(57)【要約】本明細書に記載されているのは、機能化赤血球系細胞の新規な調製物、ならびにヒト調剤学および獣医学用途において使用するための関連する組成物、試薬、および方法である。
2020507329.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面におけるタンパク質のアミノ酸側鎖を介して前記細胞表面に共有結合的に連結している外因性ポリペプチド剤を含む除核赤血球系細胞であって、前記クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有する、除核赤血球系細胞。
【請求項２】
除核赤血球系細胞であって、
複数の外因性ポリペプチド剤を含み、前記複数の各外因性ポリペプチド剤は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結しており、
ここで、前記細胞上の外因性ポリペプチド剤の少なくとも１０％は、アミノ酸側鎖を介して前記細胞表面におけるタンパク質に連結しており、
ここで、前記クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有する、除核赤血球系細胞。
【請求項３】
前記細胞上の外因性ポリペプチド剤の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％が、アミノ酸側鎖を介して前記細胞表面におけるタンパク質に連結している、請求項２に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項４】
遺伝子操作されていない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項５】
非天然のアミノ酸を含まない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項６】
前記外因性ポリペプチド剤が、π−クランプを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項７】
前記外因性ポリペプチド剤が、前記π−クランプを介して前記除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している、請求項６に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項８】
前記外因性ポリペプチド剤が、非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項９】
前記外因性ポリペプチド剤が、前記ｎｃＡＡを介して前記除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している、請求項８に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１０】
ソルターゼ転移シグネチャを欠いている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１１】
前記外因性ポリペプチド剤が、アルファ４ベータ７抗体、ＩＬ１０、酵素、例えば、アスパラギナーゼ、または凝固因子、例えば、第Ｘａ因子から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の除除核赤血球系細胞。
【請求項１２】
少なくとも約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、もしくは約２００，０００コピーの前記外因性ポリペプチド剤、または５，０００〜１０，０００コピー、１０，０００〜５０，０００コピー、５０，０００〜１００，０００コピー、もしくは１００，０００〜２００，０００コピーの前記外因性ポリペプチド剤を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１３】
前記外因性ポリペプチド剤が、結合パートナーを結合するペプチドリガンドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１４】
クリアランス速度を有し、ここで、作用剤の少なくとも２０％が、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日に亘り対象の循環器系中に留まる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１５】
前記細胞上のカップリング試薬の１０％未満が、未反応のカップリング試薬である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１６】
第２の外因性ポリペプチド剤をさらに含み、例えば、ここで、前記第２の外因性ポリペプチド剤が、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって前記細胞表面に共有結合的に連結している、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１７】
第３の外因性ポリペプチド剤をさらに含み、例えば、ここで、前記第３の外因性ポリペプチド剤が、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって前記細胞表面に共有結合的に連結している、請求項１６に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１８】
前記外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、事前選択された配向を伴って前記細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、前記外因性ポリペプチド剤の同じ部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または特定の残基、例えば、システイン）によって付着している、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項１９】
前記外因性ポリペプチド剤が、前記細胞の内因性分子、例えば、前記細胞表面における内因性ポリペプチドに共有結合的に連結している、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞。
【請求項２０】
少なくとも１０１０個、１０１１個、または１０１２個の請求項１〜１９のいずれか一項に記載の除核赤血球系細胞を含む、調製物。
【請求項２１】
前記調製物中の前記除核赤血球系細胞の少なくとも７０％が、前記作用剤を含む、請求項２０に記載の調製物。
【請求項２２】
前記調製物中の前記除核赤血球系細胞の少なくとも７０％が、例えば、実施例６のフローサイトメトリーアッセイにおいて、リガンドを結合する外因性ポリペプチド剤を含む、請求項２０または２１に記載の調製物。
【請求項２３】
前記調製物中の前記外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％が、事前選択された配向を伴って除核赤血球系細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、前記外因性ポリペプチド剤の同じ部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または特定の残基、例えば、システイン）によって付着している、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項２４】
作用剤で機能化されている除核赤血球系細胞を作製する方法であって、
（ａ）第１のクリックハンドルに共有結合をしている細胞を含む活性化された細胞を提供することと、
（ｂ）前記第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルに共有結合をしている作用剤（例えば、外因性ポリペプチド）を含む活性化された作用剤を提供することと、
（ｃ）前記活性化された細胞と前記活性化された作用剤とを接触させ、それによって、前記作用剤で機能化されている細胞を産生させることと
を含む、方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法によって産生される、除核赤血球系細胞。
【請求項２６】
ヒト対象に作用剤を投与する方法であって、有効数の請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞を前記ヒト対象に投与し、それによって、前記作用剤を前記ヒト対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
医薬として使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、それらのそれぞれの全内容が参照により本明細書中に組み込まれている、２０１７年２月１７日に出願された米国特許出願第６２／４６０，５８９号明細書および２０１７年８月０７日に出願された米国特許出願第６２／５４２，１４２号明細書に対する優先権を主張する。
配列表
本出願は、その内容全体が参照により援用される、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含む。２０１８年２月１５日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｒ２０８１−７０２１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは５１，１０３バイトである。
【背景技術】
【０００２】
国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット（Ｒｕｂｉｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）において記載されているように、いくつかの異なる疾患を処置するために、赤血球系細胞、例えば、赤血球を操作して、多種多様の外因性治療用タンパク質を発現させることができる。この操作は、導入遺伝子を赤血球系細胞前駆体中に導入し、次いで、前駆体が分化し、導入遺伝子を発現するように誘発することが関与し得る。しかし、いくつかのタンパク質は、例えば、これらが翻訳後修飾を必要とするため、またはこれらが宿主細胞の成長もしくは機能を損なうため、発現させることが困難である。このようなタンパク質を含む細胞を産生する改善された方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０７３５８７号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書に記載されているのは、ヒト調剤学および獣医学用途において使用するための有利および驚異的な質を有する、機能化赤血球系細胞の新規な調製物、ならびに関連する組成物、試薬、および方法である。例えば、本明細書において開示されている方法および組成物は、治療用途において使用するための最適化された収率、純度、安定性、生存率、免疫原性、機能、完全性、および／または生物学的機能を有する機能化赤血球系細胞を提供する。本明細書に記載されている機能化赤血球系細胞は、細胞の表面への作用剤の送達のために、または複雑もしくは発現させることが困難である作用剤、例えば、ポリペプチド、例えば、多量体ポリペプチド；大きなポリペプチド；ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導体化された作用剤、例えば、ポリペプチド；赤血球系細胞に対して有毒であり得るか、もしくは赤血球系細胞において効率的に発現することができない作用剤のために特に適している。作用剤はまた、脂質、核酸、糖、薬物、または小分子であり得る。
【０００５】
本明細書において開示する方法および組成物は、広範囲の適応症における使用のための、治療剤または診断用剤で誘導体化された、最適化された赤血球系細胞を提供する。最適化された試薬、中間体および合成法をまた提供する。
【０００６】
一態様において、本発明は、細胞毎に、５，０００と同数、１０，０００と同数、５０，０００と同数、１００，０００と同数、２００，０００と同数、３００，０００と同数、４００，０００と同数、５００，０００と同数、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも５０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも２００，０００、少なくとも３００，０００、少なくとも４００，０００、少なくとも５００，０００、５，０００超、１０，０００超、５０，０００超、１００，０００超、２００，０００超、３００，０００超、４００，０００超、５００，０００超、または約５，０００、約１０，０００、約５０，０００、約１００，０００、約２００，０００、約３００，０００、約４００，０００、約５００，０００のカップリング試薬を含む、赤血球系細胞、例えば、造血幹細胞、網状赤血球、または赤血球の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。例えば、いくつかの態様では、本開示は、細胞毎に少なくとも５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００のカップリング試薬を含む、赤血球系細胞の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。一部の実施形態では、本明細書に記載されている医薬調製物は、細胞毎に１０，０００まで、５０，０００まで、１００，０００まで、２００，０００まで、３００，０００まで、４００，０００まで、５００，０００までのカップリング試薬を含む。一実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％は、細胞毎に記載したレベルのカップリング試薬、例えば、アルキンカップリング試薬（ＫＲ）、または細胞毎にアジドカップリング試薬（ＡＲ）を有する。実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％は、細胞毎に記載したレベルの作用剤を有する。一実施形態では、調製物は、１０，０００個と同数、５０，０００個と同数、１００，０００個と同数、１０６個と同数、１０７個と同数、１０８個と同数、もしくは１０９個と同数、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、もしくは少なくとも１０９個、１０，０００個超、５０，０００個超、１００，０００個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、もしくは１０９個超、または約１０，０００個、約５０，０００個、約１００，０００個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、もしくは約１０９個の細胞を含む。一実施形態では、調製物は、１０１０個と同数、１０１１個と同数、もしくは１０１２個と同数、少なくとも１０１０個、少なくとも１０１１個、もしくは少なくとも１０１２、１０１０個超、１０１１個超、もしくは１０１２超、または約１０１０個、約１０１１個、もしくは約１０１２個の細胞を含む。一実施形態では、細胞はさらに、例えば、細胞内または細胞表面における、外因性核酸から発現されるポリペプチドを含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、細胞毎に、１，０００と同数、２，０００と同数、３，０００と同数、４，０００と同数、もしくは５，０００と同数、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも３，０００、少なくとも４，０００、もしくは少なくとも５，０００、１，０００超、２，０００超、３，０００超、４，０００超、もしくは５，０００超、または約１，０００、約２，０００、約３，０００、約４，０００、もしくは約５，０００のカップリング試薬を含む、赤血球系細胞、例えば、造血幹細胞、網状赤血球、または赤血球の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。例えば、いくつかの態様では、本開示は、細胞毎に少なくとも１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、または５，０００のカップリング試薬を含む、赤血球系細胞の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、残留リンカーによって細胞にカップリングしている、５，０００コピーと同数、１０，０００コピーと同数、５０，０００コピーと同数、１００，０００コピーと同数、２００，０００コピーと同数、３００，０００コピーと同数、４００，０００コピーと同数、５００，０００コピーと同数、少なくとも５，０００コピー、少なくとも１０，０００コピー、少なくとも５０，０００コピー、少なくとも１００，０００コピー、少なくとも２００，０００コピー、少なくとも３００，０００コピー、少なくとも４００，０００コピー、少なくとも５００，０００コピー、５，０００コピー超、１０，０００コピー超、５０，０００コピー超、１００，０００コピー超、２００，０００コピー超、３００，０００コピー超、４００，０００コピー超、５００，０００コピー超、または約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、約２００，０００コピー、約３００，０００コピー、約４００，０００コピー、約５００，０００コピーの作用剤、例えば、異種作用剤を含む、赤血球系細胞、例えば、造血幹細胞、網状赤血球、または赤血球の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。一部の実施形態では、残留リンカーは、クリックシグネチャを含む。例えば、いくつかの態様では、本開示は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞にカップリングしている、少なくとも５，０００コピー、１０，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、２００，０００コピー、３００，０００コピー、４００，０００コピー、５００，０００コピーの異種作用剤を含む、赤血球系細胞の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。
【０００９】
実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％は、細胞毎に記載したレベルの作用剤を有する。実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％は、第１の作用剤および第２の作用剤を含み、例えば、ここで、細胞は、作用剤のレベルが、その他の点では同様の非標識細胞の９９％において測定されるものより大きい場合、作用剤について陽性であると考えられる。実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、または４０％は、細胞毎に記載したレベルの作用剤を有する。実施形態では、調製物は、１０，０００個と同数、５０，０００個と同数、１００，０００個と同数、１０６個と同数、１０７個と同数、１０８個と同数、もしくは１０９個と同数、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、もしくは１０９個、１０，０００個超、５０，０００個超、１００，０００個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、もしくは１０９個超、または約１０，０００個、約５０，０００個、約１００，０００個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、もしくは約１０９個の細胞を含む。一実施形態では、調製物は、１０１０個と同数、１０１１個と同数、もしくは１０１２個と同数、少なくとも１０１０個、少なくとも１０１１個、もしくは少なくとも１０１２個、１０１０個超、１０１１個超、もしくは１０１２個超、または約１０１０個、約１０１１個、もしくは約１０１２個の細胞を含む。
【００１０】
一実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、分化し、除核されたＨＳＣからの網状赤血球である。実施形態では、赤血球系細胞は、造血前駆細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含む。
【００１１】
一実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、血液から得た赤血球である。
【００１２】
一実施形態では、赤血球系細胞は、遺伝子改変されており、例えば、細胞は、外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）から発現されるポリペプチドを含む。
【００１３】
一実施形態では、赤血球系細胞は、外来タンパク質で被包され、例えば、低浸透圧性に負荷されている。
【００１４】
一実施形態では、調製物は、遊離カップリング試薬、未反応のカップリング試薬、有機溶媒、金属（例えば、銅）、触媒、または非標識細胞もしくは非改変細胞を非含有であるか、または実質的に非含有である。
【００１５】
一実施形態では、作用剤は、それぞれが参照により本明細書にその全体が組み込まれている国際公開第２０１５／１５３０２号パンフレット；または国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載されている作用剤である。
【００１６】
一実施形態では、作用剤は、ペプチド剤、例えば、ポリペプチド、酵素、または抗体を含む。一実施形態では、ペプチド剤は、細胞外ドメイン、カウンターリガンド結合ドメイン、または他の生物活性のあるドメイン、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む、サイトカイン、受容体、リガンド、ホルモン、成長因子、血液因子、リソソーム蓄積酵素、アスパラギナーゼ、または上記のいずれかのフラグメントを含む。一実施形態では、作用剤は、抗原、例えば、腫瘍抗原、および感染症抗原、および自己抗原を含む。
【００１７】
一実施形態では、作用剤は、脂質；核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ；糖；薬物；または小分子を含む。
【００１８】
一実施形態では、作用剤は、約３０キロダルトン超、５０キロダルトン超、７５キロダルトン超、１００キロダルトン超、１５０キロダルトン超、２００キロダルトン超、２５０キロダルトン超、３００キロダルトン超、３５０キロダルトン超、または４００キロダルトン超のポリペプチドを含む。一実施形態では、作用剤は、約１〜２ｋＤａ、１〜５ｋＤａ、２〜５ｋＤａ、５〜１０ｋＤａ、１０〜２０ｋＤａ、２０〜５０ｋＤａ、５０〜１００ｋＤａ、１００〜２００ｋＤａ、または２００〜５００ｋＤａのポリペプチドを含む。一実施形態では、作用剤は、１０個超、１５個超、２０個超、２５個超、３０個超、４０個超、５０個超、１００個超、２００個超、３００個超、４００個超、または５００個超のアミノ酸のポリペプチドを含む。
【００１９】
一実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば、赤血球系細胞によって作製されないか、または赤血球系細胞によって非効率的に作製される翻訳後修飾を含む。実施形態では、ポリペプチド、例えば、抗体は、１個もしくは複数のジスルフィド架橋を含む。実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドは、翻訳後修飾を欠いているか、または哺乳動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞によって産生されるタンパク質より低いレベルで修飾を含む。実施形態では、ポリペプチド（例えば、抗体）は、脱グリコシル化を受ける。実施形態では、脱グリコシル化は、より低いＡＤＣＣ誘発および／またはＦｃガンマ受容体とのより低い相互作用をもたらす。
【００２０】
一部の実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドがヒト細胞、例えば、ヒト赤血球系細胞において産生される場合、ポリペプチドは、通常存在する翻訳後修飾を含まない。一部の実施形態では、ポリペプチドがヒト細胞において産生される場合、作用剤、例えば、ポリペプチドは、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％より低く、通常存在するより低いレベルでの翻訳後修飾を含む。
【００２１】
一部の実施形態では、ポリペプチド剤は、１種もしくは複数の非標準アミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、例えば、ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；α−アミノカプリル酸；ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；１，５−ダンシルアラニン；およびｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）であり得る。
【００２２】
一実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドは、赤血球系細胞の成長、機能、寿命、もしくは発生に対して有毒であるか、またはこれらを損なう。実施形態では、細胞に対して有毒である作用剤は、細胞に対して有毒である代謝物を生成する作用剤（例えば、酵素）である。
【００２３】
一実施形態では、作用剤は、多量体ポリペプチド、例えば、二量体、例えば、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体、三量体、例えば、ホモ三量体もしくはヘテロ三量体、または四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体、例えば、抗体または細胞表面受容体、例えば、病原媒介物、例えば、ウイルス、薬物、もしくは毒素についての受容体を含む。
【００２４】
一実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、例えば、複数のシステイン架橋を含む多量体ポリペプチドを含む。一実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、例えば、１個もしくは複数のシステイン架橋を含む多量体ポリペプチドを含む。
【００２５】
一実施形態では、作用剤は、発現させることが困難であるタンパク質を含む。実施形態では、発現させることが困難であるタンパク質は、赤血球系細胞においては通常起こらない翻訳後修飾を含むタンパク質である。実施形態では、翻訳後修飾は、赤血球系細胞において通常発現されないプロテアーゼによる切断を含む。実施形態では、発現させることが困難であるタンパク質は、活性化された凝固因子を含み、凝固因子を活性化させるプロテアーゼは、赤血球系細胞においては通常発現しない。切断によって活性化される例示的な活性化された凝固因子は、第Ｖａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、第ＸＩａ因子、第ＸＩＩＩａ因子、およびトロンビンを含む。
【００２６】
一実施形態では、作用剤は、下記の１つもしくは複数：ａ）同族の抗原を結合する十分な可変領域、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３；ｂ）ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の１つもしくは複数を含む重鎖定常配列；ｃ）機能的Ｆｃ領域；ならびにｄ）改変されたもしくは不活性なＦｃ領域、例えば、変異的に不活化されたＦｃ領域、またはＦｃ活性を損なうグリコシル化状態を有するＦｃ領域、例えば、脱グリコシル化Ｆｃ領域を含む、抗体分子、例えば、ポリペプチドを含む。一実施形態では、抗体は、例えば、二重特異性抗体などの多特異性抗体である。抗体の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのどちらか）などの単一ドメイン抗体、ラクダ科動物ＶＨＨドメイン、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む二価の断片などの抗体断片から形成される多特異性抗体、抗体から単離されたエピトープ結合断片、マキシ抗体、ミニ抗体、ナノボディ、細胞内抗体、二特異性抗体、三特異性抗体、四特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ、およびｂｉｓ−ｓｃＦｖが挙げられるが、これに限定されるものではない。実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，”５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、またはこれらの組合せによって定義される。
【００２７】
一実施形態では、作用剤は、抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤを含む。
【００２８】
