(57)【要約】  本発明は、A549宿主細胞を使用した、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)A549宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程；および
(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養し、それにより組み換えウイルスを産生する工程
を含む、組み換えウイルスを産生するための方法。
【請求項２】
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
工程(b)の後に、組み換えウイルスを精製する工程をさらに含む、請求項１〜３いずれか一項記載の方法。
【請求項５】
組み換えウイルスを精製する工程が、感染したA549宿主細胞を溶解することを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
組み換えウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
組み換えウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項４〜６いずれか一項記載の方法。
【請求項８】
組み換えウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること；および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項９】
工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて感染したHEK293宿主細胞を産生する工程、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、請求項１〜８いずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、請求項１〜９いずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換えウイルスを生じる、請求項１〜１０いずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
組み換えウイルスがアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである、請求項１〜１０いずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
組み換えウイルスが組み換え腫瘍崩壊性ウイルスである、請求項１〜１３いずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
(a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したA549宿主細胞を産生する工程；および
(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法。
【請求項１６】
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、請求項１５〜１７いずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が感染したA549宿主細胞を溶解することを含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１８〜２０いずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること；および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて感染したHEK293宿主細胞を産生する工程、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項１５〜２２いずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項１５〜２３いずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項１５〜２４いずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
(a)組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をA549宿主細胞に導入する工程；および
(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程
を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法。
【請求項２７】
A549宿主細胞がSF-BMAdR 281 A549細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
A549宿主細胞を少なくとも3日間培養する、請求項２６また２７記載の方法。
【請求項２９】
工程(b)の後に、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む、請求項２６〜２８いずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がA549宿主細胞を溶解することを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がヌクレアーゼ処理を含む、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程がイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項２９〜３１いずれか一項記載の方法。
【請求項３３】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程が、
(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；
(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して、処理された細胞溶解物を産生すること；および
(iii)イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製すること
を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性ウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をHEK293宿主に導入する工程、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項２６〜３３いずれか一項記載の方法。
【請求項３５】
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で接着培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項２６〜３４いずれか一項記載の方法。
【請求項３６】
工程(b)において、A549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件下で懸濁培養する工程を含む同様の方法と比較して、少なくとも10x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる、請求項２６〜３５いずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが5型アデノウイルス(Ad5)である、請求項１４〜３６いずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性Pea3結合部位の欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１４〜３７いずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
欠失が、E1aの開始部位の約-300〜約-250上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
欠失が、E1aの開始部位の-305〜-255上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４１】
欠失が、E1aの開始部位の-304〜-255上流に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項３８または３９記載の方法。
【請求項４２】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の195〜244に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項３８〜４１いずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
E1aプロモーターが配列GGTGTTTTGG (配列番号：2)を含む、請求項３８〜４２いずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性TATAボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１４〜４３いずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
欠失がTATAボックス全体の欠失を含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
欠失が、E1aプロモーターの-27〜-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４４または４５記載の方法。
【請求項４７】
欠失が、E1aプロモーターの-31〜-24に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
欠失が、E1aプロモーターの-44〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
欠失が、E1aプロモーターの-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の472〜475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項４４〜４９いずれか一項記載の方法。
【請求項５１】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の468〜475に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の455〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号：3)、AGTGCCCG (配列番号：8)および/またはTATTCCCG (配列番号：9)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、請求項１４〜５３いずれか一項記載の方法。
【請求項５５】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、配列CTAGGACTG (配列番号：3)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、機能性CAATボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む、請求項１４〜５５いずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
欠失が、CAATボックス全体の欠失を含む、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
欠失が、E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５６または５７記載の方法。
【請求項５９】
欠失が、Ad5ゲノム(配列番号：1)の423〜431に対応するヌクレオチドの欠失を含む、請求項５６〜５８いずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
