(57)【要約】  本発明は、微生物腐食（ＭＩＣ）に関与する細菌生物の迅速な検出のための低密度バイオチップおよび方法に関する。プローブは、ａｐｒ、ｄｓｒ、ヒドロゲナーゼ、１６Ｓ、ｍｃｒ、シンテターゼ、または亜硝酸／硝酸還元酵素遺伝子に結合することによって、一般に硫酸還元菌（ＳＲＢ）、ならびにＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、具体的には古細菌、金属還元菌（ＭＲＢ）、発酵性細菌（ＦＢ）、および硝酸還元菌（ＮＲＢ）に結合するように設計されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の腐食を引き起こす細菌の検出、同定、または定量化に好適なオリゴヌクレオチドプローブセットであって、表１、表３、表４、表５、またはそれらの任意の組み合わせからの複数のプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項２】
前記プローブが、ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）を含む、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項３】
前記セットの前記プローブが、バイオチップ上の識別可能な位置に固定化されている、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項４】
ポジティブコントロールプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）をさらに含む、請求項１に記載のプローブセット。
【請求項５】
細菌群集組成を決定するための方法であって、前記方法が、
（ａ）解析される標的ＤＮＡを提供するステップと、
（ｂ）前記標的ＤＮＡに第１の増幅を施すステップと、
（ｃ）増幅された標的ＤＮＡを断片化するステップと、
（ｄ）断片化された標的ＤＮＡに第２の増幅ステップを施し、前記標的ＤＮＡを標識するステップと、
（ｅ）標識された標的ＤＮＡの前記断片を、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むバイオチップにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットに対する標的ＤＮＡ断片のハイブリダイゼーション効率を定量化するステップであって、＞１．５のハイブリダイゼーション効率が、ハイブリダイゼーションの成功を示す、定量化するステップと、を含む、方法。
【請求項６】
標的ＤＮＡが、一本鎖である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブが、固体支持体上に固定化されている、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも２１個のプローブのハイブリダイゼーションが、腐食を引き起こす細菌の活性の指標である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
微生物腐食（ＭＩＣ）に関連する細菌を検出するための、固体支持体上に固定化された、表１、表３、表４、表５、またはそれらの任意の組み合わせからのオリゴヌクレオチドプローブを含む、バイオチップ。
【請求項１０】
前記細菌が、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、メタン生成古細菌、古細菌）、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＮＲＢからなる群から選択される、請求項９に記載のバイオチップ。
【請求項１１】
前記プローブが、ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、および１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、８４、および３６）からなる群から選択される、請求項９に記載のバイオチップ。
【請求項１２】
前記固体支持体が、３Ｄマトリックス材料を含む、請求項９に記載のバイオチップ。
【請求項１３】
前記３Ｄマトリックス材料が、デンドリマーである、請求項９に記載のバイオチップ。
【請求項１４】
解析用のＤＮＡサンプルを調製する方法であって、
（ａ）前記ＤＮＡサンプルを増幅するステップと、
（ｂ）前記増幅されたＤＮＡを精製するステップと、
（ｃ）前記精製および増幅されたＤＮＡを断片化するステップと、
（ｄ）前記断片化および増幅されたＤＮＡを精製するステップと、
（ｅ）前記精製されたＤＮＡを再度増幅し、前記ＤＮＡを標識するステップと、
（ｆ）ステップｅ）の前記標識されたＤＮＡとプローブのセットとをハイブリダイズさせるステップと、を含む、方法。
【請求項１５】
（ａ）を、２５℃で４時間実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記精製および増幅されたＤＮＡを断片化することが、Ｔ＾ＴＡＡ部位を認識する制限酵素によって実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製および増幅されたＤＮＡを断片化することが、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅまたはＳａｑＡＩを使用して実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ハイブリダイゼーションを、２５℃で４時間実施する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中の腐食を引き起こす細菌を検出、同定、および／または定量化するアッセイを実施するのに好適なキットであって、前記キットが、ａ）請求項１に記載のプローブ、および任意選択に、ｂ）前記アッセイを実施するのに必要な追加の試薬または組成物を含む、キット。
【請求項２０】
前記腐食を引き起こす細菌が、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ）、メタン生成古細菌、古細菌、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＮＲＢからなる群から選択される、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
ポジティブコントロールプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）をさらに含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記追加の試薬または組成物が、サンプル緩衝液、反応緩衝液、酵素ミックス、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ反応緩衝液、ヌクレオチドミックス、１Ｍ  ＧｕＳＣＮ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）のうちの１つ以上を含む、請求項１９に記載のキット。
【請求項２３】
腐食に関連する細菌の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブセットであって、
ａ）ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、およびＤｖ１６Ｓ＿１（配列番号１、４、５〜７、８４、８、８０、９〜１１）からなる群から選択されるプローブ、
ｂ）ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、およびＡＲＣ１６ＳＲＮＡ（配列番号１３〜１６）からなる群から選択されるプローブ、
ｃ）Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、および１６ＳＲＮＡ  ＰＲ（配列番号１７〜１８、２０〜２２、および２４）からなる群から選択されるプローブ、
ｄ）ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、およびＥ．ｃｏｌｉ（配列番号２５〜２８）からなる群から選択されるプローブ、
ｅ）ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号２９〜３２）からなる群から選択されるプローブ、ならびに
ｆ）１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）からなる群から選択されるプローブ、のうちの少なくとも１つ以上を含む、オリゴヌクレオチドプローブセット。
【請求項２４】
サンプル中の腐食を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを取得することと、
（ｂ）前記ＤＮＡを、次のプローブ：ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）のうちの１種以上と接触させること、ならびに前記ＤＮＡと個々のプローブとの間のハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって、前記サンプル中に腐食を引き起こす細菌が存在するかどうかを検出することと、
（ｃ）少なくとも１種の腐食を引き起こす細菌の前記存在が検出されるとき、腐食の前記存在を確立することと、を含む、方法。
【請求項２５】
前記サンプルが取得された表面または液体環境において、ｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡからなる群から選択される硝酸または亜硝酸還元酵素遺伝子を含む、１種以上の硝酸還元菌（ＮＲＢ）の量を増加させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
サンプル中の腐食感受性を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）ＤＮＡサンプルを取得することと、
（ｂ）前記ＤＮＡサンプルを、次のプローブ：ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）のうちの１種以上と接触させること、ならびに前記ＤＮＡサンプルと個々のプローブとの間のハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって、ＤＮＡサンプル中に腐食を引き起こす細菌が存在するかどうかを検出することと、
（ｃ）少なくとも１種の腐食を引き起こす細菌の前記存在が検出されるとき、腐食感受性の前記存在を確立することと、を含む、方法。
【請求項２７】
前記サンプルが取得された表面または液体環境において、ｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡからなる群から選択される硝酸または亜硝酸還元酵素遺伝子を含む、１種以上の硝酸還元菌（ＮＲＢ）の量を増加させることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中の腐食を引き起こす微生物を検出する方法であって、前記方法が、
（ａ）前記サンプルからＤＮＡを取得することと、
（ｂ）前記ＤＮＡを、（ｉ）１種以上の還元酵素、（ｉｉ）１種以上のヒドロゲナーゼ、および／または（ｉｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする１つ以上の遺伝子にハイブリダイズする１種以上のプローブと接触させることによって、前記サンプル中の腐食を引き起こす微生物を検出することと、を含む、方法。
【請求項２９】
前記１種以上の還元酵素が、亜硝酸還元酵素、および／または硝酸還元酵素を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記１種以上のヒドロゲナーゼが、ペリプラズムＮｉＦｅ−ヒドロゲナーゼ、膜結合ＮｉＦｅ−ヒドロゲナーゼ、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ補助タンパク質ＨｙｐＢ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記遺伝子が、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝子が、ｍｃｒ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記遺伝子が、ｍｃｒ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙａＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子が、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、ｈｙａＡ、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記遺伝子が、ｄｓｒ、ａｐｒ、ｈｙｎＢ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記遺伝子が、ｄｓｒ、ａｐｒ、ｈｙｎＢ、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、ｈｙａＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記遺伝子が、古細菌由来のメチル補酵素Ｍ還元酵素、金属還元菌（ＭＲＢ）由来のヒドロゲナーゼ、発酵性細菌（ＦＢ）由来のｆｔｈｆ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、ｈｙｄＡ、硝酸還元菌（ＮＲＢ）由来のｎａｒＧ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｐＡ、およびＥ．ｃｏｌｉ由来のｈｙａＡ、のうちの１種以上をコードする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
前記腐食を引き起こす微生物が、硫酸還元菌（ＳＲＢ）、メタン生成古細菌、硝酸還元菌（ＮＲＢ）、金属還元菌（ＭＲＢ）、発酵性細菌（ＦＢ）から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記腐食を引き起こす微生物が、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、メタン生成古細菌、古細菌）、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＮＲＢ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プローブが、配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４、のうちの１つ以上を含む、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１７年４月１２日に出願の米国仮特許出願第６２／４８４，６７２号に対する優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子データ提出された配列表を包含する。２０１７年４月１１日に作成され、２０１８年３月１４日に更新された当該ＡＳＣＩＩの写しの名称は、００５０１−００４１９３−ＷＯ０＿ＳＴ２５．ｔｘｔであり、サイズは２２，４８０バイトである。
【０００３】
本発明は、微生物腐食（ＭＩＣ）に関与する細菌生物の迅速な検出のための低密度バイオチップおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
微生物群集の構造および組成、ならびに有毒汚染、気候変化、農業的および産業的な慣行などの環境変動への応答を理解することは、望ましい生態系機能の維持および回復に重要である。しかしながら、生物の非常に高い多様性に起因して、環境的または産業的サンプル中の微生物群集の検出、特性評価、および定量化は、環境生物学者にとって、非常に困難な任務である。微生物群集を研究するための従来の培養ベースの濃縮技法は困難であることが立証されており、天然の種の大部分を培養することができないため、結局のところ、非常に限られた微生物群集の多様性およびダイナミクスの観点のみを提供している。培養することができる細菌であっても、ＭＩＣを引き起こす主な細菌（硫酸還元菌（ＳＲＢ））の成長速度では、典型的には培養に３〜５週間を必要とする。核酸ベースの技法の開発および応用により、培養に依存する方法への依存が大幅に排除され、結果的に、自然の生息地での微生物の検出および特性評価が大幅に進歩した。しかしながら、従来の核酸ベースの検出方法の限界があり、特にＭＩＣの状況下では、複雑な微生物群集を監視するための、高スループットかつ費用対効果の高い評価ツールとして容易に順応させることが阻まれている。
【０００５】
ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドベースのマイクロアレイ技術は、研究者が包括的かつ動的な分子の観点から生細胞の生理機能を観察することを可能にする強力な機能ゲノミクスツールである。多孔質膜を用いる従来の核酸ハイブリダイゼーションと比較して、スライドガラスベースのマイクロアレイ、ならびに３Ｄアレイは、高密度、高感度、迅速な（「リアルタイム」）検出、自動化、低バックグラウンドレベルの追加の利点を提供する。環境内の標的機能遺伝子は非常に多様である傾向があり、保存されたＤＮＡ配列領域を同定して、ハイブリダイゼーション用のオリゴヌクレオチドプローブまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅用のプライマーを設計することは困難であり、時には実験的にでさえも不可能である。しかしながら、マイクロアレイベースのアプローチでは、同じ機能グループの異なる集団由来の多様な遺伝子配列のすべてをアレイ上で作製し、環境サンプルの対応する分布を監視するプローブとして使用することができるため、そのような配列保存を必要としない。
【０００６】
マイクロアレイ技術は、純粋培養でのグローバルな遺伝子発現の解析への使用に成功しているが、十分な特異性、感度、および定量化する力を複雑かつ極端な環境研究での使用にうまく順応することができるかどうかは不明である［２４］。まず、環境サンプルでは、標的およびプローブの配列は非常に多様であり得、多様な環境サンプルで使用されるマイクロアレイの性能が、純粋な培養サンプルのものと同様かどうか、および配列の分岐がマイクロアレイのハイブリダイゼーションにどのように影響するかは不明である。第２に、純粋培養とは異なり、環境サンプルは一般に、腐植質、有機汚染物質、金属などの物質で汚染されており、これらが核酸ベースの分子検出に干渉し得る。第３に、純粋培養とは対照的に、環境サンプル中の回収可能なバイオマスは、一般に低い。マイクロアレイハイブリダイゼーションが環境サンプル中の微生物を検出するのに十分に高感度であるかどうかは不明である。最後に、マイクロアレイベースのハイブリダイゼーションは本質的に高い変動性を有するため、マイクロアレイベースの検出が定量的であることができるかどうかは定かではない。環境および生態学的研究では、多くの場合、特定の微生物グループの有無を検出するだけでなく、インサイチュな生物活性に関する定量的データを提供する実験ツールを必要とする。
【０００７】
配列されているプローブのタイプに基づいて、環境研究で使用されるマイクロアレイは、機能遺伝子アレイ（ＦＧＡ）、群集ゲノムアレイ（ＣＧＡ）、および系統的オリゴヌクレオチドアレイの３つの主なクラスに分類することができる。ＦＧＡは、炭素固定、硝化、脱窒、硫酸還元、汚染物質の劣化など、様々な生態学的および環境的プロセスに関与する重要な酵素をコードする遺伝子に対応するプローブを含有している［１−３］。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片と機能遺伝子に由来するオリゴヌクレオチドとの両方を使用して、ＦＧＡを作製することができる。したがって、ＰＣＲ産物ベースのＦＧＡ、ならびにオリゴヌクレオチドベースのＦＧＡがある。これらのタイプのアレイは、自然環境における微生物群集の生理学的状態および機能的活動の研究に有用である。ＣＧＡは、純粋培養微生物から単離した全ゲノムＤＮＡを使用して構築されており、その培養可能な要素の観点から微生物群集を説明するために使用することができる［４］。系統的オリゴヌクレオチドアレイは、ｒＲＮＡ遺伝子由来の短い合成オリゴヌクレオチドで構築されており、環境サンプル中の微生物群集の組成および構造の系統解析に使用することができる［５］。
【０００８】
したがって、比較的迅速かつ安価な様式で、微生物群集、特にＭＩＣなどの環境においてより少ない集団の定量的かつ高感度な解析を可能にするであろう新規のマイクロアレイベースの方法が望ましい。
【発明の概要】
【０００９】
ある特定の実施形態では、本開示は、表１、表３、表４、表５、またはそれらの任意の組み合わせからの複数のプローブを含む、サンプル中の腐食を引き起こす細菌の検出、同定、または定量化に好適なオリゴヌクレオチドプローブセットに関する。ある特定の実施形態では、プローブは、表２に例示されているカセットのうちの１つ以上の組み合わせに組み合わせることができる。
【００１０】
ある特定の実施形態では、プローブは、ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）を含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、セットのプローブは、バイオチップ上の識別可能な位置に固定化されている。
【００１２】
ある特定の実施形態では、プローブセットは、ポジティブコントロールプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）をさらに含む。
【００１３】
追加の実施形態では、本開示は、細菌群集組成を決定するための方法に関し、当該方法が、
（ａ）解析される標的ＤＮＡを提供するステップと、
（ｂ）当該標的ＤＮＡに第１の増幅を施すステップと、
（ｃ）増幅された標的ＤＮＡを断片化するステップと、
（ｄ）断片化された標的ＤＮＡに第２の増幅ステップを施し、標的ＤＮＡを標識するステップと、
（ｅ）標識された標的ＤＮＡの前記断片を本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットを含むバイオチップにハイブリダイズさせるステップと、
