(57)【要約】本発明は毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）の発現を亢進させることにより毛髪の太毛化を維持・促進する方法、並びにアデノシン及び／又はその誘導体を含有するＦＧＦ−７の発現を亢進させる組成物、特に毛髪の太毛化を維持・促進するための頭皮外用剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
毛包の細胞におけるケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法。
【請求項２】
アデノシン、アデノシン５’−リン酸、アデノシン５’−リン酸の塩、ＣＣＰＡ（２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン）、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−９−［５−（メチルカルバモイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン）及びＮＥＣＡ（Ｎ−エチルカルボキシアミドアデノシン）から成る群から選ばれる、毛包の細胞におけるＦＧＦ−７の発現を亢進させる１又は複数種の薬剤を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより前記ＦＧＦ−７の発現を亢進させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記毛包の細胞におけるＦＧＦ−７の発現を亢進させる薬剤の少なくとも１種がアデノシンである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記毛包の細胞が毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
アデノシン、アデノシン５’−リン酸、アデノシン５’−リン酸の塩、ＣＣＰＡ、ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ及びＮＥＣＡから成る群から選ばれる薬剤を活性成分として含有する、ＦＧＦ−７発現亢進組成物。
【請求項６】
前記薬剤の少なくとも１種の薬剤がアデノシンである、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
頭皮に塗布することにより毛髪の太毛化を維持・促進させる皮膚外用剤である、請求項５又は６記載の組成物。
【請求項８】
毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞に適用し、当該細胞のＦＧＦ−７の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法。
【請求項９】
前記細胞のＦＧＦ−７の発現の亢進が、細胞から抽出されたＦＧＦ−７をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が毛乳頭細胞、不死化毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である、請求項８又は９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）の発現を亢進させることにより毛髪の太毛化を維持・促進する方法、及びＦＧＦ−７の発現を亢進させる組成物、特に毛髪の太毛化を維持・促進するための頭皮外用剤に関する。
【背景技術】  高齢化社会、ストレス社会といわれる現代社会では、頭部毛髪が様々な原因により脱毛の危機にさらされる機会がますます多くなってきている。これに対応して、より優れた「育毛料」を提供すべく様々な試みがなされている。育毛料が毛髪に与える効果として主なものに、１）発毛誘導効果（発毛促進効果，成長期誘導効果）、２）毛髪の太さを維持する又はその太さを太くする、即ち、太毛化効果、３）毛髪成長期延長効果、４）５α−レダクターゼ阻害効果（退行期早期移行抑制効果）、５）血行促進効果、６）殺菌効果、７）フケ防止効果、８）保湿効果、９）抗酸化効果等が挙げられる。
男性型脱毛は、毛髪成長期の短縮により毛包が矮小化し、毛髪径が次第に減少してうぶ毛に変化することによって特徴づけられ、男性型脱毛者では、毛髪密度（単位面積当たりの毛髪数）の減少はほとんど認められないのに対し、毛髪径が極端に減少するという事実が見出されている（特開２００２−３２２０９４号公報）。この事実に基づき、発毛誘導のみならず、上記太毛化効果の重要性にも注目されている。
しかしながら、毛髪の太毛化にどのようなメカニズムが関与しているかについては生化学・分子生物学レベルにおいて未だ解明に至っておらず、その結果、太毛化の維持・促進に有効な薬剤を含有する育毛料の研究・開発も模索段階にあるといえよう。毛髪の太毛化のメカニズムが十分に解明できれば、既存の育毛料に比べ一層顕著な効果を奏するものの提供が可能となり得る。
【発明の開示】
本発明は、毛髪の太毛化のメカニズムの生化学レベルでの解明、さらには毛髪の太毛化を維持・促進する方法及びそのための皮膚外用組成物の提供を課題とする。
