(57)【要約】  円盤もしくは円筒型支持体の外周側壁上に核酸、ペプチド、糖類、脂質、各種化学物質またはその断片からなるプローブを固定配置したことを特徴とする生物学的チップを構成し、この円盤もしくは円筒の回転により、外周側壁上に配列された複数のプローブ群から得られる計測情報を大量迅速に取り込むことにした。また、円盤もしくは円筒を数多くの薄板としたり、複数の薄板を積層することにより、大量のチップあるいは大容量チップを一括生産することにした。血液検査にはチップ上に孵卵槽を並べた生物学的チップを構成することにより、システムの簡略化と小型化、省資源を実現することにした。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と該支持体表面に固定された生物由来の物質または擬似生物由来物質であるプローブとを有する生物学的チップであって、
前記支持体は、円柱あるいは円筒形状であり、
前記プローブは、核酸、ペプチド、糖類、脂質および細胞からなる群から選ばれた１つの物質あるいは当該物質の断片からなり、前記支持体の外周側壁上に固定されている、生物学的チップ。
【請求項２】
さらに前記プローブが固定されている前記支持体の表面上の位置を示すインデックスマークを有することを特徴とする請求項１に記載の生物学的チップ。
【請求項３】
前記インデックスマークは複数存しており、
前記プローブは複数存しているとともに前記支持体への固定位置も複数存しており、
前記プローブの固定位置は複数の集合に分割されており、
前記各集合が前記インデックスマークによって互いに識別されるように、当該インデックスマークが前記支持体の所定位置に設けられていることを特徴とする請求項２に記載の生物学的チップ。
【請求項４】
前記プローブは複数存しており、少なくとも１つの内部標準プローブ含んでいることを特徴とする請求項１から３のいずれか一つに記載の生物学的チップ。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一つに記載の生物学的チップを複数積み重ねた生物学的チップ積層体であって、
前記円柱あるいは円筒の中心軸が互いに略一致するように前記複数の生物学的チップを積み重ねたことを特徴とする生物学的チップ積層体。
【請求項６】
隣り合う２つの前記生物学的チップの間にはスペーサが設置されていることを特徴とする請求項５に記載の生物学的チップ積層体。
【請求項７】
少なくとも１つの前記プローブと反応を行う検体と、請求項１から４のいずれか一つに記載の生物学的チップまたは請求項５あるいは６に記載の生物学的チップ積層体とを接触させて該プローブと該検体との反応を行わせるインキュベータであって、
前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体を、前記円柱あるいは円筒の中心軸を略水平にして保持するとともに当該中心軸の周りに回転させ、
前記検体の溶液に前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体の鉛直下方に位置する一部を浸漬することを特徴とするインキュベータ。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか一つに記載の生物学的チップまたは請求項５あるいは６に記載の生物学的チップ積層体上の前記プローブに結合している分子の物理的性質、化学的性質及び生物学的性質のうちの少なくとも１つを計測する計測装置であって、
計測部位が前記円柱あるいは円筒の外周側壁に沿って且つ当該円柱あるいは円筒の中心軸の周りに回転することを特徴とする計測装置。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一つに記載の生物学的チップまたは請求項５あるいは６に記載の生物学的チップ積層体上の前記プローブに結合している分子の物理的性質、化学的性質及び生物学的性質のうちの少なくとも１つを計測する計測装置であって、
前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体を前記円柱あるいは円筒の中心軸の周りに回転させて計測することを特徴とする計測装置。
【請求項１０】
計測部位と前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体との間に介在物を有することを特徴とする請求項８または９に記載の計測装置。
【請求項１１】
円柱あるいは円筒形状の支持体と、
前記支持体の外周上に設けられている複数の容器とを備えている、生物学的チップ。
【請求項１２】
前記容器は前記支持体に着脱自在に設けられていることを特徴とする請求項１１に記載の生物学的チップ。
【請求項１３】
前記容器内部に測定試薬が収納されていることを特徴とする請求項１１または１２に記載の生物学的チップ。
【請求項１４】
前記測定試薬は固体であることを特徴とする請求項１３に記載の生物学的チップ。
【請求項１５】
前記測定試薬は、ＧＯＴ，ＧＰＴ、ＬＤＨ，ＣＰＫ，ＡＬＰ，γＧＴＰ、ＬＡＰ、ＢＵＮ、ＣＲＥ、Ｃｈ−Ｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、Ｃａ、Ｐ、Ｆｅ、Ｍｇ、アンモニア、シアル酸、ＢＳ、ＨｂＡ１Ｃ、アミラーゼ、ビリルビン、総蛋白、アルブミン、尿酸、コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ、ＣＲＰ、ジゴキシン、テオフィリン、パルブロ酸、フェニトイン、甲状腺ホルモン、ＴＳＨ、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＧＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、ＡＤＨ、ＡＣＴＨ、レニン活性、アルドステロン、ミオグロビン、ＡＮＰ、ＢＮＰ、エリスロポエチン、インスリン、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１９・９、ＡＦＰを含む分子および遺伝子からなる群から選ばれた物質と特異的に反応して当該物質の存否および量と活性とのうちいずれか一方を判定する試薬であることを特徴とする請求項１３または１４に記載の生物学的チップ。
【請求項１６】
前記複数の容器の内少なくとも１つの容器の内部に複数種類の前記測定試薬が収納されていることを特徴とする請求項１５に記載の生物学的チップ。
【請求項１７】
前記容器の外面には当該容器を他の容器から識別するための識別記号が付されていることを特徴とする請求項１１から１６のいずれか一つに記載の生物学的チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的、生化学的分子間反応を利用して、遺伝子型、遺伝子発現レベル、リガンドーレセプター関係、酵素活性、生体内物質含量など多彩な生命現象の成因と発現様式を解明する生物学的チップとその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
医療やバイオテクノロジー分野において生物のゲノム、プロテオーム、トランスクリプトームなどの検討が活発になってきた。生命活動は単純な化学反応の組み合わせでは決して表現し尽くせない多彩かつ複雑な事象であるが、可能な限り生命現象の本質に近づくためには同時に多種大量の分子情報を獲得することが必須である。【０００３】
よって、遺伝子の配列や発現を一括評価するためのＤＮＡ、プロテインチップを含む生物学的チップとこれらの計測系が実用化されている。このような生物学的チップの例としては、米国特許公報５７４４３０５号に記載されているチップを挙げることができる。【０００４】
通常ＤＮＡチップ は、ＤＮＡプローブの１つである所定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを適当な間隔で、板状の基板にスポット状に固定化したものである。【０００５】
支持体（板状の基板）としては、ガラス基板、シリコン基板、プラスチック基板などが用いられている。これらのうちもっとも広く用いられているのは、顕微鏡用のスライドガラス支持体である。【０００６】
一つのＤＮＡチップ全体では、プローブであるスポットは５０μｍ〜５００μｍの間隔で平面上にマトリクス状に配列されている。各スポットに含まれるオリゴヌクレオチドは、スポット毎に互いに異なるヌクレオチド配列を有している。【０００７】
支持体上にオリゴヌクレオチドを設置する方法としては、基板上で一塩基ずつ、オリゴヌクレオチドを伸長させながら固定化する方法と、あらかじめ別途合成させておいたオリゴヌクレオチドを基板上に固定化する方法がある。前者の代表的な方法は、フォトリソグラフィー技術であり、後者の方法にはメカニカルマイクロスポッティング技術がある。インクジェット技術はどちらの方法にも使用される。【０００８】
フォトリソグラフィー技術は、（Fordor等、Science,２５１号、７６７頁（１９９１年）参照）光反応性保護基を利用する。以下、フォトリソグラフィー技術によるスポット（プローブ）形成について説明する。【０００９】
