【手続補正書】
【提出日】平成30年7月25日(2018.7.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
伸張組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）に結合した配列番号１の配列を有する成長ホルモン（ＧＨ）の液体形状の組成物を含む、予め充填されたシリンジであって、該組成物が、配列番号７５７の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する、予め充填されたシリンジ。
【請求項２】
前記組成物が、配列番号７５７の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項３】
前記組成物が、配列番号７５７の配列と少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項４】
前記組成物が、配列番号７５７のアミノ酸２〜１２５１を含む、請求項１に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項５】
前記組成物が、配列番号７５７のアミノ酸２〜１２５１からなる、請求項１に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項６】
前記成長ホルモンの受容体に対する前記組成物の結合親和性が、前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＨの結合親和性と比較して低くなる、請求項１に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項７】
前記成長ホルモンの受容体に対する前記組成物の結合親和性が、ＸＴＥＮに結合していないＧＨと比較して少なくとも３倍低くなる、請求項６に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項８】
前記成長ホルモンの受容体に対する前記組成物の結合親和性が、前記ＸＴＥＮを持たない対応するＧＨの結合親和性と比較して少なくとも１０倍低くなる、請求項６に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項９】
低下した結合親和性を有する前記組成物が、低下した受容体介在性クリアランスを示す、請求項６に記載の予め充填されたシリンジ。
【請求項１０】
低下した結合親和性を有する前記組成物が、前記ＸＴＥＮに結合していない対応するＧＨと比較して少なくとも３倍の、半減期の対応する延長を有する、請求項６に記載の予め充填されたシリンジ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
本発明の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び具体的な実施形態に示した、付随する図表を参照することによりさらに説明され得る。
【図１】図１は、ＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（図１Ａ〜Ｈ）の例を示す模式図であり、全てはＮ末端からＣ末端方向に図示されている。図１Ａは、それぞれが単一の成長ホルモン（ＧＨ）及びＸＴＥＮを含む、異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）を示し、第一の融合タンパク質はＸＴＥＮ分子を有し（１０２）、そのＸＴＥＮ分子はＧＨのＣ末端に結合し（１０３）、そして第二の融合タンパク質はＧＨのＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子を有する（１０３）。図１Ｂはそれぞれが単一のＧＨ、スペーサー配列及びＸＴＥＮを含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）を示し、第一の融合タンパク質はＸＴＥＮ分子を有し（１０２）、そのＸＴＥＮ分子はスペーサー配列のＣ末端に結合し（１０４）そしてスペーサー配列はＧＨのＣ末端に結合しており（１０３）、第二の融合タンパク質はスペーサー配列のＮ末端に結合するＸＴＥＮ分子を有し（１０４）そしてスペーサー配列はＧＨのＮ末端に結合している（１０３）。図１Ｃは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子及び１つのＸＴＥＮ分子を含む２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一のＧＨのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有し、かつそのＧＨは第二のＧＨのＣ末端に結合し、そして第二の融合タンパク質は第一のＧＨのＮ末端にＸＴＥＮが結合し、第一のＧＨが第二のＧＨのＮ末端に結合する、反対向きの配置をとる。図１Ｄは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一はスペーサー配列のＣ末端に結合しているＸＴＥＮを有し、そしてスペーサー配列は第一のＧＨのＣ末端に結合し、第一のＧＨは第二のＧＨのＣ末端に結合しており、第二の融合タンパク質は、ＸＴＥＮがスペーサー配列のＮ末端に結合し、そしてスペーサー配列が第一のＧＨのＮ末端に結合し、第一のＧＨが第二のＧＨのＮ末端に結合している、反対向きの配置をとる。図１Ｅは、それぞれが２つの単一のＧＨ分子、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ分子を含む、２つの異なる配置のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０１）を示し、第一の融合タンパク質は第一のＧＨのＣ末端に結合したＸＴＥＮを有し、そして第一のＧＨはスペーサー配列のＣ末端に結合し、このスペーサー配列は第二のＧＨ分子のＣ末端に結合しており、第二の融合タンパク質は、ＸＴＥＮが第一のＧＨのＮ末端に結合し、第一のＧＨがスペーサー配列のＮ末端に結合し、同様にスペーサー配列が第二のＧＨ分子のＮ末端に結合している、反対向きの配置をとる。図１Ｆは、それぞれが１つのＧＨ分子及びＧＨのＮ末端及びＣ末端に結合した２つのＸＴＥＮ分子を含むＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）の配置を示す。図１Ｇは、２つのＸＴＥＮが単一のＧＨに結合した融合タンパク質の配置（１０６）を示し、ここで第二のＸＴＥＮとＧＨはスペーサー配列により離されている。図１Ｈは、２つのＧＨが２つのＸＴＥＮに結合した融合タンパク質の配置（１０６）を示し、ここで第二のＸＴＥＮは第一のＧＨのＣ末端に結合しており、第二のＧＨのＮ末端はＧＨＸＴＥＮのＣ末端に相当する。
【図２】図２は、図１の対応するＧＨＸＴＥＮポリペプチドをコードするＧＨＸＴＥＮ遺伝子のポリヌクレオチド構築物（図２Ａ−Ｈ）の例を示す模式図であり、全ては５’から３’方向に図示されている。これらＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質をコードする遺伝子の具体例は、１つのＧＨ及びＸＴＥＮ（２００）；又は１つのＧＨ、１つのスペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２００）；２つのＧＨ及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；又は２つのＧＨ、スペーサー配列及び１つのＸＴＥＮ（２０１）；１つのＧＨ及び２つのＸＴＥＮ（２０５）；又は２つのＧＨ及び２つのＸＴＥＮ（２０６）を含む。これらの図においては、ポリヌクレオチドは以下の要素をコードし、全ての配列はインフレームで結合される：ＸＴＥＮ（２０２）、ＧＨ（２０３）、及び開裂配列を含む場合のあるスペーサーアミノ酸（２０４）。
【図３】図３は、２つの単量体ＧＨＸＴＥＮの例、及びその単量体融合タンパク質が、細胞表面にある標的受容体に結合する能力（その後細胞シグナル伝達を誘導する）を模式的に示す図である。図３Ａは、ＧＨ（１０３）及びＸＴＥＮ（１０２）からなるＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１００）及び２つのＸＴＥＮ（１０５）に結合しているＧＨからなる  第二のＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質（１０５）を示す。図３Ｂは、Ｃ末端にＧＨを有するＧＨＸＴＥＮ（１００）及びＣ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮ（１０５）と、細胞表面（１０７）上の標的受容体（１０８）との間の相互作用を示す。この例においては、ＧＨが何も結合していない（フリーの）Ｃ末端を有する場合には受容体と高い親和性での結合を示すが、Ｃ末端にＸＴＥＮを有するＧＨＸＴＥＮは受容体としっかりと結合せず、図３Ｃに見られるとように解離する。図３Ｄは、高い親和性で結合したＧＨＸＴＥＮ（１００）は受容体（１０６）との結合を維持し、細胞中のエンドソーム（１１０）内に取り込まれることを示し、これは結合したＧＨの受容体介在性クリアランス及び細胞シグナル伝達の誘発（１０９）（細胞質を点描で色つけすることによって示した）を説明するものである。
