(57)【要約】ニューロンの感受性を低減し、それによって炎症及び慢性疼痛を低減する方法が本明細書に開示される。具体的には、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤であるＡＰＸ３３３０を投与して、ＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を強化し、それによって炎症メディエーターに対するニューロンの感受性を低減し、炎症又は慢性疼痛を軽減する方法が開示される。【選択図】図８Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要としている被験体におけるニューロンの感受性を低減する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記追加の治療剤が、白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
それを必要としている被験体における炎症及び慢性疼痛を治療する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項７】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加の治療剤が、白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体が、肥満及び糖尿病のうちの少なくとも１つに罹患している、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
それを必要としている被験体におけるニューロンＤＮＡ修復機能を強化する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記追加の治療剤が、白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
それを必要としている被験体における化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を治療する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１７年４月１７日出願の米国仮特許出願第６２／４８６，０３３号に対する利益を主張する。
【０００２】
政府の支援についての記載
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって与えられたＮＳ０９１６６７の下で政府の支援を受けて成された。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表の組み込み
１，０７０バイトのサイズ（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）ＥＸＰＬＯＲＥＲＡで測定したとき）の「ＩＵＲＴＣ＿２０１７−１１６−０２＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルを含むコンピュータ可読形態の配列表を本明細書に提供し、参照により本明細書に組み込む。この配列表は、配列番号１〜４からなる。
【０００４】
本開示は、一般に、ニューロンの感受性を低減し、それによって、炎症及び慢性疼痛を低減する方法に関する。具体的には、ＡＰＸ３３３０の投与を通じてＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を強化することによって、炎症メディエーターに対するニューロンの感受性が低減され、それによって、炎症又は慢性疼痛が軽減されることが本明細書において見出された。
【背景技術】
【０００５】
損傷を受けた組織及び損傷中の免疫細胞から放出される炎症メディエーターは、一次感覚ニューロンの感受性に対して急性及び慢性の作用を有し得る。プロスタグランジン、ブラジキニン、ヒスタミン、セロトニン、トリプターゼ、サイトカイン、及びＡＴＰは、感覚ニューロンの脱分極の一因となるイオンチャネルの翻訳後修飾を介して、様々な刺激に対する感覚ニューロンの感受性を変化させ得る（非特許文献１を参照）。これら炎症メディエーターはキナーゼ活性を強化し、その結果、イオンチャネルがリン酸化及び調節されて、ニューロンの感受性が変化する。末梢感作は、炎症性疾患及び慢性疼痛症候群の鍵となる構成要素である。この感作は、ヒトでは痛覚過敏及び異痛症として、並びに疼痛の動物モデルでは過剰侵害受容として顕在化する。傷害後の急性過敏症は、傷害の保護に役立つ炎症応答の重要な構成要素であるが、組織修復に必要な時間を過ぎてもこの過敏症が維持されていることが多い。
【０００６】
炎症メディエーターのキナーゼ活性に対する広く研究されている作用に加えて、炎症中及び慢性神経因性疼痛の動物モデルでは、反応性の酸素（ＲＯＳ）及び窒素の種（ＲＮＳ）の生成が増加する（非特許文献２〜７）。現在の治療法では治療が困難な多くの持続性炎症及び慢性疼痛状態の根底には、この維持された過敏性がある。具体的には、幾つかの研究で、抗酸化剤によってニューロンの感受性が回復することが示唆されている（非特許文献８〜１１）が、ＲＯＳ／ＲＮＳは細胞シグナル伝達及び細胞酸化還元ホメオスタシスにおいて広範な役割を有していることから、全身抗酸化剤治療には有害作用がある（非特許文献１２を参照）。感覚ニューロンにおけるＲＯＳ／ＲＮＳ生成の重大な帰結は、酸化的ＤＮＡ損傷である。実際、後根神経節に由来する培養物中において、ＲＯＳ／ＲＮＳ及びその後のＤＮＡ損傷が、シスプラチン、オキサリプラチン、又は電離放射線によって誘起されるニューロンの感受性の変化を媒介することが、以前の研究で証明された（非特許文献１３〜１５）。
【０００７】
ＤＮＡ損傷の修復は、ニューロンのホメオスタシスの維持にとって非常に重要である（非特許文献１６〜１９）が、その理由は、内因性代謝活性、傷害に続発する酸化的ストレス（非特許文献２０）、環境有害物質（非特許文献２１）、及び薬物（非特許文献２２）が全てニューロンのＤＮＡ損傷を引き起こし得るためである。ニューロンは、塩基除去修復（ＢＥＲ）、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、直接損傷修復、及び非相同末端結合又は相同組み換えを含む、主なＤＮＡ修復経路を含む（非特許文献２３〜２５）。ＢＥＲ経路は、塩基に対する酸化的損傷、塩基のアルキル化、又は脱アミノ化によって引き起こされる核及びミトコンドリアにおけるＤＮＡ損傷を修復し、かつニューロンを保護するための最も重要な修復経路である可能性がある。ＢＥＲにおける最初の工程は、ＤＮＡグリコシラーゼによって不正確な又は損傷を受けた塩基を除去することである。ＢＥＲ経路における第２の工程には、脱プリン及び／又は脱ピリミジン（ＡＰ）部位のすぐ５’側のホスホジエステル骨格を加水分解する酵素ＡＰＥ１が関与している。これによって、正常な３’−ヒドロキシル基及び脱塩基デオキシリボース−５−リン酸が生じるが、これは、ＢＥＲ経路の後続酵素によってプロセシングされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＶａｓｋｏ，２００２
【非特許文献２】Ｂａｕｅｒｏｖａ及びＢｅｚｅｋ，１９９９
【非特許文献３】Ｂａｂｉｏｒ，２０００
【非特許文献４】Ｋｉｍら，２００４
【非特許文献５】Ｒｅｍａｎｓら，２００５
【非特許文献６】Ｆｉｄａｎｂｏｙｌｕら，２０１１
【非特許文献７】Ｓａｌｖｅｍｉｎｉら，２０１１
【非特許文献８】Ｋｈａｔｔａｂ，２００６
【非特許文献９】Ｋｅｅｂｌｅら，２００９
【非特許文献１０】Ｆｉｄａｎｂｏｙｌｕら，２０１１
【非特許文献１１】Ｄｕｇｇｅｔｔら，２０１６
【非特許文献１２】Ｍａｒｔｉｎ及びＢａｒｒｅｔｔ，２００２
【非特許文献１３】Ｊｉａｎｇら，２００８ａ
【非特許文献１４】Ｖａｓｋｏら，２０１１
【非特許文献１５】Ｋｅｌｌｅｙら，２０１４
【非特許文献１６】Ｂｒｏｏｋｓ，２００２
【非特許文献１７】ＭｃＭｕｒｒａｙ，２００５
【非特許文献１８】Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ａ
【非特許文献１９】Ｈｅｔｍａｎら，２０１０
【非特許文献２０】Ｋｒｕｍａｎ及びＳｃｈｗａｒｔｚ，２００８
【非特許文献２１】Ｋｉｓｂｙら，１９９９
【非特許文献２２】Ａｈｌｅｓ及びＳａｙｋｉｎ，２００７
【非特許文献２３】Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ｂ
【非特許文献２４】Ｂａｒｚｉｌａｉら，２００８
【非特許文献２５】Ｆｏｒｔｉｎｉ及びＤｏｇｌｉｏｔｔｉ，２０１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在の治療法は限られた有効性しか有さず、重大な副作用が生じる場合があるので、末梢感作を維持するための機序を決定し、炎症及び慢性疼痛を治療するための新規治療法を設計するためにその情報を使用することが、臨床的に重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、本開示は、炎症メディエーターがニューロンの感受性の変化を維持する経路に洞察を加え、かつ炎症及び／又は慢性疼痛を軽減するための薬理学的ターゲットとしてニューロンＤＮＡ修復の強化にスポットを当てる。更に、本開示は、ＤＮＡ修復を強化し、ニューロンの感受性を低減するための化合物ＡＰＸ３３３０を提供する。
【００１１】
本開示は、一般に、ニューロンの感受性を低減し、それによって、炎症性及び慢性の疼痛を低減する方法に関する。具体的には、ＡＰＸ３３３０（及び／又はそのアナログ）の投与を通じてＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を強化することによって、炎症メディエーターに対するニューロンの感受性が低減され、それによって、炎症又は慢性疼痛が軽減されることが本明細書において見出された。
【００１２】
上記に基づいて、一態様では、本開示は、それを必要としている被験体におけるニューロンの感受性を低減する方法を目的とする。該方法は、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を該被験体に投与する工程を含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、それを必要としている被験体における炎症及び慢性疼痛を治療する方法を目的とする。該方法は、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を該被験体に投与する工程を含む。
【００１４】
更に別の態様では、本開示は、それを必要としている被験体におけるニューロンＤＮＡ修復機能を強化する方法を目的とする。該方法は、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を該被験体に投与する工程を含む。
【００１５】
以下の詳細な説明を考慮すると、本開示がより深く理解され、かつ上記以外の特徴、態様、及び利点が明らかになるであろう。このような詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、後肢の炎症後に腰ＤＲＧにおいてＤＮＡ損傷が強化されることを示す。図１Ａは、ラットの片側の後肢にＣＦＡを注射した５日間後の、対側及び同側のＬ４／Ｌ５  ＤＲＧにおけるｐＨ２Ａ．Ｘ及びビンクリン（ローディング対照）の発現の代表的なウエスタンブロットである。図１Ｂは、ビンクリンの量に対して正規化した、６回の実験から得られたｐＨ２Ａ．Ｘの密度の平均±ＳＥＭを示す。＊は、注射と対側のＤＲＧと比較した、ＣＦＡ注射と同側のＤＲＧにおける統計的に有意な増加を示す（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。図１Ｃは、ＣＦＡ注射の５日間後のラット由来のＬ５  ＤＲＧにおけるｐＨ２Ａ．Ｘの顕微鏡写真（２０×）である。緑色蛍光は、ｐＨ２Ａ．Ｘに対する免疫反応性を示す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、炎症メディエーターに曝露した後、ニューロン培養物においてＤＮＡ損傷が時間依存的に強化されることを示す。図２Ａは、指定の期間ＬＰＳ又はＭＣＰ−１の有り無しで成長させた培養物からのｐＨ２Ａ．Ｘ及びビンクリン（ローディング対照）の代表的なウエスタンブロットである。図２Ｂは、１μｇ／ｍＬのＬＰＳ（薄色のバー）又は１００ｎｇ／ｍＬのＭＣＰ−１（濃色のバー）で処理した後、ビンクリンに対して正規化したｐＨ２Ａ．Ｘのバンドの密度の平均±ＳＥＭを示す。＊は、時間＝０における発現からの有意差を示す、ダネットの事後検定を伴う一元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図３】図３は、炎症メディエーターに曝露した後、ニューロン培養物からのＣＧＲＰ放出が変化したことを示す。カラムは、漸増濃度のＬＰＳ（薄色のバー）又はＭＣＰ−１（濃色のバー）に２４時間曝露した後、３０ｎＭカプサイシンに１０分間曝露することによって刺激したＣＧＲＰ放出の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１の非存在下における放出からの有意差を示す、ダネットの事後検定を伴う一元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図４】図４Ａ及び４Ｂは、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１に曝露した後のＤＮＡ損傷及び刺激されたＣＧＲＰ放出の変化が、ＴＬＲ４（ＬＰＳ）並びにＣＣＲ２（ＭＣＰ−１及びＬＰＳ）に対するアンタゴニストによって回復したことを示す。カラムは、指定の通り、ＬＰＳ−ＲＳ又はＲＳ５０４９３の有り無しで、３μｇ／ｍＬのＬＰＳ（薄色のバー）又は０．３μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１（濃色のバー）に２４時間曝露した後のｐＨ２Ａ．Ｘ発現（図４Ａ）又は３０ｎＭカプサイシンに１０分間曝露することによって刺激したＣＧＲＰ放出（図４Ｂ）の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１の非存在下におけるＤＮＡ損傷又は放出からの有意差を示す、ダネットの事後検定を伴う一元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し（ｉｎｃｌｕｄｅ）、かつＣＧＲＰ放出を阻害するＬＰＳの作用が回復したことを示す。図５Ａは、処理スキームを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を阻害するＬＰＳの作用が回復したことを示す。図５Ｂは、指定の前処理後２４時間ＬＰＳの有り無しで成長させた培養物からのｐＨ２Ａ．Ｘ、ＡＰＥ１、ＨＡタグ、及びビンクリン（ローディング対照）の代表的なウエスタンブロットである。