(57)【要約】  本発明は、哺乳動物に対する化合物または組成物の効果を評価する方法に関し、哺乳動物多能性筋由来間葉系幹細胞またはその集団を取得し、前記幹細胞、幹細胞集団を関連化合物または組成物に曝露し、前記細胞に対する効果を評価することを含む。本発明の方法は、薬剤開発、毒性試験および最適化された個別化医療に適用可能な信頼できる評価方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物に対する、化合物または組成物、好ましくは医薬化合物または組成物の有効性および／または有害作用を評価する方法であって、哺乳動物多能性筋由来間葉系幹細胞またはその集団を取得し、前記幹細胞または幹細胞集団を関連する化合物または組成物に暴露し、前記幹細胞または幹細胞集団に対する前記関連する化合物または組成物の効果を評価することを含み、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、筋肉のマイクロバイオプシー、その後の密度遠心分離により取得され、少なくともＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ２９に対して陰性である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ２９に対して陰性である、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、さらにｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、およびｍｉＲ−８０２に対して陽性である、方法。
【請求項４】
請求項３の記載の方法であって、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、さらにｍｉＲ−２１８に対してわずかに陽性であり、ｍｉＲ−６５６に対して陰性である、方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、前記医薬化合物または組成物の効果は、前記関連する化合物または組成物の非存在下で実施された対照と比較することにより評価される、方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記方法は、薬物スクリーニング法であり、前記医薬化合物または組成物は、多数の個体に由来する前記幹細胞または幹細胞集団において、またはそれらに由来する分化細胞において試験される、方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法であって、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞またはその集団は、哺乳動物患者に由来し、前記方法は、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞あるいはその集団、またはそこから派生した分化細胞の陽性応答のレベルを評価することにより、前記哺乳動物患者による陽性応答の可能性を評価することをさらに含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋組織由来の哺乳動物幹細胞の新規用途に関し、より具体的には、薬物治療ならびに創薬およびスクリーニングならびに毒性試験の分野での使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤開発は、関連する薬物候補に伴う薬物有効性の評価および副作用の決定に関連する莫大な費用のために、ますます高価になっている。従来の薬剤開発プロセスは、予期しない副作用の結果として、候補薬剤が高レベルに減少することに結びつく大きな欠点に悩まされている。そのため、薬剤開発プロセスにおいて、費用および減少を減らす改良されたモデルの必要性がある。
【０００３】
また、特定のがんや遺伝的機能不全または変性に結び付く疾患のような、特定の疾患の適切な薬物療法は、患者の独特の遺伝的背景により特徴づけられる患者に合わせる治療ソリューションを必要とする傾向がある、すなわち正しい患者に正しい用量の正しい薬剤を用いる治療である。最近では、幹細胞を使用して遺伝暗号を評価し、および／または特定の治療に対する患者の反応を判断し、関連する治療に対する患者に予想される反応に薬物療法を適応させている。
【０００４】
このような方法は、幹細胞の十分な利用可能性を要求する。幹細胞の使用は依然として議論の余地があり、患者からの幹細胞の収集は、負担であり、および／または痛みを伴う。哺乳動物の幹細胞には、胚性幹細胞と成体幹細胞という２つの主要なカテゴリーがある。胚性幹細胞は、ほとんどの場合、特定の患者には利用できず、いずれの場合も倫理的問題に関連する。成体幹細胞は、成体のさまざまな組織に見いだされる。それらの役割は、それらが見いだされる組織を維持し、修復することである。これらの細胞は、個人の生涯を通じて生産され、子供や大人と同様に、新生児に見いだされる。いくつかのタイプの成体幹細胞が知られており、血液細胞の基礎を形成し、免疫系で主要な役割を果たす造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄中および臍帯中に見いだされる。臍帯由来の幹細胞は、成人患者が必要とする場合、ほとんど利用できない。成体間葉系幹細胞の通常のソースは、骨髄または脂肪組織から抽出され、収集は侵襲的であり、痛みを伴う。これらの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は多能性であり、骨、軟骨、脂肪、筋肉などに分化できる。人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）は、線維芽細胞として分化細胞から人工的に発生する。転写因子をコードする４つの特定の遺伝子の導入は、成体細胞を多能性幹細胞に変換できる。
