(57)【要約】  新規作用機序に基づく抗癌剤の提供。  ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療・予防薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療・予防薬。
【請求項２】
血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制又は細胞周期の停止をするものである請求項１記載の癌の治療・予防薬。
【請求項３】
癌がメラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される請求項１記載の癌の治療・予防薬。
【請求項４】
ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を投与することを特徴とする癌の治療・予防方法。
【請求項５】
血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制又は細胞周期の停止をするものである請求項４記載の癌の治療・予防方法。
【請求項６】
癌がメラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病およびリンパ腫からなる群から選択される請求項４記載の癌の治療・予防方法。
【請求項７】
癌の治療・予防薬製造のためのＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療および予防薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌による死亡者は年々増加し、多くの化合物により治療が試みられているが、未だ癌に対する特効薬はない。癌の発症機序が分子生物学的な方法で解明されつつあり、新たな抗癌剤が待たれている。【０００３】
ＤＳＣＲ−１はＤＯＷＮ  ＳＹＮＤＲＯＭＥ  ＣＲＩＴＩＣＡＬ  ＲＥＧＩＯＮ  １の略称であり、ＭＣＩＰ１（ＭＹＯＣＹＴＥ−  ＥＮＲＩＣＨＥＤ  ＣＡＬＣＩＮＥＵＲＩＮ−ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮ）、ＣＳＰ１（ＣＡＬＣＩＰＲＥＳＳＩＮ）およびＭＯＤＵＬＡＴＯＲＹ  ＣＡＬＣＩＮＥＵＲＩＮ  ＩＮＴＥＲＲＡＣＴＩＮＧ  ＰＲＯＴＥＩＮと同一である。【０００４】
癌は細胞の異常増殖を伴う疾患である。細胞の異常増殖には血管新生、アポトーシスの停止、細胞周期の異常が関与するということが知られている。しかしながら、ＤＳＣＲ−１がそれらの現象に関与するとの報告は殆ど知られていないが、唯一ＤＳＣＲ−１遺伝子欠損マウスにおいてＴｈ１細胞にＦＡＳＬが誘導され細胞死に繋がるとの報告がある（非特許文献１）。これはＤＳＣＲ−１欠損による細胞死であり、本発明がＤＳＣＲ−１亢進による癌細胞の異常増殖の抑制を目標としていることとは逆の現象である。
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎ．２００３，４：８７４−８８１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、新たな作用機序を有する癌の治療および予防薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで本発明者は、ＤＳＣＲ−１について種々の作用を検討していたところ、全く意外にも、ＤＳＣＲ−１に血管新生抑制作用、細胞遊走の抑制作用、細胞接着の抑制作用及び細胞周期の停止作用があることを見出した。さらに、ゼノグラフトによる移植癌細胞増殖への影響を検討した結果、移植癌細胞の増殖抑制を確認し、ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質が癌の治療および予防薬として有用であることを見出した。【０００７】
すなわち、本発明は、ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を有効成分とする癌の治療および予防薬を提供するものである。
また、本発明は、ＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質を投与することを特徴とする癌の治療・予防方法を提供するものである。
また、本発明は、癌の治療・予防薬製造のためのＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子又はＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質の使用を提供するものである。
【発明の効果】
【０００８】
本発明の抗癌剤は、従来の抗癌剤に比較し、多機能性、すなわち血管新生の抑制、細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制および細胞周期を停止するのみならず炎症抑制を示す抗癌剤である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】ＤＳＣＲ−１  による血管新生誘発・成長刺激因子および炎症誘発遺伝子発現抑制のＲＴ−ＰＣＲによる検討結果を示す図である。