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を阻害するＬＰＳの作用が回復したことを示す。図５Ｃは、ｐＨ２Ａ．Ｘの密度測定を示す。各カラムは、ＳＣｓｉＲＮＡ（薄色のバー）又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ（濃色のバー）と併せて指定の前処理後に３μｇ／ｍＬのＬＰＳで処理することによって誘起された、ビンクリンに対して正規化したｐＨ２Ａ．Ｘのバンドの密度の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＳＣｓｉＲＮＡで処理したベクター対照と比較した発現からの有意差を示す、ダネットの多重比較事後検定を伴う二元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を阻害するＬＰＳの作用が回復したことを示す。図５Ｄは、ＣＧＲＰ放出を示す。各カラムは、ＳＣｓｉＲＮＡ（薄色のバー）又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ（濃色のバー）と併せて、指定通り、ＡＰＥ１過剰発現の有り無しで、３μｇ／ｍＬのＬＰＳで処理した後の、カプサイシンによって刺激されたＣＧＲＰ放出（総含量の％として表される）の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＳＣｓｉＲＮＡで処理したベクター対照と比較した放出の有意差を示す、ダネットの多重比較事後検定を伴う二元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図６Ａ】図６Ａは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を増強するＭＣＰ−１の作用が回復したことを示す。図６Ａは、処理スキームを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を増強するＭＣＰ−１の作用が回復したことを示す。図６Ｂは、指定の前処理後２４時間ＭＣＰ−１の有り無しで成長させた培養物からのｐＨ２Ａ．Ｘ、ＡＰＥ１、ＨＡタグ、及びビンクリン（ローディング対照）の代表的なウエスタンブロットである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を増強するＭＣＰ−１の作用が回復したことを示す。図６Ｃは、ｐＨ２Ａ．Ｘの密度測定を示す。各カラムは、ＳＣｓｉＲＮＡ（薄色のバー）又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ（濃色のバー）と併せて指定の前処理後に３μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１で処理することによって誘起された、ビンクリンに対して正規化したｐＨ２Ａ．Ｘのバンドの密度の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＳＣｓｉＲＮＡで処理したベクター対照と比較した発現からの有意差を示す、ダネットの多重比較事後検定を伴う二元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図６Ｄ】図６６Ｄは、ＡＰＥ１によって媒介されるＤＮＡ修復を増加させることによって、ＤＮＡ損傷を誘起し、かつＣＧＲＰ放出を増強するＭＣＰ−１の作用が回復したことを示す。図５Ｄは、ＣＧＲＰ放出を示す。各カラムは、ＳＣｓｉＲＮＡ（薄色のバー）又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ（濃色のバー）と併せて、指定通り、ＡＰＥ１過剰発現の有り無しで、３μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１で処理した後の、カプサイシンによって刺激されたＣＧＲＰ放出（総含量の％として表される）の平均±ＳＥＭを表す。＊は、ＳＣｓｉＲＮＡで処理したベクター対照と比較した放出の有意差を示す、ダネットの多重比較事後検定を伴う二元配置分散分析、ｐ＜０．０５。
【図７Ａ】図７Ａは、感覚ニューロン対腫瘍細胞におけるＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害の種々の役割を示す。図７Ａは、腫瘍細胞では、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害が、腫瘍の成長、生存、移動、及び腫瘍の浸潤に対する複数の下流の作用を有することを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、感覚ニューロン対腫瘍細胞におけるＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害の種々の役割を示す。図７Ｂは、ＤＲＧニューロン等の感覚ニューロン細胞では、ＡＰＸ３３３０の添加が細胞に対して負の作用を有さず、ＤＮＡ  ＢＥＲ経路を発動する酸化的ＤＮＡ損傷剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン）に対するＲｅｆ−１／ＡＰＥ１  ＤＮＡ修復活性の強化を通して生存及び機能的保護を促進することを示す。右下のパネルでは、担癌マウスにシスプラチンを全身投与することによって誘起される神経毒性をＡＰＸ３３３０が弱毒化した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、感覚ニューロン対腫瘍細胞におけるＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害の種々の役割を示す。図７Ｃは、ＤＲＧ内のＤＮＡ損傷に対するシスプラチン及びＡＰＸ３３３０の効果について調べるための処理パラダイムを提供する。
【図７Ｄ】図７Ｄは、感覚ニューロン対腫瘍細胞におけるＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害の種々の役割を示す。図７Ｄは、Ｄ２４及びＤ３１におけるｐＨ２Ａ．Ｘの免疫反応性を示す代表的なブロットである。
【図７Ｅ】図７Ｅは、感覚ニューロン対腫瘍細胞におけるＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元阻害の種々の役割を示す。図７Ｅは、ｐＨ２Ａ．Ｘの免疫反応性の定量を示す。＊は、チューキーの事後検定を伴う一元配置分散分析によって決定された、Ｄ１８とＤ２４との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す（図７Ｅ）。†は、ボンフェローニの事後検定を伴う二元配置分散分析によって決定された、Ｖｅｈ／Ｖｅｈ群とＶｅｈ／Ｃｉｓ群との間の統計的有意性（ｐ＜０．０５）を示す（図７Ｅ）。
【図８】図８Ａ及び８Ｂは、新規化学物質（ＮＣＥ）；Ｅ３３３０アナログを示す。図８Ａは、Ｅ３３３０及び新規化合物の概略図である。検討した基は、キノンシリーズ（Ａ）、３位シリーズ（Ｂ）、アルキル側鎖シリーズ（Ｃ）、及びカルボン酸／アミンシリーズ（Ｄ）を含む。図８Ｂは、より強力なＲｅｆ−１酸化還元阻害を示す現在の新規アナログを示す。
【図９Ａ】図９Ａは、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を予防するための、ＡＰＥ１を標的とするＡＰＸ３３３０（Ｅ３３３０）の化学的アナログの同定及び特性評価を示す。図９Ａは、ＡＰＸ３３３０及びその化学的アナログの酸化還元阻害アッセイから得られた結果を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を予防するための、ＡＰＥ１を標的とするＡＰＸ３３３０（Ｅ３３３０）の化学的アナログの同定及び特性評価を示す。図９Ｂは、ＡＰＸ３３３０及びその化学的アナログのＮＦκＢ結合の阻害を示す。
【図９Ｃ】図９Ｃは、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を予防するための、ＡＰＥ１を標的とするＡＰＸ３３３０（Ｅ３３３０）の化学的アナログの同定及び特性評価を示す。図９Ｃは、ＩＭＲ３２細胞株におけるＡＰＸ３３３０及びそのアナログの腫瘍細胞死滅能力を示す。
【図９Ｄ】図９Ｄは、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を予防するための、ＡＰＥ１を標的とするＡＰＸ３３３０（Ｅ３３３０）の化学的アナログの同定及び特性評価を示す。図９Ｄは、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞株におけるＡＰＸ３３３０及びそのアナログの腫瘍細胞死滅能力を示す。
【図１０】図１０は、ＡＰＸ３３３０及びその化学的アナログのＥＭＳＡ及びトランス活性化のデータを示す。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、ＩＭＲ３２細胞（図１１Ａ）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞（図１１Ｂ）におけるＡＰＸ２００９の薬物動態プロファイルを示す。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、Ｅ３３３０及びＡＰＸ２００９による前処理が、感覚ニューロン培養物においてシスプラチンによって誘起される細胞死を減弱したが、ＡＰＸ２００７もＡＰＸ２０３２も減弱しなかったことを示す。図１２Ａは、指定の通り様々な濃度の薬物で２４時間処理した培養物からの細胞の生存を示す。各カラムは、百分率の平均±ＳＥＭを表す。トリパンブルー排除によって測定される細胞生存率を、３つの独立した収集から培養下で１４日目に求めた。＊は、分散分析及びチューキーの事後検定を使用した、薬物処理無しと比べた薬物処理後の生存率の有意差を示す。図１２Ｂは、ビヒクル（ＤＭＳＯ）又は２０μＭのＥ３３３０、ＡＰＸ２００７、ＡＰＸ２００９、若しくはＡＰＸ２０３２  ＡＰＸ薬（指定の通り）に７２時間及び様々な濃度のシスプラチンに２４時間曝露したニューロン培養物を示す。各カラムは、トリパンブルー排除によって測定した細胞の生存率の平均±ＳＥＭを表す。＊は、分散分析及びチューキーの事後検定を使用した、薬物で処理された培養物と比べたシスプラチンで処理されていない培養物における有意差を示す。
【図１３Ａ】図１３Ａは、ＡＰＸ３３３０の化学的アナログ（阻害剤ＩＩＩ（図１３Ａ）のＤＮＡ修復アッセイの結果を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、ＡＰＸ２００７（図１３Ｂ）のＤＮＡ修復アッセイの結果を示す。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、ＡＰＸ２００９（図１３Ｃ）のＤＮＡ修復アッセイの結果を示す。
【図１３Ｄ】図１３Ｄは、ＡＰＸ２０３２（図１３Ｄ））のＤＮＡ修復アッセイの結果を示す。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、Ｅ３３３０及びＡＰＸ２００９は、培養下の感覚ニューロンからのＣＧＲＰ放出は変化させなかったが、カプサイシンによって惹起されるＣＧＲＰの放出のシスプラチンによって誘起される低減を減弱したことを示す。各カラムは、ＣＧＲＰの基本放出（オープンカラム）又はカプサイシンによって刺激された放出（陰影カラム）（ｆｍｏｌ／ウェル／分）の平均±ＳＥＭを表す。図１４Ａは、放出実験前に７２時間、培地又は１０若しくは２０μＭの様々な薬物（指定の通り）に曝露した培養物を示す。図１４Ｂは、放出実験前に７２時間培地又は１０若しくは２０μＭの様々な薬物（指定の通り）に、及び２４時間シスプラチンに曝露した培養物を示す。＊は、分散分析及びチューキーの事後検定を使用した、未処理細胞と比べたカプサイシンによって刺激された放出における有意差を示す。
【図１５】図１５は、ＡＰＸ２００９は、感覚ニューロン培養物におけるシスプラチンによって誘起されるＨ２ＡＸのリン酸化を減弱したが、ＡＰＸ２００７もＡＰＸ２０３２も減弱しなかったことを示す。上のパネルは、１０μＭのシスプラチンに曝露する前並びに２４時間及び４８時間曝露した後の培養物からのホスホ−Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）及びビンクリンの代表的なウエスタンブロットを示す。指定の通りシスプラチン処理する前７２時間及び処理中に、ビヒクル対照としてのＤＭＳＯ又は２０μＭのＡＰＸ２００７、ＡＰＸ２００９、若しくはＡＰＸ２０３２に培養物を曝露した。下のパネルは、３つの独立した実験からのビンクリンに対して正規化したｐＨ２ＡＸ発現の密度測定の平均±ＳＥＭを表す。分散分析及びチューキーの事後検定を使用して同時点におけるＤＭＳＯ対照と比較したとき、＊は、シスプラチンで処理した細胞におけるｐＨ２ＡＸ密度の統計的に有意な増加を示し、一方、†は、薬物による有意な変化を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、培養下の感覚ニューロンのオキサリプラチンによって誘起される毒性をＡＰＸ２００９が減弱したことを示す。図１６Ａは、様々な濃度のオキサリプラチンに２４時間曝露した後の細胞生存率を示す。各カラムは、指定の通り様々な濃度のオキサリプラチンに２４時間曝露した後に、トリパンブルー排除によって測定したときの細胞生存率の平均±ＳＥＭを表す。ビヒクル対照としてのＤＭＳＯ（左）、１０μＭのＡＰＸ２００９（中央）、又は２０μＭのＡＰＸ２００９（右）で７２時間培養物を処理する。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、培養下の感覚ニューロンのオキサリプラチンによって誘起される毒性をＡＰＸ２００９が減弱したことを示す。図１６Ｂは、ＣＧＲＰの基本放出（オープンカラム）又は３０ｎＭのカプサイシンによって刺激された放出（陰影カラム）（ｆｍｏｌ／ウェル／分）を示す。カラムは、ＣＧＲＰの基本放出（オープンカラム）又は３０ｎＭのカプサイシンによって刺激された放出（陰影カラム）（ｆｍｏｌ／ウェル／分）の平均±ＳＥＭを表す。水平バーは、放出実験前に２４時間３０μＭのオキサリプラチンに、及び７２時間１０又は２０μＭのＡＰＸ２００９に曝露した培養物を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、培養下の感覚ニューロンのオキサリプラチンによって誘起される毒性をＡＰＸ２００９が減弱したことを示す。図１６Ｃの上のパネルは、指定の通り、３０μＭのオキサリプラチンに曝露する前並びに２４時間及び４８時間曝露した後、並びにシスプラチン処理する前７２時間及び処理中にＤＭＳＯ又は２０μＭのＡＰＸ２００９に曝露した、培養物からのホスホ−Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）及びビンクリンの代表的なウエスタンブロットを示す。下のパネルは、３つの独立した実験からビンクリンに対して正規化したｐＨ２ＡＸ発現の密度の平均±ＳＥＭを表す。＊は、分散分析及びチューキーの事後検定を使用して対照と比較したとき、オキサリプラチンによって処理された培養物における統計的に有意な差を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａは、ＰＤＡＣ  ３ＤモデルにおいてＡＰＸ２００９が腫瘍細胞を死滅させるが、ＣＡＦは死滅させないことを示す。図１７Ａは、ＣＡＦ（ＥＧＦＰで形質導入）の有り無しで、３Ｄ培養下で成長したＰａ０３Ｃ（腫瘍細胞（ＴｄＴｏｍａｔｏで形質導入）を示す。腫瘍細胞のみと、スフェロイド中腫瘍細胞及びＣＡＦとを示す。図１７Ａにおける中央及び右の定量グラフは、腫瘍（中央）対ＣＡＦ（右）の強度（図１７Ａ）を示す。スフェロイドをＡＰＸ２００９で処理し、腫瘍（赤色チャネル）及びＣＡＦ（緑色チャネル）の強度の面積（図１７Ａ）を培養下で１２日間後に定量した。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、ＰＤＡＣ  ３ＤモデルにおいてＡＰＸ２００９が腫瘍細胞を死滅させるが、ＣＡＦは死滅させないことを示す。図１７Ｂは、ＣＡＦ（ＥＧＦＰで形質導入）の有り無しで、３Ｄ培養下で成長したＰａ０３Ｃ（腫瘍細胞（ＴｄＴｏｍａｔｏで形質導入）を示す。腫瘍細胞のみと、スフェロイド中腫瘍細胞及びＣＡＦとを示す。図１７Ｂにおける中央及び右の定量グラフは、腫瘍（中央）対ＣＡＦ（右）の面積（図１７Ｂ）を示す。スフェロイドをＡＰＸ２００９で処理し、腫瘍（赤色チャネル）及びＣＡＦ（緑色チャネル）の面積（図１７Ｂ）を培養下で１２日間後に定量した。
