(57)【要約】本出願は、破骨細胞（ＯＣ）及び／又は樹状細胞によってＮＫ細胞をインビトロ、エクスビボ、及び／又はインビボで活性化する方法、及びこれらの活性化ＮＫ細胞を用いて疾患を治療する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ又はエクスビボでのＮＫ細胞の活性化方法であって、
培地中の前記ＮＫ細胞を破骨細胞（ＯＣ）と一緒に培養することを含む、前記方法。
【請求項２】
ｉ）ＮＫ細胞及び破骨細胞を含む細胞培養物を提供すること；並びに
ｉｉ）前記細胞培養物中の前記ＮＫ細胞及び前記破骨細胞を培養すること
を含み、それによって、前記ＮＫ細胞を活性化することを含む、方法。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞が、一次ＮＫ細胞であり、場合により、前記一次ＮＫ細胞が、形質転換されていない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化ＮＫ細胞が、４週間以内に少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加まで増殖する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培養物が、複数の破骨細胞（ＯＣ）及び複数のＮＫ細胞を含み、並びに前記細胞培養物中のＯＣ：ＮＫ細胞の比が、少なくとも１：２である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記破骨細胞が、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、場合により、前記ＮＫ細胞の細胞傷害性が、前記ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解によって測定される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫ細胞の細胞傷害性が、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を増強し、場合により、前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＬ−１２の分泌を増強する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＫＩＲ２、及びＫＩＲ３のうちの１つ以上の発現を増強する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞が、がん試料から精製される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記がん試料が、前記がんを有する対象由来である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象が、ヒトである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞培養物が、前記がん試料からも生じるＴ細胞をさらに含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞が、前記Ｔ細胞に対して優先的に増殖される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞を少なくとも１ヵ月間優先的に増殖させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記培養培地に少なくとも１つの破骨細胞を補充し、前記ＮＫ細胞を優先的に増殖させ続けることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌するが、細胞傷害性を媒介せず、場合により、前記細胞傷害性が、好ましくは５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイで、前記Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖したＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることができる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＯＣにより増殖した前記ＮＫ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗ＣＤ３抗体を前記細胞培養物に添加することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＣＤ３抗体が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性化ＮＫ細胞が、分割アネルギー化される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞培養物に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を添加することをさらに含み、場合により、前記少なくとも１つの細菌株が、生きているか又は超音波処理される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記組成物が、ｓＡＪ２細菌を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞培養物中の前記ＮＫ細胞及び／又は前記ＯＣ濃度に対する前記ｓＡＪ２細菌濃度の比が、
ｉ）ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２；
ｉｉ）ＯＣ：ｓＡＪ２について少なくとも１：４；及び／又は
ｉｉｉ）ＯＣ：ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２：４
である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞培養物に、ＮＫ細胞を活性化することができる別の薬剤を添加することをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生、分泌、及び／又は機能を増強する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ｉ）破骨細胞（ＯＣ）、ＮＫ細胞、及びＴ細胞を含む細胞培養物を提供すること；並びに
ｉｉ）前記細胞培養物中の前記ＮＫ細胞、前記Ｔ細胞、及び前記破骨細胞を培養すること
を含み、それによって、前記Ｔ細胞に比べて、前記ＮＫ細胞を優先的に活性化することを含む、方法。
【請求項３０】
ｉ）樹状細胞（ＤＣ）、ＮＫ細胞及びＴ細胞を含む細胞培養物を提供すること；並びに
ｉｉ）前記細胞培養物中の前記ＮＫ細胞、前記Ｔ細胞、及び前記樹状細胞を培養すること
を含み、それによって、前記ＮＫ細胞に比べて、前記Ｔ細胞を優先的に活性化することを含む、方法。
【請求項３１】
前記ＮＫ細胞が、一次ＮＫ細胞であり、場合により、前記一次ＮＫ細胞が、形質転換されていない、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記培養物が、複数の破骨細胞（ＯＣ）及び複数のＮＫ細胞を含み、並びに前記細胞培養物中のＯＣ：ＮＫ細胞の濃度比が、少なくとも１：２である、請求項２９又は３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記破骨細胞が、ＮＫ細胞増殖を増強し、場合により、前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＬ−１５の分泌を増強する、請求項２９、３１、又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記活性化ＮＫ細胞が、４週間以内に少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加まで増殖する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記破骨細胞が、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、場合により、前記ＮＫ細胞の細胞傷害性が、前記ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解によって測定される、請求項２９及び３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞の細胞傷害性が、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を増強し、場合により、前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＬ−１２の分泌を増強する、請求項２９及び３１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＫＩＲ２、及びＫＩＲ３のうちの１つ以上の発現を増強する、請求項２９及び３１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＮＫ細胞及び／又は前記Ｔ細胞が、がん試料から精製される、請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記がん試料が、前記がんを有する対象由来である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記対象が、ヒトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＮＫ細胞の優先的活性化が、少なくとも１ヵ月間持続する、請求項２９及び３１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＮＫ細胞の優先的活性化が減衰又は停止した後、少なくとも１つの破骨細胞を前記細胞培養物に添加することによって、前記ＮＫ細胞の活性化を継続することをさらに含み、場合により、少なくとも１つの破骨細胞の前記細胞培養物への添加が、前記ＮＫ細胞の培養の少なくとも１ヵ月後である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌するが、細胞傷害性を媒介せず、場合により、前記細胞傷害性が、好ましくは、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイで、前記Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定される、請求項２９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記増殖したＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることができる、請求項２９及び３１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＯＣにより増殖した前記ＮＫ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＤＣにより増殖した前記ＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができる、請求項３０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
抗ＣＤ３抗体を前記細胞培養物に添加することをさらに含む、請求項２９及び３１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗ＣＤ３抗体が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記活性化ＮＫ細胞が、分割アネルギー化される、請求項２９〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞培養物に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を添加することをさらに含み、場合により、前記少なくとも１つの細菌株が、生きているか又は超音波処理される、請求項２９及び３１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記組成物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物が、ｓＡＪ２細菌を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞培養物中の前記ＮＫ細胞及び／又は前記ＯＣ濃度に対する前記ｓＡＪ２細菌濃度の比が、
ｉ）ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２；
ｉｉ）ＯＣ：ｓＡＪ２について少なくとも１：４；及び／又は
ｉｉｉ）ＯＣ：ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２：４
である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞培養物に、ＮＫ細胞を活性化することができる別の薬剤を添加することをさらに含む、請求項２９及び３１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞培養物に、Ｔ細胞を活性化することができる別の薬剤を添加することをさらに含む、請求項３０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記破骨細胞（ＯＣ）が、前記ＮＫ細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生、分泌、及び／又は機能を増強する、請求項２９及び３１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
がん又はがん関連疾患若しくは障害を有するか又は有すると疑われる対象におけるがん又はがん関連疾患若しくは障害の治療方法であって、
前記対象に、治療有効量の破骨細胞（ＯＣ）、破骨細胞（ＯＣ）を含む細胞培養物、及び／又は破骨細胞（ＯＣ）を含む細胞培養物の上清を投与することを含む、前記方法。
【請求項５９】
前記破骨細胞が、前記対象中のＮＫ細胞を活性化させる、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＮＫ細胞が、一次ＮＫ細胞であり、場合により、前記一次ＮＫ細胞が、形質転換されていない、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記破骨細胞が、前記対象中のＮＫ細胞増殖を増強し、場合により、前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＬ−１５の分泌を増強する、請求項５９〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記増強されたＮＫ細胞増殖が、４週間以内に少なくとも約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記破骨細胞が、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、場合により、前記ＮＫ細胞の細胞傷害性が、前記ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解によって測定される、請求項５９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＮＫ細胞の細胞傷害性が、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を増強し、場合により、前記破骨細胞が、前記ＮＫ細胞によるＩＬ−１２の分泌を増強する、請求項５９〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記破骨細胞が、Ｔ細胞に比べて、ＮＫ細胞を優先的に活性化し、場合により、前記破骨細胞が、Ｔ細胞に比べて、ＮＫ細胞の増殖を優先的に増強させる、請求項５９〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記ＮＫ細胞の優先的な増殖が、少なくとも１ヵ月間持続する、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｔ細胞が、ＩＦＮ−γを分泌するが、前記がんの細胞傷害性を媒介せず、場合により、前記細胞傷害性が、例えば、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイで、前記Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記活性化ＮＫ細胞が、前記対象中のＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させる、請求項５９〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記活性化ＮＫ細胞が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
抗ＣＤ３抗体を前記対象に添加することをさらに含む、請求項５８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗ＣＤ３抗体が、前記ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強する、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記活性化ＮＫ細胞が、分割アネルギー化される、請求項５９〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を添加することをさらに含み、場合により、前記少なくとも１つの細菌株が、生きているか又は超音波処理される、請求項５８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記組成物が、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記組成物が、ｓＡＪ２細菌を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞培養物に、ＮＫ細胞を活性化することができる別の薬剤を添加することをさらに含む、請求項５８〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記破骨細胞（ＯＣ）が、前記ＮＫ細胞によって産生される少なくとも１つのサイトカイン又はケモカインの産生、分泌、及び／又は機能を増加又は促進する、請求項５８〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記破骨細胞、前記細胞培養物、及び／又は前記上清が、医薬組成物中で投与される、請求項５８〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記破骨細胞、前記細胞培養物、及び／又は前記上清が、前記がんに全身又は局所投与される、請求項５８〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記破骨細胞、前記細胞培養物、及び／又は前記上清が、前記対象に少なくとも２回投与され、場合により、前記破骨細胞、前記細胞培養物、及び／又は前記上清が、最初の投与から少なくとも１ヵ月後に前記対象に投与される、請求項５８〜８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象が、ヒトである、請求項５８〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年２月１５日に出願された米国仮出願第６２／４５９，３９７号に対する優先権の利益を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、がん幹細胞／未分化腫瘍を溶解し、分化して、ＭＨＣクラスＩ、ＣＤ５４及びＢ７Ｈ１を低発現し、ＣＤ４４を高発現する。末梢血リンパ球の中程度から高い細胞障害活性は、がんリスクの低下と関連し、ＮＫ細胞による腫瘍への高い浸潤は、良好な予後と関連する一方、低い活性は、がんリスクの増加と関連する。
【０００３】
ＮＫ細胞の抑制は、腫瘍微小環境におけるＮＫ受容体のダウンレギュレーションによって媒介される。ＮＫ細胞の機能は、腫瘍患者において著しく減少することが以前に示されている。いくつかのインビトロＮＫ増殖技術は、より多い治療細胞用量を可能にするために開発されている。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）又はＮＫ細胞の精製集団を、フィーダー細胞、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１５及び４１ＢＢリガンドを発現するＫ５６２細胞、ＥＢＶ−ＴＭ−ＬＣＬ、ウィルムス腫瘍又は照射ＰＢＭＣで刺激することで、十分な機能を有するより多くのＮＫ細胞が得られた。生成されたＮＫ細胞は、より高レベルのＮＫＧ２Ｄ、自然細胞傷害性受容体、ＤＮＡＭ−１、及びＩＣＡＭ−１を発現した。従って、エクスビボで増殖させ、活性化させた、ＣＤ３＋Ｔ細胞が枯渇したＮＫ細胞を得るための種々の方法が、臨床使用のために確立されている。さらに、がんが進行した患者におけるＨＬＡ半合致移植ＮＫ細胞の養子細胞移動の安全性及び有効性が確立されている。さらに、同種異系ＮＫ細胞は、固体腫瘍中で治療的役割を果たし、患者に移しても安全であることが、臨床試験により示されている。
【０００４】
ＮＫ細胞による免疫療法は、十分な数の高機能ＮＫ細胞が得られないために制限されている。さらに、健康な個体からのＮＫ細胞とは異なり、患者のＮＫ細胞の増殖は、担癌ヒト化マウスからのものと同様に、それらのより速い増殖能力によってＮＫ細胞に群がるごく一部の汚染Ｔ細胞の増殖により著しく制限される。
【０００５】
ＮＫ細胞免疫調節の発生機序は理解されていない。ＮＫ免疫療法の改善のための治療用組成物及び方法を同定する大きな必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、少なくとも一部は、破骨細胞が、ＮＫ細胞の増殖を誘導することができ、健康なヒト及びがん患者の両方においてＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比をさらに増加させるという発見に基づく。がん患者は、一般的に、健康なヒトに比べて、インビボでより高いＮＫ細胞及びＣＤ８＋／ＣＤ４＋Ｔ細胞比を有するが、過剰なＮＫ及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、（ＮＫ細胞機能を抑制し得る汚染Ｔ細胞の増殖により）寿命が短く、活性（例えば、細胞障害性及びサイトカイン選択）が欠如している。しかしながら、破骨細胞は、ＮＫ細胞増殖を誘導し、（例えば、サイトカイン分泌能力によって測定された）がん患者中のＮＫ細胞の細胞数及び機能の両方を増加することができる。樹状細胞は、Ｔ細胞の増殖を優先的に促進する一方、破骨細胞は、ＮＫ細胞の増殖を優先的に促進し、Ｔ及びＮＫ細胞の選択的増殖に対する微小環境の違いを示唆している。従って、本発明は、免疫療法戦略において使用される多数の活性化ＮＫ細胞を増殖させる方法を提供する。かかる細胞は、幹様／低分化腫瘍の分化を促進することによってがん幹細胞及び対照腫瘍の成長を阻害又は排除するために使用することができる。
【０００７】
培地中のＮＫ細胞を破骨細胞（ＯＣ）と一緒に培養することを含む、インビトロ又はエクスビボでのＮＫ細胞の活性化方法を本明細書で提供する。ＮＫは、場合により、形質転換されていない一次（初代）ＮＫ細胞であってもよい。活性化ＮＫ細胞は、４週間以内に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加まで増殖し得る。培養物は、複数の破骨細胞（ＯＣ）及び複数のＮＫ細胞を含み得、例えば、細胞培養物中のＯＣ：ＮＫ細胞の比は、少なくとも１：２である。破骨細胞は、例えば、ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解又は５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定された通り、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し得る。
【０００８】
さらに、破骨細胞は、ＮＫ細胞によって産生されたサイトカイン又はケモカインのうちの少なくとも１つの産生、分泌、及び／又は機能を増強し得る。例えば、破骨細胞は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１２の分泌、及び／又はＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＫＩＲ２、及びＫＩＲ３のうちの１つ以上の発現を増強し得る。
【０００９】
ＮＫ細胞は、ヒト対象のがん試料から精製された細胞であってもよい。ある特定の実施形態では、細胞培養物は、がん試料からも生じるＴ細胞をさらに含む。ある特定のそのような実施形態では、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞に対して優先的に増殖され得る。ＮＫ細胞は、任意の期間、例えば、少なくとも１ヵ月間増殖され得る。培養培地は、少なくとも１つの破骨細胞を補充して、ＮＫ細胞を優先的に増殖させ続けてもよい。Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイにおいて、例えば、Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定される通り、ＩＦＮ−γを分泌するが、細胞傷害性を媒介しなくてもよい。増殖したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることができ得る。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができ得る。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強するために、抗ＣＤ３抗体を細胞培養物に添加することをさらに含む。活性化ＮＫ細胞は、分割アネルギー化され得る。
【００１０】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を細胞培養物に添加することをさらに含み得、場合により、少なくとも１つの細菌株は、生きているか又は超音波処理され得る。例えば、組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含み得る。あるいは又はさらに、組成物は、ｓＡＪ２細菌を含み得る。細胞培養物中のＮＫ細胞及び／又はＯＣ濃度に対するｓＡＪ２細菌濃度の比は、例えば、ｉ）ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２；ｉｉ）ＯＣ：ｓＡＪ２について少なくとも１：４；及び／又はｉｉｉ）ＯＣ：ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２：４であり得る。
【００１１】
ある特定の実施形態では、方法は、ＮＫ細胞を活性化することができる別の薬剤を細胞培養物に添加することをさらに含み得る。
【００１２】
ある特定の好ましい実施形態では、方法は、ｉ）破骨細胞（ＯＣ）、ＮＫ細胞、及びＴ細胞を含む細胞培養物を提供すること；及びｉｉ）細胞培養物中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び破骨細胞を培養することを含み、それによって、Ｔ細胞に比べて、ＮＫ細胞を優先的に活性化することを含む。
【００１３】
同様に、ｉ）樹状細胞（ＤＣ）、ＮＫ細胞、及びＴ細胞を含む細胞培養物を提供すること；及びｉｉ）細胞培養物中のＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び樹状細胞を培養することを含み、それによって、ＮＫ細胞に比べて、Ｔ細胞を優先的に活性化することを含む、方法を本明細書で提供する。ＮＫ細胞は、一次ＮＫ細胞であってもよく、場合により、一次ＮＫ細胞は、形質転換されていない。培養物は、複数の破骨細胞（ＯＣ）及び複数のＮＫ細胞を含み得、例えば、細胞培養物中のＯＣ：ＮＫ細胞の比は、少なくとも１：２である。破骨細胞は、ＮＫ細胞増殖、及び／又はＮＫ細胞によるＩＬ−１５の分泌を増強し得る。活性化ＮＫ細胞は、４週間以内に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加まで増殖し得る。さらに、破骨細胞は、例えば、ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解によって測定された通り、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し得る。細胞の細胞傷害性は、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定され得る。
【００１４】
ある特定の実施形態では、破骨細胞（ＯＣ）は、ＮＫ細胞によって産生されたサイトカイン又はケモカインのうちの少なくとも１つの産生、分泌、及び／又は機能を増強し得る。例えば、破骨細胞は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１２の分泌を増強し得る。破骨細胞は、ＮＫ細胞によるＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４、ＫＩＲ２、及びＫＩＲ３のうちの１つ以上の発現を増強し得る。ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞は、対象、例えば、ヒト対象由来のがん試料から精製され得る。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞の優先的活性化は、少なくとも１ヵ月間持続し得る。さらに、ＮＫ細胞の優先的活性化が減衰又は停止した後、少なくとも１つの破骨細胞は、ＮＫ細胞の培養後に少なくとも１ヵ月間、細胞培養物に添加することで、ＮＫ細胞の活性化を継続し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを分泌するが、細胞傷害性を媒介しなくてもよい。細胞傷害性は、例えば、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイで、Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定され得る。増殖したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させることができ得、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができ得る。ある特定の実施形態では、ＤＣにより増殖したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対して、ＣＤ４＋Ｔ細胞を優先的に増殖させることができ得る。他の実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、例えば、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強するために、細胞培養物に添加し得る。さらに、活性化ＮＫ細胞は、分割アネルギー化され得る。
【００１５】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を細胞培養物に添加することをさらに含み得、場合により、少なくとも１つの細菌株は、生きているか又は超音波処理される。例えば、組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含み得る。
【００１６】
あるいは又はさらに、組成物は、ｓＡＪ２細菌を含み得る。ある特定のそのような実施形態では、細胞培養物中のＮＫ細胞及び／又はＯＣ濃度に対するｓＡＪ２細菌濃度の比は、例えば、ｉ）ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２；ｉｉ）ＯＣ：ｓＡＪ２について少なくとも１：４；及び／又はｉｉｉ）ＯＣ：ＮＫ細胞：ｓＡＪ２について少なくとも１：２：４であり得る。
【００１７】
さらに、方法は、ＮＫ細胞を活性化することができ得る別の薬剤を細胞培養物に添加することをさらに含み得る。方法は、Ｔ細胞を活性化することができる別の薬剤を細胞培養物に添加することをさらに含み得る。
【００１８】
同様に、対象に、治療有効量の破骨細胞（ＯＣ）、破骨細胞（ＯＣ）を含む細胞培養物、及び／又は破骨細胞（ＯＣ）を含む細胞培養物の上清を投与することによって、がん又はがん関連疾患若しくは障害を有するか又は有すると疑われる対象におけるがん又はがん関連疾患若しくは障害を治療する方法を本明細書で提供する。
【００１９】
破骨細胞は、対象中のＮＫ細胞増殖を増強し得、場合により、破骨細胞は、ＮＫ細胞によるＩＬ−１５の分泌を増強する。ある特定の実施形態では、増強されたＮＫ細胞増殖は、４週間以内に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５回、又はそれ以上の集団倍加であり得る。さらに、破骨細胞は、例えば、ＮＫ細胞による口腔扁平上皮癌幹様細胞（ＯＳＣＳＣ）の溶解によって測定された通り、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し得る。細胞の細胞傷害性は、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイによって測定され得る。