（ｆ）本明細書に記載のオリゴヌクレオチドプローブセットに対して標的ＤＮＡ断片のハイブリダイゼーション効率を定量化するステップであって、＞１．５のハイブリダイゼーション効率が、ハイブリダイゼーションの成功を示す、定量化するステップと、を含む。
【００１４】
ある特定の実施形態では、標的ＤＮＡは一本鎖である。
【００１５】
追加の実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、固体支持体上に固定化されている。
【００１６】
追加の実施形態では、少なくとも２１個のプローブのハイブリダイゼーションが、腐食を引き起こす細菌の活性の指標である。
【００１７】
追加の実施形態では、本開示は、微生物腐食（ＭＩＣ）に関連する細菌を検出するための、固体支持体上に固定化された、表１、表３、表４、表５、またはそれらの任意の組み合わせからのオリゴヌクレオチドプローブを含むバイオチップに関する。
【００１８】
ある特定の実施形態では、細菌は、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、メタン生成古細菌、古細菌）、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＮＲＢからなる群から選択される。
【００１９】
ある特定の実施形態では、プローブは、ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、および１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、８４、および３６）からなる群から選択される。
【００２０】
ある特定の実施形態では、固体支持体は、３Ｄマトリックス材料を含む。ある特定の実施形態では、３Ｄマトリックス材料は、デンドリマーである。
【００２１】
追加の実施形態では、本開示は、解析用のＤＮＡサンプルを調製する方法であって、
（ａ）ＤＮＡサンプルを増幅するステップと、
（ｂ）増幅されたＤＮＡを精製するステップと、
（ｃ）精製および増幅されたＤＮＡを断片化するステップと、
（ｄ）断片化および増幅されたＤＮＡを精製するステップと、
（ｅ）精製されたＤＮＡを再度増幅し、ＤＮＡを標識するステップと、
（ｆ）ステップｅ）の標識されたＤＮＡをプローブのセットにハイブリダイズさせるステップと、を含む、方法に関する。
【００２２】
ある特定の実施形態では、ステップ（ａ）は、２５℃で４時間実施される。
【００２３】
追加の実施形態では、精製および増幅されたＤＮＡを断片化することは、Ｔ＾ＴＡＡ部位を認識する制限酵素によって実施される。ある特定の実施形態では、精製および増幅されたＤＮＡを断片化することは、ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅまたはＳａｑＡＩを使用して実施される。
【００２４】
ある特定の実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５℃で４時間実施される。
【００２５】
追加の実施形態では、本開示は、サンプル中の腐食を引き起こす細菌を検出、同定、および／または定量化するアッセイを実施するのに好適なキットに関し、当該キットが、ａ）表１、表３、表４のプローブ表５、もしくはそれらの任意の組み合わせからのプローブ、または表２のカセット、および任意選択的に、ｂ）アッセイを実施するのに必要な追加の試薬または組成物を含む。
【００２６】
ある特定の実施形態では、腐食を引き起こす細菌が、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ）、メタン生成古細菌、古細菌、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、およびＮＲＢからなる群から選択される。
【００２７】
ある特定の実施形態では、キットは、ポジティブコントロールプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）をさらに含む。
【００２８】
ある特定の実施形態では、追加の試薬または組成物は、サンプル緩衝液、反応緩衝液、酵素ミックス、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ反応緩衝液、ヌクレオチドミックス、１Ｍ  ＧｕＳＣＮ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）のうちの１つ以上を含む。
【００２９】
さらに追加の実施形態では、本開示は、腐食に関連する細菌の検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブセットであって、
ａ）ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、およびＤｖ１６Ｓ＿１（配列番号１、４、５〜７、８４、８、８０、９〜１１）からなる群から選択されるプローブ、
ｂ）ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、およびＡＲＣ１６ＳＲＮＡ（配列番号１３〜１６）からなる群から選択されるプローブ、
ｃ）Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、および１６ＳＲＮＡ  ＰＲ（配列番号１７〜１８、２０〜２２、および２４）からなる群から選択されるプローブ、
ｄ）ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、およびＥ．ｃｏｌｉ（配列番号２５〜２８）からなる群から選択されるプローブ、
ｅ）ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号２９〜３２）からなる群から選択されるプローブ、ならびに
ｆ）１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）からなる群から選択されるプローブ、のうちの少なくとも１つ以上を含む、オリゴヌクレオチドプローブセットに関する。
【００３０】
追加の実施形態では、本開示は、腐食に関連する細菌の組み合わせの検出に好適なオリゴヌクレオチドプローブセットであって、
ａ）ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、およびＤｖ１６Ｓ＿１（配列番号１、４、５〜７、８４、８、８０、９〜１１）からなる群から選択される１１個のプローブ（複数可）、
ｂ）ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、およびＡＲＣ１６ＳＲＮＡ（配列番号１３〜１６）からなる群から選択される４個のプローブ（複数可）、
ｃ）Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、および１６ＳＲＮＡ  ＰＲ（配列番号１７〜１８、２０〜２２、および２４）からなる群から選択される６個のプローブ（複数可）、
ｄ）ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、およびＦｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、およびＥ．ｃｏｌｉ（配列番号２５〜２８）からなる群から選択される４個のプローブ（複数可）、
ｅ）ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号２９〜３２）からなる群から選択される４個のプローブ（複数可）、ならびに
ｆ）１６ＳＣＯＮＳ＿１（配列番号３６）からなる群から選択される１個のプローブ（複数可）、のうちの少なくとも１つ以上を含む、オリゴヌクレオチドプローブセットに関する。
【００３１】
追加の実施形態では、本開示は、サンプル中の腐食を検出する方法に関し、当該方法が、
（ａ）ＤＮＡサンプルを取得することと、
（ｂ）ＤＮＡサンプルを、プローブ：ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）のうちの１種以上と接触させて、ＤＮＡサンプルと個々のプローブとの間のハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって、ＤＮＡサンプル中に腐食を引き起こす細菌が存在するかどうかを検出することと、
（ｃ）少なくとも１種の腐食を引き起こす細菌の存在が検出されるとき、腐食の存在を確立することと、を含む。
【００３２】
追加の実施形態では、方法は、サンプルが取得された表面または液体環境において、ｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡからなる群から選択される硝酸または亜硝酸還元酵素遺伝子を含む、１種以上の硝酸還元菌（ＮＲＢ）の量を増加させることをさらに含む。
【００３３】
追加の実施形態では、本開示は、サンプル中の腐食感受性を検出する方法に関し、当該方法が、
（ａ）ＤＮＡサンプルを取得することと、
（ｂ）ＤＮＡサンプルを、プローブ：ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、ＭＣＲ１、古細菌１、古細菌２、ＡＲＣ１６ＳＲＮＡ、Ｇｅｏｂａｃ、Ｓｈｅｗ、ＧｅｏＳ、ＧｅｏＭ、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡ  ＰＲ、ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｉｓｈｙｄ  Ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、およびｎａｐＡ（配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４）のうちの１種以上と接触させること、ならびにＤＮＡサンプルと個々のプローブとの間のハイブリダイゼーションシグナルを検出することによって、ＤＮＡサンプル中に腐食を引き起こす細菌が存在するかどうかを検出することと、
（ｃ）少なくとも１種の腐食を引き起こす細菌の存在が検出されるとき、腐食感受性の存在を確立することと、を含む。
【００３４】
さらに追加の実施形態では、方法は、サンプルが取得された表面または液体環境において、ｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡからなる群から選択される硝酸または亜硝酸還元酵素遺伝子を含む、１種以上の硝酸還元菌（ＮＲＢ）の量を増加させることをさらに含む。
【００３５】
さらに追加の実施形態では、本開示は、サンプル中の腐食を引き起こす微生物を検出する方法に関し、当該方法が、
（ａ）サンプルからＤＮＡを取得することと、
（ｂ）ＤＮＡを、（ｉ）１種以上の還元酵素、（ｉｉ）１種以上のヒドロゲナーゼ、および／または（ｉｉｉ）１６Ｓ  ｒＲＮＡをコードする１つ以上の遺伝子にハイブリダイズする１種以上のプローブと接触させることによって、サンプル中の腐食を引き起こす微生物を検出することと、を含む。
【００３６】
ある特定の実施形態では、１種以上の還元酵素は、亜硝酸還元酵素、および／または硝酸還元酵素を含む。追加の実施形態では、１種以上のヒドロゲナーゼは、ペリプラズムＮｉＦｅ−ヒドロゲナーゼ、膜結合ＮｉＦｅ−ヒドロゲナーゼ、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ、ヒドロゲナーゼ補助タンパク質ＨｙｐＢ、またはそれらの組み合わせを含む。さらに追加の実施形態では、遺伝子は、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３７】
さらなる実施形態では、遺伝子は、ｍｃｒ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３８】
さらなる実施形態では、遺伝子は、ｍｃｒ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙａＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３９】
さらなる実施形態では、遺伝子は、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、ｈｙａＡ、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４０】
さらなる実施形態では、遺伝子は、ｄｓｒ、ａｐｒ、ｈｙｎＢ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４１】
さらなる実施形態では、遺伝子は、ｄｓｒ、ａｐｒ、ｈｙｎＢ、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、ｈｙａＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４２】
さらなる実施形態では、遺伝子は、古細菌由来のメチル補酵素Ｍ還元酵素、金属還元菌（ＭＲＢ）由来のヒドロゲナーゼ、発酵性細菌（ＦＢ）由来のｆｔｈｆ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、ｈｙｄＡ、硝酸還元菌（ＮＲＢ）由来のｎａｒＧ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｐＡ、およびＥ．ｃｏｌｉ由来のｈｙａＡ、のうちの１種以上をコードする。
【００４３】
さらなる実施形態では、腐食を引き起こす微生物は、硫酸還元菌（ＳＲＢ）、メタン生成古細菌、硝酸還元菌（ＮＲＢ）、金属還元菌（ＭＲＢ）、発酵性細菌（ＦＢ）から選択される。
【００４４】
さらなる実施形態では、腐食を引き起こす微生物が、ＳＲＢ：（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｏｌｆｏｂａｃｔｅｒ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ、メタン生成古細菌、古細菌）、ＭＲＢ：（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｇ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、ＦＢ：（酢酸生成菌、炭化水素分解菌、Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＮＲＢ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４５】
さらなる実施形態では、プローブは、配列番号１、４、５〜１１、１３〜１８、２０〜２２、２４〜３２、８０、および８４のうちの１つ以上を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】腐食に対するＳＲＢの影響を示す概略図である（カソードプロセスおよびアノードプロセス）。
【図２】生物腐食に関与する微生物群を示す概略図である。
【図３】ＤＮＡ増幅後のＰＣＲ断片のアガロースゲル解析を示す画像である。レーン１は、Ｇｅｎｅ  Ｒｕｌｅｒ  １００ｂｐ  Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）に対応し、レーン２は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（１６５ｂｐ）に対応し、レーン３は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（２２０ｂｐ）に対応し、レーン４は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（１５０ｂｐ）に対応し、レーン５は、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（１０９ｂｐ）に対応し、レーン６は、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（１７０ｂｐ）に対応し、レーン７は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ＤＮＡで増幅されたＰＣＲ断片（１５０ｂｐ）に対応する。
【図４Ａ−Ｈ】活性化されたバイオチップを用いた６種の異なるＳＲＢ遺伝子の模式図およびハイブリダイゼーション解析である。図４Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示している。濃い灰色の円は、プローブの位置マーカーである。図４Ｂは、ハイブリダイゼーションの解析を表している。ハイブリダイゼーションの結果を、シグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として提示している。図４Ｃは、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｉｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓのプローブＤｔｏｍａｃｕｌｕｍ１のハイブリダイゼーション画像である。図４Ｄは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓのプローブＤｂｕｌｂｕｓのハイブリダイゼーション画像を示している。図４Ｅは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍのプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１のハイブリダイゼーション画像である。図４Ｆは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｓｔｇａｔｅｉのプローブＤｂａｃｔｅｒ２のハイブリダイゼーション画像を示している。図４Ｇは、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂａｃｕｌａｔｕｍのプローブＤｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１のハイブリダイゼーション画像である。図４Ｈは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｌａｓｋｅｎｓｉｓのプローブＤｖのハイブリダイゼーション画像を示している。データは、２つの独立した実験の結果である。
【図５】標的ＤＮＡの調製およびハイブリダイゼーションの手順のステップの概要を示すチャートである。
【図６Ａ−Ｃ】本明細書に記載のバイオチッププロトタイプのうちの１つと反応したＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ  ＤＮＡの増幅およびハイブリダイゼーションの結果を示している。図６Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示す画像である。バイオチップの縁に沿った濃い灰色の円は、プローブの位置マーカーを示している。図６Ｂは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍのハイブリダイゼーションの画像である。図６Ｃは、ハイブリダイゼーションシグナルを示す棒グラフであり、バイオチップ上の各プローブのシグナル対ノイズ比として提示している。
【図７Ａ−Ｃ】プロトタイプバイオチップに増幅されハイブリダイズされた、ＤＮＡサンプルＡ２からの結果である。図７Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示している。バイオチップの縁に沿った濃い円は、プローブの位置マーカーである。図７Ｂは、ハイブリダイゼーション画像を示している。図７Ｃは、シグナル対ノイズ比として提示されている、バイオチップ上のプローブのハイブリダイゼーションシグナルを示している。ＤＮＡ（５．５μｇ、１６３ｐｍｏｌ  Ａｌｅｘａ５５５）を、７μｌのＨＢＢ＋ＢＳＡハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。２５℃で４時間のハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、０．５秒間の露出でＰｏｒｔａｂｌｅ  Ｉｍａｇｅｒ５０００を用いてバイオチップを画像化した。
【図８Ａ−Ｃ】Ａ２１サンプルの増幅されたＤＮＡからのプローブ設計およびハイブリダイゼーション結果を示す結果である。Ａ２１サンプルを、プロトタイプバイオチップのうちの１つに増幅しハイブリダイズさせた。図８Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示している。バイオチップの縁に沿った濃い円は、プローブの位置マーカーである。図８Ｂは、ハイブリダイゼーション画像を示している。図８Ｃは、シグナル対ノイズ比として提示されている、プロトタイプバイオチップ上のプローブのハイブリダイゼーションシグナルを示している。ＤＮＡ（２．５μｇ、１２５ｐｍｏｌ  Ａｌｅｘａ５５５）を、１０μｌのＨＢＢ＋ＢＳＡハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。２５℃で４時間のハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、０．５秒間の露出でＰｏｒｔａｂｌｅ  Ｉｍａｇｅｒ５０００を用いてバイオチップを画像化した。
【図９Ａ−Ｃ】Ａ１３サンプルの増幅されたＤＮＡからのプローブ設計およびハイブリダイゼーション結果を示す結果である。Ａ１３サンプル解析用のＭＩＣバイオチッププロトタイプは、重複する１６個のプローブで構築した。このプロトタイプは、ＳＲＢおよびＮＲＢの２つのタイプの細菌を検出するためのプローブを含む。１１個のプローブ（ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿１６Ｓ＿２、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、およびＤｓｃｏｃｃｕｓ１）をＳＲＢの検出に使用し、４個のプローブ（ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ）をＮＲＢの検出に使用した。１個のプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１は、ポジティブコントロールプローブとして機能した。図９Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示している。図９Ｂは、ハイブリダイゼーション画像を示している。図９Ｃは、シグナル対ノイズ比として提示されている、プローブのハイブリダイゼーションシグナルを示している。
