(57)【要約】動物遺伝子のセットに類似した酵母遺伝子のセットを使用し、酵母遺伝子のセット間の相互作用に基づいて予測された遺伝子相互作用を用いて動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスを増大して、動物において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングすることに向けられた方法、システム、細胞および組成物が開示される。また、神経変性タンパク質症の治療薬をスクリーニングし、使用する方法も開示される。本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてアミロイドベータ媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
2020507314.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、
（ａ）前記動物における前記生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物において同定される候補酵母遺伝子のセットを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子を含む酵母遺伝子間の相互作用を提供するステップと、
（ｃ）前記動物における遺伝子間の相互作用を提供するステップと、
（ｄ）候補酵母遺伝子の前記セットに対して相同な、前記動物における遺伝子のセットを決定するステップと、
（ｅ）ステップ（ｂ）の前記相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いて、ステップ（ｄ）において得られた前記動物における遺伝子の前記セット間の相互作用を増大することによって、前記動物における前記生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子の前記セットが、
（ｉ）前記生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物である条件下で、酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾された酵母細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前記修飾が、前記条件に対する前記酵母細胞の応答を調節するか否かを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記酵母細胞の応答が調節される場合に、前記酵母遺伝子を候補酵母遺伝子として同定するステップと
を含む方法によって得られた、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の異常な発現を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の過剰発現を含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の発現の低減または消失を含む、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１種または複数の遺伝子が、非内因性遺伝子を含む、請求項３または４に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉｉ）の酵母細胞の応答の前記調節が、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉｉ）の候補酵母遺伝子の前記同定が、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化の同定を含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記酵母細胞の応答が、細胞生存力の変化である、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子の前記セットが、酵母遺伝子のゲノムワイドスクリーンから得られた、請求項２から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ゲノムワイドスクリーンが、酵母ゲノムの欠失または過剰発現スクリーンを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（Ｐｒｉｚｅ−Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｆｏｒｅｓｔ）（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、１つまたは複数の精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｂ）および／または（ｃ）が、多様なアルゴリズムパラメータを用いる前記ＰＣＳＦアルゴリズムを使用して、マルチプルネットワークを生成することおよび最大全域木アルゴリズムを用いて前記マルチプルネットワークから代表的ネットワークを作出することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）の前記相互作用が、ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子の前記セット中に含まれない予測された遺伝子またはタンパク質ノードを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記予測された遺伝子またはタンパク質ノードが、ドラッガブルな標的を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｄ）が、前記候補酵母遺伝子と前記動物遺伝子間の核酸配列、ポリペプチド配列、タンパク質構造または分子的相互作用のうち少なくとも１つを比較することを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｄ）が、
（ｉ）前記動物遺伝子と前記候補酵母遺伝子間の配列類似性を決定することと、
（ｉｉ）前記動物遺伝子と前記候補酵母遺伝子間の進化的類似性および構造類似性を決定することと、
（ｉｉｉ）前記動物遺伝子および前記候補酵母遺伝子間の分子的相互作用類似性を決定することと、
（ｉｖ）拡散成分解析を使用してステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）における前記類似性を統合することによって、候補酵母遺伝子の前記セットに対して相同な、前記動物における遺伝子のセットを決定することと
を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｉ）が、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスおよび／またはＤＩＯＰＴを用いてＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴを利用することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｉｉ）が、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用して、マルチプル配列アラインメントを構築し、プロファイル隠れマルコフモデルを築いて、リモート進化信号をコードし、それに続いてＨＨｐｒｅｄを行うことを含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｉｉｉ）が、遺伝子の機能解析のためのマルチ−ネットワークトポロジーのコンパクト統合（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ）（Ｍａｓｈｕｐ）を利用することを含む、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｅ）が、前記賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続することを含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｅ）が、多様なアルゴリズムパラメータを用いる前記ＰＣＳＦアルゴリズムを使用して、マルチプルネットワークを生成するステップおよび最大全域木アルゴリズムを用いて前記マルチプルネットワークから代表的ネットワークを作出することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｅ）の前記生理学的プロセスまたは病理プロセスの前記モデルが、ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子の前記セット中に含まれない予測された遺伝子またはタンパク質ノードを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記予測された遺伝子またはタンパク質ノードが、ドラッガブルな標的を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記生理学的プロセスまたは病理プロセスが、神経変性疾患である、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記生理学的プロセスまたは病理プロセスが、神経変性タンパク質症である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記生理学的プロセスまたは病理プロセスが、シヌクレイン症、アルツハイマー病、前頭側頭変性症、脊髄小脳失調症、ハンチントン病または筋萎縮性側索硬化症である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記シヌクレイン症が、パーキンソン病である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記動物がヒトである、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記モデルを一時的でないコンピュータ可読媒体に記憶するステップをさらに含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
細胞を生成する方法であって、
（ａ）請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法に従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた前記モデルにおいて遺伝子ノードを同定するステップと、
（ｃ）前記遺伝子ノードの発現の変更または前記遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を生成するステップと
を含む、方法。
【請求項３２】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が、人工多能性幹細胞または人工多能性幹細胞に由来する細胞である、請求項３１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
ステップ（ｃ）が、細胞のゲノムに付加、欠失、破壊または突然変異を導入するステップを含む、請求項３１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
生理学的プロセスまたは病理プロセスのモジュレーターについてスクリーニングする方法であって、請求項３１から３５のいずれか一項に記載の方法に従って生成された細胞を得るステップおよび前記細胞を使用して、前記生理学的プロセスまたは病理プロセスのモジュレーターについて化合物をスクリーニングするステップを含む、方法。
【請求項３７】
生理学的プロセスまたは病理プロセスを有する動物において療法の標的を決定する方法であって、
（ａ）請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法に従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において得られた前記モデルの１種または複数の遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、
（ｃ）前記動物が、ステップ（ｂ）において同定された前記遺伝子またはタンパク質ノードのいずれかにおける突然変異、発現の変更または活性の変更を有するか否かを決定するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
動物において病理プロセスを処置するための化合物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法によって前記動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のモデルの遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、
（ｃ）化合物をスクリーニングして前記同定された遺伝子またはタンパク質ノードのモジュレーターを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項３９】
請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法を容易にするように構成されたシステムであって、実行された場合に、コンピュータシステムにステップ（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つを実施させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含む前記コンピュータシステムを含む、システム。
【請求項４０】
請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法を容易にするように構成されたシステムであって、実行された場合に、コンピュータシステムに、候補酵母遺伝子の前記セットに対して相同な、前記動物における遺伝子のセットを決定させる、および／またはステップ（ｂ）の前記相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いてステップ（ｄ）の得られた前記動物における遺伝子の前記セット間の相互作用を増大することによって前記動物における前記生理学的プロセスもしくは病理プロセスのモデルを作出させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含む前記コンピュータシステムを含む、システム。
【請求項４１】
前記モデルをディスプレイするためのスクリーンをさらに含む、請求項３９または４０に記載のシステム。
【請求項４２】
酵母における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、
（ａ）前記生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物において同定される酵母遺伝子のセットを提供するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）の酵母遺伝子の前記セットを含む酵母遺伝子間の相互作用を得るステップと、
（ｃ）酵母遺伝子の前記セットを使用して前記生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップと
を含み、ステップ（ｂ）の前記相互作用が、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続することによって得られる、方法。
【請求項４３】
ステップ（ａ）の酵母遺伝子の前記セットが、
（ｉ）前記生理学的プロセスまたは病理プロセスに対する酵母類似物の条件下で、酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾された酵母細胞を提供するステップと、
（ｉｉ）前記修飾が、前記条件に対する前記酵母細胞の応答を調節するか否かを決定するステップと、
（ｉｉｉ）前記酵母細胞の応答が調節される場合に、前記酵母遺伝子を候補酵母遺伝子として同定するステップと
を含む方法によって得られた、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の異常な発現を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の過剰発現を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記条件が、１種または複数の遺伝子の発現の低減または消失を含む、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記１種または複数の遺伝子が、非内因性遺伝子を含む、請求項４４または４５に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｉｉ）の酵母細胞の応答の前記調節が、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を含む、請求項４３から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｉｉｉ）の候補酵母遺伝子の前記同定が、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化の同定を含む、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記酵母細胞の応答が、細胞生存力の変化である、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子の前記セットが、酵母遺伝子のゲノムワイドスクリーンから得られた、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ゲノムワイドスクリーンが、酵母ゲノムの欠失または過剰発現スクリーンを含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
ステップ（ｂ）が、多様なアルゴリズムパラメータを用いる前記ＰＣＳＦアルゴリズムを使用して、マルチプルネットワークを生成することおよび最大全域木アルゴリズムを用いて前記マルチプルネットワークから代表的ネットワークを作出することをさらに含む、請求項４３から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ステップ（ｂ）の前記相互作用が、ステップ（ａ）の真核生物遺伝子のセット中に含まれない予測された遺伝子またはタンパク質ノードを含む、請求項４３から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記予測された遺伝子またはタンパク質ノードが、ドラッガブルな標的を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記真核生物が、酵母である、請求項４３から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記モデルを一時的でないコンピュータ可読媒体に記憶するステップをさらに含む、請求項４３から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
請求項４３から５７のいずれか一項に記載の方法を容易にするように構成されたシステムであって、実行された場合に、コンピュータシステムにステップ（ａ）〜（ｅ）のうち少なくとも１つを実施させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含む前記コンピュータシステムを含む、システム。
【請求項５９】
請求項４３から５７のいずれか一項に記載の方法を容易にするように構成されたシステムであって、実行された場合に、コンピュータシステムに、候補酵母遺伝子の前記セットに対して相同な、前記動物における遺伝子のセットを決定させる、および／またはステップ（ｂ）の前記相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いてステップ（ｄ）の得られた前記動物における遺伝子の前記セット間の相互作用を増大することによって前記動物における前記生理学的プロセスもしくは病理プロセスのモデルを作出させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含む前記コンピュータシステムを含む、システム。
【請求項６０】
前記モデルをディスプレイするためのスクリーンをさらに含む、請求項５８または５９に記載のシステム。
【請求項６１】
真核生物において病理プロセスを処置するために化合物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項４３から５７のいずれか一項に記載の方法によって前記真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングするステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）のモデルの遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、
（ｃ）化合物をスクリーニングして前記同定された遺伝子またはタンパク質ノードのモジュレーターを同定するステップと
を含む、方法。
【請求項６２】
ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞であって、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている、細胞。
【請求項６３】
ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６４】
ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６５】
表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項６２から６４のいずれかに記載の細胞。
【請求項６６】
表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項６５に記載の細胞。
【請求項６７】
表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項６６に記載の細胞。
【請求項６８】
酵母細胞である、請求項６２から６７のいずれかに記載の細胞。
【請求項６９】
哺乳動物細胞である、請求項６２から６７のいずれかに記載の細胞。
【請求項７０】
表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有する酵母細胞である、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体において欠失、破壊もしくは突然変異を有する哺乳動物細胞である、請求項６２から６４のいずれかに記載の細胞。
【請求項７１】
前記α−シヌクレインタンパク質が、突然変異体α−シヌクレインタンパク質であり、必要に応じて、前記突然変異体α−シヌクレインタンパク質が、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ１８ＴまたはＡ２９Ｓを含む、請求項６２から７０のいずれかに記載の細胞。
【請求項７２】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとα−シヌクレイン媒介毒性を抑制する、請求項６２から７１のいずれかに記載の細胞。
【請求項７３】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとα−シヌクレイン媒介毒性を増強する、請求項６２から７１のいずれかに記載の細胞。
【請求項７４】
前記酵母遺伝子の欠失が、α−シヌクレイン媒介毒性を増強する、請求項６２から７１のいずれかに記載の細胞。
【請求項７５】
前記酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体が、α−シヌクレイン毒性ネットワークにおける隠れたノードである、請求項６２から７１のいずれかに記載の細胞。
【請求項７６】
同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれかにおいて列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞。
【請求項７７】
前記哺乳動物遺伝子が、表Ｓ９、表Ｓ１０および／または表Ｓ１１において列挙される、請求項７６に記載の細胞。
【請求項７８】
前記哺乳動物遺伝子によってコードされる、または前記哺乳動物遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有するタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項７６または７７に記載の細胞。
【請求項７９】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項７８に記載の細胞。
【請求項８０】
シヌクレイン症を患う、またはシヌクレイン症と関連する遺伝的変動を有する対象に由来するヒト細胞である、請求項７６から７９のいずれかに記載の細胞。
【請求項８１】
同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、アルファ−シヌクレインの発現が増大しており、または突然変異体α−シヌクレインタンパク質を発現し、必要に応じて、前記突然変異体α−シヌクレインタンパク質が、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ１８ＴもしくはＡ２９Ｓを含む、請求項７６から８０のいずれかに記載の細胞。
【請求項８２】
ヒト細胞である、請求項７６から８１のいずれかに記載の細胞。
【請求項８３】
神経細胞またはグリア細胞である、請求項７６から８２のいずれかに記載の細胞。
【請求項８４】
α−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項６２から８３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項８５】
シヌクレイン症の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項６２から８３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項８６】
前記遺伝子が、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン毒性を抑制するものであるか、またはその欠失が、アルファ−シヌクレイン毒性を増強するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を増強する、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記遺伝子が、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン毒性を増強するものであるか、または欠失されるとその欠失がアルファ−シヌクレイン毒性を抑制するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を阻害する、請求項８４または８５に記載の方法。
【請求項８８】
アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項６２から８３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項８９】
シヌクレイン症の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項６２から８３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項９０】
アルファシヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、前記細胞の生存力を低減するアルファシヌクレインの量を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を前記薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアルファシヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定される、方法。
【請求項９１】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下でのリポータータンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の減少から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を減少させる化合物として同定される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記スクリーニングが、（ｉ）表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１種または複数において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記リポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記リポータータンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の減少から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を減少させる化合物として同定される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１種または複数において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を提供するステップと、前記タンパク質を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記タンパク質の活性を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の低下から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を低下させる化合物として同定される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
ヒト細胞または対象においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する方法であって、前記細胞または対象において表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項９５】
シヌクレイン症を処置する方法であって、シヌクレイン症の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項９６】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項９４または請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のエンハンサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項９４または請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項９４または請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のサプレッサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項９４または請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、細胞を、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるまたは前記薬剤を対象に投与することを含む、請求項９４から９９のいずれかに記載の方法。
【請求項１０１】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が増強され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードする核酸または前記ヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が阻害され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくはアンチセンス核酸、前記ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたは前記ヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞であって、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている、細胞。
【請求項１０４】
ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１０３に記載の細胞。
【請求項１０５】
ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１０３に記載の細胞。
【請求項１０６】
表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項１０３から１０５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１０７】
表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１０８】
表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１０７に記載の細胞。
【請求項１０９】
酵母細胞である、請求項１０３から１０８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１０】
哺乳動物細胞である、請求項１０３から１０８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１１】
表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有する酵母細胞である、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体において欠失、破壊もしくは突然変異を有する哺乳動物細胞である、請求項１０３から１０５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１２】
前記ＴＤＰ−４３タンパク質が、突然変異体ＴＤＰ−４３タンパク質である、請求項１０３から１１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１３】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性を抑制する、請求項１０３から１１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１４】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性を増強する、請求項１０３から１１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１５】
前記酵母遺伝子の欠失が、ＴＤＰ−４３媒介毒性を増強する、請求項１０３から１１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１６】
前記酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体が、ＴＤＰ−４３毒性ネットワークにおける隠れたノードである、請求項１０３から１１１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１１７】
同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞。
【請求項１１８】
前記哺乳動物遺伝子によってコードされる、または前記哺乳動物遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有するタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項１１７に記載の細胞。
【請求項１１９】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１１８に記載の細胞。
【請求項１２０】
ＴＤＰ−４３関連疾患を患う、またはＴＤＰ−４３関連疾患と関連する遺伝的変動を有する対象に由来するヒト細胞である、請求項１１７から１１９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２１】
同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、ＴＤＰ−４３の発現が増大している、または突然変異体ＴＤＰ−４３タンパク質を発現する、請求項１１７から１２０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２２】
ヒト細胞である、請求項１１７から１２１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２３】
