(57)【要約】  本発明は、検出アッセイによる標的分子の検出および発生した検出可能なシグナルの増幅のための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、触媒核酸酵素を用いて、標的分子（例えば、核酸およびタンパク質）の存在を示すシグナルを発生させ、かつ／または増幅する方法ならびにその方法に使用する組成物に関する。【選択図】図１３
2020516294.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的の有無を判定する方法であって、
反応混合物を準備することであって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、
前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能であり、前記ＰＡおよび前記ＰＢが透過することができず、前記ＰＡおよび／または前記ＰＢが、前記反応混合物中で可動性である、選択的透過バリアと、
（ｉｉｉ）２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドまたは
（ｉｖ）前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｉ）前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記オリゴヌクレオチド（１つまたは複数）と前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＡと前記ＰＢとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記２つのオリゴヌクレオチドがそれぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、少なくとも一方がさらに前記標的とハイブリダイズし、それにより前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記触媒酵素Ｄと前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＡと前記ＰＢとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが前記核酸二本鎖の前記切断部位に結合して切断し、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが前記透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、前記ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離した前記触媒核酸Ｂが前記透過性バリアを通過し、第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、前記第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の標的の存在を示す、
方法。
【請求項２】
前記触媒核酸Ａが触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することができず、かつ／または
前記第二のポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することができない、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記触媒核酸Ｃが、前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂを切断することができない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応混合物ポリヌクレオチド中で可動性である前記ＰＡおよび／または前記ＰＢのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記触媒核酸基質Ａの切断により、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
前記触媒核酸基質Ｂの切断により、前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になる、
請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記触媒核酸Ａと前記触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）前記触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）前記触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法であって、
前記２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な前記触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドを準備し、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記触媒核酸Ｃが、前記標的と結合することが可能なアプタマーを含み、
前記方法が、前記試料と、前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤とを接触させ、それにより触媒核酸Ｃを不活性にすることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的が前記アプタマーと結合して前記阻害剤と置き換わり、前記触媒核酸Ｃを活性にし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａの切断を促進する、
方法。
【請求項１２】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドであり、
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれ前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の方法であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記方法が、前記試料と、前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよび前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にする前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【請求項１５】
前記標的がポリヌクレオチドであり、
前記触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記触媒核酸Ａが前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａから遊離することおよび／または前記触媒核酸Ｂが前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂから遊離することにより、フルオロフォアが消光剤から分離され、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルが発生する、
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出が、
遊離した前記触媒核酸Ａおよび／または遊離した前記触媒核酸Ｂを前記反応混合物から単離することと、
単離した前記触媒核酸（１つまたは複数）を前記触媒核酸による前記触媒核酸基質の切断に適した条件下で、触媒核酸基質Ａおよび／または触媒核酸基質Ｂを含む第二の反応混合物に加えることと、
前記触媒核酸による前記触媒核酸基質の切断を検出することと
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出が、遊離した前記触媒核酸Ａおよび／または遊離した前記触媒核酸Ｂをリアルタイムで定量化することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満の前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、かつ／または
５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満の前記ＰＢポリヌクレオチドを切断して、
前記標的の検出を促進することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
試料中の標的の有無を判定する方法であって、
（ａ）反応混合物を準備することであって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能な選択的透過バリアであって、前記ＰＡおよび前記ＰＢが、前記選択的透過バリアを透過することができず、前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記ＰＣが、前記反応混合物中で可動性である選択的透過バリアと、
（ｉｖ）２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２であって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２、または
（ｖ）前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄ
のうちのいずれか１つと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｂ）（ｉ）前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２と前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＢと前記ＰＡとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの基質アームが、ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が、前記標的とハイブリダイズして前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）前記触媒酵素Ｄと前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＢと前記ＰＡとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが前記核酸二本鎖の前記切断部位に結合して切断し、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが、前記透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、前記ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＢポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離した前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が前記透過性バリアを通過し、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれの前記センサーアームが前記会合促進オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれの前記基質アームが第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、それにより触媒核酸Ｂを形成し、それが前記第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の前記標的の存在を示す、
方法。
【請求項２１】
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによって切断可能な触媒核酸基質Ｂとを含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが、前記ＰＣポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を遊離させ、
ＰＣポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の前記標的の存在を示す、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
各ＰＣポリヌクレオチドがパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と触媒核酸基質Ａとを含み、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの前記基質アームが、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が前記標的とハイブリダイズして前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＣポリヌクレオチドを切断し、それにより、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＣポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記ＰＣポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが、前記核酸二本鎖と前記切断部位に結合して切断し、それにより、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記反応混合物中で可動性である前記ＰＡポリヌクレオチド、前記ＰＢポリヌクレオチドおよび／また前記ＰＣポリヌクレオチドのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記触媒核酸基質Ａの切断により、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
前記触媒核酸基質Ｂの切断により、前記ＰＢポリヌクレオチドから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になる、
請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記方法が、前記試料と、前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよび前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にする前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【請求項２９】
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれ前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記反応混合物が、前記反応混合物中で可動性である、前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、
前記触媒核酸Ｂおよび／または前記触媒核酸Ｃが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して、前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させる、
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
試料中の標的を検出する組成物であって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、
前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
前記ＰＡと前記ＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリアと
を含む、組成物。
【請求項３２】
組成物であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能であり、前記ＰＡおよび前記ＰＢが通過することができない選択的透過バリアと
を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームおよび前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームと前記触媒核酸基質Ａとのハイブリダイゼーションならびに前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームと前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームと前記会合促進因子とのハイブリダイゼーションにより、前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｂを形成する、
組成物。
【請求項３３】
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによる切断が可能な前記触媒核酸基質Ｂとを含むか、または
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、前記触媒核酸基質Ａとを含む、
請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記ＰＡおよび／または前記ＰＢのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３５】
いずれかの前記ＰＣが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項３２または３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することができず、かつ／または
前記第二のポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することができない、
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つまたは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄをさらに含み、
前記ＰＡポリヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記標的と配列相補性を共有しているため、前記標的とハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成することが可能であり、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ内に存在しない、
請求項３１〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記標的がポリヌクレオチドであり、
前記触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項３８に記載の組成物であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記触媒核酸Ｃが、前記標的と結合することが可能なアプタマー部分を含み、
前記組成物が、前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤をさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示す、
組成物。
前記ＰＡと前記ＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリア。
【請求項４３】
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、それぞれ前記標的のポリヌクレオチドおよび前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ基質とハイブリダイズし、それにより、自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することができる、
請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項３９に記載の組成物であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記組成物が、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがそれぞれハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅの自己会合を促進することができる、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドをさらに含み、
前記組成物が、前記アプタマーとハイブリダイズし、それにより前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にすることができる阻害剤分子をさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にすることができる、
組成物。
【請求項４５】
前記触媒核酸Ｃおよび／または前記触媒核酸Ｂによる前記ＰＡポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ａをさらに含む、請求項３１〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記触媒核酸Ａによる前記ＰＢポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ｂをさらに含む、請求項３１〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項３１〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、請求項３１〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記触媒核酸Ａと前記触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、請求項３１〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
（ｉ）前記触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）前記触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、
請求項３１〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＰＡおよび／または前記ＰＢおよび／または前記ＰＣが、前記組成物中で可動性である、請求項３１〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＣポリヌクレオチドが、それぞれフルオロフォアと消光剤とを含む、請求項３１〜５１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物中で可動性である前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、請求項３１〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物中で可動性である前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、前記触媒核酸Ｃが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、請求項３８または３９に記載の組成物。
【請求項５５】
ポリヌクレオチドであって、
触媒核酸またはその成分と、
触媒核酸基質と、
前記ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐことが可能な
（ｉ）結合成分、
（ｉｉ）二次構造をもたらす自己相補性領域、
（ｉｉｉ）荷電部分
のうちのいずれか１つまたは複数のものと
を含み、
前記触媒核酸が、前記触媒核酸基質を触媒的に修飾することが不可能である、
ポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記触媒核酸がＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項５５または５６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５８】
前記ＤＮＡｚｙｍｅが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅまたは８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項５７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５９】
前記成分がＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムオリゴヌクレオチド成分である、請求項５５または５６に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検出アッセイによる標的分子の検出および発生した検出可能なシグナルの増幅のための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、触媒核酸酵素を用いて、標的分子（例えば、核酸およびタンパク質）の存在を示すシグナルを発生させ、かつ／または増幅する方法ならびにその方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料中の標的核酸またはその他の分子を検出するのに現在用いることができるアッセイは多数ある。ほとんどのアッセイがタンパク質酵素の使用に依存するものであるが、以下に記載するように、核酸の修飾を触媒する核酸酵素を利用するものも少数存在する。
【０００３】
触媒核酸酵素
触媒核酸酵素とは、特異的基質を修飾することが可能な非タンパク質酵素のことである。触媒核酸酵素には、ＤＮＡ分子（当該技術分野ではＤＮＡｚｙｍｅ、デオキシリボザイムまたはＤＮＡ酵素としても知られる）、ＲＮＡ分子（当該技術分野ではリボザイムとしても知られる）ならびに複数のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子からなる多成分核酸酵素（当該技術分野ではＭＮＡｚｙｍｅまたはＰｌｅｘＺｙｍｅとしても知られる）が含まれる。触媒核酸酵素は、例えば切断または連結によって、特異的核酸基質配列を修飾することができる。ある特有のクラスの触媒核酸酵素（当該技術分野では西洋ワサビペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡｚｙｍｅとして知られる）は、特異的化学基質を、例えば色を変化させる、または蛍光シグナルもしくは化学発光シグナルを放出することができる、その酸化産物に変換するペルオキシダーゼ反応を触媒することができる。
【０００４】
ＲＮＡ基質、ＤＮＡ基質および／またはキメラＤＮＡ／ＲＮＡ基質を切断または連結することができるＤＮＡｚｙｍｅおよびリボザイムは一般に、最小限の配列条件を満たす標的核酸基質のみを修飾することができる。例えば、基質は、酵素の基質結合アームに対して十分な塩基対相補性を示すものでなければならず、また、触媒修飾部位にある特異的配列も必要とする。触媒切断部位でのこのような配列条件の例としては、ＤＮＡｚｙｍｅ切断（１０−２３タイプ）に対するプリン：ピリミジン配列の条件、ジヌクレオチド接合部（８−１７タイプ）の条件およびハンマーヘッド型リボザイムに対する配列ウリジン：Ｘ（ＸはＧではなくＡ、ＣまたはＵであり得る）の条件が挙げられる。１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅは、核酸基質を特定のＲＮＡホスホジエステル結合の部分で切断することができるＤＮＡｚｙｍｅである。このＤＮＡｚｙｍｅは、２つの基質認識ドメイン（アーム）に隣接する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを有する。８：１７  ＤＮＡｚｙｍｅは、１０：２３  ＤＮＡｚｙｍｅとは触媒コア領域も切断部位選択性も異なるものである。８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅには厳密な基質配列条件が一切なく、４種類の５’ＮＧジヌクレオチド接合部（すなわち、５’ＧＧ、５’ＡＧ、５’ＣＧおよび５’ＵＧ）のいずれでも核酸基質を切断することができる。関連する接合部のグループ間には全体として反応性の序列は一つあり、概ね５’ＮＧ＞５’ＮＡ＞５’ＮＣ＞５’ＮＴという順序に従い、ＮＧ接合部が最も切断されやすく、ピリミジン−ピリミジン接合部が最も切断されにくい。８−１７  ＤＮＡｙｍｅは１４〜１５デオキシヌクレオチドの触媒ドメインを有し、分子内にある３塩基対の短いステム−トリループおよび４〜５一本鎖デオクスヌクレオチド（ｄｅｏｘｕｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）領域を特徴とする。
【０００５】
多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ、ＰｌｅｘＺｙｍｅｓとしても知られる）はまた別のカテゴリーの触媒核酸酵素である。これらの酵素は会合および触媒作用に会合促進因子（例えば、標的核酸）を必要とする。ＭＮＡｚｙｍｅは、１つまたは複数の会合促進因子の存在下で自己会合し、基質を修飾することができる触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅを形成する、複数の部分酵素、つまりパートザイムからなる。パートザイムは、会合促進因子（標的核酸など）と結合するセンサーアーム；基質と結合する基質アームおよび複数のパートザイム成分が会合すると組み合わさって完全な触媒コアになる部分的触媒コア配列を含む、複数のドメインを有する。ＭＮＡｚｙｍｅは、例えば様々な標的核酸配列を含めた広範囲にわたる会合促進因子を認識するよう設計することができる。会合促進因子の存在下では、パートザイム成分から触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅが組み立てられ、次いで基質と結合してこれを触媒的に修飾し出力シグナルを発生することができる。会合促進因子は、生体試料または環境試料中に存在する標的核酸であり得る。このような場合、ＭＮＡｚｙｍｅの触媒活性が標的存在の指標となる。核酸基質を切断することができるＭＮＡｚｙｍｅがいくつか報告されており、核酸基質を連結することができる別のＭＮＡｚｙｍｅも当該技術分野で公知である（例えば、国際公開第２００７／０４１７７４号、同第２００８／０４００９５号、同第２００８／１２２０８４号ならびに関連する米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号、同第２０１０−０１３６５３６号および同第２０１１−０１４３３３８号を参照されたい）。
【０００６】
アプタザイムとは、核酸酵素をアロステリックに調節するアプタマードメインと連結されているため、その活性が、アプタマードメインと結合することができる標的分析物／リガンドの存在に依存する、特定のタイプの触媒核酸（ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイムまたはＭＮＡｚｙｍｅ）のことである。これまで、標的分析物の不在下ではアプタザイム内にあるアプタマーおよび触媒核酸ドメインの一部分と結合することによりアプタザイムの活性を阻害するため、相補的な調節オリゴヌクレオチドが用いられてきた。アプタザイムの触媒活性の阻害は、標的リガンドがアプタマー部分と結合し、それにより調節オリゴヌクレオチドの除去を促進することによる可逆的なものであった。
【０００７】
シグナル増幅技術
標的検出感度を増大させるため、標的またはシグナルを増幅する戦略が用いられてきた。標的の増幅を用いる既存の方法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、鎖侵入ベースの増幅（ＳＩＢＡ）、転写産物介在増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製法（３ＳＲ）または核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。増幅を鎖置換に依存する方法、例えばＳＤＡ、ＲＣＡおよびＬＡＭＰは、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用する必要がある。ニッキングエンドヌクレアーゼを含めたヌクレアーゼを用いるシグナル増幅カスケードも記載されている（例えば、ＮＥＳＡ）。
【０００８】
既存のシグナル増幅法には多数の制約があることは明らかである。例えば、いくつかの技術では、反応速度が最初に試料中に存在する標的ＤＮＡ分子の数による制約を受ける。このため、これらおよびその他の方法は、臨床応用に必要な速度および感度に欠けることが多い。別の方法には、標的の不在下で偽陽性シグナルが発生するという問題がある。このため、シグナル増幅を組み込んだ核酸配列およびその他の標的の検出および定量化の方法が現在も必要とされている。
【０００９】
触媒核酸を用いるシグナル増幅カスケードも記載されている。１つの例として、リボヌクレオチド接合部によって連結した２つの隣接するペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡｚｙｍｅからなるオリゴヌクレオチドを使用するものがある。このオリゴヌクレオチドの両端は、末端同士をハイブリダイズさせる短いリンカーＤＮＡを介して連結し、準環状構造を形成する。この構造が形成されることにより、ＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性が一時的に阻害される。標的とする会合促進分子の存在下で会合するＭＮＡｚｙｍｅは、ＤＮＡｚｙｍｅと直接ハイブリダイズし、その間のリボヌクレオチド接合部を切断する。ＤＮＡｚｙｍｅが含まれるオリゴヌクレオチドの切断によって、２つのＤＮＡｚｙｍｅが互いに分離し、短いリンカーＤＮＡからも分離して、ＤＮＡｚｙｍｅが活性化される。この戦略の制約として、シグナルの増幅が各ＭＮＡｚｙｍｅの切断事象で活性化される２つのＤＮＡｚｙｍｅに限られることに加え、これらのペルオキシダーゼ模倣ＤＮＡｚｙｍｅは核酸基質を修飾することができないため、これらのＤＮＡｚｙｍｅがほかのＤＮＡｚｙｍｅ分子を活性化させる機序が存在しないことが挙げられる。したがって、この戦略は、シグナルを指数関数的に増幅することが可能な環状フィードバックカスケードの最初の段階としては適していない。さらに、ＤＮＡｚｙｍｅ分子が準環状構造から遊離した後、最初の切断事象が起こるために必要なＭＮＡｚｙｍｅアームとＤＮＡｚｙｍｅとの間の相補性によってＤＮＡｚｙｍｅ分子が隔離され、反応の感度が制限される可能性もある。
【００１０】
ＤｏＣとして知られるまた別の方法では、一時的に不活性化したＤＮＡｚｙｍｅからなる準環状構造を用いる。ＤＮＡｚｙｍｅはブロッカーフラグメントとのハイブリダイゼーションにより不活性化されている。ＭＮＡｚｙｍｅによりブロッカーが切断されるとＤＮＡｚｙｍｅが活性化され、それによりシグナル増幅カスケードが開始される。ただし、ブロッカーの濃度をＤＮＡｚｙｍｅの濃度より高くする必要があり、それにより相当な割合のＭＮＡｚｙｍｅ切断が無効となることから、この方法には制約がある。さらに、これらの準環状構造は不安定であり、標的の不在下でカスケードを開始させる可能性がある。
【００１１】
固体／固定支持体に係留して固定化した触媒核酸酵素を用いるシグナル増幅戦略も記載されている。この方法で触媒核酸酵素、その個々の成分および／またはその基質を固定／不動支持体に係留する目的は、酵素をその基質から空間的に分離するのを促進し、それにより反応の効率および／または特異性を高めようとすることである。ただし、固定／不動固体支持体に係留した触媒核酸酵素、基質およびその他の成分に依存するシグナル増幅法は開発が困難であることが多く、多くの場合、固有の欠点により最適に至らないことが明らかにされている。例えば、（ｉ）効率的な反応を駆動するのに相当な濃度の触媒核酸酵素、基質およびその他の成分を係留する必要があることと、（ｉｉ）分子が密集し、他の反応成分の接近が立体障害によって阻害されないようこれらの成分の密度が高くなり過ぎないようにする必要があることとのバランスを取るのに大きな困難が伴う。これ以外の困難な点としては、（ｉｉｉ）核酸触媒ドメインの活性を阻害し得る望ましくないコンホメーション変化および／または表面相互作用の可能性、（ｉｖ）拡散制限を原因とする反応速度の低下ならびに／あるいは（ｖ）標的の不在下でのカスケード開始を防ぐため未結合の触媒核酸がすべて除去されるようにする必要があることが挙げられる。
【００１２】
標的分子を検出する改善されたアッセイの必要性が存在する。好ましくは、改善されたアッセイは、シグナル増幅の改善により感度の増大を促進し得るものである。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書に記載される本発明は、固定／不動支持体に係留した反応成分を用いるシグナル増幅アッセイに関連する先行技術の問題点の少なくとも一部を軽減するものである。本発明者らは、固定／固定化支持体に依存するアッセイに固有の欠点を伴わずに核酸酵素およびその成分（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムオリゴヌクレオチド成分）とそれらの基質との空間的分離を維持することができるシステムを考案した。したがって、本明細書に記載されるアッセイにより、固定／不動支持体に係留した反応成分を用いるシグナル増幅アッセイで求められてきた反応の効率および／または特異性を増強される。本発明のアッセイでは一般に、選択的透過膜を用いて核酸酵素および／またはその成分とその基質とを分離する。成分はアッセイ混合物中で可動性が維持されるため、固定／不動支持体に依存するアッセイより優れた様々な利点がもたらされる。酵素／酵素成分が、標的分子が存在する場合にのみ引き起こされる修飾（例えば、可動性支持成分の切断、電荷および／または大きさの変化など）を受けると、膜を透過することが可能になり、それによりその基質と接触して基質を修飾し、シグナルを発生させる。
【００１４】
より具体的には、本発明者らは、それぞれが触媒核酸基質成分と、触媒核酸成分（触媒核酸全体またはパートザイムオリゴヌクレオチドなどのその一部分）と、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドがアッセイに使用する透過膜を通過するのを防ぐ成分および／または特性とを含むｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドを用いる、迅速検出アッセイを考案した。ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、例えば平面状の表面に係留されているのではなく、溶液中で可動性である。これにより、特に限定されないが、触媒核酸とその基質の接近性が改善され、膜の反対側への拡散速度が増大して検出速度が速くなることを含めたいくつかの利点がもたらされる。ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸成分は、例えば、その標的基質の存在下での触媒活性を低下させ得る、または妨げ得るいかなるコンホメーション拘束（１つまたは複数）（例えば、ハイブリダイズした阻害剤分子／オリゴヌクレオチド）もない触媒的に活性な形態で存在する。触媒核酸成分を阻害されていない形態で用いることにより、コンホメーション拘束を受けた酵素の使用に伴う触媒活性の低下が回避される。本明細書に記載されるアッセイでは、標的分子の存在がｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの切断を誘発し、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドから触媒核酸成分を遊離させ、遊離した触媒核酸成分に膜を透過させる。遊離した触媒核酸成分が膜を通過すると、その基質を含む他のｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドを切断し、それにより他の触媒核酸成分を遊離させることができる。次に、これらが膜を透過して反対側に移動し、別のｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドを切断することができるなど。したがって、本発明のアッセイは、最初の標的認識事象に続いて触媒的に活性な核酸酵素および／またはそのパートザイムオリゴヌクレオチドなどの成分が膜を通って移動することに依存する。基質成分を含む残りの切断されたｓｕｂＺｙｍｅは膜の一方にとどまり、依然として膜を透過することができない。したがって、本明細書に記載されるアッセイは、核酸酵素基質が膜を通って移動することに依存するものでも、それを必要とするものでもない。むしろ、触媒的に活性な核酸および／またはｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの成分などのその成分の準備ならびにそれに続く標的認識事象後のそれらの解離および膜を通る移動に依存するものである。
【００１５】
本明細書に記載されるアッセイの標的認識事象では、標的を特異的に検出し、検出時にｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｌｅｏｔｉｄｅ）を切断する「開始」触媒核酸酵素を用いる。本発明者らは、本明細書に開示される方法で開始酵素を使用することにより、他の方法、例えば、触媒核酸の活性を促進するために触媒核酸から阻害成分（１つまたは複数）を除去するのに標的分子に依存する方法などと比較して検出アッセイの感度および／または特異性を増大させることができるのを観察した。
【００１６】
本発明のアッセイは、フィードバックループを組み込むことにより、存在する標的分子の数とは無関係にシグナルを増幅することを可能にし得る。単一の標的分子によってカスケードを開始させることが可能であり、このカスケードでは、開始ｓｕｂＺｙｍｅが開始酵素により標的依存性に切断される。これによりｓｕｂＺｙｍｅの触媒核酸成分が遊離し、自由に膜を透過する。遊離した触媒的に活性な核酸および／またはその成分が膜を通過すると、別のｓｕｂＺｙｍｅの成分として存在するその基質に接近し切断することができる。次に、この事象によって、切断されたｓｕｂＺｙｍｅから別の触媒的に活性な核酸またはその成分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）が遊離し、透過膜を通過し、同じく別のｓｕｂＺｙｍｅの成分であるその基質を切断することができる。したがって、このようにＳｕｂＺｙｍｅ切断事象を永続させることが可能であり、さらなる標的分子が存在することとは無関係にフィードバック増幅ループが確立される。これにより、例えば、発生するシグナルの量が標的分子の存在数による制約を受けやすい線形カスケードを上回る大きな利点がもたらされる。
【００１７】
したがって、本発明は、以下に挙げる実施形態１〜５９を少なくとも一部包含することにより、既存の標的分子検出および／またはシグナル増幅アッセイの少なくとも１つの明白な欠点に対処するものである。
【００１８】
実施形態１：試料中の標的の有無を判定する方法であって、
反応混合物を準備することであって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、
触媒核酸Ｂが、触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
ＰＡとＰＢとを物理的に分離することが可能であり、ＰＡおよびＰＢが透過することができず、ＰＡおよび／またはＰＢが、反応混合物中で可動性である、選択的透過バリアと、
（ｉ）２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドまたは
（ｉｉ）標的とＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｉ）ＰＡ、ＰＢおよびオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）と試料とを接触させ、選択的透過バリアを用いてＰＡとＰＢとを分離し、
試料中に標的が存在する場合、２つのオリゴヌクレオチドがそれぞれＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、少なくとも一方がさらに標的とハイブリダイズし、それにより触媒核酸Ｃを形成し、それがＰＡポリヌクレオチドを切断し、それによりＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）ＰＡ、ＰＢおよび触媒酵素Ｄと試料とを接触させ、選択的透過バリアを用いてＰＡとＰＢとを分離し、
試料中に標的が存在する場合、標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成し、
触媒酵素Ｄの切断部位が触媒核酸Ａ内に存在せず、
触媒酵素Ｄが核酸二本鎖の切断部位に結合して切断し、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した触媒核酸Ａが、透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それによりＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸Ｂが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離した触媒核酸Ｂが、透過性バリアを通過し、第二のＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより第二のＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、
ＰＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、試料中の標的の存在を示す、
方法。
【００１９】
実施形態２：触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することができず、かつ／または
第二のポリヌクレオチドの触媒核酸Ｂが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することができない、
実施形態１による方法。
【００２０】
実施形態３：触媒核酸Ｃが、ＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ｂを切断することができない、実施形態１または実施形態２による方法。
【００２１】
実施形態４：反応混合物ポリヌクレオチド中で可動性であるＰＡおよび／またはＰＢのいずれかが、ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、実施形態１〜３のいずれか１つによる方法。
【００２２】
実施形態５：結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、実施形態４による方法。
【００２３】
実施形態６：触媒核酸基質Ａの切断により、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａから結合成分または自己相補性領域が遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
触媒核酸基質Ｂの切断により、ＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸Ｂから結合成分または自己相補性領域が遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になる、
実施形態４または実施形態５による方法。
【００２４】
実施形態７：触媒核酸Ａおよび／または触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、実施形態１〜６のいずれか１つによる方法。
【００２５】
実施形態８：触媒核酸Ａおよび／または触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、実施形態１〜７のいずれか１つによる方法。
【００２６】
実施形態９：触媒核酸Ａと触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、実施形態１〜８のいずれか１つによる方法。
【００２７】
実施形態１０：（ｉ）触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、
実施形態１〜９のいずれか１つによる方法。
【００２８】
実施形態１１：実施形態１〜１０のいずれか１つによる方法であって、
２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドを準備し、
標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
触媒核酸Ｃが、標的と結合することが可能なアプタマーを含み、
この方法が、試料と、アプタマーとハイブリダイズする阻害剤とを接触させ、それにより触媒核酸Ｃを不活性にすることをさらに含み、
阻害剤が、アプタマー部分に対して標的より低い結合親和性を示し、
標的が試料中に存在する場合、標的がアプタマーと結合して阻害剤と置き換わり、触媒核酸Ｃを活性にし、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａの切断を促進する、
方法。
【００２９】
実施形態１２：触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
２つのオリゴヌクレオチドが、標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
実施形態１〜１１のいずれか１つによる方法。
【００３０】
実施形態１３：触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
２つのオリゴヌクレオチドが、標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドであり、
標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれポリヌクレオチドとハイブリダイズしてＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
実施形態１〜１０のいずれか１つによる方法。
【００３１】
実施形態１４：実施形態１２による方法であって、
標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
この方法が、試料と、２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよびＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にするアプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
阻害剤が、アプタマー部分に対して標的より低い結合親和性を示し、
標的が、アプタマー部分とハイブリダイズして阻害剤を除去し、ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【００３２】
実施形態１５：標的がポリヌクレオチドであり、
触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
実施形態１〜１０のいずれか１つによる方法。
【００３３】
実施形態１６：触媒核酸ＡがＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａから遊離することおよび／または触媒核酸ＢがＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ｂから遊離することにより、フルオロフォアが消光剤から分離され、それにより、標的の検出を促進するシグナルが発生する、
実施形態１〜１５のいずれか１つによる方法。
【００３４】
実施形態１７：検出が、
遊離した触媒核酸Ａおよび／または遊離した触媒核酸Ｂを反応混合物から単離することと、
単離した触媒核酸（１つまたは複数）を触媒核酸による触媒核酸基質の切断に適した条件下で、触媒核酸基質Ａおよび／または触媒核酸基質Ｂを含む第二の反応混合物に加えることと、
触媒核酸による触媒核酸基質の切断を検出することと
を含む、実施形態１〜１６のいずれか１つによる方法。
【００３５】
実施形態１８：検出が、遊離した触媒核酸Ａおよび／または遊離した触媒核酸Ｂをリアルタイムで定量化することを含む、実施形態１〜１７のいずれか１つによる方法。
【００３６】
実施形態１９：５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満のＰＡポリヌクレオチドを切断し、かつ／または
５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満のＰＢポリヌクレオチドを切断して、
標的の検出を促進することを含む、実施形態１〜１８のいずれか１つによる方法。
【００３７】
実施形態２０：試料中の標的の有無を判定する方法であって、
（ａ）反応混合物を準備することであって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）ＰＡとＰＢとを物理的に分離することが可能な選択的透過バリアであって、ＰＡおよびＰＢが、選択的透過バリアを透過することができず、ＰＡ、ＰＢおよびＰＣが、反応混合物中で可動性である選択的透過バリアと、
（ｉｖ）２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２であって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２、または
（ｖ）標的とＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄ
のうちのいずれか１つと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｂ）（ｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２と試料とを接触させ、選択的透過バリアを用いてＰＢとＰＡとを分離し、
試料中に標的が存在する場合、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの基質アームが、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が、標的とハイブリダイズして触媒核酸Ｃを形成し、それがＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）触媒酵素Ｄと試料とを接触させ、選択的透過バリアを用いてＰＢとＰＡとを分離し、
試料中に標的が存在する場合、標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成し、
触媒酵素Ｄの切断部位が触媒核酸Ａ内に存在せず、
触媒酵素Ｄが核酸二本鎖の切断部位に結合して切断し、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した触媒核酸Ａが、透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それによりＰＢポリヌクレオチドのパートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離したパートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が透過性バリアを通過し、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれのセンサーアームが会合促進オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれの基質アームが第二のＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、それにより触媒核酸Ｂを形成し、それが第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより第二のＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａが遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、
ＰＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、試料中の標的の存在を示す、
方法。
【００３８】
実施形態２１：各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによって切断可能な触媒核酸基質Ｂとを含み、
遊離した触媒核酸Ａが、ＰＣポリヌクレオチドを切断し、それによりＰＣポリヌクレオチドのパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を遊離させ、
ＰＣポリヌクレオチドの切断の検出が、試料中の標的の存在を示す、
実施形態２０による方法。
【００３９】
実施形態２２：各ＰＣポリヌクレオチドがパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と触媒核酸基質Ａとを含み、
試料中に標的が存在する場合、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの基質アームが、ＰＣポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が、標的とハイブリダイズして触媒核酸Ｃを形成し、それがＰＣポリヌクレオチドを切断し、それにより、ＰＣポリヌクレオチドのパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
実施形態２０による方法。
【００４０】
実施形態２３：試料中に標的が存在する場合、標的がＰＣポリヌクレオチドとハイブリダイズして、触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成し、
触媒酵素Ｄの切断部位が、ＰＣポリヌクレオチドの触媒核酸Ａ内に存在せず、
触媒酵素Ｄが、核酸二本鎖の切断部位に結合して切断し、それにより、ＰＣポリヌクレオチドのパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
実施形態２０による方法。
【００４１】
実施形態２４：反応混合物中で可動性であるＰＡポリヌクレオチド、ＰＢポリヌクレオチドおよび／またはＰＣポリヌクレオチドのいずれかが、ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、実施形態２０〜２２のいずれか１つによる方法。
【００４２】
実施形態２５：結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、実施形態２４による方法。
【００４３】
実施形態２６：触媒核酸基質Ａの切断により、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａから結合成分または自己相補性領域が遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
触媒核酸基質Ｂの切断により、ＰＢポリヌクレオチドから結合成分または自己相補性領域が遊離し、その結果、透過性バリアを通過することが可能になる、
実施形態２４または実施形態２５による方法。
【００４４】
実施形態２７：触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
２つのオリゴヌクレオチドが、標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
実施形態２０〜２６のいずれか１つによる方法。
【００４５】
実施形態２８：実施形態２７による方法であって、
標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
この方法が、試料と、２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよびＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にするアプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
阻害剤が、アプタマー部分に対して標的より低い結合親和性を示し、
標的が、アプタマー部分とハイブリダイズして阻害剤を除去し、ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【００４６】
実施形態２９：標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれポリヌクレオチドとハイブリダイズしてＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
実施形態２７による方法。
【００４７】
実施形態３０：反応混合物が、反応混合物中で可動性である触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、
触媒核酸Ｂおよび／または触媒核酸Ｃが、触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断してフルオロフォアを消光剤から分離し、それにより、標的の検出を促進するシグナルを発生させる、
実施形態１〜２９のいずれか１つによる方法。
【００４８】
実施形態３１：試料中の標的を検出する組成物であって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、
触媒核酸Ｂが、触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
ＰＡとＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリアと
を含む、組成物。
【００４９】
実施形態３２：組成物であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）ＰＡとＰＢとを物理的に分離することが可能であり、ＰＡおよびＰＢが通過することができない選択的透過バリアと
を含み、
パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームと触媒核酸基質ＡとのハイブリダイゼーションならびにパートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームと会合促進因子とのハイブリダイゼーションにより、触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｂが形成される、
組成物。
【００５０】
実施形態３３：各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによる切断が可能な触媒核酸基質Ｂとを含むか、または
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸基質Ａとを含む、
実施形態３２による組成物。
【００５１】
実施形態３４：ＰＡおよび／またはＰＢのいずれかが、ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、実施形態３１による組成物。
【００５２】
実施形態３５：いずれかのＰＣが、ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、実施形態３２または実施形態３３による組成物。
【００５３】
実施形態３６：結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、実施形態３４または実施形態３５による組成物。
【００５４】
実施形態３７：触媒核酸Ａが、触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することができず、かつ／または
第二のポリヌクレオチドの触媒核酸Ｂが、触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することができない、
実施形態３１〜３６のいずれか１つによる組成物。
【００５５】
実施形態３８：それぞれＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、実施形態３１〜３７のいずれか１つによる組成物。
【００５６】
実施形態３９：触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
２つのオリゴヌクレオチドが、標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
実施形態３８による組成物。
【００５７】
実施形態４０：標的とＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つまたは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄをさらに含み、
ＰＡポリヌクレオチドの少なくとも一部分が、標的と配列相補性を共有しているため、標的とハイブリダイズして、触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成することが可能であり、
触媒酵素Ｄの切断部位が、ＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａ内に存在しない、
実施形態３１〜３６のいずれか１つによる組成物。
【００５８】
実施形態４１：標的がポリヌクレオチドであり、
触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
実施形態４０による組成物。
【００５９】
実施形態４２：実施形態３８による組成物であって、
標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
触媒核酸Ｃが、標的と結合することが可能なアプタマー部分を含み、
組成物が、アプタマーとハイブリダイズする阻害剤をさらに含み、
阻害剤が、アプタマー部分に対して標的より低い結合親和性を有する、
組成物。
ＰＡとＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリア。
【００６０】
実施形態４３：標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、それぞれ標的のポリヌクレオチドおよびＰＡポリヌクレオチドの触媒核酸Ａ基質とハイブリダイズし、それにより、自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することができる、
実施形態３８または実施形態３９による組成物。
【００６１】
実施形態４４：実施形態３９による組成物であって、
標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
組成物が、標的の存在下でのみ自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがそれぞれハイブリダイズしてＭＮＡｚｙｍｅの自己会合を促進することができる、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドをさらに含み、
組成物が、アプタマーとハイブリダイズし、それによりＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にすることができる阻害剤分子をさらに含み、
阻害剤が、アプタマー部分に対して標的より低い結合親和性を示し、
標的が、アプタマー部分とハイブリダイズして阻害剤を除去し、ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にすることができる、
組成物。
【００６２】
実施形態４５：触媒核酸Ｃおよび／または触媒核酸ＢによるＰＡポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ａをさらに含む、実施形態３１〜４４のいずれか１つによる組成物。
【００６３】
実施形態４６：触媒核酸ＡによるＰＢポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ｂをさらに含む、実施形態３１〜４５のいずれか１つによる組成物。
【００６４】
実施形態４７：触媒核酸Ａおよび／または触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、実施形態３１〜４６のいずれか１つによる組成物。
【００６５】
実施形態４８：触媒核酸Ａおよび／または触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、実施形態３１〜４７のいずれか１つによる組成物。
【００６６】
実施形態４９：触媒核酸Ａと触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、実施形態３１〜４８のいずれか１つによる組成物。
【００６７】
実施形態５０：（ｉ）触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、実施形態３１〜４９のいずれか１つによる組成物。
【００６８】
実施形態５１：ＰＡおよび／またはＰＢおよび／またはＰＣが、組成物中で可動性である、実施形態３１〜５０のいずれか１つによる組成物。
【００６９】
実施形態５２：ＰＡポリヌクレオチドおよび／またはＰＢポリヌクレオチドおよび／またはＰＣポリヌクレオチドが、それぞれフルオロフォアと消光剤とを含む、実施形態３１〜５１のいずれか１つによる組成物。
【００７０】
実施形態５３：組成物中で可動性である触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、触媒核酸Ｂが、触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断してフルオロフォアを消光剤から分離し、それにより、標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、実施形態３１〜５２のいずれか１つによる組成物。
【００７１】
実施形態５４：組成物中で可動性である触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、触媒核酸Ｃが、触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断してフルオロフォアを消光剤から分離し、それにより、標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、実施形態３８または実施形態３９による組成物。
【００７２】
実施形態５５：ポリヌクレオチドであって、
触媒核酸またはその成分と、
触媒核酸基質と、
ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐことが可能な
（ｉ）結合成分、
（ｉｉ）二次構造をもたらす自己相補性領域、
（ｉｉｉ）荷電部分
のうちのいずれか１つまたは複数のものと
を含み、
触媒核酸が、触媒核酸基質を触媒的に修飾することが不可能である、
ポリヌクレオチド。
【００７３】
実施形態５６：結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、実施形態５５によるポリヌクレオチド。
【００７４】
実施形態５７：触媒核酸がＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、実施形態５５または実施形態５６によるポリヌクレオチド。
【００７５】
実施形態５８：ＤＮＡｚｙｍｅが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅまたは８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅである、実施形態５７によるポリヌクレオチド。
【００７６】
実施形態５９：成分が、ＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムオリゴヌクレオチド成分である、実施形態５５または実施形態５６によるポリヌクレオチド。
【００７７】
これより、添付の図面を参照しながら、本発明の好ましい実施形態を単なる例として説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】本発明の実施形態による２種類の例示的ＳｕｂＺｙｍｅを示す図である。この図では、ＳｕｂＺｙｍｅは、（図１Ａに示されるように）触媒核酸分子または（図１Ｂに示されるように）触媒核酸分子の成分である「Ｃａｔ」と連結した酵素の基質である「Ｓｕｂ」を含む。例として、図１ＡのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａは、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであるＣａｔ  Ａと、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅによって切断可能なＳｕｂ  Ａとを含むものであり得る。あるいは、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａは、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであるＣａｔ  Ａと、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅによって切断可能なＳｕｂ  Ａとを含むものであり得る。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂとして示される（図１Ｂ）他の実施形態では、Ｓｕｂｚｙｍｅは、触媒核酸酵素によって切断可能なＳｕｂ  Ｂと連結した多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）のパートザイムＢ１成分であるＣａｔ  Ｂ１を含むものであり得る。
【図２】本発明の実施形態による交差触媒作用が可能な例示的ＳｕｂＺｙｍｅ対を示す図である。ＳｕｂＺｙｍｅはともに、ｓｕｂＺｙｍｅを操作するのに使用することができる任意選択の磁気ビーズ（ＭＢ）に付着したものとして示されている。例として、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ）はＣａｔ  ＡとＳｕｂ  Ａとを含み、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ）はＣａｔ  ＢとＳｕｂ  Ｂとを含む。例として、ＰＡは、Ｃａｔ  Ｂ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）によって切断可能なｓｕｂ  Ａと連結したＣａｔ  Ａ（１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）を含み、ＰＢは、Ｃａｔ  Ａ（１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）によって切断可能なｓｕｂ  Ｂと連結したＣａｔ  Ｂ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）を含む。これとは逆に、ＰＡは、Ｃａｔ  Ｂ（１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）によって切断可能な基質Ａと連結したＣａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）を含み、ＰＢは、Ｃａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）によって切断可能な基質Ｂと連結したＣａｔ  Ｂ（１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）を含む。さらに、Ｓｕｂ  Ａおよび／またはＳｕｂ  Ｂは、ＭＮＡｚｙｍｅ、例えば開始ＭＮＡｚｙｍｅによって切断可能なものであり得る。
【図３】本明細書で「Ｔバッグ」とも呼ばれる、本発明の実施形態による透過性バリアの例示的な構成要素および構築を示す図である。Ｔバッグは、例えばろ紙、粘着テープ、接着剤および合成オリゴヌクレオチドを含めた安価な構成要素から構築することができる。図３Ａは、図のようにろ紙に両面粘着テープを貼り付けて作製する「ウェル」を示している。次いで、磁気ビーズなどのかさ高い粒子に付着させたオリゴヌクレオチド（ＳｕｂＺｙｍｅ）をウェル内にスポットし、乾燥させることができる。２つ目のろ紙の層を上に置き、Ｔバッグをトリミングすることができる。図３Ｂは、両面粘着テープを粘着側が折り畳まれ非粘着性のライナーのみが露出するように二つ折りにすることによって作製するＴバッグを示している。「ウェル」は、図のように穴開けパンチを用いてろ紙片上にウェルを設けることにより作製することができる。次いで、磁気ビーズなどのかさ高い粒子に付着させたオリゴヌクレオチド（ＳｕｂＺｙｍｅ）をウェル内にスポットし、乾燥させることができる。２つ目のろ紙の層を上に置き、Ｔバッグをトリミングすることができる。
【図４】透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）およびＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的の検出後のシグナルを増幅する、本発明の実施形態による例示的スキームを示す図である。チューブには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ）、ＰＢ（Ｔバッグ内のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ）および選択した標的に対するパートザイムが入っている。標的の存在下では、パートザイムが整列しＣａｔ  Ｃ（ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成する。ＭＮＡｚｙｍｅがＰＡ内のＳｕｂ  Ａ（例えば、１０−２３基質）を切断してＣａｔ  Ａ（例えば、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）をＭＢから分離し、それによりＣａｔ  ＡがＴバッグの壁を通過することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断し、それによりＭＢからＣａｔ  Ｂ（例えば、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）を分離することができる。次にＣａｔ  Ｂが自由にＴバッグから溶液中に移動し、そこでＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、カスケードを開始させることができる。一定時間インキュベートした後、磁石を用いて未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断されたＭＢフラグメントを保持し、それにより、自由なＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  ＡおよびＣａｔ  Ｂ）を含んだ上清を標識されたＳｕｂ  Ａおよび／またはＳｕｂ  Ｂの入った別のチューブに移すことができる。ＤＮＡｚｙｍｅ切断によりフルオロフォアと消光剤が分離して発生する蛍光をリアルタイムでモニターすることができる。
【図５】ヒトＴＦＲＣ遺伝子に相同なオリゴヌクレオチド標的を漸増させた本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、ＴＦＲＣ標的（１ｐＭ、１００ｆＭ、１ｆＭおよび５００ａＭ）を含むか、または標的を含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。この実験では、１ｐＭおよび１００ｆＭの濃度が無標的オリゴヌクレオチドの不在下で発生したバックグラウンドシグナルを上回って容易に検出された。グラフは、Ｔバッグ内で１５分間（５Ａ）または２０分間（５Ｂ）インキュベートした後の蛍光基質切断のリアルタイムモニタリングを示している。１０分間のリアルタイムモニタリングの後、１００ｆＭの検出が明らかになった。これらの実験条件下では、標的濃度１ｆＭおよび５００ａＭではバックグラウンドを上回るシグナルは発生しなかった。
【図６】ＴＦＲＣに相同な１ｐＭの合成オリゴヌクレオチド標的の検出に成功することを実証する本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。これに対し、１ｎＭのオフターゲットオリゴ鋳型であるＢｌａ−ＫＰＣおよびＣＴ＿Ｃｄｓ２ではバックグラウンド（無標的）を上回るシグナルは得られなかった。プロットは、標的もしくはオフターゲットを含む、または標的を含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。
【図７】ベータ−ラクタマーゼ耐性をもたらすＯＸＡ遺伝子に対する１０ｐＭの合成オリゴ鋳型の検出に成功することを実証する本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、標的を含む、または標的を含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。
【図８】ヒトゲノムＤＮＡ内のヒトＴＦＲＣ遺伝子の検出に成功することを実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、標的を含む、または標的を含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。実験は１０％ヒト血清の存在下（８Ｂ）または不在下（８Ａ）で実施した。
【図９】ヒトゲノムＤＮＡ内のヒトＴＦＲＣ遺伝子の検出に成功することを実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。この実験では、ヒトＴＦＲＣ遺伝子を標的とする３種類のＭＮＡｚｙｍｅを用いて反応を開始させた。プロットは、ｇＤＮＡ標的を含む、またはｇＤＮＡ標的を含まない２０分間のＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。
【図１０】ヒトゲノムＤＮＡ内のヒトＴＦＲＣ遺伝子の検出に成功することを実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。この実験では、ヒトＴＦＲＣ遺伝子を標的とするＭＮＡｚｙｍｅを用いて反応を開始させた。プロットは、１６８，０００コピーもしくは２７０，０００コピーのＴＦＲＣ遺伝子と推定されるｇＤＮＡを含む、またはｇＤＮＡ標的を含まない２０分間のＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。
【図１１】２種類の代表的なＳｕｂＺｙｍｅを含む本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。実線は標的を含む反応であり、点線は標的を含まないものである。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ（１１ｃおよび１１ｄ）は８−１７触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸基質成分とを含む。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃ（１１ａおよび１１ｂ）は１０：２３触媒核酸成分と非相補的１０−２３触媒核酸基質成分とを含む。この結果から、８−１７触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸成分の混合物からなるＳｕｂＺｙｍｅの方が、１０−２３触媒核酸成分のみからなるＳｕｂＺｙｍｅより長期安定性が高いことがわかる。
【図１２】平面状のスライドガラス上に係留した本発明の実施形態による例示的ＳｕｂＺｙｍｅの結果を示す図である。この結果は、係留したＳｕｂＺｙｍｅ（混合物Ａ）が核酸基質を加水分解し蛍光を発生させることができたのに対し、係留したＳｕｂＺｙｍｅ（混合物Ｂ）による検出は明白ではなかったことを示している。
【図１３】本発明の実施形態による、ともに交差触媒作用が可能な２種類の例示的ＳｕｂＺｙｍｅ対を示す図である。ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）として表されるＳｕｂＺｙｍｅ対はともに、ＳｕｂＺｙｍｅを操作するのに使用することができる任意選択の磁気ビーズ（ＭＢ）に付着したものとして示されている。ＰＡおよびＰＢは任意選択で、５’末端または３’末端のいずれかにより磁気ビーズ（ＭＢ）に付着していてよい。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ（ＰＡ）は機能ドメイン、つまり、（ｉ）Ｃａｔ  Ａ（例えば、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ）、（ｉｉ）Ｓｕｂ  Ａ（例えば、１０：２３核酸酵素によって切断可能な基質Ａ）および任意選択で（ｉｉｉ）リンカー配列（図１３Ａ）または標的核酸に相補的でありエンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、例えば制限酵素（ＲＥ）／ニッキング酵素（ＮＥ）の認識部位の一方の鎖をさらに含む配列（図１３Ｂ）を含む。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ（ＰＢ）は機能ドメイン、つまり、（ｉ）Ｃａｔ  Ｂ（例えば、１０：２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）、（ｉｉ）Ｓｕｂ  Ｂ（例えば、８：１７  ＤＮＡｚｙｍｅ／Ｃａｔ  Ａによって切断可能な基質Ｂ）および任意選択で（ｉｉｉ）リンカー配列（図１３Ａおよび１３Ｂ）を含む。図１３Ａのスキームでは、標的核酸の存在によって、例えばＳｕｂＡを切断することが可能な１０：２３  ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（Ｃａｔ  Ｃ）が形成される。ＰＡ内のＳｕｂＡの切断によってＣａｔ  Ａが遊離し、次いで、これが選択的透過バリアを通過することが可能になり、ＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断してＣａｔ  Ｂを遊離させる。次にＣａｔ  Ｂが選択的透過バリアを通過することが可能になり、別のＰＡ内にある新たなＳｕｂ  Ａを切断し、さらに多くのＣａｔ  Ａを遊離させ、それにより交差触媒シグナル増幅カスケードを開始させる。図１３Ｂのスキームでは、標的核酸の存在がＰＡ内の標的特異的配列（ｉｉｉ）とハイブリダイズし、それにより、触媒酵素Ｄ／Ｃａｔ  Ｄ（例えば、ＲＥ／ＮＥ）の認識部位を形成する二本鎖の二本鎖領域が生じる。Ｃａｔ  ＤによるＰＡの切断によってＣａｔ  Ａが遊離することができ、次いで、Ｃａｔ  Ａが選択的透過バリアを通過するが可能になり、ＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断する。ＰＢの切断によってＣａｔ  Ｂが遊離し、次にこれが選択的透過バリアを通過することが可能になり、別のＰＡ内にあるＳｕｂ  Ａを切断してさらに多くのＣａｔ  Ａを遊離させ、それにより交差触媒シグナル増幅カスケードを開始させる。
【図１４】ＭＮＡｚｙｍｅの別の方法として制限酵素を用いてアッセイ開始の第一段階を実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。この戦略については図１３Ｂに示されている。プロットは、ニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ（＋／−４単位）およびｏｍｐＡ標的（＋／−２ｎＭ）を含むか、これを含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。この実験では、ニッキングエンドヌクレアーゼとｏｍｐＡ標的の両方の存在下でのみシグナルの増大が観察され、このことは、標的が誘導する表面結合ＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ａ）の遊離にはニッキングエンドヌクレアーゼとｏｍｐＡ標的がともに必要であることを示している。
