(57)【要約】  対象において抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増進させる方法であって、それを必要とする対象に治療的に効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体ならびに抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現する効果的な量のＴリンパ球および／またはＮＫ細胞を投与することを含み、ＡＣＴＲコンストラクトが、免疫グロブリン分子（Ｉｇ）のＦｃ部分に親和性を有し、それに特異的な細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；適宜、共刺激ドメイン、および免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインの１つまたは複数を含んでもよい、方法が本明細書に開示される。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象において抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増進させる方法であって、それを必要とする対象に治療的に効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体および効果的な量の免疫細胞を投与することを含み、前記免疫細胞が、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞であり、前記ＡＣＴＲコンストラクトが、
（ａ）Ｆｃ結合ドメイン；
（ｂ）膜貫通ドメイン；および
（ｃ）免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメイン
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、
（ｄ）少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン
をさらに含み、
（ｃ）または（ｄ）のいずれかが、前記ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置し、（ｃ）が、前記ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置してもよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＣＴＲが、（ａ）のＣ末端および（ｂ）のＮ末端に位置する（ｅ）ヒンジドメインをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
（ａ）の前記Ｆｃ結合ドメインが、
（ｉ）Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体であってもよいＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、
（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体断片、
（ｉｉｉ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する天然に存在するタンパク質、またはそのＦｃ結合断片、および
（ｉｖ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチド
からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｆｃ結合ドメインが、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、またはＣＤ６４Ａ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである（ｉ）であり、ＣＤ１６Ａの前記細胞外リガンド結合ドメインがＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８またはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８であってもよい、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｆｃ結合ドメインが、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディである（ｉｉ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｆｃ結合ドメインが、プロテインＡまたはプロテインＧである（ｉｉｉ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｆｃ結合ドメインが、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンである（ｉｖ）である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
（ｂ）の前記膜貫通ドメインが、１回膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＰＤ１、およびＦＧＦＲ２Ｂからなる群から選択される膜タンパク質の膜貫通ドメインである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（ｂ）の前記膜貫通ドメインが、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
（ｄ）の前記少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、およびＣＤ２からなる群から選択される共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインである、請求項２から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、単一の共刺激シグナル伝達ドメインまたは２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項２から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、
（ｉ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ；
（ｉｉ）ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢ；
（ｉｉｉ）ＣＤ２８およびＣＤ２７；
（ｉｖ）ＣＤ２８およびＯＸ４０
からのものである２つの共刺激ドメインを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）の前記細胞質シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインである、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
（ｅ）の前記ヒンジドメインが、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＩｇＧのヒンジドメインである、請求項３から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（ｅ）の前記ヒンジドメインが、天然に存在しないペプチドである、請求項３から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｅ）の前記ヒンジドメインが、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎポリペプチド（ｎは、３以上１２以下の整数である）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、そのＮ末端においてシグナルペプチドをさらに含む、請求項１から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナルペプチドが、ＣＤ８αのシグナルペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒンジドメインが、１〜６０個のアミノ酸残基の長さであり、前記ヒンジドメインが、１〜３０個のアミノ酸残基の長さまたは３１〜６０個のアミノ酸残基の長さであってもよい、請求項３から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、（ｉ）４−１ＢＢまたはＣＤ２８の単一の共刺激ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ８もしくはＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ８もしくはＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む、請求項３から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、（ｉ）４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ８のヒンジドメイン、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、（ｉ）ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、いかなる非ＣＤ１６Ａ受容体からのヒンジドメインも含まず、前記ＡＣＴＲコンストラクトが、いかなるヒンジドメインも含まないものであってもよい、請求項１、２、および４から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含んでもよい、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、配列番号１〜６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が、ＢＣＭＡ陽性がんを有するヒト患者である、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＢＣＭＡ陽性がんが、血液がんであり、前記血液がんが、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫であってもよい、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、Ｂ細胞媒介性障害を有するヒト患者であり、前記Ｂ細胞媒介性障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性胆管炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、結核、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）からなる群から選択されてもよい、請求項１から２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が、前記対象から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞である、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が、同種Ｔリンパ球または同種ＮＫ細胞である、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象への投与の前に、前記Ｔリンパ球またはＮＫ細胞がエクスビボで活性化および／または増殖され、前記エクスビボでの活性化および／または増殖が、免疫調節剤の存在下で行われ、前記免疫調節剤が、好ましくはレナリドミドである、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｔリンパ球が、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻害または除去されたＴリンパ球である、請求項３１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡＣＴＲコンストラクトが、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーション、およびＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法により前記Ｔリンパ球または前記ＮＫ細胞中に導入される、請求項１から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＣＴＲコンストラクトを発現する前記Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が、免疫調節剤と共に投与され、前記免疫調節剤が、好ましくはレナリドミドである、請求項１から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、Ｆｃ変異体断片を含有し、前記Ｆｃ変異体断片が、野生型Ｆｃ受容体に対して上昇した結合親和性を有する、請求項１から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｆｃ変異体断片が、非フコシル化されており、かつ／または前記Ｆｃ断片のヒンジおよび／またはＣＨ２ドメイン中に１つもしくは複数の突然変異を含有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じＢＣＭＡ中のエピトープに結合するか、またはＢＣＭＡへの結合について抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と競合する、請求項１から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含む、請求項１から４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
（ｉ）請求項３７から４３において定義される抗ＢＣＭＡ抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物；ならびに
（ｉｉ）請求項１から３５において定義される抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団
を含む、免疫療法用キット。
【請求項４５】
免疫調節剤をさらに含み、前記免疫調節剤が、好ましくはレナリドミドである、請求項４４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月１７日に出願された米国仮出願第６２／４６０，６６９号の出願日の利益を主張し、その内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
細胞ベースの療法、抗体療法およびサイトカイン療法などのがん免疫療法は、正常組織を残しながら異常細胞（腫瘍細胞など）を攻撃する免疫応答を惹起するために使用される。それは、薬物耐性の遺伝学的および細胞機序を回避し、正常組織を残しながら腫瘍細胞を標的化するその潜在能力のため、様々な種類のがんを治療するための有望な選択肢である。Ｔリンパ球は、血液悪性腫瘍に関する同種造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）の結果により実証される通り、大きな抗腫瘍効果を発揮することができ、この場合、Ｔ細胞媒介性の移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）は疾患の再発と逆に相関し、免疫抑制の中止またはドナーリンパ球の注入が再発を抑えることができる。Weiden et al., NEnglJ Med. 1979;300(19):1068-1073; Porter et al., NEnglJ Med. 1994;330(2):100-106; Kolb et al., Blood. 1995;86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204;およびAppelbaum, Nature. 2001;411(6835):385-389。それはまた、自己免疫障害および炎症性障害などのＢ細胞および血漿細胞媒介性の疾患のための有望な治療である。
【０００３】
細胞ベースの療法は、がん細胞、Ｂ細胞、および血漿細胞に対して偏った反応性を有する細胞傷害性Ｔ細胞を伴うことがある。Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993;90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003;9(3):279-286; Cooper et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644;およびImai et al., Leukemia. 2004;18:676-684。１つのアプローチは、１つまたは複数のＴ細胞活性化シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを有するキメラ受容体を発現させることである。抗原結合ドメインを介するがん、Ｂ細胞、または血漿細胞抗原の結合は、Ｔ細胞活性化を結果としてもたらし、細胞傷害性を誘発する。キメラ受容体発現自己Ｔリンパ球の注入を用いる臨床試験の最近の結果は、それらの臨床的潜在能力の有力な証拠を提供した。Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al., Blood. 2012;119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720;およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138。
【０００４】
別のアプローチは、ＮＫ細胞またはＴ細胞などの免疫細胞において抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）タンパク質を発現させることである。ＡＣＴＲタンパク質は細胞外Ｆｃ結合ドメインを含有する。ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞（「ＡＣＴＲ  Ｔ細胞」とも呼ばれる）が、特定の種類の細胞、例えばがん細胞を標的化する抗体と共に対象に投与された時に、それらは、抗体のＦｃドメインへの結合を介して抗体により標的化される標的化細胞に対して毒性を増進させ得る。Kudo et al., Cancer Research (2014) 74:93-103。
【０００５】
モノクローナル抗体、抗体融合タンパク質、および抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）などの抗体ベースの免疫療法は、多くの種類のがん、Ｂ細胞媒介性障害、および血漿細胞媒介性障害などの多様な疾患を治療するために使用される。そのような療法は、正常細胞（例えば、非がん細胞）と比べて除去が所望される細胞（例えば、がん細胞などの標的細胞）上に差次的に発現される細胞表面分子の認識に依存し得る。抗体ベースの免疫療法の標的細胞への結合は、様々な機序、例えば、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、または抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）からのペイロードの直接的な細胞傷害性活性を介して標的細胞の死に至る可能性がある。
【発明の概要】
【０００６】
本開示は、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）を発現する免疫細胞およびＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に特異的な抗体の併用を含む、対象において抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増進させる方法の開発に少なくとも部分的に基づく。抗ＢＣＭＡ抗体と組み合わせた本明細書に記載される改良されたＡＣＴＲコンストラクトを発現するＴ細胞は、細胞傷害性、細胞増殖および活性化（例えば、ＩＬ−２産生、ＣＤ２５＋および／またはＣＤ６９＋細胞のパーセンテージ）、および／またはインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）抗がん活性（例えば、多発性骨髄腫細胞活性などの抗ＢＣＭＡ陽性標的細胞）などの優れたインビボおよびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）生物活性を実証した。
【０００７】
したがって、本開示の一態様は、対象において抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増進させる方法であって、それを必要とする対象に治療的に効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体および効果的な量の免疫細胞を投与することを含み、免疫細胞が、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞であり得る、方法を提供する。
【０００８】
ＡＣＴＲコンストラクトは、（ａ）Ｆｃ結合ドメイン；（ｂ）膜貫通ドメイン；（ｃ）免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインおよび適宜（ｄ）少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）または少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン（ｄ）のいずれかは、ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置することができる。一部の例では、細胞質シグナル伝達ドメインは、ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置することができる。
【０００９】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、（ｅ）ヒンジドメインをさらに含んでもよく、（ｅ）ヒンジドメインは、（ａ）のＣ末端および（ｂ）のＮ末端に位置することができる。あるいはまたは加えて、ＡＣＴＲコンストラクトは、ＣＤ８αからのものであってもよいシグナルペプチドをそのＮ末端にさらに含んでもよい。
【００１０】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクト中のＦｃ結合ドメイン（ａ）は、（ｉ）Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、もしくはＦｃイプシロン受容体であってもよいＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、（ｉｉ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する抗体断片、（ｉｉｉ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する天然に存在するタンパク質、もしくそのＦｃ結合断片、または（ｉｖ）免疫グロブリンのＦｃ部分に結合する合成ポリペプチドであり得る。一部の例では、Ｆｃ結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ３２Ａ、またはＣＤ６４Ａ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。ある特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａの細胞外リガンド結合ドメインは、ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８（別名Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３Ａ）またはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８（別名Ｖ１５８  ＦＣＧＲ３Ａ）である。他の例では、Ｆｃ結合ドメインは、単鎖可変断片（ＳｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディである（ｉｉ）である。さらに他の例では、Ｆｃ結合ドメインは、プロテインＡまたはプロテインＧである（ｉｉｉ）である。あるいは、Ｆｃ結合ドメインは、Ｋｕｎｉｔｚペプチド、ＳＭＩＰ、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンである（ｉｖ）である。
【００１１】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクト中の膜貫通ドメイン（ｂ）は、１回膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインであり得る。例えば、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６Ａ、ＯＸ４０、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＰＤ１、またはＦＧＦＲ２Ｂの膜貫通ドメインである。あるいは、（ｂ）の膜貫通ドメインは、天然に存在しない疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【００１２】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲ中の少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン（ｄ）は、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１、またはＣＤ２の共刺激シグナル伝達ドメインであり得る。一部の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、単一の共刺激シグナル伝達ドメイン（ＡＣＴＲコンストラクト中の唯一の共刺激シグナル伝達ドメインとして）または２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。例示的な共刺激シグナル伝達ドメインの組合せとしては、（ｉ）ＣＤ２８および４−１ＢＢ；（ｉｉ）ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢ；（ｉｉｉ）ＣＤ２８およびＣＤ２７；または（ｉｖ）ＣＤ２８およびＯＸ４０が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１３】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクト中の細胞質シグナル伝達ドメイン（ｃ）は、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質ドメインであり得る。
【００１４】
一部の実施形態では、ヒンジドメイン（ｅ）は、ＣＤ８α、ＣＤ２８、またはＩｇＧのヒンジドメインであり得る。あるいは、ヒンジドメインは、天然に存在しないペプチド、例えば、延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎポリペプチド（ｎは、３以上１２以下の整数である）であり得る。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、１〜６０個のアミノ酸残基の長さ、例えば、１〜３０個のアミノ酸残基の長さまたは３１〜６０個のアミノ酸残基の長さである。
【００１５】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、（ｉ）４−１ＢＢまたはＣＤ２８の単一の共刺激ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ８もしくはＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ８もしくはＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、（ｉ）４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ８のヒンジドメイン、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む。ある特定の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、（ｉ）ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、および（ｉｉ）ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せを含む。特定の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、いかなる非ＣＤ１６Ａ受容体からのヒンジドメインも含まない。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、いかなるヒンジドメインも含まない。ある特定の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインおよび適宜ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。
【００１６】
一部の特定の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、（ａ）Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡまたはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａの細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、（ｃ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびに適宜（ｄ）４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを含み、（ｃ）または（ｄ）のいずれかは、ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置する。例えば、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号１の残基２２〜４３６、または配列番号３１の残基２２〜４３６のアミノ酸配列を含んでもよい。１つの特定の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号１または配列番号３１のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
一部の特定の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、（ａ）Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡまたはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａの細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ２８のヒンジおよび膜貫通ドメイン、（ｃ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびに適宜（ｄ）ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、（ｃ）または（ｄ）のいずれかは、ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置する。例えば、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号５７の残基２２〜４３２のアミノ酸配列を含んでもよい。１つの特定の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
追加の特定の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、（ａ）Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡまたはＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａの細胞外リガンド結合ドメイン、（ｂ）ＣＤ８αの膜貫通ドメイン、（ｃ）ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、および適宜（ｄ）ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含み、（ｃ）または（ｄ）のいずれかは、ＡＣＴＲコンストラクトのＣ末端に位置する。例えば、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号５８の残基２２〜３９０のアミノ酸配列を含んでもよい。１つの特定の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本明細書に記載される任意の方法では、治療される対象は、ＢＣＭＡ陽性がんを有するヒト患者である。本明細書において使用される場合、「ＢＣＭＡ陽性がん」という用語は、ＴＮＦＲＳＦ１７としても公知のＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）を発現するがん細胞を有するがんを指す。一部の実施形態では、ＢＣＭＡ陽性がんは、骨髄腫、白血病、またはリンパ腫が挙げられるがこれらに限定されない血液がんである。一部の実施形態では、対象は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性胆管炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、結核、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が挙げられるがこれらに限定されないＢ細胞媒介性障害または血漿細胞媒介性障害を有するヒト患者である。
【００２０】
本明細書に記載される任意の方法において使用するためのＴリンパ球またはＮＫ細胞は、対象から単離された自己Ｔリンパ球または自己ＮＫ細胞であり得る。あるいは、本明細書に記載される任意の方法において使用するためのＴリンパ球またはＮＫ細胞は、同種Ｔリンパ球または同種ＮＫ細胞であり得る。一部の実施形態では、自己Ｔリンパ球、自己ＮＫ細胞、同種Ｔリンパ球、または同種ＮＫ細胞は、対象への投与の前にエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で活性化および／または増殖され得る。ある特定の実施形態では、エクスビボでの活性化および／または増殖は、免疫調節剤（例えば、レナリドミド）の存在下で行われてもよい。
【００２１】
一部の例では、同種Ｔリンパ球は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻害または除去されたＴリンパ球である。
【００２２】
本明細書に記載される任意の方法では、ＡＣＴＲコンストラクトは、レトロウイルス形質導入、レンチウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーション、およびＲＮＡエレクトロポレーションからなる群から選択される方法によりＴリンパ球またはＮＫ細胞中に導入され得る。
【００２３】
本明細書に記載される任意の方法では、ＡＣＴＲコンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞は、免疫調節剤（例えば、レナリドミド）と共に投与され得る。
【００２４】
本明細書に記載される任意の方法では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＩｇＧ１重鎖定常領域を含んでもよいヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。本明細書に記載される任意の方法では、抗ＢＣＭＡ抗体はキメラ抗体であり得る。ある特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、野生型Ｆｃ受容体に対して上昇した結合親和性を有する（例えば、リツキシマブまたはトラスツズマブ中に見出されるものなどの野生型ＩｇＧと比較した場合）Ｆｃ変異体断片を含有してもよい。ある特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体のヒンジおよび／またはＣＨ２ドメイン中に１つまたは複数の突然変異を有してもよい。あるいはまたは加えて、抗ＢＣＭＡ抗体は、糖鎖が改変されていてもよい（例えば、非フコシル化されていてもよい）。
【００２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意の方法において使用される抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じＢＣＭＡ中のエピトープに結合するか、またはＢＣＭＡへの結合について抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と競合する。一部の例では、抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じ重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）および軽鎖ＣＤＲを含む。例えば、抗ＢＣＭＡ抗体は、抗体ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じ重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および同じ軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含んでもよい。
【００２６】
別の態様では、（ｉ）本明細書において定義される任意の抗ＢＣＭＡ抗体、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物；ならびに（ｉｉ）本明細書において定義される抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団を含む、免疫療法用キットが本明細書において提供される。一部の実施形態では、キットは、免疫調節剤（例えば、レナリドミド）をさらに含んでもよい。
【００２７】
ＡＣＴＲコンストラクトを発現する任意の免疫細胞と並行して本明細書に記載される任意の標的疾患の治療において使用するための任意の抗ＢＣＭＡ抗体を含む医薬組成物；ならびに標的疾患の治療において使用するための医薬の製造における抗ＢＣＭＡ抗体および免疫細胞の使用もまた本開示の範囲内である。
【００２８】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は以下の説明に記載される。本開示の他の特徴または利点は、いくつかの実施形態の詳細な説明、そしてまた添付の特許請求の範囲から明らかとなると予想される。
