(57)【要約】  本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の副作用を治療する方法であって、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を投与することを含む方法に関する。【選択図】図１１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療する方法であって、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を投与することを含む方法。
【請求項２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療するための医薬の製造における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用。
【請求項３】
前記ＭＳＣが、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−表現型を有する、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記ＭＳＣが、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項５】
治療が、前記被験体に約１×１０６〜約１×１０７個のＭＳＣを投与することを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項６】
治療が、前記被験体が前記ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後に前記ＭＳＣ（複数可）を投与することを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項７】
治療が、前記被験体が前記ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた後に前記ＭＳＣ（複数可）を投与することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項８】
治療が、前記被験体が前記ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた後２４時間〜７２時間以内に前記ＭＳＣ（複数可）を投与することを含む、請求項７に記載の方法又は使用。
【請求項９】
前記副作用又は症状が、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、任意選択でインターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の放出；マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）；オンターゲットオフがん作用、任意選択でＢ細胞無形成；腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）；神経毒性、任意選択で脳浮腫；又はアナフィラキシーである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１０】
前記ＣＡＲ  Ｔ細胞療法が、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；形質転換濾胞性リンパ腫（ＴＦＬ）；多発性骨髄腫（ＭＭ）；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；又は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療するためのものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１１】
前記ＣＡＲが、抗ＣＤ１９  ＣＡＲである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１２】
前記被験体が、哺乳類、任意選択でヒトである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法又は使用。
【請求項１３】
哺乳類被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療、改善、又は低減するための治療用組成物であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含み、前記ＭＳＣが、
（ａ）間葉系コロニーを形成するのに十分な時間、正常酸素圧条件下において、ＬｉＣｌ及びＦＧＦ２を含むが、ＰＤＧＦは含まない間葉系コロニー形成培地（Ｍ−ＣＦＭ）中で原始中胚葉細胞を培養することと；
（ｂ）（ａ）の前記間葉系コロニーを接着培養して、前記ＭＳＣを生成させることと
を含む方法によって作製され、
（ｂ）の前記ＭＳＣが、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐは発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しない、並びに／又は表現型ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−を有する治療用組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の治療用組成物を含む容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の副作用の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法は、疾患と戦うために被験体が生まれつき備える免疫系を改善するように設計された生物学的療法である。一般的に、免疫療法は、がん免疫療法を指す。
【０００３】
がん免疫療法の発展している分野は養子細胞移入（ＡＣＴ）であり、この方法では、Ｔ細胞を単離し、がん細胞を認識及び攻撃するように操作し、次いで、増幅させ、がんを有する被験体に再導入する。これは、自家ＡＣＴ用に被験体自身のＴ細胞を単離及び操作することを含み得るが、同種（時に同属とも呼ばれる）ＡＣＴ用にドナーのＴ細胞を使用することについても研究が行われている。
【０００４】
ＡＣＴでは、がん細胞で発現する抗原を認識する受容体を発現するようにＴ細胞又はＮＫ細胞を操作する。該受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得る。ＣＡＲを発現するＴ細胞をＣＡＲ  Ｔ細胞と称する。
【０００５】
今日まで、ＡＣＴ及びＣＡＲ  Ｔ細胞療法は主に血液がんに使用されており、小規模の臨床試験に限定されているが、固形がんについては非常に限られた治験しか行われていない。それにもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、進行がんの被験体において目覚ましい応答を示している。
【０００６】
Ｂ細胞に存在する細胞表面抗原であるＣＤ１９に対するＣＡＲを通常使用するＣＡＲ  Ｔ細胞療法に供されているがんとしては、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及び濾胞性リンパ腫を含む数種の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；並びに多発性骨髄腫が挙げられる。
【０００７】
有望であるにもかかわらず、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、副作用及び大きなリスクがない訳ではない。観察される副作用としては、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）に関連するサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）及びＢ細胞無形成と同様の転帰を引き起こすオンターゲットオフがん作用（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ，ｏｆｆ−ｃａｎｃｅｒ  ｅｆｆｅｃｔｓ）；腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）；脳浮腫等の神経毒性；並びに非ヒト抗原を含むＣＡＲに対する被験体のＩｇＧ応答によって引き起こされるアナフィラキシーが挙げられる。
【０００８】
ＣＲＳは、ステロイドを含む標準的な支持療法で治療されている。しかし、ステロイドは、被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞の活性又は増殖に影響を及ぼす場合がある。ＣＲＳのための別の療法は、ＣＲＳにおいて増加する炎症促進性サイトカインの阻害剤を投与することである。抗ＩＬ−６受容体抗体であるトシリズマブ及びＴＮＦ阻害剤であるエタネルセプトが、ＣＲＳを治療するために使用されている。
【０００９】
抗体産生を減少させるＢ細胞無形成は、感染を予防するために静脈内免疫グロブリンで治療されている。
【００１０】
ＴＬＳは、水分補給、利尿、アロプリノール及び組み換え尿酸オキシダーゼの投与、並びに必要に応じて血液透析を含む、標準的な支持療法によって管理されている。
【００１１】
これら副作用は様々な程度管理に成功しているが、定期的に生じる有害事象、そして更には多数の臨床試験で生じる被験体の死があり、完全に成功しているとはいえない。
【００１２】
明らかに、ＡＣＴ、特にＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用のための改善された予防及び／又は治療法が必要とされている。
【００１３】
本明細書において何らかの先行技術の刊行物を参照する場合、このような参照は、その刊行物がオーストラリア又は任意の他の国における当技術分野の技術常識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。
【発明の概要】
【００１４】
第１の態様は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療する方法であって、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体に間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を投与することを含む方法を提供する。
【００１５】
第１の態様の代替の又は追加の実施形態は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療するための医薬の製造における間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の使用を提供する。
【００１６】
第１の態様の更なる代替の又は追加の実施形態は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施されたことがあるか又は施されている被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の治療において使用するための間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。
【００１７】
一実施形態では、ＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−表現型を有する。
【００１８】
一実施形態では、ＭＳＣは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しない。
【００１９】
一実施形態では、治療は、約１×１０６〜約１×１０７個のＭＳＣを被験体に投与することを含む。
【００２０】
一実施形態では、治療は、被験体がＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後にＭＳＣ（複数可）を投与することを含む。一実施形態では、治療は、被験体がＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた後にＭＳＣ（複数可）を投与することを含む。一実施形態では、治療は、被験体がＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた後２４時間〜７２時間以内にＭＳＣ（複数可）を投与することを含む。
【００２１】
一実施形態では、副作用又は症状は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、任意選択でインターフェロン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、若しくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の放出；マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）；オンターゲットオフがん作用、任意選択でＢ細胞無形成；腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）；神経毒性、任意選択で脳浮腫；又はアナフィラキシーである。
【００２２】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；形質転換濾胞性リンパ腫（ＴＦＬ）；多発性骨髄腫（ＭＭ）；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；又は急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療するためのものである。