【図１５】ビーズに係留したＳｕｂＺｙｍｅを封入し、それがＴバッグ透過性バリアの外側に限定される反応成分と相互作用できないよう空間的に閉じ込める機序として透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）を用いる、本発明の実施形態による例示的スキームを示す図である。チューブには、Ｔバッグの内側にあるＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ／ビーズ）が入っている。開始ＤＮＡｚｙｍｅ（ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）の不在下では、ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズは半透過性バリアによってＴバッグ内に封入されたままである。しかし、チューブに開始ＤＮＡｚｙｍｅ（ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）を加えると、ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズがＴバッグの壁を通って移動できるようになり、そこでＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズ内の基質Ｂを切断し、それによりＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂをビーズから分離することができる。次に、ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂが自由にＴバッグから溶液中に移動する。磁気ビーズを用いる場合、一定時間インキュベートした後、任意選択で磁石を用いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズおよび切断されたビーズフラグメントを保持することができる。標識された基質の入った別のチューブに移す自由なＤＮＡｚｙｍｅ（ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）を含有する上清。ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ切断によるフルオロフォアと消光剤の分離後に発生する蛍光をリアルタイムでモニターすることができる。
【図１６】（パートＡ〜Ｆ）様々なサイズの磁気ビーズに係留したＳｕｂＺｙｍｅを様々な孔径からなる膜でできたＴバッグの境界内に空間的に閉じ込める本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、開始ＤＮＡｚｙｍｅを含むか、これを含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングの結果を示している。この戦略については図１５に示されている。結果は、開始ＤＮＡｚｙｍｅの不在下ではシグナルがほとんどみられないことを示しており、ＳｕｂＺｙｍｅが直径が膜の孔径より大きい磁気ビーズに係留しているときはＴバッグ膜を透過することができないことがわかる。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルがみられ、このことから、開始ＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグ内に拡散し、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを切断し、表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させることが可能であることがわかる。また、遊離したＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグの外側に移動し、蛍光標識した基質分子を切断することが可能であることもわかる。様々な磁気ビーズ径（２．８μｍ、６μｍおよび８μｍ）および様々な孔径（０．８μｍおよび２．０μｍ）で同様の結果がみられる。パートＡ〜Ｆを参照されたい。
【図１７】ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ反応へのＰＥＳ膜／秒の添加がＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性に及ぼす影響を明らかにするためこれを試験した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、ＰＥＳ膜（＋／−膜）および／または  開始ＤＮＡｚｙｍｅ（＋／−２ｎＭ  Ｄｚ）を含むか、これを含まないＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。この実験では、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ反応へのＰＥＳ膜の添加によりＤＮＡｚｙｍｅの活性が増強されるように思われる。このことは、ＰＥＳ膜を含む反応の方が膜を含まない反応よりも蛍光の経時的増大が速いという形で観察された。
【図１８】（パートＡ〜Ｃ）ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢをポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）でできたＴバッグの境界内に空間的に閉じ込められる本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。さらに、３種類の異なる孔径のＰＥＳ膜を試験した。この戦略については図１５に示されている。プロットは、開始ＤＮＡｚｙｍｅ（２ｎＭ）を含むか、これを含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。結果は、開始ＤＮＡｚｙｍｅの不在下ではシグナルがほとんどみられないことを示しており、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢは孔径が０．６５μｍ（パートＡ）、０．８μｍ（パートＢ）および１．２μｍ（パートＣ）のＰＥＳ膜から外に移動することが不可能であることがわかる。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルがみられ、このことから、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを封入し、他の反応成分から物理的に分離するのにＰＥＳなどの代替膜を用いることが可能であることがわかる。
【図１９】クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同なオリゴヌクレオチド標的の漸増を実施した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、ｏｍｐＡ標的（１００ｆＭ、１０ｆＭおよび１ｆＭ）、オフターゲット（１ｎＭ）またはヒトゲノムＤＮＡ（約２×１０５の遺伝子コピー）を含むか、ＤＮＡを含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。この実験では、１００ｆＭ、１０ｆＭおよび１ｆＭの濃度が標的オリゴヌクレオチドの不在下で発生したバックグラウンドシグナルを上回って容易に検出された。これとは対照的に、ヒトゲノムＤＮＡならびに１ｎＭのオフターゲットオリゴ鋳型ＰＰＩＡおよびｐ２７３ではバックグラウンド（無ＤＮＡ対照）を上回るシグナルは発生しなかった。
【図２０】クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の全核酸（ＴＮＡ）試料中のクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子の検出に成功することを実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、標的を含むか、これを含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。
【図２１】クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同なオリゴヌクレオチド標的の１５分未満での迅速検出を実証した本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。プロットは、標的オリゴヌクレオチド（０ｐＭ、１ｐＭまたは５００ｐＭ）を含むか、これを含まない１２分間のＴバッグインキュベーション反応後の基質切断（３分間）のモニタリングを示している。
【図２２】透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）および２種類のＳｕｂＺｙｍｅにより標的検出後のシグナル増幅を促進する本発明の実施形態による例示的スキームを示す図である。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）内の触媒成分はＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ａ）であり；ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）内の触媒成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ１）であり；ＰＣ（Ｓｕｂｚｙｍｅ  Ｂ２）内の触媒成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ２）である。標的の存在下では、開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）が形成され、これがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、ＭＢからＣａｔ  Ａを遊離させて、Ｃａｔ  ＡがＴバッグ壁を通って移動することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断することができる。これによりＣａｔ  Ｂ１がＭＢから遊離し、Ｔバッグの外に移動することが可能になり、そこでＣａｔ  Ｂ２（ＰＣ）および会合促進因子（ＡＦ−Ｂ３）とハイブリダイズして活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができる。Ｃａｔ  ＢもＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、カスケードを継続することができる。インキュベーション後、磁石を用いて、ＳｕｂＺｙｍｅおよびフラグメントを依然としてＭＢに保持することができる。自由なＣａｔ  Ａ、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃを含有する上清を標識したＳｕｂ  Ａおよび／またはＳｕｂ  Ｂの入った別のチューブに移すことができる。ＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅによる基質切断後に発生する蛍光をモニターすることができる。
【図２３】透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）および３種類のＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的検出後のシグナルを増幅する本発明の実施形態による例示的スキームを示す図である。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）内の触媒成分はＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ａ）であり；ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）内の触媒成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ１）であり；ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ２）内の触媒成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ２）であり、ＰＡ、ＰＢおよびＰＣはビーズをコンジュゲートされている。反応は図２２に記載される通りに進行するが、ここでは、過剰なレベルの分離が実現され得るため、ＰＡおよびＰＣがＰＢから分離する。
【図２４】例示的ＳｕｂＺｙｍｅ対が交差触媒作用が可能なものである本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。この実験では、２つの異なる種類のＳｕｂＺｙｍｅが交差触媒作用が可能であることを示し、ＰＡは基質と連結したＤＮＡｚｙｍｅを含み、ＰＢは基質によりビーズと連結したパートザイムを含む。この戦略については図２２に示されている。プロットは、ｏｍｐＡ標的（２ｎＭ、２００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭ）を含むか、標的を含まないＴバッグインキュベーション反応後の基質切断のモニタリングを示している。この実験では、全濃度の標的が無標的オリゴヌクレオチドの不在下で発生したバックグラウンドシグナルを上回って容易に検出された。
【図２５】８−１７成分のみからなるＳｕｂＺｙｍｅを用いる交差触媒フィードバックカスケードを実証する本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。結果は、この方法により２ｎＭ、２００ｐＭおよび２０ｐＭの開始ＤＮＡｚｙｍｅを検出することが可能であることを示している。シグナルには無ＤＮＡｚｙｍｅ対照と十分な差がみられる。
【図２６】（パートＡおよびＢ）Ｔバッグアッセイに使用する代替的なかさ高い表面としてシリカビーズを用いる本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。この戦略については図１５に示されている。結果は、開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの不在下ではシグナルがほとんどみられないことを示しており、ＳｕｂＺｙｍｅがシリカビーズ（直径１μｍ）に係留しているときはＰＥＳ膜（２６Ａ）およびＰＥＳ膜（２６Ｂ）を通って拡散することができないことがわかる。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルがみられ、このことから、開始ＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグ内に拡散し、ＳｕｂＺｙｍｅｓ−ビーズを切断し、表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させることができることがわかる。したがって、この結果から、ビーズおよび膜については、ビーズが膜孔の直径より大きいものである限り、様々な材料からなるものであってよいことがわかる。
【図２７】透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）およびＳｕｂＺｙｍｅを用いて、標的検出後に単一のチューブ内でシグナルを増幅し、シグナルを検出する本発明の実施形態による例示的スキームを示す図である。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）内の成分はＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ａ）およびＳｕｂ  Ａであり；ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）内の成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ１）およびＳｕｂ  Ｂであり；ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ２）内の成分はパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ２）および任意選択でＳｕｂ  Ｂである。標的の存在下では、パートザイムＣ１およびＣ２から形成された開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）がＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してＭＢからＣａｔ  Ａを遊離させ、それによりＣａｔ  ＡがＴバッグの壁を通って移動することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断することができる。これによりＣａｔ  Ｂ１がＭＢが遊離してＴバッグの外に移動することが可能になり、そこでＣａｔ  Ｂ２（ＰＣ）および会合促進因子（ＡＦ−Ｂ３）とハイブリダイズし、活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができる。Ｃａｔ  ＢはＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、カスケードを継続することができる。Ｃａｔ  Ｂは標識されたＳｕｂ  Ａ−ＦＱも切断し、蛍光を発生させることができる。
【図２８】図２７に示されるＴバッグ法を用いて５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭおよび５０ｐＭの合成オリゴヌクレオチド標的の検出に成功することを示す、本発明の実施形態による例示的アッセイの結果を示す図である。これとは対照的に、ＭＮＡｚｙｍｅ対照反応ではバックグラウンド（無標的）を上回るシグナルは発生しなかった。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
（定義）
本明細書では、以下に記載する意味を有するものとする特定の用語および語句を使用する。
【００８０】
本願で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を表す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「ＭＮＡｚｙｍｅ」（ａｎ  ＭＮＡｚｙｍｅ）という用語は複数のＭＮＡｚｙｍｅを包含する。文脈上他の意味に解すべき場合または特にそうではないと記載する場合を除き、本明細書に単数の整数、段階または要素として記載される本発明の整数、段階または要素は、記載される整数、段階または要素の単数形および複数形をともに包含することは明らかである。
【００８１】
そうではないと記載される場合を除き、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「〜を有する」という用語は、「主として〜を含むが、必ずしもそれのみであるとは限らない」ことを意味する。さらに、「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語の変化形、例えば「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」および「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」などは、それに応じて意味が変化する。したがって、例えば標的分子Ａを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」試料は、標的分子Ａのみからなる場合もあれば、１つまたは複数の異なる種類（１つまたは複数）の標的分子（例えば、標的分子Ｂおよび／または標的分子Ｃ）を含む場合もある。
【００８２】
本明細書で使用される「標的」および「標的分子」という用語は、本明細書に記載される分子複合体によって検出することが可能である、特に限定されないが、核酸、タンパク質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、小分子有機化合物、全細胞および生体全体を含めた任意の分子を指す。例えば、標的は、ＭＮＡｚｙｍｅの会合をさせる会合促進因子としての役割を果たす核酸、またはアプタマーと結合して、アプタマーを含む触媒核酸（例えば、アプタＭＮＡｚｙｍｅまたはその他のアプタザイム）を活性化させることが可能な任意の分子であり得る。標的核酸としては、特に限定されないが、ＤＮＡポリヌセロチド（ｐｏｌｙｎｕｃｅｌｏｔｉｄｅ）およびＲＮＡポリヌクレオチドが挙げられる。
【００８３】
「触媒核酸」、「触媒核酸分子」、「触媒核酸酵素」および「核酸酵素」という用語は、本明細書では互換的に使用され、同じ意味を有する。これらの用語は、１つまたは複数の基質（例えば、核酸基質）の特異的認識および触媒的修飾が可能な任意の核酸またはその一部分を包含する。例えば、１つまたは複数の基質は核酸であり得、触媒的修飾は連結または切断であり得る。本明細書で使用される触媒核酸酵素には、ＤＮＡ分子またはＤＮＡ含有分子、ＲＮＡまたはＲＮＡ含有分子およびＤＮＡ−ＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ含有分子が含まれる。触媒核酸酵素の非限定的な例としては、ＤＮＡｚｙｍｅ（ＤＮＡ酵素およびデオキシリボザイムとしても知られる）、リボザイム（ＲＮＡ酵素およびＲＮＡザイムとしても知られる）および当該技術分野でＰｌｅｘＺｙｍｅとしても知られる多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）が挙げられる。
【００８４】
本明細書で使用される「ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド」または「ｓｕｂＺｙｍｅ」という用語は、触媒核酸またはその一部分である成分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）と、触媒核酸基質である成分とを含む、オリゴヌクレオチドを指す。ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸は、同じｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸基質成分を触媒的に修飾することができない。触媒核酸またはその一部分および触媒核酸基質は、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドに沿った途切れることのない配列であっても、あるいは、例えば介在ヌクレオチドおよび／または当該技術分野で使用可能な任意の適切なリンカーによって、分離されていてもよい。ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基および／またはリボヌクレオチド塩基ならびに／あるいはその類似体、誘導体、変異体、フラグメントまたは組み合わせを含み得る。
【００８５】
ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは任意選択で、非限定的な例として、（例えば、反応混合物からの）その分離または精製を補助する、１つまたは複数の追加の分子、特に限定されないが、ビーズ、微粒子および酵素を含めた分子を含み得る。ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの表面への付着を可能にする追加の官能基を含み得る。本発明のいくつかの実施形態では、非限定的な例として、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅと８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、または８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅと１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅの基質を含み得る。非限定的な例として、ＳｕｂＺｙｍｅは、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される触媒核酸を含み得る。本発明によるｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド／ｓｕｂＺｙｍｅは、触媒核酸の一部分、例えばパートザイムオリゴヌクレオチドなどを含み得る。触媒性触媒核酸の一部分は、それが由来する完全な核酸と比較して、部分的または完全な触媒作用が可能なものであり得る。あるいは、触媒核酸の一部分は、それが由来する親触媒核酸の１つまたは複数の他の部分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）と組み合わさるまで触媒作用が不可能なものであり得る。
【００８６】
ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは任意選択で、非限定的な例として検出を補助し得る、１つまたは複数の追加の分子を含み得る。例としては、特に限定されないが、蛍光検出のためのフルオロフォア部分および消光剤部分；ＳＰＲ検出および／または比色検出のための金粒子または銀粒子；電気化学検出および／またはｐＨ検出のための酵素ならびに発光検出のための酵素および官能基が挙げられる。
【００８７】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、互換的に使用され、同じ意味を有するものであり、特に限定されないが、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、その他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ロックト核酸、架橋化核酸、ペプチド核酸、その誘導体、そのアンプリコンまたはその任意の組合せを含めたデオキシリボヌクレオチド塩基および／またはリボヌクレオチド塩基またはその類似体、誘導体、変異体、フラグメントもしくは組合せの一本鎖または二本鎖のポリマーを指す。非限定的な例として、本明細書に記載される所与の核酸の入手源は、合成、哺乳動物、ヒト、動物、植物、真菌、細菌、ウイルスまたは古細菌のうちいずれか１つまたは複数の入手源であり得る。
【００８８】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」という用語は、互換的に使用され、同じ意味を有するものであり、デオキシリボヌクレオチド塩基および／またはリボヌクレオチド塩基またはその類似体、誘導体、変異体、フラグメントもしくは組合せの一本鎖ポリマーを指す。本発明によるオリゴヌクレオチドの非限定的な例としては、本明細書に記載される方法および組成物による検出のための核酸標的；触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、ＭＮＡｚｙｍｅ）；パートザイムオリゴヌクレオチドなどのＭＮＡｚｙｍｅ成分；アプタマー；ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド；ならびに核酸酵素基質（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはリボザイムによって修飾され得る基質）が挙げられる。オリゴヌクレオチドは、特に限定されないが、下の表１に記載するもののうちいずれか１つまたは複数のものを含めた少なくとも１つの付加または置換を含み得る。本明細書で言及されるオリゴヌクレオチドは、例えば化学合成（例えば、成分ヌクレオチドからの合成または既存のオリゴヌクレオチドフラグメントへのヌクレオチド（１つまたは複数）の付加）を含めた任意の方法により合成され得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの複数のフラグメントを連結する、またはその他の方法で結合することにより構築することもできる。本明細書で言及される「連結産物」とは、例えばリガーゼ酵素により互いに結合（連結）した２つ以上のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含む、核酸のことである。
【００８９】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」および「ヌクレオチド残基」ならびに「塩基」という用語は、同じ意味を有し、塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵおよびその誘導体または類似体（その非限定的な例を表１に挙げる）を含むヌクレオチドを包含する。
【００９０】
本明細書で核酸またはヌクレオチドに関連して使用される「誘導体」という用語は、（例えば、組換え手段により）組み込んで作製した、または合成後に（例えば、化学的手段により）付加した任意の融合分子を含めた任意の機能的に等価な核酸またはヌクレオチドを包含する。このような融合物は、ＲＮＡもしくはＤＮＡが付加された、またはポリペプチド（例えば、ピューロマイシンもしくはその他のポリペプチド）、小分子（例えば、ソラレン）もしくは抗体とコンジュゲートされた本発明のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【００９１】
本明細書で核酸またはヌクレオチドに関連して使用される「類似体」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子または残基に関連する物理的構造を有する化合物を包含し、ＤＮＡ残基もしくはＲＮＡ残基またはその類似体と水素結合を形成することが可能な（すなわち、ＤＮＡ残基もしくはＲＮＡ残基またはその類似体とアニールして塩基対を形成することが可能な）ものであり得るが、このような結合は、前記化合物が「類似体」という用語に包含されるのに必要とされるものではない。このような類似体は、構造的に関連するリボヌクレオチド残基またはデオキシリボヌクレオチド残基とは異なる化学的特性および生物学的特性を有し得る。メチル化、ヨウ素化、臭素化またはビオチン化された残基が類似体の例である。これまでに、デオキシイノシン、Ｃ−５−インミダゾール（ｉｍｍｉｄａｚｏｌｅ）デオキシウリジン、３−（アミノプロピニル）−７−デアザ−ｄＡＴＰ、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、２’Ｏ−メチルキャップを含めたヌクレオチド類似体が含まれる活性なＤＮＡｚｙｍｅが記載されている。その他の類似体についても、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイムおよびＭＮＡｚｙｍｅなどの触媒核酸酵素の触媒活性と適合性がある可能性が考えられる。当業者には、触媒活性のある核酸を、例えば塩基同士の置換、塩基から類似体への置換または糖成分もしくはホスホジエステル主鎖の改変によって改変することは容易であろう。例えば、合成過程で、または合成後に特定の塩基を修飾することにより、改変を実施することができる。触媒核酸の塩基変化または塩基類似体などの組込み改変を実験的に検証することにより、改変した配列または特定の類似体が触媒活性に及ぼす影響を評価することができる。塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴおよびＵの類似体は当該技術分野で公知であり、一部を表１に挙げる。ヌクレアーゼ消化を阻害することができる類似体の非限定的な例も当該技術分野で周知である。このような類似体を戦略的にオリゴヌクレオチド内に配置して、エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼによる切断を防ぐことができる。
【００９２】
【表１−１】
2020516294.tif 000003
【表１−２】
2020516294.tif 000004
【００９３】
「多成分核酸酵素」および「ＭＮＡｚｙｍｅ」という用語は、本明細書では互換的に使用され、同じ意味を有するものと解釈される。これらは、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドまたはＭＮＡｚｙｍｅ会合促進ポリヌクレオチド（例えば、標的核酸）の存在下でのみ会合して、１つまたは複数の基質を触媒的に修飾することが可能な触媒活性核酸酵素を形成する２つ以上のパートザイムオリゴヌクレオチドから形成される。例えば、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢはそれぞれ、核酸標的との相補的塩基対形成により標的核酸と結合し得る。ＭＮＡｚｙｍｅは、パートザイムＡおよびＢのセンサーアームが標的核酸上で互いに隣接してハイブリダイズする場合にのみ形成される。ＭＮＡｚｙｍｅの基質アームは基質とかみ合い、その修飾（例えば、切断または連結）は、パートザイムオリゴヌクレオチドＡおよびＢ上の部分的触媒ドメインの相互作用によって形成されるＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアにより触媒される。本明細書で使用される「多成分核酸酵素」および「ＭＮＡｚｙｍｅ」という用語は、国際公開第２００７／０４１７７４号、同第／２００８／０４００９５号、同第２００８／１２２０８４号、同第２０１２／０６５２３１号、同第／２０１３／０３３７９２号、同第／２０１３／１２３５５２号および同第２０１３／１８８９１２号、関連する米国特許第８３９４９４６号、同第８９４５８３６号、同第９１２７３１１号、同第８９６２２３８号および同第９５０６１０８号ならびに関連する米国特許出願公開第２０１４００１７６６９号、同第２０１６０３４８１６１号および同第２０１６００８３７８５号（上記の各文献の内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つまたは複数のものに開示されるものを含めたあらゆる既知のＭＮＡｚｙｍｅおよび改変ＭＮＡｚｙｍｅを包含することが理解されよう。包含されるＭＮＡｚｙｍｅおよび改変ＭＮＡｚｙｍｅの非限定的な例としては、（本明細書で例示されるように）切断触媒活性を有するもの、１つまたは複数の会合阻害剤を含み、会合していない、または一部が会合したＭＮＡｚｙｍｅ、１つまたは複数のアプタマーを含むＭＮＡｚｙｍｅ（「アプタＭＮＡｚｙｍｅ」）、１つまたは複数の短縮センサーアームと、任意選択で１つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドとを含むＭＮＡｚｙｍｅ、１つまたは複数の活性阻害剤を含むＭＮＡｚｙｍｅ、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）およびリガーゼ触媒活性のあるＭＮＡｚｙｍｅ（「ＭＮＡｚｙｍｅリガーゼ」）が挙げられる。
【００９４】
本明細書で使用される「アプタザイム」という用語は、触媒核酸（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイムまたはアプタＭＮＡｚｙｍｅ）であって、改変してアプタマードメインを組み込み、その活性をアロステリックに調節してそれが標的分析物の存在に依存するようにした触媒核酸を指す。触媒核酸酵素または触媒核酸酵素成分にアプタマーを組み込む方法としては、特に限定されないが、アプタマーと、触媒核酸もしくは触媒核酸成分の１つもしくは複数のドメインとを直接コンジュゲートすること、触媒核酸の非機能性領域へのアプタマーの組込み、または触媒核酸の機能性領域に隣接させてアプタマーをコンジュゲートすることが挙げられる。分析物の不在下では、アプタザイムのアプタマーの全体または一部が阻害剤分子とハイブリダイズしてアプタザイムの触媒活性を阻害し得る。阻害剤分子は、アプタマーに対する結合親和性が標的分子と比較して低いものであり得る。
【００９５】
「会合促進分子」、「会合促進因子」、「ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチド」、「フィードバック会合促進因子」および「ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進因子」という用語は、本明細書では互換的に使用され、１つまたは複数のパートザイムオリゴヌクレオチドのセンサーアームとハイブリダイズし、それにより触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅの会合を促進することができる核酸を指す。会合促進は、切断活性、リガーゼ活性またはその他の酵素活性を有するＭＮＡｚｙｍｅの会合を促進し得る。会合促進因子は、１つまたは複数のパートザイムオリゴヌクレオチドのセンサーアームとハイブリダイズする単一の分子であっても、あるいは、別個のこのような分子を複数含むものであってもよい。会合促進因子は、検出または定量化する標的（例えば、ＤＮＡ、メチル化ＤＮＡ、アルキル化ＤＮＡ、ＲＮＡ、メチル化ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、プレマイクロＲＮＡ、プリマイクロＲＮＡ、その他の非コードＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、その誘導体、アンプリコンまたはその任意の組合せからなる群より選択される核酸）であり得る。
【００９６】
本明細書で使用される「パートザイム」、「パートザイム成分」および「パートザイムオリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、同じ意味を有するものであり、それぞれ、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進因子の存在下で２つ以上のものが「ＭＮＡｚｙｍｅ」に自己会合することができるＤＮＡ含有オリゴヌクレオチドおよび／またはＲＮＡ含有オリゴヌクレオチドを指す。パートザイムオリゴヌクレオチドは、３つのドメイン、すなわち、基質の修飾を触媒するＭＮＡｚｙｍｅの触媒コアの一部を形成する「触媒」ドメイン、会合促進因子（例えば、標的核酸）と会合および／または結合する「センサーアーム」ドメインならびに基質と会合および／または結合する「基質アーム」ドメインを含む。
【００９７】
「基質」および「基質分子」という用語は、本明細書では互換的に使用され、触媒分子（例えば、触媒核酸酵素またはタンパク質酵素）による認識および触媒的修飾が可能な任意の分子を指す。基質は、例えば、触媒核酸酵素による特異的認識および触媒的修飾が可能な一本鎖または二本鎖の核酸を含み得る。触媒的に修飾される基質は、間接的手段および／または直接的手段により検出し得る。例えば、カスケードに含まれ、触媒的に修飾される基質に依存する１つまたは複数の後続する段階により、基質の触媒的修飾を間接的に検出し得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、例えば、１つもしくは複数の修飾基質産物および／または基質の修飾により直接発生する他の任意のシグナル（例えば、基質を切断し、それにより、それまで未修飾基質上に対で存在していたフルオロフォア分子と消光剤分子を空間的に分離することにより発生する蛍光シグナル）を直接検出することにより、基質の触媒的修飾を検出し得る。本明細書では、触媒分子により触媒的に修飾されたときに直接検出することができる基質を「レポーター基質」、「レポータープローブ基質」、「レポータープローブ」または「プローブ」とも呼ぶ。
【００９８】
本明細書で使用される「アプタマー」という用語は、核酸またはペプチドの配列であって、そのより高次の構造（例えば、３次元の結合ドメインまたは結合ポケット）により１つまたは複数のリガンドを高い親和性および特異性で認識し結合することが可能な配列を包含する。アプタマーは様々なリガンドと結合することができ、そのようなリガンドの非限定的な例としては、核酸、タンパク質、プリオン、小分子有機化合物または生体全体が挙げられる。本明細書で好ましいアプタマーには、例えば、複雑な合成核酸のライブラリーから吸着、回収および再増幅の反復工程により単離することができる、短い一本鎖のＤＮＡオリゴマーまたはＲＮＡオリゴマーがある。アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質、核酸構造または全細胞にわたるほぼすべての標的分子を認識するアプタマーを作製することができる。
【００９９】
本明細書で使用される「リガンド」という用語は、アプタマーと高い親和性および特異性で結合することが可能な任意の分子を指し、このような分子としては、特に限定されないが、タンパク質、プリオン、ポリペプチド、ペプチドまたは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、小分子有機化合物、全細胞および生体全体が挙げられる。リガンドを「標的分析物」または「分析物」と呼ぶこともある。
【０１００】
本明細書で２つ以上の核酸の間の「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズした」２つ以上の核酸と言う場合、それは核酸の全体または一部分の間で起こる相補的塩基対形成を必要とするものであることが理解される。
【０１０１】
「選択的透過バリア」という用語は、特定の物質を（一方向または両方向）に通過させ、それ以外の別の物質は通過させない材料（例えば、膜）を指す。したがって、選択的透過バリアは、２つの同一でない分子の間で物理的分離を維持するよう設計することができる。選択的透過バリアにより、特に限定されないが、電荷に基づく分離、重量に基づく分離、サイズに基づく分離、形状に基づく分離、脂質溶解性に基づく分離および／または膜内に存在する担体分子に対する親和性に基づく分離を促進する特性を含めた特性に基づく物理的分離がもたらされ得る。非限定的な例として、選択的透過バリアは、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリアミド、プロピレン、ナイロン、酸化アルミニウムまたはポリテトラフルオロエチレンのいずれか１つまたは複数のものを含み得る。
【０１０２】
（略号）
本明細書全体を通して以下の略号を使用する：
ＲＥ：制限酵素／エンドヌクレアーゼ
ＮＥ：ニッキング酵素／エンドヌクレアーゼ
ＤＳＮ：二本鎖特異的ヌクレアーゼ
ＬＡＭＰ：ループ介在等温増幅
ＲＣＡ：ローリングサークル増幅
ＴＭＡ：転写産物介在増幅
３ＳＲ：自家持続配列複製法
ＮＡＳＢＡ：核酸配列ベースの増幅
ＭＮＡｚｙｍｅ：多成分核酸酵素
ＤＮＡｚｙｍｅまたはＤｚ：デオキシリボ核酸酵素；
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応；
Ｆ：フルオロフォア色素分子；
Ｑ：消光剤分子；
ＪＯＥまたは６−ＪＯＥ：６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン；
ＦＡＭまたは６−ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン
ＴｘＲ：テキサスレッド
Ｏｌｉｇｏ：オリゴヌクレオチド
ＩＢ：Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ
ＩＤＴ：Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴
Ｓｕｂ：基質
Ｐｚ：パートザイム
Ｃａｔ：触媒核酸
ＰＥＳ：ポリエーテルスルホン
ＭＢ：磁気ビーズ
【０１０３】
（詳細な説明）
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施することができる程度に本発明の例示的実施形態を詳細に伝えるものである。記載される様々な実施形態に関する特徴および限定は、必ずしも本発明の他の実施形態および本発明全体を限定するものではない。したがって、以下の詳細な説明は、請求項によってのみ定められる本発明の範囲を限定するものではない。
【０１０４】
上に記載した通り、標的分子を検出するアッセイおよびこのようなアッセイで発生するシグナルを増幅するよう設計された方法で現在用いることができるものには多数の制約があることは明らかである。これらの制約のうち１つまたは複数のものが、本発明の組成物、キットおよび方法により対処される。
【０１０５】
標的を検出、同定および／または定量化するための組成物、方法およびキットが提供される。
【０１０６】
組成物およびキット
