(57)【要約】ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含むことを特徴とする血圧降下用組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含むことを特徴とする血圧降下用組成物。
【請求項２】
天然物由来の含有物が、魚肉乾製品を水性溶媒で抽出し、その残渣をタンパク質分解酵素で分解処理したものである請求項１に記載の血圧効果用組成物。
【請求項３】
前記魚肉乾製品が、鰹、宗田鰹、鮪または鯖由来の乾製品である請求項１または２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項４】
水性溶媒での抽出が、水性エタノールで５０℃以下で行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項５】
水性溶媒での抽出が、水で熱時行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項６】
タンパク質分解酵素での分解処理が、ペプシンによりｐＨ１．６付近で行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項７】
タンパク質分解酵素での分解処理が、トリプシンまたはキモトリプシンによりｐＨ７．０付近で行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項８】
タンパク質分解酵素での分解処理が、ペプシンによる酵素処理をｐＨ１．６付近で行った後に、トリプシンもしくはキモトリプシンまたはこれら酵素の混合物によりｐＨ７．０付近で行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項９】
タンパク質分解酵素での分解処理が、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＲもしくはプロテアーゼＳまたはこれらの酵素の組み合わせによりｐＨ３．０〜７．８で行われる請求項２に記載の血圧降下用組成物。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一つに記載の血圧降下用組成物を含む食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含む血圧降下用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】  従来、魚肉乾製品、例えば鰹節は、伝統食品として、その削った物（削り節）を食品にかけて食されたり、または出し汁用として料理に用いられている。【０００３】  このように、鰹節は、古くから料理に用いられてきたが、近年、鰹節を酵素処理して得られるオリゴペプチド類が血圧降下作用を有することが報告されている。すなわち、鰹節のアルカリプロテアーゼまたは中性プロテアーゼ分解物（特許文献１）、中性プロテアーゼまたは酸性プロテアーゼ分解物（特許文献２）、プロテアーゼ分解物（特許文献３）、サーモライシン分解物であってＰｒｏ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ骨格をもつ５〜９個のアミノ酸残基からなるペプチド、（特許文献４）および熱水可溶性成分のＰｒｏ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ骨格をもつペプチド（特許文献５）などのオリゴペプチド類が、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害活性に基づく血圧降下作用を示すことが報告されている。【０００４】  また、鰹節のサーモライシン分解物中に含まれる２〜９個のアミノ酸からなるペプチドがＡＣＥ阻害作用を有し、血圧降下作用を示すことが報告されている（非特許文献１および２）。
さらに、鰯のすり身をペプシンまたはアルカリプロテアーゼで処理して得られたイワシペプチドに含まれるＶａｌ−Ｔｙｒが、ＡＣＥ阻害活性を有しており、実際に、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）を用いた実験で血圧降下作用を有することが報告されている（非特許文献３）。
しかしながら、上記の血圧降下作用を有する物質は、何れもアミノ酸が２個以上結合した、オリゴペプチドである。【０００５】  一方、アミノ酸の１つである、アルギニンが、収縮期および拡張期において血圧降下作用を有することも報告されているが（非特許文献４）、アルギニンは、血圧降下作用を示すと共に、心拍数の増加も示している。
また、チロシンまたはＬ−トリプトファンが、ラットの腹腔内投与でそれぞれ血圧降下作用を示すことも報告されている（非特許文献５および６）。【０００６】  しかしながら、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩、あるいはこれらの含有物が経口摂取で血圧降下作用を示すことは知られていない。【０００７】
【特許文献１】特許第３１９３０８５号公報
【特許文献２】特許第３１１００７５号公報
【特許文献３】特許第３０９３３７８号公報
【特許文献４】特許第３０１２２９１号公報
【特許文献５】特許第２９２２２４７号公報
【０００８】
【非特許文献１】食品と開発  １９９２年、第２７巻、第１２号、第４３−４５頁
