(57)【要約】本発明は、ウシ呼吸器疾患を治療するためのワクチンに関する。そのようなワクチンは、ウシインフルエンザＤウイルスとマンヘミア・ヘモリチカ抗原との組み合わせを含有する。ＩＤＶによる上気道感染症は、肺のＭ．ヘモリチカ病変の可能性を増加させる。このワクチンは、他のウシ呼吸器病原体由来の抗原をさらに含有し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシインフルエンザＤウイルス抗原と、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記マンヘミア・ヘモリチカ抗原が、不活性化細菌、外膜タンパク質の抽出物、および組換えロイコトキシン、ならびにそれらの任意の組み合わせの群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記ウシインフルエンザＤウイルス抗原が、不活性化ウイルスである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ウシインフルエンザＤウイルス抗原が、改変生ウイルスである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原が、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスである、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原が、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９の群から選択されるｃＤＮＡ配列を有する少なくとも１つのコドン脱最適化ゲノムセグメントを含む、請求項４に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
ウシインフルエンザＤウイルス抗原と、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤と、任意にアジュバントと、を含む、ウシ呼吸器疾患のためのワクチン。
【請求項８】
追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含む、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記追加のウシ病原体が、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせの群から選択される、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
ウシ呼吸器疾患を治療する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載の免疫原性組成物またはワクチンをウシに投与することを含む、方法。
【請求項１１】
前記投与が、経口的、鼻腔内、気管内、または注射によって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ウシ呼吸器疾患の治療におけるウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原との組み合わせの使用。
【請求項１３】
ウシ呼吸器疾患のための医薬品の製造におけるウシインフルエンザＤウイルス抗原およびマンヘミア・ヘモリチカ抗原の使用。
【請求項１４】
ウシにおけるウシ呼吸器疾患の治療、軽減、または予防に使用するための、ウシインフルエンザＤウイルス抗原と、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、を含む、組成物。
【請求項１５】
ウシ呼吸器疾患の治療における請求項１〜６に記載の免疫原性組成物または請求項７〜９に記載のワクチンの使用。
【請求項１６】
ウシ呼吸器疾患のための医薬品の製造における請求項１〜６に記載の免疫原性組成物または請求項７〜９に記載のワクチンの使用。
【請求項１７】
ウシにおけるウシ呼吸器疾患の治療、軽減、または予防に使用するための、請求項１〜６に記載の免疫原性組成物または請求項７〜９に記載のワクチンを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウシ呼吸器疾患を治療するためのワクチンに関する。そのようなワクチンは、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原との組み合わせを含有する。
【０００２】
ウシ呼吸器疾患（ＢＲＤ）は、米国のウシ産業に影響を与える最も重大な疾患であり、これによって、年間損失額は１０億ドルを超えると推定されている。不活性化および改変生細菌とウイルスとの組み合わせから可変的になるさまざまな市販ワクチンが広く使用されているが、ＢＲＤの発生率は、過去数十年にわたって増加している。多くの場合、ウシは、移動および動物の管理に起因する動物のストレスによってＢＲＤに罹りやすいと考えられている。ＢＲＤ病因において、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシヘルペスウイルス１、ウシ呼吸器合胞体ウイルス、ウシパラインフルエンザウイルス３、ウシ鼻炎ウイルス、およびおそらくインフルエンザＤウイルス（ＩＤＶ）を含む、多くのウイルスの役割が確立している（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．９０：５６３６−４２，２０１６）。
【０００３】
まず、急性呼吸器疾患を有するブタは別として、意図されたインフルエンザＤウイルスは、その後多くの国で、ウシにおいて確認された。ＩＤＶを接種されたウシは、対照と比較して軽度の呼吸器疾患のみを示し、気管内の好中球の著しい増加に伴って、気道内でウイルスの複製が検出された。最も高いウイルス力価は、鼻甲介に存在し、気道より低い組織内では減少していた。ＩＤＶは接触動物に感染し、すべての接種動物および暴露動物が血清転換した。ブタおよびヒト血清の血清学的調査では抗体保有率が低いことが判明したが（それぞれ、９．５および１．３％）、いくつかの研究によって、ＩＤＶ抗体はウシでほぼ遍在性であり、母体抗体の存在に大きく起因して、新生児肉用ウシの最大９４％がＩＤＶに関して血清陽性であることが判明した。母体抗体は、ワクチン接種および能動免疫の発達を妨げることが知られているため、ワクチン接種時の抗体の存在は、ワクチンに対する免疫応答を低下させる可能性がある。
【０００４】
決定的には確立されていないが、ＩＤＶがウシ呼吸器疾患複合体（ＢＲＤＣ）の一部である可能性がある。ＩＤＶの市販ワクチンは、例えば、ＵＳ９，２７８，９９９およびＷＯ２０１４／０１５０９１で提案されているが、採用されてはおらず、これは、ＩＤＶの最近の発見および、ＢＲＤ病因における未知の（および、おそらくは限定的な）役割に部分的に起因している可能性がある。ＩＤＶ感染が他の病原体によって引き起こされるＢＲＤの日和見感染ではなく、他のウシ呼吸器病原体によって引き起こされた疾患を悪化させる場合、ＩＤＶを市販のＢＲＤワクチンに含めることで有効性が改善し得る。