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、ＰＤＡＣ  ３ＤモデルにおいてＡＰＸ２００９が腫瘍細胞を死滅させるが、ＣＡＦは死滅させないことを示す。代表的な画像を図１７Ｃに示す。スチューデントのｔ検定（各用量におけるビヒクル対照対薬物処理）及び一元配置分散分析の両方を使用して差を求め、腫瘍のみ又はＣＡＦと共培養した腫瘍について統計的差を観察した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１）。ＡＰＸ２００９で処理したＣＡＦでは対照からの差が観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似の又は等価な任意の方法及び材料を本開示の実施又は試験で用いることができるが、好ましい方法及び材料について以下に記載する。
【００１８】
本開示は、一般に、ニューロンの感受性を低減し、それによって、炎症及び慢性疼痛を低減する方法に関する。具体的には、ＡＰＸ３３３０の投与を通じてＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を強化することによって、炎症メディエーターに対するニューロンの感受性が低減され、それによって、炎症又は慢性疼痛が軽減されることが本明細書において見出された。
【００１９】
好適な実施形態では、本開示は、有効量のＡＰＥ１阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物を、それを必要としている被験体に投与することを含み、該ＡＰＥ１阻害剤は、ＡＰＥ１タンパク質と相互作用してＡＰＥ１タンパク質のアンフォールディングを引き起こすことができ、ニューロンにおいて他のタンパク質と相互作用するか又はその酸化還元シグナル伝達機能を実行するＡＰＥ１の能力を阻害することができる。特に好適な実施形態では、該ＡＰＥ１阻害剤は、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（以後、「Ｅ３３３０」又は「３３３０」又は「ＡＰＸ３３３０」）、及び／又はそのアナログ（例えば、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（以後「ＡＰＸ２００９」）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタンアミド］（以後、「ＡＰＸ２００７」）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（以後、「ＡＰＸ２０１４」）、（２Ｅ）−２−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルプロパ−２−エンアミド（以後、「ＡＰＸ２０３２」））である。更なる好適なアナログを以下に示す。ＡＰＸ３３３０についての更なる情報は、Ａｂｅら、米国特許第５，２１０，２３９号に見出すことができ、ＡＰＸ２００９についての情報は、Ｋｅｌｌｅｙら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２０１６年１１月，３５９（２）：３００−３０９に見出すことができ、これらはそれぞれ、本明細書と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
【化１】
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【００２１】
ＡＰＸ３３３０（及び／又はそのアナログ）を投与すると、ＡＰＥ１タンパク質がニューロンにおける他のタンパク質と相互作用するのが阻害されることが本明細書で判明した。この相互作用の阻害によって、ＡＰＥ１が遊離して、損傷を受けたＤＮＡ（炎症及びニューロンの疼痛経路誘導の他のエフェクターによって損傷を受けた）における酸化又は脱塩基部位において強化されたＤＮＡ修復機能を発揮することが可能になる。具体的には、以下の実施例に記載する通り、末梢性炎症が、腰ＤＲＧのニューロンの細胞体においてＤＮＡ損傷を誘起し、炎症メディエーターＬＰＳ又はＭＣＰ−１に曝露されたＤＲＧ培養物においてこのＤＮＡ損傷を再現することが最初に証明された。また、酵素ＡＰＥ１の過剰発現を介してＤＮＡ修復を外因的に強化することによって、カプサイシンによって刺激された神経ペプチドの放出によって判定される、ニューロンの感受性の変化をＤＮＡ損傷が媒介することも本明細書において証明される。本開示は、それによって、炎症メディエーターがニューロンの感受性の変化を維持する経路を同定し、炎症又は慢性疼痛を軽減するための薬理学的ターゲットとしてニューロンＤＮＡ修復の強化にスポットを当てる。
【００２２】
具体的な一実施形態では、ＡＰＸ３３３０（及び／又はそのアナログ）の投与は、化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）の作用を阻止又は低減するのに役立ち得る。化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）は、多数の化学療法剤の潜在的に体を衰弱させる副作用である。異痛症、冷え性の悪化、固有感覚欠如、触覚欠如、腱反射の減少、及び疼痛を含むこれら神経障害の主な症状は、大部分が、末梢感覚機能の変化を特徴とし、このことは、感覚ニューロンが毒性の主な標的であることを示唆している。
【００２３】
本開示の方法において使用するための、ＡＰＥ１阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の好適な投与量は、例えば、個体の年齢及び体重、炎症又は慢性疼痛の重篤度、組成物の性質、投与経路、並びにこれらの組み合わせを含む多数の要因に依存する。最終的に、例えば、医師、獣医師、科学者、並びに他の医療及び研究の専門家等の当業者であれば、好適な投与量を容易に決定することができる。例えば、当業者は、低投与量から始めてよく、これを所望の治療成績又は結果を達成するまで増加させてよい。あるいは、当業者は、高投与量から始めてもよく、これを所望の治療成績又は結果を達成するのに必要な最低投与量に達するまで減少させてよい。
【００２４】
特に好適な一実施形態では、ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤はＡＰＸ３３３０であり、被験体に、約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する。
【００２５】
幾つかの実施形態では、ＡＰＥ１阻害剤及び薬学的に許容し得る担体を含む組成物を介してＡＰＥ１阻害剤を投与する。薬学的に許容し得る担体は、例えば、賦形剤、ビヒクル、希釈剤、及びこれらの組み合わせであってよい。例えば、組成物を経口投与するべきである場合、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、若しくはシロップ剤として製剤化してよく；又は非経口投与の場合は、注射剤（筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、脳室内、静脈内、硝子体内）、点滴調製物、又は坐剤として製剤化してよい。これらの組成物は、従来の手段によって調製することができ、必要に応じて、活性化合物（例えば、ＡＰＸ３３３０）を任意の従来の添加剤、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、可溶化剤、懸濁助剤、乳化剤、コーティング剤、又はこれらの組み合わせと混合してもよい。
【００２６】
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載される疾患、障害、及び病態を軽減、媒介、予防、及び治療するために、更なる公知の治療剤、薬物、合成化合物のプロドラッグへの修飾等を更に含んでいてもよいことを理解すべきである。例えば、一実施形態では、ＡＰＥ１阻害剤を、白金薬剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン）、タキサン（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、カバジタキセル）、ドキソルビシン、アルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、サリドマイド、レナリドミド（ｌｅｎｏｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ポマリドミド、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｘｏｍｉｂ）、カルフィルゾミブ、エリブリン、又は電離放射線のうちの１つ以上と共に投与してよい。
【００２７】
ＡＰＥ１阻害剤及び／又は本開示の方法で使用される医薬担体を含む医薬組成物は、必要としている個体の小集団に投与してもよい。本明細書で使用するとき、「必要としている個体」とは、炎症及び／若しくは慢性疼痛のリスクがあるか若しくは有している個体、又は炎症及び／若しくは慢性疼痛に関連する疾患若しくは障害（例えば、肥満、糖尿病、喘息、関節炎（変形性関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎）、慢性歯周炎、潰瘍性大腸炎、クローン病、慢性静脈洞炎、慢性活動性肝炎、慢性消化性潰瘍、憩室炎、線維筋痛、過敏性腸症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、アテローム性動脈硬化症、及び結核）のリスクがあるか若しくは有している個体を指す。更に、「必要としている個体」は、本明細書において、炎症又は慢性疼痛のリスクがあるか又は有していると医療専門家によって診断された個体を指すためにも使用される。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、一般集団のうちの小集団を対象とするので、これら実施形態において、一般集団の全てが該方法から恩恵を得ることができる訳ではない。上記に基づいて、本開示の方法の実施形態のうちの一部は、同定された個体の特定の小集団又は部分集団（すなわち、本明細書において言及される１つ以上の特定の病態に対処するのに支援「を必要としている」個体の小集団又は部分集団）を対象とするので、全ての個体が、本明細書に記載される個体の小集団又は部分集団に入る訳ではない。具体的には、必要としている個体は、ヒトである。必要としている個体は、例えば、研究動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、及び当業者に公知の他の種類の研究動物であってもよい。
【００２８】
本開示のこれら及び他の実施形態の様々な機能及び利点は、以下に示す実施例からより深く理解されるであろう。実施例は、本開示の利益を説明することを意図するものであるが、本開示の全範囲を例示するものではない。
【実施例】
【００２９】
実施例１
この実施例では、炎症メディエーターへの曝露に続発する感覚ニューロンの感受性における持続的変化のＤＮＡ損傷に対する依存性について分析した。更に、ＤＮＡ損傷及びニューロンの感受性に対するＤＮＡ  ＢＥＲ経路の強化の効果についても分析した。
【００３０】
材料及び方法
特に指定しない限り、組織培養用品は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手した。ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、マウスモノクローナル抗ビンクリン抗体、１−メチル−２−ピロリドン（ＭＰＬ）、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）、及びルーチンな化学物質は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。神経成長因子は、Ｅｎｖｉｇｏ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から、及びＮｏｒｍｏｃｉｎは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。Ｎｅｕｒｏｐｏｒｔｅｒは、Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗ヒトＡＰＥ１抗体は、研究室で産生させ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）から入手可能であり、マウスモノクローナル抗ホスホ−Ｈ２ＡＸ抗体は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製であり、セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合している抗血球凝集素（ＨＡ）抗体は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。化学発光二次抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から入手した。
【００３１】
