(57)【要約】  ＭＡＰＫ阻害剤への癌に罹患した被験体の反応は、二次耐性及び急速な再発により劇的に損なわれる。これまで、これらの耐性を駆動する分子機構は完全には理解されていない。本発明者らは、ＳＬＩＴＲＫ６（ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様ファミリー、メンバー６）の発現がＭＡＰＫ阻害剤（例、ベムラフェニブ）により誘導され、ＭＡＰＫ阻害剤の存在におけるその誘導の阻害が合成致死率を誘導することを示す。このように、活性又は発現の阻害剤によるＳＬＩＴＲＫ６の阻害だけが、ＭＡＰＫ阻害剤の抗腫瘍効果を増強し、それらの化合物への耐性の出現を回避するはずである。さらに、１５ＳＬＩＴＲＫ６の特異的発現はまた、ＡＤＣＣを媒介することが可能な抗ＳＬＩＴＲＫ６抗体又はＳＬＩＴＲＫ６に結合する抗体−薬物コンジュゲートを用いてそれらを標的化することによる残存癌細胞の枯渇に基づく戦略の道を開く。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＭＡＰＫ阻害剤及びＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤を含む治療的に効果的な組み合せを被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌を処置する方法。
【請求項２】
被験体がＭＡＰＫ経路に関与するタンパク質における変異により特徴付けられる癌に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者がＮＲＡＳ変異癌又はＢＲＡＦ変異癌に罹患している、請求項３記載の方法。
【請求項４】
被験体が、メラノーマ、多発性骨髄腫、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、血液癌、白血病、及びリンパ腫からなる群より選択される癌に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＭＡＰＫ阻害剤がＭＥＫ阻害剤及びＢＲＡＦ阻害剤からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
被験体が、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤を含む組み合わせを投与される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＭＡＰＫ阻害剤がベルマフェニブである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
薬剤がＳＬＩＴＲＫ６発現の阻害剤である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
薬剤がＳＬＩＴＲＫ６について結合親和性を有する抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
抗体が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）アクセッション番号ＰＴＡ−１３１０２下で寄託されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されたＨａｌ５−１０ａｃｌ２と命名された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含み、Ｈａｌ５−１０ａｃｌ２の重鎖可変領域が配列番号１において示すアミノ酸を有し、Ｈａｌ５−１０ａｃｌ２の軽鎖可変領域が配列番号２において示すアミノ酸配列を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
抗体が抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害を媒介する、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
抗体がアウリスタチン又はそのペプチド類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートしている、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
ｉ）被験体から得られた腫瘍サンプル中のＳＬＩＴＲＫ６の発現を検出すること、及びｉｉ）ＳＬＩＴＲＫ６の発現が工程ｉ）で検出された場合に被験体が再発すると結論付けることを含む、ＭＡＰＫ阻害剤の投与を含む処置レジメン後に、癌に罹患している被験体において再発を決定する方法。
【請求項１４】
腫瘍サンプルが、被験体から切除された腫瘍からもたらされる、被験体の原発腫瘍において実施された、若しくは被験体の原発腫瘍から離れた転移において実施された生検からもたらされる、又は循環腫瘍細胞のサンプルである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＳＬＩＴＲＫ６の発現を検出することが、ＳＬＩＴＲＫ６をコードするｍＲＮＡの量を検出することにより、又は免疫検出により決定される、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌の処置のための方法及び医薬組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
ＭＡＰＫ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）経路は、多数の正常な生理学的プロセス（例えば細胞代謝、細胞周期進行、細胞死、及び神経機能など）において重要な役割を果たすことが示されている。ＭＡＰＫ経路は、しばしばＲＡＳ又はＲＡＦ遺伝子ファミリーメンバーにおける機能獲得型変異を通じて、有意な割合のヒト腫瘍において構成的に活性化されている。例えば、ＭＡＰＫ経路における変異は、最大９０%のメラノーマ及び良性メラニン細胞性新生物がＢ−ＲＡＦ、Ｋ−ＲＡＳ、又はＮ−ＲＡＳにおいて活性化変異を保有するという点で、メラノーマ発生において非常に重要であることが示されている。ＢＲＡＦにおける活性化変異は、実際に全固形腫瘍の７〜８%、悪性メラノーマの６０%、結腸直腸癌の８〜１５%及び膵臓癌の３%、及び肺癌の２%において生じる。メラノーマは最も侵襲性の皮膚癌である。それはしばしば転移を誘導し、その発生率は迅速に増えており、驚くほどに上昇し続けている。手術は転移段階前のほぼ全ての症例において治癒的であるが、しかし、転移が現れた場合、手術、放射線療法、及び従来の化学療法はほとんど治癒効果を有さず、被験体の生存は通常短い。従って、いくつかの有望な新たな治療が、ＭＡＰＫ阻害剤、特に特異的抗ＢＲＡＦＶ６００阻害剤（例、ベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）及びダブラフェニブ）を使用した標的化学療法に本質的に基づいて開発されてきた。前臨床試験は、ベムラフェニブ及びダブラフェニブが変異ＢＲＡＦタンパク質を遮断し、この変異を保有する腫瘍の低い割合において細胞増殖停止及び細胞死を誘導することを示している。ベムラフェニブ及びダブラフェニブの臨床試験は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ陽性転移性メラノーマ患者の５０%超において治療効果を示している。より最近では、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤との組み合わせによって腫瘍反応が改善され、ＢＲＡＦ変異被験体の全生存率の増加を誘導し、そのような被験体における第一選択治療としてこの併用を提案することに導いた。しかし、残念なことに、大半の被験体では、メラノーマ細胞は、ＭＡＰＫ阻害剤への耐性が獲得されると再び発生及び進行する。従って、それらの阻害剤への耐性を媒介する未知の経路の同定及び特徴付けは、この全被験体集団にわたる前記耐性を予防及び克服するための標的戦略の合理的設計のために不可欠である。
【０００３】
発明の要約
本発明は、ＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌の処置のための方法及び医薬組成物に関する。特に、本発明は特許請求の範囲により定義する。
【０００４】
発明の詳細な説明
ＭＡＰＫ阻害剤への反応は、二次耐性及び迅速な再発により劇的に損なわれる。これまでに、これらの耐性を駆動する分子機構は完全には理解されていない。本発明者らは、ＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞において、ＢＲＡＦ又はその標的ＭＥＫの阻害が、転写因子ｃ−Ｊｕｎに依存する機構によりＲＨＯＢ発現を誘導することを示した（Oncotarget. 2015 Jun 20;6(17):15250-64）。特に、それらの知見によって、ＢＲＡＦ阻害が腫瘍細胞の生存を促進するｃ−Ｊｕｎ／ＲＨＯＢ／ＡＫＴ経路を活性化することが明らかになり、ＭＡＰＫ阻害剤へのメラノーマの耐性におけるこの経路の役割がさらに裏付けられる。今回、本発明者らは、ｃ−Ｊｕｎの活性化がＳＬＩＴＲＫ６（ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様ファミリー、メンバー６）の発現を誘導することを示す。特に、本発明者らは、ＳＬＩＴＲＫ６がＭＡＰＫ阻害剤（例、ベムラフェニブ）により誘導され、その誘導の阻害がＡ３７５株におけるようにアポトーシス細胞死に導くことを実証する。このように、活性又は発現の阻害剤によるＳＬＩＴＲＫ６の阻害だけが、ＭＡＰＫ阻害剤の抗腫瘍効果を増強し、それらの化合物への耐性の出現を回避するはずである。さらに、ＳＬＩＴＲＫ６の特異的発現はまた、ＡＤＣＣを媒介することが可能な抗ＳＬＩＴＲＫ６抗体又はＳＬＩＴＲＫ６に結合する抗体−薬物コンジュゲートを用いてそれらを標的化することによる残存癌細胞の枯渇に基づく戦略の道を開く。
【０００５】
したがって、本発明の第１の目的は、少なくとも１つのＭＡＰＫ阻害剤及びＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤を含む治療的に効果的な組み合せを被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌を処置する方法に関する。
【０００６】
本発明のさらなる目的は、ＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤の治療的に効果的な量を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体においてＭＡＰＫ阻害剤に耐性の癌を治療する方法に関する。
【０００７】
本発明のさらなる目的は、処置レジメンの一部として癌に罹患した被験体に投与されるＭＡＰＫ阻害剤の効力を増強するための方法に関し、方法は、少なくとも１つのＭＡＰＫ阻害剤との組み合わせにおいてＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な医薬的に効果的な量の薬剤を被験体に投与することを含む。
【０００８】
本発明のさらなる目的は、ＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な治療的に効果的な量の薬剤を被験体に投与することを含む、癌に罹患した被験体において投与されたＭＡＰＫ阻害剤への耐性を予防する方法に関する。
【０００９】
本明細書で使用するように、「ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＥＫ−ＥＲＫ経路」としても公知である表現「ＭＡＰＫ経路」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、細胞の表面上の受容体から細胞の核中のＤＮＡにシグナルを伝達する細胞中のタンパク質の鎖を指す。シグナルは、シグナル伝達分子が細胞表面上の受容体に結合した場合に開始し、核中のＤＮＡがタンパク質を発現し、細胞において何らかの変化（例えば細胞分裂など）を産生した場合に終了する。
【００１０】
一部の実施形態では、被験体は、ＭＡＰＫ経路の活性化の増加を示す癌（即ち、「ＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌」）に罹患している。本明細書で使用するように、増加した発現又は活性は、参照発現レベル又は参照活性レベルに関して少なくとも１０%、少なくとも２０%、少なくとも３０%、少なくとも４０%、少なくとも５０%、少なくとも１００%、少なくとも２００%、少なくとも３００%又はそれ以上である発現レベル又は活性レベルとして理解される。ＭＡＰＫ経路の所与の成分の発現レベルが増加しているか否かを決定するための方法は当技術分野において周知であり、対応する成分のｍＲＮＡレベルの決定に基づく方法（例、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲなど）及び対応する成分のタンパク質レベルの決定に基づく方法（例、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなど）を含む。ＭＡＰＫ経路の１つ以上の成分の活性が増加しているか否かを決定するための方法は、異なる成分の活性の決定に基づいており、当業者に広く公知である。ＭＡＰＫ経路の活性を決定するための適切な方法は、例えば、リン酸化ＥＲＫ（ＭＡＰＫ）タンパク質の検出、ならびにホスホＥＲＫとＥＲＫとの比率を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、被験体は、ＭＡＰＫ経路に関与するタンパク質における少なくとも１つの変異の存在により特徴付けられる癌に罹患している。典型的には、癌はチロシンキナーゼ受容体（例、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＩＧＦ−１Ｒ  ｃＭＥＴ…）、ＢＲＡＦ、ＲＡＳ、ＣＲＡＦ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ４、ＭＡＰ２Ｋ１、ＭＡＰ２Ｋ２、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ  ＨＲＡＳ、ＰＴＥＮ、ＰＩＫ３ＣＡ、及びＰ１６における少なくとも１つの変異により特徴付けられる。一部の実施形態では、被験体はＲＡＳ変異癌に罹患している。本明細書で使用するように、用語「ＲＡＳ」は、ＲＡＳファミリーのタンパク質の任意のメンバー又はその変異体を表す。