まず、基板全面に前記光反応性保護基を有するアミノ基を固定化させておく。次に、所望の塩基を結合させたいスポットにのみ、通常の半導体製造プロセスで使用されるフォトリソグラフィー技術を使って、選択的に光照射を行う。光を照射されたスポットでは、光反応性保護基とアミノ基との結合が切れてアミノ基だけが残る。ここに、同じ保護基を末端に有する所望の塩基を結合させる。そして、フォトマスクの形状を変更して、別のスポットに選択的に次の光照射を行う。このあと、同様にして、保護基を有する塩基を結合させる。この一塩基伸長させる工程を全スポットにおいて、所望の塩基配列が得られるまで繰返すことによって基板上に互いに異なる複数のオリゴヌクレオチドが整列配置される。【００１０】
一方、インクジェット法は、熱、圧電効果を利用し非常に小さい液滴を２次元平面の所定の位置に射出する技術である。ＤＮＡチップの製造では、液体チャンバーに接続された圧電素子に電圧を加えることにより、圧電素子の体積の変化によってチャンバー内の液体が接続されたキャピラリーから液滴となって射出される。射出される液滴の大きさは、キャピラリーの径、圧電素子の体積変化量、液体の物理的性質によって決定される。【００１１】
インクジェット装置を使ったＤＮＡチップ製造装置は、インクジェット装置とＤＮＡチップ基板とを相対運動させることにより、ＤＮＡチップ上の所望のスポットに所望の液滴（例えばある種の塩基など）を滴下することができる。インクジェット装置を使ったＤＮＡチップ 製造装置には、大きくわけて２種類ある。１つは１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡチップ製造装置であり、もう１つはマルチヘッドのインクジェット装置を用いた方式である。【００１２】
１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡチップ製造装置は、オリゴマー末端の保護基を除去する試薬を所望のスポットに滴下する構成になっている。所望の塩基を導入したいスポットの保護基を、このインクジェット装置を用いて除去して活性な状態にした後、ＤＮＡチップ全体に所望の塩基の結合反応操作を実施する。この際、インクジェット装置からの試薬の滴下によって、末端が活性化したオリゴマーを持つスポットのみに所望の塩基が結合する。この後、新たに付加した塩基の末端を保護する操作を行う。次に、保護基を除去するスポットを変更してこの操作を所望のヌクレオチド配列が得られるまで繰返す。【００１３】
マルチヘッドのインクジェット装置を用いたＤＮＡチップ製造装置は、各塩基を含む試薬毎にインクジェット装置を用意することによって、各スポット毎に所望の塩基を直接結合させることができる構成になっており、前述した１台のインクジェット装置を用いたＤＮＡチップ製造装置よりも高いスループットが得られる。【００１４】
また、あらかじめ合成したオリゴヌクレオチドを基板に固定化させる方法のうち、メカニカルマイクロスポッティング技術は、ステンレス製のピンの先端についたオリゴヌクレオチドを含む液体を機械的に基板上に押し付けて固定化していく技術である。マイクロスポッティング後には、ＵＶ光による固定化等の後処理が行われる。【００１５】
以上のようにして作製されたＤＮＡチップを用いて、次のようにして検査対象の注目部位のヌクレオチド配列を計測する。【００１６】
前述のようにオリゴヌクレオチドプローブが固定化されたＤＮＡチップにサンプルＤＮＡやＲＮＡを添加する。検体であるＤＮＡ、ＲＮＡは、あらかじめ増幅され、蛍光物質によるラベルが施されている。【００１７】
液相下において、サンプル中のＤＮＡ配列がＤＮＡチップに固定化されたオリゴヌクレオチドの配列と相補関係（アデニンとチミン、シトシンとグアニン間の対応関係）にあると、検体中の塩基とチップ上の塩基間に水素結合による部分二重鎖が形成される。すなわちハイブリダイゼーションを生ずる。【００１８】
ハイブリダイゼーションの後、捕らえられなかったサンプル中のＤＮＡを洗浄、除去する。これにより、サンプル中のＤＮＡのうち、プローブオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するもののみがプローブ存在部位で蛍光を発生する。ラベリングには、蛍光物質の他に放射性同位元素を使用することもある。【００１９】
ハイブリダイゼーションの結果は、アレイ リーダーにより、各プローブ存在領域の蛍光強度を測定して定量する。アレイ リーダーの測定方式には、大きくわけて二種類ある。ＣＣＤカメラを使用して同時に複数スポットの蛍光強度を測定する方式と、コンフォーカルレーザ顕微鏡を使用して生物学的チップ 上を２次元走査して測定する方式とである。コンフォーカルレーザ顕微鏡の光検出器には、光電子倍増管や、アバランシェフォトダイオードが使用されている。【００２０】
照射した励起光の強度に較べて、検体にカップルした蛍光物質からの蛍光強度は有意に小さいので、測定にはダイクロイックミラーによる波長分離や、励起光と蛍光を空間的に分離するビームスプリッタが使用される。蛍光強度の測定は、強度の校正が不要なことから、２波長以上で行われることが一般的である。ＣＣＤカメラを用いた方式では、励起光の光源にランプを使用し、広い面積を１度に励起する。コンフォーカルレーザ顕微鏡を使用する方式では、励起光の光源にレーザを使用し、集光したレーザスポットの内部のみを励起する。【００２１】
従って、ＣＣＤカメラを用いた方式では、約１平方ｃｍ程度の広い領域を１度に測定できるのに対して、コンフォーカルレーザ顕微鏡を用いた方式では、１度に直径５〜３０μｍ程度の領域しか測定できない。また、コンフォーカル方式では、ＤＮＡチップまたは、顕微鏡ヘッドの２次元走査が必要となるため、読み取りのスループットが低下する。この２次元走査は、基板の載ったステージをＸとＹの２軸方向に走査することで実現する。典型的な走査時間は、２０ｍｍ×６０ｍｍの領域を１０μｍの解像度でスキャンした場合で５〜１５分程度必要である。【００２２】
一方、コンフォーカル方法では、蛍光発生深度の絞り込みによって、ノイズ光やフレアを取り除くことができ、ＣＣＤ方式に比較して高いＳ／Ｎ比が得られる。【００２３】
測定されたＤＮＡチップ上の蛍光強度分布は１６ビット程度の情報量を有する２次元の画像データとして出力される。この際、画像判定を容易にするために、擬似色付け処理が行われる場合もある。出力された画像内で蛍光強度が高いスポットは、検体中に該スポットのオリゴヌクレオチドの配列と相補的なｃＤＮＡ配列が多く含まれていることを示す。したがって、どのスポットの蛍光強度が大きいかによって検体に多く発現した遺伝子群を調べたり、注目遺伝子のヌクレオチド配列を知ることができる。【００２４】
プロテインチップとしては、レセプターとリガンド関係、抗原と抗体関係、酵素と基質関係、薬剤と作用点分子関係、など様々な様態への応用が試行されているが、二次元平面にプローブをならべたり、一次元的にプローブを展開したものが多く、反応条件、計測手技の煩雑さや評価方法についても問題点がある。【００２５】
血液生化学領域でのアッセイではオートサンプラーによるサンプルと試薬の混合とライン制御による搬送系と計測系のすべてを備える場合が多く、大容量の血液、高価で複雑な機材や多量の試薬を要し、大量の廃棄物を発生する問題がある。【００２６】
−発明が解決しようとする課題−
従来の生物学的チップでは主として平面上に展開されたマトリックス構造を形成し、基本的にシングルチップ毎に作成する手間をかけるため、チップ製造段階に多大な資源や作業、時間を要している。また、同じ手順を踏む解析システムでも、高速で精度の高い計測が困難であった。本願では大量かつ安価に生産可能であり、計測解析においても高性能でハイスループットな生物学的チップおよびそれを利用したシステムを提供することを課題とする。また、各種血液検査にはオートアナライザーが用いられるが、機器が高価であり、故障も避けがたいうえに、試薬の使用量も大量である。従って、省経費と省資源の観点から、生物学的チップによるあらたな血液検査システムを創出することをさらなる課題とする。
【発明の開示】
【００２７】
本発明の第１の生物学的チップは、支持体と該支持体表面に固定された生物由来の物質または擬似生物由来物質であるプローブとを有する生物学的チップであって、前記支持体は、円柱あるいは円筒形状であり、前記プローブは、核酸、ペプチド、糖類、脂質および細胞からなる群から選ばれた１つの物質あるいは当該物質の断片からなり、前記支持体の外周側壁上に固定されている。擬似生物由来物質としては、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、合成ペプチド、合成ポリヌクレオチド、合成糖鎖およびこれらの複合体を含む機能物質などを挙げることができる。ここで、生物由来の物質は、その起源が微生物、リガンド、ヌクレオチド、抗体、抗原、蛋白質、ペプチド、炭水化物、多糖類、受容体、薬剤標的、植物あるいは動物細胞、細胞小器官、細菌、病原菌、抗生物質、薬剤、毒物、天然生成物、試験化合物及びこれらの断片からなる群から選択される対象物質に由来するものであることが好ましい。また、プローブは、印刷、描画、吹き付け、張り付け、巻き付け、吸着、各種化学反応または当該部位における合成により支持体に固定されることが好ましい。また、この生物学的チップを中心軸に垂直に切断することにより複数の第２の生物学的チップを作成してもよい。
