(57)【要約】  本発明は、抗Ｄ因子抗体を使用した補体系の代替経路（ＡＰ）の選択的阻害に関する。具体的には、本発明は、個体を抗Ｄ因子抗体と接触させることにより、個体におけるＡＰ媒介疾患又はＡＰ媒介障害を治療する方法に関する。
2020507581.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＤ因子に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又はその変異体からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又はその変異体からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体がＣＤＲ：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３及び配列番号２４、又はその変異体からなる群より選択されるＤ因子の少なくとも１つのアミノ酸配列内の少なくとも１つのアミノ酸を含むエピトープに結合する、請求項１記載の抗体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗Ｄ因子抗体を個体に投与するステップを含む、個体の代替経路（ＡＰ）媒介疾患又は障害を治療する方法。
【請求項１４】
疾患又は障害が、黄斑変性症（ＭＤ）、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、虚血再灌流障害、関節炎、関節リウマチ、喘息、アレルギー喘息、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）症候群、非定型溶血性尿毒症（ａＨＵＳ）症候群、表皮水疱症、敗血症、臓器移植、炎症（心肺バイパス手術及び腎透析に関連する炎症を含むが、これらに限定されない）、Ｃ３糸球体症、膜性腎症、糸球体腎炎（抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）を介した糸球体腎炎、ループス、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）、ＡＮＣＡを介した血管炎、志賀毒素誘発性ＨＵＳ、及び抗リン脂質抗体誘発性の妊娠喪失、及びそれらの組み合わせからなる群より少なくとも選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子改変非ヒト動物がヒトＤ因子を発現し、遺伝子改変非ヒト動物がマウスＤ因子を発現しない、遺伝子改変非ヒト動物。
【請求項１６】
個体の補体系の代替経路の活性を低下させる方法であって、経腸投与、非経口投与、及び組み合わせからなる群から選択される投与経路を介して抗体を個体に投与することを含み、該抗体は、以下のアミノ酸配列
ａ．配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、又はその変異体、又は
ｂ．配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０、又はその変異体
を有する６つの相補性決定領域を含む上記方法。
【請求項１７】
１７．配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群より選択される少なくとも１つを含むアミノ酸配列を有するヒトＤ因子のエピトープに結合する単離された抗体。
【請求項１８】
請求項１〜１２、及び１７の少なくとも１つの抗体を含む細胞。
【請求項１９】
請求項１〜１２、及び１７の少なくとも１つの抗体をコードする核酸を含む細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／４５７，４７７号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する陳述
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＮＩＨ  ＡＩ０８５５９６及びＮＩＨ  Ａｌｌ  １７４１０の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景補体系は、侵入する病原体に対する宿主防御の最前線を提供する。補体は、ヒトの炎症性疾患でも病原性の役割を果たす。補体系の活性化は、３つの異なる経路、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）を介して発生する。ＣＰは抗原抗体結合により開始される。ＬＰは、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）が微生物の表面糖分子と相互作用するとトリガーされる。両方の経路の活性化は、ＣＰ  Ｃ３コンベルターゼＣ４ｂ２ａのアセンブリーにつながるが、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼによるＣ３の直接切断も発生する。ＡＰは、ＡＰ  Ｃ３コンバターゼＣ３ｂＢｂによって駆動される自己増幅ループである。ＡＰの活性化は、ＣＰ又はＬＰの活性化に続いて発生する場合がある。後者の場合、低レベルの自発的なＣ３「ティックオーバー」により初期Ｃ３ｂＢｂが生成され、適切な規制がない場合にＡＰが急速に伝播される。したがって、一般的には、負の調節がないか不十分な非自己表面でのＡＰ活性化はデフォルトプロセスと見なされるが、自己細胞は通常、複数の膜結合及び液相補体阻害タンパク質の助けを借りてこの結果を回避する。特定の条件下では、変化した、損傷した、又はストレスを受けた自己細胞及び自己組織もＡＰを活性化し、炎症性損傷を引き起こす可能性がある。
【０００４】
Ｄ因子（ＦＤ）は、ＡＰ補体活性化に不可欠な酵素である。後者がＣ３ｂに結合した後に因子Ｂを切断し、活性なＣ３コンバターゼＣ３ｂＢｂを生成する。Ｄ因子は、サイズが約２４ｋＤａのセリンプロテアーゼであり、マンノース結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−３（ＭＡＳＰ−３）の酵素作用によりプロＤ因子から生成された後、構成的に活性な酵素として血液中を循環する。血液中の他の補体タンパク質と比較して、血液中のＤ因子の濃度はかなり低い（約２μｇ／ｍｌ）。後者の事実は、血液中のＤ因子活性の治療的阻害が可能であり、容易に達成できることを示唆するかもしれないが、以前の研究は、Ｄ因子の代謝回転が速いことを示しており、したがって、補体研究分野でのコンセンサスはそうではないということであるＤ因子を体系的にブロックすることが可能である。ＡＰ補体活性を全身的に阻害し、それによりＡＰ補体依存性病変を治療できる抗ヒトＤ因子ｍＡｂの分野でのニーズがあり、そのような抗ヒトＤ因子ｍＡｂをテスト及び検証する適切な動物モデルの分野でのニーズがある。本発明は、これら及び他の必要性に対処し、それを満たす。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、抗Ｄ因子抗体、及び抗Ｄ因子抗体を使用して補体の代替経路（ＡＰ）を阻害する方法に関する。
【０００６】
一実施形態では、本発明は、Ｄ因子に特異的に結合する抗体を含む組成物である。いくつかの実施形態では、Ｄ因子はヒトＤ因子である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、本発明の抗体はキメラ抗体である。一部の実施形態では、抗体は完全長抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片であり、これにはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、及びｓｃＦｖが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体は、構築物、例えば、抗体及び標的化部分又はエフェクター部分を含む融合構築物の一部である。いくつかの実施形態では、抗体は、抗体薬物複合体構築物などの複合体構築物の一部である。
【０００７】
一実施形態では、本発明の抗体は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又はその変異体。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号７のアミノ酸配列又はその変異体を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む。
【０００８】
一実施形態では、本発明の抗体は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８、ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又はその変異体。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖又はその変異体を含む抗体である。一実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列又はその変異体を含む軽鎖を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む抗体である。
【０００９】
一実施形態では、本発明の抗体はｍＡｂ  １１−８Ａ１又はｍＡｂ  １Ｆ１０−５である。一実施形態では、本発明の抗体は、Ｄ因子に結合し、少なくとも１つの他の抗Ｄ因子抗体の結合と競合する抗体である。一実施形態において、本発明の抗体は、Ｄ因子に結合し、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体の少なくとも１つの結合と競合する抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｄ因子に結合し、ｍＡｂ  １１−８Ａ１と命名された抗体のＤ因子への結合と競合する抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は、Ｄ因子に結合する抗体であるＤ及びｍＡｂ  １Ｆ１０−５と指定された抗体のＤ因子への結合と競合する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体を前記個体に投与するステップを含む、個体の代替経路（ＡＰ）媒介疾患又は障害を治療する方法である。様々な実施形態において、代替経路（ＡＰ）媒介疾患又は障害は、黄斑変性（ＭＤ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血再灌流障害、関節炎、関節リウマチ、喘息、アレルギー性喘息、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）症候群、非定型溶血性尿毒症（ａＨＵＳ）症候群、表皮水疱症、敗血症、臓器移植、炎症（心肺バイパス手術及び腎臓透析に関連する炎症を含むが、これらに限定されない）、Ｃ３糸球体症、膜性腎症、糸球体腎炎（抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）を介した糸球体腎炎、ループス、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）、ＡＮＣＡを介した血管炎、志賀毒素誘発性ＨＵＳ、及び抗リン脂質抗体誘発性妊娠損失、及びその組み合わせからなる群から少なくとも選択される。いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、代替経路を阻害するが、古典的経路及びレクチン経路の活性化を阻害しない。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、Ｃ３ｂＢｂタンパク質の生成を阻害する。いくつかの態様において、抗Ｄ因子抗体は、下流の補体シグナル伝達へのＡＰの寄与を阻害する。いくつかの実施形態では、ＡＰ媒介疾患はＣ３糸球体症である。一部の実施形態では、ＡＰ媒介性疾患は、加齢黄斑変性などの黄斑変性である。
【００１１】
一実施形態において、本発明は、経腸投与、非経口投与、及びそれらの組み合わせを含む投与経路を介して抗体を個体に投与することを含む、個体の補体系の代替経路の活性を低下させる方法であり、ここで、抗体は、以下のアミノ酸配列：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、又はその変異体を有する６つの相補性決定領域を含む。別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、経腸投与、非経口投与、及びそれらの組み合わせを含む投与経路を介して抗体を個体に投与することを含む、個体の補体系の代替経路の活性を低下させる方法であり、抗体は、以下のアミノ酸配列を有する６つの相補性決定領域を含む：配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０、又はその変異体。別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせを含む抗体断片である。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離された抗体であり、抗体は、Ｄ因子の第１エピトープ及び第２エピトープのいずれか一方に結合し、第１エピトープ及び第２エピトープの両方がコイルをとる部分を有する二次構造における立体構造、及び二次構造においてベータ鎖立体構造をとるＤ因子の部分は、第一のエピトープと第二のエピトープの間にある。別の実施形態では、第１のエピトープは配列番号２１を含むアミノ酸配列を有し、第２のエピトープは配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、第１のエピトープは配列番号２３を含むアミノ酸配列を有し、第２のエピトープは配列番号２４を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。別の実施形態では、抗体はＤ因子のエピトープに結合し、エピトープは配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離抗体であり、抗体はＤ因子のエピトープに結合し、エピトープは配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００１５】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離抗体であり、抗体はＤ因子のエピトープに結合し、エピトープは配列番号２３を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離抗体であり、抗体は、Ｄ因子の第１エピトープ及び第２エピトープのいずれか一方に交互に結合し、第１エピトープは配列番号２１を含むアミノ酸配列を有し、第２のエピトープは配列番号２２を含むアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離されたポリペプチドであり、ポリペプチドはＤ因子のエピトープに結合し、エピトープは配列番号２１又は配列番号２２を含むアミノ酸配列を有し、ポリペプチドは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、又はその変異体からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合する単離されたポリペプチドであり、ポリペプチドはＤ因子のエピトープに結合し、エピトープは配列番号２４を含むアミノ酸配列を有し、ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１８、配列番号１９、及び配列番号２０、又は変異体からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に対する抗体であり、抗体は、配列番号２に対して９０％を超える（９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれかより大きいものなどの）同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変（ｖＨ）領域を有する。別の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００２０】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に対する抗体であり、抗体は、配列番号７に対して９０％を超える（９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれかより大きいものなどの）同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変（ｖＬ）領域を有する。別の実施形態において、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される抗体断片である。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に対する抗体であり、抗体は、重鎖可変（ｖＨ）領域及び軽鎖可変（ｖＬ）領域を有し、ｖＨ領域は、配列番号２に対して９０％を超える（９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれかより大きいものなどの）同一であるアミノ酸配列を有し、およびｖＬ領域は、配列番号７に対して９０％を超える（９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のいずれかより大きいものなどの）同一であるアミノ酸配列を有する。
【００２２】
一実施形態では、本発明は抗体を産生する細胞であり、抗体はＤ因子を標的とする。一実施形態では、細胞はハイブリドーマである。別の実施形態では、細胞は細胞株である。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、ラット又はマウスなどのげっ歯類である。一実施形態において、本発明は、ヒトＤ因子を発現する遺伝子改変マウスである。一実施形態において、本発明は、ヒトＤ因子を発現するがマウスＤ因子を発現しない遺伝子改変マウスである。別の実施形態において、本発明はマウス調節因子からヒトＤ因子を発現するが、マウスＤ因子を発現しない遺伝子改変マウスである。
【００２４】
図面の簡単な説明前述の概要、ならびに本発明の例示的な実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むとよりよく理解されるであろう。しかし、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は補体経路の概略図である。補体系は、開始刺激に応じて、古典的経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の３つの異なる経路を介して活性化できる（図１）。ＣＰは、主に抗原と特異抗体で構成される免疫複合体によって活性化される。ＣｌｒとＣｌｓを活性化する抗原に結合した抗体へのＣｌｑの結合。活性化されたＣｌｓはＣ４及びＣ２を切断する。ＬＰは、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）が微生物炭水化物のマンノースグループに結合すると活性化され、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（ＭＡＳＰ）が活性化され、Ｃ４とＣ２が再び切断される。Ｃ４及びＣ２切断産物は、Ｃ３をＣ３ｂ及びＣ３ａに切断するＣＰ及びＬＰ  Ｃ３コンバターゼ、Ｃ４ｂＣ２ａを形成する。Ｃ３ｂの２番目の分子は、Ｃ４ｂＣ２ａと結合してＣＰ及びＬＰのＣ５コンバターゼを形成できる。ＡＰは、Ｃ３が自発的加水分解を受け、因子Ｂ及びＤの存在下で初期ＡＰ  Ｃ３コンバターゼＣ３（Ｈ２０）Ｂｂを形成すると活性化され、追加のＣ３開裂、及びＡＰ  Ｃ３コンバターゼ（Ｃ３ｂＢｂ）及びＡＰ  Ｃ５コンベルターゼ（Ｃ３ｂＢｂＣ３ｂ）の最終的な形成につながる。プロペルジンは、ＡＰコンベルターゼを安定化することにより、ＡＰの活性化を促進する。３つの経路すべてが転換酵素の形成に至り、それが補体系の主要なエフェクターを生成する：アナフィラトキシン（Ｃ４ａ／Ｃ３ａ／Ｃ５ａ）、膜攻撃複合体（ＭＡＣ）、及びオプソニン（例えば、Ｃ３ｂ）。アナフィラトキシンは強力な炎症誘発性分子であり、それぞれＣ４、Ｃ３、及びＣ５の切断によって生成される。Ｃ５ｂは、タンパク質Ｃ６−Ｃ９の連続した結合によって複合体を形成し、標的表面を直接溶解できるＭＡＣ（Ｃ５ｂ−９）の形成に至る。Ｃ３ｂはオプソニン化された標的の食作用を誘発し、ＡＰを介した補体活性化の増幅にも役立つ。
【図２】図２は、抗ヒトＤ因子ｍＡｂ  １１−８Ａ１及び１Ｆ１０−５によるＬＰＳ誘導性ＡＰ補体活性化の用量依存的阻害を実証する実験結果を示す。両方のｍＡｂは、５μｇ／ｍｌ以上の最終濃度で５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）に添加すると、ＡＰ補体活性化を効果的に阻害した。ＥＤＴＡを追加したサンプルは、陰性対照として機能した（ＥＤＴＡは補体活性化をブロックする）。ｍＡｂが添加されていない（０Ａｂ）サンプルは、ベースラインＡＰ補体活性化として機能した。実験はＧＶＢ−ＥＧＴＡ−Ｍｇ＋＋バッファーで実行された。ＥＬＩＳＡプレートをＬＰＳで３７℃、１時間コーティングした。ＮＨＳは、プレートに加える前にｍＡｂとプレインキュベートした。プレート上のＣ３沈着量（ＯＤ４５０）を測定することにより、ＡＰ補体活性化が検出された。
【図３Ａ】図３は、ｍＡｂ  １１−８Ａ１の重鎖（配列番号１；配列番号２）及び軽鎖（配列番号６；配列番号７）の可変領域配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。これは、ｍＡｂ  １１−８Ａ１のＣＤＲ（ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号：３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；ＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０）を含む。
【図３Ｂ】図３は、ｍＡｂ  １１−８Ａ１の重鎖（配列番号１；配列番号２）及び軽鎖（配列番号６；配列番号７）の可変領域配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。これは、ｍＡｂ  １１−８Ａ１のＣＤＲ（ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；ＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０）を含む。
【図４Ａ】図４は、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５の重鎖（配列番号１１；配列番号１２）及び軽鎖（配列番号１６；配列番号１７）の可変領域配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。これは、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５のＣＤＲ（ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列ＩＤ番号１９；ＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０）を含む。
【図４Ｂ】図４は、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５の重鎖（配列番号１１；配列番号１２）及び軽鎖（配列番号１６；配列番号１７）の可変領域配列のヌクレオチド及びアミノ酸配列を示す。これは、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５のＣＤＲ（ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列ＩＤ番号１９；ＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０）を含む。
【図５】図５は、ＬＰＳ誘発のヒト、サル、モルモット、及びマウスのＡＰ補体活性化の遮断における１１−８Ａ１及び１Ｆ１０−５  ｍＡｂｓの相対活性を評価する実験の結果を示す。ｍＡｂ  １１Ａ８−１及び１Ｆ１０−５が異なる哺乳類種の血清中の代替経路活性を阻害する能力を、ＬＰＳ−ＡＰアッセイを使用してテストした。ＥＬＩＳＡプレートをＬＰＳ、３７℃、１時間でコーティングし、ＧＶＢ−Ｍｇ＋＋−ＥＧＴＡで希釈した５０％の正常なヒト、サル、モルモット又はマウスの血清を添加し、抗ヒトＣ３抗体又は抗マウスＣ３抗体を使用してＣ３沈着を検出する前に３７℃で１時間インキュベートした。１１−８Ａ１  ｍＡｂの場合、５〜２０μｇ／ｍｌの濃度でヒトＡＰ補体活性化を阻害するのに十分であったが、１１−８Ａ１  ｍＡｂはマウス、モルモット、サル（アカゲザル及びカニクイザル）ＡＰ補体活性化を阻害できなかった。１Ｆ  １０−５  ｍＡｂの場合、５〜２０μｇ／ｍｌの濃度でヒトＡＰ補体活性化を阻害できなかったが、１Ｆ１０−５  ｍＡｂはマウス及びモルモットＡＰ補体活性化を阻害できなかった。１０又は２０μｇ／ｍｌの１Ｆ１０−５  ｍＡｂは、カニクイザルＡＰ補体活性化の阻害に効果的であった。一方、５０μｇ／ｍｌの１Ｆ１０−５  ｍＡｂは、アカゲザルＡＰ補体活性化の部分的な阻害をもたらした。
