【手続補正書】
【提出日】平成30年3月14日(2018.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のゲノム中の遺伝的変異を検出する方法であって、下記を含む前記方法：
（ａ）ポリヌクレオチドの複数のクラスタを提供することであって、（ｉ）それぞれのクラスタが、支持体に結合した核酸二本鎖の複数コピーを含み、（ｉｉ）クラスタ中のそれぞれの二本鎖が、配列Ａ−Ｂ−Ｇ′−Ｄ′−Ｃ′を５′から３′に含む第１の分子と、配列Ｃ−Ｄ−Ｇ−Ｂ′−Ａ′を５′から３′に含む第２の分子と、を含み、（ｉｉｉ）配列Ａ′が、配列Ａに相補性であり、配列Ｂ′が、配列Ｂに相補性であり、配列Ｃ′が、配列Ｃに相補性であり、配列Ｄ′が、配列Ｄに相補性であり、配列Ｇ′が、配列Ｇに相補性であり、（ｉｖ）配列Ｇが、対象からの標的ポリヌクレオチド配列の一部分であり、複数のクラスタのそれぞれに対して異なり、（ｖ）配列Ｂ′が、対応する標的ポリヌクレオチド配列中の配列Ｇに関して３′に位置し、および（ｖｉ）それぞれの第１の分子がバーコード配列を含む；
（ｂ） 第１のプライマーを前記第１の分子の配列にハイブリダイズさせること、ここで前記第１のプライマーは前記バーコード配列の３′または５′のいずれかに位置する配列にハイブリダイズするものであり；および、
（１）前記第１のプライマーが前記バーコード配列の３′に位置する配列にハイブリダイズする場合、Ｒ１配列を生成し、かつそれぞれのクラスタのバーコード配列を特定するように、前記第１のプライマーの伸長により前記第１の分子を配列決定すること；または、
（２）前記第１のプライマーが前記バーコード配列の５′に位置する配列にハイブリダイズする場合、それぞれのクラスタのＲ１配列を生成するように、前記第１のプライマーの伸長により前記第１の分子を配列決定すること；
（ｃ）第２のプライマーを前記第２の分子の配列にハイブリダイズさせること、ここで前記第２のプライマーは前記バーコード配列に相補的な配列の３′または５′のいずれかに位置する配列にハイブリダイズするものであり；ならびに、
Ｒ２配列を生成するように、および、場合により、前記第２のプライマーが前記第１の分子のバーコード配列に相補的な配列の３′に位置する配列にハイブリダイズする場合、それぞれのクラスタのバーコード配列を特定するように、前記第２のプライマーの伸長により前記第の分子を配列決定すること；
（ｄ）バーコード配列が前記ステップ（ｂ）または（ｃ）のいずれかで特定されないときは、
（ｉ）それぞれのクラスタのバーコード配列を生成するように、第３のプライマーを前記第１の分子にハイブリダイズすること；または、
（ｉ）それぞれのクラスタのバーコード配列に相補的な配列を生成するように、第３のプライマーを前記第２の分子にハイブリダイズすること；
（ｅ）全てのＲ１およびＲ２配列を参照配列に整列させるように、アルゴリズムを使用してアラインメントを行うこと、ならびに、
（ｆ）下記ステップ（ｉ）〜（ｉｉ）の少なくとも一つを実行すること：
（ｉ）ステップ（ｅ）により特定された配列変異の有無を特定すること、および／または、
（ｉｉ）前記対象のＲ１配列に基づいて複数の確率を計算すること、および前記確率をレポートに含めること、ここで、前記それぞれの確率は、前記対象または対象の子孫が疾患または形質を有するか、または発症する確率である、
ここで、ステップ（ｂ）及び（ｃ）はいずれの順序で行ってもよい。
【請求項２】
さらにレポートを受信者に送信することを含み、ここで、前記レポートがステップ（ｆ）（ｉ）で特定された配列変異、および／または（ｆ）（ｉｉ）で計算された確率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１およびＲ２配列が、同一の参照配列に整列されるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒ１およびＲ２配列が、同一のアルゴリズムを用いて整列されるものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
同じクラスタの前記Ｒ２配列が整列する前記第１の参照配列中の第２の位置から１０，０００塩基対を超えて離れた、前記第１の参照配列中の第１の位置に整列するＲ１配列を破棄することをさらに含み、および／または、
欠失されるＲ１配列の一部分が、あるクラスタの配列Ｂ′の少なくとも一部分と同一であり、配列Ｇが、そのクラスタの前記Ｒ１配列より短いとき、そのクラスタのＲ１配列の一部分を欠失させることをさらに含み、および／または、
欠失されるＲ１配列の一部分が、任意の配列Ｂ′の少なくとも一部分と同一であり、前記部分が、Ｒ１の前記５′もしくは３′ヌクレオチドのいずれかを含み、（ｉ）いかなるＲ２配列も、前記クラスタに対して生成されなかったか、または（ｉｉ）生成されたＲ２配列が、任意の配列Ｂと同一でないかのいずれかであるとき、クラスタのＲ１配列の一部分を欠失させることをさらに含む、
請求項１〜４のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
Ｒ１およびＲ２配列は、少なくとも１００個の異なる標的ポリヌクレオチドに対して生成される、請求項１〜５のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１配列が、単一反応において少なくとも約１０８個のクラスタに対して生成される、請求項１〜６のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
それぞれのバーコードが、並行して分析された複数の異なるバーコード中のバーコードと１つおきに異なるものであり、および／または、
前記バーコード配列が、単一反応における試料配列のプール中の単一試料と関連付けられるものであり、および／または、
複数のバーコード配列のそれぞれが、単一反応において配列決定された試料のプール中の単一試料と一意に関連付けられる、
請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バーコード配列に基づいて、前記クラスタから配列を分類することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
バーコード配列分類内で同じ配列およびアラインメントを有する複数のＲ１配列を、そのうちの１つを除いて全てを破棄することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
配列Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、少なくとも５個のヌクレオチド長であり、および／または、あらゆるクラスタの配列Ｇは、１〜１０００ヌクレオチド長である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
複数のクラスタのそれぞれのプローブ配列Ｂが、原因となる遺伝的変異体を含む配列、または原因となる遺伝的変異体の２００ヌクレオチド以内にある配列に相補性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
クラスタのうちの１つ以上の配列Ｂは、配列番号２２〜１２１からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
１つ以上の原因となる遺伝的変異体の存在、非存在、または対立遺伝子比が、少なくとも約９０％の精度で決定され、および／または、
コンセンサス配列が、標的ポリヌクレオチド中の挿入、欠失、または挿入および欠失を少なくとも約９０％の精度で特定するものである、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
複数のクラスタのそれぞれのプローブ配列Ｂが、非対象配列を含む配列、または非対象配列の２００ヌクレオチド以内にある配列に相補性である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１つ以上の非対象配列の存在または非存在が決定され、場合により１つ以上の非対象配列の存在または非存在が少なくとも約９０％の精度で決定される、請求項１５に記載の方法。