(57)【要約】  本願は、Ｃｙ５．５色素部分で標識され、腫瘍および病理学的部位のガイド手術に使用される、アザビシクロアルカンベースの環状ペプチドを含む、ＤＡ３６４として知られた式（Ｉ）のｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５複合体である、近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブの合成方法、に関する。【化１】2020516640.tif 000016【選択図】なし
2020516640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2020516640.tif 000011
のｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５複合体の製造方法であって、以下の工程：
ａ）式（ＩＩ）：
【化２】
2020516640.tif 000012
［式中、Ｍｔｒは、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼン−スルホニル基である。］
の化合物を水素化して、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020516640.tif 000013
［式中、Ｍｔｒは、上記で定義したとおりである。］
のアミノ誘導体を生成させること；
ｂ）塩基およびカップリング試薬の存在下で、式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）：
【化４】
2020516640.tif 000014
の化合物と反応させ、式（Ｖ）：
【化５】
2020516640.tif 000015
［式中、Ｍｔｒは、上記で定義したとおりである。］
の化合物を生成させること；
ｃ）式（Ｖ）の化合物を脱保護して、式（Ｉ）の化合物を得ること、
を含む、製造方法。
【請求項２】
式（ＩＩ）の化合物が溶媒に溶解され、該溶媒がアルコールまたはアルコールの混合物である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
式（ＩＩ）の化合物が、３〜７ｍＭの濃度である、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
工程ａ）が、溶媒に溶解した式（ＩＩ）の化合物を水素雰囲気下で金属触媒に流すことにより行われる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
工程ａ）が、１８℃〜４０℃の温度で行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
工程ｂ）が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリジノン、およびアセトニトリルから選択される溶媒の存在下で行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
カップリング試薬が、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、およびプロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ）からなる群から選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
塩基が、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリブチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、およびＮ−メチルモルホリンからなる群から選択される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項９】
式（ＩＶ）の化合物が、５〜１０ｍＭの濃度である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１０】
式（ＩＶ）の化合物と塩基との比が、１：３〜１：６（ｍｏｌ／ｍｏｌ）である、請求項１、８および９のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
工程ｂ）が、２０℃〜２５℃の温度で行われる、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１２】
式（Ｖ）の化合物が、トリフルオロ酢酸／フェノール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／水、トリフルオロ酢酸／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／アニソール、および、トリフルオロ酢酸／フェノール／水／トリイソプロピルシランからなる群から選択される酸スカベンジャーカクテルで処理される、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１３】