【０００５】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原と、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、を含む、免疫原性組成物を提供する。混合ワクチンは、ＢＲＤに対して、一価ワクチンのみと比較して増加した有効性を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシン（ｒＬＫＴ）などの、組換えによって産生された抗原であり得る。
【０００６】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む免疫原性組成物を提供し、ここで、ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスである。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、および配列番号１９からなる群から選択されるｃＤＮＡ配列を有する１つ以上の脱最適化ゲノムセグメントを有し得る。
【０００７】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む免疫原性組成物を提供し、これは、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含む。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０００８】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルスと、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤と、任意にアジュバントと、を含む、ウシ呼吸器疾患のためのワクチンを提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスであり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。
【０００９】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルスと、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤と、任意にアジュバントと、を含む、ウシ呼吸器疾患のためのワクチンを提供し、これは、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含む。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１０】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む免疫原性組成物をウシに投与することを含む、ウシ呼吸器疾患の治療方法を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。投与は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。
【００１１】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む免疫原性組成物をウシに投与することを含む、ウシ呼吸器疾患の治療方法を提供し、ここで、ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスである。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。投与は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。
【００１２】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む免疫原性組成物をウシに投与することを含む、ウシ呼吸器疾患の治療方法を提供し、これは、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含む。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。投与は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。
【００１３】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルスと、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤と、任意にアジュバントとを含む、ウシ呼吸器疾患のためのワクチンをウシに投与することを含む、ウシ呼吸器疾患を治療する方法を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスであり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。投与は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。
【００１４】
本発明は、ウシインフルエンザＤウイルスと、マンヘミア・ヘモリチカ抗原と、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤と、任意にアジュバントとを含む、ウシ呼吸器疾患のためのワクチンをウシに投与することを含む、ウシ呼吸器疾患を治療する方法を提供し、これは、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含む。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。投与は、経的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。
【００１５】
本発明は、ウシ呼吸器疾患の治療におけるウシインフルエンザＤウイルス抗原とマンヘミア・ヘモリチカ抗原との組み合わせの使用を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスであり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。治療は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって行われ得る。治療は、治療的または予防的に行われ得る。組み合わせは、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤、および任意にアジュバントをさらに含み得る。この組み合わせは、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含み得る。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１６】
