(57)【要約】本発明は、免疫トレランス及び／又は免疫不全を打ち消すための多機能性の抗体−リガンド・トラップ及びそれらの使用方法を提供する。本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップ及び融合タンパク質は、抗腫瘍の免疫応答又は病原体に対する免疫応答を回復及び引き起こすために、免疫不全を打ち消すことができる。本発明は、がん、感染症、及び免疫炎症性の障害を治療する、及び予防するための、有望な免疫療法剤を提供する。【選択図】図１
2020521759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲティング部分及び1つ以上の免疫調節部分を含む分子：ここで、
(a)  前記ターゲティング部分は、腫瘍細胞、腫瘍環境、腫瘍関連増殖因子若しくはレセプター、腫瘍関連サイトカイン若しくはレセプター、腫瘍関連Tリンパ球、T細胞の共−刺激若しくは阻害分子、免疫細胞、病原体、又は病原体関連細胞、の構成要素に特異的に結合するポリペプチドを含む、及び
(b)  前記免疫調節部分は、Tリンパ球免疫レセプター、T細胞阻害レセプター(TCIR)、T細胞共−阻害分子、T細胞共−刺激分子、Bリンパ球レセプター、DCレセプター、NK細胞レセプター、サイトカイン・レセプター、増殖因子レセプター、ケモカイン・レセプター、又は腫瘍細胞レセプター、の細胞外ドメイン(ECD)配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【請求項２】
前記ターゲティング部分のポリペプチドが、免疫グロブリン、抗体、バイスペシフィック若しくはマルチスペシフィック抗体、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、二価若しくは多価scFv、又はFc含有ポリペプチド、の抗原−結合ドメインを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項３】
前記ターゲティング部分のポリペプチドが、T細胞阻害レセプター(TCIR)、T細胞阻害レセプター・リガンド(TCIRリガンド)、T細胞共−阻害分子、又はT細胞共−刺激分子、に特異的に結合する抗体であるか；又はレセプター若しくはリガンド、の細胞外ドメイン(ECD)由来のリガンド結合配列を含む、請求項１に記載の分子。
【請求項４】
前記ターゲティング部分が抗体であり、前記免疫調節部分が前記抗体の重鎖のC末端に融合している、請求項２に記載の分子。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が抗体であり、前記免疫調節部分が前記抗体の軽鎖のC末端に融合している、請求項２に記載の分子。
【請求項６】
前記ターゲティング部分のポリペプチドが、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラム死-1タンパク質(PD-1)、プログラム死リガンド-1(PD-L1)、プログラム死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞免疫グロブリン及びムチン−ドメイン含有分子-3(TIM-3)、がん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM-1)、がん胎児性抗原(CEA)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、CD96、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換増殖因子β(TGFβ)、形質転換増殖因子βレセプター(TGFβR)、核内因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、RANKリガンド(RANKL)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、CD27、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD40、CD40L、CD47、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、IL-2R、CD25、CD3、gp120、上皮成長因子レセプター (EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2 (HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、上皮成長因子 (EGF)、形質転換増殖因子α (TGFα)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子レセプター-1 (VEGFR-1)、VEGFR-2又はVEGFR-3、のうちの1つ以上に特異的に結合する、請求項１に記載の分子。
【請求項７】
前記免疫調節部分が、形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラム死1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチン・ドメイン含有3(TIM-3)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、CD160、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD96、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核内因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、白血球関連免疫グロブリン様レセプター1(LAIR1)、又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項８】
リンカーを更に含む、請求項１に記載の分子。
【請求項９】
前記リンカーが前記ターゲティング部分及び前記免疫調節部分を融合する、請求項８に記載の分子。
【請求項１０】
前記リンカーが配列番号(SEQ ID NO): 3、4、又は5の配列を含む、請求項８に記載の分子。
【請求項１１】
前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項１２】
前記リガンド結合フラグメントがTIM-3のCEACAM-1結合フラグメントを含む、請求項１１に記載の分子。
【請求項１３】
前記免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 2の配列を含む、請求項１１に記載の分子。
【請求項１４】
前記ターゲティング部分がPD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、VISTA、TIGIT、BTLA、CCR4、41BB、OX40、GITR、VEGF、RANKL、TGF-β、IL6R、EGFR、HER2/neu、又はgp120に結合するポリペプチドであり、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１に記載の分子。
【請求項１５】
前記免疫調節部分がCD226のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項１６】
前記免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 9の配列を含む、請求項１５に記載の分子。
【請求項１７】
前記ターゲティング部分が、TIM-3、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β、IL-6R、EGFR、HER2/neu、VEGF、又はgp120に結合するポリペプチドを含む、請求項１５に記載の分子。
【請求項１８】
前記免疫調節部分が、CD44のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１に記載の分子。
【請求項１９】
前記免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 36の配列を含む、請求項１５に記載の分子。
【請求項２０】
前記ターゲティング部分が、TIM-3、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β、IL-6R、EGFR、HER2/neu、VEGF又はgp120に結合するポリペプチドであり、及び前記免疫調節部分が、CD44のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１に記載の分子。
【請求項２１】
前記免疫調節部分が、VSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項２２】
前記免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 55の配列を含む、請求項１５に記載の分子。
【請求項２３】
ターゲティング部分がTIM-3、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β、IL-6R、EGFR、HER2/neu、VEGF、又はgp120に結合するポリペプチドを含み、前記免疫調節部分がVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１に記載の分子。
【請求項２４】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NOs)：10及び145；11及び146；12及び147；13及び148；14及び149；15及び150；16及び151；17及び152；18及び153；19及び154, 20及び155；21及び156；22及び157；23及び158；24及び159；25及び160；26及び161；27及び162；28及び163；29及び164；30及び165；31及び166；32及び167；33及び168；34及び169；35及び170；37及び171；38及び172；39及び173；40及び174；41及び175；42及び176；43及び177；44及び178；45及び179；46及び180；47及び181；48及び182；49及び183；50及び184；51及び185；52及び186；53及び187；58及び188；59及び189；60及び61；62及び63；64及び65；66及び67；68及び69；70及び71；72及び73；74及び75；76及び77；78及び79；80及び81；82及び83；84及び85；86及び87；88及び89；90及び91；92及び93；94及び95；96及び97；98及び99；100及び101；102及び103；104及び105；106及び107；108及び109；110及び111；112及び113；114及び115；116及び117；118及び119；120及び121；122及び123；124及び125；126及び127；128及び129；130及び131；132及び133；134及び135；136及び137；138及び139；140及び141；142及び143；192及び193；209及び210；211及び212；221及び222；223及び224；233及び234；235及び236；245及び246；247及び248；257及び258；259及び260；269及び270；271及び272；275及び276；279及び280；283及び284；287及び288；290及び291；292及び293；294及び295；296及び297又は298及び299の配列を含む、請求項１に記載の分子。
【請求項２５】
前記ターゲティング部分がPD-1又はPD-L1に結合するポリペプチドを含み、前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項２６】
前記ターゲティング部分が抗体を含み、前記免疫調節部分が前記ターゲティング部分の重鎖又は軽鎖のいずれかに融合している、請求項２５に記載の分子。
【請求項２７】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NOs): 51及び185の配列を含む、請求項２６に記載の分子。
【請求項２８】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NOs): 52及び186の配列を含む、請求項２６に記載の分子。
【請求項２９】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 53及び187の配列を含む、請求項２６に記載の分子。
【請求項３０】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 192及び193の配列を含む、請求項２６に記載の分子。
【請求項３１】
前記ターゲティング部分がCTLA-4に結合するポリペプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項３２】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 50及び184の配列を含む、請求項３１に記載の分子。
【請求項３３】
前記ターゲティング部分がLAG-3に結合するポリペプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項３４】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 26及び161の配列を含む、請求項３３に記載の分子。
【請求項３５】
前記ターゲティング部分がVISTAに結合するポリぺプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項３６】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 12及び147の配列を含む、請求項３５に記載の分子。
【請求項３７】
前記ターゲティング部分がTIGITに結合するポリぺプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項３８】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 17及び152の配列を含む、請求項３７に記載の分子。
【請求項３９】
前記ターゲティング部分がBTLAに結合するポリペプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項４０】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 22及び157の配列を含む、請求項３９に記載の分子。
【請求項４１】
前記ターゲティング部分がCCR-4に結合するポリペプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項４２】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 31及び166の配列を含む、請求項４１に記載の分子。
【請求項４３】
前記ターゲティング部分が4-1BBに結合するポリペプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項４４】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 116及び117の配列を含む、請求項４３に記載の分子。
【請求項４５】
前記ターゲティング部分がVEGFに結合するポリぺプチドを含み、及び前記免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項１４に記載の分子。
【請求項４６】
前記分子が配列番号(SEQ ID NO): 88及び89の配列を含む、請求項４５に記載の分子。
【請求項４７】
前記免疫調節部分が、BTLA又はLIGHTのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項４８】
前記リガンド結合フラグメントがヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM、CD 270)結合フラグメントを含む、請求項４７に記載の分子。
【請求項４９】
前記免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 8又は302の配列を含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５０】
前記免疫調節部分が、CD226のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項５１】
前記リガンド結合フラグメントが、CD155又はCD112結合フラグメントを含む、請求項５０に記載の分子。
【請求項５２】
前記リガンド結合フラグメントが、配列番号(SEQ ID NO): 9の配列を含む、請求項５１に記載の分子。
【請求項５３】
前記免疫調節部分がVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項５４】
前記リガンド結合フラグメントがVISTA結合フラグメントを含む、請求項５３に記載の分子。
【請求項５５】
前記リガンド結合フラグメントが、配列番号(SEQ ID NO): 55の配列を含む、請求項５２に記載の分子。
【請求項５６】
前記免疫調節部分が、CCR4のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項１に記載の分子。
【請求項５７】
前記リガンド結合フラグメントがCCL22結合フラグメントを含む、請求項５６に記載の分子。
【請求項５８】
ターゲティング部分、第1の免疫調節部分及び第2の免疫調節部分を含む分子、ここで：
(a)  前記ターゲティング部分は、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラム死-1タンパク質(PD-1)、プログラム死リガンド-1(PD-L1)、プログラム死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞免疫グロブリン及びムチン−ドメイン含有分子-3(TIM-3)、がん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM-1)、がん胎児性抗原(CEA)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、CD96、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換増殖因子β(TGFβ)、形質転換増殖因子βレセプター(TGFβR)、核内因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、RANKリガンド(RANKL)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、CD27、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD40、CD40L、CD47、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、IL-2R、CD25、CD3、gp120、上皮成長因子レセプター (EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2 (HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、上皮成長因子 (EGF)、形質転換増殖因子α (TGFα)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子レセプター-1 (VEGFR-1)、VEGFR-2又はVEGFR-3、のうちの1つ以上に特異的に結合するポリペプチドを含む、
(b)  前記第1の免疫調節部分は、形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラム死1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチン・ドメイン含有3(TIM-3)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核内因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、白血球関連免疫グロブリン様レセプター1(LAIR1)、又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む；並びに
(c)  前記第2の免疫調節部分は、形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラム死1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチン・ドメイン含有3(TIM-3)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核内因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、白血球関連免疫グロブリン様レセプター1(LAIR1)、又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)、の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【請求項５９】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO)：201及び202；203及び204；205及び206；207及び208；213及び214；215及び216；217及び218；219及び220；225及び226；227及び228；229及び230；231及び232；237及び238；239及び240；241及び242 ；243及び244；249及び250；251及び252；253及び254；255及び256;261及び262；263及び264；265及び266；267及び268；273及び274；277及び278；281及び282；285及び286の配列を含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６０】
前記ターゲティング部分のポリペプチドが、免疫グロブリン、抗体、バイスペシフィック若しくはマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、二価若しくは多価scFv、レセプターの細胞外ドメイン(ECD)由来のリガンド結合配列、又はFc含有ポリペプチドの抗原−結合ドメインを含む、請求項５８に記載の分子。
【請求項６１】
前記ターゲティング部分のポリペプチドが抗体である、請求項５８に記載の分子。
【請求項６２】
前記第1の免疫調節部分が、前記抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に結合している、請求項６１に記載の分子。
【請求項６３】
前記第2の免疫調節部分が、前記抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に結合している、請求項６１に記載の分子。
【請求項６４】
前記第2の免疫調節部分が、前記第1の免疫調節部分に結合している、請求項５８に記載の分子。
【請求項６５】
前記第1及び第2の免疫調節部分が、リンカーを用いて前記抗体の重鎖又は軽鎖に結合している、請求項６２−６３の何れか一項に記載の分子。
【請求項６６】
前記第2の免疫調節部分が、リンカーを用いて前記第1の免疫調節部分に結合している、請求項６４に記載の分子。
【請求項６７】
前記リンカーが配列番号(SEQ ID NO): 3、4又は5の配列を含む、請求項６５又は６６に記載の分子。
【請求項６８】
前記第1の免疫調節部分が前記抗体の重鎖に結合し、前記第2の免疫調節部分が前記抗体の軽鎖に結合している、請求項６２及び６３に記載の分子。
【請求項６９】
前記第1の免疫調節部分が、TIM3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項６８に記載の分子。
【請求項７０】
前記第2の免疫調節部分が、PD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項６８に記載の分子。
【請求項７１】
前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項６５に記載の分子。
【請求項７２】
前記第1の免疫調節部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項７１に記載の分子。
【請求項７３】
前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、前記第2の免疫調節部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項６２及び６３に記載の分子。
【請求項７４】
前記抗体が、IL6R、CTLA-4、EGFR、HER2、又はVEGFに特異的に結合する、請求項６１の分子。
【請求項７５】
前記ターゲティング部分がCTLA-4に結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項７６】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 203及び204の配列を含む、請求項７５に記載の分子。
【請求項７７】
前記ターゲティング部分がCTLA-4に結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項７８】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 201及び202の配列を含む、請求項７７に記載の分子。
【請求項７９】
前記ターゲティング部分がCTLA-4に結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項８０】
前記ターゲティング部分がCTLA-4に結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項８１】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 205及び206又は207及び208の配列を含む、請求項７９又は８０に記載の分子。
【請求項８２】
前記ターゲティング部分がPD-1又はPD-L1に結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項８３】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO)：273及び274；277及び278；285及び286；又は281及び282の配列を含む、請求項８２に記載の分子。
【請求項８４】
前記ターゲティング部分がIL-6Rに結合する抗体であり、前記第1の免疫調節部分がTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントであり、前記第2の免疫調節部分がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである、請求項６５に記載の分子。
【請求項８５】
前記分子が、配列番号(SEQ ID NO): 215及び216の配列を含む、請求項８４に記載の分子。
【請求項８６】
TIM-3の細胞外結合ドメイン(ECD)又はそのリガンド結合フラグメント、並びにTGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226、LAIR1、又はVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、融合タンパク質。
【請求項８７】
前記融合タンパク質が、TIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項８６に記載の融合タンパク質。
【請求項８８】
前記融合タンパク質が、配列番号(SEQ ID NO): 190の配列を含む、請求項８７に記載の融合タンパク質。
【請求項８９】
前記融合タンパク質が、TIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む、請求項８６に記載の融合タンパク質。
【請求項９０】
前記融合タンパク質が、配列番号(SEQ ID NO): 195、196又は197の配列を含む、請求項８９に記載の融合タンパク質。
【請求項９１】
Fcをさらに含む、請求項８６−９０の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９２】
請求項１−９０の何れか一項に記載の分子又は融合タンパク質、及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物。
【請求項９３】
請求項１−９０の何れか一項に記載の分子若しくは融合タンパク質、又は請求項９１に記載の組成物、を対象に投与することを含む、がん又は感染症を有する前記対象を治療する方法。
【請求項９４】
前記分子又は組成物が、皮内、皮下、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経皮、経気管、皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内、経口、舌下口腔、直腸、膣、鼻又は眼への投与、注入、吸入（inhalation）、若しくは噴霧（nebulization）又は非経口投与によって投与される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記がんが、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝臓がん、子宮頸がん、食道がん、膀胱がん、非−ホジキン・リンパ腫、白血病、膵臓がん、腎臓がん、子宮内膜がん、頭頸がん、口唇がん、口腔がん、甲状腺がん、脳がん、卵巣がん、黒色腫、胆嚢がん、喉頭がん、多発性骨髄腫、鼻咽腔がん、ホジキン・リンパ腫、精巣がん及びカポジ肉腫からなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記感染症が、インフルエンザ、結核、HIV/AIDS、マラリア、肝炎、単純ヘルペスウイルス(HSV)、及びヒト・パピローマ・ウイルス(HPV)からなる群より選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
化学療法剤、免疫療法剤又は抗生物質が前記分子、融合タンパク質又は組成物の投与と同時に、投与前又は投与後に、投与される、請求項９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、2017年5月26日に出願された米国特許出願第62/511,911号、及び2017年11月29日に出願された米国特許出願第62/592,341号の35 U.S.C.χ119(e)に基づく優先権の利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、参照によりその全体が本出願の開示に組み込まれる。
シークエンスリストの編入
【０００２】
添付のシークエンス・リストの物質は、本用途に参照して本文書に盛り込まれている。添付の配列リストテキストファイル、名前_____は、____生成され、そして_____ kbである。ファイルは、Windows OSを使用するコンピュータ上でMicrosoft Wordを使用して評価することができる。
【技術分野】
【０００３】
本発明は一般に、標的免疫調節分子及び融合タンパク質の分野に関し、より具体的には、標的免疫刺激分子又は免疫抑制分子、並びに細胞における免疫トレランスを打ち消し、又は誘導するための融合タンパク質のための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫系はヒトの身体に、異物又は潜在的に有害であると認識される微生物及び物質に対してそれ自体を認識し、防御する手段を提供する。モノクローナル抗体によるがんの受動免疫療法及び腫瘍細胞を攻撃するためのT細胞の受動移入は有効性を実証したが、これらの免疫エフェクターを誘導し、腫瘍細胞に対する免疫学的記憶を確立するための能動免疫療法の目標は依然として困難なままである。いくつかの腫瘍特異的及び腫瘍関連抗原が同定されているが、これらの抗原は一般に弱い免疫原性であり、腫瘍は免疫学的攻撃を回避することを可能にする寛容原性環境を作り出すために多様な機構を使用する。このような免疫トレランスを克服し、強力なレベルの抗体及び/又はT細胞応答を活性化するための戦略は、有効なガン免疫療法の鍵を握る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、標的免疫調節抗体及び融合タンパク質ががん、炎症性障害、及び慢性感染症において、免疫トレランス、異常なT細胞分化、及びT細胞機能不全又は消耗を中和又は逆転させることができるという精神的知見に基づく。
【０００６】
ある実施形態に、本発明はターゲティング部分及び1つ以上の免疫調節部分/部分を含む分子を提供し、ここで、ターゲティング部分は腫瘍細胞、腫瘍環境、腫瘍関連増殖因子又はレセプター、腫瘍関連サイトカイン又はレセプター、腫瘍関連Tリンパ球、T細胞共刺激又は阻害分子、免疫細胞、病原体、又は病原体関連細胞の構成要素に特異的に結合するポリペプチドを含み、免疫調節部分は、Tリンパ球免疫レセプター、T細胞 阻害レセプター(TCIR)、T細胞共阻害分子、T細胞 共刺激分子、Bリンパ球レセプター、DCレセプター、NK細胞レセプター、サイトカイン・レセプター、増殖因子レセプター、ケモカイン・レセプター、又は腫瘍細胞 レセプターの細胞外ドメイン(ECD)配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【０００７】
一態様では、ターゲティング部分のポリペプチドが免疫グロブリン、抗体、二重特異性若しくはマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、二価若しくは多価scFv、又はFc含有ポリペプチドの抗原結合ドメインを含む。別の態様では、ターゲティング部分がレセプターの細胞外ドメイン由来のリガンド結合配列を含む。
【０００８】
特定の局面において、ターゲティング部分は、T細胞阻害レセプター(TCIR)、T細胞阻害レセプター・リガンド(TCIRリガンド)、T細胞共阻害分子、又はT細胞 共刺激分子に特異的に結合する抗体である。さらなる局面において、抗体は、TCIR、TCIR配位子、又は共阻害分子のアンタゴニストである。別の局面において、該抗体は、T細胞共刺激分子のアゴニストである。さらなる局面において、標的化部分ポリペプチドは、以下の分子のうちの1つ以上を特異的に結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラムされた死リガンド-1(PD-L1)、プログラムされた死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3(TIM-3)、がん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM-1)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換増殖因子β(TGFβR)、核因子レセプター活性化因子 κ B(RANK)、RANKリガンド(RANKL)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連蛋白質(GITR)、CD27、IL6R、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD40、CD40L、CD47、CD122、CD73、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、IL-2R、CD25、CD3。特定の態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、以下のうちの1つ以上を特異的に結合する: 上皮成長因子レセプター(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、上皮成長因子(EGF)、形質転換増殖因子α(TGFα)、血管内皮増殖因子(VEGF)、血管内皮増殖因子レセプター-1(VEGFR-1)、VEGFR-2又はVEGFR-3。特定の局面において、このターゲティング部分のポリペプチドは、ヒト免疫不全ウイルスgp120 タンパク質(HIV gp120)に特異的に結合する。
【０００９】
種々の局面において、免疫調節部分は、形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラムされた死亡1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)、Bリンパ球弱毒化剤及びTリンパ球弱毒化剤(BTLA)、CD160、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD96、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、白血球関連免疫グロブリン様レセプター1(LAIR1)、又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００１０】
いくつかの局面において、該分子はリンカーを含み、そして該リンカーは、配列番号(SEQ ID NO): 3の配列を有し得る。さらなる態様では、リンカーがターゲティング部分と免疫調節部分とを融合させる。
【００１１】
いくつかの局面において、免疫調節部分は、抗体を含むターゲティング部分の重鎖に融合される。他の局面において、免疫調節部分は、抗体を含むターゲティング部分の軽鎖に融合される。さらなる局面において、1つの免疫調節部分(IM-1)は抗体を含むターゲティング部分の重鎖に融合され、そして第2の免疫調節部分(IM-2)は同じ標的化抗体の軽鎖に融合される。
【００１２】
1つの側面では、ターゲティング部分はECDを構成する免疫調節部分又はTIM-3のリガンド結合フラグメントに融合される。具体的な側面では、リガンド結合フラグメントはTIM-3のCEACAM-1結合フラグメントから構成されている。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 2に対応するTIM-3 細胞外ドメイン(TIM-3外部ドメイン; TIM-3ecd)のリガンド結合配列を含む。
【００１３】
一態様では、本ターゲティング部分がPD-1、PD-L1、CTLA4、LAG3、VISTA、TIGIT、BTLA、CCR4、41BB、OX40、GITR、VEGF、RANKL、TGF-β、IL6R、EGFR、HER2/neu、又はgp120に結合するタンパク質を含み、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである。具体的な側面では、免疫調節部分はTIM-3のCEACAM-1結合フラグメントから構成されている。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 2に対応するTIM-3ecdのリガンド結合配列を含む。
【００１４】
特定の側面において、本ターゲティング部分はPD-1又はPD-L1を結合するポリペプチドから成り、免疫調節部分は、TIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 51、52、53又は192の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 282、288、274、278の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 51及び配列番号(SEQ ID NO): 185に対応する配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 52及び配列番号(SEQ ID NO): 186に対応する配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 53及び配列番号(SEQ ID NO): 187に対応する配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 192及び配列番号(SEQ ID NO): 193に対応する配列を含む。
【００１５】
1つの側面において、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 50の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 204の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 50及び配列番号(SEQ ID NO): 184に対応する配列を含む。
【００１６】
別の側面では、ターゲティング部分はLAG-3を結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 26の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 26及び配列番号(SEQ ID NO): 161に対応する配列を含む。
【００１７】
さらに別の側面として、本ターゲティング部分はビスタを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。さらなる局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 12の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 12及び配列番号(SEQ ID NO): 147に対応する配列を含む。
【００１８】
1つの側面において、ターゲティング部分はTIGITを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 17の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 17及び配列番号(SEQ ID NO): 152に対応する配列を含む。
【００１９】
別の側面ではターゲティング部分がBTLAを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。さらなる局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 22の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 22及び配列番号(SEQ ID NO): 157に対応する配列を含む。
【００２０】
ターゲティング部分はCCR-4を結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 31の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 31及び配列番号(SEQ ID NO): 166に対応する配列を含む。
【００２１】
更に別の側面では、ターゲティング部分は4-1BBを結合するポリペプチドから構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 116の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 116及び配列番号(SEQ ID NO): 117に対応する配列を含む。
【００２２】
1つの側面において、ターゲティング部分はVEGFを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 88の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 252の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 88及び配列番号(SEQ ID NO): 89に対応する配列を含む。
【００２３】
1つの側面において、ターゲティング部分はRANKLを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。
【００２４】
1つの側面において、ターゲティング部分はIL6-Rを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 219の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 216の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 219及び61に対応する配列を含む。
【００２５】
1つの側面において、ターゲティング部分はEGFRを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 231の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 228の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 231及び配列番号(SEQ ID NO): 75に対応する配列を含む。
【００２６】
1つの側面において、ターゲティング部分はHER2/Neuを結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 102の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 240の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 102及び配列番号(SEQ ID NO): 103に対応する配列を含む。
【００２７】
1つの側面では、ターゲティング部分はHIV gp120を結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 267の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 264の配列を含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 267及びgp120抗体の軽鎖に対応する配列を含む。
【００２８】
別の態様では、ターゲティング部分がPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合されることを含む。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、PD-L1又はPD-L2結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 194に対応するPD-1 細胞外ドメイン(PD-1ecd)のリガンド結合配列を含む。さらなる態様において、本ターゲティング部分はTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分は、ECD又はPD-1のリガンド結合フラグメントを含む。
【００２９】
別の態様では、ターゲティング部分がTGFβレセプターのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合されることを含む。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、TGFβRIIのTGFβ結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 6に対応するTGFβRII細胞外ドメイン(TGFβRII ecd)のリガンド結合配列を含む。特定の態様において、本ターゲティング部分はTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分は、ECD又はそのTGFβRIIのリガンド結合フラグメントを含む。
【００３０】
さらなる態様では、ターゲティング部分がBTLA、CD160、又は光のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合されることを含む。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM、CD 270)結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 8に対応するBTLA細胞外ドメイン(BTLA ecd)のリガンド結合配列を含む。具体的な態様では免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 302に対応する光 細胞外ドメイン(光ecd)のリガンド結合配列を含む。一定の側面において、本ターゲティング部分はTIM-3、CEACAM-1、CCR4、CTR4、LAG3、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL又はVEGFに結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。
【００３１】
さらなる局面において、ターゲティング部分は、TIGIT又はCD96のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合される。1つの局面において、このリガンド結合フラグメントは、CD155又はCD112結合フラグメントを含む。特定の局面において、免疫調節部分は、TIGITのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 289に対応するTIGIT細胞外ドメイン(TIGIT ECD)のリガンド結合配列を含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 301に対応するCD96 細胞外ドメイン(CD96 ECD)のリガンド結合配列を含む。別の態様では本ターゲティング部分がTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分はECD又はそのTIGITのリガンド結合フラグメントを含む。
【００３２】
別の局面において、ターゲティング部分は、CD226のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合される。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、CD155又はCD112結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 9に対応するCD226 細胞外ドメイン(CD226 ECD)のリガンド結合配列を含む。別の態様では本ターゲティング部分がTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分はECD又はCD226のリガンド結合フラグメントを含む。
【００３３】
別の局面において、ターゲティング部分は、VSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む免疫調節部分に融合される。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、VISTA結合フラグメントを含む。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 55に対応するVSIG8 細胞外ドメイン(VSIG8 ecd)のリガンド結合配列を含む。別の態様では本ターゲティング部分がTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分はECD又はVSIG8のリガンド結合フラグメントを含む。
【００３４】
追加の側面において、本ターゲティング部分はTIM-3、CEACAM-1、BTLA、CCR4、CTR4、LAG3、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するポリペプチドで構成され、免疫調節部分はECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。具体的な態様では、免疫調節部分が配列番号(SEQ ID NO): 36に対応するCD44 細胞外ドメイン(CD44 ecd)のリガンド結合配列である。
【００３５】
さらなる態様において、免疫調節部分はCCR4のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、リガンド結合フラグメントは、CCL22結合フラグメントを含む。
1つの局面において、この分子は、配列番号10及び145; 11及び146; 12及び147; 13及び148; 14及び149; 15及び150; 16及び151; 17及び152; 18及び153; 19及び154の配列を含む。20及び155;23及び157;24及び163;156及び159;24及び165;26及び157;24及び1530;165及び167;32及び168; 34及び169;37及び171;1739及び1740;174及び175;43及び176;44及び177;45及び179;180及び47;181及び182; 49及び183;1850及び184; 51及び185;1852及び186; 53及び187; 58及び189;59及び60及び61; 62及び63; 64及び65; 66及び67; 68及び69; 70及び71; 72及び73; 74及び75; 76及び77; 78及び79; 80及び81; 82及び83; 84及び85; 86及び87; 88及び89; 90及び92;91及び93。100、101、102、103、105、104、105、108、97、95、96、97、98、97、111、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、192、209、210、211、212、221、222、223、224、233、224、235、234、235、236、245、246、247、248、257、257、248、259、260、259、260、270、271、272、275、276、279、280、283、284、287、280。
【００３６】
