(57)【要約】Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生などに関係のある、タンパク質相互作用の阻害剤、相互作用阻害剤の検出方法などを提供することを課題とする。ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤、およびＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を提供する。相互作用の阻害剤は、それぞれの組み合わせにおいて相互作用可能な条件下で、相互作用する２種のタンパク質と候補化合物とを共存せしめ、相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤とする。検出キットには、相互作用する組み合わせのタンパク質を供給する試料が備えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
【請求項２】
ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
【請求項３】
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を選択して得られた、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤。
【請求項４】
前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を示すキナーゼである、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢと候補化合物とを共存せしめ、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を選択して得られた、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤。
【請求項６】
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法。
【請求項７】
前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を示すキナーゼである、請求項６に記載の阻害剤を検出する方法。
【請求項８】
ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢと候補化合物とを共存せしめ、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出する方法。
【請求項９】
ＰＫＣθ供給試料と、ＫＰＮＡ１供給試料とを含む、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキット。
【請求項１０】
前記ＰＫＣθ供給試料がＰＫＣθをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ＫＰＮＡ１供給試料がＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターである、請求項９に記載の阻害剤を検出するキット。
【請求項１１】
前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を有するキナーゼである、請求項９または１０に記載の阻害剤を検出するキット。
【請求項１２】
ＫＰＮＡ１供給試料と、ＮＦ−κＢ供給試料とを含む、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出するキット。
【請求項１３】
前記ＫＰＮＡ１供給試料がＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ＮＦ−κＢ供給試料がＮＦ−κＢをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである、請求項１２に記載の阻害剤を検出するキット。
【請求項１４】
医薬品の開発において、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を創薬標的とすることを特徴とする方法。
【請求項１５】
医薬品の開発において、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を創薬標的とすることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、Ｔ細胞の活性調節などに関係のある伝達経路におけるタンパク質の相互作用阻害剤、相互作用阻害剤の検出方法および相互作用阻害剤の検出キットに関する。
【背景技術】
【０００２】  ＰＫＣ（プロテインキナーゼＣ）ファミリーは、Ｃａイオン、リン脂質、脂肪酸、ホスボールエステル、ジアシルグリセロールなどの各種脂質メッセンジャーとの特異的結合によって活性化されるセリン／スレオニンキナーゼであり、細胞の成長や増殖を調節している。ＰＫＣファミリーは、調節ドメインの違いにより、通常型（ＣｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌもしくはＣｌａｓｓｉｃａｌ）と新規型（Ｎｏｖｅｌ）と異型（Ａｔｙｐｉｃａｌ）の３種類のファミリーに分類される。通常型としては、α、β、γの３種がある。また、新規型としては、δ、ε、η、θの４種がある。また、異型としては、ζ、ιの２種がある。【０００３】  ＰＫＣファミリーの１種であるＰＫＣθは、Ｃａイオン非依存型の新規型に属するＰＫＣである。ＰＫＣθの機能として明らかになっているものの１つに、Ｔ細胞の活性化がある。Ｔ細胞では他のＰＫＣも発現しているが、ＰＫＣ類でＴ細胞に寄与しているのはＰＫＣθのみと考えられている。【０００４】  抗原を認識したＴ細胞は、増殖因子であるＩＬ−２（インターロイキン２）を産出し、ＩＬ−２受容体を発現し、ＩＬ−２依存的に増殖する。ＰＫＣθをノックアウトしたマウス由来のＴ細胞では、上記のような外部刺激に応答したＴ細胞の活性化が起きず、ＩＬ−２の産出が低下する（例えば、非特許文献１）。ＩＬ−２遺伝子のノックアウトマウスでは、炎症性腸疾患、溶血性貧血の発生が知られている（例えば、非特許文献２）。【０００５】  また、ＩＬ−２遺伝子の転写活性の調節にはＮＦ−κＢなどの転写因子が重要な役割を果たすことが知られている。【０００６】
【非特許文献１】Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｗ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２：３２３−３３０
【非特許文献２】Ｈｏｒａｋ  Ｉ．，（１９９５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐ；７６（３  Ｐｔ  ２）：Ｓ１７２−３
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】  Ｔ細胞やＩＬ−２などは生体の生理的機能上、特に免疫機構において極めて重要な役割を果たしている。しかし、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生などに関連する具体的な伝達経路については未だに解明されていない点も多い。Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生などに関連する伝達経路は多岐にわたり複雑であることが予測される。伝達経路の特定にはどの段階でどのような物質が関与するかということについての知見が求められるが、Ｔ細胞の活性調節などに関係する伝達経路には多数の物質が関与していると考えられ、さらには、ごく微量で機能している可能性や物質自体の安定性が低い可能性もあることから、伝達経路に関与する物質を特定することすら容易ではない。【０００８】  他方、Ｔ細胞やＩＬ−２などの何らかの異常に係る疾患の予防や治療、そのための薬剤の開発にあたっては、Ｔ細胞やＩＬ−２に関係のある伝達経路を解明することが開発に大きく寄与することとなる。伝達経路を解明することにより、新たな創薬標的（創薬ターゲット）の開拓も期待されるのである。特に伝達経路に係わるタンパク質の相互作用について新たな組み合わせを見いだすことができれば、新たに見いだされたタンパク質の相互作用を阻害する薬剤は、その相互作用の調節を可能ならしめることとなり、その伝達経路に係わる疾患の予防、治療等に利用することが可能となる。すなわち、まずは伝達経路におけるタンパク質の相互作用の新たな組み合わせを見いだすことによって、新たな創薬標的が提供され、従来の作用機序と異なる新薬の開発を促進させることが期待される。【０００９】  本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであって、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生などに関係のある、タンパク質相互作用の阻害剤、相互作用阻害剤の検出方法、相互作用阻害剤の検出キット等を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは、上記の課題に鑑み、Ｔ細胞やＩＬ−２との関連が予測される因子について研究を進め、Ｔ細胞の活性調節あるいはＩＬ−２産生などの生体情報伝達において重要な因子であるＰＫＣθ、ＮＦ−κＢなどに係わる因子についての探求を続けた。その結果、本発明者らは、ＰＫＣθやＮＦ−κＢが係わる相互作用の新たな組み合わせを見いだし、かかる知見に基づき本発明を完成させるに至った。本発明は、下記相互作用阻害剤、相互作用阻害剤検出方法および相互作用検出キット、さらには創薬標的を提供するものである。【００１１】〔１〕ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
〔２〕ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を阻害する、タンパク質の相互作用の阻害剤。
〔３〕ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を選択して得られた、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤。
〔４〕前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を示すキナーゼである、上記〔３〕に記載の阻害剤。
