(57)【要約】  本発明は、迅速かつ簡便で高感度な分析対象物質の検出方法を提供することを目的とし、取り扱うサンプル量が微量の場合であっても、解析結果に定量性が担保される方法を提供することを目的とする。  本発明は、分析対象物質の検出方法において、標識された分析対象物質に由来する信号の強度測定を、当該信号の強度の増加中に経時的に行い、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用する、分析対象物質の検出方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象物質の検出方法において、
（１）標識された分析対象物質に由来する信号の強度の測定を、当該信号の強度が増加している間に経時的に行う工程；
（２）特定の信号の強度を、予め定めておいた値と比較する工程；
（３）当該特定の信号の強度が、当該予め定めておいた値に達した時に、当該値を有する当該信号の強度を用いて分析対象物質の定量を行う工程；
を含む分析対象物質の検出方法。
【請求項２】
分析対象物質の検出方法において、標識された分析対象物質に由来する信号の強度測定を、当該信号の強度の増加中に経時的に行い、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用する、分析対象物質の検出方法。
【請求項３】
前記の信号の強度測定の前に、下記工程：
（Ａ）標識された分析対象物質を含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された担体へ供給する工程；及び
（Ｂ）当該担体上に固相化されたプローブと、当該標識された分析対象物質とを結合させる工程；
を含む、請求項２に記載の分析対象の検出方法。
【請求項４】
前記の信号の強度測定の前に、下記工程：
ａ）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された担体へ供給する工程；
ｂ）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；及び
ｃ）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記担体と結合させる工程；
を行う、請求項２に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項５】
ａ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；
ｂ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｃ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；
ｄ’）前記多孔質担体上の前記活性化接合体Ｄの標識物質を定量する工程；
を含む分析対象物質の検出方法。
【請求項６】
ｅ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質の担体へ供給した後、当該試料溶液を、この多孔質担体の内外に駆動する工程；
ｆ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を、当該多孔質担体の内外に駆動し、前記工程e’）において担体上に固相化されたプローブと結合した前記接合体Ａと前記接合体Ｂを反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｇ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質からなる接合体Ｄを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を前記多孔質担体へ浸透させて、当該接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、活性化した当該接合体Ｄを前記多孔質担体と結合させる工程；
ｈ’）前記多孔質担体の上の前記接合体Ｄの標識物質を定量する工程；
を含む分析対象物質の検出方法。
【請求項７】
前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；a）からｃ）；ａ’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を、２０℃から７０℃の範囲内で行うことを特徴とする請求項１乃至６の何れか一項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項８】
前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；a）からｃ）；ａ’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を、２０℃から７０℃の範囲内で、かつ略同一温度で行うことを特徴とする請求項１乃至６の何れか一項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項９】
前記工程（Ｂ）の後、且つ信号の強度測定の前；前記工程ｃ）の後、且つ信号の強度測定の前；又は前記工程ｃ’）の後、且つ前記工程ｄ’）前；又は前記工程ｇ’）の後、且つ前記工程ｈ’）の前において、前記担体の洗浄工程を含むことを特徴とする請求項３乃至６の何れか一項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１０】
前記工程ｄ’）を前記工程ｃ’）の後に、任意の時間間隔で複数回行うことを特徴とする請求項５記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１１】
前記工程ｈ’）を前記工程ｇ’）の後に、任意の時間間隔で複数回行うことを特徴とする請求項６記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１２】
前記工程ｄ’）又はｈ’）において、測定した信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を用いて定量を行う、請求項１０又は１１に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１３】
下記工程a’)〜ｃ’)、又は下記工程e’)〜ｇ’）：
ａ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；
ｂ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ’）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｃ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；
ｅ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質の担体へ供給した後、当該試料溶液を、この多孔質担体の内外に駆動する工程；
ｆ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を、当該多孔質担体の内外に駆動し、前記工程e’）において担体上に固相化されたプローブと結合した前記接合体Ａと前記接合体Ｂを反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｇ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質からなる接合体Ｄを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を前記多孔質担体へ浸透させて、当該接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、活性化した当該接合体Ｄを前記多孔質担体と結合させる工程；
を含み；
更に、上記工程ｃ’）又はｇ’）の後に、下記の工程：
ｘ-１）前記多孔質担体上の特定スポット中の活性化接合体Ｄからの信号の強度のみを測定し、当該特定スポットからの信号の強度が、予め定めておいた信号の強度に到達したかを経時的に確認する工程；
ｘ-２）前記工程ｘ-１）において、当該予め定めておいた信号の強度に到達したことが確認された直後に、前記多孔質担体上のその他のスポット中の反応を停止して、当該その他のスポットからの信号の強度の測定を開始し、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を用いて定量する工程；
を含む、分析対象物質の検出方法。
【請求項１４】
前記工程ｘ−１）における前記特定スポットは、標準物質に対するプローブが固相化されたスポットである、請求項１３に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１５】
前記特定スポットが複数個からなり、一定比率の希釈系列で固相化量を調整したプローブがそれぞれのスポットに固相化されている、請求項１４に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１６】
前記洗浄工程で用いる洗浄液の量が、前記工程（Ｂ）、ｃ）、ｃ’）、又はｇ’）で用いる溶液の量より多い、請求項９記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１７】
前記分析対象物質が、核酸、糖、タンパク質、ペプチド、又はこれらの物質が修飾を受けた物質である、請求項１、２、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１８】
前記分析対象物質が核酸の場合に、当該分析対象物質の量が０．０１ｎｇ〜１．０μｇの範囲にある、請求項１７に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項１９】
前記酵素が、酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である、請求項４、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２０】
前記酵素の量が０．８pmol/ｍｌから６pmol/mlの範囲にある、請求項１９に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２１】
前記結合対が、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、リガンド−レセプターからなる群より選択される請求項４、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２２】
前記基質が置換フェノール又はホスホリル化置換フェノールである、請求項４、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２３】
前記酵素がペルオキシダーゼであり、濃度が０．００００８〜０．０００３％の過酸化水素存在下で前記工程ｃ）、ｃ’）、又はｇ’）を行う、請求項４、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２４】
前記試料溶液が界面活性剤を含む、請求項１、２、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２５】
前記洗浄工程において使用する洗浄溶液が界面活性剤を含む、請求項９に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２６】
前記多孔質担体の材質が金属酸化膜である請求項５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２７】
前記多孔質担体が、少なくともその一部に芳香族アミノ酸を含む化合物で、前処理されている、請求項５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２８】
前記分析対象物質が１又は２以上の種類からなり、各分析対象物質に対する１又は２以上の種類のプローブが、単一の反応容器内にある多孔質担体上のそれぞれ別個のスポットにおいて固相化されている、請求項１、２、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項２９】
前記分析対象が２以上であり、
前記標識物質からの信号の強度が所定の値の時の信号の強度を用いて、当該２以上の分析対象物質の定量値の比較を行う工程を更に含む、請求項１０又は１１に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項３０】
前記スポットにおけるプローブ固相化可能領域が２次元である場合には当該スポットの直径又は対角線の長さが、又は前記スポットにおけるプローブ固相化可能領域が３次元である場合には、担体のベース部と平行な、当該スポットの断面の直径又は対角線の長さが、５０乃至５００μｍの範囲にあり；
単一の担体上の前記スポットの数が、２０個以上である、
請求項１、２、５、６、又は１３の何れか１項に記載の分析対象物質の検出方法。
【請求項３１】
ＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルクからなる群より選択される少なくとも１種と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含むブロッキング剤；
酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む酵素製剤；
前記酵素製剤中の酵素に対する基質と、検出可能な標識物質とを含む接合体Ｄを含む基質含有剤；並びに
非イオン系界面活性剤と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む洗浄剤；
がそれぞれ別個の容器に含まれた、分析対象物質検出用試薬キット。
【請求項３２】
０．１％〜１０％の、ＢＳＡ、ゼラチン、及びスキムミルクからなる群より選択される少なくとも１種と、０．１Ｍから１ＭのＮａＣｌと、３ｍＭから６０ｍＭのリン酸ナトリウムとを含むブロッキング剤；
０．８ｐｍｏｌ/ｍｌ〜６ｐｍｏｌ/ｍｌのペルオキシダーゼと、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む酵素製剤；
前記酵素製剤中の酵素に対する基質と、検出可能な標識物質とを含む接合体Ｄを含む基質含有剤；
０．００００８％〜０．０００３％の過酸化水素を含む基質溶解用溶液；並びに
０．１％〜１％の非イオン系界面活性剤と、０．１Ｍ〜１ＭのＮａＣｌと、３ｍＭ〜６０ｍＭのリン酸ナトリウムとを含む洗浄液；
がそれぞれ別個の容器に含まれた、分析対象物質検出用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸等の分析対象物質を高感度で、簡易・迅速に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体中の微量物質を測定することで、病気の診断をする技術の開発が進んでいる。例えば、生体組織中の複数の遺伝子のmRNAの発現量変化や遺伝子の突然変異について解析するために、cDNAやオリゴ断片をプローブとしたマイクロアレイを用いて測定を行うことを特徴とする核酸のハイブリダイゼーション技術がある。また、生体組織や血清中のタンパク性分子の量を抗体やペプチドをプローブとしたプロテインアレイを用いて測定する技術が開発されている。【０００３】
