(57)【要約】  二部シトシン塩基エディターシステムにおいて有用な融合タンパク質であって、（ｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、デアミナーゼ酵素もしくはその活性部分に融合された非Ｒループ形成性のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、好ましくは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）もしくはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）を含む、第１の融合タンパク質、または（ｉｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合されたＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであるが、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用できるＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質を含む、第２の融合タンパク質を含む融合タンパク質が、本明細書で提供される。さらに、核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法が提供される。
2020521446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二部シトシン塩基エディターシステムにおいて有用な融合タンパク質であって、
（ｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、デアミナーゼ酵素もしくはその活性部分に融合された非Ｒループ形成性のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、好ましくは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）もしくはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）を含む、第１の融合タンパク質、または
（ｉｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合されたＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであるが、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用できるＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質を含む、第２の融合タンパク質
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記第１の融合タンパク質が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第２の融合タンパク質が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは不活性なヌクレアーゼ、または不活性なＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）タンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１から５に記載の精製された融合タンパク質を含む組成物。
【請求項７】
前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から５に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１から５に記載の融合タンパク質を発現する単離された宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から５に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物。
【請求項１３】
核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項１から５に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
【請求項１４】
前記核酸が、細胞、好ましくは真核生物細胞中にある、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、請求項１から５に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質が、ＲＮＰ、ｍＲＮＡまたはプラスミドとして送達される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
任意選択で、第１、第２、第３または第４の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質を含む第２の部分、（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分、ならびに任意選択で、（ｉｖ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含む第４の部分を含むモノマー性融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）が、いずれの順番でもよい、モノマー性融合タンパク質。
【請求項１８】
任意選択で、第１、第２または第３の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質、例えば、ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログまたは同様に欠損性の種を含む第２の部分、ならびに（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分を含む融合タンパク質であって、前記ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、いずれの順番でもよい、融合タンパク質。
【請求項１９】
前記第１の部分が、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む、請求項１７および１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記第２の部分が、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログを含む、請求項１７または１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記変異が、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記第２の部分が、ＰｌＣａｓ９、ＣｌＣａｓ９もしくはＮｃＣａｓ９；またはＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）に対する変異を有するＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９もしくはＣｊＣａｓ９を含む、請求項１７または１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＰＩＤに対する前記変異が、表２に示される、請求項２２に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む、請求項１７または１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
請求項１７から２４に記載の精製された融合タンパク質を含む組成物。
【請求項２６】
請求項１８に記載の精製された融合タンパク質、およびウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含むタンパク質を含む組成物。
【請求項２７】
前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡをさらに含む、請求項２５または２６に記載の組成物。
【請求項２８】
１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１７から２４に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３０】
請求項２９に記載の核酸を含むベクター。
【請求項３１】
請求項１７から２４に記載の融合タンパク質を発現する単離された宿主細胞。
【請求項３２】
請求項１７または１９から２４に記載の融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物。
【請求項３３】
核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項１７または１９から２４に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
【請求項３４】
前記核酸が細胞中にある、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、請求項１７もしくは１９から２４に記載の融合タンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質が、ＲＮＰとして、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の方法であって、前記核酸を、請求項１８に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む方法。
【請求項３８】
前記核酸が細胞中にある、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化の方法であって、請求項１８に記載の融合タンパク質、ＵＧＩタンパク質、および前記融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、前記選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する前記核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、前記細胞において発現させるステップ、または前記細胞をそれらと接触させるステップを含む方法。
【請求項４０】
前記融合タンパク質が、ＲＮＰとして、または前記融合タンパク質をコードするｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される、請求項３９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年５月２５日出願の米国仮特許出願第６２／５１１，２９６号；２０１７年８月４日出願の米国仮特許出願第６２／５４１，５４４号；および２０１８年１月２６日出願の米国仮特許出願第６２／６２２，６７６号の利益を主張する。上述の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援の研究または開発
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＧＭ１１８１５８の下で政府の支援で行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
標的化された塩基編集テクノロジーのゲノムワイドの特異性を改善するための方法および組成物が、本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
塩基編集（ＢＥ）テクノロジーは、ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、触媒的に不活性なＣａｓ９またはニック導入性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）の、シチジンまたはアデニンデアミナーゼおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）への融合に基づく。これらの融合タンパク質は、特異的ゲノム遺伝子座におけるＲループ形成およびシトシンまたはアデニンの脱アミノ化を可能にし、標的化された置換（Ｃ／Ｇ→Ｔ／ＡまたはＡ／Ｔ→Ｇ／Ｃ）を導入する１〜４。単一ヌクレオチドバリアントの正確で効率的な修正は、かなりの治療利益を生じ得るが、これは具体的に言うと、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介した二本鎖切断（ＤＳＢ）ベースのドナー鋳型組込みの現行のアプローチが、非効率的であり、有糸分裂後の細胞では実行可能でないからである５。シトシンからチミンへの変換に使用されるデアミナーゼは、ｓｓＤＮＡ基質を必要とするので、ｎＣａｓ９非標的鎖を一本鎖のままにするｎＣａｓ９媒介性のＲループ形成は、ＢＥ標的化の成功における重要な因子である１。
【発明の概要】
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ塩基エディタープラットフォーム（ＢＥ）は、ドナーＤＮＡ分子を必要とせずに、正確なユーザー定義されたゲノム編集事象を生じる独自の能力を有する。シチジンデアミナーゼドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合された一本鎖ニック導入性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）タンパク質を含む塩基エディター（ＢＥ）（ＢＥ３）は、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）スペーサー配列によって決定される部位特異的様式で、シトシンからチミンへの（ＣからＴへの）塩基遷移を効率的に誘導する１。全てのゲノム編集試薬を用いる場合と同様、遺伝的にコードされた有害で不可逆的な副作用を生じる可能性を制限するために、治療薬として使用する前に、ＢＥがオフターゲット変異を生じる能力をまず決定し、次いで軽減することが重要である。本明細書で、本発明者らは、適切に機能するために、隣接標的化するＤＮＡ結合ドメインの使用に依存する二部（bipartite）ＢＥ（ＢＢＥ）を記載する。脱アミノ化しかつＲループを形成する装置をモノマー単位中に含有する以前に記載されたＢＥとは異なり、本発明者らは、これら２つの重要な機能が、ロバストな脱アミノ化を刺激するためには一緒になって作用しなければならない２つのタンパク質上に分離されたシステムを記載する。そのために、本発明者らは、操作されたジンクフィンガー（ＺＦ）をデアミナーゼ酵素（ＺＦ−デアミナーゼ）に融合させ、それを、ｎＣａｓ９−ＵＧＩ結合部位に隣接するように標的化し、それによって、隣接標的化するＤＮＡ配列周囲でのＢＥの完全な機能性を再構成し、ロバストなＤＮＡ改変を刺激した。この二部酵素の効率的な活性は、２つの別々のＤＮＡ結合ドメインの特異的な隣接結合に依存するので、これは、２つの構成要素の隣接結合がその部位で起こらない限り、ゲノムＤＮＡ中のそれらのオフターゲット結合部位のいずれかにおいてその構成要素部分がロバストに機能する能力を減少させることによって、塩基編集の特異性を増加させるはずである。ｎＣａｓ９をデアミナーゼドメインから空間的に分離することもまた、標的化された塩基編集の部位に隣接しておよびその部位において、相乗的に誘導されるインデル形成を低減させ、それによって、産物純度全体を増強し、またオフターゲットインデル形成を低減させるはずである。
