(57)【要約】配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１や配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチド、例えば、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、優れたアポトーシス抑制活性を有する。従って、配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号２のアミノ酸配列、特に配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドは、神経変性疾患などのＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物として有用である。
2004113367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項３】
配列番号１〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アポトーシス抑制活性を有するペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドをコードするポリヌクレオチド、又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えベクターを含有する細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えベクターを含有するウイルス。
【請求項９】
請求項５に記載のポリヌクレオチドと、タグをコードするポリヌクレオチドとの融合ポリヌクレオチドであって、
前記ペプチドが前記タグと融合し、一つのポリペプチドとして発現することができるように構成された融合ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチドと、細胞膜透過性ペプチドとの融合タンパク質。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５または９に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、請求項７に記載の細胞、請求項８に記載のウイルス、請求項１０に記載の融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を有効成分として含有するＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載のＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患が、虚血性疾患、神経変性疾患、糖尿病、及び自己免疫疾患、からなるグループから選ばれるいずれかの疾患であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載のＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患が、心筋梗塞、肝臓虚血、脳虚血、網膜虚血、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症、後天性免疫不全症候群脳症、多発性硬化症、及び重症筋無力症からなるグループから選ばれるいずれかの疾患であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５または９に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、請求項７に記載の細胞、請求項８に記載のウイルス、請求項１０に記載の融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を有効成分として含有するＢａｘのミトコンドリアへの移行を抑制する抑制剤。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５または９に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、請求項７に記載の細胞、請求項８に記載のウイルス、請求項１０に記載の融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を用いることを特徴とするアポトーシス促進活性の抑制方法。
【請求項１６】
請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド、請求項５または９に記載のポリヌクレオチド、請求項６に記載の組換えベクター、請求項７に記載の細胞、請求項８に記載のウイルス、請求項１０に記載の融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を用いることを特徴とするＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患の治療、予防、又は進行抑制方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、アポトーシス抑制活性を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合ポリヌクレオチド、融合タンパク質、及びＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物、Ｂａｘのミトコンドリアへの移行を抑制する抑制剤、並びにアポトーシス促進活性の抑制方法、及びアポトーシス誘導性疾患の治療、予防、又は進行抑制方法に関する。
【背景技術】
【０００２】  脳虚血やアルツハイマー症などの神経変性疾患は、神経細胞死（アポトーシス）が原因により引き起こされる疾患であることが知られている。このアポトーシスは、Ｂａｘなどのアポトーシス促進タンパク質の活性化が誘導されることにより生じる。そのため、神経変性疾患の治療薬や進行抑制剤としてのアポトーシスを抑制する物質の開発が求められている。【０００３】  近年、細胞におけるアポトーシス促進活性の抑制にＢａｘのＡＲＴ（Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ドメイン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＡ０３６１９又はＡＡＡ０３６２０のＮ末端の１９アミノ酸）からなるペプチドを含むポリペプチドが有用であることが報告されている（例えば、特表２００２−５３９７６０号公報参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】  本発明の目的は、アポトーシスにより引き起こされる疾患や、その疾患の治療、予防、又は進行抑制や、アポトーシス促進活性の抑制などに対して有用な、アポトーシス抑制活性を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合ポリヌクレオチド、融合タンパク質、医薬組成物、又はＢａｘのミトコンドリアへの移行を抑制する抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】  本発明者は、アポトーシスにより引き起こされる疾患に対して有用な医薬組成物を提供すべく鋭意研究した結果、ＢａｘのＡＲＴドメインからなるペプチドＭＤＧＳＧＥＱＰＲＧＧＧＰＴＳＳＥＱＩＭ（ＢａｘのＮ末端側２０個のアミノ酸配列からなるペプチド：配列番号８）の１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）が優れたアポトーシス抑制活性を有することを見い出した。また、ＡＲＴドメインの１４〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１）は、ＡＲＴドメインの１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）に比べ、優れたアポトーシス抑制活性を有することを見い出した。