(57)【要約】サテライト細胞を生成するための方法、およびサテライト細胞を含む組成物が本明細書に開示される。一局面では、天然に存在しないサテライト細胞が提供される。別の局面では、この天然に存在しないサテライト細胞は、内因性サテライト細胞の形態に似た形態を示す。別の局面では、この天然に存在しないサテライト細胞は、Ｐａｘ７を発現する。別の局面では、この天然に存在しないサテライト細胞は、筋肉傷害に対する反応を示す。別の局面では、この天然に存在しないサテライト細胞は、移植後に筋肉再生を引き起こす。
2020521459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
天然に存在しないサテライト細胞。
【請求項２】
内因性サテライト細胞の形態に似た形態を示す、請求項１に記載の天然に存在しないサテライト細胞。
【請求項３】
Ｐａｘ７を発現する、請求項１に記載の天然に存在しないサテライト細胞。
【請求項４】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、筋肉傷害に対する反応を示す、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項５】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、移植後に筋肉再生を引き起こす、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項６】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、少なくとも１つの静止関連遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項７】
前記静止関連遺伝子が、Ｓｐｒｙ１、Ｎｍ１、Ｎｆｉａ、ＦｏｓおよびＤｕｓｐ１からなる群より選択される、請求項６に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項９】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子が、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２およびＨｅｓからなる群より選択される、請求項８に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１０】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、Ｍｙｆ５を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１１】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、少なくとも１つの静止関連遺伝子および少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１２】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１３】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１４】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１５】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１６】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１７】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、ＭｙｏＤを発現しない、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項１９】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、筋芽細胞の集団からのインビトロ脱分化により生産される、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２０】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、脱分化した筋芽細胞に由来する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２１】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、培養において拡大増殖可能である、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２２】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、サテライト細胞ニッチを再配置する能力を有する、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２３】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、ヒトのものである、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２４】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、遺伝子改変されていない、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２５】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、遺伝子改変されている、請求項１に記載の天然に存在しない細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の細胞を含む、細胞株。
【請求項２７】
天然に存在しないサテライト細胞を含む組成物であって、
ａ．前記天然に存在しないサテライト細胞が脱分化した筋芽細胞に由来し；
ｂ．前記天然に存在しないサテライト細胞が培養において拡大増殖可能であり；
ｃ．前記天然に存在しないサテライト細胞がサテライト細胞ニッチを再配置する能力を有し；または
ｄ．前記天然に存在しないサテライト細胞が移植後に筋肉再生を引き起こす、組成物。
【請求項２８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が少なくとも１つの静止関連遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記静止関連遺伝子が、Ｓｐｒｙ１、Ｎｍ１、Ｎｆｉａ、ＦｏｓおよびＤｕｓｐ１からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記天然に存在しないサテライト細胞が少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子が、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２およびＨｅｓからなる群より選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記天然に存在しないサテライト細胞がＭｙｆ５を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３３】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３４】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３７】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記天然に存在しないサテライト細胞がＭｙｏＤを発現しない、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４０】
前記天然に存在しない細胞がＰａｘ７を発現する、請求項２７に記載の組成物。
【請求項４１】
筋芽細胞の集団から天然に存在しないサテライト細胞を生成する方法であって、スピン培養中の筋芽細胞を含む細胞集団を、少なくとも１種の培地と、天然に存在しないサテライト細胞への前記スピン培養中の少なくとも１つの筋芽細胞の脱分化を誘導するために十分な時間接触させることを含む、方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１種の培地が筋芽細胞培地である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１種の培地がスピン培地である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１種の培地が分化培地である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
筋芽細胞から天然に存在しないサテライト細胞を生成する方法であって、
筋芽細胞を含む細胞集団を筋芽細胞培地と接触させて、拡大増殖した筋芽細胞集団を形成すること；
スピン培養中の拡大増殖した筋芽細胞集団をスピン培地と接触させて、分化した細胞および増殖性細胞を含む少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを形成すること；
スピン培養中の前記少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを、分化培地と、天然に存在しないサテライト細胞への前記骨格筋オルガノイドの少なくとも１つの増殖性細胞の脱分化を誘導するために十分な時間接触させること
を含む、方法。
【請求項４６】
前記細胞集団を、スピン培地の懸濁培養物中で、分化した細胞および増殖性細胞を含む骨格筋オルガノイドへの前記細胞集団中の前記筋芽細胞のインビトロ変換を誘導するために十分な期間維持する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記期間が少なくとも１０日間を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記期間が１０日間〜３０日間を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記期間が１０〜２０日間を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
前記期間が２０日間を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを、懸濁培養物中で、少なくとも１つの天然に存在しないサテライト細胞への前記骨格筋オルガノイドの前記増殖性細胞の少なくとも１つのインビトロ脱分化を誘導するために十分な期間維持する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
前記期間が少なくとも１０日間を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記期間が１０日間〜３０日間を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記期間が１０〜２０日間を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記期間が１０日間を含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞集団中の前記筋芽細胞の少なくとも１％が、天然に存在しないサテライト細胞に脱分化するように誘導される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、少なくとも１つの静止関連遺伝子および少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項５９】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ａおよび／または図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも１つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも２つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６３】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、図８Ｃに特定されている少なくとも３つの遺伝子を発現する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６４】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、筋肉傷害に対する反応を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項６５】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、移植後に筋肉再生を促す、請求項４５に記載の方法。
【請求項６６】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、脱分化した筋芽細胞に由来する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６７】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、サテライト細胞ニッチを再配置する能力を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項６８】
前記天然に存在しないサテライト細胞がヒト細胞を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項６９】
天然に存在しないサテライト細胞のインビトロ生成が拡大縮小可能である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７０】
前記天然に存在しないサテライト細胞が培養において拡大増殖可能である、請求項４５に記載の方法。
【請求項７１】
請求項４５〜７０のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された、天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団。
【請求項７２】
被包された請求項７１に記載の天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団を含む、マイクロカプセル。
【請求項７３】
請求項４５〜７０のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された天然に存在しないサテライト細胞の集団を含む、組成物。
【請求項７４】
請求項４５〜７０のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産された天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団を含む、アッセイ。
【請求項７５】
少なくとも１つの天然に存在しないサテライト細胞への少なくとも１つの筋芽細胞の脱分化を促進する１つまたはそれを超える候補薬剤の同定において使用するための、請求項７４に記載のアッセイ。
【請求項７６】
処置を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、請求項４５〜７０のいずれか一項に記載の方法にしたがって生産されたサテライト細胞の単離された集団を含む組成物を投与することを含む、方法。
【請求項７７】
前記サテライト細胞がマイクロカプセル中に被包されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記天然に存在しないサテライト細胞が、前記天然に存在しないサテライト細胞を投与する同じ被験体から得られた筋芽細胞の集団から生産される、請求項７６に記載の方法。
【請求項７９】
前記被験体が筋肉変性障害を有するか、または筋肉変性障害を発症する増加したリスクを有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８０】
前記被験体が筋肉外傷を有するか、または筋肉外傷を発症する増加したリスクを有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８１】
前記被験体がサルコペニアを有するか、またはサルコペニアを発症する増加したリスクを有する、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
投与を必要とする被験体に投与するための、請求項４５〜７０のいずれかに記載の方法により生産された天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団の使用。
【請求項８３】
前記天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団が、マイクロカプセル中に被包されて前記被験体に投与される、請求項８２に記載の使用。
【請求項８４】
前記被験体が筋肉変性障害を有するか、または筋肉変性障害を発症する増加したリスクを有する、請求項８２に記載の使用。
【請求項８５】
前記被験体が筋肉外傷を有するか、または筋肉外傷を発症する増加したリスクを有する、請求項８２に記載の使用。
【請求項８６】
前記被験体が筋肉外傷を有するか、または筋肉外傷を発症する増加したリスクを有する、請求項８２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年５月２４日に出願された米国仮出願第６２／５１０，６１７号の利益を主張する。上記出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨格筋は、顕著な再生能力を有する。この再生能力は、サテライト細胞（骨格筋幹細胞）に起因する（Ｃｏｌｌｉｎｓら、２００５；Ｋｕａｎｇら、２００７；Ｍａｕｒｏ，１９６１）。損傷に反応して、または疾患の状態では、サテライト細胞は静止状態を抜け出して増殖し、筋芽細胞と称される前駆体の移行増幅集団を生じさせる（Ｙｉｎら、２０１３）。インビトロで培養すると、サテライト細胞は筋芽細胞になり、インビボ移植後に幹細胞ニッチを再配置する能力を喪失する（Ｍｏｎｔａｒｒａｓら、２００５）。これまで、インビトロで培養された筋芽細胞が脱分化してサテライト細胞に戻り得ることを実証する証拠は存在しない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
他の使用の中でも特に、細胞療法およびスクリーニングに有用な十分量のサテライト細胞を生成するための方法またはプロトコールが必要である。本明細書に記載される３Ｄ培養系（例えば、骨格筋オルガノイド）は、インビトロで培養された筋芽細胞がサテライト細胞に脱分化するための適切なニッチを作り出す。このニッチの生成は、筋芽細胞が静止状態に戻り、サテライト細胞の転写シグネチャーを採用し、サテライト細胞ニッチにのみ存在する重要な糖タンパク質を発現し始めることを可能にする。
【０００４】
いくつかの態様では、本開示は、天然に存在しない（すなわち、非ネイティブ）サテライト細胞を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、内因性サテライト細胞または天然に存在するサテライト細胞の形態に似た形態を示す。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、Ｐａｘ７および／またはＭｙｆ５を発現し、いくつかの実施形態では、この発現は、内因性サテライト細胞または天然に存在するサテライト細胞における各遺伝子の発現レベルと一致するレベルである。いくつかの実施形態では、天然に存在しない細胞は、筋肉傷害に対する反応を示す。例えば、天然に存在しないサテライト細胞は、移植後に筋肉再生を開始させ得るかまたは促し得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、少なくとも１つの静止関連遺伝子（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ）を発現する。静止関連遺伝子は、例えば、Ｓｐｒｙ１、Ｎｍ１、Ｎｆｉａ、ＦｏｓおよびＤｕｓｐ１からなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子は、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２およびＨｅｓからなる群より選択され得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、少なくとも１つの静止関連遺伝子および少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、本明細書の図８Ａおよび図８Ｃに特定されている遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つを発現する。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、本明細書の図８Ｃに特定されている少なくとも１つ、少なくとも２つまたは少なくとも３つの遺伝子を発現する。天然に存在しないサテライト細胞は、ＭｙｏＤ（その発現が筋芽細胞に関連する遺伝子）を発現しない。
【０００６】
いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、筋芽細胞からインビトロで脱分化する。天然に存在しないサテライト細胞は、脱分化した筋芽細胞に由来し得る。天然に存在しないサテライト細胞は、ヒトのものであり得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は遺伝子改変されていないが、他の実施形態では、それは遺伝子改変され得る。例えば、天然に存在しないサテライト細胞は、細胞のレシピエントに有益であり得る目的のタンパク質（例えば、インスリン）を発現するかまたは増加したレベルで発現するように改変され得る。天然に存在しないサテライト細胞は、サテライト細胞ニッチを再配置する能力を有し、および／または培養において拡大増殖可能（ｅｘｐａｎｄａｂｌｅ）であり得る。
【０００７】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される天然に存在しないサテライト細胞を含む細胞株を提供する。
【０００８】
いくつかの態様では、本開示は、天然に存在しないサテライト細胞を含む組成物であって、前記天然に存在しないサテライト細胞が、脱分化した筋芽細胞に由来し；前記天然に存在しないサテライト細胞が、培養において拡大増殖可能であり；前記天然に存在しないサテライト細胞が、サテライト細胞ニッチを再配置する能力を有し；および前記天然に存在しないサテライト細胞が、移植後に筋肉再生を促す、組成物を提供する。
【０００９】
いくつかの態様では、本明細書に記載される研究は、筋芽細胞の集団から天然に存在しないサテライト細胞を生成する方法であって、スピン培養中の筋芽細胞を含む細胞集団を、少なくとも１種の培地と、天然に存在しないサテライト細胞への前記スピン培養中の少なくとも１つの筋芽細胞の脱分化を誘導するために十分な時間接触させることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１種の培地は、筋芽細胞培地、スピン培地（ｓｐｉｎ  ｍｅｄｉｕｍ）および／または分化培地である。
【００１０】
いくつかの態様では、本開示は、筋芽細胞の集団から天然に存在しないサテライト細胞を生成する方法であって、筋芽細胞を含む細胞集団を筋芽細胞培地と接触させて、拡大増殖した筋芽細胞集団を形成すること；スピン培養中の拡大増殖した筋芽細胞集団をスピン培地と接触させて、分化した細胞および増殖性細胞を含む少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを形成すること；スピン培養中の前記少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを、分化培地と接触させて、天然に存在しないサテライト細胞への前記骨格筋オルガノイドの少なくとも１つの増殖性細胞の脱分化を誘導することを含む方法を提供する。
【００１１】
いくつかの実施形態では、細胞集団を、スピン培地の懸濁培養物中で、分化した細胞および増殖性細胞を含む少なくとも１つの骨格筋オルガノイドへの細胞集団中の筋芽細胞の少なくとも１つ（典型的には、少なくともいくつか）のインビトロ成熟を誘導するために十分な期間維持する。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも１０日間、１０日間〜３０日間または１０日間〜２０日間を含む。いくつかの実施形態では、期間は２０日間である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの骨格筋オルガノイドを、懸濁培養物中で、少なくとも１つの天然に存在しないサテライト細胞への骨格筋オルガノイドの増殖性細胞の少なくとも１つのインビトロ成熟を誘導するために十分な期間維持する。いくつかの実施形態では、期間は、少なくとも１０日間、１０日間〜３０日間または１０日間〜２０日間を含む；いくつかの実施形態では、期間は１０日間である。いくつかの実施形態では、細胞集団中の筋芽細胞の少なくとも１％は、天然に存在しないサテライト細胞に脱分化するように誘導される。したがって、本明細書に記載される天然に存在しないサテライト細胞は、脱分化した筋芽細胞に由来し得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞のインビトロ生成は、拡大縮小可能（ｓｃａｌａｂｌｅ）である。天然に存在しないサテライト細胞は、培養において拡大増殖可能であり得る。いくつかの実施形態では、天然に存在しないサテライト細胞は、サテライト細胞ニッチを再配置する能力を有する。