ＦＧＦ−７は１９４個のアミノ酸から成る糖蛋白質で、線維芽細胞増殖因子のファミリーに属する成長因子の一つである。間葉系細胞である皮膚線維芽細胞などで分泌され、表皮細胞に存在する特異的レセプターであるＦＧＦＲ２  ＩＩＩｂに結合してパラクラインにその増殖を促進することはよく知られた事実である（Ｒｕｂｉｎ  Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８９，８６：８０２−８０６；Ｍａｒｃｈｅｓｅ  Ｃら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９９０，１４４：３２６−３３２など）。また、表皮ケラチノサイトのみならず、肝実質細胞、腸管上皮細胞（Ｈｏｕｓｅｌｅｙ  Ｒ．Ｍら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９４，９４：１７６４−１７７７）など広く上皮系細胞の増殖を促進し、毛包のケラチノサイトもこのＦＧＦ−７により増殖が促進されることが示されている（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｇ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９４，１７９：８３１−８４０）。また、マウスの実験からＦＧＦ−７が成長期の毛乳頭細胞で発現し、その機能表現に必須であるレセプターＦＧＦＲ２が毛乳頭近傍の毛母で発現していることが示され（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．１９９６；２０５（４）：３７９−３８６）、毛成長にＦＧＦ−７が関与していることが示唆されている。しかしながら、ＦＧＦ−７が毛成長においてどのような役割を果たしているかは解明されていない。そこで我々は、毛乳頭細胞においてＦＧＦ−７の発現を亢進させれば、そのターゲット細胞と考えられる毛母細胞などの増殖を介して、毛髪成長期延長作用による太毛化につながるのではないかという作業仮説を立てた。
まず、様々な薬剤を毛乳頭細胞などに作用させてＦＧＦ−７の発現を上昇させるものを探索したところ、アデノシン及びその誘導体がＦＧＦ−７遺伝子の発現を亢進させることがわかった。次に、アデノシンについての臨床試験を行ったところ、驚くべきことに太毛化効果をも有することが見出された。太毛化の維持・促進には特開２００２−３２２０９４号公報に記載の通り、毛髪成長期延長により毛成長促進作用効果を発揮する成分（例えばクララ属植物エキス）、退行期への早期移行を抑制することにより脱毛防止作用効果を発揮する成分（例えばテストテロン）、及び休止期から成長期に至る誘導作用効果を発揮する成分（例えば、デシルテトラデシルアミンオキシド）の少なくとも３種の成分が必要であると考えられていたため、単独化合物がこのような効果を奏することは驚くべきことである。
ＦＧＦ−７の毛乳頭細胞などにおける発現が亢進されるといった事実は初めて見出されたものであり、ましてやその発現の亢進が毛髪の太毛化に関与するといった事実は全く初めて見出されたものである。
従って、本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
毛包の細胞におけるＦＧＦ−７の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン５’−リン酸、アデノシン５’−リン酸の塩、並びにＣＣＰＡ（２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン）、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−９−［５−（メチルカルバモイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン）及びＮＥＣＡ（Ｎ−エチルカルボキシアミドアデノシン）から成る群から選ばれる毛包の細胞におけるＦＧＦ−７の発現を亢進させる１又は複数種の薬剤（以下、「ＦＧＦ−７発現亢進剤」と称する場合がある）を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。好ましくは、前記薬剤はアデノシンである。
別の観点において、本発明は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン５’−リン酸、アデノシン５’−リン酸の塩、並びにＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ及びＮＥＣＡから成る群から選ばれる薬剤を活性成分として含有するＦＧＦ−７発現亢進組成物を提供する。
好適な態様において、ＦＧＦ−７の発現が亢進されるのは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞である。
好適な態様において、前記薬剤はアデノシンである。
好適な態様において、前記組成物は頭皮に塗布することにより毛髪の太毛化を維持・促進させる皮膚外用剤である。
