(57)【要約】  本発明は、治療目的又は薬理学的試験の目的に使用することができる細胞化された足場の凍結保存のための方法及び材料を提供する。この方法は以下を含む：(i）その上に細胞が播種された細胞化された足場を提供する段階、(ii）該細胞化された足場を、培地及びDMSOなどの凍結保護物質を5〜30％含む凍結保存用組成物で平衡化する段階、(iii）該平衡化された細胞化された足場を、その温度を約1℃/分の速度で約-80℃に下げることにより凍結する段階、及び(iv）該凍結した細胞化された足場を-135℃〜-198℃の温度で保存する段階を含む方法。  【選択図】    なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞化された足場の凍結保存のための方法であって、
(i）細胞化された足場を提供する段階、
(ii）該細胞化された足場を、培地を含みかつ凍結保護物質を5〜30％含む凍結保存用組成物で平衡化する段階、
(iii）該平衡化された細胞化された足場を、その温度を-0.8℃〜-1.2℃/分の速度で-78℃〜-82℃に下げることにより、凍結する段階、及び
(iv）該凍結した細胞化された足場を、その温度を-135℃〜-198℃の温度で保存する段階
を含む方法。
【請求項２】
前記段階(iii）が、前記平衡化された細胞化された足場を、その温度を約-１℃／分の速度で約-８０℃まで連続的に下げることにより、凍結する段階を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記段階（i）が以下を含む、請求項２に記載の方法。
（ia）無細胞の足場を提供する段階、
（ib）該無細胞の足場に細胞を播種する段階、及び
（ic）該播種された足場を培養して、前記細胞化された足場を生成する段階
【請求項４】
前記段階（ia）が以下を含む、請求項３に記載の方法。
（ia-1）組織又は臓器又はそのサンプルを提供する段階、及び
（ia-2）界面活性剤及び酵素の一方又は両方を使用して、該組織又は器官又はそのサンプルを脱細胞化して、無細胞の足場を提供する段階
【請求項５】
前記足場が、シート状足場（好ましくは管状足場である）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記足場が、脱細胞化された器官又は組織に由来する（好ましくは該器官が管腔である）、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記足場が非ヒト起源のものである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞化された足場が、（任意に、新生児や幼児に適した）組織工学的処理がされた食道構造体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞化された足場が、中血管芽細胞及び線維芽細胞を播種された脱細胞化食道に由来する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地が、ペニシリンストレプトマイシン１％、L-グルタミン1％、非必須アミノ酸1％、ベータメルカプトエタノール0.1mM、及び塩基性線維芽細胞成長因子(Basic FGF) 5ng/mlを含む、ウシ胎児血清(FBS)を加えたメガセル(R)培地である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記足場が、球形、直方体、円筒形、六角柱、円錐形、円錐台形、又は角錐形である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記足場が直方体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記足場が、脱細胞化された実質臓器に由来する、請求項１〜４、１１又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞化された足場が組織工学的処理がされた肝臓である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞化された足場が、ヒト肝細胞を播種した脱細胞化肝臓組織である（任意に、該ヒト肝細胞がＨｅｐＧ２細胞である）、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記足場がヒドロゲル足場である、請求項１〜４、１１又は１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞化された足場が、ヒト肝細胞を播種したヒドロゲル足場である（任意に、該ヒト肝細胞がＨｅｐＧ２細胞である）、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記培養培地が、ウシ胎児血清(FBS)を加えた肝細胞支持培地を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞化された足場が、薬理学的研究のための肝臓モデル組織である、請求項１４、１５、１７又は１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞化された足場が、組織工学的処理がされた肺、腸、膵臓、筋肉又は膀胱である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結保存用組成物が、培地を８０％以上含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記凍結保存用組成物が、凍結保護剤を５％〜１５％（より好ましくは８〜１２％、更に好ましくは約１０％）の含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記凍結保護剤が、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレングリコール、グリセロール、2-メチル-2,4-ペンタンジオール、プロピレングリコール、スクロース、トレハロースからなるリストから選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記段階(ii）が、周囲温度未満（任意に、約０〜４℃）で実施される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記段階(iv）が、前記平衡化された細胞化された足場を、約-１６０℃に到達するように、液体窒素の気相中の１又はそれ以上の容器内に、配置することにより実行される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記段階(iv）が、少なくとも１、２、３又は４週間実施される、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
更に、以下を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
（v）前記凍結した細胞化された足場を、（任意に37℃の）水浴中で急速に解凍する段階
【請求項２８】
請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って得られた凍結保存された細胞化された足場。
【請求項２９】
解凍された、請求項２７に記載の凍結保存された細胞化された足場。
【請求項３０】
請求項２８に記載の凍結保存された細胞化された足場、及び１又はそれ以上の容器を含むキット。
【請求項３１】
前記キットを治療目的又は薬理学的研究目的のための使用するために、説明書又はラベルをさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
臓器不全を引き起こす慢性疾患の患者を治療する方法であって、
（i）該患者の自己細胞を使用した組織工学的処理がされた臓器置換体体である細胞化された足場を提供する段階、
（ii）請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って臓器置換物を凍結保存する段階、
（iii）患者が必要とする場合に臓器置換体を解凍する段階
（iv）該臓器置換体を使用して該患者を治療する段階
を含む方法。
【請求項３３】
同種組織工学による臓器代替品を提供するシステムであって、
（i）ユニバーサルドナーiPS細胞を使用した同種組織工学的処理がされた臓器置換体である複数の細胞化された足場を提供する段階、
（ii）請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法に従って該臓器置換物を凍結保存する段階、
（iii）臓器置換体が必要な患者を特定する段階、
（iv）互換性のある凍結保存された同種組織工学的処理がされた臓器置換体を特定する段階、
（v）該患者が必要とする場合に、該臓器置換体体を解凍する段階、
（vi）該臓器置換体を使用して該患者を治療する段階、
を含むシステム。
【請求項３４】
薬理学的研究目的に使用するための３次元工学的微小足場を提供する方法であって、
（i）薬理学的研究の目的に適した３次元工学的微小足場である細胞化された足場を提供する段階、
（ii）請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法に従って、該工学的微小足場を凍結保存する段階、
（iii）必要とされた場合に、該微小足場を解凍する段階
を含む方法。
【請求項３５】
請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法又はシステムに使用するための細胞化された足場又は凍結保存された細胞化された足場。
【請求項３６】
請求項３２又は３３に記載の方法又はシステムに使用するために、細胞化された足場又は凍結保存された細胞化された足場を、医療用インプラント又は医療用材料を調製するために使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、一般的に、細胞化された足場の凍結保存に使用するための方法及び材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
組織工学（ＴＥ）が、損傷された又は病気の臓器及び組織の従来の治療に対する実行可能で重要な代替法であることが証明されつつある［１−３］。現在、さまざまな組織工学的処理がされた臓器及び組織が前臨床試験中である（気管、心臓弁、喉頭、血管、膀胱）［４，５］。
特に有望な組織工学（ＴＥ）アプローチは、脱細胞化を行って、非免疫原性マトリックスを作成し、それを自家細胞又はその他の適合細胞で再細胞化することである。この脱細胞化のプロセスは、界面活性剤と酵素を使用して組織と器官の細胞区画を取り除く。重要なのは、この足場の細胞外マトリックスが保存されているため、組織の元の構造と組成が維持されるが［３，４，６−８］、潜在的な免疫拒絶が回避されていることである［９］。このドナー組織は人間起源である必要はないが、解剖学的に一致した種から採取することができる［１０］。従って、重大なドナー臓器不足の問題を潜在的に解決できる。
【０００３】
組織工学で脱細胞化されたマトリックスに関して公表された例には、腸［１１，１２］、食道［７］、肺［１４］、及び横隔膜［１５］に関連するものがある。一例として、自家幹細胞を使用して組織工学的処理がされた気管を準備し、これを子供に移植した例がある［５］。その後の報告によれば、この気管はまだ統合されていて、さらにこの組織工学的処理がされた器官は子供とともに成長しており、このことは組織工学（ＴＥ）の大きな有用性を示している［１６］。
国際公開WO2017/42232は、インプラント（特に、管腔組織インプラント）の改善された製造方法を開示しており、このインプラントは、無細胞の足場又はマトリックスに筋細胞前駆体及び線維芽細胞を播種する（たとえば、特定の細胞比で注入播種する。）ことによる組織工学的処理がされている。
【０００４】
病院における組織工学の応用がますます増えているので、主要な制限要因は、必要なときに十分な数の適切に細胞化された足場を迅速に提供する能力である。オンデマンドでこのような織工学的処理がされた臓器を「在庫があっていつでも買える状態」で提供する能力は、この治療から利益を得ることができる患者の数を著しく増加させる可能性がある。
この点で、再細胞化された足場を事前に調製して、構築物の構造と機能とを実質的に保存する方法で、これらを保存することができることが望ましい。
脱細胞化された足場又は天然組織の凍結保存のための複数の方法が当技術分野で提案されてきた。その例として、次が挙げられる：Franchini et al, Blood Transfus., 2009, 7, 100-105; Bonenfant et al, Biomaterials, 2013, 34, 3231-3245; Gallo et al, Heart Vessels, 2016: 1862-1873; Brockbank et al, Cell Tissue Banks, 2012, 13, 663-671;Poornejad et al, Organogenesis, 2015, 11, 30-45.