さらなる実施形態において、本発明は標的化部分、第1の免疫調節部分(IM-1)及び第2の免疫調節部分(IM-2)を含む分子を提供し、ここで、標的化部分は細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラムされた死リガンド-1(PD-1)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、B及びTリンパ球アテニュエーター(BTLA)、T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BBリガンド(CD137)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、形質転換成長因子β(TGF-β)、CD27、IL6R、IL23R、IL17R-6を含む。IL-23、CD39、CD122、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、 CD3、核因子κ-Bリガンドのレセプター活性化因子(RANK)、RANK、上皮増殖因子レセプター(EGFR)、ヒト上皮増殖因子レセプター2(HER2)又は血管内皮増殖因子(VEGF)、形質転換増殖因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラムされた死亡1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)、B-及びT-リンパ球弱毒化因子(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4の最初の免疫調節部分 キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核因子κBレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA);及び第2の免疫調節部分(IM-2)は形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラムされた死亡1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)、B及びTリンパ球弱毒化剤(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮成長因子レセプター(VEGFR)、核因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００３７】
いくつかの局面において、この分子は、配列番号(SEQ ID NO)の配列を含む: 201及び202; 203及び204; 205及び206; 207及び208; 213及び214; 215及び216; 217及び218; 219及び220; 225及び226; 227及び228; 229及び230; 231及び232; 237及び238; 239及び240; 241及び242 ; 243及び244; 249及び250; 251及び252; 253及び254; 255及び256; 261及び262; 263及び264; 265及び266; 267及び268; 273及び274; 277及び278; 281及び282; 285及び286。
【００３８】
1つの局面において、このターゲティング部分のポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体、二重特異性若しくはマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、二価若しくは多価scFv、レセプターの細胞外ドメイン由来のリガンド結合配列(ECD)、又はFc含有ポリペプチドの抗原結合ドメインを含む。特定の態様では、ポリペプチドは抗体である。
【００３９】
1つの局面において、第1の免疫調節部分は抗体の重鎖に付着され、そして第2の免疫調節部分は抗体の軽鎖に付着される。さらなる局面において、第1の免疫調節部分は抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に付着され、第2の免疫調節部分は抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に付着され、及び/又は第2の免疫調節部分は第1の免疫調節部分に付着される。
【００４０】
さらなる局面において、第1及び第2の免疫調節部分はリンカーを用いて抗体の重鎖又は軽鎖に付着され、及び/又は第2の免疫調節部分はリンカーを用いて第1の免疫調節部分に付着される。特定の局面において、リンカーは(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)の配列を有し、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10であり得る。ある態様ではリンカーが配列番号(SEQ ID NO)3の配列を有する。ある態様では第1の免疫調節部分がTIM3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第1の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、及び/又は第1の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。
【００４１】
さらに別の側面では、ターゲティング部分はIL6R、CTLA-4、PD-1、PD-L1、EGFR、HER2、VEGF又はgp120を具体的に結合する。
【００４２】
1つの側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 201及び配列番号(SEQ ID NO): 202を含む。別の側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 205及び配列番号(SEQ ID NO): 206を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 207及び配列番号(SEQ ID NO): 208を含む。別の側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 203及び配列番号(SEQ ID NO): 204を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドはイピリムマブを含む。さらなる態様において、この抗体はトレミリムマブである。
【００４３】
1つの側面において、ターゲティング部分はPD-1又はPD-L1を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はTGFβRIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 273及び配列番号(SEQ ID NO): 274を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 277及び配列番号(SEQ ID NO): 278を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 285及び配列番号(SEQ ID NO): 286を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 281及び配列番号(SEQ ID NO): 282を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドがニボルマブ又はペムブロリズマブを含む。さらに別の側面では、この抗体はアテゾリズマブ又はアベルマブ又はデュバルマブである。
【００４４】
1つの局面において、ターゲティング部分はIL-6Rに結合するポリぺプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、そして第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 213及び配列番号(SEQ ID NO): 214を含む。別の側面では、ターゲティング部分はIL-6Rを結合するポリペプチドで構成され、第1免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成され、第2免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 217及び配列番号(SEQ ID NO): 218を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 219及び配列番号(SEQ ID NO): 220を含む。別の態様ではターゲティング部分がIL-6Rに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 215及び配列番号(SEQ ID NO): 216を含む。さらなる局面において、本ターゲティング部分のポリペプチドは、IL-6Rに結合する抗体を含む。さらなる局面において、この抗体は、トシリズマブを含む。
【００４５】
1つの局面において、ターゲティング部分はVEGFに結合するポリぺプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、そして第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 249及び配列番号(SEQ ID NO): 250を含む。別の側面では、ターゲティング部分はVEGFを結合するポリペプチドで構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 253及び配列番号(SEQ ID NO): 254を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 255及び配列番号(SEQ ID NO): 256を含む。別の態様ではターゲティング部分がVEGFに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 251及び配列番号(SEQ ID NO): 252を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドはベバシズマブを含む。さらなる局面において、ターゲティング部分は、VEGFRのリガンド結合外部ドメインを含む。さらなる態様では、ターゲティング部分が自由を包含する。
【００４６】
1つの局面において、ターゲティング部分はEGFRに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 225及び配列番号(SEQ ID NO): 226を含む。別の側面では、ターゲティング部分はEGFRを結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 229及び配列番号(SEQ ID NO): 230を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 231及び配列番号(SEQ ID NO): 232を含む。別の態様ではターゲティング部分がEGFRに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 227及び配列番号(SEQ ID NO): 228を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、セツキシマブ又はパニツムマブ又はネシツムマブを含む。
【００４７】
1つの局面において、ターゲティング部分はHER2/Neuに結合するポリぺプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、そして第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 237及び配列番号(SEQ ID NO): 238を含む。別の側面では、ターゲティング部分はHER2を結合するポリペプチドで構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 243及び配列番号(SEQ ID NO): 244を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 241及び配列番号(SEQ ID NO): 242を含む。別の態様ではターゲティング部分がHER2に結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 239及び配列番号(SEQ ID NO): 240を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、トラスツズマブ又はペルツズマブを含む。
【００４８】
1つの局面において、ターゲティング部分はHIV gp120に結合するポリぺプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、そして第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 261及び配列番号(SEQ ID NO): 262を含む。別の側面では、ターゲティング部分はgp120を結合するポリペプチドで構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 265及び配列番号(SEQ ID NO): 266を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 267及び配列番号(SEQ ID NO): 268を含む。別の態様では、ターゲティング部分はgp120に結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 263及び配列番号(SEQ ID NO): 264を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、トラスツズマブ又はペルツズマブを含む。
【００４９】
更なる実施形態において、本発明は、TIM-3の細胞外結合ドメイン(ECD)又はそのリガンド結合フラグメント、並びにTGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226又はVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。一態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。特定の局面において、この融合タンパク質は、配列番号(SEQ ID NO): 190の配列を含む。別の態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。具体的な局面において、この融合タンパク質は、配列番号(SEQ ID NO): 195、196又は197の配列を含む。さらなる態様では、融合タンパク質はFcを含む。さらなる態様では、TIM-3 ECD及び他のECDがリンカーで取り付けられる。特定の局面において、このリンカーは、配列番号(SEQ ID NO)3、4、又は5の配列を有する。
【００５０】
ある実施形態に、先に記載した分子又は融合タンパク質及び医薬担体を含む組成物を提供する。
【００５１】
さらなる実施形態では、先に記載した分子、融合タンパク質又は組成物を対象に投与することを含む、がん又は感染症を有する対象の治療法を提供する。1つの局面において、該分子、融合タンパク質又は組成物は、皮内、皮下、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経皮、経気管、皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内、経口、舌下頬側、直腸、膣、鼻又は眼への投与、注入、吸入、又は非経口投与によって投与される。
【００５２】
別の局面において、がんは、肺がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、子宮頸がん、食道がん、ブラダがん、非ホジキンリンパ腫、白血病、膵がん、腎がん、子宮内膜がん、頭頸がん(HNSCC)、リップがん、口腔がん、甲状腺がん、脳がん、卵巣がん、黒色腫、胆嚢がん、喉頭がん、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、ホジキンリンパ腫、精巣がん又はカポジ肉腫である。
【００５３】
さらなる局面において、感染性病原体又は疾患は、HIV/AIDS、単純ヘルペスウイルス/ヘルペス、ヒト乳頭腫ウイルス、B型又はC型肝炎ウイルス/肝炎、エプスタインバーウイルス(EBV)、ボレリア・ブルグドルフェリ/ライム病、インフルエンザ、結核菌/結核菌、マイコバクテリア・レプラエ(Mycobacteria leprae)/レプロシ(Leprosy)、マラリア(Malaria)、梅毒(Syphilis)、ゴノルレア(Gonorrhea)、又はクレブシエラ肺炎/肺炎である。
【００５４】
更なる実施形態において、化学療法剤、免疫抑制剤又は抗生物質は該分子、融合タンパク質又は組成物の投与と同時に、投与の前後に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図1.T細胞活性化を阻害し、免疫トレランス及びT細胞消耗を誘導する自己分泌/傍分泌レセプターリガンド相互作用の模式図。自己分泌/傍分泌TGFβは、Treg系統のシグネチャ転写因子であるFOXP3の発現を誘導する。FOXP3はCTLA-4の表現を誘発するが、これはB7-CD28の相互作用を介在させることによってT細胞費用の推定を抑制するT細胞阻害レセプターである。TregはTIM-3に関与し、TIM-3/CEACAM-1共阻害軸によるエフェクタT細胞の消耗又はアポトーシスを誘発するリガンドであるガレクチン-9を発現する。PD-L1によるPD-1の係合はTregを誘導及び維持するためにFOXP3のTGFβ誘導発現を促進し、T細胞枯渇及び死亡を誘導するためにTIM-3/CEACAM-1シグナル伝達と協働する。
【図２】図2A〜C。a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdはPD-L1/PD-1シグナル伝達及びTIM-3/CEACAM-1共阻害軸を同時に遮断することにより、免疫トレランス及びT細胞枯渇を打ち消す。(A)a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdの構造及び標的の模式図。a-PD1-TIM3ecdは(i)柔軟性リンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列に融合したヒトa-PD-1抗体の重鎖、(GGGS)3(配列番号(SEQ ID NO): 53)及び(ii)ヒトa-PD-1抗体の軽鎖(配列番号(SEQ ID NO): 187)を含む。a-PDL1-TIM3ecdは(i)柔軟性リンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合したヒトa-PD-L1抗体の重鎖、(GGGS)3(配列番号(SEQ ID NO): 51)及び(ii)ヒトa-PD-L1抗体の軽鎖(配列番号(SEQ ID NO):185)を含む。(B)a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdがT細胞活性化を阻害し、T細胞枯渇を誘導するオートクリン/パラクリンレセプターリガンド 相互作用を破壊する標的及びメカニズムの概略図。自己分泌/傍分泌TGFβは、Treg系統のシグネチャ転写因子であるFOXP3の発現を誘導する。FOXP3はCTLA-4の表現を誘発するが、これはB7-CD28の相互作用を介在させることによってT細胞費用の推定を抑制するT細胞阻害レセプターである。TregはTIM-3に関与し、TIM-3/CEACAM-1共阻害軸によるエフェクタT細胞の消耗又はアポトーシスを誘発するリガンドであるガレクチン-9を発現する。PD-L1によるPD-1の係合はTregを誘導及び維持するためにFOXP3のTGFβ誘導発現を促進し、T細胞枯渇及び死亡を誘導するためにTIM-3/CEACAM-1シグナル伝達と協働する。a‐PDL1‐TIM3ecdとa‐PD1‐TIM3ecdはPD‐1/PD‐L1シグナル伝達を無効にし、同時にTIM‐3とCEACAM‐1共阻害経路を含むシス/トランス相互作用を破壊する a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdが同時にPD-L1/PD-1及びTIM-3/CEACAM-1共阻害軸を介してT細胞の多重抑制に対抗するメカニズムの模式図。a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdはPD-L1/PD-1 相互作用を中断し、同時に、(i)異種TIM-3/CEACAM-1 相互作用(cis CEACAM-1/TIM-3ヘテロ二量体化;TIM-3によるトランスCEACAM1ヘテロ二量体化);(ii)同種CEACAM-1/CEACAM-1 相互作用(cis CEACAM-1二量化;トランスCEACAM1誘導シスCEACAM-1 二量化)を破壊する。
【図３】図3A〜D。a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdの特性及び標的結合能。(A)a‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PD1抗体(ニボルマブ)の全長(FL)、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を比較するために、低減(R)及び非低減(NR)条件下のSDS‐PAGEを用いた。SDS-PAGEは、a-PD1抗体の重鎖と比較して、a-PD1-TIM3ecdの重鎖の予想されるより高い分子量を確認した(上図)。a‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PDL1抗体(アテゾリズマブ)の全長(FL)、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を比較するために、低減(R)及び非低減(NR)条件下のSDS‐PAGEを用いた。SDS-PAGEは、a-PDL1抗体の重鎖と比較して、a-PDL1-TIM3ecdの重鎖の予想されるより高い分子量を確認した(下図)。(B)a-PD1-TIM3のrhPD-1への結合を示すELISA(上のパネル):ビオチン化rhPD-1(0〜250ng/ml)を、a-PD1-TIM3ecd(1μg/ml)でコーティングしたプレートに添加した。a-PDL1-TIM3のrhPD-L1への結合を示すELISA(下図):ビオチン化rhPD-L1(0〜250ng/ml)を、a-PDL1-TIM3(1μg/ml)又はa-PDL1抗体(アテゾリズマブ)(ポジティブ・コントロール)のいずれかでコーティングしたプレートに添加した。(C)a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdはin vitroで組換えヒト(rh)CEACAM-1に結合する。CEACAM-1(5μg)をa-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-gp120-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa-PD1 mAb(ニボルマブ)(それぞれ10μg)の存在下又は非存在下でインキュベートし(一晩、4o C)、続いてタンパク質A-アガロースビーズ(10μl)と6時間インキュベートし、次いでタンパク質A-アガロースビーズで免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。免疫ブロット分析ではa‐PD1‐TIM3ecd、a‐PDL1‐TIM3ecd、及びa‐gp120‐TIM3ecdタンパク質Aプルダウン免疫沈降物中にrhCEACAM‐1を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)の免疫沈降物中には検出しなかった。(D)a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdは、共刺激ヒトT細胞上でCEACAM-1に結合する。ヒトPBMCを、a‐PD1‐TIM3ecd、a‐PDL1‐TIM3ecd、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)、又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)の存在下、抗CD3/抗CD28 ビーズと6日間共刺激した。細胞溶解物をタンパク質A-アガロースビーズ(10μL)で6時間免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。CEACAM‐1抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A‐免疫沈降物においてCEACAM‐1を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物においては検出しなかった。TIM‐3ecd抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A免疫沈降物中のa‐PD1‐TIM3ecd又はa‐PDL1‐TIM3ecdの重鎖を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物中では検出しなかった。
【図４】図4A〜C。a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdは、a-PD-1 mAb又はa-PD-L1 mAbよりも、IFNγ式の促進及び共刺激T細胞の消耗の抑制において有意に効果的である。(A)a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの併用(それぞれ5μg/ml)の存在下又は非存在下で、ヒトPBMCを抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2で3〜9日間刺激した。示された各時間(3d、6d、及び9d)での電池上澄み液中のインターフェロンγ(IFN-γ)をELISAによって定量した(データーは、各群について3回のインビトロ複製物の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。ELISAはa-PDL1-TIM3ecdとa-PD1-TIM3ecdがa-PDL1(アテゾリズマブ)、a-TIM3 Ab、あるいはa-PD1 mAbとa-TIM3 Abのいずれよりも、IFNγの式を促進し、体外での共刺激T細胞の枯渇を相殺する上で有意に効果的であることを示した。抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2により、a-PD1-PDL1-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はそれぞれ16h又は40hについてa-PD1 mAbとa-TIM3 Ab(5μg/ml)の組み合わせで刺激され、細胞上澄み液におけるIFN-γはELISA(in vitro replace/groupの平均±SEM)によって定量化された。a-PDL1-TIM3ecdはa-PDL1(アテゾリズマブ)、a-PD-1(ペムブロリズマブ)、a-TIM3 Ab、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組合せのいずれかと比較して、インビトロで共刺激されたT細胞によるIFNγ発現を促進するのに有意に効果的である[データは抗体を用いない共刺激と比較して、それぞれの抗体処理群におけるIFNγ発現の倍数変化を表す]。(C)a-PD1-TIM3ecdは、共刺激T細胞におけるIFNγ式のTGFβ媒介抑制を妨げる。ヒトPBMCを、a‐PDL1‐TIM3(5μg/ml)の有無にかかわらず、rhTGFβ1(5ng/ml)の存在下又は非存在下で、抗CD3/抗CD28及びrhIL‐2で16時間又は40時間刺激し、電池上澄み液中のインターフェロン‐γ(IFN‐γ)をELISAにより定量した(データーはそれぞれの群について3回のインビトロ複製の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。
【図５】図5A〜B。A-PD1-TIM3ecdはA-PD-1、A-TIM-3又はA-PD1(A)NSGマウス(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8週間)を3×106個のヒト末梢血単核細胞(PBMC)(抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2で共成長した)の養子移植により、A-PD1-TIM-3ecd、A-PD1 mAb(ニボルマブ)、A-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、A-PD1 mAbとA-TIM3 Abの組み合わせ、又は乗り物単独の8日間の特定の治療の存在下で再構成した。再構成マウスに、2×106D-MUT1ヒト結腸直腸がん細胞を皮下注射し、それぞれの群に、養子移入に使用したPBMCのインビトロ処理に使用したのと同じ処理をインビボ(5mg/kg i.p.5日毎)で処理した: a-PD1-TIM3ecd; a-PD1(ニボルマブ);a-TIM-3(F38-2E2); a-PD1とa-TIM-3の組合せ; 乗り物単独(未処理対照)[>=5マウス/群]。腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの片側t検定)は、a-PD1-TIM3ecdと各他の処置群との間の有意差を示す。(B)免疫欠損NSGマウス(NOD/Shi‐scid IL‐2rgnull)(4‐8週間)を200cGyで照射し、HLA A2適合ヒトCD34+.造血細胞の養子移入により免疫再構成した。再構成ヒト化マウスに、ヒト三重陰性乳がん(TNBC)HLA A2+ 腫瘍細胞(MDA‐MB‐231‐Luc)(マトリゲル中1x106;乳房脂肪体)を皮下注射した。腫瘍接種後3日目に、マウスを無作為化し、乗り物単独(未処理対照)又は以下の抗体(週1回腹腔内5mg/kg): a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD1 mAb及びa-TIM3 Abの組合せ[>=5マウス/基]のいずれかで処置した。腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの片側t検定)は、a-PD1-TIM3ecdと各他の処置群との間の有意差を示す。
【図６】図6A〜C。a-PDL1-TIM3ecdはa-PD-L1、a-PD-1、a-TIM-3又はa-PD-L1とa-TIM-3の組み合わせよりも効果的に腫瘍増殖を阻害する。欠損NSGマウス(NOD/Shi‐scid IL‐2rg null)(4〜8週)を200cGyで照射し、HLA A2ヒトCD34+.hematopoietic細胞の養子移入により免疫再構築した。再構成ヒト化マウスにヒトトリプルネガティブ乳がん(TNBC)HLA A2+ 腫瘍細胞(MDA‐MB‐231‐Luc)(マトリゲルの1x106;乳腺脂肪体)を皮下注射した。腫瘍接種後3日目に、マウスを無作為化し、乗り物単独(未処理対照)又は以下の抗体(5mg/kg i.pweekly):a-PDL1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ペムブロリズマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD-L1 mAb及びa-TIM3 Abの組合せ[>=5マウス/基]のいずれかで処置した。(A)腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの対応のないt検定)は、a-PDL1-TIM3ecdとお互いの処置群との間の有意差を示す。(B)未処置対照又は腫瘍細胞接種後7及び27日目の示された処置群における原発腫瘍の生物発光アッセイ(C)腫瘍におけるT細胞密度の定量:腫瘍体積及びフローサイトメトリーを用いて、腫瘍31mm当たりのCD4+及びCD8+ T細胞の絶対数を評価した。
【図７】図7A〜B。標的エピトープに結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びPD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、PD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。(A)ターゲティング抗体を含む本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計であって、抗体の重鎖がリンカーを介してTIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)にC末端で融合され、抗体の軽鎖がリンカーを介してPD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)にC末端で融合される、概略設計。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。(B) 本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図設計は標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してPD-1のリガンド結合外部ドメイン配列(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合外部ドメイン配列(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、VドメインIg抑制因子(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒化因子(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換成長因子βレセプター(TGF-β)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、IL6R、IL17R、IL-6、IL-23CD39、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、上皮増殖因子レセプター(EGFR、EGFR1)ErbB-1、HER1、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKリガンド(RANKL)、RANK、gp120。
【図８】図8A〜B。CTLA-4に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、PD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4(抗原結合CDRを介して)に結合し、PD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。(A)CTLA-4に結合する標的化抗体を含む、本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計であって、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 207)を介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 208)を介してPD-1のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。(B) CTLA-4に結合する標的化抗体を含む本多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略デザインであって、抗体の重鎖がリンカーペプチドを介してPD-1のリガンド結合外部ドメイン配列(配列番号(SEQ ID NO): 205)にC末端で融合され、抗体の軽鎖がリンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合外部ドメイン配列(配列番号(SEQ ID NO): 206)にC末端で融合される、概略デザイン。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。
【図９】図9.標的エピトープに結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、TGFβ(TGFβRIIecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは、リンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 6)を介してTGFβRII(TGFβRIIecd)のリガンド結合外部ドメイン配列に抗体の重鎖がC末端で融合され、リンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列に抗体の軽鎖がC末端で融合される標的化抗体を含む。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラムされた死リガンド(PD-L1)、プログラムされた死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒剤(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)IL23R、IL-6、IL-17、CD39、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25CD3、上皮成長因子レセプター(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKリガンド(RANKL)、RANK。
【図１０】図10A〜C。TIM-3(TIM-3ecd)のT細胞阻害レセプター又はリガンド、リガンド結合IgVエクトドメイン配列、及びTGFβRII(TGFβRIIecd)のリガンド結合エクトドメイン配列に結合するターゲティング抗体を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計 PD-1に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはPD-1に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 273に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 274に対応する軽鎖とを含む。別の実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 277に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 278.(B)に対応する軽鎖とを含む。PD-L1に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合性IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合性エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む、本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図設計。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはPD-L1に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合される。一つの態様において、リンカーは、(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 285に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 285に対応する軽鎖とを含む。別の実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 281に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 282に対応する軽鎖とを含む。(C)CTLA-4に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRIIのリガンド結合外部ドメイン配列(TGF-RIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 203に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 204に対応する軽鎖とを含む。
【図１１】図11.標的エピトープに結合するターゲティング抗体、PD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、TGFβ(TGFβRIIecdを介して)及びPD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)に結合することができる。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してPD-1(PD1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3(TIM-3)、CEACAM-1、がん胎児性抗原(CEA)、VドメインIg抑制因子(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒化因子(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、IL6R、IL17R、IL-6IL-23、CD39、CD122、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、上皮増殖因子レセプターEGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGFR、RANKリガンド(RANKL)、RANK。
【図１２】図12.種々の実施形態において、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは、PD-1(PD-1ecd)のT細胞阻害レセプター又はリガンド、リガンド結合外部ドメイン配列、及びTGF-RII(TGFβRIIecd)のリガンド結合外部ドメイン配列に結合する標的化抗体を含む。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 203)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してPD-1(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 202)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 202に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 203に対応する軽鎖とを含む。
【図１３】図13A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. ヒトTIM-3/HAVCR2 タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 1。B. ヒトTIM-3/HAVCR2 細胞外ドメイン(ECD)タンパク質、配列配列番号(SEQ ID NO): 2。
【図１４】図14A〜Dは、ポリペプチド配列である。A. リンカー配列配列番号(SEQ ID NO): 3。B. リンカー配列配列番号(SEQ ID NO): 144。C. リンカー配列配列番号(SEQ ID NO): 4。D. リンカー配列配列番号(SEQ ID NO): 5。
【図１５】図15A〜Dは、ポリペプチド配列である。A. TGFβレセプターII細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 6。B. PD-1 細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 7。C. BTLA細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 8。D. CD226 細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 9。
【図１６】図16 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖+TGFβRII ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 10。B. 抗VISTA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 145。
【図１７】図17 Aareはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖 + PD-1 ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 11。B. 抗VISTA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 146。
【図１８】図18 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖 + TIM-3 ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 12。B. 抗VISTA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 147。
【図１９】図19 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖 + BTLA ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 13。B. 抗VISTA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 148。
【図２０】図20 Aareはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖 + CD226 ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 14。B. 抗VISTA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 149。
【図２１】図21 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖+TGFβRII ECD融合配列、配列番号(SEQ ID NO): 15。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 150。
【図２２】図22 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖 + PD-1 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 16。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 151。
【図２３】図23 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 17。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 152。
【図２４】図24 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 18。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 153。
【図２５】図25 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 19。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 154。
【図２６】図26 A-Bは、ポリペプチド配列A.抗BTLA重鎖+TGFβRII ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 20である。B. AntiBTLA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 155。
【図２７】図27 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗BTLA重鎖 + PD-1 ECD融合タンパク質配列、配列番号21。B. AntiBTLA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 156。
【図２８】図28 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗BTLA重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 22。B. AntiBTLA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 157。
【図２９】図29 Aareはポリペプチド配列である。A. 抗BTLA重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 23。B. AntiBTLA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 158。
【図３０】図30 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3重鎖+TGFβRII ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 24。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 159。
【図３１】図31 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3 重鎖 + PD-1 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 25。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 160。
【図３２】図32 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3 重鎖 + TIM-3心電図融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 26。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 161。
【図３３】図33 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3 重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 27。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 162。
【図３４】図34 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3 重鎖 + CD226心電図融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 28。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 163。
【図３５】図35 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4重鎖+TGFβRII ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 29。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 164。
【図３６】図36 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4重鎖+PD-1 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 30。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 165。
【図３７】図37 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4重鎖+TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 31。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 166。
【図３８】図38 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4重鎖+BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 32。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 167。
【図３９】図39 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4 重鎖 + CD226 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 33。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 168。
【図４０】図40 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD1重鎖+BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 34。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 169。
【図４１】図41 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD1 重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 35。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 170。
【図４２】図42 A-Cはポリペプチド配列である。A. CD44 タンパク質配列の細胞外ドメイン、配列番号(SEQ ID NO): 36。B. 抗PD1 重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 37。C. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 171。
【図４３】図43 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CTLA-4 重鎖 + CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 38。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 172.