更なる別の観点において、本発明は毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法であって、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のＦＧＦ−７の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする方法を提供する。好ましくは、毛乳頭細胞は不死化毛乳頭細胞である。
好適な態様において、上記細胞のＦＧＦ−７の発現の亢進は、細胞中のＦＧＦ−７の量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記測定はＦＧＦ−７に特異的な抗体を利用するＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法による。
さらに好適な態様において、上記細胞のＦＧＦ−７の発現の亢進は、細胞から抽出されたＦＧＦ−７をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定される。
さらに好適な態様において、上記ｍＲＮＡの測定はＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応法）により行う。
本発明は、毛髪の太毛化の維持・促進に効果的な方法及びそのための組成物の提供を可能にする。
【図面の簡単な説明】  図１は、毛乳頭細胞におけるアデノシンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、ＦＧＦ−７発現量（相対値）として示す。
図２は、毛乳頭細胞におけるアデノシンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加３時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す。
図３は、毛乳頭細胞におけるアデノシン類縁物質のＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加２時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：ｎ＝４）。
図４は、毛乳頭細胞におけるフラバノンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加２時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：ｎ＝４）。
図５は、毛乳頭細胞における３，４’−ジメチルフラバノンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加２時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：ｎ＝３）。
図６は、毛乳頭細胞における３−メチルフラバノンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加２時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す（Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ：ｎ＝４）。
図７は、アデノシン含有育毛料の太毛化効果（８０μｍ以上の太毛率）を示す。
図８は、ヒト不死化毛乳頭細胞におけるアデノシンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加２時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す。
図９は、外毛根鞘細胞におけるアデノシンのＦＧＦ−７発現亢進効果を、薬剤添加３時間後のＦＧＦ−７相対発現量として示す。
【発明を実施するための最良の形態】  以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明は、毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるケラチノサイト増殖因子（ＦＧＦ−７）の発現を亢進させることを特徴とする、毛髪の太毛化を維持・促進する方法を提供する。
本発明でいう太毛化とは、一般に毛根の矮小化によるうぶ毛化が抑制され、毛髪の太さが維持される又は太くなることをいう。太毛化効果の有無の判定は、毛髪の太さや質に個人差があり、従って個人別にされることが好ましいが、一般には、頭部の所定面積の領域、例えば１ｃｍ２、２ｃｍ２、５ｃｍ２における所定の直径の毛髪、例えば直径４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ又は１００μｍ以上の毛髪の本数が、本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進剤の頭皮への適用、例えば１ヶ月、３ヶ月、又は６ヶ月以上の継続的な適用の結果、実質的に減少しなかった場合、例えばその減少率が１０％未満、好ましくは５％未満の場合、太毛が維持されたと判定され、例えば直径４０μｍ、６０μｍ、８０μｍ又は１００μｍの毛髪の本数が実質的に増加した場合、例えばその増加率が５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは２０％以上の場合、太毛化が促進されたものと判定できる。