【００２０】
ある特定の実施形態では、破骨細胞は、ＮＫ細胞によって産生されたサイトカイン又はケモカインのうちの少なくとも１つの産生、分泌、及び／又は機能を増加又は促進し得る。例えば、破骨細胞は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ及び／又はＩＬ−１２の分泌を増強し得る。破骨細胞は、Ｔ細胞に比べて、ＮＫ細胞を優先的に活性化し、及び／又はＴ細胞に比べて、ＮＫ細胞の増殖を優先的に増強し得る。ある特定の実施形態では、ＮＫ細胞の優先的活性化は、少なくとも１ヵ月間持続し得る。Ｔ細胞は、例えば、５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイで、Ｔ細胞によるＯＳＣＳＣの溶解によって測定される通り、ＩＦＮ−γを分泌するが、がんの細胞傷害性を媒介しなくてもよい。
【００２１】
ある特定の実施形態では、活性化ＮＫ細胞は、対象中のＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させ得、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させ得る。対象は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γの分泌をさらに増強するために、抗ＣＤ３抗体でも治療され得る。活性化ＮＫ細胞は、分割アネルギー化され得る。
【００２２】
ある特定の実施形態では、治療方法は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓから選択される少なくとも１つの細菌株を含む組成物を細胞培養物に添加することをさらに含み得、場合により、少なくとも１つの細菌株は、生きているか又は超音波処理される。例えば、組成物は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ、ＫＥ９９、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓを含み得る。ある特定の実施形態では、組成物は、ｓＡＪ２細菌を含み得る。
【００２３】
ある特定の実施形態では、方法は、ＮＫ細胞を活性化することができる別の薬剤を細胞培養物に添加することをさらに含み得る。
【００２４】
ある特定の実施形態では、破骨細胞、細胞培養物、及び／又は上清は、医薬組成物中で投与され得、がんに全身又は局所投与され得る。ある特定の実施形態では、破骨細胞、細胞培養物、及び／又は上清は、対象に少なくとも２回投与され得、例えば、破骨細胞、細胞培養物、及び／又は上清は、最初の投与から少なくとも１ヵ月後に対象に投与され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】パネルＡ、Ｂ、Ｃ、及びＤとして識別された４個のパネルを含み、破骨細胞によるＮＫ活性化リガンドのより高い発現を示す。破骨細胞（ＯＣ）を生成するため、単球は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で２１日間培養した。高純度のＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した後、それぞれ、１：２：４（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下又は不在下で、自己ＯＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現は、フローサイトメトリーを用いて、６、９、１２、１５、１９、２４、２９、及び３４日目に共培養からの１×１０４個のリンパ球試料中で解析し、培養培地を新鮮にし、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）を補充した（図１Ａ）。細胞を、図１Ａに示すように共培養し、増殖したリンパ球を、顕微鏡を用いて手動で計数した（図１Ｂ）。単球を、健康なドナーのＰＢＭＣから単離した。樹状細胞を生成するため、単球を、ＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で８日間培養した。破骨細胞を生成し、ＮＫ細胞を、図１Ａに示すように精製した後、それぞれ、１：２：４（標的細胞：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下にて自己細胞と共培養した。培養の６日目に、培養培地を除去し、ＮＫ細胞を、ｒｈ−ＩＬ−２で５時間処理した後、上清を収穫し、単一ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ−γ分泌を判断した（図１Ｃ）。単球を単離し、樹状細胞及び破骨細胞は、図１Ａ及び図１Ｄに示すように生成し、ＯＳＣＳＣ及びＫ５６２腫瘍細胞株を、材料及び方法で示すように培養し、１×１０４個の細胞を使用して、ＰＥ共役抗体及びフローサイトメトリーを用いて、ＭＨＣ−１、ＣＤ５４、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＫＬＲＧ１及びＭＩＣＡ／Ｂ表面発現を解析した。ＩｇＧ２アイソタイプは、対照として使用した（図１Ｄ）。
【図２】パネルＡ〜Ｊとして識別された１０個のパネルを含み、破骨細胞によるＮＫ細胞及び樹状細胞によるＴ細胞の優先的な増殖及び機能の有意な向上を示す。単球は、ヒトＰＢＭＣから精製し、ＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍｌ）で８日間培養し、ＤＣを生成した。破骨細胞を生成するため、単球を、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ−ＭＥＭ培地で２１日間培養した。増殖のために、精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した後、１：２：４（単球、ＤＣ又はＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比でのｓＡＪ２の存在下にて自己単球、ＤＣ、又はＯＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現は、フローサイトメトリーを用いて、図に示される日数で解析し、培養培地を新鮮にし、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）を補充した（図２Ａ）。細胞は、図２Ａに示すように共培養し、増殖したリンパ球の数を、顕微鏡測定を用いて評価した（図２Ｂ）。ＮＫ細胞（図２Ｃ）及びＴ／ＮＫＴ（図２Ｄ）細胞の数を、図２Ｂの増殖細胞の総数の内のＮＫ及びＴ／ＮＫＴ細胞（図２Ａ）のパーセンテージを用いて判断した。細胞は、図２Ａに示すように共培養し、口腔扁平上皮癌幹細胞株（ＯＳＣＳＣ）に対する細胞傷害性は、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、図に示される日数で判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要なリンパ球の逆数を用いて判断した（図２Ｅ）。図１Ａに示すように、上清を、６、９、１２及び１５日目にＮＫのＯＣとの共培養物から収穫し、単一ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ−γ分泌を判断した（図２Ｆ）。ＮＫ細胞を、自己破骨細胞と共培養し、図２Ａに示すように、１０人の健康なドナーから増殖させた。ＮＫ細胞の累積増殖倍数は、ドナーごとに３１日間算出し（図２Ｇ）、集団倍加は、ベースライン計数に対する最終計数の比の対数を、２の対数で除したものに基づいて算出した（図２Ｈ）。樹状細胞及び破骨細胞は、図２Ａに示すように生成し、１×１０４個の細胞を使用して、ＰＥ共役抗体及びフローサイトメトリー解析を用いて、ＵＬＢＰ、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＫＬＲＧ１及びＭＩＣＡ／Ｂ表面発現を解析した。ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した（図２Ｉ）。新たに単離されたＮＫ細胞（上段）、及び図２Ａに示すように自己破骨細胞と共培養し増殖させたＮＫ細胞（下段）を使用して、ＰＥ共役抗体を用いて、ＣＤ１６、Ｎｋｐ３０、Ｎｋｐ４４、Ｎｋｐ４６、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＣＤ９４、及びＮＫＧ２Ｄ表面発現を解析した。ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した（図２Ｊ）。
【図３】パネルＡ〜Ｈとして識別された８個のパネルを含み、ＮＫ細胞とは異なり、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞から精製されたＴ細胞は、ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性を媒介せず、ＩＦＮ−γを適度に分泌することを示す。精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、材料及び方法で示すように、単球由来自己破骨細胞と共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＧＬ３（ＴＣＲγ／δ）、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現は、ＦＩＴＣ−及びＰＥ−共役抗体及びフローサイトメトリーを用いて、９日目に共培養物からのリンパ球試料中で解析した（図３Ａ）。ＮＫ細胞を処理し、図１Ａに示すように、自己破骨細胞と共培養し、９日目に、ＣＤ３Ｔ陽性細胞は、ＣＤ３Ｔ陽性選択キットを用いて選別し、ＣＤ３Ｔ陰性（ＮＫ）細胞の純度は、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６  ＦＩＴＣ及びＰＥ共役抗体及びフローサイトメトリーを用いて評価した（図３Ｂ）。ＣＤ３Ｔ陽性細胞及びＣＤ３Ｔ−陰性細胞（ＣＤ１６陽性細胞）を、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８〜２０時間処理した後、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、ＯＳＣＳＣ（図３Ｃ）及びＫ５６２（図３Ｄ）細胞株に対する細胞傷害性を試験した。溶解単位３０／１０６個の細胞を、材料及び方法に記載される方法を用いて、ＯＳＣＳＣ及びＫ５６２についてそれぞれ判断した。上清を培養物から収穫し、単一ＥＬＩＳＡを用いてＩＦＮ−γ分泌を判断した（図３Ｅ）。ＮＫ細胞、ＣＤ３Ｔ、ＣＤ４Ｔ、ＣＤ８Ｔ、及びγδＴ細胞を、材料及び方法で示すように、ＰＢＭＣから精製し、ｒｈ−ＩＬ−２で１８〜２０時間活性化した後、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性を試験した（図３Ｆ）。溶解単位３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要なリンパ球の逆数を用いて判断した（図３Ｆ）。ＮＫ及びＴ細胞を、材料及び方法で示すように、ＰＢＭＣから精製し、ＮＫ細胞を、材料及び方法で示すように処理した。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８（３μｇ／ｍｌ）で１８〜２０時間活性化した後、自己ＯＣと培養し、増殖したリンパ球は、培養の４日後に顕微鏡を用いて手動で計数した（図３Ｇ）。ＮＫ及びＴ細胞を精製し、ＯＣと培養し、図３Ｇに示すように、４日目に計数し、ＯＣにより増殖したリンパ球の増殖倍数を、ＯＣを有さないリンパ球の増殖倍数で除した（図３Ｈ）。
【図４】パネルＡ〜Ｓとして識別された１９個のパネルを含み、破骨細胞及びｓＡＪ２細菌によるＮＫ細胞培養物の連続する各再刺激による、ＮＫ細胞の割合の減少、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性、及びＩＦＮ−γ分泌を示す。精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、図２Ａに示すように、単球由来自己破骨細胞と共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面発現を、フローサイトメトリー解析を用いて、図に示される日数で、共培養物からの１×１０４個のリンパ球中で解析した（図４Ａ）。３６日後、ＮＫ細胞が増殖を止めると、図２Ａに示すように、新たな自己破骨細胞で再培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現は、抗体染色及びフローサイトメトリー解析を用いて、図に示される日数で解析した（図４Ｂ）。６３日目に、細胞が増殖を止めると、示したようにＯＣと再培養し、ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面発現を、図に示される日数で解析した（図４Ｃ）。増殖したリンパ球の数を、顕微鏡測定を用いて評価し（図４Ｄ、４Ｇ、４Ｊ）、ＮＫ細胞（図４Ｆ、４Ｉ、４Ｌ）及びＴ／ＮＫＴ（図４Ｅ、４Ｈ、４Ｋ）細胞の数を、増殖細胞の総数の内のＮＫ及びＴ／ＮＫＴ細胞のパーセンテージを用いて判断した（図４Ｄ）。細胞死は、ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリー解析を用いて、３６、５９及び８３日目にリンパ球中で判断した（図４Ｍ）。精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、図２Ａに示すように、自己破骨細胞と共培養した。その後、リンパ球を、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、共培養の６、１７、及び３４日後（図４Ｎ）、共培養の４０及び６３日後（図４Ｏ）又は共培養の７６及び９２日後（図４Ｐ）に、ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性を試験した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図２Ｅに示される方法を用いて判断した。上清を収穫し、ＩＦＮ−γ分泌は、６、９、１２、１５、１８及び２１日目、（図４Ｑ）；４０、４６、５１、５５、及び５９日目（図４Ｒ）、並びに７６、８３、９２、及び９７日目（図４Ｓ）の上清を用いて、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した。
【図５】パネルＡ〜Ｈとして識別された８個のパネルを含み、Ｋ５６２又はＯＳＣＳＣではなく破骨細胞が、ＮＫ細胞を増殖させ、ＮＫ細胞機能を実質的に増加させることを示す。破骨細胞を生成するため、単球を、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地で２１日間培養し、Ｋ５６２腫瘍細胞株を、材料及び方法で示すように培養した。高純度のＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した後、それぞれ、１：２：４（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下にてＫ５６２及び自己ＯＣと共培養した。培養した細胞を、６、１０及び１３日目に顕微鏡を用いて手動で計数した（図５Ａ）。図１Ａに示すように生成した破骨細胞、及びＫ５６２腫瘍細胞株に、材料及び方法で示すように、４０グレイ（Ｇｙ）で照射した。ＮＫ細胞を精製し、材料及び方法で示すように処理した後、それぞれ、１：２：４（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下にて照射Ｋ５６２及び照射自己ＯＣと共培養した。培養した細胞を、６、１０及び１３日目に顕微鏡を用いて手動で計数した（図５Ｂ）。ＮＫ細胞を精製し、図１Ａに示すように、ＯＣ及びＫ５６２と培養し、６日間共培養したリンパ球の細胞傷害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３Ｆに記載される方法を用いて判断した（図５Ｃ）。ＮＫ細胞を精製し、図５Ｂに示すように、ＯＣ及びＫ５６２と培養し、６日間共培養したリンパ球の細胞傷害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３Ｆに記載される方法を用いて判断した（図５Ｄ）。ＮＫ細胞を精製し、図５Ａに示すように、ＯＣ及びＯＳＣＳＣと培養し、６日間共培養したリンパ球の細胞傷害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３Ｆに記載される方法を用いて判断した（図５Ｅ）。ＮＫ細胞を精製し、図３Ａに示すように、ＯＣ及びＫ５６２と培養し、上清を、３、６、７、１０及び１３日目に収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図５Ｆ）。ＮＫ細胞を精製し、照射ＯＣ及び照射Ｋ５６２と培養し、上清を、３、６、７、１０及び１３日目に収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図５Ｇ）。ＮＫ細胞を精製し、ＯＣ及びＯＳＣＳＣと培養し、上清を、１、３、６及び８日目に収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図５Ｈ）。
【図６】パネルＡ〜Ｐとして識別された１６個のパネルを含み、がん患者からのＯＣと培養した精製ＮＫ細胞が、ＮＫ細胞よりもＴ細胞を増殖させ、健康なドナーから増殖したものと比べて、非常に低い細胞傷害性及びサイトカイン分泌を媒介することを示す。健康なドナー及びがん患者からの精製したばかりのＮＫ細胞を、図２Ａに示すように、処理し、単球由来ＯＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面発現は、抗体の染色を用いて、がん患者（図６Ａ）及び健康なドナー（図６Ｂ）の６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３１日目に増殖細胞で解析した後、フローサイトメトリーで解析した。細胞死は、ＰＩ染色及びフローサイトメトリー解析を用いて、１９日目に、がん患者及び健康なドナーからの増殖ＮＫ細胞上で判断した（図６Ｃ）。共培養の６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、及び３１日後、増殖したリンパ球を、顕微鏡を用いて手動で計数した（図６Ｄ）。ＮＫ細胞（図６Ｅ）及びＴ／ＮＫＴ（図６Ｆ）細胞の数は、図６Ａ及び図６Ｂの増殖細胞の総数の内のＮＫ及びＴ／ＮＫＴ細胞のパーセンテージを用いて判断した。リンパ球の細胞障害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて、１２及び１５日目に判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図２Ｅに記載される方法を用いて判断した。図６Ｆからの溶解単位は、ＮＫ細胞に基づいて正規化した（図６Ｈ）。上清を、共培養の一晩、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、及び２７日目から収穫し、ＩＦＮ−γ（図６１）、ＩＬ−１０（図６Ｊ）、及びＩＬ−６（図６Ｋ）分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した。健康なドナー、扁桃癌（患者＃１）及び膵臓癌（患者＃２）を有するがん患者からの精製したばかりのＮＫ細胞を、図２Ａに示すように、処理し、ＯＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現は、健康なドナー及び患者ＮＫの２１日目の共培養、及び健康なドナーの８７日目の共培養（第３刺激）からのリンパ球で解析し（図６Ｌ）、Ｎｋｐ３０、Ｎｋｐ４４、Ｎｋｐ４６、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｄの表面発現は、ＣＤ１６陽性細胞内で解析した（図６Ｍ）。ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した（図６Ｌ及び図６Ｍ）。上清を、１３日目に共培養物から収穫し、各ドナーからの等量の上清（２００μｌ）を使用して、ＯＳＣＳＣを一晩分化させた後、ＭＨＣ−Ｉ、ＣＤ５４、ＣＤ４４及びＢ７Ｈ１表面発現のレベルをＯＳＣＳＣ上で判断した。ＩｇＧ２アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した（図６Ｎ）。細胞死は、ヨウ化プロピジウム染色及びフローサイトメトリー解析を用いて、未処理及びＮＫ細胞上清分化ＯＳＣＳＣで判断した（図６Ｏ）。高純度のＮＫ細胞をＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、使用して、４時間５１Ｃｒ放出アッセイで、未処理及びＮＫ上清分化ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性を判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図２Ｅに記載される方法を用いて判断した（図６Ｐ）。
【図７】パネルＡ〜Ｋとして識別された１１個のパネルを含み、がん患者からの精製ＮＫ細胞中のごく少量の汚染Ｔ細胞が、より速く増殖し、おそらくＮＫ細胞機能の低下によりＮＫ細胞に群がることを示す。健康なドナー及び膵臓癌患者からの精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、図１Ａに示すように、単球由来同種異系（異なる健康なドナーから）破骨細胞と共培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面発現を、ＦＩＴＣ−及びＰＥ共役抗体及びフローサイトメトリーを用いて、がん患者（図７Ａ）及び健康なドナー（図７Ｂ）の６、１０、１３、１７、２１、２４、２８、３２及び３６日目に、共培養物からの１×１０４個のリンパ球試料中で解析した。共培養の６、１０、１３、１７、２１、２４、２８及び３２日後に、増殖したリンパ球を、顕微鏡を用いて手動で計数した（図７Ｃ）。細胞を図７Ｃで述べたように計数し、図７Ａ及び７Ｂで解析した表面発現に基づいて調整し、Ｔ／ＮＫＴ細胞（図７Ｄ）及びＮＫ細胞の数を毎日（図７Ｅ）判断した。１８〜２０時間、１３、２０及び３２日間共培養したリンパ球の細胞障害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３Ｆに記載される方法を用いて判断した（Ｇ）。図７Ｆからの溶解単位を、図７Ａ及び７Ｂで解析した表面発現に基づいて調整し、１ＮＫ細胞が媒介した、ＯＳＣＳＣに対する細胞傷害性を判断した（図７Ｈ）。上清を、共培養の一晩、６、１０、１３、１７、２１、２４、２８及び３２日目から収穫し、ＩＦＮ−γ（図７Ｉ）、ＩＬ−１０（図７Ｊ）、及びＩＬ−６（図７Ｋ）分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した。
【図８】ｈｕ−ＢＬＴマウスの脾細胞からの、ＣＤ３  Ｔ細胞が枯渇したリンパ球の表現型を示す。ヒト化ＢＬＴ（ｈｕ−ＢＬＴ；ヒト骨髄／肝臓／胸腺）マウスは、６〜８週齢の免疫不全ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ及びＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉ１２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスの腎被膜下に、ヒト胎児肝臓及び胸腺組織を外科移植することによって生成した。組織移植の４〜６週間後に、マウスに亜致死的に照射し、胎児肝臓から単離されたＣＤ３４＋細胞を静脈内注入し、ヒト骨髄の完全再構成を支持した。ＣＤ３４＋細胞を注入した８〜１２週間後に、ヒト免疫系の再構成を、血液検体を用いて解析した。この実験の終わりに、ヒト免疫細胞の生着は、脾細胞及び骨髄細胞を抗ヒトＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８抗体で染色することで確認し、フローサイトメトリーで解析した（データ不図示）。再構成に成功したｈｕ−ＢＬＴマウス（健康なドナーに匹敵するＴ細胞のレベル及び血統）の口腔底に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを同所注入した。疾患進行及び体重減をさらに３〜４週間モニターした。動物を犠牲にし、脾臓を、犠牲にした動物から収穫し、単細胞懸濁液を材料及び方法で示すように得た。ＣＤ３Ｔ細胞は、ヒトＣＤ３Ｔ陽性選択キットを用いて選別した。フロースルーセル（ＣＤ３陰性細胞）は、それぞれ、ＰＥ共役、ＰＥ−Ｃｙ５共役、及びＦＩＴＣ共役抗体による染色後に、ヒトＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ１４の表面発現について解析した。アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した。
【図９】パネルＡ〜Ｋとして識別された１１個のパネルを含み、担癌ヒト化ＢＬＴマウスからの、Ｔ細胞を枯渇させたインビトロ増殖したリンパ球が、健康なｈｕ−ＢＬＴマウスから得られたものと比べた場合に、Ｔ細胞を増殖させ、少ないＮＫ細胞を含有し、及び低い細胞傷害性を媒介することを示す。再構成されたＢＬＴ（健康なドナーに匹敵するＴ細胞のレベル及び血統）の口腔底に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを同所注入した。疾患進行及び体重減をさらに４〜５週間モニターした。マウスを犠牲にし、脾臓を収穫し、単細胞懸濁液を補足材料及び方法で示すように得た。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、陽性選択キットを用いて選別し、フロースルーセルは、それぞれの抗体による染色後に、ヒトＣＤ３／ＣＤ１６／ＣＤ５６の表面発現について解析した。アイソタイプ対照抗体は、対照として使用した（図９Ａ）。ｈｕ−ＢＬＴマウスからのＣＤ３陰性細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した後、１：２：４（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２の存在下にてＯＣを培養した。ＣＤ３、ＣＤ１６、及びＣＤ５６の表面発現は、フローサイトメトリー解析を用いて、６、１０、１４、１８、及び２２日目に解析した（図９Ｂ）。共培養の６、１０、１８、及び２２日後に、増殖したリンパ球を、顕微鏡を用いて手動で計数した（図９Ｃ）。ＮＫ細胞（図９Ｄ）及びＴ／ＮＫＴ（図９Ｅ）細胞の数は、増殖細胞の総数の内のＮＫ及びＴ／ＮＫＴ細胞のパーセンテージを用いて判断した。１０及び１８日間共培養したＮＫ細胞の細胞障害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断し、溶解単位３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要なＮＫ細胞の逆数を用いて判断した（図９Ｆ）。溶解単位を正規化し、ＯＳＣＳＣに対するＮＫ細胞溶解ごとに調整した（図９Ｇ）。上清を、６、１０、及び１３日目に共培養物から収穫し、ＩＦＮ−γ（図９Ｈ）、ＩＬ−１０（図９Ｉ）、及びＩＬ−６（図９Ｊ）分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した。心臓穿刺による死後に、ｈｕ−ＢＬＴマウスから末梢血を回収し、血清試料を収穫し、多重アレイを用いて、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６分泌について解析した（図９Ｋ）。
【図１０】パネルＡ〜Ｃとして識別された３個のパネルを含み、一次細胞及び破骨細胞により増殖したＮＫ細胞が分泌したサイトカイン、ケモカイン、及び成長因子並びにリガンドを示す。高純度のＮＫ細胞及び単球を、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得て、ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）をＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理した後、上清を収穫した。破骨細胞を生成するため、単球を、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍｌ）を含有するアルファ−ＭＥＭ培地で２１日間培養した。増殖のために、精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８時間処理した後、それぞれ、１：２：４（ＯＣ：ＮＫ：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下にて自己破骨細胞と共培養した。上清を、共培養の６日後に収穫し、多重アッセイを使用して、一次ＮＫ細胞及び増殖したＮＫ細胞が分泌したサイトカイン（図１０Ａ）、ケモカイン（図１０Ｂ）及び成長因子（図１０Ｃ）レベルを判断した。
【図１１】パネルＡ〜Ｃとして識別された３個のパネルを含み、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、又は両方の組み合わせの遮断により、ＮＫ細胞増殖の低下、ＮＫ細胞媒介の細胞傷害性及びサイトカイン分泌をもたらしたことを示す。健康なドナーからの精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、図２Ａに示すように、抗ＩＬ１２、−ＩＬ−１５、又は抗ＩＬ−１２及び−ＩＬ−１５  ｍＡｂｓの組み合わせの存在下及び不在下で、それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌで、自己破骨細胞と共培養した。共培養物にＩＬ−２（１０００単位／ｍＬ）を２日ごとに補充した。ＮＫ細胞を、６、８、１２、１４、及び２０日目に顕微鏡を用いて計数した（図１１Ａ）。９日目及び１５日目に、各増殖試料からの１×１０５個のＮＫ細胞を、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出で使用した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要なＮＫ細胞の逆数を用いて判断した（図１１Ｂ）。上清を、８、１２、１５及び２０日目に共培養物から収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図１１Ｃ）。
【図１２】パネルＡ〜Ｇとして識別された７個のパネルを含み、抗ＣＤ３抗体の添加がＴ細胞増殖を阻害し、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞を増加させることを示す。健康なドナー及びがん患者からの精製したばかりのＮＫ細胞をＯＣで２７日間増殖させた後、培養物を、ｒｈ−ＩＬ−２及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）で処理し、その後、ＮＫ細胞（図１２Ａ）及びＴ細胞（図１２Ｂ）の数を、２９、３１、及び３５日目に顕微鏡評価で判断した（健康及び患者の両方）。前方及び側方散乱の損失は、図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように処理した健康細胞（図１２Ｃ）及び患者細胞（図１２Ｄ）で判断した。細胞をＰＩで染色し、ＤＮＡ断片化について解析した（図１２Ｅ）。培養３１日目のリンパ球を、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出で使用した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要なＮＫ細胞の逆数を用いて判断した（図１２Ｆ）。上清を、３５日目に共培養物から収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図１２Ｇ）。
【図１３】ＮＫ細胞の不在下で抗ＣＤ３  ｍＡｂで処理した精製Ｔ細胞が、前方及び側方散乱を損失しなかったことを示す。高純度のＮＫ細胞及び単球を、健康なドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得て、Ｔ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）をＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）で１８時間処理した後、それぞれ、１：２：４（ＯＣ：Ｔ細胞：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２細菌の存在下にて自己破骨細胞と共培養した。細胞は、培養の９日後に、ＣＤ３、ＣＤ１６及びＣＤ５６について解析した。抗ＣＤ３処理したＴ細胞は、ＮＫ細胞の不在下で、前方及び側方散乱を損失しなかった。