【図４４】図44 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗LAG-3 重鎖 + CD44心電図融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 39。B. 抗LAG-3 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 173。
【図４５】図45 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗TIGIT重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 40。B. 抗TIGIT軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 174。
【図４６】図46 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗BTLA重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 41。B. AntiBTLA軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 175。
【図４７】図47 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VISTA重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 42。B. 抗ビスタ軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 176。
【図４８】図48 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CCR4 重鎖 + CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 43。B. AntiCCR4 軽鎖タンパク質順序、配列番号(SEQ ID NO): 177。
【図４９】図49 A-Bはポリペプチド配列である。A.抗CTLA-4 重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 44。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 178.
【図５０】図50 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-1 重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 45。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 179。
【図５１】図51 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-L1 重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 46。B. 抗PD-L1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 180。
【図５２】図52 A-Bはポリペプチド配列である。A. AntiCTLA-4 重鎖 + CD226 ECD融合タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 47。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 181。
【図５３】図53 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-1 重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 48。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 182。
【図５４】図54 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-L1 重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 49。B. 抗PD-L1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 183。
【図５５】図55 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CTLA-4 重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 50。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 184。
【図５６】図56 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-L1 重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 51。B. 抗PD-L1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 185。
【図５７】図57 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗PD-1 重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 52。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 186。
【図５８】図58 A-Bは、ポリぺプチド配列7である。A. 抗PD-1 重鎖 + TIM-3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 53。B. 抗PD-1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 187。
【図５９】図59 A-Dはポリペプチド配列である。B. ヒトVSIG8心電図タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 55。C. ヒトVISTAタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 56。B. ヒトVISTA ECDタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 57。
【図６０】図60 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CTLA-4 重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 58。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 188。
【図６１】図61 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗CTLA-4 重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 59。B. AntiCTLA-4 軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 189。
【図６２】図62 A-Bはポリペプチド配列1である。A. 抗IL6R重鎖 + TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 60。B. 抗IL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 61。
【図６３】図63 Aareはポリペプチド配列である。A. 抗IL6R重鎖 + VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 62。B. AntiIL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 63。
【図６４】図64 A-Bはポリペプチド配列である。AAntiIL6R重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 64。B. 抗IL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 65。
【図６５】図65 A-Bは、ポリぺプチド配列7である。A. 抗IL6ROOB+CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 66。B. 抗IL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 67。
【図６６】図66 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL6R重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 68。B. 抗IL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 69。
【図６７】図67 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL6ROOB+CD226 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 70。B. 抗IL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 71。
【図６８】図68 A-Bは、ポリぺプチド配列3である。A. AntiIL6R重鎖 + LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 72。B. AntiIL6R軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 73。
【図６９】図69 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗EGFR重鎖 + TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 74。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 75。
【図７０】図70 A-Bは、ポリぺプチド配列7である。A. 抗EGFR重鎖 + VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 76。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 77。
【図７１】図71 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗EGFR重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 78。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 79。
【図７２】図72 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗EGFR重鎖 + CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 80。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 81。
【図７３】図73 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗EGFR重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 82。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 83。
【図７４】図74 A-Bは、ポリぺプチド配列5である。A. 抗EGFR重鎖 + CD226 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 84。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 85。
【図７５】図75 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗EGFR重鎖 + LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 86。B. 抗EGFR軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 87。
【図７６】図76 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VEGF重鎖 + TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 88。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質シークエンス、配列番号(SEQ ID NO): 89.
【図７７】図77 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VEGF重鎖 + VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 90。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質順序、配列番号(SEQ ID NO): 91。
【図７８】図78 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VEGF重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 92。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 93。
【図７９】図79 A-Bは、ポリぺプチド配列5である。A. 抗VEGF重鎖 + CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 94。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 95。
【図８０】図80 A-Bは、ポリペプチド配列A.抗VEGF重鎖 + BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 96である。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 97。
【図８１】図81 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VEGF重鎖 + CD226 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 98。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 99。
【図８２】図82 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗VEGF重鎖 + LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 100。B. AntiVEGF軽鎖タンパク質順序、配列番号(SEQ ID NO): 101。
【図８３】図83 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗HER2重鎖+TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 102。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 103。
【図８４】図84 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗HER2重鎖+VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 104。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 105。
【図８５】図85 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗HER2重鎖+VSIG8心電図融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 106。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 107。
【図８６】図86 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗HER2 重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 108。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 109。
【図８７】図87 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗HER2重鎖+BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 110。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 111。
【図８８】図88 A-Bは、ポリぺプチド配列3である。A. 抗HER2 重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 112。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 113。
【図８９】図89 A-Bは、ポリぺプチド配列5である。A. 抗HER2重鎖+LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 114。B. 抗HER2軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 115。
【図９０】図90 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗41BB重鎖 + TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 116。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 117。
【図９１】図91 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗41BB重鎖 + VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 118。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 119。
【図９２】図92 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗41BB重鎖 + VSIG8 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 120。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 121。
【図９３】図93 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗41BB重鎖 + CD44 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 122。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 123。
【図９４】図94 A-Bは、ポリペプチド配列41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 125である。
【図９５】図95 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗41BB重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 126。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 127。
【図９６】図96 A-Bはポリペプチド配列である。A. Anti41BB重鎖 + LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 128。B. 抗41BB軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 129。
【図９７】図97 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL23重鎖+TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 130。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 131。
【図９８】図98 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL23重鎖+VISTA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 132。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 133。
【図９９】図99 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL23重鎖+VSIG8心電図融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 134。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 135。
【図１００】図100 A-Bはポリペプチド配列である。A. 抗IL23 重鎖 + CD44 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 136。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 137。
【図１０１】図101A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 抗IL23重鎖+BTLA ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 138。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 139。
【図１０２】図102A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 抗IL23 重鎖 + CD226 融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 140。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 141。
【図１０３】図103A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. AntiIL23 重鎖 + LIGHT ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 142。B. 抗IL23軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 143。
【図１０４】図104A〜Bは、ポリペプチド配列である。TIM3 ecd-Fc-TGFβRII ecd融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 190。B. TIM3 ecd-Fc-TGFβRII ecd融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 191。
【図１０５】図105A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 抗PD-L1 重鎖 + TIM3 ECD融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 192。B. 抗PD-L1 軽鎖タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 193。
【図１０６】図106A〜Dは、ポリペプチド配列である。A. PD-1 ecdタンパク質配列のリガンド結合配列、配列番号(SEQ ID NO): 194。B. TIM3 ecd + PD-1 ecd融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 195。C TIM3 ecd + PD-1 ecd融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 196。D. TIM3 ecd + PD-1 ecd融合タンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 197。
【図１０７】図107は、PD-1 細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 198である。
【図１０８】図108は、IgG Fcタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 199である。
【図１０９】図109は、TIM-3 細胞外ドメインタンパク質配列、配列番号(SEQ ID NO): 200である。
【図１１０】図110A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):201:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):202:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１１１】図111A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):203:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):204:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１１２】図112A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):205:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖 + PD-1 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):206:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１１３】図113A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):207:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):208:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１１４】図114A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):209:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):210:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１１５】図115A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):211:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):212:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１１６】図116A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):213:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):214:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１１７】図117A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):215:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):216:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１１８】図118A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):217:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖 + PD-1 ECD.B.配列番号(SEQ ID NO):218:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１１９】図119A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):219:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):220:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２０】図120A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):221:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):222:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２１】図121A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):223:抗IL6R抗体(トシリズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):224:抗IL6R抗体(トシリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１２２】図122A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):225:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):226:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２３】図123A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):227:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):228:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１２４】図124A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):229:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖 + PD-1 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):230:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１２５】図125A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):231:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):232:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２６】図126A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):233:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):234:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２７】図127A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):235:抗EGFR抗体(セツキシマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):236:抗EGFR抗体(セツキシマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１２８】図128A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):237:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):238:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１２９】図129A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):239:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):240:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１３０】図130A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):241:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖 + PD-1 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):242:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１３１】図131A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):243:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):244:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１３２】図132A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):245:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):246:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１３３】図133A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):247:抗HER2抗体(トラスツズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):248:抗HER2抗体(トラスツズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１３４】図134A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):249:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):250:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１３５】図135A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):251:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):252:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１３６】図136A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):253:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖 + PD-1 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):254:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１３７】図137A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):255:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):256:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１３８】図138A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):257:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):258:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１３９】図139A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):259:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):260:抗VEGF抗体(ベバシズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４０】図140A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):261:抗gp120抗体(B12)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):262:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１４１】図141A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):263:抗gp120抗体(B12)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):264:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４２】図142A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):265:抗gp120抗体(B12)重鎖 + PD-1 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):266:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４３】図143A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):267:抗gp120抗体(B12)重鎖 + TIM3 ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):268:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１４４】図144A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):269:抗gp120抗体(B12)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):270:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + PD-1 ECD。