本発明は、ウシ呼吸器疾患のための医薬品の製造におけるウシインフルエンザＤウイルス抗原およびマンヘミア・ヘモリチカ抗原の使用を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスであり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。医薬品は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって投与され得る。投与は、治療的または予防的に行われ得る。医薬品は、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤、および任意にアジュバントをさらに含み得る。医薬品は、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含み得る。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１７】
本発明は、ウシにおけるウシ呼吸器疾患の治療、軽減、または予防に使用するための、ウシインフルエンザＤウイルス抗原と、マンヘミア・ヘモリチカ抗原とを含む組成物を提供する。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、不活性化された細菌、または外膜タンパク質抽出物などの不活性化された細菌からの抽出物であり得る。マンヘミア・ヘモリチカ抗原は、組換えロイコトキシンなどの、組換えによって産生された抗原であり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、不活性化ウイルスであり得る。ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、改変生ウイルスであり得る。改変生ウシインフルエンザＤウイルス抗原は、コドン脱最適化によって改変された、改変生ウイルスであり得る。本組成物は、経口的、鼻腔内、気管内、または皮下もしくは筋肉内などの注射によって投与され得る。本組成物は、薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤、および任意にアジュバントをさらに含み得る。本組成物は、追加のウシ病原体由来の少なくとも１つの抗原をさらに含み得る。追加のウシ病原体は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ）、パラインフルエンザウイルス３（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、レプトスピラ種、およびヒストフィルス・ソムニ、ならびにそれらの任意の組み合わせであり得る。
【００１８】
「ウシ」という用語は、本発明が投与される動物を指すために使用される場合、家畜ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）を含むＢｏｓ属の任意のメンバーを意味する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ウシインフルエンザＤウイルス」（ＩＤＶ）は、オルトミクソウイルス科のＲＮＡウイルスを意味する。ＩＤＶは、インフルエンザウイルスＡ、Ｂ、およびＣとは別の属であるとみなされているが、ＩＤＶは、インフルエンザウイルスＣに最も関連していると考えられる。ＩＤＶのゲノムは、７つの線形マイナス一本鎖ＲＮＡ分子を含有するＩＤＶの２つの代表的な分離株が表１に記載されており、特許請求される本発明を限定するものではない。ＲＮＡウイルスとして、ＩＤＶは高い変異率を有すると考えられ、「抗原ドリフト」と呼ばれるプロセスを引き起こし、これは、異なる抗原特性を有するウイルスを産生するゲノムの小さな変化である。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」という用語は、ウイルスの種、または互換的に、核酸、タンパク質、および脂質膜を含有し得る個々の感染単位のいずれかを意味し得る。個々の感染単位は、「ウイルス粒子」または「ビリオン」とも呼ばれ、後者の用語が同義語である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、ウイルスの「株」または「単離株」は、遺伝的に相同なビリオンの収集体を意味する。２つのウイルスが同じ系統群にマッピングされる場合、これらのウイルスは「相同」とみなされるであろう。２つのウイルスが異なる系統群にマッピングされる場合、これらのウイルスは「異種」とみなされるであろう。ＩＤＶ分離株間の多型の程度は、まだ評価されていない。
【表１】
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【００２２】
「同一性パーセント」は、核酸内の同じ位置にある同一ヌクレオチドの数を計算することによって決定され得る。同一性パーセントの計算は、２つ以上の配列間の最適なアライメントの決定を含む。Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）などのコンピュータープログラムおよびアルゴリズムを使用して、同一性パーセントを決定することができる。ＢＬＡＳＴは、米国国立生物工学情報センターによって提供される多くのリソースの１つである。遺伝暗号は縮退しており、１つを超えるコドンが規定のアミノ酸をコードできるため、核酸が同一のポリペプチドをコードする場合、核酸のコード領域は同一とみなされる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「改変生ウイルス」という用語は、個々のウイルス粒子（すなわち、「ビリオン」）またはその遺伝子配列が天然の野生型ウイルスの遺伝子配列から変更された多数のウイルス粒子に適用される。変更には、ヌクレオチドの挿入および削除、ならびにあるヌクレオチドを別のヌクレオチドに変更するトランジションおよびトランスバージョンなどの遺伝子変異が含まれるが、これらに限定されない。変更は、野生型ウイルスを組織培養システムでの複製に適応させ、組織培養システムでウイルスの継代を続けることによって達成され得、これによって、ウイルスは遺伝子変異を蓄積する。分子技法を使用して変更を行うこともできる。そのような分子技法の１つは、ウイルスのコドン使用を人為的に変更すること、または「コドン脱最適化」を伴う。そのような技法は、例えば、ＵＳ８，８４６，０５１、ＵＳ９，４７６，０３２、およびＵＳ２０１６／０２４４７７（米国出願第１４／７７７，２０４号）に記載されており、これらのすべては参照によってそれらの全体が組み込まれる。
