(57)【要約】ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）及び鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）の弁別のための質量分析のスタンダード、ならびにこれらのスタンダードを使用してサンプル中のＨＢＳに比べたＨＢＢの量を決定する方法が、本明細書において提供される。【選択図】図１
2020507059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変された溶血血液サンプルにおける鎌状赤血球突然変異の補正のレベルを評価する方法であって、
（ａ）トリプシンと共に前記サンプルをインキュベーションしてヘモグロビンの断片を得て、そこで、前記ヘモグロビン断片がＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含むことと；
（ｂ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素から前記ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｃ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して前記溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｃ）の質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることと、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされたスタンダード溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記一連のスタンダード溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの血漿サンプルから得られる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記溶血血液サンプルが、遺伝子改変を含む被験体からの赤血球の集団から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記赤血球が、遺伝子改変された造血幹細胞または誘導された多能性幹細胞から分化し、前記細胞が、ヘモグロビンをコードするゲノム配列中の鎌状赤血球突然変異を補正するように治療された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を有する複数の遺伝子改変された造血幹細胞を含む造血幹細胞の集団が、被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状を低減するのに有効かどうかを決定する方法であって、
（ａ）前記造血幹細胞の集団の第１の亜集団を赤血球へと分化させることと；
（ｂ）前記造血幹細胞の集団の第２の亜集団を保存しておくことと；
（ｃ）前記赤血球から溶血血液サンプルを得ることと；
（ｄ）トリプシンと共に前記溶血血液サンプルをインキュベーションすることと；
（ｅ）液体クロマトグラフィーによって、前記トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｆ）前記クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｇ）前記溶血血液サンプルにおける前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比が、造血幹細胞の保存しておいた亜集団は前記被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状の低減に有効であろうことを決定することと、
を含む、前記方法。
【請求項８】
前記ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｇ）の前記結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての前記質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記スタンダードカーブが、
（ａ）一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む前記合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記スタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；
（ｃ）液体クロマトグラフィーによって、前記インキュベーションされた溶液中の他の構成要素から前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；
（ｄ）各々のスタンダード溶液について前記クロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；
（ｅ）各々のスタンダード溶液について前記合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；
（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、
によって生成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記一連の溶液が、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞の第２の亜集団が、鎌状赤血球疾患を有する被験体の中へ移植される、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験体における鎌状赤血球疾患の前記症状が低減または消失される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝子改変が相同組み換え修復を含む、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）精製されたＨＢＢペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号１を含み、前記組成物が全長ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）ポリペプチド配列を含まない、前記組成物と；
