(57)【要約】本発明は、再吸収する生分解性医療用及び化粧品組成物の分野に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、前記ゲル担体が水性多糖ゲルの形態であり、前記ＰＴＭＣが１〜２００μｍの間の範囲の直径を有する微粒子の形態であり、前記微粒子が、前記微粒子全体を通じて均一な含有量及び密度を有し、本質的に丸く、滑らかな表面を有する、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項２】
ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、前記ゲル担体が水性多糖ゲルの形態であり、前記ＰＴＭＣが液体ポリマーの形態である、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項３】
前記ゲル担体がずり減粘の粘弾性特徴を含む、請求項１又は２に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項４】
前記ゲル担体が、セルロース誘導体多糖、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、疎水性修飾多糖、アルギン酸塩、カラギーナン、寒天、アガロース、多糖の分子内錯体、オリゴ糖及び大環状多糖からなる群から選択される多糖を含む、請求項１、２又は３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項５】
前記多糖ゲル担体が、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース及び酸化セルロースからなる群から選択されるセルロース誘導体多糖を含み、より好ましくは、前記再吸収性多糖ゲル担体がカルボキシメチルセルロースナトリウムを含む、請求項４に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項６】
前記ＰＴＭＣが、ホモポリマー、線状ポリマー、分枝ポリマー、コポリマー、ターポリマー、異なるタイプのホモ／コ／ターポリマーのブレンド若しくは複合体、又は架橋ポリマーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項７】
前記ＰＴＭＣが、約５００〜約６００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１００，０００〜約６００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項８】
前記ＰＴＭＣが、約１〜約４０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項９】
ゲル担体材料が、約０．２〜約２０重量パーセント（ｗ／ｗ）の濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１０】
室温で約５，０００〜約５，０００，０００ｍＰａ．ｓの粘度を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１１】
さらなる物質、好ましくは有効成分、好ましくは麻酔薬が存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１２】
医薬組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１３】
化粧品組成物又は審美的組成物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１４】
組織を、好ましくは軟組織を増大するための組成物であり、好ましくは皮内、真皮深層、真皮下又は皮下使用向けのインプラント又はフィラーである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１５】
好ましくは、皮膚異常若しくは奇形を治療するための、膀胱機能を制御するための、胃逆流を制御するための、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨疾患の治療のための、医薬としての使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物。
【請求項１６】
皮膚異常若しくは奇形を治療するための、膀胱機能を制御するための、胃逆流を制御するための、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨疾患の治療のための、医薬の調製のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用。
【請求項１７】
皮膚異常若しくは奇形の治療のための、膀胱機能を制御するための、胃逆流を制御するための、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨疾患の治療のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用。
【請求項１８】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を投与するステップを含む、皮膚異常若しくは奇形を治療する、膀胱機能を制御する、胃逆流を制御する、勃起不全及び／若しくは早漏を治療する、声帯を治療する、並びに／又は関節及び軟骨疾患を治療する、方法。
【請求項１９】
化粧品適用又は審美的適用、好ましくは組織増大のための適用、より好ましくは皮膚用インプラント又は皮膚用フィラーとしての適用における、請求項１３又は１４に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、再吸収する生分解性医療用及び化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢に伴い及び／又はある特定の疾患の結果として、筋肉、皮膚及び脂肪を含む身体の軟組織は低減することもあり、したがって、外観に影響を及ぼすこともあり及び／又は機能を低下させることもある。例えば、膀胱機能や胃逆流の制御などの、多くの身体の自律神経機能を制御する括約筋は、年齢及び疾患とともに低減する。いくつかの医療用及び化粧品フィラー化合物（組織増大化合物又は組織矯正化合物とも呼ばれる）がすでに開発されている。注射用牛コラーゲンなどの動物起源のフィラーは、主にアレルギーのリスク及びクロイツフェルトヤコブ病などの疾患の脅威に関連するいくつかの欠点を有する。注射用ウシコラーゲンの代替物として、ポリマー乳酸及び／又はグリコール酸の反復単位からできている粒子の懸濁液又は乳液を含む他のフィラーインプラント（米国特許出願公開第２００３／０９３１５７号及び国際公開第９８／５６４３１号）が開発されている。その他のフィラーは、例えばポリ−ε−カプロラクトン（ＰＣＬ）（国際公開第２００９／０１４４４１号）又はヒアルロン酸（ＨＡ）（Ｗａｎｇら、２００７）をベースとする。効果的で長期永続の皮膚用フィラーの重要な特徴は、コラーゲンの、好ましくはＩＩＩ型コラーゲンの、加えて好ましくは最終的にＩ型コラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成をもたらすという程度で、当該フィラーによって異物反応が誘導されることである。実際、理論に束縛されるものではないが、長期永続の皮膚用フィラーへの理想的な異物反応とは、製品の再吸収に加えて、コラーゲンの、好ましくはＩＩＩ型コラーゲンの、またより好ましくは且つ最終的にＩ型コラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に限定される；コラーゲンの形成は、正常な異物反応と組織の再編成及び治癒との結果であることが求められる。フィラー及び／又はその任意の化合物への異物反応が強すぎると、重度の炎症、小結節の形成、及びその他の望ましくない効果がもたらされるおそれがある。
【０００３】
先行技術のフィラーはいくつかの欠点を有する。架橋されていない線状ＨＡは数日又は数週間以内に通常には再吸収されることから、架橋されていない線状ＨＡのｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収はかなり急速である。再吸収時間を増やすために、ＨＡには化学架橋が必要である。しかし、化学的架橋剤は有毒の場合があり、組織増大に使用される注射された架橋ＨＡには残留架橋剤の量が存在する。加えて、ＨＡが分解すると、炎症反応を誘導及び／又は増強するおそれのある酸性産物の形成がもたらされる。重要なことに、製品の完全な再吸収後にボリュームロスを補うことになる任意の型のコラーゲンの有意な量に関してｄｅ  ｎｏｖｏ合成及び産生がＨＡフィラーによって刺激され、したがって、フィラーの持続的な長期永続の効果が実現するという証拠はない。
