(57)【要約】本発明の目的は、プロトン化したシトシン塩基の水素結合様式を正確に模倣し、かつ高い三重鎖形成能をもつ人工核酸を提供することである。  本発明は、下記の一般式Ｉで表される核酸誘導体又はそれらの互変異性体に関する。2005085270.tif 000056
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の一般式Ｉで表される核酸誘導体：
2005085270.tif 000055
（式Ｉ中、Ａ１，Ａ２，Ａ３は同一または異なって、水素、炭素数１から６のアルキル基、１から７個のハロゲンを有する炭素数１から３のハロゲン化アルキル基、炭素数１から６のアルコキシ、窒素原子上に炭素数１から６の同一もしくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、シアノ基、ニトロ基、若しくは炭素数１から７のアシル基を表すか、又は、Ａ１及びＡ２、若しくはＡ２及びＡ３は一緒に環状構造を形成し、Ｅは水素原子、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、又は９−フルオレニルメトキシカルボニウ基を表し、Ｘは水素、水酸基、又はアルキルオキシを表し、Ｙは水素原子、４−メトキシトリチル基、又は４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、Ｚは炭素原子上に置換基を有していてもよい炭素数１〜７のアシルアミノ基、フェニル基上に置換基を有していてもよいベンゾイル基、水酸基、アミノ基、又は、窒素原子上に炭素数１〜６の同一若しくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基を表す。）又はそれらの互換異性体。
【請求項２】
Ａ１，Ａ２及びＡ３が水素である、請求項１記載の核酸誘導体。
【請求項３】
Ａ１及びＡ２、若しくはＡ２及びＡ３が一緒に形成する環状構造がシクロアルカン、又はベンゼン環である、請求項１記載の核酸誘導体。
【請求項４】
Ｅがベンジルオキシカルボニル基又はｔ−ブトキシカルボニル基である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項５】
Ｘが炭素数１から６のアルキルオキシである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項６】
Ｙが水素原子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項７】
Ｚが水酸基、アミノ基、又はＮ−ジメチルアミノエチレン基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項８】
Ｙが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、糖の３‘水酸基がホスホロアミダイト化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項９】
ホスホロアミダイト基が一般式（ＩＩ）：−Ｐ（ＯＲ３）Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）  （ＩＩ）
（式中、Ｒ３はリン酸基の保護基であり、Ｒ４及びＲ５はアルキル基、又はアリール基である）で示される、請求項８記載の核酸誘導体。
【請求項１０】
リン酸基の保護基が２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチルーＮ−（２，２，２、−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基である、請求項８又は９記載の核酸誘導体。
【請求項１１】
リン酸基の保護基が２−シアノエチル基である、請求項１０記載の核酸誘導体。
【請求項１２】
Ｒ４及びＲ５は炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基、フェニル基、又はナフチル基である、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の核酸誘導体。
【請求項１３】
Ｒ４及びＲ５はイソプロピル基である、請求項１２記載の核酸誘導体。
【請求項１４】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）。
【請求項１５】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）。
【請求項１６】
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）ウリジン３’−２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）。
【請求項１７】
４’−Ｏ−（４，４’−Ｏ−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）シチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）。
【請求項１８】
請求項１ないし７のいずれか一項に記載の核酸誘導体を含む核酸オリゴマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、ピリジン環５位にピロリル基を導入したウリジンおよびシチジン等の核酸誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】  ＤＮＡやＲＮＡは三重鎖構造をとることができ、そのためにはピリミジン塩基の３Ｎ位がプロトン化される必要がある。中性条件下で三重鎖形成可能な人工核酸はこれまでにいくつか報告されている（非特許文献１及び２）が、プロトン化したシトシン塩基の水素結合様式を正確に模倣し、かつ高い三重鎖形成能をもつ人工核酸は未だ存在しない。【０００３】
【非特許文献１】Ｔ．Ｌ．Ｔｒａｐａｎｅ，Ｍ．Ｓ．Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｄ．Ｒｏｂｙ，Ｐ．Ｏ．Ｔｓ’ｏ，Ｄ．Ｗａｎｇ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，８４１２（１９９４）