【００２９】
以下の図面は、本明細書の部分を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含めたものであり、これらの態様は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の１つまたは複数を参照することにより、より良好に理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＳＧ１６．１７抗ＢＣＭＡ抗体を使用してフローサイトメトリーにより決定された異なる腫瘍細胞試料におけるＢＣＭＡの量を示すグラフのセットである。測定値を幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）として示す。Ａ：多発性骨髄腫細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６Ｂ１、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１Ｓ、ＯＰＭ２）およびＫ５６２対照細胞。Ｂ：細胞株ＫＭＳ−２０、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１細胞ならびに多発性骨髄腫（ＭＭ）患者由来骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）の２つの試料。
【図２】図２は、フローサイトメトリーによる配列番号１のＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞へのキメラ（Ａ）およびヒト化（Ｂ）型の抗ＢＣＭＡ  ＳＧ１６．１７およびＳＧ１６．１７ＳＥＡ（非フコシル化）抗体の結合曲線を示すグラフのセットである。抗Ｆｃ検出抗体からのＰＥシグナルの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を、増加させた濃度の各抗ＢＣＭＡ抗体について示す。
【図３】図３は、抗ＢＣＭＡキメラＳＧ１６．１７、キメラＳＧ１６．４５、キメラＳＧ１６．１７ＳＥＡ（非フコシル化）、およびキメラＳＧ１６．４５ＳＥＡ（非フコシル化）抗体と組み合わせて配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞により誘導されたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）およびＵ２６６Ｂ１（Ｂ）標的細胞の抗体特異的細胞傷害性を示すグラフのセットである。
【図４】図４は、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞ならびに抗ＢＣＭＡキメラＳＧ１６．１７、キメラＳＧ１６．４５、キメラＳＧ１６．１７ＳＥＡ（非フコシル化）、およびキメラＳＧ１６．４５ＳＥＡ（非フコシル化）抗体と共にインキュベートされた配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ−２（Ｂ）の産生を実証するグラフのセットである。
【図５】図５は、抗ＢＣＭＡキメラＳＧ１６．１７、ヒト化ＳＧ１６．１７  ＃１、ヒト化ＳＧ１６．１７  ＃９、ヒト化ＳＧ１６．１７  ＃１０、キメラＳＧ１６．４５、ヒト化ＳＧ１６．４５  ＃１、ヒト化ＳＧ１６．４５  ＃３、およびヒト化ＳＧ１６．４５  ＃１８抗体と組み合わせて配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞と共にインキュベートされたＢＣＭＡ発現標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞）の抗体特異的細胞傷害性を示すグラフのセットである。Ａ：抗ＢＣＭＡキメラＳＧ１６．１７、ヒト化ＳＧ１６．１７  ＃１、ヒト化ＳＧ１６．１７  ＃９、およびヒト化ＳＧ１６．１７  ＃１０抗体を使用した結果。Ｂ：抗ＢＣＭＡキメラＳＧ１６．４５、ヒト化ＳＧ１６．４５  ＃１、ヒト化ＳＧ１６．４５  ＃３、およびヒト化ＳＧ１６．４５  ＃１８抗体を使用した結果。
【図６】図６は、抗ＢＣＭＡヒト化ＳＧ１６．１７抗体、ヒト化ＳＧ１６．１７ＳＥＡ（非フコシル化）抗体、およびＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２に示されるＮＣＩマウスＢＣＭＡ  ＣＡＲ配列に由来する抗体と組み合わせて配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞と共にインキュベートされたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）およびＵ２６６Ｂ１（Ｂ）標的細胞の抗体特異的細胞傷害性を示すグラフのセットである。
【図７】図７は、ＢＣＭＡを発現する細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６Ｂ１、ＲＰＭＩ８２２６、ＯＰＭ２、ＭＭ１ｓ）およびＢＣＭＡを発現しない細胞株（Ｋ５６２）についての様々な濃度の非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）によるＪｕｒｋａｔ細胞活性化を評価する実験の結果を実証するグラフのセットである。Ａ：ＡＣＴＲを発現するレトロウイルスを用いて形質導入したＮＦＡＴレポーターシステムを有するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ）（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ−ＡＣＴＲ）からの結果。Ｂ：陰性対照として使用した、ＮＦＡＴレポーターシステムを有するがＡＣＴＲ発現を欠くＪｕｒｋａｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ）からの結果。
【図８】図８は、非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）と組み合わせて配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞またはＭｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートされたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）およびＵ２６６Ｂ１（Ｂ）標的細胞の抗体特異的細胞傷害性を示すグラフのセットである。
【図９】図９は、ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞）および非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）と共にインキュベートされた配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＦＮγおよびＩＬ２の産生を実証するグラフである。
【図１０】図１０は、配列番号１のＡＣＴＲ  Ｔ変異体細胞を、非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）の存在下でＢＣＭＡ発現ＭＭ標的細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）；Ｕ２６６Ｂ１（Ｃ）、およびＲＰＭＩ−８２２６（Ｄ）と共にインキュベートした時の１日目および７日目のＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖レベルを実証する一連のグラフを含む。ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞を対照Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートした時（Ｂ）にＣＤ３＋Ｔ細胞のレベルの増殖は見られなかった。
【図１１】図１１は、非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）の存在下でＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞を用いて繰り返し刺激（３〜４日毎）した後の配列番号１のＡＣＴＲ変異体を使用したＣＤ３陽性細胞の増殖のレベルを実証するグラフであり、同じ条件下、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞の存在下でＴ細胞増殖は観察されなかった。ＮＣＩ−Ｈ９２９またはＫ５６２標的細胞を非フコシル化ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）の存在下で対照Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートした時にＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖は見られなかった。
【図１２】図１２は、ＮＳＧマウスにおける多発性骨髄腫の皮下ＮＣＩ−Ｈ９２９モデルにおける腫瘍成長および腫瘍体積エンドポイントまでの時間を実証するグラフのセットである。処置群は以下の通りであった：媒体（ＰＢＳ単独）、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体単独、配列番号１のＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞単独、およびｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体と組み合わせた配列番号１のＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞。ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体で処置した群には４週にわたり週に１回マウス当たり１００μｇの抗体を投与し（ＱＷｘ４、点線の鉛直の線により表される）；ＡＣＴＲ  Ｔ細胞で処置した群には２週にわたり週に１回マウス当たり１×１０７個の細胞を投与した（ＱＷｘ２、灰色の矢印により表される）。Ａ：平均腫瘍体積を異なる処置アームのマウスについて時間の関数としてプロットした。Ｂ：試験において残っているマウスのパーセンテージを異なる処置アームのマウスの予め定義された腫瘍体積エンドポイントまでの時間の関数としてプロットした。
【図１３】図１３は、異なるエフェクターＴ細胞対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞またはＭｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートされたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）およびＵ２６６Ｂ１（Ｂ）標的細胞の細胞傷害性を示すグラフのセットである。これらは、１μｇ／ｍＬの様々なキメラ抗ＢＣＭＡ抗体またはアイソタイプ対照抗体の存在下で行う。
【図１４】図１４は、１μｇ／ｍＬの様々なキメラ抗ＢＣＭＡ抗体、またはアイソタイプ対照抗体の存在下でＢＣＭＡ陽性標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１）と共培養した後の配列番号１のＡＣＴＲ変異体のＣＤ３陽性細胞上のＣＤ２５（Ａ）およびＣＤ６９（Ｂ）活性化マーカーのレベルを実証するグラフのセットである。
【図１５】図１５は、（Ａ）ＢＣＭＡ＋ＨＥＲ２−  ＮＣＩ−Ｈ９２９または（Ｂ）ＢＣＭＡ−  ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３標的細胞および増加させた濃度の抗ＢＣＭＡ（ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ）または抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）抗体の存在下でのｍｏｃｋ  Ｔ細胞および配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＦＮγの産生を示すグラフのセットである。マッチした抗体／標的ペアと組み合わせたＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いてのみロバストなサイトカイン産生が観察され；マッチしない抗体／標的ペアの存在下でｍｏｃｋ  Ｔ細胞またはＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いた場合、低いサイトカイン産生が観察されたか、またはサイトカイン産生は観察されなかった。
【図１６】図１６は、（Ａ）配列番号５７のＡＣＴＲ変異体または（Ｂ）配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞により誘導されたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞の細胞傷害性を示すグラフのセットである。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞をこの実験において対照として含めた。ＡＣＴＲ−Ｔ細胞媒介性細胞傷害性はｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下でのみ観察され、エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比の増加と共に増加した。
【図１７】図１７は、ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体およびＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞の非存在下および存在下での（Ａ）配列番号５７のＡＣＴＲ変異体および（Ｂ）配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞の、ＣＤ２５発現により測定した活性化を示すグラフのセットである。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞をこの実験において対照として含めた。活性化マーカーＣＤ２５の発現は、ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞およびｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下で配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞の表面上で増加したが、抗体の非存在下では増加しなかった。ｍｏｃｋ  Ｔ細胞上のＣＤ２５の増加は抗体のありおよびなしのいずれでも観察されない。
【図１８】図１８は、配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞により誘導されたＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９（Ａ）標的細胞およびＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２（Ｂ）標的細胞の抗体特異的細胞傷害性を示すグラフのセットである。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞をこの実験において陰性対照として含めた。ＢＣＭＡ発現標的細胞を用いてのみ、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞により媒介される細胞傷害性が濃度依存的な様式でｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下で観察された。
【図１９】図１９は、ＢＣＭＡ発現標的細胞（ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞）および様々な濃度の抗ＢＣＭＡ抗体ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体と共にインキュベートされた配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞によるＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ２（Ｂ）サイトカイン産生を実証するグラフのセットである。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞をこの実験において陰性対照として含めた。配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞はＩＦＮγおよびＩＬ２産生の濃度依存的な増加を示し、ｍｏｃｋ  Ｔ細胞は検出可能なサイトカイン産生を示さなかった。
【図２０】図２０は、Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞または配列番号５７のＡＣＴＲ変異体細胞のいずれかを様々な濃度の抗ＢＣＭＡ抗体ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下でＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞と共にインキュベートした時の７日目のＣＤ３陽性Ｔ細胞の増殖レベルを実証するグラフである。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖は抗体の存在下でのみ観察され、ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞を対照Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートした時にはＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖は見られなかった。
【図２１】図２１は、（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ９２９および（Ｂ）ＲＰＭＩ−８２２６標的細胞を用いたレナリドミドの存在下および非存在下での配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞の増殖を示すグラフのセットである。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞をこの実験において対照として使用した。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞をｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下で培養した時にのみ増殖が観察され、増殖は１μＭのレナリドミドの存在下で増進された。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
抗体ベースの免疫療法は、多くの種類のがんなどの多様な疾患を治療するために使用される。そのような療法は、多くの場合、正常細胞（例えば、非がん細胞）と比べて除去が所望される細胞（例えば、がん細胞などの標的細胞）上に差次的に発現される細胞表面分子の認識に依存する［Weiner et al. Cell (2012) 148(6): 1081-1084］。いくつかの抗体ベースの免疫療法は、標的細胞（例えば、がん細胞）の抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性を促進することがインビトロで示されており、一部について、これはインビボでの作用機序でもあると一般に考えられている。ＡＤＣＣは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、単球細胞、マクロファージ、または好酸球などの免疫系のエフェクター細胞が、特異的抗体により認識される標的細胞（例えば、がん細胞）を活発に溶解させる細胞媒介性の自然免疫機構である。
【００３２】
本開示は、抗ＢＣＭＡ抗体およびＡＣＴＲ  Ｔ細胞の併用によりＢＣＭＡ陽性がん細胞における細胞死の増進に成功したという予想外の発見に少なくとも部分的に基づく。これらの発見は、ＢＣＭＡは抗体／ＡＣＴＲ−Ｔ細胞併用療法の好適な標的であることを指し示す。
【００３３】
したがって、本開示は、治療的に効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体および本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを発現する治療的に効果的な量の免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫリンパ球）を含む併用療法を使用する対象において抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増進させる方法、ならびに抗ＢＣＭＡ抗体および本明細書に記載されるＡＣＴＲ発現免疫細胞を含む免疫療法用キットを提供する。方法またはキットのＴリンパ球および／またはＮＫ細胞は、トランスで共刺激シグナルを提供する、共刺激ドメインまたは共刺激因子のリガンドを含む外因性ポリペプチドをさらに発現してもよい。あるいは、外因性ポリペプチドは、チェックポイント受容体またはその機能ドメインを含んでもよい。
【００３４】
本明細書において使用される場合、ＡＣＴＲコンストラクトは、宿主細胞の表面上に発現され得る天然に存在しない分子であって、ＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞のエフェクター機能を誘発するためにＦｃ部分および１つまたは複数の細胞質シグナル伝達ドメインを含有する標的分子に結合することができる細胞外ドメインを含み、ＡＣＴＲコンストラクトの少なくとも２つのドメインが異なる分子に由来してもよい、分子を指す。
【００３５】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、Ｂ細胞上、特に成熟Ｂ細胞上に発現される組織壊死因子受容体（ｔｉｓｓｕｅ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーである。ＢＣＭＡはＴＮＦＲスーパーファミリーの増殖誘導リガンドに結合し、ＮＦκＢおよびＭＡＰＫ８／ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化に繋がる。ＢＣＭＡは、Ｂ細胞発生および自己免疫応答において重要な役割を果たすことが示唆される。一例として、ヒトＢＣＭＡタンパク質は、受託番号ＢＡＢ６０８９５（配列番号７１として以下に示す）の下でＧｅｎＢａｎｋにおいて提供された。
【００３６】
抗ＢＣＭＡ抗体は、標的細胞（例えば、ＢＣＭＡ陽性がん細胞、Ｂ細胞、および血漿細胞）の表面上に発現されるＢＣＭＡタンパク質に結合することができる。そのようなＦｃ含有分子、例えば本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクト分子に結合することができる受容体を発現する免疫細胞は、標的細胞結合抗ＢＣＭＡ抗体を認識し、この受容体／抗体の結合は、免疫細胞を刺激して、細胞傷害性顆粒の放出または細胞死誘導分子の発現などのエフェクター機能を発揮し、それによりＢＣＭＡ発現標的細胞の増進された細胞傷害性がもたらされる。
【００３７】
本明細書に記載される方法はいくつかの利点を付与する。例えば、Ｆｃに結合する細胞外ドメインを介して、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、特定の標的抗原（例えば、がん抗原）に直接的に結合するのではなく抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ部分に結合することができる。したがって、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞は、抗ＢＣＭＡ抗体が結合した任意の種類のＢＣＭＡ陽性細胞の細胞死を誘導／増進させることができる。
【００３８】
Ｉ．ＡＣＴＲコンストラクト
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、免疫グロブリンのＦｃ部分に対して結合親和性および特異性を有する細胞外ドメイン（「Ｆｃ結合因子」または「Ｆｃ結合ドメイン」）、膜貫通ドメイン、および免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含んでもよい。ＡＣＴＲコンストラクトは、宿主細胞上に発現された時に、標的分子（例えば、抗ＢＣＭＡ抗体）およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインへの結合のために細胞外リガンド結合ドメインが細胞外に位置するように構成される。適宜の共刺激シグナル伝達ドメインは、活性化および／またはエフェクターシグナル伝達を誘発するために細胞質中に位置してもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｆｃ結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメイン、および少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【００３９】
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトは、ヒンジドメインをさらに含んでもよく、ヒンジドメインは、Ｆｃ結合ドメインのＣ末端および膜貫通ドメインのＮ末端に位置してもよい。あるいはまたは加えて、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、２つまたはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメインを含有してもよく、これらの共刺激シグナル伝達ドメインは、互いに連結していてもよく、またはＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインにより分離されていてもよい。ＡＣＴＲコンストラクト中の細胞外Ｆｃ結合因子、膜貫通ドメイン、適宜の共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、互いに直接的に連結していてもよく、またはペプチドリンカーを介して連結していてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトは、Ｎ末端においてシグナル配列を含んでもよい。
【００４０】
一部の例示的なＡＣＴＲコンストラクトはＷＯ２０１６０４０４４１に提供されており、文献中の関連する開示は、参照により本明細書で参照した目的および主題のために組み込まれる。
【００４１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の指示対象を含む。
【００４２】
Ａ．Ｆｃ結合ドメイン
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、Ｆｃ結合ドメインである、すなわち、好適な哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、またはサル）の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＥ）のＦｃ部分に結合することができる、細胞外ドメインを含む。好適なＦｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体またはある特定の細菌タンパク質（例えば、プロテインＡ、プロテインＧ）などの天然に存在するタンパク質に由来してもよい。さらに、Ｆｃ結合ドメインは、本明細書に記載される任意の抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ部分に高い親和性および特異性で結合するように特異的に操作された合成ポリペプチドであってもよい。例えば、そのようなＦｃ結合ドメインは、免疫グロブリンのＦｃ部分に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であり得る。例としては、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ドメイン抗体、またはナノボディが挙げられるがこれらに限定されない。あるいは、Ｆｃ結合ドメインは、Ｆｃへの結合活性についてペプチドコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定され得る、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、小モジュラー免疫医薬（ＳＭＩＰ）、アドネクチン、アビマー、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎ、またはアンチカリンなどのＦｃ部分に特異的に結合する合成ペプチドであり得る。
【００４３】
一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、哺乳動物Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインである。本明細書において使用される場合、「Ｆｃ受容体」は、多くの免疫細胞［Ｂ細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好中球、肥満細胞、および好酸球など］の表面上に発現され、抗体のＦｃドメインへの結合特異性を呈する細胞表面結合受容体である。Ｆｃ受容体は、典型的に、抗体のＦｃ（結晶化可能断片）部分への結合特異性を有する少なくとも２つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含む。一部の例では、抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体の結合は、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）効果を誘発してもよい。本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを構築するために使用されるＦｃ受容体は、天然に存在する多型変異体（例えば、ＣＤ１６  Ｖ１５８変異体）であってもよく、多型変異体は、野生型対応物（例えば、ＣＤ１６  Ｆ１５８）と比較してＦｃへの増加または減少した親和性を有してもよい。あるいは、Ｆｃ受容体は、Ｉｇ分子のＦｃ部分への結合親和性を変化させる１つまたは複数の突然変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の突然変異など、最大１０個のアミノ酸残基の置換）を有する野生型対応物の機能的変異体であってもよい。一部の例では、突然変異は、Ｆｃ受容体のグリコシル化パターン、およびしたがってＦｃへの結合親和性を変化させるものであってもよい。
【００４４】
以下の表は、本明細書に記載される任意の方法またはコンストラクトにおいて使用され得るＦｃ受容体細胞外ドメインにおけるいくつかの例示的な多型を列記する（例えば、Kim et al., J. Mol. Evol. 53:1-9, 2001を参照）。
【００４５】
【表１】
2020507604.tif 000003
【００４６】
Ｆｃ受容体は、それが結合できる抗体のアイソタイプに基づいて分類される。例えば、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）は一般にＩｇＧ抗体、例えばその１つまたは複数のサブタイプ（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）に結合し、Ｆｃアルファ受容体（ＦｃαＲ）は一般にＩｇＡ抗体に結合し、Ｆｃイプシロン受容体（ＦｃεＲ）は一般にＩｇＥ抗体に結合する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体である。Ｆｃガンマ受容体の例としては、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、およびＣＤ１６Ｂが挙げられるがこれらに限定されない。Ｆｃアルファ受容体の例はＦｃαＲ１／ＣＤ８９である。Ｆｃイプシロン受容体の例としては、ＦｃεＲＩおよびＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３が挙げられるがこれらに限定されない。以下の表は、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトの構築において使用するための例示的なＦｃ受容体および対応するＦｃドメインへのそれらの結合活性を列記する。
【００４７】
【表２】
2020507604.tif 000004
【００４８】
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するためのＦｃ受容体のリガンド結合ドメインの選択は当業者に明らかと予想される。例えば、それは、Ｆｃ受容体の結合が所望される抗ＢＣＭＡ抗体のアイソタイプおよび結合相互作用の所望の親和性などの要因に依存し得る。
【００４９】
一部の例では、（ａ）は、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインであり、それは、Ｆｃに対する親和性をモジュレートし得る天然に存在する多型を組み込んでいてもよい。一部の例では、（ａ）は、位置１５８において多型（例えば、バリンまたはフェニルアラニン）を組み込んだＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の実施形態では、（ａ）は、そのグリコシル化状態およびＦｃに対するその親和性を変化させる条件下で製造される。
【００５０】
一部の実施形態では、（ａ）は、ＡＣＴＲコンストラクトをＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的なものとする改変を組み込んだＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる突然変異を組み込んでもよい。
【００５１】
一部の例では、（ａ）は、Ｆｃに対する親和性をモジュレートし得る天然に存在する多型を組み込んでいてもよいＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の実施形態では、（ａ）は、そのグリコシル化状態およびＦｃに対するその親和性を変化させる条件下で製造される。
【００５２】
一部の実施形態では、（ａ）は、ＡＣＴＲコンストラクトをＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的なものとする改変を組み込んだＣＤ３２の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる突然変異を組み込んでもよい。
【００５３】
一部の例では、（ａ）は、Ｆｃに対する親和性をモジュレートし得る天然に存在する多型を組み込んでいてもよいＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインである。一部の実施形態では、（ａ）は、そのグリコシル化状態およびＦｃに対するその親和性を変化させる条件下で製造される。
【００５４】
一部の実施形態では、（ａ）は、ＡＣＴＲコンストラクトをＩｇＧ抗体のサブセットに対して特異的なものとする改変を組み込んだＣＤ６４の細胞外リガンド結合ドメインである。例えば、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１）に対する親和性を増加または減少させる突然変異を組み込んでもよい。
【００５５】
他の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に結合することができる天然に存在する細菌タンパク質に由来する。本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトの構築において使用するためのＦｃ結合ドメインは、全長タンパク質またはその機能的断片であり得る。プロテインＡは、元々は細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁中に見出された４２ｋＤａの表面タンパク質である。それは、それぞれが３ヘリックスバンドルにフォールディングし、ほとんどの抗体のＦｃ領域の他にヒトＶＨ３ファミリー抗体のＦａｂ領域との相互作用を通じてＩｇＧに結合することができる５つのドメインから構成される。プロテインＧは、哺乳動物ＩｇＧのＦａｂおよびＦｃ領域の両方に結合するＣ群およびＧ群連鎖球菌において発現される約６０ｋＤａのタンパク質である。天然のプロテインＧはアルブミンにも結合するが、組換え変異体は、アルブミン結合性を取り除くように操作されている。
【００５６】
ＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するためのＦｃ結合ドメインはまた、コンビナトリアルバイオロジーまたは定方向進化法を使用してデノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）で作出されてもよい。タンパク質スキャフォールド（例えば、ＩｇＧに由来するｓｃＦｖ、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼ阻害剤に由来するＫｕｎｉｔｚドメイン、アンキリンリピート、プロテインＡのＺドメイン、リポカリン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、ＦｙｎのＳＨ３ドメイン、または他のもの）から開始して、変異体スキャフォールドの大きいライブラリーを作出するために表面上の残基のセットについてアミノ酸側鎖をランダムに置換してもよい。大きいライブラリーから、最初に結合について選択した後、ファージ、リボソームまたは細胞ディスプレイによる増幅を行うことにより、Ｆｃドメインのような標的に対して親和性を有する希少な変異体を単離することができる。選択および増幅の繰返しのラウンドを使用して標的に対して最も高い親和性を有するタンパク質を単離することができる。Ｆｃ結合ペプチドは、例えば、DeLano et al., Science, 287:5456 (2000); Jeong et al., Peptides, 31(2):202-206 (2009);およびKrook et al., J. Immunological Methods, 221(1-2):151-157 (1998)など、当技術分野において公知である。例示的なＦｃ結合ペプチドは、ＥＴＱＲＣＴＷＨＭＧＥＬＶＷＣＥＲＥＨＮ（配列番号８５）、ＫＥＡＳＣＳＹＷＬＧＥＬＶＷＣＶＡＧＶＥ（配列番号８６）、またはＤＣＡＷＨＬＧＥＬＶＷＣＴ（配列番号８７）のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００５７】