上記方法を病気の診断をするための技術として確立するには、得られた微量のサンプルを使って、簡便、迅速、且つ正確な診断ができることが要求される。例えば、針生検で取得した数mgの組織、体液中の微量の細胞や、マイクロダイセクションで得られた数個の細胞からの微量mRNAやタンパクが、実際に簡便に測定できることが理想である。しかし、現状では、微量mRNAをT7-aRNA増幅法に数回かける方法によって微量の試料を増幅させ、これを核酸ハイブリダイゼーションによって検出することがなされている。この増幅工程用に、ハイブリダイゼーションに用いるRNAサンプルを調製する必要があるが、その調製には２〜４日間の煩雑な作業が必要であり、また高価な試薬を必要とする。また、微量サンプルを扱う実験系においては、微量サンプル自体を定量的に扱うことの困難性がある。即ち、微量サンプルを取り扱う場合には、サンプル量に対するその誤差の割合は、より多量のサンプルを取り扱う場合よりも顕著に大きいという事実があり、測定結果の定量性が、取り扱うサンプル量の多さ、少なさに大きく影響を受けてしまうという問題が内在している。更に、蛍光物質等の測定によりサンプルの定量を行う場合には、サンプル間でのサンプル量の差異（誤差等）に起因した発光度の差異が存在することがあるため、予め定めておいた蛍光物質の測定条件が、そのサンプル量のサンプルの測定に適切ではない条件となってしまうおそれがある。このような条件下においては、測定限界レベル未満、又は飽和レベル以上の発光度を測定することとなるサンプルが存在するおそれがあり、結果的に定量性をもって測定を行うことができないサンプルが生じてしまう。これは、一度に複数の試料を測定にかけることができるアレイシステムの利点を低減するものである。この問題は、間接標識により増感する方法や、酵素を用いて増感する方法では、増感反応の反応速度への影響が大きいことから、より顕著になる。【０００４】
ところで、核酸ハイブリダイゼーションにおいては、一般的に１本鎖の核酸プローブが、標識済サンプルにハイブリダイズされ、その結果得られた核酸二本鎖が検出される。タンパク質の検出には抗体やペプチドがプローブとして利用されている。従来、こうした核酸やタンパク質の検出には放射性標識および非放射性標識が使用されてきた。サンプルの放射性標識は、感度は良好であるが、使用できる施設が限られており、また危険を伴うため現在主流ではない。非放射性標識としては、例えば蛍光物質での標識が一般的である。【０００５】
核酸の標識方法自体には、大きく分けて直接標識と間接標識がある。直接標識法としては、標識された核酸をサンプルの増幅時に取り込ませる方法が多く用いられている。非放射性標識のうち、たとえば、蛍光物質の直接標識は感度が十分でなく、更にバックグラウンドのノイズが相対的に高いため、弱いシグナルを発するスポットの解析が影響されることが多かった。このため低発現の遺伝子については解析するのが難しく、よって一回にハイブリダイゼーションに用いるサンプル量が大量に必要となるため、多量のTotalRNAから合成したｃDNAを用いるか、複数日かけて増幅させたT7-aRNAをサンプルとしているのが実情である。これを解決するために間接標識が開発されている。【０００６】
開発された間接標識を用いる方法においては、サンプルにコンジュゲートした物質に特異的に結合する物質（例えば、ビオチン-アビジン系）や、当該コンジュゲートした物質に対する抗体に蛍光物質をつけて検出感度を増幅させている。またこれら特異的に結合する物質や抗体に酵素をつけて、酵素の基質を活性化すること（例えば、HRP酵素と発光基質ECLなど）によって検出感度を増幅する方法もとられている。【０００７】
間接標識法の例として、特許文献１（特許第２９４８９０４号公報）に記載された方法は、検出系を高感度化するために開発された方法であるが、この方法においては被検出物質の標識と特異的に結合するように修飾された酵素が用いられている。検出可能に修飾された基質を、当該酵素が活性化することによって、その活性化された基質に対するレセプターが固定化されているところではどこでも当該活性化された基質が沈着するため、沈着した基質の修飾物質の検出シグナルが増幅されることになり、よって検体中の被分析物質の検出または定量性が向上する。この方法を応用した例として、スライドガラスにｃDNAプローブを用いたマイクロアレイの検出に、パーキンエルマー社より市販されているチラミドシグナル増幅キットを用いた方法が報告されている（非特許文献１）。チラミド化合物は、過酸化水素の存在下において、ホースラディッシュペルオキシターゼの触媒作用によりラジカル化され、その近傍にある芳香族アミノ酸に共有結合で結びつく。チラミドシグナル増幅キットはこの性質を利用し、チラミド化合物に検出可能な修飾物質（例えば、蛍光物質）をつけることで、高感度な検出を行うことを目的としている。【０００８】
しかしながら、スライドガラスアレイを用いて前記の方法により核酸のハイブリダイゼーション検出を行う場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄、ブロッキング、酵素接合体の付加反応、洗浄、基質の沈着反応のすべての工程を別々の容器に入れて行わねばならず、更には一つの反応あたり数時間を要する。従ってハイブリダイゼーションから検出までに２〜３日かかるという、煩雑で手間のかかる作業となる。また、スライドガラスアレイ上にはレポーター（標識）に対するレセプターとしての芳香族アミノ酸が存在していないため、レセプターを予めアレイ表面に付加させる工程も必要になる。この表面付加工程は、一般的にタンパク性物質（ＢＳＡ、ゼラチンなど）によるコートによって行われる。また、平面であるスライドガラスアレイでは表面積が小さいため付加できるレセプター数が少なく、高発現の遺伝子と低発現の遺伝子を同時に測定した場合、比較的高発現の測定対象範囲でチラミド化合物が結合するレセプターが不足するという問題もある。【０００９】
核酸ハイブリダイゼーションのための、1本鎖プローブを固定する担体には、中空糸；中空糸＋ゲル；アルミニウム酸化膜；シリコンウェハーのエッチング物；ガラスファイバーなどを素材とした、液体を保持でき表面積の大きな基材、若しくは、ナイロン、ニトロセルロース、または樹脂を材料としたフィルター、又は、ゲルマトリックス、特許文献２（特許第３２０８３９０号公報）に記載の金属酸化膜などを利用した三次元多孔質担体がある。これらは、担体中で液体を保持できる上、内部で液体を駆動することができ、表面積が大きいことが特徴である。従って多孔質担体は通常プローブの固相化に用いられるスライドグラスに比べて、プローブの固相化量が多くなり、結果として検出感度および検出可能範囲が増すことが知られている。【００１０】
しかしながら、上記の種々の多孔質担体、例えば金属酸化膜を、プローブを固相化する担体として用いた場合の核酸ハイブリダイゼーション実験では、サンプル溶液内外のゴミが担体の孔に引っかかりやすいという問題もある。
【特許文献１】特許第２９４８９０４号公報
【特許文献２】特許第３２０８３９０号公報
【非特許文献１】カーステンら（Karsten et. al.,）、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research）、（英国）、2002年、第30巻、第2号E4
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
そこで、本発明は、迅速かつ簡便で高感度な分析対象物質の検出方法を提供することを目的とし、更には取り扱うサンプル量が微量の場合であっても、解析結果に定量性が担保される方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、分析対象物質の検出方法であって、分析対象物質と直接的又は間接的に結びついた酵素により活性化された基質を担体に沈着させる方法において、前記基質に対する外来受容基付加の前処理の工程を省略することにより、迅速、簡便で、かつ高感度に、ハイブリダイズされた核酸等の分析対象物質を検出できることを見出すことに成功し、本発明を完成するに至った。また、試料中に含まれる標準物質（遺伝子、タンパク質等）の量を定量し、その結果に基づいて各サンプルの測定時間等の測定条件や反応条件を適切に調節することにより、微量サンプル間に存在する試料の量における差異に基づくシグナル測定結果の差異を効果的に補正できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１３】
すなわち本発明の第１の発明は、分析対象物質の検出方法において、
（１）標識された分析対象物質に由来する信号の強度の測定を、当該信号の強度が増加している間に経時的に行う工程；（２）特定の信号の強度を、予め定めておいた値と比較する工程；（３）当該特定の信号の強度が、当該予め定めておいた値に達した時に、当該値を有する当該信号の強度を用いて分析対象物質の定量を行う工程；を含む分析対象物質の検出方法である。ここで、分析対象物質の標識は、直接的に標識したもの、又は間接的に標識したものとすることができる。【００１４】
本発明の第２の発明は、分析対象物質の検出方法において、標識された分析対象物質に由来する信号の強度測定を、当該信号の強度の増加中に経時的に行い、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用する、分析対象物質の検出方法である。【００１５】
本発明の第３の発明は、前記の信号の強度測定の前に、下記工程：（Ａ）標識された分析対象物質を含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された担体へ供給する工程；及び（Ｂ）当該担体上に固相化されたプローブと、当該標識された分析対象物質とを結合させる工程；を含む、第２の発明に記載の分析対象の検出方法である。【００１６】
本発明の第４の発明は、前記の信号の強度測定の前に、下記工程：ａ）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された担体へ供給する工程；ｂ）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；及びｃ）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記担体と結合させる工程；を行う、第２の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００１７】
本発明の第５の発明は、ａ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；ｂ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；ｃ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；ｄ’）前記多孔質担体上の前記活性化接合体Ｄの標識物質を定量する工程；を含む分析対象物質の検出方法である。【００１８】
本発明の第６の発明は、ｅ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質の担体へ供給した後、当該試料溶液を、この多孔質担体の内外に駆動する工程；ｆ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を、当該多孔質担体の内外に駆動し、前記工程e’）において担体上に固相化されたプローブと結合した前記接合体Ａと前記接合体Ｂを反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；ｇ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質からなる接合体Ｄを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を前記多孔質担体へ浸透させて、当該接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、活性化した当該接合体Ｄを前記多孔質担体と結合させる工程；ｈ’）前記多孔質担体の上の前記接合体Ｄの標識物質を定量する工程；を含む分析対象物質の検出方法である。【００１９】
なお、この第６の発明においては、前記基質に対する外来受容基付加の前処理を行うことにより、活性化した基質を外来受容基と結合させてもよいし、この外来受容基付加の前処理を行わずに、当該活性化した基質を担体に直接結合させてもよい。【００２０】
本発明の第７の発明は、前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；a）からｃ）；ａ’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を、２０℃から７０℃の範囲内で行うことを特徴とする第１乃至第６の発明の何れか一つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００２１】
本発明の第８の発明は、前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；a）からｃ）；ａ’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を、２０℃から７０℃の範囲内で、かつ略同一温度で行うことを特徴とする第１乃至６の発明の何れか一つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００２２】
本発明の第９の発明は、前記工程（Ｂ）の後、且つ信号の強度測定の前；前記工程ｃ）の後、且つ信号の強度測定の前；又は前記工程ｃ’）の後、且つ前記工程ｄ’）前；又は前記工程ｇ’）の後、且つ前記工程ｈ’）の前において、前記担体の洗浄工程を含むことを特徴とする第３乃至第６の発明の何れか一つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００２３】
本発明の第１０の発明は、前記工程ｄ’）を前記工程ｃ’）の後に、任意の時間間隔で複数回行うことを特徴とする請求項５記載の分析対象物質の検出方法である。【００２４】
本発明の第１１の発明は、前記工程ｈ’）を前記工程ｇ’）の後に、任意の時間間隔で複数回行うことを特徴とする第６の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００２５】
本発明の第１２の発明は、前記工程ｄ’）又はｈ’）において、測定した信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を用いて定量を行う、第１０又は第１１の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００２６】