従って、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチド、特に、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、アポトーシス抑制活性のＡＲＴにおけるコアドメインと考えられるため、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＡＲＴの部分配列であって、配列番号１又は配列番号２に示されるアミノ酸配列を含めば、優れたアポトーシス抑制活性を有すると考えられる。実際、実施例において示されるように、配列番号１〜５に示されるアミノ酸配列を有するＡＲＴの部分配列は優れたアポトーシス抑制活性を有していた。こうして本発明者は、本発明を完成するに至った。【０００６】  すなわち本発明に係るペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。【０００７】  また、本発明に係るペプチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列の一部からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有することを特徴とする。【０００８】  例えば、配列番号１〜５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドである。また、上記ペプチドにおいて、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、アポトーシス抑制活性を有するペプチドであってもよく、例えば、ＰＴＡＡＥＱＩＭ（配列番号６）、ＶＴＳＳＥＱＩＭ（配列番号７）などである。なお、本発明に係るペプチドにはＡＲＴは含まれない。【０００９】  本発明に係るポリヌクレオチド又はその塩基配列に相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドは、アポトーシス抑制活性を有するペプチドをコードすることを特徴とする。これらのポリヌクレオチドは後述するようにＢａｘのＡＲＴドメインからなるペプチドより有用なペプチドをコードしている。これらのポリヌクレオチドは、２本鎖ＤＮＡ又は１本鎖ＤＮＡを構成してもよいし、２本鎖ＲＮＡ又は１本鎖ＲＮＡを構成してもよい。【００１０】  本発明に係る組換えベクターは、上述のポリヌクレオチドを含有することを特徴とする。上述のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターは、例えば、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ＨＩＶベクター等のウイルスベクターや、トランスポゾン又はプラスミドベクターなどである。本発明に係る細胞は、前記組換えベクターを含有することを特徴とする。本発明に係る細胞として用いられる宿主細胞は、例えば、大腸菌などの微生物細胞から哺乳類動物細胞までどのようなものでもよい。本発明に係るウイルスは、遺伝子導入できるものであればどのようなものでもよく、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＨＩＶ等のウイルスなどである。【００１１】  さらに、本発明にかかる融合ポリヌクレオチドは、上述のポリヌクレオチドと、タグをコードするポリヌクレオチドとが融合し、これらがコードするペプチドが融合ペプチドとして発現することができるように構成されていることを特徴とする。タグは、細胞内で発現させたアポトーシス抑制活性を有するペプチドを精製するために用いることが可能な分子であればどのようなものでもよく、例えば、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＦＬＡＧタグなどがある。【００１２】  本発明に係る融合タンパク質は、本発明に係るペプチドと、前記ペプチドを細胞内に導入するための細胞膜透過性ペプチドとが融合していることを特徴とする。細胞膜透過性ペプチドは、例えば、疎水性のシグナルペプチド（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０，１４２５５−１４２５８，１９９５、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６，３７０−３７５，１９９８）、ＨＩＶ−１  ＴＡＴペプチドなどである。なお、マガイニン２などの抗菌性ペプチドを細胞膜透過性ペプチドとして用いることとしてもよい。【００１３】  本発明に係るＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物は、上述のペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を有効成分として含有することを特徴とする。【００１４】  また、本発明に係る、Ｂａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患の治療、予防、又は進行抑制方法は、上述のペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を用いることとする。なお、Ｂａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患を伴う脊椎動物としては、ヒトでもよいし、マウス、ラット等のヒト以外の脊椎動物であってもよい。【００１５】  なお、Ｂａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患とは、Ｂａｘが誘導するアポトーシスにより引き起こされる疾患であり、例えば、虚血性疾患、神経変性疾患、糖尿病、自己免疫疾患、アレルギー性疾患等である。虚血性疾患としては、例えば、脳虚血、網膜虚血、虚血性心疾患などであり、神経変性疾患としては、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）脳症などであり、自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症や重症筋無力症などである。【００１６】  さらに、本発明に係るＢａｘのミトコンドリアへの移行を抑制する抑制剤は、上述のペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を有効成分として含有する。【００１７】  また、本発明に係るアポトーシス促進活性の抑制方法は、上述のペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合タンパク質からなるグループから選ばれる少なくとも１つの物質を用い��ことを特徴とする。【００１８】関連文献とのクロスリファレンス
なお、本願は、２００３年６月２４日付けで出願した日本国特願２００３−１８０１３１号に基づく優先権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】  図１は、本発明の実施例２において、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性に対する、野生型ＡＲＴ及び変異型ＡＲＴの効果を示す図である。
図２は、本発明の実施例２において、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性に対する、細胞に導入した野生型ＡＲＴ及び変異型ＡＲＴの発現ベクターの量の効果を示す図である。
図３は、本発明の実施例２において、ウエスタンブロット法により調べた野生型ＡＲＴ及び変異型ＡＲＴの発現量、及びＢａｘが誘導するアポトーシス促進活性に対する、各発現量における野生型ＡＲＴ及び変異型ＡＲＴの効果を示す図である。
図４は、本発明の実施例３において、作製したＨＴＡ１３２０のアミノ酸配列を示す図である。
図５は、本発明の実施例４において、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性によるＨＴＡ１３２０の効果を示す図である。
図６は、本発明の実施例５において、Ｂａｘ又はＢａｋが誘導するアポトーシスに対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の効果を示す図である。
図７は、本発明の実施例６において、ＳＴＳが誘導するＢａｘ依存性アポトーシスに対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の抑制効果を示す図である。
図８は、本発明の実施例７において、ＳＴＳが誘導するＢａｘのミトコンドリア移行に対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の効果を示す図である。