【図６】図６は、ＬＰＳ誘導性ヒトＡＰ補体活性化の遮断におけるハイブリドーマ由来マウス１１−８Ａ１及び組換えキメラ１１−８Ａ１（１１−８Ａ１の可変領域＋ヒトＩｇＧ４の定常領域）の活性を比較する実験の結果を示す。ＥＬＩＳＡプレートをＬＰＳ、３７℃、１時間でコーティングし、ＧＶＢ−Ｍｇ＋＋−ＥＧＴＡで希釈した５０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）を加え、３７℃で１時間インキュベートした後、抗ヒトを使用してＣ３沈着を検出したＣ３抗体。ＥＤＴＡを添加したＮＨＳを陰性対照（ＥＤＴＡ）として使用した。１．２５−１０μｇ／ｍｌの濃度で、１１−８Ａ１  ｍＡｂの両方の形態は、ヒトＡＰ補体活性化を阻害するのに十分であり、活性に違いは見られなかった。
【図７】図７は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したハイブリドーマ由来マウス１１−８Ａ１及び組換えキメラ１１−８Ａ１  ｍＡｂの抗原結合親和性を比較する実験の結果を示す。アミン結合法を使用して、精製されたヒトＤ因子をＣＭ４チップに結合させなかった。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ−２０００機器で実行された。チップは、５０ｍＭ  ＮａＯＨを使用して各結合の間に再生された。１１−８Ａ１  ｍＡｂｓの２つの形態は、同様の親和性を示した。
【図８】図８は、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＩＦ  １０−５  ｍＡｂの抗原結合親和性測定の結果を示す。アミン結合法を使用して、精製されたヒトＤ因子をＣＭ４チップに結合させた。Ｂｉａｃｏｒｅ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ−２０００機器で実行された。チップは、５０ｍＭ  ＮａＯＨを使用して各結合の間に再生された。１Ｆ１０−５のＫｄは１．５Ｅ−１０Ｍであると決定された。
【図９Ａ−Ｂ】図９は、図９Ａから９Ｄを含み、欠失構築物を使用したｍＡｂ  １１−８Ａ１のエピトープマッピングの結果を示す。（図９Ａ）表示された配列（２２８アミノ酸）は、プロペプチドを含まない成熟したヒトＤ因子である。アミノ酸１０７−１１０（配列番号２１）、１３０−１３４、１４８−１５１（配列番号２２）及び１７８−１８４に下線が引かれている。（図９Ｂ）エピトープマッピングのためのヒトＤ因子の無傷及び９個の欠失変異体の模式図。これらのタンパク質はＣＨＯ細胞で発現した。（図９Ｃ）タンパク質発現の確認。ＣＨＯ細胞の上清（Ｓｕｐ）又は細胞溶解物（ＣＬ）のいずれかからのヒトＤ因子の組換え無傷及び欠失変異体を、ヤギ抗ヒトＤ因子抗体で免疫ブロットした。＋及び−は、それぞれ陽性及び陰性検出を示す。（図９Ｄ）完全及び欠失変異タンパク質に対するｍＡｂ  １１−８Ａ１の反応性は、１１−８Ａ１  ｍＡｂでの免疫沈降（ＩＰ）後のヤギ抗ヒトＤ因子ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法（ＷＢ）により評価された。＋及び−は、それぞれ陽性及び陰性検出を示す。ＮＴ；未検証。ｍＡｂの結合に重要なヒトＤ因子の領域又は部位をマッピングするために、完全長（完全）のヒトＤ因子の一連の欠失変異体との反応性についてｍＡｂ  １１−８Ａ１をテストした。ヒトＤ因子抗体は、予想される分子量でほとんどの欠失変異体の発現を確認した。しかし、いくつかの試みは、欠失−６及び９の組換えタンパク質の生産に失敗した。図９に示すように、ｍＡｂ  １１−８Ａ１はＦｕｌｌ、ｄｅｌｅｔｅ−２及び４を認識したが、ｄｅｌｅｔｅ−１、３、５、７及び８を認識しなかった。これらの結果は、１０７−１１０のＰＬＰＷ（配列番号２１）又は１４８−１５１のＶＬＤＲ（配列番号２２）の４つのアミノ酸の欠失がｍＡｂ  １１−８Ａ１による結合を破壊したことを示唆している。
【図９Ｃ−Ｄ】（図９Ｃ）タンパク質発現の確認。ＣＨＯ細胞の上清（Ｓｕｐ）又は細胞溶解物（ＣＬ）のいずれかからのヒトＤ因子の組換え無傷及び欠失変異体を、ヤギ抗ヒトＤ因子抗体で免疫ブロットした。＋及び−は、それぞれ陽性及び陰性検出を示す。（図９Ｄ）完全及び欠失変異タンパク質に対するｍＡｂ  １１−８Ａ１の反応性は、１１−８Ａ１  ｍＡｂでの免疫沈降（ＩＰ）後のヤギ抗ヒトＤ因子ポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロット法（ＷＢ）により評価された。
【図１０】図１０は、部位特異的突然変異誘発によるｍＡｂ  １１−８Ａ１のエピトープマッピングの結果を示す。部位特異的突然変異誘発研究を実施して、ｍＡｂ  １１−８Ａ１認識に影響を及ぼすヒトＤ因子の２つの結合部位（１０７−１１０及び１４８−１５１）を確認した。１０７−１１０の４つのアミノ酸ＰＬＰＷ又は１４８−１５１のＶＬＤＲをアラニン残基（ＡＡＡＡ）に置き換えた。ＣＨＯ細胞に変異タンパク質のベクターをトランスフェクトした。上清及び細胞溶解物における突然変異タンパク質の発現（トランスフェクションの４８時間後）は、ポリクローナルヤギ抗ヒトＤ因子抗体を使用したウエスタンブロットにより確認された。予想されたように、両方の変異は、ＩＰ中のｍＡｂ  １１−８Ａ１によるタンパク質認識を損ない、その後、ヤギ抗ヒトＤ因子抗体によるウエスタンブロットが続いた。欠失変異体及び突然変異誘発研究の結果（ＰＬＰＷからＡＡＡＡ、及びＶＬＤＲからＡＡＡＡ）は、ヒトＤ因子のＰＬＰＷ１０７−１１０及びＶＬＤＲ１４８−１５１に位置する４つのアミノ酸が１１−８Ａ１の結合及び機能的遮断活性に重要であることを示した。
【図１１Ａ】図１１は、図１１Ａから１１Ｄを含み、ヒトＤ因子ノックインマウスの生成の概要を示している。（図１１Ａ）ヒトＤ因子ターゲティング構築物、マウスＤ因子遺伝子座、標的対立遺伝子、及びｎｅｏ−ｄｅｌｅｔｅｄ  ａｌｌｅｌｅ（上から下）を表す模式図。ヒトＤ因子ｃＤＮＡは、シグナルペプチド、プロペプチド及び成熟ペプチドを含む２５３アミノ酸のタンパク質全体をコードする。破線は、マウスＤ因子遺伝子におけるヒトＤ因子ｃＤＮＡの組み込み部位を表している。ＥＳ細胞スクリーニングのためのプローブの位置は、図の下に示されている。略語：制限サイトＢａｍＨＩ（Ｂ）、ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）、Ｎｏｔｌ（Ｎ）及びＸｈｏｌ（Ｘ）。ＦＲＴ、ｆｉｉｐｐａｓｅ認識ターゲット。ＬｏｘＰ、ＰＩのクロスオーバーの軌跡。（図１１Ｂ）ヒトＤ因子のコード配列は、ターゲティング構築物のマウスＤ因子の５’及び３’非コード配列に隣接している。ヒトＤ因子の核酸配列に下線を付け（配列番号２５）、制限酵素Ｘｈｏｌ部位を太字にし、マウスＤ因子の５’及び３’非翻訳領域の核酸配列をそれぞれ大文字及び小文字で示す。
【図１１Ｂ】（図１１Ｂ）ヒトＤ因子のコード配列は、ターゲティング構築物のマウスＤ因子の５’及び３’非コード配列に隣接している。
【図１１Ｃ−Ｄ】（図１１Ｃ）陽性ＥＳ細胞クローンが２つのＢａｍＨＩ制限断片（５ｋｂ及び４．５ｋｂ）を生成したことを示すサザンブロッティングデータに対して、代表的な非標的ＥＳ細胞クローンは５ｋｂバンドのみを生成した。（図１１Ｄ）ヒトＤ因子に特異的な（ターゲットサイズ：４５０ｂｐ）５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡを使用した、野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合（Ｈｅｔ）及びホモ接合（Ｈｏｍｏ）ヒトＤ因子ノックインマウスのＰＣＲジェノタイピングＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号２６）及び５’−ＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号２７）、及びマウスＤ因子に特異的（標的サイズ：２９２ｂｐ）５’−ＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号：２８）及び５’−ＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号：２９）。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａ及び１２Ｂを含む図１２は、ヒトＤ因子ノックインマウスの血清におけるヒトＤ因子発現を評価する実験の結果を示している。ウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡを実施して、ヒトＤ因子ノックインマウスの血清中のヒトＤ因子タンパク質の存在を確認した。血清サンプルは、野生型、ヘテロ接合体、ホモ接合体の３つの異なる遺伝子型を持つマウスから調製された。ＮＨＳ及びマウスＤ因子ノックアウトマウス（ｆＤＫＯ）の血清をアッセイコントロールに使用した。（図１２Ａ）抗ヒトＤ因子ポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により、ヒトＤ因子を表す２４ｋＤａのタンパク質バンドが、正常なヒト血清（ＮＨＳ）及びヘテロ接合及びホモ接合のヒトＤ因子ノックイン（ＨＤＫＩ）で検出された一方、マウスＤ因子を表す約４０−４５ｋＤａのバンドが、野生型（−／−）及びヘテロ接合ＨＤＫＩマウス血清で検出された。（図１２Ｂ）ヒトＤ因子タンパク質の発現は、ホモ接合ＨＤＫＩマウスのサンドイッチＥＬＩＳＡで確認できた。プレートを、ヒトＤ因子に対するポリクローナル抗体でコーティングした（Ｒ＆Ｄ、ＡＦ１８２４）。希釈血清（１／２又は１／５）とのインキュベーション後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンに続いて、ビオチン結合ヤギ抗ヒトＤ因子抗体を使用して、ヒトＤ因子が検出された。予想どおり、ヒトＤ因子はＮＨＳ、組換えヒトＤ因子コントロールウェル、及びホモ接合性ヒトＤ因子ノックインの血清で検出されたが、野生型マウスでは検出されなかった。
【図１３】図１３は、ヒトＤ因子ノックインマウスの血清中のＬＰＳ誘導ＡＰ補体活性を評価する実験の結果を示している。ＭｏｕｅＤ因子が存在しない場合でも、ホモ接合性ヒトＤ因子ノックインマウスでＡＰ補体活性が検出され、これらのマウスで発現したヒトＤ因子はｉｎ  ｖｉｖｏで機能していることが示唆された。示されているように、ＬＰＳ誘発性ＡＰ補体活性化アッセイは、ホモ接合型ヒトＤ因子ノックインマウス及び野生型マウスが血清ＡＰ補体活性を有することを示した。一方、このアッセイでは、マウスＤ因子ノックアウトマウスの血清、又はＥＤＴＡで処理したＷＴ又はホモ接合型ノックインマウスの血清では、ＡＰ補体活性は検出されなかった。これらの観察結果は、ヒトＤ因子の発現がマウスＡＰ補体活性を回復することができ、ノックインマウスがＡＰ補体媒介疾患及び障害におけるＤ因子標的療法を調査するための実験動物モデルとして使用できることを実証した。
【図１４】図１４は、ヒトＤ因子ノックインマウスにおけるｍＡｂ  １１−８１Ａのｉｎ  ｖｉｖｏ活性と動態を評価する実験の結果を示している。ホモ接合性のヒトＤ因子ノックインマウスに１ｍｇ（ｉ．ｐ．）のｍＡｂ  １１−８Ａ１を注射した。注射前（０時間）及び注射後の様々な時点で血清サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性化についてテストした。示されているように、ＡＰ補体活性は、Ｄ因子ノックアウトマウス血清又はＥＤＴＡで処理されたＮＨＳには存在しなかった。対照的に、ＡＰ補体活性は、ＮＨＳ及び０時間（ｍＡｂ処理前）のホモ接合ヒトＤ因子ノックインマウスの血清で検出された。ホモ接合性ヒト第Ｄ因子ノックインマウスのＡＰ補体活性は、ｍＡｂ  １１−８Ａ１処理後６時間及び１〜５日目に阻害された。７日目にＡＰ補体活性は正常に戻った。これらの結果は、１ｍｇ／マウスの用量で、ｍＡｂ  １１−８Ａ１が３−５日までｉｎ  ｖｉｖｏでＡＰ補体活性を阻害できることを示唆した。
【図１５】図１５は、ヒトＤ因子ノックインマウスにおけるｍＡｂ  １Ｆ１０−５及び無関係な対照ｍＡｂ（ＭＯＰＣ）のｉｎ  ｖｉｖｏ活性及び動態を評価する実験の結果を示している。ホモ接合性ヒト第Ｄ因子ノックイン（ＨＤＫＩ）マウスに１ｍｇ（ｉ．ｐ．）のｍＡｂ  １Ｆ１０−５又はアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＭＯＰＣ、マウスＩｇＧ１）を注射した。注射前（０時間）及び注射後の様々な時点で血清サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性化についてテストした。治療前及び治療後の血清サンプルにおける循環ヒトＤ因子のレベルの変化を、ヤギ抗ヒトＤ因子ポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法により評価した。示されているように、Ｄ因子ノックアウトマウス（ＤＫＯ）血清又はＥＤＴＡで処理したＷＴ血清にはＡＰ補体活性は存在しなかった。対照的に、ＡＰ補体活性は、ＷＴ血清及び０時間（ｍＡｂ処理前）のホモ接合ＨＤＫＩマウスの血清で検出された。１Ｆ１０−５  ｍＡｂ治療後、ホモ接合ＨＤＫＩマウスのＡＰ補体活性は６時間から５日目まで様々な程度に阻害された。７日目に正常に戻って。これらの結果は、全身的に与えられた場合に、ｍＡｂ  ＩＦ１０−５がＡＰ補完活性の持続的な阻害を引き起こすことができることを示唆した。ウエスタンブロッティングのデータは、Ｄ因子／抗Ｄ因子複合体の形成による血液中のヒトＤ因子の蓄積を示した。遊離のヒトＤ因子は腎臓から排泄され、ＨＤＫＩマウスの尿中に存在していた。ＨＤＫＩマウスにおけるヒトＤ因子の血中濃度の増加は、Ｄ因子／抗Ｄ因子複合体が腎臓からの排泄を妨げていることを示唆している。アイソタイプコントロールｍＡｂ、ＭＯＰＣは、ホモ接合ＨＤＫＩマウスのＡＰ補体活性を阻害せず、血液中のヒトＤ因子の蓄積も引き起こさなかった。
【図１６】図１６は、長期治療中のヒトＤ因子ノックインマウスにおけるｍＡｂ  １１−８Ａ１のｉｎ  ｖｉｖｏ活性及び動態を評価する実験の結果を示している。２匹のホモ接合性ヒトＤ因子ノックイン（ＨＤＫＩ）マウス（マウスＩＤ＃３及び＃２１、ｍＡｂは４ｍｇごとに１ｍｇ／マウスで投与）に１１  Ａ８−１  ｍＡｂを連続投与すると、４週間、ＡＰ補体活性が持続的に阻害された。以前の単回投与実験と同様に、ｍＡｂ  １１８Ａ−１は血液中にヒトＤ因子の蓄積を引き起こしたが、Ｄ因子は最終的に両方の処理マウスで定常状態レベルに達した。合わせて、これらのデータは、抗Ｄ因子  ｍＡｂを適切な用量及び頻度で対象に投与することにより、全身性ＡＰ補体活性の持続的阻害を引き起こすことが可能であることを示した。
【図１７】図１７Ａ及び１７Ｂを含む図１７は、Ｋ／ＢｘＮマウスＩｇＧ誘導性関節炎の予防におけるｍＡｂ  １１−８Ａ１の治療効果を評価する実験の結果を示している。（図１７Ａ）。Ｋ／ＢｘＮ関節炎に対するホモ接合性ヒトＤ因子ノックイン（ＨＤＫＩ）マウスの感受性。このモデルでは、関節炎Ｋ／ＢｘＮマウスの血清又は精製ＩｇＧをＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移入し、再現性の高い方法で関節炎を誘発する。この病気は、足首の肥厚、腫脹、進行性の関節破壊など、ヒト関節リウマチの多くの顕著な特徴を示している。パネルＡに示すように、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのように、ＨＤＫＩマウスは、養子移入Ｋ／ＢｘＮマウスＩｇＧを受けた後の足首の厚さ及び臨床スコアの増加から明らかなように、Ｋ／ＢｘＮ関節炎の影響も受けた。このデータは、ヒト補Ｄ因子がＡＰ補体媒介性疾患設定のマウスで完全に機能していることを確認した。（図１７Ｂ）。ＨＤＫＩマウスのＫ／ＢｘＮ関節炎に対するｍＡｂ  １１−８Ａ１の治療効果。ｍＡｂ  １１−８Ａ１（１ｍｇ／マウス、Ｋ／ＢｘＮマウスＩｇＧ移植前に４日ごとに開始）の投与は、コントロールｍＡｂ（ＭＯＰＣ）で処理したマウスと比較して足首の厚さ及び臨床スコアの減少により示されるように、関節炎を大幅に改善した。これらの結果は、Ｄ因子を全身的に標的とすることにより、局所補体損傷を改善することが可能であることを実証した。
【図１８】図１８は、モデルとしてヒトＤ因子ノックインマウスを使用した血管外溶血（ＥＶＨ）の予防におけるｍＡｂ  １１−８Ａ１の治療効果を評価する実験の結果を示している。ホモ接合性ヒトＤ因子ノックイン（ＨＤＫＩ）マウスに、野生型及びＣｒｒｙ／ＤＡＦ／Ｃ３トリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスからの赤血球（ＲＢＣ）を輸血した。受信体のＨＤＫＩマウスは、ＲＢＣ転送の２４時間前にｍＡｂ  １１８Ａ−１（２ｍｇ／マウス、ｉ．ｐ．）又はＰＢＳで処理された。ＤＤＡＯ−ＳＥ標識ＷＴとＣＦＳＥ標識ＴＫＯ赤血球（ＲＢＣ）の１：１混合物を、尾静脈からレシピエントマウスに注射した。ＲＢＣ輸血後５分及び１、２及び３日目に、レシピエントマウスから採血し、ＲＢＣを分析して、循環中に残っている輸血ＲＢＣの割合を決定した。各受信者のＣＦＳＥ標識ＴＫＯ  ＲＢＣの数は、各時点でＤＤＡＯ−ＳＥ標識ＷＴ  ＲＢＣに対して（％として）正規化された。ｍＡｂ治療を受けていないレシピエントＨＤＫＩマウスでは、以前の発見と一致して、ＥＶＨを介してＴＫＯ  ＲＢＣが急速に除去された（Ｍｉｗａ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９：３７０７−３７１６）。ただし、抗ヒトＤ因子  ｍＡｂ  １１−８Ａ１で処理されたレシピエントＨＤＫＩマウスでは、ＥＶＨは発生せず、輸血されたＴＫＯ  ＲＢＣが持続した。これらの結果は、抗ヒトＤ因子  ｍＡｂがＥＶＨの予防に効果的であることを実証した。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｄを含む図１９は、欠失構築物を使用したｍＡｂ  １Ｆ１０−５のエピトープマッピングを示す。図１９Ａは、ヒトＤ因子の成熟配列中のアミノ酸１３２〜１３５、１５５〜１５９（配列番号２３）、１７３〜１７６（配列番号２４）及び２０２〜２０８を強調している。図１９Ｂは、４つの概略図を示す。エピトープマッピングのためのヒトＤ因子の欠失変異体。これらのタンパク質は哺乳類細胞によって生産された。図１９Ｃは、タンパク質発現を確認する結果を示している。完全及び欠失変異体の上清（Ｓｕｐ）及び細胞溶解物（ＣＬ）は、ヤギ抗ヒトＤ因子抗体で免疫ブロットされた。図１９Ｄは、ＥＬＩＳＡにより評価された完全及び欠失変異体タンパク質に対するｍＡｂ  １Ｆ１０−５の反応性を示す。これらの結果は、１５５〜１５９のＮＲＲＴＨ（配列番号２３）又は１７３〜１７６のＳＮＲＲ（配列番号２４）のアミノ酸の欠失がｍＡｂ  １Ｆ１０−５による結合を破壊したことを示唆した。
【図２０】図２０は、ヒトＤ因子ノックインマウスにおけるｍＡｂ  １１−８Ａ１、１Ｆ１０−５及び１６６−３２のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価する例示的な実験の結果を示している。１６６−３２（Ｔａｎｏｘ  ＵＳ  Ｐａｔ．Ｎｏ．８，１２４，０９０を参照）、１１−８Ａ１、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの代替経路（ＡＰ）補体活性の遮断における１Ｆ１０−５  ｍＡｂの有効性を評価するため、Ｄ因子ヒト化マウスを反復投与で治療した（１ｍｇ／マウス、３日ごと、皮下投与）。ｍＡｂ治療前（時間０）及びｍＡｂ治療後６時間、１、３、６、及び９日目に血漿サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性をテストした。様々な時点でのＡＰ補体活性は、時間０で得られた値の１００％に正規化された。データは、ｍＡｂ  １１−８Ａ１及び１Ｆ１０−５がｉｎ  ｖｉｖｏでｍＡｂ  １６６−３２と比較して優れた薬力学活性を有することを示した具体的には、ｍＡｂ  １１−８Ａ１は常にｍＡｂ投与後８０−９０％のＡＰ補体活性を抑制したが、ｍＡｂ  １６６−３２はｍＡｂ投与後６時間と１日目にのみ同等の抑制を達成した。ｍＡｂ  ＩＦ  １０−５は、９日目にＡＰ補体の５０％阻害を示したが、９日目にはｍＡｂ  １６６−３２によるＡＰ補体活性のほとんどの阻害が観察された。
【図２１】図２１は、ヒトＤ因子ノックインマウスにおけるキメラ１１−８Ａ１  ｍＡｂ及びキメラＡＦＤのインビボ活性を評価する例示的な実験の結果を示す。ｉｎ  ｖｉｖｏでの代替経路（ＡＰ）補体活性の遮断における１１−８Ａｌ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂ及びＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂの有効性を評価するために、Ｄ因子ヒト化マウスを反復投与（１ｍｇ／マウス、毎回３日間、皮下投与）。ｍＡｂ治療前（時間０）及びｍＡｂ治療後６時間、１、３、６、９、１２、及び１５日目に血漿サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性をテストした。様々な時点でのＡＰ補体活性は、時間０で得られた値の１００％に正規化された。ＡＦＤはｍＡｂ  １６６−３２のヒト化バージョンである（Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１２  Ａｐｒ  １３；２８７：１２８８６−１２８９２、ＷＯ２００８／０５５２０６、米国特許第８，３７２，４０３号、米国特許第８，２７３，３５２号、米国特許出願第２０１４／０２１２４３３号）。データは、１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂがＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂよりもはるかに強力であり、はるかに優れた薬力学プロファイルを示したことを示した。具体的には、両方のｍＡｂがｍＡｂ投与後６時間及び１日目に９０−１００％の阻害を引き起こしたが、ＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂではなく１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂは、６〜１５日目にＡＰ補体活性の７５％を超える阻害を引き起こした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、抗Ｄ因子抗体を使用した補体の代替経路（ＡＰ）の阻害に関する。様々な実施形態において、本発明は、個体を抗Ｄ因子抗体と接触させることにより個体におけるＡＰ媒介疾患又はＡＰ媒介障害を治療するための組成物及び方法に関する。本発明の組成物及び方法で治療することができるＡＰ媒介性の病状及び状態には、黄斑変性（ＭＤ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血再灌流障害、関節炎、関節リウマチ、喘息、アレルギー性喘息、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）症候群、非定型溶血性尿毒症（ａＨＵＳ）症候群、表皮水疱症、敗血症、臓器移植、炎症（心肺バイパス手術及び腎臓透析に関連する炎症を含むが、これらに限定されない）、Ｃ３糸球体症膜性腎症、糸球体腎炎（抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）媒介糸球体腎炎、ループス、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない）、ＡＮＣＡ媒介血管炎、志賀毒素誘発性ＨＵＳ、及び抗リン脂質抗体誘発性妊娠損失、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【００２７】
定義
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、例示的な方法及び材料が記載されている。
【００２８】
本書で使用されているように、以下の各用語は、このセクションでそれに関連する意味を有する。
【００２９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」とは、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「阻害する」及び「阻害」という用語は、対照値と比較して少なくとも約１０％まで活性又は機能を低減、抑制、減少又は遮断することを意味する。いくつかの実施形態では、活性は、対照値と比較して５０％、又は７５％、又は９５％抑制又はブロックされる。
【００３１】
「有効量」及び「薬学的有効量」という用語は、望ましい生物学的結果を提供するのに十分な薬剤の量を指す。その結果は、疾患、障害の兆候、症状、又は原因の減少及び／又は緩和、あるいは生体系の任意の他の望ましい変化であり得る。任意の個々の場合における適切な有効量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定され得る。
【００３２】
用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書で互換的に使用され、任意の動物、いくつかの実施形態では哺乳動物、及びいくつかの実施形態では補体系を有するヒトを指す。状態又はその続発症に対する治療の必要性、又はその影響を受けやすい。個体には、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サル、マウス及びヒトが含まれ得る。
【００３３】
「異常な」という用語は、生物、組織、細胞又はその成分の文脈で使用される場合、少なくとも１つの観察可能な又は検出可能な特性（例えば、年齢、治療、治療時間）が異なる生物、組織、細胞又はその成分を指す日など）、「正常な」（予想／恒常性）それぞれの特性を示す生物、組織、細胞、又はその成分から。ある細胞、組織の種類、又は被験者に対して正常又は期待される特性は、異なる細胞又は組織の種類に対して異常である可能性がある。
【００３４】
「疾患」は、対象が恒常性を維持できない対象の健康状態であり、疾患が改善されない場合、対象の健康は悪化し続ける。
【００３５】