【０００５】
しかし、これらの足場又は組織の構造と特性は、細胞化された足場の構造と特性とは同等でないため、これらの無細胞の足場又は天然組織に適用可能な方法は、細胞化された足場に適用することは合理的に期待できない。
チェン(Chen)らは、トレハロースの存在下で上皮シートの凍結保存を調べた(Biomaterials, 2011, 32, 8426-8435)。異なる凍結保存溶液（トレハロースを含むものと、トレハロースを含まないもの）を使用して、ケラチノサイトを播種したキトサン-ゼラチン膜を、これらのサンプルを4℃で30分間保持し、その後液体窒素に入れることにより、凍結した。これらの細胞懸濁液は、段階凍結（4℃で30分間、-20℃で2時間、-80℃で一晩、次いで液体窒素）により凍結保存した。
コスタ(Costa)らは、デンプンとポリ（カプロラクトン）の混合物に基づいた繊維メッシュである多孔質足場に、ヤギ骨髄幹細胞を播種して、その凍結保存を調べた(Tissue Engineering, 2012, 18, 852-858)。この著者らは、-196℃の液体窒素へ直接入れることにより凍結保存を行った。
【０００６】
米国特許第6638709号は、凍結保存された複合生体構築物(CCLC)及び複合生体構築物(CCLC)の製法に関し、この複合生体構築物(CCLC)は、培養線維芽細胞と培養ケラチノサイトの分離した層から構成される。この複合生体構築物(CCLC)は、非細胞透過性成分と細胞透過性成分に基づく凍結防止剤溶液で平衡化し、凍結し、極低温で保存することにより調製される。使用前に、これらを解凍してすすぎ、凍結防止剤を実質的に除去する。この凍結は、特定のさまざまな温度低下速度と保持段階を使用する指定された温度低下プログラムによって行われる。
米国特許第8367059号は、凍結保存された骨構造体に関する。一つの実施態様において、灌流バイオリアクターの中に、多孔性ヒドロキシアパタイト-キトサン-ゼラチン（HCG）足場を提供し、次いで灌流バイオリアクター中のHCG足場に細胞を播種し、その中を細胞培養培地を灌流し、細胞播種とHCG足場の成長を可能にするようにバイオリアクターを作動させる。続いて、HCG細胞構築物に適切な凍結保存液を灌流し、特定の段階的な方法で冷却する。
それでも、上述のように、凍結保存による組織工学的処理がされた器官などの長期保存を成功させるための新規の方法は、この技術に有用な貢献を提供することがわかる。
【０００７】
本発明の一般的な開示
本発明は、細胞化された足場のための特定の「徐冷」媒体と「徐冷」方法を提供し、これは、解凍後に、多数の異なるタイプの細胞化された足場において細胞機能及び足場の完全性を維持することを示す。好ましい実施態様において、本発明は、臨床使用のために既に適正製造基準(GMP)で承認されている構成要素を利用し、材料を保存するための無菌で比較的安価な方法を提供する。
本発明の方法は、食道及び肝臓の組織工学的処理がされた構造体などの足場の凍結保存に首尾よく使用されてきた。例えば、再細胞化された肝臓の解凍は、その細胞が、培養で維持された再細胞化された足場の細胞に匹敵するレベルで、アルブミンを産生できることを示した。
脱細胞化された足場及び天然組織の凍結保存に使用される他の徐冷法は、材料に損傷をもたらすことが報告されているため、この発見は特に驚くべきことである（上記の Gallo et al 及びBrockbank et alを参照されたい。）。
【０００８】
組織工学（ＴＥ）臓器の凍結保存のために新規で効果的なシステムを提供することは、この分野での新しい臨床的可能性を開く。
様々な態様において、本発明は、細胞化された足場の凍結保存のための方法及び材料を提供し、これらは治療又は薬理試験の目的に使用することができる。この方法は以下を含む：(i）細胞が播種された培養足場を提供する段階、(ii）該細胞化された足場を、培地を含みかつ凍結保護物質（DMSOなど）を5〜30％含む凍結保存用組成物で平衡化する段階、(iii）該平衡化された細胞化された足場を、その温度を特定の速度で特定の温度に下げることにより、凍結する段階、及び(iv）該凍結した細胞化された足場を、その温度を-135℃〜-198℃の温度で保存する段階。
【０００９】
本発明の詳細な開示
従って、第１の態様では、細胞化された足場の凍結保存のための方法であって、
(i）細胞化された足場を提供する段階、
(ii）該細胞化された足場を、培地を含みかつ凍結保護物質を5〜30％含む凍結保存用組成物で平衡化する段階、
(iii）該平衡化された細胞化された足場を、その温度を-0.5℃〜-2℃（例えば、-0.8℃〜-1.2℃、例えば、-1℃）/分の速度で-75℃〜-85℃（例えば、-78℃〜-82℃、例えば、-80℃）に下げることにより、凍結する段階、及び
(iv）該凍結した細胞化された足場を、その温度を-135℃〜-198℃（例えば、-160℃）の温度で保存する段階、を含む方法が提供される。
本発明の「徐冷」方法において、この段階(iii)は、段階的にではなく、連続的に実施することが好ましい。
【００１０】
「細胞化された足場」とは、無細胞の足場に細胞が播種され培養されたものを意味する。特定の実施態様において、この細胞化された足場は再細胞化された足場（すなわち、脱細胞化組織からの細胞播種足場）であってもよい。以下、再細胞化された足場及び他の細胞化された足場の例（すなわち、人工又は合成の足場を利用する）を説明する。
無細胞の足場又はマトリックスの供給源は、当技術分野で周知である。例えば、国際公開WO02/14480は、当該技術分野における足場の次の５つの一般的なカテゴリーに言及している：(1)非分解性合成ポリマー；（2）分解性合成ポリマー；（3）非多孔性である非ヒトコラーゲンゲル；（4）所望の多孔度に加工された非ヒトコラーゲンメッシュ；及び（5）ヒト（死体）脱細胞化コラーゲン組織。
【００１１】
「無細胞」の足場は、典型的には、細胞又は細胞成分を含まない。しかし、例えば、足場が生物学的供給源から使用される場合には（例えば 脱細胞化された足場）、以下で説明するように、（例えば、脱細胞化後に）いくつかの細胞が足場に残っている可能性がある。
一つの実施態様において、この足場は人工又は合成ポリマー足場である。合成ポリマーの例には、さまざまな繊維や織物に加工できるダクロン（Ｒ）やテフロン（Ｒ）が含まれる。合成組織マトリックスとして使用される他のポリマーには、ポリガラクチドやポリジオキサノンが含まれる。
他の合成足場は、本質的にタンパク質性であってもよく、これは主にコラーゲンなどの精製タンパク質で構成されている。
非合成の足場は、また本質的にタンパク質性であっても、主にコラーゲン細胞外マトリックス（ECM）から構成されていてもよい。
【００１２】
この足場は、好ましくは、脱細胞化（生物学的）マトリックスである。この足場は異種であってもよく、すなわち、それは、レシピエント（例えば、ヒトレシピエント）とは異なる種のドナーのものか、又はこれに由来する。あるいは、この足場は同種であってもよい。
これに関連して、脱細胞化に適した基質は、とりわけ、脱細胞化された動物由来（例えば、ブタ由来、ラット由来又はウサギ由来）の足場である。
【００１３】
任意の既知の脱細胞化方法を使用して、この足場を提供することができる。一般に、脱細胞化法は、細胞及び細胞成分の除去を促進する（典型的には細胞外マトリックス（ECM）の足場を残す）ために、細胞成分を破壊、分解及び/又は破壊する及び/又は細胞が埋め込まれているマトリックスを改変するために、さまざまな化学的、生化学的及び/又は物理的手段を使用する。