【００１４】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される方法にしたがって生産された天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団を提供する。
【００１５】
いくつかの態様では、本開示は、その中に被包された本明細書に記載される天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団を含むマイクロカプセルを提供する。
【００１６】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される方法にしたがって生産された天然に存在しないサテライト細胞の集団を含む組成物を提供する。
【００１７】
いくつかの態様では、本開示は、少なくとも１つの天然に存在しないサテライト細胞への少なくとも１つの筋芽細胞の脱分化を促進する１つまたはそれを超える候補薬剤を同定するためのアッセイを提供する。
【００１８】
いくつかの態様では、本開示は、処置を必要とする被験体を処置するための方法であって、被験体に、本明細書に記載される方法にしたがって生産された天然に存在しないサテライト細胞（例えば、天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団）を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、マイクロカプセル中に被包されている。天然に存在しないサテライト細胞は、天然に存在しないサテライト細胞を投与する同じ被験体から得られた筋芽細胞の集団から生産され得る。いくつかの実施形態では、被験体は、筋肉変性障害、筋肉外傷もしくは加齢に伴う筋力低下（例えば、サルコペニア）を有するか、またはそれらを発症する増加したリスクを有する。
【００１９】
いくつかの態様では、本開示は、投与を必要とする被験体に投与するための、例えば本明細書に記載される方法により生産された天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団の使用を提供する。天然に存在しないサテライト細胞の単離された集団は、マイクロカプセル中に被包されて被験体に投与され得る。いくつかの実施形態では、被験体は、筋肉変性障害、筋肉外傷もしくは加齢に伴う筋力低下（例えば、サルコペニア）を有するか、またはそれらを発症する増加したリスクを有する。
【００２０】
特に指示がない限り、本発明の実施は、典型的には、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子組換え生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来技術を用いるが、これらは当技術分野の技能の範囲内にある。特定のこれらの技術の非限定的な説明は、以下の刊行物：Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆら、（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ａｌｌ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，ｅｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ｏｆ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００８；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌ，ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，２００１；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，“Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ”，５ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ，２００５に見られる。治療剤およびヒト疾患に関する非限定的な情報は、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１１ｔｈ  Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，２００５，Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．（ｅｄ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ／Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ；１０ｔｈ  ｅｄ．（２００６）ｏｒ  １１ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２００９）に見られる。遺伝子および遺伝子障害に関する非限定的な情報は、ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｖ．Ａ．：Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ．Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９８（１２ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ）またはより最新のオンラインデータベース：Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ＯＭＩＭ（商標）．ＭｃＫｕｓｉｃｋ−Ｎａｔｈａｎｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）ａｎｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ），ａｓ  ｏｆ  Ｍａｙ  １，２０１０，Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂ  ＵＲＬ：ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／およびＯｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＯＭＩＡ），ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ，ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌ  ｓｐｅｃｉｅｓ（ｏｔｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ），ａｔ  ｏｍｉａ．ａｎｇｉｓ．ｏｒｇ．ａｕ／ｃｏｎｔａｃｔ．ｓｈｔｍｌに見られる。本明細書で言及されるすべての特許、特許出願および他の刊行物（例えば、科学論文、本、ウェブサイトおよびデータベース）は、その全体が参照により組み込まれる。本明細書と組み込まれる参考文献のいずれかとの間で矛盾がある場合には、本明細書（例えば、組み込まれる参考文献に基づくものであり得るその任意の補正を含む）が優先するものである。特に指示がない限り、本明細書では、用語の当技術分野で認められている標準的意味が使用される。本明細書では、様々な用語の標準的な略称が使用される。
【００２１】
特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な料金の支払いにより、官庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−Ｂ】図１Ａ〜１Ｄは、三次元骨格筋オルガノイドの培養を示す。図１Ａは、筋芽細胞の単離、ならびに三次元骨格筋オルガノイドを形成するためのスピンフラスコ中の拡大増殖および培養の概要を示す概略図を示す。図１Ｂは、スピンフラスコに播種した１０、２０および３０日後のマウス三次元骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＭｙＨＣ（赤色）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。図１Ｃは、スフェロイドプレートに播種した１０日後のヒト三次元骨格筋オルガノイドを示す。オービタルシェーカー上でさらに８日間培養するために、２日目に、骨格筋オルガノイドをスフェロイドプレートから低付着１０ｃｍプレートに移した。図１Ｄは、スフェロイドプレートに播種した１０日後のヒト三次元骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＭｙＨＣ（赤色）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。
【図１Ｃ−Ｄ】図１Ａ〜１Ｄは、三次元骨格筋オルガノイドの培養を示す。図１Ａは、筋芽細胞の単離、ならびに三次元骨格筋オルガノイドを形成するためのスピンフラスコ中の拡大増殖および培養の概要を示す概略図を示す。図１Ｂは、スピンフラスコに播種した１０、２０および３０日後のマウス三次元骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＭｙＨＣ（赤色）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。図１Ｃは、スフェロイドプレートに播種した１０日後のヒト三次元骨格筋オルガノイドを示す。オービタルシェーカー上でさらに８日間培養するために、２日目に、骨格筋オルガノイドをスフェロイドプレートから低付着１０ｃｍプレートに移した。図１Ｄは、スフェロイドプレートに播種した１０日後のヒト三次元骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＭｙＨＣ（赤色）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂは、骨格筋オルガノイド由来サテライト様細胞の転写プロファイリングを示す。図２Ａは、サテライト細胞および培養筋芽細胞の遺伝子プロファイルを示すヒートマップを提供する。赤色は、アップレギュレートされている遺伝子を示し、青色は、筋芽細胞とサテライト細胞との間でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、３Ｄ培養３０日後の骨格筋オルガノイド由来ｎＧＦＰ＋細胞からのｑＰＣＲ検証を示す。個々のＰａｘ７ｎＧＦＰマウスに由来する別個の筋芽細胞株を使用して、生物学的３回反復（ｎ＝３）で行った実験。結果は、増殖筋芽細胞に対する対数変化倍率として表示されている。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｂは、骨格筋オルガノイド由来サテライト様細胞の転写プロファイリングを示す。図２Ａは、サテライト細胞および培養筋芽細胞の遺伝子プロファイルを示すヒートマップを提供する。赤色は、アップレギュレートされている遺伝子を示し、青色は、筋芽細胞とサテライト細胞との間でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図２Ｂは、３Ｄ培養３０日後の骨格筋オルガノイド由来ｎＧＦＰ＋細胞からのｑＰＣＲ検証を示す。個々のＰａｘ７ｎＧＦＰマウスに由来する別個の筋芽細胞株を使用して、生物学的３回反復（ｎ＝３）で行った実験。結果は、増殖筋芽細胞に対する対数変化倍率として表示されている。
【図３Ａ−Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、骨格筋オルガノイド由来サテライト様細胞が、サテライト細胞ニッチにユニークなプロテオグリカンを発現することを実証する。図３Ａは、培養筋芽細胞上の発現と比べた、サテライト細胞特異的プロテオグリカン遺伝子のサブセットを示すヒートマップを提供する。赤色は、アップレギュレートされている遺伝子を示し、青色は、筋芽細胞とサテライト細胞との間でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図３Ｂは、３Ｄ培養３０日後の骨格筋オルガノイド由来ｎＧＦＰ＋細胞からのプロテオグリカン遺伝子のｑＰＣＲ検証を示す。個々のＰａｘ７ｎＧＦＰマウスに由来する別個の筋芽細胞株を使用して、生物学的３回反復（ｎ＝３）で行った実験。結果は、増殖筋芽細胞に対する対数変化倍率として表示されている。図３Ｃは、プロテオグリカンを検出するための骨格筋オルガノイド培養および分化の概略図を提供する。図３Ｄは、２０日目または１０日目分化の凍結切片骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＢｇｎ（赤色上）またはＴｇｆｂｒ３（赤色下）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。
【図３Ｃ−Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、骨格筋オルガノイド由来サテライト様細胞が、サテライト細胞ニッチにユニークなプロテオグリカンを発現することを実証する。図３Ａは、培養筋芽細胞上の発現と比べた、サテライト細胞特異的プロテオグリカン遺伝子のサブセットを示すヒートマップを提供する。赤色は、アップレギュレートされている遺伝子を示し、青色は、筋芽細胞とサテライト細胞との間でダウンレギュレートされている遺伝子を示す。図３Ｂは、３Ｄ培養３０日後の骨格筋オルガノイド由来ｎＧＦＰ＋細胞からのプロテオグリカン遺伝子のｑＰＣＲ検証を示す。個々のＰａｘ７ｎＧＦＰマウスに由来する別個の筋芽細胞株を使用して、生物学的３回反復（ｎ＝３）で行った実験。結果は、増殖筋芽細胞に対する対数変化倍率として表示されている。図３Ｃは、プロテオグリカンを検出するための骨格筋オルガノイド培養および分化の概略図を提供する。図３Ｄは、２０日目または１０日目分化の凍結切片骨格筋オルガノイドを示す。Ｐａｘ７（緑色）およびＢｇｎ（赤色上）またはＴｇｆｂｒ３（赤色下）に対する抗体による免疫蛍光イメージング。核はヘキストで対比染色されている。スケールバーは１００μｍを示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｅは、骨格筋オルガノイドを生成するための方法を示す。図４Ａは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞の形成を概説する概略図を提供する。ＳｋＭＯ細胞は、一般に、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を包含する。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞は、スピン培養培地で３０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞は、スピン培養培地で２０日間成長させ、分化培地で１０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である（本明細書では、天然に存在しないサテライト細胞とも称される）。図４Ｂは、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を示す。図４Ｃは、ＳｋＭＯ細胞がＰａｘ７（内因性サテライト細胞の重要な転写因子）を発現することを示す。ＲＮＡｓｅｑにより、ＳｋＭＯの転写プロファイルを検査し、図４Ｄに示されている多次元スケーリングプロットを使用して、状態空間でクラスタ化するそれらの能力を評価する。ＳｋＭＯ  ＧＦＰ＋細胞（緑色および青色）は、転写シグネチャーの点で内因性サテライト細胞（赤色）に近似する。ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞（青色）は、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞（緑色）よりも増殖的であることが示されており、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞は、内因性サテライト細胞（赤色）の近くにクラスタ化している。図４Ｅは、図４Ｄで提供されているデータをさらに裏付けるグローバルヒートマップおよびデンドログラムを提供する。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ〜４Ｅは、骨格筋オルガノイドを生成するための方法を示す。図４Ａは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞の形成を概説する概略図を提供する。ＳｋＭＯ細胞は、一般に、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を包含する。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞は、スピン培養培地で３０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞は、スピン培養培地で２０日間成長させ、分化培地で１０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である（本明細書では、天然に存在しないサテライト細胞とも称される）。図４Ｂは、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を示す。図４Ｃは、ＳｋＭＯ細胞がＰａｘ７（内因性サテライト細胞の重要な転写因子）を発現することを示す。ＲＮＡｓｅｑにより、ＳｋＭＯの転写プロファイルを検査し、図４Ｄに示されている多次元スケーリングプロットを使用して、状態空間でクラスタ化するそれらの能力を評価する。ＳｋＭＯ  ＧＦＰ＋細胞（緑色および青色）は、転写シグネチャーの点で内因性サテライト細胞（赤色）に近似する。ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞（青色）は、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞（緑色）よりも増殖的であることが示されており、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞は、内因性サテライト細胞（赤色）の近くにクラスタ化している。図４Ｅは、図４Ｄで提供されているデータをさらに裏付けるグローバルヒートマップおよびデンドログラムを提供する。
【図４Ｄ】図４Ａ〜４Ｅは、骨格筋オルガノイドを生成するための方法を示す。図４Ａは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞の形成を概説する概略図を提供する。ＳｋＭＯ細胞は、一般に、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を包含する。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞は、スピン培養培地で３０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞は、スピン培養培地で２０日間成長させ、分化培地で１０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である（本明細書では、天然に存在しないサテライト細胞とも称される）。図４Ｂは、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を示す。図４Ｃは、ＳｋＭＯ細胞がＰａｘ７（内因性サテライト細胞の重要な転写因子）を発現することを示す。ＲＮＡｓｅｑにより、ＳｋＭＯの転写プロファイルを検査し、図４Ｄに示されている多次元スケーリングプロットを使用して、状態空間でクラスタ化するそれらの能力を評価する。ＳｋＭＯ  ＧＦＰ＋細胞（緑色および青色）は、転写シグネチャーの点で内因性サテライト細胞（赤色）に近似する。ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞（青色）は、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞（緑色）よりも増殖的であることが示されており、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞は、内因性サテライト細胞（赤色）の近くにクラスタ化している。図４Ｅは、図４Ｄで提供されているデータをさらに裏付けるグローバルヒートマップおよびデンドログラムを提供する。
【図４Ｅ】図４Ａ〜４Ｅは、骨格筋オルガノイドを生成するための方法を示す。図４Ａは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞の形成を概説する概略図を提供する。ＳｋＭＯ細胞は、一般に、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を包含する。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞は、スピン培養培地で３０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である。ＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞は、スピン培養培地で２０日間成長させ、分化培地で１０日間成長させた骨格筋オルガノイド細胞である（本明細書では、天然に存在しないサテライト細胞とも称される）。図４Ｂは、ＳｋＭＯ  ３０Ｄ成長細胞およびＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞を示す。図４Ｃは、ＳｋＭＯ細胞がＰａｘ７（内因性サテライト細胞の重要な転写因子）を発現することを示す。ＲＮＡｓｅｑにより、ＳｋＭＯの転写プロファイルを検査し、図４Ｄに示されている多次元スケーリングプロットを使用して、状態空間でクラスタ化するそれらの能力を評価する。ＳｋＭＯ  ＧＦＰ＋細胞（緑色および青色）は、転写シグネチャーの点で内因性サテライト細胞（赤色）に近似する。ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞（青色）は、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞（緑色）よりも増殖的であることが示されており、ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞は、内因性サテライト細胞（赤色）の近くにクラスタ化している。図４Ｅは、図４Ｄで提供されているデータをさらに裏付けるグローバルヒートマップおよびデンドログラムを提供する。
【図５Ａ−Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）由来細胞が内因性サテライト細胞に類似することを示すバイオマーカーおよび表現型データを提供する。図５Ａは、筋芽細胞は分裂してＥｄＵを取り込むが、内因性サテライト細胞はそうではないことを示すＥｄＵ取り込みアッセイ（４８時間処理）の結果を提供する。ＳｋＭＯ由来細胞は、筋芽細胞よりもかなり静止状態であり、内因性サテライト細胞（紫色）に非常に類似する（ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ条件（赤色））（図５Ｂ）。図５Ｃは、サテライト細胞機能を予測するインビトロアッセイを提供する。懸濁９６ウェルプレートで単一細胞として培養したサテライト細胞はクローンを形成するのに対して、筋芽細胞はそうではない。これは、成体幹細胞の古典的なクローンアッセイに似ている。図５Ｄは、所定の細胞型に由来する各クローンのサイズを示す。ＳｋＭＯ由来細胞は、内因性サテライト細胞により類似する。
【図５Ｃ−Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）由来細胞が内因性サテライト細胞に類似することを示すバイオマーカーおよび表現型データを提供する。図５Ａは、筋芽細胞は分裂してＥｄＵを取り込むが、内因性サテライト細胞はそうではないことを示すＥｄＵ取り込みアッセイ（４８時間処理）の結果を提供する。ＳｋＭＯ由来細胞は、筋芽細胞よりもかなり静止状態であり、内因性サテライト細胞（紫色）に非常に類似する（ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ条件（赤色））（図５Ｂ）。図５Ｃは、サテライト細胞機能を予測するインビトロアッセイを提供する。懸濁９６ウェルプレートで単一細胞として培養したサテライト細胞はクローンを形成するのに対して、筋芽細胞はそうではない。これは、成体幹細胞の古典的なクローンアッセイに似ている。図５Ｄは、所定の細胞型に由来する各クローンのサイズを示す。ＳｋＭＯ由来細胞は、内因性サテライト細胞により類似する。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆは、損傷骨格筋への移植後に、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞が生着および再配置することを実証するインビボデータを提供する。図６Ａは、移植後にＳｋＭＯ細胞を生着および再配置するための方法を示す概略図を提供する。図６Ｂ〜６Ｃは、生物発光（ＢＬＩ）シグナルがＳｋＭＯ処置脚に由来するのに対して、筋芽細胞処置脚では、細胞は十分なＢＬＩシグナルを提供しない（図６Ｂ）ことを示す。２１日間の時間経過（Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２１）でこれを定量し、統計が含まれている（図６Ｃ）。図６Ｄは、筋芽細胞およびドナー由来ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞に由来する線維を示す。図６Ｅは、図６Ｄに示されている生着の定量を提供する。図６Ｆは、筋芽細胞と比較した、ＳｋＭＯ由来細胞の移植後の細胞によるサテライト細胞ニッチの再配置を示す。図６Ｇは、再配置アッセイの定量を提供する（＊注：現在、ＳｋＭＯ細胞は有意ではない）。