【図４】図４は、ＸＴＥＮの組み立て、生産及び評価の、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。
【図５】図５は、融合タンパク質をコードしているＧＨＸＴＥＮポリヌクレオチド構築物の組み立てについての、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。個々のオリゴヌクレオチド５０１を１２アミノ酸（「１２−ｍｅｒ」）のモチーフである配列モチーフ５０２になるようにアニーリングさせ、これを次にＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ制限酵素部位を有するオリゴ５０３とライゲーションする。所望の長さのＸＴＥＮ遺伝子５０４が得られるまで、ライブラリー由来の配列モチーフを１２−ｍｅｒにさらにアニーリングさせる。ＸＴＥＮ遺伝子をｓｔｕｆｆｅｒベクター中にクローニングする。ベクターは、Ｆｌａｇ配列５０６と、それに続くＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位を含むストッパー配列５０７、及びエキセンジン（ｅｘｅｎｄｉｎ）−４遺伝子５０８をコードし、その結果ＸＴＥＮ−ＧＨ融合タンパク質をコードしている遺伝子５００が得られる。
【図６】図６は、成長ホルモン（ＧＨ）及びＸＴＥＮを含む融合タンパク質をコードしている遺伝子の組み立て、その発現及び融合タンパク質としての回収、並びに候補ＧＨＸＴＥＮ産物としての評価における、代表的な工程を示すフローチャートの模式図である。
【図７】図７は、異なる処理方法を用いた、ＧＨＸＴＥＮ発現ベクターの設計を示す模式図である。図７Ａは、ＧＨをコードしている配列とその３’末端に融合させたＸＴＥＮをコードしている発現ベクターの例を示す。ここで留意すべき点は、このベクターにはさらなるリーダー配列を必要としないことである。図７Ｂは、ＣＢＤリーダー配列及びＴＥＶプロテアーゼ部位を有し、ＧＨをコードしている配列の５’末端に融合させたＸＴＥＮをコードしている発現ベクターを図示している。図７ＣはＣＢＤ及びＴＥＶプロセッシング部位を最適化したＮ末端リーダー配列（ＮＴＳ）に置き換えた以外は図７Ｂと同様の発現ベクターを図示する。図７Ｄは、ＮＴＳ配列、ＸＴＥＮ、ＧＨをコードしている配列、及びさらに第二のＸＴＥＮをコードしている配列をコードしている発現ベクターを図示している。
【図８】図８は、実施例２２に記載した、Ｎ末端ＸＴＥＮをコードしている配列、それに結合したｈＧＨに、及びその下流、ＸＴＥＮのＣ末端に１４４又は２８８ＸＴＥＮのいずれかをコードしている配列を結合させたＧＨＸＴＥＮ遺伝子の、工程毎の構築物を示す模式図である。
【図９】図９は、図の横軸に示した、ＧＦＰ及びＸＴＥＮ配列を含む構築物の発現アッセイの結果を示す。レポーターであるＧＦＰの発現量を決定するために、発現培養を蛍光プレートリーダーを用いて（励起３９５ｎｍ、放射５１０ｎｍ）アッセイした。箱髭図でグラフ化したように、結果は、中間値の発現レベルは、「基準」であるＣＢＤＮ末端ヘルパードメインの発現と比較しておよそ半分の発現レベルであるが、ライブラリー由来の最も良いクローンの発現レベルは基準に非常に近いことを示し、このことはそれらの配列周辺のさらなる最適化の根拠となる。結果はまた、ＭＡアミノ酸から始まるライブラリーはＭＥから始まるものよりもよい発現レベルを有したことを示す（実施例１４を参照のこと）。
【図１０】図１０は、Ｎ末端から３番目及び４番目のコドン最適化のために、クローンＬＣＷ５４６、ＬＣＷ５４７及びＬＣＷ５５２由来のクローンについてランダム化を行った、３種類のライブラリーを示す。図に示したようにこのライブラリーは、３番目及び４番目の残基がＸＴＥＮコドンの可能な限り全て組み合わせをとるように、これら残基を変更することにより設計された。各ライブラリーが可能な限り全てＸＴＥＮコドンを含むように、３番目及び４番目の残基がそれぞれ異なるコドンを有する１２アミノ酸をコードしている９対のオリゴヌクレオチドを設計し、アニーリングさせ、そしてＮｄｅＩ／ＢｓａＩ制限酵素部位で切断したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０５５１（Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＸＴＥＮ＿ＡＭ８７５−ＧＦＰ）にライゲーションし、及び大腸菌ＢＬ２１Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）コンピテントセルに形質転換して、３種類のライブラリーＬＣＷ０５６９（それぞれ、出現する順番に配列番号８４５〜８４６）、ＬＣＷ０５７０（それぞれ、出現する順番に配列番号８４７〜８４８）、及びＬＣＷ０５７１（それぞれ、出現する順番に配列番号８４９〜８５０）からのコロニーを得た。
【図１１】図１１は、実施例１５に記載したように、最適化工程を行った後に再試験した上位７５クローンの、基準であるＣＢＤ＿ＡＭ８７５構築物に対するＧＦＰ蛍光シグナルについての結果を示すヒストグラムである。結果は、ここでは、いくつかのクローンが基準よりも非常に良いことを示す。
【図１２】図１２は、Ｎ末端４８アミノ酸の２つの領域の好ましいコドン最適化の組み合わせを見いだすために用いた、コンビナトリアル手法の模式図である。この手法により、ＸＴＥＮタンパクの発現の最適化を向上させるためのＮ末端用の新規４８ｍｅｒを作出し、これはＸＴＥＮがＧＨのＮ末端にある場合に、ＸＴＥＮタンパク質を発現させ得るリーダー配列となった。
【図１３】図１３は、実施例１７に記載した、ＸＴＥＮのＮ末端のコドンを最適化した実験により得られた好ましいクローンの発現を、構築物配列のＮ末端にＣＢＤリーダー配列を含む基準となるＸＴＥＮクローンと比較して確認したＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルを示す。
【図１４】図１４は、ＧＦＰのＮ末端にＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４を融合させた融合タンパク質の安定性試験からの、試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す（実施例３９を参照のこと）。ＧＦＰ−ＸＴＥＮを、カニクイザルの血漿及びラット腎臓溶解物中で、３７℃で最長７日までインキュベートした。さらに、ＧＦＰ−ＸＴＥＮをカニクイザルに投与した場合についてもまた評価した。試料を０、１及び７日目に採血し、そしてＳＤＳ  ＰＡＧＥにより解析し、その後ウェスタン解析及びＧＦＰに対する抗体を用いた検出により検出した。
【図１５】図１５は、実施例２５に記載したように、Ｋ２８８ポリペプチドに融合させたｈＧＨと結合させていないｈＧＨの結合活性を比較する、ｈＧＨの受容体結合アッセイの結果を示す。
【図１６】図１６は、実施例２５に記載した、ｈＧＨＲ−Ｆｃに対するｈＧＨ−ＡＭ８６４（丸）及びＡＭ８６４−ｈＧＨ（逆向きの三角）のインビトロ結合アッセイの結果を示す。修飾していない組換えｈＧＨ（四角）を対照として示す。
【図１７】図１７は、実施例２６に記載したように、ｈＧＨ及びＡＭ８６４−ｈＧＨの安定性への熱処理の効果を示す。図１７Ａは、２５℃及び８０℃で１５分間処理した２種類の調整物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、図１７Ｂは、２５℃での処理に対する８０℃で処理した試料の受容体結合活性に対応するパーセンテージとの間を示す。この結果は、ＸＴＥＮにより、ｈＧＨ及びＧＨＸＴＥＮ融合タンパク質に、熱安定性及び活性の保持が付与されることを示している。
【図１８】図１８は、実施例２５に記載したように、Ｃ末端ＸＴＥＮの付加が、ＧＨＸＴＥＮがＧＨ受容体に結合する、結合親和性を低下させる能力を決定するために行った、ＥＬＩＳＡベースのアッセイの結果を示す。
【図１９】図１９は、実施例１９に記載したように、Ｋ２８８に融合させたｈＧＨの、精製過程ごとの試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図２０】図２０は、ｈＧＨ−Ｙ５７６及びＹ５７６−ｈＧＨの配置でＹ５７６に融合させたｈＧＨの最終的な精製タンパク質５μｇを用い、実施例２４に記載したように、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造業者の説明に従って行った、非還元及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図２１】図２１は、実施例２４に記載したように行い、重ねて示した、２種類のＧＨＸＴＥＮ構築物、Ｙ５７６−ＧＨ及びｈＧＨ−Ｙ５７６（ＮからＣ末端）のサイズ排除クロマトグラフィープロファイルを示す。
【図２２】図２２は、実施例３０に記載したように、カニクイザルに静脈内投与した後の、２種類のＧＨＸＴＥＮ構築物Ｙ５７６−ＧＨ及びｈＧＨ−Ｙ５７６（ＮからＣ末端）の薬物動態学的プロファイルを示す。結果は、ｈＧＨのＸＴＥＮに対する向き（Ｎ末端対Ｃ末端）は、融合タンパク質のクリアランスには影響を及ぼさないことを示す。