用語「足場」及び「マトリックス」は、文脈がそうでないことを要求しない限り、本明細書では互換的に使用される。国際公開WO02/14480（上記）は、とりわけ当技術分野で公知の様々な界面活性剤、乳化剤、タンパク質分解酵素、及び／又は高若しくは低イオン強度溶液のいずれかを含む、天然組織の脱細胞化方法を記載している。本発明は、マトリックスを実質的に無傷のままにして、細胞のかなりの部分を除去する任意の脱細胞化技術により生成される脱細胞化された足場の使用方法を包含する。
【００１４】
細胞の「実質的な部分」の除去は、典型的には、細胞の、少なくとも50％、例えば、少なくとも60、70、80、90、95又は99％の除去、特にすべての細胞又は実質的にすべての細胞の除去を指してもよい。
マトリックスを「実質的に無傷」のままにするとは、マトリックス（例えば、細胞外マトリックス（ECM））の少なくとも40、50、60、70、80、90、95又は99％の存在を保持することをいう。
【００１５】
従って、任意に、第１の態様の方法の段階（i）は以下を含む：
（ia）無細胞の足場を提供する段階、
（ib）該無細胞の足場に細胞を播種する段階、
（ic）該播種された足場を培養して、前記細胞化された足場を生成する段階
任意に、この段階（ia）が以下を含む：
（ia-1）組織又は臓器又はそのサンプルを提供する段階、
（ia-2）界面活性剤及び酵素の一方又は両方を使用して、該組織又は器官又はそのサンプルを脱細胞化して、無細胞の足場を提供する段階
代替として、この段階（ia）は以下を含む：
（ia-1）人工又は合成の無細胞の足場を提供する段階
【００１６】
培地
播種を目的として、細胞は、当技術分野で周知のものなどの適切な培地中に加えられてもよい。この培地の例には、MEGACELL(R)培地（ウシ胎児血清(FBS)5％；ペニシリンストレプトマイシン1％； L-グルタミン1％；非必須アミノ酸1％；ベータメルカプトエタノール0.1mM；線維芽細胞成長因子(塩基性)(FGF) 5ng/ml）、ダルベッコ変性イーグル培地（DMEM）などやマトリゲル(R)などのゲルが含まれる。この培地は、コラーゲン、フィブロネクチンなどを含んでもよい。細胞化された足場に適した培地の適切な例は、本明細書で言及される刊行物及び以下の実施例に記載されている。
培養培地又は増殖培地は、凍結保存の前に凍結保護剤5〜30％と混合される。例えば、一つの実施態様において、最終凍結保存用組成物は、ウシ胎児血清（FBS）50％、サプリメントを含むメガセル(R)培地40％、及びDMSO10％を含む。
【００１７】
播種と培養の条件
細胞化された足場を提供するための播種と培養の条件は、当技術分野で公知であり、本明細書で言及される刊行物に記載されている。
足場に播種される細胞の数はいくつかの因子に依存することは理解されたい。この因子には、足場の大きさ、足場に必要な細胞の密度、播種後に足場が培養される時間、及び足場の使用方法が含まれる。従って、例えば、引き続き培養を行う場合などには、細胞を足場全体に播種する必要はないかもしれない。しかし、特に、細胞は、足場の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80又は90％を覆うように播種されてもよい。さらに、例えば、細胞化された足場の最終的な使用方法に応じて、足場の1又はそれ以上の表面に細胞を播種してもよいことは理解されたい。
【００１８】
本明細書で定義される細胞化された足場を生成するために、任意の供給源から、任意のタイプの細胞を使用してもよい。この細胞は、例えば、線維芽細胞、中皮血管芽細胞、上皮細胞などであってもよい。細胞化された足場が、例えば、損傷した器官又は組織を修復又は置換するために患者へ移植するのに適した構造体を形成する場合、足場に播種される細胞は、通常、修復又は置換される臓器又は組織に存在するものに一致してもよい。このような細胞の供給源については、以下で説明する。
播種された構造体の培養は、典型的には、「バイオリアクター」で行う。
例えば、米国特許出願公開US2014/0341862において議論されているように、従来技術には、非常に多種多様な異なる組織構造体に適したリアクターが知られている。管状構造体に特に適しているのは、例えば、DE19915 610（Bader）に記載されているような反応器、又はEP0320441（Sulzer）に記載されている反応器である。（例えば）管状血管は、そのようなリアクターに固定され、従って、体内での統合の後の自然な状況に最も近くなるように、媒体又は血液の貫流にさらされる。
このバイオリアクターは、脱細胞化バイオリアクターから移し、播種し、次いで再細胞化バイオリアクターに導入できる、取り外し可能なカセットを組み込んでもよい（例えば、国際公開WO2017/042232を参照されたい）。
【００１９】
治療に関連する構造体
従って、好ましい実施態様において、本発明は、修復又は置換する必要がある組織又は器官を模倣する構造体の製造及び凍結保存に関する。この場合、足場には細胞が播種されており、細胞が足場に移植することができ、その結果、患者に移植可能な人工構造体が得られる。従って、細胞化された足場は、組織又は臓器の修復のための構造体を形成してもよい。
このような方法で使用される細胞は、典型的には自家性、すなわち組織又は器官構造体の意図されるレシピエントのものか、又はこれに由来する。しかし、この方法で使用する細胞は同種異系（すなわち、この細胞が、生成される組織又は臓器構造体のレシピエントではない患者から得られたか、又はこれに由来する。）であってもよい。さらに、異種細胞（すなわち、組織/器官構造体のレシピエントとは異なる種に由来する細胞）を使用してもよい。
【００２０】
用語「組織」又は「器官」は、文脈がそうでないことを要求しない限り、この構造体に関して本明細書で互換的に使用される。
本明細書で使用される用語「患者」又は「被験者」は、任意の哺乳動物（例えば、犬、猫などの家畜、馬、豚、牛などの農業動物、又は人間）を指す。一つの実施態様において、患者又は被験者は、新生児又は乳児、特にヒトの新生児又は乳児であってもよい。
置換組織を生産するための一般的な戦略は、細胞培養に適した足場に播種された哺乳類細胞を利用する。この細胞は、目的とするレシピエントから（例えば、生検から）得ることができ、その場合、それらの細胞は、しばしば足場を播種するために使用される前に培養で拡大される。細胞はまた、他の供給源（例えば、確立された細胞株）から入手することができる。播種後、一般に、細胞増殖は、人工組織の移植後、実験組織及び/又は患者（たとえば、細胞化された足場を含む、又はのみから成る）中で継続する。
【００２１】
医薬試験
他の実施態様において、本発明の細胞化された足場を、薬理学的研究に利用してもよい。この例には、国際公開WO2017/017474に記載された足場に基づく細胞化された足場が含まれる。この国際公開には、（特に）供給源組織からの無細胞の細胞外マトリックス（ECM）からなる脱細胞化組織足場の製造が記載されており、これは3次元構造、ECM組成、及び供給源組織の細胞外マトリックス（ECM）の生物活性を保持している。これらに、手元のアッセイの研究に適した細胞を再配置できる。国際公開WO2017/017474に記載されている構造体の例には、肝臓組織立方体が含まれる。
【００２２】
以下、これらと、本発明の他の態様及び実施態様を、より詳細に説明する：
一つの実施態様において、この構造体は管腔組織インプラントである。
「管腔」構造体などへ言及する場合、この構造体自体の構造というよりは、むしろ、以下に記載するような管腔器官又は組織の置換又は移植に適した構造体を指す。例えば、この構造体は単純にシート形状であってもよく、これは所望するように使用又は適用することができる。組織構造への言及はこのように理解する必要がある。従って、食道構造体への言及は、食道への移植に適した構造体、又は食道置換物として適切な構造体を指し、腸構造体は、腸内への移植、又は腸置換物として適切な構造体を指す。一つの実施態様において、この構造体は、管腔形状又は管状形状を有してもよい。