Ｒａｓファミリータンパク質は、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、及びＮＲＡＳ、ならびにこのサブファミリーの他のメンバー：ＤＩＲＡＳ１；ＤＩＲＡＳ２；ＤＩＲＡＳ３；ＥＲＡＳ；ＧＥＭ；ＭＲＡＳ；ＮＫＩＲＡＳ１；ＮＫＩＲＡＳ２；ＮＲＡＳ；ＲＡＬＡ；ＲＡＬＢ；ＲＡＰ１Ａ；ＲＡＰ１Ｂ；ＲＡＰ２Ａ；ＲＡＰ２Ｂ；ＲＡＰ２Ｃ；ＲＡＳＤ１；ＲＡＳＤ２；ＲＡＳＬ１０Ａ；ＲＡＳＬ１０Ｂ；ＲＡＳＬ１１Ａ；ＲＡＳＬ１１Ｂ；ＲＡＳＬ１２；ＲＥＭ１；ＲＥＭ２；ＲＥＲＧ；ＲＥＲＧＬ；ＲＲＡＤ；ＲＲＡＳ；ＲＲＡＳ２も含むが、これらに限定しない（Wennerberg et al., The Ras superfamily at a glance, J. Cell. Sci., 2005, 118 (Pt 5), 843-846）。したがって、表現「変異ＲＡＳ癌」は、癌細胞がＲａｓタンパク質中に活性化変異を含む癌を指す。特に、被験体はＮＲＡＳ変異癌に罹患している。ＮＲＡＳにおける多数の変異が公知であり、典型的にはＱ６１Ｒ、Ｑ６１Ｋ、Ｑ６１Ｈ、Ｑ６１Ｌ、Ｑ６１Ｎ、Ｑ６１Ｅ、Ｑ６１Ｐ、Ａ１４６Ｔ、Ａ１４６Ｐ、又はＡ１４６Ｖを含む。一部の実施形態では、被験体はＲＡＦ変異癌に罹患している。本明細書で使用するように、用語「ＲＡＦ」は、Ｒａｆファミリーのタンパク質の任意のメンバー又はその変異体を表す。ＲＡＦファミリータンパク質は、Ａ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、及びＣ−ＲＡＦを含むが、これらに限定しない。したがって、表現「変異ＲＡＦ癌」は、癌細胞がＲａｆタンパク質中に活性化変異を含む癌を指す。特に、被験体はＢＲＡＦ変異癌に罹患している。ＢＲＡＦにおける多数の変異が公知である。特に、Ｖ６００Ｅ変異が顕著である。見出されている他の変異はＲ４６１Ｉ、Ｉ４６２Ｓ、Ｇ４６３Ｅ、Ｇ４６３Ｖ、Ｇ４６５Ａ、Ｇ４６５Ｅ、Ｇ４６５Ｖ、Ｇ４６８Ａ、Ｇ４６８Ｅ、Ｎ５８０Ｓ、Ｅ５８５Ｋ、Ｄ５９３Ｖ、Ｆ５９４Ｌ、Ｇ５９５Ｒ、Ｌ５９６Ｖ、Ｔ５９８Ｉ、Ｖ５９９Ｄ、Ｖ５９９Ｅ、Ｖ５９９Ｋ、Ｖ５９９Ｒ、Ｖ６００Ｅ、Ａ７２７Ｖであり、これらの変異の大半が、２つの領域、Ｎローブのグリシンに富むＰループならびに活性化セグメント及び隣接領域に集中している。当技術分野において公知であるように、いくつかのＰＣＲ及び／又は配列決定に基づく方法が、ＭＡＰＫ経路における変異を検出する際での使用について公知であり、いくつかの研究論文及び米国特許（Brose, et al. Cancer Research 62:6997-7000 (2002)、Solit et al, Cancer Research 70(14): 5901-5911 (1010)、Xu, et al. Cancer research 63:4561-4567 (2003)、ならびに米国特許第７，７４５，１２８号を含むが、これらに限定しない）及び��くつかの市販のキット（Dxs Diagnostic Innovations、Applied Biosystems、及びQuest diagnosticsを参照のこと）において提示されている。
【００１２】
一部の実施形態では、被験体は、メラノーマ、多発性骨髄腫、肺癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、血液癌、白血病、及びリンパ腫からなる群より選択される癌に罹患している。特に、被験体はメラノーマ、特に転移性メラノーマを患っている。本明細書で使用するように、「メラノーマ」は、皮膚及び他の器官のメラニン細胞系から生じる腫瘍の増殖により特徴付けられる状態を指す。大半のメラニン細胞は皮膚に発生するが、髄膜、消化管、リンパ節、及び眼にも見出される。メラノーマが皮膚に生じた場合、それは皮膚メラノーマとして言及する。メラノーマは眼にも生じうるが、眼球メラノーマ又は眼球内メラノーマと呼ぶ。メラノーマは、髄膜、消化管、リンパ節、又はメラニン細胞が見出される他の領域では稀にしか生じない。メラノーマの４０〜６０%が活性化変異ＢＲＡＦを保有する。
【００１３】
本明細書で使用するように、用語「ＭＡＰＫ阻害剤」は、当技術分野において現在公知である、又は将来同定される任意の化合物を指し、被験体への投与時に被験体の癌細胞においてＭＡＰＫ経路の阻害をもたらす任意の化学物質を含む。ＭＡＰＫ阻害剤は、低分子量阻害剤、抗体又は抗体フラグメント、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（即ち、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、及びリボザイムを含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、ＭＡＰＫ阻害剤は有機低分子である。ＭＡＰＫ阻害剤は、例えば、ＲＡＳ阻害剤、ＲＡＦ阻害剤、又はＭＥＫ阻害剤を含む。
【００１４】
ＭＥＫ阻害剤は、米国特許第５，５２５，６２５号、第６欄、第３５行から始まる「酵素アッセイ」と題されたアッセイでテストした場合にＭＥＫ阻害を示す化合物である。米国特許第５，５２５，６２５号の完全な開示を参照により本明細書に組み入れる。具体的には、化合物が米国特許第５，５２５，６２５号の第６欄、第３６行から第７欄、第４行までの「ＭＡＰキナーゼ経路の阻害剤についてのカスケードアッセイ」と題されたアッセイにおいて活性を示し、及び／又は上に参照する特許の第７欄、第４〜２７行の「インビトロＭＥＫアッセイ」と題されたアッセイにおいて活性を示す場合、化合物はＭＥＫ阻害剤である。あるいは、ＭＥＫ阻害は、ＷＯ０２／０６２１３  Ａ１（その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のアッセイにおいて測定することができる。ＭＥＫ阻害剤は、例えば、ＡＲＲＹ−１４２８８６（ＡＺＤ６２４４としても公知；Array BioPharma／Astrazeneca）、ＰＤ−１８４３５２（ＣＩ−１０４０としても公知；Pfizer）、ＸＬ５１８（Exelixis）、ＰＤ０３２５９０１（Pfizer）、ＰＤ−９８０５９（Pfizer）、ＭＥＫ１（ＥＭＤ）、又は２−（２−アミノ−３−メトキシフェニル）−４−オキソ−４Ｈ−［１］ベンゾピラン、及び２−（２−クロロ−４−ヨード−フェニルアミノ）−Ｎ−シクロプロピルメトキシ−３，４−ジフルオロ−ベンズアミドを含む。本発明に従って使用することができるＭＥＫ阻害剤の具体的な好ましい例は、ＡＲＲＹ−１４２８８６、ＰＤ−１８４３５２、ＰＤ−９８０５９、ＰＤ−０３２５９０１、ＸＬ５１８、又はＭＥＫ１を含む。
【００１５】
ＲＡＳ阻害剤は、例えば、ＢＭＳ−２１４６６２（Bristol-Myers Squibb）、ＳＣＨ６６３３６（ロナファルニブとしても公知；Schering-Plough）、Ｌ−７７８，１２３（Merck）、Ｒ１１５７７７（ザルネストラ又はティピファルニブ（Tipifamib）としても公知；Johnson and Johnson）、及び６−［（４−クロロ−フェニル）−ヒドロキシ−（３−メチル−３Ｈ−イミダゾール−４−イル）−メチル］−４−（３−エチニル−フェニル）−１−メチル−１Ｈ−キノリン−２−オン（OSIPharmaceuticals, Inc.）を含む。米国特許第６，１５０，３７７号及び第６，６４５，９８２号に開示されるＲａｓ阻害剤が含まれる。米国特許第６，１５０，３７７号及び第６，６４５，９８２号の完全な開示を参照により組み入れる。
【００１６】
適切なＲＡＦ阻害剤及び特にＢＲＡＦ阻害剤は、１，２−ジシクリル置換アルキン化合物又は誘導体；１−メチル−５−（２−（５−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリジン−４−イルオキシ）−Ｎ−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−１Ｈ−ベンゾ［ｄ］イミダゾール−２−アミン）；２，６−二置換キナゾリン、キノキサリン、キノリン、及びイソキノリン化合物又は誘導体；４−アミノ−５−オキソ−８−フェニル−５Ｈ−ピリド−［２，３−Ｄ］−ピリミジン化合物又は誘導体；４−アミノ−チエノ［３，２−Ｃ］ピリジン−７−カルボン酸化合物又は誘導体；５−（４−アミノフェニル）−イソキノリン化合物又はその誘導体；ベンゼンスルホンアミドチアゾール化合物又は誘導体；ベンズイミダゾール化合物又は誘導体；二環式化合物又は誘導体；ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン化合物又は誘導体の架橋二環式複素環式又はスピロ二環式複素環式誘導体；シンナミド及びヒドロシンナミド化合物又は誘導体；二置換イミダゾール化合物又は誘導体；縮合三環ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン化合物又は誘導体；ヘテロアリール化合物又は誘導体；複素環式化合物又は誘導体；１Ｈ−ベンゾ［Ｄ］イミダゾール化合物又は誘導体；イミダゾ［４，５−Ｂ］ピリジン化合物又は誘導体；Ｎ−（６−アミノピチジン−３−イル）−３−（スルホンアミド）ベンズアミド化合物又は誘導体；Ｎ−［３−（１−アミノ−５，６，７，８−テトラヒドロ−２，４，４Ｂ−トリアザフルオレン−９−イル）−フェニル］ベンズアミド化合物又は誘導体；含窒素二環式ヘテロアリール化合物又は誘導体；複素環置換ビスアリール尿素化合物又は誘導体のＮ−オキシド；オメガ−カルボキシアリール置換ジフェニル尿素化合物又は誘導体；オキサゾール化合物又は誘導体；フェネチルアミド化合物又は誘導体；フェニルスルホンアミド置換ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン化合物又は誘導体；フェニルトリアゾール化合物又は誘導体；複素環式化合物又は誘導体；１ｈ−ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン化合物又は誘導体；プリン化合物又は誘導体；ピラゾール［３，４−Ｂ］ピリジン化合物又は誘導体；ピラゾール化合物又は誘導体；ピラゾリン化合物又は誘導体；ピラゾロ［３，４−ｂ］ピリジン、ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン化合物又は誘導体；ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン化合物又は誘導体；ピラゾロ［５，１−ｃ］［１，２，４］トリアジン化合物又は誘導体；ピラゾリル化合物又は誘導体；ピリミジン化合物又は誘導体；ピロール化合物又は誘導体；ピロロ［２，３−Ｂ］ピリジン化合物又は誘導体；置換６−フェニル−ピリド［２，３−Ｄ］ピリミジン−７−オン化合物又は誘導体；置換ベンザゾール化合物又は誘導体；置換ベンズイミダゾール化合物又は誘導体；置換ビスアリール尿素化合物又は誘導体；チエノピリジン化合物又は誘導体；チエノピリミジン、チエノピリジン、又はピロロピリミジン化合物又は誘導体；チオフェンアミド化合物又は誘導体、ならびに他の任意の適切なアリール及び／又はヘテロアリール化合物又は誘導体を含むが、これらに限定しない。いくつかの特許及び特許出願によって、本明細書に記載する実施形態に従って使用してもよい例示的なＢＲＡＦ阻害剤が開示されており、国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１１１７３８１、ＷＯ２０１１１１９８９４、ＷＯ２０１１１１７３８１、ＷＯ２０１１０９７５９４、ＷＯ２０１１０９７５２６、ＷＯ２０１１０８５２６９、ＷＯ２０１１０９０７３８、ＷＯ２０１１０２５９６８、ＷＯ２０１１０２５９２７、ＷＯ２０１１０２３７７３、ＷＯ２０１１０２８５４０、ＷＯ２０１０１１１５２７、ＷＯ２０１０１０４９７３、ＷＯ２０１０１００１２７、ＷＯ２０１００７８４０８、ＷＯ２０１００６５８９３、ＷＯ２０１００３２９８６、ＷＯ２００９１１５５７２、ＷＯ２００９１０８８３８、ＷＯ２００９１１１２７７、ＷＯ２００９１１１２７８、ＷＯ２００９１１１２７９、ＷＯ２００９１１１２８０、ＷＯ２００９１０８８２７、ＷＯ２００９１１１２６０、ＷＯ２００９１００５３６、ＷＯ２００９０５９２７２、ＷＯ２００９０３９３８７、ＷＯ２００９０２１８６９、ＷＯ２００９００６４０４、ＷＯ２００９００６３８９、ＷＯ２００８１４０８５０、ＷＯ２００８０７９２７７、ＷＯ２００８０５５８４２、ＷＯ２００８０３４００８、ＷＯ２００８１１５２６３、ＷＯ２００８０３０４４８、ＷＯ２００８０２８１４１、ＷＯ２００７１２３８９２、ＷＯ２００７１１５６７０、ＷＯ２００７０９０１４１、ＷＯ２００７０７６０９２、ＷＯ２００７０６７４４４、ＷＯ２００７０５６６２５、ＷＯ２００７０３１４２８、ＷＯ２００７０２７８５５、ＷＯ２００７００２４３３、ＷＯ２００７００２３２５、ＷＯ２００６１２５１０１、ＷＯ２００６１２４８７４、ＷＯ２００６１２４７８０、ＷＯ２００６１０２０７９、ＷＯ２００６１０８４８２、ＷＯ２００６１０５８４４、ＷＯ２００６０８４０１５、ＷＯ２００６０７６７０６、ＷＯ２００６０５０８００、ＷＯ２００６０４０５６９、ＷＯ２００５１１２９３２、ＷＯ２００５０７５４２５、ＷＯ２００５０４９６０３、ＷＯ２００５０３７２８５、ＷＯ２００５０３７２７３、ＷＯ２００５０３２５４８；ならびに米国特許番号ＵＳ８６４２７５９、ＵＳ８５５７８３０、ＵＳ８５０４７５８、ＵＳ７８６３２８８、ＵＳ７４９１８２９、ＵＳ７４８２３６７、及びＵＳ７２３５５７６を含むが、これらに限定せず；それらすべての明細書は、本明細書に十分に示されているかのように、参照により本明細書に組み入れる。一部の実施形態では、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＡＭＧ５４２、ＡＲＱ１９７、ＡＲＱ７３６、ＡＺ６２８、ＣＥＰ−３２４９６、ＧＤＣ−０８７９、ＧＳＫ１  １２０２１２、ＧＳＫ２１  １８４３６（ダブラフェニィブ、Tafinlar（登録商標））、ＬＧＸ８１８（エンコラフェニブ）、ＮＭＳ−Ｐ１８６、ＮＭＳ−Ｐ３４９、ＮＭＳ−Ｐ３８３、ＮＭＳ−Ｐ３９６、ＮＭＳ−Ｐ７３０、ＰＬＸ３６０３（ＲＯ５２１２０５４）、ＰＬＸ４０３２（ベムラフェニブ、Zelboraf（登録商標））、ＰＬＸ４７２０（ジフルオロフェニル−スルホンアミン）、ＰＦ−０４８８０５９４、ＰＬＸ４７３４、ＲＡＦ２６５（ＣＨＩＲ−２６５）、Ｒ０４９８７６５５、ＳＢ５９０８８５、ソラフェニブ、トシル酸ソラフェニブ、又はＸＬ２８１（ＢＭＳ−９０８６６２）より選択される分子の群より選択する。一部の実施形態���は、当業者は、インビトロ、インビボ、インシリコ、又は当技術分野において公知の他のスクリーニング方法を使用し、新規のＢＲＡＦ阻害剤を生成又は同定しうる。例えば、野生型ＢＲＡＦのＢＲＡＦ阻害剤は、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードにおいてＢＲＡＦの下流にある分子（例、ＭＥＫ及び／又はＥＲＫ）のリン酸化を検出するためのアッセイを使用して小分子、ペプチド、又は核酸のトレーニングセットから同定されうる。ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦ発現及び／又はシグナル伝達機能を抑制又は阻害するように作用し、それによりＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化を低下させうる。そのような実施形態において使用することができるいくつかのリン酸化アッセイが利用可能であり、キナーゼ活性アッセイ（例、R&D Systems（登録商標）、Promega（登録商標）、Life Technologies（登録商標）により販売されているもの）；イムノアッセイ、例えばウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫細胞化学、免疫組織化学などとの使用のためのリン酸化特異的抗体；質量分析、プロテオミクス、及びリン酸化タンパク質マルチプレックスアッセイを含むが、これらに限定しない。
