(57)【要約】本発明は、真核生物の標的細胞又は標的生物における正確なゲノム編集の効率を増大させるのに好適な化合物、組成物及びキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の標的細胞における、特に哺乳動物の標的細胞におけるゲノム編集のための、
（ｉ）触媒的に不活性であるが構造的に完全であり、野生型配列と比較して少なくとも１つの変異を含むＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット、
（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットをコードする核酸分子及び／又は
（ｉｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットを含むか、又は発現できる真核細胞
の使用。
【請求項２】
触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットが、触媒ループ（アミノ酸３９１７〜３９２７）において、Ｐループ（アミノ酸３７２９〜３７３５）において又は隣接領域（アミノ酸３７３６〜３７６０）において（ヒトのＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づく）、少なくとも１つの変異を含み、キナーゼ活性を低下させるか、又は不活性化するトランケーション（例、Ｙ４０４６＊）をもたらす変異を含み、アミノ酸の位置は、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る、請求項１の使用。
【請求項３】
触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットが、Ｋ３７５３位、Ｄ３９２２位、Ｔ３９５０位、及び／又はＦ３９４６位（ヒトのＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づく）に少なくとも１つの変異を含み、アミノ酸の位置は、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る、請求項１又は２の使用。
【請求項４】
変異がＫ３７５３位にあり、特にＫ３７５３Ｒであり、アミノ酸の位置がヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る、請求項３の使用。
【請求項５】
触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットが、通常その自己リン酸化機能の標的であるリン酸化クラスターにおける少なくとも１つの変異を含み、該変異が、ＰＱＲクラスター（Ｓ２０２３及び／若しくはＳ２０２９及び／若しくはＳ２０４１及び／若しくはＳ２０５３及び／若しくはＳ２０５６）についての不活性化変異、例えば、アラニン（但し、それに限定されない）である変異、そして／或いは、ＡＢＣＤＥクラスター（Ｔ２０６９及び／若しくはＳ２６１２及び／若しくはＴ２６２０及び／若しくはＳ２６２４及び／若しくはＴ２６３８及び／若しくはＴ２６４７）並びに／又はＮクラスター（Ｓ５６及び／若しくはＳ７２）並びに／又はＪＫクラスター（Ｔ９４６及び／若しくはＳ１００３）についての活性化（ホスホミミック）変異、例えば、アスパラギン酸（但し、それに限定されない）である変異を含み、表示されたアミノ酸の位置が、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る、請求項１の使用。
【請求項６】
標的細胞が、脊椎動物の標的細胞を含む真核生物の標的細胞である、請求項１〜５のいずれか１項の使用。
【請求項７】
標的細胞が、げっ歯類の標的細胞又はヒトの標的細胞を含む哺乳動物の標的細胞である、請求項１〜６のいずれかの使用。
【請求項８】
標的細胞が、真核生物の標的生物の人工多能性幹細胞又は胚性多能性幹細胞を含む幹細胞、特にヒトの人工多能性幹細胞又は胚性多能性幹細胞である、請求項１〜７のいずれか１項の使用。
【請求項９】
（ａ）ＨＤＡＣ阻害剤である化合物（Ｉ）、
（ｂ）ＮＡＥ阻害剤である化合物（ＩＩ）、
（ｃ）ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である化合物（ＩＩＩ）、若しくは
（ｄ）ＲＰＡ阻害剤である化合物（ＩＶ）
又は前記化合物のうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、若しくは４つの組合せ物、を標的細胞へ導入することを更に含む、請求項１〜８のいずれか１項の使用。
【請求項１０】
化合物（Ｉ）がトリコスタチンＡであり、及び／又は
化合物（ＩＩ）がＭＬＮ４９２４であり、及び／又は
化合物（ＩＩＩ）がＮＵ７０２６であり、及び／又は
化合物（ＩＶ）がＮＳＣ１５５２０である、
請求項１〜９のいずれか１項の使用。
【請求項１１】
ゲノム編集が、標的細胞の二本鎖ゲノムに、スタガードカット、特に５’オーバーハングを伴うスタガードカット、又は平滑末端カットを導入することを含む、請求項１〜１０のいずれか１項の使用。
【請求項１２】
ゲノム編集が、標的細胞におけるＤＮＡ切断酵素の存在、例えば、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ酵素の存在、又は（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１酵素の存在、又は（ｉｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼの存在、を含む、請求項１〜１１のいずれか１項の使用。
【請求項１３】
ゲノム編集が、標的細胞に一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ分子、特に一本鎖のＤＮＡ分子である、所望の変異を有するドナーＤＮＡ分子を導入することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項の使用。
【請求項１４】
標的細胞における内因性ＤＮＡ−ＰＫｃｓのノックダウンと組み合わせた、請求項１〜１３のいずれか１項の使用。
【請求項１５】
真核生物の標的細胞又は標的生物のゲノムを編集するための方法であって、標的細胞又は標的生物に、（ｉ）触媒的に不活性であるが構造的に完全であり、野生型配列と比較して少なくとも１つの変異を含むＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット、又は
（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットをコードする核酸分子組合せ物
を導入することを含む、方法。
【請求項１６】
真核生物の標的細胞における、特に哺乳動物の標的細胞における、より具体的にはヒトの標的細胞におけるゲノム編集のための
（ａ）ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）と、
（ｂ）ＨＤＡＣ阻害剤である少なくとも１つの化合物（Ｉ）、ＮＡＥ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩ）及び／又はＲＰＡ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＶ）、
との組合せ物のインビトロの使用であって、ゲノム編集が、標的細胞の二本鎖ゲノムにスタガードカットを導入することを含む、使用。
【請求項１７】
化合物（Ｉ）がトリコスタチンＡであり、及び／又は
化合物（ＩＩ）がＭＬＮ４９２４であり、及び／又は
化合物（ＩＩＩ）がＮＵ７０２６であり、及び／又は
化合物（ＩＶ）がＮＳＣ１５５２０である、
請求項１６の使用。
【請求項１８】
組合せ物が、
−少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）、
−少なくとも１つの化合物（Ｉ）及び／又は
−少なくとも１つの化合物（ＩＩ）並びに
−必要に応じて、少なくとも１つの化合物（ＩＶ）
を含む、請求項１６及び１７の使用。
【請求項１９】
ゲノム編集が、標的細胞の二本鎖ゲノムに５’オーバーハングを伴うスタガードカットを導入することを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項の使用。
【請求項２０】
ゲノム編集が、（ｉ）標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ酵素の存在、又は（ｉｉ）標的細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１酵素の存在を含む、請求項１６〜１９のいずれか１項の使用。
【請求項２１】
真核生物の標的生物の人工多能性幹細胞又は胚性多能性幹細胞を含む幹細胞、特にヒトの人工多能性幹細胞又は胚性多能性幹細胞におけるゲノム編集のための、請求項１６〜２０のいずれか一項の使用。
【請求項２２】
組合せ物が、少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）、少なくとも１つの化合物（Ｉ）、少なくとも１つの化合物（ＩＩ）、及び少なくとも１つの化合物（ＩＶ）を含む、請求項２１の使用。
【請求項２３】
造血細胞における、又は造血前駆細胞におけるゲノム編集のための、請求項１６〜２０のいずれか１項の使用。
【請求項２４】
組合せ物が、特に化合物（ＩＩ）の非存在下で、少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）、少なくとも１つの化合物（Ｉ）及び必要に応じて少なくとも１つの化合物（ＩＶ）を含む、請求項２３の使用。
【請求項２５】
不死化細胞におけるゲノム編集のための、請求項１６〜２０のいずれか１項の使用。
【請求項２６】
組合せ物が、特に化合物（ＩＩ）の非存在下で、少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）、少なくとも１つの化合物（Ｉ）及び少なくとも１つの化合物（ＩＶ）を含む、請求項２５の使用。
【請求項２７】
組合せ物が、
（ｉ）触媒的に不活性であるが構造的に完全であり；野生型配列と比較して少なくとも１つの変異を含み、特に変異サブユニットＫ３７５３Ｒである、ＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット、
（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットをコードする核酸分子、及び／又は
（ｉｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットを発現できる真核細胞
を更に含む、請求項１６〜２６のいずれか１項の使用。
【請求項２８】
ゲノム編集が、標的細胞に、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ分子、特に一本鎖ＤＮＡ分子である、所望の変異を有するドナーＤＮＡ分子を導入することを含む、請求項１６〜２７のいずれか１項の使用。
【請求項２９】
真核生物の標的細胞又は標的生物、特に哺乳動物の標的細胞又は標的生物、より具体的にはヒトの標的細胞又は標的生物におけるゲノム編集を含む方法における、ヒト医療又は獣医療を含む医療において用いるための
（ａ）ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）、並びに
（ｂ）ＨＤＡＣ阻害剤である少なくとも１つの化合物（Ｉ）、ＮＡＥ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩ）及び／又はＲＰＡ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＶ）、
を含む組合せ物であって、ゲノム編集が標的細胞又は標的生物の二本鎖ゲノムにスタガードカットを導入することを含む、組合せ物。
【請求項３０】
真核生物の標的細胞又は標的生物のゲノムを編集するための方法であって、標的細胞又は標的生物に、
（ａ）ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩＩ）と、
（ｂ）ＨＤＡＣ阻害剤である少なくとも１つの化合物（Ｉ）、ＮＡＥ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＩ）及び／又はＲＰＡ阻害剤である少なくとも１つの化合物（ＩＶ）、
との組合せ物を導入することを含み、
ゲノム編集が、標的細胞又は標的生物の二本鎖ゲノムにスタガードカットを導入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
明細書
本発明は、真核生物の標的細胞又は標的生物における正確なゲノム編集の効率を増大させるのに好適な化合物、組成物及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲは、真核細胞において染色体ＤＮＡ配列を正確に切断するために採用されている、細菌のウイルスＤＮＡに対するヌクレアーゼ免疫系である。かかるＤＮＡ切断は、２つの競合する経路：非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復される。
【０００３】
ＮＨＥＪにおいては、ＤＮＡ末端に結合する最初のタンパク質はＫｕ７０／Ｋｕ８０であり、ＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）が次である（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。キナーゼは、修復部位で自身及び他の下流のエフェクターをリン酸化する。Ａｒｔｅｍｉｓのようないくつかのタンパク質の動員及びリン酸化により、リガーゼＩＶ（ＬＩＧ４）、Ｘ線修復交差補完タンパク質４（ＸＲＣＣ４）、及び非相同末端結合因子１（ＸＬＦ）による末端プロセシングライゲーション（ｅｎｄ−ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）がもたらされる（Ｄｕｅｖａ，Ｉｌｉａｋｉｓ  ２０１３）。
【０００４】
この標準的なＮＨＥＪ経路が抑制される場合、代替ＮＨＥＪ経路（Ａ−ＮＨＥＪ）が活性化する（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ、Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ  ２００７）。それには、数あるタンパク質の中で、ポリ（ＡＤＰ−リボース）−ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ−１）、ウェルナー症候群ＡＴＰ依存性（ＷＲＮ）ヘリカーゼ及びＤＮＡリガーゼ３（ＬＩＧ３）又はＤＮＡリガーゼＩ（ＬＩＧ１）が必要である。ＭＲＮ（Ｍｒｅ１１、Ｒａｄ５０及びＮｂｓ１）複合体（ＭＲＮ−ｃｏｍｐｌｅｘ  （Ｍｒｅ１１，  Ｒａｄ５０  ａｎｄ  Ｎｂｓ１）  ｃｏｍｐｌｅｘ）の二本鎖切断（ＤＳＢ）への結合により、ＨＤＲが開始する（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＤＮＡエンドヌクレアーゼＲＢＢＰ８（ＣｔＩＰ）、ブルームヘリカーゼ（ＢＬＭ）、エキソヌクレアーゼ１（ＥＸＯ１）のような他のタンパク質とともに、５’末端において末端ヌクレオチドが除去され、ＤＮＡの切れ目の両側に長い３’一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）オーバーハングが生成される（Ｄｕｅｖａ，Ｉｌｉａｋｉｓ  ２０１３）。次いで、これらのテールは、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）複合体により被覆及び安定化され、続いてｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ２（ＢＲＣＡ２）に補助されるＲａｄ５１核タンパク質フィラメントの生成が起こる（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。Ｒａｄ５２は、ｓｓＤＮＡに結合したＲＰＡのＲａｄ５１との置換を促進し、ｓｓＤＮＡアニーリングを促進する（Ｇｒｉｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。ドナーＤＮＡによる鎖侵入と、その後のポリメラーゼによるＤＮＡ合成により、最終的に正確に修復されたＤＮＡがもたらされる。タンパク質キナーゼの毛細血管拡張性運動失調症変異（ＡＴＭ）は、少なくとも１２の修復タンパク質をリン酸化するため、ＨＤＲにおいて主要な役割を果たす（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９誘導性ＤＳＢのＮＨＥＪはエラーを起こしやすく、切断部位で挿入及び欠失（インデル）を頻繁に導入する。従って、標的遺伝子をノックアウトするのに有用である。対照的に、ＨＤＲにより、相同ドナーＤＮＡ配列を用いることにより、ＤＳＢの正確な修復が可能となる。このドナー配列が実験において提供され、変異を有している場合、これらはゲノムに導入される。
【０００６】
Ｃａｓ９によって導入されるＤＳＢのための要件は、ＤＮＡ中のＮＧＧ配列（ＰＡＭ部位）である。Ｃａｓ９の標的指向性は、ＰＡＭ部位に隣接する２０ヌクレオチドに相補的な結合ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって決定される。しかし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、ｇＲＮＡが標的とする配列と配列類似性を有する部位でもゲノムを切断し得る（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。これらのオフターゲット二本鎖切断は、所望の変異とともに、望まない変異がゲノム内の他の場所に出現し得ることを意味する。
【０００７】
このようなオフターゲットカットを削減する１つの戦略は、ＤＳＢではなく一本鎖ニックを導入する、Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ等の変異Ｃａｓ９を用いることである（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。２つのｇＲＮＡを用いて、互いに近接する反対のＤＮＡ鎖に２つのニックを導入すると、ＤＳＢを引き起こすのに十分近い、ゲノム中の他の場所で発生する２つのオフターゲットニックのリスクを低減しながら、所望の遺伝子座においてＤＳＢがもたらされる。別の戦略は、Ｃｐｆ１を用いることである（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。このヌクレアーゼは、ＴリッチＰＡＭ部位の近傍にスタガードカットを導入し、オフターゲット効果の発生が少ないことが示されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【０００８】
現在のアプローチにおいては、特に幹細胞における標的ヌクレオチド置換の正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率は通常低く、０．５〜１５％の範囲である（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。何名かの研究者は、ＨＤＲの促進や、ＮＨＥＪの低減を試みることにより、正確なゲノム編集の低効率に対処した。
【０００９】
Ｇ２／Ｍ期への細胞周期同調が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーによるＰＧＥを増大（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において（２６％から３８％へ）、ヒト初代新生児線維芽細胞において（検出不能から０．６％へ）及びヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）において（検出不能から１．６％へ））させることが示され（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）、及び二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）ドナーによるＰＧＥを増大（ｈＥＳＣにおいて（選別後７から４１％へ））させることが示された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。これは相同組み換えがこの期に制限され、そのタンパク質が上方制御されるからである。
【００１０】
また、効率の改善は、ｄｓＯＤＮドナーを用いて、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ細胞において、ｓｉＲＮＡによるＫｕ７０／８０及びリガーゼＩＶのような重要なタンパク質を抑制すること（５から２５％へ）、又はアデノウイルス５型タンパク質４Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６の共発現（５から３６％へ）によって達成された（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びＥ４ｏｒｆ６タンパク質は、数ある標的の中でＬＩＧ４のユビキチン化とプロテオソーム分解を媒介する。
【００１１】
小分子の使用が、ゲノム編集を増大させる一般的な戦略となっている。リガーゼＩＶ阻害剤の小分子ＳＣＲ７は、マウス胚においてＮＨＥＪを阻止し、ＰＧＥの効率を増大させる（５から２２．７％へ）と主張されている（Ｍａｒｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。他の研究者は、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ細胞における同様の増大、ＨＥＫ２９３Ａにおける、わずかではあるが有意な増大を記述したか、又はマウス胚、ウサギ胚、及びヒト幹細胞においては有意な効果を見出さなかった（Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）（Ｐｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。最近、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ＳＣＲ７の構造及び阻害特性を再解析した（Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。彼らは、ＳＣＲ７及びその誘導体は、ヒトＬＩＧ４の選択的阻害剤でも強力な阻害剤でもないと結論付けた。
