(57)【要約】  簡便に糖鎖を導入できる糖ペプチドの生成のための方法を提供すること。本発明では、糖鎖の導入のための基を保護したアミノ酸を、４塩基コドン法でタンパクに導入することにより、脱保護したのちにその部位に天然の糖鎖を導入することにより、上記課題を解決した。従って、本発明は、以下の工程：（ａ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡ改変ｔＲＮＡを提供する工程；（ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程；（ｃ）該改変核酸分子を転写してｍＲＮＡを生成する工程；および（ｄ）該改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系に該ｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
（ａ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程；
（ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程であって、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに、目的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする、工程；
（ｃ）該改変核酸分子を転写してｍＲＮＡを生成する工程；および
（ｄ）該改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系に該ｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法。
【請求項２】
前記糖鎖に結合し得る官能基は、保護されていてもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいＮ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基からなる群より選択される少なくとも１つの基を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸が天然アミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基が結合したアミノ酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸またはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、以下の式：
【化１】
2005075639.tif 000042
からなる群より選択されるアミノ酸またはその保護体であり、該アミノ酸は、前記改変ｔＲＮＡと、該アミノ酸のカルボキシル基において結合することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記改変ｔＲＮＡは、配列番号１に示されるＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＣＣＧＡＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＵＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＡという配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記改変核酸分子は、インビトロ系において機能するプロモーター配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（Ａ）請求項１に記載の方法により、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生成する工程；および
（Ｂ）該タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する工程、を包含する、糖タンパク質を生産するための方法。
【請求項１０】
以下の工程：
（ｉ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保護して保護アミノ酸を生成する工程；
（ｉｉ）５’−ホスホ−２’−デオキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（ｐｄＮｐＮ）を提供する工程；
（ｉｉｉ）該保護アミノ酸と該ｐｄＮｐＮとを脱水縮合して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸を生成する工程；
（ｉｖ）４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程；
（ｖ）該改変ｔＲＮＡと該保護ｐｄＮｐＮアミノ酸とを連結して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸連結ｔＲＮＡを提供する工程；および
（ｖｉ）該保護ｐｄＮｐＮアミノ酸が連結した改変ｔＲＮＡを脱保護してｐｄＮｐＮアミノ酸が連結したｔＲＮＡを生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを生産するための方法。
【請求項１１】
前記ｐｄＮｐＮにおけるデオキシリボヌクレオチジルは、β-D-チミジン、2’-デオキシ-β-D-シチジン、2’-デオキシ-β-D-アデノシン、2’-デオキシ-β-D-グアノシン、2’-デオキシ-β-D-ウラシルおよび2’-デオキシ-β-D-イノシンからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリンからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記保護は、フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基およびカルバメート基からなる群より選択される保護基で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ。
【請求項１５】
請求項１に記載の方法によって調製されたタンパク質を含む、組成物。
【請求項１６】
請求項９に記載の方法によって調製された糖タンパク質を含む、組成物。
【請求項１７】
以下の式：
【化２】
2005075639.tif 000043
を有する、化合物（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して保護基または水素を表し、Ｒ５は、糖鎖に結合し得る基を表す）。
【請求項１８】
前記Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素、フルオレニルメトキシカルボニル基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基および２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基からなる群より選択される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記Ｒ５は、保護されていもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいＮ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基からなる群より選択される基から水素が一つ取れたものである、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
以下の式：
【化３】
2005075639.tif 000044
【化４】
2005075639.tif 000045
2005075639.tif 000046
2005075639.tif 000047
2005075639.tif 000048
2005075639.tif 000049
【化５】
2005075639.tif 000050
【化６】
2005075639.tif 000051
【化７】
2005075639.tif 000052
【化８】
2005075639.tif 000053
および
【化９】
2005075639.tif 000054
からなる群より選択される構造を有する、化合物。
【請求項２１】
【化１０】
2005075639.tif 000055
に示される基が、アミノ酸のカルボキシル基に置換した、化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質に関連する生化学および化学の分野に関する。より特定すると、本発明は、糖タンパク質およびその合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の記載内容には、本発明の理解に有用と思われる情報が含まれている。ここに提供されている情報がいずれも本発明に対する従来技術であると認めるものでもなければ、明示的または暗黙的に参照した出版物がいずれも本発明に対する従来技術であると認めるものでもない。【０００３】
タンパク質の糖鎖による修飾は、タンパク製剤（ホルモン剤など）の血中安定性や血中保持時間の向上に役立つので重要であるが、そのほとんどは現在は動物細胞を用いてタンパク質に糖鎖修飾している。このような動物細胞をもちいた天然糖鎖付加の場合、導入される糖鎖は培養系によって決まり、自由に設計することができないことと、糖鎖の導入部位や導入率を自由に制御することができないことが難点である。【０００４】
一般に生物に使われている２０種類のアミノ酸以外の非天然アミノ酸を、対応するコドンを新たに定義することでタンパクに導入する手法として、Schultzらの開発した終止コドンを用いる方法（非特許文献１）と宍戸・芳坂らの提唱した４塩基コドンを用いる方法（非特許文献２〜４）が知られている。特に、４塩基コドンを用いる方法では、一度に使用可能なコドンが理論的には何種類にもなるので、さまざまな非天然アミノ酸をそれぞれ目的の部位に導入できる利点がある。【０００５】
この４塩基コドンを用いた非天然アミノ酸導入では、これまで、蛍光性のアミノ酸などのいくつかの例が報告されているが、糖の導入には成功していなかった。【０００６】
３塩基コドンでは、ケトン基のついた非天然アミノ酸を導入して、アミノオキシル基をつけた糖鎖を結合させた報告（非特許文献５）がある。
【非特許文献１】Schultzet al., Vol.96, Issue 9, 4780-4785, April 27, 1999
【非特許文献２】Taki M.et al.,FEBS Lett.507,35-38、2001
【非特許文献３】HohsakaT. et al.,J. Am. Chem.Soc, 121, 34-40, 1999
【非特許文献４】Hohsaka T. etal.,J. Am. Chem.Soc, 118, 9778-9779, 1996
【非特許文献５】H. Liu et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 1702-1703 ,2003
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、簡便に糖鎖を導入できる官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質およびそれから誘導される糖ペプチドの生成のための方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明では、糖鎖の導入に適したアミノオキシ基などの糖鎖導入のための基を有するアミノ酸を、４以上の塩基をコドンとして用いる方法（例えば、４塩基コドン法）でタンパク質に導入すること、および脱保護したのちにその部位に天然の糖鎖を導入することにより、上記課題を解決した。【０００９】
従って、本発明は、以下を提供する。（１）以下の工程：
（ａ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程であって、上記改変ｔＲＮＡは４塩基コドンを認識する、工程；
（ｂ）上記４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程であって、上記核酸配列は上記４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに、目的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする、工程；
（ｃ）上記改変核酸分子を転写してｍＲＮＡを生成する工程；および
（ｄ）上記改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系に上記ｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法。
（２）上記糖鎖に結合し得る官能基は、保護されていてもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいＮ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基からなる群より選択される少なくとも１つの基を有する、項目１に記載の方法。
（３）糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸誘導体が天然アミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基が結合したアミノ酸である、項目１または２に記載の方法。
（４）上記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、チロシン、ホモセリおよびセリンからなる群より選択されるアミノ酸またはその誘導体である、項目１または２に記載の方法。
（５）上記４塩基コドンは、ＣＧＧＧである、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（６）上記タンパク質合成系は、上記４塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを有しない、項目１〜５のいずれか１項に記載の方法。
（７）上記タンパク質合成系は、上記４塩基コドンの最初の３塩基および最後の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを有しない、項目１〜６のいずれか１項に記載の方法。
（８）上記改変ｔＲＮＡは、アンチコドン部分に上記４塩基コドンの相補配列を有する、項目１〜７のいずれか１項に記載の方法。
（９）上記タンパク質合成系は、上記改変ｔＲＮＡを、上記天然ｔＲＮＡに比べて有意に多い量で含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の方法。
（１０）上記タンパク質合成系は、上記改変ｔＲＮＡを、上記天然ｔＲＮＡの少なくとも４倍の量で含む、項目１〜９のいずれか１項に記載の方法。
（１１）上記タンパク質合成系は、上記４塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを他のｔＲＮＡよりも有意に少なく含む、項目１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
（１２）上記タンパク質合成系は、上記４塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを他のｔＲＮＡの１〜０．０１倍含む、項目１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
（１３）上記４塩基コドンを３塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質を取り除く工程をさらに包含する、項目１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
（１４）上記４塩基コドンを３塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質は、上記４塩基コドンを４塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質と、有意に分子量が異なる、項目１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
（１５）上記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、以下の式：【００１０】
【化１１】
2005075639.tif 000002
からなる群より選択されるアミノ酸またはその保護体であり、該アミノ酸は、上記改変ｔＲＮＡと、該アミノ酸のカルボキシル基において結合することを特徴とする、項目１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
（１６）上記核酸分子は、直鎖状で提供される、項目１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
（１７）上記核酸分子は、環状ベクターとして提供される、項目１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
（１８）上記改変ｔＲＮＡは、配列番号１に示されるＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＣＣＧＡＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＵＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＡという配列を含む、項目１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
（１９）上記改変核酸分子は、インビトロ系において機能するプロモーター配列を含む、項目１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
（２０）上記プロモーター配列は、Ｔ７プロモーター配列を含む、項目１９に記載の方法。
（２１）以下の工程
（Ａ）項目１〜２０のいずれか１項に記載の方法により、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生成する工程；および
（Ｂ）上記タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する工程、を包含する、糖タンパク質を生産するための方法。
（２１−１）前記糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸が２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−酪酸（2-amino-4-[N-methyl-aminooxy]-butyric acid）である、項目２１に記載の方法。
（２１−２）前記Ｂ工程において、前記糖鎖の濃度は、１０ｍＭ〜１Ｍの間である、項目２１に記載の方法。
（２１−３）前記Ｂ工程において、前記糖鎖は、酢酸緩衝液
（５０ｍＭ〜４００ｍＭ；ｐＨ３〜６）中で行われる、項目２１に記載の方法。
（２１−４）前記Ｂ工程は、２５〜８０℃にて行われる、項目２１に記載の方法。
（２１−５）前記Ｂ工程は、６時間〜５日間行われる、項目２１に記載の方法。
（２１−６）前記生成した糖タンパク質を精製する工程をさらに包含する、項目２１に記載の方法。
（２２）以下の工程：
（ｉ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保護して保護アミノ酸を生成する工程；
（ｉｉ）５’−ホスホ−２’−デオキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（ｐｄＮｐＮ）を提供する工程；
（ｉｉｉ）上記保護アミノ酸と上記ｐｄＮｐＮとを脱水縮合して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸を生成する工程；
（ｉｖ）４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程；
（ｖ）上記改変ｔＲＮＡと上記保護ｐｄＮｐＮアミノ酸とを連結して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸連結ｔＲＮＡを提供する工程；および
（ｖｉ）上記保護ｐｄＮｐＮアミノ酸が連結した改変ｔＲＮＡを脱保護してｐｄＮｐＮアミノ酸が連結したｔＲＮＡを生成する工程、を包含する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを生産するための方法。
（２３）上記ｐｄＮｐＮにおけるデオキシリボヌクレオチジルは、β-D-チミジン、2’-デオキシ-β-D-シチジン、2’-デオキシ-β-D-アデノシン、2’-デオキシ-β-D-グアノシン、2’-デオキシ-β-D-ウラシルおよび2’-デオキシ-β-D-イノシンからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（２４）上記ｐｄＮｐＮにおけるリボヌクレオチジルは、β-D-シチジン、β-D-アデノシン、β-D-グアノシン、β-D-ウラシルおよびβ-D-イノシンからなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（２５）上記ｐｄＮｐＮは、５’−ホスホ−２’−デオキシリボシチジリルリボアデノシン（ｐｄＣｐＡ）である、項目２２に記載の方法。
（２６）上記アミノ酸は、天然アミノ酸である、項目２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
（２７）上記アミノ酸は、チロシン、ホモセリンおよびセリンからなる群より選択される、項目２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
（２８）上記保護は、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルエチレンオキシカルボニル基およびカルバメート基からなる群より選択される保護基で行われる、項目２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
（２９）上記改変ｔＲＮＡと上記保護ｐｄＮｐＮアミノ酸との連結は、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて行われる、項目２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
（３０）上記保護基の保護は、脱水反応によって行われ、上記脱保護は、加水分解によって行われる、項目２２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
（３１）上記改変ｔＲＮＡは、配列番号１に示されるＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＣＣＧＡＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＵＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＡという配列を含む、項目２２〜３０のいずれか１項に記載の方法。
