(57)【要約】  本発明は、ＱＴＬを欠く対応する植物に対して、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉および／または果実の耐性および／または抵抗性に対応する改善された表現型を植物に付与するＱＴＬをゲノム中に含む、ソヌラム・リコペルシカム植物に関し、上記ＱＴＬは、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在するＱＴＬから選択される。ＱＴＬは、好ましくは、染色体６、９、および１１上の異なるＳＮＰの定義された対立遺伝子によって特徴付けられる。本発明は、表現型が改善されたこれらの植物の一部および子孫、別の遺伝的バックグラウンドにおいて改善された表現型を移入するためのこれらの植物の使用、ならびにトマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉および／または果実の耐性または抵抗性が増加したトマト植物または種子を取得するための異なる方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性に対応する改善された表現型を植物に付与する染色体１１の量的形質遺伝子座ＱＴＬ３をホモ接合でゲノム中に含む、ソヌラム・リコペルシカム植物であって、前記ＱＴＬ３が、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、ソヌラム・リコペルシカム植物。
【請求項２】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性に対応する改善された表現型を植物に独立して付与する染色体６上の第１の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）であるＱＴＬ１または染色体９上の第２のＱＴＬであるＱＴＬ２をゲノムにホモ接合でゲノム中に含む、ソヌラム・リコペルシカム植物であって、前記ＱＴＬ１およびＱＴＬ２が、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、ソヌラム・リコペルシカム植物。
【請求項３】
前記ＱＴＬが、ＱＴＬ１について、ＴＯ−０００５１９７（配列番号１）およびＴＯ−０１５５８１（配列番号２）により区切られた染色体領域内の染色体６上に見出され、ＱＴＬ２について、ＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）およびＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）で区切られた染色体領域内の染色体９上に見出され、ＱＴＬ３について、ＴＯ−０１２２２５２（配列番号７）およびＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）により区切られた染色体領域内の染色体１１上に見出される、請求項１または２に記載のソヌラム・リコペルシカム植物。
【請求項４】
前記ＱＴＬが、以下の遺伝子座：
・染色体６上のＴＯ−０００５１９７（配列番号１）を含む遺伝子座、
・染色体６上のＴＯ−０１４５５８１（配列番号２）を含む遺伝子座、
・染色体９上のＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）を含む遺伝子座、
・染色体９上のＴＯ−０１９６７２４（配列番号４）を含む遺伝子座、
・染色体９上のＴＯ−０１４５１２５（配列番号５）を含む遺伝子座、
・染色体９上のＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１８２２７６（配列番号７）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１２２２５２（配列番号８）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１４４３１７（配列番号９）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１４２２９４（配列番号１０）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１４２３０３（配列番号１１）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１４２３０６（配列番号１２）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１８２２７６（配列番号１３）を含む遺伝子座
・染色体１１上のＴＯ−０１８１０４０（配列番号１４）を含む遺伝子座
・染色体１１上のＴＯ−０１２３０５７（配列番号１５）を含む遺伝子座、
・染色体１１上のＴＯ−０１２５５２８（配列番号１６）を含む遺伝子座
・染色体１１上のＴＯ−０１６２４３２（配列番号１７）を含む遺伝子座、および
・染色体１１上のＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）を含む遺伝子座
のうちの１つ以上で見出され、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、請求項１または２に記載のＳ．リコペルシカム植物。
【請求項５】
以下の対立遺伝子：
・ＱＴＬ１の存在についての、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔおよび／または
・ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子、
・ＱＴＬ２の存在についての、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃおよび／または
・ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、
・ＱＴＬ３の存在についての、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔおよび／または
・ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃおよび／または
・ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔおよび／または
・ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａおよび／または
・ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａおよび／または
・ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇおよび／または
・ＴＯ−０１２５５２８および／または
・ＴＯ−０１６２４３２および／または
・ＴＯ−０１６２４２７
のうちの少なくとも１つが前記Ｓ．リコペルシカム植物のゲノム中に存在することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】
前記植物が、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８）の子孫である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物。
【請求項７】
ＴＢＲＦウイルスに対する果実または葉の耐性に対応する改善された表現型を付与する、前記染色体６上のＱＴＬ１、前記染色体９上のＱＴＬ２、および／または前記染色体１１上のＱＴＬ３をゲノム中に含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳ．リコペルシカム植物の細胞。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のＳ．リコペルシカム植物の植物部分、特に、種子、外植片、生殖材料、接ぎ穂、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、または花であって、前記植物部分が請求項９に記載の細胞を含む、Ｓ．リコペルシカム植物の植物部分。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物に成長する、Ｓ．リコペルシカム植物の種子。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物の再生可能細胞の組織培養物であって、前記再生可能細胞は、胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根先、種子、花、子葉、および／または胚軸に由来し、ＴＢＲＦウイルスに対する果実または葉の耐性に対応する改善された表現型を付与する、前記染色体６上のＱＴＬ１、前記染色体９上のＱＴＬ２、および／または前記染色体１１上のＱＴＬ３をゲノム中に含む、植物の再生可能細胞の組織培養物。
【請求項１１】
種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８）のゲノム中に見出される染色体１１上の１つのＱＴＬを有するＳ．リコペルシカム植物を検出および／または選択する方法であって、前記ＱＴＬは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性に対応する改善された表現型を付与し、前記方法は、選択される前記植物の遺伝物質試料中に、以下のマーカー、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを検出することを含む、方法。
【請求項１２】
トマトゲノム中のＱＴＬを同定するためのマーカーの使用であって、前記ＱＴＬは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性を付与し、前記マーカーは、
ＴＯ−０００５１９７およびＴＯ−０１５５８１により染色体６上で区切られた染色体領域内に位置するか、もしくは
ＴＯ−０１８０９５５およびＴＯ−０１９６１０９により染色体９上で区切られた染色体領域内に位置するか、または
ＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、もしくはＴＯ−０１９６１０９の遺伝子座から２メガベース単位未満に位置し
前記マーカーは、０．０５以下のｐ値で、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、およびＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つと関連する、使用。
【請求項１３】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性を付与するトマトゲノム中のＱＴＬを同定するためのマーカーの使用であって、前記マーカーは、
ＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７により、もしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体１１上で区切られた染色体領域に位置するか、または
ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２およびＴＯ−０１６２４２７の遺伝子座から２メガベース単位未満に位置し、
前記マーカーは、０．０５以下のｐ値で、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つに関連と関連する、使用。
【請求項１４】
ＴＢＲＦウイルスに対する果実の耐性を付与するＱＴＬに関連する分子マーカーを同定する方法であって、
ＴＯ−０００５１９７（配列番号１）およびＴＯ−０１５５８１（配列番号２）により染色体６上で区切られた染色体領域にあるか、もしくはＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）およびＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）により染色体９上で区切られた染色体領域にあるか、またはＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、またはＴＯ−０１９６１０９の遺伝子座から２メガベース単位未満にある、分子マーカーを同定することと、
前記分子マーカーの対立遺伝子または状態が、ＴＢＲＦウイルスに対する果実耐性を示す植物から生じた分離集団におけるＴＢＲＦウイルスに対する果実耐性の表現型に関連するかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項１５】
ＴＢＲＦウイルスに対する葉の耐性を付与するＱＴＬに関連する分子マーカーを同定する方法であって、
ＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７によりもしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体６上で区切られた染色体領域にあるか、またはＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）およびＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）により染色体１１上で区切られた染色体領域、またはＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、もしくはＴＯ−０１６２４２７の遺伝子座からの２メガベース単位未満にある、分子マーカーを同定することと、
前記分子マーカーの対立遺伝子または状態が、ＴＢＲＦウイルスに対する葉耐性を示す植物から生じた分離集団におけるＴＢＲＦウイルスに対する葉耐性の表現型に関連するかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記分離集団が、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子ＣおよびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを含むＴＢＲＦウイルスに対して耐性である植物から生じる、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｓ．リコペルシカム植物、好ましくはＴＢＲＦＶに易感染性のＳ．リコペルシカム植物に対する耐性および／または抵抗性を付与するための育種プログラムにおける育種パートナーとしての、ＴＢＲＦＶ感染に対する耐性または抵抗性を付与するＱＴＬをホモ接合で有する、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８でＮＣＩＭＢに寄託されたＳ．リコペルシカムの植物もしくは種子またはそれらの子孫の使用。
【請求項１８】
ＴＢＲＦＶに対する耐性をＳ．リコペルシカム植物に付与する方法であって、
ａ）ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長させた植物と、好ましくは前記ＱＴＬを欠いた最初のＳ．リコペルシカム植物とを交配するステップと、
ｂ）このようにして得られた子孫において、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３のうちの１つ、２つ、または３つを有する植物を選択するステップと、
ｃ）任意選択により、ステップｂ）で得られた前記植物を１回以上自家受粉し、このようにして得られた前記子孫において、ＴＢＲＦＶに対する耐性を有する植物を選択するステップと、を含む、方法。
【請求項１９】
ＴＢＲＦＶに対する耐性をＳ．リコペルシカム植物に付与する方法であって、
ａ）ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長させた植物と、好ましくは前記ＱＴＬを欠いた最初のＳ．リコペルシカム植物とを交配し、それによりＦ１集団を生成するステップと、
ａ２）Ｆ１交雑種を自殖して、Ｆ２集団を生成するステップと、
ｂ）このようにして得られた子孫において、ＴＢＲＦＶに対する耐性を有する個体を選択するステップと、を含む、方法。
【請求項２０】
ＳＮＰマーカーが、ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する植物を選択するためにステップｂ）および／またはｃ）で使用される、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記選択が、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つの検出により行われる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ＴＢＲＦＶに対する耐性を有するＳ．リコペルシカム植物を育種する方法であって、ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長した植物を、前記ＱＴＬを欠失した最初のＳ．リコペルシカム植物と交配するステップを含む、方法。
【請求項２３】
請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法により得られるＳ．リコペルシカム植物。
【請求項２４】
ＴＢＲＦＶに対する葉の抵抗性をＳ．リコペルシカム植物に付与する染色体１１上のＱＴＬと関連するＳＮＰマーカーＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のうちの少なくとも１つの、前記ＱＴＬと関連する代替分子マーカーを同定するための使用であって、前記代替分子マーカーが、ＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７もしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体１１上で区切られた染色体領域にあるか、またはＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、もしくはＴＯ−０１６２４２７の遺伝子座から２メガベース単位未満にある、使用。
【請求項２５】
ＴＢＲＦＶに外寄生された環境でのトマト植物の収量を改善する方法であって、前記植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する染色体６のＱＴＬ１、染色体９のＱＴＬ２、および／または染色体１１のＱＴＬ３をホモ接合でゲノム中に含むトマト植物を成長させることを含み、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、方法。
【請求項２６】
ＴＢＲＦＶに外寄生された環境でのトマト植物の収量を改善する方法であって、前記植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する染色体１１のＱＴＬをホモ接合でゲノム中に含むトマト植物を成長させることを含み、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、方法。
【請求項２７】
ＴＢＲＦＶ外寄生の状態におけるトマト生産の損失を低減する方法であって、前記植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する染色体６のＱＴＬ１、染色体９のＱＴＬ２、および／または染色体１１のＱＴＬ３をホモ接合でゲノム中に含むトマト植物を成長させることを含み、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、方法。
【請求項２８】