一実施形態では、作用剤は、抗ＰＤＬ１抗体分子、抗４−１ＢＢ抗体分子、または抗α４β７抗体分子を含む。一実施形態では、作用剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗α４β７抗体、またはタンパク質Ａ／Ｇを含む。一実施形態では、作用剤は、４−１ＢＢＬ、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、アスパラギナーゼ、ＩＬ−１０、またはＭＯＧペプチドを含む。一実施形態では、作用剤は、アスパラギナーゼを含み、細胞のアスパラギナーゼ活性は、約１×１０−１２〜１×１０−９Ｕ／細胞、１×１０−１２〜１×１０−１１Ｕ／細胞、１×１０−１１〜１×１０−１０Ｕ／細胞、または１×１０−１０〜１×１０−９Ｕ／細胞である。
【００２９】
別の態様において、本発明は、残留リンカーによって細胞にカップリングしている、１，０００コピーと同数、２，０００コピーと同数、３，０００コピーと同数、４，０００コピーと同数、５，０００コピーと同数、１０，０００コピーと同数、５０，０００コピーと同数、１００，０００コピーと同数、２００，０００コピーと同数、３００，０００コピーと同数、４００，０００コピーと同数、もしくは５００，０００コピーと同数、少なくとも１，０００コピー、少なくとも２，０００コピー、少なくとも３，０００コピー、少なくとも４，０００コピー、少なくとも５，０００コピー、少なくとも１０，０００コピー、少なくとも５０，０００コピー、少なくとも１００，０００コピー、少なくとも２００，０００コピー、少なくとも３００，０００コピー、少なくとも４００，０００コピー、もしくは少なくとも５００，０００コピー、１，０００コピー超、２，０００コピー超、３，０００コピー超、４，０００コピー超、５，０００コピー超、１０，０００コピー超、５０，０００コピー超、１００，０００コピー超、２００，０００コピー超、３００，０００コピー超、４００，０００コピー超、もしくは５００，０００コピー超、または約１，０００コピー、約２，０００コピー、約３，０００コピー、約４，０００コピー、約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、約２００，０００コピー、約３００，０００コピー、約４００，０００コピー、もしくは約５００，０００コピーの第１の作用剤、例えば、異種作用剤；および第２の残留リンカーによって細胞にカップリングしている、１，０００コピーと同数、２，０００コピーと同数、３，０００コピーと同数、４，０００コピーと同数、５，０００コピーと同数、１０，０００コピーと同数、５０，０００コピーと同数、１００，０００コピーと同数、２００，０００コピーと同数、３００，０００コピーと同数、４００，０００コピーと同数、もしくは５００，０００コピーと同数、少なくとも１，０００コピー、少なくとも２，０００コピー、少なくとも３，０００コピー、少なくとも４，０００コピー、少なくとも５，０００コピー、少なくとも１０，０００コピー、少なくとも５０，０００コピー、少なくとも１００，０００コピー、少なくとも２００，０００コピー、少なくとも３００，０００コピー、少なくとも４００，０００コピー、もしくは少なくとも５００，０００コピー、１，０００コピー超、２，０００コピー超、３，０００コピー超、４，０００コピー超、５，０００コピー超、１０，０００コピー超、５０，０００コピー超、１００，０００コピー超、２００，０００コピー超、３００，０００コピー超、４００，０００コピー超、もしくは５００，０００コピー超、または約１，０００コピー、約２，０００コピー、約３，０００コピー、約４，０００コピー、約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、約２００，０００コピー、約３００，０００コピー、約４００，０００コピー、もしくは約５００，０００コピーの第２の作用剤、例えば、異種作用剤を含む、赤血球系細胞、例えば、造血幹細胞、網状赤血球、または赤血球の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。例えば、いくつかの態様では、本開示は、クリックシグネチャを有する残留リンカーによって細胞にカップリングしている、少なくとも１，０００コピーの第１の異種作用剤；および第２のクリックシグネチャを有する第２の残留リンカーによって細胞にカップリングしている、少なくとも１，０００コピーの第２の異種作用剤を含む、赤血球系細胞の調製物、例えば、医薬調製物に注目する。一実施形態では、第１および第２の残留リンカーは、異なる構造を有する。一実施形態では、第１および第２の残留リンカーは、同じ構造を有する。一実施形態では、第１および第２の残留リンカーは、同じ構造を有するが、反対の配向を有する。実施形態では、第１のクリックシグネチャは、第２のクリックシグネチャと異なる。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも２，０００コピーの第１の異種作用剤および少なくとも２，０００コピーの第２の異種作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも５，０００コピーの第１の異種作用剤および少なくとも５，０００コピーの第２の異種作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１０，０００コピーの第１の異種作用剤および少なくとも１０，０００コピーの第２の異種作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも５０，０００コピーの第１の異種作用剤および少なくとも５０，０００コピーの第２の異種作用剤を含む。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１００，０００コピーの第１の異種作用剤および少なくとも１００，０００コピーの第２の異種作用剤を含む。
【００３０】
一実施形態では、調製物中の細胞の少なくとも約１％、２％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％は、細胞毎に記載したレベルの作用剤を有する。実施形態では、調製物は、１０，０００個と同数、５０，０００個と同数、１００，０００個と同数、１０６個と同数、１０７個と同数、１０８個と同数、１０９個と同数、１０１０個と同数、１０１１個と同数、もしくは１０１２個と同数、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個、少なくとも１０１０個、少なくとも１０１１個、もしくは少なくとも１０１２個、１０，０００個超、５０，０００個超、１００，０００個超、１０６個超、１０７個超、１０８個超、１０９個超、１０１０個超、１０１１個超、もしくは１０１２個超、または約１０，０００個、約５０，０００個、約１００，０００個、約１０６個、約１０７個、約１０８個、約１０９個、約１０１０個、約１０１１個、もしくは約１０１２個の細胞を含む。実施形態では、調製物は、少なくとも１０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも１０６個、少なくとも１０７個、少なくとも１０８個、少なくとも１０９個、少なくとも１０１０個、少なくとも１０１１個、もしくは少なくとも１０１２個の細胞を含む。
【００３１】
一実施形態では、赤血球系細胞はさらに、１種もしくは複数のさらなる作用剤、例えば、第Ｎの作用剤を含み、ここで、Ｎは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、または２００の作用剤であり、ここで、それぞれのさらなる作用剤について、細胞は、残留リンカーによって細胞にカップリングしている、１，０００コピーと同数、２，０００コピーと同数、３，０００コピーと同数、４，０００コピーと同数、５，０００コピーと同数、１０，０００コピーと同数、５０，０００コピーと同数、１００，０００コピーと同数、２００，０００コピーと同数、３００，０００コピーと同数、４００，０００コピーと同数、もしくは５００，０００コピーと同数、少なくとも１，０００コピー、少なくとも２，０００コピー、少なくとも３，０００コピー、少なくとも４，０００コピー、少なくとも５，０００コピー、少なくとも１０，０００コピー、少なくとも５０，０００コピー、少なくとも１００，０００コピー、少なくとも２００，０００コピー、少なくとも３００，０００コピー、少なくとも４００，０００コピー、もしくは少なくとも５００，０００コピー、１，０００コピー超、２，０００コピー超、３，０００コピー超、４，０００コピー超、５，０００コピー超、１０，０００コピー超、５０，０００コピー超、１００，０００コピー超、２００，０００コピー超、３００，０００コピー超、４００，０００コピー超、もしくは５００，０００コピー超、または約１，０００コピー、約２，０００コピー、約３，０００コピー、約４，０００コピー、約５，０００コピー、約１０，０００コピー、約５０，０００コピー、約１００，０００コピー、約２００，０００コピー、約３００，０００コピー、約４００，０００コピー、もしくは約５００，０００コピーのさらなる作用剤、例えば、異種作用剤を含む。
【００３２】
一実施形態では、本明細書において開示されている調製物、例えば、医薬調製物は、遊離カップリング試薬、未反応のカップリング試薬、有機溶媒、金属（例えば、銅）、触媒、または非標識細胞もしくは非改変細胞を非含有であるか、または実質的に非含有である。
【００３３】
実施形態では、本明細書において開示されている細胞または調製物、例えば、医薬調製物において、細胞上のカップリング試薬の１０％未満、２０％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、または９０％未満は、未反応のカップリング試薬である。実施形態では、本明細書において開示されている細胞または調製物、例えば、医薬調製物において、細胞上のカップリング試薬の１５％未満、１４％未満、１３％未満、１２％未満、１１％未満、または１０％未満は、未反応のカップリング試薬である。
【００３４】
一実施形態では、作用剤は、ペプチド剤、例えば、ポリペプチド、タンパク薬物、酵素、抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、サイトカイン、サイトカイン受容体、受容体分子、リガンド、ホルモン、成長因子、血液因子、リソソーム蓄積酵素、アスパラギナーゼ、抗原（例えば、腫瘍抗原、感染症抗原、もしくは自己抗原）、または免疫刺激性分子（例えば、共刺激分子）を含む。実施形態では、抗体は、全抗体、そのフラグメント、単鎖抗体、ヒト化抗体；マウス抗体；キメラのマウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、およびＦｄフラグメント、二特異性抗体、ならびに抗体関連ポリペプチドを含む。
【００３５】
別の態様において、本発明は、ａ）第１のカップリング試薬、例えば、ＧＭＰグレードのカップリング試薬を赤血球系細胞へとカップリングし、それによって、医薬調製物、生成物、または中間体を作製することを含む、医薬調製物、生成物、または中間体を作製する方法に注目する。一実施形態では、方法は、ｂ）例えば、第１のカップリング試薬と第２のカップリング試薬との反応に適した条件下で、細胞と、第２のカップリング試薬、例えば、ＧＭＰグレードのカップリング試薬にカップリングしている作用剤とを接触させることをさらに含む。実施形態では、方法は、例えば、ステップａ）の前または後に、第２のカップリング試薬を作用剤にカップリングすることを含む。実施形態では、ステップａ）の中間体を、ステップｂ）の接触の前に貯蔵する。実施形態では、第２のカップリング試薬にカップリングしている作用剤を、ステップｂ）の接触の前に貯蔵する。
【００３６】
一実施形態では、方法は、ａ）におけるカップリングのための赤血球系細胞の集団を提供することを含む。一実施形態では、方法は、第１のカップリング試薬と反応する、調製物中の実体を低減または最小化することを含む。一実施形態では、方法は、細胞を処理し、例えば、洗浄して、例えば、第１のカップリング試薬と反応することができる細胞から未結合の材料、例えば、タンパク質を除去することを含む。
【００３７】
一実施形態では、第２の作用剤は、細胞にカップリングしており、ここで、方法は、ｃ）第２のカップリング試薬、例えば、ＧＭＰグレードのカップリング試薬を赤血球系細胞へとカップリンすることと、ｄ）例えば、第１のカップリング試薬と第２のカップリング試薬との反応に適した条件下で、細胞と第２のカップリング試薬、例えば、ＧＭＰグレードのカップリング試薬にカップリングしている第２の作用剤とを接触させることとを含む。
【００３８】
実施形態では、方法は、
ａ）第１のカップリング試薬を細胞にカップリングすることと、
ｂ）細胞と、第１のカップリング試薬と反応することができる第２のカップリング試薬にカップリングしている第１の作用剤とを接触させることと、
ｃ）第３のカップリング試薬を細胞にカップリングすることと、
ｄ）細胞と、第３のカップリング試薬と反応することができる第４のカップリング試薬にカップリングしている第２の作用剤とを接触させることと
を含む。
【００３９】
実施形態では、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）は、下記の順序の１つで行われる。
ａ）、次いで、ｂ）、次いで、ｃ）、次いで、ｄ）；
ａ）、次いで、ｃ）、次いで、ｂ）、次いで、ｄ）；
ａ）、次いで、ｃ）、次いで、ｄ）、次いで、ｂ）；
ａ）、次いで、ｃ）、次いで、ｂ）およびｄ）を同時に；
ｃ）、次いで、ｄ）、次いで、ａ）、次いで、ｂ）；
ｃ）、次いで、ａ）、次いで、ｂ）、次いで、ｄ）；
ｃ）、次いで、ａ）、次いで、ｄ）、次いで、ｂ）；
ｃ）、次いで、ａ）、次いで、ｂ）およびｄ）を同時に；
ａ）およびｃ）を同時に、次いで、ｂ）、次いで、ｄ）；
ａ）およびｃ）を同時に、次いで、ｄ）、次いで、ｂ）；または
ａ）およびｃ）を同時に、次いで、ｂ）およびｄ）を同時に。
【００４０】
一実施形態では、カップリング反応のコンジュゲーション効率は、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、９７％超、または９８％超である。
【００４１】
一実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し、分化し、除核されたＨＳＣからの網状赤血球である。
【００４２】
一実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、血液から得た赤血球である。
【００４３】
一実施形態では、赤血球系細胞は、遺伝子改変されており、例えば、細胞は、外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）から発現されるポリペプチドを含む。
【００４４】
一実施形態では、赤血球系細胞は、細胞タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡに結合する作用剤である外来タンパク質で被包され、例えば、低浸透圧性に負荷されている。
【００４５】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている除核細胞は、網状赤血球、赤血球、または血小板である。
【００４６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載されている調製物、組成物、または細胞を対象に投与し、それによって、作用剤を対象に投与し、例えば、対象を処置することを含む、作用剤を対象に投与し、例えば、対象を処置する方法に注目する。一実施形態では、方法は、例えば、作製するか、または別の実体から得ることによって、調製物、組成物、または細胞を提供することを含む。別の態様において、本発明は、疾患または障害、例えば、本明細書に記載されている疾患または障害の処置において使用するための、本明細書に記載されている細胞（例えば、除核赤血球系細胞）に注目する。別の態様において、本発明は、疾患または障害、例えば、本明細書に記載されている疾患または障害を処置するための医薬の製造のための、本明細書に記載されている細胞（例えば、除核赤血球系細胞）に注目する。
【００４７】
一実施形態では、細胞は、対象に対して同種異系である。
【００４８】
一実施形態では、細胞は、対象に対して自己である。
【００４９】
一実施形態では、作用剤は、細胞にカップリングする。一実施形態では、作用剤は、ペプチド剤、例えば、ポリペプチド、酵素、または抗体を含む。一実施形態では、作用剤は、細胞外ドメイン、カウンターリガンド結合ドメイン、または他の生物活性のあるドメインを含む、サイトカイン、受容体、リガンド、ホルモン、成長因子、血液因子、リソソーム蓄積酵素、アスパラギナーゼ、または上記のいずれかのフラグメントを含む。
【００５０】
一実施形態では、作用剤を細胞にカップリングすることと、および細胞を対象に投与することとの間に、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満が経過する。
【００５１】
一実施形態では、細胞は自己であり、対象からの細胞の除去および対象への細胞の投与の間に、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、３日未満、２日未満、または１日未満が経過する。
【００５２】
一実施形態では、対象からの細胞の除去および対象（例えば、同じまたは異なる対象）への細胞の投与の間に、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１４日、２１日、または２８日が経過する。
【００５３】
一実施形態では、方法は、対象を評価し、評価に応答して、細胞へのカップリングのための作用剤を選択することを含む。
【００５４】
実施形態では、カップリングステップは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。例えば、実施形態では、カップリング剤は、カップリング試薬が細胞、例えば、赤血球系細胞にカップリングすることを可能とする条件下で対象に投与される。一部の実施形態では、第２のカップリング試薬にカップリングしている作用剤を、作用剤が細胞、例えば、赤血球系細胞にカップリングすることを可能とする条件下で対象に投与する。
【００５５】
別の態様において、本発明は、実体から作用剤、例えば、対象の処置に適した作用剤の同一性を受け取り、本明細書に記載されている方法によって作用剤を細胞にカップリングし、それによって、調製物、組成物、または細胞を提供することを含む、調製物、組成物、または細胞を提供する方法に注目する。
【００５６】
別の態様において、本発明は、下記の１つもしくは複数を含むキットに注目する：ａ）任意選択で、赤血球系細胞；ｂ）第１のカップリング試薬；ｃ）第２のカップリング試薬；ｄ）作用剤；ｅ）任意選択で、カップリング試薬にカップリングしている赤血球系細胞；ｆ）カップリング試薬にカップリングしている作用剤；またはｇ）ａ〜ｆのいずれかの存在を検出するための試薬。
【００５７】
実施形態では、キットは、ｂ、ｃ、ｄ、ｆおよびｇの１つもしくは複数を含む。
【００５８】
いくつかの態様では、本発明は、ａ）活性化された細胞（例えば、赤血球系細胞）、ｂ）第１の活性化された作用剤、ｃ）第２の活性化された作用剤、およびｄ）任意選択で第３またはさらなる活性化された作用剤を含むキットに注目する。
【００５９】
いくつかの態様では、本発明は、ａ）第三者（例えば、医師、医院、または病院）からの指示を受け取り、１種もしくは複数の特定の作用剤を有する機能化細胞を提供することと、ｂ）活性化された細胞と、作用剤または複数（例えば、２、３、４、５、１０、２０、もしくはそれ超）の異なる作用剤とを接触させ、それによって、機能化細胞を作製することと、ｃ）機能化細胞を第三者に提供することとを含む、機能化細胞（例えば、本明細書に記載されている機能化細胞）を作製する方法に注目する。
【００６０】
いくつかの態様では、本発明は、ａ）指示を第三者（例えば、実験室）に伝達し、１種もしくは複数の特定の作用剤を有する機能化細胞を提供することと、ｂ）機能化細胞を第三者から受け取ることと、ｃ）機能化細胞を、それを必要とする対象に投与することとを含む、機能化細胞（例えば、本明細書に記載されている機能化細胞）を得る方法に注目する。
【００６１】
いくつかの態様では、本開示は、
細胞表面における作用剤（例えば、外因性ポリペプチド）、および
作用剤を細胞表面に（例えば、細胞表面におけるポリペプチドまたは炭水化物に）共有結合的に連結するリンカー、例えば、残留リンカー（ここで、残留リンカーは、クリックシグネチャを含む）
を含む、細胞（例えば、赤血球系細胞および／または除核細胞、例えば、除核赤血球系細胞）に注目する。
【００６２】
一部の実施形態では、クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成された。一部の実施形態では、クリックシグネチャは、本明細書に記載されているクリックシグネチャの構造を有する。
【００６３】
本開示は、いくつかの態様では、細胞を構成するタンパク質、例えば、細胞表面におけるタンパク質のアミノ酸側鎖を介して、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している外因性ポリペプチド剤を含む、細胞（例えば、赤血球系細胞および／または除核細胞、例えば、除核赤血球系細胞）を提供し、ここで、クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されるか、またはクリックシグネチャ、例えば、本明細書に記載されているクリックシグネチャの構造を有する。
【００６４】
本開示は、いくつかの態様では、複数の外因性ポリペプチド剤を含む、細胞（例えば、赤血球系細胞および／または除核細胞、例えば、除核赤血球系細胞）を提供し、
複数の各外因性ポリペプチド剤は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結しており、
ここで、細胞上の外因性ポリペプチド剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、アミノ酸側鎖を介して細胞を構成するタンパク質、例えば、細胞表面におけるタンパク質に連結しており、ここで、クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャ、例えば、本明細書に記載されているクリックシグネチャの構造を有する。
【００６５】
いくつかの態様では、本開示は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している複数のコピーの外因性ポリペプチド剤を含む除核赤血球系細胞を提供し、ここで、クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有し、ここで、本明細書におけるリスト１の１つもしくは複数が適用される。一部の実施形態では、細胞は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている。一部の実施形態では、細胞は、クリックシグネチャに共有結合的に連結しているソルターゼ転移シグネチャを含まない。
【００６６】
いくつかの態様では、本開示は、クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している複数のコピーの外因性ポリペプチド剤を含む除核赤血球系細胞を提供し、ここで、クリックシグネチャは、クリック反応の生成物として形成されたか、またはクリックシグネチャの構造を有し、ここで、複数の外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、細胞表面に対して同じ配向を有する。一部の実施形態では、細胞は、ソルターゼ転移シグネチャを欠いている。一部の実施形態では、細胞は、クリックシグネチャへと共有結合的に連結しているソルターゼ転移シグネチャを含まない。一部の実施形態では、細胞は遺伝子操作されておらず、例えば、外因性核酸から発現されたポリペプチドを含まない。他の実施形態では、細胞は、遺伝子操作されており、例えば、外因性核酸から発現されたポリペプチドを含む。一部の実施形態では、細胞は、非天然のアミノ酸を含まない。一部の実施形態では、細胞は、非天然のアミノ酸を有する膜貫通タンパク質を含まない。
【００６７】
一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、π−クランプを含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、π−クランプを介して除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している。一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、ｎｃＡＡを含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、ｎｃＡＡを介して除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している。一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、２個もしくはそれより多いシステイン残基を含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、２個もしくはそれより多いシステイン残基を介して、例えば、チオリンカーを介して除核赤血球系細胞に共有結合的に連結している。
【００６８】
一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤は、結合パートナーを結合するペプチドリガンドである。
【００６９】
一部の実施形態では、細胞はさらに、第２の作用剤、例えば、第２の外因性ポリペプチド剤を含み、例えば、ここで、第２の外因性ポリペプチド剤は、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している。一部の実施形態では、細胞はさらに、第３の作用剤、例えば、第３の外因性ポリペプチド剤を含み、例えば、ここで、第３の外因性ポリペプチド剤は、クリックシグネチャを含む第２の残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している。
【００７０】
一部の実施形態では、作用剤、例えば、外因性ポリペプチド剤は、細胞の内因性分子、例えば、細胞表面における内因性ポリペプチドに共有結合的に連結している。
【００７１】
一部の実施形態では、外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、事前選択された配向を伴って細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、外因性ポリペプチド剤の同じ部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、または特定の残基、例えば、特定のｎｃＡＡ、または特定の複数の残基、例えば、２個のシステイン残基）によって付着している。本明細書に記載されている調製物の一部の実施形態では、調製物中の外因性ポリペプチド剤の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％は、事前選択された配向を伴って除核赤血球系細胞表面に共有結合的に連結しており、例えば、同じ部分または外因性ポリペプチド剤の部分（例えば、Ｎ末端、Ｃ末端、もしくは特定の残基、例えば、特定のｎｃＡＡ、または特定の複数の残基、例えば、２個のシステイン残基）によって付着している。
【００７２】
一部の実施形態では、作用剤、例えば、外因性ポリペプチド剤は、細胞の内因性分子、例えば、細胞表面における内因性ポリペプチドに共有結合的に連結している。一部の実施形態では、リンカーは、作用剤を、細胞の内因性分子、例えば、細胞表面における内因性ポリペプチドまたは糖に接続させる。一部の実施形態では、リンカーは、作用剤を細胞の外因性分子、例えば、細胞表面における外因性ポリペプチドまたは糖に接続させる。
【００７３】
一部の実施形態では、クリックシグネチャは、環状部分、例えば、複素環、例えば、トリアゾール、例えば、二置換トリアゾール、または環付加物を含む。一部の実施形態では、クリックシグネチャは、シクロアルケン、例えば、シクロヘキセン、アルキルスルフィド、ジヒドロピラジン、例えば、１，２−ジヒドロピラジン、ジアゾール、または硫黄含有環、例えば、チオピランを含む。
【００７４】
一部の実施形態では、クリックシグネチャは、環化付加（例えば、１，３−双極子環化付加もしくはヘテロ−ディールズアルダー環化付加）、求核開環（例えば、歪んだ複素環式求電子試薬、例えば、アジリジン、エポキシド、環状スルフェート、アジリジニウムイオン、およびエピスルホニウムイオンを開くこと）、非アルドールタイプのカルボニル化学（例えば、尿素、チオ尿素、ヒドラゾン、オキシムエーテル、アミド、もしくは芳香族複素環の形成）、または炭素−炭素多重結合への付加（例えば、エポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシル化、スルフェニルハライド付加、ニトシルハライド付加、もしくはマイケル付加）によって形成されたか、形成されることができる。
【００７５】
いくつかの態様では、本開示は、
（ａ）第１のカップリング部分、例えば、第１のクリックハンドルに結合している、例えば、共有結合をしている細胞を含む活性化された細胞を提供することと、