【非特許文献２】Ｖ．Ｓ．Ｒａｎａ，Ｋ．Ｎ．Ｇａｎｅｓｈ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８，１１６２（２０００）
【非特許文献３】Ａ．Ａｖｉｎｏ，Ｍ．Ｆｒｉｅｄｅｎ，Ｊ．Ｃ．Ｍｏｒａｌｅｓ，Ｂ．Ｇ．ｄｅ  ｌａ  Ｔｏｒｒｅ，Ｒ．Ｇ．Ｇａｒｃｉａ，Ｆ．Ａｚｏｒｉｎ，Ｊ．Ｌ．Ｇｅｌｐｉ，Ｍ．Ｏｒｏｚｃｏ，Ｃ．Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．Ｅｒｉｔｊａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３０，２６０９（２００２）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  プロトン化したシトシン塩基の水素結合様式を正確に模倣し、かつ高い三重鎖形成能をもつ人工核酸の創成はアンチジーン法をはじめとする核酸応用技術の進展に急務である。そこで、本発明者は、新規修飾シチジン誘導体およびウリジン誘導体をデザインし、高い三重鎖形成核酸を創成することを目的として、鋭意研究した結果、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  即ち、本発明は、下記の一般式Ｉで表される核酸誘導体：【０００６】
2005085270.tif 000002
【０００７】（式Ｉ中、Ａ１，Ａ２，Ａ３は同一または異なって、水素、炭素数１から６のアルキル基、１から７個のハロゲンを有する炭素数１から３のハロゲン化アルキル基、炭素数１から６のアルコキシ、窒素原子上に炭素数１から６の同一もしくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基、塩素、臭素、ヨウ素、フッ素、シアノ基、ニトロ基、若しくは炭素数１から７のアシル基を表すか、又は、Ａ１及びＡ２、若しくはＡ２及びＡ３は一緒に環状構造を形成し、Ｅは水素原子、炭素数１〜５のアルコキシカルボニル基、置換基を有していてもよいベンジルオキシカルボニル基、又は９−フルオレニルメトキシカルボニウ基を表し、Ｘは水素、水酸基、又はアルキルオキシを表し、Ｙは水素原子、４−メトキシトリチル基、又は４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、Ｚは炭素原子上に置換基を有していてもよい炭素数１〜７のアシルアミノ基、フェニル基上に置換基を有していてもよいベンゾイル基、水酸基、アミノ基、又は、窒素原子上に炭素数１〜６の同一若しくは異なるアルキル基を二つ有するジアルキルアミノ基を表す。）又はそれらの互換異性体に係る。【０００８】  本発明は、更に、Ｙが４−メトキシトリチル基又は４，４’−ジメトキシトリチル基を表し、糖の３‘水酸基がホスホロアミダイト化されている上記核酸誘導体、及び該核酸誘導体（Ｙを除いた部分）を含む、ＤＮＡオリゴマー又はＲＮＡオリゴマー等の核酸オリゴマーに係る。
【発明の効果】
【０００９】  本発明の新規人工核酸は、シチジン塩基の３Ｎ位が実際にプロトン化されなくても、ピロリル基とシトシン４位とが分子内水素結合することで互変異性を誘導し、中性条件下でもプロトン化されたシトシン塩基と同様の水素結合様式をもつため正確に塩基認識を行うことができると期待される。また、修飾ウリジン誘導体を併用することで、ピロール環同士の疎水性相互作用により中性条件下においてこれまでにない高い三重鎖形成能を獲得できる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】［図１］図１は、ＴＦＯとの結合実験において使用したヘアピンデュープレックスの構造を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】  本発明の核酸誘導体において、Ａ１，Ａ２及びＡ３の代表例として水素、Ａ１及びＡ２、若しくはＡ２及びＡ３が一緒に形成する環状構造の例として、シクロアルカン、又はベンゼン環を挙げることが出来る。Ｅの好適例として水素原子、ベンジルオキシカルボニル基、及びｔ−ブトキシカルボニル基、Ｘの好適例として、メトキシ基のような炭素数１から６のアルキルオキシ基、Ｙの好適例として水素原子、及び、Ｚの例として、水酸基（ウリジン誘導体）、アミノ基（シトシン誘導体）、又はＮ−ジメチルアミノエチレン基のようなジアルキルアミノ基を挙げることが出来る。【００１２】  核酸誘導体における糖の３‘水酸基がホスホロアミダイト化、及び、本発明の核酸誘導体を含む核酸オリゴマーは、本明細書の記載を参照し、当該技術分野における技術常識に基き、当業者であれば容易に調製することが出来る。
具体的には、ホスホロアミダイト基が一般式（ＩＩ）：−Ｐ（ＯＲ３）Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）（ＩＩ）：（式中、Ｒ３はリン酸基の保護基であり、Ｒ４及びＲ５はアルキル基、又はアリール基である）で示される。リン酸基の保護基としては、２−シアノエチル基、４−ニトロフェニルエチル基、Ｎ−（トリフロオロアセチル）アミノブチル基、又は、４−［Ｎ−メチル−Ｎ−（２，２，２、−トリフルオロアセチル）アミノ］ブチル基を挙げることが出来、２−シアノエチル基が好適である。Ｒ４及びＲ５の好適例は炭素数１〜４のアルキル基、ベンジル基、フェニル基、又はナフチル基であり、特に、イソプロピル基が好ましい。【００１３】  以下、実施例に則して本発明を更に詳しく説明する。尚、本発明の技術的範囲はこれらの記載によって何等制限されるものではない。
【実施例１】
【００１４】３’，５’−Ｏ−ジアセチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物１）【００１５】
2005085270.tif 000003