本明細書には、本発明の方法を実施するための組成物およびキットが提供される。単なる非限定的な例として、組成物およびキットは、触媒核酸酵素（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅおよび／またはそのパートザイムオリゴヌクレオチド成分（１つまたは複数）、ＤＮＡｚｙｍｅならびに／あるいはリボザイム）、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）、触媒核酸酵素の基質ならびに／あるいはタンパク質酵素の認識部位の鎖を１つ含むオリゴヌクレオチド）のうちいずれか１つまたは複数のものを含み得る。
【０１０７】
組成物およびキットの様々な成分を機能的に不活性な形態で提供し得る。上記のものに加えて、またはこれに代えて、組成物およびキット様々な成分を機能的に活性な形態で提供し得る。
【０１０８】
組成物およびキットに含めるのに適した成分の非限定的な例を以下に記載する。
【０１０９】
触媒核酸酵素
本発明の組成物およびキットは、１つまたは複数の異なる種類の触媒核酸酵素ならびに／あるいはその１つまたは複数の成分（例えば、１つまたは複数のパートザイムオリゴヌクレオチドおよび／または会合促進オリゴヌクレオチド）ならびに／あるいは触媒核酸酵素またはその成分の相補体を含み得る。
【０１１０】
触媒核酸の基質は、触媒的に修飾されたとき、検出可能なシグナルを発生することが可能なものであり得る。例えば、基質は、１つまたは複数の検出可能な標識（例えば、フルオロフォアと消光剤）を含み得る。
【０１１１】
組成物およびキットは、任意の適切な触媒核酸酵素（１つまたは複数）（その非限定的な例としては、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＭＮＡｚｙｍｅｓ、リボザイムおよび／またはアプタザイムが挙げられる）および／またはその成分（例えば、パートザイム（１つまたは複数）および／または会合促進因子（１つまたは複数））および／またはｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのさらに大きい実体の成分であるものを含み得る。
【０１１２】
例えば、本発明の組成物およびキットはＤＮＡｚｙｍｅを含み得る。任意の適切なＤＮＡｚｙｍｅを使用し得る。ＤＮＡｚｙｍｅは、既知／既存のＤＮＡｚｙｍｅであっても、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択により新たに作製したものであってもよい。ＤＮＡｚｙｍｅは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を切断または連結することが可能なものであり得る。二価金属イオン、例えばＢａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＰｂ２＋などをＤＮＡｚｙｍｅの補因子として提供し得る。ＤＮＡｚｙｍｅは、基質と特異的に結合する配列領域である２つの保存されていない基質結合ドメイン（「ハイブリダイズアーム」）と隣接する、触媒ドメイン（触媒コア）を含み得る。適切なＤＮＡｚｙｍｅの非限定的な例としては、２つの基質認識アームと隣接する１５デオキシリボヌクレオチドの触媒ドメインを含む１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅおよび８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅが挙げられる。
【０１１３】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、組成物およびキットはリボザイムを含み得る。任意の適切なリボザイムを使用し得る。リボザイムは、天然のリボザイムであっても、人工的に作製したリボザイムであってもよい。リボザイムは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を切断または連結することが可能なものであり得る。二価金属イオン、例えばＢａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＰｂ２＋ならびに／あるいは一価陽イオンをリボザイムの補因子として提供し得る。リボザイムは、基質と特異的に結合する配列領域である２つの保存されていない基質結合ドメイン（「ハイブリダイズアーム」）と隣接する、触媒ドメイン（触媒コア）を含み得る。あるいは、別個の標的結合アームおよび基質結合アームならびに触媒コアを含み得るその他のリボザイム構造が企図される。適切なリボザイムの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、分岐型リボザイム、マキシザイム、グループＩリボザイム、グループＩＩイントロンリボザイム、ＨＤＶリボザイム、ＲＮアーゼＰ、ＣＰＥＢ３リボザイム、ｇｌｍＳリボザイム、ペプチジルトランスフェラーゼ２３Ｓ  ｒＲＮＡ、ＶＳリボザイム、ＣｏＴＣリボザイムおよびＧＩＲ１リードザイムが挙げられる。
【０１１４】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、本発明の組成物およびキットは、ＭＮＡｚｙｍｅ、触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能なパートザイムオリゴヌクレオチド成分、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅ基質のいずれか１つまたは複数のものを含み得る。当業者には周知のように、ＭＮＡｚｙｍｅは、適切な会合促進因子（例えば、標的）とハイブリダイズしたとき、２つ以上のパートザイムから自己会合する、触媒的に活性な核酸酵素である。各パートザイムオリゴヌクレオチド成分は、ＭＮＡｚｙｍｅが会合したとき、組み合わさって基質を修飾することが可能な単一の触媒コアを形成する、部分的触媒コアを含む。
【０１１５】
適切なＭＮＡｚｙｍｅおよびその作製方法の非限定的な例が、例えば、国際公開第２００７／０４１７７４号、同第２００８／０４００９５号、同第２００８／１２２０８４号、同第２０１２／０６５２３１号、同第２０１３／０３３７９２号、同第２０１３／１２３５５２号および同第２０１３／１８８９１２号、関連する米国特許第８３９４９４６号、同第８９４５８３６号、同第９１２７３１１号、同第８９６２２３８号および同第９５０６１０８号ならびに関連する米国特許出願公開第２０１４００１７６６９号、同第２０１６０３４８１６１号および同第２０１６００８３７８５号（上記の各文献の内容は全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つまたは複数のものに開示されている。適切なＭＮＡｚｙｍｅとしては、切断触媒活性を有するもの、連結活性を有するもの、１つまたは複数の会合阻害剤を含み、会合していない、または一部が会合したＭＮＡｚｙｍｅ、１つまたは複数のアプタマーを含むＭＮＡｚｙｍｅ（「アプタＭＮＡｚｙｍｅ」）、１つまたは複数の短縮センサーアームと、任意選択で１つまたは複数の安定化オリゴヌクレオチドとを含むＭＮＡｚｙｍｅ、１つまたは複数の活性阻害剤を含むＭＮＡｚｙｍｅ、多成分核酸不活性プロ酵素（ＭＮＡｉ）およびリガーゼ触媒活性のあるＭＮＡｚｙｍｅ（「ＭＮＡｚｙｍｅリガーゼ」）が挙げられ、それぞれ国際公開第２００７／０４１７７４号、同第２００８／０４００９５号、同第２００８／１２２０８４号、米国特許出願公開第２００７−０２３１８１０号、同第２０１０−０１３６５３６号および／または同第２０１１−０１４３３３８号の１つまたは複数のものに詳細に記載されている。パートザイムオリゴヌクレオチドは、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進因子の存在下で自己会合してＭＮＡｚｙｍｅを形成する。いくつかの実施形態では、ＭＮＡｚｙｍｅの存在を検出することができ、ＭＮＡｚｙｍｅの存在は、ＭＮＡｚｙｍｅが会合促進因子を含む標的の存在下でのみ形成されることから、標的の存在を示すものとなる。
【０１１６】
当業者に公知のように、ＭＮＡｚｙｍｅの構造は１つまたは複数のＤＮＡｚｙｍｅ（例えば、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅおよび８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ）および／またはリボザイムを土台とするものである。ＭＮＡｚｙｍｅは、リボヌクレオチド塩基および／またはデオキシリボヌクレオチド塩基および／またはその類似体を含み得る。例えば、ＭＮＡｚｙｍｅのセンサーアーム、基質アームまたは触媒コアのうち１つまたは複数のものが、１つもしくは複数のリボヌクレオチド塩基および／または１つもしくは複数のデオキシリボヌクレオチド塩基および／または１つもしくは複数のその類似体を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＮＡｚｙｍｅは、その触媒コア内に少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体を含む。デオキシリボヌクレオチド塩基またはその類似体は、触媒活性に必要とされるものであり得る。
【０１１７】
組成物およびキットのＭＮＡｚｙｍｅには、当業者に周知の１つもしくは複数の置換、例えば類似体、誘導体、修飾もしくは改変塩基、リボヌクレオチドなど、糖もしくはリン酸主鎖の改変、様々な欠失、挿入、置換、重複もしくはその他の修飾またはこれらの任意の組合せが含まれ得る。このような修飾、置換、欠失、挿入などを、分子が触媒活性を保持するようにセンサーアームおよび／または基質アーム内ならびに／あるいは触媒コア内に施し得る。基質または会合促進因子と結合するアームの置換および修飾は、耐性が高く、分子を様々な基質／会合促進因子に合わせることを可能にするものであり得る。例えば、センサーアームの修飾により様々な会合促進因子に合わせることが可能になり、基質アームの修飾により様々な基質に合わせることが可能になる。
【０１１８】
上記のものに加えて、またはこれに代えて、本発明の組成物およびキットは、触媒核酸酵素の１つまたは複数の成分を含み得る。例えば、組成物およびキットは、ＭＮＡｚｙｍｅの個々の成分（１つまたは複数）（例えば、１つもしくは複数のパートザイムオリゴヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数の会合促進オリゴヌクレオチド）を含み得る。
【０１１９】
非限定的な例として、組成物およびキットは、標的分子を認識したとき、自己会合して、１つまたは複数の基質を修飾することが可能な触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能である、個々のパートザイム（１つまたは複数）を含み得る。このように形成されるＭＮＡｚｙｍｅを、パートザイムセンサーアームが特定の会合促進因子（特異的標的分子（１つまたは複数）であり得る）とハイブリダイズしたときにのみ会合し、かつ／またはＭＮＡｚｙｍｅの基質アーム（１つまたは複数）とハイブリダイズすることが可能な特定の特異的基質（１つまたは複数）のみを触媒的に修飾するよう設計し得る。したがって、組成物およびキットに含まれるＭＮＡｚｙｍｅを、自己会合し、１つまたは複数の基質をカスケードが起こるのに必要な産物に触媒的に修飾するために標的分子の存在を必要とすることにより、本発明による検出および／またはシグナル増幅カスケードを開始させるよう設計し得る。
【０１２０】
例えば、パートザイムのセンサーアームのみを改変し、基質アームを改変せずにおくことにより、様々な標的に特異的であり、いずれも検出に汎用性のＭＮＡｚｙｍｅ基質を使用し得る、多種多様なＭＮＡｚｙｍｅを設計することができる。当業者には、このことが、各標的に対して特別な基質も固有の基質も必要でなくなるという利点をもたらすことが理解されよう。新たな各標的に対しては、センサーアーム部分のうち１つまたは複数のものに１つまたは複数の改変を施すだけでよく、基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままでよい。したがって、１つのＭＮＡｚｙｍｅを用いる単一の標的にも、改変したＭＮＡｚｙｍｅを用いる一連のアッセイの複数の標的にも単一のＭＮＡｚｙｍｅ基質を使用することができる。ＭＮＡｚｙｍｅ基質が複数あれば、単一のアッセイに各標的に対してＭＮＡｚｙｍｅを１つ、つまり複数のＭＮＡｚｙｍｅを用いて、複数の標的の検出を多重することが可能になる。このようなＭＮＡｚｙｍｅを用いる多重化法は、溶液中で、または支持体システムに付着させて容易に実施される。本明細書では、１つまたは複数の基質、ＭＮＡｚｙｍｅパートザイム、会合促進因子または追加の酵素活性を本明細書に記載される支持体に付着させるシステムで多重化アッセイを実施し得ることが企図される。
【０１２１】
同様に、ＭＮＡｚｙｍｅを特定の基質と特異的にハイブリダイズして触媒的に修飾するよう設計し得る。例えば、パートザイムの基質アームのみを改変し、センサーアームは改変せずにおくことにより、所与の標的に特異的であり、一連の様々なＭＮＡｚｙｍｅ基質を認識して触媒的に修飾する、多種多様なＭＮＡｚｙｍｅを設計することができる。基質は、ＭＮＡｚｙｍｅによって触媒的に修飾されときに検出可能なシグナルを発生することが可能なレポーター基質であり得る。
【０１２２】
ある特定の実施形態では、組成物およびキットのＭＮＡｚｙｍｅを汎用性の基質または一般的な基質と特異的にハイブリダイズして触媒的に修飾するよう設計し得る。汎用性のＭＮＡｚｙｍｅ基質を用いて、設計を変化させて様々な標的を認識する新たなＭＮＡｚｙｍｅを作出することを可能にすることにより迅速アッセイの開発を可能にし得る。パートザイムの基質アーム部分および触媒コア部分は不変のままであってよく、新たな標的に対して必要な１つまたは複数のパートザイムのセンサーアーム部分のみを改変する。汎用性の基質配列を準備し、それにより、多数の異なる標的に対するアッセイに同じ基質を組み込むことができる。さらに、基質が溶液中に遊離させるか、支持体に係留または付着させるアッセイを含めた本明細書の様々な実施形態の方法に同じ基質を組み込むことができる。多重反応に一連の汎用性の基質を使用して、複数の標的の同時検出を可能にすることができる。汎用性の基質を用いるＭＮＡｚｙｍｅ戦略には、新たな標的それぞれに対して特異的なプローブを設計し使用する必要があるＴａｑＭａｎ（登録商標）、ＢｅａｃｏｎまたはＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅなどの検出技術より優れた大きな利点がある。ＭＮＡｚｙｍｅ基質は汎用性であり、いかなる標的にも有用であるため、この汎用性のＭＮＡｚｙｍｅ基質の切断により、いかなる標的の存在下でもシグナルの発生および増幅が可能になる。
【０１２３】
本発明の組成物およびキットに含まれるＤＮＡｚｙｍｅ、ＳｕｂＺｙｍｅ、リボザイム、パートザイム、会合促進オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチドおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅ基質は、標的分析物と結合することが可能なアプタマーを含み得る。好ましいアプタマーは、複雑な合成核酸またはペプチドのライブラリーから吸着、回収および再増幅の反復工程により単離することができる短い一本鎖のＤＮＡオリゴマーもしくはＲＮＡオリゴマーまたはペプチドを含み得る。したがって、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼすべての標的分析物に対してアプタマーを作製し得る。好ましい実施形態では、アプタマーは、例えば、好ましくは進化および選択技術によって作製される核酸結合分子を含む。アプタマーは、特に限定されないが、例えば上の表１に示されるヌクレオチド類似体を含めたＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子またはその両方の組合せを含み得る。
【０１２４】
アプタマーの使用とリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅとを組み合わせるための戦略は当該技術分野で公知である。このような分子は一般に、キメラであり、アプタマードメインとＤＮＡｚｙｍｅドメインまたはリボザイムドメインをともに含み、標的リガンドの存在により活性化される。アプタマードメインとその分析物との結合に応答してアプタザイムの機能的活性のスイッチが入り得る。アプタザイムを作製するための戦略としては、特に限定されないが、連結ドメインを介するリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅとアプタマードメインの融合が挙げられる。連結ドメインは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択法により進化させて、それが標的分析物の存在下でのみリボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅの作用を可能にする能力を改善することができる。また別の例示的戦略では、リボザイムまたはＤＮＡｚｙｍｅで単に構造上の役割を果たすだけの非機能性のステムループまたはヘアピン内にアプタマーを組み込む。アプタマーをＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムと連結し、アプタマードメインと酵素ドメインをともに、分析物の不在下で酵素ドメインの触媒的活性を阻害するのに用いられる調節オリゴヌクレオチドと部分的にハイブリダイズさせてもよい。分析物の存在下では、アプタマーは分析物と結合し、酵素ドメインから調節オリゴヌクレオチドを遊離させ、その触媒活性を回復させることができる。この場合、分析物の存在によりＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムから調節オリゴヌクレオチドが除去され、その触媒活性が回復し得る。アプタマーを用いてＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムの２つ以上の成分を架橋し、それにより、酵素がその基質を修飾することが可能になるようにすることもできる。ヘミンに対するアプタマーを含み、ヘミンの存在下でペルオキシダーゼの活性を模倣し、様々な化学基質を触媒して、蛍光シグナル、化学発光シグナルおよび比色シグナルを発生させることができる独特のクラスのＤＮＡｚｙｍｅも存在する。
【０１２５】
アプタマーの使用とＭＮＡｚｙｍｅとを組み合わせるための戦略も当該技術分野で公知である。アプタマーと連結したＭＮＡｚｙｍｅ成分を含むアプタザイムをアプタＭＮＡｚｙｍｅと呼ぶこともある。例えば、ＭＮＡｚｙｍｅの少なくとも１つのパートザイムと、アプタマー（アプタ−パートザイム）およびヘアピンを形成し、したがってＭＮＡｚｙｍｅ会合を阻害することが可能な相補的配列とを組み込み得る。検出する分析物または標的はアプタ−パートザイムと結合し、したがって活性なＭＮＡｚｙｍｅの会合を可能にし得る。標的分析物の不在下では、アプタ−パートザイムがヘアピン構造をとり、それが活性なＭＮＡｚｙｍｅの会合を阻害する。標的分析物の存在下では、標的分析物がアプタ−パートザイムのアプタマードメインと結合し、したがってヘアピン構造を妨害し、アプタ−パートザイムを活性なＭＮＡｚｙｍｅの会合に関与させる。
【０１２６】
他の実施形態では、アプタマーは、アプタマーと、ヘアピン構造を形成することが可能な相補的阻害配列とを組み込んだ会合促進オリゴヌクレオチドの一部として存在し得る。標的分析物の不在下では、会合促進オリゴヌクレオチドがヘアピン構造をとり、それにより、この成分が活性なＭＮＡｚｙｍｅを会合させる能力が阻害される。標的分析物の存在下では、標的分析物が会合促進因子のアプタマードメインと結合し、したがってヘアピン構造を妨害し、成分が触媒的に活性なＭＮＡｚｙｍｅを会合させることが可能になる。当業者には、アプタマーを１つまたは複数の会合促進分子のいずれの末端にも組み込み得ることが理解されよう。さらに、１つまたは複数のパートザイムオリゴヌクレオチド成分に複数のアプタマーを組み込むことが可能であることが理解されよう。
【０１２７】
さらなる実施形態では、アプタマー配列を標的分析物の存在下でのみ活性な開始アプタＭＮＡｚｙｍｅが形成される立体配置で（「アプタ−パートザイム」を形成している）パートザイムの末端に組み込み得る。この場合、検出戦略に必要とされるパートザイムとしては、標準的なパートザイム；一方の末端にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ−パートザイム；（標的分析物の存在下で）アプタ−パートザイムおよびパートザイムの両方と結合し、活性な開始アプタＭＮＡｚｙｍｅの会合を可能にする会合促進因子；基質；ならびにアプタ−パートザイムの少なくともアプタマー配列の一部分およびパートザイム配列の基質結合アームの一部分に及ぶ領域とハイブリダイズする会合阻害剤が挙げられる。標的の不在下では、会合阻害オリゴヌクレオチドがアプタ−パートザイムと結合し、レポータープローブ基質の切断を防ぐ。標的の存在下では、標的がアプタ−パートザイムのアプタマー配列と結合し、会合阻害剤の結合を防ぎ、開始アプタＭＮＡｚｙｍｅによるＭＮＡｚｙｍｅ基質との結合およびその切断を可能にする。このため、標的分析物の存在下でのみ、活性な開始アプタＭＮＡｚｙｍｅが形成されＭＮＡｚｙｍｅ基質を修飾することができる。
【０１２８】
当業者には、パートザイムオリゴヌクレオチド（１つまたは複数）、会合促進オリゴヌクレオチドまたはＭＮＡｚｙｍｅ基質を含めたいずれのオリゴヌクレオチド成分にも１つまたは複数のアプタマーを組み込み得ることも理解されよう。
【０１２９】
本発明の組成物およびキットの触媒核酸酵素および／またはその成分（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、ＭＮＡｚｙｍｅ、パートザイムオリゴヌクレオチド、会合促進オリゴヌクレオチド、基質および／またはアプタザイム）は、相補的塩基対形成により他の分子（１つまたは複数）とハイブリダイズした分子複合体の成分として提供され得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、組成物およびキットは、開始因子である触媒核酸酵素および／またはスイッチの触媒核酸酵素の触媒機能に必要な補因子（例えば、二価金属イオン、例えばＢａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋および／またはＰｂ２＋などならびに／あるいは一価陽イオン）を除く、本明細書に記載される分子スイッチを活性化するのに必要な成分をすべて含み得る。
【０１３１】
ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド
本発明の組成物およびキットは、１つまたは複数のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドを含み得る。本発明によるｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは一般に、少なくとも１つの触媒核酸またはその一部分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）と、少なくとも１つの触媒核酸基質とを含む。多数の実施形態では、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸またはその一部分は、同じＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸基質成分を触媒的に修飾することができない。
【０１３２】
触媒核酸またはその一部分と触媒核酸基質は、介在配列もリンカー（１つまたは複数）も用いずにｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド上に連続的に配置され得る。したがって、それらはｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドに沿って中断のない配列を構成し得る。
【０１３３】
あるいは、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸またはその一部分および触媒核酸基質は、例えば介在ヌクレオチドおよび／または当該技術分野で使用可能な任意の適切なリンカーもしくはスペーサー分子によって分離されていてよい。
【０１３４】
介在ヌクレオチドの数に関して特に制限はなく、２ヌクレオチド以上、３ヌクレオチド以上、４ヌクレオチド以上、５ヌクレオチド以上、６ヌクレオチド以上、１１ヌクレオチド以上、１６ヌクレオチド以上、２１ヌクレオチド以上、２ヌクレオチド未満、３ヌクレオチド未満、４ヌクレオチド未満、５ヌクレオチド未満、１０ヌクレオチド未満、１５ヌクレオチド未満、２０ヌクレオチド未満、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１５ヌクレオチドまたは２０ヌクレオチドであり得る。
【０１３５】
リンカーまたはスペーサーの具体的な形態および特徴に関して特に制限はなく、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの触媒核酸またはその一部分と触媒核酸基質とを分離する形でＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド中に存在し得る。スペーサーおよびリンカーを用いて、核酸基質成分と触媒核酸成分とを様々な大きさで分離することができる。例としては、特に限定されないが、炭素鎖、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリＡ、ポリＴ、脱塩基フラン、脱塩基オリゴヌクレオチドまたは光切断性ＰＣによる修飾が挙げられる。
【０１３６】
オリゴヌクレオチドと、それを付着させる表面との間にリンカーおよびスペーサーを組み込むこともできる。所与のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドと所与の表面とを分離するリンカーまたはスペーサーの具体的な形状および特徴に関して特に制限はない。距離を大きくすることによって、リンカーおよびスペーサーにより立体効果または荷電効果が軽減され得る。ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドと固体表面との間に使用することができるリンカーおよびスペーサーの例としては、特に限定されないが、炭素、デキストラン、ＴＥＧ、ＰＥＧ、ポリＡテール、ポリＴテール、ＰＮＡ、ＤＮＡまたはＬＮＡが挙げられる。
【０１３７】
ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基および／またはリボヌクレオチド塩基ならびに／あるいはその類似体、誘導体、変異体、フラグメント、リンカー、スペーサーまたは組合せを含み得る。
【０１３８】
付着に関する様々な化学的性質を利用してＳｕｂＺｙｍｅを表面に付着させることができる。表面へのＳｕｂＺｙｍｅの不動化を可能にする様々なオリゴヌクレオチド修飾があり、特に限定されないが、以下のオリゴヌクレオチド官能基、すなわち、アミン、カルボキシル、ジスルフィド、ヒドラジド、チオール、ａｃｒｙｄｉｔｅ、ビオチン、ＮＨＳエステル（アジド）、コレステロールＴＥＧ、ジゴキシゲニン、アミノオキシ、アデニル化、デスチオビオチン、ヘキシニル、マレイミド、アルキン、ジチオール、オクタジイニル、アルデヒドおよびエポキシがこれに含まれる。あるいは、ＳｕｂＺｙｍｅを既に表面に不動化されたオリゴヌクレオチドと連結またはハイブリダイズさせてもよい。
【０１３９】
ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは任意選択で、非限定的な例として、（例えば、反応混合物からの）その分離または精製を補助し得る、追加の分子（１つまたは複数）を含み得るか、これに付着させ得る。これらには、非限定的な例として、磁気ビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズまたはシリカビーズが含まれ得る。本発明のいくつかの実施形態では、非限定的な例として、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、または８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅと１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅの基質を含み得る。本発明の他の実施形態では、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、パートザイムオリゴヌクレオチドと８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、またはパートザイムオリゴヌクレオチドと１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅの基質を含み得る。
【０１４０】
ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは任意選択で、非限定的な例として、特に限定されないが、電気化学、蛍光、比色、ｐＨ、ＳＰＲ、磁気共鳴および発光を含めた検出システムを用いる検出を補助し得る、追加の分子（１つまたは複数）を含み得るか、これに付着させ得る。追加の分子の非限定的な例としては、磁気ビーズ、金粒子、銀粒子、酵素、フルオロフォア、化学基、消光剤および量子ドットが挙げられる。
【０１４１】
ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは任意選択で、検出する標的に相補的な追加の配列を含み得る。好ましい実施形態では、追加の標的特異的配列は、タンパク質エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼの認識部位を形成するのに必要とされるヌクレオチドを含み得る。非限定的な例として、追加の標的特異的配列は、制限酵素の二本鎖認識部位のうちの一方の鎖を含み得る。
【０１４２】
本発明によるｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド／ｓｕｂＺｙｍｅは、触媒核酸の一部分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）を含み得る。触媒核酸の一部分は、それが由来する完全な核酸と比較して、部分的または完全な触媒作用が可能なものであり得る。あるいは、触媒核酸の一部分は、それが由来する親触媒核酸の他の部分（１つまたは複数）（例えば、別のパートザイムオリゴヌクレオチドおよび／または会合促進因子）と組み合わさるまで触媒作用が不可能なものであり得る。本発明のいくつかの実施形態では、非限定的な例として、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、１０−２３パートザイムオリゴヌクレオチドと別の異なる１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、１０−２３パートザイムと８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、８−１７パートザイムと１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅの基質、または８−１７パートザイムと別の異なる８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅの基質を含み得る。
【０１４３】
エクソンクレアーゼ（ｅｘｏｎｃｌｅａｓｅ）およびエンドヌクレアーゼ
本発明の組成物およびキットは、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを含み得る。適切なエンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、制限酵素、マングビーンヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼＩＶ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＲＮアーゼＡ、ＲＮアーゼＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＲＮアーゼＩＩＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））またはＲＮアーゼＨ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））が挙げられる。適切なエキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、エキソヌクレアーゼＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、二本鎖の核酸二本鎖の両方の鎖を認識し切断する制限酵素であるか、二本鎖の核酸二本鎖を認識するが、一方の鎖のみを切断するニッキング酵素であり得る。
【０１４４】
オリゴヌクレオチド
本発明の組成物およびキットに含まれるオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡｚｙｍｅ、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチド、リボザイム、アプタザイム、ＭＮＡｚｙｍｅ、これらのそれぞれの基質およびＭＮＡｚｙｍｅ成分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド、会合促進オリゴヌクレオチド）などには、当業者に周知の１つまたは複数の置換、例えば類似体（例えば、表１に記載されるもの）、誘導体、修飾もしくは改変塩基、リボヌクレオチドなど、糖もしくはリン酸主鎖の改変、様々な欠失、挿入、置換、重複もしくはその他の修飾またはこれらの任意の組合せが含まれ得る。このような修飾、置換、欠失、挿入などは、オリゴヌクレオチドがその機能を保持する限り、任意の位置に施し得る。オリゴヌクレオチドの置換および修飾は、耐性が高く、特定の条件下で機能するように、または反応効率が改善されるように分子を合わせることを可能にするものであり得る。当業者には、理解されよう。ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドおよびその基質、ＭＮＡｚｙｍｅおよびその基質ならびにＭＮＡｚｙｍｅ成分（例えば、パートザイム、会合促進オリゴヌクレオチド／ポリヌクレオチド）は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれかまたはその両方を含み得る。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチドを含むものであり得、いくつかの場合には、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはその類似体からなるものであり得る。
【０１４５】
触媒核酸基質
本発明の組成物およびキットは、触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、アプタザイムおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅもしくはアプタＭＮＡｚｙｍｅ）による修飾が可能な基質を含み得る。
【０１４６】
基質は、触媒核酸酵素を含めた酵素が認識する、作用する、または修飾することが可能なデオキシリボヌクレオチド塩基もしくはリボヌクレオチド塩基またはその類似体、誘導体、変異体、フラグメントもしくは組合せの任意の一本鎖または二本鎖ポリマーであり得る。
【０１４７】
基質は、特に限定されないが切断または連結を含めた様々な酵素作用によって修飾され得るものであり、酵素による基質の修飾により、酵素の触媒作用を示す検出可能な効果がもたらされ得る。
【０１４８】
核酸酵素の基質はまた、非核酸構成要素、例えばアミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質など、または（「Ｎｅｗ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ」，Ｂ．Ｐｉｇｎａｔａｒｏ  ｉｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２０１２の）表６．１にまとめられている任意の化学的構成要素を含み得るか、これに付着させ得る。
【０１４９】
基質は、酵素の触媒作用によって生じる修飾型の基質の定量化および／または検出を促進する１つまたは複数の特徴を含む、レポーター基質であり得る。レポーター基質は、溶液中に遊離させるか、例えば表面または別の分子に結合させる（または「係留する」）ことができる。レポーター基質は、例えば、フルオロフォア（消光剤などの１つまたは複数の追加の成分の有無を問わない）、放射性標識、金粒子および／または銀粒子、ビオチン（例えば、ビオチン化）あるいは化学発光標識を含めた多種多様な手段のいずれかにより標識することができる。これらの様々な標識は、触媒核酸酵素による修飾（例えば、切断）時に検出可能なシグナルを発生させる手段となり得る。
【０１５０】
基質は、複数の触媒核酸酵素によって認識され、触媒作用を受ける汎用性の基質であり得る。汎用性の基質は固体支持体に係留し得る。本発明の組成物およびキットに含まれる基質は、触媒核酸による認識および修飾が可能な個別の成分として提供され得る。本発明のその他の態様は、２つ以上の触媒核酸によって認識され切断され得る基質に関するものである。例として、ＤＮＡｚｙｍｅの基質結合アームおよびＭＮＡｚｙｍｅのパートザイム成分の基質結合アームがともに同じ前記単一の核酸基質に相補的なものである限り、単一の核酸基質はＤＮＡｚｙｍｅおよびＭＮＡｚｙｍｅの両方により切断され得る。このような場合、ＤＮＡｚｙｍｅの特異的触媒コア配列およびＭＮＡｚｙｍｅのパートザイム対の触媒コア部分が、基質内の「切断」部位での切断に適合するものであり得る。
【０１５１】
選択的透過バリア
本発明の組成物およびキットは、本明細書に記載される方法に使用する様々な成分を分離するための選択的透過バリア（１つまたは複数）を含み得る。選択的透過バリアは一般に、その特性により、特定のアッセイ成分を通過させ、それ以外のものは通過させない。選択的透過バリアは、本明細書に記載される方法に使用する成分を二方向に通過させ得る。
【０１５２】
単なる非限定的な例として、選択的透過バリアは以下に挙げるアッセイ成分、すなわち、ＭＮＡｚｙｍｅ、ＭＮＡｚｙｍｅ成分（１つまたは複数）（例えば、会合促進オリゴヌクレオチド、パートザイムオリゴヌクレオチド）、ＭＮＡｚｙｍｅ基質、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ基質、リボザイム、リボザイム基質、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドのうちいずれか１つまたは複数のものと、１つまたは複数のそれ以外のアッセイ成分とを分離する役割を果たし得る。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、選択的透過バリアは、異なる種類のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドを互いに物理的に分離する役割を果たし得る。いくつかの実施形態では、選択的透過バリアを用いて、第一のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドと、これと同一ではない第二のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドとを物理的に分離する。
【０１５４】
第一のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、触媒核酸酵素配列（「ｃａｔ  Ａ」）と、触媒核酸酵素の基質である成分（「ｓｕｂ  Ａ」）とを含み得る。第二のＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、触媒核酸酵素配列（「ｃａｔ  Ｂ」）と、触媒核酸酵素の基質である成分（「ｓｕｂ  Ｂ」）とを含み得る。ｃａｔ  Ａは、ｓｕｂ  Ａを触媒的に修飾する（例えば、切断する）ことができず、ｓｕｂ  Ｂを触媒的に修飾する（例えば、切断する）ことができるものであり得る。ｃａｔ  Ｂは、ｓｕｂ  Ｂを触媒的に修飾する（例えば、切断する）ことができないが、ｓｕｂ  Ａを触媒的に修飾する（例えば、切断する）ことができるものであり得る。
【０１５５】
他の実施形態では、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドは、触媒核酸酵素の一部分（例えば、パートザイムオリゴヌクレオチド）と、触媒核酸酵素の基質である成分とを含み得る。触媒核酸酵素の一部分は、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドの基質とハイブリダイズすることができないものであり得る。
【０１５６】
選択的透過バリアにより、特に限定されないが、電荷に基づく分離、サイズに基づく分離、形状に基づく分離、重量に基づく分離、脂質溶解性に基づく分離、分子可動性に基づく分離および／または膜内に存在する担体分子に対する親和性に基づく分離を促進する特性を含めたバリアの特性に基づくアッセイ成分の物理的分離がもたらされ得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、選択的透過バリアは、サイズ制限によってアッセイ成分の物理的分離をもたらすことができる。例えば、バリアは、特定のアッセイ成分を通過させない特定の最大サイズの細孔を備えたものであり得る。例えば、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのアッセイ成分は、物理的特徴（例えば、自己相補性領域から生じる二次構造）を有し、かつ／または大き過ぎてバリアの細孔を通過できない実体（例えば、ビーズまたは微粒子）に付着させたものであり得る。
【０１５８】
他の実施形態では、選択的透過バリアは、電荷特性によってアッセイ成分の物理的分離がもたらされ得る。例えば、バリアは、特定のアッセイ成分を通過させない特定の電荷を有する細孔（例えば、イオンチャネル）を備えたものであり得る。例えば、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのアッセイ成分は、特定の電荷を有し、かつ／または同じまたは同程度の電荷を有するバリアの細孔を通過させない特定の電荷を有する実体（例えば、ビーズ）に付着させたものであり得る。
【０１５９】
さらに別の実施形態では、選択的透過バリアは、脂質溶解特性によってアッセイ成分の物理的分離をもたらすことができる。例えば、バリアは、特定のアッセイ成分が疎油性である場合にそれを通過させない脂質を含むものであり得る。例えば、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのアッセイ成分は、疎油性の要素を含み、かつ／または親油性バリアを通過させない疎油性特性を有する実体（例えば、ビーズ）に付着させたものであり得る。
【０１６０】
さらに別の実施形態では、選択的透過バリアは、形状制限によってアッセイ成分の物理的分離をもたらすことができる。例えば、バリアは、特定のアッセイ成分を通過させない特定の形状の細孔を備えたものであり得る。例えば、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのアッセイ成分は、ある物理的特徴（例えば、自己相補性領域から生じる二次構造）を有し、かつ／またはバリアの細孔の通過に適合性のない形状の実体（例えば、ビーズまたは微粒子）に付着させたものであり得る。
【０１６１】
さらなる実施形態では、選択的透過バリアは、バリア内に存在する担体分子に対する親和性によってアッセイ成分の物理的分離をもたらすことができる。例えば、バリアは、他の成分ではなく特定のアッセイ成分をバリアに通して輸送するのを促進する担体分子を含み得る。例えば、ＳｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドなどのアッセイ成分は、ある物理的特徴を有し、かつ／またはバリア内に存在する担体分子への付着を促進し、それにより、ｓｕｂＺｙｍｅオリゴヌクレオチドをバリアに通して輸送するのを促進する特性を有する実体（例えば、ビーズ）に付着させたものであり得る。
【０１６２】
当業者には、選択的透過バリアによるアッセイ成分の物理的分離が、特に本明細書に具体的に記載される手段に限定されず、当該技術分野で公知の任意の標準的手段によってもたらされ得ることが認識されよう。
【０１６３】
