(57)【要約】  本明細書では、非常に高い感受性および特異性で多数の実施可能な遺伝子融合を多重検出する方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は、随意に他の突然変異および融合と組み合わせて、ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１遺伝子融合を検出することができる。【選択図】図１Ａ〜図１Ｄ
2020521440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチプレックスアッセイ組成物であって、
Ａ．少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブと、
Ｂ．少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブと、
Ｃ．少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブ、および
Ｄ．内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよびプローブと、
を含むマルチプレックスアッセイ組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子が、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ａが、２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ａが、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子が、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
Ｂが、２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｂが、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子が、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２ｖ２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３５、およびＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｃが、２つ以上のＲＯＳ１融合遺伝子を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｃが、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２ｖ２、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２ｖ２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３５、およびＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
個体に由来する生体試料をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記生体試料が、血漿に由来するＲＮＡを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
マルチプレックスアッセイ組成物であって、
Ａ．少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブと、
Ｂ．少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブ、および
Ｃ．内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよびプローブと、
を含むマルチプレックスアッセイ組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子が、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子が、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２からなる群から選択される、請求項１５または１６に記載の組成物。
【請求項１８】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
逆転写酵素をさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
個体に由来する生体試料をさらに含む、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記生体試料が、血漿に由来するＲＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
がんを有する個体を同定する方法であって、
Ａ．前記個体に由来する生体試料を、請求項１〜１２および１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップと、
Ｂ．前記生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、
Ｃ．融合遺伝子がステップＢで検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、
Ｄ．それによって、少なくとも１つの融合遺伝子が存在する場合、前記個体の試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在はキナーゼ阻害剤療法に対する前記個体の感受性を示すステップと、を含む、方法。
【請求項２３】
がんを有する個体のキナーゼ阻害剤療法に対する反応の可能性を判定する方法であって、
Ａ．前記個体に由来する生体試料を、請求項１〜１２および１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップと、
Ｂ．前記生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、
Ｃ．融合遺伝子がステップＢで検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップ、および
Ｄ．前記個体が前記キナーゼ阻害剤療法に反応しそうであることを判定するステップと、を含む、方法。
【請求項２４】
前記生体試料が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生体試料が、前記個体の血漿に由来するＲＮＡである、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記増幅および検出が、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて行われる、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記キナーゼ阻害剤療法が、アレチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ロラチニブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、アパチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＤＳ６０５１ｂ、またはこれらの変異体からなる群から選択される、請求項２２〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
がんを有する個体に由来する生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在を判定する方法であって、
Ａ．前記個体に由来する生体試料を、請求項１〜１２および１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物と接触させるステップと、
Ｂ．前記生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、
Ｃ．融合遺伝子がステップＢで検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子の存在を判定するステップと、を含む、方法。
【請求項２９】
前記生体試料が、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記生体試料が、前記個体の血漿に由来するＲＮＡである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅および検出が、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を用いて行われる、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
多くのがんは遺伝子融合と関連している（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３４：４８４５）。最も初期に報告された事例はおそらく、１９６０年代におけるＢＣＲ−ＡＢＬの慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）との関連である（Ｎｏｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｈｕｎｇｅｒｆｏｒｄ（１９６０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２５：８５）。それ以降、さまざまな組織のがんにおいてさらに数百もの遺伝子融合が報告されている（Ｐｒｅｓｎｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ（２００９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ  Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１９：８２）。
【０００２】
別の例としては、チロシン受容体キナーゼＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ）が挙げられる。ＥＭＬ４‐ＡＬＫ（棘皮動物微小管関連たんぱく質様４未分化リンパ腫キナーゼ）融合は非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）と関連している。この場合、ＡＬＫのＮ末端細胞外部分はＥＭＬ４で置き換えられる（ＫＩＦ５Ｂ、ＨＩＰ１、ＫＬＣ１、ＴＦＧもまた同様にＡＬＫと融合することができる）。得られた融合遺伝子の発現が、強いＥＭＬ４プロモーターによって駆動されることで、ＡＬＫの細胞内チロシンキナーゼドメインはより高く発現する。さらに、ＥＭＬ４は、リガンドに依存しない二量体形成と、ＡＬＫチロシンキナーゼドメインの構成的活性化とをもたらすコイルドコイルを形成する。活性化キナーゼ融合のさらなる例としては、ＲＥＴ（トランスフェクション中に再配列）およびＲＯＳ１が挙げられる。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子融合の検出を用いて治療を指示することができる。ほとんどの検出法は腫瘍組織の生検を必要とするが、多くのがん患者、特に後期のがん患者には実施することができない。生検組織切片における検出は、典型的には、蛍光インサイツハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）または免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によって行われる。これらの試験は、部分的には切断プロセス中の剪断のために、高い偽陽性率およびバックグラウンドを有する。したがって、熟練した細胞学者は複数の組織切片を観察する必要があるために、衰弱した患者からの大量の生検が必要となる。同様に、ＲＴ−ＰＣＲを使用する障害は、例えばホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）形態における、腫瘍組織由来の遺伝子材料の量および質である。例えば、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳＯｎｅ  １０：ｅ０１１７０３２を参照されたい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