毛包の細胞、好ましくは毛乳頭細胞におけるＦＧＦ−７の発現の亢進は、アデノシン及びその誘導体、例えば、アデノシン５’−リン酸、アデノシン５’−リン酸の塩、並びにＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ及びＮＥＣＡから成る群から選ばれる毛包の細胞におけるＦＧＦ−７の発現を亢進させる１又は複数種の薬剤を含有する皮膚外用剤を頭皮に塗布することにより達成される。
アデノシンは、リボヌクレオシドの一つで塩基部分にプリン誘導体であるアデニンを含むものである。アデノシン５’−リン酸は、５’−アデニル酸とも呼ばれ、アデノシンのリボースの５’位のヒドロキシル基にリン酸が１分子結合したヌクレオチドである。
また、アデノシン５’−リン酸の塩において、塩を形成する対イオンとしては、酸と対イオンを形成する物質であればいずれの物質でもよく、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム等を挙げることができる。また、アデノシン５’−リン酸の塩としては、その水和物を使用することもできる。
ＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＮＥＣＡはアデノシン類縁物資である。ＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＮＥＣＡはシグマ社から入手できる。
上記アデノシン、アデノシン５’−リン酸及びアデノシン５’−リン酸の塩、ＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ及びＮＥＣＡは試薬として市販されているものを使用することができる。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物は、皮膚外用剤、好ましくは頭皮外用剤、例えば育毛料又は養毛料であり得る。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物は、上記ＦＧＦ−７発現亢進剤を全量中、例えば０．０１〜２０．０質量％、好ましくは０．１〜１０．０質量％で含む。この配合量が当該組成物の全量の０．０１質量％未満では上記成分による太毛化効果が十分に発揮されないため好ましくなく、また２０．０質量％を超えると調剤上支障をきたす傾向が顕著となり、好ましくない場合がある。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、皮膚に直接に塗布または散布する経皮投与により投与することができる。また、その投与量は、外用剤の具体的態様、使用者の年齢、症状等により変化するので明確には特定することはできないが、ヒトに投与する場合、上記ＦＧＦ−７発現亢進剤が、体重１Ｋｇおよび１日当り、一般に０．０１〜１００．０ｍｇ、好ましくは０．１〜１０．０ｍｇ投与されるような量であり、この量を１日１回又は２〜４回に分けて投与することが好ましい。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は、ヒトを始めとする哺乳動物において、優れた太毛化維持・促進作用を示し、ヘアーケアー用の医薬品、医薬部外品又は化粧品として有用である。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物、特に皮膚外用剤が採り得る剤型は、好ましくは外皮に適用可能な外用剤の剤型、例えば、液状、乳液状、クリーム状、エアゾール状等の剤型を選択することができる。また、本発明の組成物の形態も任意であり、例えば、トニック、ヘアークリーム、ムース、シャンプー、リンス、乳液、化粧水、パック、エアゾール剤等の形態を採ることができる。本発明の組成物は外皮に塗布して使用するのが特に好ましい。塗布方法は特に限定されるものではないが、例えば頭皮に１日１回以上、例えば１日１から３回、塗布する皮膚面積に応じて適量、例えば１〜５ｍｌ塗布するのが好ましい。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物、特に皮膚外用剤においては、必須成分である上記香料に加えて、必要に応じて、かつ本発明の所期の効果を損なわない限り、化粧品、医薬部外品、医薬品等において一般的に用いられる、各種の油性又は水性成分、保湿剤、増粘剤、防腐剤、酸化防止剤、香料、色剤、各種の薬剤等を配合することができる。