本明細書に記載される任意のＦｃ結合ドメインは、治療的抗体のＦｃ部分に対して好適な結合親和性を有してもよい。本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫＡを指す。ＫＡは解離定数ＫＤの逆数である。本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトのＦｃ受容体ドメインの細胞外リガンド結合ドメインは、抗体のＦｃ部分に対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍまたはより低い結合親和性ＫＤを有してもよい。一部の実施形態では、Ｆｃ結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプまたはそのサブタイプへのＦｃ結合ドメインの結合親和性と比較して、抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対して高い結合親和性を有する。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、別の抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプへのＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの結合と比較して抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに対して特異性を有する。高親和性結合を有するＦｃガンマ受容体としては、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、およびＣＤ６４Ｃが挙げられる。低親和性結合を有するＦｃガンマ受容体としては、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ１６Ａ、およびＣＤ１６Ｂが挙げられる。高親和性結合を有するＦｃイプシロン受容体としてはＦｃεＲＩであり、低親和性結合を有するＦｃイプシロン受容体としてはＦｃεＲＩＩ／ＣＤ２３である。
【００５８】
Ｆｃ受容体またはＦｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン）を含むＡＣＴＲコンストラクトに対する結合親和性または結合特異性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法などの様々な方法により決定することができる。
【００５９】
一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、天然に存在するＦｃガンマ受容体、Ｆｃアルファ受容体、またはＦｃイプシロン受容体の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列に少なくとも９０％（例えば、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一のアミノ酸配列を含む。２つのアミノ酸配列の「同一性パーセント」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993において改良されたKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定することができる。そのようなアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索をＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて行って、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されるようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトのパラメーターを使用することができる。
【００６０】
本明細書に記載されるものなどのＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの変異体もまた本開示の範囲内である。一部の実施形態では、変異体細胞外リガンド結合ドメインは、参照細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と比べて最大１０個のアミノ酸残基のバリエーション（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）を含んでもよい。一部の実施形態では、変異体は、１つまたは複数の遺伝子多型に起因する天然に存在する変異体であり得る。他の実施形態では、変異体は、天然に存在しない改変された分子であり得る。例えば、突然変異は、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン中に導入されて、そのグリコシル化パターンおよびしたがって対応するＦｃドメインへのその結合親和性を変化させてもよい。
【００６１】
一部の例では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃ、または本明細書に記載されるその変異体であり得る。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインは、本明細書に記載されるＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、ＣＤ６４Ｃの細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸配列と比べて最大１０個のアミノ酸残基のバリエーション（例えば、１、２、３、４、５、８、９、または１０個）を含んでもよい。１つまたは複数のアミノ酸バリエーションを含むそのようなＦｃドメインは、変異体と称されることがある。Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まないＦｃ受容体ドメインと比べて抗体、抗体のアイソタイプ、またはそのサブタイプに結合するＦｃ受容体ドメインの結合親和性の増加を結果としてもたらし得る。例えば、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８の突然変異は、抗体のＦｃ部分へのＦｃ受容体の結合親和性の増加を結果としてもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異は、Ｆｃガンマ受容体ＣＤ１６Ａの残基１５８におけるフェニルアラニンのバリンへの置換であり、これはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体と称される。
【００６２】
ヒトＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８およびＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体のアミノ酸配列を以下に提供し、Ｆ１５８およびＶ１５８残基を太字体および下線で強調している（シグナルペプチドをイタリック体としている）：
ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８（配列番号７０）：
【化１】
2020507604.tif 000005
ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８（配列番号７２）：
【化２】
2020507604.tif 000006
【００６３】
抗体などの分子のＦｃ部分への結合親和性を増進または低減させ得るＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン中で為され得る代替的なまたは追加の突然変異は、当業者に明らかと予想される。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体、ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８変異体、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ、ＣＤ３２Ｃ、ＣＤ６４Ａ、ＣＤ６４Ｂ、またはＣＤ６４Ｃである。
【００６４】
Ｂ．膜貫通ドメイン
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトの膜貫通ドメインは、当技術分野において公知の任意の形態であり得る。本明細書において使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜中で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造を指す。本明細書において使用されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するために適合する膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得られたものであってもよい。あるいは、それは、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメント、例えば、細胞膜中で熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【００６５】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの三次元構造に基づいて分類される。例えば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、１つより多くのアルファヘリックスの複合体、ベータバレル、または細胞のリン脂質二重層を貫通することができる任意の他の安定な構造を形成してもよい。さらには、膜貫通ドメインはまた、またはあるいは、膜貫通ドメインが膜を貫通する回数およびタンパク質の方向などの膜貫通ドメインのトポロジーに基づいて分類されることがある。例えば、１回膜貫通タンパク質は細胞膜を１回貫通し、複数回貫通膜タンパク質は細胞膜を少なくとも２回（例えば、２、３、４、５、６、７またはより多くの回数）貫通する。
【００６６】
膜タンパク質は、細胞の内側および外側と比べたそれらの末端および膜貫通セグメントのトポロジーに応じてＩ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型として定義されることがある。Ｉ型膜タンパク質は単一の膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向している。ＩＩ型膜タンパク質もまた単一の膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、タンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向している。ＩＩＩ型膜タンパク質は複数の膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数ならびにＮおよびＣ末端の位置に基づいてさらに分類されることがある。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトの膜貫通ドメインは、Ｉ型１回膜貫通タンパク質に由来する。１回膜貫通タンパク質としては、ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲζ、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ６４、ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ９、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＰＤ１、およびＦＧＦＲ２Ｂが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、以下：ＣＤ８α、ＣＤ８β、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２８、ＣＤ３４、ＣＤ４、ＦｃεＲＩγ、ＣＤ１６、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＴＣＲα、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＶＥＧＦＲ２、ＦＡＳ、ＰＤ１、およびＦＧＦＲ２Ｂから選択される膜タンパク質に由来する。一部の例では、膜貫通ドメインはＣＤ８αの膜貫通ドメインである。一部の例では、膜貫通ドメインは４−１ＢＢ／ＣＤ１３７の膜貫通ドメインである。他の例では、膜貫通ドメインはＣＤ２８またはＣＤ３４の膜貫通ドメインである。さらに他の例では、膜貫通ドメインはヒトＣＤ８αに由来しない。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトの膜貫通ドメインは１回貫通アルファヘリックスである。
【００６８】
複数回貫通膜タンパク質からの膜貫通ドメインもまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するために適合し得る。複数回貫通膜タンパク質は、複合（少なくとも２、３、４、５、６、７またはより多く）アルファヘリックスまたはベータシート構造を含んでもよい。好ましくは、複数回貫通膜タンパク質のＮ末端およびＣ末端は、脂質二重層の反対側に存在し、例えば、タンパク質のＮ末端は脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は細胞外側に存在する。複数回貫通膜タンパク質からの１つまたは複数のヘリックスの貫通は、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを構築するために使用することができる。
【００６９】
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するための膜貫通ドメインはまた、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメントの少なくとも一部分を含むことができる。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないアルファヘリックスまたはベータシートである。一部の実施形態では、タンパク質セグメントは、少なくとも約２０アミノ酸、例えば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはより多くのアミノ酸である。合成の膜貫通ドメインの例は、例えば、米国特許第７，０５２，９０６号明細書およびＰＣＴ国際公開ＷＯ２０００／０３２７７６Ａ２（これらの関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる）において当技術分野において公知である。
【００７０】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列はシステイン残基を含まない。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は１つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２つのシステイン残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインのアミノ酸配列は２つより多くのシステイン残基（例えば、３、４、５、またはより多く）を含む。
【００７１】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインのＣ末端側に位置する膜貫通領域および細胞質領域を含んでもよい。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つまたはそれより多くのアミノ酸を含んでもよく、一部の実施形態では、脂質二重層中に膜貫通ドメインを配向させるのを助ける。一部の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基が、膜貫通ドメインの膜貫通領域中に存在する。一部の実施形態では、１つまたは複数のシステイン残基が、膜貫通ドメインの細胞質領域中に存在する。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正に荷電したアミノ酸を含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸アルギニン、セリン、およびリシンを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインの膜貫通領域は疎水性アミノ酸残基を含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は、主に疎水性のアミノ酸残基、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンを含む。一部の実施形態では、膜貫通領域は疎水性である。一部の実施形態では、膜貫通領域はポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。
【００７３】
タンパク質またはタンパク質セグメントのハイドロパシー、または疎水性もしくは親水性の特徴は、当技術分野において公知の任意の方法、例えば、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅのハイドロパシー解析により評価することができる。
【００７４】
Ｃ．共刺激シグナル伝達ドメイン
多くの免疫細胞は、細胞増殖、分化および生存を促進させる他に、細胞のエフェクター機能を活性化させるために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて共刺激を必要とする。一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書において使用される場合、「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内でシグナル伝達を媒介してエフェクター機能などの免疫応答を誘導する共刺激シグナル伝達タンパク質の少なくとも断片を指す。当技術分野において公知のように、Ｔ細胞などの免疫細胞の活性化は、多くの場合、２つのシグナルを必要とする：（１）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と抗原提示細胞により提示される抗原ペプチド／ＭＨＣ複合体の結合により誘発される抗原特異的シグナルであって、これは典型的に、ＴＣＲ複合体の成分としてＣＤ３ζにより推進される；および（ｉｉ）共刺激受容体とそのリガンドとの相互作用により誘発される共刺激シグナル。共刺激受容体は、ＴＣＲ誘発性シグナル伝達への追加として共刺激シグナルを伝え、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞により媒介される応答をモジュレートする。共刺激シグナル伝達ドメインを含有するかまたはそのようなシグナル伝達ドメインを含まない本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトは、トランスで共刺激シグナルを提供する共刺激ドメインまたは共刺激因子のリガンドを含む１つまたは複数の別々のポリペプチドと免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞またはＴ細胞）中で共発現されてもよい。あるいは、ＡＣＴＲは、免疫チェックポイントシグナルを提供する別々のポリペプチドと免疫細胞中で共発現されてもよい。
【００７５】
宿主細胞（例えば、免疫細胞）中での共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、サイトカインの産生および分泌、貪食特性、増殖、分化、生存、ならびに／または細胞傷害性を増加または減少させるように細胞を誘導してもよい。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトまたは本明細書に記載される免疫細胞中での共発現のための１つもしくは複数の別々のポリペプチドにおいて使用するために適合するものであってもよい。共刺激シグナル伝達ドメインの種類は、ＡＣＴＲコンストラクトが発現される免疫細胞の種類（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）および所望の免疫エフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）などの要因に基づいて選択される。ＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するためまたは免疫細胞中での発現のための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得、共刺激タンパク質としては、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバー（例えば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、およびＰＤＣＤ６）；ＴＮＦスーパーファミリーのメンバー（例えば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦ−アルファ、およびＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）；ＳＬＡＭファミリーのメンバー（例えば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）；および任意の他の共刺激分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−��／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、およびＮＫＧ２Ｃが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、ＬＦＡ１（ＣＤ１１ａ）またはＣＤ２の共刺激シグナル伝達ドメイン、またはその任意の変異体である。
【００７６】
共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答をモジュレートすることができるような、本明細書に記載される任意の共刺激シグナル伝達ドメインの変異体もまた本開示の範囲内である。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、野生型対応物と比較して最大１０個のアミノ酸残基のバリエーション（例えば、１、２、３、４、５、または８個）を含む。１つまたは複数のアミノ酸バリエーションを含むそのような共刺激シグナル伝達ドメインは、変異体と称されることがある。
【００７７】
共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べてシグナル伝達の増加および免疫応答の刺激の増進を結果としてもたらし得る。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の突然変異は、突然変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べてシグナル伝達の減少および免疫応答の刺激の低減を結果としてもたらし得る。例えば、天然ＣＤ２８アミノ酸配列の残基１８６および１８７の突然変異は、共刺激活性およびＡＣＴＲコンストラクトの共刺激ドメインによる免疫応答の誘導の増加を結果としてもたらし得る。一部の実施形態では、突然変異は、ＣＤ２８の共刺激ドメインの位置１８６および１８７のそれぞれにおけるリシンのグリシン残基による置換であり、これはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体と称される。ドメインの共刺激活性を増進または低減させ得る共刺激シグナル伝達ドメインにおいて為され得る追加の突然変異は、当業者に明らかと予想される。一部の実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＯＸ４０、またはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体の共刺激シグナル伝達ドメインである。
【００７８】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、１つより多くの共刺激シグナル伝達ドメイン（例えば、２、３、またはより多く）を含んでもよい。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、２つまたはそれより多くの同じ共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、２コピーのＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは、異なる共刺激タンパク質からの２つまたはそれより多くの共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に記載される任意の２つまたはそれより多くの共刺激タンパク質を含む。共刺激シグナル伝達ドメインの種類の選択は、ＡＣＴＲコンストラクトと共に使用される宿主細胞の種類（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）および所望の免疫エフェクター機能などの要因に基づいてもよい。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトは２つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８および４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢである。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８およびＣＤ２７である。一部の実施形態では、２つの共刺激シグナル伝達ドメインはＣＤ２８およびＯＸ−４０である。共刺激ドメインは任意の順序で存在してもよい。例えば、２つの共刺激ドメインは、（５’から３’へ）：ＣＤ２８および４−１ＢＢ；ＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体および４−１ＢＢ；ＣＤ２８およびＣＤ２７；またはＣＤ２８およびＯＸ−４０の順序で存在してもよい。別の例として、２つの共刺激ドメインは、（５’から３’へ）：４−１ＢＢおよびＣＤ２８；４−１ＢＢおよびＣＤ２８ＬＬ→ＧＧ変異体；ＣＤ２７およびＣＤ２８；またはＯＸ−４０およびＣＤ２８の順序で存在してもよい。
【００７９】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、単一の共刺激シグナル伝達ドメイン（ＡＣＴＲコンストラクト中の唯一の共刺激シグナル伝達ドメインとして）、例えば、４−１ＢＢまたはＣＤ２８からの共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。一部の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、１コピーのみの単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含有してもよい。他の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、２コピーの同じ共刺激シグナル伝達ドメイン、例えば、２コピーのＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含有してもよい。
【００８０】
Ｄ．免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞質シグナル伝達ドメイン
免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む任意の細胞質シグナル伝達ドメインを使用して本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを作出することができる。「ＩＴＡＭ」は、本明細書において使用される場合、多くの免疫細胞中で発現されるシグナル伝達分子のテイル部分に一般に存在する保存されたタンパク質モチーフである。モチーフは、６〜８アミノ酸により分離されたアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの２つのリピート（各ｘは独立して任意のアミノ酸である）を含んで、保存されたモチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６〜８）ＹｘｘＬ／Ｉを生じてもよい。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは細胞内のシグナル伝達にとって重要であり、シグナル伝達は、少なくとも部分的には、シグナル伝達分子の活性化後のＩＴＡＭ中のチロシン残基のリン酸化により媒介される。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位として機能することがある。一部の例では、ＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζまたはＦｃεＲ１γの細胞質シグナル伝達ドメインである。他の例では、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインはヒトＣＤ３ζに由来しない。さらに他の例では、ＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインは、同じＡＣＴＲコンストラクトの細胞外リガンド結合ドメインがＣＤ１６Ａに由来する場合、Ｆｃ受容体に由来しない。
【００８１】
一つの特定の実施形態では、いくつかのシグナル伝達ドメインを追加的または相乗的な効果のために融合させることができる。有用な追加のシグナル伝達ドメインの非限定的な例としては、１つまたは複数のＴＣＲゼータ鎖およびＦｃεＲＩγの部分または全てが挙げられる。
【００８２】
Ｅ．ヒンジドメイン
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジドメインをさらに含む。ヒンジドメインは、一般にタンパク質の２つのドメインの間に見出され、タンパク質の柔軟性および１つまたは両方のドメインの互いに対する運動を可能とし得るアミノ酸セグメントである。そのような柔軟性およびＡＣＴＲコンストラクトの膜貫通ドメインに対するＦｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインの運動を提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
【００８３】
ヒンジドメインは、約１０〜１００アミノ酸、例えば、１５〜７５アミノ酸、２０〜５０アミノ酸、または３０〜６０アミノ酸を含有してもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸の長さであってもよい。
【００８４】
「約」または「おおよそ」という用語は、当業者により決定される特定の値について許容される誤差の範囲内であることを意味し、誤差の範囲は、部分的に、値がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」は、当技術分野における実施に従って、許容される標準偏差内であることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、さらにより好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内であることを意味し得る。特定の値が本出願および請求項において記載される場合、別段の言及がなければ、「約」という用語が含意され、この文脈において、特定の値について許容される誤差の範囲内であることを意味する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインである。ヒンジドメインを含むことが当技術分野において公知の任意のタンパク質のヒンジドメインは、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するために適合する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、天然に存在するタンパク質のヒンジドメインの少なくとも一部分であり、ＡＣＴＲコンストラクトに柔軟性を付与する。一部の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ８αのヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８αのヒンジドメインの一部分、例えば、ＣＤ８αのヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）個の連続するアミノ酸を含有する断片である。一部の実施形態では、ヒンジドメインはＣＤ２８のヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ２８のヒンジドメインの一部分、例えば、ＣＤ２８のヒンジドメインの少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、３５、または４０）個の連続するアミノ酸を含有する断片である。
【００８５】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジドメインはまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するために適合する。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体の定常ドメインＣＨ１およびＣＨ２を連結するヒンジドメインである。一部の実施形態では、ヒンジドメインは抗体のヒンジドメインであり、抗体のヒンジドメインおよび抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインおよび抗体のＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、抗体のヒンジドメインならびに抗体のＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体である。一部の実施形態では、抗体はＩｇＧ抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体である。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３定常領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【００８６】
天然に存在しないペプチドもまた、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトのためのヒンジドメインとして使用されてもよい。一部の実施形態では、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジドメインは、ペプチドリンカー、例えば（ＧｌｙｘＳｅｒ）ｎリンカーであり、ｘおよびｎは、独立して、３〜１２の整数、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはより多くであり得る。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号７６）であり、ｎは、３〜６０の整数、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０であり得る。ある特定の実施形態では、ｎは、６０より大きい整数であり得る。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号７７）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６（配列番号７８）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）９（配列番号７９）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１２（配列番号８０）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１５（配列番号８１）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３０（配列番号８２）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４５（配列番号８３）である。一部の実施形態では、ヒンジドメインは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）６０（配列番号８４）である。
【００８７】
他の実施形態では、ヒンジドメインは、様々な長さ（例えば、１０〜８０アミノ酸残基）の親水性残基からなる非構造ポリペプチドである延長組換えポリペプチド（ＸＴＥＮ）である。ＸＴＥＮペプチドのアミノ酸配列は当業者に明らかであり、例えば、米国特許第８，６７３，８６０号明細書（その関連する開示は参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、６０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、３０アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、４５アミノ酸を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ＸＴＥＮペプチドであり、１５アミノ酸を含む。
【００８８】
Ｆ．シグナルペプチド
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトはまた、ポリペプチドのＮ末端においてシグナルペプチド（シグナル配列としても公知）を含む。一般に、シグナル配列は、細胞中の所望の部位にポリペプチドを標的化するペプチド配列である。一部の実施形態では、シグナル配列は、ＡＣＴＲコンストラクトを細胞の分泌経路に標的化し、脂質二重層中へのＡＣＴＲコンストラクトの組込みおよび固着を可能とする。本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトにおいて使用するために適合する天然に存在するタンパク質のシグナル配列または合成の、天然に存在しないシグナル配列などのシグナル配列は、当業者に明らかと予想される。一部の実施形態では、シグナル配列はＣＤ８αから。一部の実施形態では、シグナル配列はＣＤ２８のシグナル配列である。他の実施形態では、シグナル配列はマウスカッパー鎖のシグナル配列である。さらに他の実施形態では、シグナル配列はＣＤ１６のシグナル配列である。
【００８９】
Ｇ．ＡＣＴＲコンストラクトの例
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドのある特定の例は、例えば、ＣＤ１６ＡのＦｃ結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８変異体またはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体）、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを有してもよい。そのようなＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、またはそれらの組合せをさらに含んでもよい。一部の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ８αからのものであってもよいシグナル配列をさらに含んでもよい。１つの特定の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ順番に、ＣＤ８αのシグナル配列、ＣＤ１６ＡのＦｃ結合ドメイン、ＣＤ２８のヒンジドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば配列番号５７を含む。