神経細胞またはグリア細胞である、請求項１１７から１２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１２４】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項１０３から１２３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１２５】
ＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項１０３から１２３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１２６】
前記遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３毒性を抑制するものであるか、またはその欠失が、ＴＤＰ−４３毒性を増強するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を増強する、請求項１２４または請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
前記遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３毒性を増強するものであるか、または欠失されるとその欠失がＴＤＰ−４３毒性を抑制するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を阻害する、請求項１２４または請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２８】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項１０３から１２３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１２９】
ＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項１０３から１２３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１３０】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を増強する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、前記細胞の生存力を低減するＴＤＰ−４３の量を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を前記薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定される、方法。
【請求項１３１】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現の減少から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を減少させる化合物として同定される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記スクリーニングが、（ｉ）表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記リポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記リポータータンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の減少から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を減少させる化合物として同定される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３３】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を提供するステップと、前記タンパク質を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記タンパク質の活性を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の低下から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を低下させる化合物として同定される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３４】
ヒト細胞または対象においてＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する方法であって、前記細胞または対象において表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１３５】
ＴＤＰ−４３関連疾患を処置する方法であって、ＴＤＰ−４３関連疾患の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１３６】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のエンハンサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３８】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３９】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のサプレッサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項１３４または請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４０】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、細胞を、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるまたは前記薬剤を対象に投与することを含む、請求項１３５から１３９のいずれかに記載の方法。
【請求項１４１】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が増強され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードする核酸または前記ヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が阻害され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もしくはアンチセンス核酸、前記ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたは前記ヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４３】
ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞であって、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている、細胞。
【請求項１４４】
ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１４３に記載の細胞。
【請求項１４５】
ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１４３に記載の細胞。
【請求項１４６】
表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項１４３から１４５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１４７】
表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む前記発現構築物が、前記細胞のゲノム中に組み込まれる、請求項１４６に記載の細胞。
【請求項１４８】
表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結された前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１４７に記載の細胞。
【請求項１４９】
酵母細胞である、請求項１４３から１４８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５０】
哺乳動物細胞である、請求項１４３から１４８のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５１】
表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有する酵母細胞である、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体において欠失、破壊もしくは突然変異を有する哺乳動物細胞である、請求項１４３から１４５のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５２】
前記アミロイドベータタンパク質が、突然変異体アミロイドベータタンパク質である、請求項１４３から１５１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５３】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性を抑制する、請求項１４３から１５２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５４】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性を増強する、請求項１４３から１５２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５５】
前記酵母遺伝子の欠失が、アミロイドベータ媒介毒性を増強する、請求項１４３から１５２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５６】
前記酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体が、アミロイドベータ毒性ネットワークにおける隠れたノードである、請求項１４３から１５２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１５７】
同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞。
【請求項１５８】
前記哺乳動物遺伝子によってコードされる、または前記哺乳動物遺伝子において欠失、破壊もしくは突然変異を有するタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む、請求項１５７に記載の細胞。
【請求項１５９】
前記プロモーターが、誘導性プロモーターである、請求項１５８に記載の細胞。
【請求項１６０】
アミロイドベータ関連疾患を患う、またはアミロイドベータ関連疾患と関連する遺伝的変動を有する対象に由来するヒト細胞である、請求項１５７から１５９のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６１】
同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、アミロイドベータの発現が増大している、または突然変異体アミロイドベータタンパク質を発現する、請求項１５７から１６０のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６２】
ヒト細胞である、請求項１５７から１６１のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６３】
神経細胞またはグリア細胞である、請求項１５７から１６２のいずれかに記載の細胞。
【請求項１６４】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項１４３から１６３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１６５】
アミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項１４３から１６３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１６６】
前記遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ毒性を抑制するものであるか、またはその欠失が、アミロイドベータ毒性を増強するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を増強する、請求項１６４または請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ毒性を増強するものであるか、または欠失されるとその欠失がアミロイドベータ毒性を抑制するものであり、前記薬剤が、前記タンパク質の発現または活性を阻害する、請求項１６４または請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）請求項１４３から１６３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１６９】
アミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、（ａ）請求項１４３から１６３のいずれかに記載の細胞を提供するステップと、（ｂ）前記細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、（ｃ）（ｉ）前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）前記細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、前記薬剤の不在下と比較した、前記薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、前記薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップとを含む、方法。
【請求項１７０】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現または活性を調節する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、前記細胞の生存力を低減するアミロイドベータの量を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を前記薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、前記薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、前記薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定される、方法。
【請求項１７１】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を発現する細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の発現の減少から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を減少させる化合物として同定される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７２】
前記スクリーニングが、（ｉ）表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、前記細胞を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記リポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の発現と比較した前記薬剤の存在下での前記リポータータンパク質の発現の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の発現を増大する化合物として同定される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７３】
前記スクリーニングが、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質を提供するステップと、前記タンパク質を薬剤と接触させるステップと、前記薬剤の存在下で前記タンパク質の活性を測定するステップとを含み、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の増大から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を増大する化合物として同定され、前記薬剤の不在下での前記タンパク質の活性と比較した前記薬剤の存在下での前記タンパク質の活性の低下から、前記薬剤が前記タンパク質の活性を低下させる化合物として同定される、請求項１７０に記載の方法。
【請求項１７４】
ヒト細胞または対象においてアミロイドベータ媒介毒性を阻害する方法であって、前記細胞または対象において表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１７５】
アミロイドベータ関連疾患を処置する方法であって、アミロイドベータ関連疾患の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む、方法。
【請求項１７６】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項１７４または請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとアミロイドベータ媒介毒性のエンハンサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む、請求項１７４または請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７８】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項１７４または請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７９】
前記酵母遺伝子が、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとアミロイドベータ媒介毒性のサプレッサーであり、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、前記ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む、請求項１７４または請求項１７５に記載の方法。
【請求項１８０】
前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップが、細胞を、前記ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるまたは前記薬剤を対象に投与することを含む、請求項１７４から１７９のいずれかに記載の方法。
【請求項１８１】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が増強され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードする核酸または前記ヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む、請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
前記ヒトタンパク質の発現または活性が阻害され、前記薬剤が、前記ヒトタンパク質をコードするｍＲＮＡを標的とする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸、前記ヒトタンパク質をコードする遺伝子転写物の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたは前記ヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子である、請求項１８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１月２５日に出願された米国仮出願番号第６２／４５０，５４０号の利益を主張しており、その全体の教示は、参考として本明細書中に援用される。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された認可番号ＡＧ０３８５４６、ＣＡ１８４８９８、ＧＭ０８９９０３、ＧＭ０８１８７１、ＨＧ００６０６１、ＨＧ００４２３３およびＨＧ００１７１５の下、政府支援でなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
一般的な神経変性疾患は、明確なニューロン集団の喪失およびミスフォールディングされたタンパク質の異常な蓄積をもたらす。パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体を伴う認知症および多系統萎縮症を含むシヌクレイン症は、α−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）の異常な細胞内凝集と関連している。アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド−β（Ａβ）およびタウ蓄積と関連しているが、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合性タンパク質４３（ＴＤＰ−４３）の局在性および蓄積の変更などと関連している。これらの疾患の病態形成に関する仮説の豊富な供給源は、死後脳の神経病理学に由来してきた。これらの観察は、重要な洞察を提供しながら、疾患開始の数十年後に行われる。
【０００４】
直近２０年にわたるヒト遺伝子解析における革命により、タンパク質−ミスフォールディングを神経変性プロセスと結びつける疾患を引き起こす突然変異が明らかにされた。例えば、α−ｓｙｎ（ＳＮＣＡ）遺伝子座での点突然変異および遺伝子増大は、稀であるが早期発症の、高浸透型のＰＤおよび認知症につながる。遺伝子発現を増大するＳＮＣＡ遺伝子座の調節領域における多型は、遅発性ＰＤのリスクの増大を与える（Fuchsら、２００８年；Nallsら、２０１４年）。これらの研究によって、動物および細胞疾患モデルの作出が可能となり、疾患機序の理解が深まった。しかし、これの知識をもってしても、新たな一連の課題が浮上した。
【０００５】
第１に、外見上共通点のない遺伝子が、特定の臨床表現型に関係していた。例えば、パーキンソニズムは、緩慢さ（動作緩慢）、剛直性、振戦および姿勢の不安定性を特徴とする。最も一般的な形態は、α−ｓｙｎ病理学およびドーパミンニューロンの喪失によって規定されるＰＤである。しかし、別個の遺伝的シグネチャーおよび神経病理学と関係している多数の他の疾患実体が、パーキンソニズムにつながることがあり、これは、遺伝子型、神経病理学および臨床症状の間には、簡単な対応関係があるのではないということを実証する（Martinら、２０１１年；Shulmanら、２０１０年；Verstraetenら、２０１５年）。主な臨床表現型としてパーキンソニズムを伴うそれらのいくつかの遺伝子座は、多数の「ＰＡＲＫ」命名（例えば、ＳＮＣＡ／ＰＡＲＫ１遺伝子座自体およびＬＲＲＫ２／ＰＡＲＫ８）を与えられてきたが、同一遺伝子中の突然変異でさえ、別個の神経病理学および多様な臨床症状をもたらすことがある（Martinら、２０１１年；Shulmanら、２０１０年；Verstraetenら、２０１５年）。パーキンソニズムの遺伝的リスク因子と、α−ｓｙｎ自体との関係の間の相互関係を理解することは、患者層別化および標的とされる治療戦略にとって重要である。
【０００６】
第２に、ヒト遺伝子研究は、不明瞭な、議論の余地のあるデータをもたらすこともあった。レアバリアントについては、ヒト集団のかなり最近の遺伝的多様性が、種々の集団間の交差検証の伝統的な方法を実行不可能にすることもある（Nelsonら、２０１２年；Tennessenら、２０１２年）。文献における不一致は多く存在する−例えば、「ＰＡＲＫ５」としてＵＣＨＬ１を、「ＰＡＲＫ１８」として翻訳開始因子ＥＩＦ４Ｇ１を意味付ける研究は、再現できなかった。一般的な多型について、課題は、ＳＮＰと関連する複数の候補遺伝子座間を区別することである。どの遺伝的因子が必然的に疾患プロセスと関連しているかおよびその方法を十分に確立するために、生物学的検証が必要とされるであろうということは明確になってきている（CasalsおよびBertranpetit、２０１２年）。
【０００７】
候補遺伝子バリアントを検証し、そのタンパク質症との関係を理解するための１つのアプローチは、全ゲノムを系統的にスクリーニングして、過剰発現または欠失した場合にタンパク質毒性を修飾するすべての遺伝子を同定することである。これは、パン酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、比類なき遺伝的扱いやすさの単細胞真核生物において達成可能である。酵母は、ミスフォールディングされたタンパク質によって誘導される細胞毒性を理解するために高度に情報価値があるとわかっている（KhuranaおよびLindquist、２０１０年）。神経変性疾患についてのヒトの遺伝的データは、タンパク質ホメオスタシスおよび品質管理、タンパク質輸送、ＲＮＡ代謝およびミトコンドリア機能を含む、真核細胞進化において最も高度に保存されているものの１つである細胞経路に深く関与しているので、これは驚くべきことではない（Brasら、２０１５年；Guerreiroら、２０１５年）。
【０００８】
酵母において神経変性と関連する毒性タンパク質を発現させることによって、酵母におけるゲノムワイドの表現型スクリーニングに適した頑健な容易にスコア可能な成長／生存力欠陥が生じる。α−ｓｙｎ、ベータ−アミロイドおよびＴＤＰ−４３の毒性は、酵母ゲノムの大部分を含む約５５００ＯＲＦのものを個々に過剰発現させることによってスクリーニングされている（KhuranaおよびLindquist、２０１０年；H.-J.  Kimら、２０１３年；Treuschら、２０１１年；Yeger-Lotemら、２００９年）。これらのスクリーンは、ニューロンおよび動物モデルにおける細胞病理の発見を導き（Cooperら、２００６年；Dhungelら、２０１４年；KhuranaおよびLindquist、２０１０年；H.-J.  Kimら、２０１３年）、遺伝的修飾因子データと遺伝子発現解析の関係に重要な洞察をもたらし（Yeger-Lotemら、２００９年）、新規ヒト疾患遺伝子の同定につながった（Eldenら、２０１０年）。最近、酵母シヌクレイン症モデルにおける表現型スクリーニングによって特定されたプロセスが、α−ｓｙｎ遺伝子座での突然変異による、ＰＤを有する患者に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）由来ニューロンにおける細胞病理の発見につながった（Chungら、２０１３年）。その研究では、ハイスループット遺伝子スクリーンと小分子スクリーンを統合することによって、酵母からニューロンへ病理を補正することができる遺伝子および小分子を同定した（Chungら、２０１３年；Tardiffら、２０１３年；２０１４年）。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要旨
多数の遺伝子および分子経路が、神経変性タンパク質症に関与しているが、その相互関係は、十分に理解されていない。本発明者らは、アルファ−シヌクレイン（α−ｓｙｎ）、パーキンソン病の中心となるタンパク質の毒性の根底にある分子経路を系統的にマッピングした。酵母におけるゲノムワイドスクリーンによって、α−ｓｙｎ毒性に影響を及ぼす３３２種の遺伝子を同定した。この分子ネットワークを「ヒト化」するために、本発明者らは、コンピュータによる方法、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔを開発した。これは、Ｓｔｅｉｎｅｒの賞金収集（ｐｒｉｚｅ−ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ）アプローチを、配列、構造および相互作用トポロジーを介した相同性割り当てと統合する。ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、α−ｓｙｎを、撹乱されたタンパク質輸送／ＥＲ品質管理およびｍＲＮＡ代謝／翻訳を介して、複数のパーキンソニズム遺伝子およびドラッガブルな標的と関連付けた。カルシウムシグナル伝達ハブは、これらのプロセスを、撹乱されたミトコンドリア品質管理／機能、金属イオン輸送、転写調節およびシグナル伝達と関連付けた。ネットワーク（ＡＴＰ１３Ａ２／ＰＡＲＫ９、ＶＰＳ３５／ＰＡＲＫ１７）中で空間的に反対のパーキンソニズム遺伝子相互作用プロファイルは、高度に別個であり、患者ｉＰＳ細胞由来ニューロンにおいて特定の遺伝子（ＬＲＲＫ２／ＰＡＲＫ８、ＡＴＸＮ２およびＥＩＦ４Ｇ１／ＰＡＲＫ１８）のネットワーク関係が確認された。この異種間プラットフォームは、多様な神経変性遺伝子を、特定の機序を介してタンパク質症に結び付け、標的化された療法のための患者層別化を容易にし得る。
【００１０】
ここで、本発明者らは、コンピュータによる新しいアプローチを、実質的により広い酵母遺伝子スクリーンと組み合わせることによって、α−ｓｙｎおよび他のタンパク質毒性のゲノムスケールのネットワークを構築した。酵母および患者由来ニューロンにおける有意義な分子的接続を発見するために、本発明者らは、１）配列、構造および分子的相互作用を考慮することによって、酵母ヒットをそのヒト相同体にマッピングし、２）賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ｐｒｉｚｅ−ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｆｏｒｅｓｔ）アルゴリズム（ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ）に基づいて最適化フレームワークを介して、酵母ヒットと隠れたヒト遺伝子を関連付けることによってネットワークを構築し、３）ヒトインタラクトームの相対的希薄を補うために酵母における公知の分子的相互作用の比類なき密度を利用して、酵母からヒトへ種をまたいで分子的相互作用を置き換えるＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔアルゴリズムを開発した。ネットワークは、多数のパーキンソニズムおよび神経変性疾患リスク因子を、特定の分子経路、最も著しくは小胞輸送およびｍＲＮＡ代謝を介してα−ｓｙｎ毒性と関連づけた。
【００１１】
本発明の実施は、通常、特に断りのない限り、当業者の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換え核酸（例えば、ＤＮＡ）技術、免疫学およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の従来技術を使用する。これらの技術の特定のものの限定されない説明は、以下の刊行物において見られる：Ausubel,  F.ら（編）、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、Current  Protocols  in  Immunology、Current  Protocols  in  Protein  ScienceおよびCurrent  Protocols  in  Cell  Biology、すべてJohn  Wiley  &  Sons、N.Y.、２００８年１２月時点の版；Sambrook、RussellおよびSambrook、Molecular  Cloning:A  Laboratory  Manual、第３版、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、２００１年；Harlow,  E.およびLane,  D.、Antibodies-A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、１９８８年；Freshney,  R.I.、「Culture  of  Animal  Cells,  A  Manual  of  Basic  Technique」、第５版、John  Wiley  &  Sons、Hoboken、NJ、２００５年。治療薬およびヒト疾患に関する限定されない情報は、Goodman  and  Gilman’s  The  Pharmacological  Basis  of  Therapeutics、第１１版、McGraw  Hill、２００５年、Katzung,  B.（編）Basic  and  Clinical  Pharmacology、McGraw-Hill/Appleton  &  Lange；第１０版（２００６年）または第１１版（２００９年７月）に見られる。遺伝子および遺伝的障害に関する限定されない情報は、McKusick,  V.A.:Mendelian  Inheritance  in  Man.  A  Catalog  of  Human  Genes  and  Genetic  Disorders.  Baltimore:  Johns  Hopkins  University  Press、１９９８年（第１２版）またはより最近のオンラインデータベース:  ２０１０年５月１日時点のOnline  Mendelian  Inheritance  in  Man、OMIM（商標）McKusick-Nathans  Institute  of  Genetic  Medicine、Johns  Hopkins  University  (Baltimore,  MD)およびNational  Center  for  Biotechnology  Information、National  Library  of  Medicine  (Bethesda,  MD)、ncbi.nlm.nih.gov/omim/に、および遺伝子、遺伝性障害および動物種（ヒトおよびマウス以外）における形質のデータベースである、Online  Mendelian  Inheritance  in  Animals  (OMIA)、omia.angis.org.au/contact.shtmlに見られる。すべての特許、特許出願および本明細書において言及されるその他の刊行物（例えば、科学論文、書籍、ウェブサイトおよびデータベース）は、参照によりその全文が組み込まれる。本明細書と、組み込まれた参考文献のいずれかの間が矛盾する場合には、本明細書（組み込まれた参考文献に基づく可能性がある、その任意の修正を含む）が支配するべきである。特に断りのない限り、用語の標準技術によって許容される意味が、本明細書において使用される。種々の用語の標準的な略語が本明細書において使用される。
【００１２】
いくつかの態様では、本発明は、第１の真核生物（例えば、真菌、原生動物、昆虫、植物、脊椎動物）において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）第１の真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスの類似物を有する第２の真核生物（例えば、真菌、原生動物、昆虫、植物、脊椎動物）において同定される候補真核細胞遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補真核細胞遺伝子を含む第１の真核生物の真核生物遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｃ）第２の真核生物における遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｄ）候補真核細胞遺伝子のセットに対して相同な、第１の真核生物における遺伝子のセットを決定するステップと、（ｅ）第２の真核生物から得られたステップ（ｂ）の相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いて、ステップ（ｄ）において得られた第１の真核生物における遺伝子のセット間の相互作用を増大することによって、第１の真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、第１および第２の真核生物における遺伝子のセットが、互いの相同体を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、神経変性タンパク質症である。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、シヌクレイン症、アルツハイマー病、前頭側頭変性症、脊髄小脳失調症、ハンチントン病または筋萎縮性側索硬化症である。いくつかの実施形態では、シヌクレイン症は、パーキンソン病である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、両真核生物（例えば、ヒトおよび酵母）のネットワークトポロジーならびにそれらの間の配列／構造類似性を比較して、相同性を決定する。いくつかの態様では、配列および構造類似性スコアは、確率分布に変換され、希薄なベクトルを表現するものを含むすべてのノードの対の特徴ベクトルが、関連ベクトルとパラメータ化された多項分布間のカルバック・ライブラー（Ｋｕｌｌｂｅｃｋ−Ｌｅｉｂｌｅｒ）（ＫＬ）ダイバージェンスを最小化することによって一緒にコンピュータ処理される。「ノード」とは、遺伝子またはタンパク質を指す。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の相互作用に基づいて、第１の真核生物（例えば、ヒト）における遺伝子間の相互作用を増大するために、推測された相同性を使用してもよい。いくつかの実施形態では、相互作用が第２の真核生物における遺伝子の相同なペアの中に存在する場合には、推測された相互作用を第１の真核生物のネットワークに加えてもよい。いくつかの実施形態では、第１の真核生物における遺伝子対と、第２の真核生物における遺伝子対間の、相同性の特定の閾値のみで、推測された相互作用を加える。いくつかの実施形態では、閾値は、第１の真核生物（例えば、ヒト）における相互作用の密度が、第２の真核生物（例えば、酵母）における相互作用の密度と同様であるよう設定する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第２の真核生物からの相互作用を増大することによって、第１の真核生物（例えば、ヒト）における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップは、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１３年；２０１６年；Voevodskiら、２００９年）、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、１つまたは複数の精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＦアルゴリズムの目的の機能パラメータを、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ木問題（ＰＣＳＴ）および公知のメッセージ伝達アルゴリズムを用いて決定する。Bailly-Bechetら、２０１１年；Choら、２０１５年を参照のこと。