【０００６】
一部のＣａｓ９オルソログおよびバリアントは、ＣＲＩＳＰＲ媒介性のＤＮＡ結合およびゲノムまたは塩基編集について欠損性であり得る（例えば、ＰＡＭ相互作用欠損性（ＰＩＤ）変異体またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９１４〜１６）が、本発明者らは、隣接標的化される操作されたＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＺＦまたはＴＡＬＥにそれらを融合させることによってそのＤＮＡ標的化能をレスキューすると、それらが、文献中にこれまでに記載されたものよりも良好な特異性プロファイルを有するＢＥの基礎を構築し得ることを認めた。２つのＤＮＡ結合ドメイン（ＺＦまたはＴＡＬＥおよび欠損性Ｃａｓ９バリアントまたはオルソログ）の隣接結合を必要とすることによって、得られたタンパク質は、両方の標的部位を含む総ＤＮＡ標的配列を特定し、これは複合体によって特定される総塩基の数を増加させ、それによって、この技術に、より高い全体的特異性を付与する。従って、塩基エディターの基礎としてのこれらのタンパク質の使用は、より特異的な塩基編集プラットフォームを構成する。従って、二部シトシン塩基エディターシステムにおいて有用な融合タンパク質であって、（ｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、デアミナーゼ酵素もしくはその活性部分に融合された非Ｒループ形成性のプログラム可能なＤＮＡ結合ドメイン、好ましくは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）もしくはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）を含む、第１の融合タンパク質、または（ｉｉ）任意選択で、それらの間のリンカーを伴って、ウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）に融合されたＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質であって、ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼ（nickase）であるが、ガイドＲＮＡおよび標的ＤＮＡと相互作用できるＲループ形成性Ｃａｓ９タンパク質を含む、第２の融合タンパク質を含む融合タンパク質が本明細書で提供される。
【０００７】
一部の実施形態では、第１の融合タンパク質は、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む。
【０００８】
一部の実施形態では、第２の融合タンパク質は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ニッカーゼもしくは不活性なヌクレアーゼ、または不活性なＣｐｆ１（ｄＣｐｆ１）タンパク質を含む。一部の実施形態では、変異は、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである。
【０００９】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む。
【００１０】
任意選択で、第１、第２、第３または第４の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質を含む第２の部分、（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分、ならびに任意選択で、（ｉｖ）ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含む第４の部分を含むモノマー性融合タンパク質であって、ドメイン（ｉ）〜（ｉｖ）が、いずれの順番でもよい、モノマー性融合タンパク質もまた、本明細書に記載される。
【００１１】
任意選択で、第１、第２または第３の部分のうち一部または全ての間にあるペプチドリンカーを伴って、（ｉ）デアミナーゼ酵素またはその活性部分を含む第１の部分、（ｉｉ）ヌクレアーゼ活性を欠如するもしくはニッカーゼであり、ガイドＲＮＡと相互作用できるが、ゲノム編集または塩基事象を強化するのに十分に標的ＤＮＡに結合することもＲループを形成することもないＣａｓ９タンパク質、例えば、ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログまたは同様に欠損性の種を含む第２の部分、ならびに（ｉｉｉ）ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥから選択されるＤＮＡ結合ドメインを含む第３の部分を含む融合タンパク質であって、ドメイン（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、いずれの順番でもよい、融合タンパク質が本明細書でさらに提供される。これらの融合タンパク質は、例えば、本明細書に記載される方法において、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）を含むタンパク質と組み合わせて使用され得る。
【００１２】
一部の実施形態では、第１の部分は、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様１（ＡＰＯＢＥＣ１）、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）からなる群から選択されるシチジンデアミナーゼを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、第２の部分は、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、もしくはＤ９８６およびＨ８４０もしくはＮ８６３における変異を有するＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼ、またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログを含む。一部の実施形態では、変異は、Ｄ１０ＡもしくはＤ１０Ｎの一方もしくは両方、またはＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙである。
【００１４】
一部の実施形態では、第２の部分は、例えば、表２に示されるような、ＰｌＣａｓ９、ＣｌＣａｓ９もしくはＮｃＣａｓ９；またはＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）に対する変異を有するＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９もしくはＣｊＣａｓ９を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合アレイを含む。
【００１６】
本明細書に記載される精製された融合タンパク質を含み、融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用するガイドＲＮＡを任意選択でさらに含む組成物もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む。
【００１７】
本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸、この核酸を含むベクター、ならびにこの融合タンパク質を含むおよび／または発現する単離された宿主細胞が、本明細書でさらに提供される。
【００１８】
本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸を含む組成物もまた提供される。
【００１９】
さらに、核酸中の１つまたは複数の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化のための方法が提供される。本方法は、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質、および融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、選択されたシトシンを含むまたはそれに隣接する（例えば、選択されたシトシンの１、２、５、１０、１５または２０ｎｔ以内）核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、核酸は、細胞、好ましくは真核生物細胞中にある。
【００２０】
細胞中の核酸の標的化された脱アミノ化のための方法もまた、本明細書で提供される。本方法は、本明細書に記載される融合タンパク質、および融合タンパク質のＣａｓ９部分と相互作用し、選択されたシトシンを含むもしくはそれに隣接する（例えば、選択されたシトシンの１、２、５、１０、１５または２０ｎｔ以内）核酸の一部分に結合するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、細胞において発現させるステップ、または細胞をそれらと接触させるステップを含む。
【００２１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＰとして、または融合タンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される。
【００２２】
本明細書に記載されるバリアントＳｐＣａｓ９タンパク質と、Ｃａｓ９を含む二部デアミナーゼ融合タンパク質によって標的化されるＰＡＭ配列を有する配列を標的化するガイドＲＮＡとを含むリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体もまた、本明細書で提供される。
【００２３】
核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化のための方法、または核酸中の選択されたシトシンの標的化された脱アミノ化の特異性を改善するための方法であって、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムのうち１つまたは複数と接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＲＮＰとして、または本明細書に記載される融合タンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡもしくはプラスミドとして送達される。
【００２４】
核酸中の選択されたシトシンを脱アミノ化するための方法であって、核酸を、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムと接触させるステップを含む方法もまた、本明細書で提供される。
【００２５】
さらに、本明細書に記載される精製された融合タンパク質または塩基編集システムを含む組成物が、本明細書で提供される。
【００２６】
さらに、本明細書に記載される融合タンパク質または塩基編集システムをコードする核酸、ならびにこの核酸を含むベクター、およびこの核酸を含む宿主細胞、例えば、幹細胞、例えば、造血幹細胞が、本明細書で提供される。
【００２７】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。方法および材料は、本発明における使用のために本明細書に記載される；当該分野で公知の他の適切な方法および材料もまた使用され得る。材料、方法および例は、例示に過ぎず、限定を意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。
【００２８】
本発明の他の特色および利点は、以下の詳細な説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＺＦを用いるキメラＢＥテクノロジーとしての、Ｃａｓ９  ＰＩＤ変異体またはＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９の図である。６フィンガーのジンクフィンガーアレイおよびＵＧＩは、ｎＣａｓ９のＣ末端に融合され、野生型または操作されたデアミナーゼドメインのいずれかが、ｎＣａｓ９のＮ末端に融合される。ＺＦ結合配列は、ｇＲＮＡ標的部位に直接隣接する。このモデルでは、ＺＦの結合は、ｎＣａｓ９によるＲループの形成のための必要条件であり、Ｒループが形成され得る可能なオフターゲット部位の数を、ＺＦ結合部位に隣接する部位の数まで大きく低減させる。ＺＦの代わりにＴＡＬＥを使用する類似の戦略もまた、本明細書に記載される。
【図２】ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９は、３フィンガーのＺＦに融合させた場合、ヒト細胞中で、それらの標的部位における増加した結合およびヌクレアーゼ活性を実証するグラフである。このアッセイでは、染色体に組み込まれたＥＧＦＰ遺伝子が、結合（転写の立体障害を介して）またはヌクレアーゼ活性（コード配列中のＮＨＥＪ媒介性の小さい挿入および欠失を介して）についてのレポーターとして使用される。種々のＣａｓ９オルソログと、ＥＧＦＰレポーターに対して２０または２３ヌクレオチドの相同性を有するｇＲＮＡとを発現するプラスミドの一過的トランスフェクションは、ＥＧＦＰの破壊または抑制を生じ、フローサイトメトリーによってアッセイした場合、ＥＧＦＰ陰性細胞を生じる。全ての場合において、ＺＦ融合パートナーの追加は、試験したＣａｓ９オルソログのＥＧＦＰ破壊率を増加させる。特に、ＰｌＣａｓ９へのＺＦ融合パートナーの追加は、このオルソログのＥＧＦＰ破壊活性を、背景レベルから８５％へと増加させる。
【図３】二部塩基編集構造の図である。ニック導入性Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって、脱アミノ化部位に標的化される。引き続くＲループ形成は、ｎＣａｓ９が結合しないＤＮＡ鎖（脱アミノ化された鎖）上に、ｓｓＤＮＡ編集ウインドウを生じる。ジンクフィンガー−デアミナーゼ複合体は、形成されたＲループ近傍のｄｓＤＮＡを標的化する。編集ウインドウ中の標的シトシンは、脱アミノ化される。ニック導入性Ｃａｓ９は、ゲノムＤＮＡ（脱アミノ化されていない鎖）中に一本鎖切断（ＳＳＢ）を誘導し、そうして、例えばミスマッチ修復（ＭＭＲ）経路を含むＤＮＡ修復タンパク質を誘引する。編集された標的シトシンは、ウラシルに変換され、脱アミノ化された鎖は、ニック導入された（脱アミノ化されていない）鎖のための鋳型として機能するので、修復は、意図されたシトシンからチミンへの遷移（transition）に向けて偏らせる。
