(57)【要約】本発明は、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質、そのような物質を含有する癌などの予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質。
【請求項２】
物質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である請求項１記載の物質。
【請求項３】
物質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である請求項１記載の物質。
【請求項４】
抗体が、モノクローナル抗体である請求項２または請求項３記載の物質。
【請求項５】
請求項１記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項６】
請求項１記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項７】
請求項１記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項８】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項９】
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質。
【請求項１０】
物質が、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のリン酸化を阻害する活性を有する抗体である請求項９記載の物質。
【請求項１１】
抗体が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である請求項１０記載の物質。
【請求項１２】
請求項９記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤。
【請求項１３】
請求項９記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤。
【請求項１４】
請求項９記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤。
【請求項１５】
（ａ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（ｂ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（ａ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、上記（ｂ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
（ａ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプヂドまたはその塩、および（ｂ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記（ａ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、上記（ｂ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のスクリーニング用キット。
【請求項１７】
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング用キット。
【請求項１９】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法。
【請求項２０】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のリン酸化を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法。
【請求項２２】
配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物に対して、請求項１または請求項９記載の物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法。
【請求項２４】
癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤および（または）癌細胞の増殖抑制剤を製造するための、請求項１または請求項９記載の物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質等とＰｌｅｘｉｎＢ１タンパク質等との結合を阻害する物質（例、抗体）、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質等およびＰｌｅｘｉｎＢ１タンパク質の活性を阻害する物質（例、抗体）、該物質を含有する癌の予防・治療剤またはアポトーシス促進剤、癌の予防・治療剤またはアポトーシス促進剤のスクリーニングなどに関する。
【背景技術】  近年のマイクロアレイ・オリゴヌクレオチドアレイ技術の進歩により、遺伝子発現の網羅的な解析が可能となってきた。癌においても遺伝子のマイクロアレイプロファイリングデータでその病態が評価しうることも予見され、実際、白血病においては遺伝子発現プロファイルによる白血病の分類が可能であることが報告されている。また個々の癌組織の遺伝子発現プロファイルを明らかにし、その分類を積み重ねることによって、特定の癌治療法に対する反応性を予測したり特定の癌に対する新たな創薬標的タンパク質を発見したりすることが可能となると考えられる。具体的には、ある種の癌である種のタンパク質の発現亢進が認められる場合には、新たに抗原陽性と診断された患者に対して（ｉ）その発現量を低下させる、（ｉｉ）機能を抑制する、（ｉｉｉ）該タンパク質に対する宿主免疫応答を顕在化させる等の方法によって抗腫瘍活性を導くことが可能となる。これと同時に、抗原陰性と診断された患者に対しては別の治療法への切替が迅速に行えるなど、患者に無用な負担をかける懸念がなくなると予想される。以上のように発現プロファイル解析は、癌の分子診断と分子標的治療薬の開発に多大な貢献をなしうるものと期待されている。
Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎファミリーは、分泌型分子と膜結合型分子の両方から構成される大きなタンパク質ファミリーで、脊椎動物で少なくとも１９種、非脊椎動物で３種の遺伝子が報告されている（Ｃｅｌｌ  ９７巻，５５１−５５２頁，１９９９年）。
Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎファミリーは神経軸索誘導やシナプス形成などに代表される広範囲な神経発生過程に関わることが知られている。近年になり、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎファミリーの免疫系への関与（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２巻，６７０−６７６頁，２００１年）や、臓器発生・血管新生における関与が明らかになりつつある。Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎファミリーに属するヒト由来のＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｂ、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｆは、癌抑制遺伝子として報告されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｅｉ．ＵＳＡ  ９８巻，１３９５４−１３９５９頁，２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２巻，５４２−５４６頁，２００２年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２巻，２６３７−２６４３頁，２００２年）。ヒトＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｃは、ヒト肺がん組織で発現が亢進しているという報告がある（Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．７２巻，１８−２３頁，１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４巻，１４７１３−１４７１８頁，１９９７年）。ヒトＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ３Ｅは転移性細胞で発現していると報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８巻，１２３８−１２４４頁，１９９８年）。
ヒトＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ（以下、ＳＥＭＡ４Ｂと略すこともある；配列番号：１）は、ヒトＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ４Ｄ（以下、ＳＥＭＡ４Ｄと略すこともある）とアミノ酸レベルで相同性が４１％であり、低酸素条件下で発現が上昇する遺伝子のひとつとして報告されている（ＷＯ  ０２／４６４６５号公報）。また、ジーンチップ解析に基づきＳＥＭＡ４Ｂなどを含む数百種の塩基配列が、肺癌の診断または肺癌を治療する化合物の探索などに使用できるとの報告もある（ＷＯ  ０２／８６４４３号公報）。ＳＥＭＡ４Ｂとアミノ酸レベルで９３％の相同性を有するＮＯＶ７は、癌で発現亢進していることが報告されている（ＷＯ  ０２／０６３２９号公報）。ＳＥＭＡ４Ｂなどと相同性６０％以上を有するポリヌクレオチドやポリペプチドを用いる膀胱癌の診断法、抗体、膀胱癌関連タンパク質を調節する化合物のスクリーニングなどが、ＷＯ  ０３／００３９０６号公報に報告されている。また、ヒトＰｌｅｘｉｎＢ１（以下、ＰｌｅｘｉｎＢ１と略することもある；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ００７８６７）のリガンドはＳＥＭＡ４Ｄであること（Ｃｅｌｌ、９９巻、７１〜８０頁、１９９９年）、およびＰｌｅｘｉｎＢ１はヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体と複合体を形成しており、ＳＥＭＡ４Ｄで刺激するとＰｌｅｘｉｎＢ１およびＨＧＦ受容体の両方がリン酸化され、細胞の増殖が促進されること（Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４巻、７２０頁−７２４頁、２００２年）が知られている。
癌細胞に特異的に発現する分子を標的とし、癌細胞の増殖阻害を誘導する安全な薬剤が切望されている。
【発明の開示】
本発明者らは、上記の課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ＳＥＭＡ４ＢとＰｌｅｘｉｎＢ１とが結合すること、両者の結合を阻害することにより癌細胞のアポトーシスが促進されること、ＳＥＭＡ４Ｂに対する抗体がＳＥＭＡ４ＢとＰｌｅｘｉｎＢ１との結合を阻害することを見出した。この知見に基づいて、さらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質、
〔２〕物質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体である上記〔１〕記載の物質、
〔２ａ〕さらに、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩も認識する抗体である上記〔２〕記載の物質、
〔３〕物質が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である上記〔１〕記載の物質、
〔４〕抗体が、モノクローナル抗体である上記〔２〕または〔３〕記載の物質、
〔５〕上記〔１〕記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤、
〔６〕上記〔１〕記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔７〕上記〔１〕記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔８〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔８ａ〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してなる癌の予防・治療剤、
〔８ｂ〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔９〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質、
〔９ａ〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する物質、
〔１０〕物質が、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のリン酸化を阻害する活性を有する抗体である上記〔９〕記載の物質、
〔１１〕抗体が、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体である上記〔１０〕記載の物質、
〔１２〕上記〔９〕記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤、
〔１２ａ〕上記〔９ａ〕記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤、
〔１３〕上記〔９〕記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔１３ａ〕上記〔９ａ〕記載の物質を含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔１４〕上記〔９〕記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔１４ａ〕上記〔９ａ〕記載の物質を含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔１４ｂ〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌の予防・治療剤、
〔１４ｃ〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌細胞のアポトーシス促進剤、
〔１４ｄ〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその部分ペプチドまたはその塩をコードするポリヌクレオチドに相補的または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有するアンチセンスポリヌクレオチドを含有してなる癌細胞の増殖抑制剤、
〔１５〕（ａ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（ｂ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、上記（ａ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、上記（ｂ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のスクリーニング方法、
〔１６〕（ａ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩、および（ｂ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、上記（ａ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、上記（ｂ）のタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害する物質のスクリーニング用キット、
〔１６ａ〕上記〔１５〕記載のスクリーニング方法または上記〔１６〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる物質、
〔１６ｂ〕上記〔１６ａ〕記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤、
〔１７〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を用いることを特徴とする、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング方法、
〔１７ａ〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子を用いることを特徴とする、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の遺伝子の発現を阻害する物質のスクリーニング方法、
〔１８〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩を含有することを特徴とする、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質のスクリーニング用キット、
〔１８ａ〕上記〔１７〕記載のスクリーニング方法または上記〔１８〕記載のスクリーニング用キットを用いて得られる物質、
〔１８ｂ〕上記〔１８ａ〕記載の物質を含有してなる癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤または癌細胞の増殖抑制剤、
〔１９〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩との結合を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法、
〔２０〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記〔１９〕記載の方法、
〔２１〕配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩のリン酸化を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法、
〔２１ａ〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法、
〔２２〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記〔２１〕記載の方法、
〔２２ａ〕さらに、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩も認識する抗体である上記〔２２〕記載の方法、
〔２２ｂ〕配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩に対する抗体を用いる上記〔２１ａ〕記載の方法、
〔２２ｃ〕さらに、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩も認識する抗体である上記〔２２ｂ〕記載の方法、
〔２３〕哺乳動物に対して、上記〔１〕または〔９〕記載の物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法、
〔２３ａ〕哺乳動物に対して、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質の有効量を投与することを特徴とする癌の予防・治療方法、癌細胞のアポトーシス促進方法および（または）癌細胞の増殖抑制方法、
〔２４〕癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤および（または）癌細胞の増殖抑制剤を製造するための、上記〔１〕または〔９〕記載の物質の使用、
〔２４ａ〕癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤および（または）癌細胞の増殖抑制剤を製造するための、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩の活性を阻害する物質の使用などを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】  配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明のタンパク質または本発明で用いられるタンパク質と称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１で表されるアミノ酸配列と９５％以上、好ましくは約９８％以上、好ましくは約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：４で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：４で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：７で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：７で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と９９．９％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
アミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。
上記の実質的に同質の活性としては、例えば（後述の）本発明で用いられるレセプター結合活性、本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、本発明で用いられるレセプター結合活性、本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
上記結合活性の測定は、自体公知の方法、例えばＥＩＡ法、免疫沈降法またはこれらに準じる方法に従って測定することができる。具体的には、本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターのそれぞれを、タグを付加した組換え型タンパク質として動物細胞で発現させる。該タグとしては、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなどが用いられ、本発明で用いられるタンパク質に付加するタグ（タグＡ）と、本発明で用いられるレセプターに付加するタグ（タグＢ）とは異なるものを用いる。タグＢに対する抗体で、上記タグＡ付加タンパク質および上記タグＢ付加レセプターの混合液を免疫沈降し、得られた沈殿物を、タグＡに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング操作を行うことにより、本発明で用いられるレセプターに結合した本発明で用いられるタンパク質の量を測定することができる。
上記リン酸化誘導・促進活性の測定は、自体公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２００巻、９８頁−１０７頁、１９９１年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って測定する。具体的には、例えばタグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、本発明で用いられるタンパク質と反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降し、リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量は、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウェスタンブロット法など）により測定することができる。
本発明で用いられるタンパク質としては、例えば、（１）（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテイン、（２）（ｉ）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列中の１または２個のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列に１または２個のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列中の１または２個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本発明で用いられるタンパク質の具体例としては、例えば、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（以下、本発明で用いられるレセプターと称することもある）は、ヒトや温血動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）の細胞（例、肝細胞、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくは癌細胞など）もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋などに由来するタンパク質であってもよく、合成タンパク質であってもよい。
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質としては、例えば、前記の配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。
上記の実質的に同質の活性としては、例えば本発明で用いられるタンパク質結合活性、リン酸化される活性（例、本発明のタンパク質の刺激によりリン酸化される活性など）などが挙げられる。実質的に同質とは、それらの性質が性質的に（例、生理学的に、または薬理学的に）同質であることを示す。したがって、上記の活性が同等（例、約０．０１〜１００倍、好ましくは約０．１〜１０倍、より好ましくは０．５〜２倍）であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リン酸化される活性の測定は、自体公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２００巻、９８頁−１０７頁、１９９１年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って測定する。具体的には、例えば、タグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、本発明で用いられるタンパク質と反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降する。リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量は、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウェスタンブロット法など）により定量することができる。
本発明で用いられるレセプターとしては、例えば、（ｉ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号：２６で表されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（ｖ）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有するタンパク質などのいわゆるムテインも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、欠失または置換されている場合、その挿入、欠失または置換の位置としては、とくに限定されない。
本発明で用いられるレセプターの具体例としては、例えば、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質などがあげられる。
また、本発明で用いられるレセプターは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体と複合体を形成していてもよい。
本明細書におけるタンパク質は、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明で用いられるタンパグ質およびレセプターは、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１−６アルキル基、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−８シクロアルキル基、例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ６−１２アリール基、例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１−２アルキル基などのＣ７−１４アラルキル基、ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明で用いられるタンパク質に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイルなどのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ１−６アルカノイル基などのＣ１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの部分ペプチド（本発明で用いられる部分ペプチド）としては、前記した本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの部分ペプチドであって、好ましくは、前記した本発明で用いられるタンパク質またはレセプターと同様の性質を有するものであればいずれのものでもよい。
例えば、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの構成アミノ酸配列のうち少なくとも２０個以上、好ましくは５０個以上、さらに好ましくは７０個以上、より好ましくは１００個以上、最も好ましくは２００個以上のアミノ酸配列を有するペプチドなどが用いられる。
また、上記部分ペプチドは、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が欠失し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が付加し、または、そのアミノ酸配列に１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは数（１〜５）個）のアミノ酸が挿入され、または、そのアミノ酸配列中の１または２個以上（好ましくは１〜２０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、より好ましくは数個、さらに好ましくは１〜５個程度）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい。
また、本発明で用いられる部分ペプチドはＣ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ−）、アミド（−ＣＯＮＨ２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
さらに、本発明で用いられる部分ペプチドには、前記した本発明で用いられるタンパク質と同様に、Ｃ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有しているもの、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明で用いられる部分ペプチドは抗体作成のための抗原としても用いることができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプターまたは部分ペプチドの塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸）や塩基（例、アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプター、またはその部分ペプチドまたはその塩は、前述したヒトや温血動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することもできるし、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造することができる。また、後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトや哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、ヒトや哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズした後、酸などで抽出を行ない、該抽出液を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくは部分ペプチドまたはその塩、またはそのアミド体の合成には、通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするタンパク質の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からタンパク質または部分ペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的のタンパク質もしくは部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、タンパク質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ，ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、タンパク質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジン，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することによって、後の反応に影響を与えないようにすることができる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ｔ−ペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔ−ブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ｔ−ブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルス關ルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、およびその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