【図２】管腔形成能に対するＤＳＣＲ−１の影響を示す図である。
【図３】ＤＳＣＲ−１の細胞遊走能への影響の検討を示す図である。
【図４】細胞創傷の回復に与えるＤＳＣＲ−１の影響を示す図である。
【図５】細胞創傷後１０日後の細胞の状態を示す図である。
【図６】ＦＡＣＳ  により解析したＤＳＣＲ−１  発現による  Ｇ１  （Ｇ０）  抑制効果の検討を示す図である。
【図７】ヘマトキシリン＆エオシン染色検体の観察を示す図である。
【図８】マトリゲルプラグ中のヘモグロビン含量への影響を示す図である。
【図９】ＤＳＣＲ−１の腫瘍抑制効果の検討を示す図である。
【図１０】ＤＳＣＲ−１遺伝子構造の模式図である。
【図１１】ＨＵＶＥＣで発現誘導されるアイソフォームを特定するためのリボプローブ配列を示す図である。
【図１２】ＲＮａｓｅ  プロテクションアッセイの結果を示す図である。
【図１３】ＤＳＣＲ−１（エクソン  １５６７）特異的ＰＣＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図である。
【図１４】ＴＲＡＰによるＤＳＣＲ−１遺伝子発現亢進を示す図である。
【図１５】リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着におけるＤＳＣＲ−１による阻害の検討結果を示した図である。
【図１６】リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着におけるＤＳＣＲ−１による阻害の検討結果を示した図である。
【図１７】リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着におけるＤＳＣＲ−１による阻害の検討結果を示した図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
以下、本発明について詳細に説明する。
ＤＳＣＲ−１遺伝子発現系の構築は、次のようにして行うことができる。
ＤＳＣＲ−１の全長ｃＤＮＡは、トロンビン刺激で発現が亢進するＨＵＶＥＣ等の細胞株や定常状態で発現しているＨｅｐＧ２等の細胞株のｔｏｔａｌ  ＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲ法により取得後、当業者に一般的に用いられるクローニングベクターに組み込むことができる。ＤＳＣＲ−１蛋白を大腸菌、動物細胞、昆虫細胞、酵母などで発現させるためにはそれぞれの宿主での発現に適した公知の発現ベクターにＤＳＣＲ−１の全長ｃＤＮＡを組み込むことができる。また、プラスミドに限らず、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等、一般的に遺伝子発現に使われるウイルスも用いることができる。ＤＳＣＲ−１を発現させるためのプロモーターとしては宿主に応じたＣＭＶ等の一般的に用いられているプロモーターを用いることができる。また、人体への遺伝子導入の際には、癌細胞特異的に働くプロモーターを用いたり、ある一定条件下発現を誘導できるプロモーターを用いたりすることにより副作用を抑えることもできる。タンパク精製の際には効率的な精製を目的にＧＳＴ、ＨＡ、ＦＬＡＧ、Ｈｉｓ等のタグを付加することが出来る。ＤＳＣＲ−１蛋白発現細胞の識別化のためにたとえばｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）等の発現ベクターを用いてＧＦＰタンパク質を共発現させることも出来る。また、精製の簡便化のために、ＤＳＣＲ−１蛋白にシグナルペプチドを付加し、細胞外に分泌させ、培地中にＤＳＣＲ−１蛋白を回収することもできる。構築したＤＳＣＲ−１発現用ベクターは大腸菌、ＣＨＯ、ＣＯＳ−７等の動物細胞、Ｓｆ−９等の昆虫細胞、酵母等の一般的に組み換えタンパク質の発現に用いられている宿主において発現させることが出来る。また、癌細胞の治療や予防のためにヒト癌細胞等においても発現させることができる。【００１１】
ＤＳＣＲ−１蛋白は、例えば次の方法により取得できる。
強制発現細胞株は公知の一般的な方法により培養し、ＤＳＣＲ−１蛋白を含む培養物を得ることができる。ウイルスの場合、公知の宿主細胞に感染させることによりＤＳＣＲ−１蛋白を含む培養物を得ることができる。また、大腸菌、酵母など、その他の公知の一般的に組み換えタンパク発現に用いられる生物においても同様にＤＳＣＲ−１蛋白を含む培養物を得ることができる。さらに、天然にＤＳＣＲ−１を発現しているＨｅｐＧ２等の細胞株や、トロンビン刺激後に天然のＤＳＣＲ−１発現を亢進するＨＵＶＥＣ等の細胞株からも、同様に公知の培養方法により培養することによりＤＳＣＲ−１蛋白を含む培養物を得ることができる。【００１２】
