(57)【要約】  本発明は、オルガノイド培養組成物及びこれを用いたオルガノイド培養方法に関する。本発明によれば、従来の培地に必須タンパク質成分を代替する化合物を含んでいるため、オルガノイド培養時に一貫した安定性を維持することができ、安い費用で培養が可能である。
2020521514.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の化合物を含むオルガノイド培養用組成物。
［化１］
2020521514.tif 000009
【請求項２】
オルガノイドは、成体幹細胞から由来したことを特徴とする請求項１に記載のオルガノイド培養用組成物。
【請求項３】
オルガノイドは、小腸オルガノイドであることを特徴とする請求項１に記載のオルガノイド培養用組成物。
【請求項４】
前記化合物の濃度は、前記オルガノイド培養用組成物中２５〜５０μＭであることを特徴とする請求項１に記載のオルガノイド培養用組成物。
【請求項５】
前記オルガノイド培養用組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ノギン（Noggin）、チアゾビビン、ＣＨＩＲ９９０２１及びＣＨＩＲ９９０２１の薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のオルガノイド培養用組成物。
【請求項６】
細胞を下記化学式１の化合物が含有された組成物で培養する段階を含むオルガノイドの培養方法。
［化１］
2020521514.tif 000010
【請求項７】
前記細胞は、幹細胞、幹細胞の集団、単離した組織断片であることを特徴とする請求項６に記載のオルガノイドの培養方法。
【請求項８】
前記幹細胞は、成体幹細胞であることを特徴とする請求項７に記載のオルガノイドの培養方法。
【請求項９】
前記化合物の濃度は、前記組成物中２５〜５０μＭであることを特徴とする請求項６に記載のオルガノイドの培養方法。
【請求項１０】
前記組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ノギン（Noggin）、チアゾビビン、ＣＨＩＲ９９０２１及びＣＨＩＲ９９０２１の薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１つ以上をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のオルガノイドの培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オルガノイド培養組成物及びこれを用いたオルガノイド培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、特有の分化能力（multi-potency）と自己再生（self-renewal）特徴により、不治の病の治療や病気のモデリング、組織または器官の移植など多様に活用することができるため、高い関心を集めている。しかし、最近、幹細胞を適切な３次元試験管環境で培養した場合、生体内の器官と類似した構造が形成されるという事実が明らかになった。このような生体内の器官と類似した構造は、オルガノイドと称される。
【０００３】
オルガノイド製作技術では、理論的にほとんどすべての種類の臓器を幹細胞のみで製作することができるため、様々な病気に利用可能であると期待されている。オルガノイドは、２次元で作った細胞組織よりも新薬の安全性と効能を試験するのに、より効果的であり、毀損したり正しく発達できなかった臓器にオルガノイドを移植して状態を改善するのに活用することができると考えられる。これにより、最近の再生医学の観点においても、オルガノイド関連の研究がさらに活発になる傾向にあり、様々な分野でオルガノイドを広く利用することができると期待されている。
【０００４】