E1aプロモーターが、配列TTCCGTGGCG (配列番号：10)を含む、請求項５６〜５９いずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１４〜６０いずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
ヌクレオチド配列がE1b-19K挿入部位に挿入され、E1b-19K挿入部位がE1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６４】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する202ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６５】
E1b-19K挿入部位が、E1b-19Kの開始部位に隣接する203ヌクレオチドの欠失を含む、請求項６２または６３記載の方法。
【請求項６６】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917に対応する欠失を含む、請求項６２〜６５いずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
E1b-19K挿入部位が、Ad5ゲノム(配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1916に対応する欠失を含む、請求項６２〜６５いずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項６２〜６７いずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
トランスジーンが、Ad5ゲノム(配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される、請求項６２〜６７いずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
トランスジーンがCTGACCTC (配列番号：4)とTCACCAGG (配列番号：5)の間に挿入される、請求項６２〜６９いずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが、5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：4)、トランスジーンおよびTCACCAGG (配列番号：5)を含む、請求項６２〜７０いずれか一項記載の方法。
【請求項７２】
トランスジーンが外来性のプロモーター配列に操作可能に連結されない、請求項６１〜７１いずれか一項記載の方法。
【請求項７３】
トランスジーンが、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択されるポリペプチドをコードする、請求項６１〜７２いずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
組み換えウイルスが過増殖性細胞において選択的に複製する、請求項１〜７３いずれか一項記載の方法。
【請求項７５】
組み換えウイルスが、過増殖性細胞においてトランスジーンを選択的に発現する、請求項６１〜７４いずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願についての相互参照
本願は、その全体において参照により本明細書に援用される、2017年4月10日に出願された米国仮特許出願第62/483,837号の利益およびそれに対する優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
癌を引き起こす基礎になる分子機構の広い知識に関わらず、ほとんどの進行した癌は、現在の化学療法および放射線プロトコルでは不治のままである。腫瘍崩壊性ウイルスは、種々の悪性疾患についての現在の標準的な治療を有意に増強させる可能性を有する基盤技術として明らかになっている(Kumar, S. et al. (2008) CURRENT OPINION IN MOLECULAR THERAPEUTICS 10(4):371-379; Kim, D. (2001) EXPERT OPINION ON BIOLOGICAL THERAPY 1(3):525-538; Kim D. (2000) ONCOGENE 19(56):6660-6669)。これらのウイルスは、感染-再生(reproduction)-溶解の一続きの反応により悪性細胞を直接的に破壊するだけでなく、抗腫瘍免疫を間接的に誘導もする腫瘍崩壊性剤としての将来性を示している。これらの免疫刺激特性は、ウイルスが複製するごとにコピーされて発現される治療的トランスジーンの挿入により高められる。
【０００４】
以前に開発された腫瘍崩壊性ウイルスとしては、正常細胞においては転写的に弱められるが癌細胞においては転写的に活性であるTAV-255と称される腫瘍崩壊性血清型5アデノウイルス(Ad5)が挙げられる(PCT公開公報WO2010/101921参照)。TAV-255ベクターがこの腫瘍選択性を達成する機構は、特定のDNA配列への結合を介してウイルスが宿主細胞に侵入した後に転写される最初期遺伝子であるE1aのアデノウイルス発現を制御するタンパク質である転写因子Pea3およびE2Fについての3つの転写因子(TF)結合部位の標的化された欠失を介すると考えられる。
【０００５】
今日までの努力にかかわらず、ヒト患者において癌および過増殖障害を治療するための改善されたウイルス、ならびに組み換えウイルスを産生するための改善された方法の必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
本発明は部分的に、A549宿主細胞、例えばSF-BMAdR 281 A549宿主細胞を、多くの組み換えウイルス、例えば腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するために使用し得るという発見に基づく。驚くべきことに、特定の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、血清非含有および懸濁適合性(suspension-adapted) A549細胞中、複製を許容する環境において、ウイルスベクター産生に広く使用されるHEK293細胞よりも高密度で増殖することが見出された。
【０００７】
したがって、一局面において、本発明は、(a)A549宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて、感染したA549宿主細胞を産生する工程；および(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換えウイルスを産生する工程を含む、組み換えウイルスを産生するための方法を提供する。ある態様において、A549宿主細胞はSF-BMAdR 281 A549宿主細胞である。ある態様において、感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する。
【０００８】
本方法はさらに、工程(b)の後に、組み換えウイルスを精製する工程を含み得る。組み換えウイルスを精製する工程は、感染したA549宿主細胞を溶解すること、ヌクレアーゼ処理およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーの1つ以上を含み得る。ある態様において、組み換えウイルスを精製する工程は、(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して処理された細胞溶解物を産生すること；および(iii)イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製することを含む。
【０００９】
該方法は、組み換えウイルスを産生するための同等の方法よりも高い収率の組み換えウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、該方法は、工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて、感染したHEK293宿主細胞を産生すること、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば、他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換えウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で接着培養(adherent culturing)することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換えウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換えウイルスを生じる。
【００１０】
ある態様において、組み換えウイルスはアデノウイルス、例えば5型アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスである。ある態様において、組み換えウイルスは組み換え腫瘍崩壊性ウイルスである。ある態様において、組み換えウイルスは組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスである。
【００１１】
別の局面において、本発明は、(a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて、感染したA549宿主細胞を産生する工程；および(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程を含む組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法を提供する。ある態様において、A549宿主細胞はSF-BMAdR 281 A549宿主細胞である。ある態様において、感染したA549宿主細胞を少なくとも3日間培養する。
【００１２】
該方法はさらに、工程(b)の後、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程を含み得る。組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、感染したA549宿主細胞を溶解すること、ヌクレアーゼ処理およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーの1つ以上を含み得る。ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、(i)感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して処理された細胞溶解物を産生すること；および(iii)イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより、処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製することを含む。
【００１３】
該方法は、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための同等の方法よりも高い収率の組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、該方法は、工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて、感染したHEK293宿主細胞を産生すること、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で接着培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。
【００１４】
別の局面において、本発明は、(a)組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸をA549宿主細胞に導入する工程；および(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法を提供する。ある態様において、A549宿主細胞はSF-BMAdR 281 A549宿主細胞である。ある態様において、A549宿主細胞を少なくとも3日間培養する。
【００１５】
