(57)【要約】  本発明は、ＤＮＡアレイ等を用いた核酸配列解析系における、解析可能数を増大させることを目的とする。本発明の核酸配列解析を行う方法は、検出対象核酸を捕獲するためのプローブ核酸と検出対象との間に第一のハイブリッドを形成しておき、そのハイブリッドに対して、別個の標識済配列解析用プローブ核酸を接触して第二のハイブリッドを形成し、その完全マッチしたハイブリッド中のシグナルを選択的に測定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対象核酸の一部に対して相補的な配列を有するプローブ核酸に接触して第１ハイブリッドを形成する工程；
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び/又は未反応の上記検出対象核酸を、第１ハイブリッドから分離する工程；
上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダイズする領域とは異なる領域に対して、当該第１ハイブリッドのTm値よりも有意に低いTm値でハイブリダイズする標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第１ハイブリッドに接触して第２ハイブリッドを形成する工程；
上記第１ハイブリッド及び上記第２ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含まれる未反応核酸から分離する工程；
上記複合体中の標識からのシグナルを測定する工程；
を含む、核酸配列解析を行う方法。
【請求項２】
前記標識済配列解析用プローブ核酸が、少なくともその一部において互いに異なる塩基を有し、それぞれ識別可能な異なった標識を有する複数のプローブ核酸群である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出対象核酸を他の標識と識別可能な別個の標識によって標識し、当該別個の標識に基づき前記第１ハイブリッドの量を測定する工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
上記標的核酸中に存在する、重なり合わない二以上の領域に対してそれぞれ相補的な二群以上の標識済配列解析用プローブ核酸群を、上記第２ハイブリッドを形成する工程において使用する、請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
上記第１ハイブリッドの量を基にして、検出された標識の量の補正を行う工程を更に含む、請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記シグナルを測定する工程が、カイネティックなデータ取得により行われる、請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダイズに影響しないようにして予め担体表面に固相化しておき、前記第１ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合体と未反応核酸との分離を、当該担体表面の洗浄により行う、請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダイズに影響しないようにして予め磁気ビーズと接合しておき、前記第１ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合体と未反応核酸との分離が、反応系に磁場をかけることにより行われる、請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
上記担体がマイクロアレイである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
上記プローブ核酸を複数種類からなるものとし、同一又は別個のスポット上に固相化されている、請求項７又は９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸配列を解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡアレイを利用して塩基配列を決定する方法としてシーケンシング・バイ・ハイブリダイゼーション法（Sequencing by Hybridization: SBH）が知られている（特許文献１）。ＳＢＨ法は、ある長さのオリゴヌクレオチドを構成する、ヌクレオチドの可能な組合せ配列の全てからなるものの各配列を基板上に並べ、検体ＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応によって形成される完全に相補的なハイブリッドを選択的に検出することで配列を決定するものである。【０００３】