【図６Ｂ−Ｃ】図６Ａ〜６Ｆは、損傷骨格筋への移植後に、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞が生着および再配置することを実証するインビボデータを提供する。図６Ａは、移植後にＳｋＭＯ細胞を生着および再配置するための方法を示す概略図を提供する。図６Ｂ〜６Ｃは、生物発光（ＢＬＩ）シグナルがＳｋＭＯ処置脚に由来するのに対して、筋芽細胞処置脚では、細胞は十分なＢＬＩシグナルを提供しない（図６Ｂ）ことを示す。２１日間の時間経過（Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２１）でこれを定量し、統計が含まれている（図６Ｃ）。図６Ｄは、筋芽細胞およびドナー由来ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞に由来する線維を示す。図６Ｅは、図６Ｄに示されている生着の定量を提供する。図６Ｆは、筋芽細胞と比較した、ＳｋＭＯ由来細胞の移植後の細胞によるサテライト細胞ニッチの再配置を示す。図６Ｇは、再配置アッセイの定量を提供する（＊注：現在、ＳｋＭＯ細胞は有意ではない）。
【図６Ｄ−Ｇ】図６Ａ〜６Ｆは、損傷骨格筋への移植後に、骨格筋オルガノイド（ＳｋＭＯ）細胞が生着および再配置することを実証するインビボデータを提供する。図６Ａは、移植後にＳｋＭＯ細胞を生着および再配置するための方法を示す概略図を提供する。図６Ｂ〜６Ｃは、生物発光（ＢＬＩ）シグナルがＳｋＭＯ処置脚に由来するのに対して、筋芽細胞処置脚では、細胞は十分なＢＬＩシグナルを提供しない（図６Ｂ）ことを示す。２１日間の時間経過（Ｄ２、Ｄ７、Ｄ１４およびＤ２１）でこれを定量し、統計が含まれている（図６Ｃ）。図６Ｄは、筋芽細胞およびドナー由来ＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞に由来する線維を示す。図６Ｅは、図６Ｄに示されている生着の定量を提供する。図６Ｆは、筋芽細胞と比較した、ＳｋＭＯ由来細胞の移植後の細胞によるサテライト細胞ニッチの再配置を示す。図６Ｇは、再配置アッセイの定量を提供する（＊注：現在、ＳｋＭＯ細胞は有意ではない）。
【図７Ａ−Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、ヒト筋芽細胞がＳｋＭＯ細胞を形成することを実証するヒトデータを提供する。ヒト筋芽細胞から形成されたＳｋＭＯ細胞はＰａｘ７陽性である（図７Ａ）。図７Ｂは、ヒト筋芽細胞からＳｋＭＯ細胞を生成してそれらの細胞を移植するための方法を示す概略図を提供する。図７Ｃは、ヒト筋芽細胞のＢＬＩ定量を提供する。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、ヒト筋芽細胞がＳｋＭＯ細胞を形成することを実証するヒトデータを提供する。ヒト筋芽細胞から形成されたＳｋＭＯ細胞はＰａｘ７陽性である（図７Ａ）。図７Ｂは、ヒト筋芽細胞からＳｋＭＯ細胞を生成してそれらの細胞を移植するための方法を示す概略図を提供する。図７Ｃは、ヒト筋芽細胞のＢＬＩ定量を提供する。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｅは、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定する。細胞のマルチプレックスＲＮＡシーケンシングを実施して、筋芽細胞と比較して、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定した。筋芽細胞と比べて、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ａ）およびダウンレギュレート（図８Ｂ）されている多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、内因性サテライト細胞を広く定義するために使用され得る。標準経路に関与する遺伝子は緑色で強調表示され、ｐ５３経路に関与する遺伝子は黄色で強調表示されている。（注＊Ｐａｘ７およびＴｇｆｂｒ３は、マルチプレックスＲＮＡシーケンシングにより同定されなかったので、赤色で同定されているが、以前に取得したデータに基づいて、サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞に存在することが公知である）。加えて、筋芽細胞と比べて、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ｃ）およびダウンレギュレート（図８Ｄ）されているが、内因性サテライト細胞に存在しない多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、ＳｋＭＯ細胞を内因性サテライト細胞と区別するために使用され得る。内因性サテライト細胞と比較して、ＳｋＭＯ細胞にユニークな遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害（赤色で強調表示）および／またはプロテアソーム活性化（紫色で強調表示）を含む様々な経路に関与する可能性がある。図８Ｅは、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子の重複を実証するベン図を提供する。関与する経路（Ｎｏｔｃｈ活性化、Ｗｎｔ阻害、プロテアソーム活性化）がさらに同定されている。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｅは、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定する。細胞のマルチプレックスＲＮＡシーケンシングを実施して、筋芽細胞と比較して、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定した。筋芽細胞と比べて、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ａ）およびダウンレギュレート（図８Ｂ）されている多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、内因性サテライト細胞を広く定義するために使用され得る。標準経路に関与する遺伝子は緑色で強調表示され、ｐ５３経路に関与する遺伝子は黄色で強調表示されている。（注＊Ｐａｘ７およびＴｇｆｂｒ３は、マルチプレックスＲＮＡシーケンシングにより同定されなかったので、赤色で同定されているが、以前に取得したデータに基づいて、サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞に存在することが公知である）。加えて、筋芽細胞と比べて、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ｃ）およびダウンレギュレート（図８Ｄ）されているが、内因性サテライト細胞に存在しない多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、ＳｋＭＯ細胞を内因性サテライト細胞と区別するために使用され得る。内因性サテライト細胞と比較して、ＳｋＭＯ細胞にユニークな遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害（赤色で強調表示）および／またはプロテアソーム活性化（紫色で強調表示）を含む様々な経路に関与する可能性がある。図８Ｅは、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子の重複を実証するベン図を提供する。関与する経路（Ｎｏｔｃｈ活性化、Ｗｎｔ阻害、プロテアソーム活性化）がさらに同定されている。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｅは、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定する。細胞のマルチプレックスＲＮＡシーケンシングを実施して、筋芽細胞と比較して、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定した。筋芽細胞と比べて、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ａ）およびダウンレギュレート（図８Ｂ）されている多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、内因性サテライト細胞を広く定義するために使用され得る。標準経路に関与する遺伝子は緑色で強調表示され、ｐ５３経路に関与する遺伝子は黄色で強調表示されている。（注＊Ｐａｘ７およびＴｇｆｂｒ３は、マルチプレックスＲＮＡシーケンシングにより同定されなかったので、赤色で同定されているが、以前に取得したデータに基づいて、サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞に存在することが公知である）。加えて、筋芽細胞と比べて、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ｃ）およびダウンレギュレート（図８Ｄ）されているが、内因性サテライト細胞に存在しない多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、ＳｋＭＯ細胞を内因性サテライト細胞と区別するために使用され得る。内因性サテライト細胞と比較して、ＳｋＭＯ細胞にユニークな遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害（赤色で強調表示）および／またはプロテアソーム活性化（紫色で強調表示）を含む様々な経路に関与する可能性がある。図８Ｅは、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子の重複を実証するベン図を提供する。関与する経路（Ｎｏｔｃｈ活性化、Ｗｎｔ阻害、プロテアソーム活性化）がさらに同定されている。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｅは、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定する。細胞のマルチプレックスＲＮＡシーケンシングを実施して、筋芽細胞と比較して、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定した。筋芽細胞と比べて、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ａ）およびダウンレギュレート（図８Ｂ）されている多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、内因性サテライト細胞を広く定義するために使用され得る。標準経路に関与する遺伝子は緑色で強調表示され、ｐ５３経路に関与する遺伝子は黄色で強調表示されている。（注＊Ｐａｘ７およびＴｇｆｂｒ３は、マルチプレックスＲＮＡシーケンシングにより同定されなかったので、赤色で同定されているが、以前に取得したデータに基づいて、サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞に存在することが公知である）。加えて、筋芽細胞と比べて、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ｃ）およびダウンレギュレート（図８Ｄ）されているが、内因性サテライト細胞に存在しない多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、ＳｋＭＯ細胞を内因性サテライト細胞と区別するために使用され得る。内因性サテライト細胞と比較して、ＳｋＭＯ細胞にユニークな遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害（赤色で強調表示）および／またはプロテアソーム活性化（紫色で強調表示）を含む様々な経路に関与する可能性がある。図８Ｅは、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子の重複を実証するベン図を提供する。関与する経路（Ｎｏｔｃｈ活性化、Ｗｎｔ阻害、プロテアソーム活性化）がさらに同定されている。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｅは、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定する。細胞のマルチプレックスＲＮＡシーケンシングを実施して、筋芽細胞と比較して、内因性サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子を同定した。筋芽細胞と比べて、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ａ）およびダウンレギュレート（図８Ｂ）されている多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、内因性サテライト細胞を広く定義するために使用され得る。標準経路に関与する遺伝子は緑色で強調表示され、ｐ５３経路に関与する遺伝子は黄色で強調表示されている。（注＊Ｐａｘ７およびＴｇｆｂｒ３は、マルチプレックスＲＮＡシーケンシングにより同定されなかったので、赤色で同定されているが、以前に取得したデータに基づいて、サテライト細胞およびＳｋＭＯ細胞に存在することが公知である）。加えて、筋芽細胞と比べて、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞において＞２倍アップレギュレート（図８Ｃ）およびダウンレギュレート（図８Ｄ）されているが、内因性サテライト細胞に存在しない多くの遺伝子が同定されている。これらの遺伝子は、ＳｋＭＯ細胞を内因性サテライト細胞と区別するために使用され得る。内因性サテライト細胞と比較して、ＳｋＭＯ細胞にユニークな遺伝子は、Ｗｎｔシグナル伝達の阻害（赤色で強調表示）および／またはプロテアソーム活性化（紫色で強調表示）を含む様々な経路に関与する可能性がある。図８Ｅは、内因性サテライト細胞、ＳｋＭＯ  Ｄ３０成長細胞およびＳｋＭＯ  Ｄ３０  Ｄｉｆｆ細胞においてアップレギュレートおよびダウンレギュレートされている遺伝子の重複を実証するベン図を提供する。関与する経路（Ｎｏｔｃｈ活性化、Ｗｎｔ阻害、プロテアソーム活性化）がさらに同定されている。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本開示の態様は、少なくとも１つの筋芽細胞からサテライト細胞（本明細書では、天然に存在しないサテライト細胞または非ネイティブサテライト細胞と称される）を生成するための組成物、方法、キットおよび薬剤、ならびに細胞療法、アッセイおよび様々な処置方法において使用するための、前記組成物、方法、キットおよび薬剤により生成されたサテライト細胞に関する。
【００２４】
本明細書に記載される方法にしたがって生成されたインビボ生産サテライト細胞は、多くの利点を示す；例えば、それらは、サテライト細胞ニッチを再配置して筋肉再生を増強する能力を有する。加えて、生成されたサテライト細胞は、細胞療法（例えば、追加的および／または機能的サテライト細胞を必要とする被験体への移植）および研究のための新たなプラットフォームを提供し得る。
【００２５】
定義
便宜上、ここで、すなわち本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語は、本明細書でまとめられる。特に定義がない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語はすべて、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の体を形成する任意の細胞を指す。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知）は、受精中に融合して接合子（これから、哺乳動物胚全体が発生する）と称される細胞を生産する精子および卵子である。哺乳動物の体内のあらゆる他の細胞型（精子および卵子、それらが作られる細胞（生殖母細胞）ならびに未分化幹細胞を除く）は、体細胞型である；内臓、皮膚、骨、血液および結合組織はすべて、体細胞から構成される。いくつかの実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは、胚に存在しないかまたは胚から得られない体細胞であって、インビトロでこのような細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは、胚以外の生物もしくは胎児に存在するかもしくは胚以外の生物もしくは胎児から得られるか、またはインビトロでこのような細胞の増殖から生じる細胞を意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「成体細胞」という用語は、胚発生後に体全体に見られる細胞を指す。
【００２８】
「前駆体」または「前駆」細胞という用語は本明細書では互換的に使用され、分化により生じ得る細胞と比べて原始的である（すなわち、完全に分化した細胞よりも発生経路または進行の初期段階にある）細胞表現型を有する細胞を指す。多くの場合、前駆細胞はまた、有意なまたは非常に高い増殖能力を有する。前駆細胞は、発生経路と、細胞が発生および分化する環境とに応じて、複数の異なる分化した細胞型または単一の分化した細胞型を生じさせ得る。
【００２９】
「表現型」という用語は、実際の遺伝子型にかかわらず、特定の組の環境条件および因子の下で細胞または生物を規定する１つまたは多くの全生物学的特徴を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、１つを超える分化した細胞型に分化し、好ましくは３つすべての生殖細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。多能性細胞は、例えば、ヌードマウステラトーマ形成アッセイを使用して、１つを超える細胞型、好ましくは３つすべての胚葉に分化する能力を主に特徴とする。多能性はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現により証明されるが、好ましい多能性試験は、３つの各胚葉の細胞に分化する能力の実証である。このような細胞を単に培養しても、自然にそれらが多能性になるわけではないことに留意すべきである。再プログラム化多能性細胞（例えば、本明細書でその用語が定義されるｉＰＳ細胞）はもまた、一般に培養においてごく限られた回数の分裂能力を有する初代細胞の親と比べて、成長能力を喪失せずに、長期継代能力の特徴を有する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、増殖することができる未分化細胞であって、多数の母細胞を生成する能力を有するより多くの前駆細胞を生じさせ、そして、分化した娘細胞または分化可能な娘細胞を生じさせることができる未分化細胞を指す。娘細胞それ自体は、親発生能力を有する１つまたはそれを超える細胞も保持しながら、誘導されて増殖し、１つまたはそれを超える成熟細胞型にその後分化する子孫を生産し得る。「幹細胞」という用語は、特定の環境下において、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または可能性を有する前駆体のサブセットであって、特定の環境下において、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する前駆体のサブセットを指す。一実施形態では、幹細胞という用語は、一般に、その子孫細胞（子孫）が、胚性細胞および組織の進行的多様化において生じる際に、分化により、例えば完全に個別の特徴を獲得することにより、多くの場合に異なる方向で特殊化する天然に存在する母細胞を指す。細胞分化は、多くの細胞分裂を介して典型的に起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は、それ自体が多分化能細胞に由来する多分化能細胞に由来し得る、など。これらの各多分化能細胞は幹細胞であると考えられ得るが、細胞型の範囲はそれぞれかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞はまた、より高い発生能力の細胞を生じさせる能力を有する。このような能力は天然であり得るか、または様々な因子による処理により人工的に誘導され得る。多くの生物学的事例では、幹細胞は、１つを超える異なる細胞型の子孫を生産し得るので、それらもまた「多分化能（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」であるが、これは「幹性」を必要としない。自己複製は、幹細胞定義の他の古典的な部分であり、本明細書で使用される場合、それは必須である。理論的には、自己複製は、２つの主要機構のいずれかにより起こり得る。幹細胞は非対称に分裂し得、一方の娘は幹状態を保持し、他方の娘は、いくつかの異なる他の特異的機能および表現型を発現する。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは２つの幹に対称的に分裂するので、全体として集団中のいくつかの幹細胞を維持し得るが、集団中の他の細胞は、分化した子孫のみを生じさせる。形式的には、幹細胞として開始する細胞は、分化した表現型に進行し得るが、幹細胞表現型に「戻り」、幹細胞表現型を再発現する（当業者により「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化（ｒｅｔｒｏｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」と称されることが多い用語）ことが可能である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞などを含む。
【００３２】
「内因性ミオサテライト細胞」または「内因性サテライト細胞」という用語は、本明細書では、成熟筋肉では実質的に細胞質が見られない小さな単核前駆細胞を指すために使用される。それらは、個々の筋線維の基底膜と筋線維膜（細胞膜）との間に挟まれて見られ、線維の筋線維膜下核と区別困難であり得る。内因性サテライト細胞は、分化および融合して既存の筋線維を増強し、新たな線維を形成することができる。これらの細胞は、最も古くから公知の成体幹細胞ニッチに相当し、筋肉の正常成長、および傷害または疾患後の再生に関与する。非損傷筋肉では、内因性サテライト細胞の大部分は静止状態である；それらは分化せず、細胞分裂も受けない。機械的歪みに応じて、内因性サテライト細胞は活性化される。活性化した内因性サテライト細胞は、最初に、筋原性分化を受ける前に骨格筋芽細胞として増殖する。内因性サテライト細胞は、本明細書に記載される特徴の多くにより、本発明の天然に存在しないサテライト細胞と区別可能である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「サテライト細胞」、「天然に存在しないサテライト細胞」、「非ネイティブサテライト細胞」および「ＳｋＭＯ  ３０Ｄ  Ｄｉｆｆ細胞」はすべて、筋芽細胞の脱分化により生成されるサテライト細胞を指す。サテライト細胞は、限定されないが、サテライト細胞ニッチを再配置する能力、筋肉再生を促して遺伝子マーカーの適切な発現を示す能力、糖タンパク質の適切な発現、および培養における拡大増殖可能性を含む、内因性サテライト細胞と共有し得る１つまたはそれを超える特徴を示し得る。しかしながら、天然に存在しないサテライト細胞は、本明細書に記載される内因性サテライト細胞と同一ではなく区別可能である（遺伝子発現に基づく区別を含む）。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞の成長および分裂を意味する。いくつかの実施形態では、細胞に関して本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、一定期間にわたって数が増加し得る細胞群を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、サテライト細胞増殖の「誘導」、「増強」または「増加」は、サテライト細胞がより速い速度でおよび／またはより頻繁に複製することを意味する。本明細書に記載されるこの態様および他の態様のいくつかの実施形態では、サテライト細胞増殖は、未処理対照と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて増加される。サテライト細胞増殖の％または増加倍率は、サテライト細胞が化合物と接触していない対照と比較べて、本明細書に記載される化合物との接触中の複製サテライト細胞の数を測定することにより決定され得る。増殖の増加はまた、各処理対照および未処理対照における細胞の総数に対する複製細胞の比に基づくものであり得る。いくつかの実施形態では、処理対照および未処理対照における細胞の総数は、増殖を決定するために使用される。サテライト細胞増殖は、米国特許出願公開第２００９／０１３６４８１号（この内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているＢｒｄＵ組み込み方法を使用して決定され得る。