しかし、オルガノイドの維持・培養技術は、まだ確立されていない初期の研究段階水準であって、培養時の添加物質や効果的な培養方法については、様々な研究を行う必要がある。オルガノイドの体外培養のための培養液には、Ｒ−スポンジン（R-spondin）の添加が必須である。しかし、Ｒ−スポンジンは、タンパク質の一種であって、分離及び精製が難しく、培養液に添加した時の一貫した安全性を維持することが難しい。それだけでなく、Ｒ−スポンジンは、１００μg当たり３００万ウォンに達する高価な物質であるため、治療剤として用いるためのオルガノイドの大量培養時の経済性が低下するという短所がある。したがって、臨床に適用するためのオルガノイドを培養するために、安価で安全性の高いＲ−スポンジンの代替物質が切望されているのが実情である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一目的は、オルガノイド培養用組成物を提供することにある。
本発明の他の目的は、オルガノイドを培養する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の一様態は、下記化学式１の化合物を含むオルガノイド培養用組成物を提供する。
【０００７】
［化１］
2020521514.tif 000003
【０００８】
用語「オルガノイド（Organoid）」とは、幹細胞や臓器の起源細胞から分離した細胞を、３Ｄ培養法によって再び凝集・組換えて作られた細胞集合体を意味するものであって、サスペンション細胞培養物から形成されたオルガノイドまたは細胞クラスターを含むことができる。前記オルガノイドは、小型類似臓器、臓器類似体、類似臓器とも称することができる。前記オルガノイドは、具体的に器官または組織を構成する様々な種類の細胞のうちの１つ以上の細胞種類を含み、組織または器官の形態と機能を再現することができなければならない。
【０００９】
用語「オルガノイド培養」は、オルガノイドを生成したり、維持させることができるすべての行為を含む。例えば、幹細胞または特定組織から分離した細胞を、特定機能を持つ組織や器官細胞に分化させるもので有り得、及び/またはオルガノイドを生存、成長または増殖させるもので有り得る。
【００１０】
本発明の組成物が使用されることができるオルガノイドは、例えば、多分化性幹細胞から由来したオルガノイド（PSC-derived Organiod）、または成体幹細胞から由来したオルガノイド（adSC-derived Organoid）で有り得る。前記多分化性幹細胞は、胚性幹細胞または逆分化幹細胞で有り得る。好ましくは、前記オルガノイドは成体幹細胞から由来したオルガノイドで有り得、より好ましくは、小腸クリプトに位置した幹細胞から由来したオルガノイドで有り得る。
【００１１】
前記オルガノイドは例えば、胃オルガノイド、小腸オルガノイド、結腸オルガノイド、肝臓オルガノイド、甲状腺オルガノイド、肺オルガノイド、または脳オルガノイドなどで有り得る。好ましくは、前記オルガノイドは小腸オルガノイドで有り得る。一実施例において、本発明の組成物で培養された小腸オルガノイドが、小腸上皮細胞の機能をよく維持していることを確認した。
【００１２】
本発明の培養組成物は、下記化学式１の化合物を含むことを特徴とする。
【００１３】
［化１］
2020521514.tif 000004
【００１４】
前記化学式１の化合物は、従来のオルガノイド培養に必須的に含まれるＷｎｔ信号の活性化物質を代替することができる。幹細胞が正常な役割を行うためには、Ｗｎｔ信号が重要であり、これによってオルガノイド培養にＷｎｔ信号の活性化物質の添加が必須的に要求される。現在、オルガノイドを培養するためにＷｎｔ信号の活性化物質として、Ｗｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンが使用されており、オルガノイド培養で前記化学式１の化合物がこのようなＷｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンを代替できるということを確認した。具体的には一実施例において、Ｒ−スポンジンの代わりに前記化学式１の化合物を含有した培地でオルガノイドを培養したとき、Ｒ−スポンジンが含まれた培地で培養されたオルガノイドの形態的特性、成長効率、及びマーカーの発現量が類似していた。したがって、前記組成物は、Ｗｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンを含まないことができ、または一般的にオルガノイド培養に使用していたＷｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンの通常濃度よりも少ない量を含むことができる。
【００１５】