【図２３】図２３は、実施例３０に記載したように、カニクイザルの皮下に５ｍｇ／ｋｇのＡＭ８６４−ｈＧＨを単回投与した後の薬物動態学的プロファイルを、同等のｈＧＨ濃度から得られたプロファイル（破線）と共に示す。３３時間後の終末相半減期をＷｉｎＮｏｎＬｉｎによりシングルコンパートメントフィッティングを用いて計算した。
【図２４】図２４は、実施例２７に記載したように、記載した用量のｈＧＨ又はＧＨＸＴＥＮ  ＡＭ８６４−ｈＧＨの投与に反応した、カニクイザルでのＩＧＦ−１分泌の結果を示す。
【図２５】図２５は、実施例２８に記載したように、体重１ｋｇ当たりに、記載した用量のｈＧＨ又はＡＭ８６４−ｈＧＨを投与した場合の、低酸素ラットモデルにおける効果を示す。結果は、より低頻度で投与した場合においても、ＧＨＸＴＥＮ構築物による生理活性の保持はｈＧＨの効力と同等であることを示す。
【図２６】図２６は、実施例２９に記載したように、低酸素ラットの頸骨骨端板の軟骨成長における偽薬、ｈＧＨ、及びＡＭ８６４−ｈＧＨの投与の比較効果を示す。図は９日間処理した頸骨の組織学的横断面を示す。
【図２７】図２７は、実施例３１に記載したように皮下経路でラットに投与した、ｈＧＨ  ＧＨＴＸＥＮ融合タンパク質の薬物動態学的な結果を、修飾していない組換えｈＧＨと比較して示す。
【図２８】図２８は、実施例３２に記載したように、カニクイザルに皮下投与した後の、３種類のｈＧＨ  ＸＴＥＮ構築物の濃度プロファイルを示す。
【図２９】図２９は、実施例３３に記載したように、オス及びメスのカニクイザル（ｃｙｎｏｓ  ＳＣ）に、０．３（白丸）、１．５（四角）、及び７．５ｍｇ／ｋｇ（三角）の３種類の用量レベルで投与したＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の、薬物動態学的試験の結果を示す。
【図３０】図３０は、実施例３３に記載したように、ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の投与に反応したＩＧＦ−１レベルの結果を示す（符号は図２９と同様である）。
【図３１】図３１は、実施例３４に記載したように、３種類の異なる経路を介して投与されたＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４のバイオアベイラビリティを比較した実験の結果を示す。ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４をオス及びメスのカニクイザル（ｃｙｎｏｓ  ＳＣ）に、１．５ｍｇ／ｋｇの濃度で、静脈（三角）、皮下（白丸）、及び筋内（四角）経路を介して投与した。ＧＨ  ＸＴＥＮの血漿濃度は図中に示した。
【図３２】図３２は、実施例３５に記載したように、様々な用量及び投与頻度（黒三角＝０．５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日；白三角＝１．５ｎｍｏｌ／日；四角＝３ｎｍｏｌ／ｋｇ／Ｑ２Ｄ）で投与した媒体（白丸）、組換えｈＧＨ、５ｎｍｏｌ／ｋｇ／日（黒丸）、ＧＨＸＴＥＮ  ＡＥ９１２−ｈＧＨ−ＡＥ１４４の、低酸素ラットの体重に及ぼす効果を示す。
【図３３】図３３は、図３２に図示したデータから導き出した結果に基づく、ｈＧＨ又はＧＨＸＴＥＮが治療ウインドウ中での血中レベルを維持する能力の、低酸素ラットモデルでのモデルとなった投与の結果を示す。符号は図３２と同様である。
【図３４】図３４は、実施例３７に記載したように、既知の分子量を有するタンパク質を用いて測定した、グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物試料のサイズ排除クロマトグラフィー解析の結果を示す。グラフは吸収対保持容量として表した。グルカゴン−ＸＴＥＮ構築物は、１）グルカゴン−Ｙ２８８；２）グルカゴンＹ−１４４；３）グルカゴン−Ｙ７２；及び４）グルカゴン−Ｙ３６である。結果は、ＸＴＥＮ部分の長さが長くなるほど、見かけの分子量も増えることを示す。
【図３５】図３５は、実施例３８に記載したように、様々な長さの非構造性（ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ）ポリペプチドに結合した数種類のＧＦＰ組成物を、カニクイザルに皮下又は静脈内のいずれかを介して単回投与した後の薬物動態学的プロファイル（血漿濃度）を示す。組成物は、ＧＦＰ−Ｌ２８８、ＧＦＰ−Ｌ５７６、ＧＦＰ−ＸＴＥＮ＿ＡＦ５７６、ＧＦＰ−Ｙ５７６及びＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰであった。血液試料を注入後の様々な時点で解析し、血漿中のＧＦＰ濃度を、補足抗体として抗ＧＦＰポリクローナル抗体を、及び検出抗体として同じポリクローナル抗体のビオチン化調製物を用いたＥＬＩＳＡにより測定した。結果を投与後の血漿濃度対時間（ｈ）として表し、この結果は具体的には、最も長い配列のＸＴＥＮを有する組成物であるＸＴＥＮ＿ＡＤ８３６−ＧＦＰの半減期がかなり長くなったことを示す。最も短い長さの配列を有する構築物であるＧＦＰ−Ｌ２８８の半減期が最も短かった。
【図３６】図３６は、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４へのヒトの反応を、４種類の動物、すなわちマウス、ラット、カニクイザル、及びイヌにおける測定結果に基づいて予測した、異種間物差し法（ａｌｌｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｌｉｎｇ）の結果を示す。図３６Ａは、測定した終末相半減期対体重を示し、ヒトでのＴ１／２は１３９時間と予測された。図３６Ｂは、測定した薬剤クリアランス対体重を示し、ヒトでのクリアランス率は３０ｍｌ／時間と予測された。図３６Ｃは、測定した体積分布対体重を示し、ヒトでの値は５９７０ｍｌと予測された。
【図３７】図３７は、実施例４２に記載したように行った、Ｅｘ４−ＸＴＥＮ＿ＡＥ８６４の近ＵＶ円二色性スペクトルを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
表１：動物種からの成長ホルモンのアミノ酸配列
【表１−１】
2017217014.tif 000001
【表１−２】
2017217014.tif 000002
【表１−３】
2017217014.tif 000003
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
表２：１２アミノ酸のＸＴＥＮ配列モチーフ及びモチーフファミリー
【表２】
2017217014.tif 000004
＊は、様々な置換を入れて用いた場合にも、個々のモチーフ配列が「ファミリー配列」を生じることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
表３：ＸＴＥＮポリペプチド
【表３−１】
2017217014.tif 000005
【表３−２】
2017217014.tif 000006
【表３−３】
2017217014.tif 000007
【表３−４】
2017217014.tif 000008
【表３−５】
2017217014.tif 000009
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３３】
一実施形態において、ＧＨＸＴＥＮのＮ末端ＸＴＥＮポリペプチドは、ＡＥ４８又はＡＭ４８のアミノ酸配列と、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９１％、より好ましくは少なくとも約９２％、より好ましくは少なくとも約９３％、より好ましくは少なくとも約９４％、より好ましくは少なくとも約９５％、より好ましくは少なくとも約９６％、より好ましくは少なくとも約９７％、より好ましくは少なくとも約９８％、より好ましくは少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を示す配列を含む。ＡＥ４８又はＡＭ４８のアミノ酸配列は以下に示す通りである。
ＡＥ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳ（配列番号８０）
ＡＭ４８：ＭＡＥＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳ（配列番号８１）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