本発明の第１３の発明は、下記工程a’)〜ｃ’)、又は下記工程e’)〜ｇ’）：ａ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；ｂ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ’）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；ｃ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；ｅ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質の担体へ供給した後、当該試料溶液を、この多孔質担体の内外に駆動する工程；ｆ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を、当該多孔質担体の内外に駆動し、前記工程e’）において担体上に固相化されたプローブと結合した前記接合体Ａと前記接合体Ｂを反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；ｇ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質からなる接合体Ｄを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を前記多孔質担体へ浸透させて、当該接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、活性化した当該接合体Ｄを前記多孔質担体と結合させる工程；を含み；更に、上記工程ｃ’）又はｇ’）の後に、下記の工程：ｘ-１）前記多孔質担体上の特定スポット中の活性化接合体Ｄからの信号の強度のみを測定し、当該特定スポットからの信号の強度が、予め定めておいた信号の強度に到達したかを経時的に確認する工程；ｘ-２）前記工程ｘ-１）において、当該予め定めておいた信号の強度に到達したことが確認された直後に、前記多孔質担体上のその他のスポット中の反応を停止して、当該その他のスポットからの信号の強度の測定を開始し、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を用いて定量する工程；を含む、分析対象物質の検出方法である。【００２７】
本発明の第１４の発明は、前記工程ｘ−１）における前記特定スポットは、標準物質に対するプローブが固相化されたスポットである、第１３の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００２８】
本発明の第１５の発明は、前記特定スポットが複数個からなり、一定比率の希釈系列で固相化量を調整したプローブがそれぞれのスポットに固相化されている、第１４の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００２９】
本発明の第１６の発明は、前記洗浄工程で用いる洗浄液の量が、前記工程（Ｂ）、ｃ）、ｃ’）、又はｇ’）で用いる溶液の量より多い、第９の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００３０】
本発明の第１７の発明は、前記分析対象物質が、核酸、糖、タンパク質、ペプチド、又はこれらの物質が修飾を受けた物質である、第１、第２、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３１】
本発明の第１８の発明は、前記分析対象物質が核酸の場合に、当該分析対象物質の量が０．０１ｎｇ〜１．０μｇの範囲にある、第１７の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００３２】
本発明の第１９の発明は、前記酵素が、酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素である、第４、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３３】
本発明の第２０の発明は、前記酵素の量が０．８pmol/ｍｌから６pmol/mlの範囲にある、第１９の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００３４】
本発明の第２１の発明は、前記結合対が、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、リガンド−レセプターからなる群より選択される第４、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３５】
本発明の第２２の発明は、前記基質が置換フェノール又はホスホリル化置換フェノールである、第４、第５、第６、又は第１３の発明何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３６】
本発明の第２３の発明は、前記酵素がペルオキシダーゼであり、濃度が０．００００８〜０．０００３％の過酸化水素存在下で前記工程ｃ）、ｃ’）、又はｇ’）を行う、第４、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３７】
本発明の第２４の発明は、前記試料溶液が界面活性剤を含む、第１、第２、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００３８】
本発明の第２５の発明は、前記洗浄工程において使用する洗浄溶液が界面活性剤を含む、第９に記載の分析対象物質の検出方法である。【００３９】
本発明の第２６の発明は、前記多孔質担体の材質が金属酸化膜である第５、第６、又は第１３の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００４０】
本発明の第２７の発明は、前記多孔質担体が、少なくともその一部に芳香族アミノ酸を含む化合物で、前処理されている、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００４１】
本発明の第２８の発明は、前記分析対象物質が１又は２以上の種類からなり、各分析対象物質に対する１又は２以上の種類のプローブが、単一の反応容器内にある多孔質担体上のそれぞれ別個のスポットにおいて固相化されている、第１、第２、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００４２】
本発明の第２９の発明は、前記分析対象が２以上であり、前記標識物質からの信号の強度が所定の値の時の信号の強度を用いて、当該２以上の分析対象物質の定量値の比較を行う工程を更に含む、第１０又は第１１の発明に記載の分析対象物質の検出方法である。【００４３】
本発明の第３０の発明は、前記スポットにおけるプローブ固相化可能領域が２次元である場合には当該スポットの直径又は対角線の長さが、又は前記スポットにおけるプローブ固相化可能領域が３次元である場合には、担体のベース部と平行な、当該スポットの断面の直径又は対角線の長さが、５０乃至５００μｍの範囲にあり；単一の担体上の前記スポットの数が、２０個以上である第１、第２、第５、第６、又は第１３の発明の何れか１つに記載の分析対象物質の検出方法である。【００４４】
本発明の第３１の発明は、ＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルクからなる群より選択される少なくとも１種と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含むブロッキング剤；酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む酵素製剤；前記酵素製剤中の酵素に対する基質と、検出可能な標識物質とを含む接合体Ｄを含む基質含有剤；並びに非イオン系界面活性剤と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む洗浄剤；がそれぞれ別個の容器に含まれた、分析対象物質検出用試薬キットである。【００４５】
本発明の第３２の発明は、０．１％〜１０％の、ＢＳＡ、ゼラチン、及びスキムミルクからなる群より選択される少なくとも１種と、０．１Ｍから１ＭのＮａＣｌと、３ｍＭから６０ｍＭのリン酸ナトリウムとを含むブロッキング剤；０．８ｐｍｏｌ/ｍｌ〜６ｐｍｏｌ/ｍｌのペルオキシダーゼと、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む酵素製剤；前記酵素製剤中の酵素に対する基質と、検出可能な標識物質とを含む接合体Ｄを含む基質含有剤；０．００００８％〜０．０００３％の過酸化水素を含む基質溶解用溶液；並びに０．１％〜１％の非イオン系界面活性剤と、０．１Ｍ〜１ＭのＮａＣｌと、３ｍＭ〜６０ｍＭのリン酸ナトリウムとを含む洗浄液；がそれぞれ別個の容器に含まれた、分析対象物質検出用試薬キットである。
【発明の効果】
【００４６】
本発明の方法を用いることにより、検出スポットの信号の強度が大幅に向上し、従来法では検出できなかった低発現の遺伝子群等の分析対象物質も検出できるようになる。更に、低発現の生体関連物質から、高発現の生体関連物質まで、発現レベルの高低に関わらず高精度に、定量的に検出できるようになる。【００４７】
また、検出感度が向上することにより、ハイブリダイゼーションに用いる核酸等の試料の量が少ない場合でも信号の正確な検出が可能になる。更に、得られるサンプル量が極少量である場合、例えば臨床検体よりマイクロダイセクションで採取した微量の細胞、または生体よりバイオプシーにより採取された組織、特に、ファインニードルアスピレーションバイオプシーにより採取された組織からの微量の核酸やタンパク質などの分析対象物質（例えばＲＮＡやＤＮＡ等の核酸の場合は、０．１ｎｇ〜）を取り扱う場合であっても、定量性を担保した検出が可能になり、マイクロアレイの応用範囲が臨床研究から診断へと広くなることが期待できる。【００４８】
従来法ではアレイ表面のゴミや、アレイ表面のむらなどが解析画像に写る場合があり、シグナルの解析時に画像上のゴミの除去補正やバックグラウンド値の補正が必要であったが、本発明の方法、特に試料溶液を多孔質担体へ供給した後に当該溶液を担体の内外に駆動する方法を用いることにより、検出までの露光時間が大幅に短縮できるため、アレイ表面のゴミ、むらが画像に影響しなくなり、画像解析に要する手間が短縮できる。【００４９】
さらにバックグラウンド値がほぼ均一なため、シグナルスポットの解析データの信頼性が増す。そのため、サンプル調製時にゴミの排除のためにフィルター処理を行うことや、チップにのせる各溶液をフィルター処理する必要がなくなる。また、これまではアレイ生産中に一定以上のゴミやむらのあるアレイを排除していたが、これらのものが本発明により解析に使えるようになるため、アレイ生産の歩止まりがよくなり生産効率が向上するという付加的効果が得られる。【００５０】
本発明の方法を用いることにより、従来法のガラスアレイでは長時間の煩雑な作業が必要であったものが、すべての工程を同一チャンバー内で行うことが可能な、簡便な作業ですむこととなり、しかも、溶液を担体内外に駆動する場合には、更に反応が短時間で進むため、全工程を更に短時間で処理できるようになる。【００５１】
本発明の方法においては、各工程を温度管理された同一チャンバー内で行うことにより、温度による反応強度を実験毎に管理することができ、再現性のよいデータを得ることが可能になる。また、同一チャンバー内で行うことにより、工程から工程に移る間に起こる温度変化の影響を最小限にし、また、別チャンバーに移すといった煩雑な作業が必要なく、簡便で迅速な実験ができるようになる。【００５２】
本発明の方法において、多孔質担体上の特定スポットの信号強度をモニターし、その信号強度が所定の値に達したときに他のスポット上での反応を停止して信号強度を測定する場合、当該他のスポットにおける接合体Ｃと接合体Ｄとの反応時間、及び接合体Ｄ中の基質が活性化されたものと多孔質担体との反応時間が、間接的に制御されることとなる。そのため、検出にかける分析対象物質の量が正確に測定できない場合であっても、当該他のスポットのより多くにおいて、検出限界レベル以上、飽和レベル未満の範囲内での測定を可能にすることができる。即ち、（内部標準物質に対するプローブ等が固相化された）特定スポットの信号強度がどの程度であれば、当該他のスポットのより多くにおいて当該検出範囲内での測定が可能であるかは、分析対象物質と内部標準物質との量比等を考慮し、どの程度のサンプル量、反応時間とすればよいかを予備実験で設定することが可能である。【００５３】
従って、この方法によれば、検出にかけるサンプルの量が正確でなくても、特定スポットにおける信号強度をモニターし、所定の値に当該信号強度が達したときにその他のスポットの反応を停止し、信号強度変化率が一定範囲内にあるときに当該その他のスポットにおける信号強度を測定すれば、各スポット間における測定結果に定量性を確保することが可能になる。【００５４】
本発明の分析対象物質検出用試薬キットを用いることにより、高感度な検出を簡便に行うことが可能になる。【００５５】
1.本発明の分析対象物質の検出方法においては、標識された分析対象物質からの信号の強度の測定を経時的に行い、尚且つ（i）、特定の信号の強度を予め定めておいた値と比較して、当該値に達したときの値を有する信号の強度を用いるか、又は（ii）当該信号の強度を時間の関数で表し、その測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用している。そのため、信号の強度が定量性をもって測定するのに適切な値にあるか、又は測定時間と測定信号の強度とが比例する関係にあるのか（即ち信号の強度が略線形に増大しているのか）を確認することが可能であり、最適の測定条件下での測定値を定量に使用することが可能である。従って、信号の強度が極度に小さい場合や、信号強度が測定系において飽和しつつある場合のデータを用いることなく定量をより正確に行うことが可能となる。【００５６】
２.本発明では、検出可能に標識された基質が、分析対象物質、及び結合対を含んだ接合体（接合体C）中の酵素によって活性化され、分析対象物質を捕獲（分析対象物質が核酸の場合にはハイブリダイズ）しているプローブ近傍の担体表面と反応する。検出可能に標識された基質は、特に、担体表面に付加された受容基（外来受容基）、又は基板表面のＯＨ基と反応して化学的な結合が生成する（沈着反応）。従って、基質と結合している検出可能な標識を測定することで、捕獲された分析対象物質の量を測定することができる。このように、担体と化学的に結合した標識を検出しているので、信号の強度の測定を行う工程の前に担体を洗浄する洗浄工程を導入しても、標識は容易に剥がれることはなく、反応していない物質は容易に除去できる。従って、信号を発する物質を担体から損なうことなくノイズの原因物質の除去を行うことができる。従ってシグナル-ノイズ比が上昇する。また、当該洗浄工程において、洗浄液をその前の各工程で使用した溶液の容量を越える量で使用し、尚且つ、洗浄液を担体に往復に通過させることで、未反応物質が担体からより迅速にかつきれいに洗浄されやすくなる。更には、各種反応を行う各スポットの側面についた反応液面よりもさらに高い位置に洗浄液面がくるため、バックグラウンド値の影響の出やすいスポット側面の洗い残しがなくなり、よりバックグラウンド値の低いデータを得ることができるものとなっている。前記の基質の化学的結合を沈着とよぶが、沈着による増感方法を用いることにより、担体に捕獲された分析対象物質あたりの検出可能な標識物質の量が、分析対象物質に直接検出可能な標識をする場合にくらべて大幅に増加するため、ハイブリダイズする量の少ない低発現の遺伝子でも、その分析対象物質あたりの検出可能な標識物質の量が増えることから検出可能になる。【００５７】
３．本発明ではプローブを固相化する担体に実質的に液体を保持できる担体として三次元多孔質担体を用いることができる。例えば、アルミニウムの陽極酸化膜を担体に用いると、平面であるガラスアレイと比較して500倍程度表面積が大きくなっている。従って、プローブのみならず検出系に用いる沈着物質がより多く付着することができるため、従来のガラスアレイを用いる場合と比較して、シグナルの増強の割合が大きい。また、三次元多孔質担体は奥行きがあり、上部から検出を行った場合、縦方向のシグナル強度が重なるためその効果もシグナル増強に働いている。【００５８】
