(57)【要約】  本発明は、多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチンであって、免疫原発現カセットを含み、発現カセットによってコードされるタンパク質の発現が、プロモーターによって駆動されるよう配置されており、免疫原発現カセットが、ａ）ＨＢＶコア；ｂ）改変が実質的にポリメラーゼ機能を除去する野生型ＨＢＶポリメラーゼに対する変異である、改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）；ｃ）ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）；およびｄ）少なくともＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をＨＢＶコアおよび改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と分離したタンパク質として発現させるよう配置された遺伝子間配列をコードし、遺伝子間配列が、ＨＢＶコアおよび改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）をコードする配列の下流（３’）にあり、かつＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をコードする配列の上流（５’）にあるウイルスベクターを含む、多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン；ならびに関連組成物、ワクチン接種方法およびＨＢＶ感染の治療または予防の方法に関する。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチンであって、
免疫原発現カセットを含み、前記発現カセットによってコードされるタンパク質の発現が、プロモーターによって駆動されるよう配置されており、前記免疫原発現カセットが、
ａ）ＨＢＶコアと、
ｂ）改変が実質的にポリメラーゼ機能を除去する野生型ＨＢＶポリメラーゼに対する変異である、改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と、
ｃ）ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）と、
ｄ）少なくとも前記ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を前記ＨＢＶコアおよび前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と分離したタンパク質として発現させるよう配置された遺伝子間配列とをコードし、前記遺伝子間配列が、前記ＨＢＶコアおよび前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）をコードする配列の下流（３’）にあり、かつ前記ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をコードする配列の上流（５’）にある、ウイルスベクター
を含む、多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２】
前記遺伝子間配列が、切断ドメイン、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）、スプライシングシグナルまたは第二のプロモーターを含む、請求項１に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３】
前記遺伝子間配列が切断ドメインを含み、
任意選択で、前記切断ドメインがリボソームスキッピング切断ドメインを含み、
さらに任意選択で、前記切断ドメインが、フューリン２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド配列またはその機能的バリアントを含むか、これよりなるものである、
請求項１に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項４】
前記遺伝子間配列が、少なくとも前記表面抗原（ＨｂｓＡｇ）の発現を促進する第二のプロモーターを含む、請求項１に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項５】
前記免疫原発現カセットがＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）をさらにコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項６】
前記免疫原発現カセットが、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１および／またはその短縮型をさらにコードする、請求項１〜５のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項７】
前記免疫原発現カセットがＨＢＶ  ＰｒｅＳ２をさらにコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項８】
前記免疫原発現カセットが、ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）およびＨＢＶ  ＰｒｅＳ１ならびに短縮型のＰｒｅＳ１をコードする、請求項１〜７のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項９】
前記免疫原発現カセットがＨＢＶ  ｅ抗原を発現することが可能である、請求項１〜８のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１０】
前記ＨＢＶコアおよび前記改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が、融合タンパク質として発現するよう配置されている、請求項１〜９のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１１】
前記ＨＢＶプレ−コア、前記ＨＢＶコアおよび前記改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が、融合タンパク質として発現するよう配置されている、請求項５〜１０に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１２】
前記免疫原発現カセットがＨＢＶ  Ｘタンパク質をコードしない、請求項１〜１１のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１３】
前記免疫原発現カセットが、
配列番号４６（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）もしくはそのバリアント、
配列番号４７（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ）もしくはそのバリアント、
配列番号４８（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ））もしくはそのバリアント、
配列番号４９（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））もしくはそのバリアント、
配列番号２４（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ））もしくはそのバリアントあるいは
配列番号２７もしくは配列番号５８（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアント
の配列を含む核酸を含む、請求項１〜１２のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１４】
前記ウイルスベクターが、
配列番号３（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）またはそのバリアント、
配列番号１１（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ）またはそのバリアント、
配列番号１３（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアント、
配列番号２５（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアント、
配列番号２３（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアント、
配列番号２６（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアント
のアミノ酸配列をコードする、請求項１〜１３のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１５】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターまたは改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）ベクターを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１６】
前記ウイルスベクターがＥ群サルアデノウイルスベクターを含み得る、請求項１〜１５のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１７】
前記プロモーターが前記免疫原発現カセット内にコードされている、例えば、前記プロモーターが、前記免疫原発現カセットの５’末端に、またはそれに隣接してコードされ得る、あるいは
前記プロモーターが、前記免疫原発現カセットの外側にあるウイルスベクター核酸の一部としてコードされ得る、
請求項１〜１６のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１８】
前記プロモーターが、前記免疫原発現カセットの全コードタンパク質の発現を促進する、請求項１〜１７のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項１９】
前記免疫原発現カセットが第二のプロモーターを含み、前記プロモーターが、少なくとも前記ＨＢＶコアおよび前記改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）の発現を促進し、前記第二のプロモーターによって別個に促進されるよう配置された前記ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）の発現は促進しないよう配置された、主要なプロモーターである、請求項１〜１７のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２０】
前記プロモーターが、ＣＭＶプロモーターまたはポックスウイルスプロモーターを含む、請求項１〜１９のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２１】
前記ＨＢＶコアが、完全長野生型ＨＢＶコア配列を含むか、これよりなるものである、請求項１〜２０のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２２】
前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が短縮型のＨＢＶポリメラーゼではない（すなわち、野生型ＨＢＶポリメラーゼに対して完全長である）、請求項１〜２１のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２３】
前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が、配列番号８の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものである、請求項１〜２２のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２４】
前記ＨｂｓＡｇが、完全長野生型ＨｂｓＡｇ配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものである、請求項１〜２３のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２５】
前記免疫原発現カセットが短縮型のＨＢＶ  ＰｒｅＳ１をコードし、前記短縮ＰｒｅＳ１が前記ＨＢＶ表面抗原との融合タンパク質（Ｓ／ＨｂｓＡｇ）として発現するよう配置されている、請求項１〜２４のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２６】
前記短縮ＰｒｅＳ１と前記表面抗原（Ｓ／ＨｂｓＡｇ）の間に加えられたリンカー配列をさらに含む、請求項２５に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２７】
融合した表面抗原を有する前記短縮ＰｒｅＳ１が、前記遺伝子間配列の下流（３’）にコードされている、請求項２５または２６に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２８】
前記発現カセットが、ＮΔＰｒｅＳ１とＰｒｅＳ２の融合配列をコードし、請求項１〜２７のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項２９】
コードされる前記ＮΔＰｒｅＳ１とＰｒｅＳ２の融合配列が、前記遺伝子間配列の上流（５’）にコードされている、請求項２８に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３０】
コードされる前記ＮΔＰｒｅＳ１とＰｒｅＳ２の融合配列が、前記改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）とさらに融合している、請求項２９に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３１】
前記ＰｒｅＳ２と前記改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）の間にリンカー配列が加わった、請求項３０に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３２】
前記免疫原発現カセットがペプチドアジュバントをさらにコードする、請求項１〜３１のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３３】
前記ペプチドアジュバントが、ＴＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、ヒトインバリアント鎖（Ｉｉ）もしくは非ヒトインバリアント鎖（Ｉｉ）またはそのフラグメントを含む、請求項３２に記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３４】
融合タンパク質内にもたらされるタンパク質／抗原配列のうち１つもしくは複数のものまたは全部の間にリンカー残基がコードされている、請求項１〜３３のいずれかに記載の多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチン。
【請求項３５】
ＨＢＶ免疫原発現カセットを含むか、これよりなる核酸であって、
前記免疫原発現カセットが、
ａ）ＨＢＶコアと、
ｂ）改変が実質的にポリメラーゼ機能を除去する野生型ＨＢＶポリメラーゼに対する変異である、改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と、
ｃ）ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）と、
ｄ）少なくとも前記ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を前記ＨＢＶコアおよび前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と分離したタンパク質として発現させるよう配置された遺伝子間配列と
をコードし、
前記遺伝子間配列が、前記ＨＢＶコアおよび前記改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）をコードする配列の下流（３’）にあり、かつ前記ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をコードする配列の上流（５’）にある、
核酸。
【請求項３６】
前記免疫原発現カセットがプロモーターをさらにコードする、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
前記免疫原発現カセットが、分離しているか、非ウイルスベクター内に提供されるものである、請求項３５または３６に記載の核酸。
【請求項３８】
請求項１〜３４のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項３５〜３７のいずれかに記載の核酸を含み、任意選択で、薬学的に許容される組成物である、組成物。
【請求項３９】
別の治療有効成分もしくは予防有効成分および／またはアジュバントをさらに含む、請求項３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
薬学的に許容される担体を含み、かつ／またはワクチン組成物である、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４１】
対象のＨＢＶ感染の予防または治療に使用するものであり、任意選択で、前記使用がワクチンとしての使用である、請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物、請求項１〜３４のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項３５〜３７のいずれかに記載の核酸。
【請求項４２】
請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物、請求項１〜３４のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項３５〜３７のいずれかに記載の核酸の対象への投与を含む、ＨＢＶ感染の治療方法または予防方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法の請求項４１に記載の使用のための組成物であって、前記使用または前記投与が、別の治療有効成分または予防有効成分の使用または投与と組み合わさったものである、組成物。
【請求項４４】
請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物、請求項１〜３４のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項３５〜３７のいずれかに記載の核酸を含む、プライムワクチン接種と、
請求項３８〜４０のいずれかに記載の組成物、請求項１〜３４のいずれかに記載のウイルスベクターまたは請求項３５〜３７のいずれかに記載の核酸を含む、ブーストワクチン接種と
を含む、プライムブーストワクチン接種キット。
【請求項４５】
前記プライムワクチン接種と前記ブーストワクチン接種が異なるウイルスベクターを含む、請求項４４に記載のプライムおよびブーストワクチン接種キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性Ｂ型肝炎に対する治療的ワクチン接種のためのウイルスベクターワクチン用の多抗原性ＨＢＶ免疫原に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎は、肝臓を冒すウイルス感染症の１つであり、急性疾患も慢性疾患も引き起こす可能性がある。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、感染者の血液またはその他の体液との接触を介して伝染する。急性Ｂ型肝炎に特異的な治療法はない。このため、管理は、嘔吐および下痢で失われた体液の補給を含めた快適で十分な栄養バランスの維持を目的とするものとなる。しかし、急性Ｂ型肝炎に取り組むうえで中心となるのは、ワクチン接種を用いて予防することによるものである。慢性Ｂ型肝炎感染が確立されると、経口抗ウイルス剤を含めた薬物療法が可能である。治療により、肝硬変の進行を遅らせ、肝癌の発生率を抑え、長期生存率を改善することができる。しかし、慢性感染症が確立されると、ウイルスが自発的に制御されることはまれである。したがって、主な目標は、ウイルス制御または治癒をもたらす免疫療法ＨＢＶワクチンを開発することである。