タンパク質または部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護した後、アミノ基側にペプチド（タンパク質）鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質または部分ペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除去したタンパク質または部分ペプチドとを製造し、これらのタンパク質またはペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護タンパク質またはペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗タンパク質またはペプチドを得ることができる。この粗タンパク質またはペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のタンパク質またはペプチドのアミド体を得ることができる。
タンパク質またはペプチドのエステル体を得るには、例えば、カルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、タンパク質またはペプチドのアミド体と同様にして、所望のタンパク質またはペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明で用いられる部分ペプチドまたはそれらの塩は、自体公知のペプチドの合成法に従って、あるいは本発明で用いられるタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することができる。ペプチドの合成法としては、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、本発明で用いられる部分ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としては、例えば、以下の（ｉ）〜（ｖ）に記載された方法が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（ｉｉｉ）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（ｉｖ）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（ｖ）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出・蒸留・カラムクロマトグラフィー・液体クロマトグラフィー・再結晶などを組み合わせて本発明で用いられる部分ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られる部分ペプチドが遊離体である場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に塩で得られた場合は、公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるタンパク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、
（ｉ）配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉ）配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｉｉ）配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、
（ｉｖ）配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡであれば何れのものでもよい。
配列番号：２で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２で表される塩基配列と９５％以上、好ましくは約９８以上、好ましくは約９９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：５で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：８で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：８で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：１１で表される塩基配列と９９．９％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、（ｉ）配列番号：１で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：２で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：３で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉ）配列番号：４で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：５で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：６で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｉｉ）配列番号：７で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：８で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：９で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが、（ｉｖ）配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡまたは配列番号：１２で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）としては、前述した本発明で用いられる部分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。また、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
本発明で用いられる部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列を含有するＤＮＡの一部分を有するＤＮＡ、または配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、本発明のタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの一部分を含有するＤＮＡなどが用いられる。
配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８または配列番号：１１で表される塩基配列とハイブリダイズできるＤＮＡは、前記と同意義を示す。
ハイブリダイゼーションの方法およびハイストリンジェントな条件は前記と同様のものが用いられる。
本発明で用いられるレセプターをコードするポリヌクレオチドとしては、前述した本発明で用いられるレセプターをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、前記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織よりｔｏｔａｌＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＲＴ−ＰＣＲ法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明で用いられるレセプターをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡ、または配列番号：３５で表わされる塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質と実質的に同質の性質を有するタンパク質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号：３５で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号：３５で表される塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、好ましくは約７０％以上、好ましくは約８０％以上、好ましくは約９０％以上、好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。より好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、例えば、ナトリウム濃度が約１９〜４０ｍＭ、好ましくは約１９〜２０ｍＭで、温度が約５０〜７０℃、好ましくは約６０〜６５℃の条件を示す。特に、ナトリウム濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が最も好ましい。
より具体的には、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、配列番号：３５で表される塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、部分ペプチド（以下、これらをコードするＤＮＡのクローニングおよび発現の説明においては、これらを単に本発明のタンパク質と略記する場合がある）を完全にコードするＤＮＡのクローニングの手段としては、本発明のタンパク質をコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当なベクターに組み込んだＤＮＡを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを用いて標識したものとのハイブリダイゼーションによって選別することができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ２ｎｄ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
ＤＮＡの塩基配列の変換は、ＰＣＲ、公知のキット、例えば、ＭｕｔａｎＴＭ−ｓｕｐｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｋｍ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ（株））、ＭｕｔａｎＴＭ−Ｋ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ  ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。
クローン化されたタンパク質をコードするＤＮＡは目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりして使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。
本発明のタンパク質の発現ベクターは、例えば、（イ）本発明のタンパク質をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、（ロ）該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。
これらのうち、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列を、本発明のタンパク質のＮ端末側に付加する。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合は、α−アミラーゼ・シグナル配列、サブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合は、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列など、宿主が動物細胞である場合には、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを用いて、形質転換体を製造することができる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌の具体例としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ−，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス  ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア  パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ  ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞またはＥｓｔｉｇｍｅｎａ  ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ−）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，マウスＡＴＤＣ５細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９巻，２１１０（１９７２）やＧｅｎｅ，１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って行なうことができる。
動物細胞を形質転換するには、例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って行なうことができる。
このようにして、タンパク質をコードするＤＮＡを含有する発現ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質、無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母エキス、ビタミン類、成長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。
エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４３１−４３３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７２〕が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行ない、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１巻，５３３０（１９８４）〕が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては、Ｇｒａｃｅ’ｓ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ  １６４０培地〔Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９巻，５１９（１９６７〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行ない、必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に本発明のタンパク質を生成せしめることができる。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、例えば、下記の方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊したのち、遠心分離やろ過によりタンパク質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。緩衝液の中に尿素や塩酸グアニジンなどのタンパク質変性剤や、トリトンＸ−１００ＴＭなどの界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にタンパク質が分泌される場合には、培養終了後、それ自体公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、上清を集める。
このようにして得られた培養上清、あるいは抽出液中に含まれるタンパク質の精製は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。これらの公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
かくして得られるタンパク質が遊離体で得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、組換え体が産生するタンパク質を、精製前または精製後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。タンパク質修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウェスタンブロッティングなどにより測定することができる。
「配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（本発明で用いられるタンパク質）と、配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩（本発明で用いられるレセプター）との結合を阻害する物質」としては、本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合を阻害する物質（例、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）であればいずれでもよく、例えば、本発明で用いられるタンパク質に特異的に反応する抗体、本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する抗体、本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する二重特異性抗体、本発明で用いられるレセプターの活性（例、本発明で用いられるタンパク質結合活性、リン酸化される活性など）を阻害する抗体、本発明で用いられるタンパク質の活性（例、本発明で用いられるレセプター結合活性、本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性など）を阻害する抗体（以下、これらをまとめて本発明の抗体と称することもある）などが挙げられる。
「本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質」としては、本発明で用いられるタンパク質の活性（例、本発明で用いられるレセプター結合活性、本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性など）を阻害する物質（例、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）であればいずれでもよく、例えば、本発明の抗体などが挙げられる。
「本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質」としては、本発明で用いられるレセプターの活性（例、本発明で用いられるタンパク質結合活性、リン酸化される活性など）を阻害する物質（例、抗体、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液など）であればいずれでもよく、例えば、本発明の抗体などが挙げられる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよい。
本発明の抗体として好ましくは、本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体（中和活性抗体）である。または、本発明で用いられるレセプターの活性（好ましくは、リン酸化される活性など）を阻害する抗体である。さらに好ましくは、モノクローナル抗体である。
以下に、本発明の抗体の抗原の調製法、および該抗体の製造法について説明する。
（１）抗原の調製
本発明の抗体を調製するために使用される抗原としては、例えば、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩と同一の抗原決定基を１種あるいは２種以上有する（合成）ペプチドなど何れのものも使用することができる（以下、これらを単に本発明の抗原と称することもある）。
上記タンパク質もしくはその部分ペプチドまたはその塩は、後述の参考例や公知の方法に準じて製造でき、さらに、（ａ）例えばヒト、サル、ラット、マウスなどの哺乳動物の組織または細胞から公知の方法あるいはそれに準ずる方法を用いて調製、（ｂ）ペプチド・シンセサイザー等を使用する公知のペプチド合成方法で化学的に合成、（ｃ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を培養することによっても製造される。
（ａ）該哺乳動物の組織または細胞から本発明の抗原を調製する場合、その組織または細胞をホモジナイズした後、粗分画物（例、膜画分、可溶性画分）をそのまま抗原として用いることもできる。あるいは酸、界面活性剤またはアルコールなどで抽出を行い、該抽出液を、塩析、透析、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを組み合わせることにより精製単離することもできる。
（ｂ）化学的に本発明の抗原を調製する場合、該合成ペプチドとしては、例えば上述の（ａ）の方法を用いて天然材料より精製した本発明の抗原と同一の構造を有するもの、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列において３個以上、好ましくは６個以上のアミノ酸からなる任意の箇所のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を１種あるいは２種以上含有するペプチドなどが用いられる。
（ｃ）ＤＮＡを含有する形質転換体を用いて配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩を製造する場合、該ＤＮＡは、公知のクローニング方法〔例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法など〕に従って作製することができる。該クローニング方法とは、（１）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプローブまたはＤＮＡプライマーを用い、ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーション法により配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法、または（２）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドまたはその塩のアミノ酸配列に基づきデザインしたＤＮＡプライマーを用い、ＰＣＲ法により配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩をコードするＤＮＡを含有する形質転換体を得る方法などが挙げられる。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを発現する哺乳動物細胞自体を、本発明の抗原として直接用いることもできる。哺乳動物細胞としては、上記（ａ）項で述べたような天然の細胞、上記（ｃ）項で述べたような方法で形質転換した細胞などを用いることができる。形質転換に用いる宿主としては、ヒト、サル、ラット、マウス、ハムスターなどから採取した細胞であれば何れのものでも良く、ＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７、ＣＨＯ−Ｋ１、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｂａｌｂ３Ｔ３、ＦＭ３Ａ、Ｌ９２９、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｕ１、Ｂ１６、またはＰ３８８などが好ましく用いられる。本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを発現する天然の哺乳動物細胞または形質転換した哺乳動物細胞は、組織培養に用いられる培地（例、ＲＰＭＩ１６４０）または緩衝液（例、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に懸濁された状態で免疫動物に注射することができる。免疫方法としては、抗体産生を促すことのできる方法であれば何れの方法でも良く、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射または皮下注射などが好ましく用いられる。
本発明の抗原としてのペプチドは、（１）公知のペプチドの合成法に従って、または（２）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質を適当なペプチダーゼで切断することによって製造することもできる。
該ペプチドの合成法としては、例えば固相合成法、液相合成法のいずれによっても良い。すなわち、該ペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。公知の縮合方法や保護基の脱離としてはたとえば、以下に記載された方法等が挙げられる。
（ｉ）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（ｉｉ）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９６５年）
また、反応後は通常の精製法、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などを組み合わせて該ペプチドを精製単離することができる。上記方法で得られるペプチドが遊離体である場合は、公知の方法によって適当な塩に変換することができ、逆に塩で得られた場合は、公知の方法によって遊離体に変換することができる。
ペプチドのアミド体は、アミド形成に適した市販のペプチド合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、，，−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とするペプチドの配列通りに、公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂からペプチドを切り出すと同時に各種保護基を除去し、目的のペプチドを取得する。あるいはクロロトリチル樹脂、オキシム樹脂、４−ヒドロキシ安息香酸系樹脂等を用い、部分的に保護したペプチドを取り出し、更に常套手段で保護基を除去し目的のペプチドを得ることもできる。
上記した保護されたアミノ酸の縮合に関しては、ペプチド合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができ、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としてはＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが挙げられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔなど）とともに保護されたアミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護されたアミノ酸の活性化を行ったのちに樹脂に添加することができる。保護されたアミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、ペプチド縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。たとえばＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン、クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどの三級アミン類、ジオキサン、テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル、プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度はペプチド結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜約５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常約１．５ないし約４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化して、後の反応に影響を及ぼさないようにすることができる。
原料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、たとえば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。カルボキシル基の保護基としては、たとえばＣ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、Ｃ７−１４アラルキル基、２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシルおよびベンジルオキシカルボニルヒドラジド、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド、トリチルヒドラジドなどが挙げられる。
セリンおよびスレオニンの水酸基は、たとえばエステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては例えばアセチル基などの低級（Ｃ１−６）アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが挙げられる。また、エーテル化に適する基としては、たとえばベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、たとえばＢｚｌ、Ｃｌ−Ｂｚｌ，２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ｔ−ブチルなどが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、Ｂｏｍ、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが挙げられる。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、たとえば対応する酸無水物、アジド、活性エステル［アルコール（たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル］などが挙げられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、たとえば対応するリン酸アミドが挙げられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、たとえばＰｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども挙げられる。上記酸処理による脱離反応は一般に−２０℃〜４０℃の温度で行われるが、酸処理においてはアニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、ならびにその保護基の脱離、反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知の手段から適宜選択しうる。
ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、まず、カルボキシル末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化した後、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長まで延ばした後、該ペプチド鎖のＮ末端のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドとＣ末端のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチド（またはアミノ酸）とを製造し、この両ペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護ペプチドを精製した後、上記方法によりすべての保護基を除去し、所望の粗ペプチドを得ることができる。この粗ペプチドは既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望のペプチドのアミド体を得ることができる。
ペプチドのエステル体を得るにはカルボキシ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、ペプチドのアミド体と同様にして所望のペプチドのエステル体を得ることができる。
本発明の抗原は、不溶化したものを直接免疫することもできる。また、本発明の抗原を適当な担体に結合または吸着させた複合体を免疫してもよい。該担体（キャリアー）と本発明の抗原（ハプテン）との混合比は、担体に結合あるいは吸着させた本発明の抗原に対して抗体が効率よくできれば、どのようなものをどのような比率で結合あるいは吸着させてもよく、通常ハプテン抗原に対する抗体の作製にあたり常用されている天然もしくは合成の高分子担体を重量比でハプテン１に対し０．１〜１００の割合で結合あるいは吸着させたものを使用することができる。天然の高分子担体としては、例えばウシ、ウサギ、ヒトなどの哺乳動物の血清アルブミンや例えばウシ、ウサギなどの哺乳動物のチログロブリン、例えばウシ、ウサギ、ヒト、ヒツジなどの哺乳動物のヘモグロビン、キーホールリンペットヘモシアニンなどが用いられる。合成の高分子担体としては、例えばポリアミノ酸類、ポリスチレン類、ポリアクリル類、ポリビニル類、ポリプロピレン類などの重合物または供重合物などの各種ラテックスなどを用いることができる。
また、ハプテンとキャリアーのカプリングには、種々の縮合剤を用いることができる。例えば、チロシン、ヒスチジン、トリプトファンを架橋するビスジアゾ化ベンジジンなどのジアゾニウム化合物、アミノ基同志を架橋するグルタルアルデビトなどのジアルデヒド化合物、トルエン−２，４−ジイソシアネートなどのジイソシアネート化合物、チオール基同志を架橋するＮ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレイミドなどのジマレイミド化合物、アミノ基とチオール基を架橋するマレイミド活性エステル化合物、アミノ基とカルボキシル基とを架橋するカルボジイミド化合物などが好都合に用いられる。また、アミノ基同志を架橋する際にも、一方のアミノ基にジチオピリジル基を有する活性エステル試薬（例えば、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）など）を反応させた後還元することによりチオール基を導入し、他方のアミノ基にマレイミド活性エステル試薬によりマレイミド基を導入後、両者を反応させることもできる。
（２）モノクローナル抗体の作製
本発明の抗原は、温血動物に対して、例えば腹腔内注入、静脈内注入、皮下注射などの投与方法によって、抗体産生が可能な部位にそれ自体単独であるいは担体、希釈剤と共に投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行われる。温血動物としては、例えばサル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどがあげられるが、モノクローナル抗体作製にはマウスが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体の作製に際しては、本発明の抗原を免疫された温血動物、たとえばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、本発明の抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。血清中の本発明の抗体の抗体価の測定は、例えば本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを放射性物質または酵素などで標識し、抗血清と反応させた後、抗体に結合した標識剤の活性を測定することによりなされる。融合操作は既知の方法、例えばケーラーとミルスタインの方法〔Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻、４９５頁（１９７５年）〕に従い実施できる。融合促進剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウィルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧなどが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えばＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０、ＡＰ−１などがあげられ、Ｐ３Ｕ１などが好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄細胞数との好ましい比率は、通常１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくはＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、通常２０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃、通常１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
本発明の抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用でき、例えば配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩あるいはそれらの部分ペプチドを直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識した配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドを加え、固相に結合した本発明の抗体を検出する方法などがあげられる。本発明の抗体のスクリーニング、育種は、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％の牛胎仔血清を含むＲＰＭＩ  １６４０培地、１〜１０％の牛胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行なうことができる。
本発明の抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相あるいはプロテインＡまたはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法など〕に従って行われる。
以上のようにして、ハイブリドーマ細胞を温血動物の生体内又は生体外で培養し、その体液または培養物から抗体を採取することによって、本発明の抗体を製造することができる。
（ａ）配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７もしくは配列番号：１０、または配列番号：２６で表されるアミノ酸配列を含有するタンパク質の一部領域と反応する本発明の抗体を産生するハイブリドーマ、および（ｂ）上記タンパク質とは反応するが、その一部領域とは反応しない本発明の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングは、例えば、その一部領域に相当するペプチドとハイブリドーマが産生する抗体との結合性を測定することにより行うことができる。
本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターに特異的に反応する二重特異性モノクローナル抗体は、公知の方法に準じて製造することができる。
〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、自体公知またはそれに準じる方法に従って製造することができる。例えば、免疫抗原自体、またはそれとキャリアータンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に温血動物に免疫を行ない、該免疫動物から本発明の抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行なうことにより製造することができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアータンパク質との複合体に関し、キャリアータンパク質の種類およびキャリアータンパク質とハプテンとの混合比は、キャリアータンパク質に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、どのようなものをどのような比率で架橋させてもく、例えば、ウシ血清アルブミンやウシサイログロブリン、ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合で架橋させる方法が用いられる。
また、ハプテンとキャリアータンパク質の架橋には、種々の縮合剤を用いることができ、グルタルアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。
縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位に、それ自体または担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された温血動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、例えば上記（２）で述べたハイブリドーマ培養上清の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明で用いられるタンパク質もしくはレセプターまたはその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ（以下、アンチセンスポリヌクレオチドの説明においては、これらのＤＮＡを、本発明のＤＮＡと略記する場合がある））の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を有するアンチセンスポリヌクレオチドとしては、本発明のポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）の塩基配列に相補的な、または実質的に相補的な塩基配列またはその一部を含有し、該ＤＮＡの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、いずれのアンチセンスポリヌクレオチドであってもよく、アンチセンスＤＮＡが好ましい。
本発明のＤＮＡに実質的に相補的な塩基配列とは、例えば、本発明のＤＮＡに相補的な塩基配列（すなわち、本発明のＤＮＡの相補鎖）の全塩基配列あるいは部分塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、本発明のＤＮＡの相補鎖の全塩基配列うち、（イ）翻訳阻害を指向したアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、本発明のタンパク質のＮ末端部位をコードする部分の塩基配列（例えば、開始コドン付近の塩基配列など）の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドが、（ロ）ＲＮａｓｅＨによるＲＮＡ分解を指向するアンチセンスポリヌクレオチドの場合は、イントロンを含む本発明のＤＮＡの全塩基配列の相補鎖と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有するアンチセンスポリヌクレオチドがそれぞれ好適である。
具体的には、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８．配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補的な、もしくは実質的に相補的な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチド、好ましくは例えば、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１２または配列番号：３５で表わされる塩基配列を含有するＤＮＡの塩基配列に相補な塩基配列、またはその一部分を有するアンチセンスポリヌクレオチドなどが挙げられる。
アンチセンスポリヌクレオチドは通常、１０〜４０個程度、好ましくは１５〜３０個程度の塩基から構成される。
ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、アンチセンスＤＮＡを構成する各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）は、例えば、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオネートなどの化学修飾リン酸残基に置換されていてもよい。また、各ヌクレオチドの糖（デオキシリボース）は、２’−Ｏ−メチル化などの化学修飾糖構造に置換されていてもよいし、塩基部分（ピリミジン、プリン）も化学修飾を受けたものであってもよく、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１２または配列番号：３５で表わされる塩基配列を有するＤＮＡにハイブリダイズするものであればいずれのものでもよい。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、公知のＤＮＡ合成装置などを用いて製造することができる。
本発明に従えば、本発明のタンパク質遺伝子の複製または発現を阻害することのできる該遺伝子に対応するアンチセンスポリヌクレオチド（核酸）を、クローン化した、あるいは決定されたタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列情報に基づき設計し、合成しうる。かかるアンチセンスポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質遺伝子のＲＮＡとハイブリダイズすることができ、該ＲＮＡの合成または機能を阻害することができるか、あるいは本発明のタンパク質関連ＲＮＡとの相互作用を介して本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御することができる。本発明のタンパク質関連ＲＮＡの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、および本発明のタンパク質関連ＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、生体内および生体外で本発明のタンパク質遺伝子の発現を調節・制御するのに有用であり、また病気などの治療または診断に有用である。用語「対応する」とは、遺伝子を含めたヌクレオチド、塩基配列または核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相補的であることを意味する。ヌクレオチド、塩基配列または核酸とタンパク質との間で「対応する」とは、ヌクレオチド（核酸）の配列またはその相補体から誘導される（指令にある）タンパク質のアミノ酸を通常指している。タンパク質遺伝子の５’端ヘアピンループ、５’端６−ベースペア・リピート、５’端非翻訳領域、ポリペプチド翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ＯＲＦ翻訳終止コドン、３’端非翻訳領域、３’端パリンドローム領域または３’端ヘアピンループなどは、好ましい対象領域として選択しうるが、タンパク質遺伝子内の如何なる領域も対象として選択しうる。
目的核酸と、対象領域の少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチドとの関係については、目的核酸が対象領域とハイブリダイズすることができる場合は、その目的核酸は、当該対象領域のポリヌクレオチドに対して「アンチセンス」であるということができる。アンチセンスポリヌクレオチドは、２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、Ｄ−リボースを含有しているポリヌクレオチド、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるその他のタイプのポリヌクレオチド、非ヌクレオチド骨格を有するその他のポリマー（例えば、市販のタンパク質核酸および合成配列特異的な核酸ポリマー）または特殊な結合を含有するその他のポリマー（但し、該ポリマーはＤＮＡやＲＮＡ中に見出されるような塩基のペアリングや塩基の付着を許容する配置をもつヌクレオチドを含有する）などが挙げられる。それらは、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、２本鎖ＲＮＡ、１本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドであってもよく、さらに非修飾ポリヌクレオチド（または非修飾オリゴヌクレオチド）、公知の修飾の付加されたもの、例えば当該分野で知られた標識のあるもの、キャップの付いたもの、メチル化されたもの、１個以上の天然のヌクレオチドを類縁物で置換したもの、分子内ヌクレオチド修飾のされたもの、例えば非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）を持つもの、電荷を有する結合または硫黄含有結合（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を持つもの、例えばタンパク質（例、ヌクレアーゼ、ヌクレアーゼ・インヒビター、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなど）や糖（例、モノサッカライドなど）などの側鎖基を有しているもの、インターカレント化合物（例、アクリジン、ソラレンなど）を持つもの、キレート化合物（例えば、金属、放射活性をもつ金属、ホウ素、酸化性の金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合を持つもの（例えば、αアノマー型の核酸など）であってもよい。ここで「ヌクレオシド」、「ヌクレオチド」および「核酸」とは、プリンおよびピリミジン塩基を含有するのみでなく、修飾されたその他の複素環型塩基をもつようなものを含んでいて良い。このような修飾物は、メチル化されたプリンおよびピリミジン、アシル化されたプリンおよびピリミジン、あるいはその他の複素環を含むものであってよい。修飾されたヌクレオチドおよび修飾されたヌクレオチドはまた糖部分が修飾されていてよく、例えば、１個以上の水酸基がハロゲンとか、脂肪族基などで置換されていたり、またはエーテル、アミンなどの官能基に変換されていてよい。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは修飾された核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）である。修飾された核酸の具体例としては、核酸の硫黄誘導体、チオホスフェート誘導体、ポリヌクレオシドアミドやオリゴヌクレオシドアミドの分解に抵抗性のものなどが挙げられる。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、以下のように設計されうる。すなわち、細胞内でのアンチセンスポリヌクレオチドをより安定なものにする、アンチセンスポリヌクレオチドの細胞透過性をより高める、目標とするセンス鎖に対する親和性をより大きなものにする、また、もし毒性があるような場合はアンチセンスポリヌクレオチドの毒性をより小さなものにする。このような修飾は、例えばＰｈａｒｍ  Ｔｅｃｈ  Ｊａｐａｎ，８巻，２４７頁または３９５頁，１９９２年、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３年などで数多く報告されている。
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、変化せしめられたり、修飾された糖、塩基、結合を含有していて良く、リポゾーム、ミクロスフェアのような特殊な形態で供与されたり、遺伝子治療により適用されたり、付加された形態で与えられることができうる。こうして付加形態で用いられるものとしては、リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体、細胞膜との相互作用を高めたり、核酸の取込みを増大せしめるような脂質（例、ホスホリピド、コレステロールなど）などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、コレステロールやその誘導体（例、コレステリルクロロホルメート、コール酸など）が挙げられる。こうしたものは、核酸の３’端または５’端に付着させることができ、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることができうる。その他の基としては、核酸の３’端または５’端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。こうしたキャップ用の基としては、ポリエチレングリコール、テトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
アンチセンスポリヌクレオチドの阻害活性は、本発明の形質転換体、本発明の生体内や生体外の遺伝子発現系、または本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの生体内や生体外の翻訳系を用いて調べることができる。
以下に、（ａ）本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合を阻害する物質、（ｂ）本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質、（ｃ）本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質、（ｄ）本発明の抗体、（ｅ）本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどの用途を説明する。
〔１〕癌の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤
本発明で用いられるタンパク質は癌組織で発現が増加し、本発明で用いられるレセプターと結合する。本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターは、癌細胞（例、ヒト肺癌細胞など）で同時に発現しているので、本発明で用いられるレセプターによって誘導される浸潤能の亢進を伴った細胞増殖促進が自己完結的に起こり（オートクライン増殖促進）、癌の進展・悪性化に寄与している。本発明で用いられるレセプターは、本発明で用いられるタンパク質が結合することによって活性化（例、リン酸化）され、活性化に至るメカニズムには、例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体などのチロシンキナーゼが関与する。上記のような癌細胞の増殖促進現象は、例えば（ｉ）本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合、（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質の活性（本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性、本発明で用いられるレセプター結合活性など）、（ｉｉｉ）本発明で用いられるレセプターの活性化誘導（例、リン酸化される活性誘導・促進など）などを阻害することにより消失する。また、本発明の抗体、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、癌細胞のアポトーシス誘導・促進作用、増殖抑制作用などを有する。本発明の抗体、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドが本発明で用いられるタンパク質に結合し、該タンパク質の発現を阻害することにより、癌細胞は増殖が抑制され、アポトーシスが誘導・促進される。
従って、（ａ）本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合を阻害する物質、（ｂ）本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質、（ｃ）本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質、（ｄ）本発明の抗体（その塩も含む）または本発明のアンチセンスポリヌクレオチドなどを含有する医薬は、低毒性で安全な、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などの医薬として使用することができる。
本発明の抗体または上記物質を含有する上記剤は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、腹腔内投与、皮下投与など）に投与することができる。
本発明の抗体または上記物質は、それ自体を投与しても良いし、または適当な医薬組成物として投与しても良い。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の抗体または上記物質と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであっても良い。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤、ワクチン等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調整できる。注射剤の調整方法としては、例えば、本発明の抗体または上記物質を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（５０ｍｏｌ）ａｄｄｕｃｔ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎａｔｅｄ  ｃａｓｔｏｒ  ｏｉ１）〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、本発明の抗体または上記物質を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されても良い。
経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
なお前記した各組成物は、上記抗体または物質との配合により好ましくない相互作用を生じない限り他の活性成分を含有してもよい。
上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。抗体または物質の含有量としては、投薬単位剤形当たり通常５〜５００ｍｇ、とりわけ注射剤では５〜１００ｍｇ、その他の剤形では１０〜２５０ｍｇの上記抗体または物質が含有されていることが好ましい。
上記の剤の投与量は、投与対象、対象疾患、症状、投与ルートなどによっても異なり、例えば、成人の乳癌の治療・予防のために使用する場合には、本発明の抗体または物質を１回量として、通常０．０１〜２０ｍｇ／ｋｇ体重程度、好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重程度、さらに好ましくは０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重程度を、１日１〜５回程度、好ましくは１日１〜３回程度、静脈注射により投与するのが好都合である。他の非経口投与および経口投与の場合もこれに準ずる量を投与することができる。症状が特に重い場合には、その症状に応じて増量してもよい。
さらに、本発明の抗体および上記物質は、他の薬剤、例えばアルキル化剤（例、サイクロフォスファミド、イフォスファミド等）、代謝拮抗剤（例、メソトレキセート、５−フルオロウラシル等）、抗癌性抗生物質（例、マイトマイシン、アドリアマイシン等）、植物由来抗癌剤（例、ビンクリスチン、ビンデシン、タキソール等）、シスプラチン、カルボプラチン、エトポキシドなどと併用してもよい。本発明の抗体または上記物質および上記薬剤は、同時または異なった時間に、患者に投与すればよい。
〔２〕本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの定量
本発明の抗体を用いることにより、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの測定または組織染色などによる検出を行なうことができる。これらの目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、また抗体分子のＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’またはＦａｂ画分などを用いてもよい。
本発明の抗体を用いる測定法は、特に制限されるべきものではなく、被測定液中の抗原量（例えば、本発明で用いられるタンパク質またはレセプター量）に対応した抗体、抗原もしくは抗体−抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。例えば、サンドイッチ法、競合法、イムノメトリック法、ネフロメトリーなどが用いられるが、感度、特異性の点で後述するサンドイッチ法、競合法が、特にサンドイッチ法が好ましい。
（１）サンドイッチ法
サンドイッチ法においては、不溶化した本発明の抗体に被検液を反応（１次反応）させ、さらに標識化された本発明の抗体を反応（２次反応）させた後、不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの量を定量することができる。１次反応と２次反応は同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。また、サンドイッチ法による免疫測定法において、固相用抗体あるいは標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも１種類である必要はなく、測定感度を向上させる等の目的で２種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。すなわち、１次反応および２次反応に用いられる抗体は、例えば、２次反応で用いられる抗体が、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターのＣ端部を認識する場合、１次反応で用いられる抗体は、好ましくはＣ端部以外、例えばＮ端部を認識する抗体が用いられる。
（２）競合法
本発明の抗体、被検液および標識化された本発明で用いられるタンパク質またはレセプターとを競合的に反応させ、該抗体に結合した標識化された本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの割合を測定することにより、被検液中の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを定量する。
本反応法は、例えば、固相化法を用いて行う。
具体例としては、抗マウスＩｇＧ抗体（ＩＣＮ／ＣＡＰＰＥＬ社製）を固相化抗体として用い、この固相化抗体の存在するプレートに、（ｉ）本発明の抗体、（ｉｉ）ＨＲＰで標識化された本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、および（ｉｉｉ）被検液を添加し、反応後、固相に吸着したＨＲＰ活性を測定し、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを定量する。
（３）イムノメトリック法
イムノメトリック法では、被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化された本発明の抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、あるいは被検液中の抗原と過剰量の標識化された本発明の抗体とを反応させ、次に固相化抗原を加え未反応の標識化された本発明の抗体を固相に結合させたのち、固相と液相を分離する。次に、いずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
（４）ネフロメトリー
ネフロメトリーでは、ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じた不溶性の沈降物の量を測定する。被検液中の抗原量が僅かであり、少量の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリーなどが好適に用いられる。
