(57)【要約】  本発明は、式（Ｉ）の免疫刺激マクロライドを提供する。マクロライドは、ウイルス性疾患およびがんの治療に有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
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またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３】
医薬に使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ウイルス感染症またはがんの治療に使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
治療上有効量の請求項１に記載の化合物を、それを必要とするヒトまたは動物対象に投与するステップを含む、ウイルス感染症によって引き起こされる疾患を治療または予防する方法。
【請求項６】
式（ＩＩ）
【化２】
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のアグリコンを３−ヒドロキシル位でグリコシル化する生体内変換株の培養物に添加することを含む、請求項１に定義される化合物を調製する方法。
【請求項７】
前記生体内変換株が配列番号１（ＡｎｇＭＩＩ）または配列番号２（ＡｎｇＭＩＩＩ）と７０％以上の相同性を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫系を刺激することができる新規なマクロライド化合物を提供する。本発明は、医薬、特にＨＩＶなどのウイルス性疾患の治療、および慢性炎症状態の治療、および免疫系の刺激が有益ながんで使用するための新規な化合物に関する。該化合物は、ワクチン接種における免疫調節アジュバントとしても使用され得る。新規なマクロライドは、免疫系の調節効果を最大化しながら、治療上望ましくない直接的な抗菌効果を最小化する。本発明はまた、本発明の化合物を調製する方法、および医薬に化合物を使用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
エリスロマイシンおよびアジスロマイシンなどのマクロライドは、細菌感染症の治療に長年使用されてきた。エリスロマイシンは、放線菌サッカロポリスポラ・エリスラエア（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ）の発酵によって産生されるポリケチド天然産物マクロライドである。アジスロマイシンは、エリスロマイシンの半合成アザライド誘導体である。エリスロマイシンなどのマクロライドの抗菌活性を記載する多くの参考文献が存在する。この抗菌機構は、細菌５０Ｓ細菌リボソームのＰ部位への分子の結合、よってｔＲＮＡ結合の妨害を通して達成される。
【０００３】
多くの参考文献は、半合成および生合成工学によるエリスロマイシンの類似体の生成を記載している。特に、エリスロマイシン、デソサミンおよびマイカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）のグリコシル基の半合成除去の方法が記載されている。代替グリコシル基をエリスロマイシンアグリコンに付加するための生体内変換のさらなる方法が記載されている（例えば、Ｇａｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８および国際公開第２００１０７９５２０号パンフレット参照）。しかし、この公開された研究の主な焦点は、抗菌性エリスロマイシン類似体を生成することであった。
【発明の概要】
【０００４】
直接的な抗菌活性を欠くマクロライドからの免疫刺激活性は以前に報告されていない。驚くべきことに、本発明の化合物（化合物１、図１）が、免疫系のいくつかの細胞型に対して強力な免疫刺激効果を有することが分かった。１μＭ化合物１（図１）による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２４〜４８時間のインビトロ刺激後、ＣＤ４  Ｔ細胞およびＢ細胞で活性化マーカーＣＤ６９が上方制御された（図２）。また、Ｔ細胞およびＢ細胞でのＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ−ＡＢＣ）の上方制御も観察され（図３）、ウイルス抗原の抗原提示への効果を示した。化合物１によるＰＢＭＣ集団内の単球の刺激は、共刺激分子ＣＤ８０ならびに抗原提示分子ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御をもたらした（図４）。マクロファージに分化した単球も、化合物１による刺激に応答してＣＤ８０を上方制御した（図５）。さらに、化合物１で刺激したＰＢＭＣは、一定の条件下での免疫抑制効果を示す、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生増加を伴う変化したサイトカインプロファイルを発現した。化合物１の免疫学的効果をさらに分析すると、フローサイトメトリーで測定される、６日間の刺激後のＴ細胞のサイトカイン駆動増殖プロファイルの変化が明らかになった（図７）。さらに、ウイルス特異的Ｔ細胞増殖は化合物１の影響を受けた。ＣＭＶ抗原および化合物１の存在下で培養したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染ドナーのＰＢＭＣは、ＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の発現が増加した活性化ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の変化を示した（図８）。ＣＤ１２７はＴ細胞の恒常性、分化および機能にとって重要であり、発現低下はＨＩＶおよび他の慢性ウイルス性疾患の疾患重症度と相関している（Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｅｍ  Ｉｍｍ  ２０１２）。要約すると、化合物１は、抗原提示、同時刺激ならびにＴ細胞の活性化および増殖に影響を及ぼすことによって、免疫応答を特異的に活性化および修飾する驚くべき能力を有する。これらの試験の多くでは、アッセイでほとんどまたは全く活性を示さなかったので、化合物２、（化合物２０として）Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８で以前公開されたグリコシル化が変化した別の関連マクロライドエリスロマイシン類似体を含めた。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
したがって、本発明の一態様では、式（Ｉ）の非抗菌性免疫刺激マクロライド、化合物１：
【化１】
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が提供される。
【０００６】
式（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容される塩、水和物、溶媒和物、互変異性体、エナンチオマーもしくはジアステレオマーも本発明の範囲内である。
【０００７】
化合物は、本明細書で定義される実質的な抗菌活性がない。
【０００８】
本発明の別の態様では、式ＩＩのアグリコンを３−ヒドロキシル位でグリコシル化する生体内変換株の培養物に添加することを含む、式（Ｉ）の化合物を製造する方法が提供される。
【化２】
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【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、生体内変換株が、ＡｎｇＭＩＩ（配列番号１）またはＡｎｇＭＩＩＩと７０％以上の相同性を有する、または９５％以上の相同性、例えば１００％の相同性を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する。
【００１０】