検出には時間とリソースがかかるため、検査率は比較的低くなる。ＡＬＫ融合に関連するがんは、クリゾチニブおよびセレチニブなどのＡＬＫ阻害剤に対して非常に感受性が高い。ＫＩＦ５ＢまたはＣＣＤＣ６などによる、転写中に再配列された（ＲＥＴ）遺伝子融合もまた、例えばバンデタニブによる治療に感受性である（Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｏｎｃｏｌ．７：１８７２を参照）。したがって、遺伝子融合の検査率が低いということは、治療の機会を大きく失うことを意味する。
【０００５】
本明細書では、融合遺伝子、特にＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１を含む融合遺伝子を検出するための多重方法および組成物が提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書では、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｄ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含むマルチプレックスアッセイ組成物を提供する。さらに、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含むマルチプレックスアッセイ組成物を提供する。本明細書では、（Ａ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含むマルチプレックスアッセイ組成物を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０からなる群から選択され；少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子は、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２からなる群から選択され；少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子は、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３５、およびＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５からなる群から、あらゆる組み合わせで選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子、２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子、および／または２以上のＲＯＳ１融合遺伝子を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、およびＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０を含み；少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子は、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２を含み；少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子は、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３５、およびＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５を含む。すなわち、アッセイ組成物は、リスト化された融合遺伝子の全てを増幅および検出するためのプライマーセットおよびプローブを含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を増幅するためのプライマーセットについて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、配列番号：１〜５０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する。いくつかの実施形態では、プローブが少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を検出するために、プローブ配列は配列番号：１８２〜１８６からなる群から選択される。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる適切な組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおける１、２、３、４、５、６、または７個のＡＬＫ融合変異体のいずれかを検出することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を増幅するためのプライマーセットについて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、配列番号：８３〜１４５および１８７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する。いくつかの実施形態では、プローブが少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を検出するために、プローブ配列は１８９〜１９４からなる群から選択される。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおける１、２、３、４、５、または６個のＲＥＴ融合変異体のいずれかを検出することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を検出するためのプライマーセットについて、順方向プライマーおよび逆方向プライマーは、配列番号：１９５〜２１２および列番号：２１３〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する。いくつかの実施形態では、プローブが少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を検出するために、プローブ配列は２２７〜２３０および５１からなる群から選択される。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおける１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のＲＯＳ１融合変異体のいずれかを検出することができる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、内部標準を検出する標識プローブ上の標識は、融合遺伝子を検出する標識プローブ上の標識とは異なる。いくつかの実施形態では、全ての標識プローブ上の標識は、互いに異なる。いくつかの実施形態では、単一の標識プローブを用いて、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子の全てを検出する。いくつかの実施形態では、単一の標識プローブを用いて、少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子の全てを検出する。いくつかの実施形態では、単一の標識プローブを用いて、少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子の全てを検出する。いくつかの実施形態では、標識プローブは、少なくとも１つのプライマーセット中のプライマーに結合される。いくつかの実施形態では、標識プローブは、プライマーセットから分離される。
【００１２】
２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、ＡＬＫ融合遺伝子を増幅する全てのプライマーセットは、単一の共通プライマーを含む。２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、プライマーセットは、ユニークプライマーを含む。２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、ＲＥＴ融合遺伝子を増幅する全てのプライマーセットは、単一の共通プライマーを含む。２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、プライマーセットは、ユニークプライマーを含む。２つ以上のＲＯＳ１融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、ＲＯＳ１融合遺伝子を増幅する全てのプライマーセットは、単一の共通プライマーを含む。２つ以上のＲＯＳ１融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、プライマーセットは、ユニークプライマーを含む。
【００１３】
本明細書はさらに、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含むマルチプレックスアッセイ組成物を提供する。本明細書はまた、（Ａ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含むマルチプレックスアッセイ組成物も提供する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子が増幅されて、別個のマルチプレックスアッセイにおいて検出される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０からなる群から選択され；少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子は、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２からなる群から、あらゆる組み合わせで選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子は、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３５、およびＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５からなる群から選択される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子および２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２を増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよびプローブを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子は、ＥＭＬ４エクソン１３−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２０−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン６ａ／ｂ−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン２−ＡＬＫエクソン２０、ＥＭＬ４エクソン１８−ＡＬＫエクソン２０、ＫＩＦ５Ｂエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０、およびＫＩＦ５Ｂエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０を含み；少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子は、ＫＩＦ５Ｂエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２、ＫＩＦ５Ｂエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２、ＣＣＤＣ６エクソン１−ＲＥＴエクソン１２、およびＮＣＯＡ４エクソン６−ＲＥＴエクソン１２を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、内部標準を検出する標識プローブ上の標識は、融合遺伝子を検出する標識プローブ上の標識とは異なる。