(57)【要約】本発明は、リード粒子に薬物が付着した複合粒子において、該リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させることを特徴とする該複合粒子の凝集抑制方法等を提供する。また、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物として核酸または薬物と付着競合剤を分散または溶解して含有させて、該リード粒子に薬物としての該核酸または該薬物と該付着競合剤を付着させる工程を含む、リード粒子に薬物としての該核酸または該薬物が付着した複合粒子の製造方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リード粒子に薬物が付着した複合粒子において、該リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させることを特徴とする該複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項２】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である請求項１記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項３】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である請求項１記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項４】
リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子が分散した液中に、薬物を分散または溶解して含有させて該リード粒子に薬物を付着させることにより得られる複合粒子である請求項１〜３のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項５】
リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物が静電的に付着した複合粒子である請求項１〜４のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項６】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である請求項１〜５のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項７】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である請求項１〜６のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項８】
薬物が、核酸である請求項１〜７のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項９】
薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である請求項８記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１０】
リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子である請求項１〜９のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１１】
リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子が、リード粒子が分散した液中に、薬物および付着競合剤を分散または溶解して含有させて該リード粒子に薬物および付着競合剤を付着させることにより得られる複合粒子である請求項１０記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１２】
リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物および付着競合剤が静電的に付着した複合粒子である請求項１０または１１記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１３】
付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である請求項１０〜１２のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１４】
付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である請求項１０〜１２のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
【請求項１５】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有する、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制剤。
【請求項１６】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である請求項１５記載の複合粒子の凝集抑制剤。
【請求項１７】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である請求項１５記載の複合粒子の凝集抑制剤。
【請求項１８】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物として核酸を分散または溶解して含有させて、該リード粒子に薬物としての該核酸を付着させる工程を含む、リード粒子に薬物としての該核酸が付着した複合粒子の製造方法。
【請求項１９】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物および付着競合剤を分散または溶解して含有させて、該リード粒子に該薬物および該付着競合剤を付着させる工程を含む、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の製造方法。
【請求項２０】
付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である請求項１９記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２１】
付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である請求項１９記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２２】
薬物が、核酸である請求項１９〜２１のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２３】
薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である請求項１８または２２記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２４】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である請求項１８〜２３のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２５】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である請求項１８〜２３のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２６】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である請求項１８〜２５のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２７】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である請求項１８〜２５のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
【請求項２８】
請求項１８〜２７のいずれかに記載の複合粒子の製造方法によって製造できる複合粒子。
【請求項２９】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子、
および該リード粒子に付着した薬物としての核酸を含有する複合粒子。
【請求項３０】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子、
該リード粒子に付着した薬物、
および該リード粒子に付着した付着競合剤を含有する複合粒子。
【請求項３１】
付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である請求項３０記載の複合粒子。
【請求項３２】
付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である請求項３０記載の複合粒子。
【請求項３３】
薬物が、核酸である請求項３０〜３２のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項３４】
薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である請求項２９または３３記載の複合粒子。
【請求項３５】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である請求項２９〜３４のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項３６】
糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である請求項２９〜３４のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項３７】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である請求項２９〜３６のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項３８】
リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である請求項２９〜３６のいずれかに記載の複合粒子。
【請求項３９】
請求項２８〜３８のいずれかに記載の複合粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
次いで、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を被覆層成分からなる被覆層で被覆する工程を含む被覆複合粒子の製造方法。
【請求項４０】
液Ａを調製する工程が、請求項２８〜３８のいずれかに記載の複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、
液Ｂ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液（液Ｃ）を調製する工程、
および液Ｂと液Ｃを混合する工程を含む工程である請求項３９記載の被覆複合粒子の製造方法。
【請求項４１】
被覆層が脂質膜である請求項３９または４０記載の被覆複合粒子の製造方法。
【請求項４２】
被覆層が水溶性高分子誘導体を含有する被覆層である請求項４１記載の被覆複合粒子の製造方法。
【請求項４３】
請求項３９〜４２のいずれかに記載の被覆複合粒子の製造方法によって製造できる被覆複合粒子。
【請求項４４】
請求項２８〜３８のいずれかに記載の複合粒子および該複合粒子を被覆する被覆層からなる被覆複合粒子であって、
該被覆層を構成する被覆層成分が、該複合粒子が不溶でかつ分散できる濃度範囲で極性溶媒を含む溶媒に、相対的に極性溶媒の濃度が高いときには溶解し、低いときには析出または集合する成分である被覆複合粒子。
【請求項４５】
被覆層が脂質膜である請求項４４記載の被覆複合粒子。
【請求項４６】
被覆層が水溶性高分子誘導体を含有する被覆層である請求項４５記載の被覆複合粒子。
【請求項４７】
