(57)【要約】  本発明は、新規エンドプロテーゼ、結合活性は有するが、加水分解活性が欠けているか又は低下しているその突然変異体、及びＯ−結合型糖タンパク質を研究及び単離する方法における使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｃ）前記配列番号１の配列の断片若しくは前記配列番号１のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含む、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列又はその断片が、モチーフＨＥｂｂＨ（式中、ｂは、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである）を含み、任意で、前記モチーフが、配列番号１の１８１位〜１８５位に対応する位置において前記ポリペプチド中に存在する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記モチーフが、配列ＨＥＩＧＨ又はＨＥＬＧＨ、好ましくはＨＥＬＧＨを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
（ａ）ａが、アミノ酸Ｖ、Ｔ、又はＧであり；
（ｂ）ｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷであり；
（ｃ）ｘが、任意のアミノ酸であり；
（ｄ）ｃが、疎水性アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹである、モチーフａｂｘＨＥｂｂＨｂｃを含み、
任意で、前記モチーフが、配列ＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬ又はＧＶＡＨＥＬＧＨＮＦ、好ましくはＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるＨｉｓタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記Ｃ末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むか又は配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはＡｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物と共に提供され、Ａｍ１７５７が、配列番号１１からなるポリペプチドである及び／又はＡｍ０７０７が、配列番号１４からなるポリペプチドである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
Ｏ−糖タンパク質を加水分解する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることを含み、任意で、加水分解生成物を検出又は分析することを更に含む方法。
【請求項８】
タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、生成された生成物を検出及び／又は分析することとを含み、任意で、切断生成物の有無を使用して前記サンプル中のＯ−糖タンパク質の有無を判定する、並びに／又は前記分析を実施してＯ−グリカン鎖の種類及び／若しくはそのＯ−糖タンパク質への結合位置を同定する、方法。
【請求項９】
前記分析又は検出が、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、又は質量分析によって実施される、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質又はサンプルを請求項１〜６に記載のポリペプチドと接触させる前に又は同時に、前記サンプルをシアリダーゼと共にインキュベートし、好ましくは、前記シアリダーゼが、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ａｍ１７５７が、配列番号１１からなるポリペプチドである及び／又はＡｍ０７０７が、配列番号１４からなるポリペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
Ｏ−グリカン又はＯ−糖タンパク質に結合することができ、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列；
（ｂ）前記配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）前記配列番号５若しくは配列番号２０の配列の断片、又は前記配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチド。
【請求項１３】
前記配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列又はその断片が、メタロプロテアーゼモチーフＨＥｂｂＨを含まず、好ましくは、
（ａ）１番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｂ）２番目の位置におけるＥが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、好ましくはでＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｃ）５番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換されるように破壊されたバージョンの前記モチーフを含み、
前記モチーフにおけるｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるＨｉｓタグを含み、前記タグが、リンカーによって前記Ｃ末端に連結されていてよく、任意で、前記ポリペプチドが、配列番号６又は２１のアミノ酸配列を含むか又は配列番号６又は２１のアミノ酸配列からなる、請求項１２又は１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、溶液中で提供されるか、凍結乾燥されているか、又は固定化されており、任意で、前記ポリペプチドが、シアリダーゼ、好ましくはＡｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物と共に提供される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質に結合させる方法であって、前記Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質を含むサンプルを請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、任意で、Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／若しくはＯ−糖タンパク質が結合しているかどうかを判定すること、並びに／又は得られた混合物から前記Ｏ−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質、前記Ｏ−糖ペプチド、若しくは前記Ｏ−糖タンパク質を分離することとを含み、任意で、Ｏ−グリカン若しくは結合している糖タンパク質、Ｏ−糖ペプチド、又はＯ−糖タンパク質を前記サンプルから単離することを目的とする方法。
【請求項１７】
タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、前記タンパク質を含むサンプルを請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させることと、前記タンパク質が前記ポリペプチドに結合しているかどうかを判定することとを含む、方法。
【請求項１８】
サンプル中のＯ−糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）前記サンプルを請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させて、Ｏ−糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質と前記ポリペプチドとの間で複合体を形成させることと；
（ｂ）任意で、接触させたサンプルから前記ポリペプチドを分離することと；
（ｃ）分離されたポリペプチドがＯ−結合型の糖タンパク質又は糖ペプチドに結合しているかどうかを判定して、前記サンプル中のＯ−結合型の糖ペプチド又は糖タンパク質の有無を判定することと
を含む、方法。
【請求項１９】
前記判定及び／又は分離が、アフィニティークロマトグラフィー、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、レクチンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、又は質量分析によって実施される、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
結合している物質を、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドから、
（ａ）高モル濃度の尿素；
（ｂ）高濃度の洗浄剤；又は
（ｃ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド
を含むバッファで溶出する工程を更に含む、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規エンドプロテーゼ、結合活性は有するが、加水分解活性が欠けているか又は低下しているその突然変異体、及びＯ結合型糖タンパク質を研究及び単離する方法における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、特にＯ結合型グリカンに関して、生物学的機能に対するグリコシル化の影響が大きな注目を集めている。しかし、これら重要なタンパク質修飾に対する関心は継続しているものの、グリカン及び糖タンパク質を効率的に研究するためのツールが不足している。
【０００３】
ネイティブタンパク質からのＯ結合型グリカンの除去及びグリカンのシーケンシングの両方にとって非常に有用な幾つかのエキソ−及びエンド−グリコシダーゼが開発されている。これら両アプローチは、糖タンパク質の不均一性を低減するために個々に使用することができるので、質量分析におけるタンパク質及びその断片化ペプチドの分析が容易になる。加水分解によって影響を受ける機能の下流分析によって、グリカンの生物学的効果の分析をより効率的に行うこともできる。しかし、このようなツールは、例えば、Ｏ結合型糖タンパク質の同定、グリコシル化の部位の決定、及びＯ結合型糖ペプチドの精製を容易にするには効率的ではない。
【０００４】
Ｏ−グリカンに結合し、そして、グリカンに近接するＲ−Ｎ−結合を主に加水分解する最初のＯ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼは、１９９１／１９９２年に報告された（Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １７３，５５９７−５６０３（１９９１）；Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６０，５６−６２（１９９２）。しかし、この酵素は、シアル酸を含むＯ−グリカン（Ｏ結合型グリカンの大部分であるが、全てではない）にのみ特異的であり、そして、特定のアミノ酸要求性を有し、その結果、加水分解レベルが概して低くなるので、医療及びバイオテクノロジーにおける有用性が限られている。Ｏ結合型糖タンパク質を研究するためのより優れたツールが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、本明細書ではＬＳと称される、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Akkermansia muciniphila）由来の新規ポリペプチドを同定、精製、及び特性評価した。このポリペプチドは、特定のアミノ酸配列に対する特異性又は制約を全く示さずに、Ｏ結合型グリカンのＮ末端側でありかつ接近しているアミノ酸結合を特異的に切断／加水分解するエンドプロテーゼとして作用する。
【０００６】
また、本発明者らは、ＬＳの配列を改変し、Ｏ結合型グリカンに結合することができるが、糖タンパク質を加水分解する能力が欠けているか又は低下している突然変異体を同定した。これら突然変異体は、遊離のＯ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質の選択的除去、濃縮、又は精製に使用することができる。
【０００７】
従って、本発明の第１の態様では、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）該配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｃ）該配列番号１の配列の断片若しくは該配列番号１のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドが提供される。
【０００８】
また、本発明は、Ｏ−糖タンパク質を加水分解する方法であって、該タンパク質を含むサンプルを本発明のポリペプチドと接触させることを含み、任意で、加水分解生成物を検出又は分析することを更に含む方法を提供する。
【０００９】
更に、タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、該タンパク質を含むサンプルを本発明のポリペプチドと接触させることと、生成された生成物を検出及び／又は分析することとを含み、任意で、切断生成物の有無を使用して該サンプル中のＯ−糖タンパク質の有無を判定する、並びに／又は該分析を実施してＯ−グリカン鎖の種類及び／若しくはそのＯ−糖タンパク質への結合位置を同定する方法が提供される。
【００１０】
本発明の第２の態様では、Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質に結合することができ、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５のアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；あるいは
（ｃ）該配列番号５若しくは配列番号２０の配列の断片、又は該配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸配列の断片であるアミノ酸配列
を含むポリペプチドが提供される。
【００１１】
また、本発明は、Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質に結合させる方法であって、該Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、及び／又はＯ−糖タンパク質を含むサンプルを本発明のポリペプチドと接触させることと、任意で、Ｏ−グリカン、Ｏ−糖ペプチド、若しくはＯ−糖タンパク質が結合しているかどうかを判定すること、並びに／又は得られた混合物から該Ｏ−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質、該Ｏ−糖ペプチド、若しくは該Ｏ−糖タンパク質を分離することとを含む方法を提供する。
【００１２】
更に、タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、該タンパク質を含むサンプルを本発明のポリペプチドと接触させることと、該タンパク質が該ポリペプチドに結合しているかどうかを判定することとを含む方法が提供される。
【００１３】
また、サンプル中のＯ−糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質を検出する方法であって、
（ａ）該サンプルを本発明のポリペプチドと接触させて、該本発明のポリペプチドとＯ結合型糖ペプチド及び／又はＯ−糖タンパク質との間で複合体（Ｏ結合型糖ペプチド／タンパク質−ポリペプチド複合体）を形成させることと；
（ｂ）任意で、接触させたサンプルから該ポリペプチドを分離することと；
（ｃ）分離されたポリペプチドがＯ−結合型の糖タンパク質又は糖ペプチドに結合しているかどうかを判定して、該サンプル中のＯ−結合型の糖ペプチド又は糖タンパク質の有無を判定することと
を含む方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＬＳの発現及び精製。ｐＥＴ２１（ａ）＋ベクターにおいてＣ末端Ｈｉｓタグとの融合タンパク質としてＬＳを発現させた。ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒに形質転換した後、４つの個々のクローンを発現させ、均質になるまでＨｉｓ  ＧｒａｖｉｔｙＦｌｏｗカラムで精製した。精製されたサンプル中のタンパク質の総量及びＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づく純度に基づいて、４つの試験したクローン全てが等しく良好に発現していた。
【図２】ＬＳは、Ｏ−グリカンを含有するタンパク質に対して特異的に作用する−図は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した生成物を示す。ＬＳをＩｇＧ又はＩｇＡと共にインキュベートした結果、ＩｇＡは特異的に分解されたが、ＩｇＧ（ハーセプチン／トラスツズマブ）に対する活性はみられなかった。全てのインキュベートをＰＢＳ中３７℃で一晩行った。シアリダーゼ（Ａｍ０７０７）の添加は、これら条件中のＬＳの活性にとって必須ではなかった。
【図３Ａ】最適な酵素条件。ＬＳは、広いｐＨ範囲で活性があり（Ａ）、ＮａＣｌに対する耐容性が良好である（Ｂ）が、ＥＤＴＡに対する感受性が高く（Ｃ、Ｄ）、Ｚｎ２＋によって部分的に阻害される（Ｄ）。全ての実験（ｐＨアッセイを除く）をＰＢＳ中３７℃で一晩行った。最適ｐＨを決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８〜８．８）又は５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．６）中で酵素をインキュベートした。
【図３Ｂ】最適な酵素条件。ＬＳは、広いｐＨ範囲で活性があり（Ａ）、ＮａＣｌに対する耐容性が良好である（Ｂ）が、ＥＤＴＡに対する感受性が高く（Ｃ、Ｄ）、Ｚｎ２＋によって部分的に阻害される（Ｄ）。全ての実験（ｐＨアッセイを除く）をＰＢＳ中３７℃で一晩行った。最適ｐＨを決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８〜８．８）又は５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．６）中で酵素をインキュベートした。
【図３Ｃ】最適な酵素条件。ＬＳは、広いｐＨ範囲で活性があり（Ａ）、ＮａＣｌに対する耐容性が良好である（Ｂ）が、ＥＤＴＡに対する感受性が高く（Ｃ、Ｄ）、Ｚｎ２＋によって部分的に阻害される（Ｄ）。全ての実験（ｐＨアッセイを除く）をＰＢＳ中３７℃で一晩行った。最適ｐＨを決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８〜８．８）又は５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．６）中で酵素をインキュベートした。
【図３Ｄ】最適な酵素条件。ＬＳは、広いｐＨ範囲で活性があり（Ａ）、ＮａＣｌに対する耐容性が良好である（Ｂ）が、ＥＤＴＡに対する感受性が高く（Ｃ、Ｄ）、Ｚｎ２＋によって部分的に阻害される（Ｄ）。全ての実験（ｐＨアッセイを除く）をＰＢＳ中３７℃で一晩行った。最適ｐＨを決定するために、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８〜８．８）又は５０ｍＭ酢酸（ｐＨ５．６）中で酵素をインキュベートした。
【図４Ａ】ＬＳの活性は、グリカン組成によって調節される。（Ａ）３０分間ＬＳで加水分解する前に特定のグリカンを逐次除去した結果、シアリル化されたタンパク質では活性が非常に低くなり、アシアリル化された（asialylated）タンパク質では活性が高くなり、ガラクトースが除去されたサンプルでは活性がなくなった。（Ｓ）シアリダーゼ、（ＳＧ）シアリダーゼ及びガラクトシダーゼ、（ＬＳ）ＬＳ。
【図４Ｂ】ＬＳの活性は、グリカン組成によって調節される。（Ｂ）完全にグリコシル化された（Ｅｎｂｒｅｌ）又はシアリダーゼ処理された（Ｅｎｂｒｅｌ（Ｓ））糖タンパク質を長時間インキュベート（一晩）した結果、両サンプルが完全に加水分解された。Ｅｎｂｒｅｌは、本明細書ではエタネルセプトと称される場合もある。
【図４Ｃ】ＬＳの活性は、グリカン組成によって調節される。（Ｃ）エタネルセプトのＴＮＦα結合部（ＴＮＦαＲ）をシアリダーゼ（「シアリダーゼ」）、Ｏ−グリコシダーゼ／シアリダーゼ（「Ｏ−ｇｌｙｃ」）、又はＰＮＧａｓｅＦ（「Ｎ−ｇｌｙｃ」）で前処理して、それぞれ、シアル酸、Ｏ−グリカン、及びＮ−グリカンを除去した。ＬＳをサンプルに添加し、分析前にインキュベートを一晩継続した。ＬＳは、Ｏ−グリコシダーゼで処理されたものを除く全てのサンプルで活性を有していた。
【図５Ａ】ＬＳがＯ−グリカンのＮ末端の糖タンパク質を加水分解することを示す検索結果。ＬＳで断片に加水分解され、続いて、Ｏ−グリコシダーゼ処理で脱グリコシル化されたエタネルセプトを、質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ）に供した。ｍ／ｚ値及びＭＳ／ＭＳデータに基づいて、同定されたペプチド（白色の斜線付きボックス）をエタネルセプトの配列に当てはめ、ｙ’及びｂ’のイオンを小さな灰色のボックスでマークした。白色の斜線付きボックス（例えば、ペプチド）は全て、Ｏ−グリカンが結合しているＴ又はＳでまさに始まっている。すぐ前のアミノ酸は異なり（Ｐ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｇ）、加水分解には影響を与えないと思われる。（Ａ）Ｓ／Ｔペプチダーゼで生成されたペプチドを特異的に検索する、バイアスドアプローチを使用した分析。
【図５Ｂ】ＬＳがＯ−グリカンのＮ末端の糖タンパク質を加水分解することを示す検索結果。ＬＳで断片に加水分解され、続いて、Ｏ−グリコシダーゼ処理で脱グリコシル化されたエタネルセプトを、質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ）に供した。ｍ／ｚ値及びＭＳ／ＭＳデータに基づいて、同定されたペプチド（白色の斜線付きボックス）をエタネルセプトの配列に当てはめ、ｙ’及びｂ’のイオンを小さな灰色のボックスでマークした。白色の斜線付きボックス（例えば、ペプチド）は全て、Ｏ−グリカンが結合しているＴ又はＳでまさに始まっている。すぐ前のアミノ酸は異なり（Ｐ、Ｓ、Ｈ、Ｔ、Ｇ）、加水分解には影響を与えないと思われる。（Ｂ）アンバイアスドアプローチを使用した分析。
