(57)【要約】ＩＧＦが病態の亢進に関与している癌、末端肥大症、糖尿病性合併症等の疾患の治療のための医薬品が求められている。ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２】
ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である請求の範囲１に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項３】
バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が１×１０９Ｍ−１以上である請求の範囲１または２に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項４】
抗体分子のクラスがＩｇＧである、請求の範囲１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項５】
遺伝子組換え抗体が、ヒトＩＧＦに対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求の範囲１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項６】
遺伝子組換え抗体、または抗体断片のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表される請求の範囲５に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項７】
遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される請求の範囲５に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項８】
遺伝子組換え抗体、または抗体断片のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表され、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される請求の範囲５〜７のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項９】
遺伝子組換え抗体または該抗体活性断片のＶＨが、配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１０】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１１】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１０のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１２】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１１のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１３】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜１１のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１４】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１５】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１６】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４または１５のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１７】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１８】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項１９】
遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む請求の範囲５〜８、１２、１４〜１６のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２０】
遺伝子組換え抗体がヒト型ＣＤＲ移植抗体である請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
【請求項２１】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である請求の範囲１〜１９のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項２２】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
【請求項２３】
請求の範囲２２に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
【請求項２４】
請求の範囲２３に記載の発現ベクターを導入して得られる形質転換体。
【請求項２５】
請求の範囲２４に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中に請求項１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を単離し、精製する工程を含む、遺伝子組換え抗体または該抗体断片を製造する方法。
【請求項２６】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬。
【請求項２７】
請求の範囲１〜２１のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＩＧＦ関連疾患の治療薬。
【請求項２８】
ＩＧＦ関連疾患が、癌、末端肥大症および糖尿病性合併症である請求項２７に記載の治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（以下、ｈＩＧＦ−Ｉと記す）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（以下、ｈＩＧＦ−ＩＩと記す）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬に関する。
【背景技術】  ＩＧＦは、乳房、前立腺、肺、結腸などの器官の上皮系細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）の制御に重要な役割を果たしており、その生物活性は、ＩＧＦ受容体（ＩＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；以下、ＩＧＦ−Ｒと表記する）を介在する（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３，１９９５）。また、ＩＧＦの代謝を抑制されているだけでなく、ＩＧＦの運搬およびＩＧＦの受容体への結合を制御している１０種類のＩＧＦ結合蛋白質（ＩＧＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；以下、ＩＧＦＢＰと表記する）が存在する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４，１１８４３，１９８９）。
ＩＧＦには、一本鎖のポリペプチドからなるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩの２種類が存在し、いずれもインスリンの前駆体であるプロインスリンとアミノ酸レベルで約４０％の相同性を有している（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６８，１８３，１９９６）。生体内では、インスリン受容体、ＩＧＦ−Ｉ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＲと表記する）、ＩＧＦ−ＩＩ受容体（以下、ＩＧＦ−ＩＩＲと表記する）、およびインスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲのハイブリッド受容体が、ＩＧＦの受容体として機能している。
インスリン受容体およびＩＧＦ−ＩＲは、いずれもチロシンキナーゼ型受容体であり（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３，１９９５、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４７，２３５，１９９８）、両者のアミノ酸レベルでの相同性は約６０％である。インスリン受容体およびＩＧＦ−ＩＲは、それぞれの特有のリガンドであるインスリンおよびＩＧＦ−Ｉに対して高い結合特異性を有するが、インスリン、ＩＧＦ−ＩあるいはＩＧＦ−ＩＩのそれぞれとも結合性を有する（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６３，１１４８６，１９８８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６８，７３９３，１９９３）。また、インスリン受容体とＩＧＦ−ＩＲの各サブユニットからなるハイブリッド受容体は、インスリンよりもＩＧＦ−Ｉに対して高い結合特異性を有しており、ＩＧＦ−ＩＲとして機能していると考えられているが、生体内での役割は不明である（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，３−３４，１９９５、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１６，１４３，１９９５）。ＩＧＦ−ＩＩＲは、ＩＧＦファミリーのうちＩＧＦ−ＩＩとのみ結合できるが、チロシンキナーゼ活性を有していないためＩＧＦ−ＩＩのアンタゴニストとして機能していると考えられている（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，９４，１２９８１，１９９７）。以上のように、２種のＩＧＦは、これら４種の受容体に加え、１０種のＩＧＦ結合蛋白質（以下、ＩＧＦＢＰと表記する）と複雑なネットワークを形成し、生体内で機能している。
ＩＧＦは、肉腫、白血病、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌等の多種類の癌で発現が認められており、これらの癌細胞に対して強い増殖促進作用を示すことが知られている（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，６５，３１１，１９９２、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１１，１５９１，１９９１、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１２２，５４、１９９５、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，５４，５０２，１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３７，１７６４，１９９６）。また、転移性の高い癌では、転移性の低い癌よりもＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が高いことが知られており（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，６５，８１２，１９９６）、癌の転移にもＩＧＦの関与が示唆されている。ＩＧＦの細胞増殖促進作用は、主にＩＧＦ−ＩＲを介した作用であるが（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１３６，４２９８，１９９５、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２８，６０７１，１９９９）、一部の乳癌細胞では、ＩＧＦ−ＩＩがインスリン受容体を介して作用することも知られている（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，１８，２４７１，１９９９）。
臨床的および疫学的な検討においても、乳癌（Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ＆  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎｓ，１１，１５６６，２００２、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ，４９２，１９９３）、神経膠腫、肺癌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｉｎｓｉｔｕｔｅ，９２，７３７，２０００）、大腸癌（Ｇｕｔ，４４，７０４，１９９９）、前立腺癌（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，２９４２，２００２、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７９，５６３，１９９８）、卵巣癌（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１０１，５４９，２００２）、膀胱癌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ，１６９，７１４，２００３）および骨肉腫などの多くの癌組織におけるＩＧＦあるいはＩＧＦ−ＩＲ、または血清ＩＧＦ量の増加が報告されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９２，１４７２，２０００）。更に、ＩＧＦ−ＩＲが発現している癌患者は、予後が不良となることが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５７，３０７９，１９９７）。
また、細胞死誘導活性を有するインターフェロンあるいは腫瘍壊死因子により誘導される大腸癌細胞の細胞死は、ＩＧＦ−Ｉにより抑制されることが知られている。また、多形膠芽腫患者由来の初代培養細胞では、放射線感受性の癌細胞と比較して、放射線耐性の癌細胞ではＩＧＦ−ＩＲおよびリン酸化ＩＧＦ−ＩＲの発現量が増大していること、更に放射線感受性の癌細胞の上皮増殖因子受容体の機能を阻害した場合、ＩＧＦ−ＩＲの発現量が増大することが知られている。以上のことから、ＩＧＦは癌細胞の増殖促進効果だけでなく、ＩＧＦ−ＩＲを介して癌細胞のサバイバルシグナルを増強し、癌細胞の薬剤耐性取得にも関与している（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，９３，１８５２，２００１、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２０，１９１３，２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６０，２００７，２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，２００，２００２）。
さらに、癌以外の疾患でも、ＩＧＦの関与が示唆されている疾患が報告されている。巨人症、末端肥大症では成長ホルモンの異常分泌により、二次的にＩＧＦが異常発現し、病態の亢進に関与していると考えられている（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ＆  ＩＧＦ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，９８，２００３）。また、糖尿病性合併症（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６，１７０６，１９９７、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７４，Ｆ１０４５，１９９８）、リウマチ性関節炎の病態形成にもＩＧＦ−Ｉの関与が示唆されている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，８１，５０，１９９６、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，３９，１５５６，１９９６）。
モデル動物を用いた研究においても、ＩＧＦと種々の疾患の関係が検討されている。ヒト前立腺癌細胞移植モデルマウスでは、アンドロゲン非依存性増殖能の獲得に伴い、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＲの発現が上昇することが知られている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６１，６２７６，２００１）。また、血清中のＩＧＦの大部分は肝臓で生産されるが、肝臓でのみＩＧＦ−Ｉを欠損したマウスでは同所移植した大腸癌の増殖が抑制されることから、血清中のＩＧＦが腫瘍増殖に関与していることも知られている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，１０３０，２００２）。ＩＧＦを体内局所に発現させたマウスでは、腫瘍の出現あるいは過形成が認められる（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２，８５３，２００３、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅｒｃｈ，６０，１５６１，２０００、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６９，１３７７９，１９９４）。
以上のように、ＩＧＦ、ＩＧＦ−ＲおよびＩＧＦＢＰは癌の発生、増殖、および転移だけでなく、末端肥大症、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎などにおいても重要な役割を果たしている。
これまでに、ＩＧＦとＩＧＦ−Ｒ間のシグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍効果が検討されており、ＩＧＦ−ＩＲを標的とした抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６３，５０７３，２００３、ＷＯ０２／５３５９６）、ＩＧＦ−Ｒ阻害剤（ＷＯ９９／２８３４７）、あるいは血清中のＩＧＦを抑制できるＩＧＦＢＰが動物モデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，６２，３５３０，２００２）。
しかし、抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体では、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着は阻害するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖は抑制されないことが示されており、ＩＧＦ−ＩＲの作用阻害のみでは、十分な抗腫瘍効果が得られないことが示されている（Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，２２，１０１，１９９２）。
ＩＧＦに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ抗体と表記する）としては、種々の抗体が知られている。代表的なヒトＩＧＦ−Ｉに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体と表記する）としては抗ｈＩＧＦ−Ｉマウス抗体ｓｍ１．２（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８１，２３８９，１９８４）が、あるいはヒトＩＧＦ−ＩＩに対する抗体（以下、抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体と表記する）としては、抗ｈＩＧＦ−ＩＩマウス抗体Ｓ１Ｆ２（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１２４，８７０，１９８９）があげられる。ｓｍ１．２は、ＩＧＦ−ＩＩに対して４０％の、ＳＩＦ２はｈＩＧＦ−Ｉに対して１０％程度の交差反応性を有しており、両抗体ともそれぞれｉｎ ｖｉｔｒｏでのｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩ依存性の細胞増殖を阻害できることが知られている。
ヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体をヒトに投与すると、マウス抗体が異物として認識されることにより副作用を惹起するばかりか、投与抗体の消失が早く治療上有用ではない。これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８１，６８５１，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｎａｔｕｒｅ，３２１，５２２，１９８６）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約６倍伸びたことが報告されている（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２９Ａ，４９２，１９９３）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６，１１１８，１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８，１９９５）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、ヒト化抗体を含めた抗体からＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２，２４９，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１，２９６６，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片の作製が可能となっている。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２，１９９２）。
【発明の開示】
本発明の目的は、ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬等を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）  ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ）と特異的に結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２）  ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である（１）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（３）  バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が１×１０９Ｍ−１以上である（１）または（２）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（４）  抗体分子のクラスがＩｇＧである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（５）  遺伝子組換え抗体がヒトＩＧＦに対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（６）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＨの相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（７）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（８）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号５、６および７で表され、ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３が、それぞれ配列番号８、９および１０で表される（５）〜（７）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（９）  遺伝子組換え抗体または該抗体活性断片のＶＨが、配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１０）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１１）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１０）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１２）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびＶＬが、配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１３）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつＶＬが、配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１４）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）または（１２）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１５）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む請求項５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１６）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７、２８または２９で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）または（１５）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１７）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１８）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１９）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２０）  遺伝子組換え抗体がヒト型ＣＤＲ移植抗体である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２１）  抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化可変領域（ｄｉａｂｏｄｙ）、ジスルフィド安定化可変領域（ｄｓＦｖ）およびＣＤＲを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の抗体断片。
（２２）  （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするＤＮＡ。
（２３）  （２２）に記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。
（２４）  （２３）に記載の発現ベクターを導入して得られる形質転換体。
（２５）  （２４）に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中に（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を単離し、精製する工程を含む、遺伝子組換え抗体または該抗体断片を製造する方法。
（２６）  （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬。
（２７）  （１〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有するＩＧＦ関連疾患の治療薬。
（２８）  ＩＧＦ関連疾患が、癌、末端肥大症および糖尿病性合併症である（２７）に記載の治療薬。
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの生物学的活性を阻害する遺伝子組換え抗体または該抗体断片であれば、いかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好ましい。
本発明のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合できる遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、例えば、ｈＩＧＦ−Ｉに対するモノクローナル抗体でｈＩＧＦ−ＩＩに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体あるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対するモノクローナル抗体でｈＩＧＦ−Ｉに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体から、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
抗体のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合の強さが同程度であるとは、抗体がｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対して同程度の結合活性を有していることをいう。
結合活性は、公知の測定法により数値化することができる。公知の測定法としては、酵素免疫学的測定法（以下、ＥＬＩＳＡ法と記す）や表面プラズモン共鳴の原理（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ、１４５，２２９，１９９１）などを利用したバイオセンサー法（以下、バイオセンサービアコアと記す）などが用いられる。バイオセンサービアコアによる測定は、２分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、ＳＰＲシグナルとして検出するものである。
ＥＬＩＳＡ法による測定法としては、例えば、固相化した抗原に対して結合する抗体量を測定するＥＬＩＳＡ法で得られるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対する結果を比較する方法や、同様のＥＬＩＳＡ法において抗体の反応時に抗原を同時に添加して、固相化した抗原に結合する抗体量の減少を測定する競合ＥＬＩＳＡ法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８）で得られるＩＧＦ−ＩとＩＧＦ−ＩＩに対する結果を比較する方法などによって、抗体のＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの両者に対する結合活性を測定する方法などがあげられる。
抗体がｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対して同程度の結合活性を有していることとは、上記の測定法により数値化された抗体のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性を比較して、抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を１としたとき、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性が０．１〜１０、好ましくは０．２〜５、さらに好ましくは０．５〜２、最も好ましくは１であることをいう。
ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩ両者の生物活性を阻害する能力とは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体を介するｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩからのシグナル伝達を阻害して、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの持つ生物学的活性を阻害することなどがあげられ、例えば、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体との結合を阻害することがあげられる。このような抗体が持つ抗原の生物活性を阻害する活性は、抗体の中和活性ともいう。
ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの持つ生物学的活性としては、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体を介して、細胞の増殖を促進する活性などがあげられる。
ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに特異的な受容体とは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩと結合することができる受容体をいい、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＩＧＦ−ＩＩ受容体、インスリン受容体およびＩＧＦ−Ｉとインスリン受容体のハイブリッド受容体などがあげられる。
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有していればいかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、バイオセンサービアコアで測定されるヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩに対する結合定数が好ましくは１×１０９Ｍ−１以上、より好ましくは２×１０９Ｍ−１以上、さらに好ましくは３×１０９Ｍ−１以上、最も好ましくは５×１０９Ｍ−１以上である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好適に用いられる。
本発明の遺伝子組換え抗体は、遺伝子工学的手法を用いて作製される抗体をいう。このような遺伝子組換え抗体としては、好ましくはヒト抗体の定常領域を含む遺伝子組換え抗体、より好ましくはヒト抗体の定常領域と可変領域のフレームワーク（以下、ＦＲと記す）を含んでなる遺伝子組換え抗体が望ましい。このような遺伝子組換え抗体は、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（以下、ＣＤＲと記す）移植抗体、遺伝子組換え非ヒト動物によって作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。また、人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のＣＤＲを、適当なヒト抗体のＦＲなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結させて作製された遺伝子組換え抗体なども含まれる。
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はＶ領域、重鎖はＨ鎖としてＨＶまたはＶＨと記す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はＬ鎖としてＬＶまたはＶＬと記す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、ＣＨと記す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、ＣＬと記す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体ＣＨおよびヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のＣＨとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、ｈＩｇと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３およびγ４クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型キメラ抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）を元に製造されるヒト型キメラ抗体、ＶＨが配列番号２および／またはＶＬが配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、形質転換体ＫＭ３００２（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９６）により生産される抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２などがあげられる。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをヒト抗体のＶＨおよびＶＬ中の適切な位置に移植して作製される抗体を意味する。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ配列に移植したＶ領域のアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築し、ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型ＣＤＲ移植抗体を発現させ、製造することができる。ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲ配列に移植したＶ領域アミノ酸配列は、数箇所の変異を導入した配列を設計してもよい。この様にして設計されたアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１０，６４８７（１９８２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７９，６４０９（１９８２）、Ｇｅｎｅ，３４，３１５（１９８５）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１３，４４３１（１９８５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２，４８８（１９８５）等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。置換されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＣＨとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよいが、ｈＩｇＧクラスのものが好適であり、更にｈＩｇＧクラスに属するγ１、γ２、γ３およびγ４クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のＣＬとしては、ｈＩｇに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
本発明のヒト型ＣＤＲ移植抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体であればいかなるものでも含まれ、好ましくは抗ヒトＩＧＦ抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、ラットハイブリドーマＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）により生産される抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号５、６、７および／または抗体のＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３がそれぞれ配列番号８、９、１０で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体などがあげられる。
これらのヒト型ＣＤＲ移植抗体組成物のなかでも、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体が好ましく、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号１１で表されるアミノ酸配列のうち１番目のＧｌｎ、１１番目のＶａｌ、４２番目のＧｌｙ、７５番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号１４で表されるアミノ酸配列のうち、４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号５４で表されるアミノ酸配列のうち４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号５５で表されるアミノ酸配列のうち４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体がより好ましい。
具体的には、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列、配列番号２８で表されるアミノ酸配列または配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体、抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体および抗体のＶＨが配列番号２６で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のＶＬが配列番号２９で表されるアミノ酸配列を含むヒト型ＣＤＲ移植抗体があげられる。
ヒト抗体としては、遺伝子組換え非ヒト動物から作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、あるいは遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。
本来ヒト抗体とは、天然にヒト体内に存在する抗体を示すが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩によりモノクローナルなヒト抗体の作製が可能となった。
本発明のヒト抗体としては、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には遺伝子工学的手法あるいは細胞工学的手法により、ヒト抗体産生細胞を作製し、該細胞により生産されたヒト抗体や、あるいはヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物から通常のハイブリドーマ作製法により得られたモノクローナル抗体などが含まれる。
遺伝子工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたヒト抗体ファージライブラリーを作製し、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収する方法があげられる。該抗体断片は、更に蛋白質工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換する方法などがあげられる。
細胞工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、ＥＢウイルスなどを感染させて不死化させた後、限界希釈法によるクローニングを経て、該抗体を産生する継代培養が可能なリンパ球を単離する方法があげられる。該リンパ球を培養し、該培養物中より目的の抗体を精製し、取得する方法などがあげられる。
人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のＣＤＲを、適当なヒト抗体のＦＲなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結し、遺伝子組換え抗体を作製する場合の人為的抗体遺伝子ライブラリーとしては、抗体産生細胞の集団から作製された抗体遺伝子ライブラリーや、該抗体遺伝子ライブラリーに無作為変異を導入してライブラリーのレパートリーが増大された抗体遺伝子ライブラリーなどが含まれる。
本発明の抗体断片としては、上記抗体の可変領域の一部あるいは全部を含み、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体活性断片などが含まれる。抗体断片としては、以下に示す、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
Ｆａｂは、ＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のＦａｂ’は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂ’を製造することができる。
ｓｃＦｖは、１本のＶＨと１本のＶＬとを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと記す）を用いて、ＶＨ−Ｐ−ＶＬないしはＶＬ−Ｐ−ＶＨの順で連結されたポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のｓｃＦｖは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｉａｂｏｄｙは、ｓｃＦｖが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。ｄｉａｂｏｄｙが持つ二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のｄｉａｂｏｄｙは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡをＰのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるように構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベタターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｉａｂｏｄｙを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７−７０４，１９９４）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のｄｓＦｖは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。
また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明の抗体および抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを遺伝子工学的あるいは化学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
本発明の遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片をコードするＤＮＡと、結合させたい蛋白質をコードするＤＮＡを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
本発明の化学的に結合させた抗体の誘導体は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片のＨ鎖あるいはＬ鎖のＮ末端側あるいはＣ末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４）により結合させることにより製造することができる。
放射性同位元素としては、１３１Ｉ、１２５Ｉなどがあげられ、例えば、クロラミンＴ法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、１９９６）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、１９８２）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧと記す）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（１）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（２）血中半減期の顕著な延長、（３）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。例えば、ＰＥＧと抗体を結合させる方法としては、ＰＥＧ化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、１９９３）。ＰＥＧ化修飾試薬としては、リジンのε−アミノ基の修飾剤（特昭６１−１７８９２６）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭５６−２３５８７）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平２−１１７９２０）などがあげられる。
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン２（以下、ｈＩＬ−２と記す）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＧＭ−ＣＳＦと記す）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、ｈＭ−ＣＳＦと記す）、ヒトインターロイキン１２（以下、ｈＩＬ−１２と記す）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体および抗体断片をコードするｃＤＮＡと蛋白質をコードするｃＤＮＡを連結させた融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
以下に、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに特異的に結合し、かつ、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製方法、該抗体断片の作製方法、ならびにそれらの活性の評価方法、および本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法について説明する。
１．ヒト化抗体の作製
（１）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のＣＨおよび／またはＣＬをコードする遺伝子が組み込まれた抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
ヒト抗体のＣ領域は任意のヒト抗体のＣＨおよびＣＬであることができ、例えば、ヒト抗体のＨ鎖のＩｇＧ１サブクラスのＣ領域（以下、ｈＣγ１と記す）およびヒト抗体のＬ鎖のκクラスのＣ領域（以下、ｈＣκと記す）などがあげられる。ヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体ＤＮＡあるいはｃＤＮＡを用いることもできる。
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のＣ領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ｐＡＧＥ１０７（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３，１９９０）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７，１９８７）、ｐＨＳＧ２７４（Ｇｅｎｅ，２７，２２３，１９８４）、ｐＫＣＲ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７８，１５２７，１９８１）、ｐＳＧ１βｄ２−４（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４，１７３，１９９０）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、ＳＶ４０の初期プロモーターとエンハンサー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０１，１３０７，１９８７）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーターとエンハンサー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１４９，９６０，１９８７）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Ｃｅｌｌ，４１，４７９，１９８５）とエンハンサー（Ｃｅｌｌ，３３，７１７，１９８３）などがあげられる。