４．本発明では、プローブを固相化する担体を多孔質とした場合、液体が通過可能である。このため、固相化されたプローブと結合した接合体Ａに接合体Ｂを結合させ、接合体Ｃを形成する反応は、結合対の一方の物質と特異的に結合する物質（結合対のもう一方の物質）および酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を往復に通過させながら反応を行うことが可能である。そのため、反応液量が少なくてよく、また、プローブと分析対象物質、固相化されたプローブに結合した接合体Ａと接合体Ｂが接触する回数が増えるため、前記反応を簡便且つ迅速に行うことが可能である。【００５９】
５．本発明では、実質的に液体を保持できる担体に基質を浸透させたのちこれを静置し、接合体Ａと接合体Ｂとの反応、接合体Ｃと接合体Ｄとの反応、そして酵素により活性化された基質と担体表面との反応を行うと、担体上には核酸プローブが数多く固相化され、これに数多くの分析対象物質がハイブリダイズし、従って接合体Ｄ中の酵素と基質との接触頻度が高くなる。従って、担体に対する基質の沈着反応を、分析対象物質が結合した核酸プローブ周辺で集中的に生じさせることができ、よって本発明の方法の検出感度が増大する。【００６０】
６．本発明では、CCDカメラで検出を行う場合、露光時間が短くても十分にシグナルを得ることが可能なため、サンプル中のゴミ、担体中のゴミやむらのノイズを非常に小さくすることができる。したがってサンプル調製の際に、サンプルや試薬のゴミを除く作業を行う必要がなくなり、また、むらやゴミのある担体も使用可能となる。【００６１】
７．本発明では、標識物質を測定する工程において、多孔質担体上の特定スポット中の活性化接合体Ｄからの信号の強度が、予め定めておいた信号の強度に到達したかを経時的に確認して、一定の信号の強度に到達したことを確認した直後にその他のスポット中の活性化接合体Ｄからの信号の強度を定量する。この場合、当該特定スポットに標準物質に対するプローブを固相化しておけば、その標準物質と一定の比率で存在する分析対象物質については、検出限界以上、飽和レベル未満の範囲内で測定できることが期待される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６２】
本発明の分析対象物質の検出方法は、
（１）標識された分析対象物質に由来する信号の強度の測定を、当該信号の強度が増加している間に経時的に行う工程；
（２）特定の信号の強度を、予め定めておいた値と比較する工程；
（３）当該特定の信号の強度が、当該予め定めておいた値に達した時に、当該値を有する当該信号の強度を用いて分析対象物質の定量を行う工程；
を含むことを特徴としている。【００６３】
ここで、測定（定量）を行う「信号」とは、分光学的性質を有するものであり、具体的には蛍光、吸光、発色の何れとすることができる。
また「信号の強度が増加している間」とは、検出可能に標識された分析対象物質と、分析対象物質に特異的に結合するプローブとの間の反応を進行させている場合（分析対象物質を直接標識した場合）を含む。【００６４】
更には、分析対象物質と、分析対象物質に結合させた物質に対して特異的に結合し、且つ酵素を含んだ接合体（下記の接合体Ｂ）との結合の後に、当該酵素が触媒する基質の変換反応により当該変換された基質に由来する信号の強度が増加する場合（分析対象物質を間接的に標識した場合）を含んでいる。【００６５】
このように信号の強度が増加している間に、特定信号の強度を、予め定めておいた値と比較し、当該値に達した時に当該信号の強度を用いて定量を行う。ここで「予め定めておいた値」とは、検出限界以上の値であって、信号強度が使用する検出系において略飽和していると考えられる値未満の範囲である。好ましくは、信号の強度の時間変化についての関数において、測定した時点における近似直線の傾きが略一定の時の値（信号の強度）である。より好ましくは、測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の値である。【００６６】
従って本発明の分析対象物質の検出方法は、
分析対象物質の検出方法において、標識された分析対象物質に由来する信号の強度測定を、当該信号の強度の増加中に経時的に行い、当該信号の強度を時間の関数で表し、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用することを特徴としている。【００６７】
本発明の分析対象物質の検出方法は、また、前記の信号の強度測定の前に、下記工程：
（Ａ）標識された分析対象物質を含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された担体へ供給する工程；及び
（Ｂ）当該担体上に固相化されたプローブと、当該標識された分析対象物質とを結合させる工程；
を含むことを特徴としている。【００６８】
本発明の分析対象物質検出方法は更には、前記の測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度の定量値を利用する分析対象物質の検出方法において、
ａ）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；
ｂ）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｃ）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、この活性化接合体Ｄを前記基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；
ｄ）前記多孔質担体上の前記活性化接合体Ｄの標識物質を定量する工程；
を含むことを特徴としている。【００６９】
上記工程a）〜ｃ）を経ることにより、まず、分析対象物質を含む接合体Ａと、当該接合体Ａ中に含まれる結合対の一方の物質を介して結合し、且つ酵素を含む接合体Ｂとが反応する。これにより大きな接合体Ｃが、担体上にプローブを介して形成される。次にこの接合体Ｃに対して、当該酵素の基質を標識したものを反応させる。酵素-基質反応を起こさせることにより活性化された基質を、担体表面と結合させる。このような酵素反応により、分析対象物質の量に比例して増幅された標識を担体表面に形成させ、これを次の定量（測定）工程により定量（測定）することにより、より増感した検出方法を提供することが可能になる。【００７０】
これら本発明の分析対象物質の検出方法の実施に先立ち、担体にはプローブを固相化しておく。固相化の方法は、プローブと担体との組合せについて当該技術分野で既知のものであれば特に限定する必要はない。しかし、工程a）におけるプローブと分析対象物質との間の反応が阻害されないような形態でプローブが担体に固相化させる方法を採用することが望ましい。使用するプローブとしては、分析対象物質を特異的に捕獲することができるものを利用する。分析対象物質が核酸の場合には、少なくともその一部に対して相補的な配列を有する核酸分子をプローブとする。分析対象物質がタンパク質やペプチドの場合には、それらを特異的に認識して結合することが可能な抗体、当該タンパク質やペプチドが触媒する酵素反応の基質、当該タンパク質やペプチドと特異的に結合する細胞、あるいは当該タンパク質やペプチドに対する抗体を外殻に発現しているファージなどをプローブとする。分析対象物質が既知のリガンド-レセプターの関係にある物質の組合せの何れかである場合には、レセプター又はリガンドをプローブとすることができる。このようにプローブとの間に特異的な結合関係を構築できる分析対象物質としては、核酸、糖、タンパク質、ペプチド、及びこれらの物資が種々の修飾を受けた物質（リン酸化されたタンパク質）等を挙げることができる。【００７１】
分析対象物質の量としては、担体に固相化されたプローブの量を考慮して当業者らの通常有する知識に基づき決定することもできるし、一方、分析対象物質の量が極少量である場合には、その量に見合った量のプローブを固相化することもできる。分析対象物質が核酸である場合には、例えば０．０１から１．０μｇの範囲であれば好ましいが、本発明の方法においては、検出感度が従来のものと比較して顕著に向上しているため、０．０１ｎｇ以上であればよい。【００７２】
本発明において利用する担体は、上記した沈着反応に適し、且つ表面積が大きければどのような材料のものでも使用することが可能である。好ましい担体の例としては、実質的に液体を保持でき、担体中で液体を動かすことができるもの、多孔質のものを挙げることができる。例えば、中空糸、中空糸＋ゲル、アルミニウム酸化膜、シリコンウェハーのエッチング物、ガラスファイバー、複数のガラスや樹脂のビーズを容器に保持したものなどがある。三次元多孔質担体としては、ナイロン、ニトロセルロース、若しくは樹脂を材料としたフィルター、又は、ゲルマトリックス、金属酸化膜がある。本発明での三次元多孔質担体としては、好ましくは、特許文献２（特許第３２０８３９０号）に記載の、電気化学的に製造される金属酸化膜を用いる。これらの好ましい条件を満たす担体の利用方法としては、マイクロアレイを用いることができる。【００７３】
例えばこのマイクロアレイを分析対象物質の検出に用いる場合、上記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含むハイブリダイゼーション工程によってアレイ基板上の任意のプローブスポットに結合した、検出可能に（直接的に）標識されている核酸等の試料からの信号の強度を経時的に測定することができる。そして、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を用いる。この範囲内ではハイブリダイゼーション反応が飽和していないと考えられる。従って、各プローブスポットでの測定を当該範囲内で行うことにより、各スポットの定量性が向上する。また、アレイ基板上の任意のプローブスポットに結合している核酸等の試料を、結合対を介して酵素と結合させた後、当該酵素による基質の変換反応からの信号の強度を経時的に測定する。そして、当該測定した信号の強度における近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５〜１．５倍の範囲内にあるときの信号強度を用いて、各プローブスポットでの酵素反応が飽和しない場合の反応直線の傾きを算出する。このような範囲内で測定を行うことにより、分析対象物質を間接的に標識する場合の定量性が向上する。【００７４】
本発明において使用することができる多孔質担体は、１又は２以上の分析対象物質の検出を可能にするため、各分析対象物質に対する１又は２以上の種類のプローブが、単一の反応容器内にある多孔質担体上のそれぞれ別個のスポットにおいて固相化されている。本発明の検出方法において使用される担体は一般に、複数の試料について同時に測定できるよう、複数のプローブ固相化スポットを有していて、それぞれのスポットには、別個の分析対象物質を捕獲するためのプローブが固相化されている。しかしながら、本発明の検出方法において使用する担体は、
・一種類の分析対象物質に対する一種類のプローブのみが一箇所のスポットに固相化されたものとすること、
・  一種類の分析対象物質に対する一種類のプローブが複数のスポットに固相化されたものとすること、
・一種類の分析対象物質に対する二種類以上のプローブをそれぞれの種類ごとに別個のスポットに固相化されたものとすることや、或いは
・  一種類の分析対象物質に対する二種類以上のプローブをそれぞれの種類ごとに複数個のスポットに固相化されたものとすること
も可能である。このような形態の担体は、特定目的のための専用担体として供することが可能である。【００７５】
本発明の検出方法において使用する多孔質担体が、プローブを固相化する各スポットにおいて、２次元のプローブ固相化可能領域を有する場合には、当該スポットの径（直径又は対角線の長さ）は、５０乃至５００μｍの範囲にあり、又は当該プローブ固相化可能領域が３次元である場合には、担体のベース部と平行な、当該スポットの断面の径（直径又は対角線の長さ）は、５０乃至５００μｍの範囲にあることが好ましい。多孔質担体は更には、1つの担体あたりスポットの数が２０個以上とすることができる。【００７６】
このように上記スポット（２次元の場合）の直径又は対角線の長さが、又はその断面（３次元の場合）の直径又は対角線の長さが５０乃至５００μｍの範囲にあると、担体上において直径又は対角線の長さが４ｍｍ程度の領域に、約２０乃至４００種類ものプローブを固相化することができる。更に、各スポットに供給すべき試料の体積は極少量で済む。従って、分析対象物質が極少量しか入手できない場合であっても、異なるプローブを利用した検出を同時且つ効率的に行うことが可能である。【００７７】
本発明の分析対象物質の検出方法は、また
ａ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質担体へ供給する工程；
ｂ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素を含む接合体Ｂを、前記工程ａ）において担体上に固相化されたプローブと結合した接合体Ａと反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｃ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄ中の基質を活性化し、この活性化された基質を有する活性化接合体Ｄを当該基質に対する外来受容基付加の前処理を行わずに、前記多孔質担体と結合させる工程；
ｄ’）前記多孔質担体上の前記活性化接合体Ｄの標識物質を定量する工程；
を含むことを特徴とする。【００７８】
本発明の分析対象物質の検出方法においては、担体に多孔質のものを利用することが可能であるため、その場合には各工程において担体の内外に溶液を駆動することも可能である。即ち、本発明の分析対象物質の検出方法は、
ｅ’）結合対の一方の物質及び分析対象物質を含む接合体Ａを含む試料溶液を、当該分析対象物質に対するプローブが固相化された多孔質の担体へ供給した後、当該試料溶液を、この多孔質担体の内外に駆動する工程；
ｆ’）前記結合対の一方の物質と特異的に結合する物質及び酵素からなる接合体Ｂを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を、当該多孔質担体の内外に駆動し、前記工程e’）において担体上に固相化されたプローブと結合した前記接合体Ａと前記接合体Ｂを反応させて、当該接合体Ａ及び当該接合体Ｂからなる接合体Ｃを形成させる工程；
ｇ’）前記接合体Ｂ中の酵素に対する基質及び検出可能な標識物質からなる接合体Ｄを含む溶液を前記多孔質担体へ供給した後、当該溶液を前記多孔質担体へ浸透させて、当該接合体Ｄを前記接合体Ｃに反応させ、当該接合体Ｄの基質を活性化し、活性化した当該接合体Ｄを前記多孔質担体と結合させる工程；
ｈ’）前記多孔質担体の上の前記接合体Ｄの標識物質を定量する工程；
を含むことを特徴とする。【００７９】
このように、担体に多孔質のものを利用し、適宜溶液を担体の内外に駆動することには次のような利点がある。即ち一般に、多数の分析対象物質の検出を同一担体上で行おうとする場合、各分析対象物質の検出の最適条件に差が存在するため、全ての分析対象物質についての検出を最適条件下で行うことは困難である。しかし本発明の方法において多孔質担体を利用し、更に適宜試料溶液の駆動を行い、また測定可能な標識を有する基質を酵素により活性化したものを、分析対象物質が捕獲された領域周辺に沈着させ、その標識からの信号の検出を行っている。また、測定した信号の強度ににおける近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号の強度を定量に利用することにより、定量性を保持しつつ、高感度に測定を行うことが可能となる。また、複数の分析対象物質の同時検出を好適に行うことも可能である。よって、本発明において使用する担体には、プローブを固相化するスポットの数が、例えば２０個以上とすることにより、複数試料の同時検出を高感度、高精度且つ効率的に行うことが可能となる。【００８０】