【００１７】
一部の実施形態では、被験体には、ＢＲＡＦ阻害剤とＭＥＫ阻害剤との組み合わせを用いて優先的に投与する。
【００１８】
本明細書で使用するように、用語「処置」又は「処置する」は、疾患に罹るリスクがある又は疾患に罹った疑いのある被験体、ならびに病気である又は疾患もしくは医学的状態に罹患していると診断されている被験体の処置を含む、予防的又は予防性処置ならびに治癒的又は疾患修飾処置の両方を指し、臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害又は再発性障害の１つ以上の症状を予防、治癒、その発症の遅延、その重症度の低下、又は軽減するために、或いはそのような処置の非存在において予想される生存を超えて被験体の生存を延長するために、医学的障害を有する又は最終的に障害を獲得しうる被験体に投与してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは、導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目的は、処置レジメンの初期期間の間に高レベルの薬物を被験体に提供することである。導入レジメンは（一部において又は全体において）「負荷レジメン」を用いてもよく、これは、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも高頻度に薬物を投与すること、又はその両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での被験体の維持のために、例えば被験体を長期間（月又は年）にわたり寛解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンでは、持続治療（例、定期的な間隔、例、毎週、毎月、毎年などで薬物を投与する）又は間欠治療（例、断続処置、間欠処置、再発時の処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の発現など］の達成時の治療）を用いうる。
【００１９】
本明細書で使用するように、用語「ＭＡＰＫ阻害剤に対する耐性」は、その最も広い文脈において、細胞の増殖を阻害する、細胞を死滅させる、又は１つ以上の細胞機能を阻害する少なくとも１つのＭＡＰＫ阻害剤（例、ＢＲＡＦ阻害剤単独又はＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を含む組み合わせ）の低下した有効性、及び細胞の増殖を阻害する、細胞を死滅させる、又は１つ以上の細胞機能を阻害するように設計された薬剤への曝露を生き延びる細胞の能力を指すために使用する。細胞により呈される耐性は、例えば薬剤への事前の曝露により獲得されうる、又は固有もしくは先天的でありうる。細胞により呈される耐性は、薬剤が細胞に対して完全に無効にされるという点で完全でありうる、又は薬剤の有効性が低下するという点で部分的でありうる。したがって、用語「耐性」は、疾患が前記発生又は進行の前に治癒したか否かとは非依存的に、癌の繰り返しの発生、又は癌の進行を指す。
【００２０】
本明細書で使用するように、用語「ＳＬＩＴＲＫ６」は、当技術分野においてその一般的な意味を有し、ＳＬＩＴＲＫ６遺伝子（Ｇｅｎｅ  ＩＤ：８４１８９）によりコードされるＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様ファミリーメンバー６を指す。用語「ＳＬＩＴＲＫ６」はＤＦＮＭＹＰとしても公知である。この遺伝子はＳＬＩＴＲＫタンパク質ファミリーのメンバーをコードする。このファミリーのメンバーは、２つのＮ末端ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメイン及びＴＲＫニューロトロフィン受容体と相同性を共有するＣ末端領域により特徴付けられる内在性膜タンパク質である。このタンパク質は本来、正常な聴覚及び視覚のために要求される神経突起伸長の調節因子として記載された。例示的なヒト核酸配列及びアミノ酸配列をそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０３２２２９．２及びＮＰ＿１１５６０５．２により表す。本明細書で使用するように、用語「ＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞」は、ＢＲＡＦ阻害剤の投与後にＳＬＩＴＲＫ６を発現する癌細胞を指す。
【００２１】
本明細書で使用するように、用語「ＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤」は、細胞性及び／又は生理学的条件下でＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な任意の分子を指す。特に、薬剤はＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞のアポトーシスを誘導することが可能である。一部の実施形態では、薬剤はＳＬＩＴＲＫ６癌細胞を枯渇させることが可能である。本明細書で使用するように、癌細胞に関する用語「枯渇」は、被験体におけるＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の数における測定可能な減少を指す。低下は少なくとも約１０%、例えば、少なくとも約２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%又はそれ以上でありうる。一部の実施形態では、この用語は、被験体における検出限界を下回るＳＬＩＴＲＫ６癌細胞の数における減少を指す。
【００２２】
一部の実施形態では、薬剤はＳＬＩＴＲＫ６発現の阻害剤である。本発明者らは実際に、ＳＬＩＴＲＫ６の阻害が癌細胞のアポトーシスを誘発しうることを示した。「発現の阻害剤」とは、遺伝子の発現を阻害するための生物学的効果を有する天然又は合成化合物を指す。一部の実施形態では、遺伝子発現の前記阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、又はリボザイムである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含む）は、それに結合することによりＳＬＩＴＲＫ６  ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断し、このように、タンパク質翻訳を防止する又はｍＲＮＡ分解を増加させ、このように、細胞においてＳＬＩＴＲＫ６のレベルひいては活性を減少させるように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基の、ＳＬＩＴＲＫ６をコードするｍＲＮＡ転写物配列の固有領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば従来のホスホジエステル技術により合成することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。低分子阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）はまた、本発明における使用のための発現の阻害剤として機能することができる。ＳＬＩＴＲＫ６遺伝子発現は、被験体又は細胞を小型二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は小型二本鎖ＲＮＡの産生を起こすベクターもしくは構築物と接触させることにより低下させることができ、ＳＬＩＴＲＫ６遺伝子発現が特異的に阻害されるようにする（即ち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及びリボザイムは、単独で又はベクターと共にインビボで送達されうる。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞及び典型的にはＳＬＩＴＲＫ６を発現する細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸の転移を促進することが可能な任意の媒体である。典型的には、ベクターは、ベクターの非存在をもたらしうる分解の程度と比べて、低下した分解を伴い核酸を細胞に輸送する。一般的に、本発明において有用なベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイムの核酸配列の挿入又は組み入れにより操作されたウイルス又は細菌の供給源から由来する他の媒体を含むが、これらに限定しない。ウイルスベクターは好ましい型のベクターであり、以下のウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定しない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなど；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；及びＲＮＡウイルス（例えばレトロウ���ルスなど）。命名されていないが当技術分野において公知の他のベクターを容易に用いることができる。一部の実施形態では、発現の阻害剤はエンドヌクレアーゼである。用語「エンドヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。一部、例えばデオキシリボヌクレアーゼＩなどは、ＤＮＡを比較的非特異的に（配列に関係なく）切断し、多くは典型的には制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素と呼ばれ、非常に特異的なヌクレオチド配列でのみ切断する。エンドヌクレアーゼベースのゲノム不活性化の背後にある機構は一般的に、ＤＮＡ一本鎖又は二本鎖切断の第一工程を要求し、それは次にＤＮＡ修復のための２つの異なる細胞機構を引き起こすことができ、ＤＮＡ不活性化に利用できる：エラープローン非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び高忠実度相同性指向修復（ＨＤＲ）。特定の実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓである。本明細書で使用するように、用語「ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ」は当技術分野においてその一般的な意味を有し、塩基配列の短い反復を含む原核生物ＤＮＡのセグメントに関連付けられる規則的に散在する短いパリンドローム反復を指す。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、化膿連鎖球菌からのＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、ＵＳ  ８６９７３５９  Ｂ１及びＵＳ  ２０１４／００６８７９７に記載されている。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１であり、これは、Zetsche et al.（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015)；Cell；163, 1-13）においてプレボテラ（Ｐｒｏｖｏｔｅｌａ）及びフランシセラ１（Ｃｐｆ１）から最近特徴付けられたＣＲＩＳＰＲである。
【００２３】
一部の実施形態では、薬剤は、ＳＬＩＴＲＫ６のキナーゼ活性を阻害する有機小分子、又はＳＬＩＴＲＫ６機能を阻害することができる全ての分子である。
【００２４】
一部の実施形態では、薬剤は、ＳＬＩＴＲＫ６について結合親和性を有する抗体である。一部の実施形態では、薬剤は、ＳＬＩＴＲＫ６の細胞外ドメインに対する抗体である。一部の実施形態では、抗体はＳＬＩＴＲＫ６活性の阻害に導く。一部の実施形態では、抗体は癌細胞におけるＳＬＩＴＲＫ６の内在化に導く。一部の実施形態では、抗体は癌細胞の枯渇に導く（例、本明細書で後に記載する抗体−薬物コンジュゲート）。
【００２５】