【非特許文献２】Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，（１９９５），Ｓｕｐｐｌ．１，Ｓ３０４−Ｓ３０５
【非特許文献３】日本栄養・食量学会誌、２０００年、第５３巻、第２号、第７７−７５頁
【非特許文献４】Ｋ．Ｈｉｓｈｉｋａｗら、「Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌ−ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎ  ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」、Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  １１、６３９、１９９３
【非特許文献５】Ａｌａｎ  Ｆ．Ｓｖｅｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７６，Ｎｏ．７，ｐｐ３５１１−３５１４，Ｊｕｌｙ  １９７９
【非特許文献６】Ａｌａｎ  Ｆ．Ｓｖｅｄら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２２１：３２９−３３３，１９８２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】  本発明は、古来、食品として広く用いられてきた魚肉乾製品としての鰹節、更に鰹節風味の調味料の製造過程で排出される鰹節の水性溶媒抽出残渣に含有されるアミノ酸の新規利用を図ることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】  本発明者らは、鰹節成分の新規用途の開発の過程で、鰹節、とりわけ鰹節の抽出物および抽出残渣中に含まれるアミノ酸の新規用途の開発を目的として鋭意研究した結果、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンおよびフェニルアラニン、それらの塩ならびに天然物由来のこれらの含有物が血圧降下作用を有することを見出した。【００１１】  したがって、本発明によれば、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含むことを特徴とする血圧降下用組成物ならびに該組成物を含む食品が提供される。
【発明の効果】
【００１２】  本発明による血圧降下用組成物は、アミノ酸の一つであるヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩、あるいは天然物由来のこれらの含有物を主たる有効成分としているため、安全に使用することができる。
その上、鰹節風味の調味料の製造過程で大量に排出される鰹節の水性溶媒抽出残渣を上記のアミノ酸の含有物として有効に利用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】  本発明の血圧降下用組成物は、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニン（以下、本発明においてアミノ酸と略する）またはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含む。【００１４】  有効成分としてのアミノ酸は、合成または発酵法により得られたものであっても、天然物由来のものであってもよい。【００１５】  合成または発酵法により得られるアミノ酸またはそれらの塩を用いる場合には、市場で入手できる食品添加物グレードのヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩、あるいはこれらの日本薬局方収載品を用いるのが好ましい。【００１６】  また、天然物由来のアミノ酸またはその含有物を用いる場合には、魚肉乾製品、例えば鰹節を水性溶媒で抽出し、その残渣をタンパク質分解酵素で分解処理したものが挙げられるが、この水性溶媒抽出残渣を用いる方法は、該抽出残渣を有効に活用できる点から、特に好ましい。【００１７】  抽出方法は特に限定されないが、通常、抽出材料に対して、１〜５０倍量（容量）程度、好ましくは２〜２０倍量程度の抽出溶媒を用いて行われる。抽出温度は、室温〜抽出溶媒の沸点程度の間で任意に設定できるが、例えば室温〜抽出溶媒の沸点程度の温度で、振盪下または還流下に行うのが好ましい。あるいは抽出材料と抽出溶媒からなる混合物を煮沸してもよい。抽出時間は、抽出を溶媒の沸点程度の温度で行う場合、５分〜数時間、好ましくは２０分〜２時間程度が適当である。このような抽出操作は、１回だけ行ってもよく、複数回繰り返し行ってもよい。【００１８】  抽出溶媒としては、水性溶媒、すなわち水または水性エタノールのような水性アルコールが挙げられる。
水性溶媒として水を用いる場合は、熱時抽出、すなわち５０℃〜１００℃の間の温度で行うのが、抽出効率がよい。
また、水性溶媒として２０〜６０％水性エタノールを用い、６０℃以下、好ましくは、２０〜５０℃で抽出すると、風味を損なわないので好ましい。
抽出溶媒として、水性アルコールを用いる場合は、抽出エキスの例えば限外ろ過法などの通常の方法による分子量１５００〜２０００を境とする低分子画分、または高分子画分のタンパク質分解酵素分解物を用いてもよい。【００１９】  なお、抽出材料としては、上記の鰹節をそのまま用いることもできるが、粉砕したものか、削り節を用いるのが抽出効率の点で好ましい。
上記の水性溶媒での抽出後に、分離した抽出残渣を、タンパク質分解酵素での分解処理に付すことができる。