【００９０】
本明細書に記載されるＡＣＴＲポリペプチドの他の例は、いかなる非ＣＤ１６Ａ受容体からのヒンジドメインも含まないものであってもよい（例えば、ヒンジドメインを有しないものであってもよい）。そのようなＡＣＴＲポリペプチドは、例えば、ＣＤ１６ＡのＦｃ結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８変異体またはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体）、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを有するが、ヒンジドメインを有しないものであってもよい。一部の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、追加的にＣＤ８の膜貫通ドメインを含んでもよい。一部の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、ＣＤ８αからのものであってもよいシグナル配列をさらに含んでもよい。１つの特定の例では、ＡＣＴＲポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ順番に、ＣＤ８αのシグナル配列、ＣＤ１６ＡのＦｃ結合ドメイン、ＣＤ８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば配列番号５８を含む。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、ＣＤ１６Ａ  Ｆ１５８変異体またはＣＤ１６Ａ  Ｖ１５８変異体）、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に開示されるＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζおよびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζの１つまたは複数を含んでもよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、ＣＤ１６の細胞外リガンド結合ドメイン（ＣＤ１６ＦまたはＣＤ１６Ｖ、Ｆ１５８  ＦＣＧＲ３ＡおよびＶ１５８  ＦＣＧＲ３Ａ変異体としても公知）、ＣＤ８αのヒンジおよび膜貫通ドメイン、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、例えば、本明細書に開示されるＣＤ１６Ｆ−ＢＢ−ζおよびＣＤ１６Ｖ−ＢＢ−ζ、例えば、配列番号１または配列番号３１を含んでもよい。
【００９２】
表３は、本明細書に記載される例示的なＡＣＴＲコンストラクトを提供する。これらの例示的なコンストラクトは、Ｎ末端からＣ末端へ順番に、シグナル配列、Ｆｃ結合ドメイン（例えば、Ｆｃ受容体の細胞外ドメイン）、ヒンジドメイン、および膜貫通ドメインを有し、適宜の共刺激ドメインおよび細胞質シグナル伝達ドメインの位置は入れ替えることができる。一部の実施形態では、ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号１〜６３のいずれか１つを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＡＣＴＲポリペプチドは、配列番号１〜６３のいずれか１つからなるものであってもよい。ＷＯ２０１５０５８０１８Ａ１、ＵＳ２０１５０１３９９４３Ａ１、およびＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１５９９９（これらのそれぞれは、参照により本明細書で参照した目的および主題のために本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【００９３】
【表３−１】
2020507604.tif 000007
【表３−２】
2020507604.tif 000008
【表３−３】
2020507604.tif 000009
【００９４】
例示的なＡＣＴＲコンストラクトのアミノ酸配列を以下に提供する（シグナル配列をイタリック体としている）。
配列番号１：
【化３】
2020507604.tif 000010
配列番号２：
【化４】
2020507604.tif 000011
配列番号３：
【化５】
2020507604.tif 000012
配列番号４：
【化６】
2020507604.tif 000013
配列番号５：
【化７】
2020507604.tif 000014
配列番号６：
【化８】
2020507604.tif 000015
配列番号７：
【化９】
2020507604.tif 000016
配列番号８：
【化１０】
2020507604.tif 000017
配列番号９：
【化１１】
2020507604.tif 000018
配列番号１０：
【化１２】
2020507604.tif 000019
配列番号１１：
【化１３】
2020507604.tif 000020
配列番号１２：
【化１４】
2020507604.tif 000021
配列番号１３：
【化１５】
2020507604.tif 000022
配列番号１４：
【化１６】
2020507604.tif 000023
配列番号１５：
【化１７】
2020507604.tif 000024
配列番号１６：
【化１８】
2020507604.tif 000025
配列番号１７：
【化１９】
2020507604.tif 000026
配列番号１８：
【化２０】
2020507604.tif 000027
配列番号１９：
【化２１】
2020507604.tif 000028
配列番号２０：
【化２２】
2020507604.tif 000029
配列番号２１：
【化２３】
2020507604.tif 000030
配列番号２２：
【化２４】
2020507604.tif 000031
配列番号２３：
【化２５】
2020507604.tif 000032
配列番号２４：
【化２６】
2020507604.tif 000033
配列番号２５：
【化２７】
2020507604.tif 000034
配列番号２６：
【化２８】
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配列番号２７：
【化２９】
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配列番号２８：
【化３０】
2020507604.tif 000037
配列番号２９：
【化３１】
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配列番号３０：
【化３２】
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配列番号３１：
【化３３】
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配列番号３２：
【化３４】
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配列番号３３：
【化３５】
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配列番号３４：
【化３６】
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配列番号３５：
【化３７】
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配列番号３６：
【化３８】
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配列番号３７：
【化３９】
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配列番号３８：
【化４０】
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配列番号３９：
【化４１】
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配列番号４０：
【化４２】
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配列番号４１：
【化４３】
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配列番号４２：
【化４４】
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配列番号４３：
【化４５】
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配列番号４４：
【化４６】
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配列番号４５：
【化４７】
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配列番号４６：
【化４８】
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配列番号４７：
【化４９】
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配列番号４８：
【化５０】
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配列番号４９：
【化５１】
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配列番号５０：
【化５２】
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配列番号５１：
【化５３】
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配列番号５２：
【化５４】
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配列番号５３：
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配列番号５４：
【化５６】
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配列番号５５：
【化５７】
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配列番号５６：
【化５８】
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配列番号５７：
【化５９】
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配列番号５８：
【化６０】
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配列番号５９：
【化６１】
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配列番号６０：
【化６２】
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配列番号６１：
【化６３】
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配列番号６２：
【化６４】
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配列番号６３：
【化６５】
2020507604.tif 000072
【００９５】
一部の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、以下に列記する成分の１つまたは複数を含む。一部の例では、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、以下に列記する成分の全てを含むものではない。例えば、本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトは、以下の表４に列記される配列の１つまたは複数を含まないものであってもよい。
【００９６】
【表４】
2020507604.tif 000073
【００９７】
本明細書に開示される他のＡＣＴＲコンストラクトと同様に、Ｔ細胞およびＮＫ細胞などの免疫細胞中でのこれらの例示的なＡＣＴＲコンストラクトの発現は、これらの細胞にＡＤＣＣ能力を付与し、したがって、抗ＢＣＭＡ抗体の抗腫瘍潜在能力を有意に増大させる。
【００９８】
Ｈ．ＡＣＴＲコンストラクトを含む医薬組成物の調製
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトは、組換え技術などの常用の方法により調製することができる。本明細書におけるＡＣＴＲコンストラクトを調製する方法は、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインなどのＡＣＴＲコンストラクトのドメインのそれぞれを含むポリペプチドをコードする核酸の生成を伴う。核酸コンストラクトはまた、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含んでもよい。一部の実施形態では、核酸はまた、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間のヒンジドメインをコードする。ＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸はまた、シグナル配列をコードしてもよい。一部の実施形態では、核酸配列は、配列番号１〜６３により提供される例示的なＡＣＴＲコンストラクトのいずれか１つをコードする。
【００９９】
ＡＣＴＲコンストラクトの各成分の配列は、常用の技術、例えば、当技術分野において公知の様々な供給源のいずれか１つからのＰＣＲ増幅を介して得られ得る。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトの１つまたは複数の成分の配列は、ヒト細胞から得られる。あるいは、ＡＣＴＲコンストラクトの１つまたは複数の成分の配列は、合成することができる。ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を使用して、各成分（例えば、ドメイン）の配列を直接的または間接的に連結して（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用して）ＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸配列を形成させることができる。あるいは、ＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸を合成してもよい。一部の実施形態では、核酸はＤＮＡである。他の実施形態では、核酸はＲＮＡである。
【０１００】
ＩＩ．ＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞（ＡＣＴＲ発現細胞、例えば、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞）は、Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ抗体が結合したＢＣＭＡ陽性標的細胞を認識できる特定の細胞集団を提供する。一実施形態では、そのような宿主細胞上に発現されたＡＣＴＲコンストラクトの細胞外リガンド結合ドメインの抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ部分との結合は、ＡＣＴＲコンストラクトの適宜の共刺激シグナル伝達ドメインおよび／またはＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインに活性化シグナルを伝え、そしてそれが宿主細胞の細胞増殖および／またはエフェクター機能、例えば、宿主細胞により誘発されるＡＤＣＣ効果を活性化させる。別の実施形態では、そのような宿主細胞上に発現されたＡＣＴＲコンストラクトの細胞外Ｆｃ結合ドメインの抗ＢＣＭＡ抗体のＦｃ部分との結合は、そのような宿主細胞中で共発現されたＡＣＴＲコンストラクトのＩＴＡＭ含有細胞質シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくは複数の共刺激シグナル伝達ドメインに活性化シグナルを伝え、そしてそれが宿主細胞の細胞増殖および／またはエフェクター機能、例えば、宿主細胞により誘発されるＡＤＣＣ効果を活性化させる。共刺激シグナル伝達ドメインとＩＴＡＭを含む細胞質シグナル伝達ドメインとの組合せは、細胞内での複数のシグナル伝達経路のロバストな活性化を可能とし得る。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの免疫細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。他の実施形態では、免疫細胞は、確立された細胞株、例えばＮＫ−９２細胞であり得る。
【０１０１】
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトは、トランスで共刺激シグナルを提供するために本明細書に記載される１つまたは複数の別々のポリペプチドと免疫細胞中で共発現されてもよい。
【０１０２】
免疫細胞の集団は、任意の供給源、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、または組織、例えば、脾臓、リンパ節、胸腺、または腫瘍組織から得ることができる。所望の種類の宿主細胞を得るために好適な供給源は当業者に明らかと予想される。一部の実施形態では、免疫細胞の集団はＰＢＭＣに由来する。所望の種類の宿主細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞およびＮＫ細胞）は、細胞を刺激分子と共にインキュベートすることにより得られる細胞集団内で増殖させてもよい。非限定的な例として、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体をＴ細胞の増殖のために使用してもよい。
【０１０３】
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞を構築するために、ＡＣＴＲコンストラクトの安定または一過性発現のための発現ベクターを本明細書に記載される従来法を介して作出し、免疫宿主細胞中に導入してもよい。例えば、ＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸を、好適な発現ベクター、例えば、好適なプロモーターに作動可能に連結されたウイルスベクター中にクローニングしてもよい。核酸およびベクターを好適な条件下で制限酵素と接触させて、互いに対形成することができ、リガーゼを用いて連結できる各分子上の相補的な末端を作出してもよい。あるいは、合成核酸リンカーをＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸の末端にライゲートすることができる。合成のリンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有してもよい。発現ベクター／プラスミド／ウイルスベクターの選択は、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のための宿主細胞の種類に依存するが、真核細胞中での組込みおよび複製のために好適なものであるべきである。
【０１０４】
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトの発現のために様々なプロモーターを使用することができ、プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ウイルスＬＴＲ、例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、または単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。ＡＣＴＲコンストラクトの発現のための追加のプロモーターとしては、免疫細胞中で構成的に活性な任意のプロモーターが挙げられる。あるいは、その発現を免疫細胞内でモジュレートできるような任意の調節可能なプロモーターを使用してもよい。
【０１０５】
さらに、ベクターは、例えば、以下の一部または全てを含有してもよい：宿主細胞中の安定または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマウイルス複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、汎用性のマルチクローニングサイト；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター；誘発された時にベクターを有する細胞の死を引き起こす「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼまたはｉＣａｓｐ９などの誘導性カスパーゼ）、およびＡＣＴＲコンストラクトの発現を評価するためのレポーター遺伝子。
【０１０６】
一つの特定の実施形態では、そのようなベクターはまた、自殺遺伝子を含む。本明細書において使用される場合、「自殺遺伝子」という用語は、自殺遺伝子を発現する細胞の死を引き起こす遺伝子を指す。自殺遺伝子は、自殺遺伝子が発現される細胞に剤、例えば薬物への感受性を付与し、細胞を剤と接触させるかまたは剤に曝露した時に細胞の死を引き起こす遺伝子であり得る。自殺遺伝子は当技術分野において公知であり［例えば、Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004を参照］、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、シトシンダミナーゼ（ｃｙｔｏｓｉｎｅ  ｄａｍｉｎａｓｅ）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、ニトロレダクターゼ、およびカスパーゼ８などのカスパーゼが挙げられる。
【０１０７】
導入遺伝子を含有するベクターを製造するための好適なベクターおよび方法は周知であり、当技術分野において利用可能である。ＡＣＴＲコンストラクトの発現のためのベクターの調製の例は、例えば、ＵＳ２０１４／０１０６４４９（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
【０１０８】
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸配列を含む任意のベクターもまた本開示の範囲内である。そのようなベクター、またはそれに含有されるＡＣＴＲコンストラクトをコードする配列は、任意の好適な方法により宿主免疫細胞などの宿主細胞中にデリバリーされてもよい。ベクターを免疫細胞にデリバリーする方法は当技術分野において周知であり、ＤＮＡエレクトロポレーション、ＲＮＡエレクトロポレーション、リポソームなどの試薬を使用するトランスフェクション、またはウイルス形質導入を挙げることができる。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のためのベクターは、ウイルス形質導入により宿主細胞にデリバリーされる。デリバリーのための例示的なウイルス法としては、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；およびＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号明細書および同４，７７７，１２７号明細書；ＧＢ特許第２，２００，６５１号明細書；およびＥＰ特許第０  ３４５  ２４２号明細書を参照）、アルファウイルスベースのベクター、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４；およびＷＯ９５／００６５５を参照）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のためのベクターはレトロウイルスである。一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のためのベクターはレンチウイルスである。
【０１１０】
レトロウイルス形質導入を記載する参考文献の例としては、Anderson et al.、米国特許第５，３９９，３４６号明細書; Mann et al., Cell 33:153 (1983); Temin et al.、米国特許第４，６５０，７６４号明細書; Temin et al.、米国特許第４，９８０，２８９号明細書; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988); Temin et al.、米国特許第５，１２４，２６３号明細書; Dougherty et al.による１９９５年３月１６日に公開された国際特許出願公開ＷＯ９５／０７３５８;およびKuo et al., Blood 82:845 (1993)が挙げられる。国際特許出願公開ＷＯ９５／０７３５８には、初代Ｂリンパ球の高効率の形質導入が記載されている。ＷＯ２０１６０４０４４１Ａ１（参照により本明細書で参照した目的および主題のために本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１１１】
ＡＣＴＲコンストラクトをコードするベクターがウイルスベクターを使用して宿主細胞に導入される例では、免疫細胞に感染することができ、ベクターを有するウイルス粒子は、当技術分野において公知の任意の方法により製造されてもよく、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ１９９１／００２８０５Ａ２、ＷＯ１９９８／００９２７１Ａ１、および米国特許第６，１９４，１９１号明細書に見出すことができる。ウイルス粒子は、細胞培養上清から回収され、ウイルス粒子を免疫細胞と接触させる前に単離および／または精製されてもよい。
【０１１２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（例えば、インビトロ転写）により調製された後に好適な宿主細胞、例えば、本明細書に記載される宿主細胞中に公知の方法、例えば、Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035を介して導入されてもよい。
【０１１３】
本明細書において提供される任意のＡＣＴＲコンストラクトをコードするベクター、またはキメラベクターをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子）の宿主細胞への導入後、ＡＣＴＲコンストラクトの発現を可能とする条件下で細胞は培養される。ＡＣＴＲコンストラクトをコードする核酸が調節可能なプロモーターにより調節される例では、宿主細胞は、調節可能なプロモーターが活性化される条件下で培養される。一部の実施形態では、プロモーターは誘導性プロモーターであり、免疫細胞は、誘導性分子の存在下でまたは誘導性分子が産生される条件下で培養される。ＡＣＴＲコンストラクトが発現されているかどうかの判定は当業者に明らかであり、任意の公知の方法、例えば、定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によるＡＣＴＲコンストラクトコーディングｍＲＮＡの検出によりまたはウエスタンブロッティング、蛍光顕微鏡法、およびフローサイトメトリーなどの方法によるＡＣＴＲコンストラクトタンパク質の検出により評価されてもよい。あるいは、ＡＣＴＲコンストラクトの発現は、免疫細胞が対象に投与された後にインビボで起こってもよい。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「対象」という用語は任意の哺乳動物を指す。例えば、対象は霊長動物であってもよい。好ましい実施形態では、対象はヒトである。
【０１１５】
あるいは、本明細書に開示される任意の免疫細胞中でのＡＣＴＲコンストラクトの発現は、ＡＣＴＲコンストラクトをコードするＲＮＡ分子を導入することにより達成することができる。そのようなＲＮＡ分子は、インビトロ転写または化学合成により調製され得る。次いで、ＲＮＡ分子は、例えばエレクトロポレーションにより、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞およびＮＫ細胞の両方）などの好適な宿主細胞中に導入され得る。例えば、ＲＮＡ分子は、Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17:1027-1035およびＷＯ２０１３／０４０５５７に記載されている方法に従って合成され、宿主免疫細胞中に導入され得る。
【０１１６】
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞を調製する方法はまた、エクスビボで宿主細胞を活性化させることを含んでもよい。宿主細胞を活性化させることは、細胞がエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ）を行うことが可能であり得る活性化状態になるように宿主細胞を刺激することを意味する。宿主細胞を活性化させる方法は、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のために使用される宿主細胞の種類に依存する。例えば、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、ＩＬ−２、および／またはフィトヘモアグルチニン（ｐｈｙｔｏｈｅｍｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）が挙げられるがこれらに限定されない１つまたは複数の分子の存在下でエクスビボで活性化されてもよい。他の例では、ＮＫ細胞は、４−１ＢＢリガンド、抗４−１ＢＢ抗体、ＩＬ−１５、抗ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−２１、および／またはＫ５６２細胞などの１つまたは分子（複数）の存在下でエクスビボで活性化されてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞（ＡＣＴＲ発現細胞）は、対象への投与の前にエクスビボで活性化される。宿主細胞が活性化されているかどうかの判定は当業者に明らかであり、細胞活性化と関連付けられる１つまたは複数の細胞表面マーカーの発現、サイトカインの発現または分泌、および細胞形態を評価することを含んでもよい。
【０１１７】
本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞を調製する方法は、エクスビボで宿主細胞を増殖させることを含んでもよい。宿主細胞を増殖させることは、ＡＣＴＲコンストラクトを発現する細胞の数の増加を結果としてもたらす任意の方法を伴ってもよく、これは例えば、宿主細胞が増幅するのを可能とすることまたは宿主細胞が増幅するように刺激することを伴ってもよい。宿主細胞の増殖を刺激する方法は、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のために使用される宿主細胞の種類に依存し、当業者に明らかと予想される。一部の実施形態では、本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞は、対象への投与の前にエクスビボで増殖される。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞は、対象への細胞の投与の前にエクスビボで増殖および活性化される。宿主細胞の活性化および増殖を使用して、ゲノム中へのウイルスベクターの組込みおよび本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトをコードする遺伝子の発現を可能としてもよい。ｍＲＮＡエレクトロポレーションが使用される場合、活性化および／または増殖は必要とされないことがあるが、エレクトロポレーションは、活性化細胞に対して行われた時により効果的なことがある。一部の例では、ＡＣＴＲコンストラクトは、好適な宿主細胞中で一過性に発現される（例えば、３〜５日間）。一過性発現は、潜在的な毒性がある場合に有利なことがあり、起こり得る副作用についての臨床試験の初期段階において役立つはずである。
【０１１９】
ＡＣＴＲコンストラクトを発現する任意の宿主細胞を薬学的に許容される担体と混合して医薬組成物を形成させてもよく、これもまた本開示の範囲内である。
【０１２０】
本開示の組成物との関連において使用される「薬学的に許容される」という語句は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された時に生理学的に忍容性であり、有害な反応を通常生じさせない、組成物の分子実体および他の成分を指す。好ましくは、本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制機関により承認されていることまたは米国薬局方もしくは哺乳動物、より具体的にはヒトにおいて使用するための他の一般に認識される薬局方に列記されていることを意味する。「許容される」は、担体が組成物の活性成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療的抗体）と適合し、組成物が投与される対象に負の影響を与えないことを意味する。本発明の方法において使用される任意の医薬組成物は、凍結乾燥構成（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）または水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を含むことができる。
【０１２１】
緩衝剤などの薬学的に許容される担体は当技術分野において周知であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖；および他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含んでもよい。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
【０１２２】
本開示の医薬組成物はまた、治療されている特定の適応症のためおよび／またはＡＤＣＣの増進のための必要に応じて１つまたは複数の追加の活性化合物、好ましくは、互いに有害に影響しない補完的な活性を有する追加の活性化合物を含有してもよい。可能な追加の活性化合物の非限定的な例としては、例えば、ＩＬ２の他に、当技術分野において公知のおよび以下の併用治療の議論において列記される様々な剤が挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載される任意の病態に関する限り、本開示の文脈において、「治療する」、「治療」などの用語は、そのような状態に伴う少なくとも１つの症状を緩和もしくは軽減すること、またはそのような状態の進行を緩慢化もしくは後退させることを意味する。本開示内での意味において、「治療する」という用語はまた、発症（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）を防ぐ、遅延させる、および／または疾患を発症するかもしくは悪化させるリスクを低減させることを表す。例えば、がんとの関連での「治療する」という用語は、患者の腫瘍負荷を除去もしくは低減させるか、または転移を予防、遅延もしくは阻害することなどを意味し得る。
【０１２４】
ＩＩＩ．抗ＢＣＭＡ抗体
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーの細胞表面受容体である。それは、Ｂ細胞（成熟Ｂリンパ球中で高発現される）および血漿細胞中で発現され、ＢＡＦＦ（Ｂ細胞活性化因子）に特異的に結合してＮＦ−カッパＢおよびＭＡＰＫ８／ＪＮＫの活性化に繋がることが示されている。例えば、Bayles and Milcarek, Crit Rev Immunol. 2014;34(6):481-99; Coquery and Erickson, Crit Rev Immunol. 2012;32(4):287-305;およびRickert et al., Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):115-33を参照されたい。
【０１２５】
例示的な野生型ヒトＢＣＭＡの配列（受託番号ＢＡＢ６０８９５の下でＧｅｎＢａｎｋによっても提供される）を以下に提供する：
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAILWTCLGLSLIISLAVFVLMFLLRKISSEPLKDEFKNTGSGLLGMANIDLEKSRTGDEIILPRGLEYTVEECTCEDCIKSKPKVDSDHCFPLPAMEEGATILVTTKTNDYCKSLPAALSATEIEKSISAR（配列番号７１）
【０１２６】
（ｉ）抗ＢＣＭＡ抗体
本開示は、免疫療法（例えば、がん免疫療法）におけるＡＣＴＲ  Ｔ細胞および抗ＢＣＭＡ抗体の併用に関する。抗ＢＣＭＡ抗体は、ＢＣＭＡタンパク質、例えば、細胞表面上に発現されるＢＣＭＡタンパク質に結合することができる抗体を指す。
【０１２７】
抗体（複数形において交換可能に使用される）は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を通じて炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、インタクトな（すなわち、全長）ポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、Ｆｃ領域を含むその抗原結合断片、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、ナノボディ、線状抗体、多重特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、ならびに必要とされる特異性の抗原認識部位およびＦｃ領域を含む任意の他の改変された構成の免疫グロブリン分子、例えば、抗体のグリコシル化変異体、抗体のアミノ酸配列変異体、および共有結合により改変された抗体を包含する。抗体としては、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはこれらのサブクラス）などの任意のクラスの抗体が挙げられ、抗体は任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかがサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられ得る。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元配置は周知である。本開示において使用するための抗ＢＣＭＡ抗体は、併用されるＡＣＴＲ  Ｔ細胞により認識可能なＦｃ領域を含有する。Ｆｃ領域は、ヒトまたはヒト化Ｆｃ領域であってもよい。
【０１２８】
