(57)【要約】  標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善するための方法および組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
任意選択の介在性リンカーを伴って、操作されたバリアントデアミナーゼ  ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈに連結されたＣａｓ９様ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む融合タンパク質であって、
ノンカノニカルモチーフ（non-canonical motif）において前記デアミナーゼを作用させる前記デアミナーゼの基質配列モチーフ中に、表７、８および／または９に示される１つまたは複数の変異を含み、
融合タンパク質は、任意選択で、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）をさらに含む、
融合タンパク質。
【請求項２】
ノンコグネート配列モチーフを認識する、表１または表２に列挙されたデアミナーゼドメインの操作されたバリアントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの前記操作されたバリアントが、表７または８に示される１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの前記操作されたバリアントが、（ｉ）表７および／または８に示される１つまたは複数の変異ならびに（ｉｉ）表９に示される１つまたは複数の変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの前記操作されたバリアントが、Ｎ５７；Ｋ６０および／もしくはＹ１３０のうち１つもしくは複数における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ；またはＮ５７、Ｋ６０もしくはＹ１３０に対応する変異を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、もしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記操作されたバリアントが、Ｎ５７およびＹ１３０における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｎ５７ＧもしくはＮ５７Ｑ変異；Ｋ６０ＡもしくはＫ６０Ｄ変異；および／またはＹ１３０Ｆ変異のうち１つまたは複数を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａを含む、請求項５または６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記操作されたバリアントが、Ｎ５７、Ｋ６０に対応する変異、および／またはＹ１３０に対応する変異を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈを含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｎ５７Ｇ；Ｋ６０Ｄ；またはＹ１３０Ｆに対応する変異のうち１つまたは複数を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈを含む、請求項５または７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの前記操作されたバリアントが、Ａ７１および／もしくはＩ９６における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、またはＡ７１および／もしくはＩ９６に対応する変異を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、もしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（例えば、表１０に示される通り）を含む、請求項１から９のいずれかに記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ベータサラセミア変異ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）を有する対象を処置する方法であって、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質の治療有効量を送達するステップを含み、デアミナーゼが、Ｎ５７ＧもしくはＮ５７ＡもしくはＮ５７ＱまたはＫ６０ＡもしくはＫ６０ＤまたはＹ１３０Ｆにおける変異を含むＡＰＯ３Ａを含み、好ましくは、前記融合タンパク質が、ｓｓＤＮＡニック導入性Ｃａｓ９または触媒的に不活性なＣａｓ９を含む、方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質が、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
変異体の脱アミノ化に十分な条件下で、前記対象から収集されたＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆体細胞を含む細胞の集団に、前記融合タンパク質をｅｘ  ｖｉｖｏで送達するステップ、ならびに前記細胞を、前記対象に、再注入により戻すステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
核酸中の選択されたシチジンを脱アミノ化する方法であって、前記核酸を、請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質または塩基編集システムと接触させるステップを含む方法。
【請求項１５】
請求項１から１０のいずれかに記載の精製された融合タンパク質または塩基編集システムを含む組成物。
【請求項１６】
１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１から１０のいずれかに記載の融合タンパク質または塩基編集システムをコードする核酸。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項２０】
幹細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
造血幹細胞である、請求項１９に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年５月２５日出願の米国仮特許出願第６２／５１１，２９６号；２０１７年８月４日出願の米国仮特許出願第６２／５４１，５４４号；および２０１８年１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／６２２，６７６号の利益を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＧＭ１１８１５８の下で政府の支援で行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善するための方法および組成物が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
塩基編集（ＢＥ）テクノロジーは、シチジンデアミナーゼドメインを特異的ゲノム位置に動員して、部位特異的シトシン→チミン遷移（transition）置換をもたらすために、操作されたＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＲＮＡガイドされる触媒的に不活性なＣａｓ９（ｄｅａｄ  Ｃａｓ９すなわちｄＣａｓ９）、ニッカーゼ（nickase）バージョンのＣａｓ９（ｎＣａｓ９）またはジンクフィンガー（ＺＦ）アレイ）を使用する１、２。ＢＥは、相同組換え修復（ＨＤＲ）によって正確な変異をなすことが治療的に有益ではあるが伝統的なヌクレアーゼベースのゲノム編集テクノロジーでは創出が困難である、細胞の状況で顕在化する遺伝性疾患を処置するための特に魅力的なツールである。例えば、緩徐に分裂しているまたは有糸分裂後の細胞集団から主に構成される組織においてＨＤＲの結果を達成することは困難であるまたは不可能であるが、それは、ＨＤＲ経路が、細胞周期のＧ２期およびＳ期に限定されるからである３。さらに、ヌクレアーゼ誘導性切断の非相同末端結合媒介性修復によって引き起こされる可変長さのインデル変異の競合的でより効率的な誘導によって、編集が創出される前および後においてＨＤＲ修復の効率は実質的に低下され得る。対照的に、ＢＥテクノロジーは、細胞型によって可変性のＤＮＡ修復機構を必要とすることなしに、実施者が高度に制御可能で高度に正確な変異をなすことができる可能性を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ塩基エディタープラットフォーム（ＢＥ）は、ドナーＤＮＡ分子を必要とせずに、正確なユーザー定義されたゲノム編集事象を生じる独自の能力を有する。シチジンデアミナーゼドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合された一本鎖ニック導入性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）タンパク質を含む塩基エディター（ＢＥ）（ＢＥ３）は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）スペーサー配列によって決定される部位特異的様式で、シチジンからチミジンへの（ＣからＴへの）塩基遷移を効率的に誘導する１。全てのゲノム編集試薬を用いる場合と同様、遺伝的にコードされた有害で不可逆的な副作用を生じる可能性を制限するために、治療薬として使用する前に、ＢＥがオフターゲット変異を生じる能力をまず決定し、次いで軽減することが重要である。本明細書で、本発明者らは、臨床的に適切なものに向かうＢＥテクノロジーの成熟化を可能にする、ＢＥテクノロジーへの科学技術的改善を提案する。最初に、本発明者らは、特定の２ヌクレオチドまたは３ヌクレオチドのゲノムコンテキストで存在するシトシンだけを脱アミノ化できる天然のまたは操作されたデアミナーゼ（表１）を使用してＢＥを構築することによって、ＢＥ脱アミノ化にとって利用可能な、利用可能なシトシン基質の絶対数を制限するための方法を記載する。
【０００６】
このタンパク質は、例えば、デアミナーゼタンパク質またはドメインの特異性を増加させるために、そのままで、または任意の可能な組合せで、表７に列挙された１つまたは複数の変異を含み得る。このタンパク質は、例えば、変更および増加された基質配列を有する操作されたデアミナーゼタンパク質またはドメインを創出するために、表７中の変異のいずれかと任意選択で組み合わせた、例えば、標的化可能なモチーフ配列を変更することを意図した、表８に列挙された１つまたは複数の変異を含み得る。さらに、このタンパク質は、例えば、トリヌクレオチドモチーフ中の１番目または３番目のヌクレオチドに対する変更された特異性を有し、他の可能な脱アミノ化基質モチーフと比較してその標的モチーフに対する増加した特異性を有する操作されたデアミナーゼタンパク質を創出するために、表７または表８中に列挙された変異のいずれかと任意選択で組合せた、表９に列挙された１つまたは複数の変異を含み得る。
【０００７】
一部の実施形態では、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの操作されたバリアントは、表７、８および／または９に示される１つまたは複数の変異を含む。一部の実施形態では、変異は、Ｎ５７Ａ／Ｇ／Ｑ／Ｄ／Ｅ；Ａ７１Ｖ；Ｉ９６Ｔ；Ｙ１３０Ｆ；もしくはＫ６０Ａ／Ｄ／Ｅ、またはそれらの組合せである。
【０００８】
一部の実施形態では、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの操作されたバリアントは、（ｉ）表７および／または８に示される１つまたは複数の変異ならびに（ｉｉ）表９に示される１つまたは複数の変異を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの操作されたバリアントは、Ｎ５７（好ましくはＮ５７ＧまたはＮ５７Ｑ）；Ｋ６０（好ましくはＫ６０ＡまたはＫ６０Ｄ）および／またはＹ１３０（好ましくはＹ１３０Ｆ）のうち１つまたは複数における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ；またはＮ５７（例えば、表７中に示される３位における、例えば、３位におけるＧ）、Ｋ６０（例えば、表７中に示される４位における、例えば、４位におけるＤ））もしくはＹ１３０（例えば、表７中に示される６位における、例えば、６位におけるＦ）に対応する変異を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈを含む。
【００１０】
一部の実施形態では、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの操作されたバリアントは、Ｎ５７（好ましくはＮ５７Ｇ）およびＹ１３０（好ましくはＹ１３０Ｆ）における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、またはＮ５７に対応する変異（例えば、表７中に示される３位における、例えば、３位におけるＧ）およびＹ１３０に対応する変異（例えば、表７中に示される６位における、例えば、６位におけるＦ）を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈを含む。
【００１１】
一部の実施形態では、ｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧまたはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈの操作されたバリアントは、Ａ７１および／もしくはＩ９６における変異を有するｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ、またはＡ７１および／もしくはＩ９６に対応する変異を有するｈＡＩＤ、ｒＡＰＯＢＥＣ１＊、ｍＡＰＯＢＥＣ３、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ｈＡＰＯＢＥＣ３ＧもしくはｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（例えば、表１０に示される通り）を含む。例えば、Ｉ９６Ｔ、Ａ７１ＶおよびＹ１３０Ｆは各々、あるとしても配列優先性をそれほど回復することなく、ＷＴ由来のデアミナーゼの編集活性を減弱させる（これは、オフターゲット効果に起因して重要である）ので、これらは、全ての塩基編集部位の良好な候補になっている。
【００１２】
さらに、ベータサラセミア変異ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）を有する対象を処置するための方法であって、前述の請求項のいずれか一項に記載の融合タンパク質の治療有効量を送達するステップを含み、デアミナーゼが、Ｎ５７ＧもしくはＮ５７ＡもしくはＮ５７ＱまたはＫ６０ＡもしくはＫ６０ＤまたはＹ１３０Ｆにおける変異を含むＡＰＯ３Ａを含み、好ましくは、融合タンパク質が、ｓｓＤＮＡニック導入性Ｃａｓ９または触媒的に不活性なＣａｓ９を含む、方法が、本明細書で提供される。
【００１３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される。
【００１４】
一部の実施形態では、本方法は、変異体の脱アミノ化に十分な条件下で、対象から収集されたＣＤ３４＋造血幹細胞および／または前駆体細胞を含む細胞の集団に、融合タンパク質をｅｘ  ｖｉｖｏで送達するステップ、ならびに細胞を、対象に、再注入により戻すステップを含む。
【００１５】
核酸中の選択されたシチジンを脱アミノ化するための方法であって、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提供される。
【００１６】
さらに、本明細書に記載される精製された融合タンパク質または塩基編集システムを含む組成物が、本明細書で提供される。
【００１７】
さらに、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムをコードする核酸、ならびにこの核酸を含むベクター、およびこの核酸を含む宿主細胞、例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞が、本明細書で提供される。
【００１８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当該分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００１９】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】例示的な典型的な高効率塩基編集システムの図。その２つのヌクレアーゼドメインのうち１つにおいて触媒的に不活性化性の変異を有するニック導入性Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）は、ｓｇＲＮＡの可変性のスペーサー配列によって指示される標的部位に結合する。安定なＲループの形成は、脱アミノ化されていない鎖上にｓｓＤＮＡ編集ウインドウを創出する。Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ中に一本鎖切断を創出し、宿主細胞が、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用して損傷を修復するのを促進し、そうして、シトシン→チミン遷移置換に向けて修復を偏らせる。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、それぞれ、認識ループ１（ＲＬ１）およびループ７についてのアラインメントを示す図である。両方の領域は、全てのタンパク質にわたって低い保存を示し、各酵素の配列特異性に顕著に寄与することが実験的に実証されている、または相同性に基づいて寄与すると予測される。Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスによって実施し、Ｇｅｎｅｉｏｕｓにおいて可視化したアラインメント。