【００１６】３’，５’−Ｏ−ジアセチル−５−ヨードデオキシウリジン（２１９ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピロール−２−ボロニックアシッド（１０６ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（５．６ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルフォニックアシッドトリソディウム塩（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（５３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を脱気した蒸留水−アセトニトリル（２：１，５ｍＬ）に溶解させる。６０℃にて３０分間撹拌後、さらにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピロール−２−ボロニックアシッド（１０６ｍｇ１０．５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（５．６ｍｇ１０．０２５ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルフォニックアシッドトリソディウム塩（２０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を加える。６０℃にて３０分間撹拌後、水（１０ｍＬ）で希釈し、溶媒を半分量になるまで減圧下留去する。クロロホルム（２０ｍＬ）を加えたのち、食塩水ついで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を洗浄する。有機層を回収し、炭酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を減圧下留去する。Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル）により精製し、表記化合物（１４６ｍｇ、６２％）を得る。【００１７】
2005085270.tif 000004
【実施例２】
【００１８】５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物２）【００１９】
2005085270.tif 000005
【００２０】３’，５’−Ｏ−ジアセチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物１）（３．９４ｇ、８．２５ｍｍｏｌ）をエタノール−濃アンモニア水（１：１、ｖ／ｖ、８０ｍＬ）に溶解させ室温にて８時間撹拌したのち溶媒を減圧下留去する。ピリジン（５０ｍＬ）、６０Ｎシリカゲル（１０ｇ）を加えたのち溶媒を減圧下留去する。６０Ｎシリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム−メタノール）により表記化合物（３．０６ｇ、９４％）を得る。【００２１】
2005085270.tif 000006
【実施例３】
【００２２】５−（ピロール−２−イル）デオキシウリジン（化合物３）【００２３】
2005085270.tif 000007
【００２４】５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物２）（３９３ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルを用いて共沸脱水したのち無水メタノール（１０ｍＬ）に溶解した。ナトリウムメトキシド（３．１Ｍメタノール溶液、３．２３ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を加え室温で一時間撹拌する。水（１０ｍＬ）を加え希釈したのち、塩酸水溶液を用いて中和した。溶媒をあらかた留去したときに生じる沈殿を濾過し、冷水にて洗浄する。減圧下乾燥させることで表記化合物（２４１ｍｇ、８３％）を得る。【００２５】
2005085270.tif 000008
【実施例４】
【００２６】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物４）【００２７】
2005085270.tif 000009
【００２８】３’，５’−Ｏ−ジアセチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物１）（２７０ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をピリジン−濃アンモニア水（１：２、ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解し室温にて８時間撹拌する。溶媒を減圧下留去したのち、無水ピリジンを用いて共沸脱水を行う。無水ピリジン（６ｍＬ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（２０３ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間撹拌する。クロロホルム（１５ｍＬ）で希釈したのち有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて３回洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去する。Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−酢酸エチル、１％ピリジン）を用いて精製し表記化合物（３６０ｍｇ、９４％）を得る。【００２９】
2005085270.tif 000010
【実施例５】
【００３０】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物５）【００３１】
2005085270.tif 000011