被覆複合粒子の平均粒子径が３００ｎｍ以下である請求項４４〜４６のいずれかに記載の被覆複合粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、複合粒子および被覆複合粒子ならびにそれらの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  従来から、医薬品、食品、農薬、動物用薬等において、被覆粒子の製造方法に関して多くの技術の開示が行われている。粒子（被覆される粒子）の被覆層による被覆は、例えば外的因子から受ける影響を抑制するため、外的因子の影響を選択的に受け入れ、それをトリガーとして粒子に変化を起こすため等、粒子に機能を付与する目的で行われている。【０００３】  しかしながら、例えば小型の粒子を被覆層で被覆する場合、粒子間のファンデンワールス力や静電気力、被覆層成分や液滴の架橋による力等によって粒子どうしが凝集し、好ましくない大きさで被覆粒子が得られることがある。好ましくない大きさの被覆粒子としては、例えば経肺投与用微粒子や静脈注射用微粒子において、気管や血管を閉塞させたり、生体の異物除去作用により排泄されたりしやすい大きさの被覆粒子等があげられる。【０００４】  一方、核酸の細胞内への送達手段として、カチオニックリポソームやカチオニックポリマーを用いる方法が知られている。しかし、該方法では、核酸を含有するカチオニックリポソームやカチオニックポリマーを静脈内に投与後、血中から速やかに核酸が除去されてしまい、標的組織が肝臓や肺以外の場合、例えば腫瘍部位等の場合には核酸を標的組織に送達することができず、十分な作用の発現を可能とするに至っていない。そこで、核酸が血中で速やかに除去されるという問題点を解決した核酸封入リポソーム（リポソーム内に核酸を封入したリポソーム）が報告されている（特表２００２−５０８７６５号公報、特表２００２−５０１５１１号公報、“バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）”，２００１年，第１５１０巻，ｐ．１５２−１６６および特許文献１参照）。特表２００２−５０８７６５号公報では、核酸等を含有する粒子の製造方法として、例えば、カチオン性脂質をクロロホルムに予め溶解し、次いでオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の水溶液とメタノールを加え混合後、遠心分離することでクロロホルム層にカチオン性脂質／ＯＤＮの複合体を移行させ、さらに該クロロホルム層を取り出し、これにポリエチレングリコール化リン脂質と中性の脂質と水を加え油中水型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを形成し、逆相蒸発法で処理してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、特表２００２−５０１５１１号公報およびバイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔ）では、ＯＤＮを、ｐＨ３．８のクエン酸水溶液に溶解し、脂質（エタノール中）を加え、エタノール濃度を２０ｖｏｌ％まで下げてＯＤＮ内包リポソームを調製し、サイジングろ過し、透析によって過剰のエタノールを除去した後、試料をさらにｐＨ７．５にて透析してリポソーム表面に付着したＯＤＮを除去してＯＤＮ内包リポソームを製造する方法が報告され、それぞれ核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造している。【０００５】  これらに対して特許文献１では、液体中で微粒子を脂質膜で被覆する方法で核酸等の有効成分を封入したリポソームを製造することが報告されている。該方法においては、微粒子が分散し、かつ脂質が溶解した極性有機溶媒���有水溶液中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、微粒子が脂質膜で被覆されており、液体中において被覆が行われ、例えば静脈注射用微粒子等に好適な大きさの被覆微粒子が、すぐれた効率で製造されており、また、該特許文献１では微粒子の例として薬物複合体が例示されている。該薬物複合体は、リード粒子（後記のリード粒子と同義）と薬物の複合粒子である。該複合粒子を被覆した被覆複合粒子の粒子径は、被覆される複合粒子に応じて異なり、ＯＤＮを、リード粒子であるカチオニックリポソームに付着させて製造した複合粒子を被覆して得られた被覆複合粒子は、粒子径が小さく、注射剤として使用可能であること、該被覆複合粒子は、静脈内に投与した場合、高い血中滞留性を示し、腫瘍組織に多く集積したことが報告されている。【０００６】  また一方で、ｓｉＲＮＡは近年、アンチセンス医薬より効果的な薬剤として注目を集めている［“バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）”，２００２年，第２９６巻，ｐ．１０００−１００４参照］。これまでのところ、ｓｉＲＮＡの血中動態については十分な報告がなされていないが、ｓｉＲＮＡはアンチセンス医薬と同じく、血中から速やかに消失し、標的組織に移行しないことが予想され、標的組織への移行性を高めるために、何らかのキャリアーの開発が望まれる［“バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ）”，１９９６年，第１２８１巻，ｐ．１３９−１４９、“ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ）”，１９９６年，第４１巻，ｐ．１２１−１３０参照］。
【特許文献１】国際公開第０２／２８３６７号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  本発明の目的は、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法、その製造方法等を提供することにある。また、本発明の目的は、凝集抑制された複合粒子を被覆層で被覆した被覆複合粒子の製造方法、該製造方法によって製造できる被覆複合粒子等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】  本発明は以下の（１）〜（４７）に関する。
（１）リード粒子に薬物が付着した複合粒子において、該リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させることを特徴とする該複合粒子の凝集抑制方法。
（２）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である前記（１）記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（３）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である前記（１）記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（４）リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子が分散した液中に、薬物を分散または溶解して含有させて該リード粒子に薬物を付着させることにより得られる複合粒子である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（５）リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物が静電的に付着した複合粒子である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（６）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である前記（１）〜（５）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（７）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である前記（１）〜（６）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（８）薬物が、核酸である前記（１）〜（７）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（９）薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である前記（８）記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（１０）リード粒子に薬物が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子である前記（１）〜（９）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（１１）リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子が、リード粒子が分散した液中に、薬物および付着競合剤を分散または溶解して含有させて該リード粒子に薬物および付着競合剤を付着させることにより得られる複合粒子である前記（１０）記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（１２）リード粒子に薬物および付着競合剤が付着した複合粒子が、リード粒子に薬物および付着競合剤が静電的に付着した複合粒子である前記（１０）または（１１）記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（１３）付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である前記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。
（１４）付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である前記（１０）〜（１２）のいずれかに記載の複合粒子の凝集抑制方法。【０００９】（１５）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有する、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制剤。
（１６）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である前記（１５）記載の複合粒子の凝集抑制剤。
（１７）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である前記（１５）記載の複合粒子の凝集抑制剤。【００１０】（１８）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物として核酸を分散または溶解して含有させて、該リード粒子に薬物としての該核酸を付着させる工程を含む、リード粒子に薬物としての該核酸が付着した複合粒子の製造方法。
（１９）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物および付着競合剤を分散または溶解して含有させて、該リード粒子に該薬物および該付着競合剤を付着させる工程を含む、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の製造方法。
（２０）付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である前記（１９）記載の複合粒子の製造方法。
（２１）付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である前記（１９）記載の複合粒子の製造方法。
（２２）薬物が、核酸である前記（１９）〜（２１）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
（２３）薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である前記（１８）または（２２）記載の複合粒子の製造方法。
（２４）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である前記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
（２５）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である前記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
（２６）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である前記（１８）〜（２５）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
（２７）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である前記（１８）〜（２５）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法。
（２８）前記（１８）〜（２７）のいずれかに記載の複合粒子の製造方法によって製造できる複合粒子。【００１１】（２９）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子、
および該リード粒子に付着した薬物としての核酸を含有する複合粒子。
（３０）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有するリード粒子、
該リード粒子に付着した薬物、
および該リード粒子に付着した付着競合剤を含有する複合粒子。
（３１）付着競合剤が、脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子から選ばれる１つ以上の物質である前記（３０）記載の複合粒子。
（３２）付着競合剤が、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸およびデキストランフルオレセインアニオニックから選ばれる１つ以上の物質である前記（３０）記載の複合粒子。
（３３）薬物が、核酸である前記（３０）〜（３２）のいずれかに記載の複合粒子。
（３４）薬物としての核酸が、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミドおよびｓｉＲＮＡから選ばれる１つ以上の物質である前記（２９）または（３３）記載の複合粒子。