【図３Ａ−３Ｂ】ＡＰＯ３ＡとｓｓＤＮＡ基質との間で形成されるタンパク質−ＤＮＡ接触の図である。ＲＬ１残基はマゼンタで示され、ループ７残基は赤で示され、ｓｓＤＮＡ基質は黄色で示され、ＡＰＯ３Ａの残りの残基は灰色で示される。図３Ａは、本発明者らが、本明細書に記載されるデアミナーゼドメイン（配列番号１〜９）の特異性を変更または増強するために置換変異をなすことを提案する、ＲＬ１およびループ７中の全ての残基の配向を示す。図３Ｂは、−１位（標的Ｃに対して）におけるチミンとＤ１３１（配列番号１０〜１８）との間で形成される、黒の破線で示される塩基特異的水素結合を示す。ＰＤＢコード：５ＳＷＷ。
【図４】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号１９）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、単一残基置換を有する１５個のＡＰＯ３Ａバリアントの各々についてプロットした。
【図５】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号１９）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、Ｎ５７またはＫ６０において単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質についてプロットした。これらのタンパク質の各々は、野生型塩基エディタータンパク質と比較して減少された効率で、編集ウインドウ内のオフターゲットＧＣＴモチーフを脱アミノ化したが、編集ウインドウ内のオンターゲットＴＣＧモチーフにおいては効率的な脱アミノ化活性を保持した。
【図６】ＥＧＦＰ部位１におけるオンターゲットＴＣＧおよびオフターゲットＧＣＴモチーフ（共に編集ウインドウ中にある）についてのシトシンからチミンへの編集効率の比が、単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質の各々についてプロットされたグラフである。Ｎ５７またはＫ６０置換を有するタンパク質は、野生型ＡＰＯ３Ａ塩基エディタータンパク質と比較して、増加した特異性比を有する。
【図７】ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質を、ゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の部位を標的化するガイドＲＮＡ（配列番号２０）と共に、Ｕ２ＯＳ細胞において過剰発現させたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡをこれらの細胞から抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。スペーサー内の各シトシンヌクレオチドについてのＣ＞Ｔ遷移の頻度を、各塩基エディタータンパク質についてプロットした。
【図８】ＥＧＦＰ部位２標的の編集ウインドウ内の全てのシトシン（これらは全て、オフターゲットトリヌクレオチドモチーフ中に存在する）についての、シトシンからチミンへの累積遷移頻度が、各塩基エディタータンパク質についてプロットされたグラフである。Ｎ５７およびＫ６０において単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ塩基エディタータンパク質は、この標的部位の編集ウインドウ中に存在するオフターゲットシトシンを脱アミノ化する能力が顕著に減少されている。特に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ａは、この部位においてデアミナーゼ活性を全く示さなかった。
【図９】安定に組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子を有するＵ２ＯＳ細胞に、ＥＧＦＰを標的化するガイド（配列番号２２）および示された塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクトしたグラフである。７２時間後、ゲノムＤＮＡを細胞から抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。コグネートおよびノンコグネートモチーフにおけるＣからＴへの遷移の頻度を、トランスフェクション条件の各々についてプロットした。ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ＡＰＯ３Ａ）Ｎ５７に対してなされた変異は、塩基エディター構造中のデアミナーゼドメインの配列特異性を回復することにおいて、非常に有効であった。
【図１０】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。２つの置換を有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質は一般に、試験した両方のｇＲＮＡ中のコグネートモチーフにおける顕著な活性を喪失した。しかし、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｑ／Ｙ１３０Ｆ塩基エディター３（ＢＥ３）二重変異体は、ノンコグネートモチーフにおける脱アミノ化の頻度を顕著に減少させつつ、両方のｇＲＮＡのコグネートモチーフに対する活性を保持した。
【図１１】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。２０ヌクレオチドのスペーサー配列内の全てのシチジンについてのＣからＴへの遷移の頻度が、ヒートマップ形式でプロットされる。３つ全てのＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質が、ＢＥ３ならびに操作されたバリアントＹＥ１、ＹＥ２およびＹＥＥ  ＢＥ３（ＹＥ  ＢＥ３）と比較して、コグネートモチーフに向けて脱アミノ化を強力に偏らせることができ、これは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）デアミナーゼドメイン中に、ＢＥ３と比較してその速度論的速度を緩徐化し、その編集ウインドウの長さを制限する点変異を取り込むことによってかかるバイスタンダー変異の頻度を減少させる４４。参照配列、配列番号２３〜２８。
【図１２】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。７２時間後、ゲノムＤＮＡを抽出し、標的部位をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲ産物を、ハイスループットＩｌｌｕｍｉｎａ配列決定に供した。２０ヌクレオチドのスペーサー配列内の全てのシチジンについてのＣからＴへの遷移の頻度が、ヒートマップ形式でプロットされる。３つ全てのＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質が、ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質と比較して、コグネートモチーフに向けて脱アミノ化を強力に偏らせることができた。参照配列、配列番号２９〜３４。
【図１３】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。サンプルを、以前に概説したように処理した。Ｎ５７Ｇに加えてＡ７１またはＩ９６に対する変異を有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３タンパク質は、ノンコグネートモチーフにおける脱アミノ化頻度を大きく減少させた。各部位についてのコグネート対ノンコグネートの編集の比を、バリアント塩基エディタータンパク質の各々に関して３つ全ての部位についてプロットしたところ、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  Ｉ９６Ｔ  ＢＥ３が、試験した３つの部位の各々についておよそ１３のコグネート：ノンコグネート編集比を達成したことが実証された。参照配列、配列番号３５〜３７。
【図１４】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３は、２５個のオフターゲット部位のうち１６個において、非常に高いレベルの脱アミノ化を誘導した。ＢＥ３は、より低い頻度でではあるが、ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３と同じオフターゲット部位において脱アミノ化を誘導した。ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、２５個の部位のうち６個のみにおいてインデルを誘導し、これら６個の部位では、ＢＥ３よりもかなり低い頻度であった。
【図１５】ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３は、１５個のオフターゲット部位のうち３個において、非常に高いレベルの脱アミノ化を誘導した。ＢＥ３は、より低い頻度でではあるが、ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３と同じオフターゲット部位において脱アミノ化を誘導した。ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、１５個の調査したオフターゲット部位のいずれにおいても、脱アミノ化を誘導しなかった。
【図１６】塩基エディタータンパク質を用いてＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）疾患対立遺伝子を標的化することから生じる潜在的対立遺伝子産物を示す模式図。編集ウインドウ中に存在する−２５バイスタンダーシチジンの変異は、−２８位における編集とは独立して、ベータ−サラセミア表現型を引き起こす。このように、−２５位が塩基エディタータンパク質によって編集されないことが重要である。配列番号３８〜４２が示される。
【図１７】ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）疾患原因対立遺伝子の、染色体に組み込まれた２００塩基対断片を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ＨＢＢ−２８標的化ｇＲＮＡおよび示されたＢＥタンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした図である。ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質は、およそ等しい頻度でコグネートおよびノンコグネートシチジンを脱アミノ化したが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥタンパク質は、編集ウインドウ中の２番目のシチジンの脱アミノ化を回避しつつ、疾患を修正するために、−２８コグネートモチーフを強力に脱アミノ化した。
【図１８】ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質は、疾患原因ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異の脱アミノ化を誘導するが、これは、配列決定した総対立遺伝子の１％未満において完全に修正された対立遺伝子を生じる。逆に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥタンパク質は、配列決定した総対立遺伝子の１５〜２２％において完全に修正された対立遺伝子を生じる。参照配列、配列番号４３。
【図１９】ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）対立遺伝子の、染色体に組み込まれた断片を有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、示されたｇＲＮＡおよび塩基エディタータンパク質を発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトしたグラフである。サンプルを、以前に概説したように処理した。プロットされた脱アミノ化頻度を得るために、編集ウインドウ内に入るシチジンについての全てのＣからＴへの遷移頻度を合計した。ＢＥ３は、調査した８つのオフターゲット部位のうち３つにおいて脱アミノ化を生じたが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７  ＢＥ３は、非常に低い頻度で、８つの部位のうちたった１つにおいて脱アミノ化を生じた。配列番号４４が示される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
今日までに記載された最も効率的なＢＥ構成では、シチジンデアミナーゼ（ＤＡ）ドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ；ゲノムからのウラシルの切り出しを担う酵素である宿主細胞のウラシルデグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を阻害する小さなバクテリオファージタンパク質１、４）は共に、ｎＣａｓ９（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のいずれかに由来する）に融合される。ｎＣａｓ９は、そのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と隣接プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識とによって特定される標的部位においてＲループを形成し、ＲループのＰＡＭ遠位末端近傍で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として露出された、およそ４〜８ヌクレオチドの非標的鎖を残す（図１）。ｓｓＤＮＡのこの領域は、ｓｓＤＮＡ特異的ＤＡドメインによって脱アミノ化されて、グアノシン：ウラシル（Ｇ：Ｕ）ミスマッチを生じることができる鋳型であり、編集ウインドウを規定する。ｎＣａｓ９は、ＤＮＡの脱アミノ化されていない鎖にニック導入し、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用してニック損傷を修復するように細胞に指示することによって、Ｇ：Ｕミスマッチの変換を、アデニン：チミン（Ａ：Ｔ）塩基対へと偏らせる。今日まで、これらの融合タンパク質中の記載されたＤＡドメインは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）、ヤツメウナギに由来するＣＤＡと称される活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（ＰｍＣＤＡ）、ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）、または核外輸送シグナルを欠くｈＡＩＤの高活性形態であった１〜２、５〜７。ＢＥテクノロジーは、そのｎＣａｓ９ドメインとしてＳｐＣａｓ９タンパク質（ｎＳｐＣａｓ９）を使用して当初確立された。本明細書では、本発明者らはｎＣａｓ９に言及しているが、一般に、任意のＣａｓ９様ニッカーゼが、特記しない限り、Ｃｐｆ１タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログに基づいて使用され得る。
【００２２】
治療設定におけるＢＥの使用に関する重要な考慮事項は、オフターゲット変異誘発についてそのゲノムワイドの能力をアセスメントすること、および有害なオフターゲット変異を刺激するリスクを最小化する、または理想的には排除するようにテクノロジーを改変することである。現行世代のＢＥテクノロジーを用いて、本発明者らは、オフターゲット変異誘発の３つの潜在的供給源を予測することができる：（１）オンターゲット部位内のシトシン塩基の望ましくない改変（ｎＣａｓ９刺激されたＲループ形成は、脱アミノ化のために合計で８つのオンターゲットヌクレオチドを露出させることができることが理由である）；（２）これらの部位においてシトシン脱アミノ化をもたらす、オフターゲットＲループ形成（Ｃａｓ９は、そのｓｇＲＮＡに対する変動する程度の相同性を有するオフターゲット部位に結合する、十分に報告された能力を有する８〜９）；および（３）融合物のＣａｓ９部分によるＤＮＡへの結合なしに部位において生じ得るＢＥ媒介性脱アミノ化（例えば、溶液からの、またはデアミナーゼ自体のみによって弱く特定される部位において媒介される活性）。本明細書では、本発明者らは、潜在的な望ましくないＢＥ変異誘発を低減させるまたは排除するために使用され得るＢＥに対する科学技術的改善を記載した。
【００２３】
より高いまたは変更された標的部位優先性を有するシチジンデアミナーゼドメインを使用することによって、塩基エディターの特異性を増加させる
現行世代のＢＥテクノロジーは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のおよそ８ヌクレオチドのウインドウ中にシトシン→チミン遷移置換をもたらすために、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）のシトシン脱アミノ化活性を使用する。ｓｓＤＮＡ標的ウインドウは、ＢＥ融合タンパク質のｎＣａｓ９部分によって創出されるＲループによって形成され、ｓｇＲＮＡ相補性領域の一番５’側のヌクレオチドのおよそ４ヌクレオチド下流で始まる。従って、脱アミノ化される標的Ｃは、ｇＲＮＡ標的相補性配列内にある。標的配列内では、標的Ｃは、５’側から数えて５、６、７、８または９位に位置する必要がある。
【００２４】
ｒＡＰＯＢＥＣ１ドメインは、それ自体では固有の基質配列特異性をほとんど有さず、標的Ｃに対してすぐ５’側の塩基がＧでない限り、全ての配列コンテキストにおいてシトシンを等しく良好に脱アミノ化し、標的Ｃに対してすぐ５’側の塩基がＧである場合、脱アミノ化はあまり効率的ではないがなおも可能である。さらに、ｒＡＰＯＢＥＣ１がｎＣａｓ９に融合される場合、これは、編集ウインドウ内の複数のシトシンに対して処理能力を有するようである１、つまり、ｓｓＤＮＡ標的ウインドウにおける単一の結合事象が、ウインドウ中の１つよりも多いシトシンの脱アミノ化をしばしば生じる（２つ以上のシトシンが存在する場合）。
【００２５】
