(57)【要約】臍帯血からの、より効率的な巨核球系細胞への分化、血小板生成方法を提供することを課題とする。  臍帯血を、サイトカイン存在下で、不死化ストローマ細胞と共培養することで、従来得られなかったような、１０万倍に及ぶ増殖を可能とした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３４陽性細胞及び不死化ストローマ細胞を共培養することを含む、巨核球系細胞の調製方法。
【請求項２】
サイトカインの存在下でＣＤ３４陽性細胞及び不死化ストローマ細胞を共培養する請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ３４陽性細胞及び不死化ストローマ細胞をサイトカインの存在下で共培養する工程（第１工程）、並びに不死化ストローマ細胞を除去後サイトカイン存在下で培養する工程（第２工程）からなる請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ３４陽性細胞及び不死化ストローマ細胞をサイトカインの存在下で共培養し巨核球系前駆細胞（巨核球系細胞に分化しうる造血前駆細胞）を調製する工程（第１工程）、並びに不死化ストローマ細胞を除去後巨核球系前駆細胞をサイトカイン存在下で培養する工程（第２工程）からなる請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１工程で用いるサイトカインが、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２  ｌｉｇａｎｄである請求項３又は４記載の方法。
【請求項６】
第２工程で用いるサイトカインが（１）ＴＰＯ，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３、（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１，又は（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬである請求項３又は４記載の方法。
【請求項７】
臍帯血から分離されたＣＤ３４陽性細胞を用いる請求項１〜６項いずれか１項記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７いずれか１項記載の方法で調製された巨核球系細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本願発明は、臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の巨核球への分化及び／又は増殖に関する。より具体的には、本願発明は、不死化ストローマ細胞を用いた臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の巨核球への分化／増殖に関する。
【背景技術】  白血病などの難治性血液疾患に対して行われている造血幹細胞移植には、大量の血液幹細胞を必要とする。造血幹細胞は、骨髄穿刺あるいは末梢血幹細胞採取等により、骨髄、末梢血や臍帯血から採取することができるが、このうち臍帯血は、骨髄由来の幹細胞よりも増殖力が旺盛で、免疫反応が低いため拒絶反応の可能性が低いという特徴がある。そのため、適切なドナーが見つからない場合は、有力な方法と考えられている。（非特許文献１：Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３５，ｐｐ．１５７−１６６）。
他方、臍帯血は、一度に採取できる細胞数が限られているため、増殖方法について研究されている。骨髄由来の人の幹細胞をＳＣＦ（ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＬ（Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２  ｌｉｇａｎｄ）、Ｇ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  Ｃｏｌｏｎｙ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−３，及びＩＬ−６で刺激することで、２倍に増加することが出来た旨報告があり（非特許文献２：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，１３６４８）、臍帯血についても、Ｆｌｔ−３，ＦＬ、ＳＣＦ、ＴＰＯ（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ−３（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ３、以下ＩＬ３とも記載する）を用いて、生体外で増殖させた報告もなされている。（非特許文献３：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００１  Ｖｏｌ１９，ｐｐ．３１３−３２０）
また、臍帯血は、骨髄移植や末梢血幹細胞移植に比べて、赤血球、白血球及び血小板、特に血小板の数に増えるまで時間を要するという欠点があることが知られている（非特許文献４：Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．１５６５−１５７７）。
【非特許文献１】Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３５，ｐｐ．１５７−１６６