２つのアミノ酸配列間または２つの核酸配列間の相同性は、パラメータ「同一性」によって記載される。配列のアライメントおよび相同性スコアの計算は、例えばタンパク質とＤＮＡの両方のアライメントに有用な、完全なＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアライメントを使用して行われ得る。デフォルトスコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ５０および単位行列が、それぞれタンパク質およびＤＮＡのアライメントに使用される。ギャップの最初の残基のペナルティは、タンパク質では−１２、ＤＮＡでは−１６である一方、ギャップの追加の残基のペナルティは、タンパク質では−２、ＤＮＡでは−４である。アライメントは、ＦＡＳＴＡパッケージバージョンｖ２０ｕ６で作成され得る。タンパク質配列の複数のアライメントは、「ＣｌｕｓｔａｌＷ」を使用して作成され得る。ＤＮＡ配列の複数のアライメントは、タンパク質アライメントを鋳型として使用し、ＤＮＡ配列の対応するコドンでアミノ酸を置き換えて作成され得る。あるいは、アミノ酸配列とＤＮＡ配列の整列に異なるソフトウェアを使用することができる。２つのアミノ酸配列のアライメントは、例えばＥＭＢＯＳＳパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ）バージョン２．８．０のＮｅｅｄｌｅプログラムを使用して決定される。使用される置換行列はＢＬＯＳＵＭ６２、ギャップ開始ペナルティは１０、ギャップ伸長ペナルティは０．５である。
【００１１】
一般的化学方法
当業者であれば、本発明の化合物が、種々の方法で公知の様式で調製され得ることを認識するであろう。以下の経路は、式（Ｉ）の化合物の合成に使用することができるいくつかの方法の単なる例示である。
【００１２】
１つの一般的経路では、エリスロマイシンＡを半合成操作に供してアジスロマイシンを生成する。この変換の方法が公知であるが（米国特許第３  ４７８  ０１４号明細書；米国特許第４  ３２８  ３３４号明細書；米国特許第４  ４７４  ７６８号明細書、Ｇｌａｎｓｄｏｒｐら、２００８）、これらの経路の変形またはほかの経路を同じ目的に使用することができる。マイカロース／クラジノースおよび／またはデソサミンは、グリコシド切断などのさらなる化学的方法によって除去される。手短に言えば、ある方法では、酸で処理することによって糖を除去することができる。アミノ糖の除去を促進するために、ジメチルアミンを酸化してＮ−オキシドを形成し、次いで、これを熱分解によって除去することが最初に必要である。得られた５−Ｏ糖および３−Ｏ糖を、酸性分解によって除去することができる。適切な方法は、ＬｅＭａｈｉｅｕ（１９７４）およびＤｊｏｋｉｃ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８によって教示されている。最後に、化合物を、アミノ糖を付加する細菌株を使用して生体内変換する。
【００１３】
本発明の化合物の一般的使用
本明細書に記載される化合物は、医薬、医療研究、またはこのような使用のための組成物の製造に使用することができる。したがって、以下で、「本発明の化合物」という用語が医療用途または医薬組成物に関連して使用される場合、この化合物がこのような用途について知られていない限り、この用語が式１の化合物を含むことを意図している。
【００１４】
本発明の化合物は、直接的な抗菌効果を最小化し、むしろ免疫活性化特性に焦点を合わせるよう設計されている。化合物１を細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｂ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）またはＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）の培養物に添加した場合、抗菌効果が全くまたはほとんど認められない。宿主細胞に影響を及ぼす単離免疫刺激特性を有する化合物を有することの利点は、細菌耐性の発達が回避されることである。さらに、下痢および偽膜性大腸炎を引き起こすクロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）の過剰増殖のリスクを含む、腸内細菌叢に影響を及ぼすマクロライドの周知の副作用が回避される。多くのウイルスおよびがんは、免疫認識を回避する機構、すなわちＨＬＡ発現を下方制御して、Ｔ細胞による検出を回避することによる機構を開発している。介入の化合物の機構は、感染細胞でのＨＬＡ分子の活性化および発現増加に依存している。ＨＬＡ分子は、感染細胞の排除を可能にするＴ細胞の認識シグナルを提示するために、細胞内感染因子に由来するペプチドを搭載および提示する。
【００１５】
本明細書に開示される本発明の化合物は、免疫応答刺激が有用な疾患、障害、状態および症状を治療するため、例えば、ウイルス作用因子またはウイルス性疾患、例えばＨＩＶ、アデノウイルス、アルファウイルス、アルボウイルス、ボルナ病、ブニヤウイルス、カリシウイルス、尖圭コンジローマ、コロナウイルス、コクサッキーウイルス、サイトメガロウイルス、デング熱ウイルス、伝染性膿瘡、エプスタイン−バーウイルス、伝染性紅斑、ハンタウイルス、ウイルス性出血熱、ウイルス性肝炎、単純ヘルペスウイルス、帯状疱疹ウイルス、伝染性単核球症、インフルエンザ、ラッサ熱ウイルス、麻疹、おたふく風邪、伝染性軟属腫、パラミクソウイルス、サシチョウバエ熱、ポリオーマウイルス、リフトバレー熱、風疹、スロー病ウイルス、天然痘、亜急性硬化性全脳炎、腫瘍ウイルス感染症、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、狂犬病ウイルスおよび呼吸器合胞体ウイルスに感染した患者の治療に使用され得る。特に、本発明の化合物は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳの治療に使用することができる。
【００１６】
さらに、化合物はがんの治療に使用するのに適していると考えられる。特に、副腎がん、肛門がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、脳／ＣＮＳ腫瘍、乳がん、キャッスルマン病、子宮頸がん、結腸／直腸がん、子宮内膜がん、食道がん、眼がん、胆嚢がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎臓がん、咽頭および下咽頭がん、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、肺カルチノイド腫瘍、リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔および副鼻腔がん、上咽頭がん、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔および中咽頭肺がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、陰茎がん、下垂体腫瘍、前立腺がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、基底および扁平上皮がん、黒色腫、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、胃がん、精巣がん、胸腺がん、甲状腺がん、子宮肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍。
【００１７】
したがって、先行技術のマクロライドよりも有利な本発明の化合物の特性には、以下の１つまたは複数が含まれ得る：
−直接的な抗菌活性の低下
−ＭＨＣクラスＩ刺激の改善
−免疫調節の改善
−抗原提示細胞の活性化の改善
−Ｔ細胞応答の改善
−抗ウイルス活性の改善
−ＭＨＣクラスＩＩ抗原提示の改善
【００１８】
本発明の化合物を含む医薬組成物
本発明はまた、本発明の化合物を１種または複数の薬学的に許容される希釈剤または担体と共に含む医薬組成物を提供する。同様に、本発明はまた、本発明の化合物を１種または複数の薬学的に許容される賦形剤と共に含む少なくとも１種の医薬組成物を含む医薬キットを提供する。本発明はまた、本発明の化合物を１種または複数の美容的にまたは獣医学的に許容される賦形剤と共に含む化粧用または獣医用組成物に関する。
【００１９】
本発明の化合物または本発明の化合物を含む医薬、化粧用もしくは獣医用組成物は、例えば限定されないが、非経口的、経口的、局所的、または粘膜（頬、舌下、経皮、膣、直腸、鼻、眼等を含む）を介して、医療機器（例えば、ステント）を介して、または吸入によってなどの任意の慣用的な経路によって投与され得る。治療は、単回投与またはある期間にわたる複数回投与からなり得る。
【００２０】
治療は、治療する具体的な疾患ならびに治療する患者の体重および年齢に応じて、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回等の投与により得る。治療はまた、例えば適剤を介した注入による静脈内投与などの連続投与によってもよい。
【００２１】
本発明の化合物をそのまま投与することは可能であるが、１種または複数の許容される担体と共に医薬製剤として提供することが好ましい。担体は、本発明の化合物と適合性があり、そのレシピエントに有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。適切な担体の例を、以下でさらに詳細に説明する。
