(57)【要約】石油・ガス産業、環境浄化及びその他用途に用いることのできる微生物ベースの組成物を生成するデバイス及び方法が提供される。このデバイス及び方法によって、現場の大規模発酵システムに接種するためのスケーラブルな浸水酵母培養物を生成することができる。デバイスは、支持フレームに装着された回転可能なドラムと、ドラムに接続され、ドラムを回転させるモータとを有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持フレームと、
前記支持フレームに装着された回転可能なドラムと、
前記ドラムに接続されたモータと
を含む発酵デバイスであって、前記モータが前記ドラムを回転させて、微生物を前記発酵デバイスの前記ドラムに添加し、前記発酵デバイスを操作して、前記微生物を発酵させる、前記発酵デバイスを提供し、
前記発酵デバイスを操作して、前記微生物を培養することを含む、微生物を培養する方法。
【請求項２】
前記ドラムに、前記微生物の栄養素を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記栄養素は、炭素源と窒素源とを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記栄養素は、タンパク質と、脂肪と、増殖因子とを含む、請求項２〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記増殖因子は、ビタミン、ｐＨ調整剤、又はその両方を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発酵デバイスは、前記ドラムの内側表面に、複数のバッフルをさらに含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記モータは、電気モータ又はガス動力モータである、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記発酵デバイスは、前記モータが接続されるバッテリをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記モータは、操作中、外部電源に接続されている、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記発酵デバイスは、前記フレームの下側部分に、複数のホイールをさらに含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記発酵デバイスは、前記ドラムの角度を調節する手段をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、回転軸と地面の角度が５°〜７５°の範囲となる位置にあるドラムにより操作することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、回転軸と地面の角度が１０°〜６０°の範囲となる位置にあるドラムにより操作することを含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記バッフルは、前記ドラムの回転軸に平行になるように配置される、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記バッフルは、前記ドラムの回転軸に垂直になるように配置される、請求項６〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを少なくとも１日間、連続的に操作することを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ドラムは、シリンダ又は変形シリンダの形状を有する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記ドラムの容積は、１０リットル〜１，５００リットルの範囲である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ドラムの容積は、５０リットル〜５００リットルの範囲である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記ドラムの容積は、１００リットル〜２００リットルの範囲である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の温度を測定するための温度センサと、前記ドラム内のｐＨを測定するためのｐＨセンサとをさらに含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の温度を制御するための温度制御器と、前記ドラム内のｐＨを制御するためのｐＨ制御器とをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の溶解酸素を測定するための酸素センサ、前記ドラム内の撹拌を測定するための撹拌センサ、前記ドラム内の発泡を測定するための発泡センサ、前記ドラム内の微生物培養物の純度を測定するための微生物培養物センサ、前記ドラム内の所望の代謝物の生成を測定するための代謝物センサ、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の溶解酸素を制御するための酸素制御器、前記ドラム内の撹拌を制御するための撹拌制御器、前記ドラム内の発泡を制御するための発泡制御器、前記ドラム内の微生物培養物の純度を制御するための微生物培養物制御器、前記ドラム内の所望の代謝物の生成を制御するための代謝物制御器、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記発酵デバイスは、前記ドラムを、イン・サイチュで殺菌する殺菌ユニットをさらに含む、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記殺菌ユニットは、蒸気を用いて、前記ドラムを殺菌する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記微生物を前記ドラムに添加する前に、前記ドラムを、イン・サイチュで殺菌することをさらに含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ドラムの殺菌は、蒸気、ろ過空気、熱、殺菌剤又はこれらの組み合わせを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ドラムの殺菌は、殺菌剤として過酸化水素で洗うことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記微生物は、前記発酵デバイスが自己殺菌される抗菌性代謝物又は副生成物を生成する、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、２５℃〜５０℃の範囲の温度で操作することを含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、２〜１０の範囲のｐＨで操作することを含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、３〜５の範囲のｐＨで操作することを含む、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、まず、４．０〜４．５の範囲の第１のｐＨで、次に、３．２〜３．５の範囲の第２のｐＨで操作することを含む、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、１０％の飽和より高い前記ドラム中の溶解酸素濃度で前記デバイスを操作することを含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを、２５％の飽和より高い前記ドラム中の溶解酸素濃度で前記デバイスを操作することを含む、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
抗菌性物質を前記ドラムに添加することをさらに含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記抗菌剤は、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、ソホロリピッド又はラムノリピッドである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記微生物は、バクテリア又は菌類である、請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記微生物はバクテリアであり、前記バクテリアは、Escherichia coli、Rhizobium、Bradyrhizobium、Bacillus、Azobacter、Arhrobacter、Pseudomonas、Azospirillium、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter、cyanobacteria、Pantoea、Sphingomonas、Streptomyces、Streptoverticillium、Ralslonia、Rhodospirillum、Xanthomonas、Erwinia又はClostridiumである、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記微生物は、菌類であり、前記菌類は、Starmerella、Mycorrhiza、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、F usarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma、Rhizopus spp、内生菌、Saccharomyces、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces又はPichia sppである、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記微生物は、酵母であり、前記酵母は、Starmerellaクレード菌株である、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記微生物は、Mycorrhizal菌類又はStarmerella菌類である、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