【００１７】
いくつかの実施形態では、最も頑健な代表的ネットワークを見い出すために、最大全域木アルゴリズムを使用してマルチプルネットワークを組み合わせる。いくつかの実施形態では、代表的ネットワークの統計的有意性が、第１の真核生物および第２の真核生物間の遺伝子のランダム対形成から生成されたネットワークに対して検証される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、動物（例えば、ヒト、マウス）において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物において同定される候補酵母遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子を含む酵母遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｃ）動物における遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｄ）候補酵母遺伝子のセットに対して相同な、動物における遺伝子のセットを決定するステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）の相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いて、ステップ（ｄ）において得られた動物における遺伝子のセット間の相互作用を増大することによって、動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。
【００１９】
いくつかの実施形態では、（ｉ）前記生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物である条件下で、酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾された酵母細胞を提供するステップと、（ｉｉ）修飾が、条件に対する酵母細胞の応答を調節するか否かを決定するステップと、（ｉｉｉ）酵母細胞の応答が調節される場合に、酵母遺伝子を候補酵母遺伝子として同定するステップとを含む方法によって、ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子のセットを得た。いくつかの実施形態では、条件は、１種または複数の遺伝子の異常な発現（例えば、過剰発現、発現の低減、発現の消失）を含む。いくつかの実施形態では、１種または複数の遺伝子は、非内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の酵母細胞の応答の調節は、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の候補酵母遺伝子の同定は、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化の同定を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本明細書における方法によって作出された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルは、１つまたは複数の予測された遺伝子またはタンパク質ノードを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、モデリングされた生理学的プロセスまたは病理プロセスに関与する、１種または複数の他の遺伝子またはタンパク質（例えば、予測された遺伝子またはタンパク質）を同定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、予測された遺伝子またはタンパク質ノードは、ドラッガブルな標的を含む。
【００２１】
本発明の別の態様は、細胞の生成であって、（ａ）本明細書において開示される方法のいずれかに従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において得られたモデルにおいて遺伝子ノードを同定するステップと、（ｃ）遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を生成するステップとを含む細胞の生成を対象とする。
【００２２】
いくつかの態様では、１つまたは複数の突然変異を細胞中に導入し、それが遺伝子の発現または遺伝子の遺伝子産物の活性を変更することによって、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を得る。１つまたは複数の突然変異は、細胞のゲノムへの挿入、欠失、破壊または置換のうち１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子または遺伝子の一部の追加のコピーの挿入を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、調節配列を修飾し、遺伝子の遺伝子産物の発現を増大または減少させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の遺伝子産物の活性を増大または減少させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の遺伝子産物の細胞性分解速度を増大または減少させる。
【００２３】
いくつかの態様では、本発明は、生理学的プロセスまたは病理プロセスのモジュレーターについてスクリーニングする方法であって、遺伝子ノードの発現または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞（すなわち、変更された細胞）を提供するステップと、生理学的プロセスまたは病理プロセス（例えば、本明細書において開示される方法によってモデリングされる生理学的プロセスまたは病理プロセス）のモジュレーターについて化合物をスクリーニングするために細胞を使用するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法によって細胞が得られる。いくつかの実施形態では、スクリーニングの方法は、変更された細胞を薬剤（例えば、小分子、核酸、抗体またはポリペプチド）と接触させるステップおよび少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を測定するステップを含む。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、生物（例えば、ヒト、真核生物、哺乳動物）において病理プロセスを処置するために化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）本明細書において開示される任意の方法によって生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングするステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のモデルの遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、化合物をスクリーニングして同定された遺伝子またはタンパク質ノードのモジュレーターを同定するステップとを含む方法を対象とする。
【００２５】
いくつかの態様では、本発明は、生理学的プロセスまたは病理プロセス（例えば、神経変性状態、疾患、障害）を有する生物（例えば、真核生物、ヒト）において療法のための１種または複数の標的を決定する方法であって、（ａ）本明細書において開示される方法のいずれかに従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において得られたモデルの１種または複数の遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、（ｃ）生物が、ステップ（ｂ）において同定された遺伝子またはタンパク質ノードのいずれかにおいて突然変異、発現の変更または活性の変更を有するか否かを決定するステップとを含む方法を対象とする。
【００２６】
いくつかの態様では、本発明は、第２の真核生物（例えば、酵母）において第１の真核生物（例えば、ヒト）の生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）第１の真核生物の生理学的プロセスまたは病理プロセスの第２の真核生物類似物において同定された遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）同定された遺伝子間の相互作用を得るステップと、（ｃ）生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における相互作用は、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続することによって得られる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。
【００２８】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれかにおいて列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。
【００２９】
本発明のいくつかの態様は、アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの態様は、シヌクレイン症の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【００３１】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【００３３】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物遺伝子相同体によってコードされる、または哺乳動物遺伝子相同体において欠失、破壊もしくは突然変異を有するタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【００３５】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤を同定する方法を対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む。
【００３６】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【００３７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物が、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【００３８】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子の相同体である哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。
【００３９】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【００４０】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤を同定する方法を対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてアミロイドベータ媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【００４２】
本発明のこれらおよび他の特徴は、次の詳細な説明を添付の図面と併せて参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１枚の図面を含有する。カラー図面入りの本特許または特許出願公開のコピーは、依頼および必要料金の支払いにより、担当省庁によって提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１−１】図１Ａ〜図１Ｃは、ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅが、酵母のためのタンパク質毒性ネットワークを築き、ドラッガブルな標的を明らかにすることを示す。
【００４４】
図１Ａは、ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ方法論対従来アプローチを示す。α−ｓｙｎ毒性に対する以前の過剰発現スクリーン由来の７７種の遺伝的修飾因子（「ヒット」）が、酵母インタラクトームにマッピングされる。従来アプローチは、３０種の遺伝的ヒットを見逃し、ＰＭＲ１のような「ハブ」遺伝子を過度に強調する。ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、全７７種のヒットを含み、ドラッガブルな標的Ｒｓｐ５およびカルシニューリン（Ｃｎｂ１）を含む生物学的関連性の追加的なノードを予測する。
【００４５】
【図１−２】図１Ｂ左は、酵母におけるα−ｓｙｎ、ＡβおよびＴＤＰ−４３タンパク質毒性に関する３種の発表された過剰発現スクリーン由来のヒットを示す。ベン図は、回収された遺伝的修飾因子の数を示す。図１Ｂ右は、これら３セットのスクリーンヒットのインプットから生成されたアウトプットＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅネットワークの比較を示す（１０００種の同様に接続されたランダムネットワークに関する経験的ｐ値が、トリプルワイズ比較のために示されている）。
【００４６】
図１Ｃは、ＴＤＰ−４３（左）およびα−ｓｙｎ（右）毒性における、Ｒｓｐ５を活性化する化合物、ＮＡＢの効果を実証する成長曲線を示す。黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、ＴＤＰ−４３（ＴＤＰ）またはα−ｓｙｎのいずれかを発現する酵母を、２０μＭ（ＴＤＰ−４３に対して）または１０μＭ（α−ｓｙｎに対して）ＮＡＢで処理した。６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ）によって、成長を経時的にモニターした。結果は、３回の実験の代表である。
【００４７】
【図２−１】図２Ａ〜図２Ｃは、α−ｓｙｎタンパク質毒性ネットワークへとＬＲＲＫ２を組み込む「ヒト化」ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔネットワークを示す。
【００４８】
図２Ａは、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔによって７７種のα−ｓｙｎ過剰発現スクリーンヒットから生成された「ヒト化」ネットワークを示す。各酵母遺伝子（赤色の三角形）は、相同性強度に比例する重みによって、そのヒト相同体（青色の丸）に連結される。エッジは、その信頼の実験レベルに基づき重みを加えられる。ある特定のノードは、強調のために拡大される。ＬＲＲＫ２は、ＮＳＦ１およびＳＴＵＢ１を介してネットワーク内で連結される。挿入図：酵母およびヒトにおける公知分子相互作用の密度（Ｂｉｏｇｒｉｄ、wiki.thebiogrid.org/doku.php/statisticsにおけるワールドワイドウェブ上で利用可）。略語：ＤＣＡ（拡散成分解析）；ＰＡＲＫ（公知「パーキンソニズム」遺伝子）。完全ネットワークについては補足を参照されたい。
【００４９】
【図２−２】図２Ｂは、保留酵母エッジ増大の「ヒト化」ネットワークにおける効果を示す。
【００５０】
図２Ｃは、突然変異補正済み対照ニューロンと比較した、ＬＲＲＫ２Ｇ２０１９Ｓ突然変異体ｉＰＳｃ由来ドーパミン作動性ニューロンの小胞体（ＥＲ）におけるニカストリンの蓄積を示す。エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）は、ＥＲ後グリコシル化を除去し、ＥＲ型のニカストリン、ＥＲ関連分解基質を明らかにする。成熟型の脱グリコシルＥＲ型に対する比を使用して、ＥＲ後対ＥＲの比を計算した。データは、平均±ＳＥＭとして表される（患者１に対してｎ＝２、患者２に対してｎ＝３、＊＊＊；ｐ＜０．０００１、両側ｔ検定）。
【００５１】
【図３−１】図３Ａ〜図３Ｃは、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔが、ゲノムワイド欠失および過剰発現酵母スクリーンから、α−ｓｙｎ毒性のためのゲノムスケールの分子ネットワークを築くことを示す。
【００５２】
図３Ａは、スクリーンにおいて回収された遺伝的修飾因子の概要を示す。ロースループット調査由来の１６種の遺伝的修飾因子（１４種が特有）も組み込んだ。ＰＤおよび他の神経変性障害に連結された遺伝子の酵母相同体が列挙されている。ヒト遺伝子名に先行する「ｙ」は、「酵母相同体」を示す。
【００５３】
【図３−２】図３Ｂは、「ヒト化」ネットワークが、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔによって３３２種のα−ｓｙｎスクリーンヒットから生成されることを示す。複数の神経変性関連疾患遺伝子を含む、目的の遺伝子が拡大されている（図１３および表Ｓ１４も参照）。ネットワークの「ステム」内の遺伝子オントロジープロセス濃縮は、色分けされて示されている（全詳細は表Ｓ１２に；灰色の部分は濃縮されていなかった）。褐色の線は、Ｖｍｓ１（Ａｎｋｚｆ１の酵母相同体）およびＨｒｄ１（Ｓｙｖｎ１の酵母相同体）を介したＶＣＰ／Ｃｄｃ４８への、また、ＶＣＰからパーキン／ＰＡＲＫ２およびＰｉｎｋ１／ＰＡＲＫ６への外挿された接続を示す。標的記号は、２種のドラッガブルなノード、カルシニューリン（Caraveoら、２０１４年）およびＮｅｄｄ４（ＮＡＢの標的（Tardiffら、２０１３年））をマークする。挿入図：酵母エッジの転位がないネットワーク。ＬＲＲＫ２およびＮＦＡＴは含まれていない。オントロジー的に接続されたタンパク質（例えば、Ｒａｂタンパク質）は分散されている。
【００５４】
【図４−１】図４Ａ〜図４Ｅは、パーキンソニズム感受性遺伝子の遺伝的解剖が、別個の生物学を明らかにすることを示す。
【００５５】
図４Ａは、α−ｓｙｎマップ（図３Ｂ由来）内の小胞輸送サブネットワークおよびＰＡＲＫ９（ＡＴＰ１３Ａ２）の位置を示す。緑色：輸送タンパク質；褐色：金属イオントランスポーター。
【００５６】
図４Ｂは、輸送遺伝子とα−ｓｙｎとの間の合成毒性相互作用を示す（寒天プレートにおけるスポット形成アッセイ）。Ａ−ｓｙｎ導入遺伝子は、ガラクトース誘導性プロモーターから発現される（ガラクトース、Ｇａｌにおいて「オン」；グルコース、Ｇｌｃにおいて「オフ」）。ヒト遺伝子名の前の「ｙ」は、酵母相同体を示す。ΔＧＡＬ２株（「非特異的エンハンサー」）は、ガラクトースにおける成長が不十分であるため（α−ｓｙｎ発現に関係なく）、（＋）対照として機能する。（−）対照、欠失（ΔＹＭＲ１９１Ｗ）は、α−ｓｙｎの存在下で有害効果がない（「ベースライン毒性」）。
【００５７】
【図４−２】図４Ｃは、α−ｓｙｎ発現Ｖｐｓ３５欠失「ＩｎｔＴｏｘ」細胞における酵母ＶＰＳ３５（ｙＶｐｓ３５）、ヒトＶＰＳ３５（ｈＶｐｓ３５）およびヒト突然変異体（Ｄ６２０Ｎ）ＶＰＳ３５の発現を示す（左から右に系列５×希釈を示す酵母スポット形成アッセイ；導入遺伝子は、ガラクトース誘導性プロモーターから発現される）。
【００５８】
【図４−３】図４Ｄ〜図４Ｅは、同様に毒性のＨｉＴｏｘ  α−ｓｙｎ、α−ｓｙｎ−ΔＶＰＳ３５／ＰＡＲＫ１７、α−ｓｙｎ−ΔＡＴＰ１３Ａ２／ＰＡＲＫ９株と遺伝的相互作用物質との相互比較を示す。スポット形成アッセイは、これら３種の株の間の毒性の相対レベルを実証する（図４Ｄ；左から右に５×系列希釈）。図４Ｅ）において、データは、ＨｉＴｏｘ  α−ｓｙｎ（ｘ軸）対ΔＰＡＲＫ１７／α−ｓｙｎ（ｙ軸；Ｄ）ΔＰＡＲＫ９／α−ｓｙｎ（ｙ軸；図４Ｅ）における、７７種の公知α−ｓｙｎ修飾因子（図１を参照）の有効性を比較するドットプロットで示されている。緑色：小胞輸送遺伝的修飾因子、褐色：金属イオン搬送修飾因子。軸目盛は、Ｍｉｇ１／Ｍｉｇ３陽性対照（＝１００、黒色）と比べた成長を表す。Ｍｉｇ１／Ｍｉｇ３過剰発現は、ガラクトースプロモーター駆動α−ｓｙｎ発現を抑制する。本図における各スポットアッセイは、２〜４回反復した。ドットプロットは、生物学的複製により別々の日に行われた２回の実験の代表である。実験毎に４連複製して形質転換体をプレーティングした。
【００５９】
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｅは、ｍＲＮＡ翻訳因子が、酵母から患者由来ニューロンへと、α−ｓｙｎ毒性に影響することを示す。
【００６０】
図５Ａは、ＡＴＸＮ２、ＥＩＦ４Ｇ１（ＰＡＲＫ１８）およびＰＡＢＰＣ１を含む、α−ｓｙｎ毒性（図３Ｂ由来）におけるｍＲＮＡ翻訳サブネットワークを示す。
【００６１】
図５Ｂは、α−ｓｙｎ毒性におけるｙＰＡＢＰＣ１、ｙアタキシン２およびｙＥＩＦ４Ｇ１−１の効果を示す（左：定量的ＰＣＲ；右：バイオスクリーン成長アッセイ）。
【００６２】
【図５−２】図５Ｃは、３５Ｓ−システインおよび３５Ｓ−メチオニン組み込みによって経時的に測定される（ホスフォイメージャースキャン）、同質遺伝子的突然変異補正済み対照ニューロンと比較した、突然変異体α−ｓｙｎＡ５３ＴｉＰＳｃニューロンにおけるバルクｍＲＮＡ翻訳を示す。クーマシー染色は、タンパク質のローディングを示す。突然変異補正済み系統の２種のサブクローンを、α−ｓｙｎＡ５３Ｔ細胞（ｎ＝４）と比較した。
【００６３】
図５Ｄは、ＡＴＸＮ２またはＥＩＦ４Ｇ１遺伝子の内在性レベルを上昇させるように設計されたＴＡＬＥ−ＴＦを示す。これらは、標的遺伝子の５’ＵＴＲに結合し、転写アクチベーターをリクルートする（Sanjanaら、２０１２年）。Ｑ−ＰＣＲは、Ａ５３Ｔ  ｉＰＳニューロンへのＡＡＶ媒介性ＴＡＬＥ−ＴＦ送達後の転写物レベルを示す。第１および第２のアセンブルされた六量体の配列は、配列番号１１である。
【００６４】
【図５−３】図５Ｅは、Ａ５３Ｔニューロン（ｎ＝３）におけるバルク翻訳における増加する内在性ＥＩＦ４Ｇ１またはＡＴＸＮ２レベルの効果を示す。データは、平均±ＳＥＭとして表される。＊；ｐ＜０．０５、＊＊；ｐ＜０．０１、両側ｔ検定）。
【００６５】
【図６】図６は、ＮＡＢ（Ｎ−アリールベンズイミダゾール）が、２０種の別個の毒性酵母株の成長を認識できるほどにはレスキューしないことを示す。ｘ軸に示される通り、遺伝子を個々に過剰発現させることにより、２０種の「毒性テスター」酵母株のパネルを生成した。ＮＡＢは、これらの株のいずれにおいても、毒性を実質的にレスキューしなかった。±５％の誤差で実験を３回実施した（生物学的複製）。
【００６６】
【図７】図７Ａ〜図７Ｃは、拡散成分解析（ＤＣＡ）アルゴリズムのためのパラメータ整調を示す。相対的重みは、本発明者らがＤＣＡに組み込む異なる相同性方法に対して変化したため、本発明者らは、本発明者らの方法によって予測される上位５種の相同体の遺伝子オントロジー（ＧＯ）の平均精度をコンピュータ処理した。さらなる詳細については「方法」を参照されたい。図７Ａは、ある範囲のＢＬＡＳＴ重みにわたる平均ＤＣＡ精度（青色）を示し、ネットワークトポロジーおよびＢＬＡＳＴ項のみが、拡張ＤＣＡ目的関数において保持されている。比較は、ＢＬＡＳＴそれ自体の精度（赤色）に対してなされた。図７Ｂは、ＨＨｐｒｅｄそれ自体の精度（赤色）と比較した、ＢＬＡＳＴ重みが１０に固定された、ある範囲のＨＨｐｒｅｄ重みにわたるＤＣＡアルゴリズムの平均精度（青色）を示す。図７Ｃは、ＨＨｐｒｅｄおよびＢＬＡＳＴ重みがそれぞれ５および１０に固定された、ある範囲のＤｉｏｐｔ重みにわたるＤＣＡアルゴリズムの平均精度を示す。
【００６７】
【図８−１】図８は、拡散成分解析（ＤＣＡ）アルゴリズムが、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄよりも優れていることを示す。本発明者らは、３種の測定基準を使用して相同性ツールの性能を評価した：カバレッジ、遺伝子オントロジー（ＧＯ）精度、Ｊａｃｃａｒｄ類似性。カバレッジは、方法が統計的に有意なヒト（または酵母）相同体を予測することができる、酵母（またはヒト）遺伝子の数として定義される。ＧＯ精度は、酵母（またはヒト）遺伝子と予測されるヒト（または酵母）相同体との間での重複されるＧＯ標識のパーセンテージとしてコンピュータ処理される。Ｊａｃｃａｒｄ類似性スコアは、酵母（またはヒト）遺伝子およびそのヒト（または酵母）相同体の特有のＧＯ標識の総数で割った、重複されるＧＯ標識の数である。他のＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄツールと比較するために、本発明者らは、ＢＬＡＳＴ、ＨＨｐｒｅｄおよび本発明者らのＤＣＡ方法によって予測される上位５種の相同体の平均ＧＯ精度およびＪａｃｃａｒｄ類似性スコアをコンピュータ処理した。酵母（またはヒト）タンパク質は、２種以上の優れたヒト（または酵母）相同体を有することが多いため、本発明者らは、上位５種の相同体を選択した。（ＡおよびＢ）本発明者らは先ず、酵母タンパク質のヒト相同体に関して本発明者らの方法を評価した。本発明者らの方法は、ＢＬＡＳＴ（４０２３種）またはＨＨｐｒｅｄ（４３１２種）のいずれかよりも有意に多い酵母遺伝子（４９２３種）の相同体を予測した（Ａ）。本発明者らは、予測されるＧＯ精度および予測のためのＪａｃｃａｒｄ類似性を評価した（Ｂ）。本発明者らの方法は、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄよりも多くのタンパク質の相同体を予測したため、本発明者らは、ＢＬＡＳＴまたはＨＨｐｒｅｄが相同体を同定することができたタンパク質のみにおいて精度測定基準をコンピュータ処理した。本発明者らの方法は、両方の精度測定基準において、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄよりも優れていた。これらの比較は全て、統計的に有意であった（対応ｔ検定による０．００１未満のｐ値）。本発明者らは、また、本発明者らのツールが相同体を予測することができる全４９２３種のタンパク質において、平均精度およびＪａｃｃａｒｄ類似性をコンピュータ処理した。性能（３１．６％ＧＯ精度および０．２４８Ｊａｃｃａｒｄ類似性スコア）は、ＨＨｐｒｅｄまたはＢＬＡＳＴのものと同様であったが、はるかに多いタンパク質が網羅されていた。
【図８−２】（ＣおよびＤ）本発明者らは次に、ヒトタンパク質の酵母相同体に関して本発明者らの方法を検査した。ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄを上回るカバレッジの改善は、酵母実験におけるものよりもさらにより大幅であった。本発明者らの方法は、１５２００種のタンパク質の相同体を予測した一方、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄは、はるかに少ないヒト（ｈｕｍｎ）タンパク質の酵母相同体を予測した（それぞれ７２４８および９５７７種）。精度測定基準との比較は、（Ｂ）において観察されるものと同様であった。本発明者らの方法は、ＧＯ精度およびＪａｃｃａｒｄ類似性スコアの両方に関して、ＢＬＡＳＴまたはＨＨｐｒｅｄが酵母相同体を見い出すことができたタンパク質において、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄと比較して、予測力を改善した。これらの比較は全て、統計的に有意であった（対応ｔ検定によるｐ値＜０．０００１）。
【００６８】
【図９】図９は、酵母インタラクトーム「エッジ」の転位／インジェクションが、シミュレートされた酵母遺伝的スクリーンにおける精密度およびリコールを実質的に改善することを示す。本発明者らのＰＣＳＦ  ＳｔｅｉｎｅｒＮｅｔ方法ならびに代替ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡ方法［全詳細については方法を参照］によって回収された遺伝子および予測される経路の関連性をより良く理解するために、本発明者らは、十分に制御されたシミュレーションを設計した。撹乱された経路の遺伝的スクリーンを模倣するために、本発明者らは、周知のヒト経路データベースＫＥＧＧから個々の経路を選択し、各経路における全遺伝子を同定した。次に、本発明者らは、ストリンジェントアンサンブル１対１のマッピングにより酵母相同体を同定した。本発明者らは、明らかな酵母相同体を有するヒト遺伝子を、「撹乱された」として処理し、その相同体の遺伝的相互作用隣接遺伝子を、「バーチャル酵母遺伝的スクリーン」からのヒットとして選定した。これらのようなバーチャルスクリーンは、交絡因子として実験ノイズを最小化し、アルゴリズム性能のよりクリーンな評価を可能にする。本発明者らは、「真の」経路情報を知っているため、本来のＫＥＧＧ経路における「関連性」遺伝子が、予測される（非シード（ｓｅｅｄ））遺伝子として回収される頻度を定量化することにより、本方法を使用して、アルゴリズムの感度および特異性を検査することができる。本発明者らは、明らかな酵母相同体を有する少なくとも５種のヒト遺伝子を有する５０種のＫＥＧＧ経路（表Ｓ１５）を選択し、検査のための５０種の関連する「バーチャル」スクリーンを作製した。本発明者らは、２種の性能測定基準を使用した：精密度、すなわち、本来のＫＥＧＧ経路において示される予測される隠れた遺伝子のパーセンテージ、およびリコール、すなわち、予測される経路における隠れたノードとして示される本来のＫＥＧＧ遺伝子のパーセンテージ。本発明者らは、これらの値が、異なるレベルの酵母インタラクトームエッジ転位（１０回の試行にわたり、インジェクト／転位される遺伝的相互作用の部分をランダムに除去することによる）に伴いどのように変化するかを検査した。これは、本図に描写されている。ＰＣＳＦに関して、いかなる酵母エッジもなく、平均精密度およびリコール値は、３７％および５４％である。ＤＡＰＰＬＥに関して、平均精密度およびリコール値は、それぞれ８％および２７％である。ＰＣＳＦおよびＤＡＰＰＬＥの性能は、酵母エッジインジェクション／転位により著しく改善する。＞４０％相互作用がインジェクトされる場合、性能は合理的になる。本発明者らのシミュレートされるスクリーンの構築において使用される同じ経路である、そのアルゴリズムにおけるヒトＫＥＧＧ経路情報を利用するため、ＰＥＸＡの性能は相対的に未変化のままである。
【００６９】
酵母相互作用のインジェクトは、ＰＣＳＦの精密度およびリコールを改善し、ＤＡＰＰＬＥのリコールを改善する。ＰＥＸＡおよびＤＡＰＰＬＥは、酵母インジェクションに関係なく、非常に大型かつ不正確なネットワークを生成する。ＰＥＸＡは常に高いリコールを有するが、それは、単純に、この方法が、ＫＥＧＧ経路インプットを使用してネットワークを築き、ＫＥＧＧ経路が、これらのシミュレートされる酵母遺伝的スクリーンの基盤として使用されるためである。
【００７０】
【図１０】図１０は、ＬＲＲＫ２Ｇ２０１９Ｓドーパミン作動性ニューロン濃縮培養物と同質遺伝子的対照との間で比較したＬＲＲＫ２レベルを示す。誘導された、２名の患者に由来する人工多能性幹細胞由来系統（１種の生物学的複製を含む、ペア１、２および４）およびＧ２０１９Ｓ突然変異が導入されたヒト胚性幹細胞由来系統（ペア３）に関するウエスタンブロットデータを示す（Reinhardtら、２０１３年）。
【００７１】
【図１１−１】図１１Ａ〜図１１Ｃは、酵母α−ｓｙｎ欠失スクリーニングの模式図を示す。図１１Ａは、対照またはα−ｓｙｎ株が、欠失株のライブラリーと交配されたことを示す。交配後に、二倍体株を胞子形成させ、毒性アッセイのために単数体株を選択した。α−ｓｙｎ発現株において、α−ｓｙｎは、毒性水準下レベルで発現された。
【図１１−２】図１１Ｂは、初期スクリーニングが、α−ｓｙｎにおいて合成的に致死的であるが、対照株において致死的ではない、４００種を超えるヒットを同定したことを示す。図１１Ｃは、これらが、少なくとも２回のその後の交配において都合良く選定され検査され、１５３種のヒットが検証されたことを示す。
【００７２】
【図１２−１】図１２Ａ〜図１２Ｂは、酵母α−ｓｙｎプールスクリーニングの模式図を示す。図１２Ａは、ＦＬＥＸ遺伝子ライブラリーからプールされたプラスミドを、対照ＹＦＰまたはα−ｓｙｎ発現酵母株のいずれかにまとめて形質転換したことを示す。ＹＦＰおよびα−ｓｙｎの誘導後に、プラスミドを回収し、配列決定した。増加したリードを有するプラスミドは、推定サプレッサー（α−ｓｙｎ毒性に対する生存利益を付与）であり、減少したリードを有するプラスミドは、推定エンハンサー（α−ｓｙｎ毒性の選択圧下で枯渇される）であった。ＹＦＰに非特異的効果を有するプラスミドは除外した。Ｑ−ＰＣＲおよびバイオスクリーン成長曲線アッセイによってスクリーンの検証を実施した。
【図１２−２】図１２Ｂは、漆黒の線が、ベースラインα−ｓｙｎ毒性を表すことを示す。このベースラインを上回る修飾因子は、いわゆる毒性のサプレッサーである（すなわち、レスキューする）；このベースラインを下回る修飾因子は、いわゆる毒性のエンハンサーである（すなわち、有害）。配列決定リード（１９５種のヒット）、バイオスクリーン（１３４／１９５種を立証）とＱＰＣＲ（９３／１９５種を立証）アッセイとの間に良好な一致が見られた。バイオスクリーンアッセイによって検証された全１３４種の修飾因子を、真の修飾因子と考慮した。
【００７３】
【図１３】図１３は、ＳｔｅｉｎｅｒＮｅｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅアプローチが、α−ｓｙｎ毒性の３３２種の遺伝的修飾因子に適用される場合の、α−ｓｙｎ毒性結果の扱い易い「ヒト化」ネットワークを示す。複数の神経変性関連疾患遺伝子を含む、目的の特異的遺伝子が拡大されている（表Ｓ１４も参照）。
【００７４】
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｂは、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡネットワークツールが、本発明者らのα−ｓｙｎ完全スクリーニングデータセットにより、断片化または過剰接続されたネットワークのいずれかを作製し、生物学的解釈および仮説の生成を妨害することを示す。
【００７５】
ＤＡＰＰＬＥ（Rossinら、２０１１年）およびＰＥＸＡ（Tuら、２００９年）は、本発明者らのＰＣＳＦに基づく方法の代替であると本発明者らが考慮したアルゴリズムを築く２種のネットワークである。両方の方法が、シード遺伝子を採用し、シード遺伝子にまたがるサブネットワークを同定し、これらの遺伝子の可能な機能的相互接続性を明らかにする。第１のアルゴリズムのＤＡＰＰＬＥは、ヒトインタラクトームにおける有意な直接的およびワンホップの間接的エッジを同定して、可能な限り多くのシード遺伝子を接続する（これらは、それぞれ「直接的」および「間接的」モードである）。第２のアルゴリズムのＰＥＸＡは、ＫＥＧＧまたはＲｅａｃｔｏｍｅ等の現存する経路アノテーションを利用して、シード遺伝子を網羅する。次に、統合および剪定が適用されて、接続された成分を連結し、ハンギング遺伝子を除去する。本発明者らは、図９および方法セクションにおいて、ＰＣＳＦが、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡアルゴリズムの両方よりも優れた性能を有することを示す。そこで、本発明者らは、α−ｓｙｎ毒性に関する本発明者らの実験的酵母スクリーンデータを使用して、これらのアルゴリズムを突き合わせて比較する（図３Ｃと比較）。図１４Ａは、直接的モードにおいて、ＤＡＰＰＬＥが、高い信頼度の相互作用により遺伝子を接続する一方、間接的モードにおいて、ＤＡＰＰＬＥが、単一の隠れた遺伝子を使用して、２個のシード遺伝子を接続することを示す。疎らなネットワークは、１０個のサブネットワークへと分解される。本図に示される通り、ＬＲＲＫ２／シヌクレイン、ＲＡＢ６およびＥＩＦ４Ｇ１／アタキシン−２に関するものを含む、鍵となる相互作用は失われる。図１４Ｂは、ＰＥＸＡ［Ｒｅａｃｔｏｍｅ］およびＤＡＰＰＬＥに関して、間接的モードにおいて、巨大かつ扱い難い「毛玉」が産生されることを示す。これらは、このデータセットのための妥当な生物学的仮説の生成を明らかに妨害する。言うなれば、これらの膨大さにもかかわらず、ＬＲＲＫ２によるものを含む鍵となる相互作用は、これらの方法により失われる。