該方法はさらに、工程(b)の後、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程を含み得る。組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、A549宿主細胞を溶解すること、ヌクレアーゼ処理およびイオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーの1つ以上を含み得る。ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、(i)A549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して処理された細胞溶解物を産生すること；および(iii)イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製することを含む。
【００１６】
該方法は、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための同等の方法よりも高い収率の組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、該方法は、工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、HEK293宿主細胞に導入すること、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で接着培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、工程(b)において、A549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも5x、10xまたは20x多い組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。
【００１７】
ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性Pea3結合部位の欠損を有するE1aプロモーターを含む。例えば、該ウイルスは、E1aの開始部位の約-300〜約-250上流に対応するヌクレオチドの欠失、例えばE1aの開始部位の-305〜-255または-304〜-255上流に対応するヌクレオチドの欠失を含み得る。ある態様において、該欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の195〜244に対応するヌクレオチドの欠失を含み、および/またはE1aプロモーターは配列GGTGTTTTGG (配列番号：2)を含む。
【００１８】
ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性TATAボックスの欠失、例えば完全なTATAボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む。例えば、ある態様において、該ウイルスは、それぞれAd5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド472〜475、468〜475、455〜552および353〜552に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-27〜-24、-31〜-24、-44〜+54または-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列CTAGGACTG (配列番号：3)、AGTGCCCG (配列番号：8)またはTATTCCCG (配列番号：9)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失したポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００１９】
ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、アデノウイルス5型E1aプロモーターの-29〜-26、-33〜-26、-44〜+52または-148〜+52に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列CTAGGACTG (配列番号：3)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失したポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００２０】
ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性CAATボックスの欠失、例えば完全なCAATボックスの欠失を有するE1aプロモーターを含む。例えば、ある態様において、該ウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド423〜431に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列TTCCGTGGCG (配列番号：10)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失したポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００２１】
ある態様において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、例えばE1b-19K挿入部位に挿入され得るトランスジーンをコードするヌクレオチド配列を含み、ここでE1b-19K挿入部位は、 E1b-19Kの開始部位とE1b-55Kの開始部位の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位とE1b-19Kの停止部位の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間またはAd5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、CTGACCTC (配列番号：4)とTCACCAGG (配列番号：5)の間に挿入され、例えば該ウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：4)、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列およびTCACCAGG (配列番号：5)を含む。
【００２２】
ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は外来性プロモーター配列に操作可能に連結されない。
【００２３】
ある態様において、該トランスジーンは、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択されるポリペプチドをコードする。
【００２４】
ある態様において、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、過増殖性細胞において選択的に複製し得るかおよび/または過増殖性細胞においてトランスジーンを選択的に発現し得る。過増殖性細胞は癌細胞であり得る。
【００２５】
別の局面において、本発明は、本明細書に開示される方法により産生される組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを提供する。
【００２６】
別の局面において、本発明は、癌の治療を必要とする被験体において癌を治療する方法を提供し、該方法は、該被験体に、本明細書に開示される方法により産生される組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの有効量を投与して、該被験体において癌を治療する工程を含む。
【００２７】
本発明のこれらのおよび他の局面および利点は、以下の図面、詳細な説明および特許請求の範囲により説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図面の説明
本発明は、以下の図面を参照してより完全に理解され得る。
【図１】図1は、示されるウイルスを用いた処置後のマウスにおける平均腫瘍体積を示す折れ線グラフである。
【図２】図2は、示されるウイルスを用いて処置したマウスの進行がない生存を示す折れ線グラフである。進行は200mm3を越える腫瘍体積として規定される。
【図３】図3は、HEK-293由来細胞株およびSF-BMAdR 281 (A549由来)細胞株からのウイルス産生を示す。改変されないA549細胞は血清非含有懸濁培養に適合できなかったので、改変されないA549細胞について結果は利用可能でなかった。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本発明は部分的に、A549宿主細胞、例えばSF-BMAdR 281 A549宿主細胞を、多くの組み換えウイルス、例えば腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するために使用し得るという発見に基づく。驚くべきことに、特定の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、血清非含有および懸濁適合性A549細胞中、複製を許容する環境において、ウイルスベクター産生に広く使用されるHEK293細胞よりも高い密度まで、増殖することが見出された。
【００３０】
したがって、一局面において、本発明は、(a)A549宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて、感染したA549宿主細胞を産生する工程；および(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換えウイルスを産生する工程を含む、組み換えウイルスを産生するための方法を提供する。ある態様において、該組み換えウイルスはアデノウイルス、例えば5型アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである。ある態様において、該組み換えウイルスは組み換え腫瘍崩壊性ウイルスである。ある態様において、該組み換えウイルスは組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスである。
【００３１】
別の局面において、本発明は、(a)A549宿主細胞に組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを感染させて、感染したA549宿主細胞を産生する工程、および(b)感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法を提供する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、(a)組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、A549宿主細胞に導入する工程、および(b)A549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養して、それにより組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生する工程を含む、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを産生するための方法を提供する。該核酸は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えばリポソーム系トランスフェクション、化学物質系トランスフェクション(例えばリン酸カルシウム、カチオン性ポリマー、DEAE-5デキストランまたは活性化デンドリマーを利用する)、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ナノパーティクルまたは細胞圧搾を使用して、細胞に導入され得る。該核酸は、例えばプラスミドの一部であり得るか、または例えば1つより多いプラスミドの一部であり得る。
【００３３】
前述の方法のいずれかのある態様において、A549宿主細胞はSF-BMAdR 281 A549宿主細胞である。
【００３４】
A549宿主細胞、例えば感染したA549宿主細胞は、少なくとも1日間、少なくとも2日間、少なくとも3日間、少なくとも4日間、少なくとも5日間、少なくとも6日間または少なくとも7日間培養され得る。