【０００４】
一研究（Ｗａｎｇら、２００７）では、架橋ＨＡ自体はコラーゲン産生を誘導しないことが確認されている。光損傷を受けた前腕の皮膚に注射した後、小さなコラーゲン沈着物がＨＡフィラーを囲んでいるのが観察されたが、これは、製品の注射の結果として、皮膚線維芽細胞の機械的伸張に起因するものであり、ＨＡ製品又はその任意の成分に起因するものではない、と考えられる。
【０００５】
ＰＣＬ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ｌ−乳）酸（ＰＬＬＡ）などの合成ポリマーで作製した皮膚用フィラーも欠点を有する。まず最初に、これらのポリマーはバルク侵食を通して本質的に分解され、ＨＡと同様に、その分解によって酸性産物の避けがたい形成がもたらされる。さらに、こういったポリマーは構造が半結晶であり、すなわち、アモルファス領域と結晶領域の両方を含有し、結晶領域に先立ちポリマーのアモルファス領域が分解する。結果として、周囲の組織に（分解時に）残っている結晶粒子によって製品の生体適合性プロファイルが変化する可能性がある。その形態と形状は組織を後で刺激し、炎症を引き起こすおそれがある。例えば、ＰＬＬＡの場合、当初のインプラント部位の近くに、高結晶性の安定した粒子が分解時に形成したことが見いだされたが、これは、術後３年の患者の皮下腫脹に関連していると思われる。したがって、組織増大向けの完全にアモルファスの又は非結晶性の化合物が好ましい。
【０００６】
したがって、本質的に表面侵食のメカニズムを通して再吸収され；化学毒性化合物による架橋が不要であり；酸性副産物を放出しないプロセスによって再吸収される、改良された合成フィラーに対する強い要望がある；改良された合成フィラーは、調整可能な再吸収時間を有し、重要なことに、望ましくない副作用なしに、コラーゲンの、好ましくはＩＩＩ型の、またより好ましくは且つ最終的にＩ型のｄｅ  ｎｏｖｏ合成を伴う、適当な異物反応を誘導することが好ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、ゲル担体が水性ゲルの形態であり、ＰＴＭＣが１〜２００μｍの間の範囲の直径を有する微粒子の形態である、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を提供する。
【０００８】
本発明は、ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、ゲル担体が好ましくは水性ゲルの形態である、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物をさらに提供する。
【０００９】
本発明は、皮膚異常若しくは奇形を治療するための、膀胱機能を制御するための、胃逆流を制御するための、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨疾患の治療のための、医薬の調製のための、本発明に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用をさらに提供する。
【００１０】
本発明は、皮膚異常若しくは奇形の治療のための、膀胱機能を制御するための、胃逆流を制御するための、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨疾患の治療のための、本発明に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用をさらに提供する。
【００１１】
本発明は、本発明に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を投与するステップを含む、皮膚異常若しくは奇形を治療する、膀胱機能を制御する、胃逆流を制御する、勃起不全及び／若しくは早漏を治療する、声帯を治療する、並びに／又は関節及び軟骨疾患を治療する、方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、化粧品適用又は審美的適用、好ましくは組織増大のための適用、より好ましくは皮膚用インプラント又は皮膚用フィラーとしての適用における、本発明に記載のｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物の使用をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】コラーゲンの組織形態計測評価を示す図である；標準化された関心領域の位置の代表的な顕微鏡写真が示されている（ピクロシリウスレッド染色切片）。
【図２】ウサギにおいて皮下移植して４週後及び１２週後の移植領域内の全コラーゲン含有量の百分率を示す図である。技術的な理由により、試験品１及びＨＡ対照薬２について１２週での定量化は行わなかった。
【図３】ウサギにおいて皮下移植して４週後（Ａ）及び１２週後（Ｂ）の試験品と、ウサギにおいて皮下移植して４週後（Ｃ）及び１２週後（Ｄ）のＨＡベースの対照薬製品との代表的な顕微鏡写真を示す図である。組織切片の染色にはピクロシリウスレッドを使用した。Ｍ：皮筋；Ｔ：試験品；ＨＡ：ＨＡベースの対照薬。
【図４】ウサギにおいて皮下移植して４週後及び１２週後の移植領域内のコラーゲンリモデリングインデックスの定量化を示す図である。低い、１に近い、ＣＲＩ値は、成熟度の上昇及び進行中の組織化及びコラーゲン線維ＩＩＩ型のＩ型へのリモデリングを表す。
【図５】試験品を用いてウサギにおいて皮下移植して４週後（Ａ）及び１２週後（Ｂ）のコラーゲン成熟度の評価の代表的な顕微鏡写真を示す図である。ピクロシリウスレッド切片を偏光下で分析した。コラーゲンの色は、緑から赤みがかったオレンジへ成熟度及び線維の太さの上昇を表す。
【図６】試験品４（ゲル担体のみ）の分解を示す図である−ウサギにおいて皮下移植して４週後及び１２週後の総表面積を決定した。
【図７】ウサギにおいて皮下移植して４週後（Ａ）及び１２週後（Ｂ）の試験品４（ゲル担体）の代表的な顕微鏡写真を示す図である。組織切片の染色には、サフラニン−ヘマトキシリン−エオシンを使用した。ゲル担体の完全な分解が、移植の４週間後に観察される。Ｍ：皮筋。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに必要な特徴すべてを有する化合物に到達した、前記化合物はポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）である。ＨＡと比較すると、ＰＴＭＣによって、すでに４週間後に観察されるように、コラーゲンの刺激及び合成の改善がもたらされ（下の本明細書の実施例を参照）、長期の永続効果が生み出される。他の合成フィラーからみて、ＰＴＭＣは、再吸収中に酵素的に分解されるアモルファスの非結晶性の化合物である。その結果、ＰＴＭＣの再吸収には、酸性産物を形成しない表面侵食の分解挙動が関与する。
【００１５】
ＰＴＭＣ及びトリメチレンカーボネート（ＴＭＣ）ベースのポリマーは、いくつかの生物医学適用においてこのポリマーを使用する可能性について幅広く調査されている。例えば、生体再吸収性整形外科用デバイス及びその他の組織補強インプラント、腹部抗接着性バリア、骨組織工学又は神経誘導再生用の足場、心臓血管適用向けのステントコーティング及び移植片の調製においてＰＴＭＣが使用されている。これらの適用では、ＰＴＭＣは、ＰＧＡ及びＰＥＧ又はＰＧＡ単独などの他の合成生体再吸収性ポリマーと多くの場合ブレンドされているか、又はＴＭＣモノマーは生体再吸収性ポリマーの相応するモノマーと共重合されている。Ｇｕｉら（２０１０）は、例えば、ＰＧＡで主に構成される血管組織工学用の生分解性ポリマー足場の開発に関するものであり、この場合、ＰＴＭＣ及びＰＥＧを添加して、分解挙動を調節した。Ｇｕｉらでの適用は皮内、真皮又は皮下適用ではなく、重要なことに、すでに４週後はもちろんのこと、ＰＴＭＣがコラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を誘導できるという示唆はない。加えて、Ｇｕｉらのコポリマーは、再吸収中に酸の産生をもたらす、半結晶性ＰＧＡポリマーを含んでいる。Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅら（２００９）は、軟骨組織工学における軟骨形成細胞の増殖向けの生体再吸収性足場に関するもので、この場合、ＰＴＭＣが添加された基本ポリマーとしてＰＧＡが使用された。これは皮内、真皮又は皮下適用ではなく、すでに４週後はもちろんのこと、ＰＴＭＣがコラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を誘導できるという示唆はない。加えて、Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅらのコポリマーは、再吸収中に酸の産生をもたらす、半結晶性ＰＧＡを含んでいる。Ｂａｔら（２０１０）は、皮下移植後のＰＴＭＣ、ＰＣＬ及びコポリマーフィルムのｉｎ  ｖｉｖｏ分解の調査に関するものである。重要なことに、すでに４週後はもちろんのこと、ＰＴＭＣがコラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成を誘導できるという証拠は見いだされなかった。