図９は、本発明の実施例８において、ＳＴＳが誘導するアポトーシスに対する、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０、ＴＡＴ−ＡＲＴ１４２０、又はＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０Ｐ１３Ｖの効果を示す図である。
図１０は、本発明の実施例９において、脳虚血モデルスナネズミから単離した海馬神経細胞の細胞死に対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の抑制作用を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】  これまでに、ＢａｘのＡＲＴドメインが膜貫通ドメインと分子内結合してＢａｘのミトコンドリアへの局在を抑制することにより、Ｂａｘのアポトーシス促進活性を抑制しているという仮説が提唱されている。実際に、ＡＲＴドメインを欠失したＢａｘは野生型Ｂａｘに比べてアポトーシス促進活性が高い。また、ＡＲＴドメインのアミノ酸配列（以下、ＡＲＴ配列と略す）を有するペプチド（以下、ＡＲＴと略す）を単独で発現させても、Ｂａｘのアポトーシス促進活性を抑制することができる。【００２１】  本発明者は、ＡＲＴをコードする塩基配列（配列番号９）をＧＦＰ遺伝子に融合させたコンストラクト（ＧＦＰ−ＡＲＴ）を作製し、遺伝子導入により細胞で発現させることにより、Ｂａｘが誘導する細胞死を抑制することを確認した。しかし、ＧＦＰ−ＡＲＴとＢａｘとの結合を調べたところ、従来考えられていた仮説を否定する実験結果、すなわち、ＡＲＴとＢａｘとが直接結合することなく、単独で発現させたＡＲＴはＢａｘが誘導するアポトーシス促進活性を阻害することを見い出した。【００２２】  そこで、本発明者は、ＡＲＴのアミノ酸残基の様々な欠失変異体や点変異体を構築し、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性の阻害について調べたところ、ＡＲＴの一部からなるペプチド、例えば、ＡＲＴ配列のＮ末端から数えて１３番目のプロリンから２０番目のメチオニンからなるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するコンストラクトがＡＲＴに比べて１０〜１００倍強いアポトーシス抑制活性を示すことを見い出した。【００２３】  また、本発明者らは、配列番号１又は配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するペプチドが、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するペプチドより優れた、スタウロスポリン（ＳＴＳ）誘導性アポトーシスに対する抑制活性を有することを見い出した。【００２４】  以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ  ＆  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ（Ｅｄ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ．などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。【００２５】  なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的に実施例などは、本発明の��ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。【００２６】（１）アポトーシス抑制活性を有するペプチド
本発明に係るアポトーシス抑制活性を有するペプチドは、ＡＲＴ配列の一部からなり、配列番号２に示されるアミノ酸配列（特に配列番号１に示されるアミノ酸配列）を有し、ＡＲＴが有するアポトーシス抑制活性、特にＢａｘが誘導するアポトーシスの抑制活性、に対し、優れたアポトーシス抑制活性を有する。具体的には、ＡＲＴ配列のＮ末端から数えて１４番目のスレオニンから２０番目のメチオニンまでのアミノ酸配列（配列番号１）からなるペプチド、ＡＲＴ配列のＮ末端から数えて１３番目のプロリンから２０番目のメチオニンまでのアミノ酸配列（配列番号２）からなるペプチド、ＡＲＴ配列のＮ末端から数えて１０番目のグリシンから２０番目のメチオニンまでのアミノ酸配列（配列番号３）からなるペプチド、ＡＲＴ配列のＮ末端から数えて７番目のグルタミンから２０番目のメチオニンまでのアミノ酸配列（配列番号４）からなるペプチド、又はＡＲＴ配列のＮ末端から数えて４番目のセリンから２０番目のメチオニンまでのアミノ酸配列（配列番号５）からなるペプチドなどである。また、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち３番目と４番目のセリンをアラニンに置換したペプチド（配列番号６）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列のうち１番目のプロリンをバリンに置換したペプチド（配列番号７）も、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドと同様のアポトーシス抑制活性を有する。したがって、本発明に係るアポトーシス抑制活性を有するペプチド、前記ペプチドと細胞内導入ペプチドとの融合タンパク質、前記ペプチド又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、前記組換えベクターを含有する細胞またはウイルスなどは、アポトーシス抑制活性を有するペプチドを供給することができ、アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物として有用である。【００２７】  また、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるペプチドは、ＳＴＳが誘導するＢａｘのミトコンドリア移行を抑制する作用を有する。従って、本発明に係るアポトーシス抑制活性を有するペプチド、前記ペプチドと細胞内導入ペプチドとの融合タンパク質、前記ペプチド又は前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、前記組換えベクターを含有する細胞またはウイルスなども、Ｂａｘのミトコンドリアへの移行を抑制することができ、Ｂａｘのミトコンドリア移行を抑制する抑制剤として有用である。【００２８】  なお、本発明に係るアポトーシス抑制活性を有するペプチドはＡＲＴより短いアミノ酸配列からなることから、より効率よく作製することができる。【００２９】（２）アポトーシス抑制活性を有する医薬組成物の作製方法
アポトーシス抑制活性を有するペプチドの作製は、有機化学的に合成してもよいし、またタンパク質を酵素法等の種々の方法を用いて、加水分解して取得することとしてもよい。また、適切なエンハンサー／プロモーターをもつ発現ベクターに、アポトーシス抑制活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを挿入し、組換えベクターを作製してもよいが、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグなどのタグをコードするポリヌクレオチドと、アポトーシス抑制活性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドとを融合した融合ポリヌクレオチドを挿入し、この融合ポリヌクレオチドを含有する組換えベクターを大腸菌、サルモネラ菌等の菌や、イースト、動物細胞などに導入し、融合タンパク質を発現させるのがより好ましい。この場合、発現させた融合タンパク質をタグを利用して精製することができるからである。また、上記ポリヌクレオチド又は上記融合ポリヌクレオチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写させて得られたｍＲＮＡを、ウサギ網状赤血球抽出液、大腸菌Ｓ３０抽出液、麦芽抽出液、小麦胚抽出液などを用いたインビトロ翻訳システムにより翻訳させてもよい。融合タンパク質の場合、同様にタグを利用して精製することができる。