本明細書で使用するように、用語「抗体」は、このように、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子を指すために使用し、この用語は、抗原結合ドメイン、例えばＦａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、ＴａｎｄＡｂｓ二量体、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）、ｄｓＦｖ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、Ｆｄ、線状抗体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント、バイボディ（ｂｉｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）（それぞれ二重特異性又は三重特異性のｓｃＦｖ−Ｆａｂ融合体）；ｓｃ−ダイアボディ；カッパ（ラムダ）ボディ（ｓｃＦｖ−ＣＬ融合体）；ＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、Ｔ細胞を誘引するためのｓｃＦｖ−ｓｃＦｖタンデム）；ＤＶＤ−Ｉｇ（二重可変ドメイン抗体、二重特異性フォーマット）；ＳＩＰ（小型免疫タンパク質、ミニボディの一種）；ＳＭＩＰ（「小型モジュラー免疫医薬」ｓｃＦｖ−Ｆｃ二量体；ＤＡＲＴ（ｄｓ安定化ダイアボディ「Ｄｕａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＲｅＴａｒｇｅｔｉｎｇ」）；１つ以上のＣＤＲなどを含む小型抗体模倣物などを含む。種々の抗体ベースの構築物及びフラグメントを調製及び使用するための技術は当技術分野において周知である（Kabat et al., 1991を参照のこと、参照により本明細書に具体的に組み入れられる）。ダイアボディは特に、EP 404, 097及びWO 93/1 1 161にさらに記載されているのに対し；線状抗体は、Zapata et al.(1995)にさらに記載されている。抗体は従来の技術を使用して断片化することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。結果として得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントを処理し、ジスルフィド架橋を還元してＦａｂ’フラグメントを産生することができる。パパイン消化は、Ｆａｂフラグメントの形成に導きうる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、ＴａｎｄＡｂ、ｄｓ−ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメント及び他のフラグメントはまた、組換え技術により合成することができる、又は化学的に合成することができる。抗体フラグメントを産生するための技術は周知であり、そして当技術分野において記載されている。例えば、Beckman et al., 2006；Holliger & Hudson, 2005；Le Gall et al., 2004；Reff & Heard, 2001 ；Reiter et al., 1996；及び Young et al., 1995の各々はさらに、効果的な抗体フラグメントの産生を記載し、可能にする。一部の実施形態では、本発明の抗体は一本鎖抗体である。本明細書で使用するように、用語「単一ドメイン抗体」は当技術分野においてその一般的な意味を有し、天然で軽鎖を欠くラクダ哺乳動物において見出すことができる種類の抗体の単一重鎖可変ドメインを指す。そのような単一ドメイン抗体はまた、「ナノボディ（登録商標）」である。（単一）ドメイン抗体の一般的な記載については、上で引用した先行技術、ならびにEP 0 368 684、Ward et al.（Nature 1989 Oct 12；341 (6242): 544-6）、Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11):484-490；及び  ＷＯ０６／０３０２２０、ＷＯ０６／００３３８８を参照のこと。
【００２６】
本明細書で使用するように、用語「結合する」は、抗体が表面分子について親和性を有することを示す。用語「親和性」は、本明細書で使用するように、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄにより与えられ、ここで［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、及び［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である。親和定数Ｋａは１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)において見出すことができ、これらの参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野において周知の１つの好ましい標準的な方法は、Ｂｉａｃｏｒｅ機器の使用である。
【００２７】
天然抗体では、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに結合しており、各々の重鎖がジスルフィド結合により軽鎖に結合している。２種類の軽鎖、ラムダ（１）とカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３、まとめてＣＨとして言及する）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域が、抗原への結合認識及び特異性を決定する。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖会合、分泌、経胎盤移動、補体結合、及びＦｃ受容体への結合（ＦｃＲ）などを付与する。Ｆｖフラグメントは免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からである残基から作られる。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が抗体結合部位に関与する、又は全体的なドメイン構造、及び故に結合部位に影響を及ぼしうる。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定めるアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、Ｌ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３とそれぞれ命名される３つのＣＤＲを有する。抗原結合部位は、従って、典型的には重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されたアミノ酸配列を指す。抗体可変ドメイン中の残基は、従来、Kabat et al.により考案されたシステムに従って番号付けされている。このシステムは、Kabat et al., 1987において、Sequences of Proteins of Immunological Interest（米国保健社会福祉省、ＮＩＨ）（以下、「Kabat et al.」）に示されている。この番号付けシステムを本明細書において使用する。Ｋａｂａｔ残基の命名は、配列番号中のアミノ酸残基の直線的な番号付けと常に直接対応するわけではない。実際の直線的なアミノ酸配列は、基本的な可変ドメイン構造のフレームワーク又は相補性決定領域を問わず、構造成分の短縮又は挿入に対応する厳密なＫａｂａｔ番号付けよりも少ない又は追加のアミノ酸を含みうる。残基の正しいＫａｂａｔ番号付けは、抗体の配列中の相同性の残基と「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列との整列化により、所与の抗体について決定してもよい。重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基３１〜３５Ｂ（Ｈ−ＣＤＲ１）、残基５０〜６５（Ｈ−ＣＤＲ２）、及び残基９５〜１０２（Ｈ−ＣＤＲ３）に位置付けられる。軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従って、残基２４〜３４（Ｌ−ＣＤＲ１）、残基５０〜５６（Ｌ−ＣＤＲ２）、及び残基８９〜９７（Ｌ−ＣＤＲ３）���位置付けられる。
【００２８】
一部の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。本明細書で使用するように、「ヒト化」は、ＣＤＲ領域の外側のアミノ酸の一部、大半、又は全部が、ヒト免疫グロブリン分子から由来する対応するアミノ酸で置換されている抗体を記載する。ヒト化の方法は、米国特許第４，８１６，５６７号、第５，２２５，５３９号、第５，５８５，０８９号、第５，６９３，７６１号、第５，６９３，７６２号、及び第５，８５９，２０５号に記載されているものを含むが、これらに限定せず、これらは参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
一部の実施形態では、抗体は完全ヒト抗体である。完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫化することによって調製することができる。例えば、米国特許第５，５９１，６６９号、第５，５９８，３６９号、第５，５４５，８０６号、第５，５４５，８０７号、第６，１５０，５８４号、及びそれらにおいて引用される参考文献を参照のこと。その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【００３０】
一部の実施形態では、抗体は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）アクセッション番号：ＰＴＡ−１３１０２として寄託されているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞により産生されるＨａｌ５−１０ａｃｌ２と命名された抗体の重鎖及び軽鎖可変領域を含む。Ｈａｌ５−１０ａｃｌ２の重鎖可変領域は、配列番号１に示すアミノ酸を有し、Ｈａｌ５−１０ａｃｌ２の軽鎖可変領域は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。
配列番号１
【化１】
2020507576.tif 000002
配列番号２
【化２】
2020507576.tif 000003
【００３１】
一部の実施形態では、抗体は、ＨＡ１５−１０ａｃｌ２の重鎖可変領域の重鎖ＣＤＲ（配列番号１）を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体は、ＨＡ１５−１０ａｃｌ２の軽鎖可変領域の軽鎖ＣＤＲ（配列番号２）を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害を媒介する。本明細書で使用するように、用語「抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、非特異的な細胞傷害性細胞（例、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が標的細胞上で結合抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を起こす細胞媒介性反応を指す。任意の特定の作用機序に限定されることを望まないが、ＡＤＣＣを媒介するこれらの細胞傷害性細胞は一般的にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。
【００３３】
本明細書で使用するように、「Ｆｃ領域」は、第１の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む。このように、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥ及びＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインへの柔軟なヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡ及びＩｇＭについては、ＦｃはＪ鎖を含みうる。ＩｇＧについては、Ｆｃは免疫グロブリンドメインＣガンマ２及びＣガンマ３（Ｃγ２及びＣγ３）、ならびにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端への残基Ｃ２２６又はＰ２３０を含むと定義され、ここで番号付けはKabat et al.のようにＥＵインデックスに従う（１９９１年、ＮＩＨ公開９１−３２４２、National Technical Information Service、バージニア州スプリングフィールド）。「Ｋａｂａｔに示すＥＵインデックス」は、Kabat et al.（上記）に記載されているようにヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。Ｆｃは、単離におけるこの領域、又は抗体、抗体フラグメント、もしくはＦｃ融合タンパク質の文脈におけるこの領域を指しうる。Ｆｃ変異体タンパク質は、抗体、Ｆｃ融合体、又はＦｃ領域を含む任意のタンパク質もしくはタンパク質ドメインでありうる。特に好ましいのは、Ｆｃ領域の天然に生じない変異体である、変異体Ｆｃ領域を含むタンパク質である。天然に生じないＦｃ領域（本明細書では「変異体Ｆｃ領域」としても言及する）のアミノ酸配列は、野生型アミノ酸配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、及び／又は欠失を含む。挿入又は置換の結果として変異体Ｆｃ領域の配列中に現れる任意の新たなアミノ酸残基は、天然に生じないアミノ酸残基として言及されうる。注意：多型が多数のＦｃ位置で観察されており（Ｋａｂａｔ  ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、及び３５８を含むが、これらに限定しない）、このように、提示された配列と先行技術における配列の間にわずかな違いが存在しうる。
【００３４】
用語「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するために使用する。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及び／又はＦｃγＲＩＩＶを発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現が、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92 (1991)において概要が述べられている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ、例えば米国特許第５，５００，３６２号又は第５，８２１，３３７号に記載されているものなどを実施してもよい。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、動物モデル、例えばClynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 (1998)に開示されているものなどにおいて評価しうる。本明細書で使用するように、用語「エフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。細胞は少なくともＦｃγＲＩ、ＦＣγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及び／又はＦｃγＲＩＶを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球を含む。