ＳＢＨ法に限らず、一般にオリゴヌクレオチドプローブと検体ＤＮＡの相補性を調べる場合には、ひとつの塩基について１種類のプローブのみでハイブリッドの有無を判定してその塩基を決定することは非常に難しい。理由の一つにはハイブリッドの安定性自体がそれぞれの配列に依存して変動するものであることが挙げられる。また特定の測定結果が得られれば完全に相補的なハイブリッドが形成されていると判断できるような「測定値の絶対値」というものが存在しないためでもある。【０００４】
そこで、完全マッチのハイブリッド体と、完全マッチのものより幾分強度が弱くなる１塩基のミスマッチを含むハイブリッド体のシグナル強度を比較して判定する方法が開発されている（非特許文献１）。この方法では、１５ｍｅｒのオリゴヌクレオチドのプローブ配列の中心部分に１塩基ミスマッチを配した１塩基ミスマッチプローブを用意し、完全マッチプローブと１塩基ミスマッチプローブのそれぞれが検体ＤＮＡとの間で形成するハイブリッドからのシグナル強度を測定・比較し、完全マッチの方が強度が強いときにその完全マッチプローブに相補的な配列が検体ＤＮＡ中に存在すると判定している。【０００５】
また、複数の蛍光色素を用いた解析例として、特許文献２に記載の方法が知られている。この文献に記載の方法においては、細胞から得た核酸の集団に対しそれぞれ異なった蛍光色素を用いて測定を行い、発現プロファイルやゲノムＤＮＡの比較解析を行っている。この例においては細胞間の発現解析を行うのみであり、温度やハイブリダイゼーションバッファーの組成や種類などを一定条件にしている。
【特許文献１】米国特許第５,２０２,２３１号明細書
【特許文献２】欧州特許第０８３４５７６Ｂ１号明細書
【非特許文献１】チーら（Chee M. et al.）、「サイエンス」（”Science”）、（米国）、１９９６年、２７４巻、ｐｐ.６１０-６１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＳＢＨ法やマイクロアレイにおいて多数の１塩基置換を検出する場合には、１塩基ずつ異なった全ての種類の配列をスポットする必要がある。アレイの作成において、固相化するプローブを製造して、これを個々のスポットに固相化するのに必要なコストはアレイ全体の製造コストの中で非常に大きい割合を占める。例えば１０箇所のSNPを検出する場合には、最低でも２０（１０SNPサイトｘ2タイプ）のプローブを製造して担体へスポットする必要がある。そのため、一枚のアレイにおいて解析することができる変異の数には限界が存在している。このような限界に鑑みて、解析の効率性を高めるためにアレイのスポット密度を増やし、各アレイの解析能力を向上させることが望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は斯かる事情に鑑みてなされたものであり、配列解析において必要となる、単位解析項目数当たりのスポット数を減らし、アレイ上での全解析項目数を増やすことによって、実験系のコストを削減する手段を提供するものである。【０００８】
本発明は以下のような構成をとる。
（１）本発明の核酸配列解析方法は、検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対象核酸の一部に対して相補的な配列を有するプローブ核酸に接触して第１ハイブリッドを形成する工程；
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び/又は未反応の上記検出対象核酸を、第１ハイブリッドから分離する工程；
上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダイズする領域とは異なる領域に対して、当該第１ハイブリッドのTm値よりも有意に低いTm値でハイブリダイズする標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第１ハイブリッドに接触して第２ハイブリッドを形成する工程；
上記第１ハイブリッド及び上記第２ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含まれる未反応核酸から分離する工程；
上記複合体中の標識からのシグナルを測定する工程；
を含むものである。【０００９】
（２）本発明の核酸配列解析方法では上記（１）の方法において、前記標識済配列解析用プローブ核酸を、少なくともその一部において互いに異なる塩基を有し、それぞれ識別可能な異なった標識を有する複数のプローブ核酸群とすることができる。
（３）また本発明の核酸配列解析方法では上記（１）及び（２）の方法において、前記検出対象核酸を他の標識と識別可能な別個の標識によって標識し、当該別個の標識に基づき前記第１ハイブリッドの量を測定する工程を更に含めることも可能である。【００１０】
（４）本発明の核酸配列解析方法では上記（１）〜（３）の方法において、上記標的核酸中に存在する、重なり合わない二以上の領域に対してそれぞれ相補的な二群以上の標識済配列解析用プローブ核酸群を、上記第２ハイブリッドを形成する工程において使用してもよい。
（５）また本発明の核酸配列解析方法では上記（１）〜（４）の方法において、上記第１ハイブリッドの量を基にして、検出された標識の量の補正を行う工程を更に含めることができる。