（ｂ）第１のカップリング部分と反応することができる第２のカップリング部分、例えば、第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルに結合している、例えば、共有結合をしている作用剤（例えば、外因性ポリペプチド）を含む活性化された作用剤を提供することと、
（ｃ）活性化された細胞と活性化された作用剤とを接触させ、それによって、作用剤で機能化されている細胞を産生することと
を含む、作用剤で機能化されている細胞（例えば、赤血球系細胞、例えば、除核赤血球系細胞）を作製（例えば、製造）する方法に注目する。
【００７６】
実施形態では、方法は、細胞と第１のカップリング部分、例えば、第１のクリックハンドルを含む第１のカップリング試薬とを接触させ、それによって、活性化された細胞を産生することを含む。実施形態では、方法は、作用剤と第２のカップリング部分、例えば、第２のクリックハンドルを含む第２のカップリング試薬とを接触させ、それによって、活性化された作用剤を産生することを含む。実施形態では、方法は、例えば、非標準アミノ酸の組込みによって、第２のカップリング部分、例えば、第２のクリックハンドルを含有するように作用剤を合成することを含む。実施形態では、方法は、例えば、第１のカップリング部分を含む非標準アミノ酸の組込みによって、または第１のカップリング部分を含む糖の組込み（例えば、炭水化物への）によって、第１のカップリング部分を含む細胞を作製することを含む。
【００７７】
実施形態では、細胞と第１のカップリング試薬との接触は、作用剤と第２のカップリング試薬との接触の前または後に起こる。実施形態では、細胞と第１のカップリング試薬とを接触させること、および作用剤と第２のカップリング試薬とを接触させることは、同時に起こり、例えば、同時に始まるか、同時に終わるか、または部分的な重複を有する。
【００７８】
実施形態では、第１のカップリング試薬は、膜不透過性である。実施形態では、第２のカップリング試薬は、膜不透過性である。実施形態では、第１のカップリング試薬は、膜透過性である。実施形態では、第２のカップリング試薬は、膜透過性である。
【００７９】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書における方法によって産生される細胞、例えば、赤血球系細胞、例えば、除核赤血球系細胞に注目する。一部の実施形態では、方法は、（ａ）第１のクリックハンドルに共有結合をしている細胞を含む活性化された細胞を提供することと、（ｂ）第１のクリックハンドルと反応することができる第２のクリックハンドルと共有結合をしている作用剤（例えば、外因性ポリペプチド）を含む活性化された作用剤を提供することと、（ｃ）活性化された細胞と活性化された作用剤とを接触させ、それによって、作用剤で機能化されている細胞を産生することとを含む。
【００８０】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されている機能化細胞を、それを必要とする対象に投与することを含む、疾患を処置する方法に注目する。
【００８１】
一部の実施形態では、第１のカップリング試薬は、作用剤上の下記の部分
ａ）例えば、リシンもしくはＮ末端中の第一級アミン（−ＮＨ２）、
ｂ）例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはＣ末端中のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）、
ｃ）例えば、システイン中のスルフヒドリル（−ＳＨ）、または
ｄ）例えば、糖タンパク質、例えば、酸化された糖タンパク質中のカルボニル（−ＣＨＯ）、例えば、ケトンもしくはアルデヒド基
の１つと反応する第１の基質反応性部分を含む。
【００８２】
一部の実施形態では、第２のカップリング試薬は、細胞上の下記の部分（例えば、細胞上のタンパク質または炭水化物の部分）：
ａ）例えば、リシンもしくはＮ末端中の第一級アミン（−ＮＨ２）、
ｂ）例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、もしくはＣ末端中のカルボキシル（−ＣＯＯＨ）、
ｃ）例えば、システイン中のスルフヒドリル（−ＳＨ）、または
ｄ）例えば、糖タンパク質、例えば、酸化された糖タンパク質中のカルボニル（−ＣＨＯ）、例えば、ケトンもしくはアルデヒド基
の１つと反応する第１の基質反応性部分を含む。
【００８３】
一部の実施形態では、第１の基質反応性部分および第２の基質反応性部分は、同じタイプの部分と反応し、例えば、第１の基質反応性部分は、第１の第一級アミンと反応し、第２の基質反応性部分は、第２の第一級アミンと反応する。一部の実施形態では、第１の基質反応性部分および第２の基質反応性部分は、異なるタイプの部分と反応する。
【００８４】
一部の実施形態では、第１または第２のカップリング試薬は、ソルターゼ認識部位、例えば、Ｎ末端ＧＧＧまたはＣ末端ＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含む。
【００８５】
一部の実施形態では、カップリング試薬（例えば、第１または第２のカップリング試薬）は、クリックハンドルを含む。実施形態では、クリックハンドルは、アルキン、例えば、歪んだアルキン、例えば、シクロオクチン、例えば、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルを含む。一部の実施形態では、クリックハンドルは、アジド、例えば、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステルを含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書における方法はさらに、機能化細胞と１個のみのカップリング部分、例えば、１個のクリックハンドルを含む停止試薬とを接触させることを含む。実施形態では、停止試薬は、細胞上の未反応のクリックハンドルと反応し、それによって、細胞上の未反応のクリックハンドルの数を低減させることができる。実施形態では、停止試薬は、作用剤上の未反応のクリックハンドルと反応し、それによって、作用剤上の未反応のクリックハンドルの数を低減させることができる。実施形態では、方法は、逐次的に、いずれかの順序で、機能化細胞と細胞上の未反応のクリックハンドルと反応することができる停止試薬とを接触させることと、機能化細胞と作用剤上の未反応のクリックハンドルと反応することができる停止試薬とを接触させることとを含む。実施形態では、未反応の停止試薬は、２つの接触ステップの間に洗い流される。実施形態では、停止試薬は、作用剤より低い分子量および／または低い立体障害を有する。実施形態では、停止試薬は、検出可能な標識を含む。一部の実施形態では、検出可能な標識を有する停止試薬を、機能化細胞のバッチの一定分量と接触させる。一部の実施形態では、機能化細胞と反応する検出可能な標識の量が所定の閾値未満である場合、バッチは承認または放出される。一部の実施形態では、機能化細胞と反応する検出可能な標識の量が所定の閾値超である場合、バッチは保留されるか、またはさらなる処理に供され、例えば、停止試薬と接触させる。実施形態では、停止試薬は、アジドまたはアルキン基を含む。実施形態では、いったん停止試薬が作用剤または細胞と反応すると、これは実質的に反応性ではなく、例えば、野生型ヒトグリコホリンＡのＮ末端より反応性ではない。
【００８７】
一部の実施形態では、除核赤血球系細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．５％、９９．８％、または９９．９％は標識されており、例えば、ここで、細胞は、作用剤のレベルがその他の点では同様の非標識細胞の９９％において測定されるものより大きい場合、標識されていると考えられる。
【００８８】
一部の実施形態では、除核赤血球系細胞は、細胞毎に平均で５０〜２００，０００コピーの作用剤、例えば、細胞毎に５０〜１００、１００〜２００、２００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜２，０００、２，０００〜５，０００、５，０００〜１０，０００、１０，０００〜２０，０００、２０，０００〜５０，０００、５０，０００〜１００，０００、もしくは１００，０００〜２００，０００コピーの作用剤、または細胞毎に少なくとも５０、１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、もしくは２００，０００コピーの作用剤、または細胞毎に５０まで、１００まで、２００まで、５００まで、１，０００まで、２，０００まで、５，０００まで、１０，０００まで、２０，０００まで、５０，０００まで、１００，０００まで、もしくは２００，０００コピーまでの作用剤で標識されている（または本明細書に記載されている除核赤血球系細胞は、これらで標識されている）。
【００８９】
一部の実施形態では、少なくとも１０７個、１０８個、または１０９個の除核赤血球系細胞が、標識されている。
【００９０】
一部の実施形態では、除核赤血球系細胞の集団は、少なくとも１ｎｇ、２ｎｇ、５ｎｇ、１０ｎｇ、２０ｎｇ、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または５００ｎｇの作用剤、例えば、外因性ポリペプチドで標識されている。
【００９１】
一部の実施形態では、連結されたポリペプチド剤は、抗ＰＤ−Ｌ１、抗α４β７、抗ｍ４１ＢＢＬ、４−１ＢＢＬ、第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、アスパラギナーゼ、またはＭＯＧペプチドを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、例えば、実施例６のフローサイトメトリーアッセイにおいて、標識された赤血球系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、リガンドを結合する。一部の実施形態では、例えば、実施例６のフローサイトメトリーアッセイにおいて、除核赤血球系細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％は、リガンドを結合する作用剤を含む。実施形態では、細胞が、作用剤を欠いているその他の点では同様の細胞の９９％において測定されるものよりも大きいシグナルを有する場合、細胞は、実施例６のフローサイトメトリーアッセイによってリガンドを結合すると考えられる。
【００９３】
実施形態では、作用剤は、内因性ポリペプチドのアミノ酸に連結している（例えば、介在する原子を伴わずに隣接して連結しているか、または作用剤および内因性ポリペプチドの間の１個もしくは複数の原子を有する）。実施形態では、リンカーは、少なくとも５ｎｍ、１０ｎｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、５０ｎｍ、６０ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、または１００ｎｍの長さを有する。実施形態では、リンカーは、約３０〜１００ｎｍ、約４０〜９０ｎｍ、約５０〜８０ｎｍ、または約６０〜７０ｎｍの長さを有する。実施形態では、リンカーは、作用剤が赤血球系細胞のグリコカリックスの外側であるような長さを有する。一部の実施形態では、リンカーは、ＰＥＧ、例えば、約３〜２０、例えば、約４〜１３、例えば、約４、約５、約１２、または約１３の長さを有するＰＥＧを含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ成分の長さは、約３０〜６０オングストローム、例えば、約３０〜４０オングストローム、約４０〜５０オングストローム、または約５０〜６０オングストロームである。一部の実施形態では、リンカーは、約５０〜２００オングストローム、約２００〜４００オングストローム、約４００〜６００オングストローム、約６００〜８００オングストロームまたは約８００〜１０００オングストロームの長さを有するＰＥＧを含む。
【００９４】
一部の実施形態では、リスト１の１つもしくは複数が適用され、ここで、リスト１は、以下である。
ａ）作用剤は、内因性膜タンパク質のグリシン以外のアミノ酸に（例えば、残留リンカーを介して）連結しており、例えば、少なくとも１個の非グリシン残基に連結しているか；
ｂ）作用剤は、（例えば、残留リンカーを介して）内因性膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端以外の部位に連結しているか；
ｃ）作用剤は、（例えば、残留リンカーを介して）膜タンパク質のＮ末端またはＣ末端以外の部位に連結しているか；
ｄ）作用剤は、（例えば、残留リンカーを介して）全長内因性膜タンパク質に連結しているか；
ｅ）作用剤は、少なくとも１０個、２０個、５０個、または１００個の配列特徴的ポリペプチド、例えば、内因性ポリペプチドに連結しているか；
ｆ）作用剤で機能化されている細胞は、ソルターゼ転移シグネチャ（すなわち、ソルターゼ反応によって生じることができる配列）、例えば、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）を欠いているか、
ｇ）作用剤は、ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｈ）細胞上の作用剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｉ）クリックシグネチャは、ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｊ）細胞上のクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｋ）作用剤は、細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｌ）細胞上の作用剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｍ）クリックシグネチャは、細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｎ）細胞上のクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｏ）作用剤は、膜貫通領域の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内の細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｐ）細胞上の作用剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、膜貫通領域の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内の細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｑ）クリックシグネチャは、膜貫通領域の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内の細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｒ）細胞上のクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、膜貫通領域の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内の細胞外ソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｓ）作用剤は、作用剤の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内のソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｔ）細胞上の作用剤の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、作用剤の１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内のソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｕ）クリックシグネチャは、クリックシグネチャの１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内のソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｖ）細胞上のクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、クリックシグネチャの１個、２個、３個、４個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸内のソルターゼ転移シグネチャに連結していないか、
ｗ）それに対して作用剤が連結しているポリペプチド、例えば、内因性ポリペプチドは、ＮまたはＣ末端に対応する位置においてソルターゼ転移シグネチャを有さないか、
ｘ）細胞上の作用剤の少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞を構成しているタンパク質、例えば、細胞表面におけるタンパク質のアミノ酸側鎖を介して連結しており、ここで、実施形態では、側鎖は、アミノ酸側鎖の少なくとも１個の原子が作用剤およびタンパク質の骨格の間に配置されるように連結されている、リシン、システイン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸の側鎖であるか、
ｙ）作用剤は、細胞表面上のポリペプチド（例えば、内因性タンパク質）に接続しているか、
ｚ）機能化細胞は、ソルターゼと接触していなかったか、
ａａ）機能化細胞は、細胞外で形成された結合を含むソルターゼ転移シグネチャを含まないか、
ｂｂ）細胞上のクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞とカップリング試薬とを反応させることによって産生されたか、あるいは
ｃｃ）細胞は、細胞と非天然の糖、例えば、クリックハンドルを含む糖、またはこれらの組合せとを接触させることを含まない方法によって作製される。
【００９５】
一部の実施形態では、細胞は、１，０００コピー超、５，０００コピー超、５，０００コピー超、１０，０００コピー超、５０，０００コピー超、１００，０００コピー超、２００，０００コピー超、３００，０００コピー超、４００，０００コピー超、または５００，０００コピー超の作用剤を含む。
【００９６】
一部の実施形態では：
ｉ）作用剤は、クリアランス速度を有し、ここで、作用剤の少なくとも２０％は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日に亘って対象の循環器系中に留まり、
ｉｉ）細胞の集団は、クリアランス速度を有し、ここで、作用剤の少なくとも２０％は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日に亘って対象の循環器系中に留まり、
ｉｉｉ）細胞の集団は、クリアランス速度を有し、ここで、機能的赤血球系細胞の少なくとも２０％は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、または７日に亘って対象の循環器系中に留まり；
ｉｖ）作用剤は、クリアランス速度を有し、ここで、１日後に対象の循環器系中にある作用剤の少なくとも２０％は、さらに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、１４日後、もしくは２１日後に循環器系中に留まり；
ｉｖ）細胞の集団は、クリアランス速度を有し、ここで、１日後に対象の循環器系中にある作用剤の少なくとも２０％は、さらに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、１４日後、もしくは２１日後に循環器系中に留まり；
ｉｖ）細胞の集団は、クリアランス速度を有し、ここで、１日後に対象の循環器系中にある細胞の集団の少なくとも２０％は、さらに１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後、７日後、１４日後、もしくは２１日後に循環器系中に留まる。
【００９７】
一部の実施形態では、赤血球系細胞の集団の少なくとも少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％は、除核されている。
【００９８】
一部の実施形態では、細胞は、低浸透圧性に負荷された細胞ではない。
【００９９】
一部の実施形態では、除核赤血球系細胞は、下記の特徴の１つもしくは複数を有する：
ａ）５０％未満の浸透圧脆弱性、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、もしくは０．５％ＮａＣｌでの細胞溶解；
ｂ）約１０〜２００ｆＬの細胞容量、または約１ミクロン〜約２０ミクロン、約２ミクロン〜約２０ミクロン、約３ミクロン〜約２０ミクロン、約４ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、約６ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約１５ミクロン、もしくは約１０ミクロン〜約３０ミクロンの細胞直径；
ｃ）１％超、２％超、３％超、４％超、５％超、６％超、７％超、８％超、９％超もしくは１０％超の胎児性ヘモグロビン；または少なくとも約２０ｐｇ／細胞、２５ｐｇ／細胞、もしくは３０ｐｇ／細胞のヘモグロビン；あるいは
ｄ）外葉のホスファチジルセリン含量は、アネキシンＶ染色によって測定するように、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、もしくは５％未満である。
【０１００】
一部の実施形態では、残留リンカーまたはクリックシグネチャは、細胞上のポリペプチドのアミノ酸（例えば、標準アミノ酸）の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内である。一部の実施形態では、残留リンカーまたはクリックシグネチャは、細胞の炭水化物部分の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内ではない。一部の実施形態では、作用剤は、グリコシル化されていないポリペプチドに連結している。一部の実施形態では、作用剤は、グリコシル化されているポリペプチドのアミノ酸側鎖、Ｎ末端、またはＣ末端に連結している。
【０１０１】
一部の実施形態では、残留リンカーは、細胞上のマンノース部分の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内ではない。一部の実施形態では、細胞上の残留リンカーまたはクリックシグネチャの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％は、細胞上のマンノース部分の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内ではない。一部の実施形態では、残留リンカーは、細胞上の少なくとも２（例えば、３、４、５、もしくはそれ超）つのタイプの糖に連結している。例えば、第１の残留リンカーは、細胞上の第１の糖部分の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内でよく、第２の残留リンカーは、細胞上の第２の糖部分の１個、２個、５個、１０個、２０個、または５０個の原子内でよい。
【０１０２】
一部の実施形態では、細胞は、遺伝子操作されていない。
【０１０３】
一部の実施形態では、細胞は、非標準アミノ酸を含まない。一部の実施形態では、細胞中のアミノ酸の１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、または０．０００１％未満は、非標準アミノ酸である。
【０１０４】
本開示は、上記の態様および／または実施形態の任意の１つもしくは複数の全ての組合せ、ならびに詳細な記載および実施例において記載する実施形態の任意の１つもしくは複数との組合せを意図する。
【０１０５】
本明細書に記載されているものと同様または同等である方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料を下記で記載する。本明細書において記述する全ての公開資料、特許出願、特許、および他の参照文献（例えば、配列データベース参照番号）は、その全体が参照により組み込まれている。例えば、本明細書において、例えば、本明細書における任意の表において言及される全てのＧｅｎＢａｎｋ、Ｕｎｉｇｅｎｅ、ＮＣＢＩ、およびＥｎｔｒｅｚ配列は、参照により組み込まれている。他に特定しない限り、本明細書における任意の表を含めた本明細書において特定する配列受託番号は、２０１７年８月７日時点で最新のものであるデータベースエントリーを指す。１つの遺伝子またはタンパク質が複数の配列受託番号を参照するとき、配列バリアントの全てが包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１０６】
【図１】細胞上へと作用剤をクリックする方法を示す図式である。活性化された作用剤は、例えば、作用剤と、第１の基質反応性部分、およびクリックハンドルである第１のカップリング部分を有する第１のカップリング試薬とを接触させ、第１の基質反応性部分が作用剤と反応することを可能とすることによって作製することができる。活性化された細胞は、例えば、細胞と第２の基質反応性部分、およびクリックハンドルである第２のカップリング部分を有する第２のカップリング試薬とを反応させ、第２の基質反応性部分が細胞と反応することを可能とすることによって作製することができる。次いで、活性化された作用剤および活性化された細胞を、第１のクリックハンドルが第２のクリックハンドルと反応することを可能とする条件下で合わせ、クリックシグネチャを含む残留リンカーを産生させる。
【図２Ａ−２Ｃ】図２Ａ〜２Ｃは、本明細書に記載されているカップリング試薬を使用して、例示的な作用剤（抗α４β７抗体）にカップリングされている赤血球系細胞のフローサイトメトリー像である。
【図３】抗ＰＤ−Ｌ１抗体で機能化されている赤血球系細胞、またはアイソタイプ対照抗体で機能化されている対照細胞によって結合されている腫瘍細胞の百分率を示すグラフである。
【図４】４１ＢＢＬ−ＲＣＴで処置されたマウスおよび未処置の対照における腫瘍サイズを示す時間経過である。
【図５】ＲＣＴ−アスパラギナーゼで処置されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおける、ある期間に亘る血清中アスパラギンレベルを示すグラフである。
【図６】ＲＣＴ−アスパラギナーゼで処置されたＲａｇ１−／−マウスにおける、ある期間に亘る血清中アスパラギンレベルを示すグラフである。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、Ｃｙ５標識したＲＣＴ−アスパラギナーゼで処置されたマウスにおける、ある期間に亘る蛍光を示すグラフである。図７Ａ、高用量ＡＳＮａｓｅ  ｍＲＢＣ；図７Ｂ、低用量ＡＳＮａｓｅ  ｍＲＢＣ。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、チオリンカークリックハンドルを使用したＨＩＳ６マウス４１ＢＢＬの配向された標識が、カップリングされた細胞の機能活性の増加をもたらすことを示すグラフである。図８Ａ、ＩＬ−２分泌；図８Ｂ、インターフェロン−γ分泌。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａおよび９Ｂは、クリック可能なマウス４１ＢＢＬを生じさせる、マウス４１ＢＢＬ中への非標準アミノ酸、ｅｘｏ（ＢＣＮ）−リシンの部位特異的組込みを示す。図９Ａ、ｅｘｏ（ＢＣＮ）−リシンの化学構造；図９Ｂ、クリックされたマウス４１ＢＢＬが１ｍＭまたはそれ超のｅｘｏ（ＢＣＮ）−リシンの濃度で産生されたことを示すウエスタンブロット。
【発明を実施するための形態】
【０１０７】
本明細書に記載されているのは、細胞を目的の作用剤（例えば、ペプチド剤）とカップリングする選択的生体適合性反応を使用した、赤血球系細胞の機能化を含む組成物および方法である。一部の実施形態では、反応は、水溶性および膜不透過性である試薬を使用した環化付加反応（例えば、ヒュスゲン１，３−双極子環化付加反応）である。
【０１０８】
定義
「クリックシグネチャ」は、その用語が本明細書において使用されるように、実体Ａおよび実体Ｂの間に配置され、これらを共有結合的に連結する複数の原子を指し、ここで、クリックシグネチャは、実体Ａおよび実体Ｂを連結する、クリック反応の生成物として形成される。実施形態では、クリックシグネチャは、実体Ａおよび実体Ｂを連結する、クリック反応の生成物として形成されるクリックシグネチャの構造を有するが、任意の特定のプロセスによって作製されるクリックシグネチャに限定されず、例えば、クリック反応によって形成されるクリックシグネチャに限定されず、別のプロセスによって形成または提供することができる。一実施形態では、クリックシグネチャは、アルキン／アジドクリックシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、トリアゾールを含む。
【０１０９】