【００３５】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は全長抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ３抗体である。
【００３６】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＶについての増加した親和性を有する変異体Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む変異体Ｆｃ領域を含むのに対し、前記の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、挿入、又は欠失は、ＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＶについての増加した親和性をもたらす。一部の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、又は欠失を含む変異体Ｆｃ領域を含むのに対し、前記の少なくとも１つのアミノ酸残基は、残基２３９、３３０、及び３３２からなる群より選択し、ここでアミノ酸残基はＥＵインデックスに従って番号付けする。一部の実施形態では、本発明の抗体は、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む変異体Ｆｃ領域を含み、ここで前記の少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｄ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、及び１３３２Ｅからなる群より選択し、ここでアミノ酸残基はＥＵインデックスに従って番号付けする。
【００３７】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体のグリコシル化は修飾されている。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（即ち、抗体がグリコシル化を欠く）。グリコシル化は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させるために変えることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変えることにより達成することができる。例えば、１つ以上のアミノ酸置換を作製することができ、それによって１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を除去することができる。そのような非グリコシル化は、抗原についての抗体の親和性を増加させうる。そのようなアプローチは、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号にさらに詳細に記載されている。加えて、又はあるいは、改変型のグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が低下した又は全くない低フコシル化又は非フコシル化抗体、又は二分枝ＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体などを作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化機構を伴う宿主細胞中で抗体を発現させることにより達成することができる。改変されたグリコシル化機構を伴う細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それにより改変されたグリコシル化を伴う抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、Hang et al.による欧州特許第１，１７６，１９５号には、そのような細胞株において発現される抗体が低フコシル化を示す又はフコシル残基を欠くようにフコシルトランスフェラーゼをコードする、機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株が記載されている。従って、一部の実施形態では、本発明のヒトモノクローナル抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えばフコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の不十分な発現を伴う哺乳動物細胞株における組換え発現により産生されうる。PrestaによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結炭水化物に付着させる低下した能力を伴い、また、宿主細胞中で発現される抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞が記載されている（Shields, R.L. et al, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、操作細胞株において発現される抗体が増加した二分枝ＧｌｃＮａｃ構造を示し、それによって抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらすように、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作された細胞株が記載されている（Umana et al, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180も参照のこと）。Eureka Therapeuticsは、フコシル残基を欠く改変された哺乳動物グリコシル化パターンを伴う抗体を産生することが可能な遺伝子操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞がさらに記載されている（http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html）。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターン用に操作され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することが可能な酵母又は糸状菌において産生することができる（例えば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照のこと）。
【００３８】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、補体依存的な細胞傷害を媒介した。「補体依存的な細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体活性化を開始し、補体の存在において標的を溶解する分子の能力を指す。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子（例、抗体）への補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）の結合により開始される。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイ（例、Gazzano-Santaro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996)に記載されている）が実施されうる。
【００３９】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、抗体依存的な貪食性を媒介する。本明細書で使用するように、用語「抗体依存的な貪食性」又は「オプソニン化」は、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食性を起こす細胞媒介性反応を指す。
【００４０】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、上に記載するように、ＳＬＩＴＲＫ６に対して向けられた第１の抗原結合部位及びエフェクター細胞に対して向けられた少なくとも１つの第２の抗原結合部位を含む多特異性抗体である。前記実施形態では、第２の抗原結合部位は、例えばヒトエフェクター細胞上の抗原に結合することなどにより、死滅機構を動員するために使用する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、ＡＤＣＣ（例えばナチュラルキラー細胞など）を誘導することが可能である。例えば、単球、マクロファージはＦｃＲを発現し、標的細胞の特異的な死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示に関与する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は標的抗原又は標的細胞を貪食しうる。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、液性因子（例えばサイトカインなど）により調節されうる。エフェクター細胞は、標的抗原を貪食すること、又は標的細胞を貪食もしくは溶解することができる。適切な細胞傷害性薬剤及び第２の治療的薬剤を以下に例示し、毒素（例えば放射標識ペプチドなど）、化学療法用薬剤、及びプロドラッグを含む。一部の実施形態では、第２の結合部位は上で定義したようにＦｃ受容体に結合する。一部の実施形態では、第２の結合部位はＮＫ細胞の表面分子に結合し、前記細胞を活性化できるようにする。一部の実施形態では、第２の結合部位はＮＫｐ４６に結合する。本発明の多特異性抗体分子の例示的なフォーマットは、（ｉ）化学的ヘテロコンジュゲートにより架橋された２つの抗体（１つはＩＬＣの特定表面分子への特異性を伴い、及び他は第２抗原への特異性を伴う；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一の抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域（例、余剰のペプチドリンカーによって直列に連結された２つのｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体；（ｉｖ）二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）（ここで、各々の軽鎖及び重鎖は、短いペプチド連結を通じて直列に２つの可変ドメインを含む（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-IgTM) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に結合した二重特異性（Ｆａｂ'）２フラグメント；（ｖｉ）Ｔａｎｄａｂ（標的抗原の各々についての２つの結合部位を有する四価二重特異性抗体をもたらす２つの一本鎖ダイアボディの融合体である）；（ｖｉｉ）フレキシボディ（ｓｃＦｖとダイアボディの組み合わせであり、多価分子をもたらす）；（ｖｉｉｉ）いわゆる「ドックアンドロック」分子（プロテインキナーゼＡ中の「二量体化及びドッキングドメイン」に基づき、Ｆａｂに適用すると、異なるＦａｂフラグメントに連結された２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価二重特異性結合タンパク質をもたらすことができる）；（ｉｘ）いわゆるスコーピオン分子（例えば、ヒトＦａｂアームの両端に融合した２つのｓｃＦｖを含む）；及び（ｘ）ダイアボディを含むが、これらに限定しない。二重特異性抗体についての別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制するための相補的ＣＨ３ドメインを伴うＩｇＧ様分子である。そのような分子は、公知の技術、例えばTriomab／Quadroma（Trion Pharm／Fresenius Biotech）、Knob-into-Hole（Genentech��、CrossMAb（Roche）及び静電整合（Amgen）、LUZ-Y（Genentech）、鎖交換操作ドメイン体（SEEDbody）（EMD Serono）、Biclonic（Merus）、ならびにDuoBody（Genmab A／S）技術などとして公知のものなどを使用して調製することができる。
【００４１】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のために適切な抗体は治療用部分、即ち、薬物にコンジュゲートされている。治療用部分は、例えば、細胞毒素、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解ペプチド、又は放射性同位元素でありうる。そのようなコンジュゲートは、本明細書において「抗体−薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」として言及する。
【００４２】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は細胞傷害性部分にコンジュゲートされている。細胞傷害性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；臭化エチジウム；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルチシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリン阻害剤（例えばメイタンシン又はその類似体もしくは誘導体など）；抗有糸分裂剤（例えばモノメチルアウリスタチンＥもしくはＦ又はそれらの類似体もしくは誘導体など）；ドラスタチン１０もしくは１５又はその類似体；イリノテカン又はその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、又はクラドリビンなど）；アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、ミトマイシンＣなど）；白金誘導体（例えばシスプラチン又はカルボプラチンなど）；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラヘルマイシン（ＣＣ−１０６５）、又はそれらの類似体もしくは誘導体；抗生物質（例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）など）；ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素及び関連分子（例えばジフテリアＡ鎖及びその活性フラグメントなど）ならびにハイブリッド分子、リシン毒素（例えばリシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素など）、コレラ毒素、志賀様毒素（例えばＳＬＴ  Ｉ、ＳＬＴ  ＩＩ、ＳＬＴ  ＩＩＶ）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆ボウマン・バークプロテアーゼ阻害剤、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデクシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリタンパク質、  ジアシンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質（例えばＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓなど）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリン毒素；及びシュードモナスエンドトキシンからなる群より選択してもよい。