【００２８】
さらに前記プローブが固定されている前記支持体の表面上の位置を示すインデックスマークを有することが好ましい。
【００２９】
ある好適な実施形態において、前記インデックスマークは複数存しており、前記プローブは複数存しているとともに前記支持体への固定位置も複数存しており、前記プローブの固定位置は複数の集合に分割されており、前記各集合が前記インデックスマークによって互いに識別されるように、当該インデックスマークが前記支持体の所定位置に設けられている。
【００３０】
前記プローブは複数存しており、少なくとも１つの内部標準プローブ含んでいることが好ましい。ここで内部標準プローブとは、生物学的チップと反応させるサンプル溶液に添加しておく内部標準物質とのみ反応し、サンプル物質とは反応しないプローブである。
【００３１】
本発明の生物学的チップ積層体は、前記の生物学的チップを複数積み重ねた生物学的チップ積層体であって、前記円柱あるいは円筒の中心軸が互いに略一致するように前記複数の生物学的チップを積み重ねたことを特徴とする。
【００３２】
隣り合う２つの前記生物学的チップの間にはスペーサが設置されていることが好ましい。
【００３３】
本発明のインキュベータは、少なくとも１つの前記プローブと反応を行う検体と、前記の生物学的チップまたは前記の生物学的チップ積層体とを接触させて該プローブと該検体との反応を行わせるインキュベータであって、前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体を、前記円柱あるいは円筒の中心軸を略水平にして保持するとともに当該中心軸の周りに回転させ、前記検体の溶液に前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体の鉛直下方に位置する一部を浸漬する。
【００３４】
本発明の第１の計測装置は、前記の生物学的チップまたは前記の生物学的チップ積層体上の前記プローブに結合した分子の物理的性質、化学的性質及び生物学的性質のうちの少なくとも１つを計測する計測装置であって、計測部位が前記円柱あるいは円筒の外周側壁に沿って且つ当該円柱あるいは円筒の中心軸の周りに回転する。ここで物理的性質とは発光の強さや吸光度、電導度などであり、化学的性質とは特定の試薬との反応性など、生物学的性質とは所定の酵素による産生物の種類などを例示できる。
【００３５】
本発明の第２の計測装置は、前記の生物学的チップまたは前記の生物学的チップ積層体上の前記プローブに結合した分子の物理的性質、化学的性質及び生物学的性質のうちの少なくとも１つを計測する計測装置であって、前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体を前記円柱あるいは円筒の中心軸の周りに回転させて計測する。
【００３６】
計測結果を各プローブ固有の生物学的意義と照合して、評価結果を表示することが好ましい。また、前記生物学的チップ積層体の計測において、複数の生物学的チップのプローブ部を同時に計測することが好ましい。
【００３７】
計測部位と前記生物学的チップまたは生物学的チップ積層体との間に介在物を有することが好ましい。介在物としては、膜、板、棒、粉体などを挙げることができるが、特に膜が好ましい。ここで膜とは、感光性素材、輝尽発光体、発光体と感光素材のコンポジットまたはフィルターであることが好ましい。
【００３８】
本発明の第２の生物学的チップは、円柱あるいは円筒形状の支持体と、前記支持体の外周上に設けられている複数の容器とを備えている。この容器は孵卵槽であることが好ましい。ここで容器中で反応を行った後に、容器中の反応物質を顕微測光方式およびコンフォーカル方式の少なくとも一方による吸光度計測を行うことが好ましい。この場合、容器が透光性であると、容器外から計測を行うことができ好ましい。
【００３９】
前記容器は前記支持体に着脱自在に設けられていることが好ましい。
【００４０】
前記容器内部に測定試薬が収納されていることが好ましい。
【００４１】
ある好適な実施形態において、前記測定試薬は固体である。
【００４２】
前記測定試薬は、ＧＯＴ，ＧＰＴ、ＬＤＨ，ＣＰＫ，ＡＬＰ，γＧＴＰ、ＬＡＰ、ＢＵＮ、ＣＲＥ、Ｃｈ−Ｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、Ｃａ、Ｐ、Ｆｅ、Ｍｇ、アンモニア、シアル酸、ＢＳ、ＨｂＡ１Ｃ、アミラーゼ、ビリルビン、総蛋白、アルブミン、尿酸、コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ、ＣＲＰ、ジゴキシン、テオフィリン、パルブロ酸、フェニトイン、甲状腺ホルモン、ＴＳＨ、ＨＢｓ抗原、ＨＣＶ抗体、ＧＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、プロラクチン、ＡＤＨ、ＡＣＴＨ、レニン活性、アルドステロン、ミオグロビン、ＡＮＰ、ＢＮＰ、エリスロポエチン、インスリン、ＰＳＡ、ＣＥＡ、ＣＡ１９・９、ＡＦＰを含む分子および遺伝子からなる群から選ばれた物質と特異的に反応して当該物質の存否および量と活性とのうちいずれか一方を判定する試薬であることが好ましい。上記の群に含まれる物質以外でもヒトの疾病を発見する指標となる物質やヒトの健康状態の良否を示す指標となる物質と特異的に反応して当該物質の存否および量と活性とのうちいずれか一方を判定する試薬であってもよい。
【００４３】
前記複数の容器の内少なくとも１つの容器の内部に複数種類の前記測定試薬が収納されていることが好ましい。
【００４４】
前記容器の外面には当該容器を他の容器から識別するための識別記号が付されていることが好ましい。例えば患者ＩＤ情報と計測物質の種類、計測日時を登録しておけば有用である。
【００４５】
以上説明したように、本発明による生物学的チップは、円柱あるいは円筒の外周側壁をプローブや反応容器として利用しているので多種類のプローブや反応容器を一つのチップ上に容易に且つ短時間に製作することができるとともに、サンプルとの反応や反応後の測定も容易にかつ短時間で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】第１の実施形態に係る円盤型生物学的チップの概略斜視図である。
【図２】第２の実施形態に係る多層の円盤型生物学的チップの概略斜視図である。
【図３】第３の実施形態に係る生物学的チップ積層体の概略斜視図である。
【図４】第２の実施形態に係る生物学的チップ積層体のインキュベータの概略図である。
【図５】（ａ）第４の実施形態に係る生物学的チップの模式図であり、（ｂ）孵卵槽の待ち行列の模式図である。
【図６】第２の実施形態に係るＤＮＡチップ読み取り装置の要部概略図である。
【図７】第２の実施形態に係る別のＤＮＡチップ読み取り装置の要部概略図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
まず本願の特徴を実施形態によって概観する。【００４８】
ある実施形態においては、円盤もしくは円筒型支持体の外周側壁上に核酸、ペプチド、糖類、脂質、各種化学物質またはその断片からなるプローブを固定配置したことを特徴とする生物学的チップを作成し、この円盤もしくは円筒の回転により、外周側壁上に配列された複数のプローブ群から得られる計測情報を大量迅速に取り込むことを行う。また、円盤もしくは円筒を数多くの薄板としたり、複数の薄板を積層することにより、大量のチップあるいは大容量チップを一括生産することを行う。また別の実施形態では、血液検査においてチップ上に孵卵槽を並べた生物学的チップを使用することにより、システムの簡略化と小型化、省資源を実現する。【００４９】
円盤もしくは円筒状構造体の外周側壁上において円盤あるいは円筒の中心軸と平行にプローブを線状に連続固定した後、続いて中心軸を中心として円盤もしくは円筒を一定の角度回転させる。そして、再び外周側壁上において該中心軸と平行に次のプローブを線状に連続固定してゆく。この作業を円盤あるいは円筒の回転が３６０度に達するまで反復することにより、単一工程で広い領域にわたり多種類のプローブ固定をおこなう。【００５０】
事前に、円筒もしくは円盤を薄板積層構造としておいてプローブ固定後にこれをほぐせば、あるいはプローブ固定後の円筒もしくは円柱を薄切すれば、簡単に大量の同一構成のチップを得ることができる。【００５１】
フォトリソグラフィーによりプローブを固定する場合も同様に、一種類の核塩基について、円盤あるいは円筒の中心軸に平行に光を照射して光反応性保護基を除去し、該円盤あるいは円筒を中心軸の周りに定められた角度または距離分を回転させる。そして再び光処理し、再度回転させる。この一連の作業を円盤あるいは円筒が一周するまで繰り返した後、光反応性保護基が除去された部分に特定の塩基を結合すればよい。この場合、光照射に用いるフォトマスクは直線状の一種類で済む。【００５２】