いくつかの実施形態では、全ての標識プローブ上の標識は、互いに異なる。いくつかの実施形態では、単一の標識プローブを用いて、少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子の全てを検出する。いくつかの実施形態では、単一の標識プローブを用いて、少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子の全てを検出する。いくつかの実施形態では、標識プローブは、少なくとも１つのプライマーセット中のプライマーに結合される。いくつかの実施形態では、標識プローブは、プライマーセットから分離される。
【００１７】
２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、ＡＬＫ融合遺伝子を増幅する全てのプライマーセットは、単一の共通プライマーを含む。２つ以上のＡＬＫ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、プライマーセットは、ユニークプライマーを含む。２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、ＲＥＴ融合遺伝子を増幅する全てのプライマーセットは、単一の共通プライマーを含む。２つ以上のＲＥＴ融合遺伝子が増幅および検出されるいくつかの実施形態では、プライマーセットは、ユニークプライマーを含む。
【００１８】
本開示のアッセイに使用することができる内部標準の例としては、ＳＤＨＡ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、ＰＰＩＨ、ＨＰＲＴ１、ベータアクチン、ＧＡＤＰＨ、ＡＣＴＢ、および１６Ｓ  ｒＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴａｑまたはＴａｑ誘導体などの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、逆転写酵素をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｄＮＴＰをさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＤＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素による重合を受けやすい緩衝液をさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組成物は、個体または個体の群に由来する生体試料をさらに含む。いくつかの実施形態では、個体は、がん、例えば、肺がん（例として、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平上皮がん、肺腺がん）、膀胱がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、前立腺がん、膵臓がん、腎がん、または乳がんと診断されている。
【００２１】
いくつかの実施形態では、試料は、濃縮されるかまたは単離された核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡである。いくつかの実施形態では、試料は、ＲＮＡ、例えば、血液（例として、血清、血漿、他の血液画分）、気管支肺胞洗浄、または組織生検から単離される。いくつかの実施形態では、生体試料は、融合遺伝子を含むポリヌクレオチドを１００ｎＭ以下、例えば、０．０１〜１００ｎＭ、０．０１〜２５ｎＭ、０．０１〜５ｎＭ、０．０２〜０．５ｎＭ、または０．０２〜０．１ｎＭ含む。
【００２２】
さらに、個体、例えばがんと診断された個体を治療する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｄ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、少なくとも１つの融合遺伝子が存在する場合に、個体を治療するステップと、を含む方法を提供する。さらに、個体、例えばがんと診断された個体を治療する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、少なくとも１つの融合遺伝子が存在する場合に、個体を治療するステップと、を含む方法を提供する。さらに、個体、例えばがんと診断された個体を治療する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、少なくとも１つの融合遺伝子が存在する場合に、個体を治療するステップと、を含む方法を提供する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、治療は、キナーゼ阻害剤、例えば、アレチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ロラチニブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、アパチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＤＳ６０５１ｂ、またはこれらの変異体もしくは組合せなどの選択的キナーゼ阻害剤を用いる。いくつかの実施形態では、治療コースは、放射線療法または化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル）を含む。いくつかの実施形態では、治療は、ＧＳＫ１８３８７０５Ａ、ＴＡＥ−６８４、ＣＥＰ−１４０８３、ＡＰ２６１１３、ＮＭＳ−Ｅ６２８、ソラフェニブ、バンデタニブ、モテサニブ、スニチニブ、およびＸＬ−１８４を用いる（例えば、Ｍｏｌｏｇｎｉ（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１８：１６２を参照）。
【００２４】
いくつかの実施形態では、個体は、例えば、融合遺伝子増幅産物の量が増加もしくは減少するかどうか、または異なる融合遺伝子が検出されるかどうかを判定するために、治療の間モニターされる。いくつかの実施形態では、治療は、融合遺伝子増幅産物の量が変化するかどうか、または異なる融合遺伝子が検出されるかどうかによって変更される。例えば、最初に検出された融合遺伝子の量が減少しているが、がんが進行している場合には、例えば放射線または化学療法といった標的化されにくいように治療を変更することができる。個体の状態が改善すれば、治療を減らすことができる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば分離または精製された核酸を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、例えば、血漿、血清、または他の血液画分に由来するＲＮＡである。いくつかの実施形態では、増幅および検出は、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて行われる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、個体は、肺がん（例として、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平上皮がん、肺腺がん）、膀胱がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、前立腺がん、膵臓がん、腎がん、または乳がんと診断される。
【００２７】
さらに、個体、例えばがんと診断された個体に由来する試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在を判定する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）少なくとも１つのＲＯＳ１融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｄ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、を含む方法を提供する。さらに、個体、例えばがんと診断された個体に由来する試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在を判定する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＡＬＫ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｃ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、を含む方法を提供する。さらに、個体、例えばがんと診断された個体に由来する試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在を判定する方法であって、個体に由来する生体試料を、本明細書に記載されたマルチプレックスアッセイ組成物のいずれか（例えば、（Ａ）少なくとも１つのＲＥＴ融合遺伝子を特異的に増幅および検出する少なくとも１つのプライマーセットおよび標識プローブと、（Ｂ）内部標準を特異的に増幅および検出するプライマーセットおよび標識プローブと、を含む）と接触させるステップと、生体試料中の少なくとも１つの融合遺伝子の存在下において、増幅産物の形成及び検出が可能な条件下で増幅および検出を行うステップと、融合遺伝子が検出された場合に、少なくとも１つの融合遺伝子が存在することを判定するステップと、を含む方法を提供する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、生体試料は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば分離または精製された核酸を含む。いくつかの実施形態では、生体試料は、血液、例えば、血漿、血清、または他の血液画分に由来するＲＮＡである。いくつかの実施形態では、増幅および検出は、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて行われる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、個体は、肺がん（例として、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平上皮がん、肺腺がん）、膀胱がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、前立腺がん、膵臓がん、腎がん、または乳がんと診断される。