ｂ）精製されたＨＢＳペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドが配列番号２を含み、前記組成物が全長鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）ポリペプチド配列を含まず、前記ＨＢＢペプチド及び前記ＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数がマーカーを含む、前記組成物と、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月１９日に出願された米国仮出願第６２／４３５，９４８号の優先権を主張し、当該出願はこの参照によりその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
鎌状赤血球貧血はβ−グロビン遺伝子の一塩基多型から生じる。多型は、ヘモグロビンβタンパク質（ＨＢＢ）についてのアミノ酸配列中の位置７で、グルタミン酸残基がバリン残基によって置換されることをもたらす。７番目の位置でのグルタミン酸からバリンへの置換を有するＨＢＢは、鎌状赤血球ヘモグロビンβタンパク質（ＨＢＳ）として公知である。すべてのヒトは、β−グロビン遺伝子の２つのコピーを有しており、両方のβ−グロビン遺伝子で鎌状赤血球突然変異を有する個体のみが、鎌状赤血球貧血を患う。現在、この突然変異を機能的に治癒させる医薬治療物質は同定されていないが、鎌状赤血球患者の中へのこの突然変異を欠損する造血前駆細胞の外科的移植は、鎌状赤血球患者の治療に成功している。さらに、これらの研究は、ヒト血液中でのＨＢＢのより長い半減期に起因して、ＨＢＳタンパク質の一部分のみがＨＢＢにより置き換えられることが必要であることを示した。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
幹細胞技術及び遺伝子補正技術における進歩により、患者条件付けの前に、補正された細胞において産生される必要のある、最小のＨＢＢ／ＨＢＳ比の決定は重要である。したがって、遺伝子改変された溶血血液サンプルにおける鎌状赤血球突然変異の補正のレベルを評価する方法が、本明細書において提供される。方法は、（ａ）トリプシンと共にサンプルをインキュベーションしてヘモグロビンの断片を得て、そこで、ヘモグロビン断片がＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含むことと；（ｂ）液体クロマトグラフィーによって、トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；（ｃ）クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｃ）の質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることと、を含む。
【０００４】
ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を有する複数の遺伝子改変された造血幹細胞を含む造血幹細胞の集団が、被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状を低減するのに有効かどうかを決定する方法がさらに提供される。方法は、（ａ）造血幹細胞の集団の第１の亜集団を赤血球へと分化させることと；（ｂ）造血幹細胞の集団の第２の亜集団を保存しておくことと；（ｃ）赤血球から溶血血液サンプルを得ることと；（ｄ）トリプシンと共に溶血血液サンプルをインキュベーションすることと；（ｅ）液体クロマトグラフィーによって、トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；（ｆ）クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；（ｇ）溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比が、造血幹細胞の保存しておいた亜集団は被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状の低減に有効であろうことを決定することと、を含む。
【０００５】
ａ）精製されたＨＢＢペプチドを含む組成物であって、ペプチドが配列番号１を含み、組成物が全長ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）ポリペプチド配列を含まない、前記組成物と；ｂ）精製されたＨＢＳペプチドを含む組成物であって、ペプチドが配列番号２を含み、組成物が全長鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）ポリペプチド配列を含まず、ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数がマーカーを含む、前記組成物と、を含む、キットも提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＨＢＢ及びＨＢＳの最初の１３アミノ酸残基に対応する合成ポリペプチドの固定比の希釈から得られたＨＢＢ／（ＨＢＢ＋ＨＢＳ）のスタンダードカーブである。
【図２】ＨＢＢ／ＨＢＳ定量を利用する遺伝子補正手順のためのタイムテーブルである。
【図３】飛行時間型（ＴＯＦ）−ＭＳ質量の溶出プロフィール（配列番号２及び配列番号１のトリプシン産物について、それぞれ４６１．７７（ピーク、７３９０と標識される）及び４７６．７６）を提供する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
ＨＢＢ及びＨＢＳの弁別のための最新技法は、弱陽イオン交換高圧液体クロマトグラフィーまたはキャピラリークロマトグラフィーを使用し、そして４１７ｎｍ（それはヘモグロビンタンパク質について特異的である）でのＵＶ吸光度を使用して、溶出をモニターする。しかしながら、不適切な勾配が遂行されるならば、この技法は、他のタンパク質によるＨＢＳのオーバーラップの可能性または構成物の誤認に悩まされる。さらに、同定されたピークが意図されたＨＢＢタンパク質及びＨＢＳタンパク質のみから生じることを保証するために、第２の質量分析としてピーク同定を行わなければならない。したがって、複雑な溶血血液を分析する場合に、それは、厄介な問題のある２ステップのプロセスのままである。合成のＨＢＢポリペプチド及びＨＢＳポリペプチドの２つのタンパク質分解産物のみに対応する所望される質量シグナルを特異的にモニターすることによって、これらの障害を克服する方法が本明細書において提供される。これらの方法は、所望されるペプチドと共溶出する他のポリペプチドによって限定されないが、それは、それらの異なる質量が標的の質量分析を妨害またはオーバーラップしないからである。
