(57)【要約】  本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子を発現しないが、膜結合型ＩＬ−１５、膜結合型４−１ＢＢＬリガンド、及びインターロイキン又は抗ＣＤ３抗体などの少なくとも１つの他の膜結合分子を発現するように改変された、不死化／癌細胞に由来する遺伝子操作された細胞集団に関連する。前記細胞と免疫細胞との共培養により、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大が引き起こされる。混合細胞株と刺激細胞株との共培養に由来する拡大されたＮＫ細胞集団は、癌又は感染症の治療方法に使用することができる。別の実施形態においては、操作された細胞集団の調製に使用するための複数の核酸が提供される。
2020516238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を発現しない、遺伝子操作された細胞集団であって、
前記操作された細胞集団が、不死化細胞に由来し、
前記操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、免疫細胞の活性化を刺激する、少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＩＣ）Ｉ分子を発現せず、及び
前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、結果として少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こす、操作された細胞集団。
【請求項２】
前記ｍｂＩＬ１５が、配列番号１を含む核酸配列にコードされる、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項３】
前記４−１ＢＢＬが、配列番号１３を含む核酸配列にコードされる、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項４】
各々の前記膜結合型分子が、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインに結合する、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項５】
前記ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインが、配列番号１８の配列を含む、請求項４に記載の操作された細胞集団。
【請求項６】
前記操作された細胞集団が、Ｋ５６２細胞、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０又はＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９又はＮＢ６９、胎児性精巣癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、及び神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１からなる群から選択される細胞株に由来する、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項７】
前記操作された細胞集団が、ＭＨＣＩＩ分子の発現を欠く、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項８】
前記操作された細胞集団が、Ｋ５６２細胞に由来する、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項９】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ａ、又はその断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項１０】
前記ＩＬ１２Ａが、配列番号４の配列を含む、請求項９に記載の操作された細胞集団。
【請求項１１】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項１２】
前記ＩＬ１２Ｂが、配列番号６の配列を含む、請求項１１に記載の操作された細胞集団。
【請求項１３】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項１４】
前記操作された細胞集団が、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８）、又はその断片をさらに発現する、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項１５】
前記ＩＬ１８が、配列番号８の配列を含む、請求項１４に記載の操作された細胞集団。
【請求項１６】
前記操作された細胞集団が、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、又はその断片をさらに発現する、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項１７】
前記ＩＬ２１が、配列番号１０の配列、又はその断片を含む、請求項１６に記載の操作された細胞集団。
【請求項１８】
前記細胞が、膜結合型ＩＬ２２（ｍｂＩＬ２２）、又はその断片を発現する、請求項１に記載の操作された細胞集団。
【請求項１９】
前記ＩＬ２２が、配列番号１２の配列、又はその断片を含む、請求項１８に記載の操作された細胞集団。
【請求項２０】
前記細胞が、膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）、その抗体断片、又はｓｃＦｖをさらに含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項２１】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、モノクローナル抗体である、請求項２０に記載の操作された細胞集団。
【請求項２２】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、配列番号１５のＣＤ３イプシロンの核酸配列内のエピトープを標的とする、請求項２１に記載の操作された細胞集団。
【請求項２３】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、ｓｃＦｖである、請求項２０に記載の操作された細胞集団。
【請求項２４】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１７の配列を含む、請求項２３に記載の操作された細胞集団。
【請求項２５】
免疫細胞を含む血液試料を、請求項１から２４のいずれか一項に記載の操作された細胞集団とともに共培養する工程を含む、免疫細胞を拡大させる方法。
【請求項２６】
前記免疫細胞が、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を発現しない、遺伝子操作された細胞集団であって、
前記操作された細胞集団が、癌細胞に由来し、
前記操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、免疫細胞の活性化を刺激する、少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように改変され、及び
前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こす、操作された細胞集団。
【請求項２８】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ａ、又はその断片を含む、請求項２７に記載の操作された細胞集団。
【請求項２９】
前記ＩＬ１２Ａが、配列番号４の配列を含む、請求項２８に記載の操作された細胞集団。
【請求項３０】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項２８に記載の操作された細胞集団。
【請求項３１】
前記ＩＬ１２Ｂが、配列番号６の配列を含む、請求項３０に記載の操作された細胞集団。
【請求項３２】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項２７に記載の操作された細胞集団。
【請求項３３】
前記操作された細胞集団が、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８）、又はその断片をさらに発現する、請求項２７から３２のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項３４】
前記ＩＬ１８が、配列番号８の配列を含む、請求項３３に記載の操作された細胞集団。
【請求項３５】
前記操作された細胞集団が、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、又はその断片を発現する、請求項２７から３４のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項３６】
前記ＩＬ２１が、配列番号１０の配列、又はその断片を含む、請求項３５に記載の操作された細胞集団。
【請求項３７】
前記操作された細胞集団が、膜結合型ＩＬ２２（ｍｂＩＬ２２）、又はその断片を発現する、請求項２７から３６のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項３８】
前記ＩＬ２２が、配列番号１２の配列、又はその断片を含む、請求項３７に記載の操作された細胞集団。
【請求項３９】
前記操作された細胞集団が、膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）、その抗体断片、又はｓｃＦｖをさらに含む、請求項２７から３８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項４０】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、モノクローナル抗体である、請求項３９に記載の操作された細胞集団。
【請求項４１】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、配列番号１５のＣＤ３イプシロンの核酸配列内のエピトープを標的とする、請求項３９又は４０に記載の操作された細胞集団。
【請求項４２】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、ｓｃＦｖである、請求項３９に記載の操作された細胞集団。
【請求項４３】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１７の配列を含む、請求項４２に記載の操作された細胞集団。
【請求項４４】
前記操作された細胞集団が、Ｋ５６２細胞、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０又はＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９又はＮＢ６９、胎児性精巣癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、及び神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１からなる群から選択される細胞株に由来する、請求項２７から４３のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項４５】
前記操作された細胞が、ＭＨＣＩＩ分子の発現を欠く、請求項２７から４４のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項４６】
前記操作された細胞が、Ｋ５６２細胞に由来する、請求項４５に記載の操作された細胞集団。
【請求項４７】
各々の前記膜結合型分子が、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインに結合する、請求項２７から４６のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項４８】
前記ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインが、配列番号１８の配列を含む、請求項４７に記載の操作された細胞集団。
【請求項４９】
前記ｍｂＩＬ１５が、配列番号１を含む核酸配列にコードされる、請求項２７から４８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項５０】
前記ｍｂ４−１ＢＢＬが、配列番号１３を含む核酸配列にコードされる、請求項２７から４９のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項５１】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を発現しない、遺伝子操作された細胞集団であって、
前記操作された細胞集団が、癌細胞に由来し、
前記操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、免疫細胞の活性化を刺激する、膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）を発現するように改変され、及び
前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こす、操作された細胞集団。
【請求項５２】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、モノクローナル抗体である、請求項５１に記載の操作された細胞集団。
【請求項５３】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、配列番号１５のＣＤ３イプシロンの核酸配列内のエピトープを標的とする、請求項５１又は５２に記載の操作された細胞集団。
【請求項５４】
前記ｍｂα−ＣＤ３が、ｓｃＦｖである、請求項５１に記載の操作された細胞集団。
【請求項５５】
前記ｓｃＦｖが、配列番号１７の配列を含む、請求項５４に記載の操作された細胞集団。
【請求項５６】
前記細胞が、少なくとも１つの膜結合型インターロイキン、又はその断片をさらに発現する、請求項５１から５５のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項５７】
前記インターロイキンが、ＩＬ１２Ａ、又はその断片を含む、請求項５６に記載の操作された細胞集団。
【請求項５８】
前記ＩＬ１２Ａが、配列番号４の配列を含む、請求項５７に記載の操作された細胞集団。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの膜結合型インターロイキン、又はその断片が、ＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項５６から５８のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６０】
前記ＩＬ１２Ｂが、少なくとも１つの膜結合型インターロイキン、又はその断片の配列番号６の配列である、請求項５９に記載の操作された細胞集団。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの膜結合型インターロイキン、又はその断片が、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む、請求項５６から６０のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６２】
