(57)【要約】  本発明は、新規に特徴付けられた光誘導性内向きプロトンポンプ及び医薬におけるそれらの使用、光遺伝学的ツールとしてのそれらの有用性、それらをコードする核酸コンストラクト、前記核酸コンストラクトを運ぶ発現ベクター、前記核酸コンストラクト又は発現ベクターを含む細胞、及びそれらそれぞれの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬に使用するための配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長にわたって少なくとも５９％の配列類似性を有する光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項２】
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは９９％の配列類似性を有する； 及び／又は
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも３８％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも４８％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１に記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項３】
光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１の位置Ｅ４、Ｈ４８、Ｓ５５、Ｗ７３、Ｄ７６、Ｓ８０、Ａ８７、Ｐ２０９、Ｃ２１２、Ｋ２１４、及びＤ２２０で突然変異していない； 及び／又は光駆動内向きプロトンポンプが、Ｎ末端で切断されていない、請求項１又は２に記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項４】
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）を含み、好ましくは、からなり；特にここで、前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項５】
（ｉ）前記光駆動内向きプロトンポンプが、ｐＨ６〜ｐＨ８の間； 好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９の間で活動的である； 及び／又は
（ｉｉ）前記光駆動内向きプロトンポンプの最大吸収が、５６０ｎｍ〜５８０ｎｍの間である、
（ｉｉｉ）２０℃、ｐＨ７．５、５３２ｎｍの波長で５ｎｓの持続時間のパルス及び３ｍＪ／パルスのエネルギーの供給で、１００：２：３の比のＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：光駆動内向きプロトンポンプのモル比を示すプロテオナノディスクで測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプの光サイクルが、５０ｍｓ未満、好ましくは４５ｍｓ未満、より好ましくは４０ｍｓ未満、より好ましくは３５ｍｓ未満、さらにより好ましくは、２７ｍｓ等の３０ｍｓ未満である； 及び／又は
（ｉｖ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭ グルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、２５０ｓ−１超、好ましくは３００ｓ−１超、より好ましくは３７０ｓ−１超、より好ましくは３８０ｓ−１超、より好ましくは３９０ｓ−１超、例えば４００ｓ−１の代謝回転速度を有する； 及び／又は
（ｖ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、４０Ｈｚを超える周波数、好ましくは５０Ｈｚを超える周波数、より好ましくは６０Ｈｚを超える周波数、さらにより好ましくは７０Ｈｚを超える周波数、最も好ましくは、８０Ｈｚを超える周波数で活動電位を誘発することができる； 及び／又は
（ｖｉ）ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、３ｍｓのλ＝５３２ｎｍのパルス幅及び２３ｍＷ／ｍｍ２の強度で誘発され得る、
請求項１〜４の何れか１項に記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプをコードする核酸配列を含む核酸コンストラクトであって、前記核酸配列が、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されている、核酸コンストラクト。
【請求項７】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプをコードする核酸配列又は請求項６に記載の核酸コンストラクトを含む発現ベクターであって、前記核酸配列が、ヒト細胞での発現のために最適化されており； 特に、前記ベクターは、ウイルスベクターであり； 及び／又は前記光駆動内向きプロトンポンプのコード配列が、神経細胞特異的なヒトプロモーター、好ましくは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下にある、発現ベクター。
【請求項８】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプを発現する哺乳動物細胞であって、ただし、前記哺乳動物細胞が、ヒト胚細胞又はヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するできる細胞ではない、哺乳動物細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の核酸コンストラクト又は請求項７に記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、
（ａ）海馬細胞、視細胞、杆体細胞； 網膜錐体細胞； 網膜神経節細胞； 双極ニューロン； 神経節細胞； 疑似単極ニューロン； 多極ニューロン； 錐体ニューロン； プルキンエ細胞； 又は顆粒細胞； 又は
（ｂ）神経芽腫細胞腫細胞、特に、ＮＧ１０８−１５； ＨＥＫ２９３細胞； ＣＯＳ細胞； ＢＨＫ細胞； ＣＨＯ細胞； 骨髄腫細胞； 又はＭＤＣＫ細胞、
である請求項９に記載の哺乳動物細胞。
【請求項１１】
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプを含むリポソーム。
【請求項１２】
医薬に使用するための請求項６に記載の核酸コンストラクト、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８〜１０の何れか１項に記載の哺乳動物細胞、又は請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１３】
聴力の回復、視力の回復における使用、又はアルカローシス、神経損傷、脳損傷、脳卒中、又はパーキンソン病及びアルツハイマー病等の変性神経障害の治療又は軽減における使用のための、請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプ、請求項６に記載の核酸コンストラクト、請求項７に記載の発現ベクター、請求項８〜１０の何れか１項に記載の哺乳動物細胞、又は請求項１１に記載のリポソーム。
【請求項１４】
請求項８〜１０の何れか１項に記載の細胞を含む、非ヒト哺乳動物であって、好ましくは、前記細胞が、内因性の細胞である； ただし、人間や動物に対して何れかの動物の苦しみを上回る利益を実質的にもたらさない可能性がある動物は、除外される、非ヒト哺乳動物。
【請求項１５】
（ｉ）電気的に興奮可能な細胞の光刺激のために、
（ｉｉ）プロトン濃度勾配に対して膜上でプロトンを輸送するために、
（ｉｉｉ）細胞、細胞画分、小胞、又はリポソームの内部を酸性化又はアルカリ化するために、又は
（ｉｖ）又は光遺伝学ツールとしての、
請求項１〜５の何れか１項に定義される光駆動内向きプロトンポンプの非治療的、又はｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新しく特徴付けられた光誘導性内向きプロトンポンプ及び医薬におけるそれらの使用、光遺伝学ツールとしてのそれらの有用性、それをコードする核酸コンストラクト、核酸コンストラクトを運ぶ発現ベクター、前記核酸コンストラクト又は発現ベクターを含む細胞、及びそれらそれぞれの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての細胞は、細胞質内の特定の濃度のイオンＨ+、Ｋ+、Ｎａ+及びＣｌ−を維持し、これは生命にとって重要である。細胞膜を渡るイオン勾配は、膜内在性タンパク質であるイオン輸送体によって維持される。多くの古細菌、細菌、単細胞真核生物において、これらの勾配は、（他のメカニズムの中でも）光駆動微生物ロドプシン（ｌｉｇｈｔ−ｄｒｉｖｅｎ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）、レチナールと称される補因子発色団を含む７つの膜貫通αヘリックスタンパク質によって作製される。プロトン勾配は、外向きのプロトンポンプによって維持され、ほとんどの生化学反応にエネルギーを提供する上で重要な役割を果たす。光駆動プロトンポンプロドプシン（バクテリオロドプシン）は、古くから古細菌において発見されているが（Oesterhelt, D. & Stoeckenius, W. Rhodopsin-like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium halobium. Nature 233, 149-152 (1971)）、後に他の生命の分野でも発見され、土壌、高塩分、海洋、淡水生息地において最も広い生態学的分布をとるが、全ての既知のプロトンポンプロドプシンは、外向きである（Ernst, O. P. et al. Microbial and Animal Rhodopsins: Structures, Functions, and Molecular Mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014)）。同じことが、非ロドプシンプロトンポンプにも当てはまる。内向きの細胞プロトンポンプは、これまで知られていない。それらの存在は、議論されていない。Ｎａ＋／Ｈ＋アンチポーターのような内向き細胞オルガネラプロトンポンプが知られているという事実にもかかわらず、内向き原形質膜プロトンポンプは、未だ、完全に未知である。
【０００３】
２０１１年に、他の種類のロドプシンとは異なる微生物ロドプシンの新規クラスが、発見された（Ugalde, J. A., Podell, S., Narasingarao, P. & Allen, E. E. Xenorhodopsins, an enigmatic new class of microbial rhodopsins horizontally transferred between archaea and bacteria. Biol. Direct 6, 52 (2011)）。その研究の著者は、アナベナ感覚性ロドプシン（ＡＳＲ）５（Ａｎａｂａｅｎａ ｓｅｎｓｏｒｙ ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ ５）のいくつかの新規ホモログを発見した。クラスのメンバーは、キセノロドプシン（ｘｅｎｏｒｈｏｄｏｐｓｉｎ）（ＸｅＲｓ）と名付けられた。これらのタンパク質の中には、古細菌の新規主要系統、具体的には、ｎａｎｏｈａｌｏａｒｃｈａｅｏｎ Ｎａｎｏｓａｌｉｎａ ｓｐ． ｊ０７ＡＢ４３及びＮａｎｏｓａｌｉｎａｒｕｍ ｓｐ． Ｊ０７ＡＢ５６があり、それらの間のアミノ酸同一性は、８９％であるが、ＡＳＲとの同一性は、３４％であった。アミノ酸配列アライメントを分析した結果、著者達は、キセノロドプシンは、プロトン又はハロロドプシンポンプに共通する特定の特徴を共有していないと結論付けた。しかしながら、それらは、当時知られている感覚性ロドプシンのようなドナー位置に共通のＡｓｐを欠いているため、ＡＳＲに類似する。従って、Ｕｇａｌｄｅ達は、キセノロドプシンは、感覚性ロドプシンと同様の機能を有すると推測する。同時にＵｇａｌｄｅ達は、ＡＳＲ又は他の何れかのキセノロドプシンタンパク質の感覚又はイオン輸送機能が未だ実験的に検証されていないことを認める。
【０００４】
Ｋａｗａｎａｂｅ達は、光駆動内向きプロトン輸送活性を示す人工ＡＳＲ突然変異体Ｄ２１７Ｅを報告した（Kawanabe et al. Engineering an inward proton transport from a bacterial sensor rhodopsin. J Am Chem Soc. 131, 16439-16444 (2009); Kawanabe et al. An inward proton transport using Anabaena sensory rhodopsin. J Microbiol. 49, 1-6 (2011)）。次の報告も参照されたい（Dong et al. Structure of an Inward Proton-Transporting Anabaena Sensory Rhodopsin Mutant: Mechanistic Insights. Biophys J. 111, 963-972 (September 2016)）。しかしながら、Ｋａｗａｎａｂｅ達は、Ｄ２１７Ｅ ＡＳＲによる内向きプロトン輸送の効率が低いこと（ＢＲの効率の１５倍低い）を示した。さらに、Ｋａｗａｎａｂｅ達は、Ｄ２１７Ｅ ＡＳＲが、Ｈ+ポンプ又はチャネルとして機能するかどうかを示していない。対照的に、本明細書に記載され、特徴付けられたキセノロドプシンは、非常に効率的なプロトン輸送を可能にする光駆動内向きプロトンポンプであることが証明されている。
【０００５】
Ｉｎｏｕｅ達は、光駆動外向きプロトンポンプアルケロドプシン３（ＡＲ−３）におけるレチナールの周囲に位置する３つの残基（すなわち、Ｍ１２８Ａ、Ｇ１３２Ｖ、及びＡ２２５Ｔ）を置換することにより、青色シフト、光依存性プロトンチャネル（ＡＲ３−Ｔ）の産生を記載する（Inoue et al. Converting a light-driven proton pump into a light-gated proton channel. J Am Chem Soc. 137, 3291-3299 (2015)）。光依存性プロトンチャネルＡＲ３−Ｔは、電気化学的勾配に対するプロトン輸送を許容しない。また、ＡＲ３−Ｔのフォトサイクルが非常に遅いため、ＡＲ３−Ｔがいくつかの光遺伝学的用途に適さないことも報告されている。
【０００６】
最近、Ｉｎｏｕｅ達はまた、Parvularcula oceani由来の内向きＨ+ポンプの発見（Inoue et al. A natural light-driven inward proton pump. Nat Commun. 7, 13415 (November 2016)）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）及びマウス神経細胞でのその発現を報告した。しかしながら、Parvularcula oceani由来の内向きＨ+ポンプによる光誘導脱分極電流は、神経細胞の活性化には不十分である。注目すべき報告された動態は、本明細書に記載され及び特徴付けられているキセノロドプシンと比較してかなり遅く、これは、一般に、光遺伝学ツールとしてのParvularcula oceani由来の内向きＨ+ポンプの使用を制限し、高い時間的正確度でニューロン活性化の可能性を起こらないようにする。
【０００７】
キセノロドプシンファミリー由来の３つのタンパク質、すなわちＮｓＸｅＲ（Ugalde, et al. Biol. Direct 6, 52 (2011)に開示されている配列）、ＨｒｖＸｅＲ（Ghai, R. et al. New Abundant Microbial Groups in Aquatic Hypersaline Environments. Sci. Rep. 1, (2011)に開示されている配列）及びＡｌｋＸｅＲ（Vavourakis, C. D. et al. Metagenomic Insights into the Uncultured Diversity and Physiology of Microbes in Four Hypersaline Soda Lake Brines. Front. Microbiol. 7, (2016)に開示されている配列）は、初めて特徴付けられ、３つの全てが内向きプロトンポンプであることが見出された。これらのタンパク質の１つを使用して、包括的な機能及び構造の研究を実施し、その結果を以下に説明する。さらに、ＮｓＸｅＲによる光誘導脱分極電流は、高い時間的正確度で神経細胞の信頼性の高い活性化に十分であることがわかった。従って、プロトンポンプとしてのＮｓＸｅＲは、陽イオンに依存しない活性であり、よく知られている陽イオン選択性チャネルロドプシンの代替物であるため、光遺伝学的研究にとって興味深い。
【０００８】
本開示の目的は、陽イオン非依存性であり、ｐＨ非感受性であり、広範囲の細胞で発現され得る新規光遺伝学的ツールを提供することである。そのような光遺伝学的ツールは、科学研究の分野並びに医薬研究の分野においても価値があると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Oesterhelt, D. & Stoeckenius, W. Rhodopsin-like Protein from the Purple Membrane of Halobacterium halobium. Nature 233, 149-152 (1971).