塩基については、それぞれ光反応性保護基により保護されたアデニン、グアニン、シトシン、チミンを溶液中に分散してある４種類の連続書き込み用ユニットを代わる代わるライン上にもちこんで描画すればよい。同様に、平面上で作業する場合には、ロールに巻き込まれた短冊状または糸状の支持体を平面状に整列させて、短冊状または糸状の支持体の長手方向に直交する方向にプローブを固定してゆく。支持体の端までプローブを固定し終わったら、支持体を既定の距離分ずらしてからあらたなプローブを短冊状または糸状の支持体の長手方向に直交する方向に固定する作業を繰り返す。最後に短冊または糸を分離して、一工程で多数のチップ構成パートを作成する。このようにして平面もしくは円筒上に多種類のプローブ配列を形成できる。さらには、円盤あるいは円筒外周表面にプローブを形成する場合、同時に複数のプローブ固定装置を円盤あるいは円筒の中心軸に平行に特定の間隔をおいて移動させながら円盤あるいは円筒を回転させると、作業の効率を一層高めることになり好ましい。【００５３】
また、多種類のプローブが固定された円盤もしくは円筒を何種類か積層して大情報量の生物学的チップを構成することも好ましい形態である。プローブ固定部位の配置と順序の同定のためには、円盤あるいは円筒にいくつかのラベリングを施すことが好ましい。積層の各層間における歪みやずれの修正のためには、円盤あるいは円筒にいくつかの切れ目か凹凸による噛み合わせを設けることが好ましい。各層間に異種素材のスペーサーまたはメッキ、スパッター等によるコーティングを設置して、各層の分離、識別、絶縁等を容易にすることも好ましい。【００５４】
上記のような円盤もしくは円筒の外周側壁上において縦横にプローブが規則的かつ精細に配置された生物学的チップをサンプル液と反応させるとき、様々な反応過程において、従来のＤＮＡチップのように平面上でインキュベートする場合と比べ、円盤もしくは円筒の回転を利用することにより少量のサンプルや液量で工程を賄うことのみならず、安定かつ高感度の計測を行うことが可能となる。【００５５】
また、計測においても、円盤あるいは円筒上に配置されたプローブと検体との生物学的もしくは物理化学的反応の結果を、円盤あるいは円筒の回転、または円盤あるいは円筒の周辺に設置した計測器の円盤あるいは円筒周りにおける移動により解析する生物学的チップおよび計測機器をシステム構成することにより、従来法に比べて単純簡略かつ精緻に測定系を成立する事が出来る。【００５６】
プローブと検体間における生物学的もしくは物理化学的反応の結果は、ディティクションチップによって計測すればよい。このディティクションチップは円筒あるいは円盤形状であってその外周側壁上に一つ以上の突起を設けたものとすることが好ましい。そして、この突起が円筒もしくは円盤状生物学的チップの外周側壁上におけるプローブに対向するように、ディティクションチップを該生物学的チップの近傍に設置することが好ましい。生物学的チップのプローブが該チップの中心軸方向において複数並んでいる場合は、ディティクションチップの突起はプローブの数に対応した数だけ設けられていて、各プローブと各突起とが一対一に対応して対向するように生物学的チップとディティクションチップとを向かい合わせて置くことが好ましい。さらには、生物学的チップとディティクションチップとの間にフィルター膜を介在させて、光学的、電気的、化学的、物理的、または生物的検出手段により解析する計測解析機器およびシステムを構成すれば平面状の生物学的チップを計測・解析するのと比べて精度と感度、操作の容易さの点で遙かに有用となる。【００５７】
少なくとも、プローブとサンプルとの反応結果の計測においても、円盤もしくは円筒を軸を中心とした回転および中心軸に沿った直線運動のみの、シンプルな計測システムを構築できる。また、検体が多数となっても連続的に計測を継続することも可能となる。すなわち、円盤状の生物学的チップを複数重ねた積層構造においては、各層のプローブ配置部位を一直線上に整列させておけば、ラインスキャン方式で高速にデータアクイジションを行うことができる。さらに、上述の円盤もしくは円筒の外周側壁を用いる方式によれば、チップの回転と一直線移動の組み合わせのみで全プローブ領域のスキャンが容易にかつ高速に行うことができるので、サンプルとプローブの結合前のプレスキャン、サンプル結合時のアッセイスキャン、サンプル剥脱後のポストスキャンを速やかに行って、真のプローブへのサンプル結合をより忠実に反映している測定値の獲得ができる。【００５８】
上述した方法によって獲得されて、解析されたプローブとサンプルとの各種反応結果は、個々の結果が単なる孤立した情報として存在するのでは殆ど意義を発揮できない。つまり上記の各種反応結果は、プローブ群固有の特性と照合して生物学的意義を検定導出する解析装置およびソフトウェア、また複数のサンプルとの反応結果を互いに比較することと連結して始めて、生命現象を理解して様々な介入手段を講ずる上で非常に重要な情報となる。すなわち、上記各種反応結果を優秀な情報解析システムと連結することはシステムの全体価値をはるかに高めることになる。さらに、多数のサンプルを取り扱う場合には複数の平行処理を同時に実行することが時間的また資源的な経費削減と正確な相対評価のために有用である。【００５９】
生物学的チップを用いた検査において、血液生化学検査、すなわち酵素活性など反応過程または結果の判定に精細な定量や濃度評価を要する場合には、単にチップを液中に浸すのみでなく、反応に関与する溶液の正確な液量と物質濃度の設定が要求される。ことにチップというスモールスケールの反応系の場合は僅かな誤差も大きな計測値変動に帰結する。従って、均一の形状、均一容量かつ小容量の孵卵槽をチップの円周に規則的に配置することは、従来のオートサンプラー方式によってサンプルや反応液を注入して反応・計測する場合に比べて、極めて小さなシステム内で極少量のサンプルによって、正確かつ迅速な反応と結果検定を実行するために有用である。【００６０】
このとき、反応計測システムを正確にかつ単純化するためには各種反応溶液を専用製造手段によって孵卵槽に事前収納しておくことが役立つ。一段階反応の場合は微少で精細な一定量の各種反応溶液を孵卵槽にそれぞれ収納しておく。【００６１】
二段階反応を要する場合は隔壁を設けた二槽式の孵卵槽を設け、ひとつの孵卵槽にて第一反応を実施した後、隔壁を破壊して第二反応をすすめるか、二段階目の試薬を収納した易破壊性収納器を破裂させてもよいし、インクジェット方式やマイクロピペット方式などで第二試薬を投入しても良い。孵卵槽内において少量の液体を混和するためにはバイブレーターや音波などによる振動を与えることや遠心回転が役立つ。孵卵槽を有するチップシステムにおいて吸光度法による計測の場合は透光性素材からなる孵卵槽壁を透かして計測しても良いし、ミニサンプラーで採取した反応液の吸光度をキュベット内等で計測しても良いし、吸光度を計測するマイクロプローブを孵卵槽内の反応液中へ挿入しても良い。計測方法としては、計測部位を確実に溶液中に求められるコンフォーカル法も好ましい。【００６２】
生物学的チップにおいて、反応試薬などとサンプルを液層にて反応させる必要があるが、液体の試薬は保存中に蒸発したり、経時的に活性が低下することが問題となる。ここで、凍結乾燥などにより、当初より孵卵槽に固層の必要試薬を投入してあれば、単にサンプルあるいはその希釈液を加えるのみで、正確な量と活性を維持した試薬により反応が進行する。二段階反応の場合は、隔壁を設けて第二反応開始時に隔壁を破いたり、浸透圧などで破裂する第二液の収納部を設ける方法でもよいし、またはインクジェット方式やマイクロピペット方式などで第二試薬を投入しても良い。【００６３】
また、免疫学的物質捕捉法（ＥＬＩＳＡ）を行う場合には、第１抗体を固定したチップをサンプルとインキュベートした後、洗浄を経て酵素標識された第２抗体と再度インキュベートし、洗浄後の光化学反応を計測する。【００６４】
各種医学生物学的アッセイにおいて、解析項目は多種類のなかから選択することが多い。この場合、多種類の異なる反応を行う孵卵槽を用意して着脱式孵卵槽の組み合わせにより解析項目を選択すれば、無分別に項目を選ぶ時と違い、不必要なサプライ消費を防止できるし、計測の無駄も省けることになる。また、電解質、肝機能、腎機能、心筋傷害、などに特有の解析項目をまとめてこの解析項目に対応する孵卵槽を各ブロックにまとめておき、これを数種類組みあわせて全解析項目を構成するのも便利である。【００６５】
生物学的チップにおいて着脱式孵卵槽を装着した場合、孵卵槽に自身を表示する機能がなければ、どの槽がどの患者の何の項目を計測しているのか認知することが困難となる。ここで、サンプルの由来と解析項目、検査日時などを孵卵槽にラベル表示しておけば、複数の人物の異なる種類の解析項目を同時に並行して計測することが可能となる。この場合、孵卵槽へのラベル表示は孵卵槽にラベルを貼付しても良いし、孵卵槽に直接印刷してもよい。【００６６】
また、円盤もしくは円筒の外周側壁上に複数のプローブを配置した生物学的チップにおいては、各種プローブ固定部位が円盤もしくは円筒の回転方向に沿って外周側壁上に等間隔に区画分けされ、各区画毎に互いに異なるプローブ種同定用マークを設け、さらに、プローブ固定部位には円盤もしくは円筒の回転方向に沿って、プローブ固定部位を呈示するインデックスマークを設けておくので、このインデックスマークを読み取って認識することにより計測すべきプローブ種の部位を事前に判定できるので、計測精度の向上のみでなく、連続計測の確度とスピードを飛躍的に向上できる。【００６７】
