(57)【要約】枯草菌ナットーキナーゼの部分ペプチドであって、ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列のＮ端より第２０番目アミノ酸からＣ端側の連続５０アミノ酸以上のアミノ酸配列、またはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導徃ポリペプチド、およびこのポリペプチドを含有する経口組成物。これらのポリペプチドおよび組成物は、経口投与によって糖尿病に対する治療効果を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
枯草菌ナットーキナーゼの部分ペプチドであって、ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列のＮ端より第２０番目アミノ酸からＣ端側の連続５０アミノ酸以上のアミノ酸配列、またはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導性ポリペプチド。
【請求項２】
ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列が配列番号２である請求項１のインスリン誘導性ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２のインスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物。
【請求項４】
請求項１または２のインスリン誘導性ポリペプチドを経口投与することを特徴とする糖尿病の治療方法。
【請求項５】
請求項３の経口組成物を摂取させることを特徴とする糖尿病の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  この出願の発明は、インスリン誘導性ポリペプチドと経口組成物に関するものである。さらに詳しくは、この出願の発明は、経口投与した場合にインスリン誘導・血糖値降下作用を有するポリペプチドと、このポリペプチドを含有する機能性食品や糖尿病治療薬等の組成物に関するものである。
【背景技術】  糖尿病は膵臓β細胞から分泌されるホルモンであるインスリンの絶対的不足（１型糖尿病）、あるいは相対的不足・作用不足（２型糖尿病）に起因する血糖値上昇を伴う疾患であり、先進諸国において最も大きな問題となっている生活習慣病の一種である。
治療法としてはインスリン投与が広く行われているが、急激な血糖低下作用による副作用等によって必ずしも安全なものではない。
このため、インスリンに替わる成分を用いた糖尿病治療薬の開発が進められている。このような糖尿病治療薬の成分は、各種の有機・無機化合物から広く選択されているが、タンパク質やペプチドを有効成分とする糖尿病治療薬も提案されている。例えば、ＧＬＰ−１アナログまたはそのペプチドの糖尿病治療への応用（特許文献１）、アクチビン類やその部分ペプチドを有効成分とする糖尿病治療薬（特許文献２）、β−エンドルフィンのＣ末端ペプチドを有効成分とする糖尿病治療薬（特許文献３）等が知られている。
なお、ナットーキナーゼ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）は納豆菌（枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が産生する酵素（プロテアーゼ）であり、その血栓溶解効果を利用した発明（特許文献４）が知られている。しかしながら、このナットーキナーゼとインスリン誘導および血糖値低下、あるいは高血糖改善作用との関連性は知られていない。
【特許文献】１：特開２００３−１９２６９８号公報  ２：特開２００３−１１３１１１号公報  ３：特表２０００−５１０８２１号公報  ４：特開２００２−３６０２２０号公報
【発明の開示】
タンパク質やペプチドを有効成分とする薬剤は、化合物を有効成分とする薬剤に比較して安全性の点において優れたものであるが、タンパク質やペプチドは経口投与した場合には消化器官において分解されやすいため、経口以外の投与経路（例えば血中注射）によって使用するのが一般的である。しかしながら、糖尿病は通常、日常生活を営みながら必要時に投薬治療を行うことが可能な疾患であり、過度な負担を伴う注射に頼らない、より簡便な投与形態（すなわち経口投与）を伴う糖尿病治療薬が望まれていた。
この出願の発明は、以上のとおりの事情に鑑みてなされたものであり、優れたインスリン誘導能を有するポリペプチドと、このポリペプチドを含有する組成物を提供することを課題としている。
この出願は、前記の課題を解決する第１の発明として、枯草菌ナットーキナーゼの部分ペプチドであって、ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列のＮ端より第２０番目アミノ酸からＣ端側の連続５０アミノ酸以上のアミノ酸配列、またはその配列内における複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するインスリン誘導性ポリペプチドを提供する。
この第１発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列が配列番号２であることを一つの具体的態様としている。
またこの出願は、第２の発明として、前記のインスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物を提供する。
さらにこの出願は、第３の発明として、前記第１発明のインスリン誘導性ポリペプチドを経口投与することを特徴とする糖尿病の治療方法を、第４の発明として、前記第２発明の経口組成物を摂取させることを特徴とする糖尿病の治療方法を、それぞれ提供する。