【非特許文献２】Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ．９４，ｐｐ．１３６４８−１３６５３
【非特許文献３】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ２００１  Ｖｏｌ１９，ｐｐ．３１３−３２０
【非特許文献４】Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．１５６５−１５７７
【発明の開示】
臍帯血の生体外増殖において、巨核球系細胞への分化増殖も試みられている。例えば、ＴＰＯとＳＣＦとを用いた増殖（増幅）では、培養後１４日で２１０倍、培養後２１日で２４０倍へ増加したことが報告されている。しかしながら更なる増幅を求め、まず臍帯血を４週間増幅し、その後巨核球系細胞への分化増幅を行おうとすると、ＩＬ−３−ＳＣＦ−ＩＬ−６−ＴＰＯを用いてはじめて、１４日で４０倍程度の増幅しかできず、最大増幅率で依然満足できる物ではなかった。しかも、一度ＣＢを増幅してから分化すると、巨核球系細胞が未熟で、せいぜい４倍体になるにすぎないことが報告されている。そしてこれらは、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植しても一時的にしか、ヒトＣＤ４１陽性細胞は見られないと報告されている。（Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．３７９−３８７（２００３  Ａｐｒｉｌ））
そこで、本願発明は、臍帯血からの、より効率的な巨核球系細胞への分化、血小板生成方法を提供することを課題とする。
本願発明者等は、臍帯血を、サイトカイン存在下で、不死化ストローマ細胞と共培養することで、従来得られなかったような、１０万倍に及ぶ増殖を可能とした。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００４−００７１６９号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】  図１は、本方法の実施例概略を示す図。
図２は、実施例により得られた総細胞数。
図３は、実施例により得られたＣＤ４１陽性細胞の割合。
図４は、実施例によるＣＤ４１陽性細胞の増殖度。
図５は、実施例における培養後１４日、２１日、２５日及び２８日目のメイギムザ染色および２８日目の位相差顕微鏡像（右下）。
【発明を実施するための最良の形態】  本願発明には、不死化されたストローマ細胞と、ＣＤ３４陽性細胞とを共培養することを含む、ＣＤ４１陽性細胞（巨核球系細胞）を効率的に調整する方法を包含する。
本願発明で用いるＣＤ３４陽性細胞は、骨髄、末梢血、臍帯血から得ることができ、更に、ＥＳ細胞から分化させたＣＤ３４陽性細胞及び他の（幹）細胞から分化させたＣＤ３４陽性細胞を用いることもできる。好適には、臍帯血からのＣＤ３４陽性細胞を用いることができる。
臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞としては、例えば、臍帯血から、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配法により単核球を分離し、更に、例えば、ＣＤ３４特異的抗体、スーパーパラマグネティックマイクロビーズ及びｍｉｎｉＭＡＣＳを用いる方法、又はｍｕｌｔｉ−ＭＡＣＳを用いた方法等で分離することもできる。
本願方法には、（１）ＣＤ３４陽性細胞と不死化ストローマ細胞とを共培養する方法、（２）ＣＤ３４陽性細胞と不死化ストローマ細胞とを共培養する工程、及び不死化ストローマ細胞を除去後サイトカイン存在下でＣＤ３４陽性細胞を更に培養する方法、（３）ＣＤ３４陽性細胞と不死化ストローマ細胞とをサイトカイン存在下で培養する方法が包含される。
本願発明で用いる不死化ストローマ細胞は、哺乳動物のストローマ細胞、特にヒト由来のストローマ細胞を不死化させた不死化ストローマ細胞が好適である。好適には、ＷＯ０３／０３８０７６号公報に記載のｈＴＥＲＴ遺伝子が導入されたヒト骨髄ストローマ細胞（以下ｈＴＥＲＴストローマ細胞という）を用いることができる。なお、ｈＴＥＲＴの配列は、例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７，ｐ．９５５−９５９に記載されている。
ｈＴＥＲＴストローマ細胞は、例えば、次のようにして調製できる。
ｐＣＩ−Ｎｅｏ−ｈＴＥＲＴ−ＨＡよりＰＣＲにて得たｈＴＥＲＴ  ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ  ｆｒａｇｍｅｎｔをｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏにｃｌｏｎｉｎｇしｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴを調製する（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣｉ．ＵＳＡ  ｖｏｌ９５，ｐ１４７２３−１４７２８）。
次に、ＢＯＳＣ２３パッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：８３９２−８３９６，１９９３）を用いて、ΨＣＲＩＰパッケージング細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：３５３９−３５４３，１９９３）を作成する。上記のベクターを、レトロウイルス産生細胞（ψＣＲＩＰ／Ｐ１３１）で増殖させる。