さらに、積層された円筒もしくは円盤構造については層間を認識できる標識また各層を区分する異素材の挿入を施し、プローブ固定領域を前記標識に沿って配置構成しておけば、外周側壁上の縦横に規則的かつ精細な配置構成がもたらされる。【００６８】
また、反射表面を呈する積層型円筒もしくは円盤の外周側壁表面に形成されているプローブ種の固定部位を示すマーク（インデックスマーク）と層間標識（トラッキングマーク）と、前記外周側壁の表面に積層されている透明部材と、該透明部材の表面にＤＮＡプローブが固定化されている複数の計測部位とを有し、計測部位は、前記層間標識とインデックスマークに沿って配列し、且つ配列している方向に対して区画分けされており、前記インデックスマークは前記区画毎に形成されているとともに前記区画毎に互いに異なり、且つ読み取り可能に記録されていることを特徴とする生物学的チップを構成すれば、光学的スキャンを一層容易かつ正確にできる。【００６９】
さらに、円筒もしくは円盤構造体の外周側壁表面にプローブが固定された生物学的チップをその中心軸周りに回転させることによって前記プローブ固定部位の走査を行うことを特徴とする生物学的チップ読み取り装置も実施形態に含まれる。円筒もしくは円盤構造体の外周側壁表面にプローブが固定された生物学的チップを回転させることによってプローブ固定部位の走査を行い、プローブ固定部位の走査の際にトラッキングマークに追従するトラッキングサーボ機能を有し、且つプローブ固定部位走査の際にインデックスマークに従ってプローブ固定部位を独立に読み取ることを特徴とする生物学的チップ読み取り装置であれば好ましい装置である。さらに、生物学的チップの回転に伴う、読み取りヘッドと前記生物学的チップの円盤あるいは円筒との距離変動に追従するフォーカシングサーボ機構を備えるているとより好ましい。【００７０】
また、円筒もしくは円盤構造体の外周側壁表面にプローブが固定された生物学的チップを固定し中心軸周りに回転させる回転機構および回転軸に平行してチップ位置を変化させる移動機構と、光源と、該光源から出射される光を生物学的チップに照射する照射光学系と、生物学的チップ上に照射する光源と生物学的チップとの相対的な位置を変化させる相対位置移動装置と、生物学的チップからの反射光を検出する反射光検出光学系と、生物学的チップのプローブ固定部位からの蛍光を検出する蛍光検出光学系と、これらの装置や機構、光学系等を制御する制御装置とを有し、反射光検出光学系は、生物学的チップに形成されているプローブ設置部位表示マーク（トラッキングマーク）に基づき制御装置によって位置制御されるトラッキングサーボ機能と、生物学的チップに形成されているインデックスマークに基づき制御装置によりインデックスの読み出しを行う機能とを有し、蛍光検出光学系は、光検出器と、該光検出器へ蛍光を選択的に通過させるアパチャーとを有し、光検出器からの信号が制御装置に入力し、プローブ部位走査の際にインデックスマークに従って特定のプローブ存在部位からの情報を独立に読み取ることを特徴とする生物学的チップ読み取り装置も実施形態に含まれる。また、反射光検出光学系は、生物学的チップの回転に伴う生物学的チップの表面形状の変動に追従するフォーカシングサーボ機能を更に有することを特徴とする生物学的チップ読み取り装置も実施形態に含まれる。【００７１】
さらに上記の生物学的チップ読み取り装置において、円盤型もしくは円筒型チップに対面する読みとり用ドラムを配置して当該チップとともに回転させ、該ドラムのチップとの接触面を特定の領域に限定して連続的にデータ計測することにより、プローブから得られる情報の感度、精度の向上、バックグラウンドの低下を実現した計測を行うことができる。つまり、チップ側と読み取り側の接触が接線上に限定されるためノイズの減少とバックグラウンドの設定が確実になる。このとき、チップと読みとり用ドラムとの接触面にはフィルター膜構造を介在させたり、フィルター自体を計測用媒体とできる。チップ側、フィルターまた対面するドラム側素材の構成素材として、カーボンナノチューブ、有機発光物質、金属質粉や膜、などの物質独特の性質が顕著な、感光媒体、輝尽発光体、導電成分、発光基質、接着物質、絶縁物質、などを採用すれば、光学的、電気的、物理的、化学的、生物学的等の検出手段によって、容易に感度よくプローブ領域からの計測情報を収集できるため好ましい。【００７２】
生物学的チップと読みとり用ドラム、またはチップと介在膜と読みとり用ドラムとは接触した状態としておくと、いずれかを回転もしくはスクロールすることによりチップの外周側壁からの情報を円周方向に沿って順次収集できるため好ましい。すべり防止のためには、柔構造をくみあわせることが役立つ。【００７３】
以下に、本発明による実施の形態を具体的に説明するが、本発明はこれらに限られるものではない。【００７４】
（第１の実施形態）
図１は本発明の第１の実施の形態の生物学的チップ４１を示す概略構成図である。【００７５】
生物学的チップ４１は、直径２ｃｍの円盤状であり、中心部に回転用のスピンドルに固定するための穴３が空いている。本実施形態の生物学的チップ４１はＤＮＡチップである。【００７６】
支持体である円盤は厚さ約５ｍｍのポリカーボネート製である。即ちこの生物学的チップ４１は、厚みは薄いが円柱形（中心部に穴３があるので、円筒形とも言える）である。ポリカーボネート製の円盤の外周側壁上部には、インデックスマークである窪み１及び下部には塗装によるトラッキングマーク２が形成され、プローブ４は円盤の中心軸に平行に、直線状に外周側壁に固定されている。インデックスマークである窪み１は外周側壁に複数形成されていて円盤の周方向において互いに離間しているもの同士は互いに識別されるように形状や深さなどが異なっている。なお、図１では隠れて見えていないインデックスマークがある。ここでインデックスマークとは、チップ上に配列されたプローブ４群の並び方と存在部位とを呈示するものであり、本実施形態のように多数のプローブ４が存在する場合には、これらのプローブ４が複数の集合に分かれていてこの集合同士の間にインデックスマークが形成されていて、各集合はインデックスマークによって互いに識別できるようになっている。つまり、複数のインデックスマークは互いに識別可能に形成されているため、これらのインデックスマークと対応して識別されるプローブ４の集合も互いに識別可能となるのである。また、トラッキングマーク２は、後述する信号の読み取り時に適正なプローブ位置を認識するための位置決めマークとして働くものである。【００７７】
円盤の外周側壁表面には反射膜である厚さ５００ｎｍのアルミ反射層が蒸着されている。これにより、円盤の外周側壁表面は反射面になっている。トラッキングマーク２の幅は２０μｍであり、窪み１の深さは、インデックスの読み出しに使用する光源の波長の約１／４に設定している。アルミ反射層の上には、透明部材であるガラスの層が５０μｍの厚さで積層されている。本実施形態のＤＮＡチップ４１ではガラスの層の材料はホウ珪酸ガラスであり、スパッタにより成膜されている。【００７８】
プローブ（ＤＮＡプローブ）４は、ガラスの層の表面に複数設置されており、窪み１部分以外の部分では隣接するプローブ４間は等間隔となっている。上述のように複数のインデックスマーク１によって複数の区画に区切られており、一つの区画にはインデックスマーク１と９６個のプローブ固定領域とが配置されている。このように、領域は配列の列方向に区画分けされ、各区画毎に割り振られたインデックスマークを有している。【００７９】
ここでプローブ設置領域の内の一つにブランクのプローブを設置し、別の一つに内部標準用に定められた人工的なプローブを設置し、後述の工程において内部標準用のプローブとのみ反応する合成ヌクレオチドをサンプルに一定量加えておくと、サンプル溶液とのハイブリダイゼーションの工程を経て測定を行うときに、ブランク部分は計測値が０となり、内部標準部分は規定の標準値とすることができるので計測値を保証できる。なお、ブランクというのはＤＮＡ等のサンプルと反応する物質以外の物質のことであり、例えばサケ精子ＤＮＡの溶解液のようなバッファー溶液を挙げることができる。【００８０】
次に、フォトリソグラフィーにより生物学的チップであるＤＮＡチップ４１を作製する方法の詳細を示す。【００８１】
まず、位置検出用光源であるトラッキング／インデックス用光源から出射した光は、コリメータレンズ、ハーフミラーを透過し、もう一つのハーフミラーにて反射され、レンズによって集光されてＤＮＡチップ４１上のアルミ反射面に照射される。コリメータレンズ、２つのハーフミラー、レンズが位置検出用光源から出射される光を円盤の外周側壁に照射する照射光学系を構成する。【００８２】
アルミ反射面からの反射光は、レンズ、ハーフミラーを通って別のハーフミラーによってトラッキング／インデックス検出光学系に導入される。トラッキング／インデックス検出光学系は、ＤＮＡチップ読み取り装置と同様の方法でトラッキングマークを読みとってトラッキングサーボを行う。そして、インデックスマークを読み取り、当該インデックスマークの位置を基に照射光学系によりＤＮＡチップ４１に照射された光のＤＮＡチップ上の位置座標を出力する。【００８３】