本明細書に記載される任意の抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は、異成分からなる抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源またはそれが調製される方法を限定しない。
【０１２９】
一例では、本明細書に記載される方法において使用される抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するそれらの抗原結合断片である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの部分について、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、このレシピエント抗体において、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられている。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒト残基により置き換えられている。さらには、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも取り入れられるＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに精密化および最適化するために含められる残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である、少なくとも１つ、典型的に２つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は最適にはまた、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部分を含む。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されるように改変されたＦｃ領域を有してもよい。ヒト化抗体の他の形態は、元々の抗体に関して変化した１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または６個）を有し、ＣＤＲは、元々の抗体からの１つまたは複数のＣＤＲ「に由来する」１つまたは複数のＣＤＲとも称される。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴ってもよい。
【０１３０】
別の例では、本明細書に記載される抗体はキメラ抗体であり、キメラ抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含むことができる。キメラ抗体は、第１の種からの可変領域または可変領域の部分および第２の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的に、これらのキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、１つの種の哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物）に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は、ヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体中の配列に相同的である。一部の実施形態では、アミノ酸の改変が可変領域および／または定常領域において為され得る。
【０１３１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、対応する標的抗原またはそのエピトープに特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当技術分野においてよく理解された用語である。分子は、代替的な標的よりも特定の標的抗原とより頻繁に、より迅速に、より長い期間でおよび／またはより大きい親和性で反応する場合に「特異的結合」を呈すると言われる。抗体は、他の物質に結合するよりもより大きい親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間で結合する場合に標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。例えば、抗原（ＢＣＭＡ）またはその中の抗原エピトープに特異的（または優先的）に結合する抗体は、他の抗原または同じ抗原中の他のエピトープに結合するよりもこの標的抗原により大きい親和性で、アビディティで、より容易に、および／またはより長い期間で結合する抗体である。この定義を用いる場合、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合してもよいし、結合しなくてもよいことも理解される。そのため、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（但し、排他的な結合を含み得る）。一部の例では、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他の抗原または同じ抗原中の他のエピトープに結合しなくてもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＢＣＭＡに特異的に結合する。
【０１３２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡ）またはその抗原エピトープに対して好適な結合親和性を有する。本明細書において使用される場合、「結合親和性」は、見かけの会合定数またはＫＡを指す。ＫＡは解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、標的抗原または抗原エピトープに対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０Ｍ、またはより低い結合親和性（ＫＤ）を有してもよい。結合親和性の増加はＫＤの減少に対応する。第２の抗原と比べて第１の抗原に対する抗体のより高親和性の結合は、第２の抗原への結合についてのＫＡ（または数値ＫＤ）よりも第１の抗原への結合についてのより高いＫＡ（またはより小さい数値ＫＤ）により指し示され得る。そのような場合、抗体は、第２の抗原（例えば、第２のコンホメーションにある同じ第１のタンパク質もしくはその模倣物；または第２のタンパク質）と比べて第１の抗原（例えば、第１のコンホメーションにある第１のタンパク質またはその模倣物）に対して特異性を有する。結合親和性の差異（例えば、特異性または他の比較について）は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３７．５倍、５０倍、７０倍、８０倍、９１倍、１００倍、５００倍、１０００倍、１０，０００倍または１０５倍であり得る。一部の実施形態では、任意の抗ＢＣＭＡ抗体は、標的抗原またはその抗原エピトープへの抗体の結合親和性を増加させるためにさらに親和性成熟されてもよい。
【０１３３】
結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例えば、蛍光アッセイを使用する）などの様々な方法により決定することができる。結合親和性を評価するための例示的な条件は、ＨＢＳ−Ｐ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）のＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）である。これらの技術を使用して、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質の濃度を測定することができる。結合した結合タンパク質の濃度（［結合］）は、一般に、以下の式により遊離の標的タンパク質の濃度（［遊離］）と関係する：
［結合］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
【０１３４】
ＫＡの正確な決定を行うことは必ずしも必要でなく、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定される、親和性の定量的尺度を得ることで時に充分であり、これはＫＡに比例し、したがって比較のために使用することができ、例えば、より高い親和性が例えば２倍高いかどうかの判定により、親和性の定性的尺度が得られるか、または例えば、例えばインビトロもしくはインビボアッセイといった機能アッセイにおける活性により、親和性の推定が得られる。
【０１３５】
本明細書に記載される免疫療法において使用するための抗ＢＣＭＡ抗体は、特定の領域またはその抗原エピトープに結合（例えば、特異的に結合）してもよい。
【０１３６】
本明細書に記載される方法と共に使用するための例示的な抗ＢＣＭＡ抗体としては、本明細書に記載される抗体の他に、他の公知の抗体が挙げられる。ある特定の例示的な抗ＢＣＭＡ抗体の配列を以下の表５に提供する（ＶＨおよびＶＬ配列においてＫａｂａｔのＣＤＲ配列に下線を引いている）。
【０１３７】
【表５−１】
2020507604.tif 000074
【表５−２】
2020507604.tif 000075
【表５−３】
2020507604.tif 000076
【０１３８】
本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、ラットＳＧ１６．１７またはラットＳＧ１６．４５抗体のヒト化またはキメラ抗体であってもよい。
【０１３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、ｈＳＧ１６．１７軽鎖（例えば、ＶＬまたはＶＫ２〜ＶＫ５のいずれか１つ）と対形成したｈＳＧ１６．１７ＶＨ（例えば、ＶＨ１〜ＶＨ６のいずれか）を含んでもよい。そのような組合せのいずれかはｈＳＧ１６．１７抗体である。他の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ｈＳＧ１６．４５軽鎖（例えば、ＶＫ１〜ＶＫ５のいずれか１つ）と対形成したｈＳＧ１６．４５重鎖（例えば、ＶＨ１〜ＶＨ６のいずれか１つ）を含んでもよい。そのような組合せのいずれかはｈＳＧ１６．４５抗体である。一部の例では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ｈＳＧ１６．４５のＶＨ５と同じ成熟重鎖可変領域およびｈＳＧ１６．４５のＶＫ２と同じ成熟軽鎖可変領域を含む。別の例では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ｈＳＧ１６．４５のＶＨ１と同じ成熟重鎖可変領域およびｈＳＧ１６．４５のＶＫ１と同じ成熟軽鎖可変領域を含む。さらに別の例では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ｈＳＧ１６．４５のＶＨ１と同じ成熟重鎖可変領域およびｈＳＧ１６．４５のＶＫ３と同じ成熟軽鎖可変領域を含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、本明細書に記載される任意の例示的な抗体、例えば、ｈＳＧ１６．１７またはｈＳＧ１６．４５と同じＢＣＭＡ中のエピトープに結合するか、またはＢＣＭＡへの結合について例示的な抗体と競合する。
【０１４１】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、ＤＹＹ（Ｉ／Ｍ）Ｈ（配列番号１０７）もしくはＤＨＷＭＴ（配列番号１０８）の重鎖ＣＤＲ１、（Ｙ／Ｒ／Ｉ）ＩＮＰＮＳＧＹＴ（Ｋ／Ｎ／Ｓ）Ｙ（Ｎ／Ａ）（Ｑ／Ｅ）（Ｋ／Ｎ）Ｆ（Ｑ／Ｋ）（Ｔ／Ｇ）（配列番号１０９）もしくは（Ｓ／Ａ／Ｇ）ＩＴＮＴＧＧＡＴＹＹ（Ｌ／Ａ）ＤＳＶＫＧ（配列番号１１０）の重鎖ＣＤＲ２、および／またはＹＭＷＥＲＶＴＧＦＦＤＦ（配列番号１１１）もしくはＰＧＬＹＦＤＹ（配列番号１１２）の重鎖ＣＤＲ３を含有する。あるいはまたは加えて、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体は、（Ｌ／Ｒ）ＡＳＥＤＩＳＤＤＬＡ（配列番号１１３）もしくは（Ｒ／Ｌ）Ａ（Ｓ／Ｔ）ＳＳＶＳＶＭＹ（配列番号１１４）の軽鎖ＣＤＲ１、ＴＴＳ（Ｓ／Ｒ）ＬＱ（Ｄ／Ｓ）（配列番号１１５）もしくはＳＴＳＳＬＡＳ（配列番号１１６）の軽鎖ＣＤＲ２、および／またはＱＱＴＹＫＦＰＰＴ（配列番号１１７）もしくはＨＱＷＳＳＤＰＰＴ（配列番号１１８）の軽鎖ＣＤＲ３を含有する。
【０１４２】
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、上記の表５に列記される任意の例示的な重鎖と同じ重鎖ＣＤＲおよび／または表５に列記される任意の例示的な軽鎖と同じ軽鎖ＣＤＲを含む。
【０１４３】
あるいはまたは加えて、抗体は、ｈＳＧ１６．１７のＶＨ３と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する成熟重鎖可変領域およびｈＳＧ１６．１７のＶＫ２と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する成熟軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１４４】
あるいはまたは加えて、抗体は、ｈＳＧ１６．４５のＶＨ５と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する重鎖成熟可変領域およびｈＳＧ１６．４５のＶＫ２と少なくとも９０％の配列同一性（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性）を有する成熟軽鎖可変領域を含んでもよい。
【０１４５】
本明細書に記載される任意の抗ＢＣＭＡ抗体では、位置Ｈ５８はＮまたはＫにより占められてもよく、位置Ｈ６０はＡまたはＮにより占められてもよく、位置Ｈ６１はＱまたはＥにより占められてもよく、位置Ｈ６２はＫまたはＮにより占められてもよく、位置Ｈ６４はＱまたはＫにより占められてもよく、位置Ｈ６５はＧまたはＴにより占められてもよく、位置Ｌ２４はＲまたはＬにより占められてもよく、位置Ｌ５３はＳまたはＲにより占められてもよい。一部の例では、位置Ｈ５８、Ｈ６０、Ｈ６１、Ｈ６２、Ｈ６４およびＨ６５は、それぞれ、Ｎ、Ａ、Ｑ、Ｋ、ＱおよびＧにより占められてもよく、かつ／または、Ｌ２４およびＬ５３は、それぞれ、ＲおよびＳにより占められてもよい。他の例では、位置Ｈ２０、Ｈ４８、Ｈ６９、Ｈ７１、Ｈ７３、Ｈ７６、Ｈ８０、Ｈ８８、Ｈ９１およびＨ９３は、それぞれ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ａ、Ｋ、Ｎ、Ｖ、Ａ、Ｆ、およびＴにより占められてもよく、かつ／または、位置Ｌ４６、Ｌ４８およびＬ８７は、それぞれ、Ｖ、ＶおよびＦにより占められてもよい。本明細書において使用されるナンバリングシステムはＫａｂａｔのナンバリングシステムである。
【０１４６】
本明細書に記載される任意の抗ＢＣＭＡ抗体では、位置Ｈ５０はＡまたはＳにより占められてもよく、位置Ｌ２４はＲまたはＬにより占められてもよく、かつ／または位置Ｌ２６はＳまたはＴにより占められてもよい。あるいはまたは加えて、位置Ｈ３０、Ｈ９３およびＨ９４は、それぞれ、Ｎ、ＴおよびＳにより占められてもよい。
【０１４７】
本明細書に記載される任意の抗体では、成熟重鎖可変領域は、重鎖定常領域に融合していてもよく、成熟軽鎖可変領域は、軽鎖定常領域に融合していてもよい。重鎖定常領域は、天然ヒト定常領域と比べてＦｃγ受容体に対する低減した結合性を有する天然ヒト定常領域の突然変異型であってもよい。重鎖定常領域はＩｇＧ１アイソタイプの重鎖定常領域であってもよい。重鎖定常領域および軽鎖定常領域は、表５に開示される配列を有していてもよい。重鎖定常領域は、Ｓ２３９Ｃ突然変異を含むアミノ酸配列を有していてもよい。抗体はネイキッド抗体であってもよい。抗体は、細胞傷害剤または細胞増殖抑制剤に共役されていてもよい。抗体は、細胞傷害剤に共役されていてもよい。細胞傷害剤は、酵素切断可能なリンカーを介して共役されていてもよい。細胞傷害剤はＤＮＡ副溝結合剤であってもよい。
【０１４８】
ヒト化抗体が、例示されるｈＳＧ１６．１７ＶＨ３  ＶＫ２ヒト化抗体からの任意のバリエーションを示す場合、そのような追加のバリエーションの１つの可能性は、可変領域フレームワークにおける追加の復帰突然変異である。他の例示されるヒト化重鎖または軽鎖成熟可変領域における復帰突然変異の任意または全ての位置はまた、重鎖においてＲにより占められたＨ８、Ａにより占められたＨ６７およびＡにより占められたＨ７８、Ｓにより占められたＬ４０、Ｍにより占められたＬ７８およびＤにより占められたＬ８５から構成されていてもよく（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つ全て）、またはＮにより占められたＨ３８、Ｒにより占められたＨ４０、Ｋにより占められたＨ７３、Ｓにより占められたＨ８２Ａ、およびＴにより占められたＨ８３の５つ全てから構成されていてもよく、軽鎖においてＫにより占められたＬ３、およびＩにより占められたＬ２０の１つまたは両方から構成されていてもよい。
【０１４９】
ヒト化抗体が、例示されるｈＳＧ１６．４５  ＶＨＳ  ＶＫ２ヒト化抗体からの任意のバリエーションを示す場合、そのような追加のバリエーションの１つの可能性は、可変領域フレームワークにおける追加の復帰突然変異である。他の例示されるヒト化重鎖または軽鎖成熟可変領域における復帰突然変異の任意または全ての位置はまた、Ｉ、Ｉ、Ｎ、およびＶにより占められたそれぞれＨ３７、Ｈ４８、Ｈ７６、Ｈ１０７から構成されていてもよく（すなわち、１つ、２つ、３つ、または４つ）、かつ／またはＡ、Ｖ、Ｉ、Ｈ、Ｖ、Ｙ、およびＭにより占められたそれぞれＬ１４、Ｌ１９、Ｌ２１、Ｌ３８、Ｌ５８、Ｌ７１およびＬ７８の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つもしくは７つから構成されていてもよい。
【０１５０】
一部の実施形態では、抗体は、野生型Ｆｃ受容体、例えば、野生型ＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、リツキシマブまたはトラスツズマブのＦｃ）に対する上昇した結合親和性を有するＦｃ変異体断片を含有してもよい。
【０１５１】
Ｆｃ変異体断片は、野生型ＩｇＧのＦｃと比べて１つまたは複数の突然変異を含有してもよい。一部の実施形態では、Ｆｃ中の１つまたは複数の突然変異は、ヒンジおよび／またはＣＨ２ドメイン中に位置する。抗体中の突然変異の例は、当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第７，６０１，３３５号明細書、同第８，１８８，２３１号明細書、および同第９，１２０，８５６号明細書において見出すことができ、アミノ酸残基Ｓ２３９、Ｆ２４３、Ｒ２９２、Ｓ２９８、Ｙ３００、Ｖ３０５、Ａ３３０、Ｉ３３２、Ｅ３３３、Ｋ３３４、またはＰ３９６［Kabat et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.に記載されるＥＵインデックスナンバリングを使用］の置換突然変異を含み得る。一部の実施形態では、Ｆｃ断片中の１つまたは複数の突然変異は、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｓ２９８Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｄ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、および／またはＰ３９６Ｌであり得る。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. (2001) 276(9):6591-6604; Lazar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005-4010; Stavenhagen et al. Cancer Res. (2007) 67(18): 8882-8890; Isoda et al. PLoS One (2015) 10(10): e0140120; Lu et al. J. Immunol. Met. (2011) 365:132-141; Liu et al. J. Biol. Chem. (2014) 289(6): 3571-3590;およびSmith et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109(16):6181-6186を参照されたい。米国特許第６，７３７，０５６号明細書、同第７，６６２，９２５号明細書、同第７，３１７，０９１号明細書、および同第８，２１７，１４７号明細書も参照されたい。参照した刊行物の関連する開示は、参照により本明細書で参照した目的または主題のために組み込まれる。
【０１５２】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、糖鎖が改変されていてもよい（すなわち、変化したグリコシル化を有する）。ある特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）［すなわち、非フコシル化（ｎｏｎ−ｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）］されていてもよい。
【０１５３】
抗体は、定常領域中の保存された位置などの位置においてグリコシル化されていてもよく、これは抗体の機能および構造に影響してもよい。例えば、Boyd et al., (1996) Mal. lmmunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180;およびHefferis and Lund, 上掲; Wyss and Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416)を参照されたい。グリコシル化を変化させること（すなわち、「糖鎖工学」）は、抗体上に見出される１つもしくは複数の炭水化物部分の例えば付加、シフト、もしくは欠失を通じてまたはグリコシル化の組成の変更（グリコシル化パターンの変更）を通じてである。抗体のグリコシル化を変化させることは、抗体の配列における少なくとも１つのアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはより多くのアミノ酸）の付加または置換を通じて達成されてもよい。あるいは、抗体のグリコシル化はまた、抗体の配列を変化させることなく達成されてもよい。例えば、抗体は、抗体のグリコシル化パターンを変化させる細胞により発現されてもよく、このような細胞としては、例えば、グリコシル化パターンを変化させるように遺伝子操作された細胞が挙げられる。例えば、Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070およびYang et al. (2015) Nature Biotechnology 33, 842-844を参照されたい。非限定的な例として、操作された細胞株は、ＦＵＴ８遺伝子における機能欠失型突然変異を有してもよい。細胞による発現の際のグリコシル化パターンに影響する他の要因としては、培地配合物、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームなどを挙げることができる。例えば、米国特許第５，０４７，３３５号明細書、同第５，５１０，２６１号明細書、および同第５，２７８，２９９号明細書を参照されたい。抗体はまた、例えば、エンドグリコシダーゼＨなどのエンドグリコシダーゼの使用などの酵素処理を使用して、発現後にプロセシングされてもよい。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法と共に使用するための抗体は、野生型抗体と比較した時により低量のフコースを有するグリコシル化パターン（ｐａｔｔｅｒｓ）を有してもよい。例えば、様々な実施形態では、約６０％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、または約３％未満の抗体分子は野生型フコースレベルを有する。一部の実施形態では、約２％の抗体分子は野生型フコースレベルを有する。一実施形態では、抗体は、フコースの代わりにフコースアナログを含む。フコースアナログと共に抗体産生細胞をインキュベートすることによる非フコシル化抗体の調製方法、フコースアナログの使用、およびフコースアナログそれ自体は、例えば、ＷＯ２００９１３５１８１およびＷＯ２００９１３５１８１に記載されている。これらにおける関連する開示は、参照により参照した目的および主題のために組み込まれる。
【０１５５】
（ｉｉ）抗ＢＣＭＡ抗体の調製
本明細書に記載されるＢＣＭＡに結合することができる抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により調製することができる。例えば、Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照されたい。
【０１５６】
一部の実施形態では、標的抗原（例えば、ＢＣＭＡまたはその触媒ドメイン）に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術により調製することができる。ＫＬＨなどのキャリアタンパク質に連結されていてもよい全長標的抗原またはその断片を使用して、その抗原に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫化することができる。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは、一般に、さらに本明細書に記載されるように、抗体の刺激および産生のための確立された従来技術に沿って行われる。マウス、ヒト化、およびヒト抗体の産生のための一般技術は当技術分野において公知であり、本明細書に記載されている。ヒトなどの任意の哺乳動物対象またはそれからの抗体産生細胞は、ヒトハイブリドーマ細胞株などの哺乳動物細胞株の製造のための基礎として役立つようにマニピュレートできることが想定される。典型的に、宿主動物は、腹腔内に、筋肉内に、経口的に、皮下に、足底内、および／または皮内に、本明細書に記載されるものなどのある量の免疫原を接種される。
【０１５７】
ハイブリドーマは、Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497またはBuck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)により改良された一般の体細胞ハイブリダイゼーション技術を使用してリンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。以下に限定されないがＸ６３−Ａｇ８．６５３、およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡからのものなどの利用可能な骨髄腫株をハイブリダイゼーションにおいて使用してもよい。一般に、本技術は、ポリエチレングリコールなどの融合因子を使用するか、または当業者に周知の電気的手段により骨髄腫細胞およびリンパ細胞を融合させることを伴う。融合後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択増殖培地中で生育させて、ハイブリダイズしていない親細胞を除去する。血清を添加したかまたは血清なしの本明細書に記載される任意の培地は、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用することができる。細胞融合技術の別の代替として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本明細書に記載される抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体を製造してもよい。ハイブリドーマを所望により増殖およびサブクローニングし、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性について上清をアッセイする。
【０１５８】
抗体の供給源として使用され得るハイブリドーマは、ＢＣＭＡ活性に干渉することができるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの全ての誘導物、子孫細胞を包含する。そのような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用してインビトロまたはインビボで生育させてもよい。モノクローナル抗体は、所望により、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順により培養培地または体液から単離されてもよい。望ましくない活性が存在する場合、そのような活性は、例えば、固相に取り付けられた免疫原から作られた吸着剤に調製物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出または放出させることにより除去することができる。二機能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じた共役）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を通じて）、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に共役された標的アミノ酸配列を含有する標的抗原または断片を用いる宿主動物の免疫化は、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団をもたらすことができる。
【０１５９】
所望の場合、目的の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）（例えば、ハイブリドーマにより産生される）はシークエンシングされてもよく、次いでポリヌクレオチド配列は、発現または繁殖のためにベクター中にクローニングされてもよい。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクター中に維持されてもよく、次いで宿主細胞を増殖させ、将来的な使用のために冷凍することができる。代替としては、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」するためまたは親和性（親和性成熟）もしくは抗体の他の特徴を向上させるための遺伝学的マニピュレーションのために使用されてもよい。例えば、定常領域は、抗体がヒトにおける臨床試験および治療において使用される場合に免疫応答を回避するようにヒト定常領域により似るように操作されてもよい。抗体配列を遺伝学的にマニピュレートして、標的抗原に対するより高い親和性およびＢＣＭＡの活性の阻害におけるより大きい有効性を得ることが望ましいことがある。１つまたは複数のポリヌクレオチドの変化を抗体に対して行うことができ、それでもなお標的抗原に対するその結合特異性を維持し得ることは当業者に明らかと予想される。
【０１６０】
他の実施形態では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することにより完全ヒト抗体が得られ得る。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）またはよりロバストな免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化またはヒト抗体の生成のために使用されてもよい。そのような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，  Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，  Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  ＭｏｕｓｅＴＭである。別の代替では、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母技術により組換えにより調製されてもよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書；同第５，５８０，７１７号明細書；同第５，７３３，７４３号明細書；および同第６，２６５，１５０号明細書；ならびにWinter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術［McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553］を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからインビトロでヒト抗体および抗体断片を製造することができる。
【０１６１】
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異的抗体などの遺伝子操作された抗体は、例えば、従来の組換え技術を介して製造することができる。一例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を使用して容易に単離およびシークエンシングすることができる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。ＤＮＡが単離されたら、ＤＮＡを１つまたは複数の発現ベクター中に入れてもよく、次いでベクターを、そうでなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないＥ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞中にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、ＰＣＴ国際公開ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。次いで、例えば、相同マウス配列をヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコーディング配列に代えることにより、Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851、または非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列の全てもしくは部分を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合により連結することにより、ＤＮＡを改変することができる。そのようにして、標的抗原の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子操作された抗体を調製することができる。
【０１６２】
「キメラ抗体」の製造のために開発された技術は、当技術分野において周知である。例えば、Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604;およびTakeda et al. (1984) Nature 314:452を参照されたい。
【０１６３】
ヒト化抗体を構築する方法もまた、当技術分野において周知である。例えば、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)を参照されたい。一例では、親非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域が、当技術分野において公知の方法に従って三次元分子モデリング解析に供される。次に、正しいＣＤＲ構造の形成のために重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基が、同じ分子モデリング解析を使用して同定される。並行して、親非ヒト抗体のアミノ酸配列に相同的なアミノ酸配列を有するヒトＶＨおよびＶＬ鎖が、検索クエリとして親ＶＨおよびＶＬ配列を使用して任意の抗体遺伝子データベースから同定される。次いで、ヒトＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子が選択される。
【０１６４】
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域は、親非ヒト抗体またはその機能的変異体からのＣＤＲ領域と置き換えることができる。必要な場合、ＣＤＲ領域との相互作用において重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記を参照）を使用して、ヒトアクセプター遺伝子中の対応する残基を置換することができる。
【０１６５】
当技術分野において公知の方法および本明細書に記載される方法に従って得られる抗体は、当技術分野において周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999のChapter 11に記載されるように、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイなどの、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けするための当技術分野において公知の多くの方法が存在する。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープはリニアエピトープ、すなわち、アミノ酸の単一のストレッチ中に含有されるもの、または必ずしも単一のストレッチ（一次構造リニア配列）中に含有されなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用により形成されるコンホメーショナルエピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成し（例えば、組換えにより）、抗体との結合アッセイのために使用することができる。別の例では、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来するオーバーラップペプチドを使用し、抗体による結合を決定することによる体系的スクリーニングにおいて決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームは、無作為にまたは特定の遺伝学的構築により断片化され、試験される抗体との抗原の発現された断片の反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲにより製造された後、インビトロで転写され、放射性アミノ酸の存在下でタンパク質に翻訳されてもよい。次いで、放射性標識された抗原断片への抗体の結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動により決定される。ある特定のエピトープはまた、ファージ粒子の表面上に提示されるランダムなペプチド配列の大きいライブラリー（ファージライブラリー）を使用することにより同定することができる。あるいは、オーバーラップペプチド断片の定義されたライブラリーは、単純な結合アッセイにおいて試験抗体への結合について試験され得る。追加の例では、抗原結合ドメインの変異生成、ドメインスワッピング実験およびアラニンスキャニング変異生成を行って、エピトープ結合のために要求される、充分な、および／または必要な残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、ＢＣＭＡポリペプチドの様々な断片が、密接に関連するが抗原的に別個のタンパク質（ニューロトロフィンタンパク質ファミリーの別のメンバーなど）からの配列と置き換えられ（スワップされ）ている標的抗原の突然変異体を使用して行うことができる。突然変異体ＢＣＭＡへの抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定の抗原断片の重要性を評価することができる。