【００２２】
製剤は、都合よく単位剤形を含む適切な剤形で提供してもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製してもよい。このような方法は、有効成分（本発明の化合物）を１種または複数の補助成分を構成する担体と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、有効成分を液体担体もしくは細かく分割された固体担体または両方と均一かつ密接に会合させ、次いで、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００２３】
本発明の化合物は通常、経口または任意の非経口経路による任意の慣用的な投与経路によって、有効成分を含む医薬製剤の形態で、場合により非毒性の有機または無機の酸または塩基、付加塩の形態で、薬学的に許容される剤形で投与される。治療される障害および患者、ならびに投与経路に応じて、組成物を、様々な用量および／または頻度で投与することができる。
【００２４】
医薬組成物は、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、よって、必要に応じて、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。液剤、分散剤、乳剤および懸濁剤などの液体製剤の場合、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール）、植物油およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。
【００２５】
例えば、本発明の化合物は、香味剤または着色剤を含有し得る錠剤、カプセル剤、フィルム、オビュール（ｏｖｕｌｅ）、エリキシル、液剤、乳剤または懸濁剤の形態で、経口、頬側または舌下投与され得る。
【００２６】
経口投与に適した本発明による製剤は、各々が所定量の有効成分を含有するカプセル剤、カシェ剤もしくは錠剤などの別個の単位として；例えば錠剤もしくはカプセル剤の形態で複数単位として；散剤もしくは顆粒剤として；水性液体もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として；または水中油型液体エマルジョンもしくは油中水型液体エマルジョンとして提供することができる。有効成分は、ボーラス、舐剤、またはペーストとして提供されてもよい。
【００２７】
経口投与に適した本発明の化合物の溶液または懸濁液はまた、水、アルコール、ポリオール等を含む１種または複数の溶媒、ならびにｐＨ調整剤、安定剤、界面活性剤、可溶化剤、分散剤、保存剤、香料等などの１種または複数の賦形剤を含有し得る。具体例としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、分散剤、例えばポリソルベート８０、界面活性剤および可溶化剤、例えばポリエチレングリコール、Ｐｈｏｓａｌ  ５０  ＰＧ（ホスファチジルコリン、大豆脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコールおよびパルミチン酸アスコルビルからなる）が挙げられる。本発明による製剤はエマルジョンの形態であってもよく、式（Ｉ）による化合物が水中油型エマルジョンまたは油中水型エマルジョンなどのエマルジョンで提供されてもよい。油は、天然もしくは合成油、または任意の油様物質、例えば、大豆油もしくはベニバナ油またはこれらの組み合わせであり得る。
【００２８】
錠剤は、賦形剤、例えば微結晶セルロース、ラクトース（例えば、ラクトース一水和物または無水ラクトース）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシン、ブチル化ヒドロキシトルエン（Ｅ３２１）、クロスポビドン、ヒプロメロース、崩壊剤、例えばデンプン（好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム、および一定の複合ケイ酸塩、および造粒用バインダー、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、マクロゴール８０００、スクロース、ゼラチンおよびアカシアを含有し得る。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクなどの潤滑剤を含めてもよい。
【００２９】
錠剤は、場合により１種または複数の副成分を用いて、圧縮または成形によって調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械で有効成分を粉末または顆粒などの自由流動形態に圧縮し、場合によりバインダー（例えば、ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、界面活性剤または分散剤と混合することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を適切な機械で成形することによって作製することができる。錠剤は、場合によりコーティングするまたは刻み目を入れることができ、所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用して中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化することができる。
【００３０】
同様の種類の固体組成物を、ゼラチンカプセルの充填剤として使用することもできる。これに関して好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および／またはエリキシルの場合、本発明の化合物を、種々の甘味剤または香味剤、着色料または色素、乳化剤および／または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンなどの希釈剤、ならびにこれらの組み合わせと組み合わせることができる。
【００３１】
口への局所投与に適した製剤には、フレーバーベース、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に有効成分を含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンなどの不活性ベース、またはスクロースおよびアカシア中に有効成分を含むトローチ；ならびに適切な液体担体中に有効成分を含む洗口液が含まれる。
【００３２】
局所投与に適した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、散剤、溶液、ペースト、ゲル、含浸包帯、スプレー、エアゾールまたはオイル、経皮デバイス、散粉剤などとして製剤化することができる。これらの組成物は、活性剤を含有する慣用的な方法を介して調製することができる。したがって、これらはまた、保存剤、薬物浸透を助けるための溶媒、クリームまたは軟膏の皮膚軟化剤ならびにローションのためのエタノールまたはオレイルアルコールなどの適合性の慣用的な担体および添加剤を含んでもよい。このような担体は、組成物の約１％〜最大約９８％として存在し得る。より一般的には、これらは組成物の最大約８０％を形成する。単なる例示として、クリームまたは軟膏は、所望の粘稠度を有するクリームまたは軟膏を製造するのに十分な量の約５〜１０重量％の化合物を含有する、十分な量の親水性材料および水を混合することによって調製される。
【００３３】
経皮投与に適した医薬組成物は、長期間にわたりレシピエントの表皮と緊密に接触したままであることを意図された別個のパッチとして提供され得る。例えば、活性剤をイオン泳動によってパッチからすることができる。
【００３４】
外部組織、例えば口および皮膚への施用のために、組成物は、好ましくは、局所軟膏またはクリームとして施用される。軟膏に製剤化する場合、活性剤をパラフィン系または水混和性の軟膏基剤のいずれかと共に使用することができる。
【００３５】
あるいは、活性剤を、水中油型クリーム基剤または油中水型基剤を含むクリームに製剤化することができる。
【００３６】
非経口投与の場合、有効成分と、無菌ビヒクル、例えば限定されないが、水、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油とを利用して液体単位剤形が調製され、水が好ましい。有効成分は、使用されるビヒクルおよび濃度に応じて、ビヒクル中にコロイド状であり得る、懸濁され得る、または溶解され得る。溶液の調製では、有効成分を注射用水に溶解し、適切なバイアルまたはアンプルに充填して密封する前に濾過滅菌することができる。
【００３７】
