤＮＡの非コード領域に挿入される。そうは言っても、アデノウイルスのこのいくつかの非コード領域は、例えば、選択的スプライシング、転写調節または翻訳調節において機能を有し得、これを考慮に入れる必要があり得る。
【００９７】
Ｌ５領域に付随する、本明細書において同定される部位は、複雑な実体、例えば、ＲＮＡｉ、サイトカイン、１本鎖または多量体タンパク質、例えば、抗体、特に、配列番号１２の抗体をコードする様々なＤＮＡ配列を収容するのに適当である。
【００９８】
本明細書において利用される、遺伝子は、それに付随するコードおよび任意の非コード配列、例えば、イントロンおよび付随するエクソンを指す。１つの実施形態において、遺伝子は、必須の構造成分、例えば、コード領域のみを含むか、またはからなる。
【００９９】
以下で、アデノウイルスの特定の構造エレメントに関して考察する。
【０１００】
逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列は、全ての公知のアデノウイルスに共通し（それらの対称性のためそのように呼ばれる）、ウイルス染色体の複製起点である。これらの配列の別の特性は、ヘアピンを形成するそれらの能力である。
【０１０１】
本明細書において利用される、５’ＩＴＲは、適当な場所においてアデノウイルスに取り込まれたとき、ＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの５’末端由来のＩＴＲの一部または全てを指す。１つの実施形態において、５’ＩＴＲは、国際公開第２０１６／１７４２００号の配列番号２１の約１ｂｐ〜１３８ｂｐの配列（当該配列は、参照により取り込まれる）または全長に沿ってそれに対して９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一の配列、特に、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の約１ｂｐ〜１３８ｂｐからなる配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を含むか、またはからなる。
【０１０２】
本明細書において利用される、３’ＩＴＲは、適当な場所においてアデノウイルスに取り込まれたとき、ＩＴＲの機能を保持する、アデノウイルスの３’末端由来のＩＴＲの一部または全てを指す。１つの実施形態において、３’ＩＴＲは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐの配列、または全長に沿ってそれに対して９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一の配列、特に、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の約３２１８９ｂｐ〜３２３２６ｂｐの配列を含むか、またはからなる。
【０１０３】
本明細書において利用される、Ｂ１は、アデノウイルス由来のＥ１Ａの一部または全て、アデノウイルスのＥ１Ｂ領域の一部または全て、ならびに独立して、アデノウイルスのＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の一部または全てをコードするＤＮＡ配列を指す。
【０１０４】
Ｂ１が結合であるとき、次に、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ配列は、ウイルスから覗かれる。１つの実施形態において、Ｂ１は、結合であり、故に、ウイルスは、ベクターである。
【０１０５】
１つの実施形態において、Ｂ１は、導入遺伝子をさらに含む。Ｅ１領域が、Ｅ１領域（すなわち、配列の「中間」における）に破壊的方法で挿入され得る導入遺伝子を収容し得るか、またはＥ１領域の一部または全てを欠損させて、遺伝子物質を収容するためのさらなる部屋をもたらし得ることは、当該技術分野において公知である。
【０１０６】
本明細書において利用される、Ｅ１Ａは、アデノウイルスＥ１Ａ領域の一部または全てをコードするＤＮＡ配列を指す。後者は、ここで、ポリペプチド／タンパク質Ｅ１Ａを指している。それは、Ｅ１Ａ遺伝子によりコードされるタンパク質が、野生型（すなわち、対応する非変異導入タンパク質）と同じ機能；野生型タンパク質と比較して増大した機能；野生型タンパク質と比較して、機能がないのような、減少した機能を有するか：または必要に応じて、野生型タンパク質と比較して、新たな機能またはその組み合わせを有するように、保存的あるいは非保存的アミノ酸変更（例えば、全長に渡り１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変更、付加および／または欠損）を有するように、変異導入されてもよい。
【０１０７】
本明細書において利用される、Ｅ１Ｂは、アデノウイルスＥ１Ｂ領域の一部または全て（すなわち、ポリペプチドもしくはタンパク質）をコードするＤＮＡ配列を指し、それは、Ｅ１Ｂ遺伝子／領域によりコードされるタンパク質が、野生型（すなわち、対応する非変異導入タンパク質）と同じ機能；野生型タンパク質と比較して増大した機能；野生型タンパク質と比較して、機能がないのような、減少した機能を有するか：または必要に応じて、野生型タンパク質またはその組み合わせと比較して、新たな機能を有するように、保存的あるいは非保存的アミノ酸変更（例えば、全長に渡り１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変更、付加および／または欠損）を有するように、変異導入されてもよい。
【０１０８】
従って、Ｂ１は、野生型Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂのような、野生型Ｅ１領域に比べて、修飾され得るか、または修飾され得ない。当業者は、Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂが、存在するか、または（一部）欠損されるか、もしくは変異導入されているかどうかを容易に同定することができる。
【０１０９】
本明細書において利用される、野生型は、公知のアデノウイルスまたは公知のアデノウイルス由来の配列を指す。公知のアデノウイルスは、配列情報が入手可能かどうかに関わらず、同定され、命名されたものである。
【０１１０】
１つの実施形態において、Ｂ１は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の１３９ｂｐ〜３９３２ｂｐの配列を有する。
【０１１１】
本明細書において利用される、ＢＡは、必要に応じて、任意の非コード配列を含むＥ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４領域をコードするＤＮＡ配列を指す（特に、アデノウイルス由来の天然の配列に対応する）。一般に、この配列は、導入遺伝子を含まない。１つの実施形態において、配列は、公知のアデノウイルス、例えば、表１に示される血清型、特に、Ｂ群ウイルス、例えば、Ａｄ３、Ａｄ１１またはその組み合わせのような、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１またはその組み合わせ由来の近接配列に実質的に類似または同一である。１つの実施形態において、Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４であるは、これらのエレメントおよび領域に付随する他の構造エレメントを含むことを指し、例えば、ＢＡは、一般に、タンパク質ＩＶ２ａをコードする配列、例えば、次の：ＩＶ２Ａ  ＩＶ２ａ−Ｅ２Ｂ−Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｅ２Ａ−Ｌ４を含む。
【０１１２】
１つの実施形態において、Ｅ２Ｂ領域は、キメラである。すなわち、２つ以上の異なるアデノウイルス血清型由来、例えば、Ａｄ３およびＡｄ１１ｐのようなＡｄ１１由来のＤＮＡ配列を含む。１つの実施形態において、Ｅ２Ｂ領域は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の５０６８ｂｐ〜１０３５５ｂｐの配列、または全長に渡りそれに対して９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列を有する。
【０１１３】
１つの実施形態において、成分ＢＡにおけるＥ２Ｂは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１８において示される配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を含む。
【０１１４】
１つの実施形態において、ＢＡは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１８の３９３３ｂｐ〜２７１８４ｂｐの配列を有する。
【０１１５】
本明細書において利用される、Ｅ３は、アデノウイルスＥ３領域の一部または全て（すなわち、タンパク質／ポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を指し、それは、Ｅ３遺伝子／領域によりコードされるタンパク質が、野生型（すなわち、対応する非変異導入タンパク質）と同じ機能；野生型タンパク質と比較して増大した機能；野生型タンパク質と比較して、機能がないのような、減少した機能を有するか、または必要に応じて、野生型タンパク質またはその組み合わせと比較して、新たな機能を有するように、保存的あるいは非保存的アミノ酸変更（例えば、全長に渡り１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変更、付加および／または欠損）を有するように、変異導入されてもよい。
【０１１６】
１つの実施形態において、Ｅ３領域は、表１において付与されるアデノウイルス血清型またはその組み合わせ、特に、Ｂ群血清型、例えば、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１（特に、Ａｄ１１ｐ）、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１またはその組み合わせ、例えば、Ａｄ３、Ａｄ１１（特に、Ａｄ１１ｐ）またはその組み合わせ由来である。
【０１１７】
１つの実施形態において、Ｅ３領域は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１９において示される配列を有する。
【０１１８】
１つの実施形態において、Ｅ３領域は、部分的に欠損され、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％欠損される。
【０１１９】
１つの実施形態において、Ｂ２は、結合であり、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは、存在しない。
【０１２０】
１つの実施形態において、Ｅ３領域をコードするＤＮＡは、導入遺伝子により置換されるか、または中断され得る。本明細書において利用される、「導入遺伝子により置換されるＥ３領域」は、本明細書において利用される通り、導入遺伝子を用いて置換されているＥ３領域の一部または全てを含む。
【０１２１】
１つの実施形態において、Ｂ２領域は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８の２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を含む。
【０１２２】
１つの実施形態において、Ｂ２は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８の２７１８５ｂｐ〜２８１６５ｂｐの配列からなる。
【０１２３】
本明細書において利用される、ＢＸは、ＢＢにおけるＬ５遺伝子の５’末端の近傍におけるＤＮＡ配列を指す。本明細書において利用される、Ｌ５遺伝子の５’末端の近傍または近位においては、Ｌ５遺伝子の５’末端またはそれに本質的に付随する非コード領域に隣接（近接）、すなわち、Ｌ５遺伝子の５’主要末端またはそれに本質的に付随する非コード領域に隣接しているまたは近接することを指す。あるいは、近傍または近位においては、ＢＸ領域とＬ５遺伝子の５’末端の間にコード配列が存在しないように、近くのＬ５遺伝子であることを指してもよい。
【０１２４】
従って、１つの実施形態において、ＢＸは、例えば、Ｌ５遺伝子のコード配列の開始を表す、Ｌ５の塩基に直接的に連結される。
【０１２５】
従って、１つの実施形態において、ＢＸは、例えば、非コード配列の開始を表す、Ｌ５の塩基に直接的に連結されるか、またはＬ５に天然で付随する非コード領域に直接的に連結される。本明細書において利用される、Ｌ５に天然で付随する非コード領域は、Ｌ５遺伝子の一部であるか、またはそれと近接するが、別の遺伝子の一部でない、非コード領域の全ての一部を指す。
【０１２６】
１つの実施形態において、ＢＸは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８の配列を含む。この配列は、ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子（もしくは導入遺伝子カセット）、制限酵素部位またはその組み合わせを含むＤＮＡ配列が、そこに挿入され得る、人工非コード配列である。この配列は、ウイルス安定性および生存率に対する破壊的な作用を最小にしながら、導入遺伝子の正確な場所におけるいく分かの可動性を可能にするバッファーとして作用するので、有利である。
【０１２７】
挿入物（複数可）は、５’末端、３’末端からまたは塩基１〜２０１の間、例えば、塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、３４／３５、３５／３６、３６／３７、３７／３８、３８／３９、３９／４０、４０／４１、４１／４２、４２／４３、４３／４４、４４／４５、４５／４６、４６／４７、４７／４８、４８／４９、４９／５０、５０／５１、５１／５２、５２／５３、５３／５４、５４／５５、５５／５６、５６／５７、５７／５８、５８／５９、５９／６０、６０／６１、６１／６２、６２／６３、６３／６４、６４／６５、６５／６６、６６／６７、６７／６８、６８／６９、６９／７０、７０／７１、７１／７２、７２／７３、７３／７４、７４／７５、７５／７６、７６／７７、７７／７８、７８／７９、７９／８０、８０／８１、８１／８２、８２／８３、８３／８４、８４／８５、８５／８６、８６／８７、８７／８８、８８／８９、８９／９０、９０／９１、９１／９２、９２／９３、９３／９４、９４／９５、９５／９６、９６／９７、９７／９８、９８／９９、９９／１００、１００／１０１、１０１／１０２、１０２／１０３、１０３／１０４、１０４／１０５、１０５／１０６、１０６／１０７、１０７／１０８、１０８／１０９、１０９／１１０、１１０／１１１、１１１／１１２、１１２／１１３、１１３／１１４、１１４／１１５、１１５／１１６、１１６／１１７、１１７／１１８、１１８／１１９、１１９／１２０、１２０／１２１、１２１／１２２、１２２／１２３、１２３／１２４、１２４／１２５、１２５／１２６、１２６／１２７、１２７／１２８、１２８／１２９、１２９／１３０、１３０／１３１、１３１／１３２、１３２／１３３、１３３／１３４、１３４／１３５、１３５／１３６、１３６／１３７、１３７／１３８、１３８／１３９、１３９／１４０、１４０／１４１、１４１／１４２、１４２／１４３、１４３／１４４、１４４／１４５、１４５／１４６、１４６／１４７、１４７／１４８、１４８／１４９、１５０／１５１、１５１／１５２、１５２／１５３、１５３／１５４、１５４／１５５、１５５／１５６、１５６／１５７、１５７／１５８、１５８／１５９、１５９／１６０、１６０／１６１、１６１／１６２、１６２／１６３、１６３／１６４、１６４／１６５、１６５／１６６、１６６／１６７、１６７／１６８、１６８／１６９、１６９／１７０、１７０／１７１、１７１／１７２、１７２／１７３、１７３／１７４、１７４／１７５、１７５／１７６、１７６／１７７、１７７／１７８、１７８／１７９、１７９／１８０、１８０／１８１、１８１／１８２、１８２／１８３、１８３／１８４、１８４／１８５、１８５／１８６、１８６／１８７、１８７／１８８、１８９／１９０、１９０／１９１、１９１／１９２、１９２／１９３、１９３／１９４、１９４／１９５、１９５／１９６、１９６／１９７、１９７／１９８、１９８／１９９、１９９／２００もしくは２００／２０１の間の任意の位置において、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８内のいずれにおいてでも生じることができる。
【０１２８】
１つの実施形態において、ＢＸは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８を、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９８の塩基２７〜塩基２８または位置２８１９２ｂｐと２８１９３ｂｐの間に対応する場所に挿入されたＤＮＡ配列と共に、含む。
【０１２９】
１つの実施形態において、ＢＸは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号２１の２８１６６ｂｐ〜２８３６６ｂｐの配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を有する。１つの実施形態において、ＢＸは、結合である。
【０１３０】
本明細書において利用される、ＢＢは、Ｌ５領域をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書において利用される、Ｌ５領域は、文脈において必要に応じて、ファイバーポリペプチド／タンパク質をコードする遺伝子を含有するＤＮＡ配列を指す。ファイバー遺伝子／領域は、アデノウイルスの主要なカプシド成分であるファイバータンパク質をコードする。ファイバーは、受容体認識において機能し、細胞に選択的に結合し、感染するアデノウイルスの能力に関与する。
【０１３１】
本開示のウイルスにおいて、ファイバーは、任意のアデノウイルス血清型由来であり、異なる血清型の１つについてのファイバーの変更の結果としてキメラであるアデノウイルスはまた、本開示を用いて予想される。１つの実施形態において、ファイバーは、Ｂ群ウイルス、特に、Ａｄ１１ｐのような、Ａｄ１１由来である。
【０１３２】
１つの実施形態において、ＢＢは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の２８３６７ｂｐ〜２９３４４ｂｐの配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を有する。
【０１３３】
本明細書において利用される、ＢＹに関連するＤＮＡ配列は、ＢＢのＬ５遺伝子の３’末端の近傍におけるＤＮＡ配列を指す。本明細書において利用される、Ｌ５遺伝子の３’末端の近傍または近位においては、Ｌ５遺伝子の３’末端またはそれに本質的に付随する非コード領域に隣接（近接）、すなわち、Ｌ５遺伝子の３’主要末端またはそれに本質的に付随する非コード領域（すなわち、Ｌ５にとって内在性の非コード配列の全てもしくは一部）に隣接しているまたは近接することを指す。あるいは、近傍または近位においては、ＢＹ領域とＬ５遺伝子の３’末端の間にコード配列が存在しないように、近くのＬ５遺伝子であることを指してもよい。
【０１３４】