【００３６】
細胞個体発生の文脈では、「分化した」または「分化している」という形容詞は、「分化した細胞」が、それが比較される細胞よりもさらに進んで発生経路を進行している細胞であることを意味する相対的な用語である。したがって、幹細胞は、系統制限前駆細胞（例えば、外胚葉幹細胞）に分化し得、そしてこれは、経路をさらに進んで他の種類の前駆細胞（例えば、神経外胚葉細胞）に分化し、次いで、最終段階の分化した細胞（これは、特定の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持していてもよいしまたは保持していなくてもよい）に分化し得る。
【００３７】
「分化した細胞」という用語は、その用語が本明細書で定義されるように、そのネイティブ形態では多能性ではない任意の初代細胞を含むことを意味する。別の言い方をすれば、「分化した細胞」という用語は、細胞分化プロセスにおけるあまり特殊化してない細胞型の細胞（例えば、幹細胞、例えば人工多能性幹細胞）に由来するより特殊化した細胞型の細胞を指す。
【００３８】
対照的に、「脱分化した」または「脱分化」という形容詞は、「脱分化した細胞」が、発生経路の以前のバージョンの細胞に戻った細胞であることを意味する相対的な用語である。「脱分化した細胞」という用語は、より特殊化した細胞型に由来するあまり特殊化していない細胞型である任意の細胞を含むことを意味する。例えば、筋芽細胞は、サテライト細胞に脱分化し得る。
【００３９】
本明細書で言及される「細胞培養培地」（本明細書では「培養培地」または「培地」とも称される）という用語は、細胞を培養するための培地であって、細胞生存性を維持して増殖を支援する栄養素を含有する培地である。細胞培養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれかを含有し得る：塩、緩衝液、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物および他の成分、例えばペプチド成長因子など。特定の細胞型に通常使用される細胞培養培地は、当業者に公知である。
【００４０】
「栄養培地」という用語は、増殖を促進する栄養素を含有する細胞を培養するための培地を指す。栄養培地は、適切な組み合わせで以下のいずれかを含有し得る：等張性食塩水、緩衝液、アミノ酸、抗生物質、血清または血清代替物および外因的添加因子。「馴化培地」は、培地で第１の細胞集団を培養し、次いで、培地を回収することにより調製される。次いで、（細胞により培地に分泌されたものと一緒に）馴化培地を使用して、第２の細胞集団の成長を支援し得る。
【００４１】
本明細書で言及される様々な培地としては、筋芽細胞培地、スピン培地および分化培地が挙げられる。「分化培地」という用語は、細胞の分化および脱分化の両方のための培地を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「薬剤」という用語は、任意の化合物または物質、例えば限定されないが、小分子、核酸、ポリペプチド、ペプチド、薬物、イオンなどを意味する。「薬剤」は、任意の化学物質、実体または部分、例えば限定されないが、合成および天然に存在するタンパク質性および非タンパク質性実体であり得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、核酸、核酸類似物、タンパク質、抗体、ペプチド、アプタマー、核酸のオリゴマー、アミノ酸または炭水化物、例えば限定されないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡザイム、糖タンパク質、ｓｉＲＮＡ、リポタンパク質、アプタマーならびにそれらの改変および組み合わせである。特定の実施形態では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。例えば、化学部分は、置換または非置換アルキル、芳香族またはヘテロシクリル部分、例えばマクロライド、レプトマイシンおよび関連天然産物またはその類似体を含む。化合物は、所望の活性および／もしくは特性を有することが公知であり得るか、または様々な化合物のライブラリから選択され得る。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「接触」という用語（すなわち、少なくとも１つの胚様体またはその前駆体と分化培地または薬剤との接触）は、分化培地および／または薬剤ならびに細胞をインビトロで一緒にインキュベートする（例えば、分化培地または薬剤を培養中の細胞に添加する）ことを含むことを意図する。いくつかの実施形態では、「接触」という用語は、被験体において天然に存在し得る本明細書に開示される化合物への細胞のインビボ曝露（すなわち、天然の生理学的プロセスの結果として起こり得る曝露）を含むことを意図しない。サテライト細胞の生産に関する実施形態のように、少なくとも１つの筋芽細胞またはその前駆体を分化培地または薬剤と接触させる工程は、任意の適切な方法で行われ得る。例えば、細胞は、付着培養または懸濁培養で処理され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、骨格筋オルガノイド（本明細書ではミオスフェアとも称される）の形成を促進する条件で処理される。本開示は、骨格筋オルガノイドの形成を促進する任意の条件を企図する。骨格筋オルガノイドの形成を促進する条件の例としては、限定されないが、低付着組織培養プレート、スピナーフラスコ、アグリウェルプレート（ａｇｇｒｅｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）中の懸濁培養が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明者らは、２０％血清（例えば、熱不活化ウシ胎仔血清）を含有する培地で、骨格筋オルガノイドが依然として安定であることを観察した。
【００４４】
また、分化培地および／または薬剤と接触させた細胞を別の薬剤、例えば他の分化薬剤または環境と同時にまたはその後接触させて、細胞を安定化し得るかまたは細胞をさらに分化させ得ると理解される。
【００４５】
「外因性」という用語は、その天然供給源以外の細胞または生物に存在する物質を指す。例えば、「外因性核酸」または「外因性タンパク質」という用語は、人の手を伴うプロセスにより、それが通常は見られないかまたはより少量で見られる生物系（例えば、細胞または生物）に導入されている核酸またはタンパク質を指す。物質が細胞、または物質を受け継ぐ細胞祖先に導入される場合、それは外因性であるとみなされるであろう。対照的に、「内因性」という用語は、生物系にネイティブである物質を指す。
【００４６】
「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質を産生すること、および必要に応じてタンパク質を分泌することを伴う細胞プロセス、例えば該当する場合には、限定されないが、転写、翻訳、フォールディング、改変およびプロセッシングを指す。「発現産物」は、遺伝子から転写されたＲＮＡと、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳により得られたポリペプチドとを含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリヌクレオチドの場合には、その天然供給源に見られる核酸もしくはポリヌクレオチドと共に存在し、および／または分泌ポリペプチドの場合には、細胞により発現されるかもしくは分泌されると核酸もしくはポリヌクレオチドと共に存在するであろう少なくとも１つの他の成分（例えば、核酸またはポリヌクレオチド）から分離された核酸またはポリヌクレオチドを指す。化学合成核酸もしくはポリヌクレオチド、またはインビトロ転写／翻訳を使用して合成されたものは、「単離された」とみなされる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「単離された細胞」という用語は、それが本来見られる生物から取り出されている細胞またはこのような細胞の子孫を指す。必要に応じて、細胞は、インビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されている。必要に応じて、その後、細胞は、第２の生物に導入されるか、またはそれ（またはそれに由来する細胞）が単離された生物に再導入される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、細胞の単離された集団に関する「単離された集団」という用語は、細胞の混合または不均質集団から取り出されて分離されている細胞の集団を指す。いくつかの実施形態では、単離された集団は、細胞が単離または濃縮された不均質集団と比較して実質的に純粋な細胞集団である。
【００５０】
「濃縮する」または「濃縮された」という用語は本明細書では互換的に使用され、１種類の細胞の収率（割合）が、開始培養物または調製物中のその種類の細胞の割合よりも少なくとも１０％増加していることを意味する。
【００５１】
「モジュレートする」という用語は、当技術分野におけるその使用と一致して使用され、すなわち、目的のプロセス、経路または現象の定性的または定量的な変更、変化または改変を引き起こすかまたは促進することを意味する。限定されないが、このような変更は、プロセス、経路または現象の異なる成分または分岐の相対的な強度または活性の増加、減少または変更であり得る。「モジュレーター」は、目的のプロセス、経路または現象の定性的または定量的な変更、変化または改変を引き起こすかまたは促進する薬剤である。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「マーカー」は、細胞の特徴および／または表現型を説明するために使用される。マーカーは、目的の特徴を含む細胞の選択に使用され得る。マーカーは、特定の細胞により変動するであろう。特定の細胞型の細胞の形態学的、機能的もしくは生化学的（酵素的）特徴または細胞型により発現される分子にかかわらず、マーカーは特徴的である。好ましくは、このようなマーカーはタンパク質であり、より好ましくは、抗体または当技術分野で利用可能な他の結合分子に対するエピトープを有する。しかしながら、マーカーは、細胞に見られる任意の分子、例えば限定されないが、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸およびステロイドからなり得る。形態学的特徴または形質の例としては、限定されないが、形状、サイズおよび核対細胞質比が挙げられる。機能的特徴または形質の例としては、限定されないが、特定の基材への付着能力、特定の色素の取り込み能力または排出能力、特定の条件下における遊走能力および特定の系統に沿った分化能力または脱分化能力が挙げられる。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法により検出され得る。マーカーはまた、形態学的特徴の非存在、またはタンパク質、脂質などの非存在であり得る。マーカーは、ポリペプチドおよび他の形態学的特徴の存在および非存在のユニークな特徴のパネルの組み合わせであり得る。
【００５４】
「選択マーカー」という用語は、発現されると、選択的表現型、例えば、細胞傷害剤もしくは細胞増殖抑制剤に対する耐性（例えば、抗生物質耐性）、栄養原栄養性、またはタンパク質を発現する細胞と発現しない細胞とを区別する根拠として使用され得る特定のタンパク質の発現を細胞に付与する遺伝子、ＲＮＡまたはタンパク質を指す。発現が容易に検出され得るタンパク質、例えば蛍光もしくは発光タンパク質、または基質に作用して発色、蛍光もしくは発光物質を生産する酵素（「検出可能なマーカー」）は、選択マーカーのサブセットを構成する。多能性細胞において選択的または排他的に通常発現される遺伝子にネイティブな発現制御エレメントに連結された選択マーカーの存在は、多能性状態に再プログラム化されている体細胞を同定および選択することを可能にする。様々な選択マーカー遺伝子、例えばネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）、ピューロマイシン耐性遺伝子（ｐｕｒｏ）、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、アデノシンジアミナーゼ（ａｄａ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＣ）、ヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇ）、多剤耐性遺伝子（ｍｄｒ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）およびｈｉｓＤ遺伝子が使用され得る。検出可能なマーカーとしては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色、サファイア色、黄色、赤色、オレンジ色およびシアン色蛍光タンパク質ならびにこれらのいずれかの改変体が挙げられる。発光タンパク質、例えばルシフェラーゼ（例えば、ホタルまたはウミシイタケのルシフェラーゼ）も有用である。当業者には明らかであるように、本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、遺伝子または遺伝子の発現産物、例えばコードされたタンパク質を指し得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、選択マーカーは、それを発現しないかまたは有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、それを発現する細胞に増殖および／または生存の利点を付与する。このような増殖および／または生存の利点は、典型的には、特定の条件、すなわち「選択的条件」下で細胞が維持される場合に生じる。有効な選択を保証するために、細胞の集団は、マーカーを発現しない細胞が増殖および／もしくは生存せず、集団から排除されるか、またはその数が集団のごくわずかまで減少するような条件下および十分な期間維持され得る。マーカーを発現しない細胞をほとんどまたは完全に排除するための選択条件下で細胞の集団を維持することにより、増殖および／または生存上の利点を付与するマーカーを発現する細胞を選択するプロセスは、本明細書では「陽性選択」と称され、マーカーは、「陽性選択に有用」であるといわれる。陰性選択および陰性選択に有用なマーカーもまた、本明細書に記載される特定の方法の関心対象である。このようなマーカーの発現は、それを発現しないかまたは有意に低いレベルでそれを発現する細胞と比べて、マーカーを発現する細胞に増殖および／または生存上の不利益を付与する（または、言い換えればマーカーを発現しない細胞は、マーカーを発現する細胞と比べて、増殖および／または生存上の利点を有すると考えられる）。したがって、マーカーを発現する細胞は、選択条件で十分な期間維持されると、細胞の集団からほとんどまたは完全に排除される。
【００５６】
「被験体」および「個体」という用語は本明細書では互換的に使用され、細胞を得ることができ、および／または本明細書に記載される細胞による処置（予防的処置を含む）が提供される動物、例えばヒトを指す。特定の動物、例えばヒト被験体に特異的な感染、状態または疾患状態の処置では、被験体という用語は、その特定の動物を指す。本明細書で互換的に使用される場合、「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類を含む。「被験体」という用語はまた、任意の脊椎動物、例えば限定されないが、哺乳動物、爬虫類、両生類および魚類を包含する。しかしながら、有利には、被験体は、哺乳動物、例えばヒトまたは他の哺乳動物、例えば飼育哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどまたは生産哺乳動物、例えばウシ、ヒツジ、ブタなどである。
【００５７】
単離された細胞に適用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に供すること、または細胞に対して任意の種類の操作もしくは手順を実施することを含む。被験体に適用される場合、「処置する」、「処置すること」、「処置」などの用語は、医療的または外科的注意、ケアまたは管理を個体に提供することを指す。通常、個体は病気もしくは負傷状態であるか、または集団の平均的なメンバーと比べて増加した病気リスクがあり、このような注意、ケアまたは管理を必要とする。それは、被験体が疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば有益なまたは所望の臨床的結果を示すように、有効量の組成物を被験体に投与することを含み得る。本発明の目的では、有益または所望の臨床的結果としては、限定されないが、検出可能または検出不可能にかかわらず、１つまたはそれを超える症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（すなわち、悪化しない）、疾患進行の遅延もしくは減速、疾患状態の改善もしくは軽減および寛解（部分的または完全にかかわらず）が挙げられる。処置は、処置を受けない場合に予想される生存と比較して生存を延長することを指し得る。したがって、当業者は、処置が疾患状態を改善し得るが、疾患の完治ではない可能性があることを理解する。「処置」という用語は、予防を含む。処置を必要とする者としては、状態（例えば、筋肉障害または疾患）と既に診断された者、および遺伝的感受性または他の要因により状態を発症する可能性が高い者が挙げられる。
【００５８】
「組織」という用語は、特定の特殊機能を共に実行する特殊化した細胞の群または層を指す。「組織特異的」という用語は、特定の組織に由来する細胞の供給源を指す。
【００５９】
「減少する」、「低下した」、「低下」、「減少」または「阻害する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計学的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、誤解を避けるために、「低下した」、「低下」、「減少する」または「阻害する」は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％または少なくとも約３０％または少なくとも約４０％または少なくとも約５０％または少なくとも６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％の減少または１００％までの減少（すなわち、参照サンプルと比較して非存在レベル）または１０〜１００％の任意の減少を意味する。
【００６０】
「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書では一般に、統計学的に有意な量の増加を意味するために使用される；いかなる誤解も避けるために、「増加した」、「増加する」もしくは「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約２０％もしくは少なくとも約３０％もしくは少なくとも約４０％もしくは少なくとも約５０％もしくは少なくとも約６０％もしくは少なくとも約７０％もしくは少なくとも約８０％もしくは少なくとも約９０％の増加もしくは１００％までの増加もしくは１０〜１００％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約２倍もしくは少なくとも約３倍もしくは少なくとも約４倍もしくは少なくとも約５倍もしくは少なくとも約１０倍の増加もしくは２倍〜１０倍もしくはそれを超える任意の増加を意味する。
【００６１】
「統計学的に有意」または「有意に」という用語は、統計学的有意性を指し、一般に、マーカーの通常の濃度よりも２標準偏差（２ＳＤ）低いまたはそれよりも低いことを意味する。前記用語は、差があることの統計的証拠を指す。それは、帰無仮説が実際に真である場合、帰無仮説を拒絶する決定を行う確率として定義される。決定は、多くの場合、ｐ値を使用して行われる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須の組成物、方法およびその各成分に関して使用されるが、必須か否かにかかわらず、不特定要素の包含を含む。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所定の実施形態に必要とされる要素を指す。前記用語は、本発明のその実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさないさらなる要素の存在を許容する。
【００６４】
「からなる」という用語は、本明細書に記載される組成物、方法およびその各成分を指し、実施形態のその説明に列挙されていないいかなる要素に対しても排他的である。
【００６５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上明確な表示がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本明細書に記載される種類の１つまたはそれを超える方法および／もしくは工程を含み、ならびに／またはこれは、本開示などを読むことにより当業者には明らかであろう。
【００６６】
クローニングおよび細胞培養
本明細書に記載される技術に使用され得る分子遺伝学および遺伝子工学の例示的な方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）の最新版に見られ得る。細胞生物学、タンパク質化学および抗体技術は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｓ．Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏら、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）およびＣｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｌｉｇａｎら、ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ．）に見られ得る。遺伝子操作のための例示的な試薬、クローニングベクターおよびキットは、例えば、ＢｉｏＲａｄ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎＴｅｃｈおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．から商業的に入手され得る。
【００６７】
適切な細胞培養方法は、例えば、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｍ．Ａ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ＆Ｉ．Ｆ．Ｒａｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）およびＥｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ  ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）の最新版に見られ得る。適切な組織培養供給品および試薬は、例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｎａｌｇｅｎｅ−Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．およびＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから市販されている。
【００６８】
多能性幹細胞は、当業者により、分化を促進せずに増殖を促進する培養条件を使用して、培養で連続的に増殖され得る。例示的な血清含有ＥＳ培地は、８０％ＤＭＥＭ（例えば、Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ  ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ）、２０％の規定の牛胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）または血清代替物（国際公開第９８／３０６７９号）のいずれか、１％非必須アミノ酸、１ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノールで構成される。使用直前に、ヒトｂＦＧＦは４ｎｇ／ｍＬに添加される（国際公開第９９／２０７４１号、Ｇｅｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．）。伝統的には、ＥＳ細胞は、フィーダ細胞、典型的には胚組織または胎児組織に由来する線維芽細胞の層上で培養される。
【００６９】
あるいは、多能性ＳＣは、フィーダ細胞を用いずに、未分化状態で維持され得る。フィーダフリー培養の環境は、適切な細胞基材、特に、細胞外マトリクス、例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ゼラチン状タンパク質混合物）またはラミニンを含む。典型的には、細胞が完全に分散する前（コラゲナーゼＩＶで約５分）に、酵素消化を停止する。次いで、約１０個〜２，０００個の細胞の塊を、さらに分散させずに基材上に直接プレーティングする。
【００７０】
サテライト細胞の生成
本開示の態様は、サテライト細胞（例えば、骨格筋細胞など）の生成に関する。一般に、本明細書に開示される方法にしたがって生産されたサテライト細胞は、限定されないが、サテライト細胞ニッチを再配置する能力、筋肉再生を促す能力、遺伝子マーカーの適切な発現を示す能力を含む機能的サテライト細胞のいくつかの特徴を示し、培養において拡大増殖可能である。