【００１６】
したがって、本発明は、ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、ゲル担体が水性ゲルの形態である、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を提供する。本発明に記載のゲル担体は、当業者に公知の適切な任意のゲル担体であってもよく、天然又は合成の担体であってもよい。前記組成物は、本明細書では本発明に記載の組成物と呼ぶ。再吸収性及びその同義語の生分解性という用語は、本明細書では、当分野で知られているその意味を有し、本発明に記載の組成物はｉｎ  ｖｉｖｏで、すなわち脊椎動物、好ましくは哺乳動物の体内で分解されることを典型的には意味する。本発明に記載の組成物の生分解性及び再吸収性という用語は、ＰＴＭＣがゲル担体よりも長いｉｎ  ｖｉｖｏの生分解性時間及び再吸収性時間（再吸収する時間）を典型的には有するので、ＰＴＭＣからみて解釈されるのが好ましい。
【００１７】
再吸収性ゲル担体が、ずり減粘の粘弾性特徴を含むのが好ましい。したがって、本発明に記載の組成物が、ずり減粘の粘弾性特徴を含むのが好ましい。本明細書でのずり減粘というレオロジー用語は、当分野で知られているその意味を有し、粘度がせん断歪みの下で減少する流体の非ニュートン挙動を典型的には意味する。本明細書では、せん断歪みとは、要素に垂直である通常の歪みとは対照的に、要素に平行である歪みと定義される。
【００１８】
ゲル担体が多糖ゲル担体であり、セルロース誘導体多糖、デンプン、キチン、キトサン、ヒアルロン酸、疎水性修飾多糖、アルギン酸塩、カラギーナン、寒天、アガロース、多糖の分子内錯体、オリゴ糖、大環状多糖及びそれらの混合物からなる群から選択される多糖（増粘剤とも呼ばれる）を含むか、又はそれで構成されるのが好ましい。多糖ゲル担体が、好ましくは、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、寒天メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロース、酸化セルロース及びそれらの混合物からなる群から選択されるセルロース誘導体多糖を含むか、又はそれで構成されるのがより好ましい；再吸収性多糖ゲル担体が、カルボキシメチルセルロースナトリウムを含むか、又はそれから構成されるのが、さらにより好ましい。当業者であれば、他の薬剤がゲル担体に存在してもよいことを理解するであろう、例えば、限定されないが、（ｉ）ソルビトール、マンニトール及びフルクトースからなる群から例えば選択し得る密度増強剤；他の適切な密度剤も使用可能である、（ｉｉ）ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０、４０、６０、又は８０）などの等張化湿潤剤；他の適切な張性湿潤化剤も使用可能である。本発明に記載の再吸収性ゲル担体は、様々な量の密度増強剤及び／又は等張湿潤化増強剤を含んでもよい。
【００１９】
本発明に記載の組成物は、滅菌懸濁液の形態で容器に貯蔵することができる。容器は、即時使用の充填済みシリンジであるのが好ましい。組成物は、一実施形態では、凍結乾燥し、注射用調製物向けに用事に再構成することができる。或いは、容器は、バイアルでもよい。ここでもまた、シリンジの場合のように、バイアルも、即時に使用される本発明よる組成物を含有することができる。シリンジで又はバイアルでゲルを用事に再構成するのに使用される水は、蒸留水、再蒸留水、無菌水又はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）とすることができる。したがって、本発明はまた、本発明に記載の組成物を含む容器、好ましくは即時使用のシリンジも提供する。
【００２０】
本発明に記載の再吸収性ゲル担体は、凍結保護剤及び緩衝剤からなる群から選択される成分をさらに含むことができる。凍結保護剤は、冷却中に生物学的組織中で有害な氷結晶の形成を阻止又は低減する化学物質である。適切な凍結保護剤には、限定はされないが、ｄ−マンニトール、乳糖、蔗糖、フルクトース、ソルビトール及びデキストランなどの糖類及び炭水化物が含まれ、ｄ−マンニトールが好ましい。ゲルの担体中の凍結保護剤濃度は、意図した適用及び選択した凍結保護剤の素性によって異なってもよい。緩衝剤とは、希釈又は酸若しくは塩基の少量添加のいずれかの結果としてのｐＨ変化に、ある溶液が抗することを可能にする、当該溶液に添加される化学化合物（単数）又は化合物群（複数）である。効果的な緩衝系は、多量の及びほぼ同濃度の共役酸−塩基対（又は緩衝剤）を含有する溶液を用いる。本明細書中で用いられる緩衝剤は、限定はされないが、リン酸塩及びクエン酸塩の塩（共役酸及び／又は塩基）を含めて、薬学的に許容されるかかる任意の化学化合物（複数可）とすることができる。再吸収性多糖ゲル担体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含むのが好ましい。
【００２１】
本発明に記載の組成物では、ＰＴＭＣは、当業者に公知の任意のＰＴＭＣとすることができる。ＰＴＭＣが、ホモポリマー、線状ポリマー、分枝ポリマー、コポリマー、ターポリマー、異なるタイプのホモ／コ／ターポリマーのブレンド若しくは複合体、又は架橋ポリマーであるのが好ましい。ＰＴＭＣを含む本発明に記載のポリマーのブレンドは、ＰＣＬ、ＰＧＡ、ＰＬＬＡ、ＰＥＧ、ＰＶＡ及びＰＶＰからなる群から選択されるポリマーをさらに含むのが好ましい。架橋は、限定されないが、化学的架橋、熱的架橋及び放射線による架橋などの、当業者に公知の任意の方法を用いて行うことができる；架橋に使用される化学物質は毒性の場合もあるので、非化学的架橋が好ましい（例えば、化学架橋剤をなんら添加せずに放射線により又は熱により架橋する）。ＰＴＭＣが、５００〜＞５００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは５００〜６００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは５００〜５００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは１００，０００〜３５０，０００ｇ／ｍｏｌ又は５０，０００〜６００，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば、５０，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１６５，０００、１８５，０００，２００，０００、２２５，０００、２５０，０００、２６５，０００、２８５，０００、３００，０００、３２５，０００、３５０，０００、３６５，０００、３８５，０００、４００，０００、４２５，００、４５０，０００、４６５，０００、４８５，０００、４９０，０００、５００，０００、５２５，０００、５５０，０００、５６５，０００、５８５，０００及び６００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するのが好ましい。例えば１００，０００〜２００，０００ｇ／ｍｏｌの間の低分子量、２００，０００〜３００，０００ｇ／ｍｏｌの中分子量、３００，０００及び６００，０００ｇ／ｍｏｌの高分子量の数平均分子量（Ｍｎ）の範囲もまた好ましい。当業者であれば、ポリマーの数平均分子量（Ｍｎ）は、典型的に記載されている数値のように正確ではないことを理解するであろう；したがって、Ｍｎの数値は、「約」数平均分子量（Ｍｎ）、すなわち、値±１０％と解釈することができる。