【図１４５】図145A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):271:抗gp120抗体(B12)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):272:抗gp120抗体(B12)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４６】図146A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):273:抗PD1抗体(ニボルマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):274:抗PD1抗体(ニボルマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４７】図147A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):275:抗PD1抗体(ニボルマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):276:抗PD1抗体(ニボルマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４８】図148A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):277:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):278:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１４９】図149A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):279:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):280:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１５０】図150A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):281:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):282:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１５１】図151A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):283:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):284:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１５２】図152A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):285:抗PDL1抗体(アベルマブ)重鎖 + TGFbRII ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):286:抗PDL1抗体(アベルマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１５３】図153A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):287:抗PDL1抗体(アベルマブ)重鎖。B. 配列番号(SEQ ID NO):288:抗PDL1抗体(アベルマブ)軽鎖 + TIM3 ECD。
【図１５４】図154は、配列番号(SEQ ID NO): 289のTIGITの細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【図１５５】図155A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):290:抗PD1抗体(ニボルマブ)重鎖 + TIGIT ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):291:抗PD1抗体(ニボルマブ)軽鎖。
【図１５６】図156A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):292:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)重鎖 + TIGIT ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):293:抗PD1抗体(ペムブロリズマブ)軽鎖。
【図１５７】図157A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):294:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)重鎖 + TIGIT ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):295:抗PDL1抗体(アテゾリズマブ)軽鎖。
【図１５８】図158A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):296:抗PDL1抗体(アベルマブ)重鎖 + TIGIT ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):297:抗PDL1抗体(アベルマブ)軽鎖。
【図１５９】図159A〜Bは、ポリペプチド配列である。A. 配列番号(SEQ ID NO):298:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)重鎖 + TIGIT ECD。B. 配列番号(SEQ ID NO):299:抗CTLA4抗体(イピリムマブ)軽鎖。
【図１６０】図160は、CD160、配列番号(SEQ ID NO): 300の細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【図１６１】図161は、CD96、配列番号(SEQ ID NO): 301の細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【図１６２】図162は、LIGHT, 配列番号(SEQ ID NO): 302の細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【図１６３】図163は、CD44、配列番号(SEQ ID NO): 303の細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【図１６４】図表164は、TIM-3、配列番号(SEQ ID NO): 304の細胞外ドメインの破片のポリペプチドシークエンスを示している。
【図１６５】図165は、ライト、配列番号(SEQ ID NO): 305のフラグメントのポリぺプチド配列である。
【図１６６】図166は、ライト、配列番号(SEQ ID NO): 306のフラグメントのポリぺプチド配列である。
【図１６７】図167は、LAIR1、配列番号(SEQ ID NO): 307の細胞外ドメインのポリぺプチド配列である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
がん及び感染性障害における免疫トレランス又はT細胞機能不全を打ち消すように設計された多機能性の抗体−リガンド・トラップを記載する。本発明の分子は、腫瘍又は病原体免疫微小環境において免疫不全を引き起こす多様な免疫レセプター-リガンド相互作用を含む多重自己分泌/傍分泌シグナル伝達ループを効率的に遮断するように設計される。調節性T細胞、免疫トレランスの誘導/機能、及び/又はT細胞消耗を打ち消すことによって、本発明の分子及び組成物は腫瘍性疾患/がんの処置のために、又は感染性疾患の予防又は処置のために病原体に対する免疫反応、有効な抗腫瘍免疫を回復及び増強し得る。この新規な級の多機能性の抗体−リガンド・トラップが強力な抗腫瘍免疫応答を放出することができることは、多くの級の進行がん及び耐火物がんのための有望な免疫療法ストラテジーを提供する。
【００５７】
本発明の組成物及び方法が記載される前に、本発明は、記載される特定の組成物、方法、及び実験条件に限定されず、そのような組成物、方法、及び条件は変化し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用する専門用語は特定の態様を説明する目的のためのみのものであって、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【００５８】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「a」、「an」、及び「the」は文脈が明らかにそわないことを示さない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は本明細書で説明されるタイプの1つ又は複数の方法及び/又は工程を含み、これらは、本開示などを読むと当業者には明らかになるのであろう。
【００５９】
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個々に示されたかのように、同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
異なる定義がなされていない限り、ここで使用するすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は当量な任意の方法及び物質を、本発明の実施又は試験において使用することができるが、修正及び変形が本発明の趣旨及び範囲内に包含されることが理解されるのであろう。ここで、好ましい方法及び物質について説明する。
【００６１】
がんの特徴である腫瘍環境の免疫不全
【００６２】
腫瘍細胞の固有のゲノム不安定性から生じる遺伝的突然変異は、免疫系によって認識される新生抗体を提示する。抗原提示樹状細胞とTリンパ球の間の免疫シナプスでの腫瘍抗原の交差提示は、CD4+Tヘルパー細胞(OC1)とCD8+ 細胞傷害性エフェクター細胞によって媒介され、腫瘍反応性中央記憶T細胞によって維持される適応抗腫瘍免疫反応を潜在的に活性化することができる。しかしながら、腫瘍は免疫系による脱離を回避するために免疫トレランスのメカニズムを共選択及び増幅することによって、このような免疫監視に対抗し、最終的に打ち勝つように連続的に進化する。腫瘍進行のためのこの前提条件は、機能不全の腫瘍免疫微小環境を作り出す免疫調節因子を産生するがんの能力によって可能になる。これらの因子には、T細胞、NK細胞、マクロファージ、及び樹状細胞などの免疫細胞の分化、活性化、増殖、生存、細胞傷害性機能、及び動員を調節する免疫調節リガンド、サイトカイン、及びケモカインが含まれる。腫瘍環境におけるこれらの因子の独立した協同作用は腫瘍浸潤T細胞の異常な分化及び機能によって特徴付けられる機能不全免疫表現型を試験結果:(i)T H1細胞の減少;(ii)エフェクターT細胞を抑制し、免疫トレランスを媒介するCD4+ T細胞のサブ集団である調節性T細胞の上昇(Tregs);(iii)細胞傷害性CD8+ T細胞の減少;(iv)増殖せず、エフェクター機能(例えば、抗原刺激に応じた細胞傷害性及びサイトカイン分泌)を発揮しない消耗T細胞の上昇。腫瘍浸潤免疫細胞の機能的配向性は、がん患者の転帰に大きな影響を及ぼす。T H1細胞及び細胞傷害性CD8+ T細胞は一様に強く無病生存期間の延長と関連しているが、Treg及び枯渇したCD8+ T細胞を有する腫瘍の浸潤は予後不良と相関している。
【００６３】
腫瘍環境中の免疫不全の分子決定基
【００６４】
がんはT細胞阻害レセプター(TCIR)に関与し、T細胞の活性化を阻害する免疫抑制リガンドを発現する。これらのTCIR-TCIRリガンド相互作用は、共刺激レセプター及びリガンド(図1)によるT細胞の活性化を妨害及び抑制する「免疫チェックポイント」として働く。以下のTCIR及びTCIRリガンドは、腫瘍環境における免疫トレランス及びT細胞の消耗を媒介する:
【００６５】
プログラム死1(PD-1)/PD-1 リガンド及び細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4):
【００６６】
PD-1 レセプター(CD279)及びそのリガンドであるPD-1リガンド1(PD-L1; B7-H1; CD274)及びPD-1リガンド2(PD-L2; B7-DC; CD273)は、自己寛容の維持に重要な役割を果たすB7-CD28ファミリーのメンバーである。PD‐1リガンドによるPD‐1の係合はT細胞のCD3/CD28媒介活性化を阻害し、T細胞エフェクタ機能を阻害し、T細胞枯渇を誘導し、T細胞アポトーシスPD‐1/PD‐L1シグナル伝達を促進し、T細胞の活性化を抑制する共阻害分子であるフォークヘッドボックスP3(FOXP3)転写因子及び細胞傷害性Tリンパ球抗原‐4(CTLA‐4)を発現する免疫抑制CD4+ T細胞のサブ集団である調節性T細胞(Tregs)の誘発、機能及び維持を促進する。
【００６７】
PD-1/PD-L1経路は、がんにおける免疫トレランス及びT細胞枯渇の誘導に重要な役割を果たす。PD-L1はいくつかの異なるがんにおいて高いレベルで発現され、腫瘍におけるPD-L1の高発現は予後不良と強く関連するPD-L1の細胞発現は、固有遺伝子異常(EGFR活性化又は過剰発現、RAS変異の活性化、PIK3CAの増幅/変異、又はPTENの喪失など)、又は腫瘍環境中のサイトカイン(インターフェロン、IL-6、TGFβなど)によって活性化されるシグナル伝達経路(RAS-MEK-ERK、PI3K/AKT及びJAK/STAT)によってアップレギュレートされる。PD-1発現腫瘍浸潤性CD8T細胞は多くのがんにおいて機能不全の枯渇した表現型を示し、PD-1/PD-L1シグナル伝達の抗体媒介遮断はいくつかのがんにおいて臨床転帰を改善し、機能的T細胞応答を回復することが示されている。
【００６８】
TIM-3及びCEACAM-1媒介免疫トレランス及びT細胞消耗:
【００６９】
T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有‐3(TIM‐3)及びCEACAM‐1(がん胎児性抗原関連細胞接着分子‐1)共阻害レセプターは免疫トレランス及びT細胞消耗の重要な決定因子である。TIM-3はIFN-γ産生CD4+及びCD8+ T細胞などの多くの免疫細胞型に発現するI型膜貫通タンパク質であり、自然免疫応答及び適応免疫応答の調節に重要な働きをしている。TIM-3式は、エフェクタT細胞分化に関与するサイトカインによって誘導され、T H1表現型のシグネチャ転写因子であるT-betを必要とする。慢性刺激T細胞及び末端分化エフェクターT H1セルは、TIM-3の安定化された高いレベル表現を示した。TIM-3はIFN-γの表現を阻害し、OB1細胞を抑制し、T細胞機能の逓減(T細胞枯渇)を誘発する。T細胞エフェクタ機能の調整におけるその重要な役割に加えて、TIM-3は、FOXP3+Tregs上で発現され、FOXP3+ Tregsの抑制機能を増強する。TIM-3はCD4+及びCD8+腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の両方で高度にアップレギュレートされ、T細胞でのTIM-3式の上昇は多くのヒトがんにおける免疫不全、腫瘍進行、及び予後不良と関連する。CD8+ TIL上のTIM-3式はPD-1の式と密接に関連し、TIM-3+ PD-1+ CD8+ T細胞は最も機能不全の「深く枯渇した」T細胞集団を表す。がんにおけるPD-1+及びTIM-3+ CD8+ TILの頻度増加は、治療に対する反応及び臨床転帰と逆相関する。TIM-3式はまた、腫瘍浸潤Treg上で有意にアップレギュレートされ、TILにおける優勢なTIM-3+FoxP3+ Treg集団は、リンパ節転移及び進行期などの不良な臨床病理学的パラメータと相関する、多種類のがんにわたる一般的な特徴である。
【００７０】
TIM-3の免疫抑制機能はT細胞活性及び機能をダウンレギュレートするために、活性化されたT細胞上でTIM-3と共発現される別の1型膜貫通タンパク質であるCEACAM-1とのそのヘテロ二量体相互作用を必要とする。TIM‐3とCEACAM‐1の細胞外N末端免疫グロブリン(Ig‐V)ドメインは構造的類似性を共有し、それらのFG‐CC′インタフェースに沿った共有シグネチャ「クレフト」構造を介して相互作用する。CEACAM1との異種親和性結合はTIM-3のT細胞表面への成熟及び局在化を促進し、末梢裕度TIM-3媒介誘導及び抗腫瘍免疫の抑制に役立つ。上記の異好性シス相互作用に加えて、CEACAM1はまた、トランスでTIM-3を連結し得、これは、CEACAM1発現腫瘍細胞がT細胞上でTIM-3を介して阻害シグナルを提供し得ることを示唆する。TIM-3細胞質尾部は他の阻害レセプターに見出される古典的免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)を欠くが、T細胞レセプター(TCR)シグナル伝達経路のSH2 ドメイン含有キナーゼ及びHLA-B関連転写物3(Bat3)に結合するために重要である保存されたチロシン残留分(Tyr 265、272)を含む。CEACAM-1とTIM-3との相互作用はBat3のY256/Y263リン酸化媒介放出及びBat3媒介TCRシグナル伝達の喪失を誘導し、それによってTIM-3が他の結合パートナーと協働してTCRシグナル伝達を阻害し、T細胞枯渇を誘導することを可能にする。CEACAM-1は、TIM-3(CEACAM1/TIM-3)との異種親和性相互作用を介して免疫抑制を促進することができることに加えて、シス又はトランス(CEACAM1/CEACAM1)における細胞外ドメインのホモ二量体化を介してT細胞活性を抑制することもできる。この効果親和性相互作用はCEACAM-1細胞質ドメインITIMのリン酸化、及びTCR/CD3錯体信号の広い近位抑制をもたらし、T細胞増殖、T H1サイトカイン産生、及びT細胞活性化に関連する細胞傷害性を含む種々のエフェクター機能を阻害するSHP-1/SHP-2チロシンホスファターゼの動員に必要である。これらの機構的洞察は、TIM‐3/CEACAM1軸が(i)異種親和性TIM‐3/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1/TIM‐3ヘテロ二量体化;TIM‐3とのトランスCEACAM1ヘテロ二量体化);(ii)同種親和性CEACAM‐1/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1 二量化; trans CEACAM1誘導シスCEACAM‐1 二量化)を介して、T細胞の多面的抑制を発揮することを示す。したがって、TIM-3及びCEACAM1を共発現する腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球はがんにおいて最も消耗された表現型を示し、いくつかのヒトがんにおけるCEACAM1の発現上昇は、転移及び予後不良と相関する。
【００７１】
T細胞活性化のV-ドメイン免疫グロブリンサプレッサー
【００７２】
T細胞活性化のV‐ドメインIgサプレッサーはPD‐L1とPD‐1に相同な免疫チェックポイント分子であり、T細胞活性化の抑制を引き起こす骨髄細胞で高度に発現する。VISTAは、骨髄細胞及び顆粒球細胞で高度に発現され、T細胞では弱く発現される。VISTAは、CD8+及びCD4+ T細胞の活性を抑制する。VISTA媒介T細胞抑制はVISTAの非存在下でさえ、長期間持続する(Linesら、2014)。VISTAはリガンドとして作用し、T細胞上のレセプターに結合して増殖及びサイトカイン産生を阻害することができる。VISTAはまた、T細胞に対するレセプターとして作用し得、ここで、その連結は同様に、増殖及びサイトカイン産生の抑制を誘導する。VISTAはさらにTreg誘導を促進し、腫瘍浸潤Treg上で高度に発現される。VISTA及びPD-1は、T細胞活性化を非冗長的に抑制する。
【００７３】
リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)
【００７４】
リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3;CD223とも呼ばれる)は、活性化されたCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Treg細胞、Tr1細胞、及びNK細胞、B細胞、及びDCのサブセット上で発現される負のチェックポイント調整剤である。LAG-3はCD4と構造的に相同であり、同様にMHCクラスII分子に結合する。T細胞上のLAG-3発現は、T細胞活性化を直接的に阻害する。LAG-3はMHCクラスIIとの結合に加えて、LSECtinやGalectin-3(Gal-3)とも相互作用し、いずれも腫瘍環境に発現している。LSECtin又はガレクチン-3のいずれかによるLAG-3連結は、IFNγ製造T細胞のエフェクタの低下及びTreg IL-10製造の増加をもたらす。LAG-3は共発現され、PD-1及びTIM-3と相乗作用して、消耗したT細胞表現型を誘導し、維持する。
【００７５】
B及びTリンパ球アテニュエーター(attenuator)(BTLA)
【００７６】
B及びTリンパ球アテニュエーター(attenuator)(BTLA)は、CTLA-4及びPD-1と構造的相同性を有する負のチェックポイント調整剤である。BTLAは、T細胞、成熟DC、マクロファージ、及び最も高度にB細胞上で発現される。BTLAは、T細胞、B細胞、NK細胞、DC、及び骨髄細胞上で発現されるヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM)に結合する。HVEMはまた、CD160(T細胞上で発現されるネガティブチェックポイントレギュレーター)及び光(共刺激レセプター)と相互作用する。T細胞上のBTLAシグナル伝達は、HVEM連結又はα-BTLAアゴニスト抗体の投与のいずれかを介して、T細胞増殖を阻害する。BTLA式はまた、IL-17とTNFαの負の規制を通して、γδT細胞の拡大と活性化を制限する。BTLAはまた、リガンドとして作用し、T細胞によって発現されるHVEMに結合し、T細胞の生存を促進することができる。BTLAは、CD8+ TIL上でPD-1と共発現され、相乗的及び非重複免疫抑制機構に関与するよう。
【００７７】
T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)
【００７８】
T細胞Ig及びITIMドメイン(TIGIT)は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、及びNK細胞上で発現される免疫チェックポイント分子である。TIGITは、ポリオウイルスレセプター(PVR;NECL5/ CD155とも呼ばれる)及びPVR様タンパク質PVRL2(CD112とも呼ばれる)に特異的に結合することが示されている。CD226はCD155/CD112に結合すると、正の共刺激シグナルを提供し、一方、TIGITは、阻害シグナルを送達する。TIGITは、CD112よりもCD155の方が高い親和性バインダーである。TIGITはCD155とヘテロ四量体複合体を形成し、ここで、コアのTIGITホモ二量体は、一対のCD155分子に結合する。Th1/Th17 Tヘルパー細胞上のCD226は、それがT細胞上のCD155/CD112に結合する場合、正の共刺激を提供する。TIGITはまた、CD155/CD112に結合し(そして負のシグナルを送達し)、したがってCD155/CD112への結合についてCD226と直接競合する。さらに、TIGITはCD226に直接結合し、そのホモ二量体化を妨害することが示されているが、この機構がin vivoで作用するかどうかは明らかではない。TIGITはDC上のCD155に結合して寛容原性表現型を誘導する。CD155はDCで高く表現され、その文脈でのTIGIT/CD155 相互作用はIL-10の製造を誘発し、T細胞拡散を抑制し、IFN-γの製造を制限するトルエロジェニックDCの開発につながる。(Yuら、2009)。CD155及びCD112は腫瘍細胞によって高度に発現され、これはT細胞に対する直接的な効果を介して、TIGIT媒介免疫抑制のための代替的機構を示唆する。実際、TIGITは腫瘍浸潤リンパ球(TIL)上で独特に濃縮され、FOXP3+ Treg上でのその機能はその最も強力な免疫抑制能力を構成する。
【００７９】
さらに、TIGIT連結は、エフェクターT細胞機能を直接的に抑制する。TIGITは、CD8+ TIL上でPD-1、TIM-3、及びLAG-3と共発現することが見出されている。TIGITはPD-1/PD-L1及びTIM-3と相乗作用して抗腫瘍免疫を損なうことが示されている(Kurtulusら、2013)。TIGIT結合は、それが発現されるT細胞及びNK細胞上のT細胞増殖及びサイトカイン産生を直接的に抑制することができる。TIGIT+ CD8+ TILはいくつかのエフェクター機能(例えば、IL-2及びTNF-α産生)が欠損しており、増強されたIL-10産生を介して免疫抑制に寄与する。CD4+ TILの中で、TIGITは、Tregエフェクター分子の高発現を伴うFOXP3+ Tregのサブセット上でほとんど排他的に発現される。TIGIT+ TregはTh1及びTh17応答を選択的に抑制するが、Th2応答は抑制しないよう。TIGIT+ Tregsは、Tgfb1、Foxp3、Havcr2、Lag3、及びCtla4のより高い遺伝子発現と関連している。さらに、Ccl4、Cxcr3、Ccr8、及びTbx21についての遺伝子は、TregにおけるTIGITシグナル伝達の下流に見出される。これは、Tregの移動及び保持(Ccl4、Cxcr3、Ccr8)及び安定性(Tbx21;T-betとも呼ばれる)におけるTIGITシグナル伝達の重要な因果関係を示唆する。
【００８０】
CCR4
【００８１】
CCR4はTreg上で高度に発現されるケモカイン・レセプターであり、これは、TregがCCL22連結を介して腫瘍環境に動員されることを可能にする。CCL22は、腫瘍細胞によって高度に発現され、Treg動員を介して免疫抑制を誘導する。
【００８２】
LAIR1
【００８３】
LAIR1は、免疫グロブリン様ドメイン及び2つの免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフを含む細胞質尾部を有する膜貫通糖タンパク質である。活性化されると、LAIR1はSHP-1及びSHP-2ホスファターゼを動員し、ナチュラルキラー(NK)細胞上のLAIR1抗体の断面を介してNK細胞媒介性細胞傷害性を強く阻害することができる。
【００８４】
形質転換増殖因子-β(TGFβ)
【００８５】
形質転換増殖因子-β(TGFβ)は、大多数のがんにおいて過剰発現される多官能サイトカインである。TGFβのTGFβレセプターII(TGFβRII)への高親和性結合はTGFβレセプターIをSMAD2/3をリン酸化するヘテロ四量体複合体に補充し、SMAD4との相互作用を可能にし、細胞増殖、分化、及び遊走を制御する遺伝子の活性化又は抑制をもたらす。腫瘍細胞はしばしば、TGFβの成長阻害作用に対して耐火物になり、代わりに、腫瘍環境におけるその活性を活用して、免疫トレランス及び腫瘍進行を促進する。TGFβは、自然免疫系及び適応免疫系の調節において重要な役割を果たす。TGF-βは、抗体依存性細胞傷害性(ADCC)を媒介する免疫エフェクター細胞の活性化及び細胞傷害性機能を阻害する。腫瘍浸潤T細胞の局所微小環境における自己分泌/傍分泌TGFβシグナル伝達はCD8+ T細胞の活性を減弱させ、中央メモリー細胞の発生を制限し、腫瘍進行を促進する免疫抑制調節性T細胞(Tregs)に対するCD4+ Tヘルパー細胞(T H1)の分化を歪める。TGFβは、Treg系統の機能プログラムを決定し維持するシグネチャ転写因子であるFOXP3の発現を誘導する。次に、FOXP3はT細胞の共刺激を抑制する免疫阻害レセプターである細胞傷害性Tリンパ球抗原-4(CTLA-4)、及びT細胞免疫グロブリン・ドメイン及びムチン・ドメイン-3(TIM-3)免疫阻害レセプターに関与し、エフェクタT細胞の枯渇又はアポトーシスを誘発するリガンドであるガレクチン-9(GAL-9)の式を誘導する。GAL-9はさらに、TGFβレセプターと相互作用して、SMAD3活性化を含む正フィードフォワード自己分泌ループにおいてFOXP3式を駆動し、Tregを誘導及び維持する。このように、TGFβ富化腫瘍環境は、免疫エフェクターの活性化を弱めるTregの発生を促進する。腫瘍浸潤性免疫細胞の機能的配向性ががん患者の転帰に大きな影響を及ぼすことから、TGF†がT H1表現型からTreg系統に向かってCD4+の分化を偏らせるこの能力は、重大な臨床的意義を有する。T H1細胞、細胞傷害性CD8+ T細胞、及びセントラルメモリーT細胞は一様かつ強く無病生存期間の延長と関連しているが、Tregによる腫瘍の浸潤は予後不良と相関している。TCGA-HNSCCデータセット[単細胞RNA配列決定からのT細胞型特異的参照遺伝子発現プロフィール(RGEP)を利用]におけるT細胞サブタイプの相対的存在量の推定は、大多数のがんがTregに向かうT H1細胞からのCD4+ T細胞分化の異常な歪み及び枯渇したCD8+ T細胞の増大を特徴とする機能不全免疫抑制表現型を示すことを示した。TCGAデータセットの分析は上昇したTGFβ1/3がFOXP3 mRNA発現と強く相関し、そしてより低い生存と有意に関連することを示した。
【００８６】
がんの現在の免疫療法の限界:
【００８７】
腫瘍誘発性免疫トレランスを打ち消すための現行の臨床的努力は、CTLA-4、PD-1、及びPD-L1などの免疫チェックポイントとして機能するT細胞阻害レセプター又はリガンドを標的とするモノクローナル抗体に焦点を当てている。1つのCTLA-4抗体(イピリムマブ)、2つのPD-1アンタゴニスト(ペムブロリズマブ、ニボルマブ)、及び3つのPD-L1インヒビター(アテゾリズマブ、アベルマブ、Durvalumab)は、現在、黒色腫、非小細胞肺がん、頭頸部がん、又はブラダがんなどのがんの免疫療法のための特異的な臨床適応において承認されている。進行がんを有する患者のサブセットはCTLA-4、PD-1又はPD-L1 mAbに応答して、持続的な寛解及び延長された生存を経験するが、大多数の患者はこのような治療に応答しない。このような腫瘍はT細胞機能不全を誘導し、抗腫瘍免疫を阻害するために、他の免疫調節リガンド又はサイトカインを使用し得る。PD-1-PD-L経路のみを標的とすることは、T細胞機能の完全な回復をもたらさず、そしてPD-1-PD-L経路を標的とするいくつかのがんはT細胞機能を全く回復しないので、腫瘍環境において免疫トレランス及びT細胞消耗を実行するために協調して作用する多数の分子及び阻害経路を同定し、そして同時に中和する必要がある。現在の免疫療法戦略は、がんの機能不全免疫表現型によって提起される以下の課題によって制限される:
【００８８】
(1)  免疫トレランス及びT細胞消耗の多重独立、協同、及び重複免疫レセプターリガンド相互作用は、それぞれが帰還ループによって強化されている。個々の分子行列式を標的とすることは、がんにおける免疫不全の多分化したメカニズムを打ち消すには不十分である。
【００８９】
(2)   Tregを促進し、T細胞枯渇を誘導する免疫抑制シグナル伝達経路は、腫瘍環境中のシス及びトランスにおける自己分泌及び傍分泌免疫レセプターリガンド相互作用を含む。がん免疫細胞マイクロエンスにおける免疫抑制性自己分泌/傍分泌リガンドレセプター相互作用は、現在のmAbsによって事実上中断されない。標的腫瘍細胞又は腫瘍浸潤T細胞のすぐ近くの微小環境において、このような自己分泌/傍分泌シグナル伝達ループと効果的に競合し、物理的に破壊するために、新規な戦略が必要とされる。
【００９０】
(3)  寛容のデノボ及び適応機構:免疫不全のデノボ機構を示すことに加えて、腫瘍は進化して、治療の過程にわたって免疫トレランスのさらなる機構を獲得する。そのようなものとして、1つのメカニズムに対処することは、腫瘍が当量な免疫抑制作用を達成する直角経路を利用することにつながり得る。
【００９１】
(4)  がんの機能不全免疫表現型は、腫瘍免疫微小環境におけるTreg又はT H17系統に対するT H1表現型から離れたCD4細胞の歪んだ分化を特徴とする。免疫チェックポイント(PD-1/PD-L1又はCTLA-4など)を阻害するか、又は共刺激レセプター(4-1BB又はOX40など)を活性化する抗体は免疫シナプスを調節してT細胞を共刺激することに焦点を当てているが、T H1細胞からのCD4細胞分化を、免疫トレランス及び腫瘍促進性炎症を促進するTreg又はT H17系統に向ける近位リガンドに対抗することができない。
【００９２】
標的多官能免疫調節抗体−リガンド・トラップ
【００９３】
腫瘍細胞又は腫瘍浸潤T細胞を標的とし、同時に腫瘍環境における免疫不全に寄与する重要なリガンドを隔離する標的多官能免疫調節抗体−リガンド・トラップを記載する。抗体−リガンド・トラップは、標的細胞の直近の微小環境において1つ以上の免疫抑制リガンド(レセプターECD; リガンド・トラップ)を同時に捕捉及び不能化するレセプター 細胞外ドメイン(ECD)と融合した腫瘍細胞又はT細胞免疫レセプター/リガンド(ターゲティング部分)を標的とする抗体を含む。本抗体−リガンド・トラップのターゲティング部分はそれ自体の特異的機能を示し、同時に、融合したレセプターECD(捕捉)を標的腫瘍又は免疫細胞微小環境に局在化させて、リガンドについて天然レセプターと効果的に競合する。ECDというレセプターは、Tリンパ球、骨髄細胞、NK細胞、又は樹状細胞/抗原提示細胞(DC/APC)などの任意の免疫細胞の分化、増殖、維持、生存、活性、機能又は動員を調節する任意の免疫調節レセプターのリガンド結合配列を含む。
【００９４】
本発明ターゲティング部分は、腫瘍細胞、腫瘍環境、腫瘍関連増殖因子又はレセプター、腫瘍関連サイトカイン又はレセプター、腫瘍関連Tリンパ球、T細胞の共刺激又は阻害分子、免疫細胞、病原体、又は病原体関連細胞の構成要素に特異的に結合するポリペプチドを含む。具体的な実施形態では、免疫レセプターが細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラム死-1(PD-1)、プログラム死リガンド(PD-L1)、TIM-3、VISTA、B及びTリンパ球アテニュエーター(attenuator)(BTLA)、CD160、TIGIT、CD96、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、B7-H3、CD39、CD73、アデノシンA2aレセプター、4-1BB(CD137)、OX-40(CD134)、GITR、CD27、HVEM、CD40L、CD40L、CD47、CCR4、CCR5、CXCR4、インターロイキン-12 レセプター(IL-12R)、Toll様レセプター(TLR1-10)、CD4、CD25、CD3、ICOS、Killer細胞ターゲティング部分様レセプター(KIR)、又はT細胞レセプター。
【００９５】
ターゲティング部分に融合されるレセプターECDは、Tリンパ球免疫レセプター、Bリンパ球レセプター、DCレセプター、NK細胞レセプター、サイトカイン・レセプター、増殖因子レセプター、ケモカイン・レセプター、又は腫瘍細胞レセプターの細胞外リガンド結合配列を含む。具体的な実施形態では、ターゲティング部分が以下のレセプターECDのうちの1つのリガンド結合配列に融合される:
【００９６】
【表１】
2020521759.tif 000003
【００９７】
本抗体−リガンド・トラップの融合レセプターECD配列は、最適には標的細胞微小環境中にリガンドを捕捉する:
a.  オフターゲット効果の危険なしにレセプターを介してシグナル伝達するすべての同族リガンド(及びアイソフォーム)の高度に特異的な結合
b.  decoyレセプターECDによって隔離されたすべての同族リガンドの予測可能な/信頼できる抑制;逆説的アゴニスト機能又は重複リガンドレセプター 相互作用の危険性なしにアンタゴニスト効果を保証した
c.  同族リガンドの最適結合活性
d.  ターゲティング部分は融合レセプターECDを標的細胞微小環境に局在化させ、それによってデコイレセプターECDが標的リガンドについて天然レセプターと効果的に競合することを可能にするので、自己分泌/傍分泌シグナル伝達ループを破壊する。
e.  天然レセプター心電図の免疫原性の危険性の減少
【００９８】
本抗体−リガンド・トラップは、多官能力を介して、Treg及びTMEにおける適応T細胞裕度/消耗を打ち消すことによって、抗腫瘍免疫を活性化することができる:
