(57)【要約】（１）リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、酸化物を生成するような基質と酸化還元酵素、その他反応に必要とされる物質および酸化型メディエーターを用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンを測定する方法または（２）リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して最終的にβ−Ｄ−グルコースを生成する基質と、このβ−Ｄ−グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素の存在下で反応させてβ−Ｄ−グルコースを生成させ、さらに生成したβ−Ｄ−グルコースを、酸化還元酵素の存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定する方法および（３）基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、これらの酵素および試薬が作用極上および／またはその付近に配置されたリン酸イオンセンサ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して酸化物となる基質とこの酸化物を生成するための反応を触媒する酸化還元酵素の存在下で反応させるに際し、酸化型メディエーターを共存させることにより生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項２】
リン酸イオンを、ピルビン酸オキシダーゼ、マグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロリン酸および酸化型メディエーターの存在下でピルビン酸と反応させ、アセチルリン酸と共に生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項３】
アセチルリン酸に酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを作用させ、リン酸を再生することを特徴とする請求項２記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項４】
リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して最終的にβ−Ｄ−グルコースを生成する基質と、このβ−Ｄ−グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素の存在下で反応させてβ−Ｄ−グルコースを生成させ、さらに生成したβ−Ｄ−グルコースを、酸化還元酵素の存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項５】
リン酸イオンを、マルトースホスホリラーゼの存在下でマルトースと反応させてβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生成させ、さらに生成したβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸を酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、β−Ｄ−グルコースおよびリン酸を生成させ、得られたβ−Ｄ−グルコースをグルコースオキシダーゼおよび／またはグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項６】
リン酸イオンを、マルトースホスホリラーゼおよびマルトースと共に、またはこれらの代わりに、スクロースホスホリラーゼの存在下でスクロースと反応させてα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を生成させ、生成したα−Ｄ−グルコース−１−リン酸を酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、α−Ｄ−グルコースおよびリン酸を生成させ、さらに生成したα−Ｄ−グルコースにムタロターゼを作用させてβ−Ｄ−グルコースを生成させ、得られたβ−Ｄ−グルコースをグルコースオキシダーゼおよび／またはグルコースデヒドロゲナーゼの存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項７】
酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、β−Ｄ−グルコースおよびリン酸を生成させると共に、またはこれの代わりに、β−Ｄ−グルコース−１−リン酸と共に得られたα−Ｄ−グルコースにムタロターゼを作用させてβ−Ｄ−グルコースを生成させる請求項５記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項８】
酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを用いて、α−Ｄ−グルコースおよびリン酸を生成させると共に、またはこれの代わりに、α−Ｄ−グルコース−１−リン酸と共に得られたフルクトースにグルコースイソメラーゼを作用させてβ−Ｄ−グルコースを生成させる請求項６記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項９】
酵素反応の基質であるリン酸イオンを、基質のリサイクル反応を起こす組み合わせによって検出することを特徴とする請求項３、５または６記載のリン酸イオンの検出方法。
【請求項１０】
酸化型メディエーターとして、フェリシアン化カリウム、フェロセンまたはパラベンゾキノンが用いられる請求項１乃至９のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１１】
リン酸イオンとして、ピロリン酸イオンに無機ピロホスファターゼを作用させたものが用いられる請求項１乃至１０のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１２】
核酸の検出、核酸特異配列または核酸のシークエンス、核酸増幅反応および受容体の挙動のモニタリング、リン酸イオンまたはピロリン酸イオンが触媒反応に関与する酵素の活性測定に用いられる請求項１乃至１１のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１３】
リン酸イオンが触媒反応に関与する酵素がピルビン酸オキシダーゼまたは前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼである請求項１２記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１４】
リン酸イオン以外の基質が１０ｍＭ以上の濃度で用いられる請求項１３記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１５】
連結酵素（リガーゼ）の触媒作用により生成するピロリン酸イオンを検出することで、遺伝子多型（ＳＮＰｓ）の検出を可能とする請求項１１記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１６】
リン酸イオンの検出に、酸化型メディエーターを使用した既製のセンサが用いられる請求項１乃至１５のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１７】
酸化型メディエーターを使用した既製のセンサが血糖センサである請求項１６記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１８】
基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、請求項１乃至１５記載のいずれかに記載の酵素および試薬が作用極上および／またはその付近に配置されたリン酸イオンセンサ。
【請求項１９】
請求項１８記載のバイオセンサと、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測部における計測値を表示する表示部と、計測値を保存するメモリー部とを備えたバイオセンサ装置。
【請求項２０】
計測部における計測方法としてポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法またはサイクリックボルタンメトリー法が適用される請求項１９記載のバイオセンサ装置。
【請求項２１】
さらにバイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段を備え、無線手段が非接触型ＩＣカードまたは短距離無線通信である請求項１９または２０記載のバイオセンサ装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、リン酸イオンの定性・定量法およびリン酸イオンセンサに関する。さらに詳しくは、電子伝達を利用するメディエーターを使用し、試料液中のリン酸イオンを電気化学的に検出し、定性または定量可能なリン酸イオンの定性・定量法およびそれに用いられるリン酸イオンセンサに関する。
【背景技術】
【０００２】  従来、リン酸イオンの定量法としては、吸光光度法、容量法、原子吸光法、重量法、バイオセンサ法等の測定方法が知られている。吸光光度法の中には、モリブドリン酸法、モリブデンブルー法、バナドモリブドリン酸法等がある。これらの測定法は、各試薬をリン酸に反応させた後、それぞれの反応物質に特有な波長の吸収光を照射して吸光度を測り、その結果からリン酸イオンの含有量を測定する方法である。また、容量法は、反応の終点まで濃度既知の塩基を加えその容量を測定することにより、リン酸イオンの含有量を測定する方法であって、中和滴定やキレート滴定等がある。さらに、原子吸光法は、一旦リン酸をモリブデン酸アンモニウムとして沈澱させ、これをろ過し、再び溶解させてモリブデンを原子吸光で定量する方法であり、重量法は、マグネシア混液中でマグネシウムと沈澱を生じさせた後、焼成してＭｇ２Ｐ２Ｏ７を秤量する方法である。【０００３】  しかしながら、上記吸光光度法では、測定物質の固有波長に近似した波長を有する他の物質の影響を受けるため、正確な測定値を得られ難いという不具合がある。一方、容量法、原子吸光法、重量法などは正確な定量を行えるが、操作に熟練を要するため使用者の制限があり、さらに携帯ができないため、オンサイトモニタリング（現場測定）など、現場での簡便かつ迅速な測定が不可能であるという不具合がある。さらに、上記のいずれの方法も、リン酸イオンを測定するための化学反応に重金属イオンなど、環境に負荷を与える物質を使用するという問題点があった。【０００４】  こうした問題を解決するために、バイオセンサが注目されるようになった。バイオセンサを使用するリン酸イオンの測定には、材料として生体認識素子など、生体由来の材料が多く使用され、環境への影響が少ないため、極めて優れた方法であるといえる。そのために、これまで多くのバイオセンサが提案されている。そして、リン酸イオン計測用の卓上型自動計測装置も研究開発され、その成果が報告されている。【０００５】  バイオセンサ法によるリン酸イオンの定量法には、これまでに多くの報告がある。まず、最初に報告されたのはアルカリホスファターゼとグルコースオキシダーゼを組み合わせたリン酸イオンセンサである。
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この酵素反応系では、試料液中のリン酸イオンによってアルカリホスファターゼ反応（１）が阻害される。この阻害の度合いが、グルコースオキシダーゼ反応（２）で消費される酸素量として求められる。これらの酵素は、白金電極上に膜を使用して固定化されており、酸素消費量からリン酸イオン濃度が求められる。【０００６】  その後、微細藻類や植物を用いるリン酸イオン計測用バイオセンサが提案された。このセンサは、緑藻類の一種であるＣｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓを認識素子として用い、これと酸素電極を組み合わせた微生物センサによりリン酸イオン計測を行った。この微生物センサは、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓがリン酸イオンの存在下で、光合成による酸素発生量が著しく増加することを利用したものであり、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓを酸素電極上の光透過性膜に吸着固定し、この電極と反射ランプとを組み合わせ、酸素増加量を電気化学的に測定するという原理に基づいている。【０００７】  また、植物を利用した方法としては、酸性ホスファターゼを多く含むＳｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍの組織切片にグルコースオキシダーゼを加え、リン酸イオンによる阻害作用の原理を利用してリン酸イオン濃度を電気化学的に計測するセンサシステムとしたものがある。さらに、同じ原理で酸性ホスファターゼ反応の阻害を利用した方法が、ジャガイモの組織切片を用いて行われている。【０００８】  一方、ヌクレオシドホスフォリラーゼとキサンチンオキシダーゼ反応を組み合わせた酵素センサの開発も広く行われている。
