(57)【要約】  本発明は、異なるＦｃドメインを有するヒト化抗体およびキメラ抗体を含む、ＣＤ４０に結合する抗体を提供する。これらの抗体はＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。該抗体は、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、未成熟樹状細胞の最小の活性化を示し得る。抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための使用方法、およびＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための医薬の製造における使用を提供する。
2020521453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分であって、ここで、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、
該重鎖は、ＧＹＴＦＴＤＬＳＭＨＷ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＹＩＴＰＳＳＧＹＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、ＬＩＬＱＲＧＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３およびヒト重鎖定常領域を含み；および、
該軽鎖は、ＲＡＳＫＮＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷ（配列番号４）を含むＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲ２、ＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３およびヒト軽鎖定常領域を含み、そして、
該ヒト重鎖定常領域は、（１）Ｆｃ−ガンマ−受容体（ＦｃｇＲ）への結合を低減させるＫａｂａｔ ２３８位の変異であって、ここでプロリン２３８（Ｐ２３８）が、リシン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンからなる群より選択される残基のいずれか１つに改変されており、かつここで該抗体または抗原結合部位が低減したＦｃｇＲ結合を有する、変異を有するか；または、（２）Ｋａｂａｔ ２９７位のアラニン置換、のいずれかを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、
単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
抗体またはその抗原結合部分がＣＤ４０の活性に拮抗する、請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項３】
該重鎖可変領域が、配列番号７のアミノ酸配列を含み、該軽鎖可変領域が、配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項４】
Ｆｃ−ガンマ−受容体（ＦｃｇＲ）への結合を低下するＫａｂａｔ ２３８位の変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインであって、ここで、プロリン２３８（Ｐ２３８）が、リシン、セリン、アラニン、アルギニンおよびトリプトファンからなる群より選択される残基のいずれか１つに改変されており、該抗体または抗原結合部分が低減したＦｃｇＲ結合を有する、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、請求項１から３のいずれか一項記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項５】
Ｐ２３８がリシンに変異している、請求項４記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６】
Ｆｃドメインが、配列番号９８（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、配列番号９（ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ）、配列番号９９（ＣＨ１−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ−末端Ｌｙｓ））、配列番号１０（ＣＨ１−ＩｇＧ１ａ−Ｐ２３８Ｋ）、配列番号１００（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、配列番号１１（ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ）、配列番号１０１（ＣＨ１−ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、または配列番号１２（ＣＨ１−ＩｇＧ１ｆ−Ｐ２３８Ｋ）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４または５記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項７】
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインが、配列番号９８または配列番号１００のアミノ酸配列を含む、請求項３記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項８】
重鎖が、配列番号８５、配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号１０８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり；そして、軽鎖が、配列番号８８のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項９】
Ｋａｂａｔ ２９７位にアラニン置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む、請求項１記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１０】
Ｆｃドメインが、配列番号１０２（ＩｇＧ１ａ−Ｎ２９７Ａ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、配列番号１３（ＩｇＧ１ａ−Ｎ２９７Ａ）、配列番号１０３（ＣＨ１−ＩｇＧ１ａ−Ｎ２９７Ａ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、配列番号１４（ＣＨ１−ＩｇＧ１ａ−Ｎ２９７Ａ）、配列番号１０４（ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、配列番号１５（ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ）、配列番号１０５（ＣＨ１−ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ（−Ｃ末端Ｌｙｓ））、または配列番号１６（ＣＨ１−ＩｇＧ１ｆ−Ｎ２９７Ａ）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項９記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１１】
単離された抗体またはその抗原結合部分がヒト化されている、請求項１から１０のいずれか一項記載の単離された抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１２】
抗原結合部分がｓｃＦｖ−Ｆｃである、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１３】
抗体またはその抗原結合部分が、治療薬に連結されている、請求項１２記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１４】
抗体またはその抗原結合部分が、該抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結されている、請求項１２記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１５】
追加の部分をさらに含む、請求項１記載の抗体またはその抗原結合部分。
【請求項１６】
請求項１から１５のいずれか一項記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項１９】
抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分の製造方法であって、
ａ）請求項１８に記載の細胞において抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および、
ｂ）該細胞から該抗体またはその抗原結合部分を単離すること
を含む、方法。
【請求項２０】
ａ）請求項１から１５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分；および、ｂ）薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１から１５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、該対象の免疫応答を処置または予防する方法。
【請求項２２】
対象が、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え医薬品（例えば、血友病患者のＶＩＩ因子）に対する免疫反応、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節炎、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される疾患を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１から１５のいずれか一項記載の抗体またはその抗原結合部分を含む薬剤の、それを必要とする対象を処置するための、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その内容全体を引用により本明細書中に包含させる。２０１８年５月２２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、200896_0013_00_WO_ST25.txtと称され、サイズは１８７，１５３バイトである。
【０００２】
分野
本発明は、異なるＦｃドメインを有するヒト化抗体およびキメラ抗体を含む、ＣＤ４０に結合する抗体を提供する。この抗体ポリペプチドはＣＤ４０に結合し、ＣＤ４０アゴニスト活性を示さない。この抗体は、改変されたＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み、未成熟樹状細胞の僅かな活性化を示し得る。これらの抗体を含む組成物、ＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための使用方法、およびＣＤ４０活性が関与する疾患の処置のための医薬の製造における使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＣＤ４０は、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージを含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）上に存在する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属する共刺激分子である。ＡＰＣは、ＣＤ４０がそのリガンドであるＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）にＴＨ細胞上で結合するとき、活性化される。ＣＤ４０介在性ＡＰＣ活性化は、サイトカイン産生、共刺激分子（ＣＤ８６など）の上方制御ならびに抗原提示およびＢ細胞増殖の促進を含む、種々の免疫応答に関与している。ＣＤ４０はまた、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞および上皮細胞でも発現される。
【０００４】
ＣＤ４０活性化はまた、例えば自己免疫、移植拒絶またはアレルギー反応に関係する種々の望ましくないＴ細胞応答にも関与している。望ましくないＴ細胞応答を制御するための１つの戦略は、アンタゴニスト抗体を用いてＣＤ４０を標的にすることである。例えば、以前はＣｈｉｒｏｎ １２１２として知られていたモノクローナル抗体ＨＣＤ１２２（ルカツムマブ）は、現在、特定のＣＤ４０介在性炎症性疾患の処置のための臨床治験の段階にある。ハイパーテキスト・トランスファー・プロトコル（HTTP）：
clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209 （２０１１年１月１１日最終更新）にてインターネット上の臨床治験情報（Clinical Trials Feeds）、“Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40＋ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma”を参照のこと。しかしながら、これらのモノクローナル抗体は、アゴニスト活性を示し得る。例えば、抗ＣＤ４０抗体であるＣｈｉ２２０の有用性は、その刺激能の弱さにより制限される。Adams, et al., “Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival”, J. Immunol. 174: 542-50 (2005)を参照のこと。
【発明の概要】
【０００５】
概要
