(57)【要約】  基本配列（配列番号２）の１個を有する配列番号１に記載の塩基配列からなる新規ＤＮＡがイニシエーターやプロモーターとしての機能を有することを見出した。そして、配列番号１に記載の塩基配列からなる新規ＤＮＡ、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５´末端が、基本配列（配列番号２）の１個または２個以上からなるＤＮＡの３´末端に付加されてなるＤＮＡ、さらに構造遺伝子を含む前記ＤＮＡ、前記ＤＮＡを挿入してなるベクター、該ベクターを導入されてなる形質転換体、前記ＤＮＡおよびベクターおよび形質転換体のうちのいずれかを用いる遺伝子発現調節方法または蛋白質製造方法、前記ＤＮＡおよびベクターおよび形質転換体のうちのいずれか１つを含んでなる試薬キットを提供した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項２】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５´末端が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの１個または２個以上が連結されてなるＤＮＡの３´末端に付加されてなるＤＮＡ：ここで、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの１個または２個以上が連結されてなるＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３´末端とその３´末端側に位置するＤＮＡの５´末端とが隣接するように連結されてなる。
【請求項３】
配列番号３から６のいずれか１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡであって、転写活性能を有し、該転写活性能が該ＤＮＡに含まれる配列番号２に記載の塩基配列を基本配列として基本配列数に依存的に促進することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項１から３のいずれか１項に記載のＤＮＡであって、転写活性能を有し、該転写活性能が該ＤＮＡに含まれる配列番号２に記載の塩基配列を基本配列として１から７の基本配列数に依存的に促進することを特徴とするＤＮＡ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡからなる遺伝子発現調節用装置。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡと構造遺伝子とを含み、該ＤＮＡは該構造遺伝子を発現可能に配置されてなるＤＮＡ。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクター。
【請求項９】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡとエンハンサー機能を有するＤＮＡを含むベクター。
【請求項１０】
構造遺伝子を含むベクターであって、請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡが該構造遺伝子を発現可能に配置されてなる請求項８または９に記載のベクター。
【請求項１１】
ベクターが哺乳動物発現ベクターである請求項８から１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１２】
ベクターがウイルスベクターである請求項８から１０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
遺伝子治療に用いる請求項８から１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
請求項８から１３のいずれか１項に記載のベクターを導入されてなる形質転換体。
【請求項１５】
ベクターが哺乳動物細胞に導入されてなる請求項１４に記載の形質転換体。
【請求項１６】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡの調製方法であって、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとを反応させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、次いで、作製した二本鎖ＤＮＡを結合させて結合体を作製し、その後、該結合体を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とするＤＮＡの調製方法。
【請求項１７】
ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号８および９に記載の各塩基配列からなるＤＮＡを用いて行うことを特徴とする請求項１６に記載のＤＮＡの調製方法。
【請求項１８】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項７に記載のＤＮＡまたは請求項８から１３のいずれか１項に記載のベクターを用いることを特徴とする遺伝子発現量の調節方法。
【請求項１９】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項７に記載のＤＮＡ、請求項８から１３のいずれか１項に記載のベクターまたは請求項１４若しくは１５に記載の形質転換体を用いることを特徴とする蛋白質の製造方法。
【請求項２０】
請求項１から５のいずれか１項に記載のＤＮＡ、請求項７に記載のＤＮＡ、請求項８から１３のいずれか１項に記載のベクターおよび請求項１４または１５に記載の形質転換体のうち少なくとも１つを含んでなる試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写活性能を有するヒト由来ＤＮＡおよびその利用に関する。より詳しくは、特定の配列の１個または複数個が結合した結合体からなり該配列の結合数に依存的に転写活性能を促進し得るヒト由来ＤＮＡおよび該ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物等に関する。また、上記ＤＮＡまたは上記ＤＮＡ構築物を含むベクターおよび該ベクターを導入されてなる形質転換体に関する。さらに上記ＤＮＡの調製方法に関する。また、上記ＤＮＡ、上記ＤＮＡ構築物または上記ベクターを用いることを特徴とする遺伝子発現量の調節方法に関する。さらに、上記ＤＮＡ、上記ＤＮＡ構築物、上記ベクターまたは上記形質転換体を用いる蛋白質の製造方法に関する。また、上記ＤＮＡ、上記ＤＮＡ構築物、上記ベクターおよび上記形質転換体のうちの少なくとも１つを含んでなる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡのもつ遺伝子情報は、通常ＲＮＡポリメラーゼによりメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いでｍＲＮＡの情報にしたがって蛋白質のアミノ酸配列に翻訳される。原核生物ではＲＮＡポリメラーゼ単独で基本的な転写を行うことができる。一方、真核生物では、転写反応の開始にＲＮＡポリメラーゼに加えて転写因子と呼ばれる一群の蛋白質が必要である。【０００３】