【図４】ｈＡ３Ａ融合物を使用した異なる実験条件での、ｇＲＮＡ  ５およびｇＲＮＡ  ２標的部位におけるシトシンからチミンへの（ＣからＴへの）遷移の重ね合わせの図である。従来のｈＡ３Ａ−ＢＥ（ｈＡ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）は、陽性対照として機能する。Ｃａｓ９標的部位の５’側に結合するジンクフィンガー−デアミナーゼ複合体を用いる二部塩基エディター（ＢＢＥ）は、それぞれの標的部位において強力な塩基編集を示す。ｈＡ３Ａ−ＺＦ−ＵＧＩ単独または近傍の部位を標的化するＢＢＥは、標的化されたＢＢＥと比較して、置換率を示さないまたは大きく低減させる。配列番号１〜２が示される。
【図５】ｒＡＰＯＢＥＣ１融合物を比較する、ｇＲＮＡ  ２標的部位におけるＣからＴへの遷移の重ね合わせの図である。従来のｒＡＰＯＢＥＣ１−ＢＥ（ＢＥ３）は、陽性対照として機能する。Ｃａｓ９標的部位の５’側に結合するジンクフィンガー−デアミナーゼ複合体を用いる二部塩基エディター（ＢＢＥ）は、標的部位において強力な塩基編集を示す。ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＺＦ−ＵＧＩ単独は、標的化されたＢＢＥと比較して、塩基編集活性を示さない。配列番号３が示される。
【図６】ｈＡ３Ａ融合物を比較する、ｇＲＮＡ  ４標的部位におけるシトシンからチミンへの遷移の重ね合わせの図である。以前の実験とは対照的に、ジンクフィンガー−デアミナーゼ複合体は、ｎＣａｓ９に対して逆並行に配向され、ｇＲＮＡ  ４標的部位の３’側に結合する。従って、Ｎ末端デアミナーゼ（ｈＡ３Ａ）は、非標的鎖（ｓｓＤＮＡ脱アミノ化鎖）の３’末端に面し、ＣからＴへの編集の、カノニカルＢＥ１−４編集ウインドウの３’末端側および外側へのシフトをもたらす。ＺＦ−デアミナーゼ構成成分の差示的に配向／位置させることによる塩基編集ウインドウの空間的制御が示される。配列番号６が示される。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄに関し、二部塩基エディターは、編集ウインドウをＵＧＩと隣接させること、およびニック導入性ドメインとデアミナーゼとの空間的分離によって、増強された産物純度を与え得ることを示す図である。（７Ａ）は、シトシンからプリン（Ｒ）への副産物ならびにインデルからなる、従来のシトシンからチミンへの塩基編集の「産物不純物」を示す。（７Ｂ）従来のデアミナーゼ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ融合物（例えば、ＢＥ３またはｈＡ３Ａ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）と比較して、二重の二部ＵＧＩを含むＢＢＥは、ＥＧＦＰ  ｇＲＮＡ２標的部位の全てのシチジンにわたって、大きく低減されたシトシンからプリン（Ｒ）への副産物を示す。（７Ｃ）関連する欠失頻度を示す、ｇＲＮＡ２部位にわたる単一塩基の重ね合わせ。ｈＡ３ＡおよびｒＡＰＯＢＥＣ１二部塩基エディターは共に、対照レベルに戻るまで、欠失頻度を顕著に減少させる。（７Ｄ）Ｃからのデータを、標的部位および＋／−２５ｂｐ隣接部位にわたる欠失頻度の分布として示す。
【図７−２】図７−１と同様である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
今日までに記載された最も効率的なＢＥ構成では、シチジンデアミナーゼ（ＤＡ）ドメインおよびウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ；ゲノムからのウラシルの切り出しを担う酵素である宿主細胞のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）を阻害する小さなバクテリオファージタンパク質１、４）は共に、ｎＣａｓ９（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）のいずれかに由来する）に融合される。ｎＣａｓ９は、そのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と隣接プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の認識とによって特定される標的部位においてＲループを形成し、ＲループのＰＡＭ遠位末端近傍で一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）として露出された、およそ４〜８ヌクレオチドの非標的鎖を残す。ｓｓＤＮＡのこの領域は、ｓｓＤＮＡ特異的ＤＡドメインによって脱アミノ化されて、グアノシン：ウラシル（Ｇ：Ｕ）ミスマッチを生じることができる鋳型であり、編集ウインドウを規定する。ｎＣａｓ９は、ＤＮＡの脱アミノ化されていない鎖にニック導入し、脱アミノ化された鎖を鋳型として使用してニック損傷を修復するように細胞に指示することによって、Ｇ：Ｕミスマッチの変換を、アデニン：チミン（Ａ：Ｔ）塩基対へと偏らせる。今日まで、これらの融合タンパク質中の記載されたＤＡドメインは、ラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯ１）、ヤツメウナギに由来するＣＤＡと称される活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）（ＰｍＣＤＡ）、ヒトＡＩＤ（ｈＡＩＤ）、または核外輸送シグナルを欠くｈＡＩＤの高活性形態であった１〜２、５〜７。ＢＥテクノロジーは、そのｎＣａｓ９ドメインとしてＳｐＣａｓ９タンパク質（ｎＳｐＣａｓ９）を使用して当初確立された。本明細書では、本発明者らはｎＣａｓ９に言及しているが、一般に、任意のＣａｓ９様ニッカーゼまたは触媒的に不活性なＣａｓ９が、特記しない限り、Ｃａｓ９タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログに基づいて使用され得る。
【００３１】
治療設定におけるＢＥの使用に関する重要な考慮事項は、オフターゲット変異誘発についてそのゲノムワイドの能力をアセスメントすること、および有害なオフターゲット変異を刺激するリスクを最小化する、または理想的には排除するようにテクノロジーを改変することである。本明細書では、本発明者らは、潜在的な望ましくないＢＥ変異誘発を低減させるまたは排除するために使用され得るＢＥに対する科学技術的改善を記載した。
【００３２】
ジンクフィンガー／Ｃａｓ９融合タンパク質は、オフターゲット結合および脱アミノ化を制限する
ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（例えば、ｎＣａｓ９、例示的な可能な融合オルソログの非徹底的なリストについては、表１を参照のこと）の、シチジンまたはアデニンデアミナーゼへの融合（ＢＥ）は、効率的なツールであることが証明されているが、このテクノロジーに関する主な安全性の懸念は、ＤＮＡの意図しない脱アミノ化の可能性に集中する。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）に対するＣａｓ９依存性デアミナーゼ活性の、偏りがないゲノムワイド検出はなされていないが、最近公開されたデータは、オフターゲット塩基編集が、Ｃａｓ９の公知のオフターゲット結合部位において生じることを示唆している６、７。この型のオフターゲットは、切断関連オフターゲティングとは対照的に、ヌクレアーゼの標的化および結合に関連するので、高忠実度Ｃａｓ９バリアントの使用は、この文脈では有用性は限定的であり得る。
【００３３】
重要なことに、Ｃａｓ９：ｇＲＮＡ標的化は、オフターゲットＢＥ変異誘発の重要な供給源として機能し得る特異的ｇＲＮＡ配列に依存して、オフターゲット結合事象を種々の程度まで許容できる場合が多い８。ヌクレアーゼとしてのその特異性を増加させるように化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）を操作する試みは、大部分は成功しているが、高忠実度ＳｐＣａｓ９（ＨＦ−Ｃａｓ９）９またはｅＳｐＣａｓ９１０などの操作された試薬の特異性の利点は、ＢＥと同様、Ｃａｓ９が標的化プラットフォームとして主に使用されている状況には当てはまらない場合がある。非常に短いｇＲＮＡ（約１２〜１４ｎｔ）が、触媒的に不活性なＳｐＣａｓ９ベースの転写因子融合物を標的化して、遺伝子発現を変更するのに十分であるが１１、１７ヌクレオチド以上の長さのｇＲＮＡが、ＳｐＣａｓ９によるＤＮＡ切断のために必要とされる１２という観察によって明らかなように、Ｃａｓ９結合およびＣａｓ９切断についての熱力学的パラメーターは、顕著に異なると広く考えられている。従って、操作されたＨＦ−ＳｐＣａｓ９変異を単に含むようにＢＥのｎＳｐＣａｓ９ドメインを操作することは、ＢＥのｎＳｐＣａｓ９ドメインについてオフターゲット脱アミノ化事象を刺激する能力を排除するための最適な戦略ではない可能性がある。
【００３４】
オフターゲット脱アミノ化事象を低減させるための１つの戦略は、ｎＣａｓ９結合およびＲループ形成を、そのコグネート転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）またはジンクフィンガーアレイ（ＺＦ）がＢＥ構造中に組み込まれているＴＡＬＥまたはＺＦ結合部位に直接隣接するｇＲＮＡ部位へと制限することである（図３）。いくつかのグループが、融合タンパク質の全体的特異性を増加させるために必要と通常みなされるものに加えて、余分な操作されたＤＮＡ結合ドメインを使用する「伝統的な」二本鎖切断誘導性ゲノム編集試薬を記載している１３、１４。特に、ノックダウンバージョンのＳｐＣａｓ９と６フィンガーのＺＦドメインとの間の融合は、ＺＦおよびｇＲＮＡが隣接するゲノム配列に対して標的化される場合、ＳｐＣａｓ９媒介性のゲノム編集の特異性を増加させることが示された１４。ゲノムにわたって、一過的Ｒループの、従ってＢＥによる脱アミノ化のために露出されるｓｓＤＮＡの数および範囲を制限するために、非Ｒループ形成性ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＴＡＬＥまたはＺＦを使用する改善されたＢＥテクノロジーが、本明細書に記載される。この戦略は、ＴＡＬＥまたはＺＦドメインによって特定される塩基に加えて、ｇＲＮＡによって特定される塩基を含むように、特定された塩基の数を増加させる（例えば、３フィンガーのＺＦドメインの追加は、ｎＣａｓ９単独よりも約９〜１０多い塩基を特定する）。
【００３５】
これを達成するために、ＴＡＬＥドメインアレイまたはＺＦアレイは、ヒト細胞中のそれらのｇＲＮＡによって特定される標的配列に効率的に結合することができないＣａｓ９タンパク質のＮ末端またはＣ末端に融合される（これらの融合タンパク質において使用され得るタンパク質のリストについては、表２を参照のこと）。ＩＩ型−Ａ  Ｃａｓ９タンパク質ＳｐＣａｓ９またはＳａＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）に対する変異は、第２のＤＮＡ結合ドメイン融合パートナーなしには、これらのタンパク質がヒト細胞において効率的に機能しないようにするのに十分である１４、１５（ＰＩＤ変異のリストについては、表２を参照のこと）。ＩＩ型−Ｃ  Ｃａｓ９オルソログは、二本鎖ＤＮＡを巻き戻す能力を有さないＣａｓ９酵素の進化的に多様なクラスである１６。これらのＣａｓ９オルソログの一部は、それらのコグネートｇＲＮＡと共に共発現された場合、ヒト細胞中のゲノム部位を切断することができない；しかし、本発明者らは、３フィンガーのＺＦ融合パートナーの追加的な親和性により、これらのＣａｓ９オルソログが、ゲノム部位に結合し高い活性でそれを切断できるようになることを見出した（図２）。この設定では、ＵＧＩは、ＺＦの、ｎＣａｓ９とは反対側の末端に融合される、または２Ａエレメントなどの自己切断性ペプチドを使用してＺＦ−Ｃａｓ９融合物と共に共発現され、もしくは内部リボソーム進入部位から独立して翻訳される。この戦略は、ＺＦの代わりにＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを用いても使用され得る。どの構成でも、かかる構成は、標的化複合体によって特定される機能的ＤＮＡ結合部位を拡張することによって、ＢＥの忠実度を増強するために使用され得る。
【００３６】
二部塩基エディター（ＢＢＥ）構造は、オフターゲット脱アミノ化を制限し、産物純度を増強し、塩基編集ウインドウの空間的制御を可能にする
図３に示されるように、隣接する配列に対して標的化されるデアミナーゼドメインおよびＲループ形成性Ｃａｓ９構成成分（触媒的に不活性なｄＣａｓ９もしくはニック導入性ｎＣａｓ９または同様に不活性なＣａｓ９オルソログのいずれか）に融合された非Ｒループ形成性ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦまたはＴＡＬＥ）を含む二部ＢＥ（ＢＢＥ）プラットフォームは、ＢＥ特異性を増強するためにも使用され得る。この構成では、デアミナーゼ含有タンパク質の結合は、効率的に機能するために、Ｒループ形成性タンパク質の隣接結合を必要とするが、これは、塩基編集に使用されるデアミナーゼ（原則として、表２に列挙される任意のデアミナーゼドメイン、またはＤＮＡ塩基を化学的に変異させることが可能な任意の他の酵素ドメインが検討され得る）が、Ｒループ形成の間に露出されるｓｓＤＮＡに対して主に活性であるからである。この構成は、ＤＮＡを変異させるために複合体が結合する必要があるＤＮＡ塩基の全体数を効果的に拡張することによって特異性を増加させるために使用され得る。ＺＦ−デアミナーゼもしくはＴＡＬＥ−デアミナーゼまたはＲループ形成性構成成分のいずれかの各オフターゲット結合単独では、ＤＮＡを変異させる能力が低減されているはずだからである。それは、完全にインタクトなデアミナーゼ酵素をなおも含むが、ジンクフィンガー−デアミナーゼタンパク質のオフターゲット結合は、標準的なＢＥと比較して変異を引き起こす能力が顕著に低減されており、これは、ＺＦ−デアミナーゼが、安定なＲループを創出して、ｓｓＤＮＡを露出させる能力を欠如しているからである。同時に、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９分子のオフターゲット結合は、単独では望ましくない脱アミノ化事象を刺激する能力を有さない。それがデアミナーゼドメインを欠如し、従って、酵素的に不活性であるとみなされ得、ＤＮＡ中に一本鎖ニックを創出するその能力を介して、またはＲループ形成の副産物として他の核因子にｓｓＤＮＡを露出させることによって、低レベルのオフターゲット変異を誘導することしかできないからである。
【００３７】