（３５）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体である前記（２９）〜（３４）のいずれかに記載の複合粒子。
（３６）糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤が、ポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステルおよびポリエチレングリコールアルキルエーテルから選ばれる１つ以上の物質である前記（２９）〜（３４）のいずれかに記載の複合粒子。
（３７）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつリード粒子である前記（２９）〜（３６）のいずれかに記載の複合粒子。
（３８）リード粒子が、薬物と静電的に逆の電荷をもつ脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子である前記（２９）〜（３６）のいずれかに記載の複合粒子。【００１２】（３９）前記（２８）〜（３８）のいずれかに記載の複合粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、
次いで、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を被覆層成分からなる被覆層で被覆する工程を含む被覆複合粒子の製造方法。
（４０）液Ａを調製する工程が、前記（２８）〜（３８）のいずれかに記載の複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製する工程、
液Ｂ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液（液Ｃ）を調製する工程、
および液Ｂと液Ｃを混合する工程を含む工程である前記（３９）記載の被覆複合粒子の製造方法。
（４１）被覆層が脂質膜である前記（３９）または（４０）記載の被覆複合粒子の製造方法。
（４２）被覆層が水溶性高分子誘導体を含有する被覆層である前記（４１）記載の被覆複合粒子の製造方法。
（４３）前記（３９）〜（４２）のいずれかに記載の被覆複合粒子の製造方法によって製造できる被覆複合粒子。【００１３】（４４）前記（２８）〜（３８）のいずれかに記載の複合粒子および該複合粒子を被覆する被覆層からなる被覆複合粒子であって、
該被覆層を構成する被覆層成分が、該複合粒子が不溶でかつ分散できる濃度範囲で極性溶媒を含む溶媒に、相対的に極性溶媒の濃度が高いときには溶解し、低いときには析出または集合する成分である被覆複合粒子。
（４５）被覆層が脂質膜である前記（４４）記載の被覆複合粒子。
（４６）被覆層が水溶性高分子誘導体を含有する被覆層である前記（４５）記載の被覆複合粒子。
（４７）被覆複合粒子の平均粒子径が３００ｎｍ以下である前記（４４）〜（４６）のいずれかに記載の被覆複合粒子。
【発明の効果】
【００１４】  本発明により、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法、その製造方法等が提供され、また凝集抑制された複合粒子を被覆層で被覆した被覆複合粒子の製造方法、該製造方法によって製造できる被覆複合粒子等が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】  本発明における複合粒子とは、少なくともリード粒子と薬物を含有し、薬物がリード粒子に付着している粒子のことである。【００１６】  前記薬物（以下薬物Ａ）は、本発明における複合粒子においてリード粒子に付着する薬物、好ましくはリード粒子に静電的に付着する薬物であり、薬物分子内の電荷や、分子内分極等によるカチオンまたはアニオンへの静電的引力を生じるものを包含する。例えば蛋白質、ペプチド、核酸、低分子化合物、糖類、高分子化合物等の薬理学的活性を有する物質等があげられ、好ましくは、核酸があげられ、より好ましくは、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、プラスミドおよびｓｉＲＮＡがあげられ、さらに好ましくは、プラスミドおよびｓｉＲＮＡがあげられる。【００１７】  蛋白質またはペプチドとしては、例えばブラジキニン、アンジオテンシン、オキシトシン、バソプレシン、アドレノコルチコトロピン、カルシトニン、インスリン、グルカゴン、コレシストキニン、β−エンドルフィン、メラノサイト阻害因子、メラノサイト刺激ホルモン、ガストリンアンタゴニスト、ニューロテンシン、ソマトスタチン、ブルシン、シクロスポリン、エンケファリン、トランスフェリン、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）ペプチド、甲状腺ホルモン、成長ホルモン、性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、ウリカーゼ、カルボキシペプチダーゼ、グルタミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ、インターロイキン、インターフェロン、ムラミルジペプチド、サイモポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、トリプシンインヒビター、リゾチーム、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子、神経成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、内皮細胞成長因子、フィブロブラスト（繊維芽細胞）成長因子、グリア細胞成長因子、サイモシン、特異抗体（例えば、抗ＥＧＦ受容体抗体等があげられる）等があげられる。【００１８】  核酸としては、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、センスオリゴヌクレオチド等のＯＤＮ、遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ等があげられ、該核酸は、核酸の構造中のリン酸部、エステル部等に含まれる酸素原子等が、例えば硫黄原子等の他の原子に置換された誘導体を包含する。なお、ｓｉＲＮＡとは、短い二本鎖ＲＮＡのことである。【００１９】  低分子化合物としては、例えばイプシロン−アミノカプロン酸、塩酸アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸カリウム、トラネキサム酸、硫酸ブレオマイシン、硫酸ビンクリスチン、セファゾリンナトリウム、セファロチンナトリウム、シチコリン、シタラビン、硫酸ゲンタマイシン、塩酸バンコマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸アミカシン等があげられる。【００２０】  糖類としては、例えばコンドロイチン硫酸ナトリウム、ヘパリンナトリウム、デキストランフルオレセイン等があげられる。【００２１】  高分子化合物としては、例えばポリエチレンスルホン酸ナトリウム、ジビニルエーテル−無水マレイン酸共重合体（ＤＩＶＥＭＡ）、��チレン無水マレイン酸共重合体−ネオカルチノスタチン結合体（ＳＭＡＮＣＳ）等があげられる。【００２２】  本発明におけるリード粒子とは、例えば、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を構成成分とする微粒子のことであり、好ましくはリポソームを構成成分とする微粒子があげられる。本発明におけるリード粒子は、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等を２つ以上組み合わせた複合体を構成成分としていてもよく、薬物、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等と他の化合物（例えば糖、脂質、無機化合物等）とを組み合わせた複合体を構成成分としていてもよい。【００２３】  リード粒子の構成成分としての薬物（以下薬物Ｂ）は、後記のリード粒子を分散させる溶媒中で粒子の形態をとる薬物、前記他の化合物と複合体を形成して後記のリード粒子を分散させる溶媒中で粒子の形態をとる薬物等を包含する。例えば脂質性薬物、高分子薬物、金属薬物等があげられ、具体的には、シスプラチン、ビタミンＤ、ビタミンＥ、レンチナン等があげられる。【００２４】  脂質集合体またはリポソームは、例えば脂質および／または界面活性剤等によって構成され、脂質としては、単純脂質、複合脂質または誘導脂質のいかなるものであってもよく、例えばリン脂質、グリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質、スフィンゴイド類、ステロール類等があげられ、好ましくはリン脂質があげられる。また、脂質としては、例えば界面活性剤（後記の界面活性剤と同義）、高分子（後記の高分子と同義、具体的にはデキストラン等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリエチレングリコール等）等の脂質誘導体もあげられ、好ましくはポリエチレングリコール化リン脂質があげられる。界面活性剤としては、例えば非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性界面活性剤等があげられる。【００２５】  リン脂質としては、例えばホスファチジルコリン（具体的には大豆ホスファチジルコリン、卵黄ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン等）、ホスファチジルエタノールアミン（具体的にはジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等）、グリセロリン脂質（具体的にはホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン等）、スフィンゴリン脂質（具体的にはスフィンゴミエリン、セラミドホスホエタノールアミン、セラミドホスホグリセロール、セラミドホスホグリセロリン酸等）、グリセロホスホノ脂質、スフィンゴホスホノ脂質、天然レシチン（具体的には卵黄レシチン、大豆レシチン等）、水素添加リン脂質（具体的には水素添加ホスファチジルコリン等）等の天然または合成のリン脂質があげられる。【００２６】  グリセロ糖脂質としては、例えばスルホキシリボシルグ���セリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド等があげられる。
スフィンゴ糖脂質としては、例えばガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド等があげられる。
スフィンゴイド類としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン、それらの誘導体等があげられる。誘導体としては、例えばスフィンガン、イコサスフィンガン、スフィンゴシン等の−ＮＨ２を−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｘＣＨ３（式中、ｘは０〜１８の整数を表し、中でも６、１２または１８が好ましい）に変換したもの等があげられる。【００２７】  ステロール類としては、例えばコレステロール、ジヒドロコレステロール、ラノステロール、β−シトステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、エルゴカステロール、フコステロール、３β−［Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエチル）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）等があげられる。【００２８】  その他、脂質としては、例えば、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロ酢酸（ＤＯＳＰＡ）、Ｎ−［１−（２，３−ジテトラデシルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシプロピル）］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチル臭化アンモニウム（ＤＯＲＩＥ）等もあげられる。【００２９】  非イオン性界面活性剤としては、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（具体的にはポリソルベート８０等）、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール（具体的にはプルロニックＦ６８等）、ソルビタン脂肪酸（具体的にはソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノオレエート等）、ポリオキシエチレン誘導体（具体的にはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール等）、グリセリン脂肪酸エステル等があげられる。【００３０】  アニオン性界面活性剤としては、例えばアシルサルコシン、アルキル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルホン酸塩、炭素数７〜２２の脂肪酸ナトリウム等があげられる。具体的にはドデシル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム等があげられる。