【００２３】
一実施形態では、ＣＡＲは、抗ＣＤ１９  ＣＡＲである。
【００２４】
一実施形態では、被験体は、哺乳類、任意選択でヒトである。
【００２５】
第２の態様は、哺乳類被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用を治療、改善、又は低減するための治療用組成物であって、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含み、該ＭＳＣが、
（ａ）間葉系コロニーを形成するのに十分な時間、正常酸素圧条件下において、ＬｉＣｌ及びＦＧＦ２を含むが、ＰＤＧＦは含まない間葉系コロニー形成培地（Ｍ−ＣＦＭ）中で原始中胚葉細胞を培養することと；
（ｂ）（ａ）の間葉系コロニーを接着培養して、ＭＳＣを生成させることと
を含む方法によって作製され、
（ｂ）のＭＳＣが、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐは発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しない、並びに／又は表現型ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−を有する治療用組成物を提供する。
【００２６】
第３の態様は、第２の態様の治療用組成物を含む容器を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、膜貫通及び細胞外の部分を含む、ヒトＣＤ２８由来の共刺激シグナル伝達エレメントをコードしている、配列番号７として同定された核酸配列である。
【図２】図２は、ヒトＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメインをコードしている、配列番号８として同定された核酸配列である。
【図３】図３は、実施例１８の実験設計の概略図である。
【図４】図４は、実施例１８の対照マウス及び試験マウスの直腸温度を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例１８の対照マウス及び試験マウスの臨床スコアを示すグラフである。０＝正常な活動性；１＝正常な活動性、立毛、つま先歩行；２＝猫背、活動性は低下するが、まだ移動可能；３＝運動性は低下するが、促されたときは移動可能；４＝瀕死、安楽死。
【図６】図６は、実施例１８のマウスの末梢血における、マウスＣＤ４５＋細胞の百分率、ヒトＣＤ４５＋細胞の百分率、対ヒトＣＤ４５＋細胞比でのＣＤ４＋細胞、及び対ヒトＣＤ４５＋細胞比でのＣＤ８＋細胞を示すグラフのセットである。
【図７】図７は、実施例１８のマウスの末梢血における、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現を示すグラフのセットである。
【図８】図８は、実施例１８のマウスの末梢血における、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現を示すグラフのセットである。
【図９】図９は、実施例１８のマウスの脾臓における、マウスＣＤ４５＋細胞の百分率、ヒトＣＤ４５＋細胞の百分率、対ヒトＣＤ４５＋細胞比でのＣＤ４＋細胞、及び対ヒトＣＤ４５＋細胞比でのＣＤ８＋細胞を示すグラフのセットである。
【図１０】図１０は、実施例１８のマウスの脾臓における、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現を示すグラフのセットである。
【図１１】図１１は、実施例１８のマウスの脾臓における、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣＤ６９の発現を示すグラフのセットである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本明細書で特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって及び公開されている文書を参照することによって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００２９】
用語「ａ」又は「ａｎ」は、１以上を指し、例えば、「ａ  ＭＳＣ」は、１以上のＭＳＣを表すと理解されることに留意すべきである。このように、用語「ａ」又は「ａｎ」、「１以上」、及び「少なくとも１」は、本明細書において互換的に用いることができる。
【００３０】
続く特許請求の範囲及び発明の説明では、言語表現又は必然的な関連性から文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」若しくは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」等の変形は、包括的な意味で、すなわち、記載されている特徴の存在を特定するために使用され、本発明の様々な実施形態における更なる特徴の存在又は追加を排除するために使用されるものではない。
【００３１】
用語「約」は、本明細書で使用するとき、所与の数について、その数±２５％の大きさの数値範囲を意図する。他の実施形態では、用語「約」は、所与の数について、その数±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％の大きさの数値範囲を意図する。例えば、一実施形態では、「約３グラム」は、２．７グラム〜３．３グラム（すなわち、３グラム±１０％）の値を示す。
【００３２】
同様に、事象のタイミング又は持続時間も少なくとも２５％変動し得る。例えば、特定の事象が一実施形態において１日間持続すると開示されている場合があるが、その事象は１日間よりも長い時間又は短い時間持続してもよい。例えば、「１日間」は、約１８時間〜約３０時間の時間を含み得る。他の実施形態では、期間は、その期間の±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％変動し得る。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「養子細胞移入」又は「ＡＣＴ」とは、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を単離し、特定の抗原を認識するように操作し、次いで、増幅させ、被験体に再導入するプロセスを指す。ＡＣＴに使用されるＴ細胞又はＮＫ細胞は、治療される被験体に由来する「自家」であってもよく、ＡＣＴを受ける被験体によって拒絶されないのに十分な程度類似している免疫原性プロファイルを有するドナー被験体に由来する「同種」（時に「同属」とも呼ばれる）であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用するとき、ＡＣＴにおいて移入される細胞は、「キメラ抗原受容体Ｔ細胞」、「キメラ抗原受容体ＮＫ細胞」、又は「ＣＡＲ  Ｔ細胞」である。本明細書で使用するとき、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を含む。本明細書で使用するとき、「ＣＡＲ  Ｔ細胞」は、ＣＡＲ又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作された細胞を含む。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、任意選択で規定の比率で存在する、ＴヘルパーＣＤ４＋及び／又はＴエフェクターＣＤ８＋の細胞であってよい。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、全ＣＤ３＋細胞を含んでいてよい。
【００３５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、レトロウイルス、レンチウイルス、若しくはトランスポゾンを含むウイルスベクター等のゲノムに組み込まれるベクター、又はプラスミド若しくはｍＲＮＡ等のゲノムに組み込まれない（エピソーマル）ＤＮＡ／ＲＮＡベクターを使用することによって生成され得る。ゲノムに組み込まれるベクターは、安定であるが、レシピエントのＴ細胞又はＮＫ細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える場合がある。エピソーマルベクターは、レシピエントのＴ細胞又はＮＫ細胞における内因性遺伝子発現に負の影響を与える可能性は低いが、ＣＡＲの発現が不安定であり、多くの場合約１週間以内に失われる。別のエピソーマルアプローチは、スカフォールド／マトリクス付着領域（Ｓ／ＭＡＲ）エレメントを含む、組み込まれないレンチウイルス（ＮＩＬＶ）ベクターに依存する。このアプローチは、ゲノムに組み込まれることなく、ＣＡＲ  Ｔ細胞において安定に維持される／長期間発現するという利点を有する。
【００３６】
ＣＡＲ及びＣＡＲ  Ｔ細胞の生成は、当技術分野において公知であり、（ｉ）米国特許第７，４４６，１９０号、同第７，７４１，４６５号、及び同第９，１８１，５２７号を含む多くの特許公報；並びに（ｉｉ）Ｋａｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１１，３（９５）：９５ｒａ７３、Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９，１７（８）：１４５３−６４、及びＭａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１４，３７１（１６）：１５０７−１７を含む雑誌刊行物；並びに（ｉｉｉ）本開示の実施例１〜４に記載されている。（ｉ）及び（ｉｉ）の例はそれぞれ、この相互参照によって全体が組み込まれる。
【００３７】
理論に束縛されるものではないが、ＣＡＲは、４つのドメインを含み得る：
（１）特定の細胞表面抗原（複数可）を標的とする、単鎖抗体可変断片（ｓｃＦＶ）の細胞外結合ドメイン
（２）ヒンジドメイン
（３）膜貫通ドメイン
（４）Ｔ細胞の増殖、生存、及びサイトカイン生成を誘発する、細胞質シグナル伝達ドメイン。
【００３８】
同様に、理論に束縛されるものではないが、ＣＡＲは多数のカテゴリーのうちの１つに分類することができる：第１世代（最古）、第２世代、第３世代、又は第４世代（最新）。
【００３９】
第１世代のＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）由来の単一のシグナル伝達ドメインを有する。第２世代のＣＡＲは、例えば、それぞれＣＤ３ζ及びＣＤ２８又は４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に由来する、シグナル伝達ドメイン及び共刺激ドメインを有する。第３世代のＣＡＲは、例えばＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインと、例えばＣＤ２８及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に由来する複数の共刺激ドメインとを有する。第４世代のＣＡＲは、第２世代のＣＡＲを更なる配列、例えば、ＩＬ−１２等のサイトカイン又は共刺激リガンドをコードしているカセットの発現を誘導し、それによって、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞殺傷能を増強するための活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）と組み合わせたものである。
【００４０】
ＣＡＲが標的とする関連抗原は、例えば、アルファＶベータ６インテグリン、ＣＡＩＸ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ（ＨＥＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２）、ＦＡＰ、葉酸受容体−アルファ、ＧＤ２、グリピカン３、ＩＬ−１３、カッパ軽鎖、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、メソテリン、ＭＵＣ１６、ＮＫＧ２Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲＩ（ＲＯＲアルファ）、又はＶＥＧＦＲであってよい。
【００４１】
適応症
ＣＡＲ  Ｔ細胞を使用して、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）；非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＣＬ）；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；形質転換濾胞性リンパ腫（ＴＦＬ）；多発性骨髄腫（ＭＭ）；マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を治療することができる。このリストは、網羅的であることを意図するものではない。
【００４２】