（６）本発明の核酸配列解析方法では上記（１）〜（５）の方法において、前記シグナルを測定する工程を、カイネティックなデータ取得により行うことも可能である。【００１１】
（７）更に本発明の核酸配列解析方法では上記（１）〜（６）の方法において、上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダイズに影響しないようにして予め担体表面に固相化しておき、前記第１ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合体と未反応核酸との分離を、当該担体表面の洗浄により行うことが可能である。
（８）また、本発明の核酸配列解析方法では上記（１）〜（６）の方法において、上記プローブ核酸を、検出対象核酸とのハイブリダイズに影響しないようにして予め磁気ビーズと接合しておき、前記第１ハイブリッドと未反応核酸との分離、及び前記複合体と未反応核酸との分離を、反応系に磁場をかけることにより行うことも可能である。【００１２】
（９）本発明の核酸配列解析方法では上記（７）の方法において、上記担体としてマイクロアレイを使用することが好ましい。
（１０）また、本発明の核酸配列解析方法では上記（７）又は（９）の方法において、上記プローブ核酸を複数種類からなるものとし、同一又は別個のスポット上に固相化することが可能である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の方法においては、形成された第１ハイブリッドの量を測定することにより、注目している遺伝子の発現量を定量することが可能となり、第１ハイブリッドの形成に引き続いて同一実験系にて形成される第２ハイブリッドの量を測定することにより、当該発現遺伝子中の配列種についての情報をあわせて取得することが可能になる。従来の方法では、遺伝子の発現についての解析と、発現した遺伝子中の配列情報の解析は、それぞれ別個のアレイにおいて行われていたが、本発明においては両者を同一実験系にて短時間で行うことが可能となっている。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核酸を捕獲して第１ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
【図１Ｂ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、図１Ａの第１ハイブリッドの形成後に、二つの標識済配列解析用プローブ核酸を当該第１ハイブリッドに接触させる工程を示すものである。
【図１Ｃ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、図１Ｂの接触工程の結果形成される第２ハイブリッドの状態を示すものである。
【図２Ａ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中にスプライシングバリアントが複数含まれる場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核酸を捕獲して第１ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
【図２Ｂ】この図は図２Ａで形成された第１ハイブリッドに対して、二つの標識済配列解析用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
【図２Ｃ】この図は図２Ｂの工程の結果形成される第２ハイブリッドの状態を示すものである。
【図３】この図は、スプライシングバリアントを説明する図である。
【図４Ａ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中に二つの挿入変異が存在する場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核酸を捕獲して第１ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
【図４Ｂ】この図は図４Ａで形成された第１ハイブリッドに対して、二つの標識済配列解析用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
【図４Ｃ】この図は図４Ｂの工程の結果形成される第２ハイブリッドの状態を示すものである。
【図５Ａ】この図は本発明の核酸配列解析方法において、検出対象核酸中に複数の変異が存在する場合に、担体上に固相化されたプローブ核酸により検出対象核酸を捕獲して第１ハイブリッドを形成する工程を示すものである。
【図５Ｂ】この図は図５Ａで形成された第１ハイブリッドに対して、４つの標識済配列解析用プローブ核酸を接触させる工程を示すものである。
【図５Ｃ】この図は図５Ｂの工程の結果形成される第２ハイブリッドにおけるハイブリッド部分の状態を示すものである。
【図６】この図は、実施例１の実験結果を示すものである。
【図７】この図は、実施例２の実験結果を示すものである。
