(57)【要約】鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に有用タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫を提供する。  鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に有用タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類又はその子孫又は野生型鳥類と交配することにより得られるＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
ａ）目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、
Ｇ１トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類。
【請求項２】
初期胚が、孵卵開始から２４時間以降のものである請求項１に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項３】
初期胚が、孵卵開始から４８時間以降のものである請求項２に記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項４】
目的タンパク質が、抗体である請求項１〜３のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項５】
鳥類が、ニワトリ又はウズラである請求項１〜４のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＧ１トランスジェニック鳥類を、Ｇ０トランスジェニック鳥類、該Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、Ｇ２トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類。
【請求項７】
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
ａ）目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなるＧ１トランスジェニック鳥類の作製法
【請求項８】
初期胚が、孵卵開始から２４時間以降のものである請求項７に記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項９】
初期胚が、孵卵開始から４８時間以降のものである請求項８に記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１０】
目的タンパク質が、抗体である請求項７〜９のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１１】
鳥類が、ニワトリ又はウズラである請求項７〜１０のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１２】
１×１０７ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項７〜１１のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１３】
１×１０９ｃｆｕ／ｍＬ以上のタイターをもつ複製能欠失型レトロウイルスベクターをインジェクションすることを特徴とする請求項１２記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１４】
請求項１〜５のいずれか１項記載のＧ１トランスジェニック鳥類を、Ｇ０トランスジェニック鳥類、該Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、Ｇ２トランスジェニック鳥類又はその子孫を作製することを特徴とするトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１５】
請求項７〜１４のいずれか１項記載の方法で作製されたトランスジェニック鳥類の体細胞、血液又は卵から目的タンパク質を抽出することよりなるタンパク質の生産法。
【請求項１６】
請求項１〜６のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の精子を採取し、該精子中の遺伝子を検定することよりなる生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
【請求項１７】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがモロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス由来ベクターであることを特徴とする請求項７〜１４のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１８】
複製能欠失型レトロウイルスベクターがＶＳＶ−Ｇシュードタイプであることを特徴とする請求項７〜１４のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項１９】
レトロウイルスに由来しない遺伝子が複製能欠失型レトロウイルスベクターに含有されている請求項７〜１４、１７及び１８のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２０】
レトロウイルスに由来しない遺伝子は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子である請求項１９記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２１】
レトロウイルスに由来しない遺伝子は、抗体をコードする遺伝子である請求項１９又は２０記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２２】
抗体がキメラ抗体である請求項２１記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２３】
キメラ抗体がｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体である請求項２２記載のトランスジェニック鳥類の作製法。
【請求項２４】
請求項７〜１４及び１７〜２３のいずれか１項記載の方法で作製されたトランスジェニック鳥類。
【請求項２５】
目的タンパク質を１ｍｇ／１００ｇ以上含有することを特徴とする、請求項２４記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
【請求項２６】
目的タンパク質を２０ｍｇ／１００ｇ以上含有することを特徴とする、請求項２４記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
【請求項２７】
目的タンパク質を１００ｍｇ／１００ｇ以上含有することを特徴とする、請求項２４記載のトランスジェニック鳥類が産んだ卵。
【請求項２８】
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化することにより得られた雄性Ｇ０トランスジェニック鳥類の、精子中の目的タンパク質をコードする遺伝子を確認することによる生殖系列トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
【請求項２９】
請求項１〜６のいずれか１項記載のトランスジェニック鳥類の血中における、目的タンパク質の発現を確認することによる、トランスジェニック鳥類の選別法。
【請求項３０】
鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化することにより得られたＧ０トランスジェニック鳥類の血中における、目的タンパク質の発現を確認することによる、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の選別法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】本発明は、生理活性タンパクの生産に応用可能な遺伝子導入（トランスジェニック）鳥類の作製法、ならびに該作製法により得られる遺伝子導入（トランスジェニック）鳥類に関する。