したがって、ＰＴＭＣは、約５００〜＞約５００，０００ｇ／ｍｏｌ、好ましくは約５００〜約６００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約５００〜約５００，０００ｇ／ｍｏｌ、より好ましくは約１００，０００〜約３５０，０００ｇ／ｍｏｌ又は約５０，０００〜約６００，０００ｇ／ｍｏｌ、例えば、約５０，０００、約１００，０００、約１２５，０００、約１５０，０００、約１６５，０００、約１８５，０００，約２００，０００、約２２５，０００、約２５０，０００、約２６５，０００、約２８５，０００、約３００，０００、約３２５，０００、約３５０，０００、約３６５，０００、約３８５，０００、約４００，０００、約４２５，０００、約４５０，０００、約４６５，０００、約４８５，０００、約４９０，０００、約５００，０００、約５２５，０００、約５５０，０００、約５６５，０００、約５８５，０００及び約６００，０００ｇ／ｍｏｌの数平均分子量（Ｍｎ）を有するのが好ましい。例えば約１００，０００〜約２００，０���０ｇ／ｍｏｌの間の低分子量、約２００，０００〜約３００，０００ｇ／ｍｏｌの中分子量、約３００，０００及び約６００，０００ｇ／ｍｏｌの高分子量の数平均分子量（Ｍｎ）の範囲もまた好ましい。全合成ポリマーからみてＰＴＭＣの量は、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％であるのが好ましい。全合成ポリマーからみてＰＴＭＣの量は１００％であるのが最も好ましい。
【００２２】
本発明に記載の組成物では、ＰＴＭＣは、当業者に公知の任意の形態とすることができる。ＰＴＭＣは、ナノ粒子及び微粒子などの粒子の形態；好ましくは、微粒子（「ミクロスフェア」とも呼ばれる）の形態、であるのが好ましい。そのようなＰＴＭＣ粒子は、ＰＴＭＣ、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は少なくとも９５％を含むのが好ましい。ＰＴＭＣ粒子は本質的にＰＴＭＣからなるか、１００％ＰＴＭＣからなるのが最も好ましい。
【００２３】
本発明に記載の微粒子は、以下の特徴のうちの少なくとも１つを有するのが好ましい：
ｉ）０．１〜５００μｍの間の、好ましくは１〜２００μｍの間の、より好ましくは５〜２００μｍの間の、より好ましくは２０〜２００μｍの間の、さらにより好ましくは２０〜１５０μｍの間の、さらにより好ましくは３０〜９０μｍの間の、さらにより好ましくは２５〜７５μｍの間の、さらにより好ましくは３８〜７５μｍの間の、さらにより好ましくは２５〜５０μｍの範囲の直径。より好ましい直径範囲は、３２〜４８μｍの間の範囲の直径などの、４０μｍ±１０％又は±２０％である。
ｉｉ）好ましくは微粒子全体を通じて、均一な密度、形状及び含有量、
ｉｉｉ）球形状（本質的に円形）及び表面の滑らかさ、並びに
ｉｖ）本質的に球形のミクロスフェア。
【００２４】
かかる微粒子が、微粒子全体を通じて均一な含有量及び密度を有し、本質的に丸く、滑らかな表面を有する。
【００２５】
他の実施形態と組み合わせることができる一実施形態では、本発明は、ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、ゲル担体が水性多糖ゲルの形態であり、ＰＴＭＣが１〜２００μｍの間の範囲の直径を有する微粒子の形態であり、微粒子が、微粒子全体を通じて均一な含有量及び密度を有し、本質的に丸く、滑らかな表面を有する、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を提供する。かかる微粒子が、５〜２００μｍの間の、より好ましくは２０〜２００μｍの間の、さらにより好ましくは２０〜１５０μｍの間の、さらにより好ましくは２５〜１５０μｍの間の、さらにより好ましくは３０〜９０μｍの間の、さらにより好ましくは２５〜７５μｍの間の、さらにより好ましくは３８〜７５μｍの間の、さらにより好ましくは２５〜５０μｍの範囲の直径を有することができる。より好ましい直径範囲は、３２〜４８μｍの間の範囲の直径などの、４０μｍ±１０％又は±２０％である。微粒子の形態は、例えば、光学顕微鏡使用して又は走査電子顕微鏡を使用して（Ｉｏｏｓｓら、２００１、参照により本明細書に組み込まれる）、当技術分野で知られている方法を用いて評価することができる。
【００２６】
他の実施形態と組み合わせることができる一実施形態では、本発明は、ポリ（１，３−トリメチレンカーボネート）ポリマー（ＰＴＭＣ）及び再吸収性ゲル担体を含むｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物であって、ゲル担体が水性多糖ゲルの形態であり、ＰＴＭＣが液体ポリマーの形態である、ｉｎ  ｖｉｖｏ再吸収性組成物を提供する。
【００２７】
微粒子は、例えば、Ｉｏｏｓｓら（２００１）及びＣｈｅｎら（２０００）に開示の方法などの、当技術分野で知られている方法を用いて製造することができる。ＰＴＭＣは、ジクロロメタン（ＤＣＭ）などの有機溶媒に溶かすことができる。微粒子の形成後、Ｉｏｏｓｓらの方法などにより、有機溶媒中のＰＴＭＣを界面活性剤を含む水性液体と混合することにより、有機溶媒を抽出蒸発により除去することができる。本発明に記載のＰＴＭＣ及び／又は微粒子は、本明細書で上記のように、当業者に公知の方法を用いて、製造中又は製造後に架橋することができる。
【００２８】
本発明に記載の組成物は、意図する適用に応じて、様々な量のＰＴＭＣ、好ましくは微粒子を含むことができる。本発明に記載の組成物では、ＰＴＭＣ（微粒子）が、約１〜約４０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのが好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が、約１０〜約３０体積パーセント（ｖ／ｖ）又は１０〜３０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのがさらにより好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が、約１０〜約４０体積パーセント（ｖ／ｖ）、約２０〜約４０体積パーセント（ｖ／ｖ）、又は約３０〜約４０体積パーセントの濃度で存在するのがさらにより好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が約３０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのがさらにより好ましい。
【００２９】
本発明に記載の組成物では、ＰＴＭＣ（微粒子）が、１〜４０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのが好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が、１０〜３０体積パーセント（ｖ／ｖ）又は１０〜３０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのがさらにより好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が、１０〜４０体積パーセント（ｖ／ｖ）、２０〜４０体積パーセント（ｖ／ｖ）、又は３０〜４０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのがさらにより好ましい。ＰＴＭＣ（微粒子）が３０体積パーセント（ｖ／ｖ）の濃度で存在するのがさらにより好ましい。
【００３０】