【００１２】
ＮＨＥＪ経路における重要なタンパク質複合体であるＤＮＡ−ＰＫの、小分子ＮＵ７４４１、ＫＵ−００６０６４８及びＮＵ７０２６による薬理学的阻害は、ＮＨＥＪの頻度を減少させ、ＨＥＫ２９３／ＴＬＲ細胞（１．９から３．８％へ）、ＨＥＫ２９３（３が７．６％へ）及びヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）（１３から１６％へ）（ｄｓＯＤＮドナーによる）、及びマウス胚線維芽細胞（３から１０％へ）（ｓｓＯＤＮドナーによる）におけるＰＧＥを増大させることが示された（Ｒｏｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【００１３】
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９との相同組換えを増強する単一の小分子が記載されている。ＲＡＤ５１刺激化合物ＲＳ−１は、ウサギ胚（４．４から２６．１％へ）、ＨＥＫ２９３Ａ細胞（３．５から２１％へ）、及びＵ２ＯＳ細胞（１．９から２．４％へ）におけるＰＧＥを増大させた（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）（Ｐｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）が、ｈｉＰＳＣにおいてはさせなかった（全てｄｓＯＤＮドナーによる）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。ブタ胎児線維芽細胞においては、ｓｓＯＤＮドナーを用いて、ＰＧＥ効率に対するＲＳ−１の影響は見出されなかった（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００１４】
更に、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．は、約４０００の小分子のライブラリースクリーニングを用いて、β３−アドレナリン受容体アゴニストＬ７５５５０７が、ｓｓＯＤＮを用いて、ｈｉＰＳＣにおける（０．３５から３．１３％へ）、及びｄｓＯＤＮドナーを用いてマウスＥＳＣにおける（１７．７から３３．３％へ）ＰＧＥを増大させることを見出したが、その分子の修復経路の標的は不明である（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。他者は、ＨＥＫ２９３Ａ細胞又はｈｉＰＳＣにおいて、Ｌ７５５５０７によるＰＧＥの有意な刺激作用を見出さなかった（Ｐｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。Ｐｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ＳＣＲ７、ＲＳ−１、及びＬ７５５５０７を単独で及び組合せで比較し、ＳＣＲ７及びＬ７５５５０７をＲＳ−１と共に加える場合、ＲＳ−１単独と比較して、相加効果がないことを見出した。
【００１５】
ＣＲＩＳＰＲ（ＣＲＩＰＲ）−Ｃａｓ９ゲノム編集を増強する小分子の、現在の最新の概説から、我々は、ＤＮＡ−ＰＫの阻害剤はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集においてＰＧＥを増大させ得るが、ＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７及びＲＳ−１の効果は細胞株及び遺伝子座間で一貫していなかったことを理解する。我々は、以前に試験された小分子の組合せが相加効果を示さなかったことも理解する。
【発明の概要】
【００１６】
本発明者らは、特定の化合物が、特に２以上の異なる化合物の組合せとして適用される場合、正確なゲノム編集の効率を増大させることを見出した。特に、本発明者らは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤、ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）の阻害剤、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）、特にその触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の阻害剤、及び複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）の阻害剤、から選択される化合物、並びにこれらの異なるクラスの阻害剤から選択される化合物の組合せが、ゲノム編集の効率を増大できることを見出した。化合物及びそれらの組合せは、非医療用途（例えば研究ツールとして）、又は医療用途（例えばインビボ又はエクスビボでの使用のため）の両方に適している。
【００１７】
更に、本発明者らは、触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡ−ＰＫｃｓが、上記の化合物の存在とは無関係に、正確なゲノム編集の効力を増大させることを見出した。この効果は、ゲノム編集用の複数の異なる系で見出されるため、広範に適用可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１：ゲノム編集及び解析の流れ図。ｉＣＲＩＳＰＲ  ４０９−Ｂ２  ｉＰＳＣを、２μｇ／ｍｌドキシサイクリンで少なくとも２日間処理し、Ｃａｓ９又はＣａｓ９Ｄ１０Ａ発現を誘導する。ＲＮＡｉＭＡＸ、ｇＲＮＡ（各７．５ｎＭ）、ｓｓＯＤＮ（１０ｎＭ）、及び評価する小分子によるリバーストランスフェクションを、９６ウェルプレート中で１日間行う。用いられる細胞の量により８０％までのコンフルエンシーがもたらされる。次いで、細胞を通常の培地交換により３日間増幅する。回収後、ＤＮＡ抽出、標的遺伝子座のＰＣＲ増幅、イルミナ配列決定、インデル量と正確なゲノム編集についてのＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）配列解析を行う。
【図２】図２：ヒトＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１の、ヒト及びネアンデルタール人の最後の共通祖先の、祖先型状態への正確なゲノム編集（ＰＧＥ）のための、ｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮの設計。ＤＳＢ生成のために用いられるｇＲＮＡ及びその効率スコア（ｓｃ）（ｓｇＲＮＡ  ｓｃｏｒｅｒ  １．０  Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）とともに、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のそれぞれの遺伝子座を示す。ＰＡＭ部位は灰色、標的配列は青、及び変更する塩基は赤である。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ（Ｃａｓ９ｎ）によるニック、又はＣａｓ９によるＤＳＢの位置を矢印で示す。Ｃａｓ９ｎによる編集については両方のガイドを用いるが、Ｃａｓ９による編集についてはＣＡＬＤ１  ｇ１、ＫＡＴＮＡ１  ｇ２及びＳＬＩＴＲＫ１  ｇ２を用いる。両方のＣａｓ９変異体による編集についてのそれぞれのｓｓＯＤＮも示す。所望の変異を緑色で示し、更なる変異は橙色である。「ブロック」は、遺伝子座の再切断を防ぐためのＣａｓ９ブロック変異を示す。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａドナーはすべてニックの後に５０ｎｔの相同性アームを有するが、Ｃａｓ９ドナーはすべて合計で９０ｎｔであり、所望の変異は中央に存在している。完全配列を表２に示す。
【図３−１】図３：ｉＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のゲノム編集に対する、溶媒の効果及び異なる小分子濃度の影響についての第一スクリーニング。正確なゲノム編集（ＰＧＥ）及びインデルを、それぞれ緑色の丸（三角形）又は青色の菱形によって示す。各記号はテクニカルレプリケートを表す。それぞれの平均を黒色の線として示す。各スカル（ｓｋｕｌｌ）により、位相差光学顕微鏡で測定された最大２０％の細胞死を示す。１μＭ及び０．１μＭのトリコスタチンＡによりすべての細胞が死んだ。更なる実験のために選択された濃度を青緑色で示す。
【図３−２】図３：ｉＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のゲノム編集に対する、溶媒の効果及び異なる小分子濃度の影響についての第一スクリーニング。正確なゲノム編集（ＰＧＥ）及びインデルを、それぞれ緑色の丸（三角形）又は青色の菱形によって示す。各記号はテクニカルレプリケートを表す。それぞれの平均を黒色の線として示す。各スカル（ｓｋｕｌｌ）により、位相差光学顕微鏡で測定された最大２０％の細胞死を示す。１μＭ及び０．１μＭのトリコスタチンＡによりすべての細胞が死んだ。更なる実験のために選択された濃度を青緑色で示す。
【図３−３】図３：ｉＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のゲノム編集に対する、溶媒の効果及び異なる小分子濃度の影響についての第一スクリーニング。正確なゲノム編集（ＰＧＥ）及びインデルを、それぞれ緑色の丸（三角形）又は青色の菱形によって示す。各記号はテクニカルレプリケートを表す。それぞれの平均を黒色の線として示す。各スカル（ｓｋｕｌｌ）により、位相差光学顕微鏡で測定された最大２０％の細胞死を示す。１μＭ及び０．１μＭのトリコスタチンＡによりすべての細胞が死んだ。更なる実験のために選択された濃度を青緑色で示す。
【図３−４】図３：ｉＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のゲノム編集に対する、溶媒の効果及び異なる小分子濃度の影響についての第一スクリーニング。正確なゲノム編集（ＰＧＥ）及びインデルを、それぞれ緑色の丸（三角形）又は青色の菱形によって示す。各記号はテクニカルレプリケートを表す。それぞれの平均を黒色の線として示す。各スカル（ｓｋｕｌｌ）により、位相差光学顕微鏡で測定された最大２０％の細胞死を示す。１μＭ及び０．１μＭのトリコスタチンＡによりすべての細胞が死んだ。更なる実験のために選択された濃度を青緑色で示す。
【図４】図４：Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９による、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する小分子の効果。ＰＧＥ効率を相対単位（ＲＵ）で示し、異なる遺伝子座における効率の変動を考慮するためにコントロールの平均を１に設定する。ｎ回の独立した実験のテクニカルレプリケートを示す。灰色及び黒色のバーは、それぞれ、コントロール及び各小分子の平均を表す。用いた濃度は、ＮＵ７０２６  ２０μＭ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）０．０１μＭ、ＭＬＮ４９２４  ０．５μＭ、ＮＳＣ  １９６３０  １μＭ、ＮＳＣ  １５５２０  ５μＭ、ＡＩＣＡＲ  ２０μＭ、ＲＳ−１  １μＭ、レスベラトロール１μＭ、ＳＣＲ７  １μＭ、Ｌ７５５５０７  ５μＭ、ＳＴＬ１２７６８５  ５μＭ及びＢ０２  ２０μＭであった。
【図５−１】図５：Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における、並びにＣｐｆ１によるＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する小分子の組合せの影響。小分子は、４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ株において、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥ効率に対して相加効果を有する（Ａ）が、Ｃａｓ９ではそうではない（Ｂ）。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、灰色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａ、Ｂ及びＣについての３つのテクニカルレプリケート及びＤについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。用いた濃度は、ＮＵ７０２６  ２０μＭ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）０．０１μＭ、ＭＬＮ４９２４  ０．５μＭ、ＮＳＣ  １９６３０  １μＭ、ＮＳＣ  １５５２０  ５μＭ、ＡＩＣＡＲ  ２０μＭ及びＲＳ−１  １μＭであった。ＣＲＩＳＰＹミックスは、ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４及びＮＳＣ  １５５２０の小分子混合物を示す。ノックイン効率の変化の有意性は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１にわたってプールされた二元配置分散分析及びテューキー多重比較を用いて決定した。遺伝子及び処理は、それぞれ変量効果及び固定効果として扱った。解析には、各遺伝子について３つのテクニカルレプリケートを含めた。Ｐ値は多重比較のために調整する（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図５−２】図５：Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における、並びにＣｐｆ１によるＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する小分子の組合せの影響。小分子は、４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ株において、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥ効率に対して相加効果を有する（Ａ）が、Ｃａｓ９ではそうではない（Ｂ）。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、灰色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａ、Ｂ及びＣについての３つのテクニカルレプリケート及びＤについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。用いた濃度は、ＮＵ７０２６  ２０μＭ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）０．０１μＭ、ＭＬＮ４９２４  ０．５μＭ、ＮＳＣ  １９６３０  １μＭ、ＮＳＣ  １５５２０  ５μＭ、ＡＩＣＡＲ  ２０μＭ及びＲＳ−１  １μＭであった。ＣＲＩＳＰＹミックスは、ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４及びＮＳＣ  １５５２０の小分子混合物を示す。ノックイン効率の変化の有意性は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１にわたってプールされた二元配置分散分析及びテューキー多重比較を用いて決定した。遺伝子及び処理は、それぞれ変量効果及び固定効果として扱った。解析には、各遺伝子について３つのテクニカルレプリケートを含めた。Ｐ値は多重比較のために調整する（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図５−３】図５：Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における、並びにＣｐｆ１によるＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する小分子の組合せの影響。小分子は、４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｉＰＳＣ株において、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥ効率に対して相加効果を有する（Ａ）が、Ｃａｓ９ではそうではない（Ｂ）。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、灰色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａ、Ｂ及びＣについての３つのテクニカルレプリケート及びＤについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。用いた濃度は、ＮＵ７０２６  ２０μＭ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）０．０１μＭ、ＭＬＮ４９２４  ０．５μＭ、ＮＳＣ  １９６３０  １μＭ、ＮＳＣ  １５５２０  ５μＭ、ＡＩＣＡＲ  ２０μＭ及びＲＳ−１  １μＭであった。ＣＲＩＳＰＹミックスは、ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４及びＮＳＣ  １５５２０の小分子混合物を示す。ノックイン効率の変化の有意性は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１にわたってプールされた二元配置分散分析及びテューキー多重比較を用いて決定した。遺伝子及び処理は、それぞれ変量効果及び固定効果として扱った。解析には、各遺伝子について３つのテクニカルレプリケートを含めた。Ｐ値は多重比較のために調整する（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図５−４】図５：Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における、並びにＣｐｆ１によるＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する小分子の組合せの影響。４０９−Ｂ２  ｈｉＰＳＣにおける、組換えＣｐｆ１によるＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１のＰＧＥ効率は、ＣＲＩＳＰＹミックスを用いると同様に増大した（Ｃ）。ＣＲＩＳＰＹミックスを用いると、ＰＧＥ効率は、ＳＣ１０２Ａ１  ｈｉＰＳＣｓ及びＨ９  ｈＥＳＣｓにおいても、プラスミドで送達されるＣａｓ９ｎ−２Ａ−ＧＦＰにより（ＧＦＰ−ＦＡＣＳ濃縮）、及びチンパンジーＳａｎｄｒａＡ  ｃｉＰＳＣｓにおいても組換えＣｐｆ１により増大した（Ｄ）。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、灰色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａ、Ｂ及びＣについての３つのテクニカルレプリケート及びＤについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。用いた濃度は、ＮＵ７０２６  ２０μＭ、トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）０．０１μＭ、ＭＬＮ４９２４  ０．５μＭ、ＮＳＣ  １９６３０  １μＭ、ＮＳＣ  １５５２０  ５μＭ、ＡＩＣＡＲ  ２０μＭ及びＲＳ−１  １μＭであった。ＣＲＩＳＰＹミックスは、ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４及びＮＳＣ  １５５２０の小分子混合物を示す。ノックイン効率の変化の有意性は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１にわたってプールされた二元配置分散分析及びテューキー多重比較を用いて決定した。遺伝子及び処理は、それぞれ変量効果及び固定効果として扱った。解析には、各遺伝子について３つのテクニカルレプリケートを含めた。Ｐ値は多重比較のために調整する（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１）。
【図６】図６：非多能性細胞種における、Ｃｐｆ１によるＨＰＲＴにおける正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対する、ＣＲＩＳＰＹミックス及び小分子の組合せの影響。ＣＲＩＳＰＹミックスの成分についての、あり得るすべての組合せを、ＨＥＫ２９３及びＫ５６２細胞について示す（Ａ）。ＮＵ７０２６はＰＧＥ効率を増大させるが、ＴＳＡ及びＮＳＣ１５５２０は明確な効果を有さず、ＭＬＮ４９２４はがんの特徴を持つそれら細胞株において明確な破壊的効果を有する。ＭＬＮ４９２４は、初代細胞におけるＰＧＥ効率に対して、同様に破壊的効果を有する（Ｂ）。ＭＬＮ４９２４を含まないＣＲＩＳＰＹミックスは、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ３４＋前駆細胞において、ＰＧＥ効率に対して、ＮＵ７０２６単独よりも高い効果を有する。初代ヒト表皮角化細胞（ＨＥＫａ）においては、ＮＵ７０２６及びＮＳＣ１５５２０もＰＧＥ効率に対して破壊的効果を有する。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、灰色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａについての２つの独立した実験及びＢについての２つの独立した実験のそれぞれについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。ＣＲＩＳＰＹミックスは、２０μＭ  ＮＵ７０２６、０．０１μＭ  トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、０．５μＭ  ＭＬＮ４９２４及び５μＭ  ＮＳＣ  １５５２０の小分子の混合物を示す。