【非特許文献２】Ernst, O. P. et al. Microbial and Animal Rhodopsins: Structures, Functions, and Molecular Mechanisms. Chem. Rev. 114, 126-163 (2014).
【非特許文献３】Ugalde, J. A., Podell, S., Narasingarao, P. & Allen, E. E. Xenorhodopsins, an enigmatic new class of microbial rhodopsins horizontally transferred between archaea and bacteria. Biol. Direct 6, 52 (2011).
【非特許文献４】Ghai, R. et al. New Abundant Microbial Groups in Aquatic Hypersaline Environments. Sci. Rep. 1, (2011).
【非特許文献５】Vavourakis, C. D. et al. Metagenomic Insights into the Uncultured Diversity and Physiology of Microbes in Four Hypersaline Soda Lake Brines. Front. Microbiol. 7, (2016).
【非特許文献６】Gushchin, I. et al. Crystal structure of a light-driven sodium pump. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 390-395 (2015).
【非特許文献７】Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234 (2005).
【非特許文献８】Huang, K. S., Bayley, H. & Khorana, H. G. Delipidation of bacteriorhodopsin and reconstitution with exogenous phospholipid. Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 323-327 (1980).
【非特許文献９】Racker, E. & Stoeckenius, W. Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light-driven proton uptake and adenosine triphosphate formation. J. Biol. Chem. 249, 662-663 (1974).
【非特許文献１０】Ritchie, T. K. et al. in Methods in Enzymology (ed. Duzgunes, N.) 464, 211-231 (Academic Press, 2009).
【非特許文献１１】Chizhov, I. et al. Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle. Biophys. J. 71, 2329-2345 (1996).
【非特許文献１２】Gordeliy, V. I. et al. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex. Nature 419, 484-487 (2002).
【非特許文献１３】Chernavskii, D. S. An alternative model of the bacteriorhodopsin action and unusual properties of the K-610-intermediate. Biofizika (1994).
【非特許文献１４】Buda, F., de Groot, H. J. M. & Bifone, A. Charge Localization and Dynamics in Rhodopsin. Phys. Rev. Lett. 77, 4474-4477 (1996).
【非特許文献１５】Landau, E. M. & Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 14532-14535 (1996).
【非特許文献１６】Caffrey, M. & Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).
【非特許文献１７】Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 125-132 (2010).
【非特許文献１８】Winn, M. D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 235-242 (2011).
【非特許文献１９】Vagin, A. & Lebedev, A. MoRDa , an automatic molecular replacement pipeline. Acta Crystallogr. Sect. Found. Adv. 71, s19-s19 (2015).
【非特許文献２０】Adams, P. D. et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010).
【非特許文献２１】Murshudov, G. N. et al. REFMAC 5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367 (2011).
【非特許文献２２】Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132 (2004).
【非特許文献２３】Gradinaru, V. et al. Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics. Cell 141, 154-165 (2010).
【非特許文献２４】Kuzmich, A. I., Vvedenskii, A. V., Kopantzev, E. P. & Vinogradova, T. V. Quantitative comparison of gene co-expression in a bicistronic vector harboring IRES or coding sequence of porcine teschovirus 2A peptide. Russ. J. Bioorganic Chem. 39, 406-416 (2013).
【非特許文献２５】Shcherbo, D. et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat. Methods 4, 741-746 (2007).
【非特許文献２６】Gunaydin, L. A. et al. Ultrafast optogenetic control. Nat. Neurosci. 13, 387-392 (2010).
【非特許文献２７】Hernandez et al. Optogenetic stimulation of the auditory pathway. J Clin Invest. 124, 1114-1129 (2014).
【非特許文献２８】Mace et al. Targeting channelrhodopsin-2 to ON-bipolar cells with vitreally administered AAV Restores ON and OFF visual responses in blind mice. Mol Ther. 23, 7-16 (2015).
【非特許文献２９】Kawanabe et al. Engineering an inward proton transport from a bacterial sensor rhodopsin. J Am Chem Soc. 131, 16439-16444 (2009).
【非特許文献３０】Kawanabe et al. An inward proton transport using Anabaena sensory rhodopsin. J Microbiol. 49, 1-6 (2011).
【非特許文献３１】Dong et al. Structure of an Inward Proton-Transporting Anabaena Sensory Rhodopsin Mutant: Mechanistic Insights. Biophys J. 111(5), 963-972 (September 2016).
【非特許文献３２】Inoue et al. Converting a light-driven proton pump into a light-gated proton channel. J Am Chem Soc. 137, 3291-3299 (2015).
【非特許文献３３】Inoue et al. A natural light-driven inward proton pump. Nat Commun. 7, 13415 (November 2016).
【発明の概要】
【００１０】
電気化学的プロトン勾配の生成は、細胞生体エネルギー学の最初の普遍的なステップである。原核生物において、勾配は、外向き膜タンパク質プロトンポンプによって作成される。内向き原形質膜の天然プロトンポンプは、未だに未解明である。本開示において、微生物ロドプシンのＮａｎｏｈａｌｏａｒｃｈａｅａファミリー由来の未だ特徴付けられていないキセノロドプシンの代表物の不活的な機能研究が記載される。本明細書の実施例において、それらがモデル膜系、大腸菌細胞、ヒト胎児腎細胞、神経芽細胞腫細胞及びラット海馬神経細胞の内向きプロトンポンプであることが初めて実証された。ＮｓＸｅＲは、ラット海馬神経細胞の最大内因性発火頻度まで活動電位を誘発することができる強力なポンプであることが実証されており、内向きプロトンポンプが、ニューロンの光誘導遠隔制御に適しており、良く知られている陽イオン選択性チャネルロドプシンの代替物であることを証明する。
【００１１】
それに応じて、請求項でさらに定義されるように、開示されているのは、医薬に使用するための配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長にわたって少なくとも５９％の配列類似性を有する光駆動内向きプロトンポンプである。例えば、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、配列番号２（ＨｒｖＸｅＲ１）、配列番号９（ＨｒｖＸｅＲ）、配列番号１０（ＡｌｋＸｅＲ）、配列番号１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、配列番号１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、配列番号１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、配列番号１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び配列番号１５（ＡｌｋＸｅＲ５）から選択されるアミノ酸を含み得、又はそれからなり得る。
【００１２】
また、本明細書に開示される光駆動内向きプロトンポンプをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトも提供され、ここで、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されており； 及び本開示に開示される光駆動内向きプロトンポンプ又は前記核酸コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターであり、ここで、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞における発現に最適化される。
【００１３】
本明細書に開示される光駆動内向きプロトンポンプを発現する哺乳動物細胞、ただし、哺乳動物細胞は、ヒト胚細胞又はヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するできる細胞ではなく； 及び本開示の核酸コンストラクト又は発現ベクターを含む哺乳動物細胞も企図される。さらに、本開示はまた、本明細書に開示される光駆動内向きプロトンポンプを含むリポソームを提供する。
【００１４】
本開示の光駆動内向きプロトンポンプ、核酸コンストラクト、発現ベクター、哺乳動物細胞、又はリポソームは、聴力の回復（ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ）、視力の回復（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）、又はアルカローシス、神経損傷、脳損傷、脳卒中、又はパーキンソン病及びアルツハイマー病等の変性神経障害の治療又は軽減に使用する等、医薬に有利に使用され得る。
【００１５】
加えて、本開示は、本開示の細胞を含む非ヒト哺乳動物を提供し、好ましくは、前記細胞は、内因性細胞である； ただし、人間や動物に対して何れかの動物の苦しみを上回る利益を実質的にもたらさない可能性がある動物は、除外される。
【００１６】
最後に、（ｉ）電気的に興奮可能な細胞の光刺激のために、（ｉｉ）プロトン濃度勾配に対して膜上でプロトンを輸送するために、（ｉｉｉ）細胞、細胞画分、小胞、又はリポソームの内部を酸性化又はアルカリ化するために、又は（ｉｖ）光遺伝学ツールとして、本明細書に開示されるような光駆動内向きプロトンポンプの非治療的、又はｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｖｏの使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】微生物ロドプシンの配列アライメント。配列アライメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して実行された。ヘリックス領域は、「+」記号でマークされ、Ｎ末端及び膜貫通ヘリックスが記載される。モチーフのアミノ酸及びＨ４８−Ｄ２２０プロトン受容体の対は太字で強調される。  配列のＵｎｉＰｒｏｔＩＤの説明。ＮｓＸｅＲ（Ｇ０ＱＧ７５）、ＨｒｖＸｅＲ１（Ｈ０ＡＡＫ５）、ＡＳＲ（Ｑ８ＹＳＣ４）、ＨｓＢＲ（Ｐ０２９４５）、ＰＲ（Ｑ９Ｆ７Ｐ４）、ＮｐＨＲ（Ｐ１５６４７）、ＤｅＫＲ２（Ｎ０ＤＫＳ８）、ＮｐＳＲ２（Ｐ４２１９６）、ＨｒｖＸｅＲ（Ｇｈａｉ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）、ＡｌｋＸｅＲ（Ｖａｖｏｕｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）、ＡｌｋＸｅＲｓ１−５（Ｖａｖｏｕｒａｋｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ）。
【図２】ＸｅＲの電気特性。ａ．異なるＸｅＲを発現する大腸菌細胞懸濁液の照射によるｐＨの変化。グラフは、ＣＣＣＰを添加した場合と添加しない場合のｐＨの変化を示す。ｂ．再構成されたＮｓＸｅＲ（ＣＣＣＰを含む又は含まない）を含むリポソーム懸濁液の照射によるｐＨの変化。ｃ．異なるｐＨ値で測定されたリポソーム懸濁液の照射によるｐＨの変化。