更に、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、Ｂ細胞悪性腫瘍；Ｂ細胞悪性腫瘍を有する小児若しくは若年成人；Ｂ細胞白血病；ＣＤ１９＋リンパ腫；ＣＤ１９＋Ｂ細胞リンパ腫；ＣＤ１９陽性悪性Ｂ細胞由来の白血病若しくはリンパ腫；再発性若しくは難治性のＣＤ１９＋リンパ腫；難治性／再発性のＢ細胞血液悪性腫瘍；同種幹細胞移植後の反復性若しくは持続性のＢ細胞悪性腫瘍；化学療法抵抗性若しくは難治性のＡＬＬ；再発性Ｂ細胞ＡＬＬを有する小児若しくは若年成人患者；神経膠芽腫；多形神経膠芽腫；反復性多形神経膠芽腫；ＣＤ７陽性の白血病若しくはリンパ腫；ＣＤ３０陽性リンパ腫；ＥＧＦＲ  ＶＩＩＩ＋神経膠芽腫；進行肝臓悪性腫瘍；肝細胞がん腫；神経芽腫；難治性及び／若しくは反復性の神経芽腫；小児における再発性若しくは難治性の神経芽腫；ＧＤ２＋固形腫瘍；小児固形腫瘍；ＭＵＣ１陽性の再発性若しくは難治性の固形腫瘍；乳がん；進行肉腫；がん胎児抗原（ＣＥＡ）陽性がん；ＣＤ７０発現がん；再発性及び難治性の侵襲性Ｂ細胞ＮＨＬ；再発性／難治性のＣＤ３０＋ホジキンリンパ腫若しくはＣＤ３０＋ＮＨＬ；再発性若しくは難治性のＣＤ１９＋ＣＬＬ若しくは小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）；悪性神経膠腫；再発性／難治性のＣＤ３３＋ＡＭＬ；鼻咽腔がん腫；メソテリン陽性進行悪性腫瘍；反復性若しくは転移性の悪性腫瘍；切除不可能な膵臓がん；転移性膵臓がん；進行膵臓がん腫；進行ＲＯＲ１＋悪性腫瘍；反復性若しくは難治性のＤＬＢＣＬ；ＣＤ１９陽性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；難治性若しくは転移性のＧＤ２陽性肉腫；骨髄腫；骨髄異形成症候群；胃がん；反復性若しくは難治性の急性非Ｔリンパ球白血病；ＣＤ５抗原を発現しているＴ細胞悪性腫瘍；反復性若しくは難治性の肺扁平細胞がん腫；進行肝細胞がん腫；ＧＰＣ３陽性進行肝細胞がん腫（ＨＣＣ）；進行性ＭＧ７陽性肝転移；持続性／反復性の芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍；頭頸部がん；ＨＥＲ２陽性悪性腫瘍；化学療法難治性ヒト上皮増殖因子受容体−２（ＨＥＲ−２）陽性進行固形腫瘍；化学療法抵抗性若しくは難治性のＣＤ２０＋リンパ腫；（ＦＡＰ）陽性悪性胸膜中皮腫；慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；化学療法難治性ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）陽性進行固形腫瘍；腺がん腫；又は１型糖尿病を治療するために使用することもできる。
【００４３】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０５細胞／ｋｇであってよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０１０細胞／ｋｇであってよい。他の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、５×１０５細胞／ｋｇ、１×１０６細胞／ｋｇ、５×１０６細胞／ｋｇ、１×１０７細胞／ｋｇ、５×１０７細胞／ｋｇ、１×１０８細胞／ｋｇ、５×１０８細胞／ｋｇ、１×１０９細胞／ｋｇ、又は５×１０９細胞／ｋｇであってよい。
【００４４】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０５細胞／ｍ２であってよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０１０細胞／ｍ２であってよい。他の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、５×１０５細胞／ｍ２、１×１０６細胞／ｍ２、５×１０６細胞／ｍ２、１×１０７細胞／ｍ２、５×１０７細胞／ｍ２、１×１０８細胞／ｍ２、５×１０８細胞／ｍ２、１×１０９細胞／ｍ２、又は５×１０９細胞／ｍ２であってよい。
【００４５】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０５細胞であってよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、１×１０１０細胞であってよい。他の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、５×１０５細胞、１×１０６細胞、５×１０６細胞、１×１０７細胞、５×１０７細胞、１×１０８細胞、５×１０８細胞、１×１０９細胞、又は５×１０９細胞であってよい。
【００４６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、単一用量、分割用量、又は多回用量で投与してよい。
【００４７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、標的抗原及び当該標的抗原を発現している標的細胞に関連し、従って、治療される適応症によって変動し得る。
【００４８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法についての原則に従って、投与する臨床家によって決定される。
【００４９】
副作用及び症状
サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の重篤な副作用である。ＣＲＳは、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＩＬ−２、ＩＬ−２受容体α、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）を含むサイトカインを大量に放出する、増殖しているＴ細胞に起因すると考えられる。
【００５０】
ＣＲＳの症状としては、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、吐き気、食欲不振、頻拍／低血圧、毛細血管漏出、心機能不全、腎機能障害、肝不全、及び播種性血管内凝固が挙げられる。
【００５１】
従って、ＣＲＳの被験体は、発熱；頻拍、低血圧、不整脈、心臓駆出分画の減少を含む心血管症状；浮腫、低酸素症、呼吸困難、及び肺炎を含む肺症状；通常、腎血流量の低下によって引き起こされる急性腎損傷；血清トランスアミナーゼ及びビリルビンの増加、下痢、大腸炎、吐き気、及び腹痛を含む肝臓及び胃腸の症状；グレード３〜４の貧血、血小板減少、白血球減少、好中球減少、及びリンパ球減少等の血球減少を含む血液症状；プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）の延長、Ｄダイマーの増加、低フィブリノゲン、播種性血管内凝固、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、出血、Ｂ細胞無形成、並びに低ガンマグロブリン血症を含む凝固障害；菌血症、サルモネラ、尿路感染症、ウイルス感染症、例えば、インフルエンザ、呼吸器合胞体ウイルス、及び帯状疱疹ウイルス等を含む感染性疾患；クレアチンキナーゼの増加、筋肉痛、及び脱力を含む筋骨格症状；せん妄、錯乱、及び発作を含む神経症状を経験し得る。例えば、エタネルセプト、及び抗ＴＮＦ分子、並びに抗ＩＬ−６受容体抗体であるトシリズマブといったステロイド及び抗サイトカイン療法が、ＣＲＳを治療するために使用されている。
【００５２】
ＭＡＳは、肝脾腫、リンパ節腫脹、汎血球減少、肝機能障害、播種性血管内凝固、低フィブリノゲン血症、高フェリチン血症、及び高トリグリセリド血症を経験する可能性のある被験体では、ＣＲＳと臨床的に重複している。ＣＲＳと同様に、ＭＡＳを有する被験体は、ＩＦＮ−γ及びＧＭＣＳＦを含むサイトカインの濃度上昇を呈する。
【００５３】
オンターゲットオフがん作用は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、及び標的がん抗原が他の健常／正常細胞型において内因的に発現するときに引き起こされるＢ細胞無形成と同様の転帰を引き起こす場合がある。
【００５４】
例えば、抗ＣＤ１９  ＣＡＲはＣＤ１９を発現する正常Ｂ細胞も標的とするので、Ｂ細胞無形成が生じる。Ｂ細胞無形成の結果、低免疫グロブリン血症に起因する、感染症と戦う能力が低下する。感染症を予防するためにＩＶ注入免疫グロブリン補充療法が使用される。
【００５５】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の別の副作用は、腫瘍崩壊症候群（ＴＬＳ）であり、これは、細胞死を引き起こす療法の結果として細胞の内容物が放出されるときに生じ、ほとんどの場合リンパ腫及び白血病を伴う。ＴＬＳは、血液イオン及び代謝物の不均衡を特徴とし、症状としては、吐き気、嘔吐、急性尿酸腎症、急性腎不全、発作、心不整脈、及び死亡が挙げられる。
【００５６】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法から神経毒性が生じる場合もあり、症状としては、脳浮腫、せん妄、幻覚、失語症、無動無言症、頭痛、錯乱、覚醒状態の変化、運動失調、失行症、顔面神経麻痺、振戦、測定障害、及び発作を挙げることができる。
【００５７】
ＣＡＲの一部を形成するマウス由来のタンパク質等の非宿主タンパク質から、アナフィラキシーが発生することもある。
【００５８】
副作用の管理
一般に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用は、任意の提示された症状に対する標準的な支持療法で管理される。しかし、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の結果として無数の副作用及び症状が生じ得ることを考えると、複数の支持療法が同時に必要となる場合がある。
【００５９】
間葉系幹細胞
従って、本発明は、ＣＡＲ  Ｔ細胞及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を投与することによって、ＣＡＲ  Ｔ療法によって引き起こされる副作用の数、重篤度、及び持続時間を低減するための改善された療法を提供する。ＭＳＣは、その免疫調節特性を通して効果を発揮するので、多くの副作用及び症状に対して、ＭＳＣは、当該副作用又は症状の免疫原性の原因に直接作用することができる。
【００６０】
ＭＳＣは、サイトカイン、ケモカイン、及び成長因子等の生物活性分子を分泌し、そして、免疫系を調節する能力を有する。ＭＳＣは、生着に依存することなく、再生及び免疫系に対する効果を促進することが示されている。言い換えれば、ＭＳＣ自体が必ずしも宿主に組み込まれる訳ではなく、むしろ、ＭＳＣは、短期間でその効果を発揮し、次いで、排出される。しかし、ＭＳＣが生着してもよい。
【００６１】
本明細書で使用するとき、「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」とは、骨髄、脂肪組織（脂肪）、胎盤、及び臍帯血を含む広範な組織から単離することができる特定の種類の幹細胞を指す。あるいは、ＭＳＣは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から生成することもできる。ＭＳＣは、「間葉系間質細胞」としても知られている。
【００６２】
誤解を避けるために、本明細書で使用するとき、「副作用」は「症状」を含み、両用語は、定性的に（すなわち、どんな形であれ望ましくない）又は定量的に（特定の閾値を上回ると又は下回ると望ましくない）判定される、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の望まれていない、又は有害な作用を指す。このような症状は、効果をＣＡＲ  Ｔ細胞療法の必要な又は所望の効果と区別するために「有害症状」と称されることもある。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状は、「有害事象」、「免疫介在有害事象」、又は「免疫関連有害事象」と称されることもある。
【００６３】
ＰＳＣからのＭＳＣの生成は、この相互参照によって全体が組み込まれる、２０１７年３月１４日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＡＵ２０１７／０５０２２８号に記載されており、そして、実施例５及び６に記載されている。
【００６４】
ＭＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞に対する免疫調節活性を発揮することが示されている。理論に束縛されるものではないが、根底にある機序は、免疫調節メディエーター、例えば、一酸化窒素、インドールアミン２、３、ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンＥ２、腫瘍壊死因子誘導性遺伝子６タンパク質、ＣＣＬ−２、及びプログラム死リガンド１を含み得る。これらメディエーターは、例えば、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−１７等の炎症性サイトカインによって刺激されるまで、低レベルで発現する。
【００６５】
ＭＳＣは、例えば、静脈内（ＩＶ）、動脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、皮下（ＳＣ）、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、冠動脈内、経心内膜、外科的移植、局所及び吸入（例えば、肺内）を含む経路によって、全身又は末梢に投与され得る。ＭＳＣは、生体適合性材料のスカフォールドと組み合わせて投与されてもよい。
【００６６】
一実施形態では、ＭＳＣは、投与前に前処理される。例えば、成長因子を用いて又は遺伝子編集によって前処理を行ってよく、この場合、成長因子はＭＳＣを予備刺激することができ、遺伝子編集はＭＳＣに新規治療特性を付与することができる。