i.  免疫チェックポイントレセプター/リガンドを無効にする+免疫抑制リガンドを打ち消す
ii.  共刺激レセプターを活性化する+免疫抑制リガンド/チェックポイントを打ち消す
iii.  腫瘍細胞(例えば、GFR)+を標的とし、免疫抑制リガンド/チェックポイントを打ち消す
iv.  同時に、複数の(T細胞阻害レセプター(TCIR)リガンドの利用可能性を打ち消すか、又は制限するか、又は複数のTCIR/TCIRリガンドを遮断する。
【００９９】
本抗体−リガンド・トラップは複数TCIR/TCIRリガンドを機能的に遮断し、TMEにおけるT細胞阻害経路を広く標的化するためのストラテジーとして役立ち得る。複数腫瘍TCIR/TCIRリガンド相互作用及び腫瘍/免疫細胞微小増殖におけるそれらの自己分泌/傍分泌シグナル伝達を妨害することは、複数抗体に基づく免疫チェックポイント遮断よりも効果的である。デノボ及び適応免疫トレランスの広範な多遺伝子耐性メカニズムを無効にするそれらの性能は、併用免疫療法の課題及び限界に対処し得る。これは、PD-1/PD-L1及びTIM-3/CEACAM-1が媒介する腫瘍環境中の免疫トレランス及びT細胞消耗のメカニズムを同時に打ち消すという抗体−リガンド・トラップによって例示される。
【０１００】
プログラム死 1(PD-1):プログラム死 リガンド1(PD-L1)免疫チェックポイントを標的とする抗体の説得力のある抗腫瘍活性にもかかわらず、これらの治療に対する新規及び適応耐性の両方がしばしば観察される。PD-1/PD-L1経路を標的とすることは、抗腫瘍T細胞免疫を抑制するためにPD-1と他のチェックポイント阻害剤との間に複雑な交差調節が存在し、ある場合にはPD-1遮断に続いて適応耐性が発現するので、枯渇したT細胞の機能不全を破壊するのに充分ではないかもしれない。TIM‐3/CEACAM1軸は、PD‐1/PD‐L1療法に対するde novo及び適応耐重要な決定因子である。
【０１０１】
TIM‐3/CEACAM1は、(i)異好性TIM‐3/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1/TIM‐3ヘテロ二量体化;TIM‐3によるトランスCEACAM1ヘテロ二量体化);(ii)同好性CEACAM‐1/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1 二量化; trans CEACAM1誘導シスCEACAM‐1 二量化)を介して、T細胞及びNK細胞の多面的抑制を発揮する。したがって、TIM-3及びCEACAM1を共発現する腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球は、マウスモデル及びがん患者の両方において最も消耗された表現型を示す。
【０１０２】
PD-1、TIM-3、及びCEACAM-1は腫瘍環境における免疫トレランス及びT細胞消耗の独立した協調的メカニズムを同調させるので、強力な抗腫瘍先天性及び適応性抗腫瘍免疫応答を放出するためにはこれらのチェックポイントの同時遮断が必要である。腫瘍浸潤免疫細胞上での3つすべてのT細胞阻害レセプター(TCIR: PD-1、TIM-3、CEACAM-1)の共発現の上昇に加えて、腫瘍細胞はまた、これらのTCIRが腫瘍活性T細胞(PD-L1、CEACAM-1、ガレクチン-9)を抑制するように関与する複数リガンドを共発現する。これは、免疫トレランスを誘発するために協調して作用するTME内の多重自己分泌/傍分泌シスとトランスTCIR/リガンド相互作用を混乱させるという治療上の課題を提起する(PD-1/PD-L1; Tim-3/ACAM-1; CEACAM-1/CEACAM-1)。この治療的課題は、新規な二官能性抗体−リガンド・トラップ(Y-トラップ):(i)TIM-3 IgVエクトドメイン配列に融合されたPD-L1を標的とする抗体を含むa-PDL1-TIM3ecd;(ii)TIM-3 IgVエクトドメイン配列に融合されたPD-1を標的とする抗体を含むa-PD1-TIM3ecdを発明することによって対処されてきた。
【０１０３】
aPDL1-TIM3ecd及びaPD1-TIM3ecdの作用機序: aPDL1-TIM3ecd及びaPD1-TIM3ecdは活性化されたT細胞及び腫瘍細胞上のPD-1又はPD-L1に結合し、同時に、CEACAM-1のFG-CC'裂溝インタフェースに結合する天然細胞TIM-3と効果的に競合するTIM-3ecdデコイでそれらを装飾する。このように、これらの抗体−リガンド・トラップはPD-L1/PD-1 相互作用を無効にするだけでなく、腫瘍環境(TME)のCEACAM-1/CEACAM-1 だけでなく、タイミング3/CEACAM-1 を含むシスとトランスの両方の相互作用を同時に中断する。これらの研究は、a‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PD1‐TIM3ecdがin vitroでIFNγ発現を促進し、共刺激T細胞の消耗を妨げる点で、a‐PDL1(アテゾリズマブ)又はa‐PD‐1(ペムブロリズマブ)よりも有意に効果的であることを実証する。最も有意には、これらの抗体−リガンド・トラップでの腫瘍を有するヒト化マウスのインビボ処理が腫瘍浸潤CD4+及びCD8+ T細胞の数の顕著な増大をもたらし、a-PDL1(アテゾリズマブ)、a-PD-1(ペムブロリズマブ)、a-Tim-3抗体、又はa-PDL1及びa-Tim-3の組合せでの当量処理と比較して、腫瘍進行の阻害において有意により効果的であることが見出された。これらの結果は腫瘍環境中の異好性及び同種親和性Tim‐3/CEACAM‐1 相互作用がPD‐1/PD‐L1インヒビターの抗腫瘍効果を制限すること、及びa‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PD1‐TIM3ecdがPD‐1/PD‐L1チェックポイントを同時に無効にし、Tim‐3/CEACAM‐1軸の両方の成分を打ち消すことにより、T細胞枯渇を打ち消すか又は逆転させるためのより有効な免疫療法ストラテジーを提供することを実証する。
【０１０４】
ある実施形態に、ターゲティング部分及び免疫調節部分を含む分子であって、ターゲティング部分が腫瘍細胞、腫瘍環境、腫瘍関連増殖因子又はレセプター、腫瘍関連サイトカイン又はレセプター、腫瘍関連Tリンパ球、T細胞の共刺激又は阻害分子、免疫細胞、病原体、又は病原体関連細胞の構成要素に特異的に結合するポリペプチドを含み、免疫調節部分が、Tリンパ球免疫レセプター、Bリンパ球レセプター、DCレセプター、NK細胞レセプター、サイトカイン・レセプター、増殖因子レセプター、ケモカイン・レセプター、又は腫瘍細胞レセプターの細胞外リガンド結合(ECD)配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む、分子を提供する。
【０１０５】
本明細書中で使用される場合、「ターゲティング部分」は特異的な分子又は細胞構成要素に局在化し、そして結合することができる分子をいう。ターゲティング部分は、免疫グロブリン、抗体、二重特異性若しくはマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)、抗体フラグメント、scFv、Fc含有ポリペプチド、ポリペプチド、ペプチド、又はそれらの任意の組合せの抗原結合ドメインであり得る。ある実施形態に、ターゲティング部分は、細胞又は組織中に存在する分子に結合することができる。一態様では、ターゲティング部分ががん細胞又はがんなどの疾患細胞又は組織中の分子に結合することができる。別の局面において、標的化分子は正常細胞又は組織(例えば、免疫細胞)に結合し得る。別の態様では、ターゲティング部分が免疫反応を調節する細胞又は細胞外分子に結合することができる。別の局面において、ターゲティング部分は、成長因子レセプター、成長因子、サイトカイン・レセプター、サイトカイン、又は細胞表面分子に結合する。
【０１０６】
別の実施形態では、ターゲティング部分は腫瘍ターゲティング部分である。腫瘍ターゲティング部分は腫瘍細胞の構成要素に結合することができ、又は腫瘍細胞(例えば、腫瘍血管系又は腫瘍環境)の近傍に結合することができる。ある実施形態に、腫瘍ターゲティング部分は、腫瘍細胞、腫瘍環境、腫瘍血管系、腫瘍関連リンパ球、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍細胞表面分子、腫瘍抗原決定基、腫瘍抗原含有融合タンパク質、腫瘍関連細胞、腫瘍関連免疫細胞、又は腫瘍ワクチンの構成要素に結合する。
【０１０７】
例えば、種々の実施形態において、標的化部分は上皮成長因子レセプター(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンドファミリー;インスリン様成長因子レセプター(IGFR)ファミリー、IGFRリガンドファミリー(IGFBP);血小板由来成長因子レセプター(PDGFR)ファミリー;線維芽細胞成長因子レセプター(FGFR)ファミリー、血管内皮成長因子レセプター(VEGFR)ファミリーを含むが、これらに限定されない分子又は成分に特異的である。VEGFレセプターファミリー: TRKレセプターファミリー;エフリン(EPH)レセプターファミリー; AXLレセプターファミリー;白血球チロシンキナーゼ(LTK)レセプターファミリー; TIEレセプターファミリー、アンジオポエチン1、2;レセプターチロシンキナーゼ様オーファンレセプター(ROR)ファミリー;ディソイドインドメインレセプター(DDR)ファミリー; RETレセプターファミリー; KLG形質転換増殖因子αレセプターファミリー; RYKレセプターファミリー;TGF-αレセプターファミリー;TGF-βレセプター;インターロイキン13α鎖(lL13Ralpha2)、インターロイキン-6(IL-6)、1L-6レセプター、インターロイキン-4、IL-4レセプター、サイトカインレセプター、クラスI(ヘマトポイエチンファミリー)及びクラスII(インターフェロン/lL-10ファミリー)レセプター、腫瘍壊死因子(TNF-α)、腫瘍壊死因子(TNTRSF)、死レセプターファミリー、TRAILレセプターファミリー;ケモカインレセプターファミリー;がん精巣(CT)抗原、系統特異的抗原、αアクチニン-4、ARTC1クラスター領域アベルソン(Bcr-abl)融合産物、B-RAF、カスパーゼ-5(CASP-5)、カスパーゼ-8(CASP-8)、βカテニン(CTNB1)細胞分裂周期27(CDC27)、サイクリン依存性キナーゼ4(CDK4)、CDKN2A、dek-can融合タンパク質、EFTUD-2、伸長因子6/急性骨髄性白血病1遺伝子ETS(ETC6-AML1)融合タンパク質、フィブロネクチン(FN)、GPNMB、低密度脂質レセプター/GDP-Lフコース:β-Dgalactose 2-α-Lfucosylosferase(LDLR/FUT)融合タンパク質、HLA-A2遺伝子(HLA-A*201-R170I)のα2ドメインの残基170におけるアルギニンからイソロイシンへの交換、MLA-A11、熱ショックタンパク質70-2変異(HSP70-2M)、KIAA0205、MART2ユビキタス変異1,2,3(MUM-1,2,3)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)、neo-PAP、ミオシンクラス1、NFYC、OGT、OS-9、pml-RAlpha融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K-rasトリオセホスフェートイソメラーゼ、BAGE-1、SYT-2、4、5、GAGE-1、SFRAS、HRAS、N-ras、2、GnT-V(異常N-アセチルジオシルトランスフェラーゼV、MGAT5)、HERV-K-MEL、KK-LC、KM-HN-1、LAGE、LAGE-1、CTL認識抗原(CAMEL)、MAGE-Al(MAGE-1)、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11 MAGE-A12、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B5、MAGE-B6、MAGE-C1、ムチン1(MUCl)、MART-1/Melan-A(MLANA)、gp100/Pme117(S1LV)、チロシナーゼ(TYR)NY-ESO-1、NA-88、NY-1、LAGE-2、SAGE、Sp17、TRP2-1NT2、がん胎児性抗原(CEA)、カリクフェイン4、前立腺特異的膜抗原(PSA)、前立腺特異的膜抗原、TRP-1/gp75、TRP-2、アジポフィリン、インターフェロン誘導性蛋白質不在エラニナ2(AIM-2)、BING-4、CPSF、サイクリンD1、上皮細胞接着分子(Ep-CAM)、EpbA3、線維芽細胞増殖因子-5(FGF-5)、糖蛋白質250(gp250intestinal carboxyl esterase)、α-feto蛋白質(AFP)、M-CSF、mdm-2、MUCI、p53、PBF FRAME、PSMA、RAGE-1、RU2AS、SOX10、STEAP1、サバイビン(BIRCS)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、テロメラーゼ、ウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)、SYCP1、BRDT AGE、XAGE、XAGE、CTAM1、PAGE-1、CTAGE、BORIS、HOM-TES-85、AF15q14、LDHC、MORC、SGY-1、SPO11、TPX1、NY-SAR-35、FTHLI7、NXF2 TD1、TEX、TPTE、免疫グロブリンイディオタイプ、Bence-Jonesタンパク質、エストロゲンレセプター(ER)、CD40、CD30、CD20、CD19、CD33、CD4、CD25、CD3抗原72-4(CA 15-3)、がん抗原27-29(CA 27-29)、がん抗原125(CA 125)、がん抗原19-9(CA 19-9)、βヒト絨毛性ゴナドトロピン 1-2ミクログロブリン、扁平上皮がん抗原、ニューロン特異的エノジャーゼ、熱ショック蛋白質gp96、GM2、サルグラモスチム、CTLA-4、707アラニンプロリン(707-AP)、腺がんT細胞4(ART-4)、がん原性抗原ペプチド-1(CAP-1)、カルシウム活性化塩素チャネル-2(CLCA2)、シクロフィリンB(Cyp-B)、ヒト印環腫瘍-2(HST-2)、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)蛋白質(HPV-E6、HPV-E7、主要又は小カプシド抗原、その他)、エプスタインバーウイルス(EBV)蛋白質(EBV潜在性膜蛋白質-LMP1、LMP2;その他)、B型又はC型肝炎ウイルス蛋白質、及びgp120を含むHIV蛋白質によって認識される抗原。本発明の組成物は、ペプチド/ポリペプチド及び/又はそれをコードするものとして前記のものをさらに含むことができる。
【０１０８】
1つの局面において、標的化部分ポリペプチドは、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラム死-1タンパク質(PD-1)、プログラム死リガンド-1(PD-L1)、プログラム死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3(TIM-3)、がん胎児性抗原関連細胞接着分子1(CEACAM-1)、がん胎児性抗原(CEA)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、B及びTリンパ球減弱剤(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160, T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、CD122に特異的に結合する。リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換増殖因子β(TGFβR)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞共刺激因子(ICOS)、OX-40(ICOS)、IL23R、IL17R、IL-6、IL-23、IL-17、CD39、CD47、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD25、CD3、核因子κ-Bリガンドのレセプター活性化因子(RANKL)、上皮増殖因子レセプター(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、上皮増殖因子(EGF)、形質転換増殖因子α(TGFα)、血管内皮増殖因子レセプター-1(VEGFR-1)、VEGFR-2、VEGFR-3。
【０１０９】
ある実施形態に、「免疫調節部分」と融合したターゲティング部分を含む分子を提供する。本明細書中で使用される場合、「免疫調節部分」は、Tリンパ球免疫レセプター、T細胞阻害レセプター(TCIR)、T細胞共阻害分子、T細胞 共刺激分子、Bリンパ球レセプター、DCレセプター、NK細胞レセプター、サイトカイン・レセプター、増殖因子レセプター、ケモカイン・レセプター、又は腫瘍細胞レセプターの細胞外ドメイン(ECD)配列又はそのリガンド結合フラグメントを含むポリペプチドをいう。さらなる局面において、「免疫調節部分」は、免疫系を調節するサイトカイン、サイトカイン・レセプター、共刺激分子、又は共阻害分子に特異的に結合する。1つの局面において、免疫調節部分は、結合した分子の機能を増加させるアゴニストである。別の態様では、免疫調節部分が標的分子の機能を阻害するアンタゴニストである。
【０１１０】
別の局面において、免疫調節部分は、以下の分子のうちの1つの細胞外ドメイン又はそのリガンド結合フラグメントを特異的に含む:形質転換成長因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラムされた死亡1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)、Bリンパ球減弱剤及びTリンパ球減弱剤(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD44、CD96、CD160、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核因子κBのレセプター活性化因子(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、白血球関連免疫グロブリン様レセプター1(LAIR1)、又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA)。
【０１１１】
別の局面において、免疫調節部分は、ターゲティング部分のC末端に融合される。別の局面において、免疫調節部分は、ターゲティング部分のN末端に融合される。1つの局面において、融合分子はX-Fc-Yによって表され、ここで、Xはターゲティング部分であり、Fcは免疫グロブリンFc領域であり、そしてYは免疫調節部分である。別の局面において、融合分子はY-Fc-Xによって表され、ここで、Xはターゲティング部分であり、そしてYは免疫調節部分である。
【０１１２】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、細胞小器官及び細胞の外側メンブランから細胞外空間中に突出するレセプターの部分をいう。ECDのポリペプチド配列は、アミノ酸残留分配列が本明細書に示されるポリペプチド又はペプチドの任意の類似体又はフラグメントを含む。
【０１１３】
「類似体」という語は1つ以上の残留分が機能的に類似した残留分で保存的に置換されており、本明細書に記載されるような活性を示す、本明細書に特に示される配列と実質的に同一のアミノ酸残留分配列を有する、任意のポリペプチド又はペプチドを含む。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニンのような1つの無極性(疎水性)残留分の別のものへの置換、アルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、グリシンとセリンとの間のような1つの極性(親水性)残留分の別のものへの置換、リジン、アルギニン又はヒスチジンのような1つの基本残留分の別のものへの置換、又はアスパラギン酸又はグルタミン酸のような1つの酸性残留分の別のものへの置換が含まれる。
【０１１４】
「破片」という語は、そのアミノ酸残留分配列が本明細書に開示されているポリペプチドのアミノ酸残留分配列よりも短いアミノ酸配列を有する任意の対象ポリペプチドを指す。
【０１１５】
本明細書で使用される「リガンド結合フラグメント」という語は、リガンドに結合するECDの一部又はフラグメントを指す。「リガンド結合フラグメント」が自体が「リガンド」であると考えられる分子の部分又はフラグメントを指すために使用される場合、「リガンド結合フラグメント」は、その結合相手に結合するその分子のECDの部分又はフラグメントを指す。
【０１１６】
抗体:ある実施形態に、ターゲティング部分又は融合タンパク質は免疫グロブリンである。本明細書で使用される「免疫グロブリン」という語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメントを含むが、これらに限定されない、天然又は人工の一価又は多価抗体を含む。F(ab')破片、Fab発現ライブラリーによって産生される破片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体を含む)、及び上記のいずれかのエピトープ結合破片。本明細書で使用される「抗体」という語は免疫グロブリン分子の免疫グロブリン分子及び免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。免疫グロブリンには、任意の種類(IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、IgYなど)、クラス(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2など)又は免疫グロブリン分子のサブクラスがある。
【０１１７】
本明細書中に開示される抗体は抗体フラグメント(例えば、Fab、Fab'及びF(ab')2、Fd、一本鎖Fv(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合Fv(sdfv)、並びにVL又はVHのいずれかのドメインを含むフラグメント)を含むが、これらに限定されない。ある実施形態に、ターゲティング部分は抗体又はscFvである。
【０１１８】
一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域(単数又は複数)を単独で、又はヒンジ領域、CH1、CH2、及びCH3 ドメインの全体又は一部と組合せて含むことができる。抗原結合フラグメントはまた、可変領域とヒンジ領域、CH1、CH2、及びCH3 ドメインとの任意の組合せを含み得る。また、Fc破片、抗原-Fc融合タンパク質、及びFc-ターゲティング部分も含まれる。抗体は、鳥類及び哺乳動物を含む任意の動物起源に起点し得る。1つの局面において、抗体はヒト、マウス(例えば、マウス及びラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリであるか、又はこれらに由来する。さらに、このような抗体は、抗体のヒト化バージョンであり得る。抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、又はより大きな多重特異性であり得る。
【０１１９】
本明細書中の抗体は特に、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、又は相同であり、一方、鎖の残部が、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、又は相同である「キメラ」抗体、並びにそのような抗体の破片を含む(米国特許第4,816,567号;及びMorrisonら(1984)Proc)。Natl.Acad.Sci.米国.81:6851-6855).本明細書中の目的のキメラ抗体は非ヒト霊長類(例えば、旧ワールドサル、Apeなど)に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【０１２０】
抗体を産生するために種々の方法が使用されてきた。単一型の抗体を産生するクローン化細胞株を指すハイブリドーマ技術は、マウス(マウス)、ハムスター、ラット、及びヒトを含む種々の種の細胞を使用する。抗体を調製するための別の方法は、組換えDNA技術を含む遺伝子工学を使用する。例えば、これらの技術から作製される抗体は、とりわけ、キメラ抗体及びヒト化抗体を含む。キメラ抗体は1を超えるタイプの種からのDNAコーディング領域を組み合わせる。例えば、キメラ抗体はマウスからの可変領域及びヒトからの定常領域を誘導し得る。ヒト化抗体は非ヒト部分を含むが、圧倒的に、ヒトに由来する。キメラ抗体のように、ヒト化抗体は完全にヒトの定常領域を含むことができる。しかしながら、キメラ抗体とは異なり、可変領域は部分的にヒトに由来し得る。ヒト化抗体の非ヒト、合成部分はしばしば、ネズミ抗体におけるCDRに由来する。いずれの場合においても、これらの領域は、抗体が特異的抗原を認識しそれに結合するのを可能とするのに非常に重要である。
【０１２１】
ある実施形態に、本発明の分子は、当該分野で十分に記載される組換えDNA方法を使用して合成され得る。抗体重鎖のcDNA及び抗体軽鎖のcDNAを合成し、その後、哺乳動物プロモーター及びポリアデニル化シグナルの制御下で別々のプラスミドにクローニングした。プラスミドDNAを大腸菌中で増幅し、DNAを、低エンドトキシンプラスミドDNA調製のための陰イオン交換キットを用いて精製した。DNA濃度は、260nmの波長での吸収を測定することによって決定した。シークエンスの正確性はサンガー・アレンシング(cDNAの大きさに応じて遺伝子あたり最大2個の配列決定反応)によって検証され、その後、ヘビー及び軽鎖用の遺伝子DNAは懸濁適応CHO K1電池(最初はATCCから受領し、evitriaでの休止栽培における無血清の生育に適応された)に共トランスフェクトされた。ある実施形態に、ハイブリドーマは、ターゲティング部分及び免疫調節部分を含む標的融合タンパク質を産生し得る。
【０１２２】
ある実施形態に、抗体、抗体フラグメント、又はポリペプチドを含むターゲティング部分はリンカーを用いて、又はリンカーを用いずに、ポリペプチドからなる免疫調節部分に連結又は融合される。リンカーはアミノ酸リンカーであり得る。ある実施形態に、リンカーは(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)であり、ここでnは1,2,3,4,5,6,7又は8である。例えば、GGGGGSGGGGGGS(配列番号(SEQ ID NO): 4)。別の実施形態において、リンカーは、IEGRDMD(配列番号(SEQ ID NO): 5)である。種々の局面において、リンカーの長さは、標的部分の結合又は免疫調節部分の機能を最適化するように改変され得る。
【０１２３】
種々の局面において、免疫調節部分は、標的化抗体又はFc含有融合タンパク質の重鎖のFc領域のC末端に融合されるポリぺプチドである。別の局面において、免疫調節部分は、標的化抗体の軽鎖のC末端に融合されるポリぺプチドである。別の局面において、本融合タンパク質はX-Fc-Y配列を含み、ここで、Xは標的化ポリペプチドであり、そしてYは、免疫調節ポリペプチドである。
【０１２４】
抗体フラグメントは例えば、抗原結合又はその可変部を含む、インタクトな抗体の一部を含むことができる。抗体フラグメントの例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFvフラグメント; Fcフラグメント又はFc融合産物;ダイアボディ; 直鎖状抗体;一本鎖抗体分子;及び抗体フラグメントから形成されるマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)が挙げられる。
【０１２５】
インタクト抗体は、抗原結合可変領域並びに軽鎖定常ドメイン(CL)及び重鎖定常ドメイン、CH1、CH2及びCH3を含むものである。定常ドメインは天然配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)又はそのアミノ酸配列変形例、又は任意の他の改変Fc(例えば、グリコシル化又は他の操作されたFc)であり得る。
【０１２６】
インタクトな抗体は、抗体のFc領域(天然配列Fc領域又はアミノ酸配列変異体Fc領域又は任意の他の改変Fc領域)に起因し得る生物学的活性をいう1つ以上の「エフェクター機能」を有し得る。抗体エフェクタ機能の例には、Clq結合;補体依存性細胞傷害性; Fcレセプター結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC);食作用;細胞表層レセプターの下方制御(例えば、B細胞レセプター(BCR));及び抗原提示細胞又は樹状細胞による抗原の交差提示が含まれる。ある実施形態に、標的化抗体又はFc含有融合タンパク質は、標的細胞への免疫調節部分の集中又は優先的デリバリーを促進する。別の局面において、標的化抗体は、標的化細胞の死を誘導し得るか、又は免疫細胞媒介性細胞毒性に対してそれを感作し得る。別の局面において、Fc-融合タンパク質又は抗体は、抗体結合腫瘍標的又はその両方からの免疫調節部分又は免疫原性アポトーシス物質の、抗原提示細胞(APC)への、それらのFcとFcレセプター(APC上)との間の相互作用を介したデリバリーを容易にし得る。
【０１２７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、インタクトな抗体は、種々の「クラス」に割り当てられ得るインタクトな抗体には5つの主要なクラス: IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMがあり、これらのうちのいくつかは「サブクラス」(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgC3、IgG4、IgA、及びIgA2にさらに分けることができる。重鎖定常ドメイン(ハットは、種々のクラスの抗体に対応する)がそれぞれ、α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)、及びμ(μ)と呼ばれる。種々のクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は周知である。
【０１２８】
1つの局面において、この抗体は、T細胞阻害レセプター(TCIR)、T細胞阻害レセプター・リガンド(TCIRリガンド)、T細胞共阻害分子、又はT細胞 共刺激分子に特異的に結合する。
【０１２９】
T細胞活性化は、T細胞 レセプター(TCR)による抗原提示細胞上の主要組織適合複合体(MHC)の文脈における抗原ペプチドの認識から始まる。T細胞活性化の過程は、誘導性リン酸化、酵素活性化及びタンパク質タンパク質及びタンパク質-脂質相互作用を介する多数のシグナル伝達タンパク質によって媒介される。T細胞は、完全に活性化されるために2つの信号を必要とする。抗原特異的シグナルである第一のシグナルは、ペプチド-MHC分子と相互作用するT細胞レセプター(TCR)を通じて、抗原提示細胞メンブラン(APC)上で提供される。第2のシグナル、共刺激シグナルは抗原非特異的であり、APCのメンブラン上で発現される共刺激分子とT細胞との間の相互作用によって提供される。T細胞共刺激は、T細胞の増殖、分化及び生存に必須である。共刺激を伴わないT細胞の活性化は、T細胞アネルギー、T細胞欠失、又は免疫トレランスの発生をもたらし得る。
【０１３０】
T細胞によって発現される最も特徴付けられる共刺激分子は、APCのメンブラン上でCD80(B7.1)及びCD86(B7.2)と相互作用するCD28である。T細胞によって発現される他の共刺激レセプターには、4-1BB(4-1BBリガンドのためのレセプター)、ICOS(誘導性共刺激因子)(ICOS-Lのためのレセプター)、OX40(OX40 リガンドのためのレセプター)、GITR(GITRリガンドのためのレセプター)、CD27(CD70と相互作用する)、CD40L/CD40、HVEM(光と相互作用する)、CD226(CD155と相互作用する)が含まれる。
【０１３１】
活性化シグナルは、CTLA-4、PD-1、LAG-3、TIM-3、CEACAM-1、TIGIT、CD96、BTLA、CD160、VISTA、VSIG8、LAIRを含むコ阻害レセプターと呼ばれるレセプターのファミリーによって調節される。共阻害レセプターは、対向レセプターとの外部ドメイン競合のようなメカニズムを利用することによって、及びタンパク質ホスファターゼのような細胞内メディエーターの使用によって、信号を調節する。共阻害レセプターは、T細胞免疫反応の質及び大きさを微調整することができる閾値設定因子、モジュレーター、チェックポイント及びフィードバックメカニズムとして作用することができる。
【０１３２】
T細胞機能を阻害するレセプターは、T細胞共阻害レセプターと呼ばれる。阻害レセプターは、刺激レセプターによって開始される活性化シグナルを弱め、釣り合わせる。T細胞機能に関するその後の転帰は、一時的な抑制から永久不活性化及び細胞死滅に及ぶことができる。TCRシグナル伝達は、その作用時間及び/又は標的分子が異なる様々なメカニズムによって制御することができる。ネガティブな調節メカニズムは、T細胞活性化の前に作用して、その静止状態を維持するように適所にある。
【０１３３】
T細胞共阻害レセプターの大部分は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属する。1つのメカニズムは共刺激レセプターのためのリガンドの隔離を含み、T細胞が完全な活性化に必須の活性化シグナルを受け取ることを奪う。第2のメカニズムは免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)及び/又は一定の阻害レセプターの細胞質尾部を構成する免疫レセプターチロシンベースのスイッチモチーフ(ITSM)による細胞内ホスファターゼの動員を含み、これは、TCR及び共刺激経路の下流でシグナル伝達分子を脱リン酸化し、活性化誘導遺伝子発現の定量的減少をもたらす。第3のメカニズムは、免疫機能の抑制に関与するタンパク質をコードする遺伝子のアップレギュレーション(又はダウンレギュレーション)を含む。共阻害レセプターはT細胞シグナル伝達を調節するために、上記及びおそらくは他のさらに発見されるメカニズムの組合せを使用することができる。
【０１３４】
Co-阻害レセプターは主に、サイトメリックドメインにおけるリン酸チロシン残留分に結合するセル内ホスファターゼを通して、主要な負のシグナルを伝達するトランスメンブレングリコプタンである。共阻害レセプターは、刺激シグナルを打ち消すことによって、制御されない有害な極端な反応性を防止するための安全メカニズム及び閾値設定器として作用し得る。
【０１３５】
本明細書に開示される分子、融合タンパク質、組成物、及び方法に組み込まれ得る抗体又はそのフラグメントの例には限定されないが、以下が含まれる。トラスツズマブ(抗HER2/neu抗体);セルツキシマブ(抗HER2 mAb);セツキシマブ(抗EGFR抗体);ニモツズマブ(抗EGFR mAb);ネシツマブ(抗EGFR mAb); MDX-210(ヒト化抗HER-2二重特異性抗体); MDX-447(ヒト化抗EGFレセプター二重特異性抗体);リツキシマブ(キメラマウス/ヒト抗CD20 mAb);オビヌズマブ(抗CD20 mAb);オファツムマブ(抗CD20 mAb);トシツムマブ-I131(抗CD20 mAb);イブリツムセタン(抗CD20 mAb);ベバシズマブ(抗VEGF mAb);ラムシルマブ(抗VEGFR2 mAb);ラニビズマブ(Ranibizumab)VEGFR1及びVEGFR2の細胞外ドメインをIgG1 Fcに融合; Aflibercept(細胞外ドメイン); AMG386(アンジオポエチン-1及び2結合ペプチドをIgG1 Fcに融合); Dalotuzumab(抗IGF-1R mAb); Gemtuzumab ozogamicin(抗CD33 mAb); Alemtuzumab(抗カンパシー-1/CD52 mAb); Brentuximab vedotin(抗CD30 mAb); Catumaxomab(上皮細胞接着分子及びCD3を標的とする二重特異性mAb); Naptumomab(抗5T4 mAb); Girentuximab(抗炭酸脱水酵素ix);又はFarletuzumab(抗葉酸レセプター)。他の例としては、Panorex登録商標 (17-1A)(マウスモノクローナル抗体); BEC2(ami-idiotypic Mab、GDエピトープを模倣); Oncolym(Lym-1モノクローナル抗体); SMART M195 Ab、ヒト化13'LYM-1(Oncolym)、Ovarex(B43.13、抗イディオタイプマウスMab);腺がん上のEGP40(17-1A)パンカルシノーマ抗原に結合する362294mAb;Zenapax(SMART Anti-Tac(IL-2 receptor); SMART M195 Ab、ヒト化Abなどが挙げられる。ヒト化;ノボmAb-G2(膵がん特異的抗体); TNT(ヒストン抗原に対するキメラMab);グリオマブ-H(モノクロナールヒト化抗体); GNI-250Mab; EMD-72000(キメラ-EGF拮抗薬); LymphoCide(ヒト化IL.L.2抗体);及びMDX-260二重特異的標的、 ANA Ab、SMART IDIO Ab、SMART ABL 364 Ab、ImuRAIT-CEA、ザヌリムマブ(抗CD4 Mab)ケリキシマブ(抗CD4 Mab);イピリムマブ(MDX-101;抗CTLA-4 Mab);ダクリズマブ(抗CD25/IL-2R Mab); MDX-1106(抗PD1 Mab); GITRに対する抗体; GC1008(抗TGF-β抗体)、メテリムマブ/CAT-192(抗TGF-β抗体)、ID11(抗TGF-β抗体)、デノスマブ(抗RANKL Mab)、BMS-663513(ヒト化抗4-1BB Mab)、SGN-40(ヒト化抗CD40 Mab)、CP870,893(ヒト抗CD40 Mab)、インフリキシマブ(キメラ抗TNF Mab、アダリムマブ(ヒト抗TNF Mab)、セルトリズマブ(ヒト化Fab抗)TNFRの細胞外ドメイン(抗TNF)、エタネルセプト(Fcに融合したCTLA-4の細胞外ドメイン)、アバタセプト(Fcに融合したCTLA-4の細胞外ドメイン)、ベリムマブ(抗CD3 Mab)、オテリキシズマブ(抗CD3 Mab)、テプリズマブ(抗IL6R Mab)、REGN88(抗IL6R Mab)、ウステキヌマブ(抗IL-12/23 Mab)、ブリアキヌマブ(抗IL-12/23 Mab)、ナタリズマブ(抗4インテグリン)、ベドリズマブ(抗4 β7インテグリン)rin Mab;T1H(抗CD6 Mab);Efalizumab(抗CD11a Mab);ウレルマブ:Utomilumab(抗-41BB Mab:作動薬); BMS 986178(抗OX40 Mab:作動薬);Elotuzumab(抗SLAM7/CS1 Mab);daratumab(抗CD38 Mab、グセルクマブ(抗IL23)、ニボルマブ(抗PD-1)、ペンブロリズマブ(抗PD-1)、アテゾリズマブ(抗PD-L1)、アベルマブ(抗PD-L1)、デュルバルマブ(抗PD-L1)、レラトリマブ、BMS-986016(抗LAG3 Mab)、NKTR-214(CD-122作動薬Mab)。抗体の例には、US5736167、US7060808、及びUS582137に開示されているものが含まれる。
