(57)【要約】  プラズモニックマッシュルームアレイの作製方法は、それぞれナノメートル領域の寸法を有する複数の金属ナノアイランドをガラス基板の表面上に形成し、前記複数の金属ナノアイランドが複数のキノコ型構造に変換されるように、前記複数の金属ナノアイランドが形成された前記ガラス基板を反応性イオンエッチングにかける、処理を含み、前記複数のキノコ型構造はそれぞれ前記ガラス基板の材料からなる軸によって支持された金属の笠を有し、前記ナノアイランドの寸法よりも小さい寸法を有し、前記複数のキノコ型構造は、前記ナノアイランド間の平均間隔よりも小さな間隔で略規則的なパターンに配置され、それにより、前記ガラス基板上に局在表面プラズモン共鳴を示すことができる前記複数のナノスケールのキノコ型構造を形成する。
2020516887.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
それぞれナノメートル領域の寸法を有する複数の金属ナノアイランドをガラス基板の表面上に形成し、
前記複数の金属ナノアイランドが複数のキノコ型構造に変換されるように、前記複数の金属ナノアイランドが形成された前記ガラス基板を反応性イオンエッチングにかける、
処理を含み、
前記複数のキノコ型構造はそれぞれ、前記ガラス基板の材料からなる軸によって支持された金属の笠を有し、前記ナノアイランドの寸法よりも小さい寸法を有し、
前記複数のキノコ型構造は、前記ナノアイランド間の平均間隔よりも小さな間隔で略規則的なパターンに配置され、それにより、前記ガラス基板上に局在表面プラズモン共鳴を示すことができる前記複数のナノスケールのキノコ型構造を形成する、
プラズモニックマッシュルームアレイの作製方法。
【請求項２】
前記複数の金属ナノアイランドを形成する処理は、
金属の層を前記ガラス基板の前記表面上に堆積させ、
前記金属の層が形成された前記ガラス基板をアニーリングし、前記複数の金属ナノアイランドが前記ガラス基板の前記表面上に略規則的な間隔で形成されるように前記金属のディウェッティングを引き起こす、
処理を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記金属は金であり、前記金属の層の厚みは４ｎｍであり、前記ガラス基板はＳｉＯ２基板であり、前記アニーリングは５６０℃で３時間行われ、
前記反応性イオンエッチングはＳＦ６のガスを用いて５℃で行われる、
請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の金属ナノアイランドを形成する処理は、
金属の層を前記ガラス基板の前記表面上に堆積させ、
前記金属の層をフォトリソグラフィによってパターニングし、前記複数の金属ナノアイランドを形成する、
処理を含む請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数の金属ナノアイランドを形成する処理は、前記複数の金属ナノアイランドがそれぞれ１００ｎｍ以下の直径を有し、前記金属ナノアイランド間の間隔が１００ｎｍ以下となるように実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記金属は金であり、前記ガラス基板はＳｉＯ２基板であり、
前記複数の金属ナノアイランドを形成する処理は、前記複数の金属ナノアイランドがそれぞれ、前記ナノアイランド間の間隔が２ｎｍ〜８０ｎｍであり、直径５ｎｍ〜７０ｎｍ、高さ２０ｎｍ〜２５ｎｍの高さを有する金からなる金属アイランドを有するように実行され、
前記反応性イオンエッチングは、結果として得られる前記複数のキノコ型構造がそれぞれ、高さ３０ｎｍ〜４０ｎｍを有するＳｉＯ２からなる軸によって支持された、直径１０ｎｍ〜３０ｎｍ、高さ１５ｎｍ〜２０ｎｍの金からなる金属の笠を有し、前記キノコ型構造間の間隔が５ｎｍ〜２０ｎｍとなるように実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記金属は金であり、前記ガラス基板はＳｉＯ２基板であり、
前記複数の金属ナノアイランドを形成する処理は、前記複数の金属ナノアイランドがそれぞれ、平均直径３５ｎｍ、高さ２０ｎｍ〜２５ｎｍの金からなる金属アイランドを有し、前記ナノアイランド間の平均間隔が２５ｎｍとなるように実行され、
前記反応性イオンエッチングは、結果として得られる前記複数のキノコ型構造がそれぞれ、高さ３０ｎｍ〜４０ｎｍを有するＳｉＯ２からなる軸によって支持された、平均直径２５ｎｍ、高さ１５ｎｍ〜２０ｎｍの金からなる金属の笠を有し、前記キノコ型構造間の平均間隔が１０ｎｍとなるように実行される、
請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ガラス基板と、
前記ガラス基板上に、それぞれが前記ガラス基板の材料からなる軸によって支持された金属の笠を有し、ナノスケール寸法を有する複数のキノコ型構造と、
を備え、
前記複数のキノコ型構造は、局在表面プラズモン共鳴を示すように、略規則的なパターンで配置されている、
プラズモニックプレート。
【請求項９】
前記ガラス基板はＳｉＯ２基板であり、
前記複数のキノコ型構造はそれぞれ、高さ３０ｎｍ〜４０ｎｍのＳｉＯ２からなる軸によって支持された、直径１０ｎｍ〜３０ｎｍ、高さ１５ｎｍ〜２０ｎｍの金からなる金属の笠を有し、前記キノコ型構造間の間隔は、５ｎｍ〜２０ｎｍである、
請求項８に記載のプラズモニックプレート。
【請求項１０】
前記ガラス基板はＳｉＯ２基板であり、
前記複数のキノコ型構造はそれぞれ、高さ３０ｎｍ〜４０ｎｍのＳｉＯ２からなる軸によって支持された、平均直径２５ｎｍ、高さ１５ｎｍ〜２０ｎｍの金からなる金属の笠を有し、前記キノコ型構造間の平均間隔は１０ｎｍである、
請求項８記載のプラズモニックプレート。
【請求項１１】
複数のプラズモン領域を備え、前記プラズモン領域はそれぞれ、請求項８に記載の前記プラズモニックプレートである、
プラズモンチップ。
【請求項１２】
複数のプラズモン領域を備え、前記プラズモン領域はそれぞれ、請求項９に記載の前記プラズモニックプレートである、
プラズモンチップ。
【請求項１３】
複数のプラズモン領域を備え、前記プラズモン領域はそれぞれ、請求項１０に記載の前記プラズモニックプレートである、
プラズモンチップ。
【請求項１４】
下向きに発光する発光ダイオードを含むＬＥＤ回路と、
前記ＬＥＤ回路の下に設けられ、請求項８に記載のプラズモニックプレートを含み、前記発光ダイオードからの光を受光するように前記発光ダイオードに対向するプラズモンチップと、
流体ステージに供給された流体が前記プラズモニックプレートと動作可能に結合することができるよう前記ＬＥＤ回路の下に設けられた流体ステージと、
前記プラズモンチップの下に設けられ、受光した光のスペクトルを分析するように前記プラズモニックプレートと相互作用した光を受光する分光計と、
を備える局在表面プラズモン共鳴装置。
【請求項１５】
下向きに発光する発光ダイオードを含むＬＥＤ回路と、
前記ＬＥＤ回路の下に設けられ、請求項９に記載のプラズモニックプレートを含み、前記発光ダイオードからの光を受光するように前記発光ダイオードに対向するプラズモンチップと、
流体ステージに供給された流体が前記プラズモニックプレートと動作可能に結合することができるよう前記ＬＥＤ回路の下に設けられた流体ステージと、
前記プラズモンチップの下に設けられ、受光した光のスペクトルを分析するように前記プラズモニックプレートと相互作用した光を受光する分光計と、
を備える局在表面プラズモン共鳴装置。
【請求項１６】
下向きに発光する発光ダイオードを含むＬＥＤ回路と、
前記ＬＥＤ回路の下に設けられ、請求項１０に記載のプラズモニックプレートを含み、前記発光ダイオードからの光を受光するように前記発光ダイオードに対向するプラズモンチップと、
流体ステージに供給された流体が前記プラズモニックプレートと動作可能に結合することができるよう前記ＬＥＤ回路の下に設けられた流体ステージと、
前記プラズモンチップの下に設けられ、受光した光のスペクトルを分析するように前記プラズモニックプレートと相互作用した光を受光する分光計と、
を備える局在表面プラズモン共鳴装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノプラズモニック計装、材料、方法、及びシステムインテグレーションに関する。
【背景技術】
【０００２】
ナノ構造を低コストおよび高スループットで作り出すことが可能な技術に対する需要と同様に、高感度プラズモニックナノ構造に対する需要が増え続けている。現在の技術は、マイクロ／ナノリソグラフィ技術に限定されており、これらは時間がかかり、限られたスループットかつ低い再現性で構造を産出する（非特許文献４）。
【０００３】
ナノプラズモンバイオセンサは、疾患の早期検出およびポイントオブケア（point-of-care：ＰＯＣ）臨床評価に不可欠な特徴である、リアルタイムでの生体分子相互作用の高感度なラベルフリー検出を可能にする。ナノプラズモニクスは、局在表面プラズモン共鳴（localized surface plasmon resonance：ＬＳＰＲ）として知られる現象に関連する貴金属ナノ構造の独特の物理的および光学的性質を調査する。ＬＳＰＲは、入射光子と貴金属ナノ構造の伝導帯との間の相互作用に起因する、非局在化電子のコヒーレント振動およびそれに続く紫外可視（ＵＶ−Ｖｉｓ）帯内での吸収である。トップダウンファブリケーション及びボトムアップアセンブリという２つの基本的な方式を使用して、生体適合性ナノプラズモニック材料を開発する。基本的に、トップダウンファブリケーション方式が基板からビルディングユニットを取り除いてナノ構造を作成するのに対して、ボトムアップアセンブリは、基板に物理的にビルディングユニットを追加するものである。トップダウンファブリケーションは、通常、様々なリソグラフィ方法に依存しているのに対し、ボトムアップ方式は、分子合成、コロイド化学、およびポリマー科学を採用してナノメートル寸法の構造を開発する。ボトムアップ方式の固有の性質により細かい分解能が可能になるが、トップダウン方式の方が大規模で高スループットのナノ構造生産にはるかに適している。両方式の既存の方法は、ナノ構造のサイズ、形状、および分離に対する優れた制御を可能にした。しかしながら、材料科学には、高スループットかつ作製コストが低い高感度ナノプラズモンセンサの合成を達成するために両方式を統合する有効な手段がまだ欠けている。
【０００４】
プラズマ支援ナノファブリケーションは新たな学際的研究分野であり、ナノワイヤ、ナノチューブ、ナノ粒子、およびナノテクスチャコーティングを含む、多様なナノ材料の作製に対するエキサイティングで新しい特定分野を提供する。プラズマ環境で開発されたナノ材料は、それらの伝統的なものとは一線を画す顕著なプラズマ誘起特性を有するが、標準的なリソグラフィ、電子ビームリソグラフィおよびナノインプリンティングのような従来の技術を用いてそれらを作製することは困難であることが判明している（非特許文献５，６）。プラズマ支援ナノファブリケーションのプロセスは、自然界で起こるいくつかのプロセスと多くの類似点を有する。具体的には、宇宙空間では９９％の物質がプラズマ状態で存在している。例えば、星間ガス、彗星の尾、惑星大気の上層、及び恒星環境は、原子、分子、及びイオン等のサブナノスケール粒子（ビルディングユニット）が様々な形や構成に自己組織化するプラズマ環境を含んでいる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ostrikov, K. "Colloquium: Reactive plasmas as a versatile nanofabrication tool." Reviews of modern physics 77.2 (2005): 489.