「クリック反応」は、その用語が本明細書において使用されるように、連結された生成物の好都合な生成のための、第１および第２の部分を共有結合的に連結するために使用される一連の反応を指す。クリック反応は典型的には、下記の特徴の１つもしくは複数を有する。クリック反応は、速く、特異的であり、高収率であり、効率的であり、自発的であり、連結された実体の生体適合性を有意に変化させず、高い反応速度を有し、安定な生成物を生成し、単一の反応生成物の生成に有利に働き、高い原子経済を有し、化学選択的であり、モジュール方式であり、立体選択的であり、酸素に対して非感受性であり、水に対して非感受性であり、高純度であり、非クロマトグラフ法（例えば、結晶化もしくは蒸留）によって除去することができる単に無害であるか、または相対的に無毒性の副生成物を生じさせ、溶媒を必要としないか、または害のないもしくは生理学的に適合性の溶媒、例えば、水中で行うことができ、生理学的条件下で安定である。例は、アルキン／アジド反応、ジエン／ジエノフィル反応、またはチオール／アルケン反応を含む。他の反応を、使用することができる。一部の実施形態では、クリック反応は、速く、特異的、および高収率である。例えば、実施形態では、速いクリック反応は、例えば、２０℃にてＰＢＳ中で、１０〜２００Ｍ−１ｓ−１、１〜２０Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１Ｍ−１ｓ−１、２Ｍ−１ｓ−１、３Ｍ−１ｓ−１、５Ｍ−１ｓ−１、１０Ｍ−１ｓ−１、２０Ｍ−１ｓ−１、５０Ｍ−１ｓ−１、６０Ｍ−１ｓ−１、１００Ｍ−１ｓ−１、２００Ｍ−１ｓ−１、５００Ｍ−１ｓ−１、１Ｅ３Ｍ−１ｓ−１、２Ｅ３Ｍ−１ｓ−１、５Ｅ３Ｍ−１ｓ−１、１Ｅ４Ｍ−１ｓ−１、２Ｅ４Ｍ−１ｓ−１、５Ｅ４Ｍ−１ｓ−１、１Ｅ５Ｍ−１ｓ−１、２Ｅ５Ｍ−１ｓ−１、５Ｅ５Ｍ−１ｓ−１、または１Ｅ６Ｍ−１ｓ−１の二次順方向速度定数を有する。一部の実施形態では、特異的クリック反応は、例えば、実施例２１のアッセイにおいて、非改変細胞（例えば、末梢循環から単離したヒト赤血球）が、クリックハンドルを有する作用剤と接触するとき、例えば、１時間の反応時間の後で２０℃にてＰＢＳ中、細胞の１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満が、作用剤に検出可能な程度に連結しているものである。一部の実施形態では、高収率クリック反応は、例えば、２０℃にてＰＢＳ中１時間の反応時間について、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％収率を有するものである。
【０１１０】
「クリックハンドル」は、その用語が本明細書において使用されるように、クリックシグネチャを生成するクリック反応において、第２のクリックハンドルと反応することができる化学部分を指す。実施形態では、クリックハンドルは、カップリング試薬で構成されており、カップリング試薬はさらに、基質反応性部分を含み得る。
【０１１１】
本明細書において使用する場合、「ソルターゼ転移シグネチャ」は、第１のソルターゼ認識モチーフと第２のソルターゼ認識モチーフとを連結するソルターゼ反応によって生じることができる配列であり、ここで、ソルターゼ転移シグネチャは、第１のソルターゼ認識モチーフのアミノ酸配列、および第２の認識モチーフのアミノ酸配列を含み、ソルターゼ反応の間に除去される任意のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）を除く。例えば、ソルターゼが媒介する（Ｇ）ｎとのＬＰＸＴＧＧ（配列番号２）の反応は、ＬＰＸＴ（Ｇ）ｎ（配列番号１）のソルターゼ転移シグネチャを生成することができる。
【０１１２】
細胞
本発明は、機能化細胞を含む組成物およびその使用の方法に注目する。実施形態では、細胞は、赤血球系細胞を含む。実施形態では、細胞は、血小板、血小板前駆体、または血小板前駆細胞以外である。実施形態では、細胞は、有核または除核である。実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞である。実施形態では、細胞は、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４Ｔ細胞もしくはＣＤ８Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、骨髄性細胞、樹状細胞、血小板、または好中球を含む。実施形態では、細胞は、内胚葉由来細胞、外胚葉由来細胞、または中胚葉由来細胞を含む。実施形態では、細胞は、幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞、心筋細胞、同種移植のための細胞、異種移植のための細胞、または膵臓ベータ細胞を含む。
【０１１３】
赤血球系細胞
本発明は、機能化赤血球系細胞を含む組成物およびその使用の方法に注目する。「赤血球系細胞」は、本明細書において使用する場合、造血幹細胞（ＨＳＣ）、ならびに有核および除核赤血球前駆体、除核赤血球、ならびにＨＳＣおよび除核赤血球の間の任意の中間体を含めた赤血球系の細胞である。一実施形態では、赤血球系細胞は、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性の赤芽球、正染性赤芽球、網状赤血球、および赤血球である。一実施形態では、赤血球系細胞は、臍帯血幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、脾臓コロニー形成（ＣＦＵ−Ｓ）細胞、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）細胞、胚細胞コロニー形成細胞、バースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、巨核球−赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）細胞、赤血球系コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）、網状赤血球、赤血球、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、多染性正赤芽球、正染性正赤芽球、またはこれらの組合せである。
【０１１４】
実施形態では、赤血球系細胞は、不死もしくは不死化細胞であるか、またはこれらに由来する。例えば、不死化赤芽球細胞は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃを発現し、ＴＰ５３を抑制する、ＣＤ３４＋造血前駆細胞のレトロウイルス形質導入によって生じさせることができる（例えば、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、印刷される前の電子出版９月３日に記載されているような）。
【０１１５】
実施形態では、赤血球系細胞は、自己使用を意図するか、または同種血輸血のための源を提供し得る。一部の実施形態では、赤血球系細胞は、培養される。実施形態では、赤血球系細胞は、除核赤血球である。
【０１１６】
実施形態では、赤血球系細胞は、生体試料、例えば、ヒト血液からの赤血球、または骨髄からのＨＳＣから得られる。
【０１１７】
実施形態では、赤血球系細胞は、ｅｘ−ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのプロセスから得られ、例えば、それによって、前駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、骨髄、サイトカイン刺激末梢血または臍帯血から単離されたヒト造血幹細胞）を、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖し、かつ／または分化し、除核し、例えば、網状赤血球を産生する。幹細胞から除核赤血球系細胞（例えば、網状赤血球）を製造するＥｘ  ｖｉｖｏでの方法は、例えば、これらのそれぞれが参照によりその全体が組み込まれている、Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ  ａｎｄ  Ｐａｌｉｓ  （２０１１）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  Ｄｉｓ  Ｍｅｃｈ．８（１−２）：  ｅ３−ｅ８；国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットおよび国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットに記載されている。このプロセスによって調製される赤血球系細胞、例えば、網状赤血球は、本明細書に記載の方法によって機能化し得る。
【０１１８】
実施形態では、除核細胞は、前駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、バースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、または正染性赤芽球、または誘導多能性細胞から、網状赤血球または成熟赤血球への分化によってその細胞核を失った細胞である。実施形態では、除核細胞は、前駆細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）、骨髄系共通前駆細胞（ＣＭＰ）、巨核球赤血球前駆細胞（ＭＥＰ）、バースト形成単位赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）、コロニー形成単位赤血球（ＣＦＵ−Ｅ）、前赤芽球、初期好塩基性赤芽球、後期好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、または正染性赤芽球、または誘導多能性細胞から、網状赤血球または成熟赤血球へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化によってその細胞核を失った細胞である。
【０１１９】
本明細書に記載されている機能化方法において使用される赤血球系細胞は、非改変でよいか、または改変され、例えば、遺伝子操作（例えば、外来タンパク質を発現するように遺伝子操作）されてもよく；外来タンパク質で被包され、例えば、低浸透圧性に負荷されていてもよい。本明細書に記載されている処置方法において使用される赤血球系細胞は、自己、同種異系、または異種であり得る。
【０１２０】
本明細書に記載されている調製物、化合物、方法およびキットにおいて使用するための例示的な細胞は、本明細書に記載されている。一実施形態では、細胞、例えば、赤血球系細胞、例えば、赤血球は、下記の特性の１つもしくは複数を含む：ａ）これは、血液、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養から得られるか、もしくはより原始的な細胞型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば、造血幹細胞から分化したか；ｂ）これは、作用剤で低浸透圧性に負荷されているか；またはｃ）これは、例えば、外因性作用剤、例えば、ポリペプチドを発現している遺伝子操作された赤血球系細胞である。
【０１２１】
一実施形態では、細胞は、より原始的な細胞型ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、例えば、造血幹細胞から分化する。
【０１２２】
一実施形態では、細胞は、例えば、外因性作用剤、例えば、ポリペプチドを発現している遺伝子操作された赤血球系細胞である。
【０１２３】
一実施形態では、細胞は、血液から得た赤血球である。
【０１２４】
一実施形態では、細胞は、作用剤で低浸透圧性に負荷されている。
【０１２５】
一実施形態では、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養からである。
【０１２６】
一実施形態では、細胞は、例えば、外因性作用剤、例えば、ポリペプチドを発現している遺伝子操作された赤血球系細胞である。
【０１２７】
除核赤血球系細胞の物理的特性
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞は、例えば、浸透圧脆弱性、細胞サイズ、ヘモグロビン濃度またはホスファチジルセリン含有量などの、本明細書に記載の１つまたは複数（例えば、２、３、４、またはそれ以上）の物理的特徴を有する。理論による拘束は望まないが、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞は、野生型の未処理赤血球系細胞に似た物理的特性を有する。対照的に、低浸透圧性に負荷された赤血球系細胞は、時には、浸透圧の脆弱性の増加、細胞サイズの変化、ヘモグロビン濃度の減少、または細胞膜の細胞表面側の単分子上のホスファチジルセリンレベルの増加などの異常な物理的特徴を示す。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、安定剤を欠く組成物中にある。
【０１２９】
浸透圧脆弱性
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、単離された未培養除核赤血球系細胞と実質的に同じ浸透圧膜脆弱性を示す。いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞の集団は、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のＮａＣｌで、５０％未満の細胞溶解の浸透圧脆弱性を有する。浸透圧脆弱性は、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５９の方法を用いて決定される。
【０１３０】
細胞サイズ
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、ほぼ野生型の未処理赤血球系細胞の直径または容積を有する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は約４、５、６、７、または８ミクロンの平均直径を有し、任意選択的に、集団の標準偏差は１、２、または３ミクロン未満である。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の赤血球系細胞は、約４〜８、５〜７、または約６ミクロンの直径を有する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の直径は、約１ミクロン未満、約２０ミクロンを超える、約１ミクロン〜約２０ミクロン、約２ミクロン〜約２０ミクロン、約３ミクロン〜約２０ミクロン、約４ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約２０ミクロン、約６ミクロン〜約２０ミクロン、約５ミクロン〜約１５ミクロンまたは約１０ミクロン〜約３０ミクロンである。細胞の直径は、いくつかの実施形態では、Ａｄｖｉａ  １２０血液検査システムを用いて測定される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積の容積（ｔｈｅ  ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅａｎ  ｃｏｒｐｕｓｃｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ）は、１０ｆＬ、２０ｆＬ、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬを超え、または１５０ｆＬを超える。一実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積は、３０ｆＬ、４０ｆＬ、５０ｆＬ、６０ｆＬ、７０ｆＬ、８０ｆＬ、９０ｆＬ、１００ｆＬ、１１０ｆＬ、１２０ｆＬ、１３０ｆＬ、１４０ｆＬ、１５０ｆＬ、１６０ｆＬ、１７０ｆＬ、１８０ｆＬ、１９０ｆＬ、２００ｆＬ未満であり、または２００ｆＬ未満である。一実施形態では、赤血球系細胞の平均赤血球容積は、８０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、３００〜４００、または４００〜５００フェムトリットル（ｆＬ）である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、本段落に記載される平均赤血球容積を有し、集団の標準偏差は、５０、４０、３０、２０、１０、５、または２ｆＬ未満である。平均赤血球容積は、いくつかの実施形態では、例えば、コールターカウンターなどの血液学的分析装置を用いて測定される。
【０１３３】
ヘモグロビン濃度
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、野生型未処理赤血球系細胞と同様のヘモグロビン含有量を有する。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％を超え、または１０％を超える胎児ヘモグロビンを含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、少なくとも約２０、２２、２４、２６、２８、または３０ｐｇの、任意選択的に、約３０ｐｇに至る、総ヘモグロビンを含む。ヘモグロビンレベルは、いくつかの実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例３３のドラブキン試薬法を用いて判定される。
【０１３４】
ホスファチジルセリン含有量
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、その細胞膜の細胞表面側の単分子層上に、野生型の未処理赤血球系細胞とほぼ同じホスファチジルセリン含有量を有する。ホスファチジルセリンは、主に、野生型の未処理赤血球系細胞の細胞膜の細胞質側の単分子層上にあり、低張負荷は、ホスファチジルセリンを細胞表面側の単分子層に分布させ、免疫応答を始動し得る。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、アネキシンＶ染色について陽性である約３０、２５、２０、１５、１０、９、８、６、５、４、３、２、または１％未満の細胞を含む。ホスファチジルセリン曝露は、いくつかの実施形態では、例えば、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットの実施例５４の方法を用いて、ＰＳに優先的に結合するアネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣについて染色し、フローサイトメトリーによってＦＩＴＣ蛍光を測定することで評価される。
【０１３５】
その他の特性
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、ＧＰＡに対して陽性である、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％（任意選択的に、９０または１００％に至る）の細胞を含む。ＧＰＡの存在は、いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳを用いて検出される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、除核赤血球系細胞は、対象において少なくとも３０、４５、または９０日間の半減期を有する。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞を含む細胞の集団は、約１０、５、４、３、２または１％未満の棘状赤血球を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は除核される。いくつかの実施形態では、例えば、赤血球系細胞などの細胞は、例えば、不活性化されている、非機能性核を含有する。
【０１３９】
汎用ドナー赤血球系細胞
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、細胞が投与される対象にとって、自己由来または同種異系である。例えば対象にとっての赤血球系細胞同種異系は、１つまたは複数の血液型特異的赤血球系細胞（例えば細胞は、対象と同一血液型であり得る）、または１つまたは複数の汎用ドナー赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の除核赤血球系細胞は、参照細胞と比較して免疫原性が低下しており、例えば１つまたは複数の血液型抗原のレベルが低下している。
【０１４０】
同種異系細胞が輸血に使用される場合、急性血管内溶血性輸血反応を予防するために、適合性のＡＢＯ血液型が選択され得る。ＡＢＯ血液型は、血液型抗原ＡおよびＢの有無、赤血球の表面の糖タンパク質および糖脂質に会合するオリゴ糖鎖末端に見られる単糖炭水化物構造に基づいて定義される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）で概説される）。Ｏ型赤血球は、Ａ抗原もＢ抗原のどちらも含有しないことから、それらは例えばＡ、Ｂ、ＡＢ、またはＯ型レシピエントなどの任意のＡＢＯ血液型のレシピエントに、安全に輸血され得る。Ｏ型赤血球は汎用と考えられており、全ての輸血において使用されてもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される赤血球系細胞はＯ型である。対照的に、Ａ型赤血球系細胞はＡ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、Ｂ型赤血球系細胞はＢ型およびＡＢ型レシピエントに与えられてもよく、ＡＢ型赤血球系細胞はＡＢレシピエントトに与えられてもよい。
【０１４１】
場合によっては、非Ｏ型赤血球系細胞を汎用血液型に変換することが有益であり得る。Ａ型およびＢ型赤血球の表面の免疫優性単糖類の酵素的除去を用いて、Ｏ型様赤血球系細胞の集団が作製されてもよい。（例えばＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７）を参照されたい）。Ｂ型赤血球系細胞は、生コーヒー豆由来のα−ガラクトシダーゼを使用して変換されてもよい。代案としては、またはこれに加えて、Ｅ．メニンゴセプチカム（Ｅ．ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ）細菌由来のα−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼ酵素活性を用いて、免疫優性Ａ抗原およびＢ抗原が赤血球系細胞上に存在する場合、それぞれ除去されもよい（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５：４５４−４６４（２００７））。一例では、本明細書に記載されるように単離された充填赤血球系細胞が、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼおよびα−ガラクトシダーゼのどちらかの存在下で、２００ｍＭグリシン（ｐＨ６．８）および３ｍＭ  ＮａＣｌ中で２６℃で６０分間にわたり培養される（約３００μｇ／ｍｌ充填赤血球系細胞）。処理後、赤血球系細胞は、遠心分離によって生理食塩水中で３〜４回濯いで洗浄され、標準的な血液銀行技術に従ってＡＢＯ型判定される。
【０１４２】
ＡＢＯ血液型システムは輸血および移植において最も重要である一方で、いくつかの実施形態では、投与される赤血球系細胞とレシピエントとの間でその他の血液型を一致させること、または１つまたは複数のその他の（例えばマイナー）血液型に汎用的な赤血球系細胞を選択または作製することが有用であり得る。第２の血液型はＲｈシステムであり、個人はＲｈ＋またはＲｈ−であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞はＲｈ−である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、Ｏ型かつＲｈ−型である。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、例えばＬｅ（ａ−ｂ−）（ルイス抗原システム）、Ｆｙ（ａ−ｂ−）（Ｄｕｆｆｙシステム）、Ｊｋ（ａ−ｂ−）（Ｋｉｄｄシステム）、Ｍ−Ｎ−（ＭＮＳシステム）、Ｋ−ｋ−（Ｋｅｌｌシステム）、Ｌｕ（ａ−ｂ−）（Ｌｕｔｈｅｒａｎシステム）、およびＨ抗原陰性（Ｂｏｍｂａｙ表現型）などの１つまたは複数のマイナー血液型抗原、またはそれらの任意の組合せについて陰性である。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞は、Ｏ型および／またはＲｈ−型である。マイナー血液型は、例えばそれぞれその内容全体が参照により本明細書に援用される、Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ“Ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ  ｉｎ  ｂｌｏｏｄ  ｄｏｎｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｃａｒｅ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｉｎ  ｎｏｒｔｈ  Ｉｎｄｉａ”Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｍａｒ；４８（１）：５１−５４  ａｎｄ  Ｍｉｔｒａ  ｅｔ  ａｌ“Ｂｌｏｏｄ  ｇｒｏｕｐｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ａｎａｅｓｔｈ．２０１４  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；５８（５）：５２４−５２８に記載される。
【０１４４】
赤血球系細胞組成物
いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９８％の（任意選択的に、約８０、９０、または１００％に至る）除核赤血球系細胞を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、１％未満の生存有核細胞を含有し、例えば、検出可能な生存有核細胞を含有しない。核除去は、いくつかの実施形態では、核染色を用いるＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）赤血球系細胞は、１つまたは複数（例えば、２、３、４またはそれ以上）の作用剤を含む。作用剤の存在は、いくつかの実施形態では、作用剤を結合する標識タンパク質（例えば、抗体）を用いて、ＦＡＣＳによって測定される。いくつかの実施形態では、集団中の少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、または８０％の（任意選択的に、約７０、８０、９０、または１００％に至る）赤血球系細胞は核除去され、１つまたは複数の作用剤を含む。いくつかの実施形態では、赤血球系細胞の集団は、約１×１０９〜２×１０９、２×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜２×１０１０、２×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜２×１０１１、２×１０１１〜５×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜２×１０１２、２×１０１２〜５×１０１２、または５×１０１２〜１×１０１３個の細胞を含む。
【０１４５】
クリック可能フォーマット細胞
一部の実施形態では、細胞は、細胞とコンジュゲーション剤とを化学的に反応させるステップを必要とすることなしに、コンジュゲーション剤を含む。例えば、細胞は、代謝物（例えば、アミノ酸または糖）およびカップリング部分（例えば、クリックハンドル）を含む分子と接触することができる。次いで、細胞は、代謝物を、例えば、細胞の表面上のタンパク質または炭水化物中に組み込むことができる。代謝物は、例えば、非標準アミノ酸であり得る。実施形態では、代謝物は、代謝物を特定の位置、例えば、アンバー終止コドンによってコードされるもの中に方向付けるｔＲＮＡ／アミノ−アシル−ｔＲＮＡ−シンテターゼ対を使用して組み込まれる。このように得られた活性化された細胞は、カップリング部分（例えば、クリックハンドル）を含む。次いで、活性化された細胞を、活性化された作用剤、例えば、本明細書に記載されている活性化された作用剤と接触させることができる。
【０１４６】
代謝物およびカップリング部分を含む種々の分子を使用することができる。例えば、実施形態では、分子は、
【化１】
2020507329.tif 000003
例えば、歪み促進アルキン−アジド環化付加（ＳＰＡＡＣ）反応において使用するための、ＳＣＯ−リシン；
【化２】
2020507329.tif 000004
例えば、歪み促進逆電子要請型ディールズアルダー環化付加（ＳＰＩＥＤＡＣ）反応において使用するための、シクロプロペンリシン；
【化３】
2020507329.tif 000005
例えば、ＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、ＴＣＯ＊Ａ−リシン；
【化４】
2020507329.tif 000006
例えば、ＳＰＡＡＣ反応において使用するための、Ｅｘｏ−ＢＣＮ−リシン；
【化５】
2020507329.tif 000007
例えば、ＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、ＮＢＯ−リシン；
【化６】
2020507329.tif 000008
例えば、ＳＰＡＡＣ反応において使用するための、ｒａｃ−ＢＣＮ−リシン；
【化７】