【背景技術】
【０００２】遺伝子組換え技術の発展により、数多くの生理活性タンパクが工業生産され、医薬品などの用途に用いられるようになった。しかしこれら組換えタンパクの生産に最もよく用いられる大腸菌等の微生物は、糖鎖を付与する能力がないため、生産されたタンパクは元来持っている糖鎖修飾を受けられず、本来の活性が低下したり安定性が悪くなるとの欠点があった。【０００３】更に、微生物は抗体のような複数のユニットからなる複雑なタンパクを生産することができないため、医薬品として使用されるモノクローナル抗体の生産に利用できないことも大きな難点である。【０００４】このため、現在糖鎖を必要とするエリスロポエチンなどの生理活性タンパクや、抗体医薬品などは、培養細胞リアクターによって生産されているが、このような動物細胞による生産法は微生物に比ベコストが高くつくため、患者や行政の負担増加が問題となっている。【０００５】これらの欠点を克服した新たなタンパク生産法として、遺伝子導入動物（トランスジェニック動物）の利用が注目を浴びている。トランスジェニック動物が乳汁や血液、卵中に生産するタンパクは糖鎖が付与されるうえ、その生産コストは動物培養細胞の１／１０〜１／１００との試算もある（非特許文献１）。なかでも鳥類を使ったトランスジェニックは、成熟までの期間が短い事や、飼育面積が少なくて済むとの利点があるため実用化が嘱望されている。【０００６】このように、多くの利点をもつトランスジェニック鳥類によるタンパク生産技術であるが、その実用化にはいくつかの困難があった。そのひとつは鳥類受精卵へ外部遺伝子を導入する事が難しい点であったが（非特許文献２）、本発明者らは安全性の高い複製能欠失型ウイルスベクターを用い、鳥類初期胚に遺伝子をマイクロインジェクションすることで体の一部に導入遺伝子を持つトランスジェニックキメラ（Ｇ０と呼ぶ）を効率的に作製することに成功した（特許文献１）。【０００７】しかしこのようにして導入された遺伝子は、宿主がもつ生体防御機構により不活性化され（サイレンシングと呼ばれる現象）、タンパクを発現しないか、発現しても微量である。更に医薬品としてタンパクを安定に供給するには、Ｇ０トランスジェニックキメラの子孫として体細胞全体に導入遺伝子をもつ鳥類の系統確立が必要である。これらＧ０トランスジェニックキメラの子孫は、その世代数に準じてＧ１〜Ｇ２〜Ｇ３〜と呼ばれる。
【特許文献１】特開２００２−１７６８８０号公報
【特許文献２】特表２００１−５２０００９号公報
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９，  １８４  ２００１
【非特許文献２】Ｈａｒｖｅｙ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．Ｐｏｕｌｔ．Ｓｃｉ．Ｆｅｂ．２００２，Ｖｏｌ．８１，Ｎｏ．２，ｐ．２０２−２１２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】本発明は、上記現状に鑑み、トランスジェニック鳥類を、安全で効率のよいタンパク生産系として応用するために、体細胞全体に導入遺伝子が入り、導入遺伝子に由来するタンパクを高発現する効率のよいトランスジェニック鳥類作製法を確立することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】本発明のトランスジェニック鳥類は、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
ａ）目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、Ｇ１トランスジェニック鳥類として得られる。【００１０】このＧ１トランスジェニック鳥類を、Ｇ０トランスジェニックキメラ、Ｇ１トランスジェニック鳥類同士、野生型鳥類等と交配することにより、継代的に誕生するＧ２トランスジェニック鳥類及びその子孫を開示する。
つまり、本発明は、また、Ｇ１トランスジェニック鳥類を、Ｇ０トランスジェニック鳥類、該Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより得られる、Ｇ２トランスジェニック鳥類又はその子孫であることを特徴とするトランスジェニック鳥類である。【００１１】インジェクションする初期胚は、鳥類の種類によって決まる特定の時間経過したのち、胚に形成される初期の心臓内にインジェクションすることにより、効果的に発現するトランスジェニック鳥類が得られる。【００１２】トランスジェニック鳥類に導入する目的タンパク質遺伝子としては、エリスロポエチンの構成遺伝子のように、発現したタンパクの活性に糖鎖が必要なものや、抗体遺伝子などが挙げられる。【００１３】遺伝子を導入する鳥類として、ニワトリ又はウズラを使用することにより、多産で安定的に卵の形で目的タンパク質を得る事ができる。【００１４】本発明は、また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、
ａ）目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、
ｂ）孵化によりＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を得、
ｃ）該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類を、該Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することよりなるＧ１トランスジェニック鳥類の作製法である。【００１５】本発明は、また、上記Ｇ１トランスジェニック鳥類を、Ｇ０トランスジェニック鳥類、該Ｇ１トランスジェニック鳥類若しくはその子孫、又は、野生型鳥類と交配することにより、Ｇ２トランスジェニック鳥類又はその子孫を作製することを特徴とするトランスジェニック鳥類の作製法である。【００１６】本発明は、また、上記の方法で作製されたトランスジェニック鳥類の体細胞、血液又は卵から目的タンパク質を抽出することよりなるタンパク質の生産法である。
本発明は、また、上述の方法で作製されたトランスジェニック鳥類である。【００１７】マイクロインジェクションによって導入される遺伝子の、染色体上の位置を特定することはできないが、作製されたＧ０トランスジェニックキメラの中から生殖系列に挿入遺伝子をもつ生殖系列キメラを選別することにより、Ｇ１を効率的に産生するＧ０親を特定することは可能である。選別に際してはＧ０のオスから腹部マッサージ法により精子を採取し、この精子中の導入遺伝子を検定する方法が有効である。この選別法も本発明のひとつである。【００１８】本発明は、また、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚に、目的タンパク質をコードする複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションし、孵化することにより得られたＧ０トランスジェニック鳥類の血中における、目的タンパク質の発現を確認することによる、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の選別法である。【００１９】本発明は、このようにタンパク生産に有利なトランスジェニック鳥類の作製法を開示する。また該作製法による遺伝子導入鳥類を開示する。
この方法により作製されたトランスジェニック鳥類は、医薬品等に利用可能なタンパク質の生産に利用できる。【００２０】以下に本発明を詳述する。