〔５〕ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢと候補化合物とを共存せしめ、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を選択して得られた、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤。
〔６〕ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法。
〔７〕前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を示すキナーゼである、上記〔６〕に記載の阻害剤を検出する方法。
〔８〕ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢと候補化合物とを共存せしめ、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出する方法。
〔９〕ＰＫＣθ供給試料と、ＫＰＮＡ１供給試料とを含む、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキット。
〔１０〕前記ＰＫＣθ供給試料がＰＫＣθをコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ＫＰＮＡ１供給試料がＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターである、上記〔９〕に記載の阻害剤を検出するキット。
〔１１〕前記ＰＫＣθが、恒常的なリン酸化活性を有するキナーゼである、上記〔９〕または〔１０〕に記載の阻害剤を検出するキット。
〔１２〕ＫＰＮＡ１供給試料と、ＮＦ−κＢ供給試料とを含む、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出するキット。
〔１３〕前記ＫＰＮＡ１供給試料がＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ＮＦ−κＢ供給試料がＮＦ−κＢをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである、上記〔１２〕に記載の阻害剤を検出するキット。
〔１４〕医薬品の開発において、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を創薬標的とすることを特徴とする方法。
〔１５〕医薬品の開発において、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を創薬標的とすることを特徴とする方法。
【発明の効果】
【００１２】  本発明によれば、ＰＫＣθ、ＮＦ−κＢが関連する相互作用の阻害剤、阻害剤の検出方法、検出キットが提供される。また、本発明により創薬標的が提供される。ＰＫＣθ、ＮＦ−κＢはＴ細胞の活性調節、ＩＬ−２産生などの生体情報伝達において重要な因子であり、本発明は製薬などを含むバイオテクノロジー産業に寄与するものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１はＰＫＣθとＫＰＮＡ１が細胞内で結合していることを示す図である。
【図２】図２はＰＫＣθによりＫＰＮＡ１がリン酸化されたことを示す図である。
【図３】図３はＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢの構成タンパク質であるｐ５０及びｐ６５が細胞内で結合していることを示す図である。
【図４】図４は図１の左側泳動像の一部の模式図である。
【図５】図５は図２の泳動像の一部の模式図である。
【図６】図６は図３の左側泳動像のレーン１および２の一部の模式図である。
【図７】図７は実施例４の実験結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】  以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。なお、本発明における生物化学的なあるいは遺伝子工学的な手法を実施するにあたっては、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）、新遺伝子工学ハンドブック（村松正實ら編、羊土社、実験医学別冊、第３版、１９９９年）、タンパク質実験の進め方（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第１版、１９９８年）タンパク質実験ノート（岡田雅人、宮崎香編、羊土社、第２版、１９９９年）などのような種々の実験マニュアルの記載が参照される。【００１５】（１）相互作用阻害剤
本発明の相互作用阻害剤は、Ｔ細胞の活性調節またはＩＬ−２産生に関連するタンパク質相互作用を阻害する物質であり、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤と、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤の二形態が含まれる。【００１６】（１−１）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用阻害剤
本発明の相互作用阻害剤の一形態は、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害するものである。【００１７】  ＰＫＣθはＴ細胞の活性化に影響を与える因子であり、ＩＬ−２産出に必要である。またＩＬ−２の産出には、ＮＦ−κＢなどの転写因子によりＩＬ−２遺伝子の転写が誘導されなければならない。しかしながら、如何なる伝達経路によりＰＫＣθが、ＮＦ−κＢなどの転写因子によるＩＬ−２遺伝子の転写を誘導するのかは不明であった。ここでＮＦ−κＢの転写因子としての活性化は、その細胞内局在を細胞質から核内に移行させることにより制御されていることが知られているが、その核移行に関する経路は不明であった。一方ＫＰＮＡ１は、転写因子などの核内で機能するタンパク質を認識し、これを細胞質から核まで輸送するために働くタンパク質である。本発明者らは、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用すること、およびＰＫＣθがＫＰＮＡ１を基質とし、ＫＰＮＡ１をリン酸化すること、さらにＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢが相互作用することを確認した。これらのことから、不明であったＰＫＣθからＮＦ−κＢの活性化に到る伝達経路に、タンパク質の核内輸送を担うＫＰＮＡ１が関与していることが明らかになった。【００１８】  したがって、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害する物質は、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生の調節を行うことができる蓋然性が高い物質である。すなわち、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害する物質は、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生に係る疾患の予防および／または治療薬の有力な候補物質となる。ＰＫＣθやＫＰＮＡ−１が伝達経路において直接的に関連を有する物質どうしであることについては従来まったく示唆する知見はなかったため、上記のような本形態の阻害剤が、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生に係る疾患の予防および／または治療薬の有力な候補物質となるということは、その初期的着想すら存在しなかった。また、本発明は、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１というまったく新しい相互作用の組み合わせを見いだすことにより、まったく新たに具体的な創薬標的を提供するものでもある。【００１９】  本形態の阻害剤は、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用を阻害する物質であればよく、他に特に限定されるものではない。例えば、本形態の阻害剤は材質などによって限定されるものではなく、例えばポリヌクレオチド、タンパク質などの生体物質であってもよいし、あるいは無機または有機の化学薬品などでもよい。【００２０】  本形態の阻害剤としてより具体的には、例えば、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された化合物が例示される。タンパク質の相互作用が生じたか否かの検定については下記にて別途詳説する。【００２１】（１−２）ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用阻害剤
本発明の阻害剤の他の一形態は、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を阻害するものである。【００２２】  上記のようにＫＰＮＡ１は、Ｔ細胞の活性化に影響を与える因子であるＰＫＣθと相互作用し、ＰＫＣθによってリン酸化される基質であることが本発明者らにより明らかにされた。さらにＮＦ−κＢと、タンパク質の核内輸送を担うＫＰＮＡ１と相互作用することが本発明者らにより明らかにされた。ＮＦ−κＢは核内に移行することによってＩＬ−２遺伝子の転写を活性化する因子である。【００２３】  したがって、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を阻害する物質は、ＩＬ−２の産生を抑制する蓋然性が極めて高い物質である。すなわち、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を阻害する物質は、Ｔ細胞の活性調節またはＩＬ−２の産生異常などに係る疾患を予防または治療薬の有力な候補化合物である。従来、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが伝達経路において直接的に関連を有する物質どうしであることについてはまったく示唆する知見はなかったため、上記のような本形態の阻害剤が、Ｔ細胞の活性調節やＩＬ−２の産生に係る疾患の予防および／または治療薬の有力な候補物質となるということは、初期的着想すら存在しなかった。また、本発明は、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢというまったく新しい相互作用の組み合わせを見いだすことにより、まったく新たに具体的な創薬標的を提供するものでもある。【００２４】  本形態の阻害剤は、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢの相互作用を阻害する物質であればよく、他に特に限定されるものではない。例えば、本形態の阻害剤は材質などによって限定されるものではなく、ポリヌクレオチド、タンパク質などの生体物質であってもよいし、あるいは無機または有機の化学薬品などでもよい。【００２５】  本形態の阻害剤としてより具体的には、例えば、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢと候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された物質が例示される。タンパク質の相互作用が生じたか否かの検定については下記にて別途詳説する。【００２６】（２）相互作用阻害剤検出方法