【００３１】  カチオン性界面活性剤としては、例えばアルキルアミン塩、アシルアミン塩、第四級アンモニウム塩、アミン誘導体等があげられる。具体的には塩化ベンザルコニウム、アシルアミノエチルジエチルアミン塩、Ｎ−アルキルポリアルキルポリアミン塩、脂肪酸ポリエチレンポリアミド、セチルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、アルキルポリオキシエチレンアミン、Ｎ−アルキルアミノプロピルアミン、脂肪酸トリエタノールアミンエステル等があげられる。【００３２】  両性界面活性剤としては、例えば３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンス��ホン酸、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸等があげられる。【００３３】  リポソームにおいては、これら脂質および界面活性剤は、単独でまたは組み合わせて用いられ、好ましくは組み合わせて用いられる。組み合わせて用いる場合の組み合わせとしては、例えば水素添加大豆ホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ジステアロイルホスファチジルコリン、ポリエチレングリコール化リン脂質およびコレステロールから選ばれる２成分以上の組み合わせ、ＥＰＣとＤＯＴＡＰの組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ、ＥＰＣ、ＤＯＴＡＰ、コレステロールおよびポリエチレングリコール化リン脂質の組み合わせ等があげられる。【００３４】  また、リポソームは、必要に応じて、例えばコレステロール等のステロール類等の膜安定化剤、例えばトコフェロール等の抗酸化剤等を含有していてもよい。【００３５】  脂質集合体としては、例えば球状ミセル、球状逆ミセル、ソーセージ状ミセル、ソーセージ状逆ミセル、板状ミセル、板状逆ミセル、ヘキサゴナルＩ、ヘキサゴナルＩＩおよび脂質２分子以上からなる会合体等があげられる。【００３６】  エマルジョン粒子としては、例えば脂肪乳剤、非イオン性界面活性剤と大豆油からなるエマルジョン、リピッドエマルジョン、リピッドナノスフェアー等の水中油型（Ｏ／Ｗ）エマルジョンや水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）エマルジョン粒子等があげられる。【００３７】  高分子としては、例えばアルブミン、デキストラン、キトサン、デキストラン硫酸、ＤＮＡ等の天然高分子、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸等の合成高分子、およびそれらの塩等があげられる。
ここで、高分子における塩は、例えば金属塩、アンモニウム塩、酸付加塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等を包含する。金属塩としては、例えばリチウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等があげられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩があげられ、酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩等の有機酸塩があげられ、有機アミン付加塩としては、例えばモルホリン、ピペリジン等の付加塩があげられ、アミノ酸付加塩としては、例えばグリシン、フェニルアラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン等の付加塩があげられる。【００３８】  金属コロイドとしては、例えば金、銀、白金、銅、ロジウム、シリカ、カルシウム、アルミニウム、鉄、インジウム、カドミウム、バリウム、鉛等を含む金属コロイドがあげられる。【００３９】  微粒子製剤としては、例えばマイクロスフェアー、マイクロカプセル、ナノクリスタル、リピッドナノパーティクル、高分子ミセル等があげられる。【００４０】  また、好ましくは、リード粒子は、薬物Ａと静電的に逆の電荷をもつ。ここで、薬物Ａと静電的に逆の電荷とは、薬物分子内の電荷、分子内分極等に対して静電的引力を生じる電荷、表面分極等を包含する。リード粒子が薬物Ａと静電的に逆の電荷をもつには、好ましくは、リード粒子は、薬物Ａと静電的に逆の電荷をもつ荷電物質を含有し、より好ましくは、リード粒子は、薬物Ａと静電的に逆の電荷をもつ脂質（後記のカチオン性脂質またはアニオン性脂質）を含有する。【００４１】  リード粒子に含有される荷電物質は、カチオン性を呈するカチオン性物質とアニオン性を呈するアニオン性物質とに分類されるが、カチオン性の基とアニオン性の基の両方をもつ両性の物質であっても、ｐＨや、他の物質との結合等により相対的な陰性度が変化するので、その時々に応じてカチオン性物質またはアニオン性物質に分類され得る。これら荷電物質は、前記リード粒子の構成成分として用いても、該リード粒子の構成成分に加えて用いても構わない。【００４２】  カチオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのカチオン性物質［具体的には、カチオン性脂質、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性高分子等］、等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド等があげられる。【００４３】  カチオン性脂質としては、例えばＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＲＩＥ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ等があげられる。【００４４】  カチオン性高分子としては、例えばポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔ）、キトサン等があげられる。【００４５】  等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以下の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ペプシン、リボヌクレアーゼＴ１��があげられる。【００４６】  アニオン性物質としては、例えば前記のリード粒子の定義で例示したもののうちのアニオン性物質［具体的には、アニオン性脂質、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性高分子等］、等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチド、核酸等があげられる。【００４７】  アニオン性脂質としては、例えばホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等があげられる。【００４８】  アニオン性高分子としては、例えばポリアスパラギン酸、スチレンマレイン酸共重合体、イソプロピルアクリルアミド−アクリルピロリドン共重合体、ポリエチレングリコール修飾デンドリマー、ポリ乳酸、ポリ乳酸ポリグリコール酸、ポリエチレングリコール化ポリ乳酸、デキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック等があげられる。【００４９】  等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドとしては、その物質の等電点以上の値のｐＨで、複合体の形成を行える蛋白質またはペプチドであれば、特に限定されない。例えば、アルブミン、オロソムコイド、グロブリン、フィブリノーゲン、ヒストン、プロタミン、リボヌクレアーゼ、リゾチーム等があげられる。【００５０】  アニオン性物質としての核酸としては、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等があげられ、生理活性を示さないものであれば、どのような長さ、配列のものであってもよい。【００５１】  本発明においてリード粒子に含有される糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤としては、好ましくは、糖脂質、または水溶性高分子の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体があげられ、具体的には、例えばポリエチレングリコール化脂質、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン化脂質、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。また、より好ましくは、水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。本発明における糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体および脂肪酸誘導体ならびに界面活性剤は、分子の一部がリード粒子の構成成分と例えば疎水性親和力、静電的力等で結合する性質をもち、他の部分がリード粒子の製造時の溶媒と例えば親水性親和力、静電的力等で結合する性質をもつ、２面性をもつ物質であるのが好ましい。以下、糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を凝集抑制物質と表す。【００５２】  糖、ペプチドおよび核酸から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばショ糖、ソルビトール、乳糖等の糖、例えばカゼイン由来ペプチド、卵白由来ペプチド、大豆由来ペプチド、グルタチオン等のペプチド、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ＯＤＮ等の核酸等と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質等または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられる。【００５３】  糖の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげたグリセロ糖脂質、スフィンゴ糖脂質等があげられる。【００５４】  水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール、ポリエチレンイミン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、オリゴ糖、デキストリン、水溶性セルロース、デキストラン、コンドロイチン硫酸、ポリグリセリン、キトサン、ポリビニルピロリドン、ポリアスパラギン酸アミド、ポリ−Ｌ−リジン、マンナン、プルラン、オリゴグリセロール等またはそれらの誘導体と、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、または例えばステアリン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸等の脂肪酸とが結合してなるもの等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体、ポリグリセリン誘導体等の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられ、さらに好ましくは、ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体があげられる。【００５５】  ポリエチレングリコール誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリエチレングリコール化脂質［具体的にはポリエチレングリコール−ホスファチジルエタノールアミン（より具体的には１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）等）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、クレモフォアイーエル（ＣＲＥＭＯＰＨＯＲ  ＥＬ）等］、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル類（具体的にはモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン等）、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル類等があげられ、より好ましくは、ポリエチレングリコール化脂質があげられる。【００５６】  ポリグリセリン誘導体の脂質誘導体または脂肪酸誘導体としては、例えばポリグリセリン化脂質（具体的にはポリグリセリン−ホスファチジルエタノールアミン等）、ポリグリセリン脂肪酸エステル等があげられ、より好ましくは、ポリグリセリン化脂質があげられる。【００５７】  界面活性剤としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた界面活性剤、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられ、好ましくは、ポリオキシエチレンポリプロピレングリコール、グリセリン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル等があげられる。