【図１０Ａ−Ｃ】パイロットバイオチップに増幅されハイブリダイズされた、サンプルＡ２のＤＮＡからの結果である。図１０Ａは、バイオチップ上のプローブの配置を示している。バイオチップの縁に沿った濃い円は、プローブの位置マーカーである。図１０Ｂは、ハイブリダイゼーション画像を示している。図１０Ｃは、シグナル対ノイズ比として提示されている、バイオチップ上のプローブのハイブリダイゼーションシグナルを示している。ＤＮＡ（６．７５μｇ、２４６ｐｍｏｌ  Ａｌｅｘａ５５５）を２４μｌのＨＢＢ＋ＢＳＡハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。２５℃で４時間のハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、５秒間の露出でＰｏｒｔａｂｌｅ  Ｉｍａｇｅｒ５０００を用いてバイオチップを画像化した。ＰＣは、ポジティブコントロールである。
【図１１】微生物群集を評価するための低密度ＭＩＣバイオチップのプローブに使用される遺伝子の組み合わせを示すフローチャートである。
【図１２Ａ−Ｃ】ＭＩＣを評価するための硫酸還元菌、古細菌、および金属還元菌から選択される遺伝子を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
細菌の大部分のグループは、典型的には、化学産業（タンク、パイプライン）、原子力産業（冷却水用のパイプおよびタンク）、石油およびガス産業（地下および地表）、航空産業（燃料タンク、アルミニウム製の一体型翼タンク）、ならびに海洋および造船産業（船およびはしけの過度の損傷）などの多様な産業において、水と接触する、金属製品、鉄に基づくコーティング、アルミニウム、マンガン、鉄、およびさらにはステンレス鋼、ならびにプラスチックおよびゴム製品のＭＩＣに寄与する。
【００４８】
金属腐食に関連する経済的損失（時間の損失、生産性の損失、ペナルティ料金、清掃）は、年間約２，０００億ドルと膨大である。異なる領域の産業において、細菌腐食が推定１０〜７７％寄与している。非常に活性な微生物を同定して、生物腐食の発生の可能性のある部位を決定し、可能性がある部位を監視して介入することは困難であることが判明している。
【００４９】
本発明の実施形態は、バイオチップ、より具体的には、ある特定の機能遺伝子産物が微生物腐食（ＭＩＣ）に関連する代謝経路に関与する、その機能遺伝子の検出を利用する低密度ＭＩＣバイオチップに基づくシステムに関する。ある特定の態様では、低密度ＭＩＣバイオチップおよび関連する方法は、ＭＩＣに関連する還元酵素とヒドロゲナーゼとの組み合わせの検出に依存する。追加の実施形態では、方法は、腐食抑制物質である硝酸還元菌（ＮＲＢ）（すなわち、それらの硝酸および／または亜硝酸還元酵素遺伝子）を検出することをさらに含む。したがって、提案される低密度ＭＩＣバイオチップの実施形態は、硫酸還元菌（ＳＲＢ）の４つのグループ由来のヒドロゲナーゼおよび還元酵素をコードする少なくとも１３種の機能遺伝子（表５に示されるような少なくとも２１個のプローブ、および任意選択的に記載の追加の遺伝子）、ならびに任意選択的に古細菌由来のメチル補酵素Ｍ還元酵素をコードする遺伝子、金属還元菌（ＭＲＢ）のヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、発酵性細菌（ＦＢ）由来のｆｔｈｆ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、およびｈｙｄＡをコードする遺伝子、硝酸還元菌（ＮＲＢ）由来のｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡをコードする遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉ由来のヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｙａＡを検出するように設計されるであろう（図１１を参照）。したがって、ある特定の実施形態では、少なくとも１３種の機能遺伝子（２１個のプローブ）が正確な検出に利用され、これは正確な検出に必要な最小数である。機能遺伝子は、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、ｈｙａＡ、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡである（表５に示されている）。プローブは、（表５に示されるように）番号１〜１０、１２、１６、１７、２２〜２９である。
【００５０】
追加の実施形態では、ＭＩＣバイオチップの拡張変形物は、１３種の機能遺伝子（ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、ｈｙａＡ、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ）および１６ＳｒＲＮＡ遺伝子、の１４種の遺伝子（３０個のプローブ）を有する（表５）。異なる細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子および９個のプローブが、追加の検証特色として含まれる。
【００５１】
したがって、追加の実施形態では、方法は、１６Ｓ  ｒＲＮＡに基づいて構造遺伝子を検出することをさらに含む。そのようなプローブセットの例は、少なくとも表１、表３、表４、および表５に見出すことができる。以下に記載のように、これらの表のうちのいずれかからのプローブを組み合わせて、本明細書に記載の対象の細菌を検出することができる。
【００５２】
硝酸還元集団は、次の経路によってＳＲＢ腐食活性に対抗するように作用し得る：１）硝酸ではなく亜硝酸（硝酸還元酵素の産物）が酵素異化的亜硫酸還元酵素を阻害する［Ｈｕｂｅｒｔ  Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｏｕｒｉｎｇ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｕｓｉｎｇ  ｎｉｔｒａｔｅ  ａｎｄ  ｎｉｔｒｉｔｅ．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）６８：２７２−２８２］、２）亜硝酸還元酵素、亜酸化窒素および一酸化窒素による亜硝酸還元の中間体が、周囲の酸化還元電位を高める。酸化還元電位が−１００ｍＶを超えると、生物学的な硫化物の生成は発生せず、ＳＲＢの成長を酸化還元電位の上昇によって阻害することができる［Ｐｏｓｔｇａｔｅ  ＪＲ．Ｔｈｅ  Ｓｕｌｐｈａｔｅ−Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉａ（１９７９）Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ］、３）亜硝酸還元酵素による亜硝酸還元の中間体が、酵素ヒドロゲナーゼを阻害する［Ｈａｒｕｎａ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ  ｏｆ［ＮｉＦｅ］ｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ  ｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａ（ｇｅｎｕｓ；Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ）．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（２０１４）２：１−７］、４）土壌の硫酸還元は、環境が硝酸を使い果たした状態になるまで開始されない［Ｈｅ  Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ，ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｌｏｂａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）７２：４３７０−４３８１］。したがって、本明細書に記載のＭＩＣバイオチップを使用する硝酸還元酵素遺伝子（ｎａｒＧ、ｎａｐＡ）および亜硝酸還元酵素遺伝子（ｎｉｒｋ、ｎｉｒＳ）の検出は、硝酸還元集団（ＮＲＢ）の状態を特性評価するのに役立つ。遺伝子ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、ｎｉｒｋ、およびｎｉｒＳからの対応するプローブを表５に提供する。
【００５３】
ある特定の実施形態では、本発明は、サンプル中の標的核酸の同時検出を提供する。他のＤＮＡと同時に使用することができるＤＮＡプローブの設計における主な課題のうちの１つは、ＤＮＡプローブと核酸標的との間の適切なハイブリダイゼーションに必要な条件が変動することであり、各ハイブリダイゼーション反応を個々に実行する必要がある。したがって、同時に使用することができるプローブは、同一のハイブリダイゼーション特性を必要とする。本発明の態様では、発明者らは、パイロットバイオチップに含めるのに好適ではないプローブを迅速に決定するために、すべてのプローブを等モル比で含むＤＮＡカセットを使用して、１つの反応でバイオチッププローブを評価するための新規の方法を使用した［２３］。これにより、同一のハイブリダイゼーション特性を有するプローブの設計が可能になった。したがって、本開示のパイロットバイオチップの実施形態は、感度を損なうことなく、多くのＤＮＡ標的の同時検出を達成する能力を提供する。
【００５４】
本発明の追加の実施形態は、腐食を阻害するかまたは腐食に耐性のある細菌（例えば、硝酸還元菌（ＮＲＢ）、ならびにそれらの硝酸還元酵素遺伝子および／または亜硝酸還元酵素遺伝子）由来の遺伝子産物と組み合わせた、腐食に寄与する選択された細菌由来の遺伝子産物を検出することに基づいて、低密度ＭＩＣバイオチップを使用して推定されるＭＩＣ微生物の比を取得することを含む。これらの比に基づいて、サンプル中に存在する細菌を維持、誘導、または細菌に対抗するＭＩＣの量に基づく腐食スケールを開発することができる。ある特定の態様では、本発明は、腐食を阻害するかまたは腐食に耐性のある細菌由来の遺伝子と組み合わせて、腐食に寄与する細菌から選択された遺伝子を検出することに基づいて、ＭＩＣ微生物の比を推定することに関する。例えば、ＭＩＣバイオチップは、グループＩの細菌（グループＩは、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏおよびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる）を検出することができ、グループＩの細菌がＳＲＢに対して優勢であること（ほとんどの場合、地下鉄骨構造の腐食はＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属によって引き起こされる）を説明することができ、すべての他の細菌グループからのシグナルが少ない場合、この領域では腐食リスクが高いことを意味する。グループＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶからの細菌の検出が高く、グループＩの細菌がシグナルをほとんどまたはまったく呈さない場合、このサンプルの位置／場所が中程度の腐食リスクにあることを示している。最もリスクの低い領域は、グループＩＶの細菌が優勢な場所である。ＭＩＣバイオチップを使用することにより、細菌の多様性と腐食の程度との間の関連性を検出することを可能にするであろう。これらの結果に基づいて、腐食領域のインデックスマップを開発し、予測ツールとして機能することができる。
【００５５】
本発明の一態様は、ＳＲＢを４つのグループに分類し、ＭＩＣバイオチップを使用して次の（図１２Ａに示されるような）ヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１種以上を検出することによって、腐食に対するＳＲＢの効果を評価することに関する：
●グループＩ  ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏおよびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ペリプラズム（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼ）、
●グループＩＩ  Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ、およびＤｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（膜結合（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼ）
●グループＩＩＩ  Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ（（Ｆｅ）ヒドロゲナーゼ）
●グループＩＶ  Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ（ヒドロゲナーゼ補助タンパク質ＨｙｐＢ、ｈｙｐＢ遺伝子）。
【００５６】
ＳＲＢを検出するための最小の遺伝子パネルは、５種の遺伝子、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、（１０個のプローブ）からなる（表５）。ＳＲＢに加えて、生物腐食プロセスに積極的に関与する微生物集団は、メタン生成古細菌、および金属還元菌（ＭＲＢ）である（図１２Ａ〜Ｃ）。これら２つのグループの微生物の検出は、２種の遺伝子ｍｃｒおよびｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）（３個のプローブ）に基づく。したがって、ＭＩＣへの関与の程度（ＳＲＢ、古細菌およびＭＲＢ）に基づく主なプレーヤーの検出のための最小パネルは、７種の遺伝子（１３個のプローブ）からなる（表５）。
【００５７】
したがって、低密度ＭＩＣバイオチップおよび関連する方法の実施形態は、種々の掘削／水／貯蔵環境における腐食状態の可能性に寄与する細菌群集を決定するための改善されたアプローチを提供する。これらの方法およびバイオチップの組成／アレイは、より少ないプローブを利用しながら高い特異性を提供する。これらの方法に関連する利点としては、検出速度（例えば２〜３日）、培養の要件がないこと、独特な細菌群集の定量化、数千の遺伝子を含有する高価なチップの代替、が挙げられる。さらなる利点としてはまた、本明細書に記載のプローブおよびハイブリダイゼーション最適化に少なくとも部分的に基づいて、これらの別個の遺伝子を同時に検出することも挙げられる。
【００５８】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのポリマー、例えば、約２塩基超、約１０塩基超、約１００塩基超、約５００塩基超、１，０００塩基超、最高１０，０００塩基以上で構成されているヌクレオチド、例えば２つの天然のヌクレオチドと類似の特定の配列様式で核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン−クリック塩基対合相互作用に関与し得る、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを説明する。天然のヌクレオチドとしては、グアニン、シトシン、アデニン、およびチミン（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、およびＴ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、用語「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、好適な条件下での特定のヌクレオチド配列への核酸分子の結合または二重化を指す。
【００６０】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」は、対象の標的核酸への非共有結合によって塩基対合するヌクレオチド配列を指す。標準的なワトソン−クリック塩基対合では、ＤＮＡにおいて、アデニン（Ａ）はチミン（Ｔ）と、グアニン（Ｇ）はシトシン（Ｃ）と塩基対を形成する。ＲＮＡでは、チミンはウラシル（Ｕ）に置き換えられる。そのため、ＡはＴに相補的であり、ＧはＣに相補的である。ＲＮＡでは、ＡはＵに相補的であり、逆も同様である。典型的には、「相補的」とは、配列内のすべてのヌクレオチドが対応する位置の標的核酸内のすべてのヌクレオチドに相補的であるように、対象の標的に完全に相補的なヌクレオチド配列を指す。ある特定の場合では、ヌクレオチド配列は標的に部分的に相補的であり得、その場合、すべてのヌクレオチドが、対応するすべての位置の標的核酸のすべてのヌクレオチドに相補的ではない。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「プローブ」は、典型的にはその検出を容易にするために、対象のヌクレオチド配列に相補的であり、これにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語「固体支持体」は、例えば疎水性、イオン性、または共有結合相互作用によって、オリゴヌクレオチドを結合することができる任意の固体材料を指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、用語「固定化」は、３Ｄマトリックスなどの当該固体支持体へのプローブの可逆的または不可逆的会合を指す。可逆的である場合、プローブは、本発明の方法を実行するのに十分な時間、固体支持体と会合したままである。
【００６４】
本明細書で使用される場合、用語「環境サンプル」は、細菌群集を含む任意の物質を指す。本明細書で使用される場合、環境サンプルとしては、本明細書に記載の低密度ＭＩＣバイオチップによって同定され得る様々な属および種の細菌集団を含む、水サンプルおよび油サンプルが挙げられる。環境サンプルは、地理的領域または標的貯水池独特の細菌コンソーシアムを含み得るか、あるいは細菌コンソーシアムは、他の環境部位、地勢、および貯水池に順応可能であり得る。本発明の方法は、油田もしくは油井に、または石油生産プロセス、または関連する任意の装置、表面、もしくはシステム、貯蔵タンクもしくはパイプに由来するサンプル中のＭＩＣ微生物（複数可）の存在を解析するのに好適である。
【００６５】
高密度マイクロアレイおよび低密度バイオチップ。ＤＮＡバイオチップは、高密度マイクロアレイおよび低密度バイオチップの、２つの主なクラスに分類される。マイクロアレイは、典型的には、数千から数万個のプローブを含有する。低密度バイオチップは通常、数十個から数百個のプローブを含有する。提案される、本明細書に記載の「低密度」ＭＩＣバイオチップは、細菌コンソーシアムを検出し、ＳＲＢの正確な検出に必要な５種の遺伝子（ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ）／１０個のプローブを含む１３種の遺伝子／２１個のプローブ、および好ましいメンバーを正確に検出するための１０種の遺伝子（ｍｃｒ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙａＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ）／１１個のプローブの実施形態からなる最小パネルを使用するリスク評価を特色とすることを目的としている。（表５）拡張パネルは、１４種の遺伝子／３０個のプローブからなる（表５）。ある特定の実施形態では、追加の組み合わせしたがって、ＭＩＣバイオチップは低密度バイオチップと見なすことができる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、用語「ヘアピン構造」は、二本鎖ステムセグメント、および一本鎖ループセグメントを含有するポリヌクレオチドまたは核酸を指し、二本鎖ステムセグメントを形成する２つのポリヌクレオチドまたは核酸鎖が、ループセグメントを形成する単一のポリヌクレオチドまたは核酸鎖によって連結されかつ隔てられている。「ヘアピン構造」は、二本鎖ステムセグメントから延びる３’および／または５’の一本鎖領域（複数可）をさらに含むことができる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「標識」は、検出可能な（好ましくは定量化可能な）効果を提供し、核酸に付着することができる任意の原子または分子を指す。用語「標識」としては、例えば着色された染料、放射性標識、ビオチンなどの結合部分、ジゴキシゲニンなどのハプテン、発光性、リン光性、または発蛍光性部分、および単独の蛍光染料、または蛍光のエネルギー移動によって発光スペクトルを抑制またはシフトすることができる部分と組み合わせた蛍光染料が挙げられる。標識は、例えば、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、および酵素活性によって検出可能なシグナルを提供することができる。標識は、荷電部分（正または負の電荷）であっても、中性の電荷を有してもよい。それらは、核酸またはタンパク質配列を含んでも、それらからなってもよい。好ましい標識は色素であり、具体的には好ましい標識は蛍光染料である。増幅および標識化は、同時にまたは後続のステップのいずれかで実施することができる。
【００６８】
キット
本発明はまた、キットの形で本発明の組合せの成分を含むキットを提供する。本発明のキットは、限定されないが、１つ以上のプローブが、腐食を引き起こす細菌の検出に使用される、本開示の１つ以上のプローブを含む１つ以上の構成要素を含む。一実施形態では、本発明のキットは、限定されないが、１つ以上のプローブが、サンプル中の標的核酸の検出に使用される、本開示の１つ以上のプローブを含む１つ以上の構成要素を含む。一実施形態では、キットとしては、サンプル中の標識された標的核酸を検出するための核酸プローブを含むマトリックスが挙げられる。核酸プローブは、マトリックスに埋め込まれ、標的核酸中の１つ以上の標識されたヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００６９】