標的ウインドウ１つ当たりの複数の脱アミノ化は、オンターゲット結合部位において、およびゲノム中のｎＣａｓ９が結合する他のオフターゲットＤＮＡ配列において、望ましくない変化を生じ得る。ある程度まで、オンターゲット編集ウインドウ内の望ましくない脱アミノ化は、ｒＡＰＯＢＥＣ１およびｎＣａｓ９を分離するタンパク質リンカーの長さおよび柔軟性を変化させることによって制御することができる；しかし、この制御は、編集ウインドウ中の特定の配列位置に合わせることができず、制限された編集ウインドウの外側の検出可能な脱アミノ化をなおも示す１０。
【００２６】
オンターゲット部位の編集ウインドウ内の非標的シトシンの望ましくない脱アミノ化、オフターゲット部位における任意のシトシンの脱アミノ化を減少させるまたは完全に取り除き、オンターゲット部位における望ましくない進行性の脱アミノ化事象を制限するために、本発明者らは、短い配列モチーフに対する固有の特異性および／または非進行性の脱アミノ化活性を有する操作されたデアミナーゼドメインを使用して、ＢＥを構築する。
【００２７】
塩基エディター
一部の実施形態では、塩基エディターは、シトシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼ、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼ由来のシチジンデアミナーゼ（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を参照のこと）；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）である。以下の表１は、例示的な配列を提供する；他の配列も使用することができる。
【００２８】
【表１】
2020521454.tif 000002
【００２９】
ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）、ヒトＡＰＯＢＥＣ３およびマウスＡＰＯＢＥＣ３酵素（ＡＰＯ３Ａ−ｈＡＰＯ３Ｈ、ｍＡＰＯ３）は、標的シトシン周辺の１つ、２つまたは３つのさらなるヌクレオチドに対する特異性を有する（表２）１１〜１６。１〜３つのさらなるヌクレオチドからの追加的な特異性は、ＢＥ編集ウインドウ中の非標的シトシンが、ランダムに分布したＤＮＡ中で脱アミノ化のために利用可能になる確率を、４分の１〜６４分の１に減少させる。これは、オンターゲット部位、およびｓｇＲＮＡに対する高い程度の類似性を有するｎＣａｓ９オフターゲット部位の両方におけるゲノム内の塩基編集酵素の特異性を実質的に増強し、また、ゲノム中の総基質部位の数を大きく低減させることによって、ゲノムの至る所での潜在的な誤ったｓｇＲＮＡ／ｎＣａｓ９非依存的脱アミノ化を制限することに寄与する。重要なことに、ｈＡＰＯ３およびｍＡＰＯ３酵素の固有の配列特異性は、これらのタンパク質がそれらの標的配列特異性を変更または再割り当てするために操作され得る可能性を上昇させる。このシナリオでは、目的の各標的基質配列シグネチャーを提供するために、多くの異なる２ｂｐおよび３ｂｐ認識デアミナーゼを潜在的に操作することができる。
【００３０】
【表２】
2020521454.tif 000003
【００３１】
各内因性ｈＡＰＯ３およびｍＡＰＯ３酵素は、それが作用できる、固有の２〜３ｎｔ標的基質モチーフ優先性を有する。例えば、ＡＰＯ３Ａは、ＴＣ（Ａ／Ｇ）中の太字のシトシンを脱アミノ化するが、ｈＡＰＯ３Ｇは、形態ＣＣＣの基質を標的化する。この提案されたクラスの基質特異的ＡＰＯ３含有ＢＥ試薬の標的化範囲全体を増加させるために、所与のＡＰＯ３酵素によって標的化可能な配列モチーフの範囲を改変できることが有利である。さらに、ＡＰＯ３酵素の基質特異性決定残基を操作することにより、好ましい基質部位を変更するだけでなく、ゲノムにわたって豊富に存在し得る、他の密接にマッチしたジヌクレオチドシグネチャーまたはトリヌクレオチドシグネチャーと比較して、その好ましい部位に対するＡＰＯ３酵素の特異性を改善することもできる。ｈＡＰＯ３酵素は、認識ループ１（ＲＬ１）およびループ７と呼ばれる可変性の配列組成を有する２つの認識ループ中の残基間で形成される直接的接触を介して、それらのコグネート配列モチーフを認識する１２〜１３、１７〜２２（表３、図２Ａ〜２Ｂおよび図３Ａ〜３Ｂを参照のこと）。他の研究者は、これらの残基に対してなされる、これらのドメインの特異性を緩和または変更する置換変異を以前に記載している。例えば、ｈＡＰＯ３Ｇループ７残基Ｄ３１６およびＤ３１７をアルギニンに変異させることは、ＣＣＣからＣＣＣへと、酵素の基質特異性を変化させる（ここで、太字のＣは、脱アミノ化のための基質を表す）２３。変異ｈＡＰＯ３Ｆ  Ｄ３１１Ａは、ＴＧＣおよびＴＣＣの標的化を増加させ、未改変の酵素は、ＴＴＣを標的化することを好む１５。さらに、ＲＬ１残基がｈＡＰＯ３ＧのＲＬ１残基によって置き換えられたキメラＡＰＯ３Ａタンパク質は、酵素の特異性を顕著に緩和し２４、ｈＡＩＤループ７の残基をｈＡＰＯ３ＧまたはｈＡＰＯ３Ｆ由来の残基で置換することは、ドナー酵素の標的配列プロファイルと似るように、変異体ｈＡＩＤ酵素の標的配列プロファイルを変化させる２５。この研究は、ＲＬ１およびループ７中の残基に対する置換変異が、タンパク質と標的ｓｓＤＮＡとの間で起こる塩基特異的接触を変更させることによって、ＡＰＯ３タンパク質の特異性を変更すると予測されることを確立しているが、これらの初期の研究を超えてＡＰＯ３基質配列特異性を再操作する報告は、これまで存在していない。さらに、本発明者らが知る限り、その標的配列モチーフに対するこれらのドメインの特異性を高める戦略を記載しているグループは存在しない。
【００３２】
【表３】
2020521454.tif 000004
【００３３】
この目的のために、置換変異が、ＲＬ１および／またはループ７中に存在する残基に対してなされ得る（各ＡＰＯ３またはＡＩＤ酵素に対応する残基については表３を、これらのタンパク質のアラインメントについては図２Ａ〜２Ｂを参照のこと）。ＲＬ１またはループ７中の位置における最大数のアミノ酸置換組合せをサンプリングするために、本発明者らは、これらのループ中のアミノ酸をランダム化し、所望の配列に対するロバストな脱アミノ化活性を有するライブラリーメンバーについて選択するために、細菌選択スキームを使用する。ループ７の場合、配列モチーフを特定する役割を最も大きく担っていると考えられる残基は、所望の配列モチーフと塩基特異的相互作用を形成すると予測され得る残基へと個々に変異され、ループ７中の残りの位置はランダム化される。例えば、ＡＰＯ３Ａ残基Ｄ１３１は、５’−ＴＣＹと水素結合を形成することが公知である（ここで、太字のＴは、塩基特異的接触を表す）。ＡＰＯ３Ａの配列特異性をＴＣＴからＡＣＴに変更するために、本発明者らは、Ｄ１３１の、Ｎ、ＱまたはＲへの置換を有するＡＰＯ３Ａ変異体を最初に設計する。次いで、これらのＡＰＯ３Ａバリアントの各々は、ＮＮＢ、ＮＮＳまたはＮＮＫの単純化されたコドンセット（ここで、Ｎ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｂ＝Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ｓ＝Ｃ／ＧおよびＫ＝Ｇ／Ｔである）を使用して作製された合成縮重オリゴヌクレオチドライブラリーをクローニングすることによって、１３２〜１３４位において改変される。
【００３４】
これらの残基の各々に対してなされる置換変異は、他の特定された残基位置のいずれかに対してなされた置換変異との任意の組合せでの、２０種のカノニカルアミノ酸のいずれかを含む。さらに、これらの変異は、触媒活性に必要とされる最小のドメイン（触媒ドメイン；ＣＤ）まで、表３中の酵素をトランケートすることと組み合わせてなされ得る。本明細書に記載される酵素のサブセットに由来するＣＤの例については、例示的なタンパク質配列を参照のこと。これらの変異は、ｈＡＰＯ３Ｇの溶解度および触媒活性を増加させることが以前に実証された５つの置換変異の全てまたは任意の組合せの存在下または非存在下でもなされ得る（本明細書に記載される各ＡＰＯまたはＡＩＤ酵素についての相同な置換変異の完全なリストについては、表４を参照のこと）。特に、表１に列挙されたデアミナーゼドメインは、本発明者らが行い得る任意の操作が存在しない場合、ｒＡＰＯＢＥＣ１と比較して好都合な固有の特性を有し得る。このように、本発明者らは、本発明者らが産生し得る任意の操作されたバリアントに加えて、表１に列挙された未改変のドメインを本明細書に記載する。
【００３５】
【表４】
2020521454.tif 000005
【００３６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ
本明細書に記載される配列特異的デアミナーゼは、Ｃａｓ９ニッカーゼに融合される。本明細書では、本発明者らはｎＣａｓ９に言及しているが、一般に、任意のＣａｓ９様ニッカーゼが、特記しない限り、Ｃｐｆ１タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログに基づいて使用され得る。表５は、例示的なリストを提供する。
【００３７】
【表５】
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当該分野で公知のこれらのオルソログ、ならびにそれらの変異体およびバリアントは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかにおいて使用され得る。例えば、国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレット（これは、増加した特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）および国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット（これは、変更されたＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）を参照のこと。
【００３８】
化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（以後単にＣａｓ９）は、１７〜２０ヌクレオチドの操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、シングルガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧとマッチするＰＡＭの隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間での単純な塩基対相補性を介して、ガイドされ得る（Shen et al., Cell Res (2013)；Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)；Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)；Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)；Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c)；Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１由来の操作されたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼもまた、例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015)；Schunder et al., Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013)；Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 722-736 (2015)；Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されるように使用され得る。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、単一の４２ｎｔのｃｒＲＮＡのみを必要とし、これは、その３’末端に、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに対して相補的な２３ｎｔを有する（Zetsche et al., 2015）。さらに、ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサーの３’側にあるＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識するが、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’側に見出されるＴＴＴＮ  ＰＡＭを認識する（同上）。
【００３９】
一部の実施形態では、本発明のシステムは、細菌中にコードされた、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、ならびに／またはそのＰＡＭ認識特異性および／もしくはそのゲノムワイドの特異性において改変された、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の野生型もしくはバリアントＣａｓ９タンパク質、またはアシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６もしくはラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６由来の野生型Ｃｐｆ１タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されている；例えば、とりわけ、国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１４７明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8):869-74；Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5；Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97；Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298；Dahlman et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61；Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5；Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-31；Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34；Osborn et al., Hum Gene Ther. 2015 Feb;26(2):114-26；Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8；Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45；およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):569-76を参照のこと。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１と一緒に、細胞中で発現されるまたは細胞中に存在する。ガイドＲＮＡもしくはヌクレアーゼのいずれか、または両方は、細胞において一過的にもしくは安定に発現され得、または精製されたタンパク質もしくは核酸として導入され得る。
【００４０】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させる、以下の変異のうち１つもまた含む；例えば、ＳｐＣａｓ９については、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａにおける変異（これは一本鎖ニッカーゼを創出する）。
【００４１】
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を破壊する、以下のアミノ酸位置のうち１つにおける変異もまた含む：タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするための、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙ；これらの位置における置換は、アラニン（Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある通り）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳもしくはＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照のこと）。
【００４２】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）配列に融合される；例示的なＵＧＩ配列は以下の通りである：
ＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号４５）。ＵＧＩは、Ｎ末端、Ｃ末端にあり得、または存在しなくてもよい（任意選択で、トランスで、例えば、別々に発現され、または別々に提供もしくは投与される）。
【００４３】
使用の方法
本発明の組成物および方法は、操作されたＡＰＯ３Ａデアミナーゼによるゲノムワイドの特異性を増強するために使用され得る。例えば、ＢＥ３構造において用いられるＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇは、一過的プラスミドトランスフェクションによって送達した場合、ガイドＲＮＡのスペーサー配列のアイデンティティーによって決定されるオフターゲット部位において、増加したゲノムワイドの特異性を有する。さらに、本方法は、塩基エディター試薬のゲノムワイドのオフターゲット変異誘発を制限するための、例えば、ＲＮＰまたはｍＲＮＡトランスフェクションを使用した、表７中の変異のいずれかを有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３の送達を含み得る。さらに、表７中の変異のいずれかを有するＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３は（それら自体でまたは一緒になって）、一過的プラスミドトランスフェクション、ＲＮＰまたはｍＲＮＡを使用して送達され得、ｓｓＤＮＡニック導入性Ｃａｓ９または触媒的に不活性なＣａｓ９（ｎＣａｓ９）は、融合タンパク質によるオフターゲット変異誘発を制限するために、ＳｐＣａｓ９  ＮＧＧ  ＰＡＭに対する直交性ＰＡＭ配列を認識する、任意の操作されたＳｐＣａｓ９タンパク質４６である。さらに、表７中の変異のいずれかを有する、直交性ＰＡＭ配列を認識する黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９または操作された黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９に融合されたＡＰＯ３Ａもまた、使用され得る４７。