【００２３】
一つの実施態様において、この足場はそれ自体で管状である。
一つの実施態様において、この足場は、脱細胞化された管腔器官に由来する。
一つの実施態様において、この足場は非ヒト起源のものである。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、国際公開WO2017/042232に記載されているように、筋肉細胞前駆体及び線維芽細胞を無細胞の足場又はマトリックスに播種することによって織工学的処理がされた管腔組織インプラントである。従って、この細胞は、マトリックス中に及び／又はマトリックス上に播種された中血管芽細胞及び線維芽細胞の組み合わせであってもよく、この中血管芽細胞及び線維芽細胞は、別々に、同時に、又は連続して、播種される。この足場には、神経堤細胞（例えば、マウス起源）を播種してもよい。
一つの実施態様において、培養培地はウシ胎児血清(FBS)／メガセル(R)培地である。
【００２４】
従って、一つの実施態様において、本発明の方法は以下を含む：
（i）足場を提供する段階、
（ii）この足場のマトリックス内及び/又は上に中血管芽細胞と線維芽細胞（及び、任意に、さらに神経堤細胞などの細胞）の組み合わせを播種する段階であって、この中血管血管芽細胞及び線維芽細胞は別々に、同時に、又は連続して播種される段階、
（iii）この播種された足場を培養して移植可能な構造体を生成する段階、
（iv）本明細書に記載されたように構造体を凍結保存する段階
【００２５】
一つの実施態様において、細胞化された足場は組織工学的処理がされた食道であり、これは任意に新生児又は乳児に適したものであってもよい。
非限定的な例として、新生児に適した典型的な食道構造体は、弛緩状態のとき、幅約8〜10mm、長さ4〜5cmであってもよい。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、中血管芽細胞（例えば、ヒトの）及び線維芽細胞（例えば、マウス又はヒトの）が播種された脱細胞化食道である。
一つの実施態様において、この足場は、脱細胞化された実質臓器に由来する。この足場は、任意の3次元固体（例えば、実際の又は近似の：球形、直方体、円筒形、六角柱、円錐形、円錐台形、ピラミッド形など）であってもよい。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、例えば、国際公開WO2017/017474又は国際公開WO2015/185912に記載されているような、組織工学的処理がされた肝臓である。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、脱細胞化された肝臓組織にヒト肝細胞（例えば、幹細胞、iPS細胞）又はヒト肝細胞株（任意に、HepG2細胞株である。）を播種したものである。
【００２６】
一つの実施態様において、この足場は、国際公開WO2015/185912に記載されているヒト肝臓細胞外マトリックス（ECM）足場に由来するもののような、ヒドロゲル足場である。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、ヒト肝細胞株（任意に、HepG2細胞株である）を播種したヒドロゲル足場である。
一つの実施態様において、この培養培地はウシ胎児血清(FBS)／アルファＭＥＭ培地である。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、薬理学的研究又は治療目的のモデル組織（例えば、肝臓モデル組織）である。このような足場は、最大寸法が3〜30mmである上記のような形状の固体であってもよい。
一つの実施態様において、この細胞化された足場は、例えば 約3、4、5、6、7、8、9、10mmの側面寸法を有する立方体である。
他の実施態様において、この細胞化された足場は、組織工学的処理がされた肺、腸、膵臓筋肉又は膀胱から選択されてもよい。
このような細胞化された足場は、治療目的又は薬理学的研究に使用されてもよい。
【００２７】
凍結保存用培地
いくつかの実施態様において、凍結保存用組成物は、培地を80％以上含む。例えば、この凍結保存用組成物は、凍結保護剤を20％未満、好ましくは5％〜15％、より好ましくは8〜12％、更に好ましくは約10％含んでもよい。
この凍結防止剤は、ジメチルスルホキシド（DMSO）、エチレングリコール、グリセロール、 2-メチル-2,4-ペンタンジオール、プロピレングリコール、スクロース、トレハロースから成るリストの１又はそれ以上から選択されてもよい。
【００２８】
凍結保存条件
一つの実施態様において、段階（ii）は、周囲温度未満（例えば、20、15、10又は5℃未満、任意に約0〜4℃）で実施される。
これに続く段階（iii）は、平衡化された細胞化された足場を、その温度を-0.5℃〜-2℃/分の速度で-75℃〜-85℃まで下げることにより、凍結する段階を含む。好ましい冷却速度は、約-1℃/分（すなわち、-0.8、-0.9、-1.1、又は1.2℃/分）である。
この冷却段階は、好ましくは約-80℃（例えば、-78、-79、-81、-82℃）まで継続される。
段階（iii）の冷却は、平衡化された細胞化された足場を約-80℃の1又はそれ以上の容器内に配置することにより達成されてもよい。
【００２９】
これに続く段階（iv）における冷却は、平衡化された細胞化された足場を液体窒素の気相中の1又はそれ以上の容器内に配置することにより達成され得る。これにより、約-160℃の温度が達成される。
この冷却段階は、連続的であることが好ましく、即ち、この段階は、細胞化された足場が取り外されて冷却環境に戻される段階的な温度低下を含まない。
いくつかの実施態様において、段階（iv）は、少なくとも1、2、3又は4週間以上行われる。たとえば、段階（iv）は少なくとも12、16、20、24週間行われてもよい。
凍結した細胞化された足場を利用することが望まれる場合、これは、凍結した細胞化された足場を37℃の水浴で急速に解凍することにより都合よく達成することができる。これは、保管場所において、又は治療又は使用する地点のいずれかで行ってもよい。
【００３０】
細胞生存率
一つの実施態様において、解凍された細胞化された足場は、凍結保存されていない細胞化足場に元々存在していた生細胞の元の数の少なくとも約70％の細胞生存率（細胞化された足場に存在する生細胞の総数に対する割合（％）で表される）を有する。
一つの実施態様において、この解凍された細胞化された足場は、凍結保存されていない細胞化された足場に存在する元の細胞数の少なくとも約50％を保持する。
一つの実施態様において、生細胞の代謝活性は、細胞化された足場に元々存在する生細胞の元の代謝活性の少なくとも50％である。
一つの実施態様において、この足場の構造的完全性は、凍結保存によって実質的に影響を受けない。
細胞生存率、細胞数及び代謝活性、ならびに足場の完全性を定量化及び評価する方法を以下で説明する。使用される細胞生存率の分析方法の例には、組織学的分析、生物発光イメージング、及びアルブミンの定量化が含まれる。
【００３１】
その他の側面と有用性
一つの態様において、本発明は、本明細書に記載された方法に従って得られた凍結保存された細胞化された足場、及び治療又は手術におけるその使用法を提供する。
一つの態様において、本発明は、本発明の凍結保存された細胞化された足場及び1つ又は複数の容器を含むキットを提供する。
任意に、このキットはさらに、治療又は薬理学の研究目的のためのこのキットの使用に関する指示書又はラベルを含む。
特に、キットは、任意に、凍結保存された細胞及び構造体を維持、保存、解凍、及び/又は使用する方法を説明する説明書又はラベルを任意に含むことができる。キットはまた、任意に、凍結保存された細胞化された足場の保存、維持、解凍、及び/又は成長のための培地を含むことができる。