【００５８】  本発明における付着競合剤としては、例えば薬物Ａと静電的に同じ電荷をもつ物質等があげられ、分子内の電荷、分子内分極等によるカチオンまたはアニオンへの静電的引力によりリード粒子に静電的に付着する物質を包含し、例えば脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチド、高分子等があげられる。脂質、界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチドおよび高分子としては、例えば前記荷電物質の定義の中���あげたカチオン性脂質、アニオン性脂質、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、核酸、蛋白質、ペプチド、カチオン性高分子、アニオン性高分子等があげられ、好ましくは前記荷電物質の定義の中であげたカチオン性高分子、アニオン性高分子等があげられ、より好ましくはデキストラン硫酸、デキストラン硫酸ナトリウム、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸、コンドロイチン、デルタマン硫酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ケタラン硫酸、デキストランフルオレセインアニオニック、ポリ−Ｌ−リジン、ポリエチレンイミン、ポリフェクト（ｐｏｌｙｆｅｃｔ）、キトサン等から選ばれる１つ以上の物質があげられる。付着競合剤は、リード粒子に静電的に付着することが好ましく、リード粒子に付着してもリード粒子を凝集させるような架橋を形成しない大きさの物質であるか、分子内にリード粒子との付着に反発して該リード粒子の凝集を抑制する部分をもつ物質であることが好ましい。また、特に、前記薬物Ａが、分子量５０００以上の大きな薬物（例えば遺伝子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、ｓｉＲＮＡ等）である場合に、リード粒子にさらに付着競合剤を付着させることは、本発明の最も好ましい形態の１つである。【００５９】  本発明の凝集抑制剤は、本発明における凝集抑制物質を含有し、該凝集抑制物質の凝集抑制作用を阻害しなければその他にいかなる物質を含有していてもよい。【００６０】  本発明においてリード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制は、該リード粒子に凝集抑制物質を含有させることにより行うことができるが、具体的には、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物Ａを分散または溶解して含有させて該リード粒子に薬物を付着させることによって行われ、該複合粒子の製造中における該複合粒子の凝集および／または製造後における該複合粒子の凝集が抑制される。また、好ましくは、薬物Ａを分散または溶解して含有させる際、さらに付着競合剤を含有させ、付着競合剤を薬物とともに該リード粒子に付着させることで複合粒子の凝集がより抑制される。【００６１】  より具体的には、本発明の凝集抑制方法は、例えば凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液を製造する工程およびリード粒子が分散した液中に、薬物Ａを分散または溶解して含有させる工程（例えばリード粒子が分散した液中に、薬物Ａを加えて分散または溶解する工程、リード粒子が分散した液中に、薬物Ａが分散または溶解した液を加える工程等）を含む、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の製造方法において実施することができる。ここで、リード粒子が分散した液中に、薬物Ａを分散または溶解して含有させる工程により得られる複合粒子としては、具体的には、例えばカチオン性脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子が分散した液中に、薬物としての核酸を分散または溶解させて含有させ、カチオン性脂質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子に薬物としての核酸が付着して形成される複合粒子、同様に、カチオン性脂質を含有する脂質集合体を構成成分とする微粒子に薬物としての核酸が付着して形成される複合粒子、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成���とする微粒子に薬物としての核酸が付着した複合粒子、ホスファチジン酸等のアニオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体を構成成分とする微粒子に蛋白質が付着した複合粒子、スチレンマレイン酸等のアニオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に蛋白質が付着した複合粒子、ポリ−Ｌ−リジン等のカチオン性高分子を含有する高分子を構成成分とする微粒子に蛋白質が付着した複合粒子、カチオン性脂質を含有するリポソームまたは脂質集合体を構成成分とする微粒子に蛋白質が付着した複合粒子等があげられる。また、リード粒子が分散した液中に、薬物Ａを分散または溶解して含有させる工程が、薬物Ａが分散または溶解した液に、さらに付着競合剤を含有させて、これをリード粒子が分散した液中に加える工程であることが好ましく、この場合、リード粒子に、薬物Ａと付着競合剤が共に付着して複合粒子が製造され、複合粒子の製造中における該複合粒子の凝集も、製造後における該複合粒子の凝集もより抑制される。【００６２】  凝集抑制物質を含有するリード粒子は、公知の製造方法またはそれに準じて製造することができ、リード粒子に凝集抑制物質が含有されていればいかなる製造方法で製造されたものであってよい。例えば、リード粒子の１つである凝集抑制物質を含有するリポソームを構成成分とする微粒子の製造には、公知のリポソームの調製方法が適用できる。公知のリポソームの調製方法としては、例えばバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）らのリポソーム調製法［“ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）”，１９６５年，第１３巻，ｐ．２３８−２５２参照］、エタノール注入法［“ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）”，１９７５年，第６６巻，ｐ．６２１−６３４参照］、フレンチプレス法［“エフイービーエス・レターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）”，１９７９年，第９９巻，ｐ．２１０−２１４参照］、凍結融解法［“アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）”，１９８１年，第２１２巻，ｐ．１８６−１９４参照］、逆相蒸発法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）”，１９７８年，第７５巻，ｐ．４１９４−４１９８参照］、ｐＨ勾配法（例えば特許第２５７２５５４号公報、特許第２６５９１３６号公報等参照）等があげられる。リポソームの製造の際にリポソームを懸濁させる溶液としては、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を用いることができる。また、リポソームの製造の際には、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等の抗酸化剤、例えばグリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等の添加も可能である。また、脂質等を例えばエタノール等の有機溶媒に溶解し、溶媒留去した後、生理食塩水等を添加、振とう撹拌し、リポソームを形成させることによってもリポソームを製造することができる。【００６３】  また、例えば非イオン性界面活性剤（��記と同義）、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、高分子、ポリオキシエチレン誘導体等によるリポソーム表面改質も任意に行うことができ、これらの表面改質リポソームも本発明におけるリード粒子の構成成分として用いられる［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”，（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］。高分子としては、例えばデキストラン、プルラン、マンナン、アミロペクチン、ヒドロキシエチルデンプン等があげられる。ポリオキシエチレン誘導体としては、例えばポリソルベート８０、プルロニックＦ６８、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、ポリオキシエチレンラウリルアルコール、ＰＥＧ−ＤＳＰＥ等があげられる。リポソーム表面改質は、リード粒子に糖、ペプチド、核酸および水溶性高分子から選ばれる１つ以上の物質の脂質誘導体もしくは脂肪酸誘導体または界面活性剤を含有させる方法の１つとしても用いることができる。【００６４】  リポソームの平均粒子径は、所望により自由に選択できる。平均粒子径を調節する方法としては、例えばエクストルージョン法、大きな多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を機械的に粉砕（具体的にはマントンゴウリン、マイクロフルイダイザー等を使用）する方法［ミュラー（Ｒ．Ｈ．Ｍｕｌｌｅｒ）、ベニタ（Ｓ．Ｂｅｎｉｔａ）、ボーム（Ｂ．Ｂｏｈｍ）編著，“エマルジョン・アンド・ナノサスペンジョンズ・フォー・ザ・フォーミュレーション・オブ・ポアリー・ソラブル・ドラッグズ（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｏｒｌｙ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ）”，ドイツ，サイエンティフィック・パブリッシャーズ・スチュットガルト（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ），１９９８年，ｐ．２６７−２９４参照］等があげられる。【００６５】  また、リード粒子を構成する例えば薬物Ｂ、脂質集合体、リポソーム、エマルジョン粒子、高分子、金属コロイド、微粒子製剤等から選ばれる２つ以上を組み合わせた複合体の製造方法は、例えば水中で薬物Ｂと脂質や高分子等とを混合するだけの製造方法でもよく、この際、必要であればさらに整粒工程や無菌化工程等を加えることもできる。また、複合体形成を例えばアセトン、エーテル等種々の溶媒中で行うことも可能である。【００６６】  本発明のリード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法において、リード粒子全体に対する凝集抑制物質の割合は、重量比で１：０．９〜１：０．０１が好ましく、１：０．７〜１：０．１がより好ましく、１：０．６〜１：０．２がさらに好ましく、１：０．５〜１：０．３が最も好ましい。【００６７】  リード粒子の大きさとしては、平均粒子径が１０ｎｍ〜３００ｎｍであるのが好ましく、５０ｎｍ〜１５０ｎｍであるのがより好ましく、５０ｎｍ〜１００ｎｍであるのがさらに好ましい。【００６８】  リード粒子を分散させる溶媒は、リード粒子が溶解しない溶媒であり、複合粒子の製造工程において、薬物Ａがリード粒子に付着するのを妨げない溶媒であるのが好ましい。リード粒子を分散させる溶媒としては、例えば水等を含有する溶媒があげられ、好ましくは、水があげられる。一方、リード粒子としては、例えば水等に分散するリード粒子が好ましい。リード粒子を製造する際に用いた溶媒が水の場合、同じ液中でリード粒子の製造に引き続いて、複合粒子の製造を行うことが可能である。【００６９】  凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤を分散または溶解して含有させる工程において、該リード粒子が分散した液中に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が分散または溶解した液を加える場合、薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が分散または溶解した液に使用される溶媒は、該リード粒子が分散した液と、薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が分散または溶解した液とを混合した後の混合液中で、薬物Ａが該リード粒子に付着するのを妨げない溶媒であれば、いかなるものを用いても構わない。薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤を分散または溶解させる溶媒としては、例えば水等を含有する溶媒があげられ、好ましくは、水があげられる。一方、薬物Ａおよび付着競合剤としては、例えば水等に溶解または分散する薬物Ａおよび付着競合剤がそれぞれ好ましく、水に溶解する薬物Ａおよび付着競合剤がそれぞれより好ましい。【００７０】  リード粒子のリード粒子が分散する液に対する割合は、リード粒子に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が付着できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。