そして、感染を行う前日に、ストローマ細胞を播きなおし、レトロウイルスを産生するψＣＲＩＰ／Ｐ１３１の培地を代えて培養する。次に上清に産生された組み換えレトロウイルスベクターをストローマ細胞（ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）に感染させた。４時間後培養上清を新しい培地に換えてさらに２日間培養した。その後、ｐＢＡＢＥ−ｈｙｇｒｏ−ｈＴＥＲＴはハイグロマイシン１００μｇ／ｍｌで５日間、薬剤選択を行ってｈＴＥＲＴストローマ細胞を調製することができる。
本願発明を、ＣＤ３４陽性細胞と不死化ストローマ細胞とを共培養する工程（第１工程）及び不死化ストローマ細胞を除去後サイトカイン存在下で培養する工程（第２工程）の２段階で調製する場合は、好適には、第１工程を、ＣＤ３４陽性細胞が巨核球系前駆細胞（巨核球系細胞へ分化しうる造血前駆細胞）へと分化するまで、具体的には、５−２１日、又は１０−２０日、たとえば、１４日間培養を続けることができる。又第１工程において存在させるサイトカイン類としては、ＳＣＦ、ＴＰＯ及びＦｌｔ−３／Ｆｌｋ−２  ｌｉｇａｎｄを組み合わせて用いることができる。
第２工程は、巨核球系前駆細胞が巨核球系細胞（ＣＤ４１陽性細胞）へと分化するまで、具体的には７−２１日間、又は１２−１６日間、例えば、１４日間培養することができる。第２工程に存在させるサイトカインとしては、（１）ＴＰＯ，（２）ＴＰＯ及びｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）３，（３）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６及びＩＬ１１、又は（４）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６，ＩＬ１１，ＳＣＦ及びＦＬを挙げることができる。
【実施例１】不死化ストローマ細胞を用いた臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞の巨核球への分化／増殖に関する検討：
（１）概要：
不死化ストローマ細胞（ｈＴＥＲＴ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）と１４日間共培養することで増殖させた臍帯血由来ＣＤ３４陽性細胞を、さらに１４日間トロンボポエチン（ＴＰＯ）を含むサイトカイン存在下で液体培養することにより、効率的にＣＤ４１陽性（巨核球系）細胞へと分化／増殖させた。（図１参照）
（２）材料、方法：
ＣＤ３４陽性細胞は、臍帯血より、ＭＡＣＳ分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社）を用いて、ＣＤ３４陽性細胞を分離したものを用いた。
不死化ストローマ細胞（ｈＴＥＲＴ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）は、ＷＯ０３／０３８０７６号公報に記載のｈＴＥＲＴ遺伝子が導入されたヒト骨髄ストローマ細胞を用いた。
ＣＤ４１陽性（巨核球系）細胞への分化増殖は二段階によった。
（ａ）第１工程（ＣＤ３４細胞を分離後０日目〜１４日目）：７５ｃｍ２ｆｌａｓｋを用いて、上記分離されたＣＤ３４陽性細胞は、コンフルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）となった不死化ストローマ細胞（ｈＴＥＲＴ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）と共に、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０にｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）１０ｎｇ／ｍｌ，ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＴＰＯ）５０ｎｇ／ｍｌ，Ｆｌｔ−３／Ｆｌｋ−２  ｌｉｇａｎｄ（ＦＬ）５０ｎｇ／ｍｌを加えた培地（ｍｅｄｉｕｍ）に、５ｘ１０２／９ｍｌの濃度で細胞を浮遊し、１４日間培養した。
培養後７日目に、上記と同組成の培地（ｍｅｄｉｕｍ）を９ｍｌ追加した。
（ｂ）第２工程（培養開始１４日目〜２８日目）では、第１工程で調製した浮遊細胞からなる巨核系前駆細胞を６穴プレート（６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）を用いて、Ｘ−ＶＩＶＯ  １０に（１）ＴＰＯ、（２）ＴＰＯ及びｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ（ＩＬ）３、（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１，又は（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬを添加した４系統の培地に２ｘ１０５／ｍｌの濃度で細胞を浮遊し、１４日間液体培養した。サイトカイン濃度はそれぞれ、ＴＰＯ５０ｎｇ／ｍｌ，ＩＬ１  ２５ｎｇ／ｍｌ，ＩＬ３  ２５ｎｇ／ｍｌ，ＩＬ６  ２５ｎｇ／ｍｌ，ＩＬ１１  ２５ｎｇ／ｍｌ，ＳＣＦ  ２５ｎｇ／ｍｌ，ＦＬ  ５０ｎｇ／ｍｌであった。
第２１日目で細胞を回収し、新しいメディウムに交換した。いずれも３７℃、５％ＣＯ２）の条件下で培養した。第２１日目及び第２８日目に細胞を回収し総細胞数をカウントし、フローサイトメトリーを用いて細胞の表面形質を解析した。またサイトスピン標本を作成し、メイ・ギムザ染色を行い細胞の形態を観察した。