【００３２】
本発明の一態様は、患者の状態が実質的に悪化した場合に最終的に臓器置換体が必要となるかもしれない慢性疾患患者に対する新規治療法を提供する。これは、望ましくないが、治療の準備に利用できる時間が限られていて、組織工学的処理がされた構造体又は臓器置換体を用意するのに数ヶ月かかる可能性がある、緊急事態となる可能性がある。
本発明を使用すれば、そのような材料を事前に調製することができて、必要になるまで凍結保存しておくことができる。
【００３３】
従って、本発明は、臓器不全を引き起こす慢性疾患の患者を治療する方法であって、
（i）該患者の自己細胞を使用した組織工学的処理がされた臓器置換体体である細胞化された足場を提供する段階、
（ii）ここに記載の方法に従って臓器置換物を凍結保存する段階、
（iii）患者が必要とする場合に臓器置換体を解凍する段階
（iv）該臓器置換体を使用して該患者を治療する段階
を含む方法を提供する。
人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、組織工学における有望な細胞源である。たとえば、「ユニバーサルドナー」を使用して作成された100個のiPS細胞のバンクは、人口の40％に使用できることが報告されている。
これにより、自己細胞を採取して拡大する必要無しに、再細胞化された臓器置換物を、必要に応じて人口の大部分に適した置換物を提供するのに適したさまざまなサイズで先制的に準備及び凍結保存することが可能になる。このような同種の材料は、短期間の通知で治療地点に提供することができる。
【００３４】
従って、本発明は、同種組織工学による臓器代替品を提供するシステムであって、
（i）ユニバーサルドナーiPS細胞を使用した同種組織工学的処理がされた臓器置換体である複数の細胞化された足場を提供する段階、
（ii）ここに記載の方法に従って該臓器置換物を凍結保存する段階、
（iii）臓器置換体が必要な患者を特定する段階、
（iv）互換性のある凍結保存された同種組織工学的処理がされた臓器置換体を特定する段階、
（v）該患者が必要とする場合に、該臓器置換体体を解凍する段階、
（vi）該臓器置換体を使用して該患者を治療する段階、
を含むシステムを提供する。
任意に、この細胞化された足場又は複数の細胞化された足場は、患者の治療地点から隔れたところで保存される。
【００３５】
本明細書に記載されたヒト又は動物の身体に実施される可能性のある治療的又は外科的方法、使用、及び有用性のそれぞれに関して、次のものも提供される：この材料（細胞化された足場）を、治療的又は外科的状況で使用するための薬剤又はインプラントの調製において使用する方法、及び治療的又は外科的状況で薬剤又はインプラントとして使用するための材料（細胞化足場）。
織工学的処理がされた微小足場は、その3次元構造が、2次元細胞培養の使用よりも、より現実的なモデルを提供するため、薬物検査に非常に有用である。
例示的なシステムは、ヒト肝臓細胞外マトリックス（ECM）ヒドロゲル及び肝臓微小足場に基づく（例えば、Mussbach, Franziska, et al. "Bioengineered Livers: A New Tool for Drug Testing and a Promising Solution to Meet the Growing Demand for Donor Organs." European Surgical Research 57.3-4 (2016): 224-239を参照されたい。）。ほかの例は国際公開WO2017/017474にも記載されている。
このようなシステムは、典型的には、テスト又は移植の要求に応じて用意され、理想的な生理学的条件で迅速に出荷される。本発明による凍結保存は、事前の生産を可能にする。
【００３６】
従って、本発明は、薬理学的研究目的に使用するための３次元工学的微小足場を提供する方法であって、
（i）薬理学的研究の目的に適した3次元工学的微小足場である細胞化された足場を提供する段階、
（ii）ここに記載の方法に従って、該工学的微小足場を凍結保存する段階、
（iii）必要とされた場合に、該微小足場を解凍する段階
を含む方法を提供する。
任意に、この方法は、さらに必要に応じて解凍された足場を利用する段階を含む。この段階は、例えば、それを想定される薬剤と接触させる段階、解凍された足場の生理学的又はその他のパラメータを測定する段階、そのパラメータを想定される薬剤と接触していない足場と比較する段階、等々、による。
【００３７】
特許請求の範囲を含む本明細書全体を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む」、「から成る」という用語は、述べられた整数又は段階又は複数の整数若しくは複数の段階の群を包含するが、他の整数又は段階又は複数の整数若しくは複数の段階の群を除外するものではないことを理解されたい。
本明細書に記載の材料が特定の成分の混合物を含む又はから成るとして表示される場合、これらの成分「のみから成る」又はそれらの成分から「本質的になる」材料も準用されることを理解されたい。
明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ある(a, an)」、「一つの(a, an)」、「その(the)」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。従って、例えば、「一つの乾燥段階」へ言及した場合、２又はそれ以上のそのような乾燥段階の組み合わせなどを含む。
【００３８】
本明細書では、「約」ある特定の値から及び／又は「約」他の特定の値までと表された場合、範囲が表されている。このような範囲が表現される場合、別の実施態様は、この特定の値から及び／又はこの他の特定の値までを含む。同様に、先行詞「約」を使用して値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施態様を形成することを理解されたい。
この開示は、本発明を理解するのに有用であってもよい情報を含む。ここで提供される情報のいずれもが、先行技術であること、又は現在請求されている発明に関連していること、又は具体的又は暗黙的に参照されている出版物が先行技術であることを認めるものではない。
本明細書の見出し及びサブタイトルは便宜上のためだけに含まれたものであり、その開示内容を限定するものと解釈されるべきではない。
ここで、以下の非限定的な図及び実施例を参照して、本発明をさらに説明する。当業者は、これらを参照して、本発明の他の実施態様を思い浮かべるであろう。
本明細書に引用されるすべての参考文献の開示は、本発明を実施するために当業者が使用できる限り、相互参照により本明細書に具体的に組み込まれる
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１−２】再細胞化され、組織工学的処理がされた食道の凍結保存を示す。  ラットの脱細胞化された食道に、Luc+Zs-Green+ヒト中胚葉芽細胞及びマウス線維芽細胞及びマウスGFP+神経冠細胞を播種し、バイオリアクター中で１１日目まで培養した後、開発したプロトコルで２週間凍結保存し、開発したプロトコルで解凍し、さらに１４日間培養した。  凍結保存の前後で、にインビボイメージシステム（IVIS、Perkin Elmer）により生物発光イメージング法を使用してこの細胞を追跡した。  図２Ａ、Ｂは、凍結後14日目の足場内の細胞のH＆E染色を示す。図２Ｂの各時点の左に、「MABs」の結果を示し、右側に「MABs+FBs」を示す。  図２Ｃは、ヒト中胚葉芽細胞及び線維芽細胞及びマウスGFP+神経冠細胞を含む凍結保存された食道の代表的な断面を示す。