【０００８】
遺伝子改変された溶血血液サンプルにおける鎌状赤血球突然変異の補正のレベルを評価する方法が、本明細書において提供される。方法は、（ａ）トリプシンと共にサンプルをインキュベーションしてヘモグロビンの断片を得て、そこで、ヘモグロビン断片がＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含むことと；（ｂ）液体クロマトグラフィーによって、トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；（ｃ）クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、ステップ（ｃ）の質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることと、を含む。
【０００９】
全体にわたって使用される時、溶血血液サンプルは、遺伝子改変された赤血球（ＲＢＣ）の溶解からもたらされるサンプルである。したがって、溶血血液サンプルは、被験体の中への移植の前に遺伝子改変された細胞ＲＢＣを随意に含む。サンプルは、被験体からの細胞の集団から得られ得る。
【００１０】
ＲＢＣは、ヘモグロビンβをコードするゲノム配列中の鎌状赤血球突然変異を補正するように治療された前駆細胞から分化させることができる。前駆細胞は、例えば多能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。全体にわたって使用される時、多能性細胞としては、誘導された多能性幹細胞が挙げられる。多能性幹細胞を製作する方法は当技術分野において公知である（例えばＦｏｃｏｓｉ  ｅｔ  ａｌ．“Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４，ｅ２１１  （２０１４）を参照）。細胞はＣＤ３４＋細胞でもあり得る。ＣＤ３４＋細胞は、初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞、ＣＤ３４＋末梢血液細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、及びＣＤ３４＋骨髄細胞からなる群から選択され得る。細胞は、初代細胞（例えば初代ＣＤ３４＋造血前駆細胞）でもあり得る。細胞は、インビトロまたはエクスビボであり得る。あるいは、溶血血液サンプルは、被験体への遺伝子改変を有するＲＢＣの移植後に、被験体からの血漿サンプルから得られる。
【００１１】
多数の技法が、細胞を遺伝子改変して突然変異を補正するために利用可能である。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（例えばＨｏｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｃｋｌｅ−ｃｅｌｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ／ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ，”Ｂｌｏｏｄ  １２５（１７）：２５９７−２６０４（２０１５）を参照）、ＴＡＬＥＮ（例えばＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ−Ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｂｅｔａ  Ｇｌｏｂｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔ  ｉＰＳＣｓ  Ａｆｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｉｃｋｌｅ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ，”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３３（５）：１４７０−０（２０１５）を参照）、またはＣＲＩＳＰＲ（例えばＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３（３）：５７０−７（２０１５）を参照）が、使用され得る。遺伝子改変としては、例えば細胞のゲノム中の鎌状赤血球突然変異の補正にＣＲＩＳＰＲ技法を使用することによる、突然変異の相同組み換え修復（ＨＤＲ）が挙げられる。
【００１２】
全体にわたって使用される時、鎌状赤血球突然変異の補正のレベルは、溶血血液における、ＨＢＢ（正常なヘモグロビン）対ＨＢＳ（鎌状赤血球突然変異のあるヘモグロビン）の比、またはＨＢＳに比べたＨＢＢのパーセンテージである。
【００１３】
本明細書において提供される方法において、溶血血液サンプルは、ヘモグロビンの断片を得るためにトリプシンと共にインキュベーションされる。これらの断片はＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを含む。トリプシンは、リジンまたはアルギニンのカルボキシル側でポリペプチドを切断する（プロリンがいずれかに後続する場合以外）、セリンプロテアーゼである。トリプシンによる溶血血液サンプルのインキュベーションに際して、サンプル中に存在する全長のＨＢＢ及びＨＢＳは切断されて、変動する長さの複数のペプチド（配列番号３（ＶＨＬＴＰＥＥＫ）を含むかまたはそれからなるＨＢＢペプチド、及び配列番号４（ＶＨＬＴＰＶＥＫ）を含むかまたはそれからなるＨＢＳペプチドを包含する）を産生する。
【００１４】
ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）によって、トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からクロマトグラフィー分離される。本明細書において使用される時、ＬＣは、サンプル中の他の検体からサンプル中の１つまたは複数の分子または検体の分離のためのプロセスを指す。ＬＣは、流体が微細に分割された物質のカラムを介して一様に動くにつれて、流体溶液のうちの１つまたは複数の検体が減速することを包含する。減速は、１つまたは複数の固定（ｓｔａｔｉｏｎｅｒｙ）相と移動相との間で、混合物の構成要素の分布を生じる。ＬＣとしては、例えば逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）及び高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。