（３２）
Ａ）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ；
Ｂ）上記４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子であって、上記核酸配列は上記４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子；および
Ｃ）上記改変核酸分子を転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系、を備える、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の製造キット。
（３３）
Ａ）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ；
Ｂ）上記４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子であって、上記核酸配列は上記４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子；
Ｃ）上記改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系；
Ｄ）糖鎖；および
Ｅ）上記糖鎖に結合し得る官能基と上記糖鎖との連結を行うための連結手段、を備える、糖タンパク質の製造キット。
（３４）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ。
（３５）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ、および翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含む、糖タンパク質を製造するための翻訳反応において用いるための組成物。
（３６）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系（ｓｙｓｔｅｍ）。
（３７）さらに、核酸分子を転写するための転写酵素、を含む、項目３６に記載のタンパク質合成系。
（３８）４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、上記核酸配列は上記４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子
（３９）項目１に記載の方法によって調製されたタンパク質を含む、組成物。
（４０）項目２１に記載の方法によって調製された糖タンパク質を含む、組成物。
（４１）以下の式：【００１１】
【化１２】
2005075639.tif 000003
を有する、化合物（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して保護基または水素を表し、Ｒ５は、糖鎖に結合し得る基を表す）。
（４２）上記Ｒ１は、天然アミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものである、項目４１に記載の化合物。
（４３）上記Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素、Ｆｍｏｃ基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルエチレンオキシカルボニル基およびカルバメート基からなる群より選択される、項目４１または４２に記載の化合物。
（４４）上記Ｒ５またはＲ６は、保護されていてもよいアミノオキシ基、保護されていてもよいＮ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基から水素が一つ取れたものからなる群より選択される基である、項目４１〜４３のいずれか１項に記載の化合物。
（４５）以下の式：【００１２】
【化１３】
2005075639.tif 000004
【００１３】
【化１４】
2005075639.tif 000005
【００１４】
2005075639.tif 000006
【００１５】
2005075639.tif 000007
【００１６】
2005075639.tif 000008
【００１７】
2005075639.tif 000009
【００１８】
【化１５】
2005075639.tif 000010
【００１９】
【化１６】
2005075639.tif 000011
【００２０】
【化１７】
2005075639.tif 000012
【００２１】
【化１８】
2005075639.tif 000013
および【００２２】
【化１９】
2005075639.tif 000014
からなる群より選択される構造を有する、化合物。（４６）【００２３】
【化２０】
2005075639.tif 000015
に示される基が、アミノ酸のカルボキシル基に置換した、化合物。【００２４】
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
【発明の効果】
【００２５】
本発明によって、従来達成できたものより高い収率で所望のタンパク質および糖タンパク質を得ることができること、従来達成できたものより高い選択性を持ってタンパク質および糖タンパク質（例えば、医薬、農薬、食品など）を設計することができるという効果が達成された。また、従来設計ができなかったような糖タンパク質の設計も可能にした。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、改変ｔＲＮＡを用いた場合の模式図を示す。
【図２】図２は、改変ｔＲＮＡを用いてタンパク質合成をする全体像を示す。
【図３】図３は、実施例６におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果を示す。左側：ｔＲＮＡ−ＣＡ；右側：２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）。
【図４】図４は、実施例７におけるウエスタンブロット分析の結果を示す。一次抗体：抗Ｔ７タグ抗体（マウス由来）；二次抗体：抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ。左：変異リゾチーム配列に２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）を用いないで発現させたもの；中央：野生型リゾチーム配列を発現させたもの；ならびに右：変異リゾチーム配列に２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）を用いて発現させたもの（上記実験）。
【図５】図５は、競合するアミノ酸であるアルギニンの比率を変化させて発現にどのような影響があるかどうかを示す実施例８の結果である。１：２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）（以下ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡともいう。）、２０アミノ酸（容量比はすべて１）；２：ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ（４容量）、１９アミノ酸：０．１Ａｒｇ（容量比）；３：ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ、１９アミノ酸：０．１Ａｒｇ；４：ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ、１９アミノ酸：０．０１Ａｒｇ（容量比）；５：ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ、１９アミノ酸：Ａｒｇなし；ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ  ２０アミノ酸なし；７ｎｔｒＰｈｅ−ｔＲＮＡ  １９アミノ酸なし。
【図６Ａ】図６Ａは、実施例１〜４で製造した糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸以外の化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検証する際に使用したｍＲＮＡ（ストレプトアビジン  ８３ＣＧＧＧ（配列番号６））の構造を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例１〜４で製造した糖鎖に結合し得る官能基（１〜６）を有するアミノ酸以外の化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検証した結果（右下）を示す。
【図７】図７は、タンパク質合成系において、環状核酸分子および直鎖状核酸分子を用いた場合の比較を行った結果を示す。１：環状テンプレート；２：環状テンプレート（−１．Ｈｉｓ）；３：直鎖状（ｍＲＮＡ）テンプレート；４：直鎖状（ｍＲＮＡ）テンプレート（−１．Ｈｉｓ）。
【図８】図８は、リゾチームの発現における種々の条件を示す。１：リゾチーム野生型；２：リゾチーム４４ＣＧＧＧ；３：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｔｙｒ−Ｎ３、３０℃、０．１Ａｒｇ）；４：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｔｙｒ−Ｎ３、３７℃、０．１Ａｒｇ）；５：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｔｙｒ−Ｎ３、３７℃、２０アミノ酸）；６：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｔｙｒ−Ｎ３、３７℃、１／２アミノ酸（０．１Ａｒｇ））；７：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｔｙｒ−Ｎ３、４２℃、０．１Ａｒｇ）；８：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｈｓｅｒ（ＯＮＨＴｅｏｃ）、３７℃、０．１Ａｒｇ）；９：リゾチーム４４ＣＧＧＧ（＋Ｈｓｅｒ（ＯＮＨＴｅｏｃ）×２、３７℃、０．１Ａｒｇ）；
【図９】図９は、２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンの合成の結果を、ＤＨＢをマトリックスとしてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＡＳＳにより質量分析した結果である。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【図１０】図１０は、実施例１５において、２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンをグルコースで修飾したときのDHBをマトリックスとしてMALDI TOFMASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【図１１】図１１は、実施例１５において、２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンをマルトースで修飾したときのDHBをマトリックスとして使用したときのMALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【図１２】図１２は、実施例１５において、２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンをマルトトリオースで修飾したときのDHBをマトリックスとして使用したときのMALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【図１３】図１３は、実施例１５において、２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンをN-アセチルグルコサミンで修飾したときのDHBをマトリックスとして使用したときのMALDITOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【図１４】図１４は、実施例１６においてラクトースによる修飾およびα２，３シアリルトランスフェラーゼ糖鎖伸長反応のDHBをマトリックスとして使用したときのMALDI TOF MASSでの分子量測定結果を示す。横軸は、質量電荷比（ｍ／ｚ）を示し、ａ．ｉ．は、絶対強度を示す。
【配列の説明】
【００２７】
配列番号１：本発明において使用されるｔＲＮＡ（ＲＮＡＣＧＧＧ）の配列を示す。
配列番号２：ＲＮＡＮＣＣＵ（−ＣＡ）の配列を示す。
配列番号３：本発明で生産した４塩基コドンを有するリゾチームの核酸配列
配列番号４：本発明で生産した４塩基コドンを有するリゾチームのアミノ酸配列
配列番号５：本発明で生産した４塩基コドンを有するストレプトアビジンの核酸配列
配列番号６：本発明で生産した４塩基コドンを有するストレプトアビジンのアミノ酸配列。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。【００２９】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。【００３０】
本明細書において「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合は、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸ならびにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、本明細書では、糖鎖は、「多糖（ポリサッカリド）」、「糖質」、「炭水化物」と互換可能に使用され得る。また、特に言及しない場合、本明細書において「糖鎖」は、糖鎖および糖鎖含有物質の両方を包含することがある。【００３１】
本明細書において「単糖」とは、これより簡単な分子に加水分解されず、一般式ＣｎＨ２ｎＯｎで表される化合物をいう。ここで、ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９および１０であるものを、それぞれジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース、オクトース、ノノースおよびデコースという。一般に鎖式多価アルコールのアルデヒドまたはケトンに相当するもので、前者をアルドース，後者をケトースという。【００３２】
本明細書において「単糖の誘導体」とは、単糖上の一つ以上の水酸基が別の置換基に置換され、結果生じる物質が単糖の範囲内にないものをいう。そのような単糖の誘導体としては、カルボキシル基を有する糖（例えば、Ｃ−１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ−グルコースが酸化されたＤ−グルクロン酸）、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシル基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ−アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２−デオキシ−Ｄ−リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などがあるがそれらに限定されない。あるいは、ヘミアセタール構造を形成した糖において、アルコールと反応してアセタール構造のグリコシドもまた、単糖の誘導体の範囲内にある。【００３３】
本明細書において「糖鎖含有物質」とは、糖鎖および糖鎖以外の物質を含む物質をいう。このような糖鎖含有物質は、生体内に多く見出され、例えば、生体中に含有される多糖類の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。【００３４】
本明細書において「糖タンパク質」または「糖ペプチド」とは、交換可能に使用され、糖鎖を含むタンパク質またはペプチドをいう。そのような糖タンパク質としては、種々の有用な機能性タンパク質が含まれ、例えば、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられるがそれらに限定されない。【００３５】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。ポリペプチドに含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよく、改変されたアミノ酸（例えば、糖鎖を結合し得る官能基を含むアミノ酸）であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。【００３６】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。【００３７】
本明細書において、「核酸分子」は、核酸、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用され、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどを含む。核酸分子は、環状（例えば、環状ベクター、プラスミドなど）または直鎖状（例えば、ＰＣＲ断片）で提供され得る。本明細書では、核酸および核酸分子は、用語「遺伝子」の概念に含まれ得る。ある遺伝子配列をコードする核酸分子はまた、「スプライス変異体（改変体）」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を包含する。その名が示唆するように「スプライス変異体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス変異体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。【００３８】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、
その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／または「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。【００３９】
本明細書において遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、遺伝子（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。【００４０】
本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。【００４１】
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。【００４２】
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、通常ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。したがって、本明細書においてある遺伝子のプロモーターの働きを有する部分を「プロモーター部分」という。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモーター領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。本明細書では、例えば、Ｔ７プロモーターなどを使用することができる。本明細書において「インビトロ系において機能する」とは、プロモーターに関して使用されるとき、インビトロ系（例えば、無細胞系）において遺伝子の転写を促進することができる活性を有することをいう。そのような活性は、無細胞系において、適切な遺伝子の上流または下流に目的のプロモーターを配置して、そのプロモーターがその遺伝子の転写を促進することを確認することによって判定することができる。【００４３】
本明細書において「エンハンサー」とは、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられる配列をいう。そのようなエンハンサーは当該分野において周知である。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。【００４４】
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。【００４５】
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。  そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。【００４６】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）が挙げられる。【００４７】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチプルクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチプルクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。【００４８】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞またはタンパク質発現系に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。【００４９】
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれる。本発明において用いられる細胞は、形質転換体であってもよい。【００５０】
本発明において遺伝子操作などにおいて原核生物細胞が使用される場合、原核生物細胞としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属などに属する原核生物細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１が例示される。【００５１】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の分析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる分析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。【００５２】
本明細書において「糖鎖に結合し得る」とは、糖鎖に対して、結合（好ましくは、共有結合）することができる能力をいう。【００５３】
本明細書において「共有結合」とは、当該分野における通常の意味で用いられ、電子対が２つの原子に共有されて形成する化学結合をいう。このような共有結合としては、例えば、オキシム結合、ヒドラゾン結合、チオセミヒドラゾン結合、ペルヒドロチアジン環形成およびチアゾリジン環形成などが挙げられるがそれらに限定されない。【００５４】