【０００５】
ＷＯ２０１５/０９１２１０は、筋肉のマイクロバイオプシーなどによる最小限の侵襲的努力で取得され、十分な量で入手可能な哺乳動物の筋由来の多能性間葉系幹細胞を開示する。これらの間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、少なくともＣＤ１０５、好ましくはＣＤ４４、ＣＤ９０およびＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ２９に対して陰性である。これらのＭＳＣは、さらに、通常ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、およびｍｉＲ−８０２に対して陽性であり、ｍｉＲ−２１８に対してわずかに陽性であり、ｍｉＲ−６５６に対して陰性である。これらの細胞は、その多能性を失うことなく、複数の凍結融解サイクルをサポートすることも見い出されている。さらに、細胞培養では、外植片として筋肉のマイクロバイオプシーが使用され、前駆細胞がやがて自発的に現れることに注目する。そうすることで、操作の回数が減り、潜在的な汚染源を回避する。筋肉のマイクロバイオプシー（外植片）によって自然に分泌される成長因子が十分であるため、外部の成長因子を追加する必要はない。筋由来細胞は、異なる系統および異なる発達段階からの亜集団の混合物である。特定の分子マーカーの発現に関連する密度に基づいて、および（不連続な）密度勾配のおかげで、多能性間葉系幹細胞の３つの実質的に純粋な亜集団が筋肉外植片から分離された。全ての３つの亜集団は、ＣＤ４４陽性である細胞を＞９０％含む。ＣＤ９０に対して、発現率は、２５〜３５％画分に対して３６％であり、＜１５％画分に対して４８％であり、１５〜２５画分に対して７３％である。ＣＤ１０５に対して、発現率は、５５％より高く、好ましくは６０％より高く、３つの集団において８０％あるいは８５％あるいは９０％に達し、９５％にさえ達する。３つの集団は、異なるＣＦＵ−Ｕおよび増殖性をも示す（ＷＯ２０１５／０９１２１０実施例参照）。
【０００６】
ＷＯ２０１５／０９１２１０に開示されている間葉系幹細胞は、人工誘導なしで多能性であり、多くの細胞タイプに分化する可能性があり、簡単に新しい医薬化合物のスクリーニングおよび／または試験に特に適しており、容易に利用できることが見いだされている。より具体的には筋肉のマイクロバイオプシーによる、これらの細胞の収集は、簡単であり、大きな痛みを伴わない。
【０００７】
さらに、関連する幹細胞は関連する患者からいつでも収集でき、薬物の有効性と薬物の副作用について適切に評価することができるため、ＷＯ２０１５／０９１２１０に開示されている幹細胞は、関連する患者に合わせた治療液を含む個別化医療における使用に特に適していることが見いだされている。
【発明の概要】
【０００８】
より具体的には、本発明は、哺乳動物に対する化合物または組成物、好ましくは医薬化合物または組成物の有効性および／または副作用を評価する方法に関し、哺乳動物多能性筋由来間葉系幹細胞またはその集団を取得し、前記幹細胞または幹細胞集団を関連する化合物または組成物に曝露し、前記幹細胞または細胞集団に対するその効果を評価することを含み、哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、筋肉マイクロバイオプシーとそれに続く密度勾配遠心分離によって取得し、少なくともＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＭＨＣＩＩおよびＣＤ２９に対して陰性である。
【０００９】
哺乳動物の多能性筋由来間葉系幹細胞は、哺乳動物の筋組織からマイクロバイオプシーを収集し、マイクロバイオプシーを培地に入れ、前記培地から出現する細胞を収集し、取得した細胞をコンフルエント近くまで増殖し、取得した細胞を解離し、密度勾配分画により間葉系幹細胞を培地の残りの細胞から分離することにより取得する。
【００１０】
有利なことに、マイクロバイオプシーは、ミクロバイオプシーは、首、肩、胸、背中、尾、手足、後肢、前肢、後肢、後肢などの筋肉からの骨格筋組織から取得される。ウマやヒトのような哺乳動物の場合、マイクロバイオプシーは、好ましくは上腕三頭筋の筋組織から取得され、より好ましくは上腕三頭筋の長頭から、または三角筋から採取される。
【００１１】
ウマの場合、例えば、マイクロバイオプシーは、上腕三頭筋の長頭において約５ｃｍの深さにて収集され、約１０〜約３０ｍｇの組織、好ましくは約１２ｍｇ以上、または約１５ｍｇ以下大きい組織、および／または約２５ｍｇ以下または約２０ｍｇ以下の組織を含む。
【００１２】
哺乳動物および骨格筋組織源に依存して、当業者は、一般的な知識に基づいて、および／または過度な負担の無い慣例の実験方法により、抽出される組織サンプルのマイクロバイオプシーの深さおよび量を適合させることができる。
【００１３】
培地は、約２０％のウシ胎児血清、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンホテリシンＢ（２５０μｇ/ｍｌ）および約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含有するＤＭＥＭ/Ｆ１２、または動物タンパク質を含まない他の特定の培地（例えばＦＢＳフリー培地）を含む。この場合も、必要に応じて、培地を特定の用途に適合させることができる。