すなわちこの出願の発明者は、枯草菌ナットーキナーゼ（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ）の部分ペプチドが、糖尿病モデル動物に経口投与した場合に、優れたインスリン誘導性と、それに伴う血糖値降下作用を発揮することを見出してこの発明を完成させた。
なお、この出願の発明において、「インスリン誘導」とは広く定義され、例えば機能的にはインスリンによる血糖値の低下作用が亢進することを意味する。あるいはまた、膵臓β細胞におけるインスリン遺伝子の活性化、インスリン遺伝子から発現されたインスリン前駆体タンパク質（プロインスリン）からインスリンへの変換促進等を含めたインスリン分泌の促進を意味する。
また「タンパク質」または「ポリペプチド」とは、天然のアミド結合（ペプチド結合）または天然のアミド結合以外の残基連結によって互いに結合した複数個のアミノ酸残基から構成された分子を意味する。さらには、「ポリヌクレオチド」とは、プリンまたはピリミジンが糖にβ−Ｎ−グリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステル（ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ；またはｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が結合した１００個以上連結した分子を意味する。具体的には、プロテインをコードするゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡから転写されるｍＲＮＡ、ｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡ等である。また、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。さらに、これらのゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ、ｃＤＮＡのセンス鎖およびアンチセンス鎖も含まれる。
この出願の各発明におけるその他の用語や概念は、発明の実施形態の説明や実施例において詳しく規定する。またこの発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。例えば、この発明の薬剤の調製はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０に、遺伝子工学および分子生物学的技術はＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ，１９９５等に記載されている。さらに、この発明における用語は基本的にはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによるものであり、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。
【図面の簡単な説明】  図１はこの発明のインスリン誘導性ポリペプチド（ＮＫ１−３８１、ＮＫ２０−３８１、ＮＫ２０−３２６）をＩ型糖尿病モデルマウス（ＳＴＺマウス）に経口および尾静注した０分後および６０分後の血糖値を比較したグラフと、０分後の血糖値を１００とした場合の６０分後の血糖値の割合を比較したグラフ（右上）である。
図２はポリペプチド経口投与の８０分後までの経時的な血糖血変化を示したグラフ（左）と、各群の０分後の血糖値を１００とした場合の変化の程度を示したグラフ（右）である。
図３はＳＴＺマウスへのポリペプチド尾静注の８０分後までの経時的な血糖血変化を示したグラフ（右）と、図２の左図を対比して示す。
図４はポリペプチドを経口投与または尾静注したＳＴＺマウスのＩｎｓｕｌｉｎ２血中濃度を比較したグラフである。
図５はこの発明のインスリン誘導性ポリペプチド（ＮＫ２０−３２６）およびＰＢＳ（コントロール）をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図６はポリペプチドＮＫ２０−６９をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図７はポリペプチドＮＫ２０−１１９をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図８はポリペプチドＮＫ２０−２１９をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図９はポリペプチドＮＫ４０−２１９をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図１０はポリペプチドＮＫ２０−２１９の１／１０量をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図１１はＰＢＳ（コントロール）をＳＴＺマウスへ経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図１２はＩＩ型糖尿病モデルマウス（ｄｂ／ｄｂマウス）にＰＢＳ（コントロール）を経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