【００４４】
バリアント
一部の実施形態では、融合タンパク質の構成成分は、例示的な配列（例えば、本明細書で提供される）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である、例えば、本明細書に記載される変異に加えて、例示的な配列の残基の最大で５％、１０％、１５％または２０％において、例えば保存的変異によって置き換えられた差異を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親の所望の活性、例えば、ニッカーゼ活性、ならびに／またはガイドＲＮＡおよび／もしくは標的ＤＮＡと相互作用する能力を保持する。
【００４５】
２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方において導入され得、非相同な配列は、比較目的のために無視され得る）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書で使用する場合、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列間のパーセント同一性は、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）中に取り込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；（Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方式で決定される。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較の長さは、最大で全長でありかつ全長を含む任意の長さであり得る（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）。本発明の組成物および方法の目的のために、配列の全長の少なくとも８０％がアラインされる。
【００４６】
本開示の目的のために、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティと共に、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用して達成され得る。
【００４７】
保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００４８】
スプリットデアミナーゼ（split deaminase）融合タンパク質をコードする単離された核酸、バリアントタンパク質を発現させるための１つまたは複数の調節ドメインに任意選択で作動可能に連結された単離された核酸を含むベクター、ならびにかかる核酸を含み、バリアントタンパク質を任意選択で発現させる、宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞である。
【００４９】
本明細書に記載されるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細胞のゲノムを変更するために使用され得る。本方法は一般に、細胞においてスプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現または接触させるステップを含む；１つまたは２つのＣａｓ９を使用するバージョンでは、本方法は、細胞のゲノムの選択された部分に対して相補的な領域を有するガイドＲＮＡを使用するステップを含む。細胞のゲノムを選択的に変更するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２４号明細書；米国特許第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許第２０１６００２４５１０号明細書；米国特許第２０１６００１７３６６号明細書；米国特許第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許第２０１５０３７６６５２号明細書；米国特許第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許第２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許第２０１５０２９１９６５号明細書；米国特許第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許第２０１５０２４７１５０号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８３号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許第２０１５０２０３８７２号明細書；米国特許第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許第２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許第２０１５０１７６０６４号明細書；米国特許第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許第２０１５０１６６９６９号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７５号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許第２０１５００９３４７３号明細書；米国特許第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許第２０１５００６７９２２号明細書；米国特許第２０１５００５６６２９号明細書；米国特許第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１５００２４４９９号明細書；米国特許第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許第２０１４０３５６８６７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許第２０１４０２７３２２６号明細書；米国特許第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１１３３７６号明細書；米国特許第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許第２０１３０３３０７７８号明細書；米国特許第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許第２０１２００８８６７６号明細書；米国特許第２０１１０３００５３８号明細書；米国特許第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許第２０１１０２１７７３９号明細書；米国特許第２０１１０００２８８９号明細書；米国特許第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許第２０１１０１８９７７６号明細書；米国特許第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許第２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００４５５４６号明細書；米国特許第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許第２０１４０３３５６２０号明細書；米国特許第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許第２０１４０３１５９８５号明細書；米国特許第２０１４０３１０８３０号明細書；米国特許第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許第２０１４０３０９４８７号明細書；米国特許第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５６号明細書；米国特許第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許第２０１４０２８７９３８号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３４号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３１号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許第２０１４０２５６０４６号明細書；米国特許第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７００号明細書；米国特許第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許第２０１４０２４２６６４号明細書；米国特許第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許第２０１４０２１２８６９号明細書；米国特許第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許第２０１４０１９９７６７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第２０１４０１８６９１９号明細書；米国特許第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許第２０１４０１７９００６号明細書；米国特許第２０１４０１７０７５３号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedings of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日出願の米国特許出願第６１／６５２，０８６号明細書；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照のこと。
【００５０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥまたはｎＣａｓ９）とＢＥドメインとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質中で（または連結構造にある融合タンパク質間で）使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列が含まれ得る。好ましい実施形態では、リンカーは短く、例えば、２〜２０アミノ酸であり、典型的には、柔軟性がある（すなわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの、高い程度の自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号４６）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４７）からなる１つまたは複数の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号４７）またはＧＧＧＧＳ（配列番号４６）単位の、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多いリピートを含む。他のリンカー配列もまた使用され得る。
【００５１】
一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質には、細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータンまたはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが含まれる。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8；Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611；およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照のこと。
【００５２】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞質または他のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアおよび核中への、細胞膜を横切る広範な生体分子の移動を促進する短いペプチドである。ＣＰＰによって送達され得る分子の例には、治療的薬物、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子およびリポソームが含まれる。ＣＰＰは、一般には３０アミノ酸以下であり、天然に存在するもしくは天然に存在しないタンパク質またはキメラ配列に由来し、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニンの高い相対的存在量、または極性および非極性アミノ酸の交互のパターンのいずれかを含有する。当該分野で一般に使用されるＣＰＰには、Ｔａｔ（Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193、Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）およびトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が含まれる。
【００５３】
ＣＰＰは、共有結合または非共有結合戦略を介して、それらのカーゴと連結され得る。化学的架橋（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質のクローニング（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）などの、ＣＰＰとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐための方法が、当該分野で公知である。カーゴと、極性および非極性ドメインを含む短い両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合的カップリングは、静電相互作用および疎水性相互作用を介して確立される。
【００５４】
ＣＰＰは、細胞中へ、潜在的に治療的な生体分子を送達するために、当該分野で利用されてきた。例には、免疫抑制のための、ポリアルギニンに連結されたシクロスポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍発生を阻害するための、ＭＰＧと呼ばれるＣＰＰに連結された、サイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞の成長を低減させるための、ＣＰＰに連結された腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol. Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および喘息を処置するための、Ｔａｔに融合されたドミナントネガティブ形態のＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405）が含まれる。
【００５５】
ＣＰＰは、画像化およびバイオセンシング適用のために、細胞中に造影剤を輸送するために、当該分野で利用されてきた。例えば、Ｔａｔに結合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、がん細胞を標識するために使用されてきた（Shokolenko et al., (2005) DNA Repair 4(4):511-518）。量子ドットにコンジュゲートされたＴａｔは、ラット脳の可視化のために、血液脳関門を首尾よく横断するために使用されてきた（Santra et al., (2005) Chem. Commun. 3144-3146）。ＣＰＰは、細胞画像化のための核磁気共鳴画像化技術とも組み合わされてきた（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm. 347(1):133-140）。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-7258(15)00141-2もまた参照のこと。
【００５６】
あるいは、またはさらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、核局在化配列、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号４８））およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号４９））を含み得る。他のＮＬＳは、当該分野で公知である；例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415；Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照のこと。
【００５７】
一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、リガンドに対する高い親和性を有する部分、例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。かかる親和性タグは、組換えスプリットデアミナーゼ融合タンパク質の精製を促進することができる。