便宜上、本明細書に開示の１つ以上のプローブは、キット、すなわち、診断アッセイまたは検出アッセイを実施するための指示書と所定量の試薬とを組み合わせたパッケージで提供することができる。ＤＮＡ精製、ＤＮＡ増幅、ＤＮＡ断片化、ＤＮＡ標識化、および／またはＤＮＡハイブリダイゼーションに使用される試薬などの添加物がキットに含まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明のキットは、サンプル緩衝液、反応緩衝液、酵素ミックス、Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ反応緩衝液、ヌクレオチドミックス、１Ｍ  ＧｕＳＣＮ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、または５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬溶液中の濃度を提供するように広く変動し得る。具体的には、試薬は、溶解すると適切な濃度を有する試薬溶液を提供するであろう賦形剤を含む、通常凍結乾燥された乾燥粉末として提供され得る。
【００７０】
キットの構成要素は、固体支持体に事前に付着されていてもよく、キットが使用されるときに固体支持体の表面に適用されてもよい。いくつかの実施形態では、シグナル生成手段は、本発明のプローブと事前に関連付けられてもよく、１つ以上の構成要素と組み合わせられることを必要としてもよい。任意選択的に、キットはまた、本発明の方法を実行するための指示書も含み得る。
【００７１】
また、本明細書に開示のプローブのうちの少なくとも１つと、組成物を検出試薬として使用するための指示書とを含む、本明細書に開示の検出キットを調製してもよい。そのようなキットで使用するための容器は、典型的には、その中に検出および／または治療組成物（複数可）のうちの１つ以上を入れることができ、かつ好ましくは好適に分注することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、または他の好適な容器を含むことができる。第２の検出剤も提供される場合、キットはまた、この第２の検出組成物を入れることができる第２の別個の容器を収容してもよい。あるいは、複数の化合物を単一の組成物中に調製してもよく、バイアル、フラスコ、シリンジ、ボトル、または他の好適な単一容器などの単一容器手段に包装してもよい。本発明のキットはまた、典型的には、例えば、その中に所望のバイアル（複数可）が保持される射出成形またはブロー成形されたプラスチック容器などの、商業販売用に厳重に封止したバイアル（複数可）を収容するための手段を含むであろう。放射性標識、発色性、発蛍光性、または他のタイプの検出可能な標識もしくは検出手段がキット内に含まれる場合、標識化剤は、検出または治療用組成物自体と同じ容器内で提供されても、あるいはその中にこの第２の組成物が入れられ好適に分注することができる第２の別個の容器手段に入れられてもよい。あるいは、検出試薬および標識は、単一の容器手段内で調製されてもよく、ほとんどの場合、キットはまた、典型的には、商業販売ならびに／または包装および配送に便利なように厳重に封止されたバイアル（複数可）を収容するための手段も含むであろう。
【００７２】
一般的な方法
本発明によれば、分子免疫学、細胞免疫学、薬理学、および微生物学で通常使用されるものなど、当技術分野内の多数のツールおよび技法があり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．を参照されたい。Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、およびＥｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓが記載されている（Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９９９）Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、上述）。リガンド／受容体相互作用の特性評価のための標準的な技法が利用可能である（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい）。
略語
ＣＧＡ：群集ゲノムアレイ
ＤＢＢ    Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ
ＤＢＭ    Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ＤＳＢ    Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ
ＤＣＣ−ＤＮＭ−ＤＳＳ    Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ−Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ−Ｄｅｓｕｌｆｏｓａｒｃｉｎａ
ＤＦＭ    Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ
ＤＳＶ−ＤＭＢ    Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ−Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ
ＦＢ：発酵性細菌
ＦＧＡ：機能遺伝子アレイ
ＭＩＣ：微生物腐食
ＭＲＢ：金属還元菌
ＮＲＢ：硝酸還元菌
ＳＲＢ：硫酸還元菌
【００７３】
マイクロアレイ技術の近年の進歩により、特定のアッセイ用にカスタマイズ可能な核酸マイクロアレイの開発が可能になっている。この方法論は、核酸マイクロアレイを作り出す、小型化された固定化支持体への所望の数の特定の核酸配列の付着を提供する。その後、次いでこれらのマイクロアレイを使用して、所与のフィールドサンプルの遺伝子配列をスクリーニングすることができる。解析される選択された配列は、そのような核酸マイクロアレイチップを製造する技術を有する会社に提出されてもよい。そのような会社としては、限定されないが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌが挙げられる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ．は、高密度ＧＥＮＥＣＨＩＰ（登録商標）マイクロアレイを開発し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆは、特定のｍＲＮＡの高スループット定量化を可能にする低密度ＳＩＬＶＥＲＱＵＡＮＴ（登録商標）マイクロアレイを作り出した。この意味で、密度は、特色（各位置での遺伝子配列）の数を指し、高密度は、低密度に比べて特色の数が多いことを指す。比較的低密度のシステムと比較して、高密度のシステムではより多くの遺伝子を監視することができるが、それらは顕著により高価であり得る。そのようなマイクロアレイの構築が知られており、米国特許第７，１１５，３６４号、同第７，２０５，１０４号、および同第７，２０２，０２６号に例示されている。プロセスは一般に、カスタマイズされたＤＮＡマイクロアレイへの標的ヌクレオチド配列のフォトリソグラフィーによる結合またはスポッティングを伴う。そのようなＤＮＡマイクロアレイを使用して、ハイブリダイズされたｍＲＮＡまたはＤＮＡに対応する蛍光値と、フィールドサンプルをプローブするために具体的に同定された株の標的配列を使用する定量化と相関させることができる。ある特定の実施形態では、フィールドサンプルｍＲＮＡを標的配列と直接ハイブリダイズさせても、ｃＤＮＡ（より安定な相補的ＤＮＡ）に変換して標的配列とハイブリダイズさせてもよいことに留意されたい。
【００７４】
ある特定の実施形態では、低密度ＭＩＣバイオチップ（３０個のプローブ）の拡張パネルは、表５に示されるように、合計３０個のプローブの標的機能遺伝子検出および構造遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）検出に基づくバイオチップを含む。ある特定の実施形態では、バイオチップの拡張変形物は、１３種の機能遺伝子（ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、ｈｙａＡ、ｍｃｒ、ｆｔｈｆｓ、ａ／ｂｓｓＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ）、および１種の構造遺伝子（１６ＳｒＲＮＡ）、の１４種の遺伝子（３０個のプローブ）（表５に示される）を含有する。ある特定の実施形態では、異なる細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子および９個のプローブが、追加の検証特色として含まれる。
【００７５】
追加の実施形態では、低密度ＭＩＣバイオチップは、ＦＧＡの形式であろう。
【００７６】
通常油床に存在する細菌の多くのグループは、直接または間接的に生体腐食のプロセスに寄与する。硫酸還元菌（ＳＲＢ）は、腐食に関与しかつ寄与するため、最も頻繁に同定される細菌のグループのうちの１つである。ＳＲＢは、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づいて６つの主なグループに分類することができる：
●Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ（ＤＦＭ）、グループ１、
●Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ（ＤＢＢ）、グループ２、
●Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＤＢＭ）、グループ３、
●Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ（ＤＳＢ）、グループ４、
●Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ−Ｄｅｓｕｌｆｏｎｅｍａ−Ｄｅｓｕｌｆｏｓａｒｃｉｎａ（ＤＣＣ−ＤＮＭ−ＤＳＳ）、グループ５、
●Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ−Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ（ＤＳＶ−ＤＭＢ）、グループ６。
【００７７】
ＳＲＢによって誘導される腐食は、次の反応によって概略的に説明される：
８Ｈ２Ｏ→８Ｈ＋＋８ＯＨ−（水イオン化）
４Ｆｅ→４Ｆｅ２＋＋８ｅ−（アノード部位、鉄イオン化）
８Ｈ＋＋８ｅ−→８Ｈ（金属のさらなる溶解を防止する、カソードでの保護膜の形成）。
カソード脱分極は、ＳＲＢの存在下で起こる。
ＳＯ４２−＋８Ｈ→Ｓ２−＋４Ｈ２Ｏ
加えて、二次反応が進行する。
Ｆｅ２＋＋Ｓ２−→ＦｅＳ
３Ｆｅ２＋＋６ＯＨ−→３Ｆｅ（ＯＨ）２
腐食反応の概要は、次のとおりである。
４Ｆｅ２＋＋ＳＯ４２−＋４Ｈ２Ｏ−→ＦｅＳ＋３Ｆｅ（ＯＨ）２＋２ＯＨ−
ＳＲＢの脱分極活性は、反応中のカソード部位での硫化水素の形成に起因して顕著に増加する。
２Ｈ＋＋Ｓ２−→Ｈ２Ｓ
【００７８】
頻繁な脱分極（分極した水素の消費）は、カソード領域の刺激をもたらす。加えて、鉄および他の金属の不溶性の硫化物への硫酸還元の最終生成物である新しいカソードの形成は、カソード領域を刺激する。これらの反応を考慮して、次のプロセスは、微生物腐食を加速させる。
１．金属イオンは硫化物イオンに結合し、電極付近の層で過電位（過電圧）を弱め、アノード反応を加速させ、新しいカソードを形成する。
２．ＳＲＢおよび古細菌は、電極付近の層での水素過電位（過電圧）を減少させ、それによってカソード反応を加速させる。
【００７９】
ＳＲＢの検出は、ＭＩＣ監視の重要なステップである。本発明の一態様として、機能遺伝子、異化的亜硫酸還元酵素（ｄｓｒ）、およびアデノシン５’−ホスホ硫酸還元酵素（ａｐｒ）（無機硫酸の還元に直接関連する遺伝子）の検出が、低密度ＭＩＣバイオチップの一部として提案される。ａｐｒプローブは、硫酸還元菌：Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｄｏｎｅｎｓｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ａｌａｓｋｅｎｓｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｉｅｔｎａｍｅｎｓｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｇｉｇａｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｂａｃｕｌａｔｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｌｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｆｒｉｇｕｓ  ｆｒａｇｉｌｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｆｒｉｇｕｓ  ｏｃｅａｎｅｎｓｅ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ｐｓｙｃｈｏｔｒｏｐｈｉｌａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔａｌｅａ  ａｒｃｔｉｃａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｆａｄａ  ｇｅｌｉｄａ、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｉｎｕｍ  ｉｎｆｅｒｎｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｎｉｇｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｓｐｏｒｏｓｉｎｕｓ  ｏｒｉｅｎｔｉｓの幅広いスペクトルのスクリーニングにうまく使用することができる［１０］。加えて、２種のｄｓｒ遺伝子プローブは、環境サンプル中のＳＲＢの同定に使用することができる［１１］。
【００８０】
別の態様として、ＳＲＢの検出は、特定のヒドロゲナーゼ遺伝子に基づいたグループＩ〜ＩＶへの分類に部分的に基づくことが提案されている。生物腐食はカソード水素を利用するヒドロゲナーゼにより促進されるため、ＳＲＢの還元酵素遺伝子と共にヒドロゲナーゼ遺伝子は、ＭＩＣの発生に大きく寄与する酵素をコードする遺伝子である。
【００８１】
細菌のヒドロゲナーゼは、それらの活性部位で見られる金属補因子に基づいて、（Ｆｅ）ヒドロゲナーゼ、（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼ、および（ＮｉＦｅＳｅ）ヒドロゲナーゼ、の３つの広いカテゴリーに分類することができる。（Ｆｅ）ヒドロゲナーゼは、水素への親和性が低く、高濃度で優先的に作用することを特徴とする。（ＮｉＦｅＳｅ）ヒドロゲナーゼは、水素への高い親和性を特徴とする。（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼは、他の２つのタイプのヒドロゲナーゼの活性の欠如を補うことができる。ヒドロゲナーゼはまた、阻害物質に対するそれらの感受性も異なる。（Ｆｅ）ヒドロゲナーゼは、（ＮｉＦｅＳｅ）ヒドロゲナーゼ同様に、ＣＯおよびＮＯ２−に最も高感度である。（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼは、嫌気性条件における細菌群集の代謝の主な産物であるＣＯおよびＮＯ２−などの阻害物質に特に耐性がある。（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼは、１）ペリプラズムタンパク質、２）可溶性細胞質タンパク質、３）両側膜結合タンパク質、および４）膜結合外側細胞質タンパク質、の４つのグループに分類される。
【００８２】
本発明の一態様は、ＳＲＢを４つのグループに分類し、次の（図１２Ａに示されるような）ヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１種以上を検出することによって、腐食に対するＳＲＢの効果を評価することに関する：
【表１】
2020516269.tif 000002
【００８３】
グループＩは、ＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏおよびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる。ほとんどの場合、地下鉄骨構造の腐食は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属によって引き起こされる。ＳＲＢのヒドロゲナーゼ遺伝子の概要から、研究されたすべてのＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐが、非常に相同なドメインを含有するペリプラズム（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼの遺伝子（ｈｙｎＡＢ−遺伝子）を持つことが明らかである。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐにおける（Ｆｅ）および（ＮｉＦｅＳｅ）ヒドロゲナーゼの発生は、限られている［１４］。さらに、（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼは、嫌気性条件における細菌群集の代謝の主な産物であるＣＯおよびＮＯ２−などの阻害物質に特に耐性がある。ペリプラズム（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼ遺伝子（ｈｙｎＡＢ）の使用は、ＳＲＢコンソーシアム中のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐの検出を強く示唆する。同様に、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐは、ｈｙｎＢペリプラズム（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼ遺伝子を持っている。特定のプローブは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．のｈｙｎＢ遺伝子に基づいて設計される。加えて、構造１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づいてＳＲＢを同定するための２個のプローブは、文献［Ｌｏｙ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｌｉｎｅａｇｅｓ  ｏｆ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００２）６８：５０６４−５０８１］から選択される。これらのプローブは、特定の構造遺伝子プローブによるＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．およびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．の存在を確認することを可能にする。
【００８４】
グループＩＩは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ、およびＤｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍからなる。それらは、配列的に区別される（ＮｉＦｅ）膜結合ヒドロゲナーゼ（ｈｙｄＡ）を特徴とする。
【００８５】
グループＩＩＩは、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐｐ．で構成される。これらの細菌は、他のグループとは異なり、グラム陽性菌であり、これが、ペリプラズム水素酸化なしで硫酸還元が起こる理由である。Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓを除き、すべてのヒドロゲナーゼは、Ｆｅ含有であり、（ＮｉＦｅ）ヒドロゲナーゼを持つ。腐食は、高温で、細菌属Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍによって引き起こされる。
【００８６】
グループＩＶは、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓからなる。このグループは、ヒドロゲナーゼ補助タンパク質ＨｙｐＢ遺伝子（ｈｙｐＢ）によって識別することができる。Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓグループは、電子供与体として有機基質を優先的に使用し、それによりカソード脱分極を加速しないため、このグループは、鋼の腐食に関与する危険性が低い細菌のグループである。
【００８７】
これらの相関関係を考慮すると、低密度ＭＩＣバイオチップを使用して、機能アレイ（ＦＧＡ）において、少なくとも６種の機能遺伝子と１種の構造遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）の上述のパネルを検出することで、生物腐食に関与する主なＳＲＢグループ（ｄｓｒ、ａｐｒ、ｈｙｎＡＢ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（ＮｉＦｅ）、ｈｙｄＡ（Ｆｅ）、ｈｙｐＢ、１６Ｓ  ｒＲＮＡ）の同定が可能である。主なＳＲＢグループの同定に機能遺伝子用に１０個のプローブ、構造遺伝子用に２個のプローブ、の１２個のプローブを選択した（表１、プローブ１〜１２、例えば配列番号１〜１２）。機能遺伝子用に７個のプローブを新たに設計した。
【００８８】
代謝産物がＳＲＢライフサイクルに寄与するこれらの微生物の選択は、生物腐食のリスク評価および監視に非常に有益である。
【表２−１】
2020516269.tif 000003
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【００８９】