【００６７】
本明細書で使用するとき、「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」とは、それ自体無限に再生し、任意の他の細胞型に分化する能力を有する細胞を指す。主に２種のＰＳＣが存在する：胚幹細胞（ＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）。
【００６８】
本明細書で使用するとき、「胚幹細胞」又は「ＥＳＣ」とは、体外受精療法を終了し、余剰胚を有する被験体によって同意を得て供与された５〜７日齢胚から単離された細胞を指す。ＥＳＣの使用は、ヒト胚由来の細胞の採取についての倫理上の問題がある程度妨げとなっている。
【００６９】
好適なヒトＰＳＣは、Ｈ１及びＨ９のヒト胚幹細胞を含む。
【００７０】
本明細書で使用するとき、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」とは、成人細胞に由来するＥＳＣ様細胞を指す。ｉＰＳＣは、ＥＳＣと非常によく似た特徴を有するが、ｉＰＳＣは胚に由来していないので、ＥＳＣに関連する倫理上の問題が回避される。その代わり、ｉＰＳＣは、典型的には、「初期化」されて多能性状態に戻された、完全に分化した成人細胞に由来している。
【００７１】
好適なヒトｉＰＳＣとしては、線維芽細胞に由来するｉＰＳＣ  １９−９−７Ｔ、ＭＩＲＪＴ６ｉ−ｍＮＤ１−４、及びＭＩＲＪＴ７ｉ−ｍＮＤ２−０、並びに骨髄単核細胞に由来するｉＰＳＣ  ＢＭ１１９−９が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適なｉＰＳＣは、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＣＤＩ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）から入手することができる。
【００７２】
一実施形態では、本発明に従って使用されるＭＳＣは、原始中胚葉細胞から形成される。原始中胚葉細胞は、間葉血管芽細胞（ＭＣＡ）能を有し得る。原始中胚葉細胞は、ＥＭＨｌｉｎ-ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋表現型を有し得る。一実施形態では、本発明に従って使用されるＭＳＣは、ＭＣＡ能を有するＥＭＨｌｉｎ-ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞から形成される。
【００７３】
本明細書で使用するとき、「ＭＣＡ能を有するＥＭＨｌｉｎ-ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞」とは、典型的な原始線条及び側板／胚外中胚葉の遺伝子を発現する細胞を指す。これら細胞は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）に応答して無血清培地でＭＣＡ及び血管芽細胞のコロニーを形成する能力を有する。実施例６に従って培養されるとき、これら細胞はＭＳＣになる。
【００７４】
ＥＭＨｌｉｎ-という用語は、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン内皮細胞マーカー、ＣＤ７３及びＣＤ１０５間葉／内皮細胞マーカー、並びにＣＤ４３及びＣＤ４５造血細胞マーカーを発現しないことを意味する。
【００７５】
一実施形態では、本発明に従って使用されるＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−表現型を示す。
【００７６】
一実施形態では、本発明に従って使用されるＭＳＣは、ｍｉｃｒｏＲＮＡのｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐのそれぞれを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しない。
【００７７】
ＭＳＣは、「免疫調節活性」を有し、これは、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制するＭＳＣの能力としてインビトロで評価することができる。免疫調節活性は、例えば、免疫力アッセイを使用して判定したとき、参照物質に対してインビトロで定量することができる。
【００７８】
好適な免疫力アッセイは、放射線照射された試験ＭＳＣ（例えば、本明細書に開示される方法に従って生成されたｉＰＳＣ−ＭＳＣ）及び放射線照射された参照サンプルＭＳＣを使用し、これらを、健常ドナーの末梢血から精製された、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで標識された白血球と共に様々な濃度で別々にプレーティングする。参照サンプルのサブセットとなるＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球を、ＣＤ３及びＣＤ２８の抗体を添加することによって刺激する。ＣＤ４で標識されたＴ細胞をフローサイトメトリーを使用して計数して、Ｔ細胞の増殖を評価する。参照サンプルの関数としてＩＣ５０値を記録する。より大きなＣ５０値は、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制する程度がより大きいことを示し、従って、優れたＴ細胞免疫調節特性の指標となる。その増殖能の交絡因子を排除するために、このアッセイで使用する前にＭＳＣサンプルに放射線を照射する。
【００７９】
被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を治療するために治療有効量のＭＳＣを被験体に投与する正確な方法は、医師の裁量によるものであることを当業者であれば理解するであろう。用量、他の剤との併用、投与のタイミング及び頻度等を含む投与方式は、被験体の状態及び病歴によって影響を受けることがある。
【００８０】
ＭＳＣは、治療用組成物として投与され得る。本明細書で使用するとき、用語「治療用組成物」とは、被験体に投与するために製剤化されている、本明細書に記載されるＭＳＣ又はＭＳＣの集団を含む組成物を指す。好ましくは、治療用組成物は滅菌されている。一実施形態では、治療用組成物はパイロジェンフリーである。
【００８１】
一実施形態では、治療用組成物は、容器、好ましくは滅菌容器、好ましくはパイロジェンフリー容器内で提供される。一実施形態では、容器は、例えば、ボーラス投与に好適なシリンジである。別の実施形態では、容器は、輸注に好適な輸液バッグである。
【００８２】
ＭＳＣは、良質の医療実施基準（good medical practice）に合致するように製剤化、調薬、及び投与される。この状況において考慮すべき要因としては、治療される障害及び予測される副作用又は症状の具体的な種類、治療される具体的な被験体、被験体の臨床状態、投与部位、投与方法、投与スケジュール、並びに医師に公知の他の要因が挙げられる。投与されるＭＳＣの治療有効量は、このような考慮事項によって決定される。
【００８３】
ＭＳＣの用量は、約１０３細胞／ｍ２〜約１０１０細胞／ｍ２、例えば、約１０６細胞／ｍ２〜約２×１０８細胞／ｍ２の範囲、又は約１０３細胞／ｍ２、約５×１０３細胞／ｍ２、約１０４細胞／ｍ２、約５×１０４細胞／ｍ２、約１０５細胞／ｍ２、約５×１０５細胞／ｍ２、約１０６細胞／ｍ２、約５×１０６細胞／ｍ２、約１０７細胞／ｍ２、約５×１０７細胞／ｍ２、約１０８細胞／ｍ２、約５×１０８細胞／ｍ２、約１０９細胞／ｍ２、約５×１０９細胞／ｍ２、約１０１０細胞／ｍ２、若しくは約５×１０１０細胞／ｍ２であってよい。
【００８４】
ＭＳＣの用量は、約１０３細胞／ｋｇ〜約１０１０細胞／ｋｇ、例えば、約１０６細胞／ｋｇ〜約２×１０８細胞／ｋｇの範囲、又は約１０３細胞／ｋｇ、約５×１０３細胞／ｋｇ、約１０４細胞／ｋｇ、約５×１０４細胞／ｋｇ、約１０５細胞／ｋｇ、約５×１０５細胞／ｋｇ、約１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約１０８細胞／ｋｇ、約５×１０８細胞／ｋｇ、約１０９細胞／ｋｇ、約５×１０９細胞／ｋｇ、約１０１０細胞／ｋｇ、若しくは約５×１０１０細胞／ｋｇであってよい。
【００８５】
ＭＳＣの用量は、約１０３細胞〜約１０１０細胞、例えば、約１０６細胞〜約２×１０８細胞の範囲、又は約１０３細胞、約５×１０３細胞、約１０４細胞、約５×１０４細胞、約１０５細胞、約５×１０５細胞、約１０６細胞、約５×１０６細胞、約１０７細胞、約５×１０７細胞、約１０８細胞、約５×１０８細胞、約１０９細胞、約５×１０９細胞、約１０１０細胞、若しくは約５×１０１０細胞であってよい。
【００８６】
ＭＳＣは、単一用量、分割用量、又は多回用量で投与してよい。
【００８７】
ＭＳＣは、静脈内（ＩＶ）、動脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、皮下（ＳＣ）、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、冠動脈内、経心内膜、外科的移植、局所及び吸入（例えば、肺内）の経路を含む任意の好適な方法によって被験体に投与され得る。最も好ましくは、ＭＳＣはＩＶ投与される。
【００８８】
ＭＳＣは、被験体がＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける前、受けている間、又は受けた後に投与され得る。一実施形態では、ＭＳＣは、炎症中に投与される。従って、一実施形態では、ＭＳＣは、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与後、任意選択で、炎症が始まった後、及び／又は炎症促進性サイトカインの放出が始まったか若しくは対照に比べて、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与前に比べて増加した後に投与される。理論に束縛されるものではないが、ほとんどの効果は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施した後にＭＳＣを投与することによって得られると考えられる。これは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法は本質的に免疫／炎症応答であるが、一方、ＭＳＣは免疫調節及び抗炎症の効果を発揮するためである。従って、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を施す前、最中、又は後の早すぎる時点でＭＳＣを投与すると、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の効果が弱まる場合がある。この理論にもかかわらず、本発明はそれに限定されるものではない。
【００８９】
しかし、この明らかな逆説は、当業者に理解され、受け入れられる。例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法によって引き起こされるＣＲＳの一次治療法は免疫抑制性が高いステロイドの投与である。ＭＳＣの利点としては、例えば、ステロイドによる全身免疫抑制に比べて局所的に免疫調節する、体内に残留しない、ステロイドにも他の免疫抑制療法にも反応しない被験体に更なる防御線を提供する、ステロイドに比べて毒性が低くかつ特異性が高い、及びステロイドに比べてＭＳＣは自己制御されることを挙げることができる。毒性の低下、特異性の上昇、及び自己制御は関連しており、自己制御とは、ＭＳＣはＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状の免疫応答が消失したときにその免疫調節活性を低下させる能力を有すると考えられることを意味するが、一方、ステロイドは、例えば、次の半減期でもステロイド濃度が治療濃度を下回らない場合、医師が中止しなければならない。
【００９０】
従って、一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約１週間後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた被験体にＭＳＣを投与してよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約５分間後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた被験体にＭＳＣを投与してよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約６日間、約５日間、約４日間、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約１６時間、約１２時間、約８時間、約４時間、約２時間、約６０分間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、又は約５分間後に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた被験体にＭＳＣを投与してよい。一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の投与後約２４時間〜約７２時間以内に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けた被験体にＭＳＣを投与してよい。
【００９１】