対照的に、対象の「障害」は、対象が恒常性を維持できる健康状態であるが、対象の健康状態は障害がない場合よりも不利である。治療せずに放置すると、障害は必ずしも被験者の健康状態をさらに低下させるとは限りらない。
【００３６】
疾患又は障害の兆候又は症状の重症度、患者がそのような兆候又は症状を経験する頻度、又はその両方が軽減される場合、疾患又は障害は「軽減」される。
【００３７】
化合物の「有効量」又は「治療有効量」とは、化合物が投与される対象に有益な効果を提供するのに十分な化合物の量である。
【００３８】
本明細書で使用される「指示料」には、出版物、記録、図、又はキット内の本発明の化合物、組成物、ベクター、又は送達システムの有用性を伝えるために使用できる他の発現媒体が含まれる。本明細書に列挙される様々な疾患又は障害の緩和をもたらすためである。任意に、又は代わりに、教材は、哺乳動物の細胞又は組織の疾患又は障害を緩和する１つ又は複数の方法を説明することができる。本発明のキットの説明資料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクター、又は送達システムを含む容器に添付するか、同定された化合物、組成物を含む容器と一緒に出荷することができる。ベクター、又は配信システム。代わりに、説明資料と化合物がレシピエントによって協力的に使用されることを意図して、説明資料を容器とは別に出荷することができる。
【００３９】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」又は「作動可能に連結された」とは、遺伝子の発現が空間的に連結されるプロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）又は３’（下流）に配置できる。プロモーターと遺伝子の間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであり得る。当技術分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。
【００４０】
「治療的治療」とは、疾患又は障害の徴候を示す対象に、それらの徴候を軽減又は排除する目的で施される治療である。
【００４１】
本明細書で使用する「疾患又は障害の治療」とは、患者が経験する疾患又は障害の兆候及び／又は症状の頻度及び／又は重症度を低下させることを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される「生物学的試料」、「試料」又は「標本」という語句は、核酸又はポリペプチドの発現を検出できる細胞、組織、又は体液を含む任意の試料を含むものとする。生体試料は、所望のバイオマーカーを検出するのに適した任意の生体物質を含んでもよく、個体から得られた細胞及び／又は非細胞物質を含んでもよい。そのような生物学的サンプルの例には、血液、リンパ液、骨髄、生検及び塗抹標本が含まれるが、これらに限定されない。本質的に液体であるサンプルは、本明細書では「体液」と呼ばれる。生体試料は、例えば、ある領域をこすったり拭いたりすること、又は体液を得るために針を使用することを含む、様々な技術によって患者から得られてもよい。様々な身体サンプルを収集する方法は、当技術分野で周知である。
【００４３】
本明細書で使用される「抗体」という用語は、抗原の特定のエピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然源又は組換え源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「細胞内抗体」）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２及びＦ（ａｂ’）２を含む様々な形態で存在し得る。ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ抗体などの重鎖抗体、及びヒト化抗体（Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ、１９９９、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ；Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ、１９８９、抗体：実験室マニュアル、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；ヒューストンら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；バードら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６）が含まれる。
【００４４】
本明細書で使用される「合成抗体」という用語は、例えばバクテリオファージによって発現される抗体などの組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成により生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質を発現する抗体、又は抗体を特定するアミノ酸配列を意味すると解釈されるべきであり、ここでＤＮＡ又はアミノ酸配列は利用可能であり、当技術分野で周知の合成ＤＮＡ又はアミノ酸配列技術を使用して得られた。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「重鎖抗体」又は「重鎖抗体」という用語は、ペプチドでの免疫及びその後の血清の単離、又はそのような抗体をコードする核酸配列のクローニング及び発現によるラクダ科動物種に由来する免疫グロブリン分子を含む。用語「重鎖抗体」又は「重鎖抗体」は、重鎖疾患を有する対象から単離された、又は対象からのＶＨ（可変重鎖免疫グロブリン）遺伝子のクローニング及び発現により調製された免疫グロブリン分子をさらに包含する。
【００４６】
「キメラ抗体」とは、アクセプター抗体に由来する軽鎖及び重鎖の定常領域に関連して、ドナー抗体に由来する天然に存在する可変領域（軽鎖及び重鎖）を含む操作された抗体のタイプを指す。
【００４７】
「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するＣＤＲを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来部分が１つ（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリンに由来する操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワークサポート残基は、結合親和性を保持するために変更できる（例えば、１９８９年、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３２；１９９１、Ｈｏｄｇｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１）。適切なヒトアクセプター抗体は、ドナー抗体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との相同性により、従来のデータベース、例えばＫＡＢＡＴデータベース、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓデータベース、及びＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから選択されたものであり得る。（アミノ酸ベースで）ドナー抗体のフレームワーク領域との相同性を特徴とするヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のために重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するのに適している場合がある。軽鎖定常又は可変フレームワーク領域を提供できる適切なアクセプター抗体は、同様の方法で選択することができる。アクセプター抗体の重鎖と軽鎖が同じアクセプター抗体に由来する必要はないことに注意する必要がある。先行技術は、そのようなヒト化抗体を産生するいくつかの方法を記載している（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００及びＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照）。
【００４８】
「ドナー抗体」という用語は、その可変領域のアミノ酸配列、ＣＤＲ、又は他の機能的断片又はその類似体を第１の免疫グロブリンパートナーに提供する抗体（モノクローナル、及び／又は組換え）を指し、改変された免疫グロブリンのコード領域と、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性及び中和活性を有する発現された変化した抗体である。
【００４９】
「アクセプター抗体」という用語は、その重鎖及び／又は軽鎖をコードするアミノ酸配列のすべて（又は一部、ただし一部の実施形態ではすべて）に寄与するドナー抗体と異種の抗体（モノクローナル及び／又は組換え）を指すフレームワーク領域及び／又はその重鎖及び／又は軽鎖定常領域を最初の免疫グロブリンパートナーに結合する。特定の実施形態では、ヒト抗体はアクセプター抗体である。
【００５０】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３つの重鎖及び３つの軽鎖ＣＤＲ（又はＣＤＲ領域）がある。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ」は、３つすべての重鎖ＣＤＲ、又は３つすべての軽鎖ＣＤＲ（又は適切な場合、すべて重鎖及びすべての軽鎖ＣＤＲの両方）を指す。抗体の構造及びタンパク質の折り畳みは、他の残基が抗原結合領域の一部と見なされることを意味する場合があり、当業者にはそう理解されるであろう。例えば、Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p 877-883を参照されたい。
【００５１】
本明細書で使用する「免疫測定法」とは、標的分子に特異的に結合することができる抗体を使用して、標的分子を検出及び定量する結合アッセイを指す。
【００５２】
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特異的な標的分子を認識して結合するが、サンプル中の他の分子を実質的に認識又は結合しない抗体を意味する。場合によっては、「特異的結合」又は「特異的結合」という用語は、認識及び結合が標的分子上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味するために使用される。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に特異的に結合する場合、標識「Ａ」と抗体を含む反応でエピトープＡを含む非標識分子（又は遊離の非標識Ａ）が存在すると、標識Ａの量が減少する抗体に結合した。
【００５３】
「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来核酸に対する防御のための広範な細菌システムのクラスを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、広範囲の真正細菌及び古細菌に見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブタイプが含まれる。野生型ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ媒介ヌクレアーゼであるＣａｓ９をガイドと組み合わせて使用し、ＲＮＡを活性化して外来核酸を認識及び切断する。Ｃａｓ９ホモログは、以下の分類群のバクテリアを含むがこれらに限定されない多種多様な真正細菌に含まれる。例示的なＣａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。追加のＣａｓ９タンパク質及びその相同体は、例えば、Chylinksi et al., RNA Biol. 2013 May 1; 10(5):726-737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467-477; Hou, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24; 110(39):15644-9; Sampson et al., Nature. 2013 May 9; 497(7448):254-7;及びJinek et al, Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816-21に記載されている。
【００５４】
遺伝子の「コード領域」は、ｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同又は相補的な、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基及び遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる遺伝子の転写によって生成される。
【００５５】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳中に転移のアンチコドン領域と一致し、又は停止コドンをコードするＲＮＡ分子であるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。したがって、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基のコドンを含むヌクレオチド残基（例えば、タンパク質輸出シグナル配列のアミノ酸残基）を含み得る。
【００５６】
「示差的に減少した発現」又は「ダウンレギュレーション」とは、少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％、又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以下又は未満、及び／又は２．０倍、１．８倍、１．６倍、１．４倍、１．２倍、１．１倍又はそれ未満、及びそれらの間の全体的又は部分的な増分であるバイオマーカー製品レベルを指す。
【００５７】
「示差的に増加した発現」又は「アップレギュレーション」は、少なくとも１０％以上、例えば２０％、３０％、４０％、又は５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上又はそれを超える、及び／又は２．０倍、１．８倍、１．６倍、１．４倍、１．２倍、１．１倍又はそれを超える、及びそれらの間の全体的又は部分的な増分であるバイオマーカー製品レベルを指す。
【００５８】
核酸を指すために本明細書で使用される「相補的」は、２つの核酸鎖の領域間又は同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広範な概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基対形成」）を形成できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対形成することができることが知られている。核酸の第１領域は、２つの領域が逆平行に配置されている場合、第１領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２領域の残基と塩基対形成することができる場合、同じ又は異なる核酸の第２領域に相補的である。いくつかの実施形態では、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１及び第２の部分が逆平行に配置される場合、第１部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、又は少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％は、第２部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。いくつかの実施形態では、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００５９】
本明細書で使用される「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。
【００６０】
「エンコード」とは、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内の特定のヌクレオチド配列の固有の特性を指し、定義されたヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又はアミノ酸の定義された配列のいずれか、及びそこから生じる生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のテンプレートとして機能する。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学的システムでタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。コーディング鎖（ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に記載されているヌクレオチド配列）と非コーディング鎖の両方は、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のテンプレートとして使用され、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又はその他の産物をコードするものと称され得る。
【００６１】
特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重したバージョンであり、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするフレーズヌクレオチド配列はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が何らかのバージョンでイントロンを含み得る程度までイントロンを含み得る。
【００６２】
「単離された」とは、自然状態から変更又は削除されたことを意味する。例えば、生体の通常の文脈に自然に存在する核酸又はペプチドは「単離」されないが、その自然の文脈の共存材料から部分的又は完全に分離された同じ核酸又はペプチドは「単離」される。単離された核酸又はタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、又は、例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
【００６３】
本明細書で使用される「ハイブリドーマ」という用語は、Ｂリンパ球と骨髄腫細胞などの融合パートナーとの融合から生じる細胞を指す。ハイブリドーマは、細胞培養で無期限にクローン化及び維持でき、モノクローナル抗体を産生できる。ハイブリドーマはハイブリッド細胞とみなすこともできる。
【００６４】
「単離された核酸」とは、天然に存在する状態で隣接する配列から分離された核酸セグメント又は断片、すなわち、通常断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片、すなわち、自然に発生するゲノム内の断片に隣接する配列を指す。この用語はまた、核酸に自然に付随する他の成分、すなわち細胞内に自然に付随するＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、この用語には、例えば、ベクター、自律複製プラスミド又はウイルス、又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている、又は別個の分子として存在する（すなわち、ｃＤＮＡとして）組換えＤＮＡが含まれる。又は、ＰＣＲ又は制限酵素消化によって生成されたゲノム又はｃＤＮＡ断片）は、他の配列とは無関係である。また、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡも含まれる。
【００６５】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基の以下の略語が使用される。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、「Ｕ」はウリジンを指す。
【００６６】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解できるという一般的な知識を持っている。単量体のヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解される。本明細書で使用するポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち組換えライブラリー又は細胞からの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない、当技術分野で利用可能なあらゆる手段により得られるすべての核酸配列が含まれるが、これらに限定されないゲノム、通常のクローニング技術及びＰＣＲなどを使用して、及び合成手段によって得られる。
【００６７】
本明細書で使用される「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質又はペプチドの配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドには、ペプチド結合により互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質が含まれる。本明細書で使用する場合、この用語は、例えば当技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも呼ばれる短鎖、及び当技術分野で一般にタンパク質と呼ばれる長鎖の両方を指す。多くの種類がある。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００６８】
本明細書で使用される「子孫」という用語は、子孫又は子孫を指し、哺乳動物の子孫を含み、親細胞に由来する分化又は未分化の子孫細胞も含む。ある用法では、子孫という用語は親と遺伝的に同一の子孫細胞を指す。別の使用において、子孫という用語は、親と遺伝的及び表現型的に同一である子孫細胞を指す。さらに別の用法では、子孫という用語は、親細胞から分化した子孫細胞を指す。
【００６９】
本明細書で使用される「ＲＮＡ」という用語は、リボ核酸として定義される。
【００７０】
本明細書で使用される「組換えＤＮＡ」という用語は、異なる供給源からのＤＮＡ片を結合することにより生成されるＤＮＡとして定義される。
【００７１】
本明細書で使用される「組換えポリペプチド」という用語は、組換えＤＮＡ法を使用することにより産生されるポリペプチドとして定義される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」とは、ある分子の第２の分子への共有結合を指す。
【００７３】
本明細書で使用される用語「変異体」は、それぞれ参照核酸配列又はペプチド配列と配列が異なるが、参照分子の本質的な生物学的特性を保持する核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変えない場合があり、又はアミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断をもたらす場合がある。ペプチド変異体の配列の変化は、通常、限定的又は保存的であるため、参照ペプチドと変異体の配列は全体的に非常に類似しており、多くの地域で同一である。変異体及び参照ペプチドは、任意の組み合わせで１つ又は複数の置換、追加、削除によってアミノ酸配列が異なる場合がある。核酸又はペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に存在するものでも、天然に存在することが知られていない変異体でもよい。天然に存在しない核酸及びペプチドの変異体は、突然変異誘発技術又は直接合成によって作成できる。様々な実施形態において、変異体配列は、参照配列に対して、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも参照配列と９１％、少なくとも９０％、少なくとも８９％、少なくとも８８％、少なくとも８７％、少なくとも８６％、少なくとも８５％同一である。
【００７４】
本明細書で使用される「調節する」という用語は、基質のレベル又は活性を変更する任意の方法を意味し得る。タンパク質に関する調節の非限定的な例には、発現への影響（転写及び／又は翻訳を含む）、フォールディングへの影響、分解又はタンパク質代謝回転への影響、及びタンパク質の局在化への影響が含まれる。酵素に関する調節の非限定的な例には、酵素活性への影響がさらに含まれる。「調節因子」とは、その活性に基質のレベル又は活性への影響が含まれる分子を指す。規制当局は、直接又は間接的であり得る。レギュレーターは、その基質を活性化、阻害、又は調節するように機能することができる。
【００７５】
本明細書で使用する「走査窓」とは、任意の隣接配列とは無関係に配列を評価することができるいくつかの隣接位置のセグメントを指す。一般に、スキャンウィンドウは、評価されるシーケンスの長さに沿って増分的にシフトされ、各新しいセグメントが個別に評価される。インクリメンタルシフトは、１つ又は複数の位置である場合がある。