【０１３６】
ペプチド:本発明のいくつかの局面において、ターゲティング部分又は免疫調節部分は、ペプチド又はポリぺプチドである。ペプチドは、そのアミノ酸残留分配列が本明細書中に示されるペプチドの任意の類似体、フラグメント又は化学誘導体を含む。従って、本発明のペプチドは種々の変形、置換、挿入、及び欠失に供され得、ここで、このような変化はその使用において特定の利点を提供する。この点に関して、本発明のペプチドは、1つ以上の変化がなされ、1つ以上のアッセイにおいて未修飾ペプチドとして機能する能力を保持する、列挙されたペプチドの配列と同一ではなく、むしろ一致する。
【０１３７】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍標的化ペプチド」は100未満のアミノ酸を含むポリマーを含み、ここで、ポリマーは、腫瘍細胞の細胞成分、腫瘍血管系、及び/又は腫瘍環境の成分に特異的に結合する。
【０１３８】
本発明のペプチドは、組換えDNA技術を含む、「ポリペプチド技術」の当業者に公知の技術のいずれかによって合成され得る。純度、抗原特異性、不要な副生物の不在、生成容易性、などの理由から固相メリフィールド型合成のような合成化学技術が好ましい。利用可能な多くの技術の優れたな要旨はStewardら、「固相ペプチド合成」* WHFreeman Co、San Francisco、1969; Bodanszkyら、「ペプチド合成」、John Wiley & Sons、Second Edition、1976; JMeienhofer、「ホルモンタンパク質及びペプチド」に見出すことができる。Vol.2. p.46、Academic Press(New York)、1983; Merrifield、Adv.Enzymol、32:221-96、1969; Fields et al..Int.J. ペプチドタンパク質Res.,35:161-214,1990;及び米国特許。固相ペプチド合成のためのNo.4,244,946、及び古典的溶液合成のためのSchroderら、「The Peptides」、第1巻、Academic Press(New York)、1965。このような合成に使用可能な適切な保護基は、上記のテキスト及びJFWMcOmie、「protective Groups in Organic Chemistry」、Plenum Press、New York、1973に記載されている。
【０１３９】
一態様では本ターゲティング部分がBTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分はECD又はTIM-3のリガンド結合フラグメントを含む。具体的には、この免疫調節部分はTIM-3のCEACAM 1結合フラグメントから構成されている。別の態様では本ターゲティング部分がBTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、RANKL、TGF-β又はVEGFに結合するタンパク質を含み、本免疫調節部分はECD又はCD226のリガンド結合フラグメントを含む。特定の局面において、このリガンド結合フラグメントは、CD155又はCD112結合フラグメントを含む。追加の側面において、本ターゲティング部分はBTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β又はVEGFに結合するポリペプチドから構成され、免疫調節部分はECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。更に別の側面において、本ターゲティング部分はBTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β又はVEGFに結合するポリペプチドを構成し、免疫調節部分は、ECD又はそのリガンド結合フラグメントのPD-1を構成する。別の側面において、本ターゲティング部分はBTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β又はVEGFに結合するポリペプチドを構成し、免疫調節部分は、VSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。一態様では、リガンド結合フラグメントがVISTA結合フラグメントを含む。ターゲティング部分は一定の側面において、BTLA、CCR4、CTLA4、LAG3、PD-1、PD-L1、TIGIT、VISTA、41BB、OX40、GITR、TGF-β又はVEGFに結合するポリペプチドから構成され、免疫調節部分はTGFβRIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。
【０１４０】
1つの局面において、この分子は、配列番号10及び145; 11及び146; 12及び147; 13及び148; 14及び149; 15及び150; 16及び151; 17及び152; 18及び153; 19及び154に対応する配列を含む。20及び155;23及び157;24及び163;156及び159;24及び165;26及び157;24及び1530;165及び167;32及び168; 34及び169;37及び171;1739及び1740;174及び175;43及び176;44及び177;45及び179;180及び47;181及び182; 49及び183;1850及び184; 51及び185;1852及び186; 53及び187; 58及び189;59及び60及び61; 62及び63; 64及び65; 66及び67; 68及び69; 70及び71; 72及び73; 74及び75; 76及び77; 78及び79; 80及び81; 82及び83; 84及び85; 86及び87; 88及び89; 90及び92;91及び93。100、101、102、103、105、104、105、108、109、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、192、209、210、211、212、221、222、223、224、233、224、235、234、235、236、245、246、247、248、257、248、259、260、259、260、270、271、272、275、276、279、280、283、284、287、280。
【０１４１】
特定の側面において、ターゲティング部分はPD-1又はPD-L1を結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTim-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、かつ/又は配列番号(SEQ ID NO)の順序が51、52、53又は192である。1つの側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 50の配列を含む。別の側面では、ターゲティング部分はLAG-3を結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントである。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 26の配列を含む。さらに別の側面として、ターゲティング部分はビスタを結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。さらなる局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 12の配列を含む。1つの側面において、ターゲティング部分はTIGITを結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 17の配列を含む。別の側面ではターゲティング部分がBTLAを結合する抗体から構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。さらなる局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 22の配列を含む。ターゲティング部分はCCR-4を結合する抗体で構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 31の配列を含む。さらなる局面において、ターゲティング部分は4 1BBに結合する抗体を含み、免疫調節部分は、TIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。具体的な局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 116の配列を含む。1つの側面において、ターゲティング部分はVEGFを結合する抗体で構成され、免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントで構成される。特定の局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 88の配列を含む。
【０１４２】
さらなる局面において、免疫調節部分はBTLA又は光のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、リガンド結合フラグメントは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター(HVEM、CD 270)結合フラグメントを含む。さらなる態様において、免疫調節部分はCCR4のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、リガンド結合フラグメントは、CCL22結合フラグメントを含む。
【０１４３】
さらなる態様では、免疫調節部分がCD160のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。さらなる局面において、この免疫調節部分は、配列番号(SEQ ID NO): 300の配列を含む。
【０１４４】
さらなる局面において、免疫調節部分は、LAIR1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。さらなる局面において、この免疫調節部分は、配列番号(SEQ ID NO): 307の配列を含む。
【０１４５】
さらなる実施形態において、本発明は標的化部分、第1の免疫調節部分(IM-1)及び第2の免疫調節部分(IM-2)を含む分子を提供し、ここで、標的化部分は細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4)に特異的に結合するポリペプチドを含む。CD152、プログラム死リガンド-1(PD-1)、プログラム死リガンド-1(VISTA)、B及びTリンパ球活性化抑制因子(BTLA)、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BBリガンド(CD137)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導TNFR関連タンパク質(GITR)、核因子κBリガンドのレセプター活性化因子(RANKL)、形質転換成長因子β(TGF-β)、IL6R、上皮成長因子レセプター(EGFR)、ヒト上皮成長因子レセプター2(HER2)又は血管内皮成長因子(VEGF)第1の免疫調節部分は形質転換増殖因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラム死1タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)、B-及びT-リンパ球アテニュエーター(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4の細胞外リガンド結合配列又はそのリガンド結合フラグメントを含む。キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核因子κ B(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)又はT細胞活性化のVドメインIg抑制因子(VISTA);及び形質転換増殖因子βレセプターII(TGFβRII)、プログラムされた死滅タンパク質(PD-1)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有3(TIM-3)の第2の免疫調節部分は細胞外リガンド結合フラグメントを含む。-及びT-リンパ球アテニュエーター(BTLA)、CD226、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD44、コロニー刺激因子1レセプター(CSF1R)、CCR4、キラー細胞免疫グロブリン様レセプター(KIR)、血管内皮増殖因子レセプター(VEGFR)、核因子κBレセプターアクチベーター(RANK)、Vセット及び免疫グロブリン・ドメイン含有8(VSIG8)、LIGHT(TNFSF14)、又はT細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)。
【０１４６】
1つの局面において、このターゲティング部分のポリペプチドは、免疫グロブリン、抗体、二重特異性若しくはマルチスペシフィック抗体(multispecific antibody)、抗体フラグメント、単鎖可変フラグメント(scFv)、二価若しくは多価scFv、レセプターの細胞外ドメイン由来のリガンド結合配列(ECD)、又はFc含有ポリペプチドの抗原結合ドメインを含む。特定の態様では、ポリペプチドは抗体である。
【０１４７】
さらなる局面において、第1の免疫調節部分は抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に付着され;第2の免疫調節部分が抗体の重鎖又は軽鎖のC末端に付着され、そして/又は第2の免疫調節部分は第1の免疫調節部分に付着される。
【０１４８】
さらなる局面において、第1及び第2の免疫調節部分は重鎖に付着されるか、又はリンカー及び/又は第2の免疫調節部分を有する抗体の軽鎖はリンカーを用いて第1の免疫調節部分に付着される。特定の局面において、このリンカーは、配列番号(SEQ ID NO)3の配列を有する。
【０１４９】
1つの局面において、第1の免疫調節部分は抗体の重鎖に付着され、そして第2の免疫調節部分は抗体の軽鎖に付着される。
【０１５０】
ある態様では第1の免疫調節部分がTIM3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第1の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、及び/又は第1の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。さらに別の側面では、ターゲティング部分はIL6R、CTLA-4、PD-1、PD-L1、EGFR、HER2、VEGF又はgp120を具体的に結合する。
【０１５１】
1つの側面において、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 201及び配列番号(SEQ ID NO): 202を含む。別の側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドを構成し、第1免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成し、第2免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成する。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 205及び配列番号(SEQ ID NO): 206を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 207及び配列番号(SEQ ID NO): 208を含む。別の側面では、ターゲティング部分はCTLA-4を結合するポリペプチドを構成し、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成し、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成する。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 203及び配列番号(SEQ ID NO): 204を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドはイピリムマブを含む。さらなる態様では、この抗体はトレミリムマブを含む。
【０１５２】
1つの側面において、ターゲティング部分はPD-1又はPD-L1を結合するポリペプチドから成り、第1の免疫調節部分はTGFβRIのECD又はそのリガンド結合フラグメントから成り、第2の免疫調節部分は、TIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから成る。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 273及び配列番号(SEQ ID NO): 274を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 277及び配列番号(SEQ ID NO): 278を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 285及び配列番号(SEQ ID NO): 286を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 281及び配列番号(SEQ ID NO): 282を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドがニボルマブ又はペムブロリズマブを含む。さらなる局面において、この抗体は、アテゾリズマブ又はアベルマブ又はデュルバルマブを含む。
【０１５３】
一態様ではターゲティング部分がIL-6Rに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 213及び配列番号(SEQ ID NO): 214を含む。別の側面では、ターゲティング部分はIL-6Rを結合するポリペプチドを構成し、第1免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成し、第2免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成する。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 217及び配列番号(SEQ ID NO): 218を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 219及び配列番号(SEQ ID NO): 220を含む。別の態様ではターゲティング部分がIL-6Rに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 215及び配列番号(SEQ ID NO): 216を含む。さらなる局面において、本ターゲティング部分のポリペプチドは、IL-6Rに結合する抗体を含む。さらなる局面において、この抗体は、トシリズマブを含む。
【０１５４】
一態様ではターゲティング部分がVEGFに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 249及び配列番号(SEQ ID NO): 250を含む。別の側面では、ターゲティング部分はVEGFを結合するポリペプチドを構成し、第1免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成し、第2免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成する。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 253及び配列番号(SEQ ID NO): 254を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 255及び配列番号(SEQ ID NO): 256を含む。別の態様ではターゲティング部分がVEGFに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 251及び配列番号(SEQ ID NO): 252を含む。さらなる態様では、ターゲティング部分のポリペプチドはベバシズマブを含む。さらなる局面において、ターゲティング部分は、VEGFRのリガンド結合外部ドメインを含む。さらなる態様では、ターゲティング部分が自由を包含する。
【０１５５】
1つの局面において、ターゲティング部分はEGFRに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 225及び配列番号(SEQ ID NO): 226を含む。別の側面では、ターゲティング部分はEGFRを結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 229及び配列番号(SEQ ID NO): 230を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 231及び配列番号(SEQ ID NO): 232を含む。別の態様ではターゲティング部分がEGFRに結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 227及び配列番号(SEQ ID NO): 228を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、セツキシマブ又はパニツムマブ又はネシツムマブを含む。
【０１５６】
1つの局面において、ターゲティング部分はHER2/Neuに結合するポリぺプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、そして第2の免疫調節部分は、TGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 237及び配列番号(SEQ ID NO): 238を含む。別の側面では、ターゲティング部分はHER2を結合するポリペプチドを構成し、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成し、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを構成する。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 243及び配列番号(SEQ ID NO): 244を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 241及び配列番号(SEQ ID NO): 242を含む。別の態様ではターゲティング部分がHER2に結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 239及び配列番号(SEQ ID NO): 240を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、トラスツズマブ又はペルツズマブを含む。
【０１５７】
一態様ではターゲティング部分がHIV gp120に結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 261及び配列番号(SEQ ID NO): 262を含む。別の側面では、ターゲティング部分はgp120を結合するポリペプチドから構成され、第1の免疫調節部分はPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成され、第2の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントから構成される。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 265及び配列番号(SEQ ID NO): 266を含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 267及び配列番号(SEQ ID NO): 268を含む。別の態様では、ターゲティング部分はgp120に結合するポリペプチドを含み、第1の免疫調節部分はTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含み、第2の免疫調節部分はTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。1つの局面において、該分子は、配列番号(SEQ ID NO): 263及び配列番号(SEQ ID NO): 264を含む。さらなる態様において、ターゲティング部分のポリペプチドは、トラスツズマブ又はペルツズマブを含む。
【０１５８】
一態様では、該分子が配列番号(SEQ ID NO): 201及び202; 203及び204; 205及び206; 207及び208; 213及び214; 215及び216; 217及び218; 219及び220; 225及び226; 227及び228; 229及び230; 231及び232; 237及び238; 239及び240; 241及び242 ; 243及び244; 249及び250; 251及び252; 253及び254; 255及び256; 261及び262; 263及び264; 265及び266; 267及び268; 273及び274; 277及び278; 281及び282; 285及び286に対応する配列を含む。
【０１５９】
更なる実施形態において、本発明は、TIM-3の細胞外結合ドメイン(ECD)又はそのリガンド結合フラグメント、並びにTGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226又はVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。一態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。特定の局面において、この融合タンパク質は、以下の配列番号(SEQ ID NO)の配列を有する: 190。別の態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。具体的な局面において、この融合タンパク質は、配列番号(SEQ ID NO): 195、196又は197の配列を含む。さらなる態様では、融合タンパク質はFcを含む。
【０１６０】
用語「融合分子」及び「融合タンパク質」は互換的に使用され、そしてさらなるエフェクター分子(通常、組換え、化学的又は他の好適な方法によって共有結合された(すなわち、融合された)タンパク質又はペプチド配列を伴うか又は伴わない、生物学的に活性なポリペプチドをいうことを意味する。所望であれば、融合分子は、1つ又はいくつかの部位にペプチドリンカー配列を含むことができる。あるいは、ペプチドリンカーが融合分子の構築を補助するために使用され得る。特に好ましい融合分子は融合タンパク質である。一般に、融合分子はまた、コンジュゲート分子を含み得る。
【０１６１】
更なる実施形態において、本発明は、TIM-3の細胞外結合ドメイン(ECD)又はそのリガンド結合フラグメント、並びにTGFRβII、PD-1、BTLA、LIGHT、CD226又はVSIG8のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む融合タンパク質を提供する。一態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びTGFβRIIのECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。特定の局面において、この融合タンパク質は、配列番号(SEQ ID NO): 190の配列を含む。別の態様では、融合タンパク質がTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメント、及びPD-1のECD又はそのリガンド結合フラグメントを含む。具体的な局面において、この融合タンパク質は、配列番号(SEQ ID NO): 195、196又は197の配列を含む。さらなる態様では、融合タンパク質はFcを含む。
【０１６２】
別の実施形態では、TIM-3 ECDがFc含有ポリペプチドのC末端に特異的に融合されている、Fc含有ポリペプチドとTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントとの融合タンパク質を提供する。
【０１６３】
更なる実施形態において、免疫グロブリンFcとTIM-3のECD又はそのリガンド結合フラグメントとの融合タンパク質、及びPD-1又はPD-L1に結合する抗体を含む治療法を提供する。一態様では、前記融合タンパク質の構成が(N末端)Fc-TIM3(C末端)の形態である。別の態様では、前記融合タンパク質の構造が(N末端)TIM3-Fc(C末端)の形成である。
【０１６４】
ある実施形態に、本発明の組成物は例えば、抗体−リガンド・トラップと組合せて使用することができる。例えば、US8993524、US9441044、US9850306に開示された抗体−リガンド・トラップは、本発明の構成と組み合わせて使用することができる。
【０１６５】
ある実施形態に、先に記載した分子又は融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。
【０１６６】
「薬学的に許容される」とは、担体、希釈剤又は賦形剤が配合組成物の他の成分と適合性でなければならず、そのレシピエントにとって有害でないことを意味する。
【０１６７】
さらなる実施形態では、先に記載した分子、融合タンパク質又は組成物を対象に投与することを含む、がん又は感染症を有する対象の治療法を提供する。
【０１６８】
用語「治療」は、本明細書中で用語「治療方法」と交換可能に使用され、そして1)診断された病的状態又は障害の硬化、減速、症状の軽減、及び/又は進行の停止を行う治療的処置又は測定、並びに2)予防/予防測定の両方をいう。処理を必要とするものには、特定の医学的障害を既に有する個体、並びに最終的に障害を獲得し得る個体(すなわち、予防措置を必要とする個体)が含まれ得る。
【０１６９】
用語「投与する」及び/又は「投与する」は、処理を必要とする対象に処理有効量の医薬組成物を提供することを意味すると理解されるべきである。投与経路は、経腸、局所又は非経口であり得る。そのようなものとして、投与経路には皮内、皮下、静脈内、腹腔内、動脈内、髄腔内、被膜内、眼窩内、心臓内、皮内、経皮、経気管、皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内及び胸骨内、経口、舌下頬側、直腸、膣、鼻腔内投与、並びに注入、吸入、及び噴霧が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「非経口投与」及び「非経口投与」という語句は、経腸及び局所投与以外の投与様式を意味する。
【０１７０】
用語「治療有効量」、「有効量」、「治療有効量」、「有効量」などは、研究者、獣医師、医師又は他の臨床医によって求められている組織、系、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発する対象化合物の量を指す。一般に、応答は、患者における症状の改善又は所望の生物学的結果のいずれかである。有効量は、本明細書に記載のように決定することができる。
【０１７１】
本明細書で使用される「対象」という用語は、対象方法が実施される任意の個体又は患者を指す。一般に、対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってもよい。したがって、げっ歯類(マウス、ラット、ハムスター及びモルモットを含む)、ネコ、イヌ、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ニワトリなどを含む家畜、及び霊長類(サル、チンパンジー、オランウータン及びゴリラを含む)などの脊椎動物を含む他の動物は、対象の定義内に含まれる。
【０１７２】
用語「がん」はがん(悪性腫瘍)を良性腫瘍から区別する他の部位(二次部位、転移)に侵入し、広がる可能性のある、1つの部位(一次部位)で始まる異常かつ制御されない細胞増殖を特徴とする群疾患を指す。実質的に全ての器官が冒され得、ヒトに影響を及ぼし得る100を超える型のがんを導き得る。がんは、遺伝的素因、ウイルス感染、電離放射線への露光、環境汚染物質への露光、喫煙及び/又はアルコール使用、肥満、食事不足、身体活動不足、又はそれらの任意の組合せを含む多くの原因から生じ得る。
【０１７３】
本明細書中で使用される場合、「新生物」又は「腫瘍」(その文法的バリエーションを含む)は、良性又はがん性であり得る、組織の新規かつ異常な増殖を意味する。関連局面において、新生物は、種々のがんを含むがこれらに限定されない腫瘍性疾患又は障害を示す。例えば、このようながんには、前立腺がん、膵臓がん、胆管がん、結腸がん、直腸がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、精巣がん、乳がん、卵巣がん、膵臓がん、脳がん、及び頭頸部がん、黒色腫、肉腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫などが含まれ得る。
【０１７４】
米国国立がん研究所により記載されている例示的ながんには以下がある:急性リンパ芽球性白血病、成人;急性骨髄性白血病、成人;副腎皮質がん、小児; AIDS関連悪性腫瘍;肛門がん、小児脳;星細胞腫、小児脳;胆管がん、膀胱がん、小児;骨がん、骨肉腫/悪性線維性組織球腫;脳幹グリオーマ、成人;脳腫瘍、小児;脳腫瘍、小児;脳星細胞腫、小児;脳腫瘍 脳星細胞腫/悪性グリオーマ、小児期;脳腫瘍、髄芽腫、小児期;脳腫瘍、テント上神経外胚葉性腫瘍、小児期;脳腫瘍、視覚経路及び視床下部神経膠腫、小児期(その他);乳がん及び妊娠期;乳がん、小児期;乳がん、男性;気管支腺腫/カルチノイド、小児期;カルチノイド腫瘍、消化管;がん、 副腎皮質がん、原発不明の膵島細胞がん、中枢神経系リンパ腫、小児;脳星細胞腫/悪性神経膠腫、小児;子宮頸がん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄増殖性疾患、腱鞘明細胞肉腫、結腸がん、小児;皮膚T細胞リンパ腫、子宮内膜がん、上皮がん、卵巣がん、食道がん、小児;ユーイング腫瘍、頭蓋外胚細胞腫瘍 小児;性腺外胚細胞腫瘍;眼内黒色腫;眼がん、網膜芽細胞腫;胃(胃)がん;胃(胃)がん、小児;消化管カルチノイド腫瘍;胚細胞腫瘍、小児;胚細胞腫瘍、性腺外;胚細胞腫瘍、卵巣;妊娠性絨毛腫瘍;神経膠腫。小児脳幹;神経膠腫。小児視路及び視床下部;肝細胞がん(原発性);肝細胞がん(肝細胞がん);小児(原発性);ホジキンリンパ腫、成人;ホジキンリンパ腫、小児;ホジキンリンパ腫;下咽頭がん;視床下部及び視床下部神経膠腫、小児;島細胞がん(膵臓内分泌がん);カポジ肉腫;喉頭がん;喉頭がん、小児;白血病、急性リンパ芽球性、成人;白血病急性リンパ芽球性、小児;白血病、急性骨髄性;白血病、慢性骨髄性;白血病、有毛細胞;肝がん、成人(原発性);肝がん、小児;肺がん、非小細胞;肺がん、小細胞;リンパ芽球性白血病、小児急性;リンパ球性白血病、慢性;リンパ腫、エイズ関連;リンパ腫 中枢神経系(原発性);リンパ腫、ホジキン細胞;リンパ腫、ホジキン;小児期;リンパ腫、非ホジキン;小児期;リンパ腫、非ホジキン;妊娠期;リンパ腫、非ホジキン;原発性中枢神経系;マクログロブリン血症、ワルデントローム;男性乳がん;悪性中皮腫、小児期;悪性胸腺腫;小児期;黒色腫;黒色腫眼内がん;悪性腫瘍;原発性中皮腫;多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍;骨髄異形成症候群;慢性白血病;骨髄性白血病、小児;多発性骨髄腫;慢性骨髄増殖性疾患;鼻腔及び副鼻腔がん;鼻咽頭がん;小児;神経芽腫;非ホジキンリンパ腫;小児;非ホジキンリンパ腫;非小児 -妊娠中のホジキンリンパ腫;非小細胞肺がん;小児口腔がん;口腔咽頭がん;骨の骨肉腫/悪性組織球腫;小児卵巣上皮がん;卵巣低悪性度腫瘍;膵がん、小児膵がん、膵島がん;副鼻腔がん;陰茎がん;松果体及びテント上原始胚葉腫瘍小児;下垂体腫瘍;下垂体細胞腫瘍;多発性骨髄腫;妊娠及び乳がん;妊娠及びホジキンリンパ腫;原発性中枢神経系リンパ腫;成人;原発性肝がん、小児;前立腺がん;腎細胞がん(腎臓);腎細胞がん、小児;腎骨盤及び尿管、移行上皮がん;網膜筋肉腫、小児;唾液腺がん;唾液腺がん、小児;肉腫、ユーイングファミリー 腫瘍;骨肉腫、カポジ肉腫;小児肉腫、軟部肉腫、軟部組織、小児;老人症候群;皮膚がん、小児;皮膚がん(黒色腫);皮膚がん、メルケル細胞;小細胞肺がん;軟部肉腫、成人;軟部組織肉腫、小児;原発性扁平上皮がん、転移性胃がん;胃がん 小児テント上神経外胚葉性腫瘍;小児;T細胞リンパ腫、皮膚がん;胸腺腫、悪性腫瘍;甲状腺がん、小児;腎骨盤及び尿管の移行細胞がん;栄養芽細胞性腫瘍、妊娠不明;小児の原発部位がん;尿管及び腎髄質がん;潰瘍肉腫;膣がん;視路及び視床下部神経膠腫、小児;外陰がん; Waldenstrom's Macro globulinemia; ウィルムス腫瘍。
【０１７５】
本明細書中で使用される場合、用語「感染性疾患」は、感染から生じる疾患をいう。感染は、病原体による生物体組織の侵入、それらの増殖、及び宿主組織の感染性因子及びそれらが産生する毒素への反応である。感染性物質には、ウイルス、ウイロイド、プリオン、バクテリア、寄生虫及びピンワームのような線虫、マダニ、ダニ、ノミ、及びシラミのような節足動物、リングワームのような真菌、並びに条虫及び他の蠕虫のような他の巨大寄生虫が含まれる。短期感染は急性感染であり、従って、本明細書中で使用される場合、「慢性感染」は、長期感染又は持続性感染をいう。
【０１７６】