本発明の相互作用阻害剤検出方法は、Ｔ細胞の活性調節またはＩＬ−２産生に関連するタンパク質相互作用を阻害する物質の検出を行うものであり、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法と、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出する方法の二形態が含まれる。【００２７】（２−１）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法
まず、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法を例としつつ、本発明について説明する。【００２８】  本発明の一形態では、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存せしめ、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたか否かの検定を行う。ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用が可能な条件を設けることは、阻害剤の候補化合物によってタンパク質の相互作用が阻害されたことを的確に検知するための前提であり、タンパク質の相互作用が可能な条件であればよく、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもよい。好ましくは、相互作用に係るそれぞれのタンパク質相互作用における相互接触部位の立体構造が十分に保ち得る条件が好適である。【００２９】  一例としては、タンパク質を添加することができる液体溶媒などによってタンパク質の相互作用が可能な場が提供される。好ましい液体溶媒としては水溶液があげられ、液体溶媒の温度は、好ましくは常温、より好ましくは３０〜３７℃で、ｐＨは、好ましくは中性、より好ましくは６．５〜８．５に調整される。このように調製される液体溶媒には、上記のｐＨを保つ適当な緩衝剤など、他の補助的成分を配合してもよい。【００３０】  また、ＰＫＣθ、ＫＰＮＡ１の遺伝子配列は既に公知のものがあり、これらの遺伝子を遺伝子工学的に形質導入し、所定の宿主細胞内で発現させ、相互作用させてもよい。ＰＫＣθやＫＰＮＡ１の遺伝子の取得は、例えば、配列データベース等に記録された配列に基づきプローブを作成し、ｃＤＮＡライブラリーからつり出してもよいし、プライマーを作製しｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ法などにより増幅するなどして得ることができる。ＰＫＣθやＫＰＮＡ１を含有するｃＤＮＡライブラリーは市販のライブラリーから入手可能である。【００３１】  本実験系においては、ＰＫＣθとして、恒常的なリン酸化活性を示すものが好適である。恒常的なリン酸化活性を示すとは、外的因子によってリン酸化活性のスイッチがオンになったりオフになったりするようなものではなく、タンパク質の立体構造を保ち得る通常の生化学的条件下において常時リン酸化活性を発揮することをいう。また、ここでいうリン酸化活性とは、リン酸化反応を触媒する活性のことをいう。ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法においては、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用が生じたことはＫＰＮＡ１がリン酸化されたこととして検出できる。したがって、仮に不活性化したＰＫＣθを用いてしまうと偽陰性を生じ得る。そのため、上記のように恒常的なリン酸化活性を示すＰＫＣθを用いることにより、検出方法としての信頼性を向上させることできる。【００３２】  恒常的なリン酸化活性を示すキナーゼとしては、例えば配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。配列表の配列番号９に示すアミノ酸配列は、元々はＮ末端から１４８番目のアミノ酸残基がアラニンであったところを、グルタミン酸に置換して得られたものである。１４８番目のアミノ酸残基をグルタミン酸に置換することにより、リン酸化活性のスイッチがオンになった状態が保たれる。また、本発明においては、配列表の配列番号９に示すアミ��酸配列を有するタンパク質と実質的に同一のタンパク質を用いることもできる。すなわち、配列表の配列番号９に記載のアミノ酸配列において、第１４８番目がグルタミン酸であり、かつ第１４８番目のグルタミン酸以外の領域に、置換、欠失、挿入、付加および逆位からなる群より選ばれる１または数個のアミノ酸の変異を含むアミノ酸配列を有し、かつ、恒常的なリン酸化活性を有するタンパク質を用いることもできる。ここで「数個」とは、許容される変異が恒常的なリン酸化活性を大きく損なわない範囲の変異であることを意味し、数値として具体的に例示すると２〜５０個、好ましくは２〜３０個、より好ましくは２〜１０個である。【００３３】  第１４８番目のアミノ酸残基をアラニンからグルタミン酸に置換するような変異の導入は、例えば部位特異的変異法によって、本タンパク質をコードする遺伝子の特定の部位のアミノ酸が置換されるように塩基配列を改変することなどによって得られる。【００３４】  ＰＫＣθとＫＰＮＡ１とが相互作用可能な条件下で、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを共存させる。すなわち、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１と候補化合物とを接触させる。具体的には、上記のように調製した液体溶媒に、ＰＫＣθ、ＫＰＮＡ１および候補化合物を添加してもよいし、あるいは、ＰＫＣθおよびＫＰＮＡ１を発現させた細胞に候補化合物を取り込ませる若しくは候補化合物を同細胞内で発現させるなどしてもよい。【００３５】  上記のように相互作用に対する阻害作用を検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤として得る。相互作用を阻害したか否かの識別は、適当なコントロールを設けて対比させることにより容易に識別可能である。適切なコントロールには、実験系が正常に機能していることを確認するための系の他、タンパク質相互作用が生じること又はタンパク質相互作用が生じないことが予め設定された系が例示され、対比することにより、未知の候補化合物がタンパク質の相互作用を阻害するか否かを示すことができるものなどが含まれる。識別のためには、発光物質、蛍光物質、発色物質、放射性物質、マーカー遺伝子などの各種の標識物質を用い、標識物質を定性的または定量的に測定し、その測定結果の差から阻害剤か否かを判断することがきる。【００３６】  タンパク質相互作用を検定する方法は既にいくつかの方法が知られている。タンパク質の相互作用検定法として具体的には、例えば、免疫沈降法、ファーウエスタン法、ゲルろ過法、ツーハイブリッド法、エネルギートランスファー法、表面プラズモン共鳴を用いた方法などが挙げられる。本発明の検出方法においては、上記のようなタンパク質相互作用の検出方法を用い、適切なコントロール試料を設けて、阻害剤を検出するような実験系を構築すればよい。【００３７】（２−２）ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出する方法
ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出する場合には、上記ＰＫＣθおよびＫＰＮＡ１の組み合わせに変えて、ＫＰＮＡ１及びＮＦ−κＢを用いればよい。すなわち、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとが相互作用可能な条件下で、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢ候補化合物とを共存せしめ、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用が生じたか否かを検定し、相互作用を阻害したことが示された候補化合物を阻害剤として検出する。他の好ましい条件等については、上記（２−１）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出する方法と同様である。【００３８】（３）相互作用阻害剤検出キット
本発明の相互作用阻害剤検出方法は、Ｔ細胞の活性調節またはＩＬ−２産生に関連するタンパク質相互作用を阻害する物質の検出を行う試験キットであり、ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキットと、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出するキットの二形態が含まれる。ＰＫＣθ、ＫＰＮＡ１、ＮＦ−κＢの供給試料形態としては精製タンパク質の他に、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。このポリヌクレオチドを適当なベクターに組み込むことにより、これらのタンパク質を遺伝子工学的な手法により容易に実験に供給することができる。また、これらのタンパク質の相互作用および機能が保たれるならば、これらのＮ末端やＣ末端に別のタンパク質、例えばβ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン、Ｓ−トランスフェラーゼや、ペプチドタグ、例えばＨｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグを付加したものを、実験に供給することができる。【００３９】（３−１）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキット
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキットを例としつつ、さらに本発明のキットについて説明する。本発明の一形態の検出キットは、ＰＫＣθ供給試料と、ＫＰＮＡ１供給試料とを備える。ＰＫＣθ供給試料は、例えば、ＰＫＣθの精製タンパク質、ＰＫＣθをコードするポリヌクレオチドなどが挙げられる。試験キットの好ましい一形態としては、ＰＫＣθ供給試料としてＰＫＣθをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、ＫＰＮＡ１供給試料としてＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを採用する形態が挙げられる。【００４０】  検出キットは、プラスミドなどベクターの母体種類、プロモーター、選択マーカーなどは、発現ベクターとして用いられる種々の構成を採用することができる。具体例を挙げると次の通りである。【００４１】  ベクターとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、市販品としてｐＢＴ  Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＴＲＧ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）など）、酵母由来プラスミド（例、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０など）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。また、枯草菌に好適に用いられるプラスミドとして、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４などが挙げられる。【００４２】  プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主細胞が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが挙げられる。宿主細胞が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが挙げられる。また、動物細胞を宿主細胞として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＩＶ・ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。【００４３】  発現ベクターは、組換え操作についての扱いやすさの観点からマルチクローニングサイトを有することが好ましい。また、以上の他に、発現ベクターには、所望により選択マーカー、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）、ターミネーターなどを組み込むことができる。選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子（カルベニシリン耐性遺伝子でもある。以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、クロラムフェニコール耐性遺伝子（以下、Ｃａｍｒと略称する場合がある）、テトラサイクリン耐性遺伝子（以下、Ｔｅｔｒと略称する場合がある）、ジヒドロ���酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等があげられる。また、必要に応じて、宿主細胞に合ったシグナル配列を付加する。宿主細胞がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主細胞がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主細胞が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主細胞が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などをそれぞれ利用できる。【００４４】  また、本発明の検出キットには、発現ベクターを発現させるのに適した宿主細胞を備えてもよい。宿主細胞としては、例えば、連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、エシェリヒア属菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの細菌細胞；酵母、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２）およびスポドプテラＳｆ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３、ボウズ（Ｂｏｗｓ）黒色腫細胞および血球系細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。本発明の阻害剤検出方法において用いられる宿主細胞として、より好ましくは、酵母細胞、大腸菌細胞、枯草菌細胞、哺乳動物細胞などが挙げられる。【００４５】  発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら、ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９８６）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）のような、多くの標準的な実験マニュアルに記載される方法により行うことができる。より具体的には、例えばリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、陽イオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション、スクレープ負荷、バリスティック導入または感染等がある。【００４６】  宿主の培養は、宿主の種類等に応じて調節して行えばよい。宿主の種類は多数に上るが、いくつかの具体例を挙げると次の通りである。例えば、宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地は液体培地でも寒天培地でもよく、その中には形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他を配合する。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼ���ン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機塩としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがあげられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。エシェリヒア属菌を培養する際の好適な培地として具体的には、酵母エキス、トリプトン、塩（ＮａＣｌ）を含むＬＢ培地などが例示される。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、イソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトシドのような誘導剤を添加してもよい。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加える。【００４７】  宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地、０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地などが挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００４８】  また、宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ、１９５、７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。【００４９】  宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９巻、５１９（１９６７））、１９９培地（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、７３巻、１（１９５０））などが用いられる。ｐＨは約６〜８であることが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。また必要に応じて、ＣＯ２濃度の調節を行う。【００５０】  また、本発明のキットには、上記本発明の検出方法を実施するために用いられる他の検出手段を備えるようにしてもよい。例えば、本形態のキットには、上記のタンパク質相互作用の阻害を検出するために用いられる試薬類を備えることもできる。試薬類としては、定性的または定量的に測定可能な、発光物質、蛍光物質、発色物質、放射性物質などの標識物質、目的物質を特異的に検出するための抗体試薬類、実験系を適切に調整するためのｐＨ調製剤、緩衝剤、基材などの補助剤などの試薬類を適宜選択して備えることができる。また、さらに本発明のキットには、検出試験に用いる容器、制限酵素、宿主細胞培養のための培地等を備えるようにしてもよい。【００５１】（３−２）ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出するキット
ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用を検定するキットの場合には、上記ＰＫＣθおよびＫＰＮＡ１の組み合わせに変えて、ＫＰＮＡ１及びＮＦ−κＢを用いる。すなわち、本発明の検出キットの他の一形態として、ＫＰＮＡ１供給試料と、ＮＦ−κＢ供給試料と、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の検定手段とを含む、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢとの相互作用の阻害剤を検出するキットが挙げられる。好ましい一形態としては、ＫＰＮＡ１供給試料がＫＰＮＡ１をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであり、前記ＮＦ−κＢ供給手段がＮＦ−κＢをコードするポリヌクレオチドを含むベクターである。他の構成については上記（３−１）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１との相互作用の阻害剤を検出するキットと同様である。