【００３５】
産生後、ウイルス粒子は、培養物から回収され、任意に精製される。典型的な精製工程としては、遠心分離、例えば塩化セシウム勾配遠心分離、清澄化、酵素処理、例えばヌクレアーゼもしくはプロテアーゼ処理、クロマトグラフィー工程、例えばイオン交換クロマトグラフィー(例えば陰イオン交換クロマトグラフィー)、またはろ過工程が挙げられ得る。したがって、ある態様において、前述の方法のいずれかは、工程(b)の後に、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程をさらに含む。組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、A549宿主細胞、例えば感染したA549宿主細胞を溶解すること、ヌクレアーゼ処理、および/またはイオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーを含み得る。ある態様において、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを精製する工程は、(i)A549宿主細胞、例えば感染したA549宿主細胞を溶解して細胞溶解物を産生すること；(ii)細胞溶解物をヌクレアーゼで処理して処理された細胞溶解物を産生すること；および(iii)イオン交換クロマトグラフィー、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより処理された細胞溶解物から組み換えウイルスを精製することを含む。
【００３６】
ある態様において、前述の方法のいずれかは、組み換えウイルスを産生するための同等の方法よりも高い収率の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、方法は、異なる宿主細胞型を使用する以外は同じ方法である同様の方法と比較して、より高い収率の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。ウイルス収率は、例えばqPCR、免疫細胞化学またはルシフェラーゼレポーターアッセイを含む当該技術分野において公知の任意の方法によりアッセイされ得る。
【００３７】
例えば、ある態様において、方法は、工程(a)において、HEK293宿主細胞に組み換えウイルスを感染させて、感染したHEK293宿主細胞を産生すること、および工程(b)において、感染したHEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも2x、少なくとも3x、少なくとも4x、少なくとも5x、少なくとも10x、少なくとも15x、少なくとも20x、少なくとも25xまたは少なくとも30x多い組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、方法は、工程(a)において、組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、HEK293宿主細胞に導入すること、および工程(b)において、HEK293宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも2x、少なくとも3x、少なくとも4x、少なくとも5x、少なくとも10x、少なくとも15x、少なくとも20x、少なくとも25xまたは少なくとも30x多い組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。
【００３８】
ある態様において、該方法は、懸濁培養の代わりに接着培養を使用する以外は同じ方法である同様の方法と比較して、より高い収率の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、該方法は、工程(b)において、A549宿主細胞、例えば感染したA549宿主細胞を、血清非含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で接着培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも2x、少なくとも3x、少なくとも4x、少なくとも5x、少なくとも10x、少なくとも15x、少なくとも20x、少なくとも25xまたは少なくとも30x多い組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。ある態様において、該方法は、血清非含有培地の代わりに血清含有培地を使用する以外は同じ方法である同様の方法と比較して、より高い収率の組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じ得る。例えば、ある態様において、該方法は、工程(b)において、A549宿主細胞、例えば感染したA549宿主細胞を、血清含有培地中、組み換えウイルスの複製を可能にする条件(例えば複製を許容する環境)下で懸濁培養することを含む同様の方法(例えば他の点では同一の方法)と比較して、少なくとも2x、少なくとも3x、少なくとも4x、少なくとも5x、少なくとも10x、少なくとも15x、少なくとも20x、少なくとも25xまたは少なくとも30x多い組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスを生じる。
【００３９】
ある態様において、方法はさらに、A549宿主細胞と、エピジェネティック剤(epigenetic agent)、例えばDNMT、HDACおよび/またはチロシンキナーゼ阻害剤を接触させることを含む。例示的なエピジェネティック剤としては、ボリノスタット、ロミデプシン、アザシチジン、デシタビン、RRx-001およびCUDC-101が挙げられる。ある態様において、方法はさらに、A549宿主細胞とインターフェロンを接触させることを含む。ある態様において、方法はさらに、A549宿主細胞と酸化防止剤、例えばビタミンC、ビタミンE、グルタチオンまたはN-アセチルシステインを接触させることを含む。
【００４０】
本発明の種々の特徴および局面を以下でより詳細に議論する。
【００４１】
I. ウイルス
用語「ウイルス」は、タンパク質合成機構またはエネルギー生成機構を有さない偏性細胞内寄生体のいずれかをいうために本明細書において使用される。ウイルスのゲノムはRNAまたはDNAであり得る。組み換えにより改変されたウイルスは、本明細書において「組み換えウイルス」と称される。組み換えウイルスは、例えば複製欠陥、条件的複製もしくは複製コンピテントとなるように組み換えDNA技術により改変され得るか、および/または外来性トランスジーンの発現を含むように組み換えDNA技術により改変され得る。親ベクターの特性のそれぞれの有利な要素を利用するキメラウイルスベクター(例えばFeng et al. (1997) NATURE BIOTECHNOLOGY 15:866-870参照)も、本発明の実施に有用であり得る。治療される種由来のウイルスを使用することが一般的に好ましいが、ある例において、好ましい病原性特徴を有する異なる種由来のベクターを使用することが有利であり得る。
【００４２】
ある態様において、組み換えウイルスは、腫瘍崩壊性ウイルス、例えば腫瘍選択的複製および/またはウイルス媒介性溶解を示すウイルスである。ある態様において、腫瘍崩壊性ウイルスは、遺伝子、例えばトランスジーンの選択的な発現を可能にする。例えば、ある態様において、ウイルスは、新形成細胞において遺伝子の発現を可能にするが、正常細胞において発現を弱める。ある態様において、非過増殖性細胞における遺伝子の発現は、過増殖性細胞における発現の約90%、約80%、約70%、約60%、約50%、約40%、約30%、約20%、約10%または約5%である。ある態様において、ウイルスは、非過増殖性細胞において検出可能な遺伝子の発現を示さない。遺伝子発現は、当該技術において公知の任意の適切な方法、例えばウエスタンブロットまたはELISAにより決定され得る。過増殖性細胞は、癌細胞、例えば癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、前立腺癌、肺癌、胃腸管癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、甲状腺癌、中皮腫、肝臓癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、または脳癌の細胞であり得る。
【００４３】
ある態様において、組み換えウイルスはアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスである。ある態様において、組み換えウイルスはアデノウイルスである。アデノウイルスは、ヌクレオカプシドおよび二本鎖線状DNAゲノムで構成される、中程度の大きさ(90〜100nm)のエンベロープを有さない(ネイキッド)正二十面体ウイルスである。アデノウイルスは、宿主の複製機構を使用して哺乳動物細胞の核内で複製する。用語「アデノウイルス」は、アデノウイルス属(genus Adenoviridiae)の任意のウイルスをいい、限定されないが、ヒト、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ブタ、マウスおよびサルのアデノウイルス亜属が挙げられる。特に、ヒトアデノウイルスとしてはA〜F亜属およびそれらの個々の血清型が挙げられ、個々の血清型およびA〜F亜属としては限定されないが、ヒトアデノウイルスの1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11(Ad11aおよびAd11p)、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48および91型が挙げられる。ヒトアデノウイルスの2および5型由来の組み換えウイルスが好ましい。そうではないと記載されない限り、全てのアデノウイルス5型ヌクレオチド番号は、本明細書において配列番号：1に示されるNCBI参照配列AC_000008.1に関連する。
【００４４】
アデノウイルス複製サイクルは2つの段階：4つの転写単位E1、E2、E3およびE4が発現される初期段階ならびにウイルスDNA合成の開始後、後期転写産物が主要後期プロモーター(major late promoter)(MLP)から主に発現される際に起こる後期段階を有する。後期メッセージは、ウイルスの構造タンパク質のほとんどをコードする。E1、E2およびE4の遺伝子産物は、転写活性化、細胞形質転換、ウイルスDNA複製およびその他のウイルス機能の原因であり、ウイルス増殖に必要である。
【００４５】
用語「操作可能に連結された」は、機能的な関係におけるポリヌクレオチド要素の連結をいう。核酸配列は、別の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に「操作可能に連結される」。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、遺伝子の転写に影響を及ぼす場合に、遺伝子に操作可能に連結される。操作可能に連結されたヌクレオチド配列は典型的に連続である。しかしながら、プロモーターから数キロベース離れ、イントロン配列が可変的な長さであり得る場合にエンハンサーは一般的に機能するので、いくつかのポリヌクレオチド要素は操作可能に連結され得るが、直接的に隣り合わず、異なる対立遺伝子または染色体からトランスに機能さえもし得る。
【００４６】
ある態様において、組み換えウイルスは、制御配列またはプロモーターに対して1つ以上の改変を有する。制御配列またはプロモーターに対する改変は、制御配列またはプロモーターの野生型配列と比較して1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または付加を含む。
【００４７】
ある態様において、制御配列またはプロモーターの改変は、例えば転写因子結合部位の配列の一部を欠失することによりまたは該結合部位に1つの点変異を挿入することにより、転写因子に対する親和性を低減するために、転写因子結合部位の配列の改変を含む。ある態様において、さらなる改変された制御配列は、新形成細胞における発現を高めるが、正常細胞における発現を弱める。
【００４８】
ある態様において、改変された制御配列は、タンパク質をコードする配列に操作可能に連結される。ある態様において、アデノウイルス性E1aおよびE1b遺伝子(コーディング領域)の少なくとも1つは、改変された制御配列に操作可能に連結される。ある態様において、E1a遺伝子は、改変された制御配列に操作可能に連結される。