なお、タグは、最終段階で除去し、ＨＰＬＣ（ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（−ｓｐｅｅｄ）ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）などでアポトーシス抑制活性を有するペプチドだけを精製することもできる。このように作製した本発明のアポトーシス抑制活性を有するペプチドをアポトーシス誘導性疾患の治療、予防、進行抑制などに用いることができる。【００３０】  ここで、医薬組成物として、アポトーシス抑制活性を有するペプチドの代わりに、アポトーシス抑制活性を有するペプチドを発現することのできる組換えベクターを用いてもよい。例えば、導入対象の患部に前記ベクターを導入すると、アポトーシス抑制活性を有するペプチドを発現させることが可能となる。【００３１】  また、医薬組成物として、前記組換えベクターを含有する細胞またはウイルスを用いてもよい。これらにより、生体内標的部位で、組換え細胞内で発現したアポトーシス抑制活性を有するペプチドを放出させることができる。本発明に係る組換え細胞は、例えば、動物細胞に、アポトーシス抑制活性を有するペプチドを発現できる組換えベクターをエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、アデノウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターなどを用いたウイルス感染法、又はカルシウムを用いたトランスフェクション法等によって導入することにより作製できる。また、前記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する組換えベクターを含有する細胞、細菌、又はウイルスなどを患者に投与してもよい。この際、毒性や副作用の生じないようにするために、細菌やウイルスを無害化しておくことが好ましい。例えば、感染はするが、複製しないように改変されたレトロウイルスやアデノウイルスにアポトーシス抑制活性を有するペプチドを発現することができる組換えベクターを組み込んでもよい。【００３２】（３）医薬組成物の投与
上述したように、アポトーシス抑制活性を有するペプチド、前記ペプチドと細胞内導入ペプチドとの融合タンパク質、前記ペプチド又は前記融合タンパク質を発現することができる組換えベクター、前記組換えベクターを含有する細胞やウイルスなどは、アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物として有用である。【００３３】  なお、アポトーシス抑制活性を有するペプチド又はそれをコードするポリヌクレオチドを封入したリポソームも医薬組成物として有用である。この場合、Ｔｒａｎｓ  ＩＴ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａの商品名）などを用いることもできる。また、薬物キャリアとして優れた特性を有する高分子ミセルに、上記ペプチドやポリヌクレオチドなどを内包した高分子ミセルも医薬組成物として有用である。【００３４】  また、アポトーシス抑制活性を有するペプチドを発現することができるプラスミドと、高分子キャリアとの複合体も、標的組織にプラスミドを運び、そこで薬物を遊離することが可能であることから、アポトーシス誘導性疾患に対する医薬組成物として有用である。高分子キャリアは、前記ポリヌクレオチドを細胞内に導入することが可能な物質であり、例えば、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポロタミン、キトサン、合成ペプチド、又はデンドリマーなどである。【００３５】  また、使用する部位又は目的に応じて、薬理学的に許容された適切な賦形剤又は基剤を医薬組成物にさらに含有することとしてもよい。【００３６】  以上のように作製された、アポトーシス抑制活性を有するペプチド、前記ペプチドと細胞内導入ペプチドとの融合タンパク質、前記ペプチド又は前記融合タンパク質を発現することができる組換えベクター、前記組換えベクターを含有する細胞やウイルスなどを有効成分として含み、上記のように、投与のための他の成分を含んだ医薬組成物を、ヒトまたはヒト以外の脊椎動物に対し、導入対象の患部の近傍に、直接投与するか、医薬組成物によっては非経口、経口、皮内、皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内に投与するのが好ましい。【００３７】  以上のように、生体内にアポトーシス抑制活性を有するペプチドを導入すると、疾患の原因となるアポトーシスを抑制することが可能となる。【００３８】（４）アポトーシス誘導性疾患
本発明の医薬組成物は、Ｂａｘによるアポトーシスを抑制するため、Ｂａｘが誘導するアポトーシスにより引き起こされるＢａｘ依存的アポトーシス誘導性疾患は、すべてその適用となり得る。【００３９】  例えば、従来、虚血性疾患である網膜虚血に対してＢａｘアンチセンスがアポトーシスを抑制することが報告されている（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．，Ｓｕｐｐｌ．２２，ｐｐ．Ｓ３５７，１９９８）。また、脳虚血による細胞死（第三回日本ミトコンドリア研究会年会要旨集  演題番号Ｓ１）やアルツハイマー症による神経細胞死あるいはその発症過程でＢａｘが関与することが知られている。【００４０】  他の例としては、糖尿病のモデルマウスであるＡｋｉｔａマウスにおいて、小胞体ストレスを介する膵β細胞のアポトーシスが生じているが、このアポトーシスは小胞体ストレス−ＣＨＯＰ誘導−Ｂａｘのミトコンドリア移行−ミトコンドリア経路の活性化−アポトーシスという経路を通じて引き起こされることが報告されている（第三回日本ミトコンドリア研究会年会要旨集  演題番号Ｓ１）。【００４１】  また、Ｂａｘノックアウトマウスでは、自己免疫疾患である多発性硬化症の動物モデルであるＭＯＧ（ｍｙｅｌｉｎ  ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）誘導自己免疫性脳脊髄炎の発症が抑制されたり（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ａｐｒ  １５，３５９（３），１３９−４２）、重症筋無力症の程度が増加するにつれ、Ｂａｘの発現が上昇したりする（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ．２００１  Ｏｃｔ，２０（４），７１２−２１．）ことが知られている。このように、Ｂａｘがこれらの自己免疫疾患の病因となるアポトーシスにも関与することが明らかになっている。【００４２】  以上のことから、本発明の医薬組成物は、心筋梗塞、肝臓虚血、脳虚血、網膜虚血などの虚血性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、ポリグルタミン病、プリオン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）脳症などの神経変性疾患、糖尿病、多発性硬化症や重症筋無力症などの自己免疫疾患等の治療薬、予防薬、あるいは進行抑制剤となりうる。【００４３】  また、ヨード造影剤がアポトーシスによる腎障害を引き起こすことが知られているが、それは腎尿細管培養細胞においてもアポトーシスを誘導する。この培養細胞系を用いて、ヨード造影剤によりＢａｘの発現量が増加することが明らかにされた（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，６４，２０５２−２０６３，２００３）。従って、ヨード造影剤を用いる際（血管や臓器の造影検査）に、本発明の医薬組成物を用いれば、Ｂａｘによるアポトーシスを抑制し、腎障害を防止することができると考えられる。
【実施例】
【００４４】  以下、本発明の実施例について詳細に述べる。【００４５】［実施例１］変異型ＡＲＴプラスミドの構築
１−１  ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミドの構築