ＳＲＢ群集に関連して上に同定した遺伝子を検出することに加えて、本発明の態様はまた、生物腐食プロセスの加速に寄与する次のグループ由来の１つ以上の追加の遺伝子を検出することも含み得る。
１．複雑な一連の反応が、金属表面上のＭＩＣの生成に関与する。これらの反応は、メタン生成菌の呼吸によって強く影響を受ける。ほとんどのメタン生成菌は、メタンを形成することに水素と酢酸を利用する。カソード水素を利用することにより、嫌気性領域で腐食が加速されるため、メタン生成古細菌は生物腐食に重要な役割を果たす。メチル補酵素Ｍ還元酵素（ＭＣＲ）のアルファサブユニットをコードする機能遺伝子（図１２Ｂ）は、メタン生成の最終段階を触媒し、メタン生成古細菌を含むすべてのメタン生成菌中に存在する。メタン生成菌は、機能マーカーとしてｍｃｒＡ遺伝子を標的とすることにより、環境内で便利に追跡することができる原核生物の、独特であるが系統発生的に多様なグループを表す。古細菌の構造１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存配列を、公共データベース［１６］から選択し、ＭＩＣコンソーシアム中の古細菌の検出に使用した。４個のプローブのブロック（１個は機能遺伝子ｍｃｒＡ用、３個は構造遺伝子１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子用）を、生物腐食コンソーシアム中のメタン生成古細菌の検出に使用した（プローブ１３〜１６、表１）。
２．図１２Ｃに示されるような金属還元菌（ＭＲＢ）は、鉄ならびに他の金属を代謝し、不溶性金属硫化物形成の条件を作り出し、結果として代わりにカソード領域を生成し、また、ＭＲＢは成長中に酸素を減少させ、ＳＲＢをサポートする。Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．はすべて、Ｆｅ（ＩＩＩ）を還元することによる酢酸酸化が可能である。さらに、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒの異なる種は、細胞外で電子受容体として他の生物と電気的に接触することが可能である。Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．は、種々の嫌気性環境で発生し、末端電子受容体として、Ｆｅ（ＩＩＩ）の還元が非常に重要である。最も集中的に研究されているＧｅｏｂａｃｔｅｒの種は、Ｇ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓおよびＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓである。Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属の細菌は任意の嫌気性菌であり、嫌気性環境で金属酸化物、硝酸、および硫酸を還元することができる。この属は、長期的に環境に順応することが可能である。ＧｅｏｂａｃｔｅｒおよびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属の同定は、ヒドロゲナーゼｈｙｄＡ（Ｎｉ、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ）遺伝子に基づいて実行することができる。加えて、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ、およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．の同定、ならびにＧ．ｓｕｌｆｕｒｒｄｕｃｅｎｓからＧ．ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓを区別するために、構造１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子に基づいて６個のプローブを設計した。８個のプローブ（２個は機能遺伝子（ｈｙｄＡ（Ｎｉ、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ）用）、６個は構造遺伝子（１６Ｓ  ｒＲＮＡ）用）のブロックを、生物腐食コンソーシアム中の（表１に示されるような）金属還元菌を識別するために設計した。
３．嫌気性条件下で炭化水素の分解および酸性発酵を通じて酢酸を生成することによって、メタン生細菌の代謝を増加させる発酵性細菌（ＦＢ）。ＦＢの特性評価のために、ホルミルテトラヒドロ葉酸シンテターゼ（ｆｔｈｆｓ）遺伝子、およびアルキルコハク酸シンターゼおよびベンジルコハク酸シンターゼのアルファサブユニット（ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ）遺伝子、の機能遺伝子をプローブ設計のソースとして使用した。Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓは、非常によく発達したヒドロゲナーゼ活性を有する嫌気性Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｓｐｐ．、および偏性または任意のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．を含む細菌の門である。３個のプローブ（３つすべてが機能遺伝子ｆｔｈｆ、ａｓｓＡ／ｂｓｓＡ、およびｈｙｄＡ用）のブロックを、生物腐食に関与する発酵性細菌の識別に使用した（プローブ配列番号２５〜２７、表１）。
４．カソード水素を利用するヒドロゲナーゼによって生物腐食が促進されるため、嫌気性条件下でよく発達し、活性なヒドロゲナーゼ系を有するすべての微生物は、生物腐食の活性化物質、例えばＥ．ｃｏｌｉとみなすことができる。Ｅ．ｃｏｌｉは、機能性ヒドロゲナーゼｈｙａＡに基づくプローブを使用して検出することができる（プローブ配列番号２８、表１）。
５．硝酸還元菌（ＮＲＢ）は酸化還元プロセスでＳＲＢと競合する微生物であるため、ＮＲＢの存在はＭＩＣ発生の別の重要な特性である。土壌の硫酸の低減は、環境が硝酸を使い果たしたときにのみ開始される。これは、ＮＯ３−イオンの存在下での硫酸還元の非常に高い酸化還元電位の結果、ならびに嫌気性呼吸中の電子受容体として機能し得る硝酸による硫酸還元の競合阻害の結果であると思われる。その結果、環境内でアンモニウムイオンの蓄積および顕著なアルカリ化が起こる。細菌コンソーシアム中のＮＲＢの存在は、硝酸還元経路をコードする機能ｎａｒおよびｎａｐ遺伝子、ならびに亜硝酸還元経路をコードする機能ｎｉｒ遺伝子の検出を通じて確認することができる。硝酸還元酵素は、硝酸から亜硝酸への二電子還元を触媒する。ｎａｒＧ遺伝子は、膜結合型呼吸硝酸還元酵素の触媒αサブユニットをコードし、ｎａｐＡ遺伝子は、ペリプラズム異化的硝酸還元酵素の触媒サブユニットをコードする。硝酸還元によって形成された亜硝酸は、異なるタイプの亜硝酸還元酵素によってアンモニウムまたは一酸化窒素に還元され得る。ｎｉｒＳ遺伝子はシトクロムｃｄ１亜硝酸還元酵素をコードし、ｎｉｒＫ遺伝子は銅含有亜硝酸還元酵素をコードし、脱窒菌のペリプラズムで亜硝酸を一酸化窒素に還元する。その結果、ある特定の状況下では、低密度ＭＩＣバイオチップおよび関連する方法において、ｎａｒＧ、ｎｉｒＳ／ｎｉｒＫ、およびｎａｐＡのうちの１つ以上の検出を含めることが有用であろう。機能遺伝子（ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ、ｎａｒＧ、ｎａｐＡ）の４個のプローブのブロックを使用して、脱窒菌を検出した（プローブ配列番号２９〜３２、表１）。
６．最後に、コンソーシアム中の任意の細菌を検出するために６個のプローブを選択した。これらのプローブからのハイブリダイゼーションシグナルは、低密度ＭＩＣバイオチップのポジティブコントロールとして機能し得る（プローブ配列番号３３〜３８、表１）。
【００９０】
ＳＲＢの生存の重要な要因は、メタン生成菌との種間相互作用である。硫酸が不在の場合、ＳＲＢは、他の微生物への水素の移動を実施し、受容体として機能する。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ属およびメタン生成菌（機能しているＳＲＢのサテライト）は、膜のペリプラズム空間に局在するヒドロゲナーゼによる水素の移動を達成する。
【００９１】
ある特定の条件下では、ＭＩＣリスク評価の監視プログラムで、ある特定の硫酸還元菌およびメタン生成菌を検出することが有益であろう。腐食に顕著に寄与する微生物のコンソーシアムの代謝関係を含めることにより、監視プログラムを拡大および改善することができる。ある特定の条件下では、ＭＩＣ微生物を維持するため、ＭＩＣリスク評価の監視に次の微生物を含んでもよい。
１．酢酸、Ｈ２およびＣＯ２がＳＲＢおよび古細菌のエネルギー源および炭素源であるため、有機基質を有機酸（特に酢酸）に代謝することができる発酵性細菌（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）。
２．不溶性産物、具体的には、代わりのカソード領域としての金属硫化物の形成条件を作り出す金属還元菌。
３．活性なＮｉＦｅヒドロゲナーゼ系を有する細菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）。
【００９２】
低密度ＭＩＣバイオチップの特定のプローブの独特な組み合わせは、本明細書に記載のように、かつ、部分的には、カソードおよびアノードの反応に焦点を当て、機能遺伝子をランク付けして、ＭＩＣに最も影響を与える可能性のある微生物のパネルを評価および検出することによって、同定されている。これらの機能遺伝子プローブによってコードされる酵素のある特定のグループは、生物腐食における電気化学プロセスを加速する。理論に縛られることを望まないが、活性な発達したヒドロゲナーゼ系を有する微生物を標的とし、ある特定の実施形態では、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．の検出を含む。ヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｙｎＡＢ、ｈｙｄＡの使用による、およびヒドロゲナーゼ補助タンパク質ＨｙｐＢ遺伝子ｈｙｐＢによる検出によって、ＭＩＣコンソーシアム中の硫酸還元微生物の比が提供されることが期待される。
【００９３】
ある特定の態様では、本明細書に記載の低密度ＭＩＣバイオチップは、生物腐食リスクを評価するためだけでなく、硝酸還元などの代替プロセスを推定するためのデータを提供する。他の態様では、本発明の低密度ＭＩＣバイオチップは、細菌群集の腐食スケールを提供する細菌を誘導、維持、およびこれらに対向するＭＩＣに関与する関連生物の正確なデータおよびより包括的な範囲を提供するであろう。
【００９４】
いくつかの態様では、本発明は、試験サンプル中のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーション時に好適な手段で解釈することができるパターンを生成するように、ＭＩＣバイオチップ上に固定化された、本明細書に記載の様々なシナリオに使用されるプローブのサブセットのバリエーションを有する、３０個のオリゴヌクレオチドプローブの有益な配置に関する。
【００９５】
一態様では、本明細書に記載のＭＩＣバイオチップは、より高いスループットおよび速度を達成するために、多数の試験を同時に実施することを可能にする、固体基板上に配置された小型試験部位の集合体である。本発明のＭＩＣバイオチップは、各々がプローブと称される特定のＤＮＡ配列をピコモル（１０−１２モル）含有する、ＤＮＡオリゴヌクレオチドの微細な一連のスポットの列を含む。プローブは、アレイ表面に堆積される前に合成され、次いで固体支持体（マトリックス）上に固定化される。
【００９６】
追加の態様では、ＭＩＣバイオチップは、ＭＩＣに関与する代謝経路の重要な遺伝子のＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブを提供する。得られるＭＩＣバイオチップパイロットは、３０個の非常に特異的かつ高感度のプローブで構成され、１１個のプローブが、生物腐食に関与する重要なＳＲＢグループの同定を可能にし、腐食スケールでＳＲＢグループの等級付けを可能にし、１８個のプローブが、他のＭＩＣ細菌グループの同定に使用され、１個のプローブがポジティブコントロールとして機能する。
【００９７】
別の態様では、本発明は、プローブと標的サンプルとの間の結合を検出するための方法であって、オリゴヌクレオチドプローブに結合される標的ＤＮＡを含む標的サンプルをＭＩＣバイオチップに適用することと、オリゴヌクレオチドプローブに特異的に結合する標的ＤＮＡを検出することと、を含む方法を提供する。一実施形態では、ＤＮＡの断片は、標的ＤＮＡの容易な検出のために、蛍光染料などのシグナル伝達物質で標識される。オリゴヌクレオチドプローブと標的ＤＮＡとの間の結合は、種々の方法、例えば、蛍光検出法、電気化学検出法、質量検出法、電荷検出法、または光学検出法によって検出することができ、これらは現在広く使用されており、標的物質に標識されたシグナル伝達物質のタイプに従って分類されている。
【００９８】
より具体的には、本発明は、生物腐食に関与する主な細菌グループの同定のために提案されている、３０個のプローブを含む低密度ＭＩＣバイオチップを提供する。本発明のＭＩＣバイオチップは、機能遺伝子に基づく１８個の新規のプローブ、および構造遺伝子に基づく４個の新規のプローブを含む。プローブの設計には、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の保存領域に基づいた構造１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を使用し、これは、バイオチップ上でできるだけ多くの細菌種を捕捉し、ある特定の場合にはポジティブコントロールとしても機能するであろう。
【００９９】
ある特定の実施形態では、本発明は、サンプル中の標的核酸の同時検出を提供する。他のＤＮＡと同時に使用することができるＤＮＡプローブの設計における主な課題のうちの１つは、ＤＮＡプローブと核酸標的との間の適切なハイブリダイゼーションに必要な条件が変動することであり、各ハイブリダイゼーション反応を個々に実行する必要がある。したがって、同時に使用することができるプローブは、同一のハイブリダイゼーション特性を必要とする。本発明では、発明者らは、バイオチップに含めるのに好適ではないプローブを迅速に決定するために、すべてのプローブを等モル比で含むＤＮＡカセットを使用して、１つの反応でバイオチッププローブを評価するための新規の方法を使用した［２３］。これにより、同一のハイブリダイゼーション特性を有するプローブの設計が可能になった。したがって、本開示のバイオチップは、感度を損なうことなく、多くのＤＮＡ標的の同時検出を達成する能力を提供する。
【０１００】
本開示の発明者らは、表１に記載の３８個のプローブ（配列番号１〜３８）を最初に設計し、活性を評価し、次いで４つの試験パイロットバイオチップの設計後、パイロットＭＩＣバイオチップに含めるためにそれらのハイブリダイゼーション能力および感度について実験的解析を施した。
【０１０１】
本明細書に記載のＭＩＣバイオチップの設計および生成は、多数のステップが関与する。一般に、ＭＩＣバイオチップの開発は、
ａ）適切なプローブの設計、
ｂ）マイクロアレイ形式の選択（２−Ｄアレイ対３−Ｄアレイ）、
ｃ）カセットアプローチによるバイオチッププロトタイプに含めるためのプローブのハイブリダイゼーション能力の均等化、のステップのうちのいずれかの組み合わせを含む。
【０１０２】
より具体的には、本明細書に記載のＭＩＣバイオチップの設計および開発は、プローブ設計、バイオチップマトリックスの調製、オリゴヌクレオチドプローブを固定化するための表面の活性化、活性化マトリックスへのオリゴヌクレオチドプローブの固定化、マトリックスの不活化のうちのいずれかを含む。加えて、マトリックス上に固定化されるオリゴヌクレオチドプローブの生成のために、いくつかのレベルの解析を完了した。最後に、標的ＤＮＡの調製および標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションは、本明細書に記載のように最適化もされた多段階プロセスである。
【０１０３】
バイオチップ上でのハイブリダイゼーションのための標的ＤＮＡの調製に関与する一般的なステップは、
ａ）ＤＮＡ増幅、断片化、および標識化、ならびに
ｂ）ハイブリダイゼーションおよび視覚化、である。
【０１０４】
マトリックス調整：３Ｄマトリックス対２Ｄマトリックスの感度
本発明では、多種多様な支持体を使用することができる。一態様では、支持体は、検査される単一分子が同じ平面にあるように、表面、好ましくは実質的に平坦な表面を有する剛性の固体である。後者の特色により、効率的なシグナル収集が可能になる。好適な固体支持体材料としては、ガラス、ポリアクリルアミド被覆ガラス、セラミック、シリカ、シリコン、石英、様々なプラスチックなどの材料が挙げられる。一態様では、平坦な表面の面積は、０．５〜４ｃｍ２の範囲であり得る。一態様では、固体支持体は、均一にシラン化された表面を有する顕微鏡スライドなどのガラスまたは石英である。これは、従来のプロトコル、例えば、酸処理、および続くエポキシシラン化表面を形成する、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、および無水キシレン（８：１：２４ｖ／ｖ）の８０℃の溶液への浸漬を使用して達成することができる。
【０１０５】
マイクロアレイ／バイオチップに使用される固体支持体（マトリックス）は一般に、２次元（２Ｄ）および３次元（３Ｄ）の２つの主な形式に分類することができる。典型的な２Ｄ支持体は、ＤＮＡプローブと結合するように改変されたスライドガラス（シラン化され、その後アルデヒド、エポキシ、活性化カルボキシル基などによって活性化または修飾されている）で構成される。これらの被覆基板上のＤＮＡ密度は、バイオチップの可視化中、絶対蛍光シグナル強度を制限する単層を超えてはならない。３Ｄ形式は、利用可能な表面積を大幅に増加させ、より多くのプローブ量の堆積を可能にし、バイオチップ解析のより高い感度を促進する。３Ｄ形式の支持体の例は、スライドガラスに貼り付けられ、ＤＮＡプローブと結合するように活性化されたポリアクリルアミドゲルパッドである［１７］。
【０１０６】
３Ｄ構造の別の例は、デンドリマー支持体であり、これは、特殊な様式のスライドガラス処理によって形成することができる。デンドリマーは、明確に定義された形状、サイズ、およびナノスケールの物理化学的特性を有する化学的に合成された、繰り返し分岐したポリマー分子である［１８］。従来のポリマーとは対照的に、デンドリマーは、コア、シェルの内部（世代）、および外側シェルまたは周辺の、分岐セルユニットと末端官能基からなる３つの基本的な構造構成要素を持つ独特なコア−シェル構造である［１９、２０］。同一のモノマー単位がコアの周りに繰り返し結合し、ポリマーの樹状構造を連続的に構築する。コアと周辺との間のこれらの層の各々は、世代と呼ばれる。一連の反応の繰り返しによるすべての追加の相互作用の後に、世代が上がる。デンドリマーの表面は、種々の機能を実施するための反応性末端基を含有する。
【０１０７】
したがって、本発明の方法によれば、２Ｄおよび３Ｄの固体支持マトリックスの両方を使用して、本発明のバイオチップを生成することができる。
【０１０８】
本開示の発明者らは、結合およびハイブリダイゼーション感度について、２つのタイプの３Ｄマトリックスおよび１つのタイプの市販の２Ｄマトリックス（Ｖａｎｔａｇｅアルデヒドスライド、Ａｒｒａｙｉｔ、ＵＳＡ）を試験した（実施例１）。実施例１に示されるように、デンドリマーマトリックスが最も高感度なプラットフォームであることが見出された。デンドリマーマトリックスの主な利点としては、１）ゲルマトリックスの感度と比較して高い感度（およそ２倍）、および２）ハイブリダイズされた標的から表面を剥離した後、表面を再利用することができること、が挙げられる。
【０１０９】
プローブのハイブリダイゼーション能力
核酸ハイブリダイゼーションは、非常に特異的で高感度な手順である。プローブを設計するとき、設計が、（ｉ）プローブが標的剤に特異的である、（ｉｉ）プローブの予測融解温度（Ｔｍ）が均一であること、（ｉｉｉ）好ましくは長さが１８〜２５塩基のオリゴヌクレオチドで均一であること、および（ｉｖ）ヘアピン形成の予測温度がハイブリダイゼーションの温度より上または下であること、の十分に確立された要件を満たしていることを確認することが重要である。
【０１１０】
核酸のハイブリダイゼーション速度は温度に依存し、特異性および効率はハイブリダイゼーション温度に依存する。オリゴヌクレオチドマイクロアレイを設計する際の主な困難のうちの１つは、アレイ上のすべてのプローブでほぼ同一の融解温度を達成することである。プローブのハイブリダイゼーション能力を均等化するには、いくつかのアプローチがある。最も近いモデルに基づくアルゴリズムを使用して、同じ予測融解温度（±２℃）で、オリゴヌクレオチドプローブを設計するべきである［２１］。
【０１１１】
ハイブリダイゼーション効率に関連する選択肢および課題が、この分野で説明され、取り組まれている（例えば、Ｙｉｌｍａｚ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ  Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｄ．Ｒ．（２００４）“Ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｂｌｅｍ  ｏｆ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７０：７１２６−７１３９、Ｙｉｌｍａｚ，Ｌ．Ｓ．，Ｏｋｔｅｎ，Ｈ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｄ．Ｒ．（２００６）“Ａｌｌ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １６Ｓ  ｒＲＮＡ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｒｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｔｏ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ”，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，７２：７３３−７４４、Ｙｉｌｍａｚ，Ｌ．Ｓ．ａｎｄ  Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｄ．Ｒ．（２００７）“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，９６（２）：３４９−３６３、Ｙｉｌｍａｚ，Ｌ．Ｓ．，Ｂｅｒｇｓｖｅｎ，Ｌ．，ａｎｄ  Ｎｏｇｕｅｒａ，Ｄ．Ｒ．（２００８）“Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１０（１０）：２８７２−２０８５を参照されたい）。しかしながら、以下本明細書に記載のように、バイオチップ上の複数のプローブの観点からは、ハイブリダイゼーション効率には依然向上の余地がある。