【００７６】
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｂは、エンドサイトーシス成分における欠損が、α−ｓｙｎ毒性を増強することを示す。図１５Ａは、ＶＴＨ１（ｙＳＯＲＬ１）の欠失が、α−ｓｙｎ毒性を増強することを示す。全スポットアッセイを２〜４回実施した（生物学的複製）。図１５Ｂは、バイオスクリーン成長曲線解析である。Ｙｐｔ７（ｙＲＡＢ７Ｌ１）過剰発現は、α−ｓｙｎ毒性を抑制する。これを３回反復した（生物学的複製）。
【００７７】
【図１６】図１６は、翻訳修飾因子が、異なるタンパク質毒性モデルにより、別個の遺伝的相互作用パターンを示すことを示す。スポットアッセイは、ＨｔｔＥｘ１−７２ＱにおけるＰｂｐ１の軽度成長抑制効果を除いて、ｙＥＩＦ４Ｇ１−１（Ｔｉｆ４６３１）、ｙＥＩＦ４Ｇ１−２（Ｔｉｆ４６３２）およびｙアタキシン２（Ｐｂｐ１）が、酵母においてＡβ、ＴＤＰ−４３およびポリグルタミン（ハンチンチンエクソン１−７２Ｑ）毒性を抑制しない（すなわち、これからレスキューする）ことを実証する。実際に、ｙアタキシン２は、Ａβ毒性を増強する（すなわち、増悪する）。本図に示す各スポットアッセイは、３回の実験の代表である（生物学的複製）。
【００７８】
【図１７−１】図１７Ａ〜図１７Ｄは、バルクタンパク質翻訳欠損が、α−ｓｙｎ−ＧＦＰ過剰発現細胞において同定されることを示す。図１７Ａは、ＧＦＰまたはα−ｓｙｎ−ＧＦＰを安定に発現するＨＥＫ細胞が、様々な持続時間で（５、１５および３０分間）、３５Ｓシステインおよびメチオニンのパルス標識付けされたことを示す。α−ｓｙｎ−ＧＦＰを発現する細胞は、３５Ｓシステインおよびメチオニンのよりゆっくりな組み込みを示した。クーマシー染色は、タンパク質試料の等しいローディングを示す（ｎ＝２、生物学的複製）。図１７Ｂは、ＧＦＰまたはα−ｓｙｎ−ＧＦＰを発現するラット初代皮質ニューロンが、様々な持続時間において、３５Ｓシステインおよびメチオニンでパルス標識されたことを示す。ＨＥＫ細胞と同様に、α−ｓｙｎ−ＧＦＰ過剰発現は、３５Ｓシステインおよびメチオニン組み込みの速度低減をもたらした（ｎ＝２、生物学的複製）。
【図１７−２】図１７Ｃは、ＧＦＰとα−ｓｙｎ−ＧＦＰ発現ラット初代皮質ニューロンとの間で、遊離サイトゾル３５Ｓシステインおよびメチオニンに差がなかったことを示す。３５Ｓシステインおよびメチオニンの遊離サイトゾル部分は、ＴＣＡ沈殿細胞内タンパク質を除外することにより得た。図１７Ｄは、リン酸化ｅＩＦ２Ａ（ｐ−ｅＩＦ２Ａ）が、ＧＦＰまたはα−ｓｙｎ  ＧＦＰのいずれかを過剰発現するラット初代皮質ニューロンにおいて測定されたことを示す。条件間でｐ−ｅＩＦ２Ａのレベルに差はなかった（ｎ＝１）。
【００７９】
【図１８】図１８Ａ〜図１８Ｂは、α−ｓｙｎＡ５３Ｔ突然変異体ニューロンにおける正準アンフォールドタンパク質応答の非存在を示す。
【００８０】
図１８Ａは、ＥＩＦ２Ａのリン酸化（ｐＥＩＦ２Ａ）が、およそ６週間目に、同質遺伝子的突然変異補正済み対照と比較して、α−ｓｙｎＡ５３Ｔニューロンにおいて未変化であることを示す。本実験において、α−ｓｙｎＡ５３Ｔニューロンの２種のサブクローンを、同質遺伝子的突然変異補正済み対照の２種のサブクローンと比較した。
【００８１】
図１８Ｂは、ＸＢＰ１転写物の長い方のＩＲＥ１スプライスアイソフォーム２が、１２週間目に、α−ｓｙｎＡ５３Ｔ（Ａ５３Ｔ）においても突然変異補正済み対照（ＣＯＲＲ）ニューロンにおいても同定されないことを示す、リボソーム保護断片（ＲＰＦ）のマッピングを示す。２種のクローン（Ａ５３Ｔ−１およびＣＯＲＲ−１）が本図に示されている。アイソフォーム２のＲＰＦは、赤色のボックスでマークされた領域において同定されているであろう。
【００８２】
【図１９−１】図１９Ａ〜図１９Ｄは、ＰＤ  ｉＰＳｃ由来ニューロンにおけるリボソームプロファイリングが、α−ｓｙｎ毒性に特異的に関連するｍＲＮＡ翻訳関連転写物の撹乱された翻訳を明らかにすることを示す。
【００８３】
図１９Ａは、４週間および１２週間目に、同質遺伝子的突然変異補正済み対照と比較して、突然変異体α−ｓｙｎＡ５３Ｔ患者由来ニューロンにおいて、リボソーム成分および他の翻訳因子に関連するｍＲＮＡ転写物の翻訳効率における高度に有意な減衰があることを示す。この特異的な遺伝子群も、ニューロンにおけるα−ｓｙｎのごく近傍にあるまたはこれと直接的に相互作用するＲＮＡ結合および翻訳因子を同定する添付の原稿に提示される空間的α−ｓｙｎマップのみならず（Chung、Khuranaら  Cell  Systems  ２０１６年）、α−ｓｙｎ毒性の遺伝的マップにおいて濃縮される（図３）。リボソームフットプリンティングのため、遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ；software.broadinstitute.org/gsea/index.jspにおけるワールドワイドウェブ上で利用可）名目上ｐ値および偽発見率（ＦＤＲ）を表に示す。遺伝的マップのための濃縮解析は、表Ｓ１２に記載されている。空間的マップのための濃縮解析は、添付の原稿に記載されている（Chung、Khuranaら  Cell  Systems  ２０１６年）。
【００８４】
図１９Ｂは、全体として経路の減衰に寄与する、ｍＲＮＡ翻訳に関連するｍＲＮＡ転写物を示す（図１９Ａを参照）。強調された転写物は、遺伝的（橙色青色ドット）および空間的（青色ドット）α−ｓｙｎマップにおいて同定された特異的遺伝子／タンパク質／タンパク質複合体と重複する。図２０は、完全に標識されたプロットを示す。
【００８５】
【図１９−２】図１９Ｃ〜図１９Ｄは、酵母からニューロンへの、直交性遺伝的（橙色）、空間的（青色）および翻訳的（赤色）マッピングにおいて出現する経路／複合体の例としての、翻訳開始および伸長複合体（図１９Ａを参照）ならびに翻訳開始複合体のｅｉＦ３足場（図１９Ｂを参照）の模式図を示す。
【００８６】
【図２０−１】図２０は、ＰＤ  α−ｓｙｎＡ５３Ｔ患者由来ニューロン（突然変異補正済み対照ニューロンと比較）におけるリボソームプロファイリングが、α−ｓｙｎ毒性に特異的に関連するｍＲＮＡ翻訳関連転写物の撹乱された翻訳を明らかにすることを示す。全体として経路の減衰に寄与する、ｍＲＮＡ翻訳に関連するｍＲＮＡ転写物（図１９Ｂの完全に標識されたプロットを参照）。
【図２０−２】図２０は、ＰＤ  α−ｓｙｎＡ５３Ｔ患者由来ニューロン（突然変異補正済み対照ニューロンと比較）におけるリボソームプロファイリングが、α−ｓｙｎ毒性に特異的に関連するｍＲＮＡ翻訳関連転写物の撹乱された翻訳を明らかにすることを示す。全体として経路の減衰に寄与する、ｍＲＮＡ翻訳に関連するｍＲＮＡ転写物（図１９Ｂの完全に標識されたプロットを参照）。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
発明の詳細な説明
生理学的プロセスまたは病理プロセスの増大されたモデリング
いくつかの態様では、本発明は、第１の真核生物（例えば、真菌、原生動物、昆虫、植物、脊椎動物）において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）第１の真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスの類似物を有する第２の真核生物（例えば、真菌、原生動物、昆虫、植物、脊椎動物）において同定される候補真核細胞遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補真核細胞遺伝子を含む第１の真核生物の真核生物遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｃ）第２の真核生物における遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｄ）候補真核細胞遺伝子のセットに対して相同な、第１の真核生物における遺伝子のセットを決定するステップと、（ｅ）第２の真核生物から得られたステップ（ｂ）の相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いて、ステップ（ｄ）において得られた第１の真核生物における遺伝子のセット間の相互作用を増大することによって、第１の真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、第１の真核生物は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、サル細胞）である。いくつかの実施形態では、第２の真核生物は、酵母細胞である。
【００８８】
語句「生理学的プロセスまたは病理プロセス」とは、本明細書において、任意のプロセス（例えば、２種以上の遺伝子が関与する任意の細胞性プロセス）または病理プロセスを指す。生理学的プロセスまたは病理プロセスは、組み立てられた生体単位、例えば、細胞、組織、臓器および生物の機能に関係する、規定の開始および終了を有する働きまたは分子事象のセットであり得る。通常、分子機能の１つまたは複数の秩序集合体によって達成される一連の事象である。通常、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、１つまたは複数の生物学的経路を包含する、またはそれを介して実施される。「生物学的経路」は、細胞において特定の産物または変化につながる細胞中の分子による、およびそれらの間の任意の一連の作用および／または相互作用であり得る。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、細胞性プロセスである。生理学的プロセスまたは病理プロセスとして、例えば、細胞シグナル伝達、代謝、遺伝情報プロセシング（例えば、転写、翻訳、ＲＮＡ輸送、ＲＮＡ分解、タンパク質フォールディング、ソーティング、分解、翻訳後修飾、ＤＮＡ複製および修復）、環境情報プロセシング（例えば、膜輸送、シグナル伝達）および細胞性プロセス（例えば、細胞周期、エンドサイトーシス、小胞輸送）に関係するプロセスなどが挙げられる。種々の上記の細胞性プロセスは、複数の特定の経路を包含することが認められよう。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、細胞周期、細胞分裂または細胞成長プロセスである。いくつかの実施形態では、プロセスは、疾患または障害と関連する。疾患または障害は、制限されない。
【００８９】
いくつかの実施形態では、障害は、がんである。用語「がん」とは、本明細書において、その独特の形質−正常な制御の喪失−が、未制御の成長、分化の欠如、局所組織浸潤および転移をもたらす細胞の過剰増殖と定義される。本発明の方法に関して、がんは、急性リンパ性がん、急性骨髄性白血病、肺胞横紋筋肉腫、膀胱がん、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管または肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢または胸膜のがん、鼻、鼻腔または中耳のがん、口腔のがん、外陰部のがん、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、線維肉腫、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、白血病、液体腫瘍、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性中皮腫、マスト細胞腫、黒色腫、多発性骨髄腫、上咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、卵巣がん、膵臓がん、腹膜、網および腸間膜がん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、固形腫瘍、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、尿管がんおよび膀胱がんのいずれかを含む、任意のがんであり得る。本明細書において、用語「腫瘍」とは、別に明記されない限り、悪性種類の細胞または組織の異常な成長を指し、良性種類の組織を含まない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、障害は、遺伝性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、一遺伝子性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、複遺伝子性障害である。いくつかの実施形態では、障害は、１つまたは複数のＳＮＰと関連する障害である。１つまたは複数のＳＮＰと関連する例示的障害として、米国特許第７，６２７，４３６号に記載される複合疾患、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００９／１１２８８２に記載されるようなアルツハイマー病、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１８号に記載されるような炎症性疾患、米国特許出願公開第２０１２／０３０９６４２号に記載されるような多嚢胞性卵巣症候群、米国特許第７，７３２，１３９号に記載されるような心血管疾患、米国特許出願公開第２０１２／０１３６０３９号に記載されるようなハンチントン病、欧州特許出願公開番号ＥＰ２５３５４２４に記載されるような血栓塞栓性疾患、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２０１２／００１６１３に記載されるような神経血管性疾患、米国特許出願公開第２０１０／０２９２２１１号に記載されるような精神病、米国特許出願公開第２０１１／０３１９２８８号に記載されるような多発性硬化症、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００６／０２３７１９Ａ２に記載されるような統合失調症、統合失調感情障害および双極性障害、米国特許出願公開第Ｕ．Ｓ．２０１１／０１０４６７４号に記載されるような双極性障害および他の病気、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００６／１０４３７０Ａ１に記載されるような結腸直腸がん、米国特許出願公開第Ｕ．Ｓ．２００６／０２０４９６９号に記載されるようなＡＫＴ１遺伝子座に隣接するＳＮＰと関連する障害、ＰＣＴ国際出願公開番号ＷＯ／２００３／０１２１４３Ａ１に記載されるような摂食障害、米国特許出願公開第Ｕ．Ｓ．２００７／０２６９８２７号に記載されるような自己免疫疾患、米国特許第７，７９０，３７０号に記載されるようなクローン病を有する患者における線維性狭窄性疾患および米国特許第８，１８７，８１１号に記載されるようなパーキンソン病が挙げられ、それらの各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、障害は、慢性感染性疾患である。「慢性感染性疾患」とは、感染が持続していた感染病原体によって引き起こされる疾患である。このような疾患として、肝炎（Ａ型、Ｂ型またはＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶおよびＥＢＶ）およびＨＩＶ／ＡＩＤＳを挙げることができる。非ウイルス性の例として、アスペルギルス症、カンジダ症、コクシジオイデス症のような慢性真菌疾患ならびにクリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）と関連する疾患およびヒストプラスマ症を挙げることができる。慢性細菌性感染性病原体の限定されない例は、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであり得る。いくつかの実施形態では、障害は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染である。いくつかの実施形態では、障害は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、障害は、自己免疫障害である。用語「自己免疫疾患」とは、対象が、自身の組織に対して破壊的免疫応答を開始する任意の疾患または障害を指す。自己免疫障害は、対象（例えば、ヒト）におけるほぼすべての臓器系に影響を及ぼすことがあり、限定されるものではないが、神経、胃腸および内分泌系ならびに皮膚および他の結合組織、眼、血液および血管の疾患を含む。自己免疫疾患の例として、限定されるものではないが、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、グレーブス病、強皮症、関節リウマチ、多発性硬化症、重症筋無力症および糖尿病が挙げられる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、神経学的疾患（例えば、神経変性疾患）または障害である。いくつかの実施形態では、神経学的疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病またはＡＬＳ、リソソーム蓄積症、多発性硬化症または脊髄損傷である。神経変性疾患は、神経系の罹患領域におけるニューロンの構造および／または機能の進行性喪失を含む、ニューロンの喪失を伴うことが多い種々の障害を包含する。いくつかの神経変性疾患では、ヒトタンパク質が凝集する（すなわち、タンパク質症）か、またはＲＮＡが凝集し、および／またはこのようなタンパク質もしくはＲＮＡにおける機能突然変異の有害な増加があるか、またはタンパク質もしくはＲＮＡの発現の増大がある（例えば、その遺伝子の１つまたは複数の余分のコピーを有する患者による）。このようなタンパク質ならびにタンパク質が凝集する、および／または突然変異されるまたは過剰発現される神経変性疾患の例として、アルファ−シヌクレイン（パーキンソン病およびパーキンソニズムを特徴とする他の障害）、アミロイドベータ（アルツハイマー病）、ポリグルタミンが伸長された遺伝子（ハンチントン病、運動失調）が挙げられる。このような疾患の真核生物（例えば、酵母）類似物は、真核生物における関連野生型または突然変異体ヒトタンパク質の過剰発現によって生成され得る。このようなタンパク質は、過剰発現されると、毒性効果を発揮し得る。毒性は、毒性効果を軽減する化合物および過剰発現されるまたは欠失される場合に、毒性効果を軽減する遺伝子を同定するために利用できる。このような疾患の動物（例えば、ヒト）神経系細胞モデルは、疾患を患っている、もしくは疾患と関連する遺伝子型を有する患者から誘導性神経系細胞を生成することによって、または多能性細胞に由来する、もしくは非ニューロン細胞からの分化転換に由来する、もしくは神経前駆体に由来する神経系細胞における工学的に操作された誘導性過剰発現によって作製することができる。
【００９５】
いくつかの神経変性疾患では、タンパク質の機能の喪失（例えば、突然変異による）がある。このような疾患の真核生物類似物は、タンパク質の相同体（例えば、突然変異を有する）の機能の喪失を誘導することによって作出することができる。このような疾患の動物（例えば、ヒト）神経系細胞モデルは、疾患を患う、もしくは疾患と関連する遺伝子型を有する患者から、誘導された動物神経系細胞を生成することによって、または遺伝子において遺伝子が標的とされる突然変異または欠失を工学的に操作すること、またはそうでなければ、多能性細胞に由来する、もしくは非ニューロン細胞からの分化転換に由来する、もしくは神経前駆体に由来する神経系細胞においてその遺伝子を無効にすることによって作製することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、神経変性疾患である。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、神経変性タンパク質症である。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスは、シヌクレイン症、アルツハイマー病、前頭側頭変性症、脊髄小脳失調症、ハンチントン病または筋萎縮性側索硬化症である。いくつかの実施形態では、シヌクレイン症は、パーキンソン病である。
【００９７】
用語「生理学的プロセスまたは病理プロセスの類似物」とは、第１の真核生物におけるプロセスといくつかの類似性を共有する第２の真核生物におけるプロセスを意味するものとする。類似性は、遺伝子型的なものである場合も、表現型的なものである場合もある。いくつかの実施形態では、類似物は、第１の真核生物において生理学的プロセスまたは病理プロセスに関与する遺伝子を、第２の真核生物中に導入することによって作出してもよい。疾患の異なる態様を調べるために、遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を変えてもよい。いくつかの実施形態では、類似物は、第１の真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスに関与する遺伝子に対して相同である、第２の真核生物における遺伝子の発現または遺伝子産物の活性を調節することによって作出してもよい。生理学的プロセスもしくは病理プロセスまたは生理学的プロセスもしくは病理プロセスの類似物における遺伝子または遺伝子産物の関与は、制限されない。いくつかの実施形態では、遺伝子または遺伝子産物は、生理学的プロセスまたは病理プロセスと関連するネットワークの一部である。ネットワークは、セットの各遺伝子またはタンパク質が、少なくとも１種の他の遺伝子またはタンパク質と相互作用することを特徴とする、遺伝子および／またはタンパク質のセットである。相互作用は、物理的相互作用（例えば、結合）または遺伝子相互作用（例えば、発現の調節を引き起こす）であり得る。
【００９８】
本明細書において使用されるように、真核生物（例えば、酵母）遺伝子間の相互作用は、遺伝子相互作用および／またはそれらがコードする場合には、物理的に相互作用する遺伝子産物（タンパク質またはＲＮＡ）を指す。相互作用は、相互作用する遺伝子が線（エッジ）によって結び付けられるグラフとして表すことができる。線は、相互作用の性質および／または相互作用物の性質に関する情報をコードする場合も、コードしない場合もある。このような情報は、例えば、ある遺伝子が、相互作用する遺伝子に影響を及ぼす方法（例えば、どの遺伝子がエフェクターであるか）を示す矢印の形態で、または色、幅またはパターンなどの線の特徴によってコードされ得る。「ノード」は、ネットワーク中の少なくとも２種の他の遺伝子またはタンパク質と相互作用する遺伝子またはタンパク質である。ネットワーク中の各遺伝子は、「ノード」を表す。遺伝子相互作用は、第１の遺伝子またはそのコードされる遺伝子産物（複数可）が、第２の遺伝子またはそのコードされる遺伝子産物（複数可）に影響を及ぼし得る種々の方法のいずれも包含する。遺伝子の作用は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物、通常、タンパク質によって達成されることが多く、このような作用は、別の遺伝子（単数または複数）の１種または複数の遺伝子産物に対して発揮される。遺伝子相互作用は、第１の遺伝子の発現のレベルまたは遺伝子産物の活性が、第２の遺伝子の発現のレベルまたは遺伝子産物の活性に影響を及ぼし得る、または第２の遺伝子の遺伝子産物の表現型出現に影響を及ぼし得る（例えば、抑制し得るまたは増強し得る）種々の方法のいずれも包含する。「遺伝子の発現または活性」は、遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現または活性を包含すると理解されなければならない。同様に、「遺伝子の発現または活性に対する効果」とは、通常、遺伝子自体に対してではなく、遺伝子の遺伝子産物の発現または活性に対する効果を指す。例として、例えば、発現を増強または抑制すること、表現型的効果、合成成長欠陥、合成レスキュー、合成致死などを増強または抑制することが挙げられる。いくつかの実施形態では、真核生物遺伝子間の相互作用は、公的に入手可能なデータベース（例えば、精選されたデータベース）から得られる。いくつかの実施形態では、相互作用は、欠失または過剰発現スクリーニング（例えば、ゲノムワイドスクリーニング）から得られる。スクリーニングの方法は、当技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２０１１０３００５３３を参照のこと。いくつかの実施形態では、相互作用は、公的に入手可能なデータベースおよびスクリーニングの組合せから得ることができる。いくつかの実施形態では、相互作用は、特定のサブセットの細胞種のみから得ることができる。例えば、いくつかの実施形態では、神経学的組織（例えば、脳組織）に局在するヒト細胞において公知の相互作用のみを使用してもよい。
【００９９】
第１の真核生物（例えば、ヒト）における遺伝子と、第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の間の相同性は、当技術分野で利用可能な任意の方法によってであり得る。いくつかの実施形態では、第１の真核生物遺伝子（例えば、ヒト）および第２の真核生物遺伝子（例えば、酵母）のすべての対を比較する。いくつかの態様では、配列類似性を使用してもよい。配列類似性は、例えば、ハミング距離、配列アラインメント、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＳＳＥＡＲＣＨ、ＧＧＳＥＡＲＣＨ、ＧＬＳＥＡＲＣＨ、ＦＡＳＴＭ／Ｓ／Ｆ、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴおよびそれらの任意の組合せによって得ることができる。配列類似性は、ＢＬＡＳＴおよびＤＩＯＰＴなどの公的に入手可能なツールを用いて得ることができる。Huら、２０１１年を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスを用いるＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴを使用してもよい。Altschulら、１９９０年；１９９７年を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｅ値閾値を使用して、類似性の有意性を決定してもよい。いくつかの実施形態では、Ｅ値閾値＝１Ｅ−５を使用する。いくつかの実施形態では、ＤＩＯＰＴ（GTEx  Consortium、２０１３年；Huら、２０１１年；Reinhardtら、２０１３年；Sodingら、２００５年）、統合オルソログ予測ウェブサーバーを使用して、酵母タンパク質のヒトオルソログを予測できる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、第１の真核生物（例えば、ヒト）における遺伝子と、第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の間の相同性を、進化的類似性および／または構造類似性を評価することによって評価してもよい。進化的類似性および／または構造類似性は、当技術分野で公知の任意の方法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、マルチプル配列アラインメントを作出し、リモート進化シグネチャーを決定する。いくつかの実施形態では、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを使用して、マルチプル配列アラインメントを構築し、隠れマルコフモデルを築いて、リモート進化シグネチャーをコードする。いくつかの実施形態では、プロファイル隠れマルコフモデルおよびインプットとしての二次構造アノテーションとともに、ＨＨｐｒｅｄ（Kriksら、２０１１年；RobinsonおよびOshlack、２０１０年；Schondorfら、２０１４年；Sodingら、２００５年；Voevodskiら、２００９年）を使用して、第１の真核生物遺伝子（例えば、ヒト）および第２の真核生物遺伝子（例えば、酵母）の対（例えば、すべての対）を比較する。いくつかの実施形態では、Ｅ値閾値を使用して、類似性の有意性を決定できる。いくつかの実施形態では、Ｅ値閾値＝１Ｅ−５を使用する。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、第１の真核生物（例えば、ヒト）における遺伝子と、第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の間の相同性を、分子的相互作用類似性（例えば、ネットワークトポロジー）によって評価してもよい。ネットワークトポロジー（すなわち、拡散成分解析；ＤＣＡ）アプローチは、タンパク質レベルで機能的に関連するモジュールを捕捉するよう試み、その結果、各ノードを、保存された相互作用のパターンとともに、ネットワーク中の相同タンパク質を捕捉する単一スコアの代わりに低次元ベクトルを用いて表すことができる。いくつかの実施形態では、明快なＰａｇｅＲａｎｋ様アプローチ（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１６年；Voevodskiら、２００９年）を使用して、各ノードのベクトルをコンピュータ処理する。いくつかの実施形態では、洗練された機械学習技術を使用してベクトルの次元数が低減される。いくつかの実施形態では、このアプローチは、ノイズを低減することができ、機能的類似性などのトポロジーネットワーク情報を良好に抽出することができる（Bailly-Bechetら、２０１１年；Choら、２０１５年）。いくつかの実施形態では、ネットワークトポロジーは、遺伝子の機能解析のためのマルチ−ネットワークトポロジー（Ｍｕｌｔｉ−Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ）（Ｍａｓｈｕｐ）と呼ばれる方法によって決定される（Cho,  H.ら２０１６年）。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、両真核生物（例えば、ヒトおよび酵母）のネットワークトポロジーならびにそれらの間の配列／構造類似性を比較して、相同性を決定する。いくつかの態様では、配列および構造類似性スコアは、確率分布に変換され、希薄なベクトルを表現するものを含むすべてのノードの対の特徴ベクトルが、関連ベクトルとパラメータ化された多項分布間のカルバック・ライブラー（ＫＬ）ダイバージェンスを最小化することによって一緒にコンピュータ処理される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の相互作用に基づいて、第１の真核生物（例えば、ヒト）における遺伝子間の相互作用を増大するために、推測された相同性を使用してもよい。いくつかの実施形態では、相互作用が第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子の相同対中に存在する場合には、推測された相互作用を第１の真核生物（例えば、ヒト）のネットワークに加えてもよい。いくつかの実施形態では、第１の真核生物における遺伝子対と、第２の真核生物における遺伝子対間の、相同性の特定の閾値のみで、推測された相互作用を加える。いくつかの実施形態では、閾値は、第１の真核生物（例えば、ヒト）における相互作用の密度が、第２の真核生物（例えば、酵母）における相互作用の密度と同様であるよう設定する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、第２の真核生物からの相互作用を増大することによって、第１の真核生物（例えば、ヒト）における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップは、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１３年；２０１６年；Voevodskiら、２００９年）、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、１つまたは複数の精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続するステップを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＳＦアルゴリズムの目的の機能パラメータを、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ木問題（ＰＣＳＴ）および公知のメッセージ伝達アルゴリズムを用いて決定する。Bailly-Bechetら、２０１１年；Choら、２０１５年を参照のこと。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＰＣＳＦアルゴリズムのパラメータβ、ωおよびμを各々セット上界および下界内で変えて、遺伝子またはタンパク質ノードのマルチプルネットワークを作出する。いくつかの実施形態では、上界および下界は、十分な数の予測されたタンパク質（いくつかの実施形態では、インプット賞金遺伝子数の半量である）を含有するように設定する、および／またはネットワーク解法が、インプットネットワーク中に１０００を超える隣接関係（ｎｅｉｇｈｂｏｒ）を有するハブノードを導入しないように設定する。いくつかの実施形態では、βの範囲は、｛１，２，４，６，８，１０，１２｝であり、ωの範囲は、｛１，２，３，４，５，６，７，８｝であり、μの範囲は、｛０．００１，０．００３｝である。いくつかの実施形態では、βの範囲は、｛４，６，８，１０，１２，１４，１６｝であり、ωの範囲は、｛３，４，５，６，７，８，９，１０｝であり、μの範囲は、｛０．００３，０．００５｝である。次いで、マルチプルネットワークを組み合わせて、代表的ネットワークを得る。いくつかの実施形態では、最も頑健な代表的ネットワークを見い出すために、最大全域木アルゴリズムを使用してマルチプルネットワークを組み合わせる。いくつかの実施形態では、代表的ネットワークの統計的有意性が、第１の真核生物および第２の真核生物間の遺伝子のランダム対形成から生成されたネットワークに対して検証される。
【０１０６】
ＰＣＳＴアプローチを使用してネットワークを生成することができる公的に入手可能なウェブサーバー、ＳｔｅｉｎｅｒＮｅｔは、fraenkel.mit.edu/steinernetでワールドワイドウェブでアクセスできる（Tuncbag,  N.ら、Nucl.  Acids  Res.（２０１２年）４０巻（Ｗ１号）：Ｗ５０５〜Ｗ５０９頁）。いくつかの実施形態では、公知の疾患遺伝子および／または遺伝的修飾因子は、ＰＣＳＴによって生成されたネットワークにおいて「賞金ノード（ｐｒｉｚｅｄ  ｎｏｄｅ）」であり得る。ネットワークの構築の問題に他のアルゴリズム的アプローチを使用してもよく、本発明は、この点において制限されない。例えば、フロー最適化ベースの方法を使用してもよい（Lan,  A.ら、Nucleic  Acids  Res.  ２０１１年；３９巻：Ｗ４２４〜Ｗ４２９頁およびその参考文献）。他のアプローチとして、線形計画法、ベイジアンネットワークおよび最尤ベースのアプローチが挙げられる（Tuncbag,  N.らに引用される参考文献を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ネットワークは、種々のソフトウェアツールのいずれかを使用して可視化できる。例えば、ネットワークは、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（cytoscape.org/でワールドワイドウェブで入手可能；Cline,  M  Sら、Nature  Protocols  ２巻、２３６６〜２３８２頁（２００７年）；Shannon,  P.ら、Genome  Research  ２００３年１１月；１３巻（１１号）：２４９８〜５０４頁）を使用して可視化できる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明は、動物（例えば、ヒト、哺乳動物）において生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物において同定される候補酵母遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子を含む酵母遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｃ）動物における遺伝子間の相互作用を提供するステップと、（ｄ）候補酵母遺伝子のセットに対して相同な、動物における遺伝子のセットを決定するステップと、（ｅ）ステップ（ｂ）の相互作用に基づいて予測される遺伝子相互作用を用いて、ステップ（ｄ）において得られた動物における遺伝子のセット間の相互作用を増大することによって、動物における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、（ｉ）生理学的プロセスまたは病理プロセスの酵母類似物である条件下で、酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾された酵母細胞を提供するステップと、（ｉｉ）修飾が、条件に対する酵母細胞の応答を調節するか否かを決定するステップと、（ｉｉｉ）酵母細胞の応答が調節される場合に、酵母遺伝子を候補酵母遺伝子として同定するステップとを含む方法によって、ステップ（ａ）の候補酵母遺伝子のセットを得た。いくつかの実施形態では、条件は、１種または複数の遺伝子の異常な発現（例えば、過剰発現、発現の低減、発現の消失）を含む。いくつかの実施形態では、１種または複数の遺伝子は、非内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）の酵母細胞の応答の調節は、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）の候補酵母遺伝子の同定は、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化の同定を含む。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、候補真核生物遺伝子（例えば、酵母遺伝子）は、ゲノムワイドスクリーンから得られる。いくつかの実施形態では、ゲノムワイドスクリーンは、真核生物ゲノムの欠失または過剰発現スクリーンを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（Ｐｒｉｚｅ−Ｃｏｌｌｅｃｔｉｎｇ  Ｓｔｅｉｎｅｒ  Ｆｏｒｅｓｔ）（ＰＣＳＦ）アルゴリズムが、１つまたは複数の精選されたデータベースから得た遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して遺伝子またはタンパク質ノードを接続し、コストを最小にしながらネットワークを得る。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、多様なアルゴリズムパラメータを用いるＰＣＳＦアルゴリズムを使用して、第１の真核生物、第２の真核生物のマルチプルネットワークを生成する、ならびに／または最大全域木アルゴリズムを用いてマルチプルネットワークから増大相互作用および代表的ネットワークを作出する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本明細書における方法によって作出された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルは、１つまたは複数の予測された遺伝子またはタンパク質ノードを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法は、モデリングされた生理学的プロセスまたは病理プロセスに関与する、１種または複数の他の遺伝子またはタンパク質（例えば、予測された遺伝子またはタンパク質）を同定するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、予測された遺伝子またはタンパク質ノードは、ドラッガブルな標的を含む。