まず、変異型ＡＲＴプラスミドの構築について説明する。ＧＦＰ遺伝子の上流側に位置するセンスプライマーＧＦＰ−ＡＲＴ（Ｓ）、及び、ＢａｘのＡＲＴ配列（配列番号８）をコードする塩基配列（配列番号９）と相補的な配列を５′側に有しＧＦＰ遺伝子の下流側に位置するアンチセンスプライマーＧＦＰ−ＡＲＴ（ＡＳ）を作製し、ｐＥＧＦＰ−ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、ＡｃｃｕｒＰｏｗｅｒ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、インサートＧＦＰ−ＡＲＴを得た。これをｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ（ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−２０）プラスミドを得た。
ＧＦＰ−ＡＲＴ（Ｓ）：
2004113367.tif 000003
ＧＦＰ−ＡＲＴ（ＡＳ）：
2004113367.tif 000004
【００４６】  １−２  ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−９プラスミド及びｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−１６プラスミドの構築
ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴを鋳型として、ＢａｘのＡＲＴドメインのアミノ酸配列の１〜９もしくは１〜１６の配列に相当する塩基配列をアンチセンスプライマーとし、ＧＦＰ遺伝子の上流側のセンスプライマーと共にＰＣＲ反応を行い、目的の変異型ＡＲＴの配列を有するインサートＧＦＰ−ＡＲＴ／１−９及びＧＦＰ−ＡＲＴ／１−１６を得た。これをｐＣＩ−ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−９及びｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−１６プラスミドを得た。【００４７】＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−９のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000005
ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−９（ＡＳ）：
2004113367.tif 000006
＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−１６のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000007
ＧＦＰ−ＡＲＴ／１−１６（ＡＳ）：
2004113367.tif 000008
【００４８】  １−３  ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／４−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０プラスミド及びＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０プラスミドの構築
センスプライマーＧＦＰ（Ｓ）、及び、目的の変異型ＡＲＴ配列をコードする塩基配列に相補的な配列を５′側に有し、ＧＦＰ遺伝子の下流側に位置する以下のアンチセンスプライマーＧＦＰ−ＡＲＴ（ＡＳ）をプライマーとし、ｐＥＧＦＰ−ＣＩ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を鋳型として、ＡｃｃｕｒＰｏｗｅｒ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＧＦＰと融合した変異型ＡＲＴをコードするインサートを得た。これをｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にサブクローニングし、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／４−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０プラスミド、及びｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０プラスミドを得た。【００４９】＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／４−２０のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000009
ＧＦＰ−ＡＲＴ／４−２０（ＡＳ）：
2004113367.tif 000010
＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000011
ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０（ＡＳ）：
2004113367.tif 000012
＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000013
ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０（ＡＳ）：
2004113367.tif 000014
＜ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０のＰＣＲ用プライマー＞
ＧＦＰ（Ｓ）：
2004113367.tif 000015
ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０（ＡＳ）：
2004113367.tif 000016
【００５０】［実施例２］変異型ＡＲＴのアポトーシス抑制活性の評価
実施例１により作製した各プラスミドを用いて、Ｂａｘの誘導するアポトーシス促進活性に対する変異型ＡＲＴの阻害効果を調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２穴プレートに１ウエル当たり１×１０５個の細胞をまき、一晩培養した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）及びＬｉｐｏｆｅｃｔ  Ａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて、リポフェクション法により０．１ｎｇ／ｍｌの野生型もしくは変異型ＡＲＴプラスミド及びｐＣＩ−Ｂａｘプラスミドの細胞への遺伝子導入を行った。５時間後に培地を１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社製）／ＤＭＥＭ（日水製薬社製）に交換し、４０時間後の細胞生存率をトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。その結果を図１に示す。
その結果、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／４−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０プラスミド、及びｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０プラスミドを導入した細胞の生存率は、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミドを導入した細胞の生存率と顕著な差は見られなかった。従って、ＡＲＴ配列のＣ末端部は、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性を阻害するために重要な部分であることがわかった。【００５１】  そこで、細胞に導入するプラスミドの量を変化させ、各プラスミド量におけるアポトーシス抑制活性について調べるため、上記と同様に各プラスミドを細胞に導入し、細胞の生存率をトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。細胞に導入するプラスミドとしては、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／７−２０プラスミド、ｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１０−２０プラスミド、及びｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０プラスミドを用いた。