転写因子は、プロモーターと呼ばれる遺伝子上の領域に順に集合してＲＮＡポリメラーゼと共に転写開始複合体を形成し、転写反応を開始させる。転写反応は、プロモーターやエンハンサーあるいはサプレッサー等の転写調節要素により調節されている。【０００４】
遺伝子発現調節用装置であるイニシエーターやプロモーターは、遺伝子の転写開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節する機能を有する。殆どの構造遺伝子のプロモーターには、基本エレメントであるＴＡＴＡボックス、ＣＣＡＡＴボックスおよびＧＣに富む領域が存在する。また、ＴＡＴＡボックスの代わりにイニシエーター配列を転写開始点にもつものもある。イニシエーター配列は、配列ＹＹＡＮ（Ａ／Ｔ）ＹＹで表され、ここでＹはＣまたはＴを意味し、ＮはＡまたはＴまたはＣまたはＧを意味する。【０００５】
プロモーターは、遺伝子工学的手法により有用蛋白質をコードする遺伝子を発現させる場合、発現効率を促進するために重要な要素である。特に、動物由来のかかる遺伝子を宿主細胞として動物細胞を用いて発現させる場合、プロモーターの選択が発現効率に大きな影響を与える。従来、頻繁に用いられてきた動物細胞用プロモーターとして、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＳＲαプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーターおよびアクチンプロモーター等が知られている。【０００６】
以下に本明細書において引用した文献を列記する。
【非特許文献１】サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、「モレキュラークローニング，ア  ラボラトリーマニュアル  第２版」、１９８９年、コールドスプリングハーバーラボラトリー。
【非特許文献２】「エンボ  ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ）」、１９８２年、第１巻、ｐ．８４１−
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、遺伝子発現調節用装置であるイニシエーターやプロモーターとしての機能を有する新規ＤＮＡを見出し、これを遺伝子発現に利用することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決すべく本発明者らは鋭意努力し、シナプトタグミンＸＩと称されている遺伝子の転写開始点と考えられる部位の近傍に存在し、さらにイニシエーターやプロモーター領域の特徴であるＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列および転写因子ＳＰ−１の結合部位を有する３３ｍｅｒのＤＮＡが反復している領域をインシリコの解析等により見出した。そして、該３３ｍｅｒのＤＮＡまたはその複数個が順次結合されてなるＤＮＡの３´末端にＴＣＣからなるＤＮＡが付加されてなるＤＮＡが転写活性能を有すること、さらにその転写活性能は該３３ｍｅｒのＤＮＡの結合数に依存的に促進することを明らかにして本発明を完成した。【０００９】
すなわち本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに関する。【００１０】
また本発明は、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５´末端が、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの１個または２個以上が連結されてなるＤＮＡの３´末端に付加されてなるＤＮＡ（ここで、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの１個または２個以上が連結されてなるＤＮＡは、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの３´末端とその３´末端側に位置するＤＮＡの５´末端とが隣接するように連結されてなる）に関する。【００１１】
さらに本発明は、配列番号３から６のいずれか１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに関する。【００１２】
さらにまた本発明は、前記いずれかのＤＮＡであって、転写活性能を有し、該転写活性能が該ＤＮＡに含まれる配列番号２に記載の塩基配列を基本配列として基本配列数に依存的に促進することを特徴とするＤＮＡに関する。【００１３】
また本発明は、前記いずれかのＤＮＡであって、転写活性能を有し、該転写活性能が該ＤＮＡに含まれる配列番号２に記載の塩基配列を基本配列として１から７の基本配列数に依存的に促進することを特徴とするＤＮＡに関する。【００１４】
さらに本発明は、前記いずれかのＤＮＡからなる遺伝子発現調節用装置に関する。【００１５】
さらにまた本発明は、前記いずれかのＤＮＡと構造遺伝子とを含み、該ＤＮＡは該構造遺伝子を発現可能に配置されてなるＤＮＡに関する。【００１６】
また本発明は、前記いずれかのＤＮＡを含むベクターに関する。【００１７】
さらに本発明は、前記いずれかのＤＮＡとエンハンサー機能を有するＤＮＡを含むベクターに関する。【００１８】
さらにまた本発明は、構造遺伝子をさらに含むベクターであって、前記いずれかのＤＮＡが該構造遺伝子を発現可能に配置されてなる前記ベクターに関する。【００１９】
また本発明は、ベクターが哺乳動物発現ベクターである前記いずれかのベクターに関する。【００２０】
さらに本発明は、ベクターがウイルスベクターである前記いずれかのベクターに関する。【００２１】
さらにまた本発明は、遺伝子治療に用いる前記いずれかのベクターに関する。【００２２】
また本発明は、前記いずれかのベクターを導入されてなる形質転換体に関する。【００２３】
さらに本発明は、ベクターが哺乳動物細胞に導入されてなる前記形質転換体に関する。【００２４】
さらにまた本発明は、前記いずれかのＤＮＡの調製方法であって、配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとを反応させて二本鎖ＤＮＡを形成させ、次いで、作製した二本鎖ＤＮＡを結合させて結合体を作製し、その後、該結合体を鋳型として用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことを特徴とするＤＮＡの調製方法に関する。【００２５】
また本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応を配列番号８および９に記載の各塩基配列からなるＤＮＡを用いて行うことを特徴とする前記ＤＮＡの調製方法に関する。【００２６】