例えば、高級脂肪酸、固形パラフィン、流動パラフィン、シリコーン油、スクワラン、モノオレイン酸グリセリル、オリーブ油、イソプロピルミリステート、高級アルコール等の油分；グリセリン、ヒアルロン酸、プロピレングリコール、マルチトール、アテロコラーゲン、乳酸ナトリウム等の保湿剤；マルメロ粘質物、カルボキシビニルポリマー、キサンタンガム等の増粘剤；ニコチン酸アミド、ニコチン酸ベンジル、ビタミンＥアセテート、センブリ抽出物、塩化カルプロニウム、アセチルコリン誘導体等の血管拡張剤；セリン、メチオニン、アルギニン等のアミノ酸類；ビタミンＢ６、ビタミンＥ類、ビオチン、パントテン酸類等のビタミン類；ニコチン酸、ニコチン酸メチル、ニコチン酸トコフェロール等のニコチン酸エステル類；セファランチン等の皮膚機能亢進剤；エストラジオール等の女性ホルモン剤；グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、アズレン等の消炎剤；ヒノキチオール、ヘキサクロロフェン、ベンザルコニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド、ウンデシレン酸、トリクロロカルバニリド、ビチオノール等の抗菌剤；メントール等の清涼剤；サリチル酸、亜鉛類、乳酸類等；クエン酸等の有機酸類を配合することができる。
本発明に係るＦＧＦ−７発現亢進組成物、特に皮膚外用剤は更に上記ＦＧＦ−７発現亢進剤以外で育毛作用が認められている、既知の育毛成分、例えばミノキシジル、サイクロスポリン等を加えることにより、さらに効果的な育毛効果が期待され得る。
本発明は更に毛髪の太毛化を維持・促進させる薬剤のスクリーニング方法を提供する。この方法は、候補薬剤を細胞、好ましくは毛包の細胞、より好ましくは毛乳頭細胞又は外毛根鞘細胞に適用し、当該細胞のＦＧＦ−７の発現を亢進させる薬剤を選定することを特徴とする。
毛乳頭細胞として、ヒト由来の正常な毛乳頭細胞、あるいは入手が容易であり、しかも増殖速度が速い点で有利な不死化毛乳頭細胞、例えば特開平１１−８９５６５号公報に記載のとおり、ＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞などを使用することもできる。また、スクリーニングに際しては、毛乳頭細胞の他に、ＦＧＦ−７を産生する間葉系細胞、例えばヒトから単離される皮膚線維芽細胞や、他の毛包由来の細胞、例えば外毛根鞘細胞などを用いることもできる。
細胞中のＦＧＦ−７発現の亢進は、例えば細胞中のＦＧＦ−７の量を測定することにより決定される。好ましくは、この測定はヒトＦＧＦ−７に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素等を利用する免疫染色法、ウェスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等、様々な方法により実施できる。また、細胞からＲＮＡを抽出し、ヒトＦＧＦ−７をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は逆転写反応後、定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。例えば、定量ＰＣＲは以下のプライマーの組み合わせを利用して実施できる。
組み合わせ１
2005044205.tif 000002
2005044205.tif 000003
ＰＣＲ産物の大きさ：２５１ｂｐ
組み合わせ２
2005044205.tif 000004
ＰＣＲ産物の大きさ：１９６ｂｐ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８（２），７７３−，２００３）
組み合わせ３
2005044205.tif 000005
ＰＣＲ産物の大きさ：５４３ｂｐ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９２，２４０８−，１９９３）
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、この実施例により、本発明の技術的範囲が限定的に解釈されるべきものではない。なお、以下の実施例等で、配合量を表す数値は、特に断わらない限り、配合される対象全体に対する質量％で表される。
【実施例】実験１：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（１）
１）細胞の培養
ヒト毛乳頭細胞（ｄｅｒｍａｌ  ｐａｐｉｌｌａｅ  ｃｅｌｌ；ＤＰＣ）は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた３４歳女性由来のＤＰＣを用いた。細胞密度が１．０〜１．５ｘ１０４個／ｃｍ２になるように播種し、ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＢＳ中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。２回／週の割合で培地交換を行い、細胞が集密に達したときは（播種から１０日〜２０日後）０．２５％トリプシンで細胞をディッシュから剥がして回収し、再び１．０〜１．５ｘ１０４個／ｃｍ２の密度で播種した。
２）培養細胞の薬剤処理
解凍後１−３回継代・培養したＤＰＣを２４ウェルプレートに４．０ｘ１０４個／ウェルの密度で播種し、４日後、亜集密の細胞にアデノシンを１００μＭの濃度に溶解したＭＥＭ（血清無添加）に交換した。コントロール細胞は、ＭＥＭ（血清無添加）のみを用い、同様に処理した。
３）ＲＴ−ＰＣＲ