第一の態様において、本発明は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体は、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖は、ＧＹＴＦＴＤＬＳＭＨＷ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＹＩＴＰＳＳＧＹＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲ２およびＬＩＬＱＲＧＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３を含み；そして、該軽鎖は、ＲＡＳＫＮＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷ（配列番号４）を含むＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲ２およびＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３を含む。
【０００６】
第二の態様において、本発明は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体は、重鎖および軽鎖を含み、該重鎖は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号１７）を含むＣＤＲ１、ＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲ２およびＳＱＬＧＲＲＦＤＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ３を含み；そして、該軽鎖は、ＫＡＳＱＤＶＲＴＧＶＡ（配列番号２０）を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＮＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲ２およびＱＱＨＹＳＰＰＹＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ３を含む。
【０００７】
単離された抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０の活性に拮抗し得る。単離された抗体またはその抗原結合部分はキメラ抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分はヒト化抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。
【０００８】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ−ガンマ−受容体（ＦｃｇＲ）への結合を低減させる、Ｋａｂａｔ ２３８位での変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含んでいてよく、ここで、プロリン２３８（Ｐ２３８）は、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される残基の１つに改変されており、該抗体またはその抗原結合部分は低減したＦｃｇＲ結合を有する。
【０００９】
特定の態様において、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン内にリシンに改変されたＰ２３８（Ｐ２３８Ｋ）を有し得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-P238K (-Ｃ末端 Lys); 配列番号９８)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-P238K; 配列番号９)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号９９)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-P238K; 配列番号１０)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１００)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-P238K; 配列番号１１)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０１)、または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-P238K; 配列番号１２)。
【００１０】
特定の具体的態様において、本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｋａｂａｔ ２９７位で置換されたアラニンを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０２)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-N297A; 配列番号１３)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０３)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-N297A; 配列番号１４)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０４)、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-N297A; 配列番号１５)、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０５)、または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-N297A; 配列番号１６)。
【００１１】
ある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変部（ＶＨ）、または（２）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部（ＶＬ）を含む。例えば、該単離された抗体または抗原結合部分は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有する重鎖可変部（ＶＨ）、および（２）配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変部（ＶＬ）を含む。特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖、および（２）配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。他の特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下を含む：
（１）配列番号１０６のアミノ酸配列を有する重鎖、および（２）配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖；
（１）配列番号１０７のアミノ酸配列を有する重鎖、および（２）配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖；
（１）配列番号１０８のアミノ酸配列を有する重鎖、および（２）配列番号８８のアミノ酸配列を有する軽鎖；または、
（１）配列番号８４、１０９、１１０および１１１から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖、および（２）配列番号８８のアミノ酸配列を有する５Ｆ１１−４５軽鎖。
【００１２】
他の特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、（１）ｈｚ−ＨＣ１（配列番号２３）、ｈｚ−ＨＣ２（配列番号２４）、ｈｚ−ＨＣ３（配列番号２５）、ｈｚ−ＨＣ４（配列番号２６）、ｈｚ−ＨＣ５（配列番号２７）、ｈｚ−ＨＣ６（配列番号２８）、ｈｚ−ＨＣ７（配列番号２９）、ｈｚ−ＨＣ８（配列番号３０）、ｈｚ−ＨＣ９（配列番号３１）、ｈｚ−ＨＣ１０（配列番号３２）およびｈｚ−ＨＣ１１（配列番号３３）からなる群より選択される重鎖可変部（ＶＨ）；および／または、（２）ｈｚ−ＬＣ１（配列番号３４）、ｈｚ−ＬＣ２（配列番号３５）、ｈｚ−ＬＣ３（配列番号３６）、ｈｚ−ＬＣ４（配列番号３７）およびｈｚ−ＬＣ５（配列番号３８）からなる群より選択される軽鎖可変部（ＶＬ）を含む。
【００１３】
ある特定の態様において、単離された抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４３から選択される重鎖アミノ酸配列であって、ここで、要すればＣ末端にリシンをさらに含む、重鎖アミノ酸配列；および／または、（２）配列番号４１および配列番号４４から選択される軽鎖可変（ＶＬ）アミノ酸配列を含む。説明のために、単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下からなる群より選択される：
ａ）配列番号３９の重鎖および配列番号４１の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ１−Ｐ２３８Ｋ；
ｂ）配列番号４０の重鎖および配列番号４１の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ１−Ｎ２９７Ａ；
ｃ）配列番号４２の重鎖および配列番号４４の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ２−Ｐ２３８Ｋ；ならびに、
ｄ）配列番号４３の重鎖および配列番号４４の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ２−Ｎ２９７Ａ。
【００１４】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗原結合部分は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体およびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群より選択される。
【００１５】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、治療薬に結合されている。
【００１６】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を提供し、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、該抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結されている。
【００１７】
追加の部分をさらに含む、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分を提供する。
【００１８】
単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸は本明細書に記載されている。該核酸分子を含む発現ベクターは本明細書に記載されている。該発現ベクターで形質転換された細胞もまた意図される。
【００１９】
また、抗ヒトＣＤ４０抗体またはその抗原結合部分を調整する方法も記載されており、該方法は：
ａ）本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換された細胞において、該抗体またはその抗原結合部分を発現させること；および
ｂ）該細胞から、抗体またはその抗原結合部分を単離すること
を含む。
【００２０】
ａ）本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分；およびｂ）薬学的に許容される担体を含む医薬組成物もまた提供される。
【００２１】
本明細書に記載される抗体またはその抗原結合部分を対象に投与することを含む、対象における免疫応答を処置または予防する方法を提供する。対象における免疫応答を処置または予防するかかる方法において、対象は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え医薬品（例えば、血友病患者のＶＩＩ因子）に対する免疫反応、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節炎、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択される疾患を有する。
【００２２】
また、それを必要とする対象を処置するために使用するための、本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分、またはそれを含む医薬の使用も意図される。さらに、免疫応答の処置または予防における使用のための、治療的有効量の本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分が意図され、ここで、該抗体またはその抗原結合部分は、それを必要とする患者に投与するためのものである。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、１μＭ ５Ｆ１１−４５抗体の結合を用いる、抗Ｈｉｓ ＦＡＢ表面上のｈＣＤ６４−Ｈｉｓ ７μｇ／ｍｌの捕捉についてのＳＰＲセンサーグラムデータを示す。
【図２】図２は図２Ａから２Ｃを含み、２つの独立したドナーにおける抗ＣＤ４０抗体 ５Ｆ１１による未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の処理についてのｉＤＣ活性化データを示す。細胞培養培地からのＩＬ−６（インターロイキン−６）の増加（図２Ａ）、および抗ＣＤ８６抗体および抗ＣＤ５４抗体でのフローサイトメトリー平均蛍光染色により示される細胞表面マーカー発現（ＣＤ５４およびＣＤ８６）。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、図２Ｂおよび図２Ｃの両方においてＹ軸で測定される。抗体濃度は、μｇ／ｍｌで示される。アッセイにおけるＣＨＯ−ＣＤ３２細胞の包含は、‘ｘ−ｌｉｎｋ’で示される。
【図３】図３は図３Ａから３Ｃを含み、２つの独立したドナーにおけるキメラＹ１２３８抗ＣＤ４０抗体での未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の処理についてのｉＤＣ活性化データを示す。フローサイトメトリーにより示されるＩＬ−６（図３Ａ）および細胞表面マーカー発現（すなわち、ＣＤ５４およびＣＤ８６）の増加は、抗ＣＤ８６抗体（図３Ｃ）および抗ＣＤ５４抗体（図３Ｂ）での蛍光染色を意味する。抗体濃度は、μｇ／ｍｌで示される。ＣＨＯ−ＣＤ３２細胞の包含は、‘ｘ−ｌｉｎｋ’で示される。