ＤＳＣＲ−１蛋白を含む培養物から蛋白の一般的な分離・精製法である陽／陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、キレートクロマトグラフィー等にてＤＳＣＲ−１蛋白を精製することができる。【００１３】
ＤＳＣＲ−１産生亢進物質は、例えば次の方法によりスクリーニングできる。
ＤＳＣＲ−１遺伝子発現ならびに蛋白発現を測定する方法として、当業者により良く知られた方法が用いられる。具体的には、ＤＳＣＲ−１発現組織、細胞株およびＤＳＣＲ−１強制発現細胞を用い、スクリーニング化合物を加えて培養し、ＤＳＣＲ−１遺伝子あるいは蛋白量を知られた方法にて測定した後、無添加時の量と比較することによりスクリーニングすることができる。
遺伝子量の測定には遺伝子抽出後にＲＴ−ＰＣＲ、定量的ＰＣＲ等、当業者が一般的に用いる方法が利用できる。ＤＳＣＲ−１蛋白量を測定する方法としてはＥＬＩＳＡ等の知られた方法が利用できる。
また、ＤＳＣＲ−１遺伝子の発現を向上する物質のスクリーニングのためには、一般的に用いられているレポータージーンアッセイを用いることもできる。一般的な方法とは、ＤＳＣＲ−１遺伝子のプロモーター領域をルシフェラーゼやガラクトシダーゼ、ＧＦＰ等のマーカータンパク質のｃＤＮＡの上流に接続したベクターを作製し、このベクターを一般的な方法により、動物細胞にトランスフェクションする。トランスフェクションされた細胞に、スクリーニング化合物を加えて培養し、マーカータンパク質をそれぞれに適した方法で検出することによって目的の化合物をスクリーニングすることができる。
上記の如くして得られるＤＳＣＲ−１蛋白、ＤＳＣＲ−１遺伝子およびＤＳＣＲ−１蛋白発現を亢進する物質は、血管新生抑制作用、細胞遊走抑制作用、細胞接着の抑制作用、細胞周期の停止作用、および癌細胞の増殖抑制作用を有し、種々の癌の治療および予防薬として有用である。【００１４】
ＤＳＣＲ−１の血管新生抑制能を調べるには、ＨＵＶＥＣを用いた管腔形成アッセイや鶏卵や角膜、トリの絨毛尿膜、ウサギ、マウス、ラットの角膜を用いた血管新生測定法がある。一般的な方法としては、コラーゲンゲルやマトリゲル上にＨＵＶＥＣを播種し、ＤＳＣＲ−１蛋白を細胞内への移行を促進するためのポリリジン、ポリアルギニン、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ＨＳＶ  ＶＰ２２等の担体と結合し、培地に加えて培養後の管腔形成を顕微鏡下で観察する。また、ＤＳＣＲ−１の遺伝子を導入した際の効果を調べる方法としては、遺伝子導入したＨＵＶＥＣを用いてｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ、ｔｕｂｅ形成能を調べることができる。また、鶏卵や角膜、トリの絨毛尿膜、ウサギ、マウス、ラットの角膜へ、ＤＳＣＲ−１を含んだ担体を注入したり、ＤＳＣＲ−１遺伝子を導入したりし、その後の血管新生を観察することによりＤＳＣＲ−１血管新生抑制能を調べることができる。【００１５】
細胞周期の停止を評価するには公知の方法を用いて行う。すなわち、ＤＳＣＲ−１蛋白の細胞内への移行を促進するためにポリリジン、ポリアルギニン、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ＨＳＶ  ＶＰ２２等の結合したものを加えた培地で培養した細胞、もしくは評価対象物質を発現している細胞を一般的な方法で回収し、たとえばヨー化プロビジウムなどのＤＮＡに結合する蛍光色素で染色する。こののち、細胞の蛍光量をＦＡＣＳ等で測定することによって細胞が細胞周期のどの状態にいるのかを推定できる。また、ＤＳＣＲ−１の遺伝子を導入した際の効果を調べる方法としては、遺伝子導入した細胞を用い効果を調べることができる。このことによって、細胞周期が停止しているかどうかを確認できる。【００１６】
細胞接着の抑制を評価するには公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、各種細胞刺激剤としてサイトカイン、トロンビン等を用いて培養容器付着性の血管内皮細胞等を刺激することにより、細胞表面に接着因子を発現させる。次いで、浮遊性の単球系細胞であるＴＨＰ−１、Ｕ−９３７等の細胞と混合培養する。未接着細胞を洗浄した後、接着細胞数を計測する。薬物による細胞接着抑制効果を評価するには、薬物未添加との比較により判定することができる。【００１７】
癌細胞の増殖抑制をみる一般的方法として、Ｂ１６メラノーマ細胞等の癌細胞株をマウスに移植し、腫瘍のサイズが一定の大きさ（約５０ｍｍ３）に達したところで、腫瘍中に薬物あるいは遺伝子を導入したウイルス、細胞、評価対象物質を発現できるプラスミドベクター等を静脈内投与あるいは経口投与する。その後、経時的に腫瘍の大きさを  ｃａｌｉｐｅｒ  により測定することにより移植癌細胞抑制効果を判定することができる。【００１８】
本発明の癌の治療および予防薬の対象となる癌は特に限定されないが、メラノーマ、肝癌、肺癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫などが挙げられる。【００１９】