選択的透過バリアは、当該技術分野で公知の任意の適切な材料（１つまたは複数）でできたものであり得る。材料（１つまたは複数）は一般に、アッセイで機能する成分と適合性のあるものとなる。適切な材料の非限定的な例としては、ポリエーテルスルホン、ポリカーボネート、ニトロセルロース、再生セルロース、酢酸セルロース、ポリアミド、プロピレン、ナイロン、酸化アルミニウムまたはポリテトラフルオロエチレンが挙げられる。
【０１６４】
検出可能な標識
本発明の組成物およびキットに含まれる成分は、蛍光分光法、表面プラズモン共鳴、質量分光測定法、電気化学、ＮＭＲ、電子スピン共鳴、偏光蛍光分光法、円二色法、イムノアッセイ、クロマトグラフィー、放射測定、測光、シンチグラフィー、電子工学的方法、ＵＶ、可視光もしくは赤外線分光測定法、酵素法またはその任意の組合せによって求められる出力シグナルを発生することができる検出可能な標識を含み得る。
【０１６５】
オリゴヌクレオチドに付着させたナノスケールおよび顕微鏡レベルの金粒子を用いて比色シグナルを発生させることが可能であり、この場合、近接している金粒子は青色に見え、分離すれば赤色に見える。例えば、ＭＮＡｚｙｍｅまたはＤＮＡｚｙｍｅによる基質またはＳｕｂＺｙｍｅの切断によって分離させ得る。オリゴヌクレオチドを分離すると蛍光が増大し得るフルオロフォアと消光色素で標識することができる。例えば、ＭＮＡｚｙｍｅまたはＤＮＡｚｙｍｅによる基質またはＳｕｂＺｙｍｅの切断によって分離させ得る。
【０１６６】
オリゴヌクレチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｔｉｄｅ）の一方の末端を金粒子または銀粒子で標識し、他方の末端をセンサー表面に付着させて、表面プラズモン共鳴による測定を促進し得る。例えば、付着した粒子をＭＮＡｚｙｍｅまたはＤＮＡｚｙｍｅによる基質またはＳｕｂＺｙｍｅ切断によってセンサー表面から遊離させることにより、表面プラズモン共鳴に検出可能なシフトを生じさせ得る。オリゴヌクレオチドの一方の末端を表面に付着させ、他方の末端を電気化学反応に関与する酵素に付着させることができる。ＭＮＡｚｙｍｅまたはＤＮＡｚｙｍｅによる基質またはＳｕｂＺｙｍｅの切断によって、電気化学反応に関与することができるよう酵素を表面から遊離させ得る。
【０１６７】
検出およびシグナル増幅の方法
本発明は、少なくとも１つの標的を検出、同定および／または定量化するための様々な方法を提供する。さらに、本発明は、これらの方法により発生させたシグナルを増幅するための様々なカスケードを提供する。
【０１６８】
これらの方法は本発明の組成物およびその成分を用いるものである。多くの実施形態では、これらの方法はシグナル増幅カスケードを含むものである。
【０１６９】
本発明による例示的アッセイ
本発明の実施形態による例示的スキームを図４に示す。このスキームでは、特定のアッセイ成分を封入し他の成分から物理的に分離する選択的透過バリアを「Ｔバッグ」と呼ぶ。ＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的検出後のシグナルを増幅する。例示的Ｓｕｂｚｙｍｅ対を図１および２に示し、例示的Ｔバッグの製造工程を図３に示す。ＳｕｂＺｙｍｅ種ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ）およびＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ）をともに、選択的透過バリア／Ｔバッグを通過できない大きさの磁気ビーズ（ＭＢ）に付着させる。ＳｕｂＺｙｍｅはＭＢに付着しているが、溶液中では自由であり、Ｔバッグによって画定されるアッセイの分離区画内では可動性である。反応は、透過性バリアの一方の側、Ｔバッグの外部にあるＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢと、透過性バリアのもう一方の側、Ｔバッグの内部にあるＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢとを含む。さらに、Ｔバッグの外部には、検出する標的およびＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ内の基質配列に相補的なパートザイムオリゴヌクレオチドが存在する。標的の存在下では、パートザイムオリゴヌクレオチドが整列してＣａｔ  Ｃ（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅ）を形成し、これがＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ内に存在するＳｕｂ  Ａを切断することによりＭＢからＣａｔ  Ａが遊離し、それにより、Ｃａｔ  ＡがＴバッグを通過して中に入ることが可能になる。Ｔバッグ内では、遊離したＣａｔ  ＡがＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断する。その結果、Ｃａｔ  ＢがＭＢから分離される。Ｃａｔ  Ｂは、Ｔバッグの内側からＴバッグの外側の溶液中に自由に移動し、そこではＣａｔ  ＢがＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ内のＳｕｂ  Ａを切断し、カスケード反応を開始させる。このシナリオでは、１つの標的分子が１つのＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることにより反応を開始させることができ、それによりＭＮＡｚｙｍｅが第一のＳｕｂＺｙｍｅを切断することができ、第一のＳｕｂＺｙｍｅは第二のＳｕｂＺｙｍｅを切断することが可能であり、第二のＳｕｂＺｙｍｅは、次いでさらの多くの第一のＳｕｂＺｙｍｅを切断し、交差触媒カスケード反応を開始させることが可能であり、ここでは、単一の開始事象の後、第一および第二のｓｕｂＺｙｍｅの多くが切断されて多数のＤＮＡｚｙｍｅを遊離させる。
【０１７０】
一定時間インキュベートした後、遊離したＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  ＡおよびＣａｔ  Ｂ）から未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢと切断されたＭＢフラグメントを分離することができる。図４に示されるように、例えば磁石を用いることによりこの分離を実施して、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断されたＭＢフラグメントを上清中に存在するＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  ＡおよびＣａｔ  Ｂ）から分離することができる。このＤＮＡｚｙｍｅを、ＤＮＡｚｙｍｅが切断することができる標識された基質Ａおよび／または基質Ｂが含まれるまた別のチューブまたは区画に移し得る。ＤＮＡｚｙｍｅ切断によるフルオロフォアと消光剤の分離後に発生する蛍光をリアルタイムでモニターすることができる。
【０１７１】
図２に示されるように、好ましい実施形態は、異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅおよび異なる種類の基質配列を組み込んだＳｕｂＺｙｍｅ対を含み得る。例えば、以下の発明に有効なＳｕｂＺｙｍｅ対は、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅと８−１７基質とを含むＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ（ＰＢ）とともに使用する、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅと１０−２３基質とを含むＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ（ＰＡ）；またはその逆のものを含み得る。１０：２３  ＤＮＡｚｙｍｅと８：１７  ＤＮＡｚｙｍｅは切断部位に必要な特異的配列が異なるため、ある種類のＤＮＡｚｙｍｅとまた別の種類の基質とを有するＳｕｂＺｙｍｅであれば、低ストリンジェンシー条件下で保管またはインキュベートしても自己切断する可能性がない。しかし、図２に示されるように、Ｓｕｂｚｙｍｅ対は交差触媒的に互いに切断することができる。ＳｕｂＺｙｍｅは、標識されていなくても、あるいはＳｕｂＺｙｍｅ切断時にシグナルを発生させ、リアルタイムで、または反応終了時にモニターすることができるよう標識されていてもよい。標識された基質をＳｕｂＺｙｍｅ内に使用すれば、検出する標的の存在を示すシグナルを発生するだけの機能を有するＤＮＡｚｙｍｅ基質が含まれる第二のチューブまたは区画に遊離ＤＮＡｚｙｍｅを移す必要がなくなる。ＳｕｂＺｙｍｅ内に存在する基質配列（１つまたは複数）は、ＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅによる切断に適したものであり得る。非限定的な例として、ＳｕｂＺｙｍｅは、ＤＮＡｚｙｍｅおよび最初にＤＮＡｚｙｍｅを分割することによって得られたＭＮＡｚｙｍｅにより切断さるものであり得る。
【０１７２】
カスケードの開始
当業者には、本発明のシグナル増幅カスケードを用いて、核酸および非核酸標的（例えば、タンパク質、ペプチド、分析物など）を含めた任意の標的（１つまたは複数）を検出し得ることが認識されよう。標的の存在下でのカスケード開始機序も様々なものであり得る。非限定的な例として図１３を参照すると、交差触媒作用が可能な２対の例示的ＳｕｂＺｙｍｅが別の反応開始様式とともに示されている。ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）として示されるＳｕｂＺｙｍｅ対はともに、ＳｕｂＺｙｍｅを操作に使用することができる任意選択の磁気ビーズ（ＭＢ）に付着した状態で示されている。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ（ＰＡ）は、機能ドメイン、つまり、（ｉ）触媒核酸Ａ（例えば８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）、（ｉｉ）触媒核酸Ｂ（例えば１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）によって切断可能な基質Ａおよび任意選択で（ｉｉｉ）リンカー配列（図１３Ａ）または標的核酸に相補的であり制限酵素もしくはニッキング酵素のエンドヌクレアーゼ認識部位の一方の鎖をさらに含む配列（図１３Ｂ）を含む。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢ（ＰＢ）は、機能ドメイン、つまり、（ｉ）触媒核酸Ｂ（例えば、１０：２３  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ）、（ｉｉ）触媒核酸Ａ（例えば、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）によって切断可能な基質Ｂおよび任意選択で（ｉｉｉ）リンカー配列を含む（図１３Ａおよび１３Ｂ）。
【０１７３】
図１３Ａに示されるスキームでは、標的核酸が存在することにより、Ｓｕｂ  Ａ  Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃ（ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ）が形成される。ＰＡ内のＳｕｂ  Ａが切断されることによってＣａｔ  Ａが遊離し、次いで、これが選択的透過バリアを通過することが可能になり、ＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断してＣａｔ  Ｂを遊離させる。当業者であれば、図１３ＡにはＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）によるＰＡ切断によって可動性支持体からＣａｔ  Ａが遊離することが示されているが、ＭＮＡｚｙｍｅによるＰＡの切断がこれ以外のＰＡの特性（１つまたは複数）、特に限定されないが、いずれも選択的透過バリアを透過する能力を与え得る電荷、サイズ、形状、重量、脂溶解性などを含めた特性を変化させ得ることが認識されよう。Ｃａｔ  Ｂは次いで、選択的透過バリアを通過することが可能になり、また別のＰＡ内にある新たなＳｕｂ  Ａを切断し、さらに多くのＣａｔ  Ａを遊離させ、それにより交差触媒によるシグナル増幅カスケードを開始させる。
【０１７４】
図１３Ｂの例示的スキームでは、標的核酸がＰＡ内の特異的配列（ｉｉｉ）とハイブリダイズし（最上部の図を参照されたい）し、それにより、触媒酵素Ｄ（例えば、制限酵素（ＲＥ）またはニッキング酵素（ＮＥ）などのヌクレアーゼ）の認識／切断部位を形成する二本鎖の二本鎖領域が生じる。標的ＰＡ二本鎖の両鎖の切断にはＲＥを使用することが可能であるのに対し、標的ＰＡ二本鎖のＰＡ鎖の切断にはＮＥを使用することが可能である。ＰＡ内にあり標的がハイブリダイズする配列（ｉｉｉ）は、形成される切断部位での触媒酵素Ｄによる切断によってＣａｔ  Ａが遊離するよう（図のように）ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ基質配列とＭＢの間に位置し得る。当業者には、例えば、形成される切断部位での触媒酵素Ｄによる切断によってＣａｔ  Ａが遊離するように、ＰＡ内にあり標的がハイブリダイズする配列（ｉｉｉ）がＳｕｂ  Ａ配列（ｉｉ）とＣａｔの間に位置する場合、あるいは、ＰＡ内にあり標的がハイブリダイズする配列（ｉｉｉ）がＣａｔ  ＡとＭＢの間に位置する場合など、その他の配置を用いることも可能であることが認識されよう。当業者には、触媒酵素Ｄの切断部位が形成されることにより、標的核酸の成分がＰＡのＳｕｂ  Ａ配列の一部または全部とハイブリダイズすることも、ＰＡのＣａｔ  Ａ配列の一部または全部とハイブリダイズすることも妨げられることはないことが認識されよう。ＰＡが触媒酵素Ｄによって切断されることにより、それが選択的透過バリアを透過することが可能になるように修飾され得る（図１３Ｂに可動性支持体からのＣａｔ  Ａの遊離として示されている）。当業者であれば、図１３Ｂでは触媒酵素Ｄ（ここではエンドヌクレアーゼ）によるＰＡの切断によってＣａｔ  Ａが可動性支持体から遊離することが示されているが、ＰＡの切断がこれ以外のＰＡの特性１つまたは複数）、特に限定されないが、いずれも選択的透過バリアを透過する能力を与え得る電荷、サイズ、形状、重量、脂質溶解性などを含めた特性を変化させ得ることが認識されよう。遊離したＣａｔ  Ａは膜を透過し、ＰＢ内のＳｕｂ  Ｂと接触して切断する。ＰＢ内のＳｕｂ  Ｂの切断によりＣａｔ  Ｂが遊離し、次いでこれが選択的透過バリアを通過することが可能になり、また別のＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してさらに多くにＣａｔ  Ａを遊離させ、それにより交差触媒によるシグナル増幅カスケードを開始させる。
【０１７５】
当業者には、制限酵素およびそのサブタイプニッキング酵素に加えて、標的とＰＡ内の任意選択の標的特異的領域とのハイブリダイゼーション後にＰＡを切断することが可能な酵素がほかにも多数存在することが認識されよう。非限定的な例として、ＰＡが標的特異的領域内に例えば４つ以上のリボヌクレオチドを含む場合、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）を用いてカスケードを開始させることが可能である。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖内のＲＮＡの切断を触媒することができる非配列特異的エンドクレアーゼ（ｅｎｄｏｃｌｅａｓｅ）酵素である。標的ＳｕｂＺｙｍｅハイブリッドを形成させることにより、ＲＮアーゼＨ酵素によって切断可能なＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を生じさせる一方で、ＳｕｂＺｙｍｅおよび標的の他の一本鎖領域はインタクトにしておくことが可能である。
【０１７６】
２つ目の非限定的な例として、ＲＮＡまたｓｓＤＮＡ標的の存在下では、二本鎖特異的ヌクレアーゼ（ＤＳＮ）を用いてカスケードを開始させることが可能である。ＤＳＮは、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖および二本鎖ＤＮＡ内のＤＮＡの切断に対して強い選択性を示すが、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡに対しては本質的に不活性なヌクレアーゼ酵素である。標的とＳｕｂＺｙｍｅのハイブリッドを形成させることにより、ＤＳＮ酵素によって切断可能なＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を生じさせる一方で、ＳｕｂＺｙｍｅおよび標的の他の一本鎖領域はインタクトにしておくことが可能である。
【０１７７】
当業者には、制限酵素およびそのサブタイプニッキング酵素などのエンドヌクレアーゼに加えて、標的とのハイブリダイゼーション後にＰＡポリヌクレオチドを切断するのに使用し得る酵素がほかにも多数存在することが認識されよう。非限定的な例として、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＴ７などのエキソヌクレアーゼを用いてカスケードを開始させることができる。エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素は、平滑末端もしくは陥凹末端またはＤＮＡ二本鎖の３’末端からヌクレオチドを除去するが、一本鎖ＤＮＡに対しては活性を示さない。Ｔ７エキソヌクレアーゼは、ＤＮＡ二本鎖またはＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の５’末端からヌクレオチドを除去する。標的ｓｕｂＺｙｍｅハイブリッドを形成させることにより、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたはＴ７によって切断可能な二本鎖を生じさせる一方で、ｓｕｂＺｙｍｅの他の一本鎖領域をインタクトにしておくことが可能である。
【０１７８】
さらなる例示的実施形態
図２２に示される例示的スキームでは、透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）およびＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的検出後のシグナルを増幅する。この戦略は、２つの異なる種類のＳｕｂＺｙｍｅを用いる点で図４に示されるスキームとは異なる。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）は、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃ（１０−２３  ＭＮＡｚｙｍｅ）によって切断可能な基質（Ｓｕｂ  Ａ）と連結したＣａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）を含む。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）は、Ｃａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）によって切断される基質（Ｓｕｂ  Ｂ）とコンジュゲートしたＣａｔ  Ｂ１（１０：２３パートザイムＢ１）を含む。ＰＣはＣａｔ  Ｂ２（１０：２３パートザイムＢ２）を含む。チューブには、ＭＢ（磁気ビーズ）に付着したＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ）、ＰＣ、会合促進ＡＦ−Ｂ３、選択した標的に対するパートザイムＣ１とＣ２およびＴバッグ内のＭＢに付着したＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ２−ＭＢ）が入っている。標的の存在下では、パートザイムＣ１とＣ２が整列し開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。ＭＮＡｚｙｍｅがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してＣａｔ  Ａ（８−１７  Ｄｚ）をＭＢから分離し、それによりＣａｔ  ＡがＴバッグの壁を通過することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断し、それによりＭＢからパートザイムＣａｔ  Ｂ１を分離することができる。次にＣａｔ  Ｂ１が自由にＴバッグの内側から外側の溶液中に移動し、そこでＣａｔ  Ｂ２（ＰＣ）および会合促進ＡＦ−Ｂ３とハイブリダイズして活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができる。Ｃａｔ  ＢはＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、カスケードを継続することができる。一定時間インキュベートした後、磁石を用いて未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢおよび切断されたＭＢフラグメントを保持し、それにより、自由なＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ、パートザイムＢ１およびＢ２、ＰＣ、ＡＦ−Ｂ３、パートザイムＣ１およびＣ２ならびに標的を含んだ上清を標識された基質Ａおよび／またはＳｕｂ  Ｂの入った別のチューブに移すことができる。標識された基質のＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅ切断によりフルオロフォアと消光剤が分離した後に発生する蛍光をリアルタイムでモニターすることができる。
【０１７９】
図２３に示される例示的スキームでは、透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）およびＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的検出後のシグナルを増幅する。この戦略は、２つの異なる種類のＳｕｂＺｙｍｅを用いる点で図４に示されるスキームとは異なる。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）は、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃ（１０−２３  ＭＮＡｚｙｍｅ）によって切断可能な基質（Ｓｕｂ  Ａ）と連結したＣａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）を含む。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）は、Ｃａｔ  Ａ（８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ）によって切断可能なＳｕｂ  Ｂ（８−１７基質）とコンジュゲートしたＣａｔ  Ｂ１（１０：２３パートザイムＢ１）を含む。ＰＣは、Ｃａｔ  Ａによって切断可能な同じＳｕｂ  ＢとコンジュゲートしたＣａｔ  Ｂ２（１０：２３パートザイムＢ２）を含む。ＰＡ、ＰＢおよびＰＣは任意選択で、ビーズ、例えば図のように磁気ビーズ（ＭＢ）とコンジュゲートされている。チューブには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ）；ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ２−ＭＢ）、会合促進ＡＦ−Ｂ３、溶液中で自由な選択した標的に対するパートザイムＣ１とＣ２および図３Ｂに概説されるように構築したＴバッグ内のＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１−ＭＢ）が入っている。標的の存在下では、パートザイムＣ１とＣ２が整列し、開始ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。ＭＮＡｚｙｍｅ  ＣがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してＣａｔ  ＡをＭＢから分離し、それによりＣａｔ  ＡがＴバッグの壁を通過することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断し、それによりＭＢからＣａｔ  Ｂ１（パートザイムＢ１）を分離することができる。Ｃａｔ  Ａは、ＰＣのＳｕｂ  Ｂも切断してＣａｔ  Ｂ２（パートザイムＢ２）をＭＢから遊離させることができる。次にパートザイムＢ１が自由にＴバッグの内側から外側の溶液中に移動し、そこでパートザイムＢ２および会合促進ＡＦ−Ｂ３とハイブリダイズして、活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができる。Ｃａｔ  Ｂは、ＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断しカスケードを継続することができる。一定時間インキュベートした後、磁石を用いて未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断されたＭＢフラグメントを保持し、それにより、自由なＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ（Ｃａｔ  Ａ）、パートザイムＣ１、Ｃ２、Ｂ１およびＢ２、ＡＦ−Ｂ３ならびに標的を含んだ上清を標識されたＳｕｂ  Ａおよび／またはＳｕｂ  Ｂの入った別のチューブに移すことができる。標識された基質のＤＮＡｚｙｍｅおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅ切断によりフルオロフォアと消光剤が分離した後に発生する蛍光をリアルタイムでモニターすることができる。
【０１８０】
図２７に示される例示的スキームでは、透過性バリア（「Ｔバッグ」と呼ぶ）およびＳｕｂＺｙｍｅを用いて標的検出後のシグナルを増幅する。この戦略は、最初のインキュベーション時に反応チューブ内に蛍光標識した基質（Ｓｕｂ  Ａ−ＦＱ）が存在し、それにより反応が単一の段階に簡略化され、遊離したＤＮＡｚｙｍｅを第二のチューブに移す必要がなくなるという点で、図４、図２２および図２３に示されるスキームとは異なる。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）は、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃによって切断可能なＳｕｂ  Ａと連結したＣａｔ  Ａを含む。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ１）は、Ｃａｔ  Ａによって切断可能なＳｕｂ  ＢとコンジュゲートしたＣａｔ  Ｂ１（パートザイムＢ１）を含む。ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ２）は、Ｃａｔ  Ａによって切断可能な同じＳｕｂ  ＢとコンジュゲートしたＣａｔ  Ｂ２（パートザイムＢ２）を含む。ＰＡ、ＰＢおよびＰＣは、ビーズ、例えば図のように磁気ビーズ（ＭＢ）とコンジュゲートされている。Ｓｕｂ  Ａ−ＦＱは、フルオロフォアで５’標識し消光剤で３’標識したＳｕｂ  Ａを含み、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃによって切断可能である。透過性バリア（Ｔバッグ）を用いてＰＢ（Ｃａｔ  Ｂ１）をＰＣ（Ｃａｔ  Ｂ２）から分離することにより、会合促進因子  Ｂ３（ＡＦ−Ｂ３）との活性なＭＮＡｚｙｍｅ  Ｂ（Ｃａｔ  Ｂ）の形成が阻害されるため、Ｓｕｂ  Ａ−ＦＱとハイブリダイズすることができない。これにより反応中にＳｕｂ  Ａ−ＦＱが存在し、インキュベーション段階と検出段階を単一の段階にまとめることが可能になる。Ｓｕｂ  Ａ−ＦＱは、標的の存在下で開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）によって、またＰＢの切断時にＭＮＡｚｙｍｅ  Ｂ（Ｃａｔ  Ｂ）によってのみ切断され、Ｔバッグ内からＣａｔ  Ｂ２を遊離させることができる。チューブには、Ｓｕｂ  Ａ−ＦＱ、ＰＡ、ＰＣ、ＡＦ−Ｂ３、選択した標的に対するパートザイムＣ１とＣ２および図３Ｂに概説されるように構築したＴバッグ内のＰＢが入っている。標的の存在下では、パートザイムＣ１とＣ２が整列し、開始ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。ＭＮＡｚｙｍｅ  ＣがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してＣａｔ  ＡをＭＢから分離し、それによりＣａｔ  ＡがＴバッグの壁を通過することが可能になり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断し、それによりＭＢからＣａｔ  Ｂ１を分離することができる。Ｃａｔ  Ａは、ＰＣのＳｕｂ  Ｂも切断してＣａｔ  Ｂ２をＭＢから遊離させることができる。次にＣａｔ  Ｂ１が自由にＴバッグの内側から外側の溶液中に移動し、そこでＣａｔ  Ｂ２およびＡＦ−Ｂ３とハイブリダイズして、活性なＣａｔ  Ｂを形成することができる。Ｃａｔ  ＢはＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断しカスケードを継続することができる。インキュベーション時、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃ切断によりＳｕｂ  Ａ−ＦＱ内のフルオロフォアと消光剤が分離した後に発生する蛍光を測定することができる。別の実施形態では、ＰＢまたはＰＣをビーズに付着させる代わりに、会合促進因子、例えばＣａｔ  ＢのＡＦ−Ｂ３成分をビーズ、例えばＭＢに付着させてもよい。
【０１８１】
複数の酵素を用いて複数の標的を解析する方法
当業者には、本明細書に提供される方法を用いて、１つの反応で単一の標的を検出しても、単一の反応で複数の標的を検出してもよいことが認識されよう。複数の標的を検出する場合、アッセイおよび検出対象に応じて１つまたは複数のＭＮＡｚｙｍｅを使用し得る。例えば、複数の関連する構造、例えば、（ＭＮＡｚｙｍｅによって認識される）重要な配列は共通であり、例えば長さまたは重要な配列の外側にある配列のみが異なる１群の配列などを検出する場合、単一のＭＮＡｚｙｍｅで十分であると思われる。重要な配列を有する任意の配列を検出することが可能である。わずか１個のヌクレオチドが異なる関連配列を検出するか、場合によっては大きく異なる標的を検出する場合であって、それぞれの有無を明らかにすることが望まれる場合、複数のＭＮＡｚｙｍｅが有用であることが企図される。
【０１８２】
イオン化合物の検出
また別の戦略では、試料中（例えば、環境試料または生体試料中）のイオン化合物の不在を明らかにする、イオン化合物の存在を検出する、および／またはイオン化合物を定量化する方法が提供される。イオン化合物は一価イオンまたは二価イオンであり得る。イオン化合物は、触媒核酸酵素の活性に必要とされる金属イオン補因子であり得る。
【０１８３】
この方法は、本明細書に記載される分子複合体（分子スイッチ）と、スイッチを活性化させ、それにより検出可能なシグナルを発生させることが可能な少なくとも１つの追加の成分とを準備することを含む。追加の成分の機能的活性は、被験試料中のイオン化合物の存在に依存するものであり得る。例えば、この方法は、イオン化合物を含有することが疑われる試料を、ブロッカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、それにより機能的に不活性化される第一の触媒核酸酵素と、開始触媒核酸酵素（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、会合ＭＮＡｚｙｍｅまたはＭＮＡｚｙｍｅに会合することが可能な成分）とを含む分子スイッチと接触させることを含み得る。
【０１８４】
イオン化合物はさらに、複合体の第一の触媒核酸酵素の触媒作用に必要とされる補因子であり得る。
【０１８５】
したがって、この方法では、触媒作用に特定の金属イオン補因子を必要とする触媒核酸（例えば、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイム、アプタザイムおよび／またはＭＮＡｚｙｍｅ）を用いて、試料中（例えば、環境試料または生体試料中）の金属イオンの存在を検出する、または金属イオンの不在を明らかにし得る。例えば、この方法は、ＤＮＡｚｙｍｅを介して水などの環境試料中のＰｂ２＋を検出するのを促進し得る。
【０１８６】
アプタマー
当業者には、アプタマーを用いて本明細書に記載される方法を実施してもよく、前記アプタマーは、核酸以外の標的を含めた標的の検出、同定および／または定量化を促進し得るものであり得ることが容易に理解されよう。
【０１８７】
ＭＮＡｚｙｍｅを用いて非核酸実体を含めた標的を検出する方法が企図される。このような方法では、１つまたは複数のリガンドを認識する能力を有する核酸、タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドまたはその組合せを含み得るアプタマーを使用し得る。アプタマーは、標的リガンド、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは核酸、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、生体全体、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せ、あるいはその他の任意の実体と結合し得る。
【０１８８】
本明細書の好ましいアプタマーは、複雑な合成核酸またペプチドのライブラリーから吸着、回収および再増幅の反復工程により単離することができる短い一本鎖のＤＮＡオリゴマーもしくはＲＮＡオリゴマーまたはペプチドを含み得る。したがって、アミノ酸または抗生物質などの小分子からタンパク質および核酸構造にわたるほぼすべての標的／リガンドに対してアプタマーを作製し得る。いくつかの実施形態では、アプタマーは、例えば、好ましくは進化および選択技術によって作製される核酸結合分子を含む。アプタマーは、特に限定されないが、例えば上の表１によるヌクレオチド類似体を含めたＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子またはその両方の組合せを含み得る。
【０１８９】
当業者には、ＤＮＡｚｙｍｅ、リボザイムまたはいずれかのＭＮＡｚｙｍｅ成分にアプタマーを組み込み得ることが理解されよう。アプタマーと結合したＤＮＡｚｙｍｅおよびリボザイムは、当該技術分野ではアプタザイムとして知られている。このようなアプタザイムは、そのアプタマー成分に対して親和性を有するリガンドの存在によって、その触媒作用がオンまたはオフになり得る。さらに、パートザイムオリゴヌクレオチド成分のうちの１つまたは複数のものに複数のアプタマーを組み込むことができることが理解されよう。
【０１９０】
さらなる例示的実施形態では、アプタマー配列を標的分析物の存在下でのみ活性なＭＮＡｚｙｍｅが形成される立体配置でパートザイム（アプタ−パートザイム）の末端に組み込み得る。この場合、ＭＮＡｚｙｍｅ検出戦略のためのパートザイムとしては、標準的なパートザイム；一方の末端にアプタマーが組み込まれたパートザイムであるアプタ−パートザイム；（標的の存在下で）アプタ−パートザイムおよびパートザイムの両方を結合し、活性なＭＮＡｚｙｍｅの会合を可能にする会合促進因子；基質；ならびにアプタ−パートザイムの少なくともアプタマー配列の一部分およびパートザイム配列の一部分に及ぶ領域とハイブリダイズする会合阻害剤が挙げられる。標的の不在下では、会合阻害剤がアプタ−パートザイムと結合し、それによりレポータープローブ基質の結合（および切断）を遮断する。標的の存在下では、標的がアプタ−パートザイムのアプタマー配列と結合し、会合阻害剤の結合を防ぎ、ＭＮＡｚｙｍｅ基質の結合および切断を可能にする。このため、標的の存在下でのみ、活性なＭＮＡｚｙｍｅが形成されＭＮＡｚｙｍｅ基質を修飾することができる。
【０１９１】
不溶性の支持体を用いる方法
本発明の方法では一般に、ｓｕｂＺｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＭＮＡｚｙｍｅ成分（基質、パートザイムまたは会合促進因子／標的）などの１つまたは複数の反応成分を付着させる不溶性の支持体を使用し得ることも理解されるべきである。例えば、ＭＮＡｚｙｍｅを用いて標的を検出する方法であって、反応成分（例えば、ＳｕｂＺｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＭＮＡｚｙｍｅまたはその成分（１つまたは複数））を支持体に係留し得る方法が本明細書で企図される。支持体は、反応成分を保持し、それを反応混合物のバルク中での自由な移動から排除する不溶性の材料またはマトリックスであり得る。あるいは、支持体は、反応成分を保持するが、それが別の表面に固定されることがないため、別の方法で反応混合物中での反応成分の移動を可能にする不溶性の材料またはマトリックスであり得る。触媒核酸酵素、基質およびその他の成分を支持体／表面に固定化するのではなく、移動性の実体、例えばビーズ上に不動化させるシグナル増幅法を用いることには利点がある。例えば、ビーズは体積に対する表面積比が大きいため、係留する成分の表面密度を向上させることが可能になる。その他の利点としては、（ｉ）拡散を速めることによる反応速度の増大および（ｉｉ）最終的に試薬のコストを下げる反応体積の削減を促進し得る小型化が挙げられる。さらに、ビーズには、その生産および装置内への組込みの点で高い実用性がある。当業者には、マイクロアレイに使用するのに便利なビーズおよび反応条件に適合性のあるその他の材料を含めた様々な形態の多種多様なマトリックス、ポリマーなどから支持体を選択し得ることが理解されよう。ある特定の実施形態では、支持体は、プラスチックビーズもしくはプラスチックウエハなどのプラスチック材料、金属材料、磁性材料または特定のアッセイを実施するウェルもしくはチューブの材料であり得る。ある特定の実施形態では、支持体はマイクロ担体またはナノ担体であり得る。ある特定の実施形態では、支持体はコードされたものであり得る。
【０１９２】
方法の最適化
当業者には、標的の検出、同定および／または定量化を増強するため、様々な実験パラメータを用いて本明細書に記載される方法を最適化し得ることが容易に理解されよう。最適化する具体的な実験パラメータおよびこのような最適化のレベルは、用いる具体的方法ならびに検出、同定および／または定量化しようとする具体的な標的によって決まる。このようなパラメータとしては、特に限定されないが、時間、温度、ｐＨ、塩および緩衝剤の濃度および属性、オリゴヌクレオチド、補因子、界面活性剤、陽イオンおよび特に限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＥＤＴＡ、ＡＴＰ、グリセロールを含めたその他の試薬の濃度、ＭＮＡｚｙｍｅ、ＳｕｂＺｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、基質の核酸成分の相補性の長さ、ＧＣ含有量および融点（Ｔｍ）が挙げられる。
【０１９３】
いくつかの実施形態、例えば、特定の核酸配列を検出する上記の方法では、ＭＮＡｚｙｍｅ成分と、配列変異を含むまたは含まない標的核酸との結合を識別できるよう、その方法を実施する温度を含めた実験パラメータを最適化し得る。このような方法を実施し得る温度は、約２０℃〜約９６℃、約２０℃〜約７５℃、２０℃〜約６０℃または約２０〜約５５℃の範囲内にあり得る。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、本発明の方法を実施するのに最適化した反応を提供する。このように最適化した反応は、検出するシグナルを、最適化していない反応の最大１０％、２０％または３０％増大させる。より好ましい反応条件は、検出されるシグナルを少なくとも３５％または４０％、好ましくは最大５０％以上改善し得る。他の実施形態では、最適化した反応は、触媒作用を５０％超、最大で６６％、７５％または場合によっては１００％増大させ得る。さらに別の実施形態では、完全に最適化した反応方法によりシグナル検出の１００％、２００％または場合によっては３００％の増大が得られる。他の好ましい反応条件では、触媒作用を、最適化していない反応条件で実施する方法より最大１０００％以上改善することができる。本明細書に提供される方法を最適化するのに極めて好ましい反応条件として、特定の二価陽イオンを含めるというものがある。ほとんどの核酸酵素およびタンパク質核酸修飾酵素の触媒作用が、濃度依存性に二価陽イオンの濃度に影響され得る。好ましい最適化した反応は、Ｂａ２＋、Ｓｒ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｎｉ２＋、ＣＯ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋およびＰｂ２＋の１つまたは複数のものに最適化したものである。
【０１９５】
キット
本発明は、本明細書に開示される方法を実施するキットも提供する。本発明の方法を実施するキットは通常、その方法を実施するのに必要なあらゆる試薬を含む。
【０１９６】
キットは、本発明による任意の組成物またはその成分を含み得る。単なる非限定的な例として、キットは、触媒核酸酵素（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅおよび／またはそのパートザイム成分、ＤＮＡｚｙｍｅ、ＳｕｂＺｙｍｅ、アプタザイムならびに／あるいはリボザイム）を含み得る。キットは任意選択で、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを含み得る。
【０１９７】
キットは、本明細書で定義される細分化キットまたは組合せキットであり得る。細分化キットとは、別個の容器に納められた試薬を含むものであり、小型のガラス製容器、プラスチック製容器またはプラスチック製もしくは紙製の小板を含み得る。このような容器は、試料と試薬の相互汚染を避けながら試薬をある区画から別の区画を効率的に移し、各容器の薬剤または溶液をある区画から別の区画に定量的方法で添加することを可能にするものであり得る。このようなキットは、被験試料を入れる容器、アッセイに使用する試薬の入った容器、洗浄試薬の入った容器および検出試薬の入った容器も含み得る。本発明のキットは通常、キットの構成要素を用いて適切な方法を実施するための指示書も含む。本発明のキットおよび方法を、例えば特に限定されないが、リアルタイムＰＣＲ機器、分光光度計、電気化学プラットフォームまたは表面プラズモン共鳴プラットフォームを含めた自動解析装置およびシステムとともに用い得る。
【０１９８】
例えば、キットは、第一の容器と第二の容器とを含み得る。第一の容器は、触媒核酸および／またはその一部分（例えば、ＭＮＡｚｙｍｅ、ＤＮＡｚｙｍｅ、パートザイムオリゴヌクレオチドおよび／またはＳｕｂＺｙｍｅ）を含み得る。第二の容器は、触媒核酸基質ならびに／あるいは第一の容器の内容物とは異なる種類（１つまたは複数）の触媒核酸および／またはその一部分および／または異なる種類のＳｕｂＺｙｍｅを含み得る。キットは、本明細書で定義される細分化キットまたは組合せキットであり得る。
【０１９９】
キットは、例えば本発明の方法の実施に必要とされる洗浄試薬および／またはその他の試薬の入った１つまたは複数の容器も含み得る。
【０２００】
異なる標的の検出、同定または定量化という用途には、本発明の単一のキットを適用すること可能であり得るか、あるいは、例えば各標的に特異的な試薬の入った異なるキットが必要とされ得る。本発明の方法およびキットは、任意の実体を検出、同定または定量化するのが望ましい任意の状況に適用される。
【実施例】
【０２０１】
これより、以下の具体例を参照することにより本発明をさらに詳細に説明するが、これらの具体例は、決して本発明の範囲を限定するものとして解釈するべきではない。
【０２０２】
実施例１：材料および方法
配列およびアノテーション
以下の実施例では、多くの場合、配列識別番号（配列番号）により様々なヌクレオチド配列に言及する。以下の実施例で用いる具体的な配列を下の表２に記載する。
【０２０３】
【表２−１】
2020516294.tif 000005
【表２−２】
2020516294.tif 000006