【０００３】
現在、第１相および第２相臨床試験の段階にある異なるＴ細胞誘導ワクチンが数種類あり、いずれも１つもしくは２つの完全長ＨＢＶ抗原、複数の短縮もしくは完全長キメラＨＢＶ抗原、またはＨＢＶプロテオームに基づく合成ペプチドに基づくものである。ＧｌｏｂｅＩｍｍｕｎｅ社のＧＳ−４７７４は現時点で第２相臨床試験の段階にある（ＧＳ−４７７４は、ＨＢｘ  ＨＢｓＡｇとＨＢｃＡｇのキメラを発現する熱不活化酵母細胞を有するものである）。Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ社のＴＧ１０５０は現時点で第１相臨床試験の段階にある（ＴＧ１０５０は、ヒトアデノウイルスセロタイプ５をベースとし、短縮型の３つのＨＢＶ抗原のキメラ、コア−ポリメラーゼ−エンベロープのキメラをコードするワクチンである）。Ａｌｔｉｍｍｕｎｅ社のＨｅｐＴｃｅｌｌ（商標）は現時点で第１相臨床試験の段階にある（ＨｅｐＴｃｅｌｌは、ＨＢＶタンパク質の保存された領域に由来する９つの合成３２〜４０量体ペプチドに基づく完全合成ペプチド製品である）。Ｉｎｏｖｉｏ社のＩＮＯ−１８００は現時点で第１相臨床試験の段階にある（ＩＮＯ−１８００は、Ｂ型肝炎ウイルスのクレードＡおよびＣの表面抗原およびＨＢＶコア抗原を標的とする多抗原性ＳｙｎＣｏｎ（登録商標）ＤＮＡ免疫療法である）。現在利用可能なＨＢＶ予防ワクチン（一般にＨＢＶタンパク質ワクチンをベースとする）には慢性ＨＢＶ感染者に対して治療効果がみられず、したがって、慢性ＨＢＶ感染を制御することができない。
【発明の概要】
【０００４】
したがって、本発明の１つの目的は、ＨＢＶ感染に対する改善されたワクチンを提供することである。
【０００５】
本発明の第一の態様では、多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチンであって、
免疫原発現カセットを含み、発現カセットによってコードされるタンパク質の発現が、プロモーターによって駆動されるよう配置されており、免疫原発現カセットが、
ａ）ＨＢＶコア；
ｂ）改変が実質的にポリメラーゼ機能を除去する野生型ＨＢＶポリメラーゼに対する変異である、改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）；
ｃ）ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）；および
ｄ）少なくともＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をＨＢＶコアおよび改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と分離したタンパク質として発現させるよう配置された遺伝子間配列
をコードし、遺伝子間配列が、ＨＢＶコアおよび改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）をコードする配列の下流（３’）にあり、かつＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）をコードする配列の上流（５’）にある、ウイルスベクター
を含む、多ＨＢＶ免疫原ウイルスベクターワクチンが提供される。
【０００６】
遺伝子間配列は、切断ドメイン、ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）、スプライシングシグナルまたは第二のプロモーターを含み得る。一実施形態では、遺伝子間配列は、リボソームスキッピングを引き起こすよう配置された配列を含む、切断ドメインを含む。別の実施形態では、遺伝子間配列は、少なくとも表面抗原（ＨｂｓＡｇ）の発現を促進する第二のプロモーターを含む。
【０００７】
様々なＨＢＶタンパク質に対する強力な多抗原特異的Ｔ細胞応答の導入が、慢性ＨＢＶ感染を消散させるうえでウイルスクリアランスに主要な役割を果たすと考えられる。多抗原Ｔ細胞応答の導入には、最大数のＴ細胞エピトープを有することが重要であると思われ、これにはＴ細胞誘導ＨＢＶワクチン内に完全長ＨＢＶタンパク質がコードされている必要がある。現在開発中のＨＢＶワクチンには、完全長ＨＢＶ抗原をコードしないものがある。本発明のワクチンは、ＨＢＶの完全長タンパク質を３つ（すなわち、任意選択でプレ−コア領域を有するコア、ポリメラーゼおよび表面タンパク質）をコードすることができる。さらに、ワクチンの設計は、例えばＦ２Ａペプチド切断戦略を用いる少なくとも２タンパク質の発現を用いて、分離した表面タンパク質をコードし、それがＴ細胞応答の誘導に加えて抗体応答も誘導し、Ｔ細胞ワクチンの治療効果を高める役割を果たす可能性があるほか、慢性感染者内のウイルスのクリアランスを促進する可能性があるものである。哺乳動物系に基づく抗体の導入には（他の系、例えば酵母と比較して）、天然の宿主に適した抗体を誘導することが可能な哺乳動物型のグリコシル化をもたらすという選択上有利な点がある。
【０００８】
本発明は、広範囲にわたるＴ細胞応答に加えて表面タンパク質に対する抗体も誘導することが可能な完全長多ＨＢＶ抗原をコードする、単一ワクチンが得られる点で有利である。新たなＨＢＶ免疫原は、少なくとも３つの完全長ＨＢＶ抗原（すなわち、コア、ポリメラーゼおよび表面）を含み、それらをチンパンジーアデノウイルスおよびＭＶＡウイルスベクターなどのウイルスベクター内にコードした。さらに、免疫原内のＨＢＶポリメラーゼタンパク質は、その機能を打ち消す変異がある状態で提供され、それにより同タンパク質のＨＢＶゲノム複製への関与が回避され、ワクチンの安全性が改善される。
【０００９】
ペプチド切断戦略を用いること、例えばフューリン−２Ａ切断配列または第二のプロモーターを用いることにより、導入遺伝子カセットから、ともにＴ細胞免疫応答を生じさせる少なくとも２つのタンパク質、融合したコアとポリメラーゼタンパク質および分離した表面タンパク質とを生じさせることができる。コードされる表面タンパク質は、Ｔ細胞免疫応答を生じさせることに加えて、抗体応答も生じさせることができる。
【００１０】
免疫原発現カセット
当業者には、切断ドメインがいかなる場合にも切断を引き起こすというわけではない、例えば、Ｆ２Ａに基づくリボソームスキッピング事象が発現のごく一部で起こるため、別の状況では切断によって分離されるＨＢＶタンパク質／抗原すべてが融合したタンパク質がごく一部生成する場合があることが認識されよう。したがって、一実施形態では、免疫原発現カセットは、少なくともＨＢＶコアと改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）とＨＢＶ表面抗原とを含む、融合タンパク質をさらにコードし得る。
【００１１】
一実施形態では、免疫原発現カセットはＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）をさらにコードする。別の実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１および／またはその短縮型をさらにコードする。別の実施形態では、免疫原発現カセットはＨＢＶ  ＰｒｅＳ２をさらにコードする。
【００１２】
一実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）およびＨＢＶ  ＰｒｅＳ１または短縮型のＨＢＶ  ＰｒｅＳ１をさらにコードする。別の実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）およびＨＢＶ  ＰｒｅＳ２をさらにコードする。一実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）およびＨＢＶ  ＰｒｅＳ１および短縮型のＰｒｅＳ１をさらにコードする。一実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）、ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１および／またはその短縮型およびＨＢＶ  ＰｒｅＳ２をさらにコードする。
【００１３】
ＨＢＶプレ−コアとコアとがコードされる一実施形態では、免疫原発現カセットは、ＨＢＶ  ｅ抗原を発現することが可能なものであり得る。当業者には、ＨＢＶ  ｅ抗原が、プレ−コアの１０個のＣ末端アミノ酸と、コアの１４９個のＮ末端アミノ酸とを含むか、これよりなるものであることが認識されよう。ＨＢＶ  ｅ抗原の発現では、プレ−コアとコアが一緒に発現し、この発現タンパク質全体がＮ末端およびＣ末端の切断を受ける。
【００１４】
一実施形態では、ＨＢＶコアと改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が融合タンパク質として発現するよう配置されている。免疫原発現カセットがＨＢＶプレ−コアをコードする一実施形態では、ＨＢＶプレ−コア、ＨＢＶコアおよび改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）が融合タンパク質として発現するよう配置されている。
【００１５】
一実施形態では、免疫原発現カセットは、少なくともＨＢＶコアと改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）とを含む第一の融合タンパク質および少なくともＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含む第二のタンパク質を含む、少なくとも２つのタンパク質をコードする。別の実施形態では、免疫原発現カセットは、少なくともＨＢＶコアと改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）とを含む第一の融合タンパク質および少なくともＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）を含む第二のタンパク質を含む、２つのタンパク質のみをコードする。
【００１６】
一実施形態では、免疫原発現カセットはＨＢＶ  Ｘタンパク質をコードしない。
【００１７】
一実施形態では、免疫原発現カセットは、本明細書に記載される
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ；
ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ；
ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）；または
ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）
のうちのいずれか１つをコードする核酸配列を含み得る。
【００１８】
一実施形態では、免疫原発現カセットは、配列番号４６（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）またはそのバリアントを含む。配列番号４６のバリアントは、配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４６のバリアントは、配列番号４６によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００１９】
一実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号４７（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ）またはそのバリアントを含む。配列番号４７のバリアントは、配列番号４７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４７のバリアントは、配列番号４７によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２０】
別の実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号４８（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントを含む。配列番号４８のバリアントは、配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４８のバリアントは、配列番号４８によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２１】
別の実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号４９（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントを含む。配列番号４９のバリアントは、配列番号４９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４９のバリアントは、配列番号４９によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２２】
一実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号５９（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ）またはそのバリアントを含む。配列番号５９のバリアントは、配列番号５９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号５９のバリアントは、配列番号５９によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２３】
一実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号２４（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントを含む。配列番号２４のバリアントは、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２４のバリアントは、配列番号２４によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２４】
一実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号２７（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントを含む。配列番号２７のバリアントは、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２７のバリアントは、配列番号２７によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。一実施形態では、免疫原発現カセットは配列番号５８（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントを含む。配列番号５８のバリアントは、配列番号５８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号５８のバリアントは、配列番号５８によってコードされる同等のタンパク質の免疫原性を実質的に保持しているタンパク質をコードし得る。
【００２５】
ウイルスベクター
ウイルスベクターはウイルスを含み得る。本発明の免疫原発現カセット配列は、優れた免疫応答を誘発することがわかっている任意の適切なウイルスベクターにクローニングされ得る。適切なウイルスベクターについては、これまでにＤｉｃｋｓら（Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１５  Ｆｅｂ  ２５；３３（９）：１１２１−８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｖａｃｃｉｎｅ．２０１５．０１．０４２．Ｅｐｕｂ  ２０１５  Ｊａｎ  ２５）、Ａｎｔｒｏｂｕｓら（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１４  Ｍａｒ；２２（３）：６６８−７４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１３．２８４．Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｄｅｃ  ３０．）およびＷａｒｉｍｗｅら（Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．２０１３  Ｄｅｃ  ５；１０：３４９．ｄｏｉ：１０．１１８６／１７４３−４２２Ｘ−１０−３４９）に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
ウイルスベクターは弱毒ウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターは、ヒトアデノウイルスまたはサルアデノウイルスなどのアデノウイルスを含み得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、プライムブーストレジメンのプライムワクチンに使用する場合、Ｅ群サルアデノウイルスなどのアデノウイルスを含む。ウイルスベクターは、Ｅ群サルアデノウイルスを含み得る。ウイルスベクターはＣｈＡｄＯｘ１（マラリア試験に安全に使用されるＡｄＣｈ６３ベクターに類似したＥ群サルアデノウイルス）またはＣｈＡｄＯｘ２を含み得る。当業者であれば、例えば参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２１７２２７７号のＣｈＡｄＯｘ１をベースとするウイルスベクターに精通しているであろう。ウイルスベクターはＡｄＣｈ６３を含み得る。ウイルスベクターはＡｄＣ３またはＡｄＨ６を含み得る。一実施形態では、ウイルスベクターはヒト血清型である。別の実施形態では、ウイルスベクターは改変ワクシニア・アンカラ（ＭＶＡ）を含む。ウイルスベクターは、プライムブーストレジメンにワクチンブーストとして使用する場合、ＭＶＡを含み得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、プライムブーストレジメンのプライムワクチンに使用する場合、Ｅ群サルアデノウイルスなどのアデノウイルスを含み、プライムブーストレジメンにワクチンブーストとして使用する場合、ＭＶＡを含み得る。当業者であれば、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９２７３３２７号のＭＶＡベースのウイルスベクターに精通しているであろう。
【００２７】
ＭＶＡは、異なるポックスウイルスプロモーターを用いて２つ以上のタンパク質の発現が可能である点で有利である。
【００２８】
別の実施形態では、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはレンチウイルスを含み得る。別の実施形態では、ウイルスベクターは、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスもしくはカナリア痘ウイルス（例えば、ポックスウイルス科およびトリポックスウイルス属のメンバー）またはニューヨーク弱毒ワクシニアウイルス（参照により本明細書に組み込まれるＴａｒｔａｇｌｉａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．１９９２  Ｍａｙ；１８８（１）：２１７−３２）のうちのいずれかを含み得る。別の実施形態では、ウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベクター、ヒトサイトメガロウイルスベクター、麻疹ウイルス（ＭｅＶ）ベクター、センダイウイルス（ＳｅＶ）ベクター、フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス−１７Ｄ）ベクターまたはアルファウイルスベクター、例えばシンディビスウイルス（Ｓｉｎｄｉｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＮＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルスまたはセムリキ森林ウイルスなどのうちのいずれかを含み得る。
【００２９】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号３９および４０（ＣｈＡｄＯｘ１）またはそのバリアントの配列を含む、核酸を含み得る。配列番号３９および４０のバリアントは、配列番号３９および４０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号３９および４０のバリアントは、配列番号３９および４０（ＣｈＡｄＯｘ１）のウイルスベクターの機能を実質的に保持しているウイルスベクターをコードし得る。