前記細胞が、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８）、又はその断片をさらに発現する、請求項５６から６７のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６３】
前記ＩＬ１８が、配列番号８の配列を含む、請求項６２に記載の操作された細胞集団。
【請求項６４】
前記細胞が、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、又はその断片を発現する、請求項５６から６３のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６５】
前記ＩＬ２１が、配列番号１０の配列、又はその断片を含む、請求項６４に記載の操作された細胞集団。
【請求項６６】
前記細胞が、膜結合型ＩＬ２２（ｍｂＩＬ２２）、又はその断片を発現する、請求項５６から６５のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６７】
前記ＩＬ２２が、配列番号１２の配列、又はその断片を含む、請求項６６に記載の操作された細胞集団。
【請求項６８】
前記操作された細胞が、免疫細胞の拡大に適している、請求項２５から６７のいずれか一項に記載の操作された細胞集団。
【請求項６９】
拡大された免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項６８に記載の操作された細胞集団。
【請求項７０】
ＮＫ細胞を含む試料を、請求項２５から６９のいずれか一項に記載の操作された細胞集団とともに共培養する工程を含む、ＮＫ細胞を拡大させる方法。
【請求項７１】
請求項２５から６９のいずれか一項に記載の操作された細胞集団を調製する方法であって、
前記細胞に、ｍｂＩＬ１５をコードする第１のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第１の形質導入細胞集団を生成する工程、
前記第１の形質導入細胞集団を拡大させる工程、
前記第１の形質導入細胞集団に、４−１ＢＢＬをコードする第２のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第２の形質導入細胞集団を生成する工程、
前記第２の形質導入細胞集団に、免疫細胞を刺激可能な少なくとも１つの追加の分子をコードする第３のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第３の形質導入細胞集団を生成する工程、及び
前記第３の形質導入細胞集団を拡大させる工程、
を含む、方法。
【請求項７２】
請求項２５から６９のいずれか一項に記載の操作された細胞集団の調製に使用するための複数の核酸であって、
ｍｂＩＬ１５をコードする核酸、
４−１ＢＢＬをコードする核酸、
ｍｂＩＬ１２Ａをコードする核酸
ｍｂＩＬ１２Ｂをコードする核酸、
ｍｂＩＬ１８をコードする核酸、
ｍｂＩＬ２１をコードする核酸、
ｍｂＩＬ２２をコードする核酸、及び
ｍｂα−ＣＤ３をコードする核酸、
の少なくとも３つを含む、核酸。
【請求項７３】
前記複数の核酸が、単一のコンストラクトとして設計される、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７４】
ｍｂＩＬ１５が、配列番号１を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７５】
４−１ＢＢＬが、配列番号１３を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７６】
ｍｂＩＬ１２Ａが、配列番号３を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７７】
ｍｂＩＬ１２Ｂが、配列番号５を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７８】
ｍｂＩＬ１８が、配列番号７を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項７９】
ｍｂＩＬ２１が、配列番号９、又はその断片を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項８０】
ｍｂＩＬ２２が、配列番号１１、又はその断片を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項８１】
ｍｂα−ＣＤ３が、配列番号１６を含む核酸配列によりコードされる、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項８２】
各々の前記複数の核酸が、ＧＦＰタグをさらに含む、請求項７２に記載の複数の核酸。
【請求項８３】
ＮＫ細胞を拡大させる方法であって、
ａ）ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む混合免疫細胞集団を含む、末梢血試料を得る工程、
ｂ）混合細胞集団を、ＭＨＣＩの減少した発現を示し、かつ
ｉ）膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）、
ｉｉ）４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、及び、
ｉｉｉ）免疫細胞の活性化を刺激する、少なくとも１つの追加の分子、
を発現するように改変された、操作された細胞集団に接触させる工程、並びに、
ｃ）前記混合細胞集団を、前記操作された細胞とともに、前記混合免疫細胞集団の前記ＮＫ細胞を拡大させるのに十分な期間共培養し、それにより前記ＮＫ細胞を拡大させる工程、
を含む、方法。
【請求項８４】
共培養の前又は後に、前記混合集団からＴ細胞を除去する工程を任意でさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠くＫ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株であって、前記Ｋ５６２骨髄性白血病細胞が、膜結合型インターロイキン−１５、４−１ＢＢリガンド、及び膜結合型抗ＣＤ３抗体を発現するように遺伝子改変された、細胞株。
【請求項８６】
主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠くＫ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株であって、前記Ｋ５６２骨髄性白血病細胞が、膜結合型インターロイキン−１５、膜結合型４−１ＢＢリガンド、及び少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように遺伝子改変された、細胞株。
【請求項８７】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１２である、請求項８６に記載の改変された細胞株。
【請求項８８】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１８である、請求項８６に記載の改変された細胞株。
【請求項８９】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１２及びインターロイキン−１８である、請求項８６に記載の改変された細胞株。
【請求項９０】
膜結合型抗ＣＤ３抗体をさらに含む、請求項８６から８９のいずれか一項に記載の改変された細胞株。
【請求項９１】
ｍｂＩＬ１２Ａ、ｍｂＩＬ１２Ｂ、ｍｂＩＬ１８、ｍｂＩＬ２１、ｍｂＩＬ２２、及びｍｂα−ＣＤ３の１以上をさらに含む、請求項８６から９０のいずれか一項に記載の改変された細胞株。
【請求項９２】
主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠くＫ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株であって、前記Ｋ５６２骨髄性白血病細胞が、膜結合型インターロイキン−１５、膜結合型４−１ＢＢリガンド、膜結合型抗ＣＤ３抗体、及び少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように遺伝子改変された、細胞株。
【請求項９３】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１２である、請求項９２に記載の改変された細胞株。
【請求項９４】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１８である、請求項９２に記載の改変された細胞株。
【請求項９５】
前記発現する追加の膜結合型インターロイキンが、インターロイキン−１２及びインターロイキン−１８である、請求項９２に記載の改変された細胞株。
【請求項９６】
前記少なくとも１つの追加のインターロイキンが、ｍｂＩＬ１２Ａ、ｍｂＩＬ１２Ｂ、ｍｂＩＬ１８、ｍｂＩＬ２１、及びｍｂＩＬ２２の１以上を含む、請求項９２に記載の細胞株。
【請求項９７】
ＮＫ細胞及びＴリンパ球を含む混合細胞培養物を、請求項８５から８６のいずれか一項に記載の改変された細胞株とともに培養することにより拡大した、ＮＫ細胞集団。
【請求項９８】
癌又は感染症の治療のための、請求項９７に記載のＮＫ細胞集団の使用。
【請求項９９】
請求項２５から６９のいずれか一項に記載の操作された細胞集団の、免疫細胞集団の拡大のための使用であって、前記免疫細胞集団が癌又は感染症の治療における使用に適し、及び前記免疫細胞集団がＮＫ細胞を含む、使用。
【請求項１００】
癌又は感染症の治療方法であって、
癌又は感染症を有する対象に、拡大した免疫細胞集団を含む組成物を投与する工程を含み、
前記免疫細胞が、前記免疫細胞を操作された細胞集団と共培養することにより拡大され、
前記操作された細胞集団が、癌細胞に由来し、
前記操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、免疫細胞の活性化を刺激する、少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように改変され、
前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こし、及び、
前記免疫細胞の少なくとも１つの亜集団が、前記対象に投与される、
方法。
【請求項１０１】
前記投与される細胞の亜集団が、ＮＫ細胞を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
癌又は感染症の治療方法であって、
癌又は感染症を有する対象に、拡大した免疫細胞集団を含む組成物を投与する工程を含み、
前記免疫細胞が、前記免疫細胞を操作された細胞集団と共培養することにより拡大され、
前記操作された細胞集団が、癌細胞に由来し、
前記操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団が、抗ＣＤ−３抗体を発現するように改変され、
前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こし、及び、
前記免疫細胞の少なくとも１つの亜集団が、前記対象に投与される、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２７日に出願した米国仮特許出願第６２／４７７，３１１の利益を主張し、その全体は参照によりここに組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
多くの疾患の出現及び存続は、悪性かつウイルス感染した細胞を包含する異常細胞に対する、不十分な免疫応答によって特徴づけられる。免疫療法は、種々の疾患の治療のための、患者の免疫系の使用及び操作である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
免疫療法は、疾患の治療における新たな技術的進歩を提供し、免疫細胞は疾患を有する細胞又は損傷した細胞を明確に同定し、かつこれらに反応する一定の標的及び／又はエフェクター分子を発現するように操作される。これは、少なくとも部分的には、すべての細胞が影響を受ける化学療法などのより伝統的なアプローチとは対照的に、疾患を有する細胞又は損傷した細胞を特異的に標的とする可能性による有望な進歩を表し、かつ望ましい結果は、十分に健康な細胞により患者の生存が可能になることである。患者に対するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子移植を利用する免疫療法のアプローチは、現在開発中である。しかしながらそのような治療は、遺伝子操作及び臨床用途に適した、多くのエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）の純粋ＮＫ細胞を必要とする。方法及び組成物（並びにそれらの使用）を、混合細胞培養物からのＮＫ細胞のエクスビボ拡大及び活性化のために、ここに開示する。
【０００４】
様々な操作された細胞種類、ＤＮＡコンストラクト、並びにＮＫ細胞の拡大及び活性化の方法を、ここに提供する。例えば、いくつかの実施形態においては、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を発現しない、遺伝子操作された細胞集団であって、前記操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、免疫細胞の少なくとも１つの亜集団の活性化及び拡大を引き起こす細胞集団が提供される。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、不死の細胞株に由来する。例えば、培養中に不死細胞の１つ以上の特性を示す細胞株である。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、元来不死である細胞株（例えば、幹細胞株）に由来する。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、不死化された（例えば、癌細胞）株に由来する。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、操作を通して不死化された（例えば、遺伝子操作してテロメラーゼ発現を変化させた）細胞に由来する。一部の実施形態においては、操作された細胞集団は、癌細胞に由来する。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、ＮＫ細胞の活性化及び／又は拡大を促進し及び／又は増強する、１以上の膜結合型因子を発現するように改変される。例えば、いくつかの実施形態においては、操作された細胞は、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）を発現する。さらなる実施形態においては、操作された細胞集団は、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を、ｍｂＩＬ１５に加えて、又はその代わりに発現するように改変される。さらなる実施形態においては、操作された細胞集団は、免疫細胞の活性化を刺激する少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、及び／又は他の活性化／拡大の促進因子加えて、又はその代わりに発現するように改変される。
【０００５】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、集団が全体としてｍｂＩＬ１５及び４−１ＢＢＬの両方を発現するように、少なくともｍｂＩＬ１５を発現する第１の複数の細胞及び４−１ＢＢＬを発現する第２の複数の細胞を含む。他の実施形態においては、操作された細胞集団は、ｍｂＩＬ１５及び４−１ＢＢＬの両方を発現する複数の細胞を含む。さらなる他の実施形態においては、操作された細胞集団は、ｍｂＩＬ１５を発現するいくつかの細胞、４−１ＢＢＬを発現するいくつかの細胞、及び両方を発現するいくつかの細胞を含む。一部の実施形態においては、他のリガンド及び／又は活性化の因子が、ｍｂＩＬ１５及び／又は４−１ＢＢＬに加えて又はその代わりに、追加で発現し得る。