有利には、局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤などの薬剤をビヒクルに溶解することができる。安定性を高めるために、組成物を、バイアルに充填した後、凍結し、真空下で水を除去することができる。次いで、乾燥凍結乾燥粉末をバイアルに密封し、使用する前に付随する注射用水バイアルを供給して液体を再構成することができる。
【００３８】
注射用途に適した本発明の医薬組成物は無菌水溶液または分散液を含む。さらに、組成物は、このような無菌注射溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末の形態であり得る。全ての場合で、最終注射形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性のために有効に流動性でなければならない。
【００３９】
非経口懸濁液は、有効成分を溶解する代わりにビヒクルに懸濁し、滅菌が濾過によって達成できないことを除いて、溶液と実質的に同じように調製される。有効成分は、無菌ビヒクルに懸濁する前にエチレンオキシドに曝露することによって滅菌することができる。有利には、有効成分の均一な分布を促進するために、界面活性剤または湿潤剤を組成物に含める。
【００４０】
上で特に言及される成分に加えて、本発明の製剤は、当の製剤型を考慮して、当技術分野で慣用的な他の薬剤を含んでもよく、例えば経口投与に適したものには香味剤が含まれ得ることを理解すべきである。当業者であれば、適切な製剤を選択する方法およびこれを調製する方法を知るだろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの医薬科学）１８  Ｅｄ．またはそれ以降参照）。当業者はまた、適切な投与経路および投与量を選択する方法を知っているだろう。
【００４１】
本発明の化合物の個々の投与量の最適な量および間隔は、治療している状態の性質および程度、投与の形態、経路および部位、治療している特定の対象の年齢および状態によって決定され、医師が使用される適切な投与量を最終的に決定することが当業者によって認識されるだろう。この投与量は、適宜繰り返すことができる。副作用が発生する場合、投与の量および／または頻度を、正常な臨床診療に従って、変更または減少させることができる。
【００４２】
文脈上別段の要求がない限り、本明細書で言及される全ての％値は％ｗ／ｗである。
【００４３】
定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の冠詞の文法的対象を指すために使用される。例として、「類似体（ａｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ）」は、１つの類似体または２つ以上の類似体を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「本発明の化合物」という用語は式（Ｉ）の化合物と互換的に使用され、式（Ｉ）の化合物を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「直接的な抗菌効果」という用語は、細菌のｒＲＮＡ複合体への結合を通して生じるエリスロマイシンおよび類似体の抗菌活性を指す。この効果は、宿主免疫系成分の存在を必要としないため、インビトロ最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイおよびディスク阻害アッセイなどの標準的な抗菌アッセイで明らかである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「実質的な抗菌活性がない」という用語は、本明細書の例２に従って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）およびＢ．ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）でその抗菌活性について試験した場合に、本発明の化合物が６４μｇ／ｍｌ超のＭＩＣ値を有することを意味することを意図している。
【００４７】
本発明の化合物の薬学的に許容される塩は、薬学的に許容される無機または有機の酸または塩基から形成される慣用的な塩、ならびに第四級アンモニウム酸付加塩を含む。適切な酸塩のより具体的な例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ギ酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモイック（ｐａｌｍｏｉｃ）酸、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸ヒドロキシナフトエ酸、ヨウ化水素酸、リンゴ酸、ステロイック（ｓｔｅｒｏｉｃ）酸、タンニンなどの塩が挙げられる。シュウ酸などの他の酸は、それ自体は薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびその薬学的に許容される塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に有用であり得る。適切な塩基性塩のより具体的な例としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインの塩が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】マクロライドエリスロマイシンＡ、化合物１、化合物２、化合物３およびＥＭ７０３の構造を示す図である。
【図２】Ｔ細胞およびＢ細胞のＣＤ６９上方制御を示す図である。ＰＢＭＣを化合物１、化合物２および活性化対照ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで２４時間処理した。初期活性化マーカーＣＤ６９の発現を、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞集団（左）およびＣＤ１９＋Ｂ細胞集団（右）で測定した。値は、３組の試料の平均蛍光強度、ＭＦＩおよびエラーバー標準偏差を表す。
【図３】Ｔ細胞およびＢ細胞のＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ上方制御を示す図である。ＰＢＭＣを化合物１または化合物２および活性化対照ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの発現を、フローサイトメトリーによってＣＤ４＋Ｔ細胞集団（左）およびＣＤ１９＋Ｂ細胞集団（右）で測定した。値は、３組の試料の平均蛍光強度、ＭＦＩおよびエラーバー標準偏差を表す。
【図４】血液単球のＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲ上方制御を示す図である。ＰＢＭＣを化合物１または化合物２ならびに活性化対照ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＣＤ８０およびＨＬＡ−ＤＲの発現を、フローサイトメトリーによって単球細胞集団で測定した。値は、３組の試料の平均蛍光強度、ＭＦＩおよびエラーバー標準偏差を表す。
【図５】血液単球のＣＤ８０上方制御を示す図である。ＰＢＭＣを化合物１または化合物２ならびに活性化対照ＩＦＮ−γで２４時間処理した。ＣＤ８０の発現を、フローサイトメトリーによって単球細胞集団で測定した。値は、３組の試料の平均蛍光強度、ＭＦＩおよびエラーバー標準偏差を表す。
【図６】ＥＬＩＳＡで測定した、化合物１による４８時間または１週間の刺激後のＰＢＭＣからのＩＬ−１０の産生を示す図である。
【図７】増殖色素Ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびフローサイトメトリーで測定した、化合物１による６日間の刺激後のＣＤ４  Ｔ細胞増殖を示す図である。未処理細胞（ＵＮＴ）または化合物２を対照として使用した。
【図８】フローサイトメトリーで測定した、化合物１とのインキュベーション後のＣＭＶ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞上のＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の上方制御を示す図である。
【図９】化合物１または２の存在下または非存在下で５日間、ＣＭＶペプチドにより増殖させたＰＢＭＣ（ＣＭＶ＋ドナー由来）からのインターフェロン−γ分泌（サイトメトリービーズアッセイによって測定される）を示す図である。
【図１０】指示される化合物で４８時間刺激したマクロファージからのインターフェロン−γ分泌（サイトメトリービーズアッセイによって測定される）を示す図である。