【００７１】
サテライト細胞は、筋芽細胞を所望の脱分化段階に脱分化させるための任意の適切な培養プロトコールまたは一連の培養プロトコールにしたがって生産され得る。いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、少なくとも１つの筋芽細胞がサテライト細胞に脱分化するために適切な条件下で、少なくとも１つの筋芽細胞を一定期間培養することにより生産される。いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、サテライト細胞の実質的に純粋な集団である。
【００７２】
特定の実施形態では、筋芽細胞は、筋芽細胞培地で培養される。筋芽細胞は、培地中のマイクロプレート（例えば、コラーゲンコーティングディッシュ）上で培養され得る。いくつかの実施形態では、筋芽細胞培地は、栄養培地（例えば、ハムＦ１０）、ウシ胎仔血清（例えば、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清）、線維芽細胞成長因子塩基性、非必須アミノ酸およびｇｌｕｔａｍａｘを含む。筋芽細胞は、マイクロプレートで１〜３０日間、１〜１５日間、１〜１０日間、１〜５日間または約４日間培養され得る。いくつかの態様では、筋芽細胞は、５０〜１００コンフルエンス、７５〜９０コンフルエンスまたは約８０コンフルエンスに達するまで、マイクロプレート上で培養される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、筋芽細胞は、被験体の骨格筋から単離される。例えば、筋芽細胞は、ヒトまたは非ヒト動物、例えばラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタおよび非ヒト霊長類の骨格筋から単離され得る。あるいは、筋芽細胞は、胚由来筋肉細胞であり得る。
【００７４】
特定の実施形態では、筋芽細胞は、約８０コンフルエンスに達するまで筋芽細胞培地で培養され、次いで、スピナーフラスコ、スフェロイドプレートなどに播種される。いくつかの態様では、スピナーフラスコは、細胞約５００，０００個／ｍｌ〜細胞約１５０万個／ｍｌ、または細胞約７５０，０００個／ｍｌ〜細胞約１２５万個／ｍｌ、または細胞約１００万個／ｍｌの密度で播種される。筋芽細胞は、スピン培地中のスピナーフラスコで培養される。いくつかの実施形態では、スピン培地は、基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ：Ｆ１２）、ウシ胎仔血清（例えば、２０％熱不活性化ウシ胎仔血清）、線維芽細胞成長因子塩基性、非必須アミノ酸およびｇｌｕｔａｍａｘを含む。筋芽細胞は、スピナーフラスコで少なくとも１０日間、少なくとも２０日間、少なくとも３０日間、１０〜３０日間、１０〜２０日間またはいくつかの態様では２０日間培養され得る。得られる骨格筋オルガノイドまたはミオスフェアは、Ｐａｘ７＋およびＭｙＨＣ＋細胞の組み合わせから構成される。
【００７５】
スピン培地中のスピナーフラスコで培養された筋芽細胞は、三次元スフェア（例えば、ミオスフェアまたは骨格筋オルガノイド）を形成する。いくつかの態様では、骨格筋オルガノイドは、分化した骨格筋細胞および増殖性筋原細胞を含む。骨格筋オルガノイドが形成されたら、培地を分化培地に変更し得る。いくつかの態様では、分化培地は無血清培地である。分化培地は、栄養培地（例えば、ＤＭＥＭ）、非必須アミノ酸およびｇｌｕｔａｍａｘを含み得る。いくつかの態様では、骨格筋オルガノイドは、分化培地で少なくとも１日間、少なくとも５日間、少なくとも１０日間、１〜１０日間、１〜３０日間、１０〜３０日間、１０〜２０日間またはいくつかの実施形態では１０日間培養される。分化培地による培養中、骨格筋オルガノイドに存在する増殖性筋原細胞は静止し、サテライト細胞状態に戻る。次いで、サテライト細胞を培地から単離し得る。
【００７６】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、培養において拡大増殖可能である。いくつかの実施形態では、生成されたサテライト細胞を化合物と接触させて、サテライト細胞増殖を増加させる。サテライト細胞増殖を誘導し、増強しまたは増加させる方法は、サテライト細胞を、キナーゼ阻害剤、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）モジュレーター、エピジェネティック改変因子、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）モジュレーター、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレーター、神経ペプチド、ドーパミン受容体モジュレーター、セロトニン受容体モジュレーター、ヒスタミン受容体モジュレーター、アデノシン受容体アゴニスト、イオノフォア、イオンチャネルモジュレーター、ガンマセクレターゼモジュレーター、コルチコステロイドおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物と接触させることを含む。増殖増強剤の例としては、限定されないが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６０９９号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【００７７】
サテライト細胞
いくつかの実施形態では、本開示は、機能的サテライト細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、限定されないが、サテライト細胞ニッチを再配置する能力、筋肉再生を促す能力を含む１つまたはそれを超える特徴を示し、遺伝子マーカーの適切な発現、糖タンパク質の適切な発現を示し、培養において拡大増殖可能であるサテライト細胞の生成を可能にする。
【００７８】
いくつかの実施形態では、当業者に一般的な任意の手段を使用して、少なくとも１つの分化培地への曝露による筋芽細胞の脱分化により生産されたサテライト細胞の存在を確認し得る。いくつかの実施形態では、このようなサテライト細胞は、選択的遺伝子発現マーカーにより同定され得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、サテライト細胞のマーカーの陽性発現（例えば、存在）を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、試薬を使用して検出され得る。マーカーのための試薬は、例えば、マーカーに対する抗体であり得るか、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応、例えば半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応のためのプライマーであり得る。このようなマーカーは、サテライト細胞が生産されたか否かを評価するために使用され得る。抗体または他の検出試薬は、検出において使用するための標識、例えば放射性標識、蛍光（例えば、ＧＦＰ）標識または比色標識に連結され得る。検出試薬がプライマーである場合、それは、乾燥調製物、例えば凍結乾燥調製物または溶液で供給され得る。
【００７９】
サテライト細胞への少なくとも１つの筋芽細胞またはその前駆体の進行は、サテライト細胞に特徴的なマーカーの発現を決定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、特定のマーカーの発現は、マーカーの存在または非存在を検出することにより決定される。あるいは、特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物または細胞集団中の細胞に存在するレベルを測定することにより決定され得る。特定のプロセスでは、サテライト細胞に特徴的なマーカーの発現、ならびに筋芽細胞またはその前駆体に特徴的なマーカーの有意な発現の欠如が決定される。
【００８０】
筋芽細胞からのサテライト細胞の生産のモニタリングに関して記載されるように、定性的または半定量的技術、例えばブロット転写法および免疫細胞化学は、当業者に一般的に公知の方法を使用してマーカー発現を測定するために使用され得る。あるいは、マーカー発現は、当技術分野で通常公知の方法による定量的ＰＣＲなどの技術の使用により正確に定量され得る。
【００８１】
いくつかの実施形態では、生成されたサテライト細胞は、コア筋原性遺伝子Ｐａｘ７およびＭｙｆ５から選択される１つまたはそれを超える遺伝子発現マーカーを発現する。あるいはまたは加えて、生成されたサテライト細胞は、骨格筋ＭｙｏＤのマスター転写因子を発現しない。
【００８２】
いくつかの実施形態では、あるいはまたは加えて、サテライト細胞は、静止関連遺伝子Ｓｐｒｙ１、Ｎｍ１、Ｎｆｉａ、Ｆｏｓ、Ｄｕｓｐ１またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現することを特徴とし得る。いくつかの実施形態では、骨格筋オルガノイド培養物のサテライト細胞は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２、Ｈｅｓまたはそれらの任意の組み合わせから選択される１つまたはそれを超えるマーカーを発現することを特徴とし得る。サテライト細胞は、Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５、少なくとも１つの静止関連遺伝子および少なくとも１つのＮｏｔｃｈシグナル伝達経路遺伝子を発現し得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、糖タンパク質を発現する（例えば、糖タンパク質は、典型的には、サテライト細胞ニッチにのみ存在する）。サテライト細胞により発現される糖タンパク質マーカーとしては、Ｂｇｎ、ＴｇｆｂｒＩＩＩ、Ｄａｇ１、ＤｃｎおよびＧｐｃ３が挙げられ得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個を発現する：Ｄｃｎ、Ｄｐｔ、Ｈｅｙｌ、Ｎｒ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ１、Ｐａｘ７、Ｔｇｆｂｒ３、Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１、Ｄａｇ１、Ａｐｏｅ、Ｓｐｒｙ１、Ｋａｔ２ｂ、Ｃａｖ１、Ｃｄ８２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｔｈｂｓ２、Ｉｇｆｂｐ７、Ｓｅｒｐｉｎｇ１、Ｆｏｓｂ、Ｚｆｐ３６、Ｎｒｅｐ、Ｓｅｐｐ１、Ｊｕｎｂ、Ｉｅｒ２、Ｃｏｌ１５ａ１、Ａｄｈ１、Ｃｐ、Ｒａｍｐ２、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｐ２ｒｙ１４、Ｐｍｐ２２、Ｉｇｆ１、Ｓ１ｐｒ３、Ｋｌｆ９、Ｃｏｌ６ａ１、Ｔｘｎｉｐ、Ｇｌｕｌ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｎｃａｌｄ、Ｃｃ２ｄ２ａ、Ｇｐｍ６ｂ、Ｔｉｍｐ３、Ｐｒｋｃｄｂｐ、Ｎｆｉａ、Ｇｐｒ１２４、Ｐｓｍｂ１１、Ｃｃｄｃ８０、Ｍａｌａｔ１、Ｚｆｐ３６ｌ１、Ｇｓｎ、Ｓｄｐｒ、Ｓｌｃ１６ａ２、Ｏｌｆｍｌ３、１８１００２６Ｂ０５Ｒｉｋ、Ａｄａｍｔｓ１、Ｏｌｆｍｌ２ｂ、Ｇｎｇ１１、Ｃｄ２００、Ｆｃｇｒｔ、Ｎａｖ１、Ｌａｍｃ１、Ａｔｐ２ｂ４、Ｔａｇｌｎ、Ｍｋｌ２、Ｃｏｌ４ａ２、Ｈｔｒａ３、Ｆｘｙｄ１、Ｏｇｎ、Ｔｇｆｂ３、Ｔｃｐ１１ｌ２、Ｓｐａｔｓ２ｌ、Ｃａｐｎ６、Ｆｇｆｒ１、Ｍｔ２、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｔｌｎ２、Ｎｄｒｇ２、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｆｓｔｌ１、Ｔｃｆ４、Ｉｇｓｆ３、Ｔｍｅｍ１２３、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｍｐ２、Ｉｔｍ２ａ、Ｘｂｐ１、Ｃｒｉｐ１、Ｓｐａｒｃ、Ｃｄ９、Ｉｔｇｂ５、Ｓｄｃ１、Ｖｃａｎ、Ｂｇｎ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｃｏｌ５ａ１、Ｚｃｃｈｃ２４、Ｌｕｍ、Ｐｏｓｔｎ、Ｓｆｒｐ４、Ｓｐｏｎ２、Ｃｏｌ８ａ１、Ｗｉｓｐ２、Ａｄａｍｔｓ２、Ｃｏｌｅｃ１２、Ｄｎｍ３ｏｓ、Ｐｌａｔ、２３１００１０Ｊ１７Ｒｉｋ、Ｃｔｓａ、Ａｎｋ、Ｄｋｋ２、Ｆａｐ、Ｍｍｐ３、Ｄｍｐ１、Ｃｏｌ６ａ３、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｍｇｐ、Ｔｍｅｍ１００、Ｃｔｓｃ、Ｎｒ２ｆ１、Ｃｆｈ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｄｉｏ２、Ｈｔｒａ１、Ｄｋｋ３、Ｉｓｌｒ、Ｆｏｘｓ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｍ２、Ｔｈｂｄ、Ｕｂａ７、Ａｇｔｒ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｔｓｐａｎ１５、Ｏｓｒ２、Ｆａｍ１２９ａ、Ｐｌｅｋｈａ６、Ｍｍｐ２、Ａｒｒｄｃ３、Ｍａｔｎ２、Ｍａｂ２１ｌ１、Ｐｖｒｌ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｃｄ２４８、Ｇｕｌｐ１、Ｍｆａｐ２、Ｉｄｕａ、Ｃｓｐｇ４、Ｓｐｏｃｋ１、Ｍｆａｐ４、Ｈｅｘｂ、Ｃｉｌｐ、Ｐｏｌｄ４、Ｃｒｅｂｒｆ、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｍｅｍ４２、Ｎｅｄｄ９、Ｒｃｎ３、Ｓｅｐｔ８、Ｐｃｏｌｃｅ、Ｅｄｉｌ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｈｆ１７、Ｐｌｉｎ３、Ａｅｂｐ１、Ｈｍｇｃｓ１、Ｐ４ｈａ１、Ｌａｍａ２、Ｃｓｒｐ２、Ｒｎｆ１６７、Ｈ１ｆ０、Ｆｎ１、Ｍｍｐ１４、Ｃｐｑ、Ｍｒｃ２、Ｉｆｎｇｒ１、Ｓｔ３ｇａｌ５、Ｆｂｎ１、Ｓｄｃ２、Ａｄｃｙ７、Ｃｋｍ、Ｈｅｘａ、Ｃａｐｇ、Ｋｌｈｌ１３、Ｌｏｘｌ１、Ｆｄｆｔ１、Ｉｆｉ２７ｌ１、Ｒｂｐ１、Ｎｒ２ｆ２、Ｃｓｔ３、Ｐｘｄｎ、Ｅｃｍ１、Ｍｙｂｐｃ１、Ｉｇｆ２ｒ、Ｓｅｒｐｉｎｈ１、Ｍｔ１、Ｌｐａｒ１、Ａｔｒａｉｄ、Ｓｃｄ２、Ｄａｐ、Ｐｐｉｃ、Ａｐｐ、Ｌａｍｐ２、Ｃｏｌ５ａ２、Ｇｐｃ１、Ｈｓｐａ５、Ｐｍｅｐａ１、Ｌａｐｔｍ４ａおよびＬｒｐ１。いくつかの態様では、発現された遺伝子は、筋芽細胞と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または少なくとも３倍アップレギュレートされている。
【００８５】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個を発現する：Ｄｃｎ、Ｄｐｔ、Ｈｅｙｌ、Ｎｒ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ１、Ｐａｘ７、Ｔｇｆｂｒ３、Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１、Ｄａｇ１、Ａｐｏｅ、Ｓｐｒｙ１、Ｋａｔ２ｂ、Ｃａｖ１、Ｃｄ８２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｔｈｂｓ２、Ｉｇｆｂｐ７、Ｓｅｒｐｉｎｇ１、Ｆｏｓｂ、Ｚｆｐ３６、Ｎｒｅｐ、Ｓｅｐｐ１、Ｊｕｎｂ、Ｉｅｒ２、Ｃｏｌ１５ａ１、Ａｄｈ１、Ｃｐ、Ｒａｍｐ２、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｐ２ｒｙ１４、Ｐｍｐ２２、Ｉｇｆ１、Ｓ１ｐｒ３、Ｋｌｆ９、Ｃｏｌ６ａ１、Ｔｘｎｉｐ、Ｇｌｕｌ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｎｃａｌｄ、Ｃｃ２ｄ２ａ、Ｇｐｍ６ｂ、Ｔｉｍｐ３、Ｐｒｋｃｄｂｐ、Ｎｆｉａ、Ｇｐｒ１２４、Ｐｓｍｂ１１、Ｃｃｄｃ８０、Ｍａｌａｔ１、Ｚｆｐ３６ｌ１、Ｇｓｎ、Ｓｄｐｒ、Ｓｌｃ１６ａ２、Ｏｌｆｍｌ３、１８１００２６Ｂ０５Ｒｉｋ、Ａｄａｍｔｓ１、Ｏｌｆｍｌ２ｂ、Ｇｎｇ１１、Ｃｄ２００、Ｆｃｇｒｔ、Ｎａｖ１、Ｌａｍｃ１、Ａｔｐ２ｂ４、Ｔａｇｌｎ、Ｍｋｌ２、Ｃｏｌ４ａ２、Ｈｔｒａ３、Ｆｘｙｄ１、Ｏｇｎ、Ｔｇｆｂ３、Ｔｃｐ１１ｌ２、Ｓｐａｔｓ２ｌ、Ｃａｐｎ６、Ｆｇｆｒ１、Ｍｔ２、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｔｌｎ２、Ｎｄｒｇ２、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｆｓｔｌ１、Ｔｃｆ４、Ｉｇｓｆ３、Ｔｍｅｍ１２３、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｍｐ２、Ｉｔｍ２ａ、Ｘｂｐ１、Ｃｒｉｐ１、ＳｐａｒｃおよびＣｄ９。いくつかの態様では、発現された遺伝子は、筋芽細胞と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または少なくとも３倍アップレギュレートされている。
【００８６】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個を発現する：Ｉｔｇｂ５、Ｓｄｃ１、Ｖｃａｎ、Ｂｇｎ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｃｏｌ５ａ１、Ｚｃｃｈｃ２４、Ｌｕｍ、Ｐｏｓｔｎ、Ｓｆｒｐ４、Ｓｐｏｎ２、Ｃｏｌ８ａ１、Ｗｉｓｐ２、Ａｄａｍｔｓ２、Ｃｏｌｅｃ１２、Ｄｎｍ３ｏｓ、Ｐｌａｔ、２３１００１０Ｊ１７Ｒｉｋ、Ｃｔｓａ、Ａｎｋ、Ｄｋｋ２、Ｆａｐ、Ｍｍｐ３、Ｄｍｐ１、Ｃｏｌ６ａ３、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｍｇｐ、Ｔｍｅｍ１００、Ｃｔｓｃ、Ｎｒ２ｆ１、Ｃｆｈ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｄｉｏ２、Ｈｔｒａ１、Ｄｋｋ３、Ｉｓｌｒ、Ｆｏｘｓ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｍ２、Ｔｈｂｄ、Ｕｂａ７、Ａｇｔｒ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｔｓｐａｎ１５、Ｏｓｒ２、Ｆａｍ１２９ａ、Ｐｌｅｋｈａ６、Ｍｍｐ２、Ａｒｒｄｃ３、Ｍａｔｎ２、Ｍａｂ２１ｌ１、Ｐｖｒｌ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｃｄ２４８、Ｇｕｌｐ１、Ｍｆａｐ２、Ｉｄｕａ、Ｃｓｐｇ４、Ｓｐｏｃｋ１、Ｍｆａｐ４、Ｈｅｘｂ、Ｃｉｌｐ、Ｐｏｌｄ４、Ｃｒｅｂｒｆ、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｍｅｍ４２、Ｎｅｄｄ９、Ｒｃｎ３、Ｓｅｐｔ８、Ｐｃｏｌｃｅ、Ｅｄｉｌ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｈｆ１７、Ｐｌｉｎ３、Ａｅｂｐ１、Ｈｍｇｃｓ１、Ｐ４ｈａ１、Ｌａｍａ２、Ｃｓｒｐ２、Ｒｎｆ１６７、Ｈ１ｆ０、Ｆｎ１、Ｍｍｐ１４、Ｃｐｑ、Ｍｒｃ２、Ｉｆｎｇｒ１、Ｓｔ３ｇａｌ５、Ｆｂｎ１、Ｓｄｃ２、Ａｄｃｙ７、Ｃｋｍ、Ｈｅｘａ、Ｃａｐｇ、Ｋｌｈｌ１３、Ｌｏｘｌ１、Ｆｄｆｔ１、Ｉｆｉ２７ｌ１、Ｒｂｐ１、Ｎｒ２ｆ２、Ｃｓｔ３、Ｐｘｄｎ、Ｅｃｍ１、Ｍｙｂｐｃ１、Ｉｇｆ２ｒ、Ｓｅｒｐｉｎｈ１、Ｍｔ１、Ｌｐａｒ１、Ａｔｒａｉｄ、Ｓｃｄ２、Ｄａｐ、Ｐｐｉｃ、Ａｐｐ、Ｌａｍｐ２、Ｃｏｌ５ａ２、Ｇｐｃ１、Ｈｓｐａ５、Ｐｍｅｐａ１、Ｌａｐｔｍ４ａおよびＬｒｐ１。いくつかの態様では、発現された遺伝子は、筋芽細胞と比較して少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍または少なくとも３倍アップレギュレートされている。
【００８７】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、Ｐａｘ７、Ｔｇｆｂｒ３、Ｆｏｓ、Ｓｐｒｙ１、Ｃａｖ１およびＣｄ８２の少なくとも１つを発現する。発現された遺伝子は、筋芽細胞と比較して少なくとも２倍アップレギュレートされている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、Ｗｎｔ経路阻害に関与する１つまたはそれを超える遺伝子を発現する。いくつかの態様では、Ｗｎｔ経路阻害に関与する遺伝子は、Ｓｆｒｐ４、Ｗｉｓｐ２、Ｄｋｋ２およびＤｋｋ３からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、プロテアソーム活性化に関与する１つまたはそれを超える遺伝子を発現する。いくつかの態様では、プロテアソーム活性化に関与する遺伝子は、Ｃｔｓａ、Ｃｔｓｃ、Ｉｄｕａ、Ｈｅｘｂ、Ｈｅｘａ、Ｉｇｆ２ｒ、Ｌａｍｐ２およびＬａｐｔｍ４ａからなる群より選択される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個の発現をダウンレギュレートする：Ｔｓｐａｎ９、Ｓｅｍａ３ｅ、Ｈｓｐｄ１、Ｔｉｐｉｎ、Ｒａｓａ１、Ｓｃｔ、Ｍｄｍ２、Ｃｓｆ１、Ｍｓｔｎ、Ａｌｏｘ５、Ｃｋａｐ２、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｍｃｐｔ８、Ｃｃｎｇ１、Ｔｕｂａ１ｃ、Ｒｐｓ２７ｌ、Ｈｍｇａ２、Ｃｃｎｂ１、Ｉｔｇａ６、Ｎａｓｐ、Ｄｙｎａｐ、Ｍｙｏｆ、Ｅｐｈａ２、Ｇｔｓｅ１、Ｌｃｅ１ｇ、Ｃｄ２４ａ、Ｌｇａｌｓ３、Ｓｔｅａｐ１、Ａｎｋｒｄ１、Ｈｅｓ６、Ｃｏｘ６ｂ２、Ｇｍ１５７７２、Ｓ１００ａ６、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｓｔｅａｐ２、Ｓｍｙｄ４、Ｔｍｅｍ１７１、Ｃｔｔｎ、Ｃａｒ３、Ｒｒｍ２、Ａｓｎｓ、Ｃｈｒｎａ１、Ｕｇｃｇ、Ｃｄｈ２、Ｍｙｏｄ１、Ｔｐｍ１、Ｐａ２ｇ４、Ｆａｂｐ５、Ｍｃｍ４、Ｒｒｍ１、Ｆｔｌ１、Ａａａｓ、Ｔｍｓｂ１０、Ｌｒｒｎ１、Ｄｄｘ２１、Ｏｄｃ１、Ｔｍｅｍ５５ａ、Ｐｒｄｘ６、Ｓｏｘ１１、Ｃｉｔｅｄ２、Ｄｄｘ３９、Ｓｌｃ４４ａ２、Ｂａｘ、Ｇａｌ、Ｒｂｍｘｌ１、Ｍａｋ１６、Ｎａｐ１ｌ１、Ｄｃｔｐｐ１、Ｎｍｅ１、Ｃｃｎｄ１、Ｃｋｓ１ｂ、Ｍｙｌ９、Ｐｒｒｃ２ｃ、Ｓｅｔ、Ｈｎｒｎｐｆ、Ｐｐｐ１ｒ１４ｂ、Ｒａｎ、Ｔｕｂａ１ｂ、Ｒｂｍ３、Ｈｓｐ９０ａａ１、Ｎｍｅ２、Ｈｓｐｅ１、Ｓｎｒｐｇ、Ｎｐｍ１、Ｒｅｌｎ、Ｍｓｌｎ、Ｓｅｍａ６ｄ、Ｉｔｇｂ４、Ｌｄｈｂ、Ｎｏｐ５８、Ｄｋｃ１、Ｒｐｌ１２、Ｇｃｈｆｒ、Ｍｇｍｔ、Ｍｉｌｒ１、Ｆｎｂｐ１ｌ、Ａｎｘａ３、Ｔｅｋ、２０１０２０４Ｋ１３Ｒｉｋ、Ｓｅｌｐ、Ｅｆｎｂ２、Ｃｉｒｈ１ａ、Ｆｇｆ２１、Ｓｔｍｎ２、Ｇｐａｔｃｈ４、Ｐｅｇ３、Ｓｎｈｇ８、Ｆｂｌ、Ａｈｃｙ、Ｅｂｎａ１ｂｐ２、Ｎｏｐ５６およびＰｃｎａ。いくつかの態様では、発現は、筋芽細胞と比較して多くとも１／１．５、多くとも１／２、多くとも１／２．５または多くとも１／３にダウンレギュレートされている。
【００９０】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個または少なくとも３０個の発現をダウンレギュレートする：Ｔｓｐａｎ９、Ｓｅｍａ３ｅ、Ｈｓｐｄ１、Ｔｉｐｉｎ、Ｒａｓａ１、Ｓｃｔ、Ｍｄｍ２、Ｃｓｆ１、Ｍｓｔｎ、Ａｌｏｘ５、Ｃｋａｐ２、Ｃａｍｋ１ｇ、Ｍｃｐｔ８、Ｃｃｎｇ１、Ｔｕｂａ１ｃ、Ｒｐｓ２７ｌ、Ｈｍｇａ２、Ｃｃｎｂ１、Ｉｔｇａ６、Ｎａｓｐ、Ｄｙｎａｐ、Ｍｙｏｆ、Ｅｐｈａ２、Ｇｔｓｅ１、Ｌｃｅ１ｇ、Ｃｄ２４ａ、Ｌｇａｌｓ３、Ｓｔｅａｐ１、Ａｎｋｒｄ１、Ｈｅｓ６、Ｃｏｘ６ｂ２、Ｇｍ１５７７２、Ｓ１００ａ６、Ｃｏｌ１８ａ１、Ｓｔｅａｐ２、Ｓｍｙｄ４、Ｔｍｅｍ１７１、Ｃｔｔｎ、Ｃａｒ３、Ｒｒｍ２、Ａｓｎｓ、Ｃｈｒｎａ１、Ｕｇｃｇ、Ｃｄｈ２、Ｍｙｏｄ１、Ｔｐｍ１、Ｐａ２ｇ４、Ｆａｂｐ５、Ｍｃｍ４、Ｒｒｍ１、Ｆｔｌ１、Ａａａｓ、Ｔｍｓｂ１０、Ｌｒｒｎ１、Ｄｄｘ２１、Ｏｄｃ１、Ｔｍｅｍ５５ａ、Ｐｒｄｘ６、Ｓｏｘ１１、Ｃｉｔｅｄ２、Ｄｄｘ３９、Ｓｌｃ４４ａ２、Ｂａｘ、Ｇａｌ、Ｒｂｍｘｌ１、Ｍａｋ１６、Ｎａｐ１ｌ１、Ｄｃｔｐｐ１、Ｎｍｅ１、Ｃｃｎｄ１、Ｃｋｓ１ｂ、Ｍｙｌ９、Ｐｒｒｃ２ｃ、Ｓｅｔ、Ｈｎｒｎｐｆ、Ｐｐｐ１ｒ１４ｂ、Ｒａｎ、Ｔｕｂａ１ｂ、Ｒｂｍ３、Ｈｓｐ９０ａａ１、Ｎｍｅ２、Ｈｓｐｅ１、ＳｎｒｐｇおよびＮｐｍ１。いくつかの態様では、発現は、筋芽細胞と比較して多くとも１／１．５、多くとも１／２、多くとも１／２．５または多くとも１／３にダウンレギュレートされている。
【００９１】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、以下の遺伝子の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個または少なくとも２５個の発現をダウンレギュレートする：Ｒｅｌｎ、Ｍｓｌｎ、Ｓｅｍａ６ｄ、Ｉｔｇｂ４、Ｌｄｈｂ、Ｎｏｐ５８、Ｄｋｃ１、Ｒｐｌ１２、Ｇｃｈｆｒ、Ｍｇｍｔ、Ｍｉｌｒ１、Ｆｎｂｐ１ｌ、Ａｎｘａ３、Ｔｅｋ、２０１０２０４Ｋ１３Ｒｉｋ、Ｓｅｌｐ、Ｅｆｎｂ２、Ｃｉｒｈ１ａ、Ｆｇｆ２１、Ｓｔｍｎ２、Ｇｐａｔｃｈ４、Ｐｅｇ３、Ｓｎｈｇ８、Ｆｂｌ、Ａｈｃｙ、Ｅｂｎａ１ｂｐ２、Ｎｏｐ５６およびＰｃｎａ。いくつかの態様では、発現は、筋芽細胞と比較して多くとも１／１．５、多くとも１／２、多くとも１／２．５または多くとも１／３にダウンレギュレートされている。
【００９２】
本発明は、サテライト細胞マーカーとして本明細書に列挙されるマーカーに限定されず、本発明はまた、マーカー、例えば細胞表面マーカー、抗原、ならびにＥＳＴ、ＲＮＡ（マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡを含む）、ＤＮＡ（遺伝子およびｃＤＮＡを含む）およびそれらの一部を含む他の遺伝子産物を包含すると理解される。