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これらの酵素反応系を用いた最初のセンサは、２つの酵素反応（３）、（４）によって生成した過酸化水素を電極で測定して、リン酸イオン濃度を計測するものである。【０００９】  尿酸と渦酸化水素の２つの反応生成物を同時に測定するセンサも提案され、高感度化に成功した。さらに、アルカリホスファターゼ反応を用いて、リン酸イオンを増幅して高感度化を図り、またフローインジェクション分析（ＦＩＡ）法によって、あるいはＦＩＡ法と化学発光法を組み合わせて、それぞれリン酸イオンを高感度に計測可能としている。このように（３）と（４）の反応を組み合わせた多くのセンサが報告されている。【００１０】  ピルビン酸オキシダーゼ反応と電極法、化学発光法を利用したリン酸イオンセンサも提案されており、ピルビン酸オキシダーゼの反応式は以下の如くである。
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この酵素反応ではこれまで開発されたセンサとは異なり、１種類の酵素のみが反応に寄与する特徴を有している。しかし、電極法を用いた電流測定型センサは、ピルビン酸オキシダーゼ反応（５）で消費された酸素の濃度を測定して、リン酸イオン濃度を計測している。【００１１】  次に化学発光法に着目し、ＦＩＡ型酵素センサの開発が行われ、このセンサは送液ポンプとインジェクター、酵素固定化カラム、ミキシングジョイント、化学発光検出部、レコーダーから構成されている。このセンサでは、ピルビン酸オキシダーゼをグルタルアルデヒドによる共有結合法を用いて多孔性ガラスビーズに固定化し、これをカラムに充填しており、発光試薬液としては発光体としてルミノールと、その反応を触媒するペルオキシダーゼとが使用されている。【００１２】  しかしながら、リン酸イオン測定用バイオセンサでは、酵素反応によって減少する酸素濃度または生成する過酸化水素濃度を測定する方式に限られていたため、溶存酸素濃度の影響が避けられない。さらに、酸素濃度または過酸化水素濃度を電極で計る場合には、電極間の印加電圧の設定を高くする必要があり、印加電圧を上げることは、例えば夾雑物質を多く含む環境水や食品、体液などに含まれる還元性の物質の影響を受けやすく、正確な測定を困難にするという問題がみられる。同様に、過酸化水素濃度をルミノールの化学発光法により測定することで、リン酸イオン濃度を測定するセンサにおいても、高感度ではあるが特異性に劣る化学発光法を用いることにより、還元性の物質などを始めとする種々の夾雑物質の影響を避けることができない。【００１３】  さらに、測定感度および得られる信号の再現性を向上させるために、使用する酵素をカラム内に充填したビーズに多量に固定化する必要があり、その固定化に煩雑な操作と酵素の扱いについての熟練を要するなどの問題があった。【００１４】  以上で述べたリン酸イオンの測定法およびリン酸イオンセンサは全て、試料液中の夾雑物質および溶存酸素の影響が避けられず、さらに測定には家庭用の電源を要すること、装置が持ち運びできないこと、使い捨て型でないために、カラムや電極表面に固定化した酵素は繰り返しの使用に耐え得る程度の安定性が要求されていたことなど、共通した多くの問題点を有している。【００１５】  最近になって、新しい酵素反応系を用いる化学発光とＦＩＡシステムを組み合わせたリン酸イオン計測用バイオセンサが提案された。この反応系では、マルトースとリン酸イオンを基質とするマルトースホスフォリラーゼ反応から始まり、その生成物であるα−Ｄ−グルコースはムタロターゼによってβ−Ｄ−グルコースになり、グルコースオキシダーゼ反応によって過酸化水素を生成するので、過酸化水素を含む接触液にペルオキシダーゼ／ルミノール系検出試薬を混合して生ずる化学発光の発光量を測定して、リン酸イオン濃度を測定している。このセンサのリン酸イオンの検出下限は１０ｎＭ（０．００１ｐｐｍ）であり、環境計測には十分な感度であった。しかるに、あくまで過酸化水素を測定するものであるため、妨害物質の影響を受けやすいといった問題点があった。また、ＦＩＡ法を用いているため、センサを携帯することは難しかった。【００１６���
【特許文献１】特公平０８−０２０４０１号公報
【特許文献２】特開平０５−０９３６９２号公報（特許第２，５９５，１４１号公報）
【特許文献３】特開平０９−２２００８５号公報
【特許文献４】特開平１１−２９００９６号公報
【非特許文献１】Ｔａｌａｎｔａ  第５０巻，第７９９−８０７頁（１９９９年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】  本発明の目的は、被検査試料液中の溶存酸素濃度や塩分、夾雑物質等の影響を受けることなく、リン酸イオンを正確に測定することが可能なリン酸イオン濃度の測定法およびそれに用いられる携帯可能な使い捨てタイプのリン酸イオンセンサを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１８】  かかる本発明の目的は、（１）リン酸イオンと反応して酸化物となる基質とこの酸化物を生成するための反応を触媒する酸化還元酵素の存在下で反応させるに際し、酸化型メディエーターを共存させることにより生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定する方法または（２）リン酸イオンを、リン酸イオンと反応して最終的にβ−Ｄ−グルコースを生成する基質と、このβ−Ｄ−グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素の存在下で反応させてβ−Ｄ−グルコースを生成させ、さらに生成したβ−Ｄ−グルコースを、酸化還元酵素の存在下で酸化型メディエーターと反応させ、生じた還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定する方法および（３）基板上に作用極、対極を備えたセンサにおいて、これらの酵素および試薬が作用極上および／またはその付近に配置されたリン酸イオンセンサよって達成される。
【発明の効果】
【００１９】  本発明方法により、メディエーターを用いることで、試料液中の夾雑物質、塩分や溶存酸素の影響を受けず、例えば前記過酸化水素系に比べて大きな出力値を得ることができるので、リン酸イオンを始めとする種々の測定対象物質を正確に測定することが可能となる。また、本発明方法（１）では単純な酵素反応系を用いているため、使用する酵素の数が少なく、簡便にセンサを製造・使用することが可能であり、製造・操作コスト的にも有利である。さらに繰り返し再現性の高いセンサの構築も可能となる。【００２０】  また、オンサイトモニタリングを実現する使い捨てバイオセンサに本発明方法を応用することにより、携帯可能（ｏｎ−ｓｉｔｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）な使い捨てタイプのリン酸イオンセンサが提供される。さらに、本発明方法（１）および（２）において、リン酸イオン以外の基質を十分に存在させた場合には、酸性ホスファターゼ活性が測定可能であり、前立腺の腫瘍マーカーの検出に用いることもできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】  本発明方法（１）においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、酸化物を生成するような基質と酸化還元酵素、その他反応に必要とされる物質および酸化型メディエーターを用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンが測定される。【００２２】  酸化物を生成するような触媒反応系としては、例えば前記式（５）に示されるようなものが挙げられる。
（１）ピルビン酸オキシダーゼ系
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この反応は、リン酸イオンを酸化還元酵素であるピルビン酸オキシダーゼと基質であるピルビン酸、補酵素としてのフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）および活性化剤としてのマグネシウムイオンの存在下で反応させるものである。ここで反応に際し、電子伝達体としての酸化型メディエーターを共存させると、還元型メディエーターが発生するため、この還元型メディエーターをさらに酸化することにより生じた電流を測定することで基質であるリン酸イオンの定性・定量が可能となる。【００２３】  メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、パラベンゾキノンなどが用いられる。メディエーターとして、フェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いた場合には、ピルビン酸等との反応は次のように進行する。
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この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。
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【００２４】  また、メディエーターとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、ピルビン酸オキシダーゼ存在下でのピルビン酸とパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。
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【００２５】  ピルビン酸がピルビン酸オキシダーゼ等の酵素の存在下で酸化されてアセチルリン酸を生成させ、そのとき発生するＨ２Ｏ２を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、リン酸イオン濃度を間接的に求める方法は従来技術で述べた如くである。しかしながら、かかる方法では、測定液が海水など妨害物質を含む場合には正確なリン酸濃度を測定することができない。しかるに、メディエーターをピルビン酸オキシダーゼ等と共に用いると、妨害物質に影響を受けることなくリン酸濃度を正確に測定することが可能となる。【００２６】  リン酸イオンの測定には、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上および／またはその付近に測定に必要な酵素および試薬を配したセンサが好んで用いられる。このようなセンサとしては、例えばセラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料（例えば、微生物生産ポリエステル等）などの絶縁性基板にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作用極上および／またはその付近に架橋法、共有結合法、イオン結合法等により酵素および試薬を固定化したものなどが用いられる。【００２７】  かかるリン酸濃度の測定に際しては、既製のメディエーターを使用しているバイオセンサ、例えばグルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４．）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７、１．１．１．１１８、１．１．１．１１９、１．１．９９．１０．）またはピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素およびメディエーターを使用する血糖センサ、血中乳酸センサおよび食品用のグルコースセンサ等を用いることができ、これらとしては市販のもの、例えば血糖センサとしては、アークレイ製品グルテストＰＲＯ  Ｒ（グルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウム使用）、同社製品グルテストＮｅｏ（グルコースデヒドロゲナーゼおよびフェリシアン化カリウム使用）、ＴｈｅｒａＳｅｎｓｅ社製品フリースタイル（ピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼおよびオスウミウム複合体使用）等を、血中乳酸センサとしては、京都第一科学製品ラクテート・プロ（乳酸オキシダーゼとフェリシアン化カリウムを使用）およびグルコースセンサとしては、ＮＯＫ製品グルコースメーターＧＭ１０００（食品用、グルコースオキシダーゼとフェリシアン化カリウムを使用）等をそのまま用いることもできる。すなわち、市販の血糖センサに配されているメディエーターおよび電極等を使用することにより、簡便にリン酸イオンの定性・定量が可能となる。ただしこの場合には、予めグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼなどを使用して、試料液中のグルコースを消去しておく必要がある。【００２８】  血糖センサは、グルコースを測定することを目的とするものであって、一般には、上記の如き絶縁性基板に白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作用極上および／またはその付近にグルコースオキシダーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼなどの酸化還元酵素およびメディエーターを配置したものである。市販の血糖センサは、センサ自身��包装により湿気や光などの影響を絶った状態で保存されているため持ち運びに便利であり、センサの反応検出部における電極表面は試薬層により保護されているため、それを用いた場合には、場所を選ぶことがなく手軽に測定が可能であるというバイオセンサの新しい特徴が発揮される。このような血糖センサは、近年の開発競争の激化によって、測定の精度や再現性などが年々向上している。また、血糖センサは、夾雑物質に富んだ血液（全血）中にわずかに溶けているグルコースを選択的に測定するために、基質特異性に優れた酵素であるグルコースオキシダーゼまたはグルコースデヒドロゲナーゼを使用して触媒反応を進行させ、その際に生成する電子を電子伝達体（メディエーター；Ｍｅｄ）を介して電極に伝える仕組みとなっており、従来の溶存酸素および過酸化水素測定型のグルコースセンサと比べて血液中に僅かに溶けている溶存酸素や妨害物質、塩分（０．９％ＮａＣｌ）の影響を受けないという極めて優れた特徴を有している。さらに、市販の血糖センサを使用することによって、通常の電極チップを測定に用いる場合とは異なり、電極表面を使用前に処理する必要がない、すなわち通常の電極をバイオセンサに応用する場合には、電極表面の洗浄および酸化皮膜を除去するための何らかの処理が必要であったが、近年市販されている血糖センサを使用すればその必要はないという、実際の操作上において非常に優れた利便性を兼ね備えている。【００２９】  市販の血糖センサは、使い捨てタイプのバイオセンサ（血糖センサ）本体と血糖センサからの電気信号を処理する測定器の２つの組み合わせで構成されている。携帯用の血糖センサは通常は使い捨てタイプであり、平面基板上に導電性材料でパターン化された２本ないし３本の電極が配置され、検出部を成す部分の電極表面上には主に酵素とメディエーターが展開されている。【００３０】  この血糖センサを測定器に接続し、血液試料などをこの血糖センサの試料導入口から検出部内部へ導入させることにより、酵素反応が開始し、所定の時間を置いた後に電気化学的に測定することで、試料液中のグルコース濃度の測定ができる。市販の血糖センサの場合、人体における血中グルコース濃度の範囲の測定が可能であれば良く、そのため血糖センサにおけるグルコースの測定範囲はおよそ２ｍＭから３０ｍＭである。他方、血糖センサの中には試料液の必要量が僅か０．３μｌであるものや、測定時間が僅か５秒間であるものもある。【００３１】  このような血糖センサを本発明の反応系に応用すれば、かかるセンサと同様の性能を維持した状態で、リン酸イオンを測定できる。また、高性能あるいは小型化されたバイオセンサが今後市販されれば、そのバイオセンサのリン酸イオン検出への応用も効果的に行うことができ、これらの特徴を利用することで、例えば後述するような極く限られた試料液中のＳＮＰｓの迅速な検出も可能となる。また逆に、リン酸イオン等の基質を十分に存在させることで、ピルビン酸オキシダーゼ活性の測定も可能となる。【００３２】  このような血糖センサには、必要に応じて脱塩処理したピルビン酸オキシダーゼ０．１〜１００Ｕ、好ましくは０．２〜２０Ｕを、最終濃度がそれぞれピルビン酸ナトリウム１〜５���００ｍＭ、好ましくは５０〜１０００ｍＭ、マグネシウムイオン０．１〜１００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭ、ＦＡＤ  ０〜１０００μＭ、好ましくは１〜５０μＭ、ＴＰＰ  １〜５０００μＭ、好ましくは１００〜１０００μＭとなるようにｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解した試薬混合溶液５μｌを、５μｌのリン酸測定試料液とよく混合した後、血糖センサに導入し、正確に０〜２０分間、好ましくは１〜１０分間反応させた後、例えばＰＣで制御されている電気化学アナライザー（ＢＡＳ社製品ＡＬＳ７０１）を使用し、電気化学測定法、例えばサイクリックボルタンメトリー法、ポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法などを用い、例えばサイクリックボルタンメトリー法の場合、掃引速度１〜５００ｍＶ／ｓｅｃ、好ましくは１０〜１００ｍＶ／ｓｅｃ、初期電位０Ｖ、最大負電位−１〜０Ｖ、好ましくは、−０．５〜０Ｖ、最大正電位＋０．１〜＋１Ｖ、好ましくは、＋０．１５〜＋０．７Ｖ、反応（待機）時間０〜２０分間、好ましくは０〜１０分間でピルビン酸オキシダーゼのリン酸イオンの触媒反応で生じる還元型メディエーターに対する応答を確認することにより行われる。【００３３】  上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセンサを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定する。この測定装置には、バイオセンサの電極における電気的な値を計測する計測部と、計測された値を表示する表示部が備えられる。この計測部における計測方法としては、上述した如くポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法またはクーロメトリー法またはボルタンメトリー法などを用いることができる。【００３４】  また、この装置には計測値を保存するためのメモリーを備えることもできる。さらに、測定値を遠隔的に管理する場合には、バイオセンサの計測部に計測データを送信する無線手段、好ましくは非接触型ＩＣカードまたは短距離無線通信（例えば、ブルートゥース；登録商標）などの無線手段を搭載することもできる。【００３５】  一方、淡水及び海水などの環境水中に含まれるリン酸イオン濃度は、尿（約２０ｍＭ）や食品（＜２０ｍＭ）などと比較すると極めて低い値であり、貧栄養湖の場合０．０６〜０．６μＭ  Ｐｉ、富栄養化が進んだ湖沼の水の場合でも２０μＭ  Ｐｉを超える程度である。この場合、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系と共に、以下に示す（２）基質増幅反応系を用いることで測定対象物質の高感度測定が可能となる。【００３６】（２）基質増幅反応系：
（ｉ）ピルビン酸オキシダーゼ−ホスファターゼ〔酸性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２．）またはアルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１．）〕系；
2005073399.tif 000009
【００３７】  上記反応（５）では、Ｐｉとマグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロリン酸、ピルビン酸および酸化型メディエーターの存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により、生成物の一つであるアセチルリン酸が生成し、これからは反応（９）により酢酸とＰｉを生成する。ここで言う基質増幅反応系では、測定対象であるリン酸イオンが一段目の反応により一方の基質の分解物にリン酸化された後、次の反応によって再生され、元の一段目の反応の基質となる。この反応は繰り返されることからサイクリング反応とも呼ばれる。この反応系を利用する場合、一方の基質であるピルビン酸が十分に存在すれば、極わずかなリン酸イオンの存在によっても増幅反応が進行することができ、高感度なリン酸イオンの検出が可能となる。また逆に、リン酸イオン以外の基質を十分に存在させることで、前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼ活性の測定も可能となる。【００３８】  他方、上記（１）〜（２）のリン酸イオン検出系の触媒反応に下記の（１０）式の触媒反応を組み合わせることよって、ピロリン酸イオンの検出が可能となる。
（３）無機ピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．１．）系：
2005073399.tif 000010
【００３９】  上記（１０）式のリン酸イオン検出反応系への応用によって、種々の核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の検出が可能となる。その例を、以下に示す。【００４０】（４）ＳＮＰ検出反応系：
（ｉ）ＤＮＡリガーゼ（ＥＣ６．５．１．１．、６．５．１．２．）系；
2005073399.tif 000011
上記反応系（１１）では、長鎖側の１本鎖ＤＮＡがＳＮＰの検出対象であり、その塩基配列の中心部分にＳＮＰ（変異型とする；●）が含まれている。その配列に、相補的な２種類の１本鎖ＤＮＡ（プライマー）を左辺に示すように二本鎖形成（ハイブリダイズ）させたものに、連結に必要なエネルギーの供与体であるアデノシン５′−三リン酸（ＡＴＰ）の存在下で、連結酵素として知られるＤＮＡリガーゼを作用させると、その反応は右辺に進む。この場合、２種のプライマーが測定対象の塩基配列上で５′−末端と３′−末端が連結されるには、長鎖側の１本鎖ＤＮＡの５′−末端側に相補的にハイブリダイズするプライマーの５′−末端がリン酸化されている必要がある。この反応により生成したピロリン酸イオンを、上記の方法により測定することで、ＳＮＰの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡが野生型であれば、この場合ＤＮＡリガーゼ反応は進行しない。この方法でＳＮＰを検出する場合、２種のプライマーの内、一方のＳＮＰ部分に相補的な塩基配列、すなわち３′−末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合にＤＮＡリガーゼ反応を進行させることもできる。このＳＮＰ検出反応に使用するＤＮＡリガーゼとしては、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたは大腸菌リガーゼが好適である。【００４１】  （ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．７．）系Ａ；
2005073399.tif 000012
上記１塩基対伸長反応系（１２）においても、長鎖側の１本鎖ＤＮＡがＳＮＰの検出対象であり、その塩基配列の中心部分にＳＮＰ（変異型とする；●）が含まれている。その長鎖の５′−末端からＳＮＰの塩基配列の１塩基手前までの配列に、相補的な１本鎖ＤＮＡプライマーを左辺に示すように長鎖とハイブリダイズさせたものに、基質であるデオキシリボヌクレオチド５′−三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを、上記の方法により測定することで、ＳＮＰの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡが野生型であれば、この場合にはＤＮＡポリメラーゼ反応は進行しない。この方法でＳＮＰを検出する場合、プライマーのＳＮＰ部分に相補的な塩基配列、すなわち５′−末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合にＤＮＡポリメラーゼ反応を進行させることもできる。このＳＮＰ検出反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、クレノーＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージフラグメント）およびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を喪失させたクレノーＤＮＡポリメラーゼが好適である。【００４２】  （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ系Ｂ；