【００７６】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体又は酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノムに組み込まれるベクターのいずれかであり得る。
【００７７】
用語「繁殖」は、本明細書では、結果として少なくとも１人の子孫が得られる種の繁殖を指すために使用される。
【００７８】
用語「自然繁殖」は、本明細書では、性的結合による種の繁殖を指すために使用される。
【００７９】
本明細書では、「近交系動物」という用語は、特定の特性を保存及び固定するため、又は繁殖集団に他の特性が導入されるのを防ぐために、同じ種の他の類似動物と交配された動物を指すために使用される。
【００８０】
「非近交系動物」という用語は、特定の特性の保存に関係なく、他の動物又は同じ種の被験者と繁殖する動物を指すために本明細書で使用される。
【００８１】
範囲：この開示を通して、本発明の様々な態様を範囲形式で提示することができる。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、すべての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示したと見なされるべきである。例えば、１から６などの範囲の説明は、１から３、１から４、１から５、２から４、２から６、３〜６など、及びその範囲内の個々の番号（１、２、２．７、３、４、５、５．３、６など）などのサブ範囲を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。
【００８２】
説明
本発明は、抗ヒトＤ因子抗体を使用した補体の代替経路（ＡＰ）の阻害に関する。一実施形態では、本発明は、望ましくない、制御されていない過剰なＡＰ補体活性化によって媒介される炎症及び自己免疫疾患を治療及び予防する方法に関する。一実施形態では、本発明は、個体を抗Ｄ因子抗体と接触させることによる、個体におけるＡＰ媒介疾患又はＡＰ媒介障害の治療に関する。
【００８３】
一実施形態において、本発明は、個体に抗Ｄ因子抗体を投与し、それによりＣ３ｂＢｂタンパク質複合体の生成を阻害する工程を含む、個体のＡＰ媒介疾患又は障害を治療する方法である。本発明の方法を用いて治療することができる補体媒介性病状の例には、黄斑変性（ＭＤ）、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）、虚血再灌流障害、関節炎、関節リウマチ、喘息、アレルギー性喘息が含まれるが、これらに限定されない、発作性夜間血色素尿症（ＰＮＨ）症候群、非定型溶血性尿毒症（ａＨＵＳ）症候群、表皮水疱症、敗血症、臓器移植、炎症（心肺バイパス手術及び腎透析に関連する炎症を含むが、これらに限定されない）、Ｃ３糸球体症、膜性腎症、糸球体腎炎（抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）を介した糸球体腎炎、ループス、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない）、ＡＮＣＡを介した血管炎、志賀毒素誘発性ＨＵＳ、及び抗リン脂質抗体誘発性の妊娠喪失、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
【００８４】
「自己抗原」と「非自己抗原」を識別する免疫システムの能力は、侵入する微生物に対する特定の防御として免疫システムが機能するために不可欠である。「非自己抗原とは、被験者自身の成分と検出可能に異なる又は異物である体内に入ったり、存在する物質上の抗原であるのに対し、「自己抗原とは、健康な被験者では自身と検出可能に異なる又は異物ではないものである」成分である。本方法の様々な実施形態では、阻害されるＡＰ活性化は、微生物抗原、非生物学的異物表面、変化した自己組織、又はそれらの組み合わせからなる群の少なくとも１つによって引き起こされたものである。非生物学的異物表面の一例は、心肺バイパス手術や腎臓透析で使用されるような血液チューブである。変化した自己組織の例には、アポトーシス、壊死及び虚血ストレスを受けた組織及び細胞、又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００８５】
一部の実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体はＡＰを阻害するが、古典経路（ＣＰ）又はレクチン経路（ＬＰ）の活性化を阻害しない。一般に、ＣＰは抗原抗体複合体によって開始され、ＬＰは微生物表面の糖分子へのレクチンの結合によって活性化され、ＡＰは低レベルで構成的に活性であるが、細菌、ウイルス、及び寄生細胞で迅速に増幅できる調節タンパク質の欠如による。宿主細胞は通常、調節タンパク質によるＡＰ補体活性化から保護される。しかし、調節タンパク質が欠損又は欠損している場合など、状況によっては、ＡＰが宿主細胞上で制御不能に活性化され、補体が介在する疾患又は障害を引き起こすこともある。ＣＰは、コンポーネントＣＩ、Ｃ２、Ｃ４で構成され、Ｃ３アクティベーションステップでＡＰと収束する。ＬＰは、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）及びＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ（Ｍａｓｐ）で構成され、ＣＰとコンポーネントＣ４及びＣ２を共有する。ＡＰは、コンポーネントＣ３と、Ｂ因子、Ｄ因子、Ｈ因子などのいくつかの因子で構成される。補体活性化は、（ａ）認識、（ｂ）酵素活性化、（ｃ）細胞死をもたらす膜攻撃誘導の３段階で構成される。ＣＰ補体活性化の最初のフェーズはＣＩから始まる。ＣＩは、３つの異なるタンパク質で構成されている。認識サブユニットＣｌｑ、及びセリン依存性四量体複合体Ｃｌｒ２  ｓ２で結合しているセリンプロテアーゼサブコンポーネントＣｌｒ及びＣｌｓである。ＣＩを生理学的に活性化するには、完全なＣＩ複合体が必要である。無傷のＣＩ複合体が抗原と複合体を形成した免疫グロブリンに結合すると、活性化が起こる。この結合によりＣｌｓが活性化され、Ｃ４とＣ２の両方のタンパク質が切断されてＣ４ａとＣ４ｂ、及びＣ２ａとＣ２ｂが生成される。Ｃ４ｂ断片とＣ２ａ断片は結合してＣ３コンベルターゼＣ４ｂ２ａを形成し、Ｃ４ｂ２ａはＣ３を切断してＣ３ａとＣ３ｂを形成する。ＬＰの活性化は、ターゲット表面の特定の糖に結合するＭＢＬによって開始され、これにより、Ｍａｐｓの活性化がトリガーされ、ＣＰのＣｌｓの活性に類似した方法でＣ４及びＣ２が切断され、Ｃ３コンバターゼ、Ｃ４ｂ２ａが生成される。したがって、ＣＰとＬＰは異なるメカニズムによって活性化されるが、同じコンポーネントＣ４とＣ２を共有し、両方の経路が同じＣ３コンバターゼＣ４ｂ２ａの生成につながる。Ｃ４ｂ２ａによるＣ３のＣ３ｂとＣ３ａへの切断は、２つの理由で補体経路の中心的な出来事である。表面に堆積したＣ３ｂはＡＰの中心的な中間体であるため、ＡＰ増幅ループを開始する。Ｃ３ａとＣ３ｂはどちらも生物学的に重要である。Ｃ３ａは炎症性であり、Ｃ５ａと一緒にアナフィラトキシンと呼ばれる。Ｃ３ｂ及びそのさらなる切断産物は、好中球、好酸球、単球及びマクロファージに存在する補体受容体にも結合し、それによってＣ３ｂオプソニン化粒子の食作用及びクリアランスを促進する。最後に、Ｃ３ｂはＣ４ｂ２ａと結合してＣＰ及びＬＰのＣ５コンバターゼを形成し、末端補体配列を活性化して、強力な炎症誘発性メディエーターであるＣ５ａの産生、及び細胞溶解膜攻撃複合体（ＭＡＣ）Ｃ５−Ｃ９のアセンブリーをもたらす。
【００８６】
ＡＰは、Ｃ３が自発的に加水分解してＣ３（Ｈ２０）を形成するため、低レベルで構成的に活性であると考えられている。Ｃ３（Ｈ２０）はｆＢと結合できるという点でＣ３ｂと同様に動作し、ｆＢがｆＤの切断と活性化を受けやすくなり。次に、得られたＣ３（Ｈ２０）ＢｂはＣ３を切断してＣ３ｂ及びＣ３ａを生成し、ＡＰのＣ３コンバターゼＣ３ｂＢｂを形成することによりＡＰカスケードを開始する。最初のＣ３コンバターゼが増加する量のＣ３ｂを生成すると、増幅ループが確立される。ＣＰとＬＰもＣ３ｂを生成するため、Ｃ３ｂは因子Ｂに結合してＡＰに関与するため、これらの経路が活性化されると、ＡＰ増幅ループもＣＰとＬＰに関与することに留意されたい。したがって、ＡＰは２つの機能エンティティで構成される：ＣＰ又はＬＰとは無関係の独立した補体活性化経路と、ＣＰ及びＬＰの完全な発現に関与し貢献する増幅プロセス。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、増幅プロセス又は増幅ループを阻害する。
【００８７】
一実施形態では、本発明の方法を使用して阻害されるＡＰの活性は、リポ多糖（ＬＰＳ）、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）から選択される群の少なくとも１つによって誘導されるＡＰ活性化である及び危険関連分子パターン（ＤＡＭＰ）。別の実施形態では、本発明の方法を使用して阻害されるＡＰの活性は、Ｃ３ｂＢｂタンパク質複合体の生成である。別の実施形態では、本発明の方法を使用して阻害されるＡＰの活性はＤ因子依存的である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＣＰ及びＬＰを介した感染と戦う個人の能力を保持する。一実施形態では、本発明は、抗リポタンパク質Ｄ抗体を個体に投与するステップを含む、個体の細菌性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）によって誘導されるＡＰ活性化を阻害する方法であり、それによって細菌ＬＯＳによって誘導されるＡＰ活性化を阻害する。別の実施形態では、細菌ＬＰＳにより誘導されるＡＰ活性化を阻害する方法が本明細書で提供される。特定の実施形態では、ＡＰ活性化はＳ．ｔｙｐｈｏｓａ  ＬＰＳによって誘導され、本明細書で提供される方法で使用される阻害剤は、Ｓ．ミネソタＬＰＳ又は大腸菌ＬＰＳによって誘導されるＡＰ活性を阻害しない。様々な実施形態において、本発明の抗Ｄ因子抗体はＡＰを阻害するが、ＣＰ誘発補体活性化、ＬＰ誘発補体活性化、ザイモサン誘導活性化、又はコブラ毒因子誘導活性化を阻害しない。
【００８９】
一実施形態では、本明細書で提供されるのは、個体における病原体関連分子パターン媒介ＡＰ活性化を阻害する方法であって、抗個体Ｄ抗体を前記個体に投与し、それによってＰＡＭＰ媒介ＡＰ活性化を阻害するステップを含む方法である。本発明の方法によりＡＰの活性化を阻害できるＰＡＭＰの例には、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）、細菌ＤＮＡからのＣｐＧモチーフ、２本鎖ウイルスＲＮＡ、ペプチドグリカン、リポテイコが含まれるが、これらに限定されない。酸、Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉの外表面タンパク質Ａ、合成マイコプラズママクロファージ活性化リポタンパク質−２、トリパルミトイル−システイニル−セリル−（リシル）３−リジン（Ｐ３ＣＳＫ４）、ジパルミトイル−ＣＳＫ４（Ｐ２−ＣＳＫ４）、モノパルミトイル−ＣＳＫ４（ＰＣＳＫ４）、アンホテリシンＢ、トリアシル化又はジアシル化細菌ポリペプチド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。
【００９０】
一実施形態において、本発明は、抗Ｄ因子抗体を個体に投与し、それにより個体におけるＡＰ活性化の開始を阻害するステップを含む、個体におけるＡＰ活性化の開始を阻害する方法である。別の実施形態では、個体のＡＰ活性化の増幅を阻害する方法が本明細書に提供され、前記個体にＡＰの阻害剤を投与し、それにより個体のＡＰ活性化の増幅を阻害する工程を含む。これらの実施形態の例は、ＡＰ補体媒介溶血を患うＰＮＨ患者、及びＡＰ補体媒介ａＨＵＳ、喘息、虚血／再灌流傷害、関節リウマチ及びＡＮＣＡ媒介腎疾患を患う個人である。本発明の様々な実施形態では、本発明の組成物及び方法を使用して治療することができる疾患及び障害には、ＡＰ補体媒介溶血、ＡＰ補体媒介ａＨＵＳ、喘息、虚血／再灌流傷害、リウマチが含まれるが、これらに限定されない関節炎及びＡＮＣＡ媒介腎疾患又は障害が挙げられる。
【００９１】
様々な実施形態において、本明細書で提供されるのは、ＡＰに対して阻害効果を有する潜在的抗体を同定する方法であり、以下のステップを含む：ａ）抗Ｄ因子抗体を個体に投与すること；ｂ）結果として生じる個人の表現型を測定すること；ｃ）得られた個体の表現型をＤ因子−／−ノックアウト動物の表現型と比較する。別の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用される抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子−／−ノックアウト動物を使用して潜在的な治療化合物を選択する方法により同定される。
【００９２】
様々な他の実施形態において、本明細書に提供されるのは、ＡＰに対する阻害効果を有する潜在的な抗Ｄ因子抗体を同定する方法である。そのような方法の１つには、次のステップが含まれる。ａ）プレートをリポ多糖（ＬＰＳ）でコーティングする；ｂ）プレートを洗浄して未結合ＬＰＳを除去する；ｃ）リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加える；ｄ）プレートを洗浄して、結合していないＢＳＡを除去する；ｅ）血清とプレインキュベートされ、正常なヒト血清に混合された候補抗Ｄ因子抗体化合物の混合物を追加する；ｆ）プレートの洗浄；ｇ）ＨＲＰ結合抗ヒトＣ３抗体の添加；ｈ）プレートを洗浄して未結合抗体を除去する；ｉ）ＨＲＰ基質試薬の添加；ｊ）硫酸を加えて反応を停止する；ｋ）４５０ｎｍでの光学密度の測定；１）候補抗Ｄ因子抗体化合物を含むプレートの光学密度を、ポジティブコンパレーターコントロール及びネガティブコンパレーターコントロールの光学密度と比較する；正の比較対照コントロールと比較して光学密度が減少する場合、抗Ｄ因子抗体が同定される。
【００９３】
抗Ｄ因子抗体
一部の実施形態では、本発明は、Ｄ因子に特異的に結合する抗体を含む組成物を含む。一実施形態では、抗Ｄ因子抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体はキメラ抗体である。さらなる態様において、抗Ｄ因子抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施形態では、Ｄ因子はヒトＤ因子である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗体又は抗体の断片のヒトＤ因子への結合は、無傷の生物の補体活性化経路におけるＣ３ｂＢｂの生成の減少と関連している。いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＤ因子に結合することができるタンパク質又はポリペプチドである。いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片；タンパク質又はポリペプチドは、ヒトＤ因子の関連する部分又は画分又はエピトープに結合する；そして、抗体、又はその抗体断片、又はタンパク質又はポリペプチドのヒトＤ因子の関連部分への結合は、無傷の生物におけるＣ３ｂＢｂの生成の減少と関連している。
【００９５】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子結合抗体又はそのＤ因子結合抗体断片は、タンパク質、ペプチド又は他の化合物に結合している。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗体断片がコンジュゲートされるタンパク質、ペプチド又は他の化合物は標的化部分である（すなわち、標的化部分はＤ因子以外の分子に特異的に結合する）。いくつかの実施形態では、タンパク質、ペプチド、又は抗Ｄ因子抗体又はその抗体断片が結合される他の化合物は、エフェクター分子（例えば、細胞傷害性分子）である。
【００９６】
一実施形態において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、以下からなる群から選択されるＣＤＲの少なくとも１つを含む：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又はその変異体。別の実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、以下からなる群のＣＤＲのすべてを含む：ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又はその変異体。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及びＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８、又は最大約３個（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；及びＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及びＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９、又は最大約３個（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；及びＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号１０、又は最大約３個（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；及びＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１０のアミノ酸配列を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、又は最大約３個（約１、２、又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び配列番号１０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２のアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖を含む。他の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、ｍＡｂ  １１−８Ａ１と呼ばれるモノクローナル抗体である。ｍＡｂ  １１−８Ａ１と命名されたモノクローナル抗Ｄ因子抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含む重鎖又はその変異体、及び配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖又はその変異体を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗Ｄ因子抗体はヒト化されている。いくつかの実施形態では、ｍＡｂ  １１−８Ａ１と呼ばれるモノクローナル抗Ｄ因子抗体はキメラ抗体である。
【０１０４】
一実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又はその変異体からなる群から選択されるＣＤＲのうちの少なくとも１つを含む。別の実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、ＶＨ−ＣＤＲ１：配列番号１３；配列番号１３；ＶＨ−ＣＤＲ２：配列番号１４；ＶＨ−ＣＤＲ３：配列番号１５；ＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８；ＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又はその変異体からなる群から選択されるＣＤＲのすべてを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；及びＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１、及びＶＬ−ＣＤＲ１：配列番号１８を含む。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及びＶＬ−ＣＤＲ２：配列番号１９、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、及び配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの態様において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３、及びＶＬ−ＣＤＲ３：配列番号２０を含む。
【０１０８】
いくつかの態様において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。
【０１０９】
いくつかの態様において、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２、又は最大約３（約１、２又は３のいずれかなど）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ１；配列番号１４のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ２；配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ−ＣＤＲ３；配列番号１８のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ１；配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ２；及び配列番号２０のアミノ酸配列を含むＶＬ−ＣＤＲ３を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖を含む。他の実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５と呼ばれるモノクローナル抗体である。ｍＡｂ  １Ｆ１０−５と呼ばれるモノクローナル抗Ｄ因子抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列又はその変異体を含む重鎖、及び配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖、又はその変異体を含む。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗Ｄ因子抗体はヒト化されている。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗Ｄ因子抗体はキメラ抗体である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、単離された抗体は、ヒトＤ因子に結合し、抗体は、Ｄ因子の第１エピトープ及び第２エピトープのいずれかに交互に結合し、第１エピトープ及び第２エピトープの両方が、コイル構造をとる部分を有するそれらの二次構造、及びその二次構造においてβ鎖コンフォメーションをとるＤ因子の部分は、第１のエピトープと第２のエピトープの間にある。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の抗Ｄ因子抗体は、Ｄ因子の特定のエピトープに結合するものである。一実施形態では、配列番号２１のアミノ酸の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）は、抗Ｄ因子抗体のエピトープにある。配列番号２１のアミノ酸は、Ｄ因子アミノ酸配列のアミノ酸１０７〜１１０に対応する。一実施形態では、配列番号２２のアミノ酸の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）は、抗Ｄ因子抗体のエピトープにある。配列番号２２のアミノ酸は、Ｄ因子アミノ酸配列のアミノ酸１４８〜１５１に対応する。一実施形態では、配列番号２３のアミノ酸の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）は、抗Ｄ因子抗体のエピトープにある。配列番号２３のアミノ酸は、Ｄ因子アミノ酸配列のアミノ酸１５５〜１５９に対応する。一実施形態において、配列番号２４のアミノ酸の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）は、抗Ｄ因子抗体のエピトープにある。配列番号２４のアミノ酸は、Ｄ因子アミノ酸配列のアミノ酸１７３〜１７６に対応する。
【０１１４】
一実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２１の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）のアミノ酸に結合する抗体である。一実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２２の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）のアミノ酸に結合する抗体である。一実施形態において、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２３の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）のアミノ酸に結合する抗体である。１つの態様において、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２４の少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２、３、又は４）のアミノ酸に結合する抗体である。
