(57)【要約】アレルゲンで感作されたモルモットの血液から分離され精製されたモルモット免疫グロブリンＥ画分、該画分を抗原として得られた特異性の高い抗モルモット免疫グロブリンＥ抗体、及び該抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンで感作されたモルモットの血液から分離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫グロブリンＥの単一の主バンドを得るのに充分な純度をもつ本質的に精製された下記性状を有するモルモット免疫グロブリンＥからなる画分；
（１）前記主バンドの分子量は約２００ｋＤａである、
（２）モルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体を製造するための抗原として使用できる、
（３）モルモットにおける受動皮膚アナフィラキシー反応が陽性である、
（４）実質的にモルモット免疫グロブリンＧを含有しない。
【請求項２】
請求の範囲１に記載の画分において、主バンドの分子量が１８７〜１９５ｋＤａであるモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項３】
モルモット免疫グロブリンＥの分子量が質量分析法により測定して約１８６ｋＤａである請求の範囲１又は２に記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項４】
前記主バンドが還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つに分離され、分離後の各バンドの分子量が約７０ｋＤａ及び約３０ｋＤａである、請求の範囲１〜３に記載の画分。
【請求項５】
アレルゲンが卵白アルブミンである請求の範囲１〜４に記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項６】
請求の範囲１〜５に記載の免疫グロブリンＥからなる画分でもってヒト以外の動物を免疫して製造されるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である請求の範囲６に記載のモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
【請求項８】
抗体がモルモット免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭと実質的に交差反応しないものである請求の範囲６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
モルモット免疫グロブリンＧ及び免疫グロブリンＭとの交差反応率が０．０００１％未満であるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
【請求項１０】
請求の範囲６〜９に記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１１】
請求の範囲６〜９に記載の抗体及び酵素標識された前記抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１２】
免疫測定用試薬がサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法を実施するための試薬である請求の範囲１０又は１１に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１３】
固相化された請求の範囲６〜９に記載の抗体及び標識物質により標識された卵白アルブミンを含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１４】
固相化された卵白アルブミン及び標識物質により標識された請求の範囲６〜９に記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１５】
標識物質が酵素である請求の範囲１３又は１４に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１６】
モルモット免疫グロブリンＥが卵白アルブミンを認識する免疫グロブリンＥである請求の範囲１３〜１５のいずれかに記載の免疫測定用試薬。
【請求項１７】
固相化されてなる請求の範囲６〜９に記載の抗体。
【請求項１８】
モルモット免疫グロブリンＥを製造または精製するための請求の範囲１７に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、特定の性状を有する本質的に精製されたモルモット免疫グロブリンＥ（以下「ＩｇＥ」ということもある）からなる画分に関する。また本発明は、前記画分をヒト以外の動物に免疫して製造されるモルモットＩｇＥを特異的に認識することができる抗体（以下「抗モルモットＩｇＥ抗体」ということもある）及び該抗体を含むモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬に関する。
【背景技術】  生体内に異物が侵入した場合、それを排除しようとして免疫反応が起こる。この免疫反応が過剰になった結果、生体に対して種々の病的症状をもたらす病態をアレルギーという。現在、乳幼児を中心としてアトピー性皮膚炎や喘息に代表される種々のアレルギー疾患患者が激増し、社会問題となっている。これらのアレルギー疾患の多くは、個々のアレルゲン（抗原）に対するＩｇＥ（抗体）が過剰に産生されることによって発症するＩ型（即時型）アレルギーである。
Ｉ型アレルギーにおけるＩｇＥの産生調節メカニズムの解明や、アレルギーを抑制する薬物の研究・開発が進められている。ＩｇＥの関与が大きいこのようなＩ型アレルギーの実験現場では、例えば、受動皮膚アナフィラキシー反応（ｐａｓｓｉｖｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ、以下「ＰＣＡ反応」という）に代表されるように実験動物としてモルモットが使用されることが多い。
特開２０００−２６６７４７号公報には、抗ラットＩｇＥ抗体及び該抗体を含むラットＩｇＥの測定用キットが記載されており、特開２０００−２６６７４８号公報には、抗マウスＩｇＥ抗体及び該抗体を含むマウスＩｇＥの測定用キットが記載されている。これらの両文献には抗モルモットＩｇＥ抗体及び該抗体を含むモルモットＩｇＥ抗体の測定用キット（試薬）は記載されていない。
“Ｉｎｔ．Ａｒｃｈｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎ．”、１９８５年、第７７巻、ｐ．４３８−４４４には、寄生虫を感染させたモルモットの血清からＩｇＥが豊富に含まれる画分を分離して、該画分を抗原としてウサギに免疫して製造された抗モルモットＩｇＥ抗体が記載されている。しかしながらここに記載されているモルモットＩｇＥを豊富に含む画分は、他のクラスの免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧも相当量含んでいると考えられる。そのため、該画分を抗原として得られた抗体（抗血清）は、モルモットＩｇＥに対する特異性が低く、そこから抗モルモットＩｇＥ抗体を得るためには、抗血清を正常モルモット血清によって中和する必要があった。また、“Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ”、１９８８年、第８７巻、ｐ．４２４−４２９及び“ＡＮＮＡＬＳ  ＯＦ  ＡＬＬＥＲＧＹ”、１９８１年、第４７巻、ｐ．５２−５６にも前記文献と同様な画分及び抗体が記載されている。
“Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ”、１９９１年、第１３９巻、ｐ．１２３−１３４には、モルモット血液中の免疫グロブリン画分から、免疫グロブリンの各クラスを分離する方法が開示されている。そして、その図８にはクロマトグラフィーにより分離された各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）による結果が示されているが、ＰＣＡ反応の活性を指標としてＩｇＥが含まれるとするフラクション３及び４の結果には、他のフラクションと区別できる固有の主バンドが形成されていない。これは、前記２つのフラクションには、その存在がＳＤＳ−ＰＡＧＥでは捉えられない極微量のＩｇＥしか含まれていないためであると考えられる。
仮にこのようなフラクションを抗原として使用したとしても特異性の高い抗モルモットＩｇＥ抗体を製造することはできない。
以上のとおり、これまで特異性に優れた抗モルモットＩｇＥ抗体及び該抗体を製造するための純度の高い抗原、すなわち、高純度のモルモットＩｇＥはこれまで製造されていなかったし、その性状も知られていなかった。
【発明の開示】
前述のように、現在ＩｇＥが関与するアレルギーの実験系として、モルモットのＰＣＡ反応が実施されている。しかしながら、ＰＣＡ反応はＩｇＥそれ自体を定量的に測定するものではない。ＰＣＡ反応においては、ＩｇＥと結合した肥満細胞が抗原により刺激され、放出されたケミカルメディエーター（ヒスタミン、ロイコトリエンなど）が血管に作用し、そこから漏出する色素量を測定することによって、アレルギー反応の程度を推測しているに過ぎない。
このような状況において、アレルギーの実験現場においては、特異性の高い抗モルモットＩｇＥ抗体及び該抗体を含む精度の高いモルモットＩｇＥ測定用試薬の開発が望まれていた。
