(57)【要約】本発明は、ヒト血小板膜糖蛋白質ＶＩと特異的に結合し、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒト抗体またはその活性断片；上記抗体またはその活性断片を産生する細胞；上記抗体またはその活性断片を有効成分として含有する医薬組成物等を提供する。上記細胞は、例えば、ＧＰＶＩに対する自己抗体を産生するヒトの末梢血リンパ球を特定の条件の体外免疫法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）で活性化し、マウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、そして、ＧＰＶＩとの結合能を有し、ヒト血小板のコラーゲンによる凝集能を抑制する活性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することによって得ることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血小板膜糖蛋白質ＶＩと特異的に結合し、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒト抗体またはその活性断片。
【請求項２】
ヒト血小板膜糖蛋白質ＶＩと特異的に結合し、生体内に投与することでコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制するヒト抗体またはその活性断片。
【請求項３】
ヒトＧＰＶＩと特異的に結合し、血小板上のＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を特異的に阻害する、血小板上の機能的なＧＰＶＩを消失させる、あるいは、予めヒト血小板と接触させることによりヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下もしくは欠如させる、いずれか一つ以上の作用を持つヒト抗体またはその活性断片
【請求項４】
ヒト血小板膜糖蛋白質ＶＩに特異的に結合し、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制するが、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒト抗体またはその活性断片。
【請求項５】
配列番号４７のアミノ酸配列をＶＨ  ＣＤＲ１に、配列番号４８のアミノ酸配列をＶＨ  ＣＤＲ２に、配列番号４９のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ３に、配列番号９８のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ１に、配列番号９９のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ２に、配列番号１００のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ３に、それぞれ有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号７のアミノ酸配列をＶＨ  ＣＤＲ１に、配列番号８のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ２に、配列番号９のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ３に、配列番号１０のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ１に、配列番号１１のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ２に、配列番号１２のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ３に、それぞれ有する抗体もしくはその活性断片。
【請求項６】
請求項１ないし５の抗体またはその活性断片を産生する細胞。
【請求項７】
請求項１ないし５の抗体またはその活性断片のＨ鎖及び／またはＬ鎖をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド
【請求項８】
請求項１ないし４の抗体またはその活性断片を有効成分として含有する医薬組成物。
【請求項９】
組換えヒト−ヒトキメラ抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ヒト血小板膜糖蛋白質ＶＩ（以下、ＧＰＶＩと略称することがある）に対する抗体および該抗体を産生する細胞に関するものである。
【背景技術】  血小板は血液凝固・生体防御において極めて重要な役割を担っており、生理的な役割から種々の病態における関わりが解明されつつある。特に、血小板は止血血栓を形成するという機能においても注目されており、例えば、血管内皮細胞が損傷を受けると、血管内皮下の主要なマトリックス蛋白質であるコラーゲンが露出し、ここへ血小板が粘着する。次に、コラーゲンからのシグナルにより血小板が活性化され、最終的にはフィブリノーゲンを介して血小板が凝集する。そして場合によってはこれが血栓塞栓性疾患のような病的状態の原因となることから治療の標的として注目されている。
従来、血小板凝集に基づく血栓症の治療・予防の目的で、アスピリン、チクロピジン、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト等の抗血小板薬が用いられてきたが、有効性および出血等の副作用の面から多くの問題が指摘されており、これらの問題の無い、十分な安全性、および確実かつ適切な作用を有する優れた抗血小板薬の登場が望まれている。
血小板膜上に存在するＧＰＶＩは、血小板のコラーゲン受容体であり、コラーゲン刺激による血小板の活性化に中心的役割を担っていることが明らかにされている（非特許文献１：高山博史，日本血栓止血学会誌，２００３年，第１４巻，第２号，ｐ．７５−８１参照）。すなわち、スギヤマらは自己免疫性血小板減少患者の血小板では６２ｋＤａの膜蛋白質が特異的に欠損しており、コラーゲンによる血小板凝集が認められないこと（非特許文献２：タテオ・スギヤマ（Ｔａｔｅｏ  Ｓｕｇｉｙａｍａ）、外５名，ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），（米国），１９８７年，第６９巻，第６号，ｐ．１７１２−１７２０参照）、さらに、この患者の血小板で欠損していた蛋白がＧＰＶＩであり、患者の血清より精製した抗体のＦａｂ断片がコラーゲン惹起血小板凝集を抑制することを報告している（非特許文献２および非特許文献３：マサアキ・モロイ（Ｍａｓａａｋｉ  Ｍｏｒｏｉ）、外３名，ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ），（米国），１９８９年，第８４巻，第５号，ｐ．１４４０−１４４５参照）。
これまでに自己免疫疾患患者由来の抗ヒトＧＰＶＩ自己抗体は、スギヤマら（非特許文献２参照）やタカハシら（非特許文献４参照）が報告している。しかしながら、スギヤマらの報告では患者血漿を精製した抗ヒトＧＰＶＩ自己抗体には血小板凝集を惹起する作用があり、直ちに医薬応用はできない。非特許文献４（ホウユウ・タカハシ（Ｈｏｙｕ  Ｔａｋａｈａｓｈｉ）、外１名，アメリカン・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ），（米国），２００１年，第６７巻，第４号，ｐ．２６２−２６７）には、ＧＰＶＩと推測される約６２ｋＤａの蛋白に対する自己抗体の存在、及び、この抗体が血小板凝集を惹起することが記載されている。また、これらの患者由来の抗ＧＰＶＩ抗体を医薬として臨床応用するためには安全性の高い抗体を安定した品質で大量に生産する必要があるが、工業的に生産する方法は未だ確立されていない。
現在までに作製されている抗ＧＰＶＩ抗体として、マウスＧＰＶＩに対するモノクローナルラット抗体（特許文献１：欧州特許出願公開公報第１２２８７６８号参照）、およびヒトＧＰＶＩに対するモノクローナルマウス抗体がある（特許文献２：国際特許出願公開公報第０１／００８１０号および特許文献３：国際特許出願公開公報第０２／０８０９６８号参照、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．２００３  Ｊｕｎ；８９（６）：９９６−１００３）。これらは、非ヒト動物由来の抗体であり、ヒトに投与した場合、高度な免疫原性（「抗原性」という場合もある）を有するために副作用が危惧され、該抗体をそのままヒトに投与することは不適当であり、ヒトに投与する抗体は純粋にヒト由来のヒト抗体であることが求められている。
また、ヒトＧＰＶＩを認識するヒト一本鎖抗体（ｓｃＦｖ：ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）がファージディスプレー法等を用いて作製されている（特許文献２、特許文献３、および非特許文献５：ピーター・Ａ・スメサースト（Ｐｅｔｅｒ  Ａ  Ｓｍｅｔｈｕｒｓｔ）、外１５名、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ），（米国），２００２年，第１００巻，第１１号，ｐ．４７４ａ参照）。これらの一本鎖抗体はヒト抗体のＶＨとＶＬをペプチドリンカーで結合させたものであり、ヒト由来の可変領域を有する抗体であるが、細胞が産生する通常のイムノグロブリンに比べると、一般的に抗原への親和性が低く、生体内での半減期も短い。
ＣＤＲ（相補性決定領域）移植等によるヒト化抗体の作製方法は公知であるが、ＣＤＲのアミノ酸配列および多くの場合にはフレームワーク領域（ＦＲ）の一部が非ヒト動物抗体由来であり、抗体のアミノ酸配列のすべてがヒト由来ではないために、投与した抗体に対する抗体が生体内で産生される可能性が指摘されており、免疫原性の面から医薬として有効でかつ安全なものとは言えない。ヒト抗体の作製について複数の報告があるが、いずれの報告の方法も種々の問題点を有し、あらゆる抗原に適用可能な一般化された方法であるとは認識されていないのが現状であり、一般的に高力価のヒト抗体を取得することは困難である。
【発明の開示】
このように抗血小板薬として、安全性が高く、有効性が優れ、かつ使いやすい薬剤が求められている状況において、ヒトに投与可能な、純粋にヒト由来の抗ＧＰＶＩ抗体が切望されている。
本発明の目的は、ヒト血小板膜上に存在する糖蛋白質であるＧＰＶＩに特異的に結合する新規な抗体、好ましくはモノクローナル抗体を提供するものである。特にヒトに投与可能で、有効でかつ副作用の点で問題のない、純粋にヒト由来である抗ＧＰＶＩヒト抗体を提供するものである。また、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合し新規なＣＤＲ配列を含有する抗体を提供するものである。
さらに、これらの抗体を産生する細胞、具体的には特定のハイブリドーマを提供するものである。
本発明者らは、上記の課題を解決すべく、ＧＰＶＩに対する自己抗体を産生するヒトのリンパ球を出発材料として、ＧＰＶＩを介する血小板凝集を効果的に抑制するヒト抗体の取得を着想した。この着想に基づき、鋭意研究を重ねた結果、末梢血リンパ球を特定の条件の体外免疫法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）で活性化し、マウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製したところ、複数のハイブリドーマから、ＧＰＶＩとの結合能を有し、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する活性を有する抗体を産生するハイブリドーマを得ることに成功した。そして、当該クローンを単離し、さらに検討を重ねた結果、該抗体をコードする遺伝子を得ることに成功し、この抗体のＣＤＲのアミノ酸配列が新規の配列であることを明らかにした。さらに、遺伝子組換技術により組換抗体を作製し、本発明を完成した。
なお、本明細書においては、ハイブリドーマ（例えば、クローン＃２−６）が産生する抗体を＃２−６抗体と、また、該ハイブリドーマの抗体遺伝子から遺伝子工学的に組み換えた抗体をＲ＃２−６抗体のように記載することがある。
本発明の第１の態様は、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合するヒト抗体、好ましくはモノクローナル抗体（以下抗ヒトＧＰＶＩ抗体及びヒトＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体と各々記載することがある）またはその活性断片であり、好ましくは、単独ではヒト血小板凝集を惹起しない抗体またはその活性断片である。具体的には、
（１）ヒトＧＰＶＩと特異的に結合し、生体内に投与することでコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制するヒト抗体またはその活性断片で、好ましくは、該抗体または活性断片を生体内へ投与した後に血液中より単離した血小板について、コラーゲンにより惹起される凝集能が通常の血小板に比べて低下あるいは認められないもの、
（２）ヒトＧＰＶＩと特異的に結合し、血小板上のＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を特異的に阻害する、血小板上の機能的なＧＰＶＩを消失させる、あるいは、予めヒト血小板と接触させることによりコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する、すなわち、ヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下もしくは欠如させる、いずれか一つ以上の作用を持つヒト抗体またはその活性断片、
（３）血小板上のヒトＧＰＶＩを該血小板の細胞内に取り込ませる（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）、もしくは、切断することによりコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する、前記（１）ないし（２）の抗体またはその活性断片である。
前記（１）ないし（３）の抗体は、単独ではヒト血小板凝集を惹起しない、及び／または、生体内に投与した場合、血小板減少を引き起こさない抗体が好ましい。好適な例として、クローン＃２−６または＃２−４のハイブリドーマが産生する抗体またはそれをヒトＩｇＧ、より好ましくはヒトＩｇＧ４に組み替えた抗体が挙げられる。また、本発明の抗体は、ヒトＧＰＶＩと抗体との解離定数（Ｋｄ値）が好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下の抗体である。本発明の抗体の活性断片とは、ＧＰＶＩとの結合能を有する限りにおいて、例えば、Ｆａｂ（Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含むペプチド等である。
また、具体的には、
（４）ヒトＧＰＶＩに特異的に結合し、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を特異的に抑制するがトロンビンによる凝集は抑制せず、単独ではヒト血小板凝集を惹起しないヒト抗体またはその活性断片である。該抗体は、コラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する濃度または用量と同等、好ましくは１０倍、より好ましくは１００倍、さらに好ましくは１０００倍において、単独ではヒト血小板凝集を有意に惹起しない抗体またはその活性断片である。