【００５８】
スプリットデアミナーゼ融合タンパク質が細胞に送達される方法について、これらのタンパク質は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、または適切な宿主細胞における、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸からの発現によって、産生され得る；タンパク質を産生するためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、タンパク質は、酵母、大腸菌（E. coli）、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動物または培養哺乳動物細胞において産生され得、それらから精製され得る；例えば、Palomares et al., “Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions,” Methods Mol Biol. 2004;267:15-52を参照のこと。さらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、任意選択で、タンパク質が細胞の内側に入ると切断されるリンカーを伴って、細胞中への移行を促進する部分、例えば、脂質ナノ粒子に連結され得る。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照のこと。
【００５９】
発現系
本明細書に記載されるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合があり得る。これは、種々の方式で実施され得る。例えば、スプリットデアミナーゼ融合物をコードする核酸は、複製および／または発現のために、原核生物細胞または真核生物細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングされ得る。中間ベクターは、典型的には、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の産生のためのスプリットデアミナーゼ融合物をコードする核酸の格納または操作のための、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００６０】
発現を得るために、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；および Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）およびサルモネラ属（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:229-235）。かかる発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、市販もされている。
【００６１】
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質が、遺伝子調節のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターが、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の特定の使用に依存して使用され得る。さらに、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の投与のための好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ  ＴＫ、または類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に対して応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系もまた含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照のこと）。
【００６２】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞における核酸の発現のために必要とされるさらなるエレメントを全て含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、例えば、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結のために必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットのさらなるエレメントには、例えば、エンハンサー、および異種スプライスイントロンシグナル（heterologous spliced intronic signal）が含まれ得る。
【００６３】
細胞中に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質の意図した使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターには、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに市販のタグ融合物発現系、例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺが含まれる。
【００６４】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターは、真核生物発現ベクターにおいて使用される場合が多い。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【００６５】
スプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクションの後に、哺乳動物細胞におけるスプリットデアミナーゼ融合タンパク質の発現を可能にする。
【００６６】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下にあるｇＲＮＡコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するなどの、高収量の発現系もまた適切である。
【００６７】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントには、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の独自の制限部位もまた含まれる。
【００６８】
標準的なトランスフェクション法は、標準的な技術を使用して次いで精製される大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を産生するために使用される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照のこと）。
【００６９】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための公知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウイルスベクター、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、Sambrook et al.、上記を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順が、少なくとも１つの遺伝子を、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に首尾よく導入できることだけが必要である。
【００７０】
あるいは、本方法は、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質およびガイドＲＮＡを、例えば、複合体として、一緒に送達することを含み得る。例えば、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質およびｇＲＮＡは、宿主細胞において過剰発現され得、精製され得、次いで、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するためにガイドＲＮＡと（例えば、試験管中で）複合体化され得、細胞に送達され得る。一部の実施形態では、スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細菌発現プラスミドの使用を介して、細菌において発現され得、そこから精製され得る。例えば、Ｈｉｓタグ化スプリットデアミナーゼ融合タンパク質は、細菌細胞において発現され得、次いで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。ＲＮＰの使用は、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードする、またはヌクレアーゼをｍＲＮＡとしてコードするプラスミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達は、特異性も改善し得るが、これはおそらくは、ＲＮＰの半減期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的な発現（プラスミドから得られるような）が存在しないからである。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に送達され得る。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnology 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research 24.6 (2014): 1012-1019を参照のこと。
【００７１】
本発明は、例えば、本明細書に記載される方法における使用のための、ベクター、およびベクターを含む細胞、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および核酸を含むキットもまた含む。
【００７２】
ベータ−サラセミアを処置する
ベータ−サラセミアは、ベータ−グロビン鎖の合成における遺伝的欠損を特徴とする遺伝性障害の一群である。罹患した個体が変異についてホモ接合性である重症型サラセミアは、輸血を必要とする重症貧血と関連する。軽症型サラセミアは、最も重症度が低く、典型的には処置を必要としないが、軽症型サラセミアと重症型サラセミアとの間の重症度のレベルを有するものは、中間型サラセミアを有すると言われる。例えば、Cao and Galanello, Genetics in Medicine 12, 61-76 (2010)を参照のこと。
【００７３】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ変異体、例えば、Ｎ５７ＧもしくはＮ５７ＡもしくはＮ５７ＱまたはＫ６０ＡもしくはＫ６０ＤまたはＹ１３０Ｆは、本明細書に記載されるＢＥ３構造中の融合タンパク質として、例えば、一部の東アジア人集団において一般的なベータ−サラセミア変異ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）を有する対象において、治療として使用され得る（Liang et al., Protein Cell. 2017 Nov;8(11):811-822を参照のこと）。この変異を有する対象を同定するための方法は、当該分野で公知である；例えば、Saetung et al., Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2013 Nov;44(6):1055-64；Liu et al., Hemoglobin. 2015;39(1):18-23；Doro et al., Hemoglobin. 2017 Mar;41(2):96-99；Zhang et al., BMJ Open. 2017 Jan 31;7(1):e013367を参照のこと。本方法は、ＣＤ３４＋造血幹細胞および前駆体細胞（ＨＳＰＣ）を動員し、次いでそれらを抽出することを含み得る（例えば、Bonig and Papayannopoulou, Methods Mol Biol. 2012; 904: 1-14；Jin, et al., BioMed Research International, vol. 2014, Article ID 435215, 9 pages, 2014を参照のこと）。次いで、ＨＳＰＣは、塩基エディタータンパク質をコードするｍＲＮＡを導入することによって、または精製された塩基エディタータンパク質＋ガイド（例えば、ＲＮＰ）を使用することによって、ｅｘ  ｖｉｖｏで（対象の身体の外側で）改変される。これらの細胞は、増殖させるために、例えば数日間にわたって培養物中で維持され得、その後、改変された細胞が、対象に、注入により戻される。対象はまた、改変された細胞が良好に生着することを確実にするために、注入前に骨髄破壊され得る（Sullivan, Keith M., et al., New England Journal of Medicine 378.1 (2018): 35-47を参照のこと）。次いで、改変された幹細胞は、対象の骨髄中に生着し、ベータ−サラセミアフリーの赤血球を産生することができる。
【００７４】
本明細書に記載されるように、本発明者らは、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３が、一部の東アジア人集団において一般的なβ−サラセミア原因対立遺伝子ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）における単一ヌクレオチド編集を効率的に誘導できるかどうかを調査した。本発明者らは、疾患原因ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）プロモーター対立遺伝子の、単独で組み込まれた２００ｂｐ断片を有するＨＥＫ２９３Ｔモデル細胞株を最初に創出し、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３が、ＢＥ３またはＹＥ  ＢＥ３誘導体と比較して、−２８（Ａ＞Ｇ）位における単一ヌクレオチド編集（センス鎖に影響を与えるための、アンチセンス鎖に対する編集）をより効率的に誘導できるかどうかを試験した。予想されるように、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、ＨＢＢ−２５バイスタンダーモチーフにおいて有意により少ない編集事象を誘導したが、−２８（Ａ＞Ｇ）コグネートモチーフでは高い編集活性を維持した。ＢＥ３による編集は、０．５７％の完全に修正された対立遺伝子を生じた。ＢＥ３による、編集ウインドウ中のＨＢＢ−２５シチジンの脱アミノ化は、それぞれ、対立遺伝子の１１．５％および１．８％において、原因β−サラセミア変異ＨＢＢ−２５（Ｇ＞Ｔ）および（Ｇ＞Ｃ）変異を生じる。ＢＥ３による編集後に、総対立遺伝子の１５．２％において存在する産物−２５（Ｇ＞Ａ）もまた、独立したβ−サラセミア表現型を生じ得るが、これは、臨床的にはいまだ確認されていない。逆に、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）部位におけるＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３による編集は、ＢＥ３よりも４０倍大きい、２２．５％の完全に修正された対立遺伝子を生じ、３．９６％の、−２５位における総編集率を生じた。
【実施例】
【００７５】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
【００７６】
材料および方法
プラスミドおよびオリゴヌクレオチド
アミノ酸置換を含有するＢＥ発現プラスミドを、ＰＣＲおよび標準的な分子クローニング法によって生成した。ｇＲＮＡ発現プラスミドを、アニーリングしたオリゴヌクレオチド二重鎖を、ＢｓｍＢＩで切断したＭＬＭ３６３６中にライゲーションすることによって構築した。ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）およびＣＴＮＮＢ１部位を標的化するものを除く全てのｇＲＮＡを、５’グアニンヌクレオチドを含有する部位を標的化するように設計した。
【００７７】
ヒト細胞の培養およびトランスフェクション
ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一の安定に組み込まれたコピーを含有する２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２で３７℃で培養した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞用の培地には、４００μｇ  ｍｌ−１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎを補充した。細胞株のアイデンティティーを、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）によって検証し、細胞を、マイコプラズマ混入について定期的に試験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に、ＤＮ−１００プログラムおよびＳＥ細胞株キットをＬｏｎｚａ  ４−Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで使用して、製造業者の推奨に従って、ＢＥを発現するプラスミド７５０ｎｇおよびｓｇＲＮＡを発現するプラスミド２５０ｎｇをトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３Ｔトランスフェクションについて、７５，０００個の細胞を、２４ウェルプレート中に播種し、１８時間後、製造業者の推奨に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３（Ｍｉｒｕｓ）を使用して、ＢＥを発現するプラスミド６００ｎｇおよびｓｇＲＮＡを発現するプラスミド２００ｎｇをトランスフェクトした。全ての標的化されたアンプリコン配列決定およびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ実験のために、ゲノムＤＮＡを、トランスフェクションの７２時間後に抽出した。細胞を、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．０５％ＳＤＳを含有する溶解緩衝液中で溶解させ、２５０ｒｐｍで振盪しているインキュベーター中で５５℃で一晩インキュベートした。２．５Ｍ  ＮａＣｌおよび１８％ＰＥＧ−６０００中に再懸濁されたカルボキシル改変Ｓｅｒａ−Ｍａｇ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｐｅｅｄ−ｂｅａｄｓ（磁気ビーズ）を使用して、溶解された細胞からゲノムＤＮＡを抽出した。