第２に、ＢＢＥのｎＣａｓ９（ＵＧＩありまたはなしの）構成成分は、この構成において推定オフターゲット部位に結合しそれにニック導入することができるが、デアミナーゼドメインを欠如しているので、単独ではオフターゲット塩基編集を刺激することはできない。高度にモジュール式のシステムであるので、オンターゲット脱アミノ化は、種々のニック導入性Ｃａｓ９バリアントまたは触媒的に不活性なＣａｓ９バリアント（可能なオルソログについては、表１を参照のこと）の共発現／適用によって緊密に制御され得、例えば、異なるＰＡＭ優先性を可能にする。まとめると、ゲノム共局在（「ＡＮＤゲート」）は、独立して発現される２つの異なるタンパク質によってもたらされ、オフターゲティングのリスクを最小化する。この二部塩基編集（ＢＢＥ）システムの各「半分」は、目的の標的部位へとデアミナーゼ媒介性の変異誘発を導くために必要であり、デアミナーゼ局在を、ｎＣａｓ９媒介性のＲループ形成に隣接する部位に制限することによって、ゲノム全体にわたって、オフターゲット脱アミノ化、およびその結果生じるｎＣａｓ９オフターゲット部位における変異の可能性を低減させる。
【００３８】
まとめると、ＢＢＥプラットフォームは、増強された編集ウインドウ制御の利益および低減されたゲノムワイドのＣａｓ９関連オフターゲット脱アミノ化の見込みを伴って、一定の、または潜在的に増強された、標的シトシンからチミンへの編集効率で、高度に最適化された産物純度を提供する。
【００３９】
ＤＮＡ結合ドメイン
本発明の融合タンパク質は、１つ、２つまたはそれよりも多いＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）、およびクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）Ｃａｓ  ＲＮＡガイドヌクレアーゼ（ＲＧＮ）を含み得る。
【００４０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓヌクレアーゼ
本明細書では、本発明者らは、ｎＣａｓ９およびｄＣａｓ９に言及しているが、一般に、ＢＢＥシステムについて、特記しない限り、不活性であるまたはニッカーゼ活性のみを有する任意のＲループ形成性Ｃａｓ９様酵素、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（関連するＣｐｆ１酵素クラスを含む）の任意のオルソログが使用され得る。
【００４１】
【表１】
2020521446.tif 000003
当該分野で公知のこれらのオルソログ、ならびにそれらの変異体およびバリアントは、本明細書に記載される融合タンパク質のいずれかにおいて使用され得る。例えば、国際公開第２０１７／０４０３４８号パンフレット（これは、増加した特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）および国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット（これは、変更されたＰＡＭ特異性を有するＳａＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９のバリアントを記載している）を参照のこと。
【００４２】
化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ（以後単にＣａｓ９）は、１７〜２０ヌクレオチドの操作されたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、例えば、シングルガイドＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ対と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、配列ＮＧＧまたはＮＡＧとマッチするＰＡＭの隣にある目的の標的ゲノムＤＮＡ配列の相補鎖との間での単純な塩基対相補性を介して、ガイドされ得る（Shen et al., Cell Res (2013)；Dicarlo et al., Nucleic Acids Res (2013)；Jiang et al., Nat Biotechnol 31, 233-239 (2013)；Jinek et al., Elife 2, e00471 (2013)；Hwang et al., Nat Biotechnol 31, 227-229 (2013)；Cong et al., Science 339, 819-823 (2013)；Mali et al., Science 339, 823-826 (2013c)；Cho et al., Nat Biotechnol 31, 230-232 (2013)；Jinek et al., Science 337, 816-821 (2012)）。プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ属（Francisella）１由来の操作されたＣＲＩＳＰＲ（Ｃｐｆ１）ヌクレアーゼもまた、例えば、Zetsche et al., Cell 163, 759-771 (2015)；Schunder et al., Int J Med Microbiol 303, 51-60 (2013)；Makarova et al., Nat Rev Microbiol 13, 722-736 (2015)；Fagerlund et al., Genome Biol 16, 251 (2015)に記載されるように使用され得る。ＳｐＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１は、単一の４２ｎｔのｃｒＲＮＡのみを必要とし、これは、その３’末端に、標的ＤＮＡ配列のプロトスペーサーに対して相補的な２３ｎｔを有する（Zetsche et al., 2015）。さらに、ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサーの３’側にあるＮＧＧ  ＰＡＭ配列を認識するが、ＡｓＣｐｆ１およびＬｂＣｐ１は、プロトスペーサーの５’側に見出されるＴＴＴＮ  ＰＡＭを認識する（同上）。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明のシステムは、細菌中にコードされた、もしくは哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化された、ならびに／またはそのＰＡＭ認識特異性および／もしくはそのゲノムワイドの特異性において改変された、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）もしくは黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）由来の野生型もしくはバリアントＣａｓ９タンパク質、またはアシダミノコッカス種（Acidaminococcus sp.）ＢＶ３Ｌ６もしくはラクノスピラ菌（Lachnospiraceae bacterium）ＮＤ２００６由来の野生型Ｃｐｆ１タンパク質を利用する。いくつかのバリアントが記載されている；例えば、とりわけ、国際公開第２０１６／１４１２２４号パンフレット、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４９１４７明細書、Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2016 Aug;34(8):869-74；Tsai and Joung, Nat Rev Genet. 2016 May;17(5):300-12；Kleinstiver et al., Nature. 2016 Jan 28;529(7587):490-5；Shmakov et al., Mol Cell. 2015 Nov 5;60(3):385-97；Kleinstiver et al., Nat Biotechnol. 2015 Dec;33(12):1293-1298；Dahlman et al., Nat Biotechnol. 2015 Nov;33(11):1159-61；Kleinstiver et al., Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5；Wyvekens et al., Hum Gene Ther. 2015 Jul;26(7):425-31；Hwang et al., Methods Mol Biol. 2015;1311:317-34；Osborn et al., Hum Gene Ther. 2015 Feb;26(2):114-26；Konermann et al., Nature. 2015 Jan 29;517(7536):583-8；Fu et al., Methods Enzymol. 2014;546:21-45；およびTsai et al., Nat Biotechnol. 2014 Jun;32(6):569-76を参照のこと。ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１と一緒に、細胞中で発現されるまたは細胞中に存在する。ガイドＲＮＡもしくはヌクレアーゼのいずれか、または両方は、細胞において一過的にもしくは安定に発現され得、または精製されたタンパク質もしくは核酸として導入され得る。
【００４４】
表２は、ＺＦまたはＴＡＬＥとのキメラタンパク質として使用され得る潜在的なＣａｓ９オルソログを示す。ＰｌＣａｓ９、ＣｌＣａｓ９およびＮｃＣａｓ９は、真核生物細胞ではそれらの標的部位に効率的に結合できないが、ＣｊＣａｓ９は、その標的部位において実質的な活性を有し、その部位に効率的に結合するその能力をノックダウンするために、ＰＡＭ相互作用ドメイン変異を必要とする。ニッカーゼ変異残基は、保存されたＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの触媒活性のために必要とされることが公知の、または構造情報が欠如しているＣｊＣａｓ９に対する配列アラインメントに基づいてこの触媒活性のために必要とされると予測される、酵素の位置を示す。
【００４５】
【表２】
2020521446.tif 000004
【００４６】
一部の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を低減させる１つまたは複数の変異もまた含む；例えば、ＳｐＣａｓ９については、Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａにおける変異（これは一本鎖ニッカーゼを創出する）。
【００４７】
一部の実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を破壊する、以下のアミノ酸位置のうち１つにおける変異もまた含む：タンパク質のヌクレアーゼ部分を触媒的に不活性にするための、Ｄ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、またはＤ９８６およびＨ８４０またはＮ８６３、例えば、Ｄ１０Ａ／Ｄ１０ＮおよびＨ８４０Ａ／Ｈ８４０Ｎ／Ｈ８４０Ｙ；これらの位置における置換は、アラニン（Nishimasu al., Cell 156, 935-949 (2014)にある通り）、または他の残基、例えば、グルタミン、アスパラギン、チロシン、セリンもしくはアスパラギン酸、例えば、Ｅ７６２Ｑ、Ｈ９８３Ｎ、Ｈ９８３Ｙ、Ｄ９８６Ｎ、Ｎ８６３Ｄ、Ｎ８６３ＳもしくはＮ８６３Ｈであり得る（国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレットを参照のこと）。
【００４８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、１つまたは複数のウラシルグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）タンパク質配列を含む；例示的なＵＧＩ配列は、以下の通りである：ＴＮＬＳＤＩＩＥＫＥＴＧＫＱＬＶＩＱＥＳＩＬＭＬＰＥＥＶＥＥＶＩＧＮＫＰＥＳＤＩＬＶＨＴＡＹＤＥＳＴＤＥＮＶＭＬＬＴＳＤＡＰＥＹＫＰＷＡＬＶＩＱＤＳＮＧＥＮＫＩＫＭＬ（配列番号７；Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１４７３９）。典型的には、ＵＧＩはＣ末端にあるが、Ｎ末端にあってもよく、または本明細書に記載される融合タンパク質の構成成分間にあってもよい。当該分野で公知のリンカーが使用され得る。
【００４９】
ＴＡＬエフェクターリピートアレイ
キサントモナス（Xanthomonas）属の植物病原性細菌のＴＡＬエフェクターは、宿主ＤＮＡに結合し、エフェクター特異的宿主遺伝子を活性化することによって、疾患において重要な役割を果たす、または防御を誘発する。特異性は、不完全な、典型的には約３３〜３５アミノ酸のリピートの、エフェクターごとに可変の数（effector-variable number）に依存する。多型は、本明細書でリピート可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる、リピート位置１２および１３に主に存在する。ＴＡＬエフェクターのＲＶＤは、いくらかの縮重度を伴い、明白なコンテキスト依存性なしに、直接的で直線的な様式で、１つのＲＶＤ対１つのヌクレオチドで、それらの標的部位中のヌクレオチドに対応する。一部の実施形態では、ヌクレオチド特異性を与える多型領域は、三残基またはトリプレットとして表され得る。
【００５０】
各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の塩基対の認識を決定するＲＶＤを含み得、各ＤＮＡ結合リピートは、標的ＤＮＡ配列中の１つの塩基対の認識を担う。一部の実施形態では、ＲＶＤは、以下のうち１つまたは複数：Ｃを認識するためのＨＡ；Ｃを認識するためのＮＤ；Ｃを認識するためのＨＩ；Ｇを認識するためのＨＮ；Ｇを認識するためのＮＡ；ＧまたはＡを認識するためのＳＮ；Ｔを認識するためのＹＧ；およびＧを認識するためのＮＫ、ならびに以下のうち１つまたは複数：Ｃを認識するためのＨＤ；Ｔを認識するためのＮＧ；Ａを認識するためのＮＩ；ＧまたはＡを認識するためのＮＮ；ＡまたはＣまたはＧまたはＴを認識するためのＮＳ；ＣまたはＴを認識するためのＮ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを示す；Ｔを認識するためのＨＧ；Ｔを認識するためのＨ＊、ここで、＊は、ＲＶＤの２番目の位置におけるギャップを示す；およびＴを認識するためのＩＧを含み得る。
【００５１】
ＴＡＬＥタンパク質は、ゲノム操作における相同組換えを促進できる標的化されたキメラヌクレアーゼとして、研究およびバイオテクノロジーにおいて（例えば、植物において、バイオ燃料または生物再生可能エネルギー（biorenewables）として有用な形質を追加または増強するために）有用であり得る。これらのタンパク質はまた、例えば、転写因子として、および特に、非常に高いレベルの特異性を必要とする治療的適用、例えば、非限定的な例としては病原体（例えば、ウイルス）に対する治療薬のために、有用であり得る。
【００５２】