前記組成物に含まれる前記化学式１の化合物の濃度は、例えば、総組成物の体積基準５〜２００μＭ、６.２５〜２００μＭ、６.２５〜１００μＭ、１０〜１００μＭ、１０〜７５μＭ、２０〜７５μＭ、２５〜７５μＭ、２０〜５０μＭ、または２５〜５０μＭの濃度で含むことができる。好ましくは、前記化学式１の化合物の濃度は、２０〜７５μＭ、２５〜７５μＭ、２０〜５０μＭ、または２５〜５０μＭであることができ、より好ましくは、２５〜７５μＭ、または２５〜５０μＭであることができる。また最も好ましくは、前記化学式１の化合物の濃度は、５０μＭであることができる。
【００１６】
前記組成物は、オルガノイドを培養するための基本培地に前記化学式１の化合物を含むもので有り得る。用語「培地（culture media）」とは、インビトロで細胞の成長及び生存を支持できるようにする培地を意味し、細胞の培養に適切なこの分野で使用される通常の培地をすべて含む。培養細胞の種類に応じて、培地と培養条件を選択することができる。このような細胞培養基本培地として、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbeco's Modified Eagle's Medium）、ＭＥＭ（Minimal essential Medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、（Minimal essential Medium）、ＧＭＥＭ（Glasgow’s Minimal essential Medium）、Iscove's Modified Dulbecco's Mediumなどを使用することができ、必要に応じて、ペニシリン−ストレプトマイシンのような抗生剤、または補充剤などがさらに添加されたもので有り得る。
【００１７】
本発明の組成物は、幹細胞の信号伝達またはオルガノイド形成に必要な成分をさらに含むことができる。具体的には前記組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）、ノギン（Noggin）、チアゾビビン、ＣＨＩＲ９９０２１及びＣＨＩＲ９９０２１の薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１つ以上をさらに含むことができる。前記ＣＨＩＲ９９０２１は、下記化学式２の化合物であって、６−[[２−[[４−（２,４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]−３−ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ番号２５２９１７−０６−９）を指す。
【００１８】
［化２］
2020521514.tif 000005
【００１９】
本発明の他の様態は、細胞を下記化学式１の化合物が含まれた組成物で培養する段階を含む、オルガノイドを培養する方法を提供する。
【００２０】
［化１］
2020521514.tif 000006
【００２１】
本発明に係るオルガノイドを培養する方法において、一様態のオルガノイド培養組成物に使用された用語と同一の用語は、特に言及がない限り、それぞれ前記組成物で言及したものと同一である。
【００２２】
本発明のオルガノイド培養方法は、細胞を前記化学式１の化合物と接触させる段階及び前記細胞を培養する段階を含むことができる。前記細胞は、幹細胞、幹細胞の集団、幹細胞から分化した細胞、または単離した組織断片であることができる。好ましくは、前記細胞は、成体幹細胞であることができ、より好ましくは小腸クリプトに含まれるか、または由来した細胞であることができる。
【００２３】
前記組成物に含まれる前記化学式１の化合物の濃度は、例えば、総組成物の体積基準５〜２００μＭ、６.２５〜２００μＭ、６.２５〜１００μＭ、１０〜１００μＭ、１０〜７５μＭ、２０〜７５μＭ、２５〜７５μＭ、２０〜５０μＭ、または２５〜５０μＭの濃度で含むことができる。好ましくは、前記化学式１の化合物の濃度は、２０〜７５μＭ、２５〜７５μＭ、２０〜５０μＭ、または２５〜５０μＭであることができ、より好ましくは、２５〜７５μＭ、または２５〜５０μＭであることができる。また、最も好ましくは、前記化学式１の化合物の濃度は、５０μＭであることができる。
【００２４】