【図１１】指示される化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣまたはマクロファージからのケモカインＲＡＮＴＥＳ分泌（サイトメトリービーズアッセイによって測定される）を示す図である。
【図１２】指示される化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣまたはマクロファージからのＩＬ１２ｐ７０分泌（サイトメトリービーズアッセイによって測定される）を示す図である。
【図１３】指示される化合物で４８時間刺激したＰＢＭＣ、マクロファージまたはＣＤ４  Ｔ細胞からのＩＬ１ｂ分泌（サイトメトリービーズアッセイによって測定される）を示す図である。
【図１４】指示される用量の化合物１を２４時間前に注射したＣ５７ｂｌ／６マウスの血液中のＣＤ２５高細胞％を示す図である。ＣＤ２５の発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【図１５】指示される化合物を２４時間前に注射した３匹の個々のＣ５７ｂｌ／６マウスの脾臓におけるＭＨＣクラスＩ高ＣＤ１１ｂ＋細胞％を示す図である。ＭＨＣクラスＩおよびＣＤ１１ｂの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。
【実施例】
【００４９】
実験
材料
特に指示しない限り、以下の例で使用される全ての試薬は商業的供給源から得た。
【００５０】
抗体
抗ＣＤ８０  Ｖ４５０、抗ＣＤ６９  ＰＥ、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＡＰＣ−Ｒ７００、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣおよび抗−抗ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ  ＦＩＴＣはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。Ｔ細胞増殖アッセイ用のＣｅｌｌｔｒａｃｅバイオレットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ＥＬＩＳＡ抗体はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。
【００５１】
培地
２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
【００５２】
一般的生物学的方法
免疫刺激に対する本発明の化合物の効果を、以下に記載される方法の１つまたは複数を使用して試験することができる：
【００５３】
一般的化合物方法
化合物分析−溶液中の溶解度および安定性
【００５４】
発酵ブロスおよび化合物の分析
以下に記載されるように得られた発酵ブロスのアリコートを、等体積の酢酸エチルと３０分間激しく振盪し、次いで、遠心分離によって分離する、または既に単離された化合物をメタノール：水（９：１、０．１ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、次いで、遠心分離によって分離した。上清をＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、４０℃に加熱したＬｕｎａ  ＨＰＬＣカラム（２５０×４．６ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（マクルズフィールド、英国）を使用して、塩基不活性化Ｌｕｎａ  Ｃ１８逆相シリカ（粒径５ミクロン）でクロマトグラフィーを行った。クォータナリポンプ、オートサンプラー、カラムオーブンおよびＢｒｕｋｅｒ  ＥｓｑｕｉｒｅイオントラップＭＳに連結されたダイオードアレイ検出器で構成されるＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステム。
【００５５】
移動相Ａ＝水中０．１％ギ酸
移動相Ｂ＝アセトニトリル中０．１％ギ酸
勾配：Ｔ＝０分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝４．５分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝７分、Ｂ＝１００％；Ｔ＝１０．５分、Ｂ＝１００％；Ｔ＝１０．７５分、Ｂ＝５０％；Ｔ＝１３分、Ｂ＝５０％。
化合物をＬＣ−ＭＳおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって内部標準に対して定量化した。
【００５６】
フローサイトメトリーによるマーカー発現の分析
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健康なドナーから精製した。細胞を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３７℃、５％ＣＯ２で２４〜７２時間培養し、増加する濃度の化合物１および２で刺激した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用してフローサイトメトリーで分析した。全ての試料を２連で試験した。
【００５７】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）培養
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健康なＣＭＶ陽性ドナーから精製した。ＰＢＭＣを、ＰＢＳ中５μＭ  Ｃｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で１５分間標識し、次いで、完全細胞培養培地で洗浄した。標識ＰＢＭＣを、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足したＡＩＭ−Ｖ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質（１μｇ／ペプチド／ｍｌ、ＪＰＴ）にまたがるペプチドライブラリーの存在下で、３７℃、５％ＣＯ２で６〜８日間培養した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用して、フローサイトメトリーで細胞増殖を評価した。
【００５８】
ＥＬＩＳＡ
完全ＲＰＭＩ培地、３７℃、５％ＣＯ２で、２．５μＭの化合物１および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と４８時間および７日間インキュベートした後、標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（全抗体がＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で上清ＩＬ−１０を測定した。
【００５９】
ＴＬＲ２アッセイ
試料および対照を、標準アッセイ条件を使用して、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎの細胞レポーターアッセイを使用して、組換えＨＥＫ−２９３−ＴＬＲ細胞株で２連で試験した。これらの細胞株は、ヒトＴＬＲ２タンパク質ならびに分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）であるレポーター遺伝子を機能的に過剰発現する。このレポーター遺伝子の産生は、ＮＦｋＢ誘導性プロモーターによって駆動される。ＴＬＲレポーター細胞株活性化の結果を、光学濃度値（ＯＤ）として示す。
【００６０】
２０μｌの各試験物を使用して、２００μｌの最終反応体積でｈＴＬＲ２レポーター細胞株を刺激した。２０ｕＭと１０ｕＭの少なくとも２つの濃度で試験して、試料を２連で試験した。
【００６１】
細胞透過性（双方向）の評価
１０μＭの試験物を、Ｃａｃｏ−２細胞単層の頂端膜（Ａ）表面（３７℃の０．３％ＤＭＳＯおよび５μＭ  ＬＹを含むＨＢＳＳ緩衝液中）に添加し、９０分間のインキュベーション後に基底膜（Ｂ）コンパートメントへの化合物の透過を測定した。これを、能動輸送を調べるために逆方向（基底膜から頂端膜へ）でも行った。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して、試験化合物と標準対照化合物の両方のレベルを定量化する。ＢからＡへの透過性をＢからＡへの透過性で割ることによって流出比を計算した。
【００６２】
薬物透過性：Ｐａｐｐ＝（ＶＡ／（面積×時間））×（［薬物］受容体／（（［薬物］初期、ドナー）×希釈因子）。
【００６３】
代謝安定性の評価（ミクロソーム安定性アッセイ）