【００９３】
サテライト細胞に特徴的なマーカーとしては、細胞表面タンパク質またはコード遺伝子の発現、細胞内タンパク質またはコード遺伝子の発現、細胞形態学的特徴などが挙げられる。当業者は、公知の免疫蛍光、免疫化学、ポリメラーゼ連鎖反応、インサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、化学的または放射化学的または生物学的方法がサテライト細胞特異的特徴の存在または非存在を容易に確認し得ることを認識するであろう。
【００９４】
本開示の態様は、本明細書に記載される方法にしたがって生産されたサテライト細胞の単離された集団に関する。サテライト細胞の単離された集団は、集団中の少なくともいくつかの筋芽細胞をサテライト細胞に脱分化させることにより得られ得る。
【００９５】
本開示の態様は、本明細書に記載される細胞（例えば、サテライト細胞）の単離された集団を含むマイクロカプセルを含む。マイクロカプセルは、当技術分野で周知である。マイクロカプセルの適切な例は、文献に記載されている（例えば、Ｏｒｉｖｅら、“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１３），ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１３．０７．００９；Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら、“Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｅｌｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０１０；６２：７１１−７３０；Ｍｕｒｕａら、“Ｃｅｌｌ  ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００８；１３２：７６−８３；およびＺａｎｉｎら、“Ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１２；１６０：３−１３）。マイクロカプセルは、様々な方法で製剤化され得る。例示的なマイクロカプセルは、アルギネート外膜により覆われたポリカチオン層により取り囲まれたアルギネートコアを含む。ポリカチオン膜は、安定性および生体適合性を与える半透膜を形成する。ポリカチオンの例としては、限定されないが、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−オルニチン、キトサン、ラクトース改変キトサンおよび光重合生体材料が挙げられる。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）を有する共有結合的にコンジュゲートされたオリゴペプチドを有するアルギネートコアを含む足場を生産するように改変される。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、増強した安定性の化学酵素的に操作されたアルギネートを有する共有結合的に強化されたマイクロカプセルを生産するように改変される。いくつかの実施形態では、アルギネートコアは、例えば、アクリレート官能化リン脂質のインサイチュー重合により集合した膜模倣フィルムを生産するように改変される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して酵素的に改変されたアルギネートから構成される。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接層間に共有結合的連結を含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分とカップリングされたアルギネートを含むサブシーブサイズカプセルを含む。いくつかの実施形態では、マイクロカプセルは、アルギネート−アガロースを含む足場を含む。いくつかの実施形態では、サテライト細胞は、アルギネート内に被包される前に��ＥＧで改変される。いくつかの実施形態では、細胞、例えばサテライト細胞の単離された集団は、光反応性リポソームおよびアルギネート中に被包される。マイクロカプセルにおいて用いられるアルギネートは、限定されないが、ＰＥＧ、キトサン、ＰＥＳ中空線維、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＧＤを有するデキストラン、ＥＨＤおよびＰＥＧＤＡ、ＰＭＢＶおよびＰＶＡ、ＰＧＳＡＳ、アガロース、ゼラチンを有するアガロース、ＰＬＧＡ、ならびにこれらの多層実施形態を含む他の適切な生体材料で置き換えられ得ることを認識すべきである。
【００９６】
サテライト細胞の存在および同定の確認
当業者に一般的な任意の手段を使用して、サテライト細胞、例えば本明細書に記載される筋芽細胞の脱分化により生産された天然に存在しないサテライト細胞の存在を確認し得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞マーカー、例えば化学的に誘導されたサテライト細胞の存在は、内因性サテライト細胞を示す１つまたはそれを超えるマーカーの存在または非存在を検出することにより行われ得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、サテライト細胞のマーカーの陽性発現（例えば、存在）を検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、マーカーは、例えば、Ｐａｘ７およびＭｙｆ５の検出のための試薬を使用して検出され得る。検出すべきさらなるマーカーとしては、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路マーカーＮｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、Ｎｏｔｃｈ３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２およびＨｅｓ１、ならびに静止関連遺伝子またはマーカーＮｍ１、Ｎｆｉａ、Ｆｏｓ、Ｓｐｒｙ１およびＤｕｓｐ１が挙げられる。検出すべきさらに他のマーカーは、Ｄｃｎ、Ｄｐｔ、Ｈｅｙｌ、Ｎｒ４ａ１、Ｃｏｌ４ａ１、Ｐａｘ７、Ｔｇｆｂｒ３、Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１、Ｄａｇ１、Ａｐｏｅ、Ｓｐｒｙ１、Ｋａｔ２ｂ、Ｃａｖ１、Ｃｄ８２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｔｈｂｓ２、Ｉｇｆｂｐ７、Ｓｅｒｐｉｎｇ１、Ｆｏｓｂ、Ｚｆｐ３６、Ｎｒｅｐ、Ｓｅｐｐ１、Ｊｕｎｂ、Ｉｅｒ２、Ｃｏｌ１５ａ１、Ａｄｈ１、Ｃｐ、Ｒａｍｐ２、Ｓｐａｒｃｌ１、Ｐ２ｒｙ１４、Ｐｍｐ２２、Ｉｇｆ１、Ｓ１ｐｒ３、Ｋｌｆ９、Ｃｏｌ６ａ１、Ｔｘｎｉｐ、Ｇｌｕｌ、Ｃｏｌ６ａ２、Ｎｃａｌｄ、Ｃｃ２ｄ２ａ、Ｇｐｍ６ｂ、Ｔｉｍｐ３、Ｐｒｋｃｄｂｐ、Ｎｆｉａ、Ｇｐｒ１２４、Ｐｓｍｂ１１、Ｃｃｄｃ８０、Ｍａｌａｔ１、Ｚｆｐ３６ｌ１、Ｇｓｎ、Ｓｄｐｒ、Ｓｌｃ１６ａ２、Ｏｌｆｍｌ３、１８１００２６Ｂ０５Ｒｉｋ、Ａｄａｍｔｓ１、Ｏｌｆｍｌ２ｂ、Ｇｎｇ１１、Ｃｄ２００、Ｆｃｇｒｔ、Ｎａｖ１、Ｌａｍｃ１、Ａｔｐ２ｂ４、Ｔａｇｌｎ、Ｍｋｌ２、Ｃｏｌ４ａ２、Ｈｔｒａ３、Ｆｘｙｄ１、Ｏｇｎ、Ｔｇｆｂ３、Ｔｃｐ１１ｌ２、Ｓｐａｔｓ２ｌ、Ｃａｐｎ６、Ｆｇｆｒ１、Ｍｔ２、Ｃｄｋｎ２ｃ、Ｔｌｎ２、Ｎｄｒｇ２、Ｂｈｌｈｅ４０、Ｆｓｔｌ１、Ｔｃｆ４、Ｉｇｓｆ３、Ｔｍｅｍ１２３、Ｃｏｌ３ａ１、Ｅｍｐ２、Ｉｔｍ２ａ、Ｘｂｐ１、Ｃｒｉｐ１、Ｓｐａｒｃ、Ｃｄ９、Ｉｔｇｂ５、Ｓｄｃ１、Ｖｃａｎ、Ｂｇｎ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｃｏｌ５ａ１、Ｚｃｃｈｃ２４、Ｌｕｍ、Ｐｏｓｔｎ、Ｓｆｒｐ４、Ｓｐｏｎ２、Ｃｏｌ８ａ１、Ｗｉｓｐ２、Ａｄａｍｔｓ２、Ｃｏｌｅｃ１２、Ｄｎｍ３ｏｓ、Ｐｌａｔ、２３１００１０Ｊ１７Ｒｉｋ、Ｃｔｓａ、Ａｎｋ、Ｄｋｋ２、Ｆａｐ、Ｍｍｐ３、Ｄｍｐ１、Ｃｏｌ６ａ３、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｍｇｐ、Ｔｍｅｍ１００、Ｃｔｓｃ、Ｎｒ２ｆ１、Ｃｆｈ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｄｉｏ２、Ｈｔｒａ１、Ｄｋｋ３、Ｉｓｌｒ、Ｆｏｘｓ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｍ２、Ｔｈｂｄ、Ｕｂａ７、Ａｇｔｒ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｔｓｐａｎ１５、Ｏｓｒ２、Ｆａｍ１２９ａ、Ｐｌｅｋｈａ６、Ｍｍｐ２、Ａｒｒｄｃ３、Ｍａｔｎ２、Ｍａｂ２１ｌ１、Ｐｖｒｌ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｃｄ２４８、Ｇｕｌｐ１、Ｍｆａｐ２、Ｉｄｕａ、Ｃｓｐｇ４、Ｓｐｏｃｋ１、Ｍｆａｐ４、Ｈｅｘｂ、Ｃｉｌｐ、Ｐｏｌｄ４、Ｃｒｅｂｒｆ、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｍｅｍ４２、Ｎｅｄｄ９、Ｒｃｎ３、Ｓｅｐｔ８、Ｐｃｏｌｃｅ、Ｅｄｉｌ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｈｆ１７、Ｐｌｉｎ３、Ａｅｂｐ１、Ｈｍｇｃｓ１、Ｐ４ｈａ１、Ｌａｍａ２、Ｃｓｒｐ２、Ｒｎｆ１６７、Ｈ１ｆ０、Ｆｎ１、Ｍｍｐ１４、Ｃｐｑ、Ｍｒｃ２、Ｉｆｎｇｒ１、Ｓｔ３ｇａｌ５、Ｆｂｎ１、Ｓｄｃ２、Ａｄｃｙ７、Ｃｋｍ、Ｈｅｘａ、Ｃａｐｇ、Ｋｌｈｌ１３、Ｌｏｘｌ１、Ｆｄｆｔ１、Ｉｆｉ２７ｌ１、Ｒｂｐ１、Ｎｒ２ｆ２、Ｃｓｔ３、Ｐｘｄｎ、Ｅｃｍ１、Ｍｙｂｐｃ１、Ｉｇｆ２ｒ、Ｓｅｒｐｉｎｈ１、Ｍｔ１、Ｌｐａｒ１、Ａｔｒａｉｄ、Ｓｃｄ２、Ｄａｐ、Ｐｐｉｃ、Ａｐｐ、Ｌａｍｐ２、Ｃｏｌ５ａ２、Ｇｐｃ１、Ｈｓｐａ５、Ｐｍｅｐａ１、Ｌａｐｔｍ４ａおよびＬｒｐ１からなる群より選択され得る。
【００９８】
マーカーのための試薬は、例えば、マーカーに対する抗体であり得るか、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応、例えば半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応のためのプライマーであり得る。このようなマーカーは、サテライト細胞が生産されたか否かを評価するために使用され得る。抗体または他の検出試薬は、検出において使用するための標識、例えば放射性標識、蛍光（例えば、ＧＦＰ）標識または比色標識に連結され得る。検出試薬がプライマーである場合、それは、乾燥調製物、例えば凍結乾燥調製物または溶液で供給され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞マーカーの存在は、サテライト細胞を示す１つまたはそれを超えるマーカーの存在または非存在を検出することにより行われ得る。例えば、サテライト細胞は、内因性サテライト細胞から同定され得る。いくつかの実施形態では、前記方法は、サテライト細胞のマーカーの陽性発現（例えば、存在）を検出することを含み得る。マーカーは、Ｉｔｇｂ５、Ｓｄｃ１、Ｖｃａｎ、Ｂｇｎ、Ｉｇｆｂｐ５、Ｃｏｌ５ａ１、Ｚｃｃｈｃ２４、Ｌｕｍ、Ｐｏｓｔｎ、Ｓｆｒｐ４、Ｓｐｏｎ２、Ｃｏｌ８ａ１、Ｗｉｓｐ２、Ａｄａｍｔｓ２、Ｃｏｌｅｃ１２、Ｄｎｍ３ｏｓ、Ｐｌａｔ、２３１００１０Ｊ１７Ｒｉｋ、Ｃｔｓａ、Ａｎｋ、Ｄｋｋ２、Ｆａｐ、Ｍｍｐ３、Ｄｍｐ１、Ｃｏｌ６ａ３、Ｐｄｇｆｒｂ、Ｃｏｌ１ａ１、Ｍｇｐ、Ｔｍｅｍ１００、Ｃｔｓｃ、Ｎｒ２ｆ１、Ｃｆｈ、Ｐｄｇｆｒａ、Ｄｉｏ２、Ｈｔｒａ１、Ｄｋｋ３、Ｉｓｌｒ、Ｆｏｘｓ１、Ｔｇｆｂ２、Ｔｇｍ２、Ｔｈｂｄ、Ｕｂａ７、Ａｇｔｒ２、Ｃｙｐ１ｂ１、Ｔｓｐａｎ１５、Ｏｓｒ２、Ｆａｍ１２９ａ、Ｐｌｅｋｈａ６、Ｍｍｐ２、Ａｒｒｄｃ３、Ｍａｔｎ２、Ｍａｂ２１ｌ１、Ｐｖｒｌ２、Ａｄａｍｔｓｌ４、Ｃｄ２４８、Ｇｕｌｐ１、Ｍｆａｐ２、Ｉｄｕａ、Ｃｓｐｇ４、Ｓｐｏｃｋ１、Ｍｆａｐ４、Ｈｅｘｂ、Ｃｉｌｐ、Ｐｏｌｄ４、Ｃｒｅｂｒｆ、Ｃｏｌ１４ａ１、Ｔｍｅｍ４２、Ｎｅｄｄ９、Ｒｃｎ３、Ｓｅｐｔ８、Ｐｃｏｌｃｅ、Ｅｄｉｌ３、Ｎｕｐｒ１、Ｐｈｆ１７、Ｐｌｉｎ３、Ａｅｂｐ１、Ｈｍｇｃｓ１、Ｐ４ｈａ１、Ｌａｍａ２、Ｃｓｒｐ２、Ｒｎｆ１６７、Ｈ１ｆ０、Ｆｎ１、Ｍｍｐ１４、Ｃｐｑ、Ｍｒｃ２、Ｉｆｎｇｒ１、Ｓｔ３ｇａｌ５、Ｆｂｎ１、Ｓｄｃ２、Ａｄｃｙ７、Ｃｋｍ、Ｈｅｘａ、Ｃａｐｇ、Ｋｌｈｌ１３、Ｌｏｘｌ１、Ｆｄｆｔ１、Ｉｆｉ２７ｌ１、Ｒｂｐ１、Ｎｒ２ｆ２、Ｃｓｔ３、Ｐｘｄｎ、Ｅｃｍ１、Ｍｙｂｐｃ１、Ｉｇｆ２ｒ、Ｓｅｒｐｉｎｈ１、Ｍｔ１、Ｌｐａｒ１、Ａｔｒａｉｄ、Ｓｃｄ２、Ｄａｐ、Ｐｐｉｃ、Ａｐｐ、Ｌａｍｐ２、Ｃｏｌ５ａ２、Ｇｐｃ１、Ｈｓｐａ５、Ｐｍｅｐａ１、Ｌａｐｔｍ４ａおよびＬｒｐ１からなる群より選択され得る。
【０１００】
サテライト細胞への少なくとも１つの筋芽細胞またはその前駆体の進行は、サテライト細胞に特徴的なマーカーの発現を決定することによりモニタリングされ得る。いくつかのプロセスでは、特定のマーカーの発現は、マーカーの存在または非存在を検出することにより決定される。あるいは、特定のマーカーの発現は、マーカーが細胞培養物または細胞集団の細胞に存在するレベルを測定することにより決定され得る。特定のプロセスでは、サテライト細胞に特徴的なマーカーの発現、および、それが由来する筋芽細胞またはその前駆体に特徴的なマーカーの有意な発現の欠如が決定される。
【０１０１】
筋芽細胞からのサテライト細胞の生産をモニタリングすることに関して記載されたように、定量または半定量技術、例えば、ブロット転写法および免疫細胞化学法は、当業者に一般に公知の方法を使用して、マーカー発現を測定するために使用され得る。あるいは、マーカー発現は、当技術分野で通常公知の方法による定量ＰＣＲなどの技術の使用により、正確に定量され得る。このようなものとして、細胞外マーカー含量を測定するための技術、例えば、ＥＬＩＳＡが使用され得る。
【０１０２】
本発明は、本明細書でサテライト細胞マーカーとして列記されたそれらのマーカーに限定されず、本発明はまた、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、およびβ１−インテグリン）、抗原および他の遺伝子産物、例えば、ＥＳＴ、ＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡおよびアンチセンスＲＮＡ）、ＤＮＡ（例えば、遺伝子およびｃＤＮＡ）ならびにそれらの一部などのマーカーを包含することを理解すべきである。
【０１０３】
サテライト細胞の濃縮、単離および精製
本発明の別の態様は、細胞の不均質集団、例えばサテライト細胞、筋芽細胞、分化した骨格筋細胞および増殖性筋原細胞を含む細胞の混合集団からのサテライト細胞の集団の単離に関する。上記プロセスのいずれかにより生産されたサテライト細胞の集団は、サテライト細胞が得られる筋芽細胞またはその前駆体に存在せず、サテライト細胞に存在する任意の細胞表面マーカーを使用することにより、濃縮、単離および／または精製され得る。このような細胞表面マーカーは、サテライト細胞に特異的なアフィニティタグとも称される。サテライト細胞に特異的なアフィニティタグの例は、サテライト細胞の細胞表面に存在するが、他の細胞型（例えば、筋芽細胞）に実質的に存在しないマーカー分子、例えば、ポリペプチドに特異的な、抗体、リガンドまたは他の結合剤である。いくつかのプロセスでは、サテライト細胞上の細胞表面抗原に結合する抗体が、本明細書に記載される方法により生産された、（例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの分化培地と接触させることにより）化学的に誘導されたサテライト細胞の濃縮、単離または精製のためのアフィニティタグとして使用される。このような抗体は公知であり、市販されている。
【０１０４】
当業者は、サテライト細胞の濃縮、単離および／または精製のための抗体を使用するためのプロセスを容易に理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、抗体などの試薬を、サテライト細胞を含む細胞集団であって、細胞間および基材接着を減少させるように処理されている細胞集団と共にインキュベートする。次いで、細胞集団を洗浄し、遠心分離し、再懸濁する。いくつかの実施形態では、抗体が標識で既に標識されていない場合、細胞懸濁物を、一次抗体に結合することができる二次抗体、例えばＦＩＴＣコンジュゲート抗体と共にインキュベートする。次いで、サテライト細胞を洗浄し、遠心分離し、緩衝液に再懸濁する。次いで、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用して、サテライト細胞の懸濁物を分析および選別する。抗体結合蛍光再プログラム化細胞を未結合非蛍光細胞とは別個に収集し、それにより、細胞懸濁物中に存在する他の細胞、例えば筋芽細胞、分化した骨格筋細胞または増殖性筋原細胞からサテライト細胞が単離される。
【０１０５】
本明細書に記載されるプロセスの別の実施形態では、サテライト細胞を含む単離された細胞組成物は、別の親和性ベースの方法を使用することにより、またはサテライト細胞に特異的な同じもしくは異なるマーカーを使用したさらなる選別ラウンドによりさらに精製され得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＦＡＣＳ選別を使用して、単独で、またはＰａｘ７発現と共に、あるいは本明細書に開示されるサテライト細胞マーカーと共にＭｙｆ５を発現するサテライト細胞を、細胞集団中のマーカーの１つを発現しない細胞（例えば、陰性細胞）から最初に単離する。第２のＦＡＣ選別、例えば、第１の選別とは異なるマーカーについて陽性の細胞を単離するためのＦＡＣＳを再び使用した陽性細胞の選別は、再プログラム化細胞について細胞集団を濃縮する。
【０１０６】
代替的な実施形態では、ＦＡＣＳ選別は、ほとんどの筋芽細胞に存在するがサテライト細胞に存在しないマーカーの陰性選別により、細胞を分離するために使用される。
【０１０７】
本明細書に記載されるプロセスのいくつかの実施形態では、抗体を使用せずにサテライト細胞を蛍光標識し、次いで、蛍光活性化細胞選別器（ＦＡＣＳ）を使用することにより、非標識細胞から単離する。このような実施形態では、ＧＦＰ、ＹＦＰをコードする核酸、または発現可能な蛍光マーカー遺伝子、例えばルシフェラーゼをコードする遺伝子をコードする別の核酸は、上記方法を使用して再プログラム化細胞を標識するために使用される。
【０１０８】
前述のアプローチに加えて、化学的に誘導されたサテライト細胞はまた、細胞単離のための他の技術により単離され得る。加えて、サテライト細胞はまた、サテライト細胞の選択的生存または選択的拡大増殖を促進する成長条件で連続継代培養方法により濃縮または単離され得る。このような方法は当業者に公知である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、単離されたサテライト細胞は、培養において拡大増殖可能である。いくつかの実施形態では、単離されたサテライト細胞を化合物と接触させて、サテライト細胞増殖を増加させる。サテライト細胞増殖を誘導し、増強しまたは増加させる方法は、サテライト細胞を、キナーゼ阻害剤、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）モジュレーター、エピジェニック改変因子、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）モジュレーター、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレーター、神経ペプチド、ドーパミン受容体モジュレーター、セロトニン受容体モジュレーター、ヒスタミン受容体モジュレーター、アデノシン受容体アゴニスト、イオノフォア、イオンチャネルモジュレーター、ガンマセクレターゼモジュレーター、コルチコステロイドおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物と接触させることを含む。増殖増強剤の例としては、限定されないが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６０９９号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。化合物は、サテライト細胞増殖を、未処理サテライト細胞と比べて少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、５０％、７０％、８０％、９０％、１倍、１．１倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍またはそれを超えて誘導し、増強しまたは増加させ得る。
【０１１０】
サテライト細胞を含む組成物
本発明のいくつかの実施形態は、サテライト細胞を含む細胞組成物（例えば、細胞培養物または細胞集団）であって、前記サテライト細胞が少なくとも１つの筋芽細胞に由来する細胞組成物に関する。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、筋芽細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、分化した骨格筋細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞組成物は、増殖性筋原細胞を含む。
【０１１１】
特定の実施形態によれば、化学的に誘導されたサテライト細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、このようなサテライト細胞はヒトサテライト細胞である。いくつかの実施形態では、筋芽細胞は、胚筋細胞に由来する。他の実施形態では、筋芽細胞は、被験体の骨格筋から単離されている。
【０１１２】
本発明の他の実施形態は、本明細書に開示される方法により生産されたサテライト細胞を含む組成物（例えば、単離された細胞集団または細胞培養物）に関する。このような実施形態では、サテライト細胞は、サテライト細胞集団中の総細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満を構成する。いくつかの実施形態では、組成物は、細胞集団中の総細胞の約９０％超を構成するサテライト細胞の集団を含み、例えば、細胞集団中の総細胞の約少なくとも９５％または少なくとも９６％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも約９９％または約少なくとも１００％はサテライト細胞である。
【０１１３】
組成物およびキット
本明細書に開示される方法を実施するための、および本明細書に開示されるサテライト細胞を作製するためのキットが本明細書に記載される。筋肉傷害を処置するためのキットも本明細書に記載される。一態様では、キットは、本明細書に記載される少なくとも１つの筋芽細胞および少なくとも１種の培地を含み、必要に応じて、キットは、本明細書に記載される方法を使用して少なくとも１つの筋芽細胞をサテライト細胞の集団に変換するための指示をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２つの培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも３つの培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの補助剤（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  ａｇｅｎｔ）を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも２つの補助剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも３つの補助剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、筋芽細胞をサテライト細胞に脱分化させるための培地および／または補助剤を含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、筋芽細胞をサテライト細胞に脱分化させるための培地および／または補助剤の任意の組み合わせを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの筋芽細胞培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つのスピン培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの分化培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、筋芽細胞培地、スピン培地および分化培地を含む。いくつかの実施形態では、キットは、キナーゼ阻害剤、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）モジュレーター、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）モジュレーター、ヘッジホッグシグナル伝達経路モジュレーター、神経ペプチド、ドーパミン受容体モジュレーター、セロトニン受容体モジュレーター、ヒスタミン受容体モジュレーター、イオノフォア、イオンチャネルモジュレーター、ガンマセクレターゼモジュレーターおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される化合物を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、キット中の化合物は、いくつかの実施形態ではキットの他の成分を実質的に含まない防水性または気密性容器で提供され得る。化合物は、１つを超える容器で供給され得る（例えば、それは、筋芽細胞をサテライト細胞に誘導するための所定数の反応、例えば１つ、２つ、３つまたはそれを超える数の別個の反応のための十分な試薬を有する容器に供給され得る）。培地および／または補助剤は、任意の形態、例えば、液体、乾燥または凍結乾燥形態で提供され得る。本明細書に記載される化合物（例えば、培地または薬剤）は実質的に純粋であり、および／または無菌であるのが好ましい。本明細書に記載される化合物が溶液で提供される場合、溶液は、好ましくは水溶液であり、無菌水溶液が好ましい。本明細書に記載される化合物が乾燥形態で提供される場合、一般には、再構成は、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば滅菌水または緩衝液は、必要に応じて、キットで提供され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、キットは、資料をさらに必要に応じて含む。資料は、本明細書に記載される方法および／または本明細書に記載される方法についての本明細書に記載される化合物の使用に関する説明資料、指示資料、マーケティング資料および他の資料であり得る。