【非特許文献２】Vladimirov, Sergey V., Kostya Ostrikov, and Alex A. Samarian. Physics and applications of complex plasmas. World Scientific, 2005.
【非特許文献３】Ostrikov, Kostya, Plasma nanoscience: from nature's mastery to deterministic plasma-aided nanofabrication." IEEE transactions on plasma science 35.2 (2007): 127-136.
【非特許文献４】Hammond, Jules L., et al. "Localized surface plasmon resonance as a biosensing platform for developing countries." Biosensors 4.2 (2014): 172-188.
【非特許文献５】Anker, Jeffrey N., et al. "Biosensing with plasmonic nanosensors." Nature materials 7.6 (2008): 442-453.
【非特許文献６】Willets, Katherine A., and Richard P. Van Duyne. "Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing." Annu. Rev. Phys. Chem. 58 (2007): 267-297.
【非特許文献７】Kang, Tae Yoon, et al. "Process optimization of CF 4/Ar plasma etching of Au using I-optimal design." Thin Solid Films 517.14 (2009): 3919-3922.
【非特許文献８】Knizikevicius, Rimantas. "Simulations of Si and SiO2 etching in SF6+ O2 plasma." Vacuum 83.6 (2009): 953-957.
【非特許文献９】Jia, Kun, et al. "Sensitive localized surface plasmon resonance multiplexing protocols." Analytical chemistry 84.18 (2012): 8020-8027.
【非特許文献１０】Svorcik, V., et al. "Annealing of gold nanostructures sputtered on glass substrate." Applied Physics A 102.3 (2011): 605-610.
【非特許文献１１】Manzano, Marisa, et al. "Development of localized surface plasmon resonance biosensors for the detection of Brettanomyces bruxellensis in wine." Sensors and Actuators B: Chemical 223 (2016): 295-300.
【非特許文献１２】Ou, Y. et al. Broadband antireflection silicon carbide surface by self-assembled nanopatterned reactive-ion etching. Optical Materials Express 3, 86-94 (2013).
【非特許文献１３】Kitabayashi,  H.,  Fujii,  H. & Ooishi, T., Charging of glass substrate by plasma exposure, Japanese journal of applied physics 38, 2964 (1999).
【非特許文献１４】Becker, J., Tru¨gler, A., Jakab, A., Hohenester, U. & So¨nnichsen, C.  The optimal aspect ratio of gold nanorods for plasmonic bio-sensing. Plasmonics 5, 161-167 (2010).
【非特許文献１５】Paivanranta, B. et al., High aspect ratio plasmonic nanostructures for sensing applications, ACS nano 5, 6374-6382 (2011).
【非特許文献１６】Parsons, J. et al. Localized surface-plasmon resonances in periodic nondiffracting metallic nanoparticle and nanohole arrays. Physical Review B 79, 073412 (2009)
【非特許文献１７】Willets, K. A. & Van Duyne, R. P. Localized surface plasmon resonance spectroscopy and sensing. Annu. Rev. Phys. Chem. 58, 267-297 (2007).
【非特許文献１８】Abbas, A., Tian, L., Morrissey, J. J., Kharasch, E. D. & Singamaneni, S. Hot spot-localized artificial antibodies for label-free plasmonic biosensing. Advanced functional materials 23, 1789-1797 (2013).
【非特許文献１９】Sepu´lveda, B., Angelome´, P. C., Lechuga, L. M. & Liz-Marza´n, L. M. Lspr-based nanobiosen- sors. Nano Today 4, 244-251 (2009).
【非特許文献２０】Wilkinson, C., Riehle, M., Wood, M., Gallagher, J. & Curtis, A. The use of materials patterned on a nano-and micro-metric scale in cellular engineering. Materials Science and Engineering: C 19, 263-269 (2002).
【非特許文献２１】Armbruster, D. A. & Pry, T. Limit of blank, limit of detection and limit of quantitation. Clin Biochem Rev 29, S49-52 (2008).
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明はナノプラズモニック計装、材料、方法、及びシステムインテグレーションに関する。
【０００７】
発明の追加の又は別の特徴及び利点は、以下の明細書に記載されており、一部分において、明細書から明らかであるか、又は、発明の実施によって習得される。発明の目的及び他の利点は、記載された明細書および請求の範囲、並びに添付の図面において特に指摘されている構造によって実現及び達成されるであろう。
【０００８】
本発明の目的に従ってこれらの及び他の優位性を達成するために、具体化され、広く説明されるように、１つの側面において、本発明は、それぞれナノメートル領域の寸法を有する複数の金属ナノアイランドをガラス基板の表面上に形成し、前記複数の金属ナノアイランドが複数のキノコ型構造に変換されるように、前記複数の金属ナノアイランドが形成された前記ガラス基板を反応性イオンエッチングにかける、処理を含み、前記複数のキノコ型構造はそれぞれ、前記ガラス基板の材料からなる軸によって支持された金属の笠を有し、前記ナノアイランドの寸法よりも小さい寸法を有し、前記複数のキノコ型構造は、前記ナノアイランド間の平均間隔よりも小さな間隔で略規則的なパターンに配置され、それにより、前記ガラス基板上に局在表面プラズモン共鳴を示すことができる前記複数のナノスケールのキノコ型構造を形成する、プラズモニックマッシュルームアレイの作製方法を提供する。
【０００９】
別の側面において、本発明は、ガラス基板と、前記ガラス基板上に、それぞれが前記ガラス基板の材料からなる軸によって支持された金属の笠を有し、ナノスケール寸法を有する複数のキノコ型構造と、を備え、前記複数のキノコ型構造は、局在表面プラズモン共鳴を示すように、略規則的なパターンで配置されている、プラズモニックプレートを提供する。
【００１０】
別の側面において、本発明は、下向きに発光する発光ダイオードを含むＬＥＤ回路と、前記ＬＥＤ回路の下に設けられ、上記のプラズモニックプレートを含み、前記発光ダイオードからの光を受光するように前記発光ダイオードに対向するプラズモンチップと、流体ステージに供給された流体が前記プラズモニックプレートと動作可能に結合することができるよう前記ＬＥＤ回路の下に設けられた流体ステージと、前記プラズモンチップの下に設けられ、受光した光のスペクトルを分析するように前記プラズモニックプレートと相互作用した光を受光する分光計と、を備える局在表面プラズモン共鳴装置を提供する。
【００１１】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は、例示的かつ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明のさらなる説明を提供することが意図されていることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、Ａｕナノアイランド（nanoisland：ＮＩ）からＡｕナノマッシュルーム（nanomushroom：ＮＭ）構造を作製するプラズマプロセスを概略的に示す図である。（ａ）は、ＮＩの略図と並べた走査電子顕微鏡法（scanning electron microscopy：ＳＥＭ）画像である。挿入図は、ＮＩの画像を拡大している。（ｂ）は、プラズマ曝露下のＮＩの概略図である。（ｃ）は、プラズマへのプラズマ曝露後に形成されたＮＭである。挿入図はＮＭの断面を示している。
【図２】図２は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製工程を概略的に示す図である。概略図は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（building unit：ＢＵ）の生成、それに続く、より密集したＮＭへのＢＵのアセンブリを示している。
【図３】図３は、本発明に適用されるように、ビルディングユニット（ＢＵ）のコンセプトを概略的に示す図である。
【図４】図４は、電子ビームリソグフラフィ（e-beam lithography：ＥＢＬ）を使用して作製された、１００ｎｍ間隔で、直径２００ｎｍを有するＮＩの写真である。
【図５】図５は、図４に示すＮＩ構造に対してＩＣＰ−ＲＩＥ処理を行った後の構造の写真である。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係るＮＭ製造プロセスのプロセスフローチャートである。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る高スループットのＮＭ構造を達成するためのプロセスを概略的に示す図である。
【図８】図８は、本発明の実施形態に係るＮＭ構造の寸法及び間隔を概略的に示す図である。
【図９ａ】図９ａは、ＮＩ及びＮＭについて、波長の関数としての吸光度プロットであり、ＮＩ（ＬＳＰＲピーク波長５４０ｎｍ）構造及びＮＭ（ＬＳＰＲピーク波長５３３ｎｍ）構造の典型的な共振特性を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＮＭ構造及びＮＩ構造近傍の局所的な屈折率の変化に伴うＮＭ構造及びＮＩ構造それぞれのＬＳＰＲピーク波長の変化を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のＮＭ基板上での細胞増殖（ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞）を概略的に示す図である。