2005073399.tif 000013
上記多塩基対伸長反応系（１３）において、長鎖側の１本鎖ＤＮＡがＳＮＰの検出対象であり、その塩基配列の中心部分にＳＮＰ（変異型とする；●）が含まれている。その長鎖の５′−末端からＳＮＰの塩基配列までが相補的なＤＮＡプライマーを左辺に示すように長鎖とハイブリダイズさせたものに、基質であるｄＮＴＰｓの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを上記の方法により測定することで、ＳＮＰの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡが野生型であれば、この場合はＤＮＡポリメラーゼ反応は進行しない。この方法でＳＮＰを検出する場合、プライマーのＳＮＰ部分に相補的な塩基配列、すなわち５′−末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合にＤＮＡポリメラーゼ反応を進行させることもできる。この反応系の場合、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡのＳＮＰ部位から３′−末端の間の塩基配列を長くすることで、反応系（１２）よりも少ない量の測定対象ＤＮＡから、多くのピロリン酸イオンを生成することができるという特徴がある。このＳＮＰ検出反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、反応系（１２）の場合と同様にクレノーＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくは３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去してあるクレノーＤＮＡポリメラーゼが好適である。【００４３】  （ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ系Ｃ；
2005073399.tif 000014
上記多塩基対伸長反応系（１４）において、長鎖側の１本鎖ＤＮＡがＳＮＰの検出対象であり、その塩基配列の中心部分にＳＮＰ（変異型とする；●）が含まれている。その長鎖の５′−末端からＳＮＰの塩基配列までが相補的で、続く１塩基または２塩基が長鎖側の塩基配列に対して相補的でないＤＮＡプライマーを左辺に示すように長鎖とハイブリダイズさせたものに、基質であるｄＮＴＰｓの存在下でＤＮＡポリメラーゼを作用させると、その反応は右辺に進む。この反応により生成したピロリン酸イオンを上記の方法により測定することで、ＳＮＰの検出ができる。一方、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡが野生型であれば、この場合はＤＮＡポリメラーゼ反応は進行しない。この方法でＳＮＰを検出する場合、プライマーのＳＮＰ部分に相補的な塩基配列、すなわち５′−末端の塩基の種類を変えることによって、上記の方法とは反対に、野生型の場合にＤＮＡポリメラーゼ反応を進行させることもできる。この反応系の場合、測定対象である長鎖側の１本鎖ＤＮＡのＳＮＰ部位から３′−末端の間の塩基配列を長くすることで、反応系（１２）よりも少ない量の測定対象ＤＮＡから、多くのピロリン酸イオンを生成することができるという特徴がある。このＳＮＰ検出反応に使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、反応系（１２）の場合と同様にクレノーＤＮＡポリメラーゼおよびＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはエンドヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を除去してあるクレノーＤＮＡポリメラーゼが好適である。【００４４】（５）一本鎖ゲノム検出反応系：
ＤＮＡポリメラーゼ系（ランダムプライマー法）；
2005073399.tif 000015
上記反応系（１５）、（１６）は、１本鎖のゲノムを持つウィルスや細菌などの検出に好適である。反応式（１５）は、ランダムな塩基配列からなる複数のプライマーを測定対象である一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズさせる反応である。反応式（１６）では、測定対象の１本鎖ゲノムと部分的にハイブリダイズしたプライマー同士をＤＮＡポリメラーゼによって連結することで、完全な２本鎖ＤＮＡが合成される。このとき、ｄＮＴＰｓがＤＮＡ鎖の構成材料として取り込まれ、ピロリン酸イオンが生成される。この反応系で使用するＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩまたはクレノーＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、好ましくはクレノーＤＮＡポリメラーゼなどが好適である。さらに、この方法では、ゲノムに１本鎖ＲＮＡをもつウィルスなどの検出も逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）とＤＮＡのランダムプライマー、ｄＮＴＰｓの使用、またはＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．６．）、ＲＮＡのランダムプライマー、ＮＴＰｓの使用により可能である。【００４５】（６）二本鎖ゲノム検出反応系：
ＤＮＡポリメラーゼ−ＤＮアーゼ系（ニックトランスレーション法）；
2005073399.tif 000016
上記の反応系（１７）〜（１９）は、ゲノムに二本鎖ＤＮＡを持つウィルスや細菌などの検出に好適である。反応式（１７）では、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）により、二本鎖ＤＮＡ上に無数の切れ目（ニック）が入る。この場合、ＤＮアーゼＩを使用することにより、二本鎖ＤＮＡの１本鎖部分のみにニックが入るため、二本鎖が切断されることはない。続いて、反応式（１８）では、二本鎖ＤＮＡ上に入ったニックをＤＮＡポリメラーゼが認識し、ＤＮＡポリメラーゼが持つエキソヌクレアーゼ活性によって、ニックの周囲の数十塩基を削除する。さらに、反応式（１９）では、同酵素のポリメラーゼ活性によって、二本鎖ＤＮＡは元の状態に修復される。この場合のＤＮアーゼとしてはＤＮアーゼＩ（ＥＣ３．１．２１．１）が、またＤＮＡポリメラーゼとしては大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩが好適である。この反応系では、例えば１個のウィルス由来のゲノムでも存在すれば、その反応系の一方の基質であるｄＮＴＰｓが消費されるまでこの反応は進むため、原理的にウィルスの検出は可能である。さらに、二本鎖ゲノムは熱変性またはアルカリ変性などにより、１本鎖を形成させることで、前記ランダムプライマー法による検出も可能である。この方法によればゲノムに二本鎖ＲＮＡをもつウィルスなどの検出も可能である。【００４６】  上記リン酸イオン反応系、ピロリン酸イオン反応系およびこれらの反応系は、核酸などのリン酸イオンおよびピロリン酸イオンが関与する一連の生体関連の反応として、本発明のバイオセンサに応用することが可能である。前記応用例のほかにも、核酸のシークエンス（パイロシークエンス法など）、核酸増幅反応（ＰＣＲ）法、ＲＡＣ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法など）および受容体の挙動（ＧＴＰを消費してピロリン酸イオン生成するＧプロテインの挙動など）のモニタリング、その他リン酸イオンおよびピロリン酸イオンが触媒反応に関与する酵素の活性測定への応用も可能である。この場合、使用する酵素が粗精製であったり、リン酸塩を含む懸濁液に溶解している状態であれば、限外ろ過による脱塩およびカラムクロマトグラフィーによる精製などの前処理を行うことが望ましい。特にリン酸イオンを基質サイクルとする増幅反応系では、市販の血糖センサの反応検出部分にもリン酸塩が存在しないことが望ましい。【００４７】  本発明方法（２）においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、最終的にβ−Ｄ−グルコースを生成するような基質と酵素、酸化型メディエーターおよびグルコースオキシダーゼによって代表される酸化還元酵素を用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンを測定することもできる。なお、試料液中にグルコースが存在する場合は、予めグルコースオキシダーゼなどを使用して試料液中のグルコースを消去しておく必要がある。【００４８】  最終的にβ−Ｄ−グルコー���を生成するような触媒反応系群としては次のものが挙げられる。
（７）単純反応系：
（ｉ）マルトースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．８．）−ムタロターゼ（ＥＣ５．１．３．３．）系；
2005073399.tif 000017
（ｉｉ）スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ２．４．１．７．）−グルコースイソメラーゼ（ＥＣ５．３．１．１８．）系；
2005073399.tif 000018
【００４９】  β−Ｄ−グルコースは、以下の反応等により還元型メディエーターを発生させる。
2005073399.tif 000019
【００５０】  酸化還元酵素としては、グルコースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．４．）のほかグルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．４７、１．１．１．１１８、１．１．１．１１９、１．１．９９．１０．）、ピロロキノリンキノン・グルコースデヒドロゲナーゼなどが用いられ、メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェロセン、パラベンゾキノンなどが用いられる。メディエーターとして、フェリシアン化カリウムＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を用いた場合には、グルコース等との反応は次のように進行する。
2005073399.tif 000020
この際発生したフェロシアンイオンは、作用極で酸化されて酸化電流を生ずる。
2005073399.tif 000021
【００５１】  また、メディエーターとしてフェリシアン化カリウムの代わりにパラベンゾキノンを用いた場合には、ＧＯＤ存在下でのグルコースとパラベンゾキノンとの反応でヒドロキノンが生成し、この際生成したヒドロキノンは作用極で酸化され、酸化電流を生ずるのでその値が測定される。
2005073399.tif 000022