制御装置は、トラッキング／インデックス検出光学系からの位置情報に基づき、光反応性保護基除去用光源のオン／オフを制御する。ＤＮＡチップ製造装置の光学系は、光源、受光素子、光学素子が一体化しており、光学系はその照射光をＤＮＡチップ４１の外周側壁上の任意の位置に移動できる構成になっている。つまり、ＤＮＡチップ製造装置はＤＮＡチップ４１の外周側壁を照射する光源とＤＮＡチップ４１との相対的な位置を移動させる駆動装置を有する。【００８４】
ＤＮＡチップ４１では、シランカップリング剤を用いてガラス表面全体にアミノ基が導入されており、さらに従来のフォトリソグラフィー技術によるＤＮＡプローブの合成技術で使用されたものと同様の機能を有する光反応性保護基がそのアミノ基に結合されている。また、ＤＮＡチップ４１はスピンドルに固定され、直線的な一軸運動と回転運動により動作制御される。【００８５】
トラッキング／インデックス検出光学系を用いて、ＤＮＡチップ４１の外周側壁上の座標を検出し、所望のヌクレオチドを結合させたい領域が光照射範囲の直下に来たときに、光反応性保護基除去用の光源をオンにする。光源を出た光は、レンズを透過し、ＤＮＡチップ４１上の所望の領域に照射されて当該領域の光反応性保護基を除去する。ここで、中心軸に平行にＤＮＡチップ４１を移動させると、外周側壁上で直線状に光反応性保護基の除去領域が形成される。このような操作を特定の塩基を導入したい領域に関して繰り返す。円盤の全周にわたって処理を終えた後、結合させたいヌクレオチドの含まれた溶液を投入する。この結果、光反応性保護基が除去された直線領域群にのみ所定のヌクレオチドが結合する。【００８６】
上記の工程をＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃのヌクレオチドについてそれぞれ１回毎実行する。前記一連の作業を、所望のヌクレオチド配列が得られるまで繰返すことにより、ＤＮＡチップ４１の全領域にＤＮＡプローブ４を固定化できる。一般には、事前にプログラムに入力された複数の核酸プローブ配列のうち、まずそれぞれのプローブの第一塩基につき、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、の４種類それぞれについて、外周側壁全周にわたるそれぞれのプローブ固定領域についてＤＮＡチップを少しずつ回転させては、予定領域における光保護基の除去を行い、一周させた後、ヌクレオチド結合をおこなう。すなわち光照射とヌクレオチド結合の工程を計四回繰り返すと全周にわたる一塩基の伸長がもたらされる。【００８７】
なお、本実施形態においては、光反応を用いてオリゴヌクレオチドをＤＮＡチップ４１外周側壁表面に合成固定化したが、トラッキング用光照射領域と既知の位置関係にあるインクジェット装置や、描画機構を用いてプローブを固定化してもよい。【００８８】
また本実施形態においては、回転に伴いＤＮＡチップ４１の外周側壁表面が変動してもレンズとＤＮＡチップの外周側壁との間隔を一定に保つフォーカシングサーボ機構を有することが好ましい。これによりＤＮＡチップ４１の表面が歪んでいて、回転に伴いＤＮＡチップ４１の表面の位置が変動する場合でも、ＤＮＡプローブ４を固定化することが可能となる。ＤＮＡチップ４１表面とレンズとの間隔を求める方法としては、非点収差法、フーコー法、ナイフエッジ法、SSD法等を用いればよい。【００８９】
本実施形態のＤＮＡチップ４１では、基板を円盤状としたが、円盤形状の中抜きされた筒状等であってもよい。ここで、インデックスマークの窪み１及びトラッキングマーク２が圧縮成形、塗装により形成されているとしたが、射出成形や２Ｐ法等により形成されてもよい。また、本実施形態では円盤の外周側壁表面の上にアルミ反射層は蒸着により成膜されているが、スパッタ等により成膜してもよい。また、円盤の素材はポリ塩化ビニルやアクリル等の樹脂、ガラス、アルミ等の金属、Si、多孔質セラミックス等であってもよい。円盤がアルミやSi等の高反射率の材料である場合は円盤の表面に反射膜を成膜しなくてもよいので好ましい。この場合、インデックスマークの窪み１及びトラッキングマーク２は、圧縮成形やエッチングや切削加工等により形成される。また、本実施形態のＤＮＡチップ４１では、透明部材のホウ珪酸ガラスをスパッタで成膜しているが、真空蒸着やCVD等により成膜してもよい。【００９０】
また、本実施形態のＤＮＡチップ４１では、円盤の外周側壁上反射面の上に透明部材として、ホウ珪酸ガラスを用いているが、石英ガラスやパイレックス（Ｒ）ガラス等の他のガラスを用いてもよいし、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、アクリル等の透明な樹脂を用いてもよい。基板にSiを用いた場合には、Si基板の表面にエッチング等によりトラッキングマーク及びインデックスマークを形成した後に、Si基板を熱酸化することによりSiO2膜を形成して透明部材として用いてもよい。さらに、多孔質素材を用いてＤＮＡ固定とハイブリダイゼーションの効率を改善しても良いし、カーボンナノチューブ、金薄膜などで表面処理して、電気的、物理的計測に対応しても良い。また、同一区画内プローブ固定領域は９６個以外の個数であってもよい。【００９１】
（第２の実施形態）
第２の実施形態は、厚さ１ｍｍの薄い円盤もしくは円筒を積み重ねて多数の同一チップを作製する形態であり、図２に模式図をしめす。第１の実施形態と同様に、厚さ１ｍｍで直径２ｃｍの円盤の外周側壁表面に反射膜である厚さ５００ｎｍのアルミ反射層が蒸着されている。これにより、円盤の外周側壁表面は、反射面になっている。円盤の中央には第１の実施形態と同様に穴７が設けられている。トラッキングマーク５の幅は２０μｍであり、インデックスマークである窪み６の深さは、インデックスの読み出しに使用する光源の波長の約１／４である。アルミ反射層の上には、透明部材であるガラスの層が５０μｍの厚さで積層されている。このような構成の１００枚の前記円盤を、各インデックスマークを円盤の中心軸と平行な一つの直線上に並べるようにして、各中心軸を略一致させて次々に重ねていく。【００９２】
前記作業の終了後、各々のインデックスマークに対応して配置と順列とを定められたプローブ８，８，…群の中の一つを生物学的チップ５１の中心軸に平行となるように外周側壁に直線状に連続プリント固定して行く。引き続き、円盤を０．６度だけ左回転させて次のプローブ８をインクジェットプリンタにより連続プリント固定する。このプローブ連続固定と円盤の回転を交互に６００回繰り返す。この時、円盤の円周方向におよそ１０５μｍ間隔でプローブ８，８，…が配列される。プリント描画の太さを２０μｍとすると、一枚のチップ当たり０．０２ｍｍ2の面積で一つのプローブ８が円盤に固定される。プローブ固定後の円盤を中心軸から順次とりはずして外周側壁上の３６０度にわたり６００種類のプローブを固定された、１００枚の同一構成同一ロットのＤＮＡチップ５１，５１，…を得る。なお、図には各ＤＮＡチップ５１，５１，…に隠されて見えていないが、各ＤＮＡチップ５１，５１，…の間にスペーサーが挟まれており、各ＤＮＡチップ５１，５１，…を取り外しやすくなっている。【００９３】
次に本実施形態のＤＮＡチップ５１とサンプルとのハイブリダイゼーションを行う容器をしめす。直径２ｃｍの本実施形態のＤＮＡチップ５１，５１，…を２０枚重ね合わせた厚さ２１．９ｍｍの円盤チップ積層体１１を中心軸を横向きに倒して、図４のごとく、底面が湾曲した容器１３のなかに配置する。円盤チップ積層体１１の中心軸近傍に設けられた貫通孔には支持棒１２が挿入されている。円盤チップ積層体１１の外周側壁と容器との間には僅かな間隙が生じるように支持棒１２が円盤チップ積層体１１を支持している。そしてこの間隙に、サンプル溶液１４を２００μｌ注入する。円盤チップ積層体１１を支持棒１２を中心として回転させつつインキュベートすると、プローブ８，８，…とサンプル間において、安定して確実なハイブリダイゼーションがもたらされる。サンプルとプローブ８，８，…との充分な結合が得られた時点で、円盤チップ積層体１１を容器１３から取り出して洗浄後、各ＤＮＡチップ５１，５１，…において結合したサンプル量を定量する。【００９４】
このことをさらに詳しく説明すると、オリゴヌクレオチド プローブ８，８，…が固定化された円盤型ＤＮＡチップ５１，５１，…を回転させながら、蛍光色素マーキングを施したＤＮＡを含む溶液（サンプル）とともにインキュベートする。この後、ＤＮＡチップ５１，５１，…を回転させつつ洗浄する。このようにサンプルとの半方を行うことにより、全てのプローブ８，８，…が同一条件でサンプルに曝露されるので、各プローブ８，８，…において対等条件での反応が可能となるばかりでなく、プローブ８，８，…対サンプル内結合配列の接触機会も格段に高められる。なお、動作中のチップの乾燥を防ぐために、孵卵槽内の湿度を調整することが好ましい。【００９５】
次にＤＮＡチップ５１，５１，…による反応の解析系を示す。【００９６】