さらに本発明は、前記いずれかのＤＮＡまたは前記いずれかのベクターを用いることを特徴とする遺伝子発現量の調節方法に関する。【００２７】
さらにまた本発明は、前記ＤＮＡ、前記ベクター、前記形質転換体を用いることを特徴とする蛋白質の製造方法に関する。【００２８】
また本発明は、前記ＤＮＡ、前記ベクター、前記形質転換体のうち少なくとも１つを含んでなる試薬キットに関する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明において見出した３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）またはその複数個が順次結合されてなるＤＮＡの３´末端にＴＣＣからなるＤＮＡが付加されてなるＤＮＡは、転写活性能を有し、さらに該転写活性能は該ＤＮＡに含まれる３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）の数に依存的に促進する。【００３０】
したがって、３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）またはその複数個が順次結合されてなるＤＮＡの３´末端にＴＣＣからなるＤＮＡが付加されてなるＤＮＡは、遺伝子発現方法に好適に使用できる。さらに、３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）の結合数を増減することで、蛋白質の発現量を人為的に調節することが可能になる。ひいては本発明により、生活習慣病等の多因子によって引き起こされる疾患の解明に有効な手段を提供し得る。すなわち、複数の病態関連の候補蛋白質の微妙な量的変動を３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）という基本構造をもつ同一のベクターで調節することができるため、該蛋白質の異常に起因する病態の解明に１つの有効な手段を提供できる。また本発明は、有用蛋白質の製造あるいは遺伝子治療用の発現ベクター等にも利用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の各塩基配列からなるＤＮＡ（基本配列（配列番号２）の結合数はそれぞれ１、２、３、４および８である）と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子と、ＳＶ４０エンハンサーとを含む発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞の細胞ライセートにおいて、ルシフェラーゼ活性が基本配列（配列番号２）の結合数に比例して定量的に増加したことを説明する図である。図中ＳＶ４０プロモーターとは、上記ＤＮＡの代わりにＳＶ４０プロモーターを含む発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞の細胞ライセートを示す。（実施例１）
【図２】配列番号３、配列番号１３および配列番号１４の各塩基配列からなるＤＮＡ（基本配列（配列番号２）の結合数はそれぞれ２、２および３である）と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子とを含み、ＳＶ４０エンハンサーは含まない発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞の細胞ライセートにおいて、ルシフェラーゼ活性が基本配列（配列番号２）の結合数に比例して定量的に増加したことを説明する図である。図中、ベクターに挿入したＤＮＡの１はｐＧＬ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒのみ、２は配列番号１３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを挿入したベクター、３は配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを挿入したベクター、４は配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを挿入したベクターを用いた結果を示す。（実施例２）
【図３】本発明に係るＤＮＡの転写活性能が基本配列（配列番号２）の結合数に依存的に促進するメカニズムは、結合体の結合部位に出現する、ＲＮＡポリメラーゼ等の転写開始関連因子が結合するイニシエーター配列やＴＡＴＡボックスの数が、結合数にしたがって増加することによると考えられることを説明する模式図である。本ＤＮＡには転写因子ＳＰ−１が結合するコンセンサスＧＣボックスが存在し、結合数にしたがってＳＰ−１の結合部位も同様に増加する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明は、シナプトタグミンＸＩと称されている遺伝子の転写開始点と考えられる部位の近傍に存在し、イニシエーターやプロモーター領域の特徴であるＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列および転写因子ＳＰ−１の結合部位を有する３３ｍｅｒのＤＮＡが反復している領域を見出し、該ＤＮＡの機能を明らかにしたことに基づいて達成した。【００３３】
本明細書において、上記３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）を基本配列と称することがある。また、基本配列からなるＤＮＡの複数個がそれぞれの末端において順次接するように連結されてなるＤＮＡを結合体、そして結合体を構成する基本配列の数を結合数と称することがある。【００３４】
本発明の一態様は、基本配列（配列番号２）の１個または複数個を含むＤＮＡに関する。基本配列（配列番号２）の１個を含むＤＮＡとして好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡが挙げられる。【００３５】
基本配列（配列番号２）を複数個含むＤＮＡとして好ましくは、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡの５´末端が、基本配列（配列番号２）の１個または２個以上からなるＤＮＡの３´末端に付加されてなるＤＮＡが挙げられる。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに付加される基本配列（配列番号２）の数は、好ましくは１個乃至７個である。２個以上の基本配列（配列番号２）が付加される場合は、好ましくは順次連結される基本配列（配列番号２）のそれぞれの３´末端が該ＤＮＡの下流に隣接するＤＮＡの５´末端に連結されていることが好ましい。基本配列（配列番号２）を複数個含むＤＮＡとして、具体的には配列番号３から６に記載の各塩基配列からなるＤＮＡを挙げられる。【００３６】