本発明の組成物は、幹細胞の信号伝達またはオルガノイド形成に必要な成分をさらに含むことができる。具体的には前記組成物は、上皮成長因子（ＥＧＦ：epidermal growth factor）、ノギン（Noggin）、チアゾビビン、ＣＨＩＲ９９０２１及びＣＨＩＲ９９０２１の薬学的に許容可能な塩からなる群から選択される１つ以上をさらに含むことができる。前記ＣＨＩＲ９９０２１は、下記化学式２の化合物であって、６−[[２−[[４−（２,４−ジクロロフェニル）−５−（５−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）−２−ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]−３−ピリジンカルボニトリル（ＣＡＳ番号２５２９１７−０６−９）を指す。
【００２５】
［化２］
2020521514.tif 000007
【００２６】
前記培養方法において、前記組成物は、Ｗｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンを含まないことができ、または一般的にオルガノイド培養に使用されるＷｎｔ３ａまたはＲ−スポンジンの通常濃度よりも少ない量を含むことができる。
【発明の効果】
【００２７】
本発明のオルガノイド培養用組成物及び培養方法によると、既存の培養液に必須的に添加されるタンパク質成分を代替できる化合物を含有しており、オルガノイド培養時に一貫した安全性を維持することができ、安価な費用で培養が可能である。これにより、治療剤開発に用いるためのオルガノイドの大量培養に本発明を活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１ａ】化合物スクリーニング時に使用した９６−ウェルプレート１０５個のうちの１つの全体ウェルの写真図である。最も左側列の６欄は陽性対照群、最も右側列の６欄は陰性対照群、真中の１０個列全体は実験群で使用した。
【図１ｂ】全体の小腸オルガノイド数（Viability factor）とバディングしている小腸オルガノイド数（budding factor）を用いて２次候補物質を選定した結果を示した図である。
【図１ｃ】スクリーニング結果により有意であると判断された化合物が含まれた培養溶液で培養した小腸オルガノイドの光学顕微鏡写真図である。
【図２ａ】マウス小腸クリプトにＲＳ−２４６２０４を処理して４日間培養した光学顕微鏡写真図であって、ＥＮＲは陽性対照群（Ｒ−スポンジン含む）、ＥＮは陰性対照群、ＥＮ＋ＲＳ−３４６３０４は実験群である。
【図２ｂ】ＲＳ−２４６２０４濃度に応じた小腸オルガノイド生存率を確認するためのＷＳＴ分析結果を示したグラフである。Ｙ軸はＷＳＴ活性値を百分率に変換した値であり、陰性対照群を１００％に設定した。
【図２ｃ】ＲＳ−２４６２０４の濃度に応じた小腸オルガノイドの成長後の形態別数を示したグラフである。Ｙ軸はウェル内に存在するオルガノイド数である。「Budding organoids」はバディングしたオルガノイドを意味し、「non-budding organoids」はバディングしなかったが生存しているオルガノイドを意味する。「Total viable organoids」は、budding organoids数およびnon-budding organoids数の合計を意味する。
【図２ｄ】日付別オルガノイド周りの長さを測定し、平均値を示したグラフである。グラフでＤＩＶはDay in vitroを意味し、Ｙ軸はオルガノイド周りの平均の百分率値であり、ＤＩＶ−１を１００％に設定した。
【図２ｅ】ＥＮＲとＥＮ＋ＲＳ２４６２０４条件において、それぞれ培養した小腸オルガノイドを初代培養した後、継代培養した光学顕微鏡写真図である。
【図３ａ】ＥＮＲとＥＮ＋ＲＳ２４６２０４条件において、それぞれ培養した小腸オルガノイドから抽出したＲＮＡを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを行った後の電気泳動結果の写真図である。
【図３ｂ】ＥＮＲとＥＮ＋ＲＳ２４６２０４条件において、それぞれ培養した小腸オルガノイドから抽出したＲＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲの結果を示したグラフである。