【符号の説明】
【００１５】
１・・・担体、２・・・プローブ核酸Ａ、３・・・検出対象核酸、３’・・・検出対象核酸（スプライシングバリアント＃１）、３”・・・検出対象核酸（スプライシングバリアント＃２）、４・・・プローブ核酸Ｂ、５・・・プローブ核酸Ｃ、６・・・プローブ核酸Ｄ、７・・・プローブ核酸Ｅ、８・・・第1ハイブリッド、９・・・第２ハイブリッド、１０・・・蛍光物質Ａ、１１・・・蛍光物質Ｂ、１２・・・蛍光物質Ｃ、１３・・・蛍光物質Ｄ、２０・・・塩基Ａ、２１・・・塩基Ａと相補的な塩基、２２・・・塩基Ａと非相補的な塩基、２３・・・相補的塩基対、２４・・・挿入変異Ａ、２５・・・挿入変異Ｂ、３０・・・塩基Ｂ、３１・・・塩基Ｂと相補的な塩基、４０・・・塩基Ｃ、４１・・・塩基Ｃと相補的な塩基、５０・・・塩基Ｄ、５１・・・塩基Ｄと相補的な塩基
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（定義）
本願明細書においては、以下の用語を以下に定義した意味において用いる。
「核酸」とは、ＤＮＡ、人工的ヌクレオチドを含むＤＮＡ、ＲＮＡ、及び人工的ヌクレオチドを含むＲＮＡ、ＰＮＡ、人工ヌクレオチドを含むＰＮＡの何れをも意味する。
「ハイブリッド」とは、上記の核酸の何れかの間に形成される二重鎖を意味する。
「シグナル」とは、適当な手段により適宜検出・測定可能な信号であって、蛍光、放射能、化学発光等が含まれる。【００１７】
以下においては、プローブ核酸が担体に固相化されている例を本発明の一実施態様として、その構成、実施方法、効果等について、適宜図を参照しながら説明する。
本発明の核酸配列解析方法は、検出対象核酸が含まれる試料を、当該検出対象核酸の一部に対して相補的な配列を有するプローブ核酸に接触して第１ハイブリッドを形成する工程（１）；
適宜、未反応の上記プローブ核酸及び未反応の上記検出対象核酸を、第１ハイブリッドから分離する工程（２）；
上記プローブ核酸が上記検出対象核酸にハイブリダイズする領域とは異なる領域に対して、当該第１ハイブリッドのTm値よりも有意に低いTm値でハイブリダイズする標識済配列解析用プローブ核酸を、上記第１ハイブリッドに接触して第２ハイブリッドを形成する工程（３）；
上記第１ハイブリッド及び上記第２ハイブリッドからなる複合体を、反応系全体に含まれる未反応核酸から分離する工程（４）；
上記複合体中の標識からのシグナルを測定する工程（５）；
を含んでいる。【００１８】
上記工程（１）においては（図１Ａ参照）、予め検出対象核酸３の特定部位に相補的な配列を有するプローブ核酸２を当該技術分野において知られる方法において担体１に固相化しておいたものに対し、検出対象核酸３を接触する操作をまず行う。ここで使用するプローブ核酸２の配列は検出対象核酸３を捕獲するために行うものであるため、検出対象核酸３の検出対象部位の配列に対して相補的なものであり、検出対象核酸３とプローブ核酸２との間に非特異的な二本鎖が形成されないことが望ましい。より好ましくは両者は完全に相補的である。検出対象核酸３が含まれる試料が例えば特定の遺伝子を含むＤＮＡである場合、使用するプローブ核酸２は、当該遺伝子中の不変部分に対して相補的であることが好ましい。即ち試料中の検出対象核酸３に多型や変異が存在すると考えられる場合には、そのような多型を構成したり、変異を含んでいない領域（採取した試料の種類によって影響を受けないと考えられている領域）に対して相補的な配列を有するプローブ核酸を利用することが望ましい。【００１９】
検出対象核酸３とプローブ核酸２との間の接触は、検出対象核酸３中に特定領域が含まれる場合に、当該プローブ核酸との間で完全にマッチしたハイブリッド（第１ハイブリッド７）のみが形成される条件において行う。より具体的には、接触を行う際の温度、塩濃度、ｐＨなどを当該技術分野で公知の基準に基づいて決定するか、または予備実験を行って最適な条件を検討しておくことが望ましい。【００２０】
検出対象核酸３を予め標識１０（例えば蛍光物質）により標識しておいてもよく、その場合には標識１０を検出することにより、試料中の検出対象核酸の量を推定することが可能になり、発現頻度解析を行うことが可能になる。また逆に、担体に固相化したプローブ核酸の量を推定することも可能であり、以下の工程（５）のシグナル値の補正に供することが可能となり、測定精度の上昇に寄与することができる。【００２１】
更には、検出対象核酸３が、選択的スプライシングが起こる可能性がある遺伝子である場合には（図２Ａ-Ｃ、図３参照）、配列の異なる検出対象核酸３’、３”（配列の異なったＲＮＡ分子；図２Ａ-Ｃ中、配列ｂ及び配列ｃを含む検出対象核酸３”と、配列ｂを含まず配列ｃを含む検出対象核酸３’とが存在している）の発現量解析を同時に行うことができる。図２Ａ-Ｃに示される例の場合、選択的なスプライシング（図３）が起こっても変化しない配列（配列a）の一部に相補的なものを、第一のハイブリッドを形成されるプローブに用い、この配列と相補的な配列を一部に持つ検出対象核酸３を捉える（図２Ａ）。次に、配列ｂと配列ｃに対応したプローブ核酸４、５とハイブリッドを形成させて（図２Ｂ）、それぞれの選択的スプライシングによって異なってくる配列部位を検出する（図２Ｃ）ことによって、各スプライスバリアントの核酸量を解析することが可能になる。【００２２】