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体Ｈ鎖およびＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と記す）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体Ｈ鎖およびＬ鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１６７，２７１，１９９４）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１７，５５９，１９９８）などがあげられる。
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型ＣＤＲ移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（２）ヒト以外の動物の抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは以下のようにして取得する。
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりｍＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のＣ領域部分あるいはＶ領域部分をプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のＶＨおよびＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全ＲＮＡを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５４，３，１９８７）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）などがあげられる。また、ハイブリドーマからｍＲＮＡを調製するキットとしては、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）などがあげられる。
ｃＤＮＡの合成およびｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）、あるいは市販のキット、例えば、Ｓｕｐｅｒ  ＳｃｒｉｐｔＴＭ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）やＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いる方法などがあげられる。
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，５，５８，１９９２）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｉ，４９，１９８５）、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３，２８０，１９８３）およびｐＵＣ１８（Ｇｅｎｅ，３３，１０３，１９８５）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，２７１，１９９２）、Ｃ６００（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５９，１７７−１９０，１９６８）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，７７８，１９８３）、ＮＭ５２２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６６，１，１９８３）、Ｋ８０２（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１６，１１８，１９６６）およびＪＭ１０５（Ｇｅｎｅ，３８，２７５，１９８５）などが用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識、あるいは酵素標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）により選択することができる。また、プライマーを調製し、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡあるいはｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、ＰＣＲ法と記す；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３４）によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素等で切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７４，５４６３，１９７７）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）などを用いて解析することで該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
決定した塩基配列からＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨおよびＶＬの全アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびＮ末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨおよびＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、既知の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）と比較することによって見出すことができる。
さらに、ＶＨおよびＶＬの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴやＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎなどに対してＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（３）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬの３’末端側の塩基配列とヒト抗体のＣＨおよびＣＬの５’末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成ＤＮＡとそれぞれ連結し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型として、５’末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを増幅し、それぞれを上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（４）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋなどのデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、１００塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらをＰＣＲ法により連結する。この場合、ＰＣＲでの反応効率および合成可能なＤＮＡの長さから、ＶＨ、ＶＬとも４〜６本の合成ＤＮＡを設計することが好ましい。
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ反応による連結後、ＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）などのプラスミドにクローニングし、上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドクローンを取得する。
（５）ヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型ＣＤＲ移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のＶＨおよびＶＬでは、ＣＤＲのアミノ酸残基のみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与している。ＣＤＲの移植時には、それらアミノ酸残基がヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲに由来するアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。このため、ヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、ＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、抗体の立体構造を維持するアミノ酸残基および間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらをＣＤＲの由来となったヒト以外の動物の抗体配列中に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，９，２６６，１９９１）。ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１２，５３５，１９７７）あるいはコンピューターモデリング（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，１５０１，１９９４）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型ＣＤＲ移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
ヒト抗体のＶＨおよびＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて上記２（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について上記２（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（６）ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流に、上記２（４）および（５）で構築したヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡをクローニングし、ヒト型ＣＤＲ移植抗体発現ベクターを構築することができる。
例えば、上記２（４）および（５）でヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬを構築する際に用いる合成ＤＮＡのうち、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記２（１）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のＣＨおよびＣＬをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（７）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、サル腎臓由来細胞株ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）が一般に用いられる（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）。ＣＯＳ−７細胞への発現ベクターの導入法としては、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＣＲＣ  ｐｒｅｓｓ，２８３，１９９１）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，８４，７４１３，１９８７）、発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などにより測定できる。
（８）ヒト化抗体の安定発現
上記２（３）および（６）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７７，４２１６−４２２０，１９８０）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下、ＹＢ２／０細胞と表記する）などがあげられる。
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、Ｇ４１８  ｓｕｌｆａｔｅ（以下、Ｇ４１８と記す）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、ＲＰＭＩ１６４０培地（日水製薬社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）、またはこれら培地にウシ胎児血清などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ＥＬＩＳＡにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平２−２５７８９１に開示されている方法に従い、ｄｈｆｒ増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインＡカラムを用いて精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のＨ鎖、Ｌ鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＰＡＧＥと表記する：Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）やウエスタンブロッティング法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）などで測定することができる。
２．抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および２に記載の抗ｈＩＧＦ抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
抗体断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｄｓＦｖ、ＣＤＲを含むペプチドなどがあげられる。
（１）Ｆａｂの作製
Ｆａｂは、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインＡ結合性を有するＩｇＧサブクラスであれば、プロテインＡカラムに通すことで、ＩｇＧ分子やＦｃ断片と分離し、均一なＦａｂとして回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。プロテインＡ結合性を持たないＩｇＧサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Ｆａｂは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５）。
また、Ｆａｂは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ発現用ベクターとしては、ＦａｂをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＩＴ１０６（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０４１，１９８８）などがあげられる。Ｆａｂ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったＦａｂが漏出する。
リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なＦａｂを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９２）。
（２）Ｆ（ａｂ’）２の作製
Ｆ（ａｂ’）２は、蛋白質化学的にはＩｇＧを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Ｆａｂと同様の精製操作により、均一なＦ（ａｂ’）２として回収することができる（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）。また、下記３（３）に記載のＦａｂ’をｏ−ＰＤＭやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、ＤＴＮＢ［５，５’−ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（２−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ）］で処理し、Ｓ−Ｓ結合させる方法によっても作製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（３）Ｆａｂ’の作製
Ｆａｂ’は、上記３（２）に記載のＦ（ａｂ’）２をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Ｆａｂ’は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、Ｆａｂ’発現用ベクターにクローニングし、Ｆａｂ’発現ベクターを作製することができる。Ｆａｂ’発現用ベクターとしては、Ｆａｂ’をコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えばＦａｂ’発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＦａｂ’を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるＦａｂ’とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができるリフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインＧカラムなどを用いることにより、均一なＦａｂ’を精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（４）ｓｃＦｖの作製
ｓｃＦｖは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶ領域をコードするＤＮＡを、ｓｃＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ｓｃＦｖ発現ベクターを作製することができる。ｓｃＦｖ発現用ベクターとしては、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ＆  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｓｃＦｖ発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にｓｃＦｖがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、ｓｃＦｖ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｓｃＦｖとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（５）ｄｉａｂｏｄｙの作製
ｄｉａｂｏｄｙは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記２（２）、２（４）および、２（５）に記載の抗体のＶＨとＶＬをリンカーがコードするアミノ酸残基が８残基以下となるように連結したＤＮＡを作製し、ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターにクローニングし、ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを作製することができる。ｄｉａｂｏｄｙ発現用ベクターとしては、ｄｉａｂｏｄｙをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＨＦＡ（Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５，４８，１９９４）などがあげられる。ｄｉａｂｏｄｙ発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにｄｉａｂｏｄｙを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｉａｂｏｄｙとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なｓｃＦｖを精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  ＰＲＥＳＳ，１９９６）。
（６）ｄｓＦｖの作製
ｄｓＦｖは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記２（２）、２（４）および２（５）に記載の抗体のＶＨおよびＶＬをコードするＤＮＡの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたＤＮＡを作製する。作製した各ＤＮＡをｄｓＦｖ発現用ベクターにクローニングし、ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを作製することができる。ｄｓＦｖ発現用ベクターとしては、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＵＬＩ９（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）などがあげられる。ＶＨおよびＶＬの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＶＨおよびＶＬポリペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＶＨおよびＶＬポリペプチドを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるｄｓＦｖとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
（７）ＣＤＲペプチドの作製
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法あるいはｔＢｏｃ法等の化学合成法によって作製することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドをコードするＤＮＡを作製し、作製したＤＮＡを適当な発現用ベクターにクローニングし、ＣＤＲペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、ＣＤＲペプチドをコードするＤＮＡを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、ｐＬＥＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＡＸ４ａ＋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）などがあげられる。
発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにＣＤＲペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからＣＤＲペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７，１９９４）。
３．ヒト化抗体または該抗体断片の活性評価方法
培養上清中あるいは精製した抗ｈＩＧＦヒト化抗体のｈＩＧＦに対する結合活性は、ＥＬＩＳＡ法およびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記１．（７）に示したｈＩＧＦ依存的な増殖を示す細胞株のｉｎ ｖｉｖｏあるいはｉｎ ｖｉｔｒｏの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、ｈＩＧＦの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
（１）ＥＬＩＳＡによる活性評価
結合ＥＬＩＳＡとは、抗原を９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定化し、第一抗体として反応させ、第一抗体を認識することができる標識した二次抗体を反応させて、標識物を検出することにより、抗原と抗体との結合活性を測定する方法である。
具体的には、固定化する抗原としては、ｈＩＧＦ−ＩやｈＩＧＦ−ＩＩの精製蛋白質や部分配列を有するペプチドがあげられる。第一抗体としては、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体などの測定対象物があげられる。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体があげられる。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ラットイムノグロブリン（以下、ｒＩｇと表記する）マウス抗体などがあげられる。
競合ＥＬＩＳＡとは、あらかじめｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、測定対象物である抗体と、ｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩとを同時に添加して、反応させ、プレートに固定化した抗原と反応対象物である抗体の反応を、反応液中に添加したもう一種あるいは同一の抗原が阻害することを、プレートに結合する一次抗体の量の変化で測定する方法である。抗体の結合量の変化は抗体に対する二次抗体により検出する。また、天然型のｈＩＧＦおよびｈＩＧＦの部分ペプチドを用いた競合ＥＬＩＳＡにより、天然型のｈＩＧＦとの反応性および抗原エピトープを解析することができる。抗体がｈＩＧＦの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる構造的解析法により調べることができる。構造的解析法としては、例えば、Ｘ線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。
（２）バイオセンサービアコアによる活性評価
バイオセンサービアコアによる測定は、２分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、ＳＰＲシグナルとして検出するものである。本法での測定から導きだされた結合速度定数（以下、Ｋａｓｓと表記する）、解離速度定数（以下、Ｋｄｉｓｓと表記する）から、ＫＡ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される結合定数（以下、ＫＡと表記する）が算出される。ＫＡは、Ｍ−１の単位で表される。バイオセンサービアコアでの測定は、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で行うことができる。至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化するリガンドの量は、式１により算出される最小値と式２で算出される最大値の間の範囲であることが好ましい。また、アナライトの結合量は、式３で算出される最大結合量以下であることが好ましい。式１、式２および式３において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Ｓとはリガンドの結合部位数を示す。ＲＵとは、Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔの略であり、センサーチップ表面での単位面積あたりの質量の変化量を示し、１ＲＵ＝１ｐｇ／ｍｍ２に相当する。バイオセンサービアコアでの測定では、最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った結合定数の解析を行うことができる。
（式１）
最小固定化量（ＲＵ）＝２００×１／Ｓ×（リガンドの分子量／アナライトの分子量）
（式２）
最大固定化量（ＲＵ）＝１０００×１／Ｓ×（リガンドの分子量／アナライトの分子量）
（式３）
最大結合量＝アナライトの分子量×リガンドの固定化量（ＲＵ）／リガンドの分子量×Ｓ
４．本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩと特異的にかつ同程度の強さで結合し、かつ、その機能を阻害するため、ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患などの治療に有用であると考えられる。また、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、かつ、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
ｈＩＧＦ介在性疾患および異常なｈＩＧＦの産生亢進により病態が進行する疾患としては、癌、末端肥大症および糖尿病合併症などがあげられる。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、蛋白質またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
本発明の抗ｈＩＧＦ抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される１つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体および抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体および抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および抗体断片、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】［実施例１］
抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡの構築
（１）抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の設計
抗ヒトＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
参考例５の１．項で決定した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８（ラットＩｇＧ２ｂ）のＶＨ（配列番号２）のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
公的データベースより、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＦＲと最も高い相同性を有するヒト抗体のＦＲを検索した結果、抗体ＣＡＭ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，７７，３２３９−３２４３，１９８０）が最も高い８１．６％の相同性を有していた。そこで、抗体ＣＡＭ（以下、Ｃａｍと記す）のＶＨのＦＲのアミノ酸配列を基に、抗ｈＩＧＦヒト型ＣＤＲ移植抗体（以下、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体と記す）のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
ＣａｍのＦＲには、アミノ酸配列が一義的に決定されていない箇所が４箇所（１３番目、７４番目、７７番目、９０番目）存在し、また、ヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列では一般的でないアミノ酸残基が、３番目と４０番目に認められた。そこで、これらのアミノ酸残基については、免疫原性をより低下させるため、ヒト抗体で高い頻度で認められるアミノ酸残基（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）へ改変した。このようにして設計したＣａｍ由来のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１１に記載のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０を設計した。
更に、Ｃａｍとは異なるヒト抗体ＦＲからなる抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
Ｋａｂａｔらは、既知の様々なヒト抗体のＶＨをそのアミノ酸配列の相同性から３種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＩＩ）に分類し、さらに、それら各サブグループの共通配列を報告している（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）。この様な共通配列を有する抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が低いことが期待されることから、この共通配列のＦＲを基に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列を設計した。より活性の高い抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のＶＨの３種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第１表に示した。第１表に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＩＩのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。
2005028515.tif 000002
以上の結果から、ヒト抗体のＶＨのサブグループＩＩＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号５４に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＨＶ０（３）を設計した。
次に、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。参考例５の１．で決定した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬ（配列番号４）のＣＤＲのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
Ｋａｂａｔらは、既知の様々なヒト抗体のＶＬをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（ＨＳＧ  Ｉ〜ＩＶ）に分類し、さらにそれら各サブグループの共通配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を報告している。そこで、ヒト抗体のＶＬの４種類のサブグループの共通配列のＦＲのアミノ酸配列のうち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するＦＲのアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第２表に示した。第２表に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬ領域のＦＲのアミノ酸配列はサブグループＩＶのＦＲのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。
2005028515.tif 000003
以上の結果から、ヒト抗体のＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号１４に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０を設計した。
また、２番目に相同性の高いヒト抗体のＶＬはサブグループＩであった。そこで、サブグループＩの共通配列のＦＲのアミノ酸配列の適切な位置に抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、配列番号５５に記載の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０（１）を設計した。
上記で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０およびＨＶ０（３）、ならびにＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０およびＬＶ０（１）は、選択したヒト抗体のＦＲのアミノ酸配列に抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＣＤＲのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般にヒト型ＣＤＲ移植抗体では、ＣＤＲのアミノ酸配列の移植のみでは抗原との結合活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とヒト以外の動物の抗体で異なっているＦＲのアミノ酸残基のうち、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をＣＤＲのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるＦＲのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
まず、上記で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨのアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０とＨＶ０（３）、および抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬのアミノ酸配列ＬＶ０とＬＶ０（１）からなる４通りの組み合わせのヒト型ＣＤＲ移植抗体［以下、ＣａｍＨＶ０のアミノ酸配列を有するＶＨとＬＶ０のアミノ酸配列を有するＶＬを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＣａｍＨＶ０／ＬＶ０などと記す；ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０（１）、ＨＶ０（３）ＬＶ０およびＨＶ０（３）ＬＶ０（１）。］のＶ領域の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアＰｒｏ−Ｅｘｐｌｏｒｅ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社製）、ＲａｓＭｏｌ（Ｇｌａｘｏ社製）またはＶｉｅｗｅｒ  Ｌｉｔｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．社製）を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従い、行った。同様に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域の三次元構造のコンピューターモデルも構築した。更に、それぞれのヒト型ＣＤＲ移植抗体Ｖ領域のＦＲのアミノ酸配列において、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列中に認められるアミノ酸残基と異なっている残基について、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のアミノ酸配列中のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる改変体の三次元構造モデルを同様に構築し、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、およびそれぞれの改変体の元となった４通りの組み合わせのヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶ領域の三次元構造を比較した。
その結果、改変体のＶ領域のＦＲのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の抗原との結合活性に影響を与えると考えられる残基として、ＣａｍＨＶ０では１番目のＧｌｎ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇを選択した。さらに、三次元構造モデルからでは抗体の活性への影響は明らかではなかったが、４２番目のアミノ酸は一般にＧｌｙであるのに対して、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８ではＴｈｒであり、本アミノ酸残基が抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８において特異的な役割を果たしている可能性が考えられたため、本残基も改変候補として選択した。同様に、ＨＶ０（３）では４９番目のＳｅｒ、７７番目のＡｓｎ、８４番目のＡｓｎ、９３番目のＶａｌ、９７番目のＡｌａ、９８番目のＡｒｇを、ＬＶ０では４番目のＭｅｔ、９番目のＡｓｐ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＬｅｕ、２２番目のＡｓｎ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＰｒｏ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＶａｌ、８４番目のＶａｌを、ＬＶ０（１）では４番目のＭｅｔ、９番目のＳｅｒ、１０番目のＳｅｒ、１１番目のＬｅｕ、１５番目のＶａｌ、３５番目のＴｙｒ、３９番目のＰｒｏ、４２番目のＡｌａ、４５番目のＬｅｕ、４６番目のＬｅｕ、６９番目のＡｓｐ、７０番目のＰｈｅ、７１番目のＴｈｒ、８２番目のＰｈｅをそれぞれ選択した。
このようにして選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも１つを抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列中のアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型ＣＤＲ移植抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列を設計した。
（２）ＣａｍＨＶ０をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計したアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列のＮ末端に配列番号２の１番目から１９番目のアミノ酸配列に相当する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号１２に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮した。
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、配列番号１３に示した。該塩基配列の５’末端と３’末端に、ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加し、ＣａｍＨＶ０をコードする塩基配列とした。該塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号３０、３１、３２および３３で表される４本の合成オリゴＤＮＡ（ファスマック社製）を合成した。
各合成オリゴＤＮＡを最終濃度が０．１μＭとなるようにＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）に添付の反応液に加え、更に０．４μＭ  Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）、０．４μＭ  Ｔ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）および１単位のＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、合計５０μＬとし、ＰＣＲ反応を行った。反応条件は９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃６０秒間のサイクルを３５サイクルで行った。反応後、該反応液を１．５％アガロース電気泳動により分画し、約０．５ｋｂｐ付近の遺伝子断片を、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。回収した遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、消化反応を行った後に、該反応液を１．５％アガロース電気泳動により分画し、制限酵素処理された遺伝子断片をゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（以下、ｐＢＳと記す）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を上記遺伝子断片と同様に制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＸｈｏＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、消化反応を行った後、分画、回収し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて添付説明書に従いｐＢＳとＣａｍＨＶ０遺伝子断片の連結反応を行った。連結反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析し、目的のアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０をコードする塩基配列を含む、第１図に示したプラスミドｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を取得した。
（３）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨの改変体をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＨの改変体をコードするｃＤＮＡの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
以下で使用した合成オリゴＤＮＡはファスマック社製のものを使用した。
（３−１）  １番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＱＡＲと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（２）で得られたｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を鋳型として、配列番号３８で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４１で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、９４℃３０秒間、５８℃４５秒間、７２℃６０秒間のサイクルを３５サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をｐＢＳにクローニングして、目的のアミノ酸配列ＱＡＲをコードする、配列番号１７で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＱＡＲを取得した。
（３−２）  １番目のＧｌｎをＧｌｕへ、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＱＧＡＲと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（２）で得られたｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０を鋳型として、配列番号３８で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号３９で表される合成オリゴＤＮＡを用いて約２５０ｂｐの５’−ＱＧ遺伝子断片を、また、配列番号４０で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４１で表される合成オリゴＤＮＡを用いて約２５０ｂｐの３’−ＧＡＲ遺伝子断片を、それぞれ上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応で増幅後、１．５％アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、５’−ＱＧ遺伝子断片の５’末端に位置するＴ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）および３’−ＧＡＲ遺伝子断片の３’末端に位置するＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロース電気泳動により約５００ｂｐの遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をｐＢＳにクローニングして、目的の配列番号２６で示されるアミノ酸配列ＱＧＡＲをコードする、配列番号１８で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＱＧＡＲを取得した。
（４）ＬＶ０をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計したアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡを以下のようにして構築した。
まず、設計したアミノ酸配列のＮ末端に配列番号４の１番目から２２番目のアミノ酸配列に相当する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＬ鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号１５に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。１つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）を考慮した。
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの塩基配列を設計し、配列番号１６に示した。該塩基配列の５’末端と３’末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むＰＣＲ反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加した。設計した塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号３４、３５、３６および３７で表される４本の合成オリゴＤＮＡを合成した。
各合成オリゴＤＮＡを用いて、実施例１の（２）と同様にしてＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＬＶ０をコードする、配列番号１６で示されるｃＤＮＡを含む、第１図に示したプラスミドｐＢＳ／ＬＶ０を取得した。
（５）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬの改変体をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（１）で設計した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のＶＬの改変体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、ＰＣＲ反応はＫＯＤ−ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
（５−１）  ４番目のＭｅｔをＬｅｕへ、９番目のＡｓｐをＴｈｒへ、１０番目のＳｅｒをＴｈｒへ、１１番目のＬｅｕをＭｅｔへ、１５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、Ａｌｌと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