いくつかの実施形態においては、ＸＴＥＮから分離されることによって活性化する又はより活性化するＧＨを分離することができるように、ＧＨＸＴＥＮへの開裂配列の組み込みを設計する。開裂後にＧＨに結合している残りの残基のいずれもがＧＨの活性（例えば、受容体への結合のような）を認識できるほど干渉せず、さらに開裂配列の開裂にプロテアーゼが効果的に作用できるようにするために、開裂配列はＧＨ配列に有意に隣接した位置に、通常ＧＨ配列末端から１８以内、又は１２以内、又は６以内、又は２アミノ酸以内に配置される。いくつかの実施形態において、開裂部位は、対象への投与後にＧＨＸＴＥＮが開裂され得るように、哺乳類対象の内生プロテアーゼにより開裂され得る配列である。そのような例においては、プロドラッグ又はＧＨに対する血中貯留物としてＧＨＸＴＥＮは役立つだろう。本発明で検討される開裂部位の例には、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ、カリクレイン、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＩＩａ（トロンビン）、エラスターゼ−２、グランザイムＢ、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１７又はＭＭＰ−２０から選択される、哺乳類の内生プロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列、又はＴＥＶ、エンテロキナーゼ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）プロテアーゼ（ライノウイルス３Ｃプロテアーゼ）、及びソルターゼＡのような哺乳類のものではないプロテアーゼによって開裂され得るポリペプチド配列が挙げられるが、これらの配列には限定されない。前述したプロテアーゼ及びその他により開裂される配列は当該分野において既知である。配列並びにその配列変異体中の開裂配列及び切断部位を表６に示す。例えば、ＬＴＰＲＳＬＬＶの配列（配列番号８２）に作用するトロンビン（活性化凝固第ＩＩ因子）（Ｒａｗｌｉｎｇｓ  Ｎ．Ｄ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３６：  Ｄ３２０）は、配列中の４番目の位置のアルギニンの後ろを切断するだろう。活性なＦＩＩａは、凝固経路における第ＩＸ因子の下流にあり、リン脂質及びカルシウム存在下でのＦＸａによるＦＩＩの開裂によって生産される。その凝固における天然の役割はフィブリノゲンの開裂であり、これが一旦活性化されると、次に凝固の形成が始まる。ＦＩＩａ活性はしっかりと制御されており、特定の止血に凝固が必要な場合にのみ生じる。しかしながら、凝固は哺乳類においては途切れない過程であるため、ＧＨＸＴＥＮのＧＨとＸＴＥＮの間にＬＴＰＲＳＬＬＶ配列（配列番号８３）を組み込むと、凝固が生理的に必要な場合には外因性又は内因性いずれかの凝固経路の活性化に伴ってＸＴＥＮドメインが隣接したＧＨとの接点から分離され、それによりＧＨがその間放出されるだろう。同様に、内生プロテアーゼが作用するその他の配列をＧＨＸＴＥＮ中に組み込むことにより、特定の実施形態においては、「プロドラッグ」形態のＧＨＸＴＥＮから高度に活性化されたＧＨを提供する、ＧＨの持続放出を提供することができるだろう。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６７】
表６：プロテアーゼ開裂配列
【表６】
2017217014.tif 000010
↓は開裂部位を示す
ＮＡ：適用なし
＊スラッシュの前、間、又は後に記載されている複数のアミノ酸は、その位置で置換できる別のアミノ酸を示す
「−」は、いずれのアミノ酸も、中列に記載した、対応するアミノ酸で置換できることを示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１７】
表７：ＸＴＥＮ及び前駆配列のＤＮＡ配列
【表７−１】
2017217014.tif 000011
【表７−２】
2017217014.tif 000012
【表７−３】
2017217014.tif 000013
【表７−４】
2017217014.tif 000014
【表７−５】
2017217014.tif 000015
【表７−６】
2017217014.tif 000016
【表７−７】
2017217014.tif 000017
【表７−８】
2017217014.tif 000018
【表７−９】
2017217014.tif 000019
【表７−１０】
2017217014.tif 000020
【表７−１１】
2017217014.tif 000021
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
任意に、完全長ＸＴＥＮをコードしている遺伝子は、１つ以上のシークエンスアイランドを含む。本明細書中においては、シークエンスアイランドとは、ＸＴＥＮライブラリー構築物配列からは区別され、完全長のＸＴＥＮをコードしている遺伝子中には存在しない又は存在するとは考えられない制限酵素部位を含む、短い長さの配列である。一実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＧＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＧＣＡＣＧＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号１２４）である。別の実施形態において、シークエンスアイランドの配列は、５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＣＣＣＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＴ−３’（配列番号１２５）である。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３６】
別の実施形態においては、発現量が高い独立したタンパク質ドメインを潜在的に含むリーダー配列を、ＧＨＸＴＥＮ配列のＮ末端に、プロテアーゼ開裂部位によって離して融合させることができる。設計したタンパク質分解部位での開裂を阻害しない、任意のリーダーペプチド配列を使用することができるが、好ましい実施形態における配列は、組成物全体の発現及び折り畳みが有意に悪影響を受けないように、及び好ましくは発現、溶解度、及び／又は折り畳み効率が有意に改善されるように、安定で、発現量の高い配列を含むだろう。多様な、好適なリーダー配列が文献において記載されてきた。好適な配列の非限定的なリストには、マルトース結合タンパク質、セルロース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、６ｘＨｉｓタグ（配列番号１２６）、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルチニンタグ、及び緑色蛍光タンパク質が挙げられる。リーダー配列を、文献及び上記に詳細に記載した方法によるコドン最適化、特にＡＴＧ開始コドンの次の２番目のコドンを最適化することにより、さらに改善することができる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
インビトロにおいてタンパク質を特定の部位で開裂させる、様々な酵素を用いた方法が知られている。そのような方法には、エンテロキナーゼ（ＤＤＤＫ（配列番号１２７））、Ｘａ因子（ＩＤＧＲ（配列番号１２８））、トロンビン（ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１２９））、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ（商標）（ＬＥＶＬＦＱＧＰ（配列番号１３０））、ＴＥＶプロテアーゼ（ＥＱＬＹＦＱＧ（配列番号１３１））、３Ｃプロテアーゼ（ＥＴＬＦＱＧＰ（配列番号１３２））、ソルターゼＡ（ＬＰＥＴＧ（配列番号１３３））、グランザイムＢ（Ｄ／Ｘ、Ｎ／Ｘ、Ｍ／Ｎ又はＳ／Ｘ）、インテイン、ＳＵＭＯ、ＤＡＰａｓｅ（ＴＡＧＺｙｍ（商標））、エロモナスアミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＭ、及びカルボシキペプチダーゼＡ及びＢの使用が含まれる。さらに別の方法が、Ａｒｎａｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ４８：  １−１３  （２００６）に開示されている。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
その他の例において本発明は、構築物及び、ヘルパードメインなしにタンパク質のＮ末端にあるＸＴＥＮ融合タンパク質の発現を可能にするための翻訳の開始を促進するために、発現について最適化されたポリヌクレオチド配列であって、ＸＴＥＮの特徴を有する少なくとも約２０〜約６０アミノ酸をコードし、ＸＴＥＮ担体コードしている配列のＮ末端に組み込まれたポリヌクレオチド配列を含む構築物（言い換えると、最適化された２０〜６０のアミノ酸をコードしているポリヌクレオチドを、ＧＨのＮ末端側にあるＸＴＥＮ構成要素をコードしているポリヌクレオチドに、インフレームで結合させた構築物）の作出方法を提供する。前述した構築物の利点は、配列がその後の開裂を必要とせず、それによりＸＴＥＮを含む組成物の製造工程の数が少なくなることである。実施例により詳細に記載したように、最適化されたＮ末端配列は非構造性タンパク質としての特徴をもつが、その翻訳の開始を促進する能力及び発現の向上のために選択したアミノ酸をコードしているヌクレオチド塩基を含み得る。前述の一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ９１２と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ９２３と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＥ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。前述の別の実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドは、ＡＭ４８と少なくとも約９０％の配列同一性を有するＸＴＥＮ配列をコードする。一実施形態において、最適化されたポリヌクレオチドＮＴＳは、