上記工程（１）に引き続き、ハイブリッドを形成するに至らなかった未反応検出対象核酸３をハイブリダイゼーション反応系から除去するため、ハイブリダイゼーション反応後の担体１の表面を洗浄する工程（２）を適宜行う（図１Ａ-Ｃに戻る）。この工程はオプションであり、行わない場合には以下の工程（４）における洗浄により実施してもよいが、第２ハイブリッド９の形成をより好ましい条件下で行うためには、工程（２）を行い、未反応の検出対象核酸３を除去しておくことが望ましい。洗浄に使用する溶液は、第１ハイブリッド８が解離しないような組成の溶液を、同じく第１ハイブリッド８が解離しないような条件において使用する。一般的にはハイブリッド形成反応を行った試料溶液に検出対象核酸を含めていないものを利用して、ハイブリッド反応よりも高くなく、非特異的結合がプローブ核酸と検出対象核酸との間に形成されない温度で洗浄を行う。【００２３】
次に、プローブ核酸２（図１Ｂ参照）が検出対象核酸３にハイブリダイズする領域とは異なる領域に対し、上記第１ハイブリッド８のTm値よりも有意に低いTm値でハイブリダイズする標識済配列解析用プローブ核酸５を含んだ標識済配列解析用プローブ核酸４及び５を、上記第１ハイブリッド８に接触する。これにより第２ハイブリッド９を形成する工程を行う。このハイブリッド形成は、標識済配列解析用プローブ核酸４のみが検出対象核酸３とハイブリダイズする条件において行われ、両プローブ間で競合が生じる。図１Ｂにおいて示されるプローブ核酸４及び５は、標識１１、１２を有し、検出対象核酸中の塩基２０に対して相補的な塩基２１、又は塩基２１とは異なる塩基２２をそれぞれ有している。ここで標識１１、１２は、互いに識別できるものである必要がある。標識としては、使用する測定系において検出可能なものであれば特にその制限はないが、より具体的には蛍光物質を利用することが可能である。蛍光物質としては、ＦＩＴＣ、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド等の蛍光色素や、蛍光ガラスの粒子などを挙げることができるが、これ以外のものも利用することが可能である。更に蛍光物質以外の標識としては、金や銀等の種々の金属のコロイド粒子や、ラテックス等の樹脂、半導体、ガラス等の誘電体のコロイド粒子を用いることも可能である。【００２４】
図１Ｃは、第１ハイブリッド８に引き続き、第２ハイブリッド９が形成された状態を示すものである。ハイブリダイゼーション反応は、完全マッチのみが形成される条件下で行っているため、検出対象核酸３中の特定領域と完全にマッチする配列を有するプローブ核酸４のみが検出対象核酸３と第２ハイブリッドを形成しており、当該特定領域とは完全にはマッチしないプローブ核酸５、及び余剰のプローブ核酸４が、第２ハイブリッド９外に存在している。第２ハイブリッドは、検出対象核酸中の塩基２０とプローブ核酸４中の塩基２１が互いに相補的であり、塩基対２３を形成している。特に図示していないが、第２ハイブリッドは完全マッチであるため、塩基対２３以外の部分においても全て塩基対を形成している。【００２５】
次に、第１ハイブリッド８及び第２ハイブリッド９からなる複合体を、反応系全体に含まれる未反応核酸から分離する工程を行う。この工程は、上記のオプション工程と同様に、洗浄により行うことができる。洗浄に使用する溶液は、第１ハイブリッド８及び第２ハイブリッド９が解離しないような組成の溶液を使用し、同じく両ハイブリッド以外の非特異的結合が生じない条件において行う。一般的にはハイブリッド形成反応を行った試料溶液にプローブ核酸を含めていないものを利用する。【００２６】
次に上記複合体中の標識からのシグナルを測定する工程を行い、得られたデータを利用して配列の解析を行う。【００２７】
上記の例では、第１ハイブリッドの形成後に第２ハイブリッドの形成を行ったが、これとは逆に、予め液相で第２ハイブリッドの形成を行ってから、第１ハイブリッドの形成を行うことも可能である。【００２８】
図１Ｂ及び図１Ｃにおいては配列解析用プローブ核酸として２種類（完全マッチ及び不完全マッチ）を用いて、互いに競合するようなハイブリダイゼーションを行い、一ヶ所の領域の変異についての解析を行った。これはＳＮＰｓ解析において利用することができるものである。本発明は更に、例えば図４Ａ-Ｃに示されるような複数の（図４Ａ-Ｃでは二つの）挿入変異を含んでいる場合にそれぞれを同時に検出することにも応用可能となっている。【００２９】