【００１４】
好ましくは、哺乳動物の多能性筋由来幹細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、およびＣＤ１０５に対して陽性であり、ＣＤ４５、ＭＨＣＩＩ、およびＣＤ２９に対して陰性である。
【００１５】
完全を期すために、関連する哺乳動物多能性筋由来幹細胞は、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、およびｍｉＲ−８０２に対してさらに陽性であることを見出している。また、それらは、ｍｉＲ−２１８に対して陽性であり、ｍｉＲ−６５６に対して陰性である。
【００１６】
試験する関連する化合物または組成物、好ましくは医薬化合物または組成物の有効性は、周知の方法にて、または当該分野の当業者の一般知識にて判断される。一例として、特に医薬化合物または組成物の場合、関連する化合物または組成物の効果は、医薬化合物または組成物の非存在下で実施された対照と比較することにより評価される。
【００１７】
本発明の方法は、個別の医療治療方法にも用途を見いだされ、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞またはその集団は、患者に由来し、本方法は、前記哺乳動物多能性筋由来幹細胞またはその集団の陽性応答のレベルを評価することにより、患者による陽性応答の可能性を評価することを含む。
【００１８】
本発明は、文献に既に記載されている方法に対する効果的かつ有望な代替手段を提案し、低侵襲性の幹細胞収集により、生きている哺乳動物で実施される可能性を提供する。わかっているように、筋由来細胞は、異なる系統および異なる発達段階からの亜集団の混合物である。特定の分子マーカーの発現に関連するそれらの密度に基づいて、（不連続な）密度勾配の結果、筋肉外植片から多能性間葉系幹細胞の３つの実質的に純粋な亜集団を選択することが可能である。細胞培養は簡単な方法で開始され、筋肉のマイクロバイオプシーは外植片として使用され、前駆細胞がいずれ自発的に現れる。そうすることによって、筋肉のマイクロバイオプシー（外植片）によって自然に分泌される成長因子が十分なので、操作の回数が減り、潜在的な汚染源が回避され、外部の成長因子を追加する必要がない。
【００１９】
人工多能性幹細胞（ＩＰＳＣ）を利用する最先端の評価方法とは異なり、本発明は、さらに、自己多能性幹細胞に対する関連する効果を評価することにより、患者に対する化合物または組成物の有効性および／または副作用の評価に特に適していると思われる。遺伝的特異性や異常にあまり依存しないため、評価は、（ＩＰＳＣまたは非自己細胞と比較して）より信頼性が高くなる。この利点は、特に遺伝的障害に対する薬理効果の評価および最適化された個別化医療において、特定の関連性がある。
【００２０】
ここでの利点の１つは、前記間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が培養中に線維芽細胞様のコロニーを形成できることにもある。また、他の間葉系幹細胞源で通常観察されるものとは異なり、前記細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞に分化し、それらの多能性を失うことなく複数の凍結−融解サイクルを支援する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、「医薬」（医薬化合物、医薬組成物）という用語は、薬剤または調剤に関連することを意味すると理解され、ヒトまたは獣医学の薬品の両方を含む。
【００２２】
本明細書において用いられる「約」という用語は、パラメータ、量、一時的な継続時間などの測定可能な値を参照する場合に、特定の値、または特定の値から＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変量を包含することを意図し、このような変動は、本発明において実行される限り適切である。修飾語句「約」が帰する値が、それ自体具体的に、好ましくも、開示されていることを理解されるべきである。
【００２３】
本発明に関する一般的な方法に関し、参照により本明細書に組み込まれている、例えば「分子クローニング：実権マニュアル、第二版」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他，１９８９）、動物細胞培養（Ｒ．  Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）、酵素学方法シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、哺乳動物細胞の遺伝子導入ベクター（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；「分子生物学における現行プロトコルおよび分子生物学における短期プロトコル、第３版」（Ｆ．  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他、編集、１９８７および１９９５）；組み換えＤＮＡ方法論ＩＩ（Ｒ．Ｗｕ他、編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）を含む、既知の教科書により参照がなされる。
【００２４】