操作されたＴＡＬＥアレイを生成するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許出願第６１／６１０，２１２号明細書およびReyon et al., Nature Biotechnology 30,460-465 (2012)に記載される高速ライゲーションベース自動化可能固相ハイスループット（fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput）（ＦＬＡＳＨ）システム；ならびにBogdanove & Voytas, Science 333, 1843-1846 (2011)；Bogdanove et al., Curr Opin Plant Biol 13, 394-401 (2010)；Scholze & Boch, J. Curr Opin Microbiol (2011)；Boch et al., Science 326, 1509-1512 (2009)；Moscou & Bogdanove, Science 326, 1501 (2009)；Miller et al., Nat Biotechnol 29, 143-148 (2011)；Morbitzer et al., T. Proc Natl Acad Sci U S A 107, 21617-21622 (2010)；Morbitzer et al., Nucleic Acids Res 39, 5790-5799 (2011)；Zhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)；Geissler et al., PLoS ONE 6, e19509 (2011)；Weber et al., PLoS ONE 6, e19722 (2011)；Christian et al., Genetics 186, 757-761 (2010)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 359-372 (2011)；Mahfouz et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108, 2623-2628 (2011)；Mussolino et al., Nucleic Acids Res (2011)；Li et al., Nucleic Acids Res 39, 6315-6325 (2011)；Cermak et al., Nucleic Acids Res 39, e82 (2011)；Wood et al., Science 333, 307 (2011)；Hockemeye et al. Nat Biotechnol 29, 731-734 (2011)；Tesson et al., Nat Biotechnol 29, 695-696 (2011)；Sander et al., Nat Biotechnol 29, 697-698 (2011)；Huang et al., Nat Biotechnol 29, 699-700 (2011)；およびZhang et al., Nat Biotechnol 29, 149-153 (2011)に記載される方法を参照のこと；これらは全て、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００５３】
メガヌクレアーゼとＴＡＬエフェクターとの融合物であるＭｅｇａＴＡＬもまた、本発明の方法における使用に適切である；例えば、Boissel et al., Nucl. Acids Res. 42(4):2591-2601 (2014)；Boissel and Scharenberg, Methods Mol Biol. 2015;1239:171-96を参照のこと。
【００５４】
ジンクフィンガー
ジンクフィンガータンパク質は、独立して折り畳まれた亜鉛含有ミニドメインである１つまたは複数のジンクフィンガーを含むＤＮＡ結合タンパク質であり、その構造は、当該分野で周知であり、例えば、Miller et al., 1985, EMBO J., 4:1609；Berg, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:99；Lee et al., 1989, Science. 245:635；およびKlug, 1993, Gene, 135:83で定義されている。ＤＮＡに結合したジンクフィンガータンパク質Ｚｉｆ２６８およびそのバリアントの結晶構造は、相互作用の半保存されたパターンを示し、ジンクフィンガーのアルファ−ヘリックス由来の典型的には３つのアミノ酸は、ＤＮＡ中の３つ隣接する塩基対すなわち「下位部位（subsite）」に接触する（Pavletich et al., 1991, Science, 252:809；Elrod-Erickson et al., 1998, Structure, 6:451）。従って、Ｚｉｆ２６８の結晶構造は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインが、ジンクフィンガーとＤＮＡ配列中の３塩基対「下位部位」との間の一対一相互作用によって、モジュラー様式で機能し得ることを示唆した。天然に存在するジンクフィンガー転写因子では、複数のジンクフィンガーが、典型的には互いに連結されて（例えば、３つ、４つまたは６つのジンクフィンガーの）タンデムアレイになり、連続ＤＮＡ配列の配列特異的認識を達成する（Klug, 1993, Gene 135:83）。
【００５５】
複数の研究が、ＤＮＡ結合に関与するアルファ−ヘリックス位置のアミノ酸をランダム化すること、およびファージディスプレイなどの選択方法論を使用して、目的のＤＮＡ標的部位に結合することが可能な所望のバリアントを同定することによって、個々のジンクフィンガーのＤＮＡ結合特徴を人工的に操作することが可能であることを示している（Rebar et al., 1994, Science, 263:671；Choo et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:11163；Jamieson et al., 1994, Biochemistry 33:5689；Wu et al., 1995 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 344）。かかる組換えジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現を調節し、ＤＮＡメチル化を変更し、モデル生物、植物およびヒト細胞のゲノム中に、標的化された変更を導入するために、機能的ドメイン、例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、メチル化ドメインおよびヌクレアーゼに融合され得る（Carroll, 2008, Gene Ther., 15:1463-68；Cathomen, 2008, Mol. Ther., 16:1200-07；Wu et al., 2007, Cell. Mol. Life Sci., 64:2933-44）。
【００５６】
「モジュラーアセンブリ（modular assembly）」として公知の、ジンクフィンガーアレイを操作するための１つの既存の方法は、予め選択されたジンクフィンガーモジュールを単純に繋ぎ合わせてアレイにすることを提唱する（Segal et al., 2003, Biochemistry, 42:2137-48；Beerli et al., 2002, Nat. Biotechnol., 20:135-141；Mandell et al., 2006, Nucleic Acids Res., 34:W516-523；Carroll et al., 2006, Nat. Protoc. 1:1329-41；Liu et al., 2002, J. Biol. Chem., 277:3850-56；Bae et al., 2003, Nat. Biotechnol., 21:275-280；Wright et al., 2006, Nat. Protoc., 1:1637-52）。任意の研究者によって実施されるのに十分に明快ではあるが、最近の報告は、特に、ジンクフィンガーヌクレアーゼの文脈で、この方法について高い失敗率を実証しており（Ramirez et al., 2008, Nat. Methods, 5:374-375；Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）、任意の所与の標的遺伝子について、非常に多数のジンクフィンガータンパク質の構築および細胞ベースの試験を典型的には必要とするという限界を実証している（Kim et al., 2009, Genome Res. 19:1279-88）。
【００５７】
ランダム化されたライブラリーからジンクフィンガーアレイを同定するコンビナトリアル選択ベースの方法は、モジュラーアセンブリよりも高い成功率を有することが示されている（Maeder et al., 2008, Mol. Cell, 31:294-301；Joung et al., 2010, Nat. Methods, 7:91-92；Isalan et al., 2001, Nat. Biotechnol., 19:656-660）。好ましい実施形態では、ジンクフィンガーアレイは、国際公開第２０１１／０１７２９３号パンフレットおよび国際公開第２００４／０９９３６６号パンフレットに記載され、またはこれらに記載されるように生成される。さらなる適切なジンクフィンガーＤＢＤは、米国特許第６，５１１，８０８号明細書、米国特許第６，０１３，４５３号明細書、米国特許第６，００７，９８８号明細書および米国特許第６，５０３，７１７号明細書ならびに米国特許出願公開第２００２／０１６０９４０号明細書に記載されている。
【００５８】
二部塩基エディター
一部の実施形態では、塩基エディターは、ＤＮＡ結合ドメインの、シトシンＤＮＡ塩基を改変するデアミナーゼまたはその活性部分、例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ／Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、ＡＰＯＢＥＣ４を含む、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼ由来のシチジンデアミナーゼ（例えば、Yang et al., J Genet Genomics. 2017 Sep 20;44(9):423-437を参照のこと）；活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）、例えば、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡ）、シトシンデアミナーゼ１（ＣＤＡ１）およびＣＤＡ２、ならびにｔＲＮＡに対して作用するシトシンデアミナーゼ（ＣＤＡＴ）への融合物である。以下の表２は、例示的な配列を提供する；他の配列も使用することができる。
【００５９】
【表３】
2020521446.tif 000005
【００６０】
バリアント
一部の実施形態では、融合タンパク質の構成成分は、例示的な配列（例えば、本明細書で提供される）のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％または９９％同一である、例えば、本明細書に記載される変異に加えて、例示的な配列の残基の最大で５％、１０％、１５％または２０％において、例えば保存的変異によって置き換えられた差異を有する。好ましい実施形態では、バリアントは、親の所望の活性、例えば、Ｃａｓ９バリアントまたは断片の場合には、ニッカーゼ活性を保持しまたはヌクレアーゼ活性を保持せず、ならびに／またはデアミナーゼバリアントもしくはその活性部分の場合には、ガイドＲＮＡおよび／もしくは標的ＤＮＡと相互作用する能力、またはデアミナーゼ活性を保持する。
【００６１】
２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のためにアラインされる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第１および第２のアミノ酸または核酸配列の一方または両方において導入され得、非相同な配列は、比較目的のために無視され得る）。比較目的のためにアラインされる参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも８０％であり、一部の実施形態では、少なくとも９０％または１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるヌクレオチドが比較される。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じヌクレオチドによって占有される場合、これらの分子は、その位置において同一である（本明細書で使用する場合、核酸「同一性」は、核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、これらの配列によって共有される同一な位置の数の関数である。２つのポリペプチドまたは核酸配列間のパーセント同一性は、例えば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Smith, T. F. and M. S. Waterman (1981) J Mol Biol 147:195-7）；ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  Ｐｌｕｓ（商標）中に取り込まれた「ＢｅｓｔＦｉｔ」（Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, 482-489 (1981)）、Schwarz and Dayhof (1979) Atlas of Protein Sequence and Structure, Dayhof, M.O., Ed, pp 353-358；ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ；（Altschul, S. F., W. Gish, et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10）、ＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当業者の技術範囲内の種々の方式で決定される。さらに、当業者は、比較されている配列の長さにわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。一般に、タンパク質または核酸について、比較の長さは、最大で全長でありかつ全長を含む任意の長さであり得る（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％）。本発明の組成物および方法の目的のために、配列の全長の少なくとも８０％がアラインされる。
【００６２】