ＤＳＣＲ−１蛋白の投与は、目標とする細胞内への移行を促進するためポリリジン、ポリアルギニン、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ＨＳＶ  ＶＰ２２等の担体と結合し生理食塩水等の適当な溶液に溶解し、０．１〜１００ｍｇ／人を静脈内投与することができる。
ＤＳＣＲ−１遺伝子の投与は当業者に知られた一般的な方法で行う。一般的な方法とはＤＳＣＲ−１のｃＤＮＡを組み込んだレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等を直接あるいは局所に留めるための一般的な担体と共に、腫瘍中へ投与することが出来る。またウイルスを用いない遺伝子導入法としてＤＳＣＲ−１を発現できるプラスミドベクターをリポソーム、ジーンガンやポリリジン等を用いて遺伝子を導入することもできる。
【実施例】
【００２０】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２１】
実施例１  ヒトＤＳＣＲ−１ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＤＳＣＲ−１（ｅｘｏｎ  ４−７）をコードする全長ｃＤＮＡは、ＨＵＶＥＣ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５ｕｇよりＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｔ  Ｎｏ．  １１９０４−０１８を用いて調製した１ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを鋳型とし、Ｅｘ−Ｔａｑ（Ｔａｋａｒａ，Ｃａｔ  Ｎｏ．ＲＲ００１Ａ）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。ＰＣＲの条件として２μＬのＨＵＶＥＣ由来ｃＤＮＡ、５０ｐｍｏｌのセンスプライマー（配列番号３）、アンチセンスプライマー（配列番号４）、５μｌ  １０×Ｅｘ−Ｔａｑ  ｂｕｆｆｅｒ、４μＬのｄＮＴＰ  ｍｉｘ  （２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）、２．５ＵｎｉｔｓのＥｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡ  ポリメラーゼを含む５０μＬの反応液を、９４℃、１分、６２℃、１分、７２℃、３分からなるサイクルを３０回行った。ＰＣＲ反応による増幅産物は（ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｍｅｇａ社Ｃａｔ．Ｎｏ．Ａ１３６０）を用いてＴＡベクターｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙに挿入した）ＡＢＩ３１００  ＤＮＡシーケンサーを用い配列の確認を行った結果、ヒトの全長ＤＳＣＲ−１（エクソン４−７）をコードするｃＤＮＡを単離した。配列番号１で表される配列はヒトＤＳＣＲ−１遺伝子の塩基配列を、配列番号２で表される配列はヒトＤＳＣＲ−１タンパク質のアミノ酸配列を示す。【００２２】
配列番号３：ＡＡＧＧＡＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＡＧＧ
配列番号４：ＴＴＧＧＡＡＴＧＣＧＴＣＣＴＣＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＡＧ【００２３】
実施例２  ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１の作製
ＤＳＣＲ−１全長ｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ法により、ＨＵＶＥＣ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡから取得後、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にサブクローニングした。ＤＳＣＲ−１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ配列を切り出し、ＣＭＶプロモーターを有するｐＡｄｅｎｏ  ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に組み込むことによりＤＳＣＲ−１発現用コンストラクトを構築した。ＤＳＣＲ−１発現アデノウイルスはＨＥＫ−２９３細胞への感染、増幅によって得られた。【００２４】
実施例５  トロンビン刺激でのＨＵＶＥＣ  ＤＮＡマイクロアレイ解析