本明細書において「糖鎖に結合し得る（官能）基」とは、糖鎖が結合することができる任意の官能基をさす。そのような官能基は、「アルデヒド基と流体中で反応し得る官能基」であり得る。「アルデヒド基と流体中で反応し得る官能基」とは、糖鎖が水溶液などの流体中で形成する環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡において、アルデヒド基と反応して特異的かつ安定な結合をつくることができる性質を有する官能基をいう。このような官能基としては、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基などが挙げられるがそれらに限定されない。アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、およびアジド基が好ましい。【００５５】
本明細書において「流体」は、本発明の物質（例えば、糖鎖に結合し得る（官能）基を含むアミノ酸）が、糖鎖と相互作用をする環境を提供することができる流体であればどのようなものでも使用することができる。好ましくは、そのような流体はケト基を含む物質は実質的に含まない。なぜなら、ケト基を含む物質が有意に含有されている場合、流体中のアルデヒド基と本発明の物質との反応が充分に進まないからである。したがって、ケト基を含む物質を含まない形態は必須ではないが、好ましい実施形態である。【００５６】
したがって、本明細書において使用される流体は、糖を環状のヘミアセタール型と非環状のアルデヒド型との平衡にもたらすようなものであることが好ましい。そのような流体としては、例えば、水溶液、有機溶媒およびこれらの混合物などが挙げられるがそれに限定されない。好ましくは、流体は水溶液である。【００５７】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のタンパク質またはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するタンパク質またはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、タンパク質の場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、タンパク質およびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または加減としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば上下１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」のあるなしはその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。【００５８】
本明細書において「ヌクレオチド」とは、糖部分がリン酸エステルになっているヌクレオシドをいう。本明細書において「ヌクレオシド」とは、塩基と糖とがＮ-グリコシド結合をした化合物をいう。核酸は、塩基がピリミジン塩基またはプリン塩基のヌクレオチド(ピリミジンヌクレオチドおよびプリンヌクレオチド)の重合体(ポリヌクレオチド)である。糖部分がＤ-リボースのものをリボヌクレオチドといい、RNAの加水分解によって得られる．糖部分がＤ-２’-デオキシリボースのものをデオキシリボヌクレオチドといい、DNAの酵素分解によって得られる。天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。【００５９】
本明細書において「アミノ酸」とは、当該分野において通常用いられる意味で用いられ、カルボキシル基とアミノ基とを有する有機化合物をいう。本明細書においてアミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であっても良い。用語「天然のアミノ酸」とは、生体内に存在する天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンなどが挙げられる。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体であるが、Ｄ体のアミノ酸を用いた形態もまた本発明の範囲内にある。用語「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。また、本発明において天然アミノ酸をもとに改変を施したアミノ酸は、天然アミノ酸でない場合は、非天然アミノ酸の範囲に入る。「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。本明細書では、アミノ酸の代わりに、アミノ酸アナログまたはアミノ酸模倣物を使用することができる。【００６０】
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された１文字コードにより言及され得る。【００６１】
本明細書において「糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸」は、代表的に、【００６２】
【化２１】
2005075639.tif 000016
を有し、（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して保護基または水素を表し、Ｒ５は、糖鎖に結合し得る基）で表わされる、化合物で表され得る。【００６３】
本明細書において、アミノ酸の側鎖とは、アミノ酸をRCH(NH２)COOHで表したときに、Ｒに相当する基をいう。本明細書では、アミノ酸には、RaRbCH(NH)COOH（RaおよびRbは、任意の基であり、一緒になって環状の基を形成していても良い）で示されるイミノ酸を含む。したがって、イミノ酸の場合は、RaまたはRbはあるいはその両方相当する基が側鎖に該当し得る。個々で例示的なアミノ酸としては、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、ホモセリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンなどが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、プロリンなどの環状イミノ酸の場合は、R1とR3またはR4また、アミノ酸がグリシンの場合は、R1は、単結合を意味し得る。【００６４】
ここで、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素（保護されていない場合）、あるいは、Ｆｍｏｃ基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルエチレンオキシカルボニル基、アルキレノイル基（例えば、ペンテノイル基）、オキシアルキレノイル基などであり得る。好ましくは、オキシカルボニル基がリンカーとして結合している。オキシカルボニル基が介在することによってアミノ基との連結がスムーズになるからである。【００６５】
ここで、R５は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基、システイン残基などであり得る。【００６６】
本明細書において、「５’−ホスホ−２’−デオキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド」（ｐｄＮｐＮ）とは、リボヌクレオチドに、５−ホスホ−２−デオキシリボヌクレオチドが結合した化合物をいい、３位に任意のアミノ酸を結合させて、ｔＲＮＡを作製するための基質として有用である。代表的なｐｄＮｐＮとしては、ｐｄＣｐＡ（５’−ホスホ−２’−デオキシリボシチジリルリボアデノシン）が挙げられるがそれらに限定されない。ｐｄＮｐＮにおけるデオキシリボヌクレオチジルは、β−Ｄ−チミジン、２’−デオキシ−β−Ｄ−シチジン、２’−デオキシ−β−Ｄ−アデノシン、２’−デオキシ−β−Ｄ−グアノシン、２’−デオキシ−β−Ｄ−ウラシルおよび２’−デオキシ−β−Ｄ−イノシンなどであり得る。ｐｄＮｐＮにおけるリボヌクレオチジルは、β−Ｄ−シチジン、β−Ｄ−アデノシン、β−Ｄ−グアノシン、β−Ｄ−ウラシルおよびβ−Ｄ−イノシンなどであり得る。ｐｄＣｐＡは以下の式で示される。【００６７】
【化２２】
2005075639.tif 000017
【００６８】
本明細書において、「改変ｔＲＮＡ」とは、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む、転写ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をいう。ｔＲＮＡは、細胞内には２０種類のアミノ酸に対して，それぞれ１種またはそれ以上の分子種（ｉｓｏａｃｃｅｐｔｉｎｇ  ｔＲＮＡ）が存在する。ｔＲＮＡは沈降係数４Ｓ、分子量２〜３万、ヌクレオチド数７０〜９０程度の比較的小さいＲＮＡであり、多くの修飾塩基（例えば、メチル化ヌクレオシド）を含有することが知られている。ｔＲＮＡのヌクレオチド配列（一次構造）は分子種によって互いに異なるが、いずれも二次構造としてクローバー葉モデルをとりうるような配列であり，それが折りたたまれてＬ字型三次構造をとることが知られており、各ｔＲＮＡ分子のほぼ中央部には、コドンと相補的なヌクレオチド配列（天然では３塩基配列であり、本発明において提供される改変ｔＲＮＡでは３塩基以外（例えば、４塩基以上であり、代表的には４塩基）となっている）であるアンチコドンループを形成する。３’末端にそれぞれ特異的なアミノ酸を結合したアミノアシルｔＲＮＡが、リボソーム上でｍＲＮＡのコドンと相補的な塩基対合を形成し次々とコドンをアミノ酸に対応づけることが知られている。【００６９】
そのような改変ｔＲＮＡとしては、例えば、５’−ＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＣＣＧＡＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＵＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＡ（ｔＲＮＡＣＣＣＧとも称される；配列番号１）；５’−ＧＣＧ  ＧＡＵ  ＵＵＡ  ＧＣＵ  ＣＡＧ  ＵＵＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ  ＣＧＣ  ＣＡＧ  ＡＣＵ  ＮＣＣＵ  ＡＡＵ  ＣＵＧ  ＧＡＧ  ＧＵＣ  ＣＵＧ  ＵＧＵ  ＵＣＧ  ＡＵＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＡＵＵ  ＣＧＣ  ＡＣ（ｔＲＮＡＮＣＣＵ（−ＣＡ）とも称される；Ｎは任意の塩基；配列番号２）が挙げられるがそれらに限定されない。例示的な改変ｔＲＮＡとしては、例えば、配列番号２におけるＮＣＣＵの位置に、別の4塩基配列を置換することによって、本願発明のｔＲＮＡを作製することも可能である。【００７０】
本発明の改変ｔＲＮＡにおいて用いられ得る4塩基配列としては、例えば、ＣＵＣＵ、ＣＵＣＡ、ＣＣＣＵ、ＣＧＧＵ、ＣＧＧＧなどのアンチコドンが挙げられるがそれらに限定されない。【００７１】
本明細書において４塩基コドン（またはそれ以上の塩基コドン）の「最初の３塩基」とは、５’末端から並べた場合に、第１のヌクレオチドから第３のヌクレオチドから構成されるコドンをいう。同様に、４塩基コドン（またはそれ以上の塩基コドン）の「最後の３塩基」とは、５’末端から並べた場合に、３’から数えた場合の第１のヌクレオチドから第３のヌクレオチドから構成されるコドンをいう。同様に、４塩基コドン（またはそれ以上の塩基コドン）の「任意の３塩基」とは、５’末端から並べた場合に、任意の３連続ヌクレオチドから構成されるコドンをいう。コドンの対応表は、以下の表に示される。以下の表には、３塩基コドンのほか、これまでに報告がある非天然アミノ酸を組み込んだ４塩基コドンの代表例が示されている。【００７２】
【表１】
2005075639.tif 000018
2005075639.tif 000019
【００７３】
本明細書において「アンチコドン」とは、コドンに相補的な配列またはその配列を有する分子をいう。例えば、ＣＧＴに対するアンチコドンは、ＡＣＧであり、Ａ−Ｔ（またはＵ）、Ｃ−Ｇの相互の変換および５’と３’とを逆にすることによって相補的な配列を作製することができる。【００７４】
本明細書において、「対応する」コドン、ｔＲＮＡとは、遺伝コドン（３塩基コドンに加え、４塩基およびそれ以上の塩基コドンが存在する場合はそのコドンも含む）の対応表に従って、対応関係にあるコドンとｔＲＮＡとの関係をいう。【００７５】
本明細書においてｔＲＮＡの量が「有意に多い」とは、そのｔＲＮＡによって得られるタンパク質の合成の量が有意に変更する程度に多い量をいう。代表的には、有意に多いは、統計学的に多いものをいうが、それに限定されず、当業者は、そのような量を当該分野において周知の技術を用いて選択することができる。例示的な有意に多い量としては、例えば、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１００倍などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において「有意に少ない」とは、「有意に多い」と逆の概念を指す。【００７６】
本明細書において「４塩基コドンを３塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質」とは、本発明の改変核酸分子をすべてが３塩基コドンを使用したとして転写および翻訳した場合に生成するタンパク質をいう。４塩基コドンを３塩基コドンして読むので、そのコドン以降のアミノ酸配列が異なり、通常終止コドンがずれることから、生成するタンパク質の長さが変更される。【００７７】
本明細書において、機能性タンパク質に関し、「改変核酸分子」とは、４塩基コドンまたはその相補体を含み、４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードするものをいう。ここで、４塩基コドンには、通常、その４塩基コドンに対応する改変ｔＲＮＡに結合されたアミノ酸が対応し、本発明では、代表的に、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸が相当する。【００７８】
改変ｔＲＮＡは、当該分野において周知の手法およびＨｏｈｓａｋａ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１８，  ９７７８−９７７９；およびＨｏｈｓａｋａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  、  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，１２１，  ３４−４０などを参酌して作製することができる。例示的に説明すると、既存のｔＲＮＡ（天然のものであっても、すでに改変されたものであっても良い）を用いて、例えば、部位特異的変異誘発などの遺伝子操作により所望の配列を有するように改変したものをコードするテンプレートＤＮＡを逆転写してＲＮＡを合成することによってｔＲＮＡを作製することができる。【００７９】
あるいは、ｔＲＮＡ（天然のものであっても、すでに改変されたものであっても良い）をコードするテンプレートＤＮＡをＴ７プロモーター制御下になるように化学合成し、別のｔＲＮＡ（−ＣＡ）のテンプレートを部位特異的変異誘発により作製する。次いで、化学的に合成したアミノアシルジヌクレオチドを、Ｔ７転写したテンプレートｔＲＮＡに対して、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いて連結することによって、アミノアシルｔＲＮＡ（−ＣＡ）を作製することができる。【００８０】
本明細書において、「アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素」とは、特定のアミノ酸を活性化して，対応するｔＲＮＡに正しく結合させる酵素をいう。一つのアミノ酸とそれに対応する複数のｔＲＮＡに対して、通常、一つの特異的な酵素が存在するが、２以上の特異的な酵素が存在する場合も存在し、そのような場合は、いずれの酵素も本発明において使用することができる。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、通常、２段階の反応：（１）ＡＴＰ存在下でアミノ酸をアシル化するアミノ酸活性化反応；および（２）活性化アミノ酸を、対応するｔＲＮＡの３’−末端アデノシンの３’−（または２’−）ＯＨ基に転移する転移反応を触媒する。アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素は、通常のｔＲＮＡとアミノ酸との連結反応に使用されるほか、本発明の改変ｔＲＮＡと保護ｐｄＮｐＮアミノ酸との連結反応にも用いることができる。改変ｔＲＮＡと保護ｐｄＮｐＮアミノ酸との連結は、Ｔ７リガーゼなどのリガーゼを用いて行うことができる。この場合、アミノ酸は、アミノアシルジヌクレオチドとして提供されても良い。【００８１】
本明細書において「転写」とは、当該分野において通常使用される意味と同じ意味で用いられ、伝子DNAのヌクレオチド配列を相補的RNAとして写しとる反応をいう。この反応は、通常、生体内（細胞内）で行われるが、必要な材料が存在する限り、無細胞系でも行われ得る。そのような無細胞系には、当該分野において公知のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびその補因子および／または調節因子、ならびに必要なヌクレオチドなどを含み得る。なお、転写の逆の反応（ＲＮＡを鋳型とするＤＮＡ合成反応）は、本明細書において「逆転写」という。【００８２】
本明細書において「翻訳」とは、タンパク質の生合成または人工合成の際に、mRNA上の塩基配列を読みとってその情報に対応するアミノ酸を選びだしペプチド鎖を形成していく過程をいう。翻訳もまた、通常、生体内（細胞内）で行われるが、必要な材料が存在する限り、無細胞系でも行われ得る。そのような無細胞系は、本明細書において「タンパク質合成系」という。生体内で行われる場合は、ｍＲＮＡはリボソームと結合し，そのｍＲＮＡ上のコドン（３連塩基）にそれぞれ対応した構造をもつアミノアシルｔＲＮＡによって，アミノ酸は順次連結される。無細胞系は、細胞から取り出したリボゾーム系および他の必要なアミノ酸などを含み、これらの系は試験管内で行われ得る。【００８３】
本明細書においてタンパク質合成系は、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素（代表的には、リボソームＲＮＡ＝ｒＲＮＡまたはそれを含むリボソーム）ならびに他の調節因子を含む。【００８４】
タンパク質合成は、代表的に、以下の４段階の反応工程を含む。（１）アミノ酸の活性化：各アミノ酸はそのアミノ酸に特異的なアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の上で、ＡＴＰ存在下にアシル化され活性化される．続いて同じ酵素上で，対応するｔＲＮＡの３’末端アデノシンにエステル結合してアミノアシルｔＲＮＡを形成する。この段階は、アミノ酸とそのアミノ酸に対するアンチコドンを担ったｔＲＮＡを結合する。すなわち遺伝情報とアミノ酸を正確に直接結びつける点で、タンパク質生合成の正確さを維持するのに重要である。本発明では、この段階において、改変ｔＲＮＡを使用することができる。（２）合成開始：タンパク質生合成は、通常、開始コドン（ＡＵＧ）から開始される。開始コドンは、原核細胞ではホルミルメチオニルｔＲＮＡ（ｆＭｅｔ−ｔＲＮＡ）、真核細胞ではメチオニルｔＲＮＡにより認識される。まずタンパク質鎖開始因子・ＧＴＰの介助により、ｍＲＮＡがリボソーム上の正しい位置に固定され、ｍＲＮＡ上の開始コドンにｆＭｅｔ−ｔＲＮＡが結合した開始複合体が形成される。（３）タンパク質鎖の延長：ｍＲＮＡ上の次のコドンで規定されるアミノアシルｔＲＮＡが、延長因子・ＧＴＰ・Ｍｇ２＋の介助により複合体上に結合し、次のコドンと塩基対を形成する。この段階でｆＭｅｔは次のアミノ酸のアミノ基に転移しペプチド結合を形成する。この反応は、リボソームサブユニット中のｒＲＮＡ（原核細胞では２３ＳｒＲＮＡ）により触媒される。次いでリボソームは、ｍＲＮＡ上を１コドン分だけ５’→３’方向へ移動する。このサイクルを繰り返すことで、ｍＲＮＡの示す遺伝コドンどおりにペプチド鎖は順次Ｃ末端方向に延長する。（４）合成の終結：次のアミノアシルｔＲＮＡが入る位置に終止コドンが来ると、ｔＲＮＡの代わりにタンパク質鎖終止因子が結合し、新生タンパク質鎖をｔＲＮＡから切り離してリボソームから遊離させる。リボソームは次の蛋白質生合成に再利用される。遊離した新生タンパク質鎖は折り畳まれ、プロセッシングを受けるとか何らかの翻訳後修飾を受けるなどで，最終的な生物活性をもった立体構造のタンパク質が生成される。【００８５】
タンパク質合成系は、好ましくは、転写に必要な因子を含み得る。このような場合、無細胞発現系とも称される。【００８６】
改変ｔＲＮＡを用いた場合の模式図は、図１に示す。また、改変ｔＲＮＡを用いてタンパク質合成をする全体像を図２に示す。【００８７】
本明細書において使用される4塩基コドンは、３塩基コドンで読まれた場合には通常終止コドンが別の場所に移動することからフラグメントとして翻訳が終結するかまたはより長いタンパク質として翻訳されることから、４塩基コドンで翻訳された生成物とは区別できることから、3塩基コドンと共存することができるので，自然界の3塩基コドンによる20種類のアミノ酸の体系を大きく崩すことなしに導入できる。【００８８】
本明細書において、物質（例えば、細胞、核酸またはタンパク質などの生物学的因子）の「単離」とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の物質（例えば、糖鎖または糖鎖含有物質である場合、糖鎖または糖鎖含有物質以外の因子、あるいは、目的とする糖鎖または糖鎖含有物質以外の糖鎖または糖鎖含有物質；核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」、糖鎖または糖鎖含有物質には、本発明の精製方法によって精製された糖鎖または糖鎖含有物質が含まれる。したがって、単離された糖鎖または糖鎖含有物質は、化学的に合成した糖鎖または糖鎖含有物質を包含する。【００８９】
本明細書において、物質（例えば、糖鎖、核酸またはタンパク質などの生物学的因子）の「精製」とは、その物質に天然に随伴する因子の少なくとも一部を除去することをいう。したがって、精製および分離は、その形態が一部重複する。したがって、通常、精製された物質（例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子）におけるその物質の純度は、その物質が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）が、天然に随伴する因子が低減されている限り、濃縮されていない状態も「精製」の概念に包含される。【００９０】
本明細書において物質（例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子）の「濃縮」とは、その物質が濃縮前に試料に含まれている含有量よりも高い濃度に上昇させる行為をいう。従って、濃縮もまた、精製および分離と、その概念が一部重複する。したがって、通常、濃縮された物質（例えば、糖鎖または糖鎖含有物質のような生物学的因子）は、その物質が通常存在する状態における不純物の含有量は低減されているが、目的とする物質の含有量が増加している限り、ある特定の不純物が増加していてもよく、「精製」されていない状態も「濃縮」の概念に包含される。【００９１】