本開示の目的のために、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、および５のフレームシフトギャップペナルティと共に、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２スコアリングマトリックスを使用して達成され得る。
【００６３】
保存的置換には、典型的には、以下の群内の置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００６４】
二部デアミナーゼ融合タンパク質をコードする単離された核酸、バリアントタンパク質を発現させるための１つまたは複数の調節ドメインに任意選択で作動可能に連結された単離された核酸を含むベクター、ならびにかかる核酸を含み、バリアントタンパク質を任意選択で発現させる、宿主細胞、例えば、哺乳動物宿主細胞もまた、本明細書で提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、幹細胞、例えば、造血幹細胞である。
【００６５】
本明細書に記載される二部デアミナーゼ融合タンパク質は、細胞のゲノムを変更するために使用され得る。本方法は一般に、細胞において融合タンパク質を発現または接触させるステップを含む；１つまたは２つのＣａｓ９を使用するバージョンでは、本方法は、細胞のゲノムの選択された部分に対して相補的な領域を有するガイドＲＮＡを使用するステップを含む。細胞のゲノムを選択的に変更するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、米国特許第８，９９３，２３３号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第９，０２３，６４９号明細書；国際公開第２０１４／０９９７４４号パンフレット；国際公開第２０１４／０８９２９０号パンフレット；国際公開第２０１４／１４４５９２号パンフレット；国際公開第１４４２８８号パンフレット；国際公開第２０１４／２０４５７８号パンフレット；国際公開第２０１４／１５２４３２号パンフレット；国際公開第２１１５／０９９８５０号パンフレット；米国特許第８，６９７，３５９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２９号明細書；米国特許第２０１６００２４５２４号明細書；米国特許第２０１６００２４５２３号明細書；米国特許第２０１６００２４５１０号明細書；米国特許第２０１６００１７３６６号明細書；米国特許第２０１６００１７３０１号明細書；米国特許第２０１５０３７６６５２号明細書；米国特許第２０１５０３５６２３９号明細書；米国特許第２０１５０３１５５７６号明細書；米国特許第２０１５０２９１９６５号明細書；米国特許第２０１５０２５２３５８号明細書；米国特許第２０１５０２４７１５０号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８３号明細書；米国特許第２０１５０２３２８８２号明細書；米国特許第２０１５０２０３８７２号明細書；米国特許第２０１５０１９１７４４号明細書；米国特許第２０１５０１８４１３９号明細書；米国特許第２０１５０１７６０６４号明細書；米国特許第２０１５０１６７０００号明細書；米国特許第２０１５０１６６９６９号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７５号明細書；米国特許第２０１５０１５９１７４号明細書；米国特許第２０１５００９３４７３号明細書；米国特許第２０１５００７９６８１号明細書；米国特許第２０１５００６７９２２号明細書；米国特許第２０１５００５６６２９号明細書；米国特許第２０１５００４４７７２号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１５００２４４９９号明細書；米国特許第２０１５００２０２２３号明細書；米国特許第２０１４０３５６８６７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５７号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３５号明細書；米国特許第２０１４０２７３２２６号明細書；米国特許第２０１４０２７３０３７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１１３３７６号明細書；米国特許第２０１４００９３９４１号明細書；米国特許第２０１３０３３０７７８号明細書；米国特許第２０１３０２８８２５１号明細書；米国特許第２０１２００８８６７６号明細書；米国特許第２０１１０３００５３８号明細書；米国特許第２０１１０２３６５３０号明細書；米国特許第２０１１０２１７７３９号明細書；米国特許第２０１１０００２８８９号明細書；米国特許第２０１０００７６０５７号明細書；米国特許第２０１１０１８９７７６号明細書；米国特許第２０１１０２２３６３８号明細書；米国特許第２０１３０１３０２４８号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；米国特許第２０１５００５０６９９号明細書；米国特許第２０１５００４５５４６号明細書；米国特許第２０１５００３１１３４号明細書；米国特許第２０１５００２４５００号明細書；米国特許第２０１４０３７７８６８号明細書；米国特許第２０１４０３５７５３０号明細書；米国特許第２０１４０３４９４００号明細書；米国特許第２０１４０３３５６２０号明細書；米国特許第２０１４０３３５０６３号明細書；米国特許第２０１４０３１５９８５号明細書；米国特許第２０１４０３１０８３０号明細書；米国特許第２０１４０３１０８２８号明細書；米国特許第２０１４０３０９４８７号明細書；米国特許第２０１４０３０４８５３号明細書；米国特許第２０１４０２９８５４７号明細書；米国特許第２０１４０２９５５５６号明細書；米国特許第２０１４０２９４７７３号明細書；米国特許第２０１４０２８７９３８号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３４号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３２号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３１号明細書；米国特許第２０１４０２７３２３０号明細書；米国特許第２０１４０２７１９８７号明細書；米国特許第２０１４０２５６０４６号明細書；米国特許第２０１４０２４８７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７０２号明細書；米国特許第２０１４０２４２７００号明細書；米国特許第２０１４０２４２６９９号明細書；米国特許第２０１４０２４２６６４号明細書；米国特許第２０１４０２３４９７２号明細書；米国特許第２０１４０２２７７８７号明細書；米国特許第２０１４０２１２８６９号明細書；米国特許第２０１４０２０１８５７号明細書；米国特許第２０１４０１９９７６７号明細書；米国特許第２０１４０１８９８９６号明細書；米国特許第２０１４０１８６９５８号明細書；米国特許第２０１４０１８６９１９号明細書；米国特許第２０１４０１８６８４３号明細書；米国特許第２０１４０１７９７７０号明細書；米国特許第２０１４０１７９００６号明細書；米国特許第２０１４０１７０７５３号明細書；国際公開第２００８／１０８９８９号パンフレット；国際公開第２０１０／０５４１０８号パンフレット；国際公開第２０１２／１６４５６５号パンフレット；国際公開第２０１３／０９８２４４号パンフレット；国際公開第２０１３／１７６７７２号パンフレット；米国特許第２０１５００７１８９９号明細書；Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems" 9(6) Nature Reviews Microbiology 467-477 (1-23) (Jun. 2011)；Wiedenheft et al., "RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea" 482 Nature 331-338 (Feb. 16, 2012)；Gasiunas et al., "Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria" 109(39) Proceedings of the National Academy of Sciences USA E2579-E2586 (Sep. 4, 2012)；Jinek et al., "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity" 337 Science 816-821 (Aug. 17, 2012)；Carroll, "A CRISPR Approach to Gene Targeting" 20(9) Molecular Therapy 1658-1660 (Sep. 2012)；２０１２年５月２５日出願の米国特許出願第６１／６５２，０８６号明細書；Al-Attar et al., Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPRs): The Hallmark of an Ingenious Antiviral Defense Mechanism in Prokaryotes, Biol Chem. (2011) vol. 392, Issue 4, pp. 277-289；Hale et al., Essential Features and Rational Design of CRISPR RNAs That Function With the Cas RAMP Module Complex to Cleave RNAs, Molecular Cell, (2012) vol. 45, Issue 3, 292-302を参照のこと。
【００６６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥまたはｎＣａｓ９）とＢＥドメインとの間にリンカーを含む。これらの融合タンパク質中で（または連結構造にある融合タンパク質間で）使用され得るリンカーには、融合タンパク質の機能を妨害しない任意の配列が含まれ得る。好ましい実施形態では、リンカーは短く、例えば、２〜２０アミノ酸であり、典型的には、柔軟性がある（すなわち、グリシン、アラニンおよびセリンなどの、高い程度の自由度を有するアミノ酸を含む）。一部の実施形態では、リンカーは、ＧＧＧＳ（配列番号８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号９）からなる１つまたは複数の単位、例えば、ＧＧＧＳ（配列番号８）またはＧＧＧＧＳ（配列番号９）単位の、２つ、３つ、４つまたはそれよりも多いリピートを含む。他のリンカー配列もまた使用され得る。
【００６７】
一部の実施形態では、融合タンパク質には、細胞内空間への送達を促進する細胞透過性ペプチド配列、例えば、ＨＩＶ由来ＴＡＴペプチド、ペネトラチン、トランスポータンまたはｈＣＴ由来細胞透過性ペプチドが含まれる。例えば、Caron et al., (2001) Mol Ther. 3(3):310-8；Langel, Cell-Penetrating Peptides: Processes and Applications (CRC Press, Boca Raton FL 2002)；El-Andaloussi et al., (2005) Curr Pharm Des. 11(28):3597-611；およびDeshayes et al., (2005) Cell Mol Life Sci. 62(16):1839-49を参照のこと。
【００６８】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、細胞質または他のオルガネラ、例えば、ミトコンドリアおよび核中への、細胞膜を横切る広範な生体分子の移動を促進する短いペプチドである。ＣＰＰによって送達され得る分子の例には、治療的薬物、プラスミドＤＮＡ、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質、ペプチド、ナノ粒子およびリポソームが含まれる。ＣＰＰは、一般には３０アミノ酸以下であり、天然に存在するもしくは天然に存在しないタンパク質またはキメラ配列に由来し、正に荷電したアミノ酸、例えば、リジンもしくはアルギニンの高い相対的存在量、または極性および非極性アミノ酸の交互のパターンのいずれかを含有する。当該分野で一般に使用されるＣＰＰには、Ｔａｔ（Frankel et al., (1988) Cell. 55:1189-1193、Vives et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:16010-16017）、ペネトラチン（Derossi et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:10444-10450）、ポリアルギニンペプチド配列（Wender et al., (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:13003-13008、Futaki et al., (2001) J. Biol. Chem. 276:5836-5840）およびトランスポータン（Pooga et al., (1998) Nat. Biotechnol. 16:857-861）が含まれる。
【００６９】
ＣＰＰは、共有結合または非共有結合戦略を介して、それらのカーゴと連結され得る。化学的架橋（Stetsenko et al., (2000) J. Org. Chem. 65:4900-4909、Gait et al. (2003) Cell. Mol. Life. Sci. 60:844-853）または融合タンパク質のクローニング（Nagahara et al., (1998) Nat. Med. 4:1449-1453）などの、ＣＰＰとそのカーゴとを共有結合的に繋ぐための方法が、当該分野で公知である。カーゴと、極性および非極性ドメインを含む短い両親媒性ＣＰＰとの間の非共有結合的カップリングは、静電相互作用および疎水性相互作用を介して確立される。
【００７０】
ＣＰＰは、細胞中へ、潜在的に治療的な生体分子を送達するために、当該分野で利用されてきた。例には、免疫抑制のための、ポリアルギニンに連結されたシクロスポリン（Rothbard et al., (2000) Nature Medicine 6(11):1253-1257）、腫瘍発生を阻害するための、ＭＰＧと呼ばれるＣＰＰに連結された、サイクリンＢ１に対するｓｉＲＮＡ（Crombez et al., (2007) Biochem Soc. Trans. 35:44-46）、がん細胞の成長を低減させるための、ＣＰＰに連結された腫瘍抑制因子ｐ５３ペプチド（Takenobu et al., (2002) Mol. Cancer Ther. 1(12):1043-1049、Snyder et al., (2004) PLoS Biol. 2:E36）、および喘息を処置するための、Ｔａｔに融合されたドミナントネガティブ形態のＲａｓまたはホスホイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）（Myou et al., (2003) J. Immunol. 171:4399-4405）が含まれる。