【０１１２】
バイオチップ設計の重要なステップは、同一のハイブリダイゼーション特性を有するプローブの選択である。しかしながら、多くの場合、プローブの理論的なプロファイルは実験データと矛盾し、これにより不規則なシグナル応答を有するバイオチップが生成され得る。本発明では、バイオチップに含めるのに好適ではないプローブを迅速に決定するために、すべてのプローブを等モル比で含むＤＮＡカセットを使用して、１つの反応でバイオチッププローブを評価するための新規の方法を使用した［２３］。
【０１１３】
３８個のプローブの各々のハイブリダイゼーションの可能性の評価は、１６個のｓｓ（一本鎖）カセットを使用して達成した。ｓｓカセットは、研究したプローブのセットに賞賛的な一連の直線的な配列を提示する（実施例２）。合成中に、Ｃｙ３蛍光染料をｓｓカセットの５’末端に挿入した。各カセットに含まれるプローブの数は３〜８個の範囲であり、サイズは６５〜１４２塩基で変動した。表２に、ｓｓカセットの構成を列挙する。プローブのサイズおよびヌクレオチド配列の違いから生じる、バイオチップ上の蛍光強度の変動は、カセット法によって決定した。このアプローチを使用して、発明者らは、同様の蛍光強度（または結合能力）を有する３５個のプローブを同定し、最初の３８個のプローブ（表１）からそれらを選択して、生物腐食に関与する主な細菌グループを同定した（実施例２、表３）。
【０１１４】
バイオチップ解析条件の最適化
環境サンプル中の微生物の評価へのマイクロアレイの適用は、多くの技術的課題を提起する。主な課題のうちの１つは、非標的配列の複雑な背景に対する標的核酸の特異的な検出である。マイクロアレイアプローチの困難さは、すべてのプローブを同時にハイブリダイズさせることであるが、特定のハイブリダイゼーション条件は、多くの場合プローブ間で変動する。短い（１００〜２００塩基）一本鎖ｓｓＤＮＡ（ＰＣＲ断片）とバイオチップ上の適切なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づく拡張ｓｓＤＮＡアプローチを開発し、ハイブリダイゼーション効率を評価するために使用した（実施例３）。この方法は、最適なハイブリダイゼーションシグナル強度を提供する様式でのサンプル調製を可能にする。
【０１１５】
感度は、バイオチップ用途の別の重要なパラメータである。バイオチップの感度は、バイオチップマトリックス（３−Ｄアレイ形式対２−Ｄアレイ形式）上のプローブの量、および標識された標的ＤＮＡの量など、多くの要因に依存する。パイロットＭＩＣバイオチップは、３−Ｄアレイ形式の実施形態に一部基づいて向上した感度を呈する。試験結果で、３Ｄゲルマトリックス、およびデンドリマーマトリックス、および１つのタイプの市販の２Ｄマトリックス（アルデヒドスライド、Ａｒｒａｙｉｔ、ＵＳＡ）の、３つのマトリックスの結合およびハイブリダイゼーション感度を評価した。３Ｄ−デンドリマーマトリックスの結合能力は、３Ｄゲルマトリックスよりも６倍高いことが示された。３Ｄゲルマトリックスおよび２Ｄマトリックスの結合能力は同等である。一本鎖賞賛とのハイブリダイゼーションに関して、アルデヒドスライドは最も低いハイブリダイゼーション感度を示し、両方の３Ｄマトリックスのハイブリダイゼーション特性は同等であり、２Ｄマトリックスの３〜４倍である。
【０１１６】
ハイブリダイゼーション前の標的ＤＮＡ増幅により、より強いシグナルを生じ、特定の標的の存在がたとえ低濃度であっても検出が可能である。バイオチップの可視化のための、ＤＮＡのランダムな断片化およびその蛍光標識化のステップは、ＤＮＡ断片とマトリックス上の固定化プローブとのハイブリダイゼーションに先行する。本発明者らは、ＤＮＡ増幅、断片化および標識化手順の異なる組み合わせで１０種のプロトコルを開発し、それらを純粋な細菌培養（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｄｏｎｅｎｓｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＰ）および環境サンプルを使用して試験した（実施例４）。次いで、最も効果的な手順を使用して、異なるバイオチッププロトタイプで環境サンプルを解析した。
【０１１７】
一実施形態では、標的ＤＮＡの調製は、
１．第１の標的ＤＮＡ増幅
２．増幅された標的ＤＮＡの断片化
３．同時に第２の増幅および標識化、のステップを含む。
【０１１８】
したがって、一実施形態では、増幅された標的ＤＮＡは、当業者に既知の任意の標準的な方法に従って、より小さな断片に断片化される。次のステップでは、断片化された断片は、同時に第２の増幅ステップおよび標識化を施される（実施例４）。その後、標的ＤＮＡと低密度ＭＩＣバイオチップに存在するオリゴヌクレオチドプローブとの間のハイブリダイゼーションを取得するために、標識された標的ＤＮＡの断片はハイブリダイズ反応を施される。これらのハイブリダイゼーションは、当該技術分野における一般知識に従って当業者によって実行することができる。バイオチップ上のハイブリダイゼーションのためのＤＮＡ調製の多数の異なる方法を試験し、比較し、それらとしては、１）同時に第１の増幅および標識化、次いで断片化、２）第１の増幅、断片化、および次いで第２の増幅なしの標識化などが挙げられる。しかしながら、他の９つのステップの組み合わせのうちのいずれも、上述の方法（第１の増幅、断片化、同時の第２の増幅および標識化）のように高度に検出可能な蛍光シグナルおよび明確なバックグラウンドを示さなかった。
【０１１９】
ＤＮＡ増幅、断片化、および標識化手順の異なる組み合わせでプロトコルを設計および試験することにより、発明者らは、Ｎ１０プロトコルと称される標的ＤＮＡの効率的な増幅方法を開発した（実施例４、図５）。
【０１２０】
最後に、発明者らは、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ  ＤＮＡを使用してバイオチッププロトタイプを試験し（実施例５）、特異性の取得に成功することができることを示した（図６）。
【０１２１】
実施例１
３Ｄマトリックスの生成
本開示の発明者らは、ゲルマトリックスおよび２世代デンドリマーマトリックスの、２つの異なるタイプの３Ｄマトリックスを生成した。２つのタイプの３Ｄマトリックスおよび１つのタイプの市販の２Ｄマトリックス（Ｖａｎｔａｇｅアルデヒドスライド、Ａｒｒａｙｉｔ、ＵＳＡ）の結合およびハイブリダイゼーション感度を試験した。２Ｄアルデヒドマトリックスおよび３Ｄデンドリマーマトリックスのプローブの５’末端は、合成中にＣ６−アミン基によって化学的に修飾した。結合シグナル検出のために、３’末端をＣｙ−３フルオロフォアによって化学修飾した。３Ｄゲルマトリックス上の結合シグナル検出のために、合成中に３’末端はＮ３−メチルウリジンによって化学修飾し、５’末端はＣｙ−３フルオロフォアによって化学修飾した。
【０１２２】
デンドリマープラットフォームの調整には、次のプロトコルを使用した。
１．ガラス表面の活性化（アミノ化）のための顕微鏡スライドのシラン化
顕微鏡用スライドガラスを１０％ＮａＯＨに一晩浸漬し、その後
Ｈ２Ｏ、１％ＨＣｌ、再びＨ２Ｏ、最後にメタノール（またはエタノール）で洗浄した。９５％メタノール（またはエタノール）で作製した３％の３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）溶液に１５分間浸漬した後、スライドを純メタノール（またはエタノール）、次いで水で洗浄し、窒素流下で乾燥（または遠心分離）し、１１０℃で１５分間焼いた。
【０１２３】
２．デンドリマーマトリックスの形成（リンカー系の合成）
所望のリンカー分子を取得するまで、それぞれアミンを用いて反応ステップ１および２を２回繰り返すことにより、合成を実施した。
ステップ１．アシル化反応アミノ化スライドガラスを、３０ｍｌの無水１，２−ジクロロエタン中１ｍｍｏｌのアクリロイルクロリドおよび１ｍｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル−アミン（ＤＩＥＡ）で作製した溶液中で２時間インキュベートした。その後、支持体をジクロロエタンで徹底的に洗浄し、乾燥させた。
ステップ２．アミンとの反応アシル化スライドガラスを、無水アミンを含まない３０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１ｍｍｏｌのテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）で３６時間インキュベートした。その後、スライドをＤＭＦ、エタノール、アセトンで十分に洗浄してから乾燥させた。
ステップ３．アシル化反応（ステップ１）アミノ化スライドガラスを、３０ｍｌの無水１，２−ジクロロエタン中１ｍｍｏｌのアクリロイルクロリドおよび１ｍｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル−アミン（ＤＩＥＡ）で作製した溶液中で２時間インキュベートした。その後、支持体をジクロロエタンで徹底的に洗浄し、乾燥させた。
ステップ４．アミンとの反応アシル化物質を、無水アミンを含まない３０ｍｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１ｍｍｏｌの１，４−ビス−（３−アミノプロポキシ）ブタン（ＢＡＰＢ）で３６時間インキュベートした。次いで、スライドをＤＭＦ、エタノール、アセトンで十分に洗浄してから乾燥させた。
【０１２４】
３．オリゴヌクレオチドプローブ固定化のための表面の活性化
活性化は、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）によって実施した。具体的には、活性化は、２０ｍｌの無水アセトニトリル中１ｍｍｏｌのＤＳＣおよび１ｍｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル−アミン（ＤＩＥＡ）で４時間インキュベートすることによって行った。その後、スライドをＤＭＦおよび１，２−ジクロロエタンで洗浄し、窒素流下で乾燥させた（または遠心分離した）。
【０１２５】
４．活性化されたデンドリマーマトリックスへのオリゴヌクレオチドプローブの固定化
水中１％ＤＩＥＡ中の、２５０ｐｍｏｌ／０．１μｌオリゴヌクレオチドプローブ溶液を活性化した支持媒体上に置いた。オリゴヌクレオチドプローブは、３’末端でＣ６アミノリンカーによって修飾した。
【０１２６】
スポッティングは、ピンによって実施した（２００ｎｌ／スポット）。オリゴヌクレオチドプローブの付着後、固定化のためにスライドを３７℃の湿潤チャンバ内で一晩インキュベートし、その後Ｈ２Ｏおよびメタノール（またはエタノール）で洗浄した。
【０１２７】
５．デンドリマーマトリックスの不活化
固定化したプローブを有するスライドガラス表面は、ＤＭＦ中の６−アミノ−１−ヘキサノール（５０ｍＭ）とＤＩＥＡ（１５０ｍＭ）とで作製した溶液を使用して２時間処理することによって不活化した。最後に、ＤＮＡアレイをＤＭＦ、アセトン、水で洗浄し、乾燥させた。次いで、固定化したプローブ（ハイブリダイゼーションの準備ができた状態）を有する不活化したスライドガラスは、４℃で保存してもよい（４℃での貯蔵寿命は少なくとも６か月である）。
【０１２８】
結果
結合シグナル検出により、３Ｄデンドリマーマトリックス上のプローブの結合能力が、３Ｄゲルマトリックスよりもはるかに高いが、３Ｄゲルマトリックスおよび２Ｄマトリックスの結合能力は同等であることが明らかになった。ｓｓ賞賛とのハイブリダイゼーション感度は、３Ｄデンドリマーマトリックス＞３Ｄゲルマトリックス＞２Ｄアルデヒドマトリックスの順に従って配置した。
【０１２９】
結論として、デンドリマーマトリックスの主な利点は、１）ゲルマトリックスの感度と比較して高い感度（およそ２倍）、２）ハイブリダイズされた標的から表面を剥離した後、表面を再利用することができること、である。デンドリマーマトリックスの貯蔵寿命は、３ヶ月と推定される。
【０１３０】
したがって、本発明者らは、デンドリマーマトリックスが最も高感度なプラットフォームであると決定した。したがって、ハイブリダイゼーション能力の評価のために行ったすべての実験は、本発明者らによって製造されたデンドリマーマトリックス上で実施した。
【０１３１】
実施例２
プローブのハイブリダイゼーション能力の均等化
核酸のハイブリダイゼーション速度は温度に依存し、特異性および効率はハイブリダイゼーション温度に依存する。融解温度（Ｔｍ）を決定するために、発明者らはＩＤＴ  ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１（ｈｔｔｐ：／／ｅｕ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｚｅｒ／Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ）、およびＰｒｉｍｅｒ３プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｓｉｍｇｅｎｅ．ｃｏｍ／Ｐｒｉｍｅｒ３）を使用した。Ｔｍ計算では、プログラムは、オリゴヌクレオチド配列だけでなく、同様に緩衝液条件も必要とする。したがって、Ｔｍおよびその結果としてのハイブリダイゼーション温度は、緩衝液組成に依存する。各プローブの長さは、１７〜２５塩基の範囲に設定した。ＧＣ含有量を計算し、ＧＣ含有量が４０〜６０％のプローブのみをさらに解析するために選択した。
【０１３２】
ＩＤＴ  ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ３．１プログラムは、ヘアピン形成の条件を推定するために使用した。ヘアピン（プローブの分子内自己構造）の形成は、ハイブリダイゼーションのプロセスを顕著に妨げ、マイクロアレイの感度を減少させ得る。設計されたすべてのプローブの特異性については、ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を使用して、ＧｅｎＢａｎｋ核酸データベースに対して検証した。
【０１３３】
よく確立され上記の要件に従って標的微生物の特定のプローブを生成することができるが、プローブのうちの２１〜３４％が意図する標的と一致しないと推定されているため、同等のハイブリダイゼーション能力を実験的に確認する必要があるであろう［２２］。融解温度およびその結果としてのハイブリダイゼーション温度を予測するための既存のプログラムおよびアプローチの主な制限は、これらすべての予測が、遊離オリゴヌクレオチドに対するものであり、固液界面でのハイブリダイゼーションの熱力学に関する知識が限られていることに起因して、固体表面に結合したものに対するものではないことである。これが、最適な予測融解温度を有するプローブが必ずしも最適なハイブリダイゼーションを実施しない理由であり、これにより不規則なシグナル応答を有するバイオチップが生成され得る。その上、特定のプローブ（複数可）を、最も選択されるプローブに最適なＴｍ範囲に合わせることが常に可能とは限らない。
【０１３４】
３８個のプローブの各々のハイブリダイゼーションの可能性の評価は、１６個の一本鎖カセットを使用して達成した。ｓｓカセットは、研究したプローブのセットに賞賛的な一連の直線的な配列を提示する。合成中に、Ｃｙ３蛍光染料をｓｓカセットの５’末端に挿入した。各カセットに含まれるプローブの数は３〜８個の範囲であり、サイズは６５〜１４２塩基で変動した（表２）。ハイブリダイゼーション緩衝液は、ＳＳＡＲＣ緩衝液（４ｘＳＳＣ［６００ｍＭ  ＮａＣｌ、６０ｍＭクエン酸Ｎａ］、７．２％（ｖ／ｖ）サルコシルＮａ）であった。ハイブリダイゼーション緩衝液中のサンプルは、ハイブリダイゼーション温度（４５℃、５分）に予熱した。サンプル溶液の適用後、カバーガラスの下で顕微鏡スライド上のハイブリダイゼーションを実行した。サンプル溶液の体積は、カバーされた正方形の１ｃｍ２あたり２μｌの溶液で計算する。ハイブリダイゼーションは、４５ｏＣで４時間進行させた。ハイブリダイゼーション後、バイオチップを、２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳで２分間１回、０．２ｘＳＳＣ＋０．２％ＳＤＳで２分間１回、２５℃の０．２ｘＳＳＣで２分間１回洗浄し、遠心分離によって乾燥させた。
【表３−１】
2020516269.tif 000008
【表３−２】
2020516269.tif 000009
【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【０１３５】
細菌コンソーシアム中のＳＲＢを同定するためのプローブＳＲＢ１からのシグナルは、基準として使用した。カセットプローブの同様のハイブリダイゼーション挙動は、異なるカセットの内容に使用した。さらに、このプローブは、ランダムに選択されたカセットの混合で設計されており、研究対象のすべてのプローブ間にクロスハイブリダイゼーションが存在しないことを暗示的に示している。
【０１３６】
プローブのサイズおよびヌクレオチド配列の違いから生じる、バイオチップ上の蛍光強度の変動は、カセット法によって決定する。生物腐食に関与する主な細菌グループを同定するために、試験した３８個のプローブから、同様の蛍光強度（または結合能力）を有する３５個のプローブを選択した（表３）。
【表４−１】
2020516269.tif 000013
【表４−２】
2020516269.tif 000014
【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【０１３７】
実施例３
拡張ｓｓＤＮＡアプローチを使用するプローブの最適化
前述のように、マイクロアレイアプローチの困難さは、すべてのプローブを同時にハイブリダイズさせることであるが、特定のハイブリダイゼーション条件は、多くの場合プローブ間で変動する。同等のハイブリダイゼーション能力を特徴とする選択されたプローブについて、実際の環境におけるハイブリダイゼーションシグナル強度が推定されている。プローブは、適切なＤＮＡの断片に埋め込まれ、カセットの場合のように賞賛のセットには埋め込まれない。このため、拡張ｓｓＤＮＡアプローチが開発された。アプローチは、短い（１００〜２００塩基）一本鎖ｓｓＤＮＡ（ＰＣＲ断片）とバイオチップ上の適切なオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づいている。適切なプローブに賞賛的な配列は、ｓｓＤＮＡ断片に埋め込まれている。ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）コレクションから取得したＳＲＢ株、プローブ、およびＰＣＲプライマーを表４に列挙している。個々の遺伝子特異的ＰＣＲプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３Ｐｌｕｓソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ／ｐｒｉｍｅｒ３ｐｌｕｓ．ｃｇｉ）を使用して設計した。バイオチッププローブに相補的な配列は、Ｃｙ３標識されたＰＣＲアンプリコン株のうちの１つに埋め込んだ。
【表５−１】
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【表５−２】
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【０１３８】
アプローチは、標準反応およびプライマー伸長反応の２つのＰＣＲ反応を含んだ。表４に提示される各ＤＮＡで標準ＰＣＲおよびプライマー伸長反応を実施した。第１の標準ＰＣＲ混合物（５０μｌ）は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭ（各々）デオキシヌクレオシドトリホスフェート（ｔｈｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、各々５００ｎＭのプライマー、５０ｎｇのＤＮＡテンプレートを含む１ｘｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を含有した。各プライマー対に対して、最初の変性ステップ（３０秒、９８℃）に続いて、３５サイクルの変性（１０秒、９８℃）、アニーリング（２０秒、６０℃）、伸長（１５秒、７２℃）、および１つの末端伸長ステップ（１０分、７２℃）、の同一の条件を使用して、ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅の結果は、ＤＮＡ増幅（１．５％アガロースゲル、１ｘＴＡＥランニング緩衝液、臭化エチジウム染色）後のＰＣＲ断片のアガロースゲル解析を使用して評価し、図３に示している。
【０１３９】
増幅されたＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ合成の前にＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して精製し、プライマー伸長反応のテンプレートＤＮＡとして使用した。ハイブリダイゼーション用の一本鎖ＤＮＡサンプルは、Ｃｙ３色素で標識されたその後のリバースプライマーまたはフォワードプライマーの存在下で、ｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長反応を使用して合成した（表４）。プライマー伸長反応における標識されたリバースプライマーまたはフォワードプライマーの使用は、テンプレート（ｄｓ  ＰＣＲアンプリコン）ＤＮＡの第１または第２の株のプローブに賞賛的な配列の位置によって決まる。反応は、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭ（各々）デオキシヌクレオシドトリホスフェート、１０００ｎＭののＣｙ３標識プライマー（表４）、１２０ｎｇのＤＮＡテンプレートを含有する、５０μＬの１ｘ  ｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）中で実施した。