【図１４】パネルＡ〜Ｈとして識別された８個のパネルを含み、破骨細胞が活性化したＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞数を実質的に増加させることを示す。健康なドナー及びがん患者からのＰＢＭＣを、ＰＥ−及びＦＩＴＣ共役抗体の染色を用いて、ＣＤ３、ＣＤ４及びＣＤ８の表面発現について解析した後、フローサイトメトリーで解析した（図１４Ａ）。健康なドナー及びがん患者からの精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、図２Ａに示すように、ＯＣと共培養した。Ｔ細胞は、ＣＤ３陽性選択キットを用いて、健康なドナー及びがん患者のＰＢＭＣから精製し、Ｔ細胞は、ｒｈ−ＩＬ２（１００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ）及び抗ＣＤ２８  ｍＡｂｓ（１μｇ／ｍｌ）の組み合わせで１８〜２０時間活性化させた後、１：２：４（ＯＣ：Ｔ細胞：ｓＡＪ２）の比で、ｓＡＪ２の存在下にてＯＣと共培養した。ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の表面発現を、リンパ球で解析した（図１４Ｂ）。単球は、ヒトＰＢＭＣから精製し、ＯＣ及びＤＣを生成し、精製ＮＫ細胞を図２Ａに示すように共培養し、増殖したリンパ球の数を、顕微鏡測定を用いて評価し（図１４Ｃ）、Ｔ細胞（図１４Ｄ）及びＮＫ細胞（図１４Ｅ）の数は、図１４Ｃの増殖細胞の総数内で、図２Ａに示すように、ＮＫ及びＴ細胞のパーセンテージを用いて判断した。ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の表面発現をリンパ球で解析し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１４Ｆ）及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞（図１４Ｇ）の数は、パネルＤのＴ細胞の総数の内でＣＤ４及びＣＤ８細胞のパーセンテージを用いて判断した。ＯＣにより活性化したＮＫは、Ｔ細胞を増殖させ、ＤＣにより活性化したＮＫは、Ｔ細胞を増殖させ、ＯＣにより増殖した／活性化したＴ細胞、及びＤＣにより増殖した／活性化したＴ細胞を、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＤ４４、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した。第２象限の数は、ＣＤ３＋Ｔ細胞内の抗体ごとの細胞陽性のパーセンテージを表す（図１４Ｈ）。
【図１５】パネルＡ及びＢとして識別された２個のパネルを含み、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞が、凍結後にそれらのサイトカイン分泌及び細胞障害機能を保持したことを示す。図１Ａに示すように、精製したばかりのＮＫ細胞を処理し、培養の９日後に単球由来自己破骨細胞と共培養し、増殖したＮＫ細胞を凍結した。ＮＫ細胞を解凍し、培養の６日及び９日後に、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、上清を収穫し、ＩＦＮ−γ分泌を、単一ＥＬＩＳＡ（図１５Ａ）を用いて判断した。ＮＫ細胞を図１Ａに示すように培養し、培養の６日及び９日後のリンパ球の細胞傷害性は、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。溶解単位３０／１０６個の細胞は、図３Ｆに記載される方法を用いて判断した（図１５Ｂ）。
【図１６】パネルＡ〜Ｅとして識別された５個のパネルを含み、膵臓（図１６Ｂ）、結腸（図１６Ｃ）、口腔（図１６Ｄ）、及び前立腺（図１６Ｅ）がん患者の末梢血から得られたＰＢＭＣの数の減少を示す。図１６Ａは、健康な対象対患者の減少を示す。
【図１７】パネルＡ〜Ｅとして識別された５個のパネルを含み、健康な対象（図１７Ａ）、膵臓（図１７Ｂ）、結腸（図１７Ｃ）、口腔（図１７Ｄ）、及び前立腺（図１７Ｅ）癌患者の末梢血から得られたＰＢＭＣからの、ＮＫ及びＣＤ１４単球のパーセンテージは増加したが、Ｔ細胞及びＢ細胞は著しく減少したことを示す。
【図１８】パネルＡ〜Ｄとして識別された４個のパネルを含み、健康なＮＫ細胞と比べた場合の、患者のＮＫ細胞によるＮＫ細胞の細胞傷害性の減少を示す。
【図１９】パネルＡ〜Ｈとして識別された８個のパネルを含み、患者由来の破骨細胞により増殖したＮＫ細胞、及びＩＦＮ−γの細胞障害性及び分泌を示す。
【図２０】膵臓癌患者からの、非破骨細胞により増殖したＮＫ細胞中のサイトカイン分泌を示す。
【図２１】パネルＡ〜Ｅとして識別された５個のパネルを含み、健康な対象（図２１Ａ）、膵臓（図２１Ｂ）、結腸（図２１Ｃ）、口腔（図２１Ｄ）、及び前立腺（図２１Ｅ）がん患者からの、破骨細胞により増殖したＴ細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図２２】パネルＡ〜Ｆとして識別された６個のパネルを含み、ＮＫ細胞対Ｔ細胞（図２２Ａ）、健康な対象（図２２Ｂ）、膵臓（図２２Ｃ）、結腸（図２２Ｄ）、前立腺（図２２Ｅ）、及び口腔（図２２Ｆ）がん患者からの、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、及び破骨細胞により増殖したＮＫ細胞及びＴ細胞からのＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図２３】パネルＡ〜Ｄとして識別された４個のパネルを含み、健康な対象（図２３Ａ）、膵臓（図２３Ｂ）、結腸（図２３Ｃ）、及び前立腺（図２３Ｄ）癌患者からの、ＩＦＮ−γのＴ細胞分泌を示す。
【図２４】パネルＡ〜Ｆとして識別された６個のパネルを含み、累積ＮＫ細胞対Ｔ細胞（図２４Ａ）、健康な対象からのＮＫ細胞（図２４Ｂ）、膵臓（図２４Ｃ）、結腸（図２４Ｄ）、口腔（図２４Ｅ）、及び前立腺（図２４Ｆ）癌患者において、増殖しているＴ細胞対０〜１５日以内に判断された表面受容体架橋を通じて活性化されたＴ細胞効果を通じて活性化したＮＫ細胞の総数を示す。
【図２５】パネルＡ〜Ｅとして識別された５個のパネルを含み、０〜１５日以内に判断した健康な個体（図２５Ａ）の能力と比べた場合の、膵臓（図２５Ｂ）、結腸（図２５Ｃ）、及び前立腺（図２５Ｄ）癌患者のＴ細胞を増殖する能力を示す。
【図２６】患者対健康な個体の血清中のサイトカイン及びケモカインの減少を示す。
【図２７】Ａ〜Ｂの２個のパネルを含み、健康な個体と比べた場合の、膵臓（図２７Ａ）及び結腸（図２７Ｂ）癌患者からのＰＢＭＣ中のＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージを示す。
【図２８】Ａ〜Ｅの５個のパネルを含み、膵臓（図２８Ｂ）、結腸（図２８Ｃ）、口腔（図２８Ｄ）、及び前立腺（図２８Ｅ）癌患者対健康な個体（図２８Ａ）のＰＢＭＣ内のＣＤ４／ＣＤ８  Ｔ細胞の比を示す。
【図２９】５個のパネルを含み、健康な対象（図２９Ａ）対膵臓（図２９Ｂ）、結腸（図２９Ｃ）、口腔（図２９Ｄ）、及び前立腺（図２９Ｅ）癌患者における、ＣＤ４  Ｔ細胞のＣＤ８  Ｔ細胞に対する比を示す。
【図３０】Ａ〜Ｂの２個のパネルを含み、破骨細胞を有さない（図３０Ａ）及び破骨細胞を有する（図３０Ｂ）ＣＤ８  Ｔ細胞及びＣＤ４  Ｔ細胞を培養する効果を示す。
【図３１】ＮＫ及びＣＤ８  Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図３２】破骨細胞及びＮＫ細胞によりそれぞれ促進されたＣＤ８  Ｔ細胞増殖及びＣＤ４  Ｔ細胞増殖を示す。
【図３３】破骨細胞により増殖したＮＫ細胞の、がん幹細胞／未分化腫瘍に対する細胞傷害性を示す。
【図３４】ＮＫ細胞増殖に対する、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞の効果、及び破骨細胞により増殖した細胞によるＮＫ細胞の細胞傷害効果を示す。
【図３５】ＤＣにより増殖したＮＫ細胞と比べた場合の、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞中の、エフェクターメモリー表現型を有するＴ細胞を示す。
【図３６】ＯＣにより増殖したＮＫ細胞対ＤＣにより増殖したＮＫ細胞中の、消耗表現型を有するＴ細胞の数を示す。
【図３７】膵臓癌患者からの、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞中の、ＩＦＮ−γを発現するＮＫ細胞を示す。
【図３８】ＯＣにより増殖したＴ細胞が分泌した、ＣＤ８及びＮＫ特異的サイトカイン、共刺激リガンド、グランザイム、パーフォリン及び可溶性Ｆａｓ及びＦａｓリガンドの表を示す。
【図３９】ＯＣにより増殖したＮＫ細胞培養物からのＣＤ８＋Ｔ細胞が分泌した、ＣＤ８関連サイトカイン、ケモカイン、共刺激リガンド、ｓＦａｓ及びＦａｓリガンド、及びグランザイム、及びパーフォリンの表を示す。
【図４０】ＮＫ又はＯＣにより増殖したＣＤ８細胞から分泌された、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−ａ、低い共刺激リガンドｓＣＤ１３７、グランザイム、パーフォリン、可溶性Ｆａｓ、及びＦａｓリガンドのレベルを示す。
【図４１】腫瘍のないマウスと比べた場合の、口腔腫瘍を移植したＢＬＴマウスからのＮＫ細胞の細胞障害活性を示す。
【図４２】腫瘍移植後のスーパーチャージドＮＫ細胞による免疫療法後の、ＢＭ、脾臓、及び血液中のＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。
【図４３】腫瘍移植後のＢＬＴマウス中のスーパーチャージドＮＫ細胞による免疫療法後の、血清ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６、ＩＴＡＣ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＩＬ−８を示す。
【図４４】種々の増殖日数における、破骨細胞により増殖した患者のＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図４５】種々の増殖日数における、患者における破骨細胞により増殖したＮＫ細胞集団中のＮＫ細胞の数を示す。
【図４６】１５〜２５日目の、ＤＣにより増殖したＮＫ細胞と比べた場合の、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞の数を示す。
【図４７】種々の増殖日数における、ＤＣにより増殖したＮＫ細胞と比べた場合の、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞の数を示す。
【図４８】種々の増殖日数における、破骨細胞により増殖したＴ細胞と比べた場合の、ＤＣにより増殖したＴ細胞の数を示す。
【図４９】種々の増殖日数における、ＤＣにより増殖したＮＫ細胞と比べた場合の、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞の細胞傷害性を示す。
【図５０】種々の増殖日数における、健康なドナーのＮＫ細胞と比べた場合の、一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図５１】種々の増殖日数における、健康なドナーのＴ細胞と比べた場合の、一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図５２】種々の増殖日数における、健康なドナーのＮＫ細胞から得られたものと比べた場合の、破骨細胞により増殖した患者のＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図５３】種々の増殖日数における、数人の患者中の健康なドナーのＴ細胞から得られたものと比べた場合の、一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を示す。
【図５４】種々の増殖日数における、健康なドナーのＴ細胞から得られたものと比べた場合の、一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞（Ｔ細胞は、陽性選択した）によるＩＦＮ−γ分泌（全ての増殖日数からの分泌の組み合わせ）を示す。
【図５５】健康なドナーからの陰性選択されたＴ細胞と比べた場合の、陽性選択された一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌（全ての増殖日数からの分泌の組み合わせ）を示す。
【図５６】健康なドナーから得られたＮＫ細胞と比べた場合の、破骨細胞により増殖したＴ細胞（Ｔ細胞は、陽性選択した）によるＩＦＮ−γ分泌／細胞を示す。ＩＬ−２により活性化した、一次の陽性選択されたＴ細胞は、ＮＫ細胞と比較した場合により多くのＩＦＮ−γを分泌した。
【図５７】健康なドナーから得られたＴ細胞と比べた場合の、一次の、非破骨細胞及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞（Ｔ細胞は、陽性選択した）によるＩＦＮ−ｇ分泌／細胞を示す。
【図５８】破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞（Ｔ細胞は、陽性選択した）及びＮＫ細胞によるＩＦＮ−ｇ分泌／細胞を示す。ＩＬ−２により活性化した、一次の、非破骨細胞により増殖したＴ細胞は、ＩＬ−２で処理した一次ＮＫ細胞と比較した場合により多くのＩＦＮ−ｇを分泌した。
【図５９】健康なドナーからの陰性選択されたＮＫ細胞又は陰性選択されたＴ細胞と比べた場合の、陽性選択された一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖したＴ細胞による増殖細胞数の増加を示す。
【図６０】健康なドナーから得られたものと比べた場合の、陽性選択された一次の、非破骨細胞により増殖した及び破骨細胞により増殖した患者のＴ細胞による増殖細胞数の減少を示す。
【図６１】膵臓患者の血液からの血清中のサイトカイン及びケモカインのレベルを示す。
【図６２】パネルＡ〜Ｃとして識別された１１個のパネルを含み、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入が、ＡＪ２の給餌の有無に依らず、ｈｕ−ＢＬＴマウス中の腫瘍増殖を阻害したことを示す。Ｈｕ−ＢＬＴマウスを、材料及び方法で示すように生成し、図に示す（図６２Ａ）。Ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスの口腔底に、１×１０６個のヒトＯＳＣＳＣを同所移植し、７〜１０日後に、ある群のｈｕ−ＢＬＴマウスに、尾静脈を介して、１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を注入し、マウスの疾患進行をモニターした。別の群のｈｕ−ＢＬＴマウスに、ＮＫ注射の存在下及び不在下で、ＯＳＣＳＣの移植前、及び腫瘍の移植後に、ＡＪ２プロバイオティクス細菌（５百万個／日）を４８時間ごとに２週間給餌し、実験を終了した（図６２Ｂ）。週１回の頻度でマウスを計量することで体重減をモニターした。３つの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６２Ｃ）。実験の終了時、マウスを犠牲にし、腫瘍の写真を切除後に撮影し（図６２Ｄ）、計量した（ｎ＝４）（図６２Ｅ）。図６２Ｂに示すように、マウスにヒトＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌し、腫瘍を切除し、死後に計量した（ｎ＝４）（図６２Ｆ）。ＰＢＭＣを、ｈｕ−ＢＬＴマウス及びヒトから単離し、ヒトＣＤ３（ｎ＝５）（図６２Ｇ）、ＣＤ４（ｎ＝５）（図６２Ｈ）、ＣＤ８（ｎ＝５）（図６２Ｉ）、ＣＤ１９（ｎ＝３）（図６２Ｊ）及びＣＤ１６（ｎ＝５）（図６２Ｋ）の表面発現は、抗体の染色を用いて、ＣＤ４５＋免疫細胞内で判断した後、フローサイトメトリーで解析した。
【図６３】Ａ〜Ｉとして識別された９個のパネルを含み、スーパーチャージドＮＫ細胞の注入が、ＡＪ２の給餌の有無に依らず、担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスにおける血液中のＮＫ細胞、脾臓、ＢＭ、強化ＮＫ細胞、及び精製ＣＤ３＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γ分泌及び細胞障害機能を回復させて、増加させたことを示す。図６２Ｂに示すように、Ｈｕ−ＢＬＴマウスにヒトＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌し、ＮＫ細胞注入の一週間後に、マウスに、尾静脈注入を介して抗ＰＤ１（５０μｇ／マウス）を注入した。犠牲にした後、脾臓（ｎ＝５）（図６３Ａ）、ＢＭ（ｎ＝５）（図６３Ｂ）及び末梢血（ｎ＝５）（図６３Ｃ）を回収し、単細胞懸濁液を各組織から調製し、（脾臓及びＢＭに関して１×１０６個の細胞／ｍｌ、及びＰＢＭＣに関して０．７×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で７日間処理した。ＮＫ強化細胞を、脾細胞から単離し、（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で７日間処理した（ｎ＝３）（図６３Ｄ）。細胞障害性アッセイは、ＯＳＣＳＣに対して、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて行い、ＬＵ３０／１０６個の細胞は、３０％のＯＳＣＳＣ×１００を溶解するのに必要な細胞の逆数を用いて判断した。（脾臓及びＢＭに関して１×１０６個の細胞／ｍｌ、及びＰＢＭＣに関して０．７×１０６個の細胞／ｍｌ）の脾細胞（ｎ＝５）（図６３Ｅ）、ＢＭ細胞（ｎ＝５）（図６３Ｆ）、ＰＢＭＣ（ｎ＝５）（図６３Ｇ）を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で各々処理し、１×１０６個の細胞／ｍｌの脾細胞からの陽性選択したＣＤ３＋Ｔ細胞（ｎ＝４）を、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）（図６３Ｈ）で７日間処理した後、上清を収穫し、ＩＦＮ−γのレベルを、特異的ＥＬＩＳＡを用いて判断した。各群のマウスからの各組織中のＩＦＮ−γ分泌の倍数変化は、ＯＳＣＳＣのみを注入したマウスから得られたものから判断した（図６３Ｅ〜図６３Ｈ）。
【図６４】Ａ及びＢとして識別された２個のパネルを含み、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入が、ＡＪ２の給餌の有無に依らず、ｈｕ−ＢＬＴマウス中のＣＤ８＋Ｔ細胞の数を増加させたことを示す。図６２Ｂに示すように、Ｈｕ−ＢＬＴマウスにＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌し、ＢＭ細胞（ｎ＝３）（図６４Ａ）及び脾細胞（ｎ＝３）（図６４Ｂ）内のヒトＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、抗体の染色を用いて判断した後、フローサイトメトリーで解析した。
【図６５】Ａ〜Ｊとして識別された１０個のパネルを含み、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入が、ＢＬＴマウスにおけるＡＪ２の給餌の有無に依らず、インビボでの腫瘍分化を媒介し、ＩＦＮ−γ分泌を増加し、より多くの数のヒト免疫細胞を腫瘍に移動させて、エクスビボの腫瘍増殖の減少をもたらしたことを示す。Ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスに、ＯＳＣＳＣを移植し、図６２Ｂに示すように、ＮＫ細胞を注入した。犠牲にした後、口腔腫瘍を収穫し、単細胞懸濁液を調製し、各群からの同じ数の細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌで、合計３×１０６個の細胞）を、０日目に培養した。１０日目に、上清を除去し、付着した腫瘍細胞を計数し、その後の培養では、ＮＫを注入したマウスが、最小の数の腫瘍を増殖させたため、それらから得られた数に各群の数を調整した。１０、１４、１９及び２０日目に、エクスビボ増殖する腫瘍細胞の総数を、各群で判断した。いくつかの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６５Ａ）。図６２Ｂに示すように、ＯＳＣＳＣ、又はインビトロでのＮＫ分化ＯＳＣＳＣ（分化ＯＳＣＳＣ）、又はＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに対する抗体で処理したＮＫ分化ＯＳＣＳＣをＨｕ−ＢＬＴマウスに移植して、分化を遮断した後、ｈｕ−ＢＬＴマウスにＮＫを注入した。犠牲にした後、口腔腫瘍を解離し、単細胞を調製し、（１×１０６個の細胞／ｍｌで、合計３×１０６個の細胞）で培養し、増殖する腫瘍細胞の数を、図６５Ａに示すように判断した。いくつかの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６５Ｂ）。図６２Ｂに示すように、Ｈｕ−ＢＬＴマウスに、ＯＳＣＳＣ又は、分化ＯＳＣＳＣ、又はＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αに対する抗体で処理した分化ＯＳＣＳＣを移植して、ＮＫ細胞を注入し、及び／又はＡＪ２を給餌した。犠牲にした後、口腔腫瘍を収穫し、培養し、増殖する腫瘍細胞の数を、図６５Ａに示すように判断した（ｎ＝７）（図６５Ｃ）。図６２Ａに示すように、Ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスにＯＳＣＳＣを移植した後、ｈｕ−ＢＬＴマウスにＮＫを注入した。口腔腫瘍を収穫し、単細胞懸濁液を調製した。培養１２日目の非付着細胞内にｈｕ−ＣＤ４５Ｃ免疫細胞が浸潤するパーセンテージを、抗体の染色を用いて判断した後、フローサイトメトリーで解析した。３つの代表的な図の１つをこの図で示す（図６５Ｄ）。ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスからの口腔腫瘍を図４Ａに示すように培養し、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、それらの上清を図で示される日に収穫し、ＩＦＮ−ｇレベルを、ＥＬＩＳＡを用いて判断した。いくつかの代表的な図の１つをこの図で示す（図６５Ｅ）。ヒトＣＤ５４及びＭＨＣ−Ｉの発現は、それぞれの抗体で染色後に、フローサイトメトリー解析を用いて、ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスからの口腔腫瘍培養の１０日目に評価した。いくつかの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６５Ｆ）。健康なヒトドナーの末梢血からの精製ＮＫ細胞（１×１０６個の細胞／ｍｌ）を未処理のまま、又はＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１８時間処理した後、ｈｕ−ＢＬＴマウスの異なる実験群の切除腫瘍から培養した５１Ｃｒ標識ＯＳＣＳＣにそれらを添加し、それを、種々のエフェクター対標的の比でラボで維持したＯＳＣＳＣ���培養と比較した。ＮＫ細胞媒介細胞傷害性は、標準的な４時間５１Ｃｒ放出アッセイを用いて判断した。ＬＵ３０／１０６個の細胞は、材料及び方法で示すように判断した（ｎ＝４）（図６５Ｇ及び図６５Ｈ）。図６５Ａに示すようにｈｕ−ＢＬＴマウスからの口腔腫瘍細胞を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、３及び７日後に上清を収穫し、ＶＥＧＦ分泌のレベルを、特異的ＥＬＩＳＡを用いて判断した。ＮＫ注入動物（ｎ＝６）から得られた腫瘍によるＶＥＧＦ分泌の減少は、ＯＳＣＳＣのみを注入したマウスから得られた量に基づいて算出した（図６５Ｉ）。ｈｕ−ＢＬＴマウスの異なる実験群から解離した口腔腫瘍内にｈｕ−ＣＤ４５Ｃ免疫細胞が浸潤するパーセンテージは、抗体染色後に、フローサイトメトリー解析を用いて判断した。いくつかの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６５Ｊ）。
【図６６】Ａ〜Ｃとして識別された３個のパネルを含み、スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入が、担癌マウスにおけるＡＪ２の給餌の有無に依らず、ｈｕ−ＢＬＴマウスの末梢血から得られた血清内のサイトカイン、ケモカイン、及び増殖因子の分泌を回復し、増加させた。末梢血からの血清は、実施例４に示すように得られ、多重アレイを実施して、ＩＦＮ−γの分泌を判断し、４つの代表的な図の１つをここで示す（図６６Ａ）。ＩＦＮ−γの倍数変化は、対照ｈｕ−ＢＬＴマウス（ｎ＝５）から得られた値に基づいて判断した（図６６Ｂ）。多重アレイを使用して、末梢血から得られた血清中のサイトカイン、ケモカイン、及び増殖因子の分泌を判断した（図６６Ｃ）。
【図６７】Ａ及びＢとして識別された２個のパネルを含み、ＣＤＤＰ又はパクリタキセルが、ＮＡＣの有無に依らず、ＮＫ上清で分化したＯＳＣＳＣ中では著しい細胞死を誘導し、低分化の腫瘍では誘導しないことを示す。高純度のＮＫ細胞を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３ｍｇ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理した後、ＮＫ上清を、抗ＴＮＦ−ａ（１：１００）及び抗ＩＦＮ−ｇ（１：１００）の存在下で、ＯＳＣＳＣに５日間添加した。その後、ＯＳＣＳＣを取り外し、シスプラチンの有無で１８〜２４時間処理した。ＯＳＣＳＣの生存率を、ＰＩ染色及びフローサイトメトリー解析を用いて判断した。３つの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６７Ａ）。図６７Ａに示すように、ＯＳＣＳＣを、ＮＫ細胞からの上清で処理した。その後、腫瘍を取り外し、ＮＡＣ（２０ｎＭ）の有無で２４時間処理した後、パクリタキセルで１８〜２４時間処理した。ＯＳＣＳＣ生存率は、ＰＩ染色及びフローサイトメトリー解析で判断した。３つの代表的な実験の１つをこの図で示す（図６７Ｂ）。
【図６８】Ａ〜Ｅとして識別された５個のパネルを含み、ＮＫ細胞を注入した、又はＮＫ分化ＯＳＣＳＣ腫瘍のみを移植した担癌マウスからの単球又は破骨細胞が、腫瘍のみを移植した、ＮＫ細胞を有するマウスと比べた場合に、自己ＮＫ腫瘍又は同種異系ＮＫ腫瘍の共培養物から有意に多いＩＦＮ−ｇを誘導したことを示す。図６２Ｂに示すように、Ｈｕ−ＢＬＴマウスにＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌した。犠牲の後、脾細胞からのＮＫ細胞、及びＢＭ細胞からの単球を本明細書に記載のように単離した。自己ＮＫ細胞を未処理のまま、又は単球（ＮＫ：単球、２：１）と組み合わせてＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で処理し、共培養の７日後に、ＯＳＣＳＣに対する標準的な４時間５１クロム放出アッセイにおけるエフェクター細胞としてＮＫ細胞を使用した。ＬＵ３０／１０６個の細胞は、標的細胞×１００の３０％を溶解するのに必要なＮＫ細胞の逆数を用いて判断した（図６８Ａ）。自己ＮＫ細胞を、未処理のまま、又は、単球（ＮＫ：単球、２：１）の不在下及び存在下で、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）で、若しくはＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及びＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせで７日間処理した後、上清を収穫し、ＩＦＮ−ｇ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図６８Ｂ）。実施例４に示すように、精製されたｈｕ−ＢＬＴ単球からＯＣを生成した。健康なヒトドナーからの精製同種異系ＮＫ細胞を、ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍＬ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３ｍｇ／ｍＬ）で１８時間前処理した後、ｓＡＪ２の存在下で（ＮＫ：ＯＣ：ｓＡＪ２、２：１：４）、ｈｕ−ＢＬＴ−ＯＣと培養した。培養後、培養物中のＮＫ細胞数を、顕微鏡を用いて、５、８、１２及び１５日目に計数した（図６８Ｃ）。５、８、１２及び１５日目に培養物から上清を収穫し、ＩＦＮ−ｇ分泌を、単一ＥＬＩＳＡを用いて判断した（図６８Ｅ）。ＥＬＩＳＡから得られたＩＦＮ−ｇのレベルは、図６８Ｃからの細胞計数を用いて、１×１０６個の細胞で判断した。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、一部は、破骨細胞（ＯＣ）を含む培地中でＮＫ細胞を培養することを含む、インビトロ又はエクスビボでのＮＫ細胞を活性化する方法に関する。同様に、樹状細胞（ＤＣ）を含む培地中でＴ細胞を培養することを含む、インビトロ又はエクスビボでのＴ細胞を活性化する方法を本明細書で提供する。本発明は、破骨細胞（ＯＣ）を含む培地中でＮＫ細胞及びＴ細胞を培養することを含む、Ｔ細胞に比べてＮＫ細胞をインビトロ又はエクスビボで活性化する方法をさらに提供する。本発明は、樹状細胞（ＤＣ）を含む培地中でＮＫ細胞及びＴ細胞を培養することを含む、ＮＫ細胞に比べてＴ細胞をインビトロ又はエクスビボで活性化する方法をさらに提供する。かかる活性化ＮＫ細胞は、宿主免疫応答を改善するために使用してもよく、疾患（例えば、がん）を治療するために使用してもよい。いくつかの態様では、本発明は、インビボでＮＫ細胞を活性化する、場合により、破骨細胞（ＯＣ）によってＴ細胞に比べてＮＫ細胞を活性化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＯＣ又はＯＣ培養上清は、疾患（例えば、がん）を治療するために対象に投与してもよい。いくつかの実施形態では、プロバイオティクス細菌（例えば、ｓＡＪ２）は、ＯＣの機能を改善し、ＮＫ細胞を活性化するために添加してもよい。破骨細胞（ＯＣ）及び樹状細胞（ＤＣ）に加えて、ＮＫ細胞又はＴ細胞を活性化することができる他の薬剤、例えば、任意の遺伝子、タンパク質、代謝物質などを、細胞培養物に添加又は対象に投与してもよい。
【００２８】
Ｉ．定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書では、１又は２以上（すなわち、少なくとも１つ）の、その冠詞の文法上の目的語を意味して使用される。例として、「ａｎ」要素は、１つの要素又は２以上の要素を意味する。
【００２９】
「投与すること」という用語は、薬剤（例えば、少なくとも１つの破骨細胞（ＯＣ）又は樹状細胞（ＤＣ）、少なくとも１つの破骨細胞（ＯＣ）又は樹状細胞（ＤＣ）を含む細胞培養物、かかる細胞培養物の上清、かかるＯＣ（複数可）又はＤＣ（複数可）を含む任意の組成物、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌、かかるプロバイオティクス細菌を含む任意の組成物、ＮＫ細胞及び／又はＴ細胞を活性化するか又はかかるＯＣ（複数可）又はＤＣ（複数可）及び／又はプロバイオティクス細菌などの機能促進することができる他の薬剤、例えば、明細書に記載される種々の薬剤の処理された（すなわち、単離された、精製された、濃縮された、又は治療用若しくは他の使用のための他のプロセス後）形態も含む）が、その意図した機能を実行することができる投与経路を含むことを意図する。使用することができる身体の治療の投与経路の例としては、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、髄腔内など）、経口、吸入、及び経皮経路が挙げられる。注射は、ボーラス注射であってもよく、又は持続注射であってもよい。投与経路によっては、薬剤が意図された機能を発揮する能力を妨げるおそれのある自然条件から薬剤を保護するために、薬剤を、選択された材料で被覆するか、又はその中に収容してもよい。薬剤は、単体で投与してもよいし、又は薬学的に許容可能な担体と併せて投与してもよい。また、薬剤は、インビボでその活性形態に変換されるプロドラッグとして投与してもよい。
【００３０】
「活性化すること」又は「活性化」という用語は、標的の機能の増強を指す。例えば、本開示は、インビトロ、エクスビボ、及び／又はインビボでのＮＫ細胞又はＴ細胞の活性化方法であって、場合により、かかる活性化は、それぞれ、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に比べて優先的である、方法を提供する。本開示では、細胞の活性化は、かかる細胞の機能の増強、例えば、細胞型（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）の各細胞の活性及び／又は少なくとも１つの細胞機能（例えば、細胞傷害性、細胞分裂及び／又は成長速度など）の少なくとも増強、細胞型の細胞数の増強（例えば、細胞増殖）、又は両方を指す。いくつかの実施形態では、本明細書で使用される薬剤は、少なくとも１つの細胞、例えば、ＮＫ細胞（複数可）又はＴ細胞（複数可）を活性化する。他の実施形態では、本明細書で使用される薬剤は、別のもの（例えば、Ｔ細胞、又はＮＫ細胞）に比べて、１つの細胞型（例えば、ＮＫ細胞、又はＴ細胞）を優先的に活性化する。
【００３１】