図４Ａは、挿入変異２４及び挿入変異２５を含み、更に蛍光物質１０で標識された検出対象核酸３が、担体１に固相化されたプローブ核酸２にハイブリダイズしている状態を示している。ここに、それぞれ蛍光物質１１又は１２により標識されたプローブ核酸４及び５を接触させている（図４Ｂ）。この接触はプローブ核酸４、５と検出対象核酸３との間の完全マッチのみが生じる条件下で行う。特に図示していないが、未反応の核酸を除去すべく、担体表面の洗浄を上記のようにして行った後の状態が図４Ｃに示されている。このように本発明は、複数のプローブ核酸を使用することにより、挿入変異を同時に検出することも可能なものとなっている。ここでは挿入変異を検出する態様を示したが、その他にも欠失変異、逆位変異などの検出を行うことも同様に可能である。【００３０】
図１Ａ-Ｃ、図２Ａ-Ｃ、及び図４Ａ-Ｃにおいては、２種類の標識済配列解析用プローブ核酸を利用した基本的な例を示したが、本発明においては３種類、及び４種類の標識済配列解析用プローブ核酸を使用することもできる。それぞれの配列解析用プローブ核酸を、互いに識別可能な標識でラベルしておけば、試料中に含まれる検出対象核酸の多形の情報等について同時に検出することが可能となる。【００３１】
試料となる核酸分子の配列がヘテロである場合（heterozygousな場合、及びheterogeneousな場合）があるが、本発明はそのような場合において有効に利用することができる。例えば、哺乳類の細胞には、父系の配列と母系の配列とが存在しているから２種類の配列種が存在する場合がある。また、癌細胞の場合のように配列の多様性がある場合には、更に多くの種類の配列が混在することが考えられる。従ってこのようなヘテロな核酸分子を含む試料の変異解析を行う場合には、本発明において複数の配列解析用プローブ核酸をそれぞれ識別可能な蛍光物質などで標識して、それぞれの変異の発現頻度を調べれば試料中の配列の多様性の解析を行うことが可能である。本発明では第１ハイブリッド形成において、検出対象核酸を捕獲しているから、第２ハイブリッド中の複数種類の配列解析用プローブ核酸の標識の量比は、検出対象核酸を含んでいる試料中の配列種の存在比を忠実に反映したものとなる。従来の方法においては、各配列解析用プローブ核酸を用いた反応をそれぞれ独立したスポットにおいて利用していたため、担体表面に固相化された核酸の量についての補正を行わなければ、本発明のような配列種の存在比を求めることができなかったが、本発明では第１ハイブリッド、第２ハイブリッドの形成を行うことによりそれが可能になった。【００３２】
図５Ａ-Ｃは、試料中の検出対象核酸の配列に多様性が存在する場合に４種類のプローブ核酸を利用して解析しているものである。図５Ａは、担体１に固相化されたプローブ核酸２に対して、検出対象核酸３がハイブリダイズしている状態を示しているが、検出対象核酸３は、ある領域の特定部位において、それぞれ塩基２０、塩基３０、塩基４０、又は塩基５０の何れかを含む、多型を示すものである。この状態の第１ハイブリッドに対して、プローブ核酸４、５、６、及び７を接触させる。これらのプローブ核酸４、５、６、及び７は、それぞれ蛍光物質１０、１１、１２、又は１３により標識されていて、また、それぞれ検出対象核酸３中の塩基２０、３０、４０、又は５０に相補的な塩基２１、３１、４１、又は５１を対応する部位に含んでいる。【００３３】
図５Ｃは、検出対象核酸３と、プローブ核酸４、５、６、及び７のそれぞれの間に完全マッチによりハイブリッドが形成された状態を、ハイブリダイズ部分に関して示したものである。この図においては、塩基２０と塩基２１、塩基３０と塩基３１、塩基４０と塩基４１、及び塩基５０と塩基５１とが相補対を形成している状態が示されている（図中、同一記号の対は相補的な塩基対を示している）。このように、本発明においては、複数のプローブ核酸をそれぞれ識別可能な蛍光物質などで標識することにより、試料中の検出対象核酸に含まれる多形性を同時に検出し、更にはそれぞれの蛍光強度を比較することにより変異の頻度の解析を行うことが可能になっている。【００３４】
本発明の核酸配列解析方法においては、ハイブリッドからのシグナルを測定する際に、シグナルのデータ取得をカイネティックに行うことができる。カイネティックなデータ取得とは、検出対象核酸とプローブ核酸との間のハイブリッド形成反応の測定条件又は検出条件を変更しながら行うことを意味する。カイネティックな測定・検出を行うことにより、配列の差による影響を低減することが可能になる。カイネティックなデータ取得は、時間に関して定点ではなく、反応温度、又は反応溶液の組成、容量、若しくは種類のうちの少なくとも１つを変更しながら、測定時間を数分間から数時間程度の範囲内で行う。反応条件の変更は、段階的に又は連続的に行うこともできる。【００３５】
検出対象核酸とプローブ核酸との間のハイブリッド形成は通常、配列情報に基づいた推定の最適条件において行われるものである。従ってその条件が本当に最適条件であるかはわからないのが普通である。そのために、静的（非カイネティック）に、又は定点的に測定を行う場合には、最適ではない条件下でのデータ取得を行っている可能性がある。その結果、データの信頼性が十分ではなかったり、データのばらつきが存在したりするなどの問題が存在する。【００３６】