まずＤＮＡチップ読み取り装置にＤＮＡチップ５１，５１，…を重ねた円盤チップ積層体１１を固定する。スピンドル及びサーボモーターにより円盤チップ積層体１１を固定し、円盤軸を中心として回転させる機構と一軸運動により多層に分布するプローブ領域をスキャンできる仕組みを備える。【００９７】
ＤＮＡチップ読み取り装置の光学系は、光源、受光素子、光学素子が一体化しており、一体化した光学系は、ＤＮＡチップ５１の外周側壁上の一カ所において円盤の中心軸に平行に移動できる構成になっている。つまり、ＤＮＡチップ読み取り装置はＤＮＡチップ５１上に照射される光がＤＮＡチップ５１の外周側壁の任意の位置に照射されるように移動させる駆動装置を有している。光源から出射した光は、コリメータレンズ、ハーフミラーを透過し、ミラーにて反射され、レンズによって集光されてＤＮＡチップ５１のアルミ反射面に照射される。アルミ面からの反射光は、レンズ、ミラーを通ってハーフミラーによってトラッキング／インデックス検出光学系に導入される。【００９８】
トラッキング／インデックス検出光学系は、通常のトラッキングサーボ機構に使用されているプッシュプル法、ウオブル法、３ビーム法等のいずれかにより、チップ外周面上のプローブ部位を正確に認知してＤＮＡチップ５１のアルミ反射面に照射される光がトラッキングマーク５に追従するようにトラッキングサーボを行う。従って、ＤＮＡチップ５１の中心軸がＤＮＡチップ５１の中心から偏心していたり、ＤＮＡチップ５１の外周側壁に凹凸があったとしても、トラッキング／インデックス検出光学系からの信号により一体化した光学系の位置を制御することにより、プローブが固定されている位置から照射光がずれることがない。【００９９】
また、トラッキング／インデックス検出光学系は、インデックスマーク６を読み取り、ＤＮＡチップ５１上の位置座標を表す信号を出力する。前述したようにインデックスマーク６は光源の波長の１／４の深さを有しているので、光源からの光がインデックスマーク６の段差の上の部分で反射する光と底の部分で反射する光の光路差が光源の波長の１／２となるため、インデックスマーク６部分の全反射光の強度は、インデックスマーク６のエッジ部分以外に照射されている場合の全反射光の強度に比べて小さくなる。そして、前述したように各区画毎のインデックスマーク６は互いに異なっているので、各インデックスマーク６毎の反射光の強度変化を位置座標を表す信号として利用できる。つまり、光源の波長の１／４の段差を有しているインデックスマーク６は、読み取り可能に記録されている。【０１００】
ＤＮＡチップ５１が移動して、ミラーで反射した光がＤＮＡチップ５１の外周側壁表面のＤＮＡプローブ８が固定化されている領域に照射され、且つ、当該領域内にハイブリダイゼーションが生じていると、照射された光によってＤＮＡチップ５１のプローブ固定領域表面で蛍光が生じる。生じた蛍光は、レンズによって集められ、ミラーによって反射した後、レンズによってアパチャーに集光される。アパチャーの開口部の寸法及び位置は、ＤＮＡチップ５１の表面からの蛍光が選択的に通過するように設定してあり、通常のコンフォーカル顕微鏡型の検出方法と同様の構成になっている。従ってアルミ反射面光や、コンタミネーション光や途中の光学系からのフレア等のノイズ光は、アパチャーで効率よく遮断されることになる。そして、アパチャーを通過した蛍光は光検出器によって検出される。円周上の特定部位における最上の位置の計測領域で蛍光の検出を終えると、順次ＤＮＡチップ５１，５１，…の重なりである円盤チップ積層体１１を上方に押し上げて、位置決めと計測を順次行っていく。このようにして、最終の２０番目のプローブ８位置に到達する。【０１０１】
演算装置は、トラッキング／インデックス検出光学系からの位置情報と、光検出器からの出力を基にプローブ領域の位置とプローブ番号、ハイブリダイゼーションの蛍光強度を対応させて出力する。【０１０２】
演算装置にはＤＮＡチップ５１上の各領域にあるＤＮＡプローブ８のヌクレオチド配列のもととなる遺伝子名や機能に関するデータを記憶して、このデータと以上に述べた読み取り結果との相関から検体ＤＮＡの特徴を推定出力することができる。【０１０３】
ハイブリダイゼーション後の蛍光マーカーの検出に、コンフォーカル顕微鏡法を使用するとき、高いＳ／Ｎ比と検出感度が向上を達成することができる。更に、ＤＮＡチップ５１の走査には、ＤＮＡチップ５１の回転運動および一軸直線運動と、光学系の固定化とを、もしくはＤＮＡチップ５１の回転運動と光学系の一軸運動とを組み合わせることで、Ｘ方向とＹ方向の２軸ステージ走査に較べて、明らかに走査速度を向上させ、チップの読み取り時間を短縮させることができる。【０１０４】
また、例えば、プローブ領域からの信号強度が小さく、積算測定によってS/N比を向上させようとする場合、全ての走査を繰返すことなく、特に注目している少数のプローブ領域のみについて走査を繰返すような読み取り方法を容易に実施できる。【０１０５】
複数の波長における読み取りが必要である場合には、単に光源、受光素子等を増設した構成とすればよい。【０１０６】
なお、回転に伴いＤＮＡチップ５１の外周側壁表面が変動してもレンズとＤＮＡチップ５１の外周側壁表面との間隔を一定に保つフォーカシングサーボ機構を有することが好ましい。これによりＤＮＡチップが歪んでいて、回転に伴いＤＮＡチップ５１の外周側壁表面の位置が変動する場合でも、蛍光を正確に検出することが可能となる。ＤＮＡチップ５１の表面とレンズとの間隔を求める方法としては、非点収差法、フーコー法、ナイフエッジ法、SSD法等を用いればよい。【０１０７】
ＤＮＡチップ読み取り装置としては、図６に示すように、円盤型ＤＮＡチップ５１に対向する読み取り用円盤３２（計測用センサーを内在する）と介在する膜３３から構成されるものを例示できる。このとき、ＤＮＡチップ５１上のプローブと読み取り用円盤３２内の計測用センサーは円周上の一直線でのみ接することになり、円盤の回転部位やフィルター膜３３のスクロールにより、ＤＮＡチップ５１上の特定位置のプローブ２８が計測用センサーにより計測されることになる。【０１０８】
また、図７のように、カーボンナノチューブで表面処理した後に接触端子３５を固定した円盤チップ積層体３４をサンプルとハイブリダイズした後この円盤チップ積層体３４を、有機発光素材をインターカレートした膜フィルター３６を挟んで、精細に導電配線３８された読み取り用円盤３７と対向させる。導電配線３８から円盤チップ積層体３４にパルス電位を負荷すると、ハイブリダイズしたプローブ側からカーボンナノチューブを経て効率よく電子流が流れ込み、膜フィルター３６を発光させる。この結果、読み取り用円盤３７に組み込まれたＣＣＤ素子に電荷が蓄えられてプローブに結合したＤＮＡが計測される。【０１０９】
膜フィルター３６を感光性素材からなるフィルムと重ね合わせれば、発光後に感光したフィルムを現像してハイブリダイズ反応を解析評価することができる。また、膜フィルター３６にイメージングプレートを重ねた場合には、イメージングプレートに蓄えられた光子を解析時に放出させて記録を行う。化学発光を行う場合には、例えば、ジゴキシゲニンラベルされたサンプルに対する酵素標識抗体を結合させた後、基質を浸潤させたフィルターに反応させて発光を計測する。【０１１０】
（第３の実施形態）
第三の実施形態では、図３に示すように、第２の実施形態と同様の円盤チップ積層体を用いて、円盤の中心軸と平行な直線運動Ａと円盤軸を中心とする回転運動Ｂとを同期させて、多層の全層における全てのプローブ８’、８’、…群とインデックスマーカー６の配置関係を一定とするように、複種類のプローブ８’，８’，…を同時に固定することが出来る。例えば、１０基のプリンターヘッドを備え、一度に１０種類のプローブを固定して行くときプローブ溶液のみを代えて用意すれば単一プリンターヘッドで６００回のプリント工程作業が必要なことに比べ６０回の作業で済み、多大な作業時間の短縮がもたらされる。【０１１１】
例えば、６００種類毎の相異なるプローブ群が固定された２０枚の円盤ＤＮＡチップを一工程で作製することができる。このとき、第２の実施形態と同様に前記２０種類の薄い円盤を順次中心軸に合わせて積み重ねる。ここで、材質の異なる柔軟なスペーサーを層間に介在させると、各層の隙間を密着させつつプローブの固定された円盤を保護する効果を有するとともに、プローブ固定部位の識別性が向上する。例えば、厚さ１ｍｍの円盤を０．１ｍｍの薄いスペーサーを挟んで積み重ねて、２１．９ｍｍの厚さを持った直径１ｃｍのサイズで１２，０００種類のプローブを載せた厚い円盤の形態を呈するＤＮＡチップの積層体が完成する。【０１１２】
（第４の実施形態）
第４の実施形態に係る臨床血液生化学検査装置システムにおいては、、ＧＯＴ，ＧＰＴ、ＬＤＨ，ＣＰＫ，ＡＬＰ，γＧＴＰ、ＬＡＰ、ＢＵＮ、ＣＲＥ、Ｃｈ−Ｅ、Ｎａ、Ｋ、Ｃｌ、Ｃａ、Ｐ、Ｆｅ、Ｍｇ、アンモニア、シアル酸、ＢＳ、ＨｂＡ１Ｃ、アミラーゼ、ビリルビン、総蛋白、アルブミン、尿酸、コレステロール、中性脂肪、ＨＤＬコレステロール、ＬＤＬ、ＣＲＰ、リパーゼ、各種免疫学的計測項目などのうち、３０種類の計測第一試薬をそれぞれに指定されたインクジェットプリンターの貯留槽に充填しておく。一方、本実施形態に係る生物学的チップは、図５（ａ）に模式的に示すように、第１の実施形態のＤＮＡチップに類似の円盤状チップの外周側壁に容器である孵卵槽２２，２２，…が設けられた形状のものである。このとき、各孵卵槽２２，２２，…には２次元バーコードにより解析項目、Lot.NO.、患者ＩＤ等が付されている。また、インデックスマーク２１と各孵卵槽２２，２２，…の内容及び順列（並び方）とは１対１に対応しており、特定のインデックスマーク２１には特定の各孵卵槽２２，２２，…の内容及び順列（並び方）が対応する。【０１１３】