【図７】図７：ＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分の毒性。ＲＮＡｉＭａｘ、ｇＲＮＡ、及びｓｓＯＤＮあり又はなしで、図４及び５の小分子及び組合せと２４時間インキュベーションした後の４０９−Ｂ２−ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎ細胞のレサズリンアッセイを（Ａ）に示す。レサズリンは、細胞の脱水素酵素によって蛍光性のレゾルフィンに変換され、結果生じる蛍光（励起：５３０〜５７０ｎｍ、蛍光：５９０〜６２０ｎｍ）は、細胞の生存率についてのマーカーとして認められている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＣＲＩＳＰＹミックスは黒い境界線で強調表示されており、わずかに毒性であり、その成分の相加的毒性効果は伴わない。エラーバーは、２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。ＣＲＩＳＰＹミックス及びモック処理と共に細胞を５回継代した後の核型分析を（Ｂ）に示す。バルク及び各条件の５クローンの少なくとも２０個の中期核（ｍｅｔａｐｈａｓｅ）を、トリプシン誘導性ギムザ染色を用いて解析した。ＣＲＩＳＰＹミックス（２５のうち３の中期核（倍数体））とモック処理（２５のうち４の中期核（倍数体））に対応する２つの単クローン由来の小サブセットの中期核を除いて、数的又は大規模な染色体異常は同定されなかった。
【図８−１】図８：ヒト人工多能性幹細胞におけるＢＦＰ挿入（ｓｓＯＤＮ）の有効性に対するＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分ＮＵ７０２６の影響。ｍｔａｇＢＦＰ２（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）ｓｓＯＤＮドナー及びｉＣＲＩＳＰＲ系の設計を（Ａ）に示す。我々は、ヘテロ接合性のＡＡＶＳ１  ｉＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において、Ｃａｓ９ｎのＮ末端核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）の直後に、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）の真向い（ｉｎ  ｆｒｏｎｔ  ｏｆ）に２Ａ自己切断ペプチドをコードする８７１ｎｔ（５０ｎｔ相同性アームを含む）の配列を挿入した（４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎ  ｈｉＰＳＣ）。配列を挿入する場合、ドキシサイクリンは核輸送ＢＦＰの発現をもたらす。
【図８−２】図８：ヒト人工多能性幹細胞におけるＢＦＰ挿入（ｓｓＯＤＮ）の有効性に対するＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分ＮＵ７０２６の影響。７日間のＢＦＰ発現後のモック、ＮＵ７０２７、及びＣＲＩＳＰＹミックス処理の代表的な画像を、位相差（ＰＣ）、ヨウ化プロピジウム核染色（ＰＩ）、ｍｔａｇＢＦＰ２発現（ＢＦＰ）並びにＰＩ及びＢＦＰの合成として（Ｂ）に示す。ＩｍａｇｅＪ（Ｃ）を用いて、ＢＦＰ挿入を伴う細胞のパーセンテージを定量化するために、それぞれの処理に対する３つのテクニカルレプリケートのそれぞれからの２つの画像（倍率５０倍、白色サイズバー２００μｍ）を用いた。
【図９】図９：触媒的に不活性なＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｋ３７５３Ｒ）は、相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を阻止する。例、ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９又はＣｐｆ１（灰色のｇＲＮＡを含む水色）によって誘導される二本鎖切断（ＤＳＢ）後、ＤＮＡ末端はＫｕ７０／８０（橙色）で覆われ、続いてＤＮＡ−ＰＫｃｓ（シアン色）が結合し、両方が各ＤＳＢ末端でＤＮＡ−ＰＫ複合体を構成する（Ａ）。ＤＮＡ−ＰＫｃｓの自己リン酸化により、下流のＮＨＥＪタンパク質の動員及び活性化がもたらされる。ＤＮＡ−ＰＫｃｓが触媒的に活性な場合、ＮＨＥＪはＨＤＲを凌ぐ。ＤＮＡ−ＰＫｃｓが触媒的に不活性化されている場合（例、Ｋ３７５３Ｒ変異により）、自己リン酸化は起き得ず、ＮＨＥＪ経路は阻止される。キナーゼ不活性化ＤＮＡ−ＰＫｃｓにより、ＤＳＢのＨＤＲ修復が優先的にもたらされる。ＤＮＡ−ＰＫｃｓの構成的構造（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を、そのリン酸化クラスター、そのキナーゼ（紫色）、及びＫ３７５３Ｒ変異（暗青色）と共に（Ｂ）に示す（Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４から改）。４１２８ａａ（約４７０ｋＤａ）の長さの酵素は、セリン／スレオニンからなる以下のリン酸化クラスター：Ｎ（残基５６及び７２）、ＪＫ（残基９４６及び１００３）、ＰＱＲ（２０２３と２０５６の間の５残基）、及びＡＢＣＤＥ（２６０９及び２６４７の間の６残基）を有する。一部のクラスターは、リン酸化されるとＤＮＡ−ＰＫｃｓを活性化するが、他はＮＨＥＪから離脱させるか、キナーゼを不活性にすらする（Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。Ｎクラスター及びＴ３９５０のリン酸化、並びにＫ３７５３Ｒ変異は、キナーゼ活性を不活性化することが示されている（Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１、Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８、Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ及びそのＫ３７５３近傍の配列は、脊椎動物において進化的に保存されている（Ｃ）（Ｋｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。
【図１０】図１０：触媒的に不活性なＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｋ３７５３Ｒ）は、ＤＮＡ二本鎖切断の、正確なゲノム編集（ＰＧＥ）へのほぼ完璧な変換をもたらす。ＫＲ変異体は、導入された二本鎖切断のタイプに関係なく、４０９−Ｂ２  ｈｉＰＳＣ中の野生型ＤＮＡ−ＰＫｃｓと比較してＰＧＥの増大をもたらす。Ｃａｓ９ｎダブルニッキングによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１及びＰＲＫＤＣ（Ｒ３７５３Ｋ）（Ａ）、及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１又はＣｐｆ１によるＨＰＲＴ（Ｂ）のＰＧＥの増大を示す。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、薄緑色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、Ａについての２つの独立した実験それぞれに対する３つのテクニカルレプリケート、及びＢについての２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。細胞をドキシサイクリンと３日間インキュベーションして、ＡのダブルニッキングのためにＣａｓ９ｎを発現させた。
【図１１−１】図１１：ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、及びＳＬＩＴＲＫ１の効率的な多重の正確なゲノム編集（ＭＰＧＥ）。ｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮ  ＤＮＡドナーのエレクトロポレーションにより、４０９−Ｂ２  ｈｉＰＳＣにおいて、３つの遺伝子すべてに対して、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ変異を含む、堅牢なバルクの正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率が実現する（Ａ）。ＰＧＥ、ＰＧＥ  ＋インデル、及びインデルを、それぞれ緑色、薄緑色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、２つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示し、ダブルニッキングのために、細胞を、ドキシサイクリンと４日間インキュベーションし、Ｃａｓ９ｎを発現させた。祖先型変異（ancient mutation）及びサイレントなブロック変異(blocking mutation)は、標的ヌクレオチド置換（ＴＮＳ）が起きた染色体に常に一緒に組込まれるわけではなく、他の変異から離れたブロック変異が唯一のＴＮＳとして組込まれ得る（Ｂ）。
【図１１−２】図１１：それぞれの遺伝子についてのダブルニッキングのガイドの標的（青色）と変異（緑色）を縮尺比で示す。解析した３３クローンのＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、及びＳＬＩＴＲＫ１を有する染色体におけるゲノム編集イベント（ＴＮＳ及び／又はインデル）のヒートマップを（Ｃ）に示す。ほとんどのクローンは、野生型のままであるか、又は３つの遺伝子すべてについて正確に編集される。ヒートマップは、ブロック変異か祖先型変異かにかかわらず、インデルの組込み及び任意のＴＮＳの組込みを伴って（左パネル）、又は少なくとも祖先型変異の組込みの（右パネル）、単一遺伝子について２つの染色体又は３つの遺伝子すべてについて６つの染色体のいずれかを提示する。ＭＰＧＥクローンの生成は、エレクトロポレーションしたばかりの細胞のごく一部を用いて単一細胞希釈播種を行う場合、２週間未満で可能である（Ｄ）。採取した５６個のコロニーのうち、４５個が生存し、そのうち１２個が１超の細胞に由来し（ＤＮＡ配列決定の読み取り比率に基づく）、解析用に３３個のクローンが残った。
【図１２】図１２：Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における正確なゲノム編集（ＰＧＥ）の効率に対するＣＲＩＳＰＹミックス及びＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｋ３７５３Ｒ）の相加効果。ＰＧＥ効率は、野生型（ＷＴ）と比較してＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ変異体（ＫＲ）で大幅に増大し、単一遺伝子に対するＣＲＩＳＰＹミックスの添加により更に増大し（Ａ）、一般に効率は低い、多重のＰＧＥについて、より一層増大する。ＰＧＥ、ＰＧＥ＋インデル、及びインデルを、それぞれ、緑色、薄緑色、又は青色のバーにより示す。エラーバーは、３つのテクニカルレプリケートの標準偏差を示す。ＣＲＩＳＰＹミックスは、２０μＭ  ＮＵ７０２６、０．０１μＭ  トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）、０．５μＭ  ＭＬＮ４９２４及び５μＭ  ＮＳＣ  １５５２０の小分子混合物を示す。ダブルニッキングのために、細胞を、ドキシサイクリンと共に２日間（多重化のために４日間）インキュベーションしてＣａｓ９ｎを発現させた。
【図１３】図１３：培養３か月後のＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ変異を含む４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｈｉＰＳＣの代表的な核図（ｋａｒｙｏｇｒａｍ）。トリプシン誘導性ギムザ染色によって解析された２５の中期核のうち、すべてが健全な核型（４６，ＸＸ）を示す。数的又は大規模な染色体異常は確認されなかった（バンド数３５０、モノクロ３階調）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第１の態様においては、本発明は、ゲノム編集において用いるための、以下において化合物（Ｉ）と称される、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）の阻害剤である化合物に関する。
【００２０】
ＨＤＡＣ阻害剤は、細胞周期の停止、分化及び／又はアポトーシスを誘導することにより腫瘍細胞増殖を阻害する細胞増殖抑制剤として知られる。ＨＤＡＣ阻害剤は通常、ＨＤＡＣの亜鉛含有触媒ドメインに結合することにより作用する。それらは、亜鉛イオンに結合する化学部分に従って分類され得る。好適なクラスのＨＤＡＣ阻害剤の例は：
（１）ヒドロキサム酸塩化合物、
（２）チオール基を介して亜鉛イオンに結合する環状テトラペプチド及びデプシペプチド、
（３）ベンズアミド化合物、
（４）求電子性ケトン及び
（５）脂肪酸化合物
である。
【００２１】
ＨＤＡＣ阻害剤は、例えばＫｈａｎ  ＆  Ｌａ  Ｔｈａｎｇｕｅ（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９０（２０１２），８５−９４）及びＦａｌｋｅｎｂｅｒｇ＆Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １３（２０１４）６７３−６９１）（参照により本明細書に組込まれる）に総説されている。
【００２２】
本発明によれば、ＨＤＡＣ阻害剤は、好ましくは、合成非ヌクレオシド化合物、例、１５００Ｄａ以下又は１０００Ｄａ以下の分子量を有する小分子、から選択される。ＨＤＡＣ阻害剤の具体例は、トリコスタチンＡ（Ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ）、ボリノスタット（Ｖｏｒｉｎｏｓｔａｔ）、エンチノスタット（Ｅｎｔｉｎｏｓｔａｔ）、パノビノスタット（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、モセチノスタット（Ｍｏｃｅｔｉｎｏｓｔａｔ）、ベリノスタット（Ｂｅｌｉｎｏｓｔａｔ）、ロミデプシン（Ｒｏｍｉｄｅｐｓｉｎ）、ＭＣ１５６８、ツバスタチンＡ塩酸塩（Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ  ＨＣｌ）、ジビノスタット（Ｇｉｖｉｎｏｓｔａｔ）、ＬＡＱ８２４、ＣＵＤＣ−１０１、キジノスタット２塩酸塩（Ｑｕｉｓｉｎｏｓｔａｔ  ２ＨＣｌ）、プラシノスタット（Ｐｒａｃｉｎｏｓｔａｔ）、ＰＣＩ−３４０５１、ドロキシノスタット（Ｄｒｏｘｉｎｏｓｔａｔ）、ＰＣＩ−２４７８１、ＲＧＦＰ９６６、ＡＲ−４２、ロシリノスタット（Ｒｏｃｉｌｉｎｏｓｔａｔ）、バルプロ酸（Ｖａｌｐｒｏｉｃ  ａｃｉｄ）、ＣＩ９９４、ＣＵＤＣ−９０７、ツバシン（Ｔｕｂａｃｉｎ）、Ｍ３４４、レスミノスタット（Ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ）、ＲＧ２８３３、ジバルプロエクスナトリウム（Ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ  Ｓｏｄｉｕｍ）、スクリプタイド（Ｓｃｒｉｐｔａｉｄ）、フェニルブチレート（Ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ）、ツバスタチンＡ（Ｔｕｂａｓｔａｔｉｎ  Ａ）、ＣＡＹ１０６０３、ネクスツラスタットＡ（Ｎｅｘｔｕｒａｓｔａｔ  Ａ）、ＢＧ４５、ＬＭＫ−２３５、サンタクルザメートＡ（Ｓａｎｔａｃｒｕｚａｍａｔｅ  Ａ）、ＢＲＤ７３９５４、ＨＰＯＢ、ＴＭＰ２６９、タスキニモド（Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ）及び４ＳＣ−２０２、並びにそれらの塩又は溶媒和物、特に医薬的に許容されるそれらの塩又は溶媒和物から選択される。
【００２３】
好ましい化合物（Ｉ）は、トリコスタチンＡ（その塩及び溶媒和物を含む）である。
【００２４】
第２の態様においては、本発明は、ゲノム編集において用いるための、以下において化合物（ＩＩ）と称される、ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）の阻害剤である化合物に関する。
【００２５】
ＮＡＥ阻害剤は、例、Ｎａｗｒｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｘｐ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｎｇ  Ｄｒｕｇｓ  ２１（２０１２），１５６４−１５７３）によって総説されたように抗腫瘍剤として、又は、例、Ｌｅ−Ｔｒｉｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．６（２０１６），ｄｏｉ：１９９７７）によって総説されたように抗ウイルス剤として知られる（これらは参照により本明細書に組込まれる）。
【００２６】
本発明によれば、ＮＡＥ阻害剤は、好ましくは、合成非ヌクレオシド化合物、例、１５００Ｄａ以下又は１０００Ｄａ以下の分子量を有する小分子、から選択される。好ましいＮＡＥ阻害剤は、ＭＬＮ４９２４（ペボンジスタット（Ｐｅｖｏｎｅｄｉｓｔａｔ））又は任意のその塩若しくは溶媒和物、特に任意の医薬的に許容されるその塩若しくは溶媒和物である。
【００２７】
第３の態様においては、本発明は、ゲノム編集において用いるための、以下において化合物（ＩＩＩ）と称される、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫ）の阻害剤、特にその触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の阻害剤である化合物に関する。
【００２８】
ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、例、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４（２０１３），ｄｏｉ：１３  ３３８９）（参照により本明細書に組込まれる）によって総説されたように化学療法剤として知られる。
【００２９】
本発明によれば、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は、好ましくは、合成非ヌクレオシド化合物、例、１５００Ｄａ以下又は１０００Ｄａ以下の分子量を有する小分子から選択される。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤の具体的な例は、ＮＵ７０２６、ＮＵ７４４１、ＰＩＫ−７５及びＰＩ−１０３、並びにそれらの塩又は溶媒和物、特に医薬的に許容されるそれらの塩及び溶媒和物である。
【００３０】
好ましい実施形態においては、化合物（ＩＩＩ）は、ＮＵ７０２６（その塩及び溶媒和物を含む）である。
【００３１】
第４の態様においては、本発明は、ゲノム編集用の、以下において化合物（ＩＶ）と称される、複製タンパク質Ａ（ＲＰＡ）の阻害剤である化合物に関する。
【００３２】
ＲＰＡ阻害剤は、例、Ｎｅｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．１０（２０１１），１７５６−１８０６）（参照により本明細書に組込まれる）によって総説されたように、抗腫瘍剤として知られる。
【００３３】
本発明によれば、ＲＰＡ阻害剤は、好ましくは、合成非ヌクレオシド化合物、例、１５００Ｄａ以下又は１０００Ｄａ以下の分子量を有する小分子、から選択される。ＲＰＡ阻害剤の具体的な例は、ＮＳＣ１５５２０、ＴＤＲＬ−５０５及びＮＳＣ１１１８４７、並びにそれらの塩又は溶媒和物、特に医薬的に許容されるそれらの塩及び溶媒和物である。
【００３４】
化合物（ＩＶ）の好ましい実施形態は、ＮＳＣ１５５２０（その塩及び溶媒和物を含む）である。
【００３５】
本発明者らは、化合物（Ｉ）、化合物（ＩＩ）、化合物（ＩＩＩ）、又は化合物（ＩＶ）が、動物、例、ヒトを含む哺乳動物の細胞等の、真核細胞における正確なゲノム編集の頻度を増大させることを見出した。
【００３６】
特に、本発明者らは、化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）が一緒に投与される場合、相加効果を有することを見出した。特に、化合物のトリコスタチンＡ、ＭＬＮ４９２４、ＮＳＣ１５５２０、及びＮＵ７０２６からなる組合せ物を用いる場合、最大６．７倍の正確なゲノム編集の増大又はほぼ５０％の編集された染色体が達成され、これは発明者の知る限りヒト多能性幹細胞のこれまでに記述された最高のゲノム編集効率である。更に、触媒的に不活性なＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット、特にＫ３７５３Ｒ変異体を含む多能性幹細胞において上記の化合物の組合せ物を用いる場合、最大８２％の編集された染色体又は１９．２倍の増加を伴うほぼ完全で正確なゲノム編集が達成される。更に、彼らは、両方の染色体の３遺伝子で、セレクションなしで、２週間未満で多重の正確なゲノム編集（multiplexed precise genome editing）（ＭＰＧＥ）を達成し、哺乳動物の系で初めてＭＰＧＥを示す。解析されたクローンの３分の１は、両方の染色体の３遺伝子に標的ヌクレオチド置換がある。
【００３７】
化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（ＩＶ）の２以上の組合せ物、特に少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（Ｉ）、並びに必要に応じて、少なくとも１の化合物（ＩＩ）及び／又は少なくとも１の化合物（ＩＶ）の組合せ物を、ＤＮＡ二本鎖、例、染色体ＤＮＡ、に所望の遺伝子座においてスタガードカットを導入できるヌクレアーゼ（例、Ｃｐｆ１）又はニッカーゼ酵素系（例、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）の使用とともに投与することの、特別に強力な相加効果が見出された。
【００３８】