【図３】ＮｓＸｅＲの高分子学的特性。ａ．界面活性剤ＤＤＭに可溶化されたキセノロドプシンファミリーの代表物の吸収スペクトル。対応する吸収極大の位置は、凡例に示される。ｂ．３つの特性波長３７８、４０８、及び５６４ｎｍでのＮｓＸｅＲの過渡吸収変化（ｐＨ７．５、Ｔ＝２０℃）。黒い線は実験データであり、ライトグレー及びダークグレーの線は、５つの指数を使用したフローバルフィットの結果を表す。光サイクルは、２つの調製物に対して測定された： ナノディスクにおける（ライトグレー）及びリポソームにおける（ダークグレー）ＮｓＸｅＲ。サンプル間の振幅の違いは、ナノディスクよりもリポソーム内のＮｓＸｅＲ濃度が２倍高いことに注意（図４参照）。ｃ．ナノディスクにおけるＮｓＸｅＲ光サイクルの提案モデル。
【図４】ナノディスク（ＮＤ、上段）及びリポソーム（ＬＩＰ、下段）調整（２０℃、ｐＨ７．５）でのＮｓＸｅＲの光サイクル。５つの速度論的に異なるタンパク質状態（赤線）は、図３ｂに例示されているフラッシュ光分解データのグローバルマルチ指数分析によって取得される。各パネルには、参照のために非励起タンパク質の対応するスペクトルが含まれる（Ｐ０、黒線）。Ｐｉ＝１．．５状態のスペクトルは、対応する指数スペクトルから計算され、フォトサイクルのシーケンシャル不可逆モデルを想定して、状態の微分スペクトルにさらに変換された。反応の半分の時間は、パネルの間に描かれる。サイクル分子の割合は、ＮＤで１２．５％、ＬＩＰで１５％であった。
【図５】ＨＥＫ２９３及びＮＧ１０８−１５細胞の光電流。膜電位でＮｓＸｅＲを発現している細胞の光電流は、−１００ｍｖ及び対応するＩ−Ｖ曲線から２０ｍＶステップで変化した。ａ．ピペット溶液１及びバス溶液１を含むＨＥＫ２９３。ｂ．ピペット溶液２及びバス溶液２を含むＮＧ１０８−１５細胞（プロトンが内向き電流の原因であることを確認するためのコントロール測定）。
【図６】異なる光パルス周波数でのスパイキングトレース。ＮｓＸｅＲを異種発現している海馬ニューロンが、電流クランプ条件下での全細胞構成におけるパッチクランプ実験により調査された。活動電位は、示された周波数で４０の光パルスによって引き起こされた。光パルスのパルス幅は、３ｍｓ、波長はλ＝５３２ｎｍ、強度は、２３ｍＷ／ｍｍ２であった。
【図７】スパイク遅延の変動。異なる神経細胞において測定された例示的なスパイキングトレース。光パルスのパルス幅は、Ａ）３ｍｓ及びＢ）１０ｍｓであった。ＮｓＸｅＲを異種発現しているラット海馬ニューロンが、電流クランプ条件下での全細胞構成におけるパッチクランプ実験により調査された。スパイクは、波長λ＝５３２ｎｍ、強度２３ｍＷ／ｍｍ２の光パルスによって引き起こされた。
【図８】示された膜電位でＮＧ１０８細胞で測定されたＮｓＸｅＲのオン及びオフの速度論。超短ナノ秒の光パルスは、波長λ＝５７０ｎｍでＯｐｏｌｅｔｔｅ３５５によって生成された。対応するＩ−Ｖ曲線が右側に示されており、ピーク光電流が、膜電位に対してプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
好ましい実施形態の詳細な説明
ここでの例は、微生物ロドプシンのNanohaloarchaea由来の、まだ特徴づけられていないキセノロドプシンの代表的な包括的な機能研究を示し、それらが内向きプロトンポンプであることを示す。モデル膜システム、大腸菌細胞、ヒト胚性腎細胞、神経芽腫グリオーマ細胞及びラット海馬神経細胞におけるナノサリナ由来のキセノロドプシン（ＮｓＸｅＲ）のポンピング活性の厳密な研究により、これら全ての細胞でＮｓＸｅＲが内向きポンプとして機能することが確認された。また、ＮｓＸｅＲは、代謝回転速度が、４００ｓ−１の強力なポンプであり、ラット海馬神経細胞の最大内因性発火頻度まで活動電位を引き出すことが可能であることも実証されている。ＮｓＸｅＲの結晶構造は、既知のロドプシンとは非常に異なるイオン活動経路を明らかにする。プロトンポンプとしての固有の性質により、ＮｓＸｅＲは、イオン条件に完全に依存しないため、このロドプシンは、良く知られているカチオン選択性チャネルとして、ニューロンの光誘起リモートコントロールの興味深い代替品となる。
【００１９】
従って、本明細書で開示されるものは、医薬に使用するための配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長にわたって少なくとも５９％の配列類似性を有する光駆動内向きプロトンポンプである。好ましい実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対して少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％、の配列類似性を有する。
【００２０】
あるいは、又はさらに、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対して少なくとも３８％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも４８％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは９９の配列同一性を有し得る。
【００２１】
一般に、アライメントされた配列に対するそれらの間の配列同一性が、例えば配列番号１等の前記他のアミノ酸配列の全長にわたって少なくともｘ％である場合、アミノ酸配列は、例えば、上記配列番号１等の他のアミノ酸配列と「少なくともｘ％の同一性」を有する。同様に、２つのアライメントされた配列間の配列類似性が、例えば配列番号１等の他のアミノ酸配列の全長にわたって少なくともｘ％である場合、アミノ酸配列は、例えば上記配列番号１等の他のアミノ酸配列と「少なくともｘ％類似性」を有する。
【００２２】
このようなアライメントは、例えば、ＥＭＢＬホームページhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/で提供される「ＥＭＢＯＳＳ」プログラム等の公的に利用可能なコンピュータ相同性プログラムを使用して、そこに提供されるデフォルト設定を使用して実行され得る。アミノ酸配列のセットの配列同一性又は配列類似性パーセンテージを計算するさらなる方法は、当該技術分野で周知である。
【００２３】
光駆動内向きプロトンポンプは、７つの膜貫通αヘリックス（Ａ〜Ｇ）及びシッフ塩基を介して配列番号１の２１３リジンに相当する残基に共有結合したコファクターレチナールを有する。ヘリックスＡの前には小さなＮ末端αヘリックスがあり、これは、細胞の外側でタンパク質をキャッピングしている。
【００２４】
本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、少なくとも５つの膜貫通ヘリックスを有する膜タンパク質であり、これは、感光性ポリエンと結合することができる。６又は７回膜貫通ヘリックスを持つ膜貫通タンパク質が好ましい。しかしながら、７つを超えるヘリックス、例えば８、９又は１０回膜貫通ヘリックスを有する膜貫通タンパク質も含まれる。さらに、本発明は、膜貫通部分に加えて、Ｃ及び／又はＮ末端塩基配列を含む膜貫通タンパク質を包含し、ここで、Ｃ末端配列は、膜で囲まれた管腔の内側、例えば、細胞の細胞質又はリポソームの内側まで伸びることができ、又は膜の外面に配置され得る。同じことが、任意に存在するＮ末端配列にも当てはまり、これは、菅腔及び膜の外面の両方に同様に配置され得る。Ｃ及び／又はＮ末端配列の長さは、原則として制限を受けない。しかしながら、膜に埋め込まれていないＣ末端を備え、１〜１０００個のアミノ酸、好ましくは１〜５００個、特に好ましくは５〜５０個のアミノ酸を有する光駆動内向きプロトンポンプが好ましい。Ｃ末端配列の長さとは無関係に、膜に埋め込まれていないＮ末端に位置する配列は、好ましくは１〜５００個のアミノ酸、特に好ましくは５〜５０個のアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプは、Ｎ末端で切断されていない。膜貫通ヘリックスの概念は、当業者に周知である。これらは一般に、αヘリックスタンパク質構造であり、これは、原則として２０〜２５個のアミノ酸を含む。しかしながら、天然の膜、例えば細胞膜又は原形質膜、又は合成膜でもあり得る膜の性質に依存して、膜貫通セグメントはまた、短く又は長くすることができる。例えば、人工膜の膜貫通セグメントは、最大３０個のアミノ酸を含むことができるが、一方で、わずかなアミノ酸、例えば１２〜１６個のみを含むこともできる。
【００２５】
最も好ましくは、光駆動内向きプロトンポンプＸｅＲには、７つの膜貫通αヘリックス（Ａ〜Ｇ）及びシッフ塩基を介して２１３リジンに共有結合したコファクターレチナールがある。ヘリックスＡの前には小さなＮ末端αヘリックスがあり、これは、細胞の外側でタンパク質をキャッピングしている。
【００２６】
好ましくは、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１と比較して、（半（ｓｅｍｉ））保存的置換のみを含む。保存的置換は、それら側鎖と化学的性質に関連するアミノ酸ファミリー内で起こる置換である。そのようなファミリーの例は、塩基性側鎖、酸性側鎖、非極性脂肪族側鎖、非極性芳香族側鎖、非荷電極性側鎖、小側鎖、大側鎖等を有するアミノ酸である。典型的な半保存的置換は次の通りである。
【表１】
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【００２７】
さらに、当業者は、立体的に厳しい位置にあるグリシンを置換すべきではなく、及びプロリンをアルファヘリックス構造又はベータシート構造を有するタンパク質の部分に導入すべきでないことを理解するだろう。特に、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１のＥ４、Ｈ４８、Ｓ５５、Ｗ７３、Ｄ７６、Ｓ８０、Ａ８７、Ｐ２０９、Ｃ２１２、Ｋ２１４、及びＤ２２０に相当する位置で変異すべきではない。言い換えると、光駆動内向きプロトンポンプは、好ましくは、位置４で「Ｅ」、位置４８で「Ｈ」等を含む。
【００２８】
さらにより好ましい実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）から選択されるアミノ酸配列を含み、特にここで、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列を含む。最も好ましい実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）から選択されるアミノ酸配列からなり、特にここで、特にここで、光駆動内向きプロトンポンプは、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列からなる。
【００２９】
本明細書で用いられる「内向き」という用語は、プロトンポンプが細胞内で発現され、細胞の膜に組み込まれると、プロトンを細胞内に（勾配に対しても）移動させることを意味することを意図する。「光駆動内向きプロトンポンプ」であるという機能の要件は、次のアッセイを用いてテストすることができる。精製された候補タンパク質は、前述のように大豆リポソームで再構成される（Huang, K. S., Bayley, H. & Khorana, H. G. Delipidation of bacteriorhodopsin and reconstitution with exogenous phospholipid. Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 323-327 (1980); 参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、リン脂質（大豆由来のアソレクチン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＣＨＣｌ３（クロロホルム超高純度、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ Ｐａｎｒｅａｃ）に溶解し、ガラスバイアル内のＮ２の流れの下で乾燥させる。残留溶媒は、一晩、真空ポンプで除去される。乾燥した脂質は、２％（Ｗ／Ｖ）コール酸ナトリウムで補充した０．１５Ｍ ＮａＣｌに最終濃度１％（Ｗ／Ｖ）で再懸濁された。混合物は、４℃で超音波処理にて清澄化され、キセノロドプシンが、７：１００（Ｗ／Ｗ）のタンパク質／脂質比で加えられる。界面活性剤は、界面活性剤吸収ビーズ（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ ２、Ｓｕｐｅｌｃｏ）で一晩攪拌することにより除去される。混合物は、４℃でｐＨ７に調整された０．１５Ｍ ＮａＣｌで１日間透析される（４回、２００ｍｌ交換）。測定は、０℃で攪拌されたプロテオリポソーム懸濁液２ｍｌで行われる。プロテオリポソームは、ハロゲンランプ（Ｉｎｔｒａｌｕｘ ５０００−１、ＶＯＬＰＩ）で１８分間照らされ、その後さらに１８分間暗所で保管された。ｐＨの変化は、ｐＨメーター（ＬＡＢ ８５０、Ｓｃｈｏｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でモニターされた。ネガティブコントロールとして、同じ条件下で４０ｕＭのＣＣＣＰの存在下で測定が繰り返された。内向きプロトンポンプの場合、照射時のｐＨ変化は、膜の外側の溶液の酸性化を示す。ＣＣＣＰを懸濁液に加えると、これらのｐＨ変化はなくなる。
【００３０】
特定の実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプは、ｐＨ６〜ｐＨ８の間、好ましくはｐＨ５〜ｐＨ９の間で活動的である。この特徴は、前述のリポソームアッセイを用いてテストすることができるが、透析によりプロテオリポソームをｐＨ７．０以外の開始ｐＨに調整する。
【００３１】
前述のリポソームアッセイを使用して、異なる波長の光で照らすこともできる。光駆動内向きプロトンポンプは、通常、５６０ｎｍ〜５８０ｎｍの間に最大吸収を示すことを特徴とされる。以下の実施例２も参照。
【００３２】
しかしながら、本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、そのサイクルに関してさらに特徴付けられ得る。好ましくは、２０℃及びｐＨ７．５で、１００：２：３のＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：光駆動内向きプロトンポンプのモル比を示し、５３２ｎｍの波長及び３ｍＪ／パルスのエネルギーを供給するプロテオナノディスクで測定した場合、光駆動内向きプロトンポンプの光サイクルは、５０ｍｓ未満、好ましくは４５ｍｓ未満、より好ましくは４０ｍｓ未満、より好ましくは３５ｍｓ未満、さらにより好ましくは３０ｍｓ未満、例えば２７ｍｓである。
【００３３】
簡単に説明すると、プロテオナノディスクは、標準プロトコルを用いて構築される（Ritchie, T. K. et al. in Methods in Enzymology (ed. Duzgunes, N.) 464, 211-231 (Academic Press, 2009); 参照により本明細書に組み込まれる）。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）が脂質として用いられる。アポリポタンパク質−１の細長いＭＳＰ１Ｅ３バージョンが用いられる。構築中のモル比は、ＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：ＮｓＸｅＲ＝１００：２：３である。リポソームは、上記のように調製される。
【００３４】
