(57)【要約】キシラナーゼを用いて、プロテオグリカンのコアタンパク質と糖鎖グリコサミノグリカンとの結合部位を切断し、糖鎖グリコサミノグリカンを損傷することなく採取する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテオグリカンのコアタンパク質から糖鎖グリコサミノグリカンを分離するために、キシラナーゼを用いることを特徴とする糖鎖グリコサミノグリカンの分離方法。
【請求項２】
請求項１記載の糖鎖グリコサミノグリカンの分離方法において、キシラナーゼがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来のキシラナーゼである糖鎖グリコサミノグリカンの分離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明はプロテオグリカンのコアタンパク質と糖鎖グリコサミノグリカンとの結合部位を切断して、糖鎖グリコサミノグリカンを損傷することなく採取する方法に関する。
【背景技術】  複合糖質としてのプロテオグリカン分子１個は、分子量数万から数十万のコアタンパク質と呼ばれる骨格のタンパク質１本に、分子量数千から数十万の長大な糖鎖グリコサミノグリカン（以下ＧＡＧ糖鎖という。）が数本から数十本結合している生体高分子である（第１図参照）。ＧＡＧ糖鎖は、その糖鎖の基本構成により、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸など数種類に分けられるが、基本的にはいずれもアミノ糖とウロン酸の二糖繰り返し構造からなる長鎖のヘテロ酸性多糖であり、ヒアルロン酸以外のＧＡＧ糖鎖はコアタンパク質に結合してプロテオグリカンを形成している。
そして、プロテオグリカンは、コラーゲンやヒアルロン酸とともに、ほとんどすべての動物組織において、細胞と細胞の間にある細胞外マトリックスの重要な構成成分として普遍的に存在しており、動物組織構築の重要な役割を担っているほか、細胞を取りまく物理的環境をつくり、細胞の接着、増殖、分化といったさまざまな活動を制御している。
そのＧＡＧ糖鎖部分は、生物学的情報シグナル構造に依存した異なった機能も有している為、あるプロテオグリカンのコアタンパク質に、別のプロテオグリカンのＧＡＧ糖鎖を結合できれば、本来の動物組織には存在しないプロテオグリカンを、人工的に合成することが可能となり、全く新しい物質を生化学的に作り出すことができる。しかしその為には、動物組織から抽出したプロテオグリカンのＧＡＧ糖鎖部分を、本来の機能を損なわないように分離する必要がある。
プロテオグリカンは、先に述べたように、コアタンパク質のＳｅｒにＧＡＧ糖鎖のキシロースが結合（Ｘｙｌ−Ｓｅｒ結合）している巨大分子であり、従来、ＧＡＧ糖鎖の採取にはタンパク質分解酵素によってコアタンパク質を消化して糖鎖部分のみを採取する方法、或いは、本発明者らがすでに特許出願しているエンド−β−キシロシダーゼを用いて切断する方法が考えられていた。
しかし、タンパク質分解酵素を用いる方法では、ＧＡＧ糖鎖を完全な形で採取することはできない。また、エンド−β−キシロキシダーゼを用いる方法では、この酵素自体が試薬として販売されておらず、プロテオグリカンを大量に処理することが出来ない為、一般的ではなかった。
【発明の開示】
ホタテ貝中腸腺由来のエンド−β−キシロシダーゼは、プロテオグリカンのコアタンパク質とＧＡＧ糖鎖との結合部位であるＸｙｌ−Ｓｅｒ結合を加水分解し、ＧＡＧ糖鎖を完全な形で切り離すことのできる酵素であるが、調製には多くの時間と費用を要し、ごく少量しか調製できないという欠点がある。そこで、安価で短時間で大量に調製することができる微生物由来のキシラナーゼに着目し、いくつかのキシラナーゼを用いてエンド−β−キシロシダーゼ活性のスクリーニングを行った。さらに、グリコサミノグリカンの切り出しを行う場合の至適条件を求め、本発明を完成した。
【図面の簡単な説明】  第１図は、細胞外マトリックスとプロテオグリカンの模式図を示す。
第２図は、５種類のキシラナーゼを用いて、エンド−β−キシロシダーゼ活性を比較したものである。
第３図は、ＭＵ−ＧＡＧに対するキシラナーゼの作用を調べるために、酵素反応生成物をＨＰＬＣにて解析したものである。
第４図は、ＭＵ−ＧＡＧを基質とした際の加水分解反応生成物の還元末端糖を分析したものである。
第５図は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来キシラナーゼのＭＵ−ＧＡＧに対する特性を明らかにするため、加水分解の至適特性ｐＨを調べたものである。
第６図は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来キシラナーゼのＭＵ−ＧＡＧに対する特性を明らかにするため、経時変化を調べたものである。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明の実施の形態を具体的に説明する。
エンド−β−キシロシダーゼ活性のスクリーニングは４−ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（ＭＵ）を還元末端側に有するＭＵ−ＧＡＧを基質とし、反応後、遊離したＭＵを蛍光光度計で測定した。さらに、天然の基質として、サケ鼻軟骨由来のペプチドコンドロイチン硫酸（ｐｅｐｔｉｄｅ−ＣｈＳ）、ブタ皮膚由来のデルマタン硫酸（ＤＳ）、ウシ気肺由来のヘパラン硫酸（ＨＳ）を用い、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で解析した。
本発明を完成させるために検討対象として選定したキシラナーゼは次の５種類である。
（Ａ）  Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ由来
（Ｂ）  Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来
（Ｃ）  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来