【図４】図４は図４Ａから４Ｃを含み、抗ＣＤ４０抗体Ｙ１２３８−Ｐ２３８ＫおよびＹ１２３８−Ｎ２９７Ａによる未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の処理についてのｉＤＣ活性化データを示す。細胞培養培地からのＩＬ−６（図４Ａ）の増加を測定した。細胞表面マーカー発現（ＣＤ５４およびＣＤ８６）は、抗ＣＤ８６抗体（図４Ｂ）および抗ＣＤ５４抗体（図４Ｃ）でのフローサイトメトリー平均蛍光染色により示されるように測定された。抗体濃度は、μｇ／ｍｌで示される。ＣＨＯ−ＣＤ３２細胞の包含が示される。
【図５】図５は図５Ａ−５Ｃを含み、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞の添加有（ｘ−ｌｉｎｋ）または添加無しでＹ１２３８抗体のヒト化（ｈｚ）バージョンを用いるｉＤＣの処置についてのｉＤＣ活性化データを示す。抗体の処置濃度１０、３０または１００μｇ／ｍｌが示されている。図５Ａ：サイトカイン産生ＩＬ−６（ｐｇ／ｍｌ）（上パネル）。図５Ｂ：ＣＤ５４の染色の平均蛍光強度。図５Ｃ：ＣＤ８６の平均蛍光強度。
【図６】図６は図６Ａ−６Ｃを含み、８つの独立したドナーにおける抗ＣＤ４０抗体５Ｆ１１による未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の処理についてのｉＤＣ活性化データを示す。フローサイトメトリーにより示される細胞培養培地および細胞表面マーカー発現（ＣＤ５４；図６ＢおよびＣＤ８６；図６Ｃ）からのＩＬ−６（インターロイキン−６）の増加（図６Ａ）は、抗ＣＤ８６抗体および抗ＣＤ５４抗体での蛍光染色を意味する。平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、図６Ｂおよび図６Ｃの両方でＹ軸で測定される。抗体濃度は、μｇ／ｍｌで示される（１０、３０または１００μｇ／ｍｌ）。示される通り、アッセイにおけるＣＨＯ−ＣＤ３２細胞の包含は、ＦｃｇＲ介在架橋結合またはクラスター化に介在する。ＣＤ４０アゴニスト抗体 ＃２１４１および抗ＣＤ４０−ｄＡＢ−ＩｇＧ４は、陽性対照として機能する。ＩｇＧ４−Ｌ６融合タンパク質は、陰性対照として機能する。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本発明は、抗ＣＤ４０抗体、特に、アンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体に関する。ＣＤ４０などの治療標的について、ＦｃｇＲ介在性抗ＣＤ４０抗体架橋は、望ましくないアゴニストシグナル伝達および毒性の可能性をもたらす可能性を有する。本発明はまた、“低親和性”ＦｃｇＲであるｈＣＤ３２ａ／ＦｃｇＲＩＩａ、ｈＣＤ３２ｂ／ＦｃｇＲＩＩｂ、ｈＣＤ１６ａ／ＦｃｇＲＩＩＩａ、およびｈＣＤ１６ｂ／ＦｃｇＲＩＩＩｂの低減した結合を有するアンタゴニスト性抗ＣＤ４０抗体を記載している。低親和性ＦｃｇＲの低減した結合により、望ましくないアゴニストシグナル伝達および望ましくない毒性をもたらす可能性の低下が予期される。
【００２５】
定義および略語
さらなる略語および定義を以下に示す。
ＡＰＣ                    抗原提示細胞
ＣＤ５４                  ＩＣＡＭ−１とも称される
ＣＤＲ                    相補性決定領域
ＣＨまたはＣＨ             定常重鎖
ＣＬまたはＣＬ             定常軽鎖
ＣＨＯ細胞                チャイニーズハムスター卵巣細胞
ｄＡｂ                    ドメイン抗体
ＦｃｇＲ                  ＦｃγＲと互換的に用いられる
ＦＲ                      フレームワーク領域
ＧＭ−ＣＳＦ              顆粒球マクロファージコロニー刺激因子
ＨＣ                      重鎖
ｉＤＣ                    未成熟樹状細胞
ＩＦＮ                    インターフェロン
ＩｇＧ                    免疫グロブリンＧ
ＩＬ−６                  インターロイキン−６
ＬＣ                      軽鎖
ｍＡｂ                    モノクローナル抗体
ｍｇ                      ミリグラム
ｍｌまたはｍＬ            ミリリットル
ｎｇ                      ナノグラム
ｎＭ                      ナノモル
ｐＩ                      等電点
ＳＰＲ                    表面プラズモン共鳴
ＴＮＦ                    腫瘍壊死因子
μｇ                      マイクログラム
μＭ                      マイクロモル
ＶＬまたはＶＬ             軽鎖可変ドメイン
ＶＨまたはＶＨ             重鎖可変ドメイン。
さらなる略語および定義が本明細書中に提供される。
【００２６】
本明細書の詳細な説明に従って、以下の略語および定義が適用される。本明細書で用いられる単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”には、文脈からそうでないことが明らかに示されていない限り、複数形が包含されることが特記されるべきである。従って、例えば、“抗体”への言及には複数のそのような抗体が含まれ、“投与量”への言及には、当該分野の当業者に知られている１または複数の投与量およびその同等量への言及などが含まれる。
【００２７】
本明細書で用いる用語“約”は、当業者によって理解されており、用いられる文脈によってある程度変化し得る。一般に、“約”は、本明細書中、特記しない限り、表示値（referenced value）のプラス／マイナス１０％の値の範囲を含む。
【００２８】
記載された範囲の間の任意のおよび全ての全体または一部の整数が本明細書に包含されることが理解される。
【００２９】
ＣＤ４０はまた、known and referred to as Ｂ細胞表面抗原ＣＤ４０、Ｂｐ５０、ＣＤ４Ｌ受容体、ＣＤｗ４０、ＣＤＷ４０、ＭＧＣ９０１３、ｐ５０、ＴＮＦＲＳＦ５および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５として公知であり、かつそのように記載される。“ヒトＣＤ４０”は、以下のアミノ酸配列を含むＣＤ４０を意味する：
MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI IFGILFAILL VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ（配列番号４５）。
【００３０】
本明細書で用いる用語“可変ドメイン”は、Ｋａｂａｔらの、Sequences of Immunological Interes, 5th ed., U.S. Dept. Health ＆ Human Services, Washington, D.C. (1991)により定義される免疫グロブリン可変ドメインを意味する。可変ドメイン内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けおよび位置決めは、周知のＫａｂａｔ番号付け法に従う。ＶＨ、“重鎖可変部”および“重鎖可変ドメイン”は、重鎖の可変ドメインを意味する。ＶＬ、“軽鎖可変部”および“軽鎖可変ドメイン”は、軽鎖の可変ドメインを意味する。
【００３１】
用語“ヒト”は、抗体に適用したとき、該抗体が、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＦＲおよび／またはＣＨドメインの配列を有することを意味する。配列は、該配列が以下：（ａ）ヒト個体から、またはヒト個体由来の細胞または細胞株から単離されたか；（ｂ）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列のライブラリーまたはヒト抗体可変ドメイン配列のライブラリーから単離されたか；または、（ｃ）上記のポリペプチドの１つまたは複数からの、変異導入および選択によって改変された、のいずれかであるとき、ヒト免疫グロブリンコーディング配列に“由来する”。
【００３２】
本明細書で用いる“単離された”化合物は、該化合物が天然において結合している少なくとも１つの成分から離されることを意味する。
【００３３】
本発明の抗体は、主に、他の種由来の、例えばマウスの抗体の投与によって誘発される抗抗体免疫応答を回避しながら、ヒト患者に投与され得る。例えば、当技術分野で公知の手順に従って、マウスＣＤＲをヒト可変ドメインＦＲに移植することにより、マウス抗体を“ヒト化”することができる。しかしながら、本明細書に記載のヒト抗体は、マウス抗体配列の遺伝子操作を必要とすることなく作製され得る。
【００３４】
本明細書に記載の有用な抗ＣＤ４０抗体は、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）および４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。３つのＣＤＲには、抗原と特異的な相互作用を形成し、主に抗原認識を担っている残基のほとんどが含まれる。
【００３５】
特定の態様において、本発明の抗ＣＤ４０抗体は、ヒト化抗体５Ｆ１１−４５のＣＤＲを含み得る。５Ｆ１１−４５のアミノ酸配列を表１に示す。
【００３６】
【表１】
2020521453.tif 000003
【表２】
2020521453.tif 000004
【表３】
2020521453.tif 000005
【００３７】
一態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒト化５Ｆ１１−４５重鎖可変および軽鎖可変配列（例えば、それぞれ配列番号７および８を参照のこと）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含む。モノクローナル抗体は、例えば、重鎖可変ＣＤＲ１−３それぞれについて、ＧＹＴＦＴＤＬＳＭＨＷ（配列番号１）、ＹＩＴＰＳＳＧＹＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）およびＬＩＬＱＲＧＡＹ（配列番号３）ならびに軽鎖可変ＣＤＲ１−３それぞれについて、ＲＡＳＫＮＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷ（配列番号４）、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）およびＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号６）の、６つ全てのＣＤＲ（ＶＨについて３つおよびＶＬについて３つ）を含む。
【００３８】
別の態様において、本明細書に記載の抗体は、ヒト化Ｙ１２３８重鎖可変および軽鎖可変配列（例えば、例としてそれぞれ配列番号２３および３４）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域のアミノ酸配列を含み得る。モノクローナル抗体は、例えば、重鎖可変ＣＤＲ１−３それぞれについて、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号１７）、ＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）およびＳＱＬＧＲＲＦＤＹ（配列番号１９）ならびに軽鎖可変ＣＤＲ１−３それぞれについて、ＫＡＳＱＤＶＲＴＧＶＡ（配列番号２０）、ＳＡＳＹＲＮＴ（配列番号２１）およびＱＱＨＹＳＰＰＹＴ（配列番号２２）の、６つ全てのＣＤＲ（ＶＨについて３つおよびＶＬについて３つ）を含む。
【００３９】
“抗体”（Ａｂ）としては、抗原に特異的に結合し、かつジスルフィド結合によって相互結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン、またはその抗原結合部分が含まれ得るが、これに限定されない。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書中、ＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書中、ＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。
【００４０】
Ａｂの“抗原結合部分”（“抗原結合フラグメント”とも称される）またはその抗原結合部分は、全体のＡｂに結合した抗原に特異的に結合する能力を保持する、Ａｂの１つまたは複数の配列（完全長抗体の全長またはフラグメント）を意味する。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖可変フラグメント）、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２およびｓｃＦｖ−Ｆｃが挙げられる。
【００４１】
“ヒト化”抗体とは、非ヒトＡｂのＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全てが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置換されているＡｂを意味する。Ａｂのヒト化形態の一態様において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全ては、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置換されているが、一方で、１つまたは複数のＣＤＲ領域内のアミノ酸の一部、ほとんどまたは全ては、変わっていない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または修飾は、特定の抗原に結合するＡｂの能力を無効にしない限り許容される。“ヒト化”Ａｂは、元のＡｂの抗原特異性と同様の抗原特異性を保持する。
【００４２】
“キメラ抗体”は、可変領域がある種に由来し、そして定常領域は別の種に由来するＡｂ、例えば可変領域がマウスＡｂに由来し、そして定常領域がヒトＡｂに由来するＡｂを意味する。