【００２４】
弱毒化ウイルスは、改変生ウイルスのサブセットを形成する。本明細書で使用される場合、「弱毒化された」または「弱毒化」という用語は、臨床疾患を引き起こすかまたは悪化させるウイルスの能力が軽減または排除されたことを意味する。弱毒化ウイルスは、インビトロまたはインビボのいずれかで宿主細胞に感染する可能性があり、その感染は、宿主生物に無症状の影響をもたらし得るが、その感染は、１つ以上の臨床疾患症状をもたらさない。
【００２５】
対照的に、本明細書で使用される場合、「不活性化」ウイルスまたは細菌は、宿主内でもはや複製できない病原体を意味する。不活性化された病原体は、殺滅されたかまたは死滅しているとみなされる。不活性化は、化学的変化、病原体の構造の化学的もしくは物理的変化、または病原体のゲノム核酸の化学的もしくは物理的変化を含むが、これらに限定されないさまざまな方法によって達成され得る。
【００２６】
「抗原」は、生物の免疫系によって特異的に検出できる分子である。典型的には、抗原は、病原体のゲノムによってコードされるか、または病原体のゲノムの産物に由来するタンパク質である。抗原は、ビリオンもしくは細菌全体、またはその画分、または単離されたポリペプチドであり得る。抗原は、自然にまたは組換えによって産生され得る。抗原の存在は、宿主Ｔリンパ球および宿主Ｂリンパ球の両方の表面抗原受容体、ならびに宿主細胞によって合成された抗体分子によって特異的に検出され得る。ＩＤＶ抗原の非限定的な例は、血球凝集素エステラーゼ糖タンパク質であろう。マンヘミア抗原の非限定的な例は、外膜タンパク質の抽出物（すなわち、部分的に精製された抗原の混合物）および組換え発現ロイコトキシンポリペプチドであろう。
【００２７】
「免疫原性」は、免疫応答を誘発する抗原の能力を指し、該免疫応答は、抗原特異的応答および非抗原特異的応答または自然免疫応答の両方を含む。「防御免疫」は、免疫化された動物が病原性株に曝露または暴露されたときに臨床症状を軽減または予防し得る免疫応答である。当業者が理解するように、防御免疫は、経時的に、または免疫化された動物の年齢の増加とともに低下し得る。本明細書で使用される場合、防御免疫は、免疫化の最終日から少なくとも４ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間有効でなければならない。防御免疫は、ワクチンの単回用量で誘発され得る。防御免疫応答を増加または延長するために、２回目またはそれ以降の用量が使用され得る。例えば、繁殖ウシの防御免疫応答を増加させると、子ウシの母体由来抗体のレベルの増加がもたらされ得る。
【００２８】
抗原とは対照的に、「アジュバント」は、免疫応答の非特異的刺激因子である。アジュバントは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）を結合および活性化することによって、自然免疫応答を刺激できる。そのようなＰＲＲの刺激因子は、例えば、ウイルスもしくは細菌の核酸、細菌もしくは寄生生物からの脂質、または細菌のタンパク質もしくは毒素、またはそのような分子の任意の人為的に構築された模倣物であり得る。アジュバントにはまた、抗原を凝集してＢリンパ球による認識または食細胞による取り込みを促進するミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム、または硫酸アンモニウムなどの無機化合物；油；および洗剤も含まれるが、これらに含まれない。アジュバントはまた、限定されることなくサイトカイン、リンホカイン、ケモカイン、インターフェロン、アナフィラトキシン、成長因子、分化因子、および接着分子などの免疫シグナル伝達の宿主メディエーターでもあり得る。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「免疫原性組成物」は、動物に投与されたときに免疫応答を誘発する組成物である。免疫原性組成物は、少なくとも１つの抗原および少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤を含む。薬学的に許容される賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤の説明は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”Ｌｌｏｙｄ  Ｖ．Ａｌｌｅｎ，ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２で見ることができる。抗原は、生きているかまたは不活性化されたウイルス、細菌、または他の病原体の全てであり得る。抗原は、ウイルス、細菌、または他の病原体から単離、精製、または部分精製された抗原分子でもあり得る。抗原は、ポリペプチド、多糖、核酸、または脂質であり得る。抗原は、その自然環境から少なくとも部分的に単離されており、抗原に対する効果的な免疫応答を希釈、方向転換、または妨害することができる因子が含まれる可能性がある。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ワクチン」は、動物の免疫系を刺激して、それを必要とする動物に投与された場合に疾患症状からの防御、抵抗性、予防、または治療を発達させる免疫原性組成物であり、ここで、該症状は、病原性生物、例えば、ウイルスまたは細菌によって引き起こされる。ワクチンには、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤、および任意にアジュバントを有する組成物において、生きているかまたは不活性化されたウイルス抗原または無傷ビリオンが含まれ得るが、これらに限定されない。ワクチンには、薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、安定剤、可溶化剤、または希釈剤、および任意にアジュバントを有する組成物において、生きているかまたは不活性化された細菌抗原または無傷細菌が含まれ得るが、これらに限定されない。ワクチンには、複数の病原体由来の複数の抗原が含まれ得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療すること（ｔｏ  ｔｒｅａｔ）」、または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」という用語は、既存の症状、障害、状態、または疾患の進行または重症度を抑制、減速、停止、軽減、改善、または逆転させることを含む。治療は、予防的または治療的に適用され得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「投与」には、皮膚、皮下、筋肉内、粘膜、粘膜下、経皮、気管内、経口、または鼻腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。投与は、注射または局所投与によって起こり得る。