【００３２】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシウリジン（化合物４）（３００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで共沸脱水したのち無水塩化エチレン（５ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（３７μＬ、０．２６ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（１８ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）、（２−シアノエトキシ）−ビス（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（１６５μ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、室温にて三時間撹拌する。クロロホルム（５ｍＬ）で希釈したのち有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。有機層を回収、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を減圧下留去する。イソプロピルエーテル−ジエチルエーテル（１：１，ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解し、有機層を０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で五回洗浄する。有機層を回収し溶媒を減圧下留去する。ＧＰＣカラムを装着したリサイクルＨＰＬＣ（クロロホルム、０．５％）を用いて精製し表記化合物（２８２ｍｇ、７３％）を得る。【００３３】
2005085270.tif 000012
原料合成例【００３４】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−ヨードデオキシシチジン【００３５】
2005085270.tif 000013
【００３６】５−ヨードデオキシシチジン（３５３ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を無水メタノール（１０ｍＬ）に懸濁する。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドジメチルアセタール（４８８μＬ、３ｍｍｏｌ）を加え、５０℃にて１時間撹拌する。溶媒を減圧下留去したのち、イソプロピルアルコール（１０ｍＬ）を加え生じた沈殿を濾取する。減圧下乾燥し表記化合物（３９８ｍｇ、９４％）を得る。【００３７】
2005085270.tif 000014
【実施例６】
【００３８】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン（化合物６）【００３９】
2005085270.tif 000015
【００４０】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−ヨードデオキシシチジン（１．６９ｇ、４．０ｍｍｏｌ）、Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−ボロニックアシッド（８４４ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルフォニックアシッド  トリソディウム塩（２０５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、炭酸ナトリウム（８４８ｍｇ、８．０ｍｍｏｌ）を脱気した蒸留水−アセトニトリル（２：１，４０ｍＬ）に溶解させる。６０℃にて３０分間撹拌後、さらにＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−ピロール−２−ボロニックアシッド（２１１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン−３，３’，３’’−トリスルフォニックアシッド  トリソディウム塩（２０５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）を加える。６０℃にて３０分間撹拌後、水（４０ｍＬ）で希釈し、溶媒を半分量になるまで減圧下留去する。クロロホルム（５０ｍＬ）を加えたのち、食塩水ついで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で有機層を洗浄する。有機層を回収し、炭酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を減圧下留去する。Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムーメタノール）により精製し、表記化合物（１．１３ｇ、６１％）を得る。【００４１】
2005085270.tif 000016
2005085270.tif 000017
【実施例７】
【００４２】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン（化合物７）【００４３】
2005085270.tif 000018
【００４４】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン（化合物６）（１．１３ｇ、２．４５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルを用いて共沸脱水したのち無水アセトニトリル（２５ｍＬ）に溶解する。トリエチルアミン（５１７μ、３．６８ｍｍｏｌ）、４，４’−ジメトキシトリチルクロリド（９９６ｍｇ、２．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温にて１０分間撹拌する。クロロホルム（１５ｍＬ）で希釈したのち有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を用いて３回洗浄する。有機層を回収し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧下留去する。Ｃ２００シリカゲルを用いたシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン−クロロホルム−メタノール、０．５％トリエチルアミン）を用いて精製し表記化合物（１．１９ｇ、６４％）を得る。【００４５】