【００７８】
ＨＥＫ２９３Ｔ．ＨＢＢ細胞株を、レンチウイルスベクター中で、ピューロマイシン耐性遺伝子の発現を駆動するＥＦ１ａプロモーターの上流に、ＨＢＢプロモーターの２００塩基対断片をクローニングすることによって構築した。ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異を、ＰＣＲおよび標準的な分子クローニング法によって挿入した。このレンチウイルスベクターを、２９３ＦＳ細胞中にトランスフェクトし、ウイルス粒子を含有する培地を、７２時間後に回収した。ウイルス粒子を含有する培地を、段階希釈し、およそ１千万個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共に、１０ｃｍプレートに添加した。４８時間後、培地に、２．５μｇ  ｍｌ−１のピューロマイシンを補充し、細胞を、最も少ない生存コロニーを有する１０ｃｍプレートから回収して、単一コピーの組込みを確実にした。
【００７９】
オフターゲット部位選択およびアンプリコン設計
本明細書で特徴付けた部位のうち２つ、ＥＭＸ１部位１およびＦＡＮＣＦは、ＢＥ３特異的オフターゲット部位を発見するための偏りがないアプローチである改変型Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって以前に特徴付けられた。改変型Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって発見された全てのオフターゲットを調査したが、これらの部位は、ＢＥ３を使用してｄｅ  ｎｏｖｏで発見されたので、最も網羅的なオフターゲット特徴付けを表す。ＶＥＧＦＡ部位２標的は、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって以前に特徴付けられたプロミスキャスなホモポリマー性ｇＲＮＡである。ＶＥＧＦＡ部位２  ｇＲＮＡは、１００個を超えるヌクレアーゼオフターゲット部位を有するので、本発明者らは、本発明者らが本明細書での特徴付けのために独自のＰＣＲ増幅プライマーを設計できた遺伝子座中にも存在する、最も高い数のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ読み取りを有する２０個のオフターゲット部位を選択した。ＣＴＮＮＢ１およびＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）ｇＲＮＡは、ＢＥまたはヌクレアーゼオフターゲット部位に関して以前には特徴付けられていない。本発明者らは、これらのｇＲＮＡを使用して、以前に記載されたように１７、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑを実施して、ＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼオフターゲット部位を決定し、Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒを使用して、１つのＲＮＡバルジおよび１つのミスマッチを有する潜在的オフターゲット部位を全て予測した（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑおよびＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ分析は、ｈｇ３８参照ゲノムを使用して実施した）。このクラスのオフターゲットは、ヌクレアーゼと比較して、ＢＥ３においてより優勢であり１６、従って、本発明者らがＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって発見する可能性が低かった部位である。潜在的な編集されたシチジンが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴＳ読み取りの最初の１００塩基対内に入るように、プライマーを、全てのオフターゲット部位を増幅するように設計した。ＥＭＸ１部位１、ＶＥＧＦＡ部位２およびＣＴＮＮＢ１部位１オフターゲット部位を包含する合計で６つのプライマー対は、それらの意図したアンプリコンを増幅せず、従って、さらなる分析からは排除した。
【００８０】
統計的試験
全ての統計的試験は、サンプル間の等分散を仮定せずに、Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ、ＫｒｉｅｇｅｒおよびＹｅｋｕｔｉｅｌｉの方法に従って、両側スチューデントｔ検定を使用して実施した。
【００８１】
標的化されたアンプリコン配列決定
オンターゲット部位およびオフターゲット部位を、各条件について、３つの生物学的反復試料からの約１００ｎｇのゲノムＤＮＡから増幅した。ＰＣＲ増幅は、Ｐｈｕｓｉｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）を用いて実施した。５０μｌのＰＣＲ反応を、１×体積の磁気ビーズを用いて精製した。増幅忠実度を、Ｑｉａｘｃｅｌ機器でのキャピラリー電気泳動によって検証した。直交性配列を有するアンプリコンを、各三連のトランスフェクションについてプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル適合性アダプターを、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩ  ＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐキットを製造業者の指示に従って使用して付加した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｉ５およびｉ７インデックスを、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａのプライマー（Ｄｕａｌ  Ｉｎｄｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒｓ  Ｓｅｔ  １）を使用するＱ５  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを用いたさらなる１０サイクルのＰＣＲによって付加し、０．７×体積の磁気ビーズを使用して精製した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ適合性アダプターおよびインデックスを含有する最終アンプリコンライブラリーを、液滴デジタルＰＣＲによって定量化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器での１５０ｂｐのペアードエンド読み取りを用いて配列決定した。配列決定読み取りを、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒによって逆多重化し、次いで、改変バージョンのＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏによって、各位置における塩基頻度について分析した２８。インデルを、各ｓｇＲＮＡについての予測された切断部位周辺の１０塩基対ウインドウに置いて定量化した。
【００８２】
ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）ｇＲＮＡの発現
ゲノムワイドのオフターゲット編集を減少させるＨＦ１またはＨｙｐａ変異を有するｅＡ３Ａ  ＢＥを使用するために、スペーサーと標的部位との間にミスマッチを有さないｇＲＮＡ中の２０ヌクレオチドのスペーサー配列を使用することが必要であった。本発明者らは、＋１位のグアニンヌクレオチドにおいて転写を優先的に開始するＵ６プロモーターを使用して、プラスミドからＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）ｇＲＮＡを発現させた。スペーサーと標的部位との間の完全なマッチングを保つために、本発明者らは、スペーサーの５’側においてミスマッチしたグアニンを除去することができる自己切断性５’ハンマーヘッド型リボザイムを追加した。
【００８３】
例示的なタンパク質配列
ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ  Ｌ８−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ−ＳＶ４０  ＮＬＳ
【００８４】
【化１】
2020521454.tif 000007
【００８５】
ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）
【００８６】
【化２】
2020521454.tif 000008
【００８７】
ｈＡＩＤ
【００８８】
【化３】
2020521454.tif 000009
【００８９】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【００９０】
【化４】
2020521454.tif 000010
【００９１】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域およびＣ末端のあまり構造化されていない領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【００９２】
【化５】
2020521454.tif 000011
【００９３】
ｒＡＰＯＢＥＣ１
【００９４】
【化６】
2020521454.tif 000012
【００９５】
ｍＡＰＯＢＥＣ３
【００９６】
【化７】
2020521454.tif 000013
【００９７】
ｍＡＰＯＢＥＣ３触媒ドメイン
【００９８】
【化８】
2020521454.tif 000014
【００９９】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ
【０１００】
【化９】
2020521454.tif 000015
【０１０１】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ
【０１０２】
【化１０】
2020521454.tif 000016
【０１０３】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ触媒ドメイン
【０１０４】
【化１１】
2020521454.tif 000017
【０１０５】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ
【０１０６】
【化１２】
2020521454.tif 000018
【０１０７】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ
【０１０８】
【化１３】
2020521454.tif 000019
【０１０９】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ触媒ドメイン
【０１１０】
【化１４】
2020521454.tif 000020
【０１１１】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９
【０１１２】
【化１５】
2020521454.tif 000021
【０１１３】
カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）Ｃａｓ９
【０１１４】
【化１６】
2020521454.tif 000022
【０１１５】
パルビバクラム・ラバメンチボランス（P. lavamentivorans）Ｃａｓ９
【０１１６】
【化１７】
2020521454.tif 000023
【０１１７】
ナイセリア・シネレア（N. cinerea）Ｃａｓ９
【０１１８】
【化１８】
2020521454.tif 000024
【０１１９】
カンピロバクター・ラリ（C. lari）Ｃａｓ９
【０１２０】
【化１９】
2020521454.tif 000025
【０１２１】
[実施例１]
標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善する
野生型シチジンデアミナーゼドメインは、２〜３ヌクレオチドのモチーフに対する固有の基質配列特異性を有する（表１を参照のこと）。ＡＰＯＢＥＣ酵素は、認識ループ１（ＲＬ１）およびループ７と呼ばれる可変性の配列組成を有する２つの認識ループ中の残基間で形成される直接的接触を介して、それらのコグネート配列モチーフを認識する１２〜１３、１７〜２２（表２、図２Ａ〜２Ｂおよび図３Ａ〜３Ｂを参照のこと）。例えば、ＡＰＯ３Ａ基質配列特異性の主要な決定基は、ループ７中の残基Ｄ１３１であり、これは、５’ＴＣモチーフ中のチミンと、２つの水素結合を形成する。ＡＰＯ３Ａの特異性を改変するために、本発明者らは、１３１位における残基のアイデンティティーを、塩基特異的接触を形成することが以前に実証された残基へと変更させた（表７）４３。
【０１２２】
表１に列挙された全ての他のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼの特異性を変更するために、本発明者らは、ＡＰＯ３Ａに対する配列アラインメントによって同定された、これらのタンパク質の各々からの相同な残基を変更させた。
【０１２３】
野生型ＡＰＯ３Ａは、５’ＴｃＲモチーフに対する固有の配列特異性を有するが、より低い効率で５’ＡｃＲ、５’ＧｃＲおよび５’ＣｃＲモチーフ（ここで、小文字のＣは、脱アミノ化される残基である）を脱アミノ化することができる。これは、ＴｃＧまたはＴｃＡモチーフのみが効率的に脱アミノ化されるように、ＡＰＯ３Ａとその基質ｓｓＤＮＡとの間で形成される接触の形態で過剰な結合エネルギーを除去することによって、そのカノニカルＴｃＲ基質モチーフに対するより高い特異性を有するようにＡＰＯ３Ａを操作することが可能であり得ることを示唆している。基質ｓｓＤＮＡに結合したＡＰＯ３Ａの結晶構造２１に基づいて、本発明者らは、それらを変更することで、より特異的なデアミナーゼが生じ得るように、そのＤＮＡ接触が顕著な非特異的基質結合エネルギーに寄与し得る候補残基として、Ｒ２８およびＫ３０（これらは、半特異的様式で、ＴＣＲのすぐ３’側の塩基に接触すると考えられる）ならびにＮ５７、Ｒ６０およびＹ１３０（これらは全て、非塩基特異的様式でｓｓＤＮＡ基質骨格と接触する）を同定した。本発明者らはまた、標的シトシン塩基がその中に嵌まる疎水性ポケットの形成に寄与する残基としてＷ９８を同定し、Ｗ９８Ｙが、デアミナーゼ活性を保持しつつこのポケットの疎水性を減少させ、それによって、Ｔｃモチーフの脱アミノ化に必要とされる結合エネルギーを上回る任意の可能な過剰な結合エネルギーを減少させると仮説を立てた。複数のＡＰＯＢＥＣホモログおよびオルソログが、配列レベルでＡＰＯ３Ａに対する顕著な類似性を有するので、本発明者らは、これらのタンパク質の各々に対する基質配列特異性を増加させると予測されるコグネート残基もまた同定した。
【０１２４】
本発明者らが、ＴｃＲモチーフに対する増加した特異性を有する操作された塩基編集タンパク質に寄与することができると仮説を立てた変異を検証するために、本発明者らは、哺乳動物細胞におけるタンパク質過剰発現のために、プラスミドベクター中に、ＡＰＯ３Ａ中に単一残基置換を有するＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質をコードする遺伝子をクローニングした。次いで、本発明者らは、単一の組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子内の脱アミノ化基質として作用することが可能な複数のトリヌクレオチドモチーフを有する２つの別個の部位のうち１つを標的化するガイドＲＮＡを発現するように設計したプラスミドと組み合わせて、ヒトＵ２ＯＳ細胞中に、これらのプラスミドベクターをトランスフェクトした。７２時間後、本発明者らは、トランスフェクトされたＵ２ＯＳ集団からゲノムＤＮＡを回収し、ガイドＲＮＡゲノム標的部位においてハイスループットアンプリコン配列決定を実施した。本発明者らは、野生型ＡＰＯ３Ａタンパク質をｎＣａｓ９−ＵＧＩに融合させた場合、得られたタンパク質が、予測されたＴｃＲモチーフにある標的部位においてであるが、標的部位に存在するＧｃＴおよびＧｃＧモチーフに対しても、Ｃ＞Ｔ遷移をもたらすことができることが見出された（図４）。しかし、Ｎ５７またはＫ６０を表７に列挙された残基に変異させた場合、本発明者らは、編集ウインドウ中に存在するオンターゲットＴｃＧにおいてロバストな脱アミノ化を観察したが、塩基編集ウインドウの外側および編集ウインドウ中に存在するＧｃＴモチーフにおいて、これらのタンパク質がモチーフを標的化する能力の有意な減少を観察した。特に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩおよびＡＰＯ３Ａ  Ｋ６０Ｄ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩは、編集ウインドウＴｃＧに対してロバストな活性を保持し、編集ウインドウＧｃＴモチーフに対しては、低い〜非常に低い活性を保持した（図５）。ＥＧＦＰ部位１の編集ウインドウ中におけるＴｃＧのＧｃＴに対する優先性のこの増加を定量的に評価するために、本発明者らは、編集ウインドウ中のＴｃＧモチーフにおける脱アミノ化頻度を、編集ウインドウ中のＧｃＴモチーフの脱アミノ化頻度によって除算して、これらのタンパク質についての特異性比を決定した（図６）。本発明者らは、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩおよびＡＰＯ３Ａ  Ｋ６０Ｄ／Ｅ／Ｎ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩが両方とも、野生型ＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩタンパク質と比較して、ＧｃＴモチーフではなくＴｃＧモチーフを選ぶ特異性の増加を示したことを見出した。次いで、本発明者らは、ＥＧＦＰ部位２、ＧｃＡ、ＡｃＡ、ＡｃＣ、ＣｃＣ、ＣｃＡおよびＧｃＧモチーフを有する標的部位、ならびに編集ウインドウの外側のＴｃＧモチーフに対するこれらのタンパク質の活性を評価した。以前に記載された変異体の各々が、標的部位中のこれらのオフターゲットモチーフの各々に対する有意に減少した活性、ならびに編集ウインドウの外側で見出されるオンターゲットＴＣＧモチーフに対する減少した活性を示した（図７、図８）。