【００５２】  β−Ｄ−グルコースがグルコースオキシダーゼ等の作用により酵素の存在下で酸化されてグルコノラクトンを生成させ、そのとき発生するＨ２Ｏ２を作用極上で酸化し、その際の酸化電流値を測定することにより、グルコース濃度を間接的に求める方法は従来技術で述べた如くである。しかしながら、係る方法では、測定液が海水など妨害物質を含む場合には正確なリン酸濃度を測定することができない。しかるに、メディエーターをグルコースオキシダーゼ等と共に用いると、妨害物質に影響を受けることなくリン酸濃度を正確に測定することが可能となる。【００５３】  リン酸イオンの測定は、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上に測定に必要な酵素および試薬を配したセンサが好んで用いられる。このようなセンサとしては、前述の如きものなどが用いられる。【００５４】  かかるリン酸濃度の測定に際しては、既製の血糖センサまたは食品用のグルコースセンサ等を用いることができ、これらとしては市販のものをそのまま用いることができる。例えば、血糖センサ、グルコースセンサとしては、前述の如き市販品等をそのまま用いることもできる。【００５５】  本発明方法（１）と同様に、本発明方法（２）においても、血糖センサを測定器に接続し、血液試料などをこの血糖センサの試料導入口から検出部内部へ導入させることにより、酵素反応が開始し、所定の時間を置いた後に電気化学的に測定することで、試料液中のグルコース濃度の測定ができる。このような血糖センサを本発明方法（２）の上記（７）単純反応系に応用すれば、このセンサと同じ濃度範囲のリン酸イオンを測定できる。また、このような測定範囲内であれば、血液、尿、食品などに含まれるリン酸イオンの測定に使用できる。【００５６】  このような血糖センサには、必要に応じて脱塩処理したマルトースホスホリラーゼおよびムタロターゼまたはスクロースホスホリラーゼおよびグルコースイソメラーゼを、それぞれ０．０１〜１００Ｕ、好ましくは０．１〜２０Ｕを緩衝液に溶解し、これとリン酸測定試料液および２５ｎｍｏｌｅ以上、好ましくは１２５ｎｍｏｌｅ〜５μｍｏｌｅのリン酸以外の基質液、すなわちマルトースまたはスクロール溶液をよく混合した後、血糖センサに導入し、正確に０〜２０分間、好ましくは１〜１０分間反応させた後、例えばＰＣで制御されている電気化学アナライザー（ＢＡＳ社製品ＡＬＳ７０１）を使用し、電気化学測定法、例えばサイクリックボルタンメトリー法、ポテンシャルステップクロノアンペロメトリー法、クーロメトリー法などを用い、例えばサイクリックボルタンメトリー法の場合、掃引速度１〜５００ｍＶ／ｓｅｃ、好ましくは１０〜１００ｍＶ／ｓｅｃ、初期電位０Ｖ、最大負電位−１〜０Ｖ、好ましくは、−０．５〜０Ｖ、最大正電位＋０．１〜＋１Ｖ、好ましくは、＋０．１５〜＋０．７Ｖ、反応（待機）時間０〜２０分間、好ましくは０〜１０分間でグルコースに対する応答を確認することにより行われる。【００５７】  上述のようなバイオセンサを用いて測定する場合には、測定装置に上記バイオセンサを取り付け、バイオセンサに生じた電気的な値を測定すること、用いられる測定装置の詳細および測定方法は��前述の通りである。【００５８】  一方、淡水及び海水などの環境水中に含まれるリン酸イオン濃度は、食品（＜２０ｍＭ）や尿（約２０ｍＭ）などと比較すると極めて低い値であり、貧栄養湖の場合０．０６〜０．６μＭ  Ｐｉ、富栄養化が進んだ湖沼の水の場合でも２０μＭ  Ｐｉを超える程度である。この場合、（７）単純反応系の代わりに、以下に示す（８）基質増幅反応系および（９）複合反応系を用いることで測定対象物質の高感度測定が可能となる。【００５９】  （８）基質増幅反応系：
（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−ホスファターゼ〔酸性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．２．）またはアルカリ性ホスファターゼ（ＥＣ３．１．３．１．）〕系；
2005073399.tif 000023
【００６０】  上記反応（２０）では、Ｐｉとマルトースの存在下、マルトースホスホリラーゼの作用により、生成物の一つであるβ−Ｄ−グルコース−１−リン酸が生成し、これからは反応（２９）によりβ−Ｄ−グルコースとＰｉを生成する。ここで言う基質増幅反応系では、測定対象であるリン酸イオンが一段目の反応により一方の基質の分解物にリン酸化された後、次の反応によって再生され、元の一段目の反応の基質となる。この反応は繰り返されることから基質リサイクリング反応とも呼ばれる。この反応系を利用する場合、一方の基質であるマルトースが十分に存在すれば、極わずかなリン酸イオンの存在によっても増幅反応が進行することができ、高感度なリン酸イオンの検出が可能となる。また逆に、リン酸イオン以外の基質を１０ｍＭ以上、好ましくは５０〜２０００ｍＭの濃度で存在させることで、前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼ活性の測定も可能となる。【００６１】  （ｉｉ）スクロースホスホリラーゼ−ホスファターゼ（酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）−ムタロターゼ系；
2005073399.tif 000024
上記反応も、一段目のスクロースホスホリラーゼ反応とそれに続くホスファターゼ反応との組み合わせによって、（ｉ）のマルトースホスホリラーゼ−ホスファターゼ系と同様の効果を得ることができる。【００６２】（９）複合反応系
（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−ホスファターゼ（酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）−ムタロターゼ系；
2005073399.tif 000025
（ｉｉ）スクロースホスホリラーゼ−ホスファターゼ（酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）−ムタロターゼ−グルコースイソメラーゼ系；
2005073399.tif 000026
上記（９）複合反応系における２種（ｉ）〜（ｉｉ）の反応系は（７）単純反応系と（８）基質増幅反応系を組み合わせたもので、基質増幅反応系よりも高感度なリン酸イオンの検出が可能である。【００６３】  他方、上記（７）〜（９）のリン酸イオン検出系の触媒反応に下記の（１０）式の触媒反応を組み合わせることよって、ピロリン酸イオンの検出が可能となる。
（１０）無機ピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．１．）系：
2005073399.tif 000027
【００６４】  また、（１０）無機ピロホスファターゼ系を前述した（４）ＳＮＰ検出反応系、（５）一本鎖ゲノム検出反応系および（６）二本鎖ゲノム検出反応系などのリン酸イオン検出反応系へ応用することによって、種々の核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）の検出が可能となる。
【実施例】
【００６５】  次に、本発明方法を実施例により更に詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に制限されるものではない。【００６６】  参考例１
絶縁性のプラスチック基板（７ｍｍ×２２ｍｍ）上に幅１ｍｍの白金箔が０．５ｍｍの間隔を置いて２本平行して配列しており、リン酸塩を含まない作用極上にグルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムが配されているバイオセンサに、グルコースを含む試料液（ｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液）を、毛管現象により作用極上に到達させ、試料液中のグルコースに対する電気信号を、バイオセンサの端子に接続された専用のコネクターを介して、ＰＣで制御されている電気化学アナライザー（ＢＡＳ社製ＡＬＳ７０１）を用いて検出した。電気化学測定法としてはサイクリックボルタンメトリー法を用い、掃引速度５０ｍＶ／ｓｅｃ、初期電位０Ｖ、最大電位＋０．７Ｖ、反応（待機）時間６０秒間でグルコースに対する応答を確認した。その結果、２ｍＭから１００ｍＭグルコースの範囲において、＋０．２Ｖ付近にメディエーター特有の電流値のピークが現れた。そのピーク値は図１に示される如くグルコース濃度に対し、ほぼ比例関係を示しており、このバイオセンサはグルコースに対する測定範囲が広く、本発明に関わる実施に好適であることがわかった。【００６７】［実施例１］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系を用いてリン酸イオンの測定を行った。ピルビン酸オキシダーゼ（アエロコッカスビリダンス由来）２００ｕｎｉｔｓは氷冷中の２５０μｌの反応試薬液Ｉ、すなわち、４０ｍＭマグネシウムイオンおよび４８μＭ  ＦＡＤを含むｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解した。反応試薬液ＩＩとしては、８００ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．９６ｍＭ  ＴＰＰを、氷冷中にて２５０μｌのｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解したものが用いられた。測定試料液としては、４００ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液を調製して用いた。測定は、２ｕｎｉｔのピルビン酸オキシダーゼを含む反応試薬液１２．５μＬと反応試薬液ＩＩ２．５μＬ、測定試料液５μｌとを充分に混合したものを血糖センサに導入し、正確に３分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法でリン酸イオンの測定を行った。【００６８】  比較例１
実施例１において、ＴＰＰが用いられなかった。【００６９】  比較例２
実施例１において、ＦＡＤが用いられなかった。【００７０】  比較例３
実施例１において、マグネシウムイオンが用いられなかった。【００７１】  比較例４
実施例１において、測定試料液として、１００ｍＭリン酸二水素カリウムを含まないｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられた。【００７２】  以上の実施例１および比較例１〜４で得られた結果は、図２に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、反応試薬液の成分としてＦＡＤが含まれない場合を除いて、リン酸イオンに対する応答は得られなかった。一方、ＦＡＤを除いた場合では、通常の反応試薬組成で得られたリン酸イオンに対する応答に比べ、およそ半分程度の応答を示した。これは、ピルビン酸オキシダーゼは本来ＦＡＤを備えているが、使用したピルビン酸オキシダーゼの中に精製の過程でＦＡＤが離脱したものが含まれていたためであると考えられる。以上より、ピルビン酸オキシダーゼ系においては、マグネシウムイオン、ＦＡＤ、およびＴＰＰが必要とされることが確認された。【００７３】［実施例２］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系における、ＴＰＰ濃度とセンサ応答との関係を調べた。氷冷中のｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２５０μｌに１００ｕｎｉｔｓのピルビン酸オキシダーゼ（アエロコッカスビリダンス由来）と、２０ｍＭマグネシウムイオンおよび２４μＭ  ＦＡＤが含まれる反応試薬液Ｉと、同じく氷冷中のｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２５０μｌに４００ｍＭリン酸二水素カリウムと、４００ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび所定の濃度のＴＰＰを含む反応試薬液ＩＩをそれぞれ２．５μｌずつ充分に混合し、この混合液を血糖センサに導入し、正確に１０分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００７４】  得られた結果は、図３に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。ＴＰＰに対する本バイオセンサの応答は、４８〜２４０μＭの範囲で得られた。以上より、ＴＰＰの濃度が４８μＭよりも低い場合、リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答が著しく低下することを示された。【００７５】［実施例３］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系におけるピルビン酸濃度とセンサ応答との関係を調べた。実施例２で用いられた反応試薬液Ｉと、氷冷中のｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２５０μｌに４００ｍＭリン酸二水素カリウムと、０．４８ｍＭ  ＴＰＰおよび所定の濃度のピルビン酸ナトリウムを含む反応試薬液ＩＩをそれぞれ２．５μｌずつ充分に混合し、この混合液を血糖センサに導入し、正確に１０分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００７６】  得られた結果は、図４に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。ピルビン酸に対する本バイオセンサの応答は、４〜４００ｍＭの範囲で得られた。以上より、４〜４００ｍＭの範囲であれば、本センサーがピルビン酸の測定にも応用が可能であることが示された。【００７７】［実施例４］