本発明に記載の組成物では、ゲル担体材料が、約０．２〜約２０重量パーセント（ｗ／ｗ）の濃度で存在する。ゲル担体材料が、０．２〜２０重量パーセントの濃度で存在するのがより好ましい。ゲル担体材料が、約１〜約５重量パーセントの濃度で存在するのがさらにより好ましい；ゲル担体材料が、１〜５重量パーセントの濃度で存在するのがさらにより好ましい。ゲル担体材料、少なくとも約０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５重量パーセントが存在し、最大で約２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４．９、４．８、４．７、４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、４．１、４．０、３．９、３．８、３．７、３．６、３．５、３．４、３．３、３．２、３．１、３．０、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３重量パーセントが存在するのが好ましい。ゲル担体材料、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９又は５重量パーセントが存在し、最大で２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４．８、４．６、４．４、４．２、４．０、３．８、３．６、３．４、３．２、３．０、２．８、２．６、２．４、２．２、２．０、１．８、１．６、１．４、１．２、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、又は０．３重量パーセントが存在するのがより好ましい。ゲル担体材料の好ましい範囲は約０．２〜約８重量パーセントであり、より好ましい範囲は約０．４〜約７重量パーセントであり、より好ましい範囲は約０．５〜約６重量パーセントであり、より好ましい範囲は約０．６〜約５重量パーセントであり、より好ましい範囲は約１〜約５重量パーセントである。ゲル担体の再吸収性多糖の好ましい範囲は０．２〜８重量パーセントであり、より好ましい範囲は０．４〜７重量パーセントであり、より好ましい範囲は０．５〜６重量パーセントであり、より好ましい範囲は０．６〜５重量パーセントであり、より好ましい範囲は１〜５重量パーセントである。ゲル担体の好ましい範囲は０．８〜５重量パーセントであり、より好ましい範囲は１〜４重量パーセントであり、より好ましい範囲は１．８〜４重量パーセントであり、より好ましい範囲は２〜４重量パーセントであり、より好ましい範囲は３〜４重量パーセントであり、より好ましい範囲は３．５〜４重量パーセントである。
【００３１】
本発明に記載の組成物が、室温で約５，０００〜約５，０００，０００ｍＰａ．ｓの粘度を有するのが好ましい。粘度は、大気条件下及び摂氏２０度である室温で測定することが好ましく、１ＲＰＭの回転速度が適用される場合、適切なトルク（通常５０〜７５％）を発生するように、適切なスピンドル（例えばＬＶ又はＴ−バーシリーズ）を備えた回転式粘度計（例えば、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ  Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ  ＤＶ２Ｔ）で測定を行うことが好ましい。
【００３２】
本発明に記載の組成物では、さらなる化合物、好ましくは活性化合物、好ましくは麻酔薬が存在してもよい。例示的な麻酔薬には、限定されないが、リドカイン、ノボカイン、ベンゾカイン、プリロカイン、リピバカイン、及びプロポフォールが含まれる。本発明に記載の組成物で用いることができる他の医薬には、ペプチド、組織再生剤、抗生物質、ステロイド、フィブロネクチン、サイトカイン、増殖因子、鎮痛剤、防腐剤、アルファ、ベータ、又はガンマ−インターフェロン、エリスロポエチン、グルカゴン、カルシトニン、ヘパリン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、フィルグラスチム、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、ペプチド、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、黄体形成ホルモン、心房性ナトリウム利尿因子、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、ＲＮＡ、抗体、化学療法剤、卵胞刺激ホルモン及びそれらの組み合わせ、が含まれる。さらなる化合物はまた賦形剤とすることができ、かかる賦形剤は医薬品等級であるのが好ましい。好ましい賦形剤はグリセロールである。グリセロールは組成物をより潤滑にするであろう。グリセロールは約０．０５〜約５重量パーセント（ｗ／ｗ）の濃度で存在するのが好ましい。グリセロールは、約０．１〜約４重量パーセントの濃度で、より好ましくは約０．２〜約２重量パーセントの濃度で存在するのがより好ましい。グリセロールは０．０５〜５重量パーセント（ｗ／ｗ）の濃度で存在するのが好ましい。グリセロールは、０．１〜４重量パーセントの濃度で、より好ましくは０．２〜２重量パーセントの濃度で存在するのがより好ましい。
【００３３】
本発明に記載の組成物のすべての化合物は生体適合性であるのが好ましい。再吸収性ゲル担体（好ましくは水性ゲル）を含み、水性組成物である本発明に記載の組成物は、生理的ｐＨで、すなわち約ｐＨ７．４で組成物を維持するように緩衝化されているのが好ましい。当業者であれば、溶液を緩衝する方法を知っており、適当な緩衝化合物を選択するであろう。緩衝化合物は、限定されないが、リン酸塩及び／又はクエン酸塩とすることができる。
【００３４】
本発明に記載の組成物は医薬組成物であり、このことは、すべての化合物及び組み合わせ全体（すなわち組成物）が医薬品等級であることを意味するのが好ましい。
【００３５】
或いは、又は前述のものとともに、本発明に記載の組成物は化粧品組成物又は審美的組成物である。これは、組成物が、医薬品グレードであることを排除するものではないが、化粧用の使用又は審美的使用に（も）適切であることを意味する。
【００３６】
本発明に記載の組成物は、組織を、好ましくは、腱、靭帯、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪、及び滑膜のような結合組織などの軟組織を増大するのに、好ましくは皮内、真皮深層、真皮下又は皮下使用向けのインプラント又はフィラーに、適している。
【００３７】
本発明は、本発明に記載の組成物の医学的使用をさらに提供する。したがって、本発明は、好ましくは、皮膚異常若しくは奇形を治療するための、膀胱機能を制御するための（尿道括約筋不全の治療）、胃逆流を制御するための（幽門括約筋不全の治療）、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、先天性異常を治療するための、歯科治療にあたって歯茎を埋めるための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨の潤滑のための（変形性関節症の治療）、医薬としての使用のための、本発明に記載の組成物を提供する。本発明は、皮膚異常若しくは奇形を治療するための、膀胱機能を制御するための（尿道括約筋不全の治療）、胃逆流を制御するための（幽門括約筋不全の治療）、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、先天性異常を治療するための、歯科治療にあたって歯茎を埋めるための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨の潤滑のための（変形性関節症の治療）、医薬の調製のための、本発明に記載の組成物の使用をさらに提供する。本発明は、皮膚異常若しくは奇形の治療のための、膀胱機能を制御するための（尿道括約筋不全の治療）、胃逆流を制御するための（幽門括約筋不全の治療）、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、先天性異常を治療するための、歯科治療にあたって歯茎を埋めるための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨の潤滑のための（変形性関節症の治療）、本発明に記載の組成物の使用をさらに提供する。本発明は、本発明に記載の組成物を対象に、好ましくは哺乳動物に、好ましくはヒトに投与するステップを含む、皮膚異常若しくは奇形を治療する、膀胱機能を制御するための（尿道括約筋不全の治療）、胃逆流を制御するための（幽門括約筋不全の治療）、勃起不全及び／若しくは早漏を治療するための、先天性異常を治療するための、歯科治療にあたって歯茎を埋めるための、声帯を治療するための、並びに／又は関節及び軟骨の潤滑のための（変形性関節症の治療）、方法をさらに提供する。本発明による組成物のさらなる医学的使用は、軟骨の置換、補強、潤滑、及び／又は再生である。
【００３８】
一実施形態では、本発明に記載の組成物は、尿失禁（膀胱機能の制御）などの種々の括約筋不全を治療するためのインプラント又はフィラーとして使用される。膀胱制御の喪失は、身体の動き（咳、くしゃみ、運動）及び／又は睡眠を含めて予期せぬ時での大量の切迫若しくは漏出によるストレスに起因する可能性がある。すべての種類の失禁は、患者の年齢に関係なく本発明に記載の組成物を使用して治療することができる。排泄抑制能力は、２つの構成要素：（ｉ）膀胱頚部の不随意の平滑筋；及び（ｉｉ）外括約筋の随意の骨格筋、を有する弾性のある貯蔵器及び括約筋の効率に依存する。したがって、本発明に記載の組成物を加えて括約筋又は尿道への圧迫を局所化することができ、それによって、本発明に記載の組成物の１回又は複数の注射により管腔サイズを縮小させ、したがって尿ストレス性失禁を実質的に低減又は排除する。これらの場合では、本発明に記載の組成物を、尿道又は尿道周囲組織への注射により挿入することができる。したがって、典型的な手順は、本発明に記載の組成物を、膀胱鏡の助けを借りて膀胱の頚部周囲の組織に注射して組織バルクの増加を作り出し、続いて尿道管腔を接合するステップを含む。本発明に記載の組成物は、バルクを加え、尿道を閉鎖してストレス性失禁を低減するのに有用である。注射は、通常には最適な結果を得るために定期的に繰り返してもよい。