従って、１つの実施形態において、ＢＹは、コード配列の「末端」を表すＬ５の塩基に直接的に連結される。
【０１３５】
従って、１つの実施形態において、ＢＹは、非コード配列の「末端」を表すＬ５の塩基に直接的に連結されるか、またはＬ５に天然で付随する非コード領域に直接的に連結される。
【０１３６】
本質的におよび天然には、本明細書において互換的に使用される。１つの実施形態において、ＢＹは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９９の配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を含む。この配列は、ＤＮＡ配列、例えば、導入遺伝子（もしくは導入遺伝子カセット）、制限酵素部位またはその組み合わせを含むＤＮＡ配列が、挿入され得る、非コード配列である。この配列は、ウイルス安定性および生存率に対する破壊的な作用を最小にしながら、導入遺伝子の正確な場所におけるいく分かの可動性を可能にするバッファー作用するので、有利である。
【０１３７】
挿入物（複数可）は、５’末端、３’末端から、または塩基１〜３５の間、例えば、塩基対１／２、２／３、３／４、４／５、５／６、６／７、７／８、８／９、９／１０、１０／１１、１１／１２、１２／１３、１３／１４、１４／１５、１５／１６、１６／１７、１７／１８、１８／１９、１９／２０、２０／２１、２１／２２、２２／２３、２３／２４、２４／２５、２５／２６、２６／２７、２７／２８、２８／２９、２９／３０、３０／３１、３１／３２、３２／３３、３３／３４、もしくは３４／３５の任意の位置において、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１８（当該配列は、参照により取り込まれる）内のいずれかにおいて生じることができる。
【０１３８】
１つの実施形態において、ＢＹは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９９（当該配列は、参照により取り込まれる）を、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１（当該配列は、参照により取り込まれる）における位置塩基１２および１３または２９３５６ｂｐおよび２９３５７ｂｐに対応する位置に挿入されたＤＮＡ配列と共に含む。１つの実施形態において、挿入物は、制限酵素部位の挿入物である。１つの実施形態において、制限酵素部位の挿入物は、１つまたは２つの制限酵素部位を含む。１つの実施形態において、制限酵素部位は、２つの制限酵素部位を含む１９ｂｐの制限酵素部位の挿入物である。１つの実施形態において、制限酵素部位の挿入物は、１つの制限酵素部位を含む９ｂｐの制限酵素部位の挿入物である。１つの実施形態において、制限酵素部位の挿入物は、１つまたは２つの制限酵素部位および少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、１つまたは２つの導入遺伝子のような、１つまたは２つたは３つの導入遺伝子を含む。１つの実施形態において、制限酵素部位は、２つの制限酵素部位および少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、１つまたは２つの導入遺伝子を含む１９ｂｐの制限酵素部位の挿入物である。１つの実施形態において、制限酵素部位の挿入物は、１つの制限酵素部位および少なくとも１つの導入遺伝子、例えば、１つまたは２つの導入遺伝子を含む９ｂｐの制限酵素部位の挿入物である。１つの実施形態において、２つの制限酵素部位は、２つのような、１つまたは複数の導入遺伝子（例えば、導入遺伝子カセット中）をサンドイッチする。１つの実施形態において、ＢＹは、２つの制限酵素部位を含むとき、当該制限酵素部位は、互いに異なる。１つの実施形態において、ＢＹにおける当該１つまたは複数の制限酵素部位は、それらが挿入されている特定のアデノウイルスゲノムにおいて非天然に存在する（例えば、固有である）。１つの実施形態において、ＢＹにおける当該１つまたは複数の制限酵素部位は、アデノウイルスゲノムにおける他の場所に位置する他の制限酵素部位と異なり、天然に生じる制限酵素部位またはＢＸのような、ゲノムの他の部分に導入された制限酵素部位と異なる。従って、１つの実施形態において、制限酵素部位または複数の部位は、セクションにおけるＤＮＡが、特異的に切断されることを可能にする。
【０１３９】
１つの実施形態において、ＢＹは、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の２９３４５ｂｐ〜２９３７９ｂｐの配列を有する。１つの実施形態において、ＢＹは、結合である。
【０１４０】
１つの実施形態において、挿入物は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号９９における塩基１２の後である。
【０１４１】
１つの実施形態において、挿入物は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７のおよそ位置２９３５６ｂｐにある。
【０１４２】
１つの実施形態において、挿入物は、１つまたは複数の導入遺伝子、例えば、１つまたは２つのような、１つ、２つまたは３つの導入遺伝子を含む導入遺伝子カセットである。
【０１４３】
本明細書において利用される、Ｅ４は、アデノウイルスＥ４領域の一部または全て（すなわち、タンパク質／ポリペプチド）をコードするＤＮＡ配列を指し、それは、Ｅ４遺伝子によりコードされるタンパク質が、保存的または非保存的アミノ酸変更（例えば、１、２、３、４もしくは５個のアミノ酸変更、付加および／または欠損）を有し、野生型（すなわち、対応する非変異導入タンパク質）と同じ機能；野生型タンパク質と比較して増大した機能；野生型タンパク質と比較して、機能がないのような、減少した機能を有するか、または必要に応じて、野生型タンパク質と比較して、新たな機能またはその組み合わせを有するように、変異導入されてもよい。
【０１４４】
１つの実施形態において、E4領域は、部分的に欠損され、例えば、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％欠損される。１つの実施形態において、Ｅ４領域は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐの配列を有する。
【０１４５】
１つの実施形態において、欠損されているＥ４ｏｒｆ４領域を除き、Ｅ４は存在する。
【０１４６】
１つの実施形態において、Ｂ３は、結合である、すなわち、Ｅ４は、存在しない。
【０１４７】
１つの実施形態において、Ｂ３は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号１７の３２１８８ｂｐ〜２９３８０ｂｐからなる配列を有する。
【０１４８】
本明細書において利用される、数値範囲は、端点を含む。
【０１４９】
当業者は、式（Ｉ）、（Ｉａ）のような、本明細書における式におけるエレメントが、近接し、本明細書において述べられる非コードＤＮＡ配列ならびに遺伝子およびコードＤＮＡ配列（構造特性）を統合し得ることを理解する。１つまたは複数の実施形態において、本開示の製剤は、アデノウイルスゲノムにおける天然に存在する配列を記載することを試みる。この文脈において、製剤が、ゲノムの関連するセクションを特徴付ける主要エレメントを指し、ＤＮＡのゲノムストレッチの徹底的な記載であるとは意図されないことは、当業者に明らかである。
【０１５０】
本明細書において利用される、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ３およびＥ４は、それぞれ独立して、本明細書において記載される、野生型およびその均等物、それぞれの領域の変異導入または部分的に欠損された形態、特に、公知のアデノウイルス由来の野生型配列を指す。
【０１５１】
本明細書において利用される、「挿入物」は、参照配列を中断するように、５’末端、３’末端においてまたは所定のＤＮＡ配列参照セグメント内のいずれかで取り込まれるＤＮＡ配列を指す。参照配列は、挿入物が位置するものと比べた参照ポイントとして利用した。本開示の文脈において、挿入物は、一般に、両方が国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される、配列番号９８または配列番号９９のいずれかにおいて生じる。挿入物は、一般に、導入遺伝子カセットを含有する。配列が中断されるとき、ウイルスは、依然として、元の配列を含むが、一般に、挿入物をサンドイッチする２つのフラグメントとしてである。
【０１５２】
１つの実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ＴＮ７トランスポゾンまたはその一部のような、非バイアス挿入トランスポゾンを含まない。本明細書において利用される、Ｔｎ７トランスポゾンは、国際公開第２００８／０８０００３号において記載される非バイアス挿入トランスポゾンを指す。
【０１５３】
１つの実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、調節エレメントまたは配列をさらに含む。
【０１５４】
プロモーター
本明細書において利用される、プロモーターは、特定の遺伝子または複数の遺伝子の転写を開始するＤＮＡの領域を意味する。プロモーターは、一般に、同じ鎖およびＤＮＡ上の上流（すなわち、５’）、それらが転写する遺伝子の近位に位置する。この文脈において利用される、近位は、プロモーターとして機能するのに十分に近いことを意味する。１つの実施形態において、プロモーターは、転写開始部位の１００ｂｐ以内にある。従って、本明細書において利用される、内在性プロモーターは、導入遺伝子が挿入されている、アデノウイルス（または構築物）において天然に生じる（すなわち、それにとって天然である）プロモーターを指す。１つまたは複数の実施形態において、利用される内在性プロモーターは、ウイルスゲノムにおけるその元の場所におけるウイルスにおける天然に存在するプロモーターであり、特に、これは、導入遺伝子または複数の導入遺伝子の発現において利用される主要または唯一のプロモーターである。１つの実施形態において、導入遺伝子の翻訳および場合により、転写を促進するために使用される内在性プロモーターは、常在のものであり、すなわち、アデノウイルスのゲノムに組込まれ、組換え技術により既に導入されていないものである。
【０１５５】
本明細書において利用される、内在性プロモーターの制御下は、導入遺伝子／導入遺伝子カセットが、当該内在性プロモーターの制御下であるように適当な方向で挿入されている場所を指す。すなわち、プロモーターが、一般に、アンチセンス鎖にある場合、カセットは、例えば、アンチセンス方向で挿入される。
【０１５６】
そうは言っても、遺伝子は、二方向のうちの一方向で発現され得る。しかしながら、一般に、一方の方向が、所定の（特定の）導入遺伝子に、他の方向より増大したレベルの発現をもたらす。
【０１５７】
１つの実施形態において、カセットは、センス方向である。それは、５’から３’方向に転写される。１つの実施形態において、カセットは、アンチセンス方向である。それは、３’から５’方向に転写される。
【０１５８】
ウイルスにおける内在性プロモーターは、例えば、導入遺伝子およびスプライスアクセプター配列をコードする遺伝子を利用することにより、利用することができる。従って、１つの実施形態において、カセットは、内在性プロモーターを利用する導入遺伝子を促すスプライスアクセプター配列を含む。従って、１つの実施形態において、コード配列、例えば、抗体または抗体結合フラグメントをコードする配列は、スプライスアクセプター配列をさらに含む。
【０１５９】
１つの実施形態において、導入遺伝子、複数の導入遺伝子、または導入遺伝子カセットは、Ｅ４プロモーターまたは主要後期プロモーター（ＭＬプロモーター）のような、主要後期プロモーターの制御下にある。
【０１６０】
本明細書において利用される、制御下は、特定のプロモーターが指示するとき、導入遺伝子が活性化される、すなわち、転写されることを意味する。
【０１６１】
本明細書において利用される、主要後期プロモーター（ＭＬプロモーターまたはＭＬＰ）は、Ｌ５遺伝子のような、後期に発現される遺伝子の発現を制御するアデノウイルスプロモーターを指す。ＭＬＰは、「センス鎖」プロモーターである。すなわち、プロモーターは、５’から３’方向でプロモーターの下流にある遺伝子に影響する。本明細書において利用される、主要後期プロモーターは、ウイルスゲノムに位置する元の主要後期プロモーターを指す。
【０１６２】
本明細書において利用される、Ｅ４プロモーターは、Ｅ４領域のアデノウイルスプロモーターを指す。Ｅ４領域は、アンチセンス領域であり、それ故、プロモーターは、アンチセンスプロモーターである。すなわち、プロモーターは、３’から５’方向でＥ４領域の上流にある。それ故、Ｅ４プロモーターの制御下の任意の導入遺伝子カセットは、適当に方向付けられる必要がある。１つの実施形態において、Ｅ４プロモーターの制御下のカセットは、アンチセンス方向である。１つの実施形態において、カセットは、センス方向でＥ４プロモーターの制御下である。本明細書において利用される、Ｅ４プロモーターは、ウイルスゲノムに位置する元のＥ４プロモーターを指す。
【０１６３】
従って、１つの実施形態において、複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルス血清型１１（例えば、Ａｄ１１ｐ）またはそのウイルス誘導体が提供され、ファイバー、ヘキソンおよびカプシドは、血清型１１（例えば、Ａｄ１１ｐ）であり、ウイルスゲノムは、治療抗体または抗体結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含み、Ｅ４および主要後期プロモーター（すなわち、Ｅ４プロモーターまたは主要後期プロモーター）からなるものから選択されるアデノウイルスにとって内在性のプロモーターの制御下の当該ＤＮＡ配列は、導入遺伝子が、ウイルス複製と干渉しないように、例えば、ウイルスゲノムにおけるＬ５の後に位置するような、Ｌ５領域に付随する（すなわち、当該領域の前または後）。
【０１６４】
１つの実施形態において、内在性プロモーターは、組換え技術により、所望の場所においてウイルスゲノムに導入され、例えば、導入遺伝子カセットに導入される。しかしながら、本明細書の文脈において、この配置は、一般に、外来プロモーターに言及する。
【０１６５】
１つの実施形態において、導入遺伝子カセットは、外来プロモーターを含む。本明細書において利用される、外来プロモーターは、導入遺伝子が挿入されている、アデノウイルスにおいて天然に存在しないプロモーターを指す。典型的には、外来プロモーターは、他のウイルス由来であるか、または哺乳類プロモーターである。本明細書において利用される、外来プロモーターは、遺伝子の転写を調節する、対象となる遺伝子の上流に通常位置する、ＤＮＡエレメントを意味する。
【０１６６】
１つの実施形態において、遺伝子発現の制御因子は、外来プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーターのような、ＣＭＶ（サイトメガロウイルスプロモーター）、ＣＢＡ（トリベータアクチンプロモーター）またはＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ１プロモーター）である。
【０１６７】
１つの実施形態において、外来プロモーターは、誘導可能である。
【０１６８】
１つの実施形態において、複製可能な腫瘍溶解性アデノウイルス血清型１１（例えば、Ａｄ１１ｐ）またはそのウイルス誘導体が提供され、ファイバー、ヘキソンおよびカプシドは、清型１１（例えば、Ａｄ１１ｐ）であり、ウイルスゲノムは、導入遺伝子が、ウイルス複製と干渉しないように、ウイルス複製サイクルにおいて後期に発現される、ウイルスゲノムの一部において位置する治療抗体または抗体結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を含み、当該ＤＮＡ配列は、アデノウイルスにとって外来のプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）の制御下である。１つの実施形態において、抗体またはフラグメントをコードするＤＮＡ配列は、本明細書における他の場所で記載されるＬ５領域に付随する。
【０１６９】
他の調節配列
本明細書において利用される、「遺伝子発現の制御因子」（または制御因子／調節エレメント）は、典型的には、転写または翻訳を開始させるか、または増強させることにより、遺伝子発現において役割を果たすプロモーター、エンハンサーまたはスプライスアクセプター配列のような、遺伝子エレメントを指す。
【０１７０】
本明細書において利用される、「スプライスアクセプター配列」、「スプライスアクセプター」または「スプライス部位」は、ｍＲＮＡ分子が、スプライソソーム複合体の小さい核内リボヌクレオタンパク質により認識されるときを決定する調節配列を指す。スプライソソームが会合したら、上流スプライスドナー部位へのｍＲＮＡ分子のスプライスアクセプター部位間のスプライシングを触媒し、これにより、単一のポリペプチドまたはタンパク質を産生するよう翻訳され得る成熟ｍＲＮＡ分子を産生する。
【０１７１】
異なるサイズのスプライスアクセプター配列が、本発明において利用されてもよく、これらは、短いスプライスアクセプター（小）、スプライスアクセプター（中）および分岐スプライスアクセプター（大）として記載され得る。
【０１７２】
本明細書において利用される、ＳＳＡは、短いスプライスアクセプター、典型的には、ちょうどスプライス部位、例えば、４ｂｐを含む、短いスプライスアクセプターを指す。本明細書において利用される、ＳＡは、スプライスアクセプター、典型的には、短いスプライスアクセプターおよびポリピリミジントラクト、例えば、１６ｂｐを含む、スプライスアクセプターを指す。本明細書において利用される、ｂＳＡは、分岐スプライスアクセプター、典型的には、短いスプライスアクセプター、ポリピリミジントラクトおよび分岐ポイント、例えば、２６ｂｐを含む、分岐スプライスアクセプターを指す。
【０１７３】
１つの実施形態において、本開示の構築物において利用されるスプライスアクセプターは、ＣＡＧＧまたは配列番号１５もしくは１６（両方とも、国際公開第２０１６／１７４２００号において配列番号１０および１１として開示され、当該配列は、参照により取り込まれる）。１つの実施形態において、ＳＳＡは、ＣＡＧＧのヌクレオチド配列を有する。１つの実施形態において、ＳＡは、配列番号１５のヌクレオチド配列を有する。１つの実施形態において、ｂＳＡは、ｃａｇｇのヌクレオチド配列を有する。１つの実施形態において、スプライスアクセプター配列は、ｔｇｃｔａａｔｃｔｔ  ｃｃｔｔｔｃｔｃｔｃ  ｔｔｃａｇｇ（配列番号１５）、ｔｔｔｃｔｃｔｃｔｔ  ｃａｇｇ（配列番号１６）、およびｃａｇｇを含む群から独立して選択される。
【０１７４】
１つの実施形態において、スプライス部位は、ＣＣＡＣＣを含むコンセンサスコザック配列により直ちに処理される（すなわち、５’から３’方向で続く）。１つの実施形態において、スプライス部位およびコザック配列は、最大１００以下のｂｐにより散在される（分けられる）。１つの実施形態において、コザック配列は、ＣＣＡＣＣのヌクレオチド配列を有する。
【０１７５】