（細胞系を用いる場合のタンパク質の製造方法）
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを組み込んだ組換え体ベクターを保有する微生物、動物細胞などに由来する形質転換体を、本発明の改変ｔＲＮＡおよび／または糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いて、通常の培養方法に従って培養し、本発明のタンパク質を生成蓄積させ、本発明の培養物より本発明のタンパク質を採取することにより、本発明のタンパク質または糖タンパク質を製造することができる。【００９２】
本発明の形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。大腸菌等の原核生物あるいは酵母等の真核生物を宿主として得られた形質転換体を培養する培地としては、本発明の生物が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。【００９３】
炭素源としては、それぞれの微生物が資化し得るものであればよく、グルコース、フラクトース、スクロース、これらを含有する糖蜜、デンプンあるいはデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸、プロピオン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類を用いることができる。【００９４】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の各種無機酸または有機酸のアンモニウム塩、その他含窒素物質、ならびに、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕および大豆粕加水分解物、各種発酵菌体およびその消化物等を用いることができる。【００９５】
無機塩としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウム等を用いることができる。培養は、振盪培養または深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行う。【００９６】
培養温度は１５〜４０℃がよく、培養時間は、通常５時間〜７日間である。培養中ｐＨは、３．０〜９．０に保持する。ｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア等を用いて行う。また培養中必要に応じて、アンピシリンまたはテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【００９７】
プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。遺伝子を導入した植物の細胞または器官は、ジャーファーメンターを用いて大量培養することができる。培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、またはこれら培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。【００９８】
例えば、動物細胞を用いる場合、本発明の細胞を培養する培地は、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地［Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９（１９６７）］、ＥａｇｌｅのＭＥＭ培地［Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１（１９５２）］、ＤＭＥＭ培地［Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６（１９５９）］、１９９培地［Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１（１９５０）］またはこれら培地にウシ胎児血清等を添加した培地等が用いられる。【００９９】
培養は、通常ｐＨ６〜８、２５〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行う。また培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。【０１００】
（タンパク質の精製および単離）
本発明のタンパク質をコードする核酸配列で形質転換された形質転換体の培養物から、本発明のタンパク質を単離または精製するためには、当該分野で周知慣用の通常の酵素の単離または精製法を用いることができる。例えば、本発明のタンパク質が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞外に本発明のタンパク質が分泌される場合には、その培養物を遠心分離等の手法により処理し、可溶性画分を取得する。その可溶性画分から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用い、精製標品を得ることができる。【０１０１】
本発明のタンパク質が本発明のタンパク質製造用形質転換体の細胞内に溶解状態で蓄積する場合には、培養物を遠心分離することにより、培養物中の細胞を集め、その細胞を洗浄した後に、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモジナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。その無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、溶媒抽出法、硫安等による塩析法脱塩法、有機溶媒による沈澱法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱化学）等樹脂を用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）等の樹脂を用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等の樹脂を用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を用いることによって、精製標品を得ることができる。【０１０２】
本発明のタンパク質が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより得られた沈澱画分より、通常の方法により本発明のタンパク質を回収後、そのタンパク質の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。この可溶化液を、タンパク質変性剤を含まないあるいはタンパク質変性剤の濃度をタンパク質が変性しない程度に希薄な溶液に希釈、あるいは透析し、本発明のタンパク質を正常な立体構造に構成させた後、上記と同様の単離精製法により精製標品を得ることができる。【０１０３】
また、通常のタンパク質の精製方法［Ｊ．Ｅｖａｎ．Ｓａｄｌｅｒら：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，８３，４５８］に準じて精製できる。また、本発明のタンパク質を他のタンパク質との融合タンパク質として生産し、融合したタンパク質に親和性をもつ物質を用いたアフィニティークロマトグラフィーを利用して精製することもできる［山川彰夫，実験医学（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），１３，４６９−４７４（１９９５）］。例えば、Ｌｏｗｅらの方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７−８２３１（１９８９）、ＧｅｎｅｓＤｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］に記載の方法に準じて、本発明のタンパク質をプロテインＡとの融合タンパク質として生産し、イムノグロブリンＧを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。【０１０４】
また、本発明のタンパク質をＦＬＡＧペプチドとの融合タンパク質として生産し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８６，８２２７（１９８９）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．，４，１２８８（１９９０）］。【０１０５】
さらに、本発明のタンパク質自身に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することもできる。本発明のタンパク質は、公知の方法［Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ，６，１２９−１３４、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０，１６６−１６８（１９９１）］に準じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写・翻訳系を用いてを生産することができる。【０１０６】
上記で取得されたタンパク質のアミノ酸情報を基に、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても本発明のタンパク質を製造することができる。また、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｓｙｎｔｈｅｃｅｌｌ−Ｖｅｇａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ、島津製作所等のペプチド合成機を利用し化学合成することもできる。【０１０７】
精製した本発明のタンパク質の構造解析は、タンパク質化学で通常用いられる方法、例えば遺伝子クローニングのためのタンパク質構造解析（平野久著、東京化学同人発行、１９９３年）に記載の方法により実施可能である。【０１０８】
（変異型タンパク質の作製方法）
本発明タンパク質のアミノ酸の欠失、置換もしくは付加は、出願前周知技術である部位特異的変異誘発法により実施することができる。かかる１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １〜３８，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９８７−１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，５６６２（１９８４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２４，１４３１（１９８４）、ＰＣＴ  ＷＯ８５／００８１７（１９８５）、Ｎａｔｕｒｅ，３１６，６０１（１９８５）等に記載の方法に準じて調製することができる。【０１０９】
（有機化学）
本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキル」とは、以下に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ７アルキル、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ９アルキル、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ１〜Ｃ１１アルキルまたはＣ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキルであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味し、メチル（ＣＨ３−）、エチル（Ｃ２Ｈ５−）、ｎ−プロピル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピル（（ＣＨ３）２ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシル（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−Ｃ（ＣＨ３）２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキルとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。【０１１０】
本明細書において「置換されていてもよいアルキル」とは、上で定義した「アルキル」または「置換されたアルキル」のいずれであってもよいことを意味する。【０１１１】
本明細書において「アルキレン」とは、メチレン、エチレン、プロピレンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に−ＣｎＨ２ｎ−で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキレンは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換されたアルキレン」とは、以下に規定する置換基によってアルキレンのＨが置換されたアルキレンをいう。これらの具体例は、Ｃ１〜Ｃ２アルキレン、Ｃ１〜Ｃ３アルキレン、Ｃ１〜Ｃ４アルキレン、Ｃ１〜Ｃ５アルキレン、Ｃ１〜Ｃ６アルキレン、Ｃ１〜Ｃ７アルキレン、Ｃ１〜Ｃ８アルキレン、Ｃ１〜Ｃ９アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１アルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２アルキレン、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキレン、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルキレンまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルキレンであり得る。ここで、例えばＣ１〜Ｃ１０アルキレンとは、炭素原子を１〜１０個有する直鎖または分枝状のアルキレンを意味し、メチレン（−ＣＨ２−）、エチレン（−Ｃ２Ｈ４−）、ｎ−プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、イソプロピレン（−（ＣＨ３）２Ｃ−）、ｎ−ブチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ペンチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘキシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ヘプチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−オクチレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−ノニレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、ｎ−デシレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、−ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）２−などが例示される。また、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルキレンとは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルキレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。【０１１２】
本明細書において「置換されていてもよいアルキレン」とは、上で定義した「アルキレン」または「置換されたアルキレン」のいずれであってもよいことを意味する。【０１１３】
本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換されたシクロアルキル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルキルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルキルであり得る。例えば、シクロアルキルとしては、シクロプロピル、シクロヘキシルなどが例示される。【０１１４】
本明細書において「置換されていてもよいシクロアルキル」とは、上で定義した「シクロアルキル」または「置換されたシクロアルキル」のいずれであってもよいことを意味する。【０１１５】
本明細書において「アルケニル」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−１−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルケニル、Ｃ２〜Ｃ４アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ７アルケニル、Ｃ２〜Ｃ８アルケニル、Ｃ２〜Ｃ９アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニルであり得る。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味し、ビニル（ＣＨ２＝ＣＨ−）、アリル（ＣＨ２＝ＣＨＣＨ２−）、ＣＨ３ＣＨ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。【０１１６】
本明細書において「置換されていてもよいアルケニル」とは、上で定義した「アルケニル」または「置換されたアルケニル」のいずれであってもよいことを意味する。【０１１７】
本明細書において「アルケニレン」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に−ＣｎＨ２ｎ−２−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルケニレン」とは、以下に規定する置換基によってアルケニレンのＨが置換されたアルケニレンをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ２５アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ２５置換されたアルケニレンが挙げられ、なかでも特にＣ２〜Ｃ３アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ４アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ５アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ７アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ８アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ９アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１１アルケニレンまたはＣ２〜Ｃ１２アルケニレン、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニレン、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルケニレンまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルケニレンが好ましい。ここで、例えばＣ２〜Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルケニレンを意味し、−ＣＨ＝ＣＨ−、−ＣＨ＝ＣＨＣＨ２−、−（ＣＨ３）Ｃ＝ＣＨ−などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルケニレンとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルケニレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。【０１１８】
本明細書において「置換されていてもよいアルケニレン」とは、上で定義した「アルケニレン」または「置換されたアルケニレン」のいずれであってもよいことを意味する。【０１１９】
本明細書において「シクロアルケニル」とは、環式構造を有するアルケニルをいう。「置換されたシクロアルケニル」とは、以下に規定する置換基によってシクロアルケニルのＨが置換されたシクロアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１２シクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ４置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ５置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ６置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ７置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ８置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ９置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１０置換されたシクロアルケニル、Ｃ３〜Ｃ１１置換されたシクロアルケニルまたはＣ３〜Ｃ１２置換されたシクロアルケニルであり得る。例えば、好ましいシクロアルケニルとしては、１−シクロペンテニル、２−シクロヘキセニルなどが例示される。【０１２０】
本明細書において「置換されていてもよいシクロアルケニル」とは、上で定義した「シクロアルケニル」または「置換されたシクロアルケニル」のいずれであってもよいことを意味する。【０１２１】