【０１１３】
「ドラッガブルな標的」とは、生体分子、例えば、そのレベルまたは活性が、小分子によって調節可能である（調節されることが可能である）タンパク質またはＲＮＡを指す。特定の実施形態では、ドラッガブルな標的は、少なくとも１種の小分子モジュレーターが同定されている生体分子である。特定の実施形態では、このような調節は、細胞不含アッセイ、例えば、タンパク質活性アッセイにおいて検出可能である。特定の実施形態では、このような調節は、標的を発現する細胞を使用する細胞ベースのアッセイにおいて検出可能である。任意の適したアッセイを使用してもよい。当業者ならば、タンパク質活性を測定するための多数の適したアッセイを承知し、タンパク質の公知のまたは予測された活性を考慮する適当なアッセイを選択できるであろう。活性は、例えば、結合活性、触媒活性、輸送体活性または任意の他の生物活性であり得る。いくつかの実施形態では、標的の調節は、標的の過剰発現によって誘導される表現型の少なくとも部分的逆転によって、または標的をコードする遺伝子の欠失によって検出することができる。特定の実施形態では、ドラッガブルな標的は、少なくとも１種の小分子と高親和性で結合することが公知である、もしくは結合すると予測されるタンパク質またはＲＮＡなどの生体分子である。特定の実施形態では、タンパク質は、ファミリーの他のメンバーが１種または複数の小分子によって調節されることが公知である、またはそれと結合するタンパク質ファミリーのメンバーである場合に、「ドラッガブル」であると予測される。特定の実施形態では、タンパク質は、細胞不含アッセイを使用するモジュレーターの同定に適している酵素活性を有する場合に、「ドラッガブル」であると予測される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、活性形態で産生または精製でき、その活性を測定するために使用できる少なくとも１種の公知の基質を有する。
【０１１４】
「小分子」とは、本明細書において、質量が約２キロダルトン（ｋＤａ）未満である有機分子である。いくつかの実施形態では、小分子は、約１．５ｋＤａ未満または約１ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、小分子は、約８００ダルトン（Ｄａ）、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａまたは１００Ｄａ未満である。小分子は、少なくとも５０Ｄａの質量を有することが多い。いくつかの実施形態では、小分子は、非重合体である。いくつかの実施形態では、小分子は、アミノ酸ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、ヌクレオチドではない。いくつかの実施形態では、小分子は、糖類ではない。いくつかの実施形態では、小分子は、複数の炭素−炭素結合を含有し、１個もしくは複数のヘテロ原子および／またはタンパク質との構造的相互作用（例えば、水素結合）にとって重要な１つもしくは複数の官能基、例えば、アミン、カルボニル、ヒドロキシルもしくはカルボキシル基、いくつかの実施形態では、少なくとも２つの官能基を含み得る。小分子は、必要に応じて、上記の官能基のうち１つまたは複数で置換されていてもよい、１個もしくは複数の環状炭素もしくは複素環式構造および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含むことが多い。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、第１の真核生物および第２の真核生物の遺伝子またはタンパク質間の相同性は、候補酵母遺伝子と動物遺伝子間の核酸配列、ポリペプチド配列、タンパク質構造または分子的相互作用のうち少なくとも１つを比較することを含む。いくつかの実施形態では、第１の真核生物および第２の真核生物の遺伝子またはタンパク質間の相同性は、（ｉ）動物遺伝子と候補酵母遺伝子間の配列類似性を決定するステップと、（ｉｉ）動物遺伝子と候補酵母遺伝子間の進化的類似性および構造類似性を決定するステップと、（ｉｉｉ）動物遺伝子および候補酵母遺伝子間の分子的相互作用類似性を決定するステップと、（ｉｖ）拡散成分解析を使用してステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）における類似性を統合することによって、候補酵母遺伝子のセットに対して相同な動物における遺伝子のセットを決定するステップとを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉ）は、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスおよび／またはＤＩＯＰＴを用いてＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴを利用することを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用して、マルチプル配列アラインメントを構築し、プロファイル隠れマルコフモデルを築いて、リモート進化信号をコードすることとそれに続くＨＨｐｒｅｄを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）は、遺伝子の機能解析のためのマルチ−ネットワークトポロジーのコンパクト統合（Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉ−Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｔｏｐｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ）（Ｍａｓｈｕｐ）を利用することを含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、真核生物のうち少なくとも１種は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、真核生物のうち少なくとも１種は、ヒト、マウス、ラットまたは霊長類である。いくつかの実施形態では、真核生物のうち少なくとも１種は、酵母（例えば、パン酵母）である。酵母、例えば、パン酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、実験系として相当な利点を有する。酵母は、培養および維持することが容易であり、短い世代時間を有し、高度に遺伝的に扱いやすく、これは、それらが、周知の、利用可能な技術および試薬を使用して、迅速に、予想通りに、高精度で遺伝的に修飾され得ることを意味し、ハイスループット化学的および遺伝的スクリーンに適している。株内の最小の遺伝子変動およびエピジェネティック変動がスクリーン再現性に貢献する。酵母における広範な遺伝子相互作用解析およびタンパク質相互作用解析は、酵母インタラクトーム、すなわち、細胞における分子間の物理的相互作用および酵母細胞における遺伝子間の相互作用、すなわち、遺伝子相互作用のセットに関する相当な情報が利用可能であることを意味する。分子的相互作用は、異なる生化学的ファミリー（タンパク質、核酸、脂質、炭化水素など）に属する分子間で、また所与のファミリー（例えば、タンパク質−タンパク質相互作用）内で生じ得る。酵母細胞は、神経系を有する多細胞生物の複雑性を欠きながら、ヒト細胞と共有する高度に保存されたゲノムおよび真核細胞性機構が、複雑な疾患プロセスの根底にある基本的細胞自律性機序ならびに物理的および遺伝子相互作用の理解の可能性を提供する。
細胞
【０１１７】
本発明の別の態様は、細胞の生成であって、（ａ）本明細書において開示される方法のいずれかに従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において得られたモデルにおいて遺伝子ノードを同定するステップと、（ｃ）遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を生成するステップとを含む細胞の生成を対象とする。細胞は、原核細胞（例えば、細菌）または真核細胞であり得る。真核細胞は、本明細書において開示される任意の種類であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞、マウス細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、胚幹細胞、哺乳動物胚幹細胞、ヒト胚幹細胞、マウス胚幹細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、胚幹細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞である。
【０１１８】
本明細書において開示される方法および組成物のいくつかの実施形態では、細胞は、体細胞、幹細胞、有糸分裂細胞または分裂終了細胞、ニューロン、線維芽細胞または接合体を含む。細胞、接合体、胚または出生後哺乳動物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物）起源のものであり得る。いくつかの態様では、脊椎動物は、哺乳動物または鳥類である。特定の例として、霊長類（例えば、ヒト）、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ、ブタまたは鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ダチョウ、シチメンチョウ）細胞、接合体、胚または出生後哺乳動物が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞、接合体、胚または出生後哺乳動物は、単離される（例えば、単離された細胞、単離された接合体、単離された胚）。いくつかの実施形態では、マウス細胞、マウス接合体、マウス胚またはマウス出生後哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ラット細胞、ラット接合体、ラット胚またはラット出生後哺乳動物が使用される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞、ヒト接合体またはヒト胚が使用される。本明細書において記載される方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで哺乳動物（例えば、マウス、ヒト）において使用できる。
【０１１９】
幹細胞は、全能性、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、寡能性（ｏｌｉｇｉｐｏｔｅｎｔ）および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞を含み得る。幹細胞の特定の例として、胚幹細胞、胎児幹細胞、成体幹細胞および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が挙げられる（例えば、すべて参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１４４０３１号、同２０１１／００７６６７８号、同２０１１／００８８１０７号、同２０１２／００２８８２１号を参照のこと）。
【０１２０】
体細胞は初代細胞（非不死化細胞）、例えば、動物から新たに単離されたものである場合も、培養で長期増殖可能な（例えば、３ヶ月より長期間）または不確定増殖可能な（不死化細胞）細胞系統に由来する場合もある。成体体細胞は、個体、例えば、ヒト対象から得、当業者に利用可能な標準細胞培養プロトコールに従って培養できる。本発明の態様において使用される体細胞として、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞またはげっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞などが挙げられる。それらは、種々の臓器、例えば、皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、腸、心臓、乳房、生殖器、筋肉、血液、膀胱、腎臓、尿道および他の泌尿器などから、一般的に、生存体細胞を含有する任意の臓器または組織から周知の方法によって得ることができる。種々の実施形態において有用な哺乳動物体細胞として、例えば、線維芽細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵臓細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（ＢおよびＴリンパ球）、マクロファージ、単細胞、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などが挙げられる。
【０１２１】
いくつかの態様では、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞は、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する対象から導かれる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に由来するｉＰＳｃ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、対象に由来するｉＰＳＣ細胞の前駆細胞である。
【０１２２】
いくつかの態様では、１つまたは複数の突然変異を細胞中に導入し、それが遺伝子の発現または遺伝子の遺伝子産物の活性を変更することによって、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を得る。１つまたは複数の突然変異は、細胞のゲノムへの挿入、欠失、破壊または置換のうち１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の欠失を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子または遺伝子の一部の追加のコピーの挿入を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、調節配列を修飾し、遺伝子の遺伝子産物の発現を増大または減少させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の遺伝子産物の活性を増大または減少させる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、遺伝子の遺伝子産物の細胞性分解速度を増大または減少させる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞は、細胞の調節配列（例えば、遺伝子のプロモーター領域）を変更することによって得られる。いくつかの実施形態では、調節配列のメチル化が修飾される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞は、標的化可能なヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ）を用いて細胞のゲノムを修飾することによって得られる。
【０１２５】
現在４つの主な種類の標的化可能なヌクレアーゼ（「部位特異的ヌクレアーゼ」と呼ばれることもある）が使用されている：ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＩＩ型系のＣａｓタンパク質などのＲＮＡによってガイドされるヌクレアーゼ（ＲＧＮ）および工学的に操作されたメガヌクレアーゼ。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、タンパク質に選択されたＤＮＡ配列を標的とするように適宜設計されている、部位特異的ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）に融合された制限酵素ＦｏｋＩ（またはその工学的に操作されたバリアント）のヌクレアーゼドメインを含む。ＺＦＮの場合には、ＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガーＤＢＤを含む。ＴＡＬＥＮの場合には、部位特異的ＤＢＤは、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）の種などの植物病原菌において見られる部位特異的ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーによって使用されるＤＮＡ認識コードに基づいて設計される。クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）ＩＩ型系は、ゲノム工学的操作のためにＲＮＡによってガイドされるエンドヌクレアーゼ技術として使用される細菌適応免疫系である。細菌系は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと呼ばれる２種の内因性細菌ＲＮＡならびにＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）ヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９を含む。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡに対して部分的相補性を有し、それとの複合体を形成する。Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体によって標的配列にガイドされ、これは、ｃｒＲＮＡ配列と、標的中の相補的配列間にＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを形成する。ゲノム修飾において使用するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、単一キメラガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡまたはｇＲＮＡ）に組み合わされることが多く、これでは、ｃｒＲＮＡの標的化特異性およびｔｒａｃｒＲＮＡの特性が、単一転写物に組み合わされ、これは、Ｃａｓタンパク質を標的配列に局在化させ、その結果、Ｃａｓタンパク質がＤＮＡを切断し得る。ｓｇＲＮＡは、所望の標的配列に対して相補的または相同であるおよそ２０ヌクレオチドのガイド配列と、それに続く約８０ｎｔのハイブリッドｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡを含むことが多い。当業者ならば、ガイドＲＮＡは、標的配列に対して完全に相補的または相同でなくてもよいということは理解する。例えば、いくつかの実施形態では、１つまたは２つのミスマッチを有し得る。ｇＲＮＡがハイブリダイズするゲノム配列は、通常、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列によって片側が隣接しているが、当業者ならば、特定のＣａｓタンパク質はＰＡＭ配列を緩く必要とし得ることを理解する。ＰＡＭ配列は、ゲノムＤＮＡ中に存在するが、ｓｇＲＮＡ配列中には存在しない。Ｃａｓタンパク質は、正しい標的配列およびＰＡＭ配列を有する任意のＤＮＡ配列に向けられる。ＰＡＭ配列は、Ｃａｓタンパク質が由来した細��種に応じて変わる。Ｃａｓタンパク質の具体例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９およびＣａｓ１０が挙げられる。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質を含む。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓまたはＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９を使用してもよい。これらのＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列は、それぞれ、ＮＧＧ、ＮＮＮＮＧＡＴＴ、ＮＮＡＧＡＡ、ＮＡＡＡＡＣである。特定の実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼのいくつかの工学的に操作されたバリアントが開発され、使用されることもある。例えば、Ｃａｓ９およびＦｏｋ１の工学的に操作されたバリアントが当技術分野で公知である。さらに、生物学的に活性な断片またはバリアントが使用され得るということは理解されよう。他の変動として、ハイブリッド部位特異的ヌクレアーゼの使用が挙げられる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡによってガイドされるＦｏｋＩヌクレアーゼ（ＲＦＮ）では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、触媒的に不活性Ｃａｓ９タンパク質（ｄＣａｓ９）タンパク質のアミノ末端に融合される。ＲＦＮは、二量体として作用し、２つのガイドＲＮＡを利用する（Tsai,  QSら、Nat  Biotechnol.  ２０１４年；３２巻（６号）：５６９〜５７６頁）。一本鎖ＤＮＡ切断をもたらす部位特異的ヌクレアーゼはまた、ゲノム編集にも役立つ。このようなヌクレアーゼは、「ニッカーゼ」とも呼ばれ、２つのヌクレアーゼドメインを含む部位特異的ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣａｓタンパク質など）の２つのヌクレアーゼドメインのうち１つの中の重要な触媒残基に突然変異（例えば、アラニン置換）を導入することによって生成できる。このような突然変異の例として、ＳｐＣａｓ９中の、または他のＣａｓ９タンパク質中の相同位置でのＤ１０Ａ、Ｎ８６３ＡおよびＨ８４０Ａが挙げられる。ニックは、ＨＤＲを、いくつかの細胞種では低効率で刺激し得る。互いに近接し、反対の鎖にある、配列の対に標的化される２つのニッカーゼは、各鎖で一本鎖切断を作出でき（「二重ニッキング」）、ＤＳＢを効率的に生成し、これは、必要に応じて、ドナーＤＮＡ鋳型を使用してＨＤＲによって修復され得る（Ran,  F.  A.ら  Cell  １５４巻、１３８０〜１３８９頁（２０１３年））。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＳｐＣａｓ９バリアントである。いくつかの実施形態では、ＳｐＣａｓ９バリアントは、Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ三重バリアントまたはＮ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ四重バリアントである。その全文が参照により本明細書に組み込まれる、Kleinstiverら、「High-fidelity  CRISPR-Cas9  nucleases  with  no  detectable  genome-wide  off-target  effects」、Nature、５２９巻、４９０〜４９５頁（および付録資料）（２０１６年）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃ２ｃ１、クラス２Ｖ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。その全文が参���により本明細書に組み込まれる、Yangら、「PAM-Dependent  Target  DNA  Recognition  and  Cleavage  by  C2c1  CRISPR-Cas  Endonuclease」、Cell、１６７巻、１８１４〜１８２８頁（２０１６年）を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６０３１９２６０「Engineered  CRISPR-Cas9  nucleases  with  Altered  PAM  Specificity」に記載されるものである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼ（例えば、部位特異的ヌクレアーゼ）は、天然に存在する標的化可能なヌクレアーゼに対して少なくとも９０％、９５％または９９％のポリペプチド配列同一性を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、細胞のヌクレオチド配列は、部位特異的ヌクレアーゼ（すなわち、標的化可能なヌクレアーゼ）および１つまたは複数のガイド配列を用いて修飾される。いくつかの実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質である。当技術分野で公知の種々のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子またはタンパク質を、本発明の方法において使用でき、Ｃａｓタンパク質の選択は、個々の状況に応じて変わる（例えば、www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=cas9）。特定の態様では、Ｃａｓ核酸またはタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、種々の原核生物種のいずれかに由来し得る。いくつかの実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質は、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択できる。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、公知の方法を使用して、細菌もしくは古細菌から得ることができる、または合成することができる。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性菌またはグラム陰性菌に由来し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）またはマリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）に由来し得る。いくつかの実施形態では、例えば、同一、同様または異なるＰＡＭモチーフを含む部位の認識および修飾を可能にするために、２種もしくはそれより多い異なるＣａｓタンパク質をコードする核酸または２種もしくはそれより多いＣａｓタンパク質が存在し得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃｐｆ１タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種に由来するＣｐｆ１またはその機能的部分である。特定の実施形態では、Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２タンパク質もしくはその機能的部分、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）の種ＢＶ３Ｌ６タンパク質もしくはその機能的部分またはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６タンパク質もしくはその機能的部分である。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ系のメンバーである。Ｃｐｆ１タンパク質は、約１３００個のアミノ酸を含むポリペプチドである。Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。その全文が参照によって本明細書に組み込まれる、Zetsche  Bら、「Cpf1  is  a  single  RNA-guided  endonuclease  of  a  class  2  CRISPR-Cas  system」、Cell  ２０１５年１０月２２日；１６３巻（３号）：７５９〜７１頁、doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.  Ｅｐｕｂ２０１５年９月２５日）およびＵＳ２０１６０２０８２４３を参照のこと。当業者ならば、Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、したがって、二次構造を保持する配列変化を許容する単一ステム−ループを含有するｃｒＲＮＡのみを必要とすることを理解する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼは、１つまたは複数のＣａｓ９ヌクレアーゼドメインを不活性化することによって生成できる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉドメイン中の残基１０でのアミノ酸置換は、ヌクレアーゼを、ＤＮＡニッカーゼに変換する。例えば、アミノ酸残基１０のアスパラギン酸を、アラニンと置換できる（Congら、Science、３３９巻：８１９〜８２３頁）。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、標的化可能なヌクレアーゼは、触媒的に不活性な標的化可能なヌクレアーゼ（例えば、触媒的に不活性な部位特異的ヌクレアーゼ）であり得る。いくつかの実施形態では、触媒的に不活性な標的化可能なヌクレアーゼを、エフェクタードメインとともに利用して、調節領域のメチル化度を修飾できる、従って、遺伝子の遺伝子産物の発現を増大または減少させることができる。触媒的に不活性のＣａｓ９タンパク質を作出するアミノ酸突然変異として、残基１０および／または残基８４０での突然変異させることが挙げられる。残基１０および残基８４０両方での突然変異は、本明細書においてｄＣａｓ９と呼ばれることもある触媒的に不活性のＣａｓ９タンパク質を作出し得る。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓ９は、触媒的に不活性であるＤ１０ＡおよびＨ８４０Ａ  Ｃａｓ９突然変異体である。本明細書において、「エフェクタードメイン」とは、ゲノム配列（例えば、遺伝子）の発現および／または活性化を調節する分子（例えば、タンパク質）である。エフェクタードメインは、メチル化活性（例えば、ＤＮＡメチル化活性）を有し得る。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、遺伝子の対立遺伝子の一方または両方を標的とする。エフェクタードメインは、核酸配列として、および／またはタンパク質として導入することができる。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、構成性または誘導性エフェクタードメインであり得る。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列またはそのバリアントおよびエフェクタードメイン核酸配列を、キメラ配列として細胞中に導入する。いくつかの態様では、エフェクタードメインを、Ｃａｓタンパク質と会合する（例えば、結合する）分子に融合する（例えば、エフェクター分子を、Ｃａｓタンパク質と結合する抗体またはその抗原結合断片に融合する）。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質またはそのバリアントおよびエフェクタードメインを、融合し、または繋ぎとめてキメラタンパク質を作出し、キメラタンパク質として細胞中に導入する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質およびエフェクタードメインは、タンパク質−タンパク質相互作用として結合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質およびエフェクタードメインは、共有結合によって連結される。いくつかの態様では、エフェクタードメインは、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質と非共有結合によって会合する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）核酸配列およびエフェクタードメイン核酸配列を、別個の配列および／またはタンパク質として導入する。いくつかの態様では、Ｃａｓ（例えば、ｄＣａｓ）タンパク質およびエフェクタードメインは、融合しておらず繋ぎとめられてもいない。
【０１３１】
部位特異的ヌクレアーゼまたはポリペプチド（例えば、部位特異的ヌクレアーゼおよびエフェクタードメインを含む融合ポリペプチド、部位特異的ヌクレアーゼおよびメチル化または脱メチル化活性を有するエフェクタードメインを含む融合ポリペプチド）は、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡまたはポリペプチドの適当な設計によって、哺乳動物細胞のゲノム中の特有の部位（例えば、ノードとして同定された遺伝子）を標的化することができる。ポリペプチド、ヌクレアーゼおよび／またはガイドＲＮＡは、それをコードする核酸を細胞中に導入することによって細胞中に導入することができる。プラスミドＤＮＡトランスフェクション、ウイルスベクター送達、修飾されたまたは合成ｍＲＮＡ（例えば、キャップド、ポリアデニル化ｍＲＮＡ）を用いるトランスフェクションまたはマイクロインジェクションなどの標準的な方法を使用できる。いくつかの実施形態では、修飾されたまたは合成ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを安定化する、または天然に存在するｍＲＮＡを上回る他の改善（例えば、細胞性取り込みの増大）を提供する１つまたは複数の修飾を含む。修飾されたまたは合成ｍＲＮＡの例は、Warrenら（Cell  Stem  Cell  ７巻（５号）：６１８〜３０頁、２０１０年、Mandal  PK、Rossi  DJ.  Nat  Protoc.  ２０１３年、８巻（３号）：５６８〜８２頁、米国特許出願公開第２０１２００４６３４６号および／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３２６７９（ＷＯ／２０１１／１３０６２４）に記載されている。ｍＲＮＡはまた、R.E.  Rhoads（編）、「Synthetic  mRNA:  Production,  Introduction  Into  Cells,  and  Physiological  Consequences」Series:  Methods  in  Molecular  Biology、１４２８巻において論じられている。さらなる例は、Ｍｏｄｅｒｎａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓの多数のＰＣＴおよびＵＳ出願および交付済み特許、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４６８６１、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６３６、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５４６１７、ＵＳＳＮ１４／３９０，１００（およびこれらにおいて言及されるさらなる特許および特許出願）に見い出される。ヌクレアーゼまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを導入し、コード配列は、発現のために適当な調節エレメント、例えば、プロモーターおよび終結シグナルに作動可能に連結されなければならない。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする配列を、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６またはｔＲＮＡプロモーターに作動可能に連結する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイドＲＮＡおよびＣａｓタンパク質コード配列は、同一核酸（例えば、プラスミド）から転写される。いくつかの実施形態では、複数のガイドＲＮＡが、同一プラスミドから、または異なるプラスミドから転写されるか、そうでなければ細胞中に導入される。複数のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９をゲノム中の異なる標的配列に向かわせることができ、マルチプレックス化ゲノム編集を可能にする。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）は、核局在性シグナル（例えば、ＳＶ４０  ＮＬＳ）を含み得る、または含むように修飾され得る。ヌクレアーゼタンパク質は、例えば、タンパク質形質導入を使用して細胞中に導入してもよい。ヌクレアーゼタンパク質、ガイドＲＮＡまたは両方を、マイクロインジェクションを使用して導入してもよい。例えば、ゲノム編集を実施するために部位特異的ヌクレアーゼを使用する方法は、多数の刊行物、例えば、Methods  in  Enzymology、Doudna  JA、Sontheimer  EJ.（編）、The  use  of  CRISPR/Cas9,  ZFNs,  and  TALENs  in  generating  site-specific  genome  alterations.  Methods  Enzymol.  ２０１４年、５４６巻（Elsevier）；Carroll,  D.、Genome  Editing  with  Targetable  Nucleases、Annu.  Rev.  Biochem.  ２０１４年、８３巻：４０９〜３９頁およびこれらのいずれかにおける参考文献に記載されている。米国特許出願公開第２０１４００６８７９７号、同２０１４０１８６９１９号、同２０１４０１７０７５３号および／またはＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０３４３８７（ＷＯ／２０１４／１７２４７０）も参照のこと。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイド配列は、部位特異的にＤＮＡを認識する配列を含む。例えば、ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ系によって利用されるガイドリボ核酸（ＲＮＡ）配列または部位特異的にＤＮＡを認識するＴＡＬＥＮもしくはジンクフィンガー系内の配列を含み得る。ガイド配列は、１つまたは複数のゲノム配列の各々の一部と相補的である部分を含み、触媒的に不活性の部位特異的ヌクレアーゼの結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と呼ばれる。