前記植物にＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を付与する染色体１１のＱＴＬ３をそのゲノム中に含むＴＢＲＦＶに耐性であるトマト植物を同定することであって、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、同定することと、
ＴＢＲＦＶに外寄生された環境またはＴＢＲＦＶ外寄生の状態で前記植物を成長させることと、を含む、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
トマト植物の畑、通路、または温室をＴＢＲＦＶ外寄生から保護する方法であって、前記植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する染色体６のＱＴＬ１、染色体９のＱＴＬ２、および／または染色体１１のＱＴＬ３をホモ接合でゲノム中に含む抵抗性または耐性トマト植物を成長させることを含み、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、方法。
【請求項３０】
畑、通路、または温室のＴＢＲＦＶ外寄生を制御するためのＴＢＲＦＶに耐性であるトマト植物の使用であって、前記トマト植物は、前記植物にＴＢＲＦＶに対する耐性を付与する染色体６のＱＴＬ１、染色体９のＱＴＬ２、および／または染色体１１のＱＴＬ３をホモ接合でゲノム中に含み、前記ＱＴＬが、種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８の植物のゲノム中に存在する、方法。
【請求項３１】
ＴＢＲＦＶ感染に対する耐性に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在についてＳ．リコペルシカム植物またはトマト生殖質の遺伝子型解析をする方法であって、検査される前記植物または生殖質のゲノム中において、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを含む核酸を決定または検出するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リコペルシカム・エスクレンタム（Lycopersicum esculentum）としても知られるソヌラム・リコペルシカム（Solanum lycopersicum）植物における、トバモウイルスであるトマト褐色縮葉フルーツウイルス（Tomato Brown Rugose Fruit virus）（ＴＢＲＦＶ）に対する耐性または抵抗性に関する。より具体的には、本発明は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する耐性または抵抗性をもたらす１つ以上の遺伝的決定因子を含むトマト植物および果実に関する。本発明はさらに、１つ以上の遺伝的決定因子と関連するマーカー、および遺伝的決定因子を同定または選択し、そのような耐性または抵抗性を有する植物を同定または選択するためのそのようなマーカーの使用に関する。本発明はまた、そのような植物の種子および子孫、ならびにそのような植物を取得するための繁殖性（propagation）材料、およびこれらの植物の異なる使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
トマトのすべての栽培および商業形態は、リコペルシコン・エスクレンタム・ミラー（Lycopersicon esculentum Miller）と呼ばれることが非常に多い種に属する。リコペルシコンは、トウガラシ、タバコ、およびナスを含む、約９０の属からなると考えられている非常に大きくかつ多様なナス科内の比較的小さな属である。リコペルシコン属は、商業用のトマトと容易に交配することができる種を含むエスクレンタム（esculentum）複合体と、交配させることがかなり難しい種を含むペルビアナム（peruvianum）複合体と、の２つの下位属に分けられている（Stevens, M., and Rick, C. M. 1986）。Ｌ．エスクレンタム・ミラーは、作物としての価値があるため、世界中で広く普及している。栽培トマトの正確な起源が未だに幾分不明であるとしても、それはエクアドル、ペルー、およびガラパゴス島原産のアメリカ大陸から来ているようであり、紀元７００年にはアステカおよびインカによって最初に栽培されていた。メキシコは栽培化の場所であり、最も最初の導入の起源であったようである。チェリートマト、Ｌ．エスクレンタム・バール・セラシフォルメ（L. esculentum var. cerasiforme）は、現代の栽培形態の直接の祖先である。
【０００３】
トマトはその果実のために栽培され、生食用製品または加工製品として広く使用されている。作物として、トマトは環境条件が経済的に採算の合う収量の生産を可能にするところならどこでも商業的に栽培される。新鮮な市場のトマトの大部分は、完熟および緑熟（mature green）の成熟段階で手によって収穫される。新鮮な市場トマトは一年中入手できる。加工トマトは、ほとんどが機械的に収穫され、缶詰のトマト、トマトジュース、トマトソース、ピューレ、ペースト、またはケチャップなどの多くの形態で使用される。
【０００４】
トマトは、通常、１２対の分化した染色体を有する単純な二倍体種である。しかしながら、倍数性トマトも本発明の一部である。栽培されたトマトは自家受粉性であり、ほぼ専ら自家受粉する。トマトの花は雌雄同体である。商業用の栽培品種は、最初は放任受粉されていた。雑種強勢（hybrid vigor）がトマトで同定されたため、交雑種は、より良い収量および植物特性の均一性を有して農家の間でますます人気を獲得することにより、放任受粉品種に置き換わっている。広く普及し、価値が高いため、トマトは、集約的に育種されている。これは、そのように多彩なトマトが現在入手できるのかを説明している。形状は小さいものから大きいものまであり得、チェリー状、プラム状、ナシ状、塊状、円形、およびビーフステーキのタイプがある。トマトは、植物が収穫用の果実を成熟させるのにかかる時間量によってグループ化することができ、一般に、栽培品種は早熟、中熟、または晩熟とみなされる。トマトは、植物の成長習性：確定（determinate）、半確定（semi-determinate）、または不確定（indeterminate）によってグループ化することもできる。確定植物は、最初に葉を成長させ、次いで花をつけ、受粉が成功するとこれが果実に成熟する傾向がある。すべての果物は、ほぼ同時に植物上で熟す傾向がある。不確定トマトは、一部の葉の成長によって始まり、次いで成長期を通して葉および花の生産を続ける。これらの植物は、いつでも、異なる成熟段階のトマト果実を有する傾向がある。半確定トマトは確定と不確定との間の表現型を有し、確定品種よりも大きくなることを除いて、典型的な確定タイプである。より最近のトマト育種での開発により、多彩な果物の色がもたらされている。標準的な赤い熟した色に加えて、トマトは、乳白色、ライムグリーン、ピンク、黄色、金色、オレンジ、または紫色であり得る。
【０００５】
商業用の交雑種トマトの種子は、手による授粉によって生産することができる。雄の親の花粉を収穫し、雌の同系交配の柱頭表面に手で適用する。手による授粉の前後に、昆虫が外来の花粉を持ち込んで混合物または不純物を作らないように花を覆う。花は、種子が収穫される受粉された果物を識別するために標識付けされる。
【０００６】
ウイルス、真菌、細菌、線虫、および昆虫を含む様々な病原体がトマト植物の生産性に影響を与える。トマトは特に多くのウイルスに対して易感染性（susceptible）であるため、ウイルス抵抗性は農業にとって非常に重要である。
【０００７】
トバモウイルスは、農業、特に世界中の野菜および観賞用作物に深刻な被害をもたらす最も重要な植物ウイルスの１つである。トバモウイルスは、機械的手段および種子伝染によって簡単に伝染する。トバモウイルスは一般に、４本のタンパク質をコードする一本鎖の陽性ＲＮＡゲノムを包む約３００ｎｍの桿状粒子によって特徴付けられる。トマトでは、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、トマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）は、例えば不規則な熟成（表面上の黄色がかった斑点および表面下の茶色がかった斑点がある果物）によって、作物生産に深刻な損傷を与える可能性があるため、世界中の栽培者に恐れられている。しかし、長年にわたっていくつかの遺伝子が植物育種家によって同定されており、現在ではＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶ抵抗性トマト品種が利用可能である。
【０００８】
近年、ウイルスの深刻な発生が、ヨルダンやイスラエルなどの中東のトマト生産地域に影響を及ぼした。影響を受けたトマト品種のほとんどは、ＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶ抵抗性と考えられていたが、依然として深刻な影響を受け、典型的なＴＭＶ／ＴｏＭＶ様の症状を示した。葉の症状は、ＴＭＶ／ＴｏＭＶの症状に非常に似ていたのに対し、果物の症状は、果物の病変および変形を伴うこのようなウイルス由来の通常の症状よりも非常に頻繁で深刻であった。果物の品質は非常に悪く、むしろ市場性がなかった。Ｓａｌｅｍら（Arch.Virol. 161（2）503-506. 2015）は、症候のある植物の果実および葉からＲＮＡを抽出し、様々な検査を行い、これにより新しいトバモウイルス種が同定され、これをトマト褐色縮葉フルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）と命名することを提案した。ＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶに対する抵抗性は、この新しいウイルスＴＢＲＦＶに対する抵抗性を付与しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
トバモウイルスは容易に制御されないが、抵抗性遺伝子の同定による遺伝的改善および抵抗性遺伝子の育種での使用により、およびＴＭＶおよび／またはＴｏＭＶを制御するために現在利用可能な抵抗性遺伝子は新しいトマト褐色縮葉フルーツウイルスによる損傷に対して無益であるので、この新しいトバモウイルスに対する抵抗性および／または耐性を同定する緊急の必要性があり、それがうまくいかないと、地域全体においてトマト作物を生産できなくなり得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する耐性または抵抗性を示すトマト植物を同定し、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する耐性または抵抗性をもたらすＱＴＬ（定量的形質遺伝子座）とも以下で称する遺伝的決定因子を位置特定および同定することができた。
【００１１】
本発明による耐性または抵抗性は、ウイルスに感染したトマト植物の葉のレベルで、ウイルスに感染したトマト植物の果物のレベルで、または葉および果実の両方のレベルで、トマト褐色縮葉フルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）に対する耐性または抵抗性を付与することができる新たに発見された遺伝的決定因子によって付与される。新たに発見された遺伝的決定因子は劣性（recessive nature）である。果実の耐性および／または抵抗性は２つのＱＴＬによって独立して付与され、葉の抵抗性は１つのＱＴＬによって付与されるため、特に、本発明者によって提供されるＱＴＬに関連する好適なマーカーに関する情報が与えられれば、異なる遺伝的バックグラウンド(genetic background)、すなわち様々なトマトへのそれらの移入は植物育種の当業者によって容易に実施され得る。
【００１２】
したがって、本発明は、ホモ接合状態で存在する場合に、ＴＢＲＦＶに感染したトマト植物のトマトの葉および／または果実のレベルでＴＢＲＦＶ耐性または抵抗性の表現型を付与する、ここではＱＴＬとも呼ばれるこれらの遺伝的決定因子を提供する。
【００１３】
本発明は、ＴＢＲＦＶに対する耐性または抵抗性を示す商業用のＳ．リコペルシカム植物、およびＴＢＲＦＶに対する抵抗性を示すＳ．リコペルシカム植物または集団（生殖質）を産生または同定する方法を提供する。本発明はまた、葉および／または果実耐性または抵抗性であり得、劣性である、ＴＢＲＦＶに対する耐性または抵抗性をもたらすＱＴＬに関連する分子遺伝マーカー、特にＳＮＰも開示する。そのような分子マーカーの方法および使用により得られた植物も提供される。
【００１４】
本発明はまた、ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬに関連するこれらのＳＮＰに関連する情報のいくつかの方法および使用、特に、ＴＢＲＦＶ耐性植物を同定する方法およびこの耐性に関連するさらなる分子マーカーを同定する方法、およびＴＢＲＦＶに外寄生された（infested）環境でのトマト生産収量を改善する方法、ならびにＴＢＲＦＶ外寄生からトマト畑を保護する方法も提供する。
【００１５】
定義
「抵抗性」という用語は、害虫または病原体に対する植物の反応、および野菜種子産業の非生物的ストレスを記述するためのＩＳＦ（国際種子連盟）野菜および観賞作物セクションによって定義されている。具体的には、抵抗性とは、特定された害虫または病原体の成長および発達を制限する植物品種の能力、および／または同様の環境条件および害虫または病原体の圧力下での易感染性の植物品種と比較した場合にそれらが引き起こす損傷を意味する。抵抗性品種は、重い害虫または病原体の圧力下で、いくつかの病気の症状または損傷を示し得る。
【００１６】
「耐性」という用語は、本明細書において、植物の表現型を示すために使用され、病気の症状のうちの少なくともいくつかは、感染用量のウイルスに上記植物を曝露した際に不存在のままであり、それにより、全身または局所感染の存在、ウイルス増殖、少なくとも上記植物の細胞中のウイルスゲノム配列の存在、および／またはそのゲノムの組み込みを、少なくともいくつかの培養条件下で確立することができる。したがって、耐性植物は、症状の発現には抵抗性であるが、無症状のウイルスキャリアである。ウイルス配列は、病気の症状を引き起こすことなく、植物中に存在するか、または増殖することさえする場合もある。耐性植物は、ウイルスに感染しているが、一般に、ウイルスの増殖および発達を少なくとも穏やかに制限できることを理解されたい。さらに、いくつかの植物は、いくつかの培養条件下で耐性であり、異なる条件下で抵抗性であり得る。したがって、耐性および抵抗性は相互に排他的ではない。
【００１７】
ＴＢＲＦＶの場合、葉（leave）の耐性または葉（foliar）の耐性とは、感染用量のＴＢＲＦＶに上記植物を曝露したときに葉における病気の症状が不存在のままである植物の表現型を意味する。しかしながら、果実における病気の症状は、感染植物に存在し得る。
【００１８】
果実耐性とは、ＴＢＲＦＶの場合、感染用量のＴＢＲＦＶに上記植物を曝露したときに果物における病気の症状が不存在のままである植物の表現型を意味する。しかしながら、葉における病気の症状は、感染植物に存在し得る。
【００１９】
ＴＢＲＦＶ感染の葉の症状には、一般に、モザイク、小葉（leaflet）の捩れ、多くの場合には靴紐様の症状が含まれる。ＴＢＲＦＶ感染の果実の症状には、一般に、典型的な黄色の病変および果実の変形が含まれる。多くの場合、果物には「チョコレート状斑点（chocolate spots）」もある。
【００２０】
易感染性：植物品種が特定の害虫または病原体の成長および発達を制限できないこと；易感染性植物は、ウイルス感染に関連する有害な症状、すなわち、ＴＢＲＦＶ外感染の場合には葉の損傷および果実の損傷を示す。
【００２１】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに易感染性のＳ．リコペルシカム植物は、例えば、２０１５  Ｓａｌｅｍらの刊行物で言及されている商業用の品種カンデラ（ｃａｎｄｅｌａ）である。それはまた、本出願の実施例の部分で言及されているＨａｚｅｒａ第２号およびＨａｚｅｒａ第４号でもあり得る。ＴＢＲＦＶ感染地域で成長した商業用のトマト品種はすべて、現在まで、すなわち本発明の前は、ＴＢＲＦＶに易感染性である。
【００２２】
したがって、本発明による植物は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスの感染地域で成長した品種カンデラ、より一般的には任意の商業用のトマト品種に関して、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する少なくとも改善された抵抗性または耐性、より具体的にはＴＢＲＦＶに対する少なくとも改善された葉の耐性または果実の耐性を有する。
【００２３】
本明細書で使用する場合、「子孫」または「子孫」という用語は、１つ以上の親植物またはその子孫からの無性生殖または有性生殖から子孫として生じる任意の植物を指す。例えば、子孫植物は、親植物のクローニングまたは自殖（selfing）によって得られ、または２つの親植物を交配することによって得られ、自殖ならびにＦ１若しくはＦ２またはさらなる世代を含み得る。Ｆ１は、少なくともその１つが形質のドナーとして初めて使用される親から生産される第１世代の子孫であり、第２世代（Ｆ２）の子孫または後続の世代（Ｆ３、Ｆ４など）の子孫は、Ｆ１、Ｆ２などの自殖から生産される標本である。したがって、Ｆ１は、２つの真の育種親の間の交配から生ずる交雑種であり得（通常はそうである）（真の育種は形質に対してホモ接合である）、Ｆ２は、上記Ｆ１交雑種の自家受粉から生じる子孫であり得る（通常はそうである）。
【００２４】
本明細書で使用する場合、「交配（cross）」、「交配（crossing）」、「交配受粉（cross pollination）」、または「交配育種（cross-breeding）」という用語は、１つの植物上の１つの花の花粉が別の植物の花の胚珠（柱頭）に（人工的または自然に）適用されるプロセスを指す。
【００２５】