ここで前記（１）ないし（４）の抗体のうち、ヒトＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を阻害する抗体は、好ましくは１０ｎＭ以下、より好ましくは１ｎＭ以下、さらに好ましくは０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ値）でヒトＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を阻害する抗体である。
本発明の抗体は必ずしも特定のクローンに限定されるものではなく、本発明の好ましい例（＃２−６、＃２−４、Ｒ＃２−６またはＲ＃２−４抗体等）と同様の作用を有する抗体は本発明の範囲に包含される。本発明の抗体の作用の有無は実施例に示される方法または公知の方法によって確認し得る。
また、本発明の好ましい抗体とＧＰＶＩ上の結合部位もしくはエピトープが同一か少なくとも部分的に共通である抗体、例えば、ＧＰＶＩとの結合において互いに競合する関係にある抗体は本発明の範囲に包含される。本発明の抗体との結合部位の共通性の有無は実施例に記載の方法に準じて、または公知の方法によって確認し得る。
本発明の第２の態様は、新規なＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有する抗ヒトＧＰＶＩ抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。具体的には、
（５）少なくとも抗体のＨ鎖またはＬ鎖の一方の３組のＣＤＲ、好ましくは抗体のＨ鎖およびＬ鎖両方の６組のＣＤＲが、表４に記載のクローン、好ましくはクローン＃２−６および＃２−４からなる群から選択される何れかのハイブリドーマが産生する抗体のＣＤＲのアミノ酸配列を、それぞれ対応するＣＤＲのアミノ酸配列として含有する抗ヒトＧＰＶＩ抗体またはその活性断片、
（６）配列番号４７のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ１に、配列番号４８のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ２に、配列番号４９のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ３に、配列番号９８のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ１に、配列番号９９のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ２に、配列番号１００のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ３に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号７のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ１に、配列番号８のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ２に、配列番号９のアミノ酸配列をＶＨＣＤＲ３に、配列番号１０のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ１に、配列番号１１のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ２に、配列番号１２のアミノ酸配列をＶＬＣＤＲ３に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、
（７）少なくとも抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域、好ましくは抗体のＨ鎖およびＬ鎖両方の可変領域が、表４に記載のクローン、好ましくはクローン＃２−６および＃２−４からなる群から選択される何れかのハイブリドーマが産生する抗体が有する可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ対応する可変領域のアミノ酸配列として含有するヒトＧＰＶＩ抗体またはその活性断片、
（８）配列番号１４３のアミノ酸配列をＨ鎖の可変領域に、配列番号１４４のアミノ酸配列をＬ鎖の可変領域に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、または配列番号１５のアミノ酸配列をＨ鎖の可変領域に、配列番号１６のアミノ酸配列をＬ鎖の可変領域に、それぞれ含有する抗体もしくはその活性断片、
（９）＃２−６細胞または＃２−４細胞が産生するモノクローナル抗体またはその活性断片である。
本発明の第３の態様は、第１または第２の態様の抗体を産生する細胞である。具体的には、
（１０）前記（１）ないし（９）に記載のいずれかの抗体を産生する形質転換細胞、
（１１）＃２−６細胞または＃２−４細胞である、前記（１０）記載の細胞である。
本発明の第４の態様は、第１または第２の態様の抗体またはその活性断片の少なくともＨ鎖またはＬ鎖の一方の３組のＣＤＲ好ましくは可変領域をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドまたは核酸である。具体的には、第１または第２の態様の抗体またはその活性断片をコードするポリヌクレオチドであって、
（１２）少なくとも抗体のＨ鎖またはＬ鎖の一方の３組のＣＤＲ、好ましくは抗体のＨ鎖またはＬ鎖の両方の６組のＣＤＲをコードする塩基配列として、表４に記載のクローン、好ましくはクローン＃２−６および２−４からなる群から選択される何れかのハイブリドーマの抗体の遺伝子においてそれぞれ対応するＣＤＲをコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（１３）ＶＨＣＤＲ１をコードする配列番号１４７の塩基配列と、ＶＨＣＤＲ２をコードする配列番号１４８の塩基配列と、ＶＨＣＤＲ３をコードする配列番号１４９の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ１をコードする配列番号１５０の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ２をコードする配列番号１５１の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ３をコードする配列番号１５２の塩基配列とを、それぞれ含有するポリヌクレオチド、またはＶＨＣＤＲ１をコードする配列番号２３の塩基配列と、ＶＨＣＤＲ２をコードする配列番号２４の塩基配列と、ＶＨＣＤＲ３をコードする配列番号２５の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ１をコードする配列番号２６の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ２をコードする配列番号２７の塩基配列と、ＶＬＣＤＲ３をコードする配列番号２８の塩基配列とを、それぞれ含有するポリヌクレオチド、
（１４）少なくとも抗体のＨ鎖またはＬ鎖の可変領域、好ましくは抗体のＨ鎖およびＬ鎖両方の可変領域として、表４に記載のクローン、好ましくはクローン＃２−６および＃２−４からなる群から選択される何れかのハイブリドーマの抗体の遺伝子においてそれぞれ対応する可変領域をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチド、
（１５）Ｈ鎖の可変領域をコードする配列番号１４５の塩基配列と、Ｌ鎖の可変領域をコードする配列番号１４６の塩基配列とを含有するポリヌクレオチド、またはＨ鎖の可変領域をコードする配列番号３１の塩基配列と、Ｌ鎖の可変領域をコードする配列番号３２の塩基配列とを含有するポリヌクレオチドである。
本発明の第５の態様は、第１または第２の態様の抗体を製造する方法である。具体的には第１または第２の態様の抗体を製造する方法であって、
（１６）前記（１０）の細胞を培養する工程および、該細胞が産生するモノクローナル抗体を採取する工程を含む製造方法、
（１７）前記（１１）の細胞を培養する工程および、該細胞が産生するモノクローナル抗体を採取する固定を含む製造方法、
（１８）第４の態様のポリヌクレオチド、それを含有する発現ベクター、該ポリヌクレオチドもしくは該発現ベクターを含有する細胞の何れかを用いる工程を含む製造方法である。
本発明の第６の態様は、本件第１または第２の態様の抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関するもので、好ましくは血栓性、塞栓性または動脈硬化性の疾患の予防および／または治療のための医薬組成物である。
本発明の第７の態様は、本件第１または第２の態様の抗体を用いて試料中のＧＰＶＩを検出または定量することにより疾患の診断をする方法であって、好ましくは血液凝固異常に関連する疾患の診断をする方法である。
本発明の第８の態様は、組換えヒト抗体、特に、組換えヒト−ヒトキメラ抗体、具体的にはヒト抗体（例えば、ＩｇＭ抗体）を遺伝子工学的手法によって組み替えることにより、他のクラスのヒト抗体（例えば、ＩｇＧ抗体、特にヒトＩｇＧ４抗体）またはそれらをコードするポリヌクレオチドを製造する方法であって、例えばハイブリドーマが産生する抗体（例えば、ヒトＩｇＭ）をコードするポリヌクレオチドおよび公知のヒト抗体（例えば、ＩｇＧ４抗体）のポリヌクレオチドを遺伝子工学的手法によって組み替える工程を含む。該手法としては、ハイブリドーマのｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡを鋳型として用いたＰＣＲ法が挙げられ、具体的には実施例９、好ましくは実施例１０記載の方法が挙げられる。実施例１０においては、ゲノムＤＮＡを鋳型として複数のエクソンをＰＣＲで増幅し、それら複数（ＩｇＧでは４種類）のＰＣＲ増幅産物を混合して同時にＰＣＲを実施することにより、簡便に目的の抗体をコードするポリヌクレオチドを製造しうる。
【図面の簡単な説明】  図１は、ＧＰＶＩ−Ｆｃ発現プラスミドであるｐＣＡＧＧＳ−ＧＰＶＩ−Ｆｃの構築を示すフローチャートである。
図２は、組換えウイルスを作製するためのトランスファーベクターのクローンであるｐＹＮＧ−ＧＰＶＩ−Ｆｃの構築を示すフローチャートである。
図３は、抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体１８種類の結合活性を、ＧＰＶＩ−Ｆｃとの反応性により、ＥＬＩＳＡ法で測定した結果を示したグラフである。  図４はヒト末梢血より調製した血小板に組換抗ＧＰＶＩヒト抗体（Ｒ＃２−４およびＲ＃２−６）が結合することを示すグラフである。
図５は、各種ヒトＩｇＧ化ＧＰＶＩ抗体のＧＰＶＩ−ｈＦｃへの結合性を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】（構成）
本件発明の第１の態様の抗体は、ヒト血小板上に存在する膜糖蛋白質であるＧＰＶＩを特異的に認識するものである。なお、本発明の抗体が認識するＧＰＶＩは必ずしも血小板上のものに限られず、例えば、巨核球のＧＰＶＩをも認識し得るものである。以下に、本発明をさらに詳しく説明する。
本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このモノクローナル抗体の作製方法には特定の方法に限らず、例えばハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体、抗体の遺伝子を組み込んだ組換え細胞が産生したモノクローナル抗体、またはＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）により形質転換した細胞が産生するモノクローナル抗体のいずれであってもよい。
ヒト抗体とは、可変領域全体および定常領域全体のいずれもがヒト由来のアミノ酸配列からなる抗体である。本発明のヒト抗体の作製方法は特定の方法に限らず、例えばヒト−ヒトハイブリドーマが産生したヒト抗体、トランスジェニック動物が産生したヒト抗体、ヒト抗体の遺伝子を組み込んだ組換え細胞が産生したヒト抗体、ＥＢＶにより形質転換したヒト細胞が産生するヒト抗体、または自己抗体を産生するヒトのリンパ球を用いて作製したハイブリドーマが産生したヒト抗体のいずれであってもよい。
本発明の抗体はヒトＧＰＶＩと特異的に結合する抗体である。本発明の抗体はヒトＧＰＶＩと抗体との解離定数（Ｋｄ値）が好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは５０ｎＭ以下である。ヒトＧＰＶＩと抗体との解離定数を測定する方法は特定の方法に限定されず、常法により行うことができる。例えば、チップ上に固定化したＧＰＶＩ−Ｆｃを用いてＢＩＡＣＯＲＥ３０００のような蛋白質相互作用解析装置により測定することができる。具体的には、実施例７に示されている。
本発明の抗体はコラーゲンによるヒト血小板の凝集を抑制する作用を有するものである。ここで、血小板凝集は公知の方法で測定し得るが、例えば、血小板凝集能測定装置等で光透過率を指標として凝集率を計算することにより測定でき、一般的には、光透過率が最大となる点の凝集率（以下、最大凝集率と称することがある）で表される。後述の実施例６に記載された方法において、本発明の抗体は好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以下の濃度で、最大凝集率を好ましくは対照の５０％以下に、より好ましくは対照の３０％以下に、さらに好ましくは対照の２０％以下に、最も好ましくは対照の１０％以下に減少させる。コラーゲンによるヒト血小板の凝集の抑制を測定する方法は上記の方法に限定されず、他の常法によっても行うことができる。また、実施例６に記載された方法においてコラーゲン惹起ヒト血小板凝集を抑制する作用、すなわち直接的な作用の有無に係わらず、ヒト血小板がコラーゲンに応答して凝集する能力を低下ないしは欠除させることにより、間接的にコラーゲン惹起ヒト血小板凝集を抑制する作用を有する抗体が好ましい。例えば実施例１５に記載された方法において、本発明の抗体は、例えば３０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以下の濃度で、最大凝集率を好ましくは対照の３０％以下に、好ましくは対照の１０％以下に、より好ましくは対照の５％以下に減少させる。
本発明の抗体は、好ましくは、コラーゲン以外の血小板凝集を惹起する物質、例えばトロンビンによる凝集は抑制せず、後述の実施例６に記載された方法において、本発明の抗体は好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１００μｇ／ｍＬの抗体濃度で、最大凝集率が好ましくは対照の８０％以上、より好ましくは対照の８５％以上、さらに好ましくは対照の９０％以上、特に好ましくは対照の９５％以上である。コラーゲン以外の血小板凝集を惹起する物質によるヒト血小板の凝集の抑制を測定する方法は上記の方法に限定されず、他の常法によっても行うことができる。