【０１１７】
キットの資料は、その指示または有益資料に限定されない。一実施形態では、資料は、化合物の製造、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチまたは製造場所の情報などについての情報を含み得る。一実施形態では、資料は、化合物の投与方法に関する。加えて、キットの資料は、その形式に限定されない。多くの場合、資料、例えば、指示は、印刷物、例えば、印刷文書、図および／または写真、例えば、ラベルまたは印刷されたシートで提供される。しかしながら、資料はまた、他の形式、点字、コンピュータ読み取り可能な材料、ビデオ記録またはオーディオ記録で提供され得る。別の実施形態では、キットの資料は、コンタクト情報、例えば、物理的な住所、ｅメールアドレス、ウェブサイトまたは電話番号であり、キットのユーザは、本明細書に記載される化合物、および／または、本明細書に記載される方法におけるその使用についての重要な情報を得ることができる。当然のことながら、資料は、任意の組み合わせの形式で提供され得る。
【０１１８】
一実施形態では、資料は、本明細書に記載される化合物（例えば、培地および／または補助剤）を、本明細書に記載される方法を行うのに適切な方法、例えば、適切な投与量、投与形態または投与方式（例えば、本明細書に記載される投与量、投与形態または投与方式）で、（インビトロにおける細胞またはインビボにおける細胞に）投与するための指示を含み得る。別の実施形態では、資料は、本明細書に記載される化合物を、適切な被験体、例えばヒト、例えば、本明細書に記載される障害を有するかもしくはそのリスクがあるヒトに投与するか、またはインビトロで細胞に投与するための指示を含み得る。
【０１１９】
本明細書に記載される化合物に加えて、キットの組成物は、他の成分、例えば、溶媒または緩衝液、安定剤、保存剤、矯味矯臭剤（例えば、苦味アンタゴニストまたは甘味料）、芳香剤または化粧成分、および／または本明細書に記載される状態もしくは障害を処置するためのさらなる薬剤を含み得る。あるいは、他の成分は、キットに含まれるが、本明細書に記載される化合物とは異なる組成物または容器に存在し得る。このような実施形態では、キットは、本明細書に記載される化合物と、他の成分とを混合するための、または、本明細書に記載される化合物を、他の成分と共に使用するための指示、例えば、投与前に２つの薬剤を組み合わせることについての指示を含み得る。
【０１２０】
キットは、本明細書に記載される少なくとも１種の培地および／または補助剤を含有する組成物のための１つまたはそれを超える容器を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、組成物および資料のための、別個の容器（例えば、２つの薬剤のための２つの別個の容器）、仕切りまたは区画を含む。例えば、組成物は、ボトル、バイアルまたはシリンジに含まれ得、資料は、プラスチック製のスリーブまたはパケットに含まれ得る。他の実施形態では、キットの別個の要素は、分割していない１つの容器内に含まれる。例えば、組成物は、資料がラベルの形式で付着されている、ボトル、バイアルまたはシリンジに含まれる。いくつかの実施形態では、キットは、複数（例えば、パック）の個々の容器を含み、それぞれが、本明細書に記載される化合物の１つまたはそれを超える単位投与形態（例えば、本明細書に記載される投与形態）を含有する。例えば、キットは、複数のシリンジ、アンプル、ホイルパケットまたはブリスターパックを含み、それぞれが、本明細書に記載される化合物の単回単位投与量を含有する。キットの容器は、気密性、防水性（例えば、湿気の変化または蒸発に対して不透過性）および／または遮光性であり得る。
【０１２１】
キットは、組成物の投与に適切なデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ピペット、鉗子、計量スプーン、点滴注入器（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、コットンスワブまたは木製スワブ）または任意のこのような送達デバイスを必要に応じて含む。好ましい実施形態では、デバイスは、医療用埋め込みデバイスであり、例えば、外科的挿入用にパッケージされている。
【０１２２】
キットはまた、サテライト細胞のためのマーカー、例えば、本明細書に記載されるマーカーの検出用成分、例えば、サテライト細胞の検出のための試薬を含み得る。または、いくつかの実施形態では、キットはまた、サテライト細胞の陰性選択の目的のためのサテライト細胞の陰性マーカーの検出用、または、これらの陰性マーカーを発現しない細胞（例えば、サテライト細胞）の同定のための試薬を含み得る。試薬は、例えば、マーカーに対する抗体であり得るか、またはＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応、例えば半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲもしくはＰＣＲ反応のためのプライマーであり得る。このようなマーカーは、ｉＰＳ細胞が生産されたか否かを評価するために使用され得る。検出試薬が抗体である場合、それは、乾燥調製物、例えば凍結乾燥調製物または溶液で供給され得る。抗体または他の検出試薬は、検出において使用するための標識、例えば放射性標識、蛍光（例えば、ＧＦＰ）標識または比色標識に連結され得る。検出試薬がプライマーである場合、それは、乾燥調製物、例えば凍結乾燥調製物または溶液で供給され得る。
【０１２３】
キットは、例えば陽性細胞型対照として使用するために、サテライト細胞、例えば同じ種類の筋芽細胞に由来するサテライト細胞を含み得る。
【０１２４】
細胞を投与する方法
一実施形態では、本明細書に記載される細胞、例えばサテライト細胞の集団は移植可能であり、例えば、サテライト細胞の集団は被験体に投与され得る。いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団を投与される被験体は、（例えば、自己細胞療法のために）サテライト細胞に脱分化させるために使用される筋芽細胞が得られた同じ被験体である。いくつかの実施形態では、被験体は、異なる被験体である。いくつかの実施形態では、被験体は筋肉損傷を患っているか、または正常被験体である。例えば、移植のための細胞（例えば、サテライト細胞の集団を含む組成物）は、移植に適切な形態であり得る。
【０１２５】
前記方法は、細胞を、それを必要とする被験体、例えば、哺乳動物の被験体、例えば、ヒトの被験体に投与することをさらに含み得る。細胞の供給源は、哺乳動物、好ましくは、ヒトであり得る。細胞の供給源またはレシピエントはまた、非ヒトの被験体、例えば、動物モデルであり得る。「哺乳動物」という用語は、マウス、ラット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ウマ、サル、イヌ、ネコ、および好ましくは、ヒトを含む生物を含む。同様に、移植可能な細胞は、これらの生物、例えば、非ヒトのトランスジェニック生物のいずれかから得ることができる。一実施形態では、移植可能な細胞は、遺伝子操作されており、例えば、細胞は、外因性の遺伝子を含むか、または内因性遺伝子を不活性化もしくは変化させるように遺伝子操作されている。
【０１２６】
サテライト細胞の集団を含む組成物は、埋め込み可能なデバイスを使用して、被験体に投与され得る。埋め込み可能なデバイスおよび関連技術は当技術分野で公知であり、送達システムとして有用であり、本明細書に示される化合物または組成物の連続放出送達または時限放出送達が望ましい。加えて、埋め込み可能なデバイスの送達システムは、化合物または組成物の送達の特異的な点（例えば、局所部位または臓器）の標的化に有用である。Ｎｅｇｒｉｎら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２（６）：５６３（２００１）。代替的な送達方法を伴う時限放出技術もまた、本発明に使用され得る。例えば、ポリマー技術、持続放出技術および被包技術に基づく時限放出製剤（例えば、ポリマー、リポソーム）もまた、本明細書に示される化合物および組成物の送達に使用され得る。
【０１２７】
薬学的組成物
被験体への投与のために、本明細書に開示される方法により生産された細胞集団、例えば、（少なくとも１つの筋芽細胞を少なくとも１種の培地（例えば、本明細書に記載される筋芽細胞培地、スピン培地および／または分化培地）と接触させることにより生産された）サテライト細胞の集団は、例えば、薬学的に許容され得る組成物で被験体に投与され得る。これらの薬学的に許容され得る組成物は、１つまたはそれを超える薬学的に許容され得る担体（添加剤）および／または希釈剤と共に製剤化された治療有効量の上記サテライト細胞の集団を含む。
【０１２８】
以下に詳細に記載されるように、本発明の薬学的組成物は、固体または液体形態、例えば以下のために適合されたものを含め、投与のために特別に製剤化され得る：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水性溶液または懸濁物）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル、丸剤、錠剤（例えば、頬、舌下および全身での吸収を目的としたもの）ボーラス、粉末、顆粒、舌への塗布のためのペースト；（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液もしくは懸濁物または持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による；（３）局所塗布、例えば、クリーム、軟膏または制御放出パッチまたは皮膚に適用されるスプレー；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリームまたは泡；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻。加えて、化合物は、患者に埋め込まれ得るか、または薬剤送達システムを使用して注射され得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔ，ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９−２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．“Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ”（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号；および米国特許第３５  ３，２７０，９６０号を参照のこと。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る」という用語は、健全な医療的判断の範囲内にあり、合理的な利益／リスク比に相応の、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触させて使用するために適切な化合物、材料、組成物および／または投与形態を指す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容され得る担体」という用語は、１つの臓器または身体の一部から別の臓器または身体の部分に、目的の化合物を運搬または輸送することに関与する、薬学的に許容され得る材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体の充填剤（ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛またはステアリン酸）または溶媒被包材料を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に対して傷害性でないという意味で、「許容され得る」べきである。薬学的に許容され得る担体として機能し得る材料のいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロースおよびその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロース；（４）粉末状のトラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチル；（１３）アガー；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張性食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝化溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（２２）増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２−Ｃ１２アルコール、例えば、エタノール；ならびに（２３）薬学的製剤に使用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、矯味矯臭剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、製剤に存在し得る。前記用語、例えば「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容され得る担体」などは、本明細書では互換的に使用される。
【０１３１】
細胞集団に関して本明細書で使用される場合、「治療有効量」という語句は、細胞集団中の関連細胞、例えばサテライト細胞、または本発明のサテライト細胞を含む組成物の量であって、任意の医療的処置に適用可能な合理的な利益／リスク比で、動物中の細胞の少なくとも部分集団においていくらかの所望の治療効果を生じさせるために有効な量を意味する。例えば、筋肉傷害の少なくとも１つの症状の統計学的に有意な測定可能な変化、例えば筋肉修復または筋肉再生を生じさせるために十分な量のサテライト細胞の集団が、被験体に投与される。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力内である。一般に、治療有効量は、被験体の既往歴、年齢、状態、性別ならびに被験体における医学的状態の重症度および種類、ならびに、他の薬学的に活性な薬剤の投与により変動し得る。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「修復」という用語は、筋肉組織の損傷が緩和されるかまたは完全に排除されるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、筋肉組織損傷の少なくとも１つの症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％緩和される。
【０１３３】
疾患または障害の「処置」、「予防」または「改善」は、このような疾患または障害の発症の遅延または予防、このような疾患または障害に関連する状態の進行、悪化または増悪、進行または重症度の逆転、緩和、改善、阻害、減速または停止を意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％緩和される。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「投与する」という用語は、所望の効果が生じるように、所望の部位における組成物の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路による被験体への組成物の配置を指す。本発明の方法に適切な投与経路は、局所投与および全身投与の両方を含む。一般に、局所投与は、被験体の全身と比較して多くの、投与されたサテライト細胞（または増殖増強剤処置サテライト細胞）が特定の場所に送達されるのに対して、全身投与は、本質的には被験体の全身へのサテライトの送達をもたらす。局所投与の１つの方法は、筋肉内注射によるものである。
【０１３５】
化合物処置細胞を投与する文脈では、「投与する」という用語はまた、被験体へのこのような細胞の移植を含む。本明細書で使用される場合、「移植」という用語は、少なくとも１つの細胞を被験体に埋め込むかまたは移入するプロセスを指す。「移植」という用語は、例えば、自己移植（患者のある場所から細胞を取り出して、同じ患者の同じまたは別の場所に移す）、同種移植（同じ種のメンバー間の移植）および異種移植（異なる種のメンバー間の移植）を含む。当業者は、筋肉修復および筋肉再生のために細胞を埋め込むかまたは移植するための方法であって、本発明に適した方法を十分に把握している。例えば、米国特許第７，５９２，１７４号および米国特許出願公開第２００５／０２４９７３１号（これらの内容は両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１３６】
サテライト細胞またはそれを含む組成物は、当技術分野で公知の任意の適切な経路、例えば限定されないが、経口または非経口の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸および局所（例えば、頬および舌下）の投与により投与され得る。
【０１３７】
例示的な投与様式としては、限定されないが、注射、注入、点滴注入、吸入または経口摂取が挙げられる。「注射」は、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、心室内（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）、包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｒｎａｌ）の注射および注入を含む。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注入または注射により投与される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「被験体」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、脊椎動物、例えば霊長類、齧歯類、家畜または狩猟動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザルおよびマカク、例えばアカゲザルが挙げられる。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが挙げられる。家畜および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えばイエネコ、イヌ種、例えばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、例えばニワトリ、エミュー、ダチョウおよび魚、例えばマス、ナマズおよびサケが挙げられる。患者または被験体としては、前述の任意のサブセット、例えば上記のすべてが挙げられるが、１つまたはそれを超える群または種、例えばヒト、霊長類または齧歯類を除外する。本明細書に記載される態様の特定の実施形態では、被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトである。「患者」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。「患者」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。被験体は、雄または雌であり得る。
【０１３９】
好ましくは、被験体は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマまたはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、自己免疫疾患または炎症に関連する障害の動物モデルに相当する被験体として有利に使用され得る。加えて、本明細書に記載される方法および組成物は、家畜および／またはペットを処置するために使用され得る。
【０１４０】
被験体は、筋肉損傷または筋肉萎縮／消耗を特徴とする障害と以前に診断されているか、またはそれを患っているもしくは有すると特定されている者であり得る。被験体は、筋肉変性障害と以前に診断されているか、またはそれを有すると特定されている者であり得る。
【０１４１】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、前記方法は、筋肉修復または筋肉再生のために被験体を処置する前に、筋肉損傷または筋肉萎縮／消耗について被験体を診断および／または選択することをさらに含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、損傷筋肉組織は、サルコペニアに起因する。本明細書で使用される場合、「サルコペニア」という用語は、加齢と共に必然的に生じる筋肉量および筋肉機能の喪失を指す。サルコペニアは身体活動レベルの低下の原因であり、そして、体脂肪の増加および筋肉のさらなる喪失をもたらし得る。筋肉量の喪失は、筋肉タンパク質合成と筋肉タンパク質分解との間の負の正味バランスに起因する。骨格筋量および機能のこの喪失の病因は明らかではないと考えられる。身体活動レベルの低下、中枢神経系の変化に続発する運動単位の喪失、および不十分なタンパク質取り込みのすべてが関係している。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、損傷筋肉組織は、物理的傷害または外傷に起因する。損傷筋肉は、骨格筋であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は、筋肉の傷害、傷、外傷もしくは疾患を有するか、または他の方法でそれらの影響を受ける。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、損傷筋肉組織をもたらす疾患はミオパシーである。限定されないが、ミオパシーは、先天性ミオパシーまたは後天性ミオパシーであり得る。例示的なミオパシーとしては、限定されないが、ジストロフィー、ミオトニー（神経筋緊張症（ｎｅｕｒｏｍｙｔｏｎｉａ））、先天性ミオパシー（例えば、ネマリンミオパシー、マルチ／ミニコアミオパシー、中心核ミオパシー（または筋細管ミオパシー））、ミトコンドリアミオパシー、家族性周期性麻痺、炎症性ミオパシー、代謝性ミオパシー（例えば、糖原貯蔵症および脂質貯蔵障害）、皮膚筋炎、多発性筋炎、封入体筋炎、骨化性筋炎、横紋筋融解症およびミオグロビン尿症が挙げられる。
【０１４５】
本明細書に記載されるこの態様および他の態様のいくつかの実施形態では、ミオパシーは、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー筋ジストロフィー、反射性交感神経性ジストロフィー、網膜ジストロフィー、コナルジストロフィー（Ｃｏｎａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ）、筋緊張性ジストロフィー、角膜ジストロフィーおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択されるジストロフィーである。
【０１４６】
先天性ミオパシーは、出生時に存在し得る数百の異なる神経筋肉障害に適用されることがある用語であるが、それは、通常、出生時または新生児期において筋緊張低下および衰弱を引き起こし、いくつかの場合では小児期においてその後の運動発達遅延を引き起こす一群の珍しい遺伝性原発性筋肉障害のために留保される。患者は、軽度（小児期後期発症および成人期を通して歩行能力）から重度（呼吸不全（ｒｅｓｐｉｔａｔｏｒｙ  ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）および生後１年以内に死亡）の範囲の衰弱を患う。
【０１４７】
最も一般的なタイプの先天性ミオパシーは、ネマリンミオパシー、筋細管ミオパシー、中心核ミオパシー、先天性線維型不均衡およびマルチコアミオパシーである。それらは、それらの組織学的特徴、症状および予後により主に区別される。診断は特徴的な臨床所見により示され、筋肉生検により確認される。
【０１４８】
具体的なミオパシーの例としては、限定されないが、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６０９９号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【０１４９】