【００４３】
本明細書で用いる“特異的に結合する”とは、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、約１μＭまたはそれ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する抗体による抗原の結合を意味する。好適なアッセイ系としては、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（GE Healthcare Life Sciences、Marlborough、MA）表面プラズモン共鳴システムおよびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動態評価ソフトウェア（例えば、version 2.1）が挙げられる。
【００４４】
ＣＤ４０に対する本発明の抗体の結合は、ＣＤ４０活性に拮抗する。“ＣＤ４０活性”としては、Ｔ細胞活性化（例えば、Ｔ細胞増殖またはサイトカイン分泌の誘導）、マクロファージ活性化（例えば、マクロファージにおける活性酸素種および一酸化窒素の誘導）、およびＢ細胞活性化（例えば、Ｂ細胞増殖、抗体アイソタイプスイッチング、または血漿細胞への分化）が挙げられるが、これに限定されない。ＣＤ４０活性は、他の分子との相互作用によって介在され得る。“ＣＤ４０活性”としては、ＣＤ４０と括弧内のＵｎｉｐｒｏｔ受託番号によって識別される以下の分子との間の機能的相互作用が挙げられる：ＣＡＬＲ          (P27797);
ＥＲＰ４４        (Q9BS26);
ＦＢＬ            (P22087);
ＰＯＬＲ２Ｈ      (P52434);
ＲＦＣ５          (P40937);
ＳＧＫ１          (O00141);
ＳＬＣ３０Ａ７    (Q8NEW0);
ＳＬＣ３９Ａ７    (Q92504);
ＴＲＡＦ２        (Q5T1L5);
ＴＲＡＦ３        (Q13114);
ＴＲＡＦ６        (Q9Y4K3);
ＴＸＮ            (Q5T937);
ＵＧＧＴ１        (Q9NYU2);および
ＵＳＰ１５        (Q9Y4E8)。
【００４５】
例えば、ＣＤ４０“活性”にはＴＲＡＦ２との相互作用が含まれる。ＣＤ４０／ＴＲＡＦ２相互作用は、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫを活性化する。Davies et al., Mol. Cell Biol. 25: 9806-19 (2005)を参照のこと。従って、このＣＤ４０活性は、対照と比較して、ＣＤ４０９依存性の細胞ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ活性化により決定され得る。
【００４６】
本明細書で用いる用語“活性化する”、“活性化”および“活性化された”とは、対照と比較して、所与の測定可能なＣＤ４０活性の少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、さらには１００％、またはそれ以上の増加を意味する。ＣＤ４０活性は、ＣＤ４０活性が少なくとも１０％低下される場合、例示的態様において、アンタゴニストの不存在と比較して、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、さらには１００％（すなわち、検出可能な活性がない）低下される場合、“拮抗される”。例えば、抗体は、ＣＤ４０を活性化することなく、ＣＤ４０活性の一部または全部に拮抗し得る。例えば、抗体は、Ｂ細胞増殖を活性化し得ない。抗体は、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌を活性化できず、ここで、該サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γからなる群より選択される少なくとも１つのサイトカインである。
【００４７】
可変ドメインは、ヒト生殖細胞抗体遺伝子セグメントによりコードされる対応するフレームワーク領域と同じアミノ酸配列を有する１以上のフレームワーク領域（ＦＲ）を含み得る。本明細書に記載の抗体に用いるのに好ましいフレームワーク配列は、本明細書に記載の抗体により用いられるフレームワーク配列と構造的に類似のものである。ＶＨ ＣＤＲ１、２および３配列、ならびにＶＬ ＣＤＲ１、２および３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子に見いだされるものと同一の配列を有するフレームワーク領域上に移植され得るか、または該ＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して、最大２０個の、好ましくは保存的なアミノ酸置換を含むフレームワーク領域に移植され得る。例えば、特定の例では、抗体の抗原結合能を維持または増強するために、フレームワーク領域内の残基を変異させることが有益であることが見いだされている（例えば、Queenらの、米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号；同第５，６９３，７６２号および同第６，１８０，３７０号参照）。
【００４８】
例示的なフレームワーク領域としては、以下の表２および３に記載のものが含まれるが、これらに限定されない。配列は、アミノ末端からカルボキシ末端の形式である。例示的な重鎖フレームワーク領域を表２に示す。ヒト化５Ｆ１１−４５ＶＨの好ましい重鎖フレームワーク配列の群は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（ＦＲ１；配列番号４６）、ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（ＦＲ２；配列番号４９）、ＫＴＴＬＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＦＲ３；配列番号５１）、およびＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＦＲ４：配列番号６０）である。ヒト化Ｙ１２３８ＶＨの好ましい重アフレームワーク配列の群は、ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳ（ＦＲ１；配列番号４７）、ＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧ（ＦＲ２；配列番号４９）、ＲＶＴＭＴＲＤＴＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＲＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（ＦＲ３；配列番号５２）、およびＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＦＷ４；配列番号６０）である。
【００４９】
【表４】
2020521453.tif 000006
【００５０】
例示的軽鎖フレームワーク領域を表３に示す。ヒト化５Ｆ１１−４５ ＶＬの好ましい軽鎖フレームワーク領域の群には、以下：ＤＩＶＬＴＱＳＰＤＳＬＡＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣ（ＦＲ１；配列番号６１）、ＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＫＬＬＩＹ（ＦＲ２；配列番号６３）、ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＶＹＹＣ（ＦＲ３；配列番号６６）、およびＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（ＦＲ４；配列番号７１）が含まれる。ヒト化Ｙ１２３８ ＶＬの好ましい軽鎖フレームワーク領域の群には、以下：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（ＦＲ１；配列番号６２）、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（ＦＲ２；配列番号６４）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＦＲ３；配列番号６７）、ＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣ（ＦＲ３；配列番号６８）、およびＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（ＦＲ４；配列番号７２）が含まれる。
【００５１】
【表５】
2020521453.tif 000007
【００５２】
変異体の可変ドメインは、ヒト化５Ｆ１１−４５またはＹ１２３８配列の可変ドメインと、該変異体の可変ドメインがＣＤ４０に特異的に結合する部分の最大１０個のアミノ酸または１〜１０個の任意の整数個のアミノ酸が異なっていてよい。あるいは、変異体の可変ドメインは、ヒト化５Ｆ１１−４５またはＹ１２３８配列のそれぞれの配列に対して少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９２％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性）を有し得る。同一ではないアミノ酸残基または２つの配列間で異なるアミノ酸は、アミノ酸置換、付加または欠失を示し得る。２つの配列間で異なる残基は、該２つの配列が、ＢＬＡＳＴ（登録商標）（米国国立医学図書館の登録商標）などの任意の適切なアミノ酸配列アライメントアルゴリズムによって整列されたとき、同一ではない位置として表される。
【００５３】
本発明の例示的ＣＤ４０抗体には、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合部分が含まれ得て、ここで、該抗体は重鎖および軽鎖を含み、ここで、該重鎖は、ＧＹＴＦＴＤＬＳＭＨＷ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＹＩＴＰＳＳＧＹＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、およびＬＩＬＱＲＧＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３を含み、そして該軽鎖は、ＲＡＳＫＮＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷ（配列番号４）を含むＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲ２、およびＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３を含むか、または
該重鎖は、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号１７）を含むＣＤＲ１、ＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）を含むＣＤＲ２、およびＳＱＬＧＲＲＦＤＹ（配列番号１９）を含むＣＤＲ３を含み、そして該軽鎖は、ＫＡＳＱＤＶＲＴＧＶＡ（配列番号２０）を含むＣＤＲ１、ＳＡＳＹＲＮＴ（配列番号２１）を含むＣＤＲ２、およびＱＱＨＹＳＰＰＹＴ（配列番号２２）を含むＣＤＲ３を含む。
【００５４】
特定の一態様において、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、（１）ＧＹＴＦＴＤＬＳＭＨＷ（配列番号１）を含むＣＤＲ１、ＹＩＴＰＳＳＧＹＴＡＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号２）を含むＣＤＲ２、およびＬＩＬＱＲＧＡＹ（配列番号３）を含むＣＤＲ３を含む重鎖；ならびに／または（２）ＲＡＳＫＮＶＤＳＹＧＮＳＦＭＨＷ（配列番号４）を含むＣＤＲ１、ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号５）を含むＣＤＲ２、およびＱＱＳＮＥＤＰＬＴ（配列番号６）を含むＣＤＲ３を含む軽鎖を含む。要すれば、かかる抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号７の重鎖可変部；および／または（２）配列番号８の軽鎖可変部を含む。説明すると、かかる抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号７の重鎖可変部を含む重鎖；および（２）配列番号８の軽鎖可変部を含む軽鎖を含む。
【００５５】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変部を含む重鎖、および配列番号８の軽鎖可変部を含む軽鎖を含み得て、ここで、該重鎖は、配列番号９または配列番号９８のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、配列番号７の重鎖可変部を含む重鎖、および配列番号８の軽鎖可変部を含む軽鎖を含み得て、ここで該重鎖は、配列番号１０または配列番号９９のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。
【００５６】
ヒトＣＤ４０に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号８５、配列番号１０６、１０７または１０８のアミノ酸配列を含む重鎖；および、（２）配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み得る。説明すると、かかる抗体またはその抗原結合部分は、（１）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖；および、（２）配列番号８８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００５７】
単離された抗体またはその抗原結合部分は、ＣＤ４０の活性に拮抗し得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、キメラ抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト化抗体であり得る。単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒト重鎖定常領域およびヒト軽鎖定常領域を含み得る。