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡは、上記３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）の３´末端にＴＣＣからなるＤＮＡが付加されてなるものであり、すなわち本明細書でいう基本配列を１個有する。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに１個の基本配列（配列番号２）が上記のように付加されてなるＤＮＡは、基本配列（配列番号２）を２個有することになり、このＤＮＡにおいて結合数は２である。このように、本明細書においては、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡにｎ個の基本配列（配列番号２）が上記のように付加されてなるＤＮＡは、基本配列（配列番号２）を「ｎ＋１」個有することになり、このＤＮＡにおいて結合数は「ｎ＋１」である。【００３７】
本発明に係るＤＮＡは、転写活性能を有し、さらに該転写活性能は基本配列（配列番号２）の結合数に依存的に増加することを特徴とする。例えば、配列番号１、３、４、５および６に記載の各塩基配列からなるＤＮＡ（それぞれ結合数は１、２、３、４および８である）と、その下流にルシフェラーゼ遺伝子と、さらにその下流にＳＶ４０エンハンサーとを含む発現ベクターでトランスフェクションしたＣＯＳ１細胞の細胞ライセートにおいて、ルシフェラーゼ活性が当該ＤＮＡに含まれる基本配列の結合数に比例して定量的に増加した（実施例１および図１を参照）。また、結合数が３であるＤＮＡの転写活性能は、ＳＶ４０プロモーターの転写活性能と比較して同じかまたはそれ以上であった（実施例１および図１を参照）。一方、ＳＶ４０エンハンサーを含まない発現ベクターを用いて同様に検討した結果、本ＤＮＡの転写活性能はＳＶ４０エンハンサーを含む発現ベクターを用いた結果と比較して低かったが、転写活性能は基本配列（配列番号２）の結合数に比例して促進した（実施例２および図２を参照）。これらから、本発明に係るＤＮＡが、ＳＶ４０プロモーターと同じかそれ以上の転写活性能を有すること、該転写活性能が基本配列（配列番号２）の結合数に依存的に促進すること、本ＤＮＡはＳＶ４０エンハンサーの影響によりその転写活性能がさらに著しく増加することが判明した。【００３８】
本発明に係るＤＮＡの転写活性能が、基本配列（配列番号２）の結合数に依存的に促進するメカニズムは明らかではないが、結合により結合部位にポリメラーゼ等の転写開始関連因子が結合するイニシエーター配列やＴＡＴＡボックスと考えられるＣＣＡＴＴＣからなる配列が出現し、結合数にしたがってかかるイニシエーター配列やＴＡＴＡボックスの数が増加することにより転写反応が次々に開始されるために、下流の遺伝子の転写が促進されると考える（図３）。【００３９】
本発明に係るＤＮＡは、転写活性能、いわゆるイニシエーター／プロモーター活性を有することから、本ＤＮＡはイニシエーターやプロモーター等の遺伝子発現調節用装置として使用できる。従来知られているイニシエーターやプロモーターには、本ＤＮＡのように特定の配列の結合構造を有し且つイニシエーター／プロモーター活性が該特定の配列の結合数に依存的に増加するようなものは殆ど報告されていない。本明細書においてイニシエーター／プロモーター活性とは、イニシエーターやプロモーターの下流に構造遺伝子を連結して宿主に導入したときに、宿主内でまたは宿主外に該遺伝子の遺伝子産物を生産させる能力および機能をいう。かかる活性を有することから、本ＤＮＡは遺伝子発現調節に使用することができる。イニシエーター／プロモーター活性の評価は一般的に、イニシエーターやプロモーターの下流に、レポーター遺伝子を発現可能な状態で連結させて宿主に導入し、該遺伝子の発現量を測定することで実施できる。レポーター遺伝子は、定量が容易に行える蛋白質をコードする遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子等の酵素蛋白質をコードする遺伝子等が好適に用いられる。かかる評価において、レポーター遺伝子の発現の強弱により、イニシエーター／プロモーター活性の強弱を決定することができる。【００４０】
本発明に係るＤＮＡの調製は、自体公知の核酸合成法を用いて化学合成により実施できる。【００４１】
配列番号１または２に記載の塩基配列からなるＤＮＡの調製は、自体公知の遺伝子工学的手法を用いて実施できる。例えばゲノムＤＮＡライブラリーを作製して鋳型とし、当該ＤＮＡを増幅することのできるプライマーを配列番号１または２に記載の塩基配列に基づいて作製して用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して該ＤＮＡを調製できる。【００４２】
本発明に係るＤＮＡはまた、ｉ）配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡと、配列番号７に記載の塩基配列からなるＤＮＡとを適当な条件下で反応させて二本鎖ＤＮＡ（以下、アダプターと称することもある）を形成させ、ｉｉ）次いで、作製したアダプターの複数個を公知のライゲーション法により結合させてアダプター結合体を作製し、ｉｉｉ）その後、該アダプター結合体を鋳型として用い、配列番号１に記載の塩基配列に基づいて作製したプライマーを使用してＰＣＲを行い、ｉｖ）得られたＰＣＲ増幅産物を適当なベクターに挿入し、大腸菌等の宿主を用いてクローニングした後に所望の結合体数を有するクローンを選択して、該クローンから調製することができる。【００４３】
アダプターを形成させる条件として、例えば９０℃にて１分間；７０℃から４０℃まで１時間かけて冷却；４０℃で１５分間インキュベーション；さらに４℃まで１時間かけて冷却するといった条件が挙げられる。またアダプターの結合は簡便には、市販のＤＮＡライゲーションキット等を用いて実施可能である。【００４４】
ＰＣＲに用いるプライマーは、配列番号１に記載の塩基配列に基づいて、所望のＤＮＡを増幅できるものを設計し、自体公知の方法で化学合成して得ることができる。本発明に係るＤＮＡのベクターへの導入を容易にするために、例えばこれらＤＮＡの５´および３´末端に制限酵素サイトを付加するようなときには、上記プライマーに所望の制限酵素サイトが付加されるように設計して化学合成したプライマーを用いてＰＣＲを行うことができる。具体的には例えば、制限酵素サイトとして５´末端にＭｌｕＩサイトおよび３´末端にＢｇｌＩＩサイトが付加されたＤＮＡの調製は、プライマーとして配列番号８に記載の塩基配列からなるＤＮＡおよび配列番号９に記載の塩基配列からなるＤＮＡを用いてＰＣＲを行うことにより実施できる。このようにして調製した制限酵素サイトを有する本ＤＮＡは、適当な制限酵素により処理した後に、同じ制限酵素により処理したベクターのマルチクローニングサイトに導入することが可能である。【００４５】
本発明に係るＤＮＡの調製方法は、これらの例に制限されず、慣用の遺伝子工学的手法あるいは化学合成法等の公知の手法をいずれも利用できる。【００４６】