アミノ酸配列Ａｌｌをコードする、配列番号１９で示されるｃＤＮＡの塩基配列を５’末端側から約１５０塩基ずつ計４本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約２０塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号４６、４７、４８および４９で表される合成オリゴＤＮＡを合成した。
各オリゴＤＮＡを用い実施例１（２）と同様にして、ＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列Ａｌｌをコードする、配列番号１９で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／Ａｌｌを取得した。
（５−２）  ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＬＶＶと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４２で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、５’−ＰＬＬ遺伝子断片を、また、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４９で表される合成オリゴＤＮＡを用いて３’−ＶＶ遺伝子断片をそれぞれ上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行った。反応後、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、５’−ＰＬＬ遺伝子断片の５’末端に位置するＴ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）および３’−ＶＶ遺伝子断片の３’末端に位置するＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応からｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＰＬＬＶＶをコードする、配列番号２０で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＬＶＶを取得した。
（５−３）  ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＰＬＬＶＶと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４２で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号４３で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、ＮＰＬＬ遺伝子断片を増幅し、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したＮＰＬＬ遺伝子断片および配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＰＬＬ遺伝子断片を増幅し、実施例１（２）と同様にして該反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収した５’−ＮＰＬＬ遺伝子断片、上記（５−２）で得られた３’−ＶＶ遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＮＰＬＬＶＶをコードする、配列番号２１で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＰＬＬＶＶを取得した。
（５−４）  ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＹＰＬＬと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記（５−４）で得られたｐＢＳ／ＮＰＬＬＶＶを鋳型として、配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５３で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＹＰＬＬ−１遺伝子断片を回収した。一方、実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡとＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−ＬＶ０遺伝子断片を回収した。５’−ＮＹＰＬＬ−１遺伝子断片、３’−ＬＶ０遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列ＮＹＰＬＬをコードする、配列番号２２で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＹＰＬＬを取得した。
（５−５）  ２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれへ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記（５−４）で得られたｐＢＳ／ＮＹＰＬＬを鋳型として、配列番号４５で表される合成オリゴＤＮＡと配列番号５０で表される合成オリゴＤＮＡを用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＮＹＰＬＬ−２遺伝子断片を回収した。一方、上記（５−１）で得られたｐＢＳ／Ａｌｌを鋳型として、配列番号４４で表される合成オリゴＤＮＡおよびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−３Ａｌｌ遺伝子断片を回収した。５’−ＮＹＰＬＬ−２遺伝子断片、３’−３Ａｌｌ遺伝子断片、Ｔ３プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＴ７プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２７に示されるアミノ酸配列ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌをコードする、配列番号２３で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌを取得した。
（５−６）  ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＤＦＴと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
実施例１（４）で得られたｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号５１で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＰＬ遺伝子断片を回収した。一方、ｐＢＳ／ＬＶ０を鋳型として、配列番号５２で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、３’−ＤＦＴ遺伝子断片を回収した。５’−ＰＬ遺伝子断片、３’−ＤＦＴ遺伝子断片、Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２８に示されるアミノ酸配列ＰＬＤＦＴをコードする、配列番号２４で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＤＦＴを取得した。
（５−７）  ４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、ＰＬＬＤＦＴと記す）をコードするｃＤＮＡの構築
上記で得られたｐＢＳ／ＰＬＬＶＶを鋳型として、配列番号４５で表される合成オリゴＤＮＡとＭ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−１）と同様にしてＰＣＲ反応を行い、５’−ＰＬＬ遺伝子断片を回収した。５’−ＰＬＬ遺伝子断片、上記（５−６）で得られた３’−ＤＦＴ遺伝子断片、Ｍ１３ＲＶプライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）およびＭ１３Ｍ２０プライマー（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社製）を用いて、上記（３−２）と同様にしてＰＣＲ反応から、ｐＢＳへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号２９に示されるアミノ酸配列ＰＬＬＤＦＴをコードする、配列番号２５で示されるｃＤＮＡを含むプラスミドｐＢＳ／ＰＬＬＤＦＴを取得した。
［実施例２］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現
（１）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３の適当な位置に実施例１（２）および（４）で取得したアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０またはアミノ酸配列ＬＶ０をコードするｃＤＮＡおよびこれらの改変体のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを挿入し、各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
アミノ酸配列ＣａｍＨＶ０、ＱＡＲおよびＱＧＡＲをコードするｃＤＮＡとｐＫＡＮＴＥＸ９３をそれぞれ制限酵素ＮｏｔＩおよびＡｐａＩで処理し、１．５％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約０．５ｋｂｐ、１２ｋｂｐの遺伝子断片を分離、回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｐＫＡＮＴＥＸ９３とアミノ酸配列ＣａｍＨＶ０、ＱＡＲおよびＱＧＡＲをコードする遺伝子断片を連結し、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲを取得した。
次にＶＬｃＤＮＡを挿入するため、アミノ酸配列ＬＶ０、ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、ＰＬＤＦＴおよびＰＬＬＤＦＴをコードするｃＤＮＡと上記で得られたｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲをそれぞれ制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｉＷＩで処理した後、１．５％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約０．４５ｋｂｐ、１２．５ｋｂｐの遺伝子断片を分離し、ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて回収した。Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いてｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲまたはｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲと各種ＶＬ遺伝子断片とを連結反応させ、連結反応により得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．３（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を解析し、第２図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲ／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＬＶ０、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、ｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴを取得した。
（２）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の動物細胞を用いた安定発現は、以下のように行った。
実施例２の（１）で得られた各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現ベクターの１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡを行い抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体発現細胞の選択を行った。
培養上清中に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ＤＨＦＲと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、ＭＴＸと表記する；ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ（５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の濃度を、実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡに準じて行い抗体発現量を確認した。
培養上清中に抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（５）で増殖可能かつ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を高発現する形質転換体を得た。該形質転換体の培養上清中に含まれるヒトＩｇＧの定量を実施例２（５）に記載のヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡにより行い、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現量の最も多いＭＴＸ耐性形質転換体を取得した。ＭＴＸ耐性形質転換体は必要に応じて、１〜２回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の発現量の最も多い形質転換クローンを取得した。
以下において、各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をそれぞれのＶ領域のアミノ酸配列を組み合わせて、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＡＲ／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＡＲ／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＬＶ０が導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＬＶ０と、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌが導入された形質転換体で生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体からＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌと、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴが導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴとおよびプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴが導入された形質転換体から生産される抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体をＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴとそれぞれ称す。
（３）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の培養上清からの精製
実施例２（２）で得られた各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を発現する形質転換体を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭ、を含むＧＩＴ培地（大日本製薬社製）５００ｍＬに、１〜２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、２Ｌローラーボトル（ファルコン社製）に分注した。３７℃インキュベーター内で７〜８日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約１ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を精製した。
（４）抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の抗原への結合活性の評価（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（藤沢薬品社製）とメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製して、使用した。すなわち、蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：８（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌して、メチル化ＢＳＡとｈＩＧＦ−Ｉのコンジュゲートを取得した（以下、ｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉと記す）。
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述のｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩをｈＩＧＦ−Ｉの濃度として２０ｎｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、各種形質転換体の培養上清あるいは精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄後、２０００倍に希釈したＨＲＰ標識化抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と記す）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）ヒトＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡ（サンドイッチＥＬＩＳＡ）
９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｑｕａｌｅｘ社製）をＰＢＳで２０００倍に希釈し、５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させプレートを作製した。ＢＳＡ−ＰＢＳを用いて残存する活性基をブロックする操作以降の操作は、上記の実施例２（４）に記載の結合ＥＬＩＳＡと同様に行った。
［実施例３］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の反応性の確認
実施例２（３）で得られた各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体の精製標品については、実施例２（４）に記載の結合ＥＬＩＳＡ、または下記に示す実施例３（２）に記載のバイオセンサービアコア（ビアコア社製）を用いたｈＩＧＦとの結合親和性の測定法などを用いて、ｈＩＧＦへの結合活性を検討した。以下の検討において、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２は、参考例６（４）に記載の方法に従って精製したものを用いた。
（１）ｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに対する結合ＥＬＩＳＡ
実施例２（３）に記載した方法により精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｍＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉへの結合活性を検討した。結果を第３図に示した。第３図ａに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＣＤＲのみをヒト抗体ＣａｍのＦＲおよびＶＬのサブグループＩＶの共通配列のＦＲに移植した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０では、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２に比べ、ｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性が約１／５０に低下していた。そこで、各ＦＲのアミノ酸を改変することによりｈＩＧＦ−Ｉ結合活性の増加を検討した。
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０からＶＨの１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへそれぞれ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０では、第３図ａに示したように、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べてｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性の増加は認められなかった。しかし、１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへのアミノ酸改変に加えて、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０では、第３図ａに示したように、ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と比較して約２５倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の結合活性の約１／２であった。
以上の結果から、ＣａｍＨＶ０の１番目のＧｌｎをＧｌｕへ、９７番目のＡｌａをＴｈｒへ、９８番目のＡｒｇをＴｈｒへのアミノ酸改変に加えて、４２番目のＧｌｙをＴｈｒへ改変することでｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を上昇させることが可能であること、また、三次元構造モデルでは活性への寄与が不明であった４２番目のＧｌｙは、本抗体の活性に非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
一方、ＶＬの改変体については、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０からＶＬの２２番目のＡｓｎをＴｈｒへ、３５番目のＴｙｒをＰｈｅへ、４２番目のＰｒｏをＳｅｒへ、４５番目のＬｅｕをＰｒｏへ、４６番目のＬｅｕをＴｒｐへ、６９番目のＡｓｐをＳｅｒへ、７０番目のＰｈｅをＴｙｒへ、７１番目のＴｈｒをＳｅｒへ、８２番目のＶａｌをＡｌａへ、８４番目のＶａｌをＴｈｒへそれぞれ改変した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３ＡｌｌのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性は、第３図ａに示したように、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０と比較して約２５倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の結合活性の約１／２の結合活性であった。以上の結果から、上記のＶＬの改変によってｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を上昇させることが可能であることが明らかとなった。そこで、アミノ酸配列がＱＧＡＲであるＶＨとアミノ酸配列がＮＹＰＬＬ３ＡｌｌであるＶＬとを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３ＡｌｌのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を検討した。結果を第３図ｂに示した。その結果、このようなＶＨとＶＬを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等の結合活性を示すことが確認された。
次に、ＶＬの改変体ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの１０残基の改変したアミノ酸残基の中から、活性上昇に重要なアミノ酸残基を特定するため、改変アミノ酸残基数が少ないアミノ酸配列がＰＬＤＦＴであるＶＬの改変体およびＰＬＬＤＦＴであるＶＬの改変体と、アミノ酸配列がＱＧＡＲであるＶＨの改変体とをぞれぞれ組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴのｈＩＧＦ−Ｉに対する結合活性を検討した。
結果を第３図ｂに示した。その結果、これら２種類の抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等のｈＩＧＦ−Ｉへの結合活性を示すことが明らかとなった。
（２）バイオセンサービアコアを用いた結合親和性の測定
抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と上記の実施例２（３）で精製した各種抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩへの結合活性をバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて以下のようにして、結合親和性として測定した。サンプルの希釈と測定中の反応緩衝液には、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．４）（ビアコア社製）を用いた。
センサーチップＣＭ−５（ビアコア社製）に、アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、１８．５ｐｇ／ｍｍ２でリコンビナントｈＩＧＦ−Ｉ（藤沢薬品社製）を、２６．７ｐｇ／ｍｍ２でｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｒ＆Ｄ社製）を固定化し、アナライトとして１０μｇ／ｍＬより２倍希釈で５段階に希釈した各種抗体を、流速５μＬ／分で４分間添加し、結合反応を観察した後、５分間にわたって解離反応を観察した。解離反応後、３０ｍＭ塩酸の５μＬを１回添加してセンサーチップ表面を再生した。反応は２５℃で行った。各濃度における反応曲線から、結合速度定数Ｋａｓｓおよび解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各抗体の結合定数ＫＡ（Ｍ−１）を算出した。結果を第３表に示した。
2005028515.tif 000004
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０は、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２に比べ、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡが、それぞれ約１／１７、約１／６に低下していた。
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０では、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて結合親和性の増加は殆ど認められないが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０では、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、約５倍増加した。
一方、ＶＬの抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌでは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、それぞれ約８倍、約５倍増加していた。更に、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌでは、ｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡが、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０に比べて、それぞれ約１４倍、約１０倍増加していた。
改変アミノ酸残基が最適化されたアミノ酸配列ＰＬＤＦＴまたはアミノ酸配列ＰＬＬＤＦＴを有するＶＬとアミノ酸配列ＱＧＡＲを有するＶＨを組み合わせた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴまたは抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴのｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合親和性は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌおよび抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２とほぼ同等であり、改変アミノ酸残基の減少よる活性低下は認められなかった。
［実施例４］
抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ依存性増殖阻害効果
上記実施例２（３）で得られた抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体精製標品のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を以下のようにして確認した。
ヒト大腸癌細胞株ＨＴ−２９（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−３８）をＴＦ／ＢＳＡ培地［Ｄ−ＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）に１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）、２００μｇ／ｍＬのＢＳＡを添加した培地］で５×１０４細胞／ｍＬに調製し、９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルで分注した。さらに、ＴＦ／ＢＳＡ培地で４０〜８０ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈したｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩを５０μＬ／ウェルで、ＴＦ／ＢＳＡ培地で各濃度に希釈した各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体を５０μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２〜３時間培養した後に、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４５０と表記する）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を第４図から第６図にそれぞれ示した。各抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性は、上記実施例３の結合ＥＬＩＳＡによるｈＩＧＦ−Ｉとの結合活性およびバイオセンサービアコアを用いて測定したｈＩＧＦとの結合親和性の測定結果と良く相関していた。即ち、高いｈＩＧＦとの結合親和性を有する抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体は、高いｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を有しており、作製した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のうち、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴは、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２と同等のｈＩＧＦ依存性増殖に対する阻害活性を有していることが示された。
以上の結果は、本実施例で作製した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴが、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩに対する高い結合親和性およびｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩの生物活性に対する高い中和活性を有していることを示している。また、これらの抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体は、そのほとんどのアミノ酸残基がヒト抗体の配列に由来することから、ｈＩＧＦの機能がその病態形成に関わる様々なヒト疾患の治療薬として有用である。
参考例
（参考例１）
抗ｈＩＧＦモノクローナル抗体の作製
（１）非ヒト動物の免疫
組換え型ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｒ＆Ｄ社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、２回蒸留水に溶解したメチル化ＢＳＡを、メチル化ＢＳＡ：ｈＩＧＦ−Ｉ＝１：４（重量比）になるように４℃で混合し、１０秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比１：１で混合し、免疫原（以下、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンドと記す）とした。
５週令雌ＳＤラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉアジュバンド（１００μｇのｈＩＧＦ−Ｉ相当量）を投与し、２週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を１週間に１回、計４回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を参考例１（４）項に示す結合ＥＬＩＳＡで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫３日後に脾臓を摘出した。
脾臓をＭＥＭ培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理し、赤血球を除去し、ＭＥＭ培地で３回洗浄し、細胞融合に使用した。
（２）マウス骨髄腫細胞の調製
８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株Ｐ３−Ｕ１を通常培地で培養し、細胞融合時に２×１０７個以上の細胞を確保して、細胞融合に使用した。
（３）ハイブリドーマの作製
参考例１（１）項で得られたラット脾細胞と（２）項で得られた骨髄腫細胞とを１０：１になるよう混合し、遠心分離（１２００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に３７℃で攪拌しながら、１．０×１０２個のラット脾細胞あたり０．２〜１．０ｍＬの融合培地（２ｇのＰＥＧ−１０００、２ｍＬのＭＥＭ、０．７ｍＬのジメチルスルホキシドの混液）を加え、１〜２分間毎に１〜２ｍＬのＭＥＭ培地を数回加えた後、さらに、ＭＥＭ培地を加えて全量が５０ｍＬになるようにした。遠心分離（９００ｒｐｍ、５分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、１００ｍＬのＨＡＴ培地｛通常培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地に１．５ｍＭグルタミン、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍＬジェンタマイシンおよび１０％牛胎児血清（以下、ＦＣＳと記す）を加えた培地］に０．１ｍＭヒポキサンチン、１５μＭチミジンおよび０．４μＭアミノプテリンを加えた培地｝に懸濁した。
この懸濁液を９６ウェル培養用プレートに１００μＬ／ウェルずつ分注し、５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で１０〜１４日間培養した。この培養上清を参考例１（４）項に示す結合ＥＬＩＳＡを用いて、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉに反応して、陰性対照であるメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡ［ＢＳＡを用いて上記参考例１（１）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート］に反応しないウェルを選び、さらにＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いた培地）と通常培地に換え、２回の単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
その結果、第７図に示した反応性を有する抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６９、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７０、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７１、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７２および抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７３をそれぞれ産生する６クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたＥＬＩＳＡにより検討した結果、いずれもＩｇＧ２ｂであった。
（４）モノクローナル抗体の選択（結合ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡプレートに固定化する抗原としては、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉおよび陰性対照としてメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを用いた。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に、上述の抗原をｈＩＧＦ−ＩあるいはＢＳＡの濃度として１０μｇ／ｍＬで５０μＬ／ウェルで分注し、４℃で一晩放置して吸着させた。ＰＢＳで洗浄後、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（以下、ＢＳＡ−ＰＢＳと記す）を１００μＬ／ウェルで加え、室温で１時間反応させて残存する活性基をブロックした。ＢＳＡ−ＰＢＳを捨て、被免疫ラット抗血清、抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で２時間反応させた。反応後、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（以下、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳと記す）で洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を二次抗体として５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、４１５ｎｍの吸光度（以下、ＯＤ４１５と記す）をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
（５）モノクローナル抗体の精製  プリスタン処理した８週令Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウスに参考例１（３）で得られたハイブリドーマを５〜２０×１０６細胞／匹でそれぞれ腹腔内注射した。１０〜２１日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（１〜８ｍＬ／匹）し、遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）によりＩｇＧ画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
（参考例２）
抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の反応性の検討
（１）ｈＩＧＦ−Ｉの天然の立体構造に対する反応性
参考例１（３）で選択された６種類の抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を、以下に示す競合ＥＬＩＳＡで調べた。
参考例１（４）に示した、参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、２０μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注後、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８：６．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７０：１．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７１：０．１６μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７２：７．０μｇ／ｍＬ、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４７３：１．２μｇ／ｍＬ）を５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
第８図に示したように、抗ｈＩＧＦ−Ｉラットモノクローナル抗体はいずれもｈＩＧＦ−Ｉの液層中の天然の立体構造と反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８では、液相系に含まれる１６ｎｇ／ｍＬまでの濃度の天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉを検出可能であった。
（２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉの競合的ＥＬＩＳＡでの反応性
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、上記（１）においてｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識している可能性が示唆された。しかしながら、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８は、アミノ酸一次配列を認識している可能性も考えられるため、ｈＩＧＦ−Ｉ部分ペプチドとの反応性を解析した。
（２−１）ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドの合成
ＷＯ０１／６４７５４に記載の方法に従って、ｈＩＧＦ−Ｉの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、ｈＩＧＦ−Ｉの１−１８番目（配列番号５６、以下、ｐ１−１８と記す）、１４−３０番目（配列番号５７、以下、ｐ１４−３０と記す）、２４−３５番目（配列番号５８、以下、ｐ２４−３５と記す）、２９−４１番目（配列番号５９、以下、ｐ２９−４１と記す）、３６−４７番目（配列番号６０、以下、ｐ３６−４７と記す）、４１−５６番目（配列番号６１、以下、ｐ４１−５６と記す）、５２−７０番目（配列番号６２、以下、ｐ５２−７０と記す）、５３−６１番目（配列番号６３、以下、ｐ５３−６１と記す）、６１−７０番目（配列番号６４、以下、ｐ６１−７０と記す）に相当するペプチドであり、ｈＩＧＦ−Ｉの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するＣｙｓについては、ＳｅｒあるいはＡｌａに置換した配列を合成した。また、４１−５６番目に相当する配列については、内部のＣｙｓを有する配列（配列番号６５、以下、ｐ４１−５６Ｃと記す）も合成した。
（２−２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析
上記（２−１）で合成した各種ペプチドを用いて、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ＥＬＩＳＡで検討した。
参考例１（４）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、４．０μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を５０μＬ／ウェルで分注後、５０μｇ／ｍＬより３倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはｈＩＧＦ−Ｉを５０μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００とした相対値（％）で表示した。
結果を第９図に示した。第９図に示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−Ｉにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの単なるアミノ酸一次配列ではなく、ｈＩＧＦ−Ｉの立体構造を認識していることを強く示唆する。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の競合的ＥＬＩＳＡによる交差反応性の確認
精製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンに対する交差反応性を、以下に示した競合ＥＬＩＳＡで検討した。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
参考例１（１）で作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原、あるいは参考例１（１）と同様に作製したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原を、参考例１（４）項に示した方法に従って、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉ抗原は０．１μｇ／ｍＬの濃度で、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−ＩＩ抗原は１．０μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれ固定化したプレートを準備し、０．６μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８を２５μＬ／ウェルで分注後、２０μｇ／ｍＬより４倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩあるいはヒトインスリンを２５μＬ／ウェルで分注し、混合して室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、二次抗体として抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで加えて使用した。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、ＡＢＴＳ基質液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μＬ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のＯＤ４１５を１００として相対値（％）で表示した。
結果を第１０図に示した。第１０図Ａに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。同様に、第１０図Ｂに示したように、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合は、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩで強く阻害された。すなわち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、ｈＩＧＦ−ＩとｈＩＧＦ−ＩＩの両方に同程度の強さで反応できることを示している。一方、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩへの結合は、ヒトインスリンでは阻害されなかった。
（参考例３）
抗ＩＧＦ抗体とＩＧＦとの反応性の確認
抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８と二種類の市販抗ｈＩＧＦ抗体との、抗原への反応性の比較を以下のようにして検討した。抗体としては、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２（Ｕｐｓｔａｔｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。抗原としては、ｈＩＧＦ−Ｉ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社製）、ｈＩＧＦ−ＩＩ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
（１）表面プラズモン共鳴を用いた結合強度の測定
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８と、抗原であるｈＩＧＦ−ＩあるいはｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合活性を解析するために、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２、および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２の３種の抗体の、ｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対する結合強度を表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）を利用したバイオセンサーＢｉａｃｏｒｅ２０００（ビアコア社製）を用いて以下のように測定した。アナライトの希釈並びに測定中の反応緩衝液としては、ＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ２０  ｐＨ７．４）（ビアコア社製）を用いた。
センサーチップＣＭ−５（ビアコア社製）に、アミンカップリング（ビアコア社製）を用いて、３６．０ｐｇ／ｍｍ２でｈＩＧＦ−Ｉをあるいは４１．７ｐｇ／ｍｍ２でｈＩＧＦ−ＩＩを固定化し、測定物として２０μｇ／ｍＬより２倍希釈で６段階に希釈した３種類の抗体を、流速２０μＬ／分で２分間添加した後、５分間にわたって測定物の解離を観察した。反応は２５℃で行った。各濃度における結合反応曲線から、結合速度定数Ｋａｓｓ、並びに解離速度定数Ｋｄｉｓｓを算出し、これから各抗体の結合定数ＫＡ（Ｍ−１）を算出した。結合定数ＫＡは、ＫＡ＝Ｋａｓｓ／Ｋｄｉｓｓで計算される。結果を第４表に示した。
2005028515.tif 000005
2005028515.tif 000006