【図１１ａ】図１１は、細胞増殖時の本発明の実施例ＮＭ構造のＬＳＰＲを示す図であり、図１１ａは、２４時間にわたる波長応答を示す図である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、２４時間にわたる吸光応答を示す図である。
【図１１ｃ】図１１ｃは、２４時間にわたるＲＩＵ応答を示す図である。
【図１１ｄ】図１１ｄ〜図１１ｆは、７日間にわたる細胞増殖時のＬＳＰＲを示す図であり、図１１ｄは、波長応答を示している。
【図１１ｅ】図１１ｅは、吸光応答を示している。
【図１１ｆ】図１１ｆは、ＲＩＵ応答を示している。
【図１１ｇ】図１１ｇは各日後のＮＭセンサの表面の画像を示している。
【図１１ｈ】図１１ｈは、細胞数の変化に対するセンサ応答の変化を示している。
【図１２】図１２は、ＣＮＣ機を使用し、アルミニウムで作製したステンシルハードマスクを示す写真である。
【図１３】図１３は、図１２のマスクを使用した、スポット内での金の堆積を概略的に示す図である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例に従って製造されたナノマッシュルームスポットの配列を有するＮＭチップを示す写真である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施例に従って製造されたマイクロチャンネルを有するパッケージ化されたナノマッシュルームチップを示す写真である。
【図１６】図１６は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製メカニズムを示す図であり、（ａ）は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（ＢＵ）の生成及びそれに続くより密集したＮＭへのビルディングユニットのアセンブリを概略的に示し、（ｂ）は、ＮＩからのＮＭのプラズマ指向性アセンブリにとって好ましいサイズおよびピッチ要件を示し、（ｃ）〜（ｅ）は、ＮＩに対するプラズマ効果の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であり、（ｃ）は直径２００ｎｍ、ピッチ２００ｎｍ、（ｄ）は直径２００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍ、（ｅ）はサイズ１００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍ直径である。
【図１７ａ】図１７は、検証実験の構成および結果を示す図であり、図１７ａはイオンの勾配を生成するためのプラズマシールドの概略図である。
【図１７ｂ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｃ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｄ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｅ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｆ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｇ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｈ】図１７ｈおよび図１７ｉは電子ビームリソグラフィを使用して作成されたナノアイランドを示す図である。
【図１７ｉ】図１７ｈおよび図１７ｉは電子ビームリソグラフィを使用して作成されたナノアイランドを示す図である。
【図１７ｊ】図１７ｊ及び図１７ｋは、１分間のプラズマ曝露後のナノアイランドを示す図である。
【図１７ｌ】図１７ｌおよび図１７ｍは、５分間のプラズマ曝露後のナノアイランドを示す図である。
【図１８ａ】図１８ａは、ＬＳＰＲピークの特性を示す図である。挿入図は、屈折率の変化に対するＮＩ，ＮＭ構造のＬＳＰＲピークの感度を示している。
【図１８ｂ】図１８ｂ〜図１８ｅは、ＮＭ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図であり、図１８ｂは、ＮＭ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｃ】図１８ｃは、ＮＩ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｄ】図１８ｄは、ＯＩＳＴロゴのような複雑な形状のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｅ】図１８ｅは、ＮＩが複雑な形の抗体をプリントできないことを示す図である。
【図１８ｆ】図１８ｆは、マイクロコンタクトプリント抗体上の相補的抗体の結合に対するＬＳＰＲ応答を示す図である。
【図１８ｇ】図１８ｇ及び図１８ｈは、様々な濃度の相補的抗体を付着させたときの波長および吸光の変化を示すＬＳＰＲの用量反応を示す図である。
【図１８ｈ】図１８ｇ及び図１８ｈは、様々な濃度の相補的抗体を付着させたときの波長および吸収の変化を示すＬＳＰＲの用量反応を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態に係るマッシュルームＬＳＰＲチップを有するＬＳＰＲセンサデバイスの主要構成要素を示す図である。
【図２０】図２０は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスのＬＥＤ回路の回路図である。
【図２１】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２２】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２３】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２４】図２４は、図２１〜図２３における光源パネルの写真である。
【図２５】図２５は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態における分光計モジュールのブロック図である。
【図２６ａ】図２６ａ〜図２６ｃは、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態における流体ステージの設計図を示し。図２６ａは流体チャネルの鳥瞰図である。
【図２６ｂ】図２６ｂは、ＬＳＰＲシステムに組み込まれた流体チャネルの側面図およびその拡大図である。
【図２６ｃ】図２６ｃは、流体チャネルの上面図および断面図である。
【図２７】図２７（ａ）は、光源パネルに取り付けられたステージホルダを概略的に示す図であり、図２７（ｂ）は、ドーナツ型加圧器を概略的に示す図であり、図２７（ｃ）は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態においてステージ上に加圧器を取り付けるための取り外し可能なキーを概略的に示す図である。
【図２８】図２８は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態において分光計からの信号の読み出しおよび表示に関わる全てのステップのフローチャートを示す図である。
【図２９】図２９は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態においてＬＳＰＲシグナルをリアルタイムで表示するためにＭａｔｌａｂで開発されたグラフィックユーザインタフェースを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
自然界のナノファブリケーションプロセスに着想を得て、本開示は、ＬＳＰＲ素子として使用可能である、上部を金属で覆われたキノコ状ナノ構造の非常に効果的で製造が容易な新しいプラズモニック構造を提示し、図１に示すように、六フッ化硫黄（ＳＦ６）のプラズマ環境内での、上部が金属で覆われたキノコ状ナノ構造の簡易な、実験室ベースの形成方法を示す。簡潔には、一実施形態では、不均一分布金（Ａｕ）ナノアイランド（ＮＩ）を有する二酸化ケイ素（ＳｉＯ２）基板を六フッ化硫黄（ＳＦ６）のプラズマに曝露した。Ａｕ  ＮＩを、ガラス上の（４ｎｍ厚の）薄い金フィルムをディウェッティングすることによって準備した。ＳＦ６のイオンは、ＳｉＯ２を選択的にエッチングする一方、Ａｕ  ＮＩは、下地のＳｉＯ２のナノマスクとして機能する。これにより、各ナノ構造がＡｕの笠を有するＳｉＯ２の軸からなる、Ａｕナノマッシュルーム構造（ＮＭ）の新規構造が形成された。
【００１４】
図１は、Ａｕナノアイランド（ＮＩ）からＡｕナノマッシュルーム（ＮＭ）構造を作製するプラズマプロセスを概略的に示す図である。（ａ）は、ＮＩの略図と並べた走査電子顕微鏡法（scanning electron microscopy：ＳＥＭ）画像である。挿入図は、ＮＩの画像を拡大している。（ｂ）は、プラズマ曝露下のＮＩの概略図である。（ｃ）は、プラズマへのプラズマ曝露後に形成されたＮＭである。挿入図はＮＭの断面を示している。
【００１５】
図１に示すように、ＮＭの形成中に金ナノ構造の興味深い表面再分布が観察された。ＩＣＰーＲＩＥ（inductive coupled plasma-reactive ion etching）処理後、ＮＭはＮＩ構造と比較してより均質であることがわかった。ＩＣＰーＲＩＥプロセスでプラズマ環境が金の再分布、結果として得られるこの新規の微細構造にどのように寄与するかを明らかにするための実験的証拠を以下に示す。以下に説明するように、この新規な構造は高感度なプラズモン特性を有し、そしてＬＳＰＲを利用する種々の用途に使用可能である。しかし、まずは、この新規なナノ構造を作成するためのメカニズムについて説明する。
【００１６】
ＡＵナノ構造再分布メカニズム
この驚くべき発見のメカニズムを調べるために、電子ビーム（ｅビーム）蒸着によってＳｉＯ２表面上にＡｕのナノ層を堆積させることによってＡｕ  ＮＩを作成し、その後、構造を５６０℃で３時間アニールする。次に、Ａｕ  ＮＩは、ＳｉＯ２基板のナノマスクとして機能しつつ、ＳＦ６プラズマ環境において反応性イオンエッチング（ＩＣＰ−ＲＩＥ）される。ＳＦ６は、Ａｕよりもはるかに速い速度でＳｉＯ２をエッチングし、各ＮＩの周囲のＳｉＯ２が除去されるにつれて、ＮＭの形成を可能にする。ＳｉＯ２のＳＦ６エッチングはＳｉＯ２がプラズマ環境に溶解する化学的プロセスである一方、Ａｕは物理的プロセスによって表面からエッチングされる。（原子、原子のクラスタおよびＡｕの分子の形での）これらの物理的にエッチングされたＡｕ粒子は本質的には不揮発性であり、したがって、エッチングされたＳｉＯ２表面上でのさらなるアセンブリのためのビルディングユニット（ＢＵ）として機能できる（非特許文献７）。対照的に、ＳｉＯ２の化学エッチングの生成物はオキシケイ素−フッ素であり、これはプラズマ環境で蒸発する（非特許文献７）。このＡｕ  ＢＵの分布は、１）プラズマ環境内でのＳｉＯ２基板の帯電、および２）プラズマ束とＮＩマスクの空間分布との相互作用に起因する。フッ素のプラズマは本来、電気陰性度が高く、ＳｉＯ２の表面上に正電荷を誘導する。ＳＦ６プラズマ環境での表面電荷とフッ素イオンとの間の相互作用は、Ａｕ  ＢＵを次々に基板表面上に引きつける。これらの新しく堆積されたＢＵが蓄積して、新しいより小さなＮＩを形成する一方、エッチングプロセスは継続する。図１に示すように、ＮＭの最終的な分布は、元々のＮＩ分布よりも密集する。図２に、プロセスの概略説明を示す。図２は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製プロセスを概略的に示す図である。概略図は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（ＢＵ）の生成と、それに続くＢＵのより密集したＮＭへのアセンブリと、を示している。
【００１７】