ＮＢ：オリゴヌクレオチドの配列は５’から３’に向かって記載されており、大文字はＤＮＡ塩基を表し、小文字はＲＮＡ塩基を表す（ｒＧ、ｒＵおよびｒＡはＤＮＡｚｙｍｅ切断部位に対応するＲＮＡ塩基を表す）。ｉＦｌｕｏｒＴはチミンと結合した内部フルオレセインを表し、５ＴｅｘＲｄ−ＸＮはテキサスレッド標識を表し、ＲＨＯ１０１ＮはＡｔｔｏ  Ｒｈｏ  １０１フルオロフォアを表し、５６−ＦＡＭは５’ＦＡＭフルオロフォアを表す。ＺＥＮは内部消光剤分子を表し、３ＩＡＢｋＦＱおよび３ＩＡｂＲＱＳｐは３’Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ消光剤部分を表す。５２Ｂｉｏは５’二重ビオチン部分を表し、３ＢｉｏＴＥＧはトリエチレングリコールリンカーとコンジュゲートした３’ビオチン官能基を表し、３ＡｍＭＣ６Ｔは３’アミノモディファー（ｍｏｄｉｆｅｒ）を表し、３Ｐｈｏｓは３’リン酸部分を表す。
【０２０４】
試薬
ストレプトアビジン官能化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２７０）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入した。製造業者により記載されているストレプトアビジン官能化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ−２７０）の特徴および特性は以下の通りである：超常磁性親水性のビーズ表面、直径２．８μｍ、サイズ分布（ＣＶ＜３％）、ブロッキングタンパク質不使用、等電点ｐＨ４．５、高電荷（ｐＨ７で−５０ｍＶ）、鉄含有量１４％、高塩溶液中でのビーズ凝集性が低い。
【０２０５】
ストレプトアビジン官能化ＢｉｏＭＡＧ  Ｐｌｕｓビーズ（１．５μｍ）、ＰｒｏＭａｇビーズ（１μｍ）、ＰｒｏＭａｇ  ＨＰビーズ（３μｍ）およびＣＯＭＰＥＬ磁気ビーズ（６μｍおよび８μｍ）をＢａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した。製造業者により記載されているこれらのビーズの特徴および特性は以下の通りである：球状、ポリマーマトリックスに分散させた酸化鉄結晶、磁鉄鉱含有量はそれぞれ２６．５重量％、１６重量％、９０重量％超、５．７重量％および重量％、密度はそれぞれ１．８ｇ／ｃｍ３、１．４ｇ／ｃｍ３、２．５ｇ／ｃｍ３、１．１ｇ／ｃｍ３および１．１ｇ／ｃｍ３。ビーズは、５．０ｍｇ／ｍＬの固体として提供されるＢｉｏＭＡＧ  Ｐｌｕｓビーズを除いて、いずれも１％の固体（ｗ／ｖ）として提供されるものである。
【０２０６】
ＮａＯＨ（５Ｍ）をＡｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＡＣＲ）社から購入した。トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、ＮａＣｌ（５Ｍ）、ＭｇＣｌ２（１Ｍ）および無ヌクレアーゼ水をＡｍｂｉｏｎ社から購入した。１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩをＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。ニトロセルロース膜をＢｉｏ−Ｒａｄ社から購入し、ポリエーテルスルホン膜およびポリカーボネート膜をＳｔｅｒｌｉｔｅｃｈ社から購入し、両面粘着テープをＳｅｌｌｏｔａｐｅ社から購入した。
【０２０７】
ヒトゲノムＤＮＡをＰｒｏｍｅｇａ社から購入した（１９３ｎｇ／μＬ）。合成オリゴヌクレオチドをいずれもＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）社から購入し、無ヌクレアーゼ水を用い２０μＭストック溶液として調製した。下に記載する通りに標準的な組織培養技術を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）（ＣＴ）（血清型Ｄ）ＴＮＡ試料をｉｎ  ｖｉｔｒｏで得た。
【０２０８】
１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＧｉｂｃｏ（登録商標））および２０ｍＭグルタミン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）でヒト上皮細胞系（ＨＥｐ−２）（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２３（商標））を５％ＣＯ２、３７℃でインキュベートして増殖させた。
【０２０９】
クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）をＴ７５フラスコ（Ｎｕｎｃ（商標）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）に存在するＨＥｐ−２単層上に感染多重度（ＭＯＩ）１で接種した。遠心分離を用いた接種を５００ｇ、温度２８℃で３０分間実施することにより感染を完了させ、次いでインキュベートした。感染後（ＰＩ）４時間、ＤＭＥＭを交換し１ｍｇ／ｍＬのシクロヘキサミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加し、回収まで３７℃、５％ＣＯ２で再びインキュベートした。ＰＩ２４時間の対数増殖期にセルスクレーパーおよびスクロース−リン酸−グルタミン酸（ＳＰＧ）緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１０ｎＭリン酸ナトリウムおよび５ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸）を用いて細胞を手作業で回収した。回収した材料をのちの処理まで−８０℃で保管した。ＱＩＡａｍｐ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡｇｅｎ社）を標準的プロトコルに従って用い、全核酸試料（ＴＮＡ）を抽出した。
【０２１０】
ＳｕｂＺｙｍｅＢｅａｄ複合体（ＳｕｂＺｙｍｅ＿Ｂｅａｄ）の調製
下の実施例に記載するアッセイでは、以下の２種類のプロトコルのうちの１つを用いてビーズに付着させたＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ〜Ｋ（配列番号１〜１２）を用いた。実施例２〜７では付着法１（３Ａ）を用い、実施例１０〜１１および実施例１３〜２０では付着法２（３Ｂ）を用いた。ＳｕｂＺｙｍｅ配列がビーズに付着したものである場合、その名称には「−Ｂｅａｄ」が含まれる。ＳｕｂＺｙｍｅ配列が磁気ビーズに付着したものである場合、その名称には「−ＭＢ」が含まれる（例えば、磁気ビーズに付着したＳｕｂＺｙｍｅ  Ａは「ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ」と称される）。
【０２１１】
付着法１：磁気ビーズ（ＭＢ）が均一に分散するようＭ２７０  Ｄｙｎａｂｅａｄ保管バイアルをボルテックスして十分にかき混ぜた。Ｄｙｎａｂｅａｄｓを「洗浄緩衝液Ａ」（１００ｍＭ  ＮａＯＨ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ）１００μＬで２回、それぞれ３分間洗浄し、「洗浄緩衝液Ｂ」（１００ｍＭ  ＮａＯＨ）１００μＬで１回、３分間洗浄することにより３回洗浄して保存剤を除去し、あらゆるリボヌクレアーゼを変性させた。高特異的ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いて、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡおよびＳｕｂＺｙｍｅ  ＢをＭＢ上に不動化させた。洗浄したＭＢを、「インキュベーション緩衝液」（２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と５μＭのＳｕｂＺｙｍｅ  ＡまたはＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂとを含む最終体積５０μＬで１時間、室温にてインキュベートした。インキュベーション前とインキュベーション後に分光光度計（Ｔｒｉｎｅａｎ  Ｘｐｏｓｅ）を用いてＡ２６０でインキュベーション混合物を測定し不動化効率を求めた。インキュベーション溶液を取り出して捨て、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ複合体を十分に洗浄して過剰のＳｕｂＺｙｍｅ分子を除去した。５５℃の「インキュベーション緩衝液」２００μＬを用いた５分間の洗浄を３回、次いで、５５℃の「反応緩衝液」（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ）２００μＬを用いた５分間の洗浄を２回、連続して実施した。
【０２１２】
最後の洗浄溶液を収集し、未結合のＳｕｂＺｙｍｅ鎖が完全に除去されるよう相補的な基質２００ｎＭとインキュベートした。官能化ビーズを用いて、付着したＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ複合体の濃度を推定し、残ったＤＮＡｚｙｍｅ成分が触媒的に活性であることを確認することにより、品質管理試験を実施した。最後に、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを冷蔵庫に入れ乾燥状態で５℃にて保管した。
【０２１３】
付着法２：ビーズが均一に分散するようビーズ保管バイアルをボルテックスして十分にかき混ぜた。緩衝液Ｃ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）１５０μＬを用いてビーズを３回洗浄して保存剤を除去した。高特異的ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を用いて、ＳｕｂＺｙｍｅをビーズ上に不動化させた。洗浄したビーズを、「緩衝液Ｃ」（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）と１５０ｎＭのＳｕｂＺｙｍｅとを含有する最終体積５０μＬで５分間、室温にてインキュベートした。インキュベーション溶液を取り出して捨て、ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズ複合体を十分に洗浄して過剰のＳｕｂＺｙｍｅ分子を除去した。ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズを緩衝液Ｃ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）４００μＬで１回洗浄し、次いで、無ヌクレアーゼ水４００μＬで５回洗浄し、５５℃の「反応緩衝液」（４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ）１５０μＬで２回洗浄した。最後に、ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズを無ヌクレアーゼ水２０μＬに再懸濁させ、冷蔵庫で５℃にて保管した。磁気ラックを用いて磁気ビーズを洗浄して磁気ビーズを保持し、上清を捨てた。シリカビーズ溶液を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離することにより非磁気ビーズを洗浄してビーズをペレット化した後、上清を取り出して捨てた。
【０２１４】
透過性バリア（「Ｔバッグ」）の調製
下の実施例に記載する一部のアッセイでは、以下の２種類のプロトコルのうちの１つを用いて調製した透過性バリア（Ｔバッグ）を用いた。実施例２〜７ではＴバッグ法１（３Ａ）を用い、実施例１０〜２０ではＴバッグ法２（３Ｂ）を用いた。
【０２１５】
Ｔバッグ法１：一部の透過性バリア（Ｔバッグ）は、図３Ａに示される略図に従い、以下の材料、すなわち、ニトロセルロース膜（０．４５μｍ）、両面粘着テープおよびＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを用いて手作業で調製した。図３Ａに概説するように、ニトロセルロースのシート上に粘着テープ４片を配置して小さいウェルを作製した。ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ複合体を「不動化緩衝液」１０μＬで戻し、軽くたたいて再分散させた。ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ複合体溶液のアリコート１μＬを壁の内側に加え、室温で２分間乾燥させた。ウェルを小さい円形のニトロセルロースディスク（直径約７ｍｍ）で覆い、鋏でＴバッグをトリミングした。最後に、ディスク状のＴバッグを２ｍＬのエッペンドルフチューブの中に入れて保管した。
【０２１６】
Ｔバッグ法２：一部の透過性バリア（Ｔバッグ）は、図３Ｂに示される略図に従い、以下の材料、すなわち、ポリカーボネート材料またはポリエーテルスルホン材料（ＰＥＳ）でできた膜、両面粘着テープおよびＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズを用いて手作業で調製した。最初に、両面粘着テープを粘着側が折り畳まれ非粘着性のライナーが外表面に曝されるように二つ折りにした。穴開けパンチを用いて、折り畳んだ粘着テープに直径６ｍｍの小さいウェルの穴を開けた。片側のライナーを取り除いた後、粘着テープのウェルを膜片の上に置き、圧力を加えた後、粘着テープのもう片側の保護ライナーを取り除いた。ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズ複合体のアリコート（０．５μＬ）をウェルの内側に加え、室温で約３０秒間乾燥させた。ウェルをまた別の膜片で覆い、鋏でＴバッグを円形のディスクにトリミングした。最後に、ディスク状のＴバッグを２ｍＬのエッペンドルフチューブの中に入れて保管した。
【０２１７】
実施例２：合成ヒトＴＦＲＣ遺伝子ホモログの検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、ヒトＴＦＲＣ遺伝子に対する標的オリゴヌクレオチドホモログの存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。付着法１（実施例１）を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１（実施例１；図３Ａ）を用いてＴバッグを調製した。得られた結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。
【０２１８】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）、ＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）および標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ（配列番号１７）が含まれる。配列表に配列が記載されている。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２１９】
各反応には、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ  ５．６μＬ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを含むＴバッグ１つおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積１２５μＬで含まれている。反応は、最終濃度１ｐＭ、１００ｆＭ、１ｆＭおよび５００ａＭの標的ＴＦＲＣオリゴを含むか、標的を含まない（無ＤＮＡ対照）かのいずれかであった。反応を２ｍＬの反応チューブ（エッペンドルフ社）中、加熱ブロック上で１５分間（図５Ａ）または２０分間（図５Ｂ）、断続的に手で上下を反転させてかき混ぜながら５０℃でインキュベートした。
【０２２０】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグを取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、上清中に存在する切断された「自由な」ＤＮＡｚｙｍｅ１および２とを分離した。上清の４８μＬのアリコート２つを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の別個のウェルに移した。これらのウェルそれぞれに二重標識した等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂを含有する基質混合物２μＬを加えた（図５Ａおよび５Ｂの最終濃度はそれぞれ０．１５μＭおよび０．２μＭ）。ストリップキャップ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてプレートを密閉し、短時間遠心分離した後、蛍光の変化をリアルタイムで４５分間モニターした。
【０２２１】
図５Ａに示される結果には、１ｐＭのＯｌｉｇｏ  ＡＦ−ＴＦＲＣ（細い二重線）、１００ｆＭのＡＦ−ＴＦＲＣ（破線）および無標的（太い黒線）から得られたシグナルが示されている。リアルタイムモニタリングの１０分後の位置にある縦線は、２５分間の総反応時間（すなわち、１５分間のＴバッグインキュベーションと１０分間のリアルタイムモニタリング）に相当し、１ｐＭおよび１００ｆＭの標的の検出に要した時間を示している。図５Ｂに示される反応は、２０分間インキュベートしたものであり、標的を含まない（太い黒線）か、１００ｆＭのＡＦ−ＴＦＲＣ（細い二重線）、１ｆＭのＡＦ−ＴＦＲＣ（点線）または０．５ｆＭのＡＦ−ＴＦＲＣ（破線）のいずれかを含むものである。この実験では、得られた検出限界は１００ｆＭであり、これより低い標的濃度（１ｆＭおよび５００ａＭ）では、バックグラウンド（無標的での反応）を上回るシグナルは得られなかった。
【０２２２】
以上の結果は以下のシナリオと一致する。標的オリゴヌクレオチドの存在下では、パートザイムが整列しＭＮＡｚｙｍｅを形成する。ＭＮＡｚｙｍｅが溶液中のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢを切断し、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅをＭＢの表面から分離させる。次いで、「自由な」８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグの選択的透過膜を通って移動できるようになり、そこでＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを切断し、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅをＭＢの表面から分離させる。次いで、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅが自由にＴバッグの透過膜から出て溶液中に移動し、そこでＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢを切断し、カスケードを継続することができる。一定時間インキュベートした後、磁石を用いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、切断された「自由な」ＤＮＡｚｙｍｅとを分離する。
【０２２３】
ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いてテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で５秒毎に計２０１サイクルまたは１５０サイクルにわたって取得を実施した（それぞれ図５Ａおよび５Ｂ）。図５Ａおよび５Ｂの結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。図５は、オリゴヌクレオチド標的の例示的漸増を示している。この実験では、濃度１ｐＭおよび１００ｆＭは容易に検出されたが、濃度１ｆＭおよび５００ａＭではバックグラウンド（無標的）を上回るシグナルが得られなかった。
【０２２４】
実施例３：合成ヒトＴＦＲＣ遺伝子ホモログの検出およびオフターゲット配列の解析
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、最初にヒトＴＦＲＣ遺伝子に相同な標的オリゴヌクレオチドの存在下で標的を検出してシグナルを増幅し、次に、オフターゲット配列（カルバペナム耐性細菌およびクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）にそれぞれ相同なＢｌａ＿ＫＰＣ遺伝子およびＣＴｃｄｓ２＿２遺伝子）を解析して反応の特異性を検討した。付着法１（実施例１）を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１（実施例１；図３Ａ）を用いてＴバッグを調製した。この実験の結果を図６に示す。
【０２２５】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）、ＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）、標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ（配列番号１７）、オフターゲットＯｌｉｇｏ  Ｂｌａ＿ＫＰＣ（配列番号１８）およびオフターゲットＯｌｉｇｏ  ＡＦ−ＣＴｃｄｓ２＿２（配列番号１９）が含まれる。配列表に配列が記載されている。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２２６】
各反応には、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、２．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積１２５μＬで含まれていた。反応にはさらに、１ｐＭの標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ、１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  Ｂｌａ＿ＫＰＣまたは１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  ＣＴｃｄｓ２＿２が含まれているか、ＤＮＡ標的が含まれていないかのいずれかであった。反応を２ｍＬの反応チューブ中、加熱ブロック上で２０分間、断続的に手で上下を反転させてかき混ぜながら５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグを取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、切断された「自由な」ＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコート２つを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、各ウェルに等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂ（最終濃度０．１５μＭ）を含有する基質混合物２μＬを加えた。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。プレートをＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に設置し、５０℃の一定温度で５秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。テキサスレッドのチャンネルの蛍光をリアルタイムでモニターした。図６に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。
【０２２７】
図６の結果は、無標的対照（黒色の実線）、１ｐＭのマッチするＴＦＲＣ標的（細い二重線）を含有する反応および１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  Ｂｌａ−ＫＰＣオリゴ（点線）または１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  ＣＴ＿ＣＤＳ（破線）を含有する２つの反応を含む４種類の反応を示している。
【０２２８】
図６に示される結果から、Ｔバッグシグナル増幅反応は特異性が高く、マッチする核酸配列（標的会合促進因子）とともに形成されるＭＮＡｚｙｍｅの存在下でのみ誘発されることがわかる。この実験では、ヒトゲノムＤＮＡ（ＴＦＲＣ遺伝子）を検出するよう設計したＴバッグアッセイに細菌遺伝子（Ｂｌａ−ＫＰＣおよびＣｔ−Ｃｄｓ２）と相同な高濃度の合成オリゴヌクレオチドを加えた。結果から、細菌オリゴヌクレオチドの添加によってカスケードが誘発されることはなく、バックグラウンドシグナル（無標的対照）を上回るシグナルは発生しないことがわかる。
【０２２９】
実施例４：異なる標的配列の検出へのアッセイの適合
この実験では、図４に概説される戦略を任意の核酸標的の検出に容易に適合させ得ることがわかった。実施例１（３Ａ）に記載される通りに、付着法１を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１を用いてＴバッグを調製した。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２３０】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＯＸＡパートザイムＡ（配列番号２０）、ＯＸＡパートザイムＢ（配列番号２１）および標的ＯＸＡ  Ｏｌｉｇｏ（配列番号２２）が含まれる。配列表に配列が記載されている。
【０２３１】
各反応には、０．２μＭ  ＯＸＡパートザイムＡ、０．２μＭ  ＯＸＡパートザイムＢ、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、２．４５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積１２５μＬで含まれていた。反応を２ｍＬの反応チューブ中、加熱ブロック上で２０分間、断続的に手で上下を反転させてかき混ぜながら５０℃でインキュベートした。反応には、１０ｐＭの標的ＯＸＡ  Ｏｌｉｇｏが含まれているか、ＤＮＡが含まれていないかのいずれかであった。
【０２３２】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、切断され溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコート２つを９６ウェルプレートの別個のウェルに移し、各ウェルに等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質２μＬを加えた。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で５秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。図７に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、ＯＸＡ標的の存在下での強いシグナルを示している。この実験で、実施例３でＴＦＲＣを検出したプロトコルに施した唯一の変更が、ＴＦＲＣではなくＯＸＡに特異的な標的結合アームを有するＭＮＡｚｙｍｅを使用したことであることから、ＳｕｂＺｙｍｅを用いる増幅カスケードが任意の標的核酸の検出に汎用できるものであることがわかる。
【０２３３】
実施例５：ヒト血清存在下でのヒトゲノムＤＮＡのヒトＴＦＲＣ遺伝子検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ内にヒトＴＦＲＣ遺伝子の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。さらに、１０％ヒト血清の存在が反応に影響を及ぼすかどうかを明らかにすることを目的とした。付着法１（実施例１）を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１（実施例１）を用いてＴバッグを調製した。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２３４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）およびＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）が含まれる。配列表に配列が記載されている。
【０２３５】
各反応には、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積７０μＬで含まれていた。反応には、９５℃で２分間熱変性させたゲノムＤＮＡ  ７７２ｎｇも含まれていた。予め７０℃で５分間加熱してあらゆるリボヌクレアーゼを変性させたヒト血清７μＬの不在下（図８Ａの反応）または存在下（図８Ｂの反応）で反応を実施した。
【０２３６】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢおよび部分的な切断基質Ａ−ＭＢフラグメントと、切断され溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。各反応の４８μＬの上清のアリコート１つを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、次いで、等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質２μＬと混合し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１１１サイクルにわたって取得を実施した。
【０２３７】
図８Ａに示される結果から、この方法によって約２２３，５００コピーの遺伝子（２×１０５の遺伝子コピー）に相当するヒトゲノムＤＮＡ７７２ｎｇにヒトＴＦＲＣ遺伝子（実線）を検出することが可能であることがわかる。シグナルには無ｇＤＮＡ対照（破線）と十分な差がみられる。１０％血清が含まれていた反応（図８Ｂ）は、血清の不在下で実施した反応とほぼ同じであり、この方法が血清の混入に耐え得るものであることが示唆された。
【０２３８】
実施例６：３種類のパートザイムを用いたヒトゲノムＤＮＡのヒトＴＦＲＣ遺伝子検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、ヒトゲノムＤＮＡ中に存在するヒトＴＦＲＣ遺伝子から標的を検出し、シグナルを増幅した。この実施例では、ＴＦＲＣ遺伝子の異なる領域で会合する３種類のＭＮＡｚｙｍｅ（６種類のパートザイム）を用いて反応を誘発した。実施例１に記載した通りに、付着法１を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１を用いてＴバッグを調製した。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。パートザイムＡ２およびＢ２はＴＦＲＣ標的上で会合すると第二の開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｅ）を形成し、パートザイムＡ３およびＢ３はＴＦＲＣ標的上で会合すると第三の開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｆ）を形成する。
【０２３９】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）、ＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）、ＴＦＲＣパートザイムＡ２（配列番号２３）、ＴＦＲＣパートザイムＢ２（配列番号２４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ３（配列番号２５）およびＴＦＲＣパートザイムＢ３（配列番号２６）が含まれる。配列表に配列が記載されている。
【０２４０】
反応には、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ２、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ２、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ３、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ３、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積７０μＬで含まれていた。反応には、反応に加える前に９５℃で２分間変性を実施したヒトゲノムＤＮＡも含まれているか、含まれていなかった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、断続的に手で上下を反転させてかき混ぜながら５０℃でインキュベートした。
【０２４１】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ａ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質２μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１２０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２４２】
図９に示される結果は、Ｔバッグ形式でシグナル増幅を用いてヒトゲノムＤＮＡのヒトＴＦＲＣ遺伝子を検出した結果を示している。実験はヒトゲノムＤＮＡ（２８０，０００または２．８×１０５の遺伝子コピー）の存在下（実線）または不在下（点線）で実施した。
【０２４３】
実施例７：ヒトゲノムＤＮＡのヒトＴＦＲＣ遺伝子の検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、最初にヒトＴＦＲＣ遺伝子の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。実施例１に記載した通りに、付着法１を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを調製し、Ｔバッグ法１を用いてＴバッグを調製した。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＡはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＢはＰＢであり、パートザイムＡ１およびＢ１はＴＦＲＣ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２４４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ）（配列番号２）、基質Ａ（配列番号１３）、基質Ｂ（配列番号１４）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）およびＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）が含まれる。配列表に配列が記載されている。
【０２４５】
各反応には、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、２．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｂ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積１２５μＬで含まれている。反応エーテルには、ゲノムＤＮＡが含まれていないか、あるいは９５℃で２分間熱変性させたヒトゲノムＤＮＡ９６５ｎｇまたは５７９ｎｇが含まれていた。反応を２ｍＬの反応チューブ中、加熱ブロック上で２０分間、断続的に手で上下を反転させてかき混ぜながら５０℃でインキュベートした。実験は、９６５ｎｇ（実線）もしくは５７９ｎｇ（破線）のヒトゲノムＤＮＡの存在下、またはヒトゲノムＤＮＡの不在下（点線）で実施した。
【０２４６】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ａ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコート２つを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の別個のウェルに移し、等モル濃度の基質Ａおよび基質Ｂ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質２μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で５秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。図１０は、Ｔバッグ形式でシグナル増幅を用いたこのヒトゲノムＤＮＡの例示的漸増を示している。この実験では、濃度２７０，０００コピーおよび１６８，０００コピーのＴＦＲＣ遺伝子がバックグラウンドシグナル（無標的）を上回って検出された。
【０２４７】
実施例８：８−１７触媒核酸と１０−２３触媒核酸の組合せによる安定性の改善
この実験では、２種類の例示的ＳｕｂＺｙｍｅの長期安定性を比較した。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａは、８−１７触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸基質成分とからである。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃは、１０−２３触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸基質成分とからなる。得られた結果を図１１に示す。
【０２４８】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ）（配列番号１）、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃ）（配列番号３）、ＴＦＲＣパートザイムＡ１（配列番号１５）、ＴＦＲＣパートザイムＢ１（配列番号１６）、標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ（配列番号１７）、標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ  ４（配列番号２７）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ（配列番号２８）が含まれる。配列表に配列が記載されている。
【０２４９】
ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃは１０−２３触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸基質成分とからなり、基質成分は内部フルオレセインと２つの内部ＺＥＮ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ部分とを含む。反応Ａ、Ｂ、ＣおよびＤには、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＡ１、０．２μＭ  ＴＦＲＣパートザイムＢ１、０．２μＭ  ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃ、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終反応体積２０μＬで含まれている。いずれの反応もＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５２℃にて二重反復で実施し、ＦＡＭチャンネルで蛍光を測定し、反応ＡおよびＢについては計２０１サイクル、反応ＣおよびＤについては２００サイクルにわたって、５秒毎に取得を実施した（スキャンモード：ＳＹＢＲ／ＦＡＭのみ）。反応ＡおよびＣには標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏが含まれていない。反応Ｂには１５８１ｐｇ（５ｎＭ）の標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏ  ４が含まれ、反応Ｄには５１２ｐｇ（２ｎＭ）の標的ＴＦＲＣ  Ｏｌｉｇｏが含まれている。
【０２５０】
ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａは８−１７触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸基質成分とからなり、基質成分は内部フルオレセインと２つの内部ＺＥＮ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ部分とを含む。反応Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨには、０．２μＭ  ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａ、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終反応体積２０μＬで含まれている。いずれの反応もＢｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ９６サーモサイクラーで５０℃にて二重反復で実施し、ＦＡＭチャンネルで蛍光シグナルを測定し、５秒毎に計２０１サイクルにわたって取得を実施した（スキャンモード：全チャンネル）。反応ＥおよびＧには開始ＤＮＡｚｙｍｅが一切含まれておらず、反応ＦおよびＨにはそれぞれ５０３ｐｇ（２．５ｎＭ）の開始ＤＮＡｚｙｍｅが含まれている。
【０２５１】
反応ＡおよびＢの結果を図１１Ａに示し、これらは、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃオリゴヌクレオチドを戻した直後に実施したインキュベーションでの１０−２３ＭＮＡｚｙｍｅによるＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃの基質成分の標的依存性の切断を示している。反応Ｂでの切断事象によって内部フルオロフォアと消光剤の物理的分離が起こり、蛍光の経時的増大がみられる。反応Ａでは切断事象はみられず、蛍光の経時的増大は最小限にとどまっている。図１１Ｂに示される結果は、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃを−２０℃で４３日間保管した後も、その基質成分が標的依存性に切断されたことを示している。反応ＣおよびＤでは、保管期間中のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｃの自己切断および／または分解を示すＦＡＭシグナルの経時的増大がみられる。図１１に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。
【０２５２】
反応ＥおよびＦの結果を図１１Ｃに示し、これらは、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａオリゴヌクレオチドを戻した直後に実施したインキュベーションでの１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅによるＳｕｂＺｙｍｅ  Ａの基質成分の切断を示している。反応Ｆでの切断事象によって内部フルオロフォアと消光剤の物理的分離が起こり、ＦＡＭシグナルの経時的増大がみられる。反応Ｅでは切断事象はみられず、ＦＡＭシグナルの経時的増大は最小限にとどまっている。図１１Ｄに示される結果は、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａを−２０℃で５か月にわたって保管した後も、その基質成分がＤＮＡｚｙｍｅによって切断されたことを示している。反応ＧおよびＨでは、それぞれ反応ＥおよびＦと同程度のシグナルがみられた。このことは、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ａが保管期間中に分解も自己切断もしなかったことを示している。この安定性の改善は、８−１７触媒核酸成分と１０−２３触媒核酸成分とを含む設計によるものであると考えられる。図１１に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。
【０２５３】
実施例９：ＳｕｂＺｙｍｅの平面マイクロアレイスライド上への不動化