本明細書において「アルキニル」とは、アセチレンのような、分子内に三重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ−３−で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換されたアルキニル」とは、以下に規定する置換基によってアルキニルのＨが置換されたアルキニルをいう。具体例としては、Ｃ２〜Ｃ３アルキニル、Ｃ２〜Ｃ４アルキニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ２〜Ｃ７アルキニル、Ｃ２〜Ｃ８アルキニル、Ｃ２〜Ｃ９アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１アルキニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ２〜Ｃ３置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ４置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ５置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ６置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ７置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ８置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ９置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニル、Ｃ２〜Ｃ１１置換されたアルキニルまたはＣ２〜Ｃ１２置換されたアルキニルであり得る。ここで、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルとは、例えば炭素原子を２〜１０個含む直鎖または分枝状のアルキニルを意味し、エチニル（ＣＨ≡Ｃ−）、１−プロピニル（ＣＨ３Ｃ≡Ｃ−）などが例示される。また、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０置換されたアルキニルとは、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。【０１２２】
本明細書において「置換されていてもよいアルキニル」とは、上で定義した「アルキニル」または「置換されたアルキニル」のいずれであってもよいことを意味する。【０１２３】
本明細書において「アルコキシ」とは、アルコール類のヒドロキシ基の水素原子が失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１Ｏ−で表される（ここで、ｎは１以上の整数である）。「置換されたアルコキシ」とは、以下に規定する置換基によってアルコキシのＨが置換されたアルコキシをいう。具体例としては、Ｃ１〜Ｃ２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１１アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１２アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ２置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ３置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ４置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ５置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ７置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ８置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ９置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１０置換されたアルコキシ、Ｃ１〜Ｃ１１置換されたアルコキシまたはＣ１〜Ｃ１２置換されたアルコキシであり得る。ここで、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０アルコキシとは、炭素原子を１〜１０個含む直鎖または分枝状のアルコキシを意味し、メトキシ（ＣＨ３Ｏ−）、エトキシ（Ｃ２Ｈ５Ｏ−）、ｎ−プロポキシ（ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−）などが例示される。【０１２４】
本明細書において「置換されていてもよいアルコキシ」とは、上で定義した「アルコキシ」または「置換されたアルコキシ」のいずれであってもよいことを意味する。【０１２５】
本明細書において「ヘテロ環（基）」とは、炭素およびヘテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで、ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、１つ含まれていても２以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。ヘテロ環基は置換されていてもよい。【０１２６】
本明細書において「置換されていてもよいヘテロ環（基）」とは、上で定義した「ヘテロ環（基）」または「置換されたヘテロ環（基）」のいずれであってもよいことを意味する。【０１２７】
本明細書において「アルコール」とは、脂肪族炭化水素の１または２以上の水素原子をヒドロキシル基で置換した有機化合物をいう。本明細書においては、ＲＯＨとも表記される。ここで、Ｒは、アルキル基である。好ましくは、Ｒは、Ｃ１〜Ｃ６アルキルであり得る。アルコールとしては、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノールなどが挙げられるがそれらに限定されない。【０１２８】
本明細書において「炭素環基」とは、炭素のみを含む環状構造を含む基であって、前記の「シクロアルキル」、「置換されたシクロアルキル」、「シクロアルケニル」、「置換されたシクロアルケニル」以外の基をいう。炭素環基は芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換された炭素環基」とは、以下に規定する置換基によって炭素環基のＨが置換された炭素環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基であり得る。炭素環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基であり得る。炭素環基としては、フェニル基から水素原子が１個欠失したものが例示される。ここで、水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。【０１２９】
本明細書において「置換されていてもよい炭素環基」とは、上で定義した「炭素環基」または「置換された炭素環基」のいずれであってもよいことを意味する。【０１３０】
本明細書において「ヘテロ環基」とは、炭素およびヘテロ原子をも含む環状構造を有する基をいう。ここで，ヘテロ原子は、Ｏ、ＳおよびＮからなる群より選択され、同一であっても異なっていてもよく、１つ含まれていても２以上含まれていてもよい。ヘテロ環基は、芳香族系または非芳香族系であり得、そして単環式または多環式であり得る。「置換されたヘテロ環基」とは、以下に規定する置換基によってヘテロ環基のＨが置換されたヘテロ環基をいう。具体例としては、Ｃ３〜Ｃ４炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１２炭素環基、Ｃ３〜Ｃ４置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ５置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ６置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ７置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ８置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ９置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１０置換された炭素環基、Ｃ３〜Ｃ１１置換された炭素環基またはＣ３〜Ｃ１２置換された炭素環基の１つ以上の炭素原子をヘテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基はまた、Ｃ４〜Ｃ７炭素環基またはＣ４〜Ｃ７置換された炭素環基の炭素原子を１つ以上へテロ原子で置換したものであり得る。ヘテロ環基としては、チエニル基、ピロリル基、フリル基、イミダゾリル基、ピリジル基などが例示される。水素の欠失位置は、化学的に可能な任意の位置であり得、芳香環上であってもよく、非芳香環上であってもよい。【０１３１】
本明細書において、炭素環基またはヘテロ環基は、下記に定義されるように１価の置換基で置換され得ることに加えて、２価の置換基で置換され得る。そのような二価の置換は、オキソ置換（＝Ｏ）またはチオキソ置換（＝Ｓ）であり得る。【０１３２】
本明細書において「ハロゲン」とは、周期表７Ｂ族に属するフッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などの元素の１価の基をいう。【０１３３】
本明細書において「ヒドロキシ」とは、−ＯＨで表される基をいう。「置換されたヒドロキシ」とは、ヒドロキシのＨが下記で定義される置換基で置換されているものをいう。【０１３４】
本明細書において「チオール」とは、ヒドロキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基（メルカプト基）であり、−ＳＨで表される。「置換されたチオール」とは、メルカプトのＨが下記で定義される置換基で置換されている基をいう。【０１３５】
本明細書において「シアノ」とは、−ＣＮで表される基をいう。「ニトロ」とは、−ＮＯ２で表される基をいう。「アミノ」とは、−ＮＨ２で表される基をいう。「置換されたアミノ」とは、アミノのＨが以下で定義される置換基で置換されたものをいう。【０１３６】
本明細書において「カルボキシ」とは、−ＣＯＯＨで表される基をいう。「置換されたカルボキシ」とは、カルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。【０１３７】
本明細書において「チオカルボキシ」とは、カルボキシ基の酸素原子を硫黄原子で置換した基をいい、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＨまたは−ＣＳＳＨで表され得る。「置換されたチオカルボキシ」とは、チオカルボキシのＨが以下に定義される置換基で置換されたものをいう。【０１３８】
本明細書において「アシル」とは、カルボン酸からＯＨを除いてできる１価の基をいう。アシル基の代表例としては、アセチル（ＣＨ３ＣＯ−）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ−）などが挙げられる。「置換されたアシル」とは、アシルの水素を以下に定義される置換基で置換したものをいう。【０１３９】
本明細書において「アミド」とは、アンモニアの水素を酸基（アシル基）で置換した基であり、好ましくは、−ＣＯＮＨ２で表される。「置換されたアミド」とは、アミドが置換されたものをいう。【０１４０】
本明細書において「カルボニル」とは、アルデヒドおよびケトンの特性基である−（Ｃ＝Ｏ）−を含むものを総称したものをいう。「置換されたカルボニル」は、下記において選択される置換基で置換されているカルボニル基を意味する。【０１４１】
本明細書において「チオカルボニル」とは、カルボニルにおける酸素原子を硫黄原子に置換した基であり、特性基−（Ｃ＝Ｓ）−を含む。チオカルボニルには、チオケトンおよびチオアルデヒドが含まれる。「置換されたチオカルボニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたチオカルボニルを意味する。【０１４２】
本明細書において「スルホニル」とは、特性基である−ＳＯ２−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルホニル」とは、下記において選択される置換基で置換されたスルホニルを意味する。【０１４３】
本明細書において「スルフィニル」とは、特性基である−ＳＯ−を含むものを総称したものをいう。「置換されたスルフィニル」とは、下記において選択される置換基で置換されているスルフィニルを意味する。【０１４４】
本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。【０１４５】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。【０１４６】
本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換することも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換することも可能である。【０１４７】
本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。このような置換基は、本発明において、アミノ酸の設計のときに、適宜利用することができる。【０１４８】
好ましくは、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素原子またはアルキルであり得るが、複数の置換基全てが水素原子であることはない。より好ましくは、独立して、置換基は、複数存在する場合それぞれ独立して、水素およびＣ１〜Ｃ６アルキルからなる群より選択され得る。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良いが、好ましくは、少なくとも１つの水素、より好ましくは、２〜ｎ（ここでｎは置換基の個数）の水素を有し得る。置換基のうち水素の数が多いことが好ましくあり得る。大きな置換基または極性のある置換基は本発明の効果（特に、アルデヒド基との相互作用）に障害を有し得るからである。従って、水素以外の置換基としては、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ３アルキル、Ｃ１〜Ｃ２アルキル、メチルなどであり得る。ただし、本発明の効果を増強し得ることもあることから、大きな置換基を有することもまた好ましくあり得る。【０１４９】
本明細書において、Ｃ１、Ｃ２、、、Ｃｎは、炭素数を表す。従って、Ｃ１は炭素数１個の置換基を表すために使用される。【０１５０】
本明細書において、「光学異性体」とは、結晶または分子の構造が鏡像関係にあって、重ねあわせることのできない一対の化合物の一方またはその組をいう。立体異性体の一形態であり、他の性質は同じであるにもかかわらず、旋光性のみが異なる。【０１５１】
本明細書において「保護反応」とは、Ｂｏｃのような保護基を、保護が所望される官能基に付加する反応をいう。保護基により官能基を保護することによって、より反応性の高い官能基の反応を抑制し、より反応性の低い官能基のみを反応させることができる。保護反応は、例えば、脱水反応により行うことができる。【０１５２】
本明細書において「脱保護反応」とは、Ｂｏｃのような保護基を脱離させる反応をいう。脱保護反応としては、Ｐｄ／Ｃを用いる還元反応のような反応が挙げられる。脱保護反応は、例えば、加水分解により行うことができる。【０１５３】
本明細書において「保護基」としては、例えば、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、Ｎ-フタルイミジル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２-ニトロ-４，５-ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などが代表的な保護基として挙げられる。保護基は、例えば、アミノ基、カルボキシル基などの反応性の官能基を保護するために用いることができる。反応の条件や目的に応じ、種々の保護基を使い分けることができる。ヒドロキシ基の保護基にはアセチル基、ベンジル基、シリル基またはそれらの誘導体などが、アミノ基の保護基にはアセチル基のほかベンジルオキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基またはそれらの誘導体などを使用することができる。アミノオキシ基およびN-アルキルアミノオキシ基の保護基として、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２-ニトロ-４，５-ジメトキシベンジルオキシカルボニル基またはそれらの誘導体が好ましい。【０１５４】
本発明の各方法において、目的とする生成物は、反応液から夾雑物（未反応減量、副生成物、溶媒など）を、当該分野で慣用される方法（例えば、抽出、蒸留、洗浄、濃縮、沈澱、濾過、乾燥など）によって除去した後に、当該分野で慣用される後処理方法（例えば、吸着、溶離、蒸留、沈澱、析出、クロマトグラフィーなど）を組み合わせて処理して単離し得る。【０１５５】
（糖鎖が結合した糖タンパク質の製造）
本願発明の糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質と糖鎖とを用いて、糖鎖が結合した糖タンパク質を製造することができる。糖鎖が結合した糖タンパク質の製造は、２つの材料を、適切な緩衝液の存在下で混合し、適切な温度で、適切な時間反応させることによって、行うことができる。そのような条件の選択は、本明細書の記載に基づいて行うことができる。【０１５６】
本発明において製造される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなどの発現系により製造した後、製造されたタンパク質を適切な手段（例えば、アフィニティー精製クロマトグラフィーなど）により精製し、必要に応じて凍結乾燥させる。【０１５７】
その後、製造された糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を、所望の糖鎖（例えば、ラクトース、マンノペンタオースなどのオリゴマンノース、ルイスｂ、シアリルルイスＸなど）と適切な緩衝液の存在下で混合する。ここで用いられる緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝系、燐酸緩衝系、トリス緩衝系などを用いることができる。【０１５８】
本発明において、使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質および糖鎖の濃度は、反応が進む限り、どのような濃度で使用してもよい。また、１：１での反応が想定されることから、ほぼ同モル濃度で反応させることが望ましいがそれに限定されない。従って、使用される相対比としては、例えば、１：１０〜１０：１などを使用することができる。そのような相対比は、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質と、使用される糖鎖との相対関係に依存することが理解され、そのような相対関係は、本明細書に基づいて当業者が理解することができる。【０１５９】
使用される糖鎖の絶対濃度としては、例えば、１ｍＭ〜２Ｍなどを挙げることができ、好ましくは、１０ｍＭ〜１Ｍなどを挙げることができる。【０１６０】
使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の濃度としてもまた、例えば、１ｍＭ〜２Ｍなどを挙げることができ、好ましくは、１０ｍＭ〜１Ｍなどを挙げることができる。【０１６１】
本発明では、糖鎖の付加反応は、接触が起こる限り、原理的に進むことが理解されるが、好ましくは、例えば、２５℃〜８０℃で反応が進むことが理解される。適切な温度の上限としては、例えば、８０℃、７０℃、６０℃、５０℃、４２℃、４０℃などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような温度は、タンパク質の種類にもより、熱変性しやすいタンパク質は、上限が、例えば、３７℃などであり得る。適切な温度の下限としては、例えば、２５℃、３０℃、３２℃、３７℃などであり得る。適切な温度の下限は、反応速度との関係から、必要な時間を考慮して当業者は適宜決定することができる。【０１６２】
反応時間もまた、当業者が、本明細書の記載を参酌して、適宜決定することができる。そのような時間としては、例えば、６時間〜５日などを挙げることができるがそれらに限定されない。【０１６３】
反応時間の下限としては、例えば、数時間（１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間など）、１日、数日（２−３日）などを挙げることができるが、それらに限定されず、当業者は、反応速度および効率などを考慮して本明細書の記載に基づいて適宜決定することができる。反応時間の上限としては、例えば、数日（２〜３日）、５日、６日、１０日などを挙げることができるがそれらに限定されない。生産された糖タンパク質が分解したり、変性しない程度に反応時間の上限を設定することが望ましい。【０１６４】
（本明細書において用いられる一般技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、マイクロフルイディクス、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。【０１６５】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。【０１６６】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，  ＮＹ，  １０１５８（２０００）；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ  ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（１９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２３０、２４２、２４７、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９４；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７；畑中、西村ら、糖質の科学と工学、講談社サイエンティフィク、１９９７；糖鎖分子の設計と生理機能  日本化学会編、学会出版センター、２００１などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。【０１６７】
（医薬・化粧品など、およびそれを用いる治療、予防など）
別の局面において、本発明は、医薬（例えば、ワクチン等の医薬品、健康食品、残さタンパク質又は脂質は抗原性を低減した医薬品）および化粧品に関する。この医薬および化粧品は、薬学的に受容可能なキャリアなどをさらに含み得る。本発明の医薬に含まれる薬学的に受容可能なキャリアとしては、当該分野において公知の任意の物質が挙げられる。【０１６８】
そのような適切な処方材料または薬学的に受容可能なキャリアとしては、抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的アジュバント挙げられるがそれらに限定されない。代表的には、本発明の医薬は、単離された多能性幹細胞、またはその改変体もしくは誘導体を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに含む組成物の形態で投与される。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。【０１６９】