本明細書で使用する場合、「遺伝的決定因子」および／または「ＱＴＬ」という用語は、生物学的機能に関連するＤＮＡの任意のセグメントを指す。したがって、ＱＴＬおよび／または遺伝的決定因子には、遺伝子、コード配列、および／またはそれらの発現に必要な調節配列が含まれるが、これらに限定されない。ＱＴＬおよび／または遺伝的決定因子は、例えば他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「遺伝子型」という用語は、個々の細胞、細胞培養物、組織、生物（例えば、植物）、または生物群の遺伝子構造を指す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、「接ぎ木」という用語は、台木に接ぎ穂を接ぎ木する操作である。接ぎ木の主な動機は、病気管理のための遺伝的または化学的アプローチが利用できない場合に、土壌で生育する害虫および病原体による損傷を避けることである。抵抗性の台木に易感染性の接ぎ穂を接ぎ木することにより、抵抗性を品種に引き起こす必要なく、抵抗性の品種を提供することができる。さらに、接ぎ木は、非生物的ストレスに対する耐性を高め、収量を増やし、より効率的な水および栄養の使用をもたらす。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「ヘテロ接合体」という用語は、少なくとも１つの遺伝子座に存在する異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態、遺伝的決定因子、または配列）を有する二倍体または倍数体の個々の細胞または植物を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、「ヘテロ接合」という用語は、特定の遺伝子座における異なる対立遺伝子（所定の遺伝子の形態、遺伝的決定因子、または配列）の存在を指す。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「相同染色体」または「相同体（homolog）」（または相同体（homologue））は、減数分裂中に互いに対になる１つの母系染色体および１つの父系染色体のセットを指す。これらのコピーは、同じ遺伝子座および同じセントロメア位置において同じ遺伝子を有する。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「ホモ接合体」という用語は、すべての相同染色体上の１つ以上の遺伝子座において同じ対立遺伝子を有する個々の細胞または植物を指す。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ホモ接合」という用語は、相同染色体セグメント中の１つ以上の遺伝子座において同一の対立遺伝子が存在することを指す。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「交雑種」という用語は、１つ以上の遺伝子が異なる親間の交配から生じる個々の細胞、組織または植物を指す。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「遺伝子座（locus）」（複数：「遺伝子座（loci）」）という用語は、遺伝的に定義された任意の部位を指し、これは単一の位置（ヌクレオチド）または染色体領域であり得る。遺伝子座は、遺伝子、遺伝的決定因子、もしくは遺伝子の一部、またはＤＮＡ配列であり得、異なる配列によって占有され得る。遺伝子座はまた、ＳＮＰ（一塩基多型）、複数のＳＮＰ、または２つの隣接するＳＮＰによって定義されてもよい。
【００３５】
本明細書で使用する場合、「台木」という用語は、接ぎ木プロセスにおいて接ぎ穂を受け取ることができる植物の下部である。
【００３６】
本明細書で使用する場合、「接ぎ穂」という用語は、接ぎ木プロセスにおいて台木に接ぎ木することができる植物の上部である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明者らは、Ｓ．リコペルシカム植物中にホモ接合で存在する場合に、単独でまたは本出願の他の箇所に記載されている組み合わせなどの組み合わせで、トマト褐色縮葉フルーツウイルス（ＴＢＲＦＶ）に感染しているかまたは感染する可能性があるトマト植物の果物および／または葉において改善された耐性および／または抵抗性を提供する、３つのＱＴＬを同定した。
【００３８】
本発明者らは、特に染色体６および９上でＳ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、ＴＢＲＦＶに感染しているかまたは感染する可能性があるトマト植物の果実において改善された耐性を独立してまたは組み合わせで付与する、２つのＱＴＬ、すなわちＱＴＬ１およびＱＴＬ２を同定した。さらに、本発明者らは、特に染色体１１上でＳ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、ＴＢＲＦＶに感染しているかまたは感染する可能性があるトマト植物の葉において改善された耐性を付与する、１つのＱＴＬを同定した。染色体６、９、および１１上にホモ接合で存在する場合に、３つのＱＴＬは、ＴＢＲＦＶに感染しているかまたは感染する可能性があるトマト植物の葉および果実の両方で改善された耐性および／または抵抗性を付与する。
【００３９】
実施例で実証されるように、本発明による植物の表現型は、ほとんどの状況において、ＴＢＲＦＶに対する、抵抗性ではなく、耐性、すなわち葉耐性、果実耐性、または両方の形態の耐性として最もよく特徴付けられる。しかしながら、特定の状況下では、本発明の植物はＴＢＲＦＶに対する抵抗性を示す。以下では、ＴＢＲＦＶに対する耐性について言及する。しかしながら、この表現型は、特定の状況下で、抵抗性表現型を包含する。
【００４０】
したがって、第１の態様によれば、本発明は、Ｓ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染したトマト植物の果実において改善された耐性を付与する、特にそれぞれ染色体６および／または９上の１つまたは２つのＱＴＬ、すなわちＱＴＬ１および／またはＱＴＬ２をゲノム中に含むＳ．リコペルシカム植物に関する。ＱＴＬ１は染色体６に位置し、ＱＴＬ２は染色体９に位置する。したがって、本発明は、Ｓ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、ＴＢＲＦＶに対するトマト植物において改善された果実の耐性を付与する、特に染色体６上のＱＴＬ、すなわちＱＴＬ１をゲノム中に含むＳ．リコペルシカム植物に関する。本発明はまた、Ｓ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、ＴＢＲＦＶに対するトマト植物において改善された果実の耐性を付与する、特に染色体９上のＱＴＬ、すなわちＱＴＬ２をゲノム中に含むＳ．リコペルシカム植物にも関する。
【００４１】
一実施形態によれば、本発明はさらに、本発明は、Ｓ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染したトマト植物において改善された葉の耐性を付与する、特に染色体１１上の１つのＱＴＬ、すなわちＱＴＬ３をゲノム中に含むＳ．リコペルシカム植物に関する。
【００４２】
本発明は、より具体的には、ＴＢＲＦＶに対する果実の耐性を独立して付与する、染色体６上のＱＴＬ１、若しくは染色体９上のＱＴＬ２、または両方のＱＴＬをゲノム中にホモ接合で含む植物を対象とする。本発明はまた、ＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を付与する、染色体１１上のＱＴＬ３をゲノム中にホモ接合で含む植物にも関する。
【００４３】
一実施形態によれば、本発明は、Ｓ．リコペルシカムバックグラウンド中にホモ接合で存在する場合に、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染したトマト植物の果実および葉において改善された耐性および／または抵抗性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３の様々な組み合わせをゲノム中に含むＳ．リコペルシカム植物に関する。このような組み合わせは、ＱＴＬ１およびＱＴＬ３、ＱＴＬ２およびＱＴＬ３、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３である。より好ましくは、そのような組み合わせは、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３である。すべてのＱＴＬは、ホモ接合で存在することが好ましい。
【００４４】
本発明は、前述の態様のそのような植物の細胞および上記ＱＴＬを含む種子にも関する。
【００４５】
本発明によるＴＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与するＱＴＬは、ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１の種子のゲノム中に存在するＱＴＬから選択される。このＳ．リコペルシカムの種子の試料は、Ｈａｚｅｒａ  Ｓｅｅｄｓ  Ｌｔｄ．Ｂｅｒｕｒｉｍ，Ｍ．Ｐ．Ｓｈｉｍｉｍ７９８３７（イスラエル）により、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約（「ブダペスト条約」、産業、食品、および海洋細菌の国立コレクション（National collection of Industrial, Food and Marine bacteria）（ＮＣＩＭＢ）（ＮＣＩＭＢ，Ｌｔｄ，ファーガソンビル，クレイブストーンエステート，バックスバーン，アバディーンＡＢ２１  ９ＹＡ（Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA），英国）の要件に準拠しかつそれを満たして、２０１７年５月１６日に受託番号４２７５８で寄託されている。このトマト種子の寄託物は、Ｈａｚｅｒａ  Ｓｅｅｄｓ  Ｌｔｄ．Ｂｅｒｕｒｉｍ，Ｍ．Ｐ．Ｓｈｉｍｉｍ７９８３７（イスラエル）によって維持されている。
【００４６】
ＴＢＲＦＶに対する改善された耐性を付与するＱＴＬは、好ましくは、ＱＴＬ１については染色体６上に、ＱＴＬ２については染色体９上に、ＱＴＬ３については染色体１１上に位置する。それらは、より好ましくは、ＱＴＬ１については、ＳＮＰＴＯ−０００５１９７（配列番号１）およびＳＮＰＴＯ−０１４５５８１（配列番号２）を含む染色体６の染色体間隔内に位置し、ＱＴＬ２については、ＳＮＰＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）およびＳＮＰＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）を含む染色体９の染色体間隔内に位置し、ＱＴＬ３については、ＳＮＰＴＯ−０１２２２５２（配列番号７）およびＳＮＰＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）を含む染色体１１の染色体間隔内に位置する。
【００４７】
本明細書で言及されるＳＮＰ（一塩基多型）に対応する特定の多型、およびＳ．リコペルシカムゲノム中のこれらのＳＮＰの隣接配列は、実験セクション（特に、表４、５、６、７、９、および１０を参照のこと）および付随する配列表で示されている。染色体６、９、および１１上のトマトゲノムのバージョン２．４０に対するそれらの位置は、表４、６、および９に示され、それらの隣接配列は、表５、７、および１０並びに配列表にも示されている。
【００４８】
この点に関して、定義により、ＳＮＰはゲノム中の単一のヌクレオチドを指し、これは、存在する対立遺伝子に応じて可変であるが、隣接ヌクレオチドは同一であることに留意されたい。異なるＳＮＰの位置の明確な識別を容易にするために、バージョン２．４０のトマトゲノム配列を参照し、配列番号で識別される隣接配列を参照して、それらの位置を表４、６、９に示す。本出願における特定のＳＮＰに関連する配列、例えばＳＮＰＴＯ−０００５１９７についての配列番号１では、配列内の１つのヌクレオチドのみが実際に多型に対応し、すなわち、配列番号１の６１番目のヌクレオチドがＳＮＰＴＯ−０００５１９７の多型位置に対応し、表４、５、および６に示されるようにＴまたはＣであり得る。隣接配列は、ＳＮＰをゲノム中で位置づけるために示されるが、そのような多型の一部ではない。
【００４９】
本発明者らは、目的の表現型に関与するＱＴＬ、すなわちＴＢＲＦＶに感染した場合における葉および／または果実の耐性の改善が、上記領域に沿った異なる遺伝子座、すなわち１８個の以下のＳＮＰ：染色体６上のＱＴＬ１について、ＴＯ−０００５１９７（配列番号１）およびＴＯ−０１４５５８１（配列番号２）、染色体９上のＱＴＬ２について、ＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）、ＴＯ−０１９６７２４（配列番号４）、ＴＯ−０１４５１２５（配列番号５）、およびＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）、染色体１１上のＱＴＬ３について、ＴＯ−０１２２２５２（配列番号７）、ＴＯ−０１４４３１７（配列番号８）、ＴＯ−０１４２２７０（配列番号９）、ＴＯ−０１４２２９４（配列番号１０）、ＴＯ−０１４２３０３（配列番号１１）、ＴＯ−０１４２３０６（配列番号１２）、ＴＯ−０１８２２７６（配列番号１３）、ＴＯ−０１８１０４０（配列番号１４）、ＴＯ−０１２３０５７（配列番号１５）、ＴＯ−０１２５５２８（配列番号１６）、ＴＯ−０１６２４３２（配列番号１７）、およびＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）により定義される１８個の異なる遺伝子座における配列の存在を同定することにより、上記で言及した染色体領域中に見出されることを同定した。
【００５０】
ＴＢＲＦＶに感染したときに果実の改善された耐性を有する本発明によるトマト植物は、染色体６および／または染色体９上の遺伝子座の少なくとも１つにおいて上記表現型を付与するＱＴＬを有する。好ましくは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染したときに改善された果実の耐性を有する本発明によるトマト植物は、染色体６上の少なくとも１つの遺伝子座および染色体９上の少なくとも１つの遺伝子座においてＱＴＬを有する。あるいは、本発明のトマト植物は、上記で詳述した染色体６上の２つの遺伝子座のうちの少なくとも１つにおいてＴＢＲＦＶに対する果実の耐性を付与するＱＴＬを有するか、または上記で詳述した染色体９上の４つの遺伝子座のうちの少なくとも１つにおいてＴＢＲＦＶに対する果実の耐性を付与するＱＴＬを有する。
【００５１】
ＴＢＲＦＶに感染した場合に葉の改善された耐性を有する本発明によるトマト植物は、染色体１１上の遺伝子座の少なくとも１つにおいてＱＴＬを有する。
【００５２】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染したときに葉および果実の両方のレベルで改善された耐性を有する本発明によるトマト植物は、染色体６および／または染色体９上の遺伝子座の少なくとも１つ、好ましくは、染色体６および染色体９の両方上の少なくとも１つにおいて、および１１番染色体上の遺伝子座の少なくとも１つにおいて表現型を付与する配列を有する。
【００５３】
したがって、本発明の別の実施形態によれば、本発明の植物、種子、または細胞のゲノム中に存在するＱＴＬは、好ましくは、上記で言及した上記１８個のＳＮＰを含む１８個の遺伝子座、すなわち染色体６上のＱＴＬ１について、ＴＯ−０００５１９７（配列番号１）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４５５８１（配列番号２）を含む遺伝子座、染色体９上のＱＴＬ２について、ＴＯ−０１８０９５５（配列番号３）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１９６７２４（配列番号４）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４５１２５（配列番号５）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１９６１０９（配列番号６）を含む遺伝子座、染色体１１上のＱＴＬ３について、ＴＯ−０１２２２５２（配列番号７）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４４３１７（配列番号８）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２７０（配列番号９）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２９４（配列番号１０）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０３（配列番号１１）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０６（配列番号１２）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１８２２７６（配列番号１３）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１８１０４０（配列番号１４）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２３０５７（配列番号１５）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２５５２８（配列番号１６）を含む遺伝子座、ＴＯ−０１６２４３２（配列番号１７）を含む遺伝子座、およびＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）を含む遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上において見出される。
【００５４】
本発明によるトマト植物では、その果実はＴＢＲＦＶに感染した場合に改善された耐性を有し、そのようなトマト植物の植物、種子、または細胞のゲノム中に存在するＱＴＬは、好ましくは、以下の遺伝子座：染色体６上のＱＴＬ１について、ＴＯ−０００５１９７を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４５５８１を含む遺伝子座、および／または染色体９上のＱＴＬ２について、ＴＯ−０１８０９５５を含む遺伝子座、ＴＯ−０１９６７２４を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４５１２５  を含む遺伝子座、およびＴＯ−０１９６１０９を含む遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上において見出される。
【００５５】
本発明によるトマト植物では、その葉はＴＢＲＦＶに感染したときに改善された耐性を有し、そのようなトマト植物の植物、種子、または細胞のゲノム中に存在するＱＴＬは、好ましくは、以下の遺伝子座：染色体１１上のＱＴＬ３について、ＴＯ−０１２２２５２を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４４３１７を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２７０を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２９４を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０３を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０６を含む遺伝子座、ＴＯ−０１８２２７６を含む遺伝子座、ＴＯ−０１８１０４０を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２３０５７を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２５５２８を含む遺伝子座、ＴＯ−０１６２４３２を含む遺伝子座、およびＴＯ−０１６２４２７を含む遺伝子座  のうちの少なくとも１つ以上において見出される。
【００５６】
ＴＢＲＦＶに感染した場合に葉および果実の両方の改善された耐性を有する本発明によるトマト植物について、本発明の植物、種子、または細胞のゲノム中に存在するＱＴＬは、好ましくは、染色体６上のＳＮＰを含む２つの遺伝子座、すなわちＴＯ−０００５１９７を含む遺伝子座およびＴＯ−０１４５５８１を含む遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上、および／または染色体９上のＳＮＰを含む４つの遺伝子座、すなわちＴＯ−０１８０９５５を含む遺伝子座、ＴＯ−０１９６７２４を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４５１２５を含む遺伝子座、ＴＯ−０１９６１０９を含む遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上、ならびに染色体１１上のＳＮＰを含む１２個の遺伝子座、すなわちＴＯ−０１２２２５２を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４４３１７を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２７０を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２２９４を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０３を含む遺伝子座、ＴＯ−０１４２３０６を含む遺伝子座、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２３０５７を含む遺伝子座、ＴＯ−０１２５５２８を含む遺伝子座、ＴＯ−０１６２４３２を含む遺伝子座、およびＴＯ−０１６２４２７を含む遺伝子座のうちの少なくとも１つ以上において見出される。