【化１】
2017217014.tif 000022
から選択された配列又はその相補鎖と、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を示す配列を含む。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６４】
実施例１：ＸＴＥＮ＿ＡＤ３６モチーフセグメントの構築
以下の実施例においては、３６アミノ酸のモチーフ配列をコードしている、コドン最適化した遺伝子コレクションの構築について記載する。第一の工程として、ｐＥＴベクターベースで、かつ、Ｔ７プロモーターを含むｓｔｕｆｆｅｒベクターである、ｐＣＷ０３５９を構築した。ｐＣＷ０３５９は、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）及びＴＥＶプロテアーゼ認識部位、それに続くｓｔｕｆｆｅｒ配列と隣接したＢｓａＩ、ＢｂｓＩ、及びＫｐｎＩ部位をコードする。ＢｓａＩ及びＢｂｓＩは、消化後に一致する突出末端が生成されるように挿入された。ｓｔｕｆｆｅｒ配列の後には切断型のＧＦＰ遺伝子及びＨｉｓタグが続く。ｓｔｕｆｆｅｒ配列は終止コドンを含むため、ｓｔｕｆｆｅｒプラスミドｐＣＷ０３５９を含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は蛍光を発しないコロニーを形成する。ｓｔｕｆｆｅｒセグメントを除去するためにｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９をＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られたベクター断片をアガロースゲル精製により単離した。モチーフのＡＤファミリーを反映させ、配列をＸＴＥＮ＿ＡＤ３６と命名した。そのセグメントは、［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＥＳＰＧＧＳＳＧＳＥＳ（配列番号１３６）、ＧＳＥＧＳＳＧＰＧＥＳＳ（配列番号１３７）、ＧＳＳＥＳＧＳＳＥＧＧＰ（配列番号１３８）、又はＧＳＧＧＥＰＳＥＳＧＳＳ（配列番号１３９）の、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化２】
2017217014.tif 000023
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６５】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号１４７））とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号１４８））もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０１と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＤ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
表８：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表８−１】
2017217014.tif 000024
【表８−２】
2017217014.tif 000025
【表８−３】
2017217014.tif 000026
【表８−４】
2017217014.tif 000027
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
実施例２：ＸＴＥＮ＿ＡＥ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＥ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥ（配列番号２２５）、ＧＳＥＰＡＴＳＧＳＥＴＰ（配列番号２２６）、ＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰ（配列番号２２７）、又はＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰ（配列番号２２８）の、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化３】
2017217014.tif 000028
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６９】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号２３７））とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号２３８））もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０２と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＥ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＥ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７１】
表９：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表９−１】
2017217014.tif 000029
【表９−２】
2017217014.tif 000030
【表９−３】
2017217014.tif 000031
【表９−４】
2017217014.tif 000032
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７２】
実施例３：ＸＴＥＮ＿ＡＦ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列をＸＴＥＮ＿ＡＦ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＳＴＳＥＳＰＳＧＴＡＰ（配列番号３１３）、ＧＴＳＴＰＥＳＧＳＡＳＰ（配列番号３１４）、ＧＴＳＰＳＧＥＳＳＴＡＰ（配列番号３１５）、又はＧＳＴＳＳＴＡＥＳＰＧＰ（配列番号３１６）の、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化４】
2017217014.tif 000033
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７３】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号３２５））とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号３２６））もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０３と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＦ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＦ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
表１０：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１０−１】
2017217014.tif 000034
【表１０−２】
2017217014.tif 000035
【表１０−３】
2017217014.tif 000036
【表１０−４】
2017217014.tif 000037
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７６】
実施例４：ＸＴＥＮ＿ＡＧ３６セグメントの構築
３６アミノ酸の長さのＸＴＥＮ配列をコードしているコドンライブラリーを構築した。ＸＴＥＮ配列はＸＴＥＮ＿ＡＧ３６と命名した。そのセグメントはアミノ酸配列［Ｘ］３で表せるアミノ酸配列を有し、ここでＸは、配列がＧＴＰＧＳＧＴＡＳＳＳＰ（配列番号４１５）、ＧＳＳＴＰＳＧＡＴＧＳＰ（配列番号４１６）、ＧＳＳＰＳＡＳＴＧＴＧＰ（配列番号４１７）、又はＧＡＳＰＧＴＳＳＴＧＳＰ（配列番号４１８）の、１２ｍｅｒのペプチドである。挿入断片を、以下に示す、リン酸化した合成オリゴヌクレオチド対のアニーリングによって得た。
【化５】
2017217014.tif 000038
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７７】