【０００６】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団により発現されるｍｂＩＬ１５は、配列番号１を含む核酸配列によりコードされる。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団により発現される４−１ＢＢＬは、配列番号１３を含む核酸配列によりコードされる。
【０００７】
実施形態に応じて、各々の膜結合型分子は膜貫通ドメインに結合する。いくつかの実施形態においては、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインが、分子を膜に結合させるために使用される。いくつかの実施形態においては、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号１８の配列を含む。他の膜貫通ドメインも実施形態に応じて使用され、例えば、細胞膜内又は細胞膜を横切って存在することが知られている、他の受容体又はシグナル伝達ドメイン（任意で切断する）が使用され得る。
【０００８】
いくつかの実施形態においては、前記操作された細胞集団は、Ｋ５６２細胞、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０又はＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９又はＮＢ６９、胎児性精巣癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、及び神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１からなる群から選択される細胞株に由来する。いくつかの実施形態においては、全体の集団は上記の（又は他の）細胞株の２以上に由来し、かつ組み合わされて、ＮＫ細胞などの免疫細胞の予想外に増強された活性化／拡大を可能にする細胞集団を生じる。
【０００９】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、ＭＨＣＩＩ分子の発現を欠く。いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、Ｋ５６２細胞に由来する。
【００１０】
実施形態に応じて、ここに開示する操作された細胞集団は、１以上のインターロイキン分子を発現する。いくつかの実施形態においては、インターロイキンはＩＬ１２Ａ、又はその断片を含む。いくつかの実施形態においては、ＩＬ１２Ａは、配列番号４の配列（又はその断片）を含む。ある実施形態においては、インターロイキンはＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む。ある実施形態においては、ＩＬ１２Ｂは、配列番号６の配列（又はその断片）を含む。いくつかの実施形態においては、インターロイキンはＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む。そのような実施形態においては、複製、三重複製、又はより大きな反復のいずれかで、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２ＢはＡ−Ｂ、Ｂ−Ａ、Ａ−Ｂ−Ａ−Ｂ、Ａ−Ｂ−Ｂ−Ａ、Ｂ−Ａ−Ａ−Ｂの配向でポリヌクレオチド内に配向することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８）、又はその断片をさらに発現する。いくつかの実施形態においては、ＩＬ１８は、配列番号８の配列を含む。さらなる実施形態においては、操作された細胞集団は、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、又はその断片をさらに発現する。ある実施形態においては、ＩＬ２１は配列番号１０の配列、又はその断片を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態においては、細胞は、膜結合型ＩＬ２２（ｍｂＩＬ２２）、又はその断片を発現する。ある実施形態においては、ＩＬ２２は、配列番号１２の配列、又はその断片を含む。上述の通り、種々のインターロイキンの組み合わせは、様々な組み合わせ、反復、トリプレットなどで発現可能である。いくつかの実施形態においては、ポリヌクレオチドにおける発現のそのような反復パターンは、ＮＫ細胞の予想外に増強された活性化及び／又は拡大を生じる。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞は、膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）、その抗体断片、又はｓｃＦｖをさらに含み得る。ある実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３はモノクローナル抗体である。そのようないくつかの実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３は、配列番号１５のＣＤ３イプシロンの核酸配列内のエピトープを標的にする。さらなる実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３はｓｃＦｖである。ある実施形態においては、ｓｃＦｖは配列番号１７の配列を含む。
【００１４】
ここでは、以下でより詳細に議論するように、免疫細胞の拡大方法も提供され、当該方法は、免疫細胞を含む血液試料をここに開示する操作された細胞集団のいずれかと共培養する工程を含む。いくつかの実施形態においては、免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【００１５】
いくつかの実施形態によると、癌細胞に由来する遺伝子操作された細胞集団であって、操作された細胞集団が、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）、膜結合型４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、及び免疫細胞の活性化を刺激する少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンの１、２、又はそれ以上を発現するように改変され、及び操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こす、操作された細胞集団も提供される。いくつかの実施形態においては、遺伝子操作された細胞集団は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉを発現しない。
【００１６】
いくつかの実施形態においては、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ分子を発現しない遺伝子操作された細胞集団も提供され、操作された細胞集団は癌細胞に由来し、操作された細胞集団はｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、免疫細胞の活性化を刺激する膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）を発現し、かつ操作された細胞集団と免疫細胞集団の共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こす。
【００１７】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、ＩＬ１２Ａ、又はその断片を含む追加の膜結合型インターロイキンを発現するように改変される。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１２Ａは、配列番号４の配列を含む。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１２Ａは、配列番号４の配列を有する。いくつかの実施形態においては、追加の膜結合型インターロイキンは、ＩＬ１２Ｂ、又はその断片を含む。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１２Ｂは、配列番号６の配列を含む。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１２Ｂは、配列番号６の配列を有する。いくつかの実施形態においては、追加の膜結合型インターロイキンは、膜結合型ＩＬ１２Ａ及び膜結合型ＩＬ１２Ｂ又はそれらの両方の断片を含む。さらに、操作された細胞のそのような実施形態のいずれも、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８）、又はその断片の発現をさらに含み得る。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１８は、配列番号８の配列を含む。ある実施形態においては、膜結合型ＩＬ１８は、配列番号８の配列を有する。
【００１８】
さらなる実施形態においては、操作された細胞は、膜結合型ＩＬ２１（ｍｂＩＬ２１）、又はその断片を発現する。いくつかの実施形態においては、膜結合型ＩＬ２１は、配列番号１０の配列、又はその断片を有する。ＩＬ２１との組み合わせ又は単独のいずれにおいても、いくつかの実施形態は、膜結合型ＩＬ２２（ｍｂＩＬ２２）、又はその断片を発現する操作された細胞を提供する。いくつかの実施形態においては、膜結合型ＩＬ２２は、配列番号１２の配列、又はその断片を有する。
【００１９】
さらに、いくつかの実施形態は、膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）、抗体断片又はその単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）コンストラクトを発現する操作された細胞を提供する。ある実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３は、Ｔ細胞受容体のＣＤ３のＣＤ３部分の核酸配列内のエピトープを標的にする。例えば、ある実施形態においては、ＣＤ３受容体のデルタ、イプシロン又はガンマサブユニットが、膜結合型抗ＣＤ３抗体により標的とされる。ある実施形態においては、配列番号１５のＣＤ３受容体イプシロンサブユニットは、操作された細胞で発現する膜結合型抗体により標的とされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３はｓｃＦｖである。ある実施形態においては、ｓｃＦｖは配列番号１７の配列を含み、から本質的になり、又はからなる。ある実施形態においては、ｓｃＦｖは配列番号１７の配列を有する。
【００２０】
さらに、いくつかの実施形態においては、ＩＬ１５に対する高い親和性を有するＩＬ１５受容体のアルファサブユニットを発現するように操作され、細胞表面に可溶性ＩＬ１５を飲み込み、提示させる刺激細胞が提供される。任意の追加のインターロイキン又は抗体の組み合わせを、実施形態に応じて使用して、ＮＫ細胞の予想外の優れた拡大及び活性化を提供する刺激細胞のモジュール工学を本質的に可能にすることができる。
【００２１】
いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、限定されないが、以下：Ｋ５６２細胞、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０又はＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９又はＮＢ６９、胎児性精巣癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、及び神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１を包含する細胞株に由来する。いくつかの実施形態においては、操作された細胞はＭＨＣＩＩ分子の発現を欠く。いくつかの実施形態においては、操作された細胞はＫ５６２細胞に由来する。
【００２２】
実施形態に応じて、膜結合型分子は、膜貫通ドメインに結合することにより細胞表面に結合する能力を付与される。用語「膜貫通」は、その通常の意味が与えられ、かつ細胞膜に埋め込まれたポリペプチドの少なくとも一部（例えば、ドメイン）を指すものとする。さらなる実施形態においては、少なくとも１つの膜結合型分子が単一の膜貫通ドメインに結合し得る。さらに、いくつかの実施形態においては、膜結合型分子の複数のタイプ又は複数のコピーを、膜貫通ドメインに結合させることができる。さらに、いくつかの実施形態においては、膜貫通ドメインの複数のタイプ又は複数のコピーを、膜結合型分子に結合させることができる。いくつかの実施形態においては、膜結合型分子を、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインに結合させることができる。いくつかの実施形態においては、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号１８の配列を含む。いくつかの実施形態においては、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインは、配列番号１８の配列を有する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂ４−１ＢＢＬは、配列番号１３の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５は、配列番号１の配列を含む、から本質的になる、又はからなる核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂ４−１ＢＢＬは、配列番号１３の配列を含む、から本質的になる、又はからなる核酸配列にコードされる。
【００２３】
いくつかの実施形態においては、ここに提供される操作された細胞集団は、免疫細胞の拡大及び／又は活性化に適している。ここで使用する細胞の「拡大」は、その通常の意味が与えられ、かつ同一又は異なる初期細胞集団からの特徴的な細胞の数の増加を指す。拡大のために使用される初期細胞は、拡大により生み出された細胞と同一である必要はない。例えば、拡大された細胞は、初期の操作された細胞集団の成長及び分化により生み出されてもよい。ここで使用する細胞の「活性化」は、測定可能なレベルでの、当技術分野の当業者に公知の対応する細胞の免疫機能に応答しかつ示す免疫細胞の能力を指す。免疫細胞の活性の測定方法も、当技術分野の当業者に公知である。ここで使用する「免疫細胞」は、その通常の意味が与えられ、かつ、Ｂ細胞とも呼ばれるＢリンパ球、Ｔ細胞とも呼ばれるＴリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、単球、マクロファージ、好中球、顆粒球、マスト細胞、血小板、ランゲルハンス細胞、幹細胞、樹状細胞、末梢血単核細胞、腫瘍浸潤（ＴＩＬ）細胞、ハイブリドーマを含む遺伝子改変免疫細胞、薬物改変免疫細胞、及び上記の細胞種類の誘導体、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）又は前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）を包含するが限定されない、アッセイされ得る免疫系の任意の細胞を包含する。いくつかの実施形態においては、拡大され及び／又は活性化される免疫細胞は、ＮＫ細胞である。ここで使用するように、用語「ナチュラルキラー細胞」（「ＮＫ細胞」）は、その通常の意味が与えられ、かつウイルス感染細胞への迅速な応答を提供し、形質転換細胞に応答する免疫系の細胞障害性リンパ球の一種を指す。典型的には、免疫細胞は、感染した細胞の表面上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子により提示される病原体からのペプチドを検出し、サイトカイン放出を誘発し、溶解又はアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＮＫ細胞は、ストレスを受けた細胞を、病原体からのペプチドがＭＨＣ分子上に提示されているか否かにかかわらず認識する能力を有するため、独特である。一部の態様では、ＮＫ細胞は哺乳類のＮＫ細胞である。「哺乳類の」又は「哺乳類」の例は、霊長類動物（例えば、ヒト）、イヌ科動物、ネコ科動物、齧歯類動物、ブタ、反芻動物などを包含する。具体例には、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、モルモット、ラット及びマウスが包含される。特定の態様では、哺乳類のＮＫ細胞は、ヒトＮＫ細胞である。