上述したビルディングユニット（ＢＵ）は、それらがプラズマ環境内に載置された場合にＡｕナノアイランド（ＮＩ）からスパッタアウトする小さな金片（単一原子、原子のクラスタ、金の核集塊）を指す。ガラス表面上の金のビルディングユニットの生成および再分布は、プラズマと材料の金との相互作用に起因する。ビルディングユニットのコンセプトは、図３および非特許文献１〜３のＯｓｔｒｉｋｏｖの研究からより詳細に理解することができる。図３は、非特許文献３から転載した写真である。
【００１８】
我々の元のナノアイランド基板における金の分布はランダムであるので、最初にランダムに配置された構造からＢＵ効果を明確に検証することは困難である。したがって、調査の目的で、我々はまず電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して、図４に示されるように、制御されたサイズおよび分布（規則構造）のナノ構造を含む基板を作成した。図４は、電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して作られた、１００ｎｍ間隔で、直径２００ｎｍを有するＮＩの写真である。
【００１９】
ＮＩのＩＣＰ−ＲＩＥ処理の後、小さいナノマッシュルームがより大きなナノマッシュルーム構造の間に観察される。図５は、図４に示すＮＩ構造にＩＣＰーＲＩＥ処理を施した後の構造の写真である。図５に示すように、ＮＭ構造が観察される。これらの小さなナノマッシュルームは、プラズマ環境においてナノアイランドから金を物理的にスパッタリングすることによって形成され、このことは上述した我々のビルディングブロック理論を立証している。
【００２０】
製造方法
本発明の実施形態は、概して以下のように製造することができる。
【００２１】
ステップ１：ガラス基板上に上部が金属で覆われたナノアイランド（ＮＩ）を形成する。好ましい金属は金である。これらのＮＩはＮＭの前駆体である。ＮＩは、標準的なリソグラフィ、電子ビームリソグラフィ、またはディウェッティングなどの様々な方法によって作成することができる。しかしながら、以下に詳細に記載するように、その単純さおよび経済性から、ディウェッティングが好ましい場合がある。
【００２２】
ステップ２：上記のステップ１におけるガラス基板をＩＣ−ＩＣＰ−ＲＩＥにかけ、ガラス基板上にナノマッシュルーム（ＮＭ）を作成する。（ＮＭを含む）基板サイズの精密寸法は、電子ビーム蒸発器を使用する場合、基板を処理する電子ビーム蒸発器のサイズによって制限される。本発明の実施例を作製するのに使用される電子ビーム蒸発器によって、長さ２５ｍｍおよび幅７５ｍｍのサンプル（ＮＭを有するガラス基板）を作成することができた。
【００２３】
図６のフローチャートは、本実施形態の製造プロセスの工程を示している。図７は、本発明の一実施形態に係る製造プロセスの主要工程を示す図である。それぞれがＮＩ基板から作成されたガラスの軸および金の笠（図８参照）からなるＮＭは新しいものであり、これまでに達成されたことはないと考えられる。図６は、ＮＭ製造プロセスのプロセスフローチャートである。図６に示すように、本実施形態において、金からなるＮＩは、ディウェッティングまたは電子ビームリソグラフィまたは標準的なフォトリソグラフィによって作製される。ガラス基板上での金ＮＩの大規模な高スループット生産のために、ディウェッティング、すなわち、金層を堆積した後に、アニーリングによって、ＮＩを作成することが好ましい。
【００２４】
次に、ガラス基板上にそれぞれがガラスの軸と金の笠とからなる（図８）ナノマッシュルーム（ＮＭ）を作成するように、ガラス基板上の金ＮＩを誘導結合反応性イオンエッチング（ＩＣＰーＲＩＥ）にかける。
【００２５】
図７は、本発明の実施形態に係る高スループットＮＭ構造を達成するためのプロセスを概略的に示す図である。図７に示すように、まずガラス基板を用意し、ガラス基板上に金層を堆積する。金が堆積された基板のアニーリングを実施し、ディウェッティングにより基板上にそれぞれ金からなる複数のナノアイランド（ＮＩ）を作成する。次に、得られた基板をＲＩＥにかけて、複数のより微細でより小さいナノマッシュルーム（ＮＭ）を作成する。
【００２６】
実施例
金ＮＩを作成する際にディウェッティングを使用する場合、例えば、Ａｕ層の厚み、アニーリング温度およびアニーリングの時間を変えることによって、異なる製造条件下で金ナノアイランドを作成することが可能である（非特許文献５〜７）。本発明の実施例にとって好ましいプロセスパラメータを、下記の表１に示す。
【００２７】
【表１】
2020516887.tif 000003
【００２８】
実施例は以下のステップを使用して製造した。
ステップ１：電子ビーム蒸着法を使用してガラス／ＳｉＯ２基板上に４ｎｍの金（Ａｕ）層を堆積する。（注：Ａｕは、金属の熱蒸着、化学気相成長法、又はマグネトロンスパッタリング法などの標準的な金属堆積法で堆積できる。）
ステップ２：高温炉において５６０℃で３時間、ガラス上のＡｕをアニールし、Ａｕ  ＮＩを形成する。
ステップ３：ＳＦ６ガスを使用して、５℃、１０Ｗ／１５０Ｗの電力で５分間、Ａｕの反応性イオンエッチングを行う。その結果、金ナノアイランド（Ａｕ  ＮＩ）はナノマッシュルーム（Ａｕ  ＮＭ）に転換した。
【００２９】
図８は、本発明の実施例である上記条件で作製したＮＭ構造の寸法及び間隔を模式的に示す図である。各ＮＭは、Ａｕの笠とＳｉＯ２の軸とからなる。以下の表２は、本実施例において計測された寸法をより詳細に示している。
【００３０】
【表２】
2020516887.tif 000004
【００３１】
図８及び上記の表に示すように、各マッシュルーム構造は、直径１０〜３０ｎｍのＡｕの笠を有し、４５〜６０ｎｍの高さを有し、そのうち、Ａｕの高さは１５〜２０ｎｍであり、ＳｉＯ２の高さは３０〜４０ｎｍである。マッシュルーム構造間の間隔は平均１０ｎｍであり、これは注目しているＮＩ構造よりもはるかに細かい。既存の材料と比較して、この実施例のＮＭの新たな微細なナノ構造は、以下に記載されるように、優れたプラズモン特性を有する。
【００３２】
実施形態／実施例のＬＳＰＲセンシング性能の評価
図９ａは、ＮＩおよびＮＭについて、波長の関数としての吸光度プロットである。ＮＩ（ＬＳＰＲピーク波長５４０ｎｍ）構造およびＮＭ（ＬＳＰＲピーク波長５３３ｎｍ）構造の典型的な共鳴特性を示している。一般に、ナノ構造のアスペクト比（幅／高さ）を小さくすると、ＬＳＰＲに起因するピーク波長（すなわち、ＬＳＰＲピーク波長）の青方偏移が生じる。したがって、ＮＭ構造における平均７ｎｍの青方偏移は、ＮＩ（５〜７０ｎｍ）と比較してより小さいサイズのＮＭ（１０〜３０ｎｍ）に起因する。
【００３３】
図９ｂは、ＮＭ構造およびＮＩ構造近傍の局所的な屈折率の変化に伴うＮＭ構造およびＮＩ構造それぞれのＬＳＰＲピーク波長の変化を示す。水、アセトン、イソプロパノールおよびエタノールを用いてセンサの屈折率の特性を明らかにした。線の傾きはそれぞれのナノ構造の感度を提供し、本発明の実施例に係るＮＭはＮＩ（２１．１ｎｍ／ＲＩＵ）の４倍の感度（８０．２ｎｍ／ＲＩＵ）であることが観察される。ＮＭの準均一分布に起因する周期性の増加は、ＮＭ構造の感度の向上に主に寄与する。さらに、ＮＭの先端はＮＩよりはるかに小さい。より小さなナノ構造の特徴は、局所的な屈折率の変化に対する感度を高め、ＬＳＰＲのような表面増強現象を増幅する、電磁場内のホットスポットを生じさせる。
【００３４】
ＮＭ構造の用途及び実施例
本発明のＮＭ構造の様々な用途が期待される。ＮＭ構造の上記の基本的なＬＳＰＲ特性をさらに確認し、その用途をいくつかの方法で以下に実証する。
【００３５】
細胞増殖の検出
図１０は、本発明の実施例に係る、ＮＭ基板上で行われた細胞増殖（ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞）実験／実証を概略的に実証する図である。
【００３６】
それぞれ上記のように製造されたＮＭ基板を、３５ｍｍ（９ｃｍ２）のコーニング細胞培養皿に載置した。ＮＭを、イソプロパノール、７０％エタノールを使用して滅菌し、そして最後に細胞培養バイオセーフティキャビネット内でＵＶ光下で乾燥させた。ＰＤＬ溶液は、ＰＢＳ中０．００３％で、ＮＭ基板当たり容量５００ｌを作製した。デバイスをＰＤＬ溶液でコーティングし、５％のＣＯ２を含む３７５℃の加湿環境である細胞培養インキュベータ内に３０分間載置した。次に、皿を、１０％子牛血清を添加した１ｍＬのDulbeccos Modified Eagle Medium high glucose（ＤＭＥＭ）で事前に満たした。ここで、我々は我々の細胞研究に関してＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を使用する。次に、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を低密度（１皿当たり約０．２×１０６細胞）で皿に播種した。次に、細胞培養液を添加して、最終的な体積を２ｍＬとした。ＬＳＰＲの読み取りをすぐに行った。次に、細胞を細胞培養インキュベータ内で指示された時間増殖させた。実験期間中、新しい細胞培養培液を皿に加えたり、皿から取り除いたりはしなかった。細胞数実験のために、ＬＳＰＲ測定を行った後、Ａｕ  ＮＭデバイスを１×ＰＢＳを使用して２回洗浄した。この後、１ｍＬのトリプシンを添加して細胞を剥がした。血球計数器を用いて細胞数を数えた。
【００３７】
図１１は、線維芽細胞の増殖時のＮＭプラズモンセンサのＬＳＰＲ応答を示す図である。図１１ａは、実験の最初の２４時間でのＮＭ中のＬＳＰＲの波長の変化を示す図である。細胞が分裂し始めると、ＮＭのＬＳＰＲピークは、１５時間の間、ＵＶ可視スペクトルの左（青方偏移）側に向かって直線的にシフトする。最初の１５時間の間、２〜３ｎｍの変化が観察され、その後ＬＳＰＲシグナルは次の６〜８時間安定する。これらのシフトは、１）増殖開始時の細胞数の増加、および２）細胞によって分泌されるタンパク質および他の増殖因子の吸着に起因する。細胞増殖の初期変化によるＮＭのマスキングが、１５時間後のＬＳＰＲ波長応答の安定化に主に寄与している。図１１ｂは、ＬＳＰＲの吸収強度を示す図である。ＮＭ表面は、細胞増殖および分泌によって継続的にマスクされており、これにより、ＮＭに達する入射光の強度が減少するにつれて、ＮＭの吸収強度が低下する。図１１ｃにおいて、波長変化を屈折率の変化に置き換えた。図１１ｃに示すように、最初の２４時間の間、細胞増殖時に、２５〜３０ｍＲＩＵ（milli refractive index unit）の最大変化が観察される。図１１ｄ〜図１１ｆは、７日間にわたるＬＳＰＲの波長応答、吸収強度応答、および屈折率変化応答をそれぞれ示す図である。興味深いことに、１日後のＬＳＰＲの波長ピークはＵＶ−ｖｉｓスペクトルの右側に向かってシフトし（赤方偏移）、これにより、図１１ｄに示すように、青方偏移の変化のグラフにおける波長変化応答が低下する。波長応答の変化が観察されている一方、図１１ｅに示すように、ＬＳＰＲ吸収の強度の変化は０．１単位未満である。周波数は波長に反比例するので、ＬＳＰＲピークシフトの変化の全体的な観察は、ＬＳＰＲの周波数変化に関して単純化することができる。細胞増殖の初期段階（１５時間未満）の間、ＮＭ上の細胞分泌および細胞数の増加は、共鳴周波数でのＮＭの消光係数を上昇させる。これにより、ＮＭ構造の表面上の誘電場の形で電磁エネルギの閉じ込めおよび集中が生じる。これ以降、ＬＳＰＲの周波数の増加、すなわち、波長の減少（青方偏移）がＬＳＰＲピークにおいて観察される。しかしながら、７日間にわたってセル数が増え続けると、電荷局在化効果（セル数の増加に起因するＮＭ上の表面電荷の蓄積）によってＬＳＰＲの周波数が低下し、波長が増加する（赤方偏移）。図１１ｇは、増殖実験中の７日間にわたるＮＭ上の細胞の画像を示す。この図は、本発明の実施例によって適切に検出された細胞増殖を実際に示している。
【００３８】
表面上の細胞数についてＬＳＰＲの波長応答もまた定量した。図１０（ｈ）に示すように、ＬＳＰＲ応答は細胞数の増加とともに直線的に変化することが観察された。より少ない細胞では、青方偏移が観察される一方、細胞数の増加は、ＬＳＰＲピークの赤方偏移の観察に対応する。したがって、実用的なＬＳＰＲ細胞増殖バイオセンサを、さまざまな数の細胞に対する様々な波長を用いて較正することが可能である。
【００３９】
ＮＭ  ＬＳＰＲチップ