上記（１）〜（４）において、標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ランタニド元素などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔１２５Ｉ〕、〔１３１Ｉ〕、〔３Ｈ〕、〔１４Ｃ〕などが、酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えばβ−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが、蛍光物質としては、例えばシアニン蛍光色素（例、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャムバイオサイエンス社製）など）、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが、発光物質としては、例えばルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどがそれぞれ挙げられる。さらに、抗体と標識剤との結合にビオチン−アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、物理吸着を用いてもよく、また通常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。担体としては、例えばアガロース、デキストラン、セルロースなどの不溶性多糖類、例えばポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリコンなどの合成樹脂あるいはガラスなどが挙げられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる［例えば、入江  寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江  寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ」Ｖｏｌ．７０（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ａ））、同書Ｖｏｌ．７３（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｂ））、同書Ｖｏｌ．７４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｃ））、同書Ｖｏｌ．８４（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ））、同書Ｖｏｌ．９２（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｅ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ））、同書Ｖｏｌ．１２１（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｐａｒｔ  Ｉ：Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））（以上、アカデミックプレス社発行）など参照］。したがって、本発明のサンドイッチ免疫測定法などよる測定系を構築する場合、その方法は後述する実施例に限定されない。
以上のように、本発明の抗体は、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを感度良く定量することができるので、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの生理機能のさらなる解明、および本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの関与する疾患の診断に有用である。具体的には、本発明の抗体を用いて、組織中や体液中（血液、血漿、血清、尿など）に含まれる本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの量を測定することにより、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）などを診断することができる。
〔３〕疾病に対する医薬候補物のスクリーニング
本発明で用いられるタンパク質は癌組織で発現が増加し、また、本発明で用いられるレセプターと結合する。本発明で用いられるタンパク質および本発明で用いられるレセプターは、癌細胞（例、ヒト肺癌細胞など）で同時に発現しているので、本発明で用いられるレセプターによって誘導される浸潤能の亢進を伴った細胞増殖促進が自己完結的に起こり（オートクライン増殖促進）、癌の進展・悪性化に寄与している。本発明で用いられるレセプターは、本発明で用いられるタンパク質が結合することによって活性化（例、リン酸化）され、活性化に至るメカニズムには、例えば肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体などのチロシンキナーゼが関与する。上記のような癌細胞の増殖促進現象は、例えば（ｉ）本発明で用いられるタンパク質と本発明で用いられるレセプターとの結合、（ｉｉ）本発明で用いられるタンパク質の活性（本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性、本発明で用いられるレセプター結合活性など）、（ｉｉｉ）本発明で用いられるレセプターの活性化誘導（例、リン酸化される活性誘導・促進など）などを阻害することにより消失し、癌細胞の増殖阻害が起こりアポトーシスが誘導される。
従って、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの活性を阻害する化合物またはその塩は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターは、本発明のタンパク質またはレセプターの活性を阻害する物質のスクリーニングのための試薬として、それぞれ有用である。
すなわち、本発明は、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを用いることを特徴とする、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの活性を阻害する物質のスクリーニング方法を提供する。
本発明で用いられるタンパク質の活性（例、本発明で用いられるレセプター結合活性など）を阻害する物質のスクリーニング方法としては、例えば、本発明のタンパク質および本発明で用いられるレセプターのそれぞれを、タグを付加した組換え型タンパク質として動物細胞で発現させる。該タグとしては、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなどが用いられ、本発明のタンパク質に付加するタグ（タグＡ）と、本発明で用いられるレセプターに付加するタグ（タグＢ）とは異なるものを用いる。タグＢに対する抗体で、（ｉ）上記タグＡ付加タンパク質および上記タグＢ付加レセプターの混合液、または（ｉｉ）試験化合物、上記タグＡ付加タンパク質および上記タグＢ付加レセプターの混合液をそれぞれ免疫沈降し、得られた沈殿物を、タグＡに対する抗体を用いてウェスタンブロッティング操作を行うことにより、本発明で用いられるレセプターに結合した本発明で用いられるタンパク質の量をそれぞれ測定し、上記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合とで比較する。
本発明で用いられるタンパク質の活性（例、本発明で用いられるレセプターのリン酸化誘導・促進活性など）を阻害する物質のスクリーニング方法としては、例えば、タグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、（ｉ）本発明で用いられるタンパク質、または（ｉｉ）試験化合物および本発明で用いられるタンパク質と、それぞれ反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降し、リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量を、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウェスタンブロット法など）により測定し、上記（ｉ）の場合と（ｉｉ）の場合とで比較する。リン酸化誘導・促進活性は、自体公知の方法、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２００巻、９８頁−１０７頁、１９９１年に記載の方法またはそれに準じた方法に従って行えばよい。
例えば、上記（ｉｉ）の場合における本発明で用いられるタンパク質の活性を、上記（ｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明で用いられるタンパク質の活性を阻害する物質として選択することができる。
本発明で用いられるレセプターの活性（例、リン酸化される活性など）を阻害する物質のスクリーニング方法の具体例としては、例えば、タグ（例、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、Ｖ５、ｍｙｃ、ＨＡなど）をＣ末端に付加した本発明で用いられるレセプターを、組換え型タンパク質として動物細胞に発現させ、（ｉ’）本発明で用いられるタンパク質、または（ｉｉ’）本発明で用いられるタンパク質および試験化合物と、それぞれ反応させた後、細胞を破砕し、無細胞抽出液を調製し、抗タグ抗体で免疫沈降し、リン酸化された本発明で用いられるレセプターの生成量を、抗リン酸化チロシン抗体などを用いて公知の方法（例、ウェスタンブロット法など）により定量し、上記（ｉ’）の場合と（ｉｉ’）の場合とで比較する。
例えば、上記（ｉｉ’）の場合における本発明で用いられるレセプターの活性を、上記（ｉ’）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する化合物として選択することができる。
上記の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有する細胞としては、例えば、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするＤＮＡを含有するベクターで形質転換された宿主（形質転換体）が用いられる。宿主としては、例えば、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞などの動物細胞が好ましく用いられる。該スクリーニングには、例えば、前述の方法で培養することによって、本発明のタンパク質を細胞膜上に発現させた形質転換体が好ましく用いられる。本発明のタンパク質を発現し得る細胞の培養方法は、前記した本発明の形質変換体の培養法と同様である。
試験化合物としては、例えばペプチド、タンパク質、抗体、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられる。
さらに、本発明で用いられるタンパク質の遺伝子も、癌組織において発現が増加するので、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発現を阻害する物質も、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臟癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
したがって、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物またはその塩のスクリーニングのための試薬として有用である。
スクリーニング方法としては、（ｉｉｉ）本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合と、（ｉｖ）試験化合物の存在下、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有する細胞を培養した場合との比較を行うことを特徴とするスクリーニング方法が挙げられる。
上記方法において、（ｉｉｉ）と（ｉｖ）の場合における、前記遺伝子の発現量（具体的には、本発明で用いられるタンパク質またはレセプター量または本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするｍＲＮＡ量）を測定して、比較する。
試験化合物および本発明のタンパク質を産生する能力を有する細胞としては、上記と同様のものが挙げられる。
タンパク質量の測定は、公知の方法、例えば、本発明の抗体を用いて、細胞抽出液中などに存在する前記タンパク質を、ウェスタン解析、ＥＬＩＳＡ法などの方法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
ｍＲＮＡ量の測定は、公知の方法、例えば、プローブとして配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：３５で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるノーザンハイブリダイゼーション、あるいはプライマーとして配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、配列番号：１１または配列番号：３５で表される塩基配列またはその一部を含有する核酸を用いるＰＣＲ法またはそれに準じる方法に従い測定することができる。
例えば、上記（ｉｖ）の場合における遺伝子の発現を、上記（ｉｉｉ）の場合に比べて、約２０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは約５０％以上阻害させる試験化合物を、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発現を阻害する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、または本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを産生する能力を有する細胞などを含有する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質は、上記した試験化合物、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などから選ばれる。
該塩としては、前記した本発明のタンパク質の塩と同様のものが用いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる物質を上述の剤として使用する場合、常套手段に従って製剤化することができる。
例えば、経口投与または非経口投与のための組成物としては、上記〔１〕で記載した組成物と同様のものが挙げられ、同様に製造でき、同様に使用できる。
〔４〕遺伝子診断薬
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするポリヌクレオチド（例、ＤＮＡ）は、例えば、プローブとして使用することにより、ヒトまたは温血動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）における本発明で用いられるタンパク質またはレセプターまたはその部分ペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡの異常（遺伝子異常）を検出することができるので、例えば、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの損傷、突然変異あるいは発現低下や、該ＤＮＡまたはｍＲＮＡの増加あるいは発現過多などの遺伝子診断薬として有用である。
上記の遺伝子診断は、例えば、自体公知のノーザンハイブリダイゼーションやＰＣＲ−ＳＳＣＰ法（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，第５巻，８７４〜８７９頁（１９８９年）、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，第８６巻，２７６６〜２７７０頁（１９８９年））などにより実施することができる。
例えば、ノーザンハイブリダイゼーションにより発現過多が検出された場合やＰＣＲ−ＳＳＣＰ法によりＤＮＡの突然変異などが検出された場合は、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）である可能性が高いと診断することができる。
〔５〕アンチセンスポリヌクレオチド含有医薬
本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは低毒性であり、本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、それをコードするＤＮＡの生体内における機能や作用を抑制し、癌細胞のアポトーシスを誘導することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドを上記の剤などとして使用する場合、自体公知の方法に従って製剤化し、投与することができる。
また、例えば、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独あるいはレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノウイルスアソシエーテッドウイルスベクターなどの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的に投与することができる。該アンチセンスポリヌクレオチドは、そのままで、あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認められる担体とともに製剤化し、遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる。あるいは、エアロゾル化して吸入剤として気管内に局所投与することもできる。
さらに、体内動態の改良、半減期の長期化、細胞内取り込み効率の改善を目的に、前記のアンチセンスポリヌクレオチドを単独またはリポゾームなどの担体とともに製剤（注射剤）化し、静脈、皮下等に投与してもよい。
該アンチセンスポリヌクレオチドの投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、乳癌の治療の目的で本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを投与する場合、一般的に成人（休重６０ｋｇ）においては、一日につき該アンチセンスポリヌクレオチドを約０．１〜１００ｍｇ投与する。
さらに、該アンチセンスポリヌクレオチドは、組織や細胞における本発明のＤＮＡの存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
上記アンチセンスポリヌクレオチドと同様に、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするＲＮＡの一部を含有する二重鎖ＲＮＡ、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするＲＮＡの一部を含有するリボザイムなども、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの遺伝子の発現を抑制することができ、生体内における本発明で用いられるタンパク質またはレセプター、またはそれをコードするＤＮＡの機能を抑制することができるので、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして使用することができる。
二重鎖ＲＮＡは、公知の方法（例、Ｎａｔｕｒｅ，４１１巻，４９４頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。
リボザイムは、公知の方法（例、ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７巻，２２１頁，２００１年）に準じて、本発明のポリヌクレオチドの配列を基に設計して製造することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部に公知のリボザイムを連結することによって製造することができる。本発明のタンパク質をコードするＲＮＡの一部としては、公知のリボザイムによって切断され得る本発明のＲＮＡ上の切断部位に近接した部分（ＲＮＡ断片）が挙げられる。
上記の二重鎖ＲＮＡまたはリボザイムを上記剤として使用する場合、アンチセンスポリヌクレオチドと同様にして製剤化し、投与することができる。
〔６〕本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを含有する医薬
本発明で用いられるタンパク質は癌で過剰に発現しており、本発明で用いられるレセプターも癌細胞で発現していることから、癌患者の免疫系を活性化するために本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを癌ワクチンとして用いることもできる。
例えば、強力な抗原提示細胞（例、樹状細胞）を本発明で用いられるタンパク質またはレセプター存在下培養し、該タンパク質を貪食させた後に、再び患者の体内に戻す、所謂養子免疫療法などを好ましく適用し得る。体内に戻された樹状細胞は癌抗原特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導、活性化することにより癌細胞を死滅させることが可能である。
また、本発明のタンパク質またはレセプターは、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防または治療のためのワクチン製剤として、安全に、哺乳動物（例、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ）に投与することもできる。
該ワクチン製剤は、通常、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターおよび生理学的に許容されうる担体を含有する。担体としては例えば、水、食塩水（生理食塩水を含む）、緩衝液（例、リン酸緩衝液）、アルコール（例、エタノール）などの液体の担体があげられる。
ワクチン製剤は、通常のワクチン製剤の製造方法に従って調製することができる。
通常、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターは、生理学的に許容されうる担体に溶解または懸濁される。また、本発明で用いられるタンパク質と生理学的に許容されうる担体とを別々に調製し、用時それらを混合して用いてもよい。
ワクチン製剤には、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターおよび生理学的に許容されうる担体に加え、アジュバント（例、水酸化アルミニウムゲル、血清アルブミンなど）、防腐剤（例、チメロサールなど）、無痛化剤（例、ブドウ糖、ベンジルアルコールなど）などを配合させてもよい。また、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターに対する抗体産生を促進させるために、例えばサイトカイン（例、インターロイキン−２などのインターロイキン類、インターフェロン−γなどのインターフェロン類など）をさらに配合させてもよい。
ワクチン製剤として用いる際、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターは活性体として用いてもよいが、抗原性を高めるために変性させてもよい。変性は、通常、加熱処理、タンパク質変性剤（例、ホルマリン、塩酸グアニジン、尿素）による処理により行われる。
得られたワクチン製剤は低毒性であり、通常注射剤として、例えば皮下、皮内、筋肉内に投与してもよく、また癌細胞塊またはその近傍に局所的に投与してもよい。
本発明で用いられるタンパク質またはレセプターの投与量は、例えば対象疾患、投与対象、投与ルートなどによって異なるが、例えば本発明で用いられるタンパク質またはレセプターを癌に罹患した成人（体重６０ｋｇ）に皮下的に注射剤として投与する場合、１回当たり通常０．１〜３００ｍｇ程度、好ましくは１００〜３００ｍｇ程度である。ワクチン製剤の投与回数は１回でもよいが、抗体産生量を高めるために、約２週間〜約６ヶ月の間隔をあけて、該ワクチン製剤を２〜４回投与することもできる。
〔７〕ＤＮＡ転移動物
本発明は、外来性の本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするＤＮＡ（以下、本発明の外来性ＤＮＡと略記する）またはその変異ＤＮＡ（本発明の外来性変異ＤＮＡと略記する場合がある）を有する非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物、
（２）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）記載の動物、
（３）ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第（２）記載の動物、および
（４）本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを含有し、哺乳動物において発現しうる組換えベクターを提供するものである。
本発明の外来性ＤＮＡまたはその変異ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物（以下、本発明のＤＮＡ転移動物と略記する）は、未受精卵、受精卵、精子およびその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、好ましくは、非ヒト哺乳動物の発生における胚発生の段階（さらに好ましくは、単細胞または受精卵細胞の段階でかつ一般に８細胞期以前）に、リン酸カルシウム法、電気パルス法、リポフェクション法、凝集法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、ＤＥＡＥ−デキストラン法などにより目的とするＤＮＡを転移することによって作出することができる。また、該ＤＮＡ転移方法により、体細胞、生体の臓器、組織細胞などに目的とする本発明の外来性ＤＮＡを転移し、細胞培養、組織培養などに利用することもでき、さらに、これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させることにより本発明のＤＮＡ転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、例えば、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、マウス、ラットなどが用いられる。なかでも、病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが比較的短く、また、繁殖が容易なゲッ歯動物、とりわけマウス（例えば、純系として、Ｃ５７ＢＬ／６系統，ＤＢＡ２系統など、交雑系として、Ｂ６Ｃ３Ｆ１系統，ＢＤＦ１系統，Ｂ６Ｄ２Ｆ１系統，ＢＡＬＢ／ｃ系統，ＩＣＲ系統など）またはラット（例えば、Ｗｉｓｔａｒ，ＳＤなど）などが好ましい。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける「哺乳動物」としては、上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外来性ＤＮＡとは、非ヒト哺乳動物が本来有している本発明のＤＮＡではなく、いったん哺乳動物から単離・抽出された本発明のＤＮＡをいう。
本発明の変異ＤＮＡとしては、元の本発明のＤＮＡの塩基配列に変異（例えば、突然変異など）が生じたもの、具体的には、塩基の付加、欠損、他の塩基への置換などが生じたＤＮＡなどが用いられ、また、異常ＤＮＡも含まれる。
該異常ＤＮＡとしては、異常な本発明のタンパク質を発現させるＤＮＡを意味し、例えば、正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を発現させるＤＮＡなどが用いられる。
本発明の外来性ＤＮＡは、対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの哺乳動物由来のものであってもよい。本発明のＤＮＡを対象動物に転移させるにあたっては、該ＤＮＡを動物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合したＤＮＡコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、本発明のヒトＤＮＡを転移させる場合、これと相同性が高い本発明のＤＮＡを有する各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のＤＮＡを発現させうる各種プロモーターの下流に、本発明のヒトＤＮＡを結合したＤＮＡコンストラクト（例、ベクターなど）を対象哺乳動物の受精卵、例えば、マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによって本発明のＤＮＡを高発現するＤＮＡ転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミド、λファージなどのバクテリオファージ、モロニー白血病ウィルスなどのレトロウィルス、ワクシニアウィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウイルスなどが用いられる。なかでも、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記のＤＮＡ発現調節を行なうプロモーターとしては、例えば、（ｉ）ウイルス（例、シミアンウイルス、サイトメガロウイルス、モロニー白血病ウイルス、ＪＣウイルス、乳癌ウイルス、ポリオウイルスなど）に由来するＤＮＡのプロモーター、（ｉｉ）各種哺乳動物（ヒト、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来のプロモーター、例えば、アルブミン、インスリンＩＩ、ウロプラキンＩＩ、エラスターゼ、エリスロポエチン、エンドセリン、筋クレアチンキナーゼ、グリア線維性酸性タンパク質、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、血小板由来成長因子β、ケラチンＫ１，Ｋ１０およびＫ１４、コラーゲンＩ型およびＩＩ型、サイクリックＡＭＰ依存タンパク質キナーゼβＩサブユニット、ジストロフィン、酒石酸抵抗性アルカリフォスファターゼ、心房ナトリウム利尿性因子、内皮レセプターチロシンキナーゼ（一般にＴｉｅ２と略される）、ナトリウムカリウムアデノシン３リン酸化酵素（Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ）、ニューロフィラメント軽鎖、メタロチオネインＩおよびＩＩＡ、メタロプロティナーゼ１組織インヒビター、ＭＨＣクラスＩ抗原（Ｈ−２Ｌ）、Ｈ−ｒａｓ、レニン、ドーパミンβ−水酸化酵素、甲状腺ペルオキシダーゼ（ＴＰＯ）、ペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）、βアクチン、αおよびβミオシン重鎖、ミオシン軽鎖１および２、ミエリン基礎タンパク質、チログロブリン、Ｔｈｙ−１、免疫グロブリン、Ｈ鎖可変部（ＶＮＰ）、血清アミロイドＰコンポーネント、ミオグロビン、トロポニンＣ、平滑筋αアクチン、プレプロエンケファリンＡ、バソプレシンなどのプロモーターなどが用いられる。なかでも、全身で高発現することが可能なサイトメガロウイルスプロモーター、ヒトペプチド鎖延長因子１α（ＥＦ−１α）のプロモーター、ヒトおよびニワトリβアクチンプロモーターなどが好適である。
上記ベクターは、ＤＮＡ転移哺乳動物において目的とするメッセンジャーＲＮＡの転写を終結する配列（一般にターミネターと呼ばれる）を有していることが好ましく、例えば、ウイルス由来および各種哺乳動物由来の各ＤＮＡの配列を用いることができ、好ましくは、シミアンウイルスのＳＶ４０ターミネターなどが用いられる。
その他、目的とする外来性ＤＮＡをさらに高発現させる目的で各ＤＮＡのスプライシングシグナル、エンハンサー領域、真核ＤＮＡのイントロンの一部などをプロモーター領域の５’上流、プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の３’下流に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク質の翻訳領域は、ヒトまたは各種哺乳動物（例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、モルモット、ハムスター、ラット、マウスなど）由来の肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＤＮＡおよび市販の各種ゲノムＤＮＡライブラリーよりゲノムＤＮＡの全てあるいは一部として、または肝臓、腎臓、甲状腺細胞、線維芽細胞由来ＲＮＡより公知の方法により調製された相補ＤＮＡを原料として取得することが出来る。また、外来性の異常ＤＮＡは、上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうるＤＮＡコンストラクトとして、前記のプロモーターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常のＤＮＡ工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において、本発明の外来性ＤＮＡが存在することは、作出動物の後代がすべて、その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを保持することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の外来性ＤＮＡを有する。