【図３】再細胞化されたヒト肝臓足場と肝臓ヒドロゲルの凍結保存を示す。  0.5M HepG2を16個のヒドロゲルと16個のHL-68に播種した。各足場タイプの半分を、開発された方法を使用して2週間凍結保存した。凍結保存後、新しい足場と解凍された凍結保存された足場との間に有意差はなかった。このヒストグラムでは、その左側に各時点でのHL-68の結果を示し、右側にヒドロゲルの結果を示す。
【図４】保存後の細胞生存率の維持を示す。  食道足場にLuc+ZsGreen+hMAB + mFBを播種し、静的条件下で培養し、2週間凍結保存した。Sその結果、徐冷プロセスで凍結保存された生体工学処理がされた筋肉は、保存後に細胞生存率の維持を示した。  図４Ａは、Luc+ZsGreen+hMAB + mFBを播種し、8日間（凍結前）静置培養し、2週間の凍結保存後、さらに7日間静置培養した、代表的な足場の生物発光画像を示す。検出された生物発光放射輝度の位置を矢印で示す。  図４Ｂは、播種された足場に、凍結保存後行われたMTT比色分析の代表的な画像を示す（スケールバー：1mm）。  図４Ｃは、凍結保存の前と、凍結保存の後のいくつかの時点における生物発光イメージングを使用して検出された平均放射輝度を示す（データ：平均±SEM（n = 3））。
【実施例】
【００４０】
実施例１  −  材料と方法
足場の完全性の確認
組織学的検査
複数のサンプルを、室温でPBSの10％中性緩衝ホルマリン溶液（pH 7.4; Sigma、英国）中で24時間固定し、dH2Oで洗浄し、等級アルコールで脱水し、パラフィンに包埋し、5μmで切片化した。組織スライドをヘマトキシリンとエオシン(H&E; Leica, ドイツ)で染色した。
DNAの定量
DNAを、製造元(PureLink Genomic DNA MiniKit, Invitrogen, 英国).の指示に従って組織DNA分離キットを使用して分離した。
細胞外マトリックス（ECM）成分の定量
コラーゲン、エラスチン及びグリコサミノグリカン（GAG）の含有量を、それぞれ合計コラーゲンアッセイキット（Biocolor、英国）、FASTINエラスチンアッセイ及びGAGアッセイキット（Biocolor、英国）を使用して定量した（文献14を参照されたい。）。
生体力学的試験
食道の生体力学的特性を評価するために、試験片を試験し、破損するまで一軸の縦方向の張力を加えた[文献12]。平らなダンベル（20 mm）形の試験片に、インストロン5565を使用して、100mm/分の一定の引張速度で一軸張力を加えた。サンプルの厚さを、ダンベルの3箇所でデジタル電子マイクロメーター（RS components、米国）を使用して測定し、平均した。
走査電子顕微鏡（SEM）
サンプルを、0.1 Mリン酸緩衝液中の2.5％グルタルアルデヒド（Sigma、UK）で固定し、4℃で24時間放置した。走査電子顕微鏡（SEM）は文献14に記載のとおり操作した。
【００４１】
細胞生存率、数、代謝活性の確認
細胞生存率は、当技術分野で周知の方法に従って導き出せばよく、例えば、米国特許第6638709号に記載されている。これには、「構成細胞密度（単位面積あたりの生細胞の総数）」、「細胞生存率（生存可能な細胞の総数の割合）」及び「代謝活性（栄養素を代謝し、他の細胞維持機能を実行する能力の観点から見た、生細胞の全体的な活力の尺度）」の評価が含まれる。追加的測定には、構造体内及び構造体上の細胞の存在、配置及び分布についての、細胞化された構造体の組織学的検査が含まれる。
簡単に言えば、構造体から細胞を取り出し、トリパンブルー色素排除を使用して血球計により、死細胞と生細胞を区別して、細胞生存率と細胞数を測定することができる。
代謝活性は、Alamar Blue色素と共にインキュベートしたサンプルを使用して測定してもよい。このアッセイでは、細胞のミトコンドリアに拡散する非細胞毒性のアラマーブルー色素を使用してミトコンドリアの活性を測定し、酸化還元反応を受けて蛍光生成物が得られるので、これを蛍光分光光度計で読み取る。代謝活性は、MTTアッセイを使用して測定してもよい。黄色のMTT（3-（4、5-ジメチルチアゾリル-2）-2、5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）は、デヒドロゲナーゼ酵素の作用により代謝的に活性な細胞によって還元され、NADHやNADPHなどの還元等価物を生成し、紫色のホルマザンを生成するので、これを可溶化して、分光測光法で定量する。このようにして、MTTアッセイを使用して細胞の生存率を測定することができる。
細胞生存率は、また、アポトーシスのマーカーを検出するアッセイ（例えば、カスパーゼ-3アッセイ）を使用して測定することもできる。例示的なカスパーゼ-3アッセイは、この実施例に記載されている。
組織学的検査は、その中の構造体と細胞の構造及び形態の視覚的評価を必要とする（本明細書の実施例を参照されたい）。
【００４２】
IVISイメージング：
レンチウイルスの産生
レンチウイルストランスファーベクターpHIV-LUC-ZsGreen（図２Ａで使用した）は、ブライアン・ウェルム博士（ユタ大学外科部）から、Addgene Inc.（MA, USA）を介して購入した（Plasmid #39196）。これを使用して、ZsGreen蛍光タンパク質とEF1-alphaプロモーター由来のホタルルシフェラーゼの両方を含むレンチウイルスを生成した。この第３世代のレンチウイルスは、パッケージングプラスミド(Addgene Plasmid # 12253) 及び pMDLg/pRRE (Addgene # 12251)並びに VSV-G envelope plasmid pMD2.G. (Addgene Plasmid # 12259)を必要とした。
簡潔に言うと、上記複数のプラスミドで293T細胞を同時トランスフェクトすることにより、レンチウイルスベクターを作成した。プラスミドのトランスフェクションは、メーカーの指示に従ってjetPEI／プラスミドミックスを使用した293T細胞内で行った。37℃で6時間後、ウイルス収集のため培地（ウシ胎児血清(FBS)を10％含むDMEM：Gibco、英国）を交換した。24時間後、このウイルスを含有する培地を2500rpmの遠心分離により精製し（4℃）、0.45μm膜で濾過した。培地を4℃で50,000gで2時間超遠心分離した（SW28ローター、Optima LE80K Ultracentrifuge, Beckham, High Wycombe,英国）。このウイルスペレットを100μlの予冷した無血清DMEM（Gibco、英国）に再懸濁し、使用するまでこのウイルスを-80℃で保存した。
【００４３】
ウイルス力価は、ウイルス形質導入を許容することが知られている細胞株であるHeLa細胞における形質導入効率によって計算した。HeLa細胞は完全なDMEMで拡大した。細胞を、24ウェルプレートにウェルあたり5x104細胞で播種した。20μl/mlウイルスから0.0032μl/mlウイルスの希釈系列（1：5）を、ウェルあたり合計500μlの容量で、作成した。細胞を一晩培養し、翌日に新鮮な培地に交換した。
トランスフェクションの効率は、フローサイトメトリー分析による、トランスフェクションの72時間後に蛍光タンパク質ZsGreenを発現する細胞の割合から、決定した。
ウイルス力価は次式で計算される。
【数１】
2020521483.tif 000002
ウイルス力価は、形質導入効率15〜25％で細胞を形質導入するために使用されるウイルスの容積から計算された。
【００４４】
間質細胞のレンチウイルス形質導入及びフローサイトメトリー(FACS)選別