「増強」という用語は、薬剤及び／又は標的の機能について意味ある量の任意の増加を指す、本開示における「増加」、「アップレギュレーション」、「改善」などの用語と交換可能で使用される。例えば、細胞型（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）の活性及び／又は細胞数の増強は、量の増加が、対照中の元の量及び／又は正常な量（例えば、正常な対象又は疾患若しくは障害（例えば、がん）を有さない対象中の細胞型の活性及び／又は細胞数）よりも、量の評価に使用されるアッセイの標準誤差よりも大きい量、好ましくは、その量よりも少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、３５０％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、１０００％、又はそれ以上多い場合には「有意」であり得る。あるいは、細胞型の活性及び／又は細胞数の増強は、かかる増強が、元の活性／量及び／又は正常な活性／量よりも少なくとも約２、好ましくは、少なくとも約３、４、又は５倍、又はそれ以上である場合、「有意」であると考えられ得る。かかる「有意性」は、本明細書に記載される任意の他の測定パラメーター、例えば、発現、阻害、細胞傷害性、細胞成長などに適用することもできる。いくつかの実施形態では、細胞型（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）の活性及び／又は細胞数の増強は、本明細書に記載されるように「有意」でなくてもよいが、その生物学的関連性を理解するために当業者に十分な増加であり得る。
【００３２】
本明細書で他に規定されていない限り、「抗体（単数及び複数）」という用語は、単鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体、及び多重特異的抗体などの自然発生形の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）及び組み換え抗体、並びに以上の全ての断片及び誘導体で、少なくとも１つの抗原結合部位を有する断片及び誘導体を広義に含む。抗体誘導体は、抗体と共役するタンパク質又は化学的部分を含み得る。
【００３３】
「抗体」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）も含む。「抗原結合部分」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原（例えば、バイオマーカーポリペプチド又はその断片）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、これらのドメインを、ＶＬ及びＶＨ領域が対形成して一価ポリペプチドを形成した単一のタンパク質鎖として作製することができる合成リンカーにより、組み換え方法を用いて連結することができる（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；及びＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：７７８を参照されたい）。かかる単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されることを目的とする。完全ＩｇＧポリペプチド又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に連結することもできる。ＶＨ及びＶＬは、タンパク質化学又は組み換えＤＮＡ技術のいずれかを用いて、免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ又は他の断片の生成において用いることもできる。ダイアボディなどの他の形態の単鎖抗体も包含される。ダイアボディは、二価、二重特異性抗体であり、この抗体においては、ＶＨ及びＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖において発現されるが、同じ鎖における２個のドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対形成させ、２個の抗原結合部位を形成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【００３４】
抗体は、ポリクローナル若しくはモノクローナル；異種間、同種異系間若しくは同系間；又はこれらの修飾型（例えば、ヒト化、キメラなど）であり得る。抗体は、完全にヒトであってもよい。本発明の抗体は、バイオマーカーポリペプチド又はその断片に特異的に又は実質的に特異的に結合するのが好ましい。「モノクローナル抗体」及び「モノクローナル抗体組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位のうち１種のみを含有する抗体ポリペプチドの集団を指す一方、「ポリクローナル抗体」及び「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位のうち複数種を含有する抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対する単一の結合親和性を表示する。
【００３５】
「がん」又は「腫瘍」又は「過剰増殖」という用語は、無秩序増殖、不死、転移能力、急速な成長及び増殖速度、及び特定の特徴的形態学的特性など、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞が存在することを指す。特に明記しない限り、用語は、化生を含む。いくつかの実施形態では、かかる特徴は、宿主免疫応答のサイレンシング、低減、及び／又は回避、及び／又は宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞）溶解及び／又は分化への抵抗性のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、かかるがんを引き起こす細胞は、がん幹細胞（例えば、口腔扁平上皮癌幹細胞（ＯＳＣＳＣ））である。いくつかの実施形態では、かかる細胞は、少なくとも１つの遺伝子突然変異による一部又は全てのかかる特徴を示す。がん細胞は腫瘍の形態であることが多いが、かかる細胞は、動物の体内に単独で存在するか、又は白血病細胞などの非腫瘍発生がん細胞であり得る。本明細書で使用する場合、「がん」という用語は、前悪性並びに悪性がんを含む。がんには、Ｂ細胞癌、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、及び免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織癌などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に含まれる方法に適用可能ながんのタイプの他の非限定的な例には、ヒト肉腫及び癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝癌、絨毛上皮癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫瘍、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば、急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、及び真正赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びＨ鎖病が含まれる。いくつかの実施形態では、がんは、本来は上皮性であり、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、婦人科のがん、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、又は皮膚癌を含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、がんは、口腔癌、乳癌、前立腺癌、肺癌、又は大腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、又は乳癌である。上皮癌は、漿液、子宮内膜、粘液性、明細胞、ブレナー、又は未分化型を含むが、これらに限定されない他の種々の方法で特徴付けることができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、がんは、「トリプルネガティブ乳癌」又は「ＴＮＢＣ」であり、これは、ストロゲン受容体（ＥＲ）陰性、プロゲステロン受容体（ＰＲ）陰性、及びヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ−２）陰性である乳癌を指す（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１６：２６５９−２６７１；Ｗｉｇｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３：４５−４８；Ｃａｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１３：２３２９−２３３４）。
【００３７】
ある特定の実施形態では、がんは、「ＰＩ３Ｋベータ依存性がん」であり、これは、ＰＩ３Ｋベータに機能的に依存するがんを指し得る。例えば、腫瘍組織中のＰＩ３Ｋベータ（例えば、ＰＩ３ＫベータｍＲＮＡ、ＰＩ３Ｋベータタンパク質、新たに合成されたＰＩ３Ｋベータタンパク質など）の発現レベルが、正常な組織中のその発現レベルに匹敵する場合であっても、例えば、ＲＮＡｉ又は任意の他の手段を用いることによる直接又は間接的なＰＩ３ＫベータｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の阻害、又はＰＩ３Ｋベータ遺伝子（例えば、ノックアウト又はクラスター化されて、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）技術）の欠失が、発がん、腫瘍細胞増殖、腫瘍転移の阻害をもたらすか又は腫瘍細胞分化を誘導すれば、がんは、ＰＩ３Ｋベータ依存性である。「ＰＩ３Ｋベータ依存性がん」という用語は、ＰＩ３Ｋベータが、ＰＩ３Ｋベータ依存性がんと同じ細胞型の非がん性細胞中で発現されたＰＩ３Ｋベータ（例えば、ＰＩ３ＫベータｍＲＮＡ、ＰＩ３Ｋベータタンパク質、新たに合成されたＰＩ３Ｋベータタンパク質など）の正常な量よりも有意に高いレベルで発現される、がんも指す。
【００３８】
「微小転移巣」という用語は、本明細書で使用する場合、好ましくは、大きさが０．２ｍｍより大きい、及び／又は２００個より多くの細胞を有するものから最大幅２ｍｍまでの集密的ながん細胞の群として定義される。より好ましくは、「微小転移巣」は、最大幅が０．２ｍｍから２ｍｍまでの集密的ながん細胞のグループとして定義される。（Ｅｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＡＪＣＣ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（７ｔｈ  ｅｄ．）を参照されたい）。「微小転移巣」の代わりの好ましい定義は、少なくとも１０００個のがん細胞の、最も幅広い寸法において少なくとも０．１ｍｍ〜最も幅広い寸法において１ｍｍまでの集密的な群である。微小転移巣は、一般的に、標準的なコントラストＭＲＩ画像化又は他の臨床的な画像化技法では見えない。しかしながら、ある特定のがんでは、腫瘍選択的抗原（例えば、乳癌転移に関してＨｅｒ２）に向けられた放射性抗体は、微小転移巣の可視化を可能にする。他の間接的検出法には、ＶＥＧＦに誘導される血管漏出による脳微小転移巣部位における造影剤の漏出が含まれる（Ｙａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：４９５９−４９０６７；米国特許公開第２０１５／０３５２１１３号）。微小転移巣を検出するために、より高感度な画像化技法を適用することもできる。例えば、微小転移巣を検出するために、代わりの造影剤ＵＳＰＩＯ（Ｍｏｌｄａｙ  Ｉｒｏｎ，Ｂｉｏｐａｌ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，Ｍａｓｓ．）を用いてＭＲＩにより血液量を画像化してもよい（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．２６：４０３−４１４）。
【００３９】
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能との比較を提供するために適切な任意の参照標準を指す。ある特定の実施形態では、対照は、発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルを検出し、試験試料からの発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルと比較する元となる「対照試料」を取得することを含む。かかる対照試料は、既知の結果を有する対照のがん患者からの試料（保存試料又は以前の試料測定値でもよい）、正常な患者又はがん患者などの対象から単離した正常な組織又は細胞、正常な対象又はがん患者などの対象から単離した培養一次細胞／組織、がん患者の同じ器官又は体部位から取得した隣接正常細胞／組織、正常な対象から単離した組織又は細胞試料、又は保管所から取得した一次細胞／又は組織を含むが、これらに限定されない任意の適切な試料を含み得る。他の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子、正常な組織（又は他の以前に解析した対照試料）からの発現産物レベル範囲、ある患者群からの試験試料内で以前に判定した発現産物レベル範囲、又は特定の結果（例えば、１年、２年、３年、４年などの生存率）を有する、又はある特定の治療（例えば、がん治療の標準治療）を受けた一組の患者を含むが、これらに限定されない任意の適切な源からの参照標準の発現産物レベルを含み得る。かかる対照試料及び参照標準発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルを組み合わせて、本発明の方法で対照として使用できることが、当業者には理解される。ある特定の実施形態では、対照は、正常又は非がん性細胞／組織試料を含み得る。他の好ましい実施形態では、対照は、一組のがん患者などの一組の患者、又はある特定の治療を受けた一組のがん患者、又は別の結果に対する１つの結果を有する一組の患者の発現レベル、ある特定の細胞型（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）の数、及び／又はある特定の細胞型の細胞機能を含み得る。前者のケースでは、各患者の特定の発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルを、パーセンタイルの発現、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルに割り当てるか、又は参照標準発現、細胞数、及び／又は細胞機能レベルの平均値より高い又は低いと表現することができる。他の好ましい実施形態では、対照は、正常な細胞、併用化学療法で治療した患者の細胞、及び良性腫瘍の患者の細胞を含み得る。他の実施形態では、対照は、測定値、例えば、ある母集団のハウスキーピング遺伝子又は別の細胞型の発現レベルと比べた場合の、同じ母集団の特定の細胞型（例えば、ＮＫ細胞又はＴ細胞）の特定の遺伝子、細胞数、及び／又は細胞機能の平均発現レベルも含み得る。かかる母集団は、正常な対象、いかなる治療も受けていない（すなわち、治療未処置）がん患者、標準治療中のがん患者、又は良性腫瘍の患者を含み得る。以下のデータで実証するように、本発明の方法は、試験試料の発現産物、細胞数、及び／又は細胞機能のレベルを対照と比較する際に特定の切点を使用することに限定されない。
【００４０】
「対象に対する適切な治療計画を判断すること」という用語は、本発明による解析の結果に基づいて、又は本質的に基づいて、又は少なくとも一部が基づいて開始、修正、及び／又は終了される対象に関する治療計画（すなわち、単剤療法、又は対象におけるがんの防止及び／又は治療に使用される種々の療法の組み合わせ）の判断を意味するものである。一例は、手術後にアジュバント療法を開始することであり、その目的は、再発のリスクを低下させることであり、別の例は、特定の化学療法の投与量を修正することであろう。判断は、本発明による解析の結果に加えて、治療される対象の個人的特徴に基づくことができる。ほとんどの場合、対象に対する適切な治療計画の実際の判断は、主治医又は医者によって行われるであろう。
【００４１】
「がんの診断」という用語は、本発明の方法、システム、及びコードを使用して、個体におけるがん又はそのサブタイプの有無を判定することを含む。この用語は、個体における疾患の活性レベルを評価する方法、システム、及びコードも含む。
【００４２】
「免疫細胞」という用語は、免疫応答にある役割を担っている細胞を指す。免疫細胞は、造血由来であり、リンパ球、例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球を含む。
【００４３】
「サイトカイン」という用語は、細胞シグナル伝達において重要な小タンパク質（〜５〜２０ｋＤａ）の広範かつ緩いカテゴリーを指す。それらの放出は、それらの周りの細胞の挙動に影響を及ぼし、サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達、及び内分泌シグナル伝達に関与する。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、及び腫瘍壊死因子を含み、本開示のホルモン又は成長因子をさらに含み得る。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びマスト細胞のような免疫細胞、並びに内皮細胞、線維芽細胞、及び種々の間質細胞を含む、広範囲の細胞で産生される。好ましいサイトカインは、明細書及び本開示の図面、例えば、表１に例示される。
【００４４】
「サイトカイン／ケモカイン活性」という用語は、サイトカイン又はケモカインが、細胞機能のうちの少なくとも１つを調節する能力を含む。一般的に、サイトカイン又はケモカインは、体液性及び細胞ベースの免疫応答間のバランスを調節し、特定の細胞集団の成熟、成長、及び応答性を調節する。従って、「サイトカイン／ケモカイン活性」という用語は、サイトカイン又はケモカインがその天然細胞受容体（複数可）と結合する能力、細胞シグナルを調節する能力、及び免疫応答を調節する能力を含む。
【００４５】
「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介及び／又はＢ細胞媒介免疫応答を含む。例示的な免疫応答は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン生産、及び細胞性細胞傷害性を含む。また、免疫応答という用語は、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体生産（体液性応答）及びサイトカイン応答性細胞、例えば、マクロファージの活性化を含む。
【００４６】
「免疫治療剤」という用語は、宿主免疫系を刺激して、対象中の腫瘍又はがんに対する免疫応答を生成することができる、任意の分子、ペプチド、抗体、又は他の薬剤を含み得る。種々の免疫治療剤が、本明細書に記載される組成物及び方法で有用である。
【００４７】
「阻害する」という用語は、例えば、特定の作用、機能、又は相互作用の低下、制限、又は遮断を含む。いくつかの実施形態では、がんの少なくとも１つの症状が軽減、終了、緩徐化、又は防止された場合、がんは、「阻害」されている。本明細書で使用する場合、がんの再発又は転移が軽減、緩徐化、遅延、又は防止した場合も、がんは、「阻害」されている。同様に、生物学的機能、例えば、タンパク質の機能は、基準状態、例えば、野生型状態のような対照と比較して低減している場合には阻害されている。例えば、ＰＩ３キナーゼ阻害剤と接触される変異体ＰＩ３キナーゼ又はＰＩ３キナーゼのキナーゼ活性は、キナーゼ活性が、阻害剤と接触されない野生型ＰＩ３キナーゼ及び／又はＰＩ３キナーゼと比較して、突然変異及び／又は阻害剤との接触により低減している場合には阻害されている。かかる阻害は、例えば、特定の時間及び／又は場所での薬剤の塗布によって誘導することができ、又は、例えば、遺伝性突然変異によって構成することができる。かかる阻害は、一部又は完全であり得る（例えば、基準状態、例えば、野生型状態のような対照と比較して、本質的に測定可能な活性ではない）。本質的に完全な阻害は、ブロックと呼ばれる。
【００４８】
「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指す場合、分子相互の物理的接触（例えば、結合）を指す。一般的に、かかる相互作用は、前記分子の一方又は両方に（生物学的効果を生成する）活性をもたらす。
【００４９】
「キット」は、本発明のマーカーの発現を特異的に検出する及び／又はこの発現に影響を及ぼすために、少なくとも１つの試薬、例えば、プローブ又は小分子を含む任意の製造物（例えば、パッケージ又は容器）である。キットは、本発明の方法を実行するためのユニットとして宣伝、流通、又は販売することができる。キットは、本発明の方法で有用な組成物を発現するのに必要な、１つ以上の試薬を含み得る。ある特定の実施形態では、キットは、基準物質、例えば、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、又はアポトーシスを制御するシグナル伝達経路に影響を及ぼさず、又はこれを調節しないタンパク質をコードする核酸をさらに含み得る。当業者は、一般的な分子タグ（例えば、緑色蛍光タンパク質及びベータ−ガラクトシダーゼ）、遺伝子オントロジー基準により、細胞の増殖、分裂、遊走、生存、又はアポトーシスを包含する経路のうちのいずれにも分類されないタンパク質、又は普遍的なハウスキーピングタンパク質を含むがこれらに限定されない、多くのかかる対照タンパク質を想定し得る。キット中の試薬は、個別の容器により供給することもでき、単一の容器内の、２つ又はそれ以上の試薬の混合物として供給することもできる。さらに、キット内の組成物の使用について記載する指示材料も含まれ得る。
【００５０】
「ネオアジュバント療法」という用語は、一次治療前に行われる治療を指す。ネオアジュバント療法の例には、化学療法、放射線療法、及びホルモン療法が含まれ得る。例えば、乳癌の治療では、ネオアジュバント療法は、大きな乳癌を有する患者が乳房温存手術を受けることを可能にできる。
【００５１】
バイオマーカーの発現及び／又は活性の「正常な」レベルは、がんに罹患していない対象、例えば、ヒト患者の細胞中のバイオマーカーの発現及び／又は活性のレベルである。バイオマーカーの「過剰発現」又は「有意に高い発現レベル」は、発現の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きい試験試料の発現レベルを指し、対照試料（例えば、バイオマーカー関連の疾患がない健康な対象からの試料）のバイオマーカーの発現活性又はレベル、及び好ましくはいくつかの対照試料のバイオマーカーの平均発現レベルの好ましくは、少なくとも１０％、より好ましくは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍又はそれ以上高い。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」は、対照試料（例えば、バイオマーカー関連の疾患がない健康な対象からの試料）のバイオマーカーの発現レベル、及び好ましくはいくつかの対照試料のバイオマーカーの平均発現レベルの少なくとも１０％、及びより好ましくは、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍又はそれ以上低い、試験試料のレベルを指す。同じ判断を行って、過剰発言又は過少発現を判断することができる。
【００５２】
ＮＫ細胞
ナチュラルキラー細胞又はＮＫ細胞は、自然免疫系に極めて重要な細胞傷害性リンパ球の一種である。ＮＫ細胞の役割は、ＮＫ細胞が果たす役割は、脊椎動物の適応免疫応答における細胞傷害性Ｔ細胞の役割と類似している。ＮＫ細胞は、ウイルス感染した細胞への迅速な応答（感染のおよそ３日後に作用する）を提供し、腫瘍形成に応答する。典型的には、免疫細胞は、感染した細胞表面上に提示された主要組織適合複合体（ＭＨＣ）を検出し、サイトカイン放出をトリガーし、溶解又はアポトーシスを引き起こす。ＮＫ細胞は、ユニークであるが、しかしながら、抗体及びＭＨＣの不在下で、ストレス細胞を認識する能力を有するため、はるかに迅速な免疫反応が可能になる。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラス１の「自己」マーカーが欠如している細胞を殺すために活性化する必要がないという初期概念のため、「ナチュラルキラー」と命名された。この役割は、ＭＨＣＩマーカーが欠如している有害な細胞は、他の免疫細胞、例えば、Ｔリンパ球細胞によって検出し、破壊することができないために特に重要である。
【００５３】
ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球及びＴリンパ球を生じる共通のリンパ性前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃、及び胸腺で分化及び成熟し、次いでそこから循環系に入ることが知られている。ＮＫ細胞は、起源及びそれぞれのエフェクター機能によって、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）と表現型的に異なる；しばしば、ＮＫＴ細胞活性は、ＩＦＮγを分泌することによってＮＫ細胞活性を促進する。ＮＫＴ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）又はパンＴマーカーＣＤ３又は表面免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｂ細胞受容体を発現しないが、一般的に、ヒトにおいては、表面マーカーＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）及びＣＤ５６を発現し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、ＮＫ１．１又はＮＫ１．２を発現する。ＮＫｐ４６細胞表面マーカーは、ヒト、いくつかのマウス株（例えば、ＢＡＬＢ／ｃマウス）及び３つの一般的なサル種の両方で発現されている、好みの別のＮＫ細胞マーカーを瞬時に構成する。
【００５４】
ＮＫ細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的阻害受容体によって、負の制御を受けている（Ｋａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｏｈｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。これらの特異的受容体は、ＭＨＣクラスＩ分子の多型性決定基又は他の細胞上に存在するＨＬＡに結合し、ＮＫ細胞の溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と称される受容体ファミリーに属するメンバーの一部が、ＨＬＡクラスＩ対立遺伝子の群を認識する。
【００５５】
ＫＩＲは、ＮＫ細胞を含む、リンパ球のある特定のサブセットに存在する受容体の巨大なファミリーである。ＫＩＲの命名は、細胞外ドメイン（ＫＩＲ２Ｄ又はＫＩＲ３Ｄ）の数及び細胞質尾部が長い（ＫＩＲ２ＤＬ又はＫＩＲ３ＤＬ）か、又は短い（ＫＩＲ２ＤＳ又はＫＩＲ３ＤＳ）どうかに基づいている。ヒトの中では、特定のＫＩＲの有無は、単一個体中に存在するＮＫ集団内で、ＮＫ細胞ごとに変動し得る。ヒト集団内では、ＫＩＲ分子の多型性レベルも比較的高く、ある特定のＫＩＲ分子は、一部の個体に存在するが、全ての個体に存在するわけではない。ある特定のＫＩＲ遺伝子産物は、適切なリガンドに結合したときに、リンパ球活性の刺激を引き起こす。確認されている刺激性ＫＩＲは全て、免疫刺激モチーフ（ＩＴＡＭ）を有するアダプター分子と会合する、帯電した膜貫通残基を有する短い細胞質尾部を有している。他のＫＩＲ遺伝子産物は、性質上、阻害的である。
【００５６】
プロバイオティクス細菌
いくつかの実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞機能を調節することができる、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株を含む組成物に関する。かかるプロバイオティクス細菌は、活性化ＮＫ細胞中で著しい分割アネルギー（ｓｐｌｉｔ  ａｎｅｒｇｙ）を誘導し、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの著しい誘導をもたらす。さらに、かかるプロバイオティクス細菌は、ＮＫ細胞の著しい増殖を誘導する。
【００５７】
胃腸の不快感の減少又は免疫系の強化の種々の効果を有する、多くの市販のプロバイオティクスが入手可能である。本明細書に記載される組成物及び方法で使用される好ましいプロバイオティクス細菌種は、市販のプロバイオティクス細菌株（例えば、ｓＡＪ２細菌）由来のもの、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（例えば、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｅ、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇｅｎｅｒａ（例えば、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ、Ｌ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ、Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ、Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ、及びＬ．ｃａｓｅｉ）由来のものを含む。本開示は、少なくとも１つのプロバイオティクス細菌株、好ましくは、２つ又はそれ以上の異なる細菌株の組み合わせを、対象、好ましくは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与する方法を含む。かかる投与は、全身又は局所的に（例えば、腸に直接）行ってもよい。投与経路は、経口投与が好ましい。他の経路（例えば、直腸）を使用してもよい。投与の場合、細菌（例えば、湿潤の、超音波処理、接地、又は乾燥した形態又は形式）、細菌を含む細菌培養培地、又は細菌培養培地上清（細菌を含まない）のいずれかを投与してもよい。
【００５８】
破骨細胞
破骨細胞は、造血幹細胞に由来する骨細胞の一種である。それらの機能である骨組織の吸収は、骨の維持、修復、及びリモデリングに極めて重要である。骨ホメオスタシスは、骨芽細胞の骨形成と破骨細胞の骨吸収のバランスが保たれている場合に達成される。破骨細胞は、ＲＡＮＫＬを発現する骨芽細胞からの刺激を通じて成熟し、それらの相互作用は、ＩＣＡＭ−１を介した強固な接着で媒介される。破骨細胞は、活性化ＮＫ細胞上に存在する受容体の多くのリガンドも発現する。破骨細胞は、ＵＬＢＰ−１、ＵＬＢＰ−２／５／６及びＵＬＢＰ−３を発現するが、ＮＫ細胞の活性化受容体であるＮＫＧ２ＤのＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、又はＭＨＣクラスＩ様リガンドをほとんど又は全く発現しないことが報告された。
【００５９】
破骨細胞（ＯＣ）は、樹状細胞（ＤＣ）及び単球と比較して、ＮＫ細胞増殖及び機能の重要な活性化因子である（Ｔｓｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ６（２４）：２０００２−２５）。さらに、破骨細胞は、ＮＫ細胞を活性化することが知られているＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１８をかなりの量で分泌し、破骨細胞は、重要なＮＫ活性化リガンドも発現する。本開示は、高機能で、スーパーチャージド、破骨細胞により増殖したＮＫ細胞を、他の方法論で確立されたものよりも有意に高いレベルに増殖させる方法の新規の戦略を提供する。いくつかのインビトロＮＫ増殖技術は、より高い治療細胞用量を確立する一方で、ＮＫ細胞の活性及びインビボ増殖能を強化するために開発されてきた。これらの技術のいくつかは、種々のフィーダー細胞、例えば、膜結合ＩＬ−１５及び４１ＢＢリガンドを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２−ｍｂ１５−４１ＢＢＬ）、ＥＢＶ−ＴＭ−ＬＣＬ、ウィルムス腫瘍又は照射ＰＢＭＣと時には組み合わせた、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞のＰＢＭＣ精製集団の刺激、又はヒト臍帯血の使用を含む。これらの研究は、良好な機能を有する、臨床的に意義のあるＮＫ細胞数を生成した。
【００６０】
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳動物免疫系の抗原提示細胞（アクセサリー細胞とも知られる）である。それらの主な機能は、抗原物質を処理し、それを、その表面上で、免疫系のＴ細胞に提示することである。樹状細胞は、自然免疫系と適応免疫系の間のメッセンジャーとして作用する。
【００６１】
樹状細胞は、皮膚（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊の樹状細胞型が存在する）、並びに鼻、肺、胃及び腸の内層などの外部環境と接触する組織中に存在する。それらは、血液中に未成熟状態で見ることもできる。活性化後、それらは、リンパ節に移動し、そこでＴ細胞及びＢ細胞と相互作用して、適応免疫応答を惹起し、形成する。ある発生段階では、それらは、細胞にその名称を与える樹状突起である、分岐突起部を生成させる。外観は似ているが、これらは、神経細胞の樹状突起とははっきり異なる構造である。未熟な樹状細胞は、それらが樹状突起ではなく大きな細胞質「ベール」を処理するため、ベール細胞とも呼ばれる。