【００１５】
本明細書において使用される時、分離は、サンプルマトリックスから検体（すなわちＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチド）以外のすべての材料を除去することを必ずしも指さない。その代りに、この用語は、サンプルマトリックス中に存在する１つまたは複数の他の構成要素に比べて１つまたは複数の対象となる検体の量をエンリッチする手順を指すように使用される。かかるエンリッチメントは、他の材料の完全な除去を包含し得るが、必ずしもかかる完全な除去を要求しない。分離技法を使用して、例えば質量分析による検体の検出を妨害する１つまたは複数の構成要素の量をサンプルから減少させることができる。例えば、類似する質量電荷比を有するタンパク質分解断片（複数可）は分析を妨害し得る。したがって、疎水性及び質量電荷比の両方で分離することは、妨害の可能性を減少させる。
【００１６】
本明細書において提供される方法は、クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析して溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、ＨＢＢ／ＨＢＳ比が、質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定されることを、含む。
【００１７】
本明細書において使用される時、質量分析（ＭＳ）分析は、サンプル中の分子の同定及び／または定量のための技法を指す。ＭＳは、サンプル中の分子のイオン化、荷電分子の形成、それらの質量電荷比に従う荷電分子の分離、及び荷電分子の検出を包含する。配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫ）の測定されたトリプシン産物についての質量電荷比は、４７６．７５９であり、配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫ）の測定されたトリプシン産物についての質量電荷比は、４６１．７７２である。図３は、これらのトリプシン産物について飛行時間型（ＴＯＦ）−ＭＳ質量（４６１．７７及び４７６．７６）の溶出プロフィールを提供する。
【００１８】
ＭＳは、サンプル中の分子の定性的検出及び定量的検出の両方を可能にする。分子は、当業者に公知の任意の好適な手段によってイオン化され検出され得る。タンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）（そこで、同時に２つ以上の質量分析器を使用するか、または連続して単一の質量分析器を使用して、複数のラウンドの質量分析が行われる）を使用して、サンプル中の分子を同定することができる。全体にわたって使用される時、質量分析計は、分子のイオン化及び荷電分子の検出のための手段を含む装置である。随意に、タンデム型質量分析計は四重極質量分析計である。一例として、タンデム型質量分析計は大気圧イオン化源を有し、分析ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、電子捕獲イオン化、電子イオン化、高速原子衝撃／液体二次イオン化（Ｆ  ＡＢ／ＬＳＩ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、電界イオン化、電界脱離、サーモスプレー／プラズマスプレーイオン化、及び粒子ビームイオン化からなる群から選択されるイオン化方法を含む。イオン化法は、陽イオンモードまたは陰イオンモードであり得る。分析ステップは、多重反応モニタリングまたは選択イオンモニタリング（ＳＩＭ）も包含し得る。随意に、２つ以上の生体分子は、同時にまたは連続して分析される。随意に、分析ステップは、四重極分析器（例えばトリプル四重極質量分析計）を使用する。
【００１９】
本明細書において提供される方法において、液体クロマトグラフィーカラムは、質量分析計の中へ直接または間接的に供給され得る。２つ以上のＬＣカラムは、随意に同じ質量分析計の中へ供給される。他の例において、３つ以上のＬＣカラムは、同じ質量分析計の中へ供給される。随意に、質量分析計は組み合わせたＬＣ−ＭＳシステムの一部である。任意の好適な質量分析計が使用され得る。さらに、質量分析計は、当技術分野において公知の任意の好適なイオン化方法により使用され得る。これらとしては、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化、大気圧光イオン化、及び電子捕獲イオン化が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２０】
本明細書において提供される方法において、合成のＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドは、ヘモグロビンＢ（配列番号３（ＶＨＬＴＰＥＥＫ））またはヘモグロビンＳ（配列番号４（ＶＨＬＴＰＶＥＫ））の最初の８つのＮ末端アミノ酸、及びトリプシンの標的のリジンのＣ末端側に１つの非プロリルキャッピング残基を少なくとも含む。例えば、セリン残基は、トリプシンの標的のリジンのＣ末端側の非プロリルキャッピング残基であり得る。本明細書において提供される方法において、合成のＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドは、ヘモグロビンＢまたはヘモグロビンＳの最初の９アミノ酸を少なくとも含み得る。ＨＢＢ及びＨＢＳの末端のメチオニンがアミノペプチダーゼによって新生のＨＢＢポリペプチド及びＨＢＳポリペプチドから切断されることが理解される。したがって、ヘモグロビンＢの最初の９アミノ酸を含むペプチドは、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含むペプチドであり、ヘモグロビンＳの最初の９アミノ酸を含むペプチドは、配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含むペプチドである。合成ＨＢＢペプチドは約９〜約５０のＨＢＢのアミノ酸を含むペプチドであり得、ペプチドは、ＨＢＢの最初の９アミノ酸及び全長ＨＢＢの第１のＮ末端トリプシン消化部位を含む。