【００７１】
ＣＰＰは、画像化およびバイオセンシング適用のために、細胞中に造影剤を輸送するために、当該分野で利用されてきた。例えば、Ｔａｔに結合された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、がん細胞を標識するために使用されてきた（Shokolenko et al., (2005) DNA Repair 4(4):511-518）。量子ドットにコンジュゲートされたＴａｔは、ラット脳の可視化のために、血液脳関門を首尾よく横断するために使用されてきた（Santra et al., (2005) Chem. Commun. 3144-3146）。ＣＰＰは、細胞画像化のための核磁気共鳴画像化技術とも組み合わされてきた（Liu et al., (2006) Biochem. and Biophys. Res. Comm. 347(1):133-140）。Ramsey and Flynn, Pharmacol Ther. 2015 Jul 22. pii: S0163-7258(15)00141-2もまた参照のこと。
【００７２】
あるいは、またはさらに、融合タンパク質は、核局在化配列、例えば、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（ＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号１０））およびヌクレオプラスミンＮＬＳ（ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号１１））を含み得る。他のＮＬＳは、当該分野で公知である；例えば、Cokol et al., EMBO Rep. 2000 Nov 15; 1(5): 411-415；Freitas and Cunha, Curr Genomics. 2009 Dec; 10(8): 550-557を参照のこと。
【００７３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、リガンドに対する高い親和性を有する部分、例えば、ＧＳＴ、ＦＬＡＧまたはヘキサヒスチジン配列を含む。かかる親和性タグは、組換え融合タンパク質の精製を促進することができる。
【００７４】
融合タンパク質が細胞に送達される方法について、これらのタンパク質は、当該分野で公知の任意の方法を使用して、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳、または適切な宿主細胞における、融合タンパク質をコードする核酸からの発現によって、産生され得る；タンパク質を産生するためのいくつかの方法が、当該分野で公知である。例えば、タンパク質は、酵母、大腸菌（E. coli）、昆虫細胞株、植物、トランスジェニック動物または培養哺乳動物細胞において産生され得、それらから精製され得る；例えば、Palomares et al., “Production of Recombinant Proteins: Challenges and Solutions,” Methods Mol Biol. 2004;267:15-52を参照のこと。さらに、融合タンパク質は、任意選択で、タンパク質が細胞の内側に入ると切断されるリンカーを伴って、細胞中への移行を促進する部分、例えば、脂質ナノ粒子に連結され得る。例えば、LaFountaine et al., Int J Pharm. 2015 Aug 13;494(1):180-194を参照のこと。
【００７５】
発現系
本明細書に記載される融合タンパク質を使用するために、それらをコードする核酸からそれらを発現させることが望ましい場合があり得る。これは、種々の方式で実施され得る。例えば、融合物をコードする核酸は、複製および／または発現のために、原核生物細胞または真核生物細胞中への形質転換のための中間ベクター中にクローニングされ得る。中間ベクターは、典型的には、融合タンパク質の産生のための融合物をコードする核酸の格納または操作のための、原核生物ベクター、例えば、プラスミド、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。融合タンパク質をコードする核酸はまた、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞または原生動物細胞への投与のために、発現ベクター中にクローニングされ得る。
【００７６】
発現を得るために、融合タンパク質をコードする配列は、典型的には、転写を指示するプロモーターを含有する発現ベクター中にサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは、当該分野で周知であり、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3d ed. 2001)；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)；および Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 2010)に記載されている。操作されたタンパク質を発現させるための細菌発現系は、例えば、大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）およびサルモネラ属（Salmonella）において利用可能である（Palva et al., 1983, Gene 22:229-235）。かかる発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母および昆虫細胞のための真核生物発現系は、当該分野で周知であり、市販もされている。
【００７７】
核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば、強い構成的プロモーターは、典型的には、融合タンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、融合タンパク質が、遺伝子調節のためにｉｎ  ｖｉｖｏで投与される場合、構成的または誘導性のいずれかのプロモーターが、融合タンパク質の特定の使用に依存して使用され得る。さらに、融合タンパク質の投与のための好ましいプロモーターは、弱いプロモーター、例えば、ＨＳＶ  ＴＫ、または類似の活性を有するプロモーターであり得る。プロモーターは、トランス活性化に対して応答性のエレメント、例えば、低酸素応答エレメント、Ｇａｌ４応答エレメント、ｌａｃリプレッサー応答エレメント、ならびに小分子制御系、例えば、テトラサイクリン調節系およびＲＵ−４８６系もまた含み得る（例えば、Gossen & Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547；Oligino et al., 1998, Gene Ther., 5:491-496；Wang et al., 1997, Gene Ther., 4:432-441；Neering et al., 1996, Blood, 88:1147-55；およびRendahl et al., 1998, Nat. Biotechnol., 16:757-761を参照のこと）。
【００７８】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核生物または真核生物のいずれかの宿主細胞における核酸の発現のために必要とされるさらなるエレメントを全て含有する転写単位または発現カセットを含有する。従って、典型的な発現カセットは、例えば、融合タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および例えば、転写物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位または翻訳終結のために必要とされる任意のシグナルを含有する。カセットのさらなるエレメントには、例えば、エンハンサー、および異種スプライスイントロンシグナル（heterologous spliced intronic signal）が含まれ得る。
【００７９】
細胞中に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、融合タンパク質の意図した使用、例えば、植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターには、プラスミド、例えば、ｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、ならびに市販のタグ融合物発現系、例えば、ＧＳＴおよびＬａｃＺが含まれる。
【００８０】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えば、ＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルスに由来するベクターは、真核生物発現ベクターにおいて使用される場合が多い。他の例示的な真核生物ベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、およびＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現のために有効であることが示されている他のプロモーターの指示の下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【００８１】
融合タンパク質を発現させるためのベクターは、ガイドＲＮＡの発現を駆動するＲＮＡ  Ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｈ１、Ｕ６または７ＳＫプロモーターを含み得る。これらのヒトプロモーターは、プラスミドトランスフェクションの後に、哺乳動物細胞における融合タンパク質の発現を可能にする。
【００８２】
一部の発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー、例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼおよびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。ポリヘドリンプロモーターまたは他の強いバキュロウイルスプロモーターの指示の下にあるｇＲＮＡコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するなどの、高収量の発現系もまた適切である。
【００８３】
発現ベクター中に典型的に含まれるエレメントには、大腸菌（E. coli）において機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域中の独自の制限部位もまた含まれる。
【００８４】
標準的なトランスフェクション法は、標準的な技術を使用して次いで精製される大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫の細胞株を産生するために使用される（例えば、Colley et al., 1989, J. Biol. Chem., 264:17619-22；Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)を参照のこと）。真核生物細胞および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って実施される（例えば、Morrison, 1977, J. Bacteriol. 132:349-351；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al., eds, 1983)を参照のこと）。
【００８５】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞中に導入するための公知の手順のいずれかが使用され得る。これらには、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム、マイクロインジェクション、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソームおよび組込みの両方のウイルスベクター、ならびにクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞中に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が含まれる（例えば、Sambrook et al.、上記を参照のこと）。使用される特定の遺伝子操作手順が、少なくとも１つの遺伝子を、融合タンパク質を発現することが可能な宿主細胞中に首尾よく導入できることだけが必要である。
【００８６】
あるいは、本方法は、融合タンパク質およびガイドＲＮＡを、例えば、複合体として、一緒に送達することを含み得る。例えば、融合タンパク質およびｇＲＮＡは、宿主細胞において過剰発現され得、精製され得、次いで、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成するためにガイドＲＮＡと（例えば、試験管中で）複合体化され得、細胞に送達され得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、細菌発現プラスミドの使用を介して、細菌において発現され得、そこから精製され得る。例えば、Ｈｉｓタグ化融合タンパク質は、細菌細胞において発現され得、次いで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得る。ＲＮＰの使用は、ヌクレアーゼもしくはガイドをコードする、またはヌクレアーゼをｍＲＮＡとしてコードするプラスミドＤＮＡを送達する必要性を回避する。ＲＮＰ送達は、特異性も改善し得るが、これはおそらくは、ＲＮＰの半減期がより短く、ヌクレアーゼおよびガイドの持続的な発現（プラスミドから得られるような）が存在しないからである。ＲＮＰは、例えば、脂質媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞に送達され得る。例えば、Liang et al. "Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection." Journal of biotechnology 208 (2015): 44-53；Zuris, John A., et al. "Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo." Nature biotechnology 33.1 (2015): 73-80；Kim et al. "Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins." Genome research 24.6 (2014): 1012-1019を参照のこと。