本発明は、高度に精製されたモルモットＩｇＥからなる画分、該画分を抗原として使用することによって製造される特異性に優れた抗モルモットＩｇＥ抗体及び、高い測定感度を有するとともに正確かつ簡便なモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬を提供することを目的としている。
本発明者らは、アレルゲン、特に卵白アルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ、以下「ＯＶＡ」ということもある）で感作されたモルモットの血液から分離された免疫グロブリン画分よりＩｇＥからなる画分を精製し、その性状を確認した。そして、この画分を抗原として使用することにより製造された抗モルモットＩｇＥ抗体がモルモットＩｇＥを特異的に認識すること、さらには、この抗体を利用してＩｇＥの免疫測定系を組み立てたところ高い感度で正確にモルモットのＩｇＥが測定できることを見いだし、本発明を完成した。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
［１］アレルゲンで感作されたモルモットの血液から分離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫グロブリンＥの単一の主バンドを得るのに充分な純度をもつ本質的に精製された下記性状を有するモルモット免疫グロブリンＥからなる画分；
（１）前記主バンドの分子量は約２００ｋＤａである、
（２）モルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体を製造するための抗原として使用できる、
（３）モルモットにおけるＰＣＡ反応が陽性である、
（４）実質的にモルモット免疫グロブリンＧを含有しない。
［２］上記［１］に記載の画分において、主バンドの分子量が１８７〜１９５ｋＤａであるモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
［３］モルモット免疫グロブリンＥの分子量が質量分析法により測定して約１８６ｋＤａである上記［１］又は［２］に記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
［４］前記主バンドが還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つに分離され、分離後の各バンドの分子量が約７０ｋＤａ及び約３０ｋＤａである、上記［１］〜［３］に記載の画分。
［５］アレルゲンが卵白アルブミンである上記［１］〜［４］に記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
［６］上記［１］〜［５］に記載の免疫グロブリンＥからなる画分でもってヒト以外の動物を免疫して製造されるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
［７］抗体がモノクローナル抗体である上記［６］に記載のモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
［８］抗体がモルモット免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭと実質的に交差反応しないものである上記［６］又は［７］に記載の抗体。
［９］モルモット免疫グロブリンＧ及び免疫グロブリンＭとの交差反応率が０．０００１％未満であるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
［１０］上記［６］〜［９］に記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１１］上記［６］〜［９］に記載の抗体及び酵素標識された前記抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１２］免疫測定用試薬がサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法を実施するための試薬である上記［１０］又は［１１］に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１３］固相化された上記［６］〜［９］に記載の抗体及び標識物質により標識された卵白アルブミンを含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１４］固相化された卵白アルブミン及び標識物質により標識された上記［６］〜［９］に記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１５］標識物質が酵素である上記［１３］又は［１４］に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
［１６］モルモット免疫グロブリンＥが卵白アルブミンを認識する免疫グロブリンＥである上記［１３］〜［１５］のいずれかに記載の免疫測定用試薬。
［１７］固相化されてなる上記［６］〜［９］に記載の抗体。
［１８］モルモット免疫グロブリンＥを製造または精製するための上記［１７］に記載の抗体。
上記本発明［１］によれば、抗モルモットＩｇＥ抗体を製造するための高度に精製された抗原を提供することができる。上記本発明［６］は、特異性に優れた抗モルモットＩｇＥ抗体を提供するものであり、それを含む上記本発明［１０］によって、血液等の生体試料中のモルモットＩｇＥを高感度で、正確かつ簡便に測定することができる。
また、本発明［１３］によれば、ＯＶＡを抗原抗体反応によって認識するモルモット免疫グロブリンＥを特異的に測定することができる。
また、本発明［１７］によれば、モルモット免疫グロブリンＥを高純度に製造または精製することができる。
【図面の簡単な説明】  図１は、本発明のモルモットＩｇＥ画分の主バンドの分子量を表すＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。
図２は、本発明のモルモットＩｇＥ画分の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。
図３は、本発明のモルモットＩｇＥ画分のモルモットＰＣＡ反応の実験結果である。
図４は、本発明のモルモットＩｇＥ画分が実質的にＩｇＧを含有しないことを示すウェスタンブロッティングの分析結果である。
図５は、本発明のモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬を使用して作成した標準曲線である。
図６は、本発明のモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬の希釈試験（検体１〜３）の結果である。
図７は、実施例５（３）項において作成した標準曲線である。
図８は、実施例５（４）項の（ア）の希釈試験の結果である。
図９は、実施例５（４）項の（オ）のＰＣＡ反応との相関性試験の結果である。
図１０は、分子量曲線の作成に用いた本発明のモルモットＩｇＥ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析結果である。
図１１は、本発明のモルモットＩｇＥ画分の質量分析の結果である。
【発明を実施するための最良の形態】  本発明は、アレルゲンで感作されたモルモット血液から分離され、特定の性状を有するモルモット免疫グロブリンＥからなる画分（以下「モルモットＩｇＥ画分」という）に関する。
本発明のモルモットＩｇＥ画分は、アレルゲンで感作されたモルモット血液の免疫グロブリン画分から精製されたものである。
アレルゲンとしては、そのものでもってモルモットを感作した場合に、その血液中にＩｇＥを過剰に産生せしめるものであれば、特に制限されずこの分野で公知の何れのものも使用することができる。このようなアレルゲンとして例えば、ＯＶＡ、ダニ抗原、寄生虫、寄生虫抽出蛋白、ウマ血清などが挙げられるが、これらの中でも、入手や取り扱いが容易な点においてＯＶＡが好ましい。
感作は、常法、例えばアレルゲンをモルモット腹腔内に一定期間にわたって投与することにより行なうことができる。免疫グロブリン画分は、このようにしてアレルゲンによって感作されたモルモットの血液を採取し、飽和硫酸アンモニウム塩析法などの公知の処理をなすことにより製造することができる。
このようにして得られるモルモットの免疫グロブリン画分より、それ自体公知の物理化学的手段を複数組み合わせることによって、本発明のモルモットＩｇＥ画分を製造することができる。
例えば、免疫グロブリン画分中に大量に含まれる免疫グロブリンＧを除去するためには、プロテインＧカラムやＤＥ５２陰イオン交換樹脂を利用する方法がとられる。また、モルモットＩｇＥ画分の精製のためには、Ｑ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭカラムクロマトグラフィーやＭｏｎｏＱＴＭカラムクロマトグラフィーなどの陰イオン交換処理、ＳｕｐｅｒｄｅｘＴＭ２００カラムクロマトグラフィーなどのゲル濾過カラム処理などが行なわれる。なお、これらの物理化学的手段の各々は、必要に応じて、複数回繰り返し実施してもよい。
上記各物理化学的手段においては、各手段に応じて通常使用される溶媒を特別な制限なく、適宜使用することができる。
より具体的には、後記実施例に記載されている方法によって本発明のモルモットＩｇＥ画分を製造することができる。
かくして得られる本発明のモルモットＩｇＥ画分が前記のような諸性状を有することは、後記実施例に示すとおりである。
本発明のモルモットＩｇＥ画分中に含まれるＩｇＥの純度は高い方が、抗原として使用した場合に、より特異性の高い抗ＩｇＥ抗体を得ることができる点において好ましい。