【００２４】
いくつかの実施形態においては、拡大及び／又は活性化は、ＮＫ細胞を含む末梢血試料のような血液試料を、ここで提供される操作された細胞集団の１つと共培養する工程を含む。
【００２５】
いくつかの実施形態においては、ここで提供される操作された細胞集団は、細胞に、ｍｂＩＬ１５をコードする第１のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第１の形質導入細胞集団を生成する工程、第１の形質導入細胞集団を拡大させる工程、第１の形質導入集団に、４−１ＢＢＬをコードする第２のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第２の形質導入細胞集団を生成する工程、第２の形質導入細胞集団に、免疫細胞を刺激可能な少なくとも１つの追加の分子をコードする第３のコンストラクトを用いて形質導入し、それにより第３の形質導入細胞集団を生成する工程、及び第３の形質導入細胞集団を拡大させる工程、を含む方法により調製することができる。いくつかの実施形態においては、ここで提供される操作された細胞集団は、細胞集団に、ｍｂＩＬ１５をコードする第１のコンストラクト、４−１ＢＢＬをコードする第２のコンストラクト、及び免疫細胞を刺激可能な少なくとも１つの追加の分子をコードする第３のコンストラクトを用いて同時に形質導入することにより、調製することができる。さらなる実施形態においては、ここで提供される操作された細胞集団は、細胞集団に、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、及び免疫細胞を刺激可能な少なくとも１つの追加の分子をコードする単一のコンストラクトを用いて形質導入することにより、調製することができる。
【００２６】
さらに、いくつかの実施形態においては、操作された細胞集団は、細胞に、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、並びにｍｂＩＬ１２Ａ、ｍｂＩＬ１２Ｂ、ｍｂＩＬ１８、ｍｂＩＬ２１、ｍｂＩＬ２２、及びｍｂα−ＣＤ３又はその断片の１以上をコードするコンストラクトを用いて形質導入することにより、調製することができる。
【００２７】
ここに開示する操作された細胞集団の生成における使用のための、ｍｂＩＬ１５をコードする核酸、４−１ＢＢＬをコードする核酸、ｍｂＩＬ１２Ａをコードする核酸、ｍｂＩＬ１２Ｂをコードする核酸、ｍｂＩＬ１８をコードする核酸、ｍｂＩＬ２１をコードする核酸、ｍｂＩＬ２２をコードする核酸、及びｍｂα−ＣＤ３をコードする核酸を含む核酸の群からの少なくとも３つを含む、複数の核酸も提供される。いくつかの実施形態においては、複数の核酸は、任意で単一のコンストラクト（例えば、コードされ又は任意で連結される）として設計される。いくつかの実施形態においては、複数の核酸は、１よりも多いコンストラクトの一部として設計される。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５は配列番号１にコードされる。いくつかの実施形態においては、４−１ＢＢＬは配列番号１３にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ａは、配列番号３にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ｂは、配列番号５にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１８は、配列番号７にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ２１は、配列番号９又はその断片にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ２２は、配列番号１１又はその断片にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂα−ＣＤ３は、配列番号１６にコードされる。実施形態に応じて、１よりも多い複数の核酸配列は、ＦＬＡＧタグ、ＨＩＳタグ、ＧＦＰ、若しくは他のタグのようなタグ及び／又は当技術分野の当業者に公知のマーカーを任意で含む。
【００２８】
いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む混合免疫細胞集団を含む、末梢血試料を得る工程、混合細胞集団を、ＭＨＣＩの減少した発現を示し、かつ膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）、及び、免疫細胞の活性化を刺激する、少なくとも１つの追加の分子を発現するように改変された、操作された細胞集団に接触させる工程、並びに、混合細胞集団を、操作された細胞とともに、混合集団のＮＫ細胞を拡大させるのに適した期間共培養する工程を含む、ＮＫ細胞を拡大させる方法もここでは提供される。いくつかの実施形態においては、方法は、共培養に使用する培地にＩＬ２を付加する工程を任意で含む。いくつかの実施形態においては、方法は、共培養の前又は後に混合集団からＴ細胞を除去する工程を任意でさらに含む。ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む混合免疫細胞集団からＴ細胞を除去し及び／又は分離する方法は、関連する技術分野において周知である。
【００２９】
ある実施形態においては、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠き、膜結合型インターロイキン−１５、４−１ＢＢリガンド、及び膜結合型抗ＣＤ３を発現するように遺伝子改変された、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株が提供される。用語「遺伝子改変された」及び「遺伝子操作された」にはそれらの通常の意味が与えられ、互換的に使用され、かつ有機体のゲノムの少なくとも一部の１以上の側面を操作するための、バイオテクノロジーの使用の使用を指すものとする。
【００３０】
ある実施形態においては、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠き、膜結合型インターロイキン−１５、４−１ＢＢリガンド、及び少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように遺伝子改変された、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株が提供される。いくつかの実施形態においては、少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンは、インターロイキン−１２、インターロイキン−１８並びにインターロイキン−１２及びインターロイキン−１８の組み合わせの１以上である。いくつかの実施形態においては、改変された細胞は、さらに膜結合型抗ＣＤ３抗体をさらに含む。これらの追加の膜結合型シグナル伝達分子の組み合わせが、いくつかの実施形態で使用される。ここで使用するように、用語「シグナル伝達分子」には、その通常の意味が与えられ、かつ限定されないが、インターロイキン、ＣＤ３、４−１ＢＢなどを包含するものとする。
【００３１】
ある実施形態においては、主要組織適合遺伝子複合体Ｉ分子を欠き、膜結合型インターロイキン−１５、４−１ＢＢリガンド、膜結合型抗ＣＤ３抗体、及び少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように遺伝子改変された、Ｋ５６２骨髄性白血病細胞を含む改変された細胞株が提供される。
【００３２】
ここでは、ＮＫ細胞及びＴリンパ球を含む混合細胞培養物を、ここに開示するいずれかの改変された細胞株とともに培養することにより拡大され及び／又は活性化される、ＮＫ細胞集団も提供される。そのようなＮＫ細胞集団は、癌若しくは感染症の治療、及び／又はそのような治療のための薬剤の調製において使用することができる。ここに開示する操作された細胞集団は、癌又は感染症の治療に使用される活性化ＮＫ細胞などのＮＫ細胞の活性化に使用するのに適している。
【００３３】
ここでは、拡大された及び／又は活性化されたＮＫ細胞を使用して疾患を治療する方法も提供される。例えば、いくつかの実施形態においては、癌（例えば、固形又は懸濁液のいずれかの腫瘍）又は感染症を有する対象に、拡大された免疫細胞集団を含む組成物を投与する工程を含み、免疫細胞が、免疫細胞を、膜結合型インターロイキン−１５（ｍｂＩＬ１５）及び４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）を発現するように改変され、かつ免疫細胞の活性化を刺激する少なくとも１つの追加の膜結合型インターロイキンを発現するように改変された、操作された細胞集団とともに共培養することにより拡大される、癌又は感染症の治療方法が提供される。いくつかの実施形態においては、共培養が、少なくとも１つの免疫細胞の亜集団の活性化及び拡大を引き起こし、かつ免疫細胞の少なくとも１つの亜集団が対象に投与される。いくつかの実施形態においては、操作された免疫細胞は、不死化細胞株などの癌細胞に由来する。いくつかの実施形態においては、投与される免疫細胞の亜集団は、ＮＫ細胞を含む。
【００３４】
以下の図面の説明は、ここに開示の発明の非限定的な実施形態を示す、実験及び結果に関連する。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１Ａ〜１Ｇは、ここに開示するいくつかの実施形態に従った免疫細胞の拡大における使用のための操作された細胞の、非制限的な実施例を示す。（例として）Ｋ５６２細胞が、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）及び膜結合型ＩＬ１５（ｍｂＩＬ１５）を、膜結合型ＩＬ１２Ａ／１２Ｂ（ｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂ：図１Ａ）、膜結合型ＩＬ１８（ｍｂＩＬ１８；図１Ｂ）、又はそれらの組み合わせ（図１Ｃ）のような他のサイトカインと併せて発現する、コンストラクトが提供される。細胞（例としてＫ５６２を使用）が、４−１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ１５を、サイトカイン（ｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂ及び／又はｍｂＩＬ１８、図１Ｄ〜１Ｆなど）及び抗体（例えば膜結合型抗ＣＤ３（ｍｂ抗ＣＤ３、図１Ｇ））の組み合わせと併せて共発現する、コンストラクトも提供される。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、ここに開示するいくつかの実施形態に従った、Ｋ５６２による種々の遺伝子の発現のフローサイトメトリー測定を示す。図２ＡはｍｂＩＬ１５の発現を示し、図２Ｂは４−１ＢＢＬの発現を示し、図２ＣはｍｂＩＬ１８の発現を示し、図２ＤはｍｂＩＬ１２Ａの発現を示し、図２ＥはｍｂＩＬ１２Ｂの発現を示し、及び図２Ｆはｍｂ−抗ＣＤ３の発現を示す。
【図３】図３Ａ〜３Ｂは、ここに開示する実施形態に従った種々のＫ５６２コンストラクトによる、ＮＫ細胞の拡大に関連するデータを示す。図３Ａは、最初に播種された末梢血単核細胞の数に対する、種々のＫ５６２細胞株とともに７日間の培養（ＩＬ−２とともに）の後に回収されたＮＫ細胞の割合に関するデータを示す。図３Ｂは、最初に播種されたＰＢＭＣの数に対する、種々のＫ５６２細胞株とともに７日間の培養（ＩＬ−２とともに）の後に回収されたＮＫ細胞の割合に関するデータを示す（Ｐ値は対応ｔ検定により計算した）。
【図４】図４Ａ〜４Ｆは、種々の遺伝子改変されたＫ５６２細胞を用いて刺激されたＮＫ細胞の、長期の拡大及び機能に関連するデータを示す。図４Ａは、示したＫ５６２変異体と共培養した場合の経時的なＮＫ細胞の拡大に関するデータを示す。ＰＢＭＣを、ｍｂＩＬ１５及び４−１ＢＢＬを発現する放射線照射したＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）（図４Ａ）、又はｍｂＩＬ１２（＋ｍｂ１２）（図４Ｂ）、ｍｂＩＬ１８（＋ｍｂ１８）（図４Ｃ）、若しくはｍｂＩＬ１２及びｍｂＩＬ１８の両方（＋ｍｂ１２＋ｍｂ１８）（図４Ｄ）も発現するＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞とともに共培養した。図４Ｅは、拡大されたＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する、示したエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比率における細胞障害性に関連するデータを示す。図４Ｆは、拡大されたＮＫ細胞のＫ５６２細胞に対する、示したＥ：Ｔ比率における細胞障害性に関連するデータを示す。示しているのは、３回の実験の平均（±ＳＤ値）である。Ｐ値は対応ｔ検定により計算した。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
多くの疾患の根底にある、（ウイルス感染しかつ悪性の細胞を含む）異常細胞の出現及び存続は、前記異常細胞に対する不十分な免疫応答によって可能となっている。免疫療法の目標は患者の免疫系の反応を開始し又は増大させることであり、例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞が損傷又は疾患を有する細胞を損傷し、殺傷し、又はそうでなければ阻害する能力を高めることである。疾患を有する細胞又は損傷した細胞を、特異的に特定し、かつ反応する一定の標的分子及び／又はエフェクター分子を発現するように操作された免疫細胞の養子移入は、特に有望な免疫療法のアプローチである。このアプローチの１つのバリエーションは、患者にキメラ受容体を発現するように操作されたＴ細胞を投与して、関心のある異常細胞の標的認識及び破壊を誘発することを伴う。しかしながら、このアプローチの欠点は、患者における移植片対宿主病の誘発を防ぐために、自己細胞（又はＭＨＣ適合ドナー細胞）の使用を支持する必要があることである。さらに、癌患者からの自己Ｔ細胞の回収と使用は、いくつかの潜在的に有害な問題を提起する。しかしながら、ＮＫ細胞は、ここに開示するいくつかの実施形態によると、自己由来又はドナー由来の同種細胞のいずれかを利用することができるという点で有利である。ＮＫ細胞を基礎にする免疫療法に関連する課題の１つは、ＮＫ細胞が免疫細胞集団の全細胞のごく一部を表すため、遺伝子操作及び注入のために十分に多くかつ十分に純粋な（例えば、他の細胞型を含まない）量のＮＫ細胞を得ることである。
【００３７】