本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して、該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。
受精卵細胞段階における本発明の外来性ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の外来性ＤＮＡが過剰に存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の外来性ＤＮＡを過剰に有する。
導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の正常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を促進することにより最終的に本発明のタンパク質の機能亢進症を発症することがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の正常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能亢進症や、本発明のタンパク質が関連する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、本発明の外来性正常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質に関連する疾患に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、本発明の外来性異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、交配により外来性ＤＮＡを安定に保持することを確認して該ＤＮＡ保有動物として通常の飼育環境で継代飼育することが出来る。さらに、目的とする外来ＤＮＡを前述のプラスミドに組み込んで原料として用いることができる。プロモーターとのＤＮＡコンストラクトは、通常のＤＮＡ工学的手法によって作製することができる。受精卵細胞段階における本発明の異常ＤＮＡの転移は、対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。ＤＮＡ転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の異常ＤＮＡが存在することは、作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有することを意味する。本発明の外来性ＤＮＡを受け継いだこの種の動物の子孫は、その胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常ＤＮＡを有する。導入ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得し、この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該ＤＮＡを有するように繁殖継代することができる。
本発明の異常ＤＮＡを有する非ヒト哺乳動物は、本発明の異常ＤＮＡが高発現させられており、内在性の正常ＤＮＡの機能を阻害することにより最終的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、その病態モデル動物として利用することができる。例えば、本発明の異常ＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、具体的な利用可能性としては、本発明の異常ＤＮＡ高発現動物は、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質による正常タンパク質の機能阻害（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ作用）を解明するモデルとなる。
また、本発明の外来異常ＤＮＡを転移させた哺乳動物は、遊離した本発明のタンパク質の増加症状を有することから、本発明のタンパク質または機能不活性型不応症に対する予防・治療剤、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤のスクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記２種類の本発明のＤＮＡ転移動物のその他の利用可能性として、例えば、
（ｉ）組織培養のための細胞源としての使用、
（ｉｉ）本発明のＤＮＡ転移動物の組織中のＤＮＡもしくはＲＮＡを直接分析するか、またはＤＮＡにより発現されたペプチド組織を分析することによる、本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するペプチドとの関連性についての解析、
（ｉｉｉ）ＤＮＡを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、これらを使用して、一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
（ｉｖ）上記（ｉｉｉ）記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリーニング、および
（ｖ）本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症などを含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べることができ、また、本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的所見が得られ、新しい治療方法の開発、さらには、該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、本発明のＤＮＡ転移動物から各臓器を取り出し、細切後、トリプシンなどのタンパク質分解酵素により、遊離したＤＮＡ転移細胞の取得、その培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。さらに、本発明のタンパク質産生細胞の特定化、アポトーシス、分化あるいは増殖との関連性、またはそれらにおけるシグナル伝達機構を調べ、それらの異常を調べることなどができ、本発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、本発明のＤＮＡ転移動物を用いて、本発明のタンパク質の機能不活性型不応症を含む、本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を行なうために、上述の検査法および定量法などを用いて、有効で迅速な該疾患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。また、本発明のＤＮＡ転移動物または本発明の外来性ＤＮＡ発現ベクターを用いて、本発明のタンパク質が関連する疾患のＤＮＡ治療法を検討、開発することが可能である。
〔８〕ノックアウト動物
本発明は、本発明で用いられるタンパク質またはレセプターをコードするＤＮＡ（本発明のＤＮＡ）が不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞および本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、本発明は、
（１）本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
（２）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化された第（１）項記載の胚幹細胞、
（３）ネオマイシン耐性である第（１）項記載の胚幹細胞、
（４）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（１）項記載の胚幹細胞、
（５）ゲッ歯動物がマウスである第（４）項記載の胚幹細胞、
（６）本発明のＤＮＡが不活性化された該ＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物、
（７）該ＤＮＡがレポーター遺伝子（例、大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子）を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうる第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（８）非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第（６）項記載の非ヒト哺乳動物、
（９）ゲッ歯動物がマウスである第（８）項記載の非ヒト哺乳動物、および
（１０）第（７）項記載の動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、該非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡに人為的に変異を加えることにより、ＤＮＡの発現能を抑制するか、もしくは該ＤＮＡがコードしている本発明のタンパク質の活性を実質的に喪失させることにより、ＤＮＡが実質的に本発明のタンパク質の発現能を有さない（以下、本発明のノックアウトＤＮＡと称することがある）非ヒト哺乳動物の胚幹細胞（以下、ＥＳ細胞と略記する）をいう。
非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡに人為的に変異を加える方法としては、例えば、遺伝子工学的手法により該ＤＮＡ配列の一部又は全部の削除、他ＤＮＡを挿入または置換させることによって行なうことができる。これらの変異により、例えば、コドンの読み取り枠をずらしたり、プロモーターあるいはエキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウトＤＮＡを作製すればよい。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞（以下、本発明のＤＮＡ不活性化ＥＳ細胞または本発明のノックアウトＥＳ細胞と略記する）の具体例としては、例えば、目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明のＤＮＡを単離し、そのエキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、あるいはｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ遺伝子）、ｃａｔ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子）を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによりエキソンの機能を破壊するか、あるいはエキソン間のイントロン部分に遺伝子の転写を終結させるＤＮＡ配列（例えば、ｐｏｌｙＡ付加シグナルなど）を挿入し、完全なメッセンジャーＲＮＡを合成できなくすることによって、結果的に遺伝子を破壊するように構築したＤＮＡ配列を有するＤＮＡ鎖（以下、ターゲッティングベクターと略記する）を、例えば相同組換え法により該動物の染色体に導入し、得られたＥＳ細胞について本発明のＤＮＡ上あるいはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析あるいはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列とターゲッティングベクター作製に使用した本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列をプライマーとしたＰＣＲ法により解析し、本発明のノックアウトＥＳ細胞を選別することにより得ることができる。
また、相同組換え法等により本発明のＤＮＡを不活化させる元のＥＳ細胞としては、例えば、前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、また公知ＥｖａｎｓとＫａｕｆｍａの方法に準じて新しく樹立したものでもよい。例えば、マウスのＥＳ細胞の場合、現在、一般的には１２９系のＥＳ細胞が使用されているが、免疫学的背景がはっきりしていないので、これに代わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかなＥＳ細胞を取得するなどの目的で例えば、Ｃ５７ＢＬ／６マウスやＣ５７ＢＬ／６の採卵数の少なさをＤＢＡ／２との交雑により改善したＢＤＦ１マウス（Ｃ５７ＢＬ／６とＤＢＡ／２とのＦ１）を用いて樹立したものなども良好に用いうる。ＢＤＦ１マウスは、採卵数が多く、かつ、卵が丈夫であるという利点に加えて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを背景に持つので、これを用いて得られたＥＳ細胞は病態モデルマウスを作出したとき、Ｃ５７ＢＬ／６マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景をＣ５７ＢＬ／６マウスに代えることが可能である点で有利に用い得る。
また、ＥＳ細胞を樹立する場合、一般には受精後３．５日目の胚盤胞を使用するが、これ以外に８細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、雌雄いずれのＥＳ細胞を用いてもよいが、通常雄のＥＳ細胞の方が生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。また、煩雑な培養の手間を削減するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ＥＳ細胞の雌雄の判定方法としては、例えば、ＰＣＲ法によりＹ染色体上の性決定領域の遺伝子を増幅、検出する方法が、その１例としてあげることができる。この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約１０６個の細胞数を要していたのに対して、１コロニー程度のＥＳ細胞数（約５０個）で済むので、培養初期におけるＥＳ細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうことが可能であり、早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間は大幅に削減できる。
また、第二次セレクションとしては、例えば、Ｇ−バンディング法による染色体数の確認等により行うことができる。得られるＥＳ細胞の染色体数は正常数の１００％が望ましいが、樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場合は、ＥＳ細胞の遺伝子をノックアウトした後、正常細胞（例えば、マウスでは染色体数が２ｎ＝４０である細胞）に再びクローニングすることが望ましい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、通常その増殖性は大変良いが、個体発生できる能力を失いやすいので、注意深く継代培養することが必要である。例えば、ＳＴＯ繊維芽細胞のような適当なフィーダー細胞上でＬＩＦ（１〜１００００Ｕ／ｍｌ）存在下に炭酸ガス培養器内（好ましくは、５％炭酸ガス、９５％空気または５％酸素、５％炭酸ガス、９０％空気）で約３７℃で培養するなどの方法で培養し、継代時には、例えば、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（通常０．００１〜０．５％トリプシン／０．１〜５ｍＭ  ＥＤＴＡ、好ましくは約０．１％トリプシン／１ｍＭ  ＥＤＴＡ）処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダー細胞上に播種する方法などがとられる。このような継代は、通常１〜３日毎に行なうが、この際に細胞の観察を行い、形態的に異常な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。
ＥＳ細胞は、適当な条件により、高密度に至るまで単層培養するか、または細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、頭頂筋、内臓筋、心筋などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり〔Ｍ．Ｊ．Ｅｖａｎｓ及びＭ．Ｈ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ、第２９２巻、１５４頁、１９８１年；Ｇ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、７６３４頁、１９８１年；Ｔ．Ｃ．Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、ジャーナル・オブ・エンブリオロジー・アンド・エクスペリメンタル・モルフォロジー、第８７巻、２７頁、１９８５年〕、本発明のＥＳ細胞を分化させて得られる本発明のＤＮＡ発現不全細胞は、インビトロにおける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、該動物のｍＲＮＡ量を公知方法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、正常動物と区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものが用いられる。
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、例えば、前述のようにして作製したターゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導入し、導入によりターゲッティングベクターの本発明のＤＮＡが不活性化されたＤＮＡ配列が遺伝子相同組換えにより、マウス胚幹細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明のＤＮＡと入れ換わる相同組換えをさせることにより、本発明のＤＮＡをノックアウトさせることができる。
本発明のＤＮＡがノックアウトされた細胞は、本発明のＤＮＡ上またはその近傍のＤＮＡ配列をプローブとしたサザンハイブリダイゼーション解析またはターゲッティングベクター上のＤＮＡ配列と、ターゲッティングベクターに使用したマウス由来の本発明のＤＮＡ以外の近傍領域のＤＮＡ配列とをプライマーとしたＰＣＲ法による解析で判定することができる。非ヒト哺乳動物胚幹細胞を用いた場合は、遺伝子相同組換えにより、本発明のＤＮＡが不活性化された細胞株をクローニングし、その細胞を適当な時期、例えば、８細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。作出された動物は正常な本発明のＤＮＡ座をもつ細胞と人為的に変異した本発明のＤＮＡ座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明のＤＮＡ座をもつ場合、このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、全ての組織が人為的に変異を加えた本発明のＤＮＡ座をもつ細胞で構成された個体を、例えば、コートカラーの判定等により選別することにより得られる。このようにして得られた個体は、通常、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、それらの産仔から本発明のタンパク質のホモ発現不全個体を得ることができる。
卵細胞を使用する場合は、例えば、卵細胞核内にマイクロインジェクション法でＤＮＡ溶液を注入することによりターゲッティングベクターを染色体内に導入したトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、これらのトランスジェニック非ヒト哺乳動物に比べて、遺伝子相同組換えにより本発明のＤＮＡ座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明のＤＮＡがノックアウトされている個体は、交配により得られた動物個体も該ＤＮＡがノックアウトされていることを確認して通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。すなわち、該不活化ＤＮＡの保有する雌雄の動物を交配することにより、該不活化ＤＮＡを相同染色体の両方に持つホモザイゴート動物を取得しうる。得られたホモザイゴート動物は、母親動物に対して、正常個体１，ホモザイゴート複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。ヘテロザイゴート動物の雌雄を交配することにより、該不活化ＤＮＡを有するホモザイゴートおよびヘテロザイゴート動物を繁殖継代する。
本発明のＤＮＡが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、非常に有用である。
また、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のタンパク質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、本発明のタンパク質の生物活性の不活性化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、これらの疾病の原因究明及び治療法の検討に有用である。
〔８ａ〕本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニング方法
本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療・予防効果を有する化合物のスクリーニングに用いることができる。
すなわち、本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、該動物の変化を観察・測定することを特徴とする、本発明のＤＮＡの欠損や損傷などに起因する疾病、例えば癌などに対して治療・予防効果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
該スクリーニング方法において用いられる本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液、血漿などがあげられ、これら化合物は新規な化合物であってもよいし、公知の化合物であってもよい。
具体的には、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物を、試験化合物で処理し、無処理の対照動物と比較し、該動物の各器官、組織、疾病の症状などの変化を指標として試験化合物の治療・予防効果を試験することができる。
試験動物を試験化合物で処理する方法としては、例えば、経口投与、静脈注射などが用いられ、試験動物の症状、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。また、試験化合物の投与量は、投与方法、試験化合物の性質などにあわせて適宜選択することができる。
例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）に対して治療・予防効果を有する化合物をスクリーニングする場合、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に試験化合物を投与し、試験化合物非投与群と癌の発症度合いの違いや癌の治癒度合いの違いを上記組織で経時的に観察する。
該スクリーニング方法において、試験動物に試験化合物を投与した場合、該試験動物の上記疾患症状が約１０％以上、好ましくは約３０％以上、より好ましくは約５０％以上改善した場合、該試験化合物を上記の疾患に対して治療・予防効果を有する化合物として選択することができる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のタンパク質の欠損や損傷などによって引き起こされる疾患に対して治療・予防効果を有するので、該疾患に対する安全で低毒性な予防・治療剤などの医薬として使用することができる。さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸、有機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、該化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、該化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
〔８ｂ〕本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物のスクリーニング方法
本発明は、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物に、試験化合物を投与し、レポーター遺伝子の発現を検出することを特徴とする本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物としては、前記した本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物の中でも、本発明のＤＮＡがレポーター遺伝子を導入することにより不活性化され、該レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの制御下で発現しうるものが用いられる。
試験化合物としては、前記と同様のものがあげられる。
レポーター遺伝子としては、前記と同様のものが用いられ、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）、可溶性アルカリフォスファターゼ遺伝子またはルシフェラーゼ遺伝子などが好適である。
本発明のＤＮＡをレポーター遺伝子で置換された本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物では、レポーター遺伝子が本発明のＤＮＡに対するプロモーターの支配下に存在するので、レポーター遺伝子がコードする物質の発現をトレースすることにより、プロモーターの活性を検出することができる。
例えば、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ領域の一部を大腸菌由来のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）で置換している場合、本来、本発明のタンパク質の発現する組織で、本発明のタンパク質の代わりにβ−ガラクトシダーゼが発現する。従って、例えば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）のようなβ−ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観察することができる。具体的には、本発明のタンパク質欠損マウスまたはその組織切片をグルタルアルデヒドなどで固定し、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄後、Ｘ−ｇａｌを含む染色液で、室温または３７℃付近で、約３０分ないし１時間反応させた後、組織標本を１ｍＭ  ＥＤＴＡ／ＰＢＳ溶液で洗浄することによって、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させ、呈色を観察すればよい。また、常法に従い、ｌａｃＺをコードするｍＲＮＡを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、上記した試験化合物から選ばれた化合物であり、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物は塩を形成していてもよく、該化合物の塩としては、生理学的に許容される酸（例、無機酸など）や塩基（例、アルカリ金属など）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸など）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸など）との塩などが用いられる。
本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物またはその塩は、本発明のタンパク質の発現の阻害、該タンパク質の機能を阻害することができるので、例えば癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤として有用である。
さらに、上記スクリーニングで得られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含有する医薬は、前記した本発明のタンパク質またはその塩を含有する医薬と同様にして製造することができる。
このようにして得られる製剤は、安全で低毒性であるので、例えば、ヒトまたは哺乳動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、対象疾患、投与対象、投与ルートなどにより差異はあるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を経口投与する場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者においては、一日につき該化合物を約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇ投与する。非経口的に投与する場合は、該化合物の１回投与量は投与対象、対象疾患などによっても異なるが、例えば、本発明のＤＮＡに対するプロモーター活性を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（体重６０ｋｇとして）の乳癌患者に投与する場合、一日につき該化合物を約０．０１〜３０ｍｇ、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、体重６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
このように、本発明のＤＮＡ発現不全非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡに対するプロモーターの活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングする上で極めて有用であり、本発明のＤＮＡ発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防・治療剤の開発に大きく貢献することができる。
また、本発明のタンパク質のプロモーター領域を含有するＤＮＡを使って、その下流に種々のタンパク質をコードする遺伝子を連結し、これを動物の卵細胞に注入していわゆるトランスジェニック動物（遺伝子移入動物）を作成すれば、特異的にそのタンパク質を合成させ、その生体での作用を検討することも可能となる。さらに上記プロモーター部分に適当なレポーター遺伝子を結合させ、これが発現するような細胞株を樹立すれば、本発明のタンパク質そのものの体内での産生能力を特異的に促進もしくは抑制する作用を持つ低分子化合物の探索系として使用できる。
本明細書において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ          ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ        ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ            ：アデニン
Ｔ            ：チミン
Ｇ            ：グアニン
Ｃ            ：シトシン
ＲＮＡ          ：リボ核酸
ｍＲＮＡ        ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ        ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ        ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ        ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ        ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ          ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ        ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ          ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ          ：グリシン
Ａｌａ          ：アラニン
Ｖａｌ          ：バリン
Ｌｅｕ          ：ロイシン
Ｉｌｅ          ：イソロイシン
Ｓｅｒ          ：セリン
Ｔｈｒ          ：スレオニン