【００３３】
以下の実施例は、ウシ呼吸器疾患ワクチンの例である。他の実施形態および使用が当業者には明らかであり、本発明がこれらの特定の例示的な実施例または好ましい実施形態に限定されないことが理解されよう。
【００３４】
実施例１
この研究では、高力価のインフルエンザＤウイルス（ＩＤＶ）を投与したときに６〜９ヶ月齢のウシで呼吸器の病因が発生するかどうか、およびその病因を相同不活性化ワクチンによって軽減できるかどうかを評価した。
【００３５】
この研究のために、およそ６ヶ月齢の合計８３頭のホルスタインまたはホルスタイン交雑ウシを使用した。動物を試験施設の新しい環境に最低５日間順応させた。ハウジングは、ＡＢＳＬ−２収容室で構成されており、各部屋は共通の供給ライン寝台およびオープン水タンクシステムを有した。動物は、以下の包含基準：刻耳および抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣＥ）によるＢＶＤＶ−ＰＩ陰性、０日目に実施した身体検査に基づく良好な健康状態、ＩＤＶに対する血清陰性を満たした。ランダムな割り当て計画を使用して、動物を治療グループにランダムに割り当てた（表２）。臨床観察を実施し、試料を収集し、試料を分析する研究要員には、治療識別が隠されていた。各治療（ワクチン接種）の適用後、動物を治療グループごとに収容し、各グループを各治療グループ間の物理的接触がない隔離畜舎に入れたが、曝露を受けたウシ（グループＴ０２およびＴ０３）とともに収容した治療グループ４の子ウシ（Ｔ０４）は例外とした。
【表２】
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【００３６】
実験用ワクチンは、ベータ−プロプリオラクトン（ｐｒｏｐｒｉｏｌａｃｔｏｎｅ）（ＢＰＬ）不活性化ＩＤＶ株Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＫＳ／１４−２２／２０１２で構成されていた。ワクチンを、１用量あたり６４０の血球凝集素単位（ＨＡＵ）に標準化した。抗原をバッチ処理し、３０％ＥＭＵＬＳＩＧＥＮ（登録商標）Ｄで製剤化／アジュバント化した。ワクチンには、最終産生物を血液寒天に播種し、３７℃でインキュベートし、およそ４８時間後に形成されたコロニーを検査することからなる修正無菌試験を実施した。コロニーを同定せず、産物を無菌とみなした。０日目および１４日目に、首の右側に皮下（ＳＱ）注射（２０ゲージの１インチ針）によって子ウシにワクチン接種した（２．０ｍＬ）。ワクチン接種に対する応答を評価するために、ワクチン接種のおよそ１時間後に動物を観察した。異常な事象は認められなかった。
【００３７】
曝露は３５日目（約７ヶ月齢）に発生した。３５日目（３５ｄ）に、１０６ＴＣＩＤ５０でＩＤＶ株Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＫＳ／１４−２２／２０１２を用いて、各子ウシに鼻腔内曝露した（５．０ｍｌ、２．５ｍＬ／鼻孔）。
【００３８】
すべての動物を、剖検を通して３５日目にうつ病、身体状態、および呼吸困難について評価し、スコア付けした。動物を評価し、移動または供給前にスコア付けした。曝露期間（３５〜４５日目）の間、直腸体温を毎日記録した。温度を毎日ほぼ同じ時間に記録した。施設に到着する少なくとも７日前に１つの血液試料を収集し、０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、８４、９８、１１２日目にＩＤＶ血球凝集抑制の判定のために残りの血液試料を収集した。施設に到着する少なくとも７日前に１つの鼻腔綿棒試料を収集し、３５日目（曝露前）、３７、３９、４１、４３、および４５日目にすべての動物から残りの鼻腔綿棒を収集した。綿棒を輸送培地の入ったチューブに入れた。チューブには、収集日、動物の識別（耳のタグ番号）、試料の種類（鼻腔）、および研究番号のラベルを付けた。チューブは、アイスパックを含むクーラーに入れてすぐに冷却した。チューブを−７０℃で保存した。
【００３９】
３５、３７、３９、４１、４３、および４５日目に、肺病変スコアリング、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液、およびそれぞれの組織の収集のために、それぞれの動物を人道的に安楽死させた。肺を各動物から除去した。切除した肺からＢＡＬ液を無菌収集した。無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を肺にピペットで入れ、肺を穏やかにマッサージしながらピペットで戻した。抽出したＢＡＬ液を氷上に置いたチューブに入れた。ＢＡＬ液の各試料を２つのアリコートに分割し、動物ＩＤおよび試料収集日のラベルを付けた。両方のアリコートのセットを凍結保存した（≦−２０℃）。
【００４０】
７つの肺葉の各々を、ＩＤＶに起因する肉眼的特徴病変に関して視覚的および触診の両方で検査した。各肺葉の病変／硬化の量をスコア付けし、葉の０〜１００％で実際の値として記録した。病変のある肺の割合を計算するために、各葉の病変の量（スコア）を加重式に挿入した。（肺葉の相対的な重量に応じて）７つの葉の各々に割り当てられた重量は、次のとおりである：左頂葉＝１０％、左心葉＝１０％、左横隔膜葉＝２５％、右頂葉＝１０％、右心葉＝１０％、右横隔膜葉＝２５％、およびアクセサリローブ＝１０％。重み付けされた割合の加算によって、複合肺病変スコアが得られた。
【００４１】
肺、鼻甲介、および気管組織の剖検で病変を検査し、免疫組織化学検査のために切片を切除した。気管気管支リンパ節も免疫組織化学評価のために切除した。すべての試料を、構造的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、標準的な免疫組織化学技法を使用してＩＤＶウイルスに関して染色した。
【００４２】
カンザス州立大学（ＫＳＵ）獣医診断研究所が開発した特定のプライマーセットを使用したＲＴ−ＰＣＲによって、鼻腔綿棒のＩＤＶウイルスを評価した。既知の組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）ＩＤＶウイルスの標準曲線を使用して、試験した鼻腔綿棒の閾値サイクル（ＣＴ）値の標準偏差の平均を外挿し、鼻腔綿棒のウイルス力価値を得た。既知の組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）ＩＤＶウイルスの標準曲線を使用してＣＴ値を外挿し、ウイルス力価値を得た（表３）。