サブコンフルエントＨＵＶＥＣを０．５％ＦＢＳ，ＥＢＭ−２基礎培地中で一夜処理した後、１．５ｕｎｉｔｓ／ｍＬのトロンビンを添加した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  はＴｒｉｚｏｌを用いて精製した。ｃＲＮＡの作製とＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｆｏｃｕｓ  ＡｒｒａｙへのハイブリダイゼーションはＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘのプロトコールに基づき行った。２種類のＨＵＶＥＣ  Ｂａｄｇｅを用い、１，４，１８時間後のトロンビン刺激での遺伝子変動を二重に観察した。表１はトロンビン刺激でのＨＵＶＥＣ  ＤＮＡマイクロアレイの結果である。トロンビン刺激で最も発現誘導される遺伝子を上から５番目までを示した。ＤＳＣＲ−１はトロンビン刺激において最も誘導される遺伝子として示された。【００２５】
【表１】
2005082412.tif 000002
【００２６】
表２はＤＳＣＲ−１プローブを用いたＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘマイクロアレイデータである。
ＤＳＣＲ−１はトロンビン刺激１時間でピークになる早期誘導遺伝子である。【００２７】
【表２】
2005082412.tif 000003
【００２８】
表３〜５はＤＳＣＲ−１構成的発現下でのＨＵＶＥＣトロンビン刺激１時間に対す遺伝子変動を網羅的に解析した結果である。得られた総合データは３つに分類された。（１）ａｄｅｎｏ−コントロール感染のＨＵＶＥＣ上で２倍以上トロンビン刺激によって誘導されるが、ＤＳＣＲ−１存在によって少なくとも２倍以上その誘導が減少する遺伝子：合計８９７４遺伝子中２５遺伝子が得られた。そのうち７つが細胞増殖や血管新生に関わるものであり、８遺伝子が炎症に関わるものであった。その他の１０遺伝子に関しては、セリンスレオニンキナーゼや転写因子であり、ＤＳＣＲ−１の抗血管新生、抗炎症効果に反するものは抽出されなかった。（２）ａｄｅｎｏ−コントロール感染のＨＵＶＥＣ上で２倍以上  トロンビン刺激によって抑制されるが、ＤＳＣＲ−１存在によって少なくとも２倍以上その誘導が回復する遺伝子：７遺伝子が得られた。この中に細胞周期のブレーキ役であるｐ２１およびｐ２７が得られた。（３）ａｄｅｎｏ−コントロール感染のＨＵＶＥＣ上で２倍以上トロンビン刺激によって誘導されるが、ＤＳＣＲ−１存在によってさらにその発現が誘導する（高発現）遺伝子：７遺伝子が得られた。この中に強力な抗血管新生作用を誘起するＡＤＡＭＴＳ１も含まれた。【００２９】
【表３】
2005082412.tif 000004
【００３０】
【表４】
2005082412.tif 000005
【００３１】
【表５】
2005082412.tif 000006
【００３２】
実施例６  ＤＳＣＲ−１によるトロンビン刺激誘導性の血管新生誘発・成長刺激因子および炎症誘発遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる検討
Ａｄｅｎｏ−コントロール感染未刺激（レーン）、ａｄｅｎｏ−コントロール感染トロンビン刺激１時間（レーン４）、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１感染トロンビン刺激１時間（レーン５）、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１感染未刺激（レーン６）のＲＮＡをもとにＲＴ−ＰＣＲを行った結果である（図１）。サイクロフィリンＡは内因性コントロールとして用いた。ＰＣＲプライマーとサイクル数は以下に示す。
ティシュファクター（２２サイクル），フォワード５’−ＴＣＡＧＡＧＴＴＴＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＧＧＡＡＣＡ−３’（配列番号５）およびリバース５’−ＴＴＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＡＣＣＧ−３’（配列番号６）；Ｅ−セレクチン（２２サイクル），フォワード５’−ＣＡＴＧＴＧＧＡＧＣＣＡＣＡＧＧＡＣＡＣＴＧＧＴＣＴＧ−３’（配列番号７）およびリバース５’−ＴＣＴＧＡＴＴＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号８）；アンジオポエチン−２（２０サイクル），フォワード５’−ＡＣＡＡＡＴＧＴＡＴＴＴＧＣＡＡＡＴＧＴＴＣＡＣＡＡＡ−３’（配列番号９）およびリバース５’−ＧＡＡＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＣＧＧＡＴＣＡＴＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号１０）；ＰｌＧＦ（２０サイクル），フォワード５’−ＣＣＧＧＴＣＡＴＧＡＧＧＣＴＧＴＴＣＣＣＴＴＧＣ−３’（配列番号１１）およびリバース５’−ＣＴＣＧＣＴＧＧＧＧＴＡＣＴＣＧＧＡＣＡＣＧＡＣ−３’（配列番号１２）；ｐ２７（２６サイクル），フォワード５’−ＣＧＣＡＧＧＡＡＴＡＡＧＧＡＡＧＣＧＡＣＣＴＧＣ−３’（配列番号１３）およびリバース５’−ＣＧＴＴＴＧＡＣＧＴＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴ−３’（配列番号１４）；ｐ２１（１８サイクル），フォワード５’−ＡＧＣＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号１５）およびリバース５’−ＴＧＡＣＡＧＧＴＣＣＡＣＡＴＧＧＴＣＴＴＣＣＴＣ−３’（配列番号１６）；ＡＤＡＭＴＳ１  （２０サイクル），フォワード５’−ＡＧＣＴＴＴＣＴＴＧＣＣＡＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１７）及びリバース５’−ＡＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＣＴＴＴ−３’（配列番号１８）；ＩＬ−８（２３サイクル），フォワード５’−ＴＧＴＣＡＧＴＧＣＡＴＡＡＡＧＡＣＡＴＡＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１９）およびリバース５’−ＣＴＴＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＣＴＧＣＡＣＣＣＡＧ−３’（配列番号２０）；ＩＣＡＭ−１（２３サイクル），フォワード５’−ＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＧＣＣＡＡＣＣＡＡＴＧ−３’（配列番号２１）およびリバース５’−ＡＧＧＡＧＴＣＧＴＴＧＣＣＡＴＡＧＧＴＧＡＣＴＧ−３’（配列番号２２）；サイクロフィリンＡ  （２３サイクル），フォワード５’−ＴＴＣＧＴＧＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＴＧＧＡＧＡ−３’（配列番号２３）およびリバース５’−ＧＧＡＣＣＣＧＴＡＴＧＣＴＴＴＡＧＧＡＴＧＡＡＧ−３’（配列番号２４）。【００３３】
実施例７  管腔形成能に対するＤＳＣＲ−１の影響
ＨＵＶＥＣに  ａｄｅｎｏ−コントロールとａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１をＭＯＩ＝２０  で感染させ、そのＨＵＶＥＣをゲル処理ディッシュ（２４ウェルにＥＧＭ−２  ＭＶ  ｍｅｄｉａ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）（ｂＦＧＦ不含）を含むタイプＩコラーゲンを４００μｌ加えて３７℃下でゲル化させたもの）上に１×１０５ｃｅｌｌｓ／ディッシュの割合で播いた。２４時間後、さらにＨＵＶＥＣの上に４００μＬのタイプＩコラーゲンを置き、２４時間後キャピラリーネットワーク、管腔形成能を顕微鏡下で観察した。管腔領域はＮＩＨイメージを用いて定量化した。図２はその結果である。（ａ，ｄ）は明部×４０拡大図、（ｂ，ｅ）は蛍光部×４０拡大図、（ｃ，ｆ）は蛍光部×１００拡大図を示している。ＥＧＦＰの量は上下とも同程度（アデノウイルスの感染効率は同一）であるのに対し、管腔形成能はＤＳＣＲ−１発現により減少していた。【００３４】
実施例８  ＤＳＣＲ−１の細胞遊走能への影響の検討
ＨＵＶＥＣにａｄｅｎｏ−コントロール、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１、又はａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１プラスａｄｅｎｏ−ＣＡＮＦＡＴをＭＯＩ＝４０にて感染させ、２４時間後そのＨＵＶＥＣの中心部をピペットで傷を入れた。その１日、２日後、細胞の遊走のレベルを顕微鏡観察し、ＮＩＨイメージにより定量化した。又はＨＵＶＥＣを感染、０．５％ＦＢＳ、ＥＢＭ−２培地で培養後、トロンビン存在下４時間で遊走する細胞をＢｏｙｄｅｎ  ｃｈａｍｂｅｒ法により測定した。ＤＳＣＲ−１高発現のＨＵＶＥＣは創傷治癒のレベルがコントロールに比べ減少しており、その欠如はａｄｅｎｏ−ＣＡ−ＮＦ−ＡＴを共感染することで回復した。さらに、Ａｄｅｎｏ−コントロール感染のＨＵＶＥＣはポストコンフルエントを超えて細胞がディッシュからはがれ始めているのに対し、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１感染ＨＵＶＥＣは傷が完全に除去できないまま（矢印）静止状態であった（図３、図４および図５（Ａ、Ｂ））。【００３５】
実施例９  ＦＡＣＳにより解析したＤＳＣＲ−１発現によるＧ１（Ｇ０）抑制効果の検討