したがって、ＮＫ細胞に基づく免疫療法における使用のためのＮＫ細胞のより大きな拡大の必要性が残されている。したがって、いくつかの実施形態においては、ここに開示する改変された細胞株の出発免疫細胞集団との共培養に由来する、拡大され及び活性化されたＮＫ細胞の集団が提供される。いくつかの実施形態においては、出発免疫細胞集団はＮＫ細胞及びＴ細胞を含む。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む混合細胞培養物中のＮＫ細胞を優先的に拡大する方法も提供され、当該方法は前記混合細胞培養物をここに開示する改変された細胞株とともに共培養する工程を含む。実施形態に応じて、優先的な拡大は、限定されないが、他の免疫細胞と比較して２倍、３倍、５倍、１０倍、又はそれよりも大きなＮＫ細胞の拡大を包含する。さらなる実施形態においては、優先的な拡大は、他の免疫細胞タイプよりも少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約５０％又はそれ以上のＮＫ細胞の拡大を指す。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む混合細胞培養物においてＮＫ細胞を拡大させるためにここに開示する改変された細胞株のいずれかを使用する方法も提供される。
【００３８】
免疫細胞拡大における使用のための細胞
いくつかの実施形態においては、細胞株が、拡大させる免疫細胞集団との共培養に使用される。そのような細胞株を、ここでは「刺激細胞」と呼び、これを「支持細胞」とも呼び得る。いくつかの実施形態においては、すべての免疫細胞集団が拡大される一方で、いくつかの実施形態においては、選択された免疫細胞の亜集団が優先的に拡大される。例えば、いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞が、他の免疫細胞の亜集団と比較して優先的に拡大される。一部の実施形態においては、刺激細胞は野生型細胞である一方で、いくつかの実施形態においては、刺激細胞は、免疫細胞を拡大及び／又は活性化するのに特に適したものにするために遺伝子改変される。以下により詳細に論じるように、種々の細胞株はＮＫの活性化を刺激する一定の分子の表面発現をもたらし得る遺伝子改変に適している。一定の細胞株は、ＮＫ細胞に対する阻害効果を持つＭＨＣＩ分子を発現しないものなど、ＮＫ細胞の拡大に特に適している。一部の実施形態においては、細胞はＭＨＣＩ発現を完全に欠損する必要はないが、それらは野生型細胞よりも低レベルでＭＨＣＩ分子を発現し得る。例えば、いくつかの実施形態においては、野生型細胞がＭＨＣをＸのレベルで発現するとき、使用する細胞株は、Ｘの９５％未満、Ｘの９０％未満、Ｘの８５％未満、Ｘの８０％未満、Ｘの７０％未満、Ｘの５０％未満、Ｘの２５％未満、及び列挙した発現レベルの間（及び含む）レベルでＭＨＣを発現し得る。いくつかの実施形態においては、刺激細胞は不死化されており、例えば癌細胞株である。しかしながら、いくつかの実施形態においては、刺激細胞は一次細胞である。
【００３９】
ＭＨＣＩ発現を欠損し、又は減少させた細胞タイプは、限定されないが、中でもＫ５６２細胞、一定のウイルムス腫瘍細胞株（例えば、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ）、子宮内膜腫瘍細胞（例えば、ＨＨＵＡ）、黒色腫細胞（例えば、ＨＭＶ−ＩＩ）、肝芽腫細胞（例えば、ＨｕＨ−６）、肺小細胞癌細胞（例えば、Ｌｕ−１３０及びＬｕ−１３４−Ａ）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＮＢ１９及びＮＢ６９）、胎児性精巣癌細胞（例えば、ＮＥＣ１４）、子宮頸癌細胞（例えば、ＴＣＯ−２）、神経芽細胞腫細胞（例えば、ＴＮＢ１）、７２１．２２１ＥＢＶ形質転換細胞株を包含する。いくつかの実施形態においては、刺激細胞はＭＨＣＩ発現を減少させた（又は欠損する）だけでなく、ＭＨＣＩＩ発現も減少させる（又は欠損する）。一部の実施形態においては、最初にＭＨＣクラスＩ分子を発現し得る他の細胞株を、ＭＨＣＩ発現を減少させ又はノックアウトするためのそれらの細胞の遺伝子改変と併せて使用することができる。遺伝子改変は、遺伝子編集技術（例えば、ｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ−９システム）、抑制ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）、又は細胞表面上のＭＨＣＩ分子の発現を崩壊及び／又は減少させる他の分子法の使用により、達成することができる。追加的に、又は代替的に、ＭＨＣＩ分子との結合又は他の相互作用をブロックする他のアプローチを使用することができる（例えば、抗体、干渉リガンドをブロックすることなど）。
【００４０】
いくつかの実施形態においては、拡大される／刺激される細胞に対する一定の比率の刺激細胞が使用される。例えば、いくつかの実施形態においては、約５：１の刺激細胞：「標的」細胞が使用される。いくつかの実施形態においては、１：１比率が使用される一方で、さらなる実施形態においては、約１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、及び終点を含む列挙した比率の間の任意の比率に及ぶ。一部の実施形態においては、細胞タイプの組み合わせが使用され（例えば、Ｋ５６２と１以上の追加の細胞タイプ）、結果として生じるＮＫ細胞の活性化及び／又は拡大は、いずれの単一の細胞タイプの単独での使用により達成されるものよりも大きい（例えば、細胞タイプ間の相乗作用の結果として）。一部のそのような実施形態において、組み合わせて使用される細胞株のそれぞれにおいて、ＭＨＣＩ発現が必ずしも減少及び／又は欠ける必要がない。一部の実施形態においては、所望の免疫細胞集団の拡大及び活性化を最大化するために、ある細胞タイプと他の細胞タイプの組み合わせの相対頻度を変えることができる。例えば、２つの細胞集団が使用される場合、相対頻度は、１：１０、１：２０、１：５０、１：１００、１：１，０００、１：１０，０００、１：５０，０００、１：１００，０００、１００，０００：１、５０，０００：１、１０，０００：１、１，０００：１、１００：１、５０：１、２０：１、１０：１、及び終点を含む列挙した比率の間の任意の比率に及び得る。
【００４１】
以下でより詳細に論じるように、一定の刺激分子（例えば、インターロイキン、ＣＤ３、４−１ＢＢＬなど）は、免疫細胞の拡大及び活性化を促進する細胞（例えば、刺激細胞）上又は細胞によって発現され得る。しかしながら、いくつかの実施形態においては、免疫細胞の拡大を促進するために細胞と組み合わせて、又は細胞の代わりに、固体支持体が使用される。例えば、固体支持体は、分子を付着させて保持することが可能な、金属、ガラス、プラスチック、ポリマー材料、粒子（例えば、ビーズ又はミクロスフェア）、及び／又は脂質（天然又は合成のいずれも）を包含するが、これらに限定されない表面である。一部の実施形態においては、所望の免疫細胞集団の拡大を促進するために、ここに開示される分子のような刺激分子を、培地に溶出可能な組成物を使用する。
【００４２】
刺激分子
上で簡単に論じたように、一定の分子は免疫細胞の拡大を促進する。実施形態に応じて、刺激分子は、免疫集団を拡大させるために使用する刺激細胞の表面に発現し得る一方で、一部の実施形態においては、刺激細胞は１以上の刺激分子を培地中に発現しかつ分泌するように操作され得る。さらなる実施形態においては、１以上の刺激分子は、細胞培地を補うために使用される。一部の実施形態においては、免疫細胞集団は、比較的一様に拡大する（例えば、優先的に拡大する特定の亜集団がない）。そのような一部の実施形態においては、すべての免疫細胞集団の拡大に続き、さらなる使用のために所望の亜集団は選択的に分離される（例えば、ＮＫ細胞をＴ細胞から分離する、又はその逆）。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞のような一定の特定の免疫細胞亜集団が、優先的に拡大される。
【００４３】
いくつかの実施形態においては、刺激細胞株が膜結合分子を発現するように操作するための一般的なコンストラクトは、膜結合分子の発現を最終的に駆動するシグナルペプチド、膜結合分子をコードする核酸配列、任意のリンカー、及び膜貫通ドメインを利用する。この一般的コンストラクトは、少なくとも部分的に、複雑性、サイズ又は一定の膜結合分子の発現能力に応じて、実施形態により異なり得る。
【００４４】
一部の実施形態においては、インターロイキン１５（ＩＬ１５）が、ＮＫ細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ１５は、刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂＩＬ１５」と記載する）である。一部の実施形態においては、ＩＬ１５は、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが使用される（配列番号１８）。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）ＩＬ１５が刺激細胞上で、又は近傍で発現される。一部の実施形態においては、ＩＬ１５は、全長ＩＬ１５の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ１５が使用される。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５は配列番号１の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５は配列番号２のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号１若しくは２からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。
【００４５】
いくつかの実施形態においては、刺激細胞は、ＩＬ１５受容体のすべて、又は一部を発現するように操作される。いくつかの実施形態においては、ＩＬ１５受容体の一部は、ＩＬ１５受容体の機能的な部分である。例えば、一部の実施形態においては、刺激細胞は、ＩＬ１５受容体のアルファサブユニットを発現するように操作される。いくつかの実施形態においては、細胞は可溶性ＩＬ１５を生産する、又は生産するように（例えば、分泌する）操作される。可溶性ＩＬ１５は、それにより刺激細胞によって発現されるその受容体に結合し、かつ続いて吸収され（例えば、エンドサイトーシスされる）及び他の細胞に提示されることができる。本質的に、一部の実施形態においては、操作されたｍｂＩＬ１５を発現するように刺激細胞を操作するというよりもむしろ、刺激細胞は、ＩＬ１５に結合可能なＩＬ１５受容体アルファサブユニットを発現し（残りのＩＬ１５受容体ＣＤ１２２及びＣＤ１３２サブユニットの非存在下であっても）、かつそれを細胞表面に提示し、それによりｍｂＩＬ１５に代わる方法でＩＬ１５発現を引き起こすように操作され得る。
【００４６】
一部の実施形態においては、インターロイキン１２Ａ（ＩＬ１２Ａ）及び／又は１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）が、ＮＫ細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ１２は刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂＩＬ１２」と呼ぶ）である。一部の実施形態においては、ＩＬ１２ＡとＩＬ１２Ｂの組み合わせが使用される（ここでは、「ＩＬ１２Ａ／１２Ｂ」、及び膜結合型の場合には「ｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂ」と呼ぶ）。一部の実施形態においては、ＩＬ１５は、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）ＩＬ１２Ａ及び／又は１２Ｂが刺激細胞上で、又は近傍で発現される。一部の実施形態においては、ＩＬ１２Ａ及び／又はＩＬ１２Ｂは、それぞれ全長ＩＬ１２Ａ又は１２Ｂの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ１２Ａ及び／又は１２Ｂが使用される。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ａは、配列番号３の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ａは、配列番号４のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号３若しくは４からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ｂは、配列番号５の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１２Ｂは、配列番号６のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号５若しくは６からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。一部の実施形態においては、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂの混合物が使用される。いくつかの実施形態においては、ＩＬ１２Ａ：ＩＬ１２Ｂの発現の特定の比率、例えば１：１０、１：１００、１：１０００、１：１０，０００、１０，０００：１、１０００：１、１００：１、１０：１及び終点を含む列挙した比率の間の任意の比率が使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ１２Ａ及びＩＬ１２Ｂの両方が、例えば融合タンパク質として発現される。一部の実施形態においては、ＩＬ１２Ａの断片は、ＩＬ１２Ｂの断片ともに発現される。いくつかの実施形態においては、刺激細胞上のＩＬ１２（Ａ及び／又はＢ）の発現は、細胞に、拡大される細胞の表現型及び機能に影響を与える能力を付与する。換言すると、ＩＬ１２Ａ及び／又はＢの（単独又はここに開示する他の刺激分子との組み合わせの）発現は、いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞亜集団の選択的な拡大をもたらす。いくつかの実施形態においては、その特定の亜集団は、特定のＮＫ細胞の表現型が特に有効である特定の治療用途において有利となり得る。
【００４７】
一部の実施形態においては、インターロイキン１８（ＩＬ１８）が、ＮＫ細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ１８は刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂＩＬ１８」と呼ぶ）である。一部の実施形態においては、ＩＬ１８は、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインを使用する。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）ＩＬ１８を刺激細胞上で、又は近傍で発現させる。一部の実施形態においては、ＩＬ１８は、全長ＩＬ１８の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ１８が使用される。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１８は配列番号７の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１８は配列番号８のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号７若しくは８からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。いくつかの実施形態においては、刺激細胞上のＩＬ１８の発現は、細胞に、拡大される細胞の表現型及び機能に影響を与える能力を付与する。換言すると、ＩＬ１８の（単独又はここに開示する他の刺激分子との組み合わせの）発現は、いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞亜集団の選択的な拡大をもたらす。いくつかの実施形態においては、その特定の亜集団は、特定のＮＫ細胞の表現型が特に有効である特定の治療用途において有利となり得る。