典型的には、内在性または外来プロモーター（例えば、内在性プロモーター）の制御下にあるとき、コード配列は、コザック配列により直ちに処理される。コード領域の開始は、開始コドン（ＡＵＧ）により示され、例えば、配列（ｇｃｃ）ｇｃｃＲｃｃＡＵＧｇ（配列番号８）の関係にあり、コード配列の開始の開始は、太字の塩基により示される。小文字は、この位置にある共通の塩基（それにも関わらず変動し得る）を示し、大文字は、高度に保存される塩基を示す、すなわち、「ＡＵＧＧ」配列は、仮に変更したとしても、一定または稀であり；「Ｒ」は、プリン（アデニンまたはグアニン）が、通常、この位置において見られることを示し、括弧内の配列（ｇｃｃ）は、不確に重要なものである。従って、１つの実施形態において、開始コドンＡＵＧは、コザック配列に取り込まれる。
【０１７６】
本明細書において利用される、内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）をコードするＤＮＡ配列を指す。本明細書において利用される、ＩＲＥＳは、ｍＲＮＡ配列内で始まる開始を含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列の翻訳の開始を可能にするヌクレオチド配列を意味する。これは、カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードするとき、特に有用である。ＩＲＥＳの使用は、複数の個々のタンパク質またはペプチドに翻訳されるポリシストロニックｍＲＮＡを生じる。１つの実施形態において、内部リボソーム進入ＤＮＡ配列は、国際公開第２０１６／１７４２００号において配列番号６として開示されるヌクレオチド配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を有する。１つの実施形態において、特定のＩＲＥＳは、ゲノムにおいて１回だけ使用される。これは、ゲノムの安定性に関して利点を有し得る。
【０１７７】
本明細書において利用される、「高自己切断効率２Ａペプチド」または「２Ａペプチド」は、翻訳後に効率的に切断されるペプチドを指す。適当な２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２ＡおよびＴ２Ａを含む。本発明者らは、所定の２Ａペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列が１回使用されると、同じ特定のＤＮＡ配列は、２回使用されない可能性があることに気付いた。しかしながら、ＤＮＡコードにおける重複性を使用して、同じ２Ａペプチドに翻訳されるＤＮＡを生み出し得る。２Ａペプチドの使用は、カセットがポリシストロニックｍＲＮＡをコードするとき、特に有用である。２Ａペプチドの使用は、翻訳されている単一のポリペプチド鎖を生じ、それが、翻訳後修飾されて、複数の個々のタンパク質またはペプチドを生み出す。
【０１７８】
１つの実施形態において、利用されるコードされるＰ２Ａペプチドは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、利用されるコードされるＦ２Ａペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、利用されるコードされるＥ２Ａペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。１つの実施形態において、利用されるコードされるＴ２Ａペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。
【０１７９】
１つの実施形態において、導入遺伝子によりコードされるｍＲＮＡまたはそれぞれのｍＲＮＡは、ポリアデニル化シグナル配列であり、それを含み、例えば、典型的には、ｍＲＮＡ配列の末端において、例えば、配列番号１０において示され通り、利用される。従って、１つの実施形態において、導入遺伝子または導入遺伝子カセットは、ポリアデニル化シグナル配列をコードする少なくとも１つの配列を含む。
【０１８０】
本明細書において利用される、「ポリＡ」、「ポリアデニル化シグナル」または「ポリアデニル化配列」は、転写されると、新生ｍＲＮＡ分子を切断し、ポリアデニル化する複数のタンパク質複合体により認識され得る、ＤＮＡ配列、通常、ＡＡＴＡＡＡ部位を含有するＤＮＡ配列を意味する。
【０１８１】
１つの実施形態において、ポリアデニル化配列は、国際公開第２０１６／１７４２００号において開示される配列番号６のヌクレオチド配列（当該配列は、参照により取り込まれる）を有する。
【０１８２】
１つの実施形態において、構築物は、ポリアデニル化配列を含まない。１つの実施形態において、遺伝子発現の制御因子は、スプライスアクセプター配列である。
【０１８３】
１つの実施形態において、抗体または抗体結合フラグメントのような、タンパク質／ポリペプチド／ペプチドをコードする配列は、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【０１８４】
製剤
本開示は、本明細書において記載される、ウイルスの医薬製剤に関し、またそれまで拡大する。
【０１８５】
１つの実施形態において、本開示による複製可能な腫瘍溶解性の液体非経口製剤、例えば、注入または注射のための液体非経口製剤が提供され、製剤は、１回投与容量当たり１×１０１０〜１×１０１４個のウイルス粒子の範囲の投与をもたらす。
【０１８６】
非経口製剤は、ＧＩ管を介してデリバリーされないよう設計された製剤を意味する。典型的な非経口デリバリー経路は、注射、移植または注入を含む。１つの実施形態において、製剤は、ボーラスデリバリーのための形態で提供される。
【０１８７】
１つの実施形態において、非経口製剤は、注射の形態である。注射は、静脈内、皮下、腫瘍内または筋内注射を含む。本明細書において利用される、注射は、シリンジを介した身体への液体の挿入を意味する。１つの実施形態において、本開示の方法は、腫瘍内注射を含まない。
【０１８８】
１つの実施形態において、非経口製剤は、注入の形態である。
【０１８９】
本明細書において利用される、注入は、点滴、注入ポンプ、シリンジドライバーまたは同等の装置による、よりゆっくりした速度での液体の投与を意味する。１つの実施形態において、注入は、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９  ２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、６５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０または１１５分のような、１．５分〜１２０分の範囲の期間に渡り投与される。
【０１９０】
１つの実施形態において、製剤の１用量は、例えば、シリンジドライバーにより投与される、１００ｍｌ未満、例えば、３０ｍｌである。
【０１９１】
１つの実施形態において、注射は、例えば、１．５〜３０分の期間に渡るゆっくりとした注射として投与される。
【０１９２】
１つの実施形態において、製剤は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与用である。この経路は、器官および組織の大部分への迅速なアクセスを可能にするので、腫瘍溶解性ウイルスのデリバリーに特に有効であり、転移、例えば、確立した転移、特に、肝臓および肺のような高度に血管形成した領域に位置するものの処置に特に有用である。
【０１９３】
治療製剤は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌かつ安定である。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、またはヒトへの投与に適した他の非経口製剤として製剤することができ、シリンジまたはバイアルのような予め充填された装置として、特に、１回用量として製剤されてもよい。
【０１９４】
製剤は、一般に、医薬的に許容される希釈剤または担体、例えば、ウイルスと適合する無毒性の等調な担体を含み、ウイルスは、必要な期間安定である。
【０１９５】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにその適当な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンまたはポリソルベート８０または４０のような非イオン性界面活性剤のような、分散剤または界面活性剤の使用により、維持され得る。分散系において、要求される粒子サイズの維持は、界面活性剤の存在により補助され得る。等調剤の例は、組成物において糖、多価アルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含む。
【０１９６】
１つの実施形態において、利用される非経口製剤は、次の緩衝液、例えば、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸、リン酸緩衝液および／またはトリス緩衝液、糖、例えば、デキストロース、マンノース、スクロースまたは類似、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムまたは塩化カリウムのような塩、ｂｒｉｊ、ＰＳ−８０、ＰＳ−４０または類似のもののような非イオン性界面活性剤のような洗浄剤の１つまたは複数を含んでもよい。製剤はまた、可能性のある分解の１つまたは複数の経路を妨げると考えられる、ＥＤＴＡもしくはエタノールまたはＥＤＴＡとエタノールの組み合わせのような保存剤を含んでもよい。
【０１９７】
１つの実施形態において、製剤は、本開示による精製された腫瘍溶解性ウイルス、例えば、１用量当たり１×１０１０〜１×１０１２個のウイルス粒子のような、１用量当たり１×１０１０〜１×１０１４個のウイルス粒子を含む。１つの実施形態において、製剤におけるウイルスの濃度は、２×１０１２個のウイルス粒子／ｍｌのような、範囲２×１０８〜２×１０１４個のウイルス粒子／ｍｌにある。
【０１９８】
１つの実施形態において、非経口製剤は、グリセロールを含む。
【０１９９】
１つの実施形態において、製剤は、本明細書において記載される腫瘍溶解性アデノウイルス、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸）、グリセロールおよび緩衝液を含む。
【０２００】
１つの実施形態において、非経口製剤は、開示のウイルス、ＨＥＰＥＳ、例えば、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、グリセロール、例えば、５〜２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、塩酸、例えば、ｐＨを範囲７〜８に調整した塩酸および注射用水からなる。
【０２０１】
１つの実施形態において、本開示の濃度２×１０１２個のウイルス粒子／ｍＬのウイルス０．７ｍＬは、５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２０％グリセロールにおいて、終ｐＨ７．８で製剤される。
【０２０２】
医薬的に許容される担体の完璧な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．１９９１年）において入手可能である。
【０２０３】
１つの実施形態において、製剤は、吸入を含む局所投与用の製剤として提供される。
【０２０４】
適当な吸入可能な調製物は、吸入可能な粉末、推進ガスを含有する計測エアロゾルまたは推進ガスを含まない吸入可能な溶液を含む。本開示による吸入可能な粉末は、一般に、本明細書において記載されるウイルスを生理的に許容される賦形剤と共に含有する。
【０２０５】
これらの吸入可能な粉末は、単糖（例えば、グルコースもしくはアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、ショ糖、マルトース）、オリゴおよびポリサッカライド（例えば、デキストラン）、多価アルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）または互いとのこれらの混合物を含んでもよい。特に、それらの水和物の形態のものに限らず、ラクトースまたはグルコースのような、単または二糖が、適当に使用される。
【０２０６】
肺における沈着用の粒子は、１〜９ミクロン、例えば、０．１〜５μｍ、特に、１〜５μｍのような、１０ミクロン未満の粒子サイズを要求する。ウイルスを有する粒子のサイズは、主に重要なものであり、従って、１つの実施形態において、本開示によるウイルスは、所定のサイズのラクトース粒子のような、粒子に吸着されるか、または吸収されてもよい。
【０２０７】
吸入可能なエアロゾルを調製するために使用され得る推進ガスは、当該技術分野において公知である。適当な推進ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタンもしくはイソブタンのような炭化水素ならびにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパンもしくはシクロブタンの塩素付加および／またはフッ素化誘導体のようなハロ炭化水素の中から選択される。上述の推進ガスは、それら自体またはその混合物において使用されてもよい。
【０２０８】
特に適当な推進ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａおよびＴＧ２２７の中から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）およびＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）ならびにその混合物が、特に適当である。
【０２０９】
推進ガスを含有する吸入可能なエアロゾルはまた、共溶媒、安定剤、表面活性剤（界面活性剤）、酸化防止剤、滑沢剤およびｐＨを調節するための手段のような、他の成分を含有してもよい。全てのこれらの成分は、当該技術分野において公知である。
【０２１０】
本発明による推進ガスを含有する吸入可能なエアロゾルは、最大５重量％の有効な物質を含有してもよい。本発明によるエアロゾルは、例えば、０．００２〜５重量％、０．０１〜３重量％、０．０１５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．５〜２重量％または０．５〜１重量％の有効成分を含有する。
【０２１１】
あるいは、肺への局所投与は、例えば、噴霧器のような装置、例えば、圧縮機に接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ、Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．により製造されたＰａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）圧縮機に接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）を利用する、液状の溶液または懸濁製剤の投与によるものであってもよい。
【０２１２】
例えば、非経口製剤について既に上で記載された通り、例えば、溶液または懸濁液の形態で、溶媒中に分散された、本発明のウイルスをデリバリーすることができる。それは、適当な生理学的溶液、例えば、食塩水または他の薬理学的に許容される溶媒もしくは緩衝溶液において懸濁することができる。当該技術分野において公知の緩衝溶液は、水１ｍｌ当たりエデト酸２ナトリウム０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇ、ＮａＣｌ８．０ｍｇ〜９．０ｍｇ、ポリソルベート０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇ、無水クエン酸０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇ、およびクエン酸ナトリウム０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇを含有して、ｐＨ約４．０〜５．０に至ってもよい。
【０２１３】
治療懸濁液または溶液製剤はまた、１つまたは複数の賦形剤を含有することができる。賦形剤は、当該技術分野において周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び炭酸水素緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液または懸濁液は、リポソームまたは生分解性微粒子に封入することができる。製剤は、一般に、無菌製造プロセスを利用して、実質的に無菌の形態で提供される。
【０２１４】
これは、製剤のため使用される緩衝溶媒／溶媒の濾過による生産および無菌化、無菌の緩衝溶媒溶液における抗体の無菌の懸濁、ならびに当業者が慣れ親しんだ方法による無菌の容器への製剤の分散を含んでもよい。
【０２１５】
本開示による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイル包装材料に梱包された１回用量単位（例えば、密封プラスチック容器またはバイアル）として提供されてもよい。それぞれのバイアルは、容量、例えば、２ｍＬの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含有する。
【０２１６】
本開示はまた、例えば、両方とも参照により取り込まれる、国際公開第２００９／０６８８７７号および米国公開第２００４／０１５３０３３号において開示される装置を利用する、鼻腔内デリバリーされる液体溶液または懸濁液まで拡大する。
【０２１７】
処置
さらなる態様において、本開示は、処置における使用のための、特に、癌の処置のための、本明細書において記載されるウイルスまたはその製剤まで拡大する。
【０２１８】
１つの実施形態において、処置の方法は、腫瘍の処置における使用のためである。
【０２１９】
本明細書において利用される、腫瘍は、新生物とも呼ばれる、制御されず、進行性である、過剰な細胞分裂から生じる組織の異常な塊を指すことが意図される。腫瘍は、良性（非癌性）または悪性のいずれかであってもよい。腫瘍は、癌および転移の全ての形態を包含する。１つの実施形態において、腫瘍は癌性である。
【０２２０】
１つの実施形態において、腫瘍は、固形腫瘍である。固形腫瘍は、局在性であっても、または転移性であってもよい。
【０２２１】
１つの実施形態において、腫瘍は、上皮起源のものである。
【０２２２】
１つの実施形態において、腫瘍は、結腸直腸癌、肝細胞癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、甲状腺癌、腎臓癌、膀胱癌、頭頚部癌または肺癌のような悪性腫瘍である。
【０２２３】
１つの実施形態において、腫瘍は、結腸直腸の悪性腫瘍である。
【０２２４】
本明細書において利用される、悪性腫瘍は、癌性細胞を指す。
【０２２５】
１つの実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスは、転移の処置または予防において利用される。
【０２２６】
１つの実施形態において、本明細書における方法または製剤は、薬物抵抗性の癌の処置において利用される。
【０２２７】
１つの実施形態において、ウイルスは、さらなる癌処置または療法の投与と組み合わせて投与される。
【０２２８】
１つの実施形態において、癌、例えば、上記の癌の処置のための医薬の製造における使用のための本開示によるウイルスまたは製剤が提供される。
【０２２９】