図１３はｄｂ／ｄｂマウスにポリペプチドＮＫ２０−２１９を経口投与した場合の血糖値の経時的変化を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】  第１発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、枯草菌ナットーキナーゼを構成するアミノ酸配列のＮ端より第２０番目アミノ酸からＣ端側の連続５０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるポリペプチドであって、経口投与した場合にインスリン誘導性を有し、また人為的あるいは病的に上昇した血糖値を正常レベルまで低下させる作用を有するポリペプチドである。
ナットーキナーゼには各種のものが知られており、それらを制限なく使用することができるが、この発明では、一例として配列番号２にアミノ酸配列を示したナットーキナーゼを提供する。すなわちこのこの発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、例えば配列番号２（３８１アミノ酸）におけるＮ端より第２０番目アミノ酸（Ｍｅｔ）からＣ端側の連続５０アミノ酸以上を必須として含むことを条件として、任意の長さとすることができる。またこのポリペプチドは、そのインスリン誘導能を損なわない範囲で、複数個のアミノ酸残基が欠失、付加、若しくは他のアミノ酸残基に置換した配列を有するものであってもよい。この場合の複数個とは、例えば１〜３０個程度である。ただし、Ｎ端側の第２０番目から第２６〜４０番目までのアミノ酸配列はインスリン誘導性にとって必須である。
このようなポリペプチドは、枯草菌ナットーキナーゼの公知のアミノ酸配列（例えば配列番号２、またはＧｅｎＢａｎｋ／ＡＦ３６８２８３に開示されたアミノ酸配列）に基づき、公知のペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．Ｊ．Ｓｏｌｉｄ  ｐｈａｓｅｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉ．Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｆｍｏｃ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｃ．ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，Ｐ．Ｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）によって作成することもできる。また例えばＡＢＩ４３１Ａペプチド・シンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）等を用いることによって自動的に行うこともできる。
このような合成ポリペプチドは、天然のアミド結合以外の残基連結からなるもの、あるいは天然アミノ酸残基の代わりの非天然残基からなるものであってもよい。
天然のアミド結合以外の残基連結は、例えばグルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、２官能マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の化学結合またはカップリング手段を例示することができる。また、ペプチド結合の代替となり得る連結基は、例えばケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ２−に対する−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２−ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２−Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２−Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミド、またはエステルを含む（例えば、Ｓｐａｔｏｌａ（１９８３）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｏｌ．７，ｐｐ２６７−３５７，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ｍａｒｃｅｌｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，ＮＹを参照）。
一方、非天然のアミノ酸残基は、芳香族アミノ酸については、例えばＤ−またはＬ−ナフィルアラニン（ｎａｐｈｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−またはＬ−２チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−１，−２，３−または４−ピレネイルアラニン（ｐｙｒｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−３チエネイルアラニン（ｔｈｉｅｎｅｙｌａｌａｎｉｎｅ）；Ｄ−またはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−またはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−またはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−またはＬ−２インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−またはＬ−アルキルアラニン（ａｌｋｙｌａｌａｎｉｎｅ）であって、アルキルが置換されたかまたは未置換のメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、２級−イソチル（ｉｓｏｔｙｌ）、イソ−ペンチル、または非酸性アミノ酸による置換によって生成することができる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾイル、チオフェニル、ピラゾイル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリル、およびピリジル芳香環を含む。