【００６２】
本開示は、破骨細胞を用いてＮＫ細胞を活性化し、腫瘍標的細胞のＮＫ細胞媒介アポトーシス、並びにサイトカイン産生に対する感作の増強をもたらす、新規の方法を提供する。「活性化する」、「活性化」、又は「活性化すること」という用語は、ＮＫ細胞の増殖及び／又はＮＫ細胞機能の活性化を、単独又は組み合わせて増強することを指す。「ＮＫ細胞機能（複数可）」という用語は、ＮＫ細胞の任意の機能、例えば、細胞傷害性及び／又はサイトカイン／ケモカイン産生／分泌活性を指す。
【００６３】
「防止する」、「防止すること」、「防止」、「防止的処置」などの用語は、疾患、障害、又は状態を有さないが、これらを発症する危険性があるか、又はこれらに感受性の対象における、疾患、障害、又は状態を発症する確率を低減することを指す。
【００６４】
「抗がん治療に対する応答」又は「プロバイオティクス細菌の少なくとも１つを含む組成物単体による療法又は他のＮＫ免疫療法との併用療法に対する応答」という用語は、抗がん剤（複数可）、例えば、プロバイオティクス細菌の少なくとも１つを含む組成物のみによる治療又は他のＮＫ免疫療法との併用治療に対する過剰増殖障害（例えば、がん）の任意の応答、好ましくは、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に関する。例えば、有効性のために、又はネオアジュバント又はアジュバント状況で、過剰増殖疾患応答を評価することができ、全身性介入後の腫瘍のサイズを、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波又は触診で測定したままの初期のサイズ及び寸法と比較してもよい。応答は、生検又は外科的切除の後に腫瘍のキャリパー測定又は病理検査でも評価してもよい。応答は、腫瘍体積の変化百分率のような定量的方法で、又は「病理学的完全奏功」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的不変」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、又は他の定性的基準のような定性的方法で記録してもよい。過剰増殖疾患応答の評価は、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間、数日、数週後、又は好ましくは数カ月後に実行してもよい。応答評価の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終了後、又は残留腫瘍細胞及び／又は腫瘍床の外科的除去後である。これは、典型的には、ネオアジュバント療法の開始から３カ月後である。いくつかの実施形態では、本明細書で述べる治療の臨床有効性は、臨床的利益率（ＣＢＲ）を測定することによって判定してもよい。臨床的利益率は、完全寛解（ＣＲ）である患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）である患者の数、及び不変（ＳＤ）である患者の数の合計を、治療終了から少なくとも６カ月の時点で判定することによって測定される。この式の略記は、ＣＢＲ＝６カ月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定のがん治療計画のＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上である。がん治療に対する応答を評価する追加の基準は「生存」に関し、これは以下の全てを含む。すなわち、全生存としても知られる死亡までの生存（前記死亡は原因とは無関係、又は腫瘍関連でよい）、「無再発生存」（再発という用語は、限局的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存、無疾患生存（疾患という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）である。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断又は治療開始の時）及び終点（例えば死亡、再発又は転移）を参照することによって計算してもよい。また、治療の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の結果の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大してもよい。例えば、適切な閾値を判定するために、特定のがん治療計画を対象の母集団に適用することができ、結果は、任意のがん治療を適用する前に判定したバイオマーカー測定値に相関させることができる。結果測定値は、ネオアジュバント環境で与えられた療法に対する病理学的応答としてもよい。あるいは、全生存及び無疾患生存などの結果の尺度は、がん治療後に測定値が分かっている対象についてある期間にわたってモニターすることができる。ある特定の実施形態では、投与量は、がん治療薬について当該技術分野で知られている標準的用量である。対象をモニターする期間は様々でよい。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０カ月間モニターしてもよい。がん治療の結果と相関するバイオマーカー測定値閾値は、実施例のセクションで述べるような当該技術分野で周知の方法を使用して判定することができる。
【００６５】
「抵抗性」という用語は、がん治療に対するがん試料又は哺乳動物の後天的又は先天的抵抗性（すなわち、治療的処置に対する非応答性、応答低下、応答制限）を指し、例えば、治療的処置に対して２５％以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上の応答低下を有する。応答低下は、抵抗性を獲得する前の同じがん試料又は哺乳動物と比較する、又は治療的処置に対して抵抗性がないと分かっている別のがん試料又は哺乳動物と比較することによって測定することができる。化学療法に対する典型的な後天的抵抗性は、「多剤耐性」と呼ばれる。多剤耐性は、Ｐ−グリコプロテインによって媒介できる、又は他の機序によって媒介できる、又は哺乳動物が多剤耐性微生物又は微生物の混合に感染した場合に生じることがある。治療的処置に対する抵抗性の判定は、当該技術分野の日常業務であり、当業者の技術に含まれ、例えば、本明細書で「感作」と言う細胞増殖アッセイ及び細胞死アッセイによって測定することができる。いくつかの実施形態では、「逆抵抗性」という用語は、一次がん治療（例えば、化学療法又は放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤の使用により、一次がん治療（例えば、化学療法又は放射線療法）のみでは未治療腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積を統計学的に有意に低減させることができない状況で、未治療腫瘍の腫瘍体積と比較した場合、統計学的に有意のレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積を有意に低減させることができるという意味である。これは通常、未治療腫瘍が対数的に増殖している時に、腫瘍体積の測定に適用される。
【００６６】
「応答」又は「応答性」という用語は、例えば、腫瘍サイズの低下又は腫瘍増殖の阻害という意味で抗がん応答を指す。用語は、例えば、最初の再発までの期間であり、再発のエビデンスを伴わない最初の事象若しくは死として二次原発がんを検閲する最初の再発までの期間である、再発までの時間の延長、又は処置から、任意の原因による死までの期間である、全生存の延長により反映される、予後診断の改善も指す場合がある。応答する又は応答を有するとは、刺激に曝露された場合に達せられる有益なエンドポイントがあることを意味する。あるいは、刺激に曝露されると、負の又は有害な症状は、最小化されるか、軽減されるか、又は緩和される。腫瘍又は対象が、好適な応答を呈する可能性を評価することは、腫瘍又は対象が、好適な応答を呈さない（すなわち、応答の欠如を呈するか、又は非応答性である）可能性を評価することと同等であることが理解されるであろう。
【００６７】
少なくとも１つのバイオマーカーの存在又はレベルを検出又は判定するために使用される「試料」という用語は、典型的には、脳組織、脳脊髄液、全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば、大便）、涙、及び任意の他の（例えば、「体液」の定義で上述したような）体液、又は組織試料（例えば、生検材料）、例えば、小腸、大腸試料、又は外科的切除組織である。特定の場合、本発明の方法はさらに、試料中の少なくとも１つのマーカーの存在又はレベルを検出又は判定する前に、個体から試料を取得することを含む。
【００６８】
「感作する」という用語は、がん治療（例えば、本明細書に記載の組成物で治療すること）で関連するがんのさらに効果的な治療を可能にする方法で、がん細胞又は腫瘍細胞を変化させることを意味する。いくつかの実施形態では、正常な細胞は、正常な細胞を不当に傷害するような程度まで影響を受けない。治療的処置に対する感度向上又は感度低下は、特定の治療について当該技術分野で知られている方法、及び本明細書で下述する方法により測定され、それには、細胞増殖アッセイ（Ｔａｎｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４２：２１５９−２１６４）、細胞死アッセイ（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９４：１６１−１７３；Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｐ．６９：６１５−６３２；Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｉｎ：  Ｋａｓｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ及びＬｙｍｐｈｏｍａ．Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐ  Ａ：Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３：４１５−４３２；Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｃｏｎｔｒｉｂ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｂｓｔｅｔ．１９：８２−９０）が含まれるが、これらに限定されない。感度又は抵抗性は、ある期間、例えば、ヒトの場合は６カ月及びマウスでは４〜６週間にわたって腫瘍のサイズ低減を測定することによって、動物でも測定してもよい。組成物又は方法は、かかる組成物又は方法がない状態の治療感度又は抵抗性と比べた場合の、治療感度の増大又は抵抗性の低下が２５％以上、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上から２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上である場合、治療的処置に対して応答を感作するという。治療的処置に対する感度又は抵抗性の判定は、当該技術分野の日常業務であり、当業者の技術に含まれる。がん治療の有効性を向上させるために本明細書で述べるいずれの方法も、がん治療に対して過剰増殖又は他のがん細胞（例えば、耐性細胞）を感作させる方法に同等に適用できることを理解されたい。
【００６９】
「特異的結合」という用語は、抗原などの所定の標的に結合する抗体などの作用物質を指す。典型的には、抗体は、解析物として対象の抗原を、リガンドとして抗体を使用してＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）アッセイ機器で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって決定した場合に、例えば、およそ１０−８Ｍ、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍ未満、又はさらに低いような、およそ１０−７Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合し、所定の抗原又は密接に関連した抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対するその親和性よりも少なくとも１．１−、１．２−、１．３−、１．４−、１．５−、１．６−、１．７−、１．８−、１．９−、２．０−、２．５−、３．０−、３．５−、４．０−、４．５−、５．０−、６．０−、７．０−、８．０−、９．０−、又は１０．０−倍、又はそれ以上である親和性で所定の抗原に結合する。「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語句は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と交換可能に使用される。選択的結合は、抗体が、ある抗原の結合を別のものと区別する能力を指す相対的な用語である。
【００７０】
「相乗効果」という用語は、２つ以上の抗がん剤（例えば、プロバイオティクス細菌の少なくとも１つを含む組成物の組み合わせによる治療のみ又は他のＮＫ免疫療法と併用した治療）の複合効果が、抗がん剤のみの別個の効果の合計より大きくできることを指す。
【００７１】
「対象」という用語は、任意の健康な動物、哺乳動物又はヒト、又はがん、例えば、脳転移、肺、卵巣、膵臓、肝臓、乳房、前立腺、結腸癌、黒色腫、多発性骨髄腫などに罹患した任意の動物、哺乳動物又はヒトを指す。「対象」という用語は、「患者」と交換可能である。
【００７２】
「生存」という用語は以下の全てを含む。すなわち、全生存としても知られる死亡までの生存（前記死亡は原因とは無関係、又は腫瘍関連でよい）、「無再発生存」（再発という用語は、限局的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存、無疾患生存（疾患という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）である。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断又は治療開始の時）及び終点（例えば、死亡、再発又は転移）を参照することによって計算してもよい。さらに、治療の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の結果の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大してもよい。
【００７３】
「治療効果」という用語は、薬理学的活性物質により引き起こされる、動物、特に哺乳動物、より特定には、ヒトにおける局所又は全身効果を指す。したがって、用語は、疾患の診断、治癒、軽減、治療、若しくは防止、又は動物若しくはヒトにおける、所望の身体若しくは精神の発達及び状態の増強における使用のために意図される任意の物質を意味する。「治療有効量」という語句は、何らかの所望の局所又は全身効果を、任意の治療に適用可能な、妥当な利益／リスク比で生み出す、このような物質の量を意味する。ある特定の実施形態では、化合物の治療有効量は、その治療指数、溶解度などに依存するであろう。例えば、本発明の方法により発見されるある特定の化合物は、このような治療に適用可能な、妥当な利益／リスク比をもたらすのに十分な量で投与することができる。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「無応答性」という用語は、治療に対するがん細胞の不応状態、又は、例えば、活性化受容体又はサイトカインを介した刺激のような刺激に対する治療細胞、例えば、免疫細胞の不応状態を含む。無応答性は、例えば、免疫抑制剤への暴露又は高用量の抗原への暴露のために、生じ得る。本明細書で使用する場合、「アネルギー」又は「寛容」という用語は、受容体媒介性刺激の活性化に対する不応状態を含む。そのような不応状態は、一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への暴露が終わった後も持続する。例えば、（無応答性とは異なり）Ｔ細胞におけるアネルギーは、例えば、ＩＬ−２のようなサイトカイン産生の欠如によって特徴付けられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露され、第２のシグナル（同時刺激シグナル）の不存在下で第１のシグナル（Ｔ細胞受容体又はＣＤ−３媒介シグナル）を受ける。これらの条件下で、同じ抗原への細胞の再暴露は、（たとえ再暴露が同時刺激ポリペプチドの存在下で生じても）サイトカイン産生の失敗となり、よって増殖の失敗となる。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と共に培養される場合は増殖し得る。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、指標細胞株を使用する増殖アッセイによって又はＥＬＩＳＡにより測定したＴリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によっても観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子コンストラクトを使用してもよい。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下で異種プロモーターによって、又はエンハンサー内に見出すことができるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ−２遺伝子転写の開始に失敗する（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１３４）。
【００７５】
ＩＩ．対象
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法に適する対象は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの家畜など）であり、好ましくは、ヒトである。他の実施形態では、対象は、がんの動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト口腔扁平上皮癌であるか、又はがん幹細胞（ＣＳＣ）／未分化腫瘍を含む、同所性異種移植動物モデルであり得る。
【００７６】
本発明の方法の他の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／又は抗免疫治療（例えば、ＮＫ細胞関連免疫治療）などの治療を受けていない。さらに他の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、及び／又は抗免疫治療（例えば、ＮＫ細胞関連免疫治療）などの治療を受けている。
【００７７】
ある特定の実施形態では、対象は、がん性又は前がん性組織を除去する手術を受けている。他の実施形態では、がん性組織は、除去されていない、例えば、がん性組織は、身体の手術不能な領域、例えば、命に必要不可欠な組織、又は外科的処置が患者にかなりの危害リスクを引き起こす領域に位置し得る。
【００７８】
本発明の方法を使用して、プロバイオティクス細菌のうちの少なくとも１つを含む組成物を単体又は他のＮＫ免疫療法と併用して、対象における多くの種々のがん、例えば、本明細書に記載されるもの応答性を治療及び／又は判断することができる。
【００７９】
ＩＩＩ．抗がん治療
一態様では、他の抗がん治療及び／又は免疫療法の組み合わせ、又は療法の組み合わせ（例えば、１つ以上のＰＩ３Ｋベータ選択的阻害剤、例えば、ＫＩＮ１９３を、１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤、例えば、抗ＰＤ−１抗体との組み合わせ、単独又はさらに追加の抗がん治療、例えば、標的療法との組み合わせ）は、特に、対象が本明細書に開示される組成物に対して可能性のあるレスポンダーであると最初に示されている場合に実施することができる。他の実施形態では、かかる療法は、対象が、かかる療法に対して可能性のあるレスポンダーではないと示されていれば回避することができ、代替の治療計画、例えば、標的及び／又は非標的抗がん治療を、本明細書に開示される組成物と一緒に実施することができる。
【００８０】
併用療法は、例えば、１つ以上の化学療法剤及び放射線、１つ以上の化学療法剤及び免疫療法、又は１つ以上の化学療法剤、放射線及び化学療法も考えられ、それらを含むことができ、それらの各々の組み合わせは、本明細書に開示される療法とすることができる。以下に記載するように、薬剤は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤、放射性標識した化合物との、又は手術、寒冷療法、及び／又は放射線療法との組み合わせ療法において投与することができる。前述の治療方法は、他の形態の従来療法（例えば、当業者に周知のがんの標準治療）と併せて、従来療法と連続して、その前、又はその後のいずれかで実施することができる。例えば、これらの調節薬剤は、治療上有効な用量の化学療法剤と一緒に投与することができる。他の実施形態では、これらの調節薬剤は、化学療法と併せて投与し、化学療法剤の活性及び有効性を高める。米医薬品便覧（ＰＤＲ）には、種々のがんの治療において用いられている化学療法剤の投与量が開示されている。治療上有効なこれらの前述の化学療法剤の投薬計画及び投与量は、治療される特定の黒色腫、疾患の程度及び当該技術分野における技術のある医師に精通されている他の要因に依存し、医師により決定することができる。
【００８１】
「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用することで、がんを治療する薬剤の投与を指す。一例としては、乳癌又は卵巣癌抗原が挙げられる。
【００８２】
あるいは、免疫療法は、例えば、癌ワクチン及び／又は感作抗原提示細胞の使用を含み得る標的療法の１つの形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に感染し、溶解させることができる一方、正常な細胞を無傷のままにして、がん治療に潜在的に有用にさせるウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を助長するとともに、腫瘍部位での用量増幅をもたらす。それらは、抗がん遺伝子のベクターとして作用してもよく、抗がん遺伝子を腫瘍部位に特異的に送達するのを可能にする。免疫療法は、がん抗原又は疾患抗原に対して向けられる予備生成抗体の投与（例えば、モノクローナル抗体、場合により、化学療法剤又は毒素、腫瘍抗原に結合したモノクローナル抗体の投与）により達成される、宿主の短期防御に対する受動免疫療法を伴い得る。免疫療法は、がん細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープの使用に焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍又はがんの開始、進行、及び／又は病理につながる生体分子を選択的に調節することができる。
【００８３】
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、がんを治療する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表的な例としては、化学療法、遺伝子療法、及び放射線療法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
ある特定の実施形態では、化学療法を使用する。化学療法は、化学療法剤の投与を含む。かかる化学療法剤は、以下の化合物の群：細胞傷害性抗生物質、抗代謝剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害物質、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、及び毒素、並びにこれらの合成誘導体から選択されるものであってもよいが、これらに限定されない。例示の化合物としては、アルキル化剤：シスプラチン、トレオスルファン、及びトロフォスファミド；植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル；ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、及びマイトマイシン；抗葉酸：メトトレキサート、ミコフェノール酸、及びヒドロキシウレア；ピリミジン類似体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、及びシトシンアラビノシド；プリン類似体：メルカプトプリン及びチオグアニン；ＤＮＡ抗代謝物質：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィジコリングリシネート、及びピラゾロイミダゾール；並びに抗有糸分裂剤；ハリコンドリン、コルヒチン、及びリゾキシンが含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の化学療法剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）が、用いられてもよい。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、及びＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロフォスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、及びプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１及び／又はＰＡＲＰ−２）阻害物質が用いられ、このような阻害物質は、当該技術分野において周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）；ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）；ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１、Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２ｂ）；３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）；ベンズアミド（米国再交付特許第３６，３９７号）；及びＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）。この作用機序は、一般的に、ＰＡＲＰに結合してその活性を低下させるＰＡＲＰ阻害剤の能力と関係がある。ＰＡＲＰは、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）からニコチンアミド及びポリ−ＡＤＰ−リボース（ＰＡＲ）への転換に触媒作用を及ぼす。ポリ（ＡＤＰ−リボース）及びＰＡＲＰの両方は、いずれも転写の調節、細胞増殖、ゲノム安定性、及び発がんに関連している（Ｂｏｕｃｈａｒｄ  Ｖ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３１，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２００３，ｐｐ．４４６−４５４（９）；Ｈｅｒｃｅｇ  Ｚ．；Ｗａｎｇ  Ｚ．−Ｑ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４７７，Ｎｕｍｂｅｒ  １，２  Ｊｕｎ.  ２００１，ｐｐ．９７−１１０（１４））。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７３０３−７３０７；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  Ｖ，Ｄａｎｔｚｅｒ  Ｆ，Ａｍｅ  ＪＣ，ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ  Ｇ（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５１７−５２８；Ｗａｎｇ  ＺＱ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：２３４７−２３５８）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトによりＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が誘導され、これは欠損のある相同性に誘導されたＤＳＢ修復によるがん細胞において合成致死性を誘導することができる（Ｂｒｙａｎｔ  ＨＥ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：９１３−９１７；Ｆａｒｍｅｒ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：９１７−９２１）。化学療法剤の上記の例は、例示的であり、限定するものではない。
【００８５】
他の実施形態では、放射線療法を使用する。放射線療法で用いられる放射線は、電離放射線であり得る。放射線療法はまた、ガンマ線、Ｘ線、又は陽子ビームであり得る。放射線療法の例としては、体外照射療法、放射性同位元素（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム−８９などの放射性同位元素、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法、及び／又は全腹部並びに骨盤放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。放射線療法の総括については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａを参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔放射線源から向けられる体外照射療法又は遠隔放射線療法として施され得る。放射線治療は、放射線源ががん細胞又は腫瘍塊に近接する体内に配置されている、内照射療法又は近距離照射療法としても施される。ヘマトポルフィリン若しくはその誘導体、ベルトポルフィン（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、デメトキシ−ヒポクレリンＡ、及び２ＢＡ−２−ＤＭＨＡなどの光増感剤の投与を含む光線力学療法の使用も包含される。
【００８６】
さらに他の実施形態では、外科的介入は、がん性細胞及び／又は組織を物理的に除去することができる。
【００８７】
さらに他の実施形態では、ホルモン療法を使用する。ホルモン治療的処置は、例えば、ホルモン作動薬、ホルモン拮抗薬（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨ拮抗薬）、ホルモン生合成並びにプロセシングの阻害物質、及びステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイド、ベタメタゾン、コルチゾール、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類似体、アンチゲスタゲン（例えば、ミフェプリストン、オナプリストン）、又は抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含むことができる。
【００８８】
さらに他の実施形態では、身体組織を高温（１０６°Ｆまで）に曝露する手法である温熱療法を使用する。熱は、細胞を損傷する又は生存に必要な物質を欠乏させることによって腫瘍を縮小するのを助け得る。温熱療法は、外部及び内部加熱装置を使用する、局所、領域、及び全身温熱療法であり得る。温熱療法は、それらの有効性を高める試みとしてほとんど常に他の形態の治療（放射線療法、化学療法、及び生物学的療法）と共に使用される。局所温熱療法は、腫瘍などの非常に小さな領域に適用される熱を指す。身体の外部の装置から腫瘍を目標として高周波で領域を外的に加熱し得る。内部加熱を達成するためには、細い加熱ワイヤ又は温水を満たした中空チューブ；移植マイクロ波アンテナ；及び高周波電極を含む、いくつかのタイプの無菌プローブの１つを使用し得る。領域温熱療法では、器官又は四肢を加熱する。高エネルギーを発生する磁石と装置を加熱する部位の上に設置する。灌流と呼ばれるもう１つのアプローチでは、患者の血液の一部を取り出し、加熱して、その後内的に加熱する部位に送り込む（灌流する）。全身加熱は、身体全体に広がった転移性がんを治療するために使用される。これは、温水ブランケット、高温ワックス、誘導コイル（電気毛布におけるもののような）、又はサーマルチャンバー（大きなインキュベーターに類似する）を用いて達成できる。温熱療法は、放射線副作用又は合併症の著明な上昇を引き起こさない。皮膚に直接適用される熱は、しかしながら、治療される患者の約半数に不快な、またさらには重大な局所痛を引き起こし得る。また水疱を生じさせることもあるが、一般には迅速に治癒する。
【００８９】
さらに他の実施形態では、光線力学的療法（ＰＤＴ、光放射線療法、光線療法又は光線化学療法とも呼ばれる）は、一部の種類のがんの治療に使用される。
【００９０】
さらに他の実施形態では、レーザー療法は、がん細胞を破壊するための高輝度光線の使用を含む。この技術は、しばしば出血又は閉塞などのがんの症状を緩和するため、特にがんが他の処置では治療できないときに使用される。また、腫瘍を縮小又は破壊することによってがんを治療するためにも使用し得る。