我々はまた、リン酸化したオリゴヌクレオチドである３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＦｏｒ（ＡＧＧＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＧＴＡＣ（配列番号４２７））とリン酸化していないオリゴヌクレオチドｐｒ＿３ＫｐｎＩｓｔｏｐｐｅｒＲｅｖ（ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡ（配列番号４２８））もアニーリングさせた。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対をライゲーションし、１つのＢｂｓＩ／ＫｐｎＩセグメントに結合した、様々な数の１２ｍｅｒの繰り返しを有する、様々な長さの産物の混合物を得た。３６アミノ酸の長さに相当する産物を分離用のアガロースゲル電気泳動によって混合物から単離し、そしてＢｓａＩ／ＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションした。ＬＣＷ０４０４と命名した、得られたライブラリーの大部分のコロニーは誘導後に緑色蛍光を呈し、このことからＸＴＥＮ＿ＡＧ３６がＧＦＰ遺伝子にインフレームで結合されたこと、及び大部分のＸＴＥＮ＿ＡＧ３６配列が良い発現レベルを有することが示された。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７９】
表１１：３６−ｍｅｒモチーフのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１１−１】
2017217014.tif 000039
【表１１−２】
2017217014.tif 000040
【表１１−３】
2017217014.tif 000041
【表１１−４】
2017217014.tif 000042
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２８６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２８６】
表１２：ＡＭ１４４セグメントのＤＮＡ及びアミノ酸配列
【表１２−１】
2017217014.tif 000043
【表１２−２】
2017217014.tif 000044
【表１２−３】
2017217014.tif 000045
【表１２−４】
2017217014.tif 000046
【表１２−５】
2017217014.tif 000047
【表１２−６】
2017217014.tif 000048
【表１２−７】
2017217014.tif 000049
【表１２−８】
2017217014.tif 000050
【表１２−９】
2017217014.tif 000051
【表１２−１０】
2017217014.tif 000052
【表１２−１１】
2017217014.tif 000053
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９１】
ＧＡＳＡＳＧＡＰＳＴＧ（配列番号５８５）のアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＡｓｃＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＧＣＧＣＣを含むシークエンスアイランドＡ（ＳＩ−Ａ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
【化６】
2017217014.tif 000054
（配列番号５８３）と、リン酸化していいないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＡｓｃＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
【化７】
2017217014.tif 000055
（配列番号５８４）とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、ＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化し、上述したように準備したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ａを含むｐＣＷ０４６６を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６６からのＳＩ−ＡセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせ、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
実施例１０：ＴＥＮ＿ＡＭ１３１８の構築
ＧＰＥＰＴＧＰＡＰＳＧ（配列番号５８８）のアミノ酸をコードし、かつ、この配列中に制限酵素ＦｓｅＩの認識部位であるヌクレオチド配列ＧＧＣＣＧＧＣＣを含むシークエンスアイランドＢ（ＳＩ−Ｂ）を導入するために、リン酸化したオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｆｏｒＰ：
【化８】
2017217014.tif 000056
（配列番号５８６）と、リン酸化していないオリゴヌクレオチドＢｓａＩ−ＦｓｅＩ−ＫｐｎＩｒｅｖ：
【化９】
2017217014.tif 000057
（配列番号５８７）とをアニーリングさせた。アニーリングさせたオリゴヌクレオチド対を、実施例９で用いたようなＢｓａＩ及びＫｐｎＩで消化したｓｔｕｆｆｅｒベクターｐＣＷ０３５９とライゲーションさせ、ＳＩ−Ｂを含むｐＣＷ０４６７を得た。次に、実施例８からの４３種類の好ましいＸＴＥＮ＿ＡＭ４３２セグメントとｐＣＷ０４６７からのＳＩ−ＢセグメントのＣ末端を、実施例５に記載したものと同じ二量体化工程介して再度組み合わせることにより、ＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーを構築した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４７９と命名した。この新しいＸＴＥＮ＿ＡＭ４４３セグメントのライブラリーをＬＣＷ０４８０と命名した。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９９】
表１３：１２ｍｅｒを付加したライブラリーの理論的多様性及びサンプリング数。無作為化したコドンを含むアミノ酸残基を下線で示す。
【表１３】
2017217014.tif 000058
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０１】
表１４：改良した１２ｍｅｒのＤＮＡヌクレオチド配列
【表１４】
2017217014.tif 000059
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１０】
表１８：基準となるクローンよりも非常に良かった１２ｍｅｒ及び３６ｍｅｒのコンビナトリアルクローン
【表１８−１】
2017217014.tif 000060
【表１８−２】
2017217014.tif 000061
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１６】
表２１：ＸＴＥＮ−ＡＭ８７５及びＸＴＥＮ−ＡＥ８６４の、Ｎ末端の最初の４８アミノ酸残基に対する好ましいＤＮＡヌクレオチド配列
【表２１】
2017217014.tif 000062
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３２７】
Ｎ末端にセルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、その後ろにＴｏｍａｔｏＥｔｃｈウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ開裂部位、その後にｈＧＨコード配列、及びその後にＫ２８８コード配列：ＣＢＤ−Ｋ２８８−ｈＧＨを含むタンパク質を発現する、ｐＥＴ−シリーズのベクターをＴ７プロモーターを用いて構築した。Ｋ２８８は反復配列（ＧＥＧＧＧＥＧＧＥ）３２（配列番号６２２）を有する。使用したＣＢＤ配列は、ＳｗｉｓｓｐｒｏｔファイルＱ０６８５１で示され、ＣＢＤ融合タンパク質の精製についてはＯｆｉｒ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１８０６に記載されている。ＴＥＶ開裂部位の配列はＥＮＬＹＦＱ／Ｘ（配列番号６２３）であり；Ｘの位置にはＧを用いた。この構築物をＢＬ２１（ＤＥ３）−ｓｔａｒ大腸菌株中に形質転換し、そして発現を促進する条件化で生育させた。Ｃ細胞を回収し、破砕した。細胞上清をセルロースビーズ樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）にアプライし、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０）で洗浄し、そして２０ｍＭ  ＮａＯＨでカラムから溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ＝８．０を用いて試料を滴定することにより、ｐＨを調製した。タンパク質の純度は９０％を超えると予測した。溶出したタンパク質を精製したＴＥＶプロテアーゼを用いて４℃で一晩消化し、消化した試料をセルロースビーズ樹脂（Ｐｅｒｌｏｚａ  １００）にアプライした。ＣＢＤはカラムに保持され、Ｋ２８８−ｈＧＨはフロースルー中に認められた。集めたフロースルーを陰イオン交換（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ＝８．０）で溶出し、そして１Ｍ  ＮａＣｌを含む同じ緩衝液のシャローな（ｓｈａｌｌｏｗ）直線勾配を用いてカラムから溶出した。溶出した融合タンパク質を集め、緩衝液Ａに対して透析し、濃縮し、そして最終的な精製としてサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により精製した。タンパク質の純度は９８％を超えると予測した。最終的なタンパク質はＫ２８８−ｈＧＨである。精製過程における試料のＳＤＳＰＡＧＥ解析を図２０に示した。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８０】