本発明の一態様はまた、本発明に係るＤＮＡと構造遺伝子とを含み、該ＤＮＡが該構造遺伝子を発現可能にその上流に配置されてなるＤＮＡ構築物に関する。ここで、構造遺伝子が発現可能とは、該遺伝子が該ＤＮＡにより発揮されるイニシエーター／プロモーター活性の制御下にあること、を意味する。かかるＤＮＡ構築物は、本ＤＮＡと所望の構造遺伝子とを用いて公知の遺伝子工学的手法により作製することができる。構造遺伝子は、例えばヒト由来の構造遺伝子を用いるときにはヒト由来ｃＤＮＡライブラリーを作製し、所望の遺伝子を増幅することのできるプライマーを該遺伝子の塩基配列に基づいて設計して合成し、ＰＣＲ等の遺伝子工学的手法により得ることができる。【００４７】
本発明の一態様はさらに、本発明に係るＤＮＡを含むベクターに関する。本発明に係るベクターは、適当なベクターに本ＤＮＡを挿入することにより得られる。ベクターは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、目的により公知のベクターから所望のものを選択して使用することができる。本ＤＮＡはヒト由来のＤＮＡであることから、該ＤＮＡの転写活性能を利用して構造遺伝子の発現調節を行うためには哺乳動物発現ベクターを用いることが好ましい。遺伝子治療等に用いる場合にはレトロウイルスまたはワクシニアウイルス等の動物ウイルスベクター等が好適に使用できる。その他、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）等の植物ウイルスベクターを含め、他のウイルスベクターを本発明に係るベクターとして用い得る。本ＤＮＡをベクターに挿入する方法としては、まず、挿入するＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素サイトまたはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに組込む方法等が利用できるが、この方法に限定されず、公知の遺伝子工学的方法をいずれも利用できる。【００４８】
本発明に係るベクターは、本発明に係るＤＮＡと構造遺伝子とを含むものであることができる。このとき本ＤＮＡは構造遺伝子の上流に該遺伝子を発現可能に配置されることが好ましい。本ＤＮＡを構造遺伝子の上流に連結するには、ＤＮＡリガーゼやホモポリマー法を利用することができる。ＤＮＡリガーゼにより連結する場合、例えば本ＤＮＡと構造遺伝子とが同一の制限酵素部位を有するときはこの制限酵素で消化した後、例えば文献（非特許文献１）に記載の方法に準じて、ＤＮＡリガーゼを加えることにより、本ＤＮＡと構造遺伝子とを連結することができる。また両者が同一の制限酵素部位を有しないときは末端をＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、同様にＤＮＡリガーゼで処理することによりＤＮＡと構造遺伝子とを連結することができる。【００４９】
構造遺伝子は、本発明に係るＤＮＡあるいはベクターを用いて発現させることができるものであればいずれも用いることができる。例えば哺乳動物由来の遺伝子、細菌類、酵母類、放線菌類、糸状菌類、子嚢菌類、担子菌類等の微生物由来の遺伝子、あるいは植物、昆虫等の生物由来の遺伝子等が含まれるが、好ましくは哺乳動物由来の遺伝子である。【００５０】
本発明に係るＤＮＡの転写活性能はエンハンサーの影響によりその能力がさらに促進されたため、上記ベクターにエンハンサーとしての機能を有するＤＮＡを連結することにより構造遺伝子の発現をさらに促進することができる。エンハンサーとはイニシエーターやプロモーターからの転写を著しく促進する配列をいう。エンハンサーとしての機能を有するＤＮＡは、本ＤＮＡあるいは構造遺伝子の５´上流側または３´下流側のいずれの位置に配置してもよい。かかるＤＮＡとして、好ましくはＳＶ４０エンハンサーが挙げられる。ベクターにはその他、所望によりポリＡ付加シグナル、選択マーカーまたはターミネーター等の機能を有するＤＮＡを連結することができる。さらに、必要により複製起点を有していても良い。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子等が挙げられる。【００５１】
本発明の一態様はまた、本発明に係るＤＮＡまたはＤＮＡ構築物が導入されてなる形質転換体に関する。本ＤＮＡまたは本ＤＮＡ構築物の導入は、本ＤＮＡを含むベクターあるいは本ＤＮＡ構築物を用いて実施できる。ベクターを用いて実施する方法は、周知の遺伝子工学的手法がいずれも使用できる。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等の方法が例示できる。ベクターを使用せずに実施する方法は、例えば公知文献（非特許文献２）に記載された方法等を用いることができる。【００５２】
宿主細胞として、好ましくは哺乳動物由来細胞、さらに好ましくは哺乳動物由来の培養細胞を用いることができる。例えば、ヒトの培養細胞としてはＦＬ細胞やＨｅＬａ細胞等、非ヒト哺乳動物細胞としてはサル由来のＣＯＳ細胞やＶｅｒｏ細胞等、ハムスター由来のＣＨＯ細胞やＢＨＫ細胞等、ラット由来のＧＨ３細胞等、マウス由来のＬ細胞等が挙げられるがこれらに限らず、構造遺伝子の発現や蛋白質の製造に使用されている周知の宿主細胞を使用できる。【００５３】
本発明の一態様はさらに、本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡ構築物またはベクターを用いることを特徴とする遺伝子発現量の調節方法に関する。本ＤＮＡは転写活性能を有し、該転写活性能はその特徴として本ＤＮＡに含まれる基本配列（配列番号２）の結合数に依存的して促進する。かかるＤＮＡを用いることにより、所望の遺伝子の発現量調節が可能になる。すなわち、本ＤＮＡに含まれる基本配列（配列番号２）の結合数を増減することにより、遺伝子発現量を人為的に調節することが可能である。例えば、基本配列（配列番号２）の結合数の多いものはより高い転写活性能を有するため、このようなＤＮＡを用いて構造遺伝子の発現を実施すると該遺伝子の発現量が増加し、蛋白質の生産量が増加する。一方、基本配列（配列番号２）の結合数の少ないものはより転写活性能が低いため、遺伝子の発現は低くなると考えられる。遺伝子の発現量調節は、本発明に係るＤＮＡ構築物またはベクターを用いて同様に実施可能である。【００５４】
本発明に係る遺伝子発現量の調節方法により、例えば生活習慣病等の多因子によって引き起こされる疾患の解明が可能になる。すなわち、複数の病態関連の候補蛋白質の微妙な量的変動を、例えば基本配列（配列番号２）をもつ同一のベクターで調節可能になるため、該蛋白質の異常に起因する病態の解明に有効な手段となり得る。【００５５】
本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、ベクターまたは形質転換体は蛋白質の製造方法に利用することができる。例えば、本ＤＮＡの下流に所望の構造遺伝子を配置したＤＮＡ構築物または本ベクターを、自体公知の方法で宿主細胞に導入した形質転換体を常法に従って培養し、得られた培養物から該構造遺伝子にコードされる蛋白質を採取することにより、蛋白質の生産が可能である。培養に用いられる培地としては、ベクターを導入した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択して利用でき、培養も該宿主細胞の成育に適した条件下で実施できる。所望の蛋白質が、該形質転換体の細胞内で生産される場合は、細胞を破砕することにより目的蛋白質を抽出する。また、所望の蛋白質が細胞外に生産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により細胞を除去して蛋白質を得ることができる。【００５６】