更なる実験においては、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（Ｉ）、並びに必要に応じて少なくとも１の化合物（ＩＶ）の組合せ物を、特に化合物（ＩＩ）の非存在下で、ＤＮＡ二本鎖、例、染色体ＤＮＡ、における所望の遺伝子座でスタガードカットを導入できるヌクレアーゼ（例、Ｃｐｆ１）又はニッカーゼ酵素系（例、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）の使用とともに投与することの、強力な効果が、造血細胞、例、ＣＤ４＋Ｔ細胞等のＴ細胞又は造血前駆細胞（例、ＣＤ３４＋細胞）で見出された。
【００３９】
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３及び白血病細胞株Ｋ５６２においては、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）を、必要に応じて少なくとも１の化合物（Ｉ）及び／又は少なくとも１の化合物（ＩＶ）と共に、特に化合物（ＩＩ）の非存在下で、ＤＮＡ二本鎖、例、染色体ＤＮＡ、における所望の遺伝子座でスタガードカットを導入できるヌクレアーゼ（例、Ｃｐｆ１）又はニッカーゼ酵素系（例、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ）の使用とともに投与する場合、強力な効果が見出された。
【００４０】
従って、本発明の一態様は、（ａ）化合物（Ｉ）、（ｂ）化合物（ＩＩ）、（ｃ）化合物（ＩＩＩ）、及び（ｄ）化合物（ＩＶ）のうちの少なくとも２を含む組合せ物、例、組成物又はキット、に関する。好ましい実施形態は、化合物（Ｉ）がトリコスタチンＡであり、及び／又は化合物（ＩＩ）がＭＬＮ４９２４であり、及び／又は化合物（ＩＩＩ）がＮＵ７０２６であり、及び／又は化合物（ＩＶ）がＮＳＣ１５５２０である組合せ物である。特に、本発明の組合せ物は、非医療用途及び医療用途の両方における、両方の染色体上の多重ゲノム編集を含むゲノム編集における使用が意図されている。
【００４１】
本発明の文脈において、用語「組合せ物」は、上記の通りの少なくとも２の化合物を、必要に応じて好適な担体、例、医薬的に許容される担体、と共に混合して一緒に含む組成物を包含する。用語「組合せ物」は、上記の通りの少なくとも２の化合物を、別個の形態で、必要に応じてそれぞれが好適な担体、例、医薬的に許容される担体、と共に含むキットも包含する。
【００４２】
更に、本発明は、（ｉ）少なくとも１の化合物（Ｉ）及び少なくとも１の化合物（ＩＩ）、（ｉｉ）少なくとも１の化合物（Ｉ）及び少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）、（ｉｉｉ）少なくとも１の化合物（Ｉ）及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）、（ｉｖ）少なくとも１の化合物（ＩＩ）及び少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）、（ｖ）少なくとも１の化合物（ＩＩ）及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）、又は（ｖｉ）少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物、例、組成物又はキットに関する。好ましい化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）は上記の通りである。
【００４３】
更に、本発明は、（ｉ）少なくとも１の化合物（Ｉ）、少なくとも１の化合物（ＩＩ）、及び少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）、（ｉｉ）少なくとも１の化合物（Ｉ）、少なくとも１の化合物（ＩＩ）、及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）、又は（ｉｉｉ）少なくとも１の化合物（ＩＩ）、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）、及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物、例、組成物又はキット、に関する。好ましい化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）は上記の通りである。
【００４４】
更に、本発明は、少なくとも１の化合物（Ｉ）、少なくとも１の化合物（ＩＩ）、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）、及び少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物、例、組成物又はキットに関する。好ましい化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び／又は（ＩＶ）は上記の通りである。
【００４５】
特に好ましい実施形態においては、本発明は、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（Ｉ）、並びに必要に応じて、少なくとも１の化合物（ＩＩ）及び／又は少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物に関する。いくつかの実施形態においては、化合物（ＩＩ）は存在しない。
【００４６】
更に特に好ましい実施形態においては、本発明は、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）と、化合物（Ｉ）及び化合物（ＩＶ）のうちの少なくとも１とを含む組合せ物に関する。いくつかの実施形態においては、化合物（ＩＩ）は存在しない。
【００４７】
記載された本発明の組合せ物は、１以上の更なる化合物を更に含み得る。一実施形態においては、組合せ物は、ノコダゾール及びＡＢＴ−７５１（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、パクリタキセル（Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ２（１９９７），４６３−４７０）、又はコルヒチン若しくはビンクリスチン（Ｂｌａｊｅｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１０（２００２），９１−９５）、或いはその塩又は溶媒和物等、Ｇ２／Ｍ期で細胞を同調させるための化合物を含み得る。更なる実施形態においては、組合せ物は、特に触媒的に不活性なＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットと共に、ＮＳＣ１９６３０又はその塩若しくは溶媒和物等のＡｌｔ−ＮＨＥＪ阻害剤を含み得る。
【００４８】
本発明の組合せ物、例、組成物又はキットは、真核生物の標的細胞、特に以下に記載する通りの、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトの標的細胞だけでなく、マウス又はゼブラフィッシュ等の非ヒト動物由来の標的細胞等の動物の標的細胞、を含み、幹細胞、例、ヒト幹細胞（例えば胚性幹細胞又は多能性幹細胞）を含む、真核生物の標的細胞でのゲノム編集における使用に好適である。いくつかの実施形態においては、標的細胞は、ヒト人工又は胚性多能性幹細胞等の人工又は胚性多能性幹細胞だけでなく、非ヒト動物由来の人工又は胚性多能性幹細胞を含む、真核生物の標的生物の幹細胞である。他の実施形態においては、標的細胞は造血細胞又は造血前駆細胞である。なお他の実施形態においては、標的細胞はがん細胞等の不死化細胞である。
【００４９】
本発明の組合せ物、例、組成物又はキットは、標的細胞のゲノムにスタガードカット、特に５’オーバーハングを伴うスタガードカットを導入することを含むゲノム編集手順において特に好適である。この結果を達成するために、標的細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の変異型ニッカーゼであるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｈ８４０Ａ酵素等の、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の変異型ニッカーゼ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１酵素を含み得る。代替的に、他のゲノム編集酵素、例、ＣＲＩＳＰＲ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質、細菌テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）のアルゴノート（ＴｔＡｇｏ）、リコンビナーゼ、若しくはメガヌクレアーゼ又は他の酵素、特に二本鎖標的ＤＮＡにおいてスタガードカットを提供する酵素が存在し得る。本発明は、上記の酵素の分割融合型、例、Ｃａｓ９又はＣａｓ９  Ｄ１０Ａの分割融合型（Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）と共に用いても好適である。酵素（複数可）は、それ自体で、例、タンパク質又はリボ核タンパク質として、又はそれぞれの酵素（複数可）をコードする核酸分子として標的細胞に導入され得る。核酸分子は、標的細胞における一過性又は安定な発現のための適切な発現制御エレメントと機能的に連結したプラスミド等の発現ベクターとして導入され得る。タンパク質又は核酸を真核生物の標的細胞に導入するための好適なトランスフェクション技術は、当該技術分野で周知であり、リポフェクション、エレクトロポレーション（例：ヌクレオフェクション）、リン酸カルシウム又はウイルスベースの方法が挙げられる。
【００５０】
特定の実施形態においては、本発明は、ヒト人工又は胚性幹細胞等の人工又は胚性多能性幹細胞を含む幹細胞である、真核生物の標的細胞におけるゲノム編集のための、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（Ｉ）、並びに必要に応じて、少なくとも１の化合物（ＩＩ）及び／又は少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物の使用であって、該ゲノム編集の手順が、標的細胞のゲノムにスタガードカット、特に５’オーバーハングを伴うスタガードカットを導入することを含む使用、に関する。上記の通りの酵素により、標的細胞のゲノムにスタガードカットが導入され得る。
【００５１】
更なる特定の実施形態においては、本発明は、Ｔ細胞（例：ＣＤ４＋Ｔ細胞）等の造血細胞又はＣＤ３４＋細胞等の造血前駆細胞である、真核生物の標的細胞におけるゲノム編集のため、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）及び少なくとも１の化合物（Ｉ）、並びに必要に応じて少なくとも１の化合物（ＩＶ）を含む組合せ物の、特に化合物（ＩＩ）の非存在下での使用であって、ゲノム編集の手順が、標的細胞のゲノムにスタガードカット、特に５’オーバーハングを伴うスタガードカットを導入することを含む使用、に関する。上記の通りの酵素により、標的細胞のゲノムにスタガードカットが導入され得る。
【００５２】
更なる特定の実施形態においては、本発明は、哺乳動物の不死化細胞、例、ＨＥＫ２９３又はＫ５６２、である真核生物の標的細胞におけるゲノム編集のための、少なくとも１の化合物（ＩＩＩ）を、必要に応じて少なくとも１の化合物（Ｉ）及び／又は化合物（ＩＶ）と共に含む組合せ物の、特に化合物（ＩＩ）の非存在下での使用であって、ゲノム編集の手順が、標的細胞のゲノムにスタガードカット、特に５’オーバーハング伴うスタガードカットを導入することを含む使用、に関する。スタガードカットは、上記の通りの酵素により、標的細胞のゲノムに導入され得る。
【００５３】
本発明の組合せ物、例、組成物又はキットは、（ｉ）触媒的に不活性であるが構造的に完全である（ｉｎｔａｃｔ）ＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）、（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットをコードする核酸分子及び／又は（ｉｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット（その分割融合型を含む）を含むか、又は発現できる真核細胞を更に含み得る。好ましくは、触媒的に不活性であるが、構造的に完全である変異体は、対応する野生型配列、例、ヒト配列ＮＰ＿００８８３５．５、に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有し、野生型配列と比較して、キナーゼ活性の減少をもたらす少なくとも１つの変異を含む。好適な、構造的に完全で触媒的に不活性な変異体及びかかる変異体を検出するための試験は、例、Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１（参照により本明細書に組込まれる）によって記述されている。
【００５４】
触媒的に不活性であるが、構造的に完全であるＤＮＡ−ＰＫｃｓサブユニットは、タンパク質として、又は標的細胞における一過性又は安定な発現のために、それぞれのサブユニットをコードする核酸として標的細胞に導入され得る。このアプローチは、標的細胞における内因性ＤＮＡ−ＰＫｃｓ遺伝子のノックダウン（例、標的相同組換え又はＲＮＡ干渉（例：ｓｉＲＮＡ）の使用による）と組み合わせて用いられ得る。更に、このアプローチは、内因性ＤＮＡ−ＰＫｃｓを有さない細胞においては、例えば、異なる種（例：進化的に密接に関連した種）由来のＤＮＡ−ＰＫｃｓ変異体を用いることにより、用いられ得る。
【００５５】
特に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ変異体は、触媒トライアッド（Ｎ３９２７、Ｄ３９２２、Ｈ３９２４）を含む触媒ループ（アミノ酸３９１９〜３９２７）において、又はＰループ（アミノ酸３７２９〜３７３５）において、又はアミノ酸Ｆ３９４６、Ｔ３９５０、特にＫ３７５３を含む隣接領域（アミノ酸３７３６〜３７６０）において（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づく）、少なくとも１つの変異を含む。それは、キナーゼ活性を低減又は不活性化するトランケーション（例、Ｙ４０４６＊）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づく）をもたらす変異も含み得る。表示されたアミノ酸の位置は、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る。
【００５６】
更により具体的には、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ変異体は、Ｋ３７５３位に少なくとも１の変異（例、変異Ｋ３７５３Ｒ、及び／又はＫ３７５３Ｈ）、Ｄ３９２２位に少なくとも１の変異（例、変異Ｄ３９２２Ａ）、Ｔ３９５０位に少なくとも１の変異（例、変異Ｔ３９５０Ｄ）、及び／又はＦ３９４６０位に少なくとも１の変異（例、Ｆ３９４６Ｄ）を含む（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づく）。表示されたアミノ酸の位置は、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫＣｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る。
【００５７】
更に、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、通常、その自己リン酸化機能の標的であるリン酸化クラスターにおける少なくとも１の変異を含み得る。これらには、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００８８３５．５に基づいて、ＰＱＲクラスター（Ｓ２０２３及び／若しくはＳ２０２９及び／若しくはＳ２０４１及び／若しくはＳ２０５３及び／若しくはＳ２０５６）についての不活性化変異、例えば、アラニン（但し、それに限定されない）である変異、そして／或いは、ＡＢＣＤＥクラスター（Ｔ２０６９及び／若しくはＳ２６１２及び／若しくはＴ２６２０及び／若しくはＳ２６２４及び／若しくはＴ２６３８及び／若しくはＴ２６４７）並びに／又はＮクラスター（Ｓ５６及び／若しくはＳ７２）並びに／又はＪＫクラスター（Ｔ９４６及び／若しくはＳ１００３）についての活性化（ホスホミミック）変異、例えば、アスパラギン酸（但し、それに限定されない）である変異、が含まれ得る。表示されたアミノ酸の位置は、ヒト以外の種におけるＤＮＡ−ＰＫＣｓ又はそのオルソログにおいては異なり得る。
【００５８】
組合せ物、例、組成物又はキットは、インビボ又はインビトロで増幅されたか、又は化学的に合成された一本鎖分子又は二本鎖ＤＮＡ分子を含むがこれらに限定されない、あらゆる種類のドナー核酸分子との使用に好適である。ドナー核酸分子の長さは、通常、約２０〜２０００ｎｔ又はそれ以上（例、約８０〜１２０ｎｔ、５０〜２００ｎｔ、又は５００〜２０００ｎｔ）の範囲である。ドナー核酸分子は、ゲノム編集により標的細胞のゲノムに導入される野生型配列を考慮して、少なくとも１の所望の変異を含むように設計される。変異は、単一ヌクレオチド変異又は複数のヌクレオチドを包含する変異であり得る。これに関して、変異という用語は、単一のヌクレオチド又は複数のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入を指す。
【００５９】
上記の態様は、インビボ、例、単離された細胞又は細胞クラスター中、だけでなく、インビトロ、標的生物の細胞中での使用を含む。組合せ物は、上記の通りの細胞種において、及び特にＤＮＡ二本鎖にスタガードカットを導入できるＤＮＡ切断酵素系の使用を含む、上記の通りのゲノム編集手順を用いて適用できる。この態様には、ヒト医療又は獣医療を含む医療における使用も含まれる。
【００６０】
本発明の更なる態様は、真核生物の標的細胞、特に脊椎動物の標的細胞、例、齧歯類、（．）ヒト又は非ヒトの標的細胞を含み、ヒト幹細胞を含む、哺乳動物の標的細胞におけるゲノム編集のための、（ｉ）上記の通りの、触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニット、特に変異サブユニットＫ３７５３Ｒ、（ｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットをコードする核酸分子、及び／又は（ｉｉｉ）（ｉ）のＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットを含むか又は発現できる真核細胞の使用に関する。
【００６１】
この態様は、インビボ、例、単離された細胞又は細胞クラスター中、だけでなく、インビトロ、標的生物の細胞における使用を含む。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ変異体は、すべての細胞種において、すべてのタイプのゲノム編集手順（例、任意のＤＮＡ切断酵素（例、上記の通りの、ＤＮＡ二本鎖にスタガードカットを導入できる酵素系）だけでなく、他の酵素系（例、平滑末端カット（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄｅｄ  ｃｕｔ）を導入できる酵素系）、の使用を含む）と共に適用され得る。この態様には、ヒト医療又は獣医療を含む医療における使用も含まれる。
【００６２】
本発明のなお更なる態様は、少なくとも２の異なる化合物（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、及び（ＩＶ）を含む組合せ物、例、組成物又はキットの、ヒト医療又は獣医療を含む医療における使用である。医薬組成物を製造するための生理学的に許容される担体、希釈剤及び／又は補助剤に加えて、有効投与量の、本発明による化合物若しくはそれらの塩、溶媒和物又はそれらのプロドラッグが用いられる。活性化合物の投与量は、投与経路、患者の年齢及び体重、治療される疾患の性質及び重篤度、並びに同様の要因に応じて異なり得る。１日投与量は、１回で投与される、単回投与量として与えられるか、又は２回以上での１日投与量に細分され得、原則として０．００１〜２０００ｍｇである。０．１〜５００ｍｇ、例、０．１〜１００ｍｇの１日投与量を投与することが特に好ましい。
【００６３】
好適な投与形態は、経口、非経口、静脈内、経皮、局所、吸入、経鼻、及び舌下製剤である。本発明による化合物の、経口、非経口（例、静脈内又は筋肉内、経鼻）の製剤、例、乾燥粉末、又は舌下のものを用いることが特に好ましい。錠剤、糖衣錠剤、カプセル、分散性粉末、顆粒、水溶液、アルコール含有水溶液、水性若しくは油性懸濁液、シロップ、ジュース又はドロップ等の慣習的なガレヌス製剤形態が用いられ得る。
【００６４】
固体の薬用形態は、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸ナトリウム、乳糖、デンプン、マンニトール、アルギン酸塩、ゼラチン、グアーガム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、タルク、高分散ケイ酸、シリコーン油、高分子量脂肪酸（ステアリン酸等）、ゼラチン、寒天若しくは植物若しくは動物の油脂、又は固体高分子量ポリマー（ポリエチレングリコール等）等の不活性成分及び担体物質を含み得；経口投与に好適な製剤は、所望により更なる香味料及び／又は甘味料を含み得る。
【００６５】
液体の医療用形態は、滅菌され得、及び／又は、適切な場合、防腐剤、安定化剤、湿潤剤、浸透剤、乳化剤、展着剤、可溶化剤、浸透圧の調節用若しくは緩衝用の塩、糖若しくは糖アルコール、及び／又は粘度調整剤等の補助物質を含み得る。
【００６６】
非経口投与用の製剤は、アンプル又はバイアル等の別個の投与量単位形態で存在し得る。活性化合物の溶液、好ましくは水溶液、及び特に等張溶液及び懸濁液も好ましく用いられる。これらの注射形態は、活性化合物、例えば、適切な場合、他の固体担体物質を含有する凍結乾燥物と、所望の溶媒若しくは懸濁剤とを混合することにより、即時使用調製物として利用できるようにし得るか、又は使用直前にのみ調製され得る。
【００６７】
経鼻投与製剤は、水性若しくは油性溶液として、又は水性若しくは油性懸濁液として存在し得る。それらは、使用前に好適な溶媒又は懸濁剤を用いて調製される凍結乾燥物としても存在し得る。