2020507329.tif 000009
例えば、ＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、ＴＣＯ−リシン；
【化８】
2020507329.tif 000010
例えば、ＳＰＡＡＣ反応において使用するための、Ｅｎｄｏ−ＢＣＮ−リシン、
【化９】
2020507329.tif 000011
例えば、ＳＰＡＡＣもしくはＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、ＰｒＫ−ＨＣＬ−塩；
【化１０】
2020507329.tif 000012
例えば、ＳＰＡＡＣもしくはＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、Ｎ３−リシン、
【化１１】
2020507329.tif 000013
例えば、部位特異的オキシムライゲーション（例えば、ＤＢＣＯ−アミンによって媒介される）、それに続くＳＰＡＡＣでの使用のためのｐ−アセチルフェニルアラニン、
【化１２】
2020507329.tif 000014
例えば、ＳＰＡＡＣもしくはＳＰＩＥＤＡＣ反応において使用するための、ｐ−アジドメチルフェニルアラニン；または
【化１３】
2020507329.tif 000015
例えば、マレイミドとの反応のための、セレノ−システイン
から選択される。
【０１４７】
カップリング試薬
本明細書に記載されているのは、作用剤で機能化されている赤血球系細胞の組成物であり、ここで、細胞および作用剤は、一組の二重特異性カップリング試薬を介して連結している。一部の実施形態では、一組の二重特異性カップリング試薬は、第１のカップリング試薬および第２のカップリング試薬を含む。第１のカップリング試薬は、第２のカップリング試薬上のカップリング部分、例えば、アジドと特異的に反応するカップリング部分、例えば、アルキン部分を含む。カップリング部分は、自己反応しない。実施形態では、カップリング部分は、クリックハンドルである。クリックハンドルは、アジドまたはアルキンを含み得る。
【０１４８】
各カップリング試薬はまた、例えば、目的の基質、例えば、赤血球系細胞、または赤血球系細胞への付着のための作用剤、例えば、ポリペプチド、脂質、核酸、糖、薬物、小分子への結合（例えば、共有結合的）に適した基質反応性部分を含む。実施形態では、基質反応性部分は、基質と非酵素的に反応することができる。実施形態では、基質反応性部分は、ソルターゼ反応における以外の基質と反応することができる。
【０１４９】
実施形態では、カップリング試薬は、第１の実体（例えば、細胞）と第２の実体（例えば、外因性ポリペプチド）とを共有結合的に連結することができる。
【０１５０】
第１のカップリング試薬は、その基質反応性部分を介して第１の基質、例えば、赤血球系細胞に連結することができる。第２のカップリング試薬は、その基質反応性部分を介して第２の基質、例えば、ポリペプチドまたは薬物に連結することができる。次いで、このように誘導体化された基質は、互いに連結することができる。
【０１５１】
２つの基質の連結は典型的には、第１および第２の基質の間の残留リンカーをもたらす。例えば、アジドおよびアルキンを含むカップリング試薬の場合、トリアゾール（例えば、１，２，３−トリアゾール）を含む残留リンカーを形成し得る。例示的なカップリング試薬は、アルキンカップリング試薬（ＫＲ）およびアジドカップリング試薬（ＡＲ）を含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、カップリング試薬は、アルキンカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、アルキンカップリング試薬は、プロパルギル部分またはシクロオクチニル部分を含む。例示的なアルキンカップリング試薬は、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−スルホ−ＮＨＳ−エステル、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＰＥＧ−ＮＨＳ−エステル、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−Ｃ６−ＮＨＳ−エステル、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＮＨＳ−エステル、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−アミン、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−酸、スルホジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−マレイミド、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−マレイミド、ビス−スルホン−ＰＥＧ−ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）、プロパルギル−ＮＨＳエステル、プロパルギル−マレイミド、アルキン−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、アルキン−ＰＥＧ−マレイミド、またはその誘導体を含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、カップリング試薬は、アジドカップリング試薬を含む。一部の実施形態では、アジドカップリング試薬は、アジドアルキル部分、アジドアリール部分、またはアジドヘテロアリール部分を含む。例示的なアジドカップリング試薬は、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル、アジド酢酸ＮＨＳエステル、アジド−ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、アジドプロピルアミン、アジド−ＰＥＧ−アミン、アジド−ＰＥＧ−マレイミド、ビス−スルホン−ＰＥＧ−アジド、またはその誘導体を含む。
【０１５４】
カップリング試薬はまた、アルケン部分、例えば、ｔｒａｎｓシクロアルケン部分、オキサノルボルナジエン部分、またはテトラジン部分を含み得る。さらなるカップリング試薬は、それらのそれぞれが参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｏｏｌｓ  （ｈｔｔｐｓ：／／ｃｌｉｃｋｃｈｅｍｉｓｔｒｙｔｏｏｌｓ．ｃｏｍ／），Ｌａｈａｎｎ，Ｊ  （ｅｄ）（２００９）Ｃｌｉｃｋ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＭｃＫａｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ：  ｂｉｏｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ”  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２０１４  Ｓｅｐ  １８；２１（９）：１０７５−１０１、Ｂｅｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｂｅｙｏｎｄ  ｍｅｔａｌ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ”  Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００９；４８（２７）：４９００−８．、およびＨｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ；２５（１０）：２２１６−３０において見出すことができる。
【０１５５】
実施形態では、カップリング試薬は、例えば、アルケン部分との反応のための、テトラジン部分を含む。例えば、実施形態では、テトラジンは、１，２，４，５テトラジンであり、アルケンは、歪んだアルケンである。実施形態では、アルケンカップリング試薬は、ｔｒａｎｓ−シクロオクテン、（Ｅ）−シクロオクタ−４−エノール、（Ｅ）−シクロオクタ−４−エニル２，５−ジオキソ−１−ピロリジニルカーボネート、５−ノルボルネン−２−酢酸スクシンイミジルエステル、５−ノルボルネン−２−ｅｎｄｏ−酢酸、ＴＣＯ  ＰＥＧ４スクシンイミジルエステル、ＴＣＯ−アミン、またはＴＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドを含む。実施形態では、テトラジンカップリング試薬は、（４−（１，２，４，５−テトラジン−３−イル）フェニル）メタンアミンまたは２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル５−［４−（１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ベンジルアミノ］−５−オキソペンタノエート、５−［４−（１，２，４，５−テトラジン−３−イル）ベンジルアミノ］−５−オキソペンタン酸を含む。実施形態では、テトラジンおよびアルケンは、ディールズアルダー環化付加において反応し、安定な共有結合的連結を生じさせる。実施形態では、触媒は、必要とされない。実施形態では、唯一の副生成物は、二窒素である。実施形態では、アジド−シクロオクチンをベースとするクリック化学より少なくとも一桁速い反応。理論に束縛されるものではないが、テトラジン／アルケン反応を、低濃度の反応物（例えば、作用剤）と共に使用することができる。
【０１５６】
一部の実施形態では、各カップリング試薬のカップリング部分は、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加を介して反応する。一部の実施形態では、アジド−アルキンヒュスゲン環化付加は、銅（Ｉ）触媒によるアジド−アルキン環化付加または歪み促進アジド−アルキン環化付加を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、それぞれのカップリング試薬のカップリング部分は反応して、ヘテロアリール、例えば、トリアゾールを形成する。一部の実施形態では、トリアゾールは、１，２，３−トリアゾール、例えば、１，４−二置換１，２，３−トリアゾールまたは１，５−二置換１，２，３−トリアゾールを含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、カップリング試薬は、カップリング試薬を作用剤（例えば、本明細書に記載されている作用剤）に連結する基質反応性部分を含む。一部の実施形態では、基質反応性部分は、カルボニル、エステル、カルボン酸、アミン、またはスルフヒドリル基と反応する。一部の実施形態では、基質反応性部分は、スクシンイミド（例えば、ＮＨＳ−エステル）、マレイミド、アミン、ヒドラジン、アルコキシアミン、カルボン酸、アルデヒド、ケトン、ジスルフィド、ハロゲン化アシル、イソチオシアネート、またはその誘導体を含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、基質反応性部分は、リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む。一部の実施形態では、リンカーは、直鎖である。一部の実施形態では、リンカーは、分岐鎖である。
【０１６０】
一部の実施形態では、カップリング試薬は、アルキンを含み、アミンと反応する。一部の実施形態では、カップリング剤は、シクロオクチンを含み、アミンと反応する。一部の実施形態では、カップリング剤は、ジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−スルホ−ＮＨＳ−エステルまたはジアリールシクロオクチン（ＤＢＣＯ）−ＰＥＧ５−ＮＨＳ−エステルである。
【０１６１】
一部の実施形態では、カップリング剤は、アジドを含み、アミンと反応する。一部の実施形態では、カップリング剤は、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステルまたはアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳ−エステルである。
【０１６２】
一実施形態では、カップリング試薬は、水溶性である。一実施形態では、カップリング試薬は、膜不透過性であり、例えば、これを膜不透過性とする十分な電荷を有する。実施形態では、カップリング試薬は、帯電しており、例えば、正に帯電しているか、または負に帯電している。一実施形態では、カップリング試薬は、カチオン性部分またはアニオン性部分、例えば、ＳＯ３部分を含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、カップリング剤は、例えば、機能化された赤血球系細胞の検出に有用な検出剤を含む。例示的な検出剤は、蛍光分子（例えば、シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、もしくはＣｙ７．５）、金属キレート、コントラスト剤、放射性核種、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）造影剤、赤外線造影剤、近赤外造影剤、コンピュータ断層法（ＣＡＴ）用造影剤、光子放出コンピュータ断層撮影法用造影剤（例えば、ＤＩＢＯ−ＤＦＯ、ここで、ＤＦＯは、ジルコニウム−８９をキレート化する）、Ｘ線造影剤、または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）用造影剤を含み得る。
【０１６４】
一実施形態では、カップリング試薬は、ＧＭＰグレードの材料である。
【０１６５】
一部の実施形態では、クリック反応は、環化付加（例えば、１，３−双極子環化付加もしくはヘテロ−ディールズアルダー環化付加）、求核開環（例えば、歪んだ複素環式求電子試薬、例えば、アジリジン、エポキシド、環状スルフェート、アジリジニウムイオン、およびエピスルホニウムイオンを開くこと）、非アルドールタイプのカルボニル化学（例えば、尿素、チオ尿素、ヒドラゾン、オキシムエーテル、アミド、もしくは芳香族複素環の形成）、または炭素−炭素多重結合への付加（例えば、エポキシ化、アジリジン化、ジヒドロキシル化、スルフェニルハライド付加、ニトシルハライド付加、もしくはマイケル付加）である。クリック反応のこれらのタイプの例は、さらに詳細に、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、Ｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔｏｂｅｒ；  ２５（１０）：２２１６−２２３０に記載されている。実施形態では、クリック反応は、金属非含有［３＋２］環化付加反応、ディールズアルダー反応、またはチオール−アルケンラジカル反応である。これらのタイプのクリック反応の例は、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている、Ｂｅｃｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００９，４８，４９００−４９０８により詳細に記載されている。
【０１６６】
一実施形態では、クリックシグネチャは、アルキン／アジドクリックシグネチャであり（例えば、ここで、アルキンは、シクロオクチン、活性化されたアルキン、または電子不足アルキンである）、例えば、クリックシグネチャは、トリアゾール、例えば、１，２，３−トリアゾールおよび／または二置換トリアゾールを含む。一実施形態では、クリックシグネチャは、ジエン／ジエノフィルクリックシグネチャであり（例えば、ここで、ジエノフィルは、アルケン部分を含む）、例えば、クリックシグネチャは、シクロアルケン、例えば、二置換アルケンを含む。実施形態では、クリックシグネチャは、テトラジン／アルケンクリックシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、ジヒドロピラジン、例えば、１，２−ジヒドロピラジンを含む。実施形態では、クリックシグネチャは、テトラゾール／アルケンクリックシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、ジアゾールを含む。実施形態では、クリックシグネチャは、ジチオエステル／ジエンクリックシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、硫黄含有環、例えば、テトラヒドロチオフェン、例えば、二置換テトラヒドロチオフェンを含む。実施形態では、クリックシグネチャは、ジチオエステル／ジエンシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、硫黄含有環、例えば、チオピランを含む。実施形態では、クリックシグネチャは、チオール／アルケンクリックシグネチャであり、例えば、クリックシグネチャは、アルキルスルフィドを含む。
【０１６７】
実施形態では、クリック反応は、触媒を必要としない。実施形態では、クリック反応は、銅イオンを必要とせず、例えば、Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ  （２００２）．“Ｐｅｐｔｉｄｏｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ｏｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ：  ［１，２，３］−Ｔｒｉａｚｏｌｅｓ  ｂｙ  Ｒｅｇｉｏｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｏｐｐｅｒ（Ｉ）−Ｃａｔａｌｙｚｅｄ  １，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ａｌｋｙｎｅｓ  ｔｏ  Ａｚｉｄｅｓ”に記載されている条件下で、例えば、銅イオンの非存在下で銅イオンの存在下と実質的に同じ速度で進行する。実施形態では、クリック反応は、約１０〜４０Ｃ、２０〜４０Ｃ、２０〜３０Ｃ、２０〜２５Ｃ、３０〜４０Ｃ、または３５〜４０Ｃ、または約３７Ｃの温度にて効率的に進行する。実施形態では、クリック反応は、５０Ｃ未満、４５Ｃ未満、４０Ｃ未満、３５Ｃ未満、３０Ｃ未満、２５Ｃ未満、または２０Ｃ未満の温度にて効率的に進行する。
【０１６８】
実施形態では、クリック反応についての活性化障壁は、２４〜３０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、２５〜２９ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または２６〜２８ｋｃａｌ／ｍｏｌ、例えば、約２７．８ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは２６ｋｃａｌ／ｍｏｌである。実施形態では、クリック反応についての活性化障壁は、例えば、Ｈｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．２００８  Ｏｃｔ；２５（１０）：２２１６−３０において記載するように、アジドおよび末端アルケンの間のヒュスゲンＣｕ触媒環化付加反応の活性化障壁と同じであるか、またはこれと５０％以上、４０％以上、３０％以上、２０％以上、もしくは１０％以上異なる。
【０１６９】
実施形態では、クリック反応は、例えば、−１０〜−１００ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−２０〜−９０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−３０〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−４０〜−７０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、−５０〜−６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、または約−６１ｋｃａｌ／ｍｏｌの△Ｇ°を有するエネルギー発生性である。実施形態では、クリック反応についての△Ｇ°は、アジドおよび末端アルケンの間のヒュスゲンＣｕ触媒環化付加反応の△Ｇ°と同じであるか、またはこれと５０％以上、４０％以上、３０％以上、２０％以上、もしくは１０％以上異なる。
【０１７０】
実施形態では、クリック反応は、−３０〜−１４０ｋＪ／ｍｏｌ、−４０〜−１３０ｋＪ／ｍｏｌ、−５０〜−１２０ｋＪ／ｍｏｌ、−６０〜−１１０ｋＪ／ｍｏｌ、−７０〜−１００ｋＪ／ｍｏｌ、−８０〜−９０ｋＪ／ｍｏｌ、または約８４ｋＪ／ｍｏｌの△Ｇ°を有する。
【０１７１】
環化付加反応の一例は、親双極子と１，３双極子成分とのヒュスゲン１，３−双極子環化付加であり、５員（複素）環を生成する。親双極子の例は、アルケン、アルキン、ならびに関連するヘテロ原子官能基を有する分子、例えば、カルボニルおよびニトリルである。具体的には、別の例は、アルキルアジドおよびアセチレンの２＋３環化付加である。他の環化付加反応は、共役ジエンおよびジエノフィル（例えば、アルキンまたはアルケン）のディールズアルダー反応を含む。環化付加反応の例は、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第９，５１７，２９１号明細書に記載されている。
【０１７２】
クリック反応の他の例は、Ｈ−−Ｓｉおよび単純な活性化されていないビニル化合物のヒドロシリル化反応、アルコールおよびイソシアネートからのウレタン形成、第三級アミンとヨウ化アルキルまたはアルキルトリフルオロメタンスルホネートとのメンシュトキン反応、マイケル付加、例えば、非常に効率的なマレイミド−チオール反応、−−ＳＯ２Ｃｌおよびオレフィン（Ｒ１、Ｒ２−Ｃ＝Ｃ−Ｒ３、Ｒ４）の間の原子移動ラジカル付加反応、メタセシス、アルキルアジドとのホスフィンのシュタウディンガー反応、チオールの酸化カップリング、特に、小さな歪んだ環、例えば、エポキシおよびアジリジン化合物の求核置換、カルボニル化学、例えば、尿素の形成、ならびに炭素−炭素二重結合への付加反応、例えば、ジヒドロキシル化を含む。したがって、付着した官能基は、アセチレン結合、アジド基、ニトリル基、アセチレン、アミノ基、ホスフィノ基から選択し得る。クリック化学反応は、アミノ、第一級アミノ、ヒドロキシル、スルホネート、ベンゾトリアゾール、ブロミド、クロリド、クロロホルメート、トリメチルシラン、ホスホニウムブロミド、またはポリペプチド、タンパク質および核酸を含めた生体応答性官能基から選択される官能基の付加をもたらし得る。
【０１７３】
このように、適切なカップリング試薬は、例えば、アミン、スルフェート、チオール、ヒドロキシル、アジド、アルキン、アルケン、カルボキシル基、アルデヒド基、スルホン基、ビニルスルホン基、イソシアネート基、酸無水物基、エポキシド基、アジリジン基、エピスルフィド基、−−ＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２、−−ＣＯ２Ｎ（ＣＯＣＨ２）２、−−ＣＯ２Ｈ、−−ＣＨＯ、−−ＣＨＯＣＨ２、−−Ｎ．ｄｂｄ．Ｃ．ｄｂｄ．Ｏ、−−ＳＯ２ＣＨ．ｄｂｄ．ＣＨ２、−−Ｎ（ＣＯＣＨ）２、−−Ｓ−−Ｓ−−（Ｃ５Ｈ４Ｎ）などの基、および下記の構造の基（式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒは、水素またはＣ１〜Ｃ４アルキルである）を含み得る。
【化１４】
2020507329.tif 000016
【０１７４】
一部の実施形態では、クリック反応は、非常にエネルギー効率の良い炭素−ヘテロ原子結合、特に、開環求核反応または環化付加反応を形成する。クリック化学において広範に表される反応の１タイプは、Ｃｕ（Ｉ）で触媒される上述のアルキン−アジド環化付加である。クリック反応の例はまた、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第９，４５３，８４３号明細書に記載されている。
【０１７５】
クリック化学は、小さなモジュラー単位を一緒に接合することによって、物質を急速におよび確実に生じさせ得る（例えば、それぞれのその内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている、Ｋｏｌｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．４０：２００４−２０１１；Ｅｖａｎｓ  （２００７）Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｊ．Ｃｈｅｍ．６０：３８４−３９５；Ｃａｒｌｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．３８：３５２−３６２を参照されたい）。クリック化学の例は、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている第８，９１２，３２３号明細書に記載されている。
【０１７６】
作用剤、例えば、外因性ポリペプチド剤
本発明は、作用剤で機能化された赤血球系細胞の組成物、ならびにこれらを含む方法、調製物、およびキットに注目する。本発明において使用するための例示的な作用剤は、本明細書に記載されている。
【０１７７】
一実施形態では、作用剤は、それぞれが参照により本明細書にその全体が組み込まれている国際公開第２０１５／１５３０２号パンフレット；または国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載されている作用剤である。
【０１７８】
一実施形態では、作用剤は、ペプチド剤、例えば、ポリペプチド、酵素、または抗体を含む。
【０１７９】
一実施形態では、作用剤は、外因性ポリペプチド、例えば、そのタイプの野生型細胞によって産生されないか、または外因性ポリペプチドを含有する細胞におけるよりも野生型細胞においてより低いレベルで存在するポリペプチドを含む。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、化学的または酵素的手段によって細胞の表面にコンジュゲートしているポリペプチドである。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、細胞中に導入された核酸によってコードされたポリペプチドであり、この核酸は、任意選択で細胞によって保持されない。
【０１８０】
一実施形態では、作用剤は、細胞外ドメイン、カウンターリガンド結合ドメイン、または他の生物活性のあるドメインを含む、サイトカイン、受容体、リガンド、ホルモン、成長因子、血液因子、リソソーム蓄積酵素、アスパラギナーゼ、または上記のいずれかのフラグメントを含む。
【０１８１】
一実施形態では、作用剤は、抗原、例えば、腫瘍抗原、および感染症抗原、および自己抗原を含む。
【０１８２】
一実施形態では、作用剤は、脂質、核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、糖、薬物、または小分子を含む。
【０１８３】
一実施形態では、作用剤は、約３０キロダルトン超、５０キロダルトン超、７５キロダルトン超、１００キロダルトン超、１５０キロダルトン超、２００キロダルトン超、２５０キロダルトン超、３００キロダルトン超、３５０キロダルトン超、または４００キロダルトン超のポリペプチドを含む。
【０１８４】
一実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドは、翻訳後修飾、例えば、赤血球系細胞によって作製されないか、または赤血球系細胞によって非効率的に作製される翻訳後修飾を含む。
【０１８５】
一実施形態では、作用剤、例えば、ポリペプチドは、赤血球系細胞の成長、機能、寿命、または発生に対して有毒であるか、またはこれらを損なう。
【０１８６】
一実施形態では、作用剤は、多量体ポリペプチド、例えば、二量体、例えば、ホモ二量体もしくはヘテロ二量体、三量体、例えば、ホモ三量体もしくはヘテロ三量体、または四量体、例えば、ホモ四量体もしくはヘテロ四量体、例えば、抗体または細胞表面受容体、例えば、病原媒介物、例えば、ウイルス、薬物、もしくは毒素についての受容体を含む。
【０１８７】
一実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、例えば、複数のシステイン架橋を含む多量体ポリペプチドを含む。一実施形態では、作用剤は、ポリペプチド、例えば、１個もしくは複数のシステイン架橋を含む多量体ポリペプチドを含む。
【０１８８】
一実施形態では、作用剤は、発現させることが困難であるタンパク質を含む。例えば、実施形態では、ポリペプチド剤は、赤血球系細胞において遺伝的に発現される場合、細胞毎に１，０００コピー未満、５００コピー未満、２００コピー未満、または１００コピー未満のタンパク質のコピー数に達するアミノ酸配列を有する。実施形態では、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載されているように、ポリペプチド剤は、赤血球系細胞において遺伝的に発現される場合、非効率的な翻訳または転写を有し、例えば、参照値、例えば、対照タンパク質、例えば、ＡＤＡの発現の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２％未満、１％未満のタンパク質またはｍＲＮＡレベルに達するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ポリペプチド剤は、赤血球系細胞において遺伝的に発現される場合、最も豊富なアイソフォームではなく、例えば、最も豊富なアイソフォームのレベルより少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％より低いレベルで存在するアイソフォーム、例えば、スプライス変異体を含む。