また、本発明は、上記モルモットＩｇＥ画分でもってヒト以外の動物を免疫して製造されるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体に関する。
本発明の抗体は、モルモットのＩｇＥを特異的に認識する抗体であればポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよいが、特異性及び均一性が高い点においてモノクローナル抗体の方が好ましい。
ポリクローナル抗体は、本発明のモルモットＩｇＥ画分を抗原として使用し、ヒト以外の動物を免疫することにより製造することができる。詳細には、前記のようにして得られたモルモットＩｇＥ画分を適当なアジュバントと混合してウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ニワトリなどのヒト以外の動物に免疫し、血液を採取して公知の処理をなすことによって製造することができる。またモノクローナル抗体は、このように免疫された動物の脾臓細胞を採取し、ミルシュタインらの方法によりミエローマ細胞との細胞融合、抗体産生細胞スクリーニング及びクローニング等を行い、抗モルモットＩｇＥ抗体を産生する細胞株を樹立し、これを培養することにより製造することができる。
このようにして得られた抗モルモットＩｇＥ抗体は、モルモットのＩｇＥに対する特異性が極めて高く、他のクラスの免疫グロブリン、例えば、通常血液中においてＩｇＥよりもはるかに大量に存在するとされている免疫グロブリンＧを認識しないものである。
本発明の抗ＩｇＥ抗体は、後述する本発明の免疫測定用試薬において好適に使用することができる。
さらに本発明は、上記抗モルモットＩｇＥ抗体を含むモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬に関する。
本発明のモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬は、本発明の抗モルモットＩｇＥ抗体の抗原に対する高い特異性に基づくものであり、種々の免疫測定法を実施するための試薬として有用である。ここにおける免疫測定法としては、抗原・抗体反応を含む測定法であればいずれでもよく、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、ラテックス凝集法、イムノクロマト法、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法、エバネッセンス波分析法などが挙げられる。これらの中でも、ＥＩＡ法やラテックス凝集法を実施するための本発明の試薬が操作の容易性の観点からして好適である。
本発明の免疫測定用試薬としてＥＩＡ法を実施するための試薬を選択した場合、ＥＩＡ法がモルモットＩｇＥに存在する異なるエピトープを認識する２種類の抗モルモットＩｇＥ抗体を用いたサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法（サンドイッチＥＬＩＳＡ法）であるのが好ましい。
また、サンドイッチＥＬＩＳＡ法の一種としてアビジン−ビオチン反応を利用した方法もある。本法は、試料中のモルモットＩｇＥを固相化抗モルモットＩｇＥ抗体でもって捕捉し、捕捉されたモルモットＩｇＥとビオチンで標識した抗体との間で抗原抗体反応を行わせ、次に、酵素標識ストレプトアビジンを加えて、アビジン−ビオチン反応を行わせることを測定原理としている。
このようなサンドイッチＥＬＩＳＡ法は、２種類の抗体を用いることから抗原に対する特異性が優れており、他のクラスの免疫グロブリンが混在する試料中のモルモットＩｇＥを正確に測定することができる。
本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための試薬は、固相化抗モルモットＩｇＥ抗体及び酵素またはビオチン標識抗モルモットＩｇＥ抗体から構成される。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための試薬に含まれる２種類の抗モルモットＩｇＥ抗体は、モノクローナル抗体同士、ポリクローナル抗体同士又はモノクローナル抗体とポリクローナル抗体の組合せの何れでも良い。
固相化抗モルモットＩｇＥ抗体は、前述のようにして得られた抗体を、例えば、マイクロプレートウェル、プラスチックビーズ、磁気ビーズ、クロマトグラフィー用担体（例、ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭ）などの固相に結合させることにより製造することができる。固相への結合は通常、抗体をクエン酸緩衝液等の適当な緩衝液に溶解し、固相表面と抗体溶液を適当な時間（１〜２日）接触させることにより行なうことができる。固相化抗モルモットＩｇＥ抗体は、モルモットＩｇＥの測定のみならず、後記実施例４の添加回収試験に示されるように、モルモットＩｇＥの回収率が良好であり、その性質を利用してモルモットＩｇＥの製造または精製にも使用することができる。
さらに、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン（ＢＳＡ）や牛ミルク蛋白等のリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記ＢＳＡや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般に行なわれる。
酵素標識抗モルモットＩｇＥ抗体は、上記固相化した抗体とは異なるエピトープを認識する抗モルモットＩｇＥ抗体と酵素とを結合（標識）させることにより製造することができる。該抗体を標識する酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。これらの酵素と抗モルモットＩｇＥ抗体との結合はそれ自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、マレイミド法などにより行なうことができる。
また、ビオチン標識抗モルモットＩｇＥ抗体はビオチンと抗モルモットＩｇＥ抗体とを周知の方法により結合させることにより製造することができる。例えば、市販のビオチン標識化キットを使用して、ビオチンと抗モルモットＩｇＥ抗体とを結合させることができる。
サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するための本発明の試薬には上記抗モルモットＩｇＥ抗体以外に必要に応じて、標準物質、洗浄液、酵素活性測定用試薬（基質剤、基質溶解液、反応停止液等）などを構成試薬として含んでいてもよい。また、アビジン−ビオチン反応を利用した方法を実施するための本発明の試薬には、さらに酵素標識ストレプトアビジンを含んでいてもよい。
所望により試薬に含まれる基質剤としては、選択した標識酵素に応じて適当なものが選ばれる。例えば、酵素としてペルオキシダーゼを選択した場合においては、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンチジン（ＴＭＢ）などが使用され、アルカリホスファターゼを選択した場合においては、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）などが使用される。また、反応停止液、基質溶解液についても、選択した酵素に応じて、従来公知のものを特に制限なく適宜使用することができる。
本発明の別の好ましい形態である、ラテックス凝集法を実施するための試薬には、抗モルモットＩｇＥ抗体はラテックス感作抗モルモットＩｇＥ抗体の形で含まれる。ラテックス粒子と抗体との感作（結合）は、この分野で公知の方法、例えば、架橋剤としてカルボジイミドやグルタルアルデヒド等を利用する化学結合法や物理吸着法により成すことができる。
ラテックス凝集法を実施するための試薬には、上記ラテックス感作抗モルモット免疫グロブリン抗体以外に、必要に応じて、希釈安定化緩衝液、標準物質などを含んでいてもよい。
なお、本発明の別の実施形態である放射免疫測定法（ＲＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）、ルミネッセンス免疫測定法などを実施するための試薬も上記ＥＩＡ法やラテックス凝集法を実施するための試薬に準じて常法に従い製造することができる。
以上のようにして製造された、本発明のモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬は、免疫グロブリンＥのみを特異的に測定できるものであり、他のクラスの免疫グロブリン、例えば、後記実施例に示すように免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭとは交差しない。
また本発明は、固相化された前記抗モルモットＩｇＥ抗体及び標識物質により標識されたＯＶＡを含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬に関する。
固相化された前記抗モルモットＩｇＥ抗体は、上記サンドイッチＥＬＩＳＡの場合と同様にして製造することができる。
ＯＶＡを標識する標識物質としては、酵素、蛍光物質、放射性物質等が挙げられる。酵素の具体例としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。また、蛍光物質としては、例えば、フルオレッセン又はその誘導体が挙げられ、放射性物質としては、例えば、１２５Ｉが挙げられる。このような標識物質のうち、取扱いが容易である点において酵素が好ましい。