吸収スペクトルは、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−２４０１ＰＣ分光光度計を使用して記録される。レーザーフラッシュ光分解のセットアップは、Ｃｈｉｚｈｏｖ及び同僚によって記載されたものと類似する（Chizhov, I. et al. Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle. Biophys. J. 71, 2329-2345 (1996); 参照により本明細書に組み込まれる）。励起／検出システムは、次のように構成される： Ｓｕｒｅｌｉｔｅ ＩＩ−１０ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して、５３２ｎｍの波長で５ｎｓのパルス及び３ｍＪ／パルスのエネルギーが供給される。サンプル（５×５分光石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ））が、２つのコリメートされ機械的に結合されたモノクロメーター（１／８ｍモデル７７２５０、Ｏｒｉｅｌ Ｃｏｒｐ．、ＵＳＡ）の間の恒温室に置かれる。プロービングライト（Ｘｅ−ａｒｃ ｌａｍｐ、７５Ｗ、Ｏｓｒａｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）は、最初のモノクロメーター、サンプルを通過し、ＰＭＴ検出器（Ｒ３８９６、Ｈａｍａｍａｔｚｕ、日本）で第２のモノクロメーターの後に到達する。ＰＭＴの電流−電圧コンバーターは、測定システムの時間分解能の約５０ｎｓを（５ｎｓレーザーパルスの見かけのパルス幅として測定）決定する。２つのデジタルオシロスコープ（ＬｅＣｒｏｙ ９３６１及び９４００Ａ、それぞれのチャネル当たり２５及び３２キロバイトのバッファーメモリ）を使用して、２つのオーバーラップする時間枠で過渡的な伝送変化の痕跡を記録する。最大デジタル化レートは、データポイント当たり１０ｎｓである。過渡吸収の変化は、レーザーパルスの１０ｎｓから光変換が完全に完了するまで記録される。各波長で、２５レーザーパルスが、平均化され、シグナル対ノイズ比が改善する。準対数データ圧縮により、痕跡当たりのデータポイントの初期数（〜５００００）が対数時間スケールで均等に分散される〜６００ポイントに減少し、１0時間当たり〜１００ポイントになる。波長は、コンピュータ制御のステップモーターを用いて、２ｎｍ（合計２１６スペクトルポイント）のステップで３００〜７３０ｎｍまで変化する。サンプルの吸収スペクトルは、標準分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−８００）で各実験の前後に測定される。
【００３５】
各データセットは、グローバル多指数関数非線形最小二乗近似プログラムＭＥＸＦＩＴを用い、個別に分析される（Gordeliy, V. I. et al. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex. Nature 419, 484-487 (2002); 参照により本明細書に組み込まれる）。指数成分の数は、加重残差の標準偏差がさらに改善されなくなるまで増加する。見かけの速度定数及び緩和過程の単一鎖の内部不可逆遷移への割り当てを確立した後、指数の振幅スペクトルは、最終状態のスペクトルに関して対応する中間体の差スペクトルに変換される。その後、状態の絶対吸収スペクトルは、変換された分子の割合で除算された差分スペクトルを最終状態のスペクトルに加えることによって決定される。小数値（ｆｒａｃｔｉｏｎ ｖａｌｕｅ）の決定基準は、初期状態から最終状態の計算されたスペクトルへの負の吸収性の寄与がないことである。方法の詳細については、（Chizhov, I. et al. Biophys. J. 71, 2329-2345 (1996)）を参照。
【００３６】
加えて、光駆動内向きプロトンポンプは、Ａｘｏｐａｔｃｈ２００Ｂインターフェイス（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて細胞全体の構成でパッチクランプ測定を用いることにより、さらに電気生理学的に特性評価され得る。光電流は、４００μｍ光ファイバに集光されたダイオード励起固体レーザー（λ＝５３２ｎｍ）を用いて飽和強度２３ｍＷ／ｍｍ２の光パルスに応答して測定される。光パルスは、高速コンピュータ制御シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ ＬＳ６ＺＭ２、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）によって適用される。超短ナノ秒光パルスは、Ｏｐｏｌｅｔｔｅ３５５波長可変レーザーシステム（ＯＰＴＯＰＲＩＭ）によって生成される。アクションスペクトルの測定では、異なる波長でのパルスエネルギーは、１０１９光子／ｍ２の等しい光子カウントに相当する値に設定された。さらに、−１００ｍＶ〜+６０ｍＶの範囲の膜電位での光電流と電圧の関係が測定された（膜電位が−８０ｍＶ〜+８０ｍＶの範囲であったＯｎ／Ｏｆｆカイネティクスを除く）。抵抗が２〜５ＭΩのパッチピペットは、水平プラー（モデルＰ−１０００、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で薄壁のホウケイ酸ガラス（ＧＢ１５０Ｆ−８Ｐ）から製造され得る。詳細なガイダンスは、以下の実施例３に記載される。
【００３７】
簡単に説明すると、候補光駆動内向きプロトンポンプは、アデノ随伴ウイルス媒介遺伝子導入によってラット海馬ニューロンにおいて異種的に発現され得る。海馬は、出生後のＰ１Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離され、パパイン（２０Ｕｍｌ−１）で３７℃、２０分間処理される。海馬は、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、高グルコース）で洗浄し、少量の同液で滴定する。２４ウェルプレートのポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングガラスカバースリップに、〜９６，０００個の細胞が播種される。３時間後、プレーティング培地が、培養培地（２％Ｂ−２７サプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ、及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ）に置き換えられる。
【００３８】
ｒＡＡＶ２／１ウイルスは、光駆動内向きプロトンポンプのＤＮＡ配列、Ｋｉｒ２．１にＣ末端で融合した膜トラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）シグナル、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド、ＧＦＰバリアントを含むヒトシナプシンプロモーターを含むｐＡＡＶ２ベクターを使用して調製される。簡単に説明すると、５×１０９ゲノムコピー／ｍｌ（ＧＣ／ｍｌ）のｒＡＡＶ２／１ウイルスが、プレーティングの４〜９日後に各ウェルに加えられる。電気生理学的記録は、形質導入の１９〜２３日後に行われる。
【００３９】
電気生理学的特性評価は、ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで満たされた抵抗３〜８ＭΩのパッチピペットを用いて実行される。細胞外溶液は、ｐＨ７．３に滴定された１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。電気生理学的シグナルは、１０ｋＨｚでフィルタされ、Ａｘｏｎ Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ（５０ｋＨｚ）でデジタル化され、ｐＣｌａｍｐ９ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて取得及び分析される。
【００４０】
いくつかの実施形態において、ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、２５０ｓ−１超、好ましくは３００ｓ−１超、より好ましくは３７０ｓ−１超、より好ましくは３８０ｓ−１超、より好ましくは３９０ｓ−１超、例えば４００ｓ−１の代謝回転速度を有する。
【００４１】
特定の実施形態において、ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、光駆動内向きプロトンポンプは、４０Ｈｚを超える周波数、好ましくは５０Ｈｚを超える周波数、より好ましくは６０Ｈｚを超える周波数、さらにより好ましくは７０Ｈｚを超える周波数、最も好ましくは、８０Ｈｚを超える周波数で活動電位を誘発することができる。
【００４２】
あるいは、又は加えて、ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、光駆動内向きプロトンポンプは、３ｍｓのλ＝５３２ｎｍのパルス幅及び２３ｍＷ／ｍｍ２の強度で誘発できる。
【００４３】
関連した態様において、本開示はまた、上記光駆動内向きプロトンポンプをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトを提供する。
【００４４】
最適な発現を確保するために、例えば、適切な調節配列及び／又は標的配列を追加することにより、及び／又は選択された宿主の好ましいコドンの使用にコードＤＮＡ配列を一致させることにより、コードヌクレオチド配列が適切に改変され得る。特に好ましい実施形態において、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現に最適化される。例えば、ヌクレオチド配列は、配列番号１６に示される配列を有し得る。標的配列は、細胞内の特定の部位又は区画、例えばシナプス又はシナプス後部、軸索起始部、又は小胞体への光誘導性内向きプロトンポンプを標的とするＣ末端伸長をコードし得る。核酸は、例えば、本開示の突然変異光誘導性内向きプロトンポンプの配列の発現を提供するためのプロモーター及び転写開始・停止シグナル及び翻訳開始・停止シグナル及びポリアデニル化等のさらなる要素と組み合わせられてもよい。プロモーターは、誘導性又は構成的、一般的又は細胞特異的プロモーターであり得る。細胞特異的なプロモーターの例は、双極細胞に特異的なｍＧｌｕ６プロモーターである。特定の実施形態において、光駆動内向きプロトンポンプのコード配列は、神経細胞特異的なヒトプロモーター、好ましくは、ヒトシナプシンプロモーター制御下にある。プロモーター、ベクター及び他の要素の選択は、当業者における想定の範囲内の設計の問題である。そのような要素の多くは、文献に記載されており、商業的供給業者を通じて入手可能である。
【００４５】
また、本明細書に開示される突然変異光誘導性内向きプロトンポンプ又は核酸コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターも開示され、ここで、ヌクレオチド配列は、ヒト細胞での発現に最適化される。好ましい実施形態において、ベクターは、遺伝子治療に適しており、ここで、特に、ベクターは、ウイルス媒介遺伝子導入に適しており、すなわち、ベクターはウイルスベクターである。用語「ウイルス媒介遺伝子導入に適する」は、本明細書では、前記ベクターをウイルスに詰めることができ、故に、対象の部位又は細胞に送達できることを意味する。遺伝子治療に適したウイルスの例は、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、狂犬病ウイルス、セムリキフォレストウイルス及びヘルペスウイルスである。これらのウイルスは、認識して感染できる細胞に遺伝子をどれだけ効率よく伝達するか、細胞のDNAを永久的又は一時的に変更するか否かで異なる。しかしながら、遺伝子治療はまた、そのままのＤＮＡ、リポプレックス及びポリプレックス、並びにデンドリマーの適用等、非ウイルス性の方法も含まれる。
【００４６】
得られた核酸配列は、細胞に、例えば、ウイルスをキャリアとして使用するか、例えば、化学形質移入体（リポフェクタミン、Ｆｕｇｅｎｅ等）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈及びＤＮＡの直接の核酸等を含む遺伝子導入によって導入され得る。細胞に遺伝子導入する方法は、実施例に詳述されており、それぞれの受領細胞に適合させることができる。ＤＮＡの遺伝子導入は、遺伝子導入されたＤＮＡがゲノムに組み込まれている場合、安定した細胞又は細胞株を生成するが、又はそうでない場合、不安定（一時的な）細胞又は細胞株を生成し、ここで、遺伝子導入されたＤＮＡは、染色体外の形態で存在する。さらに、エピソーム複製プラスミドを使用することにより、安定した細胞株を取得することができ、これは、染色体外プラスミドの遺伝は、細胞ゲノムに組み込まれた制御要素によって制御されることを意味する。一般に、適切なベクター又はプラスミドの選択は、目的の宿主細胞に依存する。
【００４７】
従って、本開示は、明細書に開示される光駆動内向きプロトンポンプを発現する哺乳動物細胞にも関し、ただし、哺乳動物細胞は、ヒト胚細胞又は人間の生殖系の遺伝的同一性を変更できる細胞ではない。同様に、本開示は、本発明書に開示される核酸コンストラクト又は発現ベクターを含む哺乳動物細胞を提供する。
【００４８】
天然で相当するチャネルを発現しない細胞膜への本開示の内向きプロトンポンプの組み込みは、例えば、組換えＤＮＡ技術の既知の手順を使用して、当該内向きプロトンポンプをコードするＤＮＡが、最初に適切な発現ベクター、例えば、プラスミド、コスミド又はウイルス等に組み込まれ、次いで標的細胞が、形質転換され、タンパク質が、当該宿主で発現される点で簡単に達成され得る。次に、細胞は、適切な方法、例えば、タンパク質とレチナールの間のＳｃｈｉｆｆ塩基の結合を可能にするためにレチナールを用いて処理される。本開示の光駆動内向きプロトンポンの発現は、特定の哺乳動物系で有利に達成され得る。発現は、一過性発現としてエピソームベクター、好ましくは、神経芽細胞腫細胞（例、ＮＧ１０８−１５−細胞）、メラノーマ細胞（例、ＢＬＭ細胞株）、ＣＯＳ細胞（「アフリカミドリザル腎ＣＶ１」細胞の感染により生成）若しくはＨＥＫ細胞（「ヒト胎児腎細胞」、例えばＨＥＫ２９３細胞）又はＢＨＫ細胞（「ベイビーハムスター腎細胞」）、又はＣＨＯ細胞（「チャイニーズハムスター卵巣細胞」）、骨髄腫細胞又はＭＤＣＫ細胞（Ｍａｄｉｎｅ−Ｄａｒｂｙイヌ腎細胞）又はバキュロウイルスに感染したＳｆ９昆虫細胞における安定した発現の形態（ゲノムへの組み込みによる）の何れかににおいて有効である。より好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、神経芽細胞腫細胞、特にＮＧ１０８−１５； ＨＥ２９３細胞； ＣＯＳ細胞； ＢＨＫ細胞； ＣＨＯ細胞； 骨髄腫細胞； 又はＭＤＣＫ細胞である。
【００４９】
他の好ましい実施形態において、哺乳動物細胞は、電気的に興奮可能な細胞である。細胞が、海馬細胞； 視細胞； 杆体細胞； 網膜錐体細胞； 網膜神経節細胞； 双極ニューロン； 神経節細胞； 疑似単極ニューロン； 多極ニューロン； 錐体ニューロン； プルキンエ細胞； 又は顆粒細胞であることがさらに好ましい。
【００５０】
ニューロンは、電気的及び化学的シグナル伝達により情報を処理及び送信する電気的に興奮可能な細胞である、ここで、化学的シグナル伝達は、シナプス、他の細胞との特殊な接続を介して発生する。感覚器官の細胞に影響を与える触覚、音、光、その他多くの刺激に反応する感覚ニューロン、脳と脊髄からシグナルを受信して筋肉の収縮を引き起こし、腺に影響を与える運動ニューロン、ニューロンを脳又は脊髄の同じ領域内の他のニューロンに接続する介在ニューロン等、多くの特殊なタイプのニューロンが存在する。一般的に、ニューロンは、細胞体、樹状突起、及び軸索を有する。樹状突起は、細胞体から発生するフィラメントであり、多くの場合、数百ミクロンにわたって伸長し、複数回分岐する。軸索は、軸索起始部と称される部位の細胞体から生じる特別な細胞フィラメントである。ニューロンの細胞体は、多くの場合、複数の樹状突起を生じるが、軸索は、その末端の前に何百回も分岐する可能性があるが、決して軸索を２つ以上生じない。シナプスのバルクでは、あるニューロンの軸索から別のニューロンの樹状突起にシグナルが送信される。しかし、これらの規則には多くの例外： 樹状突起を欠くニューロン、軸索を持たないニューロン、軸索を別の軸索に接続するシナプス、又は樹状突起を別の樹状突起に接続するシナプス等がある。ほとんどのニューロンは、解剖学的に単極又は疑似単極（樹状突起と軸索が同じ突起から出現する）、双極（軸索と細胞体の両端の単一樹状突起）、多極（２つ以上の樹状突起を有し、さらに、（ｉ）錐体細胞、プルキンエ細胞、及び前角細胞等の軸索突起が長く突出しているゴルジＩニューロン、及び（ｉｉ）ゴルジＩＩ： 軸索突起が、局所的に突出しているニューロン、例えば顆粒細胞としてさらに分類され得る）としてさらに特徴付けられ得る。