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫＡは７．８６×１０９Ｍ−１であり、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡは８．６３×１０９Ｍ−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡの比は、ほぼ１：１であり、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８はｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩの両者に同程度に強力に結合できることが示された。一方、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉモノクローナル抗体ｓｍ１．２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫＡは１．８６×１０８Ｍ−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡは７．３５×１０７Ｍ−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡは、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体ｓｍ１．２のＫＡと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約４２倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約１２０倍であった。また、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のｈＩＧＦ−Ｉに対するＫＡは４．６２×１０８Ｍ−１、ｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡは２．４×１０９Ｍ−１であった。抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩに対するＫＡは、市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体Ｓ１Ｆ２のＫＡと比較してｈＩＧＦ−Ｉに対しては約１８倍、ｈＩＧＦ−ＩＩに対しては約３．６倍であった。すなわち抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、市販の抗ｈＩＧＦ−Ｉ抗体であるｓｍ１．２および市販の抗ｈＩＧＦ−ＩＩ抗体であるＳ１Ｆ２と比較して、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩのそれぞれに強い結合力を有していることが示された。
（参考例４）
ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の影響
（１）ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の構築
以下のようにしてヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）にｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
（１−１）ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
１×１０７個のヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，３９，１５，１９７６）から、ＲＮＡ調製キットＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、４５．６μｇの全ＲＮＡを調製した。調製した全ＲＮＡのうち５μｇを使用して、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ｃＤＮＡを合成した。
合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲによってｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子をクローニングした。ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号６６と配列番号６７に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、並びにｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、上述で得られたヒト肺癌細胞株ＰＣ−９細胞から合成したｃＤＮＡの２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ（＋）ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＫＯＤ（＋）Ｂｕｆｆｅｒ  １（東洋紡績社製）、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ｍＭ塩化マグネシウム、１μＭの配列番号６６と６７に示した塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて１分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９４℃にて３０秒間、６２℃にて３０秒間、７２℃にて３０秒間のサイクルを３０サイクル行った。それぞれの反応液５０μＬを制限酵素ＥｃｏＲＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）およびＳａｌＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのｈＩＧＦ−１をコードする遺伝子のＰＣＲ産物を回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで消化後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとしＬｉｇａｔｉｏｎ  ｈｉｇｈ（東洋紡績社製）７．５μＬを加えて１６℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、目的であるｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子配列を有する第１１図に示したプラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
次に、上記で得られたｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−ＩのｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含む制限酵素断片（ＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ）とｐＫＡＮＴＥＸ９３のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片とを連結して、第１１図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの塩基配列を上記と同様に塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７を用いて決定した。その結果、目的のｈＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を含むプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを得た。
（１−２）ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換体の作製
上記（１−１）で得られたプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを動物細胞に導入して、ｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞を以下のよう作製した。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、８μｇを４×１０６細胞のヒト肺癌細胞株Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１８５）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、１５ｍＬのＲＰＭＩ培地［１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）］に懸濁し、Ｔ７５フラスコ（スミロン社製）に移した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．２ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示すＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ形質転換株（以下、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉと表記する）が取得された。
（２）Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清に産生されたｈＩＧＦ−Ｉの定量
上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞内において導入したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が発現して、該細胞がｈＩＧＦ−Ｉを産生しているかを確認するために、以下の実験を行った。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養を行った後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉ量を以下のＥＬＩＳＡ法により測定した。
参考例１（４）に示した、メチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを固定化したプレートを準備し、陽性対象として２μｇ／ｍＬより５倍希釈で段階的に希釈したｈＩＧＦ−Ｉ、あるいはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞またはＡ５４９細胞の培養上清を２５μｌ／ウェルで分注後、ＢＳＡ−ＰＢＳで０．６μｇ／ｍＬに希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の精製抗体を分注し、混合して室温で２時間反応させた。反応後Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温１時間で反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで洗浄後、１０００倍希釈した抗ラットＩｇＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ社製）を５０μＬ／ウェルで分注し、室温で１時間反応させた。反応後、Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳで５回洗浄した後、ＡＢＴＳ基質溶液［２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウムの０．５５ｇを１Ｌの０．１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を１μＬ／ｍＬで添加した溶液］を５０μｌ／ウェルで加えて発色させ、ＯＤ４１５をプレートリーダーＥｍａｘを用いて測定した。
結果を第１２図に示した。第１２図Ａに示したように、ｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されていないＡ５４９細胞の培養上清に対してｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子が導入されたＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清では、明らかに結合活性は低下していることから、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞はｈＩＧＦ−Ｉを発現していることが示された。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の増殖に対する影響
細胞自身が産生するｈＩＧＦ−Ｉに依存した細胞増殖（以下オートクリン細胞増殖と表記する）を抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が阻害できるかを、上記（１）で作製したｈＩＧＦ−Ｉ遺伝子導入細胞Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、調べた。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞を１０％ＦＣＳ、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、ＲＰＭＩ培地と表記する）で培養した後、それぞれ２×１０５個／ｍＬの細胞密度になるように１０μｇ／ｍＬのヒトトランスフェリン（ＧＩＢＣＯ社製）、２００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（−ＦＣＳ，−Ｐｈｅｎｏｌ  ｒｅｄ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）（以下、無血清培地と表記する）に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を９６ウェルプレート（スミロン社製）に１００μＬ／ウェルで分注した後、各ウェルに無血清培地で２００μｇ／ｍＬより５倍希釈系で段階的に希釈した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を１００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５日間培養した。培養後、細胞増殖試薬ＷＳＴ−１（Ｒｏｃｈｅ社製）を２０μＬ／ウェルで分注し、さらに、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４時間培養した後に、ＯＤ４５０をプレートリーダーＥｍａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて測定した。
結果を第１３図に示した。横軸は、培養時の各ウェル中の抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８濃度を示した。破線に示される抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性は、実線に示されるｈＩＧＦ−Ｉを産生しないＡ５４９細胞の増殖性と比較した場合、明らかに増加している。これは、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞が自己産生するｈＩＧＦ−ＩによってＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞自身の増殖を促すオートクリン増殖を示しているものである。この第１３図に表されるようなオートクリン増殖は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養時に抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加した場合に、濃度依存的に阻害された。一方、Ａ５４９細胞の増殖性には、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は影響を及ぼさなかった。すなわち、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８は、細胞自身が生産するｈＩＧＦ−Ｉによるオートクリン細胞増殖を阻害できることが示された。
（４）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞の足場非依存性増殖への影響
癌化した細胞は、軟寒天中などの細胞接着のない浮遊状態にも関わらず増殖することができる足場非依存性増殖能を有している。この足場非依存性増殖能は、細胞の造腫瘍性と非常に密接に関連しており、ｈＩＧＦ−Ｉが関与していると考えられている。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８が細胞の足場非依存性増殖を阻害できるかを、上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、以下のようにして調べた。
暖めた０．３％  ａｇａｒ  ｎｏｂｌｅ（Ｄｉｆｃｏ社製）を含む、ＲＰＭＩ培地（以下、ａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地と記す）を、１２ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ社製）に１ｍＬ／ウェルで分注し、数十分室温で放置してゲル化させたプレートを準備した。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、１×１０３個／ｍＬの細胞密度になるように暖めたａｇａｒ−ＲＰＭＩ培地に懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液を、１ｍＬ／ウェルで各ウェルに層積した。数分間室温で放置し、ゲル化させた後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で４週間培養した。培養後、各ウェル内に形成されたコロニー数を顕微鏡下で測定した。
結果を第１４図に示した。第１４図に示したようにｈＩＧＦ−Ｉを産生するＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の足場非依存性の細胞増殖性は、Ａ５４９細胞の足場非依存性の細胞増殖性と比較して上昇していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の軟寒天中での培養時に１０μｇ／ｍＬの抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加した場合には、足場非依存性の細胞増殖は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８の添加により完全に阻害された。すなわち、足場非依存性の細胞増殖にはｈＩＧＦ−Ｉが関与しており、ｈＩＧＦ−Ｉ依存的な足場非依存性の細胞増殖は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８により阻害されることが示された。
（５）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する腫瘍増殖阻害効果
上記（１）で作製したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を用いて、ｈＩＧＦ−Ｉが関与するｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍形成に対する、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の腫瘍増殖阻害効果を、以下のように検討した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞をＲＰＭＩ培地で培養した後、それぞれ１×１０６個／ｍＬの細胞密度になるようにＰＢＳに懸濁した。
Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞あるいはＡ５４９細胞の細胞懸濁液の１００μＬを６週齢、ヌードマウスＢａｌｂ／ｃ  Ａｊｃ−１  ｎｕ（メス）の右胸部に皮下移植した。マウス１匹当たりの移植した細胞数は、１×１０７個となる。移植直後から、マウス１匹につき５００μｇの抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を１週間に２回、合計８回にわたって尾静脈から投与した。陰性対象として、同一の腫瘍皮下移植マウスに対してＰＢＳ投与を同時に行った。細胞移植から５日間経過時点から、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、腫瘍の長径、短径および高さから、長径×短径×高さ×０．５２３６の式を用いて、算出した。
結果を第１５図に示した。Ａ５４９細胞とｈＩＧＦ−Ｉを生産しているＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの間で、皮下腫瘍の増殖性を比較したとき、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスの皮下腫瘍の方が、腫瘍の増殖は亢進していた。また、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスでは、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を投与した場合、皮下腫瘍の増殖は、顕著に阻害された。このことは、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８が、ｈＩＧＦ−Ｉの阻害によりｉｎ ｖｉｖｏにおいても腫瘍の増殖を阻害できることを明確に示している。
（参考例５）
抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８の遺伝子クローニング
抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶ領域をコードするｃＤＮＡを以下のようにして、単離、解析した。
（１）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８産生ハイブリドーマからのｍＲＮＡの調製
５×１０７個の抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８産生ハイブリドーマ細胞ＫＭ１４６８（ＦＥＲＭ  ＢＰ−７９７８）より、ｍＲＮＡの調製キットであるＦａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマＫＭ１４６８細胞由来のｍＲＮＡを２７μｇ調製した。
（２）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡライブラリーの作製
上記（１）で取得したハイブリドーマＫＭ１４６８細胞のｍＲＮＡの５μｇから、ＴｉｍｅＳａｖｅｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩアダプター配列が連結されたｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡの全量を２０μＬの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、ＩｇＧクラス抗体のＨ鎖に対応する約１．５ｋｂのｃＤＮＡ断片とκクラスのＬ鎖に対応する約１．０ｋｂのｃＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてそれぞれ約１．０μｇ回収した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、ＶＨとＶＬそれぞれのｃＤＮＡ断片０．１μｇ相当と、キットに添付されている制限酵素ＥｃｏＲＩで消化後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅで末端を脱リン酸化されたλＺＡＰＩＩベクターの１μｇを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後のそれぞれの反応液のうち２．５μＬをＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして５×１０４個、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブラリーとして４×１０４個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）に従い、ナイロンメンブレンフィルターＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）上に固定した。
（３）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のｃＤＮＡのクローニング
上記（２）で作製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖ｃＤＮＡライブラリー、Ｌ鎖ｃＤＮＡライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のＣ領域のｃＤＮＡ［Ｈ鎖はマウスＣγ２ｂのｃＤＮＡ断片（Ｎａｔｕｒｅ，２８３，７８６  １９８０）、Ｌ鎖はマウスＣκのｃＤＮＡ断片（Ｃｅｌｌ，２２，１９７，１９８０）］をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをＨ鎖、Ｌ鎖各１０クローン取得した。次に、λＺＡＰＩＩ  Ｐｒｅｄｉｇｅｓｔｅｄ  ＥｃｏＲＩ／ＣＩＡＰ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）の使用説明書に従い、ｉｎｖｉｖｏ  ｅｘｃｉｓｉｏｎ法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるｃＤＮＡの塩基配列をＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて決定した。その結果、ｃＤＮＡの５’末端に開始コドンと推定されるＡＴＧ配列が存在する完全長の機能的なＨ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１を得た。
（４）抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶ領域のアミノ酸配列の解析
プラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２に含まれていた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨの全塩基配列を配列番号１に、それから推定された抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨの全アミノ酸配列を配列番号２に、プラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１に含まれていた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬの全塩基配列を配列番号３に、それから推定された抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＬの全アミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示した。なお、配列番号２および４に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号１および３に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知の抗体の配列データ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１）との比較および精製した抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のｃＤＮＡは分泌シグナル配列を含む抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖をコードする完全長ｃＤＮＡであり、ＶＨについては、配列番号２に示したアミノ酸配列の１から１９番目が、ＶＬについては、配列番号４に示したアミノ酸配列の１から２２番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
次に、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース［ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ３９．０）、ＰＩＲ−Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒｅｌｅａｓｅ  ６５．０）］をＢＬＡＳＴ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５，４０３−４１０，１９９０）により検索した。その結果、ＶＨおよびＶＬともに完全に一致する配列は認められず、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
また、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬのＣＤＲを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号５、６および７に、ＶＬのＣＤＲ１、２および３のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８、９および１０にそれぞれ示した。
（参考例６）
抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の作製
（１）抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
ＷＯ９７／１０３５４に記載のヒトＩｇＧ１、κクラスの抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３と参考例５（３）で得られた抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖ｃＤＮＡを含むプラスミドを用いて抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦ−Ｉヒト型キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
まず、ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡをアミノ酸配列が変化しないように発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３に挿入するため、ＰＣＲによって抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡを再構築した。プライマーとして、ＶＨｃＤＮＡ用に配列番号６８と配列番号６９の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを、ＶＬｃＤＮＡ用に配列番号７０と配列番号７１の塩基配列をそれぞれ有する合成ＤＮＡを設計した。それぞれの合成ＤＮＡは５’末端にｐＫＡＮＴＥＸ９３へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、参考例５（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｈ５−２の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号６７と６８に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、ＤＮＡサーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９６００（ＰＥＲＫＩＮ  ＥＬＭＥＲ社製）を用いて、９４℃にて３分間加熱した後、２．５単位のＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡績社製）を添加し、９８℃にて１５秒間、６５℃にて２秒間、７４℃にて３０秒間のサイクルを２５サイクル行った。同様に、参考例５（３）で得られたプラスミドｐＫＭ１４６８Ｌ５−１の２０ｎｇを５０μＬのＫＯＤ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ添付ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＃１（東洋紡績社製）、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、１ｍＭ塩化マグネシウム、０．５μＭの配列番号６９と７０に示した塩基配列を有する合成ＤＮＡを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でＰＣＲを行なった。それぞれの反応液１０μＬをアガロースゲル電気泳動した後、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、約０．５ｋｂのＶＨのＰＣＲ産物、約０．４３ｋｂのＶＬのＰＣＲ産物をそれぞれ回収した。
次に、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）で消化後、Ｃａｌｆ  Ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下、ＣＩＡＰと表記する；Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）で末端を脱リン酸化して得られたＤＮＡ０．１μｇと、上記で得られたそれぞれのＰＣＲ産物約０．１μｇを滅菌水に加えて７．５μＬとし、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．２のｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）７．５μＬ、制限酵素ＳｍａＩ（Ｔａｋａｒａ  Ｓｈｕｚｏ社製）０．３μＬを加えて２２℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドＤＮＡ溶液を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドＤＮＡを調製し、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて塩基配列を決定した。こうして目的の塩基配列を有する第１６図に示したプラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬを得た。
次に、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＨのＶＨｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＮｏｔＩ−ＡｐａＩ）をヒト化抗体発現用ベクターｐＫＡＮＴＥＸ９３のＮｏｔＩ−ＡｐａＩ部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｈを構築した。さらに、上記で得られたｐＫＭ１４６８ＶＬのＶＬｃＤＮＡを含む制限酵素断片（ＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ）をプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８ＨのＥｃｏＲＩ−ＢｓｉＷＩ部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを構築した。プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて、ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ＦＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いてＶＨおよびＶＬｃＤＮＡの塩基配列を決定した結果、目的のＶＨおよびＶＬｃＤＮＡがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（３）抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記（２）で得られた抗ｈＩＧＦキメラ抗体発現ベクターｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを用いて抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉを制限酵素ＡａｔＩＩ（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、１０μｇを４×１０６細胞のラットミエローマ細胞株ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１）へエレクトロポレーション法（Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３−１４０，１９９０）により導入後、４０ｍＬのＨ−ＳＦＭ（５）培地［ＦＣＳを５％含むＨ−ＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）］に懸濁し、９６ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に２００μＬ／ウェルずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で２４時間培養した後、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬになるように添加して１〜２週間培養した。Ｇ４１８耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（５）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。
培養上清中に抗ｈＩＧＦキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ｄｈｆｒ遺伝子産物のＤＨＦＲの阻害剤であるＭＴＸ（ＳＩＧＭＡ社製）を５０ｎＭ含むＨ−ＳＦＭ（５）に１〜２×１０５細胞／ｍＬになるように懸濁し、２４ウェル培養プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で１〜２週間培養して、５０ｎＭ  ＭＴＸ耐性を示す形質転換体を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（５）に示す結合ＥＬＩＳＡにより測定した。培養上清中に抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、ＭＴＸ濃度を１００ｎＭ、２００ｎＭと順次上昇させ、最終的にＧ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭの濃度で含むＨ−ＳＦＭ（５）で増殖可能かつ、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体を高発現する形質転換体を得た。得られた形質転換体については、２回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体の発現の最も高い形質転換体を得た。抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８に由来する抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体産生形質転換細胞株としては、形質転換体ＫＭ３００２があげられる。なお、形質転換体ＫＭ３００２は、平成１４年４月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所  特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１  中央第６  郵便番号３０５−８５６６）にＦＥＲＭ  ＢＰ−７９９６として寄託されている。
（４）抗ｈＩＧＦキメラ抗体の培養上清からの精製
参考例５（３）で得られた抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体を発現する形質転換細胞株ＫＭ３００２を、Ｇ４１８を０．５ｍｇ／ｍＬ、ＭＴＸを２００ｎＭ、Ｄａｉｇｏ’ｓ  ＧＦ２１（和光純薬社製）を５％の濃度で含むＨ−ＳＦＭに１〜２×１０５細胞／ｍＬとなるように懸濁し、１７５ｃｍ２フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ社製）に１００ｍＬずつ分注した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内で５〜７日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約１ＬよりＰｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２を精製し、約１０．２ｍｇの精製蛋白質を取得した。得られた抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の約４μｇを、公知の方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５，１９７０）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１８図に示した。精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、非還元条件下では分子量が約１５０キロダルトン（以下、Ｋｄと表記する）の１本のバンドが、還元条件下では約５０Ｋｄと約２５Ｋｄの２本のバンドが認められた。これらの分子量は、ＩｇＧクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約１５０Ｋｄであり、還元条件下では分子内のＳ−Ｓ結合が切断され、約５０Ｋｄの分子量を持つＨ鎖と約２５Ｋｄの分子量を持つＬ鎖に分解されるという報告（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，１９８８；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，１９９６）と一致し、抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーＰＰＳＱ−１０（Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用いて解析した結果、抗ｈＩＧＦ抗体ＫＭ１４６８のＨ鎖およびＬ鎖のＮ末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
（５）抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦに対する反応性
抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８および抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を参考例１（４）に示したＥＬＩＳＡにより検討した。ただし、ＥＬＩＳＡプレートに固定化したメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉの濃度は、０．５μｇ／ｍＬ、二次抗体として、ラット抗体の場合は、４０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットＩｇ抗体（ＤＡＫＯ社製）、キメラ抗体の場合は、１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ１抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いて行った。第１９図に示したように、抗ｈＩＧＦキメラ抗体ＫＭ３００２は、ｈＩＧＦ−Ｉに対する抗体濃度依存的な結合活性を示した。また、その活性は、二次抗体が異なるため、直接の比較は困難であるが、抗ｈＩＧＦラット抗体ＫＭ１４６８と同等であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】  本発明は、ヒトインスリン様成長因子−Ｉ（以下、ｈＩＧＦ−Ｉと記す）およびヒトインスリン様成長因子−ＩＩ（以下、ｈＩＧＦ−ＩＩと記す）と特異的にかつ同程度の強さで結合し、ヒトＩＧＦ−ＩおよびヒトＩＧＦ−ＩＩの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】  第１図は、プラスミドｐＢＳ／ＣａｍＨＶ０およびｐＢＳ／ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第２図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ９３／ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０の造成工程を示した図である。
第３図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示した図である（結合ＥＬＩＳＡ）。横軸は抗体濃度を、縦軸は結合活性を吸光度（４１５ｎｍ）でそれぞれ示す。ａには、□で示した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０、■で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０および●で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果を、ｂには□で示した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、◇で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、△で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、●で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴおよび■で示した抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴの結果をそれぞれ示す。
第４図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＡＲ／ＬＶ０、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０の結果をそれぞれ示す。
第５図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、○は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＬＶ０、△は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、◇は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＣａｍＨＶ０／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌ、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果をそれぞれ示す。
第６図は、抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体のｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ依存的な細胞増殖阻害効果を示した。ａは１０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−Ｉ存在下、ｂは２０ｎｇ／ｍＬのｈＩＧＦ−ＩＩ存在下での結果をそれぞれ示した。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（ＯＤ４５０ｎｍ）でそれぞれ示す。図中実線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はｈＩＧＦ−ＩまたはｈＩＧＦ−ＩＩ非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２、◇は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＬＶ０、■は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＤＦＴ、●は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＰＬＬＤＦＴ、▲は抗ｈＩＧＦＣＤＲ移植抗体ＱＧＡＲ／ＮＹＰＬＬ３Ａｌｌの結果をそれぞれ示す。
第７図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体のｈＩＧＦ−Ｉに対する特異的な反応性を示した図である（結合ＥＬＩＳＡ）。図中、黒塗りのバーはメチル化ＢＳＡ−ｈＩＧＦ−Ｉを抗原に、白抜きのバーはメチル化ＢＳＡ−ＢＳＡを抗原に用いた時の結果を示す。
第８図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するｈＩＧＦ−Ｉに対する反応性を示した図である（競合ＥＬＩＳＡ）。◇は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７０、△は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７１、×は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７２、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４７３の結果をそれぞれ示す。
第９図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示した図である。横軸は各種ペプチド濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸は結合活性（％）をそれぞれ示す。Ａには●で示したｐ１−１８、□で示したｐ２４−３５、■で示したｐ２９−４１、△で示したｐ３６−４７、◇で示したｐ６１−７０、◆で示したｐ１４−３０、×で示したｐ４１−５６の結果を、Ｂには○で示したｈＩＧＦ−Ｉ、●で示したｐ４１−５６Ｃ、□で示したｐ５２−７０、■で示したｐ１−１８およびｐ４１−５６Ｃ、△で示したｐ１−１８およびｐ５２−７０、▲で示したｐ４１−５６Ｃおよびｐ５２−７０、◇で示したｐ１−１８、ｐ４１−５６Ｃおよびｐ５２−７０の結果をそれぞれ示す。
第１０図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−ＩおよびｈＩＧＦ−ＩＩへの結合に対する、ｈＩＧＦ−Ｉ、ｈＩＧＦ−ＩＩおよびヒトインスリンでの阻害活性を示した図である。Ａが抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−Ｉとの結合、Ｂが抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８とｈＩＧＦ−ＩＩとの結合に対する各因子による阻害をそれぞれ示す。横軸が各種因子濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が因子非添加時を１００％としたときの結合活性（％）を示す。■はｈＩＧＦ−Ｉ、○はｈＩＧＦ−ＩＩ、△はヒトインスリンの結果をそれぞれ示す。
第１１図は、プラスミドｐＢＳ（ＩＩ）ＳＫ（−）／ｈＩＧＦ−１およびｐＫＡＮＴＥＸ９３／ｈＩＧＦ−Ｉの造成工程を示した図である。
第１２図は、Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞におけるｈＩＧＦ−Ｉの発現を示した図である。Ａは、組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質による阻害度を示す。横軸は添加した組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質の濃度、縦軸は結合活性（ＯＤ４１５）を示す。破線は組換えｈＩＧＦ−Ｉ蛋白質非添加時の結果を示す。Ｂは、Ａ５４９細胞およびＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の培養上清中に含まれるｈＩＧＦ−Ｉを示す。白抜きはＡ５４９細胞、網掛けはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞をそれぞれ示す。
第１３図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８のｈＩＧＦ−Ｉ発現細胞に対する細胞増殖阻害効果を示した図である。破線は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、実線は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加のＡ５４９細胞の細胞増殖をそれぞれ示す。■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の増殖性を、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９細胞の増殖性をそれぞれ示す。