酸性アミノ酸の場合には、例えば負の電荷を維持している非カルボン酸塩アミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化トレオニンによる置換によって生成することができる。カルボキシル側基（例えば、アスパルチルまたはグルタミル）もまた、例えば１−シクロヘキシル−３（２−モルフォリニル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトールペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾することができる。アスパルチルまたはグルタミルもまた、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換可能である。塩基性アミノ酸としては、例えば（リシンおよびアルギニンに加えて）アミノ酸、オルニチン、シトルリン、または（グアニジノ）−酢酸、またはアルキルが前文に定義されている（グアニジノ）アルキル酢酸による置換によって生成することが可能である。ニトリル誘導体（例えば、ＣＯＯＨの代わりにＣＮ−部分を含んでいる）は、アスパラギンまたはグルタミン用に置換することが可能である。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基に対して脱アミノ基を行うことが可能である。非天然のアルギニン残基は、アルギニルを、例えば１以上の、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンヂオン、またはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ性の条件下に反応させることにより生成することができる。チロシン残基の場合は、チロシルを、例えば芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより生成することができる。Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンは、各々Ｏ−アセチルチロシル類および３−ニトロ誘導体を用いて形成することができる。非天然システイン残基は、システイニル残基を、２−クロロ酢酸などのα−ハロアセテート、またはクロロアセトアミドおよび相当するアミンと反応させ；カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生じさせることにより生成することができる。非天然システイン残基はまた、システイニル残基を、例えばブロモートリフルオロ酢酸、α−ブロモ−β−（５−イミダゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルスルフィド；ｐ−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；または、クロロ−７−ニトロベンゾ−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより生成することができる。非天然リジンは、リシニルを、例えば無水コハク酸または他の無水カルボン酸と反応させることにより生成する（またアミノ末端残基が変更される）ことができる。リジンおよび他のα−アミノ−含有残基模倣物はまた、メチルピコリンイミダート、ピリドキサールホスファート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンアスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４ペンタンジオンといったイミドエステルを用いた反応、およびトランスアミダーゼに触媒されるグリオキシラートを用いた反応により生成することができる。非天然メチオニンは、例えば、メチオニンスルホキシドを用いた反応により生成することができる。非天然プロリンは、例えばピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−または４−ヒドロキシプロリン、デヒドロキシプロリン、３−または４−メチルプロリン、または３，３，−ジメチルプロリンを含む。非天然ヒスチジンは、ヒスチジルを、例えばジエチルプロカルボナートまたはパラーブロモフェナシルブロミドと反応させることにより生成することができる。他の非天然のアミノ酸残基は、例えば、プロリンおよびリジンの水酸化；セエリルまたはトレオニル残基の水酸基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのα−アミノ基のメチル化；Ｎ−末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはＮ−メチルアミノ酸による置換；またはＣ−末端のカルボキシル基のアミド化等を例示することができる。
この発明のインスリン誘導性ポリペプチドはまた、それをコードするポリヌクレオチドを利用した遺伝子工学的方法によっても得ることができる。例えば、ポリヌクレオチドを保有する組換え発現ベクターからインビトロ転写によってＲＮＡを調製し、これを鋳型としてインビトロ翻訳を行うことにより目的のインスリン誘導性ポリペプチドを得ることができる。また組換え発現ベクターを大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞に導入して形質転換細胞を作製すれば、この形質転換細胞からインスリン誘導性ポリペプチドを発現させることができる。