（Ｄ）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来
（Ｅ）  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来
Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ由来のキシラナーゼはＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ由来のキシラナーゼはＨｉＴｒａｐ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｃｏｌｕｍｎ  アフィニティークロマトグラフィーを行った後、限外濾過にて濃縮、脱塩を行い、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中で４℃にて保存した。
エンド−β−キシロシダーゼ活性の人工基質であるＭＵ−ＧＡＧは培養ヒト皮膚繊維芽細胞から調整したものを用いた。ＭＵ−オリゴ糖はＭＵ−ＧＡＧをヒアルロニダーゼで消化後、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−４カラムクロマトグラフィーで調製した。ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  Ｘｙｌ−Ｘｙｌ（ＰＮＰ−Ｘ２）は、キシロビオース混合物（サントリー）から精製したキシロビオースから合成した。アクチナーゼＥは科研製薬株式会社のものを用いた。
プロテオ−コンドロイチン硫酸（Ｐｒｏｔｅｏ−Ｃｈｓ）、プロテオ−デルマタン硫酸（Ｐｒｏｔｅｏ−ＤＳ）、プロテオ−ヘパラン硫酸（Ｐｒｏｔｅｏ−ＨＳ）は、各々サケ鼻軟骨、ブタ皮膚、ウシ肺からＨｅｉｎｅｇａｒｄとＨａｓｃａｌｌに従って精製した。Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃｈｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＤＳ，Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＨＳを得るために、それらのプロテオグリカンを０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２中で、５０℃、２４時間アクチナーゼ消化した後、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００ＨＲカラムで精製した。
次に測定方法及び測定装置を示す。
（２−アミノピリジンでの蛍光標識）
オリゴ糖還元末端の蛍光（ＰＡ）標識はＨａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．の方法に従い行った。
（エンド−β−キシロシダーゼ活性の評価）
エンド−β−キシロシダーゼ活性の測定は、以下のように行った。即ち、４０μＭ  ＭＵ−ＧＡＧを基質として、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，酵素溶液を含む５０μｌの反応液を３７℃で１０分間インキュベートした。０．５Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ，  ｐＨ１０．４を１ｍｌ加えて反応を停止し、遊離したＭＵの蛍光を蛍光光度計（型番  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｆ−４５００，日立製作所製）にて励起波長（ｅｘ．）３５０ｎｍ、測定波長（ｅｍ．）４５０ｎｍで測定した。活性の値は、一定のキシラナーゼ活性（以下の条件で測定し、基質であるＰＮＰ−Ｘ２を同量加水分解するときの酵素量）を示す酵素量を用いた際の相対的な活性値で表している。キシラナーゼ活性の測定は次のように行った。０．８ｍＭ  ＰＮＰ−Ｘ２を基質として、０．１Ｍ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，酵素溶液を含む５０μｌの反応液を３７℃で１０分間インキュベートした。０．０２Ｍ  ＮａＯＨを１ｍｌ加えて反応を停止し、遊離したＰＮＰ吸光度を波長４０５ｎｍで測定した。
（高速液体クロマトグラフィー）
以下に述べる高速液体クロマトグラフィーはすべて蛍光指示計（型番Ｆ−１１５０，日立製作所製）を装備したＨＰＬＣ（型番  Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｌ−６２００，日立製作所製）を用いた。
（ＭＵオリゴ糖及びＭＵ）
ＭＵオリゴ糖とＭＵの分析はＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）、溶媒は０〜５０分間で０〜３０％のアセトニトリルを用いた。流速１．０ｍｌ／分、検出はｅｘ．３２５ｎｍ，ｅｍ．３８０ｎｍの蛍光を測定した。
（還元末端糖）
ＰＡ化還元末端糖の分析はＵｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  ＯＤＳカラム（４．６ｍｍ×２５ｃｍ）、溶媒は０．２５Ｍクエン酸ナトリウム、１％アセトニトリルを用いた。流速０．５ｍｌ／分、ｅｘ．３２０ｎｍ，ｅｍ．４００ｎｍ分、ｅｘ．３２０ｎｍ，ｅｍ．４００ｎｍで蛍光を測定した。ＰＡ−ｇｌｕｃｏｓｅ，ＰＡ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ，ＰＡ−ｘｙｌｏｓｅをスタンダードとして用いた。
（ＰＡ化ＧＡＧｓ）
ＰＡ化ＧＡＧｓ分析はＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷカラム（７．５ｍｍ×７５ｍｍ）、溶媒はＮａＣｌを用い、０〜１Ｍの直線的濃度勾配で溶質した。流速１．０ｍｌ／分、検出はｅｘ．３２５ｎｍ，ｅｍ．３８０ｎｍの蛍光を測定した。