【００４８】
一部の実施形態においては、インターロイキン２１（ＩＬ２１）が、ＮＫ細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ２１は刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂＩＬ２１」と呼ぶ）である。一部の実施形態においては、ＩＬ２１は、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）ＩＬ２１が刺激細胞上で、又は近傍で発現される。一部の実施形態においては、ＩＬ２１は、全長ＩＬ２１の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ２１が使用される。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞を刺激するために使用されるｍｂＩＬ２１は、配列番号９の核酸配列に由来する。ここで論じるように、いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが、配列番号９のＩＬ２１（又はその断片）を刺激細胞の膜に繋留するために使用される。いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞を刺激するために使用されるｍｂＩＬ２１は、配列番号１０のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号９若しくは１０からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。
【００４９】
一部の実施形態においては、インターロイキン２２（ＩＬ２２）が、ＮＫ細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、ＩＬ２２は刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂＩＬ２２」と呼ぶ）である。一部の実施形態においては、ＩＬ２２は、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、ＣＤ８αの膜貫通ドメインが使用される。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）ＩＬ２２が刺激細胞上で、又は近傍で発現される。一部の実施形態においては、ＩＬ２２は、全長ＩＬ２２の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ２２が使用される。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ２２は配列番号１１の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ２２は配列番号１２のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号１１若しくは１２からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。
【００５０】
一部の実施形態においては、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）が、免疫細胞の拡大を促進するために使用される。４−１ＢＢＬは、Ｔ細胞上の受容体である４−１ＢＢと相互作用する細胞外ドメインを有し、それによってＴ細胞に生存、増殖、及び分化の共刺激シグナルを提供する。一部の実施形態においては、４−１ＢＢＬは、膜貫通分子又は膜内在性タンパク質に結合又は接合することによる、膜結合型である。いくつかの実施形態においては、野生型（例えば、全長）４−１ＢＢＬが刺激細胞上で、又は近傍で発現される。一部の実施形態においては、４−１ＢＢＬは、全長４−１ＢＢＬの少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。一部の実施形態においては、切断型のＩＬ１８が使用される。いくつかの実施形態においては、ｍｂ４−１ＢＢＬは配列番号１３の核酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、ｍｂ４−１ＢＢＬは配列番号１４のアミノ酸配列にコードされる。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号１３若しくは１４からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。
【００５１】
一部の実施形態においては、抗ＣＤ３抗体が、免疫細胞の拡大を促進するために使用される。一部の実施形態においては、抗ＣＤ３抗体は、刺激細胞上における膜結合型（ここでは「ｍｂ抗ＣＤ３」又は「ｍｂα−ＣＤ３」と呼ぶ）である。いくつかの実施形態においては、全長抗ＣＤ３抗体が刺激細胞上で発現される。一部の実施形態においては、抗ＣＤ３抗体は、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）断片を含む。実施形態に応じて、抗体はモノクローナル又はポリクローナルであり得る。一部の実施形態においては、抗ＣＤ３抗体は、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（例えば、ダイアボディ、ナノボディ）から選択される種々の抗原性の断片及び／又は融合物を含む。一部の実施形態においては、抗体は、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビシリズマブからなる群から選択される。一部の実施形態においては、抗体は、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビシリズマブの１以上の、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％のホモログである。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞受容体のＣＤ３部分の１以上のサブユニットに結合する抗体は、刺激細胞により発現される。いくつかの実施形態においては、発現する抗体は、ガンマ、イプシロン、又はデルタＣＤ３サブユニットに対して向けられている。いくつかの実施形態においては、刺激細胞により発現される抗体は、配列番号１５のＣＤ３イプシロン核酸配列に由来するエピトープに対して向けられている。いくつかの実施形態においては、抗ＣＤ３抗体は単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態においては、ｍｂ抗ＣＤ３  ｓｃＦｖは、配列番号１６の核酸配列にコードされる。そのような一部の実施形態においては、抗体は配列番号１７のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態においては、刺激分子は、配列番号１６若しくは１７からの１以上の追加の突然変異を有し得、しかし維持し、又は一部の実施形態においては、増強された刺激活性を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態においては、Ｋ５６２細胞のような刺激細胞は、種々の刺激分子の組み合わせを発現するように遺伝子改変される。実施形態に応じて、ここに開示する刺激分子の任意の組み合わせを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ及びｍｂα−ＣＤ３が刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂが刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ及びｍｂＩＬ１８が刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１８及びｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂが刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂ及びｍｂ抗ＣＤ３が刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１８及びｍｂ抗ＣＤ３が刺激細胞上で共発現する。いくつかの実施形態においては、ｍｂＩＬ１５、４−１ＢＢＬ、ｍｂＩＬ１２Ａ／１２Ｂ、ｍｂＩＬ１８及びｍｂ抗ＣＤ３が刺激細胞上で共発現する。一部の実施形態においては、ｍｂＩＬ２１及び／又はｍｂＩＬ２２が、任意の上で列挙した刺激分子に加えて、又はその代わりに発現し得る。一部の実施形態においては、各々のこれらの分子は、個々のプラスミドを用いた遺伝子導入を介して、刺激細胞中で発現される。あるいは、２以上の刺激分子は、単一のプラスミドにコードされ得る。
【００５３】
実施形態、及び件の刺激分子に応じて、刺激分子は、免疫細胞集団との共培養工程の間の特定の時間に発現され得る。例えば、恒常的に発現するというよりもむしろ、１以上のマーカーは誘導性の、さもなければ調節可能なプロモーターの制御下にあり得る。したがって、トリガー分子又は刺激を、所望の時点で共培養に加えて、拡大及び活性化プロトコル中の特定のポイントで所望の刺激分子の発現をもたらすことができる。ここで使用するように、用語「誘導性プロモーター」及び「調節可能なプロモーター」は、それらの通常の意味を与えられるものとし、特定の生物的又は非生物的因子の存在によって転写活性が調節される（例えば、刺激又は阻害される）プロモーターを指すものとする。ここで使用するように、用語「トリガー分子」又は「トリガー刺激」は、それらの通常に意味を与えられるものとし、アルコール、テトラサイクリン、ステロイド、金属及び他の化合物、並びに高い又は低い培養温度を包含するが、これらに限定されない、誘導性又は調節可能なプロモーターに作用する化学的又は物理的な物質又は条件を指すものとする。さらに、刺激分子の調節可能な発現は、培養工程中の特定の刺激分子の発現を低減及び／又は排除するためにも使用することができる。そのような実施形態は、例えば、活性化及び拡大の工程中の特定の時点において、特定の刺激シグナルを、ＮＫ細胞が特にそのようなシグナルに対して敏感な場合に提供することにより、ＮＫ細胞などの一定の免疫細胞の亜集団の優先的拡大を促進し得る。いくつかの実施形態においては、そのようなアプローチは、ＮＫ細胞の予想外に強力な活性化及び拡大をもたらし得る。さらなる追加の実施形態においては、ＮＫ細胞の増殖の持続時間が延長され、最終的に、例えば、癌免疫療法で使用するための活性化ＮＫ細胞のより大きな集団をもたらす。
【００５４】
一部の実施形態においては、配列番号１〜１７にコードされたここに開示する刺激分子の各々の核酸配列又はアミノ酸配列と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％（及びその範囲）の相同性を有する核酸配列及びアミノ酸配列であり、かつ（ｉ）ＮＫ細胞の活性化、（ｉｉ）ＮＫ細胞の感作、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞増殖の増強、（ｉｖ）ＮＫ細胞標的親和性の増強、（ｖ）上方制御又はその他の方法でのシグナル伝達の増強、（ｖｉ）ＮＫ細胞の細胞毒性の増強、（ｖｉｉ）Ｔ細胞刺激（例えば、増殖、有用な亜集団の選択的拡大など）、（ｖｉｉｉ）特定のＮＫ細胞亜集団の選択的拡大、及び（ｉｘ）それらの組み合わせ、を包含するがこれらに限定されない、各々の配列番号１〜１７と比較した１以上の機能もまた表す配列が提供される。
【００５５】
共培養及び免疫細胞拡大の方法
いくつかの実施形態においては、刺激細胞を複数のコンストラクト（それぞれは、発現される１以上の刺激分子をコードする）により形質導入することができ、あるいは単一のコンストラクトを使用することができる。いくつかの実施形態においては、刺激細胞を、まず蛍光タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰ、又は他の蛍光部分）のような同定可能なマーカーに結合した刺激分子により形質導入する。さらなる実施形態においては、他のタグを使用することができる。例えば、いくつかの実施形態においては、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号１９）を使用する。ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号２０）、ＨＡ−タグ又はｍｙｃ−タグのような他のタグ配列も利用可能である。タグの種類の組み合わせを、一定の実施形態において使用することができる。形質導入に続いて、刺激細胞にタグの存在と発現の程度を問い合わせることができ、これは関連する刺激分子の発現と相関している。高レベルのタグ発現（かつそれにより高レベルの刺激分子の発現）を有するそれらの細胞（又は個々の細胞）を、選択しかつ拡大することができる（単一の細胞が選択された場合、クローン的に）。続いて、刺激分子の組み合わせの所望の発現が達成されるまで、１以上の追加の刺激分子によるさらなる形質導入を実行し、続いて追加の問合せ及び拡大を実行することができる。一部の実施形態においては、各後続の形質導入に関連するタグは、先行する形質導入のタグとは異なるため、各刺激分子の発現を独立して検証することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態においては、刺激細胞を培養容器に播種し、かつほぼコンフルエントに達することを可能にする。次いで、免疫細胞を、いくつかの実施形態においては、約０．５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2から約５×１０6ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の、終点を含む列挙された密度の間の任意の密度を含む、所望の濃度で培養に加えることができる。免疫細胞は、実施形態に応じて、末梢血、免疫細胞の単離された調製物、ＮＫ細胞の単離された集団などの出発試料中に存在し得る。いくつかの実施形態においては、血液試料を、ＮＫ細胞などの拡大する一定の集団に分離するために前処理する。一部の実施形態においては、末梢血試料を刺激細胞とともに共培養し、かつＮＫ細胞のような拡大する免疫細胞の所望の亜集団を、任意で拡大した細胞の混合集団から単離する。拡大の後、細胞を適した培地、例えばＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＣＳ、及び１０ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２中で維持することができる。
【００５７】