サブコンフルエントＨＵＶＥＣにａｄｅｎｏ−コントロールあるいは、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１を感染させ、細胞の細胞周期をヨー化プロピジウム含量を測定することにより同定した。コントロールＨＵＶＥＣでは、６７．２％がＧ０／Ｇ１期、１７．７％がＳ期、１５．１％がＧ２／Ｍ期であったのに対し、ＤＳＣＲ−１を過発現したＨＵＶＥＣでは９０．５％がＧ０／Ｇ１期、１．４％がＳ期、８．１％がＧ２／Ｍ期であった。また、５０％コンフルエントのＨＵＶＥＣでも同様の結果が得られた（図６）。【００３６】
実施例１０  ヘマトキシリン＆エオシン染色検体の観察
Ａｄｅｎｏ−コントロールでは毛細血管の遊走が多数検出されるのに対し、ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１では顕著に抑制されていた（図７および図８）。【００３７】
実施例１１  ＤＳＣＲ−１の腫瘍抑制効果の検討
対数増殖期のＢ１６メラノーマ細胞１×１０６を８週齢のＣ５７／ＢＬ６マウスに異種移植として皮下投与した。腫瘍のサイズが５０ｍｍ３になったところで、５×１０９ｐｆｕのａｄｅｎｏ−コントロールあるいはａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１を腫瘍中に投与し、その後経時的に腫瘍の大きさをカリパーにより測定した。Ａｄｅｎｏ−ＤＳＣＲ−１投与群はａｄｅｎｏ−コントロール投与群に比べて４日後で９．１倍、６日後で７．７倍、８日後で７．４倍（いずれもＰ＜０．０４）の腫瘍抑制効果が認められた（図９）。【００３８】
実施例１２    ＤＳＣＲ−１遺伝子発現量を測定する方法
図１０はヒトＤＳＣＲ−１遺伝子構造の模式図である。ｍＲＮＡは４つのオルタナティブ第１エクソン（ボックス１ｔｏ４）と３つの共通エクソン（ボックス５ｔｏ７）から成り立っている。図示したものは２つの主なアイソフォームＤＳＣＲ−１（エクソン４−７）とＤＳＣＲ−１（エクソン１５６７）である図１１はＨＵＶＥＣで発現誘導されるアイソフォームを特定するためのリボプローブ配列を示している。図１２はＲＮａｓｅプロテクションアッセイの結果である。１０μｇ酵母ＲＮＡ（レーン２），１０μｇ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ未処理ＨＵＶＥＣ（レーン３），トロンビン処理（レーン７−９），ＴＮＦ−α処理（レーン１０−１２）。矢印で示すバンドがＤＳＣＲ−１（エクソン４−７）からなるアイソフォームである。一方ＤＳＣＲ−１（エクソン１５６７）からなる発現物はＲＮａｓｅプロテクションアッセイでは検出されなかった（図中＊）。ＧＡＰＤＨはロードしたＲＮＡ量の内因性コントロールである。早期にＤＳＣＲ−１（エクソン４−７から構成される）遺伝子が発現誘導されることが、エクソン４−７特異的リボプローブを用いたＲＮａｓｅプロテクションアッセイにより明らかとなった。図１３はＤＳＣＲ−１（エクソン１５６７）特異的ＰＣＲプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲの結果である。増幅サイクル４０回目でその発現が検出されたが、トロンビン、ＴＮＦ−α刺激によっても発現に変化は認められなかった。同様操作でＰＡＲ−１選択的アゴニストであるＴＲＡＰを１０ｐｍｏｌ、５０ｐｍｏｌ（Ｂ，レーン８ａｎｄ９）添加することにより、トロンビン添加と同様の強い誘導が認められた（図１４）。【００３９】
ＤＳＣＲ−１はカルシニューリン（Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性ホスファターゼ）を阻害することによりＮＦ−ＡＴを阻害すること（Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２０００，９：１６８１−１６９０）は周知である。しかしながら、ＤＳＣＲ−１のシグナルの全てがカルシニューリン−ＮＦ−ＡＴ経路で伝達されるのではなく、細胞周期のブレーキ役であるｐ２１、ｐ２７ならびに抗血管新生作用を誘起するＡＤＡＭＴＳ１の発現亢進が他の伝達経路由来であることが本試験により推察された。【００４０】
カルシニューリンと細胞の異常増殖に関係する（１）血管新生、（２）アポトーシスおよび（３）細胞周期についての関わりについては下記のようである。
（１）血管新生：カルシニューリンが血管新生に関与するとの報告はない。
（２）アポトーシス：カルシニューリンがアポトーシスを誘導するとの報告が多数認められる（Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１９９８，４（１２）：２９６７−７６，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４（５４１２）：３３９−４３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，１９９９，２７４（４８）：３４４５０−８，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０００，２０（１９）：７４２６−５１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｍ．，２０００，２７５（４４）：３４５２８−３３）。この事は、カルシニューリン阻害が逆の細胞の異常増殖の亢進に繋がると言うことである。しかしながら先に記述したが、ＤＳＣＲ−１によるカルシニューリンを阻害することが周知であり、可能性としてＤＳＣＲ−１によるカルシニューリン経由以外のアポトーシスの抑制が考えられる。