【０１６６】
あるいは、同じ抗原に結合することが既知の他の抗体を使用して競合アッセイを行って、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。競合アッセイは当業者に周知である。
【０１６７】
一部の例では、抗ＢＣＭＡ抗体は、以下に例示されるように組換え技術により調製される。
【０１６８】
本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、１つの発現ベクター中にクローニングすることができ、各ヌクレオチド配列は、好適なプロモーターに作動可能に連結される。一例では、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれは、別個のプロモーター（ｐｒｏｍｐｔｅｒ）に作動可能に連結される。あるいは、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、重鎖および軽鎖の両方が同じプロモーターから発現されるように単一のプロモーターを用いて作動可能に連結することができる。必要な場合、重鎖コーディング配列と軽鎖コーディング配列との間に内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を挿入することができる。
【０１６９】
一部の例では、抗体の２つの鎖をコードするヌクレオチド配列は２つのベクター中にクローニングされ、これらのベクターは、同じまたは異なる細胞中に導入され得る。２つの鎖が異なる細胞中で発現される場合、これらのそれぞれは、それを発現する宿主細胞から単離されてもよく、単離された重鎖および軽鎖は、抗体の形成を可能とする好適な条件下で混合およびインキュベートされ得る。
【０１７０】
一般に、抗体の１つまたは全ての鎖をコードする核酸配列は、当技術分野において公知の方法を使用して好適なプロモーターと作動可能に連結されて好適な発現ベクター中にクローニングすることができる。例えば、ヌクレオチド配列およびベクターを好適な条件下で制限酵素と接触させて、互いに対形成し、リガーゼと共に連結され得る各分子上の相補的末端を作出することができる。あるいは、合成核酸リンカーは、遺伝子の末端にライゲートすることができる。これらの合成のリンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含有する。発現ベクター／プロモーターの選択は、抗体の製造において使用するための宿主細胞の種類に依存する。
【０１７１】
様々なプロモーターを本明細書に記載される抗体の発現のために使用することができ、プロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ウイルスＬＴＲ、例えば、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１  ＬＴＲ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、Ｅ．コリｌａｃ  ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
調節可能なプロモーターもまた使用することができる。そのような調節可能なプロモーターとしては、ｌａｃオペレーター保有哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節するための転写モジュレーターとしてＥ．コリのｌａｃリプレッサーを使用するもの［Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用するもの［Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998)； Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］が挙げられる。他のシステムとしては、アストラジオール（ａｓｔｒａｄｉｏｌ）、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン（ｄｉｐｈｅｎｏｌ  ｍｕｒｉｓｌｅｒｏｎｅ）、またはラパマイシンを使用するＦＫ５０６ダイマー、ＶＰ１６またはｐ６５が挙げられる。誘導性システムは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣｌｏｎｔｅｃｈおよびＡｒｉａｄから入手可能である。
【０１７３】
オペロンを有するリプレッサーを含む調節可能なプロモーターを使用することができる。一実施形態では、Ｅ．コリのｌａｃリプレッサーは、ｌａｃオペレーター保有哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節するための転写モジュレーターとして機能することができ［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、Gossen and Bujard (1992)［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を転写活性化因子（ＶＰ  １６）と組み合わせて、ｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写活性化因子融合タンパク質、ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ  １６）を作出し、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要最初期プロモーターに由来するｔｅｔＯ保有最小プロモーターと組み合わせて、哺乳動物細胞中で遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーターシステムを作出した。一実施形態では、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される。テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）は、ｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写因子融合誘導体よりもむしろ単独で、テトラサイクリンオペレーターがＣＭＶＩＥプロモーターのＴＡＴＡエレメントの下流に適切に配置された時に哺乳動物細胞中での遺伝子発現を調節するための強力なトランスモジュレーターとして機能し得る（Yao et al., Human Gene Therapy）。このテトラサイクリン誘導性スイッチの１つの特定の利点は、その調節可能な効果を達成するために、一部の例では細胞に対して毒性であり得る、テトラサイクリンリプレッサー−哺乳動物細胞トランスアクチベーターまたはリプレッサー融合タンパク質の使用を必要としないことである［Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］。
【０１７４】
さらに、ベクターは、例えば、以下の一部または全てを含有することができる：哺乳動物細胞中の安定または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ）（ＩＲＥＳ）、汎用性のマルチクローニングサイト；ならびにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６  ＲＮＡプロモーター。好適なベクターおよび導入遺伝子を含有するベクターを製造するための方法は当技術分野において周知であり、利用可能である。
【０１７５】
本明細書に記載される方法を実施するために有用なポリアデニル化シグナルの例としては、ヒトコラーゲンＩポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンＩＩポリアデニル化シグナル、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７６】
任意の抗体をコードする核酸を含む１つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）は、抗体を製造するために好適な宿主細胞中に導入されてもよい。宿主細胞は、抗体またはその任意のポリペプチド鎖の発現のために好適な条件下で培養することができる。そのような抗体またはそのポリペプチド鎖は、従来の方法、例えばアフィニティー精製を介して培養細胞により回収することができる（例えば、細胞または培養上清から）。必要な場合、抗体の産生を可能とする好適な期間にわたり好適な条件下で抗体のポリペプチド鎖をインキュベートすることができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体を調製する方法は、これも本明細書に記載されるように、抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを伴う。組換え発現ベクターは、従来の方法、例えば、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションにより好適な宿主細胞（例えば、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞）中に導入することができる。陽性形質転換体宿主細胞を選択し、抗体を形成する２つのポリペプチド鎖の発現を可能とする好適な条件下で培養することができ、抗体を細胞または培養培地から回収することができる。必要な場合、宿主細胞から回収した２つの鎖を抗体の形成を可能とする好適な条件下でインキュベートすることができる。
【０１７８】
一例では、２つの組換え発現ベクターが提供され、１つは抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖をコードし、他方は抗ＢＣＭＡ抗体の軽鎖をコードする。従来の方法、例えば、リン酸カルシウム媒介性のトランスフェクションにより２つの組換え発現ベクターの両方を好適な宿主細胞（例えば、ｄｈｆｒ−  ＣＨＯ細胞）中に導入することができる。あるいは、発現ベクターのそれぞれを好適な宿主細胞中に導入することができる。陽性形質転換体を選択し、抗体のポリペプチド鎖の発現を可能とする好適な条件下で培養することができる。２つの発現ベクターが同じ宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞中で産生される抗体を宿主細胞または培養培地から回収することができる。必要な場合、ポリペプチド鎖を宿主細胞または培養培地から回収した後、抗体の形成を可能とする好適な条件下でインキュベートすることができる。２つの発現ベクターが異なる宿主細胞中に導入される場合、これらのそれぞれを対応する宿主細胞または対応する培養培地から回収することができる。次いで、抗体の形成のために好適な条件下で２つのポリペプチド鎖をインキュベートすることができる。
【０１７９】
組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収するために標準的な分子生物学技術が使用される。例えば、プロテインＡまたはプロテインＧ連結マトリックスを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより一部の抗体を単離することができる。
【０１８０】
本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖、軽鎖、または両方をコードする任意の核酸、それを含有するベクター（例えば、発現ベクター）；およびそのようなベクターを含む宿主細胞は本開示の範囲内である。
【０１８１】
（ｉｉｉ）抗ＢＣＭＡ抗体の医薬組成物
本明細書に記載される抗体の他に、コーディング核酸もしくは核酸セット、それを含むベクター、またはベクターを含む宿主細胞を薬学的に許容される担体（賦形剤）と混合して、標的疾患の治療において使用するための医薬組成物を形成させることができる。緩衝剤などの薬学的に許容される賦形剤（担体）は、当技術分野において周知である。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照されたい。
【０１８２】
本発明の方法において使用される医薬組成物は、凍結乾燥配合物または水溶液の形態の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤を含むことができる。［Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover］。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、使用される投与量および濃度においてレシピエントに対して非毒性であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンなどの酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシン；グルコース、マンノース、またはデキストランなどの単糖、二糖、および他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。
【０１８３】
一部の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、抗体（またはコーディング核酸）を含有するリポソームを含み、リポソームは、当技術分野において公知の方法、例えば、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980);ならびに米国特許第４，４８５，０４５号明細書および同第４，５４４，５４５号明細書に記載されている方法により調製することができる。増進された循環時間を有するリポソームが米国特許第５，０１３，５５６号明細書に開示されている。ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発法により特に有用なリポソームを生成することができる。定義された孔サイズのフィルターを通じてリポソームを押し出して、所望の直径を有するリポソームがもたらされる。
【０１８４】
抗体、またはコーディング核酸はまた、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されるマイクロカプセル中に閉じ込められてもよく、マイクロカプセルは、例えば、コロイド薬物デリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミン  マイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルション中のそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルである。そのような技術は当技術分野において公知であり、例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)を参照されたい。
【０１８５】
他の例では、本明細書に記載される医薬組成物は、持続放出型として配合することができる。持続放出調製物の好適な例としては、抗体を含有する固体状疎水性ポリマーの半透性マトリックスであって、マトリックスが、成形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態であるものが挙げられる。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステル、ハイドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用マイクロスフェア）、スクロース酢酸イソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０１８６】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは、例えば、無菌の濾過膜を通す濾過により容易に達成される。治療的抗体組成物は、一般に、無菌アクセスポート、例えば、皮下注射針により貫通可能な止め具を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルを有する容器中に入れられる。
【０１８７】
本明細書に記載される医薬組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与用、または吸入もしくは吹送による投与用の、錠剤、丸剤、カプセル、粉末、顆粒、溶液もしくは懸濁液、または坐剤などの単位剤形であり得る。
【０１８８】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分を、薬学的担体、例えば、従来の錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合して、本発明の化合物、またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均質な混合物を含有する固体状予備配合組成物を形成させることができる。これらの予備配合組成物が均質であると言う場合、それは、活性成分が組成物の全体にわたって均一に分散しており、組成物を錠剤、丸剤およびカプセルなどの等しく効果的な単位剤形に容易にさらに分割し得ることを意味する。次いで、この固体状予備配合組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記される種類の単位剤形にさらに分割される。新規の組成物の錠剤または丸剤は、コーティングまたはそれ以外の調合を行うことにより、長期的作用の利点を与える剤形を提供することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内部投与コンポーネントおよび外部投与コンポーネントを含むことができ、後者は、前者の上のエンベロープの形態であり得る。２つのコンポーネントは、胃での分解に抵抗するように働き、内部コンポーネントが十二指腸にインタクトなまま通過することまたは放出を遅延させることを可能とする腸溶性層により分離され得る。そのような腸溶性層またはコーティングのために様々な材料を使用することができ、そのような材料としては、いくつかのポリマー酸ならびにシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料とのポリマー酸の混合物が挙げられる。
【０１８９】
好適な表面活性剤としては、特に、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）が挙げられる。表面活性剤を有する組成物は、好都合には、０．０５〜５％の表面活性剤を含み、これは０．１〜２．５％であり得る。必要な場合、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容される媒体を加えてもよいことが理解されると予想される。
【０１９０】
好適なエマルションは、市販の脂質エマルション、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）を使用して調製されてもよい。活性成分は、予備混合されたエマルション組成物中に溶解させてもよいし、あるいは、油（例えば、大豆油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、コーン油またはアーモンド油）ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水との混合により形成されたエマルション中に溶解されてもよい。他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを加えて、エマルションの張度を調整してもよいことが理解されると予想される。好適なエマルションは、典型的に、最大２０％、例えば、５〜２０％の油を含有する。脂質エマルションは、０．１〜１．０．ｉｍ、特に０．１〜０．５．ｉｍの脂質小滴を含むことがあり、５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有し得る。
【０１９１】
エマルション組成物は、抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその成分（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することにより調製されたものであり得る。
【０１９２】
吸入または吹送のための医薬組成物としては、薬学的に許容される、水性溶媒もしくは有機溶媒、またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末が挙げられる。液体または固体組成物は、上記したような好適な薬学的に許容される賦形剤を含有してもよい。一部の実施形態では、組成物は、局所または全身性の効果のために経口または経鼻呼吸器経路により投与される。
【０１９３】
好ましくは無菌の薬学的に許容される溶媒中の組成物は、ガスの使用により噴霧されてもよい。噴霧された溶液は、噴霧器から直接的に吸引されてもよいし、噴霧器をフェイスマスク、テントまたは間欠的陽圧呼吸装置に取り付けてもよい。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な方法で配合物をデリバリーするデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に、投与されてもよい。
【０１９４】
ＩＶ．ＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞および抗ＢＣＭＡ抗体の併用免疫療法
本開示の例示的なＡＣＴＲコンストラクトは、Ｔリンパ球に対して抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）能力を付与し、ＮＫ細胞においてＡＤＣＣを増進させる。ＢＣＭＡ発現細胞に結合した抗ＢＣＭＡ抗体が受容体に結合した時に、受容体は、Ｔ細胞活性化、持続的な増殖およびＢＣＭＡを発現する細胞に対する特異的な細胞傷害性を誘発する。例えば、この療法は、ＢＣＭＡ陽性がん細胞、Ｂ細胞、または血漿細胞に対して効果的である。非限定的な例のセットとして、ＢＣＭＡ陽性がん細胞としては、血液がん細胞（例えば、骨髄腫、多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、または形質細胞腫などの細胞）が挙げられる。この療法の効果は、少なくとも図１［ＢＣＭＡ陽性（ＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６Ｂ１、ＲＰＭＩ８２２６、ＭＭ１Ｓ、ＯＰＭ２）細胞をＢＣＭＡ陰性（Ｋ５６２）細胞と比較している］；および図７（本開示のＡＣＴＲコンストラクトのありおよびなしの両方で抗ＢＣＭＡ抗体を用いてＢＣＭＡ陽性および陰性細胞における効果を比較している）に示されるように、ＢＣＭＡを発現する細胞に特異的である。
【０１９５】
ＩｇのＦｃ部分に対するＣＤ１６の親和性の程度は、ＡＤＣＣ、したがって抗体免疫療法に対する臨床応答の不可欠な決定因子である。Ｉｇに対する高い結合親和性を有し、優れたＡＤＣＣを媒介するＶ１５８多型を有するＣＤ１６が例として選択された。Ｆ１５８受容体は、Ｔ細胞増殖およびＡＤＣＣの誘導においてＶ１５８受容体より低い力価を有するが、Ｆ１５８受容体は、一部の臨床的状況においてＶ１５８受容体と比べて利点を有することがある。
【０１９６】
本開示の方法およびＡＣＴＲコンストラクトは、１つの単一の受容体を、抗ＢＣＭＡ抗体と組み合わせた時に全てのＢＣＭＡ陽性がんのために使用可能とすることによりＴ細胞療法を促進する。抗体により方向付けられる細胞傷害性は、抗体投与の単純な中止により、必要な時にいつでも停止させることができる。あらゆる潜在的な自己免疫反応性を制限するためにＡＣＴＲコンストラクトを一過的に発現するｍＲＮＡエレクトロポレーションを使用することにより、臨床的安全性をさらに増進させることができる。
【０１９７】
したがって、一実施形態では、本開示は、それを必要とする対象においてがんの抗体ベースの免疫療法の有効性を増進させる方法であって、ＢＣＭＡ発現細胞に結合することができ、ヒトＣＤ１６に結合することができるヒト化されたＦｃ部分を有する抗ＢＣＭＡ抗体を用いて対象が治療されており、前記方法が、対象に治療的に効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体および治療的に効果的な量のＴリンパ球またはＮＫ細胞を導入することを含み、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞が本開示のＡＣＴＲコンストラクトを含む、方法を提供する。
【０１９８】
本明細書において使用される場合、用量または量に適用される「治療的に効果的」という用語は、それを必要とする対象に対して投与により所望の活性を結果としてもたらすために充分な化合物または医薬組成物の量を指す。活性成分の組合せが投与される場合［例えば、抗ＢＣＭＡ抗体を含む第１の医薬組成物、および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物］、効果的な量の組合せは、個々に投与された時に効果的であったと予想される量の各成分を含んでもよいし、含まなくてもよいことが留意される。本開示の文脈において、「治療的に効果的」という用語は、本開示の方法により治療される障害の発症を遅延させ、進行を阻み、そのような障害の少なくとも１つの症状を緩和または軽減するために充分な化合物または医薬組成物の量を指す。
【０１９９】
Ａ．免疫療法の有効性の増進
本明細書に記載されるＡＣＴＲコンストラクトを発現する宿主細胞（例えば、免疫細胞）は、対象においてＡＤＣＣを増進させるためおよび／または抗体ベースの免疫療法の有効性を増進させるために有用である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ、または家畜哺乳動物である。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象はヒトがん患者である。一部の実施形態では、対象は、本明細書に記載される任意の治療的抗体を用いて治療されたか、または治療されている。
【０２００】
本明細書に記載される方法を実施するために、本明細書に記載される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する効果的な量の免疫細胞（ＮＫ細胞および／またはＴリンパ球）および効果的な量の抗ＢＣＭＡ抗体、またはこれらの組成物は、静脈内投与などの好適な経路を介して治療を必要とする対象に投与されてもよい。本明細書において使用される場合、効果的な量は、投与により対象に対して治療効果を付与する各々の剤（例えば、ＡＣＴＲコンストラクトを発現するＮＫ細胞および／もしくはＴリンパ球、抗ＢＣＭＡ抗体、またはこれらの組成物）の量を指す。本明細書に記載される細胞または組成物の量が治療効果を達成したかどうかの判定は当業者に明らかと予想される。当業者に認識されるように、治療されている特定の状態、状態の重篤度、年齢、身体条件、身長、ジェンダー、性別、および体重などの個々の患者のパラメーター、治療の期間、現行の療法（それがある場合）の性質、特定の投与経路ならびに医療従事者の知識および技能の範囲内の同様の要因に応じて効果的な量は異なる。一部の実施形態では、効果的な量は、対象において任意の疾患または障害の症状を軽減するか、緩和するか、改善させるか、向上させるか、低減させるか、または進行を遅延させる。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、治療を必要とする対象は、ヒトがん患者である。他の実施形態では、治療を必要とする対象は、Ｂ細胞媒介性障害または血漿細胞媒介性障害を有するヒトである。
【０２０１】
本開示の方法は、任意のＢＣＭＡ陽性がんの治療のために使用されてもよい。本開示の方法により治療され得るがんの特定の非限定的な例としては、例えば、血液がん、例えば、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫または形質細胞腫）、くすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）、および意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、白血病、およびリンパ腫［例えば、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ；ワルデンシュトレームのマクログロブリン血症（ＷＭ）およびバーキットリンパ腫など）またはホジキンリンパ腫］が挙げられる。一部の実施形態では、がんは、再発性または難治性多発性骨髄腫における多発性骨髄腫であってもよい。他のＢＣＭＡ陽性がんとしては、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）または骨髄増殖性症候群（ＭＰＳ）を挙げることができる。本開示の方法は、任意のＢ細胞媒介性障害または血漿細胞媒介性障害の治療のために使用されてもよい。本明細書において使用される「Ｂ細胞」は、それらの細胞膜上にＢ細胞受容体を発現するリンパ球サブタイプの白血球の一種を指す。例示的なＢ細胞としては、血漿細胞、メモリーＢ細胞、濾胞性Ｂ細胞、辺縁帯Ｂ細胞、Ｂ−１細胞、および制御性Ｂ細胞が挙げられる。Ｂ細胞媒介性障害（例えば、血漿細胞媒介性障害）としては、例えば、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、Ｉ型糖尿病、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、血小板減少性紫斑病、多発性硬化症、乾癬、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性胆管炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ；以前にはウェゲナー肉芽腫症またはＷＧとして公知）、結核、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が挙げられる。
【０２０２】
一部の実施形態では、免疫細胞は、ＡＤＣＣ活性を最低２０％および／または少なくとも２倍増進させるために効果的な量、例えば、ＡＤＣＣを５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、またはより大きく増進させるために効果的な量で対象に投与される。
【０２０３】
免疫細胞は、ＢＣＭＡ発現細胞を標的化するために抗ＢＣＭＡ抗体と共に投与される。抗ＢＣＭＡ抗体ベースの免疫療法は、免疫療法が対象において有用であると考えられる任意の疾患または障害の症状を治療するか、軽減するか、または低減させるために使用されてもよい。
【０２０４】
抗体ベースの免疫療法の有効性は、当技術分野において公知の任意の方法により評価されてもよく、医療分野の専門家には明らかと予想される。例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性は、対象の生存によりまたは対象もしくはその組織もしくは試料中の腫瘍もしくはがん負荷により評価されてもよい。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞および／または抗ＢＣＭＡ抗体の非存在下での有効性と比較して、抗体ベースの免疫療法の有効性を少なくとも２０％および／または少なくとも２倍増進させるために効果的な量、例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性を５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはより大きく増進させるために効果的な量で治療を必要とする対象に投与される。
【０２０５】
本明細書に記載される任意の方法では、免疫細胞（例えば、ＮＫおよび／またはＴ細胞）は、対象にとって自己のものであってもよく、すなわち、免疫細胞は、治療を必要とする対象から得られ、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のために遺伝子操作され、次いで同じ対象に投与されてもよい。一つの特定の実施形態では、対象への再導入の前に、自己免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）は、エクスビボで活性化および／または増殖される。対象への自己細胞の投与は、非自己細胞の投与と比較して宿主細胞の拒絶の低減を結果としてもたらすことがある。
【０２０６】
あるいは、宿主細胞は同種細胞であり、すなわち、細胞は、第１の対象から得られ、ＡＣＴＲコンストラクトの発現のために遺伝子操作され、第１の対象とは異なるが同じ種である第２の対象に投与される。例えば、同種免疫細胞は、ヒトドナーに由来し、ドナーとは異なるヒトレシピエントに投与されてもよい。特定の実施形態では、Ｔリンパ球は、内因性Ｔ細胞受容体の発現が阻害または除去された同種Ｔリンパ球である。一つの特定の実施形態では、対象への導入の前に、同種免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）は、エクスビボで活性化および／または増殖される。Ｔリンパ球またはＮＫ細胞は、例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８、ＩＬ−２、および／またはフィトヘモアグルチニンの存在下で、当技術分野において公知の任意の方法により活性化させることができる。ある特定の実施形態では、エクスビボでの活性化および／または増殖は、免疫調節剤（例えば、レナリドミド）の存在下で行われてもよい。
【０２０７】
ＮＫ細胞は、例えば、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−１５受容体抗体、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−２１タンパク質、およびＫ５６２細胞株からなる群から選択される１つまたは複数の剤の存在下で、当技術分野において公知の任意の方法により活性化させることができる。例えば、ＮＫ細胞を増殖させるために有用な方法の説明について米国特許第７，４３５，５９６号明細書および同第８，０２６，０９７号明細書を参照されたい。例えば、本開示の方法において使用されるＮＫ細胞は、主要組織適合複合体Ｉおよび／またはＩＩ分子を欠くかまたは発現が乏しく、膜結合ＩＬ−１５および４−１ＢＢリガンド（ＣＤＩ３７Ｌ）を発現するように遺伝子操作された細胞への曝露により優先的に増殖されてもよい。そのような細胞株としては、Ｋ５６２［ＡＴＣＣ、ＣＣＬ２４３；Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)］、およびウィルムス腫瘍細胞株ＨＦＷＴ［Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)］、子宮内膜腫瘍細胞株ＨＨＵＡ、黒色腫細胞株ＨＭＶ−ＩＩ、肝芽腫細胞株ＨｕＨ−６、肺小細胞癌細胞株Ｌｕ−１３０およびＬｕ−１３４−Ａ、神経芽腫細胞株ＮＢ１９およびＮ１３６９、精巣からの胎児性癌細胞株ＮＥＣ１４、子宮頸癌細胞株ＴＣＯ−２、および骨髄転移神経芽腫細胞株ＴＮＢ１［Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)］が挙げられるがこれらに必ずしも限定されない。好ましくは、使用される細胞株は、ＭＨＣ  ＩおよびＩＩ分子を欠くかまたは発現が乏しいものであり、例えば、Ｋ５６２およびＨＦＷＴ細胞株である。細胞株の代わりに固体支持体が使用されてもよい。そのような支持体は、好ましくは、ＮＫ細胞に結合して一次活性化事象および／または増殖応答を誘導することができるか、またはそのような影響を有する分子に結合することによりスキャフォールドとして作用することができる少なくとも１つの分子をその表面上に結合しているべきである。支持体は、ＣＤ１３７リガンドタンパク質、ＣＤ１３７抗体、ＩＬ−１５タンパク質またはＩＬ−１５受容体抗体をその表面上に結合していてもよい。好ましくは、支持体は、その表面上に結合したＩＬ−１５受容体抗体およびＣＤ１３７抗体を有する。
【０２０８】
上記方法の一実施形態では、対象へのＴリンパ球、ＮＫ細胞、またはＴリンパ球およびＮＫ細胞の導入（または再導入）後に治療的に効果的な量のＩＬ−２が対象に投与される。
【０２０９】
本明細書に開示される任意のＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞（例えば、Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞）は、Ｆｃ含有抗ＢＣＭＡ抗体を用いて治療されたか、または治療されている対象に投与されてもよい。例えば、免疫細胞は、抗ＢＣＭＡ抗体と同時にヒト対象に投与されてもよい。あるいは、免疫細胞は、抗ＢＣＭＡ抗体ベースの免疫療法の経過中にヒト対象に投与されてもよい。一部の例では、免疫細胞および抗ＢＣＭＡ抗体は、少なくとも４時間の間隔で、例えば、少なくとも１２時間の間隔で、少なくとも１日の間隔で、少なくとも３日の間隔で、少なくとも１週の間隔で、少なくとも２週の間隔で、または少なくとも１カ月の間隔でヒト対象に投与され得る。
【０２１０】
一部の実施形態では、ヒト対象は成人（すなわち、１８歳以上）である。ヒト対象は、測定可能な疾患を伴う組織学的または細胞学的に確認された再発性または難治性多発性骨髄腫（ＭＭ）を有してもよい。一部の例では、ヒト対象は、少なくとも３ラインの先行する療法を受けていてもよく、そのような療法は、これらの両方に対して二重難治性でなければプロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、またはイキサゾミブ）および免疫調節剤（例えば、レナリドミドまたはポマリドミド）を用いる治療；ならびに造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）適格と考えられる対象についてＨＳＣＴを含んでもよい。ある特定の実施形態では、ＩｇＧ  ＭＭを伴う対象についての定量的な血清ＩｇＧレベルは、施設の正常値上限（ＵＬＮ）を超えないものであってもよい。一部の例では、ヒト対象は、ＥＣＯＧ（米国東海岸がん臨床試験グループ）パフォーマンスステータスが０（すなわち、ヒト対象は、完全に活発であり、制限なしに疾患前の全てのパフォーマンスを実行することができる）または１（すなわち、ヒト対象は、激しい身体活動が制限されているが歩行可能であり、軽いまたは座って為される性質の仕事、例えば、簡単な家事またはオフィスワークを実行することができる）であってもよい。あるいはまたは加えて、ヒト対象は、少なくとも６カ月の平均余命を有してもよい。ある特定の実施形態では、ヒト対象は、１０００／μＬより多い絶対好中球（ＡＮＣ）数、５０，０００／μＬより多い血小板数、３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２より多い推定球体濾過量（ＧＦＲ）、またはそれらの組合せを有してもよい。
【０２１１】
一部の実施形態では、ヒト対象は、（ｉ）既知の活性の中枢神経系（ＣＮＳ）障害（例えば、多発性骨髄腫による）を有しないか；（ｉｉ）全身リウマチ性もしくは自己免疫疾患および急性もしくは慢性感染症のいずれも有しないか；（ｉｉｉ）制御されない血栓塞栓事象および最近の重篤な出血のいずれも有しないか；（ｉｖ）５ｍｇ／日より多くのプレドニゾン（または生理学的置換レベルを超える同等のグルココルチコイド）を現在使用していないか；（ｖ）以下の以前の治療：６カ月以内のＴ細胞指向性抗体療法（例えば、アレムツズマブまたは抗胸腺細胞グロブリン）；２週以内の細胞傷害性化学療法、生物学的療法、もしくは放射線療法などの任意の以前の骨髄腫指向性療法；４週以内の任意のモノクローナル抗体もしくはＦｃドメインを含有する他のタンパク質治療剤；進行が療法に関して記録されない限り、３半減期以内の実験用剤；任意の時点における以前のＢＣＭＡ指向性治験薬；任意の時点における、遺伝子操作されていない自己細胞の移植（例えば、造血幹細胞移植）を除く以前の細胞もしくは遺伝子療法；および／もしくは任意の時点における以前の同種ＨＳＣＴのいずれも投与されていないか；（ｖｉ）妊娠および授乳のいずれにも該当しないか；または（ｉ）〜（ｖｉ）のいずれか１つの組合せである対象であってもよい。