複数の微生物は、前記ドラムに添加され、各微生物は、バクテリア又は菌類である、請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記微生物は、Escherichia coli、Rhizobium、Bradyrhizobium、Bacillus、Azobacter、Arhrobacter、Pseudomonas、Azospirillium、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter、cyanobacteria、Pantoea、Sphingomonas、Streptomyces、Streptoverticillium、Ralslonia、Rhodospirillum、Xanthomonas、Erwinia、Clostridium又はこれらの組み合わせを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記微生物は、Starmerella、Mycorrhiza、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、F usarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma、Rhizopus spp、内生菌、Saccharomyces、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces、Pichia spp又はこれらの組み合わせを含む、請求項４４〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記微生物は、Starmerellaクレード菌株の酵母を含む、請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記微生物は、Mycorrhizal菌、Starmerella菌又はこれらの組み合わせを含む、請求項４４〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記培養された微生物は、接種材、生物農薬、栄養素源、改質剤、健康製品、バイオサーファクタント又はこれらの組み合わせである、請求項１〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
前記培養された微生物は、現場適用に好適な接種材である、請求項１〜４８いずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記接種材は、さらなる安定化、保存又は保管をすることなく用いるのに好適である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記発酵デバイスを操作することは、４０％〜６０％の範囲の水分レベルで前記デバイスを操作することを含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記培養された微生物は、前記微生物が増殖した培養液を含む、請求項１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜５３のいずれかによる方法により培養された前記微生物及び／又は前記微生物の少なくとも１つの微生物増殖副生成物を含む組成物。
【請求項５５】
支持フレームと、
前記支持フレームに装着された回転可能なドラムと、
前記ドラムの内側表面にある複数のバッフルと、
前記支持フレームの下側部分に取り付けられた少なくとも１つのホイールと、
前記ドラムに接続され、前記ドラムを回転させるモータと
を含む、微生物を培養するための発酵デバイス。
【請求項５６】
前記モータは、電気モータ又はガス動力モータである、請求項５５に記載のデバイス。
【請求項５７】
前記モータが接続されるバッテリをさらに含む、請求項５５〜５６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５８】
前記モータは、操作中、外部電源に接続されている、請求項５５〜５７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項５９】
前記フレームの下側部分に、複数のホイールを含む、請求項５５〜５８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６０】
前記ドラムの角度を調節する手段をさらに含む、請求項５５〜５９のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６１】
前記デバイスは、回転軸と地面の角度が５°〜７５°の範囲となる位置となるように構成されている、請求項５５〜６０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６２】
前記バッフルは、前記ドラムの回転軸に平行になるように配置される、請求項５５〜６１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６３】
前記バッフルは、前記ドラムの回転軸に垂直になるように配置される、請求項５５〜６１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６４】
前記デバイスは、少なくとも１日間、連続的に操作するように構成されている、請求項５５〜６３のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６５】
前記ドラムは、シリンダ又は変形シリンダの形状を有する、請求項５５〜６４のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６６】
前記ドラムの容積は、１０リットル〜１，５００リットルの範囲である、請求項５５〜６５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６７】
前記ドラムの容積は、５０リットル〜５００リットルの範囲である、請求項５５〜６５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６８】
前記ドラムの容積は、１００リットル〜２００リットルの範囲である、請求項５５〜６５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項６９】
前記ドラム内の温度を測定するための温度センサと、前記ドラム内のｐＨを測定するためのｐＨセンサとをさらに含む、請求項５５〜６８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７０】
前記ドラム内の温度を制御するための温度制御器と、前記ドラム内のｐＨを制御するためのｐＨ制御器とをさらに含む、請求項６９に記載のデバイス。
【請求項７１】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の溶解酸素を測定するための酸素センサ、前記ドラム内の撹拌を測定するための撹拌センサ、前記ドラム内の発泡を測定するための発泡センサ、前記ドラム内の微生物培養物の純度を測定するための微生物培養物センサ、前記ドラム内の所望の代謝物の生成を測定するための代謝物センサ、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項５５〜７０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７２】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の溶解酸素を制御するための酸素制御器、前記ドラム内の撹拌を制御するための撹拌制御器、前記ドラム内の発泡を制御するための発泡制御器、前記ドラム内の微生物培養物の純度を制御するための微生物培養物制御器、前記ドラム内の所望の代謝物の生成を制御するための代謝物制御器、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項７１に記載のデバイス。
【請求項７３】
前記ドラムを、イン・サイチュで殺菌する殺菌ユニットをさらに含む、請求項５５〜７２のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７４】
前記殺菌ユニットは、蒸気を用いて、前記ドラムを殺菌する、請求項７３に記載のデバイス。
【請求項７５】