【００４９】
E1a制御配列は、Pea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 Vと命名される転写因子Pea3に対する5つの結合部位を含み、Pea3 Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるPea3結合部位であり、Pea3 Vは最も遠位にある。E1a制御配列はまた、本明細書でE2F IおよびE2F IIと命名される転写因子E2Fに対する結合部位を含み、E2F Iは、E1a開始部位に対して最も近位にあるE2F結合部位であり、E2F IIはより遠位にある。結合部位はE1a開始部位から以下のように整列される：Pea3 I、E2F I、Pea3 II、E2F II、Pea3 III、Pea3 IVおよびPea3 V。
【００５０】
ある態様において、これらの7つの結合部位または機能性結合部位の少なくとも1つが欠失される。本明細書で使用する場合、「機能性結合部位」は、それぞれの結合パートナー、例えば転写因子に結合し得る結合部位、例えば対応する野生型結合部位配列の結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有する結合部位をいう。本明細書で使用する場合、「非機能性結合部位」は、例えば対応する野生型結合部位配列の結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有する結合部位をいう。
【００５１】
ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性Pea3結合部位の欠失、例えばPea3結合部位全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性Pea3結合部位」は、そのそれぞれの転写因子(例えばPea3)に結合し得るPea3結合部位、例えば対応する野生型Pea3結合部位配列のPea3結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するPea3結合部位をいう。本明細書で使用する場合、「非機能性Pea3結合部位」は、例えば対応する野生型Pea3結合部位配列のPea3結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するPea3結合部位をいう。Pea3結合部位がPea3に結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００５２】
ある態様において、少なくとも1つのPea3結合部位または機能性Pea3結合部位が欠失される。欠失されるPea3結合部位はPea3 I、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vであり得る。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IVおよび/またはPea3 Vである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IIおよび/またはPea3 IIIである。ある態様において、欠失されるPea3結合部位はPea3 IIおよびPea3 IIIの両方である。ある態様において、Pea3 I結合部位または機能性Pea3結合部位は保持される。
【００５３】
ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位または機能性E2F結合部位が欠失される。ある態様において、少なくとも1つのE2F結合部位または機能性E2F結合部位は保持される。ある態様において、保持されるE2F結合部位はE2F Iおよび/またはE2F IIである。ある態様において、保持されるE2F結合部位はE2F IIである。ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、少なくとも1つのE2F結合部位またはその機能性部分の欠失を含み得、Pea3結合部位の欠失を含まない。ある態様において、全欠失は本質的に、Pea3 II、Pea3 III、Pea3 IVおよび/またはPea3 Vの1つ以上からなる。ある態様において、ウイルスは、例えばAd5ゲノム(配列番号：1)の195〜244に対応するE1a開始部位の-304〜-255上流に位置する50塩基対の領域の欠失を有し、以降TAV-255欠失と称される。ある態様において、TAV-255欠失は、配列GGTGTTTTGG(配列番号：2)を含むE1aプロモーターを生じる。
【００５４】
ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性TATAボックスの欠失、例えばTATAボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性TATAボックス」は、TATAボックス結合タンパク質(TBP)に結合し得るTATAボックス、例えば対応する野生型TATAボックス配列のTBP結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するTATAボックスをいう。本明細書で使用する場合、「非機能性TATAボックス」は、例えば対応する野生型TATAボックス配列のTBP結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するTATAボックスをいう。TBPがTATAボックスに結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野において公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００５５】
例えば、ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、それぞれAd5ゲノム(配列番号：1)のヌクレオチド472〜475、468〜475、455〜552および353〜552に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-27〜-24、-31〜-24、-44〜+54または-146〜+54に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、アデノウイルス5型E1aプロモーターの-29〜-26、-33〜-26、-44〜+52または-148〜+52に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、Ad5ゲノム(配列番号：1)の353〜552に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結から生じる配列CTAGGACTG (配列番号：3)、AGTGCCCG (配列番号：8)またはTATTCCCG (配列番号：9)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失したポリヌクレオチド配列に隣り合う。ある態様において、該ウイルスは、配列CTAGGACTG (配列番号：3)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含む。
【００５６】
ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、機能性CAATボックスの欠失、例えばCAATボックス全体の欠失を有するE1aプロモーターを含む。本明細書で使用する場合、「機能性CAATボックス」は、C/EBPまたはNF-Yタンパク質に結合し得るCAATボックス、例えば対応する野生型CAATボックス配列のC/EBPまたはNF-Y結合活性の少なくとも100%、少なくとも90%、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、少なくとも50%または少なくとも40%を有するCAATボックスをいう。本明細書で使用する場合、「非機能性CAATボックス」は、例えば対応する野生型CAATボックス配列のC/EBPまたはNF-Y結合活性の30%未満、20%未満、10%未満または0%を有するCAATボックスをいう。C/EBPまたはNF-Yタンパク質がCAATボックスに結合するかどうかを決定するためのアッセイは当該技術分野で公知である。例示的な結合アッセイとしては、電気泳動移動度シフトアッセイ、クロマチン免疫沈降アッセイおよびDNAseフットプリンティングアッセイが挙げられる。
【００５７】
例えば、ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド423〜431に対応するアデノウイルス5型E1aプロモーターの-76〜-68に対応するヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、該ウイルスは、2つのポリヌクレオチド配列の連結により生じる配列TTCCGTGGCG (配列番号：10)を含むウイルスを生じるポリヌクレオチド欠失を含み、該2つのポリヌクレオチド配列は、そうでなければ欠失したポリヌクレオチド配列に隣り合う。
【００５８】
アデノウイルスE1b-19k遺伝子は主に抗アポトーシス遺伝子として機能し、細胞性抗アポトーシス遺伝子BCL-2のホモログである。子孫ウイルス粒子の成熟の前の宿主細胞死はウイルス複製を制限するので、E1b-19kは、成熟前の細胞死を防ぎ、それにより感染を進行させ成熟ビリオンを生成させるためのElカセットの一部として発現される。したがって、ある態様において、E1b-19K挿入部位を含む組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが提供され、例えば該組み換えアデノウイルスは、E1b-19K挿入部位に挿入されたトランスジーンをコードするヌクレオチド配列を有する。ある態様において、該挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19Kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-55Kの開始部位(すなわちE1b-55kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド2019〜2021に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位(すなわちE1b-19Kの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド1714〜1716に対応するヌクレオチド配列)とE1b-19Kの停止部位(すなわちE1b-19kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド2242〜2244に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。
【００５９】
明細書および特許請求の範囲を通して、2つの部位の間の挿入、例えば(i)第1の遺伝子(例えばE1b-19k)の開始部位と第2の遺伝子(例えばE1b-55K)の開始部位、(ii)第1の遺伝子の開始部位と第2の遺伝子の停止部位、(iii)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の開始部位、または(iv)第1の遺伝子の停止部位と第2の遺伝子の停止部位の間の挿入は、挿入の周囲にある所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部または一部が最終的なウイルス内に存在し得るかまたは非存在であり得ることを意味することが理解される。同様に、2つのヌクレオチドの間の挿入は、挿入の周囲にあるヌクレオチドが最終的なウイルス内に存在し得るかまたは非存在であり得ることを意味することが理解される。
【００６０】
ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約100〜約305、約100〜約300、約100〜約250、約100〜約200、約100〜約150、約150〜約305、約150〜約300、約150〜約250または約150〜約200ヌクレオチド由来の欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、E1b-19Kの開始部位に隣接する約200ヌクレオチド、例えば202または203ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E1b-19K挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド1714〜1917または1714〜1916に対応する欠失を含む。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の1714に対応するヌクレオチドと1917に対応するヌクレオチドの間または1714に対応するヌクレオチドと1916に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列はCTGACCTC (配列番号：4)とTCACCAGG (配列番号：5)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CTGACCTC (配列番号：4)、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列およびTCACCAGG (配列番号：5)を含む。CTGACCTC (配列番号：4)およびTCACCAGG (配列番号：5)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE1b-19K挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。明細書および特許請求の範囲を通して、部位に隣接する欠失、例えば遺伝子の開始部位に隣接する欠失または遺伝子の停止部位に隣接する欠失は、該欠失が所定の開始部位または停止部位を構成するヌクレオチドの全部、一部またはゼロ個の(none)欠失を含み得ることを意味すると理解される。
【００６１】
ある態様において、E3挿入部位を含む組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスが提供され、例えば組み換えアデノウイルスは、E3挿入部位に挿入されたトランスジーンをコードするヌクレオチド配列を有する。ある態様において、挿入部位は、pVIIIの停止部位(すなわちpVIIIの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド27855〜27857に対応するヌクレオチド配列)とFiberの開始部位(すなわちFiberの開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド31042〜31044に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、約500〜約3185、約500〜約3000、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約3185、約1000〜約3000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約3185、約1500〜約3000、約1500〜約2000、約2000〜約3185、約2000〜約3000、約2000〜約2500、約2500〜約3185、約2500〜約3000または約3000〜約3185ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位(すなわちE3-10.5Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29770〜29772に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約500〜約1551、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1551、約1000〜約1500または約1500〜約1551ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する約1050ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE3挿入部位は、E3-10.5Kの停止部位に隣接する1063または1064ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5 dl309 E3欠失に対応する欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29773〜30836に対応する欠失を含むか、またはトランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の29773に対応するヌクレオチドと30836に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列はCAGTATGA (配列番号：11)とTAATAAAAAA (配列番号：12)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、CAGTATGA (配列番号：11)、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列およびTAATAAAAAA (配列番号：12)を含む。CAGTATGA (配列番号：11)およびTAATAAAAAA (配列番号：12)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE3挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。
【００６２】
ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位(すなわちE3-gp19Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド29215〜29217に対応するヌクレオチド配列)とE3-14.7Kの停止部位(すなわちE3-14.7Kの停止コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド30837〜30839に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約500〜約1824、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約1824、約1000〜約1500または約1500〜約1824ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する約1600ヌクレオチドの欠失を含む。例えばE3挿入部位は、E3-gp19Kの停止部位に隣接する1622ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E3挿入部位は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド29218〜30839に対応する欠失を含む。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、Ad5ゲノム (配列番号：1)の29218に対応するヌクレオチドと30839に対応するヌクレオチドの間に挿入される。ある態様において、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列は、TGCCTTAA (配列番号：13)とTAAAAAAAAAT (配列番号：14)の間に挿入され、例えば組み換えアデノウイルスは、5'〜3'の方向で、TGCCTTAA (配列番号：13)、トランスジーンをコードするヌクレオチド配列およびTAAAAAAAAAT (配列番号：14)を含む。TGCCTTAA (配列番号：13)およびTAAAAAAAAAT (配列番号：14)は、Ad5ゲノム (配列番号：1)内にE3挿入部位に対する特有の境界配列を画定する。
【００６３】
ある態様において、組み換えアデノウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスはE4欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位(すなわちE4-ORF6/7の開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド34075〜34077に対応するヌクレオチド配列)と右逆方向末端反復(right inverted terminal repeat) (ITR；例えば配列番号：1のヌクレオチド35836〜35938に対応する)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位(すなわちE4-ORF1の開始コドンをコードする、例えば配列番号：1のヌクレオチド35524〜35526に対応するヌクレオチド配列)の間に配置される。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位とE4-ORF1の開始部位の間のヌクレオチド配列の欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、約500〜約2500、約500〜約2000、約500〜約1500、約500〜約1000、約1000〜約2500、約1000〜約2000、約1000〜約1500、約1500〜約2500、約1500〜約2000または約2000〜約2500ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約250〜約1500、約250〜約1250、約250〜約1000、約250〜約750、約250〜約500、500〜約1500、約500〜約1250、約500〜約1000、約500〜約750、750〜約1500、約750〜約1250、約750〜約1000、約1000〜約1500または約1000〜約1250ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1450ヌクレオチドの欠失を含み、例えばE4欠失は、E4-ORF6/7の開始部位に隣接する約1449ヌクレオチドの欠失を含む。ある態様において、E4欠失は、Ad5ゲノム (配列番号：1)のヌクレオチド34078〜35526に対応する欠失を含む。
【００６４】
ウイルス遺伝子をコードする核酸をプラスミドに組み込み得、従来のトランスフェクションまたは形質転換技術により宿主細胞に導入し得る。特定の産生および精製の条件は、使用するウイルスおよび産生系に応じて変化する。アデノウイルスについて、ウイルス粒子の生成のための従来の方法は、その後のシャトルプラスミド(通常アデノウイルスゲノムの小サブセットを含み、任意に、あり得るトランスジーン発現カセットを含む)およびアデノウイルスヘルパープラスミド(全アデノウイルスゲノムのほとんどを含む)のインビボ組換えへと続く共トランスフェクションである。アデノウイルスの生成のための代替的な技術としては、細菌人工染色体(BAC)系、相補的アデノウイルス配列を含む2つのプラスミドを利用するrecA÷細菌株におけるインビボ細菌組換え、および酵母人工染色体(YAC)系の利用が挙げられる。
【００６５】
II. 治療的トランスジーン
本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、治療的トランスジーンをコードする外来性ヌクレオチド配列を含み得る。用語「トランスジーン」は、外来性遺伝子またはポリヌクレオチド配列をいう。用語「治療的トランスジーン」は、ウイルス内で複製および/またはウイルスにより発現された場合に標的細胞、体液、組織、臓器、生理学系または被験体において治療的効果を付与するトランスジーンをいう。
【００６６】
治療的トランスジーンは、治療的核酸、例えばアンチセンスRNAまたはリボザイムRNAをコードし得る。治療的トランスジーンは、治療的ペプチドまたはポリペプチド、例えばアポトーシス因子、抗体、CTL応答性ペプチド、サイトカイン、細胞溶解剤、細胞傷害剤、酵素、免疫応答を誘発するために腫瘍細胞の表面上に発現される異種抗原、免疫刺激剤もしくは免疫調節剤、インターフェロン、溶解性ペプチド、癌タンパク質、細胞死を誘導するプロセスを触媒するポリペプチド、体細胞における遺伝的欠陥を補うポリペプチド、腫瘍サプレッサータンパク質、ワクチン抗原またはそれらの任意の組合せをコードし得る。
【００６７】