【図６Ａ】不活化されたＬＳは、Ｏ結合型糖タンパク質に特異的に結合する。メタロプロテアーゼ活性部位に変異導入して、基質の親和性又は相互作用には影響を与えずに触媒能を除去した。具体的には、ＥをＡに交換することによってこれを行い、それによって、クローン「ＬＳｍｕｔ」（ＬＳＥ２０６Ａとも称される）を作製した。（Ａ）ＬＳはシアリダーゼの存在下でＥｎｂｒｅｌを加水分解することができたが、不活化されたＬｓｍｕｔは、試験した条件下でＥｎｂｒｅｌを加水分解することができなかった。活性の喪失をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【図６Ｂ】不活化されたＬＳは、Ｏ結合型糖タンパク質に特異的に結合する。メタロプロテアーゼ活性部位に変異導入して、基質の親和性又は相互作用には影響を与えずに触媒能を除去した。具体的には、ＥをＡに交換することによってこれを行い、それによって、クローン「ＬＳｍｕｔ」（ＬＳＥ２０６Ａとも称される）を作製した。（Ｂ）加水分解活性が失われたにもかかわらず、Ｌｓｍｕｔは依然としてＯ−糖タンパク質に結合することができた。ＬＳＥ２０６Ａが固定化されたスピンカラムで特異的結合が確認され、このことから、Ｏ結合型糖タンパク質に対する特異的親和性が立証された。セファロースにＬｓｍｕｔを固定化することによって、ＩｇＡをアフィニティー精製することができた。Ｏ−グリカンを欠いているハーセプチン（トラスツズマブ）及びＯ−グリコシダーゼ処理されたＩｇＡはカラムに結合せず、素通り画分（ＦＴ）において検出することができた。Ｎｅｕｒ＝ノイラミニダーゼ／シアリダーゼ０７０７。
【図７】α２−３結合したシアル酸は、ＬＳの効率を制限する。糖タンパク質基質としてＥｎｂｒｅｌを使用して、ＬＳを多様なシアリダーゼのセットと共に３０分間〜２０時間同時にインキュベートしたところ、α２−３特異的シアルジアーゼ（sialdiase）１７５７の存在下では又はミックス（０７０７＋１７５７）を用いるとより効率が高くなることが明らかになったが、広域スペクトルシアリダーゼ０７０７は、一見したところＬＳの完全活性に必須ではなく、このことはα２−６（及びα２−８）結合がＬＳ活性に関係ないことを示唆している。
【図８】ＬＳ活性の概略図。ＬＳは、Ｏ結合型ＧａｌＮＡｃに結合している末端ガラクトースに優先的に結合し、その結果、グリカンが結合しているセリン又はスレオニンのＮ末端が加水分解される。シアル酸の存在はＬＳの効率を低下させるが、阻害はしない。Ｎ結合型グリカンに対しては活性がみられなかった。
【図９Ａ】ＬＳ、Ｎ−グリカンを除去するためのＰＮＧａｓｅＦ、シアル酸を除去するためのシアリダーゼの様々な組み合わせ、及びＯ−グリカンを除去するためのＯ−グリコシダーゼでエリスロポエチン（erythropoeitin）を切断する実験の結果。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰＬＣ、及びＥＳＩ質量分析によって分析した。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果：レーン１＝ＰＮＧａｓｅＦ及びシアリダーゼで処理したＥＰＯ；レーン２＝ＰＮＧａｓｅＦ及びシアリダーゼ＋ＬＳで処理したＥＰＯ；レーン３＝ＰＮＧａｓｅＦ＋ＬＳで処理したＥＰＯ；レーン４＝ＬＳの前にＰＮＧａｓｅＦ、シアリダーゼ、Ｏ−グリコシダーゼで処理したＥＰＯ；レーン５＝酵素対照。バンドＸ＝未切断ＥＰＯ；バンドＹ＝ＬＳによって切断されたＥＰＯのＮ末端断片；バンドＺ＝ＬＳによって切断されたＥＰＯのＣ末端断片。レーン２及び３は、シアル酸が除去された場合及びシアル酸がインタクトな場合にＬＳがＥＰＯを切断することを示す。レーン２〜３は、Ｎ−グリカンがＰＮＧａｓｅＦで除去された場合もＬＳがＥＰＯを切断することを示す。レーン４は、Ｏ−グリカンが除去された場合はＬＳがＥＰＯを切断しないことを示す。
【図９Ｂ】ＬＳ、Ｎ−グリカンを除去するためのＰＮＧａｓｅＦ、シアル酸を除去するためのシアリダーゼの様々な組み合わせ、及びＯ−グリカンを除去するためのＯ−グリコシダーゼでエリスロポエチン（erythropoeitin）を切断する実験の結果。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰＬＣ、及びＥＳＩ質量分析によって分析した。（Ｂ）ＵＶクロマトグラムは、ＰＮＧａｓｅＦ及びシアリダーゼ＋ＬＳで処理したＥＰＯについてのＲＰＬＣ分離の結果を示す。図示の通り、２つの主なピークが同定された。ピーク１は、ＬＳによって消化されたＥＰＯのＣ末端断片であり；ピーク２は、ＬＳによって消化されたＥＰＯのＮ末端断片である。
【図９Ｃ】ＬＳ、Ｎ−グリカンを除去するためのＰＮＧａｓｅＦ、シアル酸を除去するためのシアリダーゼの様々な組み合わせ、及びＯ−グリカンを除去するためのＯ−グリコシダーゼでエリスロポエチン（erythropoeitin）を切断する実験の結果。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰＬＣ、及びＥＳＩ質量分析によって分析した。（Ｃ、Ｄ）は、質量スペクトル分析の結果を示す。図Ｃは、Ｏ−グリカンが（この時点でＮ末端の）セリンにまだ結合しているＥＰＯのＣ末端断片の質量を示す（四角＝ＧｌｃＮＡｃ、円＝ガラクトース）。質量の差は、ＭＳ機器におけるイオン化エネルギーによって引き起こされた可能性がある、サンプルの幾つかの部分におけるＯ−グリカンの分解（末端ガラクトースの喪失）の差に起因する。
【図９Ｄ】ＬＳ、Ｎ−グリカンを除去するためのＰＮＧａｓｅＦ、シアル酸を除去するためのシアリダーゼの様々な組み合わせ、及びＯ−グリカンを除去するためのＯ−グリコシダーゼでエリスロポエチン（erythropoeitin）を切断する実験の結果。反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰＬＣ、及びＥＳＩ質量分析によって分析した。（Ｃ、Ｄ）は、質量スペクトル分析の結果を示す。図Ｄは、グリカンを欠いているＥＰＯのＮ末端断片＋グリカンがまだ結合している未消化ＥＰＯを示す。
【図１０Ａ】ＬＳＥ２０６Ａは多少の活性を保持しているが、ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（ＬＳＨＥ２０６ＡＡと称される場合もある）は完全に不活性であることを示す実験の結果。野生型ＬＳ酵素と比べて、エタネルセプトのＴＮＦα結合部（ＴＮＦａＲ２；本明細書ではＴＮＦａＲと称される場合もある）及びエタネルセプト自体（エタネルセプト）を含む、アシアリル化Ｏ−グリコシル化基質に対するＬＳ突然変異体ＬＳＥ２０６Ａ（Ａ）及びＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（Ｂ）の活性を評価した。様々な濃度のＬＳ突然変異体を基質１μｇに添加し（１：１〜１５：１、酵素：基質）、ＰＢＳ中３７℃で一晩インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。  Ａ）レーン１：アシアリル化基質のみ；レーン２：ＬＳのみ、レーン３：ＬＳＥ２０６Ａ０．５μｇ、レーン４：ＬＳＥ２０６Ａ５μｇ、レーン５：ＴＮＦａＲ２＋ＬＳ（１：１比）、レーン６：ＴＮＦａＲ２＋ＬＳＥ２０６Ａ（１：１比）。  Ｂ）レーン１：アシアリル化基質のみ；レーン２：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（１５：１比）、レーン３：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（５：１比）、レーン４：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（１：１比）、レーン５：ＬＳ＋エタネルセプト（１：１比）、レーン６：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ
【図１０Ｂ】ＬＳＥ２０６Ａは多少の活性を保持しているが、ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（ＬＳＨＥ２０６ＡＡと称される場合もある）は完全に不活性であることを示す実験の結果。野生型ＬＳ酵素と比べて、エタネルセプトのＴＮＦα結合部（ＴＮＦａＲ２；本明細書ではＴＮＦａＲと称される場合もある）及びエタネルセプト自体（エタネルセプト）を含む、アシアリル化Ｏ−グリコシル化基質に対するＬＳ突然変異体ＬＳＥ２０６Ａ（Ａ）及びＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（Ｂ）の活性を評価した。様々な濃度のＬＳ突然変異体を基質１μｇに添加し（１：１〜１５：１、酵素：基質）、ＰＢＳ中３７℃で一晩インキュベートした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。  Ａ）レーン１：アシアリル化基質のみ；レーン２：ＬＳのみ、レーン３：ＬＳＥ２０６Ａ０．５μｇ、レーン４：ＬＳＥ２０６Ａ５μｇ、レーン５：ＴＮＦａＲ２＋ＬＳ（１：１比）、レーン６：ＴＮＦａＲ２＋ＬＳＥ２０６Ａ（１：１比）。  Ｂ）レーン１：アシアリル化基質のみ；レーン２：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（１５：１比）、レーン３：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（５：１比）、レーン４：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ＋エタネルセプト（１：１比）、レーン５：ＬＳ＋エタネルセプト（１：１比）、レーン６：ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ
【図１１Ａ】樹脂に固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６ＡがＯ−グリカン含有タンパク質に特異的に結合することを示す実験の結果。図は、いずれの場合も出発／ローディング材料、素通り画分（ＦＴ）、及び溶出液（Ｅ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ａ）サンプルは、図示の通り、ネイティブ又はシアリダーゼ混合物＋／−Ｏ−グリコシダーゼで前処理した、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、エタネルセプト、ＩｇＡ、及びＩｇＧを含んでいた。
【図１１Ｂ】樹脂に固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６ＡがＯ−グリカン含有タンパク質に特異的に結合することを示す実験の結果。図は、いずれの場合も出発／ローディング材料、素通り画分（ＦＴ）、及び溶出液（Ｅ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ｂ）サンプルは、シアリダーゼ混合物で前処理した、Ｏ−グリコシル化タンパク質（ＴＮＦαＲ及びＡｐｏＥ）、Ｎ−グリコシル化タンパク質（アフリベルセプト、ＡＧＰ（アルファ−１−酸糖タンパク質）、ＩｇＧ  Ｆｃ（ＩｇＧのＦｃドメイン）、及び非グリコシル化タンパク質（ＢＳＡ）のミックスを含んでいた。
【図１１Ｃ】樹脂に固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６ＡがＯ−グリカン含有タンパク質に特異的に結合することを示す実験の結果。図は、いずれの場合も出発／ローディング材料、素通り画分（ＦＴ）、及び溶出液（Ｅ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。（Ｃ）サンプルは、シアリダーゼ混合物で前処理した、Ｎ−グリコシル化タンパク質（セツキシマブ、アフリベルセプト、ＡＧＰ）及び非グリコシル化タンパク質（ＢＳＡ、炭酸脱水素酵素）のミックスを含んでいた。
【図１２Ａ】固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａが、Ｏ−糖タンパク質の結合について濃度依存的能力を有することを示す実験の結果。アシアリル化エタネルセプト（５０〜２５０μｇ；ＰＢＳ１００μＬ中）を、様々な固定化状態のＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（５〜１５ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら（with end-over-end rotation）、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。結合における尿素及び塩酸グアニジン（ＧＨＣｌ）の効果を調べるために、アシアリル化エタネルセプト５０μｇと共に結合バッファ中にそれを含めたが、それ以外は同様に取り扱った。（Ａ）全てのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＧｅｌＤｏｃ  ＥＺ及びソフトウェアＩｍａｇｅＬａｂを使用して濃度測定を通してバンド強度を求めた。記載されている百分率は、対照と比べたバンド強度を示す。
【図１２Ｂ】固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａが、Ｏ−糖タンパク質の結合について濃度依存的能力を有することを示す実験の結果。アシアリル化エタネルセプト（５０〜２５０μｇ；ＰＢＳ１００μＬ中）を、様々な固定化状態のＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（５〜１５ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら（with end-over-end rotation）、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。結合における尿素及び塩酸グアニジン（ＧＨＣｌ）の効果を調べるために、アシアリル化エタネルセプト５０μｇと共に結合バッファ中にそれを含めたが、それ以外は同様に取り扱った。（Ｂ）バンド強度によって求めたタンパク質結合能を、固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａの量に対してプロットした。
【図１３】ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａが樹脂１ｍＬあたりエタネルセプト約３ｍｇをアフィニティー精製することができることを示す実験の結果。アシアリル化エタネルセプト（１０〜２００μｇ；ＰＢＳ中１００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。全てのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＧｅｌＤｏｃ  ＥＺ及びソフトウェアＩｍａｇｅＬａｂを使用して濃度測定を通してバンド強度を求めた。記載されている百分率は、対照と比べたバンド強度を示す。
【図１４Ａ】ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ−基質相互作用が高イオン強度及びバッファの体積／種類の差に対して非感受性であり、広いｐＨ範囲にわたって機能することを示す実験の結果。（Ａ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示した通りの濃度のＮａＣｌを添加したＰＢＳ中１００μＬ（Ｂ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示の通りＰＢＳ中１００〜３００μＬ；（Ｃ）図示した通りの様々なｐＨの様々なバッファ中アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ）及びＢＳＡ（５０μｇ）のサンプルからの素通り画分；（Ｄ）Ｃのサンプルからの溶出液。
【図１４Ｂ】ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ−基質相互作用が高イオン強度及びバッファの体積／種類の差に対して非感受性であり、広いｐＨ範囲にわたって機能することを示す実験の結果。（Ａ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示した通りの濃度のＮａＣｌを添加したＰＢＳ中１００μＬ（Ｂ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示の通りＰＢＳ中１００〜３００μＬ；（Ｃ）図示した通りの様々なｐＨの様々なバッファ中アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ）及びＢＳＡ（５０μｇ）のサンプルからの素通り画分；（Ｄ）Ｃのサンプルからの溶出液。
【図１４Ｃ】ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ−基質相互作用が高イオン強度及びバッファの体積／種類の差に対して非感受性であり、広いｐＨ範囲にわたって機能することを示す実験の結果。（Ａ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示した通りの濃度のＮａＣｌを添加したＰＢＳ中１００μＬ（Ｂ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示の通りＰＢＳ中１００〜３００μＬ；（Ｃ）図示した通りの様々なｐＨの様々なバッファ中アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ）及びＢＳＡ（５０μｇ）のサンプルからの素通り画分；（Ｄ）Ｃのサンプルからの溶出液。
【図１４Ｄ】ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ−基質相互作用が高イオン強度及びバッファの体積／種類の差に対して非感受性であり、広いｐＨ範囲にわたって機能することを示す実験の結果。（Ａ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示した通りの濃度のＮａＣｌを添加したＰＢＳ中１００μＬ（Ｂ）アシアリル化エタネルセプト、５０μｇ；図示の通りＰＢＳ中１００〜３００μＬ；（Ｃ）図示した通りの様々なｐＨの様々なバッファ中アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ）及びＢＳＡ（５０μｇ）のサンプルからの素通り画分；（Ｄ）Ｃのサンプルからの溶出液。
【図１５Ａ】変性又は洗浄剤（detergents）の添加が、ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａに結合しているＯ−糖タンパク質を溶出することを示す実験の結果。アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ；ＰＢＳ中１００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、（Ａ）１〜８Ｍ尿素又は（Ｂ）１．２５〜１０％ＳＤＳを添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。全てのサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１５Ｂ】変性又は洗浄剤（detergents）の添加が、ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａに結合しているＯ−糖タンパク質を溶出することを示す実験の結果。アシアリル化エタネルセプト（５０μｇ；ＰＢＳ中１００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、（Ａ）１〜８Ｍ尿素又は（Ｂ）１．２５〜１０％ＳＤＳを添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。全てのサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１６Ａ】ＬＳを用いた、ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａに結合しているＯ−糖タンパク質の酵素溶出を示す実験の結果。アシアリル化されたアバタセプト（１０μｇ、ＰＢＳ中１００μＬ）及びエタネルセプト（５０μｇ；ＰＢＳ中１００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂を結合バッファ（３５０μＬ）で３回洗浄した後、総体積１００μＬのＰＢＳ中５０ユニットのＬＳを添加した。振盪しながら（４５０ｒｐｍ）、３７℃で更に６〜２４時間サンプルをインキュベートした。ＬＳによって放出されたＯ−糖タンパク質／糖ペプチドを遠心分離（１０００ｇ、１分間）を通して回収した後、最後に８Ｍ尿素を添加してカラムを溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。全てのサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１６Ｂ−１】ＬＳで溶出したエタネルセプトの質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ）の結果。同定されたペプチド（図１６Ｂ．１）は、エタネルセプトのＬＳ消化において生成されたもの（図１６Ｂ．２）と一致していた。ｍ／ｚ値及びＭＳ／ＭＳデータに基づいて、同定されたペプチド（白色ボックス）をエタネルセプトの配列に当てはめ、ｙ’及びｂ’のイオンを小さな灰色のボックスでマークした。白色ボックス（例えば、ペプチド）は全て、Ｏ−グリカンが結合しているＴ又はＳでまさに始まっている。
【図１６Ｂ−２】ＬＳで溶出したエタネルセプトの質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ）の結果。同定されたペプチド（図１６Ｂ．１）は、エタネルセプトのＬＳ消化において生成されたもの（図１６Ｂ．２）と一致していた。ｍ／ｚ値及びＭＳ／ＭＳデータに基づいて、同定されたペプチド（白色ボックス）をエタネルセプトの配列に当てはめ、ｙ’及びｂ’のイオンを小さな灰色のボックスでマークした。白色ボックス（例えば、ペプチド）は全て、Ｏ−グリカンが結合しているＴ又はＳでまさに始まっている。
【図１７Ａ】Ｏ−グリコシル化血清タンパク質のアフィニティー精製及び濃縮を示す結果。（Ａ）アシアリル化血清（２０μＬ；ＰＢＳ中１００μＬ）をＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに添加した。回転させながら、室温で２時間、タンパク質を樹脂に結合させた。樹脂を結合バッファ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した。
【図１７Ｂ】Ｏ−グリコシル化血清タンパク質のアフィニティー精製及び濃縮を示す結果。（Ｂ）相互作用に対するグリカンの影響を調べるために、サンプルをシアリダーゼ混合物＋／−Ｏ−グリコシダーゼで前処理した。下流の精製は上記の通り実施した。
【図１７Ｃ】Ｏ−グリコシル化血清タンパク質のアフィニティー精製及び濃縮を示す結果。（Ｃ）血清（４０μＬ）をＰＢＳ（１００μＬ以下）及びシアリダーゼ混合物（５０〜５００ユニット）と混合し、ＰＢＳで平衡化したカラムに添加し、回転させながら室温で２時間インキュベートし、その後、上記の通りサンプルを洗浄及び溶出した。全てのサンプルを、分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。
【図１８Ａ】ヒト血清からのＯ−糖タンパク質の濃縮を示す結果。ＰＢＳで１００μＬに２．５倍希釈されたヒト血清を、スピンカラム内のＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに適用した。シアリダーゼ混合物５０〜５００ユニットを添加し、室温で２時間樹脂上においてコインキュベートした。素通り画分を収集し、樹脂をＰＢＳで５〜１０回洗浄した。結合しているタンパク質を８Ｍ尿素で溶出し、続いて、５ｍＭ  ＤＴＴを添加して変性及び還元し、３７℃で６０分間インキュベートした。還元されたシステインを、暗所において室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。サンプルを、Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎにおいて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０にバッファ交換した。トリプシン（２．５μｇ）を溶液に添加し、３７℃で一晩消化した。ペプチドを分離し、４５℃及び流速０．２ｍＬ／分で、ＭＱ中０．１％ＦＡ：９５％ＡＣＮ中０．１％ＦＡ勾配で、Ｃ１８カラムにおいてＲＰ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。検出は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦで行った。データをｍｇｆフォーマットのファイルに変換し、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに対して検索を行った。（Ａ）タンパク質に由来する同定されたペプチドにＯ−グリコシル化タンパク質又は非Ｏ−グリコシル化とアノテーションを付けた。＞６のペプチドが一致し、ＭＡＳＣＯＴスコアが＞２００であるタンパク質のみが含まれていた。