一実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約１週間前に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける被験体にＭＳＣを投与してよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約５分間前に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける被験体にＭＳＣを投与してよい。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞の投与の約６日間、約５日間、約４日間、約７２時間、約４８時間、約３６時間、約２４時間、約１６時間、約１２時間、約８時間、約４時間、約２時間、約６０分間、約４５分間、約３０分間、又は約１５分間前に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受ける被験体にＭＳＣを投与してよい。
【００９２】
別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の投与とほぼ同時に又は投与中に、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けている被験体にＭＳＣを投与してよい。
【００９３】
用語「治療有効量」とは、被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を治療するのに有効なＭＳＣの量を指す。
【００９４】
用語「治療する」、「治療している」、又は「治療」とは、治療的処理と予防的（prophylactic）又は防止的（preventative）手段とをいずれも指し、その目的は、被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用若しくは症状を予防、低減、若しくは改善するか、又は被験体におけるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用若しくは症状の進行を減速（緩和）することである。治療を必要とする被験体としては、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を既に有しているものに加えて、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を予防又は改善すべきものが挙げられる。
【００９５】
用語「予防している」、「予防」、「防止的」、又は「予防的」とは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状が発生するのを抑えるか又は妨げる、該発生から守るか又は保護することを指す。予防を必要とする被験体は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を発現しやすい可能性がある。
【００９６】
用語「改善する」又は「改善」とは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状の減少、低減、又は排除を指す。
【００９７】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状は、二元事象として、すなわち、有りか無しか、０か１かで定量化することができる。あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状は、半定量的尺度、例えば、０〜５（０は無しを表し、１〜４は重篤度の同定可能な増大を表し、５は最高の重篤度を表す）定量化することができる。臨床試験では、多くの場合、１〜５の尺度（１は、軽度の有害事象（副作用）を表し、２は、中等度の有害事象（副作用）を表し、３は、重篤な有害事象（副作用）を表し、４は、生命を脅かすか又は日常生活に支障を来す有害事象（副作用）を表し、５は、有害事象（副作用）に関連する死を表す）が使用される。他の半定量的な尺度は、当業者に容易に明らかになるであろう。別の実施形態では、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状は、定量的尺度、例えば、組織液の体積当たりのサイトカインの質量等の体積当たりの質量、温度、持続時間、速度、酵素活性、酸素飽和度等で定量化することができる。
【００９８】
当業者であれば、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の任意の副作用又は症状を評価及び定量する方法を容易に理解し、困難も過度の負担もなくそれを行うことができるであろう。例えば、当業者は、血漿又は血清中のサイトカイン濃度、温度（発熱）、心拍数（頻拍）、血圧（低血圧）、心機能不全、腎機能障害、血清又は血漿の酵素濃度（肝機能）等を測定することができる。
【００９９】
ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状の任意の定量結果を、対照、例えば、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を受けておらずＭＳＣも投与されていない健常対照被験体、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法で治療されたが、ＭＳＣ又は集団では治療されていない罹患対照被験体と比較してよい。
【０１００】
ＭＳＣを投与することによるＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状の治療は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を約１％減少、約２％減少、約３％減少、約４％減少、約５％減少、約６％減少、約７％減少、約８％減少、約９％減少、約１０％減少、約２０％減少、約３０％減少、約４０％減少、約５０％減少、約６０％減少、約７０％減少、約８０％減少、約９０％減少、約１００％、又はそれ以上減少させることであってよい。あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状の治療は、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用又は症状を約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、又はそれ以上減少させることであってもよい。
【０１０１】
本明細書で使用するとき、用語「被験体」は、哺乳類を指し得る。哺乳類は、霊長類、特にヒトであってもよく、又は家畜、動物園の動物、若しくはコンパニオンアニマルであってもよい。本明細書に開示される方法はヒトの医学的治療に好適であることが特に意図されるが、ウマ、ウシ、及びヒツジ等の家畜、イヌ及びネコ等のコンパニオンアニマル、又はネコ科、イヌ科、ウシ科、及び有蹄動物等の動物園の動物の治療を含む獣医学的治療にも適用可能である。
【０１０２】
以下の実施例は、本発明の説明を支援するが、本発明をこのような実施例に限定するものではない。
【実施例】
【０１０３】
実施例１．ＣＡＲ及びレトロウイルスベクター
これら実施例における全てのＣＡＲは、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的な、記載されている通りの（Ｇｏｎｇ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  １，１２３−１２７（１９９９））Ｊ５９１ハイブリドーマに由来するｓｃＦｖを含有している。形質導入細胞の検出を容易にするために、全てのコンストラクトは、ＳＦＧベクターに挿入された脳心筋炎ウイルス内部リボソーム侵入部位（ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ）及びｅＧＦＰ遺伝子を含有していた。Ｐｚ１では、ヒトＣＤ８αのヒンジ及び膜貫通の配列を介してＪ５９１のｓｃＦｖ（Ｐ）がヒトＴＣＲζ（ｚ）の細胞内ドメインに結合している（Ｇｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）。Ｐ２８は、記載されている通り（Ｋｒａｕｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８，６１９−６２６（１９９８）及びＫｒａｕｓｅ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１，Ｓ２６０，７１３（２０００））、Ｊ５９１のｓｃＦｖ（Ｐ）のヒトＣＤ２８（２８）への融合物を含んでいる。Ｐ２８ｚを構築するために、プライマー５’−ＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＴＣＴＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＴＡＡＧＴＣＧＣＧ−３  配列番号２）を使用して、ＣＤ２８のヌクレオチド３３６〜６６０を増幅した。プライマー５’−ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＴＣＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＴＡＧＣＣＡＧＡ−３’（配列番号４）を使用して、ＴＣＲζの細胞内ドメインを増幅した。生成物を、配列番号１及び４のプライマーによって駆動される別個のＰＣＲ反応において融合させ、ＴａｑポリメラーゼでＡテールを付加し、ＮｏｔＩ／ＸｈｏＩリガメントとしてＳＦＧ−Ｐｚ１にサブクローニングした。Ｐｚ２８を作製するために、５’−ＧＣＡＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣ−３’（配列番号５）及び５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＧＡＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＧＣＧＴ−３’（配列番号６）（シトシンリピートに割り込むように導入された２つのサイレント突然変異に下線を引く）を使用してＣＤ２８の細胞内ドメインを増幅した。得られたＰＣＲ生成物は、ＴＣＲζの末端の９つのコドン（終止コドンを除く）をＣＤ２８の細胞内ドメインに融合させたものを表し、便利な５’ＮｓｐＩ部位を含有している。この断片をサブクローニングし、ＮｓｐＩ／ＸｈｏＩで切断し、ＳＦＧ−Ｐｚ１にライゲーションした。ＳＦＧ−ｃ−ｆｍｓは、ヒトマクロファージコロニー刺激因子受容体をコードしている。これによって、ＴＣＲζ及び／又はＣＤ２８に由来するシグナル伝達エレメントにカップリングしているＰＳＭＡ特異的ｓｃＦｖ断片を含む一連の受容体が得られた。Ｐｚ１及びＰ２８は、それぞれＰＳＭＡ依存的にシグナルを伝達するように設計されている。Ｐ２８ｚでは、ＴＣＲζの細胞内部分がＰ２８のＣ末端に連結されているが、Ｐｚ２８では、Ｐｚ１のＣ末端にＣＤ２８シグナル伝達ドメインが付加された。全てのキメラ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、高感度緑色蛍光タンパク質の上流のバイシス���ロニックなオンコ−レトロウイルスベクターにクローニングした。
【０１０４】
実施例２．初代ヒトＴ細胞の培養及びレトロウイルス形質導入
ＲＰＭＩ＋１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ヒト血清中で健常ドナー由来の末梢血単核細胞を樹立し、植物性血球凝集素（２μｇ／ｍＬ）で２日間活性化し、レトロネクチン（１５μｇ／ｍＬ；Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）でプレコーティングされた非組織培養プレート（ＦＡＬＣＯＮ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，Ｎ．Ｊ．）に移した。記載されている通り（Ｇａｌｌａｒｄｏ，Ｈ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ９０，９５２−９５７（１９９７）及びＲｉｖｉeｒｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１３３−１４２（２０００））、ＣＡＲコンストラクトを含むテナガザル白血病ウイルスエンベロープ偽型レトロウイルス粒子を作製した。
【０１０５】
マイトジェン活性化ＰＢＬの形質導入の３日間後、遺伝子導入効率は２０％〜７０％の範囲であった。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋のＴ細胞サブセットも同様の効率で形質導入された。また、融合受容体を含有するζ鎖の発現をウエスタンブロッティングによって分析したところ、ホモダイマーの形成と、存在したとしてもわずかではあるが内因性のＣＤ８又はＣＤ２８とのヘテロダイマー形成が確認された。Ｐ２８ｚ及びＰｚ２８の受容体はいずれも、ヒトＰＳＭＡを発現している線維芽細胞の特異的溶解を媒介したが、Ｐ２８は媒介しなかった。ＰＳＭＡ、Ｐｚ１、Ｐ２８ｚ、及びＰｚ２８を発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＴ細胞を刺激したとき、ＰＳＭＡ及びＢ７．１の存在下でＩＬ−２の分泌が誘発された。共刺激リガンドが存在しない場合、Ｐ２８ｚが形質導入されたＴ細胞の培養物においてのみＩＬ−２の生成が観察された。ＰＳＭＡのみを発現しているＮＩＨ３Ｔ３細胞によって刺激された場合、Ｐｚ１を発現しているＴ細胞の増幅が制限された。Ｐｚ２８が形質導入された細胞もあまり増殖しなかった。対照的に、Ｐ２８ｚが形質導入されたＴ細胞は一貫して増殖し、ＰＳＭＡ＋線維芽細胞単層上で７日間共培養した後、Ｐ２８ｚを発現しているＴ細胞はＰＳＭＡ＋標的を特異的に溶解する能力を保持していた。