本発明のＧ１トランスジェニック鳥類及び／又はその子孫は、複製能欠失型レトロウイルスベクターによって外来遺伝子が導入された鳥類であって、外来遺伝子をその体細胞に均等に含有し、その導入遺伝子に由来する目的タンパク質を、血中、卵白中あるいは卵黄中に安定に発現することを特徴とする。【００２１】本発明で使用する鳥類としては特に限定されず、例えばニワトリ、七面鳥、カモ、ダチョウ、ウズラなど、食肉、採卵目的で家畜化されている家禽鳥類や愛玩用鳥類を挙げることができる。なかでもニワトリやウズラは入手が容易で、産卵種としても多産である点が好ましい。【００２２】本発明で使用されるレトロウイルスベクターとしては、モロニー・ミューリン・ロイケミア・ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、エビアン・ロイコシス・ウイルス（ＡＬＶ）等に由来するベクターや、レンチウイルスベクター等が挙げられる。なかでもＭｏＭＬＶに由来するものが好ましいが、本発明はこれに限定されるものではない。【００２３】安全性を考慮し、遺伝子導入ベクターとして用いられるウイルスは、通常ウイルス粒子の複製に必要な３種の遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖのうちいずれかまたは全てを欠くことにより、自己複製能を欠失したウイルスが用いられる。鳥類細胞にこのウイルスベクターを効率的に感染させるため、外皮タンパクを人工的にＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルス由来）シュードタイプとしたウイルスベクターが好ましいが、本発明はこのウイルスタイプに限定されるものではない。【００２４】パッケージング細胞またはヘルパーウイルス等を利用することにより調製されたシュードタイプのウイルスベクターは、通常のマイクロインジェクション法（Ｂｏｓｓｅｌｍａｎ，Ｒ．Ａら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３、５３３）により、初期胚、血管内、心臓内へ導入される。遺伝子導入法としてはこの他にもリポフェクションやエレクトロポレーション法等が考えられる。【００２５】本発明により鳥類に導入される遺伝子は特に限定されないが、マーカー遺伝子や目的タンパク質を発現するための構造遺伝子、これらの遺伝子発現をコントロールするプロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等により構成される。【００２６】上記マーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、蛍光タンパク質例えばＧＦＰ（グリーン・フルオレッセント・プロテイン）等をコードした遺伝子が挙げられる。【００２７】上記目的タンパク質を発現するための構造遺伝子としては特に限定されず、ヒトモノクローナル抗体などの遺伝子産業上有用な抗体、酵素等をコードした遺伝子などが挙げられる。また、その他の有用生理活性物質の遺伝子を用いることもできる。特に、卵中での蓄積がよいことから、ヒトＩｇＧクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子や、ヒトＩｇＧ１、ウズラＩｇＧ２、ニワトリＩｇＧ２やマウスＩｇＧ２のサブクラスの定常領域をもつ抗体の遺伝子など外来性抗体の構造遺伝子が好ましい。【００２８】また好ましい上記構造遺伝子としては、キメラ抗体の構造遺伝子が挙げられる。キメラ抗体とは、２種以上の異なる遺伝形質から構成される抗体のことをいう。従来マウスハイブリドーマによって作製された医療用抗体は、マウス由来��あるためヒト体内に投与されると免疫系による拒絶反応が引き起こされるという問題があった。この欠点を解消するため、例えばマウス抗体を組換え手法によってＦｃ部等をヒト化することにより、拒絶反応のリスクを大幅に軽減することができる。【００２９】上記キメラ抗体としては、例えば抗ヒトＣＤ２抗体、抗ＣＤ２０受容体抗体、抗ＴＮＦ抗体などが挙げられ、すでに医薬品として上市されているものもある。【００３０】さらに好ましい上記構造遺伝子としては、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の構造遺伝子が挙げられる。医療用の組換え抗体には、この他に低分子抗体と称される一群がある。免疫グロブリンＩｇＧには直接抗原と結合する可変領域（Ｆｖ：Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれるＶＨ、ＶＬのヘテロ二量体からなるドメインがあり、このＦｖドメインはＩｇＧの約５分の１の分子量でありながら、単独で充分な抗原結合能を持つ。ＶＨ、ＶＬドメイン間を人工的にペプチドリンカーで結合したものが１本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）と呼ばれる低分子抗体で、ＶＨ、ＶＬ単独よりも安定性が向上することが知られていた。【００３１】Ｐｏｗｅｒｓら（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｄ．Ｂら（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄ．２５１，１２３）は、このｓｃＦｖにヒトＩｇＧ１に由来するＦｃ部を融合させることで、血中での安定性が増すことを見出した。このｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は医療用として有用と考えられるが、安価な大量生産システムである大腸菌では生産されない。【００３２】本発明のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類において、鳥類に導入される遺伝子として、これらヒトモノクローナル抗体遺伝子、キメラ抗体遺伝子、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子等を使用することにより、従来生産が困難だった抗体医薬品を安価に大量生産することができる【００３３】例えば、キメラ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは０．５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上であり、卵黄中の抗体含有量は、好ましくは０．１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１μｇ／ｍｌ以上である。【００３４】また、ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を導入したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の場合、血液中の抗体含有量は、好ましくは２０μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは２０００μｇ／ｍｌ以上である。また、卵白中の抗体含有量は、好ましくは５μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ以上である。卵黄中の抗体含有量は、好ましくは１μｇ／ｍｌ以上、より好ましくは１００μｇ／ｍｌ以上である。卵黄中では抗体が蓄積されたのち、酵素等により分解されるが、これは分解を受けないものとした含有量を示す。卵黄中における抗体の分解は、早い段階での酵素阻害剤の添加、分解を受ける構造の修飾等により防ぐことができる。【００３５】上記プロモーター遺伝子としては、構成的なプロモーターが挙げられる。抗体遺伝子が構成的なプロモーターにより制御されている場合、抗体遺伝子発現が安定してよいので好ましい。より好ましい構成的なプロモーターとして、ニワトリβ−アクチンプロモーターが挙げられる。β−アクチンプロモーターで発現制御した場合、目的タンパク質は血中に発現される特徴がある。【００３６】トランスジェニック動物によるタンパク生産では乳汁、あるいは卵中に目的タンパク質を生産させる時、性成熟によって乳汁分泌、あるいは産卵等が開始されるまでその生産量がどれくらいか検討がつかないとの欠点があった。生物種によっては性成熟には数年かかる場合もあり、産業的に目的タンパク質を計画生産する時の大きな不安定要素となっていた。この点、β−アクチンプロモーターで発現制御したトランスジェニック鳥類においては、幼鳥の段階で血液中のタンパク発現量を調べる事で、性成熟後の卵中タンパク発現量を予見的に把握することが可能であり、得られた結果に従い選別を行うことで計画生産には大きなプラス要因となる。