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本方法は、少なくとも１つの融合遺伝子が検出される場合に、治療コースを決定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、治療は、キナーゼ阻害剤、例えば、アレチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ロラチニブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、アパチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＤＳ６０５１ｂ、またはこれらの変異体もしくは組合せなどの選択的キナーゼ阻害剤を用いる。いくつかの実施形態では、治療コースは、放射線療法または化学療法（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル）を含む。いくつかの実施形態では、治療は、ＧＳＫ１８３８７０５Ａ、ＴＡＥ−６８４、ＣＥＰ−１４０８３、ＡＰ２６１１３、ＮＭＳ−Ｅ６２８、ソラフェニブ、バンデタニブ、モテサニブ、スニチニブ、およびＸＬ−１８４を用いる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１Ａ】図１Ａは、示されるＡＬＫ融合変異体（ＦＡＭ）が、０．１ｎｇのＷＴ  ＲＮＡ（ｎ＝３）中において５０コピーで検出可能であることを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、示されるＲＥＴ融合変異体（ＨＥＸ）が、０．１ｎｇのＷＴ  ＲＮＡ（ｎ＝３）中において５０コピーで検出可能であることを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、示されるＲＯＳ１融合変異体（ＪＡ２７０）が、０．１ｎｇのＷＴ  ＲＮＡ（ｎ＝３）中において５０コピーで検出可能であることを示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、各入力ＲＮＡの内部標準Ｃｔ値を示す。
【図２】図２は、本明細書中に記載されるマルチプレックスアッセイにおける、ＡＬＫ融合およびＲＥＴ融合の検出限界を示す。このアッセイは、ＵＨＲで希釈した２５コピーの融合転写物を検出することができる。
【図３】図３は、代表的なＡＬＫ融合変異体の直線性データを示す。
【図４】図４は、代表的なＲＥＴ融合変異体の直線性データを示す。
【図５】図５は、代表的なＲＯＳ１融合変異体の直線性データを示す。
【図６】図６は、代表的なＡＬＫ融合変異体のＬＯＤデータを示す。
【図７】図７は、代表的なＲＥＴ融合変異体のＬＯＤデータを示す。
【図８】図８は、代表的なＲＯＳ１融合変異体のＬＯＤデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
Ｉ．序文
本発明者らは、遺伝子領域間の融合を検出する、新規で定量的かつ多重的な方法を発見した。現在開示されている方法は、非侵襲的に収集することができる少量の患者試料、例えば血漿に由来する循環遊離ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）のみを必要とする。
【００３３】
腫瘍に由来する循環核酸の量が限られているため、現在の検査では生検または大量の血漿のいずれかが必要である。現在記載されている方法は、がんおよび治療への応答を予測する複数の遺伝子融合を検出するための、非常に高感度（最大約２５コピーまで）な１チューブアッセイを可能にする。本アッセイは、治療および／または進行中のモニタリングおよびサーベイランスと同様に、融合変異体の同定に用いることができる。
【００３４】
ＩＩ．定義
「遺伝子融合」とは、以前は別々であった２つの染色体位置が連結して形成されたハイブリッド染色体配列である。融合は、同じ染色体上の遺伝子間（例えば、間質性欠失もしくは染色体逆位）でも、または異なる染色体上の遺伝子間（例えば、転座）でも起こりうる。
【００３５】
「融合遺伝子」は、以前は別々であった２つの遺伝子が連結して形成されたハイブリッド遺伝子であり、腫瘍ゲノムの構造的再配列および／または変異体をもたらす。融合遺伝子は、必ずしも両方の遺伝子からのコード配列を含む必要はないが、遺伝子の１つ、例えばプロモーターまたは３’非翻訳領域からの非コード配列を含むことができる。「遺伝子１」、「遺伝子２」、「遺伝子Ａ」、「遺伝子Ｂ」として融合遺伝子を含む遺伝子の名称は、融合を構成する遺伝子を区別するために使用され、必ずしも融合における遺伝子の位置を示す必要はない。ＡＬＫ融合、ＲＥＴ融合、およびＲＯＳ１融合という用語は、ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１をメンバーとして含む融合遺伝子をそれぞれ指す。
【００３６】
「融合部位」、「融合点」、「限界点」、および同様の用語は、ある遺伝子または遺伝的位置に由来するヌクレオチドが、別の遺伝子または遺伝的位置に由来するヌクレオチドに隣接して見出される、遺伝的な融合における点を指す。
【００３７】
用語「標的領域」、「標的部位」、「標的断片」、および同様の用語は、増幅および／または分析される標的核酸配列の領域を指す。
【００３８】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、ヌクレオチド（例えば、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド）のポリマーを指し、天然に存在する（アデノシン、グアニジン、シトシン、ウラシル、およびチミジン）、天然に存在しない、ならびに修飾された核酸を含む。この用語はポリマーの長さ（例えば、モノマーの数）によって制限されない。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、一般的には５’−３’ホスホジエステル結合を含有するが、ある場合には、ヌクレオチド類似体は他の結合を有していてもよい。モノマーは、典型的にはヌクレオチドと呼ばれる。用語「非天然ヌクレオチド」または「修飾ヌクレオチド」とは、修飾された窒素塩基、糖、もしくはリン酸基を含有するヌクレオチド、またはその構造中に非天然部分を組み込むヌクレオチドを指す。非天然ヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、ビオチン化ヌクレオチド、アミノ化ヌクレオチド、脱アミノ化ヌクレオチド、アルキル化ヌクレオチド、ベンジル化ヌクレオチド、およびフルオロフォル標識ヌクレオチドが含まれる。
【００３９】
用語「プライマー」とは、好適な条件下において核酸ポリメラーゼによるポリヌクレオチド鎖合成の開始点として作用する、短い核酸（オリゴヌクレオチド）を指す。ポリヌクレオチド合成および増幅反応は、典型的には、適切な緩衝液、ｄＮＴＰおよび／またはｒＮＴＰ、ならびに１つ以上の随意の補助因子を含み、好適な温度で行われる。プライマーは、典型的には、標的配列に対して少なくとも実質的に相補的である少なくとも１つの標的ハイブリダイズ領域を含む。この領域は、典型的には、長さが約１５〜約４０のヌクレオチドである。「プライマー対」とは、標的配列の逆鎖に対して相補的であって、標的配列を増幅するように設計された順方向プライマーおよび逆方向プライマー（５’プライマーおよび３’プライマーと呼ばれることもある）を指す。順方向および逆方向プライマーは、標的配列、例えば約１０〜５０００ヌクレオチド、約２５〜５００ヌクレオチド、または約６０〜１２０ヌクレオチド上で互いに増幅可能な距離内に配置される。「プライマーセット」とは、１つ以上のプライマー対、または少なくとも１つの順方向プライマーと少なくとも１つの逆方向プライマーとの組み合わせを指す。例えば、プライマーセットは、３つの異なる増幅産物が潜在的に産生され得るように、３つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーを含むことができる。
【００４０】
融合部位（または限界点）の５’（または３’）である配列（または遺伝子の一部）に特異的なプライマーセットまたはプライマー対とは、融合部位または限界点を含まない配列を増幅するために使用されるプライマーを指す。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、「プローブ」とは、特異的に意図された標的生体分子、例えばプローブによって結合されるか、捕捉されるか、またはハイブリダイズされる対象の核酸配列と、選択的に結合することができるあらゆる分子を意味する。プローブは、典型的には、天然に存在しない部分、例えばフルオロフォア、発色団、親和性タグ（例えば、ストレプトアビジンもしくはビオチン）、および／または失活剤で標識される。
【００４２】
単語「相補的」または「相補性」とは、ポリヌクレオチド中の核酸が、第２のポリヌクレオチド中の別の核酸と塩基対を形成する能力を指す。例えば、配列Ａ−Ｇ−Ｔ（ＲＮＡではＡ−Ｇ−Ｕ）は、配列Ｔ−Ｃ−Ａ（ＲＮＡではＵ−Ｃ−Ａ）に相補的である。相補性は、いくつかの核酸のみが塩基対形成に従って一致する部分的なものであってもよいし、または全ての核酸が塩基対形成に従って一致する完全なものであってもよい。プローブまたはプライマーは、それが標的配列に対して少なくとも部分的に相補的である場合、標的配列に対して「特異的」と考えられる。条件に依存して、標的配列に対する相補性の程度は、典型的には、プライマーのような短い核酸（例えば、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上）の方が長い配列よりも高い。
【００４３】
「同一の」または「パーセント同一性（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、２つ以上の核酸、または２つ以上のポリペプチドとの関連においては、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用してデフォルトパラメータで測定されるか、もしくは手動アラインメントおよび目視検査によって測定されたものと同一である（例えば、比較ウインドウまたは指定領域上での最大一致に対して比較および整列された場合、約６０％同一、例えば６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性の少なくともいずれか）か、または特定の割合のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する２つ以上の配列またはサブシーケンスを指す。例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトである、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴを参照されたい。したがって、このような配列を「実質的に同一」であるという。パーセント同一性は、典型的には、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有する配列にその定義が適用されるように、最適に整列された配列にわたって決定される。当技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムは、ギャップおよび同様のものなどについて説明する。典型的には、同一性は、少なくとも約８〜２５アミノ酸長もしくはヌクレオチド長である配列を含む領域、または５０〜１００アミノ長酸もしくはヌクレオチド長である領域、または参照配列の全長にわたって存在する。
【００４４】
用語「対立遺伝子」とは、遺伝子の配列変異体を指す。１つ以上の遺伝的差異が対立遺伝子を構成することができる。
【００４５】
用語「キット」とは、本明細書中に記載されるＲＮＡまたはＤＮＡを特異的に増幅、捕捉、タグ付け／変換、または検出するための、核酸プローブ、プローブプール、または同様のものといった、少なくとも１つの試薬を含むあらゆる製品（例えば、包装または容器）を指す。
【００４６】