ある態様において、治療的トランスジーンは、CD80、CD137L、IL-23、IL-23A/p19、p40、IL-27、IL-27A/p28、IL-27B/EBI3、ICAM-1、TGF-βトラップ、TGF-β、CD19、CD20、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、CD154、CD86、BORIS/CTCFL、FGF、IL-24、MAGE、NY-ESO-1、アセチルコリン、インターフェロンγ、DKK1/Wnt、p53、チミジンキナーゼ、抗PD-1抗体重鎖または軽鎖、および抗PD-L1抗体重鎖または軽鎖から選択される治療的ポリペプチドをコードする。
【００６８】
III. 医薬組成物
治療的使用のために、本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、好ましくは薬学的に許容可能な担体と合わされる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な担体」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を有さず、妥当な利益/リスク比と釣り合ったヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切なバッファ、担体および賦形剤を意味する。担体(1つまたは複数)は、製剤の他の成分と適合性であり、レシピエントに対して有害でないという意味において「許容可能である」べきである。薬学的に許容可能な担体としては、医薬投与に適合性であるバッファ、溶媒、分散媒、コーティング、等張および吸収遅延剤等が挙げられる。薬学的に活性な物質についてのかかる媒体および剤の使用は当該技術分野で公知である。
【００６９】
組み換えウイルスを含む医薬組成物は、単位剤型で存在し得、任意の適切な方法で調製され得る。医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤化されるべきである。投与経路の例は、静脈内(IV)、動脈内、皮内、吸入、経皮、局所、経粘膜および直腸投与である。好ましい投与経路はIV注射である。有用な製剤は、医薬の分野で公知の方法により調製され得る。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed. (Mack Publishing Company, 1990)参照。非経口投与に適した製剤化成分としては、注射用水、食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；EDTAなどのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファ；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性の調整のための剤が挙げられる。
【００７０】
静脈内投与について、適切な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化食塩水(PBS)が挙げられる。担体は、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、微生物に対して保護されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール)、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。
【００７１】
好ましくは、医薬製剤は滅菌されている。滅菌は、任意の適切な方法、例えば滅菌濾過膜を用いた濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、濾過滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われ得る。
【００７２】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、有益または望ましい結果をもたらすのに十分な活性成分の量(例えば組み換えウイルスの量)をいう。有効量は1つ以上の投与、適用または用量で投与され得、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。
【００７３】
ある態様において、活性成分の治療有効量は、0.1mg/kg〜100mg/kg、例えば1mg/kg〜100mg/kg、1mg/kg〜10mg/kgの範囲内である。ある態様において、組み換えウイルスの治療有効量は、102〜1015プラーク形成単位(pfu)、例えば102〜1010、102〜105、105〜1015、105〜1010または1010〜1015プラーク形成単位の範囲内である。投与される量は、治療される疾患または徴候(indication)の型および程度、患者の全体的な健康、ウイルスのインビボ効力、医薬製剤ならびに投与経路等の変数に依存する。所望の血液レベルまたは組織レベルを迅速に達成するために、初期用量は高い方のレベルを超えて増加され得る。代替的に、初期用量は最適よりも小さくあり得、日用量は治療の過程の間に段々に増加され得る。ヒト用量は、例えば0.5mg/kg〜20mg/kgで実施するように設計される従来の第I相用量増加試験において最適化され得る。投与頻度は、投与経路、投与量、ウイルスの血清半減期および治療されている疾患などの要因に応じて変化し得る。例示的な投与頻度は、1日に1回、1週間に1回および2週間毎に1回である。好ましい投与経路は非経口、例えば静脈内注射である。
【００７４】
IV. 治療的使用
組み換えウイルス、例えば本明細書に開示される方法を使用して産生された組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、種々の医学的徴候、例えば癌を治療するために使用され得る。本明細書で使用する場合、「治療する(treat)」、「治療すること(treating)」および「治療(treatment)」は、被験体、例えばヒトにおける疾患の治療を意味する。これは、(a)疾患を阻害すること、すなわちその進展を止めること；および(b)疾患を軽減すること、すなわち疾患状態の後退を引き起こすことを含む。本明細書で使用する場合、用語「被験体」および「患者」は、本明細書に記載される方法および組成物により治療される生物をいう。好ましくは、かかる生物としては限定されないが、哺乳動物(例えば、マウス、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ等)、およびより好ましくはヒトが挙げられる。
【００７５】
癌の例としては、固形腫瘍、軟組織腫瘍、血液の腫瘍および転移性の病変が挙げられる。血液の腫瘍の例としては、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、B細胞、T細胞またはFAB ALL、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、例えば変形(transformed)CLL、びまん性大B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、毛様細胞性白血病、骨髄異形成症候群(myelodyplastic syndrome)(MDS)、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫またはリクター症候群(リクター形質転換(Richter's Transformation))が挙げられる。固形腫瘍の例としては悪性疾患、例えば種々の臓器系の肉腫、腺癌および癌腫、例えば頭頸部(咽頭を含む)、甲状腺、肺(小細胞または非小細胞肺癌(NSCLC))、乳房、リンパ系、胃腸(例えば口腔、食道、胃、肝臓、膵臓、小腸、結腸および直腸、および肛門(canal))、生殖器および尿生殖器管(例えば腎臓、尿路上皮、膀胱、卵巣、子宮、子宮頸、子宮内膜、前立腺、精巣)、CNS(例えば神経またはグリア細胞、例えば神経芽腫または神経膠腫)、または皮膚(例えば黒色腫)を冒すものが挙げられる。
【００７６】
ある態様において、癌は、黒色腫、皮膚の扁平上皮癌、基底細胞癌、頭頸部癌、乳癌、肛門癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、中皮腫、小細胞肺癌、腎細胞癌、前立腺癌、胃食道癌、結腸直腸癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、肝細胞癌、胆管癌、脳癌、子宮内膜癌、神経内分泌癌および膵臓癌から選択される。
【００７７】
ある態様において、癌は、鼻咽頭癌、基底細胞癌、滑膜癌、肝細胞癌、腎臓癌、結合組織の癌、黒色腫、肺癌、腸癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、脳癌、咽頭癌、口腔癌、肝臓癌、骨癌、膵臓癌、絨毛癌、ガストリノーマ、神経内分泌、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、T細胞白血病/リンパ腫、神経腫、フォン・ヒッペル-リンダウ病、ゾリンジャー-エリソン症候群、副腎癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、脳癌、希突起膠腫、神経芽腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨癌、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発性部位の癌、カルチノイド、胃腸管のカルチノイド、線維肉腫、乳癌、パジェット病、子宮頸癌、結腸直腸癌、直腸癌、食道癌、胆嚢癌、頭部癌、眼の癌、頸部癌、腎臓癌、ウィルムス腫瘍、肝臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、肺癌、精巣癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、皮膚癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、内分泌膵臓癌、グルカゴノーマ、膵臓癌、副甲状腺癌、陰茎癌、下垂体癌、軟組織肉腫、網膜芽腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、甲状腺癌、栄養膜の癌、胞状奇胎、子宮癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、聴神経腫、菌状息肉腫、インスリノーマ、カルチノイド症候群、ソマトスタチノーマ、歯肉癌、心臓癌、唇の癌、髄膜癌、口の癌、神経癌、口蓋の癌、耳下腺癌、腹膜癌、咽頭癌、胸膜癌、唾液腺癌、舌癌および扁桃癌から選択される。
【００７８】
ある態様において、組み換えウイルス、例えば組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスは、1つ以上の治療、例えば手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法またはウイルス療法と組み合わせて被験体に投与される。ある態様において、組み換えウイルスは、チミジンキナーゼ阻害剤、例えばエルロチニブと組み合わせて投与される。ある態様において、本発明の組み換えウイルスは、チェックポイント阻害剤、例えば抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて投与される。例示的な抗PD-1抗体としては、例えばニボルマブ(Opdivo(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Co.)、ペンブロリズマブ(Keytruda(登録商標)、Merck Sharp & Dohme Corp.)、PDR001 (Novartis Pharmaceuticals)およびピジリズマブ(pidilizumab) (CT-011、Cure Tech)が挙げられる。例示的な抗PD-L1抗体としては、例えばアテゾリズマブ(Tecentriq(登録商標)、Genentech)、デュバルマブ(duvalumab) (AstraZeneca)、MEDI4736、アベルマブおよびBMS 936559 (Bristol Myers Squibb Co.)が挙げられる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」投与されるは、被験体の障害による苦痛の過程で、患者に対する治療の効果がある時点で(at a point in time)重複するように、2つ(またはそれ以上)の異なる治療を被験体に送達することを意味することが理解される。ある態様において、1つの治療の送達は、第2の送達が開始された場合に依然として行われているので、投与期間の重複がある。これは本明細書において時々「同時(simultaneous)」または「同時(concurrent)送達」と称される。他の態様において、1つの治療の送達は、他の治療の送達が開始する前に終了する。いずれかの場合のいくつかの態様において、組合せの投与のために治療はより効果的になる。例えば、第2の治療はより効果的であり、例えばより少ない第2の治療で同等の効果が見られるか、または第2の治療は、第2の治療を第1の治療の非存在下で投与した場合に見られるよりも大きな程度に症状を低減し、または第1の治療により同様の状況が見られる。ある態様において、送達は、症状または障害に関連のある他のパラメーターの低減がもう一方の治療の非存在下で1つの治療を送達した場合に観察されるものよりも大きくなるようなものである。2つの治療の効果は、部分的に相加的、全体的に相加的または相加的よりも大きくあり得る。送達は、送達される第1の治療の効果が第2のものを送達する場合に依然として検出可能であるようなものであり得る。