【図３ｃ】ＥＮＲとＥＮ＋ＲＳ２４６２０４条件において、４日間培養した小腸オルガノイドを免疫蛍光染色した写真図である。ヘキスト（Hoechst：青色）は核を示し、Ａｌｅｘａ５９４（赤色）はそれぞれの抗体に対する蛍光を示す。
【図４】ＥＮＲとＥＮ＋ＲＳ２４６２０４条件において、４日間小腸オルガノイドを培養した後、フォルスコリン（forskolin）刺激を誘導した光学顕微鏡写真図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を実施例によって、より詳細に説明する。しかし、この実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。
【００３０】
〔実施例１〕
マウス小腸クリプト分離
小腸オルガノイドの製造及び培養実験に使用するために、マウスから小腸クリプトを分離した。具体的には、体重２０〜２５ｇの５−７週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスを頚椎脱臼によって致死させた後、小腸を分離した。小腸を近位端部（proximal end）から遠位端部（distal end）まで縦方向に切開し、約５ｍｍ長さの切片となるように横方向に切断した。得られた小腸の切片を氷冷却させたダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline，ＤＰＢＳ）で上層液が十分に清澄するまで洗浄した。以後、ジェントル細胞分離試薬（Gentle Cell Dissociation Reagent）（StemCell Technologies,Cambridge，ＭＡ）で処理し、細胞濾過器（cell strainer）で濾過してクリプト（crypts）を分離した。
【００３１】
〔実施例２〕
オルガノイド増殖測定を用いた化合物ライブラリのスクリーニング
韓国化合物銀行の代表ライブラリに含まれた８３６４種の化合物について、オルガノイド培養でＲ−スポンジンを代替できる化合物をスクリーニングした。
【００３２】
実施例１で分離した、７週齢Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの小腸から由来した小腸クリプトをマトリゲルに混合して、９６−ウェルプレートの各ウェルに入れた。９６−ウェルプレート１つ当たり実験群８０個ウェルを用いて、陽性対照群と陰性対照群に各３個ウェル、０.５％のＤＭＳＯが含まれた陽性対照群と陰性対照群に各３個ウェルを用いた。陰性対照群は、Ｒ−スポンジン及び化合物のいずれも含有していないＥＮ培養溶液（組成：Advanced ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、Hepesバッファー溶液、ＧＬＵＴＡＭＡＸ−Ｉ  ＳＵＰＰＬＥＭＥＮＴ、ペニシリン−ストレプトマイシン溶液、Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、B-27 Serum-Free Supplement、N-2 Supplement、非−動物性（Animal-Free）組換えミュリンＥＧＦ、組換えミュリンノギン、ＣＨＩＲ９９０２１、チアゾビビン）を用いて、陽性対照群は、ＥＮ培養溶液に１０％のＲ−スポンジンを含有させた（１０％のＲ−スポンジンを含有したＥＮ培養溶液をＥＮＲ培養溶液と称する）。実験群は、ＥＮ培養溶液に５０μＭ濃度で、互いに異なる８３６４種の化合物をそれぞれ添加した。スクリーニングに使用された化合物は、マトリゲルとクリプトの重合が完了した即時処理しており、クリプト分離直後から４日間交換なしで適用された。４日間３７℃の加湿インキュベーター（５％ＣＯ２）で維持した後、培養されたオルガノイドを観察し、分析のために光学顕微鏡写真を撮影した（図１ａ）。
【００３３】
撮影した光学顕微鏡写真を用いて生きているオルガノイドの個数、バディング（budding）しているオルガノイドの個数、各オルガノイドの周囲を測定した。個数測定には、Image Jソフトウェアのcell counterプラグインを使用し、周囲測定には、Dixi eXcopeソフトウェアの自由曲線ツールを用いた。測定した数値に基づいて順位を定めて、２次スクリーニングに使用する２９５個の候補化合物を選定した。２次スクリーニング候補化合物２９５個を１次スクリーニングと同一の方式で再実験した。１次と２次スクリーニングの結果をまとめて順位を算出して、２１個の３次スクリーニング候補物質を選定した。同一の方式で２１個の候補物質について３次スクリーニングを行った後、３回の結果をすべてまとめて最終的に７個の候補化合物を選定した（図１ｂ）。