その際の抽出残渣としては、鰹節風味の調味料の製造過程で大量に排出される残渣をそのまま、あるいは乾燥して用いることができる。【００２０】  該残渣からアミノ酸またはその含有物を得るのに用いられるタンパク質分解酵素としては、例えばペプシン、トリプシンまたはキモトリプシンなどの通常のタンパク質分解酵素、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のプロテアーゼＳ、ペニシリウムシトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）由来のプロテアーゼＢ、リゾプスオリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来のペプチダーゼＲまたはアルカリペプチダーゼ等が挙げられる。【００２１】  水性溶媒抽出残渣をタンパク質分解酵素で分解してアミノ酸を得る方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、タンパク質分解酵素としてペプシンを用いる場合は、鰹節の水性溶媒抽出残渣に対して４倍量の水を加えて充分ホモジナイズし、塩酸を加えて強酸性、例えばｐＨ１．６付近に調整し、ペプシンを全重量の１／１００量を加えて３７℃で５時間、ゆっくり撹拌して酵素分解に付すことができる。次いで、酵素分解後に１００℃で１０分間煮沸し、酵素を失活させて反応を終了させ、吸引ろ過によりアミノ酸に富むろ液を得ることができる。このようにして得られたろ液に、必要に応じて、例えば水酸化ナトリウムを加えてそれらの塩にすることができる。【００２２】  上記のアミノ酸に富むろ液から、公知の技術に従って、各アミノ酸またはそれらの塩を単離することもできる。
本発明におけるアミノ酸の塩とは、医薬的に許容な塩を意味する。例えば、塩酸塩のような酸との付加塩、またはナトリウム塩もしくはカリウム塩のようなアルカリ金属原子などとの塩が挙げられる。【００２３】  上記のペプシンに替えて、タンパク質分解酵素としてトリプシンやキモトリプシンまたはアルカリペプチダーゼを用いる場合は、ｐＨを各タンパク質分解酵素の至適ｐＨに調整して酵素反応を行う以外は、ペプシンの場合に準じて行うことができる。【００２４】  さらに、複数のタンパク質分解酵素を組合せる場合は、上記のペプシンによる分解を最初に行った後、先ず、この分解液に水酸化ナトリウムを加えて中性、例えばｐＨ７．０付近に調整する。次いで、トリプシンもしくはキモトリプシン、あるいは両酵素を同時に加えて酵素反応を行う以外は、上記のペプシンの場合に準じて行うことにより、アミノ酸に富む溶液を効率良く得ることができる。【００２５】  また、上記のペプシンに替えて、タンパク質分解酵素として、プロテアーゼＢ、ペプチダーゼＲまたはプロテアーゼＳを用い、ｐＨ３．０〜７．８で酵素反応を行う以外は、ペプシンの場合に準じて行うことができる。
さらに、プロテアーゼＢ、ペプチダーゼＲまたはプロテアーゼＳによる酵素反応を組み合わせて、順次、酵素反応を行うことにより、アミノ酸に富む溶液を効率良く得ることもできる。
上記のアミノ酸に富む溶液はそのまま用いてもよく、濃縮して用いてもよい。
さらに、上記の濃縮液を凍結乾燥または噴霧乾燥して固形化したものを組成物として用いてもよい。【００２６】  本発明における魚肉乾製品としては、鰹節以外に、宗田鰹、トビウオ、鰯、鮪および鯖などの魚肉の加工で得られる乾製品が代表的なものとして挙げられる。
しかしながら、天然物由来のアミノ酸またはそれらの含有物は上記のものに限定されず、該アミノ酸を含有するものであれば、本発明の有効成分として用いることができる。例えば、当該アミノ酸の含有量が特に高い大豆および緑豆なども、本発明の有効成分として用いることができるし、当該アミノ酸またはそれらの塩の含有物を得るための原料としても用いることができる。【００２７】  また、本発明において血圧効果用組成物の有効成分として用いることができる天然物由来のアミノ酸含有物としては、前記の魚肉乾製品の水性溶媒抽出物のタンパク質分解酵素での分解処理物以外に、魚肉乾製品を製造する際に得られる水性溶媒抽出物、魚肉乾製品の抽出物またはこれらのタンパク質分解酵素での分解処理物が挙げられる。【００２８】  上記の乾製品を製造する際に得られる水性溶媒抽出物を有効成分として用いる場合には、該抽出液を濾過し、濾液を濃縮したものを用いるのが好ましい。
魚肉乾製品の水性溶媒抽出物は、抽出したろ液をそのまま用いてもよく、濃縮して用いてもよい。
さらに上記の濃縮液を凍結乾燥または噴霧乾燥して固形化したものを組成物として用いてもよい。【００２９】  本発明者らは、インビトロでは、ＡＣＥ阻害活性が弱いヒスチジン（０．９ｍｇ／ｍｌで阻害５０％）、ロイシン（１６ｍｇ／ｍｌ以上で阻害５０％）、イソロイシン（２９ｍｇ／ｍｌで阻害５０％）、グルタミン酸（５．０ｍｇ／ｍｌ以上で阻害５０％）、セリン（１６．４ｍｇ／ｍｌで阻害５０％）もしくはフェニルアラニン（２０ｍｇ／ｍｌ以上で阻害５０％）が、自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）に対する経口投与実験において、ＳＨＲラットの心拍数に影響を与えることなく、該ラットの収縮期および拡張期における血圧を有意に低下することを見出した。【００３０】  したがって、本発明の別の観点によれば、高血圧症の患者または高血圧症になり易い人に、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンもしくはフェニルアラニンまたはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいは天然物由来のこれらの含有物を有効成分として含む血圧降下用組成物を治療または予防の有効量を投与することからなる高血圧症の治療または予防方法が提供される。【００３１】  本発明による血圧降下用組成物は、上記のアミノ酸またはそれを含有する天然物由来の含有物に、適当な賦形剤または希釈剤を添加し、医薬品の分野において用いられる通常の製剤に公知の方法で製剤化して使用できる。