ミクロソームでの代謝速度を以下のように試験した：
ヒト肝ミクロソームを緩衝液Ｃ（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）で２．５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。３０μＬの１．５μＭ化合物添加溶液をウェルに添加することによって、ミクロソーム安定性試験を行った（１．５μＬの５００μＭ添加溶液（１０μＬの１０ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液を１９０μＬ  ＡＣＮ中に入れて最終試験濃度１μＭを最終的に生成する）および４７９．７５μＬの緩衝液Ｃ中１８．７５μＬの２０ｍｇ／ｍＬの肝ミクロソーム）。全ての試料を３７℃でおよそ１５分間プレインキュベートした。この後、穏やかに混合しながら１５μＬのＮＡＤＰＨ溶液（６ｍＭ）を添加することによって、反応を開始した。アリコート（４０μＬ）を０、５、１５、３０および４５分で取り出し、内部標準（１３５μＬ）を含有するＡＣＮでクエンチした。タンパク質を遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分）によって除去し、試料プレートをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって化合物濃度について分析した。次いで、半減期を標準的な方法によって計算し、分析物の濃度を元々存在する量と比較した。
【００６４】
例
例１−化合物１の生成
ａｚ−ＡＧの生成
文献（Ｄｊｏｋｉｃ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８８）に記載されている方法を使用して、アジスロマイシンアグリコンを生成した。手短に言えば、アジスロマイシンを３−Ｏおよび５−Ｏ糖の酸性除去によってアジスロマイシンアグリコンに変換する。５−Ｏアミノ糖を最初に酸化し、熱分解して切断を促進する。
【００６５】
エリスロマイシンアグリコン（エリスロノリド）をグリコシル化することができる生体内変換株の作製
【００６６】
Ｓ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１（ｐＡＥＳ５２）の作製
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩ発現系（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）と共に、ａｎｇＡＩ、ａｎｇＡＩＩ、ａｎｇＣＶＩ、ａｎｇ−ｏｒｆ１４、ａｎｇＭＩＩＩ、ａｎｇＢ、ａｎｇＭＩおよびａｎｇＭＩＩからなる発現プラスミドであるｐＡＥＳ５２を、以下の通り作製した。
【００６７】
アンゴラマイシン糖生合成遺伝子を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州、米国）から得たＳ．エウリテルムス（Ｓ．ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５６株のコスミドライブラリーから増幅した。生合成遺伝子クラスター配列は、ＥＵ０３８２７２、ＥＵ２２０２８８およびＥＵ２３２６９３として寄託された（Ｓｃｈｅｌｌ，２００８）。
【００６８】
生合成遺伝子カセットを前記のようにベクターｐＳＧ１４４にアセンブルし（Ｓｃｈｅｌｌ，２００８，ＥＳＩ）、糖生合成に必要な８つが得られるまで連続遺伝子を付加し、プラスミドｐＡＥＳ５２を作製した。
【００６９】
ｐＡＥＳ５２を１８Ａ１株に形質転換した（国際公開第２００５０５４２６５号パンフレット）。
【００７０】
ｐＡＥＳ５２のＳ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１への形質転換
ｐＡＥＳ５２を、標準的な方法（Ｋｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０００、Ｇａｉｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）を使用してプロトプラストによりＳ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）１８Ａ１に形質転換した。得られた菌株はＩＳＯＭ−４５２２と命名され、これは２０１７年１月２４日にＮＣＩＭＢに寄託番号：ＮＣＩＭＢ  ４２７１８で寄託されている。
【００７１】
Ｓ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２（ｐＡＥＳ５４）の作製
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩ発現系（Ｒｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）と共に、ａｎｇＡＩ、ａｎｇＡＩＩ、ａｎｇＣＶＩ、ａｎｇ−ｏｒｆ１４、ａｎｇＭＩＩＩ、ａｎｇＢ、ａｎｇＭＩおよびａｎｇＭＩＩからなる発現プラスミドであるｐＡＥＳ５４を、以下の通り作製した。
【００７２】
アンゴラマイシン糖生合成遺伝子を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（マナサス、バージニア州、米国）から得たＳ．エウリテルムス（Ｓ．ｅｕｒｙｔｈｅｒｍｕｓ）ＡＴＣＣ２３９５６株のコスミドライブラリーから増幅した。生合成遺伝子クラスター配列は、ＥＵ０３８２７２、ＥＵ２２０２８８およびＥＵ２３２６９３として寄託された（Ｓｃｈｅｌｌ，２００８）。
【００７３】
生合成遺伝子カセットを前記のようにベクターｐＳＧ１４４にアセンブルし（Ｓｃｈｅｌｌ，２００８，ＥＳＩ）、糖生合成に必要な８つが得られるまで連続遺伝子を付加し、プラスミドｐＡＥＳ５２を作製した。
【００７４】
ａｃｔＩＩ−ＯＲＦ４  ｐａｃｔＩ／ＩＩＩプロモーター系を含む１１５４１ｂｐ  ＳｐｅＩ−ＮｈｅＩフラグメントを連結することによってプラスミドｐＡＥＳ５４を作製し、８  ａｎｇ遺伝子を、ストレプトマイセスに導入するためのアプラマイシン耐性遺伝子、ｏｒｉＣ、ｏｒｉＴ、および組込み形質転換のためのａｔｔＰ部位を有するｐｈｉＢＴ１インテグラーゼを含む、ｐＧＰ９からの５０８７ｂｐ  Ｘｂａｌ−Ｓｐｅｌフラグメントを有するｐＡＥＳ５２から切除した。（適合性のＮｈｅＩおよびＸｂａＩ部位を、ライゲーション中に排除した。）
【００７５】
次いで、ｐＡＥＳ５４をＳ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２に形質転換した（Ｇａｉｓｓｅｒら  ２０００、国際公開第２００５０５４２６５号パンフレット）。
【００７６】
ｐＡＥＳ５４のＳ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２への形質転換
ｐＡＥＳ５４を、標準的な方法を使用してＳ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２への連結によって移した。手短に言えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＴ１２５６７  ｐＵＺ８００２を標準的手順を介してｐＡＥＳ５４で形質転換し、アプラマイシン（５０μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３３μｇ／ｍＬ）選択により２ＴＹ上に広げた。このプレートを３７℃で一晩インキュベートした。これからのコロニーを使用して、新鮮な液体２ＴＹ培養物を設定し、後期の対数期に達するまで３７℃でインキュベートした。細胞を収穫し、洗浄し、Ｓ．エリスラエア（Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ）ＳＧＴ２の胞子と混合し、Ｒ６のプレートに広げ、２８℃でインキュベートした。２４時間後、これらのプレートを、３ｍｇのアプラマイシンおよび２．５ｍｇのナリジクス酸を含有する１ｍＬの滅菌水で覆い、２８℃でさらに５〜７日間インキュベートした。このプレート上の接合完了体を、アプラマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＲ６の新しいプレートに移した。
【００７７】
代替生体内変換株
あるいは、これはアンゴロサミンをエリスロノリドに追加するが、ＢＩＯＴ−２９４５（Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を生体内変換株として使用することもできる。
【００７８】
アジスロマイシンアグリコンの生体内変換