本発明の抗体は抗体単独、すなわち血小板凝集を惹起させる物質の非存在下においてヒト血小板の凝集を促進または惹起せず、後述の実施例６に記載された方法において、好ましくは０．１μｇ／ｍＬ以上、より好ましくは１μｇ／ｍＬ以上、さらに好ましくは１０μｇ／ｍＬ以上、特に好ましくは１００μｇ／ｍＬの抗体濃度で、最大凝集率が好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下である。抗体単独でのヒト血小板凝集を測定する方法は必ずしも限定されず、他の常法によっても行うことができる。また、例えば、全血、好ましくは抗トロンビン剤（アルガトロバン等）で処理した全血を用いて、間接的に血小板に対する影響を評価することもできる。実施例１４にその一例を示した。
現在まで報告されているヒトＧＰＶＩに対する抗体のほとんどは、前記ヒト自己抗体を含めて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗体単独で血小板を活性化させる作用、及び／または、血小板凝集を惹起もしくは促進する作用を有することから、生体に投与した場合、血小板減少を引き起こす可能性が考えられる。Ｆａｂ断片等の形態では、血小板凝集を惹起しないものも報告されているが、生体内においては、何らかの原因によりＦａｂが架橋または凝集して、ＩｇＧ等と同様な挙動を示す可能性も完全には否定できない。よって、抗体の活性断片ではなく完全な抗体分子、例えば、ＩｇＧの形態でも、そのような作用を示さない、または、そのような作用が低い抗ＧＰＶＩ抗体が好ましい。
また、生体内における動態及び安定性は、自然の形態である抗体分子、例えば、ＩｇＧ等が優れている。一般に、血中半減期はＦａｂ等の断片に比べてＩｇＧの方が遥かに長く、特に、血栓症等の慢性的疾患や長期間の抗体投与が必要な病態においては、血中半減期の長い分子形態、特にＩｇＧが望ましい。
本発明の抗体は血小板上のＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を特異的に阻害するものであってもよく、後述の実施例７に記載された方法において、本発明の抗体はＧＰＶＩとコラーゲンの結合を好ましくは１００μｇ／ｍＬ以下で、より好ましくは１０μｇ／ｍＬ以下、さらに好ましくは１μｇ／ｍＬ以下、特に好ましくは０．１μｇ／ｍＬの濃度で５０％阻害する抗体である。コラーゲンとＧＰＶＩとの結合を測定する方法は特定の方法に限定されず、他の常法により行うことができる。
本発明の抗体は生体内に投与することで、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する。本発明の抗体がコラーゲンによる血小板凝集を抑制する機序としては、（ｉ）血管内皮細胞傷害により露出したコラーゲンと血小板上に存在するＧＰＶＩとの結合を本発明の抗体が阻害する、（ｉｉ）本発明の抗体をあらかじめ血小板表面上に存在するＧＰＶＩに結合させておきコラーゲンと結合できない状態にする、（ｉｉｉ）本発明の抗体が血小板及び／または巨核球表面上のＧＰＶＩと結合することでＧＰＶＩを内部に取り込ませて（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅ）、結果として血小板表面からＧＰＶＩを消失させる、または（ｉｖ）本発明の抗体の有する活性により血小板及び／または巨核球表面に存在するＧＰＶＩを切断して結果として血小板表面からＧＰＶＩを消失させる、等が考えられる。本発明のヒト抗体によるコラーゲンによる血小板凝集抑制の機序としては何れでも良いが、複数の機序を併せ持ってもよい。
本発明の第２の態様として、新規なＣＤＲアミノ酸配列または可変領域アミノ酸配列を含有する抗ヒトＧＰＶＩモノクローナル抗体がある。
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端側には可変領域が存在し、それぞれ重鎖可変領域（ＶＨ）、軽鎖可変領域（ＶＬ）と呼ばれる。可変領域内には相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が存在し、この部分が抗原認識の特異性を担っている。可変領域のＣＤＲ以外の部分は、ＣＤＲの構造を保持する役割を有し、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。重鎖および軽鎖のＣ末端側には定常領域が存在し、それぞれ重鎖定常領域（ＣＨ）、軽鎖定常領域（ＣＬ）と呼ばれる。
重鎖可変領域中には、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。重鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて重鎖相補性決定領域と呼ぶ。軽鎖可変領域中にも同様に、第１の相補性決定領域（ＣＤＲ１）、第２の相補性決定領域（ＣＤＲ２）および第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）の３つの相補性決定領域が存在する。軽鎖可変領域中の３つの相補性決定領域をまとめて軽鎖相補性決定領域と呼ぶ。
本発明の抗体のＣＤＲ配列は必ずしも限定されないが、好ましくはＶＨＣＤＲ１として配列番号４７のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ２として配列番号４８のアミノ酸配列、ＶＨＣＤＲ３として配列番号４９のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ１として配列番号９８のアミノ酸配列、ＶＬＣＤＲ２として配列番号９９のアミノ酸配列またはＶＬＣＤＲ３として配列番号１００のアミノ酸配列のうち、いずれか１つ以上、好ましくはＨ鎖の３つ、より好ましくは全てのアミノ酸配列を含有する抗体である。
本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列は必ずしも限定されないが、好ましい抗体として、ＶＨとして配列番号１４３のアミノ酸配列もしくはＶＬとして配列番号１４４のアミノ酸配列のいずれか１つ以上を含有する抗体、またはＶＨとして配列番号１５のアミノ酸配列もしくはＶＬとして配列番号１６のアミノ酸配列のいずれか１つ以上を含有する抗体がある。
なお、本発明の抗体は必ずしも特定のアミノ酸配列のものに限定されず、その活性及び／または抗原性に実質的に影響のない範囲で、本発明の抗体のアミノ酸配列において、例えば可変領域、特にＦＲ部分において１ないし数個のアミノ酸残基の付加、欠失、置換及び／または挿入が許容される。
本発明の抗体は、抗体の定常領域が好ましくはヒト抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ、さらに好ましくはヒトＩｇＧ４由来のアミノ酸配列からなる抗体である。
本件発明の抗体は特定の分子種に必ずしも限定されるものではない。抗体、すなわち免疫グロブリンの構造は重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）とからなり、重鎖のクラス（ｙ、α、μ、δ、ε）により５つのイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ）に分けられる。このうちＩｇＧとＩｇＡは重鎖の違い（例えばヒトの場合、ｙ１、ｙ２、ｙ３、ｙ４、α１、α２）からサブクラス（例えばヒトの場合ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかのタイプに分類される。本発明の抗体はクラス、サブタイプまたはイソタイプは限定されず、いずれに分類されるものでもあってもよい。好ましくはイソタイプがＩｇＧの抗体であり、さらに好ましくは補体結合性のないという点においてサブクラスがＩｇＧ４の抗体である。
本発明の抗体としては、その活性、例えば、ＧＰＶＩとの結合能を有する限りにおいて、抗体の断片または一部でもよい。例えば、Ｆａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化抗体（ｄｓＦｖ）、ＣＤＲを含有するペプチド等が挙げられる。
本発明第３の態様として、本発明の抗体を産生する細胞が提供される。このような細胞の例としては、ハイブリドーマ、形質転換体、または本発明の抗体の遺伝子を導入した遺伝子組換え細胞等がある。抗体を産生するハイブリドーマとしては、具体的にはＧＰＶＩに対する自己抗体を産生するヒトから採取した末梢血のリンパ球を用いて作製したハイブリドーマである＃２−６細胞または＃２−４細胞がある。また、本発明により上記発明の細胞が産生する抗体が提供される。抗体産生細胞は特定の細胞に限定されないが、好ましくはＧＰＶＩに対する自己抗体を産生するヒトの末梢血から採取したリンパ球を用いて作製したハイブリドーマが産生した抗体であり、さらに好ましくは＃２−６細胞または＃２−４細胞が産生した抗体、及び該抗体より遺伝子組換技術により作製した組換抗体である。
本発明の第４の態様として、本発明第１または第２の態様の抗体をコードするポリヌクレオチドまたは核酸が提供される。該ポリヌクレオチドは、本発明の抗体のアミノ酸配列をコードするものであれば必ずしも限定されず、ポリヌクレオチドとしては、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。
本発明の抗体のＣＤＲ配列をコードするポリヌクレオチドは必ずしも限定はないが、好ましくはＶＨＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４７の塩基配列、ＶＨＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４８の塩基配列、ＶＨＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４９の塩基配列、ＶＬＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５０の塩基配列、ＶＬＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５１の塩基配列またはＶＬＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５２の塩基配列のうち、いずれか１つ以上、より好ましくはＨ鎖の３つ、さらに好ましくは全ての塩基配列を含有するポリヌクレオチドであり、また、好ましくはＶＨＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列、ＶＨＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列、ＶＨＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列、ＶＬＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列、ＶＬＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列またはＶＬＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列のうち、いずれか１つ以上、より好ましくはＨ鎖の３つ、さらに好ましくは全ての塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
本発明の抗体のＶＨおよびＶＬのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは必ずしも限定はないが、好ましくはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４５の塩基配列、またはＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４６の塩基配列のいずれか１つ、より好ましくは両方の塩基配列を含有するポリヌクレオチドであり、また、好ましくはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列、またはＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列のいずれか１つ、より好ましくは両方の塩基配列を含有するポリヌクレオチドである。
本発明の抗体の定常領域をコードするポリヌクレオチドは、好ましくはヒト抗体、より好ましくはヒトＩｇＧ、さらに好ましくはヒトＩｇＧ４由来の塩基配列を含有する。
本発明の抗体のヌクレオチド配列を含有する遺伝子を細胞に移入することにより、本発明の抗体を産生する細胞を製造することができる。移入する遺伝子として、好ましくはＶＨＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４７の塩基配列、ＶＨＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４８の塩基配列、ＶＨＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４９の塩基配列、ＶＬＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５０の塩基配列、ＶＬＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５１の塩基配列またはＶＬＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号１５２の塩基配列のいずれか一つ以上を含有する遺伝子であり、また、好ましくはＶＨＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２３の塩基配列、ＶＨＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２４の塩基配列、ＶＨＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２５の塩基配列、ＶＬＣＤＲ１としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２６の塩基配列、ＶＬＣＤＲ２としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２７の塩基配列またはＶＬＣＤＲ３としてのアミノ酸配列をコードする配列番号２８の塩基配列のいずれか一つ以上を含有する遺伝子である。また、移入する遺伝子として、好ましくはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４５の塩基配列もしくはＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４６の塩基配列のいずれか１つ以上を含有する遺伝子、またはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列もしくはＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列のいずれか１つ以上を含有する遺伝子である。また、移入する遺伝子として、好ましくはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４５の塩基配列、およびＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号１４６の塩基配列を有する遺伝子、またはＶＨとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３１の塩基配列、およびＶＬとしてのアミノ酸配列をコードする配列番号３２の塩基配列を有する遺伝子、さらに好ましくは、定常領域がヒト抗体由来のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する遺伝子である。