【００６８】
吸入可能な製剤は、粉末、溶液又は懸濁液として存在し得る。好ましくは、吸入可能な製剤は、粉末、例えば、有効成分と乳糖等の好適な製剤化助剤との混合物として、の形態である。
【００６９】
製剤は、通常の抗菌及び無菌条件下で製造、分注、及び密封される。
【００７０】
本発明の化合物は、単独で、又は更なる活性薬剤との併用療法として投与され得る。
【００７１】
本発明の組合せ物の医療における使用は、特に標的遺伝子治療、例、治療を必要とする患者の望ましくない遺伝子型に関連する障害、の治療を包含する。例えば、障害は代謝機能不全又はがんである。本発明により、患者由来の細胞は、上記の通りの組合せ物の存在下でゲノム編集手順に供され得、それにより正確なゲノム編集の効率が増大する。この手順は、インビボで、即ち組合せ物を患者に投与するか、又はエクスビボで患者から単離された細胞（―ゲノム編集が成功した後―患者に再移植される）を用いて行われ得る。患者は、哺乳動物等の脊椎動物、好ましくはヒトの患者であり得る。最後に、本発明の組合せ物は、植物細胞又は植物におけるゲノム編集にも好適である。
【００７２】
更に、本発明は、以下の図及び実施例により更に詳細に説明される。
【実施例】
【００７３】
方法
細胞培養
本プロジェクトのために培養した幹細胞株には、ヒト４０９−Ｂ２  ｈｉＰＳＣ（女性、Ｒｉｋｅｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）及びＳＣ１０２Ａ１  ｈｉＰＳＣ（男性、ＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ）、チンパンジーＳａｎｄｒａＡ  ｃｉＰＳＣ（雌性、Ｍｏｒａ−Ｂｅｒｍｕｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１６３７）、及びＨ９  ｈＥＳＣ（女性、ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，倫理許可ＡＺ  ３．０４．０２／０１１８）が含まれた。幹細胞株をＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５２４８）上で増殖させた。ｍＴｅＳＲ１  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，０５８５２）を含むｍＴｅＳＲ１（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，０５８５１）を培養培地として用いた。非多能性細胞種及び用いたそれらそれぞれの培地は：ＨＥＫ２９３（ＥＣＡＣＣ，８５１２０６０２）と１０％ＦＢＳ（ＳＩＧＭＡ，Ｆ２４４２）及び１％ＮＥＡＡ（ＳＩＧＭＡ，Ｍ７１４５）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ，３１３３０−０３８）；Ｋ５６２（ＥＣＡＣＣ，８９１２１４０７）と１０％ＦＢＳを添加したＩＭＤＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１２４４００５３）；ＣＤ４＋Ｔ（ＨｅｍａＣａｒｅ，ＰＢ０４Ｃ−１）と１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１８７５−０９３）（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＣＤ３／ＣＤ２８）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，１１１３１Ｄ）で活性化）；ＣＤ３４＋前駆細胞（ＨｅｍａＣａｒｅ，Ｍ３４Ｃ−１）とＳｔｅｍＳｐａｎ  ＣＣ１１０（ＳｔｅｍＣｅｌｌ，０２６９７）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ，０９６００）並びにＨＥＫａ（Ｇｉｂｃｏ、Ｃ００５５Ｃ）とＭｅｄｉｕｍ  １５４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｍ１５４５００）及びＨｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｓ００１５）であった。細胞を、５％ＣＯ２でガス供給した加湿インキュベーター中で３７℃で増殖させた。培地を、幹細胞については毎日、非多能性細胞株については２日ごとに交換した。細胞培養物を、８０％のコンフルエントになるまで４〜６日間維持し、１：６〜１：１０希釈で継代培養した。接着細胞を、ＥＤＴＡ（ＶＷＲ、４３７０１２Ｃ）を用いて解離させた。細胞の生存を増加させるために、１日間の細胞分裂後、培地に１０μＭ  Ｒｈｏ結合タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤Ｙ−２７６３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，６８８０００）を添加した。
【００７４】
ｉＣＲＩＳＰＲ細胞株の生成及び検証
ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９株を、ヒト４０９−Ｂ２  ｉＰＳＣを用いて、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されたように作製した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ株の生成のために、Ｐｕｒｏ−Ｃａｓ９ドナーを、Ｑ５  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｅ０５５４Ｓ）を用いて部位特異的変異誘発に供した。プライマーはＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に注文した（表２に示す）。ｉＣＲＩＳＰＲ株における多能性マーカーＳＯＸ２、ＯＣＴ−４、ＴＲＡ１−６０及びＳＳＥＡ４の発現は、ＰＳＣ  ４−Ｍａｒｋｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ａ２４８８１）を用いて検証した（データ示さず）。定量的ＰＣＲを用いて、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９又はＣａｓ９Ｄ１０Ａの発現を確認し、デジタルＰＣＲを用いて、ｉＣＲＩＳＰＲカセットのオフターゲットの組込みを排除した（データ示さず）。
【００７５】
小分子
本研究で用いた市販の小分子は、ＮＵ７０２６（ＳＩＧＭＡ，Ｔ８５５２）、ＴＳＡ（ＳＩＧＭＡ，Ｔ８５５２）、ＭＬＮ４９２４（Ａｄｏｏｑ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ａ１１２６０）、ＮＳＣ  １９６３０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，６８１６４７）、ＮＳＣ  １５５２０（ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ，６０４８０６９）、ＡＩＣＡＲ（ＳＩＧＭＡ，Ａ９９７８）、ＲＳ−１（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，５５３５１０）、レスベラトロール（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，Ｓ１３９６）、ＳＣＲ７（ＸｃｅｓｓＢｉｏ，Ｍ６００８２−２ｓ）、Ｌ７５５５０７（ＴＯＣＲＩＳ，２１９７）、Ｂ０２（ＳＩＧＭＡ，ＳＭＬ０３６４）及びＳＴＬ１２７６８５（Ｖｉｔａｓ−Ｍ）であった。ＳＴＬ１２７６８５は、市販されていないＳＴＬ１２７７０５の４−フルオロフェニル類似体である。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｄ１２３４５）を用いて、１５ｍＭ（又はＮＵ７０２６については１０ｍＭ）のストックを作製した。ＮＵ７０２６濃度に対する制限要因は溶解度である。各小分子の添加により培地中においてＤＭＳＯの最終濃度が０．０８％（又はＮＵ７０２６については０．２％）を占めるように、さまざまな濃度について好適な作業溶液を作製した。すべての小分子を添加することにより、ＤＭＳＯの最終濃度０．７％がもたらされる。
【００７６】
ｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮの設計
我々は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１に１つの所望の変異を導入して、人間とネアンデルタール人の最後の共通祖先の状態に復帰させることにした（Ｐｒｕｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａニッカーゼにより編集するためのｇＲＮＡ対を選択して、所望の変異及びそれぞれのパートナーになるｓｇＲＮＡから短い距離で効率的に切断した。効率を、パーセンタイルランクスコアとしてｓｇＲＮＡ  ｓｃｏｒｅｒ  １．０  ｔｏｏｌ（Ｃｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）を用いて推定した。ニッカーゼ編集用のためのドナーｓｓＯＤＮは、遺伝子座の再切断を防ぐために所望の変異及びＣａｓ９ブロック変異を有するように設計され、各ニックの上流及び下流に少なくとも３０ｎｔの相同性アームを有した（図２）。所望の変異のより近くを切断するニッカーゼｇＲＮＡ対のｇＲＮＡを、所望の変異を中心とし、Ｃａｓ９ブロック変異を含有する９０ｎｔ  ｓｓＯＤＮとともにＣａｓ９ヌクレアーゼ編集に用いた（図２）。Ｃｐｆ１を用いる、ＨＰＲＴ及びＤＭＮＴ１の編集のためのｓｓＯＤＮは、ＰＡＭ部位の近傍にブロック変異を含有し、切断の近傍に更なる変異を含有するよう設計された。ｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃＲ）並びにｓｓＯＤＮは、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に注文した。ｓｓＯＤＮ及びｃｒＲＮＡ標的を表２に示す。
【００７７】
オリゴヌクレオチドのリポフェクション
リポフェクションの２日前に、細胞を２μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３１３１１）を含有する培地とインキュベーションした。リポフェクション（リバーストランスフェクション）は、ａｌｔ−ＣＲＩＳＰＲの製造業者のプロトコル（ＩＤＴ）を用いて、最終濃度７．５ｎＭの各ｇＲＮＡ及び１０ｎＭの各ｓｓＯＤＮにより行った。簡単に説明すると、０．７５μｌ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１３７７８０７５）及びそれぞれのオリゴヌクレオチドを別々に各２５μｌ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，１９８５−０６２）で希釈し、室温で５分間インキュベーションした。両方の希釈液を混合して、ＲＮＡｉＭＡＸ、ｇＲＮＡ、及びｓｓＯＤＮを含む５０μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを得た。リポフェクション混合物を室温で２０〜３０分間インキュベーションした。インキュベーション中、細胞を、ＥＤＴＡを用いて５分間解離させ、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。リポフェクションミックス、Ｙ−２７６３２を添加したｍＴｅＳＲ１中に２５．０００の解離細胞を含有する１００μｌ、２μｇ／ｍｌドキシサイクリン及び試験する各小分子（複数可）を十分に混合し、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５２４８）で覆われた９６ウェルのうちの１ウェルに入れた。２４時間後に、培地を通常のｍＴｅＳＲ１培地に交換した。
【００７８】
オリゴヌクレオチド及びリボ核タンパク質のエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）
組換えＡ．ｓ．Ｃｐｆ１及びＳ．ｐ．Ｃａｓ９タンパク質及びエレクトロポレーション促進剤はＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に注文し、ヌクレオフェクションを、次の変更を除いて、製造業者のプロトコルを用いて行った。ヌクレオフェクションは、それぞれの株の１００万細胞、７８ｐｍｏｌのエレクトロポレーション促進剤、１６０ｐｍｏｌの各ｇＲＮＡ（Ｃａｓ９についてはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃＲの二本鎖及びＣｐｆ１についてはｃｒＲＮＡ）（１遺伝子についての、両方のｇＲＮＡによるダブルニッキングについて３２０ｐｍｏｌ）、２００ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮドナー、２５２ｐｍｏｌのＣＲＩＳＰＲタンパク質を含有する、１００μｌのＨｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＨ−５０２２）用又はＨｕｍａｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ（Ｌｏｎｚａ，ＶＰＡ−１００２）及びＨｕｍａｎ  ＣＤ３４  Ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＣＤ３４＋  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ（Ｌｏｎｚａ，ＶＰＡ−１００３）用のキュベットにおいて、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）のＢ−１６プログラム（又はＣＤ４＋Ｔ細胞についてはＵ−１４）を用いて行った。多重化のためには、Ｃａｓ９ｎを発現する、ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎ  ｈｉＰＳＣ株を用いたため、ｇＲＮＡと一本鎖ＤＮＡドナーのみをエレクトロポレーションした。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカウントした。
【００７９】
ＦＡＣＳ選別
２μｇプラスミドＤＮＡ（ｐＳｐＣａｓ９ｎ（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ（ＰＸ４６１），Ａｄｄｇｅｎｅ＃４８１４０）の、Ｃａｓ９を誘導的に（ｉｎｄｕｃａｂｌｙ）発現しない細胞への導入は、１００万のＳＣ１０２Ａ１  ｉＰＳＣ又はＨ９  ＥＳＣのいずれかを含有する、１００μｌ  のＨｕｍａｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｏｎｚａ，ＶＶＰＨ−５０２２）用のキュベットにおいて、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ２ｂ  Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）のＢ−１６プログラムを用い行った。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて計数した。ヌクレオフェクションの２４時間後、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＩＧＭＡ，Ａ６９６４）を用いて解離させ、単一細胞の溶液を得るために濾過し、ＧＦＰ発現細胞について蛍光関連細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）に供した。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）による選別中に、細胞をＹ−２７６３２を添加したｍＴｅＳＲ１中で４℃で維持した。選別から４８時間後、細胞を、ｓｇＲＮＡ、ｓｓＯＤＮによるリポフェクション、及び小分子での処理に供した。
【００８０】
イルミナライブラリの調製及び配列決定
リポフェクションの３日後、Ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳＩＧＭＡ，Ａ６９６４）を用いて細胞を解離させ、ペレット化し、１５μｌのＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，ＱＥ０９０５Ｔ）に再懸濁した。６５℃で１０分間、６８℃で５分間及び最後に９８℃で５分間インキュベーションを行い、ｓｓＤＮＡをＰＣＲテンプレートとして生成した。ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１の各標的遺伝子座についての、イルミナ配列決定用アダプターを含有するプライマーを、ＩＤＴ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＵＳＡ）に注文した。ＰＣＲは、ＫＡＰＡ２Ｇ  Ｒｏｂｕｓｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｐｅｑｌａｂ，０７−ＫＫ５５３２−０３）を用いて、提供されたバッファーＢ及び３μｌの細胞抽出液を用い、総体積２５μｌで、Ｔ１００サーマルサイクラー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で行った。ＰＣＲの熱サイクルプロファイルは：９５℃  ３分；（９５℃  １５秒、６５℃  １５秒、７２℃  １５秒）を３４回；７２℃  ６０秒であった。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＨＦ  ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆ−５３１Ｌ）及び０．３μｌの第一のＰＣＲの産物を用いる、第二のＰＣＲの反応物（Ｋｉｒｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）中に、サンプル特異的な指標を備えるＰ５及びＰ７イルミナアダプターを添加した。ＰＣＲの熱サイクルプロファイルは：９８℃  ３０秒；（９８℃  １０秒、５８℃  １０秒、７２℃  ２０秒）を２５回；７２℃  ５分であった。増幅を、ＥＸゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇ４０１０−１１）を用いてサイズ分離アガロースゲル電気泳動によって確認した。指標付きのアンプリコンを、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）ｂｅａｄｓ（Ｍｅｙｅｒ，Ｋｉｒｃｈｅｒ  ２０１０）を用いて精製した。二重指標ライブラリーを、２ｘ１５０  ｂｐのペアエンド配列を提供するＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。Ｂｕｓｔａｒｄ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いるベースコールの後、ｌｅｅＨｏｍを用いてアダプターを切り取った（Ｒｅｎａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【００８１】
配列データ解析
ＣＲＩＳＰｒｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）を用いて、野生型のパーセンテージ、標的ヌクレオチド置換（ＴＮＳ）、インデル、及びＴＮＳとインデルの混合について、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集実験からの配列決定データを解析した。解析に用いたパラメーターは、「−ｗ  ２０」、「−−ｍｉｎ＿ｉｄｅｎｔｉｔｙ＿ｓｃｏｒｅ  ７０」、及び「−−ｉｇｎｏｒｅ＿ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」であった（解析を、最低７０％の野生型配列との類似性を有するアンプリコン及び各ｇＲＮＡから２０ｂｐのウィンドウに制限した；配列エラーはＮＨＥＪイベントとして誤って特性解析されるため、置換は無視した。単一細胞播種後のコロニーからの配列決定データ（図３Ｂ及びＣ）を、ＳＡＭｔｏｏｌを用いて実際のリード配列を評価することによって更に解析した。配列リードの割合を用いて、クローン化コロニーを混合コロニーから区別した。リードの大部分が明確に１配列（ホモ接合性）又は類似したリード数の２配列（ヘテロ接合性）で構成されている場合、コロニーをクローンとして計数した。我々が示した核型が健全であったため、各細胞には２つの染色体があると仮定した。組込まれたブロック変異、祖先型変異、及びクローンの細胞の各染色体についてのインデルを記録した。
【００８２】
統計分析
ＴＮＳ効率の変化の有意性は、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１にわたってプールした２元配置分散分析及びテューキー多重比較を用いて決定した。遺伝子及び処理は、それぞれ変量効果及び固定効果として扱った。従って、我々は、遺伝子との相互作用に対する処理の効果を試験した（Ｚａｒ  １９９９）。解析には、各遺伝子について３つのテクニカルレプリケートを含めた。ＱＱプロット（Ｆｉｅｌｄ  ２００５）の目視検査と適合値に対してプロットされた残差（Ｑｕｉｎｎ＆Ｋｅｏｕｇｈ  ２００２）によって、正規分布の及び均一な残差の仮定が満たされているか否かを確認した。これらは、残差がほぼ対称的に分布していることを示したが、テールが長く（即ち、正と負の残差が大きすぎる）、均一性の仮定から明確な偏差はなかった。Ｐ値は、多重比較のために調整する。統計解析はＲを用いて行った。
【００８３】
レサズリンアッセイ