【００３７】本発明のタンパク生産法は、上記トランスジェニック鳥類から目的タンパク質を回収することを特徴とする。より詳細には、作製されたトランスジェニック鳥類の体細胞、血中及び／又は卵中から目的タンパク質を回収、精製するタンパク質の生産法である。また、本発明のトランスジェニック鳥類が生んだ卵もまた本発明の１つである。上記卵の目的タンパク質の含有量は、好ましくは１ｍｇ／１００ｇ以上、より好ましくは２０ｍｇ／１００ｇ以上、特に好ましくは１００ｍｇ／１００ｇ以上である。【００３８】次に本発明のＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫の親となる、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法について説明する。【００３９】当該作製法の１つとして、鳥類受精卵を孵卵し、放卵直後の胚盤葉期を除くそれ以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法が挙げられる。また、鳥類受精卵を孵卵し、孵卵開始から好ましくは２４時間以降、より好ましくは４８時間以降の初期胚へ複製能欠失型レトロウイルスベクターを感染させ、その胚を孵化させる作製法も、本発明の作製法の１つとして挙げられる。【００４０】より好ましくは、上記初期胚に形成される心臓内へ、複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションする方法である。【００４１】つまり、本発明に関わるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類の作製法は、放卵後特定の時間経過した受精卵に複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることよりなる。放卵後の受精卵の初期発生についてニワトリを例にとると、まず輸卵管内で受精した卵は、受精後約１．５時間で卵割を開始する。細胞質がつながったまま盤割が始まった卵は、１日かけて体外に放出される間に分裂し、約６万個の細胞からなる胚盤葉と呼ばれる胚になる（胚盤葉期）。この胚盤葉は、卵黄中央部の直径３〜４ｍｍの白いリングとして観察される。この胚は、上層と下層に分裂し、割腔を形成する。放卵は胚盤葉下層が形成されるころに起こり、原条が形成され、胚盤葉は上、中、下の三重構造を取り、三胚葉が形成される。その後、胚の形成、成長を経て、排卵から２２日目に孵化する。胚盤葉期は、ステージＸとも呼ばれ、この時期の細胞の一部から生殖細胞が生じることから、従来は遺伝子導入の対象としてこの時期の受精卵を使用している。【００４２】本発明においては放卵直後、胚盤葉期の受精卵を孵化条件、例えばニワトリならば３７．７〜３７．８℃、湿度５０〜７０％程度の孵化に適した環境条件においた時間を０時間とし、経時的にマイクロインジェクションを行った。ウズラでは孵卵開始から３６時間後、ニワトリでは孵卵開始後５０時間頃から、卵黄上に血管系の形成が観察され、心臓に分化する器官の脈動が観察できた。【００４３】上述の遺伝子を導入した受精卵の孵化には、本発明者らが開発した人工卵殻による方法（Ｋａｍｉｈｉｒａ，Ｍ．ら（１９９８）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．，４０，４４９）等が応用できる。【００４４】本発明の作製法において使用する複製能欠失型レトロウイルスベクター、導入する遺伝子、遺伝子導入鳥類としては、上述したＧ０トランスジェニックキメラ鳥類と同様のものが挙げられる。【００４５】本発明の作製法においては、レトロウイルスに由来しない遺伝子が複製能欠失型レトロウイルスベクターに含有されていることが好ましい。
なお本発明の作製法において、「レトロウイルスに由来しない遺伝子」としては、上述した構造遺伝子、プロモーター遺伝子、分泌シグナル遺伝子等が挙げられる。
上記レトロウイルスに由来しない遺伝子は、ニワトリβ−アクチンプロモーターにより制御されている遺伝子であることが好ましい。また、上記レトロウイルスに由来しない遺伝子は、抗体をコードする遺伝子であることが好ましい。【００４６】本発明の作製法では、好ましくは１×１０７ｃｆｕ／ｍｌ以上、より好ましくは１×１０８ｃｆｕ／ｍｌ以上、更に好ましくは１×１０９ｃｆｕ／ｍｌ以上のタイターを持つ複製能欠失型レトロウイルスベクターをマイクロインジェクションすることが、遺伝子を効率よく導入できる点で好ましい。【００４７】本発明の作製法で、受精卵に遺伝子を導入された鳥類は、その体細胞にモザイク状に導入遺伝子をもったトランスジェニック鳥類として成長する。この一世代目の遺伝子導入鳥類を、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と呼ぶ。【００４８】Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と非トランスジェニック鳥類、あるいはＧ０トランスジェニックキメラ鳥類同士を交配させて誕生する二世代目、三世代目は、これらが導入遺伝子を染色体にもつ生殖細胞から発生した場合、全身の体細胞に導入遺伝子を含有する個体として成長する。この生殖系列キメラ個体から導入遺伝子を受け継ぐ子孫を、代々Ｇ１〜Ｇ２〜Ｇ３〜トランスジェニック鳥類と称する。【００４９】本発明によるＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を同種の非トランスジェニック鳥類あるいは配偶型Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類と交配させることにより、導入遺伝子を子孫に伝播させることができるとともに、全身の体細胞に導入遺伝子をもつ完全なトランスジェニック鳥類を作製できる。このように安定的に導入遺伝子を伝播するトランスジェニック鳥類の系統を確立することで、タンパク産生システムとしての品質の安定化が可能である。更に完全なトランスジェニック鳥類は、導入遺伝子をもつ体細胞の割合が多いことから、Ｇ０トランスジェニックキメラ鳥類に比べ、導入遺伝子に由来する組換えタンパク質の産生量が増加する場合もあると予想できる。【００５０】本発明のＧ１トランスジェニック鳥類の作製法は、前述のＧ０トランスジェニックキメラ鳥類を作製し、交配させることよりなる。交配型はＧ０トランスジェニックオスと野生型メス、Ｇ０トランスジェニックメスと野生型オス、Ｇ０トランスジェニックのオスとメス等が考えられ、更に子孫とその親による戻し交配も可能である。中でもＧ０オスと野生型メスの交配型は、１羽のＧ０オスに対し、野生型メス３羽から１０羽を交配させることができるため、効率の点から好ましい。【００５１】上記Ｇ０オスの精子を採取し、精子中の導入遺伝子の有無を調べる事により、生殖系列キメラを選別できる。導入遺伝子検定法にはＰＣＲ法、ウエスタンブロット法等が考えられるが、本発明はこれに限定されない。
また、Ｇ１トランスジェニック鳥類、Ｇ２トランスジェニック鳥類やその子孫のオスの精子を採取し、同様にして精子中の遺伝子を検定する生殖系列キメラの選別法もまた本発明の１つである。【００５２】生殖系列キメラはオスの場合、導入遺伝子をもつ精子ともたない精子を併せ持った個体となる。導入遺伝子を含む精子が受精した胚から成熟した雛は、その体細胞全体に導入遺伝子をもつＧ１トランスジェニックとなる。生殖系列キメラＧ０を選別することで、ランダムに交配するよりも効率的にＧ１トランスジェニックキメラ鳥類を作製することができる。
【発明の効果】
【００５３】本発明のＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫は、安全性の高い複製能欠失型レトロウイルスベクターで導入された外来遺伝子を、不活性化することなく効率的に発現することができる。【００５４】また本発明のＧ１トランスジェニック鳥類は、体細胞全体に導入遺伝子が存在し、個体レベルでタンパクの発現が安定で、また確立された系統として安定な供給系となることができる。【００５５】更に本発明のトランスジェニック鳥類作製法は、安全かつ効率的にＧ１トランスジェニック鳥類、更にその子孫としてのＧ２、Ｇ３トランスジェニック鳥類を作製することを可能にする。【００５６】本発明のＧ１、Ｇ２、Ｇ３〜トランスジェニック鳥類は、体細胞で外来遺伝子に由来するタンパクを発現し、血清、卵白、卵黄から回収、精製することで、これまで生産困難であった糖鎖が付与したタンパクや抗体類の安価な生産系を供給することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５７】以下、実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトの作製
ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトは、以下のように作製した。【００５８】１．ｐＭＳＣＶｎｅｏ（クロンテック社製）から一連のミューリン・ホスホグリセレート・キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター及びＮｅｏｒ遺伝子を含む断片を制限酵素ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩによって除去し、残ったベクター断片のセルフライゲーションによりプラスミドｐＭＳＣＶを作製した。【００５９】２．ｐＧＲＥＥＮ  ＬＡＮＴＥＲＮ−１（ギブコＢＲＬ社製）からＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩによって切り出し、ｐＺｅｏＳＶ２（＋）（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩサイトに挿入した。Ｔ７プロモーターと同方向にＧＦＰ遺伝子が挿入された構造のプラスミドをｐＺｅｏ／ＧＦＰとした。【００６０】３．ｐＺｅｏ／ＧＦＰからＧＦＰ遺伝子断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって切り出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩによって処理したｐＭＳＣＶのベクター断片に連結し、プラスミドｐＭＳＣＶ／Ｇを作製した。【００６１】４．２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃｇｔｇｃａｔｇｃａｃｇｃｔｃａｔｔｇ−３’（配列番号１、下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｃｇｃｇｔｃｇａｃａａｃｇｃａｇｃｇａｃｔｃｃｃｇ−３’（配列番号２、下線部はＳａｌＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５０℃／３０秒→６８℃／１分：１０サイクル；９４℃／１５秒→６２℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製））によりｐＭｉｗＺ（Ｓｕｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆ．Ｄｅｖ．２９：１８１−１８５）からΔＡｃｔプロモーター断片を増幅後、制限酵素ＳａｌＩによってΔＡｃｔプロモーター断片を切り出し、ｐＥＴＢｌｕｅ−２（ノバジェン社製）のＳａｌＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔを作製した。【００６２】５．ｐＥＴＢｌｕｅ／ΔＡｃｔからΔＡｃｔプロモーター断片を制限酵素ＳａｌＩによって切り出し、ｐＭＳＣＶ／ＧのＸｈｏＩサイトへ挿入した。ＧＦＰ遺伝子と同方向にΔＡｃｔプロモーターが挿入された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡとした。【００６３】６．５’末端をリン酸化した２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃｔａｇａｃｃａｔｇａｇｇｔｃｔｔｔｇｃｔａａｔｃｔｔｇｇｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇｇ−３’（配列番号３、下線部はＸｂａＩ末端、下線部はＨａｅＩＩＩ末端）及び５’−ｃｃｃｃａｇａｇｃａｇｃｃａｇｇｇｇｃａｇｇａａｇｃａａａｇｃａｃｃａａｇａｔｔａｇｃａａａｇａｃｃｔｃａｔｇｇｔ−３’（配列番号４、下線部はＸｂａＩ末端、下線部はＨａｅＩＩＩ末端）をアニールさせ、リゾチーム分泌シグナルの遺伝子断片を調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｇｃｇｔｔｔａａａｇｔｇａｃｇｔｔｇｇａｃｇｔｃｃｇ−３’（配列番号５、下線部はＤｒａＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｃｇｇｔｃａｇｇ−３’（配列番号６、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃��１分：３０サイクル）によりＨＵＣ２１３細胞のニワトリ抗体可変領域遺伝子から調製された一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の遺伝子を含んだプラスミドｐＰＤＳ／ｓｃＦｖ（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２：１９１−１９８）からｓｃＦｖ遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＤｒａＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）（ストラタジーン社製）のＸｂａＩ、ＢａｍＨＩサイトに上記調製した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖを作製した。【００６４】７．ｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖからｓｃＦｖ遺伝子断片を制限酵素ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩによって切り出し、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン社製）のＮｏｔＩ、ＢａｍＨＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＣＥＰ４／ｓｃＦｖを作製した。【００６５】８．ヒトＩｇＧ１産生ミエローマ細胞ＩＭ−９（ジャパニーズ・コレクション・オブ・リサーチ・バイオリソーシズ  ００２４）からｍＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロッシュ社製）を用いてｍＲＮＡを取得し、得られたｍＲＮＡからＲｅｖｅｒＴｒａ  Ａｃｅ（東洋紡社製）を用いてｃＤＮＡライブラリを調製した。２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ｃａａｇｃｔｔｃａａｇｇｇｃｃｃａｔ−３’（配列番号７）及び５’−ａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号８）をプライマーとするＰＣＲ（９５℃／２分→５２℃／３０秒→７４℃／３分：３０サイクル；Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（プロメガ社製））により上記ｃＤＮＡライブラリからｈＣγ１遺伝子断片を増幅した。さらに、２つの化学合成オリゴヌクレオチド５’−ａｔｔａｇｇａｔｃｃｇａｇｃｃｃａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃ−３’（配列番号９、下線部はＢａｍＨＩ制限酵素サイト）及び５’−ａｇｃａａｇｃｔｔｔｃａｔｔｔａｃｃｃｇｇａｇａｃａｇｇｇａ−３’（配列番号１０、下線部はＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素サイト）をプライマーとするＰＣＲ（９４℃／１５秒→５８℃／３０秒→６８℃／１分：３０サイクル；ＫＯＤ−ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ）により上記ＰＣＲ産物からヒト抗体Ｈ鎖γ１のＦｃ領域（Ｆｃ）の遺伝子断片を増幅後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩサイトへ挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／Ｆｃを作製した。