前記殺菌ユニットは、蒸気、ろ過空気、熱、殺菌剤又はこれらの組み合わせを利用する、請求項７３に記載のデバイス。
【請求項７６】
前記デバイスは、前記デバイスが自己殺菌される抗菌性代謝物又は副生成物を生成する微生物を受け入れるよう構成されている、請求項５５〜７５のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７７】
前記デバイスは、２５℃〜５０℃の範囲の温度で操作するよう構成されている、請求項５５〜７６のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７８】
前記デバイスは、２〜１０の範囲のｐＨで操作するよう構成されている、請求項５５〜７７のいずれかに記載のデバイス。
【請求項７９】
前記デバイスは、１つ又は複数の微生物を受け入れるよう構成されている、請求項５５〜７８のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８０】
前記微生物は、Escherichia coli、Rhizobium、Bradyrhizobium、Bacillus、Azobacter、Arhrobacter、Pseudomonas、Azospirillium、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter、cyanobacteria、Pantoea、Sphingomonas、Streptomyces、Streptoverticillium、Ralslonia、Rhodospirillum、Xanthomonas、Erwinia、Clostridium又はこれらの組み合わせを含む、請求項７９に記載のデバイス。
【請求項８１】
前記微生物は、Starmerella、Mycorrhiza、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、F usarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma、Rhizopus spp、内生菌、Saccharomyces、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces、Pichia spp又はこれらの組み合わせを含む、請求項７９〜８０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８２】
前記微生物は、Starmerellaクレード菌株の酵母を含む、請求項７９〜８１のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８３】
前記微生物は、Mycorrhizal菌類、Starmerella菌類又はこれらの組み合わせを含む、請求項７９〜８０のいずれかに記載のデバイス。
【請求項８４】
前記デバイスは、現場適用に好適な接種材である微生物を培養するよう構成されている、請求項５５〜８３いずれかに記載のデバイス。
【請求項８５】
前記接種材は、さらなる安定化、保存又は保管することなく用いるのに好適である、請求項８４に記載のデバイス。
【請求項８６】
前記デバイスは、４０％〜６０％の範囲の水分レベルで操作するように構成されている、請求項５５〜８５のいずれかに記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１７年２月１０日出願の米国仮出願第６２／４５７，４４５号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【０００２】
本発明は、例えば、石油産業、農業、水産、鉱業、廃棄物処理、バイオレメディエーションに用いることのできる微生物ベースの組成物を生成するデバイス及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
バクテリア、酵母及び菌等の微生物の培養は、様々の有用な生物学的製剤の生成において重要である。微生物は、例えば、食品産業、調剤、農業、鉱業、環境レメディエーション及び廃棄物管理において重要な役割を果たす。
【０００４】
多用な産業において、菌の使用には大きな可能性がある。菌ベースの生成物の商品化における制限因子は、増殖密度当たりのコストであり、真菌生成物を利益のでる十分な濃度で大規模操業に適用することは非常に高価で実現不可能である。
【０００５】
微生物培養の主な２つの形態に、浸水培養と表面培養がある。バクテリア、酵母及び菌は全て、どちらの方法を用いても成長し得る。これらの培養方法は両者共、微生物の増殖について、栄養培地を必要とする。液体か固体の形態のいずれかとすることのできる栄養培地は、典型的に、炭素源、窒素源、塩及び適切な追加の栄養素及び微量元素を含む。ｐＨ及び酸素レベルは、特定の微生物にとって好適な値で維持する。
【０００６】
農業と石油産業は、もし微生物が、好ましくはより活性な形態で、より容易に入手可能になれば、極めて有益な役割を果たす２つの産業である。
【０００７】
原油が油井から流れると、原油中の物質は、生産ラインの表面で集められることが多く、流量減少や生産停止を同時に招く。様々な異なる化学薬品や機器を利用して、この問題を阻止、防止又は是正しようとしているが、より良い製品や方法、特に、効果が改善され、毒性の減じた、より環境に優しい方法が求められている。
【０００８】
収穫量を増やし、作物を病原体、害虫や病気から守るために、農業生産者は、合成化学薬品や化学肥料の使用に頼るところが大きい。しかしながら、過剰使用や不適切な適用を行うと、これらの物質は、地表水から流れ出たり、地下水に到達したり、空気中で蒸発したりする。適切に使用しても、特定の化学肥料や農薬への過度の依存や長期使用は、土壌生態系を悪化させたり、ストレス耐性を減じたり、害虫抵抗性を増大したり、動植物成長及び活力を阻害する。
【０００９】
化学物質の大規模な排除は、現時点では、実現可能ではないが、農業生産者は、総合的栄養管理及び総合的害虫管理プログラムの実行可能な要素として、生物学的手段の利用をますます取り入れるようになっている。例えば、近年では、線虫の生物的制御が着目されている。この方法は、生きた微生物、こうした微生物から派生したバイオ製品及び農薬としてのこれらの組み合わせといった生物剤を利用する。生物農薬には、他の従来の農薬に勝る重要な利点がある。例えば、従来の化学農薬に比べて害が少ない。より効果的かつ特異的でもある。また、生分解が早いことが多く、環境汚染が少なくなる。
【００１０】
生物農薬及びその他生物剤の使用は、生産、輸送、管理、価格設定、効能における問題
により非常に限定されている。例えば、多くの微生物は、増殖が難しく、さらに、有用とされる十分な量で、農業及び石油生産システムで使うのが難しい。この問題は、処理、処方、保管、配送前の安定化、安定化手段としての栄養細胞の胞子形成、輸送及び適用による、生存能力及び／又は活性の喪失によって悪化する。
【００１１】
微生物及び微生物代謝物の大量生産のためのより効率的な培養方法が利用可能になれば、微生物ベースの組成物は、これらのニーズに適合する助けとなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、石油・ガス産業、農業、バイオレメディエーション、水産及びその他多くの用途に用いることのできる微生物ベースの組成物を生成するデバイス及び方法を提供する。具体的に、本発明は、微生物の効率的な培養及び微生物増殖副生成物の生成のための方法及び材料を提供する。本発明はまた、かかる培養及び生成のためのデバイスも提供する。
【００１３】
より具体的には、本発明は、特別な訓練やスキルを必要とすることなく、低コストで使用及び輸送できる発酵デバイスを提供する。特定の実施形態において、本デバイス及び方法を用いて、酵母や菌接種源を培養し、より大きな発酵システムでそれらを用いることができる。特定の実施形態において、本デバイス及び方法は、Starmerella bombicola酵母接種源の生成に用いられる。
【００１４】
一実施形態において、本発明のデバイスは、ホイールを有していてもよいフレームで支持された回転ドラムを含む。ドラムの回転は、電源（例えば、デバイスは、外部電源に接続するためのバッテリや電源コードを有することができる）に接続されたモータ（例えば、電気モータ）を用いて行われる。ドラムはまた、通気システム、例えば、エアポンプを含む通気システムに接続することもできる。これは、ドラム内部の培養物の表面に空気を与え、かつ、内部温度を制御する手段としても機能する。
【００１５】
バッフルを、ドラムの内側表面に取り付けて、培養物の撹拌と通気を促進してもよい。ドラムの回転中、培養物は混合され、周囲空気や通気システムから供給された空気によって酸素化される。
【００１６】
好ましい実施形態において、デバイスは、培養プロセス中に連続的に動作する。生成される微生物の種類に応じて、デバイスは十分な量の培養物を生成するのに必要な限り、動作させることができる。例えば、混合デバイスは、１、２、３、４、５日以上（その一部でも）、連続運転させることができる。
【００１７】
デバイスは、効率的に自己殺菌でき、好ましい。例えば、混合デバイス内で培養された微生物は、バイオサーファクタント等の抗菌性代謝物又は副生成物を生成する菌株である。このように、微生物培養自体は、ドラム内の不要な微生物の制御と、同時に、必要な微生物の培養を行う。
【００１８】
好ましい実施形態において、本発明は、有用な微生物ベースの組成物及び生成物の生成を簡易化し、可搬性を高める培養方法を提供する。本方法は、大規模発酵システムに接種するのに好適な微生物組成物の浸水培養を提供する。