【図１８Ｂ】ヒト血清からのＯ−糖タンパク質の濃縮を示す結果。ＰＢＳで１００μＬに２．５倍希釈されたヒト血清を、スピンカラム内のＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに適用した。シアリダーゼ混合物５０〜５００ユニットを添加し、室温で２時間樹脂上においてコインキュベートした。素通り画分を収集し、樹脂をＰＢＳで５〜１０回洗浄した。結合しているタンパク質を８Ｍ尿素で溶出し、続いて、５ｍＭ  ＤＴＴを添加して変性及び還元し、３７℃で６０分間インキュベートした。還元されたシステインを、暗所において室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。サンプルを、Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎにおいて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０にバッファ交換した。トリプシン（２．５μｇ）を溶液に添加し、３７℃で一晩消化した。ペプチドを分離し、４５℃及び流速０．２ｍＬ／分で、ＭＱ中０．１％ＦＡ：９５％ＡＣＮ中０．１％ＦＡ勾配で、Ｃ１８カラムにおいてＲＰ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。検出は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦで行った。データをｍｇｆフォーマットのファイルに変換し、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに対して検索を行った。（Ｂ）様々な洗浄工程の結果、同定されたペプチドが変化し、更に、Ｏ−グリコシル化タンパク質の非Ｏ−グリコシル化タンパク質に対する比が変化した。
【図１８Ｃ】ヒト血清からのＯ−糖タンパク質の濃縮を示す結果。ＰＢＳで１００μＬに２．５倍希釈されたヒト血清を、スピンカラム内のＰＢＳで平衡化したＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ樹脂５０μＬに適用した。シアリダーゼ混合物５０〜５００ユニットを添加し、室温で２時間樹脂上においてコインキュベートした。素通り画分を収集し、樹脂をＰＢＳで５〜１０回洗浄した。結合しているタンパク質を８Ｍ尿素で溶出し、続いて、５ｍＭ  ＤＴＴを添加して変性及び還元し、３７℃で６０分間インキュベートした。還元されたシステインを、暗所において室温で３０分間、１５ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。サンプルを、Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎにおいて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０にバッファ交換した。トリプシン（２．５μｇ）を溶液に添加し、３７℃で一晩消化した。ペプチドを分離し、４５℃及び流速０．２ｍＬ／分で、ＭＱ中０．１％ＦＡ：９５％ＡＣＮ中０．１％ＦＡ勾配で、Ｃ１８カラムにおいてＲＰ−ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを使用して分析した。検出は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦで行った。データをｍｇｆフォーマットのファイルに変換し、Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔデータベースに対して検索を行った。（Ｃ）Ｓｉａ＝シアリダーゼ処理；Ｓｉａ  Ｐｒｅ＝シアリダーゼ前処理。
【図１９Ａ】固定化された二重突然変異体はより短いＯ−糖ペプチドにも結合することを示す実験の結果。Ａは、Ｏ−グリコシル化ペプチド（グリコドロソシン（glycodrosocin）（ＧＤ））と幾つかの+非グリコシル化ペプチド（Ｈ２６８６、Ｈ４０６２  Ｈ８３９０及びインスリン酸化ベータ鎖（ＩＯＢ）との調製されたミックスに対する結合のＬＣ／ＭＳ分析の代表的な結果を示す。
【図１９Ｂ】固定化された二重突然変異体はより短いＯ−糖ペプチドにも結合することを示す実験の結果。Ｂは、トリプシン消化によって１つのＯ−グリコシル化ペプチドが生成されることを示すＩｇＡの概略図を示す。
【図１９Ｃ】固定化された二重突然変異体はより短いＯ−糖ペプチドにも結合することを示す実験の結果。Ｃは、ＩｇＡのトリプシン消化物に対する結合のＬＣ／ＭＳ分析の代表的な結果を示す。
【図２０Ａ】固定化された二重突然変異体が、他の市販されているＯ−糖タンパク質結合マトリクスに優ることを示す実験の結果。Ａは、図示の通り様々な固定化されたレクチン又はＬＳ二重突然変異体と共にインキュベートした後の、素通り画分（ＦＴ）又は溶出液（Ｅ）中におけるエタネルセプト又はアシアリル化エタネルセプト（エタネルセプト（Ｓ））の存在を比較する、代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図２０Ｂ】固定化された二重突然変異体が、他の市販されているＯ−糖タンパク質結合マトリクスに優ることを示す実験の結果。Ｂは、直接ロードされた基質１．５μｇのポジティブコントロールと比べた、ゲルの濃度測定分析を示す。
【００１５】
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号２は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号１と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。この配列からなるポリペプチドは、本明細書ではＬＳと称される場合もある。
【００１７】
配列番号３は、配列番号２の配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。
【００１８】
配列番号４は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたポリペプチドの野生型アミノ酸配列である。配列番号１と比べて、これは、Ｎ末端にシグナルモチーフを含む。
【００１９】
配列番号５は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号６は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している、本発明の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号５と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。この配列からなるポリペプチドは、本明細書ではＬＳＥ２０６Ａと称される場合もある。
【００２１】
配列番号７は、配列番号６の配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。
【００２２】
配列番号８は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明の例示的なポリペプチドのメタロプロテアーゼドメインモチーフである。
【００２３】
配列番号９は、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたシアリダーゼＡｍ１７５７の野生型アミノ酸配列である。これは、Ｎ末端にシグナルモチーフを含む。
【００２４】
配列番号１０は、配列番号９と比べて、Ｎ末端におけるシグナルモチーフが欠けているシアリダーゼＡｍ１７５７の野生型アミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号１１は、例示的なシアリダーゼＡｍ１７５７のアミノ酸配列である。配列番号１０と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。
【００２６】
配列番号１２は、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたシアリダーゼＡｍ０７０７の野生型アミノ酸配列である。これは、Ｎ末端にシグナルモチーフを含む。
【００２７】
配列番号１３は、配列番号１２と比べて、Ｎ末端におけるシグナルモチーフが欠けているシアリダーゼＡｍ０７０７の野生型アミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号１４は、例示的なシアリダーゼＡｍ０７０７のアミノ酸配列である。配列番号１３と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。
【００２９】
配列番号１５は、ストレプトコッカス・オラリス（S. oralis）から単離されたＯ−グリコシダーゼのアミノ酸配列である。
【００３０】
配列番号１６及び１７は、プライマー配列である。
【００３１】
配列番号１８は、ＥＰＯのアミノ酸配列を示す。
【００３２】
配列番号２０は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号２１は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している、本発明の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。配列番号２０と比べて、これは、追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。この配列からなるポリペプチドは、本明細書ではＬＳＨＥ２０６ＡＡ又はＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａと称される場合もある。
【００３４】
配列番号２２は、配列番号２１の配列を有するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列番号２３、２４、及び２５は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している、本発明のポリペプチドにそれぞれ由来する、破壊されたメタロプロテアーゼドメインモチーフの配列である。
【００３６】
配列番号２６、２７、及び２８は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性をそれぞれ有するポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号２９、３０、及び３１は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。それぞれ配列番号２６、２７、及び２８と比べて、配列番号２９、３０、及び３１は、それぞれが追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。
【００３８】
配列番号３２、３３、及び３４は、それぞれ緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１、バクテロイデス・テタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）ＶＰＩ−５４８２、及びウェルシュ菌（Clostridium perfringens）から単離された、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドの野生型アミノ酸配列である。それぞれ配列番号２６、２７、及び２８と比べて、それぞれがＮ末端にシグナルモチーフを含む。
【００３９】
配列番号３５、３６、及び３７は、それぞれＯ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号３８、３９、及び４０は、それぞれがＯ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している、本発明の例示的なポリペプチドのアミノ酸配列である。それぞれ配列番号３５、３６、及び３７と比べて、配列番号３８、３９、及び４０は、それぞれが追加のＮ末端メチオニン及びＣ末端リンカー＋Ｈｉｓ６タグを含む。
【００４１】
配列番号４１〜４３は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼの代表的なメタロプロテアーゼモチーフのアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号４４〜４６は、Ｏ−グリカンに結合することができるが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している、ポリペプチドの代表的な破壊されたメタロプロテアーゼモチーフのアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号４７は、グリコドロソシンペプチドのアミノ酸配列である。Ｔ残基にＯ−グリコシル化部位が存在する。
【００４４】
配列番号４８〜５０は、Ｏ−グリコシル化されていないペプチドのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
開示される生成物及び方法の様々な用途は、当技術分野における具体的なニーズに応じて調整できることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないことも理解されたい。上記であろうと下記であろうと、本明細書に引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、特に明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」に対する言及は、「複数のポリペプチド（polypeptides）」等を含む。
【００４７】
一般的なポリペプチドの特徴
「ポリペプチド」は、本明細書では、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、又は他のペプチドミメティックの化合物を指すために、その最も広い意味で使用される。従って、用語「ポリペプチド」は、短いペプチド配列を含み、より長いポリペプチド及びタンパク質も含む。用語「タンパク質」、「ペプチド」、及び「ポリペプチド」は、互換的に使用することができる。本明細書で使用するとき、用語「アミノ酸」とは、Ｄ型又はＬ型の光学異性体の両方を含む、天然及び／又は非天然、すなわち、合成のアミノ酸、並びにアミノ酸アナログ、及びペプチドミメティックを指す。
【００４８】
ポリペプチドは、組み換え法又は合成法を含む好適な方法によって生成され得る。例えば、ポリペプチドは、Ｆｍｏｃ固相化学、Ｂｏｃ固相化学、又は液相ペプチド合成等の、当技術分野において公知の標準的な方法を使用して直接合成することができる。あるいは、ポリペプチドは、細胞、典型的には細菌細胞を、該ポリペプチドをコードしている核酸分子又はベクターで形質転換することによって生成することもできる。細菌宿主細胞における発現によるポリペプチドの生成については、以下に記載し、実施例に例示する。本発明は、本発明のポリペプチドをコードしている核酸分子及びベクターを提供する。また、本発明は、このような核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書に開示されるポリペプチドをコードしている例示的なポリヌクレオチド分子を配列番号３及び７として提供する。これら配列はそれぞれ、５’末端にＮ末端メチオニン（ＡＴＧ）のコドンを、そして、３’末端の終止コドン（ＴＡＡ）の前にＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカー及び６×Ｈｉｓタグのコドンを含むが、これらは任意で除外されてもよい。追加のメチオニン及びタグを任意で含めることについては、以下により詳細に論じる。
【００４９】
用語「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書では互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド又はこれらのアナログのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドの非限定的な例は、遺伝子、遺伝子断片、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードしており、単離又は実質的に単離された形態で提供され得る。実質的に単離されたとは、任意の周囲媒体からポリペプチドが完全にではないがかなりの割合単離され得ることを意味する。ポリヌクレオチドは、その意図する用途に干渉しない担体又は希釈剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離されたとみなされ得る。選択されたポリペプチドを「コードしている」核酸配列は、例えば発現ベクターにおいて適切な調節配列の制御下におかれたとき、インビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）及び翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。本発明の目的のために、このような核酸配列は、ウイルス由来のｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物のｍＲＮＡ、ウイルス又は原核生物のＤＮＡ又はＲＮＡ由来のゲノム配列、及び更には合成ＤＮＡ配列を含んでいてよいが、これらに限定されない。転写終結配列は、コード配列の３’側に位置していてよい。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、一例としてＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている通り、当技術分野において周知の方法に従って合成することができる。本発明の核酸分子は、挿入された配列に動作可能に連結され、それによって、インビボ（例えば、原核生物又は真核生物の発現系）で本発明のポリペプチドを発現することができる制御配列を含む発現カセットの形態で提供され得る。次に、これら発現カセットは、典型的には、ベクター（例えば、プラスミド又は組み換えウイルスベクター）内に提供される。このような発現カセットを宿主被験体に直接投与してもよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを宿主被験体に投与してもよい。好ましくは、遺伝子ベクターを使用してポリヌクレオチドを調製及び／又は投与する。好適なベクターは、十分な量の遺伝情報を保有し、本発明のポリペプチドを発現することができる任意のベクターであってよい。
【００５１】
従って、本発明は、このようなポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む。このような発現ベクターは、分子生物学の技術分野においてルーチン的に構築され、例えば、本発明のペプチドを発現させるために、プラスミドＤＮＡ、並びに適切なイニシエータ、プロモータ、エンハンサ、及び他のエレメント、例えば、必要になる場合がありかつ正確な配向で配置されたポリアデニル化シグナルの使用を伴っていてよい。他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。これに関する更なる例として、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照する。
【００５２】
また、本発明は、本発明のポリペプチドを発現するように改変された細胞を含む。このような細胞は、典型的には、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）等の細菌細胞を含む。このような細胞は、本発明のポリペプチドを生成するための常法を使用して培養してよい。
【００５３】
ポリペプチドの生成、単離、又は精製を支援するために、該ポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。例えば、本発明のポリペプチドが細菌宿主細胞における組み換え発現によって生成される場合、ポリペプチドの配列は、発現を改善するためにＮ末端に追加のメチオニン（Ｍ）残基を含んでいてよい。別の例として、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって、本発明のポリペプチドを誘導体化又は改変してもよい。あるいは、結合対の一方のメンバーを付加することによってポリペプチドを誘導体化又は改変してもよく、分離手段は、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化又は改変された試薬を含む。任意の好適な結合対を使用してよい。本発明において使用するためのポリペプチドが結合対の一方のメンバーの付加によって誘導体化又は改変される好ましい実施形態では、ポリペプチドは、好ましくは、ヒスチジンでタグ付けされるか又はビオチンでタグ付けされる。典型的には、ヒスチジン又はビオチンのタグのアミノ酸コード配列は遺伝子レベルで含まれ、ポリペプチドは大腸菌において組み換え的に発現する。ヒスチジン又はビオチンのタグは、典型的には、ポリペプチドのいずれかの末端、好ましくはＣ末端に存在する。該タグは、ポリペプチドに直接連結されてもよく、任意の好適なリンカー配列、例えば、３個、４個、若しくは５個のグリシン残基又はグリシン残基とセリン残基との混合物によって間接的に連結されてもよい。ヒスチジンタグは、典型的には６個のヒスチジン残基からなるが、これよりも長くてもよく、典型的には最大７アミノ酸、最大８アミノ酸、最大９アミノ酸、最大１０アミノ酸、又は最大２０アミノ酸までであり、又はこれよりも短くてもよく、例えば５アミノ酸、４アミノ酸、３アミノ酸、２アミノ酸、又は１アミノ酸である。
【００５４】
ポリペプチドは、実質的に単離又は精製された形態で提供されてもよい。すなわち、ポリペプチドが発現した細胞からの細胞抽出物中に存在する他の成分の大部分から単離されている。実質的に精製されたとは、ポリペプチドが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は好ましくは少なくとも９０％均質になるまで精製されたと理解される。純度レベルは、任意の好適な手段によって評価することができるが、典型的には、サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に続いてクマシーブルー検出を含む。ポリペプチドは、該ポリペプチドの意図する目的に干渉しない担体、希釈剤、又は保存剤と混合されてもよく、それでもなお実質的に単離又は精製されたとみなされ得る。ポリペプチドが追加の活性成分、例えば別のポリペプチドと共に組成物で提供される場合、各該ポリペプチドは、それぞれの意図する目的に適切な比で混合される前に、高レベルの均質性になるまで個々に精製される。例えば、２つのポリペプチドは、１：１比で組み合わせられる前に、少なくとも９０％均質になるまでそれぞれ精製され得る。
【００５５】