標識されたＯＶＡは、公知のグルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法またはマレイミド法などの方法により、ＯＶＡと標識物質とを結合せしめることによって製造することができる。例えば、酵素標識ＯＶＡの具体的な製造方法は後記実施例に示すとおりである。
このようにして製造された、固相化抗モルモットＩｇＥ抗体及び標識ＯＶＡを含む本発明の免疫測定用試薬は、ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥの濃度を特異的に測定するものである。その測定の機構は以下のとおりである。
マイクロプレート等に固相化された本発明の抗モルモットＩｇＥ抗体に検体中のＩｇＥが捕捉され、そこに標識物質で標識されたＯＶＡが添加されると、標識ＯＶＡは捕捉されたＩｇＥの中、ＯＶＡを認識するＩｇＥのみに結合し、その標識物質の量を公知の方法により測定することによって、ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥを特異的に測定することができる。
上記の機構において、固相化抗体に代えて固相化ＯＶＡを使用し、標識ＯＶＡに代えて標識抗体を使用することによっても、ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥを測定することができる。従って、本発明の試薬は、固相化されたＯＶＡ及び標識物で標識された前記抗モルモットＩｇＥ抗体を含むモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬の形態で実現されてもよい。
なお、ＯＶＡの固相化は、前述の抗モルモットＩｇＥ抗体の場合と同様にして行うことができる。
このようなモルモットＩｇＥの免疫測定用試薬には、前述のサンドイッチＥＬＩＳＡ法による試薬と同様に、必要に応じて標準物質、洗浄液などを構成試薬として含んでいても良い。標識物質が酵素の場合には、さらに基質剤、基質溶解液、反応停止液などの酵素活性測定用試薬を構成試薬として含んでいても良い。
【実施例】  以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に例示するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］モルモットＩｇＥ画分の製造
（１）アレルゲンの感作
１０μｇのＯＶＡと４ｍＬの水酸化アルミニウムゲルを混和し、モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ系、約６００ｇ、雌）の腹腔内に投与した。その後直ちに、百日咳ワクチン（２．５×１０１０菌体／個体）を同様にして腹腔内に投与した（初回感作）。１２日後に２５０ｍｇ／ｋｇの用量でシクロフォスファミドを腹腔内投与（生理食塩水４ｍＬ）した。その後、初回感作と同様な方法で２週間間隔で８回感作した。感作が完了した後、ジエチルエーテル麻酔下で開胸し、心臓より採血した。血液を遠心分離（３０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）し、血清３５ｍＬを回収した。
（２）免疫グロブリン画分の分離
上記（１）により得られた血清を遠心分離（１８，０００ｒｐｍ×１５ｍｉｎ）し、上清に等量の２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を加えた。この混合液と等量の飽和硫安溶液を氷冷下にて攪拌しながら滴々添加し（５０％飽和硫安）、添加後２０分間攪拌した。次に遠心分離し（１８，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ）、得られた沈殿を１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、免疫グロブリン画分液を得た。
（３）モルモットＩｇＥ画分の精製
上記（２）において得られた免疫グロブリン画分液を遠心分離し（１８，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ）内溶液中の混濁物を除去後、陰イオン交換樹脂（ＤＥ５２）を１００ｍＬ充填し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したカラムに展開した。１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でカラムを洗浄後、次に３５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）でＩｇＥを溶出させた。ＤＥ５２のＩｇＥ溶出画分液を５０％飽和硫安とし２０分間攪拌後、遠心分離した（１８，０００ｒｐｍ×３０ｍｉｎ）。得られた沈殿を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解し、同様の緩衝液にて透析を行い、ＩｇＥ含有溶液を得た。硫安精製後のＩｇＥ含有溶液を２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ［商品名］、カラムサイズ；１．６×３ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）に展開した（流速０．５ｍＬ／分）。同緩衝液での素通り画分を分取した。再度Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムへ同条件にて展開し、素通り画分を回収し、１０ｍＭ  Ｎａ，Ｋ  リン酸緩衝液ｐＨ７．５に対して透析した。
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ処理後の透析内液をＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．ｃｏｌｕｍｎ（Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ［商品名］、カラムサイズ；１．６×８．５ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）に展開した（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ＝１０ｍＭ  Ｎａ，Ｋ  リン酸緩衝液ｐＨ７．５，Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ＝０．３Ｍ  Ｎａ，Ｋ  リン酸緩衝液ｐＨ７．５，Ｆｌｏｗ＝３ｍＬ／ｍｉｎ，Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｚｅ＝３ｍＬ，Ｇｒａｄｉｅｎｔ＝０％Ｂ  ｆｏｒ  ５ｍｉｎ．０−１００％Ｂ  ｉｎ  ９０ｍｉｎ）。後述するＰＣＡ反応試験によりＩｇＥ溶出画分を決定した。
Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＩｇＥ溶出画分液を限外ろ過にて濃縮し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｃｏｌｕｍｎ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ＸＫ１６／６０［商品名］、カラムサイズ；１．６×６０ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）に展開した（流速；１ｍＬ／分、フラクションサイズ；１ｍＬ、溶出液；５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭＥＳ，０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，ｐＨ６．５）。ＰＣＡ反応試験によりＩｇＥ溶出画分を決定し、１０ｍＭ  Ｎａ，Ｋ  リン酸緩衝液ｐＨ７．５に対して透析した。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｃｏｌｕｍｎのＩｇＥ溶出画分をＭｏｎｏ  Ｑ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｍｏｎｏ  Ｑ  ＨＲ５／５［商品名］、カラムサイズ；０．５×５ｃｍ、アマシャムバイオサイエンス社）に展開した（Ｓｔａｒｔｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）：０．０１Ｍ  Ｎａ，Ｋ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｂｕｆｆｅｒ（ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）：０．３Ｍ  Ｎａ，Ｋ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ７．５、Ｇｒａｄｉｅｎｔ：ｓａｍｐｌｅチャージ後、０％Ｂ  ｆｏｒ  ５ｍｉｎ，０−１００％Ｂ  ｉｎ  ３０ｍｉｎ、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎ、ＵＶ  ｒａｎｇｅ０−０．２）。後述するＰＣＡ反応試験によりＩｇＥ溶出画分を決定し、モルモットＩｇＥ画分を得た。
（４）モルモットＩｇＥ画分の諸性状
上記（３）で得られたモルモットＩｇＥ画分の諸性状は以下のとおりであった。
［１］ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＩｇＥの単一の主バンドが得られ、その主バンドの分子量は約２００ｋＤａである；
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１）