（製法）
本発明の第５の態様として、抗体の生産方法が提供される。この発明の抗体を作成する方法には限定はないが、以下に記載の方法でも作成しうる。すなわち、ＧＰＶＩに対する自己抗体を産生する患者の末梢血からリンパ球を採取し、体外免疫法で活性化したリンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製する。作製したハイブリドーマが産生する抗体を得て、ＧＰＶＩとの結合能を有し、コラーゲンによる血小板凝集を抑制する活性を有する抗体を選択し、この抗体を産生する細胞を得る。この細胞を培養することにより、本発明の抗体を得ることができる。
本発明の抗体は、公知の方法（それぞれＮａｔｕｒｅ，３１２：６４３，１９８４、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２，１９８６以来、多くの方法が開発されている）を用いた組換えヒト抗体としても作製できる。まず、本発明の抗体を産生する細胞、例えば、リンパ球、好ましくは、抗ＧＰＶＩモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマより、ＶＨまたはＶＬをコードする核酸、例えばｃＤＮＡを取得し、塩基配列およびアミノ酸配列を決定する。次に、取得したＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを同一細胞又は別のヒト細胞より作製したヒト抗体ＣＨおよび／またはヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を含有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入し発現させることにより製造することができる。動物細胞に導入する遺伝子の作製方法には限定はなく、ハイブリドーマ由来のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡから得てもよく、ハイブリドーマのｍＲＮＡからＰＣＲによって得てもよく、また化学合成によっても得てもよい。
本発明の抗体のＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込むベクターとしては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合するベクターまたは高発現用ベクターが好ましい。好適な例としては、ＥＦプロモーター及び／またはＣＭＶエンハンサーを含有するベクターが挙げられ、例えば、ｐＥＦ−ＢＯＳまたは実施例で用いたベクターがある。また、通常ＶＨまたはＶＬをコードする核酸を組み込んだ発現ベクターをそれぞれ作製し、宿主細胞にｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔするが、単一の発現ベクターに組み込んでも良い。
発現ベクターを導入する宿主細胞としては、必ずしも限定されないが、蛋白質遺伝子等の発現に汎用され、特に抗体遺伝子の発現に適合する細胞が好ましい。例えば、細菌（大腸菌等）、放線菌、酵母、昆虫細胞（ＳＦ９等）、哺乳類細胞（ＣＯＳ−１、ＣＨＯ、ミエローマ細胞等）が挙げられる。
組換えヒト抗体の作製に用いるヒト抗体の定常領域としては、例えば、ヒト抗体重鎖定常領域としてはＣｙ１やＣｙ４、ヒト抗体軽鎖定常領域としてはＣκ等の任意のヒト抗体の定常領域を用いることができる。
ヒトのＣＤＲ配列を含有する抗体は、ヒト体内に天然に存在する抗体の他に、ヒト抗体ファージライブラリーおよびヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することによりＦａｂ、一本鎖抗体等の抗体の活性断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体の活性断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体の活性断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖および２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
本発明は重鎖２本と軽鎖２本からなる抗体のほかに、本発明の抗体の活性断片等も含まれる。抗体の活性断片としては、例えばＦａｂ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ）、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２があり、抗体の活性断片をリンカー等で結合したものとして例えば一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ｓｃＦｖ）やジスルフィド安定化抗体（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｆｖ：ｄｓＦｖ）があり、抗体の活性断片を含むペプチドとして例えばＣＤＲを含有するペプチドが挙げられる。これらは、本発明の抗体を適当な蛋白分解酵素で処理する方法または遺伝子組換技術等、公知の方法で製造することができる。
本発明のＦａｂは、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体をＩｇＭの場合はタンパク質分解酵素ペプシンで処理して、ＩｇＧの場合はタンパク分解酵素パパインで処理して得ることができる。または、該抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、Ｆａｂを製造することができる。
本発明のＦ（ａｂ’）２は、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。または、下記のＦａｂ’をチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、作製することができる。
本発明のＦａｂ’は、ＧＰＶＩに特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
本発明のｓｃＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは、本発明のハイブリドーマが産生する抗体またはヒト抗体のいずれをも用いることができる。本発明のｓｃＦｖは、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｓｃＦｖを製造することができる。
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法［Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，６９７（１９９４）］に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明のｄｓＦｖに含まれるＶＨおよびＶＬは本発明の第１または第２の態様の抗体のいずれに由来するものをも用いることができる。
本発明のｄｓＦｖは、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ｄｓＦｖを製造することができる。
ＣＤＲを含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。本発明のＣＤＲを含むペプチドは、本発明の抗ＧＰＶＩ抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、該ＤＮＡを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、ＣＤＲを含むペプチドを製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
本発明の抗体には、例えばハイブリドーマが産生するヒト抗体、ＥＢＶを用いて形質転換した細胞が産生するヒト抗体、ｃＤＮＡより発現した組換えヒト抗体、またはそれらの抗体の活性断片に放射性同位元素、タンパク質、ペプチドまたは低分子の化合物などを結合させた抗体も含まれる。本発明の抗ＧＰＶＩ抗体または抗体の活性断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、抗体または抗体の活性断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには抗体または抗体の活性断片中の糖鎖に放射性同位元素、タンパク質、ペプチドあるいは低分子の化合物などを化学的手法［抗体工学入門（金光修著１９９４年（株）地人書館）］により結合させることにより製造することができる。ハイブリドーマとは、リンパ球と、ヒト、マウス、ラット等に由来するミエローマ細胞とを細胞融合させて得られる、所望の抗原特異性を有したモノクローナル抗体を産生する細胞を意味する。
モノクローナル抗体を作製する場合は、細胞融合に使用するミエローマ細胞との適合性を考慮して選択することが好ましい。ミエローマ細胞は、公知の種々の細胞が使用可能である。これにはヒト由来のＳＫＯ−００７、ヒトマウスヘテロミエローマであるＳＨＭ−Ｄ３３、マウス由来のＰ３、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／Ｏ、ＮＳ−１、ラット由来のＹＢ２／０及びＹ３−Ａｇ１，２，３等の骨髄腫細胞が含まれる。
ハイブリドーマ作製に用いる細胞としては、必ずしも限定はされないが、ハイブリドーマ作製に用いる複数の細胞のうち少なくとも１種はヒト由来の細胞であることが好ましい。ヒト由来の細胞としては、末梢血、リンパ節または脾臓等のヒトのリンパ球が用いられ、特に自己抗体の産生が確認されているヒトのリンパ球が好ましい。
リンパ球の活性化は公知の方法により行なうことができる。例えば、ヒトの末梢血又は脾臓からＢ細胞を採取し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ法により抗原刺激し、ヒトのＢ細胞由来のミエローマ細胞あるいはマウス由来のミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製する方法、ＥＢＶでトランスフォームし、マウスミエローマ細胞と融合させる方法、ＰＷＭ等のマイトジェンで刺激しＢ細胞をポリクローナルに活性化し融合させる方法（免疫実験操作法Ｉ・ＩＩ、右田俊介他編集、南江堂）等が好ましい。
細胞を刺激するために用いる抗原は、必ずしも限定はない。抗原とするタンパク質の由来動物は、抗体の使用目的に応じて適宜選択し得るが、天然物由来のもの、遺伝子工学的に作成したもの、化学的に合成したもの、他のタンパク質やペプチドとの融合タンパク質等、いずれでもよい。例えば血小板、血小板の膜、精製ＧＰＶＩ、組換えＧＰＶＩ、ＧＰＶＩ−Ｆｃを用いることができ、好ましくはＧＰＶＩ−Ｆｃである。
活性化リンパ球とミエローマ細胞との融合は、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３巻３頁）等の公知の方法を用いて行なうことができる。例えば、融合剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用する方法（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈／著、講談社）または電気融合法等が挙げられる。免疫細胞とミエローマ細胞との混合比は、それらが融合できる比率であれば限定されないが、活性化リンパ球に対し、ミエローマ細胞を１／１０量ないし等量を使用することが好ましい。細胞融合をＰＥＧ（平均分子量１，０００〜４，０００）を使用して行なう方法ではＰＥＧ濃度は必ずしも限定されないが５０％で行なうことが好ましい。また、融合効率促進剤としてジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）等の補助剤を添加してもよい。融合は３７□に加温したＰＥＧ溶液を混合した細胞に添加することにより開始し、１〜５分間反応後、培地を添加することにより終了する。
この融合により形成されたハイブリドーマをヒポキサンチン、チミジン及びアミノプテリンを含む培地（ＨＡＴ培地）等の選択培地で１日〜１０日間培養し、未融合細胞と分離する。得られたハイブリドーマをその産生する抗体により更に選択する。選択したハイブリドーマを公知の限界希釈法に従って単一クローン化し、単一クローン性抗体産生ハイブリドーマとして樹立する。
ハイブリドーマの産生する抗体の活性を検出する方法は公知の方法を使用することができる。ここで抗体の活性は、第一段階として、ＧＰＶＩ抗原への結合能を、第二段階として、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合を阻害する活性を検出する。第一段階の活性の検出方法としては、例えばＥＬＩＳＡ法、ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ法が挙げられる。第二段階の活性の検出法としては、例えばＥＬＩＳＡ法（結合阻害型）、タンパク相互作用解析法（ＢＩＡＣＯＲＥ等）、血小板凝集抑制測定法が挙げられる。
樹立したハイブリドーマを公知の方法で培養し、その培養上清よりモノクロナール抗体を得ることができる。
抗体の精製は、塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマト法またはアフィニティークロマト法等の公知の精製手段を用いて行うことができる。
抗体の濃度は公知のタンパク質の定量方法、例えば２８０ｎｍにおける吸光度の測定により測定することができる。
本発明の抗ＧＰＶＩ抗体の抗原結合性を確認する方法、または本発明の抗ＧＰＶＩ抗体を用いて生物試料中のＧＰＶＩを検出する方法としては、蛍光抗体法、免疫酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ）、放射性物質標識免疫抗体法（ＲＩＡ）、免疫組織染色法、免疫細胞染色法などの免疫組織化学染色法（ＡＢＣ法、ＣＳＡ法等）、ウェスタンブロッティング法、免疫沈降法、上記に記した酵素免疫測定法、サンドイッチＥＬＩＳＡ法［単クローン抗体実験マニュアル（講談社サイエンティフィック、１９８７年）、続生化学実験講座５免疫生化学研究法（東京化学同人、１９８６年）］などを用いることができる。
本発明の抗体の、例えばコラーゲンのような血小板凝集を惹起させる物質によるヒト血小板凝集へ及ぼす影響の測定方法は、必ずしも限定はされず、常法により行うことができる。具体的には、ヒト血小板浮遊液に本発明の抗体を添加し、その後コラーゲンを添加し、血小板凝集能測定装置等で凝集率を測定する。
抗体単独でのヒト血小板凝集を測定する方法は必ずしも限定されず、常法により行うことができる。具体的には、ヒト血小板浮遊液に本発明の抗体を添加し、血小板凝集能測定装置等で凝集率を測定する。
（用途）
本発明の抗体は、ヒトＧＰＶＩに特異的に結合するものであり、本発明の抗体、抗体の活性断片、化学物質と結合させた抗体の修飾物、またはこれらの混液を含む組成物等は、ヒトの疾患の予防、診断および治療の用途、また被験試料、細胞および組織等のヒトＧＰＶＩの検出の用途等を含めて、種々の用途がある。