複数のヒトの血漿検体のそれぞれについて事前に指定された計測項目に必要な第１の試薬類は、予め生物学的チップ７１のインデックスマーク２１を認識することで記憶された各孵卵槽２２，２２，…の順列に対応するように、インクジェット方式により各孵卵槽２２，２２，…に放出される。一度放出される度に生物学的チップ７１をスピンドル用穴２４に存する中心軸の周りに１０度づつ回転させて次の試薬の放出されるプリンターヘッドの位置に移動させ、次の計測項目用試薬を次順の孵卵槽２２へ放出する作業をくりかえす。【０１１４】
必要な項目全ての試薬が充填されたら、空の孵卵槽２２は放置したまま、チップ７１を１０度づつ回転させながら次々に試薬の充填された孵卵槽２２，２２，…へサンプル血漿を投入する。サンプル投入量の誤差を修正するためには、全体のサンプルに滴定用マーカー物質を加えて、サンプル希釈時のマーカー濃度からアッセイに用いたサンプル量を補正する。【０１１５】
この後、加速度的回転などによる充分なミキシングを経て適当な時間のインキュベートを終える。必要に応じて、第二試薬を、第一試薬に準ずる方法で孵卵槽２２，２２，…へ投入して、混和、インキュベートする。充分な発色が生じたら、このチップ７１は単純な上下方向の移動により計測系へと移動され、１０度づつ回転させながら、各孵卵槽２２，２２，…における吸光度を計測して先に記憶済みの孵卵槽２２，２２，…の順列とサンプルの由来を参照しつつ、標準曲線と対照しつつ各計測項目の測定値を算出する。最後に当該サンプル血漿に対応する患者ファイルへのデータ保存とプリンターによるデータ打ち出しを行って作業を終了する。【０１１６】
免疫学的計測には、予め抗体の固定された孵卵槽を用意する必要がある。従って、事前に試薬が収納された着脱式のマイクロ孵卵槽２２を使用する場合は、各計測項目に対応する３０種類の孵卵槽２２，２２，…が納められたシェルフから、プログラムに入力された項目ごとの孵卵槽２２を取り出して図５（ｂ）に示すような待ち行列２３を形成してから、チップ７１の円周上にはめ込んで配列させる。ここで、サンプル血漿またはその希釈液を孵卵槽内２２，２２，…へインクジェットにより投入し恒温にて反応させる。第二試薬が必要なものは第二試薬の追加を経て孵卵槽２２，２２，…内に産出された吸光物質の濃度を計測して測定値を算出する。各サンプルデータは集計され、患者情報とともに集中管理および出力される。【０１１７】
図５に示すような、均一な形状の小容量の孵卵槽２２、２２，…をチップの円周に規則的に配置することは、従来のオートサンプラー方式によるサンプルや反応液の注入よりも、極めて小さなシステム内で極少量のサンプルによって、正確かつ迅速な反応と結果検定するために有用である。一段階反応の場合は各種反応溶液を孵卵槽２２，２２，…にそれぞれ収納しておくことが好ましい。二段階反応を要する場合は隔壁を設けた二槽式の孵卵槽の隔壁を破壊して反応をすすめるか、二段目の試薬を収納した易破壊性収納器を破裂させてもよいし、インクジェット方式やマイクロピペットなどで二段階目の試薬を投入しても良い。【０１１８】
孵卵槽２２，２２，…内の少量の液体を混和するためにはバイブレーターや超音波などによる振動や遠心回転が役立つ。チップシステムにおいて吸光度法による計測の場合は透光性素材からなる孵卵槽壁を透かして計測しても良いし、ミニサンプラーで採取した反応液の吸光度をキュベット内等で計測しても良い。また、吸光度を計測するマイクロプローブを孵卵槽２２内へ挿入しても良い。微小液量の局所からの吸光度を正確に検定するためには、顕微測光、コンフォーカル方式やスペクトル解析を採用することが好ましい。【０１１９】
生物学的チップにおいて、反応試薬などとサンプルを液層にてインキュベートする必要があるが、液体の試薬は蒸発したり、活性が低下することが問題となる。ここで、凍結乾燥などにより、当初より孵卵槽に固相の必要試薬を投入してあれば、単にサンプルあるいはその希釈液を加えるのみで、正確な量と活性を維持して反応が進行するので好ましい。この時も少量の液体を粉体と混和するためにはバイブレーターや音波などによる振動や遠心回転が役立つ。二段階反応の場合は第一反応終了時に第二反応液を加えてもよいし、隔壁を設けて第二反応開始時に隔壁を破いたり、浸透圧、加圧などで破裂する第二液の収納部を設けることが好ましい。【０１２０】
試薬類が固体であると孵卵槽２２へ入れることが容易なので、第１、第２の試薬ともに錠剤などの固形化物を用いてもよい。【０１２１】
また、免疫学的物質捕捉法（ＥＬＩＳＡ）を行う場合には、サンプルを２つの抗体で挟むことが好ましい。例えば、第１の抗体が固定された孵卵槽にサンプルを投入して第１の結合反応を行い、孵卵槽の洗浄後液状または固形の第２の抗体を投入して第２の結合反応を行った後、再度洗浄して、発光または吸光反応を用いて目的分子の定量計測を行う。
（その他の実施形態）
ＥＬＩＳＡ法を行う場合は、上述の第１から第４の実施形態に用いた生物学的チップを用いると、容易に短時間に正確な測定結果が得られる。通常のＥＬＩＳＡ法による抗原分子の測定では、１回の計測ごとに既知濃度の抗原分子を同時測定する必要があり、さらに９６穴のプレートを使用する場合などには多くの操作と材料、人手を要する。しかしながら、上述の実施形態の生物学的チップを用い場合、この生物学的チップに上述の内部標準プローブを設けておけば従来のチップの問題点が解決できる。すなわち、内部標準プローブとして測定したいサンプルには存在しない物質（内部標準物質）に反応するプローブを使用し、測定サンプルに内部標準物質を一定濃度となるように添加して生物学的チップと測定サンプルとの反応を行うのである。この場合は、事前に決定された発光もしくは発色反応のＫｄ値を基準とすることにより、数種類のプローブを固定した生物学的チップ１枚で簡便且つ正確にＥＬＩＳＡ計測が可能となる。特に、内部標準物質を２種類としこれに対応する内部標準プローブも２種類とすると、インキュベーションの環境や反応阻害物質の影響を免れて簡単に正確な計測値を得ることができる。【０１２２】
以上の実施形態は、本発明の例示であって本発明はこれらの例に限定されない。プローブとして用いる物質はＤＮＡやオリゴヌクレオチドに限定されず、タンパク質、ペプチド、糖鎖、ＲＮＡ、脂質及び細胞、あるいはこれらの断片からなる群から選ばれた物質でもよい。また、合成ＤＮＡなどの生体擬似合成物質であってもよい。【０１２３】
生物学的チップの支持体はポリカーボネート以外に、ポリアミドやポリエステルなどのプラスチック、ガラス、シリコン、金属、セラミックス、あるいはこれらの複合材などを素材とすることができる。【０１２４】
また、サンプルと反応後のチップを測定するときに、チップと測定端子との間に膜や板等を介在させて計測を行う方法は、外周側壁にプローブが固定された円筒あるいは円柱形チップを用いる場合に限定されない。従来のプローブが主面上にマトリックス状に配置された平板状チップを用いた計測の際にもこの方法を用いることができる。【０１２５】
本発明による生物学的チップのなかで、ＤＮＡチップ 、及びＤＮＡチップ読み取り装置によれば、多くの遺伝子群の多数のドメインについてのプローブを積層された幾種類かの構成薄板上に分割して網羅できるので、すべての遺伝子群のうち関心のあるグループをカバーするように構成薄板を選択して組み合わせることによりオーダーメードのチップを大量かつ安価に作製したり、逆に未知の事象に関しては無作為に大量の遺伝子群のスクリーニングもできる、応用性に富んだチップ作製と解析方式が実現できる。また、軸ぶれのない円盤回転とチップの直線運動の組み合わせにより、コンフォーカル顕微鏡などによる高いS/N比の確保のうえで、高速にチップを走査することも可能である。加えて、外周側壁表面は液中に常時含浸されることは必須でなく、孵卵中のサンプル溶液とプローブとの接触は間欠的でありながら安定均一であるので、少量のサンプル溶液でも良好なハイブリダイゼーションにより正確な検討が可能となる。一方、血液生化学用のチップでは、従来よりも遙かにコンパクトで経費節減と廃棄物減少に役立つ検査法が確立される。
【産業上の利用可能性】
【０１２６】
以上説明したように本発明は、多種類のプローブや反応容器を一つのチップ上に容易に且つ短時間に製作することができるとともに、サンプルとの反応や反応後の測定も容易にかつ短時間で行うことができる生物学的チップであるので、遺伝子機能解析やタンパク質等の検出解析などに有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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