【０１４０】
増幅プロトコルは、すべてのプライマー伸長反応で同じであり、第１の標準ＰＣＲの増幅と同じであった。ｉＰｒｏｏｆ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）は、実行されたすべての反応のＰＣＲ条件を均等化し、反応を高速化する。３５サイクルのＰＣＲは、１時間で完了する。増幅されたｓｓ  ＰＣＲ断片を、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して精製し、−２０℃で３０分間、１０倍の量のアセトン中２％のＬｉＣｌＯ４で沈殿させた。ペレットを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって収集し、アセトンで１回洗浄し、風乾した。ペレットは、バイオチップ上でハイブリダイゼーションの準備ができた標識されたｓｓＤＮＡを表す。各ｓｓＤＮＡ断片は、バイオチップ上の特定の標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションをモデルとする他の実際の配列の環境で、バイオチップ上の適切なプローブに賞賛的な配列を含有する。
【０１４１】
オリゴプローブ（表４）からのハイブリダイゼーションシグナルを評価するために、各遺伝子をシングルＰＣＲで増幅した。次いで、各遺伝子の増幅ＰＣＲをプライマー伸長反応のテンプレートとして使用して、一本鎖ＤＮＡを作り出した。その結果、各遺伝子の一本鎖ＤＮＡが標識され、６個のプローブからなる小さなマイクロアレイ上で別々にハイブリダイズされ、ＭＩＣバイオチップの一部を形成する。要約すると、異なるＳＲＢ  ＤＮＡの６種の遺伝子を増幅し、バイオチップに別々にハイブリダイズさせた（図４）。
【０１４２】
ＤＮＡおよびフルオロフォアＣｙ３の量は、各ｓｓＰＣＲ断片について分光測光法で推定した。等量の各標識ｓｓＤＮＡを、ハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのＧｕＳＣＮ（グアニジンチオシアネート）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に溶解した。混合物を９５℃で５分間変性させ、氷上で２分間冷却した。サンプルをオリゴヌクレオチドプローブアレイのスライド上に２５℃で置き、カバーガラスで覆った。２５℃のＡｒｒａｙｉｔハイブリダイゼーションチャンバ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）で、４時間ハイブリダイズさせた後、スライドを４ｘＳＳＣ、７．２％サルコシル（ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）で３０秒間すすぎ、その後、スライドを室温の０．２ｘＳＳＣで３０秒間洗浄し、１０００ｒｐｍで１分間回転乾燥させた後、ポータブルマイクロアレイリーダーＰＡ５０００（Ａｕｒｏｒａ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）で解析した。結果を図４に提示する。
【０１４３】
拡張ｓｓＤＮＡアプローチには、次の詳細なプロトコルを使用した。
１．第１の標準ＰＣＲ：合計反応量は５０μｌである。
１．１  混合：
溶解したゲノムＤＮＡ５０ｎｇ（Ｘμｌ体積）
＋２５μｌの２ｘｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
＋２００μＭ（各々）デオキシヌクレオシドトリホスフェート（Ｙμｌ体積）
＋各プライマー５００ｎＭ（Ｚμｌ体積）
＋最高５０μｌの滅菌水
１．２  ＰＣＲ条件：合計サイクル３５回
最初の変性ステップ１回（３０秒、９８℃）
３５回繰り返し：変性（１０秒、９８℃）、アニーリング（２０秒、６０℃）、および伸長（１５秒、７２℃）
末端伸長ステップ１回（１０分、７２℃）
１．３  ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用するＰＣＲ産物の精製
２．第２のプライマー伸長ＰＣＲ：合計反応緩衝液は５０μｌである。
２．１  混合：
第１のＰＣＲ後の精製されたｄｓ  ＤＮＡ１２０ｎｇ（Ｘμｌ体積）
＋２５μｌの２ｘｉＰｒｏｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）
＋２００μＭ（各々）デオキシヌクレオシドトリホスフェート（Ｙμｌ体積）
＋１０００ｎＭの、１つのＤＮＡ鎖のみを伸長するためのＣｙ３標識プライマー（Ｚμｌ体積）
＋最高５０μｌの滅菌水
２．２  ＰＣＲ条件：合計サイクル３５回
最初の変性ステップ１回（３０秒、９８℃）
３５回繰り返し：変性（１０秒、９８℃）、アニーリング（２０秒、６０℃）、および伸長（１５秒、７２℃）
末端伸長ステップ１回（１０分、７２℃）
２．３  ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用するＰＣＲ産物の精製
２．４  −２０℃で少なくとも３０分間、１０倍の量のアセトン中２％ＬｉＣｌＯ４を添加することによって、精製されたｓｓ  ＤＮＡのペレット
２．５  ４℃で、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを収集する。
２．６  １ｍｌのアセトンでペレットを１回洗浄し、放置して風乾する。
３．ハイブリダイゼーション：
３．１  ペレットをハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのＧｕＳＣＮ（グアニジンチオシアネート）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に溶解し、９５℃で５分間加熱した後、すぐに氷上で２分間冷却する。
３．２  ２５℃で４時間のハイブリダイゼーション
３．３  ４ｘＳＳＣ、７．２％のサルコシルで３０秒間１回洗浄、０．２ｘＳＳＣで３０秒間１回振盪。
【０１４４】
図４に示されるように、６種のｓｓＤＮＡすべてについて、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ）が妥当な誤差内で等しく、すべてのｓｓＤＮＡが適切なプローブにのみ一致した。アプローチは、ＳＲＢグループのプローブの代表的なセット、および６種の市販のＤＮＡで検証した。ＭＩＣバイオチップ用のすべての遺伝子特異的プローブは、クロスハイブリダイゼーションの可能性を最小限に抑えるように設計した。拡張ｓｓＤＮＡアプローチによって得られた結果は、選択されたプローブのカセット法によって得られた結果と相関している。
【０１４５】
開発されたアプローチは、利用可能なＤＮＡ株を使用して、３時間などの現実的な条件下で、ハイブリダイゼーションシグナル強度を微調整するためのサンプルを調製する機会を提供する。
【０１４６】
実施例４
バイオチップ解析のためのＤＮＡ調製方法の開発
マイクロアレイの感度は、プローブの量、バイオチップマトリックスのタイプ、および標識された標的ＤＮＡの量に依存する。本実施例におけるバイオチップ解析のためのＤＮＡ調製の評価のためのすべての実験、ならびに異なるバイオチッププロトタイプ上の環境サンプルの解析は、発明者の研究室で製造した３Ｄデンドリマーマトリックスで実施した。
【０１４７】
ハイブリダイゼーション前の標的ＤＮＡ増幅により、より強いシグナルがもたらされ、特定の標的の存在がたとえ低濃度であっても検出が可能である。バイオチップの可視化のための、ＤＮＡのランダムな断片化およびその蛍光標識化のステップは、ＤＮＡ断片とマトリックス上の固定化プローブとのハイブリダイゼーションに先行する。ＤＮＡ増幅、断片化、標識化手順の異なる組み合わせで１０種のプロトコルを設計し、純粋な細菌培養（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｉｎｄｏｎｅｎｓｉｓおよびＥ．ｃｏｌｉ  ＢＰ）および環境サンプルを使用して試験した。最も最適な手順を使用して、異なるバイオチッププロトタイプで環境サンプルを解析した。
【０１４８】
以下および図５で概説する各ステップは、当技術分野で使用される様々な方法および試薬を使用して実施することができることが理解されているが、発明者らは、Ｎ１０プロトコルを最適化し、ＭＩＣバイオチッププロトタイプの評価での実用に最終的に採用した（実施例６）。
【０１４９】
第１の増幅を、ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＨＹ  ＤＮＡ増幅キット（カタログＮｏ．：２５−６６００−２２ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）を使用して実施し、その後精製した。増幅されたＤＮＡの断片化は、他のＮＥＢＮｅｘｔ  ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ（カタログＮｏ．：Ｍ０３４８Ｓ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＵＳＡ）、他のＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＳａｑＡＩ（カタログＮｏ．：＃ＦＤ２１７４  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を使用して実施しその後精製し、第２の増幅および標識化は、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨゲノム標識化システム（カタログＮｏ．：１８０９５−１３Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して同時に実施した。
【０１５０】
ＤＮＡ増幅、断片化、および標識化のための詳細なＮ１０プロトコル：
１．第１の増幅：合計反応量は５０μｌである。
１．１  ２．５μｌのゲノムＤＮＡ＋２２．５μｌのサンプル緩衝液を混合し、９５℃で３分間インキュベートし、すぐに氷上で冷却する。反応あたりのゲノムＤＮＡの量は、求められる結果次第で１０〜１００ｎｇに変動させてもよい。
１．２  ２５μｌの反応緩衝液＋２．５μｌの酵素ミックスを添加する。
１．３  ３０℃で４時間インキュベートする。
１．４  酵素を不活化するために、サンプルを６５℃で１０分間加熱し、次いで４℃に冷却する。
１．５  増幅の程度を確認し、アガロースゲルに５μｌ取る。
１．６  製造元の指示に従って、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）ｇＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ＢａｃｔｅｒｉａキットまたはＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）の磁気ビーズによって、増幅したＤＮＡを精製する。
１．７  ＤＮＡスペクトルを取って収量を推定する。
２．ｄｓＤＮＡＦｒａｇｍｅｎｔａｓｅによる断片化：合計反応緩衝液は２０μｌである。
２．１  Ｘμｌのゲノム増幅ＤＮＡ（２μｇを超えない）＋２μｌの１０ｘｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ反応緩衝液＋４μｌの２００ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋滅菌水最高２０μｌを混合する。
２．２  ３７℃で１０分間消化する。
２．３  消化の程度を確認し、アガロースゲルに２．５μｌ取る。
２．４  ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、消化産物を精製する。
２．５  ＤＮＡスペクトルを取って収量を推定する。
または
２．ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＳａｑＡＩによる断片化：合計反応緩衝液は１０μｌである。
２．１．Ｘμｌのゲノム増幅ＤＮＡ（２μｇを超えない）＋１μｌの１０ｘＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＳａｑＡＩ
反応緩衝液＋最高１０μｌの滅菌水を混合する。
２．２．３７℃で１０分間消化する。
２．３．消化の程度を確認し、アガロースゲルに１．５μｌ取る。
２．４．ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、消化産物を精製する。
２．５．ＤＮＡスペクトルを取って収量を推定する。
３．第２の増幅：合計反応量は５０μｌである。
３．１．Ｘμｌの断片化されたゲノムＤＮＡ＋２０μｌのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５Ｐａｎｏｍｅｒ（商標）９溶液
＋最高４４μｌの滅菌水を混合し、９５℃で１０分間インキュベートし、すぐに氷上で
５分間冷却する。反応あたりのゲノムＤＮＡの量は、求められる結果次第で５００〜２０００ｎｇに変動させてもよい。
３．２．ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰを含む５μｌの１０Ｘヌクレオチドミックス＋１μｌのＥｘｏ−Ｋｌｅｎｏｗ
断片を添加する。
３．３．３０℃で８時間インキュベートする。
３．４．５μｌの停止液で反応を停止する。
３．５．増幅を確認し、アガロースゲルに５μｌ取る。
３．６．ＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）を使用して、消化産物を精製する。
３．７．ＤＮＡスペクトルを取って収量を推定する。
３．８．−２０℃で少なくとも３０分間、１０倍の量のアセトン中２％ＬｉＣｌＯ４を添加することによって、精製されたＤＮＡのペレット
３．９．４℃で、１５，０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によってＤＮＡを収集する。
３．１０．１ｍｌのアセトンでペレットを１回洗浄し、放置して風乾する。
４．ハイブリダイゼーション
４．１．ペレットをハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのＧｕＳＣＮ（グアニジンチオシアネート）、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に溶解し、９５℃で５分間加熱した後、すぐに氷上で２分間冷却する。
４．２．２５℃で４時間のハイブリダイゼーション
４．３．４ｘＳＳＣ、７．２％のサルコシルで３０秒間１回洗浄、０．２ｘＳＳＣで３０秒間１回振盪。
【０１５１】
上で概説したように、断片化は、ｄｓＤＮＡ  Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅを使用して、またはＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ  ＳａｑＡＩによって実施することができる。加えて、標的ＤＮＡの調製およびハイブリダイゼーションのステップを図５に概説する。すべての手順は、製造元の指示に従って実施した。
【０１５２】
開発したプロトコルを図５に概略的に提示する。すべての手順は、製造元の指示に従って実施した。ｉｌｌｕｓｔｒａ（商標）ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＨＹ  ＤＮＡ増幅キットは、最初のＤＮＡ量（１０〜５０ｎｇ）を２００〜１０００倍に増幅したため、異なる試験した増幅キットのうち最も効果的であった。
【０１５３】
Ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅまたは制限酵素ＳａｑＡＩは、ＤＮａｓｅＩと比較して消化後のＤＮＡ量の損失が少ないことが明らかになった。ＵＬＹＳＩＳ（登録商標）ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５４６核酸標識化キットを使用した標識化手順を、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨゲノム標識化システムに置き換えた。後者は、標識手順が増幅を伴うため、より効果的であった。加えて、ＢｉｏＰｒｉｍｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ａｒｒａｙ  ＣＧＨゲノム標識化システムキットは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５−ａｈａ−ｄＣＴＰだけでなく、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５５５で５’末端に標識されたランダムプライマーも含有する。
【０１５４】
標識された標的ＤＮＡは、−２０℃で３０分間、１０倍の量のアセトン中２％ＬｉＣｌＯ４で沈殿させた。ペレットを１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって収集し、アセトンで１回洗浄し、風乾した。ペレットは、バイオチップ上でハイブリダイゼーションの準備ができた標識された標的ＤＮＡを表す。
【０１５５】
様々なハイブリダイゼーション条件（緩衝液、温度、および時間）を試験し、最適化された条件を選択した。標識された標的ＤＮＡを、ハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭのＧｕＳＣＮ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、０．２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）に溶解した。混合物を９５℃で５分間変性させ、氷上で２分間冷却した。サンプルをオリゴヌクレオチドプローブアレイのスライド上に２５℃で置き、カバーガラスで覆った。２５℃のＡｒｒａｙｉｔハイブリダイゼーションチャンバ（Ａｒｒａｙｉｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）で、４時間ハイブリダイズさせた後、スライドを２ｘＳＳＣ、３．６％サルコシル（ラウロイルサルコシン酸ナトリウム）で３０秒間すすぎ、その後、スライドを室温の０．２ｘＳＳＣで３０秒間洗浄し、１０００ｒｐｍで１分間回転乾燥させた後、ポータブルマイクロアレイリーダーＰＡ５０００（Ａｕｒｏｒａ  Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、ＵＳＡ）で解析した。
【０１５６】
ＤＮＡ増幅、断片化、標識化手順の最も効果的な組み合わせを生成し、環境サンプルに適用した。
【０１５７】
実施例５
Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ  ＤＮＡでのバイオチッププロトタイプの試験
次に、ＤＮＡ増幅、断片化、および標識化のために開発されたプロトコルを、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ、ＤＳＭ３３８２で試験した。結果を図６に示す。小さなアレイは、各プローブを複製した１２個のプローブで構築した。機能ヒドロゲナーゼ遺伝子の検出用に８個のプローブ（Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｓｃｏｃｃｕｓ）を設計し、腐食スケールでＳＲＢの効果を評価した。構造１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子を検出するために３個のプローブを設計し、それらうちの、文献［１５］によるとＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏおよびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに特異的な２個（Ｄｖ１６Ｓ＿１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２）、ならびに１個のプローブ（１６ＳＣＯＮＳ＿１）を、細菌コンソーシアム中の任意の細菌（ポジティブコントロール）の識別に使用した。プローブＳＲＢ１を、細菌コンソーシアム中のＳＲＢの識別に使用した［１０］。
【０１５８】
バイオチップ上のプローブの配置を図６Ａに示す。図６Ｂは、ハイブリダイゼーション画像を表し、図６Ｃはシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比として推定されたハイブリダイゼーションシグナル強度を表す。プローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１からのシグナルは、細菌の存在を定義する。プローブＳＲＢ１からのシグナルは、ＳＲＢの存在を定義する。２つの特定のプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１およびＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．を識別するように選択した。プローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１のみ、シグナル対ノイズ比が１より高いことが明らかになった。したがって、シグナル対ノイズ比が１より高いと陽性反応が起こる。
【０１５９】
プローブＤｖは、ｈｙｎＢ（ペリプラズムＮｉ、Ｆｅヒドロゲナーゼ）遺伝子に基づいて、任意の細菌コンソーシアム中のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏを識別する。同様の構造は、ＤＶプローブ（配列番号４ CAC CCC TGC ATC GGC TGC AG）と比較して、差が一文字のみであるＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのｈｙｎＢ（ペリプラズムＮｉ、Ｆｅヒドロゲナーゼ）遺伝子（配列番号８３ CAC CCC TGC ATC GGG TGC AG）中にも存在する。このプローブの蛍光シグナルの強度は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．に特異的なプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１の強度よりも顕著に低いことが見出された。