Ｃｙｓ          ：システイン
Ｍｅｔ          ：メチオニン
Ｇｌｕ          ：グルタミン酸
Ａｓｐ          ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ          ：リジン
Ａｒｇ          ：アルギニン
Ｈｉｓ          ：ヒスチジン
Ｐｈｅ          ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ          ：チロシン
Ｔｒｐ          ：トリプトファン
Ｐｒｏ          ：プロリン
Ａｓｎ          ：アスパラギン
Ｇｌｎ          ：グルタミン
ｐＧｌｕ        ：ピログルタミン酸
Ｓｅｃ          ：セレノシステイン（ｓｅｌｅｎｏｃｙｓｔｅｉｎｅ）
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｍｅ            ：メチル基
Ｅｔ            ：エチル基
Ｂｕ            ：ブチル基
Ｐｈ            ：フェニル基
ＴＣ            ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
Ｔｏｓ          ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ          ：ホルミル
Ｂｚｌ          ：ベンジル
Ｃｌ２−Ｂｚｌ  ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ          ：ベンジルオキシメチル
Ｚ              ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ        ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ        ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ          ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ          ：ジニトロフェニル
Ｔｒｔ          ：トリチル
Ｂｕｍ          ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ        ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ        ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ      ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−
１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ        ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ          ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本願明細書の配列表の配列番号は、以下の配列を示す。
〔配列番号：１〕
ＳＥＭＡ４Ｂのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２〕
配列番号：１７表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４ＢをコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３〕
ＳＥＭＡ４Ｂをコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：４〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：５〕
配列番号：４で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：６〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：７〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：８〕
配列番号：７で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：９〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１０〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：１１〕
配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１２〕
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：１３〕
参考例２、参考例３、参考例１５および参考例１６で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１４〕
参考例２、参考例３、参考例１５および参考例１６で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１５〕
参考例３で用いられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１６〕
参考例３で用いられたオリゴヌクレオチドの塩基配列を示す。
〔配列番号：１７〕
参考例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１８〕
参考例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：１９〕
参考例４、参考例６および参考例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２０〕
参考例４および参考例７で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２１〕
参考例６で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２２〕
参考例８で用いられたペプチド１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２３〕
参考例８で用いられたペプチド２のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２４〕
参考例８で用いられたペプチド３のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２５〕
参考例８で用いられたペプチド４のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２６〕
ＰｌｅｘｉｎＢ１のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号：２７〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２８〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：２９〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３０〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３１〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３２〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３３〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３４〕
実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
ＰｌｅｘｉｎＢ１をコードする全長遺伝子を含むＤＮＡの塩基配列を示す。
〔配列番号：３６〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３７〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号：３８〕
実施例３で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯは、２００３年３月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１６として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯは、２００３年３月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１７として寄託されている。
後述の参考例４で得られた形質転換体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯは、２００３年３月４日から茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号３０５−８５６６）の独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センターに、寄託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−８３１８として寄託されている。
以下において、参考例および実施例により本発明をより具体的にするが、この発明はこれらに限定されるものではない。
参考例１
遺伝子発現解析
肺がん組織で特異的に発現亢進している遺伝子群を明らかにするため、肺がん組織４例、正常肺組織５例から抽出されたｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（表１）を材料とし、ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ９５Ａ，Ｕ９５Ｂ，Ｕ９５Ｃ，Ｕ９５Ｄ，Ｕ９５Ｅ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社）を用いて遺伝子発現解析を行った。実験方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社の実験手引き書（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｍａｎｕａｌ）に従った。
その結果、肺がん組織３例（ｌｏｔ．００１１−１９２−０１２８５、ｌｏｔ．００１１−１９２−０１２９３およびｌｏｔ．００１１−１９２−０１２９７）において、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ（ＳＥＭＡ４Ｂ）および後述の参考例４記載のＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ−Ｍ１（ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１）、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ−Ｍ２（ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２）ならびにＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ  ４Ｂ−Ｍ３（ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３）遺伝子の発現亢進が検出された（表２）。
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参考例２
ヒト肺癌細胞株のアポトーシス誘発
ＳＥＭＡ４Ｂおよび後述の参考例４記載のＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２ならびにＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子の発現を抑制することにより、ヒト肺がん細胞株のアポトーシスが誘発されるか否かを調べた。
まず、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より購入したヒト非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３を、ＲＰＭＩ−１６４０培地（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ含有）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に牛胎仔血清（ＡＴＣＣ）を１０％加えた培地で懸濁し、１ウェル当たり１万個の細胞密度（培地液量０．１ｍｌ）で９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。
具体的には、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の３’非翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１３）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた（以下、アンチセンスオリゴヌクレオチドと略する）。コントロールとしては、配列番号：１３で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１４）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた（以下、コントロールオリゴヌクレオチドと略する）。
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはコントロールオリゴヌクレオチドを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で５倍に希釈し室温で５分間放置したオリゴフェクトアミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と８：３の割合（容量比）で混合し、１ウェル当たり４０μＬの割合でプレートに添加した。オリゴヌクレオチドの終濃度は２５０ｎＭとなるよう調整した。上記の条件で更に３日間培養した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて添付プロトコールに従い、上記の２種類のオリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、アンチセンヌオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）はコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）に比べて約１．６倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ≦０．０１）を示した（表３）。
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参考例３
ＳＥＭＡ４Ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現量の低下
アンチセンスオリゴヌクレオチド投与により、ＳＥＭＡ４Ｂおよび後述の参考例４記載のＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２ならびにＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子の発現量が低下するか否か調ベた。
参考例２で用いたヒト非小細胞肺がん細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３を参考例２と同じ培地に懸濁し、１ウェル当たり６万個の細胞密度（培地液量０．６ｍｌ）で２４穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した後、参考例２の方法に準じてアンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクションした。但し、オリゴヌクレオチドの添加量は１ウェル当たり２４０μＬとし、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして２種類（配列番号：１３および配列番号：１５）、コントロールオリゴヌクレオチドとして２種類（配列番号：１４および配列番号：１６）のオリゴヌクレオチドを用いた。
配列番号：１５および配列番号：１６に由来するアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびコントロールオリゴヌクレオチドに関しては、配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１０で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質の３’非翻訳領域配列にハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド配列（配列番号：１５）を設計後、ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣ精製して導入実験に用いた。配列番号：１５で示される塩基配列のリバース配列（配列番号：１６）を同様にｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ化し、ＨＰＬＣ精製して用いた。
トランスフェクション後、５％炭酸ガス気流中、３７℃で２４時間培養を継続した後にＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを抽出した。約３００ｎｇのトータルＲＮＡを鋳型として、ＴａｑＭａｎ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて添付プロトコールに従い逆転写反応した。トータルＲＮＡにして７〜９ｎｇに相当するｃＤＮＡを鋳型とし、２種類のプライマー（配列番号：１７および配列番号：１８）とＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子の発現コピー数を測定した。同量の鋳型ｃＤＮＡ中に含まれるβ−アクチン遺伝子発現量をＴａｑＭａｎ  β−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて測定し内部標準とした。
オリゴヌクレオチド溶液の代わりに蒸留水を用いた場合（以下、非トランスフェクション群と略する）では、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子発現量の総和はβ−アクチン遺伝子発現量の６．６％であったのに対し、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３および配列番号：１５）投与群では０．９８％および１．１％であり、統計学的に有意（Ｐ≦０．０５）な遺伝子の発現量低下が認められた。
一方、コントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４および配列番号：１６）投与群では４．１％および３．４％であり、非トランスフェクション群と比べて統計学的に有意な発現量低下は認められなかった。
これより、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子の発現抑制とアポトーシス誘導とは相関することがわかった。
参考例４
ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードするｃＤＮＡのクローニングと塩基配列の決定
ヒト肺がん細胞株（Ａ５４９）由来のＭａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、２種のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）を用いてＰＣＲ反応を行った。該反応液５０μｌは、１μｌの上記ｃＤＮＡ、２．５Ｕ  ＰｆｕＴｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）、各１．０μＭのプライマー（配列番号：１９および配列番号：２０）、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ、および２５μｌ  ２ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を含む組成とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・１分、６０℃・１分、７２℃・４分を３０サイクル繰り返し、さらに７２℃・５分間伸長反応を行った。ＰＣＲ反応産物の３’端にｄＡＴＰを付加するため、５ＵのＥｘ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を添加して７２℃・７分間保温した。得られたＰＣＲ反応産物は、ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをＴＯＰＯ  ＴＡ  ＰＣＲクローモングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従いプラスミドベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。これを大腸菌ＴＯＰ１０に導入後、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中でｃＤＮＡを持つクローンを選択した。個々のクローンについて塩基配列を解析した結果、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８、および配列番号：１１で表されるｃＤＮＡの塩基配列がそれぞれ得られた。
ＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０４４５３３遺伝子；ＮＭ＿１９８９２５遺伝子；ＮＭ＿０２０２１０遺伝子）の塩基配列の１〜２３７番目および２７４９〜３７６６番目の塩基配列を、配列番号：２、配列番号：５、配列番号：８および配列番号：１１で表される塩基配列の５’端および３’端にそれぞれ付加した塩基配列をそれぞれ配列番号：３、配列番号：６、配列番号：９および配列番号：１２に示す。
配列番号：２で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１）はＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＸＭ＿０４４５３３遺伝子；ＮＭ＿１９８９２５遺伝子；ＮＭ＿０２０２１０遺伝子）がコードするＳＥＭＡ４Ｂタンパク質と完全に一致した。
配列番号：５で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：４）を含有するタンパク質をＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、配列番号：８で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：７）を含有するタンパク質をＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２、配列番号：１１で表される塩基配列がコードするアミノ酸配列（配列番号：１０）を含有するタンパク質をＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３とそれぞれ命名した。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１のアミノ酸配列（配列番号：４）は、ＳＥＭＡ４Ｂのアミノ酸配列（配列番号：１）の２０８番目のＳｅｒがＩｌｅに置換されている。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：５）では、ＳＥＭＡ４ＢをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）の９０番目のｇがａに、１１１番目のｇがａに、６２３番目のｇがｔにそれぞれ置換されており、６２３番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２のアミノ酸配列（配列番号：７）は、ＳＥＭＡ４Ｂのアミノ酸配列（配列番号：１）の１６３番目のＭｅｔがＩｌｅに置換されている。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：８）では、ＳＥＭＡ４ＢをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）の１５０番目のｇがａに、４８９番目のｇがａに、５２８番目のｃがｔに、ｌ２６６番目のｔがｃに、１５８８番目のｃがａに、２３４３番目のａがｇにそれぞれ置換されており、４８９番目の置換がアミノ酸置換を伴っている。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３のアミノ酸配列（配列番号：１０）は、ＳＥＭＡ４Ｂのアミノ酸配列（配列番号：１）の３６４番目のＬｙｓがＡｓｎに置換されている。
ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３をコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：１１）では、ＳＥＭＡ４ＢをコードするＤＮＡの塩基配列（配列番号：２）の１０９２番目のｇがｔに置換されており、アミノ酸置換を伴っている。
配列番号：２で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをＳＥＭＡ４Ｂ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、配列番号：５で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、配列番号：８で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、配列番号：１１で表される塩基配列を有するＤＮＡを有するプラスミドをＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯとそれぞれ名付けた。
さらに、プラスミドＳＥＭＡ４Ｂ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯが導入された形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、プラスミドＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯが導入された形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、プラスミドＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯが導入された形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ、プラスミドＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯが導入された形質転換体をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯとそれぞれ命名した。
参考例５
ヒト培養細胞株における遺伝子発現量の検討
以下で使用される脳腫瘍細胞株ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ、ＳＫ−Ｎ−ＤＺ、ＳＫ−Ｎ−ＦＩ、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ、Ｄ３４１Ｍｅｄ、Ｄａｏｙ、ＤＢＴＲＧ−０５ＭＧ、Ｕ−１１８  ＭＧ、Ｕ−８７  ＭＧ、ＣＣＦ−ＳＴＴＧ１およびＳＷ  １０８８；ヒト乳癌細胞株ＨＣＣ１９３７、ＺＲ−７５−１、ＡＵ５６５、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１；ヒト大腸癌細胞株Ｃａｃｏ−２、ＣＯＬＯ２０１、ＣＯＬＯ２０５、ＣＯＬＯ  ３２０ＤＭ、ＨＣＴ−８、ＨＴ−２９、Ｌｏｖｏ、ＬＳ１２３、ＳＮＵ−Ｃ１、ＳＫ−ＣＯ−１、ＳＷ  ４０３、ＳＷ  ４８、ＳＷ４８０、ＳＷ  ６２０、ＳＷ  ８３７およびＳＷ  ９４８；ヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３；ヒト小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１８７、ＮＣＩ−Ｈ３７８、ＮＣＩ−Ｈ５２６、ＮＣＩ−Ｈ８８９、ＮＣＩ−Ｈ１６７２、ＮＣＩ−Ｈ１８３６、ＮＣＩ−Ｈ２２２７、ＮＣＩ−Ｎ４１７およびＳＨＰ−７７；ヒト非小細胞肺癌細胞株Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＮＣＩ−Ｈ５２２、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＮＣＩ−Ｈ８１０、ＮＣＩ−Ｈ１１５５、ＮＣＩ−Ｈ１２９９、ＮＣＩ−Ｈ１３９５、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１４３５、ＮＣＩ−Ｈ１５８１、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１７９３、ＮＣＩ−Ｈ１９６３、ＮＣＩ−Ｈ２０７３、ＮＣＩ−Ｈ２０８５、ＮＣＩ−Ｈ２１０６、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ２３４２およびＮＣＩ−Ｈ２３４７；ヒト卵巣癌細胞株ＥＳ−２、Ｃａｏｖ−３、ＭＤＡＨ２７７４、ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ−９０、ＳＫ−ＯＶ−３、ＴＯＶ−１１２ＤおよびＴＯＶ−２１Ｇ；ヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ−１、ＭＩＡ−ＰａＣａ−２、ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３、Ｃａｐａｎ−１およびＣａｐａｎ−２；ヒト前立腺癌細胞株ＤＵ１４５；ヒト網膜芽腫細胞株ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１およびＹ７９；ヒト精巣癌細胞株Ｃａｔｅｓ−１Ｂの８６株は、ＡＴＣＣより購入した。ヒト正常気道上皮細胞ＳＡＥＣおよびヒト正常前立腺上皮細胞ＨＰｒＥＣは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社より購入した。ヒト大腸癌細胞株ＣＯＣＭ１、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＶＭＲＣ−ＬＣＤおよびヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３は、ＪＣＲＢより購入した。これら細胞株は参考例９以降の参考例でも用いることがある。
上記細胞株９１株よりＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてトータルＲＮＡを調製した。このトータルＲＮＡを鋳型としてランダムプライマーを用いた逆転写反応でｃＤＮＡを調製し、定量的ＰＣＲ反応を行うことにより、ＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子（配列番号：２）、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１遺伝子（配列番号：５）、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２遺伝子（配列番号：８）およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子（配列番号：１１）の発現量を検討した。
該ＰＣＲ反応は、上記トータルＲＮＡ  ３〜４ｎｇより得られたｃＤＮＡを鋳型として使用し、参考例３と同一条件でＰＣＲ反応を行い、ＳＥＭＡ４Ｂ、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３遺伝子の発現コピー数を算出した。並行してＴａｑＭａｎＴＭ  Ｈｕｍａｎβ−ａｃｔｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて上記トータルＲＮＡ  １ｎｇに含まれるβ−アクチン遺伝子のコピー数を算出し内部標準とした。
上記遺伝子全体の発現量を、β−アクチン遺伝子発現量で標準化した相対的発現率を表４に示す。
上記遺伝子発現量の総量がβ−アクチン遺伝子発現量の１％を超える癌細胞株が１７株見出され、上記遺伝子の癌細胞株における高発現が認められた。
2005061704.tif 000005
参考例６