ポリペプチド（又はその混合物）は、使用前に水溶液で再構成するのに好適な、凍結乾燥された形態で提供されてもよい。凍結乾燥組成物は改善された安定性を有するので、ポリペプチドをより長く貯蔵することが可能になる。凍結乾燥された形態のポリペプチド（又はその混合物）を調製する方法であって、好適なバッファ、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中で該ポリペプチド（又は混合物）をフリーズドライすることを含む方法が、本明細書に提供される。ポリペプチドは、典型的には、フリーズドライ前に実質的に精製される。得られる凍結乾燥された形態のポリペプチド（又は混合物）も提供される。ポリペプチド（又は混合物）の溶液を調製する方法であって、凍結乾燥された形態の該ポリペプチド（又は混合物）を提供することと、好適な担体又は希釈剤、例えば水で再構成することとを含む方法も提供される。
【００５６】
ポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を使用して、例えば、Ｄａｔｔａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ，３  Ｂｉｏｔｅｃｈ，３（１）：１−９（２０１３）に記載の通り固定化することができる。例えば、ポリペプチドは、吸着、共有結合、親和性固定化、又は封入によって固定化してよい。支持体として使用することができる材料は、例えば、アガロース、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ペクチン、セファロース等の天然支持体、セラミック、シリカ、ガラス、活性炭、若しくは炭等の無機材料、又は合成ポリマーを含むが、これらに限定されない。例えば、任意で樹脂として提供されるセファロース又はアガロース上にポリペプチドを固定してもよい。
【００５７】
エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチド
エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドの機能的特徴
一実施形態では、本発明は、Ｏ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドに関する。言い換えれば、ポリペプチドは、任意のＯ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する。ポリペプチドは、Ｏ結合型糖タンパク質、好ましくは、任意のヒトＯ結合型糖タンパク質を切断する。Ｏ結合型糖タンパク質の例は、完全長抗体、Ｆｃ断片及びＦｃ融合タンパク質、特にＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＧ３のアイソタイプのものを含む、免疫グロブリンの全て又は一部を含むか又はからなる任意のタンパク質を含む。Ｏ結合型糖タンパク質の別の例は、ＩｇＧ１のＦｃ部分に連結しているヒトＴＮＦα受容体２のリガンド結合ドメインと多数のＯ−グリコシル化部位との融合タンパク質であるエタネルセプトである。Ｏ結合型糖タンパク質の他の例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＴＮＦα受容体、フェチュイン、及びプラスミノーゲンを含む。
【００５８】
基質である糖タンパク質の加水分解（すなわち、切断）は、典型的には、Ｏ−グリコシル化セリン又はスレオニンのＮ末端側かつ近接しているペプチド結合において高い特異性で生じ、そして、Ｏ−グリカン依存性である。本発明のポリペプチドは、好ましくは、基質である糖タンパク質における全てのＯ−グリコシル化部位に近接しているこのようなペプチド結合を切断することができる。反応は、好ましくは、任意のアミノ酸に特異性又は制約を示さず、具体的には、任意の特定のアミノ酸（複数可）がＯ−グリコシル化セリン又はスレオニンのＮ末端側に存在することを必要としない。標準的な質量分析パラメータを使用して評価したとき、切断部位は、一般的には、各Ｏ−グリコシル化残基のすぐＮ末端側のペプチド結合であると観察される。
【００５９】
所与のポリペプチドのエンドプロテーゼ活性及び特異性は、好適なアッセイを用いて決定することができる。例えば、標準的なＯ−糖タンパク質基質、例えばＩｇＡ分子又はエリスロポエチン（ＥＰＯ）を、試験ポリペプチドと共にインキュベートしてよい。次いで、出発物質及び反応生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び／又は質量分析によって分析して、切断生成物（もし存在すれば）の存在を判定してよく、必要に応じて、該生成物を更に特性評価してもよい。Ｏ−グリコシル化されていない糖タンパク質基質、例えばＩｇＧ１分子をネガティブコントロールとして使用してよい。この結果を、基質を本発明の例示的なポリペプチド、例えば、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドと接触させたときに同じアッセイで得られた結果と比較してよい。配列番号２のポリペプチド１ユニットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングしたとき、３７℃で一晩、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６．８中のシアリダーゼ混合物１ユニットと組み合わせてエリスロポエチン（ＥＰＯ）１μｇの＞９０％を消化するのに必要な量として定義される（好ましいシアリダーゼ混合物については、以下で更に記載する）。試験ポリペプチドは、好ましくは、同量存在するときに類似の活性レベルを達成する。例示的なアッセイについては実施例にも記載する。
【００６０】
エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドの構造的特徴
この章は、この実施形態に係るポリペプチドの構造的特徴について記載し、これは、上の章に概説された機能的特徴に加えて適用される。
【００６１】
ポリペプチドは、典型的には、少なくとも１５０アミノ酸長、少なくとも２００アミノ酸長、少なくとも２５０アミノ酸長、少なくとも２７５アミノ酸長、少なくとも２８０アミノ酸長、少なくとも２９０アミノ酸長、少なくとも３００アミノ酸長、少なくとも３１０アミノ酸長、少なくとも３２０アミノ酸長、少なくとも３３０アミノ酸長、少なくとも３４０アミノ酸長、少なくとも３５０アミノ酸長、又は少なくとも３６０アミノ酸長である。ポリペプチドは、典型的には、４００アミノ酸長以下、３９５アミノ酸長以下、３９０アミノ酸長以下、３８５アミノ酸長以下、３８０アミノ酸長以下、３７５アミノ酸長以下、３７０アミノ酸長以下、又は３６５アミノ酸長以下である。上記下限のいずれかを上記上限のいずれかと組み合わせて、ポリペプチドの長さについての範囲を提供できることが理解されるであろう。例えば、ポリペプチドは、１５０〜４００アミノ酸長、又は２８０〜３８０アミノ酸長であってよい。ポリペプチドは、好ましくは、３４０〜３８０アミノ酸長、最も好ましくは、３６０〜３７５アミノ酸長である。
【００６２】
ポリペプチドの一次構造（アミノ酸配列）は、アッカーマンシア・ムシニフィラのＡｍｕｃ１１１９遺伝子によってコードされているポリペプチドの一次構造に基づいている。このポリペプチドの完全配列を配列番号４に示し、これは、１〜２４位にシグナルモチーフを含む。シグナルモチーフを除去した配列を配列番号１に示す。
【００６３】
本発明のポリペプチドは、配列番号１の配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。
【００６４】
あるいは、本発明のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一である、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。変異体配列は、配列番号１の配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であってよい。同一性レベルは、好ましくは、少なくとも８５％以上である。配列番号１の配列に対する同一性は、配列番号１に示す配列の少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、若しくは少なくとも３５０、若しくはそれ以上の連続するアミノ酸の領域にわたって測定してもよく、より好ましくは配列番号１の完全長にわたって測定してもよい。変異体は、典型的には、参照配列よりも５０アミノ酸以下長いか又は短い長さであり、好ましくは、参照配列とほぼ（又は正確に）同じ長さである。
【００６５】
アミノ酸の同一性は、任意の好適なアルゴリズムを使用して計算することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ，Ｆ  ｅｔ  ａｌ（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０に記載の通り、ＰＩＬＥＵＰ及びＢＬＡＳＴのアルゴリズムを使用して、同一性を計算するか又は配列を並べることができる（典型的には、そのデフォルト設定で）等価な又は対応する配列を同定する等）。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列における同じ長さのワードとアラインメントしたときに幾つかの正の値の閾値スコアＴに一致するか又は満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値（neighbourhood word score threshold）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ、上記）。これら初期近傍ワードヒットは、それを含有するＨＳＰを見つけるための検索を始めるためのシードとして作用する。累積アラインメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ減少したとき；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因して累積スコアがゼロ以下になったとき；又はいずれかの配列の末端に達したときに停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、及びＸが、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を使用する。
【００６６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的解析を実施する；例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小和確率（the smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのポリヌクレオチド又はアミノ酸の配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、第１の配列の第２の配列に対する比較における最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、ある配列が別の配列と類似しているとみなされる。あるいは、ＵＷＧＣＧパッケージは、同一性を計算するために使用することができる（例えば、そのデフォルト設定で使用される）ＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２，３８７−３９５）。
【００６７】
本発明のポリペプチドの配列は、配列番号１の配列と比べて改変、例えば、アミノ酸の付加、欠失、又は置換が行われた配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでいてよい。特に指定しない限り、改変は、好ましくは、保存的アミノ酸置換である。保存的置換は、アミノ酸を類似の化学的構造、類似の化学的特性、又は類似の側鎖体積の他のアミノ酸に置き換える。導入されるアミノ酸は、置き換えられるアミノ酸と類似の極性、親水性、疎水性、塩基性、酸性、中性、又は電荷を有していてよい。あるいは、保存的置換は、既存の芳香族又は脂肪族のアミノ酸の代わりに、芳香族又は脂肪族の別のアミノ酸を導入してもよい。保存的アミノ酸変化は当技術分野において周知であり、以下の表Ａ１に定義する２０種の主なアミノ酸の特性に従って選択してよい。アミノ酸が類似の極性を有する場合、これは、表Ａ２中のアミノ酸側鎖のヒドロパシースケールを参照することによって決定することができる。本発明のポリペプチドの配列は、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、又は６０個以下の保存的置換が行われた配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでいてよい。
【００６８】
【表１】
2020521460.tif 000003
【００６９】
【表２】
2020521460.tif 000004
【００７０】
本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、上記の通り配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含んでいてよい。しかし、配列番号１のアミノ酸配列における特定の残基は、好ましくは、該変異体配列内に保持される。例えば、該変異体配列は、典型的には、エンドプロテーゼ活性に必要であることが知られている特定の残基を保持する。従って、配列番号１の１８２位（配列番号４の２０６位に対応）のグルタミン酸は、好ましくは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において保持される。この残基は、活性部位における電子移動に必要であると考えられる。従って、本発明のポリペプチドは、典型的には、配列番号１の１８２位に対応する該変異体配列における位置にグルタミン酸（Ｅ）を有する、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含む。同様に、配列番号１の１８１位（配列番号４の２０５位に対応）のヒスチジンは、好ましくは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列において保持される。この残基は、亜鉛イオン補助因子への結合に必要であると考えられる。
【００７１】
該グルタミン酸及び該ヒスチジンの残基はいずれも、典型的には、モチーフＨＥｂｂＨ（式中、ｂは、電荷を有しないアミノ酸、例えば、アミノ酸Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである）を有するメタロプロテアーゼドメイン内に含まれる。このようなドメインの好ましい例は、配列ＨＥＬＧＨ（配列番号４１）を有し、これは配列番号１の１８１位〜１８５位（配列番号４における２０５〜２０９位）に対応する。従って、本発明のポリペプチドは、典型的には、配列番号１の１８１〜１８５位に対応する位置にモチーフＨＥｂｂＨ（例えば、ＨＥＩＧＨ（配列番号４２）又はＨＥＬＧＨ、好ましくはＨＥＬＧＨ）を含む、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含む。本発明のポリペプチドは、典型的には、メタロプロテアーゼドメインのＣ末端側に位置するＯ−グリカン特異的結合ドメインを含む。
【００７２】
モチーフＨＥｂｂＨは、モチーフａｂｘＨＥｂｂＨｂｃ（式中、ａは、アミノ酸Ｖ、Ｔ、又はＧであり、ｂは、電荷を有しないアミノ酸、例えばアミノ酸Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷであり、ｘは、任意のアミノ酸であり、ｃは、疎水性アミノ酸、例えばＡ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹである）を有するより大きなメタロプロテアーゼドメイン内に含まれる場合もある。このようなドメインの好ましい例は、配列ＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬ（配列番号８）を有し、これは配列番号１の１７８位〜１８７位（配列番号４における２０２〜２１１位）に対応する。他の例は、ＧＶＡＨＥＬＧＨＮＦ（配列番号４３）を含む。従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１の１７８〜１８７位に対応する位置にモチーフａｂｘＨＥｂｂＨｂｃ（例えば、ＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬ又はＧＶＡＨＥＬＧＨＮＦ、好ましくはＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬ）を含む、配列番号１のアミノ酸配列の変異体を含む。本発明のポリペプチドは、典型的には、メタロプロテアーゼドメインのＣ末端側に位置するＯ−グリカン特異的結合ドメインを含む。
【００７３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、上記の通り配列番号１又はその変異体のより短い断片を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。断片は、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を保持している、切断された形態の配列番号１として説明することができる。このような断片は配列番号１よりも短く、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、又は少なくとも２００アミノ酸長である。断片は、典型的には、配列番号１の１８２位に対応する位置におけるグルタミン酸残基（Ｅ）及び配列番号１の１８１位に対応する位置におけるヒスチジン残基（Ｈ）を含む、配列番号１の１７８〜１８７位に対応する位置におけるメタロプロテアーゼドメインと、該メタロプロテアーゼドメインのＣ末端側に位置するＯ−グリカン結合ドメインとを含む。
【００７４】
配列番号１若しくはその変異体又はこれらのいずれかの断片を含む本発明の任意のポリペプチドは、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含んでいてもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。
【００７５】
従って、まとめると、本発明のポリペプチドは、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドであって、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列；
（ｂ）該配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；又は
（ｃ）該配列番号１の配列の断片若しくは該配列番号１のアミノ酸配列と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含み、
任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得るポリペプチドである。
【００７６】
本発明の例示的なポリペプチドの配列を配列番号２として提供する。ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよい。このポリペプチドをコードしている例示的なポリヌクレオチド配列を配列番号３に示す。
【００７７】
Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する別のポリペプチドが、緑膿菌ＰＡＯ１、バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２、及びウェルシュ菌において同定されている（Ｎｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ；ＰＮＡＳ  ２０１７，ｐＥ６７９−６８８及び補助付録、具体的にはＭａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎに記載されている３つのペプチダーゼを参照されたい）。これらポリペプチドの完全長配列を配列番号３２、３３、及び３４として提供する。これら配列はそれぞれ、上記の通りモチーフＨＥｂｂＨを有するメタロプロテアーゼドメインを含む。ウェルシュ菌配列は、上記の通りモチーフａｂｘＨＥｂｂＨｂｃを有するより長いメタロプロテアーゼドメインも含む。これら配列はそれぞれ、存在する場合のある任意のシグナル配列若しくはプロ酵素配列を除去するため、並びに／あるいはＮ末端に追加のメチオニン及び／又はＣ末端にヒスチジン若しくは他のタグを含めるために、任意で改変されてもよい。このような追加の配列は、（例えば、大腸菌における）発現及び／又は精製に役立ち得る。シグナル及び他の未成熟配列が除去された対応する配列を配列番号２６、２７、及び２８として提供する。（Ｎ末端に追加のメチオニンを、そして、Ｃ末端にヒスチジンタグを含めることによって）大腸菌における発現及びその後の精製に対して最適化されたこれら配列のバージョンを配列番号２９、３０、及び３１として提供する。Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明のポリペプチドを使用するための本明細書に記載される方法では、任意で、本発明のポリペプチドをこれらポリペプチドのうちの１つで置換してもよい。従って、このような方法で使用するための好ましいポリペプチドは、配列番号２６〜３１のいずれか１つを含む、から本質的になる、又はからなる。
【００７８】
ポリペプチドのエンドプロテーゼ活性を使用する方法
また、本発明は、Ｏ−糖タンパク質を加水分解する方法であって、該タンパク質のサンプルを、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明のポリペプチドと接触させることを含み、任意で、加水分解生成物を検出することを更に含む方法を提供する。
【００７９】
また、本発明は、タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、該のサンプルを、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する本発明のポリペプチドと接触させることと、生成された生成物を分析することとを含む方法を含んでいてもよい。切断生成物の存在は、該サンプル中のタンパク質がＯ−グリコシル化されていたことを示し、従って、該方法は、Ｏ−糖タンパク質を検出するために使用することもできる。任意で、グリカン鎖及びそのタンパク質への結合位置を同定するために切断生成物を更に分析してもよい。
【００８０】
このような方法では、ポリペプチドがサンプル中の任意のタンパク質と相互作用するのに、そして、加水分解及び／又は切断の反応（エンドプロテーゼ活性）が生じるのに好適な条件下で、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる。好適な条件は、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、又は少なくとも１２０分間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、又は少なくとも一晩、本発明のポリペプチドと共にインキュベートすることを含む。インキュベートは、好ましくは室温で、より好ましくは約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、又は約４５℃、最も好ましくは約３７℃で行われる。上記方法は、任意の好適なｐＨ下で実施してよい。好適なｐＨ値は、例えば、約３．０、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５のｐＨを含む。本発明のポリペプチドの活性に好ましいｐＨは、５．６〜６．８の範囲内である。方法は、任意の好適なバッファ、例えば、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施してよい。サンプルのタンパク質含量に対する本発明のポリペプチドの近似比（酵素：基質）は、１：１、２：１、４：１、６：１、１０：１、１５：１、２０：１、１：２、１：４、又は１：６、１：１０、１：１５、１：２０、１：４０、１：１００、１：２００、又は１：４００であってよい。好ましい比は、１：２０である。反応時間をより短くする必要がある場合又はＯ−糖タンパク質が重度にシアリル化されている場合、酵素の基質に対する比率がより高い方が有益であり得る。あるいは、以下により詳細に論じる通り、シアル酸含量を低下させるために、前もって又は同時にシアリダーゼインキュベート工程を使用してもよい。基質は、典型的には、０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００８１】