特に、本発明の抗体の一態様としては、抗体単独ではヒト血小板の凝集を起こさないものであるから、抗体の活性断片だけでなく抗体自体もヒト血小板の凝集を抑制し、活性断片とせず抗体そのものをヒトに投与して、ヒトの疾患の予防、診断および治療等に用いることができる。
用途：医薬
本発明の抗体はＧＰＶＩへの結合の特異性が高く、かつヒト由来であって、好ましくは、単独ではヒト血小板の凝集を促進または惹起する作用を有さないことから、特に、ヒトの疾患、例えば、血小板の活性化もしくは凝集、または血管内皮障害もしくは動脈硬化性の反応によって引き起こされる疾病の予防及び／または治療に有効であり、また、血栓もしくは塞栓に起因する疾患、例えば、血栓症及び塞栓症等の予防及び／または治療に利用することができる。これらの疾患には、動脈性血栓症のみならず、静脈性血栓症も含まれ、また、心房細動に起因する脳梗塞も含まれる。
本発明の抗体により予防及び／または治療が可能なヒトの疾患または病態としては、具体的には、心筋梗塞、血栓溶解療法時、経皮的冠静脈内腔拡張術施行時、ステント施行時、バイパス手術施行時もしくは人工血管施行時の、またはこれらの後の血管内皮肥厚、血管再狭窄、狭心症もしくは心筋梗塞、心房細動もしくは心房粗動及びこれらに起因する血栓症、塞栓症もしくは脳梗塞、閉塞性血栓性血管炎、急性動脈閉塞症、閉塞性動脈硬化症または深部静脈血栓症等があり、脳梗塞（アテローム性血栓性梗塞、ラクナ梗塞、心原性梗塞）、一過性脳虚血発作、くも膜下出血後の脳血管攣縮、肺血栓、肺塞栓症、血管性紫斑病、特発性血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、播種性血管内凝固症候群、体外循環時での血液凝固防止、全身性エリテマトーデス、多発性動脈炎、抗リン脂質抗体症候群、紫斑病性腎炎、糖尿病に伴う内皮細胞傷害、糖尿病性腎炎、糖尿病性網膜症、腎塞栓、移植治療に伴う合併症（肝静脈閉塞症、移植片対宿主病）等が挙げられる。
本発明の抗体は、また、先述の予防及び／または治療対象の疾患に対して、単独で投与されるか、あるいは他の薬理活性成分と併用されることもできる。かかる薬理活性成分とは、例えば公知の血栓溶解剤（例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）ならびにそれらの誘導体（改変体あるいはいわゆる第二世代といわれるものも含む）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ）、あるいは公知の抗血小板薬（例えばアスピリン、チクロピジン、クロピドグレル、トロンボキサンアンタゴニスト、トロンボキサン合成阻害剤、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト）、公知の抗凝固薬（例えばワーファリン、ヘパリン、低分子ヘパリン、ペンタサッカライド、トロンビン阻害剤、ＦＸａ阻害剤、ＦＶＩＩａ阻害剤）などが挙げられる。ここで併用とは、本発明の抗体と、当該薬理活性成分とをともに含む合剤を投与する他、本発明の抗体と当該薬理活性成分とがそれぞれ別個の製剤として一時期にもしくは時間をずらして投与される場合をも含み、患者の血中において同時に存在する限りにおいて投与の形態は問われない。
本発明の抗体ならびに製剤学的に許容される組成物を有効成分として含有する医薬品は、通常用いられる製剤用の担体や賦形剤、その他の添加剤を用いて例えば錠剤、注射剤、散剤、坐剤等に調製され、人間その他の動物に対して投与される。
ヒトに適用する場合、その投与経路は、経口投与、静脈内投与（ボーラス投与、連続点滴、間欠的点滴）、皮下投与、筋肉内投与、関節内投与、経皮投与、経鼻投与等があるが、通常、経口投与または静脈内投与である。本発明の抗体のヒトに対する臨床投与量は適用される患者の症状、体重、年齢や性別等を考慮して適宜決定されるが、通常成人一日あたり、静脈内投与で１〜１００００ｍｇ、好ましくは１０〜１０００ｍｇであり、これを１回あるいは数回にわけて投与する。投与量は種々の条件で変動するので、上記投与量範囲より少ない量で十分な場合もある。
ここで、本発明の抗体はＧＰＶＩを認識する点で共通するものの、本発明は異なる機序を有する多様な抗体を包含するものである。例えば、ＧＰＶＩとコラーゲンの結合を直接阻害する、またはＧＰＶＩを切断することにより血小板の活性化及び／または凝集を抑制する抗体は比較的即時的な効果を期待できるので、少なくとも疾患の急性期（例えば、心筋梗塞時もしくはＰＴＣＡ実施時またはそれらの直前もしくは直後）において有用である可能性がある。このような場合には、好ましくは血中の血小板表面のＧＰＶＩの大部分に本発明の抗体を結合させるために比較的大量の抗体を投与、例えば、単回もしくは分割静注または点滴静注することができる。また、ＧＰＶＩを内部に取り込ませる抗体は即時的効果は期待できないかもしれないが、ヒト血小板の血中での寿命（９〜１０日前後）及びヒト抗体の血中半減期（ＩｇＧの場合、数週間）を考慮すると持続的な効果が期待できるので、例えば、疾患の慢性期（例えば、心筋梗塞発症後またはＰＴＣＡ実施後数日〜数ヶ月）において有用である可能性がある。このような場合には、血中の血小板のコラーゲンに対する反応性を部分的に、好ましくは完全に、阻止する程度に血小板表面のＧＰＶＩを焼失させるために必要な量の抗体を比較的間隔を置いて、例えば、１クールを数日から数週間として、投与、例えば、単回もしくは分割静注または点滴静注することができる。従って、好ましい態様において、本発明の抗体はこれらの効果を併せ持っても良い。また、それぞれの効果が期待できる抗ＧＰＶＩ抗体を複数組み合わせた治療を実施しても良い。
非経口投与のための組成物は、通常、許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された免疫グロブリンの溶液又はそれの混液を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、リン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒトアルブミン溶液等が用いられ得る。これらの溶液は、無菌であり、そして一般的には微粒子物質が存在しない。これらの組成物は、慣用の、良く知られた滅菌方法により滅菌されうる。組成物は、生理学的条件に近づけるために、要求に応じて、薬学的に許容できる補助物質、例えばｐＨ調節及び緩衝化剤、毒性調節剤等、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムを含みうる。これらの製剤中の抗体の濃度は、広範囲に、即ち、約０．００５重量％未満（通常は、少なくとも約１重量％）から１５又は２０重量％と大きい量まで変化することができ、主として、選択された投与の特定の様式に従って、液容量、粘性等に基づいて選択される。
非経口投与組成物を調製するための現実の方法は、本技術分野の熟練者にとって公知又は明白であり、例えば、レミントンズ  ファーマシューティカル  サイエンス（第１５版、マック  パブリッシング  カンパニー、イーストン、ペンシルバニア、１９８０）（本引例をもって本明細書の一部と成す）に更に詳細に記載されている。洗浄（ｌａｖａｇｅ）又はその他のルートのために適した組成物は、意図される特定の使用に従って選択される。いくつかの薬学的組成物は、抗ＧＰＶＩ抗体及びその疾患に於いて常用される他の治療剤を含みうる。いずれの場合も、ボーラス投与および持続投与が適用されうる。また、予防的または治療的有効量は、対象疾患、病態および患者の状態等によって適宜決定される。
本発明の抗体は、貯蔵のため凍結又は凍結乾燥され、使用に先だって適当な担体中で再構成されうる。この技術は、慣例の免疫グロブリンにおいて有効であると知られており、公知の、凍結乾燥及び再構成技術が用いられ得る。凍結乾燥及び再構成が、様々な程度の抗体の活性損失をもたらしうる（例えば、慣例の免疫グロブリン、ＩｇＭ抗体は、ＩｇＧ抗体よりも大きい活性損失を生じる傾向にある）ということ、及び使用レベルが、それを補うために調節されなけらばならないかもしれないということは、当業者にとって認識されることである。
用途：ＧＰＶＩ検出
本発明の抗体または抗体の活性断片を用いて、被検試料中のＧＰＶＩを検出する方法は、被験試料と本発明の抗体または抗体の活性断片を接触させる工程、本発明の抗体または抗体の活性断片に結合した被検試料中のＧＰＶＩを検出する工程を含み得る。被検試料中のＧＰＶＩを定量する工程を更に含んでも良い。被験試料中のＧＰＶＩを検出する方法により、疾患の診断を行うことができる。特に、ヒトの疾患、例えば、血栓性、塞栓性または動脈硬化性の疾患の診断に利用することができる。
本発明の抗体を用いて、被検試料中のＧＰＶＩを検出する方法としては、サンドイッチＥＬＩＳＡ系、インヒビションＥＬＩＳＡ系、蛍光抗体法、免疫組織化学染色法、放射性物質標識免疫抗体法、ウエスタンブロッティング法、免疫沈降法などがあげられるが、これらに限定されるものではない。対象となる被検試料は限定されないが生物試料が用いられ、動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片が挙げられるが、血小板であることが好ましい。
本発明の抗体または抗体の活性断片を用いて、ＧＰＶＩ又は血小板上のＧＰＶＩのコラーゲンに対する結合を阻害する方法は、ＧＰＶＩ又は血小板表面上のＧＰＶＩと本発明の抗体または抗体の活性断片を接触させる工程、ＧＰＶＩ又は血小板表面上のＧＰＶＩとコラーゲンを接触させる工程、本発明の抗体または抗体の活性断片によるＧＰＶＩ又は血小板表面上のＧＰＶＩのコラーゲンに対する結合を阻害する工程の少なくとも一つを含み得る。
本発明の抗体または抗体の活性断片によるＧＰＶＩ又は血小板上のＧＰＶＩの血小板凝集に対する阻害作用を検出する工程は、前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ系の他、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系を用いることも可能である。ここでいうｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ系とは、生体に本発明の抗体または抗体の活性断片を投与し、当該抗体または抗体の活性断片が生体の機能やステータスに与える影響を検出する評価系を意味する。たとえば、コラーゲン投与モデル動物に本発明の抗体または抗体の活性断片を投与し、病態の重篤度の指標に与える影響を評価する系が例として挙げられる。
【実施例】  以下に、実施例をもって本発明を一層具体的に説明するが、これらは一例として示すものであり、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。また、以下の記載において用いる略号は、当該分野における慣用略号に基づくものである。
［実施例１］  ヒト可溶型ＧＰＶＩ−Ｆｃの作製
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ用の抗原及びスクリーニング用抗原として用いるため、ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインとヒトＩｇＧのＦｃフラグメントとの融合蛋白質（ＧＰＶＩ−Ｆｃ）を作製した。なお、ＤＮＡ操作は特に断りのない限り、モレキュラークローニング第二版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１））にしたがって行った。
ＧＰＶＩ−Ｆｃ発現プラスミドは、以下の手順により遺伝子工学的に作製した。まず、江角らがクローニングしたヒトＧＰＶＩ  ｃＤＮＡを組込んだプラスミドｐＢＫ−ＣＭＶ−ＧＰＶＩ−１（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０００  Ｏｃｔ  １４；２７７（１）：２７−３６）を鋳型とし、センスプライマー１（配列番号３３。５’末端側に制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む）およびアンチセンスプライマー１（配列番号３４。５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を含む）を用いてＰＣＲを行い、ヒトＧＰＶＩ細胞外ドメイン（２６９アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを得た。一方、ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインｃＤＮＡが含まれるプラスミドｐＭ１３０４（ＷＯ９７／４２３１９に記載）を鋳型としＰＣＲを行い、あらためてＧＰＶＩ細胞外ドメインにインフレームで連結可能となるヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン（５０６アミノ酸）をコードするｃＤＮＡを得た。このＰＣＲのためのセンスプライマー２（配列番号３５）は、ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインＮ末端側をコードするｃＤＮＡ配列を含み、さらにその５’末端側に制限酵素ＢａｍＨＩ認識配列を配置して設計し、またアンチセンスプライマー２（配列番号３６）はヒトＩｇＧ１ＦｃドメインＣ末端側に制限酵素ＫｐｎＩ認識配列を配置して設計したものを使用した。ＰＣＲにより得られた二つのｃＤＮＡ断片を制限酵素で処理した後、哺乳動物細胞を宿主とする発現プラスミドであるｐＣＡＧＧＳ（特許第２８２４４３４号公報）のクローニング部位に挿入した。すなわち、ヒトＧＰＶＩ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片は制限酵素ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで切断し、ヒトＩｇＧ１ＦｃドメインをコードするｃＤＮＡ断片は制限酵素ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで切断した。ｐＣＡＧＧＳのクローニング部位にはリンカーを挿入し、適当な制限酵素切断部位（ＸｂａＩ、ＫｐｎＩ）を付加した後に、ヒトＧＰＶＩ細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡおよびヒトＩｇＧ１ＦｃドメインをコードするｃＤＮＡがインフレームで連結させて挿入した。この工程を図１に示す。
得られた発現プラスミド（ｐＣＡＧＧＳ−ＧＰＶＩ−Ｆｃ）を基にバキュロウイルスへのトランスファーベクターおよび組換えウイルスを作製し、カイコ蛹での発現を行った。すなわち、ｐＣＡＧＧＳ−ＧＰＶＩ−Ｆｃを制限酵素ＸｂａＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩで切断することによりＧＰＶＩ−ＦｃをコードするＤＮＡ断片を切り出し、その末端をＢｌｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて平滑末端とした。そのＤＮＡ断片をバキュロウイルスへのトランスファーベクターであるｐＹＮＧのＳｍａＩ部位に挿入し、ポリヘドリンプロモーターに対して正方向で挿入されているクローン（ｐＹＮＧ−ＧＰＶＩ−Ｆｃ）を選択した。この工程を図２に示す。そのクローンを基に組換えウイルスを作製し、ウイルス感染細胞でのＧＰＶＩ−Ｆｃ蛋白質の発現をウエスタンブロッティングで確認した。最終的に作製したウイルス溶液をカイコ蛹に接種することにより、ＧＰＶＩ−Ｆｃの発現を行った。