【０１３３】
いくつかの態様では、ガイド配列は、調節または修飾されているゲノム配列１つまたは複数の（例えば、すべて）と相補的であり得る。一態様では、ガイド配列は、単一標的ゲノム配列に対して相補的である。２つまたはそれより多い標的ゲノム配列が調節または修飾される予定である特定の態様では、各ガイド配列が１つの標的ゲノム配列に対して相補的である（特異的である）複数の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれより多い）ガイド配列を導入する。いくつかの態様では、２つまたはそれより多い、３つまたはそれより多い、４つもしくはそれより多い、５つもしくはそれより多いまたは６つもしくはそれより多いガイド配列が、同一標的配列の異なる部分に対して相補的である（特異的である）。一態様では、２つまたはそれより多いガイド配列は、ＤＮＡの同一領域の異なる配列と結合する。いくつかの態様では、単一ガイド配列は、ゲノム配列の少なくとも２つの標的またはそれより多く（例えば、すべて）に対して相補的である。ゲノム配列の１つまたは複数に対して相補的であるガイド配列の一部および触媒的に不活性の部位特異的ヌクレアーゼと結合するガイド配列の一部を、単一配列として、または２つ（またはそれより多い）の別個の配列として細胞中に導入できるということも当業者には明らかとなろう。
【０１３４】
各ガイド配列は、約８塩基対（ｂｐ）〜約２００ｂｐに長さが変わり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ配列は、約９〜約１９０ｂｐ、約１０〜約１５０ｂｐ、約１５〜約１２０ｂｐ、約２０〜約１００ｂｐ、約３０〜約９０ｂｐ、約４０〜約８０ｂｐ、約５０〜約７０ｂｐの長さであり得る。
【０１３５】
各ガイド配列が相補的である、各ゲノム配列（例えば、ノードとして同定された遺伝子）の部分も、大きさが変わり得る。特定の態様では、ガイド配列が相補的である、各ゲノム配列の部分は、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、８１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または１００ヌクレオチド（連続ヌクレオチド）の長さであり得る。いくつかの実施形態では、各ガイド配列は、各ゲノム配列の部分に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％同一または類似などであり得る。いくつかの実施形態では、各ガイド配列は、各ゲノム配列に対して完全にまたは部分的に同一または同様である。例えば、各ガイド配列は、ゲノム配列の部分に対する完全相補性とは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０ヌクレオチドなどだけ異なり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のガイド配列は、ゲノム配列の少なくとも約１０〜約２５（例えば、約２０）ヌクレオチドにわたって完全に相補性（１００％）である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、遺伝子ノードの発現の変更または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞を、細胞を、遺伝子ノードの発現を低減させる核酸と接触させることによって得る。核酸は、３を超えるヌクレオチド長を有するリボースヌクレオチドまたはデオキシリボースヌクレオチドのポリマーである。核酸は、天然に存在するヌクレオチド、合成ヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはホスホロチオエート（phosphorotiolates）などのシュードヌクレオチドならびにＰ３２、ビオチン、蛍光色素またはジゴキシゲニンなどの検出可能な標識を有するヌクレオチドを含み得る。遺伝子ノードの発現を低減できる核酸は、遺伝子ノード核酸（例えば、ｍＲＮＡ）またはその一部に対して完全に相補的であり得る。あるいは、配列間の幾分かの可変性が許容される場合もある。
【０１３７】
本発明の核酸は、細胞内条件下またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で遺伝子ノード核酸（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイズし得る。本発明の核酸は、遺伝子ノード核酸（例えば、ｍＲＮＡ）に対して、いずれかまたは両条件下で遺伝子ノードの発現を阻害するのに十分に相補的である。細胞内条件とは、通常、細胞、例えば、哺乳動物細胞内で見られる温度、ｐＨおよび塩濃度などの条件を指す。
【０１３８】
一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度およびｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書において別に認定されるような所望のストリンジェンシーの程度に応じて、選択された配列の熱融点よりも約１℃〜約２０℃の範囲低い温度を包含する。例えば、隣接するコード配列に対して相補的ではない連続ヌクレオチドのストレッチによって各々分けられている、転写因子コード配列に対して正確に相補的である連続ヌクレオチドの２、３、４または５つまたはそれより多いストレッチを含む核酸は、遺伝子ノードの機能を阻害し得る。一般に、連続ヌクレオチドの各ストレッチは、少なくとも４、５、６、７または８またはそれより多いヌクレオチド長である。非相補的介在配列は、１、２、３または４ヌクレオチド長であり得る。当業者ならば、センス核酸にハイブリダイズされる核酸の算出された融点を容易に使用して、特定の標的核酸の発現を阻害するために許容されるミスマッチの程度を推定できる。本発明の核酸は、例えば、リボザイムまたはアンチセンス核酸分子を含む。
【０１３９】
アンチセンス核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ））、酵素依存的に、または立体的遮断によって機能し得る。酵素依存的に機能するアンチセンス分子は、標的ｍＲＮＡを分解するためのＲＮａｓｅ  Ｈ活性に対して依存性の形態を含む。これらは、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡおよびホスホロチオエート分子ならびにセンス−アンチセンス鎖対合による標的ｍＲＮＡ認識と、それに続くＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体による標的ｍＲＮＡの分解を含む二本鎖ＲＮＡｉ／ｓｉＲＮＡ系を含む。ＲＮａｓｅ−Ｈ非依存性である立体遮断性アンチセンスは、標的ｍＲＮＡとの結合によって遺伝子発現または他のｍＲＮＡ依存性細胞性プロセスを干渉し、翻訳などの他のプロセスを干渉する。立体遮断性アンチセンスは、２’−Ｏアルキル（普通、ＲＮａｓｅ−Ｈ依存性アンチセンスとのキメラ中に）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）およびモルホリノアンチセンスを含む。
【０１４０】
低分子干渉ＲＮＡを使用して、例えば、遺伝子ノードの産物のレベルが低減されるように、遺伝子ノードをコードするｍＲＮＡのレベルを特異的に低減してもよい、および／または遺伝子ノードをコードするｍＲＮＡの翻訳を低減してもよい。ｓｉＲＮＡは、転写後遺伝子サイレンシングを配列特異的に媒介する。例えば、Carthewら、「Origins  and  Mechanisms  of  miRNAs  and  siRNAs」、Cell、１３６巻、４号、６４２〜６５５頁、２００９年２月２０日を参照のこと。ｓｉＲＮＡは、ひとたび、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体中に組み込まれると、複合体を相同ｍＲＮＡ転写物にガイドし、次いで、相同ｍＲＮＡ転写物が複合体によって切断されることによって、相同内因性ｍＲＮＡ転写物の切断を媒介する。ｓｉＲＮＡは、遺伝子ノードｍＲＮＡ転写物の任意の領域に対して相同であり得る。相同性の領域は、３０ヌクレオチド長またはそれより短い、２５ヌクレオチド未満、約２１〜２３ヌクレオチド長またはそれより短い、例えば、１９ヌクレオチド長であり得る。ｓｉＲＮＡは、通常、二本鎖であり、ヌクレオチド３’オーバーハングを有し得る。３’オーバーハングは、最大約５または６ヌクレオチドの’３オーバーハング、例えば、２ヌクレオチドの３’オーバーハング、例えば、３’オーバーハングＵＵジヌクレオチドなどであり得る。いくつかの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ヌクレオチド３’オーバーハングを全く含まない場合もある。ｓｉＲＮＡを設計する方法は、当業者に公知である。例えば、Elbashirら  Nature  ４１１巻：４９４〜４９８頁（２００１年）；Harborthら  Antisense  Nucleic  Acid  Drug  Dev.  １３巻：８３〜１０６頁（２００３年）を参照のこと。いくつかの実施形態では、ＡＡで始まり、センスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ鎖の両方について３’ＵＵオーバーハングを有し、およそ５０％のＧ／Ｃ含量を有する標的部位を選択する。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の標的ｍＲＮＡに対して特有であり、分解または翻訳阻害が望まれない他のｍＲＮＡでは、特有ではない標的部位を選択する。ｓｉＲＮＡは、化学的に合成してもよく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作出してもよく、またはｓｉＲＮＡ発現ベクターもしくはＰＣＲ発現カセットから発現させてもよい。例えば、ambion.com/techlib/tb/tb.sub.--506htmlでワールドワイドウェブを参照のこと。
【０１４１】
ｓｉＲＮＡが、発現ベクターまたはＰＣＲ発現カセットから発現される場合には、ｓｉＲＮＡをコードする挿入部分は、ｓｉＲＮＡヘアピンにフォールディングするＲＮＡ転写物として発現され得る。したがって、ＲＮＡ転写物は、ヘアピンのループならびに３’末端にＵ’のストリングを形成するスペーサー配列によって、その逆相補性アンチセンスｓｉＲＮＡ配列に連結されているセンスｓｉＲＮＡ配列を含み得る。ヘアピンのループは、任意の適当な長さ、例えば、最大３０ヌクレオチド長、例えば、３〜２３ヌクレオチド長であってよく、種々のヌクレオチド配列のものであってよい。ｓｉＲＮＡはまた、直接的に、または導入遺伝子もしくはウイルスによって導入された二本鎖ＲＮＡの切断によってｉｎ  ｖｉｖｏで生成されてもよい。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる増幅は、いくつかの生物において起こり得る。ｓｉＲＮＡを、当技術分野で通常の技術を有するものに公知の任意の方法に従ってさらに修飾してもよい。
【０１４２】
アンチセンス阻害性核酸を使用してまた、例えば、転写および／または翻訳を阻害することによって遺伝子ノード発現を特異的に低減してもよい。アンチセンス阻害性核酸は、遺伝子ノードの遺伝子産物をコードするセンス核酸に対して相補的である。例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に対して相補的である場合も、またはｍＲＮＡ配列に対して相補的である場合もある。全コード鎖に対して相補的である場合も、その一部のみに対して相補的である場合もある。遺伝子ノードの遺伝子産物をコードする核酸の非コード領域のすべてに対して相補的である場合も、一部に対して相補的である場合もある。非コード領域は、コード領域に隣接する５’および３’領域、例えば、５’および３’非翻訳配列を含む。アンチセンス阻害性核酸は、一般に、少なくとも６ヌクレオチド長であるが、最大約８、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチド長であり得る。より長い阻害性核酸を使用してもよい。
【０１４３】
アンチセンス阻害性核酸は、当技術分野で公知の方法を使用して、例えば、アンチセンス阻害性核酸をコードする発現ベクターからの、または発現カセットからの発現によって調製してもよい。あるいは、天然に存在するヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたはその任意の組合せを使用する化学合成によって調製してもよい。いくつかの実施形態では、阻害性核酸は、例えば、阻害性核酸の生物学的安定性を増大するように、またはアンチセンス阻害性核酸とセンス核酸の間に形成される二本鎖の細胞内安定性を増大するように設計された、修飾されたヌクレオチドまたは非リン酸ジエステル結合から作製される。
【０１４４】
天然に存在するヌクレオチド、ヌクレオシドおよび核酸塩基として、リボースまたはデオキシリボースヌクレオチドアデノシン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルが挙げられる。修飾されたヌクレオチド、ヌクレオシドおよび核酸塩基の例として、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン（isopentenyladeninje）、ウラシル−５オキシ酢酸、ブトキソシン（ｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキサ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキサ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗおよび２，６−ジアミノプリンを含むものが挙げられる。
【０１４５】
したがって、本発明の核酸は、修飾されたヌクレオチドならびにリボースおよびデオキシリボースヌクレオチドの組合せなどの天然ヌクレオチドを含んでもよく、本発明の核酸は、上記で論じられた任意の長さであってよく、遺伝子ノードの核酸配列に対して相補的である。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、遺伝子ノードの発現を調節する核酸は、小さいヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【０１４７】
ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡ干渉によって遺伝子発現をサイレンシングするために使用できる緊密なヘアピンを生成するＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞性機構によってｓｉＲＮＡに切断され、次いで、これが標的ｍＲＮＡと結合し、切断する。ｓｈＲＮＡは、ｓｈＲＮＡをコードするベクターによって細胞に導入でき、これでは、ｓｈＲＮＡコード領域は、プロモーターに作動可能に連結されている。選択されたプロモーターは、ｓｈＲＮＡの発現を可能にする。例えば、プロモーターは、ｓｈＲＮＡの連続発現にとって有用であるＵ６プロモーターであってもよい。ベクターは、例えば、娘細胞へ伝えられることができ、遺伝子サイレンシングが遺伝性であることを可能にする。McIntyre  G、Fanning  G、Design  and  cloning  strategies  for  constructing  shRNA  expression  vectors、BMC  BIOTECHNOL.  ６巻：１号（２００６年）；Paddisonら、Short  hairpin  RNAs  (shRNAs)  induce  sequence-specific  silencing  in  mammalian  cells、GENES  DEV.  １６巻（８号）：９４８〜５８頁（２００２年）を参照のこと。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、遺伝子ノードの発現を調節する核酸は、リボザイムである。リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡ分子であり、相同領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断可能である。例えば、Cech、Science  ２３６巻：１５３２〜１５３９頁（１９８７年）；Cech、Ann.  Rev.  Biochem.  ５９巻：５４３〜５６８頁（１９９０年）；Cech、Curr.  Opin.  Struct.  Biol.  ２巻：６０５〜６０９頁（１９９２年）；Couture  and  Stinchcomb、Trends  Genet.  １２巻：５１０〜５１５頁（１９９６年）を参照のこと。
【０１４９】
トランスで高度に配列特異的にＲＮＡ分子を切断できるリボザイムを設計し、構築する方法が開発されており、当技術分野で記載されている。例えば、Haseloffら、Nature  ３３４巻：５８５〜５９１頁（１９８８年）を参照のこと。リボザイムは、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を工学的に操作してリボザイム中に入れることによって特定のＲＮＡを標的化できる。ハイブリダイゼーション領域は、リボザイムが、標的と特異的にハイブリダイズすることを可能にする、標的ＲＮＡに対して相補的である配列を含有する。例えば、Gerlachら、ＥＰ３２１，２０１を参照のこと。標的配列は、約５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０または５０連続ヌクレオチドのセグメントであり得る。標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大するためにより長い相補的配列を使用してもよい。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本明細書における核酸（例えば、増強された核酸）（例えば、ＤＮＡ構築物、合成ＲＮＡ、例えば、本明細書において記載される相同または相補的ＲＮＡ、本明細書において記載されるｍＲＮＡなど）は、当業者に周知のトランスフェクション、エレクトロポレーション、カチオン性物質、ポリマーまたは脂質ベースの送達分子によって目的の細胞中に導入してもよい。本明細書において、天然に存在する対応物核酸と比較して、「増強された核酸」は、増強された特性（例えば、増強された安定性、増強された細胞性取り込み、増強された結合、増強された特異性）を有する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、または培養において細胞集団への核酸送達を増強する。例えば、複数の細胞（例えば、酵母または哺乳動物細胞などの真核細胞）を含有する細胞培養を、少なくとも１つのヌクレオシド修飾および必要に応じて翻訳可能な領域を有する増強された核酸を含有する組成物と接触させる。いくつかの実施形態では、組成物はまた、一般に、トランスフェクション試薬または宿主細胞への増強された核酸取り込みの効率を増大する他の化合物を含有する。増強された核酸は、対応する未修飾核酸に対して、細胞集団において増強された保持を示す。いくつかの実施形態では、増強された核酸の保持は、未修飾核酸の保持よりも大きい。いくつかの実施形態では、未修飾核酸の保持よりも、少なくとも約５０％、７５％、９０％、９５％、１００％、１５０％、２００％または２００％を超えて大きい。このような保持利点は、増強された核酸を用いる１ラウンドのトランスフェクションによって達成することができる、または反復ラウンドのトランスフェクション後に得ることができる。
【０１５２】
現在開示される主題の合成ＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡ、増強された核酸）を、必要に応じて、例えば、細胞への修飾されたｍＲＮＡ送達の決定を促進するリポーター遺伝子（例えば、ｍＲＮＡのコード領域の上流または下流）と組み合わせてもよい。適したリポーター遺伝子として、例えば、緑色蛍光タンパク質ｍＲＮＡ（ＧＦＰ  ｍＲＮＡ）、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ  ｍＲＮＡ）、ホタルルシフェラーゼｍＲＮＡまたはそれらの任意の組合せを挙げることができる。例えば、ＧＦＰ  ｍＲＮＡを、核局在性配列をコードするｍＲＮＡと融合して、少なくとも１つの調節エレメントから転写されるＲＮＡが起こっている細胞におけるｍＲＮＡ局在性の確認を容易にできる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、転写後に、例えば、キャップまたは他の官能基を付加することによってＲＮＡをさらに修飾できる。一態様では、合成ＲＮＡ（増強された核酸）は、５’および／または３’−キャップ構造を含む。合成ＲＮＡは、一本鎖（例えば、ｓｓＲＮＡ）または二本鎖（例えば、ｄｓＲＮＡ）であり得る。５’および／または３’−キャップ構造は、センス鎖、アンチセンス鎖のみ、または両鎖であり得る。「キャップ構造」とは、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端に組み込まれている化学修飾を意味する（例えば、本明細書において参照により組み込まれる、Adamicら、米国特許第５，９９８，２０３号を参照のこと）。これらの末端修飾は、エキソヌクレアーゼ分解から核酸分子を保護し、細胞内で送達および／または局在性において補助し得る。キャップは、５’末端（５’−キャップ）にまたは３’末端（３’−キャップ）に存在する場合も、両端に存在する場合もある。
【０１５４】
５’−キャップの限定されない例として、それだけには限らないが、グリセリル、逆位デオキシ塩基脱落残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾された塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート連結、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位塩基脱落部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位塩基脱落部分、１，４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホルアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたは架橋もしくは非架橋メチルホスホネート部分が挙げられる。
【０１５５】
３’−キャップの限定されない例として、それだけには限らないが、グリセリル、逆位デオキシ塩基脱落残基（部分）、４’，５’−メチレンヌクレオチド、１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、５’−アミノ−アルキルホスフェート、１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１，２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、アルファ−ヌクレオチド、修飾された塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、スレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’，４’−セコヌクレオチド、３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位塩基脱落部分、５’−ホスホルアミダート、５’−ホスホロチオエート、１，４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、架橋および／または非架橋５’−ホスホルアミダート、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分が挙げられる（より詳細については、参照により本明細書に組み込まれるBeaucageおよびIyer、１９９３年、Tetrahedron  ４９巻、１９２５頁を参照のこと）。
【０１５６】
合成ＲＮＡは、少なくとも１つの修飾されたヌクレオシド、例えば、シュードウリジン、ｍ５Ｕ、ｓ２Ｕ、ｍ６Ａおよびｍ５Ｃ、Ｎ１−メチルグアノシン、Ｎ１−メチルアデノシン、Ｎ７−メチルグアノシン、２’−）−メチルウリジンおよび２’−Ｏ−メチルシチジンを含み得る。修飾されたヌクレオシドを受け入れるポリメラーゼは、当業者に公知である。修飾されたポリメラーゼを使用して、合成の、修飾されたＲＮＡを生成できる。したがって、例えば、特定の修飾されたヌクレオシドを基質として許容するまたは受け入れるポリメラーゼを使用して、修飾されたヌクレオシドを含む、合成の、修飾されたＲＮＡを生成できる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、トランスフェクトされた組織または細胞集団によるｉｎ  ｖｉｖｏでの自然免疫応答の低減（または消失）またはｉｎ  ｖｉｖｏでのインターフェロン応答の低減を引き起こす。真核細胞、例えば、哺乳動物またはヒト細胞において産生されるｍＲＮＡは、重度に修飾され、修飾は、細胞が、その細胞によって産生されないＲＮＡを検出することを可能にする。細胞は、翻訳を停止すること、またはそうでなければ、自然免疫もしくはインターフェロン応答を開始することによって応答する。したがって、外因的に添加されたＲＮＡが、標的細胞によって産生された内因性ＲＮＡにおいて生じる修飾を模倣するように修飾され得る限り、外因性ＲＮＡは、外来核酸に対する標的細胞の防御の少なくとも一部を避けることができる。したがって、いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、真核生物／哺乳動物／ヒトＲＮＡにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで見い出されるような修飾を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを含む。このような天然に存在する修飾を模倣する他の修飾はまた、細胞によって許容される合成ＲＮＡ分子の産生においても有用であり得る。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、合成ＲＮＡは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞においてｍＲＮＡ安定性および／または翻訳効率を増大できる１つまたは複数の修飾（例えば、修飾された５’および／または３’ＵＴＲ配列、最適化されたコドン）を有する。参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２０６７５３号を参照のこと。
【０１５９】
本明細書において、用語「トランスフェクトする」または「トランスフェクション」とは、核酸、例えば、合成ＲＮＡ、例えば、修飾されたｍＲＮＡの細胞への、または好ましくは、標的細胞への導入を意味する。導入された合成ＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡ）は、標的細胞中で安定にまたは一過性に維持され得る。用語「トランスフェクション効率」とは、トランスフェクションに付されている標的細胞によって取り込まれた合成ＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ）の相対量を指す。実際には、トランスフェクション効率は、トランスフェクション後に標的細胞によって発現されたリポーター核酸産物の量によって推定できる。好ましい実施形態として、高トランスフェクション効率を有する組成物、特に、非標的細胞のトランスフェクションによって媒介される有害作用を最小化するそれらの組成物が挙げられる。いくつかの実施形態では、高トランスフェクション効率を実証する本発明の組成物は、潜在的な全身有害作用を最小にしながら、合成ＲＮＡ（例えば、修飾されたｍＲＮＡ、阻害性ＲＮＡ）の適当な投与量が標的細胞に送達される可能性を改善する。
スクリーニングの方法
【０１６０】
いくつかの態様では、本発明は、生理学的プロセスまたは病理プロセスのモジュレーターについてのスクリーニング方法であって、遺伝子ノードの発現または遺伝子ノードの遺伝子産物の活性の変更を有する細胞（すなわち、変更された細胞）を提供するステップと、生理学的プロセスまたは病理プロセス（例えば、本明細書において開示される方法によってモデリングされる生理学的プロセスまたは病理プロセス）のモジュレーターについて化合物をスクリーニングするために細胞を使用するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法によって細胞が得られる。いくつかの実施形態では、スクリーニングの方法は、変更された細胞を薬剤（例えば、小分子、核酸、抗体またはポリペプチド）と接触させるステップおよび少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を測定するステップを含む。
【０１６１】
広い意味で、「スクリーニング」は、細胞表現型に対する選択された効果（例えば、潜在的治療上有用な効果）を有する試験化合物または薬剤が探索されるアレイの任意の使用を含み得る。スクリーニングは、目的の１つまたは複数の細胞表現型に対する多数の（例えば、数百、数千または数百万）の別個の試験化合物、薬剤または試験化合物／薬剤組合せの効果を評価することを含むことが多い。いくつかの実施形態では、目的の細胞表現型は、化合物に対する「応答」である。応答は、例えば、細胞生存力または細胞増殖の増大または減少、細胞の１つまたは複数の生物学的機能またはプロセスの変更、１種または複数の遺伝子産物の発現または活性または細胞下局在性または翻訳後修飾の変更などであり得る。化合物と接触させた場合に目的の特定の応答を示す細胞は、化合物に対して「応答する」または化合物に対して「感受性」であるといわれ得る。応答を示さない、または例えば、感受性細胞と比較して低減された応答を示す細胞は、化合物に対して「耐性」であるといわれ得る。多数の実施形態において、培養環境（ｅｘ  ｖｉｖｏ）における目的の細胞応答は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（すなわち、ヒトまたは動物における）での目的の応答に対応し得る、またはそれと相関し得る。例えば、化合物に応じた培養におけるがん細胞生存力または増殖の低減は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのがん細胞生存力または増殖の低減と相関し得る、また、がんを有する対象において治療効力をもたらし得る。あるいは、毒性タンパク質凝集体（例えば、α−ｓｙｎ凝集体）の生成の低減または毒性タンパク質凝集体に対する感受性の低減は、タンパク質症を有する患者における有効性と相関し得る。いくつかの実施形態では、スクリーンを使用して、組合せで調節する（例えば、阻害する）ために有用であろう有用な化合物の組合せまたは標的を同定する。「併用療法」は、通常、化合物のいずれかが、単一薬剤または有効性を維持する（例えば、薬物耐性の出現を阻害することによって）のに有用であろうものと同一用量で投与される場合に達成されるであろうものよりも、大きい、またはより有益である、またはより延長された生物学的効果（通常、特定の疾患または状態に対する治療上有益な効果）を達成するための、十分に近い時間での２種またはそれより多い化合物の投与を指す。いくつかの実施形態では、２種またはそれより多い化合物を、互いに６週間以内またはそれより短い間に少なくとも１回投与する。２種またはそれより多い化合物を、互いに２４または４８時間以内または互いに最大１、２、３もしくは４週間以内に投与することが多い。いくつかの実施形態では、それらを単一組成物中で一緒に投与してもよいが、別個に投与するであろうことが多く、異なる投与経路を使用して投与しても、同一投与経路を使用して投与してもよい。併用療法は、例えば、有効性の増大をもたらし得る、またはより低用量の化合物の使用を可能にでき、これが副作用を低減し得る。併用療法において使用される化合物は、同一の標的または経路を標的とする場合も、異なる標的または経路を標的とする場合もある。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、スクリーンは、目的の表現型に関して特に関連するものであり得る細胞種、例えば、薬物候補または標的が探索される疾患において影響を受ける、または化合物の望ましくない副作用に対して特に脆弱であり得る細胞種の細胞を使用して実施できる。
【０１６３】
いくつかの態様では、本発明は、生物（例えば、ヒト、真核生物、哺乳動物）において病理プロセスを処置するために化合物についてスクリーニングする方法であって、（ａ）本明細書において開示される任意の方法によって生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングするステップと、（ｂ）ステップ（ａ）のモデルの遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、化合物をスクリーニングして同定された遺伝子またはタンパク質ノードのモジュレーターを同定するステップとを含む方法を対象とする。病理学的プロセスは、本明細書において開示される任意のプロセスであり得る。スクリーニングする方法は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によってであり得る。
療法の標的を決定する方法
【０１６４】
いくつかの態様では、本発明は、生理学的プロセスまたは病理プロセス（例えば、神経変性状態、疾患、障害）を有する生物（例えば、真核生物、ヒト）において療法のための１種または複数の標的を決定する方法であって、（ａ）本明細書において開示される方法のいずれかに従って生成された生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを得るステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において得られたモデルの１種または複数の遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、（ｃ）生物が、ステップ（ｂ）において同定された遺伝子またはタンパク質ノードのいずれかにおいて突然変異、発現の変更または活性の変更を有するか否かを決定するステップとを含む方法を対象とする。本発明において、生物が、当技術分野で公知の遺伝子またはタンパク質において突然変異、発現の変更または活性の変更を有するか否かを決定する任意の方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、方法は、生物のゲノムまたは生物のゲノムの関連部分を配列決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞においてタンパク質活性またはタンパク質濃度を検出するためのアッセイを含む。いくつかの実施形態では、方法は、細胞においてタンパク質翻訳または転写の程度を検出するステップを含む。
生理学的プロセスまたは病理プロセス（増大されていない）をモデリングする方法
【０１６５】