生成された生成物の検出又は分析は、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、レクチンブロッティング、分光分析、キャピラリー電気泳動、及びタンパク質を分析するための他の標準的な検査技術等であるがこれらに限定されない、任意の好適な分析方法によって評価してよい。
【００８２】
上記方法のいずれかにおけるサンプルは、患者、好ましくはヒト患者から採取されたサンプルであってよい。得られた結果は、診断目的のために、例えば、Ｏ結合型グリコシル化を伴うがんの存在を検出するために使用することができる。このような使用は、患者サンプルから得られた結果を、健常対照から得られたサンプルを使用して得られた結果と比較することを含んでいてよい。
【００８３】
本発明の任意の方法では、ポリペプチドを、プロテアーゼ又はグリコシダーゼ等の別の酵素と組み合わせて使用してもよい。追加のプロテアーゼ又はグリコシダーゼは、典型的には、基質タンパク質を更に消化するので、本発明のポリペプチドの活性を増強することができる及び／又は生成物をより容易に若しくはより詳細に分析することが可能になる。
【００８４】
例えば、本発明者らは、シアル酸を除去するために基質タンパク質のＯ−グリカンを最初に改変した場合、本発明のポリペプチドが改善されたエンドプロテーゼ活性を示すことを見出した。従って、本発明の好ましい方法では、シアル酸を除去するためにサンプルを剤と接触させる。該剤は、好ましくは、シアリダーゼ酵素又はこのような酵素の混合物であってよく、これらは、ＴＢＳ又はＰＢＳ等の好適なバッファ中に存在していてよい。バッファは、好ましくは、典型的には３００ｍＭ以下、２５０ｍＭ以下、２００ｍＭ以下、又は１５０ｍＭ以下の低濃度のＮａＣｌを含む。ＮａＣｌ濃度は、好ましくは、約１５０ｍＭ、例えば１２５ｍＭ〜１７５ｍＭである。シアリダーゼ（又はノイラミニダーゼ）は、糖タンパク質における複合糖質からの末端シアル酸の切断を触媒し、高度の特異性を示す。これら酵素は、Ｏ−糖タンパク質内に一般的にみられる３つの異なるシアル酸結合、すなわち、α２−３、α２−６、及びα２−８の結合を標的とする。記載の方法で使用するのに好適なシアリダーゼは、α２−３、α２−６、及びα２−８の結合を全て標的とする広域スペクトルシアリダーゼに加えて、典型的には１種の結合しか標的としない狭域スペクトルシアリダーゼも含む。α２−３結合がヒト糖タンパク質において最も一般的であるので、狭域スペクトルシアリダーゼを使用する場合、この結合を標的とすることが好ましい。好適なシアリダーゼは、ウイルス又は哺乳類のシアリダーゼを含んでいてもよいが、好ましくは、ウェルシュ菌、アルスロバクター・ウレアファシェンス（Arthrobacter ureafaciens）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、コレラ菌（Vibrio cholera）、及びアッカーマンシア・ムシニフィラの株を含むがこれらに限定されない細菌から単離されたシアリダーゼである。
【００８５】
好ましい狭域スペクトルシアリダーゼは、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたＡｍ１７５７である。Ａｍ１７５７は、α２−３結合に対して特異的活性を有する。Ａｍ１７５７の野生型配列を、シグナル配列を含む配列番号９として提供する。シグナル配列を欠いているＡｍ１７５７の野生型配列を、配列番号１０として提供する。Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含めるために、これら配列を任意で改変してもよい。このような追加の配列は、（例えば、大腸菌における）発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。Ｎ末端に追加のメチオニン、そして、Ｃ末端にＧＳＧＬＥリンカー及びＨｉｓ６タグを有する例示的なＡｍ１７５７配列を、配列番号１１として提供する。本開示におけるＡｍ１７５７に対する任意の言及は、配列番号９、１０、又は１１のいずれをも意味し得るが、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか又はからなるポリペプチドを指す。最も好ましいのは、配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８６】
好ましい広域スペクトルシアリダーゼは、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたＡｍ０７０７である。Ａｍ０７０７は、α２−３、α２−６、及びα２−８の結合に対する活性を有する。Ａｍ０７０７の野生型配列を、シグナル配列を含む配列番号１２として提供する。シグナル配列を欠いているＡｍ０７０７の野生型配列を、配列番号１３として提供する。Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含めるために、これら配列を任意で改変してもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。Ｎ末端に追加のメチオニン、そして、Ｃ末端にＧＳＧＬＥリンカー及びＨｉｓ６タグを有する例示的なＡｍ０７０７配列を、配列番号１４として提供する。本開示におけるＡｍ０７０７に対する任意の言及は、配列番号１２、１３、又は１４のいずれをも意味し得るが、好ましくは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか又はからなるポリペプチドを指す。最も好ましいのは、配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００８７】
全てのシアル酸結合を加水分解することができる好ましいシアリダーゼ混合物は、アッカーマンシア・ムシニフィラから単離されたＡｍ１７５７及びＡｍ０７０７を含む。Ａｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物は、典型的には、１：１比である。特に好ましい混合物は、配列番号１１のアミノ酸配列からなるポリペプチドと、配列番号１４のアミノ酸配列からなるポリペプチドとを含んでいてよい。
【００８８】
本発明の方法は、好ましくは、シアリダーゼの活性に好適な条件下で、本発明のポリペプチドの前に又は同時に、Ａｍ１７５７と共に又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物と共にサンプルをインキュベートすることを含んでいてよい。また、本発明は、本発明のポリペプチドと、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物とを含む組成物（凍結乾燥された又は溶液の形態）を提供する。このような組成物は、好ましくは、ｐＨ約７．６であってよいトリス緩衝生理食塩水中で凍結乾燥され得る。このような組成物では、Ａｍ１７５７及びＡｍ０７０７は、好ましくは、互いに対して１：１比で存在し、総シアリダーゼ含量（Ａｍ１７５７＋Ａｍ０７０７）も、本発明のポリペプチドに対して１：１比で存在する。例えば、組成物が２０００ユニットの本発明のポリペプチドを含む場合、該組成物は２０００ユニットのシアリダーゼも含み、該２０００ユニットのシアリダーゼは、１０００ユニットのＡｍ１７５７及び１０００ユニットのＡｍ０７０７を含む。シアリダーゼ混合物１ユニットは、典型的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングしたとき、３７℃で２時間、３７℃の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ６．８中でインキュベートしたときに糖タンパク質（フェチュイン）１μｇの≧９０％からシアル酸を加水分解するのに必要な量である。本発明のポリペプチド１ユニットは、典型的には、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってモニタリングしたとき、３７℃で一晩、シアリダーゼ混合物１ユニットと共に２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液ｐＨ６．８中でインキュベートしたときにエリスロポエチン（ＥＰＯ）１μｇの＞９０％を消化するのに必要な量である。
【００８９】
また、本発明は、異なる酵素を併用するための指示書と共に、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物とは別個の容器内に本発明のポリペプチドを含むキットを提供する。
【００９０】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、標的タンパク質からＮ−グリカンを除去するために、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる前に、同時に、又は後に、該サンプルをＮ−グリコシダーゼと共にインキュベートしてもよい。例示的なＮ−グリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅＦである。サンプルが免疫グロブリンを含むときに使用することができる他のＮ−グリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ（国際公開第２００８０７１４１８号の配列番号１を参照されたい）又はＥｎｄｏＳ２（ＥｎｄｏＳ４９と称される場合もある、国際公開第２０１３０３７８２４号の配列番号１を参照されたい）である。これら酵素はそれぞれ、ＩｇＧ１のＡｓｎ−２９７からＮ結合型糖タンパク質を除去する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドに加えて、Ｎ−グリコシダーゼ及びシアリダーゼ（又はこれらの混合物）とサンプルを接触させてもよい。このような方法では、Ｎ−グリコシダーゼ及び本発明のポリペプチドを同時に添加する前に、シアリダーゼ（又は混合物）をまず適用してよい。このような方法は、例えばＲＰＬＣを使用して生成物を分離し、続いて、例えば質量分析を使用して様々な画分を分析することによって典型的には達成される、その後のＯ−グリコシル化部位の評価に特に好適である。
【００９１】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、標的タンパク質を更に消化するために、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる前に、同時に、又は後に、該サンプルをプロテアーゼと共にインキュベートしてもよい。好適な一般的なプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、若しくは類似のエンドプロテーゼ、又はジンジバリス菌（Porphyromonas gingivalis）のＡｒｇ−ジンジパイン（ＲｇｐＢ）を含む。
【００９２】
サンプルが免疫グロブリンを含む場合、ＳｐｅＢ（国際公開第２０１５０４０１２５号における配列を参照されたい）、化膿レンサ球菌（S. pyogenes）の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ−国際公開第２０１５０４０１２５号における配列を参照されたい）、腺疫菌（S. equi）亜種ズーエピデミカスの免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＺ）、ジンジバリス菌のＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）、及びストレプトコッカス・アガラクチア（S. agalactiae）の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｇｄＥアガラクチア−国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２４６３号の配列番号３を参照されたい）等の免疫グロブリンプロテアーゼを使用してよい。本発明の方法におけるこれらプロテアーゼの任意の組み合わせの使用は、例えば質量分析（ミドルダウンアプローチ）を使用して、モノクローナル抗体及びそのサブユニットにおけるＯ−グリコシル化部位の決定を支援することができる。
【００９３】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させた後に、該サンプルをＯ−グリコシダーゼと共にインキュベートしてもよい。例えば、生成される生成物の分析を単純化するために、任意の好適な方法によって更に分析する前に、Ｏ−グリカンを除去するために該生成物をＯ−グリコシダーゼによる消化に供する。好適なＯ−グリコシダーゼは、大便連鎖球菌（Enterococcus faecalis）、ストレプトコッカス・オラリス（Streptococcus oralis）、又はビフィズス菌（Bifidobacterium bifidum）、好ましくは、大便連鎖球菌又はストレプトコッカス・オラリス、最も好ましくは、ストレプトコッカス・オラリスの株から得ることができる。ストレプトコッカス・オラリス由来の例示的なＯ−グリコシダーゼの配列を、配列番号１５として提供する。
【００９４】
Ｏ結合型糖タンパク質に結合するが、エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチド
エンドプロテーゼ活性が欠けているポリペプチドの機能的特徴
一実施形態では、本発明は、Ｏ−グリカンに結合する能力を保持しながら、エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドに関する。言い換えれば、ポリペプチドは、該グリカンが結合している糖タンパク質をそれほど加水分解しないＯ−グリカン特異的結合剤として説明することができる。
【００９５】
Ｏ−糖タンパク質エンドプロテーゼ活性は、任意の好適な方法を使用して決定してよいが、典型的には、このような活性を有する本発明のポリペプチドについて上に記載したのと同じアッセイを使用してよい。試験ポリペプチドにおける活性が欠けていることは、Ｏ−糖タンパク質基質と共にインキュベートした後に切断生成物が存在しないことによって示される。配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドによる同じ基質の切断を、ポジティブコントロールとして使用してよい。試験ポリペプチドにおける活性の低下は、同じ対照と比較することによって決定することができる。本発明のポリペプチドは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性と比べて低下しているＯ−糖タンパク質エンドプロテーゼ活性を有する。本発明のポリペプチドは、典型的には、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの活性と比べて、９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、又は５％未満であるＯ−糖タンパク質エンドプロテーゼ活性を有する。
【００９６】
Ｏ−グリカン又はＯ−糖タンパク質に結合するポリペプチドの能力も、任意の好適な方法によって評価してよい。１つのこのような方法は、例えばスピンカラムにおけるセファロースに試験ポリペプチドを固定化し、続いて、Ｏ−糖タンパク質及び／又はＯ−グリカンを含有するサンプルと共にインキュベートすることを含む。試験ポリペプチドがＯ−グリカン及び／又はＯ−糖タンパク質結合能を有する場合、Ｏ−糖タンパク質及び／又はＯ−グリカンは、カラムに結合した状態で又は続いて得られる溶出液中で検出可能である。好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドによって加水分解可能な全てのＯ−糖タンパク質に結合することができる。
【００９７】
この種の例示的なアッセイについて実施例に記載する。
【００９８】
エンドプロテーゼ活性が欠けているポリペプチドの構造的特徴
この章は、この実施形態に係るポリペプチドの構造的特徴について記載し、これは、上の章に概説された機能的特徴に加えて適用される。本発明のこの実施形態に係るポリペプチドは、該活性が低下するか又はなくなるように１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、又は置換によってアミノ酸配列が改変されていることを除いて、エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドに関連して上に記載したのと同じ構造的特徴を有し得る。典型的には、本発明のこの実施形態に係るポリペプチドは、ＨＥｂｂＨ又はａｂｘＨＥｂｂＨｂｃのインタクトなメタロプロテアーゼモチーフを含まない。該モチーフは、付加、欠失、又は置換によって破壊され得るが、好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸置換によって破壊される。好ましくは、置換は、該モチーフにおけるグルタミン酸（Ｅ）残基の別のアミノ酸による置換、及び／又は短い方のモチーフの１番目の位置に対応する位置（長い方のモチーフの４番目の位置）におけるヒスチジン（Ｈ）残基の置換、及び／又は短い方のモチーフの５番目の位置に対応する位置（長い方のモチーフの８番目の位置）におけるヒスチジン（Ｈ）残基の置換を含む。好ましくは、３つの上記置換のいずれか又は両方又は全てが非保存的である。Ｅ残基の置換は、電子移動を減少させるか又はなくすはずである。Ｈ残基のいずれかの置換は、亜鉛イオン補助因子の結合を減少させるか又はなくすはずである。従って、Ｅ残基は、好ましくは、非極性又は非荷電のアミノ酸、例えば、Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ等で置換されるが、最も好ましくは、アラニン（Ａ）又はグリシン（Ｇ）で置換される。Ｈ残基は、それぞれ個々に、任意の非Ｈアミノ酸で置換されてもよいが、同様に非極性アミノ酸、例えばＡ及びＧが好ましい。
【００９９】
従って、本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１の１８２位に対応する位置におけるグルタミン酸の置換、及び／又は配列番号１の１８１位に対応するヒスチジン残基の別のアミノ酸による置換、及び／又は配列番号１の１８５位に対応するヒスチジン残基の別のアミノ酸による置換によってＨＥｂｂＨ又はａｂｘＨＥｂｂＨｂｃのメタロプロテアーゼモチーフが破壊されている、配列番号１の配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。言い換えれば、ポリペプチドは、メタロプロテアーゼモチーフＨＥｂｂＨを含まず、好ましくは、
（ａ）１番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｂ）２番目の位置におけるＥが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、好ましくはでＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｃ）５番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換されるように破壊されたバージョンの該モチーフを含み、
該モチーフにおけるｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである
と説明することができる。
【０１００】
従って、該ポリペプチドは、
（ａ）ｘが、好ましくは、Ｈを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはＡ若しくはＧである；及び／又は
（ｂ）ｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、好ましくはＡ若しくはＧである
モチーフｘｂｂｂｘを含み；
任意で、該モチーフが、配列番号１の１８１〜１８５位に対応する位置において該ポリペプチド中に存在すると説明することができる。
【０１０１】
従って、該ポリペプチドは、例えば以下の配列のうちの任意の１つを有する、破壊されたメタロプロテアーゼモチーフを含む：ＨＡＬＧＨ（配列番号４４）、ＡＥＬＧＨ（配列番号４５）、又は最も好ましくはＡＡＬＧＨ（配列番号４６）。配列番号１に対してこの種の特定の変化を含む配列を、配列番号５及び配列番号２０に示す。従って、言い換えれば、本発明のこの実施形態のポリペプチドは、配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。
【０１０２】
あるいは、該ポリペプチドは、
（ａ）ａが、アミノ酸Ｖ、Ｔ、又はＧであり；
（ｂ）ｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷ、好ましくはＡ又はＧであり；
（ｃ）ｘが、モチーフの４番目の位置及び／又は８番目の位置におけるアミノ酸が、好ましくはＨではなく、好ましくはＡ又はＧであることを除いて、任意のアミノ酸であり；かつ
（ｄ）ｃが、疎水性アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、又はＹである
モチーフａｂｘｘｂｂｂｘｂｃを含み；
任意で、該モチーフが、配列番号１の１７８〜１８７位に対応する位置において該ポリペプチド中に存在する
と説明することができる。
【０１０３】
従って、該ポリペプチドは、例えば以下の配列のうちの任意の１つを有する、破壊されたメタロプロテアーゼモチーフを含む：ＧＭＡＨＡＬＧＨＧＬ（配列番号２３）、ＧＭＡＡＥＬＧＨＧＬ（配列番号２４）、又は最も好ましくはＧＭＡＡＡＬＧＨＧＬ（配列番号２５）。配列番号１に対してこの種の特定の変化を含む配列を、配列番号５及び配列番号２０に示す。従って、言い換えれば、本発明のこの実施形態のポリペプチドは、配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。
【０１０４】
あるいは、本発明のポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも５０％同一であるが、ただし、配列番号１の１８２位に対応する位置にグルタミン酸残基が導入されておらず、及び／又は配列番号１の１８１位に対応する位置にヒスチジン残基が導入されておらず、及び／又は配列番号１の１８５位に対応する位置にヒスチジン残基が導入されていない、配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列の変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。
【０１０５】