モルモットＩｇＥ画分を非還元性試料用緩衝液（６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、２５％グリセロール、２％  ＳＤＳ及び０．０１％ブロムフェノールブルー）に溶解し、１００℃で３分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。アクリルアミド濃度が５〜２０％濃度勾配のゲル（Ｅ−Ｔ５２０Ｌ型、アトー社）で試料を分離した。電気泳動緩衝液として、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１９２ｍｍｏｌ／Ｌ  グリシン、０．１％  ＳＤＳを使用した。４０ｍＡで８０分間電気泳動した後、ゲルを銀染色（銀染色キットワコー、和光純薬工業）した。分子量マーカーとして、ＨＭＷ  ＳＤＳマーカーキット（ミオシン［２１２，０００Ｄａ］、α２マクログロブリン［１７０，０００Ｄａ］、βガラクトシダーゼ［１１６，０００Ｄａ］、トランスフェリン［７６，０００Ｄａ］、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ［５３，０００Ｄａ］、アマシャムバイオサイエンス社）を使用した。
図１に示すように、分子量約２００ｋＤａのところに、単一の主バンドが認められた（レーン１；マーカー、レーン２；モルモットＩｇＥ画分）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（２）
分子量を詳細に求めるために、アクリルアミド濃度が７．５％濃度のゲル（Ｅ−Ｔ７．５Ｌ型、アトー社）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを前記と同様にして行った。なお、ゲルはクマシー染色（Ｂｉｏ−ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）した。分子量マーカーは前記と同じものを使用し、分子量曲線を作成して、本画分の分子量範囲を求めた。その結果、分子量範囲は１８７ｋＤａ〜１９５ｋＤａであった。
図１０にこの時のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す（レーン１；マーカー、レーン２；モルモットＩｇＥ画分）。
質量分析
モルモットＩｇＥ画分の質量分析を下記の条件で行った。
機器；ＡＸＩＭＡ−ＣＦＲ  ｐｌｕｓ（島津製作所）
レーザー光源；窒素封入型レーザー（λ＝３３７．１ｎｍ）
検出イオン；正イオン
飛行モード；リニアモード
加速電圧；２０ｋＶ
遅延引き出し；オン（ｍ／ｚ１８００００に最適化）
Ｂｅａｍ  Ｂｌａｎｋｉｎｇ；ｍ／ｚ１００００以下のイオン検出を排除
マトリクス溶液；２０ｍｇのｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄをアセトニトリル３５０μＬと０．１％のＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）３５０μＬの混合溶媒で溶解して調製した。
質量較正；Ｉｎｖｉｔｒｏｍａｓｓ  Ｈｉｇｈ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の１６０ｋＤａ  Ｍａｓｓ  Ｃａｌｉｂｒａｎｔを用いた。１６０ｋＤａ  Ｍａｓｓ  Ｃａｌｉｂｒａｎｔの［Ｍ＋Ｈ］＋ｍ／ｚ１５６０８１、［Ｍ＋２Ｈ］２＋７９５４１及び［３Ｍ＋２Ｈ］２＋２３８６２１を用い、外部標準法にて較正した。
試料調製；試料原液（モルモット免疫グロブリン画分）０．５μＬをサンプルプレートにアプライした直後にマトリクス溶液０．５μＬをさらに加え、風乾した後、測定した。
測定の結果、図１１に示すように、主成分としてｍ／ｚ１８５５９６が検出された。なお、ｍ／ｚ９２８８３及びｍ／ｚ６２８９２はそれぞれ、主成分の［Ｍ＋２Ｈ］２＋及び［Ｍ＋３Ｈ］３＋イオン、ｍ／ｚ１２６３８８は主成分の［２Ｍ＋３Ｈ］３＋イオンと考えられる。従って、本試料に含まれるモルモットＩｇＥの分子量の計測値は１８５５９６であった。
［２］前記主バンドは還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つに分離され、分離後の各バンドの分子量は約７０ｋＤａ及び約３０ｋＤａである；
モルモットＩｇＥ画分を還元性試料用緩衝液（６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、３５０ｍｍｏｌ／Ｌジチオスレイトール、２５％グリセロール、２％  ＳＤＳ及び０．０１％ブロムフェノールブルー）に溶解し、１００℃で３分間加熱後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。アクリルアミド濃度が５〜２０％濃度勾配のゲル（Ｅ−Ｔ５２０Ｌ型、アトー社）で試料を分離した。電気泳動緩衝液として、６２．５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３、１９２ｍｍｏｌ／Ｌグリシン、０．１％  ＳＤＳを用いた。４０ｍＡで８０分間電気泳動した後、上記と同様にしてゲルを銀染色した。分子量マーカーとして、ＬＭＷマーカーキット（ホスフォリラーゼ  ｂ［９７，０００Ｄａ］、アルブミン［６６，０００Ｄａ］、卵白アルブミン［４３，０００Ｄａ］、カルボニックアンヒドラーゼ［３０，０００Ｄａ］、トリプシンインヒビター［２０，１００Ｄａ］、α−ラクトアルブミン［１４，４００Ｄａ］、アマシャムバイオサイエンス社）を使用した。
図２に示すように、モルモットＩｇＥ画分の還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、上記［１］において認められた約２００ｋＤａの主バンドは認められず、約７０ｋＤａと約３０ｋＤａのバンドが認められた（レーン１；マーカー、レーン２；モルモットＩｇＥ画分）。
［３］モルモットＩｇＥを特異的に認識することができる抗体を製造するための抗原として使用できる；
この性状については、後記実施例２に記載されているとおりである。
［４］モルモットにおけるＰＣＡ反応が陽性である；
モルモットＩｇＥ画分を生理食塩水を用いて、蛋白濃度が３１．３、６２．５、１２５及び２５０ｎｇ／ｍＬとなるように希釈系列を調製した。モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ、雌、４５０〜６００ｇ）をエーテル麻酔し、背皮毛を刈り、皮膚に調製したモルモットＩｇＥ画分を０．１ｍＬずつ皮内注射した。８日間飼育後、前肢より、１ｍｇ／ｍＬＯＶＡ及び１％エバンスブルーの生理食塩水液を１ｍＬ注入し、３０分放置した。図３に示すように、屠殺後の皮膚裏側にはモルモットＩｇＥ画分の蛋白濃度依存的に青斑が認められた。
［５］実質的にモルモット免疫グロブリンＧを含有しない；
モルモットＩｇＥ画分を精製する過程におけるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムクロマトグラフィーにて、カラムに吸着したＩｇＧを溶出し、モルモットＩｇＧ画分とした。モルモットＩｇＧ画分とモルモットＩｇＥ画分を上記非還元性条件にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図４参照。レーン１；マーカー、レーン２；モルモットＩｇＧ画分、レーン３；モルモットＩｇＥ画分）。
ホライズブロット（アトー社）にてゲル中の分離された蛋白をニトロセルロース膜に転写した（１３１ｍＡで１時間）。転写後のニトロセルロース膜をブロッキング溶液（２％ブロックエース［登録商標］粉末）中で室温にて３０分間振盪した後、洗浄液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ，５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ［登録商標］−２０，ｐＨ７．５）中で室温にて１０分間振盪した。ヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体（ケミコン社）をブロッキング溶液にて最終抗体濃度が１０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。洗浄後のニトロセルロース膜を１０μｇ／ｍＬに希釈したヤギ抗モルモットＩｇＧ抗体で室温にて１時間振盪した。ニトロセルロース膜を洗浄液中で室温にて５分間振盪し、洗浄液を除去後、洗浄液を加えて再度室温にて５分間振盪した。洗浄後のニトロセルロース膜を、ブロッキング溶液にて西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ブタ抗ヤギＩｇＧ抗体（大日本製薬）を２０００倍希釈した溶液中で室温にて１時間振盪した。洗浄液中で室温にて５分間の振盪を２回繰り返し、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ，５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５中で室温にて５分間振盪した。ニトロセルロース膜をＩｍｍｕｎ−ｂｌｏｔ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）の試薬であるＤｅｖｅｌｏｐｅｒと室温にて５分間振盪し、発色反応を行い、蒸留水で洗浄し、反応を停止させた。