2005085270.tif 000019
2005085270.tif 000020
【実施例８】
【００４６】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物８）【００４７】
2005085270.tif 000021
【００４８】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］デオキシシチジン（化合物７）（２８６ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルで共沸脱水したのち無水塩化エチレン（５ｍＬ）に溶解する。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（４１μＬ、０．２９ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（２０ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ）、（２−シアノエトキシ）−ビス）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（１８４μＬ、０．５８ｍｍｏｌ）を加え、室温にて三時間撹拌する。クロロホルム（５ｍＬ）で希釈したのち有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄する。有機層を回収、無水硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、溶媒を減圧下留去する。イソプロピルエーテルージエチルエーテル（１：１，ｖ／ｖ、１０ｍＬ）に溶解し、有機層を０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で五回洗浄する。有機層を回収し溶媒を減圧下留去する。ＧＰＣカラムを装着したリサイクルＨＰＬＣ（クロロホルム、０．５％）を用いて精製し標題化合物（２８２ｍｇ、７３％）を得る。【００４９】
2005085270.tif 000022
【実施例９】
【００５０】３‘−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−メチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］−ウリジン（化合物９）の合成【００５１】
2005085270.tif 000023
【００５２】３‘−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２‘−Ｏ−メチル−ヨードウリジン（１．１８ｇ、２．３７ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−ピロール−２−ボロニックアシッド（１．０ｇ、３．５５ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（２７ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＴＰＰＴＳ（９５ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）、無水炭酸ナトリウム（５０２ｍｇ、４．７４ｍｇ）を二口なすフラスコに入れ、アルゴン置換し、脱気した純水とアセトニトリル２：１の混合溶媒（２４ｍｌ）を加えた。５０℃で３０分撹拌したのち、ハイフロスーパーセルでろ過し、ろ液を減圧下留去した。残渣に酢酸エチル（３０ｍｌ）、水（３０ｍｌ）を加え抽出し、さらに酢酸エチルで水層から二回抽出し有機層を集めた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。ＮＨシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し標題化合物（１．１ｇ、８６％）を得た。【００５３】
2005085270.tif 000024
2005085270.tif 000025
【実施例１０】
【００５４】３‘、５’−Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−メチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］−ウリジン（化合物１０）の合成【００５５】
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【００５６】化合物９（４ｇ、７．４４ｍｍｏｌ）をジメチルアセトアミド（７．５ｍｌ）に溶解し、イミダゾール（１．７ｇ、１１．１６ｍｍｏｌ）、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（１．０ｇ、１４．８８ｍｍｏｌ）、を加えた。室温で五時間撹拌したのち、水（１０ｍｌ）を加え反応を止めた。酢酸エチル（３０ｍｌ）、水（２０ｍｌ）を加え抽出し、さらに酢酸エチルで水層から二回抽出し有機層を集めた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム溶液で二回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し標題化合物（４．６５ｇ、９６％）を得た。【００５７】
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【実施例１１】
【００５８】３‘、５’−Ｏ−Ｂｉｓ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−メチル−（ピロール−２−イル）−ウリジン（化合物１１）の合成【００５９】
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【００６０】化合物１０（２．６６ｇ、４．０９ｍｍｏｌ）、ナトリウムメトキシド（１．１ｇ、２０．４５ｍｍｏｌ）を二口なすフラスコに入れ、アルゴン置換し、ＴＨＦとメタノール２：１の混合溶媒（４０ｍｌ）を加えた。室温で１時間撹拌したのち、飽和塩化アンモニウム溶液を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣に酢酸エチル（３０ｍｌ）、水（３０ｍｌ）を加え抽出し、さらに酢酸エチルで水層から二回抽出し有機層を集めた。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し標題化合物（１．８ｇ、９６％）を得た。【００６１】