【００３０】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４１および４２（ＣｈＡｄＯｘ２）またはそのバリアントの配列を含む、核酸を含み得る。配列番号４１および４２のバリアントは、配列番号４１および４２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４１および４２のバリアントは、配列番号４１および４２（ＣｈＡｄＯｘ２）のウイルスベクターの機能を実質的に保持しているウイルスベクターをコードし得る。
【００３１】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４４および４５（ＭＶＡ）またはそのバリアントの配列を含む、核酸を含み得る。配列番号４４および４５のバリアントは、配列番号４４および４５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４４および４５のバリアントは、配列番号４４および４５（ＭＶＡ）のウイルスベクターの機能を実質的に保持しているウイルスベクターをコードし得る。
【００３２】
一実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書に記載される
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）；
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）；
ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）；または
ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）
のうちのいずれか１つをコードする。
【００３３】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号３（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）またはそのバリアントをコードする。配列番号３のバリアントは、配列番号３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号３のバリアントは、配列番号３の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３４】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号１１（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ）またはそのバリアントをコードする。配列番号１１のバリアントは、配列番号１１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１１のバリアントは、配列番号１１の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３５】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号１３（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントをコードする。配列番号１３のバリアントは、配列番号１３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１３のバリアントは、配列番号１３の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３６】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号２５（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントをコードする。配列番号２５のバリアントは、配列番号２５と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２５のバリアントは、配列番号２５の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３７】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号２３（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントをコードする。配列番号２３のバリアントは、配列番号２３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２３のバリアントは、配列番号２３の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３８】
一実施形態では、ウイルスベクターは配列番号２６（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントをコードする。配列番号２６のバリアントは、配列番号２６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２６のバリアントは、配列番号２６の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００３９】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４６（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号４６のバリアントは、配列番号４６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４０】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４７（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ）またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号４７のバリアントは、配列番号４７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４１】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４８（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号４８のバリアントは、配列番号４８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４２】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号４９（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号４９のバリアントは、配列番号４９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４３】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２４（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号２４のバリアントは、配列番号２４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４４】
一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号２７（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号２７のバリアントは、配列番号２７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。一実施形態では、ウイルスベクターは、配列番号５８（ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ））またはそのバリアントの核酸配列を含む。配列番号５８のバリアントは、配列番号５８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。
【００４５】
プロモーター
一実施形態では、プロモーターは免疫原発現カセット内にコードされている、例えば、プロモーターは免疫原発現カセットの５’末端に、またはそれに隣接してコードされ得る。あるいは、プロモーターは、免疫原発現カセットの外側にあるウイルスベクター核酸の一部としてコードされ得る。例えば、プロモーターは免疫原発現カセットの上流（５’）にコードされ得る。
【００４６】
プロモーターは、免疫原発現カセットの全コードタンパク質の発現を促進し得る。免疫原発現カセットが第二のプロモーターを含む別の実施形態では、プロモーターは、少なくともＨＢＶコアおよび改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）の発現を促進し、任意選択で、第二のプロモーターによって別個に促進されるよう配置され得るＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）の発現は促進しないよう配置された、主要なプロモーターであり得る。
【００４７】
当業者には、発現宿主の必要に応じて、任意の適切なプロモーターを主要なプロモーターおよび／または第二のプロモーターとして使用し得ることが認識されよう。一実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターを含む。ＣＭＶプロモーターは長い、または短いＣＭＶプロモーターを含み得る。ウイルスベクターがＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２などのアデノウイルスベクターを含む一実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターまたはＥＦ１ａプロモーターを含み得る。ウイルスベクターがＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２などのアデノウイルスベクターを含む一実施形態では、プロモーターはＣＭＶプロモーターを含み得る。
【００４８】
ベクター、例えばアデノウイルスベクター（ＣｈＡｄＯｘ１またはＣｈＡｄＯｘ２など）に使用するプロモーターエレメント（１つまたは複数）は、テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列を含み得る。テトラサイクリンオペレーター（ｔｅｔＯ）配列は、異種タンパク質を生じさせる細胞に対して毒性のあるその異種タンパク質を発現することができるウイルスベクターの作製に有用なものである。
【００４９】
別の実施形態では、プロモーターはポックスウイルスプロモーターを含む。ウイルスベクターがＭＶＡを含む一実施形態では、プロモーターはＦ１１などのポックスウイルスプロモーターを含み得る。一実施形態では、プロモーターは初期Ｆ１１プロモーターを含む。あるいは、ポックスウイルスプロモーターは、例えばＢ８Ｒ、Ｋ６Ｌ、Ａ４４Ｌ、Ｃ１１ＲおよびＢ２Ｒのいずれかから選択される初期プロモーター、例えばｍＨ５、ｐ７．５およびＳＳＰから選択される初期活性および後期活性を有するプロモーター、または後期プロモーター、例えばＦＰ４ｂを含み得る。
【００５０】
初期プロモーターに基づく導入遺伝子発現は、主としてＴ細胞応答を目的とする免疫原に有用であり得る（これらの初期プロモーターを使用するとＴ細胞誘導の程度が高くなる）。一方、抗体応答の誘導を目的とする免疫原には、初期活性および後期活性をともに有するプロモーターを使用することができる。ただし、これらの初期活性および後期活性プロモーターは、Ｔ細胞誘導を目的とする免疫原にも使用することができる。
【００５１】
一実施形態では、プロモーターは、配列番号５０または５２（ＣＭＶの長い、または短いプロモーター）またはそのバリアントの核酸配列を含むか、これよりなるものである。配列番号５０または５２のバリアントは、それぞれ配列番号５０または５２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。バリアントは、配列番号５０または５２のプロモーター機能を実質的に保持し得る。
【００５２】
一実施形態では、プロモーターは、Ｆ１１左隣接配列内に位置する配列（配列番号３５）またはそのバリアントを含むか、これよりなるものである。バリアントは、Ｆ１１左隣接配列内に位置するプロモーター配列（配列番号３５）と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。バリアントは、Ｆ１１左隣接配列内に位置するプロモーター（配列番号３５）のプロモーター機能を実質的に保持し得る。
【００５３】
第二のプロモーター
一実施形態では、免疫原発現カセットは第二のプロモーターをコードする。第一のプロモーター／主要なプロモーターに加えて第二のプロモーターが提供される一実施形態では、第二のプロモーターは、免疫原発現カセットによって／免疫原発現カセット内にコードされ得る。第二のプロモーターは、第一のプロモーター／主要なプロモーターの３’にコードされ得る。第二のプロモーターは、発現させる第一のタンパク質／抗原の３’、例えば、ＨＢＶコアとＨＢＶ改変ポリメラーゼの下流かつＨＢＶ表面抗原の上流にコードされ得る。第二のプロモーターは少なくともＨＢＶ表面抗原の発現を促進し得る。
【００５４】
第二のプロモーターはポックスウイルスプロモーターを含み得る。第二のプロモーターは、ポックスウイルス初期プロモーター、例えばＢ８Ｒ、Ｋ６Ｌ、Ａ４４Ｌ、Ｃ１１ＲおよびＢ２Ｒのいずれかなど、または初期活性および後期活性を有するポックスウイルスプロモーター、例えばｍＨ５、ｐ７．５もしくはＳＳＰなど、またはＦＰ４ｂなどの後期プロモーターを含み得る。
【００５５】
一実施形態では、第二のプロモーターは初期／後期プロモーターｍＨ５を含む。一実施形態では、第二のプロモーターは、配列番号２８（ｍＨ５プロモーター）またはそのバリアントの核酸配列を含むか、これよりなるものである。配列番号２８のバリアントは、配列番号２８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。バリアントは、配列番号２８の第二のプロモーターの機能を実質的に保持し得る。
【００５６】
別の実施形態では、第二のプロモーターはＳＶ４０プロモーターまたはＥＦ１ａプロモーターを含み得る。
【００５７】
切断ドメイン
一実施形態では、免疫原発現カセットは切断ドメインをコードする。一実施形態では、切断ドメインは、例えばタンパク質分解切断酵素による翻訳タンパク質の切断を可能にする翻訳後タンパク質分解切断ドメインである。切断酵素は宿主によって提供されるものであり得、例えば、宿主はワクチン接種したヒトなどである。別の実施形態では、切断酵素は免疫原発現カセットまたはウイルスベクター内にコードされるものであり得る。一実施形態では、切断ドメインは、非ＨＢＶ配列、例えば哺乳動物配列を含む。一実施形態では、切断ドメインはヒト由来配列を含む。
【００５８】
一実施形態では、切断ドメインはリボソームスキッピング切断ドメインを含む。一実施形態では、切断ドメインは、Ｘが任意のアミノ酸であり得る配列ＲＸＲＲを含むかこれよりなる、フューリン認識部位を含む。一実施形態では、切断ドメインは、フューリン認識部位と２Ａペプチド配列とを含む。２Ａペプチド配列はＦＭＤＶ（口蹄疫ウイルス）２Ａペプチド配列（ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ−配列番号４３）を含み得る。あるいは、２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ）、Ｔ２Ａ（Ｔｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ）およびＥ２Ａ（ウマ鼻炎Ａウイルス［ＥＲＡＶ］２Ａ）から選択され得る。任意のピコルナウイルス２Ａペプチド配列をペプチド切断部位のために提供するか、ペプチド切断部位として機能させ得る。したがって、切断ドメインは、ピコルナウイルス２Ａペプチド配列をコードする配列を含み得る。
【００５９】
一実施形態では、切断ドメインは、フューリン２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド配列またはその機能的バリアントを含むか、これよりなるものである。切断ドメインは、配列番号９の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号９のバリアントは、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号９のバリアントは、配列番号９の切断機能を実質的に保持し得る。
【００６０】
Ｆ２Ａは、長さが短く（わずか２８アミノ酸）、そのことが適切な挿入物を提供し、大きさが制限され得るベクター、例えばＣｈＡｄＯｘ１／２を含めたアデノウイルスベースのベクターなどから２つ以上のタンパク質を発現させやすくする点で有利である。
【００６１】
ウイルスベクターがＭＶＡである、あるいはウイルスベクターをプライムワクチン接種後のブーストワクチン接種として使用する一実施形態では、異なる切断ドメインを提供して、プライムワクチン接種の切断ドメインに対してＴ細胞応答のブーストが起こる可能性を回避し得る。あるいは、プライムワクチン接種の切断ドメインに対してＴ細胞応答のブーストが起こる可能性を回避するため、切断ドメインの代わりに第二のプロモーターを使用し得る。
【００６２】
ＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）
一実施形態では、免疫原発現カセットは配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする。当業者には、ＩＲＥＳが、キャップに依存しない翻訳開始を可能にし、メッセンジャーＲＮＡの中央部分で翻訳を開始させることが可能なＲＮＡ構造体であることが認識されよう。
【００６３】
スプライシングシグナル
一実施形態では、免疫原発現カセットはｍＲＮＡスプライシングシグナルをコードする。当業者であれば、この用途に適し、よく用いられるスプライシングシグナルに精通しているであろう。使用し得るこのようなｍＲＮＡスプライシングシグナルの例の１つに、発現ベクターｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）のヒトβグロビン遺伝子の第一イントロン由来の５’ドナー部位と、免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域のイントロン由来の分岐および３’アクセプター部位とからなる、キメライントロンがある。
【００６４】
ＨＢＶプレ−コア（ＰｒｅＣ）
ＨＢＶ  ＰｒｅＣは、完全長野生型ＨＢＶ  ＰｒｅＣ配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶ  ＰｒｅＣバリアントは、短縮ＨＢＶ  ＰｒｅＣ配列を含むか、これよりなるものであり得る。
【００６５】
ＨＢＶ  ＰｒｅＣは、配列番号１６の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号１６のバリアントは、配列番号１６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１６のバリアントは、配列番号１６の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号１６のバリアントは、配列番号１６の三次構造を実質的に保持し得る。
【００６６】
ＨＢＶコア
ＨＢＶコアは、完全長野生型ＨＢＶコア配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶコアバリアントは、短縮ＨＢＶコア配列を含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶコアはＨＢＶプレ−コアを含まないものであり得る。
【００６７】
ＨＢＶコアは、配列番号６の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号６のバリアントは、配列番号６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号６のバリアントは、配列番号６の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号６のバリアントは、配列番号６の三次構造を実質的に保持し得る。
【００６８】
ＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）
ＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、完全長野生型ＨＢＶ  ｅ抗原配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶ  ｅ抗原バリアントは、短縮ＨＢＶ  ｅ抗原配列を含むか、これよりなるものであり得る。
【００６９】
ＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、配列：ＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶ（配列番号１７）を含むか、これよりなるものであり得る。
【００７０】
ＨＢＶ  ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）は、配列番号１７の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号１７のバリアントは、配列番号１７と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１７のバリアントは、配列番号１７の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号１７のバリアントは、配列番号１７の三次構造を実質的に保持し得る。
【００７１】
改変ＨＢＶポリメラーゼ
改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）は、短縮ＨＢＶポリメラーゼを含むか、これよりなるものであり得る。特に、実質的にポリメラーゼ機能を除去する野生型ＨＢＶポリメラーゼに対する変異は、短縮ＨＢＶポリメラーゼをコードする配列を含み得る。上記のものに代えてまたは加えて、変異は、ＨＢＶポリメラーゼ配列によってコードされる１つまたは複数の点変異を含む。改変は、コードされるＨＢＶポリメラーゼ配列の１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。一実施形態では、改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）は短縮型のＨＢＶポリメラーゼではない（すなわち、野生型ＨＢＶポリメラーゼに対して完全長である）。
【００７２】
改変ＨＢＶポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）は、配列番号８の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号８のバリアントは、配列番号８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号８のバリアントは、配列番号８の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号８のバリアントは、配列番号８の三次構造を実質的に保持し得る。
【００７３】
改変は、タンパク質プライミングを阻害する変異であり得る。上記のものに加えてまたはこれに代えて、逆転写酵素および／またはＲＮＡアーゼドメインに変異を生じさせて、その機能を阻害し得る。さらに、上記のものに加えてまたはこれに代えて、変異は、それがポリメラーゼの正確なタンパク質フォールディングを妨げるよう構造的になり得る。改変は、本明細書の野生型ＨＢＶポリメラーゼコンセンサス配列（すなわち、配列番号１９）を参照して、Ｙ６３、Ｃ３２３、Ｃ３３４、Ｃ３３８、Ｃ３５２、Ｒ７１４、Ｄ７８８、Ｒ７９２またはこれと同等の残基のうち１つもしくは複数のものまたは全部を含み得る。一実施形態では、改変は、本明細書の野生型ＨＢＶポリメラーゼコンセンサス配列（すなわち、配列番号１９）を参照して、Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａまたはこれと同等の残基のうち１つもしくは複数のものまたは全部を含み得る。別の実施形態では、改変は、本明細書の野生型ＨＢＶポリメラーゼコンセンサス配列（すなわち、配列番号１９）を参照して、Ｒ７１４、Ｄ７８８およびＲ７９２またはこれと同等の残基のうち１つもしくは複数のものまたは全部を含み得る。一実施形態では、改変は、本明細書の野生型ＨＢＶポリメラーゼコンセンサス配列（すなわち、配列番号１９）を参照して、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８ＡおよびＲ７９２Ａまたはこれと同等の残基のうち１つもしくは複数のものまたは全部を含み得る。同等の残基と言う場合、それは、ＨＢＶポリメラーゼが本明細書に提供されるＨＢＶポリメラーゼ配列に代わる配列に基づくものであり得、アミノ酸残基の番号付けまたは同一性が配列間で異なり得ることを意味するものと理解されるべきである。このような差および同等性は、ＨＢＶポリメラーゼ配列と本明細書の野生型ＨＢＶポリメラーゼコンセンサス配列（すなわち、配列番号１９）のアライメントによって容易に判定され得る。
【００７４】
変異Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａは、ポリメラーゼ機能を停止させる点で有利である。ただし、上記の機能的変異内での復帰変異事象の追加の手段として、追加でＹ６３の変異ならびにその他のＣ３２３、Ｃ３３４、Ｃ３３８およびＣ３５２のシステイン変異のうち１つもしくは複数のものまたは全部を加えてもよい。追加の変異は、Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａおよび／またはＣ３５２Ａを含み得る。
【００７５】
変異は、（ａ）酵素活性を停止させるＲＮＡアーゼＨの機能的変異および／または（ｂ）複製の第一段階（ＤＮＡ合成のプライミング）を停止させるＹ６３Ａ変異および／または（ｃ）天然のコンホメーションを崩壊させ、ＨＢＶポリメラーゼがウイルス複製の初期段階（タンパク質プライミング、ＲＮＡ結合およびＲＮＡパッケージング）に関与するのを阻止するシステイン変異によってＨＢＶポリメラーゼ機能が妨げられる点で有利である。
【００７６】
当業者であれば、機能を大幅に低下させるか除去することができ、本発明による改変ポリメラーゼにもたらすことができる様々なＨＢＶポリメラーゼ改変に精通しているであろう。このような改変は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６０２０５３８号、同第２０１３００７７７２号および同第２０１１０１５６５６号に記載されている。
【００７７】
一実施形態では、改変ポリメラーゼは、野生型ＨＢＶポリメラーゼに対して逆転写酵素（ＲＴアーゼ）の酵素活性の低下を示すよう改変されている。ＲＴアーゼ活性の低下は、ＲＴアーゼ酵素活性を担うドメイン内の１つまたは複数の変異によってもたらされ得る。これまでに、４つの残基がＲＴアーゼ活性に関与し、野生型ＨＢＶポリメラーゼの約５３８位〜約５４１位にモチーフ「ＹＭＤＤ」（Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、ＡｓｐおよびＡｓｐ残基）を形成することがわかっている。本発明は、このモチーフ内またはＲＴアーゼドメインの他の場所にあり、ＲＴアーゼ活性の大幅な低下（例えば、少なくとも１０倍の低下）または除去をもたらす任意の変異（１つまたは複数）を包含する。適切なＲＴアーゼ欠損ポリメラーゼ変異体の代表例が、参照により本明細書に組み込まれるＲａｄｚｉｗｉｌｌら（１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６１３）、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５３２４）およびＪｅｏｎｇら（１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２２３（２）：２６４）に記載されている。一実施形態では、改変ポリメラーゼは、ＹＭＤＤモチーフの最初のＡｓｐ残基または天然のＨＢＶポリメラーゼの同等の位置にあるアミノ酸残基のＡｓｐ以外の任意のアミノ酸残基への置換を任意選択のＨｉｓ残基への置換（Ｄ５４０Ｈ変異）とともに含み得る。
【００７８】
上記のものに加えてまたはこれに代えて、改変ポリメラーゼは、野生型ＨＢＶポリメラーゼに対してＲＮアーゼＨ酵素活性が低下するよう改変され得る。ＲＮアーゼＨ活性の低下は、ＲＮアーゼＨ酵素活性を担うドメイン内の１つまたは複数の変異によってもたらされ得る。ＲＮアーゼＨ活性に関与する機能ドメインは、野生型ポリメラーゼの約６８０位〜Ｃ末端８３２位のＨＢＶポリメラーゼのＣ末端部分の中にあり、本発明の改変ポリメラーゼは、このドメイン内にあり、ＲＮアーゼＨ活性の大幅な低下（例えば、少なくとも１０倍の低下）または除去をもたらす任意の変異（１つまたは複数）を包含し得る。適切なＲＮアーゼＨ欠損ポリメラーゼ変異体の代表例が、Ｒａｄｚｉｗｉｌｌら（１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６１３）、Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒら（１９９０，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５３２４）に記載されている。
【００７９】
ＨＢＶ表面抗原（ＨｂｓＡｇ）
当業者には、ＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２が大型（Ｌ型）のＨＢＶ表面タンパク質（例えば、Ｌ型＝ＰｒｅＳ１＋ＰｒｅＳ２＋Ｓ）の構成要素であることが理解されよう。中型（Ｍ型）のＨＢＶ表面タンパク質はＰｒｅＳ２＋Ｓを有する。このような配列を同時に有することは、Ｔ細胞エピトープが上記の順番で含まれていることを意味する。
【００８０】
ＨｂｓＡｇは、完全長野生型ＨｂｓＡｇ配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨｂｓＡｇバリアントは、短縮ＨｂｓＡｇ配列を含むか、これよりなるものであり得る。
【００８１】
ＰｒｅＳ１配列とＰｒｅＳ２配列とを含むＨｂｓＡｇは、配列番号１０の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号１０のバリアントは、配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１０のバリアントは、配列番号１０の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号１０のバリアントは、配列番号１０の三次構造を実質的に保持し得る。
【００８２】
別の実施形態では、ＨｂｓＡｇは、ＰｒｅＳ１および／またはＰｒｅＳ２のない表面抗原を含み得る。ＨｂｓＡｇは、配列番号１８の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号１８のバリアントは、配列番号１８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１８のバリアントは、配列番号１８の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号１８のバリアントは、配列番号１８の三次構造を実質的に保持し得る。
【００８３】
一実施形態では、ＨｂｓＡｇは、ＨｂｓＡｇ内の４つの既知の膜貫通領域（アミノ酸１〜２２６）、すなわち、それぞれアミノ酸（８〜３２）ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬ（配列番号５４）、アミノ酸（８０〜９８）ＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬ（配列番号５５）、アミノ酸（１６０〜１８４）ＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ（配列番号５６）およびアミノ酸（１８９〜２１０）ＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳ（配列番号５７）のうちいずれか１つのものまたは全部を含むか、これよりなるものであり得る。一実施形態では、ＨｂｓＡｇは、少なくともアミノ酸（８〜３２）ＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬ（配列番号５４）のＨｂｓＡｇ膜貫通領域を含むか、これよりなるものであり得る。
【００８４】
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１は、完全長野生型ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１は、配列番号５２の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号５２のバリアントは、配列番号５２と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号５２のバリアントは、配列番号５２の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号５２のバリアントは、配列番号５２の三次構造を実質的に保持し得る。
【００８５】
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１バリアントは、短縮ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１配列、例えば、本明細書に記載されるＣΔＰｒｅＳ１またはＮΔＰｒｅＳ１（ＣΔＰｒｅＳ１はＣ末端短縮ＰｒｅＳ１を指し、ＮΔＰｒｅＳ１はＮ末端短縮ＰｒｅＳ１を指す）を含むか、これよりなるものであり得る。一実施形態では、免疫原発現カセットはＮΔＰｒｅＳ１およびＣΔＰｒｅＳ１をともにコードし得る。免疫原発現カセットがＮΔＰｒｅＳ１およびＣΔＰｒｅＳ１をともにコードする一実施形態では、ＮΔＰｒｅＳ１は遺伝子間配列の上流（５’）にコードされ、ＣΔＰｒｅＳ１は遺伝子間配列の下流（３’）にコードされ得る。免疫原発現カセットが遺伝子間配列の上流（５’）にＮΔＰｒｅＳ１をコードする一実施形態では、ＮΔＰｒｅＳ１がＰｒｅＳ２および／または改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と融合し得る。免疫原発現カセットが遺伝子間配列の上流（５’）にＮΔＰｒｅＳ１をコードする一実施形態では、ＮΔＰｒｅＳ１がＰｒｅＳ２および／または改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と融合し、遺伝子間配列の下流（３’）にコードされるＣΔＰｒｅＳ１が表面抗原（ＨｂｓＡｇ）と融合し得る。
【００８６】
ＣΔＰｒｅＳ１
一実施形態では、免疫原発現カセットは短縮型のＨＢＶ  ＰｒｅＳ１をコードする。短縮はＣ末端短縮を含み得る。一実施形態では、短縮ＨＢＶ  ＰｒｅＳ１は、本明細書に記載されるＣΔＰｒｅＳ１（配列番号２１）を含む。一実施形態では、本明細書に記載されるＣΔＰｒｅＳ１などの短縮ＰｒｅＳ１は、ＨＢＶ表面抗原との融合タンパク質（Ｓ／ＨｂｓＡｇ）として発現するよう配置されている。短縮ＰｒｅＳ１と表面抗原（Ｓ／ＨｂｓＡｇ）との間に本明細書に記載されるリンカーなどのリンカー配列を加え得る。例えば、ＣΔＰｒｅＳ１＋リンカー＋Ｓ（本明細書にＳ（ｓｈ）として記載される）。Ｓ（ｓｈ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６１を含むか、これよりなるものであり得る。
【００８７】
ＣΔＰｒｅＳ１は、配列番号２１の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号２１のバリアントは、配列番号２１と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２１のバリアントは、配列番号２１の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号２１のバリアントは、配列番号２１の三次構造を実質的に保持し得る。
【００８８】
一実施形態では、任意選択で表面抗原と融合した本明細書に記載されるＣΔＰｒｅＳ１などの短縮ＰｒｅＳ１は、遺伝子間配列の下流（３’）にコードされている。
【００８９】
ＰｒｅＳ１短縮は、免疫原発現カセット内に提供されるＨＢＶ抗原に対するＴ細胞応答および抗体応答の両方の抗体生成に有利に働く点で有利である。理論に束縛されるものではないが、抗体生成はＰｒｅＳ１と表面抗原の適切なフォールディングによるものである可能性がある。
【００９０】
ＮΔＰｒｅＳ１
一実施形態では、短縮ＰｒｅＳ１は、本明細書に記載されるＮΔＰｒｅＳ１を含む。ＮΔＰｒｅＳ１とＰｒｅＳ２の融合体は、配列番号１５／３８またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号１５／３８のバリアントは、配列番号１５／３８と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号１５／３８のバリアントは、配列番号１５／３８の免疫原性を実質的に保持し得る。
【００９１】
ＮΔＰｒｅＳ１とＰｒｅＳ２の融合配列は、優れたＴ細胞応答をもたらす点で有利である。ＮΔＰｒｅＳ１は、依然としてＴ細胞エピトープが保存され得る配列のアミノ酸（ＣＤ８  Ｔ細胞エピトープでは８〜１１アミノ酸、ＣＤ４  Ｔ細胞エピトープではこれよりわずかに長い（１２〜１６））を含む点で有利である。
【００９２】
免疫原発現カセットが遺伝子間配列の上流（５’）にＰｒｅＳ２と融合したＮΔＰｒｅＳ１をコードする一実施形態では、ＮΔＰｒｅＳ１がさらに改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）と融合し得る。ＰｒｅＳ２と改変ポリメラーゼ（Ｐｍｕｔ）との間に本明細書に記載されるリンカーなどのリンカー配列を加え得る。例えば、ＮΔＰｒｅＳ１＋ＰｒｅＳ２＋リンカー＋Ｐｍｕｔ。
【００９３】
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２は、完全長野生型ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２バリアントは、短縮ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２配列を含むか、これよりなるものであり得る。
【００９４】
ＨＢＶ  ＰｒｅＳ２は、配列番号５３の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号５３のバリアントは、配列番号５３と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号５３のバリアントは、配列番号５３の免疫原性を実質的に保持し得る。配列番号５３のバリアントは、配列番号５３の三次構造を実質的に保持し得る。
【００９５】
ペプチドアジュバント
免疫原発現カセットはペプチドアジュバントをさらにコードし得る。ペプチドアジュバントはＴＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）を含み得る。一実施形態では、ペプチドアジュバントは、ヒトもしくは非ヒトインバリアント鎖（Ｉｉ）またはそのフラグメントを含み得る。ヒトＣＤ７４分子の長いアイソフォーム（アイソフォーム（ｂ））のフラグメントもインバリアント鎖として知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８５  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０；１３（２４）：８８２７−８８４１）。インバリアント鎖（ｌｉ）の少なくとも膜貫通ドメインを含むＮ末端フラグメントは、目的とする抗原との融合タンパク質として発現すると、驚くほど効果的なアジュバント機能を発揮することが知られている。膜貫通ドメインと細胞質ドメインとを含み、好ましくはタンパク質の長いアイソフォームのＮ末端の１６個のアミノ酸を含むフラグメントが特に効果的である。
【００９６】
インバリアント鎖は、サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）またはそのフラグメントもしくは機能的バリアントを含むか、これよりなるものであり得る。バリアントサメインバリアント鎖（ＳＩｉ）は、短縮インバリアントサメインバリアント鎖を含み得る。インバリアント鎖またはそのフラグメントのその他の非ヒト動物供給源としては、ニワトリ、ウズラ、マス、ゼブラフィッシュ、コイ、カエル、ハタ、サメ、マンダリンフィッシュまたはマガモが挙げられる。当業者であれば、発現カセット／ベクター内にコードされるペプチドアジュバントとして使用するのに適したインバリアント鎖またはそのフラグメントに精通していると思われ、例えば、インバリアント鎖は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１５０８２９２２号に記載されている任意のインバリアント鎖であり得る。