ＡＰＸ３３３０（本明細書では「Ｅ３３３０」とも称される）は、以前の刊行物（例えば、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１０年２月１１日；５３（３）：１２００−１２１０）に従って合成し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させ、４０ｍＭ原液として−８０℃で保存した。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４由来のリポ多糖類（ＬＰＳ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＭＰＬに溶解させ、５０ｍＭとして−２０℃で１ヶ月間保存した。組み換えラットＣＣＬ２／ＭＣＰ−１タンパク質は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入し、ＰＢＳに溶解させ、−２０℃で最長１ヶ月間保存した。ＴＬＲ４アンタゴニストであるＬＰＳ−ＲＳは、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎから購入し、ＭＰＬに溶解させ、−８０℃で保存した。ＣＣＲ２アンタゴニストであるＲＳ５０４３９３は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、ＭＰＬに溶解させ、−２０℃で１ヶ月間保存した。薬物処理前に、原液をＦ−１２成長培地で希釈し、培養物に添加し、指定の通り２〜９６時間インキュベートした。この実施例で使用した全ての手順は、インディアナ大学医学部（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の実験動物委員会によって承認された。
【００３２】
後肢の炎症
ラットをイソフルランで一時的に麻酔し、ＣＦＡ及び０．９％生理食塩水の１：１（ｖ／ｖ）溶液１５０μＬを右後肢の足底面に皮下注射した。発赤及び腫脹によって炎症を確認し；注射された肢の厚みが３．５ｍｍ以上増加した動物のみを実験で使用した。
【００３３】
細胞培養
後根神経節（ＤＲＧ）を成体雄（１５０〜１７５ｇ）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｅｎｖｉｇｏ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の全ての脊髄レベルから切開し、既に記載されている通り（Ｋｅｌｌｅｙら、２０１４）、細胞を解離させた。簡潔に述べると、ラットをＣＯ２窒息によって安楽死させた。ＤＲＧをコラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に移し、３７℃で１時間インキュベートした。次いで、消化されたＤＲＧを成長培地ですすぎ、遠心分離し、機械的撹拌によって解離させた。約３０，０００細胞を、１２ウェル培養プレートの各ウェルにプレーティングした。全ての培養皿を、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンでプレコーティングした。３７℃、３％ＣＯ２中において、１０％ウマ血清、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍＬのＮｏｒｍｏｃｉｎ、５０μｇ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、１５０μＭのウリジン、及び３０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを補給したＦ−１２培地中で細胞を維持した。１日おきに成長培地を交換した。
【００３４】
ＡＰＥ１発現の調節
既に記載されている通り（Ｖａｓｋｏら，２００５、Ｊｉａｎｇら，２００８ａ）、ＡＰＥ１に対する低分子干渉ＲＮＡ（ＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ）及びスクランブルｓｉＲＮＡ（ＳＣｓｉＲＮＡ）対照を使用して、感覚ニューロン細胞培養物におけるＡＰＥ１タンパク質の発現を減少させ、それぞれ対照として使用した。培養３日目、１００ｎＭのＡＰＥ１ｓｉＲＮＡ（５’−ＧＵＣＵＧＧＵＡＡＧＡＣＵＧＧＡＧＵＡＣＣ−３’（配列番号１））又はＳＣｓｉＲＮＡ（５’−ＣＣＡＵＧＡＧＧＵＣＡＧＣＡＵＧＧＵＣＵＧ−３’（配列番号２））；（Ｖａｓｋｏら，２００５））及びトランスフェクション試薬Ｎｅｕｒｏｐｏｒｔｅｒ１０μＬを含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ１培地０．５ｍＬに成長培地を交換した。次の日、抗生物質を含まない成長培地０．５ｍＬを各ウェルに添加し、更に２４時間後、ｓｉＲＮＡを含有する培地を通常の成長培地に交換した。
【００３５】
（１）ＣＭＶプロモータ、ＨＡタグ付ＡＰＥ１、ＩＲＥＳ、及び高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）；又は（２）ＣＭＶ、ＩＲＥＳ、及びＥＧＦＰを含有するレンチウイルスコンストラクトを開発した。ＤＮＡシークエンシングによって、ＷＴ−、Ｃ６５−、又は２２６＋１７７−ＡＰＥ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを含有するｐＬｅｎｔｉ６−Ｒ４Ｒ２−Ｖ５プラスミド中のコンストラクトを確認した。レンチウイルス感染のために、ＤＲＧ細胞を５日間培養した後、１５０ｐｆｕ／細胞のレンチウイルスを培地に添加した。２日間後、ウイルスを除去し、通常の培地中で更に５日間細胞を成長させた。この実施例では、ラットＡＰＥ１  ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを含むニューロン培養物ではＡＰＥ１の発現が選択的に減少し、ラットｓｉＲＮＡによって影響を受けないヒトＡＰＥ１トランス遺伝子で戻り、その理由は、ヒトＡＰＥ１ホモログが、結合部位において異なる核酸配列を有しているためである（Ｖａｓｋｏら，２００５）。
【００３６】
イムノブロッティング
組織又は細胞を収集し、ＲＩＰＡバッファ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）で溶解し、超音波処理し、４０００ＲＰＭで２分間遠心分離することによって細胞残屑を除去した。Ｌｏｗｒｙアッセイを使用してタンパク質を定量し、１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動後、タンパク質をＰＶＤＦメンブレンに転写し、穏やかに撹拌しながら、室温で１時間、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）及び５％脱脂粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水でブロッキングした。マウスモノクローナル抗ヒトＡｐｅ１抗体（１：１０００）、マウスモノクローナル抗ホスホＨ２ＡＸ抗体（１：１０００）、マウスモノクローナル抗ビンクリン抗体（１：１０００）、及び抗血球凝集素（ＨＡ）抗体をブロッキング溶液に添加し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間インキュベートした。化学発光を使用して適切な二次抗体法に従って抗体結合を検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のＱｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅソフトウェアを使用してバンドの密度を測定し、ビンクリンに対して正規化した密度としてデータを表した。
【００３７】
ＣＧＲＰ放出の測定
ニューロン培養物を適切な薬物で処理した後、２５  ＨＥＰＥＳ、１３５  ＮａＣｌ、３．５  ＫＣｌ、２．５  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、３．３  Ｄ−グルコース（単位ｍＭ）、及び０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４からなるＨＥＰＥＳバッファで該培養物を１回洗浄し、３７℃で維持した。次いで、ＨＥＰＥＳバッファ０．４ｍＬのみ（基本放出）、３０ｎＭカプサイシンを含有するバッファ、次いで、バッファのみ（基本放出への回復を評価するため）と共に１０分間隔で逐次インキュベートした。各インキュベーション後、バッファを除去し、既に記載されている通り（Ｃｈｅｎら，１９９６）、ラジオイムノアッセイを使用して、各サンプル中の免疫反応性ＣＧＲＰの量を測定した。放出実験後、各ウェル内の細胞を１０分間０．１ＭのＨＣｌ０．４ｍＬ中に入れ、ラジオイムノアッセイを使用して該培養物中の総ＣＧＲＰ含量を測定するためにアリコートを採取した。全てのインキュベーションにおいて放出された総量を細胞内で測定された量に加えることによって、総含量（ｆｍｏｌ／ウェル）を計算した。放出されたｆｍｏｌ／ウェル／１０分として、放出データを計算した。
【００３８】
統計解析
データは、各実験の少なくとも３回の反復実験からの平均±ＳＥＭとして表す。一元配置又は二元配置の分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びダネットの事後検定を使用して、ＤＲＧ培養物におけるｐＨ２Ａ．Ｘ発現及びＣＧＲＰ放出の差を求めた。スチューデントのｔ検定を使用して、ＤＲＧ組織におけるｐＨ２Ａ．Ｘ発現の差を求めた。全ての場合において、処理対対照を比較して有意性をｐ＜０．０５）に設定した。
【００３９】
結果
後肢炎症は、Ｌ４／Ｌ５  ＤＲＧにおいてＤＮＡ損傷を惹起し、ＡＰＥ１の発現を強化する
ＤＮＡを修復するニューロンの能力は、ニューロンのホメオスタシスの維持において非常に重要である（Ｂｒｏｏｋｓ，２００２、ＭｃＭｕｒｒａｙ，２００５、Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ａ、Ｈｅｔｍａｎら，２０１０）。しかし、組織炎症がＤＮＡ損傷を生じさせるのかどうかという疑問は残る。組織炎症がＤＮＡ損傷を惹起するかどうかを判定するために、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ：生理食塩水の１：１希釈液）をラットの片側の後肢の足底に注射した。注射の５日間後、動物を絶命させ、腰ＤＲＧを回収した。このようにして、炎症と同側の組織からのＤＮＡ損傷及びタンパク質発現を、対側の対照と比較することができた。図１Ａから分かる通り、Ｈ２Ａ．Ｘのリン酸化が５８％増加したことによって示される通り（Ｒｏｇａｋｏｕら，１９９８）、炎症は二本鎖ＤＮＡ切断の増加を誘起した。ＤＲＧにおける感覚ニューロン細胞体内でＤＮＡ損傷が生じたかどうかを確認するために、免疫組織学的検査を実施した。図１Ｂの代表的な画像に示す通り、ｐＨ２Ａ．Ｘの免疫反応性は、ニューロン及び支持細胞の両方の核に局在していた。免疫反応性は、炎症と同側のＤＲＧに由来する感覚ニューロン細胞体においてより強く、これによって、炎症が感覚ニューロン内でＤＮＡ損傷を引き起こすという考えが確認された。炎症がＤＮＡ損傷を引き起こす機序及び感覚ニューロンの感受性に対するＤＮＡ損傷の影響については未だ分かっていない。
【００４０】
炎症メディエーターＬＰＳ及びＭＣＰ−１は、時間依存的にＤＮＡ損傷を強化した
ＣＦＡをラットの後肢に注射すると、熱的な、及び機械的な刺激に対する行動過敏性が惹起され（Ｓｔｅｉｎら，１９８８、Ｗｏｏｌｆら，１９９４）、この過敏性は、損傷を受けた組織内の局所的炎症メディエーターの亢進が原因であった（Ｆｅｒｒｅｉｒａら，１９８８、Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＨｉｇｇｓ，１９８８、Ｃｕｎｈａら，１９９２、Ｆｅｒｒｅｉｒａら，１９９３、Ｓａｆｉｅｈ−Ｇａｒａｂｅｄｉａｎら，１９９５）。炎症によって誘起されるニューロンの感受性の変化をＤＮＡ損傷が媒介するかどうかを確認するために、感覚ニューロンの培養物を利用した。組織炎症の代わりに、培養物をＬＰＳ又はＭＣＰ−１に曝露し、次いで、ＤＮＡ二本鎖切断及びニューロンの感受性を判定した。ニューロンの培養物では、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）に曝露した結果、ｐＨ２Ａ．Ｘの濃度は時間依存的に増加し、処理の１６時間以内に明白になり、２４時間でピークに達した。ＬＰＳ処理で観察された通り、ＭＣＰ−１（１００ｎｇ／ｍＬ）への曝露によってｐＨ２Ａ．Ｘ発現が誘導されたが、これは１６時間で始まり、２４時間で作用がピークに達した。ＤＮＡ損傷に対する炎症メディエーターのピーク作用は２４時間で観察されたので、その後の実験は全てその時点で実施した。
【００４１】
ＬＰＳ及びＭＣＰ−１は、濃度依存的にＣＧＲＰ放出を変化させた
ＤＲＧ培養物内のニューロンの感受性の炎症メディエーターによって誘起される変化を証明するために、該培養物を漸増濃度の各炎症メディエーターに２４時間曝露し、次いで、推定侵害受容ニューロペプチドであるカルシトニン遺伝子関連ペプチドの基本放出及び刺激された放出について調べた。ＴＲＰＶ１受容体のアゴニストであるカプサイシンによってＣＧＲＰの放出を刺激した。図３に示す通り、カプサイシンは、１０分間にわたってＣＧＲＰの総含量の約１０％の放出を刺激した。感覚ニューロンを低濃度のＬＰＳ（１．０μｇ／ｍＬ）に曝露すると、カプサイシンによって刺激されるＣＧＲＰの放出が総含量の１４．４±１．２％に増強された。同様に、培養物を低濃度のＭＣＰ−１に２４時間曝露すると、それぞれ０．３及び１．０μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１で処理した培養物において、ＣＧＲＰの放出が総含量の１３．０±０．８及び１５．０±１．０％に増強された。対照的に、より高濃度の炎症メディエーターで処理すると、それぞれ１０．０μｇ／ｍＬのＬＰＳ及びＭＣＰ−１で処理した培養物において、ＣＧＲＰの放出が総含量の６．３±０．４及び６．３±１．０％に有意に減少した。ＣＧＲＰの放出の変化は、ニューロンにおけるＣＧＲＰの含量の変化には続発しなかったが、その理由は、ビヒクル、ＬＰＳ、及びＭＣＰ−１で処理した培養物においてＣＧＲＰの総含量が同様であったためである（データ不図示）。
【００４２】
ＤＮＡ損傷を誘起し、ＣＧＲＰ放出を変化させるＬＰＳ及びＭＣＰ−１の作用は、ＴＬＲ４及びＣＣＲ２の受容体のアンタゴニストによって回復した