その結果を図２に示す。その結果、０．０１ｎｇ／ｍｌのｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミドを導入した場合には、Ｂａｘが誘導するアポトーシス促進活性をほとんど阻害しなかったのに対して、変異型ＡＲＴプラスミドでは、０．０１ｎｇ／ｍｌという低濃度のプラスミドを導入した場合でも高濃度のｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミドを導入した場合と同様のアポトーシス抑制活性を示した。【００５２】  次に、導入したプラスミドによる発現量が、各プラスミドにより差のないことを確認した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｍｍシャーレに４×１０５個の細胞をまき、一晩培養した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）及びＬｉｐｏｆｅｃｔ  Ａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて、リポフェクション法によりｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴプラスミドもしくはｐＣＩ−ＧＦＰ−ＡＲＴ／１３−２０プラスミド及びｐＣＩ−Ｂａｘプラスミドの細胞への遺伝子導入を行った。５時間後に培地を１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒｕｍ社製）／ＤＭＥＭ（日水製薬社製）に交換し、２４時間後に細胞を回収し、ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１２５ｍＭ  ＮａＣｌ，０．５％ＮＰ−４０，０．１ｇ／ｍｌ  ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ：ｐＨ６．８）にて可溶化して細胞可溶化液を得た。この可溶化液に１／２量のＳＤＳ−ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加え、電気泳動用サンプルを得た。それらのサンプルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を用いて、ウエスタン・ブロッティングを行い、それぞれの発現量を確認した。また、プラスミドを導入した細胞の生存率を３０時間後及び４５時間後にトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。その結果を図３に示す。このことから、野生型ＡＲＴ及び変異型ＡＲＴの発現量は、等量のプラスミドを導入したとき、ほぼ同程度であり、細胞に導入するプラスミドの量に依存して変異型ＡＲＴの発現量も変化することがわかった。その結果、変異型ＡＲＴは野生型ＡＲＴに比べて１０〜１００倍強いアポトーシス抑制活性を示すことが明らかとなった。【００５３】［実施例３］ＨＴＡ１３２０の作製
次に、ＢａｘのＡＲＴドメインの１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号２）が、アポトーシス誘導性疾患に有用であるかどうかを調べるために、ＢａｘのＡＲＴドメインの１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチド（ＨＴＡ１３２０）を以下のように作製した。なお、本実施例においては細胞膜透過性を向上させるためにＨＴＡ１３２０のＮ末端側にＨＩＶのＴａｔ配列を結合させた。また、ペプチド精製を容易にするためにＨｉｓ配列を付加した。【００５４】  ３−１  ＨＴＡ１３２０発現ベクターの構築
アンチセンスプライマーＴ３、及び、５′側にＨＩＶ−ＴＡＴの配列を有し、ＡＲＴの上流側のセンスプライマーＴＡＴ−ＡＲＴ／１３−２０（Ｓ）を用い、ｐＣＩ−ＡＲＴを鋳型として、ＡｃｃｕｒＰｏｗｅｒ  ＰＣＲ  ＰｒｅＭｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ社製）を用いてＰＣＲ反応を行い、インサートＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０（配列番号１９）を得た（図４参照）。これをｐＲＡＥＴ  Ｃ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）にサブクローニングし、ｐＲＡＥＴ  Ｃ−ＴＡＴ−ＡＲＴ１３／２０を得た。
ＴＡＴ−ＡＲＴ／１３−２０（Ｓ）：
2004113367.tif 000017
Ｔ３：
2004113367.tif 000018
【００５５】３−２  ＨＴＡ１３２０の精製
ｐＲＳＥＴ  Ｃ−ＴＡＴ−ＡＲＴ１３／２０を導入した大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を培養後、培地のＯＤ６００＝０．６〜０．７の時点で１ｍＭのＩｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を添加して、Ｈｉｓ−ＴＡＴ−ＡＲＴ１３／２０（配列番号２０）の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後、６時間培養し菌体を回収した。Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（８Ｍ  ｕｒｅａ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ８．０）により可溶化し、Ｎｉ−ＮＴＡ  ａｇａｒｏｓｅカラム（ＱＩＡＧＥＮ社製）にかけ、２５ｍＭイミダゾールを含むＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで洗浄し、２５０ｍＭイミダゾールを含むＬｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒで溶出した。この溶出画分をＰＤ−１０  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いて脱塩を行い、純粋なＨＴＡ１３２０（配列番号２０）を得た（図４参照）。【００５６】［実施例４］ＨＴＡ１３２０のアポトーシス抑制活性の評価
実施例３により作製したＨＴＡ１３２０がＢａｘの誘導するアポトーシス促進活性を阻害するかどうかを調べた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２穴プレートに１ウエル当たり１×１０５個の濃度でまき、一晩培養した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）及びＬｉｐｏｆｅｃｔ  Ａｍｉｎｅ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社製）を用いて、リポフェクション法によりｐＣＩ−Ｂａｘを細胞へ導入した。５時間培養後培地を交換し、種々の濃度のＨＴＡ１３２０を添加し、４０時間後の細胞生存率をトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。その結果を図５に示す。その結果、ＨＴＡ１３２０はＢａｘが誘導するアポトーシス促進活性を阻害した。また、ＨＴＡ１３２０は低濃度でも高濃度と同程度のアポトーシス抑制活性を示すことがわかった。【００５７】［実施例５］Ｂａｘが誘導するアポトーシスに対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の効果
また、ＡＲＴの１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドが、Ｂａｘの過剰発現により誘導されるアポトーシスも抑制できるかどうかを検討した。なお、本実施例においては、ペプチド合成機により作製したＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０（配列番号１９）を用いて以下の実験を行った。【００５８】５−１  ｐＣＩ−ｍｙｃ、ｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｘ、又はｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｋのプラスミドの作製