【００９１】
療法による治療の期間及び／又は用量は、特定の治療剤又はその組み合わせに従って変更し得る。特定のがん治療剤の適切な治療時間は、当業者であれば理解されるであろう。本発明では、がん治療剤ごとの最適な治療スケジュールの継続評価が考えられ、対象のがんの表現型は、本発明の方法によって判断されるように、最適な治療用量及びスケジュールを判断する因子である。
【００９２】
他の実施形態では、組み換えバイオマーカーポリペプチド及びその断片は、対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、生物学的性質が増強された融合タンパク質を構築し、投与することができる。さらに、バイオマーカーポリペプチド及びその断片は、バイオアベイラビリティの増加及びタンパク質分解の減少など、望ましい生物学的活性をさらに増強するために、当該技術分野において周知の薬理学的方法に従って修飾することができる（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化など）。
【００９３】
臨床有効性は、当該技術分野で公知の任意の方法によって測定することができる。例えば、治療、例えば、本明細書に開示される組成物に対する応答は、がん、例えば、腫瘍の治療に対する任意の応答、好ましくは、ネオアジュバント又はアジュバント化学療法の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に関する。腫瘍応答は、ネオアジュバント又はアジュバント状況で評価してもよく、ここで、全身性介入後の腫瘍のサイズは、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波又は触診で測定したままの初期のサイズ及び寸法と比較することができ、腫瘍の細胞充実度は、組織学的に推定し、治療の開始前に採取した腫瘍生検の細胞充実度と比較することができる。応答は、生検又は外科的切除の後に腫瘍のキャリパー測定又は病理検査でも評価してもよい。応答は、腫瘍体積又は細胞充実度の変化百分率のような定量的方法で、又は「病理学的完全奏功」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的不変」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、又は他の定性的基準のような定性的方法で、残存腫瘍量などの半定量的採点システム（Ｓｙｍｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２００７）２５：４４１４−４４２２）又はＭｉｌｌｅｒ−Ｐａｙｎｅスコア（Ｏｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｂｒｅａｓｔ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）１２：３２０−３２７）を用いて記録してもよい。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間、数日、数週後、又は好ましくは数カ月後に実行してもよい。応答評価の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終了後、又は残留腫瘍細胞及び／又は腫瘍床の外科的除去後である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本明細書で述べる治療的処置の臨床有効性は、臨床的利益率（ＣＢＲ）を測定することによって判定してもよい。臨床的利益率は、完全寛解（ＣＲ）である患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）である患者の数、及び不変（ＳＤ）である患者の数の合計を、治療終了から少なくとも６カ月の時点で判定することによって測定される。この式の略記は、ＣＢＲ＝６カ月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、特定の治療計画のＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上である。
【００９５】
本明細書に開示される治療に対する応答を評価する追加の基準は「生存」に関し、これは以下の全てを含む。すなわち、全生存としても知られる死亡までの生存（前記死亡は原因とは無関係、又は腫瘍関連でよい）、「無再発生存」（再発という用語は、限局的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存、無疾患生存（疾患という用語は、がん及びそれに関連する疾患を含むものとする）である。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断又は治療開始の時）及び終点（例えば死亡、再発又は転移）を参照することによって計算してもよい。さらに、治療の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の結果の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。
【００９６】
例えば、適切な閾値を判定するために、特定のがん治療計画を対象の母集団に適用することができ、結果は、本明細書に開示される任意の組成物の投与前に判定したバイオマーカー測定値に相関させることができる。結果測定値は、ネオアジュバント環境で与えられた療法に対する病理学的応答としてもよい。あるいは、全生存及び無疾患生存などの結果の尺度は、治療後に測定値が分かっている対象についてある期間にわたってモニターすることができる。ある特定の実施形態では、同じ用量の治療組成物が、各対象に投与される。対象をモニターする期間は様々でよい。例えば、対象は、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０カ月間モニターしてもよい。本明細書に開示される治療の結果と相関するバイオマーカー測定値閾値は、実施例のセクションで述べるような当該技術分野で周知の方法を使用して判定することができる。
【００９７】
３．医薬組成物
本発明は、本明細書で開示される組成物の薬学的に許容可能な組成物を提供する。以下で詳細に述べるように、本発明の医薬組成物は、固体又は液体形態で投与するように特別に製剤化することができ、（１）経口投与、例えば、飲薬（水性又は非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、巨丸薬、粉末、顆粒、ペースト剤、（２）非経口投与、例えば、無菌溶液又は懸濁液として、例えば、皮下、筋肉、又は静脈内注入、（３）例えば、皮膚に適用されるクリーム、軟膏、又は噴霧としての局所適用、（４）例えば、ペッサリー、クリーム又は発泡体などの膣内又は直腸内、又は（５）例えば、水性エアロゾル、リポソーム製剤又は化合物を含む固体粒子としてのエアロゾル、に適応する形態が含まれる。
【００９８】
本明細書に記載される組成物、例えば、プロバイオティクス細菌の組成物は、プロバイオティクス細菌を胃腸管の組織に導入することを目的として、胃腸管への経口投与に使用してもよい。本発明の治療用組成物の製剤はまた、胞子発芽及び／又は細菌増殖を促進する他のプロバイオティクス剤又は栄養素を含んでいてもよい。例示的な物質としては、有益なプロバイオティクス細菌の増殖を促進する、ｂｉｆｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅがある。ある特定の実施形態では、プロバイオティクス細菌株は、プロバイオティクス細菌組成物は、治療上有効な用量の（好ましくは、適用範囲の広い）抗生物質又は抗真菌剤と組み合わされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、腸溶性被覆された、徐放性カプセル又は錠剤中に封入される。腸溶性被覆により、胃腸管を通過する際に、一定時間後まで、及び／又はＧＩ管の特定の部分（例えば、小腸）に到達するまで、カプセル／錠剤を無傷のまま（すなわち、未溶解）にすることができる。徐放性成分は、本明細書に記載される組成物中のプロバイオティクス細菌株の「放出」を所定の期間防止する。
【００９９】
本発明の治療用組成物はまた、既知の抗酸化剤、緩衝剤、及び他の薬剤、例えば、着色剤、香料、ビタミン又はミネラルを含み得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本発明の治療用組成物、例えば、破骨細胞、破骨細胞の細胞培養物、及び／又は破骨細胞の細胞培養物の上清は、単体で、それを投与する種に生理学的に適合性がある担体と組み合わせて投与することができる。担体は、錠剤、カプセル剤又は粉末形態の製剤の場合には固体を主成分とする乾燥材料から構成することができ、又は担体は、液体又はゲル形態の製剤に製剤化するための、液体又はゲル状の材料から構成することができる。特定の種類の担体、並びに最終的な製剤は、一部は、選択される投与経路（複数可）に依存する。本発明の治療用組成物はまた、種々の担体及び／又は結合剤を含んでいてもよい。好ましい担体は、総重量１ｇの投与量に仕上げるのに十分な量で添加された微結晶セルロース（ＭＣＣ）である。担体は、錠剤、カプセル剤又は粉末形態の製剤の場合には固体を主成分とする乾燥材料であってもよく、液体又はゲル形態の製剤の場合には液体又はゲル状の材料であってもよく、その形態は、ある程度投与の経路に依存する。乾燥製剤のための典型的な担体は、トレハロース、マルトデキストリン、米粉、微結晶セルロース（ＭＣＣ）、ステアリン酸マグネシウム、イノシトール、ＦＯＳ、ＧＯＳ、デキストロース、スクロース、及び同類の担体が含まれるが、これらに限定されない。適切な液体担体又はゲル状担体は、水及び生理食塩水、尿素、アルコール及び誘導体（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールなど）を含むが、これらに限定されない。好ましくは、水性担体は、中性のｐＨ値（すなわち、ｐＨ７．０）を有する。本明細書に記載される組成物を投与するための他の担体又は薬剤は、当該技術分野で、例えば、米国特許第６，４６１，６０７号で公知である。本発明の、破骨細胞、破骨細胞の細胞培養物、及び／又は破骨細胞の細胞培養物の上清は、当該技術分野で公知であり、かつ本明細書に記載される局所及び／又は全身投与経路を用いて投与することができる。
【０１０１】
本明細書に記載される破骨細胞（ＯＣ）又は樹状細胞（ＤＣ）は、当該技術分野で公知の任意の投与経路を通じて、任意の薬学的に許容可能な組成物で、対象に投与するために使用してもよい。例えば、ＯＣ又はＤＣ、かかるＯＣ又はＤＣを含む細胞培養物、又はかかる細胞培養物の上清は、場合により、追加の薬剤（複数可）と共に、全身及び／又は局所で（例えば、がん又は腫瘍組織又はその近くに）注射（例えば、静脈内）を介して、医薬組成物で投与してもよい。
【０１０２】
「薬学的に許容可能」という語句は、健全な医療の判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題又は合併症がなく、妥当な利益／リスクの比率に対応し、ヒト又は動物の組織と接触状態で使用するのに適しているこれらの薬剤、材料、組成物、及び／又は剤形を指すものとして、本明細書では使用される。
【０１０３】
「薬学的に許容可能な担体」という語句は、本明細書で使用する場合、主題の化学物質を１つの器官又は身体部分から別の器官又は身体部分へと運搬又は輸送することに関与する液体又は固体の充填材、希釈剤、賦活剤、溶剤又は封入材料などの、薬学的に許容可能な材料、組成物又はビヒクルを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合し、対象に有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として働くことができる材料のいくつかの例としては、（１）乳糖、ブドウ糖及び蔗糖などの糖、（２）トウモロコシ澱粉及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）粉末状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑石、（８）ココアバター及び座剤蝋などの父兄剤、（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）パイロジェン除去水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）医薬製剤に使用される他の非毒性相溶性物質が挙げられる。
【０１０４】
経口投与に適切な製剤は、カプセル、カシェ、ピル、錠剤、トローチ剤（風味付けされた基剤、通常、スクロース、及びアカシア、又はトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態で、又は、水性もしく非水性液体の溶液若しくは懸濁液として、又は、水中油型若しくは油中水型液状乳液として、又はエリキシル若しくはシロップとして、あるいはトローチ（不活性基剤、例えば、ゼラチン及びグリセリン、又はスクロース及びアカシアを使用）、及び／又はマウスウォッシュなどとしてであってよく、各々は、所定の量の本明細書に開示される１つ以上の細菌株を含有する。
【０１０５】
本発明は、本明細書に記載されるバイオマーカーを検出及び／又は調節するキットも包含する。本発明のキットはまた、本明細書に提供される本開示の方法における本開示のキット又は抗体の使用を開示又は記載する取扱い説明書が含まれる。キットはまた、そのキットが意図された特定の適用を円滑にするための付加的成分が含まれる。例えば、キットには、標識を検出する手段（例えば、酵素標識用の酵素気質、蛍光標識を検出するためのフィルターセット、適切な二次的な標識、例えば、ヒツジ抗マウスＨＲＰなど）、及び対照に必要な試薬（例えば、対照生物学的試料又は基準物質）がさらに含まれてもよい。キットはさらに、本開示の方法での使用が認められる緩衝液及び他の試薬を含んでもよい。非限定的な例としては、担体タンパク質又は洗剤など、非特異的結合を低下させるための薬剤が挙げられる。
【実施例】
【０１０６】
実施例１：実施例２及び３の材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ  １６４０完全培地（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔ）を細胞培養に使用した。口腔扁平上皮癌細胞（ＯＳＣＣ）及び口腔扁平上皮癌幹細胞（ＯＳＣＳＣ）は、ＵＣＬＡにて、舌腫瘍を有するがん患者から単離し［参考文献２及び３３〜３５を参照されたい；以下の全ての引用は、同じ参考文献リストを指す］、１０％のＦＢＳを含有するアルファ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ）を、破骨細胞及びＤＣの培養に使用した。Ｍ−ＣＳＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、ＣＡ）及びＲＡＮＫＬ、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（ＮＪ）から購入し、ｒｈ−ＩＬ−２は、ＮＩＨ−ＢＲＢから得られた。ヒトＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞活性化因子は、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。
【０１０７】
ＭＨＣ−Ｉ、ＫＩＲ２、ＫＩＲ３、ＣＤ４４、ＣＤ５４、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ／Ｂ、ＫＬＧＲ１、ＣＤ４５、ＣＤ３／１６／５６、ＣＤ８、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＧＬ３、ＮＫｐ４０、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６及びＣＤ９４に対する抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。ＵＬＢＰ１−６抗体は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ｓＡＪ２は、上述のように調製した［３６］。
【０１０８】
ヒトＰＢＭＣ及びｈｕ−ＢＬＴ脾細胞からのＮＫ細胞及びＴ細胞の精製
ＮＫ細胞及びＴ細胞は、上述のように精製した［３７］。ｈｕ−ＢＬＴ脾細胞からのＴ細胞を、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）からの単離キットを用いて積極的に精製した。
【０１０９】
ｈｕ−ＢＬＴマウス及びヒトＰＢＭＣからの、単球の精製、並びに樹状細胞及び破骨細胞の生成
ＵＣＬＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）によって承認された書面によるインフォームドコンセントは、健康な血液ドナーから得られ、全ての手順は、ＵＣＬＡ−ＩＲＢによって承認された。単球を上述のように精製した［３７］。ｈｕ−ＢＬＴマウスからの単球を、ヒトＣＤ１４単離キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、骨髄から積極的に単離した。９５％を超える純度が、フローサイトメトリー解析に基づいて、サブセットごとに達成された。Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）で２１日間処理することで、単球を破骨細胞に分化した。ＤＣを得るため、単球を、ＧＭ−ＣＳＦ（１５０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−４（５０ｎｇ／ｍＬ）で７日間処理した。
【０１１０】
ＮＫ細胞の増殖
ヒト精製ＮＫ細胞及びｈｕ−ＢＬＴ強化ＮＫ細胞を、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂ（３μｇ／ｍｌ）で１８〜２０時間活性化した後、フィーダー細胞及びｓＡＪ２と共培養した。ＩＬ−２を有する培養培地を３日ごとに新鮮にした。
【０１１１】
ｈｕ−ＢＬＴマウスからの腫瘍移植及び組織調製
本明細書で述べる動物研究は、全ての連邦、州、及び地域の法規に準じて、ＵＣＬＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＲＣ）の書面による承認の下で行った。複合免疫不全ＮＯＤ．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｊ及びＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉ１２ｒｇｔｍｌＷｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧが不足するＴ、Ｂ、及びナチュラルキラー細胞）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。ヒト化ＢＬＴ（ｈｕ−ＢＬＴ；ヒト骨髄／肝臓／胸腺）マウスは、上述及び図８に示すように、ＮＳＧバックグラウンドで調製した［３８、３９］。同所性腫瘍を確立するため、酸素と組み合わせてイソフルランでマウスを最初に麻酔し、その後、腫瘍細胞を、１０μｌのＨＣマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）（１×１０６個の細胞）を有する懸濁液中で、口腔底に直接注入した。腫瘍注入の４〜５週間後、マウスを安楽死させ、骨髄、脾臓、及び血液を収穫し、単細胞懸濁液を調製した［４０］。
【０１１２】
ＥＬＩＳＡ及び多重サイトカインアレイキット
単一ＥＬＩＳＡ及び多重アッセイは、上述のように行った［３７］。
【０１１３】
ＮＫ細胞上清によるがん幹細胞分化
ＮＫ細胞からの上清を調製し、上述のように、ＯＳＣＳＣの分化に使用した［３６］。１３日目に、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞からの上清を分化に使用した。
【０１１４】
表面染色及び細胞死アッセイ
上述のように、細胞を抗体又はヨウ化プロピジウムで標識することで、染色を行った［３７、４１、４２］。Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ２０  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬサイトメーター（Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＦｌｏｗＪｏ  ｖＸソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて結果を解析した。
【０１１５】
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ
５１Ｃｒ放出アッセイは、上述のように行った［４３］。
【０１１６】
統計解析
対応のない又は対応のある両側スチューデントｔ検定を行って、統計解析した。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析法を使用して、異なる群を比較した。＊＊＊（ｐ値＜０．００１）、＊＊（ｐ値０．００１〜０．０１）、＊（ｐ値０．０１〜０．０５）。
【０１１７】
実施例２：破骨細胞は、スーパーチャージドＮＫ細胞を優先的に活性化し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を急速に増殖させ、がん患者及びＢＬＴヒト化マウスからのナチュラルキラー細胞数の減少をもたらす。
破骨細胞によるＮＫ細胞及び樹状細胞によるＴ細胞の優先的な増殖及びそれらの機能の有意な向上。
ＮＫ細胞の増殖及び機能に対する破骨細胞、単球及びＤＣの活性化効果を比較した。ＮＫ細胞は、ＩＬ−２及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂで１８〜２０時間活性化させた後、ＯＣ及び／又はｓＡＪ２と共培養した。ＯＣ及びｓＡＪ２の組み合わせは、ＮＫ細胞を優先的に増殖させた一方、Ｔ細胞を低い割合に維持した（図１）。その後、ＮＫ培養中の汚染Ｔ細胞の増殖速度及びレベルを、ｓＡＪ２で処理したＯＣ、ＤＣ、及び単球との共培養物間で比較した。ＯＣと共培養したＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を優先的に増殖させ、汚染Ｔ細胞の増殖速度は、培養の最初の１〜２ヵ月間にわたって非常に低いままであった（図２及び４Ａ）。これに対し、ＤＣは、Ｔ細胞を優先的に増殖させ、ＮＫ細胞の割合は、低いままであった。単球は、Ｔ細胞を増殖させることもできたが、Ｔ細胞増殖は、ＮＫ細胞増殖よりも低いままであった。３つ全ての培養中でＴ細胞の割合は最初は増加したが、しかしながら、その後の培養では、Ｔ細胞の増殖速度は、ＯＣとの共培養物で減少した一方、Ｔ細胞は、増殖し続け、ＤＣとの培養物中に実質的に増加した。Ｔ細胞増殖の定常状態は、単球との共培養物でも見ることができる。（図２Ａ〜Ｄ）。
【０１１８】
ＯＣと共培養したＮＫ細胞は、単球又はＤＣと共培養したＮＫ細胞よりも著しくＯＳＣＳＣを溶解することができ、９日目〜１５日目に著しい増加があった。これは、１５日目のＯＣとの共培養物中のＮＫ細胞のより速い増殖と相関した（図２Ｅ）。ＯＣと培養した、ＩＬ−２及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂ活性化ＮＫ細胞は、単球又はＤＣと共培養したＮＫ細胞と比較して、有意に高い量のＩＦＮ−γを分泌した（図２Ｆ）。ＮＫ細胞の増殖速度及び集団倍加（ベースライン計数に対する最終計数の比の対数を、２の対数で除したものと定義した）を解析すると、ＯＣは、ＮＫ細胞を、２０日目に２１，０００〜１３２，０００倍、３１日目に３００，０００−５，１００，０００倍に増殖させ、４週間以内に１７〜２１回の集団倍加であることが分かった（図２Ｇ〜Ｈ）。
【０１１９】
単離したばかりの単球を、重要な表面受容体を発現する成熟ＤＣ及びＯＣと比較した。ＣＤ５４は、ＤＣ及びＯＣ上でアップレギュレートされた一方、ＭＨＣ−Ｉは、単球と比較して、ＤＣ及びＯＣ上で減少した（図１Ｄ）。キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＫＬＲＧ１、及びＭＩＣＡ／Ｂは、ＯＣ上で高く、単球上で中程度、ＤＣ上で非常に低かった（図２Ｉ）。ＵＬＢＰ１−６は、単球上で高く、ＯＣ上で中程度、ＤＣ上で低かった（図２Ｉ）。ＣＤ９４及びＮＫＧ２Ｄを含むＮＫ細胞受容体は、未処理の一次ＮＫ細胞（図２Ｊの上段）と比較して、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞（図２Ｊの下段）上で高かった。ＫＩＲ２及びＫＩＲ３発現は、増殖したＮＫ細胞（図２Ｊの下段）上で中程度であった。
【０１２０】
ＯＣにより増殖したＮＫ細胞から精製されたＴ細胞の残存集団は、細胞傷害性を媒介しないが、ＩＦＮ−γを分泌する。
ＯＣにより増殖したＮＫ細胞からのＴ細胞汚染の大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であった（図３Ａ）。９日目のＯＣにより増殖したＮＫ細胞からのＴ細胞汚染を選別して、精製したＴ細胞及びＮＫ細胞を得た。その後、ＣＤ１６及びＣＤ３／５６抗体を用いて、ＮＫ細胞の純度を試験した（図３Ｂ）。次いで、ＮＫ細胞及びＴ細胞をＩＬ−２で１８〜２０時間処理した後、ＯＳＣＳＣ及びＫ５６２に対する５１Ｃｒ放出アッセイで使用した。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞から単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＯＳＣＳＣ（図３Ｃ）又はＫ５６２（図３Ｄ）を溶解できなかった。ＮＫ細胞からの上清は、Ｔ細胞と比較して、有意に高いレベルのＩＦＮ−γを分泌した（図３Ｅ）。
【０１２１】
破骨細胞によるＮＫ細胞の増殖は、１ヵ月目には高いままであり、２ヵ月目に徐々に低下し、３ヵ月目にかなり低下した。
ＯＣと培養したＮＫ細胞は、３１〜３６日間増殖した一方、汚染Ｔ細胞の速度は、低いままであった（図４Ａ）。３６日目の増殖ＮＫ細胞をＯＣと再培養し、２ラウンド目の増殖をさせて、ＮＫ増殖は、２７日間継続した（図４Ｂ）。同様に、Ｔ細胞の増殖速度は、ＯＣによるＮＫ細胞増殖の２ラウンド目において非常に低いままであった（図4B）。67日目の増殖ＮＫ細胞をＯＣと再培養し、３ラウンド目の増殖をさせたが、しかしながら、ＮＫ細胞は、Ｔ細胞増殖により徐々に失われた（図４Ｃ）。細胞死レベルは、ＯＣによる増殖の３ラウンド目における増殖ＮＫ細胞中で全く若しくは僅かしか観察することができなかった（図４Ｍ）。ＮＫ細胞が、がん幹細胞を溶解し、ＩＦＮ−γを分泌する能力は、１〜２ラウンド目の増殖で徐々に低下し、Ｔ細胞のより多くのパーセンテージが増殖する３ラウンド目では、これらの機能は、最小限になった（図４Ｎ〜４Ｓ）。
【０１２２】
破骨細胞は、Ｋ５６２又はＯＳＣＳＣを除いて、ＮＫ細胞を増殖させ、及びＮＫ細胞機能を増加させる。
活性化ＮＫ細胞を、ｓＡＪ２の存在下で、ＯＳＣＳＣ、Ｋ５６２、ＯＣ、照射Ｋ５６２、又は照射ＯＣと培養し、ＮＫ増殖及びそれらの機能レベルを判断した（図５Ａ〜５Ｈ）。非照射、照射Ｋ５６２又はＯＳＣＳＣのいずれかにより誘導されたＮＫ細胞増殖及び機能（細胞傷害性及びＩＦＮ−ｇ分泌）は、非照射又は照射ＯＣにより誘導されたものよりも有意に低かった（図５）。
【０１２３】
患者からのＮＫ細胞による細胞傷害性の低下及びＩＦＮ−γの低分泌は、Ｔ細胞増殖の増加と一致する。
ＯＣと培養した場合、がん患者からの精製ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を維持することができず、実際に、１２日目までに、増殖細胞の半分以上が、Ｔ細胞であった。さらに、３１日目までに、１０％のＮＫ細胞しか培養物中に残らなかった（図６Ａ及び図７Ａ）。さらに、増殖したＮＫ及びＴ細胞の総数は、がん患者において、増殖の３１〜３６日以内に判断し、健康な対照と比較して、がん患者からの増殖細胞が少なく（図６Ｄ及び図７Ｃ）、Ｔ細胞の増殖レベルは、ＮＫ細胞よりも有意に高かった（図６Ｅ〜Ｆ及び図７Ｄ〜Ｆ）。これに対し、健康なドナーから単離されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を維持し、ＮＫの増殖レベルは、Ｔ細胞よりも有意に高かった（図６Ｂ、Ｅ、Ｆ及び図７Ｂ、７Ｅ、７Ｆ）。ＮＫ細胞の増殖は、培養の様々な日数で、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、患者のＮＫ細胞で全く又はほんの僅かしか観察されなかった（図７Ｆ）。健康なドナー又は患者のいずれかからの増殖細胞において著しい細胞死を観察することはできなかったが、細胞死の速度は、健康なドナーよりも患者からの細胞で僅かに高かった（図６Ｃ）。
【０１２４】
ＯＣと培養した患者のＮＫ細胞は、ＯＣと培養した健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＯＳＣＳＣを溶解した（図６Ｇ及び図７Ｇ）。ＮＫ細胞の数に基づいて正規化した場合、患者によるＮＫ細胞ごとに誘導された細胞傷害性は、健康な対照からのＮＫ細胞と比べた場合に低かった（図６Ｈ及び図７Ｈ）。ＯＣにより増殖した患者のＮＫ細胞は、ＯＣにより増殖した健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＩＦＮ−γを分泌した（図６Ｉ及び図７Ｉ）。ＯＣにより増殖した口腔癌患者のＮＫ細胞は、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＩＬ−１０（図６Ｊ）を分泌した一方、膵臓癌患者からのものは、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、より高いＩＬ−１０（図７Ｊ）を分泌した。健康又はがん患者のＮＫ細胞によるＩＬ−６分泌レベルについて有意差を観察することはできなかった（図６Ｋ及び図７Ｋ）。破骨細胞により増殖した健康な対照ＮＫ細胞と比較して、患者のＮＫ細胞の表面上で、ＮＫＧ２Ｄ表面発現レベルは同様であった一方、ＣＤ９４発現は高く、ＫＩＲ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６発現は、低かった（図６Ｌ及び６Ｍ）。
【０１２５】
患者の増殖ＮＫ細胞からの上清は、ＯＳＣＳＣを分化する能力が非常に低い。
ＯＳＣＳＣを、患者及び健康なドナーからの等しい容量の１３日目の上清で１８〜２０時間処理した後、ＣＤ４４、Ｂ７Ｈ１、ＣＤ５４、及びＭＨＣ−Ｉの発現レベルを解析した（図６Ｎ）。健康なＮＫ上清によるＭＨＣ−Ｉ発現は、７．１倍の増加したが、患者のＮＫ上清により誘導された増加は、僅か２．５６倍であった（図６Ｎ）。ＣＤ５４発現の場合、患者のＮＫ上清による２．１倍の増加と比較して、健康なＮＫ上清による１３倍の増加が観察された。Ｂ７Ｈ１の場合、患者のＮＫ上清による１．５倍の増加と比較して、健康なＮＫ上清による３．７５倍の増加が観察された。ＣＤ４４は、健康なＮＫ上清によって減少した一方、患者のＮＫ上清による減少は観察されなかった（図６Ｎ）。ＯＳＣＳＣをＮＫ上清で処理した後に、著しい細胞死を観察することができなかった（図６Ｏ）。図６Ｐに示すように、健康なＮＫ上清で処理した場合、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性の７４％の減少が観察された一方、患者のＮＫ上清では、３３％の減少しか観察されなかった（図６Ｐ）。
【０１２６】
ヒト化マウス中の口腔腫瘍は、Ｔ細胞を優先的に増殖させ、ＩＦＮ−γ分泌を保持しながら、ＮＫ細胞傷害性の喪失をもたらす。
ヒト化ＢＬＴマウスに口腔腫瘍を移植し、腫瘍移植の４週間後にマウスを犠牲にした。ｈｕ−ＢＬＴマウスから脾臓を収穫し、Ｔ細胞を選別した。その後、Ｂ細胞を含有するフロースルーセル（図８）を、ＩＬ−２及び抗ＣＤ１６ｍＡｂで１８〜２０時間処理した後、ＢＬＴ−ＯＣと培養した。担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスは、より大きな割合のＮＫ細胞を含んでいたが（図９Ａ）、増殖は、徐々に、かつ、著しいＴ細胞の増殖をもたらした。これは、６日目に始まり、２２日目まで継続し、この時点で、９６％の細胞がＴ細胞であり、ＮＫ細胞は僅か１．１％であった。これに対し、より少ないＮＫ細胞を最初に含んでいた、ｈｕ−ＢＬＴ腫瘍のないマウスからのフロースルーセルは、ＮＫ細胞を増殖させ、レベルは、６日目の２８．６％のＮＫ細胞から２２日目の６９％のＮＫ細胞に上昇した（図９Ｂ）。自己ＯＣと培養した場合のＮＫ細胞レベルは、培養初日から両方の動物で増加したが、腫瘍のないマウスは、０日目から６日目までに１０．５９倍に増加した一方、腫瘍のあるマウスは、４．５６倍に増加した（図９Ｂ）。増殖したリンパ球の総数は、腫瘍のないものと比較して、担癌マウスで低く（図９Ｃ）、その大部分は、Ｔ細胞であり、ＮＫ細胞ではなかった（図９Ｄ及びＥ）。
【０１２７】
担癌マウスからのＮＫ強化細胞は、ＯＣと共培養した場合、腫瘍のない対照マウスのものよりも有意に少ないＯＳＣＳＣを溶解することができた（図９Ｆ）。さらに、ＮＫ細胞１個ごとの細胞傷害性を評価した場合、腫瘍のない対照マウスからのＮＫ細胞と比較して、担癌マウスからのＮＫ細胞には、細胞傷害性の低さが見られた（図９Ｇ）。担癌マウスからのＮＫ強化細胞は、腫瘍のない対照マウスと比べた場合に、有意に高いＩＦＮ−γ（図９Ｈ）、低いＩＬ−１０（図９Ｉ）、及び僅かに低いＩＬ−６（図９Ｊ）を分泌した。担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスの末梢血からの血清は、対照腫瘍のないマウスと比較して、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、及びＩＬ−６の分泌の増加を示した（図９Ｋ）。