ＬＰＳ及びＭＣＰ−１によって活性化される同種受容体経路は、それぞれ、ＴＬＲ４受容体経路及びＣＣＲ２受容体経路である（Ｃｈａｒｏら，１９９４、Ｐｏｌｔｏｒａｋら，１９９８）が、これら炎症性物質が他の標的を調節し得ることが最近報告された（Ｍｅｓｅｇｕｅｒら，２０１４）。したがって、ＴＬＲ４及びＣＣＲ２の活性化をブロックすると、ｐＨ２Ａ．Ｘ発現を強化し、ニューロンの感受性を変化させる炎症メディエーターの作用が阻害されるかどうかを、それぞれ、ＴＬＲ４アンタゴニストであるＬＰＳ−ＲＳ（２μｇ／ｍＬ）又はＣＣＲ２アンタゴニストであるＲＳ５０４９３（１μＭ）の存在下で実験を実施することによって判定した。これら実験では、様々な濃度のＬＰＳ及びＭＣＰ−１でＤＮＡ損傷が誘起された。３．０μｇ／ｍＬのＬＰＳを使用して、炎症メディエーターによって誘起される機能の喪失を模し、０．３μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１を使用して、ＤＮＡ損傷と相関するニューロペプチド放出の過敏化を模倣した。培養下の感覚ニューロンをＬＰＳ処理すると、ＣＣＬ２の内因性生成をアップレギュレートできることが最近の研究で証明された（Ｍｉｌｌｅｒら，２０１５）ので、ニューロンのＤＮＡ損傷及びニューロペプチド放出に対するＬＰＳの作用をＣＣＲ２アンタゴニストがブロックするかどうかについても調べた。炎症メディエーターを導入する１時間前に、培養物を受容体アンタゴニストで処理し、曝露の間中培地中で維持した。既に観察されている通り、ＬＰＳ及びＭＣＰ−１の両処理によってｐＨ２Ａ．Ｘの発現が誘起された。ＬＰＳによって誘起された発現の増加は、ＴＬＲ４アンタゴニスト（８９．９％減少）及びＣＣＲ２アンタゴニスト（９２．５％減少）の両方によって回復した。また、ＣＣＲ２アンタゴニストは、ＭＣＰ−１単独で惹起した発現のわずか８．５％までｐＨ２Ａ．Ｘの発現を低減した（図４Ａ）。
【００４３】
炎症メディエーターによって誘起されるニューロペプチド放出の変化をブロックする該アンタゴニストの作用についても調べた。既に観察されている通り、３．０μｇ／ｍＬのＬＰＳは、ニューロン培養物からのＣＧＲＰの刺激された放出を３２．７％減少させた。ＴＬＲ４又はＣＣＲ２アンタゴニストによる処理はいずれも、ＬＰＳによって誘起された放出の減少をブロックした。ニューロン培養物を０．３μｇ／ｍＬのＭＣＰ−１に２４時間曝露すると、ＣＧＲＰ放出の過敏化がＭＣＰ−１の非存在下における放出の１４２．８％に惹起された。この増強は、ＲＳ５０４９３で処理することによって阻止された（図４Ｂ）。
【００４４】
ＤＮＡ損傷を誘起し、ＣＧＲＰ放出を減弱させるＬＰＳの作用は、ＡＰＥ１  ＯＥ（ｗｔ又はＣ６５）によって回復したが、ＡＰＥ１  ＯＥ（２２６／１７７）では回復しなかった
ニューロンは、ＢＥＲ、ヌクレオチド除去修復、ミスマッチ修復、直接損傷修復、及び非相同末端結合又は相同組み換えを含む主なＤＮＡ修復経路を含む（Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ｂ、Ｂａｒｚｉｌａｉら，２００８、Ｆｏｒｔｉｎｉ及びＤｏｇｌｉｏｔｔｉ，２０１０）。ＢＥＲ経路は、塩基に対する酸化的損傷、塩基のアルキル化、又は脱アミノ化によって引き起こされる核及びミトコンドリアにおけるＤＮＡ損傷を修復し、ニューロンを保護するための最も重要な修復経路である可能性がある（Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ｂを参照）。次に、ＢＥＲ経路における重要な酵素であるＡＰＥ１の活性の強化又は低下が、ＬＰＳ及びＭＣＰ−１処理によって誘起されるＤＮＡ損傷及びニューロン感受性の変化を変化させるかどうかについて調べた。
【００４５】
この実施例のために、図５Ａに示す通り培養物を処理した。培養下の４〜６日目に、培養物をＳＣｓｉＲＮＡ又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、次いで、培養下の６〜８日目に、ベクター対照、野生型ＡＰＥ１、Ｃ６５  ＡＰＥ１、又は２２６／１１７  ＡＰＥ１のための発現ベクターを含有するレンチウイルスに曝露した。Ｃ６５  ＡＰＥ１変異体は、酸化還元機能が損なわれており、一方、２２６／１１７  ＡＰＥ１変異体は、ＤＮＡ修復機能が損なわれている（Ｉｚｕｍｉら，２００４、Ｌｕｏら，２００８）。１セットの培養物において、培養下の１０〜１４日目にニューロンをＥ３３３０で処理した。最後に、実験の直前に、培養物をＬＰＳ（３μｇ／ｍＬ）で２４時間処理した。ＳＣｓｉＲＮＡで処理した培養物をＬＰＳに２４時間曝露したとき、ｐＨ２Ａ．Ｘ発現が有意に誘起された（図５Ｂ及び５Ｃ）。野生型内因性発現の約１７５％のレベルの、ＨＡタグの新規発現によって示される野生型ＡＰＥ１又はＣ６５  ＡＰＥ１（修復能力あり）のいずれかの外因性発現（図５Ｂ）は、二本鎖切断を誘起するＬＰＳの能力を緩和し、ｐＨ２Ａ．Ｘの密度をそれぞれ９５％及び９４％減少させた。対照的に、２２７／１７７  ＡＰＥ１変異体（修復不全）の外因性発現は、ＬＰＳによって誘起されるｐＨ２Ａ．Ｘのレベルに対して効果を有していなかった。野生型の発現の約２０％にＡＰＥ１発現を減少させたＡＰＥ１ｓｉＲＮＡで処理した培養物でも同様の効果が観察され；ＬＰＳはｐＨ２Ａ．Ｘを誘導し、これは、ＳＣｓｉＲＮＡ処理された培養物と比べてより作用が大きい傾向があった。興味深いことに、Ｅ３３３０によるＡＰＥ１のＤＮＡ修復活性の強化は、外因的に発現している野生型ＡＰＥ１の効果によく似ていた。Ｅ３３３０（２０μＭ）による前処理は、ＳＣｓｉＲＮＡ及びＡＰＥ１ｓｉＲＮＡで処理された培養物の両方でｐＨ２Ａ．Ｘの誘導を阻止した。ＤＮＡ損傷の回復もニューロンの感受性に対するＬＰＳの作用を回復させるかどうかを見出すために、刺激されたＣＧＲＰの放出についても調べた。ＬＰＳ（３μｇ／ｍＬ）処理は、カプサイシンによって刺激されたＣＧＲＰの放出を減弱した（図５Ｄ）。ＳＣｓｉＲＮＡで処理された培養物では、ビヒクル処理したウェルからの刺激されたＣＧＲＰの放出は、総含量の１０．４±０．６％であり、一方、ＬＰＳで２４時間処理した細胞からの放出は、総含量の７．１±０．６％に減少した。野生型ＡＰＥ１又はＣ６５  ＡＰＥ１（修復能力あり）のいずれかの外因性発現はＬＰＳの作用を回復させ、その結果、刺激されたＣＧＲＰの放出は、それぞれ、ＡＰＥ１野生型及びＣ６５変異体の存在下で総含量の１０．４±１．１及び１０．５±０．４％であった。修復不全ＡＰＥ１変異体の外因性発現は、ＬＰＳの作用を回復させなかったが、それは、放出が総含量の７．０±０．９％と依然として減弱していたためである。最後に、Ｅ３３３０による処理もＣＧＲＰ放出に対するＬＰＳの作用から保護し；Ｅ３３３０処理後の放出は総含量の９．７±０．８％であり、これは、ＬＰＳ処理しなかった場合の放出と差がなかった。
【００４６】
ＤＮＡ損傷を誘起し、ＣＧＲＰ放出を変化させるＭＣＰ−１の作用は、ＡＰＥ１  ＯＥ（ｗｔ又はＣ６５）によって回復したが、ＡＰＥ１  ＯＥ（２２６／１７７）では回復しなかった
図５Ａ〜５Ｄで使用したのと同じ方法を使用して、ＡＰＥ１の発現及び活性を操作し、次いで、実験の直前に、培養物をＭＣＰ−１（０．３μｇ／ｍＬ）で２４時間処理した（図６Ａ）。図２Ａ及び２Ｂに示す通り、ＭＣＰ−１に曝露した、ＳＣｓｉＲＮＡで処理した感覚ニューロンは、ｐＨ２Ａ．Ｘの発現が強化された（図６Ｂ及び６Ｃ）。野生型又は修復能力を有するＡＰＥ１の外因性発現の増加は、ｐＨ２Ａ．Ｘを増加させるＭＣＰ−１の能力を妨げ；ｐＨ２Ａ．Ｘのレベルは、それぞれ、野生型及びＣ６５  ＡＰＥ１の存在下ではＭＣＰ−１によって誘起される増加の３６．９％及び３３．６％に減少した。対照的に、修復不全ＡＰＥ１の外因性発現は、ＭＣＰ−１によって誘起されるｐＨ２Ａ．Ｘの発現を妨げなかった。ＡＰＥ１ｓｉＲＮＡで処理した培養物でも同様の効果が観察され；ＭＣＰ−１はｐＨ２Ａ．Ｘを誘導し、これは、ＳＣｓｉＲＮＡ処理された培養物と比べてより作用が大きい傾向があった。ＬＰＳで観察された通り、ＳＣｓｉＲＮＡ又はＡＰＥ１ｓｉＲＮＡに曝露した感覚ニューロンをＥ３３３０で処理すると、ＭＣＰ−１によるｐＨ２Ａ．Ｘの誘導が妨げられた。これらｐＨ２Ａ．Ｘ発現の変化がニューロンの感受性の変化と相関していたかどうかを判定するために、カプサイシンによって刺激されたＣＧＲＰの放出（図６Ｄ）について調べた。ＳＣｓｉＲＮＡによる処理後、ＭＣＰ−１（０．３μｇ／ｍＬ）はＣＧＲＰの放出を亢進した。この亢進は、野生型ＡＰＥ１又は修復能力のあるＡＰＥ１（Ｃ６５  ＡＰＥ１）のいずれかでＡＰＥ１発現が外因的に強化されたときには観察されなかった。しかし、修復不全ＡＰＥ１（２２６／１７７）の外因性発現は、ＭＣＰ−１によって誘起されたＣＧＲＰ放出の過敏化を妨げなかった（図６Ｄ、ライトグレーのカラム）。ＡＰＥ１ｓｉＲＮＡで処理した培養物では、ＭＣＰ−１処理によってＣＧＲＰ放出の減少が引き起こされ、このことは、ＤＮＡ修復活性の低下した培養物では、図３に提示した濃度応答曲線に基づいて、ＭＣＰ−１に対する応答が左にシフトすることを示唆する。この減少は、野生型又は修復能力のあるＡＰＥ１の外因性発現によって回復したが、修復不全ＡＰＥ１の発現には影響を受けなかった（図６Ｄ、ダークグレーのカラム）。ｐＨ２Ａ．Ｘ発現の誘導で観察された通り、Ｅ３３３０で培養物を処理すると、ＭＣＰ−１曝露によって誘起されたＣＧＲＰ放出の変化が妨げられた（図６Ｄ）。まとめると、これらデータは、ＬＰＳがニューロン核における二本鎖ＤＮＡ切断を誘起し、このＤＮＡ損傷がニューロンの感受性の変化を媒介するという考えを支持している。
【００４７】
考察
この実施例では、ニューロン培養物の炎症メディエーターへの曝露がＤＮＡ損傷及び感覚ニューロンの感受性の変化を惹起するかどうかについて調べた。次に、ＤＮＡ塩基除去修復（ＢＥＲ）経路を強化することによってＤＮＡ損傷及び感覚ニューロンの感受性の変化が回復するかどうかを判定することを目指した。結果は、ｐＨ２Ａ．Ｘ発現の増加によって示された通り、末梢性炎症が、炎症組織を神経支配する感覚ニューロンの細胞体内のＤＮＡ損傷を強化することを証明する。ｐＨ２Ａ．Ｘ発現の増加は、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１に曝露した後の、感覚ニューロン培養物でも明らかである。ＤＮＡ損傷に加えて、感覚ニューロン培養物をＬＰＳ又はＭＣＰ−１に曝露した結果、ニューロペプチドであるＣＧＲＰの休止放出又は総含量が変化することなくＣＧＲＰの放出が刺激されたことによって示される通り、ニューロンの感受性が変化した。ＡＰＥ１発現を遺伝子操作するか、又は塩基除去修復経路を介してＤＮＡ修復を強化するＡＰＥ１活性の低分子調節因子で処理すると、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１によって惹起されるＤＮＡ損傷が減弱する。ＤＮＡ損傷の修復に加えて、ＡＰＥ１のＤＮＡ修復活性を強化すると、炎症メディエーターによって誘起されるニューロンの感受性の変化が回復する。興味深いことに、ＬＰＳによって誘起されるＤＮＡ損傷及びニューロンの感受性の変化が、ＣＣＲ２アンタゴニストによって阻害されることも証明され、このことは、ＴＬＲ４活性化によって誘起される長期過敏化が、ＣＣＬ２／ＭＣＰ−１の生成及び推定オートクリン活性の増加を通して媒介されている可能性があることを示唆する。
【００４８】
炎症が一次求心性ニューロンの感受性を変化させるシグナル伝達経路は広範囲にわたって調べられており、受容体、イオンチャネル、若しくは関連する制御タンパク質の機能を可逆的に変化させる翻訳後修飾、及び受容体、イオンチャネル、若しくは神経伝達物質の発現を変化させるか又はこれらタンパク質の新規発現を誘導して感覚ニューロンの表現型を調節する転写制御を含む（Ｎｅｕｍａｎｎら，１９９６）。炎症によって誘起されるニューロンの過敏化の維持におけるＤＮＡ損傷の原因的役割を特定するために、ＤＲＧ由来のニューロン培養物を利用した。培養下のニューロンに対する炎症の作用を模倣するために、それぞれＴＬＲ４又はＣＣＲ２のリガンド、ＬＰＳ又はＭＣＰ−１／ＣＣＬ２で培養物を処理した。ＬＰＳは、インビボ炎症試験で使用される完全フロインドアジュバント中に存在する不活化結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含むグラム陰性細菌の外膜で発現し、ＴＬＲ４受容体の外因性リガンドである。ＬＰＳは、感覚ニューロンにおけるＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＣＯＸ−２、及びＭＣＰ−１の発現を強化し（Ｔｓｅら，２０１４、Ｍｉｌｌｅｒら，２０１５）、したがって、炎症によって惹起される複数の経路の活性化を再現する。更に、げっ歯動物の後肢に注射した後の侵害受容行動（Ｆｅｒｒｅｉｒａら，１９９３、Ｃａｌｉｌら，２０１４）によって、ＬＰＳが感覚ニューロンの興奮性及び開口分泌活性を強化するというインビトロ実験（Ｈｏｕ及びＷａｎｇ，２００１、Ｄｉｏｇｅｎｅｓら，２０１１、Ｍｅｓｅｇｕｅｒら，２０１４）によって証明される通り、ＬＰＳは感覚ニューロンの感受性を急性的に強化する。ＭＣＰ−１は、炎症によってＤＲＧでアップレギュレートされ（Ｊｅｏｎら，２００８）、感覚ニューロンの刺激を介してＤＲＧ又は背側脊髄から放出される（Ｄａｎｓｅｒｅａｕら，２００８）サイトカインである。ＭＣＰ−１に曝露すると、ＮＦκＢの活性化によって媒介される可能性のある（Ｔｓｅら，２０１４、Ｚｈａｏら，２０１４）、ＴＲＰＶ１及びＮａＶ１．８のニューロン発現がアップレギュレートされる（Ｋａｏら，２０１２）ことが示されている。また、後肢注射後の侵害受容行動の増加（Ｄａｎｓｅｒｅａｕら，２００８）によって、新生児ＤＲＧに由来する培養物からのＣＧＲＰの直接刺激（Ｑｉｎら，２００５）によって証明される通り、ＭＣＰ−１も翻訳後修飾を介して感覚ニューロンの感受性を強化する。ＭＣＰ−１は、ＣＣＲ２受容体のリガンドである。ＣＣＲ２は、ナイーブ動物に由来するＤＲＧニューロンでは発現しないが、ＣＣＲ２は、炎症又は神経損傷後のＤＲＧで発現する（Ｗｈｉｔｅら，２００５、Ｍｉｌｌｅｒら，２０１２、Ｚｈａｎｇら，２０１３）。更に、ＣＣＲ２は、ＤＲＧに由来する培養物中で機能的に活性である（Ｑｉｎら，２００５、Ｋａｏら，２０１２）。
【００４９】
過敏性を惹起するためのキナーゼ及び転写因子の活性化に加えて、炎症は、ニューロンの感受性の変化の媒介において役割を果たす反応性の酸素及び窒素の種の生成も強化する。炎症メディエーターは、酵素反応（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）及び自己酸化反応（代謝によって誘起される電子伝達系の漏出の増加を介する）を介してＲＯＳ／ＲＮＳの生成を強化する（Ｂａｕｅｒｏｖａ及びＢｅｚｅｋ，１９９９、Ｂａｂｉｏｒ，２０００、Ｒｅｍａｎｓら，２００５、Ｉｂｉら，２００８）。ＲＯＳ／ＲＮＳは、ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１のチャネルのアゴニストとして機能する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎら，２００８、Ｓａｗａｄａら，２００８、Ｋｅｅｂｌｅら，２００９、Ｉｔｏら，２０１３、Ｌｉｎら，２０１５）。ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＡ１の感受性を強化するＲＯＳの急性作用に加えて、フリーラジカル部分が細胞内で増加すると、核酸、タンパク質、及び脂質を含む分子の酸化が引き起こされ得、これは、感覚ニューロンの深刻な結果につながる可能性がある。最近、ＤＮＡ損傷が、シスプラチンで処理した後の感受性を変化させる原因因子であることが証明された（ＲＥＦ）。シスプラチンによって誘起される酸化障害を修復することによって、ニューロンの感受性の変化を回復させ得ることが研究によって明らかにされ、このことは、損傷しているＤＮＡによるニューロンの感受性の調節におけるＲＯＳ／ＲＮＳの重要な役割を示唆している。これら知見から、炎症によって誘起されるＲＯＳ／ＲＮＳの生成及びその後の酸化的ＤＮＡ損傷が、炎症によって誘起されるニューロンの感受性の変化の維持に重要であるという仮説が導かれた。