【００５７】
ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬに対応する本発明の１８個のＳＮＰの対立遺伝子は、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔである。ＴＢＲＦＶに対する耐性を付与するＱＴＬの存在は、上記の特定の対立遺伝子の存在によって明らかにすることができる。したがって、これらのＳＮＰの対立遺伝子は、本発明のＱＴＬの存在を反映することができる。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＴＢＲＦＶに対する耐性を付与するＱＴＬは、本発明のＳＮＰにより区切られた１つ以上の染色体間隔上にある。この実施形態によれば、ＱＴＬ１は、一方の側がＳＮＰＴＯ−０００５１９７により区切られ、他方の側がＳＮＰＴＯ−０１４５５８１により区切られた染色体６の染色体間隔上にある。
【００５９】
別の実施形態によれば、ＱＴＬ２は、一方の側がＳＮＰＴＯ−０１８０９５５により区切られ、他方の側がＳＮＰＴＯ−０１９６１０９により区切られた染色体９の染色体間隔上にある。
【００６０】
別の実施形態によれば、ＱＴＬ３は、一方の側がＳＮＰＴＯ−０１２２２５２により区切られ、他方の側がＴＯ−０１６２４２７により区切られた染色体１１の染色体間隔上にある。ＱＴＬ３が見出される染色体１１のより好ましい染色体間隔は、ＴＯ−０１４４３１７とＴＯ−０１２５５２８とにより区切られた間隔、ＴＯ−０１４２２７０とＴＯ−０１６２４３２とにより区切られた間隔、ＴＯ−０１４４３１７とＴＯ−０１６２４３２とにより区切られた間隔、およびＴＯ−０１４２２７０とＴＯ−０１２５５２８とにより区切られた間隔である。さらに好ましい間隔は、ＴＯ−０１４２２７０とＴＯ−０１２５５２８とにより区切られた間隔である。別の好ましい間隔は、ＴＯ−０１４２２９４とＴＯ−０１２５５２８とにより区切られ、かつそれらを含む間隔である。
【００６１】
この点において、染色体における特定の位置は、ゲノム上でそれらを明確に位置付けするために上記ＳＮＰの隣接配列が定義される限り、実際に一塩基多型に関して定義することができることに留意されたい。本発明者らは、異なる対立遺伝子を有する、それらの隣接配列によって同定されたＳＮＰを使用して、本発明のＱＴＬを同定および追跡した。
【００６２】
２つのＳＮＰ  ＸおよびＹで区切られた染色体領域は、これら２つのＳＮＰの位置の間にあり、かつ上記ＳＮＰを含む染色体の区画を指し、したがって、この染色体領域のヌクレオチド配列は、ＳＮＰ  Ｘに対応するヌクレオチドで始まり、ＳＮＰ  Ｙに対応するヌクレオチドで終わり、すなわち、本発明の意味において、ＳＮＰは、それらが区切る領域内に含まれる。
【００６３】
本発明の植物、種子、または細胞において、目的の表現型を付与するＱＴＬの存在は、ＴＢＲＦＶに対する耐性が果実の耐性である場合、好ましくは、染色体６上のＱＴＬ１について、ＴＯ−０００５１９７および／またはＴＯ−０１４５５８１により特徴付けられ、ならびに／あるいは染色体９上のＱＴＬ２について、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、および／またはＴＯ−０１９６１０９により特徴付けられ、ＴＢＲＦＶに対する耐性が葉の耐性である場合、好ましくは、染色体１１上のＱＴＬ３について、ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７により特徴付けられ、最も好ましくは、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８により、さらにより好ましくはＴＯ−０１８２２７６により特徴付けられる。
【００６４】
本発明によるトマト植物のゲノム中にホモ接合で存在する場合、ＱＴＬ１および／またはＱＴＬ２は、ＴＢＲＦＶに対する果実の抵抗性／耐性を独立しておよび集合的に付与し、ＱＴＬ３はＴＢＲＦＶに対する葉の抵抗性／耐性を付与する。３つのＱＴＬが本発明によるトマト植物のゲノム中にホモ接合で存在する場合、あるいはＱＴＬ１およびＱＴＬ３またはＱＴＬ２およびＱＴＬ３がホモ接合で存在する場合、そのような植物はＴＢＲＦＶに対する改善された果実および葉の耐性を有する。
【００６５】
本発明はまた、改善された表現型を有し、本発明のＱＴＬの１つ以上をホモ接合で有する植物を別のＳ．リコペルシカムと交配することにより得ることができるＳ．リコペルシカムの交雑種植物に関する。改善された表現型を有し、本発明のＱＴＬの１つ以上をホモ接合で有する植物は、ＴＢＲＦＶに対する果実の耐性を有するトマト植物であり得、そのような場合、ＱＴＬ１および／またはＱＴＬ２をホモ接合で有し、ＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を有するトマト植物であり得、そのような場合、ＱＴＬ３をホモ接合で有し、またはＴＢＲＦＶに対する果実および葉の両方の耐性を有する植物であり得る。後者の場合、トマト植物は、ＱＴＬ１およびＱＴＬ３、ＱＴＬ２およびＱＴＬ３、またはＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３、好ましくはＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３をホモ接合で有する。本発明のＱＴＬは劣性様式で作用するので、上記の交配により生産されたＳ．リコペルシカムの交雑種植物は、他のＳ．リコペルシカム交配パートナーが本発明のＱＴＬを有する場合にのみ、ＴＢＲＦＶに対する葉および／または果実耐性を有する。他のＳ．リコペルシカムの交配パートナーが本発明のＱＴＬを欠く場合、交配から生じる交雑種は本発明のＱＴＬをヘテロ接合様式で有し、トマト植物は葉および／または果実耐性を有しない。しかしながら、それらの抵抗性／耐性の子孫は、育種の当業者に利用可能である。
【００６６】
好ましくは、本発明によるＳ．リコペルシカム植物は、商業用の植物または系統である。そのような商業用の植物または系統は、好ましくは、例えば、ＴｏＭＶ（トマトモザイクウイルス）に対する抵抗性も付与する、Ｔｍ−２（対立遺伝子Ｔｍ−２もしくはＴｍ−２２（Ｔｍ−２ａとしても知られている）またはＴｍ−１抵抗性遺伝子の存在により、ＴＭＶ（タバコモザイクウイルス）に対する抵抗性も示す。本発明のこの態様による植物は、好ましくは、以下の追加の特徴：線虫抵抗性形質（Ｍｉ−１またはＭｉ−ｊ）、ならびにフザリウムおよびバーティシリウム抵抗性も有する。
【００６７】
本発明によれば、他の抵抗性または耐性も企図される。
【００６８】
好ましい実施形態によれば、本発明の植物は、ペピーノモザイクウイルス（ＰｅｐＭＶ）に対して抵抗性ではない。別の実施形態によれば、本発明のトマト植物は、ＰｅｐＭＶにも抵抗性である。
【００６９】
さらに別の実施形態によれば、本発明の植物は、確定、不確定、または半不確定（すなわち確定、不確定、または半不確定の成長習性に対応する）植物またはその種子もしくは細胞である。
【００７０】
確定とは、最初に葉を成長させ、次いで花をつけ、受粉が成功した場合にこれが成熟して果実となる傾向があるトマト植物を意味する。すべての果物は、ほぼ同時に植物上で熟す傾向がある。不確定トマトは、一部の葉の成長によって始まり、成長期を通して葉および花の生産を続ける。これらの植物は、いつでも、異なる成熟段階のトマト果実を有する傾向がある。半確定トマトは、確定と不確定との間の表現型を有し、確定品種よりも大きくなることを除いて、典型的な確定タイプである。
【００７１】
さらに別の実施形態によれば、本発明の植物は、接ぎ木プロセスにおける接ぎ穂または台木として使用される。接ぎ木は、ウリ科などの作物で長年使用されてきたプロセスであるが、最近ではトマトでのみ使用されている。接ぎ木は、疫病菌などの地中の病原体（telluric pathogen）またはある特定の線虫に対する特定のレベルの耐性を提供するために使用され得る。したがって、接ぎ木は、栽培される植物または品種と外寄生した土壌との間の接触を防ぐことを意図している。接ぎ木または接ぎ穂として使用される目的の品種、任意選択により、Ｆ１交雑種は、台木として使用される抵抗性植物へと接ぎ木される。抵抗性台木は健常なままであり、病気から隔離する接ぎ木に土壌から通常の供給を提供する。
【００７２】
さらに、本発明の商業用の植物は、好適な条件で果実を生じ、この果実は、完全な成熟で少なくとも２５ｇ、好ましくは完全な成熟で少なくとも１００ｇ、さらにより好ましくは完全な成熟で少なくとも２００ｇである。
【００７３】
上記のように、本発明は、改善された表現型を示すＳ．リコペルシカム植物およびその植物を生じさせる種子に関する。
【００７４】
本発明による植物または種子は、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８でＮＣＩＭＢに寄託された寄託種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１から成長した植物の子孫（progeny）または子孫（offspring）であり得る。寄託された種子から成長した植物は、実際に、改善された表現型を付与する本発明のＱＴＬについてホモ接合であり、したがって、それらは、染色体６、９、および１１の各相同体上の目的のＱＴＬをゲノム中に有する。それらは、交配、自殖、および／または戻し交配によって、これらの配列を別のバックグラウンドに移すために使用される。
【００７５】
本発明はまた、ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）の寄託された種子、およびこれらの種子のうちの１つから成長した植物に関する。これらの種子は、目的の表現型を付与するＱＴＬをホモ接合で含む。これらの種子は植物品種に対応せず、本発明のＱＴＬを除くほとんどの遺伝子についてホモ接合ではないことに留意されたい。したがって、それらの表現型は、本発明の葉および果実の抵抗性／耐性を除いて、繁殖の際に固定されない。それらの表現型特性のほとんどは、本発明のＴＢＲＦＶ葉および果実の抵抗性／耐性を除いて、繁殖中に分離する（segregate）。
【００７６】
本発明はまた、上記で定義される植物または種子、すなわち、ホモ接合またはヘテロ接合状態の目的の１つ、２つ、または３つのＱＴＬを含み、上記配列がホモ接合で存在する場合に改善された表現型を付与する植物または種子に関し、この植物または種子は、ＱＴＬをＳ．リコペルシカム植物（その代表的な種子はＮＣＩＭＢ受託ＮＣＩＭＢ−４２７５８で寄託されている）から別のＳ．リコペルシカム遺伝的バックグラウンドに移すことにより、例えば、上記植物を第２のトマト植物親と交配し、目的の表現型の原因となるＱＴＬを有する植物を選択することにより得ることができる。このような交配では、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／もしくはＱＴＬ３、またはそれらの任意の組み合わせを移し得る。好ましくは、果実耐性を有する植物を取得するためには、ＱＴＬ１のみ、もしくはＱＴＬ２のみ、またはＱＴＬ１およびＱＴＬ２の両方が寄託された種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）から移され、葉の耐性を有する植物を取得するためには、ＱＴＬ３が寄託された種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）から移され、果実および葉の両方の耐性を有する植物を取得するためには、ＱＴＬ１およびＱＴＬ３、ＱＴＬ２およびＱＴＬ３、またはＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３、好ましくはＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３が、寄託された種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）から移される。
【００７７】
本発明の種子または植物は、異なるプロセスによって得ることができ、本質的に生物学的なプロセスによって専ら得られるわけではないことに留意されたい。
【００７８】
このような態様によれば、本発明は、トマト植物または種子、好ましくは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実および／または葉の耐性を提供する１つ以上の変異をゲノム中に含み得る、天然に存在しないトマト植物または種子に関し、この変異は、例えば、代表的な試料が寄託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８でＮＣＩＭＢに寄託されている植物のゲノム中に存在する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実および／または葉の耐性を植物に提供する１つ以上の変異をゲノム中に有するトマト植物または種子を取得する方法に関する。このような方法は実施例７に示されており、以下：
ａ）改変されるトマト植物のＭ０種子を変異誘発剤で処理してＭ１種子を得ことと、
ｂ）このようにして得られたＭ１種子から植物を成長させてＭ１植物を取得することと、
ｃ）Ｍ１植物の自家受精によるＭ２種子の生産することと、
ｄ）任意選択により、ステップｂ）およびｃ）をｎ回繰り返して、Ｍ１＋ｎ種子を取得すること、を含み得る。
【００８０】
Ｍ１＋ｎ種子を成長させて植物にし、トマト褐色縮葉フルーツウイルス感染を享受させる。生存している植物またはより軽いＴＢＲＦＶ感染症状を有する植物は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実および／または葉の耐性についての選択を続けながら、さらに１世代以上増殖される。
【００８１】
この方法では、ステップａ）のＭ１種子は、ＥＭＳ変異誘発などの化学変異誘発によって取得することができる。他の化学変異誘発剤には、硫酸ジエチル（ｄｅｓ）、エチレンイミン（ｅｉ）、プロパンスルトン、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソウレタン（ｍｎｕ）、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＮＭＵ）、Ｎ−エチル−Ｎ−ニトロソウレア（ｅｎｕ）、およびアジ化ナトリウムが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
あるいは、変異は、例えばＸ線、高速中性子、ＵＶ放射から選択される、照射により誘発される。
【００８３】
本発明の別の実施形態では、変異は遺伝子工学によって誘発される。そのような変異には、果実および／または葉のＴＢＲＦＶ抵抗性を付与する配列の挿入、ならびに果実および／または葉のＴＢＲＦＶ抵抗性または耐性を付与する代替配列による在中の配列（residing sequences）の置換も含まれる。好ましくは、変異は、Ｓ．リコペルシカム植物の相同配列の代わりの、上記のＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３のうちの１つ以上の挿入である。さらにより好ましくは、変異は、代表的な試料が寄託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８でＮＣＩＭＢに寄託された植物のゲノム中に存在する染色体１１上の相同配列による、Ｓ．リコペルシカムゲノムの染色体１１上のＳＮＰＴＯ−０１２２２５２（配列番号７）およびＳＮＰＴＯ−０１６２４２７（配列番号１８）内に含まれる配列またはその断片の置換であり、該配列またはその断片はＴＢＲＦＶに対する葉の抵抗性を付与する。
【００８４】
使用することができる遺伝子工学的手段には、遺伝的変異により植物に新しい特性を作り出すために開発および／または使用される様々な新しい技術である新しい育種技術（New Breeding Techniques）と呼ばれるすべての技術の使用が含まれ、その目的は、標的化変異誘発、すなわち新しい遺伝子または遺伝子サイレンシング（ＲｄＤＭ）の標的化導入である。そのような新しい育種技術の例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）技術（ＺＦＮ−１、ＺＦＮ−２、およびＺＦＮ−３、米国特許第９，１４５，５６５号を参照のこと）、オリゴヌクレオチド誘発突然変異導入（ＯＤＭ）、シスジェネシスおよびイントラジェネシス、接ぎ木（ＧＭ台木上）、逆育種、アグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ａｇｒｏ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ「ｓｅｎｓｕ  ｓｔｒｉｃｔｏ」，ａｇｒｏ−ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ，ｆｌｏｒａｌ  ｄｉｐ））、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ、米国特許第８，５８６，３６３号および同９，１８１，５３５号を参照のこと）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム（米国特許第８，６９７，３５９号、同８，７７１，９４５号、同８，７９５，９６５号、同８，８６５，４０６号、同８，８７１，４４５号、同８，８８９，３５６号、同８，８９５，３０８号、同８，９０６，６１６号、同８，９３２，８１４号、同８，９４５，８３９号、同８，９９３，２３３号、および同８，９９９，６４１号を参照のこと）、工学操作（engineered）メガヌクレアーゼ  再工学操作ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡガイド（DNA guided）ゲノム編集（Gao et al., Nature Biotechnology（2016)）、および合成ゲノミクスの使用により促進される標的化配列の変更である。新しい育種技術の別の名称である標的化ゲノム編集の主要な部分は、改変が意図されるゲノム中の選択された場所でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の誘発の適用である。ＤＳＢの指向性（directed）修復により、標的化ゲノム編集が可能となる。そのような適用を利用して、変異（例えば、標的化変異または正確なネイティブ遺伝子編集）および遺伝子（シス遺伝子（cisgene）、イントラ遺伝子（intragene）、またはトランス遺伝子（transgene））の正確な挿入を生成することができる。変異を引きこす適用はしばしば、ＳＤＮ１、ＳＤＮ２、ＳＤＮ３などの部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＤＮ）テクノロジーとして同定される。ＳＤＮ１の場合、成果は、標的化された非特異的遺伝子欠失変異である：ＤＮＡ  ＤＳＢの位置は正確に選択されるが、宿主細胞によるＤＮＡ修復はランダムであり、小さなヌクレオチドの欠失、付加、または置換が生じる。ＳＤＮ２の場合、ＳＤＮは、標的化ＤＳＢを生成するために使用され、ＤＮＡ修復鋳型（１つまたはいくつかのヌクレオチドの変更を除いて、標的化ＤＳＢ  ＤＮＡ配列と同一の短いＤＮＡ配列）は、ＤＳＢを修復するために使用される：成果は、目的の所望の遺伝子における標的化された所定の点変異である。ＳＤＮ３に関しては、ＳＤＮは、新しいＤＮＡ配列（遺伝子など）を含むＤＮＡ修復鋳型とともに使用される。この技術の成果は、そのＤＮＡ配列の植物ゲノムへの挿入である。ＳＤＮ３の使用を示す最も可能性の高い適用は、選択されたゲノム位置でのシスジェニック、イントラジェニック（intragenic）、またはトランスジェニック発現カセットの挿入であろう。これらの各手法の完全な説明は、２０１１年に欧州委員会共同研究センター（ＪＲＣ）未来技術研究所によって作成された「新しい植物育種技術−商業開発のための最新技術と展望」という表題のレポートに記載されている。