また、凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤を分散または溶解して含有させる工程において、該リード粒子が分散した液中に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が分散または溶解した液を加える場合、薬物Ａと付着競合剤の総量の薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が分散または溶解した液に対する割合は、リード粒子に薬物Ａまたは薬物Ａと付着競合剤が付着できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。リード粒子に対する薬物Ａと付着競合剤の総量の割合は、重量比で１：１〜１０００：１が好ましく、２：１〜２００：１がより好ましい。【００７１】  本発明の複合粒子は、凝集抑制物質を含有するリード粒子、ならびに該リード粒子に付着した薬物としての核酸、または該リード粒子に付着した薬物および該リード粒子に付着した付着競合剤を含有する複合粒子であり、本発明の複合粒子における各構成成分の定義は、前記各定義と同義である。【００７２】  本発明の複合粒子の製造方法は、凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物としての核酸または薬物と付着競合剤を分散または溶解して含有させることによって、該リード粒子に該核酸または該薬物と該付着競合剤を付着させる工程を含む製造方法である。凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物としての核酸を分散または溶解して含有させることによって、該リード粒子に該核酸を付着させる工程を含む製造方法は、前記本発明のリード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法の説明において、薬物を核酸として、同様の方法で実施することができる。凝集抑制物質を含有するリード粒子が分散した液中に、薬物と付着競合剤を分散または溶解して含有させることによって、該リード粒子に該薬物と該付着競合剤を付着させる工程を含む製造方法は、前記本発明のリード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法の説明中、付着競合剤を使用した場合の説明で記載したのと同様の方法で実施することができる。【００７３】  本発明における複合粒子および本発明の複合粒子の大きさは平均粒子径が５０ｎｍ〜３００ｎｍであるのが好ましく、５０ｎｍ〜２００ｎｍであるのがより好ましく、５０ｎｍ〜１５０ｎｍであるのがさらに好ましい。【００７４】  また、本発明における複合粒子および本発明の複合粒子の製造工程に続いて、荷電物質または荷電物質の分散または溶解した液を加えて、該複合粒子に、荷電物質を付着させて、多重複合粒子を得ることもできる。例えば、水中でカチオン性物質と凝集抑制物質でリード粒子であるリポソームを構成成分とする微粒子を調製し、その後、薬物Ａとして例えば核酸を（好ましくは付着競合剤とともに）添加し、さらに例えばアニオン性物質を添加して、多重複合粒子とすることが可能である。また、本発明における複合粒子および本発明の複合粒子は、被覆複合粒子とすることも可能である。【００７５】  本発明の被覆複合粒子は、少なくとも本発明の複合粒子と該複合粒子を被覆する被覆層からなる被覆複合粒子であり、例えば、該被覆層を構成する被覆層成分が、該複合粒子が不溶でかつ分散できる濃度範囲で極性溶媒を含む溶媒に、相対的に極性溶媒の濃度が高いときには溶解し、低いときには析出または集合する成分である被覆複合粒子等である。【００７６】  本発明の被覆複合粒子における被覆層を構成する被覆層成分としては、例えば前記リード粒子の定義の中であげた脂質、界面活性剤、高分子等があげられ、好ましくは、前記リード粒子の定義の中であげた脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、より好ましくは、被覆層が脂質膜となる脂質および界面活性剤から選ばれる１つ以上の物質があげられ、さらに好ましくはリン脂質があげられる。【００７７】  また、被覆層が脂質膜である場合に用いられる脂質として、例えば合成脂質等もあげられる。合成脂質としては、例えばフッ素添加ホスファチジルコリン、フッ素添加界面活性剤、臭化ジアルキルアンモニウム等があげられ、これらは単独でまたは他の脂質等と組み合わせて用いられてもよい。また、被覆層が脂質膜である場合には、被覆層が水溶性高分子誘導体を含有することが好ましい。水溶性高分子誘導体としては、例えば前記凝集抑制物質の定義において例示した水溶性高分子の脂質誘導体または脂肪酸誘導体等があげられ、好ましくは前記凝集抑制物質の定義において例示したポリエチレングリコール化リン脂質等があげられる。また、水溶性高分子誘導体としては、分子の一部が本発明における凝集抑制物質または付着競合剤と、例えば親水性親和力、静電的力等で結合する性質をもち、他の部分が他の被覆層成分と例えば疎水性親和力、静電的力等で結合する性質をもつ、２面性をもつ物質が好ましく、これらを使��することにより、本発明の複合粒子の被覆の効率が高まる。被覆層成分全体に対する水溶性高分子誘導体の割合が、重量比で１：０．５〜１：０．０１であるのが好ましく、１：０．２５〜１：０．０１であるのがより好ましく、１：０．１５〜１：０．０２であるのがさらに好ましい。【００７８】  本発明の被覆複合粒子は、例えば本発明の複合粒子が分散し、かつ被覆層成分が溶解した極性有機溶媒を含む液（液Ａ）を調製する工程、次いで、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させることによって、複合粒子を被覆層で被覆する工程を含む製造方法によって製造でき、この場合、該被覆複合粒子は懸濁液（液Ｄ）の形態で得られる。液Ａにおける溶媒は、複合粒子が溶解せず、被覆層成分が溶解する溶媒であり、液Ａ中の極性有機溶媒の割合を減少させた液Ｄでは、複合粒子は溶解せず、被覆層成分は溶解しないか、または集合している。液Ａ中の溶媒が、極性有機溶媒単独である場合、例えば該極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒（液Ｅ）を、好ましくは徐々に加えることで、相対的に該極性有機溶媒の割合を減少させることができる。ここで、液Ｅは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒であり、極性有機溶媒も含んでいてもよい。また、液Ａ中の溶媒が、極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒との混合液である場合、例えば極性有機溶媒と混合可能な極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒（液Ｆ）を加えること、および／または、蒸発留去、半透膜分離、分留等によって、選択的に極性有機溶媒を取り除くことで、極性有機溶媒の割合を減少させることができる。ここで、液Ｆは、極性有機溶媒以外の溶媒を含む溶媒であり、極性有機溶媒も液Ａにおける極性有機溶媒の割合より低ければ含んでいてよい。極性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール等のアルコール類、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール等のグリコール類、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール類等があげられ、好ましくはエタノールがあげられる。極性有機溶媒以外の溶媒としては、例えば、水、液体二酸化炭素、液体炭化水素、ハロゲン化炭素、ハロゲン化炭化水素等があげられ、好ましくは水があげられる。また、液Ａ、液Ｅおよび液Ｆは、イオン、緩衝成分等を含んでいてもよい。【００７９】  極性有機溶媒と極性有機溶媒以外の溶媒の組み合わせは、相互に混合可能である組み合わせであるのが好ましく、液Ａおよび液Ｄ中の溶媒ならびに液Ｅおよび液Ｆに対する、前記複合粒子および前記被覆層成分の溶解度等を考慮して選択できる。一方、前記複合粒子については、液Ａおよび液Ｄ中の溶媒ならびに液Ｅおよび液Ｆのいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、また極性有機溶媒および極性有機溶媒以外の溶媒のいずれに対しての溶解度も低いことが好ましく、被覆層成分は、液Ｄ中の溶媒および液Ｆに対しての溶解度が低いことが好ましく、液Ａ中の溶媒および液Ｅに対しての溶解度が高いことが好ましく、また極性有機溶媒に対しての溶解度が高いことが好ましく、極性有機溶媒以外の溶媒に対する溶解度が低いことが好ましい。ここで、複合粒���の溶解度が低いとは、複合粒子に含有されるリード粒子、薬物Ａおよび付着競合剤等の各成分の、該溶媒中における溶出性が小さいことであり、各成分の個々の溶解度が高くても各成分間の結合等によって各成分の溶出性が小さくなっていればよい。例えば、リード粒子に含まれる成分のいずれかの液Ａ中の溶媒に対する溶解度が高い場合でも、付着競合剤の液Ａ中の溶媒に対する溶解度が低ければ、複合粒子中の他の成分の溶出が抑制され、複合粒子の液Ａ中の溶媒に対する溶解度を低くすることが可能である。すなわち、複合粒子中の他の成分の液Ａ中の溶媒に対する溶解度より、液Ａ中の溶媒に対する溶解度が低い付着競合剤を選択的に用いる場合には、付着競合剤は、被覆複合粒子の製造において、複合粒子の他の成分の溶出を抑制し、製造性と歩留まりを向上させる効果も備えている。【００８０】  液Ａにおける極性有機溶媒の割合は、本発明の複合粒子が溶解せずに存在し、該複合粒子を被覆する被覆層成分が溶解するという条件さえ満たしていれば特に限定されるものではなく、用いる溶媒や複合粒子、被覆層成分の種類等により異なるが、好ましくは３０ｖｏｌ％以上、より好ましくは６０〜９０ｖｏｌ％である。また、液Ｄにおける極性有機溶媒の割合は、被覆層成分が本発明の複合粒子表面で被覆層を形成しうる割合であれば特に限定されるものではないが、好ましくは５０ｖｏｌ％以下である。【００８１】  液Ａを調製する工程としては、前記複合粒子が溶解しなければ、前記極性有機溶媒、前記複合粒子および前記被覆層成分、または前記極性有機溶媒、前記複合粒子、前記被覆層成分および前記極性有機溶媒以外の溶媒をいかなる順に加えて液Ａを調製する工程でもかまわず、好ましくは、本発明の複合粒子が分散した極性有機溶媒を含む液（液Ｂ）を調製し、液Ｂ中の極性有機溶媒と同一または異なった極性有機溶媒を含む溶媒に被覆層成分を溶解させた液（液Ｃ）を調製し、液Ｂと液Ｃを混合して調製する工程があげられる。液Ｂと液Ｃを混合して液Ａを調製する際には、徐々に混合することが好ましい。【００８２】  例えば被覆層が脂質膜である本発明の被覆複合粒子の好ましい製造方法としては、以下の方法があげられる。
（工程１）本発明の複合粒子を極性有機溶媒含有水溶液、好ましくはエタノール等のアルコール類を含有する水溶液に分散（懸濁）させる。
（工程２）上記極性有機溶媒含有水溶液と同一または異なった極性有機溶媒含有水溶液、好ましくは同一の極性有機溶媒含有水溶液または極性有機溶媒に脂質膜となる脂質および／または界面活性剤（脂質膜を構成する成分）を溶解する。このとき、さらに水溶性高分子誘導体（例えば、ポリエチレングリコール修飾脂質誘導体等）を添加してもよく、ここで添加する水溶性高分子誘導体の量は特に限定されるものではない。
（工程３）工程１で得られた液と工程２で得られた液を混合する。
（工程４）工程３で得られた混合液に少しずつ水を添加するか、該混合液を透析するかまたは該混合液から極性有機溶媒を留去し、該混合液中の極性有機溶媒の相対的割合を減少させ、脂質膜で被覆された被覆複合粒子を、懸濁液の形態で得る。【００８３】  用いる複合粒子の種類や、用いる被覆層成分の種類によらず基本的には前記と同様な方法で本発明の被覆複合粒子を製造することができる。リード粒子がリポソームを構成成分とする微粒子であって、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆複合粒子は、その構成から狭義のリポソームと分類され、リード粒子がリポソームを構成成分とする微粒子以外で、被覆層成分が脂質および／または界面活性剤であって、被覆層が脂質膜である被覆複合粒子は、広義のリポソームと分類される。本発明において、リード粒子の構成成分も被覆複合粒子もリポソームであることがより好ましい。【００８４】  本発明の被覆複合粒子の製造方法において用いられる本発明の複合粒子の液Ａおよび液Ｂに対する割合は、該複合粒子を被覆層成分で被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜５００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。また、用いられる被覆層成分（例えば脂質等）の液Ａおよび液Ｃに対する割合は、本発明の複合粒子を被覆できれば特に限定されるものではないが、１μｇ／ｍＬ〜１ｇ／ｍＬが好ましく、０．１〜４００ｍｇ／ｍＬがより好ましい。本発明の複合粒子に対する被覆層成分の割合は、重量比で１：０．１〜１：１０００が好ましく、１：１〜１：１０がより好ましい。【００８５】  また、本発明の被覆複合粒子および本発明の被覆複合粒子の製造方法によって得られる被覆複合粒子の大きさは、平均粒子径が３５０ｎｍ以下であるのが好ましく、３００ｎｍ以下であるのがより好ましく、２００ｎｍ以下であるのがさらに好ましい。具体的には、例えば注射可能な大きさであるのが好ましい。