「オリゴヌクレオチドのリポフェクション」において記載したように、４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎ  ｈｉＰＳＣを、編集試薬（ＫＡＴＮＡ１編集用のＲＮＡｉＭａｘ、ｇＲＮＡ、及びｓｓＯＤＮドナー）有り又は無しのいずれかで播種した。培地に小分子又は小分子の組合せを添加し、各条件をデュプリケートで行った。２４時間後に培地を吸引し、１０μｌのレサズリン溶液（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，１１８８４）と共に１００μｌの新鮮な培地を添加した。レサズリンは、細胞の脱水素酵素によって蛍光性のレゾルフィンに変換され、その結果生じる蛍光（励起：５３０〜５７０ｎｍ、蛍光：５９０〜６２０ｎｍ）は、細胞生存率の線形マーカーとして認められている（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。細胞を３７℃でレサズリンとインキュベーションした。酸化還元反応を、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ９４１０  ｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた吸光度測定によって１時間ごとに測定した。５時間後、吸光度スキャンは飽和せずに良好なコントラストを示し、ＩｍａｇｅＪ及び「ＲｅａｄＰｌａｔｅ」プラグインを用いて吸光度を定量化するために用いた。培地及びレサズリンを含むが、細胞を含まないデュプリケートのウェルをブランクに用いた（ｕｓｅｄ  ａ  ｂｌａｎｋ）。
【００８４】
顕微鏡法と画像解析
４０９−Ｂ２  ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎ  ｈｉＰＳＣは、ｇＲＮＡ及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）一本鎖オリゴ（図（８Ａ、３３０ｎｇ）で、モック、ＮＵ７０２６、及びＣＲＩＳＰＹミックス処理のいずれかについて、２つのテクニカルレプリケートでヌクレオフェクションした。培地に２μｇ／ｍｌドキシサイクリン（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，６３１３１１）を７日間添加し、正確に編集した細胞中で核移入ＢＦＰの発現を可能にした。次いで、細胞をＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ａ２４８８１）中４％ホルムアルデヒドで１５分間固定し、１００μｇ／ｍｌ  ＲＮＡｓｅＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，ＥＮ０５３１）及び４０μｇ／ｍｌヨウ化プロピジウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｐ３５６６）を添加したＤＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ａ２４８８１）中１％サポニンで３７℃で４５分間透過処理し、ＤＰＢＳで３回洗浄した。核酸をインターカレーションするヨウ化プロピジウムを用いて核を対比染色した。蛍光顕微鏡Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて、それぞれの処理について３つのテクニカルレプリケートの各々から：位相差、ＨｃＲｅｄチャネル（ＢＰ  ５８０〜６０４ｎｍ、ＢＳ  ６１５ｎｍ、ＢＰ  ６２５  〜７２５ｎｍ、１０．０００ｍｓ）、及びＤＡＰＩチャネル（ＢＰ  ３３５〜３８３ｎｍ、ＢＳ  ３９５ｎｍ、ＢＰ  ４２０〜４７０ｎｍ、２０．０００ｍｓ）から成る画像（倍率５０倍）を２枚取得した。画像を盲検し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｔｏｏｌを用いてＢＦＰ陽性核を計数した。ＩｍａｇｅＪを用いて、核の面積（デフォルトの閾値）を平均の単一核面積で除算することにより、ヨウ化プロピジウム陽性の核を定量化した。
【００８５】
核型分析
核型の顕微鏡解析は、トリプシン誘導性ギムザ染色後に行った。解析は、‘Ｓａｅｃｈｓｉｓｃｈｅｒ  Ｉｎｋｕｂａｔｏｒ  ｆｕｅｒ  ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ’（Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により、国際品質ガイドライン（ＩＳＣＮ  ２０１６：ヒト細胞遺伝学用命名法の国際的システム４８）に従って行った。
【００８６】
研究設計
我々はｉＰＳＣ中のいくつかの小分子の正確なゲノム編集の効率を試験することを目的にした。化合物ＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７及びＲＳ−１は、文献にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターの候補として示されているが、他の試験化合物はこの目的に関してはまだ公知ではない。試験化合物を表１に示す。
【００８７】
表１：本研究において評価した小分子の概観。標的タンパク質、その機能、並びにそのそれぞれの経路及び小分子の機能を示す。アスタリスク付きの参考文献は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターとしての小分子を示す。略語：代替ＮＨＥＪ（Ａｌｔ−ＮＨＥＪ）、損傷依存性シグナル伝達（ＤＤＳ）。
【００８８】
【表１】
2020516258.tif 000002
【００８９】
ＨＤＲ効率に対する小分子の効果の解析のためのツールとして、我々は、ドキシサイクリン誘導性のＣａｓ９又はＣａｓ９Ｄ１０Ａの発現並びにｓｓＯＤＮ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の効率的な送達を可能にするｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９及びｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ  ｉＰＳＣ株を生成した（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ゲノム編集及び解析の流れ図を図１に示す。３つの例の遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１の編集において用いられるｇＲＮＡ、ｓｓＯＤＮ、及びプライマーの設計を図２及び表２に示す。
【００９０】
表２：本研究において用いたオリゴヌクレオチド。ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１、ＨＰＲＴ、ＤＭＮＴ１、ＡＡＶＳ１−ｉＣＲＩＳＰＲ、及びＰＲＫＤＣの編集のためのｇＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ標的）及び一本鎖ＤＮＡドナー（ｓｓＯＤＮ）並びにＣａｓ９  ｉＣＲＩＳＰＲドナープラスミドの解析及びＱ５部位特異的変異誘発のためのプライマーを示す。変異は太字であり、祖先型変異は下線付きでもある。ドナーのＫＡＴＮＡ１  Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ  ２及びＳＬＩＴＲＫ１  Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ  ２は異なるサイレント変異を有し、図１０〜１２に関して用いられた。
【００９１】
【表２−１】
2020516258.tif 000003
【００９２】
【表２−２】
2020516258.tif 000004
【００９３】
ＮＨＥＪを阻止する能力について試験するために我々が選択した小分子は、ＳＣＲ７、Ｋｕ７０／８０阻害剤ＳＴＬ１２７７０５の４−フルオロフェニル類似体であるＳＴＬ１２７６８５（Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）、及びＤＮＡ−ＰＫ阻害剤ＮＵ７０２６（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）である。我々は、Ａｌｔ−ＮＨＥＪを阻止するために、ＷＲＮヘリカーゼ阻害剤ＮＳＣ  １９６３０を選択した（Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。ＮＥＤＤ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害剤であるＭＬＮ４９２４は、ＣｔＩＰのｎｅｄｄ化を阻害することが示されていて、これにより、鎖切断においてＤＮＡ末端の削り込みの程度（ｅｘｔｅｎｄ）が増大し、従って、ＤＮＡ二本鎖切断修復経路の選択が、優先的にＨＤＲを経るように調節される（Ｊｉｍｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＤＮＡの削り込みにより、ｓｓＤＮＡが残り、相同性探知及び組換えを経る前に、ＲＰＡにより被覆及び安定化される。我々は、ＲＰＡの可用性が高まるとＨＤＲに好都合であると想定した。フマロピマル酸（ＮＳＣ１５５２０）は、ＲＰＡのｐ５３及びＲＡＤ９への結合を妨げ（Ｇｌａｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）（Ｇｌａｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、ｓｓＤＮＡに利用可能なＲＰＡの量を増大させる可能性がある。ＲＡＤ５１は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）による相同組換えに重要であるが、ＲＡＤ５２はｓｓＤＮＡのアニーリングに必要である（Ｇｒｉｍｍｅ  ａｔ  ａｌ．２０１０）。従って、我々は、正確なゲノム編集の効率に対する、ＲＡＤ５２阻害剤ＡＩＣＡＲ（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）、ＲＡＤ５１阻害剤Ｂ０２（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、及びＲＡＤ５１促進剤ＲＳ−１（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）の効果を試験することにした。我々は、更に、修復タンパク質キナーゼＡＴＭを増強すると記述されている小分子を含めた。レスベラトロールは、インビトロでの精製ＡＴＭの触媒効率に対する直接的な刺激効果を有すると記述されている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤のトリコスタチンＡは、ＡＴＭ依存性ＤＮＡ損傷シグナル伝達経路を活性化し、ＨＲを増大させることが記述されている（Ｌｅｅ  ２００７）（Ｊｉｍｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。最後に、我々は、β３アドレナリン受容体アゴニストＬ７５５５０７をスクリーニングに含めた。
【００９４】
結果
正確なゲノム編集に対する小分子の効果
我々は、まず、異なる濃度の小分子を試験して、ｉＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９Ｄ１０Ａを用いた、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、及びＳＬＩＴＲＫ１の正確な編集に対するそれらの効果を検証した（図３）。その結果、我々は、正確なゲノム編集の最も高い頻度をもたらすそれぞれの濃度を選択した。異なる濃度が編集に対して同様の効果をもたらした場合、我々は、より低い濃度を選択した。繰り返した独立した実験からのＣａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１における正確なゲノム編集の効率に対する、選択した小分子濃度の効果を図４に示す。
【００９５】
ＮＵ７０２６処理により、３つの遺伝子座すべてについて、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ（図４Ａ）及びＣａｓ９（図４Ｂ）によるＰＧＥが増大した。平均変化は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａでは、ＣＡＬＤ１について１．５倍、ＫＡＴＮＡ１について２．６倍及びＳＬＩＴＲＫ１について２．５倍であり、Ｃａｓ９では、ＣＡＬＤ１について１．５倍、ＫＡＴＮＡ１について１．６倍及びＳＬＩＴＲＫ１について１．２倍であった。我々は、ＮＵ７０２６に加えて、ＴＳＡ及びＭＬＮ４９２４がＣａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥの頻度に対する増強効果を有することを見出した。ＴＳＡは、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥを、ＣＡＬＤ１について１．５倍、ＫＡＴＮＡ１について２．２倍及びＳＬＩＴＲＫ１について１．８倍増大させた；興味深いことに、Ｃａｓ９では増強効果は見出されなかった。ＭＬＮ４９２４は、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡでのＰＧＥを、ＣＡＬＤ１について１．２倍、ＫＡＴＮＡ１について１．１倍及びＳＬＩＴＲＫ１について１．３倍増大させた。Ｃａｓ９では、ＰＧＥに対するＭＬＮ４９２４のわずかな減少効果がある。ＮＳＣ  １５５２０での処理により、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９による、ＣＡＬＤ１のＰＧＥが、それぞれ１．４倍及び１．３倍増大した。しかし、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１のＰＧＥに対しては効果がなかった。ＮＳＣ  １９６３０、ＡＩＣＡＲ、ＲＳ−１、レスベラトロール、ＳＣＲ７、Ｌ７５５５０７、及びＳＴＬ１２７６８５は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａでは、それぞれのコントロールと比較して、３つの遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１に対するＰＧＥ頻度に対する明確な効果を示さず、Ｃａｓ９では、効果を示さなかったか、又は減少効果を示した。Ｂ０２は、３つの遺伝子座すべてで、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ及びＣａｓ９によるＰＧＥを両方半減させた。
【００９６】
我々は、次に、小分子の組合せがＣａｓ９Ｄ１０Ａ又はＣａｓ９によるＰＧＥに対する増強効果を有するか否かを試験した。我々は、少なくとも１の遺伝子においてＣａｓ９Ｄ１０ＡによるＰＧＥの増大が示され、且つＰＧＥが決して減少しない小分子を選択した；それらの分子は：ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４、ＮＳＣ  １９６３０、ＮＳＣ  １５５２０、ＡＩＣＡＲ及びＲＳ−１である。
【００９７】
Ｃａｓ９Ｄ１０Ａ又はＣａｓ９のいずれかによる、３つ（ｔｒｅｅ）の異なる遺伝子座の編集に対する小分子の組合せの影響を図５に示す。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａによる編集については、ＰＧＥのための（ｏｒ）ＮＵ７０２６での処理により、分子なしより２．３又は１．８倍高いＰＧＥ頻度がもたらされた（テューキーの一対比較、事後比較：ｐ＜０．００１）（図５Ａ）。ＮＵ７０２６とＴＳＡの両方の組合せにより、ＮＵ７０２６又はＴＳＡのいずれか単独よりも１．３又は１．６倍高いＰＧＥ頻度がもたらされた（ｐ＜０．００１）。ＮＵ７０２６とＴＳＡの混合物にＭＬＮ４９２４を添加することにより、ＰＧＥにおいて更なる１．３倍の増大がもたらされた（ｐ＜０．０１）。編集にＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いる場合、ＮＳＣ  １５５２０の更なる添加により、すべての遺伝子座についてＰＧＥの平均がわずかに増大したが、統計的に有意には達しなかった。ＮＳＣ  １９６３０、ＡＩＣＡＲ、及びＲＳ−１の添加によっては、ＰＧＥに対する測定可能な効果がなかった。
【００９８】
我々は、Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによりＰＧＥの頻度を最も増大させる小分子のミックスは、ＮＵ７０２６（２０μＭ）、ＴＳＡ（０．０１μＭ）、ＭＬＮ４９２４（０．５μＭ）及びＮＳＣ  １５５２０（５μＭ）の組合せであると結論する。我々は、これを「ＣＲＩＳＰＹ」ニッカーゼミックスと名付ける。それはｉＣＲＩＳＰＲ  ４０９−Ｂ２  ｉＰＳＣ株において、ＣＡＬＤ１について２．８倍（１１から３１％へ）、ＫＡＴＮＡ１について３．６倍（１２．８から４５．８％へ）及びＳＬＩＴＲＫ１について６．７倍（４．７から３１．６％へ）のＰＧＥの増大をもたらした。
【００９９】
我々がブラントエンドＤＳＢを導入するＣａｓ９を用いた場合、ＮＵ７０２６に加えて他の小分子を添加しても、有意な効果は見られなかった（図５Ｂ）。対照的に、エレクトロポレーションによって４０９−Ｂ２  ｈｉＰＳＣ中に導入された、スタガードＤＮＡカットを生成する、Ｃｐｆ１リボ核タンパク質を伴うＣＲＩＳＰＹミックスは、ＰＧＥを、ＨＰＲＴについて２．９倍及びＤＭＮＴ１について４．０倍増加させた（図５Ｄ）。ＮＵ７０２６のみの添加は、ＰＧＥを、ＨＰＲＴについて２．１倍及びＤＭＮＴ１について２．４倍増加させた。
【０１００】
ＣＲＩＳＰＹミックスが他の多能性幹細胞株においてＰＧＥを増大させるか否かを試験するために、我々は、Ｃａｓ９ｎプラスミドエレクトロポレーションを用いてＳＣ１０２Ａ１  ｈｉＰＳＣ及びＨ９  ｈＥＳＣ中で遺伝子ＫＡＴＮＡ１を編集し、Ｃｐｆ１リボ核タンパク質を用いてチンパンジーｉＰＳＣ中でＨＰＲＴを編集した。ＰＧＥはそれぞれ２．６倍、２．８倍、２．３倍増加し、ＮＵ７０２６を単独で用いた場合よりも増大が大きかった（図５Ｃ）。
【０１０１】
更なる実験においては、標的ヌクレオチド置換効率に対するＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分の影響を、不死化ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３、不死化白血病細胞株Ｋ５６２、造血ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ３４＋造血前駆細胞並びに初代ヒト角化細胞（ＨＥＫα）を含む複数の非多能性細胞種でＣｐｆ１のエレクトロポレーションにより試験した。結果を図６に示す。ＣＲＩＳＰＹミックスの成分ＮＵ７０２６は、ＨＥＫａ細胞を除き、試験した細胞株で有効であることがわかった。ＨＥＫ２９３及びＫ５６２細胞においては、ＮＵ７０２６がＰＧＥ効率を大幅に増大させ、ＴＳＡ及びＮＳＣ１５５２０が効率を中程度に増大させ、ＭＬＮ４９２４はがんの特徴を有する細胞株に明確な破壊的効果を有する。ＭＬＮ４９２４は、初代細胞におけるＰＧＥ効率に対しても破壊的効果を有する。ＭＬＮ４９２４を含まないＣＲＩＳＰＹミックスは、造血ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ３４＋前駆細胞において、ＮＵ７０２６単独よりもＰＧＥ効率に対して高い効果を有する。初代ヒト角化細胞（ＨＥＫα）においても、ＮＵ７０２６及びＮＳＣ１５５２０はＰＧＥ効率に対して破壊的効果を有する。
【０１０２】
なお更なる実験においては、ＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分の毒性を試験した。Ｃａｓ９ｎダブルニッキング及び２４時間のＣＲＩＳＰＹミックス処理を伴うＫＡＴＮＡ１の編集後、細胞は、小分子処理なしと比較して７５％の生存率を示し、その成分の相加的毒性効果はなかった（図７）。重要なことに、各ラウンドが、細胞をリポフェクション試薬及びＣＲＩＳＰＹミックスと共に継代し、３日後に回収することからなる、５ラウンドの編集を我々がシミュレートした場合、トリプシン誘発性ギムザ染色によって示されるように、細胞は数的又は大規模な染色体異常のない健全な核型を有していた（図１３）。
【０１０３】
なお更なる実験においては、ヒト人工多能性幹細胞におけるＢＦＰ挿入（ｓｓＯＤＮ）効率に対する、ＣＲＩＳＰＹミックス及びその成分ＮＵ７０２６の影響を試験した。結果を図８に示す。我々は、ＡＡＶＳ１  ｉＣＲＩＳＰＲ遺伝子座における高感度青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）（Ｓｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）の真向いに２Ａ自己切断ペプチドをコードする８７１ｎｔ（５０ｎｔ相同性アームを含む）配列を挿入した。配列が挿入される場合、ドキシサイクリンは核輸送ＢＦＰの発現につながる。ＢＦＰに関して陽性の核は、無ＣＲＩＳＰＹコントロール（３．７％）と比較して７．１倍（２６．６％）増加したが、ＮＵ７０２６単独でもたらされる増加は１．６倍（６％）であり（図８Ｂ及びＣ）、ＣＲＩＳＰＹミックスによりｉＰＳＣにおける遺伝子断片の挿入効率が増大することが示される。
【０１０４】
正確なゲノム編集に対する、調製したＤＮＡタンパク質キナーゼ触媒サブユニットの効果
ＡＴＰ結合部位付近のＫ３７５３Ｒの変異により、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのキナーゼ活性が無効になる。ＣＨＯＶ３細胞においては、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ細胞におけるＤＳＢ誘導性ＨＤＲは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓヌル細胞の上昇したＨＤＲレベルの２〜３倍超、野生型ＤＮＡ−ＰＫｃｓを発現する細胞の４〜７倍超までであることが示されている（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８及び２００９）。
【０１０５】