【００３４】
最終７個の候補化合物のうち、以下の化学式１の化合物（化合物ライブラリ番号：ＳＴＫ６１１７７７）が候補物質の中で最高の小腸オルガノイド成長効果が見られ、オルガノイドを成長させて維持する能力がＲ−スポンジンと最も類似していることを数値データと肉眼で確認した（図１ｃ）。
【００３５】
［化１］
2020521514.tif 000008
【００３６】
前記化合物を「ＲＳ−２４６２０４」と命名した。
【００３７】
〔実施例２〕
ＲＳ−２４６２０４の小腸オルガノイド培養効果の確認
２.１.化合物濃度に応じた培養効果
ＲＳ−２４６０２４の小腸オルガノイド培養効果を確認するために、まずＲＳ−２４６２０４の最適濃度を確認した。ＲＳ−２４６０２４を最終濃度６.２５μＭ、１２.５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭになるように、それぞれ小腸クリプトの培養溶液に添加した後、４日間培養器でインキュベーションした。４日後、肉眼で観察した結果、２５μＭと５０μＭのＲＳ−２４６０２４が含まれた培養溶液で培養した小腸オルガノイドが、ＥＮＲ培養溶液の小腸オルガノイドと類似した形態と成長を示すことを確認した（図２ａ）。
【００３８】
２.２.ＷＳＴ分析
より正確な確認のために同一の濃度でＲＳ−２４６２０４を処理し、４日後各ウェルに１０μＬのＷＳＴを添加した。ＷＳＴは、テトラゾリウム塩として脱水素酵素（Dehydrogenase）と反応してホルマザンを生成し、培養溶液がオレンジ色を帯びる。脱水素酵素は、生きている細胞にのみ存在する酵素であるため、ＷＳＴの処理時の細胞の生存率を確認できるようにする。ＷＳＴ添加３時間後、培養溶液のみを取って４５０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群であるＥＮ培養溶液を１００％に設定して、生存率を算出した結果、ＲＳ−２４６２０４が２５μＭ、５０μＭ含まれた培養溶液が陽性対照群であるＥＮＲ培養溶液と類似したオルガノイド生存率を示した（図２ｂ）。
【００３９】
その結果、分離したクリプトを用いて小腸オルガノイドを培養したとき、Ｒ−スポンジンをＲＳ−２４６０２４に代替した培養溶液で培養した小腸オルガノイドは、既存のＲ−スポンジン含みの培養溶液で培養した小腸オルガノイドと類似した形態に成長することを確認した（図１ａ）。
【００４０】
２.３.バディング特性及び外形分析
小腸オルガノイドの最大の形態的特性は、バディング（budding）しながら成長することである。ＲＳ−２４６２０４が添加された培養溶液（以下、ＲＳ−２４６２０４培養溶液）で培養した小腸オルガノイドのバディング比率がＥＮＲ培養溶液と類似しているかを確認するために、４日間培養したウェル内の全体オルガノイド数、バディングしているオルガノイド数、バディングしていないオルガノイド数を数えた。ＲＳ−２４６２０４が５０μＭ含まれた培養溶液で培養したオルガノイドは、バディングしているものとバディングしていないものの比率が、約１:１でＥＮＲ培養溶液で培養したものの比率と類似していた（図２ｃ）。５０μＭより低い濃度では、バディングしていないオルガノイドの比率が増加しており、５０μＭより高い濃度では、オルガノイドが殆ど死滅することを確認した。
【００４１】
ＲＳ−２４６２０４培養溶液で培養した小腸オルガノイドの成長効率に差があるかを確認するために、それぞれの培養溶液で培養する小腸オルガノイドの光学顕微鏡写真を、毎日撮影した。培養培地条件別、日付別に個別にオルガノイドの周囲を測定して百分率に換算した結果、成長効率だけでなく、日付による周囲の増加比率も類似していることを確認した（図２ｄ）。
【００４２】
２.４.継代培養確認
ＥＮＲ培養溶液で培養した小腸オルガノイド継代培養と同一の方式によって、ＲＳ−２４６２０４培養溶液で培養した小腸オルガノイドの継代培養が可能であることを確認し、継代培養後も成長と維持が可能であることを観察することができた（図２ｅ）。一方、Ｒ−スポンジンまたはＲＳ−２４６２０４が含まれていない培養溶液で培養したクリプトは、小腸オルガノイドに培養は不可能であった。