【０１１５】
別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２１の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）のアミノ酸に結合する抗体と結合に関して競合する抗体である。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２２の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）のアミノ酸に結合する抗体と結合に関して競合する抗体である。実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２３の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）のアミノ酸に結合する抗体との結合について競合する抗体である。別の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号２４の少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、又は４など）のアミノ酸に結合する抗体との結合について競合する抗体である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、生体内のヒトＤ因子の配列番号２１、２２、２３及び２４から選択されるアミノ酸配列の少なくともいずれか１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）への抗ヒトＤ因子抗体又はその抗原結合断片の結合は、生体のＣ３ｂＢｂ生成の減少に関連している。いくつかの実施形態では、生物はヒトである。一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、ｍＡｂ  １１−８Ａ１又はｍＡｂ  ＩＦ  １０−５のいずれかである。いくつかの実施形態において、治療有効量のｍＡｂ  １１−８Ａ１又はｍＡｂ  ＩＦ  １０−５の生物への全身投与は、生物の補体活性化経路におけるＣ３ｂＢｂの生成を減少させる。いくつかの実施形態では、生物はヒトである。いくつかの態様において、本発明は、ヒトＤ因子の配列番号２１、２２、２３および２４から選択される少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）のアミノ酸配列に結合することができるタンパク質、抗体、抗体断片、又はペプチドに関し、生物に治療上有効な用量で投与されると、生物の代替補体活性化経路におけるＣ３ｂＢｂの生成を減少させることができる。いくつかの実施形態では、生物はヒトである。いくつかの態様において、本発明は、ヒトＤ因子の配列番号２１、２２、２３および２４から選択される少なくとも１つ（少なくとも１、２、３、４、又は５など）のアミノ酸配列に結合することができるタンパク質、抗体、抗体断片、又はペプチドに関し、ＡＰ因子ＢのＢａ及びＢｂへの触媒的切断を防ぐ。いくつかの態様において、本願は、ヒトＤ因子の１０７〜１１０位に位置するＰＬＰＷの配列を有する４つのアミノ酸、又はヒトＤ因子の１４８〜１５１位に位置するＶＬＤＲの配列を有する４つのアミノ酸に結合し、ヒトＤ因子ブロッキング活性を示すことができる抗体もしくはその断片、タンパク質又はペプチドを包含する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、抗体はキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗ヒトＤ因子抗体は、本明細書の他の箇所に記載されている可変領域ＣＤＲ配列又はその変異体と組み合わせたヒト軽鎖及びヒト重鎖定常領域を含み得る。当業者は、関心のある特定の抗体の関連ドメインを交換する既知の技術を使用してキメラ抗体を調製及び取得することができる。このような抗体は、本出願に記載されている１つ以上のＣＤＲ配列を組み込んで、異種抗体ドメインを移植することにより容易に調製される。既知の組換え技術を使用して、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域の核酸配列によりコードされる重鎖及び軽鎖定常領域；ならびに本開示に記載のＣＤＲ配列に対応する核酸配列によりコードされるＣＤＲを含む重鎖及び軽鎖可変領域を含む組換え抗体を取得及び調製することが可能である。当業者は、本開示に記載される１つ又は複数のＣＤＲ配列を含む抗ヒトＤ因子抗体を調製することができ、軽鎖のみの部分又は重鎖のみの部分は、ヒトなどの別の種に属する抗体からの領域で置換される。配列番号３−５、８−１０、１３−１５及び１８−２０から選択される１つ以上のＣＤＲ配列またはその変異体を有する可変領域を含むヒト抗ヒトＤ因子抗体は、ＣＤＲ領域の外側のマウス又は非マウス抗体構造要素と組み合わせて、当該技術分野で既知の日常的な方法により調製することができる。いくつかの実施形態において、抗体又は抗体断片は、当該分野で公知の技術を使用してさらにヒト化される。
【０１１８】
一部の実施形態では、抗Ｄ因子抗体は、配列番号３−５、８−１０、１３−１５、１８−２０に列挙された、本明細書の記載されるＣＤＲ配列の１つ以上に対して、少なくとも約８５％（少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のいずれか）のアミノ酸同一性を有する抗体を含む。
【０１１９】
一実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣＤＲ配列と約８５％同一性のＣＤＲ配列有する抗Ｄ因子抗体を包含する。本開示は、本明細書に記載のＣＤＲ配列と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％及び９９％と同一であるＣＤＲ配列を有する抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片を包含する。一実施形態において、ヒトＤ因子に対する抗体は、重鎖可変（ｖＨ）領域及び軽鎖可変（ｖＬ）領域を有し、ｖＨ領域は、配列番号２と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列を有し、ｖＬ領域は、配列番号７と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列を有する。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、抗体又は抗体断片は修飾されている。いくつかの実施形態では、修飾には、抗体又はその抗原結合断片と別のタンパク質又はタンパク質断片の一部との融合が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の抗体又はその抗体断片は、生体内で同じものの循環半減期を延長するために修飾される。例えば、断片の抗体をＦｃＲｎ分子と融合させることができ、これはｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を安定化するために新生児Ｆｃ受容体としても知られている。（Nature Reviews Immunology 7:715-725）。一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合断片は、エフェクター分子及び／又は別の標的化部分（異なる分子、異なる抗原又は異なるエピトープを認識する抗体又は抗体断片など）に結合（例えば、融合）されている。
【０１２１】
当業者は、配列番号３〜５、８〜９、１３〜１５、及び１８−２０から選択される少なくとも１つの特定のＣＤＲ配列を含む、ヒトＤ因子結合単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又はその変異体を調製することができる。ｓｃＦｖは、配列番号３〜５で示される重鎖可変領域配列、又はその変異体、及び配列番号８〜１０で示される軽鎖可変領域、又はその変異体を含み得る。ｓｃＦｖは、配列番号１３〜１５で示される重鎖可変領域配列、又はその変異体、及び配列番号１８〜２０で示される軽鎖可変領域、又はその変異体を含み得る。本開示に記載されるＣＤＲ配列に対して少なくとも約８５％８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のアミノ酸配列同一性を有するｓｃＦｖ内に組み込まれたＣＤＲ配列は、本開示の範囲内に含まれる。ｓｃＦｖは、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、及び配列番号２４からなる群に挙げられたアミノ酸配列の少なくとも１つ内のエピトープなどのヒトＤ因子に結合する。
【０１２２】
スクリーニングアッセイ
本発明は、候補抗Ｄ因子抗体がＡＰを阻害できるかどうかの決定を含む、様々なスクリーニングアッセイに適用される。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、候補抗Ｄ因子抗体の存在下でのＡＰ活性のレベルは、陽性比較対照で検出されたＡＰ活性と比較される。陽性比較対照は、試験化合物の添加なしでのＡＰ活性化を含む。いくつかの実施形態において、候補抗Ｄ因子抗体の存在下でのＡＰ活性が陽性比較対照で検出されたＡＰ活性の約７０％未満である場合、候補抗Ｄ因子抗体はＡＰの阻害剤として同定される。これは、試験化合物の存在下でのＡＰ活性の約３０％以上の阻害に相当する。他の実施形態では、候補抗Ｄ因子抗体の存在下でのＡＰ活性が陽性比較対照で検出されたＡＰ活性の約８０％未満である場合、候補抗Ｄ因子抗体はＡＰの阻害剤として同定される。これは、試験化合物の存在下でのＡＰ活性の約２０％以上の阻害に相当する。さらに他の実施形態では、候補抗Ｄ因子抗体の存在下でのＡＰ活性が陽性比較対照で検出されたＡＰ活性の約９０％未満である場合、候補抗Ｄ因子抗体はＡＰの阻害剤として同定される。これは、試験化合物の存在下でＡＰ活性の約１０％を超える阻害に相当する。いくつかの実施形態において、候補抗Ｄ因子抗体によるＡＰ阻害のレベルは、陰性比較対照で検出された阻害のレベルと比較される。
【０１２４】
競合的及び非競合的イムノアッセイ形式、抗原捕捉アッセイ、２抗体サンドイッチアッセイ、及び３抗体サンドイッチアッセイを含む様々なイムノアッセイ形式が、本発明の有用な方法である（Self et al, 1996, Curr. Opin. Biotechnol. 7: 60-65）。本発明は、アッセイがＡＰの阻害を検出できるという条件で、既知の又はこれまで未知のアッセイのいずれか１つのタイプに限定されると解釈されるべきではない。
【０１２５】
血管外溶血アッセイは、本発明の方法に含まれる。様々な実施形態において、赤血球（ＲＢＣ）は、正常な（健康な）個人、又は例えばＰＮＨなどの疾患又は障害の兆候又は症状を示す個人から得られる。種々の実施形態において、疾患又は障害は、Ｃｒｒｙ／ＤＡＦ／Ｃ３トリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスなどの動物モデルで誘発される。いくつかの実施形態では、輸血されたＲＢＣのレシピエントは、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はＰＢＳなどの対照溶液でＲＢＣ移植の２４時間前に治療される。ドナーＲＢＣを洗浄し、Miwa et al, 2002, Blood 99, 3707-3716によって記載されているような方法を使用してＣＦＳＥで標識する。いくつかの実施形態において、ドナーＲＢＣは、正常なドナーから採取され、洗浄され、製造業者によって記載される技術又は当業者が適切であると考える技術を使用してＤＤＡＯ−ＳＥで標識される。いくつかの実施形態では、１：１の正常ＲＢＣとＴＫＯ  ＲＢＣの混合物は、マウスレシピエントの場合、尾静脈を含むがこれに限定されない、当業者によって最も適切と考えられる静脈内モードを介してレシピエントに注射される。一実施形態において、血液サンプルは、ドナーＲＢＣの注射後の様々な時点で収集される。一実施形態では、輸血の５分後、６、２４、４８、７２、９６及び１２０時間後に血液サンプルが収集される。採取した血液を分析して、循環に残っているＣＦＳＥ又はＤＤＡＯ−ＳＥ標識（すなわち輸血）ＲＢＣの割合を決定する。各受信者のＣＦＳＥラベル付きＴＫＯ  ＲＢＣの数は、各時点でＤＤＡＯ−ＳＥラベル付き正常ＲＢＣに正規化される。
【０１２６】
ＫＲＮ関節炎の治療は、本発明の有用な方法である。関節炎は、Ｋ／ＢｘＮマウスから精製された総ＩｇＧを受動的に導入することにより、ホモ接合性のヒトＤ因子ノックインマウスで誘発される。一実施形態では、足首の肥厚はノギスによって測定され、臨床スコアは、木村ら等（Kimura et al, 2010, JCI; 3545-3554）によって以前に公開されたような基準を使用して記録される被験者は、抗ヒトＤ因子抗体の用量で治療される。いくつかの実施形態では、対象は、関節炎の誘発後１日目、３日目、７日目、及び１１日目、ならびに１５日目に治療される。
【０１２７】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、本発明の方法において有用である。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はウレアーゼなどの酵素を、例えば、本発明の方法で使用するための抗Ｃ３抗体又は二次抗体に結合させることができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼ検出システムは、例えば、４５０ｎｍで検出可能な過酸化水素の存在下で可溶性生成物を生成する発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともに使用できる。他の便利な酵素結合システムには、例えば、アルカリホスファターゼ検出システムが含まれ、これは、発色基質ｐ−ニトロフェニルホスフェートと共に使用して、４０５ｎｍで容易に検出可能な可溶性生成物を生成し得る。同様に、β−ガラクトシダーゼ検出システムを発色性基質ｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）とともに使用して、４１０ｎｍで検出可能な可溶性生成物を得ることができる。あるいは、ウレアーゼ検出システムは、尿素−ブロモクレゾールパープル（Ｓｉｇｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ミズーリ州セントルイス）などの基質とともに使用することができる。有用な酵素結合一次抗体及び二次抗体は、任意の数の商業ソースから入手できる。
【０１２８】
化学発光検出は、ＡＰの阻害を検出するのにも役立つ。化学発光二次抗体は、任意の数の商業ソースから入手できる。
【０１２９】
蛍光検出は、ＡＰの阻害を検出するのにも役立つ。有用な蛍光色素には、ＤＡＰＩ、フルオレセイン、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｒ−フィコシアニン、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、リサミン−フルオレセイン又はローダミン標識抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）も本発明の方法に有用である。そのようなアッセイは当技術分野で周知であり、例えばBrophy et al.（1990, Biochem. Biophys. Res. Comm. 167:898-903)及びGuechot et al.（1996, Clin. Chem. 42:558-563）に記載されている。例えば、ヨウ素−１２５標識一次又は二次抗体を用いてラジオイムノアッセイが行われる（Harlow et al、上記、1999)。
【０１３１】
検出可能な抗体から発せられるシグナルは、例えば、発色基質から色を検出するための分光光度計；ヨウ素１２５を検出するガンマカウンターなどの放射線を検出する放射線カウンター；又は、特定の波長の光の存在下で蛍光を検出する蛍光計を用いて分析される。酵素結合アッセイが使用される場合、定量分析は分光光度計を使用して実行される。本発明のアッセイは手動で実施することができ、又は必要に応じて自動化することができ、複数のサンプルから放出される信号は市販の多くのシステムで同時に検出できることが理解される。
【０１３２】
本発明の方法はまた、必要に応じて自動化することができるキャピラリー電気泳動ベースのイムノアッセイ（ＣＥＩＡ）の使用を包含する。イムノアッセイは、例えば、Schmalzing et al.に記載されているように、レーザー誘起蛍光と組み合わせて使用することもできる。（1997, Electrophoresis 18:2184-2193）及びＢａｏ（1997, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699:463-480）。フローインジェクションリポソームイムノアッセイ及びリポソームイムノセンサーなどのリポソームイムノアッセイも、本発明の方法に従って使用することができる（Rongen et al, 1997, J. Immunol. Methods 204:105-133）。
【０１３３】
定量的ウエスタンブロット法もまた、本発明の方法におけるＡＰ阻害のレベルを決定するために使用され得る。ウエスタンブロットは、スキャンデンシトメトリーなどの周知の方法を使用して定量化される（Parra et al,1998、J. Vase. Surg. 28:669-675）。
【０１３４】
投与方法
本発明の方法は、治療有効量の少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はその結合断片（本明細書の他の箇所に記載の抗体又はその断片など）を、ＡＰ媒介性の病気又は障害を有すると特定された個体に投与することを含む。一実施形態では、個体はＡＰシステムを有する哺乳動物である。一実施形態では、個体はヒトである。様々な実施形態において、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はその結合断片は、局所的、局所的、又は全身的に投与される。いくつかの実施形態では、ＡＰ媒介疾患又は障害はＣ３糸球体症である。いくつかの実施形態では、ＡＰ媒介疾患又は障害は黄斑変性症（ＡＭＤなど）である。
【０１３５】
本発明の方法は、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はその結合断片の投与を含むことができるが、本発明は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろＡＰ活性化を減少及び減少させる、既知及び未知の抗Ｄ因子抗体を包含すると解釈される。
【０１３６】
本発明の方法は、治療有効量の少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はその結合断片を個体に投与することを含み、本発明の組成物は、単独で、又は少なくとも１つの他の治療薬と組み合わせて、少なくとも１つの抗Ｄ因子抗体又はその結合断片を含む。本発明は、例えば、抗炎症療法などの他の治療法と組み合わせて使用することができる。本発明の方法と組み合わせて使用できる抗炎症療法の例には、例えば、ステロイド薬を使用する療法、及び非ステロイド薬を使用する療法が含まれる。
【０１３７】
本発明の方法は、治療有効量の抗Ｄ因子抗体又はその抗原結合断片を対象に投与することを含み、抗体は配列番号２１、２２、２３、２４から選択される配列のいずれか１つ内で結合することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、治療有効量の本発明の抗体、又は対象においてＣ３ｂＢｂの減少がもたらされるような治療有効量の抗体断片を投与することによる、ＡＰ補体経路の調節不全を伴うＤ因子関連疾患の治療方法を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、ヒトＤ因子内の特定のエピトープ又は複数のエピトープ、例えば、配列番号２１−２４から選択されるアミノ酸配列内に含まれるエピトープに結合することができる治療的有効量の抗体又は抗体断片を投与することによるＡＰ補体経路の調節不全を伴うＤ因子関連疾患の治療方法を包含する。いくつかの実施形態において、本発明は、対象に、ヒトＤ因子内の特定のエピトープに結合することができる、有効量の抗体、抗体断片、ポリペプチド、ペプチド、コンジュゲートペプチドを投与することによるＡＰ補体経路の調節不全を伴うＤ因子関連疾患の治療方法を包含し、ここで、エピトープは、配列番号２１〜２４から選択されるアミノ酸配列内に含まれ、そのため、対象においてＡＰ補体活性化経路の活性化が低下する。いくつかの実施形態では、治療方法は、配列番号２１−２４にリストされた配列から選択されるアミノ酸内で結合することができる全身有効用量の抗体又は抗体断片を対象に投与することを含み、それによりＣ３ｂＢｂの全身的減少が件名に影響する。
【０１３８】
医薬組成物及び治療
本発明の治療方法における抗Ｄ因子抗体又はその結合断片の投与は、当技術分野で公知の方法を使用して、多くの異なる方法で達成することができる。したがって、本発明の治療的及び予防的方法は、抗Ｄ因子抗体を含む薬学的組成物の使用を包含する。
【０１３９】
本発明の実施に有用な医薬組成物は、少なくとも約１ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約５００ｎｇ／ｋｇ、少なくとも約１μｇ／ｋｇ、少なくとも約５μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ、少なくとも約２５μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２５ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約５０ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約１００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約２００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約３００ｍｇ／ｋｇ、少なくとも約４００ｍｇ／ｋｇ、及び少なくとも約５００ｍｇ／ｋｇ被験者の体重の用量を送達するために投与され得る。一実施形態では、本発明は、個体において少なくとも約１ｐＭ、少なくとも約１０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１００ｎΜ、少なくとも約１μΜ、少なくとも約２μΜ、少なくとも約３μΜ、少なくとも約４μΜ、少なくとも約５μΜ、少なくとも約６μΜ、少なくとも約７μΜ、少なくとも約８μΜ、少なくとも約９μΜ、及び少なくとも約１０μΜの本発明の抗Ｄ因子抗体濃度をもたらす用量を投与する。別の実施形態において、本発明は、個体の血漿中に少なくとも約１ｐＭ、少なくとも約１０ｐＭ、少なくとも約１００ｐＭ、少なくとも約１ｎＭ、少なくとも約１０ｎＭ、少なくとも約１００ｎＭ、少なくとも約１μΜ、少なくとも約２μΜ、少なくとも約３μΜ、少なくとも約４μΜ、少なくとも約５μΜ、少なくとも約６μΜ、での少なくとも約７μΜ、少なくとも約８μΜ、少なくとも約９μΜ、及び少なくとも約１０μΜの間の本発明の抗Ｄ因子抗体濃度をもたらす用量の投与を想定する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、本発明の実施に有用な医薬組成物を投与して、対象の体重１ｋｇにして、約１ｎｇ／ｋｇ以下、約５ｎｇ／ｋｇ以下、約１０ｎｇ／ｋｇ以下、約２５ｎｇ／ｋｇ以下、約５０ｎｇ／ｋｇ以下、約１００ｎｇ／ｋｇ以下、約５００ｎｇ／ｋｇ以下、約１μｇ／ｋｇ以下、約５μｇ／ｋｇ以下、約１０μｇ／ｋｇ以下、約２５μｇ／ｋｇ以下、約５０μｇ／ｋｇ以下、約１００μｇ／ｋｇ以下、約５００μｇ／ｋｇ以下、約１ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ以下、約１０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約１００ｍｇ／ｋｇ以下、約２００ｍｇ／ｋｇ以下、約３００ｍｇ／ｋｇ以下、約４００ｍｇ／ｋｇ以下、及び約５００ｍｇ／ｋｇ以下の用量を送達することができる。一実施形態では、本発明は、個体において、約１ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１００ｎΜ以下、約１μΜ以下、約２μΜ以下、約３μΜ以下、約４μΜ以下、約５μΜ以下、約６μΜ以下、約７μΜ以下、約８μΜ以下、約９μΜ以下、及び約１０μΜ以下の本発明の抗Ｄ因子抗体の濃度をもたらす用量を投与する。別の実施形態では、本発明は、個体の血漿において、約１ｐＭ以下、約１０ｐＭ以下、約１００ｐＭ以下、約１ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１００ｎΜ以下、約１μΜ以下、約２μΜ以下、約３μΜ以下、約４μΜ以下、約５μΜ以下、約６μΜ以下、約７μΜ以下、約８μΜ以下、約９μΜ以下及び約１０μΜ以下の間の本発明の抗Ｄ因子抗体の濃度をもたらす用量の投与を想定する。また、本明細書に開示されている用量のいずれかの間の用量範囲も考えられる。
【０１４１】
典型的には、本発明の方法で対象、いくつかの実施形態ではヒトに投与できる用量は、対象の体重１キログラムあたり０．５μｇから約５０ｍｇの量の範囲である。投与される正確な投与量は、限定されるものではないが、対象のタイプ及び治療される病状のタイプ、対象の年齢、及び投与経路を含む任意の数の要因に応じて変わる。いくつかの実施形態では、化合物の投与量は、対象の体重１キログラムあたり約１μｇから約１０ｍｇまで変化する。他の実施形態では、投与量は、対象の体重１キログラムあたり約３μｇから約１ｍｇまで変化する。