トリフルオロ酢酸、チオアニソール、１，２−エタンジチオール、およびアニソールの比が、７０：１５：１０：５〜９０：５：３：２である、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
さらなる工程ｄ）精製、を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物が、アガロースマトリックス樹脂を用いて行われる陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される、請求項１および１４のいずれかに記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、光学イメージングの分野に関する。より詳しくは、本発明は、Ｃｙ５．５色素部分で標識され、腫瘍および病理学的部位のガイド手術に使用される、アザビシクロアルカンベースの環状ペプチドを含む、近赤外（ＮＩＲ）蛍光プローブ（「ＤＡ３６４」として知られている）の改良された合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＡ３６４（下記の式Ｉ参照）は、手術中のイメージングで効果的に使用されるＮＩＲ蛍光剤であり、ＮＩＲ蛍光イメージングによってガイドされる腫瘍の治療手術中に、腫瘍縁部のリアルタイム検出と境界を提供する。
【化１】
2020516640.tif 000003
【０００３】
ＤＡ３６４の合成（Ｌａｎｚａｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ  ２０１１、６、４４９−４５８参照）は、以下の反応スキーム１：
【化２】
2020516640.tif 000004
に従い、スクシンイミジルエステル（ＶＩ）（Ｃｙ５．５−ＮＨＳ）と、対応するアジド化合物（ＩＩ）の触媒還元により得られるペプチド模倣体（ＶＩＩ）（アミノ環状ｃＲＧＤ）との反応を含む。
【０００４】
しかしながら、この方法は、スケールアップ、時間、コストの面でいくつかの欠点がある。特に、Ｃｙ５．５−ＮＨＳ（ＶＩ）の合成は冗長であり、最終的なシアニンＮＨＳエステルの精製が難しく、結果、全体の収率が低下する。さらに、活性化したエステルであるため、不安定であり、乾燥固体として良好に保存できないため、使用直前に合成することを要する。加えて、化合物（ＩＩａ）からのアミノ環状ｃＲＧＤ（ＶＩＩ）の合成は、水素化だけでなく、脱保護、および、脱保護化合物（ＶＩＩ）の分取ＨＰＬＣによる副生成物からの精製という、複数の工程を要する。粗製のＤＡ３６４もまた、副生成物の存在を避けるために、分取ＨＰＬＣで精製する必要がある。
【０００５】
出願人は、現在、Ｃｙ５．５−ＮＨＳの代わりにＣｙ５．５−ＣＯＯＨ誘導体から出発し、カップリング反応までｃＲＧＤアミノ酸の保護基を保持するＤＡ３６４の改良合成を開発しており、現在の公知の製造方法のいくつかの欠点を克服している。
【０００６】
一般に、カップリング試薬の存在下での非活性化カルボン酸とアミンとの直接アミドカップリングは、イメージングプローブの製造のための代替方法として、先行技術で既に開示されており、例えば、Ｂａｉ  Ｍ．らのＣｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１２、１９（２８）、４７４２−４７５８で、引用されている。
【０００７】
このアプローチで得られる複合体の例のいくつかは、また、ＵＳ２０１４／２８８３００Ａ１で、韓国科学技術研究所の名称において、および、ＣｈｅｖａｌｉｅｒらのＯｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０１４、１６、３９４６−３９４９において、開示されており、ＨＡＴＵまたはＰｙＢＯＰなどのカップリング剤の存在下での、フルオロフォア−ＣＯＯＨとアミンとの複合体の製造について報告している。
【０００８】
しかしながら、上記の欠点を解決し、製造の収率とともに時間とコストを改良することを目的として、このアプローチをＤＡ３６４の全合成に適用することへの成功の期待を与える手掛かりは、背景技術において見当たらなかった。
【０００９】
定義
本明細書において、特に断りのない限り、「カップリング試薬」との用語は、カルボキシル部分とアミノ部分の間のアミド結合の形成に使用される試薬を意味する。この反応は、カルボキシル部分の活性化とアミノ基のアシル化という２つの連続した工程で構成される。カップリング試薬は、通常、それぞれカルボキシル基と反応し、アミノ部分によって攻撃される中間体を与えることが可能な、ホスホニウム、アミニウム、イモニウム、イミド官能基を少なくとも含む。カップリング剤の例は後述する。
【００１０】
「無水極性非プロトン性溶媒」との表現には、極性結合による双極性を有するが、Ｈ結合に供与できるＨ原子を有さない比較的大きな誘電率（例えば、＞２０）を有する乾燥溶媒が含まれる。無水極性非プロトン性溶媒の例としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリジノン、アセトニトリルが挙げられる。
【００１１】