ここで、分析対象物質には、予め結合対の一方の物質を、（必要な場合には適宜リンカーを介して）結合して、接合体（接合体Ａ）を形成しておく。ここで「結合対」とは、例えばビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、抗原−抗体、リガンド−レセプター等のように、生物学的に互いに特異的に結合しあう物質同士の組合せであり、「結合対の一方の物質」とは、これらの組合せのうちの一方の物質を意味する。分析対象物質と結合対の一方の物質との間の結合方法は、当該技術分野で既知の方法・条件等により行うことができ、結合対の一方の物質が、後の工程における結合対のもう一方の物質との間で形成する接合体形成反応を阻害しない形態であれば特に限定されることはない。【００８１】
上記工程a’）においては、接合体Ａを含む試料溶液を、プローブが固相化された担体へ供給することにより、当該プローブと当該接合体Ａ中の分析対象物質との間に特異的な結合を形成させている。また、使用する担体が多孔質であるため、適宜、液体駆動手段を備えた流路系と連結している場合には、担体へ供給した試料溶液を、多孔質担体の内外に駆動する工程e’)とすることも可能である。駆動の方法としては、反応溶液のポンピングやピペッティングが挙げられる。【００８２】
上記工程a’)及びe’)における特異的な結合の形成は、分析対象物質とプローブとの組合せに最適と考えられる条件において行う。例えば分析対象物質とプローブとが互いに相補的な配列を有する核酸である場合には、分析対象物質とプローブとの間に形成される相補的二本鎖のＴｍ値を考慮するなどして、反応温度、反応溶液の組成、反応時間などを決定する。この反応の後、未反応の分析対象物質やプローブに捕獲されない物質を反応系から除去するための工程を適宜行うことができる。除去工程としては、通常、当該工程において形成された反応生成物が解離しない溶液組成による洗浄工程が好ましく、洗浄溶液の量は、洗浄前の工程で使用した溶液の量よりも多いことが好ましい。【００８３】
次の工程b’）においては、前記の接合体Ａに対して、接合体Ｂを反応させる。接合体Ｂは、前記の結合対の一方の物質に特異的に結合する物質、即ち「当該結合対のもう一方の物質」に、（必要な場合には適宜リンカーを介して）酵素を予め結合しておいたものである。酵素の結合は、酵素活性が阻害されない限り、当該技術分野で知られる方法により行えばよく、特に限定されることはない。この工程においては、上記工程e’)と同様にして、多孔質担体の内外に溶液を駆動することも可能であり、この場合は工程ｆ’）となる。駆動の方法としては、反応溶液のポンピングやピペッティングが挙げられる。【００８４】
この工程b’）又は工程ｆ’）の反応後、担体には接合体Ｃが形成される。この接合体Ｃは、（分析対象物質-結合対の一方の物質）を含む接合体Ａと、（結合対のもう一方の物質-酵素）を含む接合体Ｂが、両者間で当該結合対を形成することにより、全体としてより大きな複合体である接合体Ｃを形成したものである。そしてこの接合体Ｃは、その中の分析対象物質を介して、担体に固相化されたプローブに結合している。【００８５】
工程ｂ’）又は工程ｆ’）の反応後、接合体Ｃに取り込まれなかった未反応物質等を除去する工程を適宜行うことができる。除去工程としては、通常、反応生成物を解離しない溶液組成による洗浄工程が好ましく、洗浄溶液の量は、洗浄前の工程で使用した溶液の量よりも多いことが好ましい。【００８６】
次の工程c’）又はｇ’）においては、工程ｂ’）又はｆ’）までで形成されている前記接合体Ｃに対して接合体Ｄを反応させる。接合体Ｄは、前記酵素に対する基質を標識物質と接合したものである。ここで酵素-基質の組合せは、酵素反応によって基質が活性化されて、活性化された基質を含む接合体Ｄが、担体表面に結合できるものであれば、特に限定されることはなく、当業者が実験系に応じて、適宜選択できるものである。具体的には、酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼ等の酵素と、これらの基質との組合せ等である。使用する酵素は、好ましくはホースラディッシュペルオキシターゼ（ＨＲＰ）またはアルカリフォスファターゼである。【００８７】
使用する酵素（即ち結合対のもう一方の物質-酵素からなる接合体Ｂ）の濃度としては、酵素の活性等を考慮して当業者らが適宜決定できるものである。この濃度は、使用する酵素の種類・活性度合に応じて変動するものであるが、一般的には、０．８〜６ｐmol/ｍｌの範囲にある。本発明においては、活性化された基質は、例えば金属酸化膜からなる担体の表面や、少なくともその一部に芳香族アミノ酸を含む化合物で前処理を行っておいた担体の表面に結合する。【００８８】
前記酵素の基質としては、置換フェノールたとえばチラミン、ホスホリル化置換フェノール例えばチロシンホスフェートを用いることができる。これらの基質は、検出可能に標識して用いる。基質の検出可能な標識物質としては、当該技術分野において知られる蛍光物質（フルオレセイン、アレクサ、シアニンなど）、化学発光物質、コロイド粒子（金や銀等の金属、ラテックス等の樹脂、ガラス、セラミックス）や蛍光ガラス粒子等を用いることができ、その選択は、当業者らが実験条件等を考慮することにより適宜行うことができるものである。【００８９】
ＨＲＰを酵素に用いる場合には、過酸化水素の存在下で反応を行うことが必要である。この場合、過酸化水素の濃度としては、０．００００８〜０．０００３％の範囲内にあることが好ましい。更に好ましくは０．０００１〜０．０００２％である。【００９０】
検出酵素を用いて基質を活性化させ、これを担体に沈着させる反応は、使用する検出酵素の作用温度で行い、沈着反応の速度を温度で制御することができる。また、最初に分析対象物質に直接的に、例えば別の標識（基質に結合している標識物質とは識別可能なもの）で蛍光標識し、プローブと結合させた後に、当該別の標識により、プローブに捕獲された分析対象物質の定量を行うことも可能である。このように分析対象物質に直接的に標識を行っている場合には、定量を行った結果、解析スポットのシグナル強度が弱く、解析が難しいスポットがあった場合、分析対象物質と結合している結合対の一方の物質に対して特異的に結合する物質（結合対のもう一方の物質）に酵素が結合した接合体（接合体B）を更に反応させて、接合体Cを形成させることができる。この場合、次に酵素の基質、例えばチラミドと標識物質が結合した接合体（接合体D）に前記酵素を反応させて当該基質を活性化させることにより、当該活性化された基質を介して標識物質を担体に沈着させて検出することで、シグナルを増感し、直接標識法で検出できなかったシグナルが検出できるようになる。この方法により、量の多い分析対象物質は直接標識、量の少ない物質は増感法で検出することが可能となる。量の多い分析対象物質のみを分析する場合は、より簡便で高速に検出できる。また、量の少ない物質も更に処理を行うことにより、従来では検出不可能であったものもデータを取得することができる。【００９１】
本発明においては、上記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；ａ）からｃ）；a’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程は、２０℃から７０℃の範囲内で行うことが望ましい。分析対象物質を直接標識している場合（工程（１）〜（３）、工程（Ａ）〜（Ｂ））には、３０〜５５℃の範囲内であり、分析対象物質を間接的に標識している場合（工程a）〜c）、工程a’）〜c’）、工程e’）〜g’））には、３４〜４０℃の範囲内（３７±３℃）であることが望ましい。また、これらの範囲内で略同一温度で行うことが望ましい。例えば分析対象物質が核酸である場合は通常、プローブの長さが２０〜８０ベースである場合、プローブとのハイブリダイゼーションは５０〜６５℃程度で行うことが好ましく、酵素反応は２０〜４５℃で行うことが好ましい。しかし、本発明においては、用いる緩衝液の塩濃度を下げることにより、ハイブリダイゼーションの温度と酵素反応の温度を、ほぼ同じ温度で行うことも可能である。例えば、緩衝液に５×ＳＳＰＥを用いたときのハイブリダイゼーションの最適な温度は５０℃であったが、１×ＳＳＰＥを用いたときには、ハイブリダイゼーションの最適な温度は４２℃であり、酵素反応が有効に起こる温度範囲内とすることも可能である。このように、ハイブリダイゼーションの温度と酵素反応をほぼ同じ温度でに行うことができるので、前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；ａ）からｃ）；a’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を略同一の温度で行えるようになる。これは、温度変更の必要がなくなるので温調制御が向上し、測定時間の短縮にもつながる。また、反応装置の自動化も容易になることから、特に好ましい。従って、より好ましくは、前記工程（１）から（３）；（Ａ）から（Ｂ）；ａ）からｃ）；a’）からｃ’）；又はｅ’）からｇ’）の工程を略同一の温度で行う。【００９２】
そして次の工程ｄ’）又は工程ｈ’）においては、上記工程によって担体上に結合した接合体Ｄ中の標識物質からのシグナルを選択的に定量することにより、間接的に分析対象物質の定量を行う。また、前記工程（Ｂ）の後、且つ信号の強度測定の前；前記工程ｃ）の後、且つ信号の強度測定の前；又は前記工程ｃ’）の後、且つ前記工程ｄ’）前；又は前記工程ｇ’）の後、且つ前記工程ｈ’）の前においては、反応を停止する工程、及び/又は未反応物質等を除去する工程を適宜行うことができる。これらの工程としては通常、担体へ結合した反応生成物を解離させない溶液組成による洗浄工程が好ましく、洗浄溶液の量は、洗浄前の工程（工程（Ｂ）、工程ｃ）、工程ｃ’）、工程ｇ’））で使用した溶液の量よりも多いことが好ましい。そして反応を停止するまで又は洗浄を開始するまでの時間は、分析対象物質の存在量等を考慮して、予め行っておいた予備実験結果に基づいて、所定の値に設定することが好ましい。【００９３】
上記工程ｄ’）又は工程ｈ’）は、上記工程ｃ’）又は工程ｇ’）の後に、任意の時間間隔で複数回行うことができる。これにより、低頻度で存在する分析対象物質についても、より高感度で検出することが可能になる。【００９４】
プローブ/分析対象物質の組合せとしては、DNA/DNA、DNA/RNAもしくはRNA/RNAである核酸について説明を行っているが、抗体/タンパク質、ペプチド/タンパク質、タンパク質（リガンド）/タンパク質（レセプター）や、糖/タンパク質、低分子化合物/タンパク質、細胞/ペプチド、細胞/タンパク質等の組合せも含まれる。上記組合せのうちいずれがプローブであっても分析対象物質であってもよい。【００９５】
分析対象物質と結合した結合対の一方の物質と、前記結合対の一方の物質に特異的に結合する物質（結合対のもう一方の物質）の組合せとしては、ハプテン/抗体、ビオチン/アビジンまたはストレプトアビジン等が含まれる。【００９６】
上記工程c’)及びg’)における酵素による基質の付加反応は、ポンピング、またはピペッティングにより、当該担体に、基質を含む接合体（接合体D）を浸透させたのち静置して行うことができる。基質に結合した検出可能な標識（酵素により活性化済）の沈着の程度をCCDカメラにてモニターし、反応の程度を確認したのち、定量を行うことができる。従って各スポットの反応の進行度を確認することも可能である。従って各スポットの沈着反応が直線域にあるか飽和しているかを確認しつつ、最適な状況下でデータ測定を行うことができる。また、各スポット間のデータを定量的に比較するためには、比較対象となるいずれのスポットにおける輝度が、検出限界以上であって、尚且つ輝度が飽和していないことが望ましい。そのため、上記工程ｄ’）又はｈ’）を行う際には、測定した信号の強度の変化率を測定し、測定した信号の強度に対する近似直線の傾きが、それ以前に取得した信号強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときのデータを使用して分析対象物質の定量を行うことが望ましい。この範囲内にある場合には、測定時間と信号強度との間には、実質的な線形性が存在するとみなすことが可能であるためである。最も好ましくは当該近似直線の傾きが略一定である場合、即ち直線の場合である。【００９７】
本発明において使用する試料溶液、及び/又は上記の各工程後に適宜行う洗浄工程において使用する洗浄溶液には、界面活性剤を含めることができる。この場合、界面活性剤の濃度は、０．１〜１％の範囲内にあることが好ましい。更に好ましくは、０．３〜０．７％である。界面活性剤の種類としては、起泡性や、標準物質の試料溶液への溶解度などを考慮して選択するが、試料溶液が種々の緩衝液を含むことから、陽イオン系界面活性剤又は非イオン系界面活性剤から選択することが好ましい。試料溶液や洗浄溶液等に含まれるアルカリ金属やアルカリ土類金属の沈殿が生じたり、界面活性効果に悪影響を与えないものから選択することができる。具体的には、例えば脂肪酸系である、ショ糖脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、脂肪酸アルカノールアミド、高級アルコール系のポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルなどの界面活性剤である。特に好ましいものは、脂肪酸アルカノールアミドであり、この中でもラウリルサルコシン[(CH3(CH2)10CON(CH3)(CH2COOH))]が最も好ましい。また、アルキル基の長さが異なっていたり、置換基を有するような、類似の構造を有する化合物も好ましい。【００９８】
本発明の分析対象物質の検出方法においては、上記工程a’)〜ｃ’）又はe’)〜ｇ’）を含み；
更に、上記工程ｃ’）又はｇ’）の後に、下記の工程：
ｘ-１）前記多孔質担体上の特定スポット中の活性化接合体Ｄからの信号の強度のみを測定し、当該特定スポットからの信号の強度が、予め定めておいた信号の強度に到達したかを経時的に確認する工程；
ｘ-２）前記工程ｘ-１）において、当該予め定めておいた信号の強度に到達したことが確認された直後に、前記多孔質担体上のその他のスポット中の反応を停止して、当該そのほかのスポットからの信号の強度の測定を開始し、当該測定した信号の強度ににおける近似直線の傾きが、それ以前に測定した信号の強度における近似直線の傾きの０．５倍〜１．５倍の範囲内にあるときの信号強度を用いて定量する工程；
を含むものとすることができる。【００９９】
この検出方法においては、工程ｘ−１）における前記特定スポットを、標準物質に対するプローブが固相化されたスポットとすることができる。ここで標準物質としては、細胞内で常に一定比率で発現しているハウスキーピング遺伝子（βアクチン遺伝子、GAPDH遺伝子等）や、これらの転写・翻訳産物などを挙げることができる（内部標準物質）。【０１００】
標準物質が捕獲されたスポットからの信号がどの程度になるまで、その他のスポットの反応・測定を行うかは、予備実験により決定することが可能である。担体上にスポットしたプローブが捕獲する分析対象物質のより多くについて、信号強度が飽和する前に測定を開始・終了することが可能な、試料溶液量、反応時間等を、当該予備実験により決定することができる。従って予備実験結果とあわせて、このような工程ｘ-１）及びｘ-２）を行うことで、数多くのスポットについて、信号強度が飽和しない条件下でデータ取得を行うことが可能になる。【０１０１】