ｍｙｃ−ｔａｇをコードするＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩで切断し平滑化したｐＣＩ−ｎｅｏ  ｖｅｃｔｏｒにサブクローニングし、ｐＣＩ−ｍｙｃ  ｖｅｃｔｏｒとした。【００５９】  また、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ−Ｂａｘ（理化学研究所清水史郎先生から供与された。）をＥｃｏＲＩで処理し、それをｐＣＩ−ｍｙｃ  ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｘプラスミドとした。【００６０】  フォワードプライマーとリバースプライマーとを用いて、ｐＣＭＶ−ｂａｋ（大阪大学大学院医学系研究科辻本賀英先生から供与された。）を鋳型にＰＣＲを行い、産物をＥｃｏＲＩで処理し、ｐＣＩ−ｍｙｃ  ｖｅｃｔｏｒのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、ｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｋプラスミドとした。
フォワードプライマー：
2004113367.tif 000019
リバースプライマー：
2004113367.tif 000020
【００６１】５−２  実験
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１×１０５個）を１２穴プレートに播種し、２４時間培養した。その後、ｐＣＩ−ｍｙｃ、ｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｘ、又はｐＣＩ−ｍｙｃ−ＢａｋのプラスミドをそれぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入することによりｍｙｃ、ｍｙｃ−Ｂａｘ、又はｍｙｃ−Ｂａｋを細胞内で過剰発現させた。１７時間培養した後、最終濃度が１００、３００、又は１０００ｎＭとなるようにＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加して更に２４時間培養した。なお、対照として、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加しない細胞も準備した。培養後、トリパンブルー細胞外排出試験法により細胞死を評価した。その結果、図６に示すように、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０は、Ｂａｘの過剰発現により誘導されたアポトーシスを阻害するが、Ｂａｋの過剰発現により誘導されたアポトーシスを阻害できないことが確認できた。以上のことから、ＡＲＴの１３〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドは、Ｂａｘの過剰発現により誘導されたアポトーシスを特異的に抑制することができることが明らかになった。【００６２】［実施例６］ＳＴＳが誘導するＢａｘ依存性アポトーシスに対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の抑制効果
スタウロスポリン（ＳＴＳ）が誘導するアポトーシスはＢａｘ依存性であることが知られている。そこで、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０が、ＳＴＳが誘導するアポトーシスを抑制できるかどうかを検討した。【００６３】  ５×１０４個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞もしくはＨｅＬａ細胞を１２穴プレートに播種し、２４時間培養した。その後、最終濃度が１、１０、１００、３００、又は１０００ｎＭとなるようにＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加して１時間前処理し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞には０．５μＭの、ＨｅＬａ細胞には０．２μＭのＳＴＳを添加して２４時間培養した。なお、対照として、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０及びＳＴＳを添加しない細胞や、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加しない細胞も準備した。培養後、細胞死をトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。その結果、図７に示すように、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において１〜１００ｎＭの濃度で、ＨｅＬａ細胞では１００〜１０００ｎＭの濃度でＳＴＳが誘導するアポトーシスを抑制することがわかった。【００６４】［実施例７］ＳＴＳが誘導するＢａｘのミトコンドリア移行に対するＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の効果
Ｂａｘが細胞死を誘導するためには、Ｂａｘがミトコンドリアに局在することが必須であると考えられている。そこで、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０が、ＳＴＳによるＢａｘのミトコンドリア移行に及ぼす影響を検討した。【００６５】  ＣＯＳ７細胞（４×１０４個）を１２穴プレートに播種して２４時間培養後、１μｇのｐＣＩ−ｍｙｃ−Ｂａｘを遺伝子導入した。その後、更に２３時間培養し、１０００ｎＭのＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加して１時間前処理した。なお、対照として、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０で前処理しない細胞も準備した。さらに、１．０μＭのＳＴＳと１００ｎＭのＭｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製）を添加し、１時間後に細胞を３％のホルムアルデヒド溶液で固定した。なお、対照として、ＳＴＳを添加しない細胞も準備した。その後、抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製：ＴＢＳ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．６）で２５００倍に希釈した溶液）で１時間処理した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８標識抗マウスＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製；３％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ）を含むＴＢＳで２５００倍に希釈した溶液）で１時間処理し、共焦点レーザー顕微鏡で観察することにより細胞内におけるＢａｘの局在を観察した。その結果を図８に示す。
図８に示すように、ＳＴＳで処理した細胞においては、Ｂａｘがミトコンドリアに局在していたが、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０及びＳＴＳで処理した細胞においては、Ｂａｘがミトコンドリアに局在していなかった。このことから、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０により、ＳＴＳが誘導するＢａｘのミトコンドリア移行を抑制できることがわかった。【００６６】［実施例８］ＳＴＳが誘導するアポトーシスに対する、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０、ＴＡＴ−ＡＲＴ１４２０、又はＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０Ｐ１３Ｖの効果