【００５８】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｃ−ガンマ−受容体（ＦｃｇＲ）への結合を低減させるＫａｂａｔの位置２３８における変異を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含んでいてよく、ここでプロリン２３８（Ｐ２３８）は、リシン（Ｋ）、セリン（Ｓ）、アラニン（Ａ）、アルギニン（Ｒ）およびトリプトファン（Ｗ）からなる群より選択される残基の１つに改変されており、かつここで該抗体またはその抗原結合部分は、低減したＦｃｇＲ結合を有する。本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインのリシンに変異されたＰ２３８を有し得る。
【００５９】
単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号９８）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-P238K; 配列番号９）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号９９）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-P238K; 配列番号１０）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１００）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-P238K; 配列番号１１）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-P238K(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０１）、または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-P238K; 配列番号１２）。
【００６０】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、Ｋａｂａｔの位置２９７におけるアラニン置換を含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含み得る。例えば、単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下から選択されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1a-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０２）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1a-N297A; 配列番号１３）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1a-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０３）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1a-N297A; 配列番号１４）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (IgG1f-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０４）、
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (IgG1f-N297A; 配列番号１５）、
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (CH1-IgG1f-N297A(-Ｃ末端 Lys); 配列番号１０５）、または
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (CH1-IgG1f-N297A; 配列番号１６）。
【００６１】
本明細書に記載の単離された抗体または抗原結合部分は、（１）ｈｚ−ＨＣ１（配列番号２３）、ｈｚ−ＨＣ２（配列番号２４）、ｈｚ−ＨＣ３（配列番号２５）、ｈｚ−ＨＣ４（配列番号２６）、ｈｚ−ＨＣ５（配列番号２７）、ｈｚ−ＨＣ６（配列番号２８）、ｈｚ−ＨＣ７（配列番号２９）、ｈｚ−ＨＣ８（配列番号３０）、ｈｚ−ＨＣ９（配列番号３１）、ｈｚ−ＨＣ１０（配列番号３２）、およびｈｚ−ＨＣ１１（配列番号３３）からなる群より選択される重鎖可変部（ＶＨ）；ならびに／または、（２）ｈｚ−ＬＣ１（配列番号３４）、ｈｚ−ＬＣ２（配列番号３５）、ｈｚ−ＬＣ３（配列番号３６）、ｈｚ−ＬＣ４（配列番号３７）、およびｈｚ−ＬＣ５（配列番号３８）からなる群より選択される軽鎖可変部（ＶＬ）を含む抗体である。
【００６２】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４２および配列番号４３から選択される重鎖アミノ酸配列を含む抗体である。
【００６３】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、配列番号４１および配列番号４４から選択される軽鎖アミノ酸配列を含む抗体である。
【００６４】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、
ａ）配列番号３９の重鎖および配列番号４１の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ１−Ｐ２３８Ｋ；
ｂ）配列番号４０の重鎖および配列番号４１の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ１−Ｎ２９７Ａ；
ｃ）配列番号４２の重鎖および配列番号４４の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ２−Ｐ２３８Ｋ；ならびに
ｄ）配列番号４３の重鎖および配列番号４４の軽鎖を有するＹ１２３８−ｈｚ２−Ｎ２９７Ａ
からなる群より選択される抗体である。
【００６５】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｄｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、二重特異性抗体、およびｓｃＦｖ−Ｆｃからなる群より選択される抗原結合部分である。
【００６６】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分は、免疫複合体であり得て、ここで該抗体またはその抗原結合部分は治療薬に結合されている。
【００６７】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分は二重特異性抗体であり得て、ここで該抗体またはその抗原結合部分は、当該抗体またはその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第二の機能的部分に結合される。
【００６８】
本明細書に記載の抗体またはその抗原結合部分は、追加の部分をさらに含む。
【００６９】
Ｆｃドメイン
重鎖のカルボキシ末端の“半分”は定常領域（Ｆｃ）と定義され、それはエフェクター機能に主に関与する。本明細書で用いる用語“Ｆｃドメイン”は、Ｋａｂａｔらの、Sequences of Immunological Interest, 5th ed., U.S. Dept. Health ＆ Human Services, Washington, D.C. (1991)に従って規定されたＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む定常領域抗体配列を意味する。Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧに由来し得る。例えば、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域に由来し得る。重鎖可変ドメインは、Ｆｃドメインに融合され得る。可変ドメインのカルボキシル末端は、Ｆｃ ＣＨ２ドメインのアミノ末端に結合または融合され得る。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自体がＦｃドメインのアミノ末端に融合されている、リンカーアミノ酸配列のアミノ末端に結合または融合され得る。あるいは、可変ドメインのカルボキシル末端は、それ自体がＦｃ ＣＨ２ドメインに融合されている、ＣＨ１ドメインのアミノ末端に結合または融合され得る。要すれば、タンパク質は、全体または一部のＣＨ１ドメインの次にヒンジ領域を含んでいてよい。要すれば、アミノ酸リンカー配列は、可変ドメインとＦｃドメインの間に存在する。軽鎖可変ドメインのカルボキシル末端は、ＣＬドメインのアミノ末端に結合または融合され得る。
【００７０】
重鎖ＣＨ１の例示的な配列は、配列番号８５のアミノ酸１１８−２１５である。軽鎖ＣＬの例示的配列は、配列番号８８のアミノ酸１１２−２１８である。
【００７１】
抗体は、ヒトＣＤ４０に特異的に結合する第一の可変ドメイン、およびＦｃドメインを含む第二のドメインを含む、融合抗体であり得る。
【００７２】
融合タンパク質に用いられる例示的Ｆｃドメインとしては、ヒトＩｇＧドメインが挙げられ得る。例示的ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインとしては、ＩｇＧ４ ＦｃドメインおよびＩｇＧ１ Ｆｃドメインが挙げられる。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子はＣ末端リシンをコード化するが、リシンは血液循環における切断の結果として内生抗体から欠失していることが多い。Ｃ末端リシンを含むＩｇＧ重鎖を有する抗体は、哺乳動物細胞培養物で発現されるとき、存在するＣ末端リシンのレベルが変化する可能性もある（Cai et al, 2011, Biotechnol Bioeng. 108(2):404-12）。従って、本明細書に記載のいずれかのＩｇＧ重鎖ＦｃドメインのＣ末端リシンは省かれてよい。
【００７３】
本明細書に記載の単離された抗体またはその抗原結合部分は、以下のアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含み得る：
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG(P/K)SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY(N/A)STYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR(D/E)E(L/M)TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K/存在しない)(Ｆｃコンセンサス；配列番号１１２）。
【００７４】
Ｆｃドメインは、表４に記載の配列から選択されるアミノ酸配列を含み得る。配列番号１０、１２、１４、１６、９９、１０１、１０３および１０５は、Ｎ末端にＣＨ１ドメインを含む（残基１−９８）。
【００７５】
【表６】
2020521453.tif 000008
【表７】
2020521453.tif 000009
【００７６】
本発明の抗体の可変領域は、要すれば“アミノ酸リンカー”または“リンカー”によりＦｃドメインに結合されていてよい。例えば、重鎖可変ドメインのＣ末端は、アミノ酸リンカーのＮ末端に融合され得て、Ｆｃドメインは、リンカーのＣ末端に融合され得る。アミノ酸リンカーはどんな長さでもよく、アミノ酸の任意の組合せからなってよいが、リンカーの長さは、結合したドメイン間の相互作用を低減するために比較的短くてよい（例えば、５個以下のアミノ酸）。リンカーのアミノ酸組成はまた、かさ高い側鎖を有するアミノ酸または二次構造を誘導する可能性のあるアミノ酸の数を減らすように調整することもできる。好適なアミノ酸リンカーとしては、最大３、４、５、６、７、１０、１５、２０または２５アミノ酸長までのものが含まれるが、これに限定されない。代表的なアミノ酸リンカー配列としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号７３）、およびＧＧＧＧＳの２、３、４または５コピー（それぞれ配列番号７４−７７）を含むリンカーが挙げられる。表５に本明細書で用いるのに適するリンカー配列を列挙する。
【００７７】
【表８】
2020521453.tif 000010
【００７８】
抗体調製
抗体は、好適な哺乳動物宿主細胞株、例えばＣＨＯ、２９３、ＣＯＳ、ＮＳＯなどにおいて常套の技術を用いて産生および精製され、その後、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む、１つの方法または方法の組合せを用いて精製することにより、得られ得る。
【００７９】
当該分野で周知のように、複数のコドンは同じアミノ酸をコードし得る。従って、タンパク質配列をコードする核酸は、コドン縮重を有する核酸を含む。本明細書に記載のポリペプチド配列は、種々の核酸によってコードされ得る。遺伝子コードは普遍的であり、よく知られている。本明細書に記載のいずれかのポリペプチド配列をコードする核酸は、当技術分野の従来の知識に基づいて理解され得て、また産生のために最適化され得る。所定のポリペプチドをコードする核酸配列の可能な数は多く、遺伝子コードの標準表が与えられ、コンピューターによって支援されるが、当業者は、所定のポリペプチドをコードする核酸配列のあらゆる可能な組合せを容易に作製することができる。
【００８０】
５Ｆ１１−４５重鎖可変ドメインをコードする代表的な核酸配列は、以下である：caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca（配列番号１１３）。この配列において、ヌクレオチド７６−１０５は、重鎖の５Ｆ１１−４５可変ドメインのＣＤＲ１をコードし、ヌクレオチド１４８−１９８はそのＣＤＲ２をコードし、そしてヌクレオチド２９５−３１８はそのＣＤＲ３をコードする。
【００８１】