製剤の例としては、散剤、細粒剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの固形製剤、または懸濁剤、溶液、シロップなどの液体製剤が挙げられる。【００３２】  固体製剤において、賦形剤または添加剤としては、乳糖、ショ糖、澱粉、タルク、セルロース、デキストリン、ソルビトール、リン酸カルシウムなどが挙げられる。
固体製剤の場合、他の添加物を含んでもよい。例えば、結合剤（例えばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドン）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはポリエチレングリコール）、崩壊剤（例えば馬鈴薯澱粉）、湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などが挙げられる。
錠剤またはカプセル剤のとき、通常の有効成分の即時放出用に、例えば糖衣錠のように、公知の方法で製剤化できる。また、有効成分の遅延または持続放出用の徐放製剤として、当業者において公知の方法に従ってポリマーで被覆してもよい。【００３３】  液体製剤においては、希釈剤として、通常、水が使用される。その他、他の添加剤として甘味剤（例えばショ糖またはソルビトール）や、保存剤（例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、またはソルビン酸）、着色剤または香料などを含んでもよい。
液体製剤は、例えば水性の懸濁液、溶液、シロップ以外に、使用前に水に室温で、または加温下に用時溶解される凍結乾燥製品であってもよい。【００３４】  本発明の血圧降下用組成物を含む食品は、主に高血圧の予防用に健康食品として使用される。その種類は、特に限定されず、例えばクッキー、せんべい、ゼリー、ようかん、ヨーグルト、まんじゅう等の菓子類、清涼飲料、お茶類、栄養飲料、スープ、パンおよびうどん等の麺類等の通常の食品、および健康食品が挙げられる。健康食品とは、通常の食品よりも積極的な意味で、保健、健康の維持・増進等を目的とした食品を意味し、例えば液体または半固形もしくは固形の製品、具体的には散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤などの形態が挙げられる。【００３５】  本発明の血圧降下用組成物を含む通常の食品は、上記のような食品の製造工程において、あるいは最終製品に、本発明の組成物を混合または塗布、噴霧などにより添加して製造することができる。【００３６】  本発明の血圧降下用組成物の医薬としての使用量は、患者の体重または症状などによって適宜増減されるが、成人に対する１日投与量は例えばヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンまたはフェニルアラニンとしてそれぞれ０．１〜１０ｇ程度が挙げられる。【００３７】  また、本発明の血圧降下用組成物を食品に用いるときは、食品の味や外観に悪影響を及ぼさない量、例えば対象となる食品１ｋｇに対して、ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンまたはフェニルアラニンとして１．５〜１００ｇ程度の範囲で用いるのが適当である。【００３８】  しかしながら、上記のアミノ酸の量に限定されることなく、適宜増減して使用できる。
さらに、本発明の組成物を食品の調理時に用いる場合には、１回分の使用量を入れたスティック状もしくは小袋状の包装形態、またはふりかけ容器に入れられた顆粒の形態で用いるのが適当である。
【実施例】
【００３９】  以下、本発明の血圧降下用組成物およびそれらの作用を、実施例、製造例および試験例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例および製造例により制限されるものではない。
なお、実施例、製造例および試験例では、特に記載がない限り、以下の試薬、材料および動物を用いた。【００４０】  ろ紙：アドバンテック社、タイプ５Ｃ
マイクロフィルター：ミリポア社、Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＨ（商標）
ペプシン：シグマ社、豚の胃粘膜由来
キモトリプシン：シグマ社、牛の膵臓由来
プロテアーゼＳ：天野エンザイム、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来
プロテアーゼＢ：天野エンザイム、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ由来
ペプチダーゼＲ：天野エンザイム、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ由来【００４１】  ヒスチジン：和光純薬工業株式会社、特級