【０１２８】
ＩＬ−１５は、一部で、破骨細胞によるＮＫ細胞の増殖を媒介する一方、ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌の増加の役割を担う。
一次ＮＫ細胞及び６日目のＯＣにより増殖したＮＫ細胞が分泌したサイトカイン、ケモカイン、成長因子、及びリガンドのレベルを判断した（図１０）。分泌したサイトカイン、ケモカイン、成長因子、及びリガンドの大部分は、ＩＬ−２及び抗ＣＤ１６  ｍＡｂで活性化された一次ＮＫ細胞が分泌したものと比べた場合に、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞でより高かった（図１０）。５０〜６０倍高いＩＬ−１２の誘導、及び２０〜２６倍高いＩＬ−１５の分泌は、一次ＮＫ細胞と比較して、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞で見られた（図１０）。抗ＩＬ−１２及び／又は抗ＩＬ−１５  ｍＡｂの添加は、細胞増殖を有意に低下させ、１μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−１５が最も効果が大きかった（図１１Ａ）。抗ＩＬ−１２及び／又は抗ＩＬ−１５による処理は、９日目のＮＫ細胞の細胞障害機能に影響を与えなかった（図１１Ｂ）が、１５日目に著しく阻害した（図１１Ｂ）。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌レベルは、抗ＩＬ−１５処理と比べた場合に、抗ＩＬ−１２でより低下した（図１１Ｃ）。
【０１２９】
抗ＣＤ３抗体の添加は、Ｔ細胞増殖を制御し、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞を増加させる。
リンパ球を、抗ＣＤ３で処理し、ＮＫ又はＴ細胞増殖を、様々な日数で評価した（図１２Ａ及び１２Ｂ）。前方及び側方散乱の両方を喪失した細胞のレベルは、増加し（図１２Ｃ及び１２Ｄ）、ＤＮＡ断片化の上昇は、細胞周期解析におけるサブＧ０／Ｇ１ピークの増加から明らかなように、Ｔ細胞の喪失を示す抗ＣＤ３処理細胞で得られた（図１２Ｅ）。したがって、ＮＫ細胞のレベルは、患者及び健康なドナーの両方で上昇した（図１２Ａ〜１２Ｂ）。前方及び側方散乱を喪失した集団は、ＣＤ３及びＣＤ１６  ｍＡｂ染色によって判断したように、ＣＤ３＋Ｔ細胞であった（データ不図示）。ＮＫ細胞の不在下で、抗ＣＤ３  ｍＡｂ処理Ｔ細胞は、前方及び側方散乱を喪失せず（図１３）、細胞死も示さなかった（データ不図示）。ＮＫ細胞の細胞傷害性を、抗ＣＤ３  ｍＡｂの添加の前後に評価した場合、健康及び患者の両方ドナーからのＮＫ細胞は、有意に低い細胞傷害性を有したが、レベルは、健康なＮＫ細胞でさらに高かった（図１２Ｇ）。これに対し、ＩＦＮ−γ分泌のレベルは、健康及び患者のＮＫ試料の両方において著しく上昇し、これは、Ｔ細胞に結合した抗ＣＤ３ｍＡｂによるＮＫ細胞中の分割アネルギーの誘導を示した（図１２Ｆ）。
【０１３０】
破骨細胞により活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞数を実質的に増加させる。
がん患者は、健康な対照と比べた場合に、平均して適度に高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞、及び低い割合のＣＤ４＋Ｔ細胞を有する（図１４Ａ）。破骨細胞と培養した場合、ＮＫ細胞の不在下のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖できなかったが、しかしながら、非常にごく少量の汚染Ｔ細胞を含んだＯＣで活性化した精製ＮＫ細胞は、患者のＮＫ細胞培養物が健康なＮＫ細胞よりも速くＴ細胞を増殖させたにも関わらず、健康及び患者の培養物の両方からＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させた（図１４Ｂ）。ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＴ細胞を、ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＴ細胞と比較した場合、ＯＣは、ＮＫ細胞媒介ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させた一方、ＤＣは、ＮＫ細胞媒介ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させた（図１４Ｃ〜図１４Ｇ）。さらに、ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−／低ＣＣＲ７−／低表示メモリー／エフェクター表現型であったため、全て活性化された表現型であった（図１４Ｈ）。
【０１３１】
インビボ及びインビトロ研究により、破骨細胞がＮＫ細胞の主要な活性化因子であることが最近示された。より重要なことは、破骨細胞による単月の刺激が、健康なドナーから２ヵ月を上回る間、スーパーチャージドＮＫ細胞の増殖を維持できたことである。さらに、ＮＫ細胞の細胞障害機能は、１ヵ月目に有意に高いままであり、増殖の２ヵ月目で衰えた。多数のＮＫ細胞が増殖し続けたにも関わらず、ＮＫ細胞機能が、刺激の２ヵ月目で衰え続ける理由は不明である。２ヵ月目でのＮＫ細胞の細胞傷害性の維持に追加のシグナルが必要である、及び／又はＯＣをより頻繁に補充する必要がある可能性がある。
【０１３２】
ＯＣをフィーダー細胞として使用することは、前述のものと比較して、多数のＮＫ細胞を増殖させるための最良の戦略であった（表１）。まず、出願者らは、２０日目に２１，０００〜１３２，０００倍の増殖、及び３１日目に０．３〜５．１百万個、増殖の４週間以内に１７〜２１回の集団倍加を得、これは、以前に報告されたいずれの方法よりもはるかに速い速度である（表１）。研究を通じて増殖したＮＫ細胞の細胞障害機能は、使用した様々な種類の標的により比較するのは難しいが、本明細書で開示される戦略は、がん幹細胞を標的にして溶解し、ＩＦＮ−γを分泌する重要な能力を有する多数のＮＫ細胞を提供する（表１）。さらに、一次ＮＫ細胞は、形質転換の可能性が全く又はほとんどない状態で増殖された。ここで、形質転換は、ほとんどのＮＫ株（例えば、ＹＴ、ＮＫ９２又はＮＫ−Ｌ）又はトランスフェクトＮＫ細胞は、それぞれ、それらの細胞障害及びＩＦＮ−γ分泌能力のほとんど又は一部のいずれかを喪失しやすいために、ＮＫ細胞死滅の可能性に影響を与えることが知られている。さらに、ＮＫ細胞増殖を維持するための抗ＣＤ３抗体治療は、Ｔ細胞増殖を制限する素晴らしい戦略であるが、かかるＮＫ細胞の細胞障害活性は、ＮＫ細胞で誘導された著しい分割アネルギーにより低い。この戦略は、ＩＦＮ−γ分泌の大きな増加により腫瘍の分化を誘導するために素晴らしいかもしれないが；しかしながら、腫瘍の除去に対する最適性が非常に低い。これは、固体腫瘍の免疫療法におけるＮＫ細胞の使用が、試験した患者の少数において腫瘍の退縮をもたらさなかった理由の１つかもしれない。
【０１３３】
【表１】
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【０１３４】
ＯＣとは異なり、ＤＣは、精製ＮＫ細胞中の少数の汚染Ｔ細胞の優先的な増殖を刺激し、Ｔ細胞レベルを、１ヵ月間上昇し続けたため、ＮＫ増殖を減少させた。したがって、ＯＳＣＳＣに対する低レベルの細胞傷害性が見られた。興味深いことに、同様の割合のＮＫ細胞がＯＣ及びＤＣ培養物で観察されたより早い時点でＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した場合、ＮＫ細胞傷害性の上昇は、ＯＣと培養したＮＫ細胞によって観察することができた（データ不図示）。同様に、ＤＣと培養したものと比べた場合に、ＯＣと培養したＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ分泌が増加し、これは、細胞１個当たりで、ＮＫ細胞が、ＤＣと培養したものと比べて、ＯＣと培養した場合により高いＩＦＮ−γを分泌したことを示す（図１Ｃ）。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞から選別したＴ細胞は、細胞傷害性が非常に低く、Ｔ細胞によって見られた最小限の細胞傷害性は、おそらくは汚染ＮＫ細胞によるものであった（図３Ｃ及び図３Ｂ）。一方、Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γを放出し得るが、そのレベルは、ＮＫ細胞が放出したものよりも有意に低かった（図３Ｅ）。Ｔ細胞のサブセット；ＣＤ８、ＣＤ４及びｇｄＴ細胞を選別し、細胞傷害性アッセイで使用した場合、ＮＫ細胞だけが、これらの細胞を溶解することができ、Ｔ細胞サブセットで見られる残存細胞傷害性は、汚染ＮＫ細胞によるものであった（図３Ｆ）。ＯＣは、ＤＣと比較して、活性化しているＮＫリガンドをより多く発現した一方、両方とも同様のレベルの分化抗原ＣＤ５４を示した。興味深いことに、両方とも、単球と比べた場合に、低レベルのＭＨＣクラスＩ発現を示した（図１Ｄ）。さらに、ＩＬ−１５分泌は、ＮＫ細胞の増殖に重要であると思われた（図１１Ａ）一方、ＩＬ−１２は、ＩＦＮ−γの分泌に重要であった（図１１Ｃ）。両方のサイトカインは、増殖のより早い時点と比較して後日に評価した場合に、ＮＫ細胞の細胞障害機能に重要であった（図１１Ｂ）。
【０１３５】
ＯＣと比較して、非照射又は照射であるかどうかに関わらず試験した全ての腫瘍細胞株は、長期間におけるＮＫ細胞の増殖を支持せず、短期間において、ＩＦＮ−γの分泌がＫ５６２及びＯＳＣＳＣとの培養物で観察することができたとしても、この効果は短命であった（図５）。さらに、ＯＣ誘導増殖を照射ＰＢＭＣと比較して、ＯＣのものよりも著しく劣ることが分かった（データ不図示）。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞は、一次ＮＫ細胞と比べた場合に、非常に高レベルの活性化受容体（ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＣＤ９４を含む）の発現を示し、阻害受容体ＫＩＲ２及びＫＩＲ３を増加させ、非常に低レベルのＣＤ１６受容体を発現した（図２Ｊ、下段）。健康なドナーのＯＣにより増殖したＮＫ細胞を比較した場合、がん患者は、一般的に、非常に低い受容体発現を有し、そのレベルは、著しい細胞障害及びサイトカイン分泌能力が喪失しており、Ｔ細胞を増殖させることができる刺激された健康なＮＫ細胞の３ラウンド目で見られるものよりもさらに低かった。患者のＮＫ細胞と同様に、Ｋ５６２及びＯＳＣＳＣにより増殖したＮＫ細胞は、短命であり、非常に低い細胞障害及びサイトカイン分泌能力を有した。Ｋ５６２又はＯＳＣＳＣは、ＯＣとは異なり、低レベルのＮＫ活性化リガンドを発現し（図１Ｄ）、ＯＣによるこれらのシグナルの増加は、ＮＫ細胞の増殖及び機能を上昇することができるため、ＮＫ細胞の増殖を担う重要なサイトカインの分泌を欠いた（図１０Ａ）。遺伝子操作されたＫ５６２細胞によるＮＫ細胞の増殖速度は、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞よりも１００倍の大きさで低いため（表１及び図５Ａ及び図５Ｂ）、遺伝子操作されたＫ５６２によるかかるシグナル（表１）が、ＯＣにより送達されたものよりも劣るかどうかはまだ確定していない。さらに、遺伝子操作されたＫ５６２による持続的な刺激が、ＮＫ増殖を維持するために必要である一方、スーパーチャージドＮＫ細胞を１ヵ月超にわたって増殖させるには、ＯＣによるたった１回の刺激で十分であった。さらに、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞は、一次ＮＫ細胞とは異なり、凍結温度にかなり耐え、生存率又は機能を喪失することなく、それらのスーパーチャージド特性及び増殖速度を保持する（図１５）。
【０１３６】
自己又は同種異系ＯＣを使用して、がん患者からのＮＫ細胞を増殖させる場合、全く異なるプロファイルが観察された。がん患者のＯＣは、培養の初期にＴ細胞も増殖させ、様々な日数でＮＫ細胞の全体的な増殖を低下させる。ＯＣ培養後に患者のＮＫ細胞の機能を評価した場合、ＮＫ細胞の細胞傷害性の著しい喪失、及びＩＦＮ−γ分泌の減少が、ＮＫ細胞ごとに観察することができた（図６Ｈ及び図１５Ｇ）。この観察は、がん患者における精製ＮＫ培養物中のごく少量の汚染Ｔ細胞の早い増殖が、ＮＫ細胞の細胞障害機能の喪失と相関するために重要である。従って、ＮＫ細胞の喪失はまた、がん幹細胞の成長及び転移に対して肥沃な土壌を提供し得る。
【０１３７】
腫瘍を移植したヒト化マウスから得られたＯＣが、がん患者のＯＣと同様に、それらの非担癌同等物よりも速く、精製ＮＫ培養物内でごく少量の汚染Ｔ細胞を増殖させるかどうかを試験するため、口腔底にＯＳＣＳＣを移植し、増殖させた。増殖の５週間後に、マウスを安楽死させ、Ｔ細胞を除去した後、細胞を自己及び同種異系ＯＣと培養し、ＮＫ細胞の増殖速度を判断した。健康なドナーのＮＫ細胞と同様に、腫瘍のないｈｕ−ＢＬＴマウスからのＮＫ細胞は、ＮＫ細胞を長期間増殖した一方、担癌マウスからのものは、ＮＫ培養物中でごく少量の汚染Ｔ細胞をより速く増殖させ、ＮＫ細胞を上回るＴ細胞の増殖に好都合である。興味深いことに、がん患者で観察されたＮＫ細胞の細胞傷害性の喪失と同様に、腫瘍を移植したｈｕ−ＢＬＴマウスにおいてＮＫ細胞の細胞傷害性の著しい喪失も観察され、これは、Ｔ細胞の増殖の発症機序であり得る。しかしながら、担癌マウスからのＯＣにより増殖したＮＫ＋Ｔ細胞は、腫瘍のないものと比べた場合に、高レベルのＩＦＮ−γを分泌し、ＮＫ細胞における分割アネルギーの潜在的な誘導ががん幹細胞の分化を駆動することを示唆している。このことは、ＮＫ注入した担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスにおける腫瘍の単細胞調製が、より高い分化抗原を示し、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性に耐性があったことが事実であると分かった。
【０１３８】
ヒトＩＬ−１５の添加がＮＫ細胞の増加を促進するため、ヒト化マウス中の微小環境は、ネズミ及びヒトＩＬ−１５の間の交差反応性の欠如によりＮＫ細胞の増殖に役に立たないと仮説を立てる。それらの増殖のために破骨細胞からのシグナルを必要とするＮＫ細胞とは異なり、Ｔ細胞は、破骨細胞の不在下で急速に増殖し、破骨細胞は、Ｔ細胞増殖を適度に刺激する（図３Ｇ及び図３Ｈ）。マウスの組織微小環境から受けたシグナルが、Ｔ及びＢ細胞増殖を維持するのに十分である一方、ＮＫ細胞増殖は、骨髄サブセットからのシグナルを必要とする可能性が高い。興味深いことに、ＮＫ及び骨髄サブセットの両方の頻度は、末梢血及び組織中で減少する一方、骨髄細胞が豊富な骨髄では、Ｔ及びＮＫ細胞のレベルは同様のままである。ＤＣが末梢血中でのＴ細胞の増殖に好都合であり、破骨細胞が骨髄中でのＮＫ細胞の増殖に好都合であるかどうかは、さらなる研究を必要とする。両方のモデルにおいて、ＮＫ細胞の低いパーセンテージ並びに機能低下は、がん進行に潜在的に寄与することが分かっているため、ヒト化マウスは、最良であり、かつ、ヒトがんモデルに最も近いもモデルである。
【０１３９】
最も刺激的な発見は、ＯＣの存在下で培養した場合に、ＮＫ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させる能力である。ＮＫ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖における重要なエフェクターであることで、ＭＨＣクラスＩをより多く発現する腫瘍細胞の標的化及び溶解を増加させることができることを、このデータは示唆している。ＮＫ細胞が、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を増加させることで、抗原特異的な方法で腫瘍細胞の溶解を増加させるかどうかは、さらなる研究を必要とする。がん患者及びヒト化マウスの末梢血／組織中のＴ細胞の急速な増殖及びＮＫ細胞数の減少は、腫瘍細胞量を最小にするために、がん幹細胞／未分化腫瘍を含むＭＨＣクラスＩ低標的をＮＫ細胞によって標的化するには有害であり得る。さらに、ＮＫ細胞は、がん幹細胞の最適な分化及びＭＨＣクラスＩの高発現を促進し、ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的化するために、多量のＩＦＮ−γも提供する。従って、がん患者におけるＮＫ細胞数及び機能の回復は、効果的な腫瘍制御を確立するために重要であろう。
【０１４０】
実施例３：破骨細胞により活性化したスーパーチャージドＮＫ細胞は、スーパーチャージドＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的かつ急速に増殖させる：がん患者及びＢＬＴヒト化マウスにおける、ＯＣにより増殖したＮＫ細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞増殖の動力学の増加。
さらなる研究を実施例２の試験のために実施し、結果を以下にまとめる。
【０１４１】
ＯＣにより増殖したＮＫ細胞から精製されたＴ細胞の残存集団は、細胞傷害性を媒介しないが、ＩＦＮ−γを分泌する。
ＯＣにより増殖したＮＫ細胞からのＴ細胞汚染の大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であった（補足図Ｓ２Ａ）。９日目のＯＣにより増殖したＮＫ細胞からのＴ細胞汚染を選別して、精製したＴ細胞及びＮＫ細胞を得た。その後、ＣＤ１６及びＣＤ３／５６抗体を用いて、ＮＫ細胞の純度を試験した（補足図Ｓ２Ｂ）。次いで、ＮＫ細胞及びＴ細胞をＩＬ−２で１８〜２０時間処理した後、ＯＳＣＳＣ及びＫ５６２に対する５１Ｃｒ放出アッセイで使用した。ＯＣにより増殖したＮＫ細胞から単離されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＯＳＣＳＣ（補足図Ｓ２Ｃ）又はＫ５６２（補足図Ｓ２Ｄ）を溶解できなかった。ＮＫ細胞からの上清は、Ｔ細胞と比較して、有意に高いレベルのＩＦＮ−γを分泌した（補足図Ｓ２Ｅ）。
【０１４２】
患者からのＮＫ細胞による細胞傷害性の低下及びＩＦＮ−γの低分泌は、Ｔ細胞増殖の増加と一致する。
ＯＣと培養した場合、がん患者からの精製ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を維持することができず、実際に、１２日目までに、増殖細胞の半分以上が、Ｔ細胞であった。さらに、３１日目までに、１０％のＮＫ細胞しか培養物中に残らなかった（図３Ａ及び補足図Ｓ４Ａ）。さらに、増殖したＮＫ及びＴ細胞の総数は、がん患者において、増殖の３１〜３６日以内に判断し、健康な対照と比較して、がん患者からの増殖細胞が少なく（図３Ｄ及び補足図Ｓ４Ｃ）、Ｔ細胞の増殖レベルは、ＮＫ細胞よりも有意に高かった（図３Ｅ〜図３Ｆ及び補足図Ｓ４Ｄ〜Ｅ）。これに対し、健康なドナーから単離されたＮＫ細胞は、ＮＫ細胞の増殖を維持し、ＮＫの増殖レベルは、Ｔ細胞よりも有意に高かった（図３Ｂ、図３Ｅ、図３Ｆ及び補足図Ｓ４Ｂ、Ｓ４Ｄ、Ｓ４Ｅ）。ＮＫ細胞の増殖は、培養の様々な日数で、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、患者のＮＫ細胞で全く又はほんの僅かしか観察されなかった（図３Ｅ及びＳ４Ｄ）。健康なドナー又は患者のいずれかからの増殖細胞において著しい細胞死を観察することはできなかったが、細胞死の速度は、健康なドナーよりも患者からの細胞で僅かに高かった（図３Ｃ）。
【０１４３】
ＯＣと培養した患者のＮＫ細胞は、ＯＣと培養した健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＯＳＣＳＣを溶解した（図３Ｇ及び補足図Ｓ４Ｆ）。ＮＫ細胞の数に基づいて正規化した場合、患者によるＮＫ細胞ごとに誘導された細胞傷害性は、健康な対照からのＮＫ細胞と比べた場合に低かった（図３Ｈ及び補足図Ｓ４Ｇ）。ＯＣにより増殖した患者のＮＫ細胞は、ＯＣにより増殖した健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＩＦＮ−γを分泌した（図３１及び補足図Ｓ４Ｈ）。ＯＣにより増殖した口腔癌患者のＮＫ細胞は、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、有意に少ないＩＬ−１０（図３Ｊ）を分泌した一方、膵臓癌患者からのものは、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、より高いＩＬ−１０（補足図Ｓ４Ｉ）を分泌した。健康又はがん患者のＮＫ細胞によるＩＬ−６分泌レベルについて有意差を観察することはできなかった（図３Ｋ及び補足図Ｓ４Ｊ）。ＮＫＧ２Ｄ表面発現レベルは、破骨細胞により増殖した患者のＮＫ細胞と比較して、健康なＮＫ細胞と同様であった（図３Ｌ）。ＣＤ９４発現の強度は、健康な対照と比較して、患者のＮＫ細胞の表面上でより高い（図３Ｌ）。ＫＩＲ２、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４及びＮＫｐ４６発現は、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、ＯＣにより増殖した患者のＮＫ細胞の表面上で低かった（図３Ｌ）一方、ＫＩＲ３発現は、健康なＮＫ細胞と比べた場合に、ＯＣにより増殖した患者のＮＫ細胞の表面上で同じか又は低いのいずれかであった（図３Ｌ）。
【０１４４】
破骨細胞により活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞数を実質的に増加させる。
がん患者は、健康な対照と比べた場合に、平均して高い割合のＣＤ８＋Ｔ細胞、及び低い割合のＣＤ４＋Ｔ細胞を有する（図７Ａ）。破骨細胞と培養した場合、ＮＫ細胞の不在下のＴ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖できなかったが、しかしながら、検出不能な又は非常にごく少量の汚染Ｔ細胞を含んだＯＣで活性化した精製ＮＫ細胞は、患者のＮＫ細胞培養物が健康なＮＫ細胞よりも速くＴ細胞を増殖させたにも関わらず、健康及び患者の培養物の両方からＣＤ８＋Ｔ細胞を増殖させた（図７Ｂ）。患者から単離されたＴ細胞は、健康な対照から単離されたＴ細胞と比べた場合に、高レベルのＣＤ４５ＲＯ、及び低レベルのＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７を有した（図７Ｃ）。
【０１４５】
ＯＣにより活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させた一方、ＤＣにより活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させた。
ＯＣ対ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＴ細胞の亜集団間に差があるかどうか判断するため、健康なドナーにおけるＣＤ４及びＣＤ８亜集団を解析した。ＯＣにより活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を優先的に増殖させた一方、ＯＣにより活性化したＮＫ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させた（図７Ｄ〜７Ｉ）。ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＣＤ８＋Ｔ細胞は、高ＣＤ４５ＲＯ及びＣＤ４４、非常に低レベルのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７及びＣＤ１２７、及び中レベルのＣＤ２８を示した一方、ＯＣにより活性化したＮＫ細胞により増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞は、低レベルのＣＤ４５ＲＯ、中レベルのＣＤ４４、及び高レベルのＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７を示し、ＣＤ１２７の変化はほとんどなく、ＣＤ２８は低レベルであった（図７Ｊ）。ＮＫ細胞の不在下でＯＣ又はＤＣのいずれかにより活性化したＴ細胞は、ＯＣにより活性化したＮＫにより得られたものと似ていたＣＤ２８発現を除いて、ＤＣにより活性化したＮＫにより得られたものと同様の表面プロファイルを示した（図７Ｊ）。ＣＤ３＋Ｔ細胞内のＣＤ４及びＣＤ８の割合は、ＰＢＭＣと、ＮＫ細胞の不在下でＯＣ又はＤＣのいずれかにより活性化したものとの間で同様であり、ＮＫ細胞の存在下又は不在下でＯＣ又はＤＣのいずれかにより活性化したＴ細胞上で有意なレベルのＰＤ−１、Ｔｉｍ３又はＫＬＲＧ−１を観察することはできなかった（図７Ｋ〜図７Ｍ）。
【０１４６】
実施例４：実施例５に対する材料及び方法
細胞株、試薬、及び抗体
１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＣＡ）を使用して、免疫細胞を培養した。ＯＳＣＳＣ及びＯＳＣＣを解離し、ＵＣＬＡで患者の舌腫瘍から増殖させて、１０％のＦＢＳを補充したＲＰＭＩ  １６４０で培養した。組み換えＩＬ−２は、ＮＩＨ−ＢＲＢから得た。この試験で使用したフローサイトメトリー抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから得た（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。モノクローナル抗ＴＮＦ−α及びモノクローナル抗ＩＦＮ−ｇ抗体は、商業的供給源から得たか又は我々の研究所で調製され、１：１００の希釈が、上述のように実験を遮断するために使用する最適濃度であることが分かった。
【０１４７】
ヒトＮＫ細胞及び単球の精製
ＵＣＬＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により承認された書面による同意書が得られ、全ての手順は、ＵＣＬＡ−ＩＲＢにより承認された。健康なヒトドナー３８０人からのＰＢＭＣを単離し、ＮＫ細胞及び単球は、前述したように、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得られた単離キットを用いて精製された。ＮＫ細胞及び単球集団の純度は、フローサイトメトリー解析に基づいて、それぞれ、９５％又はそれ以上であることが分かった。
【０１４８】
プロバイオティクス細菌
ＡＪ２は、幹細胞の分化を誘導するために使用されるグラム陽性プロバイオティクス細菌の８種の異なる株（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  １０  ｉｎｆａｎｔｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ、及びＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）の組み合わせであり、ＮＫ細胞中の炎症誘発性及び抗炎症性サイトカインの両方の最適分泌を誘導する優れた能力に対して選択される。さらに、各株を増殖させ、温度及び酸度などの環境圧力に耐える能力に基づいて、３ラウンド目のサブクローニング後に、特異的なコロニーを選択した。
【０１４９】
破骨細胞の生成及びスーパーチャージドヒト及びｈｕ−ＢＬＴ由来ＮＫ細胞の増殖
精製した単球を、Ｍ−ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＲＡＮＫＬ（２５ｎｇ／ｍＬ）を含有するアルファ−ＭＥＭ培地４００中で２１日間又は特に指定せずに培養した。培地を、Ｍ−ＣＳＦ及びＲＡＮＫＬを含有する新鮮なアルファ−ＭＥＭで、３日ごとに新鮮にした。ヒト精製及びｈｕ−ＢＬＴ強化されたＮＫ細胞を、ｒｈ−ＩＬ−２（１０００Ｕ／ｍｌ）及び抗ＣＤ１６ｍＡｂ（３ｕｇ／ｍｌ）で１８〜２０時間活性化した後、破骨細胞と共培養し、ＡＪ２を超音波処理した。上述のように、培養培地を３日ごとにｒｈ−ＩＬ−２で新鮮にした。破骨細胞及びｓＡＪ２によりエクスビボ増殖したＮＫ細胞は、他の増殖方法論と比べた場合に、優れた細胞傷害性及びＩＦＮ−ｇ分泌を有し、長期間生存したため、スーパーチャージドＮＫ細胞と呼ばれた。超音波処理の場合、ＡＪ２を計量し、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で再懸濁した。細菌を徹底的にボルテックス撹拌した後、６〜８の振幅で１５秒間、氷上で超音波処理した。その後、超音波処理した試料を、氷上で３０秒間インキュベートした。５パルスごとに１回、試料を採取し、細胞壁少なくとも８０％が溶解するまで、顕微鏡下で観察した。氷上でおよそ２０ラウンドの超音波処理／インキュベーションを実施して、完全な超音波処理を達成したと判断した。最後に、超音波処理した試料（ｓＡＪ２）をアリコートにし、−８０℃の冷凍庫で使用するまで保存した。
【０１５０】
免疫不全及びヒト化マウス中のヒト口腔癌細胞増殖の解析
動物研究は、ＵＣＬＡ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＲＣ）（２０１２−１０１−１３Ａ）の書面による承認の下で実施された。ヒト化ＢＬＴ（ｈｕ−ＢＬＴ；ヒト骨髄／肝臓／胸腺）マウスは、前述のように、我々のコア施設で調製した。
【０１５１】
口腔腫瘍のインビボ増殖は、８〜１０週齢のＮＳＧマウス又はｈｕ−ＢＬＴマウスの口腔底に腫瘍細胞を同所的に移植することで行った。イソフルランを用いてマウスを麻酔した後、腫瘍細胞を、口腔底に直接注入することで、１０ｐｌのＨＣマトリゲルと共に移した（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ，ＵＳＡ）。手術の７〜１０日後に、マウスは、尾静脈を介して１．５×１０６個のスーパーチャージドＮＫ細胞を受け取った。マウスにＡＪ２（５百万個の細菌／用量）を給餌し、腫瘍移植の１又は２週間前に給餌を開始し、実験を通して、４８時間ごとに給餌した。病的状態の兆候が明らかになると、マウスを安楽死させた。口腔腫瘍、ＢＭ、脾臓、及び末梢血を収穫した。
【０１５２】
ｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスの組織から細胞の解離及び培養
その後の解析用にマウス組織の単細胞懸濁液を調製するため、動物を犠牲にし、ＢＭ、脾臓、末梢血、及び口腔腫瘍を得た。口腔腫瘍を直ちに１ｍｍ３に切り刻み、ＤＭＥＭ中で１ｍｇ／ｍｌの（脂肪組織の）コラゲナーゼＩＩ、１０Ｕ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉ、及び１％のウシ血清アルブミンを含有する消化用緩衝液中に置き、１５０ｒｐｍ撹拌機を備えたオーブンで３７℃にて２０分間インキュベートした。消化後、４０ｐｍのセルストレーナーを通じて試料を濾過し、１５００ｒｐｍで４℃にて１０分間遠心分離した。ペレットをＤＭＥＭ中で再懸濁し、細胞を計数した。ＢＭ及び脾臓からの単細胞懸濁液は、上述のように、組織を消化することで得た。ＰＢＭＣは、ヘパリン化血液検体のフィコール・ハイパック遠心分離を用いて得た。ＰＢＭＣを含有するバフィーコートを収穫し、洗浄し、ＲＰＭＩ  １６４０培地中で再懸濁した。
【０１５３】
ｈｕ−ＢＬＴマウスからのＮＫ細胞、ＣＤ３Ｔ細胞、及び単球の精製
Ｔ細胞選択キット（Ｓｔｅｍ−Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＤ３Ｃ  Ｔ細胞をｈｕ−ＢＬＴ脾細胞から単離し、Ｔ細胞が枯渇した細胞をＮＫ強化細胞として使用し；ｈｕ−ＢＬＴマウスからのＮＫ細胞は、ヒトＣＤ５６ｃ陽性選択キット（Ｓｔｅｍ−Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて単離した。ｈｕ−ＢＬＴマウスからの単球は、ヒトＣＤ１４陽性選択キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、ＢＭ細胞から単離した。
【０１５４】
ＥＬＩＳＡ
単一ＥＬＩＳＡは、上述のように行った。サイトカイン及びケモカイン濃度を解析して得るため、製造者によって提供された組み換えサイトカインの２倍又は３倍希釈のいずれかによって標準曲線を生成した。
【０１５５】
表面染色及び細胞死アッセイ
上述のように、細胞を抗体又はヨウ化プロピジウムで標識することで染色を行った。１％のＢＳＡを含有する氷冷ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。所定の最適濃度の特異的ヒトモノクローナル抗体を、５０ｐｌの冷却ＢＳＡ中の１×１０４個の細胞に添加し、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞を冷却ＰＢＳ−ＢＳＡ中で洗浄し、ＰＢＳ−ＢＳＡと共に５００ｐｌにした。細胞死アッセイの場合、５０ｐｌの冷却ＢＳＡ中の１×１０４個の細胞を８ｐｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色し、細胞を氷上で１０分間インキュベートし、ＰＢＳ−ＢＳＡと共に５００ｐｌにした。Ｂｅｃｋｍａｎ  ４８５  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬサイトメーター（Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いてフローサイトメトリー解析を行い、ＦｌｏｗＪｏ  ｖＸソフトウェア（Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で結果を解析した。
【０１５６】
５１Ｃｒ放出細胞傷害性アッセイ