【００６６】９．ｐＣＥＰ４／ｓｃＦｖからｓｃＦｖ遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅ／ＦｃからＦｃ遺伝子断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩによって切り出した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（＋）のＨｉｎｄＩＩＩサイトへ上記切り出した２断片を挿入し、プラスミドｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖ−Ｆｃを作製した。【００６７】１０．ｐＢｌｕｅ／ｓｃＦｖ−Ｆｃからニワトリ一本鎖抗体可変領域にヒト抗体Ｈ鎖γ１・Ｆｃが連結した構造（ｓｃＦｖ−Ｆｃ）の遺伝子断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって切り出し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによって処理したｐＭＳＣＶ／ＧΔＡのベクター断片に連結した。ΔＡｃｔプロモーターと同方向にｓｃＦｖ−Ｆｃ遺伝子が連結された構造のプラスミドをｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃとした。
このように作製した複製能欠失型レトロウイルスベクターのベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を図１に示した。
【実施例２】
【００６８】ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現レトロウイルスベクターの調製
実施例１で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃよりレトロウイルスベクターを調製するため、パッケージング細胞ＧＰ２９３（クロンテック社製）を直径１００ｍｍの培養ディッシュに５×１０６細胞植え、培養した。培地を新鮮なＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）に交換し、ｐＶＳＶ−Ｇベクター（クロンテック社製）８μｇとｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃ８μｇをリポフェクション法により前記ＧＰ２９３細胞に導入した。４８時間後、ウイルス粒子を含む培養上清を回収し、０．４５μｍ酢酸セルロースフィルター（アドバンテック社製）を通して夾雑物を除去した。得られた溶液にポリブレン（シグマ社製）を１０μｇ／ｍｌとなるように加えウイルス液とした。【００６９】調製したウイルス液を別に培養したＧＰ２９３細胞に加え、４８時間培養後、細胞を限界希釈法によりクローニングし、ＧＦＰを強く発現する安定形質転換ＧＰ２９３株を取得した。【００７０】得られた安定形質転換株を８０％コンフルエントとなるよう直径１００ｍｍディッシュに培養し、１６μｇのｐＶＳＶ−Ｇをリポフェクション法で導入した。４８時間後ウイルス粒子を含む培養上清１２ｍｌを回収した。【００７１】この培養上清を５０，０００×ｇ、４℃で１．５時間遠心を行い、ウイルスを沈殿させた。上清を除き、ウイルス粒子を含む沈殿物に５０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液を加え、４℃で一晩放置後、よく懸濁してウイルス溶液を回収した。このようにして得られた高タイターウイルスベクターは、１０８〜１０９ｃｆｕ／ｍｌであった。【００７２】ウイルスタイターの測定は、以下のように行った。測定の前日にＮＩＨ３Ｔ３細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手）を直径３５ｍｍのディッシュに７×１０４細胞植え培養した。１０２〜１０６倍に希釈したウイルス溶液を各ディッシュに１ｍｌ加え、４８時間後に蛍光顕微鏡によりＧＦＰを発現している細胞の割合（１００％を１とする）を測定し、以下の計算式によりタイターを決定した。
ウイルスタイター＝細胞数×希釈率×発現割合（ｃｆｕ／ｍｌ）
【実施例３】
【００７３】ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのインジェクション
ニワトリ受精卵（日本生物化学研究所）を使用した。この受精卵を自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境に置いた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。【００７４】遺伝子注入のため、受精卵の卵殻を７０％エタノールで消毒し、鋭端部を直径３．５ｃｍの円形にダイヤモンドカッター（ＭＩＮＯＭＯ７Ｃ７１０、ミニター社製）で切り取り、胚を露出させた。孵卵後約５０時間目から卵黄表面に血管の発生が認められ、その一部が脈動して心臓の原基となることが実体顕微鏡で観察できる。この初期心臓を実体顕微鏡で観察しながら、ガラス管（ＣＤ−１、オリンパス社製）をマイクロピペット製作器（ＰＣ−１０，オリンパス社製）で加工し、外径約２０μｍとなるよう先端を折って作製した針を刺し、マイクロインジェクター（Ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６、エッペンドルフ社製）を用いて胚盤下腔の中央に、実施例２で調製したウイルス溶液約２μｌを微量注入した。この卵殻の切り口まで卵白を満たした後、卵白を糊としてテフロン膜（ミリラップ、ミリポア社製）とポリ塩化ビニリデンラップ（サランラップ、旭化成社製）とで蓋をし、３０分毎に９０度転卵しながら孵卵を行った。【００７５】孵卵開始から１８日目に転卵を停止し、２１日目に雛がハシ打ちを始めたら卵殻を破って孵化を助けた。この人工孵化による孵化率は５０〜６０％だった。
【実施例４】
【００７６】ＥＬＩＳＡ法による血清中ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体の定量
実施例３により誕生したＧ０トランスジェニックキメラニワトリを飼育して雛を成長させた。一週間後、成長した雄性雛（個体識別番号＃１１１１、＃３１０８、＃４１０２）の翼下静脈より採血を行い、血液サンプルを得た。得られた血液を１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清として得られる血清からｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体量の測定を行った。【００７７】ＰＢＳで希釈した抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）をＥＬＩＳＡプレートに１００μｇ／ｗｅｌｌ入れて４℃で一晩静置した。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液を２００μｌで各ｗｅｌｌを３回洗浄した後、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液−２％スキムミルクを１５０μｌ／ｗｅｌｌ入れた。【００７８】室温で２時間静置後、ｗｅｌｌを２００μｌのＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回洗浄し、採取した血液サンプルを１２０μｌ入れ、４℃で一晩静置した。このＥＬＩＳＡプレートを室温に戻した後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液で３回各ｗｅｌｌを洗浄し、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で希釈したＰｅｒｏｘｉｄｅ（ＰＯＤ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体（コスモバイオ社製）を１００μｌ／ｗｅｌｌ入れて室温で１時間静置した。【００７９】ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液でｗｅｌｌを４回洗浄し、発色液（１０ｍｇのｏ−フェニレンジアミン（片山化学工業製）を１ｍｌのメタノールに溶解し、蒸留水で１００ｍｌとしたものに１０μｌの過酸化水素水（和光純薬工業製）を加えて調製した）１００μｌをｗｅｌｌに加えた。８Ｍ硫酸を５０μｌ添加して反応を止め、４９０ｎｍの蛍光強度をプレートリーダーで測定して、標準検量線から濃度を計算した。ウズラ、ニワトリ各々３羽から得られたサンプルの抗体濃度を平均したものを結果とした。