【０１８９】
一実施形態では、作用剤は、下記の１つもしくは複数：ａ）同族の抗原を結合する十分な可変領域、例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、およびＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２、およびＬＣ  ＣＤＲ３；ｂ）ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３の１つもしくは複数を含む重鎖定常配列；ｃ）機能的Ｆｃ領域；ならびにｄ）改変されたもしくは不活性なＦｃ領域、例えば、変異的に不活化されたＦｃ領域、またはＦｃ活性を損なうグリコシル化状態を有するＦｃ領域、例えば、脱グリコシル化Ｆｃ領域を含む、抗体分子、例えば、ポリペプチドを含む。
【０１９０】
一実施形態では、作用剤は、抗体、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤを含む。
【０１９１】
一実施形態では、作用剤は、抗ＰＤＬ１抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗α４β７抗体、またはタンパク質Ａ／Ｇを含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、作用剤は、脱グリコシル化されている。例えば、グリコシル化された前駆体を脱グリコシル化酵素（例えば、ＥｎｄｏＳ）で処理して、作用剤を産生し得る。
【０１９３】
一部の実施形態では、作用剤は、下記のクラス、これらに限定されないが、酵素、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ＤＮａｓｅ、抗原、抗体様分子（例えば、ナノボディ、ｓｃＦｖ、ｄｕｏｂｏｄｙ、もしくは多重特異的抗体）、抗体のリガンド、成長因子、輸送体、サイトカイン、ケモカイン、成長因子受容体、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、酵素の認識配列、トランスペプチダーゼ認識配列、プロテアーゼ認識配列、切断可能ドメイン、インテイン、ＤＮＡ結合タンパク質、ＲＮＡ結合タンパク質、補体調節分子、補体カスケード分子、凝固カスケード分子、キレーター、補体調節ドメイン、ＳＣＲドメイン、ＣＣＰドメイン、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリン様ドメイン、アルマジロリピート、ロイシンジッパー、デスエフェクタードメイン、カドヘリンリピート、ＥＦハンド、ホスホチロシン結合ドメイン、プレクストリン相同性ドメイン、ＳＣＲホモロジー２ドメイン、ジンクフィンガードメイン、環状ペプチド、細胞透過性ペプチド、シャペロン分子、インテグリン、コラーゲン、担体タンパク質（例えば、アルブミン）、毒素結合ペプチド（例えば、細菌、寄生虫、真菌もしくは環境からの毒素に結合するペプチド）、ミエリン形成分子、プリオンタンパク質結合分子、分化クラスター（ＣＤ）分子、免疫調節性分子（例えば、共刺激分子、共刺激分子のアクチベーター、共刺激分子の阻害剤、共抑制分子、共抑制分子の阻害剤もしくは共抑制分子のアクチベーター）、がん抗原もしくはがん細胞マーカー、抗原提示分子、アポトーシス促進分子、標的化部分、Ｆｃ受容体結合分子、腫瘍飢餓酵素、ＤＮＡ損傷阻害剤、細胞周期阻害剤、可動性リンカー、またはエピトープタグを含めた、１つもしくは複数から選択されるか、これらに由来するポリペプチドを含む。作用剤、例えば、ポリペプチドの具体例は、例えば、これらのそれぞれが参照によりその全体が組み込まれている、国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレット、国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレット、および国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレットにおいて見出される。
【０１９４】
一部の実施形態では、作用剤は、１個もしくは複数の非標準個のアミノ酸を含む。非標準アミノ酸は、例えば、ｐ−メトキシフェニルアラニン（ｐＭｐａ）；ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡｐａ）；ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン（ｐＢｐａ）；ｐ−ヨードフェニルアラニン（ｐＩｐａ）；ｐ−アジドフェニルアラニン（ｐＡｚｐａ）；ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（ｐＰｐａ）；α−アミノカプリル酸；ｏ−ニトロベンジルシステイン（ｏ−ＮＢＣ）；１，５−ダンシルアラニン；およびｏ−ニトロベンジルセリン（ｏ−ＮＢＳ）、ならびに、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている米国特許第９，６２４，４８５号明細書に記載されているその他のものを含む。
【０１９５】
一部の実施形態では、作用剤は、ポリペプチド以外である。例えば、作用剤は、炭水化物、小分子、脂質、核酸、治療剤、天然もしくは合成化合物、またはこれらの組合せでよい。
【０１９６】
例示的な外因性ポリペプチド、例えば、表１のポリペプチド剤またはそのバリアントは、
ａ）ポリペプチドの天然形態；
ｂ）データベース、例えば、２０１７年８月７日のＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて出現する配列を有するポリペプチド；
ｃ）ａ）またはｂ）の配列から１個以下、２個以下、３個以下、４個以下、５個以下または１０個以下のアミノ酸残基だけ異なる配列を有するポリペプチド；
ｄ）そのアミノ酸残基の１％以下、２％以下、３％以下、４％以下、５％以下または１０％以下において、ａ）またはｂ）の配列と異なる配列を有するポリペプチド；
ｅ）ａ）またはｂ）の配列から実質的に異ならない配列を有するポリペプチド；あるいは
ｆ）生物活性、例えば、酵素活性（例えば、特異性もしくは代謝回転）または結合活性（例えば、結合特異性もしくは親和性）において、ａ）またはｂ）の配列を有するタンパク質と実質的に異ならないｃ）、ｄ）、またはｅ）の配列を有するポリペプチド
を含む。
【０１９７】
実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドまたはそのフラグメント、例えば、従前のパラグラフのａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、またはｆ）のポリペプチドの全てまたはフラグメントを含む。
【０１９８】
実施形態では、作用剤は、表１のポリペプチド、またはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列、またはその機能的フラグメントを含む。
【０１９９】
【表１−１】
2020507329.tif 000017
【０２００】
【表１−２】
2020507329.tif 000018
【０２０１】
【表１−３】
2020507329.tif 000019
【０２０２】
【表１−４】
2020507329.tif 000020
【０２０３】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている外因性ポリペプチドは、少なくとも２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、または８００個のアミノ酸の長さである。一部の実施形態では、外因性ポリペプチドは、２００〜３００個、３００〜４００個、４００〜５００個、５００〜６００個、６００〜７００個、または７００〜８００個のアミノ酸の長さである。
【０２０４】
一部の実施形態では、赤血球系細胞、例えば、除核赤血球系細胞は、例えば、表１の、少なくとも１，０００コピー、５，０００コピー、１０，０００コピー、１５，０００コピー、２０，０００コピー、２５，０００コピー、３０，０００コピー、５０，０００コピー、１００，０００コピー、２００，０００コピー、または５００，０００コピーの本明細書に記載されている外因性ポリペプチドを含む。
【０２０５】
実施形態では、作用剤は、１つもしくは複数の翻訳後修飾を含む。翻訳後修飾は、切断（例えば、タンパク質分解的切断）、環化、グリコシル化、リン酸化、疎水基へのコンジュゲーション（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、プレニル化、もしくはグリピエーション）、補助因子へのコンジュゲーション（例えば、リポイル化、フラビン部分（例えば、ＦＭＮもしくはＦＡＤ）、ヘムＣ付着、ホスホパンテテイニル化、もしくはレチニリデンシッフ塩基形成）、ジフタミド形成、エタノールアミンホスホグリセロール付着、ハイプシン形成、アシル化（例えば、Ｏ−アシル化、Ｎ−アシル化、もしくはＳ−アシル化）、ホルミル化、アセチル化、アルキル化（例えば、メチル化もしくはエチル化）、アミド化、ブチリル化、ガンマ−カルボキシル化、マロニル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、ヌクレオチド付加、例えば、ＡＤＰ−リボシル化、酸化、リン酸エステル（Ｏ−連結型）もしくはホスホロアミデート（Ｎ−連結型）形成、（例えば、リン酸化もしくはアデニリル化）、プロピオニル化、ピログルタメート形成、Ｓ−グルタチオン付加、Ｓ−ニトロシル化、スクシニル化、硫酸化反応、ＩＳＧ化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、Ｎｅｄｄ化、またはアミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミド、エリミニル化、もしくはカルバミル化）、ジスルフィド架橋の形成、ラセミ化（例えば、プロリン、セリン、アラニン、もしくはメチオニンの）、または任意のこれらの組合せを含む。実施形態では、グリコシル化は、糖タンパク質をもたらす、アルギニン、アスパラギン、システイン、ヒドロキシリシン、セリン、トレオニン、チロシン、またはトリプトファンへのグリコシル基の付加を含む。実施形態では、グリコシル化は、例えば、Ｏ−連結型グリコシル化またはＮ−連結型グリコシル化を含む。
【０２０６】
実施形態では、細胞は、複数の作用剤、例えば、少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、５００、または１，０００の異なる作用剤を含む。一部の実施形態では、複数の作用剤は、複数のワクチン抗原を含む。一部の実施形態では、複数の作用剤は、互いに配列類似性を有するが、少なくとも１個、２個、５個、１０個、２０個、５０個、または１００個のアミノ酸の位置において互いの間で変動する。一部の実施形態では、複数の各作用剤は、複数の互いの作用剤に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。一部の実施形態では、複数の各作用剤は、少なくとも１、２、５、１０、２０、５０、または１００の複数の他の作用剤に対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する。
【０２０７】
作用剤上のカップリング試薬の幾可学的形状
カップリング剤は、作用剤上の種々の異なる位置に付着させることができる。カップリング剤は、例えば、基質、例えば、作用剤（例えば、ポリペプチド）への結合（例えば、共有結合的）に適した基質反応性部分を含むことができる。カップリング剤はさらに、例えば、第２のカップリング剤への結合（例えば、共有結合的）に適したカップリング部分、例えば、クリックカップリング部分を含むことができる。適切な基質反応性部分は、作用剤（例えば、ポリペプチド）とのカップリング剤の付着を方向付けるように選択することができる。
【０２０８】
例えば、一部の実施形態では、基質反応部分は、例えば、リシンの側鎖上のＮＨ２基、または作用剤のＮ末端と反応することができる。ＮＨ２基と反応することができる基質反応部分の一例は、ＮＨＳエステル、イミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、またはヒドロキシメチルホスフィンである。一部の実施形態では、基質反応部分は、例えば、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸の側鎖上の作用剤のカルボキシル、または作用剤のＣ末端と反応することができる。カルボキシルと反応することができる基質反応部分の一例は、カルボジイミドである。一部の実施形態では、基質反応部分は、例えば、システインの側鎖上の作用剤のスルフヒドリルと反応することができる。スルフヒドリルと反応することができる基質反応部分の一例は、マレイミド、ハロアセチル（例えば、ブロモ−もしくはヨード−）、ピリジルジスルフィド、チオスルホネート、またはビニルスルホンである。ジスルフィド架橋を有する作用剤は、ジスルフィド架橋をスルフヒドリルに変換する還元条件下に置いてもよい。一部の実施形態では、基質反応部分は、作用剤のカルボニルと反応することができる。例えば、ケトンまたはアルデヒド基は、例えば、メタ過ヨウ素酸ナトリウムで多糖翻訳後修飾を酸化することによって、糖タンパク質において生じさせることができる。カルボニルと反応することができる基質反応部分の一例は、ヒドラジドまたはアルコキシアミンである。
【０２０９】
作用剤上の部分は、細胞上の事前選択した部分に連結することができる。例えば、一部の実施形態では、作用剤上のＮＨ２基は、細胞のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、作用剤上のカルボキシル基は、細胞のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、作用剤上のスルフヒドリル基は、細胞のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、作用剤上のカルボニル基は、細胞のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。
【０２１０】
クリック可能フォーマット作用剤
一部の実施形態では、作用剤は、所定のアミノ酸に連結したカップリング剤を有するポリペプチドである。手短に言えば、ポリペプチド剤は、第１のカップリング試薬を含む非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）が、ポリペプチド剤の１つもしくは複数のアミノ酸位置において存在するように、第１の細胞「ファクトリー細胞」において産生することができる。次いで、作用剤は、細胞表面において第２のカップリング試薬を有する第２の細胞にカップリングし、それによって、ポリペプチド剤を第２の細胞にカップリングすることができる。この技術は、細胞表面上の作用剤の配向が制御されるように、ｎｃＡＡの部位特異的組込みを使用することができる。
【０２１１】
例えば、ｎｃＡＡは、例えば、参照により本明細書中にその全体が組み込まれているＮｉｋｉｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２０１５に記載されているように、ポリペプチド剤をコードする核酸における目的の部位におけるアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を遺伝的に組み込むことによって、ポリペプチド剤中に導入することができる。アンバー終止コドンは、例えば、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、または内部において組み込むことができる。ポリペプチド剤をコードするこのプラスミドは、ファクトリー細胞（例えば、ＨＥＫ２９３またはＣＨＯ細胞）に、宿主の翻訳機構と直交するアミノアシル−ｔＲＮＡシンターゼ／ｔＲＮＡ対をコードする別のプラスミドと共にコトランスフェクトすることができる。ｎｃＡＡの存在下で、アンバーコドンのリードスルーおよびｎｃＡＡの組込みが存在する。例えば、Ｍ．Ｙ３０６ＡおよびＹ３８４Ｆ変異を有するマゼイ（Ｍ．ｍａｚｅｉ）ピロリジンアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ（ＰｙｌＲＳ／ｔＲＮＡＰｙｌ）、ならびにｎｃＡＡ：シクロオクチン−リシン（ＳＣＯ）、Ｅｎｄｏビシクロ［６．１．０］ノニン−リシン（ｅｎｄｏＢＣＮ）、Ｅｘｏビシクロ［６．１．０］ノニン−リシン（ｅｘｏＢＣＮ）、またはＲａｃビシクロ［６．１．０］ノニン−リシン（ｒａｃＢＣＮ）を使用し得る。他の適切なｎｃＡＡは、本明細書において「クリック可能フォーマット細胞」と表題されているセクションに記載されている。プラスミドは、タンパク質の分泌を方向付ける配列をさらにコードし得る。一過性トランスフェクションまたは安定な細胞系を使用することができる。
【０２１２】
クリック可能フォーマットタンパク質が産生されると、これは第２のカップリング剤を有する細胞と反応することができる。例えば、細胞は、クリックリンカー、例えば、アジドを含むクリックリンカーを有する赤血球系細胞であり得る。
【０２１３】
細胞上のカップリング試薬の幾可学的形状
カップリング剤は、細胞上の種々の異なる位置に付着させることができる。カップリング剤は、例えば、基質、例えば、細胞（例えば、細胞上のポリペプチドまたは炭水化物部分）に結合（例えば、共有結合的）するのに適した基質反応性部分を含むことができる。カップリング剤はさらに、例えば、第２のカップリング剤に結合（例えば、共有結合的）するのに適したカップリング部分、例えば、クリックカップリング部分を含むことができる。適切な基質反応性部分は、細胞とのカップリング剤の付着を方向付けるように選択することができる。
【０２１４】
適切な基質反応部分は、本明細書において、例えば、「作用剤上のカップリング試薬の幾可学的形状」と表題されているセクションにおいて記載されている。
【０２１５】
細胞上の部分は、作用剤上の事前選択した部分に連結することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞上のＮＨ２基は、作用剤のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、細胞上のカルボキシル基は、作用剤のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、細胞上のスルフヒドリル基は、作用剤のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニルに連結している。実施形態では、細胞上のカルボニル基は、作用剤のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニル連結している。
【０２１６】
ソルターゼおよびクリック
一部の実施形態では、トランスペプチダーゼ反応、例えば、ソルターゼ反応を使用して、リンカーを作用剤または細胞に付着させる。
【０２１７】
例えば、一部の実施形態では、ポリペプチド剤は、トランスペプチダーゼ認識配列、例えば、ソルターゼ認識配列を含む。ポリペプチド剤は、ソルターゼ、および適合性のソルターゼ認識配列を有するカップリング試薬と接触させ、それによって、ポリペプチド剤上へとカップリング試薬をソルタギングし得る。次いで、ポリペプチド剤は、第２のカップリング剤を有する細胞と反応することができる。第２のカップリング剤は、例えば、細胞のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニル上であり得る。
【０２１８】
一部の実施形態では、細胞（例えば、細胞上のポリペプチドまたは炭水化物）は、トランスペプチダーゼ認識配列、例えば、ソルターゼ認識配列を含む。例えば、細胞は、細胞表面においてソルターゼ認識配列を含む膜貫通タンパク質を遺伝的に発現し得る。細胞は、ソルターゼ、および適合性のソルターゼ認識配列を有するカップリング試薬と接触させ、それによって、細胞上へとカップリング試薬をソルタギングし得る。次いで、細胞は、第２のカップリング剤を有するポリペプチド剤と反応することができる。第２のカップリング剤は、例えば、ポリペプチド剤のＮＨ２基、カルボキシル、スルフヒドリル、またはカルボニル上であり得る。
【０２１９】
一部の実施形態では、ポリペプチド剤は、トランスペプチダーゼ認識配列、例えば、ソルターゼ認識配列を含まない。実施形態では、細胞は、外因性トランスペプチダーゼ認識配列、例えば、ソルターゼ認識配列を含まない。実施形態では、方法は、ソルタギングステップを含まない。実施形態では、機能化赤血球系細胞は、ソルターゼ転移シグネチャを含まない。
【０２２０】
ソルターゼは、２個のソルターゼ認識モチーフを一緒に酵素的にコンジュゲートすることができる。第１のソルターゼ認識モチーフは、ソルターゼドナーモチーフでよく、第２のソルターゼ認識モチーフは、ソルターゼアクセプターモチーフでよい。
【０２２１】
ソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＸＴＡ（配列番号１８）およびＬＰＸＴＧ（配列番号１）を含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸残基である。１つの例示的なソルターゼ認識モチーフは、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）であり、式中、Ｘは、任意のアミノ酸残基（天然または非標準）、例えば、生きている生物において見出されるタンパク質において最も一般に見出される２０の標準的なアミノ酸のいずれかであり得る。いくつかの例において、認識モチーフは、ＬＰＸＴＧ（配列番号１９）またはＬＰＸＴであり、式中、Ｘは、Ｄ、Ｅ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｋ、またはＲである。他の例において、Ｘは、ソルターゼＡによって認識可能であるＬＰＸＴＧ（配列番号２０）またはＬＰＸＴモチーフ中のＫ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、またはＡから選択される。また他の例において、Ｘは、クラスＣソルターゼによって認識可能であるＬＰＸＴＧ（配列番号２１）またはＬＰＸＴモチーフ中のＫ、Ｓ、Ｅ、Ｌ、Ａ、またはＮから選択される。例示的なソルターゼ認識モチーフには、これらに限定されないが、ＬＰＫＴＧ（配列番号２２）、ＬＰＩＴＧ（配列番号２３）、ＬＰＤＴＡ（配列番号２４）、ＳＰＫＴＧ（配列番号２５）、ＬＡＥＴＧ（配列番号２６）、ＬＡＡＴＧ（配列番号２７）、ＬＡＨＴＧ（配列番号２８）、ＬＡＳＴＧ（配列番号２９）、ＬＰＬＴＧ（配列番号３０）、ＬＳＲＴＧ（配列番号３１）、ＬＰＥＴＧ（配列番号３２）、ＶＰＤＴＧ（配列番号３３）、ＩＰＱＴＧ（配列番号３４）、ＹＰＲＲＧ（配列番号３５）、ＬＰＭＴＧ（配列番号３６）、ＬＡＦＴＧ（配列番号３７）、ＬＰＱＴＳ（配列番号３８）、ＬＰＸＴ、ＬＡＸＴ、ＬＰＸＡ、ＬＧＸＴ、ＩＰＸＴ、ＮＰＸＴ、ＮＰＱＳ（配列番号３９）、ＬＰＳＴ（配列番号４０）、ＮＳＫＴ（配列番号４１）、ＮＰＱＴ（配列番号４２）、ＮＡＫＴ（配列番号４３）、ＬＰＩＴ（配列番号４４）、ＬＡＥＴ（配列番号４５）、ＬＰＸＡＧ（配列番号４６）、ＬＰＮＡＧ（配列番号４７）、ＬＰＸＴＡ（配列番号１８）、ＬＰＮＴＡ（配列番号４８）、ＬＧＸＴＧ（配列番号４９）、ＬＧＡＴＧ（配列番号５０）、ＩＰＸＴＧ（配列番号５１）、ＩＰＮＴＧ（配列番号５２）、ＩＰＥＴＧ（配列番号５３）、ＮＰＸＴＸ、ＮＰ［Ｑ／Ｋ］−［Ｔ／ｓ］−［Ｎ／Ｇ／ｓ］、ＮＰＱＴＮ（配列番号５４）、ＮＰＫＴＧ（配列番号５５）、ＮＳＫＴＡ（配列番号５６）、ＮＰＱＴＧ（配列番号５７）、ＮＡＫＴＮ（配列番号５８）、ＮＰＱＳＳ（配列番号５９）、ＮＡ−［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］−ＴＧ（配列番号６０）、ＬＡＸＴＧ（配列番号６１）、ＱＶＰＴＧＶ（配列番号６２）、ＬＰＸＴＸ、ＬＰ［Ｑ／Ｋ］Ｔ［Ａ／Ｓ］Ｔ（配列番号６３）、またはＬＰＸＴ［Ａ／Ｓ］が含まれる。
【０２２２】
ソルターゼアクセプターモチーフは、オリゴグリシンまたはオリゴアラニン、例えば、１〜５個のグリシンフラグメントまたは１〜５個のアラニンフラグメントを含む。いくつかの例において、オリゴグリシンは、３個または５個のグリシン残基からなる。他の例において、オリゴアラニンは、３個または５個のアラニン残基からなる。
【０２２３】
ソルターゼ転移シグネチャは、ソルターゼ反応によって生じさせることができる。例えば、（Ｇ）ｎとのＬＰＸＴＧＧ（配列番号２）のソルターゼが媒介する反応は、ＬＰＸＴ（Ｇ）ｎ（配列番号１）のソルターゼ転移シグネチャを産生することができる。実施形態では、ソルターゼ転移シグネチャは、本明細書、例えば、このセクションにおいて記載されているソルターゼ認識モチーフの配列を含む。実施形態では、ソルターゼ転移シグネチャはさらに、例えば、ソルターゼ認識モチーフの配列のＣ末端において１個もしくは複数のアラニンまたはグリシンアミノ酸を含む。
【０２２４】
種々のソルターゼは、例えば、その出願のその内容全体が参照により本明細書中に組み込まれている国際公開第２０１４／１８３０７１号パンフレット（例えば、その中の３３〜３７頁）に記載されている。
【０２２５】
様々な方法によって加えられる第２の作用剤
一部の実施形態では、本明細書に記載されている細胞（例えば、除核赤血球系細胞）は、（その第１の作用剤に加えて）第２の作用剤、例えば、外因性ポリペプチド剤を含む。一部の実施形態では、第２の作用剤は、例えば、クリック化学を使用して、細胞にコンジュゲートしている。一部の実施形態では、第２の作用剤は、細胞またはその前駆体中に導入された外因性核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）から発現されたタンパク質を含む。一部の実施形態では、第２の作用剤は、細胞上へとソルタギングされたタンパク質を含む。一部の実施形態では、第２の作用剤は、細胞中へと低浸透圧性に負荷されている。一部の実施形態では、第２の作用剤は、クリックシグネチャまたは残留リンカーに共有結合的に連結していない。
【０２２６】
作用剤を細胞へと加える非コンジュゲーション方法
多くの実施形態では、作用剤を、例えば、クリック化学を使用して細胞にコンジュゲートさせる一方、種々の方法を使用して、本明細書に記載されている任意の作用剤をまた細胞に加えてもよいことが理解される。したがって、いくつかの態様では、本開示は、作用剤、例えば、本明細書に記載されている外因性ポリペプチド剤、例えば、表１のポリペプチド、またはそのフラグメントもしくはバリアントを含む細胞（例えば、赤血球系細胞、例えば、除核赤血球系細胞）を提供する。細胞は、例えば、タンパク質をコードする核酸を細胞もしくはその前駆体中に導入することによって、ソルタギングによって、低張の充填によって、または化学的コンジュゲーションによって作製することができる。
【０２２７】
例えば、赤血球系細胞などの本明細書中の組成物による治療法
操作された赤血球系細胞の投与方法は、例えば、それぞれその内容全体が参照により援用される、国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットおよび国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載される。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の赤血球系細胞は、例えば、ヒトなどの哺乳動物などの対象に投与される。治療され得る例示的哺乳類としては、限定されるものではないが、ヒト、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、および実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモットなど）が挙げられる。本明細書に記載の方法は、ヒト治療および獣医学用途の双方に応用可能である。
【０２２９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されている赤血球系細胞は、炎症、ならびに敗血症、自己免疫疾患、がん、および微生物感染を含めた炎症と関連する疾患の処置または予防のために対象に投与される。一部の実施形態では、本明細書に記載されている赤血球系細胞を、自己免疫疾患、例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、関節リウマチ、膜性腎炎、または参照により本明細書中にその全体が組み込まれている国際公開第２０１５／１５３１０２号パンフレットの表Ｆにおいて列挙されている疾患のいずれかを有する対象に投与する。
【０２３０】
いくつかの態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞などの本明細書に記載される組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、本明細書に記載の疾患または病状を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、疾患または病状はがん、例えば、本明細書に記載のがんである。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療するための、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞の使用を提供する。いくつかの態様では、本開示は、例えば、がんなどの本明細書に記載の疾患または病状を治療する薬剤を製造するための、例えば、本明細書に記載の赤血球系細胞の使用を提供する。例示的ながんは、参照により本明細書中にその全体が組み込まれている国際公開第２０１５／０７３５８７号パンフレットに記載されている。