前記特定スポットが複数個からなる場合には、一定比率の希釈系列で固相化量を調整したプローブを当該複数個からなる特定スポットのそれぞれに固相化することができる。併せて、特定スポットを含む全スポット、又は特定スポット以外のスポットの一部について同様に一定比率の希釈系列でプローブをそれぞれのスポットに固相化することも可能である。このような構成をとることにより、一のスポットにおける定量結果が検出限界未満や飽和レベルの信号強度となってしまった場合でも、同一希釈系列内のその他のスポットにおける定量結果を利用することが可能であるため、特定の分析対象物質の検出漏れを防ぐことができる。また、適切な予備実験を行っておけば、同一希釈系列内にはプローブ濃度とスポットの信号強度との間に線形性が担保されるスポットが少なくとも1つは存在すると期待できる。従って、希釈系列としては、ある１つの濃度の前後、少なくとも各１点ずつの合計３点の濃度とすることが好ましい。希釈の割合としては、使用する試料の量、分析対象物質の存在比率等を適宜当業者が考慮して決定できるものであり、例えば、２倍（１/２倍）系列、１０倍（１/１０倍）系列等とすることができる。【０１０２】
本発明の方法においては、上記特定スポットに外部標準物質に対するプローブの希釈系列をスポットしておき、分析対象物質を含む試料溶液中に、当該外部標準物質のプローブに対応する外部標準物質であって標識済みのものを任意の濃度で混ぜておき、当該外部標準物質からの信号強度を測定することもできる。この場合、外部標準物質に対するプローブの希釈系列のスポットは、分析対象物質の量が想定と大きくずれた場合に有効に利用できる。即ち、分析対象物質の量が想定よりも非常に多い場合は、活性化基質と担体との間の反応時間が短時間になるため、希釈系列中のプローブ固相化量が多いスポットで定量的な検出が可能であり、反対に分析対象物質が想定より少ない場合はチ活性化基質と担体との間の反応時間が長時間となるため、固相化量の少ないスポットで定量的な検出が可能になる。【０１０３】
分析対象物質の量を測定し、添加する試料の量を一致させて検出にかける場合には、検出にかけた試料に対して、常に同一濃度の外部標準物質（例えばオリゴDNA等）を入れておき、外部標準物質が所定の信号強度になるように、活性化基質と担体との間の反応を停止してデータを測定することで、各スポット間での反応のばらつきをおさえることができる。これは内部標準物質を決定する前の予備実験等で有効である。【０１０４】
分析対象物質の量を一致させずに検出する場合には、検出にかける試料に対して、同一濃度の外部標準物質（オリゴDNA等）を入れておき、内部標準物質が所定の信号強度になる反応時間でデータを測定する。添加する試料の量を変えて外部標準物質の信号強度と外部標準物質の濃度のデータをあらかじめ取得しておくことで、実際に分析対象物質の量を測定せずに実験した場合でも、外部標準物質の信号強度と外部標準物質の濃度のデータから分析対象物質の添加量を予測することができる。【０１０５】
工程ｄ’）及びｈ’）において、担体に沈着した基質を定量するには、好ましくはCCDカメラを用いて、基質の標識（好ましくは蛍光物質）からの信号（好ましくは蛍光強度）を測定する。【０１０６】
一つの実施形態において、ハイブリダイゼーションから検出までのすべての工程は、オリンパス社製のFD10装置を用いて行うことができる。【０１０７】
本発明は、種々の生体関連物質にも適用することが可能である。例えば、核酸、糖、タンパク質、ペプチド、及びこれらの物質が種々の修飾を受けた物質の検出を行うことができる。これらの物質が受ける種々の修飾とは、リン酸化、メチル化アセチル化、脱アセチル化が挙げられる。例えば、プロテインキナーゼの活性を測定することがこの一つである。このプロテインキナーゼの活性は、ペプチド中の特定のアミノ酸がリン酸化されたかどうかを測定することにより行うことが可能である。この場合、プローブにプロテインキナーゼの基質となるペプチドを用いることにより検出を行う。【０１０８】
本発明の一実施例においては、プロテインキナーゼの基質となるタンパク質のリン酸化部位を含んだペプチド配列をプローブとして多孔質担体の基板に固定し、人工的にγ-リン酸基に硫黄原子を導入したATP（ATP-γS）を用いてリン酸化反応を行っている。キナーゼによりプローブペプチドのリン酸化部位へ導入されたチオリン酸基の硫黄原子に対し、これと結合可能な官能基を有するビオチン（例えばヨードアセチルビオチン）を反応させ、その後これに対し、ビオチンに結合可能なアビジンに酵素を結合させた接合体分子を反応させ、更にこの反応生成物に対し、当該酵素の基質に蛍光物質が結合した別の接合体を反応させている。当該酵素により活性化された基質がリン酸化されたプローブペプチド及び基板におけるその周辺部に固定化されて、その固定化された基質-蛍光物質からの蛍光シグナルを測定することにより、プローブペプチドに導入されたリン酸基の量を推定することが可能である。この推定値により、分析に供したキナーゼ（分析対象物質）の活性を測定することが可能になる。従って本発明の方法においては、放射性物質を用いることなく、簡便にキナーゼなどの酵素活性を測定することが可能なものとなっており、将来的には臨床診断分野での応用も期待できるものとなっている。【０１０９】
本発明の分析対象物質の検出方法は、上記のように固相での反応とする以外にも、液相での反応とすることもできる。例えば、ガラスセル中において、分析対象物質である酵素の量を、基質の変換量に依存する吸光度の変化に基づいて測定する方法とすることも可能である。また、メンブレン上に固定された分析対象物質である特定のタンパク質に、ビオチン標識した検出対象物質特異的抗体を結合させ、当該ビオチン特異的に結合するストレプトアビジンを結合させた酵素を作用させて、当該酵素による基質の変換の度合を測定する方法も可能である。【０１１０】
本発明は更に、
ＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルクからなる群より選択される少なくとも１種と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含むブロッキング剤；
酸化還元酵素、加水分解酵素、リアーゼ、転移酵素、異性化酵素、リガーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む酵素製剤；
前記酵素製剤中の酵素に対する基質と、検出可能な標識物質とを含む接合体Ｄを含む基質含有剤；並びに
非イオン系界面活性剤と、１価又は２価の陽イオンを含む緩衝液とを含む洗浄剤；
がそれぞれ別個の容器に含まれた、分析対象物質検出用試薬キットを提供する。【０１１１】
本発明の分析対象物質検出用試薬キットにおいて使用するブロッキング剤には、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、ゼラチン、スキムミルクの少なくとも１種が含まれるが、ＢＳＡ、ゼラチン、スキムミルクは全体で０．１〜１０％の範囲内にあることが望ましい。、またこのブロッキング剤には、０．１Ｍ〜１ＭのＮａＣｌと、３ｍＭ〜６０ｍＭのリン酸ナトリウムとを含めることができる。また、所望の濃度のSSPE等を含めることもできる。【０１１２】
本発明の分析対象検出用試薬キットにおいて用いる酵素製剤には、使用する実験系において望ましい濃度の酵素を含めることができるが、例えば酵素がペルオキシダーゼの場合には、０．８〜６ｐｍｏｌ/ｍｌとすることが好ましい。これ以外の酵素の場合も、その活性等を考慮して、同等の範囲内の量を添加することができる。更に必要に応じてＢＳＡ、ＳＳＰＥ、ＰＢＳを適切な濃度で含めることができる。【０１１３】
本発明の分析対象物質検出用試薬キット中の基質含有剤には、
・上記酵素製剤中の酵素に対する、適切な濃度の基質と検出可能な標識物質を含む接合体Ｄを含めることができる。また、前記酵素がペルオキシダーゼの場合には、０．０００８から０．０００３％の範囲内の過酸化水素を含む気質溶解用溶液を調製して利用することができる。【０１１４】
本発明の分析対象物質用試薬キット中の洗浄剤には、上述の通り、０．１〜１％の範囲内で界面活性剤が含まれる。界面活性剤以外には、適宜、ＳＳＰＥや、ＰＢＳなどの種々の緩衝成分を含めることができる。【０１１５】
上記したキット中の製剤等の成分濃度は、それぞれ、使用時の濃度で記載したものであるが、キットとしては、最終濃度の数倍の濃度のストック溶液とすることも可能である。また、使用時に実験者が調製するよう、粉末形態とすることも可能である。
【実施例１】
【０１１６】
（実施例１）
１．核酸のハイブリダイゼーションの検出を、サンプルと結合している結合対の一方の物質にビオチン、前記結合対の一方の物質に特異的に結合する物質にストレプトアビジン、酵素にホースラディッシュペルオキシターゼ、酵素の基質にチラミン、酵素の検出可能な標識にAlexa488を使用して行った。
２．本実施例においては以下の材料を使用した（すべてRN ase-Free水を用いて調整した）。
20×SSPEストック緩衝液（Invitrogen社製）  pH6.65に調整
1%SDS溶液（Ambion社製）
PBS/0.01%tween溶液（Invtrogen社製）
0.0015%過酸化水素溶液（Molecular probe社製）    
ストレプトアビジン-HRP溶液（Molecular probes社）
Tyramide-Alexa488溶液（Molecular probes社）【０１１７】
（アッセイプロトコール）
１．フラグメント化されたaRNAサンプルを以下のように調製した。ラット（wister、オス）の肝臓よりNIPPON GENE社ISOGEN（登録商標）を用いて抽出したtotalRNA2μgを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、ビオチン化UTPの存在下でaRNAを合成した。これをAmbion社製RNA fragmentation-kitを用いて70℃、15分間の加熱により1×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションにはこのaRNA5μgを用いた。
２．プローブが固相化されたマイクロアレイとしては、PamChip（登録商標）を使用した。このアレイ上のプローブとしては、塩基数６０のものを１２７個用いた（配列番号１〜１２７）。これらの配列のうちコントロール配列は内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨ（配列番号１２６）、及び外部標準遺伝子ＬＡＭＤ（配列番号１２７）であり、配列表に示した。
３．アレイのハイブリダイゼーションおよびシグナル検出機器としてはオリンパス社製FD10を使用した。
４．以下の工程はすべてアレイを42℃にして行った。
５．FD10装置にアレイをセットし、50μlのPBS-tweenをアレイ表面にのせたのち、3回溶液のポンピングを行って、アレイ表面の前洗浄を行った。この場合ポンピングとは、アレイ上面から50μl溶液をアレイ下面に通過させて、吸引し、再びアレイ上面に同様に戻す作業のことを言う。
６．37.5μlのaRNAサンプル水溶液を99℃で5分加熱し、ついで氷中5分冷却して変性したのち、20×SSPEストック溶液を7.5μl加えて、45μlの3×SSPE濃度としたのち、前洗浄の終わったアレイ表面に全量のせ、ついで、5μlの1%SDSをのせた。
７．プローブとサンプルのハイブリダイゼーションは42℃、150回のポンピングで行った。
８．ハイブリダイゼーションの後、溶液をろ紙で取り去り、3×SSPE溶液70μlをのせ、3回ポンピングした。これをさらに2回行った。
９．１％のBSAを含有した２０×SSPEをPBSで希釈して３×SSPEとしたブロッキング溶液を50μlアレイ表面にのせ、5回ポンピングを行った。
１０．ブロッキング溶液をろ紙で取り去り、前記ブロッキング溶液で100倍に希釈したストレプトアビジンーホースラディッシュペルオキシターゼ融合体溶液をアレイ表面にのせ、20回ポンピングした。
１１．前記溶液をろ紙でとりさり、70μlの3×SSPEをのせて3回ポンピングさせた。これを3回繰り返した。
１２．100μlの過酸化水素水で1μl  Tyramide-Alexa488-を希釈した溶液50μlをアレイ表面に供給した。ついでアレイ下面に溶液を25μl吸引し、CCDカメラでオリンパス社製GFPHQフィルターを用いて50ミリ秒の露光時間でアレイ表面のスポットの明るさを目視でモニターした。10分後一番明るいシグナルスポットの明るさが飽和したことを確認したのち、溶液をアレイ上面に押し上げた。
１３．溶液をろ紙でとりさり、3×SSPE  70μlで3回ポンピングした。
１４．溶液をろ紙でとりさり、30μlの3×SSPEをのせてアレイ下面に全量吸引し、CCDカメラでGFPHQフィルターを用いて50、100、200、300ミリ秒の露光時間でアレイ画像を撮影した。結果を図１に示す。【０１１８】
（比較例１）
比較例として、蛍光物質の直接標識されたフラグメント化aRNAサンプルを以下のように調製した。Rat（wisterオス）の肝臓よりNIPPON GENE社ISOGENを用いて抽出したtotalRNA2μgを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、FITC-12-UTPの存在下でaRNAを合成した。これをAmbion社製RNA fragmentation-kitを用いて70℃、15分間の加熱により1×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションにはこのaRNA5μgを用いた。上記の2.〜8.までの反応工程を行ったのち、1000〜5000ミリ秒の露光時間でGFPHQフィルターで撮影した。結果を図１に示す。【０１１９】
（結果）
本発明の増感法の場合をFITCによる直接標識の場合と比較すると、本発明の場合においてはシグナル強度が増強されたため、露光時間が5000ミリ秒から100ミリ秒へと短縮された。このため、従来画像解析時に問題となっていたアレイ表面のゴミのシグナルが見えなくなり、画像解析が迅速かつ正確にできるようになった。（図１参照）また、多孔質アレイ特有の問題である「むら」による影響も少なくなった。画像のバックグラウンド値は700〜1000から300〜400へと半分以下に低下した。解析可能なスポット数も約2倍に増加し、低発現の遺伝子も解析可能になった。（図２参照）
アッセイに用した時間はハイブリダイゼーションから検出まで約2時間半であり、従来のグラスアレイを用いて、酵素による基質の沈着法により検出する場合の2〜3日に比べて大幅に検出までに要する時間を短縮できた。
【実施例２】
【０１２０】
（実施例２）
ハイブリダイゼーションを行いたいサンプルが微量しか得られない場合に、ハイブリダイゼーションシグナルが検出できるか確認するため、以下の実験を行った。
１．フラグメント化されたaRNAサンプルを以下のように調製した。ラット（wister、オス）の肝臓よりNIPPON GENE社ISOGEN（登録商標）を用いて抽出したtotalRNA10ngを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、ビオチン化UTPの存在下でaRNAを合成した。この全量をAmbion社製RNA fragmentation-kitを用いて70℃、15分間の加熱により1×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションにはこのaRNAの全量を用いた。