【０１４２】
化合物は、１日に数回の頻度で対象に投与されるか、又は１日１回、１日２回、１日３回、週１回、週２回、週３回、２週間ごと、２週間ごとに２回、２週間ごとに３回、１か月に１回、１か月に２回、１か月に３回、またはさらにより少ない頻度、例えば、数カ月に１回、または１年に１回もしくは数回またはそれ未満などの頻度で投与されてもよい。投与の頻度は、当業者には容易に明らかであり、治療される疾患のタイプ及び重症度、対象のタイプ及び年齢などであるがこれらに限定されない任意の数の要因に依存する。医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で既知の又は今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような準備方法には、有効成分を担体又は１つ以上の他の補助成分と結合させ、その後、必要又は望ましい場合、製品を所望の単回又は複数回用量単位に成形又は包装するステップが含まれる。
【０１４３】
本明細書で提供される医薬組成物の説明は主にヒトへの倫理的投与に適した医薬組成物に関するが、このような組成物は一般にあらゆる種類の対象への投与に適していることを当業者は理解する。組成物を様々な対象への投与に適したものにするためのヒトへの投与に適した医薬組成物の改変はよく理解されており、通常の獣医薬理学者は、もしあったとしても通常の実験でそのような改変を設計及び実行できる。本発明の医薬組成物の投与が企図される個体には、ヒト及び他の霊長類、非ヒト霊長類などの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及びイヌが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、眼科、経口、直腸、膣、非経口、局所、肺、鼻腔内、頬、眼内、硝子体内、筋肉内、皮内及び静脈内投与経路に適した製剤で調製、包装、又は販売することができる。他の考えられる製剤には、投影ナノ粒子、リポソーム製剤、活性成分を含む再封された赤血球、及び免疫学に基づいた製剤が含まれる。
【０１４５】
本発明の医薬組成物は、単一の単位用量として、又は複数の単一の単位用量として、大量に調製、包装、又は販売され得る。単位用量は、所定量の活性成分を含む個別の量の医薬組成物である。活性成分の量は、一般に、個体に投与される活性成分の投与量、又はそのような投与量の便利な部分、例えばそのような投与量の半分又は３分の１に等しい。
【０１４６】
本発明の医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容される担体、及び任意の追加成分の相対量は、治療される個体の同一性、サイズ、及び状態に応じて、さらに組成物の経路に応じて異なる管理される。例として、組成物は、０．１％から１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができる。様々な実施形態では、組成物は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約１６％、少なくとも約１７％、少なくとも約１８％、少なくとも約１９％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２２％、少なくとも約２３％、少なくとも約２４％、少なくとも約２５％、少なくとも約２６％、少なくとも約２７％、少なくとも約２８％、少なくとも約２９％、少なくとも約３０％、少なくとも約３１％、少なくとも約３２％、少なくとも約３３％、少なくとも約３４％、少なくとも約３５％、少なくとも約３６％、少なくとも約３７％、少なくとも約３８％、少なくとも約３９％、少なくとも約４０％、少なくとも約４１％、少なくとも約４２％、少なくとも約４３％、少なくとも約４４％、少なくとも約４５％、少なくとも約４６％、少なくとも約４７％、少なくとも約４８％、少なくとも約４９％、少なくとも約５０％、少なくとも約５１％、少なくとも約５２％、少なくとも約５３％、少なくとも約５４％、少なくとも約５５％、少なくとも約５６％、少なくとも約５７％、少なくとも約５８％、少なくとも約５９％、少なくとも約６０％、少なくとも約６１％、少なくとも約６２％、少なくとも約６３％、少なくとも約６４％、少なくとも約６５％、少なくとも約６６％、少なくとも約６７％、少なくとも約６８％、少なくとも約６９％、少なくとも約７０％、少なくとも約７１％、少なくとも約７２％、少なくとも約７３％、少なくとも約７４％、少なくとも約７５％、少なくとも約７６％、少なくとも約７７％、少なくとも約７８％、少なくとも約７９％、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み得る。
【０１４７】
活性成分に加えて、本発明の医薬組成物は、１つ又は複数の追加の医薬活性剤をさらに含んでもよい。
【０１４８】
本発明の医薬組成物の制御放出製剤又は持続放出製剤は、従来の技術を使用して作製することができる。
【０１４９】
医薬組成物の非経口投与には、個体の組織の物理的破壊及び組織の破壊による医薬組成物の投与を特徴とする投与経路が含まれる。保護者による管理は、局所、局部、又は全身で行うことができる。したがって、非経口投与には、組成物の注射による、外科的切開による組成物の適用による、組織貫通非外科的創傷による組成物の適用によるなどの医薬組成物の投与が含まれるが、これらに限定されない。特に、非経口投与には、静脈内、眼内、硝子体内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、胸骨内注射、及び腫瘍内が含まれることが意図されるが、これらに限定されない。
【０１５０】
非経口投与に適した医薬組成物の製剤は、滅菌水又は滅菌等張食塩水などの薬学的に許容される担体と組み合わせた活性成分を含む。そのような製剤は、ボーラス投与又は連続投与に適した形態で調製、包装、又は販売することができる。注射用製剤は、アンプル又は防腐剤を含む複数回投与容器などの単位剤形で調製、包装、又は販売することができる。非経口投与用の製剤には、懸濁液、溶液、油性又は水性ビヒクル中のエマルジョン、ペースト、及び移植可能な持続放出又は生分解性製剤が含まれるが、これらに限定されない。そのような製剤は、懸濁剤、安定剤、又は分散剤を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の追加の成分をさらに含んでもよい。非経口投与用の製剤の一実施形態では、活性成分は、再構成された組成物の非経口投与の前に、適切な媒体（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）で再構成するための乾燥（すなわち、粉末又は顆粒）形態で提供される。
【０１５１】
医薬組成物は、無菌の注射可能な水性又は油性の懸濁液又は溶液の形態で調製、包装、又は販売することができる。この懸濁液又は溶液は、既知の技術に従って製剤化することができ、活性成分に加えて、分散剤、湿潤剤、又は懸濁剤などの追加の成分を含むことができる。そのような滅菌注射製剤は、例えば水又は１，３−ブタンジオールなどの非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒を使用して調製することができる。他の許容される希釈剤及び溶媒には、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム溶液、及び合成モノ又はジグリセリドなどの固定油が含まれるが、これらに限定されない。有用な他の非経口投与可能な製剤には、微結晶形態、リポソーム製剤、又は生分解性ポリマー系の成分として活性成分を含むものが含まれる。徐放又は移植用の組成物は、エマルジョン、イオン交換樹脂、難溶性ポリマー、又は難溶性塩などの薬学的に許容されるポリマー又は疎水性材料を含んでもよい。
【０１５２】
本発明の医薬組成物は、口腔を介した肺投与に適した製剤で調製、包装、又は販売することができる。そのような製剤は、活性成分を含み、約０．５〜約７ナノメートル、いくつかの実施形態では約１〜約６ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。そのような組成物は、粉末を分散させるために噴射剤の流れを向けることができる乾燥粉末リザーバーを含む装置を使用するか、又は装置を含む自己推進溶媒／粉末分配容器を使用する投与用の乾燥粉末の形態である。密封容器内の低沸点噴射剤に有効成分が溶解又は懸濁している。いくつかの実施形態において、そのような粉末は、粒子の少なくとも９８重量％が０．５ナノメートルを超える直径を有し、粒子の少なくとも９５％が７ナノメートル未満の直径を有する粒子を含む。いくつかの実施形態では、重量で少なくとも９５％の粒子が１ナノメートルを超える直径を有し、数で少なくとも９０％の粒子が６ナノメートル未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、乾燥粉末組成物は、砂糖などの固体微粉末希釈剤を含み、単位用量形態で便利に提供される。
【０１５３】
低沸点噴射剤には、一般に、大気圧で沸点が６５°Ｆ未満の液体噴射剤が含まれる。一般に、推進剤は組成物の５０〜９９．９％（ｗ／ｗ）を構成し、活性成分は組成物の０．１〜２０％（ｗ／ｗ）を構成する。噴射剤は、液体非イオン性又は固体陰イオン性界面活性剤又は固体希釈剤などの追加成分をさらに含んでもよい（いくつかの実施形態では、活性成分を含む粒子と同じオーダーの粒子サイズを有する）。
【０１５４】
肺送達用に製剤化された本発明の医薬組成物は、溶液又は懸濁液の液滴の形態で有効成分を提供することもできる。そのような製剤は、活性成分を含む、任意に無菌の水性又は希釈アルコール溶液又は懸濁液として調製、包装、又は販売でき、噴霧又は霧化装置を使用して便利に投与できる。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの香味剤、揮発性油、緩衝剤、界面活性剤、又はメチルヒドロキシベンゾエートなどの防腐剤を含むがこれらに限定されない１つ又は複数の追加成分をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、この投与経路によって提供される液滴は、約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【０１５５】
製剤は、本発明の医薬組成物の鼻腔内送達にも有用である。
【０１５６】
鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、約０．２〜５００マイクロメートルの平均粒子を有する粗い粉末である。そのような製剤は、嗅ぎ薬が摂取される方法で、すなわち鼻孔の近くに保持された粉末の容器から鼻腔を通る急速な吸入によって投与される。
【０１５７】
経鼻投与に適した製剤は、例えば、約０．１％（ｗ／ｗ）から１００％（ｗ／ｗ）の有効成分を含み、さらに１つ以上の追加成分を含んでもよい。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、口腔投与に適した製剤で調製、包装、又は販売することができる。そのような製剤は、例えば、従来の方法を使用して作られた錠剤又はロゼンジの形態であってもよく、例えば、０．１から２０％（ｗ／ｗ）の有効成分、残りは経口溶解性又は分解性組成物、及び任意に、１つ以上の追加成分を含み得る。あるいは、口腔投与に適した製剤は、活性成分を含む粉末又はエアロゾル化又は噴霧化された溶液又は懸濁液を含んでもよい。いくつかの実施形態では、そのような粉末、エアロゾル化、又はエアロゾル化された製剤は、分散される場合、約０．１から約２００ナノメートルの範囲の平均粒子又は液滴サイズを有し、１つ又は複数の追加成分をさらに含んでもよい。
【０１５９】
本明細書で使用される「追加の成分」には、以下のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない：界面活性剤；分散剤；不活性希釈剤；造粒及び崩壊剤；結合剤；潤滑剤；甘味料；香料；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理学的に分解可能な組成物；水性ビヒクル及び溶媒；油性車両及び溶剤；懸濁剤；分散剤又は湿潤剤；乳化剤、粘滑薬；緩衝液；塩；増粘剤；フィラー；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定剤；及び薬学的に許容されるポリマー又は疎水性材料。本発明の医薬組成物に含まれ得る他の「追加成分」は当技術分野で公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences(1985, Genaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA)に記載されている。これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
抗体及びその抗原結合断片を産生する細胞
いくつかの態様において、本発明は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体又は抗原結合断片の少なくとも１つを産生する細胞又は細胞株（宿主細胞など）である。一実施形態では、細胞又は細胞株は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体又は抗原結合断片の少なくとも１つを産生する遺伝子改変細胞である。一実施形態では、細胞又は細胞株は、本明細書に記載の抗Ｄ因子抗体又は抗原結合断片の少なくとも１つを産生するハイブリドーマである。
【０１６１】
ハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）は一般に、Ｂリンパ球が非常に豊富なマウス脾細胞と骨髄腫の「融合パートナー細胞」との大量融合から生成される（Albertsら、Molecular Biology of the Cell(Garland Publishing, Inc. 1994)）Harlow et al、Antibodies。A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、1988）。その後、融合細胞はプールに分配され、所望の特異性を備えた抗体の産生について分析することができる。目的の特異性の抗体を産生する単一細胞クローンが同定されるまで、さらに細分化することができる。そのようなクローンによって産生される抗体は、モノクローナル抗体と呼ばれる。
【０１６２】
また、本明細書に開示される抗体又は抗体断片のいずれかをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクターも提供される。したがって、本発明の抗体及び断片は、組換え又はヒト化免疫グロブリンの発現に典型的に使用される細胞株などの細胞又は細胞株で核酸を発現させることにより生成することができる。したがって、本発明の抗体及び断片は、核酸を１つ又は複数の発現ベクターにクローニングし、ベクターを組換え又はヒト化免疫グロブリンの発現に典型的に使用される細胞株などの細胞株に形質転換することによって生成することもできる。
【０１６３】
免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖、又はその断片をコードする遺伝子は、当該分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない方法に従って操作され得る（例えば、Sambrook et al、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、2nd ed.、Cold Spring Harbor、NY、1989; Berger&Kimmel、Methods in Enzymology、Vol.152: Guide to Molecular Cloning Techniques、Academic Press、Inc.、San Diego、Calif、1987; Coら、1992、J. Immunol. 148:1149）。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子、又はその断片は、細胞のゲノムＤＮＡを分泌する抗体からクローン化することができ、又はｃＤＮＡは細胞のＲＮＡの逆転写により生成される。クローニングは、クローニングされる遺伝子又は遺伝子のセグメントに隣接又はオーバーラップする配列にハイブリダイズするＰＣＲプライマーの使用を含む従来の技術によって達成される。
【０１６４】
本発明の抗体、又はその重鎖もしくは軽鎖もしくはその断片をコードする核酸は、様々な宿主細胞又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳システムにおいて、特定の免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、又はその断片もしくは変異体の生産のための組換え核酸技術に従って取得及び使用することができる。例えば、抗体をコードする核酸又はその断片は、適切な原核生物又は真核生物ベクター、例えば発現ベクターに入れられ、適切な方法、例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染により適切な宿主細胞に導入され得、それにより、核酸が、例えばベクター内の、又は宿主細胞ゲノムに組み込まれた１つ又は複数の発現制御要素に作動可能に連結される。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、重鎖及び軽鎖、又はその断片は、レシピエント細胞を同時トランスフェクトするために使用できる２つの異なる発現ベクターに組み立てることができる。いくつかの実施形態では、各ベクターは、２つ以上の選択可能な遺伝子を含むことができ、１つは細菌系での選択用であり、もう１つは真核生物系での選択用である。これらのベクターは、細菌系での遺伝子の産生と増幅、それに続く真核細胞の同時トランスフェクション、及び同時トランスフェクト細胞の選択を可能にする。選択手順を使用して、２つの異なるＤＮＡベクターで真核細胞に導入された抗体核酸の発現を選択できる。
【０１６６】
あるいは、重鎖及び軽鎖をコードする核酸、又はその断片は、１つのベクターから発現されてもよい。軽鎖と重鎖は別々の遺伝子によってコード化されているが、組換え法を使用して結合できる。例えば、２つのポリペプチドは、ＶＬとＶＨ領域が対になって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作成できる合成リンカーによって結合できる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird et al.、1988、Science 242:423-426; Huston et al、1988、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。
【０１６７】
本発明は、重鎖及び／又は軽鎖、ならびにその断片をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を提供する。軽鎖及び重鎖の両方をコードする配列又はその断片を含む核酸分子は、細胞内で産生される場合、抗体又は断片の分泌のための合成シグナル配列を含むように設計することができる。さらに、核酸分子は、他の抗体配列の挿入を可能にし、抗体配列に通常見られるアミノ酸を変えないように翻訳リーディングフレームを維持できる特定のＤＮＡリンクを含むことができる。
【０１６８】
本発明によれば、抗体をコードする核酸配列を適切な発現ベクターに挿入することができる。様々な実施形態において、発現ベクターは、挿入された抗体をコードする核酸の転写及び翻訳に必要な要素を含み、抗体又はその断片の形成のための抗体配列の発現を指示する組換えＤＮＡ分子を生成する。
【０１６９】
抗体をコードする核酸又はその断片は、部位特異的突然変異誘発などの当業者に知られている様々な組換え核酸技術にかけることができる。
【０１７０】
様々な方法を使用して、細胞内で核酸を発現させることができる。核酸は多くのタイプのベクターにクローン化できる。しかしながら、本発明は、特定のベクターに限定されると解釈されるべきではない。代わりに、本発明は、容易に入手可能及び／又は当技術分野で知られている多種多様なベクターを包含すると解釈されるべきである。例えば、本発明の核酸は、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及びコスミドを含むがこれらに限定されないベクターにクローン化することができる。特に関心のあるベクターには、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び配列決定ベクターが含まれる。
【０１７１】
特定の実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター、及び哺乳動物細胞ベクターからなる群から選択される。上述の組成物の少なくとも一部又はすべてを含む多数の発現ベクターシステムが存在する。原核生物及び／又は真核生物ベクターベースのシステムは、ポリヌクレオチド又はそれらの同族ポリペプチドを生成するために本発明で使用するために使用することができる。そのようなシステムの多くは、商業的に広く利用可能である。
【０１７２】
ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al (2012)、及びAusubel et al (1999)、及びその他のウイルス学及び分子生物学のマニュアル。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）ベクターを使用して、所望の核酸を発現させる。ＭＳＣＶベクターは、細胞内で目的の核酸を効率的に発現することが実証されている。しかしながら、本発明は、ＭＳＣＶベクターの使用のみに限定されるべきではなく、むしろ、あらゆるレトロウイルス発現方法が本発明に含まれる。ウイルスベクターの他の例は、モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）及びＨＩＶに基づくものである。いくつかの実施形態では、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ又は複数の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び米国特許第６，３２６，１９３号を参照）。
【０１７３】
追加の調節要素、例えばエンハンサーを使用して、転写開始の頻度を調節することができる。プロモーターは、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することにより得られるように、遺伝子又は核酸配列に自然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」と呼ばれ得る。同様に、エンハンサーは、その配列の下流又は上流のいずれかに位置する核酸配列に自然に関連するものであってもよい。あるいは、コード化核酸セグメントを組換え又は異種プロモーターの制御下に置くことにより特定の利点が得られ、それは通常その自然環境において核酸配列に関連しないプロモーターを指す。組換えエンハンサー又は異種エンハンサーは、その自然環境において通常核酸配列に関連しないエンハンサーも指す。そのようなプロモーター又はエンハンサーには、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び他の原核細胞、ウイルス細胞、又は真核細胞から単離されたプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在しない」プロモーター又はエンハンサー、及び／又は発現を変える突然変異が含まれる場合がある。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物に関連して、ＰＣＲを含む組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を使用して生成され得る（米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写及び／又は発現を指示する制御配列も同様に使用できると考えられる。
【０１７４】
当然、発現のために選択された細胞型、オルガネラ、及び生物におけるＤＮＡセグメントの発現を効果的に指示するプロモーター及び／又はエンハンサーを使用することが重要である。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現のためにプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせを使用する方法を知っている。例えば、Sambrook et al. （2012）。使用されるプロモーターは、組換えタンパク質及びその断片の大規模生産に有利なように、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を指示する適切な条件下で構成的、組織特異的、誘導性、及び／又は有用であり得る。
【０１７５】