【０２１２】
本開示によれば、患者は、体重１キログラム当たり約１０５〜１０１０またはより多くの細胞（細胞／Ｋｇ）の範囲内の治療的に効果的な用量の免疫細胞、例えば、本開示のＡＣＴＲコンストラクトを含むＴリンパ球またはＮＫ細胞を注入することにより治療され得る。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が忍容できる限り頻繁におよび多くの回数繰り返すことができる。適切な注入の用量およびスケジュールは患者毎に異なるが、特定の患者のために治療医により決定され得る。典型的に、約１０６細胞／Ｋｇの開始用量が注入され、１Ｋｇあたり１０８個またはより多くの細胞まで段階的に増加させる。注入された細胞を増殖させるためにＩＬ−２を共投与することができる。ＩＬ−２の量は、体表面１平方メートル当たり約１〜５×１０６国際単位であり得る。
【０２１３】
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、約１００〜５００ｍｇ、５００〜１０００ｍｇ、１０００〜１５００ｍｇまたは１５００〜２０００ｍｇの１つまたは複数の用量において対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、または約９００ｍｇの１つまたは複数の用量において対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、または約１８００ｍｇの１つまたは複数の用量において対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、約１６００ｍｇの１つまたは複数の用量において対象に投与される。
【０２１４】
本明細書に記載される方法において使用される特定の投薬レジメン、すなわち、用量、時期および繰返しは、特定の対象およびその対象の治療歴に依存する。使用される抗ＢＣＭＡ抗体の適切な投与量は、治療されるがんの種類、疾患の重篤度および経過、先行する療法、患者の臨床歴および抗体への応答、ならびに主治医の自由裁量に依存する。抗体は、１つの時点においてまたは一連の治療にわたって患者に投与され得る。本開示の療法の進行は、従来の技術およびアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０２１５】
一部の実施形態では、本開示の療法の進行は、全奏効率［例えば、多発性骨髄腫についての国際骨髄腫作業部会（ＩＭＥＧ）の応答基準など］、応答の持続期間、無増悪生存期間、または全生存期間により測定されてもよい。ある特定の実施形態では、療法の持続は、フローサイトメトリーおよび／または定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により測定されてもよい。ある特定の実施形態では、本開示の療法の投与の後に炎症性マーカー、サイトカイン、および／またはケモカインが測定されてもよい。ある特定の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の血漿濃度が確認されてもよい。
【０２１６】
抗ＢＣＭＡ抗体の投与は、全身投与の他に、疾患の部位への（例えば、腫瘍への）直接的な投与など、任意の好適な経路により行われ得る。
【０２１７】
一部の実施形態では、方法は、１つの用量において対象に抗ＢＣＭＡ抗体（例えば、本明細書に開示される任意の抗ＢＣＭＡ抗体）を投与することを伴う。一部の実施形態では、方法は、複数の用量（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８つの用量）において対象に抗ＢＣＭＡ抗体を投与することを伴う。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、複数の用量において対象に投与され、抗ＢＣＭＡ抗体の第１の用量は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与の約１、２、３、４、５、６、または７日前に対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の第１の用量は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与の約２４〜４８時間前に対象に投与される。
【０２１８】
一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＡＣＴＲを発現する免疫細胞の投与の前に、およびその後約２週毎に対象に投与される。一部の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の最初の２つの用量は、約１週間（例えば、約６、７、８、または９日）の間隔で投与される。ある特定の実施形態では、３回目およびその後の用量は、約２週毎に投与される。
【０２１９】
本明細書に記載される任意の実施形態では、抗ＢＣＭＡ抗体の投与の時点はおおよそのものであり、指し示された日の３日前および３日後が挙げられる（例えば、３週毎の投与は、１８日目、１９日目、２０日目、２１日目、２２日目、２３日目、または２４日目の投与を包含する）。
【０２２０】
本明細書に記載される方法の有効性は、当技術分野において公知の任意の方法により評価されてもよく、医療分野の専門家には明らかと予想される。例えば、抗体ベースの免疫療法の有効性は、対象の生存によりまたは対象もしくはその組織もしくは試料中のがん負荷により評価されてもよい。一部の実施形態では、抗体ベースの免疫療法は、対象における療法（例えば、抗ＢＣＭＡ抗体およびＡＣＴＲコンストラクトを発現する免疫細胞の投与）の安全性または毒性に基づいて、例えば、対象の全体的健康および／または有害事象もしくは重篤な有害事象の存在により、評価される。
【０２２１】
Ｂ．併用治療
本開示に記載される組成物および方法は、がんのための他の種類の療法、例えば、化学療法、手術、放射線、遺伝子療法などと組み合わせて利用されてもよい。そのような療法は、本開示による免疫療法と同時にまたは逐次的に（任意の順序で）施され得る。
【０２２２】
追加の治療剤と共に投与される場合、各剤についての好適な治療的に効果的な投与量は、追加的な作用または相乗作用に起因して低下し得る。
【０２２３】
本開示の治療は、他の免疫調節治療、例えば、治療ワクチン（ＧＶＡＸ、ＤＣベースのワクチンなどが挙げられるがこれらに限定されない）、チェックポイント阻害剤（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３などを遮断する剤が挙げられるがこれらに限定されない）または活性化因子（４１ＢＢ、ＯＸ４０などを増進させる剤が挙げられるがこれらに限定されない）と組み合わせることができる。本開示の治療はまた、１つまたは複数の追加の薬剤と組み合わせてもよく、そのような薬剤としては、サリドマイド［Ｔｈａｌｏｍｉｄ（登録商標）］、サリドマイドの誘導体もしくはアナログ、例えば、レナリドミド［Ｒｅｖｌｉｍｉｄ（登録商標）］もしくはポマリドミド［Ｐｏｍａｌｙｓｔ（登録商標）／Ｉｍｎｏｖｉｄ（登録商標）］、ボルテゾミブ［Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）］、ＨＤＡＣ阻害剤、例えば、パノビノスタット［Ｆａｒｙｄａｋ（登録商標）］、イキサゾミブ［Ｎｉｎｌａｒｏ（登録商標）］、ダラツムマブ（ｄａｒａｔｕｍａｍａｂ）［Ｄａｒｚａｌｅｘ（登録商標）］、エロツズマブ［Ｅｍｐｌｉｃｉｔｉ（商標）］、ドキソルビシンＨＣｌ［Ｄｏｘｉｌ（登録商標）］、カルフィルゾミブ［Ｋｙｐｒｏｌｉｓ（登録商標）］、またはステロイドもしくはコルチコステロイド、例えば、デキサメタゾンおよびプレドニゾンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２４】
本開示の免疫療法との組合せのために有用な他の治療剤の非限定的な例としては、（ｉ）抗血管新生剤［例えば、ＴＮＰ−４７０、血小板因子４、トロンボスポンジン−１、メタロプロテアーゼ組織阻害剤（ＴＩＭＰ１およびＴＩＭＰ２）、プロラクチン（１６Ｋｄ断片）、アンジオスタチン（プラスミノーゲンの３８Ｋｄ断片）、エンドスタチン、ｂＦＧＦ可溶性受容体、トランスフォーミング増殖因子ベータ、インターフェロンアルファ、可溶性ＫＤＲおよびＦＬＴ−１受容体、胎盤プロリフェリン関連タンパク質の他に、Carmeliet and Jain (2000)に列記されているもの］；（ｉｉ）ＶＥＧＦアンタゴニストまたはＶＥＧＦ受容体アンタゴニスト、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ変異体、可溶性ＶＥＧＦ受容体断片、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの阻害剤およびこれらの任意の組合せ；ならびに（ｉｉｉ）化学療法化合物、例えば、ピリミジンアナログ（５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビンおよびシタラビン）、プリンアナログ、葉酸アンタゴニストおよび関連する阻害剤［メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよび２−クロロデオキシアデノシン（クラドリビン）］；抗増殖剤／抗有糸分裂剤、例えば、天然産物、例えば、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン）、微小管破壊剤、例えば、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチロン、およびナベルビン、エピジポドフィロトキシン（ｅｐｉｄｉｐｏｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）（エトポシドおよびテニポシド）、ＤＮＡ損傷剤［アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチフネラミン（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｈｎｅｌａｍｉｎｅ）、オキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メクロレタミン（ｍｅｒｃｈｌｏｒｅｈｔａｍｉｎｅ）、マイトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテール、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびエトポシド（ＶＰ１６）］；抗生物質、例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン；酵素（全身的にＬ−アスパラギンを代謝し、それら自身のアスパラギンを合成する能力を有しない細胞を除去するＬ−アスパラギナーゼ）；抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミドおよびアナログ、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ）、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア［カルムスチン（ＢＣＮＵ）��よびアナログ、ストレプトゾシン］、トラゼン（ｔｒａｚｅｎｅｓ）−ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｉｎｅ）（ＤＴＩＣ）；抗増殖性／抗有糸分裂性代謝拮抗物質、例えば、葉酸アナログ（メトトレキサート）；白金配位複合体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモンアナログ（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）およびアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩およびトロンビンの他の阻害剤）；線維素溶解剤（組織プラスミノーゲン活性化剤、ストレプトキナーゼおよびウロキナーゼなど）、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤［ブレベルジン（ｂｒｅｖｅｌｄｉｎ）］；免疫抑制剤［シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル］；抗血管新生化合物（例えば、ＴＮＰ−４７０、ゲニステイン、ベバシズマブ）および成長因子阻害剤［例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）阻害剤］；アンギオテンシン受容体ブロッカー；一酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤および分化誘導剤（トレチノイン）；ｍＴＯＲ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤［ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド（ｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、ミトキサントロン、トポテカン、およびイリノテカン］、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、およびプレドニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能障害誘導剤およびカスパーゼ活性化因子；ならびにクロマチン破壊剤が挙げられる。
【０２２５】
追加の有用な剤の例について、Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.Jも参照されたい。
【０２２６】
Ｖ．治療的使用のためのキット
本開示はまた、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性の増進および抗体ベースの免疫療法の増進における抗ＢＣＭＡ抗体および抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団の使用のためのキットを提供する。そのようなキットは、抗ＢＣＭＡ抗体および薬学的に許容される担体を含む第１の医薬組成物、ならびに本明細書に記載されるものなどの抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球および／またはＮＫ細胞の集団を含む第２の医薬組成物を含む１つまたは複数の容器を含んでもよい。Ｔリンパ球および／またはＮＫ細胞の集団は、共刺激ドメインまたは共刺激因子のリガンドを含む外因性ポリペプチドをさらに発現してもよい。
【０２２７】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意の方法において使用するための使用説明書を追加的に含むことができる。含まれる使用説明書は、対象において意図する活性を達成するため、例えば、ＡＤＣＣ活性を増進させるため、および／または抗体ベースの免疫療法の有効性を増進させるための、対象への第１および第２の医薬組成物の投与の説明を含んでもよい。キットは、対象が治療を必要とするかどうかの同定に基づいて治療のために好適な対象を選択することの説明をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、使用説明書は、治療を必要とする対象への第１および第２の医薬組成物の投与の説明を含む。
【０２２８】
本明細書に記載される第１および第２の医薬組成物の使用に関する使用説明書は、一般に、意図する治療のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）または部分単位用量であってもよい。本開示のキット中に提供される使用説明書は、典型的に、ラベルまたはパッケージ挿入物上の書面による使用説明書である。ラベルまたはパッケージ挿入物は、医薬組成物が、対象における疾患または障害の治療、発症の遅延、および／または軽減のために使用されることを指し示す。
【０２２９】
本明細書において提供されるキットは、好適なパッケージングに含まれる。好適なパッケージングとしては、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟性パッケージングなどが挙げられるがこれらに限定されない。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス、または注入デバイスと組み合わせた使用のためのパッケージも想定される。キットは、無菌アクセスポート（例えば、容器は、皮下注射針により貫通可能な止め具を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであってもよい）を有してもよい。容器もまた、無菌アクセスポートを有してもよい。第１の医薬組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載される抗ＢＣＭＡ抗体である。第２の医薬組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載される抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）コンストラクトを発現するＴリンパ球またはＮＫ細胞の集団である。
【０２３０】
キットは、適宜、緩衝剤および説明情報などの追加のコンポーネントを提供してもよい。通常、キットは、容器および容器上または容器に付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含む。一部の実施形態では、本開示は、上記されるキットの内容物を含む製品を提供する。
【０２３１】
一般技術
本開示の実施は、別に指し示さない限り、当技術分野の技術的範囲内である、分子生物学（組換え技術など）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986); and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)などの文献中に充分に説明されている。
【０２３２】
当業者は、上記の記載に基づいて、さらなる詳述がなくとも本開示を最大限利用できると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単に説明的なものとして解されるべきであり、いかなる意味でも本開示の他の部分を限定するものとして解されるべきではない。本明細書において参照される全ての刊行物は、参照により本明細書で参照した目的または主題のために組み込まれる。
【実施例１】
【０２３３】
多発性骨髄腫細胞株の表面上および患者試料におけるＢＣＭＡの発現
５つの異なる多発性骨髄腫細胞株の表面上のＢＣＭＡの発現をフローサイトメトリーにより決定した。図１のパートＡにおいて、ＢＳＡ（染色緩衝液）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株を２回洗浄した後、４℃で３０分間１０μｇ／ｍＬのＳＧ１６．１７とインキュベートした。この後に、染色緩衝液中で２回洗浄し、４℃で３０分間ＰＥ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２二次抗体をインキュベートした。染色緩衝液中での２回の洗浄後、フローサイトメトリーを介してＰＥ検出を行った。各細胞株についてのＰＥシグナルの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）をグラフ化している。図１のパートＢにおいて、ＭＭ患者由来骨髄単核細胞（ＢＭＭＣ）と共にＫＭＳ−２０、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１細胞に対してフローサイトメトリーを介してＢＣＭＡの表面発現染色を再度実行した。この実験では、ＭＭ血漿細胞集団内のＢＣＭＡの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を３つの多発性骨髄腫細胞株および２つの患者ＢＭＭＣ試料の間で比較した。患者由来ＢＭＭＣ（ＭＭ＃１およびＭＭ＃２）を解凍し、染色緩衝液中で２回洗浄した後、４℃で３０分間Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｅＦｌｕｏｒ−７８０色素を用いて染色した。生／死細胞染色の後、細胞を２回洗浄し、ＡＦ４８８共役抗ヒトＣＤ３８抗体、抗ヒトＣＤ１３８  Ｖ４５０、抗ヒトＣＤ４５  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ６０５、抗ヒトＩｇＧ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ７１１、抗ＣＤ１９−ＰＥ、抗ＣＤ５６  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、抗ＣＤ２７−ＢＶ５１０、およびＡＦ６４７共役ＳＧ１６．１７抗ＢＣＭＡ抗体からなる１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。染色後、細胞を再び染色緩衝液を用いて２回洗浄し、フローサイトメトリーを介して染色を検出した。ダブレット排除および死細胞排除後に多発性骨髄腫細胞株およびＭＭ患者由来ＢＭＭＣに対するフローサイトメトリーゲーティングを行った。
【実施例２】
【０２３４】
ＳＧ１６．１７および非フコシル化（ＳＥＡ）ＳＧ１６．１７抗体へのＡＣＴＲ  Ｔ細胞の結合
配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するコンストラクトをコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。このウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。
【０２３５】
これらのＡＣＴＲ  Ｔ細胞に結合する抗体の能力をフローサイトメトリーを介して評価した。ＡＣＴＲ形質導入Ｔ細胞を３７℃で３０分間ＸＶＩＶＯ−１５培地中で様々な濃度のキメラ（図２、パートＡ）およびヒト化（図２、パートＢ）型のＳＧ１６．１７およびＳＧ１６．１７ＳＥＡ（非フコシル化）抗体と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を氷上に置き、細胞染色緩衝液を用いて２回洗浄した後、ＰＥ共役ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ’）２抗体および抗ヒトＣＤ１６−ＡＰＣからなる抗体カクテルを用いて４℃で３０分間染色した。染色緩衝液中での２回の洗浄後、フローサイトメトリーを介して検出を行った。ＣＤ１６＋ＡＣＴＲ  Ｔ細胞内のＰＥシグナルの幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）を図２に表す。これらの結果は、非フコシル化（ＳＥＡ）型のＳＧ１６．１７抗体は、キメラ型およびヒト化型の両方についてフコシル化抗体と比較した時に増加した結合または見かけの親和性を有したことを実証する。
【実施例３】
【０２３６】
ＡＣＴＲ  Ｔ細胞に連結された様々なＢＣＭＡ抗体の存在下での多発性骨髄腫細胞株の細胞傷害性
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、４６〜５６％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。これらの細胞を、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２３７】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地を含む２００μＬの反応容量において配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を増加させた濃度の様々なキメラ抗ＢＣＭＡ抗体（図３、パートＡおよびＢ）、ヒト化抗ＢＣＭＡ抗体クローン（図５、パートＡおよびＢ）、またはＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２に示されるＮＣＩマウスＢＣＭＡ  ＣＡＲ配列に由来する抗ＢＣＭＡ抗体（図６、パートＡおよびＢ）と共に４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。分析したキメラおよびヒト化抗体は、フコシル化および非フコシル化（「ＳＥＡ」として表示する）型のＳＧ１６．１７およびＳＧ１６．４５抗ＢＣＭＡ抗体を含んだ。反応物を３７℃で２４または４８時間ＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。等容量のＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を加えた後、室温で１０分間インキュベートした。ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して発光を測定した。所与の試料の発光シグナルを抗体の非存在下での発光シグナルで割り、１００倍することにより生細胞のパーセンテージを決定した。生細胞のパーセンテージを１００から引くことにより細胞傷害性パーセントを決定した。次いで、抗体特異的細胞傷害性のパーセンテージ（％）を抗体濃度の関数としてプロットした。
【０２３８】
図３において、増加させた濃度の４つのキメラ抗ＢＣＭＡ抗体の１つの存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞との共培養の２４および４８時間後の（Ａ）ＮＣＩ−Ｈ９２９および（Ｂ）Ｕ２６６Ｂ１標的細胞の細胞傷害性の用量依存的な増加を結果は実証した。さらに、非フコシル化（ＳＥＡ）型のキメラ抗体（ｃＳＧ１６．１７ＳＥＡおよびｃＳＧ１６．４５ＳＥＡ）は、フコシル化抗体と比較した時に増加した細胞傷害性を実証した。図５のパートＡにおいて、ＳＧ１６．１７の示したヒト化クローンの３つ全ては、キメラＳＧ１６．１７抗体より良好でないとしても（クローン＃９および＃１０）、同様に働くことを結果は実証した。図５のパートＢにおいて、ＳＧ１６．４５の３つ全てのヒト化クローンは、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞を用いてのキメラＳＧ１６．４５抗体と同様に働くことを結果は実証した。図６において、ヒト化非フコシル化ＢＣＭＡ抗体ＳＧ１６．１７ＳＥＡは、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図６、パートＡ）およびＵ２６６Ｂ１（図６、パートＢ）の両方の多発性骨髄腫細胞株についてＷＯ２０１０１０４９４９Ａ２に示されるＮＣＩマウスＢＣＭＡ配列に由来する抗ＢＣＭＡ抗体と比較した時に増加した細胞傷害性を実証することを結果は実証した。類似の結果がＲＰＭＩ−８２２６多発性骨髄腫細胞を用いて得られた。
【実施例４】
【０２３９】
ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞にオプソニン化された様々なＢＣＭＡ抗体の存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞のサイトカイン放出
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、４６〜４９％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。これらの細胞をＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞との共培養アッセイにおいて使用し、サイトカイン分析のために上清を回収した。
【０２４０】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度の様々なキメラ抗体と共に配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。図４において、キメラ抗体は、１００〜０．０００５μｇ／ｍＬの濃度範囲のフコシル化および非フコシル化（ＳＥＡ）型のＳＧ１６．１７およびＳＧ１６．４５抗ＢＣＭＡ抗体を含んだ。図９において、ヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）ＳＧ１６．１７抗体を３．８〜０．００２μｇ／ｍＬの濃度範囲において使用した。２４時間後、反応容量の半分（１００μＬ）を回収し、−２０℃で冷凍した。その後に、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｋ１５１ＱＯＤ−４）およびＶ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  Ｋｉｔ（Ｋ１５１ＱＱＤ−４）を使用してＩＦＮγおよびＩＬ２について上清を分析した。簡潔に述べれば、炎症促進性キャリブレーターブレンド、検出抗体溶液、およびリード緩衝液を製造者のプロトコールに従って調製した。共培養上清を氷上で解凍し、１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中に適切に希釈した。５０μＬの希釈試料またはキャリブレーターをＭＳＤプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。２５μＬの検出抗体溶液をプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水を用いてプレートを３回洗浄した。リード緩衝液（１５０μＬ）をプレートに加え、プレートをＭＳＤ  Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０により処理した。
【０２４１】
ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞上のオプソニン化された全てのキメラおよびヒト化抗体は、増加させた抗体濃度と共に増加したＡＣＴＲ  Ｔ細胞ＩＦＮγ（図４、パートＡ；図９）およびＩＬ２（図４、パートＢ；図９）放出を誘導した。ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞をＭｏｃｋ  Ｔ細胞と共にインキュベートした時に、最小の細胞傷害性、ＩＦＮγおよびＩＬ２放出が観察された（データ示さず）。これらの結果は、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞はオプソニン化標的細胞を用いて抗ＢＣＭＡ抗体濃度依存的な様式でサイトカインを分泌できたことを実証する。非フコシル化（ＳＥＡ）型の抗体（ＳＧ１６．１７ＳＥＡおよびＳＧ１６．４５ＳＥＡ）は、それらのフコシル化対応物と比較した時にサイトカイン放出の増加した力価を実証した。
【実施例５】
【０２４２】
ＢＣＭＡ発現骨髄腫細胞株および増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下でのＪｕｒｋａｔレポーター細胞株の活性化
Ｊｕｒｋａｔ細胞を活性化させる抗ＢＣＭＡ抗体オプソニン化標的細胞の能力を、Ｔ細胞活性化を反映するＪｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイにおいて分析した。活性化Ｔ細胞核内因子（ＮＦＡＴ）コンセンサス結合部位の最小ＣＭＶプロモーターエレメントおよび縦列反復配列の下流のホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスを用いてＪｕｒｋａｔ細胞への形質導入を行った。この細胞株において、細胞活性化のマーカーであるＮＦＡＴ転写因子の上方調節は、転写応答エレメントへの結合、および、ルシフェリン基質のルシフェラーゼ切断後の発光を測定することによりモニターしたルシフェラーゼのその後の発現を結果としてもたらした。そのため、ルシフェラーゼ発現は細胞活性化を反映する。この細胞株をＪｕｒｋａｔ−Ｎと称する。
【０２４３】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地中、１００μＬの反応容量においてＪｕｒｋａｔ−Ｎ細胞をＮＣＩ−Ｈ９２９、Ｕ２６６Ｂ１、ＲＰＭＩ−８２２６、ＯＰＭ−２およびＭＭ１ｓ細胞などのＢＣＭＡ陽性標的ＭＭ細胞と１：１の比で混合した。表面ＢＣＭＡ陰性白血病細胞株であるＫ５６２を対照として使用した。反応物を３〜０．００４μｇ／ｍＬのヒト化ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体の存在下、３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中で５時間インキュベートした。５時間のインキュベーション後、ｂｒｉｔｅｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ試薬（１００μＬ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を加えて細胞を溶解し、ルシフェリン基質を加えた。次いで、反応物を暗所で１０分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ；Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用して発光を測定した。
【０２４４】
配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するレトロウイルスを用いて形質導入したＪｕｒｋａｔ−Ｎ細胞（Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ−ＡＣＴＲ）からの結果を図７のパートＡに示す。ＡＣＴＲ発現を欠くＪｕｒｋａｔ−Ｎ細胞からの結果を陰性対照として使用し、これを図７のパートＢに示す。
【０２４５】
発光シグナルの増加により立証されるように、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体およびＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株の存在下でＪｕｒｋａｔ−Ｎ  ＡＣＴＲ細胞のロバストな活性化が観察され、発光の増加は、表面ＢＣＭＡ発現を欠く白血病細胞株であるＫ５６２細胞では観察されなかった（図７、パートＡ）。さらに、ＡＣＴＲを欠くＪｕｒｋａｔ−Ｎ細胞は、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体および標的細胞の存在下で発光の増加を実証しなかった（図７、パートＢ）。これらの結果は、表面ＢＣＭＡを発現する標的細胞のみがＢＣＭＡ標的化抗体の存在下でＡＣＴＲを発現するＪｕｒｋａｔ−Ｎ細胞の活性化を促進することを実証した。さらには、標的化抗体の非存在下において（ベースシグナル；点線）、Ｊｕｒｋａｔ−Ｎ−ＡＣＴＲ細胞の活性化は観察されなかった（図７、パートＡ）。
【実施例６】
【０２４６】
ＡＣＴＲ  Ｔ細胞に連結されたヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）ＢＣＭＡ抗体の存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１多発性骨髄腫細胞株の細胞傷害性
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、４６％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞およびＡＣＴＲ  Ｔ細胞の両方を、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２４７】
図８において、１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度のヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）抗ＢＣＭＡ抗体ＳＧ１６．１７と共に配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。実施例３におけるように標的細胞の発光を測定し、細胞傷害性パーセントを決定した。
【０２４８】
ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞の細胞傷害性の増加が、細胞を配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞および増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡと２４および４８時間共培養した時に観察された（図８）。ベースの細胞傷害性は抗体の非存在下でＭｏｃｋ  Ｔ細胞を用いた場合に低かったので、細胞傷害性のこの増加は抗体依存的であり、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。
【実施例７】
【０２４９】
ヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）抗ＢＣＭＡ抗体およびＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株の存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、３３％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞（図１０、パートＡ、Ｃ、およびＤ）およびＭｏｃｋ  Ｔ細胞（図１０、パートＢ）の両方を、ＢＣＭＡ発現ＭＭ標的細胞株ＮＣＩ−Ｈ９２９（図１０、パートＡおよびＢ）；Ｕ２６６Ｂ１（図１０、パートＣ）、およびＲＰＭＩ−８２２６（図１０、パートＤ）を用いる増殖アッセイにおいて使用した。
【０２５０】
１０％のウシ胎児血清および２５Ｕ／ｍＬのＩＬ２を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度のヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）ＢＣＭＡ抗体と共に配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を１：１のエフェクター対標的比（３０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を３７℃で７日間ＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。生ＣＤ３＋Ｔ細胞の数を１日目および７日目に決定し、Ｔ細胞のインプット数（点線）と比較した。簡潔に述べれば、１日目および７日目に、細胞を染色緩衝液を用いて２回洗浄した後、４℃で３０分間Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｅＦｌｕｏｒ−７８０色素を用いて染色した。生／死細胞染色剤中でインキュベートした後、細胞を２回洗浄した後に、ＡＦ４８８共役抗ヒトＣＤ３抗体およびＡＦ６４７共役抗ヒトＣＤ１６抗体からなる１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。染色後、再び染色緩衝液を用いて細胞を２回洗浄した後に、フローサイトメトリーを介して染色を検出した。ダブレット排除および死細胞排除後にＣＤ３＋Ｔリンパ球に対するフローサイトメトリーゲーティングを行った。