経口投与用水：注射用水（大塚蒸留水、（株）大塚製薬工場製、ロット番号：２Ｇ９０Ｐ）
ＨＰＬＣ用カラム：ファルマシア社、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ｐｅｐｔｉｄｅ  １０／３００ＧＬ
ＳＨＲラット：日本エスエルシー（株）社から購入した９〜１１週齢のＩｚｍ雄性ラット
また、濾過は、特に断りのない限り、上記のろ紙を用いて吸引ろ過した。【００４２】実施例１
鰹節の熱水抽出
焙強荒本雄節（焙乾強化鰹荒本雄節）を２〜３ｍｍ以下に粉砕した粗砕品１ｋｇを、１４．５Ｌの熱水（９７℃以上）中で３０分間抽出し、抽出混合物をろ布でろ過して抽出液１２ｋｇと抽出残渣１．７ｋｇを得た。【００４３】試料（１）の調製
上記の抽出残渣を熱風乾燥機中７０℃で２時間乾燥し、放冷後微粉砕し、６０メッシュのふるいにかけて試料（１）を得た。
試料（２）の調製
上記の試料１（１６．８ｇ、タンパク質：８９．３１％）を純水１６８ｍｌに懸濁した。この懸濁液を２０％ＨＣｌでｐＨ２．０に調整し、ペプシン３３９ｍｇを加え、３７℃で１２時間撹拌した。引き続き２０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ７．８に調整し、トリプシンおよびキモトリプシン各１６９．５ｍｇを加え、３７℃で１２時間撹拌した。反応終了後、９０℃で１５分間加熱して酵素を失活させ、室温まで放冷し、吸引ろ過し、ろ液をさらにマイクロフィルターでろ過した。このろ液を凍結乾燥して試料（２）（１０ｇ）を得た。【００４４】試料（３）の調製
前記の鰹節の熱水抽出で得られた抽出液１ｋｇに、珪藻土６ｇを加え、撹拌し、吸引ろ過し、ろ液をさらにマイクロフィルターでろ過した。このろ液を凍結乾燥して試料（３）（３０ｇ）を得た。
試料（４）の調製
水４００ｍｌに前記の抽出残渣２００ｇおよびプロテアーゼＳ０．４ｇを加え、６０℃で１８時間撹拌した。酵素分解混合物を吸引ろ過し、ろ液をさらにマイクロフィルターでろ過した。このろ液を凍結乾燥して試料（４）（９ｇ）を得た。【００４５】試料（５）の調製
プロテアーゼＢを用い、４５℃で酵素反応に付した以外は、上記の試料４の場合と全く同様にして、試料（５）（７．５ｇ）を得た。
試料（６）の調製
ペプチダーゼＲを用い、４５℃で酵素反応に付した以外は、上記の試料４の場合と全く同様にして、試料（６）（８ｇ）を得た。【００４６】試料（７）の調製
水４００ｍｌに前記の抽出残渣２００ｇおよびプロテアーゼＳ０．４ｇを加え、６０℃で１２時間撹拌した。次いで、この反応液にプロテアーゼＢ０．４ｇを加え、さらに４５℃で１２時間撹拌した。酵素分解混合物を吸引ろ過し、ろ液をさらにマイクロフィルターでろ過した。このろ液を凍結乾燥して試料（７）（１０ｇ）を得た。
試料（８）の調製
焙強荒本雄節（焙乾強化鰹荒本雄節）を２〜３ｍｍ以下に粉砕した粗砕品を、７０℃で２時間熱風乾燥し、放冷後微粉砕し、６０メッシュのふるいにかけて試料（８）を得た。【００４７】試料（９）の調製
頭および内臓を除いた生鰹２００ｋｇに水４００ｋｇを加え、９７℃以上で６０〜９０分間熱水抽出した。次いで、抽出液と魚肉を分別し、抽出液をろ布でろ過して、ろ液を約４０％の容量になるまで加熱濃縮して、生鰹の抽出エキスとして試料（９）を得た。
試料（１０）の調製
鯖節粗砕品（マルハチ村松社、鯖節粗砕品ＨＦ）１０５ｇを、１．５Ｌの熱水（９７℃以上）中で３０分間抽出し、抽出混合物をろ布でろ過した。抽出残渣を熱風乾燥機中７０℃で２時間乾燥し、放冷後微粉砕し、６０メッシュのふるいにかけて試料（１０）を得た。【００４８】試料（１１）および試料（１２）の調製
鮪節の粗砕品１０５ｇを、１．５Ｌの熱水（９７℃以上）中で３０分間抽出し、抽出混合物をろ布でろ過した。抽出残渣を熱風乾燥機中７０℃で２時間乾燥し、放冷後微粉砕し、６０メッシュのふるいにかけて試料（１１）（７０ｇ）を得た。
一方、ろ液を上記の試料（３）の場合と同様の操作に付して試料（１２）（３０ｇ）を得た。
実施例２【００４９】  前記の焙強荒本雄節の粗砕品１００ｋｇに４０％の含水エタノール２００ｋｇを加え、３０℃で２時間撹拌抽出した。抽出混合物をフィルタープレス法により分離し、含水エタノール抽出液１３０ｋｇおよび抽出残渣１５０ｋｇを得た。この抽出残渣１５０ｋｇを水７００ｋｇに懸濁させ、プロテアーゼＢ５５０ｇを加え、５０℃で２時間撹拌した。次いで、懸濁液を９０℃で１０分間加熱して酵素を失活させ、フィルタープレス法によりろ液６９０ｋｇを得た。このろ液を減圧下に濃縮して、抽出エキス３７０ｋｇを得、先に得られた含水アルコール抽出液１３０ｋｇと混合し、セライトろ過して鰹節エキス４９０ｋｇを得た。【００５０】試料（１３）および試料（１４）の調製
上記の鰹節エキスを、エキス１ｇ当たり３０％含水アセトニトリル１０ｍｌに溶解し、０．１％のトリフルオロ酢酸を含む３０％含水アセトニトリルを移動相とするＨＰＬＣに付し、分子量２０００以上の画分および分子量１５００以下の画分に分画し、凍結乾燥して、試料（１３）および試料（１４）を得た。
試料（１５）の調製
先の工程で得られた試料（１３）（０．０３ｇ）を用い、実施例１の試料（２）の場合と同様にして、試料（１５）（０．０３ｇ）を得た。【００５１】試験例１
鰹節製造過程における生鰹抽出エキスおよび鰹節抽出エキス含有アミノ酸の分析