その結果、カイコ蛹磨砕液中に充分な量のＧＰＶＩ−Ｆｃの発現が認められ、その磨砕液をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）に供することによりＧＰＶＩ−Ｆｃの精製を行った。
［実施例２］  抗ＧＰＶＩ自己抗体を有するヒトの末梢血リンパ球を用いた抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体の作製
抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体はＧＰＶＩに対する自己抗体を有していることが確認されている供血者のリンパ球とミエローマ細胞を融合し、以下のように調製した。まず、書面にて同意を得た供血者から無菌的に採血したヘパリン加血液６ｍｌを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）を３ｍｌ加えたＬｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に重層し、１０００ｇにて遠心し、リンパ球分画を回収した。得られたリンパ球分画をダルベコＰＢＳ（以下、Ｄ−ＰＢＳと記載する場合がある）にて８００ｇで２回遠心洗浄後、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に懸濁し、７．４×１０７個の細胞を得た。
前記リンパ球分画に、ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ）を２．５μｇ／ｍｌ、ＬＰＳ（ＤＩＦＣＯ）を２０μｇ／ｍｌ、実施例１記載の精製ＧＰＶＩ−Ｆｃを１０μｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、細胞濃度は１×１０６個／ｍｌとなるように調製し３日間培養しリンパ球の活性化を行った。なお、培養時に、さらにＩＬ−４（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を４００Ｕ／ｍＬを添加し、また、培養期間を８日間にする等、適宜条件を微調整し、リンパ球の活性化を試みた。細胞融合は安藤ら（単クローン抗体実験操作法入門、安東民衛・千葉丈／著、講談社）にしたがい、活性化したヒトリンパ球とマウスミエローマ細胞（ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）を４：１で混合し５０％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ）により細胞を融合した。融合後、１０％ＦＣＳ、１×ＨＡＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭに懸濁し、１０日間培養後に、増殖したハイブリドーマの培養上清をサンプリングし、目的の抗体を産生しているハイブリドーマをＥＬＩＳＡ法によりスクリーニングした。
すなわち、精製ＧＰＶＩ−Ｆｃを１ウエルあたり０．２５μｇ添加して固相化したイムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）にハイブリドーマの培養上清５０μＬを添加し３７℃で１時間反応した。対照としてヒト精製Ｆｃ（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を同様に固相化したウエルを調製し、培養上清を添加し反応させた。反応終了後、各ウエルを洗浄し、次にペルオキシダーゼ標識抗ヒトカッパ抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ１２９）またはペルオキシダーゼ標識抗ヒトラムダ抗体（ＤＡＫＯ、Ｐ１３０）を各ウエルに添加した。３７℃１時間反応後、同様に洗浄し、ＴＭＢ発色液（ＢｉｏＦｉｘ）を各ウエルに添加し１０分反応後、０．５Ｍ硫酸溶液を添加し反応を停止した。続けてプレート吸光度計により４５０ｎｍの吸光度を測定し、精製ヒトＦｃでは吸光度が上昇せず、ＧＰＶＩ−Ｆｃを固定化したウエルのみで吸光度が上昇する、すなわち抗ＧＰＶＩ抗体を産生しているハイブリドーマが存在するウエルを選択した。
さらに、限界希釈法により培養を行い単一クローンを得た。すなわち、１０日間培養後の培養液について前記と同様にスクリーニングを行い、抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体を産生するハイブリドーマを得た。
選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳを含むＨｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭで培養後、無血清化し抗体を産生させた。ＩｇＭ抗体はマニュアルに従いＰｒｏｓｅｐ−ＴｈｉｏｓｏｒｂＭカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）により精製し、ＩｇＧ抗体はＰｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて精製した。精製抗体は０．０７６Ｍ  リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ｐＨ６．４）で透析し、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
［実施例３］  作製した抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体のタイピング
実施例２で得られた抗体のタイピングはＨｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｓｕｂｃｌａｓｓ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びウエスタンブロティングにより行った。ＥＬＩＳＡはマニュアルに従い、抗体の希釈液をサンプルとして使用した。キットで検出されなかった抗体は、それぞれ約１μｇを４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離後、ＰＶＤＦ膜（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）に転写し、ウエスタンブロッティングを行った。すなわち、ＰＶＤＦ膜をブロッキング後、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体（Ｐ０３２２、ＤＡＫＯ）と反応した。洗浄後、ＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）と反応させ、ライトキャプチャ（ＡＴＴＯ）により反応するバンドを検出した。得られた抗ＧＰＶＩ抗体のタイビング結果を表１に示した。
2005007800.tif 000002
［実施例４］  抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体のＧＰＶＩ結合活性の測定（ＥＬＩＳＡ法）
実施例２で得られた精製抗体のＧＰＶＩ結合活性を、実施例２に記載のＥＬＩＳＡ法にて測定した。実施例２においてハイブリドーマの培養上清の代わりに、実施例２で調製した精製抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体２０ｎｇを添加し、対照として精製ヒトＩｇＭ（Ｃａｐｐｅｌ）を使用した。
その結果、図３に示すように対照として使用したヒトＩｇＭでは吸光度が上昇しないのに対し、選択されたハイブリドーマの産生する精製抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体では、いずれも顕著な吸光度上昇が認められ、調製した抗体が特異的にＧＰＶＩを認識していることが確認された。
［実施例５］  抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体によるＧＰＶＩ−Ｆｃのコラーゲンへの結合抑制の検討
実施例２で得られた抗体が特異的にＧＰＶＩとコラーゲンとの結合を阻害していることを確認する目的で蛋白相互作用解析装置（ＢＩＡＣＯＲＥ３０００）を用いた解析を行った。まず、ヒトコラーゲンＴｙｐｅＩ（生化学工業）をＢＩＡＣＯＲＥ社のマニュアルに従い、ＣＭ５チップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）上にコラーゲンを６３０３ＲＵ（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）固定化した。ここでＲＵはＢＩＡＣＯＲＥ装置で使用されるレスポンスを表す単位であり、１０００ＲＵは約１．２ｎｇの物質が結合したことを示す。ＧＰＶＩ−Ｆｃと、精製ヒトＩｇＭまたは精製抗ＧＰＶＩ抗体とをそれぞれ５０μｇ／ｍｌとなるように混合し、コラーゲン固定化チップにインジェクトした。
［実施例６］  ヒト血小板凝集能に及ぼす抗体の影響
文書により同意を得た健常人より採血した血液から常法（Ｔａｋａｙａｍａ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１７４，ｐｐ．９２２−９２７（１９９１））に準じて血小板を調製し、終濃度約２×１０８〜３×１０８個／ｍＬで使用した。血小板凝集能の測定は、Ｅｚｕｍｉ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｌｏｏｄ，９９，ｐｐ．３２５０−３２５５（２００２））に準じて以下のように実施した。被検物質である実施例２で得た抗体またはその溶媒を添加した後、３７℃で５分間インキュベートした。さらにＣａＣｌ２溶液を終濃度で１ｍＭとなるように添加し、３７℃で撹拌しながら３分間インキュベートした。コラーゲン（ＮＹＣＯＭＥＤ  ＰＨＡＲＭＡ  ＧＭＢＨ）の溶液を終濃度で３ないし４μｇ／ｍＬとなるように加え、血小板凝集能測定装置（興和株式会社  ＰＡ−２００）にて光透過率を経時的に測定する事により、抗体のコラーゲン惹起血小板凝集抑制作用を測定した。その結果を表２に示した。なお、血小板凝集の測定結果は、光透過率が最大となった時点での透過率（最大凝集率）で表した。
次に、コラーゲンの代わりに血小板凝集惹起物質としてヒトトロンビン（Ｓｉｇｍａ）を０．３単位／ｍＬの濃度になるように添加し、同様に抗体の血小板凝集へ及ぼす影響を測定した。その結果、１０μｇ／ｍＬの抗体濃度における最大凝集率は、＃２−４抗体の場合は９６％であった。
さらに、前記の測定において、コラーゲン等の血小板凝集惹起物質を添加せずに、被検物質（抗体）単独での血小板凝集惹起作用を測定した結果、１０μｇ／ｍＬの抗体濃度における最大凝集率は、＃２−４抗体の場合は３％であった。
以上の結果から、＃２−４抗体は、単独で血小板凝集惹起作用は有さず、コラーゲンによる血小板凝集のみを特異的に抑制する事が観察された。
2005007800.tif 000003
［実施例７］  抗ＧＰＶＩモノクローナルヒト抗体の解離定数の測定
実施例６で血小板凝集抑制活性が確認された抗体の解離定数を蛋白相互作用解析装置（ＢＩＡＣＯＲＥ３０００）を用いて測定した。実施例１記載の精製ＧＰＶＩ−ＦｃをＢＩＡＣＯＲＥ社のマニュアルに従い、ＣＭ５チップ上に固定化した。＃２−４抗体についてＢＩＡＣＯＲＥ３０００のＷｉｚａｒｄ  Ｐｒｏｇｒａｍにて測定し、ＢＩＡＣＯＲＥ社のＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトを用いて解析したところ、＃２−４抗体の解離定数（Ｋｄ）は４．１３×１０−８Ｍと算出された。
［実施例８］  抗ＧＰＶＩ抗体のＣＤＲアミノ酸配列の決定
実施例２のＥＬＩＳＡ法によるスクリーニングにて選択されたハイブリドーマを実施例２に従って培養した。細胞濃度が２×１０５個／ｍｌになった段階で培養液を回収し、回収した細胞よりＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｍＲＮＡを抽出した。次に、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−ｓｔｒａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従って、ｍＲＮＡからオリゴｄＴプライマーにより一本鎖ｃＤＮＡを合成した。論文（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９９５  Ｆｅｂ  ２７；１７９（２）：２０３−１４およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１  Ｄｅｃ  ５；２２２（３）：５８１−９７）の情報を参考にして重鎖および軽鎖可変領域を増幅させるＰＣＲプライマー（配列は表３に記載）を合成し、先に調製したハイブリドーマ由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。増幅されたＤＮＡのバンドを２％アガロースを用いて確認後、ＰＣＲ産物をスピンカラム（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製した。精製されたＰＣＲ産物とｐＴ７ＢｌｕｅＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）を混和し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いて１６℃、３０分でライゲーション反応を行った。その反応液を用いてコンピテントセルＥ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９、ＴＡＫＡＲＡ）にトランスフォーメーションを行い、Ｘ−Ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢプレートに播種し、１晩培養した。出現した白コロニーをピックアップし、Ｅｘ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）、Ｕ−１９ｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列は表３に記載）、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ（配列は表３に記載、Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、コロニーダイレクトＰＣＲでインサートがベクターに挿入されていることを確認した。次に、インサートが確認されたコロニーをＬＢ培地で一晩培養し、ＱＩＡＧＥＮ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製したプラスミドはＵ−１９ｍｅｒ  ｐｒｉｍｅｒ、Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｐｒｉｍｅｒを用いてＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス）により反応後、シークエンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１００（アプライドバイオシステムズ）を用いて解析を行った。
決定したＣＤＲ配列を表４に示した。なお、＃２−４のクローンのＶＬ  ＣＤＲ３をコードする塩基配列（配列番号２８）のうち３１番目のグアニンは実際には検出されていないが、他のクローンの解析結果よりグアニンであることが予想される。この予想に基づいて、＃２−４のクローンのＶＬ  ＣＤＲ３（配列番号１２）およびＶＬ  ＣＤＲ（配列番号１６）のアミノ酸配列を記載している。