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【実施例１２】
【００６２】２’−Ｏ−メチル−５−［Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）ピロール−２−イル］−ウリジン（化合物１２）の合成【００６３】
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【００６４】化合物１０（５４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ・３ＨＦ（６３．６μｌ、０．４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１３８μｌ、１ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１ｍｌ）を二口なすフラスコに入れ、アルゴン置換し、室温で１９時間撹拌した。減圧下溶媒を留去した。残渣にヘキサン（１５ｍｌ）、水（１５ｍｌ）を加え抽出し、さらにクロロホルムで水層を抽出し有機層を集めた。無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去し標題化合物（４２ｍｇ、９０％）を得た。【００６５】
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【実施例１３】
【００６６】３‘、５’−Ｏ−（Ｂｉｓ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２’−Ｏ−メチル−５−（ピロール−２−イル）−シチジン（化合物１３）の合成【００６７】
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【００６８】化合物１１（１３０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、を塩化メチレン（２ｍｌ）、に溶解し、０．１Ｍ炭酸ナトリウム水溶液（３ｍｌ）、ＴＢＡＢ（３９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＴＰＳ−Ｃｌ（１０７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加え、４時間撹拌した。水（１０ｍｌ）、クロロホルム（１０ｍｌ）を加え抽出し、さらにクロロホルムで水層を二回抽出し有機層を集めた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、溶媒を減圧下留去した。無水アセトニトリルにより三回共沸脱水したのち、７  Ｎアンモニアメタノール溶液（１５ｍｌ）を加え、三時間撹拌した。溶媒を減圧下留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製したのち、さらにＨＰＬＣを用いて精製し標題化合物（７０ｍｇ、５３％）を得た。【００６９】
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【実施例１４】
【００７０】２’−Ｏ−メチル−５−ピロール−２−イル）−シチジン（化合物１４）の合成【００７１】
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【００７２】化合物１３（５５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ・３ＨＦ（６３．６μｌ、０．４ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１ｍｌ）を二口なすフラスコに入れ、アルゴン置換し、室温で２４時間撹拌した。減圧下溶媒を留去した。残渣にヘキサン（１５ｍｌ）、水（１５ｍｌ）を加え抽出し、さらにヘキサンで水層を二回洗浄した。水層を減圧下留去し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製したのち、さらにＬＣ９０８を用いて精製し標題化合物（２９ｍｇ、９０％）を得た。【００７３】
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【実施例１５】
【００７４】３‘−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）ウリジン（化合物１５）【００７５】
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【００７６】化合物９（２５０ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を無水ピリジンにより三回共沸脱水したのち、無水ピリジン（４．６ｍｌ）に溶解し、ＤＭＴｒＣｌ（１９０ｍｇ，０．５６ｍｍｏｌ）を加え、１４時間室温で撹拌した。水（１ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣に酢酸エチル（１５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）、を加え抽出し、さらに酢酸エチルで水層から抽出し有機層を集めた。硫酸ナトリウムを加え乾燥し、減圧下溶媒を留去した。溶出溶媒にピリジン（１％）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し標題化合物（３８６ｍｇ，ｑｕａｎｔ）を得た。【００７７】
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【実施例１６】
【００７８】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）ウリジン（化合物１６）【００７９】