インスリン誘導性ポリペプチドを遺伝子工学的に発現させるためのポリヌクレオチドは、枯草菌ナットーキナーゼをコードする公知の配列（例えば配列番号１）を利用してナットーキナーゼｃＤＮＡを取得し（例えば、ｃＤＮＡライブラリーに対するプローブハイブリダイゼーションや、ＰＣＲ法）、このナットーキナーゼｃＤＮＡからインスリン誘導性ポリペプチドのコード領域を制限酵素等によって切り出して使用することができる。あるいは、インスリン誘導性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の方法（例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号）に記載されているような周知の化学合成技術により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて合成することができる。
これらのポリヌクレオチドを使用してインスリン誘導性ポリペプチドをインビトロ翻訳で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有するベクターに挿入して組換え発現ベクターを作製し、このベクターを、プロモーターに対応するＲＮＡポリメラーゼを含むウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物などのインビトロ翻訳系に添加すれば、目的のポリペプチドをインビトロで生産することができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７、Ｔ３、ＳＰ６などが例示できる。これらのＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含むベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＴ３／Ｔ７  １８、ｐＴ７／３  １９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩなどが例示できる。
インスリン誘導性ポリペプチドを大腸菌などの微生物で発現させる場合には、微生物中で複製可能なオリジン、プロモーター、リボソーム結合部位、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有するベクターにポリヌクレオチドを組換えた発現ベクターを作製し、この発現ベクターで宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、そのポリヌクレオチドがコードしているポリペプチドを微生物において大量発現させることができる。この際、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させた後、目的のポリペプチドを分離して得ることもできる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。
インスリン誘導性ポリペプチドを真核細胞で発現させる場合には、ポリヌクレオチドを、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターに挿入して組換えベクターを作製し、真核細胞内に導入すれば、目的のポリペプチドを形質転換真核細胞で発現させることができる。発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２などが例示できる。また、ｐＩＮＤ／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−２、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１、ｐＥＧＦＰ−Ｃ１などを発現ベクターとして用いれば、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質としてポリペプチドを発現させることもできる。真核細胞としては、サル腎臓細胞ＣＯＳ７、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯなどの哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが一般に用いられるが、目的のポリペプチドを発現できるものであれば、いかなる真核細胞でもよい。発現ベクターを真核細胞に導入するには、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法など公知の方法を用いることができる。
インスリン誘導性ポリペプチドを原核細胞や真核細胞で発現させたのち、培養物から目的ペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば、尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなどが挙げられる。
以上のとおりのインスリン誘導性ポリペプチドは、それ単独で、経口薬剤に製剤化することができる。また、その場合は、ポリペプチドを「塩」の形態としてもよい。塩は、例えば、製薬上許容される酸（無機酸または有機酸）付加塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、安息硝酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、トレエンスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等である。