以下の実施例では、ＳｕｂＺｙｍｅを平面状（不動性）の表面に係留する際に直面するが、特に限定されないが磁気ビーズを含めた可動性の三次元表面にＳｕｂＺｙｍｅを係留する際には明らかではなかったいくつかの問題点に注目する。この実験では、スライドガラス上に不動化させた後のＳｕｂＺｙｍｅの活性をモニターする。不動化させたＳｕｂＺｙｍｅ（反応Ｂ）の活性を係留していない（自由な）ＤＮＡｚｙｍｅ（反応Ａ）と比較し、得られた結果を図１２に示す。
【０２５４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｄ（配列番号４）、基質Ｃ（配列番号２９）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂ（配列番号３０）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２５５】
Ｓｔｒａｌｉｓ−Ｐａｖｅｓｅら（２０１１），Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１１；６（５）：６０９−２４に記載されている洗浄方法に従って洗浄したブランクアルデヒドスライドを用いて対照反応（反応Ａ）を実施した。同じくＳｔｒａｌｉｓ−Ｐａｖｅｓｅら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，６（５），６０９−６２４に記載されている方法を用いてＳｕｂＺｙｍｅ  Ｄで官能化したＶＳＳ−２５  Ｖａｎｔａｇｅ  Ｓｉｌｙａｔｅｄ  Ａｌｄｅｈｙｄｅスライド上で試験反応（反応Ｂ）を実施した。各反応には、０．４μＭ基質Ｃ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ−２０、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩが最終体積２５μＬで含まれている。反応Ａには、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｄの触媒核酸成分に相同な５０ｎＭのＤＮＡｚｙｍｅ  Ｄが含まれていた。いずれの反応もスライド上に置いたＨｙｂｒｉｗｅｌｌ付着チャンバ（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ社、６１１２０４）内で実施した。スライドを５４℃に設定した加熱ブロック上でインキュベートした。３０分間のインキュベーションの前と後にＬｅｉｃａ蛍光顕微鏡を以下の設定；ＧＦＰ２発光、ＰＭＴ  Ｇａｉｎ設定３．５および露出時間５９．７秒で用いて蛍光を測定した。Ｉｍａｇｅ  Ｊ解析ソフトウェアを用いて画像を処理し、ここでは、８ビット緑色チャンネルを分離し、ＲＧＢ値を測定した。その画像を図１２Ａおよび図１２Ｂに示す。図１２Ｃには相対ＲＧＢ値をプロットし、この図では、「インキュベーション後」のＲＧＢ値から「インキュベーション前」のＲＧＢ値が減算されている。
【０２５６】
図１２Ａに示される結果は、対照ＤＮＡｚｙｍｅと基質を５４℃でインキュベートする前には最小の蛍光が観察され、３０分間のインキュベーション後には強い傾向が発生したことを示している。図１２Ｂに示される結果は、不動化させたＳｕｂＺｙｍｅ  Ｄを含むスライドでは３０分間のインキュベーション後も顕著な蛍光の増大はみられなかったことを示している。不動化させたＳｕｂＺｙｍｅは、平面状の表面に十分なＳｕｂＺｙｍｅが係留されなかった、かつ／またはＳｕｂＺｙｍｅを平面状のガラス表面に不動化させると触媒活性がなくなるという理由を含めたいくつかの理由により、基質を加水分解することができないものと思われる。
【０２５７】
実施例１０：ニッキングエンドヌクレアーゼを用いた開始の第一段階の実証
この実験では、図１３Ｂに概説される戦略を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同な合成オリゴヌクレオチド標的の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。この実施例では、ＭＮＡｚｙｍｅに代わる生化学的トリガーとしてニッキングエンドヌクレアーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩを用いて反応を誘発した。目的とする標的に相補的であるとともにニッキングエンドヌクレアーゼのニッキング部位を含む標的特異的配列を含むようＳｕｂＺｙｍｅを設計した。
【０２５８】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｅ）（配列番号５）、基質Ｄ（配列番号３１）および標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  １（配列番号３２）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｅを実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させる（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｅ−ＭＢ）。
【０２５９】
いずれの反応にも、１×ＮＥＢ緩衝液３．１、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｅ−ＭＢが最終体積５５μＬで含まれていた。反応Ａには、４単位のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩと２ｎＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏ  １が含まれていた。反応Ｂには、２ｎＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏ  １が含まれ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩは含まれていなかった。反応Ｃには、４単位のＮｔ．ＢｓｔＮＢＩが含まれ、標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏ  １は含まれていなかった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５５℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、試料を短時間遠心分離した。反応溶液の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、０．２μＭ（最終濃度）の基質Ｄを含有する基質２μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でＦＡＭのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２６０】
図１４に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものである。ｏｍｐＡ標的およびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの存在下ではＦＡＭのチャンネルの強いシグナルが明白であった。Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩおよび／またはｏｍｐＡ標的の不在下ではシグナルは検出されなかった。このことは、標的とＳｕｂＺｙｍｅが結合してＮｔ．ＢｓｔＮＢ１に対する二本鎖制限酵素認識部位が上手く形成され、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩがＳｕｂＺｙｍｅ鎖の切断を触媒することが可能になり、それによりビーズから活性な８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅが遊離したことを示している。ｏｍｐＡ標的の不在下でもＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの不在下でもシグナルは発生せず、標的が誘導するＤＮＡｚｙｍｅの遊離にはその両方が必要であることが確認された。標的鎖はニッキングエンドヌクレアーゼによって切断されることがないため、依然として再利用されて他のＳｕｂＺｙｍｅとハイブリダイズし、それによりさらにＤＮＡｚｙｍｅを遊離することが可能である。このことは、シグナル発生を増強し標的検出感度を増大させる機序となり得る。結果から、ＭＮＡｚｙｍｅおよびニッキングエンドヌクレアーゼなどの制限酵素を含めた様々な異なる生化学的トリガーを使用して、Ｓｕｂｚｙｍｅを用いて表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させる増幅カスケードを開始させることが可能であることがわかる。
【０２６１】
実施例１１：ＤＮＡｚｙｍｅ−ＳｕｂＺｙｍｅ、ＭＢおよびポリカーボネート膜の空間的閉込めおよび拡散
この実施例では、図１５に概説される戦略を用いて、ＳｕｂＺｙｍｅ−ビーズが様々な孔径の半透膜を通って拡散するか、そのような半透膜に保持される能力の間の関係を明らかにした。次に、この戦略を用いて、自由なＤＮＡｚｙｍｅが膜を通ってＴバッグ内に拡散し、次いでＳｕｂＺｙｍｅ内の基質領域を切断して表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させる能力を明らかにした。さらに、自由になったＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグから出て拡散し、蛍光基質を切断してシグナルを発生させることができるかどうかを明らかにすることも目的とした。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させる（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−ＭＢ）。図３Ｂに記載される略図に従い、ポリカーボネート膜を用いて、Ｔバッグの構築に用いる透過性バリアを手作業で調製した。様々なビーズ径（２．８μｍ、６μｍおよび８μｍ）のＭＢおよび２種類の異なる膜孔径（０．８μｍおよび２．０μｍ）を用いて反応を実施した。
【０２６２】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ（配列番号６）、基質Ｅ（配列番号３３）および開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ（配列番号２８）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２６３】
反応には１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−ＭＢが含まれるポリカーボネート材料でできた１×Ｔバッグ（０．８μｍまたは２μｍ）が含まれていた。反応には、２ｎＭのＤＮＡｚｙｍｅ  Ａが含まれているか、含まれていないかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、試料を短時間遠心分離した。反応溶液の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質Ｅ  ２μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２６４】
図１６Ａ〜１６Ｆに示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、開始ＤＮＡｚｙｍｅの不在下ではシグナルがほとんどみられない。このことは、磁気ビーズの直径が膜の孔径より大きい場合、ＳｕｂＺｙｍｅは磁気ビーズに係留されている間、Ｔバッグ膜を通って拡散することができないことを示している。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルが観察されたことから、開始ＤＮＡｚｙｍｅはＴバッグ内に拡散し、Ｓｕｂｚｙｍｅ−ＭＢを切断し、表面結合ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂを遊離させることができることがわかる。このことからさらに、遊離したＤＮＡｚｙｍｅ  ＢはＴバッグから出て拡散することが可能であり、上清とともに新たなチューブに移すと、遊離したＤＮＡｚｙｍｅ  Ｂは蛍光標識基質分子Ｅを切断することができることがわかる。様々な磁気ビーズ径（２．８μｍ、６μｍおよび８μｍ）および様々な孔径（０．８μｍおよび２．０μｍ）で同様の結果がみられる。
【０２６５】
実施例１２：ＰＥＳ膜によりＳｕｂＺｙｍｅおよびＤＮＡｚｙｍｅの活性を増強することができる
以下の実施例では、Ｔバッグの構築への様々な膜材料の使用を実験的に試験して、材料そのものが反応構成要素の触媒活性に影響を及ぼし得るかどうかを明らかにすることの重要性に注目する。さらに、この実施例では、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）などの一部の膜材料の存在がＤＮＡｚｙｍｅの触媒活性を増強し得ることを示す。
【０２６６】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ）（配列番号７）、基質Ｆ（配列番号３４）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（配列番号３５）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。この実施例では、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させる（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ−ＭＢ）。
【０２６７】
反応には、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１μＬ  ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ−ＭＢ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれており、かつ２ｎＭのＤＮＡｚｙｍｅ  Ｃが含まれていないか、含まれているかのいずれかであった。反応は、２×３ｍｍのＰＥＳ膜のディスクを含むか、含まないかのいずれかであり、２ｍＬチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、試料を短時間遠心分離した。磁気ラックを用いて磁気ビーズ（未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ−ＭＢおよび切断されたＳｕｂＺｙｍｅ  Ｇ−ＭＢのＭＢ−部分的基質）を保持し、反応溶液の４５μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質Ｆ  ５μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。ＰＥＳ膜を捨てた。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。いずれの反応も二重反復で実施し、その結果を図１７に示す。
【０２６８】
この実験では、ＤＮＡｚｙｍｅのＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢ切断反応にＰＥＳ膜を加えることにより、ＤＮＡｚｙｍｅの活性が増強されるように思われる。このことは、ＰＥＳ膜を含む反応の方が膜を含まない反応よりも蛍光の経時的増大が速いという形で観察された。このことは、蛍光基質が磁気ビーズの表面から遊離すると、ＤＮＡｚｙｍｅによる蛍光基質の切断が速くなることを示している。
【０２６９】
実施例１３：代替的Ｔバッグ材料の実証
この実験では、図１５に概説される戦略を用いて、Ｔバッグの構築に代替的半透膜としてポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）を用いるＴバッグ概念の普遍性を明らかにした。さらに、その目的を、ＰＥＳ膜を用いてＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢの閉込め、ＤＮＡｚｙｍｅの拡散および表面結合ＤＮＡｚｙｍｅの遊離が可能であるかどうかを明らかにすることとした。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させる（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ＰＥＳ膜を用いてＴバッグを手作業で調製し、様々な膜孔径（０．６５μｍ、０．８μｍおよび１．２μｍ）を用いて反応を実施した。
【０２７０】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ）（配列番号６）、基質Ｅ（配列番号３３）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ（配列番号２８）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２７１】
反応には１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、０．６μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−ＭＢが含まれているＰＥＳ材料でできた１×Ｔバッグ（０．６５μｍ、０．８μｍまたは１．２μｍ）が含まれていた。反応には、２ｎＭのＤＮＡｚｙｍｅ  Ａが含まれているか、含まれていないかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、試料を短時間遠心分離した。反応溶液の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質Ｅ  ２μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２７２】
図１８Ａ〜１８Ｃに示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの不在下ではシグナルがほとんどみられない。このことは、ＳｕｂＺｙｍｅが、磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ２７０  ２．８μｍ）に係留されている間はＰＥＳ膜を通って拡散することができないことを示している。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルがみられ、開始ＤＮＡｚｙｍｅがＰＥＳ膜でできたＴバッグの中に拡散し、次いでＳｕｂＺｙｍｅを切断し、表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させることができることがわかる。また、遊離したＤＮＡｚｙｍｅがＰＥＳ  Ｔバッグから出て拡散し、蛍光標識基質分子を切断することが可能であることもわかる。孔径が異なる（０．６５μｍ、０．８μｍおよび１．２μｍ）膜で同様の結果が観察され、孔径がＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢの直径より小さいものである限り、孔径はそれほど重要ではないことがわかる。図１８に示される結果は、ＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢを封入し他の反応成分から物理的に分離するのにＰＥＳなどの代替膜を用いることができることを示している。
【０２７３】
実施例１４：クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子ホモログの検出およびオフターゲット配列の解析
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同な合成オリゴヌクレオチド標的の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅して、この戦略が任意の核酸標的の検出に容易に適合され得ることを示す。第二の目的は、オフターゲット配列（ヒト遺伝子に相同なＰＰＩＡ遺伝子およびｐ２７３遺伝子）を解析して反応の特異性を検討することである。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ）およびＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。得られた結果を図１９に示す。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＨはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＩはＰＢであり、ｏｍｐＡパートザイムＡ１およびＢ１はｏｍｐＡ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２７４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ）（配列番号８）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ）（配列番号９）、基質Ｇ（配列番号３６）、基質Ｈ（配列番号３７）、ｏｍｐＡパートザイムＡ１（配列番号３８）、ｏｍｐＡパートザイムＢ１（配列番号３９）、標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（配列番号４０）、オフターゲットＯｌｉｇｏ  ｐ２７３（配列番号４１）およびオフターゲットＯｌｉｇｏ  ＰＰＩＡ（配列番号４２）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２７５】
反応には、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積７０μＬで含まれていた。Ｔバッグは孔径０．８μｍのポリカーボネート膜製のものとした。反応には、最終濃度１００ｆＭ、１０ｆＭおよび１ｆＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏ  ２、１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  ｐ２７３または１ｎＭのオフターゲットＯｌｉｇｏ  ＰＰＩＡが含まれているか、標的が含まれていない（無ＤＮＡ対照）かのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ｈ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、等モル濃度の基質Ｇおよび基質Ｈ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質混合物２μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でＦＡＭのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２７６】
図１９に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、オリゴヌクレオチド標的の例示的漸増を示している。図１９の結果には、１００ｆＭの標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（黒線）、１０ｆＭの標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（黒色の破線）、１ｆＭの標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（短い黒色の破線）、１ｎＭ  ＰＰＩＡオフターゲット（灰色の破線）、１ｎＭ  ｐ２７３オフターゲット（灰色の点線）、約２００，０００コピーのヒトゲノムＤＮＡ（灰色の実線）を含む反応およびＤＮＡを含まない反応（灰色の二重線）から得られたシグナルが示されている。図１９に示されるリアルタイムモニタリングの５分間は、２５分間の総反応時間（すなわち、２０分間のＴバッグインキュベーションと５分間の蛍光基質切断のリアルタイムモニタリング）に相当し、１００ｆＭ、１０ｆＭおよび１ｆＭのｏｍｐＡ標的の検出に要した時間を示している。この実験では、このプロトコルにより試験した最低濃度、すなわち１ｆＭのｏｍｐＡ標的を検出することができた。試料中の総ｏｍｐＡ濃度は約４，２００コピーの遺伝子（４．２×１０３の遺伝子コピー）に相当する。さらに、高濃度のオフターゲット対照（ＰＰＩＡ、ｐ２７３およびＨｕ  ｇＤＮＡ）を加えても無標的対照（無ＤＮＡ）を上回るシグナルは発生せず、このことから、Ｔバッグシグナル増幅反応は特異性が高く、マッチする標的核酸配列（この実施例ではｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２）とともに形成されるＭＮＡｚｙｍｅの存在下でのみ誘発されることがわかる。
【０２７７】
以上の結果は以下のシナリオと一致する。標的オリゴヌクレオチドの存在下では、パートザイムが整列し活性な開始ＭＮＡｚｙｍｅを形成する。ＭＮＡｚｙｍｅが溶液中のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢを切断し、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅをＭＢの表面から分離させる。次いで、「自由な」８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグの選択的透過膜を通って移動できるようになり、そこでＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢを切断し、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅをＭＢの表面から分離させることができる。次いで、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅが自由にＴバッグの透過膜から出て溶液中に移動し、そこでＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢを切断し、カスケードを継続することができる。一定時間インキュベートした後、磁石により、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、切断された「自由な」ＤＮＡｚｙｍｅとを分離することができる。自由なＤＮＡｚｙｍｅ（１０：２３および８：１７）を蛍光基質の入った第二の反応チャンバに移すことができ、その中で、自由なＤＮＡｚｙｍｅが基質を切断し、蛍光シグナルを発生させることができる。
【０２７８】
実施例１５：クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の全核酸（ＴＮＡ）試料中のクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子の検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、実施例１に記載した培養法および抽出法を用いて得たクラミジアの全核酸試料（ＴＮＡ）中に存在するクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子から標的を検出し、シグナルを増幅した。ＳｕｂＺｙｍｅ  ＨおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉを実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。得られた結果を図２０に示す。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＨはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＩはＰＢであり、ｏｍｐＡパートザイムＡ１およびＢ１はｏｍｐＡ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃａｔ  Ｃを形成する。
【０２７９】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ）（配列番号８）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ）（配列番号９）、基質Ｇ（配列番号３６）、基質Ｈ（配列番号３７）、ｏｍｐＡパートザイムＡ１（配列番号３８）、ｏｍｐＡパートザイムＢ１（配列番号３９）および標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（配列番号４０）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２８０】
反応には、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積７０μＬで含まれていた。Ｔバッグは孔径０．８μｍのポリカーボネート膜製のものとした。反応には、ＤＮＡが含まれていない（無ＤＮＡ対照）か、２ｆＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏが含まれているか、あるいは反応に加える前に９５℃で２分間熱変性させたＴＮＡであるクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＴＮＡが含まれているかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。
【０２８１】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ｈ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、等モル濃度の基質Ｇおよび基質Ｈ（最終濃度０．２μＭ）を含有する基質混合物２μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）ＦＡＭのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２８２】
図２０に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、この方法によりクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の全核酸（ＴＮＡ）試料からクラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子（黒色の実線）を検出することが可能であることを示している。試料中の総ｏｍｐＡ濃度は約３，５００，０００コピーの遺伝子（３．５×１０６の遺伝子コピー）に相当する。シグナルには、無ＤＮＡ対照（灰色の実線）と十分な差がみられ、２ｆＭの合成標的ｏｍｐＡオリゴヌクレオチドを含む反応（黒色の破線）と類似したシグナルが得られる。
【０２８３】
実施例１６：ｏｍｐＡ遺伝子ホモログの１５分間での迅速検出
この実験では、図４に概説される戦略を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子と相同な合成オリゴヌクレオチド標的の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。ここでは、試料をＴバッグとわずか１２分間インキュベートし、核酸標的の迅速検出を実証した。ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ）およびＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。得られた結果を図２１に示す。図４を参照すると、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＨはＰＡであり、ＳｕｂＺｙｍｅ  ＩはＰＢであり、ｏｍｐＡパートザイムＡ１およびＢ１はｏｍｐＡ標的上で会合すると開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。
【０２８４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ）（配列番号８）、（ＰＢ）ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ（配列番号９）、基質Ｈ（配列番号３７）、ｏｍｐＡパートザイムＡ１（配列番号３８）、ｏｍｐＡパートザイムＢ１（配列番号３９）および標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（配列番号４０）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２８５】
反応には、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢ、０．５μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｉ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。Ｔバッグは孔径０．８μｍのポリカーボネート膜製のものとした。反応には、ＤＮＡが含まれていない（無ＤＮＡ対照）であるか、５００ｐＭまたは２ｐＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏが含まれているかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で１２分間、５０℃でインキュベートした。
【０２８６】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｈ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ｈ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４６μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質である基質Ｈ（最終濃度０．２μＭ）４μＬと混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でＦＡＭのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２８７】
図２１に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、この方法により、５００ｐＭ（灰色の線）および１ｐＭ（黒色の線）の合成標的ｏｍｐＡオリゴヌクレオチドを１５分未満の総反応時間で検出することが可能であることを示している。図２１に示される３分間のリアルタイムモニタリングは、合計時間が１５分（すなわち、１２分間のＴバッグインキュベーションと３分間のリアルタイムモニタリング）の反応の最終段階であり、５００ｐＭおよび１ｐＭの合成標的ｏｍｐＡオリゴヌクレオチドの検出に要した時間を示している。シグナルには無ＤＮＡ対照（黒色の破線）と十分な差がみられる。
【０２８８】
実施例１７：ＤＮＡｚｙｍｅおよびパートザイムを組み込んだＳｕｂＺｙｍｅを用いた交差触媒カスケード
この実験では、図２２に概説される戦略を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同な合成オリゴヌクレオチド標的の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。この実験では、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ（ＰＡ）およびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１（ＰＢ）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。開始ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（Ｃａｔ  Ｃ）は、ｏｍｐＡパートザイムＡ１およびＢ１（図２２のＣ１およびＣ２に相当する）と標的ｏｍｐＡとを含むものとした。得られた結果を図２４に示す。
【０２８９】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ）（配列番号１０）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１）（配列番号１１）、ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２）（配列番号１２）、基質Ｅ（配列番号３３）、ｏｍｐＡパートザイムＡ１（配列番号３８）、ｏｍｐＡパートザイムＢ１（配列番号３９）、標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（配列番号４０）およびＡＦ−Ｂ３（フィードバック会合促進因子）（配列番号４３）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０２９０】
反応には、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｎＭ  ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２、２ｎＭフィードバック会合促進因子、０．６μＬのＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢ）、０．６μＬのＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢ）を含む１×Ｔバッグが最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、ＤＮＡが含まれていない（無ＤＮＡ対照）か、２ｎＭ、２００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭまたは１ｐＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏが含まれているかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。
【０２９１】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢ、切断された部分的基質Ｊ−ＭＢフラグメントおよび未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅおよびパートザイムとを分離した。上清の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質である基質Ｅ２μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２９２】
図２４に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて、５分後の蛍光から０分後の蛍光を減算することによりプロットした二重反復の平均値である。結果から、この方法により２ｎＭ、２００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭおよび１ｐＭの合成標的ｏｍｐＡ  オリゴヌクレオチドを検出することが可能であることがわかる。シグナルには無ＤＮＡ対照と十分な差がみられる。以上の結果は以下のシナリオと一致する。標的オリゴヌクレオチドの存在下では、パートザイムが整列し活性な開始ＭＮＡｚｙｍｅを形成する。ＭＮＡｚｙｍｅが溶液中のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢを切断し、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅをＭＢの表面から分離させる。次いで、「自由な」８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグの選択的透過膜を通って移動できるようになり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢ）を切断し、パートザイムＫ１（Ｃａｔ  Ｂ１）をＭＢの表面から分離させることができる。次いで、Ｃａｔ  Ｂ１が自由にＴバッグの透過膜から出て溶液中に移動し、そこで自由なパートザイムＫ１（Ｃａｔ  Ｂ２）およびフィードバック会合促進因子（ＡＦ−Ｂ３）とハイブリダイズして活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができ、フィードバックＭＮＡｚｙｍｅがＰＡ内のＳｕｂ  Ａ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢ）を切断することができ、それによりフィードバックカスケードを継続することができる。一定時間インキュベートした後、磁石を用いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ−ＭＢおよび切断された部分的基質−ＭＢフラグメントと、切断された「自由な」ＤＮＡｚｙｍｅおよびパートザイムとを分離する。自由なＤＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ａ）およびパートザイム（Ｃａｔ  Ｂ）を蛍光基質が含まれる第二の反応チャンバに移し、そこでは、自由なＤＮＡｚｙｍｅが切断して蛍光シグナルを発生させることができる。
【０２９３】
実施例１８：８−１７成分のみからなるＳｕｂＺｙｍｅを用いた交差触媒カスケード
この実験は、８−１７触媒核酸成分のみからなるＳｕｂＺｙｍｅを用いて、ＳｕｂＺｙｍｅおよび選択的透過バリアを用いる交差触媒シグナル増幅カスケードを実施することが可能であることを示すものである。８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｄである開始Ｃａｔ  Ｃを使用することによって図４に概説される戦略に修正を施し、ここでは、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｌ）およびＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｍ）はともに、交差触媒的に切断可能な基質配列によって結合した８：１７  ＤＮＡｚｙｍｅを含むものとした。
【０２９４】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｌ）（配列番号４４）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｍ）（配列番号４５）、基質Ｅ（配列番号３３）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ｄ（配列番号４６）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。ＳｕｂＺｙｍｅ  ＬおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｍを実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｌ−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｍ−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。得られた結果を図２５に示す。
【０２９５】
反応には、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、１．５倍濃度のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｌ−ＭＢ、１．５倍濃度のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｍ−ＭＢを含む１×Ｔバッグおよび４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、開始ＤＮＡが含まれていない（無ＤＮＡｚｙｍｅ対照）か、２ｎＭ、２００ｐＭまたは２０ｐＭの開始ＤＮＡｚｙｍｅ（ＤＮＡｚｙｍｅ  Ｄ）が含まれているかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で６０分間、４８℃でインキュベートした。
【０２９６】
最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、Ｔバッグをチューブから取り出して捨てた。試料を短時間遠心分離し、チューブを磁気ラックの上に置いて、未切断のＳｕｂＺｙｍｅ  Ｌ−ＭＢおよび切断された部分的基質Ｌ−ＭＢフラグメントと、溶液中で自由になったＤＮＡｚｙｍｅとを分離した。上清の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質である基質Ｅ２μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、４８℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０２９７】