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【００８０】化合物１５（３８６ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルにより三回共沸脱水したのち、無水ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、ＴＥＡ−３ＨＦ（２９６ｍｇ，１．８４ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（３２５ｍｇ，３．２２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１２時間撹拌した。水（１ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣に酢酸エチル（１５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）、を加え抽出し、さらに酢酸エチルで水層から抽出し有機層を集めた。硫酸ナトリウムを加え乾燥し、減圧下溶媒を留去した。溶出溶媒にピリジン（１％）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し標題化合物（３００ｍｇ，９０％）を得た。【００８１】
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【実施例１７】
【００８２】５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）ウリジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物１７）
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【００８３】化合物１６（３００ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルにより三回共沸脱水したのち、無水塩化メチレン（４ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（２５ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）、（２−シアノエトキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（１４９ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（１７ｍｇ，０．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。水（１ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣にクロロホルム（１５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）、を加え抽出し、減圧下溶媒を留去した。残渣に０．２Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ）、ジイソプロピルエーテルとジエチルエーテル２：１の混合溶媒（１５ｍｌ）で抽出し、さらに０．２Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ）で十回洗浄した。硫酸ナトリウムを加え乾燥し、減圧下溶媒を留去した。ＬＣ９０８を用いて精製し標題化合物（２６１ｍｇ，７０％）を得た。【００８４】
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【実施例１８】
【００８５】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）シチジン（化合物１８）【００８６】
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【００８７】４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−２’−Ｏ−メチル−５−ヨードシチジン（７００ｍｇ，１．５４ｍｍｏｌ）、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｐｙｒｒｏｌｅ−２−Ｂｏｒｏｎｉｃａｃｉｄ（１．３ｇ，６．１９ｍｍｏｌ）、酢酸パラジウム（１０４ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、ＴＰＰＴＳ（２６１ｍｇ，０．４６ｍｍｏｌ）、無水炭酸ナトリウム（４８９ｍｇ，４．６２ｍｍｏｌ）を二口なすフラスコに入れ、アルゴン置換し、脱気した純水とアセトニトリル２：１の混合溶媒（１５ｍｌ）を加えた。６０℃で３０分撹拌したのち、ハイフロスーパーセルでろ過し、ろ液を減圧下留去した。つづいて、残渣にメタノールを加えてろ過し、溶媒を減圧下留去した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、粗生成物として得た（５３６ｍｇ，６４％）。このときの副生成物とのプロトン比は１：０．１１であった。【００８８】
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【実施例１９】
【００８９】４’−Ｏ−（４，４’−Ｏ−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）シチジン【００９０】
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【００９１】粗精製物の化合物１８（５３６ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリルにより三回共沸脱水したのち、無水塩化メチレン（１１ｍｌ）に溶解し、ＤＭＴｒ−Ｃｌ（３６９ｍｇ，１．０９ｍｍｏｌ）を加え、４時間室温で撹拌した。水（１ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣にクロロホルム（２０ｍｌ）、炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）、を加え抽出し、さらにクロロホルムで水層から抽出し有機層を集めた。硫酸ナトリウムを加え乾燥し、減圧下溶媒を留去した。溶出溶媒にピリジン（１％）を加えたシリカゲルカラムクロマトグラフィーを用いて精製し、標題化合物を粗生成物として得た。【００９２】