【００１９】
本デバイス及び方法により生成される接種材を用いて、微生物ベースの組成物の大量生産のために、現場にある発酵システムに接種することができる。好ましい実施形態において、本デバイス及び方法をまた、現場で用いて、接種材培養物を、デバイスから現場の発酵システムへ直接移送することもできる。
【００２０】
本発明により、微生物及びその代謝物を生成する資本及び労働コストが減じ、好ましい。さらに、本発明の培養プロセスは、培養完了後、微生物を濃縮その他処理する必要性を減じたり、排除するものである。
【００２１】
可搬性は、微生物ベースの組成物のための接種材を、意図する接種の部位で、又はその近くで生成することができるため、大幅なコスト節約になり得る。接種材は、所望であれば、現地調達材料を用いて、現場で生成でき、好ましい。それによって、物流上の障害や、搬送や発送のコストが減じる。さらに、接種材のスケーリングにより生成される最終生成物は、適用時に生存微生物を含み得る。
【００２２】
本発明により生成された組成物を用いると、様々な石油産業用途で用いられる大規模発酵システムに接種することができる。これらの用途としては、これらに限られるものではないが、原油回収の向上、油粘度の減少、ロッド、管、ライナー及びポンプからのパラフィン除去、石油機器腐食阻止又は防止、流体破砕、抽出原油中のＨ２Ｓ濃度の減少、タンク、フローライン及びパイプラインのクリーニングが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】本発明の一実施形態に係るデバイスを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明の実施形態は、石油・ガス産業、農業、バイオレメディエーション、水産及びその他多くの用途に用いることのできる微生物ベースの組成物を生成するデバイス及び方法を提供する。具体的に、本発明は、微生物の効率的な培養及び微生物増殖副生成物の生成のための方法及び材料を提供する。本発明はまた、かかる培養及び生成のためのデバイスも提供する。
【００２５】
より具体的には、本発明は、特別な訓練やスキルを必要とすることなく、低コストで使用及び輸送できる発酵デバイスを提供する。
【００２６】
特定の実施形態において、本デバイス及び方法を用いて、酵母や菌接種源を生成する。特定の実施形態において、本デバイス及び方法は、Starmerella bombicola酵母接種源の生成に用いられる。
【００２７】
一実施形態において、本発明のデバイスは、フレームで支持された回転ドラムを含む。フレームは、動かしやすくするために、必要なものではないが、ホイールを有することができる。例えば、デバイスは、片側に２つのホイールがあって、もう一方の側にはホイールがないものとして、ホイールを用いて搬送したり、接地して適所に静止させておくことができる（図１に図示）。あるいは、デバイスは３つ以上のホイールを有していてもよい。ドラムの回転は、モータを用いて行われる。モータは、例えば、電気やガス動力としてよい。好ましくは、モータは、電源に接続された電気モータである。例えば、デバイスは、電源としてバッテリを有する、又はデバイスは、外部源（例えば、電源コードやワイヤレス電力伝送により）から動力を得ることもできる。
【００２８】
ドラムはまた、通気システム、例えば、エアポンプを含む通気システムに接続することもできる。これは、ドラム内部の培養物の表面に空気を与え、かつ、内部温度を制御する手段としても機能する。
【００２９】
バッフルを、ドラムの内側表面に取り付けて、培養物の撹拌と通気を促進してもよい。ドラムの回転中、培養物は混合され、周囲空気や通気システムから供給された空気によって酸素化される。
【００３０】
好ましい実施形態において、デバイスは、培養プロセス中に、連続的に動作する。生成される微生物の種類に応じて、デバイスは十分な量の培養物を生成するのに必要な限り、動作させることができる。例えば、混合デバイスは、１、２、３、４、５日以上（その一部でも）、連続運転させることができる。
【００３１】
本発明のデバイスは、意図する用途に応じてスケーリングすることができる。例えば、ドラムは、数リットルから数百リットル以上の容積とすることができる。
【００３２】
デバイスは、効率的に自己殺菌でき、好ましい。例えば、混合デバイス内で培養された微生物は、バイオサーファクタント等の抗菌性代謝物又は副生成物を生成する菌株である。このように、微生物培養自体は、ドラム内の不要な微生物の制御と、同時に、必要な微生物の培養を行う。あるいは、又は、さらに、デバイスを、外部手段、例えば、過酸化水素等の殺菌剤によって殺菌することができる。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明は、有用な微生物ベースの組成物及び生成物の生成を簡易化し、可搬性を高める培養方法を提供する。本方法は、大規模発酵システムに接種するのに好適な微生物組成物の浸水培養を提供する。
【００３４】
特定の実施形態において、方法は、発酵デバイスのドラムに、少なくとも１種類の微生物と、任意で、微生物のための栄養素を添加し、十分な量の培養物が生成されるまで、混合デバイスを操作することを含む。栄養素としては、例えば、１つ以上の炭素源、タンパク質、脂肪、窒素源、微量元素、及び／又は成長因子（例えば、ビタミン、ｐＨ調整剤）が含まれる。
【００３５】
本方法により生成される接種材を用いて、微生物ベースの組成物の大量生産のために、現場にある発酵システムに接種することができる。好ましい実施形態において、本デバイス及び方法をまた、現場で用いて、接種材培養物を、デバイスから現場の大規模発酵システムへ直接移送することもできる。
【００３６】
一実施形態において、本発明は、少なくとも１種類の微生物、及び／又は本発明のデバイスを用いて成長させた微生物から生成された少なくとも１つの微生物代謝物を含む培養組成物をさらに提供する。組成物中の微生物は、活性形態であっても、不活性形態であってもよい。組成物はまた、乾燥形態であっても、液体形態であってもよい。
【００３７】
本発明により、微生物及びその代謝物を生成する資本及び労働コストが減じ、好ましい。さらに、本発明の培養プロセスは、培養完了後、微生物を濃縮その他処理する必要性を減じたり、排除するものである。
【００３８】
可搬性は、微生物ベースの組成物のための接種材を、意図する接種の部位で、又はその近くで生成することができるため、大幅なコスト節約になり得る。接種材は、所望であれば、現地調達材料を用いて、現場で生成でき、好ましい。それによって、物流上の障害や、搬送や発送のコストが減じる。さらに、接種材のスケーリングにより生成される最終生成物は、適用時に生存微生物を含み得る。これは、生成物有効性を増大する。
【００３９】
このように、ある実施形態において、本発明は、天然起源の現地の微生物及びそれらの代謝副生成物のもつ力を引き出すものである。現地の微生物個体群を用いることは、これらに限られるものではないが、遠隔地を含む、環境修復（例えば、石油流出の場合等）、畜産、水産、林業、牧草管理、芝管理、観賞用園芸、廃棄物管理及び処理、鉱業、原油回収及び人の健康をはじめとする、状況において有利である。
【００４０】
本発明により生成された組成物を用いると、様々な石油産業用途で用いられる大規模発酵システムに接種することができる。これらの用途としては、これらに限られるものではないが、原油回収の向上、油粘度の減少、ロッド、管、ライナー及びポンプからのパラフィン除去、石油機器腐食阻止又は防止、流体破砕、抽出原油中のＨ２Ｓ濃度の減少、タンク、フローライン及びパイプラインのクリーニングが挙げられる。
【００４１】
選択された用語の定義
本明細書で用いる「微生物ベースの組成物」は、微生物又はその他細胞培養物の増殖の結果、生成された成分を含む組成物を意味する。このように、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物増殖の副生成物を含んでいてよい。細胞は、植物状態、胞子形態又は両者の混合物であってよい。細胞は、プランクトン、バイオフィルム形態、又は両者の混合物であってよい。増殖副生成物は、例えば、代謝物、細胞膜成分、発現タンパク質及び／又はその他細胞成分であってよい。細胞は無傷であっても溶解していてもよい。好ましい実施形態において、細胞は、植物状態で、それらが増殖した培養液として、微生物ベースの組成物中に存在する。細胞は、組成物１ミリリットル当たり、例えば、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、又は１×１０１１以上の細胞濃度で存在してよい。
【００４２】
本発明は、所望の結果を得るために、実際適用されることになっている生成物である、「微生物ベースの生成物」又は「培養生成物」をさらに提供する。微生物ベースの生成物は、単に、微生物培養プロセスから採取された微生物ベースの組成物のことである。あるいは、微生物ベースの生成物は、さらに、添加済みの成分を含んでいてもよい。添加済みの成分としては、例えば、緩衝液、水等の適切な担体、微生物増殖をさらにサポートする添加栄養素、及び／又は適用される環境において、微生物及び／又は組成物の追跡を促進する溶剤が挙げられる。微生物ベースの生成物はまた、微生物ベースの組成物の混合物を含んでいてもよい。微生物ベースの生成物はまた、これらに限られるものではないが、ろ過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等といった何らかの方法で処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分も含んでいてよい。