全長ＨＢＢの第１のＮ末端トリプシン消化部位は、ＨＢＢの第８のアミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間（すなわちリジン（Ｋ）とセリン（Ｓ）との間、それは、配列番号１の第８アミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間のトリプシン消化部位に対応する）に所在する。したがって、ペプチドは、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３５、４５または５０アミノ酸長であり得、ペプチドは、ＨＢＢまたはＨＢＳの最初の９アミノ酸及び全長ＨＢＢまたは全長ＨＢＳの第１のＮ末端トリプシン消化部位を含む。合成ＨＢＳペプチドは９〜５０のＨＢＳのアミノ酸を含むペプチドであり得、ペプチドは、ＨＢＳの最初の９アミノ酸及び全長ＨＢＳの第１のＮ末端トリプシン消化部位を含む。全長ＨＢＳの第１のＮ末端トリプシン消化部位は、ＨＢＳの第８のアミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間（すなわちリジン（Ｋ）とセリン（Ｓ）との間、それは、配列番号２の第８アミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間のトリプシン消化部位に対応する）に所在する。合成ＨＢＢペプチドは、トリプシン処理に際して、８アミノ酸のペプチド（配列番号３）が産生されるようにデザインされる。同様に、合成ＨＢＳペプチドは、トリプシン処理に際して、８アミノ酸のペプチド（配列番号４）が産生されるようにデザインされる。
【００２１】
本明細書において提供された方法のうちの任意のものにおいて使用される合成のＨＢＢペプチド及び／またはＨＢＳペプチドは、質量変更（ｍａｓｓ  ａｌｔｅｒｅｄ）され得るか、または質量変更され得ない。合成のＨＢＢペプチド及び／またはＨＢＳペプチドは、安定的な同位体（例えば炭素１３（１３Ｃ）または窒素１５（１５Ｎ）または重水素（２Ｈ））によるペプチドの標識によって、質量変更され得る。例えば、そして限定的ではなく、合成ＨＢＢペプチドは、所望されるトリプシン消化産物中の（例えば配列番号１または配列番号２の最初の８アミノ酸中の）１つまたは複数の１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈで標識されたアミノ酸により合成され得る。トリプシン消化から生じるペプチドは、その結果として、天然のペプチドに比較して、既知の質量によって変更される。例えば、配列番号１（合成ＨＢＢペプチド）は、１３Ｃ１（カルボニル炭素）により合成することができる。トリプシンによるこのペプチドのタンパク質分解性消化は、１ダルトンの質量変更した配列番号３を産生するだろう。次いでこの質量変更されたペプチドは、未知のサンプルの中への既知の濃度で添加され得る。質量変更されたペプチドは、質量変更されないペプチドと同じ液体クロマトグラフィー所在位置で溶出し、したがって溶血血液サンプルにおけるＨＢＢの量の絶対的定量を可能にする内部スタンダードとして供される。溶血血液サンプルにおけるＨＢＳの量を定量化するために、合成ＨＢＳペプチドを合成して所望されるトリプシン消化産物中に安定的な同位体を取り込むこともできる。
【００２２】
上で説明されるように、溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比は、質量分析の結果を、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド対配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの既知の比のトリプシン消化物についての質量分析の結果から生成されたスタンダードカーブと比較することによって決定される。
【００２３】
スタンダードカーブは、一連のスタンダード溶液を調製し、そこで、一連のスタンダード溶液のメンバーが、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を含有していることと；ステップ（ａ）のスタンダード溶液をトリプシンと共にインキュベーションすることと；液体クロマトグラフィーによって、インキュベーションされた溶液中の他の構成要素から合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；各々のスタンダード溶液についてクロマトグラフィー分離された合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；（ｅ）各々のスタンダード溶液について合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積を決定することと；（ｆ）スタンダードカーブを生成することと、によって生成される。
【００２４】
当業者は、配列番号１（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）を含む合成ＨＢＢペプチド及び配列番号２（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）を含む合成ＨＢＳペプチドの異なる既知の比を有する一連のスタンダード溶液を調製する方法に精通しているだろう。例えば、そして限定的ではなく、一連の溶液は、１００：０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１の溶液、９０：１０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第２の溶液、８０：２０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第３の溶液、７０：３０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第４の溶液、６０：４０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第５の溶液、５０：５０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第６の溶液、４０：６０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第７の溶液、３０：７０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第８の溶液、２０：８０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第９の溶液、１０：９０の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１０の溶液、及び０：１００の合成ＨＢＢ／合成ＨＢＳ比を含有する第１１の溶液のうちの１つまたは複数を含み得る。