【００３９】
一実施形態では、本発明に記載の組成物は、胃逆流を制御するためのフィラーとして又はインプラントとして使用される（幽門括約筋の不全を治療するため）。胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）は、胃の胃酸及び他の内容物の、食道又は横隔膜への逆流を伴う。逆流の発作の７０％が、下部の食道括約筋の自発的な弛緩の間に、又は嚥下後の長時間の弛緩に起因して生じる。３０％が低括約筋圧期中に生じる。主な症状は胸焼けである（食後３０〜６０分）。ＧＥＲＤの非定型症状発現には：喘息；慢性のせき；喉頭炎；咽頭痛；及び非心臓性関連胸痛が含まれる。ＧＥＲＤは生活様式の修正並びに医療介入が必要である一生の疾患である。したがって、本発明に記載の組成物を、バルクを加え、下部食道括約筋への圧迫を局在化するために注射することができる。したがって、典型的な手順は、本発明に記載の組成物を、内視鏡の助けを借りて下部の食道括約筋の周囲の組織に注射して、組織バルクの増加を作り出し、続いて接合し、括約筋圧を正常化するステップを含む。本発明に記載の組成物は、バルクを加え、括約筋を閉鎖して逆流を減らすのに有用である。注射は、通常には最適な結果を得るために毎年繰り返してもよい。本発明に記載の組成物は、局所麻酔を使用して注射してもよい。
【００４０】
一実施形態では、本発明に記載の組成物は、すべての年齢の男性に影響を及ぼし得る勃起不全（ＥＤ）を治療するためのフィラーとして又はインプラントとして使用される。本発明に記載の組成物をＥＤを治療するために使用することができる。典型的な手順は、本発明に記載の組成物を、陰茎海綿体の長さ全体にわたって直接に深筋膜に注射するステップを含む。
【００４１】
一実施形態では、本発明に記載の組成物は、声帯を治療するためのフィラーとして又はインプラントとして使用される。本発明に記載の組成物を、声帯の軟組織塊の形状を変化させることによる咽頭音源（ｌａｒｙｎｇｅａｌ  ｖｏｉｃｅ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）の声帯内注入向けに、使用することができる。
【００４２】
本発明は、化粧品適用、好ましくは組織増大のための適用、より好ましくは皮膚用インプラント又は皮膚用フィラーとしての適用における、本発明に記載の組成物の使用をさらに提供する。
【００４３】
本文書及びその特許請求の範囲では、「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用形は、この単語に続く項目を含むが、具体的に言及されていない項目を排除しないということを意味するように、その非限定的な意味で使用されている。加えて、不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」による要素への言及は、文脈上、要素のうちの１つ及び１つだけであることを明確に要求していない限り、その要素のうちの２つ以上が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を通常には意味する。
【００４４】
「約」又は「ほぼ」という単語は、数値に関連して使用される場合（例えば約１０）、その値が、その値のさらに１０％大きい又はさらに１０％小さい（１０の）任意の値とすることができることを意味するのが好ましい。
【００４５】
本明細書中で引用されるすべての特許及び参照文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本発明について、いくつかの例示的な実施形態を参照して上で説明してきた。一部の部分又は要素の変更及び代替実装が可能であり、これらは特許請求の範囲で定義されている保護範囲に含まれる。
【００４７】
本発明を、以下の実施例によってさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４８】
参考文献
Wang et al (2007); Arch Dermatol Vol 143,155-163; In Vivo Stimulation of De Novo Collagen Production Caused byCross-linked Hyaluronic Acid Dermal Filler Injections in Photodamaged HumanSkin.
Gui et al (2010); Tissue Engineering: PartA, Volume 17, Numbers 9 and 10, 1191-1200; Development of Novel BiodegradablePolymer Scaffolds for Vascular Tissue Engineering.
Mukherjee et al (2010); Journal ofBiomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 92-102 Effect of3D-Microstructure of Bioabsorbable PGA:TMC Scaffolds on the Growth ofChondrogenic Cells.
Bat et al (2010); Journal of BiomedicalMaterials Research A | 1 DEC 2010 VOL 95A, ISSUE 3, 940-949.
Iooss et al (2001); Biomaterials 22,2785-2794; A new injectable bone substitute combining polyts-caprolactone)microparticles with biphasic calcium phosphate granules.
Chen et al (2000); Polymer degradation andStability 67, 455-459; Polycaprolactone Microparticles and theirBiodegradation.
Suvarna KS et al (2018); Bancroft's Theoryand Practice of Histological Techniques, 8th ed by Kim S Suvarna, ChristopherLayton and John D. Bancroft.
Junqueira LC at al (1979); Histochem J1979, 11(4):447-55; Picrosirius staining plus polarization microscopy, aspecific method for collagen detection in tissue sections.
Alves A et al (2015); Microsc Res Tech2015,78(10):900-7; Computerized histomorphometric study of the splenic collagenpolymorphism: A control-tissue for polarization microscopy.
Lattouf R et al (2014); J HistochemCytochem 2014, 62(10):751-758; Picrosirius Red Staining: A Useful Tool toAppraise Collagen Networks in Normal and Pathological Tissues. 
Whittaker P et al (2005); Braz J MorpholSci 2005, 22(2):97-104; Collagen and Picrosirius Red Staining: A PolarizedLight Assessment of Fibrillar Hue and Spatial Distribution..