2005007800.tif 000004
2005007800.tif 000005
2005007800.tif 000006
なお、表５および表６に、＃２−４および＃２−６のクローンのＨ鎖およびＬ鎖可変領域のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列をそれぞれ示し、表７に＃２−４および＃２−６のクローンのＣＤＲのヌクレオチド配列を示す。
2005007800.tif 000007
2005007800.tif 000008
2005007800.tif 000009
［実施例９］  遺伝子組替えによるヒト抗体の生産
（１）組換えヒトＩｇＧ発現プラスミドの構築
データベース情報を参考にヒトＩｇＧ重鎖遺伝子の翻訳開始コドンのＡＴＧを含むようなセンスプライマーおよび翻訳中止コドンを含むアンチセンスプライマーを作製し、ＨｕｍａｎＳｐｌｅｅｎ５’−ＳｔｒｅｔｃｈｃＤＮＡＬｉｂｒａｒｙ（クローンテック社製）を鋳型としてＰＣＲを行う。増幅したＤＮＡ断片をヒトＩｇＧ遺伝子をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み塩基配列を確認する。ヒトＩｇＧ遺伝子の内部を切断しない適切な制限酵素によりヒトＩｇＧ遺伝子をｐＴ７Ｂｌｕｅから切り出した後、発現プラスミドであるｐＣＡＧＧＳのクローニング部位に挿入し、ヒトＩｇＧ重鎖発現プラスミドの構築を行う。なお、ヒトＩｇＧ軽鎖発現プラスミドの構築も重鎖の場合と同様の方法で行う。
（２）抗体遺伝子のクローニング
ハイブリドーマ＃２−６を培養し、細胞を調製する。得られた細胞をＤ−ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ）で洗浄後、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて単離精製する。次にＯｌｉｇｏ−ｄＴプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成する。重鎖および軽鎖可変領域を増幅させるＰＣＲプライマーを合成し、ハイブリドーマ由来の一本鎖ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行う。増幅したＤＮＡ断片をｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に組み込み塩基配列の確認を行う。
（３）ヒト−ヒトキメラ抗体発現プラスミドの構築
ヒトＩｇＧ遺伝子の重鎖可変領域を切り出すことができる適当な制限酵素を用いて重鎖可変領域を切り出し、ハイブリドーマ由来重鎖可変領域と置き換える。この時、ハイブリドーマ由来重鎖可変領域のＤＮＡ断片は、挿入する制限酵素切断部位と同じ配列を含むプライマーによりＰＣＲで増幅させる。ハイブリドーマ由来軽鎖可変領域を有する組換えヒトＩｇＧ発現プラスミドの構築も重鎖の場合と同様の方法で行う。
（４）ヒト−ヒトキメラ抗体産生クローンの選択
ＣＨＯ（ＣＣＬ−６１）又はＳＰ２／Ｏ−ａｇ１４（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）に導入し、培養後上清に産生される目的抗体をＧＰＶＩに対する結合活性により選択する。具体的には、先ず、キメラ抗体重鎖発現プラスミド、軽鎖発現プラスミド、ｐＳＶ２−ｎｅｏをそれぞれ４μｇ（計１２μｇ）とトランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティクス）６０μｇＬを混合し、しばらく清置する。次に培養面積１５０ｃｍ２の培養用フラスコにおいてセミコンフルエントの状態まで培養した細胞の培養液中にプラスミドとＦｕＧＥＮＥの混合液を添加する。２、３日の培養後、細胞を９６ｗｅｌｌマイクロプレートに０．７個／ｗｅｌｌとなるように播種し、０．２ｍｇ／ｍｌＧ−４１８を含む培地にてさらに２、３週間の培養を行う。コロニーが形成されたｗｅｌｌから培養上清を回収し、ＥＩＡにてＧＰＶＩとの結合活性を調べ、結合活性を有するクローンを得る。
（５）ヒト−ヒトキメラ抗体の産生
ヒト−ヒトキメラ抗体産生クローンを血清入りの培地で培養し、コンフルエントになった段階で無血清培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｔｅｃ）と交換した後、さらに２日間の培養を行う。得られた培養上清をプロテインＡカラム（Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ、ミリポア）で精製し、精製キメラ抗体を得る。
［実施例１０］  ハイブリドーマ由来抗ＧＰＶＩ抗体のＩｇＧ４化およびＦａｂ化の作製
（１）材料および装置
用いた材料および装置を以下に示した。
・プライマー（ＳＩＧＭＡ  Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｊａｐａｎにて合成）
2005007800.tif 000010
2005007800.tif 000011
・ＰＣＲ反応用酵素
Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）
１０Ｘ反応バッファーおよびｄＮＴＰ  ｍｉｘｔｕｒｅは付属のものを使用
・ゲノムＤＮＡ
ＨｅＬａ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌｏｔ．Ｎ３４７０７−１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
マウス  ゲノムＤＮＡ（Ｂ６マウス尾部より抽出）
・ＰＣＲ装置
ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ（ＭＪ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ，ＩＮＣ．）
・アガロースゲル電気泳動
ＳｅａＫｅｍ  ＧＴＧ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）
サブマリン型電気泳動装置（ＡＤＶＡＮＣＥ）
５０Ｘ  ＴＡＥ（２ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ａｃｅｔａｔｅ，０．０５ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）（ＮＩＰＰＯＮ  ＧＥＮＥ）
分子量マーカー（ＳｔｙＩ消化λＤＮＡ断片）
・ゲルからのＤＮＡ断片抽出キット
ＱＩＡＥＸ  ＩＩ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｋ．Ｋ．）
・哺乳細胞用発現ベクター
ｐＥＦ２ｃｅｗ（ｐＥＦ−ＢＯＳのＥＦプロモーター上流に、ＣＭＶエンハンサーを付加した改良型発現ベクター）
・ＴＡクローニング用ベクター及びライゲーション用試薬
ｐＴ７ＢｌｕｅＴ（ＮＯＶＡＧＥＮ）
ＴａＫａＲａ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｖｅｒ．２（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）
・Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌ  ＪＭ１０９（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ．）
・プラスミド精製キット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｋ．Ｋ．）
・シークエンス用キットおよび解析装置
ＤＹＥｎａｍｉｃ  ＥＴ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｋｉｔ  ｌｏｔ．１７６７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＡＢＩ３１００  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）
・培養液
ダルベッコＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ）
・トランスフェクション用試薬
ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュダイアグノスティックス）
（２）実験方法
用いた主な実験方法を以下に示した。
・ＰＣＲ反応
酵素付属の取り扱い説明書に従って行った。以下に、反応液の組成例を示した。
反応液
ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（５ｕｎｉｔｓ／μＬ）              ０．２５μＬ
１０Ｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  Ｂｕｆｆｅｒ                            ５μＬ
ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍＭ  ｅａｃｈ）              ４μＬ
ｈｕｍａｎ  ｋｉｄｎｅｙ  ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  １μＬ
ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）                １μＬ
ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）      １μＬ
Ｈ２Ｏ                                                      ３７．７５μＬ
（ａ）アガロースゲル電気泳動
まず、０．８％濃度のアガロースゲルを作製した。これを１ｘ  ＴＡＥを満たした泳動層に置き、ウエルにサンプル５μＬをアプライ後、１３５Ｖで１５分間泳動を行った。泳動終了後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、さらにＵＶ照射することでバンドを検出した。尚、分子量マーカーを同時に泳動した。
（ｂ）ゲルからのＤＮＡ断片抽出
目的とするバンドを剃刀で切り出し、ＱＩＡＥＸ  ＩＩキットを用いてゲル片から抽出を行った。方法は付属の取扱説明書に従った。抽出されたＤＮＡ断片は２０μＬの滅菌水に溶解した。
（ｃ）ライゲーション反応
抽出を終えたＤＮＡ断片１μＬとクローニング用ベクターのｐＴ７ＢｌｕｅＴを１μＬ、およびｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ  ｖｅｒ．２のＩ液２μＬを混和し、室温で１５分間静置することで行った。
（ｄ）大腸菌への形質転換
コンピテント大腸菌５０μＬを氷上で融解し、ライゲーション反応産物４μＬを加え、そのまま氷上に３０分間静置した。４２℃で４５秒間熱ショックを与え、終濃度５０μｇ／ｍＬアンピシリン含有ＬＢプレート上に塗布し、３７℃で一晩インキュベートした。
（ｅ）プラスミドの精製およびシークエンス反応
それぞれキットの取り扱い説明書に従って行った。
（ｆ）トランスフェクション
ＦｕＧＥＮＥ６の取り扱い説明書に従って行った。６穴プレートの場合、トランスフェクション前日にＣＯＳ−１細胞を１．５ｘ１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で各ウェルに２ｍＬ植え込んでおく。翌日、９７μＬのダルベッコＭＥＭ培地に３μＬのＦｕＧＥＮＥ６と１μｇの発現プラスミドを混和し１５分以上静置した後、２ｍＬの無血清ダルベッコＭＥＭ培地に滴下し、この培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。
（３）重鎖可変領域および軽鎖をコードする遺伝子のクローニング
１）各ハイブリドーマから抽出した全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマーを用いた逆転写反応により、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、以下に示す各反応により、各重鎖可変領域および軽鎖をコードする遺伝子断片をそれぞれ増幅した。
ａ）＃２−４      一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー（ＨＶ３−１１−ａおよびＩｇＭ−１）を用いたＰＣＲ反応で重鎖可変領域のｃＤＮＡを特異的に増幅した。一方、プライマー（ＩＧＬＶ１−５１−ａおよびＩｇＬ−ｂ）を用いた１回目のＰＣＲ反応を行い、次にその反応産物を鋳型とし、プライマー（ＩＧＬＶ１−５１−ｂおよびＩｇＬ−ａ）を用いた２回目のＰＣＲ反応（ｎｅｓｔｅｄ−ＰＣＲ）を行うことにより、軽鎖ｃＤＮＡを増幅した。
ｂ）＃２−６      一本鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマー（ＨＶ３−１１−ａおよびＩｇＭ−１）を用いたＰＣＲ反応で重鎖可変領域のｃＤＮＡを特異的に増幅した。同様に、プライマー（ＩＧＬＶ２−１４−ａおよびＩｇＬ−ｂ）を用いたＰＣＲ反応を行い、軽鎖ｃＤＮＡを増幅した。
２）各増幅断片をｐＴ７−ＢｌｕｅＴベクターにクローニングし、配列を確認した。＃２−４の重鎖可変領域を有するプラスミドをｐＴ７−＃２−４Ｈ、軽鎖を有するものをｐＴ７−＃２−４λとし、＃２−６も同様に、それぞれｐＴ７−＃２−６Ｈ、ｐＴ７−＃２−６λとした。
（４）重鎖定常領域（Ｃγ４）をコードする遺伝子のクローニング
ＨｅＬａゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー対でＰＣＲ反応を行った。その結果、ＩｇＧ４−ａおよびＩｇＧ４−ｄではＣＨ１ドメイン、ＩｇＧ４−ｃおよびＩｇＧ４−ｇではヒンジ部分、ＩｇＧ４−ｆおよびＩｇＧ４−ｉではＣＨ２ドメイン、ＩｇＧ４−ｈおよびＩｇＧ４−ｋではＣＨ３ドメインというように、各ドメインをコードする遺伝子領域が増幅された。次に、これら４種の増幅産物を混合し、プライマーＩｇＧ４−ｍおよびＩｇＧ４−ｊを用いたＰＣＲ反応を行うことで、各ドメインが連結された増幅産物を得た。この増幅産物をｐＴ７−ＢｌｕｅＴベクターにクローニングし、重鎖定常領域（Ｃγ４）をコードする配列であることを確認し、ｐＴＫ−２２３２とした。
（５）抗体発現用の重鎖発現プラスミドの構築
ｐＴ７−＃２−４ＨおよびｐＴ７−＃２−６Ｈの重鎖可変領域をコードする遺伝子領域を、プライマー（Ｍ４およびＨｃｈａｉｎＲＥＶ−ＳｃａＩ）を用いたＰＣＲ反応で増幅した後、その増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲ  ＩおよびＳｃａ  Ｉで切断することで、断片Ａを調製した。
一方、ｐＴＫ−２２３２を制限酵素Ｅｃｏ  ４７ＩＩＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断し、重鎖定常領域（Ｃγ４）をコードする遺伝子断片Ｂを調製した。