本発明の実行において役立つ一般的な技術のさらなる精密化のため、実行者は、細胞生物学、組織培養、および発生学の標準的な書籍およびレビューを参照することができる。これには、「奇形種および胚性幹細胞：実践的アプローチ」（Ｅ.Ｊ.Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、編集、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ.１９８７）；「マウス発達における技術ガイド」（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓｅｒｍａｎ他編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；「インビトロ胚性幹細胞分化」（Ｍ．Ｖ．Ｗｉｌｅｓ，ＭＥＴＨ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５：９００，１９９３）；「胚性幹細胞の性質および利用：ヒト生物学および遺伝子治療への適用見通し」（Ｐ．Ｄ．Ｒａｔｈｊｅｎ他、１９９３）が含まれる。幹細胞の分化は、参照により本明細書に組み込まれる、例えばＲｏｂｅｒｔｓｏｎ．１９９７．ＭＥＴＨ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７５：１７３；およびＰｅｄｅｒｓｅｎ．１９９８．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ  １０：３１、およびＵｓａｓ他、２０１１にレビューされている。
【００２５】
細胞培養および細胞収集における一般的な技術は、参照により本明細書に組み込まれる、大規模哺乳動物細胞培養（Ｈｕ他  １９９７．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：  １４８）；無血清培地（Ｋ．Ｋｉｔａｎｏ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：７３）；大規模哺乳動物細胞培養（Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２：３７５，１９９１），動物細胞の培養：基本的な技術のマニュアル、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．他  ２００５，５版、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに概説される。
【００２６】
「幹細胞」という用語は、一般的に、分化されていないか、相対的に分化されていない増殖能のある細胞を指し、自己再生が可能である、すなわち、分化せずに増殖することができる、それ自体またはその子孫が、少なくとも１つの相対的により分化した細胞タイプを生じさせることができる。この用語は、実質的に無制限の自己再生が可能な幹細胞を包含し、幹細胞またはその少なくとも一部の子孫は、母体幹細胞の分化されていないか、相対的に分化されていない表現タイプ、分化能、および増殖能力、ならびに限られた自己再生を示す幹細胞を実質的に保持し、さらなる増殖および／または分化のための子孫またはその一部の能力は、母細胞と比較して明らかに低下している。限定されない例によれば、幹細胞は、１つ以上の系統に沿って分化し、次第に相対的により分化した細胞を生成できる子孫を産生し、そのような子孫および／または次第に相対的により分化した細胞は、それ自体が本明細書で定義される幹細胞であるか、または最終分化細胞、すなわち有糸分裂後の完全に分化された細胞を産生することもある。
【００２７】
本明細書で使用される「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」という用語は、哺乳動物の成体の、中胚葉由来幹細胞として参照され、間葉系の系譜の細胞、例えば、骨細胞（骨）、軟骨細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）およびストロマジェニック（骨髄間質）系譜の、２つ、好ましくは３つ以上の間葉系の系譜、の典型的な細胞を発生することができる。一般的に、ただしこれに限定されないが、Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他  １９９９（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８４：１４３−７）またはＢａｒｂｅｒｉ他、２００５（ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ  ２：ｅ１６１）、およびＵｓａｓ他、２０１１に記載されるように、標準的な、技術的に認められた分化条件および細胞表現タイプ評価方法を使用して、脂肪細胞、軟骨細胞、および骨細胞系のそれぞれの細胞を形成できる場合、細胞はＭＳＣとみなしてもよい。ＭＳＣという用語は、ＭＳＣの子孫、例えば、対象の生物学的サンプルから取得したＭＳＣのインビトロまたはエクスビボ増殖により取得した子孫も包含する。
【００２８】