【実施例】
【００４９】
実施例１  本発明に記載の組成物による天然のｄｅ  ｎｏｖｏコラーゲン産生の刺激
目的：この研究の目的は、本発明に記載の代表的なＰＴＭＣミクロスフェアを含む皮膚用フィラーが、動物モデルへの注射後に天然のｄｅ  ｎｏｖｏコラーゲン産生を刺激する可能性を評価することである。
腫瘍評価項目：コラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成の組織学的分析、例えばＩ型及びＩＩＩ型コラーゲン。
材料：本発明に記載の皮膚用フィラー（試験製品）、市販のＨＡ皮膚用フィラー、本発明に記載のゲル担体（対照１）及び生理食塩水（対照２）。
動物：合計３匹のウサギ（ニュージーランドホワイト）で研究を実施する。試験材料、対照薬材料、及び対照材料を同じ動物に注射する。
注射部位：皮下注射について調査する。注射は、動物モデルの脊柱の両側で行う。試験材料、対照薬材料、及び対照材料を同じ動物に注射する；材料毎に２回の注射（各側で１回）、動物毎に１０回の注射。ボーラス０．２ｍＬを生じるように注射を行う。
評価の時点：評価を、注射して４週後、１２週後、及び３６週後に行い、この時点で、ペントバルビタールナトリウムの静脈内注射により、１時点毎に１匹のウサギを安楽死させる。それぞれ注射領域を外植し、組織学的分析のために直ちに処理する。
組織学的染色及び分析：組織学的切片を、通常のヘマトキシリン及びエオシン染料（１）で染色する。特定のコラーゲンを検出するために、トリクローム（２）及び／又はピクロシリウスレッド染色（３）を行う。
結果：本発明に記載の皮膚用フィラーは、対照薬製品及び対照よりも著しく良好に天然コラーゲン産生を刺激する。
【００５０】
（１）：最も広く使用されかつる重要な多目的の染色の組み合わせ。四酸化オスミウムによる固定以外のあらゆる固定後に使用できる。天然染料製品であるヘマトキシリンは、青又は黒に染色する塩基性染料として働く。核ヘテロクロマチンは青く染色し、リボ核タンパク質が豊富な細胞の細胞質も青く染色する。リボ核タンパク質の量が最小である細胞の細胞質は、ラベンダー色である傾向がある。アニリン染料であるエオシンは、細胞質、筋肉、及び結合組織をピンクとオレンジとの種々の色合いで染色する酸性染料である。
（２）：トリクローム染色（結合組織染色）は、組織切片のコラーゲン結合組織線維の組織学的視覚化での使用を意図している。
（３）：ピクロシリウスレッド染色は、組織切片の筋肉に加えて、コラーゲンＩ及びＩＩＩ線維の組織学的視覚化での使用を意図している。ＰＳＲ染色は、標準的な光学顕微鏡法又はＩ型とＩＩＩ型とを区別するためにコラーゲン線維の複屈折をもたらす偏光を使用して観察することができる。
【００５１】
実施例２  本発明に記載の３つの組成物による天然のｄｅ  ｎｏｖｏコラーゲン産生の刺激
目的
この研究の目的は、ウサギでの注射による組成物の皮下投与後に、市販のヒアルロン酸（ＨＡ）ベースの製品と比較した、ポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）ミクロスフェアを含む本発明に記載の皮膚用フィラーが天然のｄｅ  ｎｏｖｏコラーゲン産生を刺激する可能性を実証することであった。
【００５２】
材料及び方法
皮膚用フィラー試験品１〜３は、ＰＴＭＣミクロスフェアを、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４中、３．９％の濃度でのカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）からできている水性ゲル担体と混合することにより調製して、最小粘度５０，０００ｍＰａ．ｓを有する透明なゲルを得た。ＰＴＭＣミクロスフェアは、Ｉｏｏｓｓら（２００１）に記載されているような溶媒抽出法によって調製した。典型的には、１００，０００ｇ／ｍｏｌ（試験品１）、２５０，０００ｇ／ｍｏｌ（試験品２）及び４９０，０００ｇ／ｍｏｌ（試験品３）の数平均分子量を有するＰＴＭＣポリマーを、それぞれ、５．０％、３．５％、及び１．９％の濃度でジクロロメタンに溶かした。次いで、ポリマー溶液合計１００ｍＬを、７５０ｒｐｍでの連続的な機械的撹拌下で、ポリ（ビニルアルコール）３％（ｗ／ｗ）を含有する水１Ｌで乳化させた。溶媒の抽出後、形成されたミクロスフェアを濾過して、１００ｋＧｙでのガンマ線照射向けに２０〜２００μｍの間の範囲の直径を有する粒子を収集した。照射後、ＰＴＭＣミクロスフェアを洗浄し、３０％（ｖ／ｖ）の濃度でゲル担体に混合し、結果として生じる製品をシリンジに充填した。試験品４は、ゲル担体のみ、すなわち、ＰＴＭＣミクロスフェアなしで構成されていた。
【００５３】
この研究では、市販の２つのＨＡベース皮膚用フィラーを使用した：ＨＡ対照薬１、ジュビダーム（Ｊｕｖｅｄｅｒｍ）（登録商標）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）３（Ａｌｌｅｒｇａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）、及びＨＡ対照薬２、レスチレン（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ）（登録商標）ディファイン（Ｄｅｆｙｎｅ）（Ｇａｌｄｅｒｍａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国）。ジュビダーム（登録商標）ウルトラ３は、リン酸緩衝液ｐＨ７．２中、２４ｍｇ／ｍＬの濃度での架橋非動物性ＨＡゲル及び塩酸リドカイン３ｍｇ／ｍＬである。レスチレン（登録商標）ディファインは、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７中、２０ｍｇ／ｍＬの濃度での非動物性の架橋ヒアルロン酸ナトリウム及び塩酸リドカイン３ｍｇ／ｍＬを含有する。
【００５４】
研究設計
２匹のウサギ、１時点当たり１匹ずつ、それぞれに試験品又は対照薬品２００μｌを、１試験品当たり２部位及び１対照薬製品当たり１部位で、皮下注射１０回で投与した。移植して４週及び１２週後、組織形態計測分析により、全コラーゲン含有量（ＴＣＣ）及びコラーゲンリモデリングインデックス（ＣＲＩ）の定量的評価を行った。
注射部位での炎症反応を含む局所組織の効果に関する定性的及び半定量的組織病理学的分析についても報告した。この研究は、ＩＳＯ  １０９９３−６、医療機器の生物学的評価（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、パート６（２０１６）：移植後の局所効果の試験（Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ａｆｔｅｒ  Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、に適合して実施した。
【００５５】