【実施例】
【００５２】  以下、下記実施例を示し、本発明について詳細に説明する。なお、本発明は、下記実施例により限定されるものではない。【００５３】実施例１：ＰＫＣθとＫＰＮＡ１の相互作用の解析
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１が相互作用するかどうかについて、実験的に確認するために、インビボ結合試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を実施した。【００５４】１−１）ＰＫＣθの哺乳動物細胞発現プラスミドの構築
ヒトＰＫＣθのアミノ酸配列（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ：ＮＣＢＩ；アクセッション番号ＮＰ＿００６２４８）をコードするｃＤＮＡは、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行うことにより得た。ＰＣＲに用いたプライマー、ｔｈｅｔａ−Ｎとｔｈｅｔａ−Ｃの配列は、配列表の配列番号１と配列番号２にそれぞれ示す。得られたＤＮＡ断片を、哺乳動物細胞発現用ベクター、ｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に挿入した。これにより、ヒトＰＫＣθを、Ｃ末端ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付加蛋白質（以下、ＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ）として、哺乳動物細胞内で発現可能なプラスミド、ＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１を作製した。【００５５】１−２）ＫＰＮＡ１の哺乳動物細胞発現プラスミドの構築
ヒトＫＰＮＡ１のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ；アクセッション番号ＡＡＨ０３００９）をコードするｃＤＮＡは、ヒト胸腺ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行うことにより得た。ＰＣＲに用いたプライマー、ＫＰＮＡ１−ＮとＫＰＮＡ１−Ｃの配列は、配列表の配列番号３と配列番号４にそれぞれ示す。得られたＤＮＡ断片を、哺乳動物細胞発現用ベクター、ｐＣＭＶ  Ｔａｇ２Ｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に挿入した。これにより、ヒトＫＰＮＡ１を、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ付加蛋白質（以下、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１）として、哺乳動物細胞内で発現可能なプラスミド、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶを作製した。【００５６】１−３）ＰＫＣθとＫＰＮＡ１のインビボ結合試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）
ヒト胎児腎臓由来の細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、上記発現プラスミド、ＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１とＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶをトランスフェクションすることにより実験を行った。【００５７】  まず、４×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに散種し、３７℃／５％ＣＯ２存在下にて一晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてトランスフェクションを行った。その際、２μｇずつのＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１とＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ（組み合わせ１）および、陰性コントロールとして、２μｇずつのｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（ベクターのみ）とＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ（組み合わせ２）の２種類のトランスフェクションを行った。【００５８】  トランスフェクション後、３７℃／５％ＣＯ２存在下でさらに２日間培養することにより個々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷したＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により洗浄後、０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ／２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、氷中３０分間放置した。その後、１４ｋｒｐｍ、１０分間、４℃の遠心により上清を回収し、細胞抽出液を得た。回収した細胞抽出液に１０μｌのａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心により上清を回収した（Ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）。【００５９】  この上清に１０μｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え（ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１の免疫沈降）、４℃にて２時間転倒混和を行い、遠心にてアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）を回収した。さらにａｇａｒｏｓｅを０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにて４回洗浄した後、ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、５分間煮沸後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。その後、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  モノクローナル抗体（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｓｉｇｍａ社製）を用いたウエスタンブロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）により、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が免疫沈降されていることを検出した。また、ｃ−Ｍｙｃモノクローナル抗体（ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓが共沈しているかを検出した。なお、検出はＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍａｓｈｅｒｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。【００６０】  その結果を図１に示す。図１には左右２つの泳動像を示しており、各泳動像における各レーンＭ、１、２には以下に示すサンプルを電気泳動した。また、図４は図１の左側泳動像の一部の模式図を示す。
レーンＭ：分子量マーカー
レーン１：組み合わせ１をトランスフェクションさせた細胞の抽出液から、抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降したサンプル
レーン２：組み合わせ２をトランスフェクションさせた細胞の抽出液から、抗ＦＬＡＧ抗体により免疫沈降したサンプル
右側泳動像（ＷＢ；ｍｙｃ）は、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が免疫沈降されていることを示す（矢印）。左側泳動像（ＷＢ；ＦＬＡＧ）は、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１を免疫沈降することにより、ＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓが共沈したことを示す（レーン１の矢印）。なお、左右の各レーンの左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である（単位ｋＤａ）。【００６１】  まず、図１右側泳動像（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｙによるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）に示すように、組み合わせ１、２共にＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１に相当するバンド（分子量約６３ｋＤａ）が検出されており、免疫沈降実験系の妥当性が示された。そして、図１左側泳動像（ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｙによるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）に示すように、組み合わせ１においてＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓに相当するバンド（分子量約８５ｋＤａ、レーン１の矢印部）が検出されている。これは、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が細胞内でＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓと複合体を形成し供沈した事を示している。この結果から、ＰＫＣθがＫＰＮＡ１と細胞内で結合していることが確認された。【００６２】実施例２：ＰＫＣθによるＫＰＮＡ１リン酸化の解析