【０１０６】
実施例３．ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖ
ＣＤ１９特異的ｓｃＦｖを構築するために、記載されている（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ．ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，３８３３−３８３７（１９８９））縮重プライマーを使用して、ハイブリドーマ細胞株ＳＪ２５Ｃ１から重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域をクローニングした。これらのコード領域を、（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）４スペーサ領域をコードしているＤＮＡ断片と融合させた。膜貫通及び細胞外の部分（配列番号７）を得られたｓｃＦｖの３’末端に、そして、ヒト−ζの細胞質ドメイン（配列番号８）をＣＤ２８部分の３’末端にライゲーションすることを含む、ヒトＣＤ２８由来の共刺激シグナル伝達エレメントのライゲーションを行って、融合遺伝子１９−２８ｚを形成した。
【０１０７】
ＮＡＬＭ６  Ｔ細胞を注射したマウスにおける腫瘍成長を低減し、生存を強化する能力について、１９−２８ｚ融合物を試験した。ＮＡＬＭ６細胞は、ＣＤ１９、ＭＨＣ  Ｉ、及びＭＨＣ  ＩＩを発現するが、Ｂ７．１もＢ７．２も発現しない。大部分の（〜８０％）の未処理ＳＣＩＤ−Ｂｅｉｇｅマウスは、腫瘍細胞を注射した４〜５週間後に後肢麻痺を発症し、残りのマウスは、体重減少及び／又は他のＣＮＳ症状（すなわち、前庭症状）を発症する。１９−２８ｚ融合物が存在する場合、Ｔ細胞刺激はほぼ１０倍に増強され、当該マウスのうちの何匹かは、Ｐｚ１（ＰＳＭＡ特異的コンストラクト）又は共刺激シグナル伝達エレメントを有しないＣＤ１９特異的コンストラクトである１９ｚ１で処理されたマウスと比べて生存期間が大きく延長された。
【０１０８】
実施例４．ＣＤ１９特異的ＣＡＲ
実施例１の方法を使用して、ＣＤ１９結合エレメント、共刺激領域としての４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及びＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むＣＡＲを調製する。ＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−ＣＣＡＴＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＣ  配列番号９）及びＣＴＴＣＡＣＴＣＴ−ＣＡＧＴＴＣＡＣＡＴＣＣＴＴＣ  配列番号１０）を使用して４−１ＢＢを増幅して、制限酵素切断部位を有するＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータテールを含む４−１ＢＢアンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、４−１ＢＢ配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるＰＳＭＡ等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
【０１０９】
実施例１の方法を使用して、ＣＤ１９結合エレメント、共刺激領域としてのＩＣＯＳ、及びＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むＣＡＲを調製する。ＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−ＣＴＡＴＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＣＣＴ  配列番号１１）及びＣＴＴＣＡＣＴＣＴ−ＴＡＧＧＧＴＣＡＣＡＴＣＴＧＴＧＡＧ  配列番号１２）を使用してＩＣＯＳを増幅して、制限酵素切断部位を有するＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータテールを含むＩＣＯＳアンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、ＩＣＯＳ配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるＰＳＭＡ等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
【０１１０】
実施例１の方法を使用して、ＣＤ１９結合エレメント、共刺激領域としてのＤＡＰ−１０、及びＣＤ３ζ鎖の細胞内ドメインをこの順序で含むＣＡＲを調製する。ＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータ鎖の部分へのライゲーションを促進するために、以下のプライマー：ＧＣＧＧＣＣＧＣＡ−ＣＡＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡ（配列番号１３）及びＣＴＴＣＡＣＴＣＴ−ＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＡＴＧ（配列番号１４）を使用してＤＡＰ−１０を増幅して、制限酵素切断部位を有するＣＤ１９のｓｃＦｖ及びゼータテールを含むＤＡＰ−１０アンプリコンを作製する。配列におけるハイフンは、ＤＡＰ−１０配列から該テールへの移行を示す。同じ配列で終わるＰＳＭＡ等の他の結合エレメントについても同じプライマーを使用することができる。
【０１１１】
実施例５．ＭＳＣを生成するための試薬
【０１１２】
【表１】
2020516605.tif 000003
【０１１３】
表１に列挙した試薬は、当業者に公知であり、例えば、ＩＭＤＭ及びハムＦ１２等の認められている組成を有する。ＧＬＵＴＡＭＡＸは、通常０．８５％ＮａＣｌ中２００ｍＭで供給されるＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含む。ＧＬＵＴＡＭＡＸは、培養されている細胞によってジペプチド結合が切断されたときにＬ−グルタミンを放出する。既知組成脂質濃縮物は、２ｍｇ／Ｌ  アラキドン酸、２２０ｍｇ／Ｌ  コレステロール、７０ｍｇ／Ｌ  ＤＬ−アルファ−トコフェロール酢酸エステル、１０ｍｇ／Ｌ  リノール酸、１０ｍｇ／Ｌ  リノレン酸、１０ｍｇ／Ｌ  ミリスチン酸、１０ｍｇ／Ｌ  オレイン酸、１０ｍｇ／Ｌ  パルミチン酸、１０ｍｇ／Ｌ  パルミトレイン酸、９０ｇ／Ｌ  ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、１０ｍｇ／Ｌ  ステアリン酸、２．２ｇ／Ｌ  ＴＷＥＥＮ  ８０（登録商標）、及びエチルアルコールを含む。Ｈ−１１５２及びＹ２７６３２は、非常に強力で、細胞透過性である選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合コイルドコイル形成タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ）阻害剤である。
【０１１４】
【表２】
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【０１１５】
【表３】
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【０１１６】
【表４】
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【０１１７】
【表５】
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【０１１８】
【表６】
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【０１１９】
実施例６．ヒトＰＳＣをＭＳＣに分化させるためのプロトコール
１．  ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｋｇ）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基本培地＋Ｅ８サプリメント）＋１μＭ  Ｈ１１５２中でｉＰＳＣを解凍した。３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で、プレーティングしたｉＰＳＣをインキュベートした。
２．  ビトロネクチンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｋｇ）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地（ＲＯＣＫ阻害剤を含まない）中で３回継代してｉＰＳＣを増幅し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）でインキュベートした後、分化プロセスを開始させた。
３．  ｉＰＳＣを回収し、ＩＶ型コラーゲンでコーティングされた（０．５μｇ／ｃｋｇ）プラスチックの器において、Ｅ８完全培地＋１０μＭ  Ｙ２７６３２中に５×１０３細胞／ｃｋｇで単細胞／小コロニーとして播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で２４時間インキュベートした。
４．  Ｅ８完全培地＋１０μＭ  Ｙ２７６３２を分化培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２（低酸素）で４８時間インキュベートして、原始中胚葉細胞を生成した。
５．  単細胞懸濁液として分化培地接着培養物からコロニー形成原始中胚葉細胞を回収し、Ｍ−ＣＦＭ懸濁培養液に移し、間葉系コロニーが形成されるまで、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で１２日間インキュベートした。
６．  間葉系コロニーを回収し、フィブロネクチン／Ｉ型コラーゲンでコーティングされた（０．６７μｇ／ｃｋｇ  フィブロネクチン、１．２μｇ／ｃｋｇ  Ｉ型コラーゲン）プラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートして、ＭＳＣ（継代数０）を生成した。
７．  コロニーを回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｋｇで単細胞として播種し（継代数１）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
８．  回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｋｇで単細胞として播種し（継代数２）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
９．  回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｋｇで単細胞として播種し（継代数３）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１０．  回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｋｇで単細胞として播種し（継代数４）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１１．  回収し、フィブロネクチン／１型コラーゲンでコーティングされたプラスチックの器において、Ｍ−ＳＦＥＭ中に１．３×１０４細胞／ｃｋｇで単細胞として播種し（継代数５）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
１２．  単細胞として回収し、最終生成物を冷凍した。
【０１２０】
Ｍ−ＣＦＭにＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ）及び／又はＬｉＣｌ（１ｍＭ）を補給することのｉＰＳＣ−ＭＳＣのＴ細胞抑制に対する影響について調べるために、２つの実験（ＴＣ−Ａ−９６及びＤＡＤ−Ｖ−９０）を実施した。Ｗａｉｓｍａｎ  Ｂｉｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇの免疫力アッセイ（ＩｍｍｕｎｏＰｏｔｅｎｃｙ  Ａｓｓａｙ）（ＩＰＡ）を使用して生じたＴ細胞抑制を評価した。
【０１２１】
表７に概説する通り、以下の血小板由来の成長因子（ＰＤＧＦ）及びＬｉＣｌの組み合わせを評価した：ＰＤＧＦ＋／ＬｉＣｌ＋、ＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ−、ＰＤＧＦ＋／ＬｉＣｌ−、及びＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ＋。２つの異なるＤｎｅｇ１播種密度（５×１０３細胞／ｃｋｇ及び１×１０４細胞／ｃｋｇ）及び分化培地中における２つの異なるアクチビンＡ（ＡＡ）濃度（１×ＡＡ＝１５ｎｇ／ｍＬ及び０．１×ＡＡ＝１．５ｎｇ／ｍＬ）をＴＣ−Ａ−９６実験で比較したことに留意すべきである。ＤＡＤ−Ｖ−９０実験では１つのＤｎｅｇ１播種密度（５×１０ｅ３細胞／ｃｋｇ）及びアクチビンＡ濃度（１．５ｎｇ／ｍＬ）を使用した。また、第１のＩＰＡ（ＩＰＡ１）では１つのロイコパック（ＬＰＫ７）を使用し、第２のＩＰＡ（ＩＰＡ２）では２つのロイコパック（ＬＰＫ７及びＬＰＫ８）を使用した。