筋肉由来の間質細胞に上記のようにレンチウイルスを形質導入したが、T25フラスコに合わせて調整し、感染効率(MOI)を増加させて試験した。形質導入効率を、形質導入された細胞の割合としてフローサイトメトリー(FACS)により決定した。形質導入された細胞の純粋な集団を得るために、1回パスによる細胞の拡大後に細胞をFACS選別した。簡単に説明すると、細胞をトリプシン処理し、遠心分離し、1x106個の細胞を500μlのFACSバッファーに再懸濁し、FACSAria（BD Biosciences）を使用して選別した。選別された細胞をさらにパスして拡大し、フローサイトメトリーでチェックして、形質導入細胞の純粋な集団が維持され、以後の実験に使用されることを確認した。
【００４５】
バイオリアクター中の生物発光イメージング
150μg/ml D-ルシフェリンを含む培地を、3ウェイルアータップを介してバイオリアクターの内部チャンバーに注入し、上記のように画像化した。このバイオリアクターをステージ上に置き、画像化した。リアクター全体のズームした画像を得るためにステージDを使用し、他のすべての画像と分析にステージCを使用した。
その他の材料
メガセル(R)培地は、ウシ胎児血清(FBS)5％、ペニシリンストレプトマイシン1％、L-グルタミン1％、非必須アミノ酸1％、ベータメルカプトエタノール0.1mM及び線維芽細胞成長因子(塩基性)(FGF)5ng/mlを含む。
凍結保存のために、培地組成は、ウシ胎児血清（FBS）50％、サプリメント（上記）を含むメガセル(R)培地40％、及びジメチルスルホキシド（DMSO、Me2SO; Sigma、英国）10％であった。
「Mr Frosty」（Nalgene）冷凍コンテナを使用して、ゆっくりとした冷却を実現した。Nalgene凍結容器を、-80℃で一晩保管した。
【００４６】
実施例２  −  食道
ラット脱細胞化食道に、ヒト中胚葉血管芽細胞（MABs）、マウス線維芽細胞（FB）及びマウス神経冠細胞を播種したものを、バイオリアクター中で11日間培養し、以下のプロトコルで凍結した：
−播種した足場（サイズ7÷20mmの長さ）をウシ胎児血清(FBS) 500μLと共に凍結保存バイアル（サイズ：2mL）に入れた。
−このバイアルは、このプロセス全体を通して氷中で保持された。
−DMSO20％を含むメガセル(R)培地の溶液をさらに500μL加えた。
−このバイアルをナルゲン(Nalgene)凍結容器に移し、-80℃で一晩保持した。
−次に、サンプルを液体窒素の気相中に入れ、約-160℃で保管した。
−液体窒素の容器中で2〜4週間保存した後、バイアルを37℃で急速に解凍し、サンプルを10〜20mLの培地（ウシ胎児血清(FBS)と抗生物質を添加したメガセル(R)培地）に、37℃で20分間穏やかに撹拌しながら、移した。
−その後、サンプルを新鮮な培地を含む培養ペトリ皿に移し、最大7日間静置培養した。
【００４７】
細胞の生存率と局在を、生物発光と組織学的検査で確認した。ヒト中胚葉血管芽細胞（MABs）単独播種、又はヒト中胚葉血管芽細胞（MABs）とマウス線維芽細胞（FB）の共播種のいずれかをした足場は、凍結後に同等の生存率を示し、凍結保存の前後にIVISの放射輝度を測定した（図２Ａ、Ｂ）。細胞が解凍後すぐに成長していることは明らかであり、凍結保存後の14日間の培養中、播種した足場から放出される生物発光は連続的に増加した。培養の最後に、足場を組織学的検査で分析したところ、細胞の存在を確認し、食道筋層の正しい局在化を確認した。これらの結果は、播種された細胞の種類に関わらず凍結保存後に細胞が生存していることだけでなく、解凍後に完全に成長する能力があることをも示した。
足場内の細胞分化と配向を、更にhNucleiとGFPの免疫染色で評価した（図２Ｃ）。ヒト中胚葉血管芽細胞（MABs）、マウス線維芽細胞（FB）及びGFP+神経冠細胞の組み合わせを共播種した足場を動的条件で11日間培養し、14日間凍結保存し、解凍してさらに7日間培養した。免疫蛍光イメージングにより、凍結保存後に細胞の配向、GFP+神経冠細胞の形態、及び細胞間相互作用が保存されることが示され、凍結保存されていない足場に匹敵する結果を得た。
【００４８】
実施例３  −  肝臓
ヒト脱細胞化肝臓キューブ（5x5x5mm）又はヒト脱細胞化肝臓由来ヒドロゲルキューブ（5x5x5mm）にHepG2細胞株を播種し、10日間静置培養し、以下のプロトコルで凍結した。
−播種した足場をウシ胎児血清(FBS) 500μLの凍結保存バイアル（2mL）に入れた。
−このバイアルは、このプロセス全体を通して氷中で保持された。
−DMSO20％を含むアルファMEM溶液をさらに500μL加えた。
−このバイアルをナルゲン(Nalgene)凍結容器に移し、-80℃で一晩保持した。
−次に、サンプルを液体窒素の気相中に入れ、約-160℃で保管した。
−液体窒素の容器中で2週間保存した後、バイアルを37℃で急速に解凍し、サンプルを5〜10 mLの培地（ウシ胎児血清(FBS) 10％、抗生物質1％、1mMピルビン酸ナトリウム1％、非必須アミノ酸溶液(100X）1％を含むアルファMEM)に、37℃で20分間穏やかに撹拌しながら、移した。
−次に、サンプルを新鮮な培地を含む培養ペトリ皿に移し、3日間静置培養した。
その後の分析は、細胞が凍結を生き延び、凍結前のサンプルと同等のアルブミン産生を示すことを示した。
【００４９】
アルブミン測定は、Abcamの血清アルブミン（ALB）インビトロSimpleStepELISA(R)（酵素結合免疫吸着アッセイ）キットを使用して実施した。これは、ヒト血清及び血漿中の血清アルブミンタンパク質の定量測定用に設計されている。
SimpleStepELISA(R)は、アフィニティータグでラベル付けされた捕捉抗体と、溶液中のサンプル検体を免疫捕捉するレポーター結合検出抗体を使用する。この複合体全体（捕捉抗体/分析物/検出抗体）は、ウェルを覆う抗タグ抗体の免疫親和性を介して固定される。このアッセイを行うには、サンプル又は標準液をウェルに添加し、その後に抗体ミックスを添加する。インキュベーション後、ウェルを洗浄して未結合の物質を除去する。TMB基質を追加し、インキュベーション中にHRPによって触媒され、青色に変色する。その後、Stop Solutionを追加することにより、この反応を停止する（青色から黄色への色の変化で完了する。）。シグナルは、結合した検体の量に比例して生成され、強度は450 nmで測定される。任意に、エンドポイントの読み取りの代わりに、TMBの成長を600 nmで速度論的に記録できる。
【００５０】
実施例４  −  保存後の細胞生存率の維持
開発されたプロトコルを使用して調製され凍結保存された足場の凍結保存後の細胞生存率の維持をさらに実証するために、一つの実験を計画した。
Luc+ZsGreen+ヒト中胚葉血管芽細胞（MABs）＋マウス線維芽細胞（FB）を播種した食道足場を静的な条件で培養し、その後、実施例2に記載したのと同じ方法で2週間凍結保存した。保存後、サンプルを解凍し、静的培養で７日間成長させた。生物発光（図４Ａ、Ｃ）及びMTTアッセイ（図４Ｂ）を使用して、凍結保存の前後のさまざまな段階で、細胞生存率を測定した。
培養7日後、免疫蛍光法を使用して、カスパーゼ3陽性（カスパーゼ3+）細胞の数を測定した。組織サンプルをパラホルムアルデヒドで固定し、凍結した。厚さ7〜10μmの切片をクリオスタットで切断し、1％ヤギ血清/PBS/0.01% Triton X-100で希釈した一次及び二次抗体とともにインキュベートした。Zeiss LSM 710共焦点顕微鏡（Zeiss）で画像を取得し、ImageJとAdobe(R) Photoshopを使用して処理した。足場の異なる領域のランダムな断面におけるDAPI+細胞の総数に対するカスパーゼ3+細胞の数を、手動の細胞計数により、計算した。