参考例で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系におけるピルビン酸オキシダーゼ活性とセンサ応答との関係を調べた。氷冷中のｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２５０μｌに所定単位のピルビン酸オキシダーゼ（アエロコッカスビリダンス由来）と、２０ｍＭマグネシウムイオンおよび２４μＭ  ＦＡＤが含まれる反応試薬液Ｉと、同じく氷冷中のｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２５０μｌに４００ｍＭリン酸二水素カリウムと、４００ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび０．４８ｍＭ  ＴＰＰを含む反応試薬液ＩＩをそれぞれ２．５μｌずつ充分に混合し、それを血糖センサに導入し、正確に１０分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００７８】  得られた結果は、図５に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。ピルビン酸オキシダーゼ活性に対する本バイオセンサの応答は、６〜２００ｍ  ｕｎｉｔｓ／μｌの範囲で高い相関関係（ｒ＝０．９９９１）が得られた。以上より、６〜２００ｍ  ｕｎｉｔｓ／μｌの範囲であれば、本センサーがピルビン酸オキシダーゼ活性の測定にも応用が可能であることが示された。【００７９】［実施例５］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ系における、リン酸イオンとセンサ応答との関係を調べた。実施例１で用いられた反応試薬液Ｉおよび反応試薬液ＩＩを使用し、測定試料液としては、所定の濃度のリン酸二水素カリウムを含むｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液を調製して用いた。測定は、２ｕｎｉｔのピルビン酸オキシダーゼを含む反応試薬液Ｉ２．５μＬと反応試薬液ＩＩ２．５μＬ、測定試料液５μｌを充分に混合したものを血糖センサに導入し、正確に１０分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００８０】  得られた結果は、図６に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、１ｍＭ付近から１００ｍＭの範囲で得られ、食品や尿などに含まれているリン酸の測定に好適であることが確認された。【００８１】［実施例６］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（１）ピルビン酸オキシダーゼ反応系を用いて環境水中に溶解させたリン酸イオンの測定を行った。実施例１で用いられた反応試薬液Ｉおよび反応試薬液ＩＩを使用し、測定試料液としては、添加するリン酸二水素カリウムの濃度が５、１０、１５、２０ｍＭとなるように環境水中に溶解したものを使用した。環境水としては、東京工科大学敷地内にある日本庭園、カスケードおよび溜池から採取した。環境水のｐＨはそれぞれ、７．６５，７．６４，７．９３、リン酸イオン濃度はそれぞれ、０．０７３μＭ，０．６７μＭ，５．４μＭ（ＪＩＳ  Ｋ  ０１０２準拠：アスコルビン酸還元によるモリブデン青吸光光度法）であった。本発明のバイオセンサ法ではまず、ｐＨ７．０、１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液およびこれに２５ｍＭのリン酸イオンを添加した溶液に対するセンサー応答を検量線の値として求めた上で、リン酸イオンを添加した各環境水の応答を前記検量線に当てはめて各環境水中のリン酸イオン濃度を求めた。アスコルビン酸還元によるモリブデン青吸光光度法からもこれと同様に各環境水中のリン酸イオン濃度を求め、その値を従来法で求めた値とした。【００８２】  得られた結果は、図７ａ，ｂ，ｃに示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。このときのバイオセンサの応答の変動係数の平均は日本庭園が７．６％、カスケードが９．１％，溜池が８．８％であった。日本庭園ａ、カスケードｂおよび溜池ｃの順に、含まれるリン酸イオンの濃度が高い環境水ほど、センサー応答値は従来法に比べ高い値を示した。この原因としては、リン酸イオンの濃度が高い環境水ほどその他の夾雑物質を多く含み、それらがリン酸イオンと相互作用することが考えられる。すなわち、従来法ではリン・モリブデン錯体を形成させるべく、溶液を強酸性に調製する必要があるため、リン酸イオンは夾雑物質との相互作用の影響を受けにくいが、ピルビン酸オキシダーゼが触媒できるのは、真に溶存状態であるリン酸イオンだけであることから、このような結果に結びついたものと考えられる。【００８３】［実施例７］
参考例１で用いられたバイオセンサを使用して、（２）増幅反応系の（ｉ）ピルビン酸オキシダーゼ−酸性ホスファターゼ系におけるｐＨとセンサ応答との関係を調べた。氷冷した所定のｐＨの緩衝溶液２５０μｌに１００ｕｎｉｔｓのピルビン酸オキシダーゼ（アエロコッカスビリダンス由来）と、４０ｍＭマグネシウムイオンおよび４８μＭ  ＦＡＤが含まれる反応試薬液Ｉと、氷冷した所定のｐＨの緩衝溶液２５０μｌに４００ｍＭリン酸二水素カリウムと、４００ｍＭピルビン酸ナトリウムおよびの０．４８ｍＭ  ＴＰＰを含む反応試薬液ＩＩ、氷冷した所定のｐＨの緩衝溶液５０μｌに２０ｕｎｉｔｓの酸性ホスファターゼ（ポテト由来）が含まれる反応試薬液ＩＩＩをそれぞれ２．５μｌ、５μｌ、２．５μｌずつ充分に混合し、それを血糖センサに導入し、正確に６０秒間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００８４】  得られた結果は、図８に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。この図が示すように、酸性ホスファターゼ活性における最適ｐＨが存在する酸性側よりも、ピルビン酸オキシダーゼ活性における最適ｐＨ（ｐＨ７．０）付近で、リン酸イオンに対する応答が最も高いことが分かった。また、この結果より、ピルビン酸オキシダーゼのみの（１）単純反応系と比較して、（２）基質増幅反応系であるピルビン酸オキシダーゼ−酸性ホスファターゼ系のほうが、リン酸イオンに対する応答が遥かに良くなることが示された。【００８５】  参考例２
絶縁性のプラスチック基板（７ｍｍ×２２ｍｍ）上に幅１ｍｍの白金箔が０．５ｍｍの間隔を置いて２本平行して配列しており、リン酸塩を含まない作用極上にグルコースオキシダーゼおよびフェリシアン化カリウムが配されているバイオセンサに、所定濃度のグルコースを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２．５μｌを、毛管現象により作用極上に到達させ、試料液中のグルコースに対する電気信号を、バイオセンサの端子に接続された専用のコネクターを介して、ＰＣで制御されている電気化学アナライザー（ＡＬＳ７０１）を用いて検出した。電気化学測定法としてはサイクリックボルタンメトリー法を用い、掃引速度５０ｍＶ／ｓｅｃ、初期電位０Ｖ、最大電位＋０．７Ｖ、反応（待機）時間６０秒間でグルコースに対する応答を確認した。その結果、２ｍＭから１００ｍＭグルコースの範囲において、＋０．２Ｖ付近にメディエーター特有の電流値のピークが現れた。そのピーク値は図９に示される如くグルコース濃度に対し、ほぼ比例関係を示しており、このバイオセンサはグルコースに対する測定範囲が広く、本発明に関わる実施に好適であることがわかった。【００８６】［実施例８］
前記（７）単純反応系の（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−ムタロターゼ系を参考例２で用いられたバイオセンサに応用し、リン酸イオン濃度に対する応答を調べた。マルトースホスホリラーゼ（ラクトバチルス  ブレビス由来）、ムタロターゼ（豚腎臓由来）およびグルコースオキシダーゼ（アスペルギウス  ニガー由来）は、分画分子量１万の限外ろ過フィルターを使用して脱塩処理を行った後、氷冷中のｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に０．４ｕｎｉｔ／μｌとなるように溶解した。なお、グルコースオキシダーゼは、参考例２に記載される如くバイオセンサに予め配されているものの、使用したバイオセンサがロットによりバラツキが見られることから、再現性を確実なものとするため本実施例以降追加して使用することとした。また、基質液としては、４００ｍＭマルトースを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、所定濃度のリン酸二水素カリウムを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられた。次に、各酵素を含む溶液２．５μｌ、基質液２．５μｌおよび測定試料液５μｌとを充分に混合したものをバイオセンサに導入し、正確に３分間反応させた後、グルコースの測定時と同条件下でサイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００８７】  得られた結果は、図１０に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、０．２ｍＭ付近から２０ｍＭの範囲で得られ、食品や尿などに含まれているリン酸の測定に好適であることが確認された。【００８８】［実施例９］
実施例８において、ムタロターゼの代わりに酸性ホスファターゼ（ポテト由来）が同活性量で用いられ、また反応時間が１０分間に変更されて電流値の測定が行われ、前記（８）基質増幅反応系の（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ系におけるリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。ここで、アルカリ性ホスファターゼではなく酸性ホスファターゼを使用したのは、グルコースオキシダーゼが弱酸性条件下で至適であるためである。【００８９】  得られた結果は、図１１に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は実施例８に示される単純反応系の結果と比較して約１０倍の２０μＭから２ｍＭの範囲で応答が得られ、富栄養化が進んだ環境水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であることが確認された。【００９０】  比較例５
実施例９において、酸性ホスファターゼが用いられなかった。その結果、各種濃度のリン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、いずれも約１５μＡであった。この値はリン酸イオンが存在しない場合のセンサ応答値と等しいことから、反応に十分な量の基質が存在していたとしても、マルトースホスホリラーゼのみではグルコースオキシダーゼ反応が進行しないことが確認された。【００９１】［実施例１０］
前記（９）複合反応系の（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ系を血糖センサに応用して、リン酸イオンの濃度を一定として、ｐＨとセンサ応答との関係を調べた。実施例８で用いられたマルトースホスホリラーゼ、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼおよび実施例９で用いられた酸性ホスファターゼは分画分子量１万の限外ろ過フィルターを使用して脱塩処理を行った後、氷冷中のｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に０．４ｕｎｉｔ／μｌとなるように溶解した。また、基質液としては、４００ｍＭマルトースを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、１ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ４．０のフタル酸緩衝溶液および各ｐＨが５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５の０．２Ｍトリス−マレイン酸緩衝溶液がそれぞれ用いられた。次に、各酵素を含む溶液２．５μｌ、基質液２．５μｌおよび測定試料液５μｌとを充分に混合したものをバイオセンサに導入し、１０分間反応させた後、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【００９２】  得られた結果は、図１２に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。ここで、横軸に示している値は、各酵素を含む溶液、マルトース液および測定試料液が混ざった状態の血糖センサの反応検出部におけるｐＨで示してある。これにより、ｐＨの影響を調べたところ、この複合反応系における最適なｐＨは６．５付近であることが示された。また、ｐＨが８付近でセンサの応答が著しく低下した。これは、増幅反応を行う酸性ホスファターゼの活性の低下が原因として考えられる。【００９３】［実施例１１］