用語「増幅条件」とは、ハイブリダイゼーションおよびプライマーの鋳型依存性伸長を可能にする核酸増幅反応（例えば、ＰＣＲ増幅）における条件を指す。用語「単位複製配列」および「増幅産物」とは、標的核酸配列の全部または断片を含有し、あらゆる好適な増幅方法によるインビトロ増幅の産物として形成される核酸分子を指す。所与のアンプリコンの境界は、典型的には、増幅に使用される順方向および逆方向プライマーの相補的部分の位置によって規定される。好適なＰＣＲ条件は、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）ａｔ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９９０）に記載されている。
【００４７】
用語「熱安定性核酸ポリメラーゼ」または「熱安定性ポリメラーゼ」とは、例えば大腸菌由来のポリメラーゼと比較した場合、高温で比較的安定であるポリメラーゼ酵素を指す。熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ法」）に典型的な温度サイクル条件下における使用に好適である。例示的な熱安定性ポリメラーゼとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５（例えば、米国特許第５，６７４，７３８号）、およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｐ．ｓｐｓ１７、Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ、Ｈｏｔ  ＳｐｒｉｎｇファミリーＢ／クローン７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、およびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ  ａｆｒｉｃａｎｕｓの変異体、ならびにこれらの改変版が含まれる。
【００４８】
用語「試料」または「生体試料」とは、個体由来の核酸を含有するか、または含有すると推定されるあらゆる組成物を指す。この用語は、細胞、組織、または血液の精製または分離された構成要素、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、たんぱく質、無細胞部分、または細胞溶解物を含む。いくつかの実施形態では、分析は血液から単離された血漿試料について行われる。用語「患者の血液中で検出される」および「患者の血漿中で検出される」とは、患者から血液が得られ、そこから得られた血漿が分析に使用されることを意味するために、互換的に使用される。試料はまた、他の種類の生体試料、例えば、皮膚、血漿、血清、全血、および血液構成要素（例として、血小板、バフィーコート）、唾液、尿、涙、精液、膣液、組織生検、ならびにパラフィン包埋組織を含む他の体液および組織を指すこともできる。試料はまた、細胞株を含む個体から得られた細胞のインビトロ培養物の成分および構成要素も含み得る。
【００４９】
「対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）」試料または値とは、試験試料または試験条件との比較のための基準、通常は既知の基準として機能する試料を指す。例えば、試験試料は、試験条件、例えばがんを有することが疑われる個体から採取することができ、既知の条件、例えばがんを有しない個体（陰性対照）由来の試料、またはがんおよび／もしくは特定の遺伝子異常を有することが知られている個体（陽性対照）由来の試料と比較することができる。本開示の文脈において、陰性対照の例は、既知の健康な（非がん、非変異）個体由来意の生体試料であってもよく、陽性対照の例は、特定の遺伝子融合を有することが知られている患者または細胞株由来の生体試料であってもよい。対照はまた、平均値、または多数のテスト試験もしくは結果から収集された範囲を表すこともできる。反応条件に対して対照を調製することもできる。例えば、核酸の存在についての陽性対照は、試料中に存在することが知られている配列を検出するプライマーまたはプローブを含み得るが、一方で陰性対照は核酸を含まないであろう。当業者は、対照があらゆる数のパラメータを評価するために設計され得ることを認識するであろう。例えば、薬理学的データ（例として、半減期）または治療手段（例として、有益性および／または副作用の比較）に基づいて治療上の有益性を比較するために、対照を考案することができる。対照はインビトロ用途のために設計してもよい。当業者であれば、所与の状況においてどの対照が有用であるかを理解し、対照値との比較に基づいてデータを分析することができるであろう。対照はデータの重要性を判断するのにも役立つ。例えば、所与のパラメータの値が対照群で広く変動している場合、試験試料の変動は有意であるとはみなされない。
【００５０】
「内部標準」（ＩＣ）とは、試料中に存在すると予想される核酸、例えば、試料にわたり極めて標準的なレベルで発現または存在するハウスキーピング遺伝子を指す。内部標準を用いて、試料中の核酸の量および品質を他の試料のものと標準化し、増幅および検出反応が機能していることを確実にすることができる。内部標準の例としては、ＳＤＨ（コハク酸デヒドロゲナーゼ）、ＬＤＨＡ（乳酸デヒドロゲナーゼＡ）、ＮＯＮＯ、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ１）、ＰＰＩＨ、ＨＰＲＴ１、ベータアクチン、ＧＡＤＰＨ、ＡＣＴＢ、および１６Ｓ  ｒＲＮＡが挙げられる。
【００５１】
用語「診断」とは、対象ががんまたはある種のがん（例えば、遺伝子融合の結果）などの障害を有する相対的な可能性を指す。同様に、用語「予後」とは、ある種の将来的な結果が対象内で生じ得る相対的可能性を指す。例えば、本開示の文脈において、診断は、がんの分類または個体が特定の治療に応答する可能性を指すことができる。用語は、医学的診断の分野の当業者によって理解されるように、絶対的であることを意図してはいない。
【００５２】
「治療への反応」、「処置への反応」、「寛解」、および同様の用語は、症状の重症度のあらゆる低減を指す。がんを治療する場合、治療とは、例えば、腫瘍の大きさ、がん細胞の数、成長速度、転移活性、非癌細胞の細胞死の減少、悪心、および他の化学療法または放射線療法の副作用の減少などを指すことができる。用語「治療する」および「予防する」は、絶対的な用語であることを意図していない。治療および予防とは、発症のあらゆる遅延、症状の寛解、患者生存率の改善、生存期間または生存率の増加などを指すことができる。治療および予防は、完全（検出不能なレベルの新生細胞）または部分的であってもよく、その結果、患者の新生物は、治療を行わなかった場合よりも少なくなる。治療の効果は、治療を受けていない個体もしくは個体のプール（例えば、同じ遺伝子融合を有する個体）、または治療前もしくは治療中の異なる時点の同じ患者で比較することができる。いくつかの態様では、疾患の重症度は、例えば投与前の個体または治療を受けていない対照個体と比較して、少なくとも１０％低下する。いくつかの態様では、疾患の重症度は、少なくとも２５％、５０％、７５％、８０％、もしくは９０％低減されるか、またはいくつかの場合においては、標準的な診断技術を用いてもはや検出可能でない程度まで低減される。
【００５３】
患者に関して、「治療する」および「投与する」という用語は、特定の治療を患者に推奨、提供、または処方することを含み、直接、患者を物理的に治療することに限定されない。
【００５４】
用語「閾値サイクル」または「Ｃｔ」とは、相対濃度の尺度であって、リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲとも呼ばれる）において一般的に使用される。Ｃｔとは、増幅曲線と閾値線との交点を指す。閾値線は、バックグラウンドより上で信号を検出することができる時点、または増幅反応が対数期に入る時点にしばしば設定される。Ｃｔは、標的の濃度および増幅条件、例えば、検出可能な標識および増幅効率に対する条件の効果に影響され得る。高いＣｔは、低い標的濃度または非効率的な増幅に起因して、閾値に達するまでのより長い時間に対応する。
【００５５】
「個体」、「対象」、「患者」、および同様の用語は、示されている場合を除き、交換可能に使用され、ヒトを指す。非ヒト霊長類、ならびにウサギ、ラット、マウス、イヌ、ネコ、および他の哺乳動物種といった他の哺乳動物を対象とみなしてもよい。この用語は、必ずしも対象が特定の疾患と診断されていることを示す必要がないが、典型的には、医学的監督下にある個体を指す。患者は、治療、モニタリング、既存の治療レジメンの調整または変更などを求めている場合がある。患者には、療を受けていない個体、現在治療を受けている個体、手術を受けた個体、および治療を中止した個体が含まれ得る。
【００５６】
「標識」、「タグ」、「検出可能な部分」、および同様の用語は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、化学的、または他の物理的手段によって検出可能な組成物を指す。例えば、有用な標識としては、蛍光色素、発光剤、放射性同位元素（例として、32Ｐ、3Ｈ）、電子密集試薬（ｅｌｅｃｔｒｏｎ−ｄｅｎｓｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）、または親和性塩基部分（ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｂａｓｅｄ  ｍｏｉｅｔｙ）、例えば、精製用の「Ｈｉｓ標識」もしくはビオチンと相互作用する「ストレプトアビジン標識」が含まれる。
【００５７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術的および科学的用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。例えば、Ｐｆａｆｆｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑＰＣＲ，ｖｏｌ．５０（２０１０）；ｖａｎ  Ｐｅｌｔ−Ｖｅｒｋｕｉｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ＰＣＲ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  （２０１０）；Ｌａｃｋｉｅ，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＣＥＬＬ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（４ｔｈ  ｅｄ．２００７）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照されたい。用語「ひとつの（ａ）」または「ひとつの（ａｎ）」とは、「１つ以上」を意味するように意図されている。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、ステップまたは要素の記載の前にある場合、さらなるステップまたは要素の追加が随意であって、除外されないことを意味するように意図される。
【００５８】
ＩＩＩ．融合遺伝子
数々のがん関連融合遺伝子が知られており、あらゆる種類のがんに発生する。例としては、肺がん（例として、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平上皮がん、肺腺がん）、膀胱がん、神経膠芽腫、頭頸部がん、神経膠腫、甲状腺がん、卵巣がん、白血病、リンパ腫、前立腺がん、膵臓がん、腎がん、および乳がんが含まれる。がん関連融合遺伝子は一般に、融合の１つのメンバーが増殖促進シグナル伝達経路に関与するキナーゼであり、もう一方のメンバーが発現またはシグナル伝達の上昇または構成に寄与する場合に生じる。これが、ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１の融合の場合である。ＡＬＫの一般的な融合パートナーは、ＥＭＬ４およびＫＩＦ５Ｂである。ＲＥＴの一般的な融合パートナーは、ＫＩＦ５Ｂ、ＣＣＤＣ６、およびＮＣＯＡ４である。いくつかの遺伝子は、ＲＯＳ１と融合することが知られており、これには、ＣＤ７４、ＥＺＲ、ＴＰＭ３、ＳＤＣ４、ＳＬＣ３４Ａ２、およびＬＲＩＧ３が含まれる（例えば、Ｙｏｓｈｉｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３４：４８４５を参照）。