５Ｆ１１−４５軽鎖可変ドメインをコードする代表的な核酸配列は、以下である：gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaa（配列番号１１４）。この配列において、ヌクレオチド７０−１１７は、軽鎖の５Ｆ１１−４５可変ドメインのＣＤＲ１をコードし、ヌクレオチド１６０−１８０はそのＣＤＲ２をコードし、そしてヌクレオチド２７７−３０３はそのＣＤＲ３をコードする。
【００８２】
Ｐ２３８Ｋ Ｆｃドメインを含む５Ｆ１１−４５重鎖をコードする代表的な核酸配列は、以下である：
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaaagtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt（配列番号１１５）。この配列において、ヌクレオチド１−３５１は、重鎖の可変ドメインをコードする。ヌクレオチド３５２−６４５は、ＣＨ１ドメインをコードし、そしてヌクレオチド６４６−１３３８はＦｃドメインをコードする。要すれば、リシンのためのコードを、Ｆｃドメイン配列の３’末端に付加することができる。
【００８３】
５Ｆ１１−４５軽鎖をコードする代表的な核酸配列は、以下である：
gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt（配列番号１１６）。この配列において、ヌクレオチド１−３３３は、軽鎖の可変ドメインをコードし、そしてヌクレオチド３３４−６５４はＣＬをコードする。
【００８４】
重鎖および／または軽鎖のコーディング配列は、コーディング配列の５’末端に、ＭＲＡＷＩＦＦＬＬＣＬＡＧＲＡＬＡ（配列番号１１９）のようなシグナルペプチドをコードし得る。５Ｆ１１−４５重鎖および軽鎖のコーディング配列の例としては、それぞれがシグナルペプチドコーディング配列を含み、以下である：
atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggagagcgctcgcacaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaaagtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt（配列番号１１７）、および
atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggcgcgccttggccgacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt（配列番号１１８）。
【００８５】
従って、本明細書に記載の抗体をコードする核酸もまた意図される。そのような核酸は、好適な発現ベクターのようなベクターに、例えば、ｐＨＥＮ−１（Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137）に挿入され得る。さらに、ベクターおよび／または核酸を含む単離された宿主細胞が提供される。
【００８６】
本発明の抗体は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、２９３（ヒト胎児腎臓２９３細胞）、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞などのような何らかの好適な哺乳動物宿主細胞において常套技術のみを用いて産生および精製され得て、その後、プロテインＡ親和性クロマトグラフィー、イオン交換、逆相技術などを含む、１つの方法または方法の組合せを用いて精製することにより、得られ得る。
【００８７】
医薬組成物および処置法
医薬組成物は、治療的有効量の１種以上の抗体および要すれば薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体には、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組合せが含まれる。薬学的に許容される担体は、融合タンパク質の有効期間または有効性を高める、湿潤剤または乳化剤、防腐剤または緩衝液などの補助物質をさらに含み得る。組成物は、投与後に活性成分の迅速な放出、持続放出または遅延放出を提供するように製剤化され得る。好適な医薬組成物およびそれらの製造法は、当技術分野で公知である。例えば、Remington, THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY, A. Gennaro, et al., eds., 21st ed., Mack Publishing Co. (2005)を参照のこと。
【００８８】
医薬組成物はさらに、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤を含んでいてよい。
【００８９】
そのような処置を必要とする患者において免疫疾患を処置する方法は、治療的有効量の抗体を該患者に投与することを含み得る。ＣＤ４０が介在するＴ細胞活性化に拮抗することは、例えば、自己免疫、移植拒絶またはアレルギー反応中に発生する望ましくないＴ細胞応答を抑制することができる。ＣＤ４０が介在するＴ細胞活性化を阻害することは、これらの疾患の進行および／または重篤度を緩和することができる。
【００９０】
そのような処置を必要とする患者における免疫疾患の処置のための薬剤の調製における、本発明の抗体またはその薬学的に許容される塩の使用もまた、提供される。該薬剤は、例えば、免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤と組み合わせて投与され得る。
【００９１】
本明細書で用いる“患者”は、動物、例えばヒトを含む哺乳動物を意味する。患者は、免疫疾患を有すると診断され得る。“処置（treatment）”または“処置する（treat）”または“処置（treating）”とは、症状、障害、病状または疾患の進行または重篤度の緩和を伴うプロセスを意味する。“免疫疾患”とは、細胞性および／または体液性免疫反応を含む、個体における免疫反応の発現に関連するあらゆる疾患を意味する。免疫疾患の例としては、炎症、アレルギー、自己免疫疾患または移植関連疾患が挙げられるが、これに限定されない。“自己免疫疾患”とは、細胞性および／または体液性免疫反応を含む、個体における自己免疫反応の発症に関連するあらゆる疾患を意味する。自己免疫疾患の例は、潰瘍性大腸炎およびクローン病を含むがこれらに限定されない、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）である。他の自己免疫疾患としては、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、リウマチ性関節炎、糖尿病、乾癬、強皮症およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。移植関連疾患としては、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）、急性移植拒絶および慢性移植拒絶が挙げられる。
【００９２】
本発明の抗体を投与することにより処置され得る疾患は、アジソン病、アレルギー、アナフィラキシー、強直性脊椎炎、喘息、アテローム性動脈硬化症、アトピー性アレルギー、耳の自己免疫疾患、眼の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、気管支喘息、冠状動脈性心臓病、クローン病、糖尿病、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性腸疾患、組換え医薬品（例えば、血友病患者のＶＩＩ因子）に対する免疫反応、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節炎、甲状腺炎、移植拒絶、血管炎、および潰瘍性大腸炎からなる群から選択され得る。
【００９３】
医薬組成物は、単独で、または免疫抑制剤／免疫調節剤および／または抗炎症剤との併用療法として（すなわち、同時にまたは連続して）投与され得る。異なる免疫疾患は、免疫疾患の処置に有用な特定の補助化合物の使用を必要とする場合があり、これは患者毎に決定され得る。例えば、医薬組成物は、１以上の好適なアジュバント、例えばサイトカイン類（例えば、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３）または他の免疫刺激剤、例えばケモカイン類、腫瘍関連抗原、およびペプチドと組み合わせて投与され得る。好適なアジュバントは、当技術分野で公知である。
【００９４】
任意の好適な方法および経路を用いて、抗体または医薬組成物を投与することができる。投与経路としては、例えば、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与または筋肉内投与が挙げられる。投与される抗体の治療的有効用量は、例えば、処置される免疫疾患のタイプおよび重篤度、併用療法の使用、抗体または医薬組成物の投与経路、ならびに患者の体重を含む多数の因子によって変わる。ドメイン抗体の治療的有効量の限定されない範囲は、０．１−２０ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）であり、ある側面において、患者の体重に対して１−１０ｍｇ／ｋｇである。
【００９５】
キット
ヒト患者において免疫疾患を処置するのに有用なキットを提供する。キットは、（ａ）本発明の抗体の用量、および（ｂ）患者における免疫疾患の処置法における該抗体の使用のための指示書、を含み得る。
【００９６】
本明細書で用いる用語“指示書”は、出版物、記録、図、または表現の任意の他の媒体を含み、それらは、キット中の本発明の組成物および／または化合物の有用性を伝えるために用いられ得る。キットの指示書は、例えば、本発明の化合物および／または組成物を含む容器に添付され得るか、または化合物および／または組成物を含む容器と共に出荷され得る。あるいは、指示書は、レシピエントが該指示書および化合物を共同して用いることを意図して、容器とは別に出荷されてもよい。指示書の送達は、例えば、出版物の物理的配信またはキットの有用性を伝える他の表現媒体によるものであってよく、あるいは、例えば電子メールによる、またはウェブサイトからのダウンロードによるなどのコンピューターによる電子送信によって達成されてもよい。
【実施例】
【００９７】
実施例
実施例１：抗ＣＤ４０抗体のＦｃフォーマット化は、未成熟樹状細胞の活性化に影響を与える
抗体は、ヒンジおよびＦｃドメイン内などの、重鎖定常領域を変異させることにより、ＦｃｇＲ（ＦｃγＲ）に対する異なる親和性および選択性を有するように設計することができる。変異を導入して、ＦｃｇＲ結合を強化または低減することができる。これらの変異は、ＦｃｇＲ介在架橋および／またはシグナル伝達を増加または低減させ得る。ＣＤ４０などの治療標的の場合、抗ＣＤ４０抗体のＦｃｇＲ介在架橋は、望ましくないアゴニストシグナル伝達および毒性の可能性をもたらすことがあり得る。ＦｃｇＲ結合の低減ならびに架橋および／またはシグナル伝達の可能性の低下、具体的には、“低親和性”ＦｃｇＲ ｈＣＤ３２ａ／ＦｃｇＲＩＩａ、ｈＣＤ３２ｂ／ＦｃｇＲＩＩｂ、ｈＣＤ１６ａ／ＦｃｇＲＩＩＩａ、およびｈＣＤ１６ｂ／ＦｃｇＲＩＩＩｂの結合の低下を示す、抗ＣＤ４０アンタゴニスト抗体を同定することが重要である。“高親和性”受容体ＣＤ６４／ＦｃｇＲＩの結合は一般的に、この受容体が血清ＩｇＧで飽和するため、懸念が低いと考えられている。
【００９８】
抗体５Ｆ１１−４５は、アゴニスト活性を有し、かつＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂに優先して結合する能力を有するように設計されるヒトＣＤ４０への高親和性を有するヒト化抗体として、米国特許公開第２０１６０３７６３７１号（引用により本明細書中に包含させる）に記載されている。以下の表６は、５Ｆ１１−４５の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を提供する。重鎖可変領域において、ＣＤＲ１はアミノ酸２６−３５であり、ＣＤＲ２はアミノ酸５０−６６であり、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９−１０６である。軽鎖可変領域において、ＣＤＲ１はアミノ酸２４−３８であり、ＣＤＲ２はアミノ酸であり、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９３−１０１である。ＣＤＲは、各可変領域に下線が引かれている。
【００９９】
Ｆｃフォーマット化の未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）の活性化への影響を調べるために、ヒト化抗ＣＤ４０抗体５Ｆ１１−４５を、野生型ヒトＩｇＧ１ｆアイソタイプ（５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１ｆ）、ならびにＦｃｇＲ結合を低減するように設計された変異を有する４つのアイソタイプ（すなわち、５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１．３ｆ、５Ｆ１１−４５−ＣＴｚａ、５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋ、５Ｆ１１−４５−Ｎ２９７Ａ）を用いてフォーマットした。表６の配列番号８１−８５参照。表６は、各５Ｆ１１−４５抗体の重鎖および軽鎖定常領域をさらに列記する。表６中、Ｆｃドメインに下線を付している。重鎖可変領域（アミノ酸１−１１７）および軽鎖可変領域（アミノ酸１−１１１）は太字で表す。可変領域（太字）およびＦｃドメイン（下線）の間の配列（重鎖のアミノ酸１１８−２１５）は、重鎖のＣＨ１ドメインを含む。軽鎖の太字でない配列（アミノ酸１１２−２１８）はＣＬドメインを含む。
【０１００】
【表９】
2020521453.tif 000011
【表１０】
2020521453.tif 000012
【表１１】
2020521453.tif 000013
【表１２】
2020521453.tif 000014
【０１０１】
対照として、同じ５Ｆ１１−４５抗体を、ヒトＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂタンパク質（５Ｆ１１−４５−ＳＥ；重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）はそれぞれ配列番号８６および８８に示される）への結合を高めるか、またはｈＣＤ３２ａよりもｈＣＤ３２ｂ（５Ｆ１１−４５−Ｖ１１；重鎖および軽鎖はそれぞれ配列番号８７および８８に示される）への選択性を高めるために設計した。