【００８５】
本発明はまた、別の態様において、上記の本発明の種子または植物から得られる可能性のある任意の植物、およびそのような植物の植物部分、最も好ましくは、外植片、接ぎ穂、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、および任意の他の植物部分にも関し、上記の植物、外植片、接ぎ穂、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎、葉柄、および／または植物の部分は、本発明の第１の態様による種子または植物、すなわち、いずれの組み合わせでもよい１つ、２つ、または３つのＱＴＬをゲノム中にホモ接合またはヘテロ接合で有する種子または植物から得ることができる。これらの植物部分、特に、外植片、接ぎ穂、挿し木、種子、果実、根、台木、花粉、胚珠、胚、プロトプラスト、葉、葯、茎または葉柄は、ホモ接合で存在する場合に目的の表現型、すなわちＴＢＲＦＶに対する果実および／または葉の耐性を付与するＱＴＬをゲノム中に含む。
【００８６】
本発明のこの態様で言及されるＱＴＬは、本発明の植物の関連において上記で定義されたＱＴＬである。本発明の第１の態様に関して定義されたＱＴＬの異なる特徴は、本発明のこの態様に準用する。したがって、ＱＴＬは、好ましくは、寄託された材料ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８）に対応する植物のゲノム中に存在するＱＴＬから選択される。それらは、目的のＱＴＬに応じて、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの存在、好ましくは、ホモ接合でのこの対立遺伝子またはこれらの対立遺伝子の存在、すなわちＴＯ−０００５１９７の２つの対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の２つの対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の２つの対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の２つの対立遺伝子Ｔ，ＴＯ−０１４４３１７の２つの対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の２つの対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の２つの対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の２つの対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の２つの対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の２つの対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の２つの対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の２つの対立遺伝子Ｔの存在によって有利に特徴付けられる。
【００８７】
本発明はまた、Ｓ．リコペルシカム植物の細胞にも関し、これらの細胞は、ゲノム中にＳ．リコペルシカム植物に目的の表現型を付与する本発明のＱＴＬを含み、好ましくは、これらのＱＴＬはホモ接合で存在する。ＱＴＬは、本発明の枠内で既に定義されたものであり、本発明の前述の態様による植物および種子に関して既に開示された同じ特徴および好ましい実施形態によって特徴付けられる。これらのＱＴＬの存在は、上記で開示され、熟練した読み手に周知である技術によって明らかにすることができる。特に、ＱＴＬが本発明のそのような細胞のゲノム中にホモ接合またはヘテロ接合のどちらで存在するかを決定することができる。それらは、目的のＱＴＬに応じて、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの存在、好ましくは、各染色体上で同時に、すなわちホモ接合でのこの対立遺伝子またはこれらの対立遺伝子の存在によって有利に特徴付けられる。
【００８８】
本発明による細胞は、Ｓ．リコペルシカム細胞の任意の種類、特に単離された細胞および／または目的のＱＴＬを有するＳ．リコペルシカム植物全体を再生することができる細胞であり得る。
【００８９】
本発明はまた、本発明による上記で定義された植物の非再生可能または再生可能細胞の組織培養物にも関する。好ましくは、再生可能な細胞は、本発明の胚、プロトプラスト、分裂組織細胞、カルス、花粉、葉、葯、茎、葉柄、根、根端、果実、種子、花、子葉、および／または胚軸に由来し、この細胞は、ホモ接合で存在する場合に改善された表現型を付与する、すなわち、ＱＴＬ１および／またはＱＴＬ２についてはＴＢＲＦＶに対する果実耐性、ＱＴＬ３についてはＴＢＲＦＶに対する葉耐性を付与する、いずれの組み合わせでもよい１つ、２つ、または３つの目的のＱＴＬをゲノム中にホモ接合またはヘテロ接合で含む。
【００９０】
組織培養物は、好ましくは、前述のトマト植物の生理学的および形態学的特徴を有する植物を再生することができ、前述のトマト植物と実質的に同じ遺伝子型を有する植物を再生することができる。本発明はまた、本発明の組織培養物から再生されたトマト植物も提供する。
【００９１】
本発明はまた、上記で定義された植物のプロトプラスト、または上記で定義された組織培養物由来のプロトプラストも提供し、このプロトプラストは、本発明の改善された表現型を付与するＱＴＬを含む。
【００９２】
別の態様によれば、本発明は、本発明の改善された表現型を有するＳ．リコペルシカム植物を取得するための育種プログラムにおける育種パートナーとしての、好ましくは本発明のＱＴＬをホモ接合で含む本発明のトマト植物の使用にも関する。実際に、そのような育種パートナーは、目的の表現型を付与するＱＴＬをゲノム中にホモ接合で保有する。したがって、この植物をトマト植物、特に系統と交配することにより、所望の表現型を付与する本発明の１つ、２つ、または３つのＱＴＬを子孫に移すことが可能である。したがって、本発明による植物は、所望の表現型をＳ．リコペルシカム植物または生殖質に付与するＱＴＬを移入するための育種パートナーとして、好ましくは葉の抵抗性の原因となるＱＴＬを移すために使用することができる。目的のＱＴＬをヘテロ接合で有する植物または種子は、上記で詳述したように育種パートナーとしても使用することができるが、表現型の分離により、育種プログラムがより複雑になる可能性がある。
【００９３】
本発明の改善された表現型は、ＴＢＲＦＶに対する耐性、特に葉の耐性または果実の耐性、または果実および葉の耐性の組み合わせである。
【００９４】
移入されたＱＴＬは、病気に対する抵抗性、果実の早熟、干ばつ耐性、果実形状などの他の所望の遺伝的形質を含む品種に有利に導入されるであろう。
【００９５】
本発明はまた、受託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８でＮＣＩＭＢに寄託されたＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１の植物または種子との同じ使用にも関する。この植物は、Ｓ．リコペルシカム植物または生殖質に所望の表現型を付与することを目的とする育種プログラムにおける移入パートナーとしても好適である。
【００９６】
このような育種プログラムにおいて、所望の表現型を示す子孫または所望の表現型に関連するＱＴＬを有する子孫の選択は、ＳＮＰマーカーの対立遺伝子、特に本発明のＳＮＰマーカーに基づいて有利に行うことができる。
【００９７】
植物の子孫は、好ましくは、染色体６上のＱＴＬ１の存在についてのＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔおよび／またはＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、染色体９上のＱＴＬ２の存在についてのＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇおよび／またはＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、染色体１１上のＱＴＬ３の存在についてのＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの存在について選択される。ＱＴＬの劣性により、植物の子孫は、各染色体の両方のホモログ上の同じ対立遺伝子の存在について選択されることが好ましい。
【００９８】
あるいは、改善された表現型に関連する本発明の１８個のＳＮＰの対立遺伝子のうちのいずれか１つまたはこれらの対立遺伝子の組み合わせの存在に基づいて、選択を行うことができる。そのような実施形態によれば、選択は、達成されるＱＴＬの組み合わせ（ＱＴＬ１およびＱＴＬ２、ＱＴＬ１およびＱＴＬ３、ＱＴＬ２およびＱＴＬ３、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３、好ましくはできればＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３）に応じて、ＱＴＬ１についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子の存在、もしくはＱＴＬ２についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子、もしくはＱＴＬ３についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子の存在、またはＱＴＬ１についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子の存在、もしくはＱＴＬ２についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子、および／もしくはＱＴＬ３についての少なくとも１つのＳＮＰ対立遺伝子の同時存在について、選択を行うことができる。そのような選択は、選択される植物の遺伝物質試料中の目的の対立遺伝子の存在について行われる。これらの対立遺伝子の存在により、上記ＳＮＰによって定義される遺伝子座における本発明のＱＴＬの存在が実際に確認される。さらに、点変異または組換え事象に加えて、これらの対立遺伝子のうちの少なくとも１つまたは２つが失われ、目的のＱＴＬを有する残りの染色体断片が依然として目的の表現型を付与することが考えられる。
【００９９】
したがって、本発明による植物または受託番号ＮＣＩＭＢ４２７５８で寄託された種子から成長した植物は、本発明の改善された表現型を有する商業用のトマト系統および品種を取得するためのマーカー利用選択において特に価値がある。
【０１００】
本発明はまた、所望の表現型を付与する遺伝子配列の同定、配列決定、および／またはクローニングを目的とするプログラムにおける上記植物の使用にも関する。
【０１０１】
本発明の前述の態様について記載された任意の特定の実施形態は、特に目的の表現型を付与するＱＴＬの特徴に関して、本発明のこの態様にも適用可能である。
【０１０２】
本発明はまた、ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８）の種子のゲノム中に見出される本発明のＱＴＬを有するＳ．リコペルシカム植物を同定、検出、および／または選択する方法にも関し、上記ＱＴＬは、上記配列を欠く対応する植物に対して、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する耐性および／または抵抗性の改善された表現型を付与し、該方法は、同定および／または選択される植物の遺伝物質試料中において、以下のマーカー：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを検出することを含む。
【０１０３】
本発明はまた、ホモ接合で存在する場合にのみＴＢＲＦＶに対する抵抗性を付与するＱＴＬを有し、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを有するＳ．リコペルシカム植物を検出または選択するための方法にも関し、検出または選択は、検査される植物へのＴＢＲＦＶの接種を含むＴＢＲＦＶ感染の条件で行われる。好ましい実施形態によれば、本方法は、ホモ接合性で存在する場合にのみＴＢＲＦＶに対する葉の抵抗性または耐性を付与するＱＴＬを有し、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを有するＳ．リコペルシカム植物を検出または選択するためであり、検出または選択は、検査される植物の葉へのＴＢＲＦＶの接種を含むＴＢＲＦＶ感染の条件で行われる。
【０１０４】
本方法は、抵抗性を付与する本発明のＱＴＬを含む、最初の親またはその子孫としてのＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８）を用いた育種プログラムに特に適合され、検出および／または選択は、ＴＢＲＦＶによる外寄生を含む条件で行われ、上記移入された配列は、ＴＢＲＦＶに対する耐性または抵抗性を付与し、以下のマーカー：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つ、より好ましくは染色体１１の対立遺伝子、さらにより好ましくはＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを有する。
【０１０５】
さらに、本発明は、１８個のＳＮＰから選択された少なくとも１つＳＮＰの対立遺伝子の検出に基づいて、改善された表現型を付与する本発明のＱＴＬのうちの少なくとも１つを有するＳ．リコペルシカム植物を検出および／または選択する方法に関する。
【０１０６】
好ましくは、本発明のＱＴＬを有する植物は、以下のマーカー：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ以上、またはすべてが、選択される植物の遺伝物質試料中に検出される場合に、選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃの少なくとも一方または両方が検出された場合に、ＱＴＬ１の存在について選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇののうちの少なくとも１つ、２つ、もしくは３つ、または４つが検出された場合、ＱＴＬ２の存在について選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子ＣおよびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、または５つ以上が検出された場合、ＱＴＬ３の存在について選択される。
【０１０７】
植物は、本発明の対立遺伝子の組み合わせを有する場合にも検出される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃの少なくとも一方または両方が検出された場合、および以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、または４つが検出された場合に、ＱＴＬ１およびＱＴＬ２の存在について選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃの少なくとも一方または両方が検出された場合、および以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、または５つ以上が検出された場合、ＱＴＬ１およびＱＴＬ３の存在について選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、または４つが検出された場合、および以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子ＣおよびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、または５つ以上が検出された場合、ＱＴＬ２およびＱＴＬ３の存在について選択される。植物は、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃのうちの少なくとも一方または両方が検出された場合、および以下の対立遺伝子：ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ，ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、ならびにＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つ、もしくは２つ、もしくは３つ、もしくは４つ、または５つ以上が検出された場合、ＱＴＬ１、ＱＴＬ２、およびＱＴＬ３の存在について選択される。
【０１０８】
本発明の前述のすべての態様において、ＴＢＲＦＶに対する好ましい耐性は、葉の耐性である。好ましいＳＮＰは、本発明のすべての態様に関して、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、およびＴＯ−０１２５５２８であり、さらにより好ましくはＴＯ−０１８２２７６である。
【０１０９】
本発明はさらに、上記のＱＴＬの存在を明らかにする任意の分子マーカーの検出に基づいて、改善された表現型を付与する本発明のＱＴＬの少なくとも１つを有するＳ．リコペルシカム植物を検出および／または選択するための方法に関する。実際に、本発明のＱＴＬが本発明者らによって同定され、本発明の１８個のＳＮＰに加えて、分子マーカーの同定および使用は、当業者によって行われ得る。ＱＴＬ自体は、本発明の１８個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの存在によって継続して特徴付けられるが、それらはまた、異なる代替マーカーの使用により同定されるであろう。トマトゲノム中の本発明のＱＴＬを同定するための任意のそのような分子マーカーの方法および使用であって、該ＱＴＬは、該ＱＴＬを欠く対応する植物に関して、ＴＢＲＦＶに対する葉および／または果実の耐性を付与し、上記ＱＴＬは、以下のＳＮＰ：ＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１４５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、ＴＯ−０１９６１０９、ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のうちの少なくとも１つの存在により特徴付けられる、方法および使用が本発明に含まれる。
【０１１０】