実施例１０において、測定試料液として２ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、所定時間反応させた際の電流値の測定を行い、この複合反応系における反応時間とセンサ応答との関係を調べた。【００９４】  得られた結果は、図１３に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は反応時間の長さと比例して大きくなっており、マルトースが十分に存在する反応条件下であれば、この複合反応系がリン酸イオンの存在によって増幅反応を起こすことが示された。【００９５】［実施例１２］
実施例１０において、基質液としては、４００ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、所定濃度のマルトースを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、マルトース濃度に対する応答を調べた。【００９６】  得られた結果は、図１４に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。マルトースに対する本バイオセンサの応答は、１〜３００ｍＭの範囲で得られた。【００９７】［実施例１３］
実施例８において、マルトースホスホリラーゼ、ムタロターゼ、グルコースオキシダーゼに加えて実施例９で用いられた酸性ホスファターゼが用いられ、また反応時間が１０分間に変更されて電流値の測定が行われ、前記（９）複合反応系の（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ系におけるリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。【００９８】  得られた結果は、図１５に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は実施例８に示される単純反応系の結果と比較して約２０倍の１０μＭから２ｍＭの範囲で応答が得られ、また、実施例９に示される基質増幅反応系の結果と比較して約２倍の応答が得られ、富栄養化が進んだ環境水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であることが確認された。【００９９】［実施例１４］
実施例１３において、マルトースホスホリラーゼの代わりに、脱塩処理されたスクロースホスホリラーゼ（ルーコノストック  メセントロイデス由来）が同活性量で用いられ、前記（８）基質増幅反応系の（ｉｉ）スクロースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ系におけるリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。【０１００】  得られた結果は、図１６に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。リン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は０．１〜３０ｍＭの範囲で応答が得られ、富栄養化が進んだ環境水であれば本センサでのリン酸イオンの定量が可能であることが確認された。【０１０１】［実施例１５］
実施例１４において、基質液として、４００ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、所定濃度のスクロースを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が用いられ、スクロース濃度に対する応答を調べた。【０１０２】  得られた結果は、図１７に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。スクロースに対する本バイオセンサの応答は、０．３〜３０ｍＭの範囲で得られた。【０１０３】［実施例１６］
実施例１３において、測定試料液として以下の物質を超純水に溶解したものが用いられた。
・コントロール：２ｍＭリン酸イオン
・１０ｍＭアセトアミノフェンおよび２ｍＭリン酸イオン【０１０４】  得られた結果は、次の表１および図１８に示される。
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【０１０５】  比較例６
実施例１６において、バイオセンサとして、バイオセンサ上のメディエーターを含む試薬層が水で洗い流されたものが用いられた。【０１０６】  得られた結果は、次の表２および図１９に示される。
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【０１０７】  以上の結果に示されているように、過酸化水素系（比較例６）では、メディエーター系（実施例１６）に比べて著しい応答の減少がみられた。また、フェリシアン化カリウムをメディエーターとして使用することにより、試料液中の溶存酸素をメディエーターとする過酸化水素系に比べて大きな出力値を得ることができ、測定の精度が向上することが確認された。【０１０８】［実施例１７］
実施例１３において、測定試料液として以下の物質を超純水に溶解したものが用いられ、環境水をはじめ食品および体液などに含まれる夾雑物質のセンサ応答への影響を調べた。
・コントロール：２ｍＭリン酸イオン
・人工海水：２．６５％ＮａＣｌ，０．３２６％ＭｇＣｌ２，０．２０７％ＭｇＳＯ４，０．１３６％ＣａＳＯ４，０．０７１４％ＫＣｌおよび２ｍＭリン酸イオン
・０．３ｍＭアスコルビン酸および２ｍＭリン酸イオン
・１ｐｐｍ尿酸および２ｍＭリン酸イオン
・１ｐｐｍアンモニウムイオンおよび２ｍＭリン酸イオン
・１ｐｐｍドデシル硫酸ナトリウムおよび２ｍＭリン酸イオン
・１ｐｐｍ塩化ベンザルコニウムおよび２ｍＭリン酸イオン
・１ｐｐｍリグニンおよび２ｍＭリン酸イオン
・４ｐｐｍ無機陰イオン：１ｐｐｍＦ−，１ｐｐｍＮＯ２−，１ｐｐｍＮＯ３−，１ｐｐｍＳＯ４２−および２ｍＭリン酸イオン
・５ｐｐｍ重金属：１ｐｐｍＣｕ２＋，１ｐｐｍＺｎ２＋，１ｐｐｍＭｎ２＋，１ｐｐｍＣｒ３＋，１ｐｐｍＦｅ３＋および２ｍＭリン酸イオン【０１０９】  得られた結果は、次の表３および図２０に示される。これらの結果に示されているように重金属イオンおよび人工海水に含まれるリン酸イオンに対するセンサ応答がコントロールと比べてやや低い応答を示しているものの、それらの応答比は何れも９０％程度であった。この結果より、従来の溶存酸素および過酸化水素検出系の電気化学的な方法や化学発光を用いる方法と比べて夾雑物質の影響を確実に低く抑えられることが示された。
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【０１１０】［実施例１８］
つづいて、このバイオセンサを使用して、前記（８）基質増幅反応系の（ｉ）マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ系を参考例２で用いられたバイオセンサに応用し、基質であるマルトースおよびリン酸イオンが十分に存在する条件下、酸性ホスファターゼ活性とセンサ応答値との関係を調べた。実施例８と同様に脱塩処理されたマルトースホスホリラーゼおよびグルコースオキシダーゼを、氷冷中のｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に０．４ｕｎｉｔ／μｌとなるように溶解した。また、基質液としては、４００ｍＭマルトースおよび４００ｍＭリン酸二水素カリウムを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液が、測定試料液としては、実施例９と同様に脱塩処理された酸性ホスファターゼを所定濃度となるように氷冷中のｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解したものが用いられた。次に、マルトースホスホリラーゼおよびグルコースオキシダーゼを含む溶液２．５μｌと反応基質液２．５μｌとを良く混合した後、測定試料液５μｌを混合したものをバイオセンサに導入し、正確に１０分間反応させた後、サイクリックボルタンメトリー法により電流値の測定が行われた。【０１１１】  得られた結果は、図２１に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。酸性ホスファターゼ活性とセンサ応答値との関係は試料液中の酵素活性が０．０２〜０．２ｕｎｉｔ／ｌの範囲で直線的な応答を示した。これらの結果から、本センサでのリン酸イオンの定量法を応用することで前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼ活性の測定に用いることが可能であることが確認された。【０１１２】［実施例１９］
実施例８において、測定試料液として所定濃度のピロリン酸イオンを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２．５μｌおよび脱塩された無機ピロホスファターゼ（パン酵母由来）を０．４ｕｎｉｔ／μｌとなるようにｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解したもの２．５μｌとを混合し、５分間反応させたものが用いられ、前記（１０）無機ピロホスファターゼ系のピロリン酸イオン濃度に対する応答を調べた。【０１１３】  得られた結果は、図２２に示される。なお、各数値は、ｎ＝３の平均値を示している。ピロリン酸イオンに対する本バイオセンサの応答は、１〜１００ｍＭの範囲で得られた。【０１１４】［実施例２０］
実施例１９において、測定試料液として１０ｍＭピロリン酸イオン、１０ｍＭ  ＡＴＰまたは１０ｍＭ  ｄＮＴＰｓを含むｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液２．５μｌおよび脱塩された無機ピロホスファターゼを０．４ｕｎｉｔ／μｌとなるようにｐＨ６．５、２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝溶液に溶解したもの２．５μｌとを混合し、５分間反応させたものが用いられた。【０１１５】  得られた結果は、表４および図２３に示される。これより、核酸検出の基質として必要とされるＡＴＰおよびｄＮＴＰには無機ピロホスファターゼが反応しないことが確認された。
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【産業上の利用可能性】
【０１１６】  本発明に係るリン酸イオン濃度の測定法を用いることにより、例えば海水中に含まれるリン酸イオンを、妨害物質の影響を受けることなく測定することが可能となり、環境測定、医療、食品などの各分野において有効に利用することができる。また血糖センサの応用により、環境水中のリン酸イオンの測定を目的としたセンサを製作することができ、また、ピロリン酸イオンを測定することにより、携帯型のＳＮＰ診断、超高感度ウィルス検出にも有効に利用することができる。さらに、リン酸イオン以外の基質を十分に存在させた場合には、酸性ホスファターゼの活性の測定が可能となり、前立腺の腫瘍マーカーの検出による診断への応用も可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】［図１］血糖センサのグルコースに対する応答性を示すグラフである
［図２］ピルビン酸オキシダーゼ系における、ＴＰＰ、ＦＡＤおよびマグネシウムイオンの要否を検討した結果を示すグラフである
［図３］ピルビン酸オキシダーゼ系における本バイオセンサのＴＰＰに対する応答性を示すグラフである
［図４］ピルビン酸オキシダーゼ系における本バイオセンサのピルビン酸に対する応答性を示すグラフである