ＳＶ２培地（４０ｍＬ）および８μＬのチオストレプトン（２５ｍｇ／ｍＬ）を含有するＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ（２５０ｍＬ）に、０．２ｍＬの菌株ＩＳＯＭ−４５２２の胞子ストックを接種し、３０℃でインキュベートし、２．５ｃｍ行程で３００ｒｐｍで４８時間振盪した。
【００７９】
【表１】
2020516584.tif 000005
【００８０】
ＥｒｙＰＰ培地（７ｍＬ）を含有する栓をした滅菌ファルコンチューブ（５０ｍＬ）を準備し、抗生物質を用いないで種フラスコの培養物を（ファルコンチューブ１本あたり０．５ｍＬ）を接種した。ファルコンを３０℃でインキュベートし、２．５ｃｍ行程で３００ｒｐｍで２４時間振盪した。
【００８１】
【表２】
2020516584.tif 000006
【００８２】
２４時間後、アジスロマイシンアグリコン（ＤＭＳＯ中０．５ｍＭ、５０μＬ）を各ファルコンチューブに添加し、２．５ｃｍ行程で３００ｒｐｍでさらに６日間インキュベーションを続けた。
【００８３】
化合物１の単離
全ブロスをｐＨ９．５に調整し、１容量の酢酸エチルで２回抽出した。遠心分離（３５００ｒｐｍ、２５分）後、吸引によって有機層を回収した。有機層を合わせ、真空下で減量すると、化合物１を含有する茶色ゴムが現れた。この抽出物を酢酸エチル（２００ｍｌ）と塩化アンモニウム水溶液（２０ｍｌの５０％濃縮溶液）に分配した。分離後、有機層をさらなる容量（２００ｍｌ）の塩化アンモニウム水溶液で抽出した。次いで、合わせた水層を水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ９．０に調整し、１容量当量の酢酸エチルで２回抽出した。有機層を合わせ、真空下で減量すると、茶色固体になった。次いで、この抽出物をシリカカラムにアプライし、以下により段階的に（５００ｍｌロットで）溶出した：
【表３】
2020516584.tif 000007
【００８４】
化合物１は主にＦおよびＧ中にあった。これらの溶媒を合わせ、真空中で減量させると、化合物１を含有する茶色固体が得られた。次いで、この物質を分取ＨＰＬＣ（２０ｍＭ酢酸アンモニウムおよびアセトニトリルを溶媒として使用したＣ１８  Ｇｅｍｉｎｉ  ＮＸカラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）によって精製した。標的化合物を含有する画分をプールし、乾燥させ、引き続いて、Ｃ１８  ＳＰＥカートリッジで脱塩した。
【００８５】
例２−直接的な抗菌活性の評価
一般的な腸内細菌４菌株（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）亜種サリバリウス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）およびビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ））および一般的な哺乳動物皮膚分離菌ミクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｕｔｅｕｓ）に対するマクロライド化合物の生理活性を、最小阻害濃度（ＭＩＣ）アッセイを使用して評価した。ＮＣＩＭＢから得たＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）を除いて、細菌株をＤＳＭＺ（ブランズウィック、ドイツ）から購入し、−８０℃で２０％グリセロールに保存した。陽性対照（アジスロマイシンおよびエリスロマイシン）ならびに試験化合物１および２のストック溶液（１００％ＤＭＳＯ）を、ブロスに希釈して、２５６μｇ／ｍｌの使用ストック濃度（最終アッセイ試験濃度範囲１２８μｇ／ｍｌ〜０．００３９１μｇ／ｍｌ）にした。他の全ての化合物のストック溶液をブロスに希釈して、１２８μｇ／ｍｌの使用ストック濃度にした（最終アッセイ試験濃度範囲６４μｇ／ｍｌ〜０．００１９５μｇ／ｍｌ）。細菌株を、３７℃で好気的に培養したＭ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ）を除いて、３７℃で嫌気性チャンバー内の適切なブロスで培養した。１８時間培養物をブロスに希釈してＯＤ５９５を０．１にし、次いで、１：１０にさらに希釈した。９６ウェルプレートで、２連で、２００μｌの試験化合物の使用ストックをウェル１に移し、ブロスで連続希釈（１：２）した。１００μｌの細菌懸濁液を各ウェルに分注し、完全に混合した。適切な無菌対照を含め、プレートを嫌気性チャンバー内で、または好気的（Ｍ．ルテウス（Ｍ．ｌｕｔｅｕｓ））に３７℃で１８時間インキュベートした。ＭＩＣを、目に見える増殖がない最初のウェルの試験化合物の濃度であると決定した。
【００８６】
【表４】
2020516584.tif 000008
【００８７】
表１に提示されるデータから分かるように、化合物１は、試験した細菌株のいずれに対しても抗菌活性を示さない一方で、エリスロマイシンおよびアジスロマイシンはいくつかの菌株に対して強力な活性を示す。
【００８８】
例３−免疫刺激活性の評価
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度遠心分離で健康なドナーから精製した。細胞を、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎児血清、１００μｇ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。細胞を、組織培養プレート中増加する濃度の化合物１および２で、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間（試験１〜４）または４８時間〜１週間（試験５）刺激した。細胞をプレートから取り出し、ＰＢＳで洗浄し、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製のモノクローナル抗体およびＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーで、細胞特異的表面マーカーおよびＭＨＣクラスＩの発現を分析した。
【００８９】
完全ＲＰＭＩ培地、３７℃、５％ＣＯ２で、２．５μＭの化合物１および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と４８時間および７日間インキュベートした後、標準サンドイッチＥＬＩＳＡ（全抗体がＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）で上清ＩＬ−１０を測定した。
【００９０】
試験１：１μＭ化合物１（図１）による末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２４時間のインビトロ刺激後、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＢ細胞で活性化マーカーＣＤ６９が上方制御された（図２）。
【００９１】
試験２：また、Ｔ細胞およびＢ細胞での分子ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ−ＡＢＣ）の上方制御も観察され（図３）、ウイルス抗原の抗原提示への効果を示した。
【００９２】
試験３：化合物１によるＰＢＭＣの刺激は、単球上の共刺激分子ＣＤ８０ならびに抗原提示分子ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ−ＤＲ）の上方制御をもたらした（図４）。
【００９３】
試験４：マクロファージに分化した単球も、化合物１による刺激に応答してＣＤ８０を上方制御した（図５）。
【００９４】
試験５：化合物１で４８時間および７日間刺激したＰＢＭＣは、サンドイッチＥＬＩＳＡで測定される、免疫抑制性サイトカインＩＬ−１０の産生増加を伴う変化したサイトカインプロファイルを発現した。これは、一定の条件下での免疫抑制効果を示している（図６）。
【００９５】
試験６：ＰＢＭＣを化合物１で刺激し、ＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅバイオレット色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で６日間、ＲＰＭＩ培地で培養した。増殖をフローサイトメトリーで測定した。化合物１の免疫学的効果を分析すると、Ｔ細胞のサイトカイン駆動増殖プロファイルの変化が明らかになった（図７）。
【００９６】