【００５０】
ＲＯＳ／ＲＮＳは、内因性代謝活性、傷害に続発する酸化的ストレス（Ｋｒｕｍａｎ及びＳｃｈｗａｒｔｚ，２００８）、環境有害物質（Ｋｉｓｂｙら，１９９９）、及び薬物（Ａｈｌｅｓ及びＳａｙｋｉｎ，２００７）によって生成され得、ＲＯＳ／ＲＮＳは酸化的ＤＮＡ損傷を惹起するので、感覚ニューロンは、ＲＯＳ／ＲＮＳの過剰生成に対抗するための内因性抗酸化機序を有する。フリーラジカル部分が内因性抗酸化物質を圧倒する場合、感覚ニューロンは、酸化的ＤＮＡ損傷を修復するためのＤＮＡ修復機序も有する。感覚ニューロンは有糸分裂後であるが、ＤＮＡ損傷は、遺伝子転写の完全性に対して及びニューロンのホメオスタシスの維持にとって依然として大きな影響を有し得る（Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ｂ）ので、感覚ニューロンは、ＸＸ経路を介してＤＮＡ損傷を修復する（ＲＥＦＳ）。ニューロンにおけるこれら様々なＤＮＡ修復経路の中でも、塩基除去修復経路（ＢＥＲ）が優勢であり（Ｆｉｓｈｅｌら，２００７ｂ）、酸化的損傷によって引き起こされるＤＮＡの修復に関与している。ＢＥＲは、酸化的に損傷を受けた塩基をＤＮＡグリコシラーゼによって除去して脱プリン／脱ピリミジン部位（ＡＰ部位）を作製すること、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１／酸化還元因子（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１又はＡＰＥ１）によってＤＮＡ骨格を切断して、それぞれ新規塩基を挿入し、ＤＮＡ骨格とライゲーションするためのＤＮＡポリメラーゼ及びリガーゼの調製において３’−ＯＨ末端を生成することを含む、ＤＮＡ損傷部を修復するための幾つかの工程を含む。酸化的ＤＮＡ損傷の修復に失敗すると、突然変異、ＤＮＡ複製の妨害、及び遺伝的不安定性が生じる場合がある。上述の通り、単離された感覚ニューロンを抗癌治療の毒性作用から保護することにおけるＢＥＲ経路、具体的にはＡＰＥ１の活性の重要性について調べられている。ＡＰＥ１の発現が減少すると、シスプラチン曝露によって生じる神経毒性が増大するが、ＡＰＥ１の活性を増強すると、神経毒性が減弱される（Ｖａｓｋｏら，２００５、Ｊｉａｎｇら，２００８ｂ、Ｊｉａｎｇら，２００９、Ｋｅｌｌｅｙら，２０１４）。ＡＰＥ１のＡＰエンドヌクレアーゼ機能に加えて、この酵素は、転写因子の酸化還元状態を調節してその機能（ＲＥＦ）を制御する活性も有する。酸化還元能力のあるＡＰＥ１ではなくＤＮＡ修復能力のあるＡＰＥ１の過剰発現の知見は、炎症メディエーターによって誘起される過敏化を回復させるのにＤＮＡ修復能力のあるＡＰＥ１が必須であることを示唆している。したがって、感覚ニューロンが炎症に曝露されると、様々なシグナル伝達経路を通じて過敏性を惹起し得るようであるが、この過敏化の維持は、ＤＮＡ損傷に依存する。
【００５１】
感覚ニューロンをどのようにＭＣＰ−１に曝露するとＤＮＡ損傷の発生が惹起されるかは知られていない。ＭＣＰ−１はＤＮＡ損傷を生じさせるが、これはＢＥＲを強化することによって回復させることができるので、ＭＣＰ−１によって誘起されたＤＮＡ損傷は、ＲＯＳ／ＲＮＳの増加によって媒介されたと仮定される。反応性の酸素及び窒素の種は、複数の起源によって生成され得る：ＲＯＳ／ＲＮＳ生成の主な駆動因子は、ミトコンドリアにおける呼吸鎖活性であるが、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、シクロオキシゲナーゼ、シトクロムｐ４５０、及びリポキシゲナーゼ等の酵素によって、非ミトコンドリアＲＯＳ／ＲＮＳも生成され得る（Ｓａｕｅｒら，２００１、Ｈｏｌｍｓｔｒｏｍ及びＦｉｎｋｅｌ，２０１４）。ＬＰＳの作用はＣＣＲ２アンタゴニストによって減弱され得ることが見出されたので、ＬＰＳによって誘起される過敏性の維持は、ＴＬＲ４の活性化とその後のＭＣＰ−１／ＣＣＬ２のアップレギュレーションを通して媒介されると考えられる。マクロファージではＴＬＲ４の活性化がＲＯＳ／ＲＮＳの生成を惹起する（Ｚｈａｎｇら，２０１５）ので、この知見は驚くべきことであったが、ニューロンでは、ＣＣＲ２の活性化なしにＴＬＲ４の活性化が感受性を維持することはできない。したがって、ＲＯＳ／ＲＮＳ生成の定量的、空間的、及び時間的な側面が、ＤＮＡ損傷の誘起にとって重要であり、更に研究されるであろうと考えられる。
【００５２】
炎症又は炎症メディエーターによって惹起される一見するとランダムな酸化的ＤＮＡ損傷が、どのようにして、このような再現可能な表現型を惹起してニューロンの過敏性を維持することができるのかは未だ不明である。酸化的ストレスによって形成される主な酸化的ＤＮＡ傷害、８ｏｘｏＧが、炎症及び加齢の発現の一因であると疑われている（Ｓｈｉｇｅｎａｇａら，１９９４、Ｄａｖｉｄら，２００７）が、最近のデータは、グアニンヌクレオチド交換因子特性を有し、全８ｏｘｏＧ負荷ではなく細胞内ホメオスタシスの破壊の原因となるトリガーであるＯＧＧ１−８ｏｘｏＧ複合体の形成を、８−オキソグアニン−ＤＮＡグリコシラーゼ−１（ＯＧＧ１）による８ｏｘｙＧの除去が促進することを示唆している（Ａｇｕｉｌｅｒａ−Ａｇｕｉｒｒｅら，２０１４）。ＢＥＲの促進がＤＮＡ損傷によって誘起される感受性の変化を減少させるので、これらデータは、一見すると上記知見と矛盾する。８ｏｘｏＧがどのようにして感覚ニューロンに影響を与えるかを見出すために、ニューロンの機能におけるＯＧＧ１の役割について調べる更なる実験が進行中である。ＡＰＥ１の酸化還元機能が他の細胞型において炎症応答の一因となることが既に認められている（Ｊｅｄｉｎａｋら，２０１１）が、本開示は、ＡＰＥ１のＤＮＡ修復機能にとっての保護的役割を初めて関連付ける。炎症メディエーターの翻訳後及び転写の効果は、ニューロンにおける過敏性の誘起を媒介することができるが、ＤＮＡ損傷は、転写活性に対する酸化的ＤＮＡ傷害の影響に起因して、これら変化を維持すると考えられる。したがって、炎症は、再現可能なニューロンにおける機能的変化の一因となり得、その強化されたＤＮＡ修復が、損傷によって誘起されるニューロンの機能的変化を回復させることができる。ＤＮＡに対する酸化的損傷は、プロモータ領域を認識し、結合する転写因子の能力を変化させることが知られており（Ｚｉｅｌら，２００４、Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，２００９、Ｐａｓｔｕｋｈら，２０１５）、したがって、炎症によって既に活性化されている遺伝子又は転写因子のプロモータ／リプレッサ領域に対する損傷のため、炎症によって引き起こされるＤＮＡ損傷は再現可能であり得る（Ｒｕｃｈｋｏら，２００９）。
【００５３】
まとめると、本開示は、炎症又は炎症メディエーターへの曝露が感覚ニューロンにおいてＤＮＡ損傷を惹起することを証明する。塩基除去修復を強化することによって、このＤＮＡ損傷は、炎症メディエーターによって誘起されるニューロンの過敏性の維持を媒介することが証明される。
【００５４】
実施例２
この実施例では、ＤＮＡ修復活性に対する効果についてＡＰＸ３３３０を分析した。
【００５５】
６週齢の雄ＮＳＧマウスの右側腹部に神経芽細胞腫細胞を皮下移植し、腫瘍体積１５０ｍｍ３以上になるまで増殖させた。次いで、シスプラチンによる処理±ＡＰＸ３３３０処理についてマウスを無作為化した。シスプラチン及びＡＰＸ３３３０を３週間にわたって（０日目〜１７日目）同時投与し、シスプラチンの最後の投与後の幾つかの時点において、マウスのＤＲＧ内で神経毒性のエンドポイントを評価した。
【００５６】
単離された感覚ニューロンをＡＰＸ３３３０に曝露したとき、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１エンドヌクレアーゼ活性が濃度依存的に増大したが、これは腫瘍細胞では観察されない。ＡＰＸ３３３０はＲｅｆ−１／ＡＰＥ１の酸化還元機能を標的とする阻害剤であるが、感覚ニューロンの状況では、タンパク質のＤＮＡ修復（ＡＰエンドヌクレアーゼ）活性を強化することもできると思われる（図７Ａ〜７Ｅ）。ＡＰＸ３３３０は、経時的にタンパク質をアンフォールドさせる。このアンフォールディングによって、主に、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１のアミノ末端が変化して、タンパク質のフォールド／アンフォールド状態の平衡を乱し、修復活性を促進することによって、下流の転写因子標的との相互作用に影響を及ぼす。このようにＲｅｆ−１／ＡＰＥ１をそのＲｅｆ−１／ＡＰＥ１酸化還元活性から切り離すことによって、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１修復エンドヌクレアーゼ活性を強化することができた。
【００５７】
神経毒性のための任意の想定療法の重要な特性は、投与される治療（複数可）の抗癌機能を損なわないことである。重要なことに、ＡＰＸ３３３０によるＤＮＡ修復活性の強化は、有糸分裂細胞では観察されなかった。ＡＰＸ３３３０は、腫瘍細胞株、患者由来の細胞株、及び動物モデルにおける腫瘍の成長及び／又は生存に負の影響を与えることが既に示されている。したがって、ＡＰＸ３３３０は、腫瘍細胞に対する抗癌薬の効果を変化させることなく分裂終了細胞を保護することが可能である（図７Ｃ〜７Ｅ）。更に、ＡＰＸ３３３０は、シスプラチン又はオキサリプラチンのインビボにおける腫瘍死滅効果には影響を与えなかったが、酸化的ＤＮＡ損傷からＤＲＧニューロンを保護する（データ不図示）。健常細胞では、Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１の酸化還元機能ではなく、ＤＮＡ修復機能が、感覚ニューロンの生存／機能に必要であると思われる。これは、腫瘍細胞とは正反対である。まとめると、これらデータは、ＡＰＸ３３３０が、治療を損なうことなく癌療法から神経を保護することができるという考えを支持している。
【００５８】
実施例３
この実施例では、白金の抗腫瘍効果を減弱しないと同時に、シスプラチン又はオキサリプラチンによって誘導される神経毒性から保護する能力について、ＡＰＸ３３３０アナログを分析した。また、神経芽細胞腫細胞株及び３Ｄスフェロイド膵臓腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果について、アナログＡＰＸ２００９を評価した。
【００５９】
材料及び方法
材料
一般的な組織培養用品は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手し、化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。感覚ニューロン培養物については、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から、神経成長因子はＨａｒｌａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から、ｎｏｒｍｏｃｉｎはＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。マウスモノクローナル抗ヒトＡＰＥ１抗体は、研究室で産生させ、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＣＯ）から入手可能である。マウスモノクローナル抗ホスホ−Ｈ２ＡＸ抗体は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）製であり、β−アクチンモノクローナル抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）製であった。化学発光二次抗体は、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）製であった。
【００６０】
シスプラチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、オキサリプラチンは、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．から購入した。シスプラチンは、まず、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解させ、４０ｍＭ溶液として−８０℃で保存し、オキサリプラチンは、ＰＢＳに溶解させ、５ｍＭ原液として−８０℃で保存した。薬物処理前に、原液をＦ−１２成長培地で希釈し、培養物に添加し、２４〜７２時間曝露した。これら研究で使用した全ての手順は、インディアナ大学医学部（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の実験動物委員会によって承認された。
【００６１】
新規化学物質の合成
ＡＰＸ３３３０の新規第二世代アナログ化合物の合成についての完全な詳細は、Ｓａｒｄａｒ  Ｐａｓｈａ  Ｓｈｅｉｋ  Ｐｒａｎ  Ｂａｂｕら，Ｒｅｆ−１／ＡＰＥ１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｂｌｏｃｋｓ  ｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，オンラインで入手可能、２０１８年４月６日；ｄｏｉ：１０．１１０１／２９６５９０に提供されており、これは、本明細書と一致する範囲で参照により組み込まれる。該化合物は、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ  ９７４０１  ＵＳＡによって合成された。まとめると、２−ヨード−３−ヒドロキシ−１，４−ナフトキノンの一般的な中間体であるｉｏｄｏｌａｗｓｏｎｅは、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙから入手可能である。記載されている通り、後続反応において、ｉｏｄｏｌａｗｓｏｎｅをメタクリル酸又は２−プロピルアクリル酸、塩化オキサリル及び対応するアミン、並びにメタノール中ナトリウムメトキシドで処理して、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジメチルペンタンアミド（ＡＰＸ２００７）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド（ＡＰＸ２００９）、及び（２Ｅ）−２−（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）−Ｎ，Ｎ，２−トリメチルプロパ−２−エンアミド（ＡＰＸ２０３２）を生成する。更なる情報は、発行されている特許「Ｑｕｉｎｏｎｅ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｉｎｇ  Ａｐｅ１  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ」（Ｍａｒｋ  Ｒ．Ｋｅｌｌｅｙ及びＪａｍｅｓ  Ｈ．Ｗｉｋｅｌ）、米国特許第９，１９３，７００号、２０１５年１１月２４日公開に見出すことができ、これは、本明細書と一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