ＰＫＣθとＫＰＮＡ１の相互作用が確認されたことを踏まえ、ＫＰＮＡ１がＰＫＣθのリン酸化基質となるかどうかを確認するため、インビトロリン酸化実験（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）を実施した。【００６３】２−１）ＰＫＣθによるリン酸化実験の陽性コントロールおよび陰性コントロール
ＰＫＣθのリン酸化基質としてはＭＳＮが公知である（Ｓａｌｖａｔｏｒｅ  Ｆ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２７３，１３：７５９４−７６０３）。ＰＫＣθによるリン酸化実験の陽性コントロールとして用いるため、ヒトＭＳＮ蛋白質の哺乳動物細胞発現プラスミド、ＭＳＮ−Ｖ５−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を使用した。これにより細胞内で、ＭＳＮをＣ末端Ｖ５−Ｈｉｓタグ付加蛋白質（以下、ＭＳＮ−Ｖ５−Ｈｉｓ）として発現させることが可能である。【００６４】  一方、陰性コントロールとしてはＬｕｃｉｆｅｒａｓｅを使用した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅの哺乳動物細胞発現プラスミドとしてはｐＣＭＶ  Ｔａｇ２  ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いた。これにより細胞内で、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをＮ末端ＦＬＡＧタグ付加蛋白質（以下、ＦＬＡＧ−Ｌｕｃ）として発現させることが可能である。【００６５】２−２）インビトロ  リン酸化実験（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｋｉｎａｓｅ  ａｓｓａｙ）
基質となる蛋白質（ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１、ＦＬＡＧ−Ｌｕｃ、ＭＳＮ−Ｖ５−Ｈｉｓ）は以下の手順により細胞内で発現後、免疫複合体として回収した。【００６６】  まず、４×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに散種し、３７℃／５％ＣＯ２存在下にて一晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションしたプラスミドＤＮＡは、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ、ｐＣＭＶ  Ｔａｇ２  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＭＳＮ−Ｖ５−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１をそれぞれ２μｌずつである。【００６７】  トランスフェクション後、３７℃／５％ＣＯ２存在下でさらに２日間培養することにより個々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷したＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により洗浄後、０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％  Ｔｒｉｔｏｎ／２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、氷中３０分間放置した。その後、１４ｋｒｐｍ、１０分間、４℃の遠心により上清を回収し、細胞抽出液を得た。回収した細胞抽出液に１０μｌのａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心により上清を回収した（Ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）。【００６８】  この上清にＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１、ＦＬＡＧ−Ｌｕｃの場合は、１０μｌのａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を、ＭＳＮ−Ｖ５−Ｈｉｓの場合は、１０μｌのａｎｔｉ−Ｖ５  ａｇａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を加え、４℃にて２時間転倒混和を行い、遠心にてａｇａｒｏｓｅを回収した。さらにＡｇａｒｏｓｅを０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにて２回洗浄した後、ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５／５ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／２ｍＭ  ＤＴＴ／０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）にて２回洗浄した。【００６９】  以上の操作により回収された基質蛋白質に、上記ｋｉｎａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒにＡＴＰ（最終濃度１０μＭ）、ＭｎＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｓｅｒｉｎｅ（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）、ｄｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌ）、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ  ｇｌｙｃｅｒｏｌ（最終濃度０．２ｍｇ／ｍｌ）、および５μＣｉのγ３２Ｐ−ＡＴＰを加えた反応液２４．５μｌを加え、更に精製ＰＫＣθ（Ｕｐｓｔａｔｅ社製）を０．５μｌ（約３００ｎｇに相当）を加えた。これを３０℃にて３０分間反応させ、ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え５分間煮沸した。このサンプルをＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分離後、ゲルをＸ線フィルムに感光しリン酸化された基質特異的なバンドの有無を検出した。【００７０】  その結果を図���に示す。また図５には、図２の泳動像の一部の模式図を示す。陽性コントロールであるＭＳＮは、ＰＫＣθによりリン酸化され（白抜き矢頭）、陰性コントロールであるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅは、ＰＫＣθによりリン酸化されていない。この同一条件下において、ＫＰＮＡ１はＰＫＣθによりリン酸化されている（黒塗り矢頭）。なお、矢印はＰＫＣθの自己リン酸化を示しており、図の左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である（単位ｋＤａ）。【００７１】  まず全てのレーンに共通してＰＫＣθの自己リン酸化バンドが確認された（分子量約８３ｋＤａ）。次いで、陽性コントロールであるＭＳＮではリン酸化バンドが認められ（分子量約７１ｋＤａ）、陰性コントロールであるＬｕｃではリン酸化バンドが認められない（分子量約６２ｋＤａ）ことから、実験系の妥当性が確認された。この条件下において、ＫＰＮＡ１のリン酸化バンド（分子量約６３ｋＤａ）が確認された。このことから、ＫＰＮＡ１はＰＫＣθのリン酸化基質であることが確認された。【００７２】実施例３：ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢの相互作用の解析
本実験では、ＫＰＮＡ１とＮＦ−κＢが相互作用するかどうかについて確認するために、インビボ結合試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を実施した。【００７３】３−１）ＮＦ−κＢを構成するｐ５０及びｐ６５の発現プラスミドの構築
ヒトＮＦ−κＢはｐ５０とｐ６５のヘテロ２量体で構成されていることが公知である。またヒトｐ５０は、最初に前駆体であるｐ１０５（ＮＣＢＩ；アクセッション番号ＡＡＡ３６３６１）として発現し、その後細胞内で４３６番目のメチオニンと４３７番目アスパラギン酸の間で切断され、ｐ５０となることが知られている。【００７４】  ヒトｐ５０のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行うことにより得た。ｐ５０取得のためＰＣＲに用いたプライマー、ｐ５０−Ｎとｐ５０−Ｃの配列は、配列表の配列番号５と配列番号６にそれぞれ示す。なおｐ５０−Ｃの配列は、ｐ１０５の４３６番目のメチオニン（ＡＴＧ）の後に終止コドンであるＴＡＡが付加されるように設計してある。【００７５】  ヒトｐ６５のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ；アクセッション番号ＡＡＡ３６４０８）をコードするｃＤＮＡは、ヒト骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（タカラバイオ社製）を鋳型にＰＣＲを行うことにより得た。ｐ６５取得のためＰＣＲに用いたプライマー、ｐ６５−Ｎとｐ６５−Ｃの配列は、配列表の配列番号７と配列番号８にそれぞれ示す。得られたＤＮＡ断片を、哺乳動物細胞発現用ベクター、ｐＣＭＶ  Ｔａｇ２Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）にそれぞれ挿入した。これにより、ヒトｐ５０を、Ｎ末端ｍｙｃタグ付加蛋白質（以下、ｍｙｃ−ｐ５０）として、またヒトｐ６５を、Ｎ末端ｍｙｃタグ付加蛋白質（以下、ｍｙｃ−ｐ６５）として哺乳動物細胞内で発現可能なプラスミド、ｍｙｃ−ｐ５０／ｐＣＭＶとｍｙｃ−ｐ６５／ｐＣＭＶを作製した。【００７６】３−２）ＫＰＮＡ１とｐ５０およびｐ６５のインビボ結合試験（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓｓａｙ）