変異体配列は、配列番号５の配列と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％同一であってよい。同一性レベルは、好ましくは、少なくとも８５％以上である。配列番号５又は配列番号２０の配列に対する同一性は、配列番号５若しくは配列番号２０に示す配列の少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、若しくは少なくとも３５０、若しくはそれ以上の連続するアミノ酸の領域にわたって測定してもよく、より好ましくは配列番号５若しくは配列番号２０の完全長にわたって測定してもよい。本発明のポリペプチドの配列は、１０個以下、２０個以下、３０個以下、４０個以下、５０個以下、又は６０個以下の保存的置換が行われている、配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列の変異体を含んでいてよい。配列同一性の決定、並びに保存的及び非保存的置換の説明は、エンドプロテーゼ活性を有するポリペプチドに関する章に提供されており、ここでも等しく適用される。
【０１０６】
あるいは、本発明のポリペプチドは、上記の通り配列番号５若しくは配列番号２０のより短い断片又はその変異体を含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。断片は、Ｏ−糖タンパク質結合活性を保持している、切断された形態の配列番号５又は配列番号２０として説明することができる。このような断片は、配列番号１よりも短く、典型的には、少なくとも１００アミノ酸長、少なくとも１５０アミノ酸長、又は少なくとも２００アミノ酸長である。
【０１０７】
配列番号５若しくは配列番号２０、又はこれらの変異体、あるいはこれらのいずれかの断片を含む本発明の任意のポリペプチドは、任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジン若しくは他のタグを含んでいてもよい。このような追加の配列は、発現及び／又は精製に役立ち得る。ヒスチジンタグは、好ましくは、６個のヒスチジン残基からなる。ヒスチジンタグは、好ましくは、典型的にはアミノ酸の短い配列、例えば３〜５個のアミノ酸であるリンカーによってＣ末端に連結される。リンカーは、典型的には、主にグリシン及びセリンの残基からなり、好ましくは、配列ＧＳＧを含んでいてよい。例えば、ＧＳＧ及びＧＳＧＬＥが好適なリンカーである。
【０１０８】
従って、まとめると、本発明のポリペプチドは、Ｏ−糖タンパク質結合活性を有するが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下しているポリペプチドであって、
（ａ）配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列；
（ｂ）該配列番号５又は配列番号２０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列；
（ｃ）該配列番号５若しくは配列番号２０の配列の断片、又は該配列番号５若しくは配列番号２０のアミノ酸と８５％同一であるアミノ酸の断片であるアミノ酸配列
を含み、
任意で、Ｎ末端における追加のメチオニン及び／又はＣ末端におけるヒスチジンタグを含み、該タグが、リンカーによってＣ末端に連結され得るポリペプチドである。
【０１０９】
本発明の例示的なポリペプチドの配列を、配列番号６として提供する。ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよい。このポリペプチドをコードしている例示的なポリヌクレオチド配列を、配列番号７に示す。本発明の別の例示的なポリペプチドの配列を、配列番号２１として提供する。ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含んでいてもよく、からなっていてもよい。このポリペプチドをコードしている例示的なポリヌクレオチド配列を、配列番号２２に示す。
【０１１０】
該ポリペプチドは、好ましくは、任意で樹脂として提供される、アガロース又はセファロース等に固定化された状態で提供される。
【０１１１】
Ｏ−糖タンパク質結合活性を有するが、Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明の更なるポリペプチドは、メタロプロテアーゼドメインモチーフＨＥｂｂＨ又はａｂｘＨＥｂｂＨｂｃを含むＯ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有する任意の他のポリペプチドにおけるこのようなモチーフを破壊することによって生成され得る。エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドを使用するための本明細書に記載される方法では、本発明のポリペプチドに対する言及は、このようなポリペプチドを含む。該モチーフの破壊は、好ましくは、
（ａ）１番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｂ）２番目の位置におけるＥが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、好ましくはＡ若しくはＧで置換される；及び／又は
（ｃ）５番目の位置におけるＨが、別のアミノ酸、好ましくはＡ若しくはＧで置換されるように、上記の通り達成され、
該モチーフにおけるｂは、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、又はＷである。
【０１１２】
従って、該ポリペプチドは、
（ａ）ｘが、好ましくは、Ｈを除く任意のアミノ酸であり、好ましくはＡ若しくはＧである；及び／又は
（ｂ）ｂが、非荷電アミノ酸、任意でＡ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、若しくはＷ、好ましくはＡ若しくはＧである
モチーフｘｂｂｂｘを含むと説明することができる。
【０１１３】
Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性を有し、この方法で破壊され得る他のポリペプチドは、緑膿菌ＰＡＯ１、バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２、及びウェルシュ菌において同定されていると上に記載されている（Ｎｏａｃｈ  ｅｔ  ａｌ；ＰＮＡＳ  ２０１７，ｐＥ６７９−６８８及び補助付録、具体的には、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎに記載されている３つのペプチダーゼを参照されたい）。これらポリペプチドの完全長配列を、配列番号３２、３３、及び３４として提供する。対応する成熟配列（例えば、シグナル及び他の配列が除去された）を、配列番号２６、２７、及び２８として提供する。（Ｎ末端に追加のメチオニンを、そして、Ｃ末端にヒスチジンタグを含めることによって）大腸菌における発現及びその後の精製に対して最適化されたこれら配列のバージョンを、配列番号２９、３０、及び３１として提供する。従って、配列番号２６〜３４はそれぞれ、本発明の更なるポリペプチドを生成するために、上記モチーフｘｂｂｂｘを生成するために破壊され得るモチーフＨＥｂｂＨを有するメタロプロテアーゼドメインを含む。ＨＥｂｂＨモチーフがこのように破壊されている配列番号２６、２７、及び２８のバージョンを、配列番号３５、３６、及び３７として提供する。（Ｎ末端に追加のメチオニンを、そして、Ｃ末端にヒスチジンタグを含めることによって）大腸菌における発現及びその後の精製に対して最適化されたこれら配列のバージョンを、配列番号３８、３９、及び４０として提供する。Ｏ−糖タンパク質特異的エンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドは、配列番号３５、３６、３７、３８、３９、又は４０のいずれか１つを含んでいてもよく、から本質的になっていてもよく、からなっていてもよい。
【０１１４】
エンドプロテーゼが欠けているか又は低下しているＬＳ変異体を使用する方法
また、本発明は、Ｏ−グリカンに結合させる方法であって、該Ｏ−グリカンを含むサンプルを、Ｏ−グリカンに結合することができ、かつＯ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドと接触させることを含む方法を提供する。方法は、任意で、Ｏ−グリカンが結合しているかどうかを判定すること、及び／又は得られた混合物からＯ−グリカン及び任意の結合している糖タンパク質を分離することを更に含む。
【０１１５】
また、本発明は、タンパク質のグリコシル化状態を評価する方法であって、該のサンプルを、Ｏ−グリカンに結合することができ、かつＯ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドと接触させることと、該タンパク質が該ポリペプチドに結合しているかどうかを判定することとを含む方法も含み得る。
【０１１６】
また、本発明は、サンプル中のＯ結合型糖タンパク質を検出する方法であって、Ｏ−グリカンに結合することができ、かつＯ−グリコシル化タンパク質に特異的なエンドプロテーゼ活性が欠けているか又は低下している本発明のポリペプチドと該サンプルとを接触させて、Ｏ結合型糖タンパク質−ポリペプチド複合体を形成させることを含む方法も含み得る。方法は、任意で、接触させたサンプルから該ポリペプチドを分離することと、分離したポリペプチドがＯ結合型糖タンパク質に結合しているかどうかを判定して、該サンプル中のＯ結合型糖タンパク質の有無を判定することをそれによって判定することができることとを含んでいてよい。また、方法は、Ｏ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質を含有するサンプルからＯ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質を単離するために使用することもできる。
【０１１７】
このような方法では、ポリペプチドがサンプル中の任意のＯ−グリカン又はタンパク質と相互作用するのに、そして、結合が生じるのに好適な条件下で、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる。好適な条件は、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、又は少なくとも１２０分間、少なくとも３時間、少なくとも５時間、少なくとも１０時間、又は少なくとも一晩、典型的には混合しながら、例えば回転させて混合しながら本発明のポリペプチドと共にインキュベートすることを含む。インキュベートは、好ましくは、室温で、より好ましくは、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、又は約４５℃、最も好ましくは、約３７℃で行われる。上記方法は、任意の好適なｐＨ下で実施してよい。好適なｐＨ値は、例えば、約３．０、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、又は約９．５のｐＨを含む。本発明のポリペプチドの活性に好ましいｐＨは、５．６〜６．８の範囲内である。方法は、任意の好適なバッファ、例えば、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で実施してよい。サンプルのタンパク質含量に対する本発明のポリペプチドの近似比は、１：１、２：１、４：１、６：１、１０：１、１５：１、２０：１、１：２、１：４、又は１：６、１：１０、１：１５、１：２０、１：４０、１：１００、１：２００、又は１：４００（重量：重量）であってよい。好ましい比は１：１（重量：重量）である。反応時間をより短くする必要がある場合又はＯ−糖タンパク質が重度にシアリル化されている場合、ポリペプチドの基質に対する比率がより高い方が有益であり得る。あるいは、以下により詳細に論じる通り、シアル酸含量を低下させるために、前もって又は同時にシアリダーゼインキュベート工程を使用してもよい。基質は、典型的には、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬ、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【０１１８】
Ｏ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質が結合しているかどうかを判定するためのサンプルの検出又は分析は、例えば、質量分析、ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＥＬＩＳＡ、レクチンブロッティング、分光分析、キャピラリー電気泳動、及びタンパク質を分析するための他の標準的な検査技術等であるがこれらに限定されない、任意の好適な分析方法によって評価してよい。例えば、ポリペプチドの分子量を分析してよい。Ｏ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質に結合している本発明のポリペプチドは、Ｏ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質に結合していないポリペプチドよりも高い分子量を有する。
【０１１９】
結合しているＯ−グリカン又はＯ結合型糖タンパク質及び本発明のポリペプチドの分離は、任意の好適な分離手段によって実施してよい。例えば、分離手段は、磁性ナノ粒子の集団を含んでいてよい。これらは、磁場分離、好ましくは、高勾配磁場分離を使用してサンプルから分離され得る。試薬又は分離手段の例は、本発明のポリペプチドに結合することができる磁性粒子の集団である。例えば、ポリペプチドがヒスチジンタグで誘導体化されている場合、磁性粒子は、その表面上にニッケル、銅、又は亜鉛のイオンを保有しているキレート化基を含有する。あるいは、ポリペプチドがビオチンタグで誘導体化されている場合、磁性粒子は、その表面上にストレプトアビジンを含有する。
【０１２０】
また、分離手段は、本発明のポリペプチドが固定化されている固体支持体を含んでいてもよい。固体支持体の例は、前の章に記載したものを含み、アガロース若しくはセファロースの樹脂、架橋アガロースビース、又は類似のものを含んでいてよい。支持体を、アフィニティークロマトグラフィーカラムにおいてマトリクスとして使用してもよい。あるいは、固体支持体は、本発明のポリペプチドを直接吸着することができる、好適なシリカベースの材料若しくはポリスチレン、又はマイクロタイタープレート若しくは等価物等のプラスチック容器を含んでいてもよい。
【０１２１】
別の分離手段は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を含む試薬を含み、これは、当技術分野において標準的な方法によって生成され得る。この意味における抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、又はヒト化抗体を含む。抗体は、インタクトな免疫グロブリン分子、又はその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、若しくはＦｖの断片であってよい。１つを超える抗体が存在する場合、抗体は、好ましくは、本発明のポリペプチドに同時に結合することができるように、異なる重複していない決定基を有する。抗体は、固体支持体に結合していてもよく、その分離又は単離を支援するために、標識されるか又は別の化学基若しくは化学分子にコンジュゲートされていてもよい。例えば、典型的な化学基は、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）若しくはフィコエリトリン（ＰＥ）等の蛍光標識、又はビオチン等のタグを含む。
【０１２２】
他の好適な分離手段は、接触させたサンプルから得られたポリペプチドを好適な溶出バッファと接触させることによって、（典型的には固定化されている）ポリペプチドからタンパク質を溶出することを含む。溶出バッファの選択は、タンパク質の酸感受性に依存し得る。好ましい溶出バッファは、高モル濃度の尿素（典型的には、少なくとも５Ｍ、少なくとも６Ｍ、少なくとも７Ｍ、又は最も好ましくは、少なくとも８Ｍ）又は高濃度の洗浄剤（典型的には、少なくとも約１％、少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％）を含んでいてよい。好適な洗浄剤は、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、及びＲａｐｉＧｅｓｔ  ＳＦ界面活性剤を含むが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が好ましい。高モル濃度の尿素が洗浄剤よりも好ましいが、その理由は、下流の手順が洗浄剤の存在に対して感受性である可能性がより高いためである。
【０１２３】
別の好ましい溶出バッファは、好適な濃度の、Ｏ−糖タンパク質エンドプロテーゼ活性を有する本発明のポリペプチド、例えば、配列番号１のポリペプチドを含む。このポリペプチドがＯ−グリカンを切断することによって、結合しているＯ−糖タンパク質が放出されるので、尿素又は洗浄剤ベースの溶出の必要性がなくなる。
【０１２４】
固定化されている本発明のポリペプチドからＯ−糖タンパク質を溶出する好ましい方法を実施例に示す。
【０１２５】
上記方法のいずれかにおけるサンプルは、患者、好ましくはヒト患者から採取されたサンプルであってよい。得られた結果は、診断目的のために、例えば、Ｏ結合型グリコシル化を伴うがんの存在を検出するために使用することができる。このような使用は、患者サンプルから得られた結果を、健常対照から得られたサンプルを使用して得られた結果と比較することを含んでいてよい。
【０１２６】
本発明の任意の方法では、ポリペプチドを、プロテアーゼ又はグリコシダーゼ等の別の酵素と組み合わせて使用してもよい。追加のプロテアーゼ又はグリコシダーゼは、典型的には、基質タンパク質又はグリカンを更に消化するので、生成物をより容易又はより詳細に分析することが可能になる。
【０１２７】
例えば、本発明のポリペプチドは、シアル酸を除去するための剤と組み合わせて使用してもよい。該剤は、好ましくは、上の章に記載した通り、シアリダーゼ酵素又はこのような酵素の混合物であってよい。また、本発明は、本発明のポリペプチドと、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物とを含む組成物（凍結乾燥された又は溶液の形態）を提供する。また、本発明は、異なる酵素を併用するための指示書と共に、Ａｍ１７５７又はＡｍ１７５７とＡｍ０７０７との混合物とは別個の容器内に本発明のポリペプチドを含むキットを提供する。
【０１２８】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、標的タンパク質からＮ−グリカンを除去するために、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる前に、同時に、又は後に、該サンプルをＮ−グリコシダーゼと共にインキュベートしてもよい。例示的なＮ−グリコシダーゼは、ＰＮＧａｓｅＦである。サンプルが免疫グロブリンを含むときに使用することができる他のＮ−グリコシダーゼは、ＥｎｄｏＳ（国際公開第２００８０７１４１８号の配列番号１を参照されたい）又はＥｎｄｏＳ２（ＥｎｄｏＳ４９と称される場合もある、国際公開第２０１３０３７８２４号の配列番号１を参照されたい）である。これら酵素はそれぞれ、ＩｇＧ１のＡｓｎ−２９７からＮ結合型糖タンパク質を除去する。本発明のポリペプチドに加えて、Ｎ−グリコシダーゼ及びシアリダーゼ（又はこれらの混合物）とサンプルを接触させてもよい。このような方法では、Ｎ−グリコシダーゼ及び本発明のポリペプチドを同時に添加する前に、シアリダーゼ（又は混合物）をまず適用してよい。
【０１２９】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、標的タンパク質を更に消化するために、サンプルを本発明のポリペプチドと接触させる前に、同時に、又は後に、該サンプルをプロテアーゼと共にインキュベートしてもよい。好適な一般的なプロテアーゼは、トリプシン、キモトリプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ｇｌｕ−Ｃ、Ａｒｇ−Ｃ、若しくは類似のエンドプロテーゼ、又はジンジバリス菌のＡｒｇ−ジンジパイン（ＲｇｐＢ）を含む。
【０１３０】
サンプルが免疫グロブリンを含む場合、ＳｐｅＢ（国際公開第２０１５０４０１２５号における配列を参照されたい）、化膿レンサ球菌の免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＳ−国際公開第２０１５０４０１２５号における配列を参照されたい）、腺疫菌亜種ズーエピデミカスの免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｄｅＺ）、ジンジバリス菌のＬｙｓ−ジンジパイン（Ｋｇｐ）、及びストレプトコッカス・アガラクチアの免疫グロブリンＧ分解酵素（ＩｇｄＥアガラクチア−国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５２４６３号の配列番号３を参照されたい）等の免疫グロブリンプロテアーゼを使用してよい。本発明の方法におけるこれらプロテアーゼの任意の組み合わせの使用は、例えば質量分析を使用して、基質タンパク質又はグリカンの分析を支援することができる。
【０１３１】
別の例として、本明細書に記載される方法のいずれかでは、任意の好適な方法によって更に分析する前に、単離されたＯ結合型糖タンパク質をＯ−グリコシダーゼと共にインキュベートして、Ｏ−グリカンを除去してよい。好適なＯ−グリコシダーゼは、大便連鎖球菌、ストレプトコッカス・オラリス、又はビフィズス菌、好ましくは、大便連鎖球菌又はストレプトコッカス・オラリス、最も好ましくは、ストレプトコッカス・オラリスの株から得ることができる。ストレプトコッカス・オラリス由来の例示的なＯ−グリコシダーゼの配列を、配列番号１５として提供する。
【０１３２】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【０１３３】
実施例１
材料及び方法
ＬＳの突然変異誘発
プライマーＥ２０６Ａ＿ｆｗｄ  ５’−ＡＴＧＧＣＧＣＡＣＧＣＧＣＴＧＧＧＣＣＡＣＧ−３’及び５’−ＧＣＣＡＣＣＧＴＡＣ  ＣＡＴＴＴＣＧＴＣ−３’（ｒｅｖ）を使用し、製造業者の指示書に従って（アニーリング温度６８℃、３分間伸長）、Ｑ５（ＮＥＢ）を使用する部位特異的突然変異誘発を実施し；それによって、アッカーマンシア・ムシニフィラ由来のＡｍｕｃ１１１９遺伝子におけるグルタミン酸をアラニンに変化させて、突然変異体Ａｍｕｃ１１１９Ｅ２０６Ａ（ＬＳＥ２０６Ａ）を作製した。コンストラクトをＤＨ５α大腸菌に形質転換し、単離し、シーケンシングを使用して確認した（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。
【０１３４】
ＬＳ及びＬＳＥ２０６Ａの組み換え発現
アッカーマンシア・ムシニフィラＡＴＣＣ  ＢＡＡ−８３５由来の遺伝子Ａｍｕｃ１１１９及び突然変異体Ａｍｕｃ１１１９Ｅ２０６Ａ（Ａｍｕｃ１１１９−ＬＳ；Ａｍｕｃ１１１９Ｅ２０６Ａ−ＬＳＥ２０６Ａ）を、大腸菌における発現に対してコドン最適化し（ＤＮＡ２．０）、融合タンパク質の一部としてＣ末端における６×Ｈｉｓタグと共に発現ベクターにクローニングした。
【０１３５】
コドン最適化された遺伝子をＢＬ２１（ＤＥ３）Ｓｔａｒ細胞に形質転換した。大腸菌を１８０ｒｐｍで３７℃のＬＢ中でルーチン的に培養した。プラスミドの存在下で、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加した。一晩インキュベートした後、培養物を新鮮ＬＢ（Ｋａｎａ）で１：２０希釈し、ＯＤ６２０が約０．７〜０．８になるまで成長させ、その後、１ｍＭ  ＩＰＴＧを添加することによって組み換えタンパク質発現を誘導し、６時間発現を継続させた後、細胞を収集し、凍結させた。凍結細胞を解凍し、Ｈｉｓ結合バッファ（２０ｍＭ  ＮａＰ  ｐＨ７．４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に溶解させ（resolved）、細胞内タンパク質を放出させるために超音波処理した。遠心分離によって細胞残屑を除去した。滅菌濾過した上清をニッケルカラムでアフィニティー精製し、ＰＤ−２５カラムにおいて２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０に再緩衝した。Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用してタンパク質の濃度を決定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通して純度を推定した。