いくつかの態様では、本発明は、第２の真核生物（例えば、酵母）において第１の真核生物（例えば、ヒト）の生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングする方法であって、（ａ）第１の真核生物の生理学的プロセスまたは病理プロセスの第２の真核生物類似物において同定された遺伝子のセットを提供するステップと、（ｂ）同定された遺伝子間の相互作用を得るステップと、（ｃ）生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出するステップとを含む方法を対象とする。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）における相互作用は、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムを使用して、ネットワークを得るためのコストを最小にしながら、精選されたデータベースからの遺伝子相互作用、物理的相互作用およびアノテートされた経路を介して、遺伝子またはタンパク質ノードを接続することによって得られる。いくつかの実施形態では、本明細書において開示される、および当技術分野で公知の方法を使用して、生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデル（例えば、ネットワーク）を作出してもよい。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の第２の真核生物遺伝子のセットは、調節された遺伝子発現または遺伝子産物活性を有するように修飾された細胞を提供するステップと、（ｂ）修飾が、生理学的プロセスまたは病理プロセスと関連する状態に対する細胞の応答を調節するか否かを決定するステップと、（ｃ）細胞応答が調節される場合に、生理学的プロセスまたは病理プロセスの類似物に関与するような遺伝子を同定するステップとを含む方法によって得た。いくつかの実施形態では、生理学的プロセスまたは病理プロセスと関連する状態は、１種または複数の遺伝子の異常な発現（例えば、過剰発現、発現の低減、発現の排除）を含む。いくつかの実施形態では、１種または複数の遺伝子は、非内因性遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、細胞応答は、少なくとも１つの表現型の変化、少なくとも１種の遺伝子の発現の変化、少なくとも１種のタンパク質の活性の変化または細胞生存力の変化を含む。いくつかの実施形態では、第２の真核生物遺伝子のセットは、酵母遺伝子のゲノムワイドスクリーンから得られる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、方法は、多様なアルゴリズムパラメータを用いるＰＣＳＦアルゴリズムを使用してマルチプルネットワークを生成するステップおよび最大全域木アルゴリズムを用いてマルチプルネットワークから代表的ネットワークを作出するステップをさらに含む。
【０１６８】
本発明のその他の態様は、真核生物において病理プロセスを処置する化合物についてスクリーニングする方法であって、本明細書において開示される方法によって真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスをモデリングするステップと、モデルの遺伝子またはタンパク質ノードを同定するステップと、同定された遺伝子またはタンパク質ノードのモジュレーターを同定する化合物をスクリーニングするステップとを含む方法を対象とする。
細胞および方法：ヒトα−シヌクレインタンパク質
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０１７０】
酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、本明細書において開示される任意の方法によって決定することができる。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、表Ｓ９、表Ｓ１０または表Ｓ１１に示される相同体を含む。
【０１７１】
プロモーターは、制限されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、核酸を構成的に発現する。誘導性プロモーターは、制限されない。用語「誘導性プロモーター」は、本明細書において、インデューサー（化学的薬剤および／または生物学的薬剤など）の不在下で、インデューサーに応じて作動可能に連結された遺伝子（ｃＤＮＡを含む）の発現を指示しない、または低レベルの発現を指示し、発現を指示するその能力が増強されるプロモーターを指す。例示的誘導性プロモーターとして、例えば、重金属に応答するプロモーター（CRC  Boca  Raton、Fla.（１９９１年）、１６７〜２２０頁；Brinsterら  Nature（１９８２年）、２９６巻、３９〜４２頁）、熱ショックに、ホルモンに応答するプロモーター（Leeら  P.N.A.S.  USA（１９８８年）、８５巻、１２０４〜１２０８頁；（１９８１年）、２９４巻、２２８〜２３２頁；Klockら  Nature（１９８７年）、３２９巻、７３４〜７３６頁；IsraelおよびKaufman、Nucleic  Acids  Res.（１９８９年）、１７巻、２５８９〜２６０４頁）、化学的薬剤、例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトースまたは抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）に応答するプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。
【０１７２】
酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性の増大または減少を引き起こす修飾は、本明細書において開示される任意の方法によるものであり得る。いくつかの態様では、修飾は、細胞のゲノムに導入された（例えば、標的化可能なヌクレアーゼを用いて）欠失、置換、付加または破壊である。いくつかの実施形態では、修飾は、調節配列を修飾することによって、またはｍＲＮＡ翻訳を阻害することによって（例えば、干渉核酸を用いて）タンパク質の発現を低減する。いくつかの実施形態では、発現は、調節配列のメチル化を変更することによって増大または減少される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、修飾は、細胞へ、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を導入することである。いくつかの実施形態では、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物は、細胞のゲノムに組み込まれる。発現構築物をゲノムに組み込むための方法および構築物は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを使用して発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、相同組換えを使用して、発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、組み込まれた発現構築物は、誘導性プロモーターを含む、または誘導性プロモーターの制御下にある。
【０１７４】
細胞は、本明細書において開示される任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つもしくは複数において列挙される遺伝子中に欠失、破壊または突然変異を有する酵母細胞であるか、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体中に欠失、破壊または突然変異を有する哺乳動物細胞である。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、α−シヌクレインタンパク質は、突然変異体α−シヌクレインタンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異体α−シヌクレインタンパク質は、野生型α−シヌクレインタンパク質と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。いくつかの実施形態では、突然変異体α−シヌクレインタンパク質は、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ１８ＴまたはＡ２９Ｓ突然変異を含む。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとα−シヌクレイン媒介毒性を抑制する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとα−シヌクレイン媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の欠失は、α−シヌクレイン媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体は、α−シヌクレイン毒性ネットワークにおける隠れたノード（例えば、予測されたノード）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物相同体は、表Ｓ９、表Ｓ１０および／または表Ｓ１１において列挙される。
【０１７７】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれかにおいて列挙される酵母遺伝子の相同体である、哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性の増大または減少を有するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。いくつかの実施形態では、哺乳動物遺伝子相同体は、表Ｓ９、表Ｓ１０および／または表Ｓ１１において列挙される。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物遺伝子相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含むか、または哺乳動物遺伝子相同体中に欠失、破壊または突然変異を有する。欠失、破壊または突然変異は、本明細書において開示される任意の方法によってであり得る。プロモーターは、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において開示される任意の適したプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、細胞は、シヌクレイン症を患っている、またはシヌクレイン症と関連する遺伝的変異を有する対象に由来するヒト細胞である。いくつかの実施形態では、シヌクレイン症は、レビー小体を伴う認知症、グリア細胞質内封入体を伴う多系統萎縮症、シャイ・ドレーガー症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、脳内鉄沈着を伴う神経変性症Ｉ型、嗅覚機能障害および筋萎縮性側索硬化症の群から選択される。いくつかの実施形態では、シヌクレイン症は、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体を伴う認知症および多系統萎縮症の群から選択される。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ヒト細胞）は、同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、アルファ−シヌクレインの発現が増大するか、または細胞は、突然変異体α−シヌクレインタンパク質を発現し、必要に応じて、突然変異体α−シヌクレインタンパク質は、Ａ３０Ｐ、Ｅ４６Ｋ、Ａ５３Ｔ、Ｈ５０Ｑ、Ｇ５１Ｄ、Ａ１８ＴまたはＡ２９Ｓを含む。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ヒト細胞）は、神経細胞またはグリア細胞である。
【０１８０】
本発明のいくつかの態様は、アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【０１８１】
本発明のいくつかの態様は、シヌクレイン症の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０１８２】
化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン毒性を抑制するものまたはその欠失がアルファ−シヌクレイン毒性を増強するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を増強する。化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン毒性を増強するものまたは欠失されるとその欠失がアルファ−シヌクレイン毒性を抑制するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を阻害する。
【０１８３】
本発明のいくつかの態様は、アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ヒトアルファ−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０１８４】
本発明のいくつかの態様は、シヌクレイン症の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアルファ−シヌクレイン毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がシヌクレイン症の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０１８５】
本発明のいくつかの態様は、アルファシヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１つまたは複数において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現もしくは活性を調節する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、細胞の生存力を低減するアルファシヌクレインの量を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアルファシヌクレイン媒介毒性を阻害する化合物として同定される方法を対象とする。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でのタンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのリポータータンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、（ｉ）表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１種または複数において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でリポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのリポータータンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のうちいずれか１種または複数において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を提供するステップと、タンパク質を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でタンパク質の活性を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の増大から、薬剤がタンパク質の活性を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の低下から、薬剤がタンパク質の活性を低下させる化合物として同定される。
【０１８９】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてアルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０１９０】
本発明のいくつかの態様は、シヌクレイン症を処置する方法であって、シヌクレイン症の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第１列、表Ｓ５、表Ｓ６または表Ｓ７のいずれか１つまたは複数において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０１９１】
アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する、またはシヌクレイン症を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０１９２】
アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する、またはシヌクレイン症を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のエンハンサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０１９３】
アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する、またはシヌクレイン症を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０１９４】
アルファ−シヌクレイン媒介毒性を阻害する、またはシヌクレイン症を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとアルファ−シヌクレイン媒介毒性のサプレッサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０１９５】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、細胞を、ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップまたはその薬剤を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は増強され、薬剤は、ヒトタンパク質をコードする核酸またはヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は阻害され、薬剤は、ヒトタンパク質、ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたはヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子をコードするｍＲＮＡを標的とする短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸である。
【０１９６】
上記で開示される方法の実施形態では、ヒトアルファ−シヌクレインを、真核生物または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、旧世界または新世界霊長類、ブタなど）アルファ−シヌクレインタンパク質またはその相同体で置換してもよい。本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、酵母タンパク質のヒト相同体は、表Ｓ９、表Ｓ１０および／または表Ｓ１１に列挙されている。
細胞および方法：ヒトＴＤＰ−４３タンパク質
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。いくつかの実施形態では、発現構築物は、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含み、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０１９８】
酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、本明細書において開示される任意の方法によって決定できる。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、表Ｓ１１に示される相同体を含む。
【０１９９】
プロモーターは、制限されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、核酸を構成的に発現する。誘導性プロモーターは、制限されない。用語「誘導性プロモーター」とは、本明細書において、インデューサー（化学的薬剤および／または生物学的薬剤など）の不在下で、インデューサーに応じて作動可能に連結された遺伝子（ｃＤＮＡを含む）の発現を指示しない、または低レベルの発現を指示し、発現を指示するその能力が増強されるプロモーターを指す。例示的誘導性プロモーターとして、例えば、重金属に応答するプロモーター（CRC  Boca  Raton、Fla.（１９９１年）、１６７〜２２０頁；Brinsterら  Nature（１９８２年）、２９６巻、３９〜４２頁）、熱ショックに、ホルモンに応答するプロモーター（Leeら  P.N.A.S.  USA（１９８８年）、８５巻、１２０４〜１２０８頁；（１９８１年）、２９４巻、２２８〜２３２頁；Klockら  Nature（１９８７年）、３２９巻、７３４〜７３６頁；IsraelおよびKaufman、Nucleic  Acids  Res.（１９８９年）、１７巻、２５８９〜２６０４頁）、化学的薬剤、例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトースまたは抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）に応答するプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。
【０２００】
酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性の増大または減少を引き起こす修飾は、本明細書において開示される任意の方法によるものであり得る。いくつかの態様では、修飾は、細胞のゲノムに導入された（例えば、標的化可能なヌクレアーゼを用いて）欠失、置換、付加または破壊である。いくつかの実施形態では、修飾は、調節配列を修飾することによって、またはｍＲＮＡ翻訳を阻害することによって（例えば、干渉核酸を用いて）タンパク質の発現を低減する。いくつかの実施形態では、発現は、調節配列のメチル化を変更することによって増大または減少される。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、修飾は、細胞へ、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を導入することである。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物は、細胞のゲノムに組み込まれる。発現構築物をゲノムに組み込むための方法および構築物は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを使用して発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、相同組換えを使用して、発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、組み込まれた発現構築物は、誘導性プロモーターを含む、または誘導性プロモーターの制御下にある。
【０２０３】
細胞は、本明細書において開示される任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子中に欠失、破壊または突然変異を有する酵母細胞であるか、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体（例えば、ヒト）中に欠失、破壊または突然変異を有する哺乳動物細胞である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＴＤＰ−４３タンパク質は、突然変異体ＴＤＰ−４３タンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異体ＴＤＰ−４３は、野生型ＴＤＰ−４３と約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性を抑制する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の欠失は、ＴＤＰ−４３媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体は、ＴＤＰ−４３ネットワークにおける隠れたノード（例えば、予測されたノード）である。
【０２０６】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子の相同体である、哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性の増大または減少を有するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物遺伝子相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含むか、または哺乳動物遺伝子相同体中に欠失、破壊または突然変異を有する。欠失、破壊または突然変異は、本明細書において開示される任意の方法によってであり得る。プロモーターは、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において開示される任意の適したプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＴＤＰ−４３関連疾患を患っている対象に由来するヒト細胞であるか、またはＴＤＰ−４３関連疾患と関連する遺伝的変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、ＴＤＰ−４３の発現が増大しているか、または細胞は、突然変異体ＴＤＰ−４３タンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ヒト細胞）は、神経細胞またはグリア細胞である。
【０２０８】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【０２０９】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤を同定する方法を対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第２列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む。
【０２１０】
化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３毒性を抑制するものまたはその欠失がＴＤＰ−４３毒性を増強するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を増強する。化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３毒性を増強するものまたは欠失されるとその欠失がＴＤＰ−４３毒性を抑制するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を阻害する。
【０２１１】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）ＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０２１２】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒトＴＤＰ−４３タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてＴＤＰ−４３媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのＴＤＰ−４３毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がＴＤＰ−４３関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０２１３】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現もしくは活性を増強する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、細胞の生存力を低減するＴＤＰ−４３の量を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する化合物として同定される方法を対象とする。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でのタンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、（ｉ）表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でリポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのリポータータンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第２列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を提供するステップと、タンパク質を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でタンパク質の活性を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の増大から、薬剤がタンパク質の活性を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の低下から、薬剤がタンパク質の活性を低下させる化合物として同定される。
【０２１７】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０２１８】
本発明のいくつかの態様は、ＴＤＰ−４３関連疾患を処置する方法であって、ＴＤＰ−４３関連疾患の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第２列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０２１９】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する、またはＴＤＰ−４３毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０２２０】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する、またはＴＤＰ−４３毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のエンハンサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強することを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０２２１】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する、またはＴＤＰ−４３毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害することを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０２２２】
ＴＤＰ−４３媒介毒性を阻害する、またはＴＤＰ−４３毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとＴＤＰ−４３媒介毒性のサプレッサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０２２３】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、細胞を、ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップまたはその薬剤を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は増強され、薬剤は、ヒトタンパク質をコードする核酸またはヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は阻害され、薬剤は、ヒトタンパク質、ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたはヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子をコードするｍＲＮＡを標的とする短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸である。
【０２２４】
上記で開示される方法の実施形態では、ヒトＴＤＰ−４３を、真核生物または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、旧世界または新世界霊長類、ブタなど）ＴＤＰ−４３タンパク質またはその相同体で置換してもよい。本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、酵母タンパク質のヒト相同体は、表Ｓ１１に列挙されている。
細胞および方法：ヒトアミロイドベータタンパク質
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む細胞を対象とし、細胞は、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されている。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物が、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０２２６】
酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、本明細書において開示される任意の方法によって決定できる。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の哺乳動物相同体は、表Ｓ１１に示される相同体を含む。
【０２２７】
プロモーターは、制限されない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、核酸を構成的に発現する。誘導性プロモーターは、制限されない。用語「誘導性プロモーター」とは、本明細書において、インデューサー（化学的薬剤および／または生物学的薬剤など）の不在下で、インデューサーに応じて作動可能に連結された遺伝子（ｃＤＮＡを含む）の発現を指示しない、または低レベルの発現を指示し、発現を指示するその能力が増強されるプロモーターを指す。例示的誘導性プロモーターとして、例えば、重金属に応答するプロモーター（CRC  Boca  Raton、Fla.（１９９１年）、１６７〜２２０頁；Brinsterら  Nature（１９８２年）、２９６巻、３９〜４２頁）、熱ショックに、ホルモンに応答するプロモーター（Leeら  P.N.A.S.  USA（１９８８年）、８５巻、１２０４〜１２０８頁；（１９８１年）、２９４巻、２２８〜２３２頁；Klockら  Nature（１９８７年）、３２９巻、７３４〜７３６頁；IsraelおよびKaufman、Nucleic  Acids  Res.（１９８９年）、１７巻、２５８９〜２６０４頁）、化学的薬剤、例えば、グルコース、ラクトース、ガラクトースまたは抗生物質（例えば、テトラサイクリンまたはドキシサイクリン）に応答するプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ガラクトース誘導性プロモーターである。
【０２２８】
酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または活性の増大または減少を引き起こす修飾は、本明細書において開示される任意の方法によるものであり得る。いくつかの態様では、修飾は、細胞のゲノムに導入された（例えば、標的化可能なヌクレアーゼを用いて）欠失、置換、付加または破壊である。いくつかの実施形態では、修飾は、調節配列を修飾することによって、またはｍＲＮＡ翻訳を阻害することによって（例えば、干渉核酸を用いて）タンパク質の発現を低減する。いくつかの実施形態では、発現は、調節配列のメチル化を変更することによって増大または減少される。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、修飾は、細胞へ、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を導入することである。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質をコードする核酸またはその哺乳動物相同体に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物は、細胞のゲノムに組み込まれる。発現構築物をゲノムに組み込むための方法および構築物は、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターを使用して発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、相同組換えを使用して、発現構築物を組み込む。いくつかの実施形態では、組み込まれた発現構築物は、誘導性プロモーターを含む、または誘導性プロモーターの制御下にある。