本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡ構築物またはベクターにより所望の遺伝子の発現調節が可能であるため、これらは遺伝子治療に用いることができる。例えば、特定の遺伝子の発現が不足または欠如していることに起因する疾患の遺伝子治療に適用できる。また、これらを導入した動物由来細胞、好ましくはヒト由来細胞を遺伝子治療に用いることもできる。【００５７】
遺伝子治療に用いる場合、本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、ベクターまたは形質転換体は、直接体内に導入するインビボ法と、患者の体内より標的とする細胞を一旦取り出して体外で遺伝子を導入して、その後、該細胞を体内に戻すエクスビボ法の両方の方法に適用できる。インビボ法がより好ましい。遺伝子を導入する標的組織および標的細胞は、遺伝子治療（処置）の対象により適宜選択することができる。例えば、標的細胞として、リンパ球、線維芽細胞、肝細胞、造血幹細胞等の細胞を挙げられるが、これらに制限されない。【００５８】
遺伝子の体内または細胞内への導入法は、非ウイルス性のトランスフェクション法、あるいはウイルスベクターを利用したトランスフェクション方法のいずれも適用できる。非ウイルス性のトランスフェクション法は、ウイルスベクターを利用した方法と比較して、安全性および簡便性の点で優れておりかつ安価であるためより好ましい。いずれのトランスフェクション法も、遺伝子治療に用いられている各種の方法に従って実施できる。【００５９】
遺伝子治療に用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調製することもできる。投与は、１日に１回または数回に分けて行うことができ、１日から数週間の間隔で間歇的に投与することもできる。【００６０】
本発明に係るＤＮＡ、ＤＮＡ構築物、ベクターおよび形質転換体はいずれも、それ自体を単独で、試薬等として使用できる。また、これらから選ばれる少なくとも１つを含んでなる試薬キットも、本発明の範囲に含まれる。試薬または試薬キットであるとき、これらは緩衝液、塩、安定化剤および／または防腐剤等の物質を含んでいてもよい。【００６１】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００６２】
（３３ｍｅｒ  ＤＮＡ結合体の作製）
シナプトタグミンＸＩと称されている遺伝子の転写開始点と考えられる部位の近傍には、イニシエーターやプロモーター領域の特徴であるＴＡＴＡボックス、イニシエーター配列および転写因子ＳＰ−１の結合部位を有する３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）が反復している領域が存在している。この領域に着目し、３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）の１つ以上を有する結合体を作製した。以下、３３ｍｅｒのＤＮＡ（配列番号２）を基本配列と称することがある。【００６３】
合成オリゴヌクレオチド、３３ｍｅｒ  Ｕｎｉ．（配列番号２）および３３ｍｅｒ  Ｒｅｖ．（配列番号７）を用い、これらを次に示す条件下で反応させて２本鎖ＤＮＡフラグメント（以下、アダプターと称する）を作製した：９０℃にて１分間加熱；７０℃から４０℃まで１時間かけて冷却；４０℃で１５分間インキュベーション；さらに４℃まで１時間かけて冷却。アダプターは、５´末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＴＡＫＡＲＡ社）によりリン酸化し、次いで２つ以上の該アダプターをＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）により結合させてアダプター結合体を作製した。【００６４】
３３ｍｅｒ  Ｕｎｉ．：５´−ＴＴＣ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＴＣ  ＴＴＣ  ＣＧＡ  ＧＧＡ  ＣＣＡ３´（配列番号２）
３３ｍｅｒ  Ｒｅｖ．：５´−ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＣＣ  ＧＣＣ  ＴＣＴ  ＴＣＣ３´（配列番号７）【００６５】
アダプター結合体は、ベクター（ＰＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入するために、制限酵素サイトを付加した。具体的には、作製したアダプター結合体を鋳型とし、プライマーとしてＭｌｕＩ  ３３ｍｅｒ  Ｕｎｉ．（配列番号８）、ＢｇｌＩＩ  Ｒ３  Ｌｏｎｇ（配列番号９）を用いてＰＣＲを実施することにより、アダプター結合体に制限酵素サイトを付加した。制限酵素サイトを付加したアダプター結合体は、ＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）およびＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３７℃にて１時間制限酵素処理し、ベクターへの挿入に供した。【００６６】
ＭｌｕＩ  ３３ｍｅｒ  Ｕｎｉ．：５´−ＣＧＡ  ＣＧＣ  ＧＴＴ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＣＧ  ＧＡＧ  ＴＣ３´（配列番号８）
ＢｇｌＩＩ  Ｒ３  Ｌｏｎｇ：５´−ＧＧＡ  ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＣＧＧ  ＡＡＧ  ＡＡＧ  ＡＣ３´（配列番号９）【００６７】
（３３ｍｅｒ  ＤＮＡ結合体を含むベクターの調製）