【０１３６】
タンパク質基質を使用する活性評価
ＴＮＦαＲを２：１比でＬＳと混合し、３７℃で１５〜６０分間インキュベートし、その後、４〜２０％Ｎｏｖｅｘ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。ＬＳ活性に対するＮａＣｌ（０〜１Ｍ）、二価カチオン、ＥＤＴＡ、及びｐＨの影響を調べ、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＥＺ（ＢｉｏＲａｄ）を使用した濃度測定分析を通して生成された加水分解断片の差を測定した。
【０１３７】
活性の時間及び用量依存性
ＴＮＦαＲ（０．５μｇ）を、ＰＢＳ中３７℃で１５又は６０分間、様々な用量のＬＳと共にインキュベートし、その後、４〜２０％Ｎｏｖｅｘ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離した。効率的なインキュベート条件に最適な用量及び時間を求めるために、生成された断片の強度（濃度測定）を使用した。
【０１３８】
基質特異性
２：１の比（基質：酵素）で、ＬＳを様々なＮ又はＯ結合型基質と共に３７℃で一晩インキュベートした。５０：１（基質：酵素）の比で、ＬＳをＥＰＯ（０．３ｍｇ／ｍＬ）と共にインキュベートした。タンパク質を分離し、４〜２０％Ｎｏｖｅｘ勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。
【０１３９】
ＬＳＥ２０６Ａの固定化
ＬＳＥ２０６Ａをカップリングバッファ（０．２Ｍ  ＮａＨＣＯ３、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ８．３）に再懸濁させ、２０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。製造業者の指示書に従って、カップリング用にＮＨＳ活性化セファロース４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を調製した（例えば、ＨＣｌ洗浄及びカップリングバッファで平衡化）。常に混合するためにゆっくり揺らしながら、４℃で一晩セファロースと共にインキュベートすることによって、ＬＳＥ２０６Ａを固定化した。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５を添加することによってセファロースをブロッキングし、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５／０．１Ｍ  ＮａＡｃ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ５．０による洗浄を３回繰り返し、使用までＥｔＯＨ中で保存した。
【０１４０】
ＬＳＥ２０６Ａの結合親和性
ＰＢＳで平衡化した固定化されたＬＳＥ２０６Ａ（例えば、約５０μｇのタンパク質）５０μＬを含むスピンカラムを、シアリダーゼミックス（Ａｍ０７０７：Ａｍ１７５７）又はシアリダーゼとストレプトコッカス・オラリスのエンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ（例えば、Ｏ−グリコシダーゼ）との組み合わせのいずれかで前処理した糖タンパク質１０μｇと共にインキュベートした。サンプルを３７℃で２時間インキュベートし、その後、カラムをＰＢＳで洗浄し（１０体積；１００ｇ、３０秒間）、０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧで分析した。
【０１４１】
質量スペクトル分析
エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は、臨床的に承認されている、ＴＮＦαに結合するＦｃ融合タンパク質である。エタネルセプトは幾つかのＯ−グリカンを含有する。酵素の切断特異性を試験するために、エンドプロテーゼをエタネルセプトと共に３７℃で一晩インキュベートした。質量スペクトル分析を単純化するために、第２ラウンドの酵素処理を行って、シアリダーゼ及びＯ−グリコシダーゼを使用して残りのＯ−グリカンを除去した（一晩、ＰＢＳ中、１：４０比の全ての単一酵素）。Ｃ１８逆相液体クロマトグラフィによってペプチドを分離した後、生成されたペプチドをＭＳ／ＭＳによって分析した。
【０１４２】
結果
ＬＳは、推定メタロプロテアーゼである
配列及びドメインの類似性に基づいて、ＬＳは、一般的なメタロプロテアーゼ配列ａｂｘＨＥｂｂＨｂｃ（ａ＝Ｖ／Ｔ、ｂ＝非荷電、ｃ＝疎水性）に対する類似性を共有している、推定活性部位配列ＧＭＡＨＥＬＧＨＧＬを含有する幾つかのメタロプロテアーゼと相同性を共有している。ヒスチジンは、一般に基質結合及びＺｎ２＋親和性に関与するが、グルタミン酸は、ヒスチジンと共に電子移動、ひいては、加水分解効果を媒介する。酵素を更に特性評価することができるように、ＥをＡに変更することによって基質に結合することはできるが、加水分解能が欠けているか又は低下しているＬＳＥ２０６Ａ突然変異体を構築した。完全に不活性にするために、更なる改変（例えば、ＨからＡへの変更）が必要になる場合もある。両コンストラクトは良好に発現し、そのＨｉｓタグに基づいて、アフィニティークロマトグラフィーを使用して容易に精製された（図１）。
【０１４３】
ＬＳは、Ｏ−グリカンを有する糖タンパク質を特異的に加水分解する
ＬＳの基質特異性について調べるために、プロテアーゼを多様なタンパク質と共にインキュベートした。図２に示す通り、ＬＳをＩｇＡ及びハーセプチン（トラスツズマブ）と共にインキュベートした。ＬＳは、ＩｇＡ等のＯ結合型グリカンを有するタンパク質にのみ作用することができた。一見したところ末端シアル酸の存在がＬＳの活性を部分的に阻害するが、シアル酸が存在しないことが加水分解にとって必須ではない（図４）。
【０１４４】
ＬＳは、多様な条件下でＯ結合型糖タンパク質に作用することができる
ＬＳの酵素特性を評価するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの濃度測定分析を実施した。ＬＳは、ほとんどの条件下で活性であるが、わずかに酸性のｐＨ及び低ＮａＣｌ濃度が好ましい（図３Ａ〜３Ｂ）。Ｍｇ２＋及びＣａ２＋のイオンは、いずれもＬＳの加水分解活性に対して正の影響を与えたが、Ｚｎ２＋の存在は活性を著しく低下させ、ＥＤＴＡは活性を完全に消失させた（図３Ｃ〜Ｄ）。
【０１４５】
Ｏ結合型ガラクトシダーゼ残基が、ＬＳの活性にとって重要である
末端シアル酸の非存在下では増大した活性を有するが、ＬＳの活性にとってＯ−グリカンにおける他の糖質の重要性は完全には理解されていなかった。ＬＳの活性は末端シアル酸の非存在下において著しく増大するが、ガラクトースを除去するとＬＳの活性が完全に阻害される（図４Ａ）。更に、シアリル化タンパク質におけるＬＳの活性低下は、一晩インキュベートした後の完全な加水分解によって示される通り、シアル酸の存在下で結合を加水分解する能力がないことに起因するのではない（図４Ｂ）。ＬＳの活性はＯ−グリカンに完全に依存しているが、その理由は、Ｎ−グリカンの除去がＬＳによる加水分解に影響を与えなかったためである（図４Ｃ）。
【０１４６】
Ｏ結合型グリカンがＬＳの切断部位を指定する
Ｏ−グリカンが活性にとって重要であることが示されたので、次に、ＬＳの特異的切断部位について調べようとした。質量分析を使用して、ＬＳがＯ−グリコシル化Ｓｅｒ／ＴｈｒとそのＮ末端アミノ酸との間のアミノ結合を、アミノ酸の種類にかかわらず（例えば、プロリンが加水分解を阻害するとは思われない）加水分解することを立証することができた（図５）。
【０１４７】
Ｏ結合型グリカンの存在量が多いことからモデルタンパク質としてエタネルセプトを使用して、糖タンパク質をＬＳで処理し、その後、質量スペクトル分析を容易にするために、Ｏ−グリコシダーゼで続いて処理した。質量スペクトル分析から得られたｍ／ｚ値をＭＳ／ＭＳデータと組み合わせて、エタネルセプトに当てはめた。同定されたペプチドは全てＮ末端のセリン又はスレオニンを有しており、これは、ＬＳがＯ−グリカンのすぐＮ末端側を切断することと一致している（図５）。指向型探索（directed search）（パラメータにおいてＳ／Ｔ加水分解を定義する；図５Ａ）及びアンバイアスドアプローチ（図５Ｂ）の両方において、分析によってペプチドが同定された。
【０１４８】
ＬＳの加水分解不活性変異体は、Ｏ−グリカン含有タンパク質に特異的に結合する
ＬＳのＯ−グリカンに結合し、グリカンに隣接する（例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒに隣接する）アミノ酸結合を特異的に加水分解する能力を備えていることから、ＬＳのＥ２０６Ａ突然変異体は加水分解能が欠けているが、結合能は保持していると仮定した。このようなツールは、特に、ａ）Ｏ結合型糖タンパク質の同定、ｂ）除去又は研究のためのＯ結合型糖ペプチドのアフィニティー精製、及びｃ）Ｏ−グリカンのアフィニティー精製にとって有用である。
【０１４９】
図６Ａは、突然変異体ＬＳが検出可能な加水分解活性を全く有していなかったことを示す。ＬＳは、シアリダーゼの存在下でエタネルセプトを加水分解することができたが、Ｌｓｍｕｔはエタネルセプトを加水分解することができず、このことから、試験した条件下で遺伝子変化が実際にＯ−グリコプロテアーゼを不活化したことが確認された。
【０１５０】
取り扱いをより容易にするために、ＬＳＥ２０６Ａをセファロースに固定化し、スピンカラムに添加した。重要なことに、ＬＳＥ２０６Ａの様々な基質への結合は、ＬＳの加水分解活性と完全に相関していた（図６Ｂ）。ＬＳＥ２０６Ａ（ＬＳｍｕｔと表示）は、Ｏ結合型糖タンパク質に対する特異的親和性を示した。セファロースにＬｓｍｕｔを固定化することによって、ＩｇＡをアフィニティー精製することができた。しかし、恐らく親和性が強いことに起因して、タンパク質を溶出することはできなかった。Ｏ−グリカンを欠いているハーセプチン（トラスツズマブ）及びＯ−グリコシダーゼ処理されたＩｇＡは、カラムに結合せず、素通り画分（ＦＴ）において検出することができた。
【０１５１】
完全ＬＳ活性のためには２−３シアル酸結合を除去することが重要である
エンドプロテーゼ活性が特定のシアル酸結合に依存しているので、最大の効果を得るためには２−３及び２−６結合シアル酸の両方を除去する必要があることが本発明者らによって最近判明した。ＬＳの活性に対する特定のシアル酸結合の個々の役割を決定するために、Ｅｎｂｒｅｌを、ＬＳと組み合わせて様々なシアリダーゼと共に３０分間〜２０時間インキュベートした。ＬＳによる加水分解には、２−３結合を除去すれば十分であると思われた（図７）。
【０１５２】
ＬＳは、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を切断する
ＥＰＯをＰＮＧａｓｅＦ、シアリダーゼ（Ｓｍｉｘ、Ａｍ０７０７及びＡｍ１７５７を含む）、及び／又はＯ−グリコシダーゼで処理し、ＬＳと共にインキュベートした。
【０１５３】
次いで、得られた生成物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色、並びにＲＰＬＣ及び質量分析によって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図９Ａに示すが、これは、シアル酸が除去されたとき及びシアル酸がインタクトなときの両方でＬＳがＥＰＯを切断することを示す。更に、ＬＳは、Ｎ−グリカンがＰＮＧａｓｅＦで除去された場合もＥＰＯを消化し、このことから、ＬＳ活性はＮ−グリカンの除去に影響を受けないことが確認された。しかし、Ｏ−グリカンがＯ−グリコシダーゼで除去されたときには、ＬＳはＥＰＯを切断せず、このことは、ＬＳがタンパク質を切断するためにＯ−グリカンが必要であることを示す。１０：１、５：１、及び２：１（基質：酵素）の比で等価な結果が観察された（データは割愛する）。
【０１５４】
ＰＮＧａｓｅＦ、Ｓｍｉｘ、及びＬＳと共にインキュベートした後のサンプル混合物を逆相液体クロマトグラフィによって分離し、酵素処理後の反応生成物を同定するためにＥＳＩ質量分析によって分析した。
【０１５５】
図９Ｂは、ＲＰＬＣから得られたＵＶクロマトグラムを示す。予想通り、ＥＰＯが示唆されたＯ−グリカン位置を１つしか有していないと仮定すると（以下の配列番号１４における予測位置を参照されたい）、クロマトグラムは、ＬＳによる切断から生じた２つの断片に対応する２つのピークを示す。
【０１５６】
これら断片をＭＳによって更に分析し（図９Ｃ及びＤを参照されたい）、以下の通り同定した：
ＳＡＡＰＬＲＴＩＴＡＤＴＦＲＫＬＦＲＶＹＳＮＦＬＲＧＫＬＫＬＹＴＧＥＡＣＲＴＧＤ（質量＝４９００．５８６８Ｄａ−切断点のＣ末端側の配列に対応、従って、Ｎ末端セリンに依然として結合しているＯ−グリカンを含む）；及び
ＡＰＰＲＬＩＣＤＳＲＶＬＥＲＹＬＬＥＡＫＥＡＥＤＩＴＴＧＣＡＥＨＣＳＬＤＥＮＩＴＶＰＤＴＫＶＤＦＹＡＷＫＲＭＥＶＧＱＱＡＶＥＶＷＱＧＬＡＬＬＳＥＡＶＬＲＧＱＡＬＬＶＮＳＳＱＰＷＥＰＬＱＬＨＶＤＫＡＶＳＧＬＲＳＬＴＴＬＬＲＡＬＧＡＱＫＥＡＩＳＰＰＤＡＡ（質量＝１３７１４．１１９９Ｄａ、切断点のＮ末端側の配列に対応）。
【０１５７】
従って、ＰＮＧａｓｅＦ、シアリダーゼミックス、及びＬＳの併用によって、ＥＰＯにおけるＯ−グリカンを有するセリンを単離し、正確に同定することが可能になった。この種の方法は、任意のＯ−糖タンパク質に適用可能であり、Ｏ−グリカンの結合位置を迅速に同定することを可能にする。
【０１５８】
実施例２
序論
実施例１に記載のＬＳＥ２０６Ａ突然変異体には、ＬＳの活性部位の部位特異的突然変異（ａｂｘＨＥｂｂＨｂｃからａｂｘＨＡｂｂＨｂｃへ）が組み込まれたので、酵素クレフトの電子移動能が除去されている。以下に更に説明する通り、更なるストレス試験時に、この変化によって野生型配列に比べてＯ−グリコプロテアーゼ活性が低下するが、完全にはなくならないことが見出された。従って、本発明者らは、酵素クレフトに更なる置換が組み込まれた別の突然変異体を開発し、特性評価した。具体的には、補助因子亜鉛イオンの配向において重要なＨｉｓ残基をＡｌａで置換した。得られた二重突然変異体をＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（ａｂｘＨＥｂｂＨｂｃからａｂｘＡＡｂｂＨｂｃへ）と称する。
【０１５９】
２．１  二重突然変異体の生成
（例えば、実施例１に示すような）標準的なプロトコールを使用する部位特異的突然変異誘発を使用して、アッカーマンシア・ムシニフィラのＡｍｕｃ１１１９遺伝子に比べてヒスチジン及びグルタミン酸の両方をアラニンに変化させて、二重突然変異体Ａｍｕｃ１１１９Ｈ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ）を作製した。コンストラクトを大腸菌に形質転換し、実施例１の通り単離し、シーケンシングを使用して確認した。実施例１に記載の通り、大腸菌における発現を実施した。発現したタンパク質の配列を配列番号２１として提供する。
【０１６０】
２．２  二重突然変異体の特性評価
２．２．１  二重突然変異体はＬＳの活性を完全に不活化する
実施例１に示す通り、２時間でＯ−糖タンパク質を加水分解する能力がないことに鑑みて、単一突然変異体ＬＳＥ２０６Ａは不活性であることが分かった。しかし、ストレス試験では、Ｏ−グリコプロテアーゼ活性が完全にはなくならず、より高い酵素：Ｏ−糖タンパク質比及びより長いインキュベート時間では若干の活性が観察されたので低下するだけであることが見出された。
【０１６１】
１：１（重量：重量）比のＬＳＥ２０６Ａ：アシアリル化Ｏ−糖タンパク質を２４時間インキュベートした結果、基質が著しく加水分解されたが、野生型ＬＳと同程度ではなかった（図１０Ａ）。対照的に、二重突然変異体ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａは、一晩インキュベートした後、酵素：Ｏ−糖タンパク質の比が１５：１（重量：重量）であっても加水分解の証拠が全く得られず（図１０Ｂ）、このことは、第２の突然変異の追加によって酵素が完全に不活性になったことを示唆している。
【０１６２】
２．２．２  二重突然変異体はＯ−糖タンパク質に特異的に結合する
様々なタンパク質に対する結合を評価するために、固定化されたＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ（５０μＬ樹脂）（実施例１と同じプロトコールを使用して調製）をＰＢＳで平衡化し、その後、様々なタンパク質サンプル５０μｇを０．５ｍｇ／ｍＬの濃度で添加し、回転させながら室温で２時間インキュベートした。遠心分離（２００ｇ、１分間）を介して素通り画分を回収し、樹脂をＰＢＳ３５０μＬで３回洗浄した。８Ｍ尿素５０μＬと共に２回逐次５分間インキュベートし、続いて、遠心分離（１０００ｇ、１分間）することによって、結合しているタンパク質を溶出した。全てのサンプルを等体積でロードした。出発／ローディング物質、素通り画分、及び溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０１６３】
第１の実験では（図１１Ａを参照されたい）、シアリダーゼミックス（Ａｍ０７０７：Ａｍ１７５７）又はシアリダーゼミックスとストレプトコッカス・オラリスのエンド−α−Ｎ−アセチル−ガラクトサミニダーゼ（例えば、Ｏ−グリコシダーゼ）との組み合わせのいずれかでグリコシル化タンパク質又は非グリコシル化タンパク質を前処理した後、樹脂と共にインキュベートし、洗浄し、溶出した。製造業者の指示書に従ってサンプルの前処理（シアリダーゼ混合物＋／−Ｏ−グリコシダーゼ）を行った。Ｏ−グリカンを有するタンパク質のみが樹脂に結合し、シアル酸の非存在下では親和性が増大した。Ｏ−グリコシダーゼによる処理後に相互作用がなくなったことによって示される通り、Ｏ−グリカンの存在が、任意の結合が生じるのに必須であった。
【０１６４】
第２の実験では（図１１Ｂを参照されたい）、Ｎ−グリコシル化、Ｏ−グリコシル化、及び非グリコシル化のタンパク質のミックスをＬＳ二重突然変異体樹脂と共にインキュベートした。Ｏ−グリコシル化タンパク質（ＴＮＦαＲ及びＡｐｏＥ）のみがマトリクスに結合し、８Ｍ尿素で溶出された。Ｎ−グリコシル化（アフリベルセプト、ＡＧＰ（α−１−酸糖タンパク質）、ＩｇＧのＦｃドメイン（ＩｇＧ  Ｆｃ）、及び非グリコシル化（ＢＳＡ）は、ＬＳ二重突然変異体樹脂に結合せず、素通り画分中にみられた。従って、サンプルがＮ−、Ｏ−、及び非グリコシル化タンパク質の混合物を含有しているとき、二重突然変異体樹脂は、Ｏ−グリコシル化タンパク質のみに特異的に結合する。
【０１６５】
第３の実験では（図１１Ｃを参照されたい）、Ｎ−グリコシル化タンパク質と非グリコシル化タンパク質とのミックスをＬＳ二重突然変異体樹脂と共にインキュベートした。Ｏ−糖タンパク質との競合の可能性がない場合でさえも、非特異的結合は存在しなかった（何も存在しない）。溶出液中にタンパク質はみられなかった。従って、二重突然変異体樹脂は、Ｏ−グリカンを欠いているタンパク質には結合しない。
【０１６６】
２．２．３  能力を増強するために、二重突然変異体を様々な濃度で樹脂上に固定化することができる
より多くのＯ−グリコシル化タンパク質に結合するように、固定化された二重突然変異体樹脂の能力を改善する能力について調べるために、樹脂への固定化中に様々な濃度の二重突然変異体（５〜１５ｍｇ／ｍＬ）を使用した。代表的なゲルを図１２Ａに示す。示されている％は、ポジティブコントロールに比べた結合レベルであり、ゲルの濃度測定分析によって決定した。結果を図１２Ｂのグラフに示す。固定化中により高い濃度の二重突然変異体を使用したとき、Ｏ−糖タンパク質結合能が高くなると共に能力の用量依存的増大がみられた。１５ｍｇ／ｍＬの固定化二重突然変異体を使用して更に実験を継続した。更に、１Ｍ尿素及び１Ｍ  ＧＨＣｌの存在下でさえも高い程度のＯ−糖タンパク質結合が維持されたが、後者では、結合効率が著しく低下した。
【０１６７】
２．２．４  二重突然変異体のアフィニティー精製能は、〜３ｍｇ（糖タンパク質）／Ｌ（樹脂）である
Ｏ−糖タンパク質をアフィニティー精製する二重突然変異体樹脂の能力、及びこの能力に対するサンプル濃度の影響を具体的に調べるために、様々な量及び濃度のアシアリル化エタネルセプトを樹脂に添加した。個々のカラム（二重突然変異体樹脂５０μＬを含有する）は、Ｏ−糖タンパク質約１５０μｇに結合する能力、すなわち、３ｍｇ（糖タンパク質）／Ｌ（樹脂）を有していた。図１３は、代表的なゲルを示す。
【０１６８】
２．２．５  Ｏ−糖タンパク質の二重突然変異体に対する結合は、イオン強度によってもバッファの体積／種類によってもそれほど影響を受けず、広いｐＨ範囲にわたって機能する
樹脂の結合能に対するイオン強度、バッファの体積／種類、及びｐＨの効果を試験するために、多様な異なる条件下で、回転させながら室温で２時間、サンプルタンパク質を二重突然変異体樹脂に結合させた。いずれの場合も、次いで、樹脂をそのそれぞれの結合バッファ（３５０μＬ）で３回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した（５０μＬ、５分間インキュベート；２回繰り返す）。次いで、全てのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０１６９】
第１の実験では（図１４Ａを参照）、様々なイオン強度を有するバッファにおける相互作用の安定性を調べるために、アシアリル化エタネルセプトからなるサンプルを０〜４Ｍ  ＮａＣｌ中で二重突然変異体樹脂と共にインキュベートし、更に、それぞれの濃度のＮａＣｌを用いて全ての洗浄工程を実施した。ＮａＣｌの添加は、アシアリル化エタネルセプトの結合に対してそれほど影響を与えなかった。
【０１７０】
第２の実験では（図１４Ｂを参照されたい）、サンプルは、様々な異なる体積のＰＢＳ中のアシアリル化エタネルセプトからなっていた。洗浄工程は、ＰＢＳを使用した。基質体積を１００〜３００μＬで変化させても、効率に著しい影響を与えなかった。
【０１７１】
第３の実験では（図１４Ｃ及びＤを参照されたい）、サンプルは、様々なｐＨ（ｐＨ４〜９）の様々なバッファ（１００ｍＭ酢酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）中アシアリル化エタネルセプト及びＢＳＡからなっていた。洗浄工程には、対応するバッファを使用した。ｐＨ６〜８が最もよく機能することが見出されたが、ｐＨ４は全く機能せず、ｐＨ９は、ｐＨ８よりもわずかに効率が低かった。Ｏ−グリカンを全く含有しないＢＳＡは、いずれの結合条件下でも樹脂に結合しなかった。
【０１７２】
２．２．６  尿素及びＳＤＳは、親和性結合しているＯ−糖タンパク質を溶出することができる
二重突然変異体とそのＯ−糖タンパク質基質との間の高い親和性に基づいて、本発明者らは、イオン強度に基づかない、結合しているタンパク質を樹脂から溶出するための様々な手段について調べた。尿素は、用量依存的溶出を有し、８Ｍ尿素を使用すると１００％近く溶出された（図１５Ａ）。高濃度のＳＤＳ（例えば、５〜１０％）も、結合しているタンパク質の大部分を溶出した（図１５Ｂ）。しかし、多くの下流の用途は洗浄剤の存在に対して感受性であるので、結合しているタンパク質／ペプチドの非酵素的放出にとっては、高レベルの尿素の使用がより実用性が高い可能性がある。
【０１７３】
２．２．７  野生型ＬＳを使用して、二重突然変異体に結合しているＯ−糖タンパク質を溶出することができる