【００４３】
「接種材」は、「微生物ベースの生成物」に含まれる。本明細書で用いる接種材とは、例えば、大規模発酵システム又はプロセスに接種する種培養として用いることのできる微生物ベースの生成物を意味する。接種材は、所望量の微生物ベースの組成物及び生成物を生成するために、このような発酵システムにおいて、スケーリングすることができる。
【００４４】
本明細書で用いる「現場発酵システム」とは、微生物ベースの組成物及び／又は生成物の適用場所又はその近くで、微生物ベースの組成物及び／又は生成物を生成するのに用いるシステムを意味する。
【００４５】
本明細書で用いる「採取」とは、増殖容器から微生物ベースの組成物の一部又は全てを取り出すことを指す。
【００４６】
バイオサーファクタント（その他活性剤）又はバイオサーファクタント生成微生物により得られる活性を指すのに用いる場合、明細書で用いる「制御」は、害虫を、死滅、無力化又は固定化したり、その他害虫が実質的に害を及ぼさないようにする行為にまで拡大される。
【００４７】
混合デバイス設計及び操作
図１に、本発明の一実施形態による発酵デバイスを示す。図１を参照すると、デバイス１０は、フレーム２００に支持された回転ドラム１００を含む。フレーム２００は、必須ではないが、動きやすくするためのホイール３００を有することができる。例えば、デバイスは、片側に２つのホイール３００、もう一方の側４００にはホイールがなくてもよく、デバイスは、ホイールを用いて搬送したり、接地して適所に静止させておくことができる。あるいは、デバイスは３つ以上のホイール３００を有していてもよい（地面と接触する全ての点がホイールであるか、又は、ホイールのないセクション４００がさらに含まれていてもよい）。ホイール３００は、搬送しないとき、特に、地面と接触する全ての点がホイールである場合は、デバイスを適所に保持するホイールロックを有していてもよい。ドラム１００の回転は、モータを用いて行われる。モータは、例えば、電気やガス動力としてよい。好ましくは、モータは、電源に接続された電気モータである。例えば、デバイスは、電源としてバッテリを有する、又はデバイスは、外部源（例えば、電源コードやワイヤレス電力伝送により）から動力を得ることもできる。デバイス１０は、ドラム１００の角度を調節する手段を備えていてもよい。かかる手段としては、例えば、フレーム２００についたレバー５００及び／又はヒンジやその他回転サポートを挙げることができる。
【００４８】
一実施形態において、デバイス１０のドラム１００は、浸水培養接種材を保持、混合及び増殖させるための開閉可能な回転ドラムである。ドラムは、例えば、ガラス、１種類以上のポリマー、１種類以上の金属、１種類以上の金属合金、及び／又はこれらの組み合わせで作製することができる。
【００４９】
ドラム１００は、支持フレーム２００に装着することができる。支持フレーム２００は、ホイール３００を有することができ、これによって、広範なスキル、訓練、コスト又は時間を必要とすることなく、デバイス全体の容易な搬送が促進される。ホイール３００は、例えば、１種類以上のポリマー、ゴム、又は農業や原油抽出環境のような様々な地域環境において移動するのに好適な耐久性のある材料で作製することができる。フレーム２００は、例えば、ガラス、１種類以上のポリマー、１種類以上の金属、１種類以上の金属合金、及び／又はこれらの組み合わせで作製することができる。
【００５０】
ドラムは、電源に接続された電気モータ等のモータと操作可能に係合している。モータによって、ドラムを、例えば、１０〜３０ｒｐｍ、好ましくは、１５〜２５ｒｐｍの速度で連続的に回転させることができる。
【００５１】
ドラムはまた、例えば、エアポンプを含む通気システムに接続することもできる。エアポンプは、ドラム内部に空気を与えて、ドラム内部で動く培養物の表面に通気する。ドラムが回転している間、培養物は中で混合され、通気システムにより供給される空気により酸素化される。ある実施形態において、空気を加熱又は冷却して、ドラムの内部温度及び培養環境を制御するのを補助することができる。
【００５２】
地面に対するドラムの軸の角度は、０°〜９０°とすることができる。ドラム内の培養液の表面積を増大するために、角度は９０°未満であるのが好ましい。角度は、水平（すなわち、０°）又は略水平であってよい。角度は、例えば、約５°〜約７５°、又は約１０°〜約６０°であってよい。デバイスは、角度を調節する手段を備えていてもよい。
【００５３】
ドラムの軸の角度を最適化すると共に、ドラムの形状もまた最適化して、培養プロセス中に空気供給される培養物の面積を最大化するのが好ましい。ドラムの形状は、例えば、シリンダ又は変形シリンダとすることができるが、これらに限られるものではない。変形シリンダとしては、テーパー付きシリンダ、缶形シリンダ、又は端部より中央の方が広い形状のシリンダを挙げることができる。
【００５４】
さらに、バッフルを、ドラムの内側表面に存在させて、培養物の適切な撹拌及び通気を補助することができる。好ましくは、３〜４つのバッフルを、ドラムの内側周囲に均等に、又は略均等に配置し、ドラムの回転軸に平行になるように配置する。あるいは、バッフルは、ドラムの回転軸に垂直になるように配置することもできる。
【００５５】
好ましい実施形態において、デバイスは、培養プロセス中連続的に操作される。デバイスは、生成している特定の微生物種に応じて、十分な容積の培養物を生成するのに必要な時間、操作することができる。例えば、混合デバイスは、数日間、連続運転できる。特定の実施形態において、混合デバイスは、１、２、３、４又は５日以上、あるいはその一部、連続運転される。
【００５６】
一実施形態において、混合デバイスは、好適な量の微生物の所望の菌株を含む接種材の現場生成のために提供される可動性又は携帯バイオリアクターである。生成される液体の培養接種材の量は、例えば、２〜５００リットル、５〜２５０リットル、１０〜１００リットル、１５〜７５リットル、２０〜５０リットル又は３５〜４０リットルである。接種材は、従来の生成物の安定化、保存及び輸送プロセスに頼ることなく、適用現場で生成されるため、より高い密度の生きた微生物が生成され、現場の発酵システムにおいて使用するのに必要な微生物組成物の量がはるかに減る。これによって、システムの可動性及び可搬性を促進する、スケールダウンしたバイオリアクター（例えば、小さ目の発酵タンク、少な目の出発材料、栄養剤、ｐＨ調整剤、消泡剤等の供給）が可能となる。
【００５７】
本発明のデバイスは、意図する用途に応じて、スケーリングすることができる。例えば、特定の発酵システムに接種するのに必要な接種材の量に応じて、ドラムは、数リットルから数百リットルとすることができる。ドラムは、例えば、１リットル〜５，０００リットル以上であってよい。典型的には、ドラムは、１０〜１，５００リットル、好ましくは、５０〜５００リットル、より好ましくは、１００〜２００リットルとすることができる。
【００５８】
一実施形態において、デバイスは、機能コントロール／センサを有しているか、又は機能コントロール／センサに接続されて、ｐＨ、酸素、圧力、温度、攪拌機軸動力、湿度、粘度、微生物密度及び／又は代謝物濃度等の培養プロセスにおいて重要な因子を測定する。
【００５９】
一実施形態において、デバイスは、少なくとも温度とｐＨについては、自身の制御及び測定システムを有している。温度及びｐＨのモニタリングと制御に加え、ドラムはまた、例えば、溶解酸素、撹拌、発泡、微生物培養物の純度、所望の代謝物の生成等をモニタリング及び制御する能力も有していてよい。
【００６０】
さらなる実施形態において、デバイスはまた、容器内での微生物の成長をモニターすることもできる（例えば、細胞数及び成長フェーズの測定）。あるいは、日常サンプルを容器から取り出して、希釈平板法等、業界に公知の技術により計数してもよい。希釈平板は、サンプル中のバクテリアの数を推定するのに用いられる単純な技術である。この技術によってまた、異なる環境や処理を比較することのできる指数も得られる。
【００６１】
一実施形態において、本方法で用いる培養培地、空気及び機器、培養プロセスを殺菌する。リアクター／容器等培養機器は、殺菌ユニット、例えば、オートクレーブと接続されているが、離してよい。培養機器はまた、接種を、例えば、蒸気を用いて始める前に、イン・サイチュで殺菌する殺菌ユニットを有していてもよい。空気は、業界に公知の方法により殺菌することができる。例えば、周囲空気は、容器に補充される前に、少なくとも１つのフィルタに通すことができる。他の実施形態において、培地は、低温殺菌するか、又は任意で熱を全く加えずに、低水活性及び低ｐＨを利用して、バクテリアの増殖を制御してもよい。
【００６２】
培養の前に、ドラムは、過酸化水素溶液（例えば、１．０％〜３．０％の過酸化水素）等の殺菌剤で洗うことができる。これは、汚染を阻止又は防ぐために、例えば、８０〜９０℃で、湯洗浄前又は後に行うことができる。培養物培地成分（例えば、炭素源、水、脂質源、微量栄養素等）にもまた、温度汚染除去及び／又は過酸化水素汚染除去を行うこともできる（その後、潜在的に、ＨＣｌ、Ｈ２ＳＯ４等の酸を用いて、過酸化水素により中和される）。
【００６３】
デバイスは自己殺菌もでき、好ましい。例えば、混合デバイス内での培養のために選択された微生物は、バイオサーファクタント等の抗菌性代謝物又は副生成物を生成することが知られている菌株である。このように、微生物培養物自体が、ドラム内の不要な微生物の制御と、同時に、必要な微生物の培養を行う。
【００６４】