実施例１の鰹節の熱水抽出で得られた抽出液および抽出に用いた鰹節の粗砕品を、アクダック（株）製のケルテック分解装置およびケルテックオート蒸留装置を用いたケルダール法により分析したところ、鰹節中の窒素成分の約１７％が抽出液に移行していることが判った。さらに抽出液を、日本ウォーターズ（株）製のアライアンスＵＶシステムを用いるピコタグアミノ酸分析法により分析したところ、抽出液中の全窒素成分中の約４５％が遊離アミノ酸由来であり、ペプチドとして存在する結合アミノ酸由来が約２０％であり、残りはクレアチン、クレアチニンおよび核酸由来であることが判明した。鰹節抽出エキス中の遊離アミノ酸組成を以下の表１に示す。【００５２】  また、実施例１の試料（９）の調製の際に得られた抽出エキス中の遊離アミノ酸の分析を上記と同様にして行った。その結果を表１に併せて示す。【００５３】表１：鰹節抽出エキスおよび生鰹抽出エキス中の遊離アミノ酸組成
【表１】
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【００５４】  上記の表１から明らかなように、鰹節抽出エキスおよび生鰹抽出エキスのどちらにおいてもヒスチジンが遊離アミノ酸の大半を占めることが判明した。そこで、上記の試料（１）〜（１５）と同様に、ヒスチジンそのものも、以下の血圧降下試験に用いた。
なお、以下の投与実験における試料の投与量は、全てタンパク質量に換算した量を意味する。【００５５】試験例２
ＳＨＲラットを用いた血圧降下作用の試験
９週齢の雄性ラットを、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、照明１２時間（８：００〜２０：００）および換気回数１３〜１７回／時間の環境下で、１週間予備飼育した。
小動物無加温型非観血式血圧計（ＭＫ−２０００、室町機械（株）製）を用いて、各試料の投与前および投与後のＳＨＲラットの血圧および心拍数を測定した。
１０週齢のＳＨＲラットを、収縮期血圧がほぼ同一になるように、５匹ずつの群に分け、以下の試験に用いた。【００５６】  上記の実施例で得られた各試料の所定量を、注射用水溶液に用時溶解し、１試料当たり５匹の一夜絶食したＳＨＲラットに４ｍｌ／ｋｇの割合で経口投与し、投与後２４時間の収縮期および拡張期の血圧ならびに心拍数を測定した。なお、対照群には注射用蒸留水を４ｍｌ／ｋｇの割合で経口投与した。【００５７】  以下、試験例を説明するが、心拍数はいずれの試験においても、対照群および試料投与群の間で有意差は認められなかった（データ非表示）。
なお、試料の投与試験で得られた数値は、各群での平均値および標準誤差を算出した。各群間の有意差は、バートレット（Ｂｒｔｌｅｔｔ）法（有意水準５％）により等分散性の検定を行い、等分散であったため、さらに一元配置分散分析を行い、有意な場合タキー（Ｔｕｋｅｙ）法により平均値の比較を行った。有意水準は危険率５％および１％とした。【００５８】試料（１）、（１３）、（１４）および（１５）のラットに対する血圧降下作用の測定
ラットの体重当たり、試料（１）を１０００ｍｇ／ｋｇ、試料（１３）、（１４）および（１５）をそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇとなるように、各試料につき５匹のラットに投与した。上記のようにして、投与後２４時間の収縮期および拡張期血圧の変化を測定した。収縮期血圧の測定結果を表２に、拡張期血圧の測定結果を表３にそれぞれ示す。【００５９】表２：試料（１）、（１３）、（１４）および（１５）のラットの収縮期における血圧降下作用
【表２】
2005063245.tif 000003
【００６０】表３：試料（１）、（１３）、（１４）および（１５）のラットの拡張期における血圧降下作用
【表３】
2005063245.tif 000004
【００６１】試験例３
試料（１）、（３）、（９）、（１０）およびヒスチジンのラットに対する血圧降下作用の測定
ラットの体重当たり、試料（１）を５００ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇ、試料（３）を１０００ｍｇ／ｋｇおよび２００ｍｇ／ｋｇ、試料（９）および（１０）をそれぞれ５００ｍｇ／ｋｇならびにヒスチジンを１００ｍｇ／ｋｇとなるように、ラットに対して上記のように投与し、投与後２４時間の収縮期および拡張期血圧の変化を測定した。収縮期血圧の測定結果を表４に、拡張期血圧の測定結果を表５にそれぞれ示す。【００６２】表４：試料（１）、（３）、（９）、（１０）およびヒスチジンのラットの収縮期における血圧降下作用
【表４】
2005063245.tif 000005
【００６３】表５：試料（１）、（３）、（９）、（１０）およびヒスチジンのラットの拡張期における血圧降下作用
【表５】
2005063245.tif 000006
【００６４】試験例４
試料（７）のラットに対する血圧降下作用の測定
ラットの体重当たり、試料（７）を１００ｍｇ／ｋｇとなるように、ラットに対して上記のように投与し、投与後４時間の収縮期および拡張期血圧の変化を測定した。収縮期および拡張期の血圧の測定結果を表７にそれぞれ示す。【００６５】表６：試料（７）のラットの収縮期および拡張期における血圧降下作用
【表６】
2005063245.tif 000007
【００６６】試験例５
試料（２）、（３）、（５）、（８）、（９）、（１１）、（１２）およびヒスチジンのラットに対する血圧降下作用の測定