第１４図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８の足場非依存性増殖阻害効果を示した図である。図中の白抜きのカラムはＡ５４９細胞のコロニー形成数を、網掛けのカラムはＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数を、黒塗りのカラムは抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８を添加したＡ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞の形成数をそれぞれ示す。
第１５図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８の抗腫瘍効果を示した図である。横軸は腫瘍移植後の経過日数を、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ示す。Ａ５４９細胞を移植したマウスのうち、●は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加時を、○は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。Ａ５４９／ｈＩＧＦ−Ｉ細胞を移植したマウスのうち、■は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８非添加時を、□は抗ｈＩＧＦラットモノクローナルＫＭ１４６８添加時をそれぞれ示す。
第１６図は、プラスミドｐＫＭ１４６８ＶＨおよびｐＫＭ１４６８ＶＬの造成工程を示した図である。
第１７図は、プラスミドｐＫＡＮＴＥＸ１４６８Ｃｈｉの造成工程を示した図である。
第１８図は、精製した抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンＭが非還元時は高分子量マーカーおよび還元時は低分子量マーカー、レーン１が抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の泳動パターンをそれぞれ示す。
第１９図は、抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８および抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２のｈＩＧＦ−Ｉに対する反応をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μｇ／ｍＬ）、縦軸が結合活性（ＯＤ４１５）をそれぞれ示す。○が抗ｈＩＧＦラットモノクローナル抗体ＫＭ１４６８、●が抗ｈＩＧＦヒト型キメラ抗体ＫＭ３００２の反応性をそれぞれ示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月19日(2007.9.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】ヒトインスリン様成長因子に対する遺伝子組換え抗体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子-I（以下、hIGF-Iと記す）およびヒトインスリン様成長因子-II（以下、hIGF-IIと記す）と特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
IGFは、乳房、前立腺、肺、結腸などの器官の上皮系細胞の増殖、分化、細胞死（アポトーシス）の制御に重要な役割を果たしており、その生物活性は、IGF受容体（IGF receptor; 以下、IGF-Rと表記する）を介在する（Endocrine Reviews, 16, 3, 1995）。また、IGFの代謝を抑制されているだけでなく、IGFの運搬およびIGFの受容体への結合を制御している10種類のIGF結合蛋白質（IGF-binding protein; 以下、IGFBPと表記する）が存在する（Journal of Biological Chemistry, 264, 11843, 1989）。
【０００３】
IGFには、一本鎖のポリペプチドからなるIGF-IとIGF-IIの2種類が存在し、いずれもインスリンの前駆体であるプロインスリンとアミノ酸レベルで約40%の相同性を有している（Advances in Cancer Research, 68, 183, 1996）。生体内では、インスリン受容体、IGF-I受容体（以下、IGF-IRと表記する）、IGF-II受容体（以下、IGF-IIRと表記する）、およびインスリン受容体とIGF-IRのハイブリッド受容体が、IGFの受容体として機能している。
【０００４】
インスリン受容体およびIGF-IRは、いずれもチロシンキナーゼ型受容体であり（Endocrine Reviews, 16, 143, 1995、Breast Cancer Research & Treatment, 47, 235, 1998）、両者のアミノ酸レベルでの相同性は約60%である。インスリン受容体およびIGF-IRは、それぞれの特有のリガンドであるインスリンおよびIGF-Iに対して高い結合特異性を有するが、インスリン、IGF-IあるいはIGF-IIのそれぞれとも結合性を有する（Journal of Biological Chemistry, 263, 11486, 1988、Journal of Biological Chemistry, 268, 7393, 1993）。また、インスリン受容体とIGF-IRの各サブユニットからなるハイブリッド受容体は、インスリンよりもIGF-Iに対して高い結合特異性を有しており、IGF-IRとして機能していると考えられているが、生体内での役割は不明である（Endocrine Reviews, 16, 3-34, 1995、Endocrine Reviews, 16, 143, 1995）。IGF-IIRは、IGFファミリーのうちIGF-IIとのみ結合できるが、チロシンキナーゼ活性を有していないためIGF-IIのアンタゴニストとして機能していると考えられている（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94, 12981, 1997）。以上のように、２種のIGFは、これら４種の受容体に加え、１０種のIGF結合蛋白質（以下、IGFBPと表記する）と複雑なネットワークを形成し、生体内で機能している。
【０００５】
IGFは、肉腫、白血病、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、甲状腺癌、脳腫瘍、卵巣癌、子宮癌等の多種類の癌で発現が認められており、これらの癌細胞に対して強い増殖促進作用を示すことが知られている（British Journal of Cancer, 65, 311, 1992、Anticancer Research, 11, 1591, 1991、Annals of Internal Medicine, 122, 54、1995、Oncology, 54, 502, 1997、Endocrinology, 137, 1764, 1996）。また、転移性の高い癌では、転移性の低い癌よりもIGF-IIおよびIGF-IRの発現が高いことが知られており（International Journal of Cancer, 65, 812, 1996）、癌の転移にもIGFの関与が示唆されている。IGFの細胞増殖促進作用は、主にIGF-IRを介した作用であるが（Endocrinology, 136, 4298, 1995、Oncogene, 28, 6071, 1999）、一部の乳癌細胞では、IGF-IIがインスリン受容体を介して作用することも知られている（Oncogene, 18, 2471, 1999）。
【０００６】
臨床的および疫学的な検討においても、乳癌(Cancer Epidemiology, Biomarkers & Preventions, 11, 1566, 2002、European Journal of Cancer, 29A, 492, 1993)、神経膠腫、肺癌（Journal of the National Cancer, Insitute, 92, 737, 2000）、大腸癌（Gut, 44, 704, 1999）、前立腺癌(Cancer Research, 62, 2942, 2002、Science, 279, 563, 1998)、卵巣癌（International Journal of Cancer, 101, 549, 2002）、膀胱癌（Journal of Urology, 169, 714, 2003）および骨肉腫などの多くの癌組織におけるIGFあるいはIGF-IR、または血清IGF量の増加が報告されている（Journal of the National Cancer Institute, 92, 1472, 2000）。更に、IGF-IRが発現している癌患者は、予後が不良となることが報告されている（Cancer Research, 57, 3079, 1997）。
【０００７】
また、細胞死誘導活性を有するインターフェロンあるいは腫瘍壊死因子により誘導される大腸癌細胞の細胞死は、IGF-Iにより抑制されることが知られている。また、多形膠芽腫患者由来の初代培養細胞では、放射線感受性の癌細胞と比較して、放射線耐性の癌細胞ではIGF-IRおよびリン酸化IGF-IRの発現量が増大していること、更に放射線感受性の癌細胞の上皮増殖因子受容体の機能を阻害した場合、IGF-IRの発現量が増大することが知られている。以上のことから、IGFは癌細胞の増殖促進効果だけでなく、IGF-IRを介して癌細胞のサバイバルシグナルを増強し、癌細胞の薬剤耐性取得にも関与している（Journal of the National Cancer Institute, 93, 1852, 2001、Oncogene, 20, 1913, 2001、Cancer Research, 60, 2007, 2000、Cancer Research, 62, 200, 2002）。
【０００８】
さらに、癌以外の疾患でも、IGFの関与が示唆されている疾患が報告されている。巨人症、末端肥大症では成長ホルモンの異常分泌により、二次的にIGFが異常発現し、病態の亢進に関与していると考えられている（Growth hormone & IGF Research, 13, 98, 2003）。また、糖尿病性合併症（Science, 276, 1706, 1997、American Journal of Physiology, 274, F1045, 1998）、リウマチ性関節炎の病態形成にもIGF-Iの関与が示唆されている（Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 81, 150, 1996、Arthritis & Rheumatism, 39, 1556, 1996）。
【０００９】
モデル動物を用いた研究においても、IGFと種々の疾患の関係が検討されている。ヒト前立腺癌細胞移植モデルマウスでは、アンドロゲン非依存性増殖能の獲得に伴い、IGF-IおよびIGF-IRの発現が上昇することが知られている（Cancer Research, 61, 6276, 2001）。また、血清中のIGFの大部分は肝臓で生産されるが、肝臓でのみIGF-Iを欠損したマウスでは同所移植した大腸癌の増殖が抑制されることから、血清中のIGFが腫瘍増殖に関与していることも知られている（Cancer Research, 62, 1030, 2002）。IGFを体内局所に発現させたマウスでは、腫瘍の出現あるいは過形成が認められる（Oncogene, 22, 853, 2003、Cancer Reserch, 60, 1561, 2000、Journal of Biological Chemistry, 269, 13779, 1994）。
【００１０】
以上のように、IGF、IGF-RおよびIGFBPは癌の発生、増殖、および転移だけでなく、末端肥大症、糖尿病性合併症やリウマチ性関節炎などにおいても重要な役割を果たしている。
これまでに、IGFとIGF-R間のシグナル伝達を阻害することによる抗腫瘍効果が検討されており、IGF-IRを標的とした抗IGF-IR抗体（Cancer Research, 63, 5073, 2003、WO02/53596）、IGF-R阻害剤（WO99/28347）、あるいは血清中のIGFを抑制できるIGFBPが動物モデルにおいて抗腫瘍効果を示すことが報告されている（Cancer research, 62, 3530, 2002）。
【００１１】
しかし、抗IGF-IR抗体では、マウスに移植されたエストロゲン非依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着は阻害するものの、エストロゲン依存性増殖を示すヒト乳癌細胞の生着や生着したヒト乳癌細胞の増殖は抑制されないことが示されており、IGF-IRの作用阻害のみでは、十分な抗腫瘍効果が得られないことが示されている（Breast Cancer Research & Treatment, 22, 101, 1992）。
【００１２】
IGFに対する抗体（以下、抗hIGF抗体と表記する）としては、種々の抗体が知られている。代表的なヒトIGF-Iに対する抗体（以下、抗hIGF-I抗体と表記する）としては抗hIGF-Iマウス抗体sm1.2（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 2389, 1984）が、あるいはヒトIGF-IIに対する抗体（以下、抗hIGF-II抗体と表記する）としては、抗hIGF-IIマウス抗体S1F2（Endocrinology, 124, 870, 1989）があげられる。sm1.2は、IGF-IIに対して40%の、S1F2はhIGF-Iに対して10%程度の交差反応性を有しており、両抗体ともそれぞれinvitroでのhIGF-IあるいはhIGF-II依存性の細胞増殖を阻害できることが知られている。
【００１３】
ヒト以外の動物の抗体、例えばマウス抗体をヒトに投与すると、マウス抗体が異物として認識されることにより副作用を惹起するばかりか、投与抗体の消失が早く治療上有用ではない。これらの問題点を解決するため、遺伝子組換え技術を利用してヒト以外の動物の抗体をヒト型キメラ抗体あるいはヒト型相補性決定領域（以下、CDRと表記する）移植抗体などのヒト化抗体にすることが試みられている。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、V領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、C領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81, 6851, 1984）、ヒト型CDR移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のV領域中のCDRのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Nature, 321, 522, 1986）。これらのヒト化抗体は、マウス抗体などのヒト以外の動物の抗体に比較してヒトへの臨床応用上、様々な利点を有している。例えば、免疫原性および血中での安定性に関しては、ヒト型キメラ抗体では、ヒトに投与した場合、マウス抗体に比べて血中半減期が約6倍伸びたことが報告されている（European Journal of Cancer, 29A, 492, 1993）。ヒト型CDR移植抗体においても、サルを用いた実験でマウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が延長したことが報告されている（Cancer Research, 56, 1118, 1996、Immunology, 85, 668, 1995）。即ち、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続することが期待される。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して作製するため、様々な形態の分子として作製することができる。最近の蛋白質工学、遺伝子工学の進歩により、ヒト化抗体を含めた抗体からFab、Fab'、F(ab')2、scFv（Science, 242, 423, 1988）、dsFv（Molecular Immunology, 32, 249, 1995）、CDRを含むペプチド（Journal of Biological Chemistry, 271, 2966, 1996）などのより分子量の小さい抗体断片の作製が可能となっている。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さい為、標的組織への移行性に優れている（Cancer Research, 52, 3402, 1992）。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の目的は、IGF-IおよびIGF-IIと特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬等を提供することにある。
本発明は以下の（１）〜（２８）に関する。
（１）  ヒトインスリン様成長因子-I（IGF-I）およびヒトインスリン様成長因子-II（IGF-II）と特異的に結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２）  ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに対する結合の強さが同程度である（１）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（３）  バイオセンサービアコアで測定されるヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに対する結合定数が1×109M-1以上である（１）または（２）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（４）  抗体分子のクラスがIgGである、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（５）  遺伝子組換え抗体がヒトIGFに対するモノクローナル抗体の重鎖可変領域（VH）および軽鎖可変領域（VL）の相補性決定領域（CDR）を含む、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（６）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のVHの相補性決定領域（CDR）１、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号5、6および7で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（７）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のVLのCDR１、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号8、9および10で表される（５）に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（８）  遺伝子組換え抗体または抗体断片のVHのCDR１、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号5、6および7で表され、VLのCDR１、CDR2およびCDR3が、それぞれ配列番号8、9および10で表される（５）〜（７）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（９）  遺伝子組換え抗体または該抗体活性断片のVHが、配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれかに1項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１０）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVLが、配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（８）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１１）   遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびVLが、配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列または配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１０）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１２）   遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列、およびVLが、配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１３）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつVLが、配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む（５）〜（１１）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１４）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）または（１２）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１５）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVLが配列番号27、28または29で表されるアミノ酸配列を含む請求項５〜８または１２のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１６）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号27、28または29で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）または（１５）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１７）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号27で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１８）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号28で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（１９）  遺伝子組換え抗体または該抗体断片のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつVLが配列番号29で表されるアミノ酸配列を含む（５）〜（８）、（１２）、（１４）〜（１６）のいずれかに１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２０）  遺伝子組換え抗体がヒト型CDR移植抗体である（１）〜（１９）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片。
（２１）  抗体断片が、Fab、Fab’、F(ab’)2、一本鎖抗体（scFv）、二量体化可変領域（diabody）、ジスルフィド安定化可変領域（dsFv）およびCDRを含むペプチドから選ばれる抗体断片である（１）〜（１９）のいずれか1項に記載の抗体断片。
（２２）  （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片をコードするDNA。
（２３）  （２２）に記載のDNAを含有する発現ベクター。
（２４）  （２３）に記載の発現ベクターを導入して得られる形質転換体。
（２５）  （２４）に記載の形質転換体を培地中で培養し、培養物中に（１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を生成蓄積させ、該培養物から該遺伝子組換え抗体または該抗体断片を単離し、精製する工程を含む、遺伝子組換え抗体または該抗体断片を製造する方法。
（２６）  （１）〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬。
（２７）  （１〜（２１）のいずれか１項に記載の遺伝子組換え抗体または該抗体断片を有効成分として含有するIGF関連疾患の治療薬。
（２８）  IGF関連疾患が、癌、末端肥大症および糖尿病性合併症である（２７）に記載の治療薬。
【００１５】
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、hIGF-IおよびhIGF-IIと特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの生物学的活性を阻害する遺伝子組換え抗体または該抗体断片であれば、いかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、hIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合の強さが同程度である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好ましい。
【００１６】
本発明のhIGF-IおよびhIGF-IIと特異的に結合できる遺伝子組換え抗体または該抗体断片は、例えば、hIGF-Iに対するモノクローナル抗体でhIGF-IIに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体あるいはhIGF-IIに対するモノクローナル抗体でhIGF-Iに対する交差反応性を有するモノクローナル抗体から、遺伝子工学的手法を用いて作製することができる。
【００１７】
抗体のhIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合の強さが同程度であるとは、抗体がhIGF-IおよびhIGF-IIに対して同程度の結合活性を有していることをいう。
結合活性は、公知の測定法により数値化することができる。公知の測定法としては、酵素免疫学的測定法（以下、ELISA法と記す）や表面プラズモン共鳴の原理（Journal of Immunological Method、145, 229, 1991）などを利用したバイオセンサー法（以下、バイオセンサービアコアと記す）などが用いられる。バイオセンサービアコアによる測定は、2分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、SPRシグナルとして検出するものである。
【００１８】
ELISA法による測定法としては、例えば、固相化した抗原に対して結合する抗体量を測定するELISA法で得られるIGF-IとIGF-IIに対する結果を比較する方法や、同様のELISA法において抗体の反応時に抗原を同時に添加して、固相化した抗原に結合する抗体量の減少を測定する競合ELISA法（Antibodies；A laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, Chapter 14, 1988）で得られるIGF-IとIGF-IIに対する結果を比較する方法などによって、抗体のIGF-IおよびIGF-IIの両者に対する結合活性を測定する方法などがあげられる。
【００１９】
抗体がhIGF-IおよびhIGF-IIに対して同程度の結合活性を有していることとは、上記の測定法により数値化された抗体のhIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合活性を比較して、抗体のhIGF-Iに対する結合活性を1としたとき、hIGF-IIに対する結合活性が0.1〜10、好ましくは0.2〜5、さらに好ましくは0.5〜2、最も好ましくは1であることをいう。
hIGF-IおよびhIGF-II両者の生物活性を阻害する能力とは、hIGF-IまたはhIGF-IIに特異的な受容体を介するhIGF-IおよびhIGF-IIからのシグナル伝達を阻害して、hIGF-IおよびhIGF-IIの持つ生物学的活性を阻害することなどがあげられ、例えば、hIGF-IおよびhIGF-IIと、hIGF-IまたはhIGF-IIに特異的な受容体との結合を阻害することがあげられる。このような抗体が持つ抗原の生物活性を阻害する活性は、抗体の中和活性ともいう。
【００２０】
hIGF-IおよびhIGF-IIの持つ生物学的活性としては、hIGF-IまたはhIGF-IIに特異的な受容体を介して、細胞の増殖を促進する活性などがあげられる。
hIGF-IまたはhIGF-IIに特異的な受容体とは、hIGF-IまたはhIGF-IIと結合することができる受容体をいい、IGF-I受容体、IGF-II受容体、インスリン受容体およびIGF-Iとインスリン受容体のハイブリッド受容体などがあげられる。
【００２１】
本発明の遺伝子組換え抗体または該抗体断片としては、hIGF-IおよびhIGF-IIと特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有していればいかなる遺伝子組換え抗体または該抗体断片も包含されるが、バイオセンサービアコアで測定されるヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIに対する結合定数が好ましくは1×109M-1以上、より好ましくは2×109M-1以上、さらに好ましくは3×109M-1以上、最も好ましくは5×109M-1以上である遺伝子組換え抗体または該抗体断片が好適に用いられる。
【００２２】
本発明の遺伝子組換え抗体は、遺伝子工学的手法を用いて作製される抗体をいう。このような遺伝子組換え抗体としては、好ましくはヒト抗体の定常領域を含む遺伝子組換え抗体、より好ましくはヒト抗体の定常領域と可変領域のフレームワーク（以下、FRと記す）を含んでなる遺伝子組換え抗体が望ましい。このような遺伝子組換え抗体は、例えば、ヒト型キメラ抗体、ヒト型相補性決定領域（以下、CDRと記す）移植抗体、遺伝子組換え非ヒト動物によって作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。また、人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のCDRを、適当なヒト抗体のFRなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結させて作製された遺伝子組換え抗体なども含まれる。
【００２３】
ヒト型キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物の抗体重鎖可変領域（以下、可変領域はV領域、重鎖はH鎖としてHVまたはVHと記す）および抗体軽鎖可変領域（以下、軽鎖はL鎖としてLVまたはVLと記す）とヒト抗体の重鎖定常領域（以下、CHと記す）およびヒト抗体の軽鎖定常領域（以下、CLと記す）とからなる抗体を意味する。ヒト以外の哺乳動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどのハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【００２４】
ヒト型キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、VHおよびVLをコードするcDNAを取得し、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、宿主細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
ヒト型キメラ抗体のCHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、hIgと表記する）に属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するγ1、γ2、γ3およびγ4クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００２５】
本発明のヒト型キメラ抗体としては、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には抗hIGFラットモノクローナルKM1468（FERM BP-7978）を元に製造されるヒト型キメラ抗体、VHが配列番号2および／またはVLが配列番号4に記載のアミノ酸配列を含むヒト型キメラ抗体、形質転換体KM3002（FERM BP-7996）により生産される抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002などがあげられる。
【００２６】
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRをヒト抗体のVHおよびVL中の適切な位置に移植して作製される抗体を意味する。
ヒト型CDR移植抗体は、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を、ヒト抗体のVHおよびVLのFR配列に移植したV領域のアミノ酸配列を設計し、該アミノ酸配列をコードするcDNAを構築し、ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子を有する宿主細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築し、該発現ベクターを宿主細胞へ導入することによりヒト型CDR移植抗体を発現させ、製造することができる。ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を、ヒト抗体のVHおよ
びVLのFR配列に移植したV領域アミノ酸配列は、数箇所の変異を導入した配列を設計してもよい。この様にして設計されたアミノ酸配列をコードするcDNAは、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989、Current Protocols in Molecular Biology、Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 （1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。置換されるアミノ酸の数は１個以上でありその数は特に限定されないが、上記の部位特異的変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、例えば、１〜数十個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個である。
【００２７】
ヒト型CDR移植抗体のCHとしては、hIgに属すればいかなるものでもよいが、hIgGクラスのものが好適であり、更にhIgGクラスに属するγ1、γ2、γ3およびγ4クラスといったサブクラスのいずれも用いることができる。また、ヒト型キメラ抗体のCLとしては、hIgに属すればいかなるものでもよく、κクラスあるいはλクラスのものを用いることができる。
【００２８】
本発明のヒト型CDR移植抗体としては、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有するヒト型CDR移植抗体であればいかなるものでも含まれ、好ましくは抗ヒトIGF抗体のVHおよびVLのCDRを含むヒト型CDR移植抗体、ラットハイブリドーマKM1468（FERM BP-7978）により生産される抗hIGFラットモノクローナルKM1468のVHおよびVLのCDRを含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号5、6、7および／または抗体のVLのCDR1、CDR2、CDR3がそれぞれ配列番号8、9、10で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体などがあげられる。
【００２９】
これらのヒト型CDR移植抗体組成物のなかでも、抗体のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVLが配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列および配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体が好ましく、抗体のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号11で表されるアミノ酸配列のうち1番目のGln、11番目のVal、42番目のGly、75番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97��目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号14で表されるアミノ酸配列のうち、4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号54で表されるアミノ酸配列のうち49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号55で表されるアミノ酸配列のうち4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体がより好ましい。
【００３０】
具体的には、抗体のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVLが配列番号27で表されるアミノ酸配列、配列番号28で表されるアミノ酸配列または配列番号29で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号27で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体、抗体のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号28で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体および抗体のVHが配列番号26で表されるアミノ酸配列を含み、かつ抗体のVLが配列番号29で表されるアミノ酸配列を含むヒト型CDR移植抗体があげられる。
【００３１】
ヒト抗体としては、遺伝子組換え非ヒト動物から作製されたハイブリドーマより生産されるヒト抗体、あるいは遺伝子工学的手法を用いてモノクローン化されたヒト抗体などがあげられる。
本来ヒト抗体とは、天然にヒト体内に存在する抗体を示すが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩によりモノクローナルなヒト抗体の作製が可能となった。
【００３２】
本発明のヒト抗体としては、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有するヒト抗体であればいかなるものでも含まれるが、具体的には遺伝子工学的手法あるいは細胞工学的手法により、ヒト抗体産生細胞を作製し、該細胞により生産されたヒト抗体や、あるいはヒト抗体産生トランスジェニック非ヒト動物から通常のハイブリドーマ作製法により得られたモノクローナル抗体などが含まれる。
【００３３】
遺伝子工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒトB細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりFab（Fragment of antigen binding）、一本鎖抗体等の抗体断片をファージ表面に発現させたヒト抗体ファージライブラリーを作製し、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収する方法があげられる。該抗体断片は、更に蛋白質工学的手法により、2本の完全なH鎖および2本の完全なL鎖からなるヒト抗体分子へも変換する方法などがあげられる。
【００３４】
細胞工学的手法によりヒト抗体産生細胞を作製する方法としては、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、EBウイルスなどを感染させて不死化させた後、限界希釈法によるクローニングを経て、該抗体を産生する継代培養が可能なリンパ球を単離する方法があげられる。該リンパ球を培養し、該培養物中より目的の抗体を精製し、取得する方法などがあげられる。
【００３５】
人為的に作製された抗体遺伝子ライブラリーから選抜された抗体のCDRを、適当なヒト抗体のFRなどと連結させ、さらにヒト抗体の定常領域などと連結し、遺伝子組換え抗体を作製する場合の人為的抗体遺伝子ライブラリーとしては、抗体産生細胞の集団から作製された抗体遺伝子ライブラリーや、該抗体遺伝子ライブラリーに無作為変異を導入してライブラリーのレパートリーが増大された抗体遺伝子ライブラリーなどが含まれる。
【００３６】
本発明の抗体断片としては、上記抗体の可変領域の一部あるいは全部を含み、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体活性断片などが含まれる。抗体断片としては、以下に示す、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（H鎖の224番目のアミノ酸残基で切断される）、H鎖のN末端側約半分とL鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
【００３７】
本発明のFabは、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のFabをコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fabを製造することができる。
【００３８】
F(ab')2は、IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち（H鎖の234番目のアミノ酸残基で切断される）、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のF(ab')2は、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のFab'をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
【００３９】
Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のFab'は、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有するF(ab')2を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。または、該抗体のFab'断片をコードするDNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Fab'を製造することができる。
【００４０】
scFvは、1本のVHと1本のVLとを適当なペプチドリンカー（以下、Pと記す）を用いて、VH-P-VLないしはVL-P-VHの順で連結されたポリペプチドで、抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明のscFvは、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、scFvを製造することができる。
【００４１】
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体断片である。diabodyが持つ二価の抗原結合活性は、同一であることもできるし、一方を異なる抗原結合活性とすることもできる。
本発明のdiabodyは、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAをPのアミノ酸配列の長さが8残基以下となるように構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、diabodyを製造することができる。
【００４２】
dsFvは、VHおよびVL中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はReiterらにより示された方法（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994）に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。
本発明のdsFvは、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、dsFvを製造することができる。
【００４３】
CDRを含むペプチドは、VHまたはVLのCDRの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
本発明のCDRを含むペプチドは、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体のVHおよびVLのCDRをコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、CDRを含むペプチドを製造することができる。
【００４４】
また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体は、本発明の抗体および抗体断片に放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを遺伝子工学的あるいは化学的に結合させた抗体の誘導体を包含する。
【００４５】
本発明の遺伝子工学的に結合させた抗体の誘導体は、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片をコードするDNAと、結合させたい蛋白質をコードするDNAを連結させて発現用ベクターに挿入し、該発現ベクターを適当な宿主細胞へ導入し、発現させることにより製造することができる。
【００４６】
本発明の化学的に結合させた抗体の誘導体は、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有する抗体および抗体断片のH鎖あるいはL鎖のN末端側あるいはC末端側、抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体および抗体断片中の糖鎖などに放射性同位元素、低分子の薬剤、高分子の薬剤、蛋白質などを化学的手法（抗体工学入門、金光修著、地人書館、1994）により結合させることにより製造することができる。
【００４７】
放射性同位元素としては、131I、125Iなどがあげられ、例えば、クロラミンT法などにより抗体に結合させることができる。
低分子の薬剤としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロフォスファミドなどのアルキル化剤、5-フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンC、ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤などの抗癌剤（臨床腫瘍学、日本臨床腫瘍研究会編、癌と化学療法社、1996）、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤などの抗炎症剤（炎症と抗炎症療法、医歯薬出版株式会社、1982）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法などがあげられる。
【００４８】
高分子の薬剤としては、ポリエチレングリコール（以下、PEGと記す）、アルブミン、デキストラン、ポリオキシエチレン、スチレンマレイン酸コポリマー、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ヒドロキシプロピルメタクリルアミドなどがあげられる。これらの高分子化合物を抗体および抗体断片に結合させることにより、（1）化学的、物理的あるいは生物的な種々の因子に対する安定性の向上、（2）血中半減期の顕著な延長、（3）免疫原性の消失、抗体産生の抑制、などの効果が期待される（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、1993）。例えば、PEGと抗体を結合させる方法としては、PEG化修飾試薬と反応させる方法などがあげられる（バイオコンジュゲート医薬品、廣川書店、1993）。PEG化修飾試薬としては、リジンのε-アミノ基の修飾剤（特昭61-178926）、アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基の修飾剤（特昭56-23587）、アルギニンのグアニジノ基の修飾剤（特平2-117920）などがあげられる。
【００４９】
蛋白質としては、免疫担当細胞を活性化するサイトカイン、例えば、ヒトインターロイキン2（以下、hIL-2と記す）、ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（以下、hGM-CSFと記す）、ヒトマクロファージコロニー刺激因子（以下、hM-CSFと記す）、ヒトインターロイキン12（以下、hIL-12と記す）などがあげられる。また、癌細胞を直接障害する活性を有するリシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、蛋白質との融合抗体ついては、抗体および抗体断片をコードするcDNAと蛋白質をコードするcDNAを連結させた融合抗体をコードするDNAを構築し、該DNAを原核生物あるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００５０】
以下に、hIGF-IおよびhIGF-IIに特異的に結合し、かつ、hIGF-IおよびhIGF-IIの機能を阻害する能力を有するヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の作製方法、該抗体断片の作製方法、ならびにそれらの活性の評価方法、および本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法について説明する。
１.ヒト化抗体の作製
（1）ヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト化抗体発現用ベクターとしては、ヒト抗体のCHおよび／またはCLをコードする遺伝子が組み込まれた抗体発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
【００５１】
ヒト抗体のC領域は任意のヒト抗体のCHおよびCLであることができ、例えば、ヒト抗体のH鎖のIgG1サブクラスのC領域（以下、hCγ1と記す）およびヒト抗体のL鎖のκクラスのC領域（以下、hCκと記す）などがあげられる。ヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子としてはエキソンとイントロンからなる染色体DNAあるいはcDNAを用いることもできる。
【００５２】
動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体のC領域をコードする遺伝子を組込み発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、pAGE107（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、pAGE103（Journal of Biochemistry, 101, 1307, 1987）、pHSG274（Gene, 27, 223, 1984）、pKCR（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527, 1981）、pSG1βd2-4（Cytotechnology, 4, 173, 1990）などがあげられる。動物細胞用発現ベクターに用いるプロモーターとエンハンサーとしては、SV40の初期プロモーターとエンハンサー（Journal of Biochemistry, 101, 1307, 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRプロモーターとエンハンサー（Biochemical & Biophysical Research Communications, 149, 960, 1987）、イムノグロブリンＨ鎖のプロモーター（Cell, 41, 479, 1985）とエンハンサー（Cell, 33, 717, 1983）などがあげられる。
【００５３】
ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体H鎖およびL鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と記す）のどちらでも用いることができるが、ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体H鎖およびL鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用ベクターの方が好ましい（Journal of Immunological Methods, 167, 271, 1994）。タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、pKANTEX93（WO97/10354）、pEE18（Hybridoma, 17, 559, 1998）などがあげられる。
【００５４】
構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト型CDR移植抗体の動物細胞での発現に使用できる。
（2）ヒト以外の動物の抗体のV領域をコードするcDNAの取得およびアミノ酸配列の解析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは以下のようにして取得する。
【００５５】
マウス抗体などを産生するハイブリドーマよりmRNAを抽出し、cDNAを合成する。合成したcDNAをファージあるいはプラスミドなどのベクターにクローニングしてcDNAライブラリーを作製する。該ライブラリーより、マウス抗体のC領域部分あるいはV領域部分をプローブとして用い、VHをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよびVLをコードするcDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体のVHおよびVLの全塩基配列を決定し、塩基配列よりVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定する。
【００５６】
ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイブリドーマを作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイブリドーマから全RNAを調製する方法としては、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymology, 154, 3, 1987）、また全RNAからmRNAを調製する方法としては、オリゴ(dT)固定化セルロースカラム法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）などがあげられる。また、ハイブリドーマからmRNAを調製するキットとしては、Fast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）、Quick Prep mRNA Purification Kit（Amercham Pharmacia社製）などがあげられる。
【００５７】
cDNAの合成およびcDNAライブラリー作製法としては、常法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）、あるいは市販のキット、例えば、Super ScriptTM Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（GIBCO BRL社製）、ZAP-cDNA Synthesis Kit（Stratagene社製）やTimeSaver cDNA Synthesis Kit（Amersham-Pharmacia社製）を用いる方法などがあげられる。
【００５８】
cDNAライブラリーの作製の際、ハイブリドーマから抽出したmRNAを鋳型として合成したcDNAを組み込むベクターは、該cDNAを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。例えば、ZAP Express（Strategies, 5, 58, 1992）、pBluescript II SK(+)（Nucleic Acids Research, 17, 9494, 1989）、λZAP II（Stratagene社製）、λgt10、λgt11（DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985）、Lambda BlueMid（Clontech社製）、λExCell、pT7T3 18U（Amersham-Pharmacia社製）、pcD2（Molecular& Cellular Biology, 3, 280, 1983）およびpUC18（Gene, 33, 103, 1985）などのファージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
【００５９】
ファージあるいはプラスミドベクターにより構築されるcDNAライブラリーを導入する大腸菌としては該cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、XL1-Blue MRF'（Journal of Biotechnology, 23, 271, 1992）、C600（Genetics, 59, 177-190, 1968）、Y1088、Y1090（Science, 222, 778, 1983）、NM522（Journal of Molecular Biology, 166, 1, 1983）、K802（Journal of Molecular Biology, 16, 118, 1966）およびJM105（Gene，38, 275,1985）などが用いられる。
【００６０】
cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAクローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識、あるいは酵素標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法あるいはプラーク・ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）により選択することができる。また、プライマーを調製し、mRNAから合成したcDNAあるいはcDNAライブラリーを鋳型として、Polymerase Chain Reaction（以下、PCR法と記す；Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）によりVHおよびVLをコードするcDNAを調製することもできる。
【００６１】
上記方法により選択されたcDNAを、適当な制限酵素等で切断後、pBluescript SK(-)（Stratagene社製）などのプラスミドベクターにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、ジデオキシ法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463, 1977）などの反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）などを用いて解析することで該cDNAの塩基配列を決定することができる。
【００６２】
決定した塩基配列からVHおよびVLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、取得したcDNAが分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。分泌シグナル配列を含む抗体のVHおよびVLの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のVHおよびVLの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さおよびN末端アミノ酸配列を推定でき、さらにはそれらが属するサブグループを知ることができる。また、VHおよびVLの各CDRのアミノ酸配列についても、既知の抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することによって見出すことができる。
【００６３】
さらに、VHおよびVLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、SWISS-PROTやPIR-Proteinなどに対してBLAST法（Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990）などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することができる。
（3）ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLの3'末端側の塩基配列とヒト抗体のCHおよびCLの5'末端側の塩基配列とから成り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成DNAとそれぞれ連結し、それぞれを上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLをコードするcDNAを含むプラスミドを鋳型として、5'末端に適当な制限酵素の認識配列を有するプライマーを用いてPCR法によりVHおよびVLをコードするcDNAを増幅し、それぞれを上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
（4）ヒト型CDR移植抗体のV領域をコードするcDNAの構築
ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAは、以下のようにして構築することができる。まず、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植するヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも用いることができる。例えば、Protein Data Bankなどのデータベースに登録されているヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列、ヒト抗体のVHおよびVLのFRの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and HumanServices, 1991）などがあげられるが、その中でも、十分な活性を有するヒト型CDR移植抗体を作製するためには、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも60%以上）を有するアミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮して塩基配列に変換し、ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設計する。設計した塩基配列に基づき、100塩基前後の長さからなる数本の合成DNAを合成し、それらをPCR法により連結する。この場合、PCRでの反応効率および合成可能なDNAの長さから、VH、VLとも4〜6本の合成DNAを設計することが好ましい。
【００６４】
また、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記2（1）で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングすることができる。PCR反応による連結後、PCR産物をpBluescript SK(-)（Stratagene社製）などのプラスミドにクローニングし、上記2（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドクローンを取得する。
（5）ヒト型CDR移植抗体のV領域のアミノ酸配列の改変
ヒト型CDR移植抗体は、目的のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLのCDRのみをヒト抗体のVHおよびVLのFRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の抗体に比べて低下してしまうことが知られている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991）。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体のVHおよびVLでは、CDRのアミノ酸残基のみならず、FRのいくつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関与している。CDRの移植時には、それらアミノ酸残基がヒト抗体のVHおよびVLのFRに由来するアミ
ノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。このため、ヒト型CDR移植抗体では、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基、CDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、抗体の立体構造を維持するアミノ酸残基および間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらをCDRの由来となったヒト以外の動物の抗体配列中に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266, 1991）。ヒト型CDR移植抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるFRのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにX線結晶解析（Journal of Molecular Biology, 112, 535, 1977）あるいはコンピューターモデリング（Protein Engineering, 7, 1501, 1994）などによる抗体の立体構造の構築および解析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒト型CDR移植抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト型CDR移植抗体の作製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必要である。
【００６５】
ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成DNAを用いて上記2（4）に記載のPCR法を行うことにより、達成できる。PCR後の増幅産物について上記2（2）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
（6）ヒト型CDR移植抗体発現ベクターの構築
上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流に、上記2（4）および（5）で構築したヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAをクローニングし、ヒト型CDR移植抗体発現ベクターを構築することができる。
【００６６】
例えば、上記2（4）および（5）でヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLを構築する際に用いる合成DNAのうち、両端に位置する合成DNAの5'末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上記2（1）に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体のCHおよびCLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングすることができる。
（7）ヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評価するために、上記2（3）および（6）に記載のヒト化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができるが、その発現量の高さから、サル腎臓由来細胞株COS-7細胞（ATCC CRL1651）が一般に用いられる（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991）。COS-7細胞への発現ベクターの導入法としては、DEAE-デキストラン法（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991）、リポフェクション法（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 7413, 1987)、発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト化抗体の発現量及び抗原結合活性はELISA（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）などにより測定できる。
（8）ヒト化抗体の安定発現
上記2（3）および（6）に記載のヒト化抗体発現ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト化抗体を安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。
【００６７】
宿主細胞への発現ベクターの導入法としては、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）などがあげられる。
ヒト化抗体発現ベクターを導入する宿主細胞としては、ヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。    例えば、マウスSP2/0-Ag14細胞（ATCC CRL1581）、マウスP3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下、dhfrと表記する）が欠損したCHO細胞（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 4216-4220, 1980）、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、YB2/0細胞と表記する）などがあげられる。
【００６８】
発現ベクターの導入後、ヒト化抗体を安定に発現する形質転換体は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、G418 sulfate（以下、G418と記す）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択できる。動物細胞培養用培地としては、RPMI1640培地（日水製薬社製）、GIT培地（日本製薬社製）、EX-CELL302培地（JRH社製）、IMDM（GIBCO BRL社製）、Hybridoma-SFM（GIBCO BRL社製）、またはこれら培地にウシ胎児血清などの各種添加物を添加した培地などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上清中にヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中のヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、ELISAにより測定できる。また、形質転換細胞は、特開平2-257891に開示されている方法に従い、dhfr増幅系などを利用してヒト化抗体の発現量を上昇させることができる。
【００６９】
ヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテインAカラムを用いて精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよび限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト化抗体のH鎖、L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、PAGEと表記する：Nature, 227, 680-685, 1970）やウエスタンブロッティング法（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）などで測定することができる。
２.抗体断片の作製
抗体断片は、上記１および2に記載の抗hIGF抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白質化学的手法により、作製することができる。
【００７０】
遺伝子工学的手法としては、目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うなどの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、パパインなどの蛋白質分解酵素を用いた部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
【００７１】
抗体断片としては、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv、diabody、dsFv、CDRを含むペプチドなどがあげられる。
（1）Fabの作製
Fabは、蛋白質化学的にはIgGを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作製することができる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテインA結合性を有するIgGサブクラスであれば、プロテインAカラムに通すことで、IgG分子やFc断片と分離し、均一なFabとして回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995）。プロテインA結合性を持たないIgGサブクラスの抗体の場合は、イオン交換クロマトグラフィーにより、Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995）。
【００７２】
また、Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab発現用ベクターにクローニングし、Fab発現ベクターを作製することができる。Fab発現用ベクターとしては、FabをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pIT106（Science, 240, 1041, 1988）などがあげられる。Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにFabを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFabとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持ったFabが漏出する。
【００７３】
リフォールディング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用いることにより、均一なFabを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company, 1992）。
（2）F(ab')2の作製
F(ab')2は、蛋白質化学的にはIgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより、作製することができる。ペプシンの処理後は、Fabと同様の精製操作により、均一なF(ab')2として回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, Academic Press, 1995）。また、下記3（3）に記載のFab'をo-PDMやビスマレイミドヘキサンなどのようなマレイミドで処理し、チオエーテル結合させる方法や、DTNB［5,5'-dithiobis（2-nitrobenzoic acid）］で処理し、S-S結合させる方法によっても作製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
（3）Fab'の作製
Fab'は、上記3（2）に記載のF(ab')2をジチオスレイトールなどの還元剤で処理して得ることができる。また、Fab'は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、Fab'発現用ベクターにクローニングし、Fab'発現ベクターを作製することができる。Fab'発現用ベクターとしては、Fab'をコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えばFab'発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにFab'を生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるFab'とすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収させることができるリフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、プロテインGカラムなどを用いることにより、均一なFab'を精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
（4）scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のV領域をコードするDNAを、scFv発現用ベクターにクローニングし、scFv発現ベクターを作製することができる。scFv発現用ベクターとしては、scFvをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E（Amersham-Pharmacia社製）、pHFA（Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48, 1994）などがあげられる。scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させることで、ファージ表面にscFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを得ることができる。また、scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるscFvとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なscFvを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
（5）diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のVHとVLをリンカーがコードするアミノ酸残基が8残基以下となるように連結したDNAを作製し、diabody発現用ベクターにクローニングし、diabody発現ベクターを作製することができる。diabody発現用ベクターとしては、diabodyをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pCANTAB5E（Amersham Pharmacia社製）、pHFA（Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994）などがあげられる。diabody
発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプラズムにdiabodyを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdiabodyとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーションなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールディング後あるいは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一なdiabodyを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996）。
（6）dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用いて作製することができる。まず、上記2（2）、2（4）および2（5）に記載の抗体のVHおよびVLをコードするDNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシステインに置換されたDNAを作製する。作製した各DNAをdsFv発現用ベクターにクローニングし、VHおよびVLの発現ベクターを作製することができる。dsFv発現用ベクターとしては、dsFvをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pULI9（Protein Engineering, 7, 697, 1994）などがあげられる。VHおよびVLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにVHおよびVLポリペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからVHおよびVLポリペプチドを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールディング法により、活性のあるdsFvとすることができる。リフォールディング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Protein Engineering, 7, 697, 1994）。
（7）CDRペプチドの作製
CDRを含むペプチドは、Fmoc法あるいはtBoc法等の化学合成法によって作製することができる。また、CDRを含むペプチドをコードするDNAを作製し、作製したDNAを適当な発現用ベクターにクローニングし、CDRペプチド発現ベクターを作製することができる。発現用ベクターとしては、CDRペプチドをコードするDNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、pLEX（Invitrogen社製）、pAX4a+（Invitrogen社製）などがあげられる。      
【００７４】
発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプラズムにCDRペプチドを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズムからCDRペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過などにより、精製することができる（Protein Engineering, 7, 697, 1994）。
３.ヒト化抗体または該抗体断片の活性評価方法
培養上清中あるいは精製した抗hIGFヒト化抗体のhIGFに対する結合活性は、ELISA法およびバイオセンサービアコアなどにより測定することができる。また、上記1.（7）に示したhIGF依存的な増殖を示す細胞株のinvivoあるいはin vitroの増殖に対する抗体の影響を検討することにより、hIGFの機能を阻害する本発明の抗体の活性を測定することができる。
（1）ELISAによる活性評価
結合ELISAとは、抗原を96ウェルELISAプレートに固定化し、第一抗体として反応させ、第一抗体を認識することができる標識した二次抗体を反応させて、標識物を検出することにより、抗原と抗体との結合活性を測定する方法である。      
【００７５】
具体的には、固定化する抗原としては、hIGF-IやhIGF-IIの精製蛋白質や部分配列を有するペプチドがあげられる。第一抗体としては、ハイブリドーマなどの培養上清あるいは精製抗体などの測定対象物があげられる。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビオチン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体があげられる。具体的には、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗ラットイムノグロブリン（以下、rIgと表記する）マウス抗体などがあげられる。
【００７６】
競合ELISAとは、あらかじめhIGF-IあるいはhIGF-IIをELISAプレートに固定化し、測定対象物である抗体と、hIGF-IあるいはhIGF-IIとを同時に添加して、反応させ、プレートに固定化した抗原と反応対象物である抗体の反応を、反応液中に添加したもう一種あるいは同一の抗原が阻害することを、プレートに結合する一次抗体の量の変化で測定する方法である。抗体の結合量の変化は抗体に対する二次抗体により検出する。また、天然型のhIGFおよびhIGFの部分ペプチドを用いた競合ELISAにより、天然型のhIGFとの反応性および
抗原エピトープを解析することができる。抗体がhIGFの立体構造を認識しているか否かは、通常行われる構造的解析法により調べることができる。構造的解析法としては、例えば、X線結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。
（2）バイオセンサービアコアによる活性評価
バイオセンサービアコアによる測定は、2分子間の結合と解離に伴うセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化を光学現象により、SPRシグナルとして検出するものである。本法での測定から導きだされた結合速度定数（以下、Kassと表記する）、解離速度定数（以下、Kdissと表記する）から、KA＝Kass/Kdissで計算される結合定数（以下、KAと表記する）が算出される。KAは、M-1の単位で表される。バイオセンサービアコアでの測定は、添付の使用説明書に従って至適な測定条件下で行うことができる。至適な測定条件としては、センサーチップへ固定化するリガンドの量は、式1により算出される最小値と式２で算出される最大値の間の範囲であることが好ましい。また、アナライトの結合量は、式3で算出される最大結合量以下であることが好ましい。式１、式2および式3において、リガンドとはセンサーチップに固定化する分子を示し、アナライトとは流路系を介して添加する分子を示し、Sとはリガンドの結合部位数を示す。RUとは、Resonance Unitの略であり、センサーチップ表面での単位面積あたりの質量の変化量を示し、１RU＝１pg/mm2に相当する。バイオセンサービアコアでの測定では、最大結合量が維持できるように流速および洗浄条件を設定することにより、蛋白質の結合様式に則った結合定数の解析を行うことができる。
（式1）
最小固定化量(RU)=200×1/S×（リガンドの分子量/アナライトの分子量）
（式2）
最大固定化量(RU)=1000×1/S×（リガンドの分子量/アナライトの分子量）
（式3）
最大結合量=アナライトの分子量×リガンドの固定化量(RU)/リガンドの分子量×S
４.本発明のヒト化抗体または該抗体断片の使用方法
本発明の抗hIGF抗体およびその抗体断片は、hIGF-IおよびhIGF-IIと特異的にかつ同程度の強さで結合し、かつ、その機能を阻害するため、hIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患などの治療に有用であると考えられる。また、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体に比べ、ヒト抗体のアミノ酸配列に由来する部分がほとんどであるため、ヒト体内において免疫原性を示さず、反復投与が可能であり、かつ、その効果が長期間に渡り持続することが期待される。
【００７７】
hIGF介在性疾患および異常なhIGFの産生亢進により病態が進行する疾患としては、癌、末端肥大症および糖尿病合併症などがあげられる。
本発明の抗hIGF抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【００７８】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、経口投与、または口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内などの非経口投与をあげることができ、蛋白質またはペプチド製剤の場合、望ましくは静脈内投与をあげることができる。
本発明の抗hIGF抗体およびその抗体断片は、単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される1つあるいはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
【００７９】
投与形態としては、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤などがあげられる。経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などがあげられる。
乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖などの糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールなどのグリコール類、ごま油、オリーブ油、大豆油などの油類、p-ヒドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミントなどのフレーバー類などを添加剤として用いて製造できる。
【００８０】
カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤などは、乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニトールなどの賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸エステルなどの界面活性剤、グリセリンなどの可塑剤などを添加剤として用いて製造できる。
【００８１】
非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤などがあげられる。注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液あるいは両者の混合物からなる担体などを用いて調製される。
座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸などの担体を用いて調製される。
また、噴霧剤は該抗体および抗体断片そのもの、ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体および抗体断片を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体などを用いて調製される。
【００８２】
担体として具体的には乳糖、グリセリンなどが例示される。該抗体および抗体断片、さらには用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダーなどの製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重などにより異なるが、通常成人１日当たり10μg/kg〜10mg/kgである。
【００８３】
以下に、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８４】
【実施例1】
【００８５】
抗ヒトIGF ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLをコードするcDNAの構築
（1）抗ヒトIGF ヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列の設計
抗ヒトIGFヒト型CDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
参考例５の１．項で決定した抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468（ラットIgG2b）のVH（配列番号2）のCDRのアミノ酸配列を移植するための、ヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
【００８６】
公的データベースより、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのFRと最も高い相同性を有するヒト抗体のFRを検索した結果、抗体CAM（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 77, 3239-3243, 1980）が最も高い81.6%の相同性を有していた。そこで、抗体CAM（以下、Camと記す）のVHのFRのアミノ酸配列を基に、抗hIGF ヒト型CDR移植抗体（以下、抗hIGFCDR移植抗体と記す）のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
【００８７】
CamのFRには、アミノ酸配列が一義的に決定されていない箇所が4箇所（13番目、74番目、77番目、90番目）存在し、また、ヒト抗体のVHのFRのアミノ酸配列では一般的でないアミノ酸残基が、3番目と40番目に認められた。そこで、これらのアミノ酸残基については、免疫原性をより低下させるため、ヒト抗体で高い頻度で認められるアミノ酸残基（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）へ改変した。このようにして設計したCam由来のFRのアミノ酸配列の適切な位置に、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号11に記載のVHのアミノ酸配列CamHV0を設計した。
【００８８】
更に、Camとは異なるヒト抗体FRからなる抗hIGFCDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。
Kabatらは、既知の様々なヒト抗体のVHをそのアミノ酸配列の相同性から3種類のサブグループ（HSG I〜III）に分類し、さらに、それら各サブグループの共通配列を報告している（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）。この様な共通配列を有する抗体は、ヒトにおいて、免疫原性が低いことが期待されることから、この共通配列のFRを基に抗hIGFCDR移植抗体のVHのアミノ酸配列を設計した。より活性の高い抗hIGFCDR移植抗体を作製するために、設計にあたってはヒト抗体のVHの3種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第１表に示した。第１表に示したように、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVH領域のFRのアミノ酸配列はサブグループIIIのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。
[表１]
第１表
ヒト抗体のVHの各サブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列と抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのFRのアミノ酸配列との間の相同性
HSGI   HSGII   HSGIII
63.2%  56.3%   86.2%  
以上の結果から、ヒト抗体のVHのサブグループIIIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号54に記載の抗hIGFCDR移植抗体のVHのアミノ酸配列HV0(3)を設計した。
【００８９】
次に、抗hIGFCDR移植抗体のVLのアミノ酸配列を以下のようにして設計した。参考例５の１．で決定した抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVL（配列番号4）のCDRのアミノ酸配列を移植するためのヒト抗体のVLのFRのアミノ酸配列を以下のようにして選択した。
Kabatらは、既知の様々なヒト抗体のVLをそのアミノ酸配列の相同性から４種類のサブグループ（HSG I〜IV）に分類し、さらにそれら各サブグループの共通配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を報告している。そこで、ヒト抗体のVLの4種類のサブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列のうち、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有するFRのアミノ酸配列を検索した。相同性の検索結果を第２表に示した。第２表に示したように、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVL領域のFRのアミノ酸配列はサブグループIVのFRのアミノ酸配列と最も高い相同性を有していた。
[表２]
第２表
ヒト抗体のVLの各サブグループの共通配列のFRのアミノ酸配列と抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLのFRのアミノ酸配列との間の相同性
HSGI    HSGII    HSGIII    HSGIV
66.3%    61.3%    66.3%     67.5%
以上の結果から、ヒト抗体のVLのサブグループIVの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号14に記載の抗hIGFCDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV0を設計した。
【００９０】
また、2番目に相同性の高いヒト抗体のVLはサブグループIであった。そこで、サブグループIの共通配列のFRのアミノ酸配列の適切な位置に抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLのCDRのアミノ酸配列を移植し、配列番号55に記載の抗hIGFCDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV0(1)を設計した。
上記で設計した抗hIGFCDR移植抗体のVHのアミノ酸配列CamHV0およびHV0(3)、ならびにVLのアミノ酸配列LV0およびLV0(1)は、選択したヒト抗体のFRのアミノ酸配列に抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のCDRのアミノ酸配列のみを移植した配列であるが、一般にヒト型CDR移植抗体では、CDRのアミノ酸配列の移植のみでは抗原との結合活性が低下してしまうことが多く、それを回避するため、ヒト抗体とヒト以外の動物の抗体で異なっているFRのアミノ酸残基のうち、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるアミノ酸残基をCDRのアミノ酸配列とともに移植することが行われている。そこで、本実施例においても、抗原との結合活性に影響を与えると考えられるFRのアミノ酸残基を以下のようにして同定した。
【００９１】
まず、上記で設計した抗hIGFCDR移植抗体のVHのアミノ酸配列CamHV0と HV0(3)、および抗hIGFCDR移植抗体のVLのアミノ酸配列LV0とLV0(1)からなる４通りの組み合わせのヒト型CDR移植抗体［以下、CamHV0のアミノ酸配列を有するVHとLV0のアミノ酸配列を有するVLを組み合わせた抗hIGFCDR移植抗体をCamHV0/LV0などと記す；CamHV0/LV0、CamHV0/LV0 (1)、HV0(3)LV0およびHV0(3)LV0(1) 。］のV領域の三次元構造をコンピューターモデリングの手法を用いて構築した。三次元構造座標作製に関してはソフトウェアAbM（Oxford Molecular社製）を、三次元構造の表示についてはソフトウェアPro-Explore（Oxford Molecular社製）、RasMol(Glaxo社製)またはViewer Lite（Accelrys Inc.社製）を用いて、それぞれ添付の使用説明書に従い、行った。同様に、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のV領域の三次元構造のコンピューターモデルも構築した。更に、それぞれのヒト型CDR移植抗体V領域のFRのアミノ酸配列において、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のV領域のアミノ酸配列中に認められるアミノ酸残基と異なっている残基について、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のアミノ酸配列中のアミノ酸残基に改変したアミノ酸配列からなる改変体の三次元構造モデルを同様に構築し、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468、およびそれぞれの改変体の元となった４通りの組み合わせのヒト型CDR移植抗体のV領域の三次元構造を比較した。
【００９２】
その結果、改変体のV領域のFRのアミノ酸残基の中で抗原結合部位の三次元構造を変化させ、抗体の抗原との結合活性に影響を与えると考えられる残基として、CamHV0では1番目のGln、97番目のAla、98番目のArgを選択した。さらに、三次元構造モデルからでは抗体の活性への影響は明らかではなかったが、42番目のアミノ酸は一般にGlyであるのに対して、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468ではThrであり、本アミノ酸残基が抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468において特異的な役割を果たしている可能性が考えられたため、本残基も改変候補として選択した。同様に、HV0(3)では49番目のSer、77番目のAsn、84番目のAsn、93番目のVal、97番目のAla、98番目のArgを、LV0では4番目のMet、9番目のAsp、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のLeu、22番目のAsn、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のPro、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のVal、84番目のValを、LV0(1)では4番目のMet、9番目のSer、10番目のSer、11番目のLeu、15番目のVal、35番目のTyr、39番目のPro、42番目のAla、45番目のLeu、46番目のLeu、69番目のAsp、70番目のPhe、71番目のThr、82番目のPheをそれぞれ選択した。
【００９３】
このようにして選択したアミノ酸残基のうち、少なくとも1つを抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のV領域のアミノ酸配列中のアミノ残基へ改変し、様々な改変を有するヒト型CDR移植抗体のVHおよびVLのアミノ酸配列を設計した。
（2）CamHV0をコードするcDNAの構築
実施例1（1）で設計したアミノ酸配列CamHV0をコードするcDNAを以下のようにして構築した。
【００９４】
まず、設計したアミノ酸配列のN末端に配列番号2の1番目から19番目のアミノ酸配列に相当する抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のH鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号12に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮した。
【００９５】
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、配列番号13に示した。該塩基配列の5’末端と3’末端に、ヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加し、CamHV0をコードする塩基配列とした。該塩基配列を5’末端側から約150塩基ずつ計4本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号30、31、32および33で表される4本の合成オリゴDNA(ファスマック社製)を合成した。
【００９６】