【００８６】  さらに、上記で得られる被覆複合粒子に抗体等の蛋白質、糖類、糖脂質、アミノ酸、核酸、種々の低分子化合物、高分子化合物等の物質による修飾を行うこともでき、これらで得られる被覆複合粒子も本発明の被覆複合粒子に包含される。例えば、ターゲッティングに応用するため、上記で得られる被覆複合粒子に対して、さらに抗体等の蛋白質、ペプチド、脂肪酸類等による脂質膜表面修飾を行うこともでき［ラジック（Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ）、マーティン（Ｆ．Ｍａｒｔｉｎ）編，“ステルス・リポソームズ（Ｓｔｅａｌｔｈ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）”，（米国），シーアールシー・プレス・インク（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．），１９９５年，ｐ．９３−１０２参照］、また、リード粒子の構成成分であるリポソームのときと同様に例えば非イオン性界面活性剤（前記と同義）、カチオン性界面活性剤（前記と同義）、アニオン性界面活性剤（前記と同義）、高分子（前記と同義）、ポリオキシエチレン誘導体（前記と同義）等による表面改質も任意に行うことができ、これら脂質膜表面修飾または表面改質されたものも本発明の被覆複合粒子に包含される。【００８７】  本発明の被覆複合粒子は、例えば血液成分等の生体成分、消化管液等に対する薬剤���安定化、副作用の低減、腫瘍等の標的臓器への薬剤集積性の増大、経口や経粘膜での薬剤の吸収の改善等を目的とする製剤として使用できる。【００８８】  本発明の被覆複合粒子を製剤として使用する場合、上述の方法により調製した被覆複合粒子の懸濁液をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該懸濁液から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該懸濁液、または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトース、グリシン等の賦形剤を加えた該懸濁液を凍結乾燥して使用することもできる。【００８９】  注射剤の場合、前記の被覆複合粒子の懸濁液または前記の溶媒を除去または凍結乾燥した被覆複合粒子に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理的食塩液、アミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システイン、ＥＤＴＡ等の抗酸化剤、グリセリン、ブドウ糖、塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。【００９０】  また、本発明の被覆複合粒子は、適当な賦形剤等と共に造粒、乾燥する等して例えばカプセル剤、錠剤、顆粒剤等の経口用製剤に加工してもよい。【００９１】  次に、実施例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００９２】  なお、本実施例において用いたＯＤＮは、ホスホロチオエート型、２０ｍｅｒ、５’末ＦＩＴＣ標識、５’ＡＣＴＡＧＴＧＧＣＴＡＧＣＧＡＡＴＣＴＣ３’、タカラバイオ社である。【００９３】  また、本実施例において用いたプラスミドは、
ＣＡＧプロモーターに連結したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む８．５ｋｂのプラスミド（以下、ｐＣＡＧ−ＬａｃＺ）、またはＣＡＧプロモーターに連結したＲＬｕｃ遺伝子を含む６．１ｋｂのプラスミド（以下、ｐＣＡＧ−ＲＬｕｃ）である。【００９４】  ｐＣＡＧ−Ｒｌｕｃプラスミドは、次の方法で調製した。
プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ  ｖｅｃｔｏｒ［プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製］１μｇを３０μＬのバッファー（ｐＨ７．５）［Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｈ；５０ｍｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、６．６ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１０ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトールおよび１００ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、宝酒造社製、以下同様］に溶解し、１０単位の制限酵素Ｓａｌ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉを加えて３７℃で２時間消化反応を行った。得られた反応溶液をアガロースゲル電気泳動に付した後、３．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を精製キット［ＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、クアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社製、以下同様］を用いて回収した。
次に国際公開第０１／３３９５７号パンフレットに記載のプラスミドｐＢＳＫＳ（＋）ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ１μｇを３０μＬのバッファー（ｐＨ７．５）に溶解し、制限酵素Ｓａｌ  ＩとＥｃｏＲ  Ｉを加えて３７℃で２時間消化反応を行った、得られた反応溶液をアガロースゲル電気泳動に付した後、１．７ｋｂｐのＣＡＧプロモーターを含むＤＮＡ断片を精製キットを用いて回収した。
上記で得られた、プラスミドｐＲＬ−ｎｕｌｌ  ｖｅｃｔｏｒ由来のＳａｌ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ断片（３．３Ｋｂｐ）０．１μｇおよびプラスミドｐＢＳＫＳ（＋）ＣＡＧ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ由来のＳａｌ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｉ断片（１．７ｋｂｐ）０．１μｇをＴ４リガーゼ緩衝液［６６ｍｍｏｌ／Ｌトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、１０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化マグネシウム、１ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトールおよび０．１ｍｍｏｌアデノシン三リン酸、宝酒造社製］３０μＬに溶解し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ１００単位（宝酒造社製）を加え、１６℃で１６時間連結反応を行った。
得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ５α（東洋紡社製）をコーエンらの方法［“プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）”，１９７２年，第６９巻，ｐ．２１１０−２１１４参照］によって形質転換し、アンピシリン耐性株を得た。この形質転換株から公知の方法に従ってｐＣＡＧ−Ｒｌｕｃプラスミドを単離した。【００９５】  また、本実施例において用いたｓｉＲＮＡは、５’末をＦＩＴＣ標識したセンス配列５’
ＣＵＧＧＡＵＣＧＵＡＡＧＡＡＧＧＣＡＧｄＴ．ｄＴ３’とアンチセンス配列５’
ＣＵＧＣＣＵＵＣＵＵＡＣＧＡＵＣＣＡＧｄＴｄＴ３’とからなるｓｉＲＮＡである。
【実施例１】
【００９６】  ＤＯＴＡＰ［アバンティー（Ａｖａｎｔｉ）社製、以下同様］／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（日本油脂製、以下同様）／蒸留水を３０ｍｇ／６ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製、以下同様）に４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製、以下同様）に１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルター（ワットマン製、以下同様）に２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例２】
【００９７】  ＤＯＴＡＰ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／蒸留水を３０ｍｇ／９ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例３】
【００９８】  ＤＯＴＡＰ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／蒸留水を３０ｍｇ／１２ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例４】
【００９９】  ＤＯＴＡＰ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／蒸留水を３０ｍｇ／１８ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例５】
【０１００】  ＤＯＴＡＰ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ／蒸留水を３０ｍｇ／２４ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例６】
【０１０１】  ＤＯＴＡＰ／ポリオキチエチレン硬化ヒマシ油［ＨＣＯ−６０、日本油脂製］／蒸留水を３０ｍｇ／２４ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。【０１０２】比較例１
ＤＯＴＡＰ／蒸留水を３０ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例７】
【０１０３】  実施例１と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例８】
【０１０４】  実施例２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例９】
【０１０５】  実施例３と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例１０】
【０１０６】  実施例４と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
【実施例１１】
【０１０７】  実施例５と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。【０１０８】比較例２
比較例１と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．０２ｍＬに、８ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．００５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。【０１０９】試験例１
実施例１〜１１および比較例１〜２で得られた各複合粒子について、複合粒子の平均粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置（ＮａｎｏＺＳ、マルバーン社製）で測定した。
結果を表１に示す。【０１１０】
【表１】
2005092389.tif 000002
【０１１１】  実施例１〜１１で調製された複合粒子では、平均粒子径が３００ｎｍ以下であったので凝集が抑制されたと考えられるのに対し、比較例１および２で調製された複合粒子では、平均粒子径が３００ｎｍより大きくなった。
【実施例１２】
【０１１２】  ＤＯＴＡＰ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［アバンティー（Ａｖａｎｔｉ）社製、以下同様］／蒸留水を３０ｍｇ／１２ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０４ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。【０１１３】比較例３
ＤＯＴＡＰ／蒸留水を３０ｍｇ／ｍＬになるように混合し、ボルテックスミキサーで振とう攪拌した。得られた懸濁液を室温で０．４μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに４回、０．１μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに１０回、さらに０．０５μｍのポリカーボネートメンブランフィルターに２４回通してリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．０４ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．０１ｍＬを添加して複合粒子を調製した。【０１１４】試験例２