【０１２５】
そのｓｓＤＮＡ基質との複合体中のＡＰＯ３Ａの結晶構造２１に基づいて、本発明者らは、Ｋ３０が、ＴｃＧモチーフ中の３番目のヌクレオチドと塩基特異的に接触すると判定した。本発明者らは、この位置において残基に対してなされた変異が、トリヌクレオチド基質モチーフ中のＡＰＯ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩによって認識される３番目のヌクレオチドのアイデンティティーを変更させると仮説を立てた。本発明者らは、３０位における残基のアイデンティティーが、基質モチーフ中の３番目のヌクレオチドのアイデンティティーに顕著に影響すると予測するので、本発明者らは、本発明者らが表９中の特定の塩基に接触すると予測する残基を決定した。
【０１２６】
塩基エディタータンパク質をコードする得られたプラスミドＤＮＡを、一過的トランスフェクションによって、染色体に組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子を標的化するｇＲＮＡをコードするプラスミドと一緒にヒト細胞に送達した場合、ＡＰＯ３Ａ中の種々の残基に対してなされた変異（表９）は、様々な程度まで、配列優先性を回復することができた（図９）。本発明者らは、表７に列挙された位置に対する変異を組み合わせ、プラスミドの一過的トランスフェクションによってＢＥタンパク質を同じＥＧＦＰ標的部位へと標的化することによって、そのコグネート５’ＴＣモチーフに対するＡＰＯ３Ａの特異性を増強でき、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７ＡまたはＮ５７Ｇ  ＢＥ３と類似のモチーフ特異性を有するＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｑ／Ｙ１３０Ｆ  ＢＥ３バリアント（図１０）を生じることもまた見出した。
【０１２７】
本発明者らは、別のノンコグネート５’ＶＣ（ここで、Ｖ＝Ａ、ＣまたはＧである）に加えて、編集ウインドウ中にコグネート５’ＴＣモチーフを含有する１２個の内因性ゲノム部位において、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７ＡもしくはＮ５７Ｇまたは（Ｎ５７Ｑ／Ｙ１３０Ｆ）ＢＥ３の活性をスクリーニングし、それらを、ＢＥ３ならびに技術水準の操作されたバリアントＹＥ１、ＹＥ２およびＹＥＥ  ＢＥ３（ＹＥ  ＢＥ３）に対して比較したが、これは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）デアミナーゼドメイン中に、ＢＥ３と比較してその速度論的速度を緩徐化し、その編集ウインドウの長さを制限する点変異を取り込むことによってかかるバイスタンダー変異の頻度を減少させる４４。本発明者らは、１２個の部位のうち８個において、操作されたＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３バリアントが、ノンコグネート５’ＶＣモチーフの５倍〜２６４倍、コグネートモチーフにおけるＣからＴへの編集を誘導したことを見出した（図１１〜１２）。しかし、操作されたＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３バリアントは、残り４つの部位において、５未満の比でコグネート：ノンコグネート編集を誘導した。
【０１２８】
本発明者らは次に、相同なタンパク質の触媒速度および処理能力に影響することが以前に示された残基において、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３への変異を追加することによって、これらの部位において配列特異的脱アミノ化を改善しようとした（表１０）。ＹＥ  ＢＥ３タンパク質に由来する個々の相同な変異の追加は、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ二重変異体の配列特異性を顕著に増加させなかったが、残基Ａ７１およびＩ９６に対してなされた変異は、試験した３つの部位について、コグネート：ノンコグネート編集比を、５未満からおよそ１３まで大きく増加させた（図１３）。
【０１２９】
決定的なことに、これらの変異の正確な性質は、送達モダリティに依存した様式で異なり得る。例えば、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）による、またはｍＲＮＡ中にコードされたこれらの試薬の送達は、細胞中でのタンパク質のより短い持続時間を生じ得る。細胞中での塩基エディタータンパク質のより短い持続時間は、例えばプラスミドトランスフェクションによるより長く続く送達と比較して、異なる変異スペクトルを生じ得る４５。結果として、プラスミドによって送達した場合には最適未満の配列特異性を保持するが、より短く続くモダリティによって送達した場合には最適な配列特異性を保持する操作されたシチジンデアミナーゼＢＥ、例えば、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７ＱまたはＫ６０ＤまたはＹ１３０Ｆ  ＢＥ３を使用することが必要であり得る。
【０１３０】
操作されたバリアントＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３はまた、野生型ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３およびＢＥ３と比較して、オフターゲット部位における増加したゲノムワイドの忠実度を示した。本発明者らは、十分に特徴付けられたＥＭＸ１（図１４）またはＦＡＮＣＦ  ｇＲＮＡ（図１５）を発現するプラスミドと一緒に、ＡＰＯ３Ａ  ＢＥ３、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３またはＢＥ３をコードするプラスミドＤＮＡを、細胞に一過的にトランスフェクトした。ＢＥ３は、ＥＭＸ１については２５個の以前に同定されたオフターゲット部位のうち１６個において、ＦＡＮＣＦについては１５個のオフターゲット部位のうち３つにおいて、ハイスループット配列決定によって検出可能な編集を誘導した。逆に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、ＥＭＸ１については６／２５の部位、ＦＡＮＣＦについては０／１５の部位において編集を誘導した。ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３がオフターゲット編集を誘導した部位では、これは、ＢＥ３と比較して、大きく低減された頻度でであった。ＨＦ１またはＨｙｐａ  ＳｐＣａｓ９からの高忠実度変異の、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３への追加は、アッセイの検出閾値を下回るまで、全てのオフターゲット編集を低減させた。
【０１３１】
最後に、本発明者らは、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ塩基エディターが、ベータ−サラセミア変異ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）をより効率的に修正するために使用することができるかどうかを決定しようとした。アンチセンス鎖上のこの変異を標的化するｇＲＮＡ（ＣＴＧＡＣＴＴｃＴＡＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣ（ここで、太字の小文字「ｃ」は、標的シトシンである））では、５’Ａが先行する２番目のシチジン（バイスタンダーシチジン）が、−２８位における５’Ｔが先行する標的シチジンに加えて、編集ウインドウ中に存在する。バイスタンダーシチジンの変異は、独立したベータサラセミア表現型を生じ、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異については、なんらかの潜在的治療で回避すべきである。本発明者らは、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異をコードするＨＢＢプロモーターの、レンチウイルスに組み込まれた２００塩基対断片を有するＨＥＫ２９３細胞中に、ＢＥ３またはＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３（ならびに第２のＵＧＩドメインをＡ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３に追加するもの、またはＨＦ１もしくはＨｙｐａ高忠実度変異をｎＣａｓ９部分に追加するものを含む、図１６に示される他のタンパク質）をコードするプラスミドＤＮＡを一過的にトランスフェクトした。７２時間後、本発明者らは、細胞からゲノムＤＮＡを回収し、ＰＣＲを使用して標的部位を増幅し、ｉｌｌｕｍｉｎａハイスループット配列決定によってＰＣＲ産物を配列決定して、標的シチジンおよびバイスタンダーシチジンの両方の脱アミノ化頻度を試験した。
【０１３２】
本発明者らは、ＢＥ３およびＹＥ  ＢＥ３タンパク質が、およそ等しい比率で標的シチジンおよびバイスタンダーシチジンの両方を編集したが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３が、標的シチジンを、バイスタンダーシチジンのおよそ１５倍脱アミノ化したことを見出した（図１７）。次いで、本発明者らは、ＢＥ３でＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）部位を編集することが、完全に修正された対立遺伝子（すなわち、−２８位は編集されているが、いずれの他の位置も編集されていない対立遺伝子）を生じた頻度を分析した。ＢＥ３は、配列決定した総対立遺伝子の０．５％の頻度で、完全に編集された対立遺伝子を生じた。逆に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３で編集することは、ＢＥ３で編集することの４０倍、配列決定した対立遺伝子の総計の２２％の比率で、完全に編集された対立遺伝子を生じた（図１８）。本発明者らは、次に、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３で編集することが、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）ｇＲＮＡを使用して、ＢＥ３よりも少ないオフターゲット脱アミノ化事象を生じるかどうかを調査した。ＢＥ３は、８つのオフターゲット部位のうち３つにおいて検出可能な脱アミノ化を誘導したが、ＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３は、８つのオフターゲット部位のうちたった１つにおいて編集を誘導した（図１９）。従って、操作されたＡＰＯ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３バリアントは、ＢＥ３または技術水準のＹＥ  ＢＥ３タンパク質と比較して、試験した８つの部位においてより少ないオフターゲット効果で、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）疾患原因対立遺伝子をより効率的に修正することができる。
【０１３３】
さらなる実験では、寄付から回収された、ＨＢＢ−２８（Ａ＞Ｇ）変異を有するヒト患者のＣＤ３４＋ＨＳＰＣを使用する。精製されたＡ３Ａ  Ｎ５７Ｇ  ＢＥ３タンパク質を、ガイドＲＮＡと共に細胞に送達する。５日後、ｇＤＮＡを抽出し、疾患修正を配列決定によって評価する。
【０１３４】
表７に列挙された変異は、そのままで、または任意の可能な組合せで、デアミナーゼタンパク質またはドメインの特異性を増加させるために使用され得る。表８に列挙された変異は、標的化可能なモチーフ配列を変更するために意図され、変更および増加された基質配列を有する操作されたデアミナーゼタンパク質またはドメインを創出するために、表７中の変異のいずれかと組み合わされ得る。さらに、表９に列挙された変異は、トリヌクレオチドモチーフ中の１番目または３番目のヌクレオチドに対する変更された特異性を有し、他の可能な脱アミノ化基質モチーフと比較してその標的モチーフに対する増加した特異性を有する操作されたデアミナーゼタンパク質を創出するために、表７または表８中に列挙された変異のいずれかと組み合わされ得る。
【０１３５】
【表６】
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【０１３６】
表７は、特異性操作のための、顕著な配列および構造類似性を有するＡＰＯＢＥＣオルソログを示す。これらの例では、ＡＰＯ３Ａに対するタンパク質配列アラインメントを使用して、ＡＰＯ３Ａ位置に対して相同な残基を決定した。変異される６つの残基位置の各々が、デアミナーゼタンパク質とそのｓｓＤＮＡ基質との間の過剰な結合エネルギーを低減させることによって、そのカノニカルまたは再操作された基質配列に対するそのデアミナーゼドメインの特異性を増加させると予測される１つまたは複数の残基と共に列挙される。
【０１３７】
【表７】
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【０１３８】
これらの例では、ＡＰＯ３Ａに対するタンパク質配列アラインメントを使用して、ＡＰＯ３Ａ  Ｄ１３１に対して相同な残基を決定した。各タンパク質の配列特異性を変更すると予測される残基変異の位置およびアイデンティティーが、各２ヌクレオチドモチーフについて与えられる。全ての位置情報は、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇから得た野生型タンパク質配列を指す。
【０１３９】
【表８】
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【０１４０】
これらの例では、ＡＰＯ３Ａに対するタンパク質配列アラインメントを使用して、ＡＰＯ３Ａ  Ｋ３０に対して相同な残基を決定した。各タンパク質の配列特異性を変更すると予測される残基変異の位置およびアイデンティティーが、各３ヌクレオチドモチーフについて与えられる。全ての位置情報は、ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇから得た野生型タンパク質配列を指す。
【０１４１】
【表９】
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【０１４２】
参考文献
１．Komor, Alexis C., Yongjoo B. Kim, Michael S. Packer, John A. Zuris, and David R. Liu. "Programmable Editing of a Target Base in Genomic DNA without Double-stranded DNA Cleavage." Nature533.7603 (2016): 420-24.
２．Yang, Luhan, Adrian W. Briggs, Wei Leong Chew, Prashant Mali, Marc Guell, John Aach, Daniel Bryan Goodman, David Cox, Yinan Kan, Emal Lesha, Venkataramanan Soundararajan, Feng Zhang, and George Church. "Engineering and Optimising Deaminase Fusions for Genome Editing." Nature Communications 7 (2016): 13330.
３．Jasin, Maria, and Rodney Rothstein. "Repair of strand breaks by homologous recombination." Cold Spring Harbor perspectives in biology 5.11 (2013): a012740.
４．Cone, Richard, Thomas Bonura, and E. C. Friedberg. "Inhibitor of uracil-DNA glycosylase induced by bacteriophage PBS2. Purification and preliminary characterization." Journal of Biological Chemistry 255.21 (1980): 10354-10358.
５．Kuscu, Cem, and Mazhar Adli. "CRISPR-Cas9-AID Base Editor Is a Powerful Gain-of-function Screening Tool." Nature Methods 13.12 (2016): 983-84.
６．Hess, Gaelen T., Laure Fresard, Kyuho Han, Cameron H. Lee, Amy Li, Karlene A. Cimprich, Stephen B. Montgomery, and Michael C. Bassik. "Directed Evolution Using DCas9-targeted Somatic Hypermutation in Mammalian Cells." Nature Methods 13.12 (2016): 1036-042.
７．Nishida, K., T. Arazoe, N. Yachie, S. Banno, M. Kakimoto, M. Tabata, M. Mochizuki, A. Miyabe, M. Araki, K. Y. Hara, Z. Shimatani, and A. Kondo. "Targeted Nucleotide Editing Using Hybrid Prokaryotic and Vertebrate Adaptive Immune Systems." Science353.6305 (2016).