【００５１】
視細胞は、光伝達が可能な網膜に見られる特殊なニューロンである。２つの古典的な光受容体は、杆体と錐体であり、それぞれ視覚システムが使用する情報を提供する。網膜神経節細胞は、眼の網膜の内側近くに位置するニューロンの一種である。これらの細胞は、保護体（中脳）、視床下部の視交叉上核、及び外側膝状体（視床）に突出する樹状突起と長い軸索を有する。わずかな割合で視覚にほとんど又は全く寄与しないが、それ自体が感光性である。それらの軸索は、網膜視床下部路を形成し、概日リズム及び瞳孔の光反射、瞳孔のサイズ変更に貢献する。それらは、２つの中間ニューロンタイプ： 双極細胞及びアマクリン細胞を介して光受容体から視覚情報を受け取る。アマクリン細胞は、網膜の介在ニューロンであり、網膜神経節細胞への入力の７０％を担っている。網膜神経節への入力の他の３０％の原因となる双極細胞は、アマクリン細胞によって制御される。網膜の一部として、光受容体（杆体細胞及び錐体細胞）及び神経節細胞の間に双極細胞が存在する。それらは、光受容体から神経節細胞にシグナルを送信するために触接的又は間接的に作用する。
【００５２】
細胞は、適切な温度及びガスの混合物（通常、３７℃、５％ＣＯ２）で、必要に応じて当業者に知られ、実施例において特定の細胞株又は細胞型について例示される細胞インキュベーターにおいて、単離（及び遺伝子改変）、維持及び培養され得る。培養条件は、細胞型ごとに異なる場合があり、特定の細胞型の条件の変化は、異なる表現型をもたらす可能性がある。温度とガス混合物は別として、細胞培養システムにおいて一般的に最も変化する要因は、増殖培地である。増殖培地の組成は、ｐＨ、グルコース濃度、増殖因子、及び他の栄養成分の存在によって異なり得る。増殖培地は、市販されているもの、又はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手可能な組成に従って調製され得るものの何れかである。補充培地に使用される増殖因子は、多くの場合、子牛血清等の動物の血液に由来する。さらに、抗生物質が、増殖培地に加えられ得る。細胞培養で行われる一般的な操作には、培地交換及び継代培養がある。
【００５３】
従って、現在開示されている光駆動内向きプロトンポンプは、電気的に興奮可能な細胞、特にニューロン細胞の光刺激のための非治療的使用等の研究ツールとして特に有用である。例えば、海馬ニューロン培養物、及び海馬ニューロンからの電気生理学的記録、並びにＨＥＫ細胞の電気生理学的記録に関するさらなるガイダンスは、以下の実施例のセクションで見出され得る。
【００５４】
細胞の代わりとして、本開示はまた、本明細書に開示される及び／又は特許請求の範囲に定義される光駆動内向きプロトンポンプを含むリポソームを提供する。
【００５５】
一般に、本開示の光駆動内向きプロトンポンプの機能に必要なレチナール又はレチナール誘導体は、前記内向きプロトンポンプで遺伝子導入される細胞によって産生される。その立体構造に応じて、レチナールは、オールトランスレチナール、１１−シス−レチナール、１３−シス−レチナール、又は９−シス−レチナールであり得る。しかしながら、上記のように、本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、小胞、リポソーム又は他の人工細胞膜に組み込まれ得ることも企図される。従って、本開示の光駆動内向きプロトンポンプ、及びレチナール又はレチナール誘導体を含むチャネルロドプシンも開示される。好ましくは、レチナール誘導体は、３，４−デヒドロレチナール、１３−エチルレチナール、９−ｄｍ−レチナール、３−ヒドロキシレチナール、４−ヒドロキシレチナール、ナフチルレチナール； ３，７，１１−トリメチル−ドデカ−２，４，６，８，１０−ペンタエナル； ３，７−ジメチル−デカ−２，４，６，８−テトラエナル； ３，７−ジメチル−オクタ−２，４，６−トリエナル； 及び６−７回転抑止レチナール、８−９回転抑止レチナール、及び１０−１１回転抑止レチナールからなる群から選択される。
【００５６】
最後に、例えば、天然の視覚細胞が機能しなくなったが、全ての神経細胞が、機能し続けることができる多くの病気が存在する。現在、様々な研究センターにおいて、網膜上に人工セラミック光細胞を薄膜に埋め込む試みが行われている。これらの光細胞は、網膜の未だに無傷の二次細胞を脱分極し、それによって神経インパルスを誘発することを目的とする（バイオニックアイ）。これらの神経節細胞、アマクリン細胞又は双極性細胞における本開示の突然変異光制御内向きプロトンポンプの意図的な発現は、非常に優れた解決策であり、より良い三次元視覚解像度とすることを可能とする。
【００５７】
従って、本開示はまた、医薬に使用するための本開示による光駆動内向きプロトンポンプ、核酸コンストラクト、発現ベクター、哺乳動物細胞、又はリポソームを企図する。以下の実施例に示すように、原理の証明は、当該技術分野において既に実証されており、現在開示されている光駆動内向きプロトンポンプに容易に適合させることができる。これらのデータを考慮して、現在開示されている光駆動内向きプロトンポンプは、聴覚障害者の聴覚能力を回復するために、又は視覚障害者の視力を回復するために使用することが企図される。
【００５８】
それらのｐＨ改変能力により、光駆動プロトンポンプは、アルカローシスの治療又は緩和にも使用され得る。同様に、その電気生理学的能力により、本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、神経損傷、脳損傷、脳卒中、又はパーキンソン病及びアルツハイマー病等の神経変性疾患の治療又は緩和に適切に適用され得ると考えられる。これら全ての治療事例において、光駆動内向きプロトンポンプは、リポソームにより、より好ましくは、本開示の核酸コンストラクト又は発現ベクターを治療される対象に投与することにより送達され得る。
【００５９】
さらに、開示されるのは、本開示の細胞について記載されるように、本開示による細胞、すなわち本開示による光駆動内向きプロトンポンプを機能的に発現する細胞、例えばニューロン、特にらせん神経節ニューロン等の細胞を含む非ヒト動物である。好ましい実施形態において、細胞は、内因性細胞である。非ヒト動物は、ヒト以外の任意の動物であり得る。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウス又はラット等のげっ歯類、又は霊長類である。
【００６０】
特に、いくつかのモデル生物、例えば、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）、アスナロウニ（Ａｒｂａｃｉａ ｐｕｎｃｔｕｌａｔａ）、カタユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、通常、キイロショウジョウバエ種（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ダンゴイカ（Ｅｕｐｒｙｍｎａ ｓｃｏｌｏｐｅｓ）、ヒュドラ（Ｈｙｄｒａ）、アメリカケンサキイカ（Ｌｏｌｉｇｏ ｐｅａｌｅｉ）、線虫（Ｐｒｉｓｔｉｏｎｃｈｕｓ ｐａｃｉｆｉｃｕｓ）、アメリカムラサキウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ）、シムサギッチフェラ・ロスコッフェンシス（Ｓｙｍｓａｇｉｔｔｉｆｅｒａ ｒｏｓｃｏｆｆｅｎｓｉｓ）、及びコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）が好ましい、脊椎動物の中で、例えばモルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）、ハムスター、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、及びラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、並びにチキン（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ ｄｏｍｅｓｔｉｕｓ）、ネコ（Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｔｕｓ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）、ヤツメウナギ（Ｌａｍｐｒｅｙ）、ニホンメダカ（Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ）、アカゲザル（Ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅ）、アラゲコトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ）、キンカチョウ（Ｔａｅｎｉｏｐｙｇｉａ ｇｕｔｔａｔａ）、フグ（Ｔａｋｉｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｒｅｓ）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）、及びゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）等の他の種である。また、非ヒト霊長類、すなわち、ホモ属のメンバーではない全ての霊長類の全ての種の動物、例えば、アカゲザル、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、及びミドリザルも好ましい。しかしながら、これらの例は、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。いずれの場合においても、これらの動物は除外され、人間又は動物に実益的な医薬的に利益をもたらさない可能性が高いため、特許法又は司法権下で特許性の対象ではないことに留意されたい。当業者は、例えば、人間や動物への実質的な医薬的に利益が動物の苦しみを上回ることを保証するための動物福祉の国際ガイドラインに定められている適切な措置を講じるだろう。
【００６１】
最後に、本開示の光駆動内向きプロトンポンプの非治療的、又はｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ使用が企図される。例えば、本開示の光駆動内向きプロトンポンプは、（ｉ）電気的に興奮可能な細胞の光刺激のために、（ｉｉ）プロトン濃度勾配に逆らって膜上でプロトンを輸送するために、（ｉｉｉ）細胞、細胞区画、小胞、又はリポソームの内部を酸性化又はアルカリ化するために、又は（ｉｖ）光遺伝学的ツールとして、有利に適用され得る。
【００６２】
以下の実施形態により本発明をさらに説明する。
１．医薬に使用するための配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長にわたって少なくとも５９％の配列類似性を有する光駆動内向きプロトンポンプ。
２．前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７１％、より好ましくは少なくとも７２％、より好ましくは少なくとも７３％、より好ましくは少なくとも７４％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも７６％、より好ましくは少なくとも７７％、より好ましくは少なくとも７８％、より好ましくは少なくとも７９％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは９９％の配列類似性を有する； 及び／又は
前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）の全長に対し少なくとも３８％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも４８％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも５６％、より好ましくは少なくとも５７％、より好ましくは少なくとも５８％、より好ましくは少なくとも５９％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する、実施形態１の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
３．光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１の位置Ｅ４、Ｈ４８、Ｓ５５、Ｗ７３、Ｄ７６、Ｓ８０、Ａ８７、Ｐ２０９、Ｃ２１２、Ｋ２１４、及びＤ２２０で突然変異していない、実施形態１又は２の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
４．光駆動内向きプロトンポンプが、N末端で切断されていない、実施形態１〜３の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
５．前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）から選択されるアミノ酸配列； 特にここで、前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列を含む、実施形態１の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
６．前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）、２（ＨｒｖＸｅＲ１）、９（ＨｒｖＸｅＲ）、１０（ＡｌｋＸｅＲ）、１１（ＡｌｋＸｅＲ１）、１２（ＡｌｋＸｅＲ２）、１３（ＡｌｋＸｅＲ３）、１４（ＡｌｋＸｅＲ４）、及び１５（ＡｌｋＸｅＲ５）から選択されるアミノ酸配列からなる； 特にここで、前記光駆動内向きプロトンポンプが、配列番号１（ＮｓＸｅＲ）のアミノ酸配列からなる、実施形態１の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
７．前記光駆動内向きプロトンポンプが、ｐＨ６〜ｐＨ８の間； 特にｐＨ５〜ｐＨ９の間で活動的である、実施形態１〜６の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
８．前記光駆動内向きプロトンポンプの最大吸収が、５６０ｎｍ〜５８０ｎｍの間である、実施形態１〜７の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
９．２０℃、ｐＨ７．５、５３２ｎｍの波長で５ｎｓの持続時間のパルス及び３ｍＪ／パルスのエネルギーの供給で、１００：２：３の比のＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：光駆動内向きプロトンポンプのモル比を示すプロテオナノディスクで測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプの光サイクルが、５０ｍｓ未満、好ましくは４５ｍｓ未満、より好ましくは４０ｍｓ未満、より好ましくは３５ｍｓ未満、さらにより好ましくは、２７ｍｓ等の３０ｍｓ未満である、実施形態１〜８の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