実施例１２および比較例３で調製された各複合粒子の凝集物の生成を目視で観察した。結果を表２に示す。【０１１５】
【表２】
2005092389.tif 000003
【０１１６】  表２からわかるように、実施例１２で調製された複合粒子ではプラスミドを添加しても凝集物の生成が認められなかったのに対し、比較例３で調製された複合粒子では凝集物の生成が認められた。
【実施例１３】
【０１１７】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、０．５ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、被覆層成分のＥＰＣ［日本油脂製；以下同様］／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．２５ｍＬを添加し、次に蒸留水２３ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例１４】
【０１１８】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、３ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液から、実施例１３と同様に被覆複合粒子の調製を経て、製剤を得た。
【実施例１５】
【０１１９】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．１２５ｍＬを、および６ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸（メルク社製、以下同様）水溶液０．１２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液から、実施例１３と同様に被覆複合粒子の調製を経て、製剤を得た。
【実施例１６】
【０１２０】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．１２５ｍＬおよび１２ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸水溶液０．１２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液から、実施例１３と同様に被覆複合粒子の調製を経て、製剤を得た。
【実施例１７】
【０１２１】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．１２５ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸水溶液０．１２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液を、実施例１３と同様に被覆複合粒子の調製を経て、製剤を得た。
【実施例１８】
【０１２２】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、１ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＬａｃＺプラスミド水溶液０．１２５ｍＬおよび３ｍｇ／ｍＬのデキストランフルオレセインアニオニック（モレキュラープローブス社製）水溶液０．１２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液から、実施例１３と同様に被覆複合粒子の調製を経て、製剤を得た。【０１２３】試験例３
実施例１３〜１８で得られた各製剤について、被覆微粒子の平均粒子径を動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置（Ａ  ｍｏｄｅｌ  ＥＬＳ−８００、大塚電子製）で測定した。結果を表３に示す。【０１２４】
【表３】
2005092389.tif 000004
【０１２５】  実施例１３〜１８で得られたいずれの製剤おいても、平均粒子径が３５０ｎｍ以下であったので、被覆複合粒子の製造工程中に複合粒子の凝集が抑制されたと考えられる。【０１２６】試験例４
実施例１３および実施例１５〜１７で得られた各製剤における、プラスミドおよびＥＰＣの仕込み量に対する回収率を以下のように求めた。
各製剤を水で１０倍希釈し、この希釈液２００μＬに１０ｗ／ｖ％トライトンエックス−１００（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、和光純薬製、以下同様）水溶液２００μＬを加え、２μｇ／ｍＬエチジウムブロマイド（和光純薬社製）水溶液２００μＬ、さらに生理食塩水１４００μＬを加えた。蛍光光度計（日立、Ｆ−４５００）を使用して、励起波長５８０ｎｍおよび蛍光波長６１５ｎｍでの蛍光を測定することにより、各製剤中のプラスミドを定量した。また、製剤中のＥＰＣを、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬製、以下同様）による酵素法により定量した。プラスミドおよびＥＰＣの回収率は、それぞれ下記式（１）および（２）で算出した。結果を表４に示す。【０１２７】
【数１】
2005092389.tif 000005
【０１２８】
【表４】
2005092389.tif 000006
【０１２９】  表４からわかるように、実施例１３および１５〜１７で得られた製剤では、いずれもプラスミドの回収率が５０％以上と高く、被覆用脂質による複合粒子の被覆が良好である。また、付着競合剤を含有する実施例１５〜１７で得られた製剤では、ＥＰＣの回収率もおよそ５０％以上と高く、被覆用脂質による複合粒子の被覆が効率よくもあり、より好ましい。
【実施例１９】
【０１３０】  実施例１２と同様にリード粒子を調製した。得られたリード粒子の懸濁液０．５ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのｓｉＲＮＡ水溶液０．１２５ｍＬおよび６ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸水溶液０．１２５ｍＬを添加し、エタノール１ｍＬを加えて複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．２５ｍＬを添加し、次に蒸留水２３ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加し、次に、１２０重量部のＥＰＣに対し５０重量部のＰＥＧ−ＤＳＰＥ（複合粒子懸濁液の４ｖｏｌ％）を少量のエタノールに溶解して混合し、７０℃で２分間加温して、製剤を得た。【０１３１】試験例５
実施例１９で得られた製剤における被覆微粒子の平均粒子径をＤＬＳ測定装置（Ａ  ｍｏｄｅｌ  ＥＬＳ−８００、大塚電子製）で測定した。結果を表５に示す。【０１３２】
【表５】
2005092389.tif 000007
【０１３３】  なお、実施例１９で得られた製剤おいて、平均粒子径が３５０ｎｍ以下であったので、被覆複合粒子の製造工程中に複合粒子の凝集が抑制されたと考えられる。【０１３４】試験例６
実施例１９で得られた製剤における、ｓｉＲＮＡおよびＥＰＣの仕込み量に対する回収率を以下のように求めた。
製剤を水で２０倍希釈し、この希釈液５０μＬに１０ｗ／ｖ％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００水溶液５０μＬを加え、さらに生理食塩水４００μＬを加えた。蛍光マイクロプレートリーダー（ワラック（ＷＡＬＬＡＣ）、アルボエスエックス１４２０マルチラベルカウンター（ＡＲＶＯＴＭＳＸ  １４２０  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ））を使用して、励起波長４８５ｎｍおよび蛍光波長５３０ｎｍでの蛍光を測定することにより、製剤中のｓｉＲＮＡを定量した。また、製剤中のＥＰＣを、リン脂質Ｃテストワコー（和光純薬製）による酵素法により定量した。ｓｉＲＮＡおよびＥＰＣの回収率は、それぞれ下記式（３）および（４）で算出した。結果を表６に示す。【０１３５】
【数２】
2005092389.tif 000008
【０１３６】
【表６】
2005092389.tif 000009
【０１３７】  表６からわかるように、実施例１９で得られた製剤では、ｓｉＲＮＡの回収率が５０％以上と高く、被覆用脂質による複合粒子の被覆が良好であり、ＥＰＣの回収率も５０％以上と高く、被覆用脂質による複合粒子の被覆が効率よくもあった。
【実施例２０】
【０１３８】  実施例３と同様にリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．２５ｍＬに、１５ｍｇ／ｍＬのＯＤＮ水溶液０．１２５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣを１２０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２１】
【０１３９】  実施例２０と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（日本油脂製、以下同様）を１２０ｍｇ／１０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、ＰＢＳを添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２２】
【０１４０】  実施例２０と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、ＰＢＳを添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２３】
【０１４１】  実施例２０と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／５０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、ＰＢＳを添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２４】
【０１４２】  実施例３と同様にリード粒子を調製した。
得られたリード粒子の懸濁液０．２５ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのｐＣＡＧ−ＲＬｕｃプラスミド水溶液０．０６２５ｍＬ、および２０ｍｇ／ｍＬのデキストラン硫酸水溶液０．０６２５ｍＬを添加して複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣを１２０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２５】
【０１４３】  実施例２４と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／１０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２６】
【０１４４】  実施例２４と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／２５ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再懸濁して製剤を得た。
【実施例２７】
【０１４５】  実施例２４と同様に複合粒子を調製した。
得られた複合粒子の懸濁液に、エタノール０．５ｍＬを加え、さらに被覆層成分のＥＰＣ／ＰＥＧ−ＤＳＰＥを１２０ｍｇ／５０ｍｇ／ｍＬになるようにエタノールに溶解した溶液０．１２５ｍＬを添加し、次に蒸留水１１．５ｍＬを徐々に加え、エタノールの濃度が５ｖｏｌ％以下になるよう調整し被覆複合粒子を調製した。
得られた被覆複合粒子の懸濁液を超遠心（１時間、１１０，０００×ｇ、２５℃）し、上清を除去し、生理食塩水を添加して再懸濁して製剤を得た。【０１４６】試験例７
実施例２０〜２７で得られた各製剤について、被覆微粒子の平均粒子径をＤＬＳ測定装置（ＮａｎｏＺＳ、マルバーン社製）で測定した。結果を表７に示す。【０１４７】
【表７】
2005092389.tif 000010
【０１４８】  実施例２０〜２７で得られた製剤おいて、平均粒子径が３５０ｎｍ以下であったので、被覆複合粒子の製造工程中に複合粒子の凝集が抑制されたと考えられる。【０１４９】試験例７
実施例２０〜２７で得られた各製剤における、ＥＰＣの仕込み量に対する回収率を試験例４と同様に求めた。結果を表８に示す。【０１５０】
【表８】
2005092389.tif 000011
【０１５１】  表８からわかるように、実施例２０〜２７で得られた製剤では、ＥＰＣの回収率がいずれも高く、被覆用脂質による複合粒子の被覆が効率よく行われていた。また、被覆層成分全体に対する水溶性高分子誘導体の割合が、重量比で１：０．２５〜１：０．０１である実施例２１、２２、２５および２６で得られた製剤は、被覆微粒子の平均粒子径がより小さくかつＥＰＣの回収率がより高く、より好ましかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５２】  本発明により、リード粒子に薬物が付着した複合粒子の凝集抑制方法、その製造方法等が提供され、また凝集抑制された複合粒子を被覆層で被覆した被覆複合粒子の製造方法、該製造方法によって製造できる被覆複合粒子等が提供される。
【国際調査報告】
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