本明細書で使用される受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；アスコルビン酸、α−トコフェロール；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。【０１７０】
例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、その生成物は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。【０１７１】
本発明の医薬は、経口的または非経口的に投与され得る。あるいは、本発明の医薬は、静脈内または皮下で投与され得る。全身投与されるとき、本発明において使用される医薬は、発熱物質を含まない、薬学的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能な組成物の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などを考慮することにより、当業者は、容易に行うことができる。本明細書において、投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）であり得る。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。【０１７２】
本発明の医薬は、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（日本薬局方第１４版またはその最新版、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０などを参照）と、所望の程度の純度を有する糖鎖組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で調製され保存され得る。【０１７３】
本発明の処置方法において使用される糖鎖組成物の量は、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被検体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。【０１７４】
本発明が化粧品として使用されるときもまた、当局の規定する規制を遵守しながら化粧品を調製することができる。【０１７５】
（農薬）
本発明の組成物は、農薬の成分としても用いることができる。農薬組成物として処方される場合、必要に応じて、農学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤などを含み得る。【０１７６】
本発明の組成物が、農薬として使用される場合は、除草剤（ピラゾレートなど）、殺虫・殺ダニ剤（ダイアジノンなど）、殺菌剤（プロベナゾールなど）、植物成長調整剤（例、パクロブトラゾールなど）、殺線虫剤（例、ベノミルなど）、共力剤（例、ピペロニルブトキサイドなど）、誘引剤（例、オイゲノールなど）、忌避剤（例、クレオソートなど）、色素（例、食用青色１号など）、肥料（例、尿素など）などもまた必要に応じて混合され得る。【０１７７】
（保健・食品）
本発明はまた、保健・食品分野においても利用することができる。このような場合、上述の経口医薬として用いられる場合の留意点を必要に応じて考慮すべきである。特に、特定保健食品のような機能性食品・健康食品などとして使用される場合には、医薬に準じた扱いを行うことが好ましい。好ましくは、本発明の糖鎖組成物は、低アレルゲン食品としても用いることができる。【０１７８】
（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。【０１７９】
（糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の生産および糖タンパク質を生産するための方法）
１つの局面において、本発明は、（ａ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程；（ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子を提供する工程であって、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに、目的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする、工程；（ｃ）該改変核酸分子を転写してｍＲＮＡを生成する工程；および（ｄ）該改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系に該ｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成する工程を含む、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質を生産するための方法を提供する。本発明ではまた、別の局面において、本発明のこの糖タンパク質生産するための基質となるタンパク質を生産する方法によって得られたタンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する工程、を包含する、糖タンパク質（例えば、生物学的に活性を有する糖タンパク質）を製造するための方法を提供する。本発明では、糖タンパク質を、所望の位置に、所望の糖鎖を導入した形態で提供することができ、あるいは、そのための基質を提供することができ、しかも、その操作が容易であり、従来より高い収率で所望の糖タンパク質を得ることができること、従来より高い選択性を持って糖タンパク質（例えば、医薬、農薬、食品など）を設計することができるという点で有用であり、顕著な効果を奏する。【０１８０】
本発明の方法において、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含み、４塩基コドンまたはそれ以上の塩基（例えば、５塩基）を認識する改変ｔＲＮＡは、任意のアミノ酸の任意の基（例えば、側鎖中の水素）を糖鎖に結合し得る官能基に置換して糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を得、およびその糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸をｔＲＮＡに結合することによって提供することができる。このような改変ｔＲＮＡは、例えば、３塩基コドンを認識するアンチコドンの部分を所望の４塩基コドンまたは５塩基コドンなどを認識するアンチコドンに置換するように変異を入れることによって作製することができる。そのような変異は、当該分野において周知の部位特異的変異誘発方法などを用いて導入することができる。【０１８１】
本発明において、４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子は、当該分野において周知の任意の方法を用いて作製することができる。そのような作製方法としては、例えば、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド自動合成などによってＤＮＡを生成することなどが挙げられるがそれらに限定されない。ここで、本発明の改変核酸分子は、４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに目的の糖タンパク質のタンパク質部分をコードする核酸配列を含むように構築される。当業者は、どのような核酸配列を含む核酸分子であっても、そのような核酸分子を任意に設計し、作製することができることが理解される。【０１８２】
本発明において、改変核酸分子の転写によるｍＲＮＡの生成は、当該分野において周知の任意の転写方法を用いて実施することができる。そのようなｍＲＮＡの生成は、テンプレートとなるＤＮＡ（例えば、本発明の改変核酸分子）およびその転写を触媒する酵素（例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）、基質となるＲＮＡ分子、および必要に応じて他の調節因子、補因子などを用いて行うことができる。【０１８３】
本発明において、改変ｔＲＮＡおよび翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含むタンパク質合成系にｍＲＮＡを曝してタンパク質を生成することもまた、当該分野において周知の任意の系（例えば、無細胞合成系、あるいは細胞合成系など）を用いて実施することができる。翻訳に必要なセットのｔＲＮＡは、目的とするタンパク質において含まれるべきアミノ酸を含むｔＲＮＡを少なくとも１種類ずつ含むことで十分である。従って、目的とするタンパク質が２０種類のアミノ酸から構成されるときは、通常、その２０種類のアミノ酸に対応するｔＲＮＡを少なくとも１つずつ有する。好ましくは、６４種類のコドンすべてに対応するｔＲＮＡを含むことが有利であるがそれに限定されない。コドン数が少ない場合は、それに応じて本発明の改変核酸分子の核酸配列を変更することによって、目的の糖タンパク質を生産することができる。目的とするタンパク質が１９種類以下のアミノ酸で構成される場合は、１９種類以下のアミノ酸に対応するｔＲＮＡを含むことで十分であり得る。【０１８４】
本発明において、タンパク質と所望の糖鎖とを結合させて糖タンパク質を生成する技術もまた、当該分野において公知の化学的方法または酵素学的方法などを用いて実施することができる。化学的方法であれば、本発明の糖鎖に結合し得る官能基が、糖と結合する条件に本発明の方法で生成したタンパク質と所望の糖鎖とを含む反応混合物を曝すことによって実現される。酵素学的方法であれば、脱水縮合などを触媒する酵素を適切な条件下で本発明の方法で生成したタンパク質と所望の糖鎖とを含む反応混合物を曝すことによって実現される。【０１８５】
１つの実施形態において、本発明において、使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質および糖鎖の濃度は、反応が進む限り、どのような濃度で使用してもよい。また、１：１での反応が想定されることから、ほぼ同モル濃度で反応させることが望ましいがそれに限定されない。従って、使用される相対比としては、例えば、１：１０〜１０：１、５：１〜１：５、２：１〜１：２などを使用することができる。そのような相対比は、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質と、使用される糖鎖との相対関係に依存することが理解され、そのような相対関係は、本明細書に基づいて当業者が理解することができる。糖鎖の濃度としては、任意の濃度を使用することができ、例えば、１ｍＭ〜２Ｍ、１０ｍＭ〜１Ｍ、５０ｍＭ〜５００ｍＭなどの間であればどのような濃度でもよい。好ましくは５０ｍＭ〜３００ｍＭであり得る。【０１８６】
１つの実施形態において、本発明において使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の濃度としてもまた、例えば、１ｍＭ〜２Ｍなどを挙げることができ、例えば、１０ｍＭ〜１Ｍ、２０ｍＭ〜５００ｍＭ、５０ｍＭ〜２００ｍＭなどを挙げることができるがそれらに限定されない。【０１８７】
１つの実施形態において、糖鎖とタンパク質との結合反応は、接触が起こる限り、原理的に進むことが理解されることから任意の温度で行うことができ、好ましくは、例えば、２５℃〜８０℃が使用される。適切な温度の上限としては、例えば、８０℃、７０℃、６０℃、５０℃、４２℃、４０℃などが挙げられるがそれらに限定されない。そのような温度は、タンパク質の種類にもより、熱変性しやすいタンパク質は、上限が、例えば、３７℃などであり得る。適切な温度の下限としては、例えば、２５℃、３０℃、３２℃、３７℃などであり得る。適切な温度の下限は、反応速度との関係から、必要な時間を考慮して当業者は適宜決定することができる。従って、例えば、使用可能な温度範囲としては、２５℃〜６０℃、２５℃〜５０℃、３０℃〜４２℃などが例示され得るがそれらに限定されない。【０１８８】
反応時間もまた、当業者が、本明細書の記載を参酌して、適宜決定することができる。そのような時間としては、例えば、６時間〜５日などを挙げることができるがそれらに限定されない。反応時間の下限としては、例えば、数時間（１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間など）、１日、数日（２−３日）などを挙げることができるが、それらに限定されず、当業者は、反応速度および効率などを考慮して本明細書の記載に基づいて適宜決定することができる。反応時間の上限としては、例えば、数日（２〜３日）、５日、６日、１０日などを挙げることができるがそれらに限定されない。生産された糖タンパク質が分解したり、変性しない程度に反応時間の上限を設定することが望ましい。【０１８９】
反応したものの同一性は、質量分析、ＮＭＲなどによって分析することができる。【０１９０】
本発明の好ましい実施形態では、使用され得る糖鎖に結合し得る官能基は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基などが挙げられるがそれらに限定されない。さらに好ましくは、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基などを使用することができる。最も好ましくは、アミノオキシ基である。これらの官能基は、保護基によって保護されていてもよい。【０１９１】
本発明の好ましい実施形態では、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸は、天然アミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸誘導体であり得るがそれらに限定されない。天然アミノ酸の形態に近いアミノ酸誘導体を使用する方が、もともと有する生物学的活性を保持する可能性が高いからであるが、所望の生物学的活性などを有する限り、天然アミノ酸以外のアミノ酸に糖鎖に結合し得る官能基を含むアミノ酸誘導体を使用してもよいことが理解される。好ましいアミノ酸としては、例えば、チロシン、ホモセリン、セリンまたはその誘導体が挙げられるがそれらに限定されない。【０１９２】
本発明の改変ｔＲＮＡにおいて使用される４塩基コドンとしては、ＣＵＣＵ、ＣＵＣＡ、ＣＣＣＵ、ＣＧＧＵ、ＣＧＧＧなどのアンチコドンが挙げられるがそれらに限定されず、より好ましくはＣＧＧＧが使用される。【０１９３】
１つの好ましい実施形態において、本発明において使用されるタンパク質合成系は、４（またはそれ以上の）塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを有しない。このような３塩基コドンは、本発明の４塩基コドンなどと競合するからである。そのような場合は、除かれる３塩基コドンに対応するコドンを、あらかじめ目的のタンパク質をコードする核酸配列から除くか別のコドン（好ましくは、同じアミノ酸をコードする）に変更しておくことが好ましい。【０１９４】
別の好ましい実施形態では、本発明において使用されるタンパク質合成系は、４塩基コドンの最初の３塩基および最後の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを有しない。あるいは、５塩基以上のコドンが用いられる場合は、その５塩基以上のコドンにおける任意の３塩基コドンに対応するｔＲＮＡを有しないことが好ましい。上記同様、そのような場合は、除かれる３塩基コドンに対応するコドンを、あらかじめ目的のタンパク質をコードする核酸配列から除くか別のコドン（好ましくは、同じアミノ酸をコードする）に変更しておくことが好ましい。【０１９５】
好ましい実施形態において、本発明の改変ｔＲＮＡの４塩基コドンの認識は、その改変ｔＲＮＡがアンチコドンとして４塩基コドンの相補配列を有することによって達成される。そのような４塩基コドンの相補配列をｔＲＮＡに含ませる技術は、当該分野において周知であり、部位特異的変異誘発方法などを用いて、対応するＤＮＡレベルで行うことによって行うことが例示される。【０１９６】
本発明において使用されるタンパク質合成系は、本発明の改変ｔＲＮＡを、天然ｔＲＮＡに比べて有意に多い量で含むことが好ましい。ここで、改変ｔＲＮＡは、競合する３塩基コドン（例えば、最初の３連続のコドンなど）を有する天然ｔＲＮＡに比較して有意に多い量で含まれることで十分であり得る。ここで、好ましくは、タンパク質合成系は、本発明の改変ｔＲＮＡを、天然ｔＲＮＡまたは特定の競合するｔＲＮＡの少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍の量で含んでいてもよい。１〜１００倍の範囲が好ましいようであるが、それに限定されない。【０１９７】
あるいは、本発明において使用されるタンパク質合成系は、４塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを他のｔＲＮＡよりも有意に少なく含んでいてもよい。ここで、好ましくは、４塩基コドンの最初の３塩基からなるコドンに対応するｔＲＮＡを他のｔＲＮＡの１〜０．０１倍、より好ましくは０．５〜０．１倍含む。【０１９８】
好ましい実施形態において、本発明の方法では、４塩基コドンを３塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質が混入することが予測されることから、本発明の方法は、そのようなタンパク質を取り除く工程をさらに包含し得る。このようなタンパク質除去は、分子量の違いまたは存在する２種類のタンパク質において相違するアミノ酸配列に起因する活性に基づいて分離し、必要でないものを取り除くことによって実施することができる。例えば、分子量カラム、アフィニティーカラム、電気泳動などが挙げられるがそれらに限定されない。【０１９９】
従って、本発明において、４塩基コドンを３塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質が４塩基コドンを４塩基コドンとして読んだ場合に生成するタンパク質と、有意に分子量が異なるように設計されることが好ましい。そのような設計は、当該分野において周知の技術を用いて、遺伝コドンを参酌しながら実施することができる。【０２００】
好ましい実施形態において、本発明において使用される糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸としては、以下の式：【０２０１】
【化２３】
2005075639.tif 000020
からなる群より選択される化合物およびその保護体が挙げられる。ここで、このアミノ酸は、代表的には、本発明の改変ｔＲＮＡと、そのアミノ酸自体のカルボキシル基において結合する。【０２０２】
本発明の核酸分子は、直鎖状または環状ベクターとして提供される。当該分野において、インビトロで翻訳を行うタンパク質合成系には、直鎖状の核酸分子をテンプレートとして用いるものと、環状ＤＮＡをテンプレートとして用いるものとが存在する。直鎖状のものは、代表的にｍＲＮＡを直接使用することによって翻訳がなされる。環状ＤＮＡを用いるものは、タンパク質をコードする核酸を含むベクターとして提供される。このようなキットは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａなどから市販されており、本明細書においてはいずれも使用することができる。ｍＲＮＡをテンプレートとして用いるものは、例示的に、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターにＴ７プロモーターを導入して、転写をインビトロで行うように設計されている。環状ＤＮＡを用いるものは、例示的に、Ｔ７プロモーターを有するベクターから、転写および翻訳を反応液中において行うことができる。このようなキットとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＴ７Ｓ３０ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｌａｒ ＤＮＡ、ＴＮＴ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔなどをあげることができる。従って、本発明の改変核酸分子は、インビトロ系において機能するプロモーター配列を含んでいてもよい。ここで、このプロモーター配列は、代表的に、Ｔ７プロモーター配列であり得る。【０２０３】
本発明において使用される、改変ｔＲＮＡとしては、例えば、配列番号１、配列番号２に示す配列またはその改変体を含む。ここで、改変ｔＲＮＡの改変体は、アンチコドン、アミノアシル化などの部位に実質的に改変を含まず、ｔＲＮＡの機能を有する限り、どのような改変を有していてもよい。従って、改変ｔＲＮＡの改変体には、核酸配列において１または複数個の置換、付加、または欠失が含まれていても良いことが理解される。【０２０４】
本明細書の方法では、ｍＲＮＡへの転写およびタンパク質への翻訳は、同じ工程で同時に行っても、別々に行っても良い。同じ工程で行う方が好ましい。工程数が減少するからである。【０２０５】
（糖鎖導入のためのｔＲＮＡを生産するための方法）
別の局面において、本発明は、（ｉ）糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を保護して保護アミノ酸を生成する工程；（ｉｉ）５’−ホスホ−２’−デオキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（ｐｄＮｐＮ）を提供する工程；（ｉｉｉ）該保護アミノ酸と該ｐｄＮｐＮとを脱水縮合して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸を生成する工程；（ｉｖ）４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡを提供する工程；（ｖ）該改変ｔＲＮＡと該保護ｐｄＮｐＮアミノ酸とを連結して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸連結ｔＲＮＡを提供する工程；および（ｖｉ）該保護ｐｄＮｐＮアミノ酸が連結した改変ｔＲＮＡを脱保護してｐｄＮｐＮアミノ酸が連結したｔＲＮＡを生成する工程、を包含する、糖鎖導入のためのｔＲＮＡを生産するための方法を提供する。【０２０６】
本発明の方法において、アミノ酸の保護は、当該分野において周知の任意の方法を用いて行うことができる。アミノ酸の保護は、カルボキシル基、アミノ基、および／または側鎖の反応性の官能基のいずれかまたはその複数の組み合わせまたはすべてに対して行うことができる。例えば、アミノ基には、アセチル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基，ｔ−ブトキシカルボニル基などのオキシカルボニル基が結合した基などを保護基として使用することができる。あるいは、カルボキシル基には、アルキルカルボニル、ベンジルカルボニル、シアノメチルオキシカルボニルまたはその誘導体などとして保護することができる。【０２０７】
本発明の方法において、５’−ホスホ−２’−デオキシリボヌクレオチジルリボヌクレオチド（ｐｄＮｐＮ）は、当該分野において周知の任意の方法によって生成することができる。あるいは、市販の製品を使用しても良い。ここで、ｐｄＮｐＮにおけるデオキシリボヌクレオチジルは、β−Ｄ−チミジン、２’−デオキシ−β−Ｄ−シチジン、２’−デオキシ−β−Ｄ−アデノシン、２’−デオキシ−β−Ｄ−グアノシン、２’−デオキシ−β−Ｄ−ウラシル、２’−デオキシ−β−Ｄ−イノシンであり得る。ｐｄＮｐＮにおけるリボヌクレオチジルは、β−Ｄ−シチジン、β−Ｄ−アデノシン、β−Ｄ−グアノシン、β−Ｄ−ウラシル、β−Ｄ−イノシンなどであり得る。【０２０８】