２．上記実施例１の２.から１４.の反応工程を行い、データを得た。結果を図３に示す。【０１２１】
（比較例２）
１．比較例として、蛍光物質の直接標識されたフラグメント化aRNAサンプルを以下のように調製した。ラット（wisterオス）の肝臓よりNIPPON GENE社ISOGENを用いて抽出したtotalRNA10ngを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、FITC-12-UTPの存在下でaRNAを合成した。この全量をAmbion社製RNA fragmentation-kitを用いて70℃、15分間の加熱により1×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションにはこのaRNAの全量を用いた。上記実施例１の２.〜８.までの反応工程を行ったのち、1000〜5000ミリ秒の露光時間でGFPHQフィルターで撮影した。結果を図３に示す。【０１２２】
（結果）
ごく微量のtotalRNAから得たサンプルaRNAでのハイブリダイゼーションの結果、本発明の方法を用いた場合は、アレイ中の約半分のスポットを検出することが可能であった。一方、従来法である蛍光物質の直接標識では、発現量の多い遺伝子のみしか検出できなかった。本発明を用いることで、臨床検体より得られる微量サンプルでも解析が可能である。
また、従来法では全工程に４〜５日かかっていたものが、本実施例では２日ででき、検出までに要する時間を大幅に短縮できた。
【実施例３】
【０１２３】
アレイ表面にチラミド基質の付加するための外来受容基（芳香族アミノ酸レセプター）の付加反応が必要かどうか確認するため、実施例１について、工程９.を省略し、工程１０.の項目について前記ブロッキング溶液を、２０×SSPEをPBSで希釈して３×SSPEとした溶液に置き換えて行った。結果を図４に示す。【０１２４】
（結果）
基質に対する外来受容基付加反応（ブロッキング）を行わず、アレイ表面に基質の外来受容基を付加しない場合は、画像のバックグラウンド値は300〜400で、解析できるスポット数は、外来受容基付加反応（ブロッキング）を行う場合と同一であった。このため、本実験では三次元多孔質担体に基質の外来受容基（芳香族アミノ酸）を付加する工程が必要がないことがわかった。（図４参照）
【実施例４】
【０１２５】
１．  フラグメント化されたaRNAサンプルを以下のようにして調製した。ラット（Ｗｉｓｔｅｒ、オス）の肝臓よりＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ社製のＩＳＯＧＥＮを用いて抽出したtotalRNA２μｇを鋳型として用いた。これとＡｍｂｉｏｎ社製messageAmp-kitとを用いて、ビオチン化ＵＴＰの存在下で、aRNAを合成した。これをＡｍｂｉｏｎ社製ＲＮＡfragmentation-kitを用いて７０℃、１５分間の加熱により１×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションには、このaRNA５μｇを用いた。
２．  プローブ核酸が固相化されたマイクロアレイとしては、ステンレス製のキャピラリーチューブ（外径が０．５ｍｍ）にアクリルアミドゲルを充填したものを縦１２本、横１２本、合計１４４本並べて接着し、５ｍｍの厚さに切断したものを使用した。各キャピラリーチューブには、異なるプローブDNAをアクリルアミドゲルに混ぜて充填した。このアレイ上のプローブ核酸の配列は、配列表の配列番号１〜１２７に記載したものである。
３．  以下の工程は全て、アレイを４２℃に設定して行った。
４．  アレイを小タッパに入れ、PBS-tweenに浸し、１０分間置いた後、PBS-tween溶液を廃棄した。
５．  ３７５μｌのaRNAサンプル水溶液を、９９℃で５分間加熱し、次いで氷中で５分間冷却して変性させた。次に、２０×SSPEストック溶液を変性後の当該サンプル水溶液に７５μｌ加え、４５０μｌの３×SSPE濃度とした後、この全量を、上記４.の作業が終わったアレイ表面にのせ、次に５０μｌの１％SDS水溶液を加えた。
６．  小タッパのフタを閉め、軽く揺らしながら一晩、ハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション後、アレイを別のタッパに移し、３×SSPE溶液を５ｍｌ加え、軽く揺らして行う１時間の洗浄を３回行った。
７．  １％のBSAを含有した２０×SSPEをPBSで希釈して３×SSPEとしたブロッキング溶液１ｍｌをアレイ表面にのせて、１時間軽く揺らして、ブロッキング反応を行わせた。
８．  BSAブロッキング溶液を廃棄し、前記ブロッキング溶液で１００倍に希釈したストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキダーゼ接合体含有溶液をアレイ表面にのせ、そのまま２時間静置して反応させた。
９．  反応後、当該接合体含有溶液を廃棄し、３×SSPE溶液を加えて軽く揺らしながら１時間の洗浄を３回行った。
１０．  １ｍｌの０．００１５％過酸化水素水で１０μｌのTyramide-Alexa４８８を希釈した溶液をアレイ表面にのせ、１０分間静置した。
１１．  Tyramide-Alexa４８８を含む上記溶液を廃棄し、３×SSPE溶液で５分間、アレイを洗浄した。
１２．  アレイをCCDカメラのついた蛍光顕微鏡（オリンパス社製）にのせ、GFPHQフィルター（オリンパス社製）を用いて、５０、１００、２００、３００ミリ秒の露光時間でアレイ画像を撮影した。【０１２６】
（比較例）
比較対照試料として、蛍光物質が直接標識されたフラグメント化aRNAサンプルを次のようにして調製した。
１．ラット（Wister；オス）の肝臓より、NIPPON  GENE社製ISOGEN（登録商標）を用いて抽出したtotalRNA２μｇを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いてFITC-12-UTPの存在下でaRNAを合成した。これをAmbion社製fragmentation-kitを用いて７０℃、１５分間の加熱により、１×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションには、このaRNA５μｇを用いた。上記実施例４の工程２．〜８．を行い、１０００〜５０００ミリ秒に露光時間でGFPHQフィルターで撮影した。【０１２７】
（結果）
実施例４及び比較例の結果を図５に示す。本願発明の方法（増感法）と、比較例の方法（直接標識）とを比較した場合、シグナル強度が本願発明の方法では増強されたため、露光時間が５０００ミリ秒から１００ミリ秒へと短縮された。画像のバックグラウンド値は、比較例では７００〜１０００であったのに対し、本願発明の方法では、３００〜４００へと、半分以下に低減した。解析可能なスポット数も、本願発明の方法では約２倍に増加し、尚且つ、低発現の遺伝子の解析も可能になった。
【実施例５】
【０１２８】
２種類のサンプルを用いて、分析対象遺伝子の発現量の比較を行った。
Ａ．
まず、酵素による多孔質担体へのチラミドの沈着反応時間のタイムコースを確認するために、以下の工程よりなる実験を行った。
１．  フラグメント化されたaRNAサンプルを次のように調製した。ラット（Wister、オス）の肝臓よりNIPPON  GENE社製ISOGEN（登録商標）を用いて抽出したtotalRNA２μｇを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、ビオチン化UTPの存在下で、aRNAを合成した。このうちの２μｇをAmbion社製RNA  fragmentation-kitを用いて７０℃、１５分間の加熱により、１×のフラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションには、このａＲＮＡの全量を用いた。次に、上記実施例１中の工程２.〜１１.の反応を行った。
１２．  １００μｌの過酸化水素水で１μｌのTyramide-Alexa488を希釈した溶液を５０μｌを、多孔質アレイ表面に載せた。次にアレイの下面に溶液を２５μｌ吸引して、３、５、８、又は１０分間、チラミドを担体に沈着させ、その後それぞれの溶液をアレイ上面に押し上げ、すぐさま以下の工程１３．を行った。
１３．  担体より押し上げられた溶液をろ紙で取り去り、３×SSPE溶液７０μｌを載せて、３回ポンピングした。
１４．  ポンピングに使用した溶液をろ紙で取り去り、３０μｌの３×SSPEを載せて、アレイ下面に全量を吸引し、CCDカメラでGFPHQフィルターを用いて、５０、１００、２００、又は３００ミリ秒の露光時間でアレイ画像を撮影した。【０１２９】
（結果）
アレイの撮影結果を分析したものを図６に示す。
チラミドを担体に沈着させる時間を変化させると、本発明の方法の場合には、アレイ中のシグナルスポット輝度は、８分以降、増加が見られず、チラミド沈着反応は、約８分間で飽和することがわかった。この図より、スポットシグナル輝度が低い遺伝子も、高い遺伝子も、シグナル輝度が飽和するまでの間、その存在比率をほぼ保持しながら推移していることも更にわかる。しかし、分析対象の一つの遺伝子からのシグナルが一旦飽和してしまうと、それ以降は他の遺伝子に対する相対比率が大きく異なってしまうことになる。従って、同一アレイ上で比較を行う全ての遺伝子においては、シグナル強度が飽和する前、即ち取得した信号強度の変化率が正であるときの信号強度を用いて分析対象物質の検出を行うことが好ましい。
試料溶液中の分析対象物質により、飽和するタイミングが異なる場合がある。このような場合には、例えば分析対象物質の全てのシグナルが飽和する前のデータを用いて、試料溶液中の分析対象物質の相対量を算定しておき、次に信号の輝度を稼ぐために更にデータ取得を継続し、飽和までの時間がかかる分析対象物質の信号強度が十分な値になったときに（但し、飽和する前まで）、この値を用いて素早く飽和する分析対象物質と、より遅く飽和する分析対象物質の相対的な補正を行い、全ての分析対象物質を検出することも可能である。【０１３０】
Ｂ.
次に、サンプル中の分析対象遺伝子のaRNA量を反映したスポットシグナル輝度を示すためのサンプル量がどの程度であるかを算定するために、上記実施例５  Ａ.における工程１．で得られたaRNA量を、０．０６５、０．１２５、０．２５、０．５、１、２μｇ用いて上記実施例５  Ａ．の工程２.〜１４.の方法で実験を行った。チラミドの沈着時間は５分間とした。【０１３１】
（結果）
結果を図７に示した。この図からは、aRNAの量が１．０μｇ以上であってもシグナル強度は高くならず、サンプルの量とシグナル強度が対応しなくなるので、適切なaRNAの量は、０．０１〜１．０μｇの範囲であることがわかる。ある程度のシグナル強度があったほうが、信頼のおけるデータとなるので、好ましくは０．０５〜０．７５μｇであり、更に好ましくは０．１〜０．５μｇである。本実施例では、aRNAをサンプルとして使用したが、ｃDNAをaRNAの場合と同量使用することにより、最適な条件で検出を行うことが可能である。【０１３２】
Ｃ.
次に、チラミドの沈着反応を生じさせる、ホースラディッシュペルオキシアダーゼ（ＨＲＰ）-ストレプトアビジンの濃度の最適量を検討するため、前記物質の希釈濃度を１/１００（４７．２pmol/ｍｌ）、１/１０００（４．７２pmol/ｍｌ）、１/４０００（１．１８pmol/ｍｌ）、１/８０００（０．５９ｐmol/ｍｌ）の４点とし、チラミド沈着時間を５分間、サンプルaRNA量を０．２μｇとして、上記実施例５  Ａ．の条件下で実験を行った。【０１３３】
（結果）
アレイ表面のバックグラウンド値は、酵素濃度が低くなるにつれて低下する傾向を示したが、スポットのシグナル輝度は、１/４０００の希釈度の場合にもっとも明るく、１/１００及び１/８０００の希釈度の場合には、分析可能なシグナルスポットの数、及びスポット輝度が、１/４０００の希釈度の場合の値のそれぞれ半分以下であった。これは、酵素とチラミドの反応産物が酵素の反応を阻害するために、酵素濃度と基質濃度との間のバランスには至適な比率があることを示唆している。このため、酵素HRP-ストレプトアビジンの濃度は、０．８〜６ｐmol/ｍｌが適切であることがわかる。ある程度のシグナル強度があったほうが信頼のおけるデータとなるので、好ましくはこの濃度は０．９から４pmol/ｍｌであり、更に好ましくは、１〜２pmol/mlである。【０１３４】
Ｄ.  上記Ａ〜Ｃの実験結果を受けて、２種類のサンプルでの分析対象遺伝子の発現量の差を検出する以下の実験を行った。
フラグメント化された２種類のaRNAサンプルを次のように調製した。ラット（Wister、オス、フェノバルビタール投与群及び非投与群）の肝臓より、NIPPON  GENE社製のISOGENを用いて抽出したtotalRNA２μｇを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、ビオチン化UTPの存在下でaRNAを合成した。このうち、それぞれ０．２μｇをAmbiion社製RNAfragmentation-kitを用いて７０℃、１５分間の加熱により、１×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションには、このaRNAの全量を用いた。上記実施例５  Ｃ．において酵素量を１/４０００とし、工程２.〜１４.の反応を行い、データを取得した。【０１３５】
（比較例）
比較対照として、蛍光物質が直接標識されたフラグメント化aRNAサンプルを次のように調製いした。ラット（Wister、オス、フェノバルビタール投与群及び非投与群）の肝臓より、NIPPON  GENE社製のISOGENを用いて抽出したtotalRNA２μｇを鋳型として用いた。これとAmbion社製messageAmp-kitとを用いて、FITC-12-UTPの存在下でaRNAを合成した。このうち、それぞれ２μｇをAmbiion社製RNAfragmentation-kitを用いて７０℃、１５分間の加熱により、１×フラグメンテーション緩衝液中でフラグメント化した。ハイブリダイゼーションには、このaRNAの全量を用いた。工程２〜８の反応を行った後、１０００〜５０００ミリ秒の露光時間で、ＧＦＰＨＱフィルターで撮影した。【０１３６】
（結果）
発現比については、本願発明の方法（増感法）と比較例のＦＩＴＣ直接標識法との間で比較すると、同等であった。しかしながら本願発明の方法で使用されているサンプル量は、０．２μｇと微量であるにも関わらず、解析可能なスポット数が、対照（サンプル量が１０倍の２μｇ使用）の結果と同等であり、しかも発現比が正確に保たれていた（図８）。
チラミド法は一般的にＦＩＳＨやＣＧＨなど、微量なものの発現を高感度に検出する必要がある場合に用いられてはいたが、定量的な実験を行う場合には微量でもシグナルが飽和してしまうため、定量実験にはあまり用いられてはいなかった。本願発明においては、チラミドを利用した発現比検出法でも、チラミド沈着時間、サンプル濃度、酵素量の至適範囲で実験を行えば、定量的な実験を行うことが可能であり、またそれに必要なサンプル量は、従来法の直接標識と比較してたいへん微量でよいことがわかった。このことより、チラミド法は、解析に必要なサンプル量が微量でよく、しかも定量性のあるデータが得られるため、マイクロダイセクションのサンプルや、サンプル量の限られる医療現場での診断等においても発現解析のデータ取得を行うのに非常に有益な方法であるといえる。
【実施例６】
【０１３７】
Ａ.