【０２３１】
一部の実施形態では、赤血球系細胞は、例えば、静脈内注入によって、静脈内に投与される。
【０２３２】
本明細書において引用した全ての参照は、全内容が参照により本明細書中に組み込まれている。
【実施例】
【０２３３】
本明細書に記載されている本発明をより完全に理解し得るように、下記の実施例を記載する。本出願において記載されている実施例は、本明細書において提供する組成物、調製物、および方法を例示するために提供し、それらの範囲を限定するものと決して解釈されない。
【０２３４】
実施例１
クリックハンドルを含む赤血球系細胞の調製
赤血球系細胞の集団を、カップリング試薬による標識のために調製した。全血から得た赤血球を濾過し、３．３１×１０９個の細胞／ｍＬの密度まで濃縮した。細胞を氷冷のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、２×１ｍＬ）で２回洗浄し、残留量をピペットによって除去した。次いで、ｐＨ８でのＰＢＳ（１００ｕＬ）を、次いで、細胞に加えた。
【０２３５】
下記のカップリング試薬のストック溶液を、１ｍＭで調製し（ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル、およびアジド−ＰＥＧ４−ＮＨＳエステル）、０．１ｍＭまたは０．０４ｍＭの最終カップリング試薬濃度のために各溶液を細胞の試料に加えた。反応物を、１０分毎に穏やかな撹拌を伴って、室温にて３０分間インキュベートした。
【０２３６】
標識反応物を、１ｍＬのＰＢＳＡ（０．１％ＢＳＡを有するＰＢＳ）を各反応物に加え、各反応物を室温にて５分間インキュベートすることを可能とすることによってクエンチした。細胞を遠心分離（２５００ｒｐｍで５分）によってペレット化し、上清を吸引によって除去した。次いで、細胞ペレットをＰＢＳ（１ｍＬ）で洗浄し、再びペレット化し（２５００ｒｐｍで５分）、上清を吸引によって除去した。
【０２３７】
標識のレベルを検出するために、Ｃｙ５−ビオチン−アジドまたはＣｙ５−ＤＢＣＯを含む検出試薬ストック溶液を、１００ｎＭで調製した。検出試薬（１００ｕＬ）を各反応物に加え、反応物を、室温にて３０分間インキュベートした。標識効率をフローサイトメトリーによって決定したが、表２において下記で要約する。
【０２３８】
【表２−１】
2020507329.tif 000021
【０２３９】
【表２−２】
2020507329.tif 000022
【０２４０】
実施例２
クリックハンドルを含む作用剤の調製
目的のタンパク質は、カップリング試薬で標識することによって、赤血球系細胞へのカップリングのために調製した。標識のための例示的なタンパク質は、抗体（例えば、抗ＰＤＬ１（ラット抗マウスＰＤＬ１抗体）および抗α４β７（ラット抗マウスα４β７抗体））、４−１ＢＢリガンド、およびタンパク質Ａ／Ｇを含んだ。タンパク質を典型的には脱塩し、緩衝液をＰＢＳに交換し、標識の前に≧１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、ｐＨをｐＨ７〜８に調節した。抗体をエンドグリコシダーゼ（例えば、ＥｎｄｏＳ）で通常通りに脱グリコシル化し、ＡＤＣＣを防止した；カップリング試薬の添加の前に、親和性精製を使用してエンドグリコシダーゼを除去した。
【０２４１】
カップリング試薬のストック溶液は、実施例１において記載されているように調製した。５ｍｇ／ｍＬ超の濃度を有するタンパク質溶液について、カップリング試薬を、タンパク質濃度に対して１０倍過剰なモル濃度で加えた。５ｍｇ／ｍＬ未満の濃度を有するタンパク質溶液について、カップリング試薬を、タンパク質濃度に対して２０倍〜５０倍過剰なモル濃度で加えた。タンパク質標識反応物を、１０分毎の穏やかな撹拌を伴って、室温にて３０分間インキュベートした。
【０２４２】
標識のレベルを検出するために、Ｃｙ５−ビオチン−アジドまたはＷＳ−ＤＢＣＯ−ビオチンを含む検出試薬ストック溶液を調製し、各反応物に加え、反応物を室温にて３０分間インキュベートした。標識効率は、検出のための抗ビオチン抗体を使用してウエスタンブロッティングによって決定した。
【０２４３】
標識の程度についての検出の代替方法において、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓプログラムを使用して、概ね１〜３μＬの標識されたタンパク質を、７５０ｎｍでのベースライン補正を伴って２８０ｎｍおよび３０９ｎｍの吸光度で読み取った。
【０２４４】
実施例３
クリックシグネチャを含む残留リンカーによる細胞表面に共有結合的に連結している作用剤を含む除核赤血球系細胞の産生
タンパク質を、下記に記載する一般手順によって赤血球系細胞にカップリングした。実施例１において記載したような３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（表２における試料番号１１）で標識した赤血球系細胞を、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルまたはＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステルで標識した１．５〜３モル当量の抗α４β７（マウス）抗体と共にインキュベートし、室温または４℃にて反応物を室温にて１２時間までインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳまたはＰＢＳＡで洗浄し、検出剤に連結した抗マウス抗体で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質標識効率を決定した。図２Ａ〜２Ｃにおいて示すように、タンパク質標識効率は、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル−連結抗α４β７抗体（図２Ｂ）について９８．４％、およびＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル−連結抗α４β７抗体（図２Ｃ）について９４．４％であると決定した。
【０２４５】
別の実験において、高濃度のタンパク質を使用して、タンパク質を小反応容量で赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識した。抗α４β７（ラット）抗体を、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）またはＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ＤＰ）で標識した。標識細胞を、５〜１０μＬの容量の無希釈中で、細胞毎に１〜２０Ｅ６モル当量の抗α４β７抗体と共に２３℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、フルオロフォア（フルオレセインイソチオシアネート）に連結した抗ラット抗体で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。表３において示すように、タンパク質クリック効率は、９８．９〜９９．８％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、例えば、小反応容量および多量のタンパク質を使用することによって、非常に高い百分率の細胞をタンパク質で標識することが可能であることを示す。この実験はまた、抗体が２個の重鎖および２個の軽鎖を有するため、多量体を細胞に連結することは可能であることを示す。この実施例はまた、抗体が約１５０ｋＤａの分子量を有するため、大きな部分を細胞に連結することは可能であることを示す。
【０２４６】
【表３】
2020507329.tif 000023
【０２４７】
実施例４
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介した赤血球系細胞への抗体剤のカップリング
複数のサブユニットおよび／または翻訳後修飾を有するタンパク質を細胞にコンジュゲートさせることは望ましいことがある。この実施例は、細胞表面への抗体のコンジュゲーションについて記載する。
【０２４８】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体（ａＰＤ−Ｌ１）（ラットＩｇＧ２ｂ）を、表４において記載する異なる反応条件下で赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を、０．１ｍＭのＡＳの標識濃度について０．１ｍＭの３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）（ＤＭＳＯに再懸濁する）で標識した。ａＰＤ−Ｌ１を、１０×過剰なＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）（２０ｕｌの１０ｍＭのＤＳ）で標識した。標識細胞を、表４において示す濃度、容量および量の標識されたａＰＤ−Ｌ１と共に２５℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、フルオロフォア（ＰＥ）に連結した抗ラットカッパ軽鎖抗体で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質標識効率を決定した。表４において示すように、タンパク質標識効率は、９９．７〜９９．９％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。細胞毎に存在するａＰＤ−Ｌ１分子の数を決定し、細胞毎に７０００〜１５０００個の分子のａＰＤ−Ｌ１であることが見出された。細胞毎にクリックされたタンパク質の量（ｎｇで）をまた決定したが、表４において示す。一般に、より高い濃度のタンパク質を加えることは、細胞毎により高い百分率の細胞が改変され、より高い分子数がコンジュゲートされることをもたらした。この実験は、タンパク質による非常に高い標識効率を有する、例えば、細胞毎に７０００〜１４，０００個の分子の範囲の細胞毎の平均分子数を達成する、細胞の集団の産生を示す。この実験はまた、抗体が２個の重鎖および２個の軽鎖を有するため、多量体が細胞に連結することができることを示す。実験はまた、例えば、１Ｅ８または１Ｅ９赤血球系細胞を有する細胞の大きな集団を、標識することができ、高い百分率の細胞が標識され、細胞毎に所望の量のタンパク質が達成されることを示す。
【０２４９】
【表４】
2020507329.tif 000024
【０２５０】
実施例５
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介した赤血球系細胞へのタンパク質リガンド剤のカップリング
４１ＢＢリガンド（ｍ４１ＢＢＬ）を、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ｍ４１ＢＢＬをＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、１０〜３０μＬの容量の１〜５ｍｇ／ｍｌの標識されたｍ４１ＢＢＬと共に２３℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ｍ４１ＢＢＬ−ＰＥ）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。表５において示すように、タンパク質クリック効率は、１．１４〜９９．９％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、タンパク質リガンドによる非常に高い標識効率を有する細胞の集団の産生を示す。
【０２５１】
【表５】
2020507329.tif 000025
【０２５２】
実施例６
赤血球系細胞にカップリングしているタンパク質リガンドは、結合活性を有する
細胞毎に高い百分率の標識細胞、および高レベルのクリックされたタンパク質を有する細胞集団を産生することは望ましいことが多い。同時に、「過標識する」、例えば、タンパク質上の多すぎる部位にリンカーをコンジュゲートすることによってタンパク質の機能性を破壊することを回避することが通常望ましい。結果的に、クリックされたタンパク質を有する機能化赤血球系細胞を、生理学的リガンドを結合する能力について試験した。
【０２５３】
４１ＢＢリガンド（ｍ４１ＢＢＬ）を、実施例５において記載するように赤血球系細胞にカップリングした。次いで、細胞を、４１ＢＢ（４１ＢＢＬの同族の結合パートナー）、４１ＢＢを結合するフィコエリトリン−標識抗体、および４１ＢＢを結合するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−標識抗体と接触させた。細胞への４１ＢＢの結合は、４１ＢＢＬが細胞上に存在するだけでなく、その結合部位が機能的であり、結合を可能とするように配向されていることを示す。抗４１ＢＢＬ抗体の結合は、４１ＢＢＬが細胞上に存在することを確実にする。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質標識効率を決定した。表６において示すように、４１ＢＢ結合は、７１．４〜９７．０％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、非常に高い標識効率を有するが、「過標識」を伴わない、例えば、リガンドの結合部位を破壊することを伴わない、細胞の産生を示す。
【０２５４】
【表６】
2020507329.tif 000026
【０２５５】
実施例７
赤血球系細胞にカップリングしている抗体は、結合活性を有する
「過標識」を伴わずに、細胞毎に高い百分率の標識細胞、および高レベルのクリックされたタンパク質を有する細胞集団を産生することが望ましいことが多い。結果的に、クリックされた抗体を、その抗原を結合する能力について試験した。
【０２５６】
抗ＰＤ−Ｌ１を、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ａＰＤ−Ｌ１をＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、２０ｕｌの容量の２ｍｇ／ｍｌの標識された抗ＰＤ−Ｌ１と共に２０℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、Ｆｃキメラタグを有する組換えマウスＰＤ−Ｌ１と接触させた。これは、抗Ｆｃ抗体で検出することができる。組換えタンパク質への、ａＰＤ−Ｌ１と共にクリックされたマウス赤血球系細胞の結合は、集団の完全なシフトによって示されたが、そのため、細胞の全ては、ラット抗体（抗体の存在を示す）およびＦｃタグ（組換えタンパク質への結合を示す）について二重陽性である。
【０２５７】
さらに、ＰＤ−Ｌ１を発現しているマウス腫瘍細胞系に結合するａＰＤ−Ｌ１で標識された赤血球系細胞の能力を評価した。最初に、ＰＤ−Ｌ１発現を、（腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１発現を誘発する）２４時間のＩＦＮｇ刺激を伴うまたは伴わない、３つの細胞系：ＣＴ−２６、Ｂ１６Ｆ．１０およびＡ２０において評価した。ＰＤ−Ｌ１の発現を、アイソタイプ対照抗体と比較して、ａＰＤ−Ｌ１抗体で染色することによって評価した。ＰＤ−Ｌ１を発現している細胞へのａＰＤ−Ｌ１と共にクリックされた赤血球系細胞の結合は、ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  Ｆａｒ  ｒｅｄで事前標識したがん細胞、および赤血球系細胞を４℃にて２時間インキュベートすることによって評価した。細胞懸濁液を抗カッパ鎖抗体で染色し、フローサイトメーターにおいてアセスメントした。Ｆａｒ  Ｒｅｄおよびカッパについて二重陽性である集団は、赤血球系細胞が腫瘍細胞に結合することを示す。この実験は、ＩＦＮｇプレインキュベーションを伴うまたは伴わない条件を評価し、ａＰＤ−Ｌ１をクリックした赤血球系細胞と、アイソタイプ対照抗体をクリックした細胞とを比較した。ａＰＤ−Ｌ１マウス赤血球系細胞に結合した腫瘍細胞の百分率は、腫瘍細胞系におけるＰＤ−Ｌ１発現のレベルによって６０〜９９％の範囲であった（図３）。アイソタイプ対照をクリックしたマウス赤血球系細胞に結合した腫瘍細胞の百分率は、予想通りに、ＰＤ−Ｌ１発現のレベルと相関しなかった。全体的に、腫瘍細胞へのａＰＤ−Ｌ１マウス赤血球系細胞の結合は、ＰＤ−Ｌ１発現の増加と共に有意に増進された。組換えＰＤ−Ｌ１へのおよびＰＤ−Ｌ１を発現している腫瘍細胞への、ａＰＤ−Ｌ１を発現している赤血球系細胞の結合は、抗ＰＤ−Ｌ１が細胞上に存在することだけでなく、その結合部位が機能的であり、結合を可能とするように配向されていることを示す。
【０２５８】
実施例８
細胞およびタンパク質上の未反応のカップリング試薬の定量化
一部の実施形態では、クリックリンカーが連結している細胞およびタンパク質上に存在する未反応のクリックリンカーを有さないか、または非常に低いレベルを有することが望ましい。理論に束縛されるものではないが、一部の実施形態では、より低いレベルの未反応のクリックリンカーは、機能化細胞のより低い免疫原性と関連する。この実施例は、細胞およびタンパク質上に存在する未反応のクリックリンカーの定量化について記載する。
【０２５９】
細胞は、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）との反応によって標識し、ｍ４１ＢＢＬタンパク質は、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）との反応によって標識した。次いで、細胞およびタンパク質を合わせ、タンパク質を細胞表面にコンジュゲートした。次いで、未反応の残留リンカーを蛍光標識されたリンカーを加えることによって検出したが、ここで、Ｃｙ５ＤＢＣＯの付加は、細胞上の残留リンカーと反応し、これを同定し、Ｃｙ５ビオチンアジドの付加は、タンパク質上の残留リンカーと反応し、これを同定した。実験は、タンパク質上の低レベルの未反応のリンカー、特に、１１．２％を示した。この実施例は、例えば、品質管理試験として、製造された細胞およびタンパク質上の従前に未反応のリンカー部位を検出する能力を示す。この実施例はまた、製造された細胞およびタンパク質とリンカー、例えば、低い立体障害を有するリンカーとを反応させることによって、製造された細胞およびタンパク質上の未反応のリンカー部位の数を低減させる能力を示す。
【０２６０】
実施例９
様々な細胞型上への外因性ポリペプチド剤のコンジュゲーション
細胞の混合物を、機械的な撹乱および赤血球の溶解によってマウス脾臓から得た。残存する細胞を、０．１ｍＭの３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識した。精製した大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）アスパラギナーゼを、ＤＢＣＯで標識した。次いで、標識細胞およびタンパク質を合わせ、コンジュゲーションを可能とした。表面のアスパラギナーゼを、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６５７で標識したウサギ抗アスパラギナーゼ抗体および抗ウサギ二次抗体で検出した。各細胞型の同一性を、表７において記載したマーカーを使用して検出した。細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。実験は、集団における異なるタイプの細胞を区別するように設計したゲーティング戦略を使用して、表７において示すような試験した全ての細胞型の有意な標識を示した。
【０２６１】
【表７】
2020507329.tif 000027
【０２６２】
実験はまた、免疫細胞、有核細胞、および除核細胞を含めた多数の細胞の表面への酵素のコンジュゲーションを示す。
【０２６３】
実施例１０
外因性ポリペプチド剤にコンジュゲートした赤血球系細胞は、腫瘍成長がｉｎ  ｖｉｖｏで遅延する
結腸がんのＭＣ３８マウスモデル系を用いて、機能化赤血球系細胞の腫瘍増殖に対する効果を試験した。理論により拘束されることなく、４１ＢＢＬは、先天性および適応性免疫アームの双方で、多様な免疫エフェクター応答を誘発することによって腫瘍増殖を遅延させると考えられている。最も強力な応答は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が増殖し、それらのエフェクター能力が、インターフェロンγ産生の増加と複数のグランザイムの発現を通じて増加するように、刺激する。対照的に、複数の４−１ＢＢ作動薬を使用した既報の前臨床データは、ＭＣ３８またはその他のモデルにおいて、単剤抗腫瘍活性をほとんどまたは全く示さなかった（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ，２０１４；Ｋｕｄｏ−Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ，２００６；Ｋｏｃａｋ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ２００６；Ｔｉｒａｐｕ，ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；Ｊｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃ  Ｒｅｓ  ２０１２）。活性におけるこれらの差異は、４−１ＢＢ−Ｌを発現している赤血球系細胞による細胞性提示を使用して４−１ＢＢエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）の細胞−細胞結合を再現することが、アゴニスト抗体をベースとするアプローチより抗腫瘍応答の刺激において有効であることを示唆する。
【０２６４】
細胞を、実施例５に記載の４−１ＢＢＬにコンジュゲートさせた。この研究において、９４．７％の細胞がｍ４−１ＢＢ−Ｌで標識された。フローサイトメトリーを用いて、細胞当たりの標識された分子の量を定量化した。動物に投与するためには、１用量当たり平均で１．１ｅ９個のｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣを投与し、１用量当たり０．０８４ｍｇ／ｋｇのｍ４−１ＢＢ−Ｌに相当する細胞当たり平均３６，２００個のｍ４−１ＢＢ−Ｌ分子を投与した。
【０２６５】
６〜８週齢の１４匹のメスＣ５７／Ｂ６マウスの左側腹部に、５×１０５個のＭＣ−３８細胞を皮下接種した。動物の体重および状態を毎日記録し、腫瘍を週に３回測定した。
【０２６６】
各腫瘍を２つの寸で測定することにより、腫瘍を週に３回測定した。（Ｌ×Ｗ２）／２の標準式を用いて、腫瘍体積を計算した。各時点で、各群について平均腫瘍重量および標準誤差を計算した。
【０２６７】
未処置対照と比較したｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣの観察された抗腫瘍活性が図４に示され、ｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣで処置したマウスにおける腫瘍増殖の減少が実証される。腫瘍体積分布は、研究の早くも５日目から９日目までに、群間における統計的に有意な差を実証した（Ｐ＜０．０５、Ｔ検定）。
【０２６８】
体重を毎日記録した。体重の変化を１日目に記録された体重と比較して、各マウスについて計算した。ほとんどのマウスの全体的な体重の増加によって示されるように、治療は良好に耐容された。体重のいくらかの減少を示したマウスでは、研究全体にわたり全身重量の５％を超える体重低下はなかった。
【０２６９】
これらのデータは、アゴニスト抗体アプローチを超えた、赤血球系細胞を介した４−１ＢＢ−Ｌの細胞性提示の有意な有効性および効力の利点を支持する。ＭＣ３８モデルにおけるｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣで有意な抗腫瘍活性が観察されたが、これは同じモデルにおけるｍ４−１ＢＢ−Ｌより１０倍高いレベルで投与された４−１ＢＢアゴニスト抗体では従前見られなかった（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ，２０１４）。アゴニスト抗体アプローチと比較した、ｍ４−１ＢＢ−Ｌ  ｍＲＢＣの効力および活性の増加は、４−１ＢＢ−Ｌ細胞性提示、および４−１ＢＢを介した強力なシグナル伝達を誘発することを必要とせず（Ｂｒｅｍｅｒ，２０１３）、かつ免疫シナプス内で通常起こる、対応する４−１ＢＢ受容体多量体化と一致する。
【０２７０】
実施例１１
クリックシグネチャを含む残留リンカーによって細胞表面に共有結合的に連結している３つの外因性ポリペプチド剤を含む赤血球系細胞
複数の作用剤で細胞を標識する能力を試験するために、赤血球系細胞を３つの異なる作用剤で機能化した。３つの作用剤（第ＶＩＩａ因子、第Ｘａ因子、およびＣｙ５）を、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識するか、または標識されたＤＢＣＯ（すなわち、Ｃｙ５）として購入した。細胞を、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識した。標識細胞を標識された作用剤と合わせ、コンジュゲーションが起こることを可能とした。細胞上の３つの作用剤の存在は、フローサイトメトリーによって検出した。実験は、３つの作用剤の全てについて細胞の３３．６％が陽性であったことを示した。
【０２７１】
実施例１２
糖に連結した作用剤
作用剤は、例えば、上記のように、細胞表面上のタンパク質に直接連結することができる。しかし、作用剤はまた、この実施例において記載されているように、細胞表面上の糖、例えば、糖タンパク質上のグリカン鎖に連結することができる。細胞表面においてグリカンを有する細胞を、１個のクリックハンドル、およびグリカンと反応する１個の基を有する二官能性リンカーで標識する。
【０２７２】
１つのアプローチにおいて、クリックハンドルを、抗体上のグリカンを標識するために開発された市販のキットの適合を使用してグリカンに加える。この適合において、抗体よりも細胞をエンドグリコシダーゼで最初に処理し、コアＧｌｃＮＡｃの後にグリカンを加水分解する。次いで、細胞を洗浄し、操作されたガラクトシルトランスフェラーゼ、ＧａｌＴ（Ｙ２８９Ｌ）およびＧａｌＮＡｚｉｄｅで処理する。ＧａｌＴは、ＧａｌＮＡｚｉｄｅ残基を曝露されたＧｌｃＮＡｃに付着させ、アルキン修飾されたタンパク質による生体適合性歪み促進アジド−アルキン化学反応のために利用可能であるアジドをもたらす。
【０２７３】
別のアプローチにおいて、グリカン内の糖部分を最初に修飾して、ｄｅ  Ｂａｎｋ  ｅｔ  ａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８１：  ８００−８０８，２００３に記載されている方法論を使用した隣接ジオールの穏やかな過ヨウ素酸によって媒介される酸化によってアルデヒドおよびケトンを生じさせる。次いで、アルキン含有またはアジド含有クリックハンドルは、それぞれ、アルキンヒドラジドまたはエチミルヒドラジドを使用して、このように得られたアルデヒドおよびケトン基に加えることができる。次いで、作用剤は、上記の他の実施例において記載したように対応するアジドまたはアルキンで標識することができる。次いで、標識された作用剤を標識細胞と共にインキュベートし、コンジュゲーションが起こることを可能とする。細胞への作用剤の連結は、例えば、上記のようなフローサイトメトリーによって検出することができる。
【０２７４】
連結はまた、作用剤上の糖を伴うことができる。例えば、糖を有する作用剤（例えば、外来タンパク質または抗体）は、１個のクリックハンドル、およびグリカンと反応する１個の基を有する二官能性リンカー、例えば、上記のリンカーの１つで標識することができる。細胞は、第２のリンカー、例えば、細胞表面におけるタンパク質または糖と反応するリンカーで標識することができる。次いで、標識細胞および標識された作用剤を一緒に混合し、コンジュゲーションが起こることを可能とする。細胞への作用剤の連結は、例えば、上記のようなフローサイトメトリーによって検出することができる。
【０２７５】
実施例１３
機能化赤血球系細胞の免疫原性の測定
一部の実施形態では、機能化赤血球系細胞は、低い免疫原性を有する。免疫原性は、赤血球系または他の細胞上に発現するタンパク質に対して生じる抗体の測定によって試験することができる。これらの抗体を測定する１つの標準的な方法は、直接的ＥＬＩＳＡを使用することである。赤血球系細胞に連結したタンパク質または作用剤に対する免疫原性は、数日または数週間に亘って、動物または患者に機能化赤血球系細胞を投与し、次いで、血漿または血清試料を得ることによって測定することができる。試料の段階希釈を調製し、次いで、赤血球系細胞を機能化するために使用されるタンパク質または作用剤で事前コーティングされているＥＬＩＳＡプレートウェルにおいて１０〜１２０分間インキュベートし、その結果、タンパク質または作用剤に対して生じた任意の抗体は結合することができる。次いで、プレートを洗浄し、タンパク質または作用剤に結合している任意の抗体に結合する酵素標識された（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）ポリクローナル抗体と共にインキュベートする。次いで、ウェルを洗浄し、ウェル中に残存する酵素活性のレベルを測定して、赤血球系細胞を機能化するために使用されるタンパク質または作用剤に対して生じた抗体のレベルをアセスメントする。