上で論じたように、いくつかの実施形態においては、免疫細胞集団を活性化及び／又は拡大するのに適した、操作された細胞集団（ここでは刺激細胞も指す）が提供される。いくつかの実施形態においては、操作された集団は癌細胞に由来し、かつｍｂＩＬ１５、ｍｂ４−１ＢＢＬ、及び免疫細胞の活性化を刺激する少なくとも１つの追加の膜結合分子を発現するように改変され、操作された細胞の免疫細胞集団との共培養は、ＮＫ細胞のような免疫細胞の少なくとも１つの亜集団の活性化及び／又は拡大をもたらす。いくつかの実施形態においては、追加の分子は、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ２１、及び／又はＩＬ２２のような１以上のインターロイキン（又はその断片）を含む。一部の実施形態においては、追加の分子は抗体を含む。いくつかの実施形態においては、抗体は膜結合型抗ＣＤ３抗体（ｍｂα−ＣＤ３）、抗体若しくはｓｃＦｖ、又はその断片を含む。いくつかの実施形態においては、抗体はモノクローナルである。いくつかの実施形態においては、抗体は少なくとも１つのインターロイキン、又はその断片を共発現する。実施形態に応じて、１以上の膜結合分子を、ヒトＣＤ８αの膜貫通ドメインに結合させる。ここでは、ＮＫ細胞を拡大させる方法であって、ＮＫ細胞がそのような操作された細胞とともに共発現される、方法が提供される。例えば、いくつかの実施形態においては、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む免疫細胞の混合集団を含む末梢血試料を得る工程、混合細胞集団をそのような操作された細胞集団に接触させる工程、及び混合細胞集団を、操作された細胞とともに、混合集団のＮＫ細胞を拡大させるのに適した期間共培養する工程、を含む、ＮＫ細胞を拡大させる方法が提供される。いくつかの実施形態においては、Ｔ細胞を任意で除去し、より純粋なＮＫ細胞集団をもたらす。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、細胞集団は１以上の以下の細胞株、即ちＫ５６２細胞、ウイルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０又はＬｕ−１３４−Ａ、神経芽細胞腫細胞株ＮＢ１９又はＮＢ６９、胎児性精巣癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、及び神経芽細胞腫細胞株ＴＮＢ１に由来する。いくつかの実施形態においては、細胞集団はＭＨＣＩ及び／又はＭＨＣＩＩ分子の発現を欠く。
【００５９】
いくつかの実施形態においては、免疫細胞を拡大させるための操作された細胞集団を生成において使用するための、複数の核酸を含むキットも提供され、キットは、ｍｂＩＬ１５をコードする核酸、４−１ＢＢＬをコードする核酸、ｍｂＩＬ１２Ａをコードする核酸、ｍｂＩＬ１２Ｂをコードする核酸、ｍｂＩＬ１８をコードする核酸、ｍｂＩＬ２１をコードする核酸、ｍｂＩＬ２２をコードする核酸、及びｍｂα−ＣＤ３をコードする核酸の少なくとも３つを含む。いくつかの実施形態においては、１以上の核酸は、ＧＦＰ、ＦＬＡＧタグ、又はＨＩＳタグのようなタグを含み得る。
【００６０】
ここでは、ここに記載の遺伝子操作された細胞を含む組成物及び／又はここに記載の遺伝子操作された細胞と共培養された免疫細胞の拡大集団を含む組成物を対象に投与する工程を含む、癌又は感染症を有する対象を治療する方法がさらに提供される。ここで使用するように、対象に対する療法の投与の文脈における用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、及び「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、それらの通常の意味を与えられるものとし、かつ対象が療法から得る有益な効果を指すものとする。一定の実施形態においては、ここに記載の遺伝子操作された細胞を含む組成物及び／又はここに記載された遺伝子操作された細胞と共培養された免疫細胞の拡大集団を含む組成物の投与を用いた対象の治療は、以下の効果、例えば、（ｉ）疾患又はそれに関連する症状の重症度の減少又は改善、（ｉｉ）疾患と関連する症状の持続期間の減少、（ｉｉｉ）疾患又はそれに関連する症状の進行に対する保護、（ｉｖ）疾患又はそれに関連する症状の退縮、（ｖ）疾患に関連する症状の進展又は発症に対する保護、（ｖｉ）疾患に関連する症状の再発に対する保護、（ｖｉｉ）対象の入院の減少、（ｖｉｉｉ）対象の入院期間の短縮、（ｉｘ）疾患を有する対象の生存の増加、（ｘ）疾患に関連する症状の数の減少、（ｘｉ）別の治療の予防又は治療効果の増強、改善、補充、補完、又は増大、を包含する効果の１、２、３、４、又はそれ以上を達成する。
【００６１】
投与は、罹患組織への静脈内、動脈内、皮下、筋肉内、肝内、腹腔内及び／又は局所送達を含むがこれらに限定されない、種々の経路によることができる。遺伝子操作された細胞及び／又はここに記載の遺伝子操作された細胞と共培養された免疫細胞の拡大集団の用量は、対象の体重、疾患の種類及び状態、並びに治療の所望の攻撃性に基づいて、特定の対象に対して容易に決定することができるが、実施形態に応じて、１ｋｇ当たり約１０5細胞から１ｋｇ当たり約１０12細胞（例えば、１０5〜１０7、１０7〜１０10、１０10〜１０12、及びその中の重複範囲）の範囲にわたる。ある実施形態においては、用量漸増レジメンが使用される。いくつかの実施形態においては、ここに記載の遺伝子操作された細胞と共培養した免疫細胞の拡大集団の範囲、例えば約１×１０6細胞／ｋｇから約１×１０8細胞／ｋｇが投与される。実施形態に応じて、種々の種類の癌及び感染症が治療され得る。ここに提供される種々の実施形態は、以下の、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、カポジ肉腫、リンパ腫、胃腸癌、虫垂癌、中枢神経癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍（星細胞腫、骨髄腫瘍、脳幹神経膠腫、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄上皮腫を包含するが、これらに限定されない）、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、乳管癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞白血病、腎細胞癌、白血病、口腔癌、鼻咽頭癌、肝臓癌、肺癌（非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及び小細胞肺癌を包含するが、これらに限定されない）、膵臓癌、腸癌、リンパ腫、黒色腫、眼癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、下垂体癌、子宮癌、及び膣癌を包含するが、これらに限定されない癌の非限定的な例の治療又は予防を包含する。
【００６２】
さらに、ここに提供される種々の実施形態は、例えば１以上の以下の属、即ち、ボルデテラ、ボレリア、ブルセラ、カンピロバクター、クラミジア及びクラミドフィラ、クロストリジウム、コリネバクテリウム、エンテロコッカス、エシェリヒア、フランシセラ、ヘモフィルス、ヘリコバクター、レジオネラ、レプトスピラ、リステリア、マイコバクテリウム、マイコプラズマ、ナイセリア、シュードモナス、リケッチア、サルモネラ、シゲラ、スタフィロコッカス、ストレプトコッカス、トレポネーマ、ビブリオ、及びエルシニア、並びにそれらの変異体又は組み合わせ、からの細菌感染を包含し得る、細菌由来の感染症を包含するが、これに限定されない感染症の非限定的な例の治療又は予防を包含する。いくつかの実施形態においては、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エプスタイン−バーウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、サイトメガロウイルス、エボラウイルス、ヒトヘルペスウイルス８型、ＨＩＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、パラインフルエンザウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、呼吸器多核体ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルスなどの１以上の細菌により引き起こされるものなどの、種々の細菌感染を治療するための治療方法が提供される。
【００６３】
いくつかの実施形態においては、拡大及び／又は活性化細胞は、治療的有効量（例えば、癌に関連する症状の改善、癌の発症の予防若しくは遅延、さらに癌の症状の重症度若しくは頻度の低下、及び／又は癌の転移の予防、遅延若しくは克服のような、癌の治療に十分な量）で投与される。特定の個体の治療において治療的に有効であり得る量は、状態（例えば、癌）の症状及び重症度に依存し、かつ標準的な臨床技術により決定することができる。さらに、インビトロ又はインビボアッセイを、最適な用量範囲を特定するのを助けるために、任意で利用することができる。製剤に利用される正確な用量は、投与経路及び癌の重症度にも依存し、かつ医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られる用量反応曲線から推定することができる。いくつかの実施形態においては、拡大された免疫細胞は１以上の刺激細胞とともに投与される一方で、一部の実施形態においては、刺激細胞（又は刺激細胞により生産され、分泌され、又は回収される１以上の因子）は、内在性免疫細胞集団を活性化するために投与される。
【００６４】
投与方法は、限定されないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内を包含する。他の適した導入方法は、遺伝子療法、充電式又は生分解性の装置、粒子加速装置（例えば、「遺伝子銃」）及び徐放性ポリマー装置もまた包含し得る。いくつかの実施形態においては、本発明の医薬組成物を、他の組成物との組み合わせの療法の一部として投与することも可能である。
【００６５】
実施例
以下は、以下に開示する実施例で使用した実験方法及び材料の、非限定的な説明である。
実施例１−Ｋ５６２誘導体の調製、ＮＫ細胞の拡大
末梢血試料を、シンガポールの国立大学病院血液バンクにて、健康な成人ドナーからの血小板提供の、処分された匿名化された副産物から得た。
単核細胞を、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度ステップ（ナイコメッド社、ノルウェー、オスロ）で遠心分離することにより分離し、かつＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。末梢血単核細胞から最初のＮＫ細胞を精製するため、ミルテニー社（ドイツ、ベルギッシュ・グラートバハ）のＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用した。
Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞株（図１Ａ）を、前述の通り作成した（Ｉｍａｉ  Ｃ，  Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｓ，  Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２００５；１０６：３７６−３８３；  Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｈ，  Ｋａｋｕｄａ  Ｈ，  Ｓｈｉｍａｓａｋｉ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００９；６９（９）：４０１０−４０１７）。
【００６６】
他のＫ５６２変異体を、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞を、膜結合インターロイキン（ＩＬ）−１２、ＩＬ−１８、若しくは両方、又は膜結合抗ヒトＣＤ３  ＳｃＦｖをコードするｃＤＮＡ配列を含有するレトロウイルスベクターを用いて形質導入することにより生成した。クローニングコンストラクトのための配列は、配列番号２１（ｍｂＩＬ１５）、配列番号２３（ｍｂＩＬ１２Ａ）、配列番号２４（ｍｂＩＬ１２Ｂ）、配列番号２５（ｍｂＩＬ１８）、及び配列番号２６（ｍｂ−抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ）に提供される。対応するｃＤＮＡを含有するＲＤ１４４−シュードタイプＭＳＣＶレトロウイルスを、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞を形質導入するために使用した。レトロウイルスベクター馴化培地を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラ社、日本、大津）でコーティングされたポリプロピレンチューブに加え、遠心分離及び上清の除去の後、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞をチューブに加え、３７℃で１２時間放置し、新鮮なウイルスの上清を、他の連続した２日間加えた。次いで、細胞をＦＢＳ及び抗生物質とともに、ＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。
【００６７】
ＩＬ−１２ａ、ＩＬ１２ｂ及びＩＬ１８の表面発現を、アロフィコシアニン（ＡＰＣ、ミルテニー社）又はフィコエリトリン（ＰＥ、Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネソタ州、ミネアポリス）に結合した抗体抗ＩＬ１２ａ、抗ＩＬ１２ｂ  ＡＰＣ（バイオレジェンド社、カルフォルニア州、サンディエゴ）、抗ＩＬ１８（ＭＢＬ、マサチューセッツ州、ウォバーン）、後続のヤギ抗マウスＩｇＧ１  ＰＥ（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社、アラバマ州、バーミンガム）を使用するフローサイトメトリーにより分析した。抗ＣＤ３を、ビオチンに結合したヤギ抗マウスＦａｂ２抗体、後続のストレプトアビジンＡＰＣ（両方ともジャクソンイムノリサーチ社（ペンシルベニア州、ウェスト・クローブ）から）を使用して検出した。高レベルの導入遺伝子を発現するサブクローンを、フローサイトメトリーにより濃縮し、かつＮＫ細胞拡大を刺激するために使用した。
【００６８】
ヒトＮＫ細胞拡大
ＮＫ細胞を拡大するため、ＰＢＭＣ及び遺伝子改変されたＫ５６２細胞を共培養した。一時的に、末梢血単核細胞（３×１０6）を６ウェル組織培養プレート中で、放射線照射した２×１０6（１００Ｇｙ）Ｋ５６２−改変細胞とともに、１０％ＦＢＳ及び４０ＩＵ／ｍＬヒトインターロイキン（ＩＬ）−２（ノバルティス社、スイス、バーゼル）を含有するＳＣＧＭ培地（セルジェニックス社、ドイツ、フライブルグ）中で培養した。各２〜３日、新鮮な組織培地及びＩＬ−２を加えた。７日間の共培養の後、残りのＴ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＣＤ３（サーモフィッシャー社）を用いて除去し、＞９０％ＣＤ５６＋  ＣＤ３−  ＮＫ細胞を含有する細胞集団を生産した。
【００６９】
結果
コンストラクトを生成し、かつＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞をそれぞれのレトロウイルスベクターで形質導入した後、Ｋ５６２細胞を、フローサートメトリーを用いて種々の膜結合分子の発現について評価した。図２Ａ〜２Ｆは、評価結果を示す。示したように、発現される６分子の各々が、得られたＫ５６２細胞株のほぼ１００％が示された分子（２Ａ−ｍｂＩＬ１５、２Ｂ−４１ＢＢＬ、２Ｃ−ｍｂＩＬ１８、２Ｄ−ｍｂＩＬ１２Ａ、２Ｅ−ｍｂＩＬ１２Ｂ、及び２Ｆ−ｍｂ抗ＣＤ３）を発現することを示した。これらのデータは、生成された種々のコンストラクトが、Ｋ５６２細胞（又は他の種類の刺激細胞）による所望の刺激分子の発現に、うまく翻訳されたことを示す。
【００７０】