４×１０５個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ｃｍ  ｄｉｓｈに散種し、３７℃／５％ＣＯ２存在下にて一晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いてトランスフェクションを行った。その際、２μｇずつのｍｙｃ−ｐ５０／ｐＣＭＶとＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ（組み合わせ１）、２μｇずつのｍｙｃ−ｐ６５／ｐＣＭＶとＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ（組み合わせ２）および、陰性コントロールとして、２μｇずつのｐＣＭＶ  Ｔａｇ３  ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）とＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ（組み合わせ３）の３種類のトランスフェクションを行った。【００７７】  なお、組み合わせ３に使用したｐＣＭＶ  Ｔａｇ３  ｃｏｎｔｒｏｌは、ＬｕｃｉｆｅｒａｓｅをＮ末端ｍｙｃタグ付加蛋白質（以下、ｍｙｃ−Ｌｕｃ）として発現させることが可能な発現プラスミドである。【００７８】  トランスフェクション後、３７℃／５％ＣＯ２存在下でさらに２日間培養することにより個々の蛋白質を細胞内で一過的に発現させた。次いで、細胞を氷冷したＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）により洗浄後、０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  Ｎａ２ＥＤＴＡ／１ｍＭ  ＥＧＴＡ／１％Ｔｒｉｔｏｎ／２．５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  β−ｇｌｙｃｅｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ／１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４／１μｇ／ｍｌ  Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ／１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に懸濁し、氷中３０分間放置した。その後、１４ｋｒｐｍ，１０分間，４℃の遠心により上清を回収し、細胞抽出液を得た。回収した細胞抽出液に１０μｌのａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｎｏｒｍａｌ  ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を加え、４℃にて３０分間転倒混和した後、遠心により上清を回収した（Ｐｒｅ−ｃｌｅａｎ）。【００７９】  この上清に１０μｌのａｎｔｉ−ｍｙｃ  ａｇａｒｏｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を加え（ｍｙｃ−ｐ５０、ｍｙｃ−ｐ６５、ｍｙｃ−Ｌｕｃの免疫沈降）、４℃にて２時間転倒混和を行い、遠心にてａｇａｒｏｓｅを回収した。さらにＡｇａｒｏｓｅを０．５ｍｌのＣｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒにて４回洗浄した後、ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、５分間煮沸後、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離した。その後、ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇにより、ｍｙｃ−ｐ５０、ｍｙｃ−ｐ６５、ｍｙｃ−Ｌｕｃが免疫沈降されていることを、またａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｓｉｇｍａ社）を用いたＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇによりＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が共沈しているかを検出した。なお、検出はＥＣＬ  ｐｌｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍａｓｈｅｒｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を使用した。【００８０】  その結果を図３に示す。図３には、左右２つの泳動像を示しており、各泳動像におけるの各レーンＭ、１、２、３には以下に示すサンプルを電気泳動���た。また、図６には図３の左側泳動像のレーン１および２の一部の模式図を示す。
レーンＭ：分子量マーカー
レーン１：組み合わせ１をトランスフェクションさせた細胞の抽出液から、抗ｍｙｃ抗体により免疫沈降したサンプル
レーン２：組み合わせ２をトランスフェクションさせた細胞の抽出液から、抗ｍｙｃ抗体により免疫沈降したサンプル
レーン３：組み合わせ３をトランスフェクションさせた細胞の抽出液から、抗ｍｙｃ抗体により免疫沈降したサンプル
右側泳動像（ＷＢ；ｍｙｃ）は、レーン１でｍｙｃ−ｐ５０、レーン２でｍｙｃ−ｐ６５、レーン３でｍｙｃ−Ｌｕｃが免疫沈降されていることを示す（レーン１、２、３における各矢印）。左側泳動像（ＷＢ；ＦＬＡＧ）は、レーン１ではｍｙｃ−ｐ５０を免疫沈降することにより、レーン２ではｍｙｃ−ｐ６５を免疫沈降することにより、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が共沈したことを示す（レーン１および２における各矢頭）。なお、左右の各レーンの左側に示した数値は分子量マーカーの分子量である（単位ｋＤａ）。【００８１】  まず、図３右側泳動像（ｃ−Ｍｙｃ（９Ｅ１０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  によるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）に示すように、組み合わせ１、２、３にそれぞれｍｙｃ−ｐ５０（分子量約５２ｋＤａ）、ｍｙｃ−ｐ６５（分子量約６５ｋＤａ）、ｍｙｃ−Ｌｕｃ（分子量約６２ｋＤａ）に相当するバンドが検出されており、免疫沈降実験系の妥当性が示された。一方、図３左側泳動像（ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＡｎｔｉｂｏｄｙによるＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）に示すように、組み合わせ１および２においてＫＰＮＡ１相当するバンド（分子量約６３ｋＤａ）が検出されている。また陰性コントロールである組み合わせ３においては、ＫＰＮＡ１相当するバンド（分子量約６３ｋＤａ）が検出されていない。これはＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１が細胞内でｍｙｃ−ｐ５０ならびにｍｙｃ−ｐ６５と複合体を形成している事を示している。この結果から、ＫＰＮＡ１はＮＦ−κＢと細胞内で結合していることが確認された。【００８２】実施例４：ＫＰＮＡ１のリン酸化によるＮＦ−κＢの転写活性の変動
ＰＫＣθによりＫＰＮＡ１がリン酸化されることで、ＮＦ−κＢの転写活性が影響をうけるかどうかを、以下のようにルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて検討した。【００８３】４−１）実験材料
４−１−１）宿主細胞
レポーターアッセイには、宿主細胞としてＪｕｒｋａｔ，Ｃｌｏｎｅ  Ｅ６−１（大日本製薬株式会社製、以下Ｊｕｒｋａｔ細胞と記す）を使用した。Ｊｕｋｒｋａｔ細胞は、ヒト急性白血病由来のＴ細胞から樹立された細胞株であり、抗原認識に伴うＴ細胞活性化、特にＩＬ−２の遺伝子発現の解析のモデル細胞として一般的に使用されているものである。Ｊｕｒｋａｔ細胞で、ＰＫＣθ、ＫＰＮＡ１およびＮＦ−κＢは発現している。【００８４】４−１−２）活性型ＰＫＣθおよび不活性型ＰＫＣθの哺乳動物細胞発現プラスミドの構築
ＰＫＣθは、調節ドメインとキナーゼドメインの２つの領域から構成されている。通常、活性化されていないＴ細胞内においてＰＫＣθはリン酸化酵素としては不活性化されている。それは、調節ドメインにある偽基質領域（ＰＫＣθ自身の基質となる配列に類似した配列を備える領域）がキナーゼドメインの触媒クレフトに入り込み、キナーゼ活性を阻害しているからである。しかし、Ｔ細胞活性化に伴い産出されるジアシルグリセロールなどの脂質メッセンジャーが調節ドメインに結合することによりＰＫＣθは構造変化を起こし、調節ドメインがキナーゼドメインから離れる。これによりＰＫＣθはリン酸化酵素として活性化された状態になり、Ｔ細胞活性化のシグナルが伝達されて行く。【００８５】  ＰＫＣθは、７０６アミノ酸残基からなるが、偽基質領域内の１４８番目のアラニンをグルタミン酸に変異させると先に述べた構造変化と同等の構造変化を起こす。従って、この変異を持つＰＫＣθ（以下、ＰＫＣθＡＥと記す）は、恒常的にリン酸化酵素として活性化されている。また、ＰＫＣθＡＥを過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞では、抗原認識などの刺激を加えなくても、ＩＬ−２の転写活性化が起きることが知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６  Ａｐｒ；１６（４）：１８４２−５０．）。【００８６】  また、ＰＫＣθのキナーゼドメイン内の４０９番目のリジンをアルギニンに変異させると、リン酸化酵素として不活性化されることが知られている。このリジンは、結合したＡＴＰのγ位のリン酸基を、リン酸化を受ける基質側水酸基に配向する役割を果たしている。