【０１０２】
全ての５Ｇ１１−４５ Ｆｃ変異体は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、ＣＤ４０標的への高い結合親和性を示した（表７）。
【０１０３】
【表１３】
2020521453.tif 000015
【０１０４】
Ｆｃ改変５Ｆ１１−４５抗体のＦｃｇＲ結合プロファイルは、Ｆｃ変異が、ＦｃｇＲ結合および選択性に望ましい影響を与えるかどうかを決定するために、ＳＰＲによって特徴付けられた。ＦｃｇＲ結合のＳＰＲデータを表８に示す。
【０１０５】
【表１４】
2020521453.tif 000016
【０１０６】
表８に示されるように、５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１ｆは全てのＦｃｇＲに結合し、ＣＤ６４、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８およびＣＤ３２ａ−Ｈ１３１に特につよく結合する。Ｓ２６７Ｅ変異体（５Ｆ１１−４５−ＳＥ）（対照）は、ＣＤ３２ａおよびＣＤ３２ｂタンパク質への予期される増強された結合を示す。５Ｆ１１−４５−Ｖ１１のＩｇＧ１ Ｖ１１アイソタイプに存在する５つの変異は、ＣＤ３２ｂに対する選択性を高めた。
【０１０７】
示される他の４つの５Ｆ１１−４５ Ｆｃ変異体は、低減したＦｃｇＲ結合を示した。５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１．３ｆは、ＣＤ６４への最も弱い結合を含む全てのＦｃｇＲへの低減した結合が示された。顕著に高い抗体濃度（すなわち、１０μＭ）では、５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１．３ｆのＣＤ３２ａ−Ｒ１３１への弱い結合が観察される。対照的に、他の３つの変異体（５Ｆ１１−４５−ＣＴｚａ、５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋおよび５Ｆ１１−４５−Ｎ２９７Ａ）は、１０μＭの抗体濃度でさえ、低親和性ＦｃｇＲのほぼ検出不可能な結合を示した。上記表７参照。相違点はまた、ＣＤ６４結合で、とりわけ解離速度で観察され、それは、５Ｆ１１−４５−ＣＴｚａまたは５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１ｆと比較して、５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋおよび５Ｆ１１−４５−Ｎ２９７Ａについてかなり速かった（図１）。
【０１０８】
未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）は、サイトカイン放出（例えば、インターロイキン−６、ＩＬ−６）および細胞表面活性化シグナルの上方制御（例えば、ＣＤ８６およびＣＤ５４)につながる未成熟ＤＣの活性化をもたらし得るクラスター化／架橋結合を介したＣＤ４０の間接的活性化に感受性である。ＣＤ３２ａを高度に過剰発現し、ＦｃｇＲとの低親和性を有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を用いて、ＦｃｇＲを介したクラスター化／架橋結合の可能性を示した。ＣＨＯ細胞とｉＤＣの比は１：６であり、これはクラスター化／架橋結合の誇張された（exaggerated）レベルを表す。
【０１０９】
ＢＭＳ−９８６０９０は、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインに融合された抗ＣＤ４０アンタゴニストドメイン抗体であり、以下のアミノ酸配列を有する：
【化１】
2020521453.tif 000017
ＢＭＳ−９８６０９０配列の下線部分は、ＢＭＳ３ｈ−５６−２６９ドメイン抗体（WO 2012/145673の配列番号417）に対応する。点線部分“ＡＳＴ”（配列番号７８）はリンカーであり、残りの部分はＩｇＧ４．１と称されるＦｃドメインである。２１４１（ｍＡｂ１３４−２１４１）は、ＣＤ４０アゴニスト抗体である（Robert Vonderheide et al., “Clinical Activity and Immune Modulation in Cancer Patients Treated with CP-870,893, a Novel CD40 Agonist Monoclonal Antibody”, 25(7): 876-883 (2007)参照）。ＢＭＳ−９８６０９０および２１４１を、架橋介在抗ＣＤ４０ ｉＤＣ活性化の陽性対照として用いた。ＣＤ４０結合能を有さない融合タンパク質であるＬ６−ＩｇＧ４を陰性対照として用いた。図２に示す通り、５Ｆ１１−４５−ＣＴｚａ、５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋおよび５Ｆ１１−４５−Ｎ２９７Ａは、増加したサイトカイン（インターロイキン−６；Ｉｌ−６；図２Ａ）あるいは細胞表面ＣＤ３２により可溶性または架橋結合／クラスター化された場合、活性化マーカーの増加（ＣＤ８６ ＭＦＩ；図２ＣおよびＣＤ５４ ＭＦＩ；図２Ｂ）によって測定されるように、架橋介在抗ＣＤ４０ ｉＤＣ活性化を示さなかった。５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１．３ｆは、ＣＤ５４およびＣＤ８６細胞表面染色の増加によって示されるように、ＣＤ３２ ＣＨＯ細胞と共にインキュベートしたときのみ、適度なｉＤＣ活性化を示した。低親和性ＦｃｇＲ（すなわち、５Ｆ１１−４５−ＩｇＧ１ｆ、５Ｆ１１−４５−ＳＥおよび５Ｆ１１−４５−Ｖ１１）への結合を示した全ての変異体は、ＣＤ３２ ＣＨＯ細胞の添加により顕著に増加したｉＤＣ活性化を示した（図２）。ＣＴｚａ、Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａでフォーマット化された５Ｆ１１−４５抗体は、検出可能なｉＤＣ活性化を示さなかった。これらのデータは、ＣＴｚａ、Ｐ２３８ＫまたはＮ２９７Ａでフォーマット化された５Ｆ１１−４５抗体がＣＤ４０活性に拮抗することを裏付けている。
【０１１０】
他の抗体においてこれらの観察をさらに評価するために、強力なマウス抗ヒト−ＣＤ４０抗体Ｙ１２３８を、これらのアイソタイプを有するキメラ抗体として、およびＩｇＧ１．３ｆとして（重鎖について配列番号９０−９３および軽鎖について配列番号９４）フォーマット化した。表９参照。重鎖可変領域は、アミノ酸１−１１８（太字）である。重鎖可変領域において、ＣＤＲ１はアミノ酸２６−３６であり、ＣＤＲ２はアミノ酸５０−６６であり、そしてＣＤＲ３はアミノ酸９９−１０７である。Ｆｃドメインはアミノ酸２１７−４４８である。可変領域（太字）とＦｃドメイン（下線）の間の配列（重鎖のアミノ酸１１９−２１６）は、重鎖のＣＨ１ドメインを含む。軽鎖可変領域はアミノ酸１−１０７である。軽鎖可変領域において、ＣＤＲ１はアミノ酸２４−３４であり、ＣＤＲ２はアミノ酸５０−５６であり、そしてＣＤＲ３はアミノ酸８９−９７である。軽鎖のアミノ酸１０８−２１４はＣＬドメインを含む。
【０１１１】
【表１５】
2020521453.tif 000018
【表１６】
2020521453.tif 000019
【０１１２】
これらのキメラ抗体は、ＳＰＲによるＣＤ４０結合およびＦｃｇＲ結合について、ならびにｉＤＣ活性化について試験された。Ｆｃ変異体Ｙ１２３８キメラ抗体は全て、ヒト−ＣＤ４０に対する高親和性を示した（表１０）。
【０１１３】
【表１７】
2020521453.tif 000020
【０１１４】
５Ｆ１１−４５と同様に、Ｆｃドメインを操作したキメラＹ１２３８抗体は、ＩｇＧ１ｆアイソタイプ対照と比較して、はるかに弱いＦｃｇＲ結合を示した。Ｙ１２３８−ＩｇＧ１．３ｆ分子は、低親和性ＦｃｇＲ、特にＣＤ３２ａ−Ｒ１３１およびＣＤ３２ｂに対して弱いが測定可能な結合応答を示した。対照的に、ＣＴｚａ、Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａ変異体は、１０μＭの抗体濃度であっても、これらのＦｃｇＲへの結合が非常に弱いかまたは検出不可能であった（表１１）。
【０１１５】
【表１８】
2020521453.tif 000021
【０１１６】
ＣＤ６４結合は、キメラＹ１２３８抗体について５Ｆ１１−４５変異体と同様であり、ＩｇＧ１．３ｆは最も弱いＣＤ６４結合を示した。Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａ変異体は両方とも、Ｙ１２３８キメラ抗体形態であれ、５Ｆ１１−４５であれ、ＣＴｚａよりも顕著に速い解離速度を有する。
【０１１７】
５Ｆ１１−４５と同様に、キメラＹ１２３８は、ＣＴｚａ、Ｐ２３８ＫまたはＮ２９７Ａアイソタイプでフォーマット化されたとき、単独で、またはＦｃｇＲ（ＣＤ３２）を過剰発現するＣＨＯ細胞の添加によるいずれでもｉＤＣの活性化を示さなかった（図３）。最小活性化が、ＩｇＧ１．３ｆ Ｆｃ配列を有するキメラＹ１２３８で観察された。しかしながら、ｉＤＣサイトカイン放出（図３Ａ）および活性化マーカー上方制御（図３Ｂおよび３Ｃ）は、ＣＤ３２を発現するＣＨＯ細胞との共インキュベーションで増加した。
【０１１８】
キメラＹ１２３８−Ｐ２３８ＫおよびＹ１２３８−Ｎ２９７Ａは、追加のドナー由来のｉＤＣでさらに試験され、これらの分子が、単独またはＣＤ３２ ＣＨＯ細胞の添加のいずれでも、未成熟樹状細胞を活性化しないことを確認した（図４）。これらの試験における陽性対照はＢＭＳ−９８６０９０および２１４１である；両抗体は、溶液において用いられるとき、ドナーの亜集団由来の細胞においてｉＤＣ活性化をもたらす（図３および４）。しかしながら、ｉＤＣ活性化は、ＣＤ３２ ＣＨＯ細胞クラスター化／架橋結合に伴って顕著に増加し、これらの条件下で試験された全てのドナー由来の細胞において観察された。
【０１１９】
実施例２：ヒト化ＣＤ４０アンタゴニスト抗体Ｙ１２３８は、Ｐ２３８ＫまたはＮ２９７Ａ変異を含むアイソタイプでフォーマット化されたとき、ＣＤ４０シグナル伝達を強力に阻害し、アゴニストシグナルを示さないことを示す。
ヒト化の背景技術／手順は、ＷＯ２０１７００４００６のセクション“II．変異導入抗体および改変抗体”に記載されており、この文献は、引用によりその内容全体を本明細書中に包含される。この分析に基づいて、１１個のＶＨ 配列（配列番号２３−３３）および５個のＶκ 配列（配列番号３４−３８）が試験のために選択された。置換を太字および点線で示す。重鎖可変部および軽鎖可変部のＣＤＲは、ＣＤＲ１−ＣＤＲ２−ＣＤＲ３の順であり、下線で示され、すなわち、重鎖可変部ＣＤＲについてそれぞれ、ＧＹＡＦＴＮＹＬＩＥ（配列番号１７）、ＶＩＮＰＧＳＧＧＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１８）およびＳＱＬＧＲＲＦＤＹ（配列番号１９）であり（表１２）、ならびに軽鎖可変部ＣＤＲについてそれぞれＫＡＳＱＤＶＲＴＧＶＡ（配列番号２０）、ＳＡＳＹＲＮＴ（配列番号２１）およびＱＱＨＹＳＰＰＹＴ（配列番号２２）である（表１３）。
【０１２０】
【表１９】
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【０１２１】
【表２０】
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【０１２２】
ＶＨ配列は、ＩｇＧ１．３ｆアイソタイプに照らしてフォーマット化された。Ｖκ配列は、共通のＣＬ配列を有する完全長軽鎖としてフォーマット化された。これらのヒト化ＨＣおよびＬＣ構築物の５５個全ての組合せ、ならびにキメラＹ１２３８分子を、ＳＰＲによる結合分析のために３ｍｌの上清として発現させた。５６個の上清、ならびに精製したＹ１２３８−キメラＩｇＧ１抗体のそれぞれを、プロテインＡセンサーチップ上に捕捉し、スクリーニングアッセイにおいてＢＩＡｃｏｒｅ（商標） ＳＰＲを用いて、２つの濃度（すなわち、２００ｎＭおよび１０００ｎＭ）のｈＣＤ４０−モノマーへの結合について試験した。ｈｚ−ＨＣ３を含む抗体を除く全ての抗体は、１００倍希釈の発現上清を用いて高レベル（＞３００ ＲＵ）で捕捉され、このことは、ｈｚ−ＨＣ３サンプルを除く上清の抗体力価が高いことを示している。２つの濃度のｈＣＤ４０−モノマーの反応動態(kinetic)データは、１：１のラングミュアモデルに適合し、これらの相互作用の反応動態および親和性の推定値を導き出し、異なる分子を比較した。これらのデータは、捕捉された抗体が、ＣＤ４０に高い親和性で結合したことを示し；推定ＫＤ値は、２．６５ｎＭと１８．２ｎＭの間であった（表１４参照）。所定の軽鎖について、重鎖ｈｚＨＣ１、ｈｚ−ＨＣ２、ｈｚ−ＨＣ４、ｈｚ−ＨＣ５、ｈｚ−ＨＣ６、ｈｚ−ＨＣ７、ｈｚ−ＨＣ８およびｈｚ−ＨＣ９を有する抗体は、ｈｚ−ＨＣ１０またはｈｚ−ＨＣ１１を含む抗体よりも高いＣＤ４０親和性を示した。また、所定の重鎖について、軽鎖ｈｚ−ＬＣ１またはｈｚ−ＬＣ２を有する抗体は、ｈｚ−ＬＣ３、ｈｚ−ＬＣ４またはｈｚ−ＬＣ５を有する抗体よりも高いＣＤ４０親和性を有した。代表的な上清および精製キメラＹ１２３８へのＣＤ４０結合の完全な動態滴定系もまた、２点（２００ｎＭおよび１０００ｎＭ）スクリーニングデータに基づく推定ＫＤ値が、表１４に示すように、分析物の完全な動態滴定系と比較した場合とき、上清サンプルについての結合動態および親和性の合理的な推定値であることも示した。
【０１２３】
【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【０１２４】
上清スクリーニングＳＰＲデータおよびフレームワーク復帰突然変異のより少ない構築物に対するバイアスに基づき、ヒト化Ｙ１２３８抗体のサブセットを、発現、精製およびさらなる特性化について選択した。これらの抗体のうち２つ（すなわち、Ｙ１２３８−ｈｚ１およびＹ１２３８−ｈｚ２）は、Ｐ２３８ＫおよびＮ２９７Ａアイソタイプ（すなわち、重鎖について配列番号３９、４０、４２および４３；軽鎖について表１５参照）を用いてフォーマット化され、ＳＰＲによりＣＤ４０結合およびＦｃｇＲ結合について試験された。ＣＤ４０結合ＳＰＲデータは、各抗体が高親和性を有するＣＤ４０標的に結合したことを示した（表１６）。データは、別の抗ＣＤ４０抗体である抗体ＢＩ−ｍＡｂ−Ｂ（すなわち、配列番号９５および９６、米国特許第９，０９０，６９６号に開示され、そこでは“抗体Ｂ”と称される）のデータと比較され、該抗体は、ヒト化Ｙ１２３８分子よりもはるかに低い親和性で結合する（表１５）。Ｆｃドメインには下線が付されている。