「酸スカベンジャーカクテル」との表現には、その意味の中に、いくつかの保護基、特に、Ｍｔｒ（２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼン−スルホニル）、Ｐｍｃ（２，２，５，７，８−ペンタメチル−６−クロマン−スルホニル）、ＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ−ブチルエステル）、Ｔｒｔ（トリフェニルメチル）、Ｐｂｆ（２，２，４，６，７−ペンタメチル−２，３−ジヒドロ−１−ベンゾフラン−５−スルホニル）、を取り除くのに適した開裂酸試薬混合物が含まれる。酸スカベンジャーカクテルの例は後述する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、式（Ｉ）：
【化３】
2020516640.tif 000005
のｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５複合体の製造方法であって、以下の工程：
ａ）式（ＩＩ）：
【化４】
2020516640.tif 000006
［式中、Ｍｔｒは、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼン−スルホニル基である。］
の化合物を水素化して、式（ＩＩＩ）：
【化５】
2020516640.tif 000007
［式中、Ｍｔｒは、上記で定義したとおりである。］
のアミノ誘導体を生成させること；
ｂ）塩基およびカップリング試薬の存在下で、式（ＩＩＩ）の化合物を式（ＩＶ）：
【化６】
2020516640.tif 000008
の化合物と反応させ、式（Ｖ）：
【化７】
2020516640.tif 000009
［式中、Ｍｔｒは、上記で定義したとおりである。］
の化合物を生成させること；
ｃ）式（Ｖ）の化合物を脱保護して、式（Ｉ）の化合物を得ること、
を含む、製造方法に関する。
【００１３】
本発明の目的である新規な合成アプローチは、最終収率が少なくとも１２％増加する最も効果的なＤＡ３６４の製造方法を提供し、工業的規模の生産において特に有利ないくつかの改良をもたらす。
【００１４】
実際、Ｃｙ５．５−ＮＨＳの代わりに、反応性は低いもののより安定なＣｙ５．５−ＣＯＯＨ誘導体を選択することにより、分解の問題なく出発物質を保存することができる。
【００１５】
さらに、シアニンとｃＲＧＤペプチドのカップリングの後のみにアミノ酸保護基を取り除く戦略は、意外にも、いくつかの理由で有益であることが判明した。たとえば、望ましくない副生成物の形成を避ける；精製せずにそのまま使用することで、アジド化合物（ＩＩ）の精製工程を省く；未反応のシアニンから複合体をクロマトグラフィーにより分離および精製することを容易にし、回収および再利用が容易になり得る。最後に、カップリングは、ホウ酸緩衝液の代わりに無水極性非プロトン性溶媒中で行うことができ、中間体を分解することなく保存する機会をもたらす。
【００１６】
上記の複数の成果は、驚くべきことに、従来の教示なしに得られたものである。特に、従来技術には、酸スカベンジャーカクテルの存在下で実施される最終の脱保護工程で適用される強酸条件に対するｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５複合体の安定性に関する証拠は見られない。
【００１７】
それにもかかわらず、本発明は、強酸性条件の存在下でさえ、ＤＡ３６４を分解することなく良好な収率で得る方法を提供する。
【００１８】
さらに、本方法の精製工程は、例えば、カップリングの前の煩わしいＨＰＬＣ分取工程の除去、またはフラッシュクロマトグラフィーによるより簡単で迅速な精製の追加により、劇的に簡略化される。実際、驚くべきことに、例えば、アガロースマトリックス樹脂を用いて行われる陰イオン交換クロマトグラフィーを使用すると、カップリングしていないシアニンから最終の複合体化合物を分離することが可能であり、それにより、それに続くＨＰＬＣ精製工程を改良することが見出された。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、以下のスキーム２に示すように、当該技術分野においてＤＡ３６４として知られる、式（Ｉ）のｃＲＧＤ−Ｃｙ５．５複合体の製造方法を開示する。
【００２０】
【化８】
2020516640.tif 000010
【００２１】
本方法の第１工程は、中間体化合物（ＩＩ）を水素化し、保護されたｃＲＧＤ化合物（ＩＩＩ）を得ることを含む。Ｌａｎｚａｒｄｏらによって開示された方法とは異なり、副生成物の形成を避けるために、化合物（ＩＩＩ）のアスパラギン酸およびアルギニンの保護基は除去されず、精製は不要である。アジド化合物（ＩＩ）は、例えば、ＭａｎｚｏｎｉらのＣｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、２００９、４、６１５−６３２に開示された方法により、合成することができる。
【００２２】
このように、工程ａ）によれば、化合物（ＩＩ）は、適切な溶媒、好ましくはアルコール、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｔ−ブタノール、より好ましくはメタノール、またはそれらの混合物に、溶解される。通常、アジドは、３ｍＭ〜７ｍＭ、好ましくは、５〜５．５ｍＭ、より好ましくは、５ｍＭの濃度で、溶解することができる。