１０．ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭ グルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、２５０ｓ−１超、好ましくは３００ｓ−１超、より好ましくは３７０ｓ−１超、より好ましくは３８０ｓ−１超、より好ましくは３９０ｓ−１超、例えば４００ｓ−１の代謝回転速度を有する、実施形態１〜９の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
１１．ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、４０Ｈｚを超える周波数、好ましくは５０Ｈｚを超える周波数、より好ましくは６０Ｈｚを超える周波数、さらにより好ましくは７０Ｈｚを超える周波数、最も好ましくは、８０Ｈｚを超える周波数で活動電位を誘発することができる、実施形態１〜１０の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
１２．ｐＨ７．３に滴定された、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰで充填された抵抗３〜８ＭΩのパッチピペット、及びｐＨ７．３に滴定された、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む細胞外溶液を用いた細胞全体の構成において、パッチクランプ測定によりラット海馬ニューロンにおいて測定した場合、前記光駆動内向きプロトンポンプが、３ｍｓのλ＝５３２ｎｍのパルス幅及び２３ｍＷ／ｍｍ２の強度で誘発される得る、実施形態１〜１１の何れか１つに記載の使用のための光駆動内向きプロトンポンプ。
１３．核酸コンストラクトであって、ヌクレオチド配列が、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されており； ここで、前記ヌクレオチド配列が、配列番号１６に示される配列を有する、実施形態１〜１２の何れか１つで定義される光駆動内向きプロトンポンプをコードするヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクト。
１４．発現ベクターであって、ヌクレオチド配列が、ヒト細胞での発現に最適化される、実施形態１〜１２の何れか１つで定義される光駆動内向きプロトンポンプ又は実施形態１３に記載の核酸コンストラクトをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
１５．前記ベクターが、ウイルスベクターである、実施形態１４に記載の発現ベクター。
１６．前記光駆動内向きプロトンポンプのコード配列が、神経細胞特異的なヒトプロモーター、好ましくは、ヒトシナプシンプロモーターの制御下にある、実施形態１４又は１５に記載の発現ベクター。
１７．実施形態１〜１２の何れか１つで定義される光駆動内向きプロトンポンプを発現する哺乳動物細胞であって、ただし、前記哺乳動物細胞が、ヒト胚細胞又はヒトの生殖細胞系列の遺伝的同一性を改変するできる細胞ではない、哺乳動物細胞。
１８．実施形態１３に記載の核酸コンストラクト又は実施形態１４〜１６の何れか１つに記載の発現ベクターを含む哺乳動物細胞。
１９．前記細胞が、
ｉ．  海馬細胞、視細胞、杆体細胞； 網膜錐体細胞； 網膜神経節細胞； 双極ニューロン； 神経節細胞； 疑似単極ニューロン； 多極ニューロン； 錐体ニューロン； プルキンエ細胞； 又は顆粒細胞； 又は
ｉｉ．  神経芽腫細胞腫細胞、特に、ＮＧ１０８−１５； ＨＥＫ２９３細胞； ＣＯＳ細胞； ＢＨＫ細胞； ＣＨＯ細胞； 骨髄腫細胞； 又はＭＤＣＫ細胞、
である実施形態１７又は１８に記載の哺乳動物細胞。
２０．実施形態１〜１２の何れか１つで定義される光駆動内向きプロトンポンプを含むリポソーム。
２１．医薬に使用するための実施形態１３に記載の核酸コンストラクト、実施形態１４〜１６の何れか１つに記載の発現ベクター、実施形態１７〜１９の何れか１つに記載の哺乳動物細胞、又は実施形態２０に記載のリポソーム。
２２．聴力の回復、視力の回復における使用、又はアルカローシス、神経損傷、脳損傷、脳卒中、又はパーキンソン病及びアルツハイマー病等の変性神経障害の治療又は軽減における使用のための、実施形態１〜１２の何れか１つに定義される内向きプロトンポンプ、実施形態１３に記載の核酸コンストラクト、実施形態１４〜１６の何れか１つに記載の発現ベクター、実施形態１７〜１９の何れか１つに記載の哺乳動物細胞、又は実施形態２０に記載のリポソーム。
２３．実施形態１７〜１９の何れか１つに記載の細胞を含む、非ヒト哺乳動物であって、好ましくはここで、前記細胞が、内因性の細胞である； ただし、人間や動物に対して何れかの動物の苦しみを上回る利益を実質的にもたらさない可能性がある動物は、除外される、非ヒト哺乳動物。
２４．（ｉ）電気的に興奮可能な細胞の光刺激のために、
（ｉｉ）プロトン濃度勾配に対して膜上でプロトンを輸送するために、
（ｉｉｉ）細胞、細胞画分、小胞、又はリポソームの内部を酸性化又はアルカリ化するために、又は
（ｉｖ）又は光遺伝学ツールとしての、
実施形態１〜１２の何れか１つで定義される光駆動内向きプロトンポンプの非治療的、又はｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｒｔｏ使用。
【００６３】
以下において、本発明は、本発明の範囲を限定することを意図しない図及び実施例によって例示される。
【００６４】
配列の説明
2020516295.tif 000003
2020516295.tif 000004
2020516295.tif 000005
【実施例】
【００６５】
実施例１−キセノロドプシンの特性評価
大腸菌懸濁液中でのｐＨ変化
ＮｓＸｅＲ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ０ＱＧ７５）、ＨｒｖＸｅＲ（Ghai, R. et al. Sci. Rep. 1,(2011)）及びＡｌｋＸｅＲ（Vavourakis, C. D. et al. Front. Microbiol. 7,(2016)）、のコーディングＤＮＡが、商業的に合成された（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）。ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）ソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、大腸菌発現用に最適化された。５’リボソーム結合部位及び追加のＬＥＨＨＨＨＨＨ＊タグをコードする３’伸長を有する遺伝子が、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素部位を介してｐＥＴ１５ｂ発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に導入された。
【００６６】
タンパク質は、修正を加えて以前の報告（Gushchin, I. et al. Crystal structure of a light-driven sodium pump. Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 390-395 (2015)； その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のように発現された。大腸菌細胞株Ｃ４１（ＤＥ３）（Ｌｕｃｉｇｅｎ）は、発現プラスミドで形質転換された。形質転換された細胞は、３７℃で、１００ｍｇ／Ｌアンピシリンを含む自己誘導培地、ＺＹＰ−５０５２（Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 41, 207-234(2005)；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）のバッフル付きフラスコで振盪培養され、１ｍＭイソプロピルβ−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）でＯＤ６００で０．６〜０．７の光学密度で誘導され、１０μＭオールトランスレチナールが補充された。誘導の３時間後、細胞は、３，０００ｇで１０分間の遠心分離によって採集され、洗浄と洗浄の間に３０分間隔で非緩衝塩溶液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）で３回洗浄し、細胞内のイオンをバルクと交換した。その後、細胞は、１００ｍＭ ＮａＣｌ溶液に再懸濁され、ＯＤ６００が８．５に調整された。測定は、１℃に保った攪拌細胞懸濁液の３ｍｌアリコートで実施された。細胞は、ハロゲンランプ（Ｉｎｔｒａｌｕｘ５０００−１、ＶＯＬＰＩ）で５分間照明され、ｐＨメーター（ＬＡＢ８５０、Ｓｃｈｏｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で光誘導のｐＨの変化がモニターされた。
【００６７】
細胞懸濁液のｐＨは、照明すると増加し、光を消すと低下した（図２ａ）。３０μＭのシアン化カルボニルｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）を加えた後、同じ条件下で繰り返した場合、ｐＨ変化の影響は完全に消失した。バクテリオロドプシン（ＢＲ）等の他のプロトンポンプで以前に行われた同様の実験では、細胞の照射時にｐＨに関して反対の挙動が得られた（データは示していない）。本研究で試験したキセノロドプシンファミリーの他の２つのメンバーであるＨｒｖＸｅＲ及びＡｌｋＸｅＲは、ＮｓＸｅＲと同じ結果をもたらした（図２ａ）。従って、ｐＨ実験は、Ｎａｎｏｈａｌｏａｒｃｈａｅａロドプシンが、内向きプロトンポンプであることの証明を提供する。
【００６８】
リポソーム懸濁液のｐＨの変化
タンパク質は、上記のように発現された。しかしながら、誘導の３時間後、細胞は、３，０００ｇで３０分の遠心分離により採集された。採集された細胞は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５％グリセロール、０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）及び５０ｍｇ／Ｌ ＤＮａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を含む緩衝液中で２５，０００ｐｓｉでＭ−１１０Ｐ Ｌａｂ Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、ＵＳＡ）で破壊された。細胞溶解物の膜画分は、４℃で１時間、９０，０００ｇでの超遠心分離によって分離された。ペレットは、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）、０．１Ｍ ＮａＣｌ及び１％ＤＤＭ（Ａｎａｔｒａｃｅ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、ＵＳＡ）を含む緩衝液に再懸濁され、可溶化のために一晩攪拌された。不溶性画分は、９０，０００ｇ、４℃で１時間の超遠心分離によって除去された。上清は、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に充填され、キセノロドプシンが、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍイミダゾール及び０．２％ＤＤＭを含む緩衝液で溶出した。溶出液は、１００容量の５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．５）、０．１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に対して２時間２回透析し、イミダゾール処理を行った。
【００６９】
精製されたＮｓＸｅＲは、以前の報告のようにダイズリポソームで再構成された（Huang, K. S., Bayley, H. & Khorana, H. G. Delipidation of bacteriorhodopsin and reconstitution with exogenous phospholipid. Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 323-327 (1980)；参照により本明細書に組み込まれる）。簡単に説明すると、リン脂質（ダイズ由来のアソレクチン、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が、ＣＨＣｌ３（クロロホルム超高純度、Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ Ｐａｎｒｅａｃ）に溶解され、ガラスバイアル中でＮ２の流れの下で乾燥させた。残留溶媒は、真空ポンプで一晩除去された。乾燥脂質は、２％（ｗ／ｖ）コール酸ナトリウムを補充した０．１５Ｍ ＮａＣｌに１％（ｗ／ｖ）の最終濃度で懸濁された。混合物は、４℃での超音波処理により清澄化され、キセノロドプシンが、タンパク質／脂質比７：１００（ｗ／ｖ）で加えられた。界面活性剤は、界面活性剤吸着ビーズ（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ ２、Ｓｕｐｅｌｃｏ）で一晩攪拌することにより除去された。混合物は、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（所望のｐＨに調整）に対して４℃で１日間（２００ｍｌを４回交換）透析して、一定のｐＨにした。
【００７０】
測定は、０℃で２ｍｌの攪拌プロテオリポソーム懸濁液で行われた。プロテオリポソームは、ハロゲンランプ（Ｉｎｔｒａｌｕｘ５０００−１、ＶＯＬＰＩ）で１８分間照射され、その後さらに１８分間暗所で保管された。ｐＨの変化は、ｐＨメーター（ＬＡＢ８５０、Ｓｃｈｏｔｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）でモニターされた。同じ条件下で、異なる開始ｐＨ及び４０μＭのＣＣＣＰの存在下で、測定が繰り返された。
【００７１】
照明時のｐＨの変化は、膜の外側の溶液の酸性化を示した（図２ｂ）。これらのｐＨの変化は、ＣＣＣＰが懸濁液に加えられた際に消失した。同様の実験で、既知の外向きプロトンポンプ（ＢＲ及びＰＲ等）は全て、反対のｐＨの挙動を示すため（Racker, E. & Stoeckenius, W. Reconstitution of purple membrane vesicles catalyzing light-driven proton uptake and adenosine triphosphate formation. J. Biol. Chem. 249, 662-663(1974)）、ＮｓＸｅＲは、実際に内向きプロトンポンプであると結論付けた。興味深い点は、広範囲のｐＨ（ｐＨ５〜９）で、当該実験は、未だ内向きプロトンポンプを示していることである（図２ｃ）。
【００７２】
吸収スペクトル及び光サイクル
ここでは、２つのデータセットの分析結果が報告される： ＸｅＲタンパク質は、ナノディスク及びリポソームで再構成される。プロテオナノディスクは、標準プロトコルを用いて再構成された（Ritchie, T. K. et al. in Methods in Enzymology(ed. Duzgunes,N.)464, 211-231(Academic Press, 2009)；参照により本明細書に組み込まれる）。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＣ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ、ＵＳＡ）が脂質として用いられた。アポリポタンパク質−１の細長いＭＳＰ１Ｅ３が使用された。アセンブリ中のモル比は、ＤＭＰＣ：ＭＳＰ１Ｅ３：ＮｓＸｅＲ＝１００：２：３であった。リポソームは、上記のように調製された。