各合成オリゴDNAを最終濃度が0.1μMとなるようにKOD-plus polymerase（TOYOBO社製）に添付の反応液に加え、更に0.4μM T3 プライマー（Takara Bio社製）、0.4μM T7 プライマー（Takara Bio社製）および1単位のKOD-plus polymerase（TOYOBO社製）を用いて、合計50μLとし、PCR反応を行った。反応条件は94℃ 30秒間、60℃ 30秒間、72℃ 60秒間のサイクルを35サイクルで行った。反応後、該反応液を1.5 %アガロース電気泳動により分画し、約0.5 kbp付近の遺伝子断片を、ゲル抽出キット（QIAGEN社製）を用いて回収した。回収した遺伝子断片を制限酵素EcoRI（Takara Bio社製)およびXhoI（Takara Bio社製)を用いて、消化反応を行った後に、該反応液を1.5%アガロース電気泳動により分画し、制限酵素処理された遺伝子断片をゲル抽出キット（QIAGEN社製）を用いて回収した。
【００９７】
pBluescript II SK(-)（以下、pBSと記す）（Stratagene社製）を上記遺伝子断片と同様に制限酵素EcoRI（Takara Bio社製)およびXhoI（Takara Bio社製)を用いて、消化反応を行った後、分画、回収し、Ligation high（TOYOBO社製）を用いて添付説明書に従いpBSとCamHV0遺伝子断片の連結反応を行った。連結反応により得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（QIAGEN社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析し、目的のアミノ酸配列CamHV0をコードする塩基配列を含む、第1図に示したプラスミドpBS/CamHV0を取得した。
（3）抗hIGFCDR移植抗体のVHの改変体をコードするcDNAの構築
実施例１（1）で設計した抗hIGFCDR移植抗体のVHの改変体をコードするcDNAの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、PCR反応はKOD-plus polymerase（TOYOBO社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
【００９８】
以下で使用した合成オリゴDNAはファスマック社製のものを使用した。
（3-1）  1番目のGlnをGluへ、97番目のAlaをThrへ、98番目のArgをThrへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、QARと記す）をコードするcDNAの構築
実施例１（2）で得られたpBS/CamHV0を鋳型として、配列番号38で表される合成オリゴDNAと配列番号41で表される合成オリゴDNAを用いて、94℃ 30秒間、58℃ 45秒間、72℃ 60秒間のサイクルを35サイクルの条件でPCR反応を行った。反応後、実施例１（2）と同様にして該反応液を1.5 %アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をpBSにクローニングして、目的のアミノ酸配列QARをコードする、配列番号17で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/QARを取得した。
（3-2）  1番目のGlnをGluへ、42番目のGlyをThrへ、97番目のAlaをThrへ、98番目のArgを Thr へ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、QGARと記す)をコードするcDNAの構築
実施例１（2）で得られたpBS/CamHV0を鋳型として、配列番号38で表される合成オリゴDNAと配列番号39で表される合成オリゴDNAを用いて約250bpの5’-QG遺伝子断片を、また、配列番号40で表される合成オリゴDNAと配列番号41で表される合成オリゴDNAを用いて約250bpの3’-GAR遺伝子断片を、それぞれ上記（3-1）と同様にしてPCR反応で増幅後、1.5 %アガロース電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、5’-QG遺伝子断片の5’末端に位置するT3プライマー（Takara Bio社製）および3’-GAR遺伝子断片の3’末端に位置するT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて上記（3-2）と同様にしてPCR反応を行った。反応後、実施例１（2）と同様にして該反応液を1.5 %アガロース電気泳動により約500bpの遺伝子断片を分画、回収した後、回収した遺伝子断片をpBSにクローニングして、目的の配列番号26で示されるアミノ酸配列QGARをコードする、配列番号18で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/QGARを取得した。
（4）LV0をコードするcDNAの構築
実施例1（1）で設計したアミノ酸配列LV0をコードするcDNAを以下のようにして構築した。
【００９９】
まず、設計したアミノ酸配列のN末端に配列番号4の1番目から22番目のアミノ酸配列に相当する抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のL鎖の分泌シグナル配列を連結した。該配列を配列番号15に示した。次に、該アミノ酸配列を遺伝子コドンに変換した。1つのアミノ酸残基に対して複数の遺伝子コドンが存在する場合は、抗体の遺伝子の塩基配列に見られる使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮した。
【０１００】
変換した遺伝子コドンを連結して、該アミノ酸配列をコードするcDNAの塩基配列を設計し、配列番号16に示した。該塩基配列の5’末端と3’末端にヒト化抗体発現用ベクターへクローニングするための制限酵素認識配列を含むPCR反応時の増幅用プライマーの結合塩基配列をそれぞれ付加した。設計した塩基配列を5’末端側から約150塩基ずつ計4本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号34、35、36および37で表される4本の合成オリゴDNAを合成した。
【０１０１】
各合成オリゴDNAを用いて、実施例1の（2）と同様にしてPCR反応からpBSへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列LV0をコードする、配列番号16で示されるcDNAを含む、第１図に示したプラスミドpBS/LV0を取得した。
（5）抗hIGFCDR移植抗体のVLの改変体をコードするcDNAの構築
実施例1（1）で設計した抗hIGFCDR移植抗体のVLの改変体のアミノ酸配列をコードするcDNAの構築は以下のように行った。改変後のアミノ酸残基の遺伝子コドンについては、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468で見られる遺伝子コドンとなるように行った。また、PCR反応はKOD-plus polymerase（TOYOBO社製）を使用し、添付説明書に従って行った。
（5-1）  4番目のMetをLeuへ、9番目のAspをThrへ、10番目のSerをThrへ、11番目のLeuをMetへ、15番目のLeuをProへ、22番目のAsnをThrへ、35番目のTyrをPheへ、42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、69番目のAspをSerへ、70番目のPheをTyrへ、71番目のThrをSerへ、82番目のValをAlaへ、84番目のValをThrへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、Allと記す）をコードするcDNAの構築
アミノ酸配列Allをコードする、配列番号19で示されるcDNAの塩基配列を5’末端側から約150塩基ずつ計4本の塩基配列に分割し（隣り合う塩基配列は、その末端に約20塩基の重複配列を有するようにする）、それらをセンス鎖、アンチセンス鎖の交互の順にして、配列番号46、47、48および49で表される合成オリゴDNAを合成した。
【０１０２】
各オリゴDNAを用い実施例1（2）と同様にして、PCR反応からpBSへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列Allをコードする、配列番号19で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/Allを取得した。
（5-2）  42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、82番目のValをAlaへ、84番目のValをThrへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、PLLVVと記す）をコードするcDNAの構築
実施例１（4）で得られたpBS/LV0を鋳型として、配列番号42で表される合成オリゴDNAと配列番号50で表される合成オリゴDNAを用いて、5’-PLL遺伝子断片を、また、配列番号44で表される合成オリゴDNAと配列番号49で表される合成オリゴDNAを用いて3’-VV遺伝子断片をそれぞれ上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行った。反応後、実施例１（2）と同様にして該反応液を1.5%アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したそれぞれの遺伝子断片、5’-PLL遺伝子断片の5’末端に位置するT3プライマー（Takara Bio社製）および3’-VV遺伝子断片の3’末端に位置するT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて上記（3-1）と同様にしてPCR反応からpBSへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列PLLVVをコードする、配列番号20で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/PLLVVを取得した。
（5-3）  22番目のAsnをThrへ、42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、82番目のValをAlaへ、84番目のValをThrへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、NPLLVVと記す）をコードするcDNAの構築
実施例１（4）で得られたpBS/LV0を鋳型として、配列番号42で表される合成オリゴDNAと配列番号43で表される合成オリゴDNAを用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、NPLL遺伝子断片を増幅し、実施例１（2）と同様にして該反応液を1.5%アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収したNPLL遺伝子断片および配列番号50で表される合成オリゴDNAを用いて上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、5’-NPLL遺伝子断片を増幅し、実施例１（2）と同様にして該反応液を1.5%アガロースゲル電気泳動により目的の遺伝子断片を分画、回収した。回収した5’-NPLL遺伝子断片、上記（5-2）で得られた3’-VV遺伝子断片、T3プライマー（Takara Bio社製）およびT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-2）と同様にしてPCR反応から、pBSへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列NPLLVVをコードする、配列番号21で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/NPLLVVを取得した。
（5-4）  22番目のAsnをThrへ、35番目のTyrをPheへ、42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへそれぞれ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、NYPLLと記す）をコードするcDNAの構築
上記（5-4）で得られたpBS/NPLLVVを鋳型として、配列番号50で表される合成オリゴDNAと配列番号53で表される合成オリゴDNAを用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、5’-NYPLL-1遺伝子断片を回収した。一方、実施例１（4）で得られたpBS/LV0を鋳型として、配列番号44で表される合成オリゴDNAとT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、3’-LV0遺伝子断片を回収した。5’-NYPLL-1遺伝子断片、3’-LV0遺伝子断片、T3プライマー（Takara Bio社製）およびT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-2）と同様にしてPCR反応から、pBSへのクローニングまでの操作を行い、目的のアミノ酸配列NYPLLをコードする、配列番号22で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/NYPLLを取得した。
（5-5）  22番目のAsnをThrへ、35番目のTyrをPheへ、42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、69番目のAspをSerへ、70番目のPheをTyrへ、71番目のThrをSerへ、82番目のValをAlaへ、84番目のValをThrへそれぞれへ改変した改変体のアミノ酸配列（以下、NYPLL3Allと記す）をコードするcDNAの構築
上記（5-4）で得られたpBS/NYPLLを鋳型として、配列番号45で表される合成オリゴDNAと配列番号50で表される合成オリゴDNAを用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、5’-NYPLL-2遺伝子断片を回収した。一方、上記（5-1）で得られたpBS/Allを鋳型として、配列番号44で表される合成オリゴDNAおよびT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、3’-3All遺伝子断片を回収した。5’-NYPLL-2遺伝子断片、3’-3All遺伝子断片、T3プライマー（Takara Bio社製）およびT7プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-2）と同様にしてPCR反応から、pBSへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号27に示されるアミノ酸配列NYPLL3Allをコードする、配列番号23で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/NYPLL3Allを取得した。
(5-6)   42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、69番目のAspをSerへ、70番目のPheをTyrへ、71番目のThrをSerへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、PLDFTと記す）をコードするcDNAの構築
実施例１（4）で得られたpBS/LV0を鋳型として、配列番号51で表される合成オリゴDNAとM13RVプライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、5’-PL遺伝子断片を回収した。一方、pBS/LV0を鋳型として、配列番号52で表される合成オリゴDNAとM13M20プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、3’-DFT遺伝子断片を回収した。5’-PL遺伝子断片、3’-DFT遺伝子断片、M13RVプライマー（Takara Bio社製）およびM13M20プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-2）と同様にしてPCR反応から、pBSへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号28に示されるアミノ酸配列PLDFTをコードする、配列番号24で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/PLDFTを取得した。
【０１０３】
（5-7）  42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、69番目のAspをSerへ、70番目のPheをTyrへ、71番目のThrをSerへそれぞれ変換した改変体のアミノ酸配列（以下、PLLDFTと記す）をコードするcDNAの構築
上記で得られたpBS/PLLVVを鋳型として、配列番号45で表される合成オリゴDNAとM13RVプライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-1）と同様にしてPCR反応を行い、5’-PLL遺伝子断片を回収した。5’-PLL遺伝子断片 、上記（5-6）で得られた3’-DFT遺伝子断片、M13RVプライマー（Takara Bio社製）およびM13M20プライマー（Takara Bio社製）を用いて、上記（3-2）と同様にしてPCR反応から、pBSへのクローニングまでの操作を行い、目的の配列番号29に示されるアミノ酸配列PLLDFTをコードする、配列番号25で示されるcDNAを含むプラスミドpBS/PLLDFTを取得した。
【実施例２】
【０１０４】
抗hIGFCDR移植抗体の発現
（1）抗hIGFCDR移植抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93の適当な位置に実施例1(2)および(4)で取得したアミノ酸配列CamHV0またはアミノ酸配列LV0をコードするcDNAおよびこれらの改変体のアミノ酸配列をコードするcDNAを挿入し、各種抗hIGFCDR移植抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
【０１０５】
アミノ酸配列CamHV0、QARおよびQGARをコードするcDNAとpKANTEX93をそれぞれ制限酵素NotIおよびApaIで処理し、1.5％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約0.5kbp、12kbpの遺伝子断片を分離、回収した。Ligation high（TOYOBO社製）を用いてpKANTEX93とアミノ酸配列CamHV0、QARおよびQGARをコードする遺伝子断片を連結し、プラスミドpKANTEX93/CamHV0、pKANTEX93/QARおよびpKANTEX93/QGARを取得した。
【０１０６】
次にVLcDNAを挿入するため、アミノ酸配列LV0、NYPLL3All、PLDFTおよびPLLDFTをコードするcDNAと上記で得られたpKANTEX93/CamHV0、pKANTEX93/QARおよびpKANTEX93/QGARをそれぞれ制限酵素EcoRIおよびBsiWIで処理した後、1.5％アガロースゲル電気泳動により、それぞれ約0.45kbp、12.5kbpの遺伝子断片を分離し、ゲル抽出キット（QIAGEN社製）を用いて回収した。Ligation high（TOYOBO社製）を用いてpKANTEX93/CamHV0、pKANTEX93/QARまたはpKANTEX93/QGARと各種VL遺伝子断片とを連結反応させ、連結反応により得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株を形質転換し、形質転換株よりミニプレップ（QIAGEN社製）を用いて、添付説明書に従いプラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit ver.3（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を解析し、第２図に示したプラスミドpKANTEX93/CamHV0/LV0、pKANTEX93/QAR/LV0、pKANTEX93/QGAR/LV0、pKANTEX93/CamHV0/NYPLL3All、pKANTEX93/QGAR/PLDFTおよびpKANTEX93/QGAR/PLLDFTを取得した。
（2）抗hIGFCDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現
抗hIGFCDR移植抗体の動物細胞を用いた安定発現は、以下のように行った。
【０１０７】
実施例２の（1）で得られた各抗hIGFCDR移植抗体発現ベクターの10μgを4×106細胞のラットミエローマ細胞株YB2/0細胞（ATCC CRL1581）へエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、40 mLのH-SFM（5）培地［ FCSを5%含むH-SFM（Gibco BRL社製）］に懸濁し、96ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に200μL/ウェルずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、実施例２（5）に記載のヒトIgG定量ELISAを行い抗hIGFCDR移植抗体発現細胞の選択を行った。
【０１０８】
培養上清中に抗hIGFCDR移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、dhfr遺伝子産物のジヒドロ葉酸還元酵素（以下、DHFRと表記する）の阻害剤であるメソトレキセート（以下、MTXと表記する；SIGMA社製）を50nM含むH-SFM(5)に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェル培養プレート（Greiner社製）に1mLずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で1〜2週間培養して、50nM MTX耐性を示す形質転換株を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗hIGFCDR移植抗体の濃度を、実施例２（5）に記載のヒトIgG定量ELISAに準じて行い抗体発現量を確認した。
【０１０９】
培養上清中に抗hIGFCDR移植抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nM、200nMと順次上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nMの濃度で含むH-SFM(5)で増殖可能かつ、抗hIGFCDR移植抗体を高発現する形質転換体を得た。該形質転換体の培養上清中に含まれるヒトIgGの定量を実施例２（5）に記載のヒトIgG定量ELISAにより行い、抗hIGFCDR移植抗体の発現量の最も多いMTX耐性形質転換体を取得した。MTX耐性形質転換体は必要に応じて、1〜2回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗hIGFCDR移植抗体の発現量の最も多い形質転換クローンを取得した。
【０１１０】
以下において、各抗hIGFCDR移植抗体をそれぞれのV領域のアミノ酸配列を組み合わせて、プラスミドpKANTEX93/CamHV0/LV0が導入された形質転換体から生産される抗hIGFCDR移植抗体をCamHV0/LV0と、プラスミドpKANTEX93/QAR/LV0が導入された形質転換体から生産される抗hIGFCDR移植抗体をQAR/LV0と、プラスミドpKANTEX93/QGAR/LV0が導入された形質転換体から生産される抗hIGFCDR移植抗体をQGAR/LV0と、プラスミドpKANTEX93/CamHV0/NYPLL3Allが導入された形質転換体で生産される抗hIGFCDR移植抗体からCamHV0/NYPLL3Allと、プラスミドpKANTEX93/QGAR/PLDFTが導入された形質転換体から生産される抗hIGFCDR移植抗体をQGAR/PLDFTとおよびプラスミドpKANTEX93/QGAR/PLLDFTが導入された形質転換体から生産される抗hIGFCDR移植抗体をQGAR/PLLDFTとそれぞれ称す。
（3）抗hIGFCDR移植抗体の培養上清からの精製
実施例２（2）で得られた各抗hIGFCDR移植抗体を発現する形質転換体を、G418を0.5mg/mL、MTXを200nM、を含むGIT培地（大日本製薬社製）500 mLに、1〜2×105細胞/mLとなるように懸濁し、2Lローラーボトル（ファルコン社製）に分注した。37℃インキュベーター内で7〜8日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約1LよりProsep-A（Bioprocessing社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、各種抗hIGFCDR移植抗体を精製した。
（4）抗hIGFCDR移植抗体の抗原への結合活性の評価（結合ELISA）
ELISAプレートに固定化する抗原としては、hIGF-I（藤沢薬品社製）とメチル化BSA（SIGMA社製）とのコンジュゲートを作製して、使用した。すなわち、蒸留水に溶解したメチル化BSAを、メチル化BSA:hIGF-I=1:8（重量比）になるように4℃で混合し、10秒間ボルテックスミキサーで攪拌して、メチル化BSAとhIGF-Iのコンジュゲートを取得した（以下、mBSA-hIGF-Iと記す）。
【０１１１】
96ウェルELISAプレート（Greiner社製）に、上述のmBSA-hIGF-IをhIGF-Iの濃度として20 ng/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSAを含むPBS（以下、BSA-PBSと記す）を100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。BSA-PBSを捨て、各種形質転換体の培養上清あるいは精製した各種抗hIGFCDR移植抗体を50μL/ウェルで分注し、室温で2時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween 20を含むPBS（以下、Tween-PBSと記す）で洗浄後、2000倍に希釈したHRP標識化抗ヒトIgG抗体（American Qualex社製）を二次抗体として50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2’-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、415nmの吸光度（以下、OD415と記す）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
（5）ヒトIgG定量ELISA（サンドイッチELISA）
96ウェルELISAプレート（Greiner社製）に、抗ヒトIgG抗体（American Qualex社製）をPBSで2000倍に希釈し、50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させプレートを作製した。BSA-PBSを用いて残存する活性基をブロックする操作以降の操作は、上記の実施例２（4）に記載の結合ELISAと同様に行った。
【実施例３】
【０１１２】
抗hIGFCDR移植抗体の反応性の確認
実施例２（3）で得られた各種抗hIGFCDR移植抗体の精製標品については、実施例２（4）に記載の結合ELISA、または下記に示す実施例３（2）に記載のバイオセンサービアコア（ビアコア社製）を用いたhIGFとの結合親和性の測定法などを用いて、hIGFへの結合活性を検討した。以下の検討において、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002は、参考例６（4）に記載の方法に従って精製したものを用いた。
（1）mBSA-hIGF-Iに対する結合ELISA
実施例２（3）に記載した方法により精製した各種抗hIGFCDR移植抗体のmBSA-hIGF-Iへの結合活性を検討した。結果を第３図に示した。第３図aに示したように、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のCDRのみをヒト抗体CamのFRおよびVLのサブグループIVの共通配列のFRに移植した抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0では、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002に比べ、hIGF-Iに対する結合活性が約1/50に低下していた。そこで、各FRのアミノ酸を改変することによりhIGF-I結合活性の増加を検討した。
【０１１３】
抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0からVHの1番目のGlnをGluへ、97番目のAlaをThrへ、98番目のArgをThrへそれぞれ改変した抗hIGFCDR移植抗体QAR/LV0では、第３図aに示したように、CamHV0/LV0に比べてhIGF-Iに対する結合活性の増加は認められなかった。しかし、1番目のGlnをGluへ、97番目のAlaをThrへ、98番目のArgをThr へのアミノ酸改変に加えて、42番目のGlyをThrへ改変した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0では、第３図aに示したように、CamHV0/LV0と比較して約25倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002の結合活性の約1/2であった。
【０１１４】
以上の結果から、CamHV0の1番目のGlnをGluへ、97番目のAlaをThrへ、98番目のArgをThrへのアミノ酸改変に加えて、42番目のGlyをThrへ改変することでhIGF-Iに対する結合活性を上昇させることが可能であること、また、三次元構造モデルでは活性への寄与が不明であった42番目のGlyは、本抗体の活性に非常に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
【０１１５】
一方、VLの改変体については、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0からVLの22番目のAsnをThrへ、35番目のTyrをPheへ、42番目のProをSerへ、45番目のLeuをProへ、46番目のLeuをTrpへ、69番目のAspをSerへ、70番目のPheをTyrへ、71番目のThrをSerへ、82番目のValをAlaへ、84番目のValをThrへそれぞれ改変した抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/NYPLL3AllのhIGF-Iに対する結合活性は、第３図aに示したように、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0と比較して約25倍の結合活性の上昇が認められ、その活性は、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002の結合活性の約1/2の結合活性であった。以上の結果から、上記のVLの改変によってhIGF-Iに対する結合活性を上昇させることが可能であることが明らかとなった。そこで、アミノ酸配列がQGARであるVHとアミノ酸配列がNYPLL3AllであるVLとを組み合わせた抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3AllのhIGF-Iに対する結合活性を検討した。結果を第３図bに示した。その結果、このようなVHとVLを組み合わせた抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3Allは、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002と同等の結合活性を示すことが確認された。
【０１１６】
次に、VLの改変体NYPLL3Allの10残基の改変したアミノ酸残基の中から、活性上昇に重要なアミノ酸残基を特定するため、改変アミノ酸残基数が少ないアミノ酸配列がPLDFTであるVLの改変体およびPLLDFTであるVLの改変体と、アミノ酸配列がQGARであるVHの改変体とをぞれぞれ組み合わせた抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFTおよび抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTのhIGF-Iに対する結合活性を検討した。
【０１１７】
結果を第３図bに示した。その結果、これら２種類の抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFTおよび抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTは、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002と同等のhIGF-Iへの結合活性を示すことが明らかとなった。
(2) バイオセンサービアコアを用いた結合親和性の測定
抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002と上記の実施例２（3）で精製した各種抗hIGFCDR移植抗体のhIGF-IまたはhIGF-IIへの結合活性をバイオセンサーBiacore2000（ビアコア社製）を用いて以下のようにして、結合親和性として測定した。サンプルの希釈と測定中の反応緩衝液には、HBS-EP（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween20 pH7.4）（ビアコア社製）を用いた。
【０１１８】
センサーチップCM-5（ビアコア社製）に、アミンカップリングキット（ビアコア社製）を用いて、18.5 pg/mm2でリコンビナントhIGF-I（藤沢薬品社製）を、26.7 pg/mm2でhIGF-II（R＆D社製）を固定化し、アナライトとして10μg/mLより2倍希釈で5段階に希釈した各種抗体を、流速5μL/分で4分間添加し、結合反応を観察した後、5分間にわたって解離反応を観察した。解離反応後、30 mM 塩酸の5μLを1回添加してセンサーチップ表面を再生した。反応は25℃で行った。各濃度における反応曲線から、結合速度定数Kassおよび解離速度定数Kdissを算出し、これから各抗体の結合定数KA（M-1）を算出した。結果を第３表に示した。
【表３】
2005028515.tif 000062
抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0は、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002に比べ、hIGF-IまたはhIGF-IIに対するKAが、それぞれ約1/17、約1/6に低下していた。抗hIGFCDR移植抗体QAR/LV0では、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0に比べて結合親和性の増加は殆ど認められないが、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0では、hIGF-IおよびhIGF-IIに対するKAが、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0に比べて、約5倍増加した。
【０１１９】
一方、VLの抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/NYPLL3Allでは、hIGF-IまたはhIGF-IIに対するKAが、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0に比べて、それぞれ約8倍、約5倍増加していた。更に、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3Allでは、hIGF-IまたはhIGF-IIに対するKAが、抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0に比べて、それぞれ約14倍、約10倍増加していた。
改変アミノ酸残基が最適化されたアミノ酸配列PLDFTまたはアミノ酸配列PLLDFTを有するVLとアミノ酸配列QGARを有するVHを組み合わせた抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFTまたは抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTのhIGF-IまたはhIGF-IIに対する結合親和性は、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3Allおよび抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002とほぼ同等であり、改変アミノ酸残基の減少よる活性低下は認められなかった。
【実施例４】
【０１２０】
抗hIGFCDR移植抗体のhIGF依存性増殖阻害効果
上記実施例２（3）で得られた抗hIGFCDR移植抗体精製標品のhIGF依存性増殖に対する阻害活性を以下のようにして確認した。
ヒト大腸癌細胞株HT-29（ATCC HTB-38）をTF/BSA培地[D-MEM/F-12（Gibco BRL社製）に10μg/mLのヒトトランスフェリン（Gibco BRL社製）、200μg/mLのBSAを添加した培地]で5×104細胞/mLに調製し、96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルで分注した。さらに、TF/BSA培地で40〜80 ng/mLの濃度に希釈したhIGF-IあるいはhIGF-IIを50μL/ウェルで、TF/BSA培地で各濃度に希釈した各抗hIGFCDR移植抗体を50μL/ウェルで添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で5日間培養した。培養後、細胞増殖試薬WST-1（Roche社製）を20μL/ウェルで分注し、さらに、37℃、5%CO2インキュベーター内で2〜3時間培養した後に、OD450nmの吸光度（以下、OD450と表記する）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１２１】
結果を第４図から第６図にそれぞれ示した。各抗hIGFCDR移植抗体のhIGF依存性増殖に対する阻害活性は、上記実施例３の結合ELISAによるhIGF-Iとの結合活性およびバイオセンサービアコアを用いて測定したhIGFとの結合親和性の測定結果と良く相関していた。即ち、高いhIGFとの結合親和性を有する抗hIGFCDR移植抗体は、高いhIGF依存性増殖に対する阻害活性を有しており、作製した抗hIGFCDR移植抗体のうち、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3All、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFT、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTは、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002と同等のhIGF依存性増殖に対する阻害活性を有していることが示された。
【０１２２】
以上の結果は、本実施例で作製した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3All、抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFTおよび抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTが、hIGF-I、hIGF-IIに対する高い結合親和性およびhIGF-I、hIGF-IIの生物活性に対する高い中和活性を有していることを示している。また、これらの抗hIGFCDR移植抗体は、そのほとんどのアミノ酸残基がヒト抗体の配列に由来することから、hIGFの機能がその病態形成に関わる様々なヒト疾患の治療薬として有用である。
(参考例)
【０１２３】
(参考例１)
【０１２４】
抗hIGFモノクローナル抗体の作製
（1）非ヒト動物の免疫
組換え型hIGF-I（R&D社製）は、免疫原性を高める目的で以下の方法でメチル化BSA（SIGMA社製）とのコンジュゲートを作製し、免疫原とした。すなわち、2回蒸留水に溶解したメチル化BSAを、メチル化BSA:hIGF-I=1:4（重量比）になるように4℃で混合し、10秒間ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、連結針付きシリンジを用いて完全フロインドアジュバントあるいは不完全フロインドアジュバントと容量比1:1で混合し、免疫原（以下、メチル化BSA-hIGF-Iアジュバンドと記す）とした。
【０１２５】
5週令雌SDラットに、完全フロインドアジュバントを用いて上記のように調製したメチル化BSA-hIGF-Iアジュバンド（100μgのhIGF-I相当量）を投与し、2週間後より不完全フロインドアジュバントを用いて同様に調製した免疫原を1週間に1回、計4回投与した。
眼底静脈叢より採血し、その血清中の抗体価を参考例1（4）項に示す結合ELISAで調べ、十分な抗体価を示したラットから最終免疫3日後に脾臓を摘出した。
【０１２６】
脾臓をMEM培地（日水製薬社製）中で細断し、ピンセットでほぐし、遠心分離（1200 rpm、5分間）した後、上清を捨て、トリス-塩化アンモニウム緩衝液（pH7.65）で1〜2分間処理し、赤血球を除去し、MEM培地で3回洗浄し、細胞融合に使用した。
（2）マウス骨髄腫細胞の調製
8-アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3-U1を通常培地で培養し、細胞融合時に2×107個以上の細胞を確保して、細胞融合に使用した。
（3）ハイブリドーマの作製
参考例1（1）項で得られたラット脾細胞と（2）項で得られた骨髄腫細胞とを10:1になるよう混合し、遠心分離（1200rpm、5分間）した後、上清を捨て、沈澱した細胞に37℃で攪拌しながら、1.0×102個のラット脾細胞あたり0.2〜1.0mLの融合培地（2gのPEG-1000、2mLのMEM、0.7mLのジメチルスルホキシドの混液）を加え、1〜2分間毎に1〜2mLのMEM培地を数回加えた後、さらに、MEM培地を加えて全量が50mLになるようにした。遠心分離（900 rpm、5分間）した後、上清を捨て、緩やかに細胞をほぐした後、100mLのHAT培地｛通常培地［RPMI-1640培地に1.5mMグルタミン、50μM 2-メルカプトエタノール、10μg/mLジェンタマイシンおよび10% 牛胎児血清（以下、FCSと記す）を加えた培地］に0.1mM ヒポキサンチン、15μM チミジンおよび0.4μM アミノプテリンを加えた培地｝に懸濁した。
【０１２７】
この懸濁液を96ウェル培養用プレートに100μL/ウェルずつ分注し、5%CO2インキュベーター中、37℃で10〜14日間培養した。この培養上清を参考例1（4）項に示す結合ELISAを用いて、メチル化BSA-hIGF-Iに反応して、陰性対照であるメチル化BSA-BSA[BSAを用いて上記参考例1（1）と同様の反応を行い作製したコンジュゲート]に反応しないウェルを選び、さらにHT培地（HAT培地からアミノプテリンを除いた培地）と通常培地に換え、2回の単一細胞化を行い、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを確立した。
【０１２８】
その結果、第７図に示した反応性を有する抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468、抗hIGFラットモノクローナルKM1469、抗hIGFラットモノクローナルKM1470、抗hIGFラットモノクローナルKM1471、抗hIGFラットモノクローナルKM1472および抗hIGFラットモノクローナルKM1473をそれぞれ産生する6クローンのハイブリドーマを取得した。各ハイブリドーマが産生する抗体のサブクラスを、サブクラスタイピングキットを用いたELISAにより検討した結果、いずれもIgG2bであった。
（4）モノクローナル抗体の選択（結合ELISA）
ELISAプレートに固定化する抗原としては、参考例1（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-Iおよび陰性対照としてメチル化BSA-BSAを用いた。96ウェルELISAプレート（Greiner社製）に、上述の抗原をhIGF-IあるいはBSAの濃度として10μg/mLで50μL/ウェルで分注し、4℃で一晩放置して吸着させた。PBSで洗浄後、1%BSAを含むPBS（以下、BSA-PBSと記す）を100μL/ウェルで加え、室温で1時間反応させて残存する活性基をブロックした。BSA-PBSを捨て、被免疫ラット抗血清、抗hIGF-Iモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの培養上清あるいは精製した抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体を50μL/ウェルで分注し、室温で2時間反応させた。反応後、各ウェルを0.05%Tween 20を含むPBS（以下、Tween-PBSと記す）で洗浄後、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を二次抗体として50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、415nmの吸光度（以下、OD415と記す）をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。（5）モノクローナル抗体の精製  プリスタン処理した8週令Balb/cヌード雌マウスに参考例1（3）で得られたハイブリドーマを5〜20×106細胞/匹でそれぞれ腹腔内注射した。10〜21日後に、ハイブリドーマが腹水癌化したマウスから、腹水を採取（1〜8mL/匹）し、遠心分離（3000 rpm、5分間）して固形分を除去した。その後、カプリル酸沈殿法（Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）によりIgG画分を精製し、精製モノクローナル抗体とした。
(参考例２)
【０１２９】
抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の反応性の検討
（1）hIGF-Iの天然の立体構造に対する反応性
参考例1（3）で選択された６種類の抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を保つhIGF-Iに対する反応性を、以下に示す競合ELISAで調べた。
参考例１（4）に示した、参考例１（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-Iを固定化したプレートを準備し、20μg/mLより5倍希釈で段階的に希釈したhIGF-Iを50μL/ウェルで分注後、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体の精製抗体を希釈した溶液（抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468:6.0μg/mL、抗hIGFラットモノクローナルKM1470:1.0μg/mL、抗hIGFラットモノクローナルKM1471:0.16μg/mL、抗hIGFラットモノクローナルKM1472:7.0μg/mL、抗hIGFラットモノクローナルKM1473:1.2μg/mL）を50μL/ウェルで分注し、混合して室温で2時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１３０】
第８図に示したように、抗hIGF-Iラットモノクローナル抗体はいずれもhIGF-Iの液層中の天然の立体構造と反応性を示した。また、本系において、最も高い感度を示した抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468では、液相系に含まれる16ng/mLまでの濃度の天然の立体構造を有するhIGF-Iを検出可能であった。
（2）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-Iの競合的ELISAでの反応性
抗hIGFラットモノクローナルKM1468は、上記（1）においてhIGF-Iの立体構造を認識している可能性が示唆された。しかしながら、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468は、アミノ酸一次配列を認識している可能性も考えられるため、hIGF-I部分ペプチドとの反応性を解析した。
（2−1）hIGF-Iの部分ペプチドの合成
WO01/64754に記載の方法に従って、hIGF-Iの部分ペプチドを合成した。合成したペプチドは、hIGF-Iの1-18番目（配列番号56、以下、p1-18と記す）、14-30番目（配列番号57、以下、p14-30と記す）、24-35番目（配列番号58、以下、p24-35と記す）、29-41番目（配列番号59、以下、p29-41と記す）、36-47番目（配列番号60、以下、p36-47と記す）、41-56番目（配列番号61、以下、p41-56と記す）、52-70番目（配列番号62、以下、p52-70と記す）、53-61番目（配列番号63、以下、p53-61と記す）、61-70番目（配列番号64、以下、p61-70と記す）に相当するペプチドであり、hIGF-Iの全長を網羅するように設計した。上記ペプチドにおいては、内部に存在するCysについては、SerあるいはAlaに置換した配列を合成した。また、41-56番目に相当する配列については、内部のCysを有する配列（配列番号65、以下、p41-56Cと記す）も合成した。
（2−2）抗hIGFラットモノクローナルKM1468の抗原認識部位の解析
上記（2-1）で合成した各種ペプチドを用いて、抗hIGFラットモノクローナルKM1468の抗原認識部位の解析を以下に示す競合ELISAで検討した。
【０１３１】
参考例１（4）に示したように抗原を固定化したプレートを準備し、4.0μg/mLに希釈した抗hIGFラットモノクローナルKM1468を50μL/ウェルで分注後、50μg/mLより3倍希釈で段階的に希釈した各種ペプチド溶液の単独あるいは種々の組合せ、あるいはhIGF-Iを50μL/ウェルで分注し、混合して室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、二次抗体として4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のOD415を100とした相対値（%）で表示した。
【０１３２】
結果を第９図に示した。第９図に示したように、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-Iに対する結合は、hIGF-Iにより濃度依存的に阻害されたが、各種ペプチドでは、単独あるいは組合せに拘わらず、阻害活性は認められなかった。以上の結果は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468が、hIGF-Iの単なるアミノ酸一次配列ではなく、hIGF-Iの立体構造を認識していることを強く示唆する。
（3）抗hIGFラットモノクローナルKM1468の競合的ELISAによる交差反応性の確認
精製した抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IIおよびヒトインスリンに対する交差反応性を、以下に示した競合ELISAで検討した。抗原としては、hIGF-I（Pepro Tech社製）、hIGF-II（Pepro Tech社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
【０１３３】
参考例１（1）で作製したメチル化BSA-hIGF-I抗原、あるいは参考例1（1）と同様に作製したメチル化BSA-hIGF-II抗原を、参考例1（4）項に示した方法に従って、メチル化BSA-hIGF-I抗原は0.1μg/mLの濃度で、メチル化BSA-hIGF-II抗原は1.0μg/mLの濃度でそれぞれ固定化したプレートを準備し、0.6μg/mLに希釈した抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468を25μL/ウェルで分注後、20μg/mLより4倍希釈で段階的に希釈したhIGF-I、hIGF-IIあるいはヒトインスリンを25μL/ウェルで分注し、混合して室温で1時間反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、二次抗体として抗hIGFラットモノクローナルKM1468の場合は、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL/ウェルで加えて使用した。反応後、Tween-PBSで洗浄後、ABTS基質液［2, 2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）アンモニウムの0.55gを1Lの0.1Mクエン酸緩衝液（pH4.2）に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/mLで添加した溶液］を50μL/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。結果は、抗体のみを添加した時のOD415を100として相対値（%）で表示した。