【００８７】
本発明は、例えば、本明細書に記載される方法における使用のための、ベクター、およびベクターを含む細胞、ならびに本明細書に記載されるタンパク質および核酸を含むキットもまた含む。
【実施例】
【００８８】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない以下の実施例においてさらに記載される。
【００８９】
材料および方法
以下の材料および方法を、本明細書の実施例において使用した。
【００９０】
分子クローニング
発現プラスミドを、それらが顕著な重複末端を有するようにＰＣＲ法を使用して所望のＤＮＡ配列を選択的に増幅すること、および等温アセンブリ（または「Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、ＮＥＢ）を使用して、ｐＣＡＧ発現ベクター中に所望の順番でそれらをアセンブルすることによって構築した。ＰＣＲを、Ｑ５またはＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して実施した。Ｃａｓ９  ｇＲＮＡを、Ｕ６プロモーターの制御下にあるｐＵＣ１９ベースの進入ベクターＢＰＫ１５２０を（ＢｓｍＢＩカセットを介して）使用してクローニングした。
【００９１】
ガイドＲＮＡおよびジンクフィンガー標的部位
以下のＥＧＦＰ標的化ジンクフィンガーを使用した：
ＺＦ  １１−１（２２３Ｌ）、標的部位ｇＧＴＣＧＧＧＧＴＡｇ（配列番号１２）
ＺＦ  １３−６（２９２Ｌ）、標的部位ａＧＡＡＧＡＴＧＧＴｇ（配列番号１３）
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ  ２プロトスペーサー（ＰＡＭ）：ＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣ（ＡＧＧ）（配列番号１４）
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ  ４プロトスペーサー（ＰＡＭ）：ＣＡＴＧＣＣＣＧＡＡＧＧＣＴＡＣＧＴＣＣ（ＡＧＧ）（配列番号１５）
Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ  ５プロトスペーサー（ＰＡＭ）：ＣＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＡ（ＴＧＧ）（配列番号１６）
【００９２】
細胞培養およびトランスフェクション
ＢＢＥ実験のために、組み込まれたＥＧＦＰレポーター遺伝子が組み込まれたＨＥＫ２９３細胞株（未公開）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％の１０，０００Ｕ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）および１％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）からなる培地を使用して培養物中で成長させた。細胞を、３〜４日毎に継代して、活発に成長している集団を維持し、無酸素状態を回避した。所望のタンパク質／ｇＲＮＡをコードするトランスフェクション品質のＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍａｘｉ−またはＭｉｎｉｐｒｅｐ）８００ナノグラムを含むトランスフェクションを、２４ウェルのＴＣ処理したプレート中に１×１０５個の細胞を播種し、製造業者のプロトコール（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）に従ってＴｒａｎｓＩＴ−２９３試薬を使用することによって実施した。ｇＤＮＡを、ＤＮＡｄｖａｎｃｅキット（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して、トランスフェクションの３日後に回収した。ＥＧＦＰ−ＰＥＳＴレポーター遺伝子の単一の安定に組み込まれたコピーを含有するＵ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０％熱不活性化胎仔ウシ血清、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中で、５％ＣＯ２で３７℃で培養した。
【００９３】
Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞用の培地には、４００μｇ  ｍｌ−１のＧｅｎｅｔｉｃｉｎを補充した。細胞株のアイデンティティーを、ＳＴＲプロファイリング（ＡＴＣＣ）によって検証し、細胞を、マイコプラズマ混入について定期的に試験した。Ｕ２ＯＳ．ＥＧＦＰ細胞に、ＤＮ−１００プログラムおよびＳＥ細胞株キットをＬｏｎｚａ  ４−Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで使用して、製造業者の推奨に従って、ＢＥを発現するプラスミド７５０ｎｇおよびｓｇＲＮＡを発現するプラスミド２５０ｎｇをトランスフェクトした。ＥＧＦＰ遺伝子の破壊を、トランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーを使用して評価した。
【００９４】
ハイスループットアンプリコン配列決定
標的部位ゲノムＤＮＡを、所望の標的配列に隣接する遺伝子特異的ＤＮＡプライマーを使用して増幅した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑアダプターを、ＰＣＲまたはＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  ＩＩキット（ＮＥＢ）のいずれかによって、アンプリコンの末端に付加し、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｄｕａｌ  Ｉｎｄｅｘ  Ｐｒｉｍｅｒｓ（ＮＥＢ）を用いて分子的にインデックス化した。サンプルを、ライブラリーへと組み合わせ、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ  ｖ２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ装置で配列決定した。配列決定結果を、バッチバージョンのソフトウェアＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（ｃｒｉｓｐｒｅｓｓｏ．ｒｏｃｋｓ）を使用して分析した。
【００９５】
関連するタンパク質配列
Ｎ−ｎＣａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＳＧＧＳリンカー−ＵＧＩ−ＳＶ４０ＮＬＳ−Ｃ
【００９６】
【化１】
2020521446.tif 000006
【００９７】
Ｎ−ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ−８ＡＡリンカー−ＺＦ−ＬＲＧＳリンカー−ＵＧＩ−ＳＧＧＳリンカー−ＳＶ４０ＮＬＳ−Ｃ
【００９８】
【化２】
2020521446.tif 000007
【００９９】
Ｎ−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−８ＡＡリンカー−ＺＦ−ＬＲＧＳリンカー−ＵＧＩ−ＳＧＧＳリンカー−ＳＶ４０ＮＬＳ−Ｃ
【０１００】
【化３】
2020521446.tif 000008
【０１０１】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）Ｃａｓ９
【０１０２】
【化４】
2020521446.tif 000009
【０１０３】
カンピロバクター・ジェジュニ（C. jejuni）Ｃａｓ９
【０１０４】
【化５】
2020521446.tif 000010
【０１０５】
パルビバクラム・ラバメンチボランス（P. lavamentivorans）Ｃａｓ９
【０１０６】
【化６】
2020521446.tif 000011
【０１０７】
ナイセリア・シネレア（N. cinerea）Ｃａｓ９
【０１０８】
【化７】
2020521446.tif 000012
【０１０９】
ｈＡＩＤ
【０１１０】
【化８】
2020521446.tif 000013
【０１１１】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【０１１２】
【化９】
2020521446.tif 000014
【０１１３】
Ｎ末端ＲＮＡ結合領域およびＣ末端のあまり構造化されていない領域を欠如するｈＡＩＤｖ溶解度バリアント
【０１１４】
【化１０】
2020521446.tif 000015
【０１１５】
ｒＡＰＯＢＥＣ１
【０１１６】
【化１１】
2020521446.tif 000016
【０１１７】
ｍＡＰＯＢＥＣ３
【０１１８】
【化１２】
2020521446.tif 000017
【０１１９】
ｍＡＰＯＢＥＣ３触媒ドメイン
【０１２０】
【化１３】
2020521446.tif 000018
【０１２１】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ
【０１２２】
【化１４】
2020521446.tif 000019
【０１２３】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ
【０１２４】
【化１５】
2020521446.tif 000020
【０１２５】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ触媒ドメイン
【０１２６】
【化１６】
2020521446.tif 000021
【０１２７】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｈ
【０１２８】
【化１７】
2020521446.tif 000022
【０１２９】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ
【０１３０】
【化１８】
2020521446.tif 000023
【０１３１】
ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｆ触媒ドメイン
【０１３２】
【化１９】
2020521446.tif 000024
【０１３３】
カンピロバクター・ラリ（C. lari）Ｃａｓ９
【０１３４】
【化２０】
2020521446.tif 000025
【０１３５】
[実施例１]
本発明者らは、隣接する配列に標的化された、ｒＡＰＯＢＥＣ１（ＷＴ）−ＺＦ融合物またはｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ（ＷＴ）−ＺＦ融合物のいずれかおよびｎＣａｓ９−ウラシルＤＮＡグリコシラーゼインヒビター（ＵＧＩ）からなるＢＢＥを生成した。ｎＣａｓ９−ＵＧＩ構造は、機能的ＢＥタンパク質の重要な部分であることが公知の標準的なＢＥ３構造を模倣する。第２のＵＧＩの使用が産物純度を増強する証拠があるので、本発明者らは、ＵＧＩを、ＺＦ（ＬＲＧＳリンカーを介して）ならびにｎＣａｓ９（従来のＢＥ３と同じリンカー）Ｃ末端の両方に融合させた１７。
【０１３６】
さらに、ｎＣａｓ９からのデアミナーゼドメインの物理的分離、および二部塩基エディターの両方の構成成分へのＵＧＩの融合は、より低い、「産物不純物」と一般に呼ばれる従来の塩基エディターの相乗的オンターゲット副作用、例えば挿入／欠失（インデル）または望ましくない置換（シトシンからプリンへの置換、例えば、ＣからＧへの置換またはＣからＡへの置換）を生じるようであった。この特性は、ＵＧＩによるＵＤＧ酵素のより強い阻害を生じ得、これは、ＢＥの産物純度を補助することが公知である。
【０１３７】
ＨＥＫ２９３細胞中の組み込まれたＥＧＦＰレポーター遺伝子上の互いに６〜８塩基対離れた隣接部位に標的化される場合、ｒＡＰＯＢＥＣ１  ＢＢＥおよびｈＡＰＯＢＥＣ３Ａ  ＢＢＥは共に、（デアミナーゼ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ形態の）モノマー性ＢＥ対応物と類似のまたはそれよりも高い比率で、効率的な塩基編集を刺激することができる（図４〜６）。この効果は、互いに対する２つの構成成分の配向とは関係なく一貫しており、複数の異なるＺＦまたはｇＲＮＡを使用して作用する。ＺＦ−デアミナーゼ融合物が、ｎＣａｓ９部位の上流に（５’末端に向けて）標的化された場合、ＢＢＥは、従来のＢＥについて記載されたものと類似の「編集ウインドウ」中のシトシンを、類似の分布で変異させた（図４および５）。ＺＦ−デアミナーゼを、ｎＣａｓ９部位の８塩基対下流に位置させる場合、ＢＢＥは、ｇＲＮＡ標的部位の３’末端に向けてシフトするかなり広い編集ウインドウを有し、このことは、デアミナーゼ含有二部「半分」のプログラムされた近接性による編集ウインドウの可能な制御を示唆している。この編集ウインドウの柔軟性は、二部塩基編集回路に空間的制御を追加する（図６）。未だ試験されていないＢＢＥの空間的配向および間隔は、ＢＢＥのより興味深い有用な特性を明らかにするであろうと想像できる、またはさらにはその可能性が高い。これらの実験で使用したＺＦは、ＯＰＥＮ法を使用して当初構築され、引き続いて、高度に活性なＤＮＡ結合タンパク質として記載された。予測されるように、二重ＵＧＩアプローチを使用することは、標的部位のシトシンからグアニンへの編集およびシトシンからアデニンへの編集の量を低減させる（図７Ａおよび７Ｂ）８。最も重要なことに、第２のＵＧＩのみには必ずしも起因しないが、本発明者らは、ＢＢＥを使用して、インデル形成における実質的な低減を観察し（図７Ｃおよび７Ｄ）、従って、これは、ＢＢＥが、顕著により少ない産物不純物および改善されたオフターゲティング特性を有する塩基編集方法論を提示し得ることを示している。
【０１３８】
参考文献
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【０１３９】
他の実施形態
本発明は、その詳細な説明と併せて記載されてきたが、上述の説明は、本発明の範囲を限定するのではなく例示する意図であり、本発明は、添付の特許請求の範囲によって規定されることを理解すべきである。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
2020521446.tif 000027
【図３】
2020521446.tif 000028
【図４】
2020521446.tif 000029
【図５】
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【図６】
2020521446.tif 000031
【図７−１】
2020521446.tif 000032
【図７−２】
2020521446.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020521446.tif 000035
2020521446.tif 000036
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