好ましい実施形態では、本発明において用いられるｐｄＮｐＮは、５’−ホスホ−２’−デオキシリボシチジリルリボアデノシン（ｐｄＣｐＡ）である。本発明で用いる４塩基コドンを用いた拡張コドンを利用したタンパク質の合成において首尾よく合成が進捗することが知られているからである。【０２０９】
本発明において、保護アミノ酸とｐｄＮｐＮとを脱水縮合することによって、保護ｐｄＮｐＮアミノ酸を生成する技術もまた、当該分野において周知の技術によって達成することができる。そのような技術としては、例えば、適切な条件下で、保護アミノ酸と、ｐｄＮｐＮとを混合して必要に応じて触媒を混合してやることによって実施する方法などがある。そのような技術においては、例えば、ｐｄＮｐＮは、反応性の少ない溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなど）に溶解することができる。反応は、アセトニトリルを用いることができる。【０２１０】
本発明の方法において、４塩基コドンを認識する改変ｔＲＮＡは、当該分野において周知の方法を用いて生成することができる。例えば、既知のｔＲＮＡのアンチコドン部分に、部位特異的変異誘発方法によってその４塩基コドンを認識する配列（代表的にはその４塩基コドンのアンチコドン）を置換することによって作製することができる。【０２１１】
本発明の方法において、改変ｔＲＮＡと保護ｐｄＮｐＮアミノ酸とを連結して保護ｐｄＮｐＮアミノ酸連結ｔＲＮＡを提供する方法は、当該分野において周知の任意の方法を用いて実行することができる。そのような連結方法では、例えば、Ｔ４ＲＮＡリガーゼを使用することができる。【０２１２】
本発明の方法において、保護ｐｄＮｐＮアミノ酸が連結した改変ｔＲＮＡを脱保護してｐｄＮｐＮアミノ酸が連結したｔＲＮＡを生成する技術もまた、当該分野において周知の任意の脱保護方法を用いて実施することができる。【０２１３】
本発明のｐｄＮｐＮアミノ酸が連結したｔＲＮＡにおいて、使用されるアミノ酸材料としては、天然アミノ酸または非天然アミノ酸が挙げられる。いずれを使用しても良いが、好ましくは、挿入された糖タンパク質において目的の活性（例えば、生物学的活性）が損なわれていないことが好ましい。従って、１つの実施形態では、天然アミノ酸を用いることが好ましくあり得る。そのようなアミノ酸としては、例えば、チロシン、ホモセリン、セリンなどを挙げることができるがそれらに限定されない。【０２１４】
本発明の方法において使用される保護基としては、Ｆｍｏｃ基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、カルバメート基などを挙げることができ、それらは、保護されるべき官能基の種類に応じて適宜選択することができる。【０２１５】
本発明の方法における保護・脱保護反応は、脱水縮合および加水分解の組み合わせであり得るがそれに限定されない。【０２１６】
（改変ｔＲＮＡ）
１つの局面において、本発明は、４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡを提供する。このような改変ｔＲＮＡは、上記のような本発明の方法を用いて生成することができるがそれに限定されない。改変ｔＲＮＡは、配列番号１に示されるＧＣＧＧＡＵＵＵＡＧＣＵＣＡＧＵＵＧＧＧＡＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＣＣＧＡＡＵＣＵＧＧＡＧＧＵＣＣＵＧＵＧＵＵＣＧＡＵＣＣＡＣＡＧＡＡＵＵＣＧＣＡＣＣＡという配列またはその改変体を含み得る。この場合、改変体において、コドンを認識する部分（代表的には、アンチコドン）は改変されていないことが好ましい。【０２１７】
（糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の生産キットおよび糖タンパク質の生産キット）
別の局面において、本発明は、Ａ）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ；Ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子；Ｃ）該改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系を備える、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含むタンパク質の生産キットを提供する。あるいは、本発明は、Ａ）４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ；Ｂ）該４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子；Ｃ）該改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系；Ｄ）糖鎖；およびＥ）該糖鎖に結合し得る官能基と該糖鎖との連結を行うための連結手段、を備える、糖タンパク質の製造キットを提供する。ここで、４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ；４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子；改変核酸分子の転写するための転写酵素、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系は、本明細書の他の部分（特に、糖タンパク質を製造するための方法）において説明されるような形態を採ることができる。【０２１８】
本発明のキットにおいて含まれるべき糖鎖は、その糖タンパク質に含まれるべき糖鎖であることが好ましいが、より短い糖鎖を連結してその後伸長してもよく、あるいは、より長い糖鎖を連結して後に切断しても良い。【０２１９】
本発明のキットにおいて含まれるべき、糖鎖に結合し得る官能基と該糖鎖との連結を行うための連結手段は、その官能基とその糖鎖との連結を触媒することができる限り、どのような手段であっても良い。代表的には、加水分解活性のある酵素が挙げられるがそれに限定されず、触媒の不存在下であっても、平衡反応によって、連結されることができることが本発明の特徴の一つであることが理解されるべきである。従って、本発明において用いられるこの連結手段は、単なる溶媒（水または有機溶媒など）であってもよい。【０２２０】
（糖タンパク質を製造するための翻訳反応において用いるための組成物）
別の局面において、本発明は、４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ、および翻訳に必要なセットのｔＲＮＡを含む、糖タンパク質を製造するための翻訳反応において用いるための組成物を提供する。糖ペプチドを生成するためのこのようなｔＲＮＡのセットにおいて含まれるべき、改変ｔＲＮＡは、本明細書において別の場所（特に、改変ｔＲＮＡ）において説明したような任意の形態をとることができることが理解されるべきである。【０２２１】
（タンパク質合成系）
別の局面において、本発明は、４塩基コドンを認識する、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を含む改変ｔＲＮＡ、翻訳に必要なセットのｔＲＮＡおよびｍＲＮＡを翻訳するための翻訳酵素を含むタンパク質合成系を提供する。このようなタンパク質合成系は、本明細書の他の部分（特に、糖タンパク質を製造するための方法）において説明されるような形態を採ることができる。翻訳酵素としては、例えば、天然の細胞のリボゾーム抽出物を用いてもよい。そのようなリボソーム抽出物を利用した合成系は、市販されており、そのような製品を利用しても良い。好ましくは、このようなタンパク質合成系は、さらに、核酸分子の転写するための転写酵素、を含み得る。【０２２２】
（改変核酸分子）
別の局面において、本発明は、４塩基コドンまたはその相補体を含む核酸配列を含む改変核酸分子、該核酸配列は該４塩基コドンに１アミノ酸を対応させたときに機能性タンパク質をコードする、改変核酸分子を提供する。このような核酸分子は、従来のタンパク質合成系では、何ら意味のないタンパク質を合成することになるが、本発明の技術を用いれば、目的の糖タンパク質を合成するための核酸分子に相当することが理解される。このような改変核酸分子は、本明細書の他の部分（特に、糖タンパク質を製造するための方法）において説明されるような形態を採ることができる。【０２２３】
（糖タンパク質）
別の局面において、本発明は、本発明の糖タンパク質の製造方法によって調製された糖タンパク質を含む組成物を提供する。このような組成物は、医薬、農薬、化粧品、特定保健食品、食品、工業用材料など種々の用途に使用される組成物であり得る。特に、医薬品などにおいて、特定の糖鎖を有するタンパク質が所望される場合に、簡便に選択性をもって作製することを本発明は達成しており、その意味で有用性は高い。【０２２４】
（化合物）
別の局面において、本発明は、以下の式：【０２２５】
【化２４】
2005075639.tif 000021
を有する、化合物（式中、Ｒ１はアミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり、Ｒ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して保護基または水素を表し、Ｒ５は、糖鎖に結合し得る基を表す）を提供する。ここで、このような改変核酸分子は、本明細書の他の部分（特に、糖タンパク質を製造するための方法および糖鎖導入のためのｔＲＮＡを生産するための方法）において説明されるような任意の形態を採ることができる。ここで、好ましくは、Ｒ１は、天然アミノ酸の側鎖から水素が一つ取れたものであり得る。【０２２６】
保護基であるＲ２〜Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、水素、フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、アセチル基、ベンジル基、ベンゾイル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、ｔ−ブチルジメチル基、Ｎ−フタルイミジル基、シリル基、トリメチルシリルエチル基、トリメチルシリルエチルオキシカルボニル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジル基、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基などから選択され得る。好ましい実施形態では、カルボキシル基の保護基である、Ｒ２は、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、トリメチルシリルエチレンオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基，アルキニルメチル基、ｔ−ブトキシカルボニル基またはその誘導体などであり得る。好ましくは、アミノ基の保護基である、Ｒ３およびＲ４は、少なくとも一方が保護されていることが重要であり、より好ましくは、これらの保護基は、アセチル基、ベンジルオキシカルボニル基，ｔ−ブトキシカルボニル基などの保護基であり得る。【０２２７】
糖鎖に結合し得る基であるＲ５は、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基などの基から水素が一つ取れたものであり得る。保護されていない場合は、Ｒ５およびＲ６と一緒になって、アミノオキシ基、Ｎ−アルキルアミノオキシ基、ヒドラジド基、アジド基、チオセミカルバジド基およびシステイン残基などであり得る。【０２２８】
従って、本発明は、例えば、以下の式：【０２２９】
【化２５】
2005075639.tif 000022
で示される構造を有する化合物およびそれらの保護体を提供する。この化合物は、糖鎖を結合し得る官能基を有するアミノ酸の代表例である。【０２３０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の式：【０２３１】
【化２６】
2005075639.tif 000023
【０２３２】
2005075639.tif 000024
【０２３３】
2005075639.tif 000025
【０２３４】
2005075639.tif 000026
または【０２３５】
2005075639.tif 000027
に示される構造を有する化合物を提供する。糖鎖を結合する官能基を有しその官能基が保護された代表的なアミノ酸の例である。【０２３６】
別の好ましい実施形態では、本発明は、以下の式：【０２３７】
【化２７】
2005075639.tif 000028
に示される構造を有する化合物を提供する。この化合物は、アミノ酸のアミノ基およびカルボキシル基が保護され、かつ、糖鎖を結合する官能基が保護された、本発明の糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸の代表例である。【０２３８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、以下の中間体または生成物を提供する。このような中間体は、本発明の糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸および／または改変ｔＲＮＡを製造する際に生じる中間体または生成物である。【０２３９】
【化２８】
2005075639.tif 000029
【０２４０】
【化２９】
2005075639.tif 000030
【０２４１】
【化３０】
2005075639.tif 000031
【０２４２】
【化３１】
2005075639.tif 000032
【０２４３】
【化３２】
2005075639.tif 000033
【０２４４】
これらにおいて、アミノ酸の側鎖、糖鎖に結合し得る官能基、ヌクレオチドの塩基などが別の例に変更された化合物もまた、本発明の範囲内に含まれることが理解される。【０２４５】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。【０２４６】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【実施例】
【０２４７】
以下、実施例により、本発明の構成をより詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。以下において使用した試薬類は、特に言及した場合を除いて、和光純薬、Ｐｒｏｍｅｇａから市販されているものを使用した。【０２４８】
（実施例１：Ｎ−（４−ペンテノイル）−Ｌ−ホモセリンｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成）
まず、本発明の例示として、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を合成した。合成にあたり、まず、アミノ酸のアミノ基およびカルボキシル基を保護した。アミノ酸としてはホモセリンを使用した。【０２４９】
【化３３】
2005075639.tif 000034
【０２５０】
２００ｍｌのナス型フラスコにＬ−ホモセリン（２．０ｇ、１６．８ｍｍｏｌ）を入れて水６ｍｌ、メタノール４ｍｌで溶かした。０℃に冷やした後、このフラスコに４−ペンテノイック無水物（３．６８ｍｌ、２０．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．８１ｍｌ、２０．１ｍｍｏｌ）を加えた。０℃で３０分、室温で１２時間反応させた。反応溶液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール：水＝６５：１５：１）により粗精製化した。これを２００ｍｌのナス型フラスコに入れて、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２５ｍｌに溶かした。このフラスコにベンジルトリエチルアミンクロリド（４．０ｇ、１７．６ｍｍｏｌ）を加えて室温で５分間撹拌する。さらに炭酸カリウム（２２．１ｇ、１６０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルブロミド（２６．５ｍｌ、２３０ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で６時間撹拌する。氷水を加えて酢酸エチルで３回抽出し、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバポーレーターで除去し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝３：２）により分取して表題化合物（２．２９ｇ、収率５３％）を得た。【０２５１】
１H-NMR δ (CDCl3): 6.39 (1H, d, J=7.20 Hz) (NH-),5.85~5.78 (1H, m) (C=CH-), 5.11~5.02 (2H, m)(-C=CH2), 4.65〜4.60 (1H, m) (α-H), 3.78 (1H,dd, J=4.55, 9.34Hz) (-OH),3.71〜3.65 (1H, m) (γ-H2), 3.56〜3.50 (1H, m) (γ-H2),2.45〜2.35(4H,m) (C=C-CH2-,C=C-C-CH2-),2.21〜2.15 (1H, m) (β-H2),1.54〜1.50 (1H, m) (β-H2),1.48 (9H, s) ((CH3)3-C-)【０２５２】
（実施例２：２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−フタルイミジル］アミノ］ヒドロキシ−酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成）
次に、実施例１で合成したアミノ酸において糖鎖に結合し得る官能基の連結を行った。【０２５３】
【化３４】
2005075639.tif 000035
【０２５４】
１００ｍｌのナス型フラスコにＮ−（４−ペンテノイル）−Ｌ−ホモセリンｔｅｒｔ−ブチルエステル（４２２ｍｇ、１．６４ｍｍｏｌ）を入れてテトラヒドロフラン１０ｍｌで溶かし、トリフェニルホスフィン（５１７ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（３２１ｍｇ、１．９７ｍｍｏｌ）を窒素ガス充填下において加える。ジエチルアゾジカルボキシレート（３１０μｌ、１．９７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下し、室温で２時間撹拌する。反応液を減圧濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）により分取して表題化合物（５５７ｍｇ、収率８４％）を得た。【０２５５】
１H-NMR δ (CDCl3): 7.86〜7.77 (4H, m) (-Ph), 7.13 (1H, d, J=7.93 Hz) (NH-),5.88〜5.84 (1H, m)(C=CH-), 5.10〜4.98 (2H, m) (-C=CH2), 4.73〜4.70 (1H, m) (α-H), 4.31〜4.29(2H, m) (γ-H2),2.46〜2.41 (4H, m) (C=C-CH2-,C=C-C-CH2-),2.33〜2.28(2H,m) (β-H2),1.46 (9H, s) ((CH3)3-C-)。【０２５６】
（実施例３：２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−アミノオキシ−酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの合成）
実施例２に引き続いて、実施例１で合成したアミノ酸において糖鎖に結合し得る官能基の連結を行った。【０２５７】
【化３５】
2005075639.tif 000036
【０２５８】
（式中、記号は前記と同義を示す。）
２５ｍｌのナス型フラスコに２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−フタルイミジル］アミノ］ヒドロキシ−酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１５６ｍｇ、３８８μｍｏｌ）を入れて４０％メチルアミン（メタノール溶液）２ｍｌに溶かす。室温で４５分間撹拌した後、反応液を減圧濃縮する。析出した結晶を減圧濾過し、濾液を濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル＝１：５）により分取して表題化合物（９４ｍｇ、収率８９％）を得た。【０２５９】
１H-NMR δ (CDCl3): 6.03 (1H, d, J=7.19 Hz) (NH-),5.88〜5.80 (1H, m) (C=CH-),5.44(2H, bs)(-O-NH2), 5.10〜5.00 (2H, m)(-C=CH2), 4.60〜4.56 (1H, m) (α-H), 3.76〜3.71(2H, m) (γ-H2),2.43〜2.31 (4H, m) (C=C-CH2-,C=C-C-CH2-), 2.11〜1.96 (2H,m) (β-H2),1.48(9H, s) ((CH3)3-C-)。【０２６０】
（実施例４：２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−酪酸シアノメチルエステルの合成）
次に、導入した糖鎖に結合し得る官能基を保護する反応を行った。【０２６１】
【化３６】
2005075639.tif 000037
【０２６２】
２５ｍｌフラスコに２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−アミノオキシ−酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（４４ｍｇ、１６２μｍｏｌ）をいれてトリフルオロ酢酸１ｍｌを加える。０℃で３０分、室温で１時間撹拌する。窒素ガスでトリフルオロ酢酸を除去する。これを水５００μｌ、ジオキサン１ｍｌに溶かし、トリエチルアミン（６７μｌ、４８０μｍｏｌ）とトリメチルシリルエトキシカルボニルスクシンイミド（６２ｍｇ２４０μｍｏｌ）を加えた。室温で１８時間撹拌した後、酢酸エチルで薄めて分液した。５％クエン酸水溶液、飽和食塩水で良く洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバポーレーターで除去した。これをアセトニトリル７００μｌに溶かし、窒素ガス充填下０℃に冷やした後、トリエチルアミン（６７μｌ、４８０μｍｏｌ）とクロロアセトニトリル（１０１μｌ、１．６ｍｍｏｌ）を加えた。撹拌しながら室温へ温度を上げて２４時間反応した後、酢酸エチルで薄めて分液した。飽和食塩水で良く洗った後、硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引ろ過し、溶液をエバポーレーターで除去した。シリカゲルクロマトグラフィー（ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により分取して表題化合物（４２ｍｇ、収率６５％）を得た。１H-NMR δ (CDCl3): 7.84 (1H, bs) (NH-), 7.59 (1H, s)(-O-NH-), 5.88〜5.82 (1H, m)(C=CH-),5.10〜4.99 (2H, m) (-C=CH2),4.84〜4.81 (1H, m) (α-H), 4.76 (2H,dd, J=15.65, 33.46Hz) (-O-CH2-CN),4.30〜4.23 (2H, m) (-O-CH2-C-Si),4.00〜3.95 (2H, m) (γ-H2),2.44〜2.39 (4H, m) (C=C-CH2-,C=C-C-CH2-),2.31〜2.26 (1H, m) (β-H2), 2.12〜2.07 (1H, m) (β-H2),1.03 (2H,t, J=8.62Hz) (-O-C-CH2-Si), 0.06 (9H, s) ((CH3)3-Si-)。【０２６３】