試験７：ウイルス特異的Ｔ細胞増殖も化合物１によって影響された。ＣＭＶ抗原および化合物１の存在下で６日間培養したサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染ドナーのＰＢＭＣは、フローサイトメトリーで測定される、ＩＬ−７受容体α（ＣＤ１２７）の発現が増加した活性化ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の表現型の変化を示した（図７）。ＣＤ１２７はＴ細胞の恒常性、分化および機能にとって重要であり、発現低下はＨＩＶおよび他の慢性ウイルス性疾患の疾患重症度と相関している（Ｃｒａｗｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｅｍ  Ｉｍｍ  ２０１２）。
【００９７】
分かるように、化合物１は、抗原提示、同時刺激ならびにＴ細胞の活性化および増殖に影響を及ぼすことによって、免疫応答を特異的に活性化および修飾する驚くべき能力を有する。これらの試験の多くでは、化合物２、（化合物２０として）Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２００８で以前公開されたグリコシル化が変化した別の関連マクロライドエリスロマイシン類似体を含めたが、アッセイでほとんどまたは全く活性を示さなかった。
【００９８】
試験８：未処理または化合物１もしくは化合物２に３日間曝露した、ＣＭＶ感染ドナーからのＰＢＭＣをＣＭＶ抗原の存在下で培養した。化合物１への曝露は、高レベルのＩＦＮ−γの分泌を誘導したが、抗原培養単独または抗原と化合物２は、ＩＦＮ−γ分泌を誘導しなかった（図９）。
【００９９】
試験９：化合物１または２に４８時間曝露した健康なドナーのマクロファージ。化合物１に曝露したマクロファージのみがＩＦＮ−γを分泌したが、未処理マクロファージおよび化合物２に曝露したマクロファージはＩＦＮ−γを分泌しなかった（図１０）。したがって、化合物１は、健康なドナーのマクロファージにおいてＩＦＮ−γ分泌を誘導することができる。
【０１００】
試験１０：化合物１または２に２日間曝露したＰＢＭＣおよびマクロファージ（図１１）。ＰＢＭＣでのＲＡＮＴＥＳの基底発現は、化合物２によって影響を受けなかったが、化合物１は発現の２倍の上方制御を誘導した。ＲＡＮＴＥＳの発現はマクロファージでは非常に小さく、化合物１は高い発現を誘導した。
【０１０１】
試験１１：化合物１および２に２日間曝露したＰＢＭＣおよびマクロファージ。ＰＢＭＣおよびマクロファージは化合物１に応答してＩＬ−１２ｐ７０を分泌したが、化合物２は未処理細胞に対して分泌を誘導できなかった（図１２）。
【０１０２】
試験１２：化合物１および２に２日間曝露したＰＢＭＣ、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞。ＩＬ−１βの分泌はマクロファージでは化合物１により、ＰＢＭＣではわずかに増加したが、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではＩＬ−１βは誘導されなかった（図１３）。
【０１０３】
試験１３：化合物１を０．１６５ｍｇ／ｋｇ〜５ｍｇ／ｋｇでＣ５７ｂｌ／６マウスに静脈内投与した。最高用量の５ｍｇ／ｋｇを投与された動物では、同群の体重（示さず）と同様に、ＣＤ２５＋細胞存在量が増加した（図１４）。
【０１０４】
試験１４：化合物１または２をＣ５７ｂｌ／６マウスに静脈内投与した。２４時間後、脾臓を取り出し、ＣＤ１１ｂ＋脾細胞でのＭＨＣクラスＩ発現を評価したところ、化合物１は、高いＭＨＣ  Ｉ発現を伴う脾細胞の増加を誘導したが、化合物２を注射したマウスの脾細胞では効果は観察されなかった。
【０１０５】
例４−ＴＬＲ２に対する活性の評価
ＴＬＲ２受容体の刺激を測定するＴＬＲ２レポーターアッセイ（一般的方法参照）を使用して、化合物を試験した。刺激効果を、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の放出による陰性対照と比較した光学濃度（ＯＤ）の増加として測定し、これを表２に示す。
【０１０６】
【表５】
2020516584.tif 000009
【０１０７】
分かるように、化合物１は５μＭまでの濃度でＴＬＲ２を刺激したが、エリスロマイシンＡ、アジスロマイシン、ＥＭ７０３（例えば、欧州特許第１３５０５１０号明細書参照）ならびに化合物２および３、（化合物１７および２０として）Ｓｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２００８で以前公開されたグリコシル化が変化した関連マクロライドエリスロマイシン類似体は、最大２０μＭの濃度でほとんどまたは全く刺激を示さなかった。
【０１０８】
例５−ｃａｃｏ−２透過性の評価
標準的なｃａｃｏ−２双方向透過性アッセイを使用して、化合物を試験した（一般的方法参照）。生成されたデータを表３に示す。
【０１０９】
【表６】
2020516584.tif 000010
【０１１０】
表３のデータから分かるように、化合物１はより細胞透過性であり、アジスロマイシンとＥＭ７０３の両方よりも低い流出比を有する（例えば、欧州特許第１３５０５１０号明細書参照）。
【０１１１】
例６−代謝安定性の評価
本発明の化合物の代謝安定性を、標準的なヒトミクロソーム安定性アッセイで評価した（一般的方法参照）。半減期が長い化合物は、投与後の半減期が長くなると予想され、これは少ない投与頻度を可能にするのに有用となり得る。半減期が短い化合物は、活性実体が患者の系に入ると急速に分解する「ソフトドラッグ」としての使用に有用となり得るだろう。評価した化合物の半減期を、以下の表４に示す：
【０１１２】
【表７】
2020516584.tif 000011
【０１１３】
参考文献
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【０１１４】
特許および特許出願を含む本出願で言及される全ての参考文献は、可能な限り最大限に参照により本明細書に組み込まれる。
【受託番号】
【０１１５】
ＮＣＩＭＢ  ４２７１８
【配列表フリーテキスト】
【０１１６】
配列番号：１＜２２３＞ＡｎｇＭＩＩ
配列番号：２＜２２３＞ＡｎｇＭＩＩＩ
【０１１７】
2020516584.tif 000012
【図１】
2020516584.tif 000015
【図２】
2020516584.tif 000016
【図３】
2020516584.tif 000017
【図４】
2020516584.tif 000018
【図５】
2020516584.tif 000019
【図６】
2020516584.tif 000020
【図７】
2020516584.tif 000021
【図８−１】
2020516584.tif 000022
【図８−２】
2020516584.tif 000023
【図９】
2020516584.tif 000024
【図１０】
2020516584.tif 000025
【図１１】
2020516584.tif 000026
【図１２】
2020516584.tif 000027
【図１３】
2020516584.tif 000028
【図１４】
2020516584.tif 000029
【図１５】
2020516584.tif 000030
【配列表】
2020516584000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成30年12月19日(2018.12.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物
【化１】
2020516584.tif 000031
またはその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物と、１種または複数の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項３】
医薬に使用するための、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ウイルス感染症またはがんの治療に使用するための請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
治療上有効量の請求項１に記載の化合物を、それを必要とするヒトまたは動物対象に投与するステップを含む、ウイルス感染症によって引き起こされる疾患を治療または予防する方法。
【請求項６】
式（ＩＩ）
【化２】
2020516584.tif 000032
のアグリコンを３−ヒドロキシル位でグリコシル化する生体内変換株の培養物に添加することを含む、請求項１に定義される化合物を調製する方法であって、前記生体内変換株が配列番号１（ＡｎｇＭＩＩ）または配列番号２（ＡｎｇＭＩＩＩ）と７０％以上の相同性を有するグリコシルトランスフェラーゼを発現する、上記方法。
【国際調査報告】
2020516584.tif 000033
2020516584.tif 000034