【００２３】
化合物（ＩＩ）のアジド基から化合物（ＩＩＩ）のアミノ基への還元は、水素雰囲気下、室温で、金属触媒（例えば、カートリッジの形態で）に、溶液を流すこと（例えば、０．２〜０．８ｍｌ／分、好ましくは０．５ｍｌ／分）により行うことができる。金属触媒は、パラジウムまたは白金が好ましく、パラジウムがより好ましい。好ましい実施形態では、金属触媒は、適切な支持材、例えば、炭素粉末と、好ましくは金属触媒が５〜１０重量％となる量で、混合される。
【００２４】
反応は、１８℃〜４０℃の温度、好ましくは２０℃〜３０℃、さらには室温（すなわち約２２℃）で行うことができる。
【００２５】
反応は、フローリアクターシステム（連続モード）、またはバッチ条件で行うことができる。
【００２６】
本方法の第２工程は、Ｃｙ５．５（中間体化合物（ＩＶ））のカルボン酸を化合物（ＩＩＩ）のアミノ基にカップリングして、粗製のＤＡ３６４化合物を得ることを含む。
【００２７】
工程ｂ）によれば、カップリングは無水極性非プロトン性溶媒の存在下で行われる。溶媒は、好ましくは、乾燥した、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、Ｎ−メチルピロリジノン、アセトニトリルなどからなる群から選択され、好ましくは、乾燥Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００２８】
Ｃｙ５．５−ＣＯＯＨ化合物（ＩＶ）は、５〜１０ｍＭ、好ましくは７〜９ｍＭ、より好ましくは８．６ｍＭの濃度で溶媒に溶解することができる。Ｃｙ５．５−ＣＯＯＨ化合物（ＩＶ）は、商業的に入手可能な化合物である（Ｌｕｍｉｐｒｏｂｅ、カタログ番号１７３９０）。あるいは、６−アミノ−１，３−ナフタレンジスルホン酸二ナトリウム塩から出発して、ＭｕｊｕｍｄａｒらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９６、７、３５６−３６２、および、ＣＮ１０２０１０６１４Ａに記載された方法に従って、合成することができる。フラッシュクロマトグラフィーにより粗精製でき、分取ＨＰＬＣ精製を必要とする従来技術の方法と比較して、多くの時間を節約することができる。上記のように、Ｃｙ５．５−ＣＯＯＨ化合物（ＩＶ）は対応するエステル（ＶＩ）（公知の製造方法で使用）よりも反応性が低く、保存が可能である。
【００２９】
中間体化合物（ＩＶ）は反応性が比較的低いため、化合物（ＩＶ）と化合物（ＩＩＩ）の反応を行うために、カップリング試薬の使用を要する。カップリング試薬は、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴＭＭ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＡＴＵ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ΗＢＴＵ）、プロピルホスホン酸無水物（Ｔ３Ｐ（登録商標））、好ましくはＴＢＴＵ、からなる群から選択することができる。中間体化合物（ＩＶ）とカップリング試薬との比は、１：１〜１：５（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは１：１．５〜１：３、より好ましくは約１：２にすることができる。
【００３０】
活性化は、反応混合物に塩基を添加することによっても促進される。塩基は、Ｃｙ５．５−ＣＯＯＨ化合物（ＩＶ）のカルボン酸を脱プロトン化するのに加え、残った酸性を中和するｐＨ緩衝剤として有利に作用する。塩基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、トリブチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、またはＮ−メチルモルホリン、好ましくはＮ−メチルモルホリン、から選択することができる。中間体化合物（ＩＶ）と塩基との比は、１：３〜１：６（ｍｏｌ／ｍｏｌ）、好ましくは１：３．５〜１：５、より好ましくは約１：４にすることができる。
【００３１】
カップリングは、好ましくは、撹拌下、暗所、およびＮ２雰囲気下において、１〜８時間、好ましくは３時間で行われる。好ましくは、２０℃〜２５℃の温度、より好ましくは室温で行われる。
【００３２】
ｃＲＧＤ化合物（ＩＩＩ）の保護基が、ｃＲＧＤ化合物（ＩＩＩ）のアルギニンとＣｙ５．５化合物（ＩＶ）のカルボキシル基との反応による副生成物の形成を避けるため、提案されたＤＡ３６４の合成は、非常に特異的である。
【００３３】
第３工程は、ペプチド模倣体部分に残るｔ−ブチルエステルおよび２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）基の脱保護を含み、粗製のＤＡ３６４を得る。
【００３４】