トマトゲノム中の本発明のＱＴＬを同定するための任意のそのような分子マーカーの方法および使用であって、ＱＴＬは、該ＱＴＬを欠く対応する植物に対して、ＴＢＲＦＶに対する葉および／または果実の耐性を付与し、該ＱＴＬは、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの少なくとも１つの存在によって特徴付けられる、方法および使用も含まれる。
【０１１１】
さらに別の態様によれば、本発明は、所望の表現型を有するＳ．リコペルシカム植物、特に商業用の植物および近交系の親系統の生産のための方法またはプロセスにも関する。本発明は、実際に、定義された改善された表現型を付与する本発明の１つ、２つ、または３つのＱＴＬを他のトマト品種または他の種もしくは近交系の親系統に移すことも目的とし、新しいタイプおよび品種のトマトを生産するのに有用である。
【０１１２】
これらの特徴を有する植物の生産のための方法またはプロセスは、以下のステップを含み得る：
ａ）ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長した植物と、好ましくは上記ＱＴＬを欠く、最初のＳ．リコペルシカム植物とを交配するステップ、
ｂ）このようにして得られた子孫において、本発明のＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３のうちの１つ、２つ、または３つを有する１つの植物を選択するステップ、
ｃ）任意選択により、ステップｂ）で得られた植物を１回または数回自家受粉し、このようして得られた子孫において、子孫の植物に存在するＱＴＬに応じて、果実の耐性、葉の耐性、またはその両方でもよいＴＢＲＦＶに対する耐性を有する植物を選択するステップ。
【０１１３】
あるいは、本方法またはプロセスは、ステップａ）の代わりに以下のステップを含み得る：
ａ１）ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子（ＮＣＩＭＢ４２７５８）またはその子孫に対応する植物と、好ましくは上記ＱＴＬを欠く、最初のＳ．リコペルシカム植物とを交配するステップ、
ａ２）自殖によってＦ１交雑種を増殖し、Ｆ２集団を生成するステップ。
【０１１４】
上記の方法またはプロセスにおいて、ＳＮＰマーカーは、好ましくは、目的の耐性および／または抵抗性の表現型を付与する配列を有する植物を選択するためにステップｂ）および／またはｃ）で使用される。
【０１１５】
ＳＮＰマーカーは、好ましくは、本発明の１８個のＳＮＰマーカーのうちの１つ以上（本出願の他の箇所で言及されるそれらのすべての組み合わせを含む）である。
【０１１６】
好ましい実施形態によれば、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉耐性を有する植物の選択は、ＴＯ−０１８２２７６に基づいて、またはＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８のうちの少なくとも１つに基づいて行われる。
【０１１７】
ＳＮＰの対立遺伝子が、このＳＮＰについてのＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１親の対立遺伝子に対応する対立遺伝子であり、最初のＳ．リコペルシカム植物の対立遺伝子ではない場合に、１つ以上のＳＮＰの対立遺伝子に基づいて植物を選択することにより、最初の植物に関して、果実の耐性／抵抗性、葉の耐性／抵抗性、またはその両方でよいＴＢＲＦＶに対する耐性を有するものとして植物が選択されることを理解されたい。例えば、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔが検出された場合に、本発明の改善された表現型を有するものとして、植物が選択され得る。
【０１１８】
好ましくは、ステップａ）のＳ．リコペルシカム植物は、商業的に望ましい形質または望ましい植物栽培形質を有する植物を取得するために使用される優秀な系統である。
【０１１９】
上記で定義された方法またはプロセスは、Ｓ．リコペルシカム植物のすべての特徴的な特徴を有する植物を取得するために、好ましくはステップｃ）の後に、戻し交配ステップを有利に含み得る。その結果、これらの特徴を有する植物の生産のための方法またはプロセスは、以下の追加のステップも含み得る：
ｄ）ステップｂ）またはｃ）で選択した抵抗性植物をＳ．リコペルシカム植物と戻し交配するステップ、
ｅ）最初の植物に関して、本発明のＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３のうちの１つ、２つ、または３つを有する植物を選択するステップ。
【０１２０】
ステップａ）で使用される植物、すなわち、寄託された種子に対応する植物は、寄託された種子から成長した植物であり得る。あるいは、それは、表現型を付与するＱＴＬを有する、好ましくはこれらの配列をホモ接合で有する、本発明の第１の態様による任意の植物であり得る。
【０１２１】
ステップｅ）において、ＳＮＰマーカーは、最初の植物に関して、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性を有する植物を選択するために使用することができる。前の項目で説明したように、ＳＮＰマーカーは、本発明のＳＮＰマーカーである。
【０１２２】
好ましい実施形態によれば、本発明の方法またはプロセスは、選択ステップ、すなわちｂ）、ｃ）、および／またはｅ）の少なくとも１つについては、選択が、以下の対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つの検出に基づくようにして行われる。
【０１２３】
改善された表現型を有し、この表現型を付与するＱＴＬの１つ以上をホモ接合で有する植物を選択する場合、選択は、ＱＴＬを代表する対立遺伝子、すなわち対立遺伝子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１親の存在について、再発Ｓ．リコペルシカム親を代表する対立遺伝子の不存在と組み合わせて、本発明の１つ以上のＳＮＰに基づいて行われることに留意されたい。
【０１２４】
ステップｅ）で選択される植物は、好ましくは商業用の植物、特に、通常の培養条件での完熟状態で少なくとも２５ｇ、少なくとも１００ｇ、または少なくとも２００ｇの重量を有する果実を有する植物である。
【０１２５】
好ましくは、ステップｄ）およびｅ）は、少なくとも２回、好ましくは３回繰り返され、必ずしも同じＳ．リコペルシカム植物でなくてもよい。上記Ｓ．リコペルシカム植物は、好ましくは育種系統である。
【０１２６】
上記で開示されたプロセスの各選択ステップにおいて、線虫の形質に対する抵抗性またはＴｏＭＶに対する抵抗性をさらに選択することができる。
【０１２７】
自己受粉および戻し交配ステップは、任意の順序で実施することができ、間に挿入することができ、例えば、１回または数回の自家受粉の前後に戻し交配を実施することができ、１回または数回の戻し交配の前後の自家受粉を企図することができる。
【０１２８】
所望の改善された表現型を有する子孫の選択は、特に実施例に開示されているプロトコルにより、Ｓ．リコペルシカム親に由来するトマト褐色縮葉フルーツウイルス抵抗性の比較に基づいて行うこともでき、検査される抵抗性／耐性は、果実の抵抗性／耐性、もしくは葉の抵抗性／耐性、またはその両方のいずれかであり得る。
【０１２９】
対立遺伝子の検出に使用される方法は、特定の染色体上のＳＮＰの２つの異なる対立遺伝子間の区別を可能にする任意の技術に基づくことができる。
【０１３０】
本発明はまた、そのような方法により取得されたまたは取得することができる植物にも関する。そのような植物は、実際に、本発明の第１の態様による改善された表現型を有するＳ．リコペルシカム植物である。
【０１３１】
本発明はまた、最初のＳ．リコペルシカム植物に対して、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実および／または葉の耐性および／または抵抗性に対応する所望の改善された表現型を有する商業用のトマト植物またはその近交系の親系統を取得する方法であって、以下のステップを含む方法にも関する：
ａ）ＴＢＲＦＶ耐性を付与するＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３を有する寄託された種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１  ＮＣＩＭＢ受託番号４２７５８またはその子孫を発芽させることにより得られた植物を商業用のＳ．リコペルシカム植物と戻し交配するステップ、
ｂ）本発明のＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３のうちの１つ、２つ、または３つを有する植物を選択するステップ。
【０１３２】
好ましくは、本発明の他の方法について詳述したように、本発明の１８個のＳＮＰのうちの１つ以上に基づいて選択が行われる。
【０１３３】
本発明による本発明のすべての方法およびプロセスにおいて、最初のＳ．リコペルシカム植物は、確定、不確定、または半確定である。
【０１３４】
既に開示したように、本発明によるトマト植物は、好ましくは、トマトモザイクウイルス、線虫、ならびにフザリウムおよびバーティシリウムにも抵抗性である。本発明のプロセスおよび方法においてそのような植物を取得するために、育種スキームにおいて使用されるＳ．リコペルシカム親は、好ましくは、トマトモザイクウイルス、線虫、ならびにフザリウムおよびバーティシリウムに対する抵抗性を付与する配列を有し、選択ステップは、本発明の改善された表現型を付与するＱＴＬに加えて、これらの抵抗性配列を有する植物を選択するように行われる。
【０１３５】
本発明はまた、上記で開示された方法およびプロセスのいずれかにより取得することができるＳ．リコペルシカム植物および種子に関する。そのようなＳ．リコペルシカムの種子は、好ましくは、植物栄養素、強化微生物（enhancing microorganism）、または種子および植物の環境を消毒するための製品などの、個々のまたは組み合わせた活性種でコーティングまたはペレット化される。そのような種および化学物質は、植物の成長を促進する製品、例えばホルモン、もしくは環境ストレスに対する抵抗性を高める製品、例えば保護刺激剤（defense stimulator）、もしく基質およびそのすぐ周辺のｐＨを安定化する製品、または栄養素であってもよい。
【０１３６】
それらはまた、本明細書においてウイルスおよび病原性微生物を含む、若い植物の成長に好ましくない作用因子から保護するための製品、例えば、殺真菌剤（fungicidal）、殺菌剤、殺線虫剤（hematicidal）、殺虫剤、または除草剤であってもよく、これらは接触、摂取、またはガス拡散によって作用する。それらは、例えば任意の好適なエッセンシャルオイル、例えばタイムの抽出物である。これらの製品はすべて、植物の抵抗性反応を増強し、および／または上記植物の環境を消毒または調節する。それらは、必要であればその生存能力を確保する培地とともに、生きている生物学的材料、例えば、非病原性微生物、例えば少なくとも１つの真菌、もしくは細菌、またはウイルスであってもよく、例えばシュードモナス、バチルス、トリコデルマ、クロノスタキ、フザリウム、リゾクトニアなどの種のこの微生物は、植物の成長を刺激するか、または病原体から保護する。
【０１３７】
前述のすべての方法およびプロセスにおいて、ＴＢＲＦＶに対する果実および／または葉の耐性の原因となるＱＴＬをホモ接合で有する植物の同定は、各ＱＴＬと関連する対立遺伝子のうちの少なくとも１つの検出だけなく、本発明のＳＮＰの他の対立遺伝子形態の不存在との組み合わせによっても行われ得る。したがって、本発明のＱＴＬ１をホモ接合性に有する植物の同定は、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔおよび／またはＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃの同定、ならびにＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子ＣおよびＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｔの不存在に基づく。同様に、本発明のＱＴＬ２をホモ接合で有する植物の同定は、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇおよび／またはＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃおよび／またはＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇおよび／またはＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇの同定、ならびにＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ａ、およびＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｔの不存在に基づく。同様に、本発明のＱＴＬ３をホモ接合で有する植物の同定は、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ，、および／またはＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ，、および／またはＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ，、および／またはＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ，、および／またはＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ，、および／またはＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ，、および／またはＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ，、および／またはＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ，、および／またはＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ，、および／またはＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ，、および／またはＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔの同定、ならびにＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｔ、およびＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｃの不存在に基づく。
【０１３８】
本発明はまた、本発明者らによって本明細書に提供される情報の使用、すなわちＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１の寄託された種子に存在し、改善された表現型をＳ．リコペルシカム植物に付与する、３つのＱＴＬの存在、およびこれらのＱＴＬに関連する分子マーカーの開示にも関する。この知識は、特に、ＱＴＬの正確なマッピング、それらの配列の定義付け、改善された表現型を付与するＱＴＬを含むトマト植物の同定、およびこれらのＱＴＬに関連するさらなるマーカーまたは代替マーカーの同定に使用することができる。そのようなさらなるマーカーは、それらの位置、すなわち本発明で開示されている１８個のマーカーに近い位置、好ましくは染色体１１上の１２個のＳＮＰに由来する位置により、および本発明によって明らかにされた目的の表現型、すなわち、ＴＢＲＦＶに対する葉の耐性、もしくは果実の耐性、またはその両方のいずれかの耐性との関連により特徴付けられる。
【０１３９】
関連、または遺伝的関連、およびより具体的には遺伝的連鎖（genetic linkage）により、マーカーの遺伝子多型（すなわちＳＮＰマーカーの特定の対立遺伝子）および目的の表現型が同時に生じること、すなわち偶然の発生によって予想されるよりも頻繁に一緒に遺伝すること、すなわち同じ染色体上での近接の結果として、対立遺伝子および表現型の原因となる遺伝子配列の非ランダムな関連があることを理解されたい。
【０１４０】
本発明の分子マーカー、上記で開示された１８個のマーカーまたは代替マーカーのいずれか１つは、好ましくは減数分裂の９０％超、好ましくは減数分裂の９５％、９６％、９８％、または９９％超において目的の表現型を伴って遺伝する。
【０１４１】
したがって、本発明は、トマトゲノム中のＱＴＬを細かくマッピングまたは同定するための１つ以上の分子マーカーの使用に関し、上記ＱＴＬは、ホモ接合で存在する場合に本発明の改善された表現型をＳ．リコペルシカム植物に付与し、上記１つ以上のマーカーは、以下の染色体領域：ＴＯ−０００５１９７およびＴＯ−０１５５８１により染色体６上で区切られた染色体領域、ＴＯ−０１８０９５５およびＴＯ−０１９６１０９により染色体９上で区切られた染色体領域、ＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７またはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体１１上で区切られた染色体領域のうちの１つに位置するか、あるいは本発明の１８個のＳＮＰマーカー、すなわち、ＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、ＴＯ−０１９６１０９、ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のうちの１つの遺伝子座から２メガベース単位未満に位置する。
【０１４２】
改善された表現型は、果実または葉の耐性のいずれかのＴＢＲＦＶに対する耐性である。
【０１４３】
より具体的には果実の耐性を付与するＱＴＬの細かいマッピングまたは同定のために、上記の１つ以上のマーカーは、上記で定義された染色体６および９の染色体領域に位置するか、またはＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、またはＴＯ−０１９６１０９の遺伝子座から２メガベース未満に位置する。より具体的には葉の耐性を付与するＱＴＬの細かいマッピングまたは同定のために、上記の１つ以上のマーカーは、上記で定義された染色体１１の染色体領域に位置するか、またはＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７の遺伝子座から２メガベース未満に位置する。
【０１４４】
好ましい実施形態によれば、上記の１つ以上のマーカーは、ＴＯ  −０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７，  もしくはＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１２５５２８，  もしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１６２４３２，  もしくはＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１６２４３２，  またはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により区切られた染色体領域にある。
【０１４５】