さらなる態様において、それを必要とする患者に、例えば、ヒト患者に治療上有効量の本開示によるウイルスまたは製剤を投与する工程を含む、癌を処置する方法が提供される。
【０２３０】
１つの実施形態において、本明細書における腫瘍溶解性ウイルスまたは製剤は、別の療法と組み合わせて投与される。
【０２３１】
本明細書において利用される、「組み合わせにおいて」は、腫瘍溶解性ウイルスが、癌処置または療法の前、同時および／または後に投与される場合を包含することが意図される。しかしながら、一般に、併用療法についての処置レジメンは、一般に、重複する。
【０２３２】
本明細書において利用される、「併用療法」は、例えば、キットとして、または特に、癌の処置における使用のため同時に製剤化された２つの薬物製品一緒を指す。
【０２３３】
癌療法は、外科手術、放射線療法、標的療法および／または化学療法を含む。
【０２３４】
本明細書において利用される、癌処置は、治療化合物または生物学的な剤、例えば、癌を処置することが意図された抗体を用いた処置、および／またはその管理療法を指す。
【０２３５】
１つの実施形態において、癌処置は、化学療法剤；抗体薬物複合体のような、標的化抗癌剤；放射線療法、放射性同位体療法またはその任意の組み合わせを含む任意の他の抗癌療法から選択される。
【０２３６】
１つの実施形態において、腫瘍溶解性アデノウイルスのような本開示のウイルスを、外科手術（ネオアジュバント療法）のような、療法に対する前処置として使用して、例えば、腫瘍を縮小させて、例えば、転移を処置し、および／または転移もしくはさらなる転移を予防し得る。腫瘍溶解性アデノウイルスを、外科手術（アジュバント療法）のような、療法後に使用して、例えば、寛解にある癌を維持して、転移を処置し、および／または転移もしくはさらなる転移を処置し得る。
【０２３７】
１つの実施形態において、本開示のウイルスまたは製剤は、管理療法において利用される。
【０２３８】
本明細書において利用される、同時は、腫瘍溶解性アデノウイルス製剤と同時またはほぼ同時の追加の癌処理の投与である。処置は、同じ製剤内に含有されるか、または別個の製剤として投与されてもよい。
【０２３９】
１つの実施形態において、ウイルスは、化学療法剤の投与との組み合わせで投与される。
【０２４０】
本明細書において利用される、化学療法剤は、悪性細胞および組織にとって選択的に破壊的である特定の抗悪性新生物の化学剤または薬物を指すことが意図される。例えば、アルキル化剤、代謝拮抗物質、アントラサイクリン、植物アルカロイド、トポイソメラーゼ阻害剤、および他の抗腫瘍剤。特定の化学療法剤の例は、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカン、ならびにシスプラチンおよびオキサリプラチンのようなプラチンを含む。用量は、処置されている癌の性質に基づき、開業医により選択されてもよい。
【０２４１】
１つの実施形態において、治療剤は、免疫応答および／または腫瘍血管新生の制御において補助し得る、ガンシクロビルである。
【０２４２】
１つの実施形態において、本明細書における方法において利用される１つまたは複数の療法は、低用量の抗癌薬物を用いた継続的または頻繁な処置であり、しばしば他の療法と併用される、メトロノミックである。
【０２４３】
Ｂ亜群腫瘍溶解性アデノウイルス、特に、Ａｄ１１およびＥｎＡｄのようなそれらからもたらされるものは、アポトーシス、主として壊死性機序による癌細胞の殺傷にほぼ独立した作用機序を有すると思われるので、特に、化学療法剤と相乗的であり得る。さらに、化学療法中に生じる免疫抑制は、腫瘍溶解性ウイルスが、より効率的に機能することを可能にし得る。
【０２４４】
本明細書において利用される、治療用量は、適当な処置レジメンにおいて利用されるとき、意図される治療効果、例えば、疾患の症状または状態の改善、特に、用量規制副作用を誘発することない改善を達成するのに適当である腫瘍溶解性アデノウイルスのような、ウイルスの量を指す。ウイルス粒子が、次の：腫瘍または転移性成長が、遅延されるか、または停止される、または腫瘍または転移のサイズが縮小することが見出され、および／または患者の寿命が延長される、をもたらすのに十分であるとき、用量は、癌または転移の処置における治療用量とみなされ得る。適当な治療用量は、一般に、治療効果と許容できる毒性の間のバランスであり、例えば、副作用および毒性が、療法により達成される利点を考え、許容できる場合である。
【０２４５】
１つの実施形態において、１回の処置サイクルにおける本開示による腫瘍溶解性アデノウイルスの非経口製剤の複数回用量の全身投与が提供され、例えば、それぞれの投与において付与されるトータルの用量は、１回用量当たり１×１０１０〜１×１０１４個のウイルス粒子の範囲にある。
【０２４６】
１つの実施形態において、ウイルス粒子デリバリーの速度が、１分当たり２×１０１０個の粒子〜１分当たり２×１０１２個の粒子の範囲にあるように、１つまたは複数の用量（例えば、それぞれの用量）のウイルスまたはそれを含む組成物が、投与される。
【０２４７】
１つの実施形態において、本開示によるウイルスまたは治療構築物（それを含む製剤を含む）は、毎週投与され、例えば、１週目に１回用量が、１、３、５日目に、続いて、それぞれの続く週に１回用量が投与される。
【０２４８】
１つの実施形態において、本開示によるウイルスまたは治療構築物（それを含む製剤を含む）は、２週間に１回または３週間に１回投与され、例えば、１週目において、１、３および５日目に１回、および２または３週目に、その１、３および５日目にも投与される。この投与レジメンは、必要に応じた回数繰り返され得る。
【０２４９】
１つの実施形態において、本開示によるウイルスまたは治療構築物（それを含む製剤を含む）は、毎月、例えば、処置サイクルにおいて、または管理療法として投与される。
【０２５０】
１つの実施形態において、本開示のウイルスおよび構築物は、組換え技術により調製される。当業者は、目的のアデノウイルスゲノムが、ゲノムまたはゲノムの一部もしくは全てを含むプラスミドの完全な合成を含む、他の技術的手段により、製造することができることを理解する。当業者は、ゲノムの合成現象において、挿入の領域は、制限酵素部位のヌクレオチドを、後者はクローニング方法を使用した遺伝子の挿入後のアーチファクトであるので、含まなくてもよいことを理解する。
【０２５１】
１つの実施形態において、目的のアデノウイルスゲノムは、完全に合成で製造される。
【０２５２】
本明細書における開示は、導入遺伝子または導入遺伝子カセットの挿入から得られた、または得られ得る、式（Ｉ）またはそのサブの式のアデノウイルスまでさらに拡大する。
【０２５３】
本明細書において利用される、「である」は、含むことを意味する。
【０２５４】
本明細書の文脈において、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」として解釈されるべきである。
【０２５５】
ある種の特性／エレメントを含む本発明の実施形態はまた、関連するエレメント／特性から「なる」または「本質的になる」代替の実施形態まで拡大することが意図される。
【０２５６】
技術的に適当な場合、本発明の実施形態は、組合わされてもよい。
【０２５７】
特許および出願のような技術的参考文献は、参照により取り込まれる
【０２５８】
本明細書において具体的および明確に引用される任意の実施形態は、単独または１つもしくは複数のさらなる実施形態との組み合わせのいずれかで排除の基礎を形成してもよい。
【０２５９】
本明細書において見出しを利用して、文書を節に分け、それは、本明細書において提供される開示の意味を解釈するために使用されることは意図されない。
【０２６０】
本開示はまた、本明細書における任意のウイルス配列またはカセット配列の具体的開示、当該ウイルスを含む組成物、ウイルスを生み出すための当該カセットの使用、および療法、特に、癌療法における開示によるウイルスの使用まで拡大する。
【０２６１】
本出願は、両者とも２０１７年６月１日に出願された英国特許出願第１７０８７７９．２号および英国特許出願第１７０８７７８．４号に基づく優先権を主張する。それぞれの開示は、参照により本明細書に取り込まれ、特に、そこで開示されるアミノ酸およびポリヌクレオチド配列が取り込まれる。優先権の書類は、本明細書の補正のための基礎として利用され得る。
【０２６２】
本発明は、以下の実施例において説明のみの目的でさらに記載される。
【実施例】
【０２６３】
実施例１：抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ＮＧ−３５０）発現ＥｎＡｄウイルスの産生
抗ＣＤ４０モノクローナル抗体をコードする生成した第１のｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルスゲノムを、ＮＧ−３５０（配列番号１３）と命名した。
【０２６４】
ＮＧ−３５０ゲノムプラスミドを産生するために、プラスミドｐＥｎＡｄ２．４への、５’短いスプライスアクセプター配列（ＣＡＧＧ、配列番号２）；重鎖リーダー配列（配列番号３）、抗ＣＤ４０ＶＨ鎖（配列番号４）、抗体重鎖定常領域（配列番号５）、Ｐ２Ａ高い効率の自己切断可能なペプチド（配列番号６）、軽鎖リーダー配列（配列番号７）、抗ＣＤ４０ＶＬ鎖（配列番号８）、抗体軽鎖定常領域（配列番号９）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）テール（配列番号１０）をコードするカセットの直接的挿入により、ｐＮＧ−３５０を生成した。導入遺伝子カセット（配列番号１１）の図を、図１において示す。
【０２６５】
ウイルス産生および特徴決定
プラスミドｐＮＧ−３５０を、酵素ＡｓｃＩを用いた制限酵素切断により直線化して、ウイルスゲノムＮＧ−３５０（配列番号１）を産生した。ウイルスＮＧ−３５０を増幅させ、以下で与える方法に従い、精製した。
【０２６６】
切断したＤＮＡを、フェノール／クロロホルム抽出により精製し、１６時間、−２０℃、９５％より高い分子生物学的グレードのエタノール３００μｌおよび３Ｍ酢酸ナトリウム１０μｌにおいて沈殿させた。沈殿したＤＮＡを、１４０００ｒｐｍにおいて、５分遠心分離することにより、ペレット化し、７０％エタノール５００μｌにおいて洗浄後、１４０００ｒｐｍにおいて、５分再度遠心分離した。きれいなＤＮＡペレットを空気乾燥させ、リポフェクタミン遺伝子導入試薬１５μｌを含有するＯｐｔｉＭＥＭ５００μｌに再懸濁し、３０分間、ＲＴでインキュベーションした。次に、遺伝子導入混合物を、７０％の集密度まで成長させた２９３細胞を含有するＴ−２５フラスコに滴下した。細胞を遺伝子導入混合物と２時間３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションした後、細胞培地（２％ＦＢＳを添加したグルタミンを含むＤＭＥＭ高グルコース）４ｍｌを細胞に加え、フラスコを、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。
【０２６７】
遺伝子導入した２９３細胞を、２４時間毎にモニターし、４８〜７２時間毎に追加の培地を添加した。細胞単層における有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）の観察により、ウイルスの産生をモニターした。大規模なＣＰＥを観察したら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。回収したウイルスを使用して、２９３細胞に再感染させ、ウイルスストックを増やした。増幅中の生存可能なウイルスの産生を、細胞単層における有意なＣＰＥの観察により、確認した。ＣＰＥを観察したら、３回の凍結融解サイクルにより、ウイルスを２９３細胞から回収した。増やしたストックを、さらなる増幅のため使用し、その後、ウイルスを、二重塩化セシウムバンディングにより精製して、ＮＧ−３５０ウイルスストックを産生した。
【０２６８】
実施例２：ＮＧ−３５０ウイルス活性および抗ＣＤ４０抗体産生
粒子収量に関するＮＧ−３５０ウイルス活性および分泌された抗ＣＤ４０抗体産生を、ＨＥＫ２９３懸濁培養細胞株において評価した。ＨＥＫ２９３細胞を、振盪フラスコにおいて１×１０６個のウイルス粒子／ｍＬの密度で播種し、細胞１個当たり５０個のＮＧ−３５０ウイルス粒子（ｐｐｃ）を感染させた。ＨＥＫ２９３細胞をまた、ＮＧ−３５０親ウイルス、対照としてｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）を感染させた（５０ｐｐｃ）。感染の４８および７２時間後に、細胞上清を、５分間、１２００ｒｐｍ遠心分離することにより、収集した。試料の清透化した上清を、ＨＰＬＣによりウイルス粒子濃度またはヒトＩｇＧ２ＥＬＩＳＡにより抗ＣＤ４０抗体濃度を評価するため使用した。
【０２６９】
ＨＰＬＣ解析
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ（陰イオン交換）カラムを使用した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、上清中のウイルス粒子濃度を定量した。ウイルス溶出を２６０ｎｍにおいて検出し、２６０ｎｍのシグナルピークを積分し、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ標準曲線から濃度を計算することにより、ウイルス濃度を決定した。Ｎｇ−３５０およびｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ細胞からのウイルス産生の比較は、トータルの粒子産生に関するＮＧ−３５０ウイルス活性および細胞上清におけるウイルス粒子産生が、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖより有意に少ないことを示した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【０２７０】
ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡ
清透化した上清を、ＰＢＳ１０％ＢＳＡに２分の１希釈した。標準曲線および陰性対照試料を、製造元のプロトコール（ＩｇＧ２ヒトＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ２０２４０２、Ａｂｃａｍ）に従い調製した。試料および標準をＥＬＩＳＡプレートに加え、製造元のプロトコールに従い、アッセイを行った。プレートのそれぞれのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して測定し、分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を、標準曲線から書き入れることにより、決定した（図２Ｃ）。ＮＧ−３５０から、抗ＣＤ４０を産生させ、分泌させたが、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖが感染した細胞ではなかった。
【０２７１】
これらのデータの統合により、ＮＧ−３５０は、抗ＣＤ４０抗体を産生することができたが、この改変されたウイルスのウイルス活性は、有意に損なわれたことを示した。そのため、ＮＧ−３５０ウイルス粒子のさらなる特徴決定を行った（実施例３）。
【０２７２】
実施例３：ＮＧ−３５０ウイルス同一性試験およびゲノム解析 
制限酵素解析
ＮＧ−３５０ウイルスストック物質の同一性を、制限酵素解析を介してゲノム同一性を解析することにより、まず調べた。ＮＧ−３５０またはｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子（３．５×１０１１個のウイルス粒子）を、ＰＢＳにおいて終容積２００μＬまで希釈した。製造元のプロトコールに従い、ＱＩＡｇｅｎ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅウイルススピンキットを使用して、ウイルスからＤＮＡを抽出した。酵素ＡｓｃＩを用いて、２時間、３７℃でｐＮＧ−３５０プラスミドを直線化し、次に、アガロースゲル電気泳動およびＱｉａＱｕｉｃｋ  Ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いたゲル抽出により、精製することにより、アッセイのための対照ＤＮＡを調製した。制限酵素ＥｃｏＲｖ／ＮｈｅＩの組み合わせ（図３Ａ）または個々の制限酵素ＮｃｏＩもしくはＦｓｐＩ（図３Ｂ）を使用して、精製した対照またはＮＧ−３５０ＤＮＡを制限酵素切断した。切断したＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＵＶトランスイルミネーターを使用して、可視化した。ＦｓｐＩまたはＥｃｏＲＶ／ＮｈｅＩを用いた切断は、予測していなかった、ＮＧ−３５０ウイルスゲノム物質における追加のバンドを示した（図３、赤色の矢印）。
【０２７３】
ＰＣＲ解析
表１に示す、８種の異なるプライマープローブセットを使用したウイルスゲノムのＰＣＲ解析により、ゲノム同一性をさらに評価した。
【表２】
2020521496.tif 000004
【０２７４】
１種より多くのゲノム種が、ＮＧ−３５０ウイルスストックに存在するかどうか、この種が、抗ＣＤ４０抗体導入遺伝子カセットを含有したかを決定するために、これらのＰＣＲを設計した。ＮＧ−３５０またはｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス粒子（２×１０１０個のウイルス粒子）を、ＰＢＳにおいて終容積２００μＬまで希釈した。製造元のプロトコールに従い、ＱＩＡｇｅｎ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅウイルススピンキットを使用して、ウイルスからＤＮＡを抽出した。制限酵素解析に関して、対照ＤＮＡを調製した。フォワードおよびリバースプライマー（２μＭ）およびＰｈｕｓｉｏｎ高フィデリティーマスターミックス（ＮＥＢ）を含有する反応容積５０μＬ中ＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）１μＬを使用して、ＰＣＲ反応を設定した。ＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＵＶトランスイルミネーターを使用して、可視化した（図５Ａおよび５Ｂ）。プライマーセットＤを用いた解析により、陽性対照ＤＮＡおよびＮＧ−３５０試験試料における２９２０ｂｐの予想バンドサイズを明らかになった。しかしながら、ＮＧ−３５０試験試料は、ＮＧ−３５０ウイルスを生み出すために使用されたｐＮＧ−３５０−ＰＳＩ−０１プラスミドＤＮＡを用いては見られなかった、約８００ｂｐのＰＣＲ産物を追加で含有した。プライマーセット１〜６を用いた解析はまた、プライマーセット５および６を使用したとき、追加のコンタミしたバンドを示した。これらのデータは、２つのウイルス種が、ＮＧ−３５０ウイルスストックに存在し、１つが、全長抗ＣＤ４０導入遺伝子カセットを含有し、１つが、切断バージョンのカセットを含有することを示した。コンタミしたＰＣＲ産物の配列決定により、この切断を確認した。
【０２７５】
導入遺伝子カセット最適化