【０１２２】
このアッセイは、各ＭＳＣ株がＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制することができる程度を評価するように設計される。健常個体の末梢血から精製された凍結保存白血球（ロイコパック（ＬＰＫ）に由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ））を使用して、凍結保存ＭＳＣを試験した。従って、ドナー間でＬＰＫ細胞集団がばらつくことが予測される。研究グレードの材料について１つのＰＭＢＣサンプルに試験を限定することを選択肢にしつつ、臨床グレードの材料について２人の異なる個体に由来するＰＭＢＣに対して各ＭＳＣ試験サンプルを試験した。アッセイの整合性／再現性を確保し、試験サンプルを正規化するために、参照標準ＭＳＣ株と併せて各ＭＳＣ試験サンプルについてのアッセイを実施した。このアッセイは、Ｂｌｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２０１５，１７（２）：１４０−５１に記載されている。
【０１２３】
簡潔に述べると、試験ＭＳＣを２１Ｇｙのガンマ線照射に曝露した。４８ウェル組織培養プレートにおいて、４×１０ｅ５、２×１０ｅ５、４×１０ｅ４、及び２×１０ｅ４個の放射線照射されたＭＳＣを個々のウェルにプレーティングした。ＰＭＢＣをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで別々に標識した。標識されたＰＭＢＣ細胞を、上記ＭＳＣを含むウェル当たり４×１０５細胞でプレーティングする。これによって、ＰＢＭＣ：ＭＳＣ比は１：１、１：０．５、１：０．１、及び１：０．０５に用量設定される。更なるウェルには刺激されたＰＢＭＣのみをプレーティングし、別のウェルにはＭＳＣのみをプレーティングし、更に別のウェルには刺激せずに１：０．０５比でプレーティングし、これらは全て対照として役割を果たす。続いて、Ｔ細胞刺激性モノクローナル抗体である抗ヒトＣＤ３−イプシロン（ｅｐｉｌｓｏｎ）及び抗ヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を各ウェルに添加した。
【０１２４】
培養４日目、個々のウェルから細胞を回収した。各ウェルからの細胞を、アロフィコシアニンで標識された抗ヒトＣＤ４と共にインキュベートした。次いで、フローサイトメーターを使用してカルボキシフルオレセイン強度を介して、ＣＤ４＋細胞を増殖について分析した。ＭＳＣのみの対照は、共培養ウェルからＭＳＣをゲートして除くことに役立った。ＰＢＭＣのみの対照は、最大のＴ細胞増殖についてのポジティブコントロールとしての役割を果たし、それに対するＭＳＣが媒介した抑制の程度を測定する。刺激されていない１：０．０５比のウェルは、ネガティブコントロールのゲートを作製するために使用され、それに対する増殖を測定した。
【０１２５】
試験サンプル比から、最良適合曲線を使用してＩＣ５０値を得た。ＩＣ５０値を参照標準に対して正規化した（ＩＣ５０参照標準／ＩＣ５０試験サンプル）。この正規化されたＩＣ５０は、より作用の強い（より抑制性の高い）サンプルについてはより大きな値が得られ、より作用の弱いサンプルについてはより小さな値が得られる。
【０１２６】
結果
表７に提示するＩＣ５０のデータは、免疫調節性であるｉＰＳＣ−ＭＳＣを生成するために、分化しているｉＰＳＣにとって、ＬｉＣｌを補給したが、ＰＤＧＦは含まない（すなわち、ＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ＋）Ｍ−ＣＦＭが最適であったことを示す。更に、より低濃度のアクチビンＡもｉＰＳＣ−ＭＳＣの免疫抑制を改善した。
【０１２７】
【表７】
2020516605.tif 000009
【０１２８】
この実施例に従って生成されたＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−表現型を示す。
【０１２９】
実施例７．ＭＳＣマイクロＲＮＡ分析
実施例６に従って生成されたＭＳＣを、１１９４個のｍｉＲＮＡ、及びｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２９９−５ｐからなる独自のｍｉＲＮＡパネルを含むマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）アイクロアレイに対する分析に供し、７１個のＭＳＣサンプル及び９４個の非ＭＳＣサンプルに対して検証した。
【０１３０】
実施例６に従って生成されたＭＳＣは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐのそれぞれを発現したが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しなかった。
【０１３１】
実施例８．別の免疫力アッセイ１
ＭＳＣの免疫力を以下の通り評価する：様々なドナー由来のヒトＰＢＭＣをリン酸緩衝生理食塩水にプールし（個体間の免疫応答のばらつきを最小化するため）、２×１０７ＰＢＭＣ／ｍＬの細胞密度で、暗条件下において３７℃で１５分間、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ、２μＭ）で染色した。１０％ヒト血液型ＡＢ血清を補給したＲＰＭＩ−１６４０培地を等量添加することによって、反応を停止させる。次いで、１０％のプールされたヒト血小板溶解物、２ＩＵ／ｍＬ  防腐剤不含ヘパリン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ；Ｇｉｂｃｏ）、１００ＩＵ／ｍＬ  ペニシリン（Ｓｉｇｍａ）、及び１００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を補給したＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた、ＣＦＳＥで標識されたＰＢＭＣ３×１０５個を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１ウェルごとにトリプリケートでプレーティングする。Ｇａｌｌｉｏｓ１０色フローサイトメーター及びＫａｌｕｚａ  Ｇ１．０ソフトウェア（いずれもＣｏｕｌｔｅｒ）を使用して、Ｔ細胞の増殖を判定する。生存している、７−アミノアクチノマイシン−Ｄ（７−ＡＡＤ−；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を排除しているＣＤ３−ＡＰＣ＋（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）Ｔ細胞を４〜７日間後に分析する。Ｍｏｄｆｉｔ  ４．１ソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ）を使用して、増殖動態及び集団分布を分析する。
【０１３２】
実施例９．別の免疫力アッセイ２
ＭＳＣの免疫力を以下の通り評価する：製造業者の指示書に従ってＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球をＣｅｌｌＴｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、次いで、９６ウェルＵ底プレートにおいて、５：１のＴ細胞／ビーズ比で、抗ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされたビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって刺激する。次いで、レスポンダーＣＤ４  Ｔ細胞を、参照標準としての放射線照射（１００Ｇｙ）されたＫａｒｐａｓ２９９細胞（Ｋ２９９細胞；Ｓｉｇｍａ）又はＭＳＣと共にインキュベートする。共培養された細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で７２時間、ＲＰＭＩ−１６４０培地中においてインキュベートする。次いで、該細胞をアネキシンＶ結合バッファ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄し、暗条件下、室温で１５分間、アネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアネート又はＡＰＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色する。このインキュベート後、該細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、次いで、ＬＳＲＩＩ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において直ちにデータを取得する。収集されたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン８．８．６；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析する。アネキシンＶ陰性かつＰＩ陰性のＴ細胞集団によって生存率を測定する。この生存細胞の集団をＣＴＶｄｉｍ（増殖％）について分析する。以下の等式を用いてＴ細胞集団の抑制を計算する：抑制％＝１００−（ａ／ｂ×１００）（式中、ａはサプレッサー細胞の存在下における増殖率であり、ｂはサプレッサー細胞の非存在下における増殖率である）。
【０１３３】
実施例１０．ＡＬＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の発生率の低下
難治性ＡＬＬ被験体を２群に分け、ＣＤ１９に特異的な自家ＣＡＲ  Ｔ細胞を各群にＩＶ注入する。ＣＤ１９  ＣＡＲをコードしているレンチウイルスベクターで該ＣＡＲ  Ｔ細胞に形質導入する。体重１キログラム当たり０．７６×１０６〜２０．６×１０６個のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
【０１３４】
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入した後３時間以内に、１群の被験体に１×１０６〜１×１０７個のＭＳＣをＩＶ注入する。
【０１３５】
被験体の約９０％でＡＬＬの完全寛解が予測される。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、増殖し、応答被験体の血液、骨髄、及び脳脊髄液において検出可能になると予測される。ＡＬＬの持続的寛解が予測され、推定６ヶ月無再発生存率は約６７％、推定全生存率は約８０％である。
【０１３６】
ＭＳＣを注入しない全ての被験体は、ＣＲＳを発症すると予測される。この群の被験体の約２５％は、重篤なＣＲＳを発症すると予測され、これはトシリズマブで治療される。
【０１３７】
ＭＳＣを注入する全ての被験体は、ＭＳＣで治療されない被験体と比べて症状の重篤度の低下として示される、ＣＲＳの低減を示すと予測される。この群の被験体は、より少なくかつより重篤度が低い、ＣＲＳ以外の副作用も示すと予測される。
【０１３８】
実施例１１．ＡＬＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の治療
難治性ＡＬＬ被験体を２群に分け、ＣＤ１９に特異的な自家ＣＡＲ  Ｔ細胞を各群にＩＶ注入する。ＣＤ１９  ＣＡＲをコードしているレンチウイルスベクターで該ＣＡＲ  Ｔ細胞に形質導入する。体重１キログラム当たり０．７６×１０６〜２０．６×１０６個のＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の用量を被験体に注入する。応答、毒性、及び副作用、並びに循環ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増幅及び持続性について患者をモニタリングする。
【０１３９】
ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入した２４〜７２時間後に、１×１０６〜１×１０７個のＭＳＣを１群の被験体にＩＶ注入する。
【０１４０】
被験体の約９０％でＡＬＬの完全寛解が予測される。ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ細胞は、増殖し、応答被験体の血液、骨髄、及び脳脊髄液において検出可能になると予測される。ＡＬＬの持続的寛解が予測され、推定６ヶ月無再発生存率は約６７％、推定全生存率は約８０％である。
【０１４１】
ＭＳＣを注入しない全ての被験体は、ＣＲＳを発症すると予測される。この群の被験体の約２５％は、重篤なＣＲＳを発症すると予測され、これはトシリズマブで治療される。
【０１４２】
ＭＳＣを注入する全ての被験体は、ＭＳＣで治療されない被験体と比べて症状の重篤度の低下として示される、ＣＲＳの低減を示すと予測される。この群の被験体は、より少なくかつより重篤度が低い、ＣＲＳ以外の副作用も示すと予測される。
【０１４３】
実施例１２．ＣＬＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の発生率の低下