ベクターは、ＰＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。ＰＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒは、ＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）およびＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３７℃にて１時間制限酵素処理し、次いでアルカリホスファターゼ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて５６℃で１時間の脱リン酸化処理を３回実施した。アダプター結合体は、上記のように制限酵素処理した後にＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔを用いてＰＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ／ＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ／ＢＡＰｘ３に挿入し、大腸菌（ＤＨ５α、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフォーメーションした。ベクターに挿入された３３ｍｅｒ  ＤＮＡ結合体の配列と該結合体に含まれる基本配列（配列番号２）の結合数を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により検討した。最終的にｐＧＬ３−Ｅｎｈａｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒのルシフェラーゼ遺伝子の上流に基本配列（配列番号２）を１、２、３、４または８個有する結合体が配置されてなるベクターが調製できた。各ベクターに挿入された結合数１、２、３、４または８の基本配列（配列番号２）を有するＤＮＡを、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示した。【００６８】
（３３ｍｅｒ  ＤＮＡ結合体の転写活性能の測定）
３３ｍｅｒ  ＤＮＡ結合体の転写活性能の測定は、レポーター酵素としてホタルルシフェラーゼを有するＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用い、ルシフェラーゼ活性を指標にして行った。【００６９】
被検試料として、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の各塩基配列からなるＤＮＡを有する上記ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒを用いた。配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の各塩基配列からなるＤＮＡはそれぞれ、結合数１、２、３、４または８の基本配列（配列番号２）を有する。ネガティブコントロールとして何も挿入していないｐＧＬ３−Ｅｎｈａｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒを、ポジティブコントロールとしてＳＶ４０プロモーターおよびＳＶ４０エンハンサーを有するｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。同時に、トランスフェクション効率の差異を補正するためにウミシイタケルシフェラーゼの遺伝子をレポーター酵素として有するｐｈＲＬ−ＴＫ  Ｖｅｃｔｏｒを内部コントロールベクターとして使用した。【００７０】
ベクターをトランスフェクションする細胞としてＣＯＳ−１細胞を用い、１０％牛胎仔血清（ＦＢＳ、ＧＩＢＣＯ社）を含むＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社）にて培養した。トランスフェクションはＴｒａｎｓＦａｓｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて定法に従い実施した。まず、ＣＯＳ−１細胞をＮＵＮＣＬＯＮ  Ｓｕｒｆａｃｅ（Ｎｕｎｃ社）２４ｗｅｌｌに播種した（細胞数５×１０４／ｍｌ、１ｍｌ／ｗｅｌｌ）。翌日、被検試料５００ｎｇ／ｗｅｌｌ、ｐｈＲＬ−ＴＫ  Ｖｅｃｔｏｒ  ５００ｐｇ／ｗｅｌｌをＦＢＳを含まない新鮮培地２００μｌ／ｗｅｌｌに添加して混和し、さらにＴｒａｎｓＦａｓｔ  Ｒｅａｇｅｎｔ  １．５μｌ／ｗｅｌｌを添加してよく混和した後、室温にて１０分間放置した。前日播種した細胞の培地を取り除いた後のｗｅｌｌに上記混和液を加えて３７℃で１時間培養し、さらにＦＢＳを含む新鮮培地を１ｍｌ加えて３７℃にて２４時間培養した。その後、培養上清を取り除き、Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（ｋｉｔに添付）を用いて細胞ライセートを調製した。被験試料の代わりに、ネガティブコントロールまたはポジティブコントロールを用いて、同様に細胞ライセートを調製した。【００７１】
各細胞ライセートのルシフェラーゼ活性の測定を、Ｍｉｃｒｏ  Ｌｕｍａｔ  Ｐｌｕｓ（ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して行った。ルシフェラーゼ活性は、得られた測定値から、以下の式を用いて算出した値で表示した。【００７２】
【数１】
2005042738.tif 000002
【００７３】
図１に示したように、基本配列（配列番号２）の結合数に比例して、ルシフェラーゼ活性が定量的に増加した。このことから、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６の各塩基配列からなるＤＮＡは、該ＤＮＡの下流に配置された遺伝子を発現させ得る転写活性能を有し、該転写活性能は基本配列の結合数に依存的に促進することが明らかになった。また、配列番号４、配列番号５および配列番号６の各塩基配列からなるＤＮＡによるルシフェラーゼ発現量は、ＳＶ４０プロモーターと同等またはそれ以上であったことから、これらＤＮＡはイニシエーターやプロモーターとして十分な機能を有することが判明した。
【実施例２】
【００７４】
（シナプトタグミンＸＩ遺伝子の上流域の調製）
ヒトゲノムＤＮＡ１０ｎｇを鋳型ＤＮＡとし、プライマー１（配列番号１０）およびプライマー２（配列番号１１）を用いてＬＡ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）によりＰＣＲを行い、シナプトタグミンＸＩ遺伝子の転写調節領域のＤＮＡ（以下、転写調節領域のＤＮＡと称する）を得た。転写調節領域のＤＮＡは、ベクター（ＰＧＬ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）に挿入するため、さらにプライマー３（配列番号１２）およびＢｇｌＩＩ  Ｒ３  Ｌｏｎｇ（配列番号９）を用いてＰＣＲを実施し、制限酵素サイトを付加した。制限酵素サイトを付加した転写調節領域のＤＮＡは、ＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）およびＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３７℃にて１時間制限酵素処理し、ベクターへの挿入に供した。ＰＧＬ−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒは、実施例１で用いたＰＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒと比較して、ＳＶ４０エンハンサー部位が欠如している他は、全く同じ構成要素を有するベクターである。【００７５】
プライマー１：５´−ＧＧＣ  ＡＧＴ  ＣＧＡ  ＴＡＣ  ＴＧＡ  ＡＡＴ  ＣＣＡ  ＧＧＣ−３´（配列番号１０）