【０２５１】
図１０において、結果は、増加させた濃度のヒト化ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下でのＢＣＭＡ陽性標的細胞との共培養の７日後における配列番号１のＡＣＴＲ変異体のＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖の増加を実証する。ベースの増殖は抗体の非存在下でＭｏｃｋ  Ｔ細胞を用いた場合に低かったので、Ｔ細胞増殖の増加は抗体依存的であり、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。恐らく同種刺激に起因して、一部のベースの増殖（抗体の非存在）がＵ２６６Ｂ１細胞を用いて観察された。ＡＣＴＲ＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ３＋Ｔ細胞と同じ傾向に従う（データ示さず）。
【実施例８】
【０２５２】
ヒト化非フコシル化（ＳＥＡ）抗ＢＣＭＡ抗体およびＢＣＭＡ発現多発性骨髄腫細胞株の存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、６３％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞およびＭｏｃｋ  Ｔ細胞の両方を、ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞株およびＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞などの標的細胞を用いる再刺激またはＴ細胞増殖アッセイにおいて使用した。
【０２５３】
１０％のウシ胎児血清および２５Ｕ／ｍｌのＩＬ２を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において０．１μｇ／ｍＬのヒト化ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡと共にＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を１：１のエフェクター対標的比（３０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。実施例７に記載の方法と類似の方法で生／死染色剤および抗ＣＤ３抗体を用いて染色することにより、３〜４日毎に、生ＣＤ３＋Ｔ細胞数をフローサイトメトリーにより測定し、ＡＣＴＲ＋細胞を測定するために抗ＣＤ１６抗体を用いる細胞の染色も行った。ＣＤ３＋Ｔ細胞数に基づいて３〜４日毎にＴ細胞を標的細胞を用いて１：２の比で再刺激し、０．１μｇ／ｍＬのヒト化ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡもまた各再刺激において加えた。
【０２５４】
配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いた結果を図１１に示し、これは、０．１μｇ／ｍＬのヒト化ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下で、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞を用いて再刺激した時にＣＤ３＋Ｔ細胞の２８日目における増殖を実証するが、ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞を用いた時にはそれを実証しない。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞を用いて観察されなかったので、Ｔ細胞増殖の増加はＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。ＡＣＴＲ＋Ｔ細胞の増殖は、ＣＤ３＋Ｔ細胞と同じ傾向に従う（データ示さず）。
【実施例９】
【０２５５】
ＮＳＧマウスにおける多発性骨髄腫の皮下ＮＣＩ−Ｈ９２９モデルにおけるｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体と組み合わせたＡＣＴＲ  Ｔ細胞
雌ＮＳＧマウスの脇腹に１：１のマトリゲル：無血清培地（１×１０５細胞／マウス）中のＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の懸濁液を接種することにより皮下ＮＣＩ−Ｈ９２９  ＭＭ異種移植モデルを確立した。平均腫瘍体積が８０〜１００ｍｍ３に達した時に、マウスを処置群に無作為化した。各処置群は５または１０匹のマウスを有し、処置群は以下の通りであった：媒体（ＰＢＳ単独）、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体単独、配列番号１のＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞単独、およびｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体と組み合わせた配列番号１のＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞。ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体で処置した群には４週にわたり週に１回マウス当たり１００μｇの抗体を投与し（ＱＷｘ４、図１２のグラフ上で点線の鉛直の線により表される）；ＡＣＴＲ  Ｔ細胞で処置した群には２週にわたり週に１回マウス当たり１×１０７個の細胞を投与した（ＱＷｘ２、図１２のグラフ上で灰色の矢印により表される）。マウスを連日モニターし、体重および腫瘍体積測定を試験の継続期間にわたり週に２回行った。腫瘍体積が１０００ｍｍ３を超えた時にマウスを安楽死させた。図１２のパートＡにおいて、平均腫瘍体積を異なる処置アームのマウスについて時間の関数としてプロットした。データは、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡと組み合わせたＡＣＴＲ  Ｔ細胞が、いずれかの単剤単独よりも大きい腫瘍成長阻害を誘導することを実証した。試験において残っているマウスのパーセンテージを異なる処置アームのマウスの予め定義された腫瘍体積エンドポイントまでの時間の関数としてプロットした（図１２、パートＢ）。ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体と組み合わせたＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いる処置は、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体単独と比較した時に、予め定義された腫瘍体積エンドポイントまでの時間を長期化させた。
【実施例１０】
【０２５６】
ＡＣＴＲ  Ｔ細胞および抗ＢＣＭＡ抗体の増加させたＥ：Ｔ比に伴うＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１多発性骨髄腫細胞株の細胞傷害性
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、４９％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。これらの細胞を、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２５７】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において１０μｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ抗体の存在下でＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を様々なエフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）細胞比でインキュベートした（図１３）。抗体は、フコシル化および非フコシル化（ＳＥＡ）型の２つの抗ＢＣＭＡ抗体（ＳＧ１６．１７およびＳＧ１６．４５）を含んだ。反応物を、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（図１３、パートＡ）について２４時間またはＵ２６６Ｂ１細胞（図１３、パートＢ）について４８時間３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。実施例３におけるように標的細胞の発光を測定し、細胞傷害性パーセントを決定した。
【０２５８】
配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いた結果を図１３に示し、これは、固定濃度の４つの抗ＢＣＭＡ抗体の存在下で増加させた数のＡＣＴＲ  Ｔ細胞を用いてＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞の細胞傷害性の増加を実証した。非フコシル化（ＳＥＡ）型のキメラ抗体（ｃＳＧ１６．１７ＳＥＡおよびｃＳＧ１６．４５ＳＥＡ）は、フコシル化抗体と比較して力価の増加を実証した。アイソタイプ抗体の存在下でＭｏｃｋ  Ｔ細胞を用いてベースの細胞傷害性は、両方の標的細胞株において非常に低いことが観察された。
【実施例１１】
【０２５９】
抗ＢＣＭＡ抗体オプソニン化ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１多発性骨髄腫細胞株の存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞の活性化
実施例２に記載した通りにＡＣＴＲ  Ｔ細胞を生成させた。ＣＤ１６発現についての抗体染色後のフローサイトメトリーにより、４６％のＴ細胞がＡＣＴＲを発現することが実証された。
【０２６０】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において１μｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ抗体と共にＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を１：１のエフェクター対標的比（３０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を２４時間３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。２つの活性化マーカーＣＤ２５およびＣＤ６９の幾何平均蛍光強度（ｇＭＦＩ）をフローサイトメトリーを介して全ＣＤ３＋ＣＤ１６＋ＡＣＴＲ  Ｔ細胞ゲートにおいて決定した。簡潔に述べれば、細胞を染色緩衝液中で２回洗浄した後、４℃で３０分間Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｅＦｌｕｏｒ−４５０色素を用いて染色した。生／死細胞染色剤中でインキュベートした後、細胞を２回洗浄した後に、ＡＦ４８８共役抗ヒトＣＤ３抗体、ＡＰＣ共役抗ヒトＣＤ１６抗体、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５共役抗ヒトＣＤ２５抗体、およびＢＶ５１０共役抗ヒトＣＤ６９抗体からなる１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。その後に、細胞を２回洗浄し、固定し、透過処理し、細胞内分子について染色した後、フローサイトメトリーを介して検出を行った。ダブレットおよび死細胞排除後にＣＤ３＋ＣＤ１６＋ＡＣＴＲ  Ｔ細胞に対するフローサイトメトリーゲーティングを行った。
【０２６１】
配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いた結果を図１４に示し、これは、抗ＢＣＭＡ抗体の存在下でＢＣＭＡ陽性標的細胞、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１と共培養した時に、２４時間でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞上の活性化マーカーＣＤ２５（図１４、パートＡ）およびＣＤ６９（図１４、パートＢ）のレベルの有意な増加を実証した。非フコシル化（ＳＥＡ）型の抗体（ｃＳＧ１６．１７ＳＥＡおよびｃＳＧ１６．４５ＳＥＡ）と共にインキュベートしたＡＣＴＲ  Ｔ細胞は、それらのフコシル化対応物とのインキュベーションと比較した時にＣＤ２５およびＣＤ６９の発現の増進を実証した。アイソタイプ対照抗体は、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞の存在下でＡＣＴＲ  Ｔ細胞の最小の活性化を誘導したか、または活性化を誘導しなかった。
【実施例１２】
【０２６２】
ＢＣＭＡ陽性およびＢＣＭＡ陰性標的細胞の存在下でのｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ連結ＡＣＴＲ  Ｔ細胞のサイトカイン産生の特異性
増加させた濃度の抗ＢＣＭＡ（ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ）または抗ＨＥＲ２（トラスツズマブ）標的化抗体の存在下でＡＣＴＲまたはｍｏｃｋ  Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を４：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。これらの実験のために、ＢＣＭＡ＋ＨＥＲ２−  ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＢＣＭＡ−  ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３標的細胞を使用した。３７℃／５％のＣＯ２インキュベーター中での２４時間のインキュベーション後に細胞上清を回収した。その後、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｋ１５１ＱＯＤ−４）を使用してＩＦＮγについて上清を分析した。簡潔に述べれば、炎症促進性キャリブレーターブレンド、検出抗体溶液、およびリード緩衝液を製造者のプロトコールに従って調製した。共培養上清を氷上で解凍し、１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中に適切に希釈した。５０μＬの希釈試料またはキャリブレーターをＭＳＤプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。２５μＬの検出抗体溶液をプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水を用いてプレートを３回洗浄した。リード緩衝液（１５０μＬ）をプレートに加え、プレートをＭＳＤ  Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０により処理した。
【０２６３】
配列番号１のＡＣＴＲを発現するＴ細胞を、増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体およびＢＣＭＡ＋ＨＥＲ２−  ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞と共にインキュベートした時に、ＩＦＮγ産生の濃度依存的な増加が観察され（図１５、パネルＡ）、配列番号１のＡＣＴＲを発現するＴ細胞を、増加させた濃度のＨＥＲ２標的化トラスツズマブ抗体およびＢＣＭＡ−  ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３標的細胞と共にインキュベートした時に類似の結果が観察された（図１５、パネルＢ）。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞は、ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体およびＢＣＭＡ−  ＨＥＲ２＋ＳＫＢＲ３細胞の存在下で最小のＩＦＮγを産生し（図１５、パネルＢ）、観察されたサイトカイン産生は標的特異的であることを実証した。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞はまた、トラスツズマブおよびＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の存在下で最小のＩＦＮγを産生し（図１５、パネルＡ）、観察されたエフェクター機能は抗ＢＣＭＡ  ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体に特異的であることを実証した。これらの実験は、ＡＣＴＲ発現Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生は、マッチした抗体−標的ペアに依存することを実証する。
【実施例１３】
【０２６４】
増加させたエフェクター対標的細胞比の存在下でのＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞の細胞傷害性
配列番号５７または配列番号５８のＡＣＴＲ変異体をコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。これらのウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこれらのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。その後、これらの細胞を、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞およびＢＣＭＡ標的化ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用した。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させ、この実験において対照として使用した。
【０２６５】
１μｇ／ｍＬのｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下でＴ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞（標的；Ｔ）を様々なエフェクター対標的比でインキュベートした。反応物を４４時間３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした後、フローサイトメトリー染色を行った。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄した後、固定可能な生体染色色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）を用いて染色した。細胞を再びＰＢＳを用いて洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８共役抗ヒトＣＤ３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７共役抗ヒトＣＤ１６、およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５共役抗ヒトＣＤ２５抗体を含有する１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。３０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメーターによりデータを取得した。生体染色色素陰性のＣＤ３−  ＣＤ１６−細胞をゲーティングすることにより生標的細胞数を決定した。所与の試料からの生標的細胞数を標的細胞単独のウェル中の生標的細胞数で割ることにより生標的細胞のパーセンテージを決定した。１００から生細胞パーセントを引くことにより細胞傷害性パーセントを決定した。細胞傷害性パーセントをＥ：Ｔ比の関数としてプロットした（図１６）。
【０２６６】
ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞およびｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下で培養した時に、配列番号５７のＡＣＴＲ変異体（図１６、パネルＡ）および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体（図１６、パネルＢ）を発現するＡＣＴＲ  Ｔ細胞について細胞傷害性のＴ細胞用量依存的な増加が観察された。抗体の非存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞ならびに抗体の非存在下および存在下でのｍｏｃｋ  Ｔ細胞は、最小の細胞傷害性を実証した（図１６、パネルＡおよびＢ）。
【実施例１４】
【０２６７】
増加させたエフェクター対標的細胞比の存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカーの上方調節
配列番号５７または配列番号５８のＡＣＴＲ変異体をコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。これらのウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこれらのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。その後、これらの細胞を、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞およびＢＣＭＡ標的化ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体を用いる活性化アッセイにおいて使用した。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させ、この実験において対照として使用した。
【０２６８】
１μｇ／ｍＬのｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下でＴ細胞（エフェクター；Ｅ）およびＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞（標的；Ｔ）を様々なエフェクター対標的比でインキュベートした。反応物を４４時間３７℃のＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした後、フローサイトメトリー染色を行った。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳを用いて２回洗浄した後、固定可能な生体染色色素を用いて染色した。細胞を再びＰＢＳを用いて洗浄した後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８共役抗ヒトＣＤ３、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７共役抗ヒトＣＤ１６、およびＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５共役抗ヒトＣＤ２５抗体を含有する１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。３０分のインキュベーション後、細胞を２回洗浄し、フローサイトメーターによりデータを取得した。ＣＤ２５の幾何平均蛍光強度をＣＤ３＋Ｔ細胞ゲート内で算出し、Ｅ：Ｔ比の関数としてプロットした（図１７）。
【０２６９】
配列番号５７のＡＣＴＲ変異体（図１７、パネルＡ）および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体（図１７、パネルＢ）を発現するＴ細胞は、抗体の非存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞と比べてＣＤ２５発現の増加を示した。同様に、抗体の非存在下でＡＣＴＲ  Ｔ細胞上にならびに抗体の非存在下および存在下でｍｏｃｋ  Ｔ細胞上に低いレベルのＣＤ２５が観察された。
【実施例１５】
【０２７０】
ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ連結ＡＣＴＲ  Ｔ細胞の細胞傷害性はＢＣＭＡ陽性標的細胞の存在下で濃度依存的であるがＢＣＭＡ陰性標的細胞の存在下で濃度依存的でない
配列番号５７または配列番号５８のＡＣＴＲ変異体をコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。これらのウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこれらのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞およびＡＣＴＲ変異体Ｔ細胞の両方を、ホタルルシフェラーゼを構成的に発現するＮＣＩ−Ｈ９２９およびＫ５６２標的細胞を用いる細胞傷害性アッセイにおいて使用した。
【０２７１】
図１８において、１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度のヒト化非フコシル化抗ＢＣＭＡ抗体ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡと共にＴ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を４：１のエフェクター対標的比（３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を４８時間５％のＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートした。実施例３に記載した通りに標的細胞の発光を測定し、細胞傷害性パーセントを決定した。
【０２７２】
ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞および増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下で配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いて標的細胞の細胞傷害性の増加が観察された（図１８、パネルＡ）。ＢＣＭＡ陰性Ｋ５６２細胞および増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下で配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いて細胞傷害性の増加は観察されなかった（図１８、パネルＢ）。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞の存在下で最小の細胞傷害性が観察されたので、このＮＣＩ−Ｈ９２９細胞傷害性は抗体依存的およびＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。ＢＣＭＡ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞を用いて類似の結果が観察された（データ示さず）。
【実施例１６】
【０２７３】
ＢＣＭＡ発現ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞にオプソニン化されたｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞のサイトカイン放出
配列番号５７または配列番号５８のＡＣＴＲ変異体をコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。これらのウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこれらのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。これらのエフェクター細胞を、ＢＣＭＡ陽性の、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１標的細胞を用いる共培養アッセイにおいて使用し、図１９におけるサイトカイン分析のために上清を回収した。
【０２７４】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体（０〜３μｇ／ｍＬ）と共にＭｏｃｋまたはＡＣＴＲ  Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を４：１のエフェクター対標的比（１２０，０００個のＴ細胞；３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を４８時間５％のＣＯ２のインキュベーター中３７℃でインキュベートした。反応容量の半分（１００μＬ）を回収し、−２０℃で冷凍した。その後、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  Ｋｉｔ（Ｋ１５１ＱＯＤ−４）およびＶ−Ｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２  Ｋｉｔ（Ｋ１５１ＱＱＤ−４）を使用してＩＦＮγおよびＩＬ２について上清を分析した。簡潔に述べれば、炎症促進性キャリブレーターブレンド、検出抗体溶液、およびリード緩衝液を製造者のプロトコールに従って調製した。共培養上清を氷上で解凍し、１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中に適切に希釈した。５０μＬの希釈試料またはキャリブレーターをＭＳＤプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。次いで、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのＰＢＳを用いてプレートを３回洗浄した。２５μＬの検出抗体溶液をプレートに加え、プレートを密閉し、暗所中で２時間、６００×ｇのシェーカー上でインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有する１５０μＬのリン酸緩衝生理食塩水を用いてプレートを３回洗浄した。リード緩衝液（１５０μＬ）をプレートに加え、プレートをＭＳＤ  Ｑｕｉｃｋｐｌｅｘ  ＳＱ  １２０により処理した。
【０２７５】
配列番号５７および配列番号５８のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞は、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡおよびＮＣＩ−Ｈ９２９の存在下で抗体依存的および抗体濃度依存的なＩＦＮγ（図１９、パネルＡ）およびＩＬ２（図１９、パネルＢ）放出を示した。ｍｏｃｋ  Ｔ細胞を用いて低いサイトカイン放出が観察されたか、サイトカイン放出は観察されなかった。これらの結果は、ＡＣＴＲ  Ｔ細胞は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞を用いてＡＣＴＲ特異的、抗体依存的およびｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ濃度依存的様式でサイトカインを分泌できることを実証した。ＢＣＭＡ発現Ｕ２６６Ｂ１細胞の存在下で類似の結果が観察された（データ示さず）。
【０２７６】
類似の実験において、ＮＣＩ−Ｈ９２９およびＵ２６６Ｂ１  ＢＣＭＡ陽性標的細胞株の両方と共に追加のＡＣＴＲ変異体を用いてＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出も観察された。これらの実験において１μｇ／ｍＬのｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ抗体を用いて観察されたＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出は表６および表７に見出すことができる。これらの実験は、複数のＡＣＴＲ変異体がＢＣＭＡ陽性標的細胞株の存在下でｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ依存的なサイトカイン放出を示したことを実証する。
【０２７７】
【表６】
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【０２７８】
【表７】
2020507604.tif 000078
【実施例１７】
【０２７９】
ＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫細胞株の存在下でのｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ連結ＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖
配列番号５７のＡＣＴＲ変異体をコードするガンマ−レトロウイルスを生成させた。これらのウイルスを使用して初代ヒトＴ細胞に感染させ、感染細胞の表面上にこれらのＡＣＴＲ変異体を発現する細胞を生成させた。Ｍｏｃｋ  Ｔ細胞（ＡＣＴＲ変異体を発現しないＴ細胞）をＡＣＴＲ  Ｔ細胞と類似の方法で増殖させた。ＡＣＴＲ  Ｔ細胞およびＭｏｃｋ  Ｔ細胞の両方を図２０におけるＮＣＩ−Ｈ９２９などのＢＣＭＡ発現ＭＭ標的細胞株を用いる増殖アッセイにおいて使用した。
【０２８０】
１０％のウシ胎児血清を添加したＲＰＭＩ  １６４０培地中、２００μＬの反応容量において増加させた濃度のヒト化非フコシル化抗ＢＣＭＡ抗体（ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡ）と共にＭｏｃｋ  Ｔ細胞またはＡＣＴＲ  Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を１：１のエフェクター対標的細胞比（３０，０００個の標的細胞）でインキュベートした。反応物を３７℃で７日間ＣＯ２（５％）インキュベーター中でインキュベートした。生ＣＤ３＋Ｔ細胞の数を７日目に決定した。簡潔に述べれば、７日目に、細胞を染色緩衝液を用いて２回洗浄した後、４℃で３０分間Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｅＦｌｕｏｒ−７８０色素を用いて染色した。生／死細胞染色剤中でインキュベートした後、細胞を２回洗浄した後に、ＡＦ４８８共役抗ヒトＣＤ３抗体およびＡＦ６４７共役抗ヒトＣＤ１６抗体からなる１００μＬの抗体カクテルと共にインキュベートした。染色後、再び染色緩衝液を用いて細胞を２回洗浄した後に、フローサイトメトリーを介して染色を検出した。ダブレット排除および死細胞排除後にＣＤ３＋Ｔリンパ球に対するフローサイトメトリーゲーティングを行った。
【０２８１】
図２０において、結果は、配列番号５７のＡＣＴＲ  Ｔ細胞変異体、ＢＣＭＡ陽性ＮＣＩ−Ｈ９２９標的細胞および増加させた濃度のｈＳＧ１６．１７ＳＥＡとの７日間の共培養後のＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖の増加を実証する。増殖は抗体の非存在下でＭｏｃｋ  Ｔ細胞を用いた場合に最小であったので、Ｔ細胞増殖のこの増加は抗体依存的およびＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。
【０２８２】
追加の実験において、いくつかの異なるＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を用いて上記されたものと類似の条件下、１μｇ／ｍＬのｈＳＧ１６．１７ＳＥＡの存在下でＴ細胞増殖を評価した。抗体なしの反応と比べたＣＤ３＋細胞の数の増加を決定した。これらのＡＣＴＲ変異体は抗体依存的な増殖を示した（表８）。これらの実験は、ｈＳＧ１６．１７ＳＥＡと組み合わせた複数のＡＣＴＲ変異体は、ＢＣＭＡ陽性標的細胞株の存在下で抗体依存的なＴ細胞増殖を示したことを実証する。
【０２８３】
【表８】
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【実施例１８】
【０２８４】
ＢＣＭＡ＋多発性骨髄腫標的細胞、ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体、および免疫調節薬物レナリドミドの存在下でのＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖
抗ＢＣＭＡ抗体ｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ（１μｇ／ｍＬ）の存在下および非存在下でＭｏｃｋまたはＡＣＴＲ  Ｔ細胞（エフェクター；Ｅ）および標的細胞（標的；Ｔ）を１：１のエフェクター対標的細胞比でインキュベートした。レナリドミド（１μＭ）の非存在下または存在下でＮＣＩ−Ｈ９２９およびＲＰＭＩ−８２２６標的細胞を用いて増殖アッセイを実行した。ＣＯ２（５％）インキュベーター中での７日間のインキュベーション後にフローサイトメトリーにより総ＣＤ３＋Ｔ細胞数を決定した。簡潔に述べれば、細胞をＰＢＳ中で１回洗浄した後、固定可能な生体染色色素を用いて染色した。生体染色色素とのインキュベーション後、細胞染色緩衝液を用いて細胞を洗浄した後、ＡＦ４８８共役抗ヒトＣＤ３抗体およびＡＦ６４７共役抗ヒトＣＤ１６抗体からなる１００μＬの抗体カクテルを用いて染色した。染色後、染色緩衝液を用いて細胞を２回洗浄し、フローサイトメトリーを介して検出した。死細胞排除後にＣＤ３＋Ｔリンパ球に対するフローサイトメトリーゲーティングを行った。レナリドミド濃度の関数として総ＣＤ３＋Ｔ細胞数をプロットした。
【０２８５】
ＢＣＭＡ＋標的細胞およびｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ抗体の存在下で配列番号１のＡＣＴＲ変異体を発現するＴ細胞を培養した時にＣＤ３＋Ｔ細胞数の増加が観察された。レナリドミドは、ＮＣＩ−Ｈ９２９（図２１、パネルＡ）およびＲＰＭＩ−８２２６（図２１、パネルＢ）多発性骨髄腫標的細胞の存在下でｈＳＧ１６．１７  ＳＥＡ連結ＡＣＴＲ  Ｔ細胞の増殖をさらに増進させた。抗体の非存在下でＭｏｃｋ  Ｔ細胞を用いた場合に最小の増殖が観察されたので、Ｔ細胞増殖のこの増加は抗体依存的およびＡＣＴＲ  Ｔ細胞特異的であった。
【０２８６】
他の実施形態
本明細書に開示される全ての特徴は、任意の組合せで組み合わせられてもよい。本明細書に開示される各特徴は、同じ、同等の、または類似の目的を果たす代替的な特徴により置き換えられてもよい。したがって、別段の明示的な記載がなければ、開示される各特徴は、包括的な一連の同等または類似の特徴の例に過ぎない。
【０２８７】
上記の記載から、当業者は、本開示の必須の特徴を容易に確認することができ、またその精神および範囲から離れることなく、様々な使用および条件に適合させるために本開示の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、他の実施形態もまた請求項に含まれる。
【図１】
2020507604.tif 000080
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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