プロモーターの例は、初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに機能的に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動できる強力な構成的プロモーター配列である。ただし、他の構成プロモーター配列も使用され得、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタインバールウイルス極初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、及びアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーターなどのヒト遺伝子プロモーター筋肉クレアチンプロモーターが挙げられる。さらに、本発明は構成的プロモーターの使用に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本発明の一部として意図される。本発明における誘導性プロモーターの使用は、そのような発現が望まれる場合に作動可能に連結されるポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、又は発現が望まれない場合に発現をオフにすることができる分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、組織特異的プロモーター又は細胞型特異的プロモーターの使用を含み、これは、所望の組織又は細胞でのみ活性であるプロモーターである。組織特異的プロモーターは、当技術分野で周知であり、ＨＥＲ−２プロモーター及びＰＳＡ関連プロモーター配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
核酸の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又はその両方を含んで、目的の細胞集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にすることもできるウイルスベクターを介してトランスフェクト又は感染される。他の実施形態において、選択可能なマーカーは、別個の核酸に担持され、同時トランスフェクション手順で使用され得る。選択可能なマーカーとレポーター遺伝子の両方に、宿主細胞での発現を可能にする適切な調節配列が隣接していてもよい。有用な選択可能マーカーは当技術分野で知られており、例えば、ネオなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。
【０１７７】
レポーター遺伝子は、潜在的にトランスフェクトされた細胞を特定し、調節配列の機能を評価するために使用される。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子は、当技術分野で周知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物又は組織に存在又は発現されない遺伝子であり、その発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により明示されるタンパク質をコードする。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の適切な時間にアッセイされる。
【０１７８】
適切なレポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が含まれ得る（例えば、Ui-Tei et al、2000 FEBS Lett. 479:79-82を参照）。適切な発現系は周知であり、周知の技術を使用して調製するか、商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を持つ構築物がプロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用され得る。
【０１７９】
核酸を細胞に導入及び発現させる方法は、当技術分野で知られている。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当技術分野の任意の方法により、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫細胞に容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により宿主細胞に移入され得る。
【０１８０】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝撃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、レーザーポレーションなどが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrook et al (2012)及びAusubel et al. (1999)を参照されたい。
【０１８１】
目的の核酸を宿主細胞に導入する生物学的方法には、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、ヒト細胞などの哺乳動物に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法になった。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第４，９８３，８３４号を、第５，３５０，６７４号及び第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１８２】
核酸を宿主細胞に導入する化学的手段には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散系、及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質ベースのシステムが含まれる。インビトロ及びインビボで送達媒体として使用するための好ましいコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。そのようなシステムの調製及び使用は、当技術分野で周知である。
【０１８３】
外因性核酸を宿主細胞に導入するため、又は細胞を本発明の核酸にさらすために、あるいは宿主細胞中の組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために使用される方法に関係なく、様々なアッセイを行うことができる。そのようなアッセイには、例えば、サザン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者に周知の「分子生物学的」アッセイが含まれる。特定のペプチドの有無の検出などの「生化学的」アッセイ、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）又は本明細書に記載のアッセイにより、本発明の範囲内にある薬剤を特定する。
【０１８４】
非ヒト動物を発現するヒトＤ因子
本発明はまた、ヒトＤ因子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＤ因子を発現する遺伝子改変された非ヒト動物は、非ヒト動物Ｄ因子を発現しない。一実施形態では、本発明は、非ヒト動物の内因性調節要素からヒトＤ因子を発現するが、非ヒト動物Ｄ因子を発現しない、遺伝的に改変された非ヒト動物である。いくつかの態様において、非ヒト動物は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はげっ歯類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物はラット又はマウスである。
【０１８５】
遺伝子改変された非ヒト動物を作成するために、ヒトＤ因子タンパク質をコードする核酸を、宿主細胞におけるヒトＤ因子タンパク質の発現に適した形で組換え発現ベクターに組み込むことができる。「宿主細胞における融合タンパク質の発現に適した形態」という用語は、核酸のｍＲＮＡへの転写及びｍＲＮＡのヒトＤ因子タンパク質への翻訳を可能にするように、組換え発現ベクターが、ヒトＤ因子タンパク質をコードする核酸に機能的に連結される１つ又は複数の調節配列を含むことを意味するものとする。「調節配列」という用語は当技術分野で認識されており、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような調節配列は当業者に知られており、1990、Goeddel、Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Califに記載されている。発現ベクターの設計は、トランスフェクトされる宿主細胞の選択及び／又は発現されるヒトＤ因子タンパク質の量などの因子に依存し得る。
【０１８６】
遺伝的に修飾された非ヒト動物は、例えば、マイクロインジェクションにより、ヒトＤ因子タンパク質をコードする核酸（構成的又は組織特異的エンハンサーなどの適切な調節要素に典型的に連結される）を卵母細胞に導入することにより作成できる、卵母細胞が雌の創始マウスで発達することを可能にする。イントロン配列及びポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に含めて、導入遺伝子の発現効率を高めることができる。マウスなどの遺伝的に改変された動物を生成する方法は、当技術分野で慣例になっており、例えば、米国特許第４，９８３，９８３号、米国特許第４，７３６，８６６号及び第４，８７０，００９号及び１９８６、Ｈｏｇａｎ他、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、コールドスプリングハーバー研究所に記載されている。遺伝子組み換えファウンダー動物を使用して、導入遺伝子を持つ追加の被験者を繁殖させることができる。本発明のＤ因子タンパク質をコードする導入遺伝子を保有する遺伝子改変動物は、他の導入遺伝子を保有する他の遺伝子改変動物、又は他のノックアウト動物、例えばマウスＤ因子遺伝子を発現しないノックアウトマウスとさらに交配させることができる。遺伝的に改変された動物に加えて、このシステムを使用して、他のヒトＤ因子発現対象を生成できることが理解される。
【０１８７】
一実施形態では、非ヒト動物の調節要素からヒトＤ因子を発現するが、非ヒト動物のＤ因子を発現しない遺伝子改変非ヒト動物は、非ヒト動物の因子を置換するシステムを使用して生成されるＤ因子エクソン配列（又はエクソン及びイントロン配列）とヒトＤ因子エクソン配列（又はエクソン及びイントロン配列）、ただし、非ヒト動物の天然の調節要素（プロモーター、エンハンサー、隣接領域、イントロンなど）配列の１つ、複数、又はすべては変更されていない。任意の適切なシステムを使用することができるが、この方法で遺伝子改変された非ヒト動物を産生することができる１つの例示的なシステムはＣＲＩＳＰｒ／Ｃａｓ９システムである。「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ」システムは、外来核酸に対する防御のための広範な細菌システムのクラスを指す。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、広範囲の真正細菌及び古細菌に見られる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムには、タイプＩ、ＩＩ、及びＩＩＩのサブタイプが含まれる。野生型ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ媒介ヌクレアーゼであるＣａｓ９をガイドと組み合わせて使用し、ＲＮＡを活性化して外来核酸を認識及び切断する。Ｃａｓ９ホモログは、以下の分類群のバクテリアを含むがこれらに限定されない多種多様な真正細菌に含まれる：例示的なＣａｓ９タンパク質は、化膿連鎖球菌Ｃａｓ９タンパク質である。追加のＣａｓ９タンパク質及びその相同体は、例えば、Chylinksi et al, RNA Biol. 2013 May 1; 10(5):726-737; Nat. Rev. Microbiol. 2011 June; 9(6):467-477; Hou、et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Sep 24; 110(39):15644-9; Sampson et al.、Nature. 2013 May 9; 497(7448):254-7;及びJinek et al, Science. 2012 Aug 17; 337(6096):816-21に記載されている。
【０１８８】
一実施形態において、本発明の遺伝子改変された非ヒト動物は、ＣＶＭ−ＩＥエンハンサーを有するニワトリβ−アクチンプロモーターからヒトＤ因子を発現するが、当業者は、本発明の遺伝子改変された非ヒト動物が他のプロモーター及びエンハンサーからのヒトＤ因子の発現。本発明において有用なプロモーターの例には、ネイティブマウスプロモーター、ＤＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、ＰＧＫプロモーター、ユビキチンプロモーター、アルブミンプロモーター、グロビンプロモーター、オボアルブミンプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、レトロウイルスＬＴＲ、及びレンチウイルスＬＴＲ。本発明において有用なプロモーター及びエンハンサー発現系には、誘導性及び／又は組織特異的発現系も含まれる。
【０１８９】
本明細書に記載の遺伝子改変された非ヒト動物は、様々な研究及び臨床用途に有用であり得る。いくつかの実施形態において、本願は、抗Ｄ因子化合物（抗体など）をスクリーニングする方法を提供する。いくつかの実施形態では、本願は、抗Ｄ因子化合物（抗体など）を検証する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本願は、ヒト化非ヒトにおいて誘発され得る疾患及び障害を含む、様々な補体媒介疾患及び障害における抗Ｄ因子化合物（抗体など）の治療効果を評価する方法を提供する。ヒトＤ因子非ヒト動物と他の変異を有する他の変異非ヒト動物との交雑により産生され、補体を発達させることができる二重変異非ヒト動物に自発的に発生しうるヒト動物又は疾患又は障害関連する疾患又は障害（例えば、Lesher, 2013, J. Am. Soc. Nephrol. 24:53-65; Ueda et al, 2017, Blood Mar 2; 129:1184-1196を参照）。
【０１９０】
キット
本発明はまた、本発明の抗Ｄ因子抗体又はその組み合わせ、及び例えば、治療因子として個体に抗Ｄ因子抗体又はその組み合わせを投与すること、又は、本書の他の場所で説明されている非治療用途を説明する説明資料を含むキットを含む。一実施形態では、このキットは、例えば、抗体を個体に投与する前に、本発明の抗Ｄ因子抗体又はその組み合わせを含む治療組成物を溶解又は懸濁するのに適した薬学的に許容される担体をさらに含む。任意で、キットは抗体を投与するためのアプリケーターを含む。
【実施例】
【０１９１】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明する。これらの実施例は例示のみを目的として提供されており、本発明はこれらの実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、本明細書で提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆるバリエーションを包含すると解釈されるべきである。
【０１９２】
さらに説明することなく、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を製造及び利用し、特許請求の方法を実施できると考えられる。したがって、以下の実施例は、開示の残りを何らかの形で限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１９３】
実施例１
抗ヒトＤ因子モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５）によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して生成されたが、いくつかの修正を伴う。Ｂａｌｂ／ｃ雌（Ｊａｃｋｓｏｎ実験室）マウスを、アジュバントで乳化した１００μｇの精製ヒトＤ因子（ヒト血漿由来）で免疫した。２１日目及び３５日目に、アジュバントで乳化した精製ヒトＤ因子１００μｇでマウスを再び免疫化した。融合の前に、マウスを２５μｇの精製ヒトＤ因子で２回追加免疫した。次に、頸部脱臼によりマウスを犠牲にし、機械的破壊による単細胞懸濁液の調製のために脾臓を単離した。脾臓細胞懸濁液をＨＹＢ−ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ＦＢＳ培地で１回洗浄し、細胞をカウントし、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と２：１の比率で混合した。細胞混合物を再びＨＹＢ−ＳＦＭ培地で洗浄し、遠心分離（１０００ｒｐｍ×５分）により細胞ペレットを調製した。細胞ペレットを穏やかに乱し、ほぐした後、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ  １５００）（３×１０８細胞の場合は１．５ｍｌ  ＰＥＧ）をゆっくりと加えることにより、細胞融合を誘導した。細胞を３７℃で１分間放置した後、２０ｍｌのＨＹＢ−ＳＦＭ培地を３分で細胞に加えた（最初の１分間は１ｍｌ、２分間は３ｍｌ、３分間は１６ｍｌ）。混合物を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞をＨＡＴ培地（１０ｍｌ  ＨＡＴ［Ｓｉｇｍａ  Ｈ０２６２］、５ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、５００μＭゲンタマイシン及び５００ｍｌ  ＨＹＢ−ＳＦＭ培地中の１０％ＦＢＳ）中の２４ウェルプレートに播種した。２週間後、ＥＬＩＳＡによる精製ヒトＤ因子との反応性のスクリーニングのために、目に見えるコロニーのあるウェルの上清を回収した。陽性クローンをピックアップし、限界希釈法により９６ウェルプレートに播種して、ＥＬＩＳＡによる２回目のスクリーニング後に単一クローンを得た。陽性クローンをＨＴ−培地（５００ｍｌ  ＨＹＢ−ＳＦＭ培地中の１０ｍｌ  ＨＴ、５ｍｌ  Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ  ５００μＭゲンタマイシン及び１０％ＦＢＳ）で拡大した。抗体収集の前に、ハイブリドーマ細胞を２〜３日間無血清培地（ＨＹＢ−ＳＦＭ）に切り替えた。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによるｍＡｂ精製のために、細胞培養培地を収集した。
【０１９４】
実施例２
マイクロタイタープレートは、３７℃で１時間、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中のリポ多糖（ＬＰＳ）（μｇ／ウェル）でコーティングされた。ＰＢＳＴ（リン酸緩衝生理食塩水及び０．０５％トゥイーン）でプレートを３回洗浄した後、プレートをＰＢＳ中の１％ＢＳＡでＲＴで１時間ブロックした。１０％正常ヒト血清（ＮＨＳ）、正常カニクイザル血清、正常アカゲザル血清、正常モルモット血清、正常マウス血清を異なる濃度の１１  Ａ８−１  ｍＡｂ又は１Ｆ１０−５  ｍＡｂ又はキメラ１１  Ａ８−１でプレインキュベートした４℃で１時間。Ｍｇ＋＋−ＥＧＴＡ  ＧＶＢ＋＋バッファー中の１０％血清が陽性対照として機能し、ＧＶＢ＋＋ＥＤＴＡバッファー中の１０％血清が陰性対照として機能した。プレートをＮＨＳとともに３７℃で１時間インキュベートし、次にＰＢＳ中の冷１０ｍＭ  ＥＤＴＡで停止し、３回洗浄した。プレートを、ブロッキング緩衝液で１：４０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＣ３ポリクローナル抗体又は抗マウスＣ３ポリクローナルＣ３抗体とともに室温で１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＨＲＰ基質で６〜１０分間現像した。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１９５】
実施例３
ポリスチレンマイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の精製ヒトＤ因子（５０ｎｇ／ウェル）で３７℃で１時間コーティングした。Ｄ因子溶液を吸引した後、室温で１時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを含むＰＢＳでウェルをブロックした。ｆＤコーティングのないウェルは、バックグラウンドコントロールとして機能した。ブロッキング溶液中の異なる濃度の１１Ａ８−１  ｍＡｂ又は１Ｆ１０−５  ｍＡｂ又はキメラ１１Ａ８−１、５０μｌ／ウェルをウェルに加えた。室温で１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳＴで徹底的に洗浄した。ヒトＤ因子結合ｍＡｂは、ブロッキング溶液で１：４０００に希釈した抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰを添加することにより検出され、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴで洗浄した後、プレートをＨＲＰ基質で６〜１０分間現像した。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０１９６】
実施例４
表面プラズモン共鳴分析を使用して、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、固定化１１  Ａ８−１  ｍＡｂ、１Ｆ１０−５  ｍＡｂ及びキメラ１１Ａ８−１へのヒトＤ因子の結合の結合及び解離速度定数を測定し、すべてのＢｉａｃｏｒｅ実験は２５℃で実施された。ＣＭ５センサーチップのカルボキシル化デキストランマトリックスを使用して、アミン結合化学により精製抗体、１１Ａ８−１  ｍＡｂ、１Ｆ１０−５  ｍＡｂ及びキメラ１１Ａ８−１を結合させ、４００−５００ＲＵの表面密度を得た。ヒトｆＤをＨＢＳＥＴ（Ｔｗｅｅｎ  ２０を含むＨＥＰＥＳ緩衝液ＥＤＴＡ）バッファーで１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２、１．５６、０ｎＭに希釈し、サンプルを１１Ａ８−１  ｍＡｂ、１Ｆ１０−５  ｍＡｂに注入したそして、１２０秒間３０μｌ／分でキメラ１１Ａ８−１表面（６０μｌ注入）及び結合した分析物の解離を９００秒間進行させた。データは、二価結合モデルを想定してＢＩＡ評価ソフトウェア３．２によって分析された。表面の再生は、５０ｍＭ  ＮａＯＨの５０μｌ注入（５０μｌ／ｍｉｎ）で達成された。
【０１９７】
実施例５
１１Ａ８−１及び１Ｆ１０−５のｃＤＮＡをクローニングするために、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ）によってハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した逆転写によりファーストストランドｃＤＮＡを合成し、重鎖ｃＤＮＡ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｂ）を増幅し、ＰＣＲ反応で次のプライマーを使用した：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧ（Ｔ／Ａ）Ｃ（ＴＶＡ）ＧＧ−３’（配列番号６８）及び５’−ＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’（配列番号６９）。軽鎖を増幅するために、以下のプライマーを使用した：４つの上流プライマーの混合物：５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７０）。５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７１）；５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号７２）；５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’（配列番号：７３）；下流プライマー：５’−ＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ−３’（配列番号７４）。ＰＣＲアンプリコンをｐＣＲ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。ｍＡｂｓのシグナルペプチド（リーダー）配列を得るために、５’−ＲＡＣＥ法をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキット（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ）とともに使用した。５’−ＲＡＣＥ及び初期配列決定データから決定された特異的プライマーを使用して、完全な可変領域ｃＤＮＡを増幅した。
【０１９８】
実施例６