ＩＳＣＴは、以下のような間葉系幹細胞（ＭＳＣ）として定義するために、細胞が持つべき品質を正確に決定した。すなわち、細胞は、プラスチック接着性であり、マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、およびＣＤ１０に対して陽性であり、マーカーＣＤ１４（またはＣＤ１１ｂ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ７９ａ（またはＣＤ１９）およびＭＨＣ−ＩＩに対して陰性でなければならず、また骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞などの中胚葉起源の細胞に分化する能力を示さなければならない（Ｄｏｍｉｎｉｃｉ他、２００６）。ＣＤ２９またはＣＤ４４などの他のＭＳＣマーカーの使用も報告されている（Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ他、１９９９）。したがって、本発明に従って使用される哺乳動物ＭＳＣ細胞は、少なくとも間葉マーカーＣＤ１０５、および好ましくは以下のマーカー：ＣＤ４４およびＣＤ９０の１つ以上を発現または同時発現する（すなわち、陽性である）という点で定義される。本発明の哺乳動物ＭＳＣ細胞はまた、以下のマイクロＲＮＡ：ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３３Ｂ、ｍｉＲ−２１８またはｍｉＲ−８０２の１つ以上を発現または同時発現する（すなわち、陽性である）というように定義される。本発明の哺乳動物ＭＳＣ細胞は、ｍｉＲ−６５６を発現しないというようにも定義される。
【００２９】
マイクロＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲまたはｅｃａ−ｍｉＲという用語は、本明細書で互換的に使用され、動物などの生物の内因性遺伝子に由来する１９〜２５のヌクレオチド成熟非コードＲＮＡ、またはその前駆体、またはその断片を指す。成熟したマイクロＲＮＡは、約７５のヌクレオチドの長さを有するプレ−マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍｉＲ）と呼ばれるより長いヘアピン様前駆体からプロセシングされる。
【００３０】
細胞が特定のマーカーまたはマイクロＲＮＡに対して陽性であると考えられる場合、これは、適切な対照と比較して、適切な測定を実行する際に、そのマーカーまたはマイクロＲＮＡに対して、例えば、抗体検出可能または逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による検出などの、明確なシグナルの存在または証拠を当業者が結論付けることを意味する。本方法がマーカーまたはマイクロＲＮＡの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は、対照とは有意に異なり、対照よりもより高いまたはより強いシグナル、例えば、これに限定されないが、対照細胞によって発生するシグナルより少なくとも１．５倍高い、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高い、またはさらに高いシグナルを発生する。
【００３１】
細胞特異的マーカーの発現は、免疫細胞化学またはアフィニティ吸着、ウエスタンブロット分析、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野で公知の任意の適切な免疫学的技術を使用して、または酵素活性の任意の適切な生化学的アッセイにより、または例えばノーザンブロット、半定量的または定量的ＲＴ−ＰＣＲなどの、マーカーｍＲＮＡの量を測定する適切な技術により、検出される。
【００３２】
マイクロＲＮＡの発現は、例えば、包括的な遺伝子発現のアッセイ（例えば、マイクロＲＮＡ発現プロファイリング分析用マイクロアレイアッセイ、使用準備済のマイクロＲＮＡ  ｑＰＣＲプレートあるいはＲＮＡシーケンシングを用いる）を用いて、または、例えば、これに限定はされないが、定量ＰＣＲ、定量逆転写（リアルタイム）ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）リアルタイムＰＣＲ、またはノーザンブロット法などの特異性検出アッセイにより決定してもよい。特に、マイクロＲＮＡの発現の測定は、前記マイクロＲＮＡの検出に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いて実施してもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、直接および特異的にマイクロＲＮＡに結合してもよく、または特異的に前記マイクロＲＮＡを逆転写してもよい。前記オリゴヌクレオチドプローブは、前記マイクロＲＮＡから取得されたｃＤＮＡを増幅してもよい。
【００３３】
本明細書に列挙されるマーカータンパク質の核酸およびアミノ酸配列データは、一般的に知られており、とりわけＮＩＨ「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｗｅｂ」データベース（http：//mpr.nci.nih.gov/prow/）、ＮＩＨ「Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ」データベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=gene）またはＵｎｉｐｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース（http：//www.expasy.org/）などの公開データベースから取得することができる。前記マーカーに適する検出試薬および方法は、そのような配列情報に基づいて設計することができ、より一般的には市販されている（例えば、標識モノクローナル抗体試薬）。
【００３４】
「ＣＤ１０５」という用語は、ＣＤ１０５として知られる抗原、またはエンドグリンなどの同義語を含む。ＣＤ１０５は、細胞表面にある膜糖タンパク質であり、間葉系幹細胞マーカーとして知られている。一例として、ウマＣＤ１０５抗原の部分アミノ酸配列は、受託番号ＡＧＷ１６３４５．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００３５】