感染症には、急性軟骨炎(AFM);アナプラズマ症; Babesis;Brucellosis; Burkholderia mallei(Glanders); Burkholderia pseudomallei(Melioidesis); Campylobacteriosis(CRE/CRPA); Chancroid;Thikungunya virus infection(Thikungunya); Chlamydia;Clostridium Difficile infection; Clostridium Perfringens(Epsilon Toxin);Cocidioidycosis fungal Infection(Valley Fever); Creutzfeldt-Jacob diseaseが含まれる。伝染性海綿状脳症(CJD);クリプトスポリジウム症(Crypto);デング熱、1,2,3,4(デング熱);ジフテリア大腸菌感染(E.Coli); Ebola hemorrhagic fever(Ebola); ehrlichiosis; encephalitis; Arbovirus or parainfectious; Enterovirus infection、Non-Polio Enterovirus); Enterovirus infection; D68(EV-D68); Giardias(Giardia); Gonococcal infection(Gonorrhea);Granuloma inguinale; Haemophilus Influenza Disease; B型(Hib又はH-Flu); Hantavirus Pulmonary syndrome(HPS);溶血性尿毒症 症候群(HUS);B型肝炎(Hep A); C型肝炎(Hep D);E型肝炎(Hep E);ヘルペス;帯状疱疹;VZV(Shingles);ヒストプラズマ症(Histoplasmosis);ヒト免疫不全ウイルス/AIDS(HIV/AIDS);ヒトパピロマリブス(HPV);インフルエンザ(flu);鉛中毒;レジオネラ症(Legionnailes disease);レプトスピラ症(Hansens disease);レプトスピラ症(Listeria);リンパ肉芽腫性感染(LVG);マラリア;髄膜炎;ウイルス性(Meningitis)髄膜炎;細菌性コロナウイルス(MERS-CoV); Mumps;ノロウイルス;麻痺性殻中毒(麻痺性殻中毒、シグアテラ);ペディキュローシス(lice、Head and Body lice);骨盤炎症性疾患(PID);百日咳(Whooping Cough);プレーグ;ブボン性敗血症性肺炎(plague);肺炎(pneumonia); ポリオ(Polio);ポワッサン(Powassan); Pthiriasis(Crabs); Pustular lice Rash diseases(Pubstular lice Infestation);Q-fever;Ricin poisoning; Rickettioning(Rocky Mountted fever);風疹(German Measles); Salmonellosis gasteritis(Salmonella); Scabies Infestation(Scabies); Scombroid;Svere Acpiratory syndrome(SARS); Shigellosis gastroenteritis(Shigella); Smallpox; Staphyloccal infection)メチシリン耐性(MRSA);ブドウ球菌中毒;ブドウ球菌感染;ブドウ球菌感染;バンコマイシン耐性(VRSA);連鎖球菌病(Strep A);連鎖球菌病;B群(Strep-B);連鎖球菌毒素ショック症候群; STSS;中毒性ショック(STSS、TSS);梅毒、原発性、二次性、早期潜伏性、先天性;破傷風(Lock Jaw);トリコノシス感染(Trichinosis);結核(TB)結核(潜在性);結核(潜在性); D群;チフス;膣炎、細菌性(酵母感染);水痘(水痘);コレラ菌(コレラ菌);ウイルス性出血熱(エボラ、ラッサ)マルバーグ;アクニトバクター感染症;アフリカトリパノソーマ症;アフリカ(イエルシニア);アフリカ・トリパノソーマ症;アレルシア症;アカノバクテリウム・ヘモリチカム感染症;アスペルギラ症;アスペルギラ症;アストロウイルス感染症;バチルス・セレウス感染症;細菌性膣炎;バランチジア症;バチルスカリス感染症; BKウイルス感染症; Black piedra; Blastocystosis;ボリビア出血熱; Bubonic Plague;ブルーリ潰瘍;カリシウイルス感染症;カンピロバクター症;カンジダ症、腸管毛細血管病、カリオン病、カトネラ・スクラッチ病、セルリア炎、シャーガス病(アメリカン・トリパノソーマ症)、チャンクロイド、Chlamydophila pneumoniae感染、クロモブラストミコーシス、Chytridiomycosis、クロノルキア症 コロラドマダニ熱(CTF);普通の寒さ;クリプトスポリジウム症;皮膚幼虫移行症;シスチクロシス;シストメガロウイルス感染症;デスモデムス感染症;ジフテリア症;ジフィルボスリア症;エキノコッカス症;腸内菌症(Pinworm感染症);腸球菌感染症;腸球菌感染症;エピデミックチフス・リケッチア・プロワゼキ;エリテマ・サブイトム(Erythema infectiosum)(第5病);エクサンテム・サブイトム(Exanthem subitum)(第6病);ファシオラシス;フ���シオロプシア症;家族性不眠症(FFI);フィラリア症;遊離生存アメーバ感染症;多発性フソバクテリア感染症;ガス壊疽(クロストリジウム・ミオネクローシス)、ゲルストマン・シュレインカー症候群(GSS)、巨人症、巨人症、肉芽腫鼠径部(ドノバノーゼ)、連鎖球菌感染、手足口病(HFMD)、ハンタウイルス肺症候群(HPS)、ハートランドウイルス病ハートランドウイルス、ヘリコバクター・ピロリ感染、溶血性尿毒症症候群(HUS)、腎症候群を伴う出血熱(HFRS)、ヒストプラスマ感染、ヒトボカウイルス感染、ヒトヒューインギー ヒト顆粒球性アナプラズマ症(HGA);ヒト単球性エールリキア症;ヒトパピローマウイルス(HPV)感染;ヒトパラインフルエンザウイルス感染;エプスタイン・バー感染性単核球症(モノ);インフルエンザ(インフルエンザ);イソスポリア症; Kawasaki多発性ケラチス; Kingella kinge感染; Kuru PRNP;ラッサ熱(ポンティアック熱);リーシュマニア症;レプトスピラ症(Leptospira species);リンパ球性フィラリア症(Elephantiasis);リンパ球性脈絡髄膜炎;中東呼吸器症候群(MERS);メリオイドーシス(Whitmore'S Disease);髄膜炎(Meningococcal Disease);Metagonimiasis; Microsporidiosis; Molluscum contagiosus(MC); Mumps; Mumkeyphus(Endemic Typhus); Mycoplasma Pneumonia; Myicetoma(disambiguation); Myisasis parasitic; Neonatal conjunctivitis(Ophthalmia neonatorum); Norovirus(小児及び乳児); Nocardiosis(Nocardiosis); Opisthorchidioidycosis(South American blastomycosis); Paragonimiasis; Pasteurellosis(Head captis); Pediculosis corporis(Body Lice); Pediculosis pubis炎症性疾患(PID);ペルツシス;肺炎球菌感染;肺炎(PCP);多発性ポリオ;前立腺脳炎;Q熱;狂犬病;再発熱;RSV;リノスポリジウム症;リケッチア感染;RVF;Rocky Mountain spotted Fever(RMSF);ロタウイルス感染;風疹; SARS(重症急性呼吸器症候群); Scabies; Scarlet Fever Group A S;多発性敗血症;赤痢(ヘルペス帯状疱疹); Smallpox(Variola); Staphylococcal foodising; Strongyloidiasis; Syphilis; Taenis;Tatanus(ロックジョー); Tinea barbae(バルバーかゆみ); Tinea capitis(頭皮のリンゴワーム); Tinea corporis(体のリンゴワーム); Tinea cruris(ジョックかゆみ); Tinea manum(手のリンゴワーム); Tinea nigra(チネアペディス)アスリートの足;チネア・ユンギウム(足);チネア・バーシシス(OLM);トキソカリア症(OLM);トキソプラズマ症(Visceral larva migrans);トラコマ症;トリコマ症(Trichonisis);トリコマ症(Whiphoriasis);結核;結核;台風熱;ウレアプラルリチカム感染;バレー熱;ベネズエラ馬脳炎V;ベネズエラ出血熱;ビブリオ・パラヘモリチカス;ウイルス性肺炎;西ナイル熱;ホワイトピエドラ(Tinea blanca); Yersinia pseudotuberculosis感染;エルシニア症;接合菌症。
【０１７７】
いくつかの態様では、投与が1つ以上の追加の治療薬剤と組合せることができる。「併用療法」、「併用療法」などの語句は応答を増大させるために、2つ以上の薬物又は治療を同時に使用することを指す。本発明の組成物は例えば、他の薬物又は処理(例えば、免疫療法又は化学療法)と組み合わせて使用され得る。このような治療は本発明の組成物の投与前、投与と同時に、又は投与後に投与することができる。
【０１７８】
本明細書で使用される「化学療法剤」という語は、がんを治療するために使用される任意の治療薬剤を指す。化学療法剤の例としてはアクチノマイシン、アザチオプリン、ブレオマイシン、カルボプラチン、カペシタビン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ドキソルビシン、エポチロン、エトポシド、フィオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、メルカプトプリン、メトトレキサート、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テニポシド、チオグアニン、トルビシン、ビンクリスチン、ビンセチン、ビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。パニツマブ、Erbitux(cetuximab)、マツズマブ、IMC-R3、デノスマブ、アバスチン(ベバシズマブ)、ハミラ(アダリムマブ)、ハーセプチン(トラスツズマブ)、レミカド(インフリキシマブ)、リツキシマブ(パリズマブ)、マイロターグ(ゲムツズマブ・オキサミシン)、ラプチバ(エファリズマブ)、ツェナパックス(ナタリズマブ)、ニュートロスペック(テクネチウム(99mTc)ファノレソマブ)、トシリズマブProstaScint(インジウム-III標識カプロマブペンデチド)、Bexxar(トシツモマブ)、イットリウム90に結合したZevalin(イブリツモマブチウキセタン(IDEC-Y2B8))、Xolair(オマリズマブ)MabThera(Rituximab)、MabCampath(alemtuzumab)、Simulect(basiliximab)、LeukoScan(sulesomab)、CEA-Scan(arcitumomab)、Verluma(nofetumomab)、Panorex(Edrecomab)、alemtuzumab、CDP 870 ナタリズマブGilotrif(afatinib)、Lynparza(olaparib)、Perjeta(pertuzumab)、Bosulif(bosutinib)、Cabometyx(cabozantinib)、Ogivri(trastuzumab-dkst)、Sutent(sunitinib malate)、Adcetris(brentuximab vedotinib)、Alecence(acalabrutinib)、Yescarta(Verzenio(abemacib))、Keytruda(pembrolizumab)、Aliqopa(copanlisib)、Nerlynx(neratinib)、Imfinzi(durvalumab)、Darzalex(daratumab)、Tecentriq(atezolizumab)、及びTarceva(erlotinib)。免疫療法剤の例としてはインターロイキン(Il-2、Il-7、Il-12)、サイトカイン(インターフェロン、G-CSF、イミキモド)、ケモカイン(CCL3、CCl26、CXCL7)、免疫調節イミド製剤(タリドミド及びその類似品)などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
抗生物質の例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない。アミカシン;ゲンタマイシン;カナマイシン;ネチルマイシン;トブラマイシン;ペルタマイシン;リファクシン;ロラカーベフ;エルタペネム;ドリペネム;イミペネム;セファゾリン;セファレキシン;セファクロル;セフロキシム;セフィキシム;セフジニル;セフォペラゾン;セフォタキシム;セフタジジム;セフチブテン;セフトリアキソン;セフタロリンフォサミル;セフトビプロレ;テイコプラニン;バンコマイシン;ダルババンシン;オリタバンシン;リンコサミド;クリンダマイシン;リスロマイシン;ダジスロマイシン;リスロマイシン;ラミシン;スピラマイシン;モノバクタム;アズトレオナム;ニトロフランス;オキサゾリドン;ポジゾリド;ラデゾリド;トレゾリド;ペニシリン;アモキシシリン;アズロキシシリン;フルクロキサシリン;メチシリン;オキサシリン;ペニシリンG;ペニシリンG;ペニシリン;テカルシリン;ペニシリンの組み合わせ;アモキシシリン/クラブラネート;アンピシリン/スルバクタム;ピペラシリン/タゾバクタム、チカルシリン/クラブラン酸塩、ポリペプチド、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンBフロキサシン;ガチフロキサシン;フロキサシン;ノルフロキサシン;フロキサシン;ノルフロキサシン;フロキサシン;テフロキサシン;スルファフロキサシン;スルファジアジン;スルファジアジン;スルファジメトキシシン;スルファメトキシゾール;スルファメトキサゾール;スルファジアジン;デメクロサイクリン;ドキシサイクリン;ミノサイクリン;オキシテトラサイクリン;テトラサイクリン;クロファジミン;ダプソン;シクロセリン;エチオナミド;イソニアミド;ピラジンアミド;リファンピシン;リファペンチン;ストレプトマイシン;アルフェニコール;ホスホマイシン;フシジン酸;メトロニダゾール;ムピロシン;プラテンシマイシン;キヌプリスチン/ダルホプリスチン;チアムフェニコール;チゲサイクリン;チニダゾール及びトリメトプリム。
【０１８０】
別の実施形態では、免疫トレランスを誘導方法促進する一方本発明する。この方法はそれを必要とする被験体に、本発明の1つ以上の分子を投与する工程を包含する。
【０１８１】
以下の実施例は本発明の実施形態をさらに説明するために提供されるが、本発明の範囲を限定することは意図されない。それらは使用され得るもの典型的なものであるが、当業者に知られている他の手順、方法論、又は技術が代わりに使用されてもよい。
【実施例】
【０１８２】
プログラム死 1(PD-1):プログラム死 リガンド1(PD-L1)免疫チェックポイントを標的とする抗体の説得力のある抗腫瘍活性にもかかわらず、これらの治療に対する新規及び適応耐性の両方がしばしば観察される。PD-1/PD-L1経路を標的とすることは、抗腫瘍T細胞免疫を抑制するためにPD-1と他のチェックポイント阻害剤との間に複雑な交差調節が存在し、ある場合にはPD-1遮断に続いて適応耐性が発現するので、枯渇したT細胞の機能不全を破壊するのに充分ではないかもしれない。TIM‐3/CEACAM1軸は、PD‐1/PD‐L1療法に対するde novo及び適応耐重要な決定因子である。
【０１８３】
TIM‐3/CEACAM1は、(i)異好性TIM‐3/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1/TIM‐3ヘテロ二量体化;TIM‐3によるトランスCEACAM1ヘテロ二量体化);(ii)同好性CEACAM‐1/CEACAM‐1 相互作用(cis CEACAM‐1 二量化; trans CEACAM1誘導シスCEACAM‐1 二量化)を介して、T細胞及びNK細胞の多面的抑制を発揮する。したがって、TIM-3及びCEACAM1を共発現する腫瘍浸潤CD8+Tリンパ球は、マウスモデル及びがん患者の両方において最も消耗された表現型を示す。
【０１８４】
PD-1、TIM-3、及びCEACAM-1は腫瘍環境における免疫トレランス及びT細胞消耗の独立した協調的メカニズムを同調させるので、強力な抗腫瘍先天性及び適応性抗腫瘍免疫応答を放出するためにはこれらのチェックポイントの同時遮断が必要である。腫瘍浸潤免疫細胞上での3つすべてのT細胞阻害レセプター(TCIR: PD-1、TIM-3、CEACAM-1)の共発現の上昇に加えて、腫瘍細胞はまた、これらのTCIRが腫瘍活性T細胞(PD-L1、CEACAM-1、ガレクチン-9)を抑制するように関与する複数リガンドを共発現する。これは、免疫トレランスを誘発するために協調して作用するTME内の多重自己分泌/傍分泌シスとトランスTCIR/リガンド相互作用を混乱させるという治療上の課題を提起する(PD-1/PD-L1; Tim-3/ACAM-1; CEACAM-1/CEACAM-1)。この治療的挑戦は、新規な二官能性抗体−リガンド・トラップ(Y-トラップ):(i)TIM-3 IgVエクトドメイン配列に融合されたPD-L1を標的とする抗体を含むa-PDL1-TIM3ecd;(ii)TIM-3 IgVエクトドメイン配列に融合されたPD-1を標的とする抗体を含むa-PD1-TIM3ecdを発明することによって対処された。
【０１８５】
aPDL1-TIM3ecd及びaPD1-TIM3ecdの作用機序: aPDL1-TIM3ecd及びaPD1-TIM3ecdは活性化されたT細胞及び腫瘍細胞上のPD-1又はPD-L1に結合し、同時に、CEACAM-1のFG-CC'裂溝インタフェースに結合する天然細胞TIM-3と効果的に競合するTIM-3ecdデコイでそれらを装飾する。このように、これらの抗体−リガンド・トラップはPD-L1/PD-1 相互作用を無効にするだけでなく、腫瘍環境(TME)のCEACAM-1/CEACAM-1 だけでなく、タイミング3/CEACAM-1 を含むシスとトランスの両方の相互作用を同時に中断する。これらの研究は、a‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PD1‐TIM3ecdがin vitroでIFNγ発現を促進し、共刺激T細胞の消耗を妨げる点で、a‐PDL1(アテゾリズマブ)又はa‐PD‐1(ペムブロリズマブ)よりも有意に効果的であることを実証する。最も有意には、これらの抗体−リガンド・トラップでの腫瘍を有するヒト化マウスのインビボ処理が腫瘍浸潤CD4+及びCD8+ T細胞の数の顕著な増大をもたらし、a-PDL1(アテゾリズマブ)、a-PD-1(ペムブロリズマブ)、a-Tim-3抗体、又はa-PDL1及びa-Tim-3の組合せでの当量処理と比較して、腫瘍進行の阻害において有意により効果的であることが見出された。これらの結果は腫瘍環境中の異好性及び同種親和性Tim‐3/CEACAM‐1 相互作用がPD‐1/PD‐L1インヒビターの抗腫瘍効果を制限すること、及びa‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PD1‐TIM3ecdがPD‐1/PD‐L1チェックポイントを同時に無効にし、Tim‐3/CEACAM‐1軸の両方の成分を打ち消すことにより、T細胞枯渇を打ち消すか又は逆転させるためのより有効な免疫療法ストラテジーを提供することを実証する。
【０１８６】
図1.T細胞活性化を阻害し、免疫トレランス及びT細胞消耗を誘導する自己分泌/傍分泌レセプターリガンド相互作用の模式図。自己分泌/傍分泌TGFβは、Treg系統のシグネチャ転写因子であるFOXP3の発現を誘導する。FOXP3はCTLA-4の表現を誘発するが、これはB7-CD28の相互作用を介在させることによってT細胞費用の推定を抑制するT細胞阻害レセプターである。TregはTIM-3に関与し、TIM-3/CEACAM-1共阻害軸によるエフェクタT細胞の消耗又はアポトーシスを誘発するリガンドであるガレクチン-9を発現する。PD-L1によるPD-1の係合はTregを誘導及び維持するためにFOXP3のTGFβ誘導発現を促進し、T細胞枯渇及び死亡を誘導するためにTIM-3/CEACAM-1シグナル伝達と協働する。
【０１８７】
図2.a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdはPD-L1/PD-1シグナル伝達及びTIM-3/CEACAM-1共阻害軸を同時に遮断することにより、免疫トレランス及びT細胞枯渇を打ち消す。
【０１８８】
(A)a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdの構造及び標的の模式図。a-PD1-TIM3ecdは(i)柔軟性リンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列に融合したヒトa-PD-1抗体の重鎖、(GGGS)3(配列番号(SEQ ID NO): 53)及び(ii)ヒトa-PD-1抗体の軽鎖(配列番号(SEQ ID NO): 187)を含む。a-PDL1-TIM3ecdは(i)柔軟性リンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合したヒトa-PD-L1抗体の重鎖、(GGGS)3(配列番号(SEQ ID NO): 51)及び(ii)ヒトa-PD-L1抗体の軽鎖(配列番号(SEQ ID NO): 185)、(B)a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdがT細胞活性化を阻害し、T細胞枯渇を誘導する自己分泌/パラクリンレセプターリガンド 相互作用を破壊する標的及びメカニズムの概略図。自己分泌/傍分泌TGFβは、Treg系統のシグネチャ転写因子であるFOXP3の発現を誘導する。FOXP3はCTLA-4の表現を誘発するが、これはB7-CD28の相互作用を介在させることによってT細胞費用の推定を抑制するT細胞阻害レセプターである。TregはTIM-3に関与し、TIM-3/CEACAM-1共阻害軸によるエフェクタT細胞の消耗又はアポトーシスを誘発するリガンドであるガレクチン-9を発現する。PD-L1によるPD-1の係合はTregを誘導及び維持するためにFOXP3のTGFβ誘導発現を促進し、T細胞枯渇及び死亡を誘導するためにTIM-3/CEACAM-1シグナル伝達と協働する。a‐PDL1‐TIM3ecdとa‐PD1‐TIM3ecdはPD‐1/PD‐L1シグナル伝達を無効にし、同時にTIM‐3とCEACAM‐1共阻害経路を含むシス/トランス相互作用を破壊するa-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdが同時にPD-L1/PD-1及びTIM-3/CEACAM-1共阻害軸を介してT細胞の多重抑制に対抗するメカニズムの模式図。a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdはPD-L1/PD-1 相互作用を中断し、同時に、(i)異種TIM-3/CEACAM-1 相互作用(cis CEACAM-1/TIM-3ヘテロ二量体化;TIM-3によるトランスCEACAM1ヘテロ二量体化);(ii)同種CEACAM-1/CEACAM-1 相互作用(cis CEACAM-1二量化;トランスCEACAM1誘導シスCEACAM-1 二量化)を破壊する。
【０１８９】
図3.a-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecdの特性及び標的結合能。(A)a‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PD1抗体(ニボルマブ)の全長(FL)、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を比較するために、低減(R)及び非低減(NR)条件下のSDS‐PAGEを用いた。SDS-PAGEは、a-PD1抗体の重鎖と比較して、a-PD1-TIM3ecdの重鎖の予想されるより高い分子量を確認した(上図)。a‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PDL1抗体(アテゾリズマブ)の全長(FL)、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)を比較するために、低減(R)及び非低減(NR)条件下のSDS‐PAGEを用いた。SDS-PAGEは、a-PDL1抗体の重鎖と比較して、a-PDL1-TIM3ecdの重鎖の予想されるより高い分子量を確認した(下図)。(B)a-PD1-TIM3のrhPD-1への結合を示すELISA(上のパネル):ビオチン化rhPD-1(0〜250ng/ml)を、a-PD1-TIM3ecd(1μg/ml)でコーティングしたプレートに添加した。a-PDL1-TIM3のrhPD-L1への結合を示すELISA(下図):ビオチン化rhPD-L1(0〜250ng/ml)を、a-PDL1-TIM3(1μg/ml)又はa-PDL1抗体(アテゾリズマブ)(ポジティブ・コントロール)のいずれかでコーティングしたプレートに添加した。(C)a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdはin vitroで組換えヒト(rh)CEACAM-1に結合する。CEACAM-1(5μg)をa-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-gp120-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa-PD1 mAb(ニボルマブ)(それぞれ10μg)の存在下又は非存在下でインキュベートし(一晩、4o C)、続いてタンパク質A-アガロースビーズ(10μl)と6時間インキュベートし、次いでタンパク質A-アガロースビーズで免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。免疫ブロット分析ではa‐PD1‐TIM3ecd、a‐PDL1‐TIM3ecd、及びa‐gp120‐TIM3ecdタンパク質Aプルダウン免疫沈降物中にrhCEACAM‐1を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)の免疫沈降物中には検出しなかった。(D)a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdは、共刺激ヒトT細胞上でCEACAM-1に結合する。ヒトPBMCを、a‐PD1‐TIM3ecd、a‐PDL1‐TIM3ecd、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)、又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)の存在下、抗CD3/抗CD28 ビーズと6日間共刺激した。細胞溶解物を、タンパク質A-アガロースビーズ(10■l)で6時間免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。CEACAM‐1抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A‐免疫沈降物においてCEACAM‐1を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物においては検出しなかった。TIM‐3ecd抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A免疫沈降物中のa‐PD1‐TIM3ecd又はa‐PDL1‐TIM3ecdの重鎖を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物中では検出しなかった。
【０１９０】
図4.a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdは、a-PD-1 mAb又はa-PD-L1 mAbよりも、IFNγ式の促進及び共刺激T細胞の消耗の抑制において有意に効果的である。(A)ヒトPBMCを、a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組合せ(それぞれ5μg/ml)の存在下又は非存在下で、抗CD3/抗CD28 ビーズ(5■l/ml)及びrhIL-2で3〜9日間刺激した。示された各時間(3d、6d、及び9d)での電池上澄み液中のインターフェロンγ(IFN-γ)をELISAによって定量した(データーは、各群について3回のインビトロ複製物の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。ELISAはa-PDL1-TIM3ecdとa-PD1-TIM3ecdがa-PDL1(アテゾリズマブ)、a-TIM3 Ab、あるいはa-PD1 mAbとa-TIM3 Abのいずれよりも、IFNγの式を促進し、体外での共刺激T細胞の枯渇を相殺する上で有意に効果的であることを示した。抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2により、a-PD1-PDL1-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はそれぞれ16h又は40hについてa-PD1 mAbとa-TIM3 Ab(5μg/ml)の組み合わせで刺激され、細胞上澄み液におけるIFN-γはELISA(in vitro replace/groupの平均±SEM)によって定量化された。a-PDL1-TIM3ecdはa-PDL1(アテゾリズマブ)、a-PD-1(ペムブロリズマブ)、a-TIM3 Ab、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組合せのいずれかと比較して、インビトロで共刺激されたT細胞によるIFNγ発現を促進するのに有意に効果的である[データは抗体を用いない共刺激と比較して、それぞれの抗体処理群におけるIFNγ発現の倍数変化を表す]。(C)a-PD1-TIM3ecdは、共刺激T細胞におけるIFNγ式のTGFβ媒介抑制を妨げる。ヒトPBMCを、a‐PDL1‐TIM3(5μg/ml)の有無にかかわらず、rhTGFβ1(5ng/ml)の存在下又は非存在下で、抗CD3/抗CD28及びrhIL‐2で16時間又は40時間刺激し、電池上澄み液中のインターフェロン‐γ(IFN‐γ)をELISAにより定量した(データーはそれぞれの群について3回のインビトロ複製の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。
【０１９１】
図5.a-PD1-TIM3ecdは、a-PD-1、a-TIM-3又はa-TIM-3とa-PD1の併用よりも効果的に腫瘍増殖を阻害する。(A)NSGマウス(NOD/Shi-scid IL-2rgnull)(4-8週間)を、以下の特定の処置: a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組み合わせ、又は乗り物単独の存在下で、8日間(それぞれ5■g/ml)、抗CD3/抗CD28 ビーズ(5■l/ml)及びrhIL-2で共刺激した3×106ヒト末梢血単核細胞(PBMC)の養子移植で再構成した。再構成マウスに、2×106D-MUT1ヒト結腸直腸がん細胞を皮下注射し、それぞれの群に、養子移入に使用したPBMCのインビトロ処理に使用したのと同じ処理をインビボ(5mg/kg i.p.5日毎)で処理した: a-PD1-TIM3ecd; a-PD1(ニボルマブ);a-TIM-3(F38-2E2); a-PD1とa-TIM-3の組合せ; 乗り物単独(未処理対照)[>=5マウス/群]。腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの片側t検定)は、a-PD1-TIM3ecdと各他の処置群との間の有意差を示す。(B)免疫欠損NSGマウス(NOD/Shi‐scid IL‐2rgnull)(4‐8週間)を200cGyで照射し、HLA A2適合ヒトCD34+.造血細胞の養子移入により免疫再構成した。再構成ヒト化マウスに、ヒト三重陰性乳がん(TNBC)HLA A2+ 腫瘍細胞(MDA‐MB‐231‐Luc)(マトリゲル中1x106;乳房脂肪体)を皮下注射した。腫瘍接種後3日目に、マウスを無作為化し、乗り物単独(未処理対照)又は以下の抗体(週1回腹腔内5mg/kg): a-PD1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD1 mAb及びa-TIM3 Abの組合せ[>=5マウス/基]のいずれかで処置した。腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの片側t検定)は、a-PD1-TIM3ecdと各他の処置群との間の有意差を示す。
【０１９２】
図6.a-PDL1-TIM3ecdは、a-PD-L1、a-PD-1、a-TIM-3又はa-PD-L1とa-TIM-3の併用よりも効果的に腫瘍増殖を阻害する。免疫欠損NSGマウス(NOD/Shi‐scid IL‐2rg null)(4〜8週)を200cGyで照射し、HLA A2ヒトCD34+.hematopoietic細胞の養子移入により免疫再構築した。再構成ヒト化マウスにヒトトリプルネガティブ乳がん(TNBC)HLA A2+ 腫瘍細胞(MDA‐MB‐231‐Luc)(マトリゲルの1x106;乳腺脂肪体)を皮下注射した。腫瘍接種後3日目に、マウスを無作為化し、乗り物単独(未処理対照)又は以下の抗体(5mg/kg i.pweekly):a-PDL1-TIM3ecd、a-PD1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ペムブロリズマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、a-PD-L1 mAb及びa-TIM3 Abの組合せ[>=5マウス/基]のいずれかで処置した。(A)腫瘍サイズを、処置群に対して盲検で測定し、そして腫瘍体積を、式(長さ×幅×高さ)を使用して計算した。インビボ腫瘍増殖曲線(平均+ SEM)を示す。p値は、不対の両側t検定を用いて導出された。p値(p<0.02、スチューデントの対応のないt検定)は、a-PDL1-TIM3ecdとお互いの処置群との間の有意差を示す。(B)未処置対照又は腫瘍細胞接種後7及び27日目の示された処置群における原発腫瘍の生物発光アッセイ(C)腫瘍におけるT細胞密度の定量:腫瘍体積及びフローサイトメトリーを用いて、腫瘍31mm当たりのCD4+及びCD8+ T細胞の絶対数を評価した。
【０１９３】
図7.標的エピトープに結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びPD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、PD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。(A)ターゲティング抗体を含む本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計であって、抗体の重鎖がリンカーを介してTIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)にC末端で融合され、抗体の軽鎖がリンカーを介してPD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)にC末端で融合される、概略設計。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。(B)本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図設計は標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してPD-1のリガンド結合外部ドメイン配列(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合外部ドメイン配列(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、VドメインIg抑制因子(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒化因子(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、形質転換成長因子βレセプター(TGF-β)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、IL6R、IL17R、IL-6、IL-23CD39、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、上皮増殖因子レセプター(EGFR、EGFR1)ErbB-1、HER1、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKリガンド(RANKL)、RANK、gp120。
【０１９４】
図8.設計8.CTLA-4に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、PD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4(抗原結合CDRを介して)に結合し、PD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。(A)CTLA-4に結合する標的化抗体を含む、本発明の多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計であって、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 207)を介してTIM-3のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 208)を介してPD-1のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。(B)CTLA-4に結合する標的化抗体を含む本多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略デザインであって、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してPD-1 配列番号(SEQ ID NO):205のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3のリガンド結合外部ドメイン配列(配列番号(SEQ ID NO): 206)にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。
【０１９５】