【０１６０】
したがって、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の識別は、バイオチップ上のプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１によって達成される。１６ＳＣＯＮＳ＿１、ＳＲＢ１、およびＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１のプローブは、プローブがカセット法で試験されると同様の蛍光シグナルが観察されることが、明らかになった。
【０１６１】
バイオチップに含めるための同一のハイブリダイゼーション能力を有するプローブを選択するための、カセットと拡張ｓｓＤＮＡアプローチとの関連性は、細菌ＤＮＡで確認した。
【０１６２】
実施例６
３つの異なるＭＩＣバイオチッププロトタイプを使用する環境サンプルの解析
最終的なパイロットＭＩＣバイオチップ（表５に列挙したプローブを含む）を開発するために、発明者らは、３種のＤＮＡサンプル（Ａ２、Ａ２１、およびＡ１３）を使用し、４つの異なるＭＩＣバイオチッププロトタイプを使用して各々解析した。異なるバイオチッププロトタイプによって、環境サンプルに適用した際の選択されたプローブの効率を解析し、ハイブリダイゼーションシグナル検出に十分なＤＮＡ量を推定する機会を提供した。実施例４に記載のＤＮＡ増幅、断片化、および標識化のために開発されたＮ１０プロトコルを、ハイブリダイゼーション用のすべてのＤＮＡサンプルの調製に使用した。
【０１６３】
Ａ２サンプル解析用のバイオチッププロトタイプは、重複する１２個のプローブで構築した。１１個のプローブ（ＳＲＢ１、ＤＳＲ２、Ｄｖ、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、およびＤｓｃｏｃｃｕｓ１）を、細菌コンソーシアム中のＳＲＢおよびその７種の属の検出に使用し、１個のプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１を、ポジティブコントロールプローブとして使用した。結果を図７に提示する。
【０１６４】
細菌コンソーシアム中の任意のＳＲＢを検出するために、プローブＳＲＢ１およびＤＳＲ２を選択した。プローブＳＲＢ１は、環境サンプルＡ２に適用することで非常に効果的であった。ＳＲＢの７種の属のうち、６種の属Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｏｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．を検出した。最高のハイブリダイゼーションシグナルは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．、およびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、続いて、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｏｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．で観察された。これらの観察は、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．およびＤｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．が、サンプルＡ２のＳＲＢコンソーシアム中で優勢であることを示している。Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．は、サンプルＡ２にバイオチップを適用しても検出されなかった。
【０１６５】
Ａ２１サンプル解析用のＭＩＣバイオチッププロトタイプは、重複する１７個のプローブを使用して構築した。１６個のプローブ（ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｖ＿ｈｙｎＢ２、Ｄｖ＿１＿ｈｙｎＡ２、Ｄｖ＿２＿ｈｙｎＡ２、Ｄｖ＿３＿ｈｙｎＡ２、Ｄｖ１６Ｓ＿１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿１６Ｓ＿２、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ１、およびＤｓｃｏｃｃｕｓ１）をＳＲＢの検出に使用し、１個のプローブ（１６ＳＣＯＮＳ＿１）をポジティブコントロールプローブとして使用した。結果を図８に提示する。ＭＩＣ発生の主な属としてＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．の詳細について、ヒドロゲナーゼ遺伝子の５個のプローブ（Ｄｖ、Ｄｖ＿ｈｙｎＢ２、Ｄｖ＿１＿ｈｙｎＡ２、Ｄｖ＿２＿ｈｙｎＡ２、およびＤｖ＿３＿ｈｙｎＡ２）を試験した。ヒドロゲナーゼ遺伝子のすべてのプローブは、同じハイブリダイゼーションシグナルを示した。これは、サンプルＡ２１中のＤｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．の存在を強く裏付けている。
【０１６６】
ＳＲＢの７種の属のうち、６種の属のＳＲＢが、Ａ２１サンプル中に存在していた。最高のハイブリダイゼーションシグナルは、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．およびＤｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．、続いてＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．およびＤｅｓｏｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、次いでＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．およびＤｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．で観察された。Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．は、バイオチッププロトタイプを環境サンプルＡ２１に適用しても検出されなかった。
【０１６７】
結論として、本発明者らは、サンプルＡ２およびＡ２１中のＳＲＢのプロファイルが異なることを観察した。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．、およびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．は、サンプルＡ２中で優勢であるが、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．およびＤｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．は、サンプルＡ２１中で優勢である。バイオチップの結果を視覚化するためには、２．５μｇの合計ＤＮＡで十分であった。
【０１６８】
Ａ１３サンプル解析用の別のＭＩＣバイオチッププロトタイプは、重複する１６個のプローブで構築した。このプロトタイプは、ＳＲＢおよびＮＲＢの２つのタイプの細菌を検出するためのプローブを含む。ＮＲＢは、ＳＲＢによって引き起こされる生物腐食プロセスを弱めることができる。１１個のプローブ（ＳＲＢ１、Ｄｖ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ＿１６Ｓ＿２、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｂａｃｔｅｒ１、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、およびＤｓｃｏｃｃｕｓ１）をＳＲＢの検出に使用し、４個のプローブ（ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ）をＮＲＢの検出に使用した。１個のプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１は、ポジティブコントロールプローブとして機能した。
【０１６９】
結果を図９Ａ〜Ｃに示す。これらの結果は、ＳＲＢと共にＮＲＢも同様に検出されることを示している。細菌の両方のグループは、同等の蛍光シグナルを示している。サンプルＡ２およびＡ１３中のＳＲＢのプロファイルは同様であった。Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｂｕｌｂｕｓ  ｓｐ．、およびＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．、続いてＤｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｓｐ．、Ｄｅｓｏｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．、Ｄｅｓｕｌｆｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｓｐ．が優勢であった。Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．は、サンプルＡ２、Ａ２１、Ａ１３にバイオチップを適用しても検出されなかった。
【０１７０】
次に、重複する２９個のプローブを含有するさらに別のＭＩＣバイオチッププロトタイプを、生物腐食に関与する重要な細菌グループを同定するために、Ａ２サンプルの解析に使用した。結果を図１０に示す。プローブの配置を図１０Ａに提示し、ハイブリダイゼーション画像を図１０Ｂに提示し、プローブ間のハイブリダイゼーションシグナルの分布を図１０Ｃに提示する。
【０１７１】
１２個のプローブ（ＳＲＢ１、ＤＳＲ１、ＤＳＲ２、Ｄｖ、Ｄｖ１６Ｓ＿１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２、Ｄｂｕｌｂｕｓ、Ｄｂａｃｔｅｒ２、Ｄｓｍｉｃｒｏｂｉｕｍ１、Ｄｔｏｍａｃｕｌｕｍ２、およびＤｓｃｏｃｃｕｓ１）を、細菌コンソーシアム中のＳＲＢおよびそれらの７種の属の検出に使用した。６個のプローブ（Ｇｅｏｂａｃ、ＧｅｏＭ、ＧｅｏＳ、Ｓｈｅｗ１、ＳｈｅｗＲＮＡ１、１６ＳＲＮＡＰＲ）を、細菌コンソーシアム中のＭＲＢの検出に使用した。３個のプローブ（ＦＴＨＦＳ、ａ／ｂｓｓＡ、ＦｉｒｍｉｃｙｔｉｓｈｙｄＡ）を、細菌コンソーシアム中のＦＢの同定に使用した。４個のプローブ（ｎａｒＧ、ｎａｐＡ、ｎｉｒＳ、ｎｉｒＫ）を、細菌コンソーシアム中のＮＲＢの検出に使用した。細菌コンソーシアム中の任意の細菌を識別するために、３個のプローブ（１６ＳＣＯＮＳ＿１、１６ＳＣＯＮＳ＿２、１６ＳＣＯＮＳ＿３）を含めた（ＰＣ−ポジティブコントロール）。
【０１７２】
２９個のプローブバイオチップを使用したＡ２サンプルの解析により、両方のバイオチッププロトタイプでのＳＲＢのハイブリダイゼーションシグナルは同じプロファイルを示した（図１０Ｃ、７Ｃ）。ハイブリダイゼーションシグナルの強度は、ＤＮＡおよびフルオロフォアの濃度がより高かったため、より小さな１２プローブバイオチッププロトタイプでより高かった（図１０Ｃ）。５．５μｇのＤＮＡを７μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（１２プローブバイオチッププロトタイプの場合）に溶解し、対して、６．５μｇのＤＮＡを２４μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（２９プローブバイオチッププロトタイプの場合）に溶解して、バイオチップのより小さい面積をカバーした。
【０１７３】
ＭＲＢグループのうちＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐ．が検出されたが、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．は検出されなかった。ＦＢグループでは、炭化水素分解菌が同定された。硝酸および亜硝酸還元酵素遺伝子プローブに基づいて、ＮＲＢが検出された。最後に、Ａ２サンプルには検出可能なＥ．ｃｏｌｉは含有されていなかった。
【０１７４】
様々なバイオチッププロトタイプによる環境サンプルの解析により、一部のプローブには蛍光シグナルが存在しないことが明らかになった。これは、研究したコンソーシアム（サンプル）中に適切な細菌グループが存在しないか、特定のバイオチップでの細菌検出にプローブが好適でないことのいずれかを示している可能性があった。
【０１７５】
機能プローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１および構造プローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２を、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．の識別用に選択した。新規に設計したプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１はシグナルを示したが、文献［１５］から選択したプローブＤｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２は、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ  ＤＮＡを含む、研究したどのケースでもシグナルを提供しなかった。したがって、シグナルの欠如は、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２プローブが細菌検出に好適でないことを示している。したがって、Ｄｂａｃｔｅｒｉｕｍ１６Ｓ＿２プローブは、パイロットバイオチップに含めなかった。
【０１７６】
コンソーシアム中の任意のＳＲＢ検出のために、プロトタイプＭＩＣ−バイオチップのうちの１つに３個のプローブＳＲＢ１、ＤＳＲ１、およびＤＳＲ２を含めた。環境サンプルの解析は、プローブＳＲＢ１のみが非常に効果的であったが、プローブＤＳＲ１およびＤＳＲ２からシグナルはほとんど検出されなかったことを示した。これらのプローブは、両方とも文献［１１］から選択した。しかしながら、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃｕｍ  ＤＮＡを含むすべての研究ケースでは、プローブＳＲＢ１（ａｐｒ遺伝子に基づく）が強力なシグナルを提供した。ｄｓｒ遺伝子は十分に保存的ではないことが知られている。弱いシグナルは、これらのプローブが細菌検出に好適でないことを示唆するため、ＤＳＲ１およびＤＳＲ２は、パイロットＭＩＣバイオチップに含めなかった。３つのすべてのポジティブコントロールプローブ（１６ＳＣＯＮＳ＿１、１６ＳＣＯＮＳ＿２、１６ＳＣＯＮＳ＿３）は検出可能なシグナルを示したが、本発明者らは、すべての研究ケースでは最も効果的であったため、パイロットＭＩＣバイオチップにポジティブプローブ１６ＳＣＯＮＳ＿１１つのみを含めた。
【０１７７】
Ｄｂａｃｔｅｒ１およびＤｂａｃｔｅｒ２機能プローブを、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．の検出用に選択した。２個のプローブのうちのいずれも環境サンプルを使用してシグナルを示さなかったが、プローブＤｂａｃｔｅｒ２はＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ株で良好に機能した（図４Ｆ）。研究ケースでは、この結果はＤｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．の不在に起因する可能性が最も高い。したがって、Ｄｂａｃｔｅｒ１プローブおよびＤｂａｃｔｅｒ２プローブの両方をパイロットバイオチップに含めた。
【０１７８】
本明細書に記載の実験により、発明者らは、表５に列挙された３０個のプローブを含むパイロットＭＩＣバイオチップの開発が可能になった。３０個のプローブのうち１１個のプローブは、生物腐食に関与する主なＳＲＢグループの同定を可能にし、腐食スケールを提供し、１８個のプローブは追加のＭＩＣ細菌グループ（古細菌、ＭＲＢ、ＦＢ、ＮＲＢ、Ｅ．ｃｏｌｉ）、１つのポジティブコントロールプローブ（１６ＳＣＯＮＳ＿１）の同定を可能にする。
【表６−１】
2020516269.tif 000020
【表６−２】
2020516269.tif 000021
【表６−３】
2020516269.tif 000022
【０１７９】
等価物
本発明は、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。前述の実施形態は、本明細書に記載の発明を限定するのではなく、あらゆる点で例示的であると見なされるべきである。本発明の方法およびシステムの様々な実施形態では、含む、という用語が記載されたステップまたは構成要素に関して使用される場合、方法およびシステムが、記載されたステップまたは構成要素から基本的になるか、またはそれらからなることもまた、考慮される。さらに、本発明が動作可能である限り、ステップの順序またはある特定の行為を実施する順序は重要ではないことが理解されるべきである。さらに、２つ以上のステップまたは行為は、同時に行うことができる。本明細書で使用されるすべてのパーセンテージおよび比は、特に明記しない限り、重量によるものである。
【０１８０】
本明細書では、文脈で明確に指示されない限り、単数形には複数形も含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が優先されるであろう。
参照文献：
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９．Ｈｅ  Ｑ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｔｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｈｉｌｄｅｎｂｏｒｏｕｇｈ，ｉｎｆｅｒｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｇｌｏｂａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００６）７２：４３７０−４３８１
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【０１８１】
参照による援用
本明細書中に引用されたすべての参照文献は、各個々の刊行物、データベースエントリー（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が具体的かつ個々に参照により援用されると示される場合と同じ程度で、参照により援用される。各々かつすべての個々の出版物、データベースエントリー（例えばＧｅｎｂａｎｋ配列またはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許に関する参照による援用についての記述は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５７（ｂ）（１）に従っており、たとえそのような引用が参照による援用についての特定の記述の直近になくとも、それらの各々が３７ＣＦＲ§１．５７（ｂ）（２）に準拠して明確に特定されることを、出願人は意図するものである。明細書の中に参照による援用の特別な記述があったとしても、それが参照によるこの一般的な援用の宣言を決して弱めることはない。本明細書中の参考文献の引用は、その参考文献が関連する先行技術であることを承認することを意図するものではなく、これらの出版物または文書の内容または日付に関していかなる承認も構成するものでもない。
【０１８２】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書に記載されたものに加えて本発明の様々な改変は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１８３】
前述の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分であると考えられる。本明細書に示され記載されたものに加えて本発明の様々な改変は、前述の記載から当業者に明らかとなりそして添付の特許請求の範囲内に入る。訂正証明書、特許出願書類、科学論文、政府報告書、ウェブサイト、および本明細書で言及される他の参照文献を含む特許文書の各々の全開示は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に援用される。用語に矛盾がある場合、本明細書が優先される。
【図１】
2020516269.tif 000023
【図２】
2020516269.tif 000024
【図３】
2020516269.tif 000025
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020516269.tif 000027
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2020516269.tif 000029
【図４Ｅ】
2020516269.tif 000030
【図４Ｆ】
2020516269.tif 000031
【図４Ｇ】
2020516269.tif 000032
【図４Ｈ】
2020516269.tif 000033
【図５】
2020516269.tif 000034
【図６Ａ】
2020516269.tif 000035
【図６Ｂ】
2020516269.tif 000036
【図６Ｃ】
2020516269.tif 000037
【図７Ａ】
2020516269.tif 000038
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2020516269.tif 000040
【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
2020516269.tif 000042
【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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