【００５９】
本発明の組成物および方法は、ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１融合を検出するためのマルチプレックスアッセイの設計に焦点を当てる。がん患者では、侵襲的生検または過剰な採血がしばしば実施不可能である。本発明の組成物および方法は、非侵襲性血漿試料であり得る、患者由来の比較的小さな試料とのいくつかの実用的な遺伝子融合の検出を可能にする。
【００６０】
これらの高度なマルチプレックスアッセイの設計は変化し得る。複数のＡＬＫ融合が検出される場合、例えば、融合点近くのＡＬＫ遺伝子内の配列にハイブリダイズする共通のプライマーおよびプローブ、ならびに種々の融合パートナーに特異的なプライマーを使用することができる。したがって、例えば、５つの異なるＡＬＫ融合が検出される場合、アッセイは、１５個のオリゴヌクレオチド（１０プライマーおよび５プローブ）または７個のオリゴヌクレオチド（１つの共通プライマー、１つの共通プローブ、および５つの特異的プライマー）を含むことができる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、マルチプレックスアッセイは、単一の増幅および検出反応にて、２、３、４、５、６、または７のＡＬＫ融合、および２、３、４、５、または６のＲＥＴ融合を検出する。いくつかの実施形態では、マルチプレックスアッセイは、同じ反応において、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のＲＯＳ１融合をさらに検出する。いくつかの実施形態では、ＲＯＳ１融合は別個の増幅および検出反応において検出される。いくつかの実施形態では、増幅および検出反応は、内部標準（例えば、ハウスキーピング遺伝子）をさらに含む。
【００６２】
ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１融合の存在は、がん患者が選択的キナーゼ阻害剤に応答性であることを示す。これらには、アレチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ロラチニブ、ブリガチニブ、カボザンチニブ、アパチニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、レンバチニブ、ＤＳ−６０５１ｂ、およびこれらの変異体、またはこれらの組み合わせが含まれる。患者の融合状態により、治療を通して監視して、治療アプローチを、例えば異なるキナーゼ阻害剤またはより標準的な化学療法もしくは放射線療法に変更することができるかどうかを決定することができる。
【００６３】
ＩＶ．試料の調製
遺伝的融合を検査するための試料は、あらゆる供給源から得ることができるが、有利には、非侵襲的様式、例えば、血液または血液画分（例として、血漿、血清、血小板など）から得る。本発明の方法のための試料はまた、尿、気管支肺胞洗浄、または組織生検から採取することもできる。生体試料から核酸を単離する方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋに記載されているように公知であり、いくつかのキットが市販されている（例として、ロシュ社のＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、およびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡを調製し、現在開示されている増幅および検出方法のための鋳型として使用する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを調製する。ＲＮＡをＰＣＲによる増幅の鋳型として使用する場合には、ｃＤＮＡを調製するために逆転写ステップが必要である。次いで、Ｔａｑまたは別の熱安定性ポリメラーゼといったＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅を行うことができる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、試料は、血漿から単離されるＲＮＡである。患者の状態に応じて、約１〜１０ｍＬの血漿を検査のために採取することができる（通常は約２ｍＬ）。循環遊離ＲＮＡを単離するためのキットは、例えば、Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  ＣｏｒｐまたはＱｉａｇｅｎから市販されている。
【００６６】
実施例に示されるように、カスタム標的特異的オリゴを用いた試料調製および増幅／検出のための現在開示されている方法は、非常に感度が高く、かつ野生型ＲＮＡバックグラウンドで１：４０００に希釈された試料中の約５０コピーおよびある場合には約２０コピーという少ない遺伝子融合突然変異を検出するために使用することができる。これは、標的配列が非常にまれである試料、例えば、循環無細胞ＲＮＡ（ｃｆＲＮＡ）における融合変異体の検出を可能にする。血漿中のＲＮＡおよびＤＮＡの種々のバックグラウンドは、低コピー数であっても検出の特異性を損なわない。
【００６７】
Ｖ．増幅および検出
核酸増幅は、あらゆるプライマー依存的方法を用いて行うことができる。いくつかの実施形態では、増幅は定量的であるため、所与の増幅標的の相対的または実際の存在量は、増幅産物の量によって決定することができる。
【００６８】
ＤＮＡベースの方法は、現在開示されている増幅および検出方法、例えばＰＣＲに用いることができる。いくつかの実施形態では、リアルタイムまたは定量的ＰＣＲが使用される（ＲＴＰＣＲまたはｑＰＣＲ）。ｑＰＣＲは、ＰＣＲプロセスの各サイクル中に生成される産物の信頼できる検出および測定を可能にする。このような技術は当技術分野で周知であり、キットおよび試薬は、例えば、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄなどから市販されている。例えば、Ｐｆａｆｆｌ（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑＰＣＲ  ｖｏｌ．５０を参照されたい。いくつかの実施形態では、増幅および検出は、失活剤およびフルオロフォア（例えば、Ｇａｓｐａｒｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３９６：２０２３を参照）で標識された二重標識プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎ、ＣＰＴ、ＬＮＡ、またはＭＧＢプローブ）の存在下で行われる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、予備的な逆転写ステップが行われる（ＲＴ−ＰＣＲとも呼ばれ、リアルタイムＰＣＲと混同されることはない）。例えば、Ｈｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）７２：７１４８を参照されたい。本明細書中で使用される場合、用語「ｑＲＴ−ＰＣＲ」とは、定量的ＰＣＲに先んじた逆転写を指す。どちらの反応も、例えば試薬を加えるために、中断することなく単一のチューブ内で行うことができる。
【００７０】
ＲＮＡベースの増幅方法はまた、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）または核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）も使用することができる。例えば、Ｆａｋｒｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏａｌｌｉｅｄ  Ｓｃｉ．５：２４５；ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：ｅ１５；Ｋａｍｉｓａｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：３１０を参照されたい。
【００７１】
本発明のアッセイで使用されるオリゴヌクレオチドのいくつか（プライマーおよびプローブ）は、選択的増幅を増強するためのアルキル塩基修飾を、特に多重形式で含む。
【００７２】
プローブ、またはプライマー対におけるプライマーの一方もしくは両方は、直接的または間接的に検出可能なシグナルを放出または生成するあらゆる物質または構成要素で標識することができる。いくつかの実施形態では、標識はフルオロフォア（染料）であり、その多くは文献に報告され、当業者に知られており、かつその多くは市販されている。フルオロフォアは、例えば、Ｃａｒｄｕｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：８７９０；Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４５：１３３；Ｓｅｌｖｉｎ（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２４６：３００；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４０：８３−１１４（１９７１）；およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７：１１９７−１２０３（１９９５）に記載されている。
【００７３】
フルオロフォアの例としては、以下の標識を使用することができる：４−アセトアミド−４’−イソチオシアネートスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジン；アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート［００７０］Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アンスラニラミド；ＢＯジＰＹ；ブリリアントイエロー；クマリン；７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）／７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（クマラン１５１）；シアニン色素；シアノシン４’，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）；５’，５’’−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（ブロモピロガロールレッド）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアネートフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミンペンタアセテート；４，４’−ジイソチオシアネートジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアネートスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−（４’−ジメチルアミノフェニラゾ）安息香酸（ＤＡＢＣイル）；４−ジメチルアミノフェニラゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシン；エオシンイソチオシアネート；エリスロシンＢ；エリスロシンイソチオシアネート；エチジウム；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）；５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）；２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）；フルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート；フルオレサミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；マラカイトグリーンイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロン；オルトクレソルフタレイン；ニトロチロシン；パラロザニリン；フェノールレッド；フェコエリトリン（ＢおよびＲ型を含むがこれらに限定されない）；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレン；ピレンブチレート；サクシニミドイル１−ピレンブチレート；量子ドット；反応性レッド４（シバクロンブリリアントレッド３Ｂ−Ａ）；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）；６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）；リザミンローダミンＢスルホニルクロリドローダミン；ローダミンＢ；ローダミン１２３；ローダミンＸイソチオシアネート；スルホローダミンＢ；スルホローダミン１０１；スルホローダミン１０１（テキサスレッド）のスルホニルクロリド誘導体；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸；ならびにランタニドキレート誘導体。