我々は、Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）によって記述されたように、ドキシサイクリン誘導性Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｄ１０Ａ）を含む人工多能性幹（ｉＰＳＣ）株を作製し、オフターゲットが減少した高効率の標的ＤＳＢを達成した（Ｓｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。我々は、組込まれたＣａｓ９Ｄ１０Ａを用いて、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのキナーゼ活性部位付近のリジンをアルギニンに交換し（Ｋ３７５２Ｒ）、完全な全体構造を維持しつつ、そのキナーゼ活性を不活性化した（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８及び２００９）。我々は、野生型ＤＮＡ−ＰＫｃｓを用いた正確なゲノム編集の効率をＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲと比較するために、神経突起伸長遺伝子ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１を人間とネアンデルタール人の最後の共通祖先の祖先状態に正確に編集して復帰させることにした（Ｐｒｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。我々は、Ｒ３７５３をリジンに交換して復帰させることにより、ＰＲＫＤＣ（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）の不活性化を覆す効率も調べた。野生型ＤＮＡ−ＰＫｃｓ又はＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲのいずれかが発現している、ｉＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９Ｄ１０ＡによるＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１、ＳＬＩＴＲＫ１及びＰＲＫＤＣのＰＧＥ効率を図１０Ａに示す。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲを用いる場合、ＰＧＥ効率は、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１について、２．５倍（３６％）、４．１倍（７８．５％）及び７．８倍（５１．１％）増加する。これは、ＰＧＥ／ＮＨＥＪの比の、それぞれ０．２３、０．２９及び０．０８から３．４９、２５．４５及び２．６０へのシフトに対応する。我々は、染色体の７１．４％でＰＲＫＤＣの復帰変異（back mutation）を達成する。組換えＣａｓ９又はＣｐｆ１をエレクトロポレーションする場合、ＣＡＬＤ１又はＨＰＲＴについてのＰＧＥ効率は４．８倍（７２．２％）又は８．３倍（４３．７％）増大し、ＰＧＥ／ＮＨＥＪの比が０．４５から１２．８又は０．０８から７．１にシフトした。従って、ＰＧＥはＤＳＢのタイプに関係なくＫＲ株によって増大する。
【０１０６】
我々は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲによるこれらの高ＰＧＥ効率を踏まえ、次に３つの遺伝子の多重編集を試みた。我々が、ｇＲＮＡ及びｓｓＤＮＡドナーの多重リポフェクションを用いた時、達成したＰＧＥ効率は、ある遺伝子についてせいぜい３〜１０％であった（データ示さず）。我々は、３つの遺伝子のｇＲＮＡ及びｓｓＯＤＮをエレクトロポレーションした時、ＣＡＬＤ１について２１．３％、ＫＡＴＮＡ１について３２．０％及びＳＬＩＴＲＫ１について３４．０％のＰＧＥ効率を達成した（図１１Ａ）。リポフェクションとは異なり、エレクトロポレーションのためには、細胞を単一細胞懸濁液として調製する。細胞の大部分は、後のバルクＤＮＡ単離のためにプレーティングしたが、１０パーセントは１細胞からコロニーの子孫が生じる単一細胞希釈液としてプレーティングした。３３クローンの解析により、祖先型変異及びサイレントなブロック変異は、標的ヌクレオチド置換（ＴＮＳ）が起こった染色体に常に共に組込まれるわけではないことが示された（図１１Ｂ）。図１１Ｃは、インデルの組込み及びブロック変異であるか祖先型変異であるかに関係なく任意のＴＮＳの組込み（左パネル）又は少なくとも祖先型変異の組込み（右パネル）を伴う染色体のヒートマップを示す。ほとんどのクローンは、野生型のままであるか、３つの遺伝子すべてに対して正確に編集されるかのいずれかである。驚くべきことに、クローンの３分の１が、３つの遺伝子すべてについて両方の染色体に何ら更なるインデルのないＴＮＳを有する。クローンの１２．１％は、少なくとも、３つの遺伝子すべてについて両方の染色体に何ら更なるインデルのない祖先型ＴＮＳを有する。３３．３％の１２．１％への低下は、主にＣＡＬＤ１ドナーの設計に起因し、右のブロック変異は他の２つの変異から遠く離れており（ｗｅｒｅ）、それは３０％のＣＡＬＤ１  ＴＮＳ陽性染色体（３０のうち９）に組込まれている唯一の置換である（図３Ａ）。３つの遺伝子の両方の染色体上でのＴＮＳの取込みは、単一の遺伝子ＴＮＳの効率に基づいて、偶然による予測よりも４倍超高い（任意のＴＮＳについて７．１％と予測及び少なくとも祖先型ＴＮＳについて２．９％と予測）。ここに提示されているＭＰＧＥは効率的なだけでなく、高速でもある。エレクトロポレーションの直後に単一細胞希釈液の播種を用いることにより、２週間未満で所望のＭＰＧＥを伴うクローンの生成が可能となる（図１１Ｄ）。重要なことに、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ  ｈｉＰＳＣは、トリプシン誘導性のギムザバンド形成で示されるように、２６継代（３ヶ月に相当）後に数的又は大規模な染色体異常のない健全な核型を維持した（図１３）。
【０１０７】
我々が更なる実験で示すように、変異ＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在下でのＰＧＥ効率は、Ｃａｓ９Ｄ１０Ａを含むＣＲＩＳＰＹミックスによって更に増強され得る。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ変異体では、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１についてのＰＧＥがそれぞれ２．８倍、４、３倍、１２．４倍増加した（図１２を参照）。更に、ＣＲＩＳＰＹミックスにより、小分子処理なしのＤＮＡ−ＰＫｃｓ野生型と比較したＰＧＥの効率が更に一段と増大した。ＰＧＥ効率は、ＣＡＬＤ１、ＫＡＴＮＡ１及びＳＬＩＴＲＫ１についてそれぞれ４８％（３．７倍の増大）、８２％（４．７倍の増大）、５７．５％（１９．２倍の増大）であった。
【０１０８】
考察
ＣＲＩＳＰＹミックスは、試験した４つの（３つのヒトの及び１つのチンパンジーの）多能性幹細胞株すべてにおいて、それを構成する任意の個々の成分よりもＰＧＥを増加させるが（図５Ａ、Ｃ、及びＤ）、これは、試験した他の細胞株についてはそうならない（図６）。実際、我々の結果は、小分子とその組合せが、異なる細胞株におけるＰＧＥに対して正反対の効果を与え得ることを示す。これは、細胞株が異なる修復タンパク質又は修復経路に依存することに起因する可能性があり、ＤＮＡ修復の細胞種特異的メカニズムに関する追跡研究が必要であることを示唆する。ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣが非常に高いＤＮＡ修復能力（分化後に減少する）を有することを示す研究（Ｂｌａｎｐａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１１，Ｒｏｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）は、この解釈に合致している。それは、いくつかの研究間の矛盾（例、ＤＮＡリガーゼＩＶ阻害剤ＳＣＲ７及びＲＡＤ５１促進剤ＲＳ−１は、一部の細胞種においては正確なゲノム編集を促進するが、他ではしない）も説明し得る。従って、小分子を、目的の各細胞種におけるＣＲＩＳＰＲ編集に対するそれらの効果についてスクリーニングすることが必要であり得る。
【０１０９】
多能性幹細胞においてＣａｓ９Ｄ１０Ａ及びｓｓＯＤＮドナーによるＰＧＥを、を単独（図４Ａ）及びミックス（図５Ａ）で共に増加させた小分子は、ＮＵ７０２６、ＴＳＡ、ＭＬＮ４９２４及びＮＳＣ  １５５２０である。ミックスは、ＮＵ７０２６での単回処理と比較して、Ｃｐｆ１によるＰＧＥに対する更なる増大効果も示すが、Ｃａｓ９だと示さない。ＮＵ７０２６は、ＮＨＥＪ経路における主要な複合体であるＤＮＡ−ＰＫを阻害し（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、ｈｉＰＳＣにおけるＰＧＥ効率を増大させることが以前に示されている（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。ＴＳＡは、ＡＴＭ依存性のＤＮＡ損傷シグナル伝達経路を活性化し得る（Ｌｅｅ  ２００７）。Ｎｅｄｄ８活性化酵素（ＮＡＥ）阻害剤ＭＬＮ４９２４は、ＣｔＩＰのｎｅｄｄ化を阻害することが示されており、これは鎖切断におけるＤＮＡ末端の削り込みの程度を増大させ、それによってＨＤＲを促進する（Ｊｉｍｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ＤＮＡの削り込みによりｓｓＤＮＡが残り、相同性探知及び組換えを経る前にＲＰＡにより被覆及び安定化される。ＮＳＣ１５５２０は、ＲＰＡのｐ５３及びＲＡＤ９への結合を妨げ（Ｇｌａｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）（Ｇｌａｎｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、ｓｓＤＮＡにとって利用可能なＲＰＡの量を増大させる可能性があり、これはＨＤＲに好都合であり得る。ＰＧＥを増大させる能力について相反する報告があるＲＳ−１、ＳＣＲ７、及びＬ７５５５０７は、我々のもとでは、Ｃａｓ９によってもＣａｓ９Ｄ１０ＡによってもＰＧＥに対する明確な効果を示さなかった。
【０１１０】
Ｃａｓ９Ｄ１０Ａダブルニッキング又はＣｐｆ１と共に用いた場合の、ＴＳＡ及びＭＬＮ４９２４の、ＰＧＥに対する増強効果は、Ｃａｓ９による効果が顕在化しないのとは対照的に、異なる修復メカニズムによってブラント及びスタガードＤＮＡカット（５’オーバーハング）が修復されることを示唆する。これまでｓｓＯＤＮによるＨＤＲのメカニズムは明確ではないが、モデルは提案されている（Ｂｏｔｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。Ｂｏｔｈｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、５’オーバーハング構造は３’オーバーハングよりも高レベルのＨＤＲをもたらし、異なるオーバーハング極性が異なる修復経路に関与することを示唆する。
【０１１１】
しかしながら、Ｃａｓ９の編集によるＭＬＮ４９２４の負の効果は、用いられるより短いｓｓＯＤＮ（Ｃａｓ９Ｄ１０Ａのより長いｓｓＯＤＮと比較して）に起因し得る。ＭＬＮ４９２４によって引き起こされる大幅なＤＮＡの削り込みが起きる場合、短いドナーが用いられると、ｓｓＯＤＮアニーリングのための相同性は残存しない（ａｒｅ  ｉｓ）。Ｃａｓ９Ｄ１０Ａの編集においては長い５’オーバーハングが存在するため、大幅な削り込み後でも相同性のあるＤＮＡが提供される。従って、より長いドナーの使用により、Ｃａｓ９を用いる場合にも、ＭＬＮ４９２４が正確なゲノム編集の増強において効果的になり得る。
【０１１２】
ＲＡＤ５１は、ｄｓＤＮＡによる古典的な相同組換えのためには明らかに重要であるが（（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、ｓｓＤＮＡのアニーリングにはＲＡＤ５２が必要であるため（Ｇｒｉｍｍｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）、我々は、ＲＡＤ５１ではなくＲＡＤ５２がｓｓＯＤＮのＨＤＲを支援する原動力になり得るか否かを検証することを望んだ。ＲＡＤ５２阻害剤ＡＩＣＡＲ、ＲＡＤ５１阻害剤Ｂ０２、及びＲＡＤ５１促進剤ＲＳ−１のＰＧＥ効率に対する効果の、我々の結果は、Ｂ０２によるＲＡＤ５１の阻害が半減し、ＲＡＤ５２の阻害はＰＧＥ効率に対して効果がないことから、ＲＡＤ５２ではなくＲＡＤ５１が、ｓｓＯＤＮによる正確な編集に重要であることを示唆している。興味深いことに、ＲＳ−１によるＲＡＤ５１の刺激には、ＰＧＥに対する有益な効果はなかった。
【０１１３】
ＰＧＥの効率を増大させるために、我々は誘導性のＣａｓ９Ｄ１０Ａ  ｉＰＳＣ株を生成し、ｓｓＯＤＮの送達を最適化した。時折、細胞の９０％超でインデルが観察される（図３Ａ）。我々は、ＣＲＩＳＰＹ小分子ミックスを用いて、ｈｉＰＳＣで、ほぼ５０％のＰＧＥを達成するが、これは我々の知る限りこれまでに記述されているヒト多能性幹細胞の最高のＰＧＥ効率である（図３Ａ）。我々は、更に、ＣＲＩＳＰＹミックスを活用してＣｐｆ１を用いることによる、効率的なＰＧＥ（２０％）を初めて示す（図５Ｃ）。ＣＲＩＳＰＹミックスは、ＰＧＥ頻度を増大させるための簡単なツールを提供し、従って、多くの研究者又は医療専門家にとって、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて正確なゲノム編集を行うのに有用であり得る。
【０１１４】
ｉＣＲＩＳＰＲを用いて効率的なＤＳＢ誘導を活用し、ＮＨＥＪとＨＤＲの切り替えとしてキナーゼデッドＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲを利用することにより、非常に効率的な、ゲノムの正確な編集が可能である（図１０）。高いＰＧＥ効率は、高い、インデルに対するＰＧＥの比と密接に関連している。我々は、いくつかの遺伝子を多重にする場合、すべての標的染色体におけるＴＮＳの取込みは、単一の遺伝子ＴＮＳ効率に基づいて偶然により予想されるよりもはるかに高いことも示す。ＤＮＡ−ＰＫｃｓのＨＤＲ阻害特性は、そのキナーゼ活性に絶対的に依存することが示されている（Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。我々のデータと同様に、ＣＨＯＶ３  ＫＲ細胞におけるＨＤＲは、野生型ＤＮＡ−ＰＫｃｓを発現している細胞の４〜７倍超であることが示されている（Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．２００８及び２００９）。驚くべきことに、ＣＨＯＶ３  ＫＲ細胞におけるＨＤＲの増大はＣＨＯＶ３  ＤＮＡ−Ｐｋｃｓノックアウト細胞よりも高かった。これは、更に増強されたＨＤＲにはタンパク質構造が必要であることを示唆している。ＡＢＣＤＥ又はＪＫクラスターのリン酸化は、それぞれ末端処理を促進するか、ＮＨＥＪを阻害することが示されている（図９Ｂを参照）。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ欠損により、培養細胞株及びマウスにおける重要な修復キナーゼＡＴＭのレベル低下がもたらされる（１０）。Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．はＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲのＡＴＭ依存性リン酸化の回復、及び恐らくＡＴＭ促進性のＲＡＤ５１代謝回転が、過剰組換えの表現型（Ｎｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）に寄与すると主張している。触媒的に不活性であるが構造的に完全であるＤＮＡ−ＰＫｃｓを用いることにより、下流のｃ−ＮＨＥＪタンパク質のリン酸化及びリン酸化誘導性のＡＴＭキナーゼ活性の阻害が阻止されるが（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、ＡＴＭレベルはキナーゼ非依存的様式で維持され、従って、ＨＤＲの増強がもたらされる。ｃ−ＮＨＥＪにおけるＤＮＡ−ＰＫｃｓの中心的な役割と、Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌによる、チャイニーズハムスター卵巣細胞におけるＨＤＲ増大に関する同様の知見を踏まえ、我々は、ＫＲ変異が細胞の各種類（ｔｙｐｅ）及び種類（ｓｐｅｃｉｅｓ）で一貫した効果をもたらすと考えている。ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、及びＫ３７５３近傍のその配列は脊椎動物において保存されているため（図９Ｃ）、ＫＲ変異はいくつかの動物モデルにおいて貴重な遺伝子改変ツールであり得る。ＤＮＡ−ＰＫｃｓオルソログは、蚊、ミツバチ、及びこの酵素の古代の祖先を示唆するアメーバ粘菌にも見出されている（Ｄｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．２００４，Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０１１５】
我々は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲ  ｈｉＰＳＣを３か月培養した後、数的又は大規模な染色体異常を何ら検出しなかった（図１３）。標的ゲノム切断以外に、活性酸素種及び複製フォークの崩壊につながる物理的ストレスのために、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え中と同様に、内因性ＤＳＢが定期的に発生する。ＤＮＡ−ＰＫｃｓのキナーゼ活性を不活性化することによりエラーを起こしやすいｃ−ＮＨＥＪが損なわれると、細胞に、緩慢なエラープローンａ−ＮＨＥＪにより、姉妹染色分体を利用した、信頼度が高く強化されたＨＤＲでＤＳＢを修復するか、又は死ぬかが一任される。従って、推測では、ヘテロ接合性損失の代償による、ＨＤＲによる信頼度の高い修復のために、ＫＲ細胞でゲノムの安定性は、野生型と比較して一層良好な（ｂｙ）可能性がある。
【０１１６】
我々は、Ｒ３７５３を変異させリジンに復帰させることによる、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの効率的な逆不活性化（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）も示した（図１０Ａ）。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えはｃ−ＮＨＥＪに依存するため、Ｔ細胞への細胞分化の前においては、標的変異を実施した後にＤＮＡ−ＰＫｃｓを再活性化することが望ましい。ニューロンのような非増殖細胞への細胞分化の前にＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲの変異を復帰させることも有益であり得る。ＨＤＲは分裂細胞に限られ、従ってＮＨＥＪは有糸分裂後の細胞におけるＤＮＡ修復の中核を成す。しかし、ＸＬＦを伴う、ｃ−ＮＨＥＪ因子であるＫｕ７０／８０、ＸＲＣＣ４、及びＬＩＧ４は、低レベルの損傷を修復するのに十分であり（Ｇｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、ａ−ＮＨＥＪはいずれにせよＤＮＡ−ＰＫｃｓに非依存的である。
【０１１７】
ＣＲＩＳＰＹ小分子ミックスを触媒的に不活性なＤＮＡ−ＰＫｃｓと共に用いると、複数の遺伝子座を一度に編集することが可能なため、この知見は、ＣＲＩＳＰＲが促進する研究及びテーラーメイドゲノムに革命を起こす可能性がある。編集の効率が非常に高い（最大８２％）だけでなく、インデルの限られた割合により、高速（多重）で正確なゲノム編集がこれより可能になる（図１０及び１１）。
【０１１８】
結論として、ＣＲＩＳＰＲ技術と組合せたＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ＫＲの過剰組換え効果は、正確なゲノム編集における予期せぬ効率をもたらす。これは、ヒト多能性幹細胞において、ＣＲＩＳＰＹ小分子ミックスによって更に増大させ得る。これにより、ゲノム研究の様々な分野において時間と労力を大幅に削減し得る。これらには、関連する医学的に重要な特性のハイスループットゲノムワイドアソシエーションスクリーン（ＧＷＡＳ）検証、疾患モデル化及び薬物スクリーニング、種比較分析、エックスビボ遺伝子治療、オーダーメイド動物モデルの簡易生産、種のディエクスティンクション、そしていつかはデノボ合成された大ゲノム断片の導入の可能性のようなエキサイティングな応用が含まれる。
【０１１９】
参考文献
１．Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｍ．，Ｓｏｍｍｅｒｓ，Ｊ．Ａ．，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ，Ｒ．Ｈ．＆  Ｂｒｏｓｈ，Ｒ．Ｍ．，Ｊｒ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｍｐａｉｒｓ  Ｗｅｒｎｅｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｈｅｌｉｃａｓｅ  （ＷＲＮ）  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｏｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，１５２５−１５３０（２０１１）．
２．Ｂｌａｎｐａｉｎ，Ｃ．，Ｍｏｈｒｉｎ，Ｍ．，Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ，Ｐ．Ａ．＆  Ｐａｓｓｅｇｕｅ，Ｅ．ＤＮＡ−ｄａｍａｇｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８，１６−２９（２０１１）．
３．Ｃｈａｒｉ，Ｒ．，Ｍａｌｉ，Ｐ．，Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ，Ｍ．＆  Ｃｈｕｒｃｈ，Ｇ．Ｍ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｖｉａ  ａ  ｌｉｂｒａｒｙ−ｏｎ−ｌｉｂｒａｒｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２，８２３−８２６（２０１５）．
４．Ｃｈｕ，Ｖ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３，５４３−５４８（２０１５）．