このため、この変異を持つＰＫＣθ（以下、ＰＫＣθＫＲと記す）では、基質に対してリン酸基の受け渡しがうまく行われないため、リン酸化酵素として不活性化の状態となり、これを過剰発現させたＪｕｒｋａｔ細胞では、抗原認識などの刺激を加えても、内在性のＰＫＣθがあるにも関わらず、ＩＬ−２の転写活性化が起きないことが知られている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １９９６  Ａｐｒ；１６（４）：１８４２−５０．）。【００８７】  本実験では、ＰＫＣθによりＫＰＮＡ１がリン酸化されている状態と、リン酸化されていない状態それぞれについてＮＦ−κＢの転写活性を測定する必要があったので、以上の知見からＰＫＣθＡＥおよびＰＫＣθＫＲの各発現プラスミドを作製した。【００８８】  ＰＫＣθＡＥおよびＫＲの各発現プラスミドの作製には、上記実施例１の「ＰＫＣθとＫＰＮＡ１のインビボ結合試験」に使用したＰＫＣθ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１を利用した。野生型ＰＫＣ・タンパク質をコードするＤＮＡ対し、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて変異を導入し、アミノ酸配列の１４８番目のアラニンをグルタミン酸にいれたもの（以下、ＰＫＣθＡＥ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１と記す）、あるいは４０９番目のリジンをアルギニンに変換したもの（以下、ＰＫＣθＫＲ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１と記す）の２種を作製した。ＰＫＣθＡＥのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に、ＰＫＣθＫＲのアミノ酸配列を配列表の配列番号１０に示す。【００８９】  ついで、ＰＫＣθＡＥおよびＫＲを哺乳動物細胞内でより安定して発現させることを目的として、発現ベクターをｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−ＨｉｓからｐＣＩベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に変更した。このベクターはヒトサイトメガロウィルスのエンハンサー／プロモーターの下流に、人工的に作製したイントロンを組み込んであり、これによりその下流に挿入した遺伝子の発現をより安定かつ高レベルな状態にすることが出来る。ＰＫＣθＡＥ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１およびＰＫＣθＫＲ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐｃＤＮＡ３．１を制限酵素Ｋｐｎ  ＩとＰｍｅ  Ｉで処理することにより、Ｃ末端ｍｙｃ−Ｈｉｓタグ付きのＰＫＣθＡＥあるいはＫＲをコードするＤＮＡ断片をそれぞれ調製し、ｐＣＩベクターのＫｐｎ  ＩサイトとＰｍｅ  Ｉサイトの間に組み込んだ。これによりＰＫＣθＡＥ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐＣＩならびにＰＫＣθＫＲ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐＣＩを得た。これを用いてＣ末端にｍｙｃ−Ｈｉｓタグが融合したＰＫＣθＡＥおよびＫＲをＪｕｒｋａｔ細胞内でそれぞれ発現させた。【００９０】４−２）トランスフェクションおよびレポーターアッセイ
ＮＦ−κＢの転写活性検出用レポータープラスミドは、ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を使用した。これはホタルルシフェラーゼをコードするＤＮＡの上流に、ＮＦ−κＢが転写活性化因子として働くために必要なエンハンサー配列（５’−ＴＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＧＣ−３’配列番号１１）を５回繰り返して挿入されているものである。すなわち、レポータープラスミドｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃには、ＮＦ−κＢが結合する配列部位（ＮＦ−κＢ結合領域）と、このＮＦ−κＢ結合領域の下流にレポーターとなるホタルルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれている。ホタルルシフェラーゼ活性が検出されれば、ＮＦ−κＢがＮＦ−κＢ結合領域に結合し、転写活性化因子として作動していることが示される。また、内部標準としてｐｈＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用した。これは単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼのプロモーター配列の下流にウミシイタケのルシフェラーゼが挿入されているレポータープラスミドである。【００９１】  ＫＰＮＡ１の哺乳動物細胞内発現プラスミドは、上記「ＰＫＣθとＫＰＮＡ１のインビボ結合試験」に使用したＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶを使用した。【００９２】  また、トランスフェクションする際の総ＤＮＡ量を合わせるため、ＰＫＣθＡＥやＫＲを組み込むのに用いたｐＣＩベクター、あるいはＫＰＮＡ１をを組み込むのに用いたｐＣＭＶ  Ｔａｇ２を用いた。なお、ＮＦ−κＢは細胞に内在するものを利用した。【００９３】  １ｘ１０５個のＪｕｒｋａｔ細胞を１２ウェルプレートに散種し、１晩培養後、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）３μｌを用いてトランスフェクションを行った。トランスフェクションに用いたプラスミドＤＮＡは、ｐＮＦ−κＢ−Ｌｕｃを１９０ｎｇ、ｐｈＲＬ−ＴＫを１０ｎｇ、ＰＫＣθＡＥ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐＣＩあるいはＰＫＣθＫＲ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐＣＩを４００ｎｇ、ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶとｐＣＭＶ  Ｔａｇ２をあわせて４００ｎｇとし、合計１μｇとした。ＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶは０、１００、２００、３００、４００ｎｇと加える量を変動させた。また４００ｎｇのＦＬＡＧ−ＫＰＮＡ１／ｐＣＭＶ単独の効果を見るときは、ｐＣＩベクターを４００ｎｇ加えた。【００９４】  トランスフェクション後、さらに４８時間培養し、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて、ホタルルシフェラーゼ活性とウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ついで、ホタルルシフェラーゼ活性をウミシイタケルシフェラーゼ活性で除することで補正値を算出した。さらに、ＰＫＣθＫＲ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ｐＣＩを４００ｎｇとｐＣＭＶ  Ｔａｇ２を４００ｎｇトランスフェクションした時の補正値を１として、その他組み合わせにおける補正値の相対値を算出し、ＮＦ−κＢの転写活性に依存して発現するホタルルシフェラーゼ活性の変動を数値化した。なお、実験は独立に６回行い、平均値と標準偏差も算出した。【００９５】  結果
平均値に標準偏差もあわせグラフ化した実験結果を図７に示す。【００９６】  まず、リン酸化酵素として活性化しているＰＫＣθＡＥを単独で発現させることでＮＦ−κＢの転写活性がＰＫＣθＡＥ単独と比較して約６倍にまで上昇しており、系の妥当性が示された。また、ＰＫＣθＡＥとＫＰＮＡ１を共発現させることにより、ＫＰＮＡ１の発現量の増加に伴いＮＦ−κＢの転写活性が上昇していることが示され、ＰＫＣθＡＥ単独に比べさらに約６．４倍まで上昇した。さらにこの現象は、リン酸化酵素として不活性化しているＰＫＣθＫＲとＫＰＮＡ１の共発現、ならびにＫＰＮＡ１単独において全く観察されなかった。【００９７】  以上の結果から、ＫＰＮＡ１はＰＫＣθと結合し、かつＰＫＣθによりリン酸化されることにより、結果としてＮＦ−κＢの転写活性因子としての機能が増強されることになることが明らかとなった。【００９８】  以上の実施例１から４の結果に基づくと、ＩＬ−２の発現経路の一つとして、次のような経路が存在すると考えられる。まずＰＫＣθにより、転写因子などを核内へ輸送するタンパク質であるＫＰＮＡ１がリン酸化される。ＫＰＮＡ１はリン酸化されることにより、より効率的にＮＦ−κＢと複合体を形成し、この複合体によってＮＦ−κＢが核内へ輸送される。そして、核内に移行したＮＦ−κＢがＩＬ−２遺伝子の転写を促進するという経路が存在するものと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９９】  本発明は、バイオテクノロジー産業などで利用可能である。本発明は、医薬、生物学的試薬などの開発・製造産業において好適である。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】配列番号１；プライマー（ｔｈｅｔａ−Ｎ）
配列番号２；プライマー（ｔｈｅｔａ−Ｃ）
配列番号３；プライマー（ＫＰＮＡ１−Ｎ）
配列番号４；プライマー（ＫＰＮＡ１−Ｃ）
配列番号５；プライマー（ｐ５０−Ｎ）
配列番号６；プライマー（ｐ５０−Ｃ）
配列番号７；プライマー（ｐ６５−Ｎ）
配列番号８；プライマー（ｐ６５−Ｃ）
配列番号９；ＰＫＣθＡＥのアミノ酸配列
配列番号１０；ＰＫＣθＫＲのアミノ酸配列
配列番号１１；ＮＦ−κＢのエンハンサー配列
【図１】
2005017146.tif 000002
【図２】
2005017146.tif 000003
【図３】
2005017146.tif 000004
【図４】
2005017146.tif 000005
【図５】
2005017146.tif 000006
【図６】
2005017146.tif 000007
【図７】
2005017146.tif 000008
【国際調査報告】
2005017146.tif 000009
2005017146.tif 000010
2005017146.tif 000011
2005017146.tif 000012
2005017146.tif 000013
2005017146.tif 000014