本発明の実施形態のナノマッシュルーム（ＮＭ）を任意の一般的なバイオアッセイ用途に使用するためには、標準的な９６ウェルＥＬＩＳＡプレート等のナノ構造用のアッセイプレートを作ることが重要である。上記の２段階（ディウェッティングおよびＩＣＰ−ＲＩＥ）ＮＭ製造プロセスにより、１００万個を超えるナノマッシュルーム構造からなるプラズモニックスポットを作ることが可能になる。各スポットは、標準的なＥＬＳＩＡプレートの個々のウェルのようなものである。それを作成するために、ステンシル（ハードマスク）を使用して、予め定義されたアレイフォーマットからナノマッシュルームのスポットを作成してもよい。まず、図１３に示すように、金の蒸発中に、図１２に示すハードマスクをガラス基板上に載置する。次に、ガラス基板上に形成されたＡｕ層に対して、ホットオーブン炉内で５６０℃で３時間アニーリングを行い、Ａｕ  ＮＩを形成する。続いて、ＮＩの反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を、ＳＦ６ガスを用いて、５℃、１０Ｗ／１５０Ｗの電力で５分間行う。その結果、金ナノアイランド（Ａｕ  ＮＩ）がナノマッシュルーム（Ａｕ  ＮＭ）に変わる。
【００４０】
図１４は、この日製造された、開発されたスポッテッドプラズモンチップを示す図である。各スポットは１０６〜１０７個を超えるナノマッシュルームを有し、各スポットは単一のアッセイに使用することができる。スポット直径は３ｍｍであったが、ユーザの必要に応じてスポットのサイズを変えることが可能である。これは、ハードマスクのサイズを調整することによって実行できる。また、マスクは再利用可能である。
【００４１】
ＮＭプラズモンチップのパッケージ化：ナノマッシュルーム上のマイクロチャネル
ナノマッシュルームチップをパッケージ化することで、開発したスポット上での正確な液体ハンドリングが可能になる。本発明のＮＭ構造をマイクロチャネルと一体化した。図１５は、本発明の一実施例に係る、製造されたマイクロチャネルを有するパッケージ化されたナノマッシュルームチップを示す写真である。チップをパッケージ化する方法は以下のステップを含む。
【００４２】
１）標準的なソフトリソグラフィプロトコルを用いてシリコンマスタを作製する。マイクロチャネルはＡｕｔｏＣＡＤを使用して設計されている。スライドガラスを、１０５０ＲＰＭで３０秒間、負のフォトレジスト（ｍｒ−ＤＷＬ、マイクロレジストテクノロジー社）でスピンコートして、厚さ１００μｍのマスタを作製する。
２）マスタを５０℃で５分間、そして８０℃で３０分間ホットプレート上でプリベークする。
３）マスクレスリソグラフィシステム（Ｄｌｉｇｈｔ  ＤＬ−１０００、ナノシステムソリューションズ社）を用いて５００ｍＪ／ｃｍ２の強度でＬＥＤ光の下でマスタを露光する。次に、マスタをホットプレート上で５０℃で５分間、そして８０℃で３０分間ソフトベークする。
４）マスタをフォトレジスト現像液で５分間現像し、続いてホットプレート上で５０℃で５分間、そして８０℃で３０分間ハードベークする。
【００４３】
＜マイクロチャネル作製＞
１）１０：１の混合比を有するＰＤＭＳのベース剤および硬化剤（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４、ダウコーニング社）をシリコンマスタ上に注ぎ、真空デシケータ中で脱気し、そしてオーブン内で７０℃で６時間硬化させた。
２）ＰＤＭＳデバイスをマスタから切り取り、尖った、先端が平らな針で打ち抜き、入口と出口を作る。
３）ＰＤＭＳデバイスと金ナノアイランドを有するスライドガラスとを４０秒間酸素プラズマで処理し、続いてそれらを手でしっかりと接合する。
４）接合強度を高めるために、デバイスをホットプレート上に１２０℃で２０分間載置する。
【００４４】
上述したように、本開示は、幅２５ｍｍ、長さ７５ｍｍの大きさのガラス基板上に金属の笠を有するナノマッシュルーム構造を作る方法を提供する。このプロセスは、高スループットのＮＭ生産プロセスである。得られた金属の笠を有するナノマッシュルーム構造は、高感度で生体適合性のＬＳＰＲセンサを作成する上で新しく、非常に効果的である。高められた感度および高められた生体適合性は生細胞の生存に特に有用である。これは、例えば細胞生物学における多数の未知の用途のためのＬＳＰＲセンシングを開発する新たな機会を生み出す。
【００４５】
複数のＮＭスポットを有する多重化ＬＳＰＲチップ、マイクロフルイディクスと統合されたＮＭチップを含む、新規なＮＭ構造の様々な用途が開示される。以下の表３は、既存の技術に対する本発明の様々な利点を要約している。
【００４６】
【表３】
2020516887.tif 000005
【００４７】
発明の実施形態の追加の詳細
上記の開示の特定のさらなる詳細を以下に提供する。以下の説明のいくつかは、上記の説明と重複する。
【００４８】
上記の反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）は、５℃の温度で、４５ｓｃｃｍのＳＦ６流量、１０Ｗのイオンステアリングパワーおよび１５０Ｗの電力強度で、ＮＭを適切に形成するために実行され得る。
【００４９】
準ランダムなアイランドから生じる準周期構造の驚くべき結果：上述したように、Ａｕの準ランダムなアイランドからＡｕナノマッシュルーム準周期構造への遷移は、適切な動作条件でＳＦ６プラズマを使用することによって促進される。電気陰性のＳＦ６プラズマは、ＳｉＯ２に対する周知のエッチャントである。しかしながら、ＳｉＯ２のエッチング中に、プラズマ環境においてＡｕもエッチングされるが、はるかに遅いエッチング速度である。１〜２オングストローム／分未満のＡｕエッチングと比較して、ＳｉＯ２は１０ｎｍ／分（層厚）の速度でエッチングされる（すなわち、ＳｉＯ２は、Ａｕよりも少なくとも１００倍速くエッチングされる）（非特許文献８）。ナノアイランド（ＮＩ）のサイズおよびギャップサイズが１００ｎｍ未満である場合、ＳｉＯ２表面上のＡｕの再分布が体系的実験から観察される。この結果は、ＮＭ形成に必要とされるＮＩの好ましいそしておそらく臨界的なサイズおよびギャップサイズがいずれも約１００ｎｍであることを示している。
【００５０】
上記のＮＩおよびＮＭのサイズおよび間隔寸法の分布および平均を決定する際、すなわち、これらのナノ構造の表面分布分析を実行する際に、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してＦＦＴ（高速フーリエ変換）プロファイルプロット分析を使用した。
【００５１】
ナノアイランド（ＮＩ）を作成するためのプロセスパラメータの臨界：上述したように、例えば初期Ａｕ厚み、アニーリング温度およびアニーリング時間等の製造条件を変えることによって、異なるサイズおよび間隔を有するＡｕ  ＮＩを作成することが可能である。これは文献に報告されている（非特許文献９〜１１）。本発明者らによって行われた広範囲な研究に基づけば、平均サイズおよび間隔が１００ｎｍ未満のＡｕ  ＮＩが、その後の適切なプラズマエッチング工程を伴うＮＭ形成にとって好ましい。所望のＮＩを作成するための好ましいプロセスパラメータの例は上述の通りである。すなわち、Ａｕの厚みが４ｎｍ、アニーリング温度が５６０℃、及びアニーリング時間が３時間である。
【００５２】
＜プラズマ支援ナノマッシュルーム作製の評価＞
ナノマッシュルームのプラズマ支援作製をさらに調査するために、電子ビーム蒸着を用いて、ＳｉＯ２表面上にＡｕのナノ層を堆積させ、５６０℃で５時間アニーリングしてＡｕ  ＮＩを形成する。その後のＳＦ６プラズマ環境でのＲＩＥの間、これらのＡｕ  ＮＩはＳｉＯ２基板のナノマスクとして機能する。ＳＦ６はＡｕよりもはるかに速くＳｉＯ２をエッチングし（非特許文献１２）、各ＮＩの周囲のＳｉＯ２が除去されるにつれてＮＭの形成を可能にする。ＳＦ６エッチングは、ＳｉＯ２及びＡｕのサブナノメートル粒子を表面から取り出す。したがって、これらの粒子は、ナノアセンブリにおいてビルディングユニット（ＢＵ）として機能できる。このアセンブリは、ＳｉＯ２のＢＵが基板から取り出される一方、Ａｕ  ＢＵがその代わりに表面上に再分布して新しいＮＭを形成することによって促進される。Ａｕ  ＢＵ再分布は、１）プラズマ環境内でのＳｉＯ２基板の帯電（非特許文献１３）、および２）プラズマ束とＮＩマスクの空間分布との相互作用に起因する。フッ素のプラズマは本来は電気陰性度が高く、ＳｉＯ２の表面上に正電荷を誘導する。ＳＦ６プラズマ環境における表面電荷とフッ素イオンとの間の相互作用により、Ａｕ  ＢＵは基板表面上に押し戻される。これらの新たに堆積されたＢＵは蓄積して新しいより小さなＮＩを形成し、そしてエッチングが継続する。したがって、図１６に示すように、ＮＭの最終的な分布は、元のＮＩの分布よりも密集したものになる。
【００５３】
図１６は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製メカニズムを示す図である。（ａ）は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（ＢＵ）の生成およびそれに続くＢＵのより密集したＮＭへのアセンブリを概略的に示し、（ｂ）は、ＮＩからのＮＭのプラズマ指向性アセンブリにとって好ましいサイズおよびピッチ要件を示し、（ｃ）〜（ｅ）は、ＮＩに対するプラズマ効果の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であり、（ｃ）は、直径２００ｎｍ、ピッチ２００であり、（ｄ）は直径２００ｎｍ、ピッチ１００であり、（ｅ）は、サイズ１００ｎｍピッチ１００ｎｍ直径である。
【００５４】
ＮＩマスクの空間分布もプラズマ束と干渉し、エッチング速度を変化させる。金属のプラズマ指向性再組織化に対するＮＩサイズおよび間隔（ピッチ）の役割を評価するために、均一なサイズのＮＩグリッドの３つのセット（第１セット：直径２００ｎｍ、ピッチ２００、図１６（ｃ）、第２セット：直径２００ｎｍ、ピッチ１００、図１６（ｄ）、第３セット：サイズ１００ｎｍ、ピッチ１００、図１６（ｅ））を電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して作製した。
【００５５】
ＮＩのサイズが減少するにつれて粒子の再堆積および再組織化に起因して、エッチング中に無秩序性が増大することが観察される。図１６（ｅ）における第３セットから、Ａｕ  ＮＩは再配向を開始し（遷移段階）、作製プロセスが完了すると、その前駆体であるＮＩと比較して、ＮＭの分布が乱されることを観察できる。しかしながら、ディウェッティングを用いて作製した不均一に分布したＮＩを考慮すると、上述のように、ＮＩ間のギャップを新しい構造が埋めるので、ＮＭの形成時に分布は最終的に準均一になる。したがって、ＮＩ上のサイズおよび間隔が減少するにつれて、エッチングにより誘導された無秩序性が増加する。これらの観察に基づいて、図１６（ｂ）に示すように、Ａｕの特徴サイズおよびそれらの間のピッチのいずれもが１００ｎｍ未満である場合にのみ、Ａｕの再分布および再組織化がプラズマによって駆動されることが好ましい。
【００５６】
＜金属のプラズマ支援再組織化＞
金属の再組織化がプラズマによって駆動されたことを確認するために、２つの実験を行った。第１の実験では、図１７ａに示すように、プラズマの勾配を作り出すためのゴムのシールドを開発した。シールドはプラズマ処理中に基板の表面上に反応性イオンの勾配を発生させる。シールドの入り口でイオンの濃度が最も高く、シールドの端で濃度が最も低い。反応性イオンのこの勾配はプラズマの勾配を生み出し、それによりＮＩの表面をエッチング速度の勾配に曝露する。シールドはガラスからのＳｉＯ２のエッチング速度も遅くし、その結果、ＮＭは目に見えないことが観察された。このエッチング速度の低下は、主に、反応性イオンがシールドされた領域に入った後のプラズマのエネルギ損失に起因する。興味深いことに、プラズマシールドの異なる領域下で観察されたＡｕの分布の差から明らかなように、我々はプラズマの再組織化特性が失われていなかったことに気づく。したがって、これらの勾配により、ＮＩからのＮＭの形成に寄与するプラズマの再組織化特性のいくつかを捉えることが可能になる。図１７ｂ〜図１７ｇは、反応性イオンの最低濃度から最高濃度の順に、５分間プラズマに曝露されたシールド下のＮＩ基板の異なる領域を示す図である。図１７ｅ及び図１７ｆに示すように、より高濃度の反応性イオンに曝露された領域においてＡｕの再分布が観察された。驚くべきことに、これらの領域におけるＡｕの再分布は表面上にその均一な分布をもたらした。図１７ｅおよび図１７ｆにおけるＡｕ構造は、図１７ｂ〜図１７ｄに見られる不均一なＮＩ分布と比較して、明確な形状を有する。図１７ｇは、シールドの入り口におけるＮＩの領域を示す。この領域では、シールドがなく、その結果としてＳｉＯ２のエッチング速度が減少しないため、プラズマ曝露の期間に、基板が過剰にエッチングされる。このようなオーバーエッチングは、図１７ｆに示す領域がより長くエッチングされると、Ａｕのいくつかの構造が完全に取り出され、再堆積して粗く分布したより大きな構造を形成することを暗示している。さらに、所定の領域内のＡｕの質量は、新しい構造をアセンブリしている間保存される。図１７ｈは、図１７ｂ〜図１７ｇの画像におけるＡｕの総面積をプロットしたものである。各領域におけるわずかな違いは、ＮＩの不均一分布に起因しており、これはプラズマ曝露前に各表面領域に存在するＡｕの量を変化させる。これらの結果は、上述したように、ＢＵ生成およびセルフアセンブリへの移動のプロセスをサポートする。