【００４３】
〔実施例３〕
ＲＳ−２４６２０４によって培養された小腸オルガノイドの発現遺伝子分析
３.１.ＲＴ−ＰＣＲ分析
ＲＳ−２４６２０４で培養時、小腸オルガノイドの特異的系統マーカーを発現しているかを確認するために、ＲＮＡ分析を行った。ＥＮＲとＲＳ−２４６２０４培養溶液で４日間それぞれ培養された小腸オルガノイドを収去してＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに合成してＲＴ−ＰＣＲを行った。腸幹細胞（intestinal stem cells）、ゴブレット細胞（goblet cells）、パネート細胞（paneth cells）、腸内分泌細胞（enteroendocrine cells）及び腸細胞（enterocyte）に対するマーカーとして、それぞれLgr5、muc-1とmuc-2、ディフェンシン−５（defensin-5）、クロモグラニンＡ（ChgA）、ビリン（villin）に対するＲＮＡプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果、ＲＳ−２４６２０４によって培養された小腸オルガノイドでこれらのすべての細胞が存在することを確認し、またLgr5シグナリングの下流（downstream）に位置する遺伝子であるオルファクトメジン４（Olfactomedin-4）（Olfm4）とＣＤ４４も発現していることを確認した（図３ａ）。
【００４４】
さらに定量的な分析のために、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を行った。AccuPower 2X Greenstar qPCR MasterMix（Bioneer）とThermal Cycler Dice(R) Real Time System III（Takara,Japan）を用い、９５℃で１０秒（denaturation）、５７℃で１５秒（annealing）、及び７２℃で２０秒（extension）の反応を行った。ＲＮＡプライマーは、ＲＴ−ＰＣＲ試験で使用したもののうち、Muc1を除き、腸細胞（enterocyte）マーカーをビリンからIntestinal Alkaline Phosphatase（ＩＡＰ）に変更し、残りは同一の配列を用いた。ｑＲＴ−ＰＣＲ結果は、発現するマーカーの相対的な量がＥＮＲとＲＳ−２４６２０４培養溶液間の差がほとんどないことを示した（図３ｂ）。
【００４５】
３.２.免疫蛍光分析
追加的にＥＮＲとＲＳ−２４６２０４培養溶液で培養された小腸オルガノイドに対して免疫蛍光染色を行って、Muc-2、リゾチームと増殖細胞（proliferating cells）マーカーであるKi67の発現を確認した（図３ｃ）。
【００４６】
〔実施例４〕
ＳＴＫ６１１７７７によって培養された小腸オルガノイドの機能維持確認
ＲＳ−２４６２０４培養溶液を使用して培養した小腸オルガノイドが小腸上皮細胞の機能を維持しているか確認するために、ＣＦＴＲ作用剤（agonist）であるフォルスコリン（Forskolin）分析を行った。フォルスコリンは、イオンチャンネルを開放するように刺激して、水分の排出を促進する化合物である。小腸オルガノイドの場合、フォルスコリン刺激時、内腔に水分が集まってサイズが大きい球形に形態が変わって上皮細胞機能の維持を確認することができる。ＲＳ−２４６２０４培養溶液及びＥＮＲ培養溶液のそれぞれで４日間培養した後、５μＭ濃度のフォルスコリンが添加された培養溶液に交換した。交換直後から１時間の間、１０分間隔で光学顕微鏡写真撮影を行った。光学顕微鏡写真に基づいてDixi eXcope（Korea）プログラムの自由曲線ツールを用いて、時間別にそれぞれのオルガノイド周囲を測定して周囲変化を分析した。
【００４７】
その結果、ＲＳ−２４６２０４培養溶液で培養した小腸オルガノイドは、上皮細胞としての機能を実行していることを確認し、ＥＮＲ培養培地で培養したものと類似した周囲の変化を示した（図４）。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【国際調査報告】
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