「ＣＤ９０」という用語は、抗原ＣＤ９０、またはＴｈｙ−１膜糖タンパク質などの同義語を含む。一例として、ウマＣＤ９０抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＡＣＧ６１２２３．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００３６】
「ＣＤ４４」という用語は、一般的にＣＤ４４として知られる抗原、または細胞外マトリックス受容体ＩＩＩ、ＧＰ９０リンパ球ホーミング／接着受容体、ＨＵＴＣＨ−Ｉ、エルメス抗原、ヒアルロン酸受容体、貪食糖タンパク質１などの同義語を含む。一例として、ウマＣＤ４４抗原のアミノ酸配列は、受入番号ＣＡＡ４７３３１．１にてＧｅｎｂａｎｋデータベースに見いだされる。
【００３７】
前記ＭＳＣマーカーの検出のための例示的な市販の抗体試薬は、とりわけモノクローナル抗体、抗ＣＤ１０５−ＲＰＥ（ＡＢＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）、抗ＣＤ４４−ＡＰＣ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、および抗ＣＤ９０（ＶＭＤＲ）を含む。ＣＤ１０５、ＣＤ４４、またはＣＤ９０に特異的に結合する代替抗体は、当業者によって同定されることができる。
【００３８】
本明細書に挙げられているマイクロＲＮＡは、一般に知られており、とりわけｍｉＲＢａｓｅデータベース（http://www.mirbase.org）などの公開データベースから取得できる。「ｍｉＲ−１２８」という用語は、ｍｉＲ−１２８として知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−１２８のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８２１にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。「ｍｉＲ−１３３Ｂ」という用語は、ｍｉＲ−１３３Ｂとして知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−１３３Ｂのヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２８４４にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。「ｍｉＲ−６５６」という用語は、ｍｉＲ−６５６として知られるマイクロＲＮＡまたはその前駆体を含む。一例として、ウマｍｉＲ−６５６のヌクレオチド配列は、受入番号ＭＩ００１２９１５にてｍｉＲＢａｓｅデータベースに見いだされる。当業者は、マイクロＲＮＡが異なる名前または同義語で参照されることをよく知っている。
【００３９】
「細胞集団」という用語は一般に、細胞のグループ化を指す。細胞集団は、少なくとも共通のタイプの、または共通の特徴を有する細胞の画分からなるか、またはそれを含んでもよい。そのような特徴は、限定はされないが、形態学的特徴、分化の可能性（例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、単能性など、例えば、多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）または単能性の場合、特定の細胞タイプに分化する能力）、または１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の細胞関連マーカー、例えば表面抗原の存在および／またはレベルを含めてもよい。したがって、そのような特徴は、細胞集団またはその一部を定義し得る。好ましくは、そのような細胞集団は、間葉系幹細胞集団であり、より好ましくは間葉系幹細胞の実質的に均質な集団である。
【００４０】
「実質的に均一な」または「実質的に純粋な」間葉系幹細胞の集団という用語は、上記で定義されたＭＳＣの画分を含む細胞集団を示し、前記細胞集団における前記画分は、少なくとも５０%、例えば少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、例えば少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、さらにより好ましくは 少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４%、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、さらには１００％に近い、または１００％に近いあるいは１００％と同等である。
【００４１】