より活性の強いペプチドの開発を目的に、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の改変ペプチドを作製し、ＳＴＳ誘導性アポトーシスの抑制活性を検討した。なお、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の改変ペプチドとしては、ペプチド合成機により作製したＴＡＴ−ＡＲＴ１４２０（配列番号２５）及びＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０Ｐ１３Ｖ（配列番号２６）を用いた。【００６７】  ＨｅＬａ細胞（５×１０４個）を１２穴プレートに播種し、２４時間培養した。その後、最終濃度が１００、３００、１０００ｎＭとなるようにＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０又はその改変ペプチドを添加して１時間前処理した後、０．２μＭのＳＴＳを添加して２４時間培養した。なお、対照として、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０及びＳＴＳを添加しない細胞や、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を添加しない細胞も準備した。）。培養後、細胞死をトリパンブルー細胞外排出試験法により評価した。その結果を図９に示す。
図９に示すように、ＴＡＴ−ＡＲＴ１４２０やＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０Ｐ１３Ｖは、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０に比べて同等もしくはそれ以上にアポトーシスを抑制することが明らかになった。このことから、アポトーシスの抑制活性には、特に、ＡＲＴ配列の１４〜２０番目のアミノ酸配列からなるペプチドが重要であることが明らかになった。【００６８】［実施例９］ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の抑制作用
次に、神経変性疾患などのアポトーシスにより引き起こされる疾患に対する、本発明に係るペプチドの効果を確認するために、スナネズミ両側総頚動脈４分間閉塞による脳虚血モデルを用いて、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０（３，３０ｍｇ／ｋｇ）の再灌流後の神経症状スコアおよび再灌流４日後の脳海馬遅発性神経細胞死に及ぼす影響を検討した。【００６９】９−１  試験動物
１３週齢の雄性スナネズミ（ＳＰＦ、日本エスエルシー）を、温度（２３±２℃）、湿度（５５±１５％）、換気（回数：１５回／時間以上）および照明（１２時間照明：午前６時３０分〜午後６時３０分）がそれぞれ調節されたバリアーシステム動物室で１週間以上予備飼育し、そのスナネズミ（体重６０〜８０ｇ）を試験動物として用いた。なお、飼育は自由摂餌摂水下にて行った。【００７０】９−２  両側総頚動脈閉塞−再灌流
試験動物をエーテル麻酔下で頚正中部皮膚を切開し、両側総頚動脈を露出させて（両側総頚動脈を露出と同時にエーテル麻酔を中止）、動脈クレンメにて両側同時に閉塞し、脳虚血を誘導した。閉塞から４分後に動脈クレンメを取り外し、血流を再開通させて皮膚を縫合した後、すぐにＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０又は生理食塩水を投与し、その後、試験動物が再び活動を始めるまで、試験動物を赤外線ランプで温めた。【００７１】９−３  ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の投与
ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の投与には、３ｍｇ又は３０ｍｇのＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を１０ｍｌの生理食塩水に溶解して調製したものを用いた。投与液量は１０ｍｌ／ｋｇ−体重とした。血流再開通直後に、試験動物に対して、３ｍｇ／ｋｇ−体重又は３０ｍｇ／ｋｇ−体重でＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を尾静脈内投与し、５時間後にもう一回静脈内投与した（３ｍｇ／ｋｇ−体重でＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を投与した試験動物（ｎ＝１３）を３ｍｇ／ｋｇ群と、３０ｍｇ／ｋｇ−体重でＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を投与した試験動物（ｎ＝１３）を３０ｍｇ／ｋｇ群とそれぞれ称する。）。翌日、静脈内投与を皮下投与に切り換え、当量のＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を５時間間隔で２回投与した。それ以後は、１日１回皮下投与した。なお、生理食塩水のみを投与した試験動物（ｎ＝１３；コントロール群）を対照として用いた。【００７２】９−４  症状観察
血流再開通−ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０又は生理食塩水の投与直後から、中枢神経症状（意識障害、痙攣、運動抑制、眼瞼下垂）の観察を開始し、３０分、１、２、４、又は６時間後、およびその後１日１回観察した。各症状の発現の程度及び持続時間により各症状のスコア化を行い、各個体のスコアを算出して集計した。
その結果、脳虚血を伴うコントロール群（ｎ＝１３）では、意識障害、痙攣発作、眼瞼下垂などの神経症状スコアが８．２±１．４であったが、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０を投与した試験動物では、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０の用量依存的に神経症状スコアの低下が見られ、３０ｍｇ／ｋｇ群では特に有意な低下（２．８±０．６，Ｐ＜０．０５）が認められた。【００７３】９−５  脳採材
脳虚血−再灌流４日後に、スナネズミをエーテル麻酔し、経心的に１０％の中性ホルマリン緩衝液を１５分灌流し、脳を固定して全脳を摘出した。摘出した脳は、１０％の中性ホルマリン緩衝液により１日以上浸漬し、十分に固定して以下の実験に用いた。【００７４】９−６  病理組織検査
固定した脳から左右の海馬領域を切り出し、それぞれ厚さ４μｍのパラフィン切片（Ｂｒｅｇｍａ後方約１．５ｍｍの部分）を作製し、クレシル紫（ニッスル小体を染色）とルクソールファースト青（髄鞘を染色）を用いたクリューバー・バレラ染色（ｋｌｕｖｅｒ−Ｂａｒｒｅｒａ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。その後、画像解析装置（ＭａｃＳＣＯＰＥ）を用いて、左右の海馬ＣＡ１領域の長さを計測し、また、顕微鏡を用いて、各切片における生存神経細胞数をそれぞれ計数し、左右の海馬ＣＡ１領域の単位長さ当りの生存神経細胞数の平均値を各個体の生存神経細胞数とした。その結果、図１０に示すように、３０ｍｇ／ｋｇ群における生存神経細胞（ＳＮ）数（７４．５±２３．１）はコントロール群のもの（１５．４±５．２）に比べ遙かに高く、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０が用量依存的に脳海馬ＣＡ１神経細胞死を有意に抑制することがわかった。このことから、ＴＡＴ−ＡＲＴ１３２０は、脳虚血による神経細胞死に対して抑制作用を有することが明らかになった。【００７５】  以上のことから、本発明に係るペプチド、それをコードするヌクレオチド等は、脳虚血モデルスナネズミにおいて、機能障害のみならず細胞死に対しても改善効果を有することが明らかとなり、神経変性疾患などのアポトーシスにより引き起こされる疾患に対する治療、予防、又は進行抑制に有用であると考えられる。
産業上の利用の可能性【００７６】  以上のように、本発明によると、アポトーシスにより引き起こされる疾患や、その疾患の治療、予防、又は進行抑制や、アポトーシス促進活性の抑制などに対して有用な、アポトーシス抑制活性を有するペプチド、ポリヌクレオチド、組換えベクター、細胞またはウイルス、融合ポリヌクレオチド、融合タンパク質、医薬組成物、又はＢａｘのミトコンドリアへの移行を抑制する抑制剤を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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