図４に示すようにモルモットＩｇＧ画分試料では分子量約１６０ｋＤａ付近にモルモットＩｇＧに関与する強い発色が認められた（レーン４；モルモットＩｇＧ画分）。一方、モルモットＩｇＥ画分試料では分子量約１６０ｋＤａ付近には発色が認められなかった（レーン５；モルモットＩｇＥ画分）。これらのことより、本発明のモルモットＩｇＥ画分が実質的にモルモットＩｇＧを含有しないことが示された。
［実施例２］抗モルモットＩｇＥ抗体の製造
実施例１で得られた画分とアジュバント（Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ：シグマ社製）を等量混合後、超音波処理により乳化させ、実施例１で得られた画分２５μｇ／エマルジョン０．５ｍＬ／マウスとなるよう調製した。この免疫抗原をマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、４週齢）に２週間間隔で３回皮内及び皮下に投与した。３回目の免疫から１週間後に、マウスより脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞とＰＥＧ法にて細胞融合した。融合後、ハイブリドーマを９６ウェルプレートに分注し、３７℃の炭酸ガス培養器（５％ＣＯ２，３７℃）中で１−２週間培養し、ＨＡＴ培地による選択を行った。モルモットＩｇＥ画分を固相化したマイクロプレートを用いて、融合細胞の上清をＥＬＩＳＡ法により検出し、抗体の有無を確認した。陽性となったウエルに対しては、限界希釈法によるクローニングを２回繰り返し、モルモットＩｇＥに対する反応性を有するクローンを選出した。得られたクローンの産生するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞をＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で増殖させた後、その腹水中からプロテインＧセファロースゲルを用いて精製した。
［実施例３］サンドイッチＥＬＩＳＡ試薬の製造
サンドイッチＥＬＩＳＡ法によるモルモットＩｇＥの測定用試薬を以下のように製造した。
（１）西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗モルモットＩｇＥモノクローナル抗体の調製
西洋ワサビペルオキシダーゼ４ｍｇを蒸留水１ｍＬに溶解し、その６００μＬに０．１ｍｏｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウム溶液１２０μＬを加えて、室温で２０分間反応させた。この溶液を１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）に対して一夜透析し、過ヨウ素酸酸化ペルオキシダーゼ溶液を得た。過ヨウ素酸酸化ペルオキシダーゼ溶液３００μＬに、０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸緩衝液を１５μＬ加えて、実施例２において製造したマウス抗モルモットＩｇＥモノクローナル抗体（２ｍｇ／ｍｌ）を混合し、常温、遮光下で２時間インキュベーションした。その後、４ｍｇ／ｍＬ水素化ホウ素ナトリウムを２５μＬ加え、４℃で２時間放置した。５０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に一晩透析した。
（２）マウス抗モルモットＩｇＥ抗体の担体へのコーティング
実施例２において得られたマウス抗モルモットＩｇＥ抗体を抗体液用緩衝液（５ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩、０．９％ＮａＣｌ  ｐＨ７．０）に１０μｇ／ｍＬとなるように溶解した。これをマイクロタイタープレート（マイクロモジュールプレート、Ｍａｘｓｏｒｐ−Ｆ８、Ｎｕｎｃ社）に２００μＬずつ分注し、４℃で３晩放置した。
（３）マイクロタイタープレートのブロッキング
各ウェルを３００μＬのプレート洗浄液（４０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸塩、０．９％ＮａＣｌ、０．１％防腐剤［プロクリン１５０；ローム・アンド・ハース社］０．１％ウシ血清アルブミンｐＨ７．０）で３回洗浄後、保存用緩衝液（０．１％プロクリン１５０、１％ブロックエース［登録商標］粉末；大日本製薬）３００μＬを加え室温で２時間放置し、その後保存用緩衝液を除去した。
（４）標準物質の調製
前記と同様にして非還元性条件にて、モルモットＩｇＥ画分のＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲルをクマシーブリリアントブルー染色した。染色したゲルをデンシトメーター（島津二波長フライングスポットスキャニングデンシトメータＣＳ−９３００ＰＣ）で計測した。約２００ｋＤａのモルモットＩｇＥ主バンドの染色強度の割合を求めた結果、７９％であった。本画分をＢＣＡ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ社）で蛋白定量し、その蛋白濃度に０．７９を乗じた値を本画分中のモルモットＩｇＥ濃度とした。本画分をウシ胎児血清で希釈し、０，２５，５０，１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬの標準溶液を調製した。
［実施例４］実施例３で製造した試薬によるモルモットＩｇＥの測定
（１）標準曲線の作成
マイクロタイタープレートの各ウェルに反応用緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ２−モルホリノエタンスルホン酸−ＮａＯＨ，０．９％ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ，０．２％プロクリン１５０）を１００μＬ分注した。ここに、標準物質（０，５０，１００，２００，４００，８００ｎｇ／ｍＬ）を同様に各ウェルに２５μＬ加え、室温で１時間放置した。また、各ウェルを洗浄液３００μｌで３回洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識マウス抗モルモットＩｇＥモノクローナル抗体を希釈液で希釈し、１００μｌずつ加え、室温で１時間放置した。次に、各ウェルを洗浄液３００μＬで３回洗浄後、ＴＭＢ溶液を１００μＬずつ加え、室温遮光下で３０分間反応させた。その後、３．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬずつ加え反応を停止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍで測定した。図５に標準モルモットＩｇＥ（８００ｎｇ／ｍｌ）の希釈系列試料の測定結果を示した。この図は良好な標準曲線が得られたことを示している。
（２）試薬の基礎性能試験
（ア）希釈試験
上記（１）の方法に従ってモルモット血清検体の希釈試験を行った。血清はＩｇＥ量の不明な血清３検体を検体希釈液でそれぞれ希釈系列を調製し、同時に測定した標準モルモットＩｇＥから得られた標凖曲線に基づいて、検体のＩｇＥ濃度を算出した。図６の結果に示すとおり、ほぼ原点を通る良好な希釈直線性が得られた。
（イ）添加回収試験
上記（１）の方法に従ってモルモットＩｇＥの添加回収試験を行った。血清検体３検体に標凖モルモットＩｇＥを添加し、測定値から添加したＩｇＥ量の回収率を求めた。下記表１に示すとおり、添加回収率は９８．９％から１０９．７％と良好な結果が得られた。
2005063978.tif 000002
（ウ）同時再現性試験
上記（１）の方法に従って、同一のモルモット血清サンプルを８回測定して、同時再現性試験を実施した。その間の変動係数ＣＶ％は１．８％以下という良好な成績であった。
（エ）交差反応性試験
上記（１）の方法に従って、精製モルモットＩｇＧ及び精製モルモットＩｇＭ（Ｃｏｒｔｅｘ社）を試料として測定した結果、下記表２に示すように、ＩｇＧ及びＩｇＭとはほとんど交差しなかった（交差反応率は、０．０００１％未満）。よって、本測定系はモルモットＩｇＧ及びモルモットＩｇＭには交差反応しない測定系であり、モルモットＩｇＥに特異的な測定系であることが示された。
2005063978.tif 000003
これらの基礎性能試験の結果は、本発明の免疫測定試薬は非常に高い精度でモルモットＩｇＥを測定することができることを示すものである。
また、本発明の免疫測定用試薬は、わずか２５μＬのモルモット血清中に存在する６．２ｎｇ／ｍＬ、さらには３．１ｎｇ／ｍＬのモルモットＩｇＥが検出可能であり、非常に感度が高いものであった。本発明の免疫測定用試薬では、測定可能なモルモットＩｇＥの濃度範囲を適宜設定することができるが、例えば血液試料の場合、約３〜約８００ｎｇ／ｍＬの範囲が好適である。なお、本発明の免疫測定用試薬で正常モルモットの血液中ＩｇＥ濃度を測定したところ、３１．９〜９７．６ｎｇ／ｍＬであった。
［実施例５］ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥの測定
（１）ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥ標準物質の調製
実施例３で調製したモルモットＩｇＥ標準物質をＯＶＡ固相化カラムに展開して、ＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥだけを吸着させた。カラムを通過したモルモットＩｇＥを実施例４に記載の方法で定量し、カラムに展開したモルモットＩｇＥ量から差し引くことによりカラムに吸着したＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥの濃度を求めた。
以下、詳細に説明する。
（ａ）ＯＶＡ固相化カラムの調製
ＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（アマシャムバイオサイエンス社製）を５ｍＬカラムにとり、イソプロパノールを除去した。氷冷した３０ｍＬの１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＣｌで洗浄後、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬ  ＯＶＡとなるようにカップリング緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．２ｍｏｌ／Ｌ炭酸ナトリウム［ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ］，ｐＨ８．３）で希釈した溶液を５ｍＬ加え、室温で３０分間静置した。３０ｍＬのカップリング緩衝液、３０ｍＬの洗浄緩衝液（０．５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ，０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム［ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ］，ｐＨ４．０）、３０ｍＬのブロッキング緩衝液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．８）で洗浄し、室温で１時間静置した。３０ｍＬの洗浄緩衝液、３０ｍＬのブロッキング緩衝液、３０ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄した。ＯＶＡを固相化したＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗゲルを展開緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウム［ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］，ｐＨ７．０）で懸濁し、ゲル容量が１ｍＬとなるように別のカラムに詰めた。
（ｂ）ＯＶＡ固相化カラムクロマトグラフィーによるＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥ濃度の測定
前項で調製したＯＶＡ固相化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ゲル容量：１ｍＬ）を前項と同様の展開緩衝液１０ｍＬで平衡化した。７６０ｎｇ／ｍＬのモルモットＩｇＥ標準物質１００μＬをカラムに展開し、展開緩衝液でカラムを洗浄した。カラムを通過した分画は、１ｍＬずつ採取した。採取した分画中のモルモットＩｇＥ濃度を実施例４に記載の方法で定量した。定量した結果を下記表３に示した。カラムを通過した分画中のモルモットＩｇＥの積算量は１９．２ｎｇであった。カラムに展開したモルモットＩｇＥ量（７６ｎｇ）からカラムを通過したモルモットＩｇＥ量（１９．２ｎｇ）を差し引くことにより、カラムに吸着したＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥ量（５６．８ｎｇ）を求めた。これより、上記ＯＶＡ固相化カラムクロマトグラフィーに用いたモルモットＩｇＥ標準物質試料（７６０ｎｇ／ｍＬ）中には５６８ｎｇ／ｍＬのＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥが含有されていることが示された。
2005063978.tif 000004
（２）西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ＯＶＡの調製
（ａ）ＯＶＡのＳＡＴＡ修飾
２７ｍｇのＯＶＡ（シグマ社製）を１ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。最終濃度が２４ｍｍｏｌ／Ｌ  ＳＡＴＡ（Ｎ−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ，ピアス社製）となるようにＮ，Ｎ’−ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅで希釈した溶液を調製し、上記ＯＶＡ溶液に０．１ｍＬ添加し、３０℃で３０分間インキュベートした後、０．１ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．０）、０．１ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、０．１５ｍＬの１ｍｏｌ／Ｌヒドロキシルアミン（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｍｉｎｅ）（ｐＨ７．０）を添加し、３０℃で１５分間インキュベートした。Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｇ−２５（５ｍＬ）カラムに展開し（展開緩衝液：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムｐＨ６．０，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、分画容量：０．５ｍＬ）で精製後、最終濃度が４ｍｇ／ｍＬとなるようにＯＶＡ−ＳＡＴＡ修飾溶液を調製した。
（ｂ）ＨＲＰ−Ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳの調製
１６ｍｇのＨＲＰ（東洋紡社製、ＴＹＰＥ  Ｉ−Ｃ）を２．０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。４ｍｇのＳｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ（Ｎ−（８−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｙｌｏｘｙ）ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ，ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ同仁化学研究所社製）を０．２７５ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で溶解した。上記ＨＲＰ溶液全量に、０．２ｍＬのＳｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ溶液を加え、３０℃で６０分間インキュベートした。Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｇ−２５（５ｍＬ）カラムに展開し（展開緩衝液：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムｐＨ６．０，５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ、分画容量：０．５ｍＬ）で精製後、最終ＨＲＰ濃度が７．２ｍｇ／ｍＬとなるようにＨＲＰ−Ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ溶液を調製した。
（ｃ）ＯＶＡのＨＲＰ標識
ＯＶＡ−ＳＡＴＡ修飾溶液と等量のＨＲＰ−Ｓｕｌｆｏ−ＨＭＣＳ溶液を混合し、４℃で２０時間インキュベートした。１０ｍｍｏｌ／Ｌシステアミン塩酸塩（Ｃｙｓｔｅａｍｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を１ｍＬあたり２０μＬ添加した。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００  ＸＫ−２６／７０カラム（展開緩衝液：０．１ｍｏｌ／Ｌリン酸ナトリウムｐＨ６．５、流速：０．８ｍＬ／ｍｉｎ、分画容量：２．０ｍＬ）に展開し、ゲルろ過分画した。各分画のＨＲＰ活性及び、力価測定より回収画分を決定した。
（３）標準曲線の作成
プラスチック製マイクロプレートの各ウェルに１５０μＬの反応用緩衝液（２０ｍｍｏＬ／Ｌ  ２−モルホリノエタンスルホン酸−ＮａＯＨ，０．９％ＮａＣｌ，０．１％  ＢＳＡ，０．２％プロクリン１５０）を分注し、さらに前項（１）において調製した標準物質の希釈系列（０，３５．５，７１．０，１４１．９，２８３．９，５６８ｎｇ／ｍＬ）を同様に各ウェルに１５μＬ加え、攪拌後室温で１０分間放置した。プラスチック製マイクロプレートの各ウェルより１１０μＬずつ試料を取り出し、実施例３において調製したマウス抗モルモットＩｇＥ抗体をコーティングしたマイクロタイタープレートの各ウェルに分注し、攪拌後、室温で１時間放置した。各ウェルを洗浄液３００μＬで３回洗浄後、上記調製の西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ＯＶＡを１００μＬずつ加え、室温で３０分間放置した。次に、各ウェルを洗浄液３００μＬで３回洗浄後、ＴＭＢ溶液を１００μＬずつ加え、室温遮光下で３０分間反応させた。その後、３．２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００μＬずつ加え反応を停止させた。各ウェルの吸光度をマイクロプレートリーダーを用いて主波長４５０ｎｍ、副波長６３０ｎｍで測定した。図７に前項（１）において調製したＩｇＥ標準物質（５６８ｎｇ／ｍｌ）の希釈系列試料の測定結果を示した。この図は良好な標準曲線が得られたことを示している。