ラットの体重当たり、試料（２）、（５）および（９）をそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇ、試料（３）を１００ｍｇ／ｋｇおよび５００ｍｇ／ｋｇ、試料（８）、（１１）および（１２）をそれぞれ５００ｍｇ／ｋｇならびにヒスチジンを５０ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇとなるように、ラットに対して上記のように投与し、投与後２４時間の収縮期および拡張期血圧の変化を測定した。収縮期血圧の測定結果を表７に、拡張期血圧の測定結果を表８にそれぞれ示す。【００６７】表７：試料（２）、（３）、（５）、（８）、（９）、（１１）、（１２）およびヒスチジンのラットの収縮期における血圧降下作用
【表７】
2005063245.tif 000008
【００６８】表８：試料（２）、（３）、（５）、（８）、（９）、（１１）、（１２）およびヒスチジンのラットの拡張期における血圧降下作用
【表８】
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【００６９】  次いで、ヒスチジンに加え、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、グルタミン酸などについても血圧降下作用を測定した。すなわち、次の被験物質を前記の注射用蒸留水に溶解し、以下の表９および１０に記載の投与量でラットにそれぞれ投与した。
試料番号：
１６．  対照：注射用蒸留水
１７．  ＢＳＡ（対照、牛血清アルブミン）；和光純薬工業（株）
１８．  カプトプリル；シグマアルドリッチ社
１９．  カプトプリル；シグマアルドリッチ社
２０．  イソロイシン；和光純薬工業（株）
２１．  ロイシン；和光純薬工業（株）
２２．  アルギニン；和光純薬工業（株）【００７０】２３．  ヒスチジン；和光純薬工業（株）
２４．  ３−メチル−１−ヒスチジン；シグマアルドリッチ社
２５．  グルタミン酸ナトリウム；和光純薬工業（株）
２６．  カルノシン；和光純薬工業（株）
２７．  アンセリン；シグマアルドリッチ社
２８．  タウリン；和光純薬工業（株）
２９．  イノシン酸モノリン酸塩；協和発酵工業（株）【００７１】製造例１
鰹節の粉砕物２００ｇを４０％含水エタノール４００ｇに加え、撹拌下に、３５℃で２時間抽出し、固液分離して、抽出液と抽出残渣を得た。この抽出残渣を、予め４５℃に加温した水１５００ｇに加え、撹拌下に、プロテアーゼＢ１．２ｇを加え、同温度で２時間撹拌を継続した。次いで、固液分離して、得られた溶液を９０℃で１５分間加熱して、酵素を失活させて、減圧下に約半分量まで濃縮した。この濃縮液を、上記の抽出液と合わせて、セライトろ過して鰹節エキスを得た。このエキスを常法に従って、凍結乾燥に付して、４０ｇの乾燥物を得、これを試料（３０）とした。【００７２】試験例６
ＳＨＲラットを用いた血圧降下作用の試験
１０週齢の雄性ラットを、温度２２±３℃、湿度５０±２０％、照明１２時間（８：００〜２０：００）および換気回数１３〜１７回／時間の環境下で、１週間予備飼育した。
小動物無加温型非観血式血圧計（ＭＫ−２０００、室町機械（株）製）を用いて、各試料の投与前および投与後のＳＨＲラットの血圧および心拍数を測定した。
１１週齢のＳＨＲラットを、収縮期血圧がほぼ同一になるように、５匹ずつの群に分け、以下の試験に用いた。【００７３】  上記の各試料を、注射用水溶液に用時溶解し、１試料当たり５匹の一夜絶食したＳＨＲラットに経口投与し、投与後１２時間の収縮期および拡張期の血圧ならびに心拍数を測定した。なお、対照群には注射用蒸留水を４ｍｌ／ｋｇの割合で経口投与した。
以下、試験例を説明するが、心拍数はいずれの試験においても、対照群および試料投与群の間で有意差は認められなかった（データ非表示）。【００７４】  なお、試料の投与試験で得られた数値は、各群での平均値および標準誤差を算出した値である。各群間の有意差は、バートレット（Ｂｒｔｌｅｔｔ）法（有意水準５％）により等分散性の検定を行い、等分散であったため、さらに一元配置分散分析を行い、有意な場合タキー（Ｔｕｋｅｙ）法により平均値の比較を行った。有意水準は危険率５％および１％とした。【００７５】試料（１６）〜（３０）のラットに対する血圧降下作用の測定
試料（１６）〜（３０）を表９および１０に記載の割合で、各試料につき５匹のラットに投与して、投与後１２時間の収縮期および拡張期における血圧の変化を測定した。収縮期血圧の測定結果を表９に、拡張期血圧の測定結果を表１０にそれぞれ示す。【００７６】表９：試料（１６）〜（３０）のラットの収縮期における血圧降下作用
【表９】
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【００７７】表１０：試料（１６）〜（３０）のラットの拡張期における血圧降下作用
【表１０】
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【００７８】  次いで、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシンおよびグルタミン酸に加え、セリン、フェニルアラニンおよびチロシンについても血圧降下作用を測定した。すなわち、次の被験物質を前記の注射用蒸留水に溶解し、以下の表１１および１２に記載の投与量でラットにそれぞれ投与した。
試料番号：
３１．  対照：注射用蒸留水
３２．  ヒスチジン；和光純薬工業（株）
３３．  イソロイシン；和光純薬工業（株）
３４．  ロイシン；和光純薬工業（株）
３５．  グルタミン酸ナトリウム；和光純薬工業（株）
３６．  セリン；和光純薬工業（株）
３７．  フェニルアラニン；和光純薬工業（株）