【００２５】
本明細書において提供される方法において、質量分析ピーク体積は、ＬＣ−ＭＳシステムからの溶出の間の所与の質量についてのピーク形状を検出し決定することによって計算され得る。合成ＨＢＢペプチドは４７６．７５９の既知の質量を有し、合成ＨＢＳペプチドは４６１．７７２の既知の質量を有するので、これらの質量に対応するピークの強度は、溶出期間の間に追跡され得る（図３を参照）。多数のソフトウエアプログラムがこれらのピークの強度の検出及び決定のために利用可能であり、例えばＳｃｉｅｘ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）から利用可能なＰｅａｋＶｉｅｗ  ２．２ソフトウェアである。方法は、タンデム型分光法（ＭＳ／ＭＳ）の結果の精査によってピークの同一性を検証して、断片化パターンが、ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドについて予測される断片化パターンに対応すると保証することをさらに含み得る。
【００２６】
ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を有する複数の遺伝子改変された造血幹細胞を含む造血幹細胞の集団が、被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状を低減するのに有効かどうかを決定する方法がさらに提供される。方法は、（ａ）造血幹細胞の集団の第１の亜集団を赤血球へと分化させることと；（ｂ）造血幹細胞の集団の第２の亜集団を保存しておくことと；（ｃ）赤血球から溶血血液サンプルを得ることと；（ｄ）トリプシンと共に溶血血液サンプルをインキュベーションすることと；（ｅ）液体クロマトグラフィーによって、トリプシン処理されたサンプル中の他の構成要素からＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドをクロマトグラフィー分離することと；（ｆ）クロマトグラフィー分離されたＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドを質量分析によって分析することと；（ｇ）溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳ比を決定し、そこで、約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比が、造血幹細胞の保存しておいた亜集団は被験体における鎌状赤血球疾患の１つまたは複数の症状の低減に有効であろうことを決定することと、を含む。
【００２７】
本方法は、補正された細胞が成功裡に分化し、被験体の中へ細胞を移植する前にＨＢＢ／ＨＢＳの必要な比を産生できることを確認するために有用である。随意に、方法は、疾患の症状を低減または消失させるために、鎌状赤血球疾患を有する被験体の中へ遺伝子改変された造血幹細胞の保存しておいた第２の集団を移植することを、さらに含み得る。少なくとも約３０％以上のＨＢＢ／ＨＢＳ比を有する補正された造血幹細胞の亜集団は、被験体の中へ移植され得る。したがって、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはこれらのパーセンテージの間の任意のパーセンテージのＨＢＢ／ＨＢＳ比を有する補正された造血幹細胞の亜集団の移植は、鎌状赤血球疾患を有する被験体の中へ移植され得る。
【００２８】
本明細書において提供される方法において、造血幹細胞は、分化有りまたは無しで被験体の中へ移植され得る。例えば、修飾された造血幹細胞（ＨＳＣ）は骨髄移植中に投与され、ＨＳＣは被験体中でインビボで分化及び成熟することを可能にされる。あるいは、修飾された細胞は、移植前に所望される細胞の集団へと分化され得る。
【００２９】
本明細書において使用される時、被験体への細胞の移植、導入または投与は、被験体の中への細胞の配置を指す。例えば、ヘモグロビンをコードするゲノム配列中で補正された鎌状赤血球突然変異を含む細胞の集団は、所望される部位での移植細胞の少なくとも部分的な局在化をもたらす適切な経路によって、被験体の中へ移植され得る。細胞は、所望される部位へ直接埋込まれるか、または、あるいは、被験体中の所望される所在位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され、そこで、埋込まれた細胞のうちの少なくとも一部分が生存可能なままである。例えば、細胞は、静脈内点滴を経由して全身に投与され得る。被験体への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば２４時間）〜数日程の短さから、数年程の長さである。
【００３０】
補正された細胞は、疾患を有する被験体（修飾の前または後の）または血縁のドナーから採取された細胞であり得る。自己細胞を使用して、細胞の拒絶をもたらし得る免疫反応を避けることができる。換言すれば、自己細胞を使用する場合に、ドナー及びレシピエントは同じ被験体である。あるいは、細胞は、例えばドナー、好ましくは血縁のドナーから採取された、非相同のものであり得る。第２の被験体は同じ種または異なる種であり得る。典型的には、細胞がドナーに由来する場合に、それらは、移植拒絶の機会を低減するために、及び／または免疫抑制療法についての必要性を低減するために、レシピエントと十分に免疫学的適合性のあるドナーからであろう。細胞は、異種源（すなわちレシピエントまたはレシピエントの種と十分に免疫学的適合性がある、遺伝子操作された非ヒト哺乳類）からも得ることができる。本明細書において記載される障害を治療する方法のうちの任意のものは、１つまたは複数の免疫抑制物質を被験体へ投与することをさらに含み得る。
【００３１】
移植を伴う方法において、被験体は、随意に本明細書において記載される細胞のうちの任意のものの移植前に、骨髄破壊療法を受ける。骨髄破壊療法は、健康な骨髄細胞の重度または完全な涸渇をもたらす用量の化学療法、放射線療法または両方のうちの１つまたは複数を投与することを包含し得る。別の例において、被験体は、健康な骨髄細胞の一部分を枯渇させる用量の化学療法、放射線療法または両方のうちの１つまたは複数を投与することを含む、サブ骨髄破壊療法を受けることができる。細胞は、非切除的な化学療法を受けた被験体の中へも移植され得る。例えば、細胞は、ブスルファン、フルダラビン及び／またはトレオスルファンにより治療された被験体の中へ移植され得る。