図２５に示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、この方法より２ｎＭ（黒色の実線）、２００ｐＭ（黒色の破線）および２０ｐＭ（黒色の点線）の開始ＤＮＡｚｙｍｅを検出することが可能であることを示している。シグナルには無ＤＮＡｚｙｍｅ対照（灰色の線）と十分な差がみられる。
【０２９８】
実施例１９：代替的ビーズ材料の実証
この実験では、図１５に概説される戦略を用いて、Ｔバッグの構築に代替的ビーズ材料としてシリカビーズ（孔径１μｍ）を用いるＴバッグ概念の普遍性を明らかにした。さらに、その目的を、磁気ビーズに代えてシリカビーズを用いてＳｕｂＺｙｍｅの閉込め、ＤＮＡｚｙｍｅの拡散および表面結合ＤＮＡｚｙｍｅの遊離が可能であるかどうかを明らかにすることとした。ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ）を実施例１の付着法２に記載した通りに１μｍのシリカビーズに付着させる（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−Ｂｅａｄ）が、洗浄方法は磁気ラックの代わりに遠心分離を用いて実施した。各洗浄段階は、シリカビーズ溶液を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離してビーズをペレット化した後、上清を取り出して捨てる操作を伴うものであった。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（孔径０．８μｍ）またはＰＥＳ膜（孔径０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。
【０２９９】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ）（配列番号６）、基質Ｅ（配列番号３３）およびＤＮＡｚｙｍｅ  Ａ（配列番号２８）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０３００】
反応には１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、０．６μＬのＳｕｂＺｙｍｅ  Ｆ−ＳＢが含まれるポリカーボネート材料（０．８μｍ）またはＰＥＳ材料（０．８μｍ）でできた１×Ｔバッグが含まれていた。反応には、２ｎＭのＤＮＡｚｙｍｅ  Ａが含まれているか、含まれていないかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。最初のインキュベーション後、試料を加熱ブロックから移動させ、試料を短時間遠心分離した。反応溶液の４８μＬのアリコートを９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、基質Ｅ  ２μＬ（最終濃度０．２μＭ）と混合した。プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に１５０サイクルにわたって取得を実施した。
【０３０１】
図２６Ａおよび２６Ｂに示される結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）を用いて二重反復の平均値をプロットしたものであり、開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの不在下ではシグナルがほとんどみられない。このことは、ＳｕｂＺｙｍｅが、シリカビーズ（直径１μｍ）に係留されている間は膜を通って拡散することができないことを示している。開始ＤＮＡｚｙｍｅ  Ａの存在下では強いシグナルがみられ、開始ＤＮＡｚｙｍｅがポリカーボネート膜またはＰＥＳ膜ででたＴバッグの中に拡散し、次いでＳｕｂＺｙｍｅｓ−ＳＢを切断し、表面結合ＤＮＡｚｙｍｅを遊離させることができることがわかる。また、遊離したＤＮＡｚｙｍｅがＴバッグから出て拡散し、蛍光標識基質分子を切断することが可能であることもわかる。異なる材料（ＰＥＳおよびポリカーボネート）でできた膜でも同様の結果が観察される。この結果から、ビーズ材料および膜材料については、ビーズが膜孔の直径より大きいものである限り、様々な材料からなるものであってよいことがわかる。図２６に示される結果は、ＳｕｂＺｙｍｅを封入し他の反応成分から物理的に分離するのにシリカなどの代替的ビーズ材料を用いることができることを示している。
【０３０２】
実施例２０：エンドポイント検出を実施するＳｕｂＺｙｍｅおよびパートザイムを用いた交差触媒カスケード
この実験では、図２７に概説される戦略を用いて、クラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ｏｍｐＡ遺伝子に相同な合成オリゴヌクレオチド標的の存在下で標的を検出し、シグナルを増幅した。この実験では、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１）およびＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２）を実施例１の付着法２に記載した通りに磁気ビーズに付着させた（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢ、ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢおよびＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２−ＭＢ）。図３Ｂに示される略図に従い、ポリカーボネート膜（０．８μｍ）を用いてＴバッグを手作業で調製した。開始ＭＮＡｚｙｍｅ  Ｃ（Ｃａｔ  Ｃ）は、ｏｍｐＡパートザイムＡ１およびＢ１（図２７のＣ１およびＣ２に相当する）と標的ｏｍｐＡとを含むものとした。得られた結果を図２８に示す。
【０３０３】
この実験に特有のオリゴヌクレオチドには、ＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ）（配列番号１０）、ＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１）（配列番号１１）、ＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２）（配列番号１２）、基質Ｅ（配列番号３３）、ｏｍｐＡパートザイムＡ１（配列番号３８）、ｏｍｐＡパートザイムＢ１（配列番号３９）、標的ｏｍｐＡ  Ｏｌｉｇｏ  ２（配列番号４０）およびＡＦ−Ｂ３（フィードバック会合促進因子）（配列番号４３）が含まれる。配列表にその配列が記載されている。
【０３０４】
Ｔバッグ反応には、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｎＭフィードバック会合促進因子（ＡＦ−Ｂ３）、０．６μＬのＰＡ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｊ−ＭＢ）、０．６μＬのＰＣ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ２−ＭＢ）および０．６μＬのＰＢ（ＳｕｂＺｙｍｅ  Ｋ１−ＭＢ）を含む１×Ｔバッグが最終体積６０μＬで含まれていた。ＭＮＡｚｙｍｅ対照反応には、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＡ１、５０ｎＭ  ｏｍｐＡパートザイムＢ１、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩおよび４５ｍＭ  ＭｇＣｌ２が最終体積６０μＬで含まれていた。反応には、ＤＮＡが含まれていない（無ＤＮＡ対照）か、５００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭまたは５０ｐＭの標的ｏｍｐＡ  ｏｌｉｇｏが含まれているかのいずれかであった。反応を２ｍＬのチューブ中、加熱ブロック上で２０分間、５０℃でインキュベートした。
【０３０５】
インキュベーション後、試料を加熱ブロックから取り出し、短時間遠心分離した。溶液のアリコート（４０μＬ）を９６ウェルプレート（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に移し、プレートを密閉し、短時間遠心分離した。ＣＦＸ９６リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でテキサスレッドのチャンネルの蛍光を測定し、５０℃の一定温度で１０秒毎に５サイクルにわたって取得を実施した。
【０３０６】
図２７の結果を、各試料の反応の蛍光から無標的対照（ＮＴＣ）の反応の蛍光を減算することによって算出し正規化した蛍光値として示す。結果は、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ  １４）に２つ組の反応をそれぞれ５回測定した結果から算出した平均値および標準偏差を用いてプロットしたものである。この結果は、図２７に示されるＴバッグ法により５００ｐＭ，２００ｐＭ，１００ｐＭおよび５０ｐＭの合成標的ｏｍｐＡオリゴヌクレオチドを検出することが可能であることを示している。シグナルには無標的対照と十分な差がみられる。同じ標的濃度の検出についてもＭＮＡｚｙｍｅ対照反応を用いた無標的対照と大きな差はみられず、図２７に示される戦略によってシグナル増幅の増強がもたらされることがわかる。以上の結果は以下のシナリオと一致する。標的オリゴヌクレオチドの存在下では、パートザイムが整列し活性な開始ＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｃ）を形成する。Ｃａｔ  ＣがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断し、Ｃａｔ  ＡをＭＢの表面から分離させる。次いで、Ｃａｔ  ＡがＴバッグの選択的透過膜を通って移動できるようになり、そこでＰＢ内のＳｕｂ  Ｂを切断し、Ｃａｔ  Ｂ１をＭＢの表面から分離させることができる。次いで、Ｃａｔ  Ｂ１が自由にＴバッグの透過膜から出て溶液中に移動し、そこでＣａｔ  Ｂ２およびフィードバック会合促進因子（ＡＦ−Ｂ３）とハイブリダイズして活性なフィードバックＭＮＡｚｙｍｅ（Ｃａｔ  Ｂ）を形成することができ、フィードバックＭＮＡｚｙｍｅがＰＡ内のＳｕｂ  Ａを切断してフィードバック増幅を継続することができる。この結果はまた、フィードバック増幅を開始させることに加えて、Ｃａｔ  ＢおよびＣａｔ  Ｃは同時にＳｕｂ  Ａ−ＦＱを切断して蛍光を発生させ、それによりリアルタイムで標的の存在を示すこともできることを示している。
【０３０７】
（相互参照による組込み）
本願は、２０１７年４月１１日に出願されたオーストラリア仮出願第２０１７９０１３２１号の優先権を主張するものであり、上記出願の全内容は相互参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020516294.tif 000007
【図２】
2020516294.tif 000008
【図３】
2020516294.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020516294.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020516294.tif 000028
【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月10日(2019.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的の有無を判定する方法であって、
反応混合物を準備することであって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、かつ触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが不可能であり、
前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能であり、かつ触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが不可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能であり、前記ＰＡおよび前記ＰＢが透過することができず、前記ＰＡおよび／または前記ＰＢが、前記反応混合物中で可動性である、選択的透過バリアと、
（ｉｉｉ）２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドまたは
（ｉｖ）前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｉ）前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記オリゴヌクレオチド（１つまたは複数）と前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＡと前記ＰＢとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記２つのオリゴヌクレオチドがそれぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、少なくとも一方がさらに前記標的とハイブリダイズし、それにより前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記触媒酵素Ｄと前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＡと前記ＰＢとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが前記核酸二本鎖の前記切断部位に結合して切断し、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが前記透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、前記ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離した前記触媒核酸Ｂが前記透過性バリアを通過し、第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、前記第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の標的の存在を示す、
方法。
【請求項２】
前記触媒核酸Ｃが、前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂを切断することができない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記反応混合物ポリヌクレオチド中で可動性である前記ＰＡおよび／または前記ＰＢのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記触媒核酸基質Ａの切断により、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
前記触媒核酸基質Ｂの切断により、前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ｂから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になる、
請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記触媒核酸Ａと前記触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
（ｉ）前記触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）前記触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、
前記２つのオリゴヌクレオチドであって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な前記触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドを準備し、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記触媒核酸Ｃが、前記標的と結合することが可能なアプタマーを含み、
前記方法が、前記試料と、前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤とを接触させ、それにより触媒核酸Ｃを不活性にすることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的が前記アプタマーと結合して前記阻害剤と置き換わり、前記触媒核酸Ｃを活性にし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａの切断を促進する、
方法。
【請求項１１】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドであり、
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれ前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記方法が、前記試料と、前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよび前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にする前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【請求項１４】
前記標的がポリヌクレオチドであり、
前記触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記触媒核酸Ａが前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａから遊離することおよび／または前記触媒核酸Ｂが前記ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂから遊離することにより、フルオロフォアが消光剤から分離され、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルが発生する、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出が、
遊離した前記触媒核酸Ａおよび／または遊離した前記触媒核酸Ｂを前記反応混合物から単離することと、
単離した前記触媒核酸（１つまたは複数）を前記触媒核酸による前記触媒核酸基質の切断に適した条件下で、触媒核酸基質Ａおよび／または触媒核酸基質Ｂを含む第二の反応混合物に加えることと、
前記触媒核酸による前記触媒核酸基質の切断を検出することと
を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出が、遊離した前記触媒核酸Ａおよび／または遊離した前記触媒核酸Ｂをリアルタイムで定量化することを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満の前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、かつ／または
５個未満、６個未満、７個未満、８個未満、９個未満、１０個未満、１５個未満もしくは２０個未満の前記ＰＢポリヌクレオチドを切断して、
前記標的の検出を促進することを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
試料中の標的の有無を判定する方法であって、
（ａ）反応混合物を準備することであって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、かつ前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが不可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能な選択的透過バリアであって、前記ＰＡおよび前記ＰＢが、前記選択的透過バリアを透過することができず、前記ＰＡ、前記ＰＢおよび前記ＰＣが、前記反応混合物中で可動性である選択的透過バリアと、
（ｉｖ）２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２であって、それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２、または
（ｖ）前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つもしくは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄ
のうちのいずれか１つと
を含む、反応混合物を準備することと、
（ｂ）（ｉ）前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２と前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＢと前記ＰＡとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの基質アームが、ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が、前記標的とハイブリダイズして前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になること、または
（ｉｉ）前記触媒酵素Ｄと前記試料とを接触させ、前記選択的透過バリアを用いて前記ＰＢと前記ＰＡとを分離し、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＡポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが前記核酸二本鎖の前記切断部位に結合して切断し、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になることと
を含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが、前記透過性バリアを通過し、ＰＢポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ｂとハイブリダイズし、前記ＰＢポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＢポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
遊離した前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１が前記透過性バリアを通過し、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれの前記センサーアームが前記会合促進オリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１およびＢ２それぞれの前記基質アームが第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、それにより触媒核酸Ｂを形成し、それが前記第二のＰＡポリヌクレオチドを切断し、それにより前記第二のＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａが遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の前記標的の存在を示す、
方法。
【請求項２０】
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによって切断可能な触媒核酸基質Ｂとを含み、
遊離した前記触媒核酸Ａが、前記ＰＣポリヌクレオチドを切断し、それにより前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を遊離させ、
ＰＣポリヌクレオチドの切断の検出が、前記試料中の前記標的の存在を示す、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各ＰＣポリヌクレオチドがパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と触媒核酸基質Ａとを含み、
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２それぞれの前記基質アームが、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズし、前記パートザイムオリゴヌクレオチドＣ１およびＣ２のうち少なくとも一方が前記標的とハイブリダイズして前記触媒核酸Ｃを形成し、それが前記ＰＣポリヌクレオチドを切断し、それにより、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料中に前記標的が存在する場合、前記標的がＰＣポリヌクレオチドとハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む前記核酸二本鎖を形成し、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が前記ＰＣポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ内に存在せず、
前記触媒酵素Ｄが、前記核酸二本鎖と前記切断部位に結合して切断し、それにより、前記ＰＣポリヌクレオチドの前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２が遊離する、
請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記反応混合物中で可動性である前記ＰＡポリヌクレオチド、前記ＰＢポリヌクレオチドおよび／また前記ＰＣポリヌクレオチドのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記触媒核酸基質Ａの切断により、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になり、かつ／または
前記触媒核酸基質Ｂの切断により、前記ＰＢポリヌクレオチドから前記結合成分または前記自己相補性領域が遊離し、その結果、前記透過性バリアを通過することが可能になる、
請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項１９〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２６に記載の方法であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記方法が、前記試料と、前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがＭＮＡｚｙｍｅに自己会合するのを促進するＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドおよび前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にする前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤分子とを接触させることをさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にする、
方法。
【請求項２８】
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、自己会合時にそれぞれ前記ポリヌクレオチドとハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成する、
請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記反応混合物が、前記反応混合物中で可動性である、前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、
前記触媒核酸Ｂおよび／または前記触媒核酸Ｃが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して、前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させる、
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
試料中の標的を検出する組成物であって、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、
各ＰＢポリヌクレオチドが、触媒核酸Ｂと触媒核酸基質Ｂとを含み、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、かつ前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが不可能であり、
前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが可能であり、かつ前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが不可能であり、
前記ＰＡおよび／またはＰＢが前記組成物中で可動性である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団およびポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団と、
前記ＰＡと前記ＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリアと
を含む、組成物。
【請求項３１】
組成物であって、
（ｉ）ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団であって、
各ＰＡポリヌクレオチドが、触媒核酸Ａと触媒核酸基質Ａとを含み、かつ前記組成物中で可動性であり、
各ＰＢポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１と触媒核酸基質Ｂとを含み、
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームが、前記触媒核酸基質Ａとハイブリダイズすることが可能であり、
前記触媒核酸Ａが、前記触媒核酸基質Ｂを触媒的に修飾することが可能であり、かつ触媒核酸基質Ａを触媒的に修飾することが不可能である、
ポリヌクレオチドＡ（ＰＡ）の集団、ポリヌクレオチドＢ（ＰＢ）の集団およびポリヌクレオチドＣ（ＰＣ）の集団と、
（ｉｉ）パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームおよびパートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームとハイブリダイズすることが可能な会合促進オリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）前記ＰＡと前記ＰＢとを物理的に分離することが可能であり、前記ＰＡおよび前記ＰＢが通過することができない選択的透過バリアと
を含み、
前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１の基質アームおよび前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２の基質アームと前記触媒核酸基質Ａとのハイブリダイゼーションならびに前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ１のセンサーアームと前記パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２のセンサーアームと前記会合促進因子とのハイブリダイゼーションにより、前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｂを形成する、
組成物。
【請求項３２】
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、触媒核酸Ａによる切断が可能な前記触媒核酸基質Ｂとを含むか、または
各ＰＣポリヌクレオチドが、パートザイムオリゴヌクレオチドＢ２と、前記触媒核酸基質Ａとを含む、
請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ＰＡおよび／または前記ＰＢのいずれかが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３４】
いずれかの前記ＰＣが、前記ポリヌクレオチドの前記選択的透過バリアの透過を防ぐ、
結合成分および／または
二次構造をもたらす自己相補性領域および／または
荷電部分
を含む、請求項３１または３２に記載の組成物。
【請求項３５】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項３３または３４に記載の組成物。
【請求項３６】
それぞれＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａと特異的にハイブリダイズし、少なくとも一方が前記標的と特異的にハイブリダイズし、それにより、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸基質Ａを切断することが可能な触媒核酸Ｃを形成することが可能な２つのオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記触媒核酸Ｃが多成分核酸酵素（ＭＮＡｚｙｍｅ）であり、
前記２つのオリゴヌクレオチドが、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な２つのパートザイムオリゴヌクレオチドである、
請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
前記標的と前記ＰＡとのハイブリダイゼーションにより形成された核酸二本鎖の１つまたは複数の鎖を切断することが可能な触媒酵素Ｄをさらに含み、
前記ＰＡポリヌクレオチドの少なくとも一部分が、前記標的と配列相補性を共有しているため、前記標的とハイブリダイズして、前記触媒酵素Ｄの認識／切断部位を含む核酸二本鎖を形成することが可能であり、
前記触媒酵素Ｄの前記切断部位が、前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ内に存在しない、
請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記標的がポリヌクレオチドであり、
前記触媒酵素Ｄがエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼである、
請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項３６に記載の組成物であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記触媒核酸Ｃが、前記標的と結合することが可能なアプタマー部分を含み、
前記組成物が、前記アプタマーとハイブリダイズする阻害剤をさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示す、
組成物。
前記ＰＡと前記ＰＢとを分離することが可能な選択的透過バリア。
【請求項４１】
前記標的が、ポリヌクレオチドを含むか、これよりなるものであり、
前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドが、それぞれ前記標的のポリヌクレオチドおよび前記ＰＡポリヌクレオチドの前記触媒核酸Ａ基質とハイブリダイズし、それにより、自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することができる、
請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項３７に記載の組成物であって、
前記標的が、タンパク質、分析物、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、細胞、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、抗体、代謝産物、病原体、毒素、汚染物質、毒物、小分子、ポリマー、金属イオン、金属塩、プリオンまたはその任意の誘導体、一部分もしくは組合せを含むか、これよりなるものであり、
前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドのうち少なくとも一方が、前記標的と特異的にハイブリダイズすることが可能なＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチドアプタマー部分を含み、
前記組成物が、前記標的の存在下でのみ自己会合して前記ＭＮＡｚｙｍｅを形成することが可能な前記２つのパートザイムオリゴヌクレオチドがそれぞれハイブリダイズして前記ＭＮＡｚｙｍｅの自己会合を促進することができる、ＭＮＡｚｙｍｅ会合促進オリゴヌクレオチドをさらに含み、
前記組成物が、前記アプタマーとハイブリダイズし、それにより前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に不活性にすることができる阻害剤分子をさらに含み、
前記阻害剤が、前記アプタマー部分に対して前記標的より低い結合親和性を示し、
前記標的が、前記アプタマー部分とハイブリダイズして前記阻害剤を除去し、前記ＭＮＡｚｙｍｅを触媒的に活性にすることができる、
組成物。
【請求項４３】
前記触媒核酸Ｃおよび／または前記触媒核酸Ｂによる前記ＰＡポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ａをさらに含む、請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
前記触媒核酸Ａによる前記ＰＢポリヌクレオチドの切断によって遊離する触媒核酸Ｂをさらに含む、請求項３０〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、ＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記触媒核酸Ａおよび／または前記触媒核酸Ｂが、８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ、１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ、９−８６  ＤＮＡｚｙｍｅ、１２−９１  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＧＲ−５  ＤＮＡｚｙｍｅ、１７Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＲＦＤ−ＥＣ１  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｆ−８  ＤＮＡｚｙｍｅ、３９−Ｅ  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｅ２  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ｍｇ５  ＤＮＡｚｙｍｅ、Ａ４３  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＤＡＢ２２  ＤＮＡｚｙｍｅ、ＰＳ２．Ｍ  ＤＮＡｚｙｍｅ、ハンマーヘッド型リボザイム、Ｌ−ヒスチジン依存性ＤＮＡｚｙｍｅおよびＨＲＰ  ＤＮＡｚｙｍｅからなる群より選択される、請求項３０〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記触媒核酸Ａと前記触媒核酸Ｂが、それぞれ異なる種類のＤＮＡｚｙｍｅである、請求項３０〜４６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
（ｉ）前記触媒核酸Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であるか、または
（ｉｉ）前記触媒核酸Ａが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅであり、前記触媒核酸Ｂが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅであり、かつ
前記触媒核酸基質Ａが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅ基質であり、前記触媒核酸基質Ｂが８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅ基質である、
請求項３０〜４７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記ＰＡおよび前記ＰＢが前記組成物中で可動性であるか、あるいは前記ＰＡ、前記ＰＢおよび／または前記ＰＣが前記組成物中で可動性である、請求項３０〜４８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＰＡポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＢポリヌクレオチドおよび／または前記ＰＣポリヌクレオチドが、それぞれフルオロフォアと消光剤とを含む、請求項３０〜４９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記組成物中で可動性である前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、前記触媒核酸Ｂが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、請求項３０〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物中で可動性である前記触媒核酸基質Ａの集団をさらに含み、前記集団の触媒核酸基質Ａがそれぞれ、フルオロフォア分子と消光剤分子とを含み、前記触媒核酸Ｃが、前記触媒核酸基質Ａの集団のメンバーを切断して前記フルオロフォアを前記消光剤から分離し、それにより、前記標的の検出を促進するシグナルを発生させることが可能である、請求項３６または３７に記載の組成物。
【請求項５３】
ポリヌクレオチドの集団であって、それぞれが
触媒核酸またはその成分と、
触媒核酸基質と、
前記ポリヌクレオチドの選択的透過バリアの透過を防ぐことが可能な
（ｉ）結合成分、
（ｉｉ）二次構造をもたらす自己相補性領域、
（ｉｉｉ）荷電部分
のうちのいずれか１つまたは複数のものと
を含み、
前記触媒核酸が、前記触媒核酸基質を触媒的に修飾することが不可能であり、
前記ポリヌクレオチドの集団が、溶液中で可動性である、
ポリヌクレオチドの集団。
【請求項５４】
前記結合成分が、
リガンドとハイブリダイズしたアプタマー、
ビーズ（例えば、磁気ビーズ）、
微粒子、
ナノ粒子または
荷電部分
である、請求項５３に記載のポリヌクレオチド集団。
【請求項５５】
前記触媒核酸がＤＮＡｚｙｍｅまたはリボザイムである、請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド集団。
【請求項５６】
前記ＤＮＡｚｙｍｅが１０−２３  ＤＮＡｚｙｍｅまたは８−１７  ＤＮＡｚｙｍｅである、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
前記成分がＭＮＡｚｙｍｅのパートザイムオリゴヌクレオチド成分である、請求項５３または５４に記載のポリヌクレオチド集団。
【国際調査報告】
2020516294.tif 000035
2020516294.tif 000036
2020516294.tif 000037