ウイルス増幅中に生じる切断についての説明は、導入遺伝子カセットにおける予測できない不安定性であり、これが、ＶＨ領域とＳＶ４０ポリＡの間の組換えをもたらし、それ故、抗体コード領域の大部分の喪失をもたらす。それ故、導入遺伝子カセットＤＮＡ配列は、この問題を克服するために修飾されることを必要とする。それ故、ＤＮＡ配列を変更して、他のカセットおよびウイルス配列との相同性を低減し、少数の直接および逆方向反復を取り除いた（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＵＫが行った）。最適化したカセット配列を使用して、実施例４による新規プラスミドｐＮＧ−３５０Ａを生み出した。
【０２７６】
実施例４：抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（ＮＧ−３５０Ａ）発現ＥｎＡｄウイルスの産生
ＮＧ−３５０Ａゲノムプラスミドを産生するために、プラスミドｐＥｎＡｄ２．４への、５’短いスプライスアクセプター配列（ＣＡＧＧ、配列番号２）；重鎖リーダー配列（配列番号３）、抗ＣＤ４０ＶＨ鎖（配列番号４）、抗体定常重鎖（配列番号５）、Ｐ２Ａ高い効率の自己切断可能なペプチド（配列番号６）、軽鎖リーダー配列（配列番号７）、抗ＣＤ４０ＶＬ鎖（配列番号８）、抗体定常軽鎖（配列番号９）およびＳＶ４０ポリ（Ａ）テール（配列番号１０）をコードするカセットの直接的挿入により、ｐＮＧ−３５０を生成した。抗ＣＤ４０抗体をコードするＮＧ−３５０Ａのアミノ酸配列は、ＮＧ−３５０ウイルスにおいてコードされるものと同一であり、カセット構造は同じであった（図１）。しかしながら、導入遺伝子カセットの核酸配列を修飾し、それは、ＮＧ−３５０のもの（配列番号１１）と有意に異なった。
【０２７７】
ウイルス産生および特徴決定
プラスミドｐＮＧ−３５０Ａを、酵素ＡｓｃＩを用いた制限酵素切断により直線化して、ウイルスゲノムＮＧ−３５０（配列番号１）を産生した。ウイルスＮＧ−３５０Ａを増幅させ、実施例１において記載した方法に従い、精製した。
【０２７８】
実施例５：ＰＣＲによるＮＧ−３５０Ａウイルス同一性試験
導入遺伝子カセットにまたがる産物を生み出す、２種のプライマープローブセット（表２；ＤおよびＫ）を使用したＰＣＲ解析により、ＮＧ−３５０Ａゲノム同一性を確認した。実施例３に詳述した方法に従い、ＮＧ−３５０Ａ  ＤＮＡおよび対照ＤＮＡを調製した。実施例３において詳述した方法に従い、プライマーセットＤおよびＫを使用して、ＰＣＲ解析を行った。ＰＣＲ産物の可視化により、予想したサイズの単一の産物を示した（図６）。いずれのプライマーセットを用いても、コンタミしている産物を検出しなかった。
表２  同一性ＰＣＲプライマーセット
【表３】
2020521496.tif 000005
【０２７９】
実施例６：大腸癌腫細胞におけるＮＧ−３５０Ａウイルスの複製および腫瘍溶解性活性
ウイルス腫瘍溶解能
ＨＴ−２９大腸癌腫細胞を、９６ウェルプレートにおいて２．５ｅ４細胞／ウェルの細胞密度において播種した。プレートを、４時間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションし、その後、細胞に、１個の細胞当たり１００〜０．３９個の粒子（ｐｐｃ）の感染密度範囲で、ＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａウイルス粒子のいずれかを感染させた。感染の７２時間後、細胞タイター９６ＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ：Ｇ３５８１）を使用して、ＨＴ−２９細胞生存率を評価した。それぞれの感染密度における％細胞生存の定量により、ＥｎＡｄに類似の、ＮＧ−３５０Ａが、ＨＴ−２９細胞に対する強力な腫瘍溶解性活性を示すことを示した（図７Ａ）。
【０２８０】
ウイルス複製
肺癌腫細胞（Ａ５４９）または大腸癌腫細胞（ＨＣＴ−１１６）に、１００ｐｐｃのＮＧ−３５０ＡもしくはＮＧ−３５０Ａ親ウイルス、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖを２４、４８、７２または９６時間感染させるか、または感染させないままにした。大腸癌腫細胞（ＨＴ−２９）または膀胱癌腫細胞（ＨＴＢ−５、ＨＴ−１１９７およびＨＴ−１３７６）に、１００ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａもしくはｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖを２４、４８、７２、１４４および１６８時間感染させるか、または感染させないままにした。それぞれの時間ポイントにおいて、細胞上清を収集し、５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離することにより、清透化させた。製造元のプロトコールに従い、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、上清１０μＬ（ＨＴ−２９、Ａ５４９もしくはＨＣＴ−１１６）または５０μＬ（ＨＴＢ−５、ＨＴ−１１９７およびＨＴ−１３７６）からＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５ｅ１０〜２．５ｅ５ウイルス粒子）を使用した標準曲線をまた、調製し、ＤＮｅａｓｙ血液および組織キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖＥ３遺伝子に特異的なプライマーとプローブセットを使用したｑＰＣＲにより、それぞれの抽出した試料または標準を解析した。
【０２８１】
１個の細胞当たりの検出したウイルスゲノムの数の定量により、ウイルス複製のＮＧ−３５０Ａおよびｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ動態が、試験した全ての細胞株において、かつ解析した全ての時間ポイントにおいて比較可能であることを示した（図７および図８）。感染させていない細胞において検出することができたウイルスゲノムはなかった（データは示していない）。
【０２８２】
実施例７：ＮＧ−３５０Ａ感染大腸癌腫細胞株における抗ＣＤ４０抗体発現
ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡ
１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、２つの異なるバッチのＮＧ−３５０Ａ（ＮＧ−３５０Ａ  Ｂ１もしくはＮＧ−３５０Ａ  Ｂ２）を２４、４８または７２時間感染させた、または感染させないままの、Ａ５４９細胞を、ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２ヒトＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ２０２４０２、Ａｂｃａｍ）による抗ＣＤ４０抗体発現の解析のため使用した。培養上清をそれぞれのウェルから取り出し、５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを取り除いた。清透化した上清を、ＰＢＳ１０％ＢＳＡに２分の１希釈した。標準曲線および陰性対照試料を、製造元のプロトコールに従い調製した。試料および標準をＥＬＩＳＡプレートに加え、製造元のプロトコールに従い、アッセイを行った。プレートのそれぞれのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して測定し、分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を、標準曲線の記入形態により、決定した（図９Ａおよび９Ｂ）。
【０２８３】
ＣＤ４０結合ＥＬＩＳＡ
１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、２つの異なるバッチのＮＧ−３５０Ａ（ＮＧ−３５０Ａ  Ｂ１もしくはＮＧ−３５０Ａ  Ｂ２）を２４、４８または７２時間感染させた、または感染させないままの、Ａ５４９細胞を、ＣＤ４０結合ＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ４０抗体発現の解析のため使用した。
【０２８４】
培養上清をそれぞれのウェルから取り出し、５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを取り除いた。炭酸／炭酸水素緩衝液中のヒトＣＤ４０（１００μｇ／ｍＬ、Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１４９３−ＣＤ）を用いて一晩、４℃においてコーティングすることにより、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルマイクロプレート）を調製した。全ての続く結合工程の間で、ＰＢＳ０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて、プレートを洗浄した。プレートを、１時間、室温において、ＰＢＳ５％ＢＳＡを用いてブロッキングした。
【０２８５】
清透化した感染上清を、ＰＢＳ５％ＢＳＡにおいて希釈した（２分の１、１０分の１および１００分の１）。このアッセイにおいて、抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、３３４３０８）を、ＥＬＩＳＡプレートへのヒトＣＤ４０結合についての陽性対照として使用した。それを、ＰＢＳ５％ＢＳＡ中、濃度３０ｎｇ／ｍＬで調製した。全ての試料を、ＣＤ４０でコーティングしたプレートに加え、１時間、室温でインキュベーションした。次に、ウイルス上清について、検出抗体ＨＲＰ結合抗ヒトＩｇＧ２−Ｆｃ（Ａｂｃａｍ、ａｂ９７２２５）または陽性対照抗体のため抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ、ａｂ６７２８）を、１時間、室温にて全てのウェルに適用した。ＨＲＰ基質溶液３．３．５．５’−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＭＢ、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、ＨＲＰ検出を行った。反応を停止するため、１Ｍ  ＨＣｌを使用し、発生した色を、プレートリーダー上４５０ｎｍにおいて測定した。４５０ｎｍにおける吸光度を、ＥｎＡｄ、ＮＧ−３５０Ａおよび陽性対照についてプロットし（図９Ｃ）、ＮＧ−３５０Ａ感染細胞の上清に存在する分泌された抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０への特異的結合を示した。
【０２８６】
実施例８：ＣＤ４０機能的シグナル伝達レポーターアッセイ
１０ｐｐｃのＥｎＡｄ、ＮＧ−３５０Ａを用いて２４もしくは４８時間またはＮＧ−１６５（対照抗体［抗ＶＥＧＦ］を発現するウイルス）を用いて４８時間のいずれかで感染させた、あるいは感染させていないままのＡ５４９細胞を、それらの膜で発現したＣＤ４０分子を介した活性化に対して応答してアルカリホスファターゼ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を分泌するＣＤ４０＋ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞を使用した、抗ＣＤ４０抗体機能活性の解析のため使用した。感染後、Ａ５４９細胞由来の培養上清をそれぞれのウェルから取り出し、５分間、１５００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを取り除いた。
【０２８７】
培養上清２０μＬを、培地１８０μＬにおいて希釈し、Ｈｅｋ−ＢｌｕｅＣＤ４０細胞に２０時間適用した。濃度１０ｎｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌを、培地において陽性対照として調製した。次に、上清をＨＥＫ−ＢｌｕｅＣＤ４０細胞から収集し、遠心分離することにより、清透化した。１時間、３７℃にてＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ試薬１６０μＬとインキュベーションすることにより、清透化した上清４０μＬを、アルカリホスファターゼ活性についてアッセイした。
【０２８８】
プレートリーダーを使用して、それぞれの試料について、６２０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＥｎＡｄまたはＮＧ−１６５感染細胞ではなく、ＮＧ−３５０Ａ由来の上清が、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅレポーター細胞を発現するＣＤ４０からのＳＥＡＰ産生の引き金を引くことを示した（図１０）。
【０２８９】
実施例９：癌腫細胞株におけるＮＧ−３５０Ａウイルスの選択的活性
ＥｎＡｄウイルス活性に半寛容である、肺癌腫細胞（Ａ５４９）、大腸癌腫細胞（ＨＣＴ−１１６）または肺線維芽細胞細胞（ＭＲＣ−５）を使用して、癌細胞についてのＮＧ−３５０Ａウイルスの選択性を示した。細胞株に７２時間、１００ｐｐｃのＮＧ−３５０ＡもしくはＮＧ−３５０Ａ親ウイルス、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖを感染させるか、または感染させないままにした。
【０２９０】
それぞれの時間ポイントにおいて、培養上清をそれぞれのウェルから取り出し、ｑＰＣＲによるウイルスゲノム複製、またはＥＬＩＳＡによる抗ＣＤ４０抗体発現の解析のため使用した。ＲＴ−ｑＰＣＲにより、ウイルス遺伝子Ｅ３および導入遺伝子の発現について、ウェルに残る細胞を解析した。
【０２９１】
ウイルス複製
細胞上清を収集し、５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離することにより、清透化させた。製造元のプロトコールに従い、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｅｌｕｔｅ  ＤＮＡ抽出キットを使用して、上清１０μＬ（Ａ５４９、ＨＣＴ−１１６）または１００μＬ（ＭＲＣ−５）からＤＮＡを抽出した。ＥｎＡｄウイルス粒子（２．５ｅ１０〜２．５ｅ５ウイルス粒子）を使用した標準曲線をまた、調製し、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｅｌｕｔｅキットを使用して抽出した。ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖＥ３遺伝子に特異的なプライマーとプローブセットを使用したｑＰＣＲにより、それぞれの抽出した試料または標準を解析した。
【０２９２】
１個の細胞当たりの検出したウイルスゲノムの数の定量により、ＮＧ−３５０Ａおよびｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖウイルス複製が、Ａ５４９およびＨＣＴ−１１６細胞において比較可能なレベルで検出可能であったが、ＭＲＣ−５における発現が、癌腫細胞株におけるものより有意に低いことを示した（図１１Ａ）。感染させていない細胞において検出することができたウイルスゲノムはなかった（データは示していない）。
【０２９３】
ＩｇＧ２抗体発現
ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡ（ＩｇＧ２ヒトＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ２０２４０２、Ａｂｃａｍ）により、細胞上清にあった抗体発現を評価した。培養上清をそれぞれのウェルから取り出し、５分間、１２００ｒｐｍで遠心分離して、細胞デブリを取り除いた。清透化した上清を、ＰＢＳ１０％ＢＳＡに２分の１希釈した。標準曲線および陰性対照試料を、製造元のプロトコールに従い調製した。試料および標準をＥＬＩＳＡプレートに加え、製造元のプロトコールに従い、アッセイを行った。プレートのそれぞれのウェルにおける４５０ｎｍでの吸光度を、プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して測定し、分泌されたＩｇＧ２抗ＣＤ４０抗体の濃度を、標準曲線の記入形態により、決定した（図１１Ｂ）。
【０２９４】
実施例１０：ＮＧ−３５０Ａ感染細胞からの抗ＣＤ４０抗体の精製
懸濁液ＨＥＫ２９３細胞を、１×１０６個の細胞／ｍＬにてエルレンマイヤーフラスコにおいて播種し、１００ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａを感染させた。７２時間後、５％ＦＢＳおよびタンパク質分解酵素阻害剤カクテル（１：２０００）を細胞に加え、懸濁液を１５分間、４６００ｒｐｍで遠心分離した。上清を注意深く取り出し、５００ｋＤａの分子量カットオフ中空ファイバー膜を通して濾過して、ＮＧ−３５０Ａウイルス粒子を抗ＣＤ４０抗体から分けた。抗ＣＤ４０抗体を含有する、濾過工程由来の素通り画分を、３０ｋＤａの分子量カットオフを有する第２の中空ファイバー膜を通過させた。ＡＫＴＡを使用したタンパク質Ａカラム上での第２の濾過工程由来の残余分から、抗ＣＤ４０抗体を精製した。精製した抗体を濾過滅菌し、−８０℃において保存した。製造元のプロトコールに従い、ＩｇＧ２ヒトＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ２０２４０２、Ａｂｃａｍを使用したＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡにより、精製した抗体の濃度を決定した（図１２）。
【０２９５】
実施例１１：初代ヒト単球由来ＤＣにおけるＮＧ−３５０Ａ由来抗ＣＤ４０抗体活性およびウイルス活性との相乗効果
英国、オクスフォードにあるＮＨＳの血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球コーンから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。ＣＤ１４マイクロビーズキット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４＋単球を単離した。次に、単球をカウントし、遠心分離し（３００×ｇ）、ＧＭ−ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ−４（５００Ｕ／ｍＬ）を添加した１０％ＲＰＭＩ培地中５×１０５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。単球懸濁液４０ｍＬを、１つのＴ１７５フラスコに移した。
【０２９６】
７２時間培養後、単球由来のＤＣ（ｍｏＤＣ）を、１０％ＲＰＭＩ培地中２４ウェルプレートにおけるウェル毎に１×１０６個の細胞密度で播種した。それらを、０．５μｇ／ｍＬ抗ＣＤ４０抗体（実施例１０に従い、ウイルス感染細胞から精製した）、ＥｎＡｄ（１００ｐｐｃ）、ヒトＣＤ４０Ｌを用いて処理するか、または無処理のままにした。並行して、ｍｏＤＣを、精製した抗ＣＤ４０抗体（０．５μｇ／ｍＬ）とＥｎＡｄ（１００ｐｐｃ）の両方で処理した。次に、プレートを、４８時間インキュベーションし、その後、上清および細胞を回収した。
【０２９７】