【００７３】
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＵＶ−２４０１ＰＣ分光光度計を使用して、吸収スペクトルが記録された。レーザーフラッシュ光分解のセットアップは、Ｃｈｉｚｈｏｖ達によって説明されたものと同様であった（Chizhov, I. et al. Spectrally silent transitions in the bacteriorhodopsin photocycle. Biophys. J. 71, 2329-2345(1996)；参照により本明細書に組み込まれる）。励起／検出システムは、ＳｕｒｅｌｉｔｅＩＩ−１０ Ｎｄ：ＹＡＧレーザー（Ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）を使用して、５３２ｎｍの波長で５ｎｓのパルス及び３ｍＪ／パルスのエネルギーが与えられた。サンプル（５×５ｍｍ分光石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ、Ｇｅｒｍａｎｙ））は、２つのコリメートされ、機械的に結合されたモノクロメーター（１／８ｍモデル７７２５０、Ｏｒｉｅｌ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）の間の恒温室に置かれた。プローブ光（Ｘｅ−ａｒｃ ｌａｍｐ、７５Ｗ、Ｏｓｒａｍ、Ｇｅｒｍａｎ）は、最初のモノクロメーター、サンプルを通過し、ＰＭＴ検出器（Ｒ３８９６、Ｈａｍａｍａｔｚｕ、Ｊａｐａｎ）で２番目のモノクロメーターの後ろに到達した。ＰＭＴの電流／電圧コンバーターは、約５０ｎｓの測定システムの時間分解能を決定する（５ｎｓレーザーパルスの見かけのパルス幅として測定）。２つのデジタルオシロスコープ（ＬｅＣｒｏｙ９３６１及び９４００Ａ、チャネルごとに２５及び３２キロバイトのバッファーメモリ）を使用して、２つのオーバーラップする時間枠で過渡的な伝送変化のトレースを記録した。最大デジタル化レートは、データポイント当たり１０ｎｓであった。レーザーパルスの１０ｎｓから光変換が完全に完了するまでの過渡吸収の変化が記録された。各波長で、２５のレーザーパルスが平均化され、シグナル対ノイズ比を改善した。準対数データ圧縮により、トレース当たりのデータポイントの初期数（〜５００００）が、対数時間スケールで均等に分散される〜６００ポイントに減少し、１０時間ごとに〜１００ポイントになる。波長は、コンプーター制御のステップモーターを使用して、３００ｎｍ〜７３０ｎｍまで２ｎｍのステップ（全部で２１６スペクトルポイント）で変化した。標準的な分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ−８００）で各実験の前後にサンプルの吸収スペクトルが測定された。
【００７４】
各データセットは、グローバル多指数関数非線形最小二乗近似プログラムＭＥＸＦＩＴを用い、個別に分析される（Gordeliy, V. I. et al. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex. Nature 419, 484-487 (2002); 参照により本明細書に組み込まれる）。指数成分の数は、加重残差の標準偏差がさらに改善されなくなるまで増加した。見かけの速度定数及び緩和プロセスの単一チェーンの内部不可逆遷移への割り当てを確立した後、指数の振幅スペクトルは、最終状態のスペクトルに関して、対応する中間体の差スペクトルに変換された。続いて、状態の絶対吸収スペクトルは、変換された分子の割合で割った差スペクトルを最終状態のスペクトルに追加することで決定された。フラクション値の決定基準は、負の吸収性がなく、初期状態から最終状態の計算されたスペクトルへの寄与がないことであった。方法の詳細については以下の文献を参照（Chizhov, I. et al. Biophys. J. 71, 2329-2345 (1996)）。
【００７５】
可溶化された形態のＮｓＸｅＲの最大吸収は、５６５ｎｍである（図３ａ）。緩衝液のｐＨが４．５〜９．０の範囲で変化しても、その位置は変化しない。ＮｓＸｅＲは、明暗適応を示さない。ＡｌｋＸｅＲホモログは、赤方に遷移したバリアントであり、その吸収極大は、５７７ｎｍである（図３ａ）。ＮｓＸｅＲの過渡吸収の変化（ｐＨ７．５、Ｔ＝２０℃）は、３つの特徴的な波長３７８、４０８、及び５６４ｎｍで示され、ＮｓＸｅＲは、２つの異なる方法で準備される： ナノディスク（ライトグレー）及び単一の脂質小胞（ダークグレー）（図３ｂ）。５つの指数を使用したグローバルフィットの結果が、図４に示される。ナノディスクでのＮｓＸｅＲの光サイクルは、脂質小胞（５０ｍｓ）よりも高速（２７ｍｓ）である。ナノディスクにおけるＮｓＸｅＲの光サイクルが、図３ｃに示される。
【００７６】
ＮｓＸｅＲの光サイクルは、通常、エネルギーを与えられたイオン（この場合は、Ｈ＋）の放出とイオンの緩和及び再取込のミリ秒部分の多段階反応に割り当てられるマイクロ秒部分が含まれる。
【００７７】
しかしながら、ＮｓＸｅＲ光サイクルは、レチナールタンパク質の以前の研究では報告されていないいくつかの明確な特徴を明らかにしている（図４）。Ｋ及びＬのようなスペクトルシフト（Ｐ１、λｍａｘ＝５７０ｎｍ、Ｐ２、λｍａｘ＝５３０ｎｍ）の原型的（ａｒｃｈｅｔｙｐｉｃａｌ）な中間体を含む光サイクルのマイクロ秒部分（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３）の後、ミリ秒時間の領域において、スペクトル的にも速度論的にも異なるＭ中間体を取得した（Ｐ４及びＰ５）。第１のＭ型（Ｐ４）は、３６０、３７８、及び３９８ｎｍに最大値を有する３つのバンドの吸収スペクトルを有する。ナノディスクで２ミリ秒（脂質小胞で３ミリ秒）の半減期を有するこの状態は、３９２ｎｍで単一の最大値を有する状態Ｐ５に変換される。両方の中間体は、レチナールＳｃｈｉｆｆ塩基の脱プロトン化状態に対応する必要がある。興味深いのは、Ｐ４状態が以前に報告された１１バクテリオロドプシン（ＢＲ）のレトロレチナールのスペクトルと同じ特性を有することである。この型のレチナールは、骨格炭素Ｃ１４のＣＨからＣＨ２型への変換と、それに対応するＣ１４＝Ｃ１３の二重結合の単一結合への変換と、レチナールに沿ったπ電子共役の変化によって特徴付けられる。ＢＲのレトロレチナール型は、サンプルの遠紫外線照射及び（又は）ＨＣｌ酸溶液への添加により達成されたことが報告された。このレトロＢＲは、光活性を示さない。一方、レチナールの励起状態でのπ電子共役の変化は、Ｃ１４の共有結合の変化なしに、脱プロトン化状態で同様のスペクトル特性を引き起こす可能性がある。光励起時のレチナールに沿った電荷分離及びそれに伴う電子共役の変化のソリトン機構が提案され（Chernavskii, D. S. An alternative model of the bacteriorhodopsin action and unusual properties of the K-610-intermediate. Biofizika (1994)）及びさらに理論的に裏付けられた（Buda, F., de Groot, H. J. M. & Bifone, A. Charge Localization and Dynamics in Rhodopsin. Phys. Rev. Lett. 77, 4474-4477 (1996)）。おそらく、発明者達は、提案された機構の最初の実験的証拠を観察している。他のレチナールプロトンポンプ（ＢＲ、ｐＳＲＩＩ、ＰＲ）とは異なり、再プロトン化の経路に追加の中間体（Ｎ又はＯ等の）が見られないことは興味深い。ＭＩＩ（Ｐ５）状態は、２７ミリ秒（脂質小胞では５０）ミリ秒で、ＮｓＸｅＲの基底状態に直接変換される。
【００７８】
実施例２−ＮｓＸｅＲの結晶化
ＮｓＸｅＲタンパク質は、実施例１に記載されるように調製及び精製された。最終的に、タンパク質は、結晶化のために７０ｍｇ／ｍｌに濃縮された。ＮｓＸｅＲ結晶は、以前の研究で使用されていたものと同様の（Gordeliy, V. I. et al. Molecular basis of transmembrane signalling by sensory rhodopsin II-transducer complex. Nature 419, 484-487 (2002)；参照により本明細書に組み込まれる）メソアプローチ（Landau, E. M. & Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: A novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 93, 14532-14535 (1996)； 及びCaffrey, M. & Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009)； それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）で成長した。結晶化緩衝液中の可溶化タンパク質は、４７℃であらかじめ融解されたモノウンデセノイン（Ｎｕ−Ｃｈｅｋ Ｐｒｅｐ）と混合して、脂質中間相を形成した。タンパク質−中間相混合物の１００ｎｌアリコートが、９６ウェルＬＣＰガラスサンドイッチプレート（Ｍａｒｉｅｎｆｅｌｄ）にスポットされ、ＮＴ８結晶化ロボット（Ｆｏｒｍｕｌａｔｒｉｘ）により６００ｎＬの沈殿剤溶液で覆った。２０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度及び２．０Ｍマロン酸ナトリウム、ｐＨ８．０（Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）で最良の結晶が得られた。結晶は、２２℃で成長し、１〜４週間で出現した。
【００７９】
Ｘ線回析データ（波長０．９６９及び０．９７２Ａ）は、ＰＩＬＡＴＵＳ ６Ｍ検出器を使用して、１００ＫでＥＳＲＦのＩＤ２３−１ビームラインで採集された。回析画像は、ＸＤＳで処理された（Kabsch, W. XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 125-132 (2010);； 参照により本明細書に組み込まれる）。反射強度は、ＣＣＰ４スイートのＳＣＡＬＡでスケールされた（Winn, M. D. et al. Overview of the CCP 4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 235-242 (2011)； 参照により本明細書に組み込まれる）。以下の表に、結晶学的データの採集及び微細化の統計（ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を示す。
【表２】
2020516295.tif 000006
【００８０】
構造は、３．４Åの分解能に微細化された。ＭｏＲＤａパイプラインでは、分子置換のための参照モデル（ａｒｃｈａｅｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２、ＰＤＢ ２Ｅ１４）が選択された（Vagin, A. & Lebedev, A. MoRDa , an automatic molecular replacement pipeline. Acta Crystallogr. Sect. Found. Adv. 71, s19-s19 (2015)； 参照により本明細書に組み込まれる）。Ａｕｔｏｂｕｉｌｄを使用した自動モデル構築及び再構築により、Ｐ２１２１２１スペースグループで初期フェーズが正常に取得された（Adams, P. D. et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221 (2010)； 参照により本明細書に組み込まれる）。初期モデルは、ＲＥＦＭＡＣ５（Murshudov, G. N. et al. REFMAC 5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367 (2011)； 参照により本明細書に組み込まれる）、ＰＨＥＮＩＸ及びＣｏｏｔ（Emsley, P. & Cowtan, K. Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 60, 2126-2132 (2004)； 参照により本明細書に組み込まれる）を使用して繰り返し改良された。
【００８１】
Ｐ２１２１２１スペースグループ結晶は、非対称ユニットにＮｓＸｅＲの三量体の１つが含まれる。ループＣＤの残基９５−９７、ループＥＦの１５４−１５６の位置は、分解されない。
【００８２】
光駆動内向きプロトンポンプＸｅＲは、７つの膜貫通αヘリックス（Ａ−Ｇ）及びＳｃｈｉｆｆ塩基を介して２１３リジンに共有結合したコファクターレチナールを有する。ヘリックスＡの前には小さなＮ末端αヘリックスがあり、これは細胞外側でタンパク質をキャッピングしている。
【００８３】
ＢＲ構造（ＰＤＢ １Ｃ３Ｗ）との比較は、おそらくそれらのヘリックスにプロリンが存在するため、ヘリックスの局在と形状に、かなりの違いがあることを示す。キセノロドプシンは、ＢＲのＡｓｐ２１２の位置に局在する保存的残基Ｐｒｏ−２０９（ＮｓＸｅＲの位置）を有する。発明者達の実験では、Ａｓｐで置換するとタンパク質が不安定になることが示された。グリシンに変更すると、ポンピング活性が劇的に減少する（以下の表を参照）。従って、Ｐｒｏ２０９は、プロトンポンピングに不可欠である。
【表３】
2020516295.tif 000007
【００８４】
プロトン取り込み領域及び活性中心
レチナールは、１３−ｃｉｓ構造である。しかしながら、分解能が不十分であるため、１５−ｓｙｎ又は１５−ａｎｔｉ構造化を区別することができない。ＮｓＸｅＲは、大きなプロトン取り込み空洞があり、これは、タンパク質の細胞外部部分にＮ末端の非常に短いヘリックスを有するバルクから単離される。空洞は、水分子で満たされていることを提案する。推定のプロトンドナーＡｓｐ７６は、その空洞から利用できる可能性がある。Ａｓｐ７６のＧｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｓｎへの突然変異により、タンパク質が正しく折り畳まれない（突然変異体は、着色されていない。上記の表を参照）。これは、機能的だけでなく、これらのアミノ酸の重要な構造的役割の証拠である。Ｓｅｒ５５は、Ａｓｐ７６の近くにあり、この残基を安定化する可能性がある。Ｓｅｒ５５のアラニン（ＢＲにおけるＡｌａ５３）の置換もタンパク質の折り畳みを破壊する。
【００８５】
Ｎ末端ヘリックス由来のＴｙｒ３及び高度に保存されたアミノ酸Ａｒｇ８２（ＢＲにおける位置）のアナログであるＴｒｐ７３は、タンパク質の細胞外部分のバルクからプロトン取り込み空洞を分離し、そのため、プロトンは、ヘリックスＡ及びＢ並びにループＢＣの間の空間からタンパク質に入り得る。Ｔｒｐ７３のＡｒｇへの置換は、タンパク質の折り畳みにとって致命的であった（Ｗ７３Ｒは非着色）。Ｗ７３Ａ突然変異体は、レチナールに結合し、野生型タンパク質の色を保つが、ポンピング活性を示さないため、この残基はプロトン移動に重要である。
【００８６】
プロトン放出領域
ＮｓＸｅＲと他の既知の微生物レチナールプロトンポンプの他の大きな違いは、ＢＲのＡｓｐ９６（ＮｓＸｅＲでは、Ａｌａ７１である）に相当する位置に荷電アミノ酸が無いことである。しかしながら、残基Ｈｉｓ４８（基底状態のＳｃｈｉｆ塩基から１０Å）及びＡｓｐ２２０（１２Å）は、水素結合を介して接続されており、予想されるプロトンポンプ受容体位置の近くに位置する。Ａｓｐ２２０をＡｓｎに置き換えると、プロトンポンプが完全に機能しない。
【００８７】