プライマー２：５´−ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＧＡＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＴＣＣ−３´（配列番号１１）
プライマー３：５´−ＣＧＡ  ＣＧＣ  ＧＴＧ  ＧＣＡ  ＧＴＣ  ＧＡＴ  ＡＣＴ  ＧＡＡ  ＡＴＣ  ＣＡＧ−３´（配列番号１２）【００７６】
（シナプトタグミンＸＩ遺伝子の転写調節領域のＤＮＡを含むＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒの調製）
ベクターは、ＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いた。ＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒは、ＭｌｕＩ（ＴＡＫＡＲ社）およびＢｇｌＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて３７℃にて１時間制限酵素処理し、次いでアルカリホスファターゼ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いて５６℃にて１時間の脱リン酸化処理を３回実施した。転写調節領域のＤＮＡは、上記のように制限酵素処理した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社）を用いてＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ／ＭｌｕＩ／ＢｇｌＩＩ／ＢＡＰｘ３に挿入し、大腸菌（ＤＨ５α；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にトランスフォーメーションした。ベクターに挿入された転写調節領域のＤＮＡの塩基配列をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）により確認した後、該ベクターをレポーターアッセイに供した。ベクターに挿入された転写調節領域の塩基配列を、配列番号１３または配列番号１４に示す。配列番号１３および配列番号１４に記載の各塩基配列からなるＤＮＡは、それぞれ基本配列（配列番号２）の結合数が２および３であるＤＮＡを含むことが判明した。また、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡ（基本配列（配列番号２）の結合数が２である）を転写調節領域のＤＮＡの代わりに用いて同様の方法でＰＧＬ３−Ｂａｓｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒに挿入し、得たベクターをレポーターアッセイに供した。【００７７】
レポーターアッセイは、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ遺伝子を用い実施例１と同じ方法により実施した。図２に示すように、上記各ベクターを導入された形質転換体において発現されたルシフェラーゼの活性は、挿入された配列番号１３または配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡに含まれる基本配列（配列番号２）の結合数に比例して定量的に増加した。一方、配列番号３に記載の塩基配列からなるＤＮＡを挿入したベクターを導入された形質転換体において発現されたルシフェラーゼ活性は、配列番号１３または配列番号１４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを導入された形質転換体と比較して低かったが、コントロールベクターを導入した形質転換体と比較して明らかに高かった。【００７８】
これらから、ＳＶ４０エンハンサーの影響がない条件下においても、基本配列（配列番号２）を有するＤＮＡ自体が転写活性能を示すこと、また該転写活性能は基本配列（配列番号２）の結合数に依存的に促進することが明らかになった。【００７９】
さらに、基本配列（配列番号２）の結合数が２であるＤＮＡを含むベクターを導入された形質転換体のルシフェラーゼ活性が、ＳＶ４０エンハンサーを有さないベクター（図２）に比べて、ＳＶ４０エンハンサーを有するベクター（図１）では著しく高いことから、該ＤＮＡの転写活性能はＳＶ４０エンハンサーの影響によりさらに著しく増加することが判明した。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明は、遺伝子発現量の人為的な調節や有用蛋白質の製造等のために利用可能であり、基礎科学研究から医薬開発まで広い分野で非常に有用性が高い。
【配列表フリーテキスト】
【００８１】
配列番号１：イニシエーター／プロモーターとして機能し得る設計されたＤＮＡ。
配列番号２：配列番号１のＤＮＡの５´末端に付加したときに該ＤＮＡのイニシエーター／プロモーター活性を促進し得る設計されたＤＮＡ。
配列番号３：イニシエーター／プロモーターとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号４：イニシエーター／プロモーターとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号５：イニシエーター／プロモーターとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号６：イニシエーター／プロモーターとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号７：配列番号２のＤＮＡと二本鎖ＤＮＡを形成するＤＮＡ。
配列番号８：プライマーとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号９：プライマーとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号１０：プライマーとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号１１：プライマーとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号１２：プライマーとして機能し得るＤＮＡ。
配列番号１３：シナプトタグミンＸＩ遺伝子の転写調節領域の塩基配列。
配列番号１４：シナプトタグミンＸＩ遺伝子の転写調節領域の塩基配列。
【図１】
2005042738.tif 000003
【図２】
2005042738.tif 000004
【図３】
2005042738.tif 000005
【配列表】
2005042738000001.app
【国際調査報告】
2005042738.tif 000006
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2005042738.tif 000008
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