【０１２５】
【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【０１２６】
表１５のＨｚ１およびＨｚ２の２つの軽鎖配列（配列番号４１および４４）のアライメントは次の通りであり、２つの配列間の１変異差異を示す（位置６６；以下、下線を付す）：
【化２】
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【０１２７】
【表２８】
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【０１２８】
全てのＹ１２３８抗体は、可溶性ＣＤ４０Ｌ三量体またはＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞由来の細胞性ＣＤ４０ＬのいずれかによるＢ細胞増殖の強力なアンタゴニストであることが示されている（表１７参照）。対照的に、競合抗体ＢＩ−ｍＡｂ−Ｂおよび５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋは、可溶性ＣＤ４０ＬシグナルによるＢ細胞増殖の強力な阻害を示すが、細胞性ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌを発現するＣＨＯ細胞）によるＢ細胞増殖の阻害にはあまり効果がなかった。Ｙ１２３８キメラ抗体およびヒト化抗体は、細胞性ＣＤ４０ＬがＢ細胞の刺激に用いられたとき、約１０倍の効力シフトのみを示した。
【０１２９】
【表２９】
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【０１３０】
ヒト化Ｙ１２３８抗体（すなわち、Ｙ１２３８−ｈｚ１−Ｎ２９７Ａ、Ｙ１２３８−ｈｚ１−Ｐ２３８Ｋ、Ｙ１２３８−ｈｚ２−Ｐ２３８ＫおよびＹ１２３８−ｈｚ１−Ｎ２９７Ａ）のＦｃｇＲ結合は、キメラＹ１２３８抗体および５Ｆ１１−４５抗体の以前のデータと一致しており、全ての低親和性ＦｃｇＲに対する顕著に弱い結合応答を示している（表１８）。
【０１３１】
【表３０】
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【０１３２】
加えて、Ｙ１２３８抗体のヒト化バージョンは、単独で、またはＦｃｇＲ ＣＤ３２を発現するＣＨＯ細胞を添加して、試験したとき、陰性対照タンパク質Ｌ６−ＩｇＧ４よりも最小のｉＤＣ活性化を示した。この結果は、ＣＤ３２を過剰発現するＣＨＯ細胞によって提供される過剰な架橋を有してもＣＤ４０を活性化するヒト化Ｙ１２３８抗体の不活性化と一致する。対照的に、２１４１およびＢＭＳ−９８６０９０の両対照抗体は、ＣＤ３２ ＣＨＯ細胞により架橋またはクラスター化されたとき、ロバストに増加したｉＤＣ単独のドナー依存性の中程度の活性化を示した（図５および６）。同様に、５Ｆ１１−４５−Ｐ２３８Ｋは、ｉＤＣドナーのより大きなパネルで試験したとき、単独で、あるいはＣＤ３２を介したクラスター化または架橋による、活性化を示さなかった（図６）。
【０１３３】
実施例における材料および方法
ＦＣＧＲ結合ＳＰＲ：ＦｃｇＲ結合は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの方法を用いて精製ＦｃｇＲを用いてインビトロで測定することができる。１つの方法は、抗Ｈｉｓ抗体の固定化Ｆａｂフラグメントに捕捉されたＨｉｓタグ付きＦｃｇＲタンパク質（ＦｃｇＲ−Ｈｉｓ）に対する精製抗体の結合を試験する。これらの試験は、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００またはＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００装置（GE Healthcare Life Sciences、Marlborough、MA）において２５℃で実施される。マウス抗６ｘＨｉｓ抗体（社内で作製）由来のＦａｂフラグメントをＣＭ５センサーチップ上に、標準エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学とエタノールアミンブロッキングを用いて、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤 ｐ２０（ＨＢＳ−ＥＰ＋）の泳動緩衝液中、３０００ＲＵまでの密度で固定化する。残りの全ての研究は、１０ｍＭ ＮａＰＯ４、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ ｐ２０（ＰＢＳ−Ｔ） ｐＨ ７．１の泳動緩衝液を用いて行う。Ｃ末端 ６ｘ ポリヒスチジンタグ（社内で作製）を含む種々のＦｃγＲタンパク質が、この表面上に、１０μｌ／分で３０秒間の接触時間を用いて捕捉される（一般的に、７μｇ／ｍｌまでのＦｃｇＲ−ｈｉｓタンパク質濃度を用いて）。種々の濃度の精製抗体を結合について、例えば３０μｌ／分で１２０秒間の結合時間、および３０μｌ／分で１２０秒の解離時間を用いて、試験する。これらの試験でテストされたＦｃｇＲタンパク質には、“高親和性”のＦｃｇＲ ＣＤ６４（ｈＦｃｇＲＩ）、ならびに“低親和性”のＦｃｇＲ ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｈ１３１）、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１（ＦｃｇＲＩＩａ−Ｒ１３１）、ＣＤ３２ｂ（ＦｃｇＲＩＩｂ）、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８（ＦｃｇＲＩＩＩａ−Ｖ１５８）、およびＣＤ１６ｂ−ＮＡ２（ＦｃｇＲＩＩＩｂ−ＮＡ２）が含まれる。
【０１３４】
結合応答を定量的に分析し、異なる分子のＦｃｇＲ結合を比較するために、以下の式を用いて、理論上の最大結合応答（％Ｒｍａｘ）の割合として最大結合応答を計算することにより、ＳＰＲ結合データを分析することができる：
式１：％Ｒｍａｘ＝（結合応答分析物）／［（（Ｍｗ 分析物）／（Ｍｗ リガンド）） ｘ （応答リガンド） ｘ （分析物：リガンド化学量論）］
（式中、“分析物”は抗体であり、リガンドは捕捉されたＦｃｇＲタンパク質である。）
【０１３５】
この分析では、抗体またはＦｃｇＲのグリコシル化の質量を考慮することなく、捕捉されたリガンドの１００％部分活性（fractional activity）を仮定している。ＦｃｇＲはグリコシル化されているため、％Ｒｍａｘ値は、通常、飽和条件下でさえ１００％未満である。％Ｒｍａｘ分析は、“低親和性”ＦｃｇＲ ＣＤ３２ａ−Ｈ１３１、ＣＤ３２ａ−Ｒ１３１、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ−Ｖ１５８およびＣＤ１６ｂ−ＮＡ２（それらは、テストした分析物濃度（１μＭ）付近またはそれ以下で、比較的速い結合および解離速度ならびに親和性を有するため、これらの条件下では表面の飽和は一般に達成されない）の結合を評価するのに特に有用である。対照的に、“高親和性”ＦｃｇＲ ＣＤ６４は、特にＩｇＧ１およびＩｇＧ４に対して、他のＦｃｇＲよりも高い親和性および遅い解離速度で結合する。従って、これらのアイソタイプは、一般的に、マイクロモルの分析物濃度下でＣＤ６４表面を飽和させ、％Ｒｍａｘを用いて結合親和性を区別することはより困難である。これらの相互作用の場合、抗体間の相違は、センサーグラムデータの解離速度を比較することにより容易に観察できる。
【０１３６】
ＣＤ４０結合動態および親和性：抗体分子の一価のＣＤ４０結合親和性は、２５℃にて、固定化されたプロテインＡセンサーチップ表面上に抗体を捕捉し、次いでＰＢＳ−Ｔ（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むリン酸緩衝生理食塩水）、ｐＨ ７．１中、３０μｌ／分で、１８０秒の結合時間、３６０秒の解離時間を用いて、ヒト−ＣＤ４０−モノマータンパク質（社内で調製）を結合することにより、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ１００またはＴ２００装置（GE Healthcare）のＳＰＲにより測定される。
【０１３７】
初代細胞単離および培養：ＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を、フィコール密度勾配分離によってヘパリン化ヒト血液から単離する。単球を、マニュアルＥａｓｙＳｅｐプロトコール（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、Vancouver、Canada）に従ってＰＢＭＣから単離する。単離された単球１００万個を、６ウェルプレートの各ウェル中に、ヒトＩＬ−４（インターロイキン−４、１００ｎｇ／ｍｌ）およびヒトＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、１００ｎｇ／ｍｌ）を含む６ｍｌの完全培地（RPMI-1640、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清、１００単位／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン）をプレーティングし、３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートし、一日おきに培地を交換して、同じ濃度のサイトカインを含む新鮮な培地と置き換える。６日目にｉＤＣを回収し、よく洗浄して、完全培地に再懸濁させた。
【０１３８】
ＦｃγＲクラスター化／架橋の存在下または不存在下における抗ＣＤ４０抗体を用いたｉＤＣの処理：種々の生物学的製剤の滴定液を完全培地で作製し、デュプリケートで９６ウェルプレートに添加する。架橋の場合、抗体を細胞に、１：６の比でＣＤ３２ａ発現ＣＨＯ細胞を添加する前に、３０分間加える。細胞を、３７℃で５％ ＣＯ２にて、約１８−２０時間インキュベートした。１５０μＬの上清を各ウェルから採取し、１：５に希釈し、市販のＥＬＩＳＡキット（R&D Systems、Minneapolis、MN）を製造者の指示に従って用いて、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＬ−１２のタンパク質濃度を評価する。回収した上清からプレートに残った細胞を、デュプリケートの処理当たり１サンプルに合わせ、新しい９６ウェルの丸底（ＲＢ）プレートに移し、４℃に置く。細胞を、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋不含有のＤ−ＰＢＳ（ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Fixable Near-IR Dead Cell Stain キット（Invitrogen、Carlsbad、CA）を用いて生存細胞を氷上で３０分間染色する。細胞を洗浄し、Ｄ−ＰＢＳ、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋不含有、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、０．１％ ＮａＮ３（染色緩衝液）に再懸濁し、５μｌ／ウェルの染色緩衝液中ヒト TruStain FcX（商標） （Ｆｃ受容体ブロッキング溶液、Biolegend、San Diego、CA）でブロッキングする。
【０１３９】
ＤＣを、ＰｅｒＣｐＣｙ５．５結合αＣＤ３、αＣＤ１９、αＣＤ１４（Ｌｉｎ−）、ＢＵＶ３９５結合αＣＤ１１ｃ（BD Biosciences、San Diego、CA）、ＡＰＣ結合αＣＤ８６（Biolegend、San Diego、CA）、ＰＥ結合αＣＤ８３（eBioscience、San Diego、CA）、ＦＩＴＣ結合αＣＤ５４（Biolegend、San Diego、CA）を用いて免疫染色し、４℃で４５分間インキュベートする。細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、１００μｌのBD Cytofix 固定緩衝液（BD Bioscience、San Diego、CA）を添加することにより固定する（ＲＴにて１５分間、光から保護）。ＤＣを、LSRII-Fortessa フローサイトメーター（BD Biosciences、San Diego、CA）およびFlowJo 分析ソフトウェア（Treestar、Ashland、OR）を用いて、ＣＤ８６、ＩＣＡＭ−１およびＣＤ８３発現ついて評価する。
【０１４０】
ＣＤ４０Ｌの阻害は、ヒトＢ細胞増殖を誘導する：ヒト扁桃腺Ｂ細胞を、常套の扁桃摘出術中に小児患者から得る。該細胞を、組織を細かく分割し穏やかに押しつぶして単離し、該細胞をスクリーンを通過させ、そしてヒト Lympholyte（登録商標）−Ｈ分離媒体（Cedarlane Labs、Burlington、ON）を用いた密度勾配分離により単核細胞を単離する。単核細胞をインターフェイスから回収し、洗浄し、ヒツジ赤血球細胞（SRBC、Colorado Serum Company; Denver、CO）を用いて４℃で１時間ロゼット形成させ、次いで密度勾配分離を行ってＴ細胞を除去する。細胞を再度洗浄し、１０％ ＦＢＳを含むＲＰＭＩ（完全培地）に再懸濁させる。抗体の滴定液を完全培地で作製し、トリプリケートで９６ウェル丸底（ＲＢ）プレートに添加する。１Ｘ１０５ 個の扁桃腺ヒトＢ細胞を添加し、可溶性ＩＺ−ｈＣＤ４０Ｌ（２μｇ／ｍＬ）または１０，０００Ｒａｄを照射したヒトＣＤ４０Ｌで安定にトランスフェクトした（ＣＨＯ−ｈＣＤ４０Ｌ）チャイニーズハムスター卵巣細胞のいずれかを用いて刺激する；その後、細胞を２Ｘ１０３細胞／ウェルで播種し、各ウェル当たり２００μＬの最終容量とする。プレートを３７℃、５％ ＣＯ２で７２時間インキュベートし、最後の６時間、１ウェル当たり０．５μＣｉの３［Ｈ］−チミジンで標識し、回収し、そして液体シンチレーションで計数する。Ｂ細胞増殖を、チミジン取り込みに基づいて定量した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020521453.tif 000041
【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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