【００５７】
第２の実験は、プラズマ再組織化中の質量保存をより詳細に観察するために行われた。この実験では、図１７ｉに示すように、電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して、サイズ１００ｎｍおよびピッチ１００ｎｍの規則正しいＡｕ  ＮＩをシリコン（Ｓｉ）基板上に作製した。Ｓｉ上のＡｕの付着力は弱く、プラズマへの曝露時、Ａｕ  ＮＩが基板から剥離して空のＳｉ表面を生成すると予想される。ＮＩはその初期の堆積点から剥離する一方、図１７ｊ〜図１７ｍに示すように、堆積の全領域に閉じ込められたままであり、Ａｕ  ＮＩ上のプラズマの強い再組織化特性をサポートする。
【００５８】
さらに、エッチングが５分を超えて長引いた場合、ＮＩは依然としてそれらが最初に堆積された全領域内に閉じ込められたままである。除去の代わりに、ＮＩのプラズマ再組織化は、タンパク質構造に似ている短いＡｕ  ＮＩ鎖のナノアセンブリをもたらす。図１７ｉから分かるように、長時間のプラズマ曝露は、ＮＩをさらに硬いタンパク質様鎖にさらに押し込む。これらの鎖の継続的な形成は、プラズマが金属の再組織化を支援するという我々の主張の実験的証拠をさらに確立するものである。プラズマ再組織化のこれらの特性は、前駆体であるＮＩと比較してＮＭの準均一分布に主によるものである。
【００５９】
＜マイクロコンタクトプリンティング及びバイオアッセイ＞
図１８ａは、ＮＩ（５４０ｎｍ）およびＮＭ（５３３ｎｍ）構造の典型的な共振特性をそれぞれ示す図である。一般に、ナノ構造のアスペクト比（幅／高さ）を小さくすると、ＬＳＰＲの波長の青方偏移が生じる（非特許文献１４，１５）。したがって、ＮＭ構造における平均７ｎｍの青方偏移は、ＮＩと比較してより小さいサイズのＮＭに起因する。図１８ａの挿入図は、ＮＭ構造およびＮＩ構造近傍の局所的な屈折率の変化に伴うＮＭ構造およびＮＩ構造の波長の変化を示す。センサの屈折率は、水、アセトン、イソプロパノールおよびエタノールを用いて特性を明らかにした。線の傾きはナノ構造の感度を提供し、ＮＭはＮＩ（２１．１ｎｍ／ＲＩＵ）の４倍の感度（８０．２ｎｍ／ＲＩＵ）であることが観察される。ＮＭの準均一分布に起因する周期性の増加は、ＮＭ構造の感度の向上に主に寄与している（非特許文献１６）。さらに、ＮＭの先端はＮＩよりもはるかに鋭い。鋭いナノ構造の特徴は、局所的な屈折率の変化に対する感度を高め、ＬＳＰＲのような表面増強現象を増幅する、電磁場内のホットスポットを生じさせる（非特許文献１７〜１９）。
【００６０】
結合試験にＮＭを使用することを検証するために、我々は抗体の相補対の選択的結合を検出した。抗体は、マイクロコンタクトプリンティング（ＣＰ）を用いてナノ構造（ＮＭおよびＮＩ）上に固定化した。続いて、相補的抗体対を特異的に付着させた。図１８ｂおよび図１８ｃは、ＮＭ（図１８ｂ）およびＮＩ（図１８ｃ）への抗体のプリントを示す。ＮＭへの抗体のプリントはＮＩへの抗体のプリントよりも均一かつ均質であることが観察され、ＮＭ分布の表面はＮＩのそれと比較して平坦かつ均質であることを実証している。さらに、複雑な形状のタンパク質で表面をパターニングすることは、細胞のミクロ／ナノ環境を作成するのに有用である（非特許文献２０）。図１８ｄ及び図１８ｅは、ＮＩの粗い表面モルフォロジに起因する不完全なプリントと比較して（図１８ｅ）、ＮＭ上にうまくプリントされたタンパク質の複雑なパターン（ＯＩＳＴロゴ）（図１８ｄ）を示している。これらの結果は、生体分子を有するナノスケール表面のセンシング及びパターニングについて、その前駆体であるＮＩよりも優れているナノ構造としてのプラズマ組立ＮＭの有用性を強調している。図１８ｆは、１０ａｇ／ｍｌ〜１０００ｎｇ／ｍｌの相補的抗体の結合を伴う、濃度依存性のＬＳＰＲ用量反応を示す。図１８ｇ及び図１８ｈにおいて、１）ＮＭ上でパターニングされたその相補的対への抗体の特異的結合、及び２）（パターニングされた抗体を有さない）ブランクのＮＭ表面上の相補的抗体の吸着についてのＬＳＰＲ応答（波長の変化、図１８ｇおよび吸光度強度、図１８ｈ）をプロットしている。二次抗体の濃度を変化させると、標準的なバイオアッセイ応答（Ｓ字型）が、ＬＳＰＲシグナルの波長および吸光度強度の両方において観察される。パターニングされたＮＭ表面上に１０ａｇ／ｍｌの相補的抗体を付着させると、平均５ｎｍのＬＳＰＲ赤方偏移及び０．１単位未満の吸光度強度の変化が観察される。ＬＳＰＲ応答は、最大で１００ｆｍ／ｍｌの濃度までの抗体のさらなる添加の際に２ｎｍ未満および０．１Ｕの変化を示す。１００ｆｍ／ｍｌを超えると、１００ｆｍ／ｍｌから１００ｐｍ／ｍｌまでの範囲の抗体濃度を添加すると、ＬＳＰＲシグナルにおける線形応答が観察され、その後、ＬＳＰＲシグナルは飽和する。したがって、我々は、１００ｆｍ／ｍｌ〜１００ｐｍ／ｍｌをこの特定の実施形態／実施例のＮＭ  ＬＳＰＲセンサのダイナミックレンジとみなす。吸収された抗体に起因するＬＳＰＲシグナル変化は、３ｎｍ未満および０．１ＵのＬＳＰＲ応答の変化を示した。これらの変化は、ＮＭ表面上の高濃度での抗体の非特異的付着に起因する。我々はさらに、パターニングされたＮＭ上の抗体付着の検出限界（非特許文献２１）を計算し、それは６５ｚＭであることがわかった。これらの結果は、ＮＭが一般的なバイオアッセイ用途およびパターニングされた表面上の生体分子結合事象の検出のための高感度なプラットフォームとして使用できることを確認している。
【００６１】
＜上記の製造及び評価実験における詳細事項＞
上記の製造および評価実験の詳細事項を以下に提供するが、いくつかは上記に提供された情報と重複する場合がある。
【００６２】
＜ナノマッシュルーム作製＞
クラス１０００のクリーンルーム内でＫａｗａｓａｋｉ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＫＥ６０４ＴＴ１−ＴＫＦ１電子ビーム蒸着装置を使用して、ＳｉＯ２基板およびＳｉ基板の両方にＡｕのナノ層を堆積させた。堆積前に基板をアセトンおよびイソプロパノールで洗浄した。４ｎｍのＡｕ膜を０．３ｎｍ／秒の速度で堆積した。次に、試料を５６０℃で３時間アニールし、基板の表面全体にＡｕ  ＮＩの分布を生成した。次に、オックスフォードインスツルメンツ社のＰｌａｓｍａｌａｂ  １００  Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｐｌａｓｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＩＣＰ  ＣＶＤ）装置を使用して、試料に反応性イオンエッチング（ＲＩＥ）を行い、ＮＭを生成した。ＳＦ６ガスをＲＩＥチャンバ内に導入し、内圧１０ｍｔｏｒｒ、流速４５ｓｃｃｍ（Standard Cubic Centimeters per Minute）に維持した。ＲＦ電力コイルおよびＲＦバイアスコイルをそれぞれ１５０Ｗおよび１０Ｗに固定し、プラズマチャンバ内の温度を５℃に維持した。
【００６３】
＜材料特性評価＞
試料をＳＥＭを用いて画像化した。ダイヤモンドチップガラスカッターを使用して元の試料から基板の一部を小さく切り取り、カーボンテープを使用してＳＥＭマウントに取り付けた。５ｅＶ〜３０ｅＶの間で動作するＦＥＩ  Ｑｕａｎｔａ  ２５０  ＦＥＧ  ＳＥＭを使用して測定を行い、少なくとも１７５ｋの倍率で高解像度画像を得た。
【００６４】
＜再組織化に対するプラズマ効果の測定＞
プラズマ処理中に基材表面にわたって反応性イオンの勾配を生じさせるためのシールドを、Ｏｂｊｅｔ  ５００  ３Ｄプリンタ（ストラタシス社）を用いてプリントした。プラズマシールドを、特許ポリマー材料（ストラタシス社）を使用してプリントした。これらのプラズマシールドは、高さＨＥＩＧＨＴｍｍ、幅１０ｍｍ、長さ１５ｍｍの内部寸法を有していた。反応性イオンがシールドの正面入口からのみ入ることができるようにシールドの端を閉じ、それにより基板を横切る反応性イオン束の一方向勾配をもたらした。シールドへの開口がスライドのほぼ中央になるようにシールドをＮＩ基板の上部に置いた。この配置により、ＮＩ表面の遮蔽されていない部分を比較対照試料として使用できた。プラズマチャンバの装填および排気中に移動しないように、カーボンテープを使用してシールドを適切な位置で支えた。プラズマ処理後、シールドを取り除き、表面を上述のようにＳＥＭにより分析した。
【００６５】
＜電子ビームリソグラフィ及び再組織化に対するサイズ効果の特性評価＞
電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を用いて一連の均一サイズのＮＩアレイを作製した。ＥＢＬを、天然酸化物の薄い（１０ｎｍ）層を有するＳｉウェハ、及び、よりロバストな、ＳｉＯ２の５００ｎｍ層でコーティングされたウェハに対して実行した。試料を、５００ｒｐｍで１０秒間、その後、６０００ｒｐｍで５０秒間、正の電子ビームレジストＡＲ−Ｐ  ６２００でスピンコートした。その後、１５０℃で３分間ソフトベークした。ＥＢＬは、０．８〜１．５５秒のピクセル露光シリーズにおいて１６回複製されたアレイを用いて、１５０の視野サイズで１０ｐＡで行われた。ＩＰＡ中で洗浄する前に、酢酸アミル中で３０秒間ＥＢＬパターンの現像を行った。現像の大規模な解像度は、オリンパスＢＸ５１光学顕微鏡で確認した。
【００６６】
ＥＢＬの後、電子ビーム蒸着を用いて１０ｎｍのチタン（Ｔｉ）層を堆積し、続いて３０ｎｍのＡｕ層を堆積した。Ｔｉを添加して、表面粗さを増加させ、ＳｉＯ２表面へのＡｕのより強い付着を確実にした。両方の材料を０．３ｎｍ／秒の速度で堆積した。
【００６７】
蒸着後、試料をホットプレート上で５０℃で２０分間ＥＢＲＰＧに浸漬することによってリフトオフを行った。次に、ピペットを使用して、試料をＥＢＲＰＧから取り除くことなく過剰の金を吹き飛ばした。このプロセスによって、ＥＢＬパターンの配置にのみ構造が残った。次に、これらの構造を上記のようにＳＥＭで画像化した。これらの試料に対してＲＩＥを実施して、上記のようにＮＩをＮＭに変化させた。
【００６８】
＜ＬＳＰＲ計装及び測定＞
ＬＳＰＲ応答を研究するために使用される機器は、照明および試料からの光の収集に必要な個別の光学部品を組み合わせることによって実験室で組み立てた。装置は私達が以前に出版した研究３０，３１で使用された装置と同一である。アセンブリには、反射プローブ（Ｒ４００−７ＵＶ−ＶＩＳ）、ハロゲン光源（ＬＳ−１−ＬＬ）、および分光器（ＵＳＢ４０００−ＵＶ−ＶＩＳ−ＥＳ）が含まれる。分光器からの信号を取得する前に、システムを暗スペクトルモードおよび明スペクトルモードについて較正した。次に、ＯｃｅａｎＶｉｅｗソフトウェア（オーシャンオプティクス社製のクロスプラットフォーム分光操作ソフトウェア）によって、ナノ粒子によって吸収された光の波長依存性を観察することによって、ＬＳＰＲシグナルを吸収モードで記録した。
【００６９】
＜細胞増殖検出＞
ＮＭ基板を３５ｍｍ（９ｃｍ２）のコーニング細胞培養皿に配置した。ＮＭを、イソプロパノール、７０％エタノールを使用して滅菌し、そして最後に細胞培養バイオセーフティキャビネット内でＵＶ光下で乾燥させた。ＰＤＬ溶液は、ＰＢＳ中０．００３％で、ＮＭ基板当たり５００ｌの体積で作製した。デバイスをＰＤＬ溶液でコーティングし、３７℃で５％のＣＯ２を有する加湿環境である細胞培養インキュベータ内に３０分間載置した。次に、皿に、１０％子牛血清を添加した１ｍＬのDulbeccos Modified Eagle Medium high glucose（ＤＭＥＭ）を予め充填した。次に、ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞を低密度（１皿当たり約０．２×１０６細胞）で皿に播種した。次に、細胞培養液を添加して最終的な体積を２ｍＬにした。ＬＳＰＲの読み取りを即座に行った。次に、細胞を細胞培養インキュベータ内で指示された時間増殖させた。実験期間中、新しい細胞培養液を皿に加えたり、皿から取り除いたりはしなかった。細胞数実験のために、ＬＳＰＲ測定を行った後、Ａｕ  ＮＭデバイスを１×ＰＢＳで２回洗浄した。この後、１ｍＬのトリプシンを添加して細胞を剥がした。血球計数器を用いて細胞数を数えた。