【０２７６】
実施例１４
赤血球系細胞への細胞毒性剤による赤血球系細胞の機能化
この実施例は、どのようにして細胞を、有毒な作用剤、例えば、赤血球系細胞において発現した場合、赤血球系細胞に対して有毒な作用剤、例えば、成長速度、生存率、細胞寿命、または機能を低減させる作用剤（赤血球系細胞への細胞毒性）で機能化することができるかを記載する。細胞毒性剤は、例えば、アミノ酸を分解し、かつ細胞の成長および増殖を損なう酵素タンパク質、重要な代謝分子もしくは分子の中間体を修飾もしくは分解することにおいて関与する酵素、または重大な細胞過程を妨げるタンパク質もしくは分子、例えば、リシンを含む。
【０２７７】
赤血球系細胞への細胞毒性剤の一例は、臨床的にがん細胞を飢餓させるために使用されるアスパラギナーゼである。成熟赤血球系細胞におけるアスパラギナーゼの過剰発現は、細胞成長および細胞の成熟を妨げる。
【０２７８】
細胞、例えば、Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１ＭｏｍＩＪ（Ｒａｇ１ノックアウトマウス）からのマウス赤血球を、マウスに２ｍｇの３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステルを注射し、次いで、細胞を２日後に収集することによってｉｎ  ｖｉｖｏで標識する。
【０２７９】
赤血球系細胞への細胞毒性剤、例えば、アスパラギナーゼを、５×および２．５×過剰なモル濃度のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルで２５℃にて３０分間標識する。５×過剰なモル濃度のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルは、アスパラギナーゼモノマー毎に約２個の標識をもたらし、２．５×過剰なモル濃度のＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルは、アスパラギナーゼモノマー毎に約１．２個の標識をもたらす。
【０２８０】
次いで、標識細胞を、２つの異なる濃度のアスパラギナーゼ標識されたＤＢＣＯと異なる程度まで６０分間合わせ、コンジュゲーションが起こり、異なる程度に標識された細胞が達成されることを可能とする。細胞の表面上の作用剤の存在は、アスパラギナーゼに対する抗体によるフローサイトメトリーを使用して、アスパラギナーゼについての活性アッセイを使用して検出することができる。
【０２８１】
【表８】
2020507329.tif 000028
【０２８２】
血清アスパラギナーゼをある期間に亘って枯渇させる、コンジュゲートしていないアスパラギナーゼに対する、赤血球がコンジュゲートしたアスパラギナーゼの相対的な能力は、マウスにおいて試験することができる。マウスに、表９において示すように、対照赤血球、高量もしくは低量のアスパラギナーゼで一緒に標識したＲＢＣ、または低量、中量、もしくは高量のコンジュゲートしていない組換えアスパラギナーゼで標識したＲＢＣを注射した。対照、およびアスパラギナーゼをコンジュゲートしたＲＢＣを、蛍光タグ、Ｃｙ５でさらに標識し、注射に続いてＲＢＣの薬物動態を決定した。次いで、血液試料を注射の後の様々な時間において採取し、アスパラギンのレベルおよび標識されたＲＢＣレベルを決定する。
【０２８３】
【表９】
2020507329.tif 000029
【０２８４】
０．３９マイクログラム、２．８マイクログラム、または１５マイクログラムの組換えアスパラギナーゼを、Ｃ５５７ＢＬ／６マウスに注射したとき、血清中アスパラギンは、注射の６時間後にほぼゼロに低減した（図５）。しかし、０．３９ｕｇの群について、血清中アスパラギンレベルは、注射の１日後までにほぼ正常レベルに上昇し、一方、２．８ｕｇおよび１５ｕｇの用量群は、概ねまたは約正常レベルに４日目までに上昇した。対照的に、アスパラギンレベルは、赤血球にカップリングしている定量または高量のアスパラギナーゼを投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスにおいて、６時間から８日までほぼゼロに低減し、レベルは、１１日目までに再び上昇し始めた（図５）。同様の結果をＲａｇ１マウスにおいて得た（図６）。しかし、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと対照的に、アスパラギンレベルは、２９日目までほぼゼロのままであった（図６）。ＡＳＮａｓｅがコンジュゲートした細胞の薬物動態をまた、フローサイトメトリーを使用して、注射の後の様々な時間においてＣｙ５−陽性細胞の百分率を検出することによって測定する。注射の１日後、残存するＡＳＮａｓｅがコンジュゲートした細胞のクリアランスは、Ｃｙ５−標識細胞と同様であった（図７Ａおよび７Ｂ）。１日目において循環中に存在するＲＢＣの概ね２０％は、血液中に１８日目まで留まった。より高いレベルのＡＳＮａｓｅを有する細胞について、細胞の最初の急速なクリアランスは、より低いレベルのＡＳＮａｓｅを有する細胞についてよりも大きかった。この最初の急速なクリアランスにも関わらず、１日目より後に循環中に留まっている細胞は、少なくとも２２日目まで循環において検出可能のままであった。この実験は、アスパラギナーゼを赤血球にコンジュゲートすることが、血液中のアスパラギナーゼの循環時間を劇的に改善させることを示す。この増進された曝露は、単回投与による数日および数週間に亘る、血清アスパラギンレベルを低減させる能力における劇的な改善と関連する。
【０２８５】
さらに、アスパラギナーゼ標識されたＲＢＣについての薬物動態プロファイルはまた、反復投与で変化しなかったが、このアッセイによって検出可能なように、３つのレベル全てのアスパラギナーゼについての、アスパラギナーゼ標識されたＲＢＣに対する免疫原性応答の欠如を示す。
【０２８６】
実施例１５
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介した赤血球系細胞への酵素剤のカップリング
第Ｘａ因子（ＦＸａ）を、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、１ｅ９〜１．３６ｅ１０個の細胞／ｍｌの赤血球系細胞を３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ＦＸａをＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、１０μＬ〜３ｍＬの容量の０．５〜１．７ｍｇ／ｍｌの標識されたＦＸａと共に２３℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ＦＸａ−ＰＥ）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。タンパク質クリック効率は、９９％の範囲であると決定した。この実験は、酵素による非常に高い標識効率を有する細胞の集団の産生を示す。
【０２８７】
細胞毎の第Ｘａ因子タンパク質分子の数を、抗体結合能力によって細胞毎に１，０００〜２５０，０００個の分子であると定量化した。細胞毎のタンパク質の数は、例えば、実施例４において記載したように、例えば、タンパク質濃度、細胞の数、および反応容量を使用して調節することができる。
【０２８８】
第Ｘａ因子の活性を、細胞毎に１４，０００個までの活性分子として、ＴＧＡ活性によって定量化した。
【０２８９】
実施例１６
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介したヒト赤血球系細胞へのタンパク質剤のカップリング
第Ｘａ因子（ＦＸａ）およびアスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）を、ヒト赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ＦＸａおよびＡＳＮａｓｅを、それぞれ、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ５−ＮＨＳエステル（ＤＰ）およびＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、１０μＬの容量の１．０３ｍｇ／ｍｌの標識されたＦＸａおよび４．５３５ｍｇ／ｍｌのＡＳＮａｓｅと共に２３℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ＦＸ−ＰＥおよび抗ＡＳＮａｓｅ−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。タンパク質クリック効率は、ＦＸａについて９９．９％およびＡＳＮａｓｅについて７１．１％の範囲であると決定した。この実験は、異なるタンパク質による非常に高い標識効率を有するヒト赤血球系細胞の集団の産生を示す。
【０２９０】
実施例１７
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介した赤血球系細胞へのペプチド剤のカップリング
ビオチン化ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質３５−５５（ＭＯＧ）ペプチドを、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を、異なる量（高量および低量）の３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ＭＯＧペプチドを、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、１０μＬの容量の２．７ｍｇ／ｍｌの標識されたＭＯＧ−ＤＢＣＯと共に２３℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ビオチン−ＰＥ）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ペプチドクリック効率を決定した。ペプチドクリック効率は、ＭＯＧについて６７．４％〜９１．８％の範囲であると決定した。この実験は、ペプチドによる調節可能な程度の標識効率を有する細胞の集団の産生を示す。この実験はまた、短いペプチド（約２０個のアミノ酸）を赤血球系細胞上へと効率的にクリックすることができることを示す。
【０２９１】
実施例１８
クリックシグネチャを含む残留リンカーを介した赤血球系細胞へのサイトカイン剤のカップリング
ヒトＩＬ１０（ｈＩＬ１０）を、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ｈＩＬ１０をＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で標識した。標識細胞を、２μＬの容量の０．２４〜０．７９ｍｇ／ｍｌの標識されたｈＩＬ１０と共に２３℃にて１〜３時間または４℃にて１６時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ｈＩＬ１０−ＰＥ）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。表１０において示すように、タンパク質クリック効率は、７６．７〜１００％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、非常に高い標識効率、例えば、細胞毎に２００，０００個超の分子を伴う細胞の集団の産生を示す。
【０２９２】
【表１０】
2020507329.tif 000030
【０２９３】
実施例１９
赤血球系細胞にカップリングしているサイトカインは、結合活性を有する
クリックされたタンパク質を有する機能化赤血球系細胞を、生理学的リガンドを結合する能力について試験した。上記で考察するように、タンパク質の結合活性を保存する一方で、細胞毎に高い百分率の標識細胞および高レベルのクリックされたタンパク質を有することが望ましいことが多い。
【０２９４】
ヒトＩＬ１０（ｈＩＬ１０）を、実施例１８に記載するように血球系細胞にカップリングした。次いで、細胞をヒトＩＬ１０受容体アルファＦｃ融合（ｈＩＬ１０の同族の結合パートナー）と接触させ、Ｆｃを結合するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）−標識抗体を使用して、細胞上へとクリックされたｈＩＬ１０の相互作用、およびヒトＩＬ１０受容体アルファへのその結合を検出した。細胞へのｈＩＬ１０受容体アルファの結合は、ｈＩＬ１０が赤血球系細胞上に存在するだけでなく、その結合部位が機能的であり、結合を可能とするように配向されていることを示す。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質標識効率を決定した。表１１において示すように、ｈＩＬ１０結合は、９０．０〜９５．０％の範囲であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、非常に高い標識効率を有するが、「過標識」を伴わない、例えば、リガンドの結合部位を破壊することを伴わない細胞の産生を示す。
【０２９５】
【表１１】
2020507329.tif 000031
【０２９６】
実施例２０
赤血球系細胞への標的化部分と組み合わせたサイトカインのカップリング
抗α４β７Ｆａｂと組み合わせたヒトＩＬ１０（ｈＩＬ１０）を、赤血球系細胞にカップリングした。反応を行うために、赤血球系細胞を、３−アジドプロピオン酸スルホ−ＮＨＳエステル（ＡＳ）で標識し、ｈＩＬ１０および抗α４β７Ｆａｂを、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステル（ＤＳ）で個々に標識した。標識細胞を、３０μＬの容量の０．５８３ｍｇ／ｍｌの標識されたｈＩＬ１０と共に、および１９．３５μＬの容量の２．４３４ｍｇ／ｍｌの標識された抗α４β７Ｆａｂと共に、２３℃にて２時間インキュベートした。次いで、細胞を、０．１％ウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝食塩水で洗浄し、蛍光検出試薬（抗ｈＩＬ１０−ＢＶ４２１および抗ラットカッパ軽鎖−ＰＥ）で染色した。次いで、細胞をフローサイトメトリーによって分析し、タンパク質クリック効率を決定した。二重タンパク質クリック効率は、概ね９８．３％であると決定した。細胞は、その蛍光がその他の点では同様の非標識細胞の９９％超である場合、蛍光について陽性であると考えられる。この実験は、サイトカインおよび標的化部分による非常に高い標識効率を有する細胞の集団の産生を示す。
【０２９７】
実施例２１
クリック特異性
この実施例は、クリック標識の特異性を示す。３つの試料をアッセイした。最初に、未処置のマウス赤血球（クリックハンドルを欠いている）を、ＤＢＣＯクリックハンドルを有するタンパク質剤（抗ａ４ｂ７Ｆａｂ）と混合した。第２に、アジドクリックハンドルを有するマウス赤血球を、クリックハンドルを欠いていた抗ａ４ｂ７Ｆａｂと混合した。第３に、アジドクリックハンドルを有するマウス赤血球を、適合性のＤＢＣＯクリックハンドルを有する抗ａ４ｂ７Ｆａｂと混合した。反応をＰＢＳ中で室温にて１時間進行させた。次いで、細胞と、ＰＥ（フィコエリトリン）抗体とコンジュゲートした抗ラットＩｇＧカッパとを接触させ、フローサイトメトリーを行うことによって、細胞を、抗ａ４ｂ７Ｆａｂの存在についてアッセイした。細胞は、そのシグナルが、検出試薬の存在下ではあるが、抗ａ４ｂ７Ｆａｂタンパク質の非存在下で未処理のその他の点では同様の細胞の９９％のそれより大きかった場合、蛍光について陽性であると考えられた。予想どおりに、第１および第２の試料は、低い蛍光（それぞれ、１．８１％および１．５３％の細胞が蛍光を発する）を有し、一方、第３の試料は、高度に蛍光性であった（９５．２％の細胞が蛍光を発する）。この実施例は、クリック標識が高度に特異的であることを示す。
【０２９８】
実施例２２
作用剤のＮ末端へのクリックハンドルのコンジュゲーション
例えば、Ｃ末端ドメインの機能性をより良好に保存するために、例えば、標識を目的のタンパク質のＮ末端に向いて偏ることによって、タンパク質生物学の撹乱を防止することが望ましいことが多い。目的のタンパク質を、カップリング試薬で標識することによって赤血球系細胞へのカップリングのために調製した。ヒトＩＬ１０の機能性をより良好に保存するために、ＮＨＳエステル化学は、Ｎ末端標識に向いて偏っていた。タンパク質を脱塩し、緩衝液をＰＢＳに交換し、次いで、標識の前に≧１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ｐＨを中性ｐＨ、概ね７〜７．４で維持した。
【０２９９】
カップリング試薬のストック溶液を、実施例１において記載するように調製した。カップリング試薬を、タンパク質濃度に対して１対１のモル比で加えた。タンパク質標識反応物を、１０分毎の穏やかな撹拌を伴って、室温にて１時間から１時間３０分インキュベートした。標識のレベルを検出するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓプログラムを使用して、概ね１〜３μＬの標識されたタンパク質を、７５０ｎｍでのベースライン補正を伴って２８０ｎｍおよび３０９ｎｍの吸光度で読み取った。標識の程度は、タンパク質毎に０．６３〜１．３９個の範囲のＤＢＣＯクリックハンドル分子であった。
【０３００】
実施例２３
マレイミド化学を使用した、例えば、π−クランプに位置している遊離システイン残基を含む作用剤へのクリックハンドルのコンジュゲーション
例えば、部位特異的マレイミド化学コンジュゲーションのための目的のタンパク質中に遊離システインを導入することによって、タンパク質生物学をより良好に保存することは望ましくあり得る。目的のタンパク質（例えば、マウス４１ＢＢＬ）を、カップリング試薬との標識によって赤血球系細胞へのカップリングのために調製した。タンパク質機能性をより良好に保存するために、遊離システインを、部位特異的マレイミド化学コンジュゲーションのための「π−クランプ」として公知である４つのアミノ酸配列（ＦＣＰＦ、配列番号６４）における組換え４１ＢＢＬタンパク質中に導入した。π−クランプがこの実施例において使用されているが、任意の遊離システイン残基を、例えば、本明細書に記載のような部位特異的コンジュゲーションのために使用し得ることが意図されている。タンパク質を脱塩し、緩衝液をＰＢＳに交換し、標識の前に≧１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。タンパク質を１ｍＭのＤＴＴで還元し、室温にて１時間インキュベートし、ＮＡＰ５カラム上で脱塩した。
【０３０１】
マレイミドカップリング試薬を、タンパク質濃度に対して５倍過剰なモル濃度で加えた。タンパク質標識反応物を、室温にて４時間インキュベートし、ＮＡＰ１０カラムを使用して脱塩した。標識のレベルを検出するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓプログラムを使用して、概ね１〜３μＬの標識されたタンパク質を、７５０ｎｍでのベースライン補正を伴って２８０ｎｍおよび３０９ｎｍの吸光度で読み取った。標識の程度は、タンパク質毎に６〜７．６個の範囲のＤＢＣＯクリックハンドル分子であった。
【０３０２】
実施例２４
チオリンカー化学を使用した２個のシステイン残基を含む作用剤へのクリックハンドルのコンジュゲーション
目的のタンパク質における特定の部位において、および／または特定の配向で、クリックハンドルを導入することは望ましくあり得る。目的のタンパク質を、カップリング試薬で標識することによって赤血球系細胞へのカップリングのために調製した。１つの方法において、チオリンカー化学を、架橋ジスルフィド結合を介した部位特異的クリックハンドルコンジュゲーションのために、組換え抗ＣＴＬＡ４Ｆａｂタンパク質に導入した。Ｆａｂを脱塩し、緩衝液をＰＢＳに交換し、標識の前に≧１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次いで、Ｆａｂを５ｍＭのＤＴＴで還元し、３７℃にて１時間インキュベートし、次いで、緩衝液をＰＢＳへと交換した。チオリンカーカップリング試薬を、タンパク質濃度に対して１５倍過剰なモル濃度で加え、還元されたジスルフィド結合を標識した。タンパク質標識反応物を、４℃にて１６〜１８時間インキュベートし、Ｚｅｂａカラムを使用して脱塩した。標識のレベルを検出するために、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＵＶ−Ｖｉｓプログラムを使用して、概ね１〜３μＬの標識されたタンパク質を、７５０ｎｍでのベースライン補正を伴って２８０ｎｍおよび３０９ｎｍの吸光度で読み取った。標識の程度は、タンパク質毎に８．３個のＤＢＣＯクリックハンドル分子であった。抗ＣＴＬＡ−４Ｆａｂ上のチオリンカー配向クリックハンドル標識を他のクリックハンドル試薬と比較し、細胞の十分な標識がもたらされたことが見出された。チオリンカー標識された抗ＣＴＬＡ−４はまた、組換えＣＴＬＡ４への機能的結合を有意に増加させたことが見出された。
【０３０３】
別の方法において、チオリンカー化学を使用して、組換えタンパク質（ＨＩＳ６マウス４１ＢＢＬ）を、ＨＩＳ６精製タグを介して部位特異的に標識した。タンパク質を典型的には脱塩し、緩衝液をＰＢＳに交換し、標識の前に≧１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。次いで、チオリンカーカップリング試薬を、タンパク質濃度に対して２０倍過剰なモル濃度で加え、タンパク質（非還元）のＨＩＳ６タグを標識した。タンパク質標識反応物を、室温にて３時間インキュベートし、Ｚｅｂａ脱塩カラムを使用して緩衝液をＰＢＳに交換した。ＡＳ標識したＲＢＣ上へとクリックされたＨＩＳ６マウス４１ＢＢＬのチオリンカー標識は、それぞれ、ＩＬ−２産生（図８Ａ）およびインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）産生（図８Ｂ）によって示されるように、免疫細胞を活性化する４１ＢＢＬをクリックされた細胞についての機能的能力の増加をもたらした。ＨＩＳ６マウス４１ＢＢＬの配向された連結は、ランダム連結と比較して実質的に多いＩＬ−２およびＩＦＮ−γ分泌をもたらしたが、後者は、クリックＣＴＬ対照（ＡＳ標識したＲＢＣのみ）よりも有意により多いサイトカイン分泌を誘発したことが観察された。
【０３０４】
実施例２５
非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を含む作用剤の生成
例えば、目的のタンパク質中に部位特異的様式で非標準アミノ酸（ｎｃＡＡ）を組み込むことによって、目的のタンパク質内の目的の特定の部位においてカップリング試薬を導入することが望ましくあり得る。この実施例において、目的のタンパク質を、ｔＲＮＡ／アミノ−アシル−ｔＲＮＡシンターゼ対を含有するプラスミド、および目的の部位において組み込まれているアンバー終止コドン（ＴＡＧ）を有する目的のタンパク質（ｍＩｇ−マウス４１ＢＢＬ）をコードするプラスミドによる、Ｅｘｐｉ２９３細胞の同時トランスフェクションによって産生した。細胞を蒔き、１日目にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅキットを使用して、プラスミドを１．５μｇ／ｍＬの各プラスミドでトランスフェクトした。異なる濃度（２ｍＭ、１．３ｍＭ、１ｍＭ、２５０μＭ）のｎｃＡＡ（Ｅｘｏ（ＢＣＮ）−Ｌｙｓ；図９Ａ）を、アンバー終止コドンの代わりに部位特異的組込みのためにトランスフェクトされた細胞に同日に加えた。トランスフェクション後３日目に、媒体を収集して、分泌されたタンパク質を得た。分泌されたタンパク質は、室温にて３０分間のアジド−ビオチンＣｙ５とのインキュベーション、次いで、ウエスタンブロット分析によって、部位特異的ｎｃＡＡ組込みを有すると確認された。タンパク質を、抗４１ＢＢＬ抗体および二次ＨＲＰ抗体で検出し、クリックハンドル組込みを、抗ビオチン−ＨＲＰ抗体で検出した。
【０３０５】
【表１２】
2020507329.tif 000032
【０３０６】
図９Ｂに示されているように、ｎｃＡＡ  ｅｘｏ（ＢＣＮ）−リシンの部位特異的組込みは、クリック可能なマウス４１ＢＢＬの産生をもたらした。
【０３０７】
実施例２６
クリックシグネチャを有するリンカーを介した赤血球系細胞への尿酸オキシダーゼのカップリング
組換えトルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）Ｈｉｓ６−尿酸オキシダーゼを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現させ、精製し、ＤＢＣＯ−スルホ−ＮＨＳエステルで標識し、モノマー毎に概ね１つの標識の比で尿酸オキシダーゼを得た。マウス赤血球（ＲＢＣ）を、６−アジドヘキサン酸スルホ−ＮＨＳエステルで標識した。カップリング反応を行ったが、ここで、１ｅ９個の標識されたマウスＲＢＣを、０ｕＭまたは７５ｕＭのＤＢＣＯ標識された尿酸オキシダーゼの存在下で室温にて２時間インキュベートした。尿酸オキシダーゼコンジュゲーションの程度を、Ｈｉｓ６−尿酸オキシダーゼについてのマウスＲＢＣをＤｙＬｉｇｈｔ４８８で標識した抗Ｈｉｓ６抗体で染色し、それに続くフローサイトメトリー分析によって評価した。７５ｕＭの尿酸オキシダーゼと共にインキュベートしたＲＢＣの１００％を、酵素で標識した。対照的に、０ｕＭの尿酸オキシダーゼで処理した陰性対照細胞の０．１６％のみが、このアッセイにおいて蛍光陽性を示した。尿酸オキシダーゼにカップリングしているＲＢＣは、尿酸を効率的に枯渇させることができたが、約４．６ｅ〜１２単位／細胞の尿酸オキシダーゼ活性を示す。
【０３０８】
実施例２７
外因性ポリペプチド剤を含む赤血球系細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性である
除核赤血球系細胞をそれらの表面で抗ＰＤ−Ｌ１に結合させ、マウスの腫瘍に浸潤する能力について試験した。
【０３０９】
マウスにＢ１６Ｆ１０細胞ＳＣを接種した。投与前に腫瘍を４００立方ｍｍまで成長させた。マウスＲＢＣを抗マウスＰＤ−Ｌ１由来のフラグメント抗体（Ｆａｂ）およびアイソタイプ対照にコンジュゲートさせた。コンジュゲートされたマウスＲＢＣを製造元のプロトコルに従ってＣＴＦＲで標識した。細胞を動物に注入した。注入の１日後、腫瘍を採取した。腫瘍を切片化し、抗ＣＤ３１で染色して腫瘍血管系を視覚化し、ＤＡＰＩで核を視覚化した。染色切片をスキャンし、写真を撮影した。Ｈａｌｏソフトウェアを用いて、腫瘍領域と血管系領域を特定した。これら２つの領域における標識されたＲＢＣの総細胞数を、アイソタイプ対照および抗ＰＤ−Ｌ１の双方について数えた。腫瘍内に見いだされたＲＢＣと、血管内に見いだされたＲＢＣとの比率を計算した。アイソタイプ対照コンジュゲートＲＢＣについて、血管内のＲＢＣと腫瘍内のＲＢＣとの比率が１であり（８匹のマウスからの腫瘍における測定の平均）、腫瘍および血管系における同様の量が示される。血管内のＲＢＣと腫瘍内のＲＢＣとの比率は、抗ＰＤ−Ｌ１処置マウスについて１．７であり、アイソタイプ対照マウスと比較して、抗ＰＤ−Ｌ１群における腫瘍内のＲＢＣの富化が示される。２群間の比率の差はＰ＜０．０１（スチューデントＴ検定）であり、統計的に有意であった。
【０３１０】
理論による拘束は望まないが、より高いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍は、より低いレベルのＰＤ−Ｌ１を発現する腫瘍よりも、抗ＰＤ−Ｌ１を含むＲＣＴに対してより良好に応答してもよい。１０ｎｇ／μｌのＩＦＮ−γで刺激した場合、Ｂ１６Ｆ１０細胞は、細胞あたり約３００，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現した。対照的に、同一条件下で、ＣＴ２６細胞は１細胞当たり約１５０，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現し、Ａ２０細胞は１細胞当たり約１００，０００コピーのＰＤ−Ｌ１を発現した。ＰＤ−Ｌ１コピー数は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒキット（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて測定した。それらの表面に抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む赤血球系細胞は、ＩＦＮ−γ処理Ｂ１６Ｆ１０細胞およびＣＴ２６に対して、Ａ２０細胞に対するよりも大きな結合を示し、腫瘍細胞上でのより高いレベルのＰＤ−Ｌ１発現と一致して、赤血球系細胞の腫瘍細胞への結合の増加をもたらした。
【図１】
2020507329.tif 000033
【図２Ａ−２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2020507329.tif 000038
【図７Ａ−７Ｂ】
2020507329.tif 000039
【図８Ａ−８Ｂ】
2020507329.tif 000040
【図９Ａ−９Ｂ】
2020507329.tif 000041
【配列表】
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【国際調査報告】
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