【００４３】
気管支肺胞上皮洗浄液（表４）および気管綿棒（４１、４３、および４５日目）（表５）もＲＴ−ＰＣＲによってＩＤＶウイルスについて評価し、ＣＴ値を既知の組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）ＩＤＶウイルスの標準曲線を使用して外挿し、各試料グループのウイルス力価値を得た。
【表３】
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【表４】
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【００４４】
上に概説した上気道および肺病変スコアリングの評価を盲検研究調査員によって行った。複合肺病変を、各時点でのグループごとの平均複合スコア／動物の数として表６に概説する。
【表５】
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【表６】
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【００４５】
軽度の肺病変スコアが観察され、ワクチン接種を受けた動物と曝露を受けた動物との間にわずかな傾向の違いがあった。より強力な統計力および曝露モデルの改良を追加して、ＩＤＶによって引き起こされる肉眼的肺病理をさらに調査した。気管のみを含む上気道の肉眼的病理学的検査は、曝露後４日目と６日目にピークの所見があるムコイド滲出液を示した。
【００４６】
鼻甲介および気管からの固定組織試料を処理し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで、ＩＤＶウイルスに特異的な抗体で染色した。鼻甲介試料および気管試料のグループごとの動物の総数のうちの陽性試料の数を、それぞれ表７および８に示す。
【表７】
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【表８】
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【００４７】
血清学的抗体力価をワクチンへの血清学的変換について研究日（ＳＤ）０、１４、２１、２８、３５、および４２日目に評価した。各グループの血清の血球凝集抑制（ＨＩ）力価の幾何平均力価（ＧＭＴ）を表９に示す。血清学的評価は、ワクチン接種を受けていないグループと比較して、ワクチン接種を受けたグループのＩＤＶに対するＨＩ力価が増加したことを示す。通常の用量およびワクチンの最適化は、さらに評価することができて、抗体力価を高める可能性がある。比較のために、ヒトにおける４０のＨＩ力価（５．３ｌｏｇ２）は、一般的に、インフルエンザウイルスＡ感染に対する防御とみなされているが、疾患の症状を完全に緩和するわけではない。
【表９】
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【００４８】
うつ病および身体状態のスコアリングの臨床的所見にはほとんど目立った箇所はなかった。曝露を受けた動物で呼吸困難が実証され、曝露後６日目に臨床症状がピークに達した。ワクチン接種された動物とワクチン接種されていない動物との間に呼吸困難の違いは観察されなかった。
【００４９】
この研究の主な目的は、ウシインフルエンザＤウイルス（ＩＤＶ）が臨床的病因を誘発できるかどうかを評価し、同種の不活性化ワクチン製剤が臨床的病因を予防できるかどうかを発見することであった。ＩＤＶで曝露した動物では、ＲＴ−ＰＣＲに基づいて上気道でウイルスの複製が起こった。ウイルス複製の動態は、曝露後６日目に最高のウイルス力価が示されたことを提示している。ウイルス量は、気管綿棒およびＢＡＬＦ試料で最大の差があるワクチン接種を受けたグループと比較して、治療グループ２（Ｔ０２）の鼻腔綿棒、気管綿棒、およびＢＡＬＦで高くなる傾向があった。さらに、ＩＤＶの免疫組織化学染色を、上気道の固定された切除組織（鼻甲介および気管）で行った。曝露を受けた動物は、染色によるＩＤＶウイルス陽性であり、５頭中５頭のウシが曝露後６日目に陽性であった。ワクチン接種を受けた動物は、ＩＨＣ染色によるＩＤＶ陽性ではなかった。免疫は、上気道のウイルス量を軽減することによって、ウイルスの広がりを制限し得る仮説を立てることができる。さらに、接触対照グループ（Ｔ０４）は、ウイルスが曝露を受けた動物（Ｔ０２）から共に収容される未処置の動物に移されたことを示した。
【００５０】
この研究の結果に基づいて、ＩＤＶは、上気道で複製し、免疫組織化学的所見に基づく軽度の炎症を誘発すると考えられる。このウイルス感染は、ウシ呼吸器疾患複合体の重要な原因であり得、ここで、ワクチンのような予防的介入がウシの全体的な健康を増進する可能性がある。
【００５１】
実施例２
この研究は、インフルエンザＤウイルスによって引き起こされる上気道感染症が、より重度の二次性マンヘミア・ヘモリチカ感染症の前駆体または増悪因子であるという仮説を評価した。
【００５２】
この研究のために、合計７０頭のホルスタインまたはホルスタイン交雑ウシ（５〜９ヶ月齢）を使用した。動物を試験施設の新しい環境に最低５日間順応させた。ハウジングはＡＢＳＬ−２収容室で構成されており、各部屋は共通の供給ライン寝台およびオープン水タンクシステムを有した。動物は、以下の包含基準：刻耳および抗原捕捉ＥＬＩＳＡ（ＡＣＥ）によるＢＶＤＶ−ＰＩ陰性、０日目に実施した身体検査に基づく良好な健康状態、ＩＤＶに対する血清陰性、ならびにＭ．ヘモリチカのロイコトキシン（ＬＫＴ）に対する血清陰性を満たした。
【００５３】
ＩＤＶ実験ワクチンは、ＢＰＬ不活性化ＩＤＶ株Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＮＥ／１０３７９５／２０１２で構成されていた。免疫化および曝露に使用されるインフルエンザウイルスの株を、Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＫＳ／１４−２２／２０１２からＤ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＮＥ／１０３７９５／２０１２に変更したが、これは、後者のウイルスがスケールアップに関してより良好に成長していることに起因した。ワクチンを１用量あたり１２８０ＨＡＵに標準化した。抗原をバッチし、ＳＥＰＰＩＣ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ２０１ＶＧと１：１の重量比で製剤化／アジュバント化した。ワクチンには、使用前に、Ｆｌｕｉｄ  Ｔｈｉｏｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ  Ｍｅｄｉａ（ＦＴＭ）およびＴｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＳＢ）ブロスで７日間の培地ボトル無菌試験を実施した。