本明細書に記載されるサテライト細胞組成物は、本明細書に記載される増殖増強剤および／または薬学的に活性な薬剤と組み合わせて被験体に同時投与され得る。例示的な薬学的に活性な化合物としては、限定されないが、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１３ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｅｄｓ．Ｔ．Ｒ．Ｈａｒｒｉｓｏｎら、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｎ．Ｙ．，ＮＹ；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５０ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，１９９７，Ｏｒａｄｅｌｌ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏ．；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，８ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，１９９０；Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ，Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｒｙ，ＵＳＰ  ＸＩＩ  ＮＦ  ＸＶＩＩ，１９９０；Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｏｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの最新版；およびＴｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘの最新版（これらの全内容はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見られるものが挙げられる。
【０１５０】
本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、薬学的に活性な薬剤は成長因子である。例示的な成長因子としては、限定されないが、塩基性上皮成長因子（ｂＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−４、サイモシン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−アルファ、ＴＧＦ−ベータ、軟骨誘導因子−Ａおよび−Ｂ、類骨誘導因子、オステオゲニン、骨形成タンパク質および他の骨成長因子、コラーゲン成長因子、ヘパリン結合成長因子−１または−２ならびにそれらの生物学的に活性な誘導体が挙げられる。
【０１５１】
サテライト細胞組成物、増殖増強剤および／または薬学的に活性な薬剤は、（同時にまたは異なる時間に）同じ薬学的組成物または異なる薬学的組成物で被験体に投与され得る。異なる時間に投与される場合、サテライト細胞組成物、増殖増強剤および／または薬学的に活性な薬剤は、他方の投与の５分、１０分、２０分、６０分、２時間、３時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間以内に投与され得る。サテライト細胞組成物、増殖増強剤および／または薬学的に活性な薬剤が異なる薬学的組成物で投与される場合、投与経路は異なり得る。
【０１５２】
サテライト細胞の集団を含む組成物の投与の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な投与量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により決定され得る。大きな治療指数を示すサテライト細胞の集団を含む組成物が好ましい。
【０１５３】
サテライト細胞の集団を含む組成物の量は、複数の十分確立された動物モデルを使用して試験され得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための投与量の範囲を処方するために使用され得る。このような化合物の投与量は、好ましくは、ほとんど毒性を有しないか、または、毒性を有しないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形態および採用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。
【０１５５】
治療有効投与量の、サテライト細胞の集団を含む組成物は、細胞培養アッセイから最初に推定され得る。あるいは、任意の特定の投与量の効果が、適切なバイオアッセイによりモニタリングされ得る。
【０１５６】
処置の持続期間および頻度に関して、処置が治療的利益を提供している時を決定し、投与量を増加または減少させるか、投与頻度を増加または減少させるか、処置を中断するか、処置を再開するか、または、処置レジメンに他の変更を加えるかを決定するために、被験体をモニタリングするのは、技量を有する臨床医にとって典型的なことである。投与スケジュールは、数多くの臨床的要因に応じて、１週間１回から毎日に変動し得る。所望の投与量は一度に投与され得るか、または部分投与量、例えば２〜４つの部分投与量に分割され、一定期間にわたって、例えば、日を通しての適切な間隔または他の適切なスケジュールで投与され得る。このような部分投与量は、単位投与形態として投与され得る。いくつかの実施形態では、投与は、長期、例えば、数週間または数か月の期間にわたって、毎日１回またはそれを超える投与量である。投与スケジュールの例は、１週間、２週間、３週間、４週間、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月または６カ月またはそれを超えて、毎日、１日２回、１日３回、１日４回またはそれより頻繁な投与である。
【０１５７】
本発明の別の態様では、前記方法は、本明細書に開示されるサテライト細胞の単離された集団の使用を提供する。本発明の一実施形態では、本明細書に開示されるサテライト細胞の単離された集団は、処置を必要とする被験体、例えば、筋肉疾患または筋肉障害（例えば、筋肉変性障害）を有するかまたはそれを発症するリスクがある被験体への移植において使用するための薬学的組成物の生産に使用され得る。例としては、筋肉萎縮または筋肉損傷を有する被験体が挙げられる。一実施形態では、サテライト細胞の単離された集団は遺伝子改変され得る。別の態様では、被験体は、筋肉損傷または筋肉萎縮を有し得るかまたはそのリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなサテライト細胞の単離された集団は、自己および／または同種のものであり得る。いくつかの実施形態では、被験体は哺乳動物であり、他の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１５８】
本発明の一実施形態は、被験体における筋肉傷害または筋肉疾患を処置する方法であって、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団を含む有効量の組成物を、筋肉傷害または筋肉疾患を有する被験体に投与することを含む方法に関する。他の実施形態は、被験体における筋肉変性障害を処置する方法であって、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団を含む有効量の組成物を、筋肉変性障害を有する被験体に投与することを含む方法に関する。さらなる実施形態では、本発明は、筋肉疾患を処置するための方法であって、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団を含む組成物を、筋肉疾患を有するかまたはそれを発症する増加したリスクを有する被験体に投与することを含む方法を提供する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団は、任意の生理学的に許容され得る賦形剤で投与され得、サテライト細胞は、複製、増殖および／または生着に適切な部位を見出し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団は、注射、カテーテルなどにより導入され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団は、液体窒素の温度で凍結されることができ、長期間保存されることができ、解凍時に使用可能である。凍結される場合、サテライト細胞の集団は、通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％ＦＣＳ、４０％ＲＰＭＩ１６４０培地に保存されるであろう。解凍されると、細胞は、本明細書に開示されるサテライト細胞の培養に関連する成長因子および／またはフィーダ細胞の使用により拡大増殖され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるサテライト細胞の集団は、ヒトへの投与用に十分無菌条件下で調製された等張性賦形剤を含む薬学的組成物の形態で供給され得る。医療製剤の一般原則について、読み手は、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ  Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ＆Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ＆Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００に言及される。本明細書に開示されるサテライト細胞の集団を含む組成物における細胞賦形剤および任意の付随的要素の選択は、投与に使用される経路およびデバイスに基づいて採用されるであろう。いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団を含む組成物はまた、サテライト細胞の生着または機能的な動員を容易にする、１つまたはそれを超える他の成分を含み得るか、またはそれを伴い得る。適切な成分としては、サテライト細胞または補完的細胞型の付着を支持または促進するマトリクスタンパク質が挙げられる。別の実施形態では、組成物は、吸収性または生分解性のマトリクス足場を含み得る。
【０１６１】
遺伝子治療は、遺伝子産物を置き換え、組織の再生を促進し、疾患を処置し、または、被験体への埋め込み後の細胞の生存を改善する（すなわち、拒絶を防止する）ためのいずれかで、細胞を改変するために使用され得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団は、個々の患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重ならびに医療従事者に公知の他の要因を考慮して、医療の品質管理に関する基準に基づいて投与および投薬され得る。したがって、本明細書の目的のための薬学的に「有効な量」は、当技術分野で公知なように、このような考慮により決定される。量は、改善、例えば限定されないが、改善した生存率、より急速な回復、または、当業者による適切な尺度として選択された場合、症状および他の指標の改善もしくは排除を達成するために有効でなければならない。サテライト細胞の集団は、以下の場所：診療所、病院、救急部門、病棟、集中治療室、手術室、カテーテル法室（ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｕｉｔｅ）、放射線室（ｒａｄｉｏｌｏｇｉｃ  ｓｕｉｔｅ）で、被験体に投与され得る。
【０１６３】
他の実施形態では、サテライト細胞の集団は、後の埋め込み／注入のために保存される。サテライト細胞の集団の一部が後の適用のために保持され、一部が被験体に即時に適用されるように、サテライト細胞の集団は、１つを超えるアリコートまたは単位に分割され得る。米国特許出願公開第２００３／００５４３３１号および国際公開第０３／０２４２１５号（これらは、その全体が参照により組み込まれる）に開示されているように、細胞バンクにおける全部または一部の細胞の中程度から長期間の保存もまた、本発明の範囲内である。処理の終了時に、濃縮細胞は、当業者に公知の任意の手段によりレシピエント内に配置するための送達デバイス、例えばシリンジ内に充填され得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団は単独で、または他の細胞、組織、組織断片、成長因子、例えば、ＶＥＧＦおよび他の公知の血管新生もしくは血管原性の成長因子、生物学的に活性もしくは不活性な化合物、吸収性プラスチック足場または、集団の送達、有効性、耐容性もしくは機能を増強させることを意図した他の添加剤との組み合わせで適用され得る。いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団は、構造的または治療的目的を引き出すために、細胞の機能を変化、増強または追加するように、ＤＮＡの挿入または細胞培養中での配置により改変され得る。例えば、幹細胞についての遺伝子移入技術は、（Ｍｏｒｉｚｏｎｏら、２００３；Ｍｏｓｃａら、２０００）に開示されているように、当業者に公知であり、ウイルストランスフェクション技術、およびより具体的には、（Ｗａｌｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎ，２０００）および（Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓら、２０００）に開示されているアデノ関連ウイルス遺伝子移入技術が挙げられ得る。非ウイルス系技術もまた、（Ｍｕｒａｒｎａｔｓｕら、１９９８）に開示されているように実施され得る。
【０１６５】
別の態様では、いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団は、血管新生促進性成長因子をコードする遺伝子と組み合わせられ得る。抗アポトーシス因子または薬剤をコードする遺伝子も適用され得る。遺伝子（または、遺伝子の組み合わせ）の追加は、当技術分野で公知の任意の技術、例えば限定されないが、アデノウイルス形質導入である、「遺伝子銃」、リポソーム媒介性形質導入およびレトロウイルスまたはレンチウイルス媒介性形質導入、プラスミドアデノ関連ウイルスによるものであり得る。細胞は、形質導入が継続または開始し得るように、経時的に細胞に対して遺伝子を放出および／または提示することができる遺伝子送達ビヒクルを有する担体材料と共に埋め込まれ得る。特に、細胞および／または細胞を含む組織が、細胞および／または組織が得られた患者以外の患者に投与される場合、１つまたはそれを超える免疫抑制剤が、細胞および／または組織を受けている患者に投与されて、移植片の拒絶を減少させ、好ましくは、防止し得る。本明細書で使用される場合、「免疫抑制薬または免疫抑制剤」という用語は、正常な免疫機能を阻害または妨害する、医薬品を含むことを意図する。本明細書に開示される方法に適切な免疫抑制剤の例としては、Ｔ細胞／Ｂ細胞の同時刺激経路を阻害する薬剤、例えば、米国特許出願公開第２００２／０１８２２１１号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＣＴＬＡ４およびＢ７経路を介したＴ細胞とＢ細胞とのカップリングを妨害する薬剤が挙げられる。一実施形態では、免疫抑制剤は、シクロスポリンＡである。他の例としては、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシンおよび抗−胸腺細胞グロブリンが挙げられる。一実施形態では、免疫抑制薬は、少なくとも１つの他の治療剤と共に投与される。免疫抑制薬は、投与経路に適合した製剤で投与され、目的の治療効果を達成するために十分な投与量で被験体に投与される。別の実施形態では、免疫抑制薬は、本発明のサテライト細胞に対する寛容を誘導するために十分な期間にわたって一時的に投与される。
【０１６６】
有効量のサテライト細胞の集団を含む薬学的組成物もまた、本発明により企図される。これらの組成物は、薬学的に許容され得る担体、添加剤または賦形剤と必要に応じて組み合わせて、有効数のサテライト細胞を含む。特定の適応症では、被験体へのサテライト細胞の集団の全身投与が好ましい場合があるのに対して、他の適応症では、罹患組織および／または損傷組織の部位またはその近傍への直接投与が好ましい場合がある。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、サテライト細胞の集団は、必要に応じて、所望の目的、例えば、被験体への投与前のサテライト細胞の集団の再構成または解凍（凍結されている場合）に関する書面での指示と共に、適切な容器でパッケージングされ得る。
【実施例】
【０１６８】
実施例１−３Ｄスピン環境で培養した筋芽細胞は、分化した骨格筋および増殖性筋原性集団から構成される骨格筋オルガノイドに自己集合する
ＷＴ（Ｃ５７ｂｌ／６）、ＭｙｏＤＣｒｅ  ＲＯＳＡＴｄｔｏｍａｔｏ、Ｐａｘ７ｎＧＦＰおよびＰａｘ７Ｃｒｅ  ＲＯＳＡＴｄｔｏｍａｔｏから単離した筋芽細胞は、３Ｄスピン条件で培養すると、３Ｄスフィアに自己集合する（図１Ａ）。骨格筋オルガノイド内に存在する細胞の分化状態を決定するために、本発明者らは、３Ｄ条件における成長の１０日目、２０日目および３０日目にスフィアを収集した。各時点において、収集したスフィアをＯＣＴ：スクロース中で凍結し、１０μｍで切片化した。筋芽細胞またはサテライト細胞を同定するためのＰａｘ７（ＤＳＨＢ）（Ｓｅａｌｅら、２０００）、およびミオシン重鎖（ＭｙＨＣ、ＭＦ２０−ＤＳＨＢ）（骨格筋の最終分化のマーカー）を認識する抗体（Ｂａｄｅｒら、１９８２）で切片を染色した。３つの各時点における骨格筋オルガノイドは、Ｐａｘ７＋およびＭｙＨＣ＋細胞の組み合わせから構成されており、Ｐａｘ７＋細胞の割合は時間と共に減少する。
【０１６９】
この知見がヒト細胞に当てはまるかどうかを決定するために、本発明者らは、より高濃度のｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）を含む筋芽細胞培地で、ＷＴヒト骨格筋芽細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＃Ａ１２５５５）を増殖させた。ヒト筋芽細胞をスフェロイド９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ−４５１５）に４日間播種してから、オービタルシェーカー上で維持された１０ｃｍ低接着プレートに移した。１０日間の培養後、ヒト骨格筋オルガノイドが形成された（図１Ｂ）。Ｐａｘ７およびＭｙＨＣで染色したヒト骨格筋オルガノイドの凍結切片は、ＭｙＨＣ陽性である細胞の大部分を示す。興味深いことに、通常の培養中では、ヒト筋芽細胞は転写因子Ｐａｘ７を発現しないので、骨格筋オルガノイド内に存在するＰａｘ７陽性ヒト細胞の存在に留意することが重要である（図１Ｃ）。本発明者らのデータは、スフェロイドプレートに播種すると、ヒト筋芽細胞が３Ｄスフィアに自己集合することができることを示唆している。スフィア形成後、Ｐａｘ７＋ヒト筋原細胞の出現は、脱分化または再プログラミングが起こって、筋芽細胞が、サテライト細胞状態に似た細胞に戻ったことを示唆している。
【０１７０】
次に、本発明者らは、ＲＮＡｓｅｑ分析を行って、サテライト細胞状態の転写フィンガープリントを同定した（図２Ａ）。サテライト細胞（Ｐａｘ７、Ｍｙｆ５）では、複数のコア筋原性遺伝子が高度に発現されているが、骨格筋ＭｙｏＤのマスター転写因子は、筋芽細胞では優先的に発現されており、サテライト細胞では存在しない。これらの筋原性マーカーは、静止関連遺伝子のパネル（Ｓｐｒｙ１、Ｎｍ１、Ｎｆｉａ、Ｆｏｓ、Ｄｕｓｐ１）およびＮｏｔｃｈシグナル伝達経路のメンバー（Ｎｏｔｃｈ１、２、３、ＨｅｙＬ、Ｈｅｙ２、Ｈｅｓ）と組み合わせて、サテライト細胞を特定する転写フィンガープリントとして機能する。骨格筋オルガノイドに存在するＰａｘ７陽性細胞がサテライト細胞と同様の転写プロファイルを共有するかどうかを決定するために、本発明者らは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、３０日間培養した骨格筋オルガノイドから精製したｎＧＦＰ細胞から全ＲＮＡを単離した（図２Ｂ）。ｑＰＣＲ分析後、本発明者らは、ＭｙｏＤ（約１／５０）の有意な減少と一緒に、Ｐａｘ７（約４．５倍）およびＭｙｆ５（約１８倍）の増加を決定した。さらに、ｎＧＦＰ＋３０日目骨格筋オルガノイド由来細胞では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路マーカーＮｏｔｃｈ１（約２．５倍）、Ｎｏｔｃｈ２（約４倍）、Ｎｏｔｃｈ３（約３５倍）、ＨｅｙＬ（約５８０倍）、Ｈｅｙ２（約３７倍）およびＨｅｓ１（約１１倍）が増加していた。３０日目骨格筋オルガノイド由来ｎＧＦＰ＋細胞集団では、Ｎｍ１（約５倍）、Ｎｆｉａ（５倍）、Ｆｏｓ（約４８０倍）、Ｓｐｒｙ１（約３４倍）およびＤｕｓｐ１（約２０倍）を含む活性化の静止関連遺伝子またはマーカーが増強されていた（図２Ｂ）。このデータは、骨格筋オルガノイドから単離したｎＧＦＰ＋細胞が、サテライト細胞のものに似た転写プロファイルを有することを示唆している。
【０１７１】
骨格筋オルガノイドがどのようにして、筋原細胞がサテライト細胞状態に戻ることを可能にするかを機構的に取り組むために、本発明者らは、標準的な２Ｄ培養と３Ｄ培養との間の環境の差を検討した。成体幹細胞は非対称に分裂する能力を有するので、前駆体集団を生じさせると同時に、自己再生して幹細胞プールを維持する（Ｋｕａｎｇら、２００７）。これが起こるためには、幹細胞ニッチ内の因子が重要である。本発明者らは、２Ｄおよび３Ｄ培養で筋芽細胞に提示されるニッチのこれらの差を説明し得る細胞外分子に関する本発明者らのＲＮＡｓｅｑデータセットを評価した。分析後、筋芽細胞と比較して、サテライト細胞について濃縮されたプロテオグリカンのコアグループが出現した（図３Ａ）。３Ｄ培養後、これらのプロテオグリカンマーカーについて、ｎＧＦＰ＋細胞は高度に濃縮されている（図３Ｂ）。タンパク質レベルでこれらのプロテオグリカンの存在をさらに確認するために、本発明者らは、スピン培地で２０日間培養したかまたはスピン培地で１０日間培養し、続いて無血清分化培地で１０日間培養した骨格筋オルガノイドを切片化および染色した（図３Ｃ）。無血清培地における分化後、本発明者らは、ＢｇｎおよびＴｇｆｂｒＩＩＩの存在の増加を観察した（図３Ｄ）。本発明者らのデータは、３Ｄ培養がインビボにおけるサテライト細胞ニッチにより正確に似ているので、転写プロファイルでサテライト細胞に似た細胞を生じさせ、サテライト細胞ニッチの確立に重要なプロテオグリカンを分泌することを示唆している。
【０１７２】
材料および方法
培地
筋芽細胞培地−ハムＦ１０（Ｗｉｓｅｎｔ）、２０％熱不活化ウシ胎仔血清、５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１７３】
スピン培地−ＤＭＥＭ：Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２０％熱不活化ウシ胎仔血清、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０１７４】
分化培地−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。
【０１７５】
細胞株
複数のマウス系統およびヒト株（Ｂｌ／６、ＭｙｏＤｉＣｒｅ、Ｐａｘ７ｎＧＦＰ、Ｐａｘ７ＣｒｅＲＯＳＡＴｄｔ、Ｐａｘ７ＣｒｅＲＯＳＡＬｕｃを含む）ならびにＧｉｂｃｏおよびＣｏｏｋのヒト株を使用して、サテライト細胞を生成するための方法を行った。
【０１７６】
筋芽細胞の拡大増殖
複数のマウス系統由来の筋芽細胞を後肢骨格筋から単離し、筋芽細胞培地中のコラーゲンコーティングディッシュ上で培養した。トリプシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、筋芽細胞株を継代した。１０ｃｍ培養ディッシュ上で筋芽細胞株を拡大増殖して、１０個のプレートを得た。続いて、細胞を継代し、１０個の１５ｃｍプレートに播種し、それらが約８０コンフルエンスに達するまで培養してから、スピナーフラスコに播種した。
【０１７７】
３Ｄスフィア形成条件
筋芽細胞を、細胞１００万個／ｍｌの密度で１２５ｍｌスピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種する。フラスコの回転速度を５５ｒｐｍに設定する。培地の半分を除去し、それを新鮮培地と交換することにより、培養を２日ごとに供給する。
【０１７８】
分化条件
スピン培養（スピン培地）中の筋芽細胞は、分化した細胞および増殖性細胞から構成されるミオスフィアまたは骨格筋オルガノイドを形成した。無血清条件（分化培地）における培養後、増殖性筋原細胞は静止し、サテライト細胞状態に戻る。骨格筋オルガノイドをスピン培地で２０日間成長させる。分化を１０日間行う。
【０１７９】
【化１】
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【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−Ｂ】
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【図３Ｃ−Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−Ｃ】
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【図６Ｄ−Ｇ】
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【図７Ａ−Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【国際調査報告】
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