（４）試薬の基礎性能試験
（ア）希釈試験
前項（３）の方法に従ってモルモット血清検体の希釈試験を行った。血清はＯＶＡを認識するＩｇＥ量の不明な血清３検体を検体希釈液でそれぞれ希釈系列を調製し、前項（３）と同様にして得られた標準曲線に基づいて、検体中の、ＯＶＡを認識するＩｇＥ濃度を算出した。図８の結果に示すとおり、ほぼ原点を通る良好な希釈直線性が得られた。
（イ）添加回収試験
前項（３）に記載の方法に従ってＯＶＡを認識するモルモットＩｇＥの添加回収試験を行った。血清検体５検体に前項（１）と同様にして調製された標準モルモットＩｇＥを添加し、測定値から添加したＩｇＥ量の回収率を求めた。下記表４に示すとおり、添加回収率は９７．７％から１０３．７％と良好な結果が得られた。
2005063978.tif 000005
（ウ）同時再現性試験
前項（３）の方法に従って、同一のモルモット血清サンプルを８回測定して、同時再現性試験を実施した。その間の変動係数ＣＶ％は５％以下という良好な成績であった。
（エ）特異性試験
ＯＶＡを感作したモルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ系）及び無感作のモルモット（同系）より採取した血清検体を試料として、実施例４及び本実施例において使用した測定試薬によってＩｇＥ量を測定し、得られた値を比較した。感作は２０ｍｇのＯＶＡ（シグマ社製）を０．８ｍＬの生理食塩水に溶解し、モルモットの腹腔内と背側皮下に０．４ｍＬずつ注入することにより行い、感作から６週間後にモルモットから血液を採取した。
下記表５の測定結果に示すように、無感作モルモット血液中においては、実施例４に記載の試薬によって測定した場合にはＩｇＥが検出され、本実施例に記載の試薬によって測定した場合ＩｇＥは検出されなかった。これに対し、ＯＶＡ感作モルモットにおいては、両試薬で測定した場合ともにＩｇＥが検出され、その濃度は実施例４に記載の試薬で測定した場合の方が高かった。この結果は、実施例４に記載の試薬はＯＶＡを認識するＩｇＥ及びそれ以外のＩｇＥを測定しており、本実施例に記載の試薬はＯＶＡを認識するＩｇＥを特異的に測定していることを意味している。
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（オ）ＰＣＡ反応との相関性試験
血液中に存在するＯＶＡを認識するＩｇＥの指標であるモルモットのＰＣＡ反応と、本実施例の測定系との相関性を次のようにして検討した。１８匹のＨａｒｔｌｅｙ系モルモットを対象とし、その中の１匹にはＯＶＡ感作を行わずに血液を採取し、常法に従い血清を得た。残りの１７匹には、腹腔内と背側皮下に２５ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ生理食塩水溶液を注入して感作した。感作後、６週間に至るまで、感作したモルモットを経時的に屠殺して血液を採取し、常法に従い血清を得た。このようにして得られた血清中のＩｇＥ量を本実施例に記載の方法により測定した。
ＰＣＡ反応は次のようにして実施した。採取したモルモット血清を生理食塩水にて１０倍、２０倍、４０倍及び８０倍に希釈し、希釈系列を調製した。Ｈａｒｔｌｅｙ系モルモットをエーテル麻酔し、背皮毛を刈り、皮膚に調製した希釈系列試料を０．１ｍＬずつ皮内注射した。７日間モルモットを飼育後、前肢より１ｍｇ／ｍＬＯＶＡ及び１％エバンスブルーの生理食塩水液を１ｍＬ注入し、３０分間放置した。モルモットを屠殺後、背皮を剥いで、青い斑点が認められる最高希釈倍率をＰＣＡ反応値とした。図９に示すように、本実施例の測定系とＰＣＡ反応との間には、回帰式ｙ＝２．２ｘ＋４．８、相関係数ｒ＝０．９６７という非常に良好な相関関係が認められた。このような試験結果は、本実施例のモルモットＩｇＥの免疫測定試薬は、ＯＶＡを認識するＩｇＥを特異的に測定できることを示すものである
【産業上の利用可能性】  本発明は、高度に精製されたモルモットＩｇＥ画分、特異性に優れた抗モルモットＩｇＥ抗体、及び該抗体を含むモルモットＩｇＥを正確かつ簡便に測定可能な試薬を提供する。このような本発明により、アレルギーなどの動物実験の現場において、例えば、モルモット血液中のＩｇＥ濃度を感度良く測定することができる。
以上、本発明の具体的な態様のいくつかを詳細に説明したが、当業者であれば示された特定の態様には、本発明の教示と利点から実質的に逸脱しない範囲で様々な修正と変更をなすことは可能である。従って、そのような修正及び変更も、すべて後記の請求の範囲で請求される本発明の精神と範囲内に含まれるものである。
本出願は、日本で出願された特願２００３−４３４６１８（出願日：２００３年１２月２６日）及び特願２００４−２８９９３９（出願日：２００４年１０月１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月30日(2006.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンで感作されたモルモットの血液から分離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより免疫グロブリンＥの単一の主バンドを得るのに充分な純度をもつ本質的に精製された下記性状を有するモルモット免疫グロブリンＥからなる画分；
（１）前記主バンドの分子量は約２００ｋＤａである、
（２）モルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体を製造するための抗原として使用できる、
（３）モルモットにおける受動皮膚アナフィラキシー反応が陽性である、
（４）実質的にモルモット免疫グロブリンＧを含有しない。
【請求項２】
請求項１に記載の画分において、主バンドの分子量が１８７〜１９５ｋＤａであるモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項３】
モルモット免疫グロブリンＥの分子量が質量分析法により測定して約１８６ｋＤａである請求項１又は２に記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項４】
前記主バンドが還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２つに分離され、分離後の各バンドの分子量が約７０ｋＤａ及び約３０ｋＤａである、請求項１〜３いずれかに記載の画分。
【請求項５】
アレルゲンが卵白アルブミンである請求項１〜４いずれかに記載のモルモット免疫グロブリンＥからなる画分。
【請求項６】
請求項１〜５いずれかに記載の免疫グロブリンＥからなる画分でもってヒト以外の動物を免疫して製造されるモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
【請求項７】
抗体がモノクローナル抗体である請求項６に記載のモルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体。
【請求項８】
抗体がモルモット免疫グロブリンＧ又は免疫グロブリンＭと実質的に交差反応しないものである請求項６又は７に記載の抗体。
【請求項９】
請求項６〜８いずれかに記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１０】
請求項６〜８いずれかに記載の抗体及び酵素標識された前記抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１１】
免疫測定用試薬がサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法を実施するための試薬である請求項９又は１０に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１２】
固相化された請求項６〜８いずれかに記載の抗体及び標識物質により標識された卵白アルブミンを含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１３】
固相化された卵白アルブミン及び標識物質により標識された請求項６〜８いずれかに記載の抗体を含むモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１４】
標識物質が酵素である請求項１２又は１３に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１５】
モルモット免疫グロブリンＥが卵白アルブミンを認識する免疫グロブリンＥである請求項１２〜１４のいずれかに記載の免疫測定用試薬。
【請求項１６】
モルモット免疫グロブリンＥを特異的に認識することができる抗体を含み、モルモット免疫グロブリンＧ及びモルモット免疫グロブリンＭと実質的に交差反応しないモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１７】
モルモット免疫グロブリンＧ及びモルモット免疫グロブリンＭとの交差反応率が０．０００１％未満である請求項１６に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１８】
免疫測定用試薬がサンドイッチ酵素結合免疫固相測定法を実施するための試薬である請求項１７に記載のモルモット免疫グロブリンＥの免疫測定用試薬。
【請求項１９】
固相化されてなる請求項６〜８いずれかに記載の抗体。
【請求項２０】
モルモット免疫グロブリンＥを製造または精製するための請求項１９に記載の抗体。
【国際調査報告】
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