【００９７】
ペプチドアジュバントは、配列番号４（ＳＩｉ）の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号４のバリアントは、配列番号４と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号４のバリアントは、配列番号４のアジュバント機能を実質的に保持し得る。
【００９８】
ペプチドアジュバントは、配列番号２９の配列（ＴＰＡ核酸配列）またはそのバリアントを含むかこれよりなる配列によってコードされ得る。配列番号２９のバリアントは、配列番号２９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号２９のバリアントは、配列番号２９によってコードされるＴＰＡのアジュバント機能を実質的に保持しているペプチドアジュバントをコードし得る。ペプチドアジュバントは、配列番号６０の配列（ＴＰＡ核酸配列）またはそのバリアントを含むかこれよりなる配列によってコードされ得る。配列番号６０のバリアントは、配列番号６０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号６０のバリアントは、配列番号６０によってコードされるＴＰＡのアジュバント機能を実質的に保持しているペプチドアジュバントをコードし得る。
【００９９】
ペプチドアジュバントは、配列番号３０の配列（ＴＰＡ）またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号３０のバリアントは、配列番号３０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号３０のバリアントは、配列番号３０のアジュバント機能を実質的に保持し得る。
【０１００】
ペプチドアジュバントは、免疫原発現カセットから発現させるタンパク質／抗原のＮ末端側の位置にコードされ得る。第一のペプチドアジュバントが、免疫原発現カセットから発現させる第一のタンパク質／抗原（コアとポリメラーゼの融合体など）のＮ末端側の位置にコードされ、第二のペプチドアジュバントが、免疫原発現カセットから発現させる第二のタンパク質／抗原（表面抗原など）のＮ末端側の位置にコードされ得る。
【０１０１】
ＨＢＶ遺伝子型
ＨＢＶはＨＢＶ遺伝子型Ｃであり得る。別の実施形態では、ＨＢＶは、１０種類の遺伝子型（Ａ〜Ｊ）のうちのいずれか１つのものであり得る。コードされるＨＢＶタンパク質／抗原がいずれも１つの遺伝子型、例えばＨＢＶ遺伝子型Ｃに由来するものであり得る。
【０１０２】
リンカー
一実施形態では、融合タンパク質内にもたらされるタンパク質／抗原配列のうち１つもしくは複数のものまたは全部の間にリンカー残基がコードされ（例えば、タンパク質内の配列の間に接合部がもたらされ）得る。ペプチドアジュバントを含む一実施形態では、ペプチドアジュバントと下流にコードされるタンパク質／抗原との間にリンカーがコードされ得る。一実施形態では、ＨＢＶコアと改変ＨＢＶポリメラーゼの配列の間にリンカーがコードされる。
【０１０３】
リンカー残基は、ランダムなアミノ酸配列、またはエピトープ予測コンピュータプログラムもしくは動物モデルの実験に基づき非免疫原性になるよう選択したアミノ酸を含み得る。例えば、リンカーは、それがエピトープであることが予測されるか、わかっている場合、考慮されないことがある（すなわち、ＨＢＶにみられないエピトープ、例えば人工エピトープに対する免疫応答を回避するため）。リンカーは柔軟なものであり得る。リンカーは、Ｋ、Ｇ、ＰもしくはＳアミノ酸残基またはその組合せを含むか、これよりなるものであり得る。一実施形態では、リンカーは、Ｇアミノ酸残基および／またはＰアミノ酸残基を含むか、これよりなるものであり得る。リンカー残基は、長さが１〜１０アミノ酸であり得る。別の実施形態では、リンカー残基は、長さが２〜８残基であり得る。別の実施形態では、リンカー残基は、長さが１〜６残基であり得る。
【０１０４】
リンカーは、配列ＫＧＧＧＰＧＧＧ（配列番号５）、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号７）、ＫＧＧＳ（配列番号１４）、ＫＳＰ、ＧＳＫＧＫ（配列番号２０）、ＬＥＧＧＳＧＧ（配列番号２２）、ＳＫＳＧＰＰＳＧＫＳ（配列番号３１）、ＧＳＫＳＧＳＫ（配列番号３２）、ＳＫＳＰＧＳＧＰＰ（配列番号３３）またはＡＳＫＧＧＫＳＧ（配列番号３４）のいずれかを含むか、これよりなるものであり得る。
【０１０５】
一実施形態では、リンカーは配列ＫＧＧＧＰＧＧＧ（配列番号５）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号７）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＫＧＧＳ（配列番号１４）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＫＳＰを含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＧＳＫＧＫ（配列番号２０）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＬＥＧＧＳＧＧ（配列番号２２）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＳＫＳＧＰＰＳＧＫＳ（配列番号３１）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＧＳＫＳＧＳＫ（配列番号３２）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＳＫＳＰＧＳＧＰＰ（配列番号３３）を含み得る。別の実施形態では、リンカーは配列ＡＳＫＧＧＫＳＧ（配列番号３４）を含み得る。
【０１０６】
リンカーの使用は、ヒトプロテオームと相同性のあるペプチド（自己抗原に対して免疫応答を生じさせる可能性がある）の生成を回避することができる点で有利であり、リンカーが免疫優性人工エピトープを回避する。さらに、リンカーがタンパク質のセグメント間に柔軟なヒンジをもたらし得るため、タンパク質のセグメントがその天然のコンホメーションにフォールドすることができる。例えば、ＣΔＰｒｅＳ１とＳの間にリンカーがあると、ＣΔＰｒｅＳ１とＳが独立にフォールドすることが可能になるため、両者がそれぞれのタンパク質の立体構造エピトープに対して抗体を生じさせることが可能である。
【０１０７】
リンカーは、様々な免疫原発現カセット間で異なるものであり得る。様々なリンカーを用いることにより、可能性のある人工エピトープに対して生じるいかなるＴ細胞応答のブーストも（すなわち、リンカーを変化させること、または接合部を変化させることにより）回避される。例えば、ワクチンをプライムブーストワクチン接種戦略で使用する場合、免疫原の配置内にあるリンカーまたはタンパク質の順序を変化させることにより、人工エピトープ応答のブーストを克服することができる。
【０１０８】
免疫原発現カセット（１つまたは複数）のその他のエレメント
免疫原発現カセットがＭＶＡベクターに使用するためのものである一実施形態では、免疫原発現カセットは、相同組換えによるＭＶＡ  Ｆ１１遺伝子座内への挿入を可能にするため、Ｆ１１左隣接配列および右隣接配列をさらに含み得る。
【０１０９】
Ｆ１１左隣接配列は、配列番号３５の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。Ｆ１１右隣接配列は、配列番号３６の配列またはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。配列番号３５または３６のバリアントは、それぞれ配列番号３５または３６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を有する配列を含み得る。配列番号３５または３６のバリアントは、それぞれ配列番号３５または３６の相同組換え機能を実質的に保持し得る。当業者には、機能に影響を及ぼさずに１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のアミノ酸残基を置換、付加または除去し得ることが理解されよう。例えば、保存的置換が考慮され得る。
【０１１０】
免疫原発現カセットは転写ターミネーター配列をさらに含み得る。転写ターミネーター配列は、第二のプロモーターを含む免疫原発現カセットの実施形態で加え得る。例えば、転写ターミネーター配列を、主要なプロモーターによって発現するタンパク質の下流であるが、第二のプロモーターの前（上流）である場所に加え得る。転写ターミネーター配列は、配列ＴＴＴＴＴＧＴまたはそのバリアントを含むか、これよりなるものであり得る。
【０１１１】
一実施形態では、本明細書に記載される免疫原発現カセットは、分離しているか、非ウイルスベクター内に提供されるものであり得る。
【０１１２】
したがって、本発明のまた別の態様では、本明細書に記載される免疫原発現カセットを含み、任意選択で、分離した核酸である、核酸が提供される。
【０１１３】
本発明のまた別の態様では、本発明によるウイルスベクターを含み、任意選択で、薬学的に許容される組成物である、組成物が提供される。
【０１１４】
組成物は、例えばヒトなどの哺乳動物において、免疫原性であり得る。組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。組成物は、薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であり得る。組成物は、ＨＢＶ感染の予防または治療に使用するものであり得る。
【０１１５】
本発明のまた別の態様では、本発明によるウイルスベクター、核酸または組成物の投与を含む、ＨＢＶ感染の治療方法または予防方法が提供される。
【０１１６】
ＨＢＶ感染の治療方法または予防方法は、ワクチン接種法であり得る。
【０１１７】
本発明のまた別の態様では、ＨＢＶ感染の治療または予防に使用し、任意選択で、使用がワクチンでのものである、本発明によるウイルスベクター、核酸または組成物が提供される。
【０１１８】
本発明のまた別の態様では、本発明によるウイルスベクター、核酸または組成物を含む、ワクチンが提供される。
【０１１９】
ワクチンはプライムワクチンであり得る。ワクチンはブーストワクチンであり得る。プライムワクチンの後にブーストワクチンを投与する場合、ウイルスベクターは、異なる本発明によるウイルスベクターであり得る。
【０１２０】
プライムワクチンとブーストワクチンとで異なるウイルスベクターにすると、あるタンパク質／抗原配列と別のタンパク質／抗原配列の接合部を越えて形成される「偽」エピトープが生じるのを回避することができる点で有利である。すなわち、並べ替えたタンパク質に同じ接合部が生じ得ない。
【０１２１】
本発明のまた別の態様では、
本発明によるプライムワクチン接種と、
本発明によるブーストワクチン接種と
を含む、プライムブーストワクチン接種キットが提供される。
【０１２２】
プライムワクチン接種とブーストワクチン接種は異なるウイルスベクターを含み得る。
【０１２３】
ウイルスベクターを別の治療有効成分または予防有効成分と組み合わせてワクチンの形で使用し得る。ウイルスベクターをアジュバントと組み合わせてワクチンの形で使用し得る。
【０１２４】
ウイルスベクター、ウイルスベクターをコードする核酸を薬学的に許容される担体に入れて提供し得る。
【０１２５】
本発明によるウイルスベクターもしくは組成物は野生型ＨＢＶを含まないものであり得るか、または本発明による核酸は野生型ＨＢＶをコードしないものであり得る。
【０１２６】
本明細書で使用される配列「同一性」に言及する場合、それは標準的なＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｐパラメータ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）を用いて整列させた２つの配列の間の同一性の割合を指し得る。
【０１２７】
「免疫原性」という用語を本発明のウイルスベクター、核酸または組成物に用いる場合、同用語は、ヒトまたは動物の体内に免疫応答を誘発することが可能であることを意味する。免疫応答はＨＢＶに対する防御であり得る。「防御」という用語は、Ｂ型肝炎疾患の予防、Ｂ型肝炎疾患のリスクの低下、ＨＢＶの感染、伝染および／または進行のリスクの低下、Ｂ型肝炎疾患の重症度の軽減、Ｂ型肝炎の治癒、Ｂ型肝炎の症状の緩和、あるいはＢ型肝炎疾患症状の重症度の軽減を意味する。
【０１２８】
「予防」という用語は、Ｂ型肝炎の予防または防御的処置を意味する。予防は、ＨＢＶの感染、伝染および／またはＢ型肝炎疾患の進行のリスクの低下、あるいはＢ型肝炎疾患の重症度の軽減を含み得る。
【０１２９】
「治療」という用語は、Ｂ型肝炎の治癒、症状の緩和またはＢ型肝炎疾患もしくはＢ型肝炎疾患症状の重症度の軽減を意味する。
【０１３０】
「バリアント」核酸配列に関して、当業者には、機能に影響を及ぼさずに１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のコドンを置換、付加または除去し得ることが理解されよう。例えば、保存的置換が考慮され得る。
【０１３１】
「バリアント」アミノ酸配列に関して、当業者には、機能に影響を及ぼさずに１個、２個、３個、４個、５個またはそれ以上のアミノ酸を置換、付加または除去し得ることが理解されよう。例えば、保存的置換が考慮され得る。
【０１３２】
当業者には、本発明のある実施形態または態様の任意選択の特徴を、必要に応じて本発明の他の実施形態または態様に適用することが可能であることが理解されよう。
【０１３３】
これより添付図面を参照しながら、本発明の諸実施形態を単なる例としてさらに詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１３４】
【図１】（Ａ）コンセンサス配列を得るのに用いた１４４７のＨＢＶ遺伝子型Ｃ配列の系統発生的関係、（Ｂ）ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス（配列番号１）とＫＰ０１７２６９．１ＨＢＶ単離株ＪＰ−０２（配列番号２）の比較を示す図である。ＨＢＶデータベース、ＨＢＶｄｂ：ｈｔｔｐｓ：／／ｈｂｖｄｂ．ｉｂｃｐ．ｆｒ／ＨＢＶｄｂ／ＨＢＶｄｂＩｎｄｅｘからダウンロードした１４４７のＨＢＶ遺伝子型Ｃヌクレオチド配列を、ＭＡＦＦＴ（多配列アライメントプログラム）を用いて整列させて、ＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス配列および系統樹を作成した。コンセンサス配列と選択した患者の配列（ＫＰ０１７２６９．１ＨＢＶ単離株ＪＰ−０２）の３２１５ヌクレオチド配列のアライメントから、灰色で強調した３つのヌクレオチドの相違（５２位、１０５３位および２６９９位）が明らかになった。１４４７の遺伝子型ｃ単離株ｊｐ−０２から得たＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス配列の配列が下に記載されている。
【図２】（Ａ）ＨＢＶウイルスのゲノムおよびコドンの配置。ＨＢＶビリオンは（ポリメラーゼタンパク質と結合した完全長負鎖ＤＮＡと部分合成正鎖ＤＮＡとを有する）部分的二本鎖ＤＮＡを有する。ゲノムは、長さが約３．２Ｋｂであり、４つの主要コドン、すなわち、コア（プレコア領域を含む）、ポリメラーゼ、表面（ｐｒｅＳ１およびｐｒｅＳ２領域を含む）およびＸを有する。（Ｂ）ＨＢＶ免疫原の配置。２つの免疫原、ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳおよびＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔを設計した。免疫原はともにＨＢＶコドン（プレコア、コア、ポリメラーゼ［Ｐｍｕｔ］、ｐｒｅＳ１、ｐｒｅＳ２および表面タンパク質を含む）および非ＨＢＶコドン（短縮サメインバリアント鎖［ＳＩｉ］、２つのリンカー［青緑色で示されている］およびフューリン２Ａ［Ｆ２Ａ］ペプチド配列からなる）をコードする。哺乳動物発現カセット内では、免疫原コドン配列がＣＭＶプロモーターの隣に位置している。（Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現解析。ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳおよびＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔをコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を溶解させ、マウス抗ＨＢＶ−ＰｒｅＳ１抗体およびマウス抗ＨＢＶ−ポリメラーゼ抗体を用いたウエスタンブロット実験で溶解物を解析した。マウス抗ＧＡＰＤＨでプローブしたブロットをローディング対照とした。（Ｄ）ＣｈＡｄＯＸ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ。ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原コドンを有する哺乳動物発現カセットを複製欠損ＣｈＡｄＯｘ２ベクターに挿入した。既に記載されている標準的方法を用いてＣｈＡｄＯＸ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳベクターをＴ−ＲＥｘ（商標）−２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）にトランスフェクトすることにより、組換えＣｈＡｄＯＸ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳウイルスを作製した。
【図３】ナイーブマウスモデルを用いたＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンに関する試験を示す図である。（Ａ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾細胞応答。（Ｂ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの肝内リンパ球応答。（Ｃ）ＣＤ１マウスの脾細胞応答。（Ｄ）ＣＤ１マウスの肝内リンパ球応答。ＢＡＬＢ／ｃマウス（７週齢のマウス４匹）およびＣＤ１（１８週齢のマウス２匹および１３週齢のマウス５匹）にそれぞれマウス１匹当たり４×１０７ＩＵおよび５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを筋肉内注射により接種した。ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、標準的プロトコルに従って脾臓および肝臓から脾細胞および肝内リンパ球（ＩＨＬ）を単離した。脾細胞２×１０５個およびＩＨＬ  １×１０５個を（一晩インキュベートすることにより抗マウスＩＮＦγモノクローナル抗体で予めコートした）ＥＬＳＩＰＯＴプレートにＤＭＳＯ（１％）、非ＨＢＶペプチドプール（濃度３μｇ／ｍｌのＡ、Ｉ、Ｌ）、ＨＢＶペプチドプール（濃度３μｇ／ｍｌのコア、Ｐｏｌ−１、Ｐｏｌ−２、Ｐｏｌ−３、Ｐｏｌ−４、ＰｒｅＳ１／Ｓ２および表面）または陽性対照のマイトジェン（濃度がそれぞれ１０μｇ／ｍｌおよび１２．５μｇ／ｍｌのＰＨＡまたはコンカナバリンＡ）とともに播いた。３７℃で一晩、１５時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで７回洗浄し、ビオチンコンジュゲートマウス抗ＩＮＦγと室温で２時間インキュベートした後、ＰＢＳで４回洗浄し、ＡＰコンジュゲート抗ビオチンと室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳで４回洗浄し、ウェル上にスポットが現れるまでＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質で発色させた。最後に水で洗浄し、乾燥させた後、個々のプレートの細胞１００万個当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）を自動ＥＬＩＳｐｏｔプレートリーダーでカウントした。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣＤ１マウスの脾細胞およびＩＨＬを各ペプチドプールで刺激したときのＥＬＩＳＰＯＴ応答が別々の図表で表されている。全ＨＢＶペプチドプール（コア、Ｐｏｌ−１、Ｐｏｌ−２、Ｐｏｌ−３、Ｐｏｌ−４、ＰｒｅＳ１／Ｓ２および表面）に対するＥＬＩＳＰＯＴ応答を合計することにより、ＨＢＶペプチド刺激による全応答も算出した。