所望の刺激分子の発現を確認した後、ＮＫ細胞を拡大させるための種々のＫ５６２変異体の能力を評価した。上で論じたように、ＰＢＭＣを、ｍｂＩＬ１５及び４−１ＢＢＬを共発現する放射線照射したＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）とともに共培養した。このＫ５６２コンストラクトを、ｍｂＩＬ１２（＋ｍｂ１２）、ｍｂＩＬ１８（＋ｍｂ１８）、又はｍｂＩＬ１２及びｍｂＩＬ１８の両方（＋ｍｂ１２＋ｍｂ１８）をさらに発現するコンストラクトと比較した。最初に播種されたものと比較して、７日間の培養後に回収されたＮＫ細胞の数（ＣＤ５６の発現及びＣＤ３の欠損により定義する）を計算し、図３Ａに示す。すべての培養において、ＩＬ−２  ４０ＩＵ／ｍＬ（Ａｌｄｅｕｓｋｉｎ、ノバルティス社）を加えた。４人の健康なドナーからの細胞を用いた、５つの実験の結果を示す。水平バーは、中央値に対応する。これらのデータは、ｍｂＩＬ１２、ｍｂＩＬ１８、及びそれらの組み合わせの追加による、増強されたＮＫ細胞拡大への明確な傾向を示す。これは、Ｋ５６２細胞を発現するｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬの刺激性の性質を補充することが、ここに記載のいくつかの実施形態に係るコンストラクトを使用して達成されることを示唆している。
【００７１】
図３Ｂは、培養の７日間の、ＰＢＭＣと、Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞又はｍｂ１２及びｍｂ１８を発現するＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞との共培養を通して、ＮＫ細胞を比較する追加の実験を示す。このデータは、８人のドナーからの末梢血単核細胞を用いた１２の実験からのものである。Ｐ値を対応ｔ検定によって計算した。これらのデータは、（開始集団と比較した）ＮＫ細胞の程度の有意な増加を示す。したがって、ここに記載のいくつかの実施形態に係るコンストラクトは、ＮＫ細胞集団の有意な拡大をもたらす。Ｋ５６２細胞が複数の刺激分子を発現することにより、予想外に強力なＮＫ細胞の拡大がもたらされ、治療用途に使用できるかなり大きな集団が生じるため、この拡大はいくつかの実施形態において特に有利である。
【００７２】
実施例２−Ｋ５６２変異体により刺激されるＮＫ細胞の長期的な拡大及び機能
長期的拡大
ＮＫ細胞が拡大を継続する能力を評価した。ＰＢＭＣを、ｍｂＩＬ１５及び４−１ＢＢＬを発現する放射線照射したＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）（図４Ａ）、又はｍｂＩＬ１２（＋ｍｂ１２）（図４Ｂ）、ｍｂＩＬ１８（＋ｍｂ１８）（図４Ｃ）、若しくはｍｂＩＬ１２及びｍｂＩＬ１８の両方（＋ｍｂ１２＋ｍｂ１８）（図４Ｄ）も発現するＫ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ細胞とともに、共培養した。細胞集団の倍加を計算するために、最初に播種した細胞と比較して各培養で異なる時間間隔後に回収したＮＫ細胞の数（ＣＤ５６の発現及びＣＤ３の欠損により定義する）を計算した。ＮＫ細胞の潜在的な拡大を更新するため、新鮮な遺伝子改変Ｋ５６２細胞を２週間ごとに５：１のＫ５６２：ＮＫ比で加え、かつ最初の１週間はＩＬ−２濃度を４０  ＩＵ／ｍＬに維持し、続いてＴ細胞の枯渇後は４００ＩＵ／ｍＬに維持した。矢印は、Ｋ５６２細胞の追加にもかかわらずＮＫ細胞が拡大を停止した時点を示し、これは老化を示唆する。
【００７３】
上で論じた拡大データと同様に、これらのデータは、いくつかの実施形態において、ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬの発現が拡大の閾値をもたらす一方で、追加の刺激分子の発現が拡大の有意な増強をもたらすことを示唆している。特に、ｍｂＩＬ１２単体の発現は、ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ発現細胞を使用して達成される能力を超えてＮＫ細胞の拡大を継続する能力を変化させるようには思われなかった。しかしながら、ｍｂＩＬ１８及びｍｂＩＬ１２−ｍｂＩＬ１８の組み合わせの両方を発現するＫ５６２細胞は、ＮＫ細胞の拡大を有意に長く持続させ、各コンストラクトはほぼ２０週間にわたってＮＫ細胞の拡大を刺激した（Ｋ５６２細胞を発現するｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬよりも、〜３倍）。これは、ここに開示するいくつかの実施形態によると、一定の刺激分子の発現が予想外にＮＫ細胞の拡大を増強することを示す。さらに、いくつかの実施形態によると、複数の刺激分子の共発現は、相乗的な刺激効果をもたらし得る。
【００７４】
細胞障害性アッセイ
ＮＫ細胞の拡大に加え、拡大細胞の細胞障害性を評価して、刺激細胞の一定の操作された変異体が拡大ＮＫ細胞により高い細胞障害性を付与したか否かを判断した。
標的細胞を、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁し、カルセインＡＭ（シグマ社）で標識し、かつ９６ウェル平板プレート（コスター、コーニング、ニューヨーク州）に播いた。次いで、１０％ＦＢＳを有するＲＰＭＩ−１６４０に懸濁した拡大ＮＫ細胞を、示されているように種々のＥ：Ｔ比で加え、かつ標的細胞とともに４時間共培養した。次いで細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、かつＡｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）を使用したフローサートメトリーにより細胞障害性を計測し、種々の標的細胞の数を数え上げた（カルセインＡＭ−陽性、ヨウ化プロビジウム−陰性、及び種々の細胞の光散乱特性）。
【００７５】
図４Ｅは、培養８日後及び１５日後に示されるエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比での４時間アッセイにおける、Ｋ５６２に対するＮＫ細胞の細胞障害性の計測データを示す。最初の８日間の時点で、両方のＥ：Ｔ比において、異なるコンストラクトで刺激されたＮＫ細胞が異なる細胞障害性を示した。示したように、それらのＮＫ細胞はｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ１８コンストラクトとともに８日間拡大し、かつｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬは最大の細胞障害性を示した。興味深いことに、培養物中でさらに７日間（全体で１５日間、第２週は４４００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２とともに）培養した群は、細胞障害性における違いは減少し、すべての群がほぼ１００％の細胞障害性効果を示した。
【００７６】
図４Ｆは、培養６４日後（培養物中で９週間）のＮＫ細胞の細胞障害性に関連するデータを、示されたＥ：Ｔ比を使用して示す。これらのデータは、培養の相当な時間後でさえも、細胞障害性がなお示されることを実証する。１：１のＥ：Ｔ比では、ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ１８を発現するＫ５６２細胞を使用して拡大されたＮＫ細胞は、おおよそ３０％の細胞障害性を実証する一方で、ｍｂＩＬ１５−４１ＢＢＬ＋ｍｂＩＬ１２＋ｍｂＩＬ１８を発現するＫ５６２細胞を使用して拡大されたＮＫ細胞は、ほぼ８０％の細胞障害性を実証した。標的細胞の数が多い場合（１：２のＥ：Ｔ）、それぞれのＮＫ細胞は細胞障害性を示したが、１：１の比と比較して減少していた。これに対して、標的細胞よりも多く存在する場合（２：１のＥ：Ｔ比）、ＮＫ細胞はより高い細胞障害性を示した。これらのデータは、長期間培養する場合、ＮＫ細胞の効力が低下し得ることを示唆している（数が増加するにもかかわらず）。したがって、一部の実施形態によると、共培養期間の増加により、ＮＫ細胞の生の数（ｒａｗ  ｎｕｍｂｅｒ）が増加されるだけでなく、各ＮＫ細胞の細胞障害性効果の増加ももたらされる。したがって、一部の実施形態は、より大きなＮＫ細胞数という結果をもたらすだけでなく、拡大されたＮＫ細胞集団の各メンバーの効力が増強され、それにより全体としてより大きな臨床効果をもたらす。いくつかの実施形態によると、細胞数と結果として生じる細胞障害性効果との最適なバランスを取るために、培養期間対効力のバランスがとられている。
【００７７】
いくつかの実施形態においては、４−１ＢＢＬをコードする核酸は、以下に示す配列番号２２の核酸配列を含み、から本質的になり、又はからなる。
gaattcgccc ttccaccatg gaatacgcct ctgacgcttc actggacccc gaagccccgt       
ggcctcccgc gccccgcgct cgcgcctgcc gcgtactgcc ttgggccctg gtcgcggggc      
tgctgctgct gctgctgctc gctgccgcct gcgccgtctt cctcgcctgc ccctgggccg      
tgtccggggc tcgcgcctcg cccggctccg cggccagccc gagactccgc gagggtcccg      
agctttcgcc cgacgatccc gccggcctct tggacctgcg gcagggcatg tttgcgcagc      
tggtggccca aaatgttctg ctgatcgatg ggcccctgag ctggtacagt gacccaggcc      
tggcaggcgt gtccctgacg gggggcctga gctacaaaga ggacacgaag gagctggtgg      
tggccaaggc tggagtctac tatgtcttct ttcaactaga gctgcggcgc gtggtggccg      
gcgagggctc aggctccgtt tcacttgcgc tgcacctgca gccactgcgc tctgctgctg      
gggccgccgc cctggctttg accgtggacc tgccacccgc ctcctccgag gctcggaact      
cggccttcgg tttccagggc cgcttgctgc acctgagtgc cggccagcgc ctgggcgtcc      
atcttcacac tgaggccagg gcacgccatg cctggcagct tacccagggc gccacagtct     
tgggactctt ccgggtgacc cccgaaatcc cagccggact cccttcaccg aggtcggaat      
aactcgag                                  （配列番号２２）
【００７８】
上で開示した実施形態の特定の特徴及び態様の種々の組み合わせ又はサブコンビネーションを作成され、かつそれでも１以上の本発明の範囲内に収まることが企図される。さらに、実施形態に関連するいずれかの特定の特徴、態様、方法、特質、特性、品質、属性、要素などの本発明の開示は、ここに記載の他のすべての実施形態で使用することができる。したがって、開示された発明の様々な様式を形成するために、開示された実施形態の種々の特徴及び態様が互いに組み合わされ、又は置換され得ることを理解されたい。したがって、ここに開示する本発明の範囲は、上に記載した特定の開示された実施形態に限定されるべきものではないことを意図している。さらに、本発明は種々の修正及び代替形態が可能であるが、その特定の例が図面に示されており、かつここに詳細に説明される。しかしながら、本発明は開示された特定の形態又は方法に限定されず、反対に、本発明は種々の記載された実施形態及び添付の特許請求の範囲の精神および範囲内にあるすべての修正、同等物、及び代替物を網羅することを理解されたい。ここに開示するいずれの方法も、列挙された順序で実行される必要はない。ここに開示する方法は、医師によってとられる一定の行動を含むが、明示的に又は暗黙的に、それらの行動のサードパーティーの指示を含めることもできる。例えば、「拡大されたＮＫ細胞集団を投与すること」などの行動は、「拡大されたＮＫ細胞集団の投与を指示すること」を包含する。さらに、開示の特徴及び態様がマーカッシュ群の用語で記載されている場合、当技術分野の当業者は、開示がそれにより当該マーカッシュ群の個々のメンバー又はメンバーの下位群のいずれかの用語でも記載されていることを認識するであろう。
【００７９】
ここに開示する範囲はまた、一切の重複、部分範囲、及びそれらの組み合わせを包含する。「最大で」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「の間」などの言語は、列挙された数を包含する。「約」又は「おおよそ」などの用語が前に置かれている数字は、記載されている数字を包含する。例えば、「９０％」は「９０％」を包含する。一部の実施形態においては、少なくともの９５％の相同性は、参照配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の相同性を包含する。さらに、配列がヌクレオチド又はアミノ酸配列を「含む」と開示される場合、そのような参照は、特に明記しない限り、列挙された配列を「含む」、「からなる」又は「から本質的になる」配列も包含するものとする。
【００８０】
冠詞「その（ａ）」、「その（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」などは、反対の示唆がない限り、又はそうでなければ文脈から明らかでない限り、１以上の意味を有し得る。明細書及び特許請求の範囲において、ここで使用する語句「及び／又は」は、そのように結合された要素の「いずれか又は両方」を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で挙げられた複数の要素は、同じように解釈する必要があり、即ちそのように結合された「１以上」の要素である。「及び／又は」句で具体的に特定される要素以外に、任意で他の要素が存在し得る。明細書及び特許請求の範囲において、ここで使用するように、「又は」は上で定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、要素のリストで使用される場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的、即ち、要素のリスト及び任意でさらなるリストされていない要素を少なくとも１つ、しかし任意で複数含むと解釈されるものとする。「ただ１つ」又は「正確に１つ」などの明らかに反対を示す用語のみが、数字又は要素のリストの正確に１つの要素を含むことを指す。したがって、反対に示唆されない限り、特定の製品又は方法に１つ、１以上、又は全ての群のメンバーが存在し、利用され、又はそうでなければ関連している場合、群の１以上のメンバーの間に「又は」を包含する特許請求の範囲は、充足されているとみなされる。群の正確に１つのメンバーが存在し、利用され、又はそうでなければ所定の製品又は方法に関連する実施形態が提供される。１以上の、又は全ての群のメンバーが存在し、利用され、又はそうでなければ所定の製品又は方法に関連する実施形態が提供される。実施形態、態様、特徴、要素、若しくは特性、又はそれらの組み合わせのいずれかを明示的に除外するために、いずれの１以上の請求項も補正することができる。薬剤、組成物、量、用量、投与経路、細胞型、標的、細胞マーカー、抗原、標的化部分、又はそれらの組み合わせを除外するために、いずれの１以上の請求項も補正することができる。
【図１】
2020516238.tif 000003
【図２】
2020516238.tif 000004
【図３】
2020516238.tif 000005
【図４】
2020516238.tif 000006
【配列表】
2020516238000001.app
【国際調査報告】
2020516238.tif 000007
2020516238.tif 000008
2020516238.tif 000009
2020516238.tif 000010
2020516238.tif 000011
2020516238.tif 000012