この出願の第２発明は、前記のインスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物である。この組成物は、口腔から摂取されて消化器官において吸収される形態からなる組成物、例えば、飲食部や経口医薬品等である。さらに具体的には、糖尿病の予防や症状の軽減のための機能性食品、健康補助食品、栄養食品、栄養補助食品等、あるいは糖尿病の治療用薬剤である。なお、この発明のインスリン誘導性ポリペプチドは、食品として広く摂取されている納豆に含まれるナットーキナーゼの一部分であるから、飲食品や薬剤の成分としての安全性には全く問題はない。
糖尿病治療薬としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉末剤、または懸濁剤やシロップ剤のような経口液体調製物等に製剤化することが好ましい。担体としては、常用の製薬補助剤、例えば結合剤（シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫酸ナトリウム等）を使用することができる。ストロベリー・フレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加することもできる。また錠剤は常法によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶液またはドライプロダクトにすることができる。そのような経口液剤は常用の添加剤、例えば保存剤（ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン酸等）を包含していてもよい。
薬効成分であるインスリン誘導性ポリペプチドの含有量は症状の程度や剤形に応じて適宜とすることができるが、通常は５〜１００％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜６０％（ｗ／ｗ）の範囲とすることができる。また薬剤の投与量は、患者の年齢や体重、症状等によって異なるが、インスリン誘導性ポリペプチド量として１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ程度とすることができる。
飲食物等の組成物の場合には、既存の製品製造の過程で、インスリン誘導性ポリペプチドを、その活性を損なわないように配合して製造することができる。そのような飲食物の例としては、例えば、清涼飲料、栄養飲料、果実飲料、乳酸飲料などの飲料（これらの飲料を調整する為の濃縮原液および／または調整粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベットなどの冷菓；そば、うどん、パン、餅、餃子の皮など、穀物の加工品；飴、キャンディー、チョコレート、スナック菓子、ビスケット、クッキー、クラッカー、ゼリー、ジャムなど、菓子類；かまぼこ、はんぺん、ハム、ソーセージなど、水産、畜産加工食品；加工乳、チーズ、バターなど、乳製品；マーガリン、ラード、マヨネーズなど、油脂および油脂加工食品；醤油、ソース、味噌、ポン酢、昆布だし、スープの素など、調味料；各種惣菜類；漬物類；その他の各種形態の栄養および健康補助食品などが挙げられるが、勿論これらに限定されるものではない。
以上のようなインスリン誘導性ポリペプチドからなる治療薬剤や、インスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物は、糖尿病患者等の血糖値を正常化し、耐糖能障害、糖尿病（ＩＩ型糖尿病など）、インスリン抵抗性症候群（インスリン受容体異常症など）、多嚢胞性卵巣症候群、高脂質血症、アテロー厶性動脈硬化症、心臓血管疾患（狭心症、心不全など）、高血糖症、高血圧症、狭心症、肺高血圧、鬱血性心不全、糖尿病合併症（例えば糖尿病性壊疽、糖尿病性関節症、糖尿病性糸球体硬化症、糖尿病性皮膚障害、糖尿病性神経障害、糖尿病性白内障、糖尿病性網膜症など）、或いは、皮膚障害、味覚障害などの予防や治療に効果を有する。
【実施例】  以下、実施例を示してこの出願の発明についてさらに詳細に説明するが、この出願の発明は以下の例によって限定されるものではない。
［実施例１］
（１）組換えナットーキナーゼ（ＮＫ）のｃＤＮＡクローニング
納豆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｎａｔｔｏ）からＤｎｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＵＩＡＧＥＮ社）を用いてゲノムＤＮＡを調製し、これを鋳型として全長ＫＮ遺伝子ｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した。具体的には、公知のＮＫ  ｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ／ＡＹ２１９９０１：配列番号１）に基づきＰＣＲプライマーを設計し、ゲノムＤＮＡを鋳型とて、ＫＯＤｐｌｕｓ（ＴＯＹＯＢＯ社）によりＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物の分子量を電気泳動により確認後、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）にクローニングし、配列を確認した。
（２）ＮＫポリペプチドの作製