本発明者らは、二重突然変異体に結合しているタンパク質にＬＳを添加した結果、それが放出され得るので、尿素の添加は溶出に必須ではないと推測した。アバタセプト及びエタネルセプトはいずれも６時間でＬＳによって加水分解され、二重突然変異体樹脂から溶出され得たが、２４時間後にはわずかにより完全に溶出された（図１６Ａ）。その後の尿素の添加によって、アフィニティーマトリクスに結合した状態のままのＯ−糖タンパク質が非常にわずかであることが示され、このことは、ＬＳ溶出ストラテジが非常に効率的であったことを立証する。
【０１７４】
ＬＳで溶出したエタネルセプトを質量スペクトル分析（ＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ）にも供した。同定されたペプチド（図１６Ｂ．１）は、エタネルセプトのＬＳ消化において生成されたもの（図１６Ｂ．２）と一致していた。この実験から得られた追加のＭＳデータを以下の表に示す。
【０１７５】
【表３】
2020521460.tif 000005
【０１７６】
２．２．８  二重突然変異体を使用して、複合サンプルからＯ−糖タンパク質をアフィニティー精製することができる
単純化された系だけでなく、複合培地でも、この系がＯ−グリコシル化されたタンパク質のための汎用アフィニティーマトリクスとして機能し得ることの概念実証として、本発明者らは、ヒト血清からＯ−糖タンパク質を精製する二重突然変異体の能力について調べた。ヒト血清は、主に非グリコシル化（ＢＳＡ）及びＮ−グリコシル化（ＩｇＧ）されたタンパク質からなり、全血清プロテオームのうちのほんのわずかしかＯ−グリコシル化されていない。
【０１７７】
シアリダーゼで処理された血清２０μＬ（タンパク質約１．２ｍｇ）を固定化された二重突然変異体樹脂カラム５０μＬに適用することによって、幾つかの選択されたタンパク質を溶出しながら、非グリコシル化及びＮ−グリコシル化されたタンパク質のほとんど全てを除去することができた（図１７Ａ）。シアリダーゼ及びＯ−グリコシダーゼの前処理の有り無しでより多量の血清（例えば、タンパク質２．５ｍｇ）を添加することによって、相互作用がＯ−グリカンと末端シアル酸の除去とに依存することが立証された（図１７Ｂ）。更に、シアリダーゼによる前処理によって、シアリダーゼ処理されていないサンプルと比べて、結合しているＯ−糖タンパク質の量が著しく増加すると結論付けられた。アフィニティー精製されたＯ−糖タンパク質の量を改善するには、シアリダーゼミックス（Ａｍ０７０７：Ａｍ１７５７）５０Ｕの添加で十分であった（図１７Ｃ）。
【０１７８】
質量分析における分析によって、アフィニティー精製された血清タンパク質の大部分にＯ−グリコシル化タンパク質とアノテーションを付けることができる（図１８Ａを参照されたい、以下の表中、名称を太字のイタリック体で記載する）。非Ｏ−糖タンパク質ペプチドに関連する同定されたＯ−糖タンパク質ペプチドの数は、同定されたペプチドの総数の観点で（図１８Ｂ）及びＯ−糖タンパク質ペプチド対非Ｏ−糖タンパク質ペプチドの比（図１８Ｃ）に対して、洗浄工程における様々なストリンジェンシーによって影響を受け得た。従って、親和性樹脂は、Ｏ−糖タンパク質を特異的かつ選択的にアフィニティー精製及び濃縮するその能力において非常に効率的であることは明らかである。この実験から得られた追加のＭＳデータを以下の表に示す。
【０１７９】
【表４】
2020521460.tif 000006
【０１８０】
【表５】
2020521460.tif 000007
【０１８１】
２．２．９  固定化された二重突然変異体はより短いＯ−糖タンパク質にも結合する
ＬＳ二重突然変異体がＯ−糖タンパク質に対しても特異的であることを立証するために、一連の実験を実施した。第１の実験では、Ｏ−グリコシル化ペプチド（スレオニンにコア１Ｏ−グリカンを含むグリコドロソシン（ＧＤ）＝ＧＫＰＲＰＹＳＰＲＰＴＳＨＰＲＰＩＲＶ（配列番号４７））及び幾つかの非グリコシル化ペプチド（Ｈ２６８６、Ｈ４０６２、Ｈ８３９０、及びインスリン酸化ベータ鎖（ＩＯＢ））のミックスをＬＳ二重突然変異体樹脂と共にインキュベートした。（Ｈ２６８６＝ＹＩＹＧＳＦＫ（配列番号４８）、Ｈ４０６２＝ＫＫＬＶＦＦＡ（配列番号４９）、Ｈ８３９０＝ＦＬＰＬＩＬＧＫＬＶＫＧＬＬ（配列番号５０））。
【０１８２】
回転させながら室温で２時間、固定化された二重突然変異体樹脂５０μＬにペプチドミックスを結合させた。樹脂を結合バッファ（３００μＬ）で５回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した。ロード、素通り画分、及び溶出液中のペプチドをＬＣ／ＭＳで分析した。ＲＰ−ＬＣ  Ｃ１８カラム（Ａｄｖａｎｃｅ  ＢｉｏＰｅｐｔｉｄｅ  Ｍａｐ  ２．１×１００  ２．７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ製）で分離を実施し、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｍｐａｃｔ  ＩＩで検出した。結果を図１９Ａに示す。Ｏ−ＧａｌＮＡｃＧａｌを含有するミックス中の唯一のペプチドであるグリコドロソシンは、主に溶出画分でみられ、非グリコシル化ペプチドは素通り画分画分でみられた。
【０１８３】
第２の実験では、ＬＳ二重突然変異体がトリプシンによるタンパク質消化物（例えば、異なる種類のペプチド混合物）からＯ−グリコシル化ペプチドを濃縮できるかどうかを調べた。
【０１８４】
消化の標的としてＩｇＡを選択した。ＩｇＡにおけるトリプシン部位及び報告されているＯ−グリコシル化部位に基づいて、トリプシン消化の結果、ＩｇＡの８９〜１２６位に対応するＯ−グリコシル化ペプチドが１つだけ得られるはずである（図１９Ｂの概略図を参照）。
【０１８５】
トリプシン消化物を作製するために、尿素が６Ｍに、そして、ＤＴＴが５ｍＭになるようにＩｇＡと混合し、続いて、３７℃で１時間インキュベートした。ＩＡＭを１５ｍＭになるように添加し、続いて、暗所において室温で３０分間インキュベートした。次いで、サンプルを、Ｚｅｂａ  ｓｐｉｎ  ７０００  Ｋカラムにおいて５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０にバッファ交換した。次いで、１：２０でトリプシンを添加し、続いて、３７℃で一晩インキュベートした。１ｍｇ／ｍｇトリプシン阻害剤を添加し、続いて、室温で２０分間インキュベートした。得られたトリプシン消化物にシアリダーゼミックス及びＮａＣｌを添加した。回転させながら、室温で２時間、ミックスを樹脂に結合させた。樹脂をＰＢＳバッファ（３００μＬ）で１０回洗浄し、次いで、８Ｍ尿素を添加して溶出した（５０μＬ、２分間；２回繰り返す）。
【０１８６】
ロード、素通り画分、及び溶出液のペプチドを分離し、ＭＱ中０．１％ＦＡ：９５％ＡＣＮ中０．１％ＦＡ勾配、４５℃、及び流速０．２ｍＬ／分で、Ｃ１８カラム（Ａｄｖａｎｃｅ  ＢｉｏＰｅｐｔｉｄｅ  Ｐｌｕｓ  ２．１×１５０ｍｍ  ２．７μｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）においてＲＰ−ＬＣ  ＭＳＭＳを使用して分析した。検出は、ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｉｍｐａｃｔ  ＩＩ機器で行った。結果を図１９Ｃに示す。Ｏ−グリコシル化ペプチド８９〜１２６は溶出液で著しく濃縮され、特異的Ｏ−糖ペプチド８９〜１２６はインタクトな質量で同定された。
【０１８７】
２．２．１０  固定化された二重突然変異体は、他のＯ−糖タンパク質結合マトリクスに優る
本発明者らは、他の市販されているＯ−糖タンパク質結合マトリクス、具体的には、レクチンピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）及びナヨクサフジ（Vicia villosa）レクチン（ＶＶＡ）と比べて、Ｏ−糖タンパク質をアフィニティー精製する二重突然変異体の能力を評価した。エタネルセプト及びアシアリル化エタネルセプトをモデル基質として使用した。
【０１８８】
ＰＢＳ（ＰＮＡ及びＬＳ二重突然変異体）又はレクチン結合バッファ（ＶＶＡ）中基質５０μｇを、体積５０μＬの、それぞれのバッファ中で予め平衡化された様々な固定化されたレクチン又はＬＳ二重突然変異体樹脂（合計１００μＬ）に添加した。（レクチン結合バッファは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、各１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、ＺｎＣｌ２、及びＭｎＣｌ２である）。回転させながら室温で２時間、基質を樹脂と相互作用させた。結合していないタンパク質を、それぞれＰＢＳ又はレクチン結合バッファで洗い流した（１００ｇ、１分間；３回）。遠心分離（１０００ｇ、１分間）によって樹脂を乾燥させた。８Ｍ尿素（ＰＮＡ及びＬＳ二重突然変異体樹脂用）又は製造業者に従ったＶＶＡ溶出バッファ（ＶＶＡ樹脂用）（５０μＬ、１０００ｇで１分間遠心分離する前に５分間処理；２回）を添加して、結合しているタンパク質を溶出し、素通り画分（ＦＴ）及び溶出液（Ｅ）の両方をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。基質１．５μｇをポジティブコントロールとして各ゲル（例えば、３μＬ）に添加し、濃度測定分析を実施して、効率１００％であると思われるロードされた基質１．５μｇに比べて樹脂の効率を評価した。エタネルセプト及びアシアリル化エタネルセプト（エタネルセプトＳ）の代表的なゲルを図２０Ａに示す。濃度測定分析の結果を図２０Ｂに示す。ＬＳＨ２０５Ａ／Ｅ２０６Ａ二重突然変異体は、アシアリル化基質の精製の効率について、最良の性能の市販レクチンと少なくとも同等に機能する。
【０１８９】
配列
配列番号１
【０１９０】
【表６】
2020521460.tif 000008
【０１９１】
配列番号２
【０１９２】
【表７】
2020521460.tif 000009
【０１９３】
配列番号３
【０１９４】
【表８】
2020521460.tif 000010
【０１９５】
配列番号４
【０１９６】
【表９】
2020521460.tif 000011
（下線はシグナル配列）
【０１９７】
配列番号５
【０１９８】
【表１０】
2020521460.tif 000012
【０１９９】
配列番号６
【０２００】
【表１１】
2020521460.tif 000013
【０２０１】
配列番号７
【０２０２】
【表１２】
2020521460.tif 000014
【０２０３】
配列番号８
【０２０４】
【表１３】
2020521460.tif 000015
（メタロプロテアーゼモチーフ）
【０２０５】
配列番号９
【０２０６】
【表１４】
2020521460.tif 000016
（下線はシグナル配列）
【０２０７】
配列番号１０
【０２０８】
【表１５】
2020521460.tif 000017
【０２０９】
配列番号１１
【０２１０】
【表１６】
2020521460.tif 000018
【０２１１】
配列番号１２
【０２１２】
【表１７】
2020521460.tif 000019
（下線はシグナル配列）
【０２１３】
配列番号１３
【０２１４】
【表１８】
2020521460.tif 000020
【０２１５】
配列番号１４
【０２１６】
【表１９】
2020521460.tif 000021
【０２１７】
配列番号１５−Ｓ．オラリス由来のＯ−グリコシダーゼ
【０２１８】
【表２０】
2020521460.tif 000022
【０２１９】
配列番号１６−Ｅ２０６Ａ＿フォワードプライマー
【０２２０】
【表２１】
2020521460.tif 000023
【０２２１】
配列番号１７−Ｅ２０６Ａ＿リバースプライマー
【０２２２】
【表２２】
2020521460.tif 000024
【０２２３】
配列番号１８−ＥＰＯ
【０２２４】
【表２３】
2020521460.tif 000025
（注記：下線は、予測されるＯ−グリカンを有するセリン；Ｃ末端アルギニンは、一般的に発現中に切断される）
【０２２５】
配列番号２０
【０２２６】
【表２４】
2020521460.tif 000026
【０２２７】
配列番号２１
【０２２８】
【表２５】
2020521460.tif 000027
【０２２９】
配列番号２２
【０２３０】
【表２６】
2020521460.tif 000028
【０２３１】
配列番号２３
【０２３２】
【表２７】
2020521460.tif 000029
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２３３】
配列番号２４
【０２３４】
【表２８】
2020521460.tif 000030
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２３５】
配列番号２５
【０２３６】
【表２９】
2020521460.tif 000031
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２３７】
配列番号２６  緑膿菌ＰＡＯ１（シグナル配列が除去されたネイティブ配列）
【０２３８】
【表３０】
2020521460.tif 000032
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２３９】
配列番号２７  バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２（シグナル配列が除去されたネイティブ配列）
【０２４０】
【表３１】
2020521460.tif 000033
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２４１】
配列番号２８  ウェルシュ菌（シグナル配列が除去されたネイティブ配列）
【０２４２】
【表３２】
2020521460.tif 000034
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２４３】
配列番号２９  緑膿菌ＰＡＯ１（Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグ）
【０２４４】
【表３３】
2020521460.tif 000035
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２４５】
配列番号３０  バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２（Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグ）
【０２４６】
【表３４】
2020521460.tif 000036
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２４７】
配列番号３１  ウェルシュ菌（Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグ）
【０２４８】
【表３５】
2020521460.tif 000037
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２４９】
配列番号３２  緑膿菌ＰＡＯ１（シグナル配列を含む完全ネイティブ配列）
【０２５０】
【表３６】
2020521460.tif 000038
（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ｑ９Ｉ５Ｗ４．１）
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
（太字、下線はシグナル配列）
【０２５１】
配列番号３３  バクテロイデス・テタイオタオミクロンVPI-5482（シグナル及び他の配列を含む完全ネイティブ配列）
【０２５２】
【表３７】
2020521460.tif 000039
（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ｑ８９ＺＸ７．１）
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
（太字、下線はシグナル配列）
（太字、イタリック体は成熟タンパク質において除去される他の配列）
【０２５３】
配列番号３４  ウェルシュ菌（シグナル及び他の配列を含む完全ネイティブ配列）
【０２５４】
【表３８】
2020521460.tif 000040
（Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション：Ａ０Ａ０Ｈ２ＹＮ３８．１）
（下線はメタロプロテアーゼモチーフ）
（太字、下線はシグナル配列）
（太字、イタリック体は成熟タンパク質において除去される他の配列）
【０２５５】
配列番号３５  緑膿菌ＰＡＯ１（シグナル配列が除去された二重突然変異体）
【０２５６】
【表３９】
2020521460.tif 000041
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２５７】
配列番号３６  バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２（シグナル及び他の未成熟配列が除去された二重突然変異体）
【０２５８】
【表４０】
2020521460.tif 000042
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２５９】
配列番号３７  ウェルシュ菌(シグナル及び他の未成熟配列が除去された二重突然変異体)
【０２６０】
【表４１】
2020521460.tif 000043
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２６１】
配列番号３８  緑膿菌ＰＡＯ１（シグナル配列が除去され、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグを有する二重突然変異体）
【０２６２】
【表４２】
2020521460.tif 000044
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２６３】
配列番号３９  バクテロイデス・テタイオタオミクロンＶＰＩ−５４８２（シグナル及び未成熟タンパク質由来の他の配列が除去され、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグを有する二重突然変異体）
【０２６４】
【表４３】
2020521460.tif 000045
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２６５】
配列番号４０  ウェルシュ菌（シグナル及び未成熟タンパク質由来の他の配列が除去され、Ｎ末端Ｍｅｔ、Ｃ末端リンカー／タグを有する二重突然変異体）
【０２６６】
【表４４】
2020521460.tif 000046
（下線は破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２６７】
配列番号４１
【０２６８】
【表４５】
2020521460.tif 000047
（メタロプロテアーゼモチーフ）
【０２６９】
配列番号４２
【０２７０】
【表４６】
2020521460.tif 000048
（メタロプロテアーゼモチーフ）
【０２７１】
配列番号４３
【０２７２】
【表４７】
2020521460.tif 000049
（メタロプロテアーゼモチーフ）
【０２７３】
配列番号４４
【０２７４】
【表４８】
2020521460.tif 000050
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２７５】
配列番号４５
【０２７６】
【表４９】
2020521460.tif 000051
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２７７】
配列番号４６
【０２７８】
【表５０】
2020521460.tif 000052
（破壊されたメタロプロテアーゼモチーフ）
【０２７９】
配列番号４７
【０２８０】
【表５１】
2020521460.tif 000053
（ＴにＯ−ｇｌｙ部位を有するグリコドロソシンペプチド）
【０２８１】
配列番号４８
【０２８２】
【表５２】
2020521460.tif 000054
（非Ｏ−グリコシル化ペプチド）
【０２８３】
配列番号４９
【０２８４】
【表５３】
2020521460.tif 000055
（非Ｏ−グリコシル化ペプチド）
【０２８５】
配列番号５０
【０２８６】
【表５４】
2020521460.tif 000056
（非Ｏ−グリコシル化ペプチド）
【図１】
2020521460.tif 000057
【図２】
2020521460.tif 000058
【図３Ａ】
2020521460.tif 000059
【図３Ｂ】
2020521460.tif 000060
【図３Ｃ】
2020521460.tif 000061
【図３Ｄ】
2020521460.tif 000062
【図４Ａ】
2020521460.tif 000063
【図４Ｂ】
2020521460.tif 000064
【図４Ｃ】
2020521460.tif 000065
【図５Ａ】
2020521460.tif 000066
【図５Ｂ】
2020521460.tif 000067
【図６Ａ】
2020521460.tif 000068
【図６Ｂ】
2020521460.tif 000069
【図７】
2020521460.tif 000070
【図８】
2020521460.tif 000071
【図９Ａ】
2020521460.tif 000072
【図９Ｂ】
2020521460.tif 000073
【図９Ｃ】
2020521460.tif 000074
【図９Ｄ】
2020521460.tif 000075
【図１０Ａ】
2020521460.tif 000076
【図１０Ｂ】
2020521460.tif 000077
【図１１Ａ】
2020521460.tif 000078
【図１１Ｂ】
2020521460.tif 000079
【図１１Ｃ】
2020521460.tif 000080
【図１２Ａ】
2020521460.tif 000081
【図１２Ｂ】
2020521460.tif 000082
【図１３】
2020521460.tif 000083
【図１４Ａ】
2020521460.tif 000084
【図１４Ｂ】
2020521460.tif 000085
【図１４Ｃ】
2020521460.tif 000086
【図１４Ｄ】
2020521460.tif 000087
【図１５Ａ】
2020521460.tif 000088
【図１５Ｂ】
2020521460.tif 000089
【図１６Ａ】
2020521460.tif 000090
【図１６Ｂ−１】
2020521460.tif 000091
【図１６Ｂ−２】
2020521460.tif 000092
【図１７Ａ】
2020521460.tif 000093
【図１７Ｂ】
2020521460.tif 000094
【図１７Ｃ】
2020521460.tif 000095
【図１８Ａ】
2020521460.tif 000096
【図１８Ｂ】
2020521460.tif 000097
【図１８Ｃ】
2020521460.tif 000098
【図１９Ａ】
2020521460.tif 000099
【図１９Ｂ】
2020521460.tif 000100
【図１９Ｃ】
2020521460.tif 000101
【図２０Ａ】
2020521460.tif 000102
【図２０Ｂ】
2020521460.tif 000103
【配列表】
2020521460000001.app
【国際調査報告】
2020521460.tif 000104
2020521460.tif 000105