【００７４】
リスト化したフルオロフォア（染料）のいずれをも、本明細書に記載される核酸を標識するために、現在記載されるアッセイにおいて使用することができる。フルオロフォアは、フルオロフォアおよび／または核酸上の適切な官能基を用いて、従来の共有結合によって結合され得る。
【００７５】
上記のように、二重標識プローブを検出に使用することができる。二重標識プローブは、上記のフルオロフォアのいずれかなどのフルオロフォア、および失活剤を含んでなっていてもよい。好適な失活剤としては、ＤＤＱ−Ｉ、ダブシル、エクリプス、アイオワブラックＦＱ、ＢＨＱ−１、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ＤＤＱ−ＩＩ、アイオワブラックＲＱ、ＱＳＹ−２１、およびＢＨＱ−３が含まれる、これらに限定されない。５００〜５５０ｎｍの発光極大を有するフルオロフォア（例えば、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＨＥＸ）については、４５０〜５００ｎｍの吸収極大を有する失活剤を選択することができる（例えば、ダビシルまたはＢＨＱ−１）。５５０ｎｍを超える発光極大を有するフルオロフォア（例えば、ローダミンおよびＣｙ色素）については、５５０ｎｍを超える吸収極大を有する失活剤を選択することができる（例えば、ＢＨＱ−２）。色素失活剤対を選択する際の考察については、例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ（２００３）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：１７を参照されたい。
【００７６】
検出装置は当技術分野で公知であり、選択された標識に適切なものとして選択することができる。定量的ＰＣＲに適した検出装置には、ｃｏｂａｓ（登録商標）およびＬｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）、ＰＲＩＳＭ７０００および７３００リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などが含まれる。
【００７７】
ＶＩ．キット
いくつかの実施形態では、現在開示されている方法を実施するための試薬および材料は、キットに含まれる。いくつかの実施形態では、キットは、試料を入手し、保存し、および／または調製するための構成要素を含む。そのような構成要素としては、例えば、滅菌針およびシリンジ、ＥＤＴＡラインチューブ、緩衝液（例として、核酸のマトリックスへの結合、およびマトリックスからの溶出）、リボヌクレアーゼ阻害剤、ならびに／またはデオキシリボヌクレアーゼなどが含まれる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１〜５０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＡＬＫ融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１８２〜１８６からなる群から選択される配列を有するＡＬＫ融合変異体を検出するためのプローブを含む。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる適切な組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおけるあらゆる１、２、３、４、５、６、または７個のＡＬＫ融合変異体を検出することができる。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：８３〜１４５および１８７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＲＥＴ融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、１８９〜１９４からなる群から選択される配列を有するＲＥＴ融合変異体を検出するためのプローブを含む。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおけるあらゆる１、２、３、４、５、または６個のＲＥＴ融合変異体を検出することができる。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１９５〜２１２、ならびに配列番号：２１３〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＲＯＳ１融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、２２７〜２３０および５１からなる群から選択される配列を有するＲＯＳ１融合変異体を検出するためのプローブを含む。順方向および逆方向プライマー配列ならびにプローブ配列を、あらゆる組み合わせで一緒に使用して、あらゆる組み合わせにおけるあらゆる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３個のＲＯＳ１融合変異体を検出することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１〜１０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＭＬエクソン１３−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１１〜２０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＭＬエクソン２０−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２１〜３０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＭＬエクソン６−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。キットは、配列番号：３１〜３５、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＭＬエクソン２−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：３６〜４０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＭＬエクソン１８−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：４１〜４５、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン２４−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：４６〜５０、ならびに配列番号：５２〜６１および１８１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン１７−ＡＬＫエクソン２０融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１８２〜１８６からなる群から選択される配列を有するＡＬＫ融合を検出するためのプローブを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：８３〜９７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン１５−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：９８〜１０７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン１６−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１０８〜１１７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン２２−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１１８〜１２７および１８７、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＫＩＦエクソン２３−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１２８〜１３５および１１８、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＣＣＤＣエクソン１−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１３６〜１４５、ならびに配列番号：１６１〜１８０からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＮＣＯエクソン６−ＲＥＴエクソン１２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１８９〜１９４からなる群から選択される配列を有するＲＥＴ融合を検出するためのプローブを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１９５〜１９７、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１９５〜１９７、ならびに配列番号：２１３〜２１５からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＣＤ７４エクソン６−ＲＯＳ１エクソン３２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０８、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＥＺＲエクソン１０−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２１１〜２１２、ならびに配列番号：２１６〜２２１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＴＰＭ３エクソン８−ＲＯＳ１エクソン３５融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２００〜２０２、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１９８〜１９９、ならびに配列番号：２１３〜２１５からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：１９８〜１９９、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＤＣ４エクソン２−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２００〜２０２、ならびに配列番号：２１３〜２１５からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＤＣ４エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０３〜２０５、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０３〜２０５、ならびに配列番号：２１３〜２１５からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン１３−ＲＯＳ１エクソン３２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０６〜２０７、ならびに配列番号：２１３〜２１５からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３２融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０６〜２０７、ならびに配列番号：２２２〜２２６からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＳＬＣ３４Ａ２エクソン４−ＲＯＳ１エクソン３４融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号：２０９〜２１０、ならびに配列番号：２１６〜２２１からなる群から選択される配列をそれぞれ有する、ＬＲＩＧ３エクソン１６−ＲＯＳ１エクソン３５融合変異体を増幅するための順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、プライマーセットのそれぞれは、例えばユーザによって決定される比率で添加されるように、別々のチューブにパッケージされる。いくつかの実施形態では、プライマーセットの１つ以上または全ては、所定の比率で単一のチューブにパッケージされる。
【００８３】
キットはまた、逆転写酵素および／またはＤＮＡポリメラーゼのような酵素も含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、熱サイクル条件、例えばＴａｑまたはＴａｑ誘導体で増幅することができる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、キットはｄＮＴＰを含む。いくつかの実施形態では、キットは、選択されたポリメラーゼによる重合／増幅に対して伝導性の緩衝液を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、キットは、例えば、検出されるべき遺伝子融合において野生型であるポリヌクレオチド（すなわち、遺伝的融合がない）、または検出されるべき遺伝子融合を含むポリヌクレオチドを含む。
【００８５】
キットはまた、試料管またはバイアルなどの消耗品、反応容器（例えば、チューブ、マルチウェルプレート、マイクロ流体チップ、またはチャンバーなど）、および使用方法またはウェブサイトへの参照も含むことができる。
【実施例】
【００８６】
ＶＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１融合パネルの検出用マルチプレックスアッセイ
この例では、ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１融合（ＡＬＫ／ＲＥＴ／ＲＯＳ１パネル）を検出するために、多重定量ＲＴ−ＰＣＲ法を試験した。測定可能で信頼できる結果を達成するのに必要な試料の量を減らすために、４つの異なるセットのプライマーおよびプローブを単一チューブ（または、容器、ウェル、チャンバー、コンパートメント）アッセイにおいて使用する。これら４つのセットは、（ｉ）ＡＬＫ（第１の標識で標識された１つ以上のプローブで検出）、（ｉｉ）ＲＥＴ（第２の標識で標識された１つ以上のプローブで検出）、（ｉｉｉ）ＲＯＳ１（第３の標識で標識された１つ以上のプローブで検出）、および（ｉｖ）内部標準（第４の標識で標識されたプローブで検出）と対応する。標識は、本明細書に開示されたものから選択することができ、いくつかの実施形態では、互いに識別可能である。本実施例では、ＡＬＫ融合はＦＡＭ標識プローブで検出され、ＲＥＴ融合はＨＥＸ標識プローブで検出され、ＲＯＳ１融合はＪＡ２７０標識プローブで検出され、内部標準はＣｙ５．５標識プローブで検出される。
【００８７】
高度マルチプレックスアッセイの適用範囲を、括弧内に示された融合変異体番号と共に表１に示す。
【００８８】
【表１】
2020521440.tif 000003
【００８９】
多重化は、種々の遺伝子融合検出の組合せを含むことができ、いくつかの実施形態では、より少ない融合がアッセイされて検出される。ＡＬＫおよびＲＥＴ融合の検出のためのアッセイ形式の例を表２に示す。ＲＯＳ１中の融合は、例えば表３に示すように、別個に、または並行アッセイにおいて検出することができる。
【００９０】
【表２】
2020521440.tif 000004
【００９１】
【表３】
2020521440.tif 000005
【００９２】
表４〜６に示されるオリゴヌクレオチドは、アッセイにおいて使用するために選択することができる。順方向および逆方向プライマーの第１のセットは、ＥＭＬ４−ＡＬＫおよびＫＩＦ５Ｂ−ＡＬＫ融合にわたって増幅する。プライマーは、遺伝子名（例えば、ＥＭＬ４はＥＭＬ）、エクソン（例えば、エクソン１３は１３）、および記号（例えば、Ｆｏｒｗａｒｄ１はＦ１）で指定される。記号＜ｔ＿ｂｂ＿ｄＡ＞、＜ｔ＿ｂｂ＿ｄＣ＞、＜ｔ＿ｂｂ＿ｄＴ＞、＜ｔ＿ｂｂ＿ｄＧ＞とは、ｐ−ｔｅｒｔブチルベンジル修飾Ａ、Ｃ、Ｔ、およびＧをそれぞれ指し示す。当業者によって理解されるように、順方向および逆方向プライマーは、異なる融合産物を増幅するために、単一の対またはあらゆる組み合わせで使用することができる。本実施例では、表１〜３に示すように、反応中のオリゴヌクレオチドの数は最小であった。全ての反応における逆方向プライマーは、逆転写酵素反応のプライマーとして機能した。
【００９３】
【表４−１】
2020521440.tif 000006
【表４−２】
2020521440.tif 000007
【００９４】
【表５−１】
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【表５−２】
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【表５−３】
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【００９５】
【表６−１】
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【表６−２】
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【００９６】
本発明者らは、Ｈｏｒｉｚｏｎ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙのＥＭＬ４−ＡＬＫ陽性細胞株ＮＣＩ−Ｈ２２２８およびＥＭＬ４−ＡＬＫ融合変異形１細胞株、ＣＣＤＣ６−ＲＥＴ細胞株ＬＣ２ＡＤ、ならびにＮＳＣＬＣホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）および血漿検体に由来するからＲＮＡを用いて、この方法を試験した。
【００９７】
血漿の場合は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｌｙｓｉｓ  ＢｕｆｆｅｒおよびＥｓｐｅｒａｓｅ酵素を用いたＲｏｃｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ＦＦＰＥＴ  ＲＮＡ抽出キットを用いてｃｆＲＮＡを抽出した。ｃｆＲＮＡの収率は正確に測定するには低すぎるため、一定量（全体の１／２４）の抽出した血漿ｃｆＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲに投入した。
【００９８】
反応条件は以下の通りであった。各反応について、２５ｕＬの入力ＲＮＡを、順方向および逆方向プライマー、標識プローブ、緩衝液、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ＵＮＧ、およびＺ０５酵素を含むＲＴ−ＰＣＲ反応混合物へ添加して、最終容量５０ｕＬとした。反応は、それぞれが表１に示された全ての融合変異体に特異的なプライマーおよびプローブを用いて、複数回行った。
【００９９】
結果は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイでカバーされる融合変異体を検出する次世代シーケンシングアッセイを用いて確認した。
【０１００】
最大Ｃｔ（閾値サイクル）を３８に設定した。これは、シグナルがＣｔ３８以内のバックグラウンド上で検出可能でなければならないことを意味する。データを図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄに示す。各反応の入力ＲＮＡは、示された融合変異体を有することが知られていた。各反応を３回繰り返した。
【０１０１】
図１Ａは、各ＡＬＫ融合変異体が、５０コピーで検出可能であることを示す。図１Ｂは、各ＲＥＴ融合変異体が、５０コピーで検出可能であることを示す。図１Ｃは、各ＲＯＳ１融合変異体が、５０コピーで検出可能であることを示す。図１Ｄは、内部標準Ｃｔ’によって示されるように、反応効率と入力とが同等であったことを示す。
【０１０２】
Ｂ．実施例２：力価転写物におけるＡＬＫおよびＲＥＴ融合の感受性
実施例１、表１に示されるＡＬＫおよびＲＥＴ融合変異体の検出限界について、多重ｑＲＴ−ＰＣＲを試験した。ＡＬＫまたはＲＥＴ融合陽性転写物を、２５０、１００、５０、または２５コピーで０．１ｎｇのユニバーサルヒトＲＮＡ（ＵＨＲ）に力価測定することによって、マルチプレックスアッセイを試験した。増幅および検出反応を３回繰り返した。
【０１０３】
図２に示されるように、試験されたＡＬＫおよびＲＥＴ融合変異体の全ては、２５コピーまで検出可能であった。
【０１０４】
Ｃ．実施例３：直線性試験およびさらなる検出限界（ＬＯＤ）試験
ＡＬＫ、ＲＥＴ、およびＲＯＳ１融合について検出の直線性を判定するため、図３〜５に示した上で解説するように、さらなる研究を実施した。
【０１０５】
感度または検出限界（ＬＯＤ）の研究を、図６〜８に示した上で解説する。各アッセイのＬＯＤを表７および８に示す。７のＡＬＫ、６のＲＥＴ、および１３のＲＯＳ１融合変異体の全ては、１０コピー未満まで検出可能である。主要な融合変異体は＊で示される。
【０１０６】
【表７】
2020521440.tif 000013
【０１０７】
【表８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020521440.tif 000016
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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