アデノシン添加の２、４、８、２４時間後、ＭａｇＮＡＰｕｒｅＬＣ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で培養細胞からｍＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のキットを用いてｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡを鋳型にＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）で二重鎖ＤＮＡの副溝に結合する蛍光色素ＣｙｂｅｒＧｒｅｅｎ  Ｉを用いたリアルタイムＰＣＲにより発現量の比較を行った。詳しくは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡマスターＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、添付のマニュアルに従って全量２０μｌの反応液（ＭｇＣｌ２  ２ｍＭ，Ｆｏｒｗａｒｄ及びＲｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ各０．２５μＭ）を調製し、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒでＰＣＲ反応（酵素活性化９５℃／１０分、熱変性９５℃／１５秒、アニーリング５８℃／５秒、伸長反応７２℃／１０秒、熱変性〜伸長反応サイクルを４０回）を行い、各サイクルの伸長反応終了時の蛍光強度をモニタリングした。この蛍光強度はその時点におけるＰＣＲ産物量を反映している。遺伝子の発現量は、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅期において初期鋳型量ＡのＰＣＲ産物ＹがＰＣＲのサイクル数Ｘに対してＹ＝Ａ×２Ｘを満たしながら増幅されるものと仮定して、一定量のＰＣＲ産物が得られるまでのサイクル数から相対値を算出した。以下に本研究で用いたＦＧＦ−７増幅用プライマーを示す。
2005044205.tif 000006
ＰＣＲ産物の大きさ：２５１ｂｐ
図１にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてＦＧＦ−７の発現の顕著な亢進が認められた。
実験２：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（２）
実験１と同様にして、但しアデノシンの濃度を１０μＭ及び１００μＭの二通りとし、アデノシン処理時間を３時間として、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。その結果を図２に示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された毛乳頭細胞においてＦＧＦ−７の発現が、アデノシン濃度依存的に亢進することが確認された。
実験３−１：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（３）
実験１と同様にして、但しアデノシンの代わりにアデノシン類縁物質であるＣＣＰＡ（２−クロロ−Ｎ６−シクロペンチルアデノシン）（１００μＭ）、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ（２−クロロ−Ｎ６−（３−ヨードベンジル）−９−［５−（メチルカルバモイル）−β−Ｄ−リボフラノシル］アデニン）（５０μＭ）又はＮＥＣＡ（Ｎ−エチルカルボキシアミドアデノシン）（１０μＭ）を用い、薬剤処理時間を３時間として、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。（尚、薬剤の溶解性が低い場合には薬剤無添加のコントロールを含めた全ての薬剤入り培地においてＤＭＳＯ終濃度が０．１％となるよう調製してもよい。）
その結果を図３に示す。この図から明らかなとおり、ＣＣＰＡ、Ｃｌ−ＩＢ−ＭＥＣＡ又はＮＥＣＡで処理された毛乳頭細胞においてもＦＧＦ−７の発現の顕著な亢進が認められた。
実験３−２：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（４）
実験１と同様にして、但しアデノシンの代わりにフラバノン、３，４’−ジメチルフラバノン（ＹＧＵ４２７）、３−メチルフラバノン（ＹＧＵ４２９）をそれぞれ１００μＭを用い、薬剤処理時間を２時間としてＲＴ−ＰＣＲ実験を施した。その結果を図４，５，６にそれぞれ示す。いずれもＦＧＦ−７遺伝子の発現亢進結果を示したが、アデノシンレセプターの阻害剤である８−ＳＰＴ（８−スルフォニルテオフィリン）による阻害が認められないことから、ＦＧＦ−７の発現亢進には必ずしもアデノシンレセプターが必要ではないことを示す。
実験４：アデノシンの毛髪に対する太毛化効果の検討
以上のＦＧＦ−７亢進効果の見出された各種薬剤のうち、アデノシンを、毛髪の太毛化効果について以下の方法で検討した。