５．Ｄｏｒｅ，Ａ．Ｓ．，Ｄｒａｋｅ，Ａ．Ｃ．，Ｂｒｅｗｅｒｔｏｎ，Ｓ．Ｃ．＆  Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，Ｔ．Ｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ＰＫ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｒｔｈｒｏｐｏｄｓ．Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎｃｉｅｎｔ  ａｎｃｅｓｔｒｙ  ｏｆ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ  （Ａｍｓｔ）３，３３−４１（２００４）．
６．Ｄｏｕｇｌａｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｉｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｏｎ  ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ３９５０，ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｄｏｍａｉｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７，１５８１−１５９１（２００７）．
７．Ｆｉｅｌｄ，Ａ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ＳＰＳＳ．（Ｓａｇｅ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；２００５）．
８．Ｆｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，８２２−８２６（２０１３）．
９．Ｇ．，Ｄ．Ｒ．Ｉ．Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ（ＮＨＥＪ）ｉｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｒａｎｓｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２（２０１３）．
１０．Ｇｌａｎｚｅｒ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｐ５３  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｒｏｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１，２０４７−２０５９（２０１３）．
１１．Ｇｌａｎｚｅｒ，Ｊ．Ｇ．，Ｌｉｕ，Ｓ．＆  Ｏａｋｌｅｙ，Ｇ．Ｇ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＰＡ７０  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １９，２５８９−２５９５（２０１１）．
１２．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｉＣＲＩＳＰＲ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｘａｂｌｅ，ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １５，２１５−２２６（２０１４）．
１３．Ｇｒｅｃｏ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．ＳＣＲ７  ｉｓ  ｎｅｉｔｈｅｒ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｎｏｒ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ＩＶ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）４３，１８−２３（２０１６）．
１４．Ｇｒｉｍｍｅ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  Ｒａｄ５２  ｂｉｎｄｓ  ａｎｄ  ｗｒａｐｓ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ａｎｎｅａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｗｏ  ｈＲａｄ５２−ｓｓＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，２９１７−２９３０（２０１０）．
１５．Ｇｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  Ｋｕ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７，２６６８−２６７３（２０００）．
１６．Ｈｕａｎｇ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＲＡＤ５１  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ６，６２８−６３５（２０１１）．
１７．Ｊｉｍｅｎｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｄｄｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＣｔＩＰ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３，９８７−９９９（２０１５）．
１８．Ｋｅｎｔ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｂｒｏｗｓｅｒ  ａｔ  ＵＣＳＣ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １２，９９６−１００６（２００２）．
１９．Ｋｉｍ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，８６３−８６８（２０１６）．
２０．Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｓａｗｙｅｒ，Ｓ．＆  Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｄｏｕｂｌｅ  ｉｎｄｅｘｉｎｇ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｉｎａｃｃｕｒａｃｉｅｓ  ｉｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０，ｅ３（２０１２）．
２１．Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ，Ｂ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｃｐｆ１  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，８６９−８７４（２０１６）．
２２．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．，Ｇｕｏ，Ｚ．，Ｍｙｌｅｒ，Ｌ．Ｒ．，Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．＆  Ｐａｕｌｌ，Ｔ．Ｔ．Ｄｉｒｅｃｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＭ  ｂｙ  ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ  ｕｎｄｅｒ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，ｅ９７９６９（２０１４）．
２３．Ｌｅｅ，Ｊ．Ｓ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＭ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ａ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ  Ａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  Ｔｒｅａｔ  ３９，１２５−１３０（２００７）．
２４．Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｓｔａａｈｌ，Ｂ．Ｔ．，Ａｌｌａ，Ｒ．Ｋ．＆  Ｄｏｕｄｎａ，Ｊ．Ａ．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｉｍｉｎｇ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｅｌｉｆｅ  ３，ｅ０４７６６（２０１４）．
２５．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３３，５３８−５４２（２０１５）．
２６．Ｍｅｙｅｒ，Ｍ．＆  Ｋｉｒｃｈｅｒ，Ｍ．Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈｌｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２０１０，ｐｄｂ  ｐｒｏｔ５４４８（２０１０）．
２７．Ｍｉｌａｎｏｗｓｋａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．ＲＥＰＡＩＲｔｏｉｒｅ−−ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３９，Ｄ７８８−７９２（２０１１）．
２８．Ｎｅａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｉｓ  ｔｉｔｒａｔａｂｌｅ，ａｎｄ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３１，１７１９−１７３３（２０１１）．
２９．Ｎｅａｌ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｕｎｒａｖｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３４，２１６２−２１７５（２０１４）．
３０．Ｎｅａｌ，Ｊ．Ａ．，Ｘｕ，Ｙ．，Ａｂｅ，Ｍ．，Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，Ｅ．＆  Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＤＮＡ−ＰＫｃｓ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｅｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９６，３０３２−３０４２（２０１６）．
３１．Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ａ．＆  Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ，Ｍ．Ｃ．Ａ  ｂａｃｋｕｐ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｍｏｖｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｆｏｒｅｆｒｏｎｔ．Ｃｅｌｌ  １３１，２２３−２２５（２００７）．
３２．Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．，Ｏｒｔｏｎ，Ｔ．＆  Ｐｏｇｎａｎ，Ｆ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｄｙｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６７，５４２１−５４２６（２０００）．
３３．Ｐｉｎｄｅｒ，Ｊ．，Ｓａｌｓｍａｎ，Ｊ．＆  Ｄｅｌｌａｉｒｅ，Ｇ．Ｎｕｃｌｅａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ‘ｋｎｏｃｋ−ｉｎ’  ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３，９３７９−９３９２（２０１５）．
３４．Ｐｉｎｅｌｌｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４，６９５−６９７（２０１６）．
３５．Ｐｒｕｆｅｒ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａ  Ｎｅａｎｄｅｒｔｈａｌ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ａｌｔａｉ  Ｍｏｕｎｔａｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０５，４３−４９（２０１４）．
３６．Ｑｕｉｎｎ，Ｇ．Ｐ．Ｋ．，Ｍ．Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  ａｎｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ；２００２）．
３７．Ｒｅｎａｕｄ，Ｇ．，Ｓｔｅｎｚｅｌ，Ｕ．＆  Ｋｅｌｓｏ，Ｊ．ｌｅｅＨｏｍ：ａｄａｐｔｏｒ  ｔｒｉｍｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｅｒｇｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２，ｅ１４１  （２０１４）．
３８．Ｒｏｂｅｒｔ，Ｆ．，Ｂａｒｂｅａｕ，Ｍ．，Ｅｔｈｉｅｒ，Ｓ．，Ｄｏｓｔｉｅ，Ｊ．＆  Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ−ＰＫ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｅｄ  ７，９３（２０１５）．
３９．Ｒｏｃｈａ，Ｃ．Ｒ．，Ｌｅｒｎｅｒ，Ｌ．Ｋ．，Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｏ．Ｋ．，Ｍａｒｃｈｅｔｔｏ，Ｍ．Ｃ．＆  Ｍｅｎｃｋ，Ｃ．Ｆ．Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｕｔａｔ  Ｒｅｓ  ７５２，２５−３５（２０１３）．
４０．Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｎｉｃｋａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，３９９−４０２（２０１４）．
４１．Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ，Ｍ．，Ｄｅ  Ｈａｒｏ，Ｌ．Ｐ．＆  Ｎｉｃｋｏｌｏｆｆ，Ｊ．Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １８，１３４−１４７（２００８）．
４２．Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  ａｎｄ  ＡＴＭ  ｃｏ−ｒｅｇｕｌａｔｅ  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）８，９２０−９２９（２００９）．
４３．Ｓｏｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＲＳ−１  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７，１０５４８（２０１６）．
４４．Ｓｕｂａｃｈ，Ｏ．Ｍ．，Ｃｒａｎｆｉｌｌ，Ｐ．Ｊ．，Ｄａｖｉｄｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．＆  Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ，Ｖ．Ｖ．Ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｂｌｕｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｈｒｏｍｏｐｈｏｒｅ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２８６７４（２０１１）．
４５．Ｓｕｌｌｉｖａｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ＲＡＤ５２  ｂｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １１，ｅ０１４７２３０（２０１６）．
４６．Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｖｉａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ５４０，１４４−１４９（２０１６）．
４７．Ｗａｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐｉｇｓ  ｖｉａ  ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｓｓＯＤＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５，ｅ３９６（２０１６）．
４８．Ｗｅｔｅｒｉｎｇｓ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｕ７０／８０．ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ）４３，９８−１０６（２０１６）．
４９．Ｙａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇ２／Ｍ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｈａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＨＤＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐａｉｒ  ｗｉｔｈ  ｃｕｓｔｏｍｉｚａｂｌｅ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６，２１２６４（２０１６）．
５０．Ｙｕ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １６，１４２−１４７（２０１５）．
５１．Ｚａｒ，Ｊ．Ｈ．Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．（Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；１９９９）．
５２．Ｚｅｔｓｃｈｅ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｐｆ１  ｉｓ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｅｌｌ  １６３，７５９−７７１（２０１５）．
５３．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｅｃｉｓｅ  ｋｎｏｃｋｉｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ  ｃｕｔ  ＨＤＲ  ｄｏｎｏｒ  ａｆｔｅｒ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ  １８，３５（２０１７）．
５４．Ｚｈｏｕ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＤＮＡ  Ｄａｍａｇｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ−ＰＫｃｓ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＭ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６５，９１−１０４（２０１７）．
【図１】
2020516258.tif 000005
【図２】
2020516258.tif 000006
【図３−１】
2020516258.tif 000007
【図３−２】
2020516258.tif 000008
【図３−３】
2020516258.tif 000009
【図３−４】
2020516258.tif 000010
【図４】
2020516258.tif 000011
【図５−１】
2020516258.tif 000012
【図５−２】
2020516258.tif 000013
【図５−３】
2020516258.tif 000014
【図５−４】
2020516258.tif 000015
【図６】
2020516258.tif 000016
【図７】
2020516258.tif 000017
【図８−１】
2020516258.tif 000018
【図８−２】
2020516258.tif 000019
【図９】
2020516258.tif 000020
【図１０】
2020516258.tif 000021
【図１１−１】
2020516258.tif 000022
【図１１−２】
2020516258.tif 000023
【図１２】
2020516258.tif 000024
【図１３】
2020516258.tif 000025
【配列表】
2020516258000001.app
【国際調査報告】
2020516258.tif 000026
2020516258.tif 000027
2020516258.tif 000028
2020516258.tif 000029
2020516258.tif 000030