「密度勾配遠心分離」という表現は、細胞の密度ベースの分離を含む、あらゆるタイプの細胞分離技術または製品を含む。非限定的な例は、ショ糖ポリマーまたはコロイドシリカの勾配における密度勾配遠心分離であり得る。市販の勾配の非限定的な例は、パーコール（ポリビニルピロリドンまたはシランでコーティングされたコロイドシリカ）、フィコール（高分子量スクロースポリマー）、フィコール−パック（フィコール＋ジアトリゾ酸ナトリウムおよびエデト酸カルシウム二ナトリウム）、浮力密度溶液（ＢＤＳ、コロイドシリカを含む）、リンホプレップ（ジアトリゾ酸ナトリウムおよび多糖類）などである。当業者が本発明による方法により取得された幹細胞を分離するために適切な勾配を選択できることは明らかである。本発明の方法を使用すると、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、１２５０ｘｇ（２５℃、２０分）での遠心分離後、通常、＜１５％、１５〜２５％、または２５〜３５％パーコール密度界面に見いだされる。次いで、所望のマーカータンパク質を同時発現する間葉系幹細胞は、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、磁気活性化セルソーティング（ＭＡＣＳ）、アフィニティベースの技術、特にアフィニティクロマトグラフィー、またはプレプレートテクニックとそれらの組み合わせを用いて、それ自体既知の方法により、単離および任意に拡大された細胞の一般集団から選択、濃縮または単離することができる。例示的な方法は、Ｗｕ他、２０１０年に報告されている（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｕｎ；３４０（３）：５４９−６７を参照）。
【００４２】
所望の発現プロファイルを有する生細胞は、それぞれのマーカーに特異的な試薬（最も一般的には、例えばモノクローナル抗体などの免疫学的試薬）と結合することができ、前記試薬は、そのように結合されていない細胞から前記試薬によって結合された細胞の選択または捕捉を容易にするように、順番に（例えば、フルオロフォア、または磁性粒子あるいは別のタイプの固定相による固定化によって）修飾される。これらの方法に関する一般的なガイダンスについて、フローサイトメトリーおよび細胞分類、第２版、Ａｎｄｒｅａｓ  Ｒａｄｂｒｕｃｈ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  １９９９  （ＩＳＢＮ  ３５４０６５６３０８）；現実のままに：フローサイトメトリーおよび細胞分類におけるプロトコル、第１版、ＲＡ  ＤｉａｍｏｎｄおよびＳ  Ｄｅｍａｇｇｉｏ（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ２０００（ＩＳＢＮ  ３５４０６５１４９７）；フローサイトメトリープロトコル（分子生物学における方法）、第２版、ＴＳ  ＨａｗｌｅｙおよびＲＧ  Ｈａｗｌｅｙ（編）、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  ２００４（ＩＳＢＮ  １５８８２９２３５５）；アフィニティ分離：実践的アプローチ、Ｐ  Ｍａｔｅｊｔｓｃｈｕｋ（編）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７（ＩＳＢＮ  ０１９９６３５５０１）；およびＤａｉｎｉａｋ他  ２００７．Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １０６：１−１８を参照する。
【００４３】
「適切な培養培地」という表現は、細胞間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹細胞集団の生存および／または成長をサポートするすべての細胞培養培地を包含する。非限定的な例は、ＤＦ２０、ＤＭＥＭ−ＨａｍのＦ１２、ＤＭＥＭ、Ａｌｐｈａ−ＭＥＭなどであり、必要に応じて抗真菌剤と緩衝液を追加する。一例としてのみ、次の培地：約２０％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２、約５ｍｌのペニシリン（１０００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００００μｇ／ｍｌ）、約２．５ｍｌのアンホテリシンＢ（２５０μｇ／ｍｌ）および約５ｍｌのＨＥＰＥＳを含むＤＦ２０培地である。他の例は、ＣＴＳ（商業名）およびＴｈｅｒａｐｅａｋ（商業名）培地である。
【００４４】
細胞を「分離する」、「分散する」、「解離する」または「切り離す」適切な方法は、当技術分野で一般的に知られており、本発明で使用することができる。これらは、例えば、タンパク質分解酵素による処理、二価イオンのキレート化、機械的分解、または上記のいずれかの組み合わせを含む。好ましくは、前記細胞解離は、酵素消化、好ましくはトリプシンを使用して（例えば、上記のように）、任意に二価イオンのキレート化と組み合わせて、好ましくはＥＤＴＡを使用して（例えば、上記のように）、および／またはそのように処理した細胞の機械的解離を含んでいてもよい。後者は、例えば、小口径ピペット（例えば、１０００μｌのマイクロピペットチップ）に細胞を繰り返し通過させること、および／または細胞を含む懸濁液の流れを固体表面（例えば、細胞壁に対して）でピペッティングすることを含んでいてもよい。この方法において本発明のＭＳＣを含有する細胞懸濁液を取得することができる。
【００４５】
本明細書で使用する「曝露する」という用語は、関連する細胞を、関連する医薬分野で知られているように、例えば毒性剤または医薬品を含む化合物または組成物の潜在的効果に曝露する全ての方法を含む。そのような方法は、例えば、適切な培地中において関連する細胞と関連する化合物または組成物を接触させることを含む。
【００４６】
本発明の方法は、哺乳動物の自己細胞に対する化合物または組成物の有効性および／または副作用の評価を可能にし、それにより、遺伝的特異性または異常性に依存しない信頼できる評価を提供する。結果として、本発明の方法は、遺伝的障害に対する薬理効果の評価に特に適する。
【国際調査報告】
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