化学構造の提示
化学構造、部分構造、及び反応を描画、表示、及び特性評価するためにＭａｒｖｉｎを使用した、Ｍａｒｖｉｎ  １５．８．２４．０，２０１５，ＣｈｅｍＡｘｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍａｘｏｎ．ｃｏｍ）。構造特性の予測にはＣａｌｃｕｌａｔｏｒ  Ｐｌｕｇｉｎｓを使用した、Ｍａｒｖｉｎ  １５．８．２４．０，２０１５，ＣｈｅｍＡｘｏｎ（ｗｗｗ．ｃｈｅｍａｘｏｎ．ｃｏｍ）。分子モデリングは、Ｏｐｅｎ  Ｅｙｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃソフトウェアＯＭＥＧＡ（ＯＭＥＧＡ  ２．５．１．４）（Ｈａｗｋｉｎｓら，２０１０）及びＲＯＣＳ（ＲＯＣＳ  ３．２．１．４：ＯｐｅｎＥｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ．ｗｗｗ．ｅｙｅｓｏｐｅｎ．ｃｏｍ）（Ｈａｗｋｉｎｓら，２００７）を使用して実施した。分子の可視化は、Ｏｐｅｎ  Ｅｙｅ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃソフトウェアＶＩＤＡ（ＯｐｅｎＥｙｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎｔａ  Ｆｅ，ＮＭ．ｗｗｗ．ｅｙｅｓｏｐｅｎ．ｃｏｍ）を使用して実施した。
【００６３】
感覚ニューロンの培養
既に記載されている通り（Ｖａｓｋｏら，２００５）、感覚ニューロンの初代培養物を収集し、維持した。簡潔に述べると、成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（１５０〜１７５ｇ；Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）をＣＯ２窒息によって安楽死させ、全ての脊髄レベルから後根神経節（ＤＲＧ）を切開し、コラゲナーゼ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）に移し、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、機械的撹拌によって解離させた。約３０，０００細胞又は６０，０００細胞を、それぞれ、１２ウェル又は６ウェルの培養プレートの各ウェルにプレーティングした。全ての培養皿を、ポリ−Ｄ−リジン及びラミニンでプレコーティングした。３７℃、３％ＣＯ２中において、１０％のウマ血清、２ｍＭのグルタミン、１００μｇ／ｍＬのｎｏｒｍｏｃｉｎ（商標）、５０μｇ／ｍＬのペニシリン、５０μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、５０μＭの５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１５０μＭのウリジン、及び３０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを補給したＦ−１２培地中で細胞を維持した。１日おきに成長培地を交換した。細胞を１２〜１４日間培養下で維持した後に実験を実施した。
【００６４】
ニューロン細胞の生存率
既に記載されている通り（Ｖａｓｋｏら，２０１１）、感覚ニューロン培養物のトリパンブルー排除分析を実施した。０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液及び培地を各ウェルに添加することによって、細胞を剥離した。ＰＢＳ中０．４％（ｗ／ｖ）トリパンブルーを細胞懸濁液に等体積添加し、血球計数器を使用して位相差顕微鏡下で生細胞数（すなわち、色素を排除するもの）を計数した。生細胞を全細胞数（死細胞及び生細胞を含む）で除した百分率として生存率を計算した。
【００６５】
細胞株の確認及び特性評価
ＩＭＲ３２及びＳＫ−Ｎ−ＳＨの細胞株をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ−１６４０中で成長させた。種についてのＤＮＡフィンガープリント分析（ＩＤＥＸＸ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及びベースラインショートタンデムリピート分析試験によって細胞株のアイデンティティを確認した。全ての細胞株は１００％ヒトであり、９マーカーショートタンデムリピート分析はファイルされている。
【００６６】
細胞増殖アッセイ
細胞を９６ウェルプレートに播種し（ＩＭＲ３２：１０００細胞／ウェル；ＳＫ−Ｎ−ＳＨ：３０００細胞／ウェル）、ＡＰＸ２００７、ＡＰＸ２００９、ＡＰＸ２０３２、又はＡＰＸ３３３０（本明細書では「Ｅ３３３０」とも称される）で５日間処理した。最終ＤＭＳＯ濃度は、０．１％以下であった。既に記載されている通り（Ｔｏｎｓｉｎｇ−Ｃａｒｔｅｒら，２０１５）、メチレンブルーアッセイを使用して細胞生存率を求めた。各実験をトリプリケートで実施し、３回繰り返した。対照に対して正規化した生存率をグラフ化し、Ｃｈｏｕ−Ｔａｌａｌａｙ法（Ｃｈｏｕ及びＴａｌａｌａｙ，１９８４）を使用してＥＤ５０値を求めた。
【００６７】
イムノブロッティング
既に記載されている通り（Ｋｅｌｌｅｙら，２０１４）、イムノブロッティングを実施した。簡潔に述べると、細胞をＲＩＰＡバッファ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）中で溶解させ、Ｌｏｗｅｙアッセイを使用してタンパク質を定量した。４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することによって、タンパク質を分離した。ゲルをＰＶＤＦメンブレンに転写し、穏やかに撹拌しながら、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）及び５％脱脂粉乳を含有するＴｒｉｓ緩衝生理食塩水中において４℃で一晩インキュベートした。マウスモノクローナル抗ヒトＡｐｅ１抗体（１：５００）、マウスモノクローナル抗ホスホＨ２ＡＸ抗体（１：１０００）、又はβ−アクチンモノクローナル抗体（１：１０００）をブロッキング溶液に添加し、穏やかに撹拌しながら室温で一晩インキュベートした。化学発光を使用して適切な二次抗体法に従って抗体結合を検出した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）製のＱＵＡＬＩＴＹＯＮＥ（登録商標）ソフトウェアを使用してバンドの密度を測定し、アクチンに対して正規化した密度としてデータを表した。
【００６８】
カルシトニン遺伝子関連ペプチドの放出の測定
放出実験のために、２５  ＨＥＰＥＳ、１３５  ＮａＣｌ、３．５  ＫＣｌ、２．５  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＣｌ２、３．３  Ｄ−グルコース（単位ｍＭ）、及び０．１％ウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４からなるＨＥＰＥＳバッファで細胞培養物を洗浄し、３７℃で維持した。次いで、ＨＥＰＥＳバッファ０．４ｍＬのみ（基本放出）、３０ｎＭカプサイシンを含有するバッファ、次いで、バッファのみ（基本放出への回復を評価するため）と共に１０分間隔で逐次インキュベートした。各インキュベーション後、バッファを除去し、既に記載されている通り（Ｃｈｅｎら，１９９６）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を使用して、各サンプル中の免疫反応性カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の量を測定した。放出プロトコールの最後に、培養物からＣＧＲＰを抽出し、ＲＩＡを使用して総含量を測定した。処理によって総含量はそれほど変化しなかったので、放出されたペプチドのｆｍｏｌ／ウェル／１０分として放出データを提示する。
【００６９】
ＡＰエンドヌクレアーゼＤＮＡ修復アッセイ
既に記載されている通り（Ｂａｐａｔら，２０１０）、ＡＰＥ１  ＤＮＡ修復エンドヌクレアーゼ活性の阻害又は強化を実施した。一方の鎖にクエンチャーを含有する２つのアニールされたオリゴヌクレオチド（５’−６−ＦＡＭ−ＧＣＣＣＣＣ＊ＧＧＧＧＡＣＧＴＡＣＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＴＣＣ−３’（配列番号３）及び３’−Ｑ−ＣＧＧＧＧＧＣＣＣＣＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＧＧ−５’（配列番号４））と、ＡＰ部位模倣物としてテトラヒドロフランを有する蛍光６−ＦＡＭ標識とを使用して、プレートアッセイでＡＰＥ１修復活性アッセイを実施した。ＡＰ模倣部位におけるオリゴ切断の結果、６−ＦＡＭが放出され、検出される。Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａプレートリーダー（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｒｅ，Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）を使用して、１分間隔で５回蛍光を読み取った。反応の速度を使用して、ビヒクル対照と比較したＡＰＥ１修復活性の変化を求めた。
【００７０】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
既に記載されている通り（Ｌｕｏら，２０１２）、ＥＭＳＡを実施した。精製されたＡＰＥ１を１．０ｍＭのＤＴＴで１０分間還元し、ＰＢＳ中０．０２ｍＭのＤＴＴで最終濃度が０．００６ｍＭになるように希釈した。還元されたＡＰＥ１を、ＤＮＡ結合ドメイン及びロイシンジッパーを含有する精製された切断型ｃ−Ｊｕｎ及びｃ−Ｆｏｓタンパク質の０．００７ｍＭのタンパク質混合物（１：１）２ｍＬを含むＥＭＳＡ反応バッファ（１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のグリセロール）に添加し、室温で３０分間インキュベートした。既に記載されている通り（Ｌｕｏら，２００８；Ｎｙｌａｎｄら，２０１０；Ｋｅｌｌｅｙら，２０１１；Ｌｕｏら，２０１２）、ＥＭＳＡアッセイを実施した。
【００７１】
一過的ルシフェラーゼレポーターアッセイ
既に記載されている通り（Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓら，２００８；Ｋｅｌｌｅｙら，２０１１；Ｃａｒｄｏｓｏら，２０１２ｂ；Ｌｕｏら，２０１２）、レポーターアッセイを実施した。ＮＦ−κＢ−応答プロモータを含有し、ルシフェラーゼ遺伝子の発現を駆動するＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼコンストラクト、及びウミシイタケルシフェラーゼ対照レポーターベクターｐＲＬ−ＣＭＶで細胞をトランスフェクトした。２４時間のトランスフェクション期間後、細胞を溶解し、正規化のためにウミシイタケルシフェラーゼ活性を使用して、ホタル及びウミシイタケのルシフェラーゼ活性をアッセイした。トランスフェクション実験は全てトリプリケートで実施し、独立な実験で少なくとも３回繰り返した。代表的な実験からの平均±標準誤差としてデータを表し、スチューデントのｔ検定を実施した。
【００７２】
腫瘍及び癌関連線維芽細胞（ＣＡＦ）の３Ｄ共培養
患者由来の腫瘍細胞及びＣＡＦ１９細胞は、Ａｎｉｒｂａｎ  Ｍａｉｔｒａ博士（Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）（Ｊｏｎｅｓら，２００８）から供与された。全ての細胞株は、ＳＴＲ分析（ＩＤＥＸＸ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を介して認証され、マイコプラズマのコンタミネーションについて規定通りチェックされた。既に記載されている通り（Ｓｅｍｐｅｒｅら，２０１１；Ａｒｐｉｎ，２０１５）、Ｕｌｔｒａ  ｌｏｗ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＣＡＦの有り無しで３次元腫瘍スフェロイドを生成した。ＴｄＴｏｍａｔｏで標識されたＰＤＡＣ細胞及びＥＧＦＰで標識されたＣＡＦを、１：４の細胞比（腫瘍：ＣＡＦ）で３％還元成長因子マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及び５％ＦＢＳを含有する無色のＤＭＥＭ培地に再懸濁させ、プレーティング後４及び８日目に供給した。共培養の１２日目に、Ｔｈｅｒｍｏ  ＡｒｒａｙＳｃａｎを介して両細胞集団を強度及び面積について定量した。
【００７３】
薬物動態（ＰＫ）及びＰ４５０代謝分析
Ｅ３３３０について既に記載されている通り（Ｆｉｓｈｅｌら，２０１１）、ＩＵ  Ｓｉｍｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｅ（ＣＰＡＣ）においてＰＫ試験を実施し、該化合物の標準を使用した。ヒトミクロソームを使用するＰ４５０代謝試験も、Ｄａｖｉｄ  Ｊｏｎｅｓ博士の指導でＣＰＡＣにおいて実施した。
【００７４】
統計解析
最低３回の独立な収集又は実験からの平均±ＳＥＭとしてデータを表す。対照と様々な処理との間の統計的に有意な差は、スチューデントｔ検定を使用して評価した。二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びチューキーの事後検定を使用して、トリパンブルー排除、ガンマ−Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）、及びＣＧＲＰ放出を使用した細胞生存率の差を求めた。
【００７５】
結果
Ｅ３３３０アナログの化学合成、酸化還元阻害の検証、及び薬物動態