各観測期間の終わりに、割り当てられたウサギを麻酔し、各製品２００μＬを１回の皮下注射で動物の背部皮膚に投与して、組織学的特性評価及び分解分析についてベースラインを得た（Ｔ０部位）。動物を注射用バルビツレートで屠殺し、移植部位を切除し（皮膚及び皮内層を包含するほぼ２×２ｃｍの標本）、ホルマリン固定し、パラフィンに包埋し、組織学用に処理した。すべての製品及び相応するＴ０について、４つの中央切片をミクロトーム（厚さ４〜７μｍ）でカットし、それぞれ、マッソントリクローム変法、サフラニン−ヘマトキシリン−エオシン（ＳＨＥ）、アルシアンブルー及びピクロシリウスレッドで染色した。ＳＨＥ及びアルシアンブルーによって、細胞の組織化及び細胞外マトリックス構造の情報が提供された。トリクローム染色及びピクロシリウスレッド染色によって、それぞれ青色及び赤色に染色された状態でコラーゲン含有量が強調される（Ｓｕｖａｒｎａ  ＫＳら、２０１８）。ピクロシリウスレッド染色のスライドを偏光下でさらに分析して、コラーゲンリモデリングを確認した。偏光下では、色の違いがコラーゲンの成熟度及び線維の太さを表している：未熟な／細い線維は緑／黄色に現れ、成熟した／太い線維はオレンジ／赤に現れる（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ  ＬＣら、１９７９、Ａｌｖｅｓ  Ａら、２０１５）。
【００５６】
組織形態計測分析では、標準化された関心領域（ＲＯＩ）を、移植材料を包含するように、注射部位の中心（ほぼ１０ｍｍにわたって）に手動で画定した（図１の代表的な写真）。デジタルスライドスキャナー顕微鏡（ＡｘｉｏＳｃａｎ．ＺＩ、ＺＥＩＳＳ、フランス）及び画像分析システムＣＡＬＯＰＩＸバージョン３．２．０（ＴＲＩＢＶＮ、フランス）を使用して、すべての切片を検査した。
【００５７】
結果
組織形態計測分析−コラーゲンの評価
プロステーシス移植又は傷の生成に続く治癒相は、コラーゲンリモデリングに関連する：初期相時に沈着した細い未熟な（ＩＩＩ型）コラーゲン線維は、太い成熟（Ｉ型）コラーゲン線維で次第に置き換えられる。
【００５８】
コラーゲンは、全コラーゲン含有量の定量化を可能にするピクロシリウスレッド染色によって特異的に着色される。さらに、ピクロシリウスレッド染色に続いて交差偏光顕微鏡を使用すると、コラーゲン線維は高度に複屈折であり、Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの量、線維の太さ及びパッキング、並びにコラーゲン分子の組織化に基づいて様々な色合いを提示する（Ｊｕｎｑｕｅｉｒａ  ＬＣら、１９７９）。細い、緩く配列した未熟な線維は緑に現れ、一方、より太く、密に詰まった成熟した線維は、赤みがかったオレンジに現れる（Ａｌｖｅｓ  Ａら、２０１５）。治癒組織のレベルでの緑の線維と赤みがかったオレンジの線維との比率を定量化でき、コラーゲンマトリックスのリモデリングプロセスを表すと考えられる（Ｌａｔｔｏｕｆ  Ｒら、２０１４）。他の文献の記述に従い（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｐら、２００５）、同じ条件下で調製されたリンパ系器官（ラット脾臓）のピクロシリウスレッド染色切片を陽性対照として使用して、偏光角を、脾臓嚢及び小柱のコラーゲンネットワークに基づいて画定した。
【００５９】
全コラーゲン含有量（ＴＣＣ）
ピクロシリウスレッド染色のデジタル化切片を明視野顕微鏡で検査して、移植して４週目及び１２週目でのＴＣＣを計算した。結果は、選択したＲＯＩ内で測定されたコラーゲン表面積の百分率として表したが、図２にまとめられている。この評価で使用した、組織学的染色切片の代表的な顕微鏡写真を図３に示す。
【００６０】
移植して４週後、移植部位内で決定したコラーゲンの百分率は、ＨＡベースの皮膚用フィラーと比較して、試験品１〜３についてほぼ２倍ですでに上昇していた。ゲル担体のみの試験品４は、移植して４週後に完全に分解され、コラーゲン含有量は定量化されなかった（図６）。これらの結果が表すことは、天然コラーゲンを産生する刺激は、実際、ＰＴＭＣミクロスフェアの存在に起因するということである。１２週後、移植されたＨＡベースの皮膚用フィラーと比較して、全コラーゲンの百分率は試験品２〜３において依然としてより大きかった。製品１及びＨＡ対照薬２の全コラーゲン含有量については、組織学的な調製時の技術的理由により決定しなかった。
【００６１】
コラーゲンリモデリングインデックス（ＣＲＩ）
交差偏光顕微鏡を使用して、試験品のピクロシリウスレッド染色のデジタル化切片を検査して、移植して４週目及び１２週目での移植領域内に存在するコラーゲンの成熟度を決定した。偏光下では、コラーゲン線維の色は、緑から赤みがかったオレンジまで、線維の太さ及び成熟度の上昇を表す。したがって、選択したＲＯＩ内の緑（未熟、ＩＩＩ型コラーゲン）の表面積と赤みがかったオレンジ（成熟、Ｉ型コラーゲン）の表面積との比率を計算したが、ＣＲＩとして提示する。結果を図４にまとめ、代表的な顕微鏡写真を図５に示す。
【００６２】
４週間後、試験品１、２及び３のＣＲＩ値は、それぞれ、０．８６、１．０６、及び０．９５であったが、このことは、同様の複屈折を有する線維が観察されたことすなわち、移植されたエリア内でコラーゲンの成熟度及び線維の太さに明確な違いはなかったこと、を表している。１２週後、少なくとも試験品２については、偏光画像の分析により、赤みがかったオレンジのコラーゲン線維の量の増加が示されたが、この増加は、太い成熟した１型コラーゲン線維のリモデリング、組織化及び沈着が開始したことを示唆している。
【００６３】
試験品４（ゲル担体）の分解
各期間の終わりに、ゲル担体の量を、対応するＴＯ部位と比較して、ＳＨＥ切片上の所定のＲＯＩの表面積の組織形態計測評価により定量化した。
【００６４】
ウサギの背中に皮下移植して４週後、結果が示したところは、ゲル担体はすでに完全に分解されていたことである。したがって、移植して１２週後に製品は検出されなかった（図６、図７の代表的な顕微鏡写真）。
【００６５】
病理組織学的評価−局所組織の影響：
注射部位での炎症反応を含む局所組織の影響の組織病理学的評価を、ＳＨＥ及びアルシアンブルー切片上で、基準（ＩＳＯ  １０９９３−６）に適合して実施した。
ウサギでの皮下注射後の時間経過とともに、試験品１〜３は、局所的な副作用を誘導することなく、分解に関して軽度から中度の兆候を示した。担体材料（試験品４）は、完全に分解されたが、軽微な残留局所炎症のみを生じたので、試験品１〜３で観察された局所炎症の等級が（中度）、ポリマーミクロスフェアの存在に関連付けられた。試験品１〜３と比較すると、対照薬１及び２が誘導したのはより低い徴候の局所炎症であった。
【００６６】
インプラント部位の肉眼的観察により、０日目から１２週目まで、いずれの品についても浮腫、紅斑又は痂皮の徴候は示されなかった。
【００６７】
結論
本研究は、動物モデルでの皮下投与に続いて、現在販売されているＨＡベースの皮膚用フィラー製品と比較して、ＣＭＣゲル担体に懸濁したＰＴＭＣミクロスフェアの新生コラーゲン形成（ｎｅｏｃｏｌｌａｇｅｎｅｓｉｓ）能を調査することを目的とした。
【００６８】
結果が実証しているところは、ＨＡベースの対照薬製品と比較して、本発明に記載のＰＴＭＣミクロスフェア組成物によって、天然コラーゲンのｄｅ  ｎｏｖｏ合成及び沈着に関して刺激がより高いことによって特徴付けられる、局所組織での異物反応が引き起こされて、すでに移植後４週で最大で２倍より高い量でコラーゲンの合成がもたらされるということである。さらに、未熟な（ＩＩＩ型）コラーゲンと成熟した安定したコラーゲン（Ｉ型）との比率は、成熟したＩ型コラーゲンの方を選択して時間とともにシフトすることが示され、これは、コラーゲン分子のその天然維構造への再構成による細胞外マトリックスネットワークの構造的回復を表している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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