（実施例５：５’−ホスホ−２’−デオキシシチジル（３’−５’）−２’（３’）−Ｏ−［２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル］アデノシンの合成）
次に、糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を、ジヌクレオチド（ｐｄＣｐＡ）に連結した。【０２６４】
【化３７】
2005075639.tif 000038
【０２６５】
１．７ｍｌエッペンチューブに、５’−ホスホ−２’−デオキシシチジル（３’−５’）アデノシン（ｐｄＣｐＡ）の１．０ＯＤ／μｌＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド溶液（５μｌ、２２０ｎｍｏｌ）と２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−酪酸シアノメチルエステル（７７０μｇ、１．９２μｍｏｌ）を加えて１時間反応させる。反応液にジエチルエーテル１．５ｍｌを加えて遠心分離し、上澄みを取り除く。アセトニトリル２０μｌを加えて溶かし、ジエチルエーテル１．５ｍｌを加えて遠心分離し、上澄みを取り除く。再度、アセトニトリル２０μｌを加えて溶かし、ジエチルエーテル１．５ｍｌを加えて遠心分離した後、上澄みを取り除く。逆相ＨＰＬＣ（水：メタノール０．１Ｍ酢酸アンモニウムｐＨ４．５ ＝ ８０：２０から０：１００）にて分離、凍結乾燥した後、ジメチルスルホキシド３０μｌに溶解させた。これにより表題化合物のジメチルホルスルホキシド溶液３０μｌ（０．０５５６ＯＤ／μｌ、７３．３ｎｍｏｌ、３３％）を得た。【０２６６】
質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）：［Ｍ−Ｈ−］９７７．２６２０  （計算値  ９７７．２６３３）。【０２６７】
（実施例６：２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）の合成）
次に、実施例５において糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を連結したジヌクレオチドを、ｔＲＮＡに連結した。【０２６８】
１０μｌ中に、５’−ホスホ−２’−デオキシシチジル（３’−５’）−２’（３’）−Ｏ−［２−（Ｎ−（４−ペンテノイル））アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル］アデノシンのジメチルスルホキシド溶液（２μｌ）、酵母菌由来のフェニルアラニンｔＲＮＡを骨格としたアンチコドンがＣＣＣＧであり３’末端のＣＡが欠落したｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）−ＣＡ（配列番号１からＣＡが欠損したもの）の０．１ＯＤ／μｌ溶液（２．５μｌ）、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＰＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、０．００５％ ＢＳＡ、Ｔ４ＲＮＡリガーゼ（４０ユニット）を含む反応液を４℃で反応させた。２時間後、酢酸カリウム（ＰＨ５．５）を終濃度０．３Ｍになるように加え、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１（ｐＨ５．２）およびクロロホルムによって抽出した。３倍量のエタノールを加え−３０℃に１５分静置、３０分間遠心した後上澄みを捨てた。−３０℃に冷やした７０％エタノールを少量加えて5分間遠心した後上澄みを捨て、減圧下において乾燥させた。これを５０ｍＭ Ｉ２溶液（水：テトラヒドロフラン＝１：１）に溶解し３０分間静置した。酢酸カリウム（ＰＨ５．５）を終濃度０．３Ｍになるように加え、さらに３倍量のエタノールを加え−３０℃に１５分静置、３０分間遠心した後上澄みを捨てた。−３０℃に冷やした７０％エタノールを少量加えて5分間遠心した後上澄みを捨て、減圧下において乾燥し、表題化合物を得た。【０２６９】
これを、電気泳動により、実際に合成されていることを確認した（図３）。電気泳動は、８％ポリアクリルアミド−７Ｍ尿素電気泳動１２０ボルト ６０分の条件で行った。【０２７０】
（実施例７：２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−酪酸を導入したリゾチームの合成）
次に、実施例６において合成したｔＲＮＡを用いて、タンパク質を合成した。以下にその手順を示す。【０２７１】
ＰＲＯＭＥＧＡ社から販売されている「Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ７Ｓ３０Ｅｘｔｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｌａｒ ＤＮＡ」を使用した。ベクターにはＴ７プロモーター領域下流に開始コドン、Ｔ７タグ配列、変異リゾチーム配列（配列番号３（核酸）および配列番号４（アミノ酸））、ヒスチジンタグ配列、終始コドンをもつものを使用した。変異リゾチームの配列はリゾチームの４４残基部位（配列表では５９位）にＣＧＧＧの４塩基配列を挿入したものを使用した。１０μｌの反応溶液中に、ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）−ＣＡの０．１ＯＤ／μｌ溶液２．５μｌから合成した２−アミノ−４−［Ｏ−［Ｎ−トリメチルシリルエトキシカルボニル］アミノ］ヒドロキシ−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）（１ｍＭ酢酸カリウム１μｌに溶解）、Ｓ３０Ｅｘｔｒａｃｔ（３μｌ）、Ｓ３０ｐｒｅｍｉｘ（４μｌ）、ベクター（５３３μｇ）、０．１ｍＭアミノ酸混合物を含む溶液を３７℃に静置した。１時間後、０℃に冷やし反応を停止させ表題化合物を得た。【０２７２】
この化合物を、ウェスタンブロット分析（一次抗体：抗Ｔ７タグ抗体（マウス由来）；二次抗体：抗マウスＩｇＧ−アルカリフォスファターゼ）により確認した（図４）。【０２７３】
（実施例８：競合するｔＲＮＡの影響）
次に、実施例６〜７に記載の手順に代えて、リゾチーム配列の代わりに、ストレプトアビジンの８３位（配列表では９９位）がＣＧＧＧになっている変異ストレプトアビジン（配列番号５（核酸)、配列番号６（アミノ酸））を用いて、同様の発現実験を行った。【０２７４】
本実施例では、競合するアミノ酸がアルギニンであることがわかっているので、図５右上に示されるように、競合するアミノ酸であるアルギニンの比率を変化させて発現にどのような影響があるかどうかを観察した。その結果を図５に示す。【０２７５】
その結果、図５からも明らかなように、レーン２および３から、本発明の改変（アミノアシル）ｔＲＮＡの量が多いほど、全長配列のタンパク質の発現が顕著に増加していた。また、レーン１、３および４の記載から明らかなように、アルギニンは、ストレプトアビジンの場合は、１〜０．０１倍のすべてでタンパク質の発現が見られ、好ましくは０．１倍程度であることがわかった。【０２７６】
このように、競合するアミノ酸は、他のアミノ酸より少なく存在させることが好ましいことが実証された。ただし、その量は、目的とするタンパク質の種類およびアミノ酸含量によるようである。【０２７７】
（実施例９：他のアミノ酸誘導体）
次に、実施例１〜４で製造した糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸に代えて、図６Ｂに表される化合物を導入した場合に全長タンパク質が合成されるかどうかを検証した。【０２７８】
これらの化合物の合成は、実施例１〜４に準じた。【０２７９】
これらの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いて、実施例５〜７に記載されるように、タンパク質を合成した。ｍＲＮＡとしては、ストレプトアビジン  ８３ＣＧＧＧ（配列番号６）を使用した。その構造は、図６Ａに示す。その結果を図６Ｂに示す。【０２８０】
示されるように、いずれの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸を用いても、全長タンパク質が合成されることが明らかになった。これらの結果から、ストレプトアビジンへの糖鎖に結合し得る官能基を有するアミノ酸の導入効率を算出した結果を以下の表に示す。【０２８１】
【表２】
2005075639.tif 000039
【０２８２】
ここで、図６における６がTyr-C4-N3に相当し、５がＴyr-C4-Teocに相当し、４がHse(ONMeNVOC) に相当し、３がHse(ONHNVOC)に相当し、２がHse(ONMeTeoc)に相当し、１がHse(ONHTeoc)に相当する。【０２８３】
（実施例１０：環状核酸分子および直鎖状核酸分子の比較）
次に、タンパク質合成系において、環状核酸分子および直鎖状核酸分子を用いた場合の比較を行った。【０２８４】
環状核酸分子での合成系は、実施例７に準じた。【０２８５】
直鎖状核酸分子での合成系としては、実施例７における環状用のキットに代えて直鎖状核酸分子のための合成系を用いた。【０２８６】
発現させたタンパク質はリゾチームであり、その結果は、図７に示す。【０２８７】
示されるように、環状核酸分子および直鎖状核酸分子のいずれを用いても、リゾチームの発現が見られたが、環状核酸分子の方が、１００：７７で多かった。【０２８８】
（実施例１１：条件検討）
次に、発現の条件を種々検討した。その条件は、図８に示す。図８に示した条件以外は、実施例７に記載されるように、実験を行った。【０２８９】
その結果は、図８に示されるように、リゾチームとしては、温度としては、３０℃または４２℃より３７℃が適切であり、アルギニンの量は減らしても効果がなく、むしろ１倍の方がより多く全長タンパク質が合成された。【０２９０】
以下の表に示すように、リゾチームおよびストレプトアビジンは、アルギニンの含量が顕著に異なる。【０２９１】
【表３】
2005075639.tif 000040
【０２９２】
従って、競合するアミノ酸（ここでは、アルギニン）の含量が多い場合は、そのアミノ酸を減少させると、そのタンパク質の合成自体に影響が出ることから、好ましくないことが明らかになった。このように、タンパク質のアミノ酸含量などをも考慮することによって、適切な条件を検討することができることが明らかになった。【０２９３】
（実施例１２：糖鎖の導入）
次に、実施例７で製造したタンパク質を用いて、糖鎖の導入実験を行う。導入される糖鎖としては、例えば、シアル酸、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコースなどの単糖、ラクトースなどの二糖を挙げることができる。【０２９４】
実施例７で製造したタンパク質と、上記単糖とを混合する。混合する条件は、例えば、以下のような条件がある。【０２９５】
酢酸緩衝液（ｐＨ５．６）を適量（例えば、２００マイクロリットル）添加する。そこに、糖鎖溶液適量（例えば、２００マイクロリットル）、メタノール適量（例えば、２００マイクロリットル）（糖鎖とほぼ等量）を添加し３７℃で１２時間程度放置する。例えば、マイクロコン（ミリポア社製）を用いて１０，０００回転／分、１０°Ｃの条件で４０分間遠心濾過を行う。この濃縮液に超純水を適量（糖鎖溶液とほぼ等量）添加し、再度同条件により遠心濾過を行う。濃縮液（１００分の１量程度にまで減少させることができる）に超純水適量（例えば、１００マイクロリットル）を添加し糖鎖が結合した糖タンパク質を得ることができる。【０２９６】
（実施例１３：２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンの合成とラクトースによる糖鎖修飾）
糖鎖が結合した糖タンパク質の製造例として、２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−酪酸（以下の化学式）を導入した変異ストレプトアビジンを製造した。その手順および結果を以下に示す。【０２９７】
【化３８】
2005075639.tif 000041
【０２９８】
タンパク質の発現系として、ＰＲＯＭＥＧＡ社から販売されている「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｉｒｃｌａｒ  ＤＮＡ」を使用した。ベクターとしては、Ｔ７プロモータ領域下流に開始コドン、Ｔ７タグ配列、変異ストレプトアビジン配列（配列番号５）、ヒスチジンタグ配列、終始コドンをもつものを使用した。変異ストレプトアビジンの配列はストレプトアビジンの８３残基部位にＣＧＧＧの４塩基配列を挿入したものを使用した。２００μｌの反応溶液中に、ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）−ＣＡの０．１３ＯＤ／μｌ溶液１１μｌから合成した２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−ブチリックアシジル−ｔＲＮＡ（ＣＣＣＧ）（１ｍＭ  酢酸カリウム２０μｌに溶解）、Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ（６０μｌ）、Ｓ３０ｐｒｅｍｉｘ（８０μｌ）、ベクター（１．６８μｇ）、０．１ｍＭアミノ酸混合物を含む溶液（いずれも「Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔ７  Ｓ３０  Ｅｘｔｒａｃｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｃｉｒｃｌａｒ
ＤＮＡ」に添付される）を３７℃に静置した。１時間後、０℃に冷やし反応を停止させた。この反応液を、Ｔ７  Ｔａｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｇａｒｏｓｅ（５０μｌ）（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を用いて精製し、溶出液をＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ１０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて脱塩濃縮し５０μｌの溶液を得た。このうち約２００ｎｇの変異ストレプトアビジンを含む溶液５μｌを凍結乾燥により乾燥させた。４００ｍＭのラクトースを含む２００ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を３μｌ加えて、３７℃において２日間反応させた。反応後、ＭａｇｎｅＨｉｓ  Ｎｉ−ｐａｒｔｉｃｌｅｓ（２μｌ）（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製した。Ｃ４  Ｚｉｐ  Ｔｉｐ（ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いて脱塩後、２，５−ジヒドロ安息香酸（２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）＝ＤＨＢ）をマトリックスとしてＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＡＳＳにて分子量測定を行った。２−アミノ−４−［Ｎ−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジン（分子量理論値  １８８７５．３、測定値  １８８６９．２）とラクトースにより修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値  １９１９９．６、測定値  １９１９５．４）が確認された（図９）。【０２９９】
（実施例１４：糖鎖が結合した糖タンパク質の製造条件の検討）
次に、変異タンパク質と、糖鎖との結合の際の条件を検討する。【０３００】
実施例１３において、ラクトースを、１ｍＭ〜２Ｍにまで変化させ（例えば、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１Ｍ、１．２５Ｍ、１．５Ｍ、１．７５Ｍ、２Ｍ）；酢酸緩衝液は、ｐＨ２．５〜７の間を０．２刻みで変化させ、濃度は、１０ｍＭ〜１Ｍ（例えば、１０ｍＭ、２０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、３００ｍＭ、４００ｍＭ、５００ｍＭ、６００ｍＭ、７００ｍＭ、８００ｍＭ、９００ｍＭ、１Ｍ）の間を変化させる。【０３０１】
反応条件は、２０℃〜１００℃の間を変化させ、反応は、１時間後から１時間おきに観察する。【０３０２】
上記実験を行うことにより、例えば、ラクトースは１０ｍＭ〜１Ｍにおいて反応が好ましく進行し、酢酸緩衝液の濃度は、５０〜４００ｍＭ、ｐＨ３〜６において反応が好ましく進行し、反応温度としては、２５℃〜８０℃、反応時間としては、６時間〜５日間のものが好ましく反応が進行することが観察される。【０３０３】
（実施例１５：２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸を導入した変異ストレプトアビジンの糖鎖修飾）
（グルコースによる修飾）
約２００ngの変異ストレプトアビジンを４００mMのグルコースを含む１００mMアセテートバッファ（PH４．０）に溶解し３７℃で４４時間反応させた。反応後、MagneHisNi-particles （２μｌ）（Promega社）を用いて精製した。C４ Zip Tip（millipore社）を用いて脱塩後、DHBをマトリックスとしてMALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図１０に示す。グルコースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値 19037.5、測定値[M+H] 19034.3）が確認された。収率 約６０％。【０３０４】
（マルトースによる修飾）
約２００ngの変異ストレプトアビジンを４００mMのグルコースを含む１００mMアセテートバッファ（PH４．０）に溶解し３７℃で４４時間反応させた。反応後、MagneHisNi-particles （２μｌ）（Promega社）を用いて精製した。C４ Zip Tip（millipore社）を用いて脱塩後、DHBをマトリックスとしてMALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図１１に示す。マルトースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値 19199.6、測定値[M+H] 19206.8）が確認された。収率 約５０％。【０３０５】
（マルトトリオースによる修飾）
約２００ngの変異ストレプトアビジンを４００mMのグルコースを含む１００mMアセテートバッファ（PH４．０）に溶解し３７℃で４４時間反応させた。反応後、MagneHisNi-particles （２μｌ）（Promega社）を用いて精製した。C４ Zip Tip（millipore社）を用いて脱塩後、DHBをマトリックスとしてMALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図１２に示す。マルトトリオースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値 19361.7、測定値[M+H] 19368.5）が確認された。収率 約２０％【０３０６】
（N-アセチルグルコサミンによる修飾）
約２００ngの変異ストレプトアビジンを４００mMのグルコースを含む１００mMアセテートバッファ（PH４．０）に溶解し３７℃で４４時間反応させた。反応後、MagneHisNi-particles （２μｌ）（Promega社）を用いて精製した。C４ Zip Tip（millipore社）を用いて脱塩後、DHBをマトリックスとしてMALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図１３に示す。N-アセチルグルコサミンにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値19078.5、測定値 [M+H] 19073.1）が確認された。収率 約４０％。【０３０７】
（実施例１６：ラクトースにより修飾された２−アミノ−４−［N−メチル−アミノオキシ］−酪酸の酵素による糖鎖伸長反応）
（ラクトースによる修飾およびα２，３シアリルトランスフェラーゼによる糖鎖伸長反応）
約２００ngの変異ストレプトアビジンを４００mMのグルコースを含む１００mMアセテートバッファ（PH４．０）に溶解し３７℃で４４時間反応させた。反応後、MagneHisNi-particles （２μｌ）（Promega社）を用いて樹脂に固定化した後、洗浄した。樹脂を0.01％ BSA、0.2％ TritonX-100、3mM CMP-NANA、30 mUα２，３シアリルトランスフェラーゼ（Rat recombinant、CALBIOCHEM）を含む50 ｍM HEPES-Nabuffer (pH 7.5) に懸濁させて、37℃で22時間振とうさせる。反応後、樹脂に固定化されているタンパク質を精製した。C４ Zip Tip（millipore社）を用いて脱塩後、DHBをマトリックスとしてMALDITOF MASSにて分子量測定を行った。結果を図１４に示す。シアリルラクトースにより特異的に修飾された変異ストレプトアビジン（分子量理論値 19490.9、測定値[M-H] 19488.2）が確認された。収率 約１０％。【０３０８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、この実施形態に限定して解釈されるべきものではない。本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。当業者は、本発明の具体的な好ましい実施形態の記載から、本発明の記載および技術常識に基づいて等価な範囲を実施することができることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０３０９】
本発明により、医薬、農薬、食品などで使用され得る、有用な糖タンパク質を、自在にしかも選択性よく、簡便に製造することができるようになった。従って、その用途は、種々の分野に及ぶことが理解される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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