（３）結果：
図２に培養により得られた総細胞数を示す。
（ａ）第１工程の共培養にて総細胞数は、５ｘ１０２から４ｘ１０６まで８，０００倍に増幅された。
（ｂ）さらに第２工程の液体培養で、（１）ＴＰＯを添加した場合は１．７ｘ１０５（３３０倍），（２）ＴＰＯおよびＩＬ３を添加した場合は５．２ｘ１０７（１０４，０００倍），（３）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６及びＩＬ１１を添加した場合は１．５ｘ１０７（３０，０００倍），（４）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６，ＩＬ１１，ＳＣＦ及びＦＬを添加した場合は２．８ｘ１０７（５６，０００倍）まで増幅された。
（ｃ）図３にフローサイトメトリーを用いた解析の結果を示す。
第１４日目の時点では、ＣＤ４１陽性細胞は６６％で、第２１日目では、ＣＤ４１陽性細胞は、（１）ＴＰＯでは８９％，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３では６０％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１では６０％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬでは６０％であった。
第２５日目においては、ＣＤ４１陽性細胞は、（１）ＴＰＯでは８１％，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３は７０％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１は５０％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬでは４５％であった。
また、第２８日目では、ＣＤ４１陽性細胞は、（１）ＴＰＯは８１％，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３では７０％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１では４４％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬでは３９％であった。
（ｄ）つまり、図４に示すように５ｘ１０２のＣＤ３４陽性細胞から、培養開始後２８日目には、それぞれ、（１）ＴＰＯは２６０倍，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３では７３，０００倍，（３）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６及びＩＬ１１では１５，０００倍，（４）ＴＰＯ，ＩＬ１，ＩＬ３，ＩＬ６，ＩＬ１１，ＳＣＦ及びＦＬでは２４，０００倍のＣＤ４１陽性細胞へと分化増殖させることができた。
（ｅ）図５にメイ・ギムザ染色と位相差顕微鏡像を示す。
培養開始後第１４日目では殆どが幼若な前駆細胞と思われた。
培養開始後第２１日目では、やや大型の細胞が、（１）ＴＰＯを用いた場合は３５％，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３を用いた場合は２５％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１を用いた場合は２０％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬを用いた場合は１０％を占めた。
培養開始後２５日目には、大型の細胞は、（１）ＴＰＯを用いた場合は６０％，（２）ＴＰＯ及びＩＬ３を用いた場合は５０％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１を用いた場合は４０％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬは３０％を占めた。
培養開始後２８日目では、（１）ＴＰＯを用いた場合は７０％、（２）ＴＰＯ及びＩＬ３は６５％，（３）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６及びＩＬ１１を用いた場合は４５％，（４）ＴＰＯ、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＳＣＦ及びＦＬを用いた場合は３０％を占めた。
それぞれの系で経時的に大型の細胞の増加を認めた。
培養開始後２８日目に位相差顕微鏡像で、大型の細胞を観察すると、突起を有していることが認められ、ｐｒｏｐｌａｔｅｌｅｔと考えられた。
（ｆ）以上から、不死化ストローマ細胞を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで大量の巨核球系細胞を増殖させる技術を確立した。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
産業上の利用の可能性
本発明の方法により、臍帯血を巨核球系細胞に分化及び又は増殖することで、例えば、化学療法により引き起こされた血小板減少症（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ）等の治療が可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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