その結果、徐冷プロセスで凍結保存された生体工学処理された筋肉は、保存後の細胞生存率を維持していることを示した。解凍後、凍結保存前と比較して、足場の細胞生存率はわずかに低下した。しかし、細胞が静止培養で7日までに回復し成長することができることが、生物発光の読み取りとMTTアッセイで確認された（図４）。7日間の培養後、凍結保存された足場で非常に少ないカスパーゼ3+細胞（<0.1％）が見つかった（データは示さない）。
【００５１】
参考文献
１．Atala A. Engineering tissues, organs and cells. J Tissue Eng Regen Med 2007;1:83-96. pmid:18038397 doi: 10.1002/term.18.
２．Orens JB, Garrity ER. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc 2009;6:13-9. doi: 10.1513/pats.200807-072GO. pmid:19131526.
３．Orlando G, Wood KJ, De Coppi P, Baptista PM, Binder KW, Bitar KN, et al. Regenerative medicine as applied to general surgery. Ann Surg 2012;255:867-80. 
４．Maghsoudlou P, Urbani L, De Coppi P. Organ bioengineering for the newborn. Semin Pediatr Surg. 2014 Oct;23(5):314-23. 
５．Elliott MJ, De Coppi P, Speggiorin S, Roebuck D, Butler CR, Samuel E, et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet 2012;380:994-1000. doi: 10.1016/S0140-6736(12)60737-5. pmid:22841419.
６．Totonelli G, Maghsoudlou P, Garriboli M, Riegler J, Orlando G, et al. (2012) A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials 33: 3401-3410.
７．Totonelli G, Maghsoudlou P, Georgiades F, Garriboli M, Koshy K, et al. (2013) Detergent enzymatic treatment for the development of a natural acellular matrix for oesophageal regeneration. Pediatr Surg Int 29: 87-95.
８．Maghsoudlou P, Georgiades F, Tyraskis A, Totonelli G, Loukogeorgakis SP, et al. (2013) Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment. Biomaterials 34: 6638-6648.
９．Fishman JM, Lowdell MW, Urbani L et al. Immunomodulatory effect of a decellularized skeletal muscle scaffold in a discordant xenotransplantation model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 110, no. 35, pp. 14360-14365, 2013.
１０．Badylak SF, Taylor D, Uygun K. Whole-Organ Tissue Engineering: Decellularization and Recellularization of Three-Dimensional Matrix Scaffolds. Annual Reviews; 2011 Jul 14; 
１１．Maghsoudlou P, Totonelli G, Loukogeorgakis SP, Eaton S, De Coppi P. A decellularization methodology for the production of a natural acellular intestinal matrix. J Vis Exp. 2013 Jan;(80). 
１２．Totonelli G, Maghsoudlou P, Garriboli M, Riegler J, Orlando G, Burns AJ, et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 2012 Apr;33(12):3401-10. 
１３．[削除]
１４．Maghsoudlou P, Georgiades F, Tyraskis A, Totonelli G, Loukogeorgakis SP, Orlando G, et al. Preservation of micro-architecture and angiogenic potential in a pulmonary acellular matrix obtained using intermittent intra-tracheal flow of detergent enzymatic treatment. Biomaterials. 2013 Sep;34(28):6638-48. 
１５．Piccoli M, Urbani L, Alvarez-Fallas ME, Franzin C, Dedja A, Bertin E, et al. Improvement of diaphragmatic performance through orthotopic application of decellularized extracellular matrix patch. Biomaterials. 2016 Jan;74:245-55.
１６．Hamilton NJ, Kanani M, Roebuck DJ, Hewitt RJ, Cetto R, Culme-Seymour EJ, Toll E, Bates AJ, Comerford AP, McLaren CA, Butler CR, Crowley C, McIntyre D, Sebire NJ, Janes SM, O'Callaghan C, Mason C, De Coppi P, Lowdell MW, Elliott MJ, Birchall MA. Tissue-Engineered Tracheal Replacement in a Child: A 4-Year Follow-Up Study. Am J Transplant. 2015 Oct;15(10):2750-7.
１７．韓国特許出願公開KR 1020140037677 A
１８．韓国特許出願公開KR 1020140112465 A
１９．国際公開WO 2015/151047 A1
２０．ヨーロッパ特許出願公開EP 2885969 A1
２１．国際公開WO 99/38952 A2
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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