しかし本発明において、カイネティックなデータ取得と連動して反応条件を変更することにより、複数の反応条件でハイブリダイズ反応を進行させ、それを経時的に測定することが可能となる。従って、例えばＴｍ値など、配列固有の特性値が異なる複数種類のプローブが同一アレイ上に固相化されている場合であっても、カイネティックなデータ取得を行えば、その特性値の範囲を考慮して実験を行い、複数種類の配列の検出をほぼ同時に正確に行うことが可能となる。【００３７】
上記では、プローブ核酸を予め担体表面に固相化しておき、ハイブリッドと未反応核酸との分離を、担体表面の洗浄により行う例を挙げた。一方、本発明においてはプローブ核酸を担体表面には固相化せずに磁気ビーズに接合させ、ハイブリッドと未反応核酸からなる反応溶液に対して磁場をかけて磁気ビーズを含んだハイブリッドと、磁気ビーズを含まない未反応核酸とを分離することも可能である。この態様を利用する場合には、固相での反応を介することなく、液相で反応、測定などを行うことが可能となる。【００３８】
本発明において担体にプローブ核酸を固相化する場合には、担体としては、種々の形態のものを適用することが可能である。例えばシリコンウェハやガラスのような２次元基板、メンブレンフィルター、マイクロタイタープレート、種々のガラスビーズや樹脂ビーズ、種々の多孔質基板、種々のゲルを適用することが可能である。マイクロアレイを使用することができる。マイクロアレイ等の担体には、複数種類のプローブ核酸を、同一又は別個のスポット上に固相化することができる。第１のプローブを同一標的核酸の配列中の複数の個所から選択して、同一スポットに固相化する。次に標的核酸と第一のプローブとの間に第一のハイブリッドを形成される。第１のプローブが、１種類の時に、ハイブリダイゼーションの効率が低いと、第２のハイブリッドを形成しても十分な信号強度が得られない場合がある。しかし、第１のプローブを同一標的核酸の配列中の複数の個所から選択すると、ハイブリダイゼーションの効率を平均化することができるので、第２のハイブリッドを形成したときに十分な信号強度が得られる。
【実施例１】
【００３９】
p53ガン抑制遺伝子のCodon237における変異を解析する実験を行った。試料として、ヒトリンパ芽球腫WTK-1及び正常細胞株TK6の細胞株を利用した。WTK-1では、p53遺伝子のエクソン第7コドンの273部分がATGからATAへ変異していることが確認されている。各培養細胞株のゲノムＤＮＡを定法によって抽出し、それぞれの培養細胞のDNAをTK6=100%、TK6:WTK-1=1:1、WTK-1=100%となるように混合し、この変異部分を含む234bpを、配列番号1-2のプライマーを用いてPCR法により増幅処理した。得られた増幅ＤＮＡを、95℃で熱変性させた。10分後に急冷し、一本鎖のＤＮＡサンプルとした。一方、この増幅ＤＮＡとハイブリダイズするp53ガン抑制遺伝子検出用プローブ核酸（配列番号3-4）を合成し、多孔質の構造を有する基板上に固相化した。ハイブリダイゼーションの分析は、オリンパス（株）製のPAM マイクロアレイシステム：FD10によって行った。この実験システムは、反応フィルターの周りの溶液駆動と温度制御、および蛍光スポットの画像の記録を自動的に行うことが出来るように設計されている。直径6mmのマイクロアレイが設置された専用チャンバーの反応部分に、50μLの反応溶液を加え、溶液駆動と温度変化を与え、蛍光画像を撮像した。第1ハイブリッドの形成反応は、試料溶液をハイブリダイゼーションバッファーに3xSSPEになるように溶解し、マイクロアレイに添加後、52℃で、多孔質構造を有する核酸反応担体への出し入れを30回行うことにより実施した（駆動制御）。これらの反応で、検出対象核酸とp53ガン抑制遺伝子検出用プローブ核酸がハイブリダイズし、第一のハイブリッドが形成された。次に、Cy3で蛍光標識され、コドン273部分がATGの配列を持つp53ガン抑制遺伝子配列解析用正常型プローブ核酸（配列番号5、7）と、Cy5で蛍光標識され、コドン273部分がATAの配列を持つp53ガン抑制遺伝子配列解析用変異型プローブ核酸（配列番号6、8）を等量添加し、50℃で、配列解析用プローブ溶液の駆動を30回行った。これらの反応で、検出対象核酸とp53ガン抑制遺伝子配列解析用プローブ核酸が完全一致である場合のみハイブリダイズが生じ、完全一致ハイブリッドによる第二ハイブリッドを形成した。各蛍光色素のシグナルを検出し、得られた画像を変異検出用にプログラムした解析ソフトウエアを利用して解析しその配列の存在を推定した。【００４０】
結果を図４Ａ-Ｃに示した。本発明を利用したこの実験系においては、一つのスポット内で、2色蛍光の強度を測定・比較することにより、一塩基の違いの識別が可能であることが確認された。即ち、TK6のゲノムＤＮＡ100%の試料では、Cy3の蛍光のみがみられ、Cy5の蛍光は見られなかった。また、TK6:WTK-1 のゲノムＤＮＡを1:1に混合したの試料では、Cy3とCy5のシグナルが両方見られた。WTK-1のゲノムＤＮＡ100%の試料では、Cy5の蛍光がみられ、Cy3の蛍光は見られなかった。
【実施例２】
【００４１】