【００７０】
＜マイクロコンタクトプリンティング及びバイオアッセイ＞
（ｉ）５０ｍの間隔を有する５０ｍ×５０ｍの正方形の配列、（ｉｉ）大学のロゴ（厚さ５０ｍｍ、総直径１ｍｍ）を含むスタンプデザインを、ＡｕｔｏＣＡＤ（オートデスク社、米国）を用いて設計した。スタンプのマスタを作製するために、シリコンウェハ（直径４インチ、ＥＭ  Ｃｏｒｐ．Ｌｔｄ．、日本）を５０ｍのｍｒ−ＤＷＬ  ４０フォトレジスト（マイクロレジストテクノロジー社、ドイツ）層でコーティングし、外観をＤＬ１０００マスクレスライタ（ナノシステムソリューションズ社、日本）を使用してフォトリソグラフィによってパターニングし、ｍｒ−Ｄｅｖ  ６００現像液（マイクロレジストテクノロジー社、ドイツ）を使用して現像した。完全なベーキングおよび洗浄の後、デシケータ内で気相でのトリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ  ２Ｈ−ペルフルオロオクチル）シラン（シグマアルドリッチ社、日本）に曝露することによって、ウェハを付着防止層で被覆した。Ｓｉウェハ上に存在するパターンの逆コピーを有するＰＤＭＳスタンプは、ウェハ上に１０：１ポリ−（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）（ダウコーニング社、日本）を流し込み、気泡を除去するために脱気した後６０℃で２４時間プレポリマーを硬化させることによって得た。
【００７１】
マイクロコンタクトプリンティングプロセスの前に、ＮＩ基板およびＮＭ基板をエタノールで洗浄し、よく乾燥させた。プラズマ活性化（ＨａｒｒｉｃｋＰｌａｓｍａ社、米国）カバースリップ下で５−７分間、パターニングしたスタンプに、１×ＰＢＳ中１０ｇ／ｍｌの濃度で１０ＬのAlexaFluor546 conjugated goat anti-chicken Immunoglobulins（ＩｇＧｓ）（アブカム社、日本）を塗布した。Ｎ２ガスの強いパルスで急速乾燥させる前に、スタンプを１×ＰＢＳ、そのあとにミリＱ水（ミリポア社、日本）でそれぞれ５秒間すすいだ。次に、インクを塗ったＰＤＭＳスタンプを予め洗浄した基板と５秒間接触させた。続いて、蛍光標識されたＩｇＧｓのマイクロパターンを、Ｔｉ−ＥＥｃｌｉｐｓｅ倒立蛍光顕微鏡（ニコン社、日本）で、全サンプルについて１０秒間の固定露光時間で画像化した。印刷された一次抗体の存在を確認した後、パターニングされた抗体を用量反応バイオアッセイ研究のために様々な濃度の二次抗体に曝露した。
【００７２】
ポータブルＬＳＰＲデバイス
本発明の追加の実施形態として、ポータブルＬＳＰＲデバイスを以下に説明する。図１９は、製造されたＬＳＰＲセンサデバイスの主要構成要素を示す図である。図１９に示すように、デバイスは、Ａ）ＬＥＤベースの光源パネル、Ｂ）本発明のＬＳＰＲチップ、Ｃ）流体ステージ、Ｄ）分光計パネル、およびＥ）読み出し部品の５つの部品を備える。これらの部品はまとめられ、ナノマッシュルーム（ＮＭ）ＬＳＰＲチップからのナノプラズモン共鳴を測定するデバイスを形成する。開示されたデバイス設計は、ＬＳＰＲチップの高感度のために、本発明のナノマッシュルームＬＳＰＲチップと組み合わされるときに特に有用であるが、デバイスは類似の寸法を有するより一般的なＬＳＰＲチップを使用してもよい。
【００７３】
本実施形態の光源は、白色発光ダイオードを含む。ＬＥＤ用の回路の回路図を図２０に示す。図２０に示すように、回路は、１．ＬＥＤ、２．電圧ブースタ、３．電池パック、４．太陽電池、５．逆バイアスが低いダイオード、及び６．スイッチの６つの構成要素から構成されている。このようにして、太陽電池および／または電池パックからの電力を使用して、ＬＥＤが発光するようにＬＥＤに電圧を加えることができる。
【００７４】
図２１〜図２３は、側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む、本実施形態に含まれる光源パネルの様々な図である。これらの図に示すように、上部にはソーラーパネルが取り付けられており、ＬＥＤが底部に下向きに設けられている。反射器がＬＥＤを囲んで設けられている。ＬＥＤに隣接してＰＣＢが設けられる。パネル背面にスイッチが設けられている。図２４は光源パネル全体の写真である。ＰＣＢは、光の強度を制御するための可変抵抗器等の様々な追加の電子部品を備え、タッチスクリーンも光の強度を制御するために設けられている。
【００７５】
このポータブルＬＳＰＲデバイスに内蔵されるＬＳＰＲチップとして、上述のＮＭチップを用いた。
【００７６】
この実施形態では、ＬＳＰＲチップのスペクトル応答を捕捉するために、浜松製のＣ１２６６６ＭＡ分光計およびＣ１２８８０ＭＡ分光計を使用した。これらの分光計はＬＳＰＲ応答を取得するためにＡｒｄｕｉｎｏ基板を使用して制御される。様々な構成要素内のロジック、エレクトロニクス、および接続を説明するブロック図が図２５に記載されている。
【００７７】
分光計のさまざまな部品を以下に記載する。
１）電力供給装置：１つの電源バンクが、マイクロコントローラ、ディスプレイ、およびマイクロ分光計からなる完全な分光計モジュールに電力を供給するのに必要なエネルギを供給する。分光器には５Ｖの電力供給が必要である。この５Ｖの電位は、ソーラーパネルまたは直接電力供給のいずれかを電力源とする充電式電池によって供給される。
２）マイクロコントローラ：これは分光計のメインコントロールユニットである。マイクロコントローラによって実行される重要な３つのタスクがある。第１に、分光計が光に曝露される期間を制御するために、分光計へのクロック信号（分光計への入力）を提供する。この期間は分光計の積分時間としても知られている。第２に、マイクロコントローラは分光計と通信し、積分時間中に分光計によって取得された信号（分光計の出力）を受信する。最後に、マイクロコントローラは、取得したスペクトルを表示するためにディスプレイユニットまたはグラフィックユーザインタフェースと通信する。
【００７８】
本実施形態のポータブルＬＳＰＲデバイスの流体ステージは以下のように構成されている。デバイスは、流体がプラズモンチップを通過することを可能にする流体チャネルを有する。流体チャネルはアクリル材料からなる。それは透明であり、光がＬＳＰＲチップ上のナノ構造に到達することを可能にする。図２６ａ〜図２６ｃは、流体ステージの設計図を示す図である。図２６ａは、流体チャネルの鳥瞰図であり、図２６ｂは、ＬＳＰＲシステムに統合された流体チャネルの側面図およびその拡大図を示し、図２６ｃは、流体チャネルの上面図および断面図を示す。矢印はチャネル内の流体の方向を示す。
【００７９】
流体チャネルは、流体漏れを回避するためにプラズモンチップとの気密接続を形成するＯリングからなる。例えば、チャネルのサイズ（長さ５ｍｍ）および形状（円形、直径１．２ｍｍ）は、１０ミクロンから１０ｍｍの範囲で装飾されることができる（図２６参照）。取り外し可能なキーを使用してホルダ内に取り付けることができるドーナツ型加圧器を使用して、流体チャネルをプラズモンチップと接触して保持した。図２７（ａ）は、光源パネルに取り付けられたステージホルダを概略的に示す図であり、図２７（ｂ）はドーナツ型加圧器を概略的に示す図であり、図２７（ｃ）は、加圧器をステージに取り付けるための取り外し可能なキーを概略的に示している。すべての主要な機械的構造は、３Ｄプリンタを使用して光路を一直線にするために同心円状の穴で設計されている。
【００８０】
図２８は、実施形態に係る、分光計からの信号の読み出しおよび表示に関係するすべてのステップのフローチャートを示す。読み出しの目的タスクは３つある。最初のタスクは、正確な波長振動パラメータを取得するためのマイクロコントローラとのシリアル通信を含むソフトウェアの初期化である。初期化後、ソフトウェアは背景信号および基準信号を取得し、これらは後に信号の吸光度を表示するために処理される。
【００８１】
図２９は、ＬＳＰＲシグナルをリアルタイムで表示するためにＭａｔｌａｂで開発されたグラフィックユーザインタフェースを示す図である。パネルは、ユーザが監視時間を変更し、取得時間を固定し、そしてプラズモン共鳴における波長シフトおよび吸光度シフトを観察することにより測定の動態を追跡することを可能にするパネルからなる。読み出しは、タッチスクリーンディスプレイパネルとも統合されている。
【００８２】
上述したように、本発明の実施形態として、本発明のＬＳＰＲチップを利用して携帯可能で非常に効果的なＬＳＰＲデバイスが実現された。本開示のＬＳＰＲチップ及び構造の高感度かつ有効な性質により、結果として得られるＬＳＰＲデバイスもまた非常に有効かつ信頼性を有していた。
【００８３】
本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に様々な修正および変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。したがって、本発明は、特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある修正および変形を網羅することが意図されている。特に、上記の任意の２つ以上の実施形態の任意の部分または全体、およびそれらの変更は、本発明の範囲内で組み合わせて考慮することができることが明示的に企図されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１１ｄ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１１ｇ】
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【図１１ｈ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１７ｅ】
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【図１７ｆ】
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【図１７ｇ】
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【図１７ｈ】
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【図１７ｉ】
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【図１７ｊ】
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【図１７ｌ】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１８ｃ】
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【図１８ｄ】
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【図１８ｅ】
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【図１８ｆ】
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【図１８ｇ】
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【図１８ｈ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６ａ】
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【図２６ｂ】
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【図２６ｃ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月11日(2019.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