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【実施例２０】
【００９３】４’−Ｏ−（４，４’−Ｏ−ジメトキシトリチル）−４−Ｎ−ジメチルアミノエチレン−２’−Ｏ−メチル−５−（Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルピロール−２−イル）シチジン３’−（２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミダイト）（化合物２０）【００９４】
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【００９５】粗精製物の化合物１９（２００ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリルにより三回共沸脱水したのち、無水塩化メチレン（３ｍｌ）に溶解し、Ｎ，Ｎジイソプロピルアミン（２２μｌ，０．１６ｍｍｏｌ）、（２−シアノエトキシ）（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスフィン（１００μｇ，０．３１ｍｍｏｌ）、１Ｈ−テトラゾール（１１ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間撹拌した。水（１ｍｌ）を加えて反応を止め、減圧下溶媒を留去した。残渣にクロロホルム（１５ｍｌ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍｌ）、を加え抽出し、減圧下溶媒を留去した。残渣に０．２Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ）、ジイソプロピルエーテルとジエチルエーテル２：１の混合溶媒（１５ｍｌ）で抽出し、さらに０．２Ｎ水酸化ナトリウム（１５ｍｌ）で十回洗浄した。硫酸ナトリウムを加え乾燥し、減圧下溶媒を留去した。ＬＣ９０８を用いて精製し、二段階収率１１％で得た。（１２０ｍｇ，１１％）【００９６】
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【実施例２１】
【００９７】５−ピロリル−２’−デオキシウリジン、５−ピロリル−２’−デオキシシチジン、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルシチジンを含むオリゴＤＮＡもしくはオリゴ２’−Ｏ−メチルＲＮＡの合成【００９８】合成は、化合物５、８、１７、２０と市販のデオキシヌクレオシドホスホロアミダイトユニット、もしくは２’−Ｏ−メチルヌクレオシドホスホロアミダイトユニットと市販のＣＰＧ固相担体に結合したヌクレオシドを用い、ＡＢＩ３９２ＤＮＡ自動合成機を用い、標準的なプロトコールを用いて行った。合成終了後、末端のジメトキシトリチル基を脱保護後、０．８Ｍナトリウムメトキシド（メタノール溶液）に３時間固相担体をひたし、脱保護と切り出しを行った。合成したオリゴヌクレオチドは陰イオン交換ＨＰＬＣで精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析にて構造を確認した。５−ピロリル−２’−デオキシウリジン、５−ピロリル−２’−デオキシシチジンを含むオリゴＤＮＡの合成例を表１に示す。また、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルシチジンを含むオリゴ２’−Ｏ−メチルＲＮＡの合成例を表２に示す。表中でＣｐｙ、Ｕｐｙの各記号は対応する５−ピロリルウリジン誘導体ならびに、５−ピロリルシチジン誘導体を表わす。【００９９】
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【０１００】
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【実施例２２】
【０１０１】５−ピロリル−２’−デオキシウリジン、５−ピロリル−２’−デオキシシチジン、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルウリジン、５−ピロリル−２’−Ｏ−メチルシチジンを含むオリゴＤＮＡもしくはオリゴ２’−Ｏ−メチルＲＮＡの三重鎖結合核酸（ＴＦＯ）としての性能評価【０１０２】図１に示すヘアピンデュープレックスとＴＦＯとの結合実験を行い、その安定性をＵＶ熱融解曲線で評価した。ヘアピンデュープレックス（２  μＭ）と表３に示す適当なＴＦＯ（２μＭ）を１０ｍＭカコジル酸ナトリウム緩衝液（５００ｍＭ食塩および１０ｍＭの塩化マグネシウムを含む）に溶解した溶液を表３に示すｐＨに調整した。この溶液の摂氏５度から８０度まで昇温し、２６０ｎｍの吸光度を測定し、ＵＶ熱融解曲線を描いた。得られたＵＶ熱融解曲線の変曲点を融解温度とし、三重鎖の安定性を評価した。今回試験したＴＦＯはいずれもｐＨ６．０から７．４の領域で三重鎖を形成することが示された。【０１０３】
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【産業上の利用可能性】
【０１０４】  本発明の化合物は、プロトン化したシトシン塩基の水素結合様式を正確に模倣し、高い三重鎖形成能をもつ人工核酸の創成に寄与することができる。従って、アンチジーン法、蛍光プローブの作製、及び遺伝子診断等の広範囲な核酸応用技術に利用することができる。
【図１】
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【国際調査報告】
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