標準検量線作製のための標準抗体（コスモバイオ社製）は、５０％卵黄−ＰＢＳ（Ｗ／Ｖ）で希釈した。【００８０】標準検量線は精製したｓｃＦｖ−Ｆｃを用いて作製した。実施例１で作製したベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−Ｆｃをリポフェクション法によりＧＰ２９３細胞に導入し、その培養上清を４℃、１０分間、３０００ｒｐｍで遠心して固形物を除去した。この上清を冷却しながら攪拌し、５０％飽和となるよう細かく砕いた硫酸アンモニウムを徐々に加え（３１３ｇ硫安／１０００ｍｌ水）、タンパク質を沈殿させた。これを４℃で一晩静置した後、４℃で１０分間、１５，０００ｒｐｍで遠心して沈殿を完全に沈降させ、少量のＰＢＳで溶解した。２ＬのＰＢＳで３回透析して硫安を除去した。【００８１】精製用のプロテインＧカラム（日本ガイシ社製）の初期洗浄をＢｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮａＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ  １．５６ｇ／ｌ、ＮａＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ７．１６ｇ／ｌ）１０ｍＬ、Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒ（酢酸２０％、蒸留水８０％）１０ｍｌ、Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ１０ｍｌの順で行った（流速２ｍｌ／分）。ＰＢＳに溶解したタンパク液を１ｍｌ／分で流し、ｓｃＦｖ−Ｆｃをカラムに吸着させた。Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ２０ｍｌを１．７ｍｌ／分で流して不要なタンパクを除去し、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（グリシン７．５０７ｇ／ｌ、２Ｎ  ＨＣｌにてｐＨ２．５〜３．０に調製）を１．５ｍｌ／分で流してｓｃＦｖ−Ｆｃを溶出した。【００８２】溶出分画をＰＢＳ（２Ｌ）で３回透析し、精製ｓｃＦｖ−Ｆｃとし、波長２８０ｎｍの吸光度よりタンパク濃度を定量した。実施例３で誕生した３羽（個体識別番号＃１１１１、＃３１０８、＃４１０２）の雄性Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリ雛の血中抗体値を表１に示す。【００８３】
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【実施例５】
【００８４】ＰＣＲ法による精子中導入遺伝子の確認
実施例３で誕生した３羽（個体識別番号＃１１１１、＃３１０８、＃４１０２）の雄性Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリ雛を飼育成長させ、性成熟を待った。６ヵ月後、生育した雄性トランスジェニックキメラニワトリから、腹部マッサージ法により０．２ｍＬの精子を採取した。【００８５】採取した精子からキット（東洋紡社製  ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍｅ−）を用いて抽出したゲノムＤＮＡ５０ｎｇを使い、ＰＣＲ法で導入遺伝子を確認した。【００８６】ＰＣＲ法には、導入遺伝子に含まれるｓｃＦｖ遺伝子断片の一部３９３ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＧＴＣＴＴＡＴＴＡＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＴＡＧＴＡＧＣＡＣＡＡ−３’（配列番号１１）／５’−ＧＡＧＡＣＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＣＡＴＡ−３’（配列番号１２）及び導入遺伝子に含まれるＧＦＰ遺伝子の一部３１１ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＡＧＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＴＴＣＡＴＣＴＧＣＡＣＣＡＣＴＧ−３’（配列番号１３）／５’−ＧＴＴＧＴＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＡＴＧＴＴ−３’（配列番号１４）を用いた。
【実施例６】
【００８７】交配によるＧ１トランスジェニックニワトリの作製
実施例５により、精子中に導入遺伝子を検出した雄性Ｇ０トランスジェニックキメラニワトリ（＃４１０２）を３羽の野生型メス（白色レグホン）と交配し、有精卵を得た。【００８８】この有精卵を、自動転卵装置が内蔵された孵卵器（昭和フランキ社製Ｐ−００８型）内で３７．９℃、湿度６５％環境にて孵化処理し、２１日〜２２日目に雛を誕生させた。この雛を一週間飼育して翼下静脈より１００μｌ採血して血清を分離し、血清中の抗体量を実施例４のＥＬＩＳＡ法で定量した。また、遠心で得られた血沈から、実施例５の方法でゲノム抽出し、ＰＣＲ法で導入遺伝子を確認した。【００８９】ＰＣＲ法には、導入遺伝子に含まれるＧＦＰ遺伝子の一部３５５ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＣＡＡＣＡＣＴＧＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴＴＣＡＣＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１５）／５’−ＡＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１６）を用いた。内部標準として、ニワトリゲノムに含まれるオボアルブミン遺伝子の一部３１７ｂｐを増幅可能なプライマーセット：５’−ＣＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＴＴＣＧＧ−３’（配列番号１７）／５’−ＣＡＴＣＴＡＧＣＴＧＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＧＴＡＣＡ−３’（配列番号１８）を用いた。【００９０】１１０羽の雛から導入遺伝子を検定した結果、５羽から導入遺伝子を検出した。偶発的に死亡したこのＧ１個体の各臓器よりゲノムを抽出し、ＰＣＲ法で導入遺伝子を確認した。
【実施例７】
【００９１】Ｇ１臓器中の導入遺伝子の確認
実施例６により作製され、血液より抽出したゲノム中に導入遺伝子が確認されたＧ１個体のうち１羽が偶発的に死亡したため、胃、肝臓、腎臓、腸、筋肉を摘出して実施例６の方法によりゲノムを抽出し、ＰＣＲ法により導入遺伝子を確認した（図２）。【００９２】この結果より、この個体は体中の各臓器に導入遺伝子をもつＧ１個体であるとの確証が得られた。【００９３】５羽のＧ１の血中ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体値を実施例４の方法により定量したところ、うち３羽が１ｍｇ／ｍＬの抗体を発現していた。【００９４】これにより、本方法により導入遺伝子に基づくｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を発現し、体細胞全体に導入遺伝子をもつ完全なＧ１トランスジェニックニワトリが作製できることが明らかとなった。