インビトロ転写・翻訳系（無細胞系）にてポリペプチドを作製した。ＴＯＹＯＢＯ社製ＰＲＯＴＥＩＯＳ  Ｗｈｅａｔ  ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ−ｔｒｅｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｏｒｅ  ｋｉｔに添付されているｐＥＵ３−ＮＩＩベクターのＥｃｏＲＶ／ＸｈｏＩ部位に、終止コドンを除去してＨｉｓタグ配列を付加した４種類のＮＫ  ｃＤＮＡをそれぞれ挿入した。すなわち、３８１アミノ酸からなる全長ＮＫポリペプチド（ＮＫ１−３８１）をコードするｃＤＮＡ、全長ＮＫのＮ端から１９アミノ酸を削除したＮＫポリペプチド（ＮＫ２０−３８１）をコードするｃＤＮＡ、全長ＮＫのＮ端から１９アミノ酸、Ｃ端から５５アミノ酸を削除したＮＫポリペプチド（ＮＫ２０−３２６）をコードするｃＤＮＡをそれぞれインサートとする発現ベクターを構築した。
次いで、ＴＯＹＯＢＯ社製Ｔｈｅｒｍｏ  Ｔ７  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（１５０Ｕ）を３７℃で４時間反応させてｍＲＮＡを転写させ、電気泳動にて確認の後、転写されたｍＲＮＡ（１２μｇ）を用いて２６℃２４時間の翻訳反応により４種類のポリペプチドを得た。得られたポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて電気泳動の後、クマーシーブルー染色により確認した。また、Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより融合ポリペプチドを確認した。
（３）ＮＫポリペプチドの経口投与（Ｉ）
５週齡のＣ５７ＢＬ／５雄性マウスにＳＴＺ（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｄｏｃｉｎ）２ｍｇを腹腔投与し、１型糖尿病（インスリン欠乏型）モデルマウスを作成した。１２週齢で３時間の絶食後の血糖値が約４００ｍｇ／ｄｌに達したものを用いた。１８時間絶食させ、空腹時の血糖値を測定した後に、２ｇ／ｋｇの糖負荷（胃ゾンデによる砂糖水の経口投与）を行った。血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキャピラリーを用いて採血を行い、グルテストエース（ＧＴ−１６４０：三和化学研究所製）によって測定した。糖負荷３０分後に血糖値が上昇したことを確認し、ＮＫポリペプチド（ＮＫ１−３８１、ＮＫ２０−３８１、ＮＫ２０−３２６）をＳＴＺマウスに経口投与した。なお、ポリペプチドはＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）に懸濁し、１匹当たり約０．５μｇ／５０μｌを投与した。その後は２０分ごとに１２０分後まで血糖値を測定し、測定の終了したマウスは心臓採血により全血を採取した。
また、ＳＴＺマウスに対して、各ポリペプチドを静脈（尾静脈）注射（約０．５μｇ／５０μｌ）した。試験時間は、マウスの絶食時間が２４時間であったこと、および静脈注射後の血糖値測定が３０分後および６０分後であったことを除き、前記経口投与と同一である。
結果は、図１−３に示したとおりである。図１は、ポリペプチド（ＮＫ１−３８１、ＮＫ２０−３８１、ＮＫ２０−３２６）を経口および尾静注した０分後および６０分後の血糖値を比較したグラフである。この図１から明らかなように、ポリペプチドは、尾静注に比較して、経口投与の場合に有意に６０分後の血糖血を低下させた。この結果は、ポリペプチド投与の８０分後までの経時的な血糖血変化を示した図２（経口投与）および図３（尾静注）の結果からも明らかである。なお、図２に示したように、経口投与の場合には、ＮＫ２０−３８１、ＮＫ１−３８１、ＮＫ２０−３２６の順番で血糖値が低下したが、有意な差は見いだせなかった。
さらに、マウスから採取した全血を対象として、ＥＬＩＳＡによりＩｎｓｕｌｉｎ２の血中濃度を測定した。その結果、図４に示したように、特にＮＫ２０−３８１の経口投与によって血中インスリン濃度が極めて高くなることが確認された。
（４）ＮＫポリペプチドの経口投与（ＩＩ）
ＳＴＺ投与による１型糖尿病モデルマウス（Ｃ５７ＢＬ／６：６、８週齡、体重１７−１９ｇ：１９時間絶食後の血糖値５００ｍｇ／ｄｌ以上、インスリン検出下限以下：各群５匹）を用いて、インスリン誘導性ポリペプチドの効果を試験した。ポリペプチドとしては、ＮＫ２０−３２６を使用した。このポリペプチドＮＫ２０−３２６を、ＰＢＳに懸濁し、４０μｇ／０．２ｍｌの投与量でＳＴＺマウスに経口投与した。具体的には、１９時間絶食後、２ｇ／ｋｇの糖負荷の３０分後にポリペプチドＮＫ２０−３２６を経口投与し、１時間後、２時間後、４時間後、８時間後の血糖値を測定した。コントロールとしては０．２ｍｌのＰＢＳをサンプルと同一条件で投与し、同一時間経過で血糖値を測定した。
表１（左上）は５匹のＳＴＺマウスの体重であり、表１（右上）はＮＫ２０−３２６投与直前の血糖値（ｍｇ／ｄｌ）を示す。表１の他は、ＮＫ２０−３２６投与１時間後（左中）、２時間後（右中）、４時間後（左下）、８時間後（右下）における各マウスの血糖値である。表２は、コントロール（ＰＢＳ経口投与）の結果を表１と同様に示した。さらに図５は表１および表２の結果をグラフ化したものである。
この表１、２および図５に示したとおり、この発明のインスリン誘導性ポリペプチドＮＫ２０−３２６を経口投与されたＳＴＺマウスは、コントロールと比較して有意（ｔテスト：ｐ＜０．０５）に血糖値を低下させた。
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（５）比較試験