【図４】ＨＢＶ免疫原ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳの免疫原性に関するサメインバリアント鎖（ＳＩｉ）を有するものと有さないものとの比較を示す図である。（Ａ）ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原の配置。ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳに存在するＳＩｉおよび第一のリンカーを欠失させることにより免疫原ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳを作製した。ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳは、ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原に存在するＳＩｉおよび第一のリンカー配列がないこと以外は全く同じアミノ酸を有する。（Ｂ）ＣＤ１マウスの脾細胞応答。（Ｃ）ＣＤ１マウスの肝内リンパ球応答。前に記載した通りにＣｈＡｄＯＸ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳを作製し、ＣＤ１マウス（７週齢のマウス１０匹）にマウス１匹当たり５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを筋肉内注射により接種し、ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、前に記載した通りに脾細胞および肝内リンパ球の応答データを得た。ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳおよびＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳをそれぞれ接種した５匹および１０匹のＣＤ１マウスから得たデータを比較し、比較しやすいように図表で表した。
【図５Ａ】ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す図である。
【図５Ｂ】ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す図である。
【図６Ａ】ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す図である。
【図６Ｂ】ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す図である。
【図７】ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いたＣｈＡｄＯｘ１−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチン、脾細胞応答に関する試験である：ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢のマウス８匹）にマウス１匹当たり５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ１−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを筋肉内注射により接種した。ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、前に記載した通りに脾細胞応答のデータを得た。各ペプチドプール刺激に対する脾細胞Ｔ細胞応答および全ＨＢＶペプチドプールからプールした全応答が棒グラフで表されている。
【図８】ＣｈＡｄＯｘ１を介してコードされたＨＢＶ免疫原ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳとＣｈＡｄＯｘ２を介してコードされた同ＨＢＶ免疫原の免疫原性の比較を示す図である。前に記載した通りに、ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原をコードするＣｈＡｄＯｘ１ウイルスベクターワクチンおよびＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原をコードするＣｈＡｄＯｘ２ウイルスベクターワクチンを作製した（図２Ｄ）。７週齢のＣＤ１マウス１０匹および８週齢のＣＤ１マウス８匹にそれぞれマウス１匹当たり５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンおよびＣｈＡｄＯｘ１−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを筋肉内注射により接種し、ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、前に記載した通りに脾細胞応答のデータを得た。ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳおよびＣｈＡｄＯｘ１−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳを接種した１０匹のＣＤ１マウスおよび８匹のＣＤ１マウスのデータを比較し、比較しやすいように図表で表した。ＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを接種したマウスでは、ＣｈＡｄＯｘ１−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンより統計的に有意に高い強度の全脾細胞Ｔ細胞応答が観察された。
【図９】短いＣＭＶプロモーターまたは長いＣＭＶプロモーターを用いＣｈＡｄＯｘ１ウイルスベクターを介してコードされたＨＢＶ免疫原ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）（ＨＢＶ−ｖ２と称する）とＣｈＡｄＯｘ２ウイルスベクターを介してコードされた同ＨＢＶ免疫原の免疫原性の比較を示す図である。ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）免疫原（ＨＢＶ−ｖ２と称する）をコードする、短いＣＭＶプロモーターをベースとする２種類および長いＣＭＶプロモーターをベースする１種類のＣｈＡｄＯｘ１（ＣｈＡｄＯｘ１−ＬＰ−ＨＢＶ−ｖ２およびＣｈＡｄＯｘ１−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２）およびＣｈＡｄＯｘ２（ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２）ワクチンを前に記載した通りに作製した。８週齢のＢａｌｂｃマウス１５匹を３つのグループ（１グループあたりマウス５匹）に分け、５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ１−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチン、ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチンまたはＣｈＡｄＯｘ１−ＬＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチンを筋肉内注射により接種した。ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、前に記載した通りに脾細胞応答のデータを得た。比較しやすいようにＨＢＶ−ｖ２ワクチンの比較データが３種類とも同じ図表に表されている。ＣｈＡｄＯｘ１−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチンを接種したマウスでは、他の２種類のＨＢＶ−ｖ２ワクチンと比較して統計的に有意に高い強度の全脾細胞Ｔ細胞応答が観察された。さらに、ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチンでは、ＣｈＡｄＯｘ１−ＬＰ−ＨＢＶ−ｖ２ワクチンと比較して統計的に有意に高い強度の全脾細胞Ｔ細胞応答がみられた。
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｇ。（Ａ）ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ；（Ｂ）ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ；（Ｃ）ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ；（Ｄ）ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）；（Ｅ）ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）；（Ｆ）ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）および（Ｇ）ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）の免疫原の配置を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１３５】
慢性ＨＢＶ感染の頻度が高い東南アジアで最もよくみられるＨＢＶ遺伝子型の１つであるＨＢＶ遺伝子型ＣをベースにＨＢＶワクチンを作製した。ＨＢＶ免疫原を設計するため、コンセンサスに最も近い患者のＨＢＶ遺伝子型Ｃ配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ：ＫＰ０１７２６９．１）を選択し、このコンセンサスは、Ｂ型肝炎ウイルスデータベースであるＨＢＶｄｂから１４４７のＨＢＶ遺伝子型Ｃ配列を整列させることにより作製したものである（図１Ａおよび１Ｂ）。選択したＨＢＶ遺伝子型Ｃ配列にはコンセンサスと比較してヌクレオチド変化がわずか３つであり、このうち２つはサイレント変異であり、１つはポリメラーゼタンパク質に変異がみられた（図１Ｃ）。
【０１３６】
ＨＢＶ感染消散のウイルスクリアランスには、様々なＨＢＶタンパク質に対する強力で多抗原特異的なＴ細胞応答が主要な役割を果たすと考えられている。このことに基づき、ウイルスのあらゆる主要タンパク質、すなわち、コア（プレ−コア領域を含む）、非機能的ポリメラーゼＰｍｕｔ（Ｐｍｕｔ：ワクチンがコードするポリメラーゼがＨＢＶウイルス複製に関与できないようにすることを目的とする、機能的変異を有するＨＢＶポリメラーゼ）および表面タンパク質（そのＰｒｅＳ１領域およびＰｒｅＳ２領域を含む）をコードするＨＢＶ免疫原を設計した。図２Ａおよび２Ｂに、ＨＢＶゲノムのコドン配置および最初の２つのＨＢＶワクチン免疫原の設計の略図をそれぞれ示す。この配置は、リボソームスキッピング事象を引き起こすことによって単一のオープンリーディングフレームから２つのタンパク質をコードさせるフューリン２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド切断機序を用いて、融合タンパク質であるプレ−コアとコアとＰｍｕｔおよび分離した表面タンパク質をコードするよう設計したものである。
【０１３７】
単一の導入遺伝子カセット内に複数のタンパク質をコードさせるには慎重な設計が必要であり、この場合、コドン配列がＣＭＶプロモーターに近接していることがコードタンパク質の発現レベルに重要な役割を果たす。この２つの免疫原（図２Ｂ）を解析するため、本発明者らが作製し、免疫原カセットの終端または先頭に表面タンパク質をそれぞれコードするＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳおよびＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔをウエスタンブロット発現試験で検討した。ウエスタンブロット発現解析では、配置ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳがＦ２Ａ切断の可能性が最も高く、予想されるＣＰｍｕｔおよびＳタンパク質がＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔと比較して大量に生じることがわかった（図２ｃ）。
【０１３８】
この観察結果に基づき、本発明者らはＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳの免疫原配置をチンパンジーアデノウイルス（ＣｈＡｄＯｘ２）ベースのＴ細胞誘導ＨＢＶワクチンの作製に進めることにした（図２Ｄ）。オックスフォード大学ジェンナー研究所のウイルスベクターコア施設で製造管理および品質管理に関する基準に従い、小規模バッチのＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳを製造し、マウス免疫原性試験に用いた。
【０１３９】
ナイーブマウスモデルを用いて、ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンがＴ細胞免疫応答を生じさせる能力を試験した。ナイーブＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣＤ１マウスを筋肉内注射によりそれぞれマウス１匹当たり４×１０７ＩＵおよび５×１０７ＩＵのＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンで感作した。ワクチン接種の１４日後、マウスを屠殺し、脾臓および肝臓から単離した脾細胞および肝内リンパ球（ＩＨＬ）を用いてＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施した。ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原全体にわたって作製し、１１個のアミノ酸が重複する１５量体の合成ペプチドを特定のプール（ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原の様々な領域を代表する）にまとめ、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイに刺激物質として使用した。結果から、ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンによりＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ免疫原に対して良好なＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答が得られることがわかった（図３）。ＢＡＬＢ／ｃマウス、ＣＤ１マウスともに、免疫原のうちポリメラーゼおよび表面タンパク質に対して強い応答がみられ、コアタンパク質に対しては弱い応答がみられ、非ＨＢＶタンパク質（サメインバリアント鎖［ＳＩｉ］、Ｆ２Ａおよびリンカー）に対してはほとんどないし全く応答がみられなかった。
【０１４０】
これまでの試験で、サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）を免疫原のＮ末端に位置させると、それが分子アジュバントとして機能し、免疫原に対するＴ細胞免疫応答を全体的に増大させることが明らかにされている。このことを検討するため、本発明者らは、ＳＩｉのないＨＢＶ免疫原（ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチン）（図４Ａ）を作製し、次いでＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳワクチンを作製し、それらを同様のＣＤ１マウス免疫原性実験で試験した。結果から、ＳＩｉワクチン（ＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）の方が非ＳＩｉワクチン（ＣｈＡｄＯｘ２−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ）より強度の高いＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答（図４Ｂ、４Ｃに示される脾細胞および肝内リンパ球の両方のＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ応答）が生じることが明らかになった。
【０１４１】
ウイルスベクターＨＢＶワクチン設計の主な目的は、ＨＢＶ免疫原に対してＴ細胞応答および抗体応答をともに生じさせることである。良好な抗体応答を生じさせるには、免疫原コードタンパク質がその天然のコンホメーションにフォールドする必要がある。このことを生じさせるため、抗体誘導免疫原構成要素として、リンカーにより表面タンパク質のＳドメインと融合したＰｒｅＳ１ドメインのＮ末端側半分をコードするＨＢＶ免疫原、ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）およびＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）（図５Ａおよび５Ｂ）を設計し、Ｔ細胞免疫応答の発生に必要とされると思われるＴ細胞エピトープを保存するため、表面タンパク質の残りのペプチド配列（ＰｒｅＳ１ドメインのＣ末端側半分とＰｒｅＳ２ドメイン全体）をプレコア／コア／Ｐｍｕｔと融合させた。図５Ａおよび５ＢにＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す。
【０１４２】
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）およびＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）と同様の設計に従ったＭＶＡ−ＨＢＶ免疫原も設計した。ただし、ＨＢＶ免疫原ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳのＴ細胞構成要素は初期プロモーターＦ１１によってコードされ、抗体誘導構成要素Ｓ（ｓｈ）またはＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）は初期／後期プロモーターｍＨ５によってコードされる。相同組換えによるＦ１１遺伝子座内への挿入を可能にするため、クローニングカセットは、Ｆ１１左隣接配列およびＦ１１右隣接配列も有する。図６Ａおよび６Ｂに、それぞれＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）およびＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）の模式的配置を示す。
【０１４３】
結論：新規な多抗原性ＨＢＶ免疫原ベースのＣｈＡｄＯｘ２−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳはナイーブマウスモデルにおいて高い免疫原性を示す。以上の試験は、免疫療法的アプローチにより慢性ＨＢＶマウスモデルが慢性ＨＢＶ感染を克服できるかどうかを評価するため同モデルを用いて今後実施される試験への道を開くものである。
【０１４４】
配列：
１４４７の遺伝子型Ｃ配列から得たＨＢＶ遺伝子型Ｃコンセンサス配列（３２１５塩基対）を配列番号１として記載する。ＫＰ０１７２６９．１ＨＢＶ単離株ＪＰ−０２の配列を配列番号２として記載する。
【０１４５】
カセットの例
１．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ
１．１．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：免疫原の配置を図１０Ａに示す
１．２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：アミノ酸配列（配列番号３）
【化１】
2020516264.tif 000003
１．３．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
１．３．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
１．３．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化２】
2020516264.tif 000004
１．３．４．Ｃ＝
１．３．４．１．ＰｒｅＣ＝
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
１．３．４．２．コア＝ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化３】
2020516264.tif 000005
１．３．６．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化４】
2020516264.tif 000006
【化５】
2020516264.tif 000007