８．Tsai, Shengdar Q., Zongli Zheng, Nhu T. Nguyen, Matthew Liebers, Ved V. Topkar, Vishal Thapar, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, A. John Iafrate, Long P. Le, Martin J. Aryee, and J. Keith Joung. "GUIDE-seq Enables Genome-wide Profiling of Off-target Cleavage by CRISPR-Cas Nucleases." Nature Biotechnology 33.2 (2014): 187-97.
９．Wu, Xuebing, David A. Scott, Andrea J. Kriz, Anthony C. Chiu, Patrick D. Hsu, Daniel B. Dadon, Albert W. Cheng, Alexandro E. Trevino, Silvana Konermann, Sidi Chen, Rudolf Jaenisch, Feng Zhang, and Phillip A. Sharp. "Genome-wide Binding of the CRISPR Endonuclease Cas9 in Mammalian Cells." Nature Biotechnology 32.7 (2014): 670-76.
１０．Kim, Y. Bill, Alexis C. Komor, Jonathan M. Levy, Michael S. Packer, Kevin T. Zhao, and David R. Liu. "Increasing the Genome-targeting Scope and Precision of Base Editing with Engineered Cas9-cytidine Deaminase Fusions." Nature Biotechnology 35.4 (2017): 371-76.
１１．Byeon, In-Ja L., Jinwoo Ahn, Mithun Mitra, Chang-Hyeock Byeon, Kamil Hercik, Jozef Hritz, Lisa M. Charlton, Judith G. Levin, and Angela M. Gronenborn. "NMR Structure of Human Restriction Factor APOBEC3A Reveals Substrate Binding and Enzyme Specificity." Nature Communications 4 (2013): 1890.
１２．Bransteitter, Ronda, Courtney Prochnow, and Xiaojiang S. Chen. "The Current Structural and Functional Understanding of APOBEC Deaminases." Cellular and Molecular Life Sciences 66.19 (2009): 3137-147.
１３．Mitra, Mithun, Dustin Singer, Yu Mano, Jozef Hritz, Gabriel Nam, Robert J. Gorelick, In-Ja L. Byeon, Angela M. Gronenborn, Yasumasa Iwatani, and Judith G. Levin. "Sequence and Structural Determinants of Human APOBEC3H Deaminase and Anti-HIV-1 Activities." Retrovirology 12.1 (2015): 3.
１４．Nair, S., S. Sanchez-Martinez, X. Ji, and A. Rein. "Biochemical and Biological Studies of Mouse APOBEC3." Journal of Virology 88.7 (2014): 3850-860.
１５．Langlois, Marc-Andre, et al. "Mutational comparison of the single-domained APOBEC3C and double-domained APOBEC3F/G anti-retroviral cytidine deaminases provides insight into their DNA target site specificities." Nucleic acids research33.6 (2005): 1913-1923.
１６．Harris, Reuben S., Svend K. Petersen-Mahrt, and Michael S. Neuberger. "RNA Editing Enzyme APOBEC1 and Some of Its Homologs Can Act as DNA Mutators." Molecular Cell 10.5 (2002): 1247-253.
１７．Chen, Kuan-Ming, Elena Harjes, Phillip J. Gross, Amr Fahmy, Yongjian Lu, Keisuke Shindo, Reuben S. Harris, and Hiroshi Matsuo. "Structure of the DNA Deaminase Domain of the HIV-1 Restriction Factor APOBEC3G." Nature 452.7183 (2008): 116-19.
１８．Pham, Phuong, Samir A. Afif, Mayuko Shimoda, Kazuhiko Maeda, Nobuo Sakaguchi, Lars C. Pedersen, and Myron F. Goodman. "Structural Analysis of the Activation-induced Deoxycytidine Deaminase Required in Immunoglobulin Diversification." DNA Repair43 (2016): 48-56.
１９．Shandilya, Shivender M.d., Madhavi N.l. Nalam, Ellen A. Nalivaika, Phillip J. Gross, Johnathan C. Valesano, Keisuke Shindo, Ming Li, Mary Munson, William E. Royer, Elena Harjes, Takahide Kono, Hiroshi Matsuo, Reuben S. Harris, Mohan Somasundaran, and Celia A. Schiffer. "Crystal Structure of the APOBEC3G Catalytic Domain Reveals Potential Oligomerization Interfaces." Structure 18.1 (2010): 28-38.
２０．Shi, Ke, Michael A. Carpenter, Kayo Kurahashi, Reuben S. Harris, and Hideki Aihara. "Crystal Structure of the DNA Deaminase APOBEC3B Catalytic Domain." Journal of Biological Chemistry 290.47 (2015): 28120-8130.
２１．Shi, Ke, Michael A. Carpenter, Surajit Banerjee, Nadine M. Shaban, Kayo Kurahashi, Daniel J. Salamango, Jennifer L. Mccann, Gabriel J. Starrett, Justin V. Duffy, Ozlem Demir, Rommie E. Amaro, Daniel A. Harki, Reuben S. Harris, and Hideki Aihara. "Structural Basis for Targeted DNA Cytosine Deamination and Mutagenesis by APOBEC3A and APOBEC3B." Nature Structural & Molecular Biology24.2 (2016): 131-39.
２２．Salter, Jason D., Ryan P. Bennett, and Harold C. Smith. "The APOBEC Protein Family: United by Structure, Divergent in Function." Trends in Biochemical Sciences 41.7 (2016): 578-94.
２３．Holden LG, Prochnow C, Chang PY, Bransteitter R, Chelico L, Sen U, Stevens RC, Goodman MF, Chen XS (2008) Crystal structure of the anti-viral APOBEC3G catalytic domain and functional implications. Nature 456:121-124. 
２４．Logue, Eric C., et al. "A DNA sequence recognition loop on APOBEC3A controls substrate specificity." PloS one 9.5 (2014): e97062.
２５．Kohli, R. M., S. R. Abrams, K. S. Gajula, R. W. Maul, P. J. Gearhart, and J. T. Stivers. "A Portable Hot Spot Recognition Loop Transfers Sequence Preferences from APOBEC Family Members to Activation-induced Cytidine Deaminase." Journal of Biological Chemistry 284.34 (2009): 22898-2904.
２６．Kim, Daesik, Kayeong Lim, Sang-Tae Kim, Sun-Heui Yoon, Kyoungmi Kim, Seuk-Min Ryu, and Jin-Soo Kim. "Genome-wide Target Specificities of CRISPR RNA-guided Programmable Deaminases." Nature Biotechnology (2017).
２７．Kleinstiver, Benjamin P., Vikram Pattanayak, Michelle S. Prew, Shengdar Q. Tsai, Nhu T. Nguyen, Zongli Zheng, and J. Keith Joung. "High-fidelity CRISPR-Cas9 Nucleases with No Detectable Genome-wide Off-target Effects." Nature529.7587 (2016): 490-95.
２８．Slaymaker, I. M., L. Gao, B. Zetsche, D. A. Scott, W. X. Yan, and F. Zhang. "Rationally Engineered Cas9 Nucleases with Improved Specificity." Science 351.6268 (2015): 84-88.
２９．Dahlman, James E., Omar O. Abudayyeh, Julia Joung, Jonathan S. Gootenberg, Feng Zhang, and Silvana Konermann. "Orthogonal Gene Knockout and Activation with a Catalytically Active Cas9 Nuclease." Nature Biotechnology 33.11 (2015): 1159-161.
３０．Fu, Yanfang, et al. "Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs." Nature biotechnology 32.3 (2014): 279-284.
３１．Boissel, S., J. Jarjour, A. Astrakhan, A. Adey, A. Gouble, P. Duchateau, J. Shendure, B. L. Stoddard, M. T. Certo, D. Baker, and A. M. Scharenberg. "MegaTALs: A Rare-cleaving Nuclease Architecture for Therapeutic Genome Engineering." Nucleic Acids Research 42.4 (2013): 2591-601.
３２．Bolukbasi, Mehmet Fatih, Ankit Gupta, Sarah Oikemus, Alan G. Derr, Manuel Garber, Michael H. Brodsky, Lihua Julie Zhu, and Scot A. Wolfe. "DNA-binding-domain Fusions Enhance the Targeting Range and Precision of Cas9." Nature Methods12.12 (2015): 1150-156.
３３．Kleinstiver, Benjamin P., et al. "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition." Nature biotechnology (2015).
３４．Ma, Enbo, et al. "Single-stranded DNA cleavage by divergent CRISPR-Cas9 enzymes." Molecular cell 60.3 (2015): 398-407.
３５．Santos-Pereira, Jose M., and Andres Aguilera. "R Loops: New Modulators of Genome Dynamics and Function." Nature Reviews Genetics 16.10 (2015): 583-97.
３６．Rebhandl, Stefan, Michael Huemer, Richard Greil, and Roland Geisberger. "AID/APOBEC Deaminases and Cancer." Oncoscience2 (2015): 320.
３７．Suspene, Rodolphe, et al. "Recovery of APOBEC3-edited human immunodeficiency virus G→ A hypermutants by differential DNA denaturation PCR." Journal of general virology 86.1 (2005): 125-129.
３８．Aynaud, Marie-Ming, et al. "Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A." Journal of Biological Chemistry 287.46 (2012): 39182-39192.
３９．Shinohara, Masanobu, et al. "APOBEC3B can impair genomic stability by inducing base substitutions in genomic DNA in human cells." Scientific reports 2 (2012): 806.
４０．Holtz, Colleen M., Holly A. Sadler, and Louis M. Mansky. "APOBEC3G cytosine deamination hotspots are defined by both sequence context and single-stranded DNA secondary structure." Nucleic acids research (2013): gkt246.
４１．Rebhandl, Stefan, Michael Huemer, Richard Greil, and Roland Geisberger. "AID/APOBEC Deaminases and Cancer." Oncoscience 2 (2015): 320.
４２．Ear, Po Hien, and Stephen W. Michnick. "A General Life-death Selection Strategy for Dissecting Protein Functions." Nature Methods 6.11 (2009): 813-16.
４３．Luscombe, Nicholas M., Roman A. Laskowski, and Janet M. Thornton. "Amino acid-base interactions: a three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at an atomic level." Nucleic acids research 29.13 (2001): 2860-2874.
４４．Kim, Y. Bill, et al. "Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions." Nature Biotechnology 35.4 (2017): 371-376.
４５．Rees, Holly A., et al. "Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery." Nature Communications 8 (2017): ncomms15790.
４６．Kleinstiver, Benjamin P., et al. "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities." Nature 523.7561 (2015): 481-485.
４７．Kleinstiver, Benjamin P., et al. "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition." Nature biotechnology 33.12 (2015): 1293-1298.
【０１４３】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、本発明の範囲を限定するのではなく例示する意図であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
2020521454.tif 000030
【図２Ａ】
2020521454.tif 000031
【図２Ｂ】
2020521454.tif 000032
【図３Ａ−３Ｂ】
2020521454.tif 000033
【図４】
2020521454.tif 000034
【図５】
2020521454.tif 000035
【図６】
2020521454.tif 000036
【図７】
2020521454.tif 000037
【図８】
2020521454.tif 000038
【図９】
2020521454.tif 000039
【図１０−１】
2020521454.tif 000040
【図１０−２】
2020521454.tif 000041
【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
2020521454.tif 000048
【図１５】
2020521454.tif 000049
【図１６】
2020521454.tif 000050
【図１７】
2020521454.tif 000051
【図１８】
2020521454.tif 000052
【図１９】
2020521454.tif 000053
【配列表】
2020521454000001.app
【国際調査報告】
2020521454.tif 000054
2020521454.tif 000055
2020521454.tif 000056
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