【０２３１】
細胞は、本明細書において開示される任意の細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母細胞または哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子中に欠失、破壊または突然変異を有する酵母細胞であるか、またはこのような遺伝子の哺乳動物相同体（例えば、ヒト）中に欠失、破壊または突然変異を有する哺乳動物細胞である。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、アミロイドベータタンパク質は、突然変異体アミロイドベータタンパク質である。いくつかの実施形態では、突然変異体アミロイドベータは、野生型アミロイドベータと約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を共有する。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性を抑制する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子の欠失は、アミロイドベータ媒介毒性を増強する。いくつかの実施形態では、酵母遺伝子またはその哺乳動物相同体は、アミロイドベータネットワークにおける隠れたノード（例えば、予測されたノード）である。
【０２３４】
本発明のその他の態様は、同一種類の修飾されていない細胞と比較して、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子の相同体である、哺乳動物遺伝子によってコードされる哺乳動物タンパク質の発現または活性が増大または減少するように修飾されている哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス）に関する。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物遺伝子相同体によってコードされるタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含むか、または哺乳動物遺伝子相同体中に欠失、破壊または突然変異を有する。欠失、破壊または突然変異は、本明細書において開示される任意の方法によってであり得る。プロモーターは、当技術分野で公知のおよび／または本明細書において開示される任意の適したプロモーターであり得る。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、細胞は、アミロイドベータ関連疾患を患っている対象に由来するヒト細胞であるか、またはアミロイドベータ関連疾患と関連する遺伝的変異を有する。いくつかの実施形態では、細胞は、同一種類の正常哺乳動物細胞と比較して、アミロイドベータの発現が増大するか、または細胞は、突然変異体アミロイドベータタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、細胞（例えば、ヒト細胞）は、神経細胞またはグリア細胞である。
【０２３６】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定することを対象とし、方法は、
（ａ）ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む。
【０２３７】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤を同定する方法を対象とし、方法は、
（ａ）ヒトα−シヌクレインタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供するステップであって、細胞が、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、表Ｓ３：第３列に列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む。
【０２３８】
化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ毒性を抑制するものまたはその欠失がアミロイドベータ毒性を増強するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を増強する。化合物または候補薬剤を同定するための上記の方法のいくつかの実施形態では、遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ毒性を増強するものまたは欠失されるとその欠失がアミロイドベータ毒性を抑制するものであり、薬剤は、タンパク質の発現または活性を阻害する。
【０２３９】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、
（ａ）アミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０２４０】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤を同定する方法であって、
（ａ）ヒトアミロイドベータタンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを含む発現構築物を含む本明細書において記載されるような細胞を提供し、細胞が、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているか、または同一種類の修飾されていない細胞と比較して、このような酵母遺伝子の哺乳動物相同体によってコードされるタンパク質の発現もしくは活性が増大もしくは減少するように修飾されているステップと、
（ｂ）細胞を、試験薬剤と接触させるステップと、
（ｃ）（ｉ）薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップであって、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、試験薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップまたは（ｉｉ）細胞においてアミロイドベータ媒介毒性と関連する少なくとも１つの表現型を測定するステップであって、薬剤の不在下と比較した、薬剤の存在下でのアミロイドベータ毒性と関連する少なくとも１つの表現型の減少から、薬剤がアミロイドベータ関連疾患の処置のための候補薬剤として同定されるステップと
を含む方法を対象とする。
【０２４１】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物を同定する方法であって、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体の発現もしくは活性を増強する薬剤を同定するためにスクリーニングするステップと、細胞の生存力を低減するアミロイドベータの量を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下で細胞生存力を測定するステップとを含み、薬剤の不在下での細胞生存力と比較した、薬剤の存在下での細胞生存力の増大から、薬剤がアミロイドベータ媒介毒性を阻害する化合物として同定される方法を対象とする。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を発現する細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でのタンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、（ｉ）表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子またはその哺乳動物相同体のプロモーター配列および（ｉｉ）リポータータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むリポーター構築物を含む細胞を提供するステップと、細胞を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でリポータータンパク質の発現を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の増大から、薬剤がタンパク質の発現を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのリポータータンパク質の発現と比較した薬剤の存在下でのリポータータンパク質の発現の減少から、その薬剤がタンパク質の発現を減少させる化合物として同定される。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、前記スクリーニングは、表Ｓ３：第３列において列挙される遺伝子によってコードされるタンパク質またはその哺乳動物相同体を提供するステップと、タンパク質を薬剤と接触させるステップと、薬剤の存在下でタンパク質の活性を測定するステップとを含み、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の増大から、薬剤がタンパク質の活性を増大する化合物として同定され、薬剤の不在下でのタンパク質の活性と比較した薬剤の存在下でのタンパク質の活性の低下から、薬剤がタンパク質の活性を低下させる化合物として同定される。
【０２４５】
本発明のいくつかの態様は、ヒト細胞または対象においてアミロイドベータ媒介毒性を阻害する方法であって、細胞または対象において、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０２４６】
本発明のいくつかの態様は、アミロイドベータ関連疾患を処置する方法であって、アミロイドベータ関連疾患の処置を必要とする対象において、表Ｓ３：第３列において列挙される酵母遺伝子によってコードされる酵母タンパク質の相同体であるヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップを含む方法を対象とする。
【０２４７】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する、またはアミロイドベータ毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０２４８】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する、またはアミロイドベータ毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性のサプレッサーであるか、または欠失されるとアミロイドベータ媒介毒性のエンハンサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を増強するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって増強してもよい。
【０２４９】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する、またはアミロイドベータ毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０２５０】
アミロイドベータ媒介毒性を阻害する、またはアミロイドベータ毒性を処置する上記の方法のいくつかの実施形態では、酵母遺伝子は、過剰発現されるとアミロイドベータ媒介毒性のエンハンサーであるか、または欠失されるとアミロイドベータ媒介毒性のサプレッサーであり、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、ヒトタンパク質の発現または活性を阻害するステップを含む。ヒトタンパク質の発現または活性は、本明細書において開示される、または当技術分野で公知の任意の方法によって阻害してもよい。
【０２５１】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性を調節するステップは、細胞を、ヒトタンパク質の発現または活性を調節する薬剤と接触させるステップまたはその薬剤を対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は増強され、薬剤は、ヒトタンパク質をコードする核酸またはヒトタンパク質をコードするＲＮＡ転写物の転写を活性化する合成転写アクチベーターを含む。いくつかの実施形態では、ヒトタンパク質の発現または活性は阻害され、薬剤は、ヒトタンパク質、ヒトタンパク質をコードする遺伝子の転写を抑制する合成転写レプレッサーまたはヒトタンパク質と結合するアプタマー、ポリペプチドもしくは小分子をコードするｍＲＮＡを標的とする短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはアンチセンス核酸である。
【０２５２】
上記で開示される方法の実施形態では、ヒトアミロイドベータを、真核生物または哺乳動物（例えば、マウス、ラット、旧世界または新世界霊長類、ブタなど）アミロイドベータタンパク質またはその相同体で置換してもよい。
【０２５３】
本明細書において開示される方法のいくつかの実施形態では、酵母タンパク質のヒト相同体は、表Ｓ１１に列挙されている。
一時的でない媒体および系
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法の任意の結果を、一時的でないコンピュータ可読媒体に記憶させてもよい。いくつかの実施形態では、方法を使用して同定されるドラッガブルなノードおよび必要に応じて、ドラッガブルなノードを調節する化合物を、一時的でないコンピュータ可読媒体に記憶させてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書において記載される方法によって作出される、または本明細書において記載されるネットワークまたはモデルを、一時的でないコンピュータ可読媒体に記憶させてもよい。
【０２５５】
本発明のいくつかの態様は、本明細書において記載される方法を容易にするように構成されたシステムであって、実行された場合に、コンピュータシステムに、本明細書において記載される方法のステップのうち少なくとも１つを実施させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを含むシステムを対象とする。いくつかの実施形態では、システムは、第１の真核生物（例えば、ヒト）および第２の真核生物（例えば、酵母）における遺伝子間の相同性を決定することを容易にするように構成され、システムは、実行された場合に、コンピュータシステムに、第２の真核生物における遺伝子のセットに対して相同な第１の真核生物における遺伝子のセットを決定させる、および／または第２の真核生物に由来する相同な遺伝子のセットから得られた相互作用を用いて遺伝子のセット間の相互作用を増大することによって真核生物における生理学的プロセスまたは病理プロセスのモデルを作出させる１つまたは複数のコンピュータにより実行可能な命令を実行するようにプログラムされた１つまたは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを含む。いくつかの実施形態では、システムは、本明細書において開示される方法のいずれかによって生成されたモデルをディスプレイするためのスクリーンをさらに含む。
【０２５６】
本明細書において開示される本発明の特定の実施例を、実施例において以下に示す。
【０２５７】
当業者ならば、本発明が、目的を実施するのに、また記載された目標および利点ならびにそれらにおける固有のものを得るのに十分に適応していることを容易に理解する。本明細書における説明および実施例の詳細は、特定の実施形態の代表であり、例示的なものであって、本発明の範囲に対する制限と意図されない。それにおける改変および他の使用は、当業者には思い浮かぶであろう。これらの改変は、本発明の趣旨内に包含される。本明細書において開示される本発明に、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく様々な置換および改変を行うことができるということは、当業者には容易に明らかとなろう。
【０２５８】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書において使用される冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」とは、反対に明確に示されない限り、複数の言及を含むと理解されなければならない。群メンバーの１つ、１つよりも多く、またはすべてが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それに使用される、そうでなければそれと関連する場合に、反対に示されない限り、または文脈から明らかでない限り、群の１つまたは複数のメンバー間に「または」を含む特許請求の範囲または説明は満たされると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それに使用される、そうでなければそれと関連する実施形態を含む。本発明はまた、群の１つよりも多い、またはすべてが、所与の製品またはプロセス中に存在する、それに使用される、そうでなければそれと関連する実施形態を含む。さらに、本発明は、すべての変動、組合せおよび順列を提供し、特に断りのない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうと当業者に明らかでない限り、列挙された特許請求の範囲のうち１つまたは複数に由来する１つまたは複数の制限、要素、条項、記述用語などは、同一の基本の特許請求の範囲に依存して（または、関連する任意の他の特許請求の範囲として）別の特許請求の範囲に導入されるということは理解されるべきである。本明細書において記載されるすべての実施形態は、必要に応じて、本発明のすべての異なる態様に適用可能であるということは考慮される。実施形態または態様のいずれも、必要に応じて１つまたは複数の他のこのような実施形態または態様と自由に組み合わせることができるということも考慮される。要素が、例えば、マーカッシュ群または同様の形式でリストとして提示される場合には、要素の各亜群も開示され、任意の要素が群から除去され得るということは理解されるべきである。一般に、本発明または本発明の態様は、特定の要素、特徴などを含むと呼ばれ、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなる、またはそれから本質的になるということは理解されなければならない。簡潔さのために、それらの実施形態は、どの場合においても、本明細書において非常に多くの言葉で具体的に示されているわけではない。本発明の任意の実施形態または態様は、特定の排除が本明細書において列挙されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲から明確に排除され得るということは理解されなければならない。例えば、任意の１種または複数の核酸、ポリペプチド、細胞、生物の種または種類、障害、対象またはそれらの組合せが排除され得る。
【０２５９】
特許請求の範囲または説明が、物質の組成物、例えば、核酸、ポリペプチド、細胞または非ヒトトランスジェニック動物に関する場合、本明細書において開示される方法のいずれかに従って物質の組成物を作製または使用する方法および本明細書において開示される目的のいずれかのために物質の組成物を使用する方法は、特に断りのない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうと当業者に明らかでない限り、本発明の態様であるということは理解されるべきである。特許請求の範囲または説明が、方法に関する場合、例えば、方法を実施するのに有用な組成物を作製する方法、方法に従って製造された製品は、特に断りのない限り、または矛盾もしくは不一致が生じるであろうと当業者に明らかでない限り、本発明の態様であるということは理解されるべきである。
【０２６０】
範囲が本明細書において与えられる場合には、本発明は、端点が含まれる実施形態、両端点が排除される実施形態および一方の端点が含まれ、もう一方が排除される実施形態を含む。特に断りのない限り、両端点が含まれることが想定されなければならない。さらに、特に断りのない限り、またそうでなければ文脈および当業者の理解から明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において示された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を、文脈が明確に別に示さない限り、範囲の下限の単位の１／１０まで想定できることは理解されるべきである。一連の数値が本明細書において示される場合には、本発明は、一連のものの中の任意の２つの値によって規定される任意の介在する値または範囲に類似的に関する、最低値を最小ととってもよく、最大値を最大ととってもよい実施形態を含むということも理解される。数値は、本明細書において、パーセンテージとして表される値を含む。数値に「約」または「およそ」が前置きされる本発明の任意の実施形態について、本発明は、正確な値が列挙される実施形態を含む。数値に「約」または「およそ」が前置きされない本発明の任意の実施形態について、本発明は、値に「約」または「およそ」が前置きされる実施形態を含む。「およそ」または「約」は、一般に、特に断りのない限り、または文脈から明らかでない限り、いずれかの方向に（数より大きいまたは数より小さい）数の１％の範囲内に、いくつかの実施形態では、５％の範囲内に、またはいくつかの実施形態では、１０％の範囲内に入る数を含む（このような数が、あり得る値の１００％を許容されないほど超える場合を除く）。反対に明確に示されない限り、１つより多い行為を含む本明細書において特許請求される任意の方法において、方法の行為の順序は、方法の行為が列挙される順序に必ずしも制限されず、本発明は、順序がそのように制限されない実施形態を含むということは理解されなければならない。特に断りのない限り、または文脈から明らかでない限り、本明細書において記載される任意の製品または組成物が「単離された」と考えられ得るということは理解されなければならない。
【実施例】
【０２６１】
ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅネットワークは、α−ｓｙｎスクリーンヒット間の生物学的接続を明らかにする
【０２６２】
遺伝子リストからネットワークを作製するための従来の一アプローチは、これらを公知の遺伝的または物理的タンパク質−タンパク質相互作用により接続することである。例証するため、本発明者らは、本発明者らの以前の過剰発現スクリーンにおいてα−ｓｙｎ毒性を修飾する７７種の遺伝子を考慮した（表Ｓ１および表Ｓ２）。豊富な酵母インタラクトームを用いても、３０種のヒットが、ネットワークに組み込まれなかった（図１Ａ、上部パネル）。さらに、一部の遺伝子（「ハブ」）は、タンパク質毒性に対するその重要性のせいではなく、より多くの遺伝子に接続されたために、ネットワークにおける中心位置を占有した。例えば、ＰＭＲ１は、７７種の修飾因子にわたる７０種の相互作用の中央値と比較して、ＢｉｏＧＲＩＤにおける９５５種のアノテートされた相互作用を有するハブである（図１Ａ、右上；表Ｓ２）。
【０２６３】
表Ｓ１：図１、図２および図３に関連する、本研究において生成されたネットワークの指標。
【０２６４】
表Ｓ２：図１および図２に関連する、以前の過剰発現スクリーンにおいて回収された酵母修飾因子。
【０２６５】
より包括的なネットワークを築くために、本発明者らは、分子相互作用または「エッジ」を介して遺伝子またはタンパク質「ノード」を接続する、「賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズム」を適応させた（S.-S.  C.  HuangおよびFraenkel、２００９年；Tuncbagら、２０１３年；２０１６年）（図１Ａ、下部）。エッジは、遺伝的もしくは物理的相互作用、または精選されたデータベース由来のアノテートされた経路を含むことができ（Szklarczykら、２０１４年）、「コスト」を最小化することにより精緻化される。１）「懸賞された」ノード（遺伝的スクリーン由来の本来のヒット）が除外された場合；２）２個のノードを接続する「エッジ」が、低い信頼度の相互作用から派生する場合；または３）エッジがハブに接続する場合、コストは増加する。本発明者らのＰＣＳＦが、特異的パラメータ化に依存しなかったことを確実にするために、本発明者らは、異なるアルゴリズムパラメータにより１１２種の個々の森のアンサンブルを生成し、最大全域木アルゴリズムにより平均されたまたは「崩壊された」代表的ネットワークを作製した（「ＳｔｅｉｎｅｒＮｅｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ」；図１Ａ、右下）。
【０２６６】
見込みのない相互作用を回避しつつ最大数の懸賞されたノードを包括するために、ＰＣＳＦ方法は、本来の懸賞されるヒットリストの一部ではないタンパク質または遺伝子である「予測されるノード」を導入する（図１Ａ、緑色の三角形）。予測されるノードは、ネットワーク内の２個のノードの間に発生するであろう。しかし、最終ネットワークは、多くの異なるネットワークの重ね合わせであるため、これらは、最終アンサンブルアウトプットにおける末梢に存在し得る。いずれのハイスループットスクリーンも、多くの真の生物学的接続を見逃すであろうことから、予測されるノードは、生物学的値を加えることができる。
【０２６７】
本発明者らが、本発明者らの以前のα−ｓｙｎ過剰発現スクリーンデータにＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅを適用した場合、断片化されたネットワークは、よりコヒーレントに接続されるようになった。全７７種の修飾因子遺伝子は現在、ネットワークに組み込まれている（図１Ａ、左下；表Ｓ１；表Ｓ３）。遺伝的修飾因子の排除およびハブの包含にペナルティーを科すことにより、ＰＣＳＦアルゴリズムは、ハブの支出における生物学的文脈を好んだ。ネットワークアウトプットの特異性を確立するために、本発明者らは、α−ｓｙｎ修飾因子リストへと、同一接続性（次数分布）により酵母ゲノムからランダムに選択される７７種の遺伝子の１０００セットから森のアンサンブルを生成した。ノード毎の経験的ｐ値（ネットワークにおける偶然に発生する確率に基づく）は有意であった（ｐ＝０．０２５、ＳＤ＝０．０２１）。
【０２６８】
表Ｓ３：図１に関連する、３種のタンパク質毒性スクリーンのためのネットワークアウトプット（修飾因子＋予測されるノード）。
【０２６９】
重要なことに、予測されるノード（図１Ａ、緑色の三角形）は、Ｓｅｃ１４（ホスホリパーゼＤ）（OuteiroおよびLindquist、２００３年）およびＰｂｐ１（アタキシン−２の酵母相同体、後述および図３を参照）を含む、本来のスクリーンにおけるヒットではないが、他の研究により明らかになった、α−ｓｙｎ毒性の遺伝的修飾因子を含んだ。このネットワークは、２種のドラッガブルな標的も同定した：Ｃｎｂ１（カルシニューリンサブユニットＢ）およびＲｓｐ５（図１Ａ、右下）。Ｃｎｂ１は、α−ｓｙｎ毒性を改良する薬物であるＦＫ５０６によって標的化される（Caraveoら、２０１４年）。Ｒｓｐ５は、α−ｓｙｎ毒性から保護する特異的Ｎ−アリールベンズイミダゾール（ＮＡＢ）の標的である（Tardiffら、２０１３年）。よって、ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅ方法論は、ドラッガブルな標的を含む生物学的に関連性がある経路を介して遺伝的スクリーンヒットを接続する。
【０２７０】
α−ｓｙｎ、ＴＤＰ−４３およびＡβタンパク質症の相互比較は、別個のおよび共有される機構を明らかにする
【０２７１】
異なるタンパク質症を相互比較するために、本発明者らは、以前のＡβおよびＴＤＰ−４３過剰発現スクリーンを試験したところ（図１Ｂ；表Ｓ１における「酵母過剰発現ネットワーク」）、実質的に重複を見い出さなかった（図１Ｂ、左；表Ｓ２）。しかし、酵母遺伝的修飾因子、および次のものを含むヒト障害に関連する疾患遺伝子の間には、再保証する重複が存在した：α−ｓｙｎスクリーンにおいて回収された推定パーキンソニズム遺伝子［ＡＴＰ１３Ａ２（ＰＡＲＫ９）およびＥＩＦ４Ｇ１（ＰＡＲＫ１８）］；ＡβスクリーンにおけるＡＤリスク因子［ＰＩＣＡＬＭ、ＣＤ２ＡＰ、ＩＮＰＰ５ＤおよびＲＩＮ３］；ＴＤＰ−４３スクリーンにおけるＡＬＳ遺伝的リスク因子（Eldenら、２０１０年）。
【０２７２】
これらのスクリーンヒット由来のＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、タンパク質輸送、ｍＲＮＡ翻訳、ユビキチン化および細胞周期遺伝子を含む、これらのタンパク質症の間のより多くの生物学的重複を明らかにした（表Ｓ３および表Ｓ４；図１Ｂ右）。別個のヒト疾患の遺伝的リスク因子の間のクロスオーバーも存在した：ＡＴＸＮ２相同体は、α−ｓｙｎネットワークにおける予測されるノードであった（α−ｓｙｎ毒性の修飾因子として確認；図３および図４）；パーキンソニズム遺伝子ＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）の相同体は、酵母Ａβネットワークにおける予測されるノードであった。ＶＰＳ３５は、レトロマー複合体の鍵となる成分をコードし、欠損したレトロマー機能が、ＡＤ脳および動物モデルにおいて同定された（Smallら、２００５年）。これらの重複は、遺伝子数の増加に無関係であった。ペアワイズ（ｐ＜＝０．００２）またはトリプルワイズ（ｐ＜＝０．００１）で考慮するかにかかわらず、１０００種の同様に接続されたランダムネットワークの経験的ｐ値は、統計的に有意であった。
【０２７３】
表Ｓ４：タンパク質毒性の比較：図１に関連する、過剰発現スクリーンヒットインプット対ＳＴＥＩＮＥＲネットワークアウトプット。
【０２７４】
全３種のタンパク質症の間で共通ノードであることが予測される１種の輸送遺伝子は、ＮＡＢによって活性化されるユビキチンリガーゼであるＲｓｐ５であった。実際に、ＮＡＢは本来、酵母におけるＴＤＰ−４３タンパク質症に対する小分子スクリーンにおいて回収された。本発明者らは、高感度バイオスクリーンアッセイを利用して、これらのタンパク質症によって誘導される成長欠損におけるＮＡＢを検査した。実際に、ＮＡＢは、ネットワークによって予測される通りに全３種のタンパク質症をレスキューした。これは、α−ｓｙｎに最も有効であり（図１Ｃ）、Ａβ毒性から保護することが公知の他の化合物と組み合わせて相乗的にＡβ毒性に対してレスキューしただけであった（データ示さず）。ＮＡＢは、いずれか２０種の無関係な毒性酵母株に有意なレスキューを提供することができなかった（図６）。
【０２７５】
ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、「ヒト化」ネットワークを生成する
【０２７６】
酵母に明快な相同体がないヒト疾患遺伝子を含むヒト遺伝子への本発明者らの酵母分子ネットワークの間の接続を同定することが望ましいであろう。したがって、本発明者らは、酵母分子ネットワークを「ヒト化」するための一式のコンピュータ処理による方法である、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔを開発した（図２Ａ）。
【０２７７】
Ｔｒａｎｓｐｏｓｅｎｅｔにおける第１のステップは、配列類似性（ＢＬＡＳＴおよびＤＩＯＰＴ（Huら、２０１１年）スコア）、酵母−対−ヒト構造アラインメント（ＨＨｐｒｅｄツールを使用）（Sodingら、２００５年）を考慮し、ネットワークトポロジー（図２Ａ、左上）を組み込むことによる、酵母−対−ヒト相同性の割り当てである。ネットワークトポロジーは、所与のタンパク質の周りの遺伝的および物理的分子相互作用の近隣を評価し、ネットワーク内のトポロジカルな場所が生物学的機能に関連するという「連座の誤謬」論理を仮定する（Choら、２０１６年）。よって、同様の隣接の共有は、２種のタンパク質が相同体であるか否かの決定における因子となるべきである。各相同性方法の相対的重みは、慎重に整調され（全詳細については「ＳＴＡＲ方法」および図７）、より網羅的で統一されたタンパク質相同性スコアを提供する（Bergerら、２０１３年；Singhら、２００８年；Sodingら、２００５年）。これらの異なる特色に従って遺伝子を関連付ける根底にあるフレームワークは、拡散成分解析（ＤＣＡ）として公知である。ＤＣＡは、複数の不均一インタラクトームを統合するためのツールであるＭａｓｈｕｐにおけるコアアルゴリズムとしても使用されてきた。さらなる情報は、「ＳＴＡＲ方法」の「方法詳細」セクションおよびChoら（２０１６年）に見い出すことができる。
【０２７８】
本発明者らの方法は、４９２３種の酵母タンパク質をヒト相同体に割り当て、逆に、１５，２００種のヒトタンパク質に対して酵母相同体を予測し、これは、ＢＬＡＳＴ（４０２３種の酵母対ヒトおよび７２４８種のヒト対酵母）またはＢＬＡＳＴとＨＨｐｒｅｄ（４３１２種の酵母対ヒトおよび９５７７種のヒト対酵母）を上回る実質的な改善である。その上、本発明者らの方法は、遺伝子オントロジー（ＧＯ）精度およびＪａｃｃａｒｄ類似性スコア（「ＳＴＡＲ方法」；図８）によって決定される予測を改善し、高い信頼度の酵母−ヒトタンパク質ペアのために偽陽性を導入しなかった（ＥｎｓｅｍｂｌＣｏｍｐａｒａ；「ＳＴＡＲ方法」）。
【０２７９】
酵母から人へのコア真核生物の生物学のこのように高い保存、および酵母における中心的相補性研究は、ヒトを含む他の種における多くの遺伝子の機能を決定した（OsbornおよびMiller、２００７年）（Kachrooら、２０１５年）。これに基づいて、本発明者らは、本発明者らの相同性ツールを使用して、はるかにより良い精選された酵母インタラクトームから推論される相互作用によるヒトインタラクトームを増大させた。これは、ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔを有効にした鍵となる進歩であった。重要なことに、この異種間「エッジ」転位は、偽陽性ヒットの率を増加させなかった。むしろ、これは、ネットワーク性能を実質的に改善した。実際に、本発明者らのスクリーンヒットに関して、ＰＣＳＦに基づくＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、２種の代替ネットワークが築く方法論、ＤＡＰＰＬＥ（Rossinら、２０１１年）およびＰＥＸＡ（Tuら、２００９年）よりも優れていた（「ＳＴＡＲ方法」および図９）。
【０２８０】
本発明者らの「ヒト化ネットワーク」（表Ｓ１；図２Ａ、右において指標化）において、各酵母遺伝子（赤色の三角形）は、本発明者らの相同性ツール生成スコアに基づき、１種または複数のヒト相同体（丸）に接続される。次に、ＳｔｅｉｎｅｒＦｏｒｅｓｔ  Ｅｎｓｅｍｂｌｅは、「ヒト化」酵母分子インタラクトームにより増大されたヒトインタラクトームから生成されたエッジを介して、その結果得られたヒト遺伝子／タンパク質のそれぞれを相互接続する。酵母遺伝的修飾因子の特定のヒト相同体が、パーキンソニズム遺伝子として意味付けられた場合、小さい包含重みが与えられる。しかし、本発明者らの酵母ヒットの他の緊密な相同体のいかなるヒト疾患遺伝子にも、特別な優先度は与えられなかった。
【０２８１】
過剰発現スクリーン由来のヒト化ネットワークは、α−ｓｙｎを他のヒト疾患遺伝子に接続する
【０２８２】
本発明者らは、α−ｓｙｎ過剰発現スクリーン由来の７７種の修飾因子におけるヒト化ネットワークアプローチを検査した（「α−ｓｙｎ過剰発現ヒト化ネットワーク」；表Ｓ１、表Ｓ９および表Ｓ１１；図２Ａ、右）。結果としてのヒト化ネットワークにおけるいくつかの予測されるヒトノードは、酵母プロテオームに明らかな相同体がなく、最も著しい例は、α−ｓｙｎそれ自体である。α−ｓｙｎは、ニューロンにおいてα−ｓｙｎのごく近傍に局在化するクラスリンアダプター複合体の成分である、予測されるノードＡｐ１ｂ１（図２Ａ、右）を介して、ＥＲ品質管理およびタンパク質輸送修飾因子に接続された（添付の原稿；Chungら、Cell  Systems  ２０１６年）。ヒト化ネットワークにおけるα−ｓｙｎの出現は、本発明者らの本来の酵母遺伝的ヒットとα−ｓｙｎとの間の機能的で高度に相互接続された関係性が、酵母から人に保存されていることを強く示す。
【０２８３】
表Ｓ９：図２に関連する、ヒト化アルファ−シヌクレイン過剰発現相互作用ネットワーク、酵母−ヒトペア形成（インプットおよびＳＴＥＩＮＥＲＦＯＲＥＳＴ  ＥＮＳＥＭＢＬＥアウトプット）。
【０２８４】
表Ｓ１１：図２および図３に関連する、ヒト化ネットワークにおいて推論される、予測されるノード。
【０２８５】
ＬＲＲＫ２およびα−ｓｙｎは、ＥＲストレスおよび小胞輸送を介して接続される
【０２８６】
明らかな酵母相同体がない別のＰＤ遺伝子コードタンパク質である、キナーゼ／ＧＴＰａｓｅ  ＬＲＲＫ２は、ヒト化ネットワークの中心に組み込まれた（図２Ａ、右）。本発明者らは、ランダムに選択された遺伝子の１０００種のリストからヒト化Ｓｔｅｉｎｅｒ森のアンサンブルをコンピュータ処理により生成することにより、この知見の頑健性および特異性を検査した（本発明者らの本来のα−ｓｙｎ遺伝的修飾因子リストのサイズをマッチさせる）。ＬＲＲＫ２およびα−ｓｙｎ（ＳＮＣＡ）は、本発明者らのインプットリストからＰＣＳＦにより生成されたヒト化ネットワークの７２％において一緒に発生した（個々には、ＳＮＣＡは、ネットワークの８６％において現れ、ＬＲＲＫ２は、７６％において現れた）。どちらも、ＡβまたはＴＤＰ−４３スクリーンヒットから生成されたヒト化ネットワークのいずれにも組み込まれなかった（表Ｓ１における「ＴＤＰ−４３」のおよび「Ａβ」の「過剰発現ヒト化ネットワーク」）。ＬＲＲＫ２およびα−ｓｙｎは、ランダムに生成されたアンサンブルの０／１０００種のネットワークにおいて一緒に現れた。