上清および細胞を培養ウェルから取り出し、遠心分離した（３００×ｇ）。上清を、ＰＢＳ５％ＢＳＡを用いて２分の１希釈し、ＥＬＩＳＡ解析のため保存した。細胞ペレットをＰＢＳ２００μＬにおいて洗浄し、遠心分離し、次に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈ）を含有するＰＢＳ５０μＬにおいて１５分間、ＲＴにおいて再懸濁した。細胞をＦＡＣ緩衝液（１％ＦＢＳ／ＰＢＳ）において１回洗浄し、その後、直接結合抗体：ＢＶ４２１に結合した抗ＣＤ８６；ＡＦ６４７に結合した抗ＣＤ５４およびＰｅＣｙ５に結合した抗ＨＬＡ−ＤＲのパネルを用いて染色した。それぞれの共培養条件由来の細胞試料を、関連するアイソタイプ対照抗体を用いて染色した。全ての染色を、ＦＡＣｓ緩衝液中トータルの容積５０μＬ／ウェルにおいて、１５分間、４℃にて行った。次に、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（２００μＬ）を用いて２回洗浄し、その後、ＦＡＣｓ緩衝液２００μＬにおいて再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）により、解析した。
【０２９８】
上清試料を融解し、製造元のプロトコールに従い、希釈し、アッセイを行うことによるＥＬＩＳＡ（ＩＬ−１２  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ、ＤＰ４００、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により解析した。
【０２９９】
ウイルス感染細胞から精製した抗ＣＤ４０抗体を用いた処理は、ＣＤ８６、ＣＤ５４およびＨＬＡ−ＤＲ活性化マーカーを発現するｍｏＤＣのパーセンテージにおける増大、ならびにＩＬ１２ｐ４０の分泌を導いた（図１３および図１４）。有意には、抗ＣＤ４０抗体とＥｎＡｄウイルスの両方を用いたｍｏＤＣの組み合わせ処置が、抗ＣＤ４０抗体またはＥｎＡｄウイルス単独と比較して、より強力なｍｏＤＣ活性化を生じた。
【０３００】
実施例１２：初代ヒトＢ細胞におけるＮＧ−３５０Ａ由来抗ＣＤ４０抗体活性およびウイルス活性との相乗効果
英国、オクスフォードにあるＮＨＳの血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球から、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。Ｐａｎ  Ｂ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１９＋Ｂ細胞を単離した。次に、Ｂ細胞を、１０％ＲＰＭＩ培地中２４ウェルプレートにおけるウェル毎に１×１０６個の細胞密度で播種した。それらを、増大する濃度の精製した抗ＣＤ４０導入遺伝子抗体、ヒトＣＤ４０Ｌで処理するか、または処理しないままにした。次に、プレートを、４８時間インキュベーションし、その後、上清および細胞を回収した。
【０３０１】
上清および細胞を培養ウェルから取り出し、遠心分離した（３００×ｇ）。上清を、注意深く取り出し、ＰＢＳ５％ＢＳＡを用いて２分の１希釈し、ＥＬＩＳＡ解析のため保存した。細胞ペレットをＰＢＳ２００μＬにおいて洗浄し、遠心分離し、次に、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈ）を含有するＰＢＳ５０μＬにおいて１５分間、ＲＴにおいて再懸濁した。細胞をＦＡＣ緩衝液において１回洗浄し、その後、直接結合抗体：ＢＶ４２１に結合した抗ＣＤ８６；ＡＦ６４７に結合した抗ＣＤ５４；ＰｅＣｙ５に結合した抗ＨＬＡ−ＤＲおよびＢＶ６０５に結合した抗ＣＤ８０のパネルを用いて染色した。それぞれの共培養条件由来の細胞試料を、関連するアイソタイプ対照抗体を用いて染色した。全ての染色を、ＦＡＣｓ緩衝液中トータルの容積５０μＬ／ウェルにおいて、１５分間、４℃にて行った。次に、細胞をＦＡＣｓ緩衝液（２００μＬ）を用いて２回洗浄し、その後、ＦＡＣｓ緩衝液２００μＬにおいて再懸濁し、フローサイトメトリー（Ａｔｔｕｎｅ）により、解析した。
【０３０２】
試験した全ての濃度の抗ＣＤ４０抗体を用いたＢ細胞の処理は、未処理またはアイソタイプ対照処理Ｂ細胞と比較して、ＣＤ８６、ＣＤ１９およびＣＤ８０を発現するＢ細胞のパーセンテージにおける増大、ならびにＣＤ１９＋細胞上でのＨＬＡ−ＤＲ  ＭＦＩにおける増大を生じた（図１５）。抗ＣＤ４０抗体を用いた処理はまた、増殖している細胞のパーセンテージに関するＢ細胞の活性化を生じた（図１６）。有意には、抗ＣＤ４０抗体およびＥｎＡｄウイルスを用いたＢ細胞の併用処置は、抗体またはウイルス処置単独と比較して、増殖しているＢ細胞の％における増強を生じた（図１６）。
【０３０３】
実施例１３：初代ヒト単球由来ＤＣ上のＮＧ−３５０Ａ由来抗ＣＤ４０抗体活性
Ａ５４９腫瘍細胞を、Ｔ１７５フラスコまたはＨｙｐｅｒｆｌａｓｋにおいて、それぞれ、１個のフラスコ当たり１０×１０６または５０×１０６個の細胞の密度にて播種した。４時間後、細胞に、１個の細胞当たり１０個のＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａウイルス粒子を感染させた。７２時間後、上清を回収し、３００ｋＤａのカットオフ除外カラムを使用して、ウイルスを枯渇させた。５０ｋＤａのカットオフサイズ除外カラムを使用して、ウイルスを枯渇させた上清を、抗体について続いて濃縮した。これらのウイルスを枯渇させた抗体濃縮分画を、−８０℃において保存した。ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡを使用して、抗ＣＤ４０抗体タイターを決定し、実施例８において記載したＨＥＫ  Ｂｌｕｅレポーター細胞アッセイを使用して、機能性を確認した。
【０３０４】
さらなるセットの研究について実施例１１において概説した通り、単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）を本質的に調製した。英国、オクスフォードにあるＮＨＳの血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球コーンから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣ（ドナー１７７）を単離した。ＣＤ１４マイクロビーズキット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４＋単球を単離した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４との７２時間培養後、１０％ＲＰＭＩ培地中４８ウェルプレートにおける１個のウェル当たり１．２５×１０５個の細胞、または２４ウェルプレートにおける１個のウェル当たり２．５×１０５個の細胞の密度にてＭｏＤＣを播種し、上の段落において記載したウイルス枯渇ＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄ培養上清とインキュベーションした。フローサイトメトリー解析のため、細胞を染色した。サイトカインビーズアレイ（Ｌｅｇｅｎｄｐｌｅｘ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）によるサイトカイン解析のため、上清を使用した。
【０３０５】
ＭｏＤＣの表面上でのＣＤ４０への抗ＣＤ４０抗体結合を示すために、細胞を、ＮＧ−３５０Ａ感染細胞（異なる希釈液を使用して、異なる量の抗体をもたらした）由来の増大する濃度のウイルス枯渇抗ＣＤ４０抗体濃縮上清を用いて、細胞を処理するか、または未処理（培地）のままにした。対照として、それらを、ウイルス枯渇ＥｎＡｄ上清（ｄＥｎＡｄ）を用いて、容積の一致している、ＮＧ−３５０Ａ抗ＣＤ４０抗体を含有する試料のものを用いて処理した。２４時間および４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ４０への蛍光標識抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。図１７Ａは、１０００ｎｇ／ｍＬ抗体を用いた処置の２４時間後に得られた代表的なフローサイトメトリー結果を示し、図１７Ｂは、異なる濃度のウイルス枯渇上清を用いた処理の２４時間および４８時間後のＭｏＤＣ上でのＣＤ４０発現を示す。より高い抗体濃度において、ＣＤ４０ＦＡＣＳ染色は低減するか、または存在せず、これは、ＮＧ−３５０Ａウイルス枯渇培養上清における抗ＣＤ４０抗体の結合による遮断を反映している。
【０３０６】
次に、ＭｏＤＣ上での細胞表面マーカーアップレギュレーションに対する抗ＣＤ４０ＴｇＡｂ処理（ウイルス枯渇上清を使用した）の効果を評価した。ＭｏＤＣを、増大する濃度の精製した抗ＣＤ４０Ｔｇ抗体を用いて処理したか、または未処理（培地）のままにした。それらを、ウイルス枯渇ＥｎＡｄ上清（ｄＥｎＡｄ）を用いて、容積の一致している抗ＣＤ４０抗体のものを用いて処理した。２４時間および４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ５４、ＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカーに対する抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。ドナー１７７由来のＰＢＭＣを用いて調製したＭｏＤＣについて、１０００ｎｇ／ｍＬ抗体を用いた処理の２４時間後に得た代表的なフローサイトメトリー結果を、図１８Ａにおいて示す。図１８Ｂは、処理の２４時間および４８時間後の４人の異なるドナー由来のＭｏＤＣ上での活性化マーカー発現を示す。
【０３０７】
次に、ＭｏＤＣサイトカイン産生に対する抗ＣＤ４０Ｔｇ抗体の効果を評価した。４人の異なるドナー由来のＭｏＤＣを、増大する濃度の抗ＣＤ４０抗体含有ウイルス枯渇上清を用いて処理するか、または処理しない（培地）ままにした。それらを、ウイルス枯渇ＥｎＡｄ上清（ｄＥｎＡｄ）を用いて、容積の一致している抗ＣＤ４０抗体のものを用いて処理した。２４時間および４８時間後、上清を回収し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ビーズベースのイムノアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、炎症性サイトカイン分泌について解析した。図１９は、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＩＬ−８の選択的誘導を示す。
【０３０８】
実施例１４：初代ヒト単球由来ＤＣの活性に対するＮＧ−３５０Ａウイルスおよび由来抗ＣＤ４０抗体含有ウイルス腫瘍細胞上清の活性
実施例１３において記載したものと類似の研究において、Ａ５４９細胞を、Ｔ２５フラスコにおいて密度４×１０６個の細胞において播種した。４時間後、細胞に、１個の細胞当たり１０個のＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａウイルス粒子を感染させた。７２時間後、上清を回収し、１６００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。この研究において、これらの清透化した上清を、ウイルスを除去するよりむしろ、使用（１時間以内）まで３７℃において維持した。従って、上清は、ウイルスと抗ＣＤ４０抗体導入遺伝子産物の両方を含む、ＮＧ−３５０Ａ（またはＥｎＡｄ対照）感染腫瘍細胞の産物を含有する。
【０３０９】
英国、オクスフォードにあるＮＨＳの血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球コーンから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。ＣＤ１４マイクロビーズキット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４＋単球を単離した。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４との７２時間の培養後、ＭｏＤＣを、４８ウェルプレートにおける１個のウェル当たり１．２５×１０５個の細胞の密度にて播種し、異なる希釈のＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａウイルス上清を用いて処理した。次に、プレートを、２４時間および４８時間インキュベーションし、その後、上清および細胞を回収した。上清を遠心分離し、細胞ペレットを取り除き、−８０℃において保存した。フローサイトメトリー解析のため、細胞を染色した。ＣＢＡによるサイトカイン解析のため、上清を使用した。
【０３１０】
ＭｏＤＣの表面上でのＣＤ４０への抗ＣＤ４０抗体結合を示すために、細胞を、ＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄ感染細胞（異なる希釈液を使用して、異なる量の抗体をもたらした）由来の増大する濃度の上清を用いて、細胞を処理するか、または未処理（培地）のままにした。２４時間および４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ４０への蛍光標識抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。図２０は、異なる濃度の上清を用いた処理の２４時間および４８時間後のＭｏＤＣ上でのＣＤ４０発現を示す。ＮＧ−３５０Ａ（だが、ＥｎＡｄでない）感染腫瘍細胞由来の１：２上清希釈液において、ＣＤ４０ＦＡＣＳ染色は低減するか、または存在せず、これは、ＮＧ−３５０Ａウイルス処理培養上清における抗ＣＤ４０抗体の結合による遮断を反映している。
【０３１１】
次に、２人のドナー（１７７および１７９）由来のＭｏＤＣ上での細胞表面マーカーアップレギュレーションに対するＮＧ−３５０Ａウイルス処理腫瘍細胞上清の効果を評価した。ＭｏＤＣを、希釈したＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａウイルス上清を用いて処理するか、または未処理（培地）のままにした。２４時間および４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ８６、ＣＤ５４およびＣＤ８３に対する抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。図２１における結果は、ＮＧ−３５０Ａにより選択的にアップレギュレーションした全３種のＭｏＤＣ活性化マーカーを示す。
【０３１２】
次に、ＭｏＤＣサイトカイン産生に対するＮＧ−３５０Ａウイルス上清の効果を評価した。２人のドナー（１７７および１７９）由来のＭｏＤＣを、希釈したＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａウイルス処理腫瘍細胞上清を用いて処理するか、または未処理（培地）のままにした。２４時間および４８時間後、上清を回収し、ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘ（商標）ビーズベースのイムノアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用して、炎症性サイトカイン分泌について解析した。図２２における結果は、ＮＧ−３５０Ａ処理細胞上清によるＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−２８およびＩＬ−２９の選択的アップレギュレーションを示す。
【０３１３】
実施例１５：初代ヒトＢ細胞上のＮＧ−３５０Ａ由来抗ＣＤ４０抗体活性
英国、オクスフォードにあるＮＨＳ血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球コーンから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。Ｐａｎ  Ｂ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｂ細胞を単離した。次に、細胞を、１０％ＲＰＭＩ培地中４８ウェルプレートにおける１個のウェル当たり１．２５×１０５個の細胞密度で播種した。それらを、実施例１３において記載したＮＧ−３５０Ａ感染細胞由来の異なる濃度のウイルス枯渇抗ＣＤ４０抗体濃縮上清を用いて処理するか、または未処理（培地）のままにした。Ｂ細胞をまた、対照としてウイルス枯渇ＥｎＡｄウイルス上清を用いて処理した。次に、プレートを、２４時間および４８時間インキュベーションし、その後、細胞を回収した。細胞を、ＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。図２３は、ウイルス枯渇ＮＧ−３５０Ａ抗ＣＤ４０抗体含有上清による、３人の異なるドナー（１７７、１７８、１７９）由来のＢ細胞上での全４種の表面マーカー（ＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ）の選択的アップレギュレーションを示す。
【０３１４】
実施例１６：初代ヒトＢ細胞の活性に対するＮＧ−３５０Ａウイルスおよび由来抗ＣＤ４０抗体含有ウイルス腫瘍細胞上清の活性
英国、オクスフォードにあるＮＨＳ血液および移植ユニットから供給源されたＮＣ２４白血球コーンから、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配遠心分離により、ＰＢＭＣを単離した。Ｐａｎ  Ｂ細胞単離キット（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を使用して、Ｂ細胞を単離した。細胞を、４８ウェルプレートにおける１個のウェル当たり１．２５×１０５個の細胞の密度にて播種し、ＥｎＡｄおよび実施例１４において記載した同じＮＧ−３５０Ａウイルス上清の試料の異なる希釈液を用いて処理した。次に、プレートを２４時間および４８時間インキュベーションし、その後、細胞を回収し、ＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を用いて染色し、その後、フローサイトメトリー解析を行った。細胞に、単一（ＦＳＣ−Ｈ  ｖｅｒｓｕｓ  ＦＳＣ−Ａ）生細胞（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）上にゲートを掛けた。図２４は、ウイルスおよびＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞由来の抗ＣＤ４０抗体含有上清による、３人の異なるドナー（１７７、１７８、１７９）由来のＢ細胞上での全４種のマーカー（ＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ）の選択的アップレギュレーションを示す。
【０３１５】
実施例１７：
別の研究において、ＮＧ−３５０Ａの活性を、６種の癌指標に渡る広範な異なる腫瘍細胞株（結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、卵巣および膀胱）に対して評価した。細胞に、１個の細胞当たり１または１００個の粒子（ｐｐｃ）のｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）またはＮＧ−３５０Ａを感染させ、３〜１１日間培養し、これにより、ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞におけるウイルスゲノム複製、ウイルス介在性腫瘍退縮、ウイルス導入遺伝子発現（ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにおける）ならびに機能的ウイルス導入遺伝子発現を評価した。全ての実験において、ＮＧ−３５０Ａの活性を、ＥｎＡｄのものと比較した。Ａ５４９（非小細胞肺癌腫）細胞を陽性対照として、ＣＴ２６（マウス大腸腫瘍）細胞を陰性対照として使用した。