１．３．８．表面タンパク質（Ｓ）＝
１．３．８．１．ＰｒｅＳ１＝
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡ（配列番号５２）
１．３．８．２．ＰｒｅＳ２＝
ＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号５３）
１．３．８．３．表面（Ｓ）＝
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１０）
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳヌクレオチド配列を配列番号４６として記載する。
【０１４６】
２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ
２．１．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ：免疫原の配置を図１０Ｂに示す
２．２．ＳＩｉ＿ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ：アミノ酸配列（配列番号１１）
【化６】
2020516264.tif 000008
２．３．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔ：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
２．３．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
２．３．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化７】
2020516264.tif 000009
２．３．４．表面タンパク質（Ｓ）＝
２．３．４．１．ＰｒｅＳ１＝
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡ（配列番号５２）
２．３．４．２．ＰｒｅＳ２＝
ＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号５３）
２．３．４．３．表面（Ｓ）＝
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１０）
【化８】
2020516264.tif 000010
２．３．６．Ｃ＝
２．３．６．１．プレコア＝
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
２．３．６．２．コア＝ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化９】
2020516264.tif 000011
２．３．８．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化１０】
2020516264.tif 000012
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＳＣＰｍｕｔヌクレオチド配列を配列番号４７として記載する：
【０１４７】
３．ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ
３．１．ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：免疫原の配置を図１０Ｃに示す
３．２．ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：アミノ酸配列（配列番号１２）
【化１１】
2020516264.tif 000013
３．３．ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＳ：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
３．３．１．Ｃ＝
３．３．１．１．プレコア＝
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
３．３．１．２．コア＝ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化１２】
2020516264.tif 000014
３．３．３．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化１３】
2020516264.tif 000015
【化１４】
2020516264.tif 000016
３．３．５．表面タンパク質（Ｓ）＝     
３．３．５．１．ＰｒｅＳ１＝
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡ（配列番号５２）
３．３．５．２．ＰｒｅＳ２＝
ＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号５３）
３．３．５．３．表面（Ｓ）
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１０）
【０１４８】
４．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）
４．１．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）：免疫原の配置を図１０Ｄに示す
４．２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）：アミノ酸配列（配列番号１３）
【化１５】
2020516264.tif 000017
４．３．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
４．３．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
４．３．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化１６】
2020516264.tif 000018
４．３．４．Ｃ＝
４．３．４．１．プレコア＝
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
４．３．４．２．コア＝ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化１７】
2020516264.tif 000019
４．３．６．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化１８】
2020516264.tif 000020
【化１９】
2020516264.tif 000021
４．３．８．ＮΔＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２＝
ＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号１５）
【化２０】
2020516264.tif 000022
【化２１】
2020516264.tif 000023
４．３．１１．Ｓ（ｓｈ）＝
４．３．１１．１．ＣΔＰｒｅＳ１＝ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧ（配列番号２１）
【化２２】
2020516264.tif 000024
４．３．１１．３．表面（Ｓ）＝
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１８）
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−Ｓ（ｓｈ）ヌクレオチド配列を配列番号４８として記載する。
【０１４９】
５．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）
５．１．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）：免疫原の配置を図１０Ｅに示す
５．２．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）：アミノ酸配列（配列番号２３）
【化２３】
2020516264.tif 000025
５．３．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
５．３．１．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
５．３．１．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化２４】
2020516264.tif 000026
５．３．１．４．ＮΔＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２＝ＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号１５）
【化２５】
2020516264.tif 000027
５．３．１．６．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化２６】
2020516264.tif 000028
【化２７】
2020516264.tif 000029
５．３．１．８．Ｃ＝
５．３．１．８．１．プレコア
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
５．３．１．８．２．コア＝
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
５．３．１．９．Ｓ（ｓｈ）
５．３．１．９．１．ＣΔＰｒｅＳ１＝
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧ
【化２８】
2020516264.tif 000030
５．３．１．９．３．表面＝
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１８）
５．４．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列を配列番号２４として記載する。
５．５．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列に関する説明：
５．５．１．Ｆ１１−Ｌ−隣接＝塩基１〜１０９７（配列番号３５）
５．５．２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ＝塩基１０９８〜４８３８（配列番号３７）
５．５．３．転写ターミネーター配列＝塩基４８３９〜４８４５
ＴＴＴＴＴＧＴ
５．５．４．ｍＨ５プロモーター＝塩基４８４６〜４９４２（配列番号２８）
５．５．５．Ｓ（ｓｈ）＝塩基４９４３〜５８２４（配列番号３８）
５．５．６．Ｆ１１−Ｒ−隣接＝塩基５８２５〜７１４３（配列番号３６）
【０１５０】
６．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）
６．１．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：免疫原の配置を図１０Ｆに示す
６．２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：アミノ酸配列（配列番号２５）
【化２９】
2020516264.tif 000031
６．３．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
６．３．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
６．３．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化３０】
2020516264.tif 000032
６．３．４．Ｃ＝
６．３．４．１．プレコア
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
６．３．４．２．コア＝ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化３１】
2020516264.tif 000033
６．３．６．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化３２】
2020516264.tif 000034
【化３３】
2020516264.tif 000035
６．３．８．ＮΔＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２＝
ＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号１５）
【化３４】
2020516264.tif 000036
【化３５】
2020516264.tif 000037
【化３６】
2020516264.tif 000038
６．３．１２．Ｓ（ｓｈ）＝
６．３．１２．１．ＣΔＰｒｅＳ１＝ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧ（配列番号２１）
【化３７】
2020516264.tif 000039
６．３．１２．３．表面（Ｓ）＝
ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１８）
ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＣＰｍｕｔＰｒｅＳ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）ヌクレオチド配列を配列番号４９として記載する。
【０１５１】
７．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）
７．１．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：免疫原の配置を図１０Ｇに示す
７．２．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：アミノ酸配列（配列番号２６）
【化３８】
2020516264.tif 000040
７．３．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）：ＨＢＶ免疫原のアミノ酸配列に関する説明
７．３．１．１．ポリペプチドの最初のアミノ酸＝Ｍ
７．３．１．２．サメインバリアント鎖（ＳＩｉ）＝ＳＬＬＷＧＧＶＴＶＬＡＡＭＬＩＡＧＱＶＡＳＶＶＦＬＶ（配列番号４）
【化３９】
2020516264.tif 000041
７．３．１．４．ＮΔＰｒｅＳ１およびＰｒｅＳ２＝ＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ（配列番号１５）
【化４０】
2020516264.tif 000042
７．３．１．６．Ｐｍｕｔ＝（変異：Ｙ６３Ａ、Ｃ３２３Ａ、Ｃ３３４Ａ、Ｃ３３８Ａ、Ｃ３５２Ａ、Ｒ７１４Ａ、Ｄ７８８Ａ、Ｒ７９２Ａ）
【化４１】
2020516264.tif 000043
【化４２】
2020516264.tif 000044
７．３．１．８．Ｃ＝
７．３．１．８．１．プレコア＝
ＭＱＬＦＨＬＣＬＩＩＳＣＳＣＰＴＶＱＡＳＫＬＣＬＧＷＬＷＧ（配列番号１６）
７．３．１．８．２．コア＝
ＭＤＩＤＰＹＫＥＦＧＡＳＶＥＬＬＳＦＬＰＳＤＦＦＰＳＩＲＤＬＬＤＴＡＳＡＬＹＲＥＡＬＥＳＰＥＨＣＳＰＨＨＴＡＬＲＱＡＩＬＣＷＧＥＬＭＮＬＡＴＷＶＧＳＮＬＥＤＰＡＳＲＥＬＶＶＳＹＶＮＶＮＭＧＬＫＩＲＱＬＬＷＦＨＩＳＣＬＴＦＧＲＥＴＶＬＥＹＬＶＳＦＧＶＷＩＲＴＰＰＡＹＲＰＰＮＡＰＩＬＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲＲＧＲＳＰＲＲＲＴＰＳＰＲＲＲＲＳＱＳＰＲＲＲＲＳＱＳＲＥＳＱＣ（配列番号６）
【化４３】
2020516264.tif 000045
７．３．１．１０．Ｓ（ｓｈ）＿＝
７．３．１．１０．１．ＣΔＰｒｅＳ１＝
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧ（配列番号２１）
【化４４】
2020516264.tif 000046
７．３．１．１０．３．表面（Ｓ）＝ＭＥＮＴＴＳＧＦＬＧＰＬＬＶＬＱＡＧＦＦＬＬＴＲＩＬＴＩＰＱＳＬＤＳＷＷＴＳＬＮＦＬＧＧＡＰＴＣＰＧＱＮＳＱＳＰＴＳＮＨＳＰＴＳＣＰＰＩＣＰＧＹＲＷＭＣＬＲＲＦＩＩＦＬＦＩＬＬＬＣＬＩＦＬＬＶＬＬＤＹＱＧＭＬＰＶＣＰＬＬＰＧＴＳＴＴＳＴＧＰＣＫＴＣＴＩＰＡＱＧＴＳＭＦＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＡＲＦＬＷＥＷＡＳＶＲＦＳＷＬＳＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶＧＬＳＰＴＶＷＬＳＶＩＷＭＭＷＹＷＧＰＳＬＹＮＩＬＳＰＦＬＰＬＬＰＩＦＦＣＬＷＶＹＩ（配列番号１８）
７．４．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列を配列番号２７として記載する。
７．５．ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列に関する説明：
７．５．１．Ｆ１１−Ｌ−隣接＝塩基１〜１０９７（配列番号３５）
７．５．２．ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ＝塩基１０９８〜４８３８（配列番号３７）
７．５．３．転写ターミネーター配列＝塩基４８３９〜４８４５
ＴＴＴＴＴＧＴ
７．５．４．ｍＨ５プロモーター＝塩基４８４６〜４９４２（配列番号２８）
７．５．５．ＴＰＡ＝塩基４９４３〜５０３８（配列番号２９）
７．５．６．Ｓ（ｓｈ）＝塩基５０３９〜５９２０（配列番号３８）
７．５．７．Ｆ１１−Ｒ−隣接＝塩基５９２１〜７２３９（配列番号３６）
【０１５２】
８．低ＧＣ含有型ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−ＴＰＡ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列（配列番号５８）：