ｐＮＤ１プラスミドを使用して、最終的なターゲティングベクターを組み立てた。短腕相同配列について、５’−ＣＣＣＧＧＧＣＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＣ−３’（フォワード；Ｓｍａｌ部位に下線が引かれている）及び５’−ＣＣＣＧＧＧＴＣＣＴＴＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＣ−３’（リバース；Ｓｍａｌ部位に下線が引かれている）をプライマーとして使用して、マウスＤ因子遺伝子の３’領域を含む４．２ｋｂ  ｓｍａｌ−ｓｍａｌ断片を増幅した（Ｓｍａｌ部位に下線が引かれている）。この断片を、ブランティング試薬で処理したＫｐｎＩ部位でｐＮＤ１ベクターにクローン化した。ロングアーム相同配列の場合、５’−ＡＴＣＧＡＴＡＣＴＣＡＧＡＡＡＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＣ−３’（フォワード；Ｃｌａｌ部位に下線が引かれている）及び５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＧＡＣＣＡＧＡＡＣＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（リバース；ＮｏｔＩ部位に下線が引かれている）をプライマーとして使用して、マウスＤ因子遺伝子の５’領域を含む５．７ｋｂの断片を増幅した。また、５’−ＣＴＣＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＣＧＴＧＧＣＴＣＡＣＡＡＴＡ−３’（フォワード；Ｘｈｏｌサイトに下線が引かれている）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＡＡＴＴＡＴＣＧＡＡＧＴＡＣＴＣＣＡＣＣＧ−３’（リバース；Ｘｈｏｌサイトに下線が引かれている）をプライマーとして増幅した（Ｓｍａｌサイトには下線が引かれています）。Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐを介してヒトＤ因子のコード配列を含む８２６ｂｐ断片を合成し、ＮｏｔＩ及びＸｈｏｌで消化することにより０．７５ｋｂ  ＮｏｔＩ−Ｘｈｏｌ断片を単離した。これらの３つの断片、５．７ｋｂ  Ｃｌａｌ−ＮｏｔＩ断片、０．７５ｋｂ  Ｎｏｔｌ−Ｘｈｏｌ断片及び１．２ｋｂ  Ｘｈｏｌ−Ｘｈｏｌ断片を、Ｃｌａｌ−Ｘｈｏｌ部位で上記ｐＮＤ１ベクターにサブクローニングした。標的構築物を線形化し、Ｃ５７ＢＬ／６  ＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ネオマイシン耐性について選択した。ＢａｍＨＩ消化後の適切に修飾されたゲノム領域で５ｋｂの野生型断片と４．５ｋｂの断片を認識した３’プローブを使用したサザンブロット法により、標的ＥＳクローンを同定した（図１１ｃ）正しく標的化されたＥＳクローンを胚盤胞に注入して、キメラマウスを作成した。得られた雄のキメラを雌のＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させて、標的対立遺伝子の生殖細胞系伝達を決定した。ヘテロ接合性ヒトＤ因子ノックインマウスをＦＬＰｅ遺伝子改変マウス（Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンド、ジャクソン研究所）と交配して、ヒトＤ因子ノックイン対立遺伝子からｎｅｏカセットを除去した。ネオカセットを欠くヘテロ接合性ヒトＤ因子ノックインマウスを交配して、ホモ接合性ヒトＤ因子ノックインマウスを生成した。野生型（ＷＴ）、ヘテロ接合（Ｈｅｔ）及びホモ接合（Ｈｏｍｏ）のヒトＤ因子ノックインマウスを、ヒトＤ因子に特異的なターゲットＤＮＡ  ＰＣＲジェノタイピング（標的サイズ：４５０ｂｐ）５’−ＧＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＡＧ−３’（配列番号：２６）及び５’−ＣＣＣＡＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣ−３’（配列番号：��７）、マウスＤ因子に特異的（標的サイズ：２９２ｂｐ）５’−ＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＴＴＡＧＣＴＡＴＣＣ−３’（配列番号２８）及び５’−ＡＣＣＣＡＧＡＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＣＡＣ−３’（配列番号２９）（図１１ｄ）により同定した。
【０１９９】
実施例７
ホモ接合性のヒトＤ因子ノックインマウスにおける１１Ａ８−１及び１Ｆ１０−５  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ活性及び動態を調べるために実験が行われた。マウスに１ｍｇ（ｉ．ｐ．）の１１Ａ８−１  ｍＡｂ又は１Ｆ１０−５  ｍＡｂを注射した。血液サンプル（５０−７５μＭ）を注射前（２４時間）に採取し、注射後の様々な時点で眼窩後部の出血と血清を調製した。ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性化について血清サンプルをテストした。このアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、Ｎｕｎｃ）を５０μＬＬＰＳ溶液（ＰＢＳで２ｕｇ／ウェル、３７℃、１時間）でコーティングした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、５０μｌの連続希釈（１：１０から開始）マウス血清を各ウェルに加えた。マウス血清をＧＶＢ−ＥＧＴＡ−Ｍｇ＋＋（１０ｍＭ  ＥＧＴＡ及び２．５ｍＭ  Ｍｇ＋＋最終濃度を含む）で希釈した。プレートを３７℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、５０μｌのＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＣ３抗体（１：４０００、Ｃａｐｐｅｌ）を添加し、プレートを１時間放置した。時間室温。プレートをＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ  Ａ＋Ｂ試薬を使用して現像した。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で６−１０分後に反応を停止した。プレート上のＣ３沈着量（ＯＤ４５０）を測定することにより、ＡＰ補体活性化が検出された。
【０２００】
実施例８
欠失変異体を生成するために、接触部位がフォワード及びリバースプライマーで削除されるようにプライマー（表１）を設計した。置換変異体は、フォワードプライマーに目的のヌクレオチドを組み込むことによって作成される。２０ｎｇのｐＣＭＶ−ＸＬ４−ｈｆＤプラスミドを、Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙマスターミックスを使用して、それぞれのフォワード及びリバースプライマーで増幅した。増幅産物をアガロースゲル電気泳動にかけ、純度を確認した。対応する増幅産物をアガロースゲルから切除し、Ｂｉｏｎｅｅｒゲル精製キットを使用してＤＮＡを抽出した。精製したＤＮＡをＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ  ＤＮＡリガーゼミックス）でライゲーションし、ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換し、ＬＢ寒天アンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）プレートに１００μｌを塗り広げた。コロニーをピックアップし、７５μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地に接種した。プラスミドを単離し、ＮｏｔＩ制限酵素で消化することにより挿入物の放出を確認した。制限陽性プラスミドは、欠失及び置換変異体について配列決定された。欠失及び置換陽性変異プラスミドは、トランスフェクションによる欠失タンパク質の発現に使用された。
【０２０１】
【化１】
2020507581.tif 000003
【０２０２】
実施例９
エンドトキシンを含まないプラスミドをトランスフェクションに使用した。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、８５〜９０％のコンフルエンスまで６ウェルプレートで増殖させた。陽性対照及び欠失変異体プラスミドに、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１：２の比のリポフェクタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、上清を回収し、使用するまで−２０℃で保存した。細胞を氷冷ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄し、非変性ＲＩＰＡ（ラジオイムノ沈降アッセイ）バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）を加え、３０日間氷上で維持した時々揺れながら分。遠心分離後に細胞溶解物を収集し、上清を−２０℃で保存した。ＣＨＯ細胞上清及び細胞溶解物を陰性対照として使用した。
【０２０３】
実施例１０
１１Ａ８−１のエピトープマッピングは、免疫沈降法及びウエスタンブロッティング法によって行われた。３００ｍｇのＣＮＢｒ活性化セファロースビーズ４Ｂ（カタログ番号１７−０４３０−１  ＧＥヘルスケア）を１ｍＭ  ＨＣｌで１５分間膨潤させた。次に、ビーズを焼結ガラス漏斗に移し、２００ｍｌの１ｍＭ  ＨＣｌで洗浄した。ゲル（ビーズ）をカップリングバッファーｐＨ９．０（０．１Ｍ  ＮａＨＣ０３−ｐＨ９．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）で洗浄し、５分以内にカップリングバッファーに１１ｍｇの１１−８Ａ１抗体を含むチューブに直ちに移した。チューブを回転プラットフォーム上で４０℃で一晩保持した。カップリングの前後に抗体溶液の吸光度を測定することにより、ＣＮＢｒビーズへの抗体のカップリングをチェックした。カップリング緩衝液で３回洗浄することにより過剰のリガンドを洗い流し、残りの活性部位を室温で２時間、ブロッキング緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅ、ｐＨ９．０）でブロックした。カップリング後に過剰な未結合リガンドを除去するために、ビーズを低ｐＨ（０．１Ｍ酢酸、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）及び高ｐＨ（カップリングバッファー）洗浄バッファーで２回交互に洗浄した。２００μｌのカップリングされたビーズをトランスフェクション上清及び細胞溶解物とともに、回転プラットフォーム上で室温で２時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ中の０．５Ｍ  ＮａＣｌで５回洗浄した。タンパク質は抗体溶出バッファー（０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．０）で溶出し、１．５Ｍトリス、ｐＨ９．０で中和した。５０μｌの溶出サンプルを免疫ブロットに使用した。
【０２０４】
実施例１１
１Ｆ１０−５のエピトープマッピングはＥＬＩＳＡ法によって行われた。マイクロタイタープレートを、ＰＢＳ中の１Ｆ１０−５（２μｇ／ｍｌ）で３７℃で１時間コーティングした。抗体溶液を吸引した後、室温で１時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡを含むＰＢＳでウェルをブロックした。ヒトＤ因子の完全又は４つの欠失変異体（変異体−９、１０、１１又は１２）の一過性ＣＨＯトランスフェクタントからの細胞培養上清をウェルに加えた。ブランクは、トランスフェクトされていない細胞の細胞培養培地である。室温で１時間インキュベートした後、ウェルを徹底的に洗浄した。ＨＲＰ結合ストレプトアビジンに続いてビオチン結合ヤギ抗ヒトＤ因子抗体を使用することにより、１Ｆ１０−５結合ヒトＤ因子が検出された。洗浄後、プレートを６〜１０分間ＨＲＰ基質で現像した。２Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で反応を停止し、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍでプレートを読み取った。
【０２０５】
エピトープマッピングについては、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５を、ヒトＤ因子の完全及び４つの欠失変異体との反応性についてテストした。ウェスタンブロット法により、４つの欠失変異体のタンパク質発現が確認された。ＥＬＩＳＡでは、ｍＡｂ  １Ｆ１０−５はＦｕｌｌ、ｍｕｔａｎｔ−９及び−１２に結合したが、ｍｕｔａｎｔ−１０及び−１１への結合は大幅に減少した。図１９に示すこれらの結果は、１５５−１５９のＮＲＲＴＨの５アミノ酸（配列番号２３）又は１７３−１７６の４アミノ酸ＳＮＲＲ（配列番号２４）の欠失がｍＡｂ  １Ｆ１０−５による結合を破壊したこと、及びｍＡｂ  ＩＦ−１０のエピトープがアミノ酸ＳＮＲＲを含むことを示唆している。
【０２０６】
実施例１２
ホモ接合性ヒト第Ｄ因子ノックインマウスに、野生型及びＣｒｒｙ／ＤＡＦ／Ｃ３トリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスからの赤血球（ＲＢＣ）を輸血した。レシピエントマウス（ホモ接合性ヒトＤ因子ノックインマウス）を、ｍＡｂ  １１８Ａ−１（２ｍｇ／マウス、ｉ．ｐ。）又はＰＢＳでＲＢＣ導入の２４時間前に処理した。ドナーＲＢＣをＴＫＯマウスから採取し、ＰＢＳで洗浄し、以前に公開された手順（Ｍｉｗａ  ｅｔ  ａｌ、２００２、Ｂｌｏｏｄ  ９９；３７０７−３７１６）に従ってＣＦＳＥで標識した。同様に、ドナーＲＢＣも野生型（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）マウスから採取し、ＰＢＳで洗浄し、製造元の指示に従ってＤＤＡＯ−ＳＥ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識した。２００μｌの血液に相当するＷＴ及びＴＫＯ  ＲＢＣの１：１混合物を尾静脈からレシピエントマウスに注射した。ＲＢＣ輸血後５分及び６、２４、４８、７２、９６、１２０時間で、レシピエントマウスから採血し、ＲＢＣを分析して、循環に残っているＣＦＳＥ又はＤＤＡＯ−ＳＥ標識（すなわち輸血）ＲＢＣの割合を決定した。各受信者のＣＦＳＥ標識ＴＫＯ  ＲＢＣの数は、各時点でＤＤＡＯ−ＳＥ標識ＷＴ  ＲＢＣに対して（％として）正規化された。
【０２０７】
実施例１３
関節炎は、Ｋ／ＢｘＮマウス（２ｍｇ／マウス、ｉ．ｐ．０日目と２日目）から精製された総ＩｇＧを受動的に移すことにより、ホモ接合ヒトＤ因子ノックインマウスで誘発された。足首の肥厚をノギス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）で測定し、臨床スコアを以前に公開された基準を使用して記録した（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、２０１０、ＪＣＩ；３５４５−３５５４）。マウスは、−１、３、７、１１、及び１５日目に１１ｍｇの１１Ａ８−１で治療された。
【０２０８】
実施例１４
ｍＡｂ  １１−８Ａ１、１Ｆ１０−５、及び１６６−３２のｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、ヒトＤ因子ノックインマウスで評価された。１６６−３２（タノックスＵＳ８１２４０９０を参照）、１１−８Ａ１、及びｉｎ  ｖｉｖｏでの代替経路（ＡＰ）補体活性の遮断における１Ｆ１０−５  ｍＡｂの有効性を評価するため、Ｄ因子ヒト化マウスを反復投与（１ｍｇ／マウス、３日ごと、皮下投与）。ｍＡｂ治療前（時間０）及びｍＡｂ治療後６時間、１、３、６、及び９日目に血漿サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性をテストした。様々な時点でのＡＰ補体活性は、時間０で得られた値の１００％に正規化された。データは、ｍＡｂ  １１−８Ａ１及び１Ｆ１０−５がｍＡｂ  １６６−３２と比較してｉｎ  ｖｉｖｏで優れた薬力学活性を有することを示した（図２０）。具体的には、ｍＡｂ  １１−８Ａ１は常にｍＡｂ投与後８０−９０％のＡＰ補体活性を抑制したが、ｍＡｂ  １６６−３２はｍＡｂ投与後６時間と１日目にのみ同等の抑制を達成した。ｍＡｂ  １Ｆ１０−５は９日目にＡＰ補体の５０％阻害を示したが、９日目にｍＡｂ  １６６−３２によるＡＰ補体活性のほとんどの阻害が観察された（図２０）。
【０２０９】
キメラ１１−８Ａ１  ｍＡｂ及びキメラＡＦＤのｉｎ  ｖｉｖｏ活性は、ヒトＤ因子ノックインマウスで評価された。ｉｎ  ｖｉｖｏでの代替経路（ＡＰ）補体活性の遮断における１１−８Ａｌ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂ及びＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂの有効性を評価するために、Ｄ因子ヒト化マウスを反復投与（１ｍｇ／マウス、毎回３日間、皮下投与）。ｍＡｂ治療前（時間０）及びｍＡｂ治療後６時間、１、３、６、９、１２、及び１５日目に血漿サンプルを収集し、ＬＰＳ誘発ＡＰ補体活性をテストした。様々な時点でのＡＰ補体活性は、時間０で得られた値の１００％に正規化された。ＡＦＤはｍＡｂ  １６６−３２のヒト化バージョンである（Ｋａｔｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ。２０１２  Ａｐｒ  １３；２８７：１２８８６−１２８９２、ＷＯ２００８／０５５２０６、米国特許第８，３７２，４０３号、米国特許第８，２７３，３５２号、米国特許出願第２０１４／０２１２４３３号）。データは、１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂがはるかに強力であり、ＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂよりもはるかに優れた薬力学プロファイルを示したことを示した（図２１）。具体的には、両方のｍＡｂがｍＡｂ投与後６時間と１日目に９０−１００％の阻害を引き起こしたのに対し、ＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂではなく１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂは、６−１５日目に、ＡＰ補体活性の７５％以上の阻害を引き起こした（図２１）。
【０２１０】
この実施例で使用される材料と方法について説明する。
【０２１１】
１６６−３２  ｍＡｂの精製
精製された１６６−３２  ｍＡｂを調製するために、ヒトＤ因子に結合するモノクローナル抗体１６６−３２２を分泌するマウスハイブリドーマ細胞（ＨＢ  １２４−７６）をＡＴＣＣから入手し（Ｔａｎｏｘ  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．８，１２４，０９０を参照）、培養した。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによるｍＡｂ精製のために、細胞培養培地を収集した。
【０２１２】
１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂの調製ｍＡｂ  １１−８Ａ１のｃＤＮＡをクローニングするために、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｓｉｇｍａ）によりハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用した逆転写により、ファーストストランドｃＤＮＡを合成した。重鎖ｃＤＮＡ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ／ｂ）を増幅するために、ＰＣＲ反応で次のプライマーを使用した：５’−ＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧ（Ｔ／Ａ）Ｃ（Ｔ／Ａ）ＧＧ−３’配列番号７２及び５’−ＧＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ−３’配列番号７３。カッパ軽鎖を増幅するために、以下のプライマーを使用した：４つの上流プライマーの混合物：５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡ−３’配列番号７４；５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’配列番号７５；５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’配列番号７６；５’−ＣＣＡＧＴＴＣＣＧＡＧＣＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＴＣＴＣＣＡ−３’配列番号７７；下流プライマー：５’−ＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣ−３’配列番号７８において使用した。ＰＣＲアンプリコンをｐＣＲ  ＴＯＰＯ  ＴＡ  ２．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定した。  ｍＡｂｓのシグナルペプチド（リーダー）配列を得るために、５’−ＲＡＣＥ法をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのキット（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ）とともに使用した。５’−ＲＡＣＥ及び初期配列決定データから決定された特異的プライマーを使用して、完全な可変領域ｃＤＮＡを増幅した。ｍＡｂ  １１−８Ａ１の重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡを、それぞれｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ４及びｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。ＩｇＧ４分子の交換を防ぐために、Ｓ８２８Ｐ突然変異が１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂのＦｃドメインに導入された。組換え１１−８Ａ１／ヒトＩｇＧ４キメラは、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発現された。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによるキメラｍＡｂ精製のために、細胞培養培地を収集した。
【０２１３】
ヒト化１６６−３２（ＡＦＰ）Ａｂの調製
ＡＦＤの重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードするｃＤＮＡ（Katschke et al, J Biol Chem. 2012 Apr 13; 287:12886-12892, WO2008/055206、US Patent No. 8,372,403、US Patent No. 8,273,352、U.S. Pat. App. No. 2014/0212433）を合成し、それぞれｐＦＵＳＥ−ＣＨＩｇ−ｈＧ４及びｐＦＵＳＥ２−ＣＬＩｇ−ｈｋベクター（ＩｎＶｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）にクローニングした。ＩｇＧ４分子の交換を防ぐため、Ｓ２２８Ｐ変異をＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂのＦｃドメインに導入した。組換えＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４  ｍＡｂはＥｘｐｉＣＨＯ発現システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で発現した。プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーによるキメラｍＡｂ精製のために、細胞培養培地を収集した。
【０２１４】
ホモ接合性ヒトＤ因子ノックインマウスにおけるｍＡｂの薬力学の評価ホモ接合性ヒト第Ｄ因子ノックインマウスにおけるマウス１１−８Ａ１、１Ｆ１０−５、１６６−３２及び１１−８Ａｌ／ヒトＩｇＧ  ４キメラ及びＡＦＤ／ヒトＩｇＧ４キメラｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏ活性を調べて比較するための実験を行った。マウス（１０−１２週齢）に３日ごとに１ｍｇ／マウス（ＰＢＳ中の皮下注射）のｍＡｂを注射した。レピルジン抗凝固血漿サンプル（５０−７５μＭ）を注射前（時間０）に収集し、注射後の様々な時点で眼窩後出血と血漿を調製した。血漿サンプルを−８０℃で凍結し、ＥＬＩＳＡベースのＬＰＳ誘導ＡＰ補体活性化アッセイで試験するまで保存した。ＡＰ補体活性化は、記載されているように、プレート上の活性化Ｃ３断片沈着量（ＯＤ４５０）を測定することにより評価された（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ、２００８、Ｂｌｏｏｄ  １１１：７３２−４０を参照）。
【０２１５】
本明細書に引用されるありとあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、本発明の他の実施形態及び変形が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく他の当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態及び同等の変形を含むと解釈されることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図９Ｃ−Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ−Ｄ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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