【０３１６】
ウイルスゲノム複製
腫瘍細胞株を、１７５ｃｍ２のフラスコにおいて、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムおよび１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を添加した高グルコース（成長培地）において培養した。使用前、細胞を顕微鏡を使用して検査して、６０〜８０％の集密度を確実にした。次に、ＰＢＳおよび０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを加えて、細胞を洗浄して、細胞をフラスコの底からはがした。細胞がはがれるまで、細胞を２〜１０分間、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションし、その後、トリプシンを成長培地を使用して脱活性化した。細胞懸濁液を混合し、３００ｇにて５分間スピンした。上清を捨て、細胞ペレットを、アッセイ培地；２％（１０％の代わりに）ＦＢＳを添加した上記のＤＭＥＭ培地１０ｍＬに再懸濁した。細胞をカウントして、細胞懸濁液を、アッセイ培地を使用して希釈して、濃度５×１０５個の細胞／ｍＬにし、その１００μＬを、平底９６ウェルプレートに播種した（それぞれの細胞株を、１種のウイルス当たり２つのウェルに播種し、時間ポイント毎に１枚のプレートを用いて、１枚のプレート当たり未感染の対照（ＵＩＣ）２つのウェルを含めた）。ＥｎＡｄおよびＵＩＣについての試料を、一方のセットのプレートに播種し（感染させ）、ＮＧ−３５０ＡおよびＵＩＣについての試料を、別のセットのプレートに播種した（感染させた）。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２においてインキュベーションし、その後、細胞播種の４〜６時間後に接種した。
【０３１７】
この時間の後、ＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａウイルスを、アッセイ培地において希釈して、濃度５×１０５個のウイルス粒子／ｍＬにし、その１００μＬを、細胞のそれぞれの関連するウェルに加えた（それぞれのウイルスを、それぞれのプレート上のそれぞれの細胞株にデュプリケートで加えた）。これは、１ｐｐｃのＥｎＡｄまたは１ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａの接種液を生じた。ウイルスの添加の代わりに、アッセイ培地１００μＬをまた、それぞれのプレート上のそれぞれの細胞株（ＵＩＣ）のデュプリケートのウェルに加えた。
【０３１８】
接種の２０時間後、培地を細胞から取り出し、新鮮アッセイ培地２００μＬと置き換えた。次に、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２において、接種後３、４、８または１１日間インキュベーションした。８日以上、細胞をインキュベーションすべきであるなら、接種後４日間、アッセイ培地５０μＬを細胞に与えた。
【０３１９】
ＤＮＡ回収：接種後、培地を細胞から取り出し、９６ウェルＶ底プレートにおいて遠心分離した。次に、上清を新鮮９６ウェル平底プレートに移し、−８０℃において保存した。次に、１×レポーター溶解バッファー（ＲＬＢ）２００μＬを、元のプレートの細胞に加え、−８０℃において保存した。
【０３２０】
標準曲線の調整：ストックＥｎＡｄを、１．２５×１０１１〜１．２５×１０６個のウイルス粒子／ｍＬに希釈し、その後、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ９６キットを用いて、ＤＮＡ抽出した（それぞれの標準曲線試料２００μＬを抽出し、精製したＤＮＡを、容積２００μＬに溶出した）。次に、精製したＤＮＡをアリコートに分け、それぞれのｑＰＣＲプレート上での使用まで−２０℃において保存した。これらの標準曲線試料２μＬを、１つのｑＰＣＲウェル毎に２．５×１０３〜２．５×１０８のゲノムと等しい、それぞれのｑＰＣＲ反応において使用した。
【０３２１】
ＤＮＡ抽出：上清および溶解試験試料を融解し、その後、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ９６キットを使用して、ＤＮＡを抽出した（試験試料５０μＬを抽出し、精製したＤＮＡを、容積２００μＬに溶出した）。１×ＲＬＢの抽出対照を、それぞれのプレート上で抽出した。
【０３２２】
実施例６において概説したＥ３プライマーとプローブのセットを使用した細胞溶解物および上清（Ｓ／Ｎ）のｑＰＣＲにより、ウイルスゲノム複製を評価した。１０種の試験腫瘍細胞株、および陽性（Ａ５４９）細胞由来の細胞溶解物と上清試料の両方についての時間経過を、図２５Ａ〜Ｆにおける腫瘍タイプ（大腸、ＨＴ−２９およびＨＣＴ−１１６；前立腺ＤＵ１４５；膵臓ＢｘＰＣ−３；乳房ＭＢＡ−ＭＢ−４５３；卵巣ＰＡ−１およびＣａｏｖ−３；膀胱ＲＴ２４、Ｔ２４  および  ＵＭ−ＵＣ−３）に従いプロットした。陰性対照細胞（マウスＣＴ２６）は陰性であり、プロットしなかった。ＥｎＡｄ感染細胞において検出したウイルスゲノムを、点線を用いて示し、ＮＧ−３５０Ａ感染細胞において検出したウイルスゲノムを、実線を用いて示す。データは、ＮＧ−３５０Ａが、広範囲の異なる癌腫細胞タイプに渡り、ＥｎＡｄ親ウイルスと比較可能に、そのゲノムＤＮＡを複製することを示す。
【０３２３】
ＮＧ−３５０Ａの腫瘍溶解性効果を評価するために、４種の腫瘍細胞株に１００ｐｐｃのＥｎＡｄ、１００ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａ、アッセイ培地単独（未感染対照）または４％ｔｗｅｅｎ（溶解）を接種した。ウイルスを接種した細胞の５０％を超える溶解が生じるまで、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞分析器（ＲＴＣＡ）により、細胞の成長および生存率をモニターした。全ての時間ポイントに渡る細胞指数（ＣＩ）を、ｘＩＭＴソフトウエアにより計算し、未感染、ＥｎＡｄ、ＮＧ−３５０Ａおよび溶解したトリプリケートの平均およびＳＤを決定した；平均をグラフにプロットし、ＳＤをエラーバーにより表した。未感染対照、ＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａを接種した細胞、および溶解した細胞についてのｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅトレースを、図２６において示す。細胞を０時間において播種し、播種の２４時間後（それぞれのグラフにより示す時間ポイントにおいて）に感染させた。腫瘍細胞株を、グラフ毎に１つの細胞株として示す：大腸（ＨＴ−２９およびＨＣＴ−１１６）、前立腺（ＢｘＰＣ−３）ならびに乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−４５３）。ＮＧ−３５０Ａは、ＥｎＡｄ親ウイルスに対して比較可能な腫瘍溶解性活性を示した。
【０３２４】
抗ＣＤ４０導入遺伝子ｍＲＮＡ発現をまた、ＮＧ−３５０Ａを感染させた腫瘍細胞株から異なる時間に採取した溶解物において評価した。この研究のゲノム複製部分について使用したのと同じ１０種の試験腫瘍細胞株、ならびに陽性（Ａ５４９）および陰性（ＣＴ２６）対照細胞株に、１ｐｐｃのＥｎＡｄ、１ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａまたはアッセイ培地単独（未感染の対照）を感染させた。接種後の異なる時間（３、４、８および１１日目）において、細胞溶解物を回収し、その後、ＲＮＡ抽出およびＤＮａｓｅ精製を行った。次に、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲを、抗ＣＤ４０特異的プライマー／プローブセットを使用して実行した。抗ＣＤ４０のセンス鎖に対応する合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用して、試験試料のＲＮＡ量を計算した標準曲線を生成した。それぞれの未感染対照トリプリケートについての平均ＲＮＡ量は、対応する個々のＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａ値から引いたバックグラウンドであった。次に、１個の細胞当たりの抗ＣＤ４０ｍＲＮＡコピーを計算し、２つのＥｎＡｄおよび２つのＮＧ−３５０Ａ  ＲＴ−ｑＰＣＲトリプリケートの平均を決定した。次に、これらのデュプリケートの平均およびＳＤを、それぞれの細胞株について、それぞれの時間ポイントにおいて計算した（ｎ＝２、ｎ＝１である、ＢｘＰＣ−３の８日目の試料を除く）。平均をプロットし、グラフを、図２７において示し、ＳＤをエラーバーにより表した。ＥｎＡｄ接種細胞は、無視できる応答を生じ、これにより、生物学的デュプリケートから計算した１個の細胞当たりのゲノムは、全ての時間ポイントおよび細胞株に渡り０×１００〜６．２６×１００の範囲であった。従って、ＥｎＡｄデータをプロットしなかった。未感染の対照試料について、生物学的デュプリケートから計算した１個の細胞当たりの平均抗ＣＤ４０コピーは、０．００×１００〜９．０９×１００の範囲であった。グラフは、大腸（Ａ）、前立腺、膵臓および乳房（Ｂ）、卵巣（Ｃ）ならびに膀胱（Ｄ）腫瘍細胞株における抗ＣＤ４０導入遺伝子発現を描く。ＮＧ−３５０Ａ感染は、全てのヒト腫瘍細胞株において抗ＣＤ４０導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を導き、異なる細胞について観察した動態における相違を伴った。
【０３２５】
導入遺伝子タンパク質ＩｇＧ２発現を評価するために、ＮＧ−３５０Ａを感染させた異なる腫瘍細胞株による、ヒトＩｇＧ２（ＮＧ−３５０Ａによりコードされる抗ＣＤ４０抗体重鎖のアイソタイプ）の産生を測定した。６種の試験腫瘍細胞株、ならびに陽性（Ａ５４９）および陰性（ＣＴ２６）対照細胞株に、１ｐｐｃのＮＧ−３５０Ａ、１ｐｐｃのＥｎＡｄまたはアッセイ培地単独（未感染の対照）を感染させた。接種後の異なる時間（３、４、８および１１日目）において、上清を回収し、使用まで−８０℃において保存した。ＮＧ−３５０Ａ接種試験細胞株およびＡ５４９細胞由来の上清を、１：２、１：５、１：１０、１：２０、１：４０および１：８０希釈した。全ての未感染の対照試料、ＥｎＡｄ感染細胞、およびＮＧ−３５０Ａ感染ＣＴ２６細胞由来の上清を、１：２希釈のみした。次に、製造元のプロトコールに従い、ヒトＩｇＧ２インビトロＳｉｍｐｌｅＳｔｅｐ  ＥＬＩＳＡ（Ａｂｃａｍ）を行った。ヒトＩｇＧ２精製タンパク質（ＥＬＩＳＡキットにより供給される）を使用して、標準曲線を生成し、試料中のＩｇＧ２タンパク質の濃度を決定した（ｎｇ／ｍＬ）。次に、１×１０６個の細胞当たりのＩｇＧ２タンパク質の量（ｎｇ／１×１０６個の細胞）を計算した。平均およびＳＤを、標準曲線内にあるＥＬＩＳＡデュプリケートの平均から決定した。平均をプロットし、グラフを、図２８において示し、ＳＤをエラーバーにより表した。未感染対照試料を使用したバックグラウンド減算を、それぞれの細胞株および時間ポイントに関して行い、これらの試料は、応答しなかった（０×１００ｎｇ／１×１０６個の細胞）。ＥｎＡｄ接種細胞も応答せず、故に、ＥｎＡｄデータをプロットしなかった。ＮＧ−３５０Ａを感染させた全ての細胞株を用いて、ＩｇＧ２抗体産生を検出した。
【０３２６】
実施例８において記載したＨＥＫ−ＢｌｕｅＣＤ４０シグナル伝達レポーターアッセイを使用して、ＮＧ−３５０Ａを感染させた異なる腫瘍細胞株により産生された抗体の機能性を試験した。６種の試験腫瘍細胞株、ならびに陽性（Ａ５４９）および陰性（ＣＴ２６）対照細胞株に、１ｐｐｃのＥｎＡｄ、１ｐｐｃのNG-348またはアッセイ培地単独（ＵＩＣ）を感染させた。接種の８または１１日後に、上清を回収した。次に、上清を、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞と２０〜２４時間インキュベーションした。次に、上清を処理したＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞から取り出し、Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅに加え、１時間インキュベーションし、その後、６２０ｎｍの吸光度を読み取るよう設定したＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘ上で光学密度（ＯＤ）を読み取った。それぞれのＵＩＣアッセイデュプリケートについての平均光学密度を、対応する個々のＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａ値から引き、これにより、感染した腫瘍細胞の上清における抗体のＣＤ４０シグナル伝達活性を評価した。次に、ＵＩＣバックグラウンドを減算したＥｎＡｄおよびＮＧ−３５０Ａアッセイデュプリケートの平均をとり、これにより、それぞれの播種および接種のデュプリケートに対応する、それぞれの細胞株について２つの値（条件毎）を得た。次に、これらの副生物の平均および標準偏差（ＳＤ）を決定し、表３において示す。
表３  ＮＧ−３５０Ａ感染腫瘍細胞由来の上清における機能的抗ＣＤ４０抗体活性（ＨＥｋ−Ｂｌｕｅレポーターアッセイ）
【表４】
2020521496.tif 000006
【０３２７】
実施例１８
さらなる一連の実験において、ＮＧ−３５０Ａウイルスのインビボウイルス粒子介在性効果をモニターし、マウスにおける１回または複数回静脈内投与後のＥｎＡｄのものと比較した。メスＣＤ−１マウスに、ビークル対照またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０１０個の粒子をＩＶ注射した。注射の６時間、２４時間、４８時間、または７日後に、マウスの心臓から採血し、血液を抗凝固剤チューブに収集し、処理して血漿を回収した。血漿試料をＥＬＩＳＡアッセイにより試験して、ウイルス粒子に対する実際のサイトカイン応答を検出し、図２９において示すデータは、１群当たり３〜６匹のマウスを表す。ＮＧ−３５０Ａ投与による刺激されたＭＣＰ−１（図２９Ａ）、ＩＬ−６（図２９Ｂ）およびＴＮＦα（図２９Ｃ）レベルは、ＥｎＡｄについてのものと類似した。黒色の実線は、平均を表す。ベースラインは、ビークル対照群の平均＋３×ＳＤを表す。
【０３２８】
血漿試料の他のアリコートを、実際の肝臓毒性の測定値としてアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルについて試験した。ＡＬＴ比色分析エンドポイント酵素アッセイキットを使用して、血漿試料を解析した。図３０において示すデータは、１群当たり３〜６匹のマウスを表す。黒色の実線は、平均を表す。ベースラインは、ビークル対照群の平均＋３×ＳＤを表す。ＡＬＴレベルは、異なるマウス間で変動したが、ＮＧ−３５０ＡおよびＥｎＡｄは、類似の応答特性を誘導した。
【０３２９】
さらなる群のメスＣＤ−１マウスに、１日目にＰＢＳ、または１、３および５日目にＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０１０個のウイルス粒子をＩＶ注射した。投与の６時間後に、ＰＢＳ処置マウスの心臓から血液採取した。第１の投与の６時間および２４時間後に側尾静脈ならびに心穿刺（それぞれ）を介して、または６時間後に心穿刺を介してまたは第３の投与の２４時間もしくは７日後に、ウイルス処置マウスから採血した。血漿試料をＥＬＩＳＡアッセイにより試験して、ウイルス粒子に対する実際のサイトカイン応答を検出し、図３１において示すデータは、１群当たり３〜６匹のマウスを表す。ＮＧ−３５０Ａ投与による刺激されたＭＣＰ−１（図３１Ａ）およびＩＬ−６（図３１Ｂ）レベルは、ＥｎＡｄについてのものと類似した。黒色の実線は、平均を表す。ベースラインは、ビークル対照群の平均＋３×ＳＤを表す。
【０３３０】
実施例１９
免疫適格ＣＤ−１マウスにおける１、３および５日目での２．２×１０１０個のウイルス粒子の３回の静脈内（ＩＶ）投与のそれぞれの投与後、ＮＧ−３５０Ａの血液薬物動態を、ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）と比較した。
【０３３１】
メスＣＤ−１マウスに、１、３および５日目にＥｎＡｄまたはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０１０個のウイルス粒子をＩＶ注射した。それぞれの投与後、それぞれのウイルスを用いて処置した４匹のマウスの群から、投与の１、２、３、５、７、１０および６０分後に血液採取した。ＤＮＡを抽出し、ＥｎＡｄとＮＧ−３５０Ａの両方に共通するウイルスＥ３遺伝子を標的にするｑＰＣＲにより解析した。図３２において示すデータは、１群当たり４匹のマウス＋ＳＤを表す。値がアッセイの定量限界未満になった場合、それらを除外した。７分間を超えるデータは、アッセイの定量限界未満に一貫してなったので、プロットしなかった。ＮＧ−３５０Ａは、ＥｎＡｄのものと比較可能な薬物動態特性を示した。
【０３３２】
実施例２０
１回の静脈内投与後に組織から生きたウイルスの回復を測定することにより、ＮＧ−３５０Ａを用いたマウスの投与後のウイルス体内分布を評価した。メスＣＤ−１マウスに、ビークル対照またはＮＧ−３５０Ａの２．２×１０１０個の粒子をＩＶ注射した。マウスの群を、投与の６時間、２４時間、８日または２８日後のいずれかにおいて安楽死させ、それらの肝臓、肺および脾臓を切除し、直ちにドライアイス上で凍結した。試料を後に融解し、タンパク質保存溶解バッファーにおいてホモジナイズし、溶解物を希釈し、陽性対照および陰性対照としてそれぞれの器官についてのＮＧ−３５０Ａ添加組織ホモジネートと共に、コンフルエントなＡ５４９単層に加えた。単層を９６時間培養し、その後、固定し、抗アデノウイルスヘキソン抗体を使用した免疫染色アッセイの対象にした。図３３におけるそれぞれのウェルの試料写真により、データを表す。ヘキソン陽性細胞は、茶色に染まった（図において濃い灰色として示す）。２４時間より後では、マウスの肝臓、肺または脾臓（マウスにおけるウイルス体内分布の主要部位）において、生きたウイルスを検出することはできなかった。
【０３３３】
実施例２１
この一連の研究において、ＮＧ−３５０Ａウイルス活性を、ヒト腫瘍異種移植片を生じる免疫不全マウスにおいてインビボで評価した。
【０３３４】
３回のＩＶ注射または１回の分画腫瘍内（ＩＴ）投与後、皮下Ａ５４９肺細胞株腫瘍において、ウイルス複製を評価した。
【０３３５】
メスＳＣＩＤマウスのそれらの側腹部に、Ａ５４９腫瘍細胞を皮下移植し、腫瘍が少なくとも５０ｍｍ３に達したら、ウイルスまたは対照をＩＴまたはＩＶいずれかで注射した。トータルの用量２０μＬ／４．４×１０９個のウイルス粒子についての腫瘍の空間的に別の領域に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子の２回の１０μＬ注射液を、ＩＴ投与マウスに注射した。トータルの用量３００μＬ／６．６×１０９個のウイルス粒子について１、３および５日目に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子１００μＬを、ＩＶ投与マウスに注射した。投与の７または２１日後のいずれかで、麻酔後、腫瘍をマウスから切除し、凍結した。腫瘍を後にホモジナイズし、ＤＮＡを抽出し、ＥｎＡｄとＮＧ−３５０Ａの両方に共通するウイルスＥ３領域を標的にするプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲにより解析した。図３４ＡおよびＢにおいて示すデータは、１群当たり２〜４匹のマウス＋／−ＳＤを表す。ＮＧ−３５０Ａは、ＩＴ（図３４Ａ）またはＩＶ（図３４Ｂ）のいずれかの投与後、ＥｎＡｄのものと比較可能な、Ａ５４９腫瘍異種移植片における複製を示した。