活性を調節するために、コアジメトキシベンゾキノン（Ａ）をナフトキノン環で置換し、環構造におけるメチル基（Ｂ）を様々なハロゲン又は水素で置換し、二重結合における炭素鎖（Ｃ）を短くすることによって、Ｅ３３３０の多数のアナログを合成した（図８Ａ）。継続的な努力において、二重結合における炭素鎖（Ｃ）を短くすることに合わせて、カルボン酸部分（Ｄ）を修飾した。これら変化によって、構造の２つの物性が改変された。Ｅ３３３０は、生理学的ｐＨにおいて荷電分子として存在する。荷電している支持化学的特徴（ｓｕｐｐｏｒｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｆｅａｔｕｒｅ）ではない、カルボン酸（Ｄ）のアミド誘導体が調製された。更に、Ｅ３３３０は、非常に親油性の高い炭素鎖を有し、これは、改変可能な特徴であると考えられる。新規構造は、二重結合において著しく短い炭素鎖（Ｃ）を有するので、親油性がより低い。詳細な合成データは、米国特許第９，０８９，６０５号に見出すことができ、これは、本明細書に一致する範囲で参照により本明細書に組み込まれる。作製された化合物のうちの３つの新規構造（図８Ｂ）を、酸化還元ＡＰＥ１電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）試験において分析して、どの化合物がＡＰＥ１の酸化還元機能に影響を与えるかを判定した。該化合物は、ＡＰＸ２００７  ２μＭ、ＡＰＸ２００９  １μＭ、及びＡＰＸ２０３２  １μＭの酸化還元阻害ＩＣ５０を有していた（図９Ａ）。Ｅ３３３０は既に提示されており、同様のアッセイで２５μＭのＩＣ５０を有する。
【００７６】
レポータートランス活性化アッセイを実施して、新規化合物が細胞において有効であり、このアッセイにおいてＮＦκｋＢ機能を制御するその標的ＡＰＥ１にヒットすることを確認した。これらアッセイでは、３つの化合物ＡＰＸ２００７、ＡＰＸ２００９、及びＡＰＸ２０３２の全てが、７μＭのＩＣ５０でレポーターコンストラクトに対するＮＦκＢの結合を同様に阻害することが証明され、一方Ｅ３３３０は４５μＭの活性を有する（図９Ｂ）。更に、２つの神経芽細胞腫細胞株ＩＭＲ３２（ｐ５３ｗｔ、ＭＹＣＮ増幅）及びＳＫ−Ｎ−ＳＨ（ｐ５３ｗｔ、ＭＹＣＮ非増幅）において、腫瘍細胞死滅についてのＥＤ５０を決定した（図９Ｃ及び９Ｄ）。３つの化合物全てがＥ３３３０に比べて低いＥＤ５０を有していた；ＩＭＲ３２細胞では７〜１０倍大きく、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞では４〜６倍大きい（図９Ｃ及び９Ｄ）。強化された腫瘍細胞死滅データは、図１０のＥＭＳＡ及びトランス活性化データによって証明される通り、ＡＰＥ１機能に対する化合物の有効性の増大と一致している。ＡＰＸ２００９の薬物動態プロファイルについても評価した。図１１Ａ及び１１Ｂに示す通り、ＡＰＸ２００９の半減期は、Ｅ３３３０の３．６時間に比べて２５．８時間であり、すなわち、約７倍半減期が増加する。更に、Ｐ４５０代謝分析においてヒトミクロソームを使用して、ＡＰＸ２００９は、２０分間に対して１７３分間の半減期を有し、すなわち、８．７倍増加した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
【００７７】
感覚ニューロン培養物を１０、２０、又は４０μＭのＥ３３３０に２４時間曝露した場合、トリパンブルー排除によって測定して、有意な細胞死は存在しなかった（図１２Ａ）。同様に、培養物を様々な濃度のＡＰＸ２００９に曝露しても、細胞生存率は有意には低下しなかった（図１２Ａ）。対照的に、４０μＭのＡＰＸ２００７で２４時間、又は２０μＭ若しくは４０μＭのＡＰＸ２０３２で２４時間細胞を処理した結果、細胞生存率が有意に低下した（図１２Ａ）。同様に、培養物を２０又は４０μＭのＡＰＸ  ２００７又はＡＰＸ２０３２に７２時間曝露すると、細胞死が有意に増加した（データ不図示）。
【００７８】
既に記載されている通り（Ｂａｐａｔら，２０１０）、ＤＮＡ修復活性アッセイを実施した。図１３Ａ〜１３Ｄに示す通り、ＡＰＸ２００９のみがこのアッセイにおいてＡＰＥ１修復活性の刺激を示し、ナノモル範囲において、Ｅ３３３０と比べて活性の著しい増加を示した（図１１Ａ及び１１Ｂ）。ＡＰＸ２００７及びＡＰＸ２０３２は、ＡＰＥ１エンドヌクレアーゼ活性の刺激についても阻害についても効果を有していなかった。
【００７９】
Ｅ３３３０及びＡＰＸ２００９は、感覚ニューロン培養物においてシスプラチンによって誘起される細胞死を減弱したが、ＡＰＸ２００７もＡＰＸ２０３２も減弱しなかった
ニューロン培養物のＥ３３３０への曝露は神経保護的であるので（Ｖａｓｋｏら，２００５；Ｊｉａｎｇら，２００８；Ｖａｓｋｏら，２０１１；Ｋｅｌｌｅｙら，２０１４）、Ｅ３３３０及び他のアナログが培養下のシスプラチンによって誘起される細胞死に影響を与えるかどうかについて評価した。ニューロン培養物を漸増濃度のシスプラチンに２４時間曝露すると、それぞれ３０及び１００μＭで６６±５％及び５０±７％に細胞生存率が濃度依存的に減少する（図１２Ｂ）。このシスプラチンによって誘起される細胞死は、シスプラチン処理前に４８時間及び該処理の間中、Ｅ３３３０（２０μＭ）又はＡＰＸ２００９（２０μＭ）にニューロン培養物を曝露することによってブロックされた（図１２Ｂ）。対照的に、２０μＭのＡＰＸ２００７又はＡＰＸ２０３２で前処理しても、シスプラチンによって誘起される細胞死は減弱せず、ＡＰＸ２０３２及びシスプラチン（１００μＭ）の組み合わせは細胞生存率を９±９％に低下させる（図１２Ｂ）。したがって、ＡＰＸ２００９は、使用した全ての用量レベルにおいて、シスプラチンによって誘起される細胞死に対して感覚ニューロン培養物を保護し、一方ＡＰＸ２００７及びＡＰＸ２０３２は、高用量（１００μＭ）において細胞死滅を引き起こした。
【００８０】
Ｅ３３３０及びＡＰＸ２００９は、シスプラチンによって誘起される感覚ニューロンからの伝達物質の放出の減少を減弱したが、ＡＰＸ２００７もＡＰＸ２０３２も減弱しなかった
感覚ニューロン培養物において細胞死を引き起こすには比較的高濃度のシスプラチンが必要であるが、より低濃度では、感覚ニューロンからの伝達物質の放出が低減される。したがって、Ｅ３３３０アナログが、シスプラチンによって誘導される神経毒性の機能的エンドポイントを減弱できるかどうか、すなわち、カプサイシンによって惹起されるＣＧＲＰの放出の減少について更に判定した。培養下の感覚ニューロンをＥ３３３０（２０μＭ）又はＡＰＸ２００９（１０若しくは２０μＭ）に７２時間曝露し、ＣＧＲＰ放出について調べたとき、未処理細胞と比べて、基本（休止）放出も３０ｎＭのカプサイシンによって刺激された放出も有意には変化しなかった（図１４Ａ）。しかし、ＡＰＸ２００７又はＡＰＸ２０３２（１０μＭ）で７２時間前処理してもＣＧＲＰ放出に影響を与えず、一方各２０μＭは、カプサイシンによって刺激される放出を有意に増加させた（図１４Ａ）。試験した濃度の薬物はいずれも、培養下のＣＧＲＰの総含量を変化させなかった（データ不図示）。上述の結果を確認して、ニューロン培養物を１０μＭのシスプラチンに曝露した結果、カプサイシンによって惹起されるＣＧＲＰの放出が著しく減少した（図１４Ｂ）。シスプラチンに曝露する前４８時間及び曝露の間中、２０μＭのＥ３３３０又はＡＰＸ化合物で培養物を前処理すると、抗癌薬によって引き起こされた放出の減少が無効になった（図１４Ｂ）。１０μＭのＡＰＸ２００７又はＡＰＸ２００９で７２時間処理しても、シスプラチンによって誘起される放出の減少は阻止されなかったが、１０μＭのＡＰＸ２０３２はシスプラチンの効果をブロックした。ＡＰＸ２００７及びＡＰＸ２０３２のみでは伝達物質の放出を増強したので、シスプラチン効果の回復は非特異的である可能性があった。対照的に、Ｅ３３３０及びＡＰＸ２００９は共に、単独で投与されたときに放出を変化させないので、神経保護的であると思われる。
【００８１】
ＡＰＸ２００９は、感覚ニューロン培養物中でシスプラチンによって誘起されるＤＮＡ損傷を著しく減少させた
シスプラチン処理後のＡＰＸ２００９の神経保護効果の更なる確認として、様々なＥ３３３０アナログの有り無しで、ＤＮＡ損傷のマーカーであるホスホ−Ｈ２ＡＸ（ｐＨ２ＡＸ）のレベルを感覚ニューロン培養物中で測定した。培養物を１０μＭのシスプラチンに２４又は４８時間曝露した場合、ウエスタンブロットを使用して測定してｐＨ２ＡＸの濃度が著しく増大し、白金化合物によるＤＮＡ損傷が確認された（図１５）。シスプラチンへの曝露前４８時間又は曝露の間中、ＡＰＸ２００９（２０μＭ）で培養物を前処理すると、ｐＨ２ＡＸのレベルが著しく低下した。対照的に、ＡＰＸ２００７もＡＰＸ２０３２も（２０μＭ）、ＤＮＡ損傷を生じさせるシスプラチンの能力を変化させなかった（図１５）。
【００８２】
ＡＰＸ２００９は、オキサリプラチンによって誘導される神経毒性に対して神経保護的である
ＡＰＸ２００９は、シスプラチンによって誘起されるＤＮＡ損傷及びＣＧＲＰ放出の減少から保護したが、ＡＰＸ２００７及びＡＰＸ２０３２は保護しなかったという知見に基づいて、別の白金剤であるオキサリプラチンを用いたその後の研究における使用についてはＡＰＸ２００９を優先した。シスプラチン及びオキサリプラチンは共に、細胞内で著しいレベルのＲＯＳを生成し、シスプラチンがより高いレベルで生成する。しかし、これら２つの剤によって生成されるＤＮＡの架橋は異なる：シスプラチンはＰｔ−１−２−ｄ（ＧｐＧ）鎖内ＤＮＡ架橋を生成し、一方オキサリプラチンは、主にＰｔ−１−３  ｄ（ＡｐＧ）鎖内ＤＮＡ架橋を生成する。Ｅ３３３０がシスプラチン及びオキサリプラチンによって誘導される神経毒性の両方から保護することは既に証明されている。したがって、オキサリプラチン処理後に同様の保護効果を有しているかどうかを判定するためにＡＰＸ２００９を分析し、これも、酸化的ＤＮＡ損傷の修復が白金架橋除去の制御に関与しているという仮説を支持する。図１６Ａに示す通り、１０又は２０μＭのＡＰＸ２００９で７２時間処理すると、オキサリプラチンに２４時間曝露することによって引き起こされる細胞死滅から感覚ニューロン培養物を保護した。同様に、オキサリプラチンに２４時間曝露する前４８時間及び曝露の間中、ＡＰＸ２００９でニューロン培養物を前処理すると、オキサリプラチンによって誘起される、感覚ニューロンからのＣＧＲＰ放出の減少が阻止された（図１６Ｂ）。
【００８３】
また、ＡＰＸ２００９は、オキサリプラチンで２４及び４８時間処理した後にＨ２ＡＸのリン酸化を著しく減少させ（図１６Ｃ）、これは、その神経保護効果がＤＮＡ損傷の減少に起因している可能性があることを示す。
【００８４】
ＡＰＸ２００９によるヒトＰＤＡＣ  ３Ｄ腫瘍モデルの処理
ＡＰＸ２００９の神経保護効果は明らかである一方、これらＥ３３３０アナログが、Ｅ３３３０でみられたのと同様に腫瘍細胞を死滅させることができるかどうかについても調べた。低継代数の患者由来の腫瘍細胞及び癌関連線維芽細胞の両方を含むエクスビボ系として、膵臓癌の３次元共培養モデルを使用した。腫瘍細胞のみ及びＣＡＦとの共培養物の両方の面積及び強度に対する、ＡＰＸ２００９によって誘導される細胞毒性の作用を評価した。患者由来のＰＤＡＣ細胞（Ｐａ０３Ｃ−赤色で標識）及びＣＡＦ１９細胞（緑色で標識）で構成されるスフェロイドをＡＰＸ２００９で処理し、各細胞型のマーカーとして、赤色及び緑色の蛍光の面積及び強度を別々に評価した（図１７Ａ〜１７Ｃ）。興味深いことに、ＣＡＦはＡＰＸ２００９処理によって有意には影響を受けず、このことも、非腫瘍形成性細胞が、腫瘍細胞よりもＡＰＥ１阻害の効果に耐容性を示し得ることを示唆している。このデータは、Ｅ３３３０で観察されるものと同様であるが、より低い用量レベルで有効であり、ＡＰＸ２００９が、ＣＩＰＮ保護の指標も示すと同時に、潜在的ＰＤＡＣ治療剤であると確認される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月17日(2019.12.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要としている被験体におけるニューロンの感受性を低減する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項２】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
それを必要としている被験体における炎症及び慢性疼痛を治療する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項６】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
それを必要としている被験体におけるニューロンＤＮＡ修復機能を強化する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項１０】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤がＡＰＸ３３３０であり、前記被験体に約５μＭ〜約５０μＭのＡＰＸ３３３０を投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの追加の治療剤を前記被験体に投与する工程を更に含み、前記追加の治療剤が白金薬剤、タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
それを必要としている被験体における化学療法誘発性末梢神経障害（ＣＩＰＮ）を治療する方法であって、ＡＰＥ１のアミノ末端部分を選択的に阻害する、脱プリン／脱ピリミジン部位エンドヌクレアーゼ１酸化還元因子１（ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１）阻害剤、その薬学的に許容し得る塩又は薬学的に許容し得る溶媒和物の有効量を前記被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項１４】
前記ＡＰＥ１／Ｒｅｆ−１阻害剤が、３−［（５−（２，３−ジメトキシ−６−メチル１，４−ベンゾキノイル）］−２−ノニル−２−プロピオン酸（ＡＰＸ３３３０）、［（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ，Ｎ−ジエチルペンタンアミド］（ＡＰＸ２００９）、（２Ｅ）−２−［（３−メトキシ−１，４−ジオキソ−１，４−ジヒドロナフタレン−２−イル）メチリデン］−Ｎ−メトキシペンタンアミド］（ＡＰＸ２０１４）、これらの薬学的に許容し得る塩及び薬学的に許容し得る溶媒和物、並びにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１５】
タキサン、ドキソルビシン、アルカロイド、サリドマイド、レナリドミド、ポマリドミド、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、エリブリン、電離放射線、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの追加の治療剤を投与する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【国際調査報告】
2020516663.tif 000042
2020516663.tif 000043
2020516663.tif 000044
2020516663.tif 000045