５１Ｃｒ放出アッセイは、上述のように行った。簡単に言えば、異なる数のエフェクター細胞を５１Ｃｒ標識標的細胞でインキュベートした。４時間のインキュベーション期間後、上清を各試料から収穫し、γ計数器を用いて、放出放射能を計数した。特異的細胞傷害性のパーセンテージを以下のように算出した：
％細胞障害性Ｄ実験ｃｐｍ−自発ｃｐｍ総ｃｐｍ−自発ｃｐｍ
ＬＵ３０／１０６は、３０％の腫瘍標的細胞を溶解するのに必要なエフェクター細胞の数の逆数を用いて算出する。
【０１５７】
ＮＫ細胞上清による幹細胞分化
ＮＫ細胞を、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体（３ｐｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２（１，０００Ｕ／ｍＬ）の組み合わせで１８時間処理した後、上清を除去し、分化実験に使用した。活性化ＮＫ細胞により産生したＩＦＮ−γの量は、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定した。ＮＫ細胞上清の量を増加させて徐々に日々添加することで、ＯＳＣＳＣを分化した。平均して、分化を誘導するため、上清を含有するＩＦＮ−γの合計３，５００ｐｇを４日間添加し、ＯＳＣＳＣの分化及びＮＫ細胞媒介細胞傷害性に対する抵抗性を誘導した。その後、標的細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、取り外し、前述のように実験に使用した。
【０１５８】
統計解析
対応のない両側スチューデントｔ検定を行って、統計解析した。ボンフェローニ事後検定による一元配置分散分析法を使用して、異なる群を比較し、（ｎ）は、実験に使用したマウスの数を示す。細胞傷害性及びサイトカイン解析の場合、二重又は三重試料のいずれかを評価に使用した。以下の記号は、各解析内で統計有意性のレベルを表し、＊＊＊（ｐ値＜０．００１）、＊＊（ｐ値０．００１〜０．０１）、＊（ｐ値０．０１〜０．０５）。
【０１５９】
実施例５：スーパーチャージドＮＫ細胞は、ヒト化ＢＬＴマウスにおける幹様／低分化口腔腫瘍のインビボ成長及び進行を阻害する。
スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入は、ＯＳＣＳＣ腫瘍増殖を阻害し、マウスの健康を著しく改善した。
Ｈｕ−ＢＬＴマウスを生成し、ヒトＯＳＣＳＣをＮＳＧ及びｈｕ−ＢＬＴマウスの口腔底に移植し（図６２Ａ及び図６２Ｂ）、体重減を週１回の頻度でモニターした（図６２Ｃ）。スーパーチャージドＮＫ細胞の単回注入は、ＯＳＣＳＣを移植したマウスの少しの体重減をもたらした（図６２Ｃ）。ＯＳＣＳＣを移植し、ＮＫ細胞を注入したマウスは、病的状態を示さず、食物を摂取することができた一方、ＮＫ注入の不在下で口腔腫瘍を有するマウスは、病的になり、腫瘍の増殖により食物摂取の合併症を有し（データ不図示）、急速な体重減を示した（図６２Ｃ）。興味深いことに、ＮＫ注入をしない担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスは、担癌ＮＳＧマウスと比べた場合に、体重減が少なく、再構成されたヒト免疫細胞が腫瘍増殖を僅かに制限することができるが、効率的ではないことを示した（図６２Ｃ）。ｈｕ−ＢＬＴマウスにおけるＮＫ注入の治療効果は、腫瘍切除後に腫瘍サイズを比較した場合にも見られた。ＮＫを注入しない担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスからの腫瘍は、ＮＫを注入した担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスのものよりもはるかに大きい（図６２Ｄ及び６２Ｅ）。腫瘍重量は、ＮＫ処置を受けなかった担癌マウスで形成された大きな腫瘍（図６２Ｄ〜図６２Ｆ）と比較して、ＮＫ又はＮＫ注入／ＡＪ２給餌マウス（図６２Ｆ）において実質的に小さいままであった。さらに、体重減データに一致して、ＮＫを注入しない担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスは、担癌ＮＳＧマウスと比べた場合に、僅かに小さな腫瘍を有し、再構成されたヒト免疫細胞が腫瘍増殖を制限することができるが、効率的ではないことを示した（データ不図示）。
【０１６０】
Ｈｕ−ＢＬＴマウスは、汚染マウスＣＤ４５Ｃ免疫細胞について考えると、ＢＭ、脾臓、及び１００末梢血中のｈＣＤ４５Ｃ免疫細胞との９６％〜９９％を超える再構成を示した。ｈｕ−ＢＬＴマウスの末梢血中のＣＤ３ｃＴ細胞（図１６Ｇ）、ＣＤ３ＣＣＤ４ＣＴ細胞（図１６Ｈ）、及びＣＤ３ＣＣＤ８ＣＴ細胞（図６２Ｉ）のプロファイルは、ヒト末梢血のものと似ていたが；しかしながら、ヒトと比べて、ｈｕ−ＢＬＴマウスにおいて、Ｂ細胞のパーセンテージは、僅かに高い（図６２Ｊ）一方、ＮＫ細胞のパーセンテージは、低かった（図６２Ｋ）。
【０１６１】
全ての組織コンパートメント内の担癌マウスにおけるＮＫ細胞傷害性及びＩＦＮ−γ分泌の喪失、並びにＮＫ注入及び／又は給餌ＡＪ２及び抗ＰＤ１注入による回復
担癌マウスは、脾細胞（図６３Ａ）、ＢＭ由来の免疫細胞（図６３Ｂ）、ＰＢＭＣ（図６３Ｃ）、及びＣＤ３＋枯渇脾細胞（図６３Ｄ）において、低いＮＫ媒介細胞傷害性を示す。ＮＫを注入した担癌マウスは、単体及びＡＪ２の給餌との組み合わせの両方で、全ての組織コンパートメントにおいてＮＫ細胞傷害性の上昇を示し、最も大きな増加は、マウスにＡＪ２を給餌し、ＮＫ細胞及び抗ＰＤ１抗体を注入した場合に観察された（図６３Ａ〜図６４Ｄ）。ＣＤ３＋陽性選択キットによってＴ細胞を脾細胞から枯渇させた場合、同様のＮＫ細胞傷害性プロファイルが、図６３Ａで観察されたように、ＣＤ３＋枯渇脾細胞で見ることができた（図６３Ｄ）。１２５匹の担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスの脾細胞（図６３Ｅ及び表２）、ＢＭ由来の免疫細胞（図６３Ｆ）、ＰＢＭＣ（図６３Ｇ）、及び脾細胞からのＣＤ３＋Ｔ細胞（図６３Ｈ）は、低いＩＦＮ−γを分泌した。ＮＫ細胞及びＡＪ２と組み合わせた抗ＰＤ１抗体の注入は、ＮＫ及びＡＪ２群と比べた場合に、全ての組織コンパートメントにおいて、ＩＦＮ−γ分泌に対する効果がないか又はその効果の低下のいずれかを有した（図６３Ｅ〜図６３Ｇ）。ＮＫを注入した担癌マウスは、全ての組織コンパートメント内でＩＦＮ−γ分泌の上昇を示し、最も大きな増加は、マウスにＡＪ２を給餌した場合に観察された（図６３Ｅ〜図６３Ｈ）。ＣＤ３＋陽性選択キットによってＴ細胞を脾細胞から枯渇させた場合、ＮＫ注入を受けた担癌マウスが、ＮＫ注入の不在下の担癌マウス、又はＮＫを注入した非担癌対照マウスと比較して、ＩＦＮ−γ分泌の最も大きな増加を有した（図６３Ｉ）。
【０１６２】
【表２】
2020507343.tif 000004
【０１６３】
ｈｕ−ＢＬＴマウスにＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌した場合、種々の組織コンパートメントにおいてＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加した。
ＣＤ３＋又はＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の増加は、ＮＫ細胞を単体で又はＡＪ２給餌と組み合わせて注入したマウスのＢＭ（図６４Ａ）、脾臓（図６４Ｂ）及び血液（データ不図示）中で見られた（表３及び表４）。犠牲の時点のＴ細胞のパーセンテージを考えた場合、ＰＢＭＣ、脾臓、及びＢＭは、高いパーセンテージのＣＤ３＋Ｔ細胞を示し、ＢＭは、ＮＫ細胞を単体で又はＡＪ２給餌と組み合わせて注入した担癌マウスにおいて、ＨＬＡＤＲ＋ＣＤ１１Ｂ＋免疫サブセットの上昇を示した（表３）。ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、ＢＭ及び脾細胞を培養した場合、ＮＫ細胞を単体で又はＡＪ２給餌と組み合わせて注入した担癌マウスで増加した（表３）。同様に、ＮＫ及び／又は給餌ＡＪ２を注入した担癌マウスから解離した腫瘍は、犠牲の時点のＣＤ３＋Ｔ細胞レベルの上昇を示した（表４）。
【０１６４】
【表３】
2020507343.tif 000005
【０１６５】
【表４】
2020507343.tif 000006
【０１６６】
ＮＫ注入及び／又はＡＪ２給餌は、幹様口腔腫瘍の増殖及び進行を阻害し、ｈｕ−ＢＬＴマウスにおいて、インビボでＣＳＣを分化する。
ＮＫを注入しないＮＳＧ（図６５Ａ）及びｈｕ−ＢＬＴマウスからの腫瘍細胞は、急速に増殖した一方、ＮＫ細胞を有するものは、増殖しないか又は非常にゆっくり増殖した（図６５Ａ〜図６５Ｃ）。同様に、ＮＫ上清により分化した腫瘍を移植したｈｕ−ＢＬＴマウスからの腫瘍は、増殖せず（図６５Ｃ）、移植前に抗ＩＦＮ−γ及び抗ＴＮＦ−α抗体を組み合わせて腫瘍分化を遮断することにより、インビボでの腫瘍増殖を回復させた（図６５Ｂ及び図６５Ｃ）。腫瘍増殖は、ＮＫ単体を注入したマウスと比較して、ＡＪ２を給餌したＮＫ注入マウスでより少なく（図６５Ｃ）、両方とも、口腔腫瘍移植のみを受けたものよりも実質的に少なかった（図６５Ｃ）。９〜１１倍以上のｈＣＤ４５Ｃ免疫細胞が、腫瘍のみのマウスと比べた場合に、ＮＫ細胞を注入した担癌マウスの腫瘍に浸潤した（図６５Ｄ）。腫瘍中で表面ＥｐＣＡＭを発現する上皮細胞のパーセンテージは、ＮＫを注入した担癌マウスと比べた場合に、ＮＫを注入しない担癌マウスからおよそ５倍以上であった。
【０１６７】
有意に多いＩＦＮ−ｇ分泌が、担癌ｈｕ−ＢＬＴ又はＮＳＧマウスからのものと比べた場合に、様々な培養日数で、ＮＫ細胞を注入した担癌マウスの腫瘍から得られた（図６５Ｅ）。ＣＤ５４及びＭＨＣ−Ｉの発現は、腫瘍のみを受けたｈｕ−ＢＬＴ及びＮＳＧマウスと比べた場合に、ＮＫを注入した担癌マウスから得られた腫瘍上でより高かった（図６５Ｆ）。ＡＪ２の給餌の不在下及び存在下でＮＫを注入した担癌マウスからの腫瘍は、ＮＫを注入しない担癌マウスからの腫瘍と比べた場合に、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性に強い抵抗性を示し、それらの分化した表現型が実証された（図６５Ｇ及び図６５Ｈ）。腫瘍細胞のＮＫ媒介分化が、移植前に抗ＩＦＮ−γ及び抗ＴＮＦ−α抗体で遮断された場合、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性に対する腫瘍の感受性は回復した（図６５Ｈ）。ＮＫ細胞を注入したｈｕ−ＢＬＴマウスからの口腔腫瘍は、担癌マウスからのＶＥＧＦの分泌に基づいて標準化した場合、比較的少ないＶＥＧＦを分泌した（図６５Ｉ）。ＮＫを注入したｈｕ−ＢＬＴマウスからの腫瘍は、高レベルのｈＣＤ４５Ｃ浸潤リンパ球を有し、最も高い増加は、ＮＫ細胞を注入し、ＡＪ２を給餌したもので見られた（図６５Ｊ）。浸潤ＣＤ４５Ｃ免疫細胞の大部分は、ＣＤ３＋Ｔ細胞であり、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットは、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも適度に高い割合を有し、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋ＣＤ１６ＣＮＫＴサブセットを実証した。腫瘍をＩＬ−２で処理した場合、腫瘍との相互作用中にダウンレギュレートされた、高強度のＣＤ４、ＣＤ８、及びＣＤ１６／ＣＤ５６表面発現が回復した。
【０１６８】
ＮＫを注入した担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスの末梢血からの血清は、ＮＫ細胞がない担癌ｈｕ−ＢＬＴマウスからのものと比べた場合に、ＩＦＮ−γ分泌、並びに他のサイトカイン／ケモカイン／成長因子及びリガンドの増加を示し、特に、ＩＦＮ−γ分泌は、マウスにＡＪ２を給餌することでさらに増強された（図６６Ａ及び図６６Ｃ）。
【０１６９】
ＣＤＤＰ又はパクリタキセルは、ＮＡＣの有無に依らず、ＩＬ−２＋抗ＣＤ１６ｍＡｂで処理したＮＫ上清で分化したＯＳＣＳＣ中で有意な細胞死を誘導する。
ＮＫ上清によるＯＳＣＳＣの分化は、ＣＤＤＰに対する腫瘍の有意な感受性をもたらした（図６７Ａ）。同様に、パクリタキセルは、ＮＫ上清により分化したＯＳＣＳＣのより高い細胞死を媒介し、ＮＡＣは、パクリタキセル媒介の細胞死を有意に増加させた（図６７Ｂ）。抗ＩＦＮ−γ及び抗ＴＮＦ−α抗体によるＯＳＣＳＣのＮＫ媒介分化の遮断は、ＮＡＣの有無に依らず、ＣＤＤＰ又はパクリタキセルにより誘導された細胞死を実質的に減少させた（図６７Ｂ）。ＣＤＤＰ又はパクリタキセル及びＮＡＣによるＯＳＣＣ（患者由来の分化口腔腫瘍）の処置は、より高い細胞死を示した。
【０１７０】
ＮＫを注入した担癌マウスからの単球及び破骨細胞は、ＮＫ注入の不在下で、担癌マウスからのものと比べた場合に、ＮＫ細胞を活性化するより大きな能力を有した。
自己単球と培養した場合のＮＫを注入した担癌マウス及びＮＫ上清により分化した担癌マウスからのＮＫ細胞は、ＮＫ細胞注入の不在下で、未分化腫瘍を移植したものと比べた場合に、細胞傷害性（図６８Ａ）及びＩＦＮ−γ分泌（図６８Ｂ）を有意に増加させた。移植前のＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γに対する抗体の添加を通じた腫瘍のＮＫ媒介分化の遮断は、ＮＫ細胞の細胞傷害性（図６８Ａ）及びＩＦＮ−γ分泌（図６８Ｂ）を減少させた。その後、ｈｕ−ＢＬＴマウスのＢＭ由来単球からＯＣを生成し、健康なヒトドナーからの同種異系ＮＫ細胞と培養し、ＮＫ細胞増殖の程度を試験した。ＮＫ細胞増殖（図６８Ｃ）及びＩＦＮ−ｇ分泌（図６８Ｄ及び図６８Ｅ）は、ＮＫを注入しない担癌マウスから得られたものと比べた場合に、ＮＫを注入した担癌マウス又はＮＫ上清により分化した担癌マウスで増加した（図６８Ｃ〜図６８Ｅ）。従って、ＮＫを注入した担癌マウスからの単球及び破骨細胞は、ＮＫ注入の不在下で、担癌マウスからのものよりも大きなＮＫ細胞を活性化する能力を有した。
【０１７１】
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２５．Ｇａｒｇ  ＴＫ，Ｓｚｍａｎｉａ  ＳＭ，Ｋｈａｎ  ＪＡ，Ｈｏｅｒｉｎｇ  Ａ，Ｍａｌｂｒｏｕｇｈ  ＰＡ，Ｍｏｒｅｎｏ−Ｂｏｓｔ  Ａ，Ｇｒｅｅｎｗａｙ  ＡＤ，Ｌｉｎｇｏ  ＪＤ，Ｌｉ  Ｘ，Ｙａｃｃｏｂｙ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ：Ｈｉｇｈｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｄ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１２，９７（９）：１３４８−１３５６．
２６．Ｉｍａｉ  Ｃ，Ｉｗａｍｏｔｏ  Ｓ，Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０６（１）：３７６−３８３．
２７．Ｌａｐｔｅｖａ  Ｎ，Ｄｕｒｅｔｔ  ＡＧ，Ｓｕｎ  Ｊ，Ｒｏｌｌｉｎｓ  ＬＡ，Ｈｕｙｅ  ＬＬ，Ｆａｎｇ  Ｊ，Ｄａｎｄｅｋａｒ  Ｖ，Ｍｅｉ  Ｚ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｋ，Ｖｅｒａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ：Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１２，１４（９）：１１３１−１１４３．
２８．Ｋｏｅｐｓｅｌｌ  ＳＡ，Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ，ＭｃＫｅｎｎａ  ＤＨ，Ｊｒ．：Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ：ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ２０１３，５３（２）：４０４−４１０．
２９．Ｍｉｌｌｅｒ  ＪＳ，Ｓｏｉｇｎｉｅｒ  Ｙ，Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ  Ａ，ＭｃＮｅａｒｎｅｙ  ＳＡ，Ｙｕｎ  ＧＨ，Ｆａｕｔｓｃｈ  ＳＫ，ＭｃＫｅｎｎａ  Ｄ，Ｌｅ  Ｃ，Ｄｅｆｏｒ  ＴＥ，Ｂｕｒｎｓ  ＬＪ  ｅｔ  ａｌ：Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｌｏｏｄ  ２００５，１０５（８）：３０５１−３０５７．
３０．Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｕ  ＥＧ，Ｋｏｕｎｔｏｕｒａｋｉｓ  Ｐ，Ｋａｒａｍｏｕｚｉｓ  ＭＶ，Ｄｏｕｆｅｘｉｓ  Ｄ，Ａｒｄａｖａｎｉｓ  Ａ，Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ＣＮ，Ｒｉｇａｔｏｓ  Ｇ，Ｐａｐａｍｉｃｈａｉｌ  Ｍ，Ｐｅｒｅｚ  ＳＡ：Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ２０１０，５９（１２）：１７８１−１７８９．
３１．Ｓｏｔｉｒｏｐｏｕｌｏｕ  ＰＡ，Ｐｅｒｅｚ  ＳＡ，Ｇｒｉｔｚａｐｉｓ  ＡＤ，Ｂａｘｅｖａｎｉｓ  ＣＮ，Ｐａｐａｍｉｃｈａｉｌ  Ｍ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ２００６，２４（１）：７４−８５．
３２．Ｇｅｌｌｅｒ  ＭＡ，Ｃｏｏｌｅｙ  Ｓ，Ｊｕｄｓｏｎ  ＰＬ，Ｇｈｅｂｒｅ  Ｒ，Ｃａｒｓｏｎ  ＬＦ，Ａｒｇｅｎｔａ  ＰＡ，Ｊｏｎｓｏｎ  ＡＬ，Ｐａｎｏｓｋａｌｔｓｉｓ−Ｍｏｒｔａｒｉ  Ａ，Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ  Ｊ，ＭｃＫｅｎｎａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ：Ａ  ｐｈａｓｅ  ＩＩ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｖａｒｉａｎ  ａｎｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２０１１，１３（１）：９８−１０７．
３３．Ｔｓｅｎｇ  ＨＣ，Ａｒａｓｔｅｈ  Ａ，Ｐａｒａｎｊｐｅ  Ａ，Ｔｅｒｕｅｌ  Ａ，Ｙａｎｇ  Ｗ，Ｂｅｈｅｌ  Ａ，Ａｌｖａ  ＪＡ，Ｗａｌｔｅｒ  Ｇ，Ｈｅａｄ  Ｃ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  ＴＯ  ｅｔ  ａｌ：Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅｉｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ；  ｄｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ２０１０，５（７）：ｅ１１５９０．
３４．Ｔｓｅｎｇ  ＨＣ，Ｉｎａｇａｋｉ  Ａ，Ｂｕｉ  ＶＴ，Ｃａｃａｌａｎｏ  Ｎ，Ｋａｓａｈａｒａ  Ｎ，Ｍａｎ  ＹＧ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ  Ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａｓ  ｂｙ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１５，６（９）：８６６−８７６．
３５．Ｂｕｉ  ＶＴ，Ｔｓｅｎｇ  Ｈ−Ｃ，Ｍａｕｎｇ  ＰＯ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ  Ａ，Ｍａｎｎ  Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ  Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ＩＦＮ−γ  ａｎｄ  ＴＮＦ−α  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ；  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＬ−１０．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１５，６．
３６．Ｂｕｉ  ＶＴ，Ｔｓｅｎｇ  ＨＣ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ  Ａ，Ｍａｕｎｇ  ＰＯ，Ｋａｕｒ  Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ  Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ａｕｇｍｅｎｔｅｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ｉｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｔｅｍ−Ｌｉｋｅ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ；  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＩＬ−１０．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１５，６：５７６．
３７．Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ，Ｂｏｎａｖｉｄａ  Ｂ：Ｔａｒｇｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｂｙ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１９９６，１５６（３）：９０７−９１５．
３８．Ｓｈｉｍｉｚｕ  Ｓ，Ｈｏｎｇ  Ｐ，Ａｒｕｍｕｇａｍ  Ｂ，Ｐｏｋｏｍｏ  Ｌ，Ｂｏｙｅｒ  Ｊ，Ｋｏｉｚｕｍｉ  Ｎ，Ｋｉｔｔｉｐｏｎｇｄａｊａ  Ｐ，Ｃｈｅｎ  Ａ，Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｇ，Ｇａｌｉｃ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ：Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ＣＣＲ５  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕ−ＢＬＴ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０，１１５（８）：１５３４−１５４４．
３９．Ｖａｔａｋｉｓ  ＤＮ，Ｋｏｙａ  ＲＣ，Ｎｉｘｏｎ  ＣＣ，Ｗｅｉ  Ｌ，Ｋｉｍ  ＳＧ，Ａｖａｎｃｅｎａ  Ｐ，Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｇ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ  Ｄ，Ｋｏｈｎ  ＤＢ，Ｒｉｂａｓ  Ａ  ｅｔ  ａｌ：Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ２０１１，１０８（５１）：Ｅ１４０８−１４１６．
４０．Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ  ＡＫ，Ｋａｕｒ  Ｋ，Ｔｏｐｃｈｙａｎ  Ｐ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：ＣＩＩ  ２０１６．
４１．Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ，Ｃａｖａｌｃａｎｔｉ  Ｍ，Ｂｏｎａｖｉｄａ  Ｂ：Ｐｉｖｏｔａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）１９９７，１５９（１０）：４８１５−４８２２．
４２．Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ，Ｂｏｎａｖｉｄａ  Ｂ：Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｕｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９５，１５（１）：３５−４４．
４３．Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ，Ｗａｎｇ  ＭＹ，Ｔｅｒｕｅｌ  Ａ，Ｐｏｕｐａｋ  Ｚ，Ｂｏｓｔａｎｉａｎ  Ｚ，Ｐａｒｋ  ＮＨ：Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｖｅｒｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ５４（ＩＣＡＭ１）ａｎｄ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎ  ＨＥｐ２  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ：ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００３，６４（５）：５０５−５２０．
４４．Ｔｓｅｎｇ  ＨＣ，Ｋａｎａｙａｍａ  Ｋ，Ｋａｕｒ  Ｋ，Ｐａｒｋ  ＳＨ，Ｐａｒｋ  Ｓ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋａ  Ａ，Ｓｕｎ  Ｓ，ＭｃＫｅｎｎａ  ＣＥ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｉ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｉｎｇｉｖａ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１５，６（２４）：２０００２−２００２５．
４５．Ｔａｍ  ＹＫ，Ｍａｒｔｉｎｓｏｎ  ＪＡ，Ｄｏｌｉｇｏｓａ  Ｋ，Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ  ＨＧ：Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ−９２  ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅ  ｕｎｄｅｒ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００３，５（３）：２５９−２７２．
４６．Ｍａｇｉｓｔｅｒ  Ｓ，Ｔｓｅｎｇ  ＨＣ，Ｂｕｉ  ＶＴ，Ｋｏｓ  Ｊ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｌｉｔ  ａｎｅｒｇｙ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ  Ｃ  ａｎｄ  Ｈ  ａｎｄ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｆ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１５，６（２６）：２２３１０−２２３２７．
４７．Ｐｅｒｉｓｉｃ  Ｎａｎｕｔ  Ｍ，Ｓａｂｏｔｉｃ  Ｊ，Ｊｅｗｅｔｔ  Ａ，Ｋｏｓ  Ｊ：Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＮＫ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４，５：６１６．
４８．Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｃ，Ｈｕｅｒｇｏ−Ｚａｐｉｃｏ  Ｌ，Ｐａｒｏｄｉ  Ｍ，Ｐｅｄｒａｚｚｉ  Ｍ，Ｍｉｎｇａｒｉ  ＭＣ，Ｍｏｒｅｔｔａ  Ａ：ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｔｕｍｏｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ：Ｎｅｗ  Ｈｉｎｔｓ  ｆｏｒ  ＮＫ−Ｂａｓｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ？  ２０１６，２０１６：４６８４２６８．
４９．Ｔａｌｌｅｒｉｃｏ  Ｒ，Ｇａｒｏｆａｌｏ  Ｃ，Ｃａｒｂｏｎｅ  Ｅ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｅａｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１６，７：１７９．
５０．Ｋａｍｉｙａ  Ｔ，Ｃｈａｎｇ  ＹＨ，Ｃａｍｐａｎａ  Ｄ：Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１６．
【０１７２】
参照文献による援用
本明細書で述べた全ての刊行物、特許、及び特許出願は、あたかも各個々の刊行物、特許又は特許出願が出典明示により特にかつ個々に援用されるべきことが示されるように、出典明示によりその全体がここに援用される。矛盾する場合、本明細書での定義を含む本出願が優先する。
【０１７３】
その全体が出典明示によりまた援用されるものは、例えば、ワールドワイドウェブｔｉｇｒ．ｏｒｇにＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）及び／又はワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）によって維持されているもののような公的データベースにおけるエントリーに相関する受託番号を引用する任意のポリヌクレオチド及びポリペプチド配列である。
【０１７４】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載された発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し又は常套的なものに過ぎない実験を使用して確認できるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるものである。
【図１−１】
2020507343.tif 000007
【図１−２】
2020507343.tif 000008
【図１−３】
2020507343.tif 000009
【図２−１】
2020507343.tif 000010
【図２−２】
2020507343.tif 000011
【図２−３】
2020507343.tif 000012
【図２−４】
2020507343.tif 000013
【図２−５】
2020507343.tif 000014
【図３−１】
2020507343.tif 000015
【図３−２】
2020507343.tif 000016
【図４−１】
2020507343.tif 000017
【図４−２】
2020507343.tif 000018
【図４−３】
2020507343.tif 000019
【図５−１】
2020507343.tif 000020
【図５−２】
2020507343.tif 000021
【図６−１】
2020507343.tif 000022
【図６−２】
2020507343.tif 000023
【図６−３】
2020507343.tif 000024
【図６−４】
2020507343.tif 000025
【図６−５】
2020507343.tif 000026
【図６−６】
2020507343.tif 000027
【図７−１】
2020507343.tif 000028
【図７−２】
2020507343.tif 000029
【図７−３】
2020507343.tif 000030
【図８】
2020507343.tif 000031
【図９−１】
2020507343.tif 000032
【図９−２】
2020507343.tif 000033
【図９−３】
2020507343.tif 000034
【図１０ａ】
2020507343.tif 000035
【図１０ｂ】
2020507343.tif 000036
【図１０ｃ】
2020507343.tif 000037
【図１１】
2020507343.tif 000038
【図１２−１】
2020507343.tif 000039
【図１２−２】
2020507343.tif 000040
【図１３】
2020507343.tif 000041
【図１４−１】
2020507343.tif 000042
【図１４−２】
2020507343.tif 000043
【図１５】
2020507343.tif 000044
【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３−１】
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【図６３−２】
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【図６４】
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【図６５−１】
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【図６５−２】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【国際調査報告】
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