【０３３６】
ＨＣＴ−１１６大腸癌細胞株を使用した第２の腫瘍異種移植片モデルを使用して、この実験をまた繰り返した。メスＳＣＩＤマウスのそれらの側腹部に、HCT116腫瘍細胞を皮下移植し、腫瘍が少なくとも５０ｍｍ３に達したら、ウイルスまたは対照をＩＴまたはＩＶいずれかで注射した。トータルの用量２０μＬ／４．４×１０９個のウイルス粒子についての腫瘍の空間的に別の領域に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子の２回の１０μＬ注射液を、ＩＴ投与マウスに注射した。トータルの用量３００μＬ／６．６×１０９個のウイルス粒子について１、３および５日目に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子１００μＬを、ＩＶ投与マウスに注射した。投与の７または２１日後のいずれかで、麻酔後、腫瘍をマウスから切除し、凍結した。腫瘍を後にホモジナイズし、ＤＮＡを抽出し、ＥｎＡｄとＮＧ−３５０Ａの両方に共通するウイルスＥ３領域を標的にするプライマーおよびプローブを使用したｑＰＣＲにより解析した。図３４ＣおよびＤにおいて示すデータは、１群当たり２〜４匹のマウス＋／−ＳＤを表す。ＮＧ−３５０Ａは、ＩＴ（図３４Ｃ）またはＩＶ（図３４Ｄ）のいずれかの投与後、ＥｎＡｄのものと比較可能な、ＨＣＴ−１１６腫瘍異種移植片における複製を示した。
【０３３７】
ＳＣＩＤマウスにおけるＡ５４９とＨＣＴ−１１６両方の皮下異種移植片腫瘍を用いた類似の実験において、腫瘍におけるウイルスＲＮＡ発現を測定した。メスＳＣＩＤマウスのそれらの側腹部に、Ａ５４９またはＨＣＴ−１１６腫瘍細胞を皮下移植し、腫瘍が少なくとも５０ｍｍ３に達したら、ウイルスまたは対照をＩＴまたはＩＶいずれかで注射した。トータルの用量２０μＬ／４．４×１０９個のウイルス粒子についての腫瘍の空間的に別の領域に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子の２回の１０μＬ注射液を、ＩＴ投与マウスに注射した。トータルの用量３００μＬ／６．６×１０９個のウイルス粒子について１、３および５日目に、ＰＢＳ、またはＥｎＡｄもしくはＮＧ−３５０Ａいずれかの２．２×１０９個のウイルス粒子１００μＬを、ＩＶ投与マウスに注射した。投与の７日後に、麻酔後、腫瘍をマウスから切除し、凍結した。腫瘍を後にホモジナイズし、ＲＮＡを抽出し、ＥｎＡｄとＮＧ−３５０Ａの両方に共通するウイルスＥ３ｍＲＮＡを標的にするプライマーおよびプローブを使用したＲＴ−ｑＰＣＲにより解析した。図３５において示すデータは、１群当たり３〜４匹のマウスを表す。黒色の線は、平均を表す。Ａ５４９ＩＴ（図３５Ａ）、ＩＶ（図３５Ｂ）、ＨＣＴ−１１６ＩＴ（図３５Ｃ）およびＨＣＴ−１１６ＩＶ（図３５Ｄ）は、ＮＧ−３５０ＡまたはＥｎＡｄいずれかの投与後に比較可能なウイルスＥ３ｍＲＮＡ発現を示す。
【０３３８】
抗ＣＤ４０抗体導入遺伝子ｍＲＮＡ発現のレベルをまた、同じ皮下Ａ５４９およびＨＣＴ−１１６異種移植片腫瘍ＲＮＡ試料において測定した。αＣＤ４０抗体導入遺伝子ｍＲＮＡを標的にするプライマーおよびプローブを使用したＲＴ−ｑＰＣＲにより、ＲＮＡを解析した。図３６において示すデータは、１群当たり３〜４匹のマウスを表す。黒色の線は、平均を表す。唯一ＮＧ−３５０Ａ処置腫瘍において、抗ＣＤ４０抗体導入遺伝子ｍＲＮＡ発現を容易に検出した。Ａ５４９ＩＴ（図３６Ａ）、ＩＶ（図３６Ｂ）、ＨＣＴ−１１６ＩＴ（図３６Ｃ）およびＨＣＴ−１１６ＩＶ（図３６Ｄ）。
【０３３９】
ＩｇＧ２  ＥＬＩＳＡを使用して、腫瘍溶解物とＡ５４９腫瘍を生じるマウスの血清の両方において、抗ＣＤ４０抗体タンパク質のレベルをまた測定した。図３７において示したデータは、血中より腫瘍においてより高いレベルで、ＩＴ（Ａ）またはＩＶ（Ｂ）いずれかでのＮＧ−３５０Ａ投与後に、抗体の選択的な検出を示す。
【０３４０】
配列
配列番号４−抗ＣＤ４０ＶＨ鎖アミノ酸配列
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＧＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＷＩＮＰＤＳＧＧＴＮＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＮＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＱＰＬＧＹＣＴＮＧＶＣＳＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０３４１】
配列番号５−抗体定常重鎖アミノ酸配列
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０３４２】
配列番号８−抗ＣＤ４０ＶＬ鎖アミノ酸配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＶＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＹＳＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＮＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＮＩＦＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ
【０３４３】
配列番号９−定常軽鎖アミノ酸配列
ＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【０３４４】
配列番号１２−ＮＧ−３５０Ａ導入遺伝子カセット核酸配列
ＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＡＣＧＧＧＡＧＣＴＣＡＴＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＡＧＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＴＡＧＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＣＴＧＧＣＴＡＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＣＡＧＧＧＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＡＡＴＣＣＧＧＡＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＣＡＡＴＴＡＣＧＣＡＣＡＡＡＡＧＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＣＧＧＧＡＣＡＣＴＴＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＧＣＣＴＧＡＧＧＴＣＧＧＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＴＧＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＣＧＣＴＣＧＣＧＡＣＣＡＡＣＣＣＣＴＧＧＧＧＴＡＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＧＧＡＧＴＧＴＧＴＴＣＡＴＡＣＴＴＣＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＣＴＧＧＴＣＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣＣＡＣＴＡＡＧＧＧＣＣＣＧＴＣＧＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＡＧＣＴＣＣＧＴＧＣＴＣＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＴＣＧＧＡＡＴＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＡＣＴＣＧＧＡＴＧＣＣＴＴＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＡＧＡＡＣＣＣＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧＡＡＣＴＣＡＧＧＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＧＧＴＧＴＣＣＡＣＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＴＣＡＴＣＧＧＧＧＣＴＡＴＡＣＡＧＣＣＴＧＡＧＣＡＧＣＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＧＴＣＡＴＣＡＡＡＣＴＴＣＧＧＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＴＡＣＡＣＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＴＣＡＡＡＴＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＴＧＴＴＧＣＧＴＧＧＡＡＴＧＣＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＣＧＧＣＣＣＣＣＣＣＡＧＴＣＧＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＧＡＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＣＡＣＴＣＴＧＡＴＧＡＴＴＴＣＧＡＧＡＡＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＣＧＴＧＴＣＧＣＡＣＧＡＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＧＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＡＡＴＴＣＡＡＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＣＧＧＧＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＡＧＡＣＴＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＡＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＡＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＴＧＴＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＡＣＣＡＡＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＡＧＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＴＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＡＣＧＧＡＣＡＡＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＧＡＣＧＧＧＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＡＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＣＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＧＧＴＧＡＴＧＣＡＣＧＡＡＧＣＴＴＴＧＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＴＣＡＡＡＡＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＧＣＧＣＣＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＡＧＣＡＧＧＣＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＧＧＧＣＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＣＧＣＡＡＣＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＴＧＧＴＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＧＣＡＴＣＧＧＴＧＧＧＧＧＡＣＡＧＡＧＴＣＡＣＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＡＣＡＡＧＧＧＡＴＣＴＡＴＴＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＴＧＧＴＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＡＡＧＧＣＣＣＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＣＴＣＴＣＣＡＧＴＣＡＧＧＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＣＧＧＴＴＣＴＣＡＧＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＡＣＴＡＴＣＡＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＧＡＴＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＴＣＣＧＣＴＡＡＣＴＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＣＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＴＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＴＣＣＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＧＴＣＡＧＡＣＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＧＣＣＴＣＣＧＴＣＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＡＣＧＣＧＡＧＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＡＧＴＧＧＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＡＡＣＡＧＣＣＡＧＧＡＧＴＣＡＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＴＴＡＣＴＣＧＣＴＣＴＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＧＡＡＧＧＣＧＧＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＣＴＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＴＣＴＣＡＴＣＡＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＴＣＧＣＧＧＡＧＡＡＴＧＣＴＡＧＧＣＴＡＧＣＴＴＧＡＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＴＡＣＡＧＣＧＴＡＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＧＡＣＡＴＧＡＴＡＡＧＡＴＡＣＡＴＴＧＡＴＧＡＧＴＴＴＧＧＡＣＡＡＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＡＡＡＡＡＡＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＴＴＧＴＧＡＴＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＧＴＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＴＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＡＧＧＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＣＡＡＧＴＡＡＡＡＣＣＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧ
【図１】
2020521496.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020521496.tif 000013
【図８】
2020521496.tif 000014
【図９】
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【図１０】
2020521496.tif 000016
【図１１Ａ】
2020521496.tif 000017
【図１１Ｂ】
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【図１２】
2020521496.tif 000019
【図１３】
2020521496.tif 000020
【図１４】
2020521496.tif 000021
【図１５−１】
2020521496.tif 000022
【図１５−２】
2020521496.tif 000023
【図１６】
2020521496.tif 000024
【図１７】
2020521496.tif 000025
【図１８Ａ】
2020521496.tif 000026
【図１８Ｂ】
2020521496.tif 000027
【図１８Ｃ】
2020521496.tif 000028
【図１８Ｄ】
2020521496.tif 000029
【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２５Ｅ】
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【図２５Ｆ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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