ヒト・インスリン（４００ｎｇ／匹）を経口または皮下投与、ナットウキナーゼ（粗精製品：純度４０％以下）の２００ｍｇ／ｋｇを経口投与、ナットーキナーゼ（精製品：純度６５％程度）の１ｍｇ／ｋｇを経口または皮下投与、リコンビナントプロテイン合成キットの培地（８／８サンプル）の０．２ｍｌを経口または皮下投与を行った以外は、前記（３）と同一の条件でＳＴＺマウスの血糖値変化を測定した。
その結果、これらの物質を経口または皮下投与した場合には、血糖血は全く低下しなかった。
［実施例２］
（１）ＮＫポリペプチドの作製
ＮＫポリペプチド（ＮＫ２０−６９、ＮＫ２０−１１９、ＮＫ２０−２１９、ＮＫ４０−２１９）をコードするｃＤＮＡを調製し、実施例１（２）と同様にしてインスリン誘導性ＮＫポリペプチドを作製した。
（２）ＮＫポリペプチドの経口投与
６週齢のＣ５７ＢＬ／５雄性マウス（ＳＬＣ）にＳＴＺ（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｄｏｃｉｎ）１９５ｍｇ／ｋｇを腹腔投与し、１型糖尿病（インスリン欠乏型）モデルマウスを作成した。３時間の絶食後の血糖値が約４００ｍｇ／ｄｌに達したものを用いた。１８時間絶食させ、空腹時の血糖値を測定した後に、２ｇ／ｋｇの糖負荷（胃ゾンデによる砂糖水の経口投与）を行った。血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキャピラリーを用いて採血を行い、グルテストエース（ＧＴ−１６４０：三和化学研究所製）によって測定した。糖負荷３０分後に血糖値が上昇したことを確認し、ＮＫポリペプチドの各々をＳＴＺマウスに経口投与した。なお、ポリペプチドはＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）に懸濁して１００ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、０．２ｍｌ／匹を投与した。また、コントロールとしてＰＢＳ＋ＢＳＡをＮＫポリペプチドと同量投与した。その後は３０分ごとに４時間後まで血糖値を測定した。
結果は図６−１１に示したとおりである。図６に示したＮＫ２０−６９はコントロール（図１１）と比較して有意な血糖値低下作用は示さなかった。これに対してＮＫ２０−１１９（図７）、ＮＫ２０−２１０（図８）はそれぞれコントロールと比較して有意（ｐ＜０．０５）な血糖値低下作用を示した。ただし、ＮＫのＮ端３９アミノ酸を欠失したＮＫ４０−２１９には、１／１量（図９）でも１／１０量（図１０）でも有意な血糖値低下作用は観察されなかった。
以上の結果から、Ｎ端の第２０番目アミノ酸からＣ端側の５０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるＮＫポリペプチドにインスリン誘導性（血糖値低下作用）があることが確認された。またＮＫ４０−２１９が血糖値低下作用を示さなかったことから、Ｎ端２０−３９アミノ酸領域が必須の活性領域であることも確認された。
［実施例３］
（１）ＮＫポリペプチドの作製
実施例１（２）と同様にしてインスリン誘導性ＮＫポリペプチドＮＫ２０−２１９を作製した。
（２）ＮＫポリペプチドの経口投与
６週齡のＣ５７ＢＬ  ｄｂ／ｄｂ雄性マウス（日本クレア：Ｉ型糖尿病モデルマウス）を、３時間の絶食後の平均血糖値が約４００ｍｇ／ｄｌとなるように群分けした。１８時間絶食させ、空腹時の血糖値を測定した後に、２ｇ／ｋｇの糖負荷（胃ゾンデによる砂糖水の経口投与）を行った。血糖値はマウスの眼窩静脈叢からキャピラリーを用いて採血を行い、グルテストエース（ＧＴ−１６４０：三和化学研究所製）によって測定した。糖負荷３０分後に血糖値が上昇したことを確認し、ＮＫポリペプチドＮＫ２０−２１９をｄｂ／ｄｂマウスに経口投与した。なお、ポリペプチドはＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ）に懸濁して１００ｍｇ／ｍｌとなるように調製し、０．２ｍｌ／匹を投与した。また、コントロールとしてＰＢＳをＮＫポリペプチドと同量投与した。その後は１、２、４時間後まで血糖値を測定した。
結果は図１２、１３に示したとおりである。すなわち図１２に示したとおり、ＩＩ型糖尿病マウスにおいては、ＰＢＳ（コントロール）を経口投与しても血糖値の低下は全く観察されなかった。これに対して、ＮＫポリペプチド（ＮＫ２０−２１９）は、図１３に示したとおりに顕著な血糖値低下作用を示した。
以上の結果から、この発明のインスリン誘導性ポリペプチドはＩＩ型糖尿病に対しても有効な治療効果を有することが確認された。
【産業上の利用可能性】  以上詳しく説明したとおり、この発明によって、インスリンを効果的に誘導して血糖値を低下させることができ、しかも経口投与することのできる、糖尿病等の予防、改善および治療に有効な薬剤および組成物が提供される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月27日(2006.2.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】請求の範囲
【請求項１】枯草菌ナットーキナーゼの部分ペプチドであって、ナットーキナーゼを構成する配列番号２のアミノ酸配列の第２０番目アミノ酸からＣ端側の連続５０アミノ酸以上のアミノ酸配列からなるインスリン誘導性ポリペプチド。
【請求項２】（削除）
【請求項３】請求項１のインスリン誘導性ポリペプチドを含有する経口組成物。
【請求項４】請求項１のインスリン誘導性ポリペプチドを経口投与することを特徴とする糖尿病の治療方法。
【請求項５】請求項３の経口組成物を摂取させることを特徴とする糖尿病の治療方法。
【国際調査報告】
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