［図５］ピルビン酸オキシダーゼ系における本バイオセンサのピルビン酸オキシダーゼ活性に対する応答性を示すグラフである
［図６］ピルビン酸オキシダーゼ系における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図７］ピルビン酸オキシダーゼ系における本バイオセンサと従来法との比較を示すグラフである（ａ）日本庭園、ｂ）カスケードｃ）溜池）
［図８］基質増幅反応系であるピルビン酸オキシダーゼ−酸性ホスファターゼ系における本バイオセンサのｐＨに対する応答性を示すグラフである
［図９］血糖センサのグルコースに対する応答性を示すグラフである
［図１０］単純反応（マルトースホスホリラーゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図１１］基質増幅反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ）系におけるリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図１２］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのｐＨの影響を示すグラフである
［図１３］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における反応時間と本バイオセンサの応答性との関係を示すグラフである
［図１４］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのマルトースに対する応答性を示すグラフである
［図１５］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図１６］基質増幅反応（スクロースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図１７］基質増幅反応（スクロースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのスクロースに対する応答性を示すグラフである
［図１８］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサのアセトアミノフェンの影響を示すグラフである
［図１９］過酸化水素系におけるアセトアミノフェンの影響を示すグラフである
［図２０］複合反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ−ムタロターゼ）系における本バイオセンサの各種夾雑物質の影響を示すグラフである
［図２１］基質増幅反応（マルトースホスホリラーゼ−酸性ホスファターゼ）系における酸性ホスファターゼ活性に対する応答性を示すグラフである
［図２２］無機ピロホスファターゼ系における本バイオセンサのピロリン酸イオンに対する応答性を示すグラフである
［図２３］無機ピロホスファターゼ系における本バイオセンサのＡＴＰおよびｄＮＴＰに対する応答性を示すグラフである
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【手続補正書】
【提出日】平成17年11月18日(2005.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液を、リン酸イオンと反応して酸化物となる基質およびこの酸化物を生成するための反応を触媒する酸化還元酵素と共に酸化型メディエーターを使用した既製のセンサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項２】
試料液を、ピルビン酸オキシダーゼ、マグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびチアミンピロリン酸と共に酸化型メディエーターを使用した既製のセンサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項３】
さらに酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼを試料液と共に用いて、リン酸を再生することを特徴とする請求項２記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項４】
試料液を、リン酸イオンと反応して最終的にβ-D-グルコースを生成する基質およびこのβ-D-グルコースを生成するための各反応を触媒する酵素と共に既製の血糖センサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項５】
試料液を、マルトース、マルトースホスホリラーゼおよび酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼと共に既製の血糖センサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項６】
さらにムタロターゼが用いられる請求項５記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項７】
酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼの代わりに、ムタロターゼが用いられる請求項５記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項８】
試料液を、スクロース、スクロースホスホリラーゼ、酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼおよびムタロターゼと共に既製の血糖センサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定することを特徴とするリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項９】
さらにマルトースおよびマルトースホスホリラーゼが用いられる請求項８記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１０】
さらにグルコースイソメラーゼが用いられる請求項８または９記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１１】
酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼの代わりに、グルコースイソメラーゼが用いられる請求項８または９記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１２】
酵素反応の基質であるリン酸イオンを、基質のリサイクル反応を起こす組み合わせによって検出することを特徴とする請求項３、５、６、８、９または１０記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１３】
さらに無機ピロホスファターゼ用いられる請求項１乃至１２のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１４】
核酸の検出、核酸特異配列または核酸のシークエンス、核酸増幅反応および受容体の挙動のモニタリング、リン酸イオンまたはピロリン酸イオンが触媒反応に関与する酵素の活性測定に用いられる請求項１乃至１３のいずれかに記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１５】
リン酸イオンが触媒反応に関与する酵素がピルビン酸オキシダーゼまたは前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼである請求項１４記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１６】
リン酸イオン以外の基質が10mM以上の濃度で用いられる請求項１５記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【請求項１７】
連結酵素(リガーゼ)の触媒作用により生成するピロリン酸イオンを検出することで、遺伝子多型(SNPs)の検出を可能とする請求項１３記載のリン酸イオンの定性・定量法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
かかる本発明の目的は、(1)試料液を、リン酸イオンと反応して酸化物となる基質およびこの酸化物を生成するための反応を触媒する酸化還元酵素と共に酸化型メディエーターを使用した既製のセンサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定する方法または(2)試料液を、ピルビン酸オキシダーゼ、マグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチドおよびチアミンピロリン酸と共に酸化型メディエーターを使用した既製のセンサ中で反応させた後、電圧を印可することにより生じた電流を測定する方法によって達成される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明方法(1)においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、酸化物を生成するような基質と酸化還元酵素、その他反応に必要とされる物質および既製のセンサに使用されている酸化型メディエーターを用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンが測定される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
リン酸イオンの測定には、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上および／またはその付近に測定に必要な酵素および試薬を配したセンサが用いられる。このようなセンサとしては、例えばセラミックス、ガラス、プラスチック、紙、生分解性材料(例えば、微生物生産ポリエステル等)などの絶縁性基板にスクリーン印刷法、蒸着法、スパッタリング法などによって白金、金、カーボン等から形成された各電極が形成され、作用極上および／またはその付近に架橋法、共有結合法、イオン結合法等により酵素および試薬を固定化したものなどが用いられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
上記反応(5)では、Piとマグネシウムイオン、フラビンアデニンジヌクレオチド、チアミンピロリン酸、ピルビン酸および既製のセンサに使用されている酸化型メディエーターの存在下、ピルビン酸オキシダーゼの作用により、生成物の一つであるアセチルリン酸が生成し、これからは反応(9)により酢酸とPiを生成する。ここで言う基質増幅反応系では、測定対象であるリン酸イオンが一段目の反応により一方の基質の分解物にリン酸化された後、次の反応によって再生され、元の一段目の反応の基質となる。この反応は繰り返されることからサイクリング反応とも呼ばれる。この反応系を利用する場合、一方の基質であるピルビン酸が十分に存在すれば、極わずかなリン酸イオンの存在によっても増幅反応が進行することができ、高感度なリン酸イオンの検出が可能となる。また逆に、リン酸イオン以外の基質を十分に存在させることで、前立腺の腫瘍マーカーである血中酸性ホスファターゼ活性の測定も可能となる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明方法(2)においては、リン酸イオンの存在によって酵素触媒反応が起こり、最終的にβ-D-グルコースを生成するような基質と酵素、既製のセンサに使用されている酸化型メディエーターおよびグルコースオキシダーゼによって代表される酸化還元酵素を用い、リン酸から還元型メディエーターを発生させ、さらにこれを酸化し、生ずる酸化電流を測定することにより、試料液中のリン酸イオンを測定することもできる。なお、試料液中にグルコースが存在する場合は、予めグルコースオキシダーゼなどを使用して試料液中のグルコースを消去しておく必要がある。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
リン酸イオンの測定は、基板上に作用極および対極、さらに必要に応じて参照極を設け、作用極上に測定に必要な酵素および試薬を配したセンサが用いられる。このようなセンサとしては、前述の如きものなどが用いられる。
【国際調査報告】
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