上記の１つ以上の分子マーカーは、さらに好ましくは、０．０５以下のｐ値で、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つと関連する。
【０１４６】
分子マーカーは、好ましくはＳＮＰマーカーである。それは、より好ましくは、本発明の１８個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの遺伝子座から１メガベース未満にある。
【０１４７】
ＱＴＬは、寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８中に見出される。
【０１４８】
ｐ値は、好ましくは０．０１未満である。
【０１４９】
本発明はまた、本発明による改善された表現型を付与する、６番染色体上のＱＴＬ（リストの最初の２つのＳＮＰ）、染色体９上のＱＴＬ（リストの３番目から６番目のＳＮＰ）、および染色体１１上のＱＴＬ（リストの７番目から最後のＳＮＰ）に関連する、ＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、ＴＯ−０１９６１０９、ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のＳＮＰマーカーのリストのうちの少なくとも１つの、上記ＱＴＬに関連する代替分子マーカーを同定するための使用にも関し、上記代替分子マーカーは、ＴＯ−０００５１９７およびＴＯ−０１５５８１により染色体６上で区切られた染色体領域、ＴＯ−０１８０９５５およびＴＯ−０１９６１０９により染色体９上で区切られた染色体領域、ＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７によりもしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体１１上で区切られた染色体領域にあるか、または本発明の１８個のＳＮＰマーカー、すなわちＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、ＴＯ−０１９６１０９、ＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７の遺伝子座から２メガベース単位未満にある。
【０１５０】
好適な実施形態によれば、上記代替マーカーは、ＴＯ  −０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７、もしくはＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１２５５２８、もしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１６２４３２、もしくはＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１６２４３２、またはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により区切られた染色体領域にある。
【０１５１】
代替分子マーカーは、０．０５以下、好ましくは０．０１未満のｐ値を有する上記ＱＴＬと関連することが好ましい。ＱＴＬは、寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８に見出される。
【０１５２】
本発明は、ホモ接合で存在する場合にＴＢＲＦＶに果実の耐性を付与するＱＴＬに関連する分子マーカーを同定するための方法であって、ＳＮＰマーカーＴＯ−０００５１９７およびＴＯ−０１５５８１により染色体６上で区切られた染色体領域にあるか、もしくはＳＮＰマーカーＴＯ−０１８０９５５およびＴＯ−０１９６１０９により染色体９上で区切られた染色体領域中にあるか、またはＳＮＰマーカーＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、およびＴＯ−０１９６１０９のうちの少なくとも１つの遺伝子座から２メガベース単位未満にある、分子マーカーを同定することと、上記分子マーカーが、上記改善された表現型を示す植物から生じた分離集団においてＴＢＲＦＶに対する果実の耐性に関連または連鎖するかどうかを決定することと、を含む方法にも関する。集団は、好ましくは、本発明の果実耐性を示す寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長した植物から生じる。
【０１５３】
本発明による果実の耐性を付与する上記で言及した染色体６および９上のＱＴＬは、ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）に存在するＱＴＬである。
【０１５４】
遺伝的関連または遺伝的連鎖は上記で定義したとおりである。好ましくは、関連または連鎖は、好ましくは０．０５未満のｐ値、最も好ましくは０．０１未満またはさらに少ないｐ値を有する。
【０１５５】
分子マーカーおよび抵抗性表現型は、好ましくは減数分裂の９０％超、好ましくは９５％超で一緒に遺伝する。
【０１５６】
本発明はまた、ホモ接合で存在する場合にＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を付与するＱＴＬに関連する分子マーカーを同定するための方法であって、ＳＮＰマーカーＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７によりもしくはＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１２５５２８により染色体１１上で区切られた染色体領域中にあるか、またはＳＮＰマーカーＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のうちの少なくとも１つの遺伝子座から２メガベース単位未満にある、分子マーカーを同定することと、上記分子マーカーが、上記改善された表現型を示す植物から生じた分離集団においてＴＢＲＦＶに対する葉の耐性に関連または連鎖するかどうかを決定することを含む方法にも関する。集団は、好ましくは、本発明の葉の耐性を示す寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２７５８またはその子孫から成長した植物から生じる。
【０１５７】
本発明による葉の耐性を付与する上記で言及した染色体１１上のＱＴＬは、ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１（ＮＣＩＭＢ４２７５８）に存在するＱＴＬである。
【０１５８】
本発明のこの態様による分子マーカーは、最も好ましくはＳＮＰマーカーである。それらは、より好ましくは、本発明の１８個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの遺伝子座から１メガベース未満である。
【０１５９】
本発明はまた、ホモ接合で存在する場合にＳ．リコペルシカム植物にＴＢＲＦＶに対する果実の耐性を付与するＱＴＬをゲノム中に含むトマト植物を同定または選択するための分子マーカーの使用にも関し、マーカーは、ＳＮＰマーカーＴＯ−０００５１９７およびＴＯ−０１５５８１により染色体６上で区切られた染色体領域に位置するか、もしくはＳＮＰＴＯ−０１８０９５５およびＴＯ−０１９６１０９により染色体９上で区切られた染色体領域に位置するか、またはＳＮＰマーカーＴＯ−０００５１９７、ＴＯ−０１５５８１、ＴＯ−０１８０９５５、ＴＯ−０１９６７２４、ＴＯ−０１４５１２５、およびＴＯ−０１９６１０９のうちの少なくとも１つの遺伝子座から２メガベース単位未満に位置し、上記分子マーカーは、０．０５以下、好ましくは０．０１以下のｐ値で、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、およびＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇのうちの少なくとも１つと関連する。ＱＴＬがホモ接合で存在する場合にＴＢＲＦＶ表現型に対する果実の耐性が付与される。
【０１６０】
本発明はまた、ホモ接合で存在する場合にＳ．リコペルシカム植物に対するＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を付与するＱＴＬをゲノム中に含むトマト植物を同定または選択するための分子マーカーの使用にも関し、マーカーは、ＳＮＰマーカーＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７により染色体１１上で区切られた染色体領域に位置するか、またはＳＮＰマーカーＴＯ−０１２２２５２、ＴＯ−０１４４３１７、ＴＯ−０１４２２７０、ＴＯ−０１４２２９４、ＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、ＴＯ−０１８２２７６、ＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、ＴＯ−０１２５５２８、ＴＯ−０１６２４３２、およびＴＯ−０１６２４２７のうちの少なくとも１つの遺伝子座から２メガベース単位未満に位置し、上記分子マーカーは、０．０５以下、好ましくは０．０１以下のｐ値で、以下のＳＮＰ対立遺伝子：ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つと関連する。ＱＴＬがホモ接合で存在する場合にＴＢＲＦＶ表現型に対する葉の耐性が付与される。
【０１６１】
この実施形態に従って使用される分子マーカーは、特に、上記で開示されている、さらなるまたは代替の分子マーカーを同定するための方法によって得ることができる。分子マーカーは、好ましくは、ＳＮＰマーカーである。それらは、より好ましくは、本発明の１８個のＳＮＰのうちの少なくとも１つの遺伝子座から１メガベース未満にある。
【０１６２】
さらに別の態様によれば、本発明はまた、ＴＢＲＦＶ感染に対する抵抗性または耐性に関連する少なくとも１つの遺伝子マーカーの存在について、植物、好ましくはＳ．リコペルシカム植物またはトマト生殖質の遺伝子型を解析する方法にも関し、該方法は、検査される植物のゲノム中において、本発明のマーカーの少なくとも１つを含むまたは上記で開示された代替分子マーカーの少なくとも１つを含む核酸の決定または検出することを含む。好ましくは、該方法は、検査される目的の植物の試料において、ＴＯ−０００５１９７の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４５５８１の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１８０９５５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６７２４の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４５１２５の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１９６１０９の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔのうちの少なくとも１つを含む核酸中のＴＢＲＦＶに対する抵抗性／耐性に関連する特定の配列を同定するステップを含む。より好ましくは、該方法は、検査される植物の試料において、ＴＯ−０１２２２５２の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４４３１７の対立遺伝子Ｃ、ＴＯ−０１４２２７０の対立遺伝子Ｔ、ＴＯ−０１４２２９４の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１４２３０３の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１４２３０６の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１８１０４０の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２３０５７の対立遺伝子Ｇ、ＴＯ−０１２５５２８の対立遺伝子Ａ、ＴＯ−０１６２４３２の対立遺伝子Ｃ、および／またはＴＯ−０１６２４２７の対立遺伝子Ｔを含む核酸中のＴＢＲＦＶに対する抵抗性に関連する特定の配列を検出することを含む。
【０１６３】
この方法の最も好ましい実施形態によれば、該方法は、検査植物において、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを含む核酸の存在を検出することを含む。
【０１６４】
ＳＮＰの特定の対立遺伝子の検出は、当業者である読み手に周知である任意の方法によって行うことができる。
【０１６５】
本発明の抵抗性植物がＴＢＲＦＶ感染によって引き起こされる損傷を制限する能力を考慮すると、該植物は、ＴＢＲＦＶに外寄生された環境またはＴＢＲＦＶに外寄生されたもしくは感染している可能性のある環境で有利に成長する。これらの条件では、本発明の抵抗性または耐性植物は、易感染性の植物よりも市場性の高いトマトを生産する。したがって、本発明は、本発明の前述の態様により定義され、上記植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する、染色体６、染色体９、および／または染色体１１上のＱＴＬをゲノム中にホモ接合で含むトマト植物を成長させることを含む、ＴＢＲＦＶに感染した環境におけるトマト植物の収量を改善するための方法にも関する。好ましくは、該方法は、目的のＱＴＬの１つ以上をホモ接合で有するトマト植物を選別または選択する第１のステップを含む。該方法は、トマト畑、通路、または温室の生産性を向上させる方法として定義することもできる。
【０１６６】
一実施形態によれば、該方法は、ＴＢＲＦＶに対する葉の抵抗性を付与する上記で定義された染色体１１上のＱＴＬ３を含むトマト植物を成長させることを含む。
【０１６７】
本発明はまた、上記で定義されたトマト植物を成長させることを含む、ＴＢＲＦＶ外寄生または感染の状態におけるトマト生産の損失を低減するための方法にも関する。
【０１６８】
これらの方法は、畑、通路、または温室におけるトマト植物の集団に特に価値がある。
【０１６９】
あるいは、トマト生産の収量を改善するまたは損失を低減する上記方法は、ＴＢＲＦＶに抵抗性／耐性であり、植物にＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を付与する染色体６、９、および／または１１上のＱＴＬをゲノム中に含むトマト植物を同定し、次いで、ウイルスに外寄生されたまたは外寄生される可能性のある環境で上記耐性または抵抗性植物を成長させる、第１のステップを含み得る。好ましくは、植物は、本発明により定義され、ホモ接合で存在する場合にＴＢＲＦＶに対する葉の耐性を付与する染色体１１上のＱＴＬを含む。好ましい実施形態によれば、第１のステップで同定される植物は、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを含む。
【０１７０】
本発明の抵抗性植物はまた、ＴＢＲＦＶの増殖を制限することもでき、したがって、さらなる植物の感染およびウイルスの増殖を制限する。したがって、本発明はまた、畑、通路、もしくは温室、または他の任意の種類の栽培地をＴＢＲＦＶ外寄生から保護する方法、あるいは上記畑、通路、または温室のＴＢＲＦＶによる外寄生レベルを少なくとも制限する方法、あるいは畑、通路、温室、特にトマト畑でのＴＢＲＦＶの拡散を制限する方法にも関する。そのような方法は、好ましくは、本発明の抵抗性または耐性植物、すなわち、ＴＢＲＦＶに対する抵抗性または耐性を植物に付与する染色体６、９、および／または１１上のＱＴＬをホモ接合でゲノム中に含む植物を成長させるステップを含む。使用される本発明の植物は、好ましくは染色体１１上のＱＴＬ３を含み、より好ましくは、植物は、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを示す。
【０１７１】
好ましくは、該方法は、目的のＱＴＬ、特に染色体１１上のＱＴＬ３をホモ接合で有するトマト植物を選別または選択する第１のステップを含む。
【０１７２】
本発明はまた、畑、通路、もしくは温室、または他の栽培地におけるＴＢＲＦＶの外寄生または感染を制御するためのＴＢＲＦＶに抵抗性または耐性の植物の使用にも関する。そのような植物は、それぞれ、上記で定義された染色体６、９、および１１上のＱＴＬ１、ＱＴＬ２、および／またはＱＴＬ３のうちの少なくとも１つをゲノム中にホモ接合で含む本発明の植物である。したがって、この使用によれば、本発明の植物は、畑、通路、または温室をＴＢＲＦＶの外寄生から保護するために使用される。使用される本発明の植物は、好ましくは染色体１１上のＱＴＬ３を含み、より好ましくは、それらは、ＴＯ−０１８２２７６の対立遺伝子Ｇを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】図１は、ＨＡＺ１×ＨＡＺ２のＦ２集団に基づく果実のＴＢＲＦＶ抵抗性に関連するＱＴＬのｐ値プロットを示す。この図は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性および／または抵抗性に関する二親性マッピング集団（ＨＡＺ１×ＨＡＺ２、実施例４を参照のこと）のマッピング結果を示すマンハッタンプロットである。縦軸（ｙ軸）は、−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示し、横軸（ｘ軸）は、物理マップに沿った染色体ごとの位置（物理的距離ｂｐ）によってすべてのＳＮＰを表す。
【図２】図２は、ＨＡＺ１×ＨＡＺ２のＦ２集団に基づく葉のＴＢＲＦＶ抵抗性に関連するＱＴＬのｐ値プロットを示す。この図は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性に関する二親性マッピング集団（ＨＡＺ１×ＨＡＺ２、実施例４を参照のこと）のマッピング結果を示すマンハッタンプロットである。縦軸（ｙ軸）は、−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示し、横軸（ｘ軸）は、物理マップに沿った染色体ごとの位置（物理的距離ｂｐ）によってすべてのＳＮＰを表す。
【図３】図３は、ＨＡＺ３×ＨＡＺ４のＦ２集団に基づく葉のＴＢＲＦＶ抵抗性に関連するＱＴＬのｐ値プロットを示す。この図は、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性に関する二親性マッピング集団（ＨＡＺ３×ＨＡＺ４、実施例６を参照のこと）のマッピング結果を示すマンハッタンプロットである。縦軸（ｙ軸）は、−ｌｏｇ１０（ｐ値）を示し、横軸（ｘ軸）は、物理マップに沿った染色体ごとの位置（物理的距離ｂｐ）によってすべてのＳＮＰを表す。
【実施例】
【０１７４】
実施例１：トマト褐色縮葉フルーツウイルスの収集および同定：
本発明者らは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに感染した、イスラエルの異なる生産地域（北、中央、および南イスラエル）由来の異なる分離株の収集物を作成した：７つの異なる分離株を収集し、Ｓａｌｅｍらによって記載されたプロトコルに従って分析した。ヨルダンのトマト褐色縮葉フルーツウイルスとの配列比較により、イスラエルの分離株がすべて、ヨルダンの分離株と同一であることが示され、同じウイルスが両国に存在することを確認した。
【０１７５】
実施例２：抵抗性の同定
本発明者らは、イスラエルの主要なトマト作物生産地域であるイスラエル南部のＢｓｏｒ地域にある自然感染した温室中でトマト育種遺伝物質をスクリーニングした。約４４３の異なるトマトをスクリーニングした。各トマトを温室中の異なる場所に、１反復あたり１０の植物で、２反復で植え付けた。
【０１７６】