【００４３】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、アウリスタチン又はそのペプチド類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。アウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解ならびに核及び細胞分裂に干渉することが示されており（Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584）、抗癌活性（ＵＳ５６６３１４９）及び抗真菌活性（Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965）を有する。例えば、アウリスタチンＥをパラ−アセチル安息香酸又はベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれＡＥＢ及びＡＥＶＢを産生することができる。他の典型的なアウリスタチン誘導体は、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ）、及びＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）を含む。適切なアウリスタチンならびにアウリスタチン類似体、誘導体、及びプロドラッグ、ならびにＡｂへのアウリスタチンのコンジュゲートのための適切なリンカーは、例えば、米国特許第５，６３５，４８３号、第５，７８０，５８８号、及び第６，２１４，３４５号ならびに国際特許出願公開ＷＯ０２０８８１７２、ＷＯ２００４０１０９５７、ＷＯ２００５０８１７１１、ＷＯ２００５０８４３９０、ＷＯ２００６１３２６７０、ＷＯ０３０２６５７７、ＷＯ２００７００８６０、ＷＯ２０７０１１９６８、及びＷＯ２０５０８２０２３において記載されている。
【００４４】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、ピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。適切なＰＤＢ及びＰＤＢ誘導体、ならびに関連技術は、例えば、Hartley J. A. et al., Cancer Res 2010；70(17) : 6849-6858；Antonow D. et al., Cancer J 2008；14(3) : 154-169；Howard P.W. et al., Bioorg Med Chem Lett 2009；19: 6463-6466、及びSagnou et al., Bioorg Med Chem Lett 2000；10(18) : 2083-2086において記載されている。
【００４５】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、アントラサイクリン、メイタンシン、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、ドラスタチン１０、ドラスタチン１５、イリノテカン、モノメチルアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＦ、ＰＤＢ、又はそれらのいずれかの類似体、誘導体、もしくはプロドラッグからなる群より選択される細胞傷害性部分にコンジュゲートする。
【００４６】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、アントラサイクリン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はメイタンシン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はカリケアマイシン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はデュオカルマイシン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はラヘルマイシン（ＣＣ−１０６５）又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はドラスタチン１０又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はドラスタチン１５又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はモノメチルアウリスタチンＥ又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はモノメチルアウリスタチンＦ又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はピロロ［２，１−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。一部の実施形態では、抗体はイリノテカン又はその類似体、誘導体、もしくはプロドラッグにコンジュゲートする。
【００４７】
一部の実施形態では、癌細胞の枯渇のための適切な抗体は、核酸又は核酸関連分子にコンジュゲートする。そのような一実施形態では、コンジュゲート核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）又はデオキシリボヌクレアーゼ（例、ＤＮａｓｅ  Ｉ）、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例、ｓｉＲＮＡ分子）、又は免疫刺激性核酸（例、免疫刺激性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。一部の実施形態では、抗体はアプタマー又はリボザイムにコンジュゲートする。
【００４８】
分子を抗体にコンジュゲートするための技術は当技術分野において周知である（例えば、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985)；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,” Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)；及び Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58.を参照のこと。また、ＰＣＴ公開ＷＯ８９／１２６２４．を参照のこと）。典型的には、核酸分子は、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基を通じて、抗体上のリジン又はシステインに共有結合的に付着される。操作されたシステインを使用したコンジュゲート又は非天然アミノ酸の組み入れの方法によって、コンジュゲートの均一性が改善されることが報告されている（Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.；Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutula et al. (2008)は、「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的なコンジュゲートを開発し、それは従来のコンジュゲート方法と比較して改善された治療指数を呈すると主張している。抗体中に組み入れられている非天然アミノ酸へのコンジュゲートもまた、ＡＤＣについて探索されている；しかし、このアプローチの一般性はまだ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者はまた、アシル供与グルタミン含有タグ（例、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ又はＱタグ）又はポリペプチド操作により反応性に作製された内因性グルタミン（例、ポリペプチド上のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は変異を介して）を用いて操作されたFc含有ポリペプチドを想定することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミン供与薬剤（例、反応性アミンを含む又はそれに付着された小分子）と共有結合的に架橋し、アミン供与薬剤がアシル供与グルタミン含有タグ又は接近可能／曝露／反応性内因性グルタミンを介してＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的にコンジュゲートされた操作されたＦｃ含有ポリペプチドコンジュゲートの安定で均質な集団を形成することができる（ＷＯ ２０１２０５９８８２）。
【００４９】
本明細書で使用するように、用語「組み合わせ」は、第１の薬物をさらなる（第２、第３…）薬物と一緒に提供する全ての投与の形態を指すことを意図する。薬物は同時に、別々に、又は連続的に、及び任意の順序で投与してもよい。組み合わせにおいて投与される薬物は、薬物が送達される被験体において生物学的活性を有する。本発明の文脈内で、組み合せは、このように、少なくとも２つの異なる薬物を含み、それにおいて１つの薬物は少なくともＭＡＰＫ阻害剤（例、ＢＲＡＦ阻害剤又はＢＲＡＦ阻害剤＋ＭＥＫ阻害剤）であり、それにおいて他の薬物は少なくとも、ＳＬＩＴＲＫ６発現癌細胞の細胞死を誘導することが可能な薬剤である。一部の例では、本発明の組み合わせは癌細胞の総合的な致死率をもたらす。
【００５０】
「治療的に効果的な量」は、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を達成するのに効果的な量を指す。治療的に効果的な量の薬物は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する薬物の能力などの因子に従って変動しうる。治療的に効果的な量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害な効果よりも、治療的に有益な効果が上回っている量である。薬物の効率的な投与量及び投与レジメンは、処置される疾患又は状態に依存し、当業者により決定されうる。当技術分野における通常の技術を有する医師は、要求される医薬的組成物の効果的な量を容易に決定し、処方しうる。例えば、医師は、所望の治療的な効果を達成し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させるために、要求されるよりも低いレベルで、医薬的組成物中で用いられる薬物の投与量を開始することができる。一般的に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンに従って治療的効果を産生するために効果的な最低用量である化合物の量であろう。そのような効果的な量は一般的に、上で記載する因子に依存するであろう。例えば、治療的使用のための治療的に効果的な量は、疾患の進行を安定化させるその能力により測定されうる。治療用化合物の治療的に効果的な量は、腫瘍の大きさを減少させる、そうでなければ、被験体において症状を寛解させうる。当業者は、被験体の大きさ、被験体の症状の重症度、及び選択された特定の組成物又は投与の経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるであろう。薬物の治療的に効果的な量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜１００mg/kg（例えば約０．１〜５０mg/kgなど）、例えば約０．１〜２０mg/kg（例えば約０．１〜１０mg/kgなど）、例えば約０．５（例えば約０．３など）、約１、約３mg/kg、約５mg/kg、又は約８mg/kgである。本発明の抗体の治療的に効果的な量の例示的で非限定的な範囲は、０．０２〜１００mg/kg、例えば約０．０２〜３０mg/kgなど、例えば約０．０５〜１０mg/kg又は０．１〜３mg/kgなど、例えば約０．５〜２mg/kgである。投与は、例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下でありうるが、例えば標的部位の近位に投与する。上の処置方法及び使用における投薬レジメンは、最適な所望の反応（例、治療反応）を提供するように調整する。例えば、単回ボーラスを投与してもよく、数回に分割した用量を経時的に投与してもよく、又は治療状況の緊急性により示されるように用量を比例的に低下又は増加させてもよい。一部の実施形態では、処置の有効性は治療の間に（例、所定の時間点で）モニターする。非限定的な例として、本発明に従った処置は、約０．１〜１００mg/kg、例えば０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００mg/kg/日などの量の本発明の薬剤の１日投与量として、処置の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７���２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日の少なくとも１つ、又は代わりに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週の少なくとも１つで、又はそれらの任意の組み合わせで、２４、１２、８、６、４、もしくは２時間毎に単一又は分割用量、又はそれらの任意の組み合わせを使用して提供してもよい。