【００５４】
Ｍ．ヘモリチカワクチンは、不活性化された外膜タンパク質（ＯＭＰ）抽出物および組換えＬＫＴ（ｒＬＫＴ）で構成されていた。ワクチンを、１用量あたり２５０μｇのＯＭＰおよび１２５μｇのＬＫＴに標準化した。抗原をバッチし、ＳＥＰＰＩＣ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧと１：１の重量比で製剤化／アジュバント化した。ワクチンには、使用前に、ＦＴＭおよびＴＳＢブロスで７日間の培地ボトル無菌試験を実施した。
【表１０】
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【００５５】
混合ワクチンは、ＢＰＬ不活性化ＩＤＶ株Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＮＥ／１０３７９５／２０１２に加えて、不活性化外膜タンパク質（ＯＭＰ）抽出物およびｒＬＫＴで構成されていた。ワクチンを、ＩＤＶの１用量あたり１２８０ＨＡＵ、２５０μｇのＯＭＰ、および１用量あたり１２５μｇのＬＫＴに標準化した。抗原をバッチし、ＳＥＰＰＩＣ  ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ  ２０１  ＶＧと１：１の重量比で製剤化／アジュバント化した。ワクチンには、使用前に、ＦＴＭおよびＴＳＢブロスで７日間の培地ボトル無菌試験を実施した。
【００５６】
選択基準および包含／除外基準を満たしたすべての候補動物は、登録の資格があった。ランダムな割り当て計画を使用して、動物を治療グループにランダムに割り当てた。臨床観察を実施し、試料を収集し、試料を分析する研究要員には、治療識別が隠されていた。肺病変スコアリングを実施した研究調査員には、スコアリング中、特定の子ウシＩＤは知らされていなかった。
【００５７】
研究施設に到着後、動物を３つのＡＢＳＬ−２収容室に収容した。グループＴ０１、Ｔ０２、Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７を２つの部屋（部屋ごとに２５頭の動物）に収容し、部屋間で治療グループを均等に表示した。グループＴ０３およびＴ０４を、曝露を受けた動物からのＩＤＶが脱落して、ＩＤＶ未処置の動物に交差汚染することを防ぐために、別の３番目の部屋に収容した。動物を３つの部屋で混合させた。研究４１日目（ＳＤ４１）のＭ．ヘモリチカの曝露に続いて、群れ全体を再分別して、１室あたり２３〜２４頭の動物を有する３つのＡＢＳＬ−２収容室に治療グループ（Ｔ０１〜Ｔ０７）を均等に分配した。再分別に続いて、各治療グループで同等に表示した（１室あたり１グループにつき３〜４頭）。
【００５８】
０日目に首の右側に（１８ゲージの１インチ針）、１４日目に首の左側に皮下（ＳＱ）注射によって子ウシのワクチン接種（２．０ｍＬ）を行った。ワクチン接種に対する応答を評価するために、ワクチン接種のおよそ１時間後に動物を観察した。研究動物を毎日観察して、５日目に始めて４８日目まで続く一般的な健康状態を判定した。毎日ほぼ同じ時間に観察を行った。動物の健康の観察は、動物の健康の指標のための動物の畜舎側の視覚的評価から構成されていた。
【００５９】
インフルエンザＤウイルスの曝露は、グループＴ０１、Ｔ０２、Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７の３５日目（約６〜１０ヶ月齢）に発生した。３５日目に、１０５．７ＴＣＩＤ５０のＩＤＶ株Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＮＥ／１０３７９５／２０１２で使い捨てＰＲＥＶＡＬ（登録商標）缶アトマイザー（１０．０ｍＬ、５ｍＬ／ｎｏｓｔｒｉｌ）を用いて、各子ウシに鼻腔内曝露を行った。
【００６０】
ＩＤＶを次のように産生した。３つの８５０ｃｍ２の組織培養ポリスチレンローラーボトル内で、７．５％ＦＢＳおよび４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＥＭＥＭ培地に、標的密度２×１０７の細胞／ボトル（すなわち、２３５２９細胞／ｃｍ２）のＳＴ−Ｃ細胞を播種した。ローラーボトルを３７℃で０．２５ｒｐｍで回転させた。７日後、細胞は感染した。感染のために、使用済みの培地をあらかじめ温めておいたＥＭＥＭ培地のみと交換し、ＩＤＶ（Ｄ／Ｂｏｖｉｎｅ／ＮＥ／１０３７９５／２０１２）を０．０５の感染多重度（ＭＯＩ）で添加した。０．２５ｒｐｍおよび３７℃でさらに３日間インキュベートした後、ローラーボトルおよび内容物全体を−８０℃で凍結し、解凍して、無菌的に分注することによって採取した。
【００６１】
採取時に、ウイルス力価アッセイのために試料を取った。アッセイのために、ＳＴ−Ｃ細胞を９６ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェルで播種した。移植の３日後、細胞が約９５％コンフルエントになったとき、ウェルをＰＢＳで２回洗浄してから、０．２ｍＬ／Ｌゲンタマイシンを有する１００μＬのＥＭＥＭを各ウェルに添加した。次に、採取したＩＤＶ試料を連続的に１：１０に希釈した後、１００μＬの各希釈液を各ウェルに添加した。３７℃および５％ＣＯ２でさらに３日間インキュベーションした後、プレートを−２０℃で８０％アセトンを用いて少なくとも２０分間固定してから、３７℃で乾燥した。染色のために、一次抗体をＤ−ＰＢＳで希釈し、各ウェルに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体をＤ−ＰＢＳで希釈し、各ウェルに添加し、３７℃で７５分間インキュベートした。ＰＢＳで２回洗浄した後、結果を蛍光顕微鏡で視覚的に得て、Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒの式を介して計算した。
【００６２】
マンヘミア・ヘモリチカ曝露は、グループＴ０１、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７に関して４１日目（約６〜１０ヶ月齢）に発生した。４１日目に、グループＴ０１、Ｔ０３、Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７の各子ウシに、使い捨てアトマイザーで鼻腔内曝露し（５．０ｍＬ、２．５ｍＬ／鼻孔）、１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ヘモリチカ株で喉頭／気管分岐点に内視鏡を用いて気管内曝露した。４１日目に、グループＴ０４の各子ウシを、気管の分岐点を特定し、およそ１０ｃｍ引き戻し、内視鏡を用いて１０９ＣＦＵ／ｍＬのＭ．ヘモリチカ株６０ｍＬを送達することによって、気管内曝露した。