組換え型完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
参考例４で得たプラスミドＳＥＭＡ４Ｂ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯを鋳型とし、ＰＣＲでＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子を増幅した。該反応における反応液の組成はＳＥＭＡ４Ｂ／ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ  ２ｎｇを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を２．５Ｕ、２種類のプライマー（配列番号：１９および配列番号：２１）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および１０ｘ  Ｐｆｕ  Ｂｕｆｆｅｒを５μｌ加え、５０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・１分、６０℃・１分、７２℃・４分のサイクルを２５回繰り返し行った。次にＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）にて該ＰＣＲ反応産物を精製した後、制限酵素Ｘｂａ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩにて処理した。プラスミドｐ３ｘＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（Ｓｉｇｍａ社）もＸｂａ  ＩおよびＥｃｏ  ＲＩにて処理した。それぞれのＤＮＡ断片はＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製し、ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を用いてライゲーション反応を行った。ライゲーション反応液を大腸菌ＴＯＰ１０に導入した後、形質転換された大腸菌をアンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択し個々のクローンを解析した結果、ＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子（配列番号：２）に相当するｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂを得た。
参考例７
組換え型タグ付き完全長タンパク質の動物細胞用発現ベクターの構築
ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質のＣ末端に３ｘＦＬＡＧタグを融合したタンパク質を発現する動物細胞用発現ベクターを構築した。ＳＥＭＡ４Ｂ遺伝子をＰＣＲで増幅する時に用いるプライマーペアを、別のプライマーペア（配列番号：１９および配列番号：２０）に変更したこと以外は参考例６記載の方法に従い、形質転換した大腸菌の選別を行った。その結果、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）のＣ末端に３ｘＦＬＡＧタグが融合したタンパク質をコードするｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂ−３ｘＦＬＡＧを得た。
参考例８
ペプチド抗体の作製と精製
ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１タンパク質（配列番号：４）、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２タンパク質（配列番号：７）およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３タンパク質（配列番号：１０）のアミノ酸配列に基づき、１２〜１５アミノ酸からなる以下の４種のペプチド（ペプチド１〜４）をＦｍｏｃ固相合成法により合成した。
ペプチド１のアミノ酸配列〔Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号：２２）〕は、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）の４０２番目から４１２番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
ペプチド２のアミノ酸配列〔Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号：２３）〕のアミノ酸配列は、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）の５８２番目から５９６番目までの配列である。
ペプチド３のアミノ酸配列〔Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号：２４）〕は、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）の７８１番目から７９４番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
ペプチド４のアミノ酸配列〔Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ（配列番号：２５）〕は、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）の７９７番目から８０９番目までのアミノ酸配列のＣ末端に、Ｃｙｓを付加した配列である。
上記ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４のそれぞれのペプチドに、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）をキャリアータンパク質として結合させ抗原とし、以下のように、ウサギポリクローナル抗体を作製した。
免疫動物は雄性ウサギＫＢＬ：ＪＷ（１１週齢、オリエンタル酵母）一羽を用い、初回感作は完全フロインドアジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）懸濁液、２回目以降は不完全フロインドアジュバンド（Ｄｉｆｃｏ社）懸濁液を用いた。感作は背部皮下注射により行い、１回の感作には各抗原０．５ｍｇを用い、初回感作後１４日毎に３回繰り返した。初回感作後５２日目に麻酔下頚動脈採血を行い、血清約５０ｍｌを得た。このようにして得られた血清を硫酸アンモニウム塩析法により濃縮し、得られた粗ＩｇＧ画分全量をプロテインＡアフィニティーカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）により精製し、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３またはペプチド４を免疫したウサギから、それぞれ約１０３ｍｇ、約７６ｍｇ、約１１２ｍｇおよび約１２２ｍｇの精製ＩｇＧを得た。さらに、各々の免疫源ペプチドを固定化したカラムに結合するＩｇＧ画分を取得した。固定化には各ペプチドのＣ末端のＣｙｓを利用し、ホウ酸緩衝液を用いてセファロースカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）にカップリングした。カラムからの溶出には８Ｍ尿素／リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）を用いた。溶出液をＰＢＳに対して透析して尿素を除いた後、限外濃縮、フィルターろ過滅菌することにより、ペプチド１、ペプチド２、ペプチド３およびペプチド４に対するアフィニティー精製抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１およびＡＳ−２５９２を、約１５ｍｇ、約１２６ｍｇ、約１７ｍｇおよび約３５ｍｇずつ取得した。
参考例９
ウサギペプチド抗体を用いたウェスタンブロッティング
ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）の検出は、参考例８で作製した精製ペプチド抗体を用いて行った。ヒト非小細胞肺癌由来ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞１．５×１０６個を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁し、直径１０ｃｍのペトリディッシュに播種した。５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。参考例６で作製したプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂ  ６μｇとＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とを混合し、室温で１５分間放置した後、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）およびＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉを添加し、さらに室温で１５分間放置した。この混合液を培養液に滴下して培養を継続した。発現プラスミド導入２日後に細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、氷冷したＲＩＰＡ緩衝液〔５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸、ＣｏｍｐｌｅｔｅＴＭタブレット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）、Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−２（Ｓｉｇｍａ社）〕１ｍｌを添加し４℃で３０分間放置した。このＲＩＰＡ緩衝液を回収し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。この無細胞抽出液および２倍濃度ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔１２５ｍＭトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、４０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０４％ブロモフェノールブルーおよび５％２−メルカプトエタノール〕を等容量で混合し、９５℃で５分間加熱した後、１０μｌを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動分離したタンパク質は、常法に従いクリアブロットＰ膜（ＡＴＴＯ社）に転写した後、ブロッキング溶液〔５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭ塩化ナトリウム、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、５％スキムミルク〕中に１時間室温放置した。次に、参考例８で作製したペプチド抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１またはＡＳ−２５９２を、３μｇ／ｍｌの濃度となるようブロッキング溶液で希釈し、４℃にて一晩反応させた。続いて、ブロッキング溶液で５万倍または１０万倍に希釈したＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）中で１時間室温放置した。検出にはＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用い、添付プロトコールに従いＳＥＭＡ４Ｂタンパク質を検出した。
ＡＳ−２５３１を除き、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１およびＡＳ−２５９２のいずれを用いた場合でも、分子量１００ｋＤ近傍の位置にＳＥＭＡ４Ｂタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
参考例１０
ウサギペプチド抗体を用いた免疫沈降
参考例８で作製した精製ペプチド抗体を用いて、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の免疫沈降を非変性状態にて行った。
参考例７で得たプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂ−３ｘＦＬＡＧを用いて、参考例９と同様の操作で無細胞抽出液を調製した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を等容量のＲＩＰＡ緩衝液で懸濁した懸濁液５０μｌに無細胞抽出液４００μｌを加え、さらに参考例８記載のペプチド抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１またはＡＳ−２５９２のいずれか一つを５μｇ加えた混合液を調製し、４℃にて一晩撹拌した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ共沈殿画分をＲＩＰＡ緩衝液にて洗浄後、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー〔６２．５ｍＭトリス・塩酸緩衝液、ｐＨ６．８、２０％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルーおよび２．５％２−メルカプトエタノール〕に懸濁し、９５℃で５分間加熱した後、５μｌまたは１０μｌを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。検出は参考例９記載の方法に準拠した。但し、マウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）をブロッキング溶液で０．２μｇ／ｍｌまたは０．１μｇ／ｍｌとなるように希釈したものを一次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）をブロッキング溶液で２．５万倍または５万倍に希釈したものを二次抗体として用いた。
ペプチド抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１およびＡＳ−２５９２のいずれを用いて免疫沈降を行った場合にも、分子量１００ｋＤ近傍にＳＥＭＡ４Ｂタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。
これより、ペプチド抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、ＡＳ−２５９１およびＡＳ−２５９２は、未変性のＳＥＭＡ４Ｂタンパク質と結合することが明らかとなった。
参考例１１
癌細胞株におけるＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の発現検討
肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ１６５１、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ２３ならびにＮＣＩ−Ｈ１７０３；卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ−３ならびにＴＯＶ−２１Ｇ；前立腺癌細胞株ＤＵ１４５；および膵癌細胞株ＰＡＮＣ−１を、直径１０ｃｍのペトリディッシュ２枚で培養した。各々の細胞についてペトリディッシュ１枚分をトリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で分散し、細胞数を計測した。計測した細胞数を基にして、５×１０６個の細胞に対して１ｍｌの割合で氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（参考例９に記載）を残りのペトリディッシュ１枚に添加し、４℃で３０分間放置した。このＲＩＰＡ緩衝液を回収し、１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した上澄液を無細胞抽出液とした。一方、ＳｉｚｅＴＭ  Ｘ  ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）の添付プロトコールに従い参考例８記載のペプチド抗体ＡＳ−２５３１をＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に架橋した樹脂を用意し、等容量のＲＩＰＡ緩衝液で懸濁した。この懸濁液３０μｌに前述の無細胞抽出液４００μｌを加え、４℃にて一晩撹拌を行った。ＰｒｏｔｅｉｎＧ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ共沈殿画分をＲＩＰＡ緩衝液にて洗浄後、参考例１０記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファ−３０μｌに懸濁し９５℃で５分間加熱した後、２０μｌを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。検出はペプチド抗体ＡＳ−２５３２を用いて参考例９記載の方法に準じて行った。
上記９種類の細胞株の中で、ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ３５８、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＳＫＯＶ−３、ＤＵ１４５およびＰＡＮＣ−１の各細胞株において、分子量１００ｋＤ近傍に、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質に由来する特異的なバンドが認められた。これより、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質が、上記６種類の癌細胞株で高発現していることが明らかとなった。
参考例１２
組換え型完全長タンパク質安定発現細胞株の樹立
ヒト非小細胞肺がん由来ＮＣＩ−Ｈ３５８細胞２．０×１０５個を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）２ｍｌに懸濁し、６ウェルプレートに播種した後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。一方、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈した参考例６記載のプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂ  １μｇをＰｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）６μｌと混合し室温で１５分間放置した後、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉで希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）４μｌを添加し、さらに室温で１５分間放置した。この混合液を培養液に滴下してさらに１日培養を継続した後、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で細胞を分散し、上記の培養培地にＧ４１８（プロメガ社）を４００μｇ／ｍｌとなるように加えた培地で１０倍に希釈して２４ウェルプレートに播種した。３日または４日ごとにＧ４１８を含む上記培地（Ｇ４１８選択培地）を交換しながら５％炭酸ガス気流下、３７℃で培養を継続した。１個〜３個の細胞が増殖しコロニーを形成したウェルから細胞を回収し、４８ウェルプレートの２ウェルに等しく播種した。細胞密度が５０％以上になるまで培養を継続した後、１ウェル分の細胞に参考例１０記載のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー５０μｌを加え、細胞溶解液を調製した。９５℃で５分間加熱処理した後、５μｌを１０％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。参考例９で記載した方法に準じ、ペプチド抗体ＡＳ−２５３２を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）を構成的に発現する安定発現細胞を探索した。もう一方のウェルから回収した細胞を、１ウェルあたり０．７個となるように希釈後、９６ウェルプレートに播種した。Ｇ４１８選択培地を３日あるいは４日ごとに交換しながら細胞密度が５０％程度になるまで、５％炭酸ガス気流下、３７℃で培養を継続した。再び、４８ウェルプレートの２ウェルに等しく播種し、細胞密度が５０％以上になるまで培養を継続し、１ウェル分の細胞から調製した細胞溶解液を用いて、上記と同様にウェスタンブロッティングを行った。ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質（配列番号：１）を最も高発現するクローンを選び、ＳＥＭＡ４Ｂ安定発現細胞株ＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８を得た。
参考例１３
ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の局在性検討（ビオチン標識）
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８ならびにＮＣＩ−Ｈ３５８、および参考例１２で作製した組換え型完全長タンパク質の安定発現細胞株（ＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８）を用いて、細胞表層上に露出しているタンパク質をＣｅｌｌｕｌａｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いてビオチン標識した。続いて、参考例９の方法に従い調製した無細胞抽出液１ｍｌと参考例８で作製したペプチド抗体ＡＳ−２５９１５μｇとを用いて、参考例１０の方法に従って免疫沈降しＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。ＨＲＰ標識したストレプトアビジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて検出したところ、分子量１００ｋ  Ｄ近傍にＳＥＭＡ４Ｂタンパク質に由来するバンドが認められ、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１タンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２タンパク質およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。
参考例１４
ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の局在性検討（ＦＡＣＳ解析）
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８ならびにＮＣＩ−Ｈ３５８、および参考例１２に記載したＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８を、直径１０ｃｍのペトリディッシュにそれぞれ播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。各細胞をＰＢＳで洗浄後、０．５％ＢＳＡおよび５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加え室温で１５分間放置し、細胞を分散した。次に、緩衝液Ａ〔２％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および０．１％アジ化ナトリウムを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）〕で４×１０６個／ｍｌの濃度になるように細胞を懸濁し、終濃度１０μｇ／ｍｌとなるようＡＳ−２５３２または非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を加え、氷中に３時間放置した。緩衝液Ａで細胞を洗浄後、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む緩衝液Ａで懸濁し、氷上にて２時間放置した。緩衝液Ａで再び洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）にて解析した。その結果、いずれの細胞においてもウサギペプチド抗体ＡＳ−２５３２特異的に染色され、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１タンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２タンパク質およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３タンパク質が細胞表面上に局在していることが明らかとなった。
参考例１５
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８のアポトーシス誘導
参考例２に記載のＮＣＩ−Ｈ１７０３以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においてもアンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）でＮＣＩ−Ｈ３５８を懸濁し、１ウェル当たり８×ｌ０３個の細胞密度（培地液量８０μｌ）となるよう、ＮＣＩ−Ｈ３５８を９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した。一方、参考例２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）およびコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）各０．０６μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈し、Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．５μｌと混合した後、室温で１５分間放置した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉで希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．４μｌを加え、さらに室温で１５分間放置した。この混合液全量をＮＣＩ−Ｈ３５８の培養液に添加し３日間培養を継続した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）およびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）の添付プロトコールに従い、上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、ＮＣＩ−Ｈ３５８においては、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳおよびＣａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ３／７ａｓｓａｙともに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ１．４２倍および１．７７倍のアポトーシス誘導活性を示し、統計学的に有意な差（Ｐ≦０．０１）を示した（表５および表６）。
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参考例１６
アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によるヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８、ＮＣＩ−Ｈ１６５１およびＮＣＩ−Ｈ２３のアポトーシス誘導
ＮＣＩ−Ｈ１７０３（参考例２）およびＮＣＩ−Ｈ３５８（参考例１５）以外のヒト非小細胞肺癌細胞株においても、アンチセンスオリゴヌクレオチド導入によりアポトーシスが誘発されるか否かを検討した。
ＮＣＩ−Ｈ２２２８には、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。ＮＣＩ−Ｈ１６５１には、１０％ＦＢＳを含むＡＣＬ−４培地（ＡＴＣＣ）を用いた。ＮＣＩ−Ｈ２３には、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）および２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。各細胞をそれぞれの培地に懸濁し、１ウェル当たり７．５×１０３個（ＮＣＩ−Ｈ２２２８）、７．５×１０３個（ＮＣＩ−Ｈ１６５１）および５×１０３個（ＮＣＩ−Ｈ２３）の細胞密度（培地液量１２５μｌ）となるよう９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した。一方、参考例２記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号：１３）およびコントロールオリゴヌクレオチド（配列番号：１４）各０．１３５μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈し、Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．７５μｌと混合した後、室温で１５分間放置した。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉで希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）０．４μｌを加え、さらに室温で１５分間放置した。この混合液全量を各細胞の培養液に添加し３日間培養を継続した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の添付プロトコールに従い上記オリゴヌクレオチドのアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、いずれの細胞株においても、アンチセンスオリゴヌクレオチドは陰性対象として用いたコントロールオリゴヌクレオチドに比べ、それぞれ１．５８倍（ＮＣＩ−Ｈ２２２８）、１．２１倍（ＮＣＩ−Ｈ１６５１）および１．２５倍（ＮＣＩ−Ｈ２３）のアポトーシス誘導活性を示し、危険率はＰ≦０．０５（ＮＣＩ−Ｈ２２２８）、Ｐ≦０．０５（ＮＣＩ−Ｈ１６５１）およびＰ≦０．０１（ＮＣＩ−Ｈ２３）と算出され、統計学的に有意な差を示した（表７、表８および表９）。
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参考例１７
ウサギペプチド抗体を用いたアポトーシス誘発
ヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８を、参考例８で取得したウサギペプチド抗体ＡＳ−２５３１およびＡＳ−２５３２で処理し、これらウサギペプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
ＮＣＩ−Ｈ２２２８を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、１ウェル当たり４×１０３個の細胞密度になるようＩ型コラーゲンをコートした９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種し、５％炭酸ガス気流中、３７℃で一晩培養した。参考例８で取得したウサギペプチド抗体ＡＳ−２５３１、ＡＳ−２５３２、および非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）をＰＢＳで希釈し、各抗体について終濃度が１５μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌおよび１５０μｇ／ｍｌとなるよう培養液にそれぞれ添加した。さらに５日間培養を継続した後、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）の添付プロトコールに従い、上記ウサギペプチド抗体のアポトーシス誘導活性を測定した。
その結果、４５μｇ／ｍｌおよび１５μｇ／ｍｌのＡＳ−２５３１存在下では、同濃度の非免疫ウサギＩｇＧに比べ、１．２６倍および１．３１倍のアポトーシス誘導活性を示した（Ｐ≦０．０５およびＰ≦０．０１）。また、１５０μｇ／ｍｌのＡＳ−２５３２存在下では、同濃度の非免疫ウサギＩｇＧに比べ、１．２７倍のアポトーシス誘導活性を示した（Ｐ≦０．０１）。
このように、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ１タンパク質、ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ２タンパク質およびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｍ３タンパク質は、ヒト肺癌細胞の生存維持に重要な働きをしていることが明らかとなった。
【実施例１】ＰｌｅｘｉｎＢ１とＳＥＭＡ４Ｂとの結合
（１）ＰｌｅｘｉｎＢ１細胞外領域ｃＤＮＡのクローニング