本願発明のチラミド法を用いてキナーゼリン酸化反応の検出を行うため、次の実験を行ったが、リコンビナントｃｄｃ２キナーゼ酵素活性は、ｃｄｃ２キナーゼの基質ペプチドを用いて測定し、測定機器としてはオリンパス社製ＦＤ１０を使用した。
１．  3次元多孔質基板としては、上記実施例１-５で用いたＰａｍＣｈｉｐを用い、ｃｄｃ２キナーゼ基質（ヒストンＨ１）の一部であるペプチド配列、Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｔｈｒ-Ｐｒｏ-Ｌｙｓ-Ｌｙｓ-Ａｌａ-Ｌｙｓ-Ｌｅｕ（プロメガ社製）の希釈系列８点（０、１、２、４、６、８、１０、及び１５μＭ）をスポッターでスポットし、共有結合により基板表面に固定した。
２．  ＰＢＳ-Ｔween中１％のＢＳＡ溶液５０μｌをアレイ表面に加え、５回、溶液を基板の内外に駆動した。
３．  リコンビナントhuman  ｃｄｃ２キナーゼ（プロメガ社製）を、溶液（２５ｍＭのＭＯＰｓ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、４０ｍＭのβ-グリセロホスフェート、２０ｍＭのｐ-ニトロフェニルホスフェート、０．１ｍＭのバナジン酸ナトリウム、１００μＭのＡＴＰγ-Ｓ）で希釈して３０μｌとし、アレイ表面に加えた。反応温度は、３７℃とし、試料溶液は、１分間に１回のペースでアレイ基板の上下に駆動させ、３０分間継続した。
４．  反応液をアレイ上部に押し上げた後、これをろ紙で除去し、ＰＢＳ-tween溶液を７０μｌ入れて、３回駆動させ、未反応のATP及び酵素をアレイより除去した。
５．  １５０ｍＭのTris-HCｌ（ｐH9.2）、５ｍＭのＥＤＴＡを２０μｌ加え、更に３０ｍＭヨードアセチルビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ社製）溶液（５０ｍＭのリン酸緩衝液、ｐＨ6.0）を２０μｌ加えた後、２０回、溶液をアレイの内外に上下駆動させて反応を行った。その後、２％β-ＭＥ２０μｌを加えて反応を停止した。
６．  反応液をろ紙で除去し、ＰＢＳ-tween溶液を７０μｌ入れて、３回駆動させ、未反応のヨードアセチルビオチンを洗い流した。
７．  アビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Vetter社製）をPBS-tweenで４０００倍に希釈した溶液５０μｌを上記４の溶液と置換して、２０回、上下に駆動した。
８．  反応液をアレイ上部に押し上げた後、これをろ紙で除去し、PBS-tween溶液を７０μｌ入れて、３回駆動させ、未反応の酵素を洗い流した。
９．  ０．００１５％のH2O2溶液で１００倍に希釈したTyramide-Alexa488溶液（Molecular  Probe社製）５０μｌをアレイ表面にのせ、２５μｌしたに引いたまま５分間静置した後、溶液をアレイ表面に押し上げて、これをろ紙で取り去り、７０μｌのPBS-tween溶液を入れて１回、上下に駆動させた。
１０．  PBS-tween溶液を、３０μｌのPBS-tween溶液に置換した後、GFPHQフィルターを用いて５０〜８００ミリ秒の撮影時間で撮影を行った。【０１３８】
（結果）
アレイにスポットした基質ペプチドの濃度勾配に比例して、スポットのシグナル輝度は増加した。【０１３９】
Ｂ．
次に、上記Ａのリン酸化反応が特異的なものかを評価するために、ｃｄｃ２キナーゼの特異的阻害剤であるＯｌｏｍｏｕｃｉｎｅ（プロメガ社製）を用いてｃｄｃ２キナーゼの阻害実験を行った。
上記実施例５  Ａ.における工程３の反応溶液に、Ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅを、０、２５、５０、又は１００μＭ入れて、実施例５  Ａ.と同一の実験を行った。【０１４０】
（結果）
結果を図９に示した。Ｏｌｏｍｏｕｓｉｎｅの濃度に依存して、ペプチドスポットのシグナル輝度は減少し、ｃｄｃ２キナーゼのリン酸化反応が阻害されていることがわかった。このことより、この反応は特異的な反応であることがわかった。更に、上記Ａ及びＢの実験により、多孔質基板表面にキナーゼ基質ペプチドを固定し、チラミド法によりキナーゼ活性測定を行うことが可能なことがわかった。
【実施例７】
【０１４１】
1. Rat（wisterオス；フェノバルビタール投与群、非投与群）の肝臓より針生検をおこない、得られた組織の全量（5mg程度）から、NIPPON GENE社ISOGENにてtotalRNAを抽出したのち、得られた全量をAmbion社MessageAmp kitを用いてビオチン化UTPの存在下でaRNA合成を行った。
2.次に、1.で合成したaRNAの全量を用いて、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションに用いたアレイは実施例１で用いた遺伝子群のプローブ以外に、外部標準遺伝子LAMDのプローブ（配列番号１２７）の希釈系列が、スポット時のオリゴ濃度として100、10、1、0.1、0.01、0mM濃度でスポットしてあるものを用いた。また、ハイブリダイゼーション時のサンプルにはこの配列と相補的な配列をもつオリゴDNAを、同濃度（10pM）混ぜた。
3.実施例1の1-12.の工程を、実施例5で得られた最適条件、さらに過酸化水素濃度0.00015%で行った後、チラミド溶液をアレイ表面にのせたのち半量をアレイ表面に吸引し、50msecの露光時間で継続的にアレイ表面の撮影を行った。
4.内部標準遺伝子GAPDHのスポットシグナル強度をモニターし2500になった際に、それぞれのサンプルを乗せたアレイでチラミド溶液をアレイ表面に全量押し上げて、洗浄液と交換したのち、洗浄を行い、100、500、1000、2000msecの露光時間で最終撮影を行った。
5.対照実験として、前記4.の工程をいずれのサンプルも5分に固定して実験を行った。
6.前記１-4の内部標準遺伝子GADPHのスポットシグナル強度によりチラミド反応時間を調整した実験では（表１）、最終撮影で撮影された画像の内部標準遺伝子のシグナル強度が投与群、非投与群のサンプルともに同一であり、実施例5の添加サンプル量を定量して同量添加した場合の実験とほぼ同一の発現比の結果を得ることができた（表２）。一方、対照群では、同一のチラミド反応時間で、非投与群で、多くのスポットがチラミド反応が飽和しており、内部標準遺伝子のシグナル強度を用いて補正した場合でも、発現比は実施例5とは大きく異なっていた（表３）。【０１４２】
【表１】
2005052583.tif 000002
【０１４３】
【表２】
2005052583.tif 000003
【０１４４】
【表３】
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【０１４５】
7.次に、外部標準遺伝子の希釈系列のシグナルは、投与群で10uM濃度で飽和しており、非投与群では100uM濃度でも飽和が見られなかった。予備実験で、外部標準遺伝子であるLAMD遺伝子のオリゴDNAを一定とし、サンプル濃度の希釈系列を作成してハイブリダイゼーションさせた結果がある。この結果と比較すると、ハイブリダイゼーションに用いたサンプル濃度は投与群ではaRNA100ng、非投与群ではaRNA400ng程度であったことを見積もることができた。対照実験では、チラミド反応時間および撮影時の露光時間が同じであったため、LAMDのシグナル強度は両サンプルで同一であった。
8.本実験により本方法により、サンプル量のわからない場合のハイブリダイゼーションであってもチラミド反応時での内部標準遺伝子のスポットシグナル強度が同一のところで反応を止めてシグナルを取得することで、正確な発現比のデータを取得することが可能であり、かつ外部標準遺伝子を一定量入れておくことで最初に投入したサンプル量を正確に見積もる事が可能である。
9.また、本方法ではチラミド反応液添加後すぐに、内部標準遺伝子GAPDHのシグナル強度が飽和した場合、投入するサンプル核酸量が定量性のある限界以上（１μg以上）であると見積もれるため、サンプルを希釈して再度実験するように促すことが可能である。
10.本方法では、投入するサンプル量が1μg以下の場合に特に有効であり、ファインニードルバイオプシ-などの微量しかサンプルが得られない場合に、増感によって検出が可能であり、かつ正確な測定を行うことができる。
【実施例８】
【０１４６】
（過酸化水素水の濃度の効果）
チラミド反応時に基質となる過酸化水素の濃度によってシグナル強度が影響されるか実験をおこなった。
1.  実施例４の方法で1-14までの工程を行ったのち、チラミド-Alexa488を溶解する過酸化水素水濃度を、0.000015から0.0015(%)の範囲で実験を行った。
2.  その結果、過酸化水素水0.00015％を用いた場合に、0.000015%、または、0.0015%の場合と比較し、アレイのシグナル強度は約1.5倍明るく、バックグラウンド値も低かった。
3.  シグナル強度とバックグラウンド強度の比較結果より、チラミド反応時の過酸化水素濃度は、0.00008〜0.0003％が好ましく、より好ましくは、0.0001%〜0.0002%であった。
【実施例９】
【０１４７】
（界面活性剤の添加の効果）
ハイブリダイゼーション時および、洗浄時に界面活性剤を入れた場合、シグナル強度に影響がでるか検討を行った。
1. 実施例４の方法で1-14までの工程でハイブリダイゼーションバッファーおよび洗浄液を、0.001%から5%の範囲でラウリルサルコシンを含有した3×SSPEに置き換えて実験を行った。
2. 0.5%ラウリルサルコシンを含有した3×SSPEを用いた場合、含有してない場合と比較してシグナル強度は2倍増加し、バックグラウンド値も約半分に減少した。
3.シグナル強度とバックグラウンド強度の比較結果より、チラミド反応時のラウリルサルコシンの濃度は、0.1〜1％が好ましく、より好ましくは、0.3%〜0.7%であった。
【実施例１０】
【０１４８】
１. ラット（wister、オス；フェノバルビタール投与群、及び非投与群）の肝臓より針生検を行い、得られた組織の全量（約５ｍｇ）から、NIPPON GENE社ISOGEN（登録商標）を用いてtotalRNAを抽出したのち、0.5μgを、QIAGEN社Label-starを用いてビオチン化ｄUTPの存在下でｃDNAの合成を行った。
２.次に、上記１．で合成したｃDNAのうち、０．１ｎｇを用いてハイブリダイゼーションを行った。
３．上記実施例１の工程１.-１２．を、上記実施例５で得られた最適条件下、更に過酸化水素濃度を０．０００１５％として行った後、チラミド溶液を、アレイ表面に載せ、その半量をアレイ表面から内部へ吸引し、５０ｍｓｅｃの露光時間で、継続的にアレイ表面の撮影を行い、ＧＡＰＤＨが２５００の値になった際に反応を停止させ、データを取得した。
４.ハイブリダイゼーションの結果は、実施例５と同等のものであった（結果示さず）。ｃＤＮＡを用いた場合には、ｃＤＮＡの断片長がaRNAと比較して長いことから、aRNAよりも少ない量でシグナルを検出することが可能であると考えられる。このことから、分析対象物質が核酸の場合には、適切な量は、０.０１ｎｇ〜１μｇである。
【実施例１１】
【０１４９】
（実施例１１）
１. ラット（wister、オス；フェノバルビタール投与群、及び非投与群）の肝臓より針生検を行い、得られた組織の全量（約５ｍｇ）から、NIPPON GENE社ISOGEN（登録商標）を用いてtotalRNAを抽出したのち、得られた全量を、Ambion社Message Amp Kitを用いてFITC-12-UTPの存在下でａRNAの合成を行った。
２.次に、上記１で合成したaＲＮＡの全量を持ちして、ハイブリダイゼーションを行った。マイクロアレイの基板としてはスライドグラスを用い、このアレイ上のプローブとしては、塩基数６０のものを１２７個用いた（配列番号１〜１２７）。これらの配列のうちコントロール配列は、内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨ（配列番号１２６）及び外部標準遺伝子ＬＡＭＤ（配列番号１２７）であり、配列表に示した。
３．３７５μｌのａRNA試料水溶液を、９９℃で５分間加熱し、次いで氷中で５分間冷却して変性させた。次に２０×SSPEストック溶液を、前記変性後の試料溶液に７５μｌ加え、４５０μｌの３×SSPE濃度とした後、この全量を、上記２のスライドガラスアレイ表面に載せた。
４．スライドガラスアレイを軽く揺らしながら、ハイブリダイゼーション反応を行った。１時間ごとにCCDカメラでアレイ表面の画像を撮影し、内部標準遺伝子GAPDHのスポットからの信号の強度が、２５００になった際に、それぞれのアレイを別個のタッパに移し、３×SSPE溶液を５ｍｌ加えて、軽く揺らしながら１時間の洗浄を３回行った。
５．アレイを風乾させた後、蛍光強度をCCDカメラで測定した。【０１５０】
（比較例）
ハイブリダイゼーション反応の進行を、CCDカメラによる１時間ごとに撮影してモニターして、内部標準遺伝子に由来する信号の強度が予め一定になった際に反応を停止する代わりに、内部標準遺伝子に由来する信号の強度の定量を行わずにハイブリダイゼーションを一晩かけてアレイの画像撮影を行う以外は、上記実施例１１と同様の構成で実験を行い、信号の強度測定を行った。【０１５１】
（結果）
上記実施例１１では、経時的な撮影の最後に撮影された画像においては、内部標準遺伝子に由来する信号の強度が、フェノバルビタール投与群及び非投与群の試料間でともに同一レベルであり、上記実施例５（添加する試料の量を定量して、同一量添加した場合）の実験とほぼ同一の発現比の結果を得ることができた。一方の比較例では、同一のハイブリダイゼーション反応時間においては、非投与群で多くのスポットが飽和しており、内部標準遺伝子由来の信号強度を用いて補正した場合でも、発現比は、試料の量を調整して行った実験とは大きく異なっていた。
【実施例１２】
【０１５２】
上記実施例１１のスライドガラスアレイを用いる代わりに多孔質のアルミニウム陽極酸化膜を有する担体を用い、更に試料溶液をポンプによって担体内外に移動させながら信号の強度の測定を行う以外は、上記実施例１１と同様の構成で実験を行った。【０１５３】
（結果）
上記実施例１１の時と比較して、約２０分の１程度の時間で、実施例１１と同様の結果を得ることができた。
【産業上の利用可能性】
【０１５４】
本発明の分析対象物質の検出方法は、病気を診断するための検査方法として、検査業界や医療業界などにおいて利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】本発明における解析画像中のゴミの数を示す図である。
【図２】本発明における解析可能なスポットの数を示した図である。
【図３】本発明において、微小量のサンプルを用いたときの解析可能なスポットの数を示した図である。
【図４】本発明における、外来受容基の有無による解析可能なスポットの数を示した図である。
【図５】本発明による方法と従来の方法との間で、解析可能なスポット数の違いを示す図である。
【図６】本発明の方法において、活性化された基質が担体に沈着する時間を変化させたときに、低発現量遺伝子及び高発現量遺伝子の検出量がどのように変化するかを示す図である。
【図７】本発明の方法において、使用する分析対象物質の濃度と、得られるシグナル強度との関係を示す図である。
【図８】従来の直接標識法による発現量比と、本発明の増感法による発現量比との間の相関関係を示す図である。
【図９】本発明の方法を使用して、Olomoucineによるｃｄｃ２キナーゼの活性阻害を調べた結果を示す図である。
【図１０】本発明の方法を使用して、分析対象物質の量を一致させずに測定した時の発現量の比と、分析対象物質の量を一致させて測定した時の発現量の比の相関関係を示した図である。
【図１１】本発明の方法を使用して、分析対象物質の量を一致させずに測定した時の発現量の比と、従来法を使用して、分析対象物質の量を一致させずに測定した時の発現量の比の相関関係を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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