工程ｃ）によれば、官能基脱保護反応は、トリフルオロ酢酸／フェノール／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／水、トリフルオロ酢酸／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／アニソール、または、トリフルオロ酢酸／フェノール／水／トリイソプロピルシラン、などの有効な酸スカベンジャーカクテルを用いて、好ましくは、トリフルオロ酢酸／チオアニソール／１，２−エタンジチオール／アニソールを、トリフルオロ酢酸、チオアニソール、１，２−エタンジチオール、およびアニソールの比率７０：１５：１０：５〜９０：５：３：２、好ましくは、９０：５：３：２で用いて、公知の技術に従って行うことができる。
【００３５】
脱保護は、撹拌下、室温、暗所で１〜８時間、好ましくは２時間で行うことができる。
【００３６】
工程ｄ）によれば、粗製のＤＡ３６４の精製は、従来技術の組み合わせにより行われる。好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィー工程とそれに続く分取ＨＰＬＣとを含む２工程の精製プロセスの後に、純粋なＤＡ３６４生成物を得ることができる。
【００３７】
陰イオン交換クロマトグラフィーの工程は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌの緩衝液中で、ｐＨ７〜８、好ましくは７．５で、０〜１００％の１Ｍ  ＮａＣｌのグラジエントまたはイソクラティック溶出によって、または、好ましくはそれぞれ、１０〜３０％の１Ｍ  ＮａＣｌ、７０〜１００％の１Ｍ  ＮａＣｌ、および１ＭのＮａＣｌの、３０％イソプロパノールによる３段階のイソクラティック溶出によって、行うことができる。陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、強い陰イオン交換体でも、弱い陰イオン交換体でもよいが、固体マトリックス、好ましくはアガロースビーズに結合した、第四級アンミン基が好ましい。
【００３８】
分取ＨＰＬＣは、０．１％酢酸アンモニウム緩衝液中、０〜１００％、好ましくは２〜９５％のアセトニトリルのグラジエントで行うことができる。あるいは、２０〜３０％、好ましくは２０％のアセトニトリル、および、７０〜８０％、好ましくは８０％の８ｇ／ｌの酢酸アンモニウムによるイソクラティック溶出により行うことができる。ＨＰＬＣカラムは、シリカＲＰカラムであり、フェニル結合相が好ましい。
【００３９】
この戦略により、精製工程が軽減され、多くの時間とコストが節約される。
【００４０】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４１】
実施例１：ＤＡ３６４の合成
材料および装置
ＤＡ３６４の合成に用いた市販の試薬は、すべて、さらに精製することなく使用した。中間体化合物（ＩＩ）は、アルギニンが、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（Ｐｍｃ）保護基の代わりに、２，３，６−トリメチル−４−メトキシベンゼンスルホニル（Ｍｔｒ）保護基で保護されたこと以外は、ＭａｎｚｏｎｉらのＣｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９、４、６１５−６３２に記載された方法に従って合成した。化合物（ＩＶ）は、ＭｕｊｕｍｄａｒらのＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９６、７、３５６−３６２、およびＣＮ１０２０１０６１４Ａに記載された方法に従って合成し、０．１％ギ酸水溶液中１０％〜１００％のアセトニトリルのグラジエントを用いたＣｏｍｂｉｆｌａｓｈ自動精製システムを使用して、Ｃ１８カートリッジで粗精製した。
【００４２】
水素化工程は、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを有するフローリアクターで行った。
【００４３】
反応は、波長２２０ｎｍ、２５４ｎｍ、６７７ｎｍの吸収の検出器を有するＭＳ−ＨＰＬＣを使用して、追跡した。
【００４４】
最終化合物の精製は、ＦＰＬＣシステムの後、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより行った。
【００４５】
ＵＶ−Ｖｉｓ／ＮＩＲ吸収スペクトルは、Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｊｅｎａ、Ｓｐｅｃｏｒｄ  ２００  Ｐｌｕｓ分光光度計で測定した。
【００４６】
ＤＡ３６４の合成
ＤＡ３６４の合成は、スキーム２に従って行う。
水素化
アジド化合物（ＩＩ）（０．３９ｍｍｏｌ）をメタノール（８０ｍｌ）に溶解し、この溶液を水素雰囲気下で１０％パラジウムカートリッジに通過させた。２サイクルの後、得られた生成物を収集し、溶液を真空で濃縮した。化合物（ＩＩＩ）を、さらに精製することなく使用した。
【００４７】
カップリング
粗製の中間体化合物（ＩＩＩ）を、化合物（ＩＶ）（０．４３ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルモルホリン（１．７３ｍｍｏｌ）、およびＴＢＴＵ（０．８６ｍｍｏｌ）の乾燥ジメチルホルムアミド（５０ｍｌ）溶液に加えて、濃い青色の溶液を得た。反応物を暗所で、Ｎ２雰囲気下で３時間撹拌した。反応の完了後、溶媒をエバポレートし、粗生成物を以下に記載するように処理して、さらに精製することなく保護基を除去した。