【実施例８】
【００９５】ＦＩＳＨ法によるＧ１染色体解析
実施例６により孵化した７７番目のニワトリ雛は、実施例６のＰＣＲ法による検定により、Ｇ１トランスジェニックニワトリ（メス）であることがわかった。このＧ１の個体番号を＃７７とする。同様に１０３番目の雛もＰＣＲ法により、Ｇ１トランスジェニックニワトリ（オス）だった（個体番号＃１０３）。【００９６】この２羽のＧ１の翼下静脈から採血を行い、血液２ｍＬからフィコールパック法でリンパ球を分離し、マイトジェン（コンカナバリンＡ  コスモバイオ社製）、メルカプトエタノール（和光純薬工業製）、硫酸カナマイシン（コスモバイオ社製）、および１８％ＦＢＳ（インビトロジェン社製）を加えたＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で培養を行った。染色体標本作製の数時間前にＢｒｄＵ（５−ブロモデオキシウリジン  メルク社製）を培地に添加し、さらにコルセミド（メルク社製）を添加して１時間後、細胞を回収して低張処理を行い、メタノール：酢酸（３：１）固定液で固定し、標本を作製した。【００９７】作製した染色体標本は数日間乾燥させた後、ヘキスト３３２５８（メルク社製）での染色、ＵＶ処理を施し乾燥後、ＦＩＳＨ法による解析を行った。プローブＤＮＡ（ｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−ＦｃΔＢａｍＨ１）はビオチン（コスモバイオ社製）で標識し、ヤギ抗ビオチン抗体／ＦＩＴＣ−抗ヤギＩｇＧを反応させ、蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＡシステム）による撮像、画像解析装置（Ｌｅｉｃａ５５０ＣＷ−ＱＦＩＳＨソフトウェア）による解析を行った。【００９８】プローブＤＮＡ（ｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−ＦｃΔＢａｍＨ１）は、実施例１のｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−Ｆｃから制限酵素処理によりＢａｍＨ１−ＢａｍＨ１断片（１．５７ｋｂ）を切り出し、常法に従ってビオチン標識して作製した。
このようにして解析した＃７７と＃１０３のＦＩＳＨ解析結果を、図３に示す。このＦＩＳＨ解析結果から、＃７７個体はマイクロ染色体に２個の導入遺伝子が挿入されたＧ１であり、＃１０３は第３染色体長腕部に導入遺伝子が１コピー挿入されたＧ１トランスジェニックニワトリであることがわかった。
【実施例９】
【００９９】交配によるＧ２トランスジェニックニワトリの作製
実施例８のＧ１＃７７個体（メス）を野生型オス（白色レグホン）、＃１０３個体（オス）を野生型メス（白色レグホン）とそれぞれ交配し、有精卵を取得・孵化させた。この雛の血漿から実施例５の方法によりゲノム抽出し、ＰＣＲ法で導入遺伝子の有無を解析してＧ２トランスジェニックニワトリであるかどうか検定した。【０１００】＃７７は導入遺伝子を一方の染色体に２コピーもつＧ１であり、野生型との交配で生まれる雛の３／４がトランスジェニックであることが確率的に期待される。このうち１／４がＧ１親と同じく２コピーの導入遺伝子をもち、２／４はＧ１親がもつ導入遺伝子の一方のみをもつＧ２となるはずである。【０１０１】実際に孵化した雛を調べたところ、２０羽中１４羽がＧ２トランスジェニックであり、ほぼ確率的に期待される頻度で、Ｇ２が誕生したことがわかった。
同様にＧ１＃１０３と野生型の交配によって生まれた雛を、ＰＣＲ法により検定した。＃１０３は導入遺伝子を１コピーもつＧ１であるため、Ｇ２は１／２の確率で出現することが予測される。実際の検定結果は４３羽中２２羽がＧ２トランスジェニックであり、本発明により作製されたトランスジェニックＧ１ニワトリからは、確率的に期待できる通りのＧ２が誕生することがわかった。【０１０２】作製したＧ２を飼育し、メスが産卵する卵中抗体発現量ならびに血中発現量を、実施例４の方法で測定した。Ｇ１＃７７及び＃１０３の子孫であるＧ２（６ヶ月齢）の血中抗体発現量をそれぞれ表２、表３に、＃７７の６ヶ月齢Ｇ２メスが産んだ卵中抗体発現量を表４に示す。【０１０３】
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【０１０４】
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【０１０５】
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【０１０６】表２に示すように、Ｇ１＃７７は血中抗体価が０．５〜０．８ｍｇ／ｍＬであるのに対し、野生型との交配の結果、誕生したＧ２は同程度の血中抗体価であった。また表３に示すように、Ｇ１＃１０３は血中抗体価が０．３〜０．５ｍｇ／ｍＬであるのに対して、野生型との交配によるＧ２で同程度の血中抗体価を示した。更に表４に示すように、平均的卵白中抗体発現量が０．３ｍｇ／ｍＬの＃７７のＧ２メスは、同程度の抗体を、卵白中に発現していた。【０１０７】この結果から本発明法のトランスジェニックニワトリは、世代を重ねても遺伝子サイレンシングを起こさず、交配によって増やされた子孫を使う事によって、コストの安いタンパク生産工場として応用可能であることが実証された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】本発明のＧ１トランスジェニック鳥類及びその子孫は、安全性の高い複製能欠失型レトロウイルスベクターで導入された外来遺伝子を、不活性化することなく効率的に発現することができる。【０１０９】また本発明のＧ１トランスジェニック鳥類は、体細胞全体に導入遺伝子が存在し、個体レベルでタンパクの発現が安定で、また確立された系統として安定な供給系となることができる。【０１１０】更に本発明のトランスジェニック鳥類作製法は、安全かつ効率的にＧ１トランスジェニック鳥類、更にその子孫としてのＧ２、Ｇ３トランスジェニック鳥類を作製することを可能にする。【０１１１】本発明のＧ１、Ｇ２、Ｇ３〜トランスジェニック鳥類は、体細胞で外来遺伝子に由来するタンパクを発現し、血清、卵白、卵黄から回収、精製することで、これまで生産困難であった糖鎖が付与したタンパクや抗体類の安価な生産系を供給することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】［図１］ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体発現ベクターコンストラクトｐＭＳＣＶ／ＧΔＡｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を示す。Ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示す。ＰΔａｃｔはβ−アクチンプロモーター遺伝子を示す。Ψ＋はパッケージングシグナル配列を示す。ＧＦＰはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示す。ｓｃＦｖ−ＦｃはｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体遺伝子を示す。５‘ＬＴＲ及び３’ＬＴＲはそれぞれＭｏＭＬＶのロングターミナルリピート配列を示す。
［図２］Ｇ１トランスジェニックニワトリの各臓器からの抽出ゲノム中の導入遺伝子のＰＣＲ解析結果を示す。Ｍはマーカー、Ｃ１は陽性コントロール、Ｃ２は陰性コントロールを示す。Ｌ、Ｋ、Ｈ、ＭＵ及びＩはそれぞれ肝臓、腎臓、心臓、筋肉、腸を示す。ＧＦＰはグリーン・フルオレッセント・プロテイン遺伝子を示し、ＯＶＡはオボアルブミン遺伝子を示す。
［図３］Ｇ１トランスジェニックニワトリ＃７７、＃１０３のＦＩＳＨ解析結果を示す。矢印は導入遺伝子（ｐＭＳＣＶ／ｓｃＦｖ−ＦｃΔＢａｍＨ１）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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