下記の組成１を有するアデノシン含有育毛料及びコントロールとしての下記の組成２を有するニコチン酸アミド含有育毛料を、３０〜５０歳の男性型脱毛を呈する男性被験者（各群５１名）の皮髪頭部に対し１日２回、適量（約２〜３ｍｌ）にて６ヶ月間にわたり塗布使用し、使用開始時との比較におけるアデノシンの太毛化効果について調べた。本実験においては、うぶ毛は４０μｍ未満の直径を有する毛髪とし、直径６０μｍ以上のものを太毛とし、直径８０μｍ以上のものは顕著に太毛化した毛髪とした。アデノシン含有育毛料を使用してから６ヶ月目において、使用開始時と比べ、うぶ毛は７％以上減少し、また直径６０μｍ以上の太毛は１０％以上増加した。更に、直径８０μｍ以上の太毛は５％以上増加した。アデノシン含有育毛料を継続的に使用すると、ニコチン酸アミド含有育毛料を使用したときと比べ、これらの太毛の増加量が顕著に高かった。その結果を図７に示す。
尚、アデノシン含有育毛料とニコチン酸アミド含有育毛料の毛髪密度に対する効果を調べたところ、両者の間に統計学的に有意な差は認められなかった（データーは示さない）。従って、培養毛乳頭細胞においてＦＧＦ−７発現亢進効果を示すアデノシンが特に毛髪の太毛化の維持・促進に有効であることが明らかとなった。
アデノシン含有育毛料（組成１）
成分                                      配合量（質量％）
アデノシン                                    ０．７５
イソステリルアルコール                        ０．５０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．５０
ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液    ０．５０
ジプロピレングリコール                      １０．０
エタノール                                  ５０．０
精製水                                          残量
ＤＬ−リンゴ酸                                  適量
ニコチン酸アミド含有育毛料（組成２）
成分                                      配合量（質量％）
ニコチン酸アミド                              ０．１０
イソステリルアルコール                        ０．５０
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油                ０．５０
ビニルピロリドン−Ｎ，Ｎ−ジメチル
エチルメタクリル酸共重合体ジエチル硫酸塩液    ０．５０
ジプロピレングリコール                      １０．０
エタノール                                  ５０．０
精製水                                          残量
ＤＬ−リンゴ酸                                  適量
実験５：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（４）
実験１と同様に、但しＤＰＣとしてヒト不死化毛乳頭細胞（特開平１１−８９５６５号公報に記載のＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原遺伝子による形質転換により得られる不死化ヒト毛乳頭細胞）を用い、薬剤処理時間を２時間として、ＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。
その結果を図８に示す。この図から明らかなとおり、毛乳頭細胞としてヒト不死化毛乳頭細胞を用いても、アデノシンによるＦＧＦ−７の発現の亢進が確認された。従って、ＦＧＦ−７発現亢進剤のスクリーニングにおいて、ヒト不死化毛乳頭細胞を用いることもできることが明らかとなった。
実験６：定量ＰＣＲ実験によるＦＧＦ−７の発現亢進の検討（５）
１）細胞の培養
ヒト外毛根鞘細胞（ｏｕｔｅｒ  ｒｏｏｔ  ｓｈｅａｔｈ  ｃｅｌｌ：ＯＲＳ）は整形手術の副産物として生じたヒト頭皮より単離・培養後凍結保存しておいた４０歳女性由来のＯＲＳを用いた。細胞密度が１．０〜１．５ｘ１０４個／ｃｍ２になるように播種し、Ｋ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）中、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で培養した。Ｐ３のＯＲＳを２４ウェルプレートに２．０×１０４個／ウェルの密度で播種して３日後、亜集密の細胞にアデノシンを１０又は１００μＭの濃度に溶解したＫＢＭ培地（クラボウ）に交換した。コントロール細胞は、ＫＢＭ培地のみを用い、同様に処理した。ＲＴ−ＰＣＲは実験１と同様に行った。
図９にその結果を示す。この図から明らかなとおり、アデノシンで処理された外毛根鞘細胞においても、毛乳頭細胞と同様、ＦＧＦ−７の発現の顕著な亢進が認められた。
【産業上の利用可能性】  本発明は、毛髪の太毛化の維持・促進に効果的な方法及びそのための組成物の提供を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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