ｇｔａａｔｃｔａｔｔｃｇａｔａｔａｃｃｇｔｔｇｃｔａａｃａｇｔａｔａｃｔｇｇｃｃｃａａｔａａｃｔｇｔｇｇａｔｇｇａａａａｔｃｔａｔａａｔａａｔａｃａｔｔａａｔａｔｃａｔｃｃｇａｔｇｇｔｇｃｔａｇｇｇｔｔａｔｔｔｇｇａｔｇｇａｔｇｃｇｔａｔａａａｔｔｔｔｃｔｔｇｃｇｇｔｔｔａｔｃｔｔｔａｃａａｇａｃｔａｔｔｇｔｔａｔｃａｔｔｇｇｇｇｔａｇｃａａａｃｃａｇａｇａｇｃｃｇａｃｃａｔｔｃｇａｔｔｔａａｔａａａａａａａｔｃａｇａｔｇｃｔａａａｃｇｃａａｔｔｃｔａａａｔｃｇｔｔｇｇｔｃａａａｇａａｔｃｔａｔｇｇｃａｔｃｃｔｔｇａａａｔｃｃｔｔｇｔａｃｇａｇｇｃａｔｔｃｇａｇａｃａｃａａｔｃａｇｇａｇｃｇｔｔａｇａａｇｔｔｔｔａａｔｇａｇｔｃｃａｔｇｔａｇｇａｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔｔｔｃｔａｇａａｔａｇａａｇａｃａｔｇｔｔｃｔｔａａｃｔａｇｔｇｔｃａｔｔａａｔａｇａｇｔａｔｃｃｇａｇａａｔａｃｔｇｇａａｔｇｇｇｇａｔｇｔａｔｔａｔｃｃｔａｃｃａａｃｇａｔａｔａｃｃｔｔｃｔｃｔａｔｔｔａｔｃｇａａｔｃａｔｃｔａｔｃｔｇｔｃｔａｇａｔｔａｔａｔｔａｔａｇｔａａａｔａａｔｃａｇｇａａｔｃｃａａｃａａａｔａｔｃｇｔａｔｃａａａｔｃｔｇｔｔｃｔｃｇａｔａｔｃａｔｔｔｃｔｔｃａａａａｃａａｔａｃｃｃｔｇｃａｇｇａｃｇｔｃｃｃａａｃｔａｃｇｔｔａａａａａｔｇｇｔａｃａａａａｇｇａａａｇｔｔａｔａｔａｔｃｇｃｇｔｔｇｔｇｔａａａｇｔｔａｃｃｇｔａｃｃｔａｃｔａａｃｇａｃｃａｔａｔｔｃｃａｇｔａｇｔｔｔａｔｃａｃｇａｔｇａｔｇａｃａａｔａｃｔａｃｃａｃｃｔｔｔａｔｔａｃａｇｔａｔｔｇａｃｇｔｃｃｇｔｃｇａｔａｔｔｇａａａｃｔｇｃｔａｔｃａｇａｇｃａｇｇａｔａｔｔｃｇａｔａｇｔｃｇａａｔｔａｇｇｇｇｃｔｔｔａｃａａｔｇｇｇａｔａａｔａａｔａｔｔｃｃａｇａａｃｔｔａａａａａｃｇｇｔｔｔａｃｔｇｇａｔａｇｔａｔｃａａｇａｔｇａｔｔｔａｔｇａｃｔｔｇａａｃｇｃａｇｔｔａｃａａｃａａａｔａａｔｔｔａｔｔｇｇａａｃａｇｃｔｃａｔａｇａａａａｔａｔｔａａｃｔｔｔａａｃａａｃｔｃｔａｇｔａｔａａｔｔｔｃｇｔｔｇｔｔｔｔａｔａｃａｔｔｔｇｃｃａｔｔａｇｔｔａｔｔｇｃｃｇａｇｃａｔｔｃａｔｔｔａｃｔｃａａｔｔａｔｇｇａａａｃｃａｔａｇａｔｃｃｇｇｔｇｔａｔａｔａｔｃｔｃａｇｔｔｃａｇｔｔａｔａａａｇａａｔｔａｔａｃｇｔｔａｇｔａｇｃｔｃｔｔａｔａａａｇａｔａｔｔａａｔｇａａｔｃｃａｔｇａｇｔｃａｇａｔｇｇｔａａａａｔｔａｔａａａａａｇｔｇａａａａａｃａａｔａｔｔａｔｔｔｔｔａｔｃｇｔｔｇｇｔｔｇｔｔａｃａｃｔＡＴＧＴＣＡＣＴＴＣＴＴＴＧＧＧＧＣＧＧＡＧＴＴＡＣＡＧＴＴＣＴＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＴＴＡＴＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＣＴＴＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴＣＴＧＧＡＣＣＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＴＣＴＡＡＴＴＣＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＴＴＧＧＧＡＴＴＴＣＡＡＴＣＣＴＡＡＣＡＡＡＧＡＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＡＧＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＴＴＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＴＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＧＧＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＡＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴＣＴＡＣＡＡＡＴＡＧＡＣＡＡＴＣＴＧＧＴＡＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＡＧＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＣＣＴＣＡＡＧＣＴＡＴＧＣＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＡＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＡＧＡＧＴＴＡＧＡＧＧＡＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＣＴＡＴＡＴＴＴＴＣＴＡＧＡＡＣＡＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＡＴＧＧＡＴＣＡＡＡＡＴＣＴＧＧＡＴＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＴＣＴＧＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＣＴＴＴＡＧＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＣＣＴＡＧＡＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴＡＡＴＡＧＡＡＧＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＴＡＡＴＣＴＧＧＧＡＡＡＴＣＴＴＡＡＴＧＴＴＴＣＴＡＴＴＣＣＴＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＣＡＣＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＡＧＡＧＧＡＴＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＧＴＴＧＧＡＣＣＡＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＧＣＴＡＧＡＴＴＣＴＡＴＣＣＴＡＡＴＣＴＴＡＣＡＡＡＧＴＡＴＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＡＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＴＡＴＴＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＧＡＡＴＣＡＣＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＡＧＡＣＡＴＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＡＣＴＧＴＧＧＡＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＴＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＴＣＴＧＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＣＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＡＡＣＡＴＧＧＴＡＧＡＣＴＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＣＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＣＴＣＡＡＡＧＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＣＴＴＧＴＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＡＡＣＡＡＴＣＴＡＧＡＣＴＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＴＡＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＡＣＡＡＣＴＡＧＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＧＧＡＧＴＴＧＡＡＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＡＴＴＧＡＴＡＡＴＴＣＴＧＣＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＴＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＧＴＣＴＡＣＴＴＣＴＡＡＧＡＧＡＣＡＡＴＣＡＴＣＴＴＣＴＧＧＡＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＡＴＡＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡＧＴＧＣＴＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＴＴＣＴＡＡＡＣＣＴＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＴＴＡＡＴＴＴＧＣＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＧＧＧＡＣＣＴＧＣＴＡＣＡＧＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＡＣＡＣＡＡＴＡＴＴＡＧＡＡＴＡＣＣＴＡＧＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＡＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＴＡＡＴＡＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＡＧＡＣＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＴＧＴＴＴＣＴＴＧＧＣＣＴＡＡＡＴＴＴＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＡＣＡＡＡＴＴＴＧＣＴＴＴＣＡＴＣＴＡＡＴＣＴＴＴＣＴＴＧＧＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴＣＡＴＡＴＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＣＣＴＣＡＴＴＴＧＣＴＴＧＴＴＧＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＡＣＴＴＣＣＡＡＧＡＴＡＴＧＴＴＧＣＴＡＧＡＣＴＴＡＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＡＡＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＴＴＧＴＡＧＴＡＧＧＡＡＴＣＴＧＴＡＴＧＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＡＡＧＡＣＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＣＴＧＧＧＴＴＴＴＡＧＡＡＡＧＡＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧＡＧＴＴＧＧＡＣＴＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＴＴＧＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＧＡＡＧＧＧＣＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＴＧＴＣＴＴＧＣＡＴＴＴＴＣＴＴＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＣＴＡＡＡＴＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＴＡＣＴＡＡＴＴＴＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＣＴＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＣＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＧＡＴＧＧＧＧＡＴＡＴＴＣＴＣＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＡＴＧＴＴＡＴＴＧＧＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＡＣＡＣＴＴＣＣＴＣＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＧＴＴＴＴＧＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣＡＡＴＧＴＴＴＣＡＧＡＡＡＡＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＡＴＡＧＡＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＧＡＡＡＧＴＴＴＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＴＧＴＧＧＧＡＣＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＡＣＡＡＴＧＴＧＧＡＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＡＴＧＣＣＡＣＴＴＴＡＴＧＣＴＴＧＴＡＴＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＣＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＡＣＡＡＡＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＣＴＧＡＡＴＣＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＣＴＡＧＡＣＡＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＣＴＴＴＧＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＴＧＣＴＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＣＴＴＧＣＴＡＴＴＧＧＡＣＡＴＡＧＡＧＣＴＡＴＧＡＧＡＧＧＡＡＣＡＴＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＧＣＣＴＡＴＴＣＡＴＡＣＡＧＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＴＣＴＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＴＧＧＴＡＣＡＧＡＴＡＡＴＡＧＴＧＴＴＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＧＡＡＡＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＧＧＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴＡＡＴＴＧＧＡＴＴＣＴＴＡＧＡＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＴＴＡＡＴＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＴＡＴＡＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴＴＴＴＡＧＡＣＣＡＡＣＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＴＣＴＣＴＴＴＡＴＧＣＴＧＴＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＣＡＴＴＴＧＣＣＴＧＡＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＴＣＡＴＧＴＴＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＴＣＴＡＡＡＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＣＴＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＡＴＣＡＴＴＡＧＣＴＧＴＴＣＴＴＧＴＣＣＴＡＣＡＧＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴＴＧＴＣＴＴＧＧＡＴＧＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＡＴＣＣＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＧＡＧＣＴＡＧＴＧＴＴＧＡＡＴＴＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＣＣＣＴＴＣＴＡＴＴＣＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＣＴＧＴＡＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＡＡＴＣＴＣＣＴＧＡＡＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＡＴＡＣＡＧＣＡＣＴＴＡＧＡＣＡＡＧＣＴＡＴＴＣＴＴＴＧＴＴＧＧＧＧＡＧＡＡＣＴＴＡＴＧＡＡＴＣＴＴＧＣＴＡＣＡＴＧＧＧＴＴＧＧＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＧＧＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＴＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＧＧＡＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＧＡＣＡＡＣＴＧＣＴＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＣＴＣＴＴＧＴＣＴＴＡＣＡＴＴＴＧＧＴＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＣＴＴＴＴＧＧＣＧＴＴＴＧＧＡＴＴＡＧＡＡＣＡＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＡＴＡＧＡＣＣＴＣＣＴＡＡＴＧＣＴＣＣＴＡＴＴＴＴＧＴＣＴＡＣＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＣＡＡＣＡＧＴＣＧＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＧＴＣＣＴＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＴＣＡＡＴＣＡＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＴＣＡＡＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＣＴＴＧＡＧＧＧＴＴＧＴＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＡＴＣＡＴＡＡＡＴＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＧＡＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＧＴＴＴＴＧＣＴＴＣＴＴＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＴＴＴＧ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８．１  低ＧＣ含有型ＭＶＡ−ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ−Ｓ（ｓｈ）のヌクレオチド配列に関する説明：
８．１．１  Ｆ１１−Ｌ−隣接＝塩基１〜１０９７（配列番号３５）
８．１．２  ＳＩｉ−ＨＢＶ−ＰｒｅＳ−Ｐｍｕｔ−Ｃ＝塩基１０９８〜４８３８（配列番号５９）
８．１．３  転写ターミネーター配列＝塩基４８３９〜４８４５
ＴＴＴＴＴＧＴ
８．１．４  ｍＨ５プロモーター＝塩基４８４６〜４９４２（配列番号２８）
８．１．５  ＴＰＡ＝塩基４９４３〜５０３８（配列番号６０）
８．１．６  Ｓ（ｓｈ）＝塩基５０３９〜５９２０（配列番号６１）
８．１．７  Ｆ１１−Ｒ−隣接＝塩基５９２１〜７２３９（配列番号３６）
【０１５３】
野生型ＨＢＶポリメラーゼの配列を配列番号１９として記載する。
【０１５４】
ＣｈＡｄＯｘ１配列
ＣｈＡｄＯｘ１配列の５’から免疫原カセットまでを配列番号３９として記載する。ＣｈＡｄＯｘ１配列の３’から免疫原カセットまでを配列番号４０として記載する。
【０１５５】
ＣｈＡｄＯｘ２配列
ＣｈＡｄＯｘ２配列の５’から免疫原カセットまでを配列番号４１として記載する。ＣｈＡｄＯｘ２配列の３’から免疫原カセットまでを配列番号４２として記載する。
【０１５６】
ＭＶＡ配列
ＭＶＡ配列の５’から免疫原カセットまでを配列番号４４として記載する。ＭＶＡ配列の３’から免疫原カセットまでを配列番号４５として記載する。
【０１５７】
Ｔｅｔｒｏｎオペレーター配列を有するＣＭＶの長いプロモーターを配列番号５０として記載する。Ｔｅｔｒｏｎオペレーター配列を有するＣＭＶの短いプロモーターを配列番号５１として記載する。
【０１５８】
ＰｒｅＳ１配列（配列番号５２）：
ＭＧＧＷＳＳＫＰＲＱＧＭＧＴＮＬＳＶＰＮＰＬＧＦＦＰＤＨＱＬＤＰＡＦＧＡＮＳＮＮＰＤＷＤＦＮＰＮＫＤＨＷＰＥＡＮＱＶＧＡＧＡＦＧＰＧＦＴＰＰＨＧＧＬＬＧＷＳＰＱＡＱＧＩＬＴＴＶＰＡＡＰＰＰＡＳＴＮＲＱＳＧＲＱＰＴＰＩＳＰＰＬＲＤＳＨＰＱＡ
【０１５９】
ＰｒｅＳ２配列（配列番号５３）：
ＭＱＷＮＳＴＴＦＨＱＡＬＬＤＰＲＶＲＧＬＹＦＰＡＧＧＳＳＳＧＴＶＮＰＶＰＴＴＡＳＰＩＳＳＩＦＳＲＴＧＤＰＡＰＮ
【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１】
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【図１Ｂ−２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年12月18日(2019.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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