ある細胞内の一遺伝子に、点突然変異による変異型遺伝子と正常型遺伝子が存在するヘテロ接合である場合、発現しているmRNAもへテロで存在する。それらのmRNAの存在比率を解析するモデル実験を行った。発現するmRNAがヘテロであるモデルサンプルとして、ヒトリンパ芽球腫WTK-1とTK-6の細胞株を利用した。培養細胞株をTK6:WTK-1=1:1、TK6:WTK-1=0:1となるように混合し、各培養細胞株集団より、全RNAの抽出を行った。全RNA抽出は、RNA抽出キットISOGEN (ニッポンジーン)を用いてその説明書に従って行った。培養後の細胞集団を各割合で混合し、3 mLのIsogen (4M チオシアン酸グアニジウム、25mM シアン酸ナトリウム、 0.5% サルコシルサルコシル、 0.1M β-メルカプトエタノール、pH7.0)に溶解させた。20Gカテラン注射針付2.5 mL注射器で20〜30回吸出操作を行った。CHCl3を0.6 mL（Isogenの1/5量）加えて、ミキサーで15秒間混合させた後、室温で2〜3分間静置させた。4℃で15,000 rpm、15分間遠心を行った。上清を新しいチューブに移し、Ethachinmate (ニッポンジーン)3μL、イソプロパノール1.5 mL（Isogenの1/2量）を加え、転倒混和して室温で10分間静置させた。4℃で15,000rpm、15分間遠心を行い、沈殿物に75% エタノール3 mL（Isogenの等量）を加え、15,000 rpm、4℃で5分間遠心した。沈殿物を風乾もしくは2〜3分間真空乾燥させた。RNase-free蒸留水を10μL加えてRNA溶液とした。次に、p53遺伝子を検出するためのプローブ核酸（配列番号３）を合成し、多孔質の構造を有する基板上に固相化した。ハイブリダイゼーションの分析は、オリンパス（株）製のPAM マイクロアレイシステム：FD10によって行った。cDNA合成は、以下のように行った。全RNA 2-5 μgから、RNA Fluorescence Labeling Core Kit (TaKaRa)のプロトコールにそってcDNAの合成と蛍光ラベリングを行った。即ち、oligo-dTをプライマーとして、Reverse Transcriptaseを用いて逆転写し１本鎖の蛍光標識cDNAを作製した。この際、基質としてCy3-dUTPやCy5-dUTPの代わりに、Alexa Fluor 488-dUTP (Moleculer probe社製)を用い標識した。次に、キットに付属のカラムにより、このcDNAを精製し、フェノール・クロロホルム抽出による酵素類の除去とエタノール沈殿を行い、35mlの水に溶解した。これを94℃で5分の熱変性を行い、4℃に急冷後、6xSSPEバッファーと混合し、ハイブリダイゼーションサンプルとした。これをアレイに入れ、50℃で2時間ハイブリダイゼーションした。ハイブリダイゼーション後、6xSSPEバッファーで後洗浄を行い、さらにAlexa Fluor 568-dUTP (Moleculer probe)によって標識されたp53遺伝子のエクソン第7コドンの273部分がATAへ変異した配列を検出する解析用プローブ（配列番号8）とAlexa Fluor 680-dUTP (Moleculer probe)によって標識されたp53遺伝子のエクソン第7コドンの273部分がATGの正常型配列を検出する解析用プローブ（配列番号7）を添加し、さらにハイブリダイゼーションを行った。15分間のハイブリダイゼーションの後、これらの3つの蛍光色素の蛍光量を測定した。なお、配列の解析に用いたプローブの蛍光強度と分子数の関係を予め測定しておき、色素間の蛍光量から分子数を推定できるようにした。その結果、図５Ａ-Ｃのように、一つのスポット内で、3色蛍光の強度を観察することによって、遺伝子全体の発現量とそれぞれの遺伝子型の発現量を推定することができた。即ち、TK6:WTK-1=1:1としたp53遺伝子は、正常型のmRNAと変異型のmRNAがヘテロで発現しているモデルであり、正常型と変異型の発現量はほぼ１：１の割合であった。また、WTK-1のp53遺伝子は、正常型のシグナルが見られず、全て変異型の発現であった。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明の核酸配列解析方法は、遺伝子の発現解析及び変異解析を並行して行うことが可能であり、特定遺伝子の発現を調べるのみならず、その発現遺伝子中の変異の種類についての情報を迅速且つ正確に取得することが可能である。ＳＮＰｓ分析、点変異、挿入変異、欠失変異等の塩基配列解析を行うことができる。また、遺伝子の発現頻度解析を、これらの塩基配列解析と同時に行うことが可能になる。更に選択的なスプライシングが起こる可能性のある遺伝子の発現頻度解析を行っても、核スプライスバリアントの核酸量を解析することが可能となるので、タンパク質の発現量と良好な相関を持った解析が可能となる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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