図9.標的エピトープに結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合性IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGF-RIIのリガンド結合性エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、TGFβ(TGFβRIIecdを介して)及びTIM-3 リガンド(CEACAM-1)(TIM-3ecdを介して)に結合することができる。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは、リンカーペプチド(配列番号(SEQ ID NO): 6)を介してTGFβRII(TGFβRIIecd)のリガンド結合外部ドメイン配列に抗体の重鎖がC末端で融合され、リンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列に抗体の軽鎖がC末端で融合される標的化抗体を含む。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、プログラムされた死リガンド(PD-L1)、プログラムされた死リガンド(PD-L2)、B7-H3(CD276)、T細胞活性化のVドメインIgサプレッサー(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒剤(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)IL23R、IL-6、IL-17、CD39、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25CD3、上皮成長因子レセプター(EGFR、EGFR1、ErbB-1、HER1)、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮成長因子(VEGF)、VEGFR(VEGFR1、VEGFR2)、RANKリガンド(RANKL)、RANK。
【０１９６】
図10.TIM-3(TIM-3ecd)のT細胞阻害レセプター又はリガンド、リガンド結合性IgVエクトドメイン配列、及びTGFβRII(TGFβRIIecd)のリガンド結合性エクトドメイン配列に結合する標的化抗体を含む、本多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略デザイン。(A)PD-1に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはPD-1に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 273に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 274に対応する軽鎖とを含む。別の実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 277に対応する重鎖及び配列番号(SEQ ID NO): 278に対応する軽鎖を含む。(B)PD-L1に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはPD-L1に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合される。一つの態様において、リンカーは、(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 285に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 285に対応する軽鎖とを含む。別の実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 281に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 282に対応する軽鎖とを含む。(C)CTLA-4に結合するターゲティング抗体、TIM-3のリガンド結合IgVエクトドメイン配列(TIM-3ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの模式図。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してTIM-3(TIM-3ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 2)のリガンド結合IgV外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 203に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 204に対応する軽鎖とを含む。
【０１９７】
図11.標的エピトープに結合するターゲティング抗体、PD-1のリガンド結合エクトドメイン配列(PD-1ecd)、及びTGFβRIIのリガンド結合エクトドメイン配列(TGFβRIIecd)を含む多機能性の抗体−リガンド・トラップの概略設計。多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的エピトープ(抗原結合CDRを介して)に結合し、TGFβ(TGFβRIIecdを介して)及びPD-1 リガンド、PD-L1及びPD-L2(PD-1ecdを介して)に結合することができる。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 6)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してPD-1(PD1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 7)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。種々の実施形態において、本発明の多機能性抗体−リガンド・トラップの標的化抗体は、以下の分子のうちの1つを結合する:細胞傷害性Tリンパ球関連抗原-4(CTLA-4、CD152)、T細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有-3(TIM-3)、CEACAM-1、がん胎児性抗原(CEA)、VドメインIg抑制因子(VISTA)、VSIG8、B及びTリンパ球弱毒化因子(BTLA)、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター(HVEM)、CD160、T細胞Ig及びITMドメイン(TIGIT)、CD226、リンパ球活性化遺伝子-3(LAG-3)、4-1BB(CD137)、誘導性T細胞Costimulator(ICOS)、OX-40(CD134)、グルココルチコイド誘導性TNFR関連タンパク質(GITR)、IL6R、IL17R、IL-6IL-23、CD39、CCR4、CCR5、CXCR4、IL12R、CD4、CD25、CD3、上皮増殖因子レセプター(EGFR)、 EGFR1、ErbB-1、HER1、ErbB-2(HER2/neu)、ErbB-3/HER3、ErbB-4/HER4、EGFRリガンド、血管内皮増殖因子(VEGF)、VEGFR、RANKリガンド(RANKL)、RANK。
【０１９８】
図12.種々の実施形態において、本多機能性の抗体−リガンド・トラップは、PD-1(PD-1ecd)のT細胞阻害レセプター又はリガンド、リガンド結合外部ドメイン配列、及びTGFβRII(TGFβRIIecd)のリガンド結合外部ドメイン配列に結合する標的化抗体を含む。ある実施形態に、本多機能性の抗体−リガンド・トラップはCTLA-4に結合する標的化抗体を含み、ここで、抗体の重鎖はリンカーペプチドを介してTGFβRII(TGFβRIIecd)(配列番号(SEQ ID NO): 203)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合され、そして抗体の軽鎖はリンカーペプチドを介してPD-1(PD-1ecd: 配列番号(SEQ ID NO): 202)のリガンド結合外部ドメイン配列にC末端で融合される。一態様では、リンカーが(GGGGS)n(配列番号(SEQ ID NO): 3)というペプチドである。一実施形態では、多機能性の抗体−リガンド・トラップが配列番号(SEQ ID NO): 202に対応する重鎖と、配列番号(SEQ ID NO): 203に対応する軽鎖とを含む。
【０１９９】
抗体−リガンド・トラップ(Y-トラップ)の設計及び特徴付け。
【０２００】
抗体重鎖のcDNA及び抗体軽鎖のcDNAを合成し、その後、哺乳動物プロモーター及びポリアデニル化シグナルの制御下で別々のプラスミド(pEvi3;エビトリアAG、スイス)にクローニングした。プラスミドDNAを大腸菌中で増幅し、DNAを、低エンドトキシンプラスミドDNA調製のための陰イオン交換キットを用いて精製した。DNA濃度は、260nmの波長での吸収を測定することによって決定した。シークエンスの正確性はサンガー・アレンシング(cDNAの大きさに応じて遺伝子あたり最大2個の配列決定反応)によって検証され、その後、ヘビー及び軽鎖用の遺伝子DNAは懸濁適応CHO K1電池(最初はATCCから受領し、evitriaでの休止栽培における無血清の生育に適応された)に共トランスフェクトされた。種結晶を、化学的に定義された動物成分を含まない無血清培地であるeviGrow培地中で増殖させた。電池をeviFect(evitria AG、Switzerland)でトランスフェクトした。CHO細胞を、無血清動物成分非含有培地であるeviMake2(evitria AG、Switzerland)中で培養した。生存率が75%に達したら生産を終了し、これはトランスフェクション後8日目に起こった。上澄み液を遠心分離及びその後のろ過(0.2 umフィルター)によって回収した。MabSelect登録商標 Sure登録商標を用いて精製した。CHO-K1細胞上澄み液からの精製抗体のタンパク質同定を、重鎖(HC)及び軽鎖(LC)のアミノ酸配列を確認するために、液体クロマトグラフィーFTFTタンデムマススペクトロメトリー(LCMS/MS)によって行った(例えば、図2Aa-PDL1-TIM3ecd及びa-PD1-TIM3ecd)。還元及び非還元条件下でのSDS-PAGEを使用して、抗体−リガンド・トラップ及びそれらの対応する親抗体の全長、重鎖及び軽鎖を比較した(例えば、非特許文献1)。図3A。a-PDL1-TIM3ecd、a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1 mAb(アテゾリズマブ)及びa-PD1 mAb(ニボルマブ)。
【０２０１】
抗体−リガンド・トラップの標的結合能。
【０２０２】
(i)PD-1 リガンドへの結合(ELISA):ビオチン化rhPD-L1(0〜250ng/ml)を、抗体−リガンド・トラップ(1μg/ml)又はa-PDL1抗体(アテゾリズマブ)(ポジティブ・コントロール)(1μg/ml)のいずれかでコーティングしたELISAプレートに添加し、HRP-アビジン(R & Dシステム)によって検出した。各実験は、示された各条件について3連のウェルを用いて2回行った。a-PDL1-TIM3(1μg/ml)又はa-PDL1抗体(アテゾリズマブ)(ポジティブ・コントロール)(1μg/ml)のrhPD-L1結合能を示すELISAを図3Aに示す。このアッセイはまた、PD-1エクトドメイン(PD-1ecd)のビオチン化rhPD-L1及びrhPD-L2へのリガンド結合配列を含む任意の抗体−リガンド・トラップの結合を評価するためにも使用される。
【０２０３】
(ii)PD-1への結合(ELISA):ビオチン化rhPD-1(0〜250ng/ml)を、抗体−リガンド・トラップ(1μg/ml)又はa-PD1抗体(ニボルマブ又はペムブロリズマブ)(ポジティブ・コントロール)(1μg/ml)のいずれかでコーティングしたプレートに添加し、HRP-アビジン(R & Dシステム)によって検出した。各実験は、示された各条件について3連のウェルを用いて2回行った。a-PD1-TIM3ecdのrhPD-1への結合を示すELISAを図3Aに示す。このアッセイはまた、PD-1標的化抗体を含む任意の抗体−リガンド・トラップの結合を評価するためにも使用される。
【０２０４】
(iii)インビトロでのTIM-3 リガンド/co-阻害レセプター(CEACAM-1)への結合。CEACAM-1(5μg)を、TIM-3エクトドメイン(TIM3ecd)(抗体-TIM3ecd)又はa-gp120-TIM3ecd(ポジティブ・コントロール)(それぞれ10μg)のリガンド結合配列を含む抗体−リガンド・トラップの有無下で(一晩、4oC)インキュベートし、続いてタンパク質A-アガロースビーズ(10μl)と6時間インキュベートし、次いでタンパク質A-アガロースビーズで免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。in vitroでの組換えヒト(rh)CEACAM-1へのa-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdの結合を図2Cに示す。免疫ブロット分析ではa-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、及びa-gp120-TIM3ecdタンパク質A-プルダウン免疫沈降物中にrhCEACAM-1が検出されたが、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa-PD1 mAb(ニボルマブ)の免疫沈降物中には検出されなかった(図2C)。このアッセイはまた、TIM-3 ecodonomain(TIM-3ecd)のリガンド結合配列のリガンド結合配列からなる任意の抗体−リガンド・トラップの、rh ACAM-1 への結合を評価するために使用される。
【０２０５】
(iv)共刺激ヒトT細胞上のTIM-3 リガンド/co-阻害レセプター(CEACAM-1)への結合。ヒトPBMCを、TIM3ecd(抗体‐TIM3ecd)又はa‐gp120‐TIM3ecd(ポジティブ・コントロール)(それぞれ10μg)のリガンド結合配列を含む抗体−リガンド・トラップの有無下で、6日間、免疫培養培地(STEMCELL技術)中で抗CD3/抗CD28 ビーズと共刺激した。細胞溶解物をタンパク質A-アガロースビーズ(10μL)で6時間免疫沈降させた。沈殿した錯体を免疫沈降バッファーで洗浄し、還元剤を含むNuPAGEサンプルバッファーに再懸濁し、煮沸し、Bis-Tris Criterion XTゲル系で分離し、PVDFメンブランに移した。メンブランを一次抗体[CEACAM1(D1P4T); TIM3(D5D5R(商標))]で一晩イムノブロットし、洗浄し、二次抗体と共にインキュベートし、アマーシャムECLウェスタンブロット検出試薬によって可視化した。a-PD1-TIM3ecd及びa-PDL1-TIM3ecdのCEACAM-1への共刺激ヒトT細胞への結合を図2Dに示す。CEACAM‐1抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A‐免疫沈降物においてCEACAM‐1を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物においては検出しなかった。TIM‐3ecd抗体を用いた免疫ブロット分析はa‐PD1‐TIM3ecd及びa‐PDL1‐TIM3ecd処理細胞溶解物のタンパク質A免疫沈降物中のa‐PD1‐TIM3ecd又はa‐PDL1‐TIM3ecdの重鎖を検出したが、a‐PD‐L1 mAb(アテゾリズマブ)又はa‐PD1 mAb(ニボルマブ)処理細胞溶解物の免疫沈降物中では検出しなかった。このアッセイはまた、共刺激されたヒトT細胞上のCEACAM-1へのTIM-3外部ドメイン(TIM-3ecd)のリガンド結合配列を含む任意の抗体−リガンド・トラップの結合を評価するために使用される。
【０２０６】
(v)TGFβへの結合(ELISA)。TGFβRII外部ドメイン(TGFβRII)(抗体‐TGFβRIIecd)のリガンド結合配列を含む抗体−リガンド・トラップのTGFβ結合能をELISAによって評価し、組換えヒトTGFβ(rhTGFβ1;0〜2000pg/ml)を抗体‐TGFβRII(βg/ml)でコーティングしたプレートに添加し、ビオチン化抗TGFβ1及びHRP‐Avidin(R & Dシステム)によって検出した。非特異的IgG-TGFβRII及びrhTGFβRII-Fcでコーティングしたプレートは、試験サンプルのTGFβへの結合能を分析するためのポジティブ・コントロールとして役立った。
【０２０７】
任意の抗体−リガンド・トラップが一次抗体標的に結合し、融合同族レセプター外部ドメイン配列(レセプターecd)によって標的化されたリガンドを捕捉する多機能性を評価するために、標準ELISAを使用する。それぞれのケースにおいて、ELISAプレートを抗体−リガンド・トラップ(1μg/ml)でコーティングし、続いてビオチン化標的分子(0〜1000ng/ml)を加え、HRP-アビジン(R & Dシステム)で検知する。
【０２０８】
抗体−リガンド・トラップがIFNγ発現を促進し、共刺激T細胞の消耗を妨げる能力:
【０２０９】
(A)ヒトPBMCを、a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組合せ(それぞれ5g/ml)の存在下又は非存在下で、抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2で3〜9日間刺激した。示された各時間(3d、6d、及び9d)での電池上澄み液中のインターフェロンγ(IFN-γ)をELISAによって定量した(データーは、各群について3回のインビトロ複製物の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。ELISAは、a‐PDL1‐TIM3ecd及びa‐PD1‐TIM3ecdがa‐PDL1(アテゾリズマブ)、a‐PD‐1(ペムブロリズマブ)、a‐TIM3 Ab、又はa‐PD1 mAbとa‐TIM3 Abの組合せのいずれかと比較して、インビトロでIFNγ発現を促進し、共刺激T細胞の枯渇を抑制するのに有意に効果的であることを示した。
【０２１０】
(B)a-PD1-TIM3ecd、a-PDL1-TIM3ecd、a-PD-L1 mAb(アテゾリズマブ)、a-PD1 mAb(ニボルマブ)、a-ヒトTIM3 Ab(F38-2E2)、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの併用(それぞれ5μg/ml)の存在下又は非存在下で、ヒトPBMCを抗CD3/抗CD28 ビーズ(5μl/ml)及びrhIL-2で16時間又は40時間刺激し、電池上澄み液中のIFN-γをELISA(3インビトロ複製物/群の平均±SEM)により定量した。a-PDL1-TIM3ecdはa-PDL1(アテゾリズマブ)、a-PD-1(ペムブロリズマブ)、a-TIM3 Ab、又はa-PD1 mAbとa-TIM3 Abの組合せのいずれかと比較して、インビトロで共刺激されたT細胞によるIFNγ発現を促進するのに有意に効果的である[データーは抗体なしの共刺激と比較して、それぞれの抗体処理群におけるIFNγ発現の倍数変化を表す]。
【０２１１】
(C)a-PD1-TIM3ecdは、共刺激T細胞におけるIFNγ式のTGFβ媒介抑制を妨げる。ヒトPBMCを、a‐PDL1‐TIM3(5μg/ml)の有無にかかわらず、rhTGFβ1(5ng/ml)の存在下又は非存在下で、抗CD3/抗CD28及びrhIL‐2で16時間又は40時間刺激し、電池上澄み液中のインターフェロン‐γ(IFN‐γ)をELISAにより定量した(データーはそれぞれの群について3回のインビトロ複製の平均± 走査型電子顕微鏡を表す)。
【０２１２】
ヒト腫瘍異種移植片を有するヒト化マウスの処置。免疫不全NSGマウス(NOD/Shi‐scid IL‐2rg null)(4〜8週齢)を、正常ドナー由来のヒト末梢血単核細胞(PBMC)又はヒト骨髄CD34+細胞の養子移植で再構成した。ヒト化マウスにヒト腫瘍細胞を接種した。腫よう接種後、マウスを盲検ブロックランダム化を用いて基に割り付け、乗り物単独(未処理対照)又は以下の抗体:a‐PDL1‐TIM3ecd; a‐PDL1‐TIM3ecd, a‐PDL1(アテゾリズマブ);a‐TIM‐3; a‐PD‐1(ペムブロリズマブ);a‐PDL1とa‐TIM‐3の組み合わせ;a‐PDL1とa‐TIM‐3の組み合わせで処置した(5mg/kg腹腔内)。
【０２１３】
原発腫瘍の生物発光イメージング。MDA-MB-231-Lucを有するマウスにおける腫瘍負荷を、Xenogen IVIS Spectrumシステムを用いたインビボルシフェラーゼ活性の可視化によって評価した。画像は、50mg/kgのルシフェリンの腹腔内投与の注射の10分後に取得した。転移を検出するために、原発腫瘍からの生物発光を最小限にするために、再画像化の前に、各動物の下部を遮蔽した。肺を採取し、ex vivoで画像化して、in vivo観察を確認した。光子束を用いて、処置群間の腫瘍負荷の差を定量化した。
【０２１４】
治療効果の評価:腫瘍サイズを6週間毎週測定し[長さ、幅、高さ]、腫瘍体積を計算した。腫瘍増殖阻害(%TGI)値を、式: %TGI =[1-(Tf-Ti)/(Cf-Ci)]×100によって、処置群(T)及び未処置対照群(C)についての初期(i)及び最終(f)腫瘍体積を使用して計算した。
【０２１５】
T細胞の免疫表現型解析フローサイトメトリー:
以下のように、T細胞の免疫表現型解析のために、腫瘍、排出リンパ節(DLN)、及び骨髄(BM)を、未処理の対照群及び処置群(治療の終わりに)のマウスから採取した:(a)調節性T細胞:それぞれの群のマウスから単離された腫瘍浸潤、DLN、又はBM T細胞におけるTregを、フローサイトメトリーによって測定した。電池を抗ヒトCD4-PE、抗ヒトCD25-PEOB5、及び抗ヒトCD127-FITC(BD Biosciences)で電池外染色した。次に、電池を透過性にし、抗ヒトFOXP3-APC又は対応するアイソタイプ対照IgG1-APC(eBioscience)で電池内染色し、次にフローサイトメトリーにより分析してTreg(CD4+ CD25+CD127low FOXP3+電池)を定量した。(b)メモリT細胞:中央メモリ(CD45RO+ CD62L+)又はエフェクタメモリ(CD45RO+ CD62L-)免疫表現型を有するCD8+及びCD4+ T細胞を、それぞれの群のマウスから単離したBM、DLN及び腫瘍浸潤T細胞において測定した。細胞を抗ヒトCD4‐PE、抗ヒトCD8‐PEOOB7、抗ヒトCD45RO‐APC、及び抗ヒトCD62L‐FITC(BDバイオサイエンス)で染色し、中央記憶表現型(CD45RO high CD62Lhigh)を有するT細胞を定量するためにフローサイトメトリーにより分析した。(c)IFNγを発現する腫瘍反応性CD4+及びCD8+T細胞:in T細胞で腫瘍特異的IFNγ発現を評価するために、DLN又はBM細胞を腫瘍細胞溶解物、非特異的対照ペプチド、又は培地の存在下でプレート(2x105細胞/ウェル)した。電池を72時間培養した後、ゴルジストップと共に4時間インキュベートした。細胞を抗CD4-FITC及び抗CD8-APC抗体で細胞外染色し、透過性化し、抗CD4-FITC及び抗CD8-APC抗体で細胞外染色した抗IFNγで細胞内染色し、原発腫瘍における透過(d)T細胞密度:腫瘍体積を計算し、フローサイトメトリーを用いて腫瘍31mm当たりのCD4+及びCD8+ T細胞の絶対数を計算した。
【０２１６】
TMEにおける免疫阻害レセプター/リガンドの評価:
未処置対照群及び処置群(処置の最後)のマウスからの腫瘍を、T細胞活性化を阻害するか、又はT細胞消耗を誘導する以下の免疫レセプター/リガンドの発現について分析した:(a)腫瘍浸潤T細胞、DLN T細胞、及び腫瘍細胞上でのPD-1及びPD-L1の発現:細胞を、抗ヒトCD4-APC、CD8-FITC、並びに抗ヒトPD-1-PE又はPD-L1-PEのいずれかで染色し、PD-1又はPD-L1を発現するT細胞及びPD-L1を発現する腫瘍細胞の平均百分率を、フローサイトメトリーによって定量した。腫瘍におけるPD-L1式のレベルもまた、IHCによって評価した。(b)  腫瘍浸潤T細胞、DLN T細胞及び腫瘍細胞におけるTIM‐3及びTIM‐3 リガンド(ガレクチン‐9及びCEACAM‐1)の式:細胞を抗ヒトCD4‐APC、CD8‐FITC、及び抗ヒトTIM‐3‐PE、ガレクチン‐9‐PE、又はCEACAM‐1‐PE(BD Biosciences)で染色し、TIM‐3及び腫瘍細胞式Galctin‐9又はCEACAM‐1を式するT細胞の平均百分率をフローサイトメトリーにより定量した。(c)   TGFβββ信号:T細胞の免疫ブロット分析-Smad-2/3/4発現及び活性(リン酸化)。
【０２１７】
TILにおける免疫不全のシグネチャの評価(Tregの上昇及び/又はT細胞枯渇)。RNAを腫瘍(全ての処置群及び対照群から)から抽出し、RNA-Seqを行った(品質チェック、ライブラリー調製、配列決定及びデータ処理を含む)。ばらばらのRNA-Seqデータには、がんシングルセル-RNA配列決定データからのセルタイプ固有の参照遺伝子表現輪郭(RGEP)を用いて、数学的デコンボリューションが適用される。デコンボリューションはナイーブ様、調節性、細胞傷害性、及び枯渇した4つのT細胞サブタイプの注釈付けを容易にする差次的に発現された遺伝子の集合を使用して実施され、各サブタイプの推定比率は各105について計算される。この手法は、T細胞マーカーの差次的発現に基づいて、4つの異なるT細胞サブタイプ(CD4+ T H1細胞、CD4+ Treg、CD8+細胞傷害性T細胞、及びCD8+枯渇T細胞)の相対的指標を評価するために使用される。以下の比率は、CD4+又はCD8+ TILの様々なサブセットを有する腫瘍の相対的浸透の数値的な代理として役立つ:(i)Treg/T H1及び(ii)枯渇したCD8+ T細胞/細胞傷害性CD8+ T細胞。同時に、T H1細胞を特徴付ける特異的マーカー(TBET、IFNγ細胞(TBET、IFNed CD8+ T細胞/細胞傷害性CD8+ T細胞)の式を平行なマルチプレックスRT-PCR反応(QuantiTect、Qiagen)で測定し、以下の比率を計算する:(i)Treg/T H1 = FOXP3/TBET又はCTLA-4/IFN;(ii)枯渇T細胞/細胞傷害性T細胞=(TIM3 + PD-1)/GZMB。免疫阻害リガンドの発現を評価するためにも、RNA-Seqデータが用いられる。
【０２１８】
上記の実施例に関連して本発明が説明されたが、修飾及びバリエーションが、本発明の本旨及び範囲に包含されることが理解されるのであろう。従って、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ制限される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２９Ａ】
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【図３０Ａ】
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【図３２Ａ】
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【図３３Ａ】
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【図３４Ａ】
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【図３５Ａ】
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【図３７Ａ】
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【図４２Ａ】
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【図４５Ａ】
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【図５２Ａ】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６Ａ】
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【図５６Ｂ】
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【図５７Ａ】
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【図５８Ａ】
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【図５８Ｂ】
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【図５９Ａ】
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【図５９Ｃ】
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【図６１Ａ】
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【図６２Ａ】
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【図６２Ｂ】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６５Ａ】
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【図６７Ａ】
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【図７４Ａ】
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【図７６Ａ】
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【図１０９】
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【図１２１Ａ】
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【図１２３Ａ】
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【図１２４Ａ】
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【図１２５Ａ】
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【図１２７Ｂ】
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【図１２８Ａ】
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【図１２９Ａ】
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【図１２９Ｂ】
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【図１３０Ａ】
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【図１３４Ｂ】
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【図１３５Ａ】
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【図１３５Ｂ】
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【図１３６Ａ】
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【図１３６Ｂ】
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【図１３７Ａ】
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【図１３７Ｂ】
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【図１３８Ａ】
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【図１３８Ｂ】
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【図１３９Ａ−Ｂ】
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【図１４０Ａ】
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【図１４０Ｂ】
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【図１４１Ａ】
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【図１４１Ｂ】
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【図１４２Ａ】
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【図１４２Ｂ】
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【図１４３Ａ】
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【図１４３Ｂ】
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【図１４４Ａ】
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【図１４４Ｂ】
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【図１４５Ａ】
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【図１４５Ｂ】
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【図１４６Ａ】
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【図１４６Ｂ】
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【図１４７Ａ】
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【図１４７Ｂ】
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【図１４８Ａ】
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【図１４８Ｂ】
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【図１４９Ａ】
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【図１４９Ｂ】
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【図１５０Ａ】
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【図１５０Ｂ】
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【図１５１Ａ】
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【図１５１Ｂ】
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【図１５２Ａ】
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【図１５２Ｂ】
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【図１５３Ａ】
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【図１５３Ｂ】
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【図１５４】
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【図１５５Ａ】
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【図１５５Ｂ】
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【図１５６Ａ】
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【図１５６Ｂ】
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【図１５７Ａ】
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【図１５７Ｂ】
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【図１５８Ａ】
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【図１５８Ｂ】
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【図１５９Ａ】
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【図１５９Ｂ】
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【図１６０】
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【図１６１】
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【図１６２】
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【図１６３】
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【図１６４】
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【図１６５】
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【図１６６】
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【図１６７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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