難治性ＣＬＬの被験体を実施例１０に従って治療する。ＭＳＣなしで治療されたＡＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＡＬＬ被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、ＭＳＣなしで治療されたＣＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＣＬＬ被験体における改善が期待される。
【０１４４】
実施例１３．ＣＬＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の治療
難治性ＣＬＬの被験体を実施例１１に従って治療する。ＭＳＣなしで治療されたＡＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＡＬＬ被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、ＭＳＣなしで治療されたＣＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＣＬＬ被験体における改善が期待される。
【０１４５】
実施例１４．ＮＨＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の発生率の低下
ＮＨＬの被験体を実施例１０に従って治療する。ＭＳＣなしで治療されたＡＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＡＬＬ被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、ＭＳＣなしで治療されたＮＨＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＮＨＬ被験体における改善が期待される。
【０１４６】
実施例１５．ＮＨＬについてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の治療
ＮＨＬの被験体を実施例１１に従って治療する。ＭＳＣなしで治療されたＡＬＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＡＬＬ被験体における改善と比べて、同一ではないが同様な、ＭＳＣなしで治療されたＮＨＬ被験体に対するＭＳＣで治療されたＮＨＬ被験体における改善が期待される。
【０１４７】
実施例１６．肉腫又はＧＤ２陽性固形腫瘍についてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の発生率の低下
反復性／難治性ＧＤ２陽性肉腫の被験体を２群に分ける。Ｔ細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして１８００ｍｇ／ｍ２／日  シクロホスファミドを被験体に投与する。ＧＤ２  ＣＡＲをコードしているレンチウイルスベクターＣＡＲ  Ｔ細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に１×１０５〜１×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇをＩＶ注入する。応答及び副作用、並びに循環ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
【０１４８】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入する３日間前に、被験体に、１日２回、２時間にわたって１８００ｍｇ／ｍ２／日  シクロホスファミドをＩＶ投与し、１日２回、連続ＩＶ注入によって１８００ｍｇ／ｍ２／日  Ｍｅｓｎａを投与する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入日、３０〜６０分間前に、被験体に、１ｍｇ／ｋｇ／日  ジフェンヒドラミン（最大５０ｍｇ）をＩＶ又はｐ．ｏ．投与し、１５ｍｇ／ｋｇ／用量  アセトアミノフェン（最大６５０ｍｇ）をｐ．ｏ．投与する。ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を１５〜３０分間にわたって注入する。
【０１４９】
ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入した後３時間以内に、１群の被験体に１×１０６〜１×１０７個のＭＳＣをＩＶ注入する。
【０１５０】
ＭＳＣを注入しない全ての被験体は、ＣＲＳの少なくとも１つの症状又はＣＲＳ以外の副作用を発症すると予測される。ＭＳＣを注入する全ての被験体は、ＣＲＳの少なくとも１つの症状又はＣＲＳ以外の副作用の重篤度及び／又は持続期間の減少を示すと予測される。
【０１５１】
実施例１７．肉腫又はＧＤ２陽性固形腫瘍についてのＣＡＲ  Ｔ細胞療法の副作用の治療
反復性／難治性ＧＤ２陽性肉腫の被験体を２群に分ける。Ｔ細胞の回収後、リンパ球枯渇レジメンとして１８００ｍｇ／ｍ２／日  シクロホスファミドを被験体に投与する。ＧＤ２  ＣＡＲをコードしているレンチウイルスベクターでＣＡＲ  Ｔ細胞に形質導入する。次いで、各群の被験体に１×１０５〜１×１０７  ＣＡＲ  Ｔ細胞／ｋｇをＩＶ注入する。応答及び副作用、並びに循環ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞の増幅及び持続性について被験体をモニタリングする。
【０１５２】
ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入する３日間前に、被験体に、１日２回、２時間にわたって１８００ｍｇ／ｍ２／日  シクロホスファミドをＩＶ投与し、１日２回、連続ＩＶ注入によって１８００ｍｇ／ｍ２／日  Ｍｅｓｎａを投与する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の注入日、３０〜６０分間前に、被験体に、１ｍｇ／ｋｇ／日  ジフェンヒドラミン（最大５０ｍｇ）をＩＶ又はｐ．ｏ．投与し、１５ｍｇ／ｋｇ／用量  アセトアミノフェン（最大６５０ｍｇ）をｐ．ｏ．投与する。ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞を１５〜３０分間にわたって注入する。
【０１５３】
ＧＤ２  ＣＡＲ  Ｔ細胞を注入した２４〜７２時間後に、１群の被験体に１×１０６〜１×１０７個のＭＳＣをＩＶ注入する。
【０１５４】
ＭＳＣを注入しない全ての被験体は、ＣＲＳの少なくとも１つの症状又はＣＲＳ以外の副作用を発症すると予測される。ＭＳＣを注入する全ての被験体は、ＣＲＳの少なくとも１つの症状又はＣＲＳ以外の副作用の重篤度及び／又は持続期間の減少を示すと予測される。
【０１５５】
実施例１８．サイトカイン放出症候群の予防又は治療
この実施例では、重篤な免疫不全であるＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスを使用するので、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の生着及び分化によってこれらマウスをヒト化することができ、その結果、マウスの末梢血及び脾臓において高い割合のヒトＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が生じる。ＯＫＴ３抗体はヒトＴ細胞に結合し、ヒトサイトカインを強く誘導し、それによって、ヒトにおけるＣＲＳをモデル化する。
【０１５６】
ゼロ日目に、２０×１０６個のヒトＰＢＭＣ（ｈｕＰＢＭＣ）を８〜１２週齢の雌ＮＯＤ．Ｃｇ−ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウスに尾静脈を通して静脈内注射した。実験設計の概略図を図３に提供する。
【０１５７】
冷凍ヒトＰＢＭＣはＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入し、ＮＳＧマウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。
【０１５８】
製造業者の指示書に従って、冷凍ｈｕＰＢＭＣサンプルを保存及び解凍した。簡潔に述べると、冷凍細胞のバイアルを３７℃の水浴で解凍し、バイアルの外側を７０％エタノールで清浄にし、３７℃に予め加熱しておいたＲＰＭＩ１０％ＦＢＳを１０ｍＬ含有する１５ｍＬのコニカルチューブに該細胞を移し、１５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳ１０ｍＬで１回洗浄し、トリパンブルー色素排除によって細胞をカウントするためにＰＢＳ１ｍＬに懸濁させた。ＰＢＳ１５０μＬ中２０×１０６個のｈｕＰＢＭＣのアリコートを調製し、注射のためにマウスを準備している間氷上で維持した。
【０１５９】
マウスをケージに入れ、ランプで２〜３分間温めて、尾静脈の拡張を誘導した。次に、マウスをマウス拘束衣に入れ、尾を７０％エタノールで清浄にし、１ｍＬのシリンジ、２７Ｇの針を用いて投与される２０×１０６個のｈｕＰＢＭＣを、尾静脈を通してマウスに注射した。注射後、出血を防ぐために注射部位に軽く圧力を印加した。安楽死の日まで、疾患の兆候についてマウスを毎日モニタリングした。
【０１６０】
ｈｕＰＢＭＣ生着の１０〜１２日間後、マウスを対照コホート（ｎ＝２）又は試験コホート（ｎ＝５）に割り付けた。対照コホートには、腹腔内注射を介して１０μｇの用量でムロモナブ−ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体を投与した。ＯＫＴ３抗体は、臓器移植後の急性拒絶反応を治療するために免疫抑制剤として使用される抗ＣＤ３抗体である。ＯＫＴ３抗体は、ａｂｃａｍ（カタログ番号ａｂ８６８８３）若しくはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号１４−００３７−８２）等の商業的供給元、又はＷａｌｔｅｒ  ａｎｄ  Ｅｌｉｚａ  Ｈａｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ等の他の供給元から購入することができる。ｈｕＰＢＭＣ投与の１２時間後に、腹腔内注射を介して対照及び試験のコホートにＯＫＴ３抗体を投与した。試験コホートには、ＯＫＴ３投与の５時間前（すなわち、ｈｕＰＢＭＣ投与の７時間後）に、尾静脈注射によって２×１０６個のＭＳＣを投与した。他の例では、ＯＫＴ３投与と同時に、又はＯＫＴ３投与の１時間、３時間、５時間、若しくは２４時間後にＭＳＣを投与する（図３）。
【０１６１】
ＯＫＴ３抗体投与の０、１、３、５、及び２４時間後にマウスの体温を取得した。直腸温度と表面／皮膚温度との間の差を補正するために、標準的な直腸体温計に対して較正された非接触式赤外線放射温度計を使用して温度を測定した。
【０１６２】
ＯＫＴ３抗体投与の５時間後、滅菌した４ｍｍ  Ｇｏｌｄｅｎｒｏｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｌａｎｃｅｔを使用する頬静脈穿刺を介して、又は尾静脈から採血することによって、末梢血サンプルを得た。
【０１６３】
臨床スコア及び体温に依存して、ＯＫＴ３投与の５又は２４時間後にマウスを殺処分した。心臓穿刺を介して安楽死させた直後に末梢血サンプルを得、次いで、脾臓を採取した。標準的なフローサイトメトリー染色及び分析によって、循環中及び脾臓でみられたヒトＣＤ４５、ＣＤ４、及びＣＤ８  Ｔ細胞の百分率を求めた。表面染色及びフローサイトメトリー分析によって、循環及び脾臓のＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ６９発現を評価した。
【０１６４】
ＯＫＴ３投与の５及び２４時間後に回収した血漿サンプルを、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１０、並びに任意選択でＩＬ−４及びＩＬ−５の発現について評価する。
【０１６５】
このＣＲＳモデルでは、試験マウスは、対照マウスと比べて高い直腸温度を示した（図４）。また、試験マウスは、このＣＲＳモデルにおいて試験マウスと比べて低い臨床スコアを示した（図５）。
【０１６６】
末梢血（図６）又は脾臓（図９）におけるＣＤ４５＋細胞の百分率では、対照マウスと試験マウスとの間に差はみられなかった。
【０１６７】
しかし、ＣＤ６９発現は、末梢血（図７）及び脾臓（図１０）の両方におけるヒトＣＤ４＋細胞において、また、末梢血（図８）及び脾臓（図１１）の両方におけるヒトＣＤ８＋細胞において、対照マウスと比べて試験マウスで減少した。
【０１６８】
対照マウスと比べて試験マウスのヒトＣＤ４＋細胞及びヒトＣＤ８＋細胞におけるＣＤ６９発現が減少したことに鑑みて、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＦＮγ、ＴＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、及びＩＬ−５のうちの１つ以上の発現が、対照マウスと比べて試験マウスで減少すると予測される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020516605.tif 000018
【図１０】
2020516605.tif 000019
【図１１】
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【国際調査報告】
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2020516605.tif 000022
2020516605.tif 000023
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