【００８０】
明細書を通して、ウイルス、組成物および系が特定の成分を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、またはプロセスおよび方法が特定の工程を有する、含む(including)または含む(comprising)と記載される場合、追加的に、記載される成分から本質的になるかまたは記載される成分からなる本発明の組成物、デバイスおよび系があることならびに記載されるプロセス工程から本質的になるかまたは記載されるプロセス工程からなる本発明のプロセスおよび方法があることが企図される。
【００８１】
本願において、要素もしくは成分が記載される要素もしくは成分のリストに含まれるおよび/または該リストから選択されるといわれる場合、要素もしくは成分は、記載される要素もしくは成分のいずれか1つであり得るか、または要素もしくは成分は記載される要素もしくは成分の2つ以上からなる群より選択され得ることが理解されるべきである。
【００８２】
さらに、本明細書に記載されるウイルス、組成物、系、方法またはプロセスの要素および/または特徴は、本明細書において明示的であるか黙示的であるのいずれにせよ、本発明の精神および範囲を逸脱することなく種々の方法で組み合され得ることが理解されるべきである。例えば、特定のウイルスについて参照がなされる場合、該ウイルスは、文脈からそうではないと理解されない限り、本発明の組成物および/または本発明の方法の種々の態様で使用され得る。すなわち、本願の範囲内で、態様は、明確かつ簡潔な適用が記載および図示されるのを可能にする様式で記載され、示されるが、態様は、本教示および発明(1つまたは複数)から逸脱することなく、種々に組み合され得るかまたは分離され得ることが意図され理解される。例えば、本明細書に記載されかつ示される全ての特徴は、本明細書に記載されかつ示される発明(1つまたは複数)の全ての局面に適用可能であり得ることが理解される。
【００８３】
文脈および用途からそうではないと理解されない限り、語句「の少なくとも1つ」は個々に、該語句の後に記載される物のそれぞれおよび記載される物の2つ以上の種々の組合せを含むことが理解されるべきである。3つ以上の記載される物に関しての語句「および/または」は、文脈からそうではないと理解されない限り、同じ意味を有することが理解されるべきである。
【００８４】
用語「含む(include)」、「含む(includes)」、「含む(including)」、「有する(have)」、「有する(has)」、「有する(having)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」または「含む(containing)」の使用は、それらの文法上の同等物を含めて、そうではないと具体的に記されるかまたは文脈から理解されない限り、一般的に開放型であり非限定的であり、例えば記載されないさらなる要素または工程を排除しないと理解されるべきである。
【００８５】
本明細書の種々の場所において、ウイルス、組成物、系、プロセスおよび方法またはそれらの特徴は、群または範囲において開示される。該記載は、かかる群および範囲の構成メンバーのそれぞれおよび全ての個々の下位組合せ(subcombination)を含むことが具体的に意図される。他の例として、1〜20の範囲の整数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19および20を個々に開示することが具体的に意図される。
【００８６】
用語「約」の使用が量的値の前にある場合、そうではないと具体的に記されない限り、本発明は特定の量的値自身も含む。本明細書で使用する場合、用語「約」は、そうではないと示されるかまたは推測されることがない限り、名目上の値から±10%の変動をいう。
【００８７】
工程の順序または特定の行為を行う順序は、本発明が実施可能なままである限りは重要ではないことが理解されるべきである。さらに、2つ以上の工程または行為は、同時に行われてもよい。
【００８８】
本明細書における任意および全ての例または例示的な用語、例えば「など(such as)」または「含む(including)」の使用は、単に本発明をよりよく説明することを意図し、特許請求されない限り本発明の範囲に対して限定を与えない。本明細書における用語は、任意の特許請求されない要素を本発明の実施についての必須のものとして示すと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８９】
実施例
以下の実施例は単なる例示であり、いかなる方法においても本発明の範囲または内容を限定することを意図しない。
【００９０】
実施例1: 腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生
この実施例には、A549細胞における組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生が記載される。
【００９１】
(米国特許第9,073,980号に以前に記載されるように)E1a開始部位の-304〜-255上流に配置されるヌクレオチド領域の欠失を保有し、E1a発現を癌選択的にするアデノウイルス5型ウイルスを構築した。得られたウイルスは、以降TAVと称する。
【００９２】
E1b-19k領域に約200塩基対の欠失を保有するようにTAVをさらに改変した。得られたウイルスは、以降TAV-Δ19kと称する。改変したE1b-19k領域のヌクレオチド配列は以下のとおりであり、融合したSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引く：
【化１】
2020516277.tif 000002
(配列番号：6)
【００９３】
TAV-Δ19kを、改変されたE1b-19k領域内にマウスTGF-βトラップ(マウスTGFβII型受容体とマウスIgG1の融合タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含むように改変した。得られたウイルスは、以降TAV-mTGFβ-トラップと称する。TGF-βトラップをコードするヌクレオチド配列は以下のとおりである：
【化２−１】
2020516277.tif 000003
【化２−２】
2020516277.tif 000004
(配列番号：7)
【００９４】
SF-BMAdR 281 A549細胞(National Research Council of Canadaから購入)を、浸透フラスコ中、懸濁培養において血清非含有培地(Hyclone SFM4Transfx-293)中で培養した。100mLの総体積中2x106細胞/mLの密度まで増殖させた後、細胞を遠心分離して、100mLの新しいSFM4Transfx-293培地に再懸濁した。50mLの再懸濁培養物にTAV-Δ19kアデノウイルスを感染させて、50mLの再懸濁培養物にTAV-mTGFβ-トラップアデノウイルスを感染させた。浸透フラスコ中、細胞を懸濁培養で3日間維持して、ウイルス複製を可能にし、次いで培養物を、凍結-融解サイクルにより溶解して細胞溶解物を得た。
【００９５】
次いで、遠心分離、ヌクレアーゼ処理、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびインビボ投与に適したバッファ(10mM Tris、1mM MgCl2、3%スクロース、pH8)への透析により細胞溶解物からウイルスを精製した。
【００９６】
次いで、インビボでの効力についてウイルスを試験した。成体129S4マウスに1x106 ADS-12細胞、肺癌細胞株を皮下注射して、皮下の腫瘍を形成させた。処置に十分なだけ大きく腫瘍が成長した後、10匹のマウスをそれぞれ、TAV-Δ19kアデノウイルスまたはTAV-mTGFβ-トラップアデノウイルスのいずれかの腫瘍内注射により処置した。1x109IUのそれぞれのウイルスの3用量を4日毎に投与した。それぞれのウイルスで処置したマウスにおける平均腫瘍体積を図1に示し、それぞれのウイルスで処置したマウスの進行がない生存を図2に示す。
【００９７】
実施例2: 腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生
この実施例には、HEK-293由来細胞と比較したA549由来細胞における組み換え腫瘍崩壊性アデノウイルスの産生が記載される。
【００９８】
(米国特許第9,073,980に以前に記載されるように)E1a開始部位の-304〜-255上流に配置されるヌクレオチド領域の欠失を保有し、E1a発現を癌選択的にするアデノウイルス5型ウイルスを構築した。得られたウイルスは、以降TAVと称する。
【００９９】
E1b-19k領域中に約200塩基対の欠失を保有するようにTAVをさらに改変した。得られたウイルスは、以降TAV-Δ19kと称する。改変したE1b-19k領域のヌクレオチド配列は以下のとおりであり、融合したSalIおよびXhoI部位由来の残存塩基に下線を引く：
【化３】
2020516277.tif 000005
(配列番号：6)
【０１００】
改変したE1b-19k領域中にヒトTGF-βトラップ(ヒトTGFβII型受容体とヒトIgG1の融合タンパク質)をコードするヌクレオチド配列を含むようにTAV-Δ19kを改変した。得られたウイルスは、以降TAV-hTGFβ-トラップと称する。
【０１０１】
TAV-hTGFβ-トラップアデノウイルスを、HEK-293細胞(293-3F6)およびA549細胞(SF-BMAdR)の両方で産生させた。血清非含有培地(SFM4Transfx-293)中5x105細胞/mLで培養したHEK-293細胞に、TAV-hTGFβ-トラップを3の感染多重度(MOI)で感染させた。感染後4日目に収率は42PFU/細胞であった。別の実験において、血清非含有培地(SFM4Transfx-293)中1x106細胞/mLで培養したHEK-293細胞に、TAV-hTGFβ-トラップを3のMOIで感染させた。感染後4日目に収率は10PFU/細胞未満であった。血清非含有培地(SFM4Transfx-293)中1x106細胞/mLで培養したA549細胞に、TAV-hTGFβ-トラップを3のMOIで感染させた。感染後4日目に収率は1100PFU/細胞であった。未改変のA549細胞は、懸濁培養において同じ血清非含有培地(SFM4Transfx-293)中の増殖に適合できなかった。これらの細胞株からのウイルス産生を図3に示す。
【０１０２】
まとめると、これらの結果は、A549由来宿主細胞、例えばSF-BMAdR A549宿主細胞は、より高い収率の特定の腫瘍崩壊性ウイルス、例えばTAV-hTGFβ-トラップアデノウイルスを産生することを示す。
【０１０３】
参照による援用
本明細書に参照される特許文献および科学論文のそれぞれの全開示は、全ての目的で参照により援用される。
【０１０４】
均等物
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態において具体化され得る。そのため、前述の態様は、全ての局面において本明細書に記載される発明の限定ではなく例示とみなされる。したがって、本発明の範囲は、前述の記載ではなく添付の特許請求の範囲により示され、特許請求の範囲の均等物の意味および範囲内にある全ての変更が本発明に含まれることが意図される。
【図１】
2020516277.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020516277.tif 000012
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