【００４８】
脱保護
要時調製したＴＦＡ／スカベンジャーカクテル（トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジチオール、アニソール、９０：５：３：２、合計２０ｍｌ）を、上記の工程で得られた粗生成物に加え、混合物を室温、暗所で２時間撹拌した。次いで、反応混合物をエバポレートし、青色の油状物を水（１００ｍｌ）に溶解し、ジエチルエーテルまたはイソプロピルエーテル（２×３０ｍｌ）で洗浄した。純粋なＤＡ３６４生成物は、２段階の精製プロセスの後に得られた。
【００４９】
精製
このプロセスは、ｐＨ約７の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ含有緩衝液中のＮａＣｌ線形グラジエントを用いた市販のアガロースマトリックス樹脂（７０ｍｌ）で行われる陰イオン交換クロマトグラフィーのステップと、酢酸アンモニウム緩衝液中の０〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントを用いたＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｐｈｅｎｙｌ分取カラム（２５０×５０ｍｍ）で行われる逆相高速液体クロマトグラフィーのステップと、を含む。
【００５０】
精製後、純粋なＤＡ３６４化合物が、アジド化合物（ＩＩ）に対して３６％の収率（０．１４ｍｍｏｌ）で、青色の凍結乾燥粉末として得られた。
【００５１】
比較例２：ＤＡ３６４の比較合成
ＤＡ３６４を、スキーム１に記載された合成方法に従う、ＬａｎｚａｒｄｏらのＣｏｎｔｒａｓｔ  Ｍｅｄｉａ  Ｍｏｌ．Ｉｍａｇｉｎｇ、２０１１、６、４４９−４５８に記載された方法に従って得た。
【００５２】
材料および装置
合成に用いた市販の試薬は、すべて、さらに精製することなく使用した。中間体化合物（ＩＩ）は、ＭａｎｚｏｎｉらのＣｈｅｍ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００９、４、６１５−６３２に記載された方法に従って合成した。中間体（ＶＩＩ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、凍結乾燥粉末として次の工程で使用した。
【００５３】
水素化工程は、１０％Ｐｄ／Ｃカートリッジを有するＨ−Ｃｕｂｅ  Ｐｒｏ（商標）フローリアクターで行った。
【００５４】
カップリング反応は、波長２２０ｎｍ、２５４ｎｍ、６７７ｎｍの吸収の検出器を有するＭＳ−ＨＰＬＣを使用して、追跡した。
【００５５】
最終化合物の精製は、分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより行った。
【００５６】
ＤＡ３６４の合成
アジド化合物（ＩＩ）（１．４３ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１５０ｍｌ）に溶解し、この溶液を水素雰囲気下で１０％パラジウムカートリッジに通過させた。２サイクルの後、得られた生成物を収集した。収集した溶液を真空で濃縮し、要時調製したＴＦＡ／スカベンジャーカクテル（トリフルオロ酢酸、チオアニソール、エタンジチオール、アニソール、９０：５：３：２、合計２０ｍｌ）を加えた。混合物を室温、暗所で２時間撹拌した。次に、溶液をエバポレートし、得られた油状物を水（１００ｍｌ）に溶解し、イソプロピルエーテル（２×３０ｍｌ）で洗浄した。酢酸アンモニウム緩衝液中の０〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントを用いたＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｐｈｅｎｙｌ分取カラム（２５０×５０ｍｍ）によるＲＰ−ＨＰＬＣ精製工程の後、純粋な化合物（ＶＩＩ）（０．６５ｍｍｏｌ）を得た。
【００５７】
凍結乾燥粉末である化合物３（０．６５ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶解し、純粋な化合物（ＶＩ）（０．６５ｍｍｏｌ、スキーム１参照）を溶液に加えた。混合物を室温、暗所で一晩撹拌した。５％酢酸溶液をｐＨ７になるまで加えることにより、反応をクエンチした。酢酸アンモニウム緩衝液中の０〜９５％アセトニトリルの線形グラジエントで溶出することによるＲＰ−ＨＰＬＣ  ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｐｈｅｎｙｌ分取カラム（２５０×５０ｍｍ）によって、粗製の濃い青色の反応混合物を精製した。
【００５８】
精製後、純粋なＤＡ３６４化合物が、アジド化合物（ＩＩ）に対して２４％の収率（０．３３ｍｍｏｌ）で、青色の凍結乾燥粉末として得られた。
【国際調査報告】
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