【００３２】
移植を伴う方法において、有効用量または有効量の補正された細胞が、被験体へ投与される。有効量及び有効投薬量という用語は互換的に使用される。有効量という用語は、所望される生理的応答を産生するのに必要な任意の量として定義される。いくつかの方法において、約１×１０６〜約７×１０６の補正された細胞／ｋｇが投与され得るが、この量は変動し得る。細胞の投与のための有効量及びスケジュールは経験的に決定され、かかる決定を行うことは当該技術分野の技能内である。投与のための投薬量範囲は、所望される効果（例えば症状、例えば鎌状赤血球貧血の症状の低減）を産生するのに十分な程多いものである。投薬量は、実質的な有害副作用（望まれない交差反応、アナフィラキシー反応及び同種のもの等）を引き起こす程多量であるべきでない。一般的に、投薬量は、年齢、病態、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与経路、または他の薬物がレジメン中に含まれているかどうかにより変動し、当業者によって決定され得る。投薬量は、任意の禁忌の事象において個別の医師によって調整され得る。投薬量は変動し、薬剤は必要に応じて、１つまたは複数の用量投与で１日または複数日の間毎日投与され得る。
【００３３】
全体にわたって使用される時、被験体は、脊椎動物、より具体的には哺乳類（例えばヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット及びモルモット）であり得る。この用語は、特定の年齢または性別を表わさない。したがって、成体及び若い被験体が、オスであるかメスであるかにかかわらず、カバーされることを意図する。本明細書において使用される時、患者または被験体は互換的に使用され、障害を有する被験体または障害を発症するリスクがある被験体を指し得る。患者または被験体という用語は、ヒト被験体及び動物被験体を包含する。
【００３４】
鎌状赤血球疾患の症状を低減または消失させる方法において、鎌状赤血球疾患を有する被験体は、随意に輸血依存性被験体または少なくとも１つの無症候性梗塞を有する被験体であり得る。被験体は、年齢で、約１２か月、１１か月、１０か月、９か月、８か月、７か月、６か月、５か月、４か月、３か月、２か月、または１か月未満でもあり得る。乳児は鎌状赤血球疾患についてルーチンにスクリーニングされるので、乳児は疾患の症状が現われる前に治療され得る。本明細書において提供される方法は、障害（例えば鎌状赤血球疾患）を有する被験体を診断することをさらに含み得る。
【００３５】
鎌状赤血球疾患の症状としては、疼痛、貧血、感染、脳血管発作、脳合併症、視覚問題、高血圧症、腎臓機能の低減、肝臓合併症、及び下腿潰瘍のいくつかが挙げられるがこれらに限定されない。したがって、症状における減少または低減は、対照に比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１０％〜１００％の間の任意のパーセントの低減を指し得る。
【００３６】
ａ）精製されたＨＢＢペプチドを含む組成物であって、ペプチドが配列番号１を含み、組成物が全長ヘモグロビンβ（ＨＢＢ）ポリペプチド配列を含まない、前記組成物と；ｂ）精製されたＨＢＳペプチドを含む組成物であって、ペプチドが配列番号２を含み、組成物が全長鎌状赤血球ヘモグロビンβ（ＨＢＳ）ポリペプチド配列を含まず、ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数がマーカーを含む、前記組成物と、を含む、キットも提供される。マーカーは、同位体のマーカーまたは標識（例えば炭素１３（１３Ｃ）または窒素１５（１５Ｎ）または重水素（２Ｈ））であり得る。蛍光のマーカーまたは標識も、ＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドのうちの１つまたは複数の中へ取り込まれ得る。精製ＨＢＢペプチドは９〜５のアミノ酸を含むペプチドであり得、ペプチドは、ＨＢＢの最初の９アミノ酸及び全長ＨＢＢの第１のＮ末端トリプシン消化部位を含む。全長ＨＢＢの第１のＮ末端トリプシン消化部位は、ＨＢＢの第８のアミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間（すなわちリジン（Ｋ）とセリン（Ｓ）との間、それは、配列番号１の第８アミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間のトリプシン消化部位に対応する）に所在する。精製ＨＢＳペプチドは９〜１５のアミノ酸を含むペプチドであり得、ペプチドは、ＨＢＳの最初の９アミノ酸及び全長ＨＢＳの第１のＮ末端トリプシン消化部位を含む。全長ＨＢＳの第１のＮ末端トリプシン消化部位は、ＨＢＳの第８のアミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間（すなわちリジン（Ｋ）とセリン（Ｓ）との間、それは、配列番号２の第８アミノ酸位置と第９のアミノ酸位置との間のトリプシン消化部位に対応する）に所在する。キットは、適切な希釈バッファー、赤血球溶解剤、スタンダード、及び／または対照をさらに含み得る。
【００３７】
開示される方法及び組成物のために使用され得るか、それらと併用して使用され得るか、それらの調製において使用され得るか、またはそれらの産物である、材料、組成物及び構成要素が開示される。これら及び他の材料は本明細書において開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用及び群などが開示される場合に、各々の様々な個別の及び集合的な組み合わせ及び順列の具体的な参照が明示的に開示されなくてもよいが、各々は本明細書において具体的に企図及び記載されることが理解される。例えば、方法が開示及び検討され、方法中に包含される多くの組成物へ行われ得る多くの修飾が検討されるならば、各々及びすべての方法の組み合わせ及び順列ならびに可能な修飾は、相反することが具体的に指摘されない限り、具体的に企図される。同様に、任意のサブセットまたはこれらの組み合わせも具体的に企図及び開示される。この概念は、本開示のすべての態様（方法におけるステップが挙げられるがこれらに限定されない）へ適用される。したがって、遂行され得る様々な追加のステップがあるならば、任意の具体的な方法ステップまたは開示される方法の方法ステップの組み合わせにより、これらの追加のステップのうちの各々が遂行され得ること、及び、各々のかかる組み合わせまたは組み合わせのサブセットは具体的に企図され、開示されたと判断されるべきであることが理解される。本明細書において検討される任意のペプチドまたは組成物は、本明細書において記載される任意の方法、化合物、ペプチド、ポリペプチド、システム、または組成物などに関して実装され得ること、及びその逆も企図される。