【実施例】（キシラナーゼにおけるエンド−β−キシロシダーゼ活性のスクリーニング）
市販のＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ（Ａ）、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ（Ｂ）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ（Ｃ）由来のキシラナーゼ、調製した  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ（Ｄ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ（Ｅ）由来の５種類のキシラナーゼを用いて、エンド−β−キシロシダーゼ活性を比較した（第２図）。各値は、一定のキシラナーゼ活性を示す酵素量を用いた際の相対的な活性値で表している。その結果、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ以外の４種のキシラナーゼにエンド−β−キシロシダーゼ活性が検出された。これらのうち活性が高かったのは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来のキシラナーゼであったため、本酵素に着目して、実際にＸｙｌ−Ｓｅｒ結合を加水分解していることを証明するために次の実験を行った。
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来のキシラナーゼのＭＵ−ＧＡＧに対する作用）
ＭＵ−ＧＡＧに対するキシラナーゼの作用を調べるために、酵素反応生成物をＨＰＬＣにて解析した（第３図）。第３図において、ＡはＭＵ−ＧＡＧ酵素消化前、ＢはＭＵ−ＧＡＧ酵素消化後を示し、矢印はスタンダードのＭＵ溶出位置を示している。ＭＵ−ＧＡＧのピークは、キシラナーゼによる酵素消化後に消失し、溶出時間３３分に新たなピークが見られ、これはスタンダードのＭＵの溶出位置と一致した。
次にＭＵ−ＧＡＧを基質とした際の加水分解反応生成物の還元末端糖を分析した。即ち、加水分解反応生成物をＰＡ化して、終濃度２Ｍの塩酸で１００℃、２時間で加水分解後、ＨＰＬＣにて単糖分析を行った（第４図）。図の矢印はそれぞれ、１はＰＡ−ｇｌｕｃｏｓｅ、２はＰＡ−ｇａｌａｃｔｏｓｅ、３はＰＡ−ｘｙｌｏｓｅのスタンダードの溶出位置を示している。その結果、スタンダードのＰＡ−ｘｙｌｏｓｅと同じ溶出位置にピークが検出された。以上の結果から、本酵素はＭＵ−ＧＡＧのキシロシド結合（ＭＵ−β−Ｘｙｌ）をエンド型で加水分解する、エンド−β−キシロシダーゼ活性を持つことが明らかとなった。
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来キシラナーゼのエンド−β−キシロシダーゼ活性における特性）
本酵素のＭＵ−ＧＡＧに対する特性を明らかにするため、加水分解の至適特性ｐＨ（第５図）、経時変化（第６図）を調べた。第５図において、ｐＨ２は０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ３−６は０．１Ｍ  ｃｉｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７−８は０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ９−１２は０．１Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。ＭＵ−ＧＡＧを基質としたときの加水分解の至適ｐＨは６．０であり、本酵素のキシラナーゼ活性の至適ｐＨ５．７とほぼ一致した。また、第６図の経時変化に示したように、本測定条件下では反応３０分でエンド−β−キシロシダーゼ活性が一定になることが明らかになった。
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｏｖｉｒｉｄｉｓ由来キシラナーゼにおけるＧＡＧ構成要素による活性への影響）
Ｐｒｏｔｅｏ−ＣｈＳ，Ｐｒｏｔｅｏ−ＤＳ，Ｐｒｏｔｅｏ−ＨＳは異なる繰り返し二糖を持っているが、コアタンパク質との結合部位は、ＧｌｃＡ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘｙｌ−Ｓｅｒという共通構造である。そこで、ＧＡＧ構成要素の違いによる加水分解活性への影響を調べた。Ｐｒｏｔｅｏ−ＣｈＳ，Ｐｒｏｔｅｏ−ＤＳ，Ｐｒｏｔｅｏ−ＨＳを精製した酵素とともに３７℃、ｐＨ６．０、２４時間インキュベートした。生成物のオリゴ糖還元末端をＰＡ化した後ＨＰＬＣにて解析し、そのピーク面積から加水分解活性を算出して相対的に表した（表１）。
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Ｐｅｐｔｉｄｅ−ＣｈＳを加水分解する際の活性を１００として相対的な値であらわしている。
これらの結果から、精製した酵素は、Ｐｅｐｔｉｄｏ−ＣｈＳ，Ｐｅｐｔｉｄｏ−ＤＳ，Ｐｅｐｔｉｄｏ−ＨＳを加水分解することが明らかになり、いずれのプロテオグリカンの分解にも有効であることが判明した。
【産業上の利用可能性】  本発明を利用してＧＡＧ糖鎖を全く無傷に切り出し、それをタンパク質に導入することができれば、これまで合成することのできなかった新規のプロテオグリカンの作成が可能となる。
従って、遺伝子工学的には糖鎖の欠損や不完全な糖鎖の結合のため、その生理活性の発現やタンパク質の安定性に問題のあったリコンビナントタンパク質も、この手法を用いることによって解決策が見いだされる可能性がある。
本発明は、人工的にプロテオグリカンを合成できるため、遺伝子工学と組み合わせることによって、新薬の開発への道が拓かれることが期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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