表２７：ポリペプチド配列のＣＨＯＵ−ＦＡＳＭＡＮ及びＧＯＲ予測計算
【表２７−１】
2017217014.tif 000063
【表２７−２】
2017217014.tif 000064
【表２７−３】
2017217014.tif 000065
【表２７−４】
2017217014.tif 000066
【表２７−５】
2017217014.tif 000067
【表２７−６】
2017217014.tif 000068
【表２７−７】
2017217014.tif 000069
【表２７−８】
2017217014.tif 000070
【表２７−９】
2017217014.tif 000071
＊Ｈ：アルファーヘリックスＥ：ベータシート
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８２】
表２８に示した結果は、２又は３アミノ酸型の非構造性ポリペプチドは高い部分列スコアを有するが、アミノ酸Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、及びＡの１２アミノ酸モチーフからなる、内部の反復性が低い非構造性ポリペプチドは、１０未満、いくつかの例においては５未満の部分列スコアを有することを示す。例えば、２つのアミノ酸型を有し、短く、かつ反復性の高い配列を有するＬ２８８配列の部分列スコアは５０．０である。３つのアミノ酸型を有するが、短く、かつ反復性の配列を有するポリペプチドＪ２８８の部分列スコアは３３．３である。Ｙ５７６もまた３つのアミノ酸型を有するが、内部の反復性は形成されておらず、このことは、最初の２００アミノ酸にわたる部分列スコアが１５．７であることに反映される。Ｗ５７６は４つのアミノ酸型を含むが、内部反復性の度合いが高く、例えば「ＧＧＳＧ」（配列番号６４９）、２３．４の部分列スコアを生じる。ＡＤ５７６は４つの型の１２アミノ酸モチーフを含み、それぞれが４つの型のアミノ酸からなる。個々のモチーフの内部反復性の度合いが低いことから、最初の２００アミノ酸全体の部分列スコアは１３．６である。一方、それぞれにおける内部反復性の度合いが低い、６型のアミノ酸を含む４種類のモチーフからなるＸＴＥＮの部分列スコアはより低く、すなわち、ＡＥ８６４（６．１）、ＡＦ８６４（７．５）、及びＡＭ８７５（４．５）である。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８４】
表２８：ポリペプチド配列の部分列スコアの計算
【表２８−１】
2017217014.tif 000072
【表２８−２】
2017217014.tif 000073
【表２８−３】
2017217014.tif 000074
【表２８−４】
2017217014.tif 000075
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８５】
実施例４５：ＴＥＰＩＴＯＰＥスコアの算出
９ｍｅｒペプチド配列のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを、Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏによって記載されたように［Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  １７：  ５５５］、ポケットポテンシャルを加算することにより算出することができる。本実施例においては、個々のＨＬＡアレルについて、別個のＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出した。表２９は例として、コーカサス（白人）集団では高い頻度で生じる、ＨＬＡ＊０１０１Ｂのポケットポテンシャルを示す。配列Ｐ１−Ｐ２−Ｐ３−Ｐ４−Ｐ５−Ｐ６−Ｐ７−Ｐ８−Ｐ９を含むペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアを算出するために、対応する個々のポケットポテンシャルを表２９に加えた。配列ＦＤＫＬＰＲＴＳＧ（配列番号６６７）を有する９ｍｅｒペプチドであるＨＬＡ＊０１０１Ｂのスコアは、０、−１．３、０、０．９、０、−１．８、０．０９、０、０の総和となるだろう。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３８７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３８７】
この方法によって算出されたＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは、およそ−１０から＋１０までの範囲になる。しかしながら、Ｐ１位置に疎水性アミノ酸（ＦＫＬＭＶＷＹ（配列番号６６８））をもたない９ｍｅｒペプチドのＴＥＰＩＴＯＰＥスコアは−１００９から−９８９の範囲になると算出された。この値は生物学的に意味をもたず、疎水性アミノ酸がＨＬＡへの結合におけるアンカー残基となることを反映するものであり、そして、Ｐ１に疎水性残基をもたないペプチドはＨＬＡに対して結合しないと考えられる。大部分のＸＴＥＮ配列は疎水性残基を有さないことから、９ｍｅｒ部分列の、全組み合わせのＴＥＰＩＴＯＰＥの範囲は、−１００９から−９８９になるであろう。この方法は、ＸＴＥＮポリペプチドがＴ細胞エピトープをほとんどもたない、又は全くもたないということを確認するものである。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９３】
表３４：生理活性の具体例、アッセイの具体例及び好ましい指標
【表３４−１】
2017217014.tif 000076
【表３４−２】
2017217014.tif 000077
表３５：成長ホルモン及び単一のＸＴＥＮを含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３５−１】
2017217014.tif 000078
【表３５−２】
2017217014.tif 000079
【表３５−３】
2017217014.tif 000080
【表３５−４】
2017217014.tif 000081
【表３５−５】
2017217014.tif 000082
【表３５−６】
2017217014.tif 000083
【表３５−７】
2017217014.tif 000084
【表３５−８】
2017217014.tif 000085
【表３５−９】
2017217014.tif 000086
【表３５−１０】
2017217014.tif 000087
【表３５−１１】
2017217014.tif 000088
【表３５−１２】
2017217014.tif 000089
【表３５−１３】
2017217014.tif 000090
【表３５−１４】
2017217014.tif 000091
【表３５−１５】
2017217014.tif 000092
【表３５−１６】
2017217014.tif 000093
【表３５−１７】
2017217014.tif 000094
【表３５−１８】
2017217014.tif 000095
【表３５−１９】
2017217014.tif 000096
【表３５−２０】
2017217014.tif 000097
【表３５−２１】
2017217014.tif 000098
【表３５−２２】
2017217014.tif 000099
【表３５−２３】
2017217014.tif 000100
【表３５−２４】
2017217014.tif 000101
【表３５−２５】
2017217014.tif 000102
【表３５−２６】
2017217014.tif 000103
【表３５−２７】
2017217014.tif 000104
【表３５−２８】
2017217014.tif 000105
【表３５−２９】
2017217014.tif 000106
【表３５−３０】
2017217014.tif 000107
【表３５−３１】
2017217014.tif 000108
【表３５−３２】
2017217014.tif 000109
【表３５−３３】
2017217014.tif 000110