【００５１】
典型的には、本発明の薬物は、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の形態で被験体に投与する。これらの組成物中で使用されうる医薬的に許容可能な担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えばリン酸など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩又は電解質（例えば硫酸プロタミンなど）、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレン グリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びウール脂肪を含むが、これらに限定しない。被験体への投与における使用のために、組成物は被験体への投与のために製剤化されるであろう。本発明の組成物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、直腸性に、経鼻的に、頬側に、経膣的に、又は埋め込まれたリザーバーを介して投与してもよい。本明細書で使用するものは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内、及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。本発明の組成物の無菌注射形態は、水性又は油性懸濁液でありうる。これらの懸濁液は、適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。無菌注射用製剤は、例えば1,3-ブタンジオール中の溶液として、無毒の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中の無菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。用いることが許容されるビヒクル及び溶媒としては、水、リンゲル液、及び等張塩化ナトリウム溶液がある。また、無菌固定油が溶媒又は懸濁媒として従来から用いられている。この目的のために、任意の無菌性固定油（合成モノグリセリド又はジグリセリドを含む）を用いてもよい。脂肪酸（例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体など）は、天然の医薬的に許容可能な油（例えばオリーブ油又はヒマシ油など）と同様に、特にそれらのポリオキシエチル化バージョンで、注射剤の調製において有用である。これらの油性溶液又は懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤（例えばカルボキシメチルセルロースなど）、又は乳剤及び懸濁剤を含む医薬的に許容可能な剤形の製剤化において一般に使用される類似の分散剤を含みうる。他の一般に使用される界面活性剤、例えば医薬的に許容可能な固体、液体、又は他の剤形の製造において一般に使用されるＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎｓ、及び他の乳化剤又はバイオアベイラビリティー促進剤などもまた製剤化の目的のために使用してもよい。本発明の組成物は、任意の経口的に許容可能な剤形（カプセル、錠剤、水性懸濁液剤、又は液剤を含むが、これらに限定しない）で経口投与してもよい。経口使用のための錠剤の場合いおいて、一般に使用される担体はラクトース及びコーンスターチを含む。滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウムなど）も典型的に加えられる。カプセル形態での経口投与のために、有用な希釈剤は、例えば、ラクトースを���む。水性懸濁液が経口使用のために要求される場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤と組み合わせる。所望の場合、特定の甘味剤、香味剤、又は着色剤も加えてもよい。あるいは、本発明の組成物は直腸投与用の坐剤の形態で投与してもよい。これらは、室温では固体であるが、しかし直腸温度では液体であり、従って、直腸内で融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することにより調製することができる。そのような材料は、カカオバター、ミツロウ、及びポリエチレングリコールを含む。本発明の組成物はまた、特に処置の標的が局所適用により容易に接近可能な領域又は器官（眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む）を含む場合、局所投与してもよい。適切な局所製剤は、これらの領域又は器官の各々について容易に調製される。局所適用のために、組成物は、１つ以上の担体中に懸濁又は溶解した活性成分を含む適切な軟膏剤中で製剤化してもよい。本発明の化合物の局所投与用の担体は、鉱油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水を含むが、これらに限定しない。あるいは、組成物は、１つ以上の医薬的に許容可能な担体中に懸濁又は溶解された活性成分を含む適切なローション又はクリーム中に製剤化することができる。適切な担体は、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水を含むが、これらに限定しない。下部腸管のための局所適用は、直腸坐剤製剤（上記参照）において又は適切な浣腸製剤においてもたらすことができる。パッチを使用してもよい。本発明の組成物はまた、鼻用エアロゾル又は吸入により投与してもよい。そのような組成物は医薬製剤の分野において周知の技術に従って調製し、ベンジルアルコール又は他の適当な防腐剤、生物学的利用能を増強するための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の通常の可溶化剤もしくは分散剤を用いて生理食塩水中の溶液として調製してもよい。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００mg（１０mL）又は５００mg（５０mL）の使い捨てバイアル中に１０mg/mLの濃度で供給することができる。産物は、９．０mg/mLの塩化ナトリウム、７．３５mg/mLのクエン酸ナトリウム二水和物、０．７mg/mLのポリソルベート８０、及び注射用滅菌水中でＩＶ投与用に製剤化する。ｐＨを６．５に調整する。本発明の医薬組成物中の抗体についての例示的な適切な投与量の範囲は、約１mg/m 2 〜５００mg/m 2でありうる。しかし、これらのスケジュールは例示的なものであり、臨床試験において決定されなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び忍容性を考慮に入れて、最適なスケジュール及びレジメンを適合させることができることが理解されるであろう。注射用（例、筋肉内、静脈内）の本発明の医薬組成物は、無菌緩衝水（例、筋肉内用に１ml）、及び約１ng〜約１００mgの間、例えば、約５０ng〜約３０mgの間、又はより好ましくは約５mg〜約２５mgの間の本発明の阻害剤を含むように調製することができうる。
【００５２】
本発明のさらなる目的は、ｉ）被験体から得られた腫瘍サンプル中のＳＬＩＴＲＫ６の発現を検出すること、及びｉｉ）ＳＬＩＴＲＫ６の発現が工程ｉ）で検出された場合に被験体が再発すると結論付けることを含む、ＭＡＰＫ阻害剤の投与を含む処置レジメン後に、癌に罹患した被験体において再発を決定する方法に関する。
【００５３】
本明細書で使用する用語「再発」は、反応性の初期期間（例、完全反応又は部分反応）後の癌の再出現を指す。反応性の初期期間は、特定の閾値を下回る（例、２０%、１%、１０%、５%、４%、３%、２%、又は１%を下回る）癌細胞のレベルを含みうる。再出現は、特定の閾値を上回り（例、２０%、１%、１０%、５%、４%、３%、２%、又は１%を上回り）上昇した癌細胞のレベルを含みうる。より一般的には、反応（例、完全反応又は部分反応）は、検出可能なMRD（最小残存病変）の非存在を含みうる。一部の実施形態では、反応性の初期期間は少なくとも１、２、３、４、６、８、１０、もしくは１２ヶ月間；又は少なくとも１、２、３、４、もしくは５年間持続する。
【００５４】
本明細書で使用するように、用語「腫瘍サンプル」は、被験体から由来する任意の組織腫瘍サンプルを意味する。前記組織サンプルはインビトロ評価の目的のために得る。一部の実施形態では、腫瘍サンプルは、被験体から切除された腫瘍から由来しうる。一部の実施形態では、腫瘍サンプルは、被験体の原発腫瘍において実施された、又は被験体の原発腫瘍から離れた転移性サンプルにおいて実施された生検からもたらされうる。一部の実施形態では、腫瘍サンプルは循環腫瘍細胞のサンプルである。本明細書で使用するように、用語「循環性腫瘍細胞」又は「ＣＴＣ」は、腫瘍から剥離し、被験体の血流中を循環している癌性腫瘍から由来する癌細胞を指す。典型的には、ＣＴＣは、フィルター及び／又はマーカーに基づく方法を使用して血液サンプルから単離する。例えば、ＣＴＣは、例えばCellSearchシステムを用いて、その表面上にこの抗原を発現するＣＴＣを磁気的にとらえるための抗ＥｐＣＡＭ抗体を使用して単離することができる（Scher et al., 2005；Berthold et al., 2008；Madan et al., 2011；Fleming et al., 2006；Gulley and Drake, 2011；Bubley et al., 1999；Scher et al., 2008）。他のアプローチは、例えば、抗ＥｐＣＡＭ抗体との組み合わせにおいても使用される抗サイトケラチン８及び１８抗体を用いた免疫組織化学で、又はＣＴＣチップ上で、ならびにＥＰＩＳＰＯＴテスト（ＣＤ４５細胞を最初に枯渇させ、残りの細胞を検証する）で循環する核酸の存在を検出すること（Schwarzenbach et al., 2011）を含む。また、コラーゲン接着マトリックスアッセイ（ＣＡＭアッセイ）を使用することができる（これらの方法に関する概説については、Doyen et al., 2011を参照のこと）。
【００５５】
ＳＬＩＴＲＫ６の発現の検出は、当技術分野において周知の任意の方法により実施してもよい。
【００５６】
一部の実施形態では、検出は、免疫検出（例えば免疫組織化学又は免疫蛍光など）により実施する。例えば、免疫組織化学は、典型的には以下の工程を含む：ｉ）腫瘍組織サンプルをホルマリンで固定すること、ｉｉ）前記腫瘍組織サンプルをパラフィン中に包埋すること、ｉｉｉ）染色のために前記腫瘍組織サンプルを切片に切断すること、ｉｖ）前記切片をマーカー（即ち、ＳＬＩＴＲＫ６）について特異的な結合パートナーとインキュベートすること、 ｖ）前記切片をリンスすること、ｖｉ）前記切片を典型的にはビオチン化された二次抗体とインキュベートすること、及びｖｉｉ）抗原−抗体複合体を、典型的にはアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体を用いて明らかにすること。したがって、腫瘍組織サンプルを最初に結合パートナーとインキュベートする。洗浄後、目的のマーカーに結合している標識抗体は、標識抗体の種類（例、放射性、蛍光、又は酵素標識）に依存して、適切な技術により明らかにされる。多重標識化を同時に実施することができる。あるいは、本発明の方法は、（染色シグナルを増強するために）増幅系に結合した二次抗体及び酵素分子を使用しうる。そのような結合二次抗体は商業的に利用可能である（例、DakoからのEnVisionシステム）。対比染色を使用することができる（例、Ｈ＆Ｅ、ＤＡＰＩ、Hoechst）。当業者には明らかなように、他の染色方法を任意の適切な方法又はシステムを使用して達成することができる（自動化、半自動化、又は手動システムを含む）。例えば、１つ以上の標識を抗体に付着させることができ、それにより標的タンパク質（即ち、マーカー）の検出を可能にする。例示的な標識は、放射性同位元素、発蛍光団、リガンド、化学発光剤、酵素、及びそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、標識は量子ドットである。一次及び／又は二次親和性リガンドにコンジュゲートすることができる標識の非限定的な例は、蛍光色素又は金属（例、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フルオレサミン）、発色性色素（例、ロドプシン）、化学発光化合物（例、ルミナール、イミダゾール）、生物発光タンパク質（例、ルシフェリン、ルシフェラーゼ）、ハプテン（例、ビオチン）を含む。種々の他の有用な蛍光剤及び発色団が、Stryer L (1968) Science 162:526-533及びBrand L and Gohlke J R (1972) Annu. Rev. Biochem. 41:843-868に記載されている。親和性リガンドはまた、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ラクタマーゼ）、放射性同位元素（例、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉ）及び粒子（例、金）で標識することができる。結果として得られた染色標本は、検出可能なシグナルを見て、画像（例えば染色のデジタル画像など）を取得するためのシステムを使用して画像化することができる。画像取得のための方法は当業者には周知である。例えば、一度サンプルが染色されると、任意の光学的又は非光学的撮像装置を使用して染色又はバイオマーカー標識を検出することができる（例えば、例えば正立又は倒立光学顕微鏡、走査型共焦点顕微鏡、カメラ、走査型又はトンネル電子顕微鏡、走査型プローブ顕微鏡、及び撮像赤外線検出器など）。一部の例では、画像はデジタル的にとらえることができる。得��れた画像を次に、サンプル中のマーカーの量を定量的又は半定量的に決定するために使用することができる。免疫組織化学での使用のための適切な種々の自動化サンプル処理、走査、及び分析システムを当技術分野において利用可能である。そのようなシステムには、自動染色及び顕微鏡スキャン、コンピューター画像分析、連続切片比較（サンプルの向き及びサイズにおける変動を制御するため）、デジタル報告書作成、ならびにサンプルの記録及び追跡（例えば組織切片を置いたスライドなど）を含みうる。細胞及び組織（免疫染色サンプルを含む）の定量分析を実施するために従来の光学顕微鏡とデジタル画像処理システムを組み合わせた細胞撮像システムが商業的に利用可能である。例えば、ＣＡＳ−２００システム（Becton、Dickinson＆Co.）を参照のこと。特に、検出は手動で又は画像処理技術（コンピュータープロセッサ及びソフトウェアを含む）により行うことができる。そのようなソフトウェアを使用し、例えば、画像を、当業者に公知の手順を使用して、例えば、因子（染色品質又は染色強度を含む）に基づいて構成、較正、標準化、及び／又は検証することができる（例えば、公開された米国特許公開番号ＵＳ２０１００１３６５４９を参照のこと）。