Ｈｉｓ４８は、他の既知の微生物ロドプシンの同様の位置には存在しないユニークな残基である。発明者達の実験では、ヒスチジン４８を他のアミノ酸の何れかに置換するとタンパク質構造が破壊されることが示され（全ての突然変異体は、着色されない）、タンパク質の構造における重要な役割が示された。Ｈｉｓ４８−Ａｓｐ２２０の対は、プロトン受容体であり、プロトン化は、Ｓｃｈｉｆｆ塩基からＨｉｓ４８残基、より正確にはＨｉｓ４８−Ａｓｐ２２０の対を介して進むことを提案する。驚くべきことに、プロテオロドプシンと全く同じプロトン受容体対である。しかしながら、ＸｅＲとは異なり、Ｓｃｈｉｆｆ塩基に近いタンパク質の細胞外部分に配置され、Ｓｃｈｉｆｆ塩基のプロトン受容体として機能し、これは、大きなプロトン放出空洞を介してバルクから直接アクセスできるため、プロトン勾配に沿ってバルクに直接容易に進むことができる。従って、ＮｓＸｅＲのキー残基のユニークかつ、珍しいセットは、内向きプロトンポンピングをもたらす。
【００８８】
内向きプロトンポンプの推定機構
突然変異アミノ酸での構造及び実験は、内向きプロトン輸送の機構への見識を提供する。照射すると、レチナールが異性化し、疎水性環境に囲まれたＳｃｈｉｆｆ塩基が脱プロトン化し、プロトンが脱プロトン化されたＨｉｓ４８−Ａｓｐ２２０に移行する。両方の中間体がレチナールＳｃｈｉｆｆ塩基の脱プロトン化状態に対応するため、ＭＩ及びＭＩＩ中間状態で起こる。実際、Ａｓｐ−Ｈｉｓ相互作用は、その脱プロトン化状態を安定化させることにより、ＡｓｐのｐＫａを大幅に低下させることが知られている。プロトン転位におけるＡｓｐ−Ｈｉｓ対の重要な役割は、突然変異Ａｓｐ及びＨｉｓを用いた上記の実験によって裏付けられる。レチナールの再異性化後、親水性空洞（「プロトン放出空洞」）に接続されたプロトン化されたＡｓｐ−Ｈｉｓ対が、細胞質に直接プロトンを放出することを提案する。レチナールの異性化後、Ａｓｐ７６は、親水性空洞を介してプロトン化する。レチナールの再異性化は、Ｄ７６からＳｃｈｉｆｆ塩基の再プロトン化をもたらす。
【００８９】
実施例３−光遺伝学的関連
ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ）及び神経芽細胞腫神経膠腫細胞（ＮＧ）を用いた実験
ヒトコドン最適化ＮｓＸｅＲ遺伝子は、商業的に合成された（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）。遺伝子は、付加的な膜輸送シグナル（Gradinaru, V. et al. Molecular and Cellular Approaches for Diversifying and Extending Optogenetics. Cell 141, 154-165 (2010)； 参照により本明細書に組み込まれる）、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド（Kuzmich, A. I., Vvedenskii, A. V., Kopantzev, E. P. & Vinogradova, T. V. Quantitative comparison of gene co-expression in a bicistronic vector harboring IRES or coding sequence of porcine teschovirus 2A peptide. Russ. J. Bioorganic Chem. 39, 406-416 (2013)； 参照により本明細書に組み込まれる）及びＣ末端のＧＦＰバリアント（Shcherbo, D. et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nat. Methods 4, 741-746 (2007)； 参照により本明細書に組み込まれる）を有するｐｃＤＮＡ３．１（−）ベクターにクローニングされた。遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの下でクローン化された。配列は、シーケンシングによって検証された。
【００９０】
８０％の培養密度のＨＥＫ２９３及びＮＧ１０８−１５細胞に、製造元（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）のプロトコルに従ってプラスミド及びリポフェクタミンＬＴＸが遺伝子導入された。測定前に、細胞は、５％Ｃｏ２下、３７℃で２日間インキュベートされた。
【００９１】
ＮｓＸｅＲの電気生理学的特性評価のために、全細胞パッチクランプ記録が実施された（Ａｘｏｐａｔｃｈ ２００Ｂ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ、Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。２〜５ＭΩの抵抗のパッチピペットは、水平プラー（Ｍｏｄｅｌ Ｐ−１０００、Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上の薄壁ホウケイ酸ガラス（ＧＢ１５０Ｆ−８Ｐ）から製造された。ＨＥＫ２９３細胞での実験では、ピペット溶液には、１１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれ（ｐＨ７．４）（ピペット溶液１）、バス溶液には、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれる（ｐＨ７．４）（バス溶液１）。ＮＧ１０８−１５細胞での実験では、ピペット溶液には、１１０ｍＭ Ｎａ２ＳＯ４、４ｍＭ ＭｇＳＯ４、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれ（ｐＨ７．４）（Ｈ２ＳＯ４を含む）（ピペット溶液２）、バス溶液には、１４０ｍＭ Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、４ｍＭ ＭｇＳｏ４、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳが含まれる（ｐＨ７．４）（Ｈ２ＳＯ４を含む）（バス溶液２）。
【００９２】
光電流は、４００μｍの光ファイバに集光されたダイオード励起固体レーザー（λ＝５３２ｎｍ）を使用して、飽和強度２３ｍＷ／ｎｍ２の光パルスに応答して測定された。光パルスは、高速コンピュータ制御シャッターによって適用された（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ ＬＳ６ＺＭ２、Ｖｉｎｃｅｎｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）。超短ナノ秒光パルスは、Ｏｐｏｌｅｔｔｅ３５５波長可変レーザーシステム（ＯＰＴＯＰＲＩＭ）によって生成された。アクションスペクトルの測定では、異なる波長でのパルスエネルギーは、１０１９光子／ｍ２の等しい光子カウントに対応する値に設定された。加えて、−１００ｍＶ〜＋６０ｍＶの範囲の膜電位での光電流／電圧の関係が測定された（膜電位が−８０ｍＶ〜＋８０ｍＶの範囲であったＯＮ／Ｏｆｆ速度論を除く）。
【００９３】
図５ａは、ＨＥＫ細胞におけるＮｓＸｅＲによって生成された光電流を示す。典型的な光電流値は、−６０ｍＶの印加電位において４０〜１５０ｐＡで変化するが、セルの静電容量（サイズを意味する）に正規化された電流は、約１〜２ｐＡ／ｐＦである。ＮＧ１０８−１５細胞における追加のコントロール実験が実施された。Ｃｌイオンの輸送を排除するために（見かけの「内向き」電流の原因となる可能性がある）、緩衝液中の塩化物塩が、硫酸塩に置き換えられた。セルへの一価イオン輸送を排除するために、溶液中のＮａ＋を大きなＮ−メチル−Ｄ−グルカミンに置き換えた。溶液のｐＨは、対照的であった（ｐＨ７．４）。しかしながら、同様の光電流が、この実験構成で記録されたため（図５ｂ）、プロトンの輸送が効果の原因であることが分かった。従って、ＨＥＫ及びＮＧ細胞を使用した実験では、ＮｓＸｅＲが内向きプロトンポンプであることも確認され、細胞への照射時に原形質膜を介して大きな電流を生成できることが示されている。
【００９４】
ラット海馬ニューロンの光誘発性スパイク
アデノ随伴ウイルスを介した遺伝子導入により、ラット海馬ニューロンでＮｓＸｅＲが異種発現された。海馬は、出生後のＰ１Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離され、パパイン（２０Ｕ ｍｌ−１）、３７℃で２０分間処理された。海馬は、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ、高グルコース）で洗浄され、少量のこの溶液で滴定された。２４ウェルプレートのポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングガラスカバースリップに〜９６，０００個の細胞が播種された。３時間後、プレーティング培地を培養培地（２％Ｂ−２７サプリメントを含むＮｅｕｒｏｂａｓａｌ Ａ、及び２ｍＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ−Ｉ）に置き換えた。
【００９５】
ｒＡＡＶ２／１ウイルスは、ＮｓＸｅＲのヒト化ＤＮＡ配列を含むヒトシナプシンプロモーター、Ｋｉｒ２．１膜輸送シグナル、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド及びＧＦＰバリアントにＣ末端で融合したｐＡＡＶ２ベクターを使用して調製された。簡単に説明すると、５×１０９ゲノムコピー／ｍｌ（ＧＣ／ｍｌ）のｒＡＡＶ２／１ウイルスが、播種の４〜９日後に各ウェルに加えられた。電気生理学的記録は、形質導入の１９〜２３日後に行われた。
【００９６】
電気生理学的特性評価のために、電流クランプ条件下で全細胞パッチクランプ実験が実施された。簡単に説明すると、１２９ｍＭグルコン酸カリウム、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ ＫＣｌ、４ｍＭ ＭｇＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ３ＧＴＰを充填し、ｐＨ７．３に滴定した。細胞外溶液は、ｐＨ７．３に滴定された１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭグルコース及び２５ｍＭ ＨＥＰＥＳを含む。電気生理学的シグナルは、１０ｋＨｚでフィルタされ、Ａｘｏｎ Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ（５０ｋＨｚ）でデジタル化され、ｐＣｌａｍｐ９ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて取得及び分析される。
【００９７】
ＮｓＸｅＲを介したプロトンの光誘発性内向き輸送は、膜電位の脱分極をもたらした。従って、ラット海馬ニューロンにおける光誘発性スパイクが可能であった（図６）。ＮｓＸｅＲは、４０Ｈｚの周波数までの発火成功率が１００％の高速、神経光刺激を可能にした。ラット海馬ニューロンの大部分は４０〜６０Ｈｚの最大発火頻度を有しているため、より高い刺激周波数でのスパイク障害は、ラット海馬ニューロンの固有の特性によって説明され得る（Gunaydin, L. A. et al. Ultrafast optogenetic control. Nat. Neurosci. 13, 387-392 (2010)）。
【００９８】
重要な観察結果は、わずか３ｍｓのパルス幅で光誘発性スパイクが達成され得ることであり（図７ａ）、これは、ポンプのターンオーバー時間にほぼ一致する（図８）。従って、各ＮｓＸｅＲによる単一のプロトンの輸送による脱分極の程度は、活動電位を正常に誘引することに十分である。しかしながら、スパイク遅延の変動が観察され（図７）、場合によって光誘発性スパイク（図７ｂ）により長いパルス幅が必要であった。これらのニューロンにおいて、ＮｓＸｅＲの比較的低い発現によって、より長いスパイク遅延が説明できる。
【００９９】
実施例４−聴覚経路の光遺伝学的刺激
Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ達は、げっ歯類の聴覚経路の光遺伝学的刺激の戦略を証明している（Hernandez et al. J Clin Invest. 124, 1114-1129 (2014)）（参照により本明細書に組み込まれる）。特に、著者達は、光ゲーテッドイオンチャネルチャネルロドプシン−２（ＣｈＲ２）を発現するように遺伝子操作されたニューロンの光刺激である光遺伝刺激を特徴づけるための動物モデルを記載する。単一ニューロン及びニューロンの集団応答の記録によって示されるように、らせん神経節ニューロン（ＳＧＮ）の光遺伝学的刺激は、聴覚経路を活性化する。さらに、ＳＧＮの光遺伝学的刺激は、聴覚障害マウスの聴覚活動を回復する。閾値以上の光学的、音響的、電気刺激に応じて下丘の局所フィールド電位（ＬＦＰ）を記録することによる蝸牛の興奮の空間的広がりの近似は、光遺伝学的刺激が、単極電気刺激よりも優れた周波数分解能を達成することを示している。
【０１００】
ＮｓＸｅＲ等の本開示の光誘導性内向きプロトンポンプのコード配列を、例えば、Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ達によって記載されたコンストラクトに導入することは、日常的な作業を意味する。
【０１０１】
実施例５−視力回復のための光遺伝学的アプローチ
Ｍａｃｅ達は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療によって媒介されるレチナールニューロンの光遺伝学的再活性化について記載している（Mace et al. Mol Ther. 23, 7-16 (2015)）（参照により本明細書に組み込まれる）。ほとんどの遺伝性レチナールジストロフィーは、進行性の視細胞変性を示し、重度の視覚障害を引き起こす。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）遺伝子治療によって媒介されるレチナールニューロンの光遺伝学的再活性化は、患者固有の突然変異に関係なく、視力を回復する可能性がある。臨床的トランスレータビリティ（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）の課題は、脆弱な変性網膜に外科的に安全な送達経路を使用しながら、可能な限り自然な視力に近い視力を回復することである。網膜内部の視覚的処理を維持するために、ＯＮ双極細胞が標的とされており、これは、疾患の後期に未だ存在している。安全な遺伝子送達のために、最近設計されたＡＡＶバリアントが使用され、これは眼の容易にアクセス可能な硝子体液への注入後に双極細胞を形質導入することができる。ＯＮ双極細胞特異的プロモーターの下でチャネルロドプシンをコードするＡＡＶは、硝子体投与後のＯＮ双極細胞に限定された長期的遺伝子送達を媒介することが示されている。ＯＮ双極細胞でのチャネルロドプシンの発現は、網膜及び皮質レベルでのＯＮ及びＯＦＦ応答の回復につながる。さらに、処置された盲目のマウスでは、光によって誘導される運動特性が回復する。
【０１０２】
ＮｓＸｅＲ等の本開示の光誘導性内向きプロトンポンプのコード配列を、例えばＭａｃｅ達によって記載されたコンストラクトに導入することは、日常的な作業を意味する。本開示の新規光誘導性内向きプロトンポンプは、ＯＮ双極細胞及び網膜の神経節細胞の活性化のためにカセットに挿入される。
【図１】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ）】
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【図７Ｂ）】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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