これらの断片を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断して調製した発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に、断片Ａ＋断片Ｂとなるように連結し、各重鎖発現プラスミドを構築した。配列を確認後、ｐＴＫ−＃２−４γおよびｐＴＫ−＃２−６γとした。
（６）Ｆａｂ発現用の重鎖発現プラスミドの構築
▲１▼Ｆａｂ重鎖のみを発現するプラスミドの構築
ｐＴ７−＃２−４ＨおよびｐＴ７−＃２−６Ｈの重鎖可変領域をコードする遺伝子領域を、プライマー（Ｍ４およびＨｃｈａｉｎＥｃｏ４７ＮｈｅＩ）を用いたＰＣＲ反応で増幅した後、その増幅産物を制限酵素ＥｃｏＲ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉで切断することで、断片Ｃを調製した。
一方、ｐＴＫ−２２３２を鋳型とし、プライマー（ＩｇＧ４−ｍおよびＩｇＧ４−ｎ）を用いたＰＣＲ反応を行い、ＣＨ１ドメインの直後に停止コドンを有するＣＨ１遺伝子断片を増幅した。このＣＨ１増幅断片をｐＴ７−ＢｌｕｅＴベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＩｇＧ４ｍｎを構築した。このｐＴ７−ＩｇＧ４ｍｎを制限酵素Ｎｈｅ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで切断し、断片Ｄを調製した。
これらの断片を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断して調製した発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に、断片Ｃ＋断片Ｄとなるように連結し、各Ｆａｂ重鎖のみを発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、ｐＴＫ−＃２−４ＦａｂおよびｐＴＫ−＃２−６Ｆａｂとした。
▲２▼Ｃ末端にヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有するＦａｂ重鎖（Ｆａｂ−Ｈｉｓ）を発現するプラスミドの構築
ｐＴＫ−２２３２を鋳型とし、プライマー（ＩｇＧ４−ｍおよびＩｇＧ４−ｔ）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＣＨ１ドメインの直後にＨｉｓ−ｔａｇを有するＣＨ１遺伝子断片を増幅した。このＣＨ１増幅断片をｐＴ７−ＢｌｕｅＴベクターにクローニングし、ｐＴ７−ＩｇＧ４ｍｔを構築した。このｐＴ７−ＩｇＧ４ｍｔを制限酵素Ｎｈｅ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断し、断片Ｅを調製した。
これらの断片を、ＥｃｏＲ  ＩおよびＢａｍ  ＨＩで切断して調製した発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に、断片Ｃ＋断片Ｅとなるように連結し、Ｃ末端にＨｉｓ−ｔａｇを有するＦａｂ重鎖を発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、ｐＴＫ−＃２−４Ｆａｂ−ＨｉｓおよびｐＴＫ−＃２−６Ｆａｂ−Ｈｉｓとした。
（７）軽鎖発現プラスミドの構築
各軽鎖遺伝子を有するプラスミド（ｐＴ７−＃２−４λおよびｐＴ７−＃２−６λ）を、軽鎖部分を切断しない適当な制限酵素（例えばＥｃｏ  ＲＩおよびＸｂａ  Ｉ等）で切り出し、断片Ｆを調製した。
この断片Ｆを同じ制限酵素で切断して調製した発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に連結し、各軽鎖発現プラスミドを構築した。配列を確認後、ｐＴＫ−＃２−４λおよびｐＴＫ−＃２−６λとした。
（８）組換え抗体およびＦａｂの発現
１）ＣＯＳ−１細胞は１０％胎仔ウシ血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代し、トランスフェクション前日に、１．５ｘ１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で培養容器に植え込んだ。翌日、重鎖（あるいはＦａｂ）発現プラスミドおよび軽鎖発現プラスミドをトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュダイアグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコＭＥＭ培地に滴下し、これを培養液と交換することで、コトランスフェクションを行った。
その結果、ｐＴＫ−＃２−４γおよびｐＴＫ−＃２−４λをコトランスフェクションした場合には、組換えＩｇＧ４抗体であるＲ＃２−４抗体を培養液中に分泌発現させることができた。同様に、ｐＴＫ−＃２−６γおよびｐＴＫ−＃２−６λを用いることでＲ＃２−６抗体を、ｐＴＫ−＃２−４ＦａｂおよびｐＴＫ−＃２−４λ、あるいはｐＴＫ−＃２−６ＦａｂおよびｐＴＫ−＃２−６λを用いることで、組換えＦａｂ（Ｒ＃２−４ＦａｂおよびＲ＃２−６Ｆａｂ）を、ｐＴＫ−＃２−４Ｆａｂ−ＨｉｓおよびｐＴＫ−＃２−４λ、あるいはｐＴＫ−＃２−６Ｆａｂ−ＨｉｓおよびｐＴＫ−＃２−６λを用いることで、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する組換えＦａｂ（Ｒ＃２−４Ｆａｂ−ＨｉｓおよびＲ＃２−６Ｆａｂ−Ｈｉｓ）を培養液中に分泌発現させることができた。
２）５％  ＣＯ２存在下、３７℃で２〜３日間培養し、培養液を回収した。
（９）組換え抗体の精製
【組換えＩｇＧ抗体の精製】
培養液からの、組換えＩｇＧ４抗体（Ｒ＃２−４抗体およびＲ＃２−６抗体）の精製は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
【組換えＦａｂの精製】
１）培養液からの、組換えＦａｂ分子（Ｒ＃２−４ＦａｂおよびＲ＃２−６Ｆａｂ）の精製は、抗ヒトｌａｍｂｄａ軽鎖抗体カラム（自家作製）を用いて行った。
２）培養液からの、Ｈｉｓ−ｔａｇを有する組換えＦａｂ分子（Ｒ＃２−４Ｆａｂ−ＨｉｓおよびＲ＃２−６Ｆａｂ−Ｈｉｓ）の精製は、先ずＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて１回目の精製を行った後、抗ヒトｌａｍｂｄａ軽鎖抗体カラムを用いて２回目の精製を行うことで達成した。
３）全てのＦａｂは精製後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析し、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。尚、血小板凝集阻害実験に使うＦａｂは生理食塩水で透析した。
［実施例１１］  ヒトＧＰＶＩ−マウスＦｃ融合蛋白質の作製
（１）ＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白発現プラスミドの構築
１）マウスゲノムＤＮＡを鋳型とし、以下のプライマー対でＰＣＲ反応を行った。その結果、ｍＩｇＧ２ｃ−ａおよびｍＩｇＧ２ｃ−ｃではＣＨ１ドメイン、ｍＩｇＧ２ｃ−ｂおよびｍＩｇＧ２ｃ−ｅではヒンジ部分、ｍＩｇＧ２ｃ−ｄおよびｍＩｇＧ２ｃ−ｇではＣＨ２ドメイン、ｍＩｇＧ２ｃ−ｆおよびｍＩｇＧ２ｃ−ｈではＣＨ３ドメインというように、マウスイムノグロブリン（ｍＩｇＧ２ｃ）重鎖定常領域の各ドメインをコードする遺伝子領域が増幅された。次に、これら４種の増幅産物を混合し、プライマーｍＩｇＧ２ｃ−ａおよびｍＩｇＧ２ｃ−ｈを用いたＰＣＲ反応を行うことで、各ドメインが連結された増幅産物を得た。この増幅産物をｐＴ７−ＢｌｕｅＴベクターにクローニングし、重鎖定常領域（Ｃγ２ｃ）をコードする配列であることを確認し、ｐＴ７−ｍＩｇＧ２ｃとした。
２）このｐＴ７−ｍＩｇＧ２ｃからマウスＦｃ領域をコードする遺伝子断片を制限酵素Ｂａｍ  ＨＩおよびＫｐｎ  Ｉで切り出し、断片Ｈを調製した。一方、ｐＣＡＧＧＳ−ＧＰＶＩ−Ｆｃプラスミドから、ヒトＧＰＶＩの細胞外ドメインをコードする遺伝子断片を制限酵素Ｘｂａ  ＩおよびＢｇｌ  ＩＩで切り出し、断片Ｉを調製した。これらの断片を、Ｘｂａ  ＩおよびＫｐｎ  Ｉで切断して調製した発現ベクターｐＥＦ２ｃｅｗのＥＦプロモーター下流に、断片Ｈ＋断片Ｉとなるように連結し、ヒトＧＰＶＩとマウスＦｃ融合蛋白（ＧＰＶＩ−ｍＦｃ）を発現するプラスミドを構築した。配列を確認後、ｐＴＫ−２２４９とした。
（２）ＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質の発現および精製
１）ＣＯＳ−１細胞は１０％胎仔ウシ血清入りのダルベッコＭＥＭ培地で継代し、トランスフェクション前日に、１．５ｘ１０＾５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの密度で培養容器に植え込んだ。翌日、ｐＴＫ−２２４９をトランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ６、ロシュダイアグノスティックス）と適当量混和した後に、無血清のダルベッコＭＥＭ培地に滴下し、これを培養液と交換することで、トランスフェクションを行った。
２）５％  ＣＯ２存在下、３７℃で２〜３日間培養し、培養液を回収した。
３）培養液からの、ＧＰＶＩ−ｍＦｃ融合蛋白質の精製は、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）を用いて行い、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析後、２８０ｎｍの吸光度より濃度を算出した。
［実施例１２］  各種抗ＧＰＶＩ抗体のＧＰＶＩ結合活性の測定（Ｃｅｌｌ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
健常人より採血した血液から遠心分離により血小板分画を調製した。５×１０６の血小板を５％ヒト血漿、０．５％非働化胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）含有ＰＢＳ−、５０μＬに懸濁し、実施例１０で作製した各種組換抗ＧＰＶＩヒト抗体（ＩｇＧ４）２μｇを添加後、室温１時間インキュベートした。０．５％非働化ＦＢＳ含有ＰＢＳ−、１ｍＬで２回洗浄後、０．５％非働化ＦＢＳ含有ＰＢＳ−、５０μＬに再懸濁し、１μｇの抗ヒトＩｇＧ抗体ＦＩＴＣ標識抗体を加えた後、室温１時間インキュベーションした。０．５％非働化ＦＢＳ含有ＰＢＳ−、１ｍＬで２回洗浄後、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  ＦＣ５００（ベックマンコールター）でＦＩＴＣ陽性血小板数を測定した。
この結果、Ｒ＃２−６抗体を反応させた血小板は９０％以上が、またＲ＃２−４抗体では６８％がＦＩＴＣ陽性細胞であった。
なお、図４は、ヒト末梢血より調製した血小板に組換抗ＧＰＶＩヒト抗体（Ｒ＃２−４およびＲ＃２−６）が結合することを示す図である。図４中、白抜きのヒストグラムは陰性対照としたヒト全ＩｇＧを反応させた際の蛍光強度分布を示す。灰色で示したヒストグラムはＲ＃２−４あるいはＲ＃２−６抗体を反応させた際の蛍光強度分布を示す。
［実施例１３］  各種抗ＧＰＶＩ抗体のＧＰＶＩ結合活性測定（ＥＬＩＳＡ法）
ＧＰＶＩ−ｈＦｃキメラタンパク質あるいはＧＰＶＩ−ｍＦｃキメラタンパク質をＰＢＳ−で３μｇ／ｍＬに調製し、ＥＬＩＳＡ用９６ｗｅｌｌプレートに５０μＬ／ｗｅｌｌずつ添加し、３７℃、２時間インキュベーションすることにより固相化した。４００μＬ／ｗｅｌｌのＰＢＳ−で５回洗浄した後、２％スタビリガード／ＰＢＳ−で室温１時間ブロッキング処理した。実施例１０で調製した各種組換抗ＧＰＶＩヒト抗体（ＩｇＧ４）をＧＰＶＩ−Ｆｃ固相化プレートに１０μｇ／ｍＬの濃度で添加し、室温２時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ−で３回、ＰＢＳ−で２回洗浄したのち、二次抗体（抗ヒトκ−軽鎖抗体ＨＲＰ標識あるいは抗ヒトλ＿軽鎖抗体ＨＲＰ標識）をそれぞれＰＢＳ−で１０００倍希釈、２０００倍希釈し、各ｗｅｌｌに添加、室温２時間インキュベーションした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ−で３回、ＰＢＳ−で２回洗浄したのち、ＴＭＢ溶液を添加し、室温２０分発色させ、１Ｍ硫酸を加え発色を停止させて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
この結果、陰性対照としたヒト全ＩｇＧではＧＰＶＩ−ｈＦｃとほとんど結合しないが、Ｒ＃２−４およびＲ＃２−６抗体は１０μｇ／ｍＬでＧＰＶＩ−ｈＦｃに対して著明な結合活性を示した（図５）。また、Ｒ＃２−６およびＲ＃２−４抗体はＧＰＶＩ−ｍＦｃにも親和性を示した。
［実施例１４］  全血及び血小板に及ぼす抗ＧＰＶＩ抗体単独の影響
（１）全血を用いた血餅形成における抗ＧＰＶＩ抗体の影響
健常人より抗トロンビン剤を用いて採血した血液、２ｍＬに各種ＧＰＶＩ抗体を最終濃度３０μｇ／ｍＬになるように添加し、３７℃で３時間インキュベーションした。その後、目視により血餅形成を確認した。既知の抗ＧＰＶＩ抗体、例えば、自己免疫性血小板減少患者血中由来ＩｇＧは単独で血小板凝集を惹起するため（非特許文献２）、この系では凝固系が過度に活性化され血餅形成を引き起こすと考えられるが、コントロールＩｇＧ添加の場合と同様に、Ｒ＃２−４及びＲ＃２−６抗体添加のいずれにおいても血餅形成は全く認められなかった。
（２）血小板に及ぼす抗ＧＰＶＩ抗体の影響
実施例６に準じて、ＰＲＰを用いて、抗体単独での血小板凝集惹起作用を測定した。その結果、１００μｇ／ｍＬの濃度においてもＲ＃２−４及びＲ＃２−６抗体は単独ではヒト血小板凝集を惹起しなかった。
［実施例１５］  ヒトＩｇＧ化抗ＧＰＶＩ抗体による血小板のコラーゲン応答性に及ぼす効果
健常人より抗トロンビン剤用いて採血した血液、２ｍＬに各種ＧＰＶＩ抗体を添加し、３７℃で３時間インキュベーションした。その後、血小板を単離し、３×１０＾８ｐｌａｔｅｌｅｔｓ／ｍＬに調製し、ＣａＣｌ２溶液を終濃度で１ｍＭとなるように添加し、３７℃で撹拌しながら３分間インキュベートした。コラーゲン溶液を終濃度で１〜２μｇ／ｍＬとなるように加え、血小板凝集能測定装置（エー・シー・メディカル株式会社、ＭＣＭヘマトレーサー８０１）にて濁度を測定した。
この結果、３０μｇ／ｍＬのＲ＃２−６またはＲ＃２−４抗体で処理した血小板ではコラーゲンに対する血小板凝集能の顕著な低下が認められた。
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【産業上の利用可能性】  本発明の抗体は、ヒト血小板上のＧＰＶＩと特異的に結合することにより血小板凝集能を低下させるので、例えば抗血小板薬等の医薬として用いることができる。また、本発明のヒト抗体は、医薬としてヒトに投与しても異種抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体の持つ免疫原性がない点で有用である。本発明の抗体で単独でヒト血小板の凝集を惹起しないものは、例えばＦａｂにする等の処理をせずにそのまま医薬として投与することができる。本発明の抗体は既存の抗体よりも低用量でコラーゲンによる血小板凝集を抑制することができ、より少ない用量で医薬として有効である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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