【００６３】
曝露期間（３５〜４８日目）の間、直腸体温を毎日記録した。温度を毎日ほぼ同じ時間に記録した。
【００６４】
施設に到着する最低７日前に１つの血液試料を収集し、ＩＤＶ血球凝集抑制および抗Ｍ．ヘモリチカＬＫＴ抗体の判定のために残りの血液試料を−２、１４、２１、２８、３５、４１、および４８日目に収集した。
【００６５】
施設に到着する最低７日前に１つの鼻腔綿棒の試料を収集し、残りの鼻腔綿棒を３５日目（曝露前）、３７、３９、４１、４３、４５、および４７日目にすべての動物から収集した。さらに、４８日目の剖検で気管の綿棒を得た。
【００６６】
４８日目に、肺病変スコアリング、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）液の収集、および組織収集のために、提示があった動物を人道的に安楽死させた。肺を各動物から除去し、切除した肺からＢＡＬ液を無菌収集した。無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を肺にピペットで入れ、肺を穏やかにマッサージしながらピペットで収集した。ＢＡＬ液抽出物を氷上に置いたチューブに入れた。ＢＡＬ液の各試料を２つのアリコートに分割し、動物ＩＤおよび試料収集日のラベルを付けた両方のアリコートのセットを凍結保存した（≦−２０℃）。
【００６７】
７つの肺葉の各々を、Ｍ．ヘモリチカおよび／またはＩＤＶに起因する肉眼的特徴病変の視覚的および触診の両方で検査した。各肺葉の病変／硬化の量をスコア付けし、葉の０〜１００％で実際の値として記録した。病変のある肺の割合を計算するために、各葉の病変の量（スコア）を加重式に挿入した。（肺葉の相対的な重量に応じて）７つの葉の各々に割り当てられた重量は、次のとおりである：左頂葉＝１０％、左心葉＝１０％、左横隔膜葉＝２５％、右頂葉＝１０％、右心葉＝１０％、右横隔膜葉＝２５％、アクセサリローブ＝１０％。
【００６８】
鼻甲介、気管、気管気管支リンパ節、および肺組織の剖検で病変を検査し、各々の切片を切除した。セクションを分割して、半分を免疫組織化学評価用の固定液（緩衝ホルマリンまたは同等品）に入れ、構造的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、残りの半分をＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）に入れるか、またはサイトカインおよび炎症性遺伝子のＰＣＲ分析のために−７０℃で凍結する。
【００６９】
主要変数であるＳＤ４８の合計パーセント肺病変スコアを、実施例１と同様に計算および分析した。毎日のうつ病スコア、毎日の身体状態スコア、毎日の呼吸スコア、およびＳＤ３５〜ＳＤ４８までの毎日の直腸体温、ならびにＳＤ３５〜ＳＤ４８までの死亡率および除去率を含む二次変数を要約または分析した。
【００７０】
７つの治療グループＴ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４、Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７のデータをプールして分析した。動物は実験単位であったため、各変数についての計算を動物ごとに行った。特に明記しない限り、すべてのテストを５％の有意水準で実施した。
【００７１】
４８日目の合計パーセント肺病変スコアをアルシン（ｓｑｒｔ（合計パーセント肺スコア））を使用して変換し、線形混合モデル分析（ＳＡＳ（登録商標）ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ  ｖ９．４以上）を使用して、治療ごとに固定効果で分析した。以下のペアワイズ比較を使用して、線形コントラストを実施した。
Ｔ０１対Ｔ０２、Ｔ０３、Ｔ０４；
Ｔ０２対Ｔ０３、Ｔ０４；
Ｔ０３対Ｔ０４；ならびに
Ｔ０４対Ｔ０５、Ｔ０６、およびＴ０７。
【００７２】
最小二乗平均（ＬＳＭＥＡＮ）および標準誤差、ならびに算術平均および標準偏差を各治療グループに対して計算し、逆変換した結果を表示する。
【００７３】
さらに、緩和率（ＭＦ）の要約統計を表示した（Ｒバージョン３．０．３（２０１４−０３−０６））。毎日のうつ病スコア、毎日の身体状態スコア、および毎日の呼吸スコアの頻度分布を治療時に毎回得た。
【００７４】
疾病率に起因する２つの死亡があり、その両方が治療グループ４であった。他のグループには死亡率はなかった。
【００７５】
この研究の主な目的は、異なる治療グループの死亡率および肺病変スコアを評価すること、ならびにインフルエンザＤウイルスによって引き起こされる上気道感染症が、より重度の二次性マンヘミア・ヘモリチカ感染症の前駆体であるという仮説を評価することであった。インフルエンザＤウイルスの曝露後にＭ．ヘモリチカを鼻腔内曝露した動物の平均肺病変スコアは、Ｍ．ヘモリチカのみを鼻腔内曝露した動物と比較して４倍を超える増加を示した（グループＴ０１＝５．６およびグループＴ０３＝１．２）。これは、ＩＤＶによる上気道感染が、Ｍ．ヘモリチカが上気道から移動する可能性を増加させ、ここで、それが典型的に下気道および肺にコロニー形成し、病理が現われ始めるという仮説を支持する。
【００７６】
ＩＤＶおよびＭ．ヘモリチカで曝露されたウシの平均肺病変スコアは、より大量の細菌（１０ｍＬの鼻腔内／気管内と比較して６０ｍＬ）が肺に直接送達される典型的なＭ．ヘモリチカ感染モデルで観察されたものよりも低かった。重症度の違いは、用量の減少、ならびに上気道と肺との間の解剖学的および器質的免疫防御によって説明することができる。
【表１１】
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【表１２】
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【００７７】
さらに、ＩＤＶおよびＭ．ヘモリチカ抗原の両方を含有する混合不活性化ワクチンは、ワクチンを認可するために使用されるＭ．ヘモリチカモデルの現在の統計的基準の概要として有効であるとみなされるであろう肺病変スコアリングの二重の曝露に対して、統計的に有意な防御（ＭＦによる測定）を提供した（上限と下限が正の０．４ＭＦを超える）。ＩＤＶの一価ワクチン（２．５の平均肺病変スコア）およびＭ．ヘモリチカの一価ワクチン（０．９の平均肺病変スコア）は、基準を超えるＭＦを提供したが、信頼限界の上限と下限は、満足できる基準を満たしていなかった。したがって、ＩＤＶおよびＭ．ヘモリチカの混合ワクチンは、ウシ呼吸器疾患を制御するための効果的な手法である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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