本発明により用いられる培養温度は、例えば、約２５〜４０℃であるが、本プロセスは、この範囲外で操作されてもよい。微生物は、約２〜１０のｐＨ範囲、より具体的には、約３〜５のｐＨ範囲で培養することができる（塩基、酸及び緩衝剤、例えば、ＨＣｌ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ、Ｈ３ＰＯ４を用いて、手動又は自動でｐＨは調整される）。ただし、本発明は、このｐＨ範囲外でも実施することができる。
【００６５】
酵母培養は、まず、第１のｐＨ（例えば、ｐＨ４．０〜４．５）で始め、後に、第２のｐＨ（例えば、ｐＨ３．２〜３．５）に変更して、残りのプロセスを行って、汚染を排除するのを助け、その他の望ましい結果を得る（第１のｐＨは、第２のｐＨより高くても低くてもよい）。培養中、溶解酸素濃度を、１０、１５、２０又は２５％の飽和より高く保つことで好ましい結果が得られる。一実施形態において、接種材は、培養後にさらに処理する必要がない（例えば、酵母、代謝物及び残留炭素源は、ソホロリピッドから分離する必要がない）。物理特性（例えば、粘度、密度等）もまた、業界で公知の様々な化学物質や材料を用いて調整することができる。
【００６６】
１種類以上の抗菌性物質を、培養物培地（例えば、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、ソホロリピッド及びラムノリピッド）に添加して、発酵前、中又は後の汚染をさらに阻止又は防止することができる。１つ以上の有機及び無機窒素源を培地（例えば、タンパク質、アミノ酸、酵母エキストラクト、酵母自己消化物、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、コーンペプトン、カゼイン加水分解物及び大豆タンパク質）に添加することができる。
【００６７】
微生物
本発明により増殖した微生物は、例えば、バクテリア、酵母、菌又は多細胞生物である。好ましい実施形態において、微生物は酵母である。特に好ましい実施形態において、微生物はStarmerellaクレード菌株のものである。
【００６８】
一実施形態において、微生物は、グラム陽性及びグラム陰性バクテリアをはじめとするバクテリアである。これらのバクテリアは、これらに限られるものではないが、例えば、Escherichia coli、Rhizobium（例えば、Rhizobium japonicum、Sinorhizobium meliloti、Sinorhizobium fredii、Rhizobium leguminosarum biovar trifolii及びRhizobium etli）、Bradyrhizobium（例えば、Bradyrhizobium japanicum及びB.parasponia）、Bacillus（例えば、Bacillus subtilis、Bacillus firmus、Bacillus laterosporus、Bacillus megaterium、Bacillus amyloliquifaciens）、Azobacter（例えば、Azobacter vinelandii及びAzobacter chroococcum）、Arhrobacter（例えば、Agrobacterium radiobacter）、Pseudomonas（例えば、Pseudomonas chlororaphis subsp.aureofaciens（Kluyver））、Azospirillium（例えば、Azospirillumbrasiliensis）、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter（例えば、C.xyli subsp.xyli及びC.xyli subsp.cynodontis）、cyanobacteria、Pantoea（例えば、Pantoea agglomerans）、Sphingomonas（例えば、Sphingomonas paucimobilis）、Streptomyces（例えば、Streptomyces griseochromogenes、Streptomyces qriseus、Streptomyces cacaoi、Streptomyces aureus及びStreptomyces kasugaenis）、Streptoverticillium（例えば、Streptoverticillium rimofaciens）、Ralslonia（例えば、Ralslonia eulropha）、Rhodospirillum（例えば、Rhodospirillum rubrum）、Xanthomonas（例えば、Xanthomonas campestris）、Erwinia（例えば、Erwinia carotovora）、Clostridium（例えば、Clostridium bravidaciens及びClostridium malacusomae）並びにこれらの組み合わせである。
【００６９】
一実施形態において、微生物は、菌類（酵母を含む）であり、これらに限られるものではないが、例えば、Starmerella、Mycorrhiza（例えば、vesicular-arbuscular mycorrhizae（VAM）、arbuscular mycorrhizae（AM））、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、F usarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma（例えば、Trichoderma reesei、T.harzianum、T.viride及びT.hamatum）、Rhizopus spp、内生菌（例えば、Piriformis indica）、Saccharomyces（例えば、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces boulardii sequela及びSaccharomyces torula）、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces（例えば、Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis）、Pichia spp（例えば、Pichia pastoris）及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７０】
一実施形態において、一種類の微生物が混合デバイスにおいて増殖する。変形実施形態において、増殖や得られる生成物に有害な影響を与えることなく、共に増殖し得る複数の微生物を、混合デバイス中で共に増殖することができる。例えば、２〜３以上の異なる微生物を、デバイス中で同時に増殖することができる。
【００７１】
培養及び増殖培地
本発明は、スケーラブルな浸水微生物培養物を効率的に生成する方法を提供するものである。本方法は、浸水培養プロセスに必要な材料の全てを提供するものであるが、真水は、現地から供給されると考えられる。
【００７２】
一実施形態において、本方法は、生存酵母又はその他微生物を混合デバイスのドラム内に提供することを含む。大量の糖脂質バイオサーファクタントを堆積することのできる様々な菌株が含まれる。より具体的には、本方法は、例えば、Starmerella（Candida）bombicola,、Candida apicola、Candida batistae、Candida floricola、Candida riodocensis、Candida stellate、Candida kuoi、Candida sp.NRRL Y-27208、Rhodotorula bogoriensis sp.、Wickerhamiella domericqiae及びStarmerellaクレードのその他ソホロリピッド生成菌株といった害虫制御、バイオレメディエーション、原油回収の向上及びその他有用な目的を可能とする１つ以上の生存真菌株を添加することを含む。
【００７３】
一実施形態において、本発明において用いる培養物培地は、微生物のための補助栄養素を含んでいてよい。典型的には、炭素源、タンパク質及び／又は脂肪、窒素源、微量元素及び／又は増殖因子（例えば、ビタミン、ｐＨ調整剤）が挙げられる。栄養素濃度、水分含量、ｐＨ等を調整して、特定の微生物の増殖を最適化することは、当業者には明白であろう。
【００７４】
炭素源、脂質源、窒素源及び／又は微量栄養素源はそれぞれ、培養プロセス中、適切な時に、混合デバイスのドラムに添加することのできる個別パッケージで提供することができる。各パッケージは、培養プロセス中、特定の時点（例えば、酵母、ｐＨ及び／又は栄養素レベルが、特定の濃度より上又は下のとき）又は時間（例えば、１０時間、２０時間、３０時間、４０時間後等）に添加することのできるいくつかのサブパッケージを含む。
【００７５】
脂質源は、例えば、トリグリセリドをはじめとする遊離脂肪酸、その塩又はそのエステルを含有する植物又は動物起源の油脂を含む。脂肪酸としては、これらに限られるものではないが、１６〜１８個の炭素原子を含有する遊離及びエステル化脂肪酸、疎水性炭素源、パーム油、動物脂肪、ココナツ油、オレイン酸、大豆油、ひまわり油、キャノーラ油、ステアリン酸及びパルミチン酸が例示される。その他の炭素源としては、グルコース、キシロース、マンノース、スクロース、ガラクトース、マンニトール、ソルボース、リボース、アルブチン、ラフィノース、グリセロール、エリスリトール、キシリトール、グルコネート、シトレート、モラセス、加水分解デンプン、コーンシロップ及びグルコースをはじめとする加水分解セルロース材料等の１つ以上の糖が挙げられる。