【００５７】
一部の実施形態では、ＳＬＩＴＲＫ６の発現を検出することは、ＳＬＩＴＲＫ６をコードするｍＲＮＡの量を検出することにより決定する。ｍＲＮＡの量を決定するための方法は当技術分野において周知である。例えば、サンプル（例、被験体から調製された細胞又は組織）中に含まれる核酸は、例えば溶解酵素又は化学溶液を使用して標準的な方法に従って最初に抽出するか、又は製造者の指示に従って核酸結合樹脂により抽出する。抽出されたｍＲＮＡを次に、ハイブリダイゼーション（例、ノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション）及び／又は増幅（例、ＲＴ−ＰＣＲ）により検出する。他の増幅の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、及び核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）を含む。典型的には、核酸プローブは、例えば、開示されたプローブを使用して標的核酸分子の検出を可能にするための1つ以上の標識を含む。検出可能な標識は、有色、蛍光、燐光、及び発光分子ならびに材料、（例えば無色物質を有色物質に変換すること、もしくはその逆により、又は沈殿物を産生すること、もしくはサンプルの濁度を増加させることにより）１つの物質を別の物質に変換して検出可能な差を提供する触媒（例えば酵素など）、抗体結合相互作用により検出することができるハプテン、ならびに常磁性及び磁性分子又は材料を含む。検出可能な標識の特定の例は、蛍光分子（又は蛍光色素）を含む。多数の蛍光色素が当業者に公知であり、例えば、Life Technologies（以前のInvitrogen）より選択することができ、例えば、The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologiesを参照のこと。開示された方法を使用して作製されたプローブは、核酸検出、例えばＩＳＨ手順（例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、発色インサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、及び銀インサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ））又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などのために使用することができる。ＦＩＳＨ、ＣＩＳＨ、及びＳＩＳＨのための多数の手順が当技術分野において公知である。例えば、ＦＩＳＨを実施するための手順が、米国特許第５，４４７，８４１号；第５，４７２，８４２号；及び第５，４２７，９３２号； 例えば、Pir1kel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83:2934-2938, 1986；Pinkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9138-9142, 1988；及び Lichter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:9664-9668, 1988において記載されている。ＣＩＳＨは、例えば、Tanner et al., Am. .1. Pathol. 157:1467-1472, 2000、及び米国特許第６，９４２，９７０号において記載されている。追加の検出方法が米国特許第６，２８０，９２９号において提供されている。
【００５８】
本発明を以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１．ＳＬＩＴＲＫ６  ｍＲＮＡ発現は、ＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞においてＭＡＰＫ阻害剤処理下で誘導される。Ａ）Ａ３７５、Ｌｕ１２０５、ＷＭ２６６−４、及びＷＭ９８３Ｂ細胞株を、１μM単独で、又は０．１μMのＭＥＫ阻害剤（ＡＺＤ６２４４）との組み合わせにおいてＢＲＡＦ阻害剤（ＰＬＸ４０３２）で処理した。ＤＭＳＯ対照と比べたｍＲＮＡ増加（倍）をＱ−ＰＣＲにより決定する。結果を、３回の独立した実験の平均の平均値±ＳＤとして提示する。＊＊＊ｐ＜０．００１；Ｔ検定。Ｂ）ＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞株ＷＭ３５及びＷＭ１１５を、単独で又はＭＥＫ阻害剤（ＡＺＤ６２４４、０．１μM）との組み合わせにおいてＢＲＡＦ阻害剤（ＰＬＸ４０３２、１μM）で７２時間にわたり処理し、ＳＬＩＴＲＫ６  ｍＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。示したデータは、３回の独立した実験の平均値±標準偏差である。＊＊ｐ＜０．０１；＊ｐ＜０．０５；ｔ検定。
【図２】図２．ＳＬＩＴＲＫ６に対して向けられたｓｉＲＮＡは、転移性メラノーマ細胞株においてその発現を阻害する。Ａ３７５及びＷＭ２６６−４細胞株を、最初にＳＬＩＴＲＫ６に対するｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次に１μM単独で又は０．１μMのＡＺＤ６２４４との組み合わせにおいて７２時間にわたりＰＬＸ４０３２で処理する。ＳＬＩＴＲＫ６の発現をウエスタンブロットにより分析する。チューブリンを添加対照として使用する。
【図３】図３．ＭＡＰＫ経路及びＳＬＩＴＲＫ６の同時阻害がＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞のアポトーシスを誘発する。Ａ３７５及びＷＭ２６６−４細胞株を、最初にＳＬＩＴＲＫ６又は対照ｓｉＲＮＡについて特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次に１μM単独で又は０．１μMのＡＺＤ６２４４との組み合わせにおいて７２時間にわたりＰＬＸ４０３２で処理する。経時的なカスパーゼ３及び７の活性化の動態を、Incucyte（登録商標）を使用して蛍光によりモニターする。データは、実験終了時のウェル当たりの細胞数に関して標準化する。これらの結果は２つの実験の代表である。
【図４】図４．ＭＡＰＫ経路及びＳＬＩＴＲＫ６の同時阻害は、ＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞においてアポトーシスを誘発する。Ａ３７５及びＷＭ２６６−４細胞株を、最初にＳＬＩＴＲＫ６又は対照ｓｉＲＮＡについて特異的なｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次に１μM単独で又は０．１μMのＡＺＤ６２４４との組み合わせにおいて７２時間にわたりＰＬＸ４０３２で処理する。カスパーゼ３及びＰＡＲＰの切断はウエスタンブロットにより分析する。チューブリン及びアクチンを添加対照として使用する。これらの結果は３回の実験の代表である。
【図５】図５．ＳＬＩＴＲＫ６に対する抗体は、ＭＡＰＫ阻害剤処理後にだけ膜でその標的に特異的に結合する。Ａ３７５細胞を、ＰＬＸ４０３２（１μM）単独又はＡＺＤ６２４４（０．１μM）との組み合わせにおける４８時間にわたる処理の前に、ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉ−Ｃｔｌ）又はターゲティングＳＬＩＴＲＫ６（ｓｉ−ＳＬＩＴＲＫ６）でトランスフェクトした。細胞を次にＳＬＩＴＲＫ６（緑色）について染色し、ＤＮＡをＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。これらの結果は３つの独立した実験の代表である。
【図６】ＳＬＩＴＲＫ６に対する抗体は、ＭＡＰＫｉ処理後にだけその標的を特異的に内在化する。Ａ３７５細胞を、ＰＬＸ４０３２（１μM）単独又はＡＺＤ６２４４（０．１μM）との組み合わせにおける４８時間にわたる処理の前に、ｓｉＲＮＡ対照（ｓｉ−Ｃｔｌ）又はターゲティングＳＬＩＴＲＫ６（ｓｉ−ＳＬＩＴＲＫ６）でトランスフェクトした。細胞を次に、ＳＬＩＴＲＫ６（緑色）について染色し、ＤＮＡをＤＡＰＩ（青色）で対比染色した。これらの結果は３つの独立した実験の代表である。
【図７】図７．ＳＬＩＴＲＫ６に対するＭＭＡＥコンジュゲート抗体は、単独では細胞の生存率に対する効果を有さない。ＷＭ２６６−４細胞をＤＭＳＯで、又は１０μg/mLのＳＬＩＴＲＫ６（ＡＤＣ）に対する薬物コンジュゲート抗体で７２時間にわたり処理した。細胞生存率をＭＴＳにより測定した。示したデータは、１つの実験の３通りでの平均値±標準偏差である。
【図８】ＳＬＩＴＲＫ６に対するＭＭＡＥコンジュゲート抗体は、２つの細胞株（Ａ３７５及びＷＭ２６６−４）においてＰＬＸ４０３２に細胞を感作させる。Ａ．Ａ３７５細胞をＰＬＸ４０３２単独で、又は１０μg/mLのＳＬＩＴＲＫ６（ＡＤＣ）に対する薬物コンジュゲート抗体との組み合わせにおいて７２時間にわたり処理した。細胞生存率をＭＴＳにより測定し、用量反応を分析した。示したデータは、１つの実験の３通りでの平均値±標準偏差である。Ｂ．Ａ３７５細胞を、１μM単独で、又は１０μg/mLのＳＬＩＴＲＫ６（ＡＤＣ）に対して薬物結合した抗体と、又は０．１μMのＡＺＤ６２４４との組み合わせにおいて、ＰＬＸ４０３２で４８時間にわたり処理した。切断型カスパーゼ−３及び切断型ＰＡＲＰをウエスタンブロッティングにより分析した。ＳＬＩＴＲＫ６の発現を並行して分析した。アクチンが添加対照であった。Ｃ．ＷＭ２６６−４細胞をＰＬＸ４０３２単独で、又は１０μg/mLのＳＬＩＴＲＫ６に対する薬物コンジュゲート抗体（ＡＤＣ）との組み合わせにおいて７２時間にわたり処理した。細胞生存率をＭＴＳにより測定し、用量反応を分析した。示したデータは、１つの実験の３通りでの平均値±標準偏差である。Ｄ．ＷＭ２６６−４細胞を、１μMのＰＬＸ４０３２単独で、又は１０μg/mLのＳＬＩＴＲＫ６（ＡＤＣ）に対する薬物コンジュゲート抗体との組み合わせにおいて、又は０．１μMのＡＺＤ６２４４との組み合わせにおいて４８時間にわたり処理した。切断型カスパーゼ−３及び切断型ＰＡＲＰをウエスタンブロッティングにより分析した。ＳＬＩＴＲＫ６の発現を並行して分析した。アクチンが添加対照であった。
【００６０】
実施例：
ＢＲＡＦ阻害剤へのＢＲＡＦ変異癌に罹患している被験体の反応は、二次耐性及び迅速な再発により劇的に損なわれる。これまで、これらの耐性を駆動する分子機構は完全には理解されていない。最近、本発明者らは、ＢＲＡＦ変異メラノーマ細胞株におけるＢＲＡＦ又はその標的ＭＥＫの阻害が、転写因子ｃ−Ｊｕｎに依存する機構によりＲＨＯＢ発現を誘導することを示した（Oncotarget. 2015 Jun 20;6(17):15250-64） 。特に、本発明者らの知見は、ＢＲＡＦ阻害が腫瘍細胞生存を促進するｃ−Ｊｕｎ／ＲＨＯＢ／ＡＫＴ経路を活性化することを明らかにし、さらにメラノーマのベムラフェニブ耐性におけるこの経路の役割を裏付ける。トランスクリプトーム分析後、本発明者らは、ｃ−Ｊｕｎの活性化がＳＬＩＴＲＫ６（ＳＬＩＴ及びＮＴＲＫ様ファミリー、メンバー６）の発現を誘導することを示した。特に、本発明者らは、ＳＬＩＴＲＫ６発現がベムラフェニブ（ＰＬＸ４０３２）により誘導されることを実証した（図１）。さらに、その誘導の阻害はアポトーシス細胞死に導き（図３及び４）、同時のＢＲＡＦ（又はＭＡＰＫ経路）阻害及びＳＬＩＴＲＫ６下方制御を通じた合成致死経路を明らかにする。このように、活性又は発現の阻害剤によるＳＬＩＴＲＫ６の阻害は、ＭＡＰＫ阻害剤の抗腫瘍効果を増強し、ＭＡＰＫ阻害剤への耐性の出現を回避するはずである。さらに、タンパク質の特異的発現はまた、ＡＤＣＣを媒介することが可能な抗ＳＬＩＴＲＫ６抗体又はＳＬＩＴＲＫ６に結合する抗体−薬物コンジュゲートを用いてそれらを標的化することによる残存癌細胞の枯渇に基づく戦略の道を開く。その目的において、本発明者らは、細胞がＭＡＭＰＫ阻害剤で処理された場合にのみ、ＳＬＩＴＲＫ６に対して向けられたＨａｌ５−１０ａｃｌ２抗体がメラノーマ細胞に結合することを示す。さらに、本発明者らは、抗体がＭＡＰＫ阻害剤での処置後にのみ腫瘍細胞を内在化することを示す。最後に、本発明者らは、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートした抗体が腫瘍細胞をＭＡＰＫ阻害剤に感作させることを２つの細胞株に示す。したがって、結果は、ＭＡＰＫ阻害剤との組み合わせにおける抗ＳＬＩＴＲＫ６抗体−薬物コンジュゲートが合成致死率に導くことを示し、この組み合わせがＭＡＰＫ経路の活性化に関連付けられる癌の処置のために適切でありうることを示す。
【００６１】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献が、本発明が関係する最先端技術を記載している。これらの参考文献の開示を、参照により本開示中に組み入れる。
【図１Ａ】
2020507576.tif 000004
【図１Ｂ】
2020507576.tif 000005
【図２】
2020507576.tif 000006
【図３】
2020507576.tif 000007
【図４】
2020507576.tif 000008
【図５】
2020507576.tif 000009
【図６】
2020507576.tif 000010
【図７】
2020507576.tif 000011
【図８Ａ】
2020507576.tif 000012
【図８Ｂ】
2020507576.tif 000013
【図８Ｃ】
2020507576.tif 000014
【図８Ｄ】
2020507576.tif 000015
【配列表】
2020507576000001.app
【国際調査報告】
2020507576.tif 000016
2020507576.tif 000017
2020507576.tif 000018