【００３８】
本明細書において引用される公報、及び引用される材料は、その全体が参照によって具体的に本明細書に援用される。
【００３９】
多数の態様が記載されてきた。それにもかかわらず、様々な修飾が行われ得ることが理解されるだろう。さらに、１つの特徴またはステップが記載される場合に、たとえ組み合わせが明示的に述べられなくても、それは本明細書において任意の他の特徴またはステップと組み合わせられ得る。したがって、他の態様は請求項の範囲内である。
【００４０】
以下の実施例は、本明細書において請求される化合物及び／または方法がどのように作製及び評価されるかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために出され、本発明の純粋な例示であることが意図され、それらが添付の請求項中に包含される程度を除いて、及びその程度まで、本発明者が自身の発明と見なす範囲を限定することは意図されない。
【実施例】
【００４１】
以下のプロトコールを使用して、溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ／ＨＢＳの比を決定した。このプロトコールは単に例示的であり、限定であることは意図されない。ＨＢＢの最初の９アミノ酸（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳ）（配列番号１）を含む、１３のアミノ酸ポリペプチド（ＶＨＬＴＰＥＥＫＳＡＶＴＡ）（配列番号５）（天然質量または変更された質量）及びＨＢＳの最初の９アミノ酸（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳ）（配列番号２）を含む、１３のアミノ酸ポリペプチド（ＶＨＬＴＰＶＥＫＳＡＶＴＡ）（配列番号６）（天然質量または変更された質量）を、合成及び精製した。精製に後続して、精製したポリペプチドをＰＢＳ中で再懸濁した。一次元（１Ｄ）ＮＭＲ分光法を精製したポリペプチドの絶対的定量のために使用して、溶液中の等価なモル濃度を確実にした。定量化後に、２つのペプチドの固定比（１００：０、９０：１０、８０：２０、７０：３０、６０：４０、５０：５０、４０：６０、３０：７０、２０：８０、１０：９０、０：１００）を含有する一連の溶液を調製した。固定濃度の一連の溶液の各々のメンバーにおける合成ＨＢＢペプチド及び合成ＨＢＳペプチドを、トリプシンと共にタンパク質分解性消化した。ＨＢＢ／ＨＢＳの未知の比を含有するサンプル溶血血液のトリプシンによるタンパク質分解性消化も遂行した。ＬＣを使用する、タンパク質分解性消化した合成のＨＢＢペプチド及びＨＢＳペプチドの分離、ならびにＭＳを使用する、アウトプットのそのすぐ後の分析を、遂行した。溶血血液サンプルのタンパク質分解性消化物のＬＣ分離及びＭＳ分析も遂行した。ＨＢＢ／ＨＢＳのスタンダードカーブ（図１）を、合成のＨＢＢ及びＨＢＳの固定比を含有する一連の溶液からの各々の比について、タンパク質分解性消化したＨＢＢ及びＨＢＳペプチドの質量分析のピーク体積から準備した。質量分光法によって分析した未知の溶血血液におけるＨＢＢ／ＨＢＳの比を、一連の固定比希釈から得たスタンダードカーブを使用して決定した。
【００４２】
より具体的には、溶血血液を、５×体積の溶血血液バッファー（５ｍＭのリン酸塩、０．５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４））中でのパックしたＲＢＣの溶解によって調製した。氷上での１０分間の溶解後に、ＮａＣｌを１％まで添加し、ＲＢＣ膜を１０，０００×ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。次いでもたらされた上清を３７℃で１８時間１２．５ｎｇ／ｕＬのトリプシンと共に処理し、次いで、０．１％の蟻酸を添加した。次いで消化物のアリコート（５〜１０ｕＬ）を、２０ｕＬ／分で５ｍｍ×１００μΜ  Ｃ１８逆相カートリッジの上へロードした。カートリッジを二段蒸留水中の０．１％の蟻酸により５分間洗浄し、結合されたペプチドを、１５分間の０．１％の蟻酸中の５〜５０％のアセトニトリル勾配により、２２ｃｍ×１００ｕＭ（内径）Ｃ１８逆相分析カラムの上へフラッシングした。溶出されたペプチドを、５６００  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴｏＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒの中へチップから直接通過させた。同定されたペプチド質量についてのピーク強度を、小数点第三位までの質量の正確な識別を可能にする高解像度装置類によりＰｅａｋＶｉｅｗ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）を使用して追跡した。次いでこの曲線下の面積をＰｅａｋＶｉｅｗにおいて計算して、対象となるペプチドを定量化する。次いで２つのペプチド強度の比を計算し、スタンダードカーブ（図１）に比較して、溶血血液サンプルにおけるＨＢＢ対ＨＢＳの相対的比を決定する。
【００４３】
本明細書において提供される方法（このプロトコールが挙げられるがこれらに限定されない）を使用して、補正された細胞（例えば造血細胞）が成功裡に分化し、被験体の中へ細胞を移植する前にＨＢＢ／ＨＢＳの必要な比を産生できることを確認できる。図２中で示されるように、患者細胞を、（ｉ）取り出し、（ｉｉ）補正し、（ｉｉｉ）凍結することができる。（ｉｖ）補正された細胞の一部分の成熟血液細胞（ＲＢＣ）へのインビトロの分化、及び（ｖ）ＲＢＣの集団がＨＢＳに比べて十分な量のＨＢＢを産生すること（例えば少なくとも約３０％のＨＢＢ）の確認、に後続して、（ｖｉ）患者は、ステップ（ｉｉｉ）から凍結／融解した補正された細胞を受け入れるように条件付けることができる。最終的に、（ｖｉｉ）これらの細胞は被験体の中へ移植することができる。
【図１】
2020507059.tif 000003
【図２】
2020507059.tif 000004
【図３】
2020507059.tif 000005
【配列表】
2020507059000001.app
【国際調査報告】
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2020507059.tif 000007