３８．  チロシン；和光純薬工業（株）【００７９】  前記試験例６とまったく同様にして上記の試料（３１）〜（３８）を表１１および１２に記載の割合で、各試料ににつき、５匹のラットに経口投与して、投与後１２時間の収縮期および拡張期における血圧の変化を測定した。収縮期血圧の測定結果を表１１に、拡張期血圧測定結果を表１２にそれぞれ示す。【００８０】表１１：試料（３１）〜（３８）のラットの収縮期における血圧降下作用
【表１１】
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【００８１】表１２：試料（３１）〜（３８）のラットの拡張期における血圧降下作用
【表１２】
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【００８２】実施例３
実施例１の試料（１３）および試料（１４）の調製で得た試料（１３）を、１包当たり０．７ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８３】実施例４
実施例１の試料（１３）および試料（１４）の調製で得た試料（１３）１重量部を、ラクトース１重量部と混合し、１包当たり試料（１３）を２ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８４】実施例５
実施例１の試料（１３）および試料（１４）の調製で得た試料（１４）を、１包当たり０．７ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８５】実施例６
実施例１の試料（１３）および試料（１４）の調製で得た試料（１４）１重量部を、ラクトース１重量部と混合し、１包当たり試料（１４）を２ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８６】実施例７
製造例１で得た試料（３０）を、１包当たり１ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８７】実施例８
製造例１で得た試料（３０）１重量部を、ラクトース１重量部と混合し、１包当たり試料（３０）を４ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００８８】実施例９
ヒスチジン、ロイシン、イソロイシン、グルタミン酸、セリンおよびフェニルアラニンをそれぞれ１部ずつ混合し、アミノ酸の混合物を得た。【００８９】実施例１０
実施例９で得た混合物を１包当たり０．７ｇ含むスティック状の包装品を製造した。【００９０】実施例１１
以下の成分を常法により混合して、１包当たり実施例９のアミノ酸混合物を１ｇ含むスティック状の包装品を製造した。
実施例９のアミノ酸混合物    １重量部
ラクトース              ９重量部【００９１】  実施例１２
以下の成分を常法により混合して、１包当たり実施例９のアミノ酸混合物を５ｇ含むスティック状の包装品を製造した。
実施例９のアミノ酸混合物    １重量部
ラクトース              １重量部【００９２】  実施例１３
米粉５０重量部、砂糖５重量部、全卵１０重量部、製造例１で得た試料（３０）１重量部を秤量した。
全卵に砂糖を混合した後、予め篩に通した米粉を加え、軽く混ぜ合わせて生地を作り、これを適当な形に成形し、オーブンで焼き上げて、せんべいを作った。【００９３】  実施例１４
米粉５０重量部、砂糖５重量部、全卵１０重量部、実施例９のアミノ酸混合物０．５重量部を秤量した。
全卵に砂糖を混合した後、予め篩に通した米粉を加え、軽く混ぜ合わせて生地を作り、これを適当な形に成形し、オーブンで焼き上げて、せんべいを作った。【００９４】実施例１５
実施例１４において、実施例９のアミノ酸混合物の量０．５重量部に替えて、２重量部を用い、同様にして、せんべいを作った。【００９５】実施例１６
実施例１４において、実施例９のアミノ酸混合物の量０．５重量部に替えて、５重量部を用い、同様にして、せんべいを作った。【００９６】実施例１７
小麦粉１００重量部、塩４重量部、製造例１の試料（３０）５重量部および水４５重量部を秤量し、常法に従ってこれらをよく混合して、うどんを製造した。【００９７】実施例１８
実施例１７において、製造例１の試料（３０）に替えて、実施例９のアミノ酸混合物２重量部を用い、同様にして、うどんを製造した。【００９８】実施例１９
実施例１７において、製造例１の試料（３０）に替えて、実施例２で得た鰹節エキス５重量部および水４５重量部に替えて、水４０重量部を用い、全く同様にして、うどんを製造した。【００９９】実施例２０
製造例１で得た試料（３０）１０重量部をラクトース２５重量部と混合し、ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に試料（３０）が５００ｍｇ含有されるゼラチンカプセル剤を得た。【０１００】実施例２１
実施例９で得たアミノ酸混合物１０重量部をラクトース１５重量部と混合し、ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル中に該アミノ酸混合物が１ｇ含有されるゼラチンカプセル剤を得た。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】  本発明によれば、アミノ酸またはそれらの塩の少なくとも一つ、あるいはそれらの含有物を安全な血圧降下用組成物の有効成分として、医薬または食品に利用できる。
【国際調査報告】
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