（３）細胞周期：ＦＧＦによるサイクリンＡおよびＥの発現をカルシニューリン阻害薬であるサイクロスポリン  Ａが抑制する（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９８，３５３（２）：３７４−８）。一方で、サイクロスポリンＡが細胞周期に対し逆の現象であるｃｄｋ４キナーゼ活性を促進する（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２０００，１９（２４）：２８２０−７）ことから、カルシニューリンの阻害が必ずしも細胞周期を抑制するとは限らない。【００４１】
従って、ＤＳＣＲ−１による癌細胞の異常増殖の抑制に対するカルシニューリン経由の関与は極めて薄いことが推察される。【００４２】
実施例１３    リンパ腫由来細胞株の血管内皮細胞への接着におけるＤＳＣＲ−１による阻害
癌の転移において、細胞接着は重要な現象である。一方、癌組織において炎症像が確認できるが、炎症の場における細胞接着は重要な現象であることは言うまでもない。ＤＳＣＲ−１の細胞接着への関与を明らかにするため、以下の検討をした。
すなわち、ＨＵＶＥＣを  ２４ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌまき、６時間後、Ａｄ−Ｃｏｎｔｒｏｌ，Ａｄ−ＤＳＣＲ−１，Ａｄ−ＣＡ−ＮＦＡＴ，Ａｄ−ＩκＢαをＭＯＩ＝４０にて感染させた。４８時間後、細胞の培地をｓｅｒｕｍ−ｓｔａｒｖｅｄ  ｍｅｄｉａ（ＥＢＭ−２  ｐｌｕｓ  ０．５％  ＦＢＳ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に換えて、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  ｃｕｌｔｕｒｅしてから、ｔｈｒｏｍｂｉｎ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）あるいはＰＢＳを添加し、６時間刺激した。ＨＵＶＥＣはＲＰＭＩ−１６４０ｐｌｕｓ  １％ＦＢＳ  （Ｉｗａｋｉ）で洗い、その上にＰＫＨ−２６（Ｓｉｇｍａ）で赤色標識したリンパ腫由来細胞株Ｕ−９３７細胞を７．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で加え、１．５時間静置した。その後、ＨＢＳＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で２回、接着していないＵ−９３７細胞を洗い除き、接着したＵ−９３７細胞を透過光、及び蛍光下顕微鏡観察した。
接着したＵ−９３７の定量は少なくとも４つの独立した視野から、存在する蛍光の量をＮＩＨ  ｉｍａｇｅを用いて換算した。
Ａｄ−Ｃｏｎｔｒｏｌを感染させたＨＵＶＥＣではｔｈｒｏｍｂｉｎ刺激に伴い、Ｕ−９３７細胞の接着が６倍上昇するのに対し、Ａｄ−ＤＳＣＲ−１感染ＨＵＶＥＣではｔｈｒｏｍｂｉｎ刺激に伴うＵ−９３７細胞の接着は２．５倍であり、Ａｄ−ｃｏｎｔｒｏｌに比べ約５８％減少している（図１５および図１７）。この減少効果はＡｄ−ＣＡ−ＩκＢαの存在下の７７％抑制に比べ少ないものの、ＤＳＣＲ−１が構成的に発現することで有意に単球接着を抑制できることが明らかとなった。またＤＳＣＲ−１の主たる標的阻害転写因子であるＮＦ−ＡＴを構成的に発現させると、ｔｈｒｏｍｂｉｎの刺激なしでも常に単球の接着状態、炎症下にあることがこのデータから示唆され（図１６および図１７）、ＤＳＣＲ−１が癌の転移および炎症阻害に有効であると推察された。
【産業上の利用可能性】
【００４３】
癌による死亡者は年々増加し、多くの化合物により治療が試みられているが、未だ癌に対する特効薬はない。癌の発症機序が分子生物学的な方法で解明されつつあり、新たな抗癌剤が待たれている。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてはＤＳＣＲ−１は細胞遊走の抑制、細胞接着の抑制、細胞増殖の停止および毛細血管形成抑制、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもゼノグラフトによる移植癌細胞増殖の抑制を示すことが確認された。さらに、カルシニューリンの阻害に基づく炎症の抑制も考えられることから、本発明により新規な作用機序に基づく癌の抑制および治療薬を提供することができると思われる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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