温室中の各列は１２０の植物を含んだ。各列に、易感染性の系統対照として１０の植物を植え付けた。対照を温室中の異なる場所に広げるために、温室中の異なる列に沿って斜めに対照を配置した。
【０１７７】
このスクリーニングでは、少数のトマトが、葉のＴＢＲＦＶ症状を示さず、果実のＴＢＲＦＶ症状をほとんど示さなかった。これらのうち、２つの症状のないトマトおよび２つの易感染性のトマトを次の段階のために選択した。
【０１７８】
これらの実験の結果を表１に示す。選択された２つの易感染性のトマトは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに易感染性であるとみなされる意味で、４４１の易感染性のトマトを代表している。
【０１７９】
Ｈａｚｅｒａ第１号（またはＨＡＺ１）は、約１７０ｇｒの規則的で丸くて暗赤色の果実を有する、ルーズ（loose）タイプの不確定トマトである。植物は、暗緑色の葉を有し、バーティシリウム・ダーリエ（Verticillium dahlia）、サツマイモ・ネコブセンチュウ（Meloidogyne incognita）、トマト黄化葉巻ウイルス（Tomato yellow leaf curl virus）、およびステムフィリウム・ソラニ（Stemphylium solani）に対して抵抗性である。
【０１８０】
Ｈａｚｅｒａ第２号（またはＨＡＺ２）は、約２８０ｇｒの規則的かつ中程度で扁平性の濃い暗赤色の果実を有する、ビーフ（beef）タイプの不確定トマトである。この植物は、バーティシリウム・ダーリエ、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ１，２（Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici 1,2）、トマトモザイクウイルス、 フルビア・フルバ（Fulvia fulva）、サツマイモ・ネコブセンチュウ、トマト黄化壊疽ウイルス（Tomato spotted wilt virus）に対して抵抗性である。
【０１８１】
Ｈａｚｅｒａ第３号（またはＨＡＺ３）は、約２７０ｇｒの中程度で扁平性の赤い果実を有する、ビーフタイプの不確定トマトである。この植物は、トマト黄化壊疽ウイルス、バーティシリウム・ダーリエ、フザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ1,2、および ステムフィリウム・ソラニに対して抵抗性である。
【０１８２】
Ｈａｚｅｒａ第４号（またはＨＡＺ４）は、約１８０ｇｒの丸くて赤い果実を有する、ミニビーフ（minibeef）タイプの不確定トマトである。この植物は、トマトモザイクウイルス、トマト黄化葉巻ウイルス、クラドスポリウム・フルヴム（Cladosporium fulvum）（CF9)、バーティシリウム・ダーリエ、およびフザリウム・オキシスポラム・ｆ・エスピー・リコペルシシ１，２に対して抵抗性である。
【０１８３】
【表１】
2020521492.tif 000002
【０１８４】
実施例３：抵抗性の確認
耐性／抵抗性表現型の基礎をなす遺伝学をよりよく理解し、１回目のスクリーニングで同定されたリードを検証するために、本発明者らは、１回目のスクリーニングの条件と同様の条件下で２回目のスクリーニングを行った：自然感染下の温室中の各列は１２０の植物を含み、各列において、易感染性の対照（１０の植物）を植え付けた。対照を温室中の異なる場所に広げるために、対照を温室中の異なる列に沿って斜めに配置した。
【０１８５】
１回目のスクリーニングで同定された抵抗性トマトに加えて、抵抗性植物と易感染性系統との交配から得られたＦ１およびＦ２が検査に含まれた。
【０１８６】
表２は、葉の評価に関する２回目のスクリーニングの結果を示す。芽の頂点にいくらかのモザイクおよび捩れがあり次第、植物を易感染性とみなした。耐性／抵抗性植物は、芽の頂点に症状がない。
【０１８７】
【表２】
2020521492.tif 000003
【０１８８】
Ｆ１およびＦ２植物の表現型解析データは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性が単一の遺伝子またはＱＴＬによって劣性様式で制御されることを示す傾向がある。
【０１８９】
表３は、果実の評価に関する２回目のスクリーニングの結果を示す。植物は１〜４の尺度で評点付けされ、それにより、１〜３の評点を有する植物は易感染性とみなされ、等級１の植物については、典型的な果実病変の重篤な症状およびいくつかの果実の変形を有し、等級２の植物については、いくつかの果実のみでの中程度の病変を有し、３は軽い症状を有する。３．５および４の植物、すなわち果実に症状がない植物のみを抵抗性とみなす。
【０１９０】
【表３】
2020521492.tif 000004
【０１９１】
Ｆ２植物の表現型解析データは、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性および／または抵抗性が、少数の、１つまたは２つのＱＴＬにより劣性様式で制御されることを示す傾向がある。
【０１９２】
実施例４：遺伝子マッピングの関連付け分析
トマト植物Ｈａｚｅｒａ第１号およびＨａｚｅｒａ第２号を使用して、Ｆ２二親性マッピング集団を構築した。トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する抵抗性表現型（果実および葉）を示すトマト植物Ｈａｚｅｒａ第１号を、易感染性植物と交配してＦ１を作成し、その後、これを使用してＦ２分離集団を生成した。Ｈａｚｅｒａ第３号およびＨａｚｅｒａ第４号に基づく検証（葉のＱＴＬ）に使用される追加の二親性集団を同じ方法で作成した（実施例６を参照のこと）。
【０１９３】
ＤＮＡ抽出：製造業者の手順に従って、ＮｕｃｌｅｏＭａｇ（登録商標）植物キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して、擦りつぶした葉からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ精製は、植物組織からゲノムＤＮＡを単離するための磁気ビーズ技術に基づいた。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて、ＤＮＡ濃度を定量化した。
【０１９４】
Ｆ２集団（Ｈａｚｅｒａ第１号およびＨａｚｅｒａ第２号に基づく）の遺伝子型解析は、トマトについての約９５００個のＳＮＰを含む特注のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｘｉｕｍチップアレイ（多重遺伝子型解析技術）を使用して行った。
【０１９５】
トマトＳＮＰマーカーは、パブリックドメイン、ＬＶＳプロジェクト、およびコラボレーションを含む異なる情報源から選択および発見された。すべてのＳＮＰを事前スクリーニング（他の技術での従前の経験）で検証し、以下に従って選択した：
・多型／対立遺伝子頻度
・表現ワールドワイドバリエーション（Representing world wide variation）
・ＳＮＰクラスターの除去
・物理的マップ距離に従って均等に配置されたＳＮＰ
・ヘテロクロマチン（動原体周辺（pericentromeric））領域での低い表現−高ＬＤ。
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ａｘｉｏｍチップアレイでの遺伝子型解析を、製造業者が推奨する標準プロトコルを使用して行った。手順には、以下のステップ：ＤＮＡ増幅、断片化、沈殿、再懸濁およびハイブリダイゼーション調製、チップへのハイブリダイゼーション、洗浄、ライゲーション、染色、ならびに走査が含まれる。最後の２つのステップは、ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＧｅｎｅＴｉｔａｎ機器によって行われる。分析は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが開発したクラスタリングの自動アルゴリズムによって行われる。
【０１９６】
混合線形モデルの関連付け（mixed linear model association）を、果実および葉の症状の両方に対して独立して使用した。
【０１９７】
マッピングの結果により、染色体１１上に位置する、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性に関連する１つの候補ＱＴＬ、およびトマト染色体６および染色体９に位置する、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性および／または抵抗性に関連する２つの候補ＱＴＬが明らかとなった。
【０１９８】
トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉および／または果実の耐性および／または抵抗性のための様々なＱＴＬと有意に関連するマーカーおよびトマトゲノム上のそれらの位置を表４に纏めている。表５および本出願の添付の配列表部分において、隣接配列を含むＳＮＰの配列を報告する。
【０１９９】
結果により、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性および／または抵抗性の原因となる１つのＱＴＬ（本発明のＱＴＬ１）が、染色体６上において位置３３９３２４３８と位置３３９３３９０５との間に位置し、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実の耐性および／または抵抗性の原因となる第２のＱＴＬ（本発明のＱＴＬ２）が、染色体９上において位置４８００６８０と位置５９０１４５４０との間に位置することが示され、ゲノム上のそのような物理的位置はトマトゲノムのバージョン２．４０に基づいている（Bombarely 2011）。染色体９の領域は、組換え率の低い領域である。
【０２００】
染色体６の領域は移入が起こりやすい領域であり、いくつかの目的の遺伝子はこの領域に既にマッピングされており、特に、Ｓ．リコペルシコイデス（S. lycopersicoides）、Ｓ．ペネリー（S. pennellii）およびＳ．ピンピネリホリウム（S. pimpinellifolium）由来の塩耐性に関与する遺伝子の移入(Li et al, Euphytica（2011）178: 403)、Ｓ．ハブロカイテス（S. habrochaites）およびＳ．ネオリキー（S. neorickii）由来のうどんこ病の抵抗性に関与する遺伝子の移入(Seifi et al, Eur J Plant Pathol（2014）138: 641)、およびペピーノモザイクウイルスに関与する遺伝子の移入（ＷＯ２０１３／０６４６４１）がある。
【０２０１】
結果により、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性および／または抵抗性の原因となるＱＴＬが、染色体１１上において位置９５４８０２９と位置１００１５４７８との間に位置することが示され、ゲノム上のそのような物理的位置はトマトゲノムのバージョン２．４０に基づいている（Bombarely 2011）。
【０２０２】
葉の抵抗性の原因となる染色体１１上のＱＴＬをより良好に特徴付けるために、追加のマーカーを用いてさらなる分析を行った。結果を表６に示し、ＳＮＰの配列を表５および７に報告する。
【０２０３】
これらの追加の結果により、染色体１１についてのｐ値およびＲ2値に基づいてならびにこれらの値の変動に基づいて、トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の耐性の原因となるＱＴＬが、染色体１１上においてＳＮＰＴＯ−０１２２２５２とＴＯ−０１６２４２７との間、すなわち位置８０９０２６４と位置１００１８８１１との間に広く位置していたと定義することができ、ゲノム上のそのような物理的位置はトマトゲノムのバージョン２．４０に基づいている。より広い定義のＱＴＬ遺伝子座に隣接するＳＮＰＴＯ−０１２２２５２およびＴＯ−０１６２４２７は、表６においてアスタリスク（＊）によって示されている。染色体１１上のより狭い定義のＱＴＬの位置は、ＳＮＰＴＯ−０１４２２７０およびＴＯ−０１６２４３２によって定義される領域である。より狭い定義の遺伝子座のこれらの隣接マーカーは、表６の(**)によって示されている。葉の抵抗性／耐性を付与するＱＴＬとより有意な関連を有するＳＮＰは、表６の（＋）によって示され、すなわちＴＯ−０１８１０４０、ＴＯ−０１２３０５７、およびＴＯ６０１２５５２８である。
【０２０４】
【表４】
2020521492.tif 000005
【０２０５】
【表５】
2020521492.tif 000006
【０２０６】
【表６】
2020521492.tif 000007
【０２０７】
【表７】
2020521492.tif 000008
【０２０８】
実施例５：マーカーのさらなる検証
ＴＢＲＦウイルスに対する葉の耐性と最も関連する１つマーカーが、抵抗性遺伝子に近い候補マーカーであるＱＴＬ３領域の端において定義された。このＳＮＰは、ＳＮＰ  ｍｏｎｏｐｌｅｘ  ＫＡＳＰａｒ技術向けに設計された：検証に使用されるＫＡＳＰａｒアッセイを、ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＬＧＣ  Ｇｒｏｕｐ、テディントン、ミドルセックス、英国）のＫＡＳＰ法に基づいて行った。
【０２０９】
ＬＧＣのプライマーピッカー（primer picker）ソフトウェアを使用して、ＫＡＳＰ  ＳＮＰアッセイ用のプライマーを設計した。ＳＮＰにより、ＳＮＰアッセイごとに、２つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーおよび１つの一般的なリバースプライマーを設計した。ＫＡＳＰ遺伝子型解析アッセイは、競合的対立遺伝子特異的ＰＣＲに基づいており、特定の遺伝子座におけるＳＮＰの二重対立遺伝子（bi-allelic）評点付けを可能にする。要約すると、ＳＮＰ特異的ＫＡＳＰアッセイミックス（KASP assay mix）およびユニバーサルＫＡＳＰマスターミックス（KASP Master mix）をＤＮＡ試料に添加し、次いで熱サイクリング反応を行い、続いてエンドポイント蛍光読み取りを行った。二重対立遺伝子の識別は、２つの対立遺伝子特異的フォワードプライマーの競合的結合によって達成され、それぞれ、２つのユニバーサルＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）カセットに対応する特有のテール（tail）配列を有し、そのうちの１つがＦＡＭ（商標）色素で標識され、他方がＶＩＣ（商標）色素で標識されている（ＬＧＣ、ｗｗｗ．ｌｇｃｇｒｏｕｐ．ｃｏｍ）。
【０２１０】
３μｌの体積のＤＮＡを黒色の３８４ウェルｈａｒｄ  ｓｈｅｌｌ  ＰＣＲプレートにピペットで入れ、室温で乾燥させた。遺伝子型解析を行った際、製造元のプロトコル（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に従って、３μｌのＰＣＲミックスを添加することによりＤＮＡを懸濁した。遺伝子型解析ＰＣＲの結果をソフトウェアＫｌｕｓｔｅｒＣａｌｌｅｒ（ＫＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して分析した。本研究で使用されたマーカーは、ＴＯ−０１８２２７６（配列番号１３）である。
【０２１１】
ＨＡＺ３×ＨＡＺ４  Ｆ２集団（表２）をこのマーカー検証に使用した。Ｆ２植物の遺伝子型解析をこのマーカーを使用して行い、実施例３に記載した葉の症状について表現型解析も行った。関連性は、２５１の植物のデータに基づき、１００％であった。
【０２１２】
葉の症状の表現型解析および候補マーカーの遺伝子型解析の要約データを表８に示す。Ｒマーカーは、抵抗性／耐性対立遺伝子に対してホモ接合であることを意味し、Ｓマーカーは、易感染性対立遺伝子に対してホモ接合であることを意味し、Ｈマーカーは、２つの対立遺伝子からなるヘテロ接合を意味する。
【０２１３】
【表８】
2020521492.tif 000009
【０２１４】
実施例６：遺伝子マッピングのための関連付け分析
トマト植物Ｈａｚｅｒａ第３号およびＨａｚｅｒａ第４号を使用して、Ｆ２二親性マッピング集団を構築した。トマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する葉の抵抗性表現型を示すトマト植物Ｈａｚｅｒａ第３号を易感染性の植物Ｈａｚｅｒａ第４号と交配してＦ１を作成し、その後、これを使用してＦ２分離集団を生成した。
【０２１５】
ＨＡＺ１およびＨＡＺ２を使用して、交配、表現型解析、および関連付けを実施例４に記載されるように行った。
【０２１６】
表９に詳細に示され、図３に示されるように、葉の抵抗性のためのＱＴＬおよび最も重要な関連を有するマーカーを染色体１１上において同定した。
【０２１７】
実施例４のように、ＱＴＬを含むより広い定義の遺伝子座は、表９中のアスタリスクの付いている隣接マーカー、すなわちＳＮＰＴＯ−０１２２５２およびＴＯ０１６２４２７によって定義される。これらのＳＮＰは、他の耐性の供給源、すなわちＨＡＺ１で得られた結果から推定される、より広い定義のＱＴＬ位置に隣接するものと同じである。この点は、葉の耐性のためのＱＴＬがＨＡＺ１およびＨＡＺ３では同じであるという結論を強く裏付けている。
【０２１８】
ＨＡＺ１は、受託番号４２７５８でＮＩＣＭＢに寄託された種子ＨＡＺＴＢＲＦＶＲＥＳ１に対応する。
【０２１９】
ＨＡＺ３集団についての結果から推定される、より狭い定義のＱＴＬの遺伝子座は、染色体１１上の隣接マーカーであるＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１２５５２８（表９中のマーカー＊＊）によって定義される。ＴＢＲＦＶ葉耐性／抵抗性と最も有意な関連を有するマーカーは、（＋）で示されたマーカー、すなわちＴＯ−０１４２３０３、ＴＯ−０１４２３０６、およびＴＯ６０１４２２９４である。
【０２２０】
【表９】
2020521492.tif 000010
【０２２１】
【表１０】
2020521492.tif 000011
【０２２２】
纏めると、これらの結果により、ＴＯ−０１２２５２およびＴＯ０１６２４２７、より正確には、ＴＯ−０１４４３１７およびＴＯ−０１２５５２８により区切られた染色体領域内に広く位置する葉の耐性を付与するＱＴＬの存在が確認される。
【０２２３】
したがって、実施例４の結果を考慮すると、これらの結果は、このＱＴＬの位置がＴＯ−０１４２２７０とＴＯ−０１２５５２８との間として有利に定義できることを示している。
【０２２４】
実施例７：メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）によるトマト種子の遺伝子組み換え
品種ごとに約２０００個の種子を０．５％（ｗ／ｖ）ＥＭＳまたは０．７％ＥＭＳのいずれかの通気溶液に室温で２４時間浸漬することにより、トマト品種の種子をＥＭＳで処理する。
【０２２５】
品種ごと、ＥＭＳ用量ごとに約１５００個の処理した種子を発芽させ、得られた植物を、好ましくは温室中で、例えば５月から９月まで成長させて、種子を生産する。
【０２２６】
成熟後、Ｍ２種子を収穫し、処理ごと、品種ごとに１つのプールに纏める。得られたＭ２種子のプールを出発材料として使用して、個々のＭ２種子、およびトマト褐色縮葉フルーツウイルスに対する果実および／または葉の耐性を有する植物を同定する。
【図１】
2020521492.tif 000012
【図２】
2020521492.tif 000013
【図３】
2020521492.tif 000014
【配列表】
2020521492000001.app
【国際調査報告】
2020521492.tif 000015
2020521492.tif 000016
2020521492.tif 000017