ヒト腎臓由来ｃＤＮＡ（ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ、ＢＤ  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を鋳型とし、ＰｌｅｘｉｎＢ１のｃＤＮＡをＰＣＲで取得した。該反応における反応液の組成は上記ｃＤＮＡ  １μｌを鋳型として使用し、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を１．２５Ｕ、２種類のプライマー（配列番号：２７および配列番号：２８）を各２μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を１０μｌ加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・１５秒、６０℃・３０秒、７２℃・６分３０秒のサイクルを４０回繰り返し、さらに７２℃・７分間の反応を追加した。同様の条件で、別のプライマーペア（配列番号：２９および配列番号：３０）を用いたＰＣＲ反応も並行して行った。それぞれのＰＣＲ反応産物をＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の処方に従い、クリスタルバイオレットを１．６μｇ／ｍｌとなるよう添加した０．８％アガロースゲルで分離し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した。これをプラスミドベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングし大腸菌ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に導入した後、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を解析した結果、ＰｌｅｘｉｎＢ１全長ｃＤＮＡの−９５番目から３０１６番目に相当するｃＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＮＴ）、および１６２８番目から５８４０番目に相当するｃＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＣＴ）をそれぞれ得た。
まず、ｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＮＴを２種類の制限酵素（ＥｃｏＲＩとＳｎａＢＩ）で同時消化し約２ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−１）。続いて、ｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＣＴを３種類の制限酵素（ＳｎａＢＩ、ＤｒａＩおよびＸｂａＩ）で同時消化し約４．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−２）。最後にｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２種類の制限酵素（ＥｃｏＲＩとＸｂａＩ）で同時消化し、約５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−３）。上記ＤＮＡ断片−１、ＤＮＡ断片−２およびＤＮＡ断片−３を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて別々に精製した後、容量比２：２：１の割合で混合し５μｌとした。さらにＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）の溶液Ｉを５μｌ加え１６℃で３０分間反応させた後、２μｌを抜きとり、大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。個々のクローンの配列を解析し、ＰｌｅｘｉｎＢ１全長ｃＤＮＡの−９５番目から５８４０番目に相当するｃＤＮＡ断片を含むプラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＬＸＮＢ１−ＮＴ２）を得た。
次に、細胞外領域のみをコードするｃＤＮＡ断片を取得する為に、上記プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）−ＰＬＸＮＢ１−ＮＴ２）を鋳型とするＰＣＲ反応を行った。該反応における反応組成は、上記プラスミドを１０ｎｇ、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．２５Ｕ、２種類のプライマー（配列番号：３１および配列番号：３２）を各１μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉを１０μｌ加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・５分のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃・７分間の反応を追加した。ＰＣＲ反応産物をＴＯＰＯ  ＸＬ  ＰＣＲクローニングキットの処方に従い、クリスタルバイオレットを１．６μｇ／ｍｌとなるよう添加した０．８％アガロースゲルで分離し、４〜５ｋｂｐの長さのＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて精製した。これをプラスミドベクターｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯへサブクローニングし、大腸菌ＴＯＰ１０に導入した後、カナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択した。個々のクローンを解析した結果、ＰｌｅｘｉｎＢ１全長ｃＤＮＡの−４４番目から４４４３番目に相当する断片の両端に、制限酵素ＢａｍＨＩの認識配列が付加したＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤを得た。
（２）ＰｌｅｘｉｎＢ１細胞外領域部分タンパク質発現ベクターの構築
上記（１）で得られたプラスミド（ｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ）のＰｌｅｘｉｎＢ１配列中に存在するＢａｍＨＩ認識配列を潰すために、Ｑｕｉｋ  Ｃｈａｎｇｅ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）の処方に従い、ＰｌｅｘｉｎＢ１全長ｃＤＮＡの３４８３番目に位置するＴをＣに変換し、サイレント変異を導入したプラスミドｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ−Ｍ１を作製した。
一方、Ｃ末端にヒト免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域を付加した融合タンパク質としてＰｌｅｘｉｎＢ１細胞外領域を発現させるために、ヒトＦｃ領域をＰＣＲで増幅した。反応液の組成は、ヒト脾臓由来ｃＤＮＡ（ＭＴＣ  Ｐａｎｅｌ、ＢＤ  ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を１μｌ、Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを１．２５Ｕ、２種類のプライマー（配列番号：３３および配列番号：３４）を各０．５μＭ、ｄＮＴＰｓを２００μＭ、および２ｘ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｉを１０μｌ加え、２０μｌの液量とした。ＰＣＲ反応は、９５℃・１分の後、９５℃・３０秒、６５℃・３０秒、７２℃・１分のサイクルを３０回繰り返し、さらに７２℃・７分間の反応を追加した。ＰＣＲ反応産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、プラスミドベクターｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）へサブクローニングした。形質転換した大腸菌ＴＯＰ１０をカナマイシンを含むＬＢ寒天培地中で選択し個々のクローンの配列を解析した結果、ヒトＦｃ領域をコードするｃＤＮＡ断片を含むプラスミドｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｆｃを得た。
まず、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯ−Ｆｃを２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で同時消化し、約０．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−４）。次に、前述のｐＣＲ−ＸＬ−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ−Ｍ１をＢａｍＨＩで消化し、約４．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−５）。最後にｐｃＤＮＡ３．１（−）プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を２種類の制限酵素（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）で同時消化し、約５．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た（ＤＮＡ断片−６）。ＤＮＡ断片−４、ＤＮＡ断片−５およびＤＮＡ断片−６をＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて別々に精製した後、容量比２：２：１の割合で混合し５μｌとした。ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２の溶液Ｉを５μｌ加え、１６℃で一晩反応させた後、２μｌを抜きとり大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換した。アンピシリンを含むＬＢ寒天培地中で選択した個々のクローンを解析した結果、ヒトＦｃ領域がＣ末端側に繋がったＰｌｅｘｉｎＢ１キメラタンパク質を発現させることのできるプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＰＬＸＮＢＩ−ＥＣＤ／Ｆｃを得た。
（３）組換え型ＰｌｅｘｉｎＢ１／Ｆｃ融合タンパク質の調製
参考例５に記載したヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３（１．５×１０６個）を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした直径１０ｃｍのペトリディッシュ（ＢＤファルコン社）に播種後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。実施例１−（２）で得たプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ／Ｆｃ  ６μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で２００μｌとなるように希釈し、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）１８μｌを加え室温で３０分間放置した。この混合液を培養液に滴下し一晩培養を継続した。翌日細胞をＰＢＳで洗浄し、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに培地交換し、さらに二日間培養を継続した。その後、培養液をＭＩＬＬＥＸ−ＧＶ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）でろ過し、分画分子量が１０，０００の膜を装着した遠心式限外濃縮装置（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて約２０倍に濃縮した。この濃縮液をＰＬＸＮＢ１／Ｆｃと命名した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ／Ｆｃを添加せずにトランスフェクションした場合の培養上清も並行して調製し、陰性対照と命名した。
（４）ＰｌｅｘｉｎＢ１とＳＥＭＡ４Ｂとの結合実験
参考例１０に記載の方法に従って、ヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８にプラスミドｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂ−３ｘＦＬＡＧ（参考例７に記載）をトランスフェクションし、無細胞抽出液を調製した。実施例１−（３）で調製したＰＬＸＮＢ１／Ｆｃ２００μｌまたは陰性対照２００μｌに、上記無細胞抽出液を２５０μｌ加えた混合液を用意し、参考例１０に記載したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）懸濁液５０μｌを添加し、４℃で一晩撹拌した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４ＦＦ共沈殿画分をＲＩＰＡ緩衝液（参考例９に記載）で洗浄後、５０μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファー（参考例９に記載）に懸濁した。９５℃で５分間加熱した後、２０μｌを７．５％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ＡＳ−２５９１抗体（参考例８に記載）を、参考例９記載のブロッキング溶液で３μｇ／ｍｌとなるように希釈したもの、またはマウス抗ＦＬＡＧ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ社）を上記ブロッキング溶液で０．２μｇ／ｍｌとなるように希釈したものを一次抗体として用いた。その後、ＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を上記ブロッキング溶液で１０万倍に希釈したもの、またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を上記ブロッキング溶液で５万倍に希釈したものを二次抗体として用い、ＥＣＬ  ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）の添付プロトコールに従いＳＥＭＡ４Ｂタンパク質を検出した。その結果、ＰＬＸＮＢ１／Ｆｃを用いた場合にのみ、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質が検出できた。
これより、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質はＰｌｅｘｉｎＢ１タンパク質と結合することが明らかとなった。
【実施例２】ＰｌｅｘｉｎＢ１とＳＥＭＡ４Ｂとの結合（ＦＡＣＳ解析）
（１）組換え型ＰｌｅｘｉｎＢ１／Ｆｃ融合タンパク質安定発現株の樹立
参考例５に記載したヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３（２×１０６個）を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした直径１０ｃｍのペトリディッシュ（岩城硝子社）に播種後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。実施例１−（２）で得たプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）−ＰＬＸＮＢ１−ＥＣＤ／Ｆｃ６μｇをＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で１２００μｌとなるように希釈し、ＦｕＧＥＮＥ６トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）１８μｌを加え室温で３０分間放置した。培養液に滴下してさらに１日培養を継続した後、トリプシン・ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で細胞を分散し、上記の培養培地にＧ４１８（プロメガ社）を７５０μｇ／ｍｌとなるように加えた培地（Ｇ４１８選択培地）で１０倍に希釈して、Ｉ型コラーゲンをコートした直径１０ｃｍのペトリディッシュに播種した。３日または４日ごとにトリプシン・ＥＤＴＡで細胞を分散し１０倍に希釈した後、Ｇ４１８選択培地で培養を継続した。Ｇ４１８選択培地で培養を開始してから２週間後に増殖してきた細胞を集め、ＰｌｅｘｉｎＢ１／Ｆｃ融合タンパク質安定発現ＨＥＫ２９３細胞株（ＰＬＸＮＢ１−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３）と命名した。
（２）ＰｌｅｘｉｎＢ１／ＳＥＭＡ４Ｂ結合活性の解析
実施例２−（１）で得たＰＬＸＮＢ１−Ｆｃ／ＨＥＫ２９３を１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに懸濁し、Ｉ型コラーゲンをコートした直径１０ｃｍのペトリディッシュ（岩城硝子社）に播種後、５％炭酸ガス気流下、３７℃で一晩培養した。翌日細胞をＰＢＳで洗浄し、非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とＩＴＳ−Ｘサプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＭ１９９培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）１０ｍｌに培地交換し、さらに二日間培養を継続した。その後、培養液を孔径０．４５μｍのフィルター（ＢＤファルコン社）でろ過し、分画分子量１００，０００の限外濃縮装置（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社）を用いて約１０倍に濃縮した。この濃縮液をＰＬＸＮＢ１／Ｆｃ（ｌｏｔ  Ｎｏ．２）と命名し以下の検討に用いた。
参考例５に記載したヒト非小細胞肺癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ３５８および参考例１２で得たＳＥＭＡ４Ｂ安定発現細胞株ＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８を、１０％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、それぞれの細胞を直径１０ｃｍのペトリディッシュ（ＢＤファルコン社）に播種し、サブコンフルエントになるまで培養した。各細胞をＰＢＳで洗浄し、０．２５％ＢＳＡおよび２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳを加え１５分間室温放置して細胞を分散した。前述のＰＬＸＮＢ１／Ｆｃ（ｌｏｔ  Ｎｏ．２）を５０μｌ含むように調製した２５０μｌの緩衝液Ａ（参考例１４に記載）で３×１０６個の細胞を懸濁し、氷中に３時間放置した。その後、緩衝液Ａで細胞を洗浄し、１０μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ４８８標識抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社）を含む緩衝液Ａで再懸濁し、氷中で１時間放置した。緩衝液Ａで再度洗浄後、ＦＡＣＳｃａｎ（ＢＤバイオサイエンス社）で細胞に結合したＡｌｅｘａ４８８の蛍光強度を測定した。
その結果、いずれの細胞もＰＬＸＮＢ１／Ｆｃ（ｌｏｔ  Ｎｏ．２）と結合したものの、ＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８細胞株はＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株に比べＰＬＸＮＢ１／Ｆｃ（ｌｏｔ  Ｎｏ．２）結合量が多く、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質発現量と良く相関した。このことから、ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質とＰｌｅｘｉｎＢ１タンパク質が特異的に結合することが明らかとなった。
【実施例３】ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体のＳＥＭＡ４Ｂ／ＰｌｅｘｉｎＢ１結合阻害活性
（１）組換え型ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の発現と精製
組換え型ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質は、ＳＥＭＡ４Ｂの細胞外ドメインとそのＣ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇまたは６ｘＨｉｓ−ｔａｇを付加したタンパク質を発現するようにベクターを作製し、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてタンパク質発現系の構築を行った。すなわち、ＦＬＡＧ−ｔａｇ付きタンパク質の場合はＮ末端側にＥｃｏＲ  Ｉの制限酵素サイトを付加したプライマー（配列番号：３６）とＣ末端側にＦＬＡＧ−ｔａｇ、終止コドンおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの制限酵素切断サイトを付加するようなプライマー（配列番号：３７）を用いた。６ｘＨｉｓ−ｔａｇ付きタンパク質の場合はＮ末端側にＥｃｏＲ  Ｉの制限酵素サイトを付加したプライマー（配列番号：３６）とＣ末端側に６ｘＨｉｓ−ｔａｇ、終止コドンおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩの制限酵素切断サイトを付加するようなプライマー（配列番号：３８）を用いた。各々のプライマーペアを用い参考例６に記載されているｐＣＭＶ−１４−ＳＥＭＡ４Ｂを鋳型にしてＬＡ−Ｔａｑ  ＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）を添加しＰＣＲ反応を行い、ＳＥＭＡ４Ｂ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片（２１５１ｂｐ）を取得した。ＰＣＲ反応は、９４℃・３０秒、６０℃・３０秒、７２℃・３分を３０サイクル繰り返した。ＰＣＲ産物はアガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）で回収後、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にクローニングしてｐＣＲ２．１／ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧおよびｐＣＲ２．１／ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｈｉｓを得た。塩基配列を確認後、ｐＣＲ２．１／ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧおよびｐＣＲ２．１／ＳＥＭＡ４Ｂ−ＨｉｓをそれぞれＥｃｏＲ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）とＨｉｎｄ  ＩＩＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社）とで同時消化した後、アガロースゲル電気泳動を行いＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ＫｉｔでＤＮＡ消化断片を回収した。ｐＦＡＳＴＢＡＣ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）についても同様にしてＤＮＡ消化断片を回収し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ社）を用いてライゲーション反応を行い、Ｃ末端にＦＬＡＧ−ｔａｇを付加させたベクターｐＦＢ／ＳＥＭＡ−ＦＬＡＧまたはＣ末端に６×Ｈｉｓ−ｔａｇを付加させたベクターｐＦＢ／ＳＥＭＡ−Ｈｉｓを作製した。次に、ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの添付プロトコールに従い、組換えＢａｃｍｉｄ  ＤＮＡを調製後、組換えバキュロウィルスを取得した。
組換え型ＳＥＭＡ４Ｂタンパク質の発現は、上記で得られた組換えウィルス１／１００量（ｖ／ｖ）をＳｆ＋細胞株（日本農産社）に感染させて行った。感染後、無血清培地Ｓｆ−９００ＩＩ  ＳＦＭを用いて２７℃、１００ｒｐｍで３日間振とう培養し、組換え型タンパク質を含む上清を回収した。ＦＬＡＧタグ付きタンパク質を含む培養液上清の場合はＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ  Ｍ２  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社）を用い、６×Ｈｉｓタグ付きタンパク質を含む培養液上清の場合はＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて分離精製し、更にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ｐｇ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で精製し、組換え型ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧおよびＳＥＭＡ４Ｂ−Ｈｉｓを取得した。
（２）ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体の作製と精製
実施例３−（１）で調製した組換え型ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧタンパク質を免疫原としてウサギポリクローナル抗体を作製した。ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧタンパク質のＰＢＳ溶液とフロインド完全アジュバントとを等量混合して作製したエマルションを家兎（日本白色種、雌、３ｋｇ）３羽の背部皮下および皮内に０．１ｍｇタンパク質／１羽で免疫した。２回目以降の免疫にはフロインド不完全アジュバントに置き換えたタンパク質エマルションを同様に調製し、２週間毎に７回追加免疫を繰り返した。
免疫前および４回目と６回目の免疫１週後に耳静脈より採血し、ＳＥＭＡ４Ｂ−ＦＬＡＧタンパク質をコートしたイムノプレートを用いるＥＬＩＳＡにより血清抗体価の上昇を確認した。最終免疫の１週間後に３羽のウサギより麻酔下、頚動脈採血を行いＮｏ．１のウサギから６５．１ｍｌ、Ｎｏ．２のウサギから７９．５ｍｌ、Ｎｏ．４のウサギから６８．０ｍｌの抗血清を取得した。これらの抗血清をＰＢＳで２倍希釈し、遠心分離して上清を取得した後、実施例３−（１）に記載した組換え型ＳＥＭＡ４Ｂ−Ｈｉｓタンパク質をＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）に固定化した抗原カラムに吸着させた。カラムをＰＢＳで洗浄後、０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ／０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ３）で溶出し、溶出液を１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）で中和した後、ＰＢＳに対して４℃で終夜透析し、ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体を精製取得した。
（３）ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体のＳＥＭＡ４Ｂ／ＰｌｅｘｉｎＢ１結合阻害活性
ＳＥＭＡ４Ｂに対するＰｌｅｘｉｎＢ１の結合活性は、参考例１２記載のＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８細胞株を用い実施例２−（２）に記載した方法に従ってフローサイトメトリー法で解析した。ウサギＩｇＧの結合阻害活性の測定は、実施例３−（２）で取得したウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４または非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を添加して測定した。非免疫ウサギＩｇＧ存在下で得られるＰｌｅｘｉｎＢ１結合活性を１００％と定義し、上記ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体の結合阻害活性を算出した。ＰｌｅｘｉｎＢ１結合活性の算出には、得られた蛍光強度の中央値を用いた。
その結果、終濃度１００μｇ／ｍｌでウサギポリクローナル抗体Ｎｏ．１が６３％、Ｎｏ．２が７４％、Ｎｏ．４が６０％の結合阻害活性をそれぞれ示した。さらに、ウサギポリクローナル抗体Ｎｏ．４のＦ（ａｂ’）２断片を用いて同様の結合阻害活性を検討したところ、終濃度１００μｇ／ｍｌで７３％、１０μｇ／ｍｌで３０％の結合阻害活性をそれぞれ示した。
【実施例４】ウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体の増殖抑制活性
参考例５記載のＮＣＩ−Ｈ３５８細胞株または参考例１２記載のＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８細胞株を、１％牛胎仔血清（ＪＲＨ社）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で懸濁し、１ウェル当たり５×１０３個の細胞密度となるように９６穴平底組織培養プレート（ＢＤファルコン社）に播種した。播種と同時に、実施例３−（２）で取得したウサギ抗ＳＥＭＡ４Ｂポリクローナル抗体Ｎｏ．１、Ｎｏ．２、Ｎｏ．４または非免疫ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ社）を終濃度が１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌまたは１００μｇ／ｍｌとなるように添加し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で６日間培養した。培養終了後にＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ社）を２０μｌ添加し、５％炭酸ガス気流下、３７℃で９０分間反応させた後、４５０ｎｍおよび６２０ｎｍでの吸光度の差分を測定した。抗体非存在下を陰性対照として上記ウサギポリクローナル抗体の細胞増殖抑制活性を算出した。
その結果、ＮＣＩ−Ｈ３５８に対しては終濃度１００μｇ／ｍｌで、ウサギポリクローナル抗体Ｎｏ．１が２６％、Ｎｏ．２が１９％、Ｎｏ．４が３２％の増殖抑制活性をそれぞれ示し、終濃度１０μｇ／ｍｌではＮｏ．４が１１％の増殖抑制活性を示し、それぞれ統計学的に有意な差（Ｐ≦０．０１）を示した（表１０）。
ＳＥＭＡ４Ｂ／Ｈ３５８に対しては終濃度１００μｇ／ｍｌで、ウサギポリクローナル抗体のＮｏ．１が４５％、Ｎｏ．２が４６％、Ｎｏ．４が５５％の増殖抑制活性をそれぞれ示し、終濃度１０μｇ／ｍｌではＮｏ．１が１１％、Ｎｏ．４が２１％の増殖抑制活性をそれぞれ示し、それぞれ統計学的に有意な差（Ｐ≦０．０１）を示した（表１１）。
非免疫ウサギＩｇＧはどちらの細胞株に対しても統計学的に有意な増殖抑制活性を示さなかった（表１０、表１１）ことから、増殖抑制活性は、ＳＥＭＡ４Ｂ特異的に誘発されていることが明らかとなった。
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【産業上の利用可能性】  本発明に係る配列番号：１、配列番号：４、配列番号：７または配列番号：１０で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（本発明で用いられるタンパク質）と配列番号：２６で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質（本発明で用いられるレセプター）との結合を阻害する物質、〔好ましくは、上記タンパク質と上記レセプターとの結合によりもたらされる癌細胞増殖刺激を中和する活性を有する抗体（以下、中和活性抗体と称することもある）〕は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして安全に使用することができる。また、本発明で用いられるタンパク質の活性、および（または）本発明で用いられるレセプターの活性を阻害する物質（好ましくは、中和活性抗体など）は、例えば、癌（例、大腸癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、食道癌、胃癌、肝臓癌、胆道癌、脾臓癌、腎癌、膀胱癌、子宮癌、卵巣癌、精巣癌、甲状腺癌、膵臓癌、脳腫瘍、血液腫瘍など）の予防・治療剤、癌細胞のアポトーシス促進剤、癌細胞の増殖抑制剤などとして安全に使用することができる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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