＊配列名は、成長因子及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
表３６：成長ホルモン及び２つのＸＴＥＮ配列を含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３６−１】
2017217014.tif 000111
【表３６−２】
2017217014.tif 000112
【表３６−３】
2017217014.tif 000113
【表３６−４】
2017217014.tif 000114
【表３６−５】
2017217014.tif 000115
【表３６−６】
2017217014.tif 000116
【表３６−７】
2017217014.tif 000117
【表３６−８】
2017217014.tif 000118
【表３６−９】
2017217014.tif 000119
【表３６−１０】
2017217014.tif 000120
【表３６−１１】
2017217014.tif 000121
【表３６−１２】
2017217014.tif 000122
【表３６−１３】
2017217014.tif 000123
【表３６−１４】
2017217014.tif 000124
【表３６−１５】
2017217014.tif 000125
【表３６−１６】
2017217014.tif 000126
【表３６−１７】
2017217014.tif 000127
【表３６−１８】
2017217014.tif 000128
【表３６−１９】
2017217014.tif 000129
【表３６−２０】
2017217014.tif 000130
【表３６−２１】
2017217014.tif 000131
【表３６−２２】
2017217014.tif 000132
【表３６−２３】
2017217014.tif 000133
【表３６−２４】
2017217014.tif 000134
【表３６−２５】
2017217014.tif 000135
【表３６−２６】
2017217014.tif 000136
【表３６−２７】
2017217014.tif 000137
【表３６−２８】
2017217014.tif 000138
【表３６−２９】
2017217014.tif 000139
【表３６−３０】
2017217014.tif 000140
【表３６−３１】
2017217014.tif 000141
【表３６−３２】
2017217014.tif 000142
【表３６−３３】
2017217014.tif 000143
【表３６−３４】
2017217014.tif 000144
【表３６−３５】
2017217014.tif 000145
【表３６−３６】
2017217014.tif 000146
【表３６−３７】
2017217014.tif 000147
【表３６−３８】
2017217014.tif 000148
【表３６−３９】
2017217014.tif 000149
【表３６−４０】
2017217014.tif 000150
【表３６−４１】
2017217014.tif 000151
【表３６−４２】
2017217014.tif 000152
【表３６−４３】
2017217014.tif 000153
【表３６−４４】
2017217014.tif 000154
【表３６−４５】
2017217014.tif 000155
【表３６−４６】
2017217014.tif 000156
【表３６−４７】
2017217014.tif 000157
【表３６−４８】
2017217014.tif 000158
【表３６−４９】
2017217014.tif 000159
【表３６−５０】
2017217014.tif 000160
【表３６−５１】
2017217014.tif 000161
【表３６−５２】
2017217014.tif 000162
【表３６−５３】
2017217014.tif 000163
【表３６−５４】
2017217014.tif 000164
【表３６−５５】
2017217014.tif 000165
【表３６−５６】
2017217014.tif 000166
【表３６−５７】
2017217014.tif 000167
【表３６−５８】
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【表３６−５９】
2017217014.tif 000169
【表３６−６０】
2017217014.tif 000170
【表３６−６１】
2017217014.tif 000171
【表３６−６２】
2017217014.tif 000172
【表３６−６３】
2017217014.tif 000173
＊配列名は、成長因子及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する
表３７：成長ホルモン、ＸＴＥＮ及び開裂配列を含むＧＨＸＴＥＮの具体例
【表３７−１】
2017217014.tif 000174
【表３７−２】
2017217014.tif 000175
【表３７−３】
2017217014.tif 000176
【表３７−４】
2017217014.tif 000177
【表３７−５】
2017217014.tif 000178
【表３７−６】
2017217014.tif 000179
【表３７−７】
2017217014.tif 000180
【表３７−８】
2017217014.tif 000181
【表３７−９】
2017217014.tif 000182
【表３７−１０】
2017217014.tif 000183
【表３７−１１】
2017217014.tif 000184
【表３７−１２】
2017217014.tif 000185
【表３７−１３】
2017217014.tif 000186
【表３７−１４】
2017217014.tif 000187
【表３７−１５】
2017217014.tif 000188
【表３７−１６】
2017217014.tif 000189
【表３７−１７】
2017217014.tif 000190
【表３７−１８】
2017217014.tif 000191
【表３７−１９】
2017217014.tif 000192
【表３７−２０】
2017217014.tif 000193
【表３７−２１】
2017217014.tif 000194
【表３７−２２】
2017217014.tif 000195
【表３７−２３】
2017217014.tif 000196
【表３７−２４】
2017217014.tif 000197
【表３７−２５】
2017217014.tif 000198
【表３７−２６】
2017217014.tif 000199
【表３７−２７】
2017217014.tif 000200
【表３７−２８】
2017217014.tif 000201
【表３７−２９】
2017217014.tif 000202
【表３７−３０】
2017217014.tif 000203
【表３７−３１】
2017217014.tif 000204
【表３７−３２】
2017217014.tif 000205
【表３７−３３】
2017217014.tif 000206
【表３７−３４】
2017217014.tif 000207
【表３７−３５】
2017217014.tif 000208
【表３７−３６】
2017217014.tif 000209
【表３７−３７】
2017217014.tif 000210
【表３７−３８】
2017217014.tif 000211
【表３７−３９】
2017217014.tif 000212
【表３７−４０】
2017217014.tif 000213
【表３７−４１】
2017217014.tif 000214
【表３７−４２】
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【表３７−４３】
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【表３７−４４】
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【表３７−４５】
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【表３７−４６】
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【表３７−４７】
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【表３７−４８】
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【表３７−４９】
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【表３７−５０】
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【表３７−５１】
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＊配列名は、成長因子、開裂配列及びＸＴＥＮ構成要素のＮ末端側からＣ末端側への配置を反映する