【０１３４】
結果を第１０図に示した。第１０図Aに示したように、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-Iに対する結合は、hIGF-IおよびhIGF-IIで強く阻害された。同様に、第１０図Bに示したように、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IIに対する結合は、hIGF-IおよびhIGF-IIで強く阻害された。すなわち、抗hIGFラットモノクローナルKM1468は、hIGF-IとhIGF-IIの両方に同程度の強さで反応できることを示している。一方、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IあるいはhIGF-IIへの結合は、ヒトインスリンでは阻害されなかった。
(参考例３)
【０１３５】
抗IGF抗体とIGFとの反応性の確認 
抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468と二種類の市販抗hIGF抗体との、抗原への反応性の比較を以下のようにして検討した。抗体としては、抗hIGFラットモノクローナルKM1468、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2（Upstate biotechnology社製）および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2（Upstate biotechnology社製）を用いた。抗原としては、hIGF-I（Pepro Tech社製）、hIGF-II（Pepro Tech社製）およびヒトインスリン（和光純薬社製）を使用した。
（1）表面プラズモン共鳴を用いた結合強度の測定
抗hIGFラットモノクローナルKM1468と、抗原であるhIGF-IあるいはhIGF-IIに対する結合活性を解析するために、抗hIGFラットモノクローナルKM1468、市販の抗hIGF-I抗体sm1.2、および市販の抗hIGF-II抗体S1F2の3種の抗体の、hIGF-IおよびhIGF-IIに対する結合強度を表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance）を利用したバイオセンサーBiacore2000（ビアコア社製）を用いて以下のように測定した。アナライトの希釈並びに測定中の反応緩衝液としては、HBS-EP（10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween20 pH7.4）（ビアコア社製）を用いた。
【０１３６】
センサーチップCM-5（ビアコア社製）に、アミンカップリング（ビアコア社製）を用いて、36.0pg/mm2でhIGF-Iをあるいは41.7pg/mm2でhIGF-IIを固定化し、測定物として20μg/mLより2倍希釈で6段階に希釈した3種類の抗体を、流速20μL/分で2分間添加した後、5分間にわたって測定物の解離を観察した。反応は25℃で行った。各濃度における結合反応曲線から、結合速度定数Kass、並びに解離速度定数Kdissを算出し、これから各抗体の結合定数KA（M-1）を算出した。結合定数KAは、KA＝Kass/Kdissで計算される。結果を第４表に示した。
【表４】
2005028515.tif 000063
抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-Iに対する KAは7.86×109M-1であり、hIGF-IIに対するKAは8.63×109M-1であった。抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のhIGF-IおよびhIGF-IIに対するKAの比は、ほぼ1:1であり、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468はhIGF-IおよびhIGF-IIの両者に同程度に強力に結合できることが示された。一方、市販の抗hIGF-Iモノクローナル抗体sm1.2のhIGF-Iに対するKAは1.86×108M-1、hIGF-IIに対するKAは7.35×107M-1であった。抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IおよびhIGF-II に対するKAは、市販の抗hIGF-I抗体sm1.2のKAと比較してhIGF-Iに対しては約42倍、hIGF-IIに対しては約120倍であった。また、市販の抗hIGF-II抗体S1F2のhIGF-Iに対するKAは4.62×108M-1、hIGF-IIに対するKAは2.4×109M-1であった。抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IおよびhIGF-II に対するKAは、市販の抗hIGF-II抗体S1F2のKAと比較してhIGF-Iに対しては約18倍、hIGF-IIに対しては約3.6倍であった。すなわち抗hIGFラットモノクローナルKM1468は、市販の抗hIGF-I抗体であるsm1.2および市販の抗hIGF-II抗体であるS1F2と比較して、hIGF-I、hIGF-IIのそれぞ
れに強い結合力を有していることが示された。
(参考例４)
【０１３７】
hIGF-I発現細胞の増殖に対する抗hIGFラットモノクローナルKM1468の影響
（1）hIGF-I発現細胞の構築
以下のようにしてヒト肺癌細胞株A549細胞（ATCC CCL-185）にhIGF-I遺伝子を導入した形質転換体を作製した。
（1−1）hIGF-I遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
1×107個のヒト肺癌細胞株PC-9細胞（British Journal of Cancer, 39, 15, 1976）から、RNA調製キットRNeasy（QIAGEN社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、45.6μg の全 RNAを調製した。調製した全 RNAのうち5μgを使用して、Superscript II（GIBCO-BRL社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、cDNAを合成した。
【０１３８】
合成したcDNAを鋳型として、PCRによってhIGF-I遺伝子をクローニングした。hIGF-I遺伝子増幅用のプライマーとして、配列番号66と配列番号67に示した塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを設計した。それぞれの合成DNAは5’末端にプラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）、並びにpKANTEX93（WO97/10354）へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、上述で得られたヒト肺癌細胞株PC-9細胞から合成したcDNAの20ngを50μLのKOD(+) DNA Polymerase添付KOD(+) Buffer 1（東洋紡績社製）、0.2mMdNTPs、2mM塩化マグネシウム、1μMの配列番号66と67に示した塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて、94℃にて1分間加熱した後、2.5単位のKOD DNA Polymerase（東洋紡績社製）を添加し、94℃にて30秒間、62℃にて30秒間、72℃にて30秒間のサイクルを30サイクル行った。それぞれの反応液50μLを制限酵素EcoRI（Takara Shuzo社製）およびSalI（Takara Shuzo社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動し、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、約0.5kbのhIGF-1をコードする遺伝子のPCR産物を回収した。
【０１３９】
次に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）を制限酵素EcoRIおよびSalIで消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（以下、CIAPと表記する；Takara Shuzo社製）で末端を脱リン酸化して得られたDNA0.1μgと、上記で得られたそれぞれのPCR産物約0.1μgを滅菌水に加えて7.5μLとしLigation high（東洋紡績社製）7.5μLを加えて16℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。その結果、目的であるhIGF-Iをコードする遺伝子配列を有する第１１図に示したプラスミドpBS(II)SK(-)/hIGF-Iを得た。
【０１４０】
次に、上記で得られたpBS(II)SK(-)/hIGF-IのhIGF-Iをコードする遺伝子を含む制限酵素断片（EcoRI-KpnI）とpKANTEX93のEcoRI-KpnI断片とを連結して、第１１図に示したプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを構築した。プラスミドpKANTEX93/hIGF-Iの塩基配列を上記と同様に塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377を用いて決定した。その結果、目的のhIGF-Iをコードする遺伝子を含むプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを得た。
（1−2）hIGF-I形質転換体の作製
上記（1−1）で得られたプラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを動物細胞に導入して、hIGF-I発現細胞を以下のよう作製した。
【０１４１】
プラスミドpKANTEX93/hIGF-Iを制限酵素AatII（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、8μgを4×106細胞のヒト肺癌細胞株A549細胞（ATCC CCL-185）へエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、15mLのRPMI培地［10% FCS、50μg/mL ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むRPMI1640培地（Invitrogen社製）］に懸濁し、T75フラスコ（スミロン社製）に移した。37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した後、G418を0.2mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示すA549/hIGF-I形質転換株（以下、A549/hIGF-Iと表記する）が取得された。
（2）A549/hIGF-I細胞の培養上清に産生されたhIGF-Iの定量
上記（1）で作製したA549/hIGF-I細胞内において導入したhIGF-I遺伝子が発現して、該細胞がhIGF-Iを産生しているかを確認するために、以下の実験を行った。
【０１４２】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養を行った後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるhIGF-I量を以下のELISA法により測定した。
参考例１（4）に示した、メチル化BSA-hIGF-Iを固定化したプレートを準備し、陽性対象として2μg/mLより５倍希釈で段階的に希釈したhIGF-I、あるいはA549/hIGF-I細胞またはA549細胞の培養上清を25μl /ウェルで分注後、BSA-PBSで0.6μg/mLに希釈した抗hIGFラットモノクローナルKM1468の精製抗体を分注し、混合して室温で2時間反応させた。反応後Tween-PBSで洗浄後、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）を50μL /ウェルで分注し、室温1時間で反応させた。反応後、Tween-PBSで洗浄後、1000倍希釈した抗ラットIgG-HRP（DAKO社製）を50μL/ウェルで分注し、室温で１時間反応させた。反応後、Tween-PBSで５回洗浄した後、ABTS基質溶液［2, 2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)アンモニウムの0.55gを1Lの0.1 Mクエン酸緩衝液(pH4.2)に溶解し、使用直前に過酸化水素水を1μL/ mLで添加した溶液］を50μl/ウェルで加えて発色させ、OD415をプレートリーダーEmaxを用いて測定した。
【０１４３】
結果を第１２図に示した。第１２図Aに示したように、hIGF-I遺伝子が導入されていないA549細胞の培養上清に対してhIGF-I遺伝子が導入されたA549/hIGF-I細胞の培養上清では、明らかに結合活性は低下していることから、A549/hIGF-I細胞はhIGF-Iを発現していることが示された。
（3）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-I発現細胞の増殖に対する影響
細胞自身が産生するhIGF-Iに依存した細胞増殖（以下オートクリン細胞増殖と表記する）を抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468が阻害できるかを、上記（1）で作製したhIGF-I遺伝子導入細胞A549/hIGF-I細胞を用いて、調べた。
【０１４４】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞を10% FCS、50μg/mL ゲンタマイシン（ナカライテスク社製）を含むRPMI1640培地（Invitrogen社製）（以下、RPMI培地と表記する）で培養した後、それぞれ2×105個/mLの細胞密度になるように10μg/mLのヒトトランスフェリン（GIBCO社製）、200μg/mL BSA（Invitrogen社製） を含むDMEM/F12培地(-FCS, -Phenol red)（Invitrogen社製）（以下、無血清培地と表記する）に懸濁した。
【０１４５】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液を96ウェルプレート（スミロン社製）に100μL/ウェルで分注した後、各ウェルに無血清培地で200μg/mLより５倍希釈系で段階的に希釈した抗hIGFラットモノクローナルKM1468を100μL/ウェルで添加し、37℃、5%CO2インキュベーター内で5日間培養した。培養後、細胞増殖試薬WST-1（Roche社製）を20μL/ウェルで分注し、さらに、37℃、5%CO2インキュベーター内で4時間培養した後に、OD450をプレートリーダーEmax（Molecular Devices社製）を用いて測定した。
【０１４６】
結果を第１３図に示した。横軸は、培養時の各ウェル中の抗hIGFラットモノクローナルKM1468濃度を示した。破線に示される抗hIGFラットモノクローナルKM1468非添加のA549/hIGF-I細胞の増殖性は、実線に示されるhIGF-Iを産生しないA549細胞の増殖性と比較した場合、明らかに増加している。これは、A549/hIGF-I細胞が自己産生するhIGF-IによってA549/hIGF-I細胞自身の増殖を促すオートクリン増殖を示しているものである。この第１３図に表されるようなオートクリン増殖は、A549/hIGF-I細胞の培養時に抗hIGFラットモノクローナルKM1468を添加した場合に、濃度依存的に阻害された。一方、A549細胞の増殖性には、抗hIGFラットモノクローナルKM1468は影響を及ぼさなかった。すなわち、抗hIGFラットモノクローナルKM1468は、細胞自身が生産するhIGF-Iによるオートクリン細胞増殖を阻害できることが示された。
（4）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-I発現細胞の足場非依存性増殖への影響
癌化した細胞は、軟寒天中などの細胞接着のない浮遊状態にも関わらず増殖することができる足場非依存性増殖能を有している。この足場非依存性増殖能は、細胞の造腫瘍性と非常に密接に関連しており、hIGF-Iが関与していると考えられている。抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468が細胞の足場非依存性増殖を阻害できるかを、上記（1）で作製したA549/hIGF-I細胞を用いて、以下のようにして調べた。
【０１４７】
暖めた0.3% agar noble（Difco社製）を含む、RPMI培地（以下、agar-RPMI培地と記す）を、12ウェルプレート（Costar社製）に1 mL/ウェルで分注し、数十分室温で放置してゲル化させたプレートを準備した。A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養した後、1×103個/mLの細胞密度になるように暖めたagar-RPMI培地に懸濁した。
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液を、1mL/ウェルで各ウェルに層積した。数分間室温で放置し、ゲル化させた後、37℃、5%CO2インキュベーター内で4週間培養した。培養後、各ウェル内に形成されたコロニー数を顕微鏡下で測定した。
【０１４８】
結果を第１４図に示した。第１４図に示したようにhIGF-Iを産生するA549/hIGF-I細胞の足場非依存性の細胞増殖性は、A549細胞の足場非依存性の細胞増殖性と比較して上昇していた。また、A549/hIGF-I細胞の軟寒天中での培養時に10μg/mLの抗hIGFラットモノクローナルKM1468を添加した場合には、足場非依存性の細胞増殖は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468の添加により完全に阻害された。すなわち、足場非依存性の細胞増殖にはhIGF-Iが関与しており、hIGF-I依存的な足場非依存性の細胞増殖は、抗hIGFラットモノクローナルKM1468により阻害されることが示された。
（5）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-I発現細胞に対する腫瘍増殖阻害効果
上記（1）で作製したA549/hIGF-I細胞を用いて、hIGF-Iが関与するin vivo腫瘍形成に対する、抗hIGFラットモノクローナルKM1468の腫瘍増殖阻害効果を、以下のように検討した。
【０１４９】
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞をRPMI培地で培養した後、それぞれ1×106個/mLの細胞密度になるようにPBSに懸濁した。
A549/hIGF-I細胞あるいはA549細胞の細胞懸濁液の100μLを6週齢、ヌードマウス Balb/c Ajc-1 nu（メス）の右胸部に皮下移植した。マウス1匹当たりの移植した細胞数は、1×107個となる。移植直後から、マウス1匹につき500μgの抗hIGFラットモノクローナルKM1468を1週間に2回、合計8回にわたって尾静脈から投与した。陰性対象として、同一の腫瘍皮下移植マウスに対してPBS投与を同時に行った。細胞移植から5日間経過時点から、腫瘍体積を測定した。腫瘍体積（mm3）は、腫瘍の長径、短径および高さから、長径×短径×高さ×0.5236の式を用いて、算出した。
【０１５０】
結果を第１５図に示した。A549細胞とhIGF-Iを生産しているA549/hIGF-I細胞を移植したマウスの間で、皮下腫瘍の増殖性を比較したとき、A549/hIGF-I細胞を移植したマウスの皮下腫瘍の方が、腫瘍の増殖は亢進していた。また、A549/hIGF-I細胞を移植したマウスでは、抗hIGFラットモノクローナルKM1468を投与した場合、皮下腫瘍の増殖は、顕著に阻害された。このことは、抗hIGFラットモノクローナルKM1468が、hIGF-Iの阻害によりinvivoにおいても腫瘍の増殖を阻害できることを明確に示している。
(参考例５)
【０１５１】
抗hIGF抗体KM1468の遺伝子クローニング
抗hIGFラットモノクローナルKM1468のV領域をコードするcDNAを以下のようにして、単離、解析した。
（1）抗hIGFラットモノクローナルKM1468産生ハイブリドーマからのmRNAの調製
5×107個の抗hIGFラットモノクローナルKM1468産生ハイブリドーマ細胞KM1468（FERM BP-7978）より、mRNAの調製キットであるFast Track mRNA Isolation Kit（Invitrogen社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、ハイブリドーマKM1468細胞由来のmRNAを27μg調製した。
（2）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のH鎖およびL鎖cDNAライブラリーの作製
上記（1）で取得したハイブリドーマKM1468細胞のmRNAの5μgから、TimeSaver cDNA Synthesis Kit（Amersham-Pharmacia社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、両端にEcoRI-NotIアダプター配列が連結されたcDNAを合成した。合成したcDNAの全量を20μLの滅菌水に溶解後、アガロースゲル電気泳動にて分画し、IgGクラス抗体のH鎖に対応する約1.5kbのcDNA断片とκクラスのL鎖に対応する約1.0kbのcDNA断片をQIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いてそれぞれ約1.0μg回収した。次に、λZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit（Stratagene社製）を用いて、VHとVLそれぞれのcDNA断片0.1μg相当と、キットに添付されている制限酵素EcoRIで消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphataseで末端を脱リン酸化されたλZAPIIベクターの1μgを、添付の使用説明書に従い、連結した。連結後のそれぞれの反応液のうち2.5μLをGigapack III Gold Packaging Extracts （Stratagene社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、λファージにパッケージングし、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のH鎖cDNAライブラリーとして5×104個、L鎖cDNAライブラリーとして4×104個のファージクローンを取得した。次に、各々のファージを常法（Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）に従い、ナイロンメンブレンフィルターHybond-N+（Amersham-Pharmacia社製）上に固定した。
（3）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のH鎖およびL鎖のcDNAのクローニング
上記（2）で作製した抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のH鎖cDNAライブラリー、L鎖cDNAライブリーのナイロンメンブレンフィルターを、ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems（Amersham-Pharmacia社製）を用いて、添付の使用説明書に従い、マウス抗体のC領域のcDNA[H鎖はマウスCγ2bのcDNA断片（Nature, 283, 786 1980）、L鎖はマウスCκのcDNA断片（Cell, 22, 197, 1980）]をプローブとして検出し、プローブに強く結合したファージクローンをH鎖、L鎖各10クローン取得した。次に、λZAPII Predigested EcoRI/CIAP-Treated Vector Kit（Stratagene社製）の使用説明書に従い、invivoexcision法により各ファージクローンをプラスミドに変換した。こうして得られた各プラスミドに含まれるcDNAの塩基配列をBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて、添付の使用説明書に従って反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて決定した。その結果、cDNAの5'末端に開始コドンと推定されるATG配列が存在する完全長の機能的なH鎖cDNAを含むプラスミドpKM1468H5-2およびL鎖cDNAを含むプラスミドpKM1468L5-1を得た。
（4）抗hIGFラットモノクローナルKM1468のV領域のアミノ酸配列の解析  
プラスミドpKM1468H5-2に含まれていた抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHの全塩基配列を配列番号1に、それから推定された抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHの全アミノ酸配列を配列番号2に、プラスミドpKM1468L5-1に含まれていた抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLの全塩基配列を配列番号3に、それから推定された抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVLの全アミノ酸配列を配列番号4にそれぞれ示した。なお、配列番号2および4に記載したアミノ酸配列にそれぞれ対応する塩基配列は、配列番号１および3に記載したもの以外に無数に存在するが、それらはすべて本発明の範囲に包含される。既知の抗体の配列データ（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）との比較および精製した抗hIGFラットモノクローナルKM1468のVHおよびVLのN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ-10（Shimadzu社製）を用いて解析した結果との比較から、単離した各々のcDNAは分泌シグナル配列を含む抗hIGFラットモノクローナルKM1468のH鎖およびL鎖をコードする完全長cDNAであり、VHについては、配列番号2に示したアミノ酸配列の1から19番目が、VLについては、配列番号4に示したアミノ酸配列の1から22番目が分泌シグナル配列であることが明らかとなった。
【０１５２】
次に、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のVHおよびVLのアミノ酸配列の新規性について検討した。配列解析システムとしてGCG Package（version 10.0、Genetics Computer Group社製）を用い、既存の蛋白質のアミノ酸配列データベース[SWISS-PROT (Release 39.0)、PIR-Protein (Release 65.0)]をBLAST法（Journal of Molecular Biology, 215, 403-410, 1990）により検索した。その結果、VHおよびVLともに完全に一致する配列は認められず、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のVHおよびVLは新規なアミノ酸配列を有していることが確認された。
【０１５３】
また、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のVHおよびVLのCDRを、既知の抗体のアミノ酸配列と比較することにより同定した。抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHのCDR1、2および3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号5、6および7に、VLのCDR1、2および3のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号8、9および10にそれぞれ示した。
(参考例６)
【０１５４】
抗hIGFヒト型キメラ抗体の作製
（1）抗hIGFヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
WO97/10354に記載のヒトIgG1、κクラスの抗体を発現できるヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93と参考例5（3）で得られた抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のH鎖およびL鎖cDNAを含むプラスミドを用いて抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468に由来する抗hIGF-Iヒト型キメラ抗体発現ベクターを以下のようにして構築した。
【０１５５】
まず、KM1468のVHおよびVLcDNAをアミノ酸配列が変化しないように発現ベクターpKANTEX93に挿入するため、PCRによって抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のVHおよびVLcDNAを再構築した。プライマーとして、VHcDNA用に配列番号68と配列番号69の塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを、VLcDNA用に配列番号70と配列番号71の塩基配列をそれぞれ有する合成DNAを設計した。それぞれの合成DNAは5'末端にpKANTEX93へクローニングするための制限酵素認識配列を含んでいる。実際には、参考例5（3）で得られたプラスミドpKM1468H5-2の20ngを50μLのKOD DNA Polymerase添付PCR Buffer #1（東洋紡績社製）、0.2mM dNTPs、1mM塩化マグネシウム、0.5μMの配列番号67と68に示した塩基配列を有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、DNAサーマルサイクラーGeneAmp PCR System 9600（PERKIN ELMER社製）を用いて、94℃にて3分間加熱した後、2.5単位のKOD DNA Polymerase（東洋紡績社製）を添加し、98℃にて15秒間、65℃にて2秒間、74℃にて30秒間のサイクルを25サイクル行った。同様に、参考例5（3）で得られたプラスミドpKM1468L5-1の20ngを50μLのKOD DNA Polymerase添付PCR Buffer #1（東洋紡績社製）、0.2mM dNTPs、1mM塩化マグネシウム、0.5μMの配列番号69と70に示した塩基配列を有する合成DNAを含む緩衝液に添加し、上記と同様の方法でPCRを行なった。それぞれの反応液10μLをアガロースゲル電気泳動した後、QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN社製）を用いて、約0.5kbのVHのPCR産物、約0.43kbのVLのPCR産物をそれぞれ回収した。
【０１５６】
次に、プラスミドpBluescript II SK(-)（Stratagene社製）を制限酵素SmaＩ（Takara Shuzo社製）で消化後、Calf Intestine Alkaline Phosphatase（以下、CIAPと表記する；Takara Shuzo社製）で末端を脱リン酸化して得られたDNA0.1μgと、上記で得られたそれぞれのPCR産物約0.1μgを滅菌水に加えて7.5μLとし、TaKaRa DNA Ligation Kit Ver.2のsolution I（Takara Shuzo社製）7.5μL、制限酵素SmaＩ（Takara Shuzo社製）0.3μLを加えて22℃で一晩反応させた。このようにして得られた組換えプラスミドDNA溶液を用いて大腸菌DH5α株（東洋紡績社製）を形質転換した。形質転換株より各プラスミドDNAを調製し、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。 こうして目的の塩基配列を有する第１６図に示したプラスミドpKM1468VHおよびpKM1468VLを得た。
【０１５７】
次に、上記で得られたpKM1468VHのVHcDNAを含む制限酵素断片（NotI-ApaI）をヒト化抗体発現用ベクターpKANTEX93のNotI-ApaI部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドpKANTEX1468Hを構築した。さらに、上記で得られたpKM1468VLのVLcDNAを含む制限酵素断片（EcoRI-BsiWI）をプラスミドpKANTEX1468HのEcoRI-BsiWI部位に挿入し、第１７図に示したプラスミドpKANTEX1468Chiを構築した。プラスミドpKANTEX1468Chiを用いて、BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit（Applied Biosystems社製）を用いて添付の説明書に従い、反応を行い、塩基配列自動分析装置ABI PRISM 377（Applied Biosystems社製）を用いてVHおよびVLcDNAの塩基配列を決定した結果、目的のVHおよびVLcDNAがクローニングされたプラスミドが得られたことを確認した。
（3）抗hIGFヒト型キメラ抗体の動物細胞を用いた安定発現
上記（2）で得られた抗hIGFキメラ抗体発現ベクターpKANTEX1468Chiを用いて抗hIGFヒト型キメラ抗体の動物細胞での発現を以下のようにして行った。
【０１５８】
プラスミドpKANTEX1468Chiを制限酵素AatII（東洋紡績社製）で処理して直鎖状化した後、10μgを4×106細胞のラットミエローマ細胞株YB2/0細胞（ATCC CRL1581）へエレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133-140, 1990）により導入後、40mLのH-SFM（5）培地［ FCSを5%含むH-SFM（Gibco BRL社製）］に懸濁し、96ウェル培養プレート（住友ベークライト社製）に200μL/ウェルずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で24時間培養した後、G418を0.5mg/mLになるように添加して1〜2週間培養した。G418耐性を示す形質転換体のコロニーが出現し、コンフルエントになったウェルより培養上清を回収し、上清中の抗hIGFヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（5）に示す結合ELISAにより測定した。
【０１５９】
培養上清中に抗hIGFキメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、dhfr遺伝子増幅系を利用して抗体発現量を増加させる目的で、G418を0.5mg/mL、dhfr遺伝子産物のDHFRの阻害剤であるMTX（SIGMA社製）を50nM含むH-SFM(5)に1〜2×105細胞/mLになるように懸濁し、24ウェル培養プレート（Greiner社製）に1mLずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で1〜2週間培養して、50nM MTX耐性を示す形質転換体を誘導した。形質転換体がウェルにコンフルエントになった時点で培養上清中の抗hIGFヒト型キメラ抗体の濃度を後述の本参考例（5）に示す結合ELISAにより測定した。培養上清中に抗hIGFヒト型キメラ抗体の発現が認められたウェルの形質転換体については、上記と同様の方法により、MTX濃度を100nM、200nMと順次上昇させ、最終的にG418を0.5mg/mL、MTXを200nMの濃度で含むH-SFM(5)で増殖可能かつ、抗hIGFヒト型キメラ抗体を高発現する形質転換体を得た。得られた形質転換体については、2回の限界希釈法による単一細胞化を行い、抗hIGFヒト型キメラ抗体の発現の最も高い形質転換体を得た。抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468に由来する抗hIGFヒト型キメラ抗体産生形質転換細胞株としては、形質転換体KM3002があげられる。なお、形質転換体KM3002は、平成１４年４月２日付けで独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東1丁目1番地１  中央第６  郵便番号 ３０５−８５６６）にFERM BP-7996として寄託されている。
（4）抗hIGFキメラ抗体の培養上清からの精製
参考例5（3）で得られた抗hIGFヒト型キメラ抗体を発現する形質転換細胞株KM3002を、G418を0.5mg/mL、MTXを200nM、Daigo's GF21（和光純薬社製）を5%の濃度で含むH-SFMに1〜2×105細胞/mLとなるように懸濁し、175cm2フラスコ（Greiner社製）に100mLずつ分注した。37℃、5%CO2インキュベーター内で5〜7日間培養し、コンフルエントになった時点で培養上清を回収した。培養上清約1LよりProsep-A（Bioprocessing社製）カラムを用いて、添付の説明書に従い、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002を精製し、約10.2mgの精製蛋白質を取得した。得られた抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002の約4μgを、公知の方法（Nature, 227, 680-685, 1970）に従って電気泳動し、分子量および精製度を調べた。その結果を第１８図に示した。精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002は、非還元条件下では分子量が約150キロダルトン（以下、Kdと表記する）の1本のバンドが、還元条件下では約50Kdと約25Kdの2本のバンドが認められた。これらの分子量は、IgGクラスの抗体は、非還元条件下では分子量は約150Kdであり、還元条件下では分子内のS-S結合が切断され、約50Kdの分子量を持つH鎖と約25Kdの分子量を持つL鎖に分解されるという報告（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996）と一致し、抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002が正しい構造の抗体分子として発現されていることが確認された。また、精製した抗hIGFキメラ抗体KM3002のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列をプロテインシーケンサーPPSQ-10（Shimadzu社製）を用いて解析した結果、抗hIGF抗体KM1468のH鎖およびL鎖のN末端アミノ酸配列と一致することを確認した。
（5）抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGFに対する反応性
抗hIGFラット抗体KM1468および抗hIGFキメラ抗体KM3002のhIGF-Iに対する反応性を参考例1（4）に示したELISAにより検討した。ただし、ELISAプレートに固定化したメチル化BSA-hIGF-Iの濃度は、0.5μg/mL、二次抗体として、ラット抗体の場合は、4000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ラットIg抗体（DAKO社製）、キメラ抗体の場合は、1000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウス抗ヒトIgG1抗体（Southern Biotechnology社製）を用いて行った。第１９図に示したように、抗hIGFキメラ抗体KM3002は、hIGF-Iに対する抗体濃度依存的な結合活性を示した。また、その活性は、二次抗体が異なるため、直接の比較は困難であるが、抗hIGFラット抗体KM1468と同等であることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１６０】
本発明は、ヒトインスリン様成長因子-I（以下、hIGF-Iと記す）およびヒトインスリン様成長因子-II（以下、hIGF-IIと記す）と特異的にかつ同程度の強さで結合し、ヒトIGF-IおよびヒトIGF-IIの生物活性を阻害する能力を有する遺伝子組換え抗体または該抗体断片、該抗体または該抗体断片を生産する形質転換体、該抗体または該抗体断片の製造法および該抗体または該抗体断片を有効成分として含有する医薬を提供することを目的とする。
【図面の簡単な説明】
【０１６１】
【図１】第１図は、プラスミドpBS/CamHV0およびpBS/LV0の造成工程を示した図である。
【図２】第２図は、プラスミドpKANTEX93/CamHV0/LV0の造成工程を示した図である。
【図３】第３図は、抗hIGFCDR移植抗体のhIGF-Iに対する特異的な反応性を示した図である（結合ELISA）。横軸は抗体濃度を、縦軸は結合活性を吸光度（415nm）でそれぞれ示す。aには、□で示した抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002、○で示した抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0、△で示した抗hIGFCDR移植抗体QAR/LV0、■で示した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0および●で示した抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/NYPLL3Allの結果を、bには□で示した抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002、○で示した抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0、◇で示した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0、△で示した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3All、●で示した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFTおよび■で示した抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFTの結果をそれぞれ示す。
【図４】第４図は、抗hIGFCDR移植抗体のhIGF-IまたはhIGF-II依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。aは10ng/mLのhIGF-I 存在下、bは20ng/mLのhIGF-II存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（OD450nm）でそれぞれ示す。図中実線はhIGF-IまたはhIGF-II添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はhIGF-IまたはhIGF-II非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002、○は抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0、△は抗hIGFCDR移植抗体QAR/LV0、■は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0の結果をそれぞれ示す。
【図５】第５図は、抗hIGFCDR移植抗体のhIGF-IまたはhIGF-II依存的な細胞増殖阻害効果を示した図である。aは10ng/mLのhIGF-I 存在下、bは20ng/mLのhIGF-II存在下での結果をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（OD450nm）でそれぞれ示す。図中実線はhIGF-IまたはhIGF-II添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はhIGF-IまたはhIGF-II非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002、○は抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/LV0、△は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0、◇は抗hIGFCDR移植抗体CamHV0/NYPLL3All、■は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3Allの結果をそれぞれ示す。
【図６】第６図は、抗hIGFCDR移植抗体のhIGF-IまたはhIGF-II依存的な細胞増殖阻害効果を示した。aは10ng/mLのhIGF-I 存在下、bは20ng/mLのhIGF-II存在下での結果をそれぞれ示した。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が細胞の増殖の値を吸光度（OD450nm）でそれぞれ示す。図中実線はhIGF-IまたはhIGF-II添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインを、破線はhIGF-IまたはhIGF-II非添加かつ抗体非添加時の細胞増殖のベースラインをそれぞれ示す。□は抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002、◇は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/LV0、■は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLDFT、●は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/PLLDFT、▲は抗hIGFCDR移植抗体QGAR/NYPLL3Allの結果をそれぞれ示す。
【図７】第７図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体のhIGF-Iに対する特異的な反応性を示した図である（結合ELISA）。図中、黒塗りのバーはメチル化BSA-hIGF-Iを抗原に、白抜きのバーはメチル化BSA-BSAを抗原に用いた時の結果を示す。
【図８】第８図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体の液相系における天然の立体構造を有するhIGF-Iに対する反応性を示した図である（競合ELISA）。◇は抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468、■は抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1470、△は抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1471、×は抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1472、○は抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1473の結果をそれぞれ示す。
【図９】第９図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のhIGF-Iに対する結合における各種ペプチドによる阻害活性を示した図である。横軸は各種ペプチド濃度（μg/mL）、縦軸は結合活性（%）をそれぞれ示す。Aには●で示したp1-18、□で示したp24-35、■で示したp29-41、△で示したp36-47、◇で示したp61-70、◆で示したp14-30、×で示したp41-56の結果を、Bには○で示したhIGF-I、●で示したp41-56C、□で示したp52-70、■で示したp1-18およびp41-56C、△で示したp1-18およびp52-70、▲で示したp41-56Cおよびp52-70、◇で示したp1-18、p41-56Cおよびp52-70の結果をそれぞれ示す。
【図１０】第１０図は、抗hIGFラットモノクローナルKM1468のhIGF-IおよびhIGF-IIへの結合に対する、hIGF-I、hIGF-IIおよびヒトインスリンでの阻害活性を示した図である。Aが抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468とhIGF-Iとの結合、Bが抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468とhIGF-IIとの結合に対する各因子による阻害をそれぞれ示す。横軸が各種因子濃度（μg/mL）、縦軸が因子非添加時を100％としたときの結合活性（%）を示す。■はhIGF-I、○はhIGF-II、△はヒトインスリンの結果をそれぞれ示す。
【図１１】第１１図は、プラスミドpBS(II)SK(-)/hIGF-1およびpKANTEX93/hIGF-Iの造成工程を示した図である。
【図１２】第１２図は、A549/hIGF-I細胞におけるhIGF-Iの発現を示した図である。Aは、組換えhIGF-I蛋白質による阻害度を示す。横軸は添加した組換えhIGF-I蛋白質の濃度、縦軸は結合活性（OD415）を示す。破線は組換えhIGF-I蛋白質非添加時の結果を示す。Bは、A549細胞およびA549/hIGF-I細胞の培養上清中に含まれるhIGF-Iを示す。白抜きはA549細胞、網掛けはA549/hIGF-I細胞をそれぞれ示す。
【図１３】第１３図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468のhIGF-I発現細胞に対する細胞増殖阻害効果を示した図である。破線は抗hIGFラットモノクローナルKM1468非添加のA549/hIGF-I細胞の増殖性を、実線は抗hIGFラットモノクローナルKM1468非添加のA549細胞の細胞増殖をそれぞれ示す。■は抗hIGFラットモノクローナルKM1468を添加したA549/hIGF-I細胞の増殖性を、○は抗hIGFラットモノクローナルKM1468を添加したA549細胞の増殖性をそれぞれ示す。
【図１４】第１４図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468の足場非依存性増殖阻害効果を示した図である。図中の白抜きのカラムはA549細胞のコロニー形成数を、網掛けのカラムはA549/hIGF-I細胞の形成数を、黒塗りのカラムは抗hIGFラットモノクローナルKM1468を添加したA549/hIGF-I細胞の形成数をそれぞれ示す。
【図１５】第１５図は、抗hIGFラットモノクローナルKM1468の抗腫瘍効果を示した図である。横軸は腫瘍移植後の経過日数を、縦軸は腫瘍体積をそれぞれ示す。A549細胞を移植したマウスのうち、●は抗hIGFラットモノクローナルKM1468非添加時を、○は抗hIGFラットモノクローナルKM1468添加時をそれぞれ示す。A549/hIGF-I細胞を移植したマウスのうち、■は抗hIGFラットモノクローナルKM1468非添加時を、□は抗hIGFラットモノクローナルKM1468添加時をそれぞれ示す。
【図１６】第１６図は、プラスミドpKM1468VHおよびpKM1468VLの造成工程を示した図である。
【図１７】第１７図は、プラスミドpKANTEX1468Chiの造成工程を示した図である。
【図１８】第１８図は、精製した抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002のSDS-PAGE（4〜15%グラジエントゲルを使用）の電気泳動パターンを示した図である。左側が非還元条件、右側が還元条件でそれぞれ電気泳動を行った図である。レーンMが非還元時は高分子量マーカーおよび還元時は低分子量マーカー、レーン1が抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002の泳動パターンをそれぞれ示す。  
【図１９】第１９図は、抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468および抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002のhIGF-Iに対する反応をそれぞれ示す。横軸が抗体濃度（μg/mL）、縦軸が結合活性（OD415）をそれぞれ示す。○が抗hIGFラットモノクローナル抗体KM1468、●が抗hIGFヒト型キメラ抗体KM3002の反応性をそれぞれ示す。
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【国際調査報告】
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