【図１】図１は、Ａｕナノアイランド（nanoisland：ＮＩ）からＡｕナノマッシュルーム（nanomushroom：ＮＭ）構造を作製するプラズマプロセスを概略的に示す図である。（ａ）は、ＮＩの略図と並べた走査電子顕微鏡法（scanning electron microscopy：ＳＥＭ）画像である。挿入図は、ＮＩの画像を拡大している。（ｂ）は、プラズマ曝露下のＮＩの概略図である。（ｃ）は、プラズマへのプラズマ曝露後に形成されたＮＭである。挿入図はＮＭの断面を示している。
【図２】図２は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製工程を概略的に示す図である。概略図は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（building unit：ＢＵ）の生成、それに続く、より密集したＮＭへのＢＵのアセンブリを示している。
【図３】図３は、本発明に適用されるように、ビルディングユニット（ＢＵ）のコンセプトを概略的に示す図である。
【図４】図４は、電子ビームリソグフラフィ（e-beam lithography：ＥＢＬ）を使用して作製された、１００ｎｍ間隔で、直径２００ｎｍを有するＮＩの写真である。
【図５】図５は、図４に示すＮＩ構造に対してＩＣＰ−ＲＩＥ処理を行った後の構造の写真である。
【図６】図６は、本発明の実施形態に係るＮＭ製造プロセスのプロセスフローチャートである。
【図７】図７は、本発明の実施形態に係る高スループットのＮＭ構造を達成するためのプロセスを概略的に示す図である。
【図８】図８は、本発明の実施形態に係るＮＭ構造の寸法及び間隔を概略的に示す図である。
【図９ａ】図９ａは、ＮＩ及びＮＭについて、波長の関数としての吸光度プロットであり、ＮＩ（ＬＳＰＲピーク波長５４０ｎｍ）構造及びＮＭ（ＬＳＰＲピーク波長５３３ｎｍ）構造の典型的な共振特性を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ＮＭ構造及びＮＩ構造近傍の局所的な屈折率の変化に伴うＮＭ構造及びＮＩ構造それぞれのＬＳＰＲピーク波長の変化を示す図である。
【図１０】図１０は、本発明のＮＭ基板上での細胞増殖（ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞）を概略的に示す図である。
【図１１ａ】図１１は、細胞増殖時の本発明の実施例ＮＭ構造のＬＳＰＲを示す図であり、図１１ａは、２４時間にわたる波長応答を示す図である。
【図１１ｂ】図１１ｂは、２４時間にわたる吸光応答を示す図である。
【図１１ｃ】図１１ｃは、２４時間にわたるＲＩＵ応答を示す図である。
【図１１ｄ】図１１ｄ〜図１１ｆは、７日間にわたる細胞増殖時のＬＳＰＲを示す図であり、図１１ｄは、波長応答を示している。
【図１１ｅ】図１１ｅは、吸光応答を示している。
【図１１ｆ】図１１ｆは、ＲＩＵ応答を示している。
【図１１ｇ】図１１ｇは各日後のＮＭセンサの表面の画像を示している。
【図１１ｈ】図１１ｈは、細胞数の変化に対するセンサ応答の変化を示している。
【図１２】図１２は、ＣＮＣ機を使用し、アルミニウムで作製したステンシルハードマスクを示す写真である。
【図１３】図１３は、図１２のマスクを使用した、スポット内での金の堆積を概略的に示す図である。
【図１４】図１４は、本発明の実施例に従って製造されたナノマッシュルームスポットの配列を有するＮＭチップを示す写真である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施例に従って製造されたマイクロチャンネルを有するパッケージ化されたナノマッシュルームチップを示す写真である。
【図１６】図１６は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製メカニズムを示す図であり、（ａ）は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（ＢＵ）の生成及びそれに続くより密集したＮＭへのビルディングユニットのアセンブリを概略的に示し、（ｂ）は、ＮＩからのＮＭのプラズマ指向性アセンブリにとって好ましいサイズおよびピッチ要件を示し、（ｃ）〜（ｅ）は、ＮＩに対するプラズマ効果の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であり、（ｃ）は直径２００ｎｍ、ピッチ２００ｎｍ、（ｄ）は直径２００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍ、（ｅ）はサイズ１００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍである。
【図１７ａ】図１７は、検証実験の構成および結果を示す図であり、図１７ａはイオンの勾配を生成するためのプラズマシールドの概略図である。
【図１７ｂ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｃ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｄ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｅ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｆ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｇ】図１７ｂ〜図１７ｇは、スタンプ下の領域のＳＥＭスキャンであり、プラズマイオンの強度への曝露は、図１７ｂから図１７ｇに向かって増加している。各画像の内側において、挿入図は、ナノ構造のサイズ分布を示す。
【図１７ｈ】図１７ｈおよび図１７ｉは電子ビームリソグラフィを使用して作成されたナノアイランドを示す図である。
【図１７ｉ】図１７ｈおよび図１７ｉは電子ビームリソグラフィを使用して作成されたナノアイランドを示す図である。
【図１７ｊ】図１７ｊ及び図１７ｋは、１分間のプラズマ曝露後のナノアイランドを示す図である。
【図１７ｌ】図１７ｌおよび図１７ｍは、５分間のプラズマ曝露後のナノアイランドを示す図である。
【図１８ａ】図１８ａは、ＬＳＰＲピークの特性を示す図である。挿入図は、屈折率の変化に対するＮＩ，ＮＭ構造のＬＳＰＲピークの感度を示している。
【図１８ｂ】図１８ｂ〜図１８ｅは、ＮＭ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図であり、図１８ｂは、ＮＭ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｃ】図１８ｃは、ＮＩ上のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｄ】図１８ｄは、ＯＩＳＴロゴのような複雑な形状のマイクロコンタクトプリント抗体を示す図である。
【図１８ｅ】図１８ｅは、ＮＩが複雑な形の抗体をプリントできないことを示す図である。
【図１８ｆ】図１８ｆは、マイクロコンタクトプリント抗体上の相補的抗体の結合に対するＬＳＰＲ応答を示す図である。
【図１８ｇ】図１８ｇ及び図１８ｈは、様々な濃度の相補的抗体を付着させたときの波長および吸光の変化を示すＬＳＰＲの用量反応を示す図である。
【図１８ｈ】図１８ｇ及び図１８ｈは、様々な濃度の相補的抗体を付着させたときの波長および吸収の変化を示すＬＳＰＲの用量反応を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態に係るマッシュルームＬＳＰＲチップを有するＬＳＰＲセンサデバイスの主要構成要素を示す図である。
【図２０】図２０は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスのＬＥＤ回路の回路図である。
【図２１】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２２】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２３】図２１〜図２３は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態に含まれる光源パネルの側面図、上面図および底面図、ならびに正面図および背面図を含む様々な図である。
【図２４】図２４は、図２１〜図２３における光源パネルの写真である。
【図２５】図２５は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態における分光計モジュールのブロック図である。
【図２６ａ】図２６ａ〜図２６ｃは、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態における流体ステージの設計図を示し。図２６ａは流体チャネルの鳥瞰図である。
【図２６ｂ】図２６ｂは、ＬＳＰＲシステムに組み込まれた流体チャネルの側面図およびその拡大図である。
【図２６ｃ】図２６ｃは、流体チャネルの上面図および断面図である。
【図２７】図２７（ａ）は、光源パネルに取り付けられたステージホルダを概略的に示す図であり、図２７（ｂ）は、ドーナツ型加圧器を概略的に示す図であり、図２７（ｃ）は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態においてステージ上に加圧器を取り付けるための取り外し可能なキーを概略的に示す図である。
【図２８】図２８は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態において分光計からの信号の読み出しおよび表示に関わる全てのステップのフローチャートを示す図である。
【図２９】図２９は、図１９に示すＬＳＰＲセンサデバイスの実施形態においてＬＳＰＲシグナルをリアルタイムで表示するためにＭａｔｌａｂで開発されたグラフィックユーザインタフェースを示す図である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
表面上の細胞数についてＬＳＰＲの波長応答もまた定量した。図１１ｈに示すように、ＬＳＰＲ応答は細胞数の増加とともに直線的に変化することが観察された。より少ない細胞では、青方偏移が観察される一方、細胞数の増加は、ＬＳＰＲピークの赤方偏移の観察に対応する。したがって、実用的なＬＳＰＲ細胞増殖バイオセンサを、さまざまな数の細胞に対する様々な波長を用いて較正することが可能である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
図１６は、ナノマッシュルーム状構造（ＮＭ）の作製メカニズムを示す図である。（ａ）は、ナノアイランド（ＮＩ）からのビルディングユニット（ＢＵ）の生成およびそれに続くＢＵのより密集したＮＭへのアセンブリを概略的に示し、（ｂ）は、ＮＩからのＮＭのプラズマ指向性アセンブリにとって好ましいサイズおよびピッチ要件を示し、（ｃ）〜（ｅ）は、ＮＩに対するプラズマ効果の走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像であり、（ｃ）は、直径２００ｎｍ、ピッチ２００ｎｍであり、（ｄ）は直径２００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍであり、（ｅ）は、サイズ１００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
ＮＩマスクの空間分布もプラズマ束と干渉し、エッチング速度を変化させる。金属のプラズマ指向性再組織化に対するＮＩサイズおよび間隔（ピッチ）の役割を評価するために、均一なサイズのＮＩグリッドの３つのセット（第１セット：直径２００ｎｍ、ピッチ２００ｎｍ、図１６（ｃ）、第２セット：直径２００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍ、図１６（ｄ）、第３セット：サイズ１００ｎｍ、ピッチ１００ｎｍ、図１６（ｅ））を電子ビームリソグラフィ（ＥＢＬ）を使用して作製した。
【国際調査報告】
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