【００７６】
本方法は、１種類以上の微量栄養素源、例えば、カリウム、マグネシウム、カルシウム、亜鉛及びマンガン、好ましくはその塩、リン、例えば、ホスフェート、及びその他増殖刺激成分を添加することを含む。タンパク質、アミノ酸、酵母エキストラクト、酵母自己消化物、アンモニア又はアンモニウム塩、尿素、コーンペプトン、カゼイン加水分解物及び大豆タンパク質等の１種類以上の有機及び無機窒素源を含むことができる。
【００７７】
本方法は、培養中、汚染を阻止又は防止するために、１種類以上の抗菌性物質（例えば、ストレプトマイシン、オキシテトラサイクリン、ソホロリピッド及びラムノリピッド）を添加することを含むことができる。さらに、本方法は、漂白剤や過酸化水素といった予備培養汚染除去材料を含むことができる。漂白剤や過酸化水素は、最初は濃縮形態で、使用前に、発酵場所で希釈して用いることができる。例えば、過酸化水素は、濃縮形態で提供され、予備濯ぎ汚染除去のために、希釈されて、１．０重量（容積）％〜３．０重量（容積）％の過酸化水素に処方される。
【００７８】
本方法はまた、塩基、酸及び緩衝剤（例えば、ＨＣｌ、ＫＯＨ、ＮａＯＨ及び／又はＨ３ＰＯ４、Ｈ２ＳＯ４等）の１種類以上のｐＨ調整物質を添加することも含むことができる。ｐＨ調整は、自動的手段により、又は手動で行うことができる。自動ｐＨ調整としては、ｐＨ測定に応じて、適切に、ｐＨ調整物質を分配するｐＨプローブ及び電子デバイスが挙げられる。ｐＨは、ユーザーにより特定の数に設定したり、培養プロセス全体に応じてｐＨを変更するよう予めプログラムすることができる。ｐＨ調整を手動で行う場合は、手動試験用の業界に公知のｐＨ測定ツールを用いることができる。
【００７９】
温度計や熱電対といった温度センサを用いて、温度をモニターすることができる。温度計は、手動でも自動でもよい。自動温度計は、加熱及び冷却源を適切に管理して、培養プロセス全体にわたって温度を制御することができる。
【００８０】
一実施形態において、本方法は、培養に窒素源を補充することを含む。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素及び塩化アンモニウム等の無機形態、又は、タンパク質やアミノ酸等の有機形態とすることができる。これらの窒素源は、単独、又は２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００８１】
本方法は、さらに、培養に炭素源を補充することができる。炭素源は、典型的に、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール及びマルトース等の炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸及びピルビン酸等の有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール及びグリセロール等のアルコール、大豆油、米糠油、オリーブ油、コーン油、ゴマ油及び亜麻仁油等の油脂、等である。これらの炭素源は、単独、又は２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００８２】
一実施形態において、微生物の増殖因子及び微量栄養素が培地に含まれている。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及びコバルト等の微量元素を含む無機栄養素もまた、培地に含まれていてもよい。
【００８３】
一実施形態において、無機塩もまた含まれていてよい。無機塩は、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムである。これらの無機塩は、単独、又は２つ以上組み合わせて用いてもよい。
【００８４】
本方法は、例えば、空気の動きを遅くして、増殖培養物の酸素化を容易にして、低酸素含有空気を除去し、酸素化空気を導入する点で好ましい。酸素化空気は、周期的、例えば、毎日補充される周囲空気であってよい。
【００８５】
ある実施形態において、培養の方法は、培養プロセスの前及び／又は中に、液体培地に、追加の酸及び／又は抗菌剤を添加することをさらに含む。抗菌剤又は抗生物質を用いて、培養物の汚染を阻止又は防止してよい。さらに、消泡剤も添加して、培養及び発酵中に気体が生成されるとき、泡の形成及び／又は堆積を阻止又は防止してもよい。
【００８６】
一実施形態において、微生物を培養する方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは、約１５℃〜６０℃、より好ましくは、２５℃〜５０℃で行われる。さらなる実施形態において、培養は、一定温度で、連続的に実施される。他の実施形態において、培養は、温度を変えて行ってもよい。
【００８７】
一実施形態において、混合物の水分レベルは、当該微生物に好適なものとしなければならない。例えば、水分レベルは、２０％〜９０％、好ましくは、３０％〜８０％、より好ましくは、４０％〜６０％である。
【００８８】
一実施形態において、混合物のｐＨは、当該微生物に好適なものとしなければならない。炭酸塩やリン酸塩といった緩衝塩やｐＨ調整剤を用いて、ｐＨを最適値近くまで安定化してよい。金属イオンが高濃度で存在するときは、液体培地において、キレート化剤を用いることが必要である。
【００８９】
微生物は、プランクトン形態やバイオフィルムとして増殖し得る。バイオフィルムの場合には、容器は中に、微生物がバイオフィルム状態で増殖し得る基質を有していてよい。システムはまた、例えば、バイオフィルム増殖特性を促進及び／又は改善する刺激（例えば、せん断応力）を与える能力を有していてもよい。
【００９０】
微生物ベースの生成物の生成
本発明の微生物ベースの生成物は、微生物及び／又は微生物増殖副生成物、及び、任意で、例えば、水、担体、助剤、栄養素、粘度調節剤、及びその他活性剤等の増殖培地及び／又は追加の成分を含む生成物である。
【００９１】
本発明の微生物ベースの生成物は、例えば、微生物接種材、生物農薬、栄養素源、改質剤、健康製品及び／又はバイオサーファクタントである。
【００９２】
本発明の１つの微生物ベースの生成物は、微生物及び／又は残渣栄養素により生成された、微生物及び／又は微生物増殖副生成物を含有する培養物培地を含む接種材である。この培養方法による生成物は、抽出や精製することなく直接用いられる。所望であれば、当業者に知られた標準的な抽出方法や技術を用いて、容易に抽出及び精製を行うことができる。
【００９３】
接種材中の微生物は、活性又は不活性形態のいずれでもよい。接種材は、さらなる安定化、保存及び保管をすることなく、用いられる。これら接種材の直接使用により、微生物の高い生存能力を保持し、異物や不要な微生物による汚染の可能性を減じ、微生物増殖の副生成物の活性を維持し、好ましい。
【００９４】
接種材は、ドラムから取り出して、例えば、すぐ使えるよう、管を介して移送することができる。
【００９５】
本発明によれば、接種材は、微生物が増殖した培養液を含み、好ましい。生成物は、例えば、少なくとも１重量％、５重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％、７５重量％又は１００重量％の培養液である。生成物中のバイオマスの量は、例えば、０重量％〜１００重量％の間のいずれかである。
【００９６】
本発明は、バイオマス（例えば、生存細胞材料）、細胞外代謝物（例えば、小分子と大分子の両方）及び／又は細胞内成分（例えば、酵素及びその他タンパク質）を生成するための材料及び方法をさらに提供する。本発明の微生物及び微生物増殖副生成物はまた、鉱石のような基質の変形に用いることができ、変形された基質が生成物である。
【００９７】
本発明は、微生物ベースの生成物と、多くの設定で有益な結果、例えば、１種類以上の微生物ベースの生成物を適用することによる、改善されたバイオレメディエーション及び鉱業、廃棄物管理及び処理、家畜及びその他動物の健康向上、並びに植物の健康及び生産性の促進を得るための生成物の使用とをさらに提供する。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、例えば、現場発酵システムにおいて本明細書に開示した微生物ベースの生成物をスケーリングし、スケーリングした生成物を、土壌、種又は植物の一部に適用することによって、植物の健康を改善し、及び／又は作物収量を増加する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、スケーリングした生成物の複数の適用を含む、作物又は植物収量を増加する方法を提供する。
【００９９】
他の実施形態において、微生物増殖副生成物を生成する方法は、当該副生成物を濃縮し、精製するステップをさらに含んでいてよい。
【０１００】
一実施形態において、組成物は、農業に適している。例えば、組成物は、スケーリングして、土壌、植物及び種を処理するのに用いることができる。組成物はまた、農薬としても用いてよい。
【０１０１】
一実施形態において、本発明は、現地のニーズに従った材料及び方法へのカスタマイズをさらに提供する。例えば、微生物の培養方法を用いて、現地の土壌又は特定の油井や汚染場所に位置する微生物を増殖してもよい。特定の実施形態において、現地の土壌を、天然の増殖環境を与える培養方法において、固体物質として用いてよい。これらの微生物は有益で、現地のニーズにより適合し、好ましい。
【０１０２】
実施例
以下の例示の実施例によって、本発明及び多くの利点を示す。以下の実施例は、本発明の方法、適用、実施形態及び変形例のいくつかを例示するものであり、本発明を限定するものとは考えられない。数多くの変更及び修正を、本発明において行える。
【０１０３】
実施例１  混合及び培養デバイス、並びに操作モード
分配可能な携帯混合デバイスを、図１に示すように構成した。デバイスは、ゴムホイール付きのフレームで支持されたプラスチック回転ドラムを有している。３〜４個のバッフルが、ドラムの内側周囲に取り付けられている。
【０１０４】
電源に接続された電気モータの動力によりドラムは回転する。ドラムは、１５〜２５ｒｐｍの速度で回転する。ドラムは、細胞及び代謝物生成のために、Starmerella酵母を増殖する１００リットル（Ｌ）の作業容積を有している（ただし、サイズや規模は、必要な用途に応じて変えることができる）。デバイスは、大規模現場発酵システムに接種するのに好適なStarmerellaクレード酵母接種材の浸水培養に特に好適である。
【０１０５】
培養物生成のコストをさらに下げ、技術の拡張性を確保するために、このシステムでは、従来の方法を用いて殺菌する必要はない。代わりに、空の衛生容器を用いる方法により、ドラムの内側表面に高圧蒸気ストリームを１０分間適用した後、ドラムを回転させながら、１〜３％の過酸化水素、好ましくは、３％の過酸化水素により内側表面を一晩処理する。さらに、汚染の可能性を減じるために、培養物を生成するのに用いる水は、０．１ミクロンのフィルタによりろ過することができる。
【０１０６】
栄養素培地組成物及び酵母培養物の培養
酵母接種材を生成するのに用いた培養物培地は、表１に示す成分を含んでいた。
【０１０７】
【表１】
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【０１０８】
培養物培地成分は、１リットルの１０％過酸化水素中で一晩殺菌した。殺菌組成物を、ミキサーのドラム中で、ろ過水と混合した。
【０１０９】
培養温度は、略室温の１８℃〜２５℃であった。培地の初期ｐＨは約５．５〜６．０であった。
【０１１０】
この培養条件で、約１〜約５日の培養後、好ましくは、約４８時間の培養時間後、バイオマス、ソホロリピッド及びその他代謝物の工業的に有用な生成が達成される。
【０１１１】
培養完了時の得られた酵母の最終濃度は約２００〜４００ＣＦＵである。培養物を用いて、発酵システムに接種することができる。培養物は、様々な工業目的についてスケーリングすることができる。
【０１１２】
本明細書に記載した実施例及び実施形態は、例示のためのみであって、様々な修正又は変更は当業者に示唆され、本明細書の精神及び範囲に含まれるものと考えられる。
【０１１３】
本明細書で参照又は引用した全ての特許、特許出願、予備出願及び公報は、本明細書の明白な教示と矛盾しない範囲で、図表を含む全内容が組み込まれる。
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月16日(2020.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持フレームと、
前記支持フレームに装着された回転可能なドラムと、
前記ドラムに接続されたモータと
を含む発酵デバイスであって、前記モータが前記ドラムを回転させて、微生物を前記発酵デバイスの前記ドラムに添加し、前記発酵デバイスを操作して、前記微生物を発酵させる、前記発酵デバイスを提供し、
前記発酵デバイスを操作して、前記微生物を培養することを含む、微生物を培養する方法。
【請求項２】
前記ドラムに、前記微生物の栄養素を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記発酵デバイスは、前記ドラムの内側表面に、複数のバッフルをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵デバイスは、前記ドラムの角度を調節する手段をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発酵デバイスを操作することは、前記デバイスを少なくとも１日間、連続的に操作することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ドラムの容積は、１０リットル〜１，５００リットルの範囲である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記微生物を前記ドラムに添加する前に、前記ドラムを、イン・サイチュで殺菌することをさらに含む、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記ドラムの殺菌は、殺菌剤として過酸化水素で洗うことを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は、前記発酵デバイスが自己殺菌される抗菌性代謝物又は副生成物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物は、バクテリア又は菌類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記微生物はバクテリアであり、前記バクテリアは、Escherichia coli、Rhizobium、Bradyrhizobium、Bacillus、Azobacter、Arhrobacter、Pseudomonas、Azospirillium、Azomonas、Derxia、Beijerinckia、Nocardia、Klebsiella、Clavibacter、cyanobacteria、Pantoea、Sphingomonas、Streptomyces、Streptoverticillium、Ralslonia、Rhodospirillum、Xanthomonas、Erwinia又はClostridiumである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物は、菌類であり、前記菌類は、Starmerella、Mycorrhiza、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Penicillium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、F usarium venenalum、Aspergillus、Trichoderma、Rhizopus spp、内生菌、Saccharomyces、Debaromyces、Issalchenkia、Kluyveromyces又はPichia sppである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記微生物は、Mycorrhizal菌類又はStarmerella菌類である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１による方法により培養された前記微生物及び／又は前記微生物の少なくとも１つの微生物増殖副生成物を含む組成物。
【請求項１５】
支持フレームと、
前記支持フレームに装着された回転可能なドラムと、
前記ドラムの内側表面にある複数のバッフルと、
前記支持フレームの下側部分に取り付けられた少なくとも１つのホイールと、
前記ドラムに接続され、前記ドラムを回転させるモータと
を含む、微生物を培養するための発酵デバイス。
【請求項１６】
前記モータは、電気モータ又はガス動力モータである、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記モータが接続されるバッテリをさらに含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記モータは、操作中、外部電源に接続されている、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記フレームの下側部分に、複数のホイールを含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記ドラムの角度を調節する手段をさらに含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記ドラムは、シリンダ又は変形シリンダの形状を有する、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２２】
前記ドラムの容積は、１０リットル〜１，５００リットルの範囲である、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２３】
前記ドラム内の温度を測定するための温度センサと、前記ドラム内のｐＨを測定するためのｐＨセンサとをさらに含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記発酵デバイスは、前記ドラム内の溶解酸素を測定するための酸素センサ、前記ドラム内の撹拌を測定するための撹拌センサ、前記ドラム内の発泡を測定するための発泡センサ、前記ドラム内の微生物培養物の純度を測定するための微生物培養物センサ、前記ドラム内の所望の代謝物の生成を測定するための代謝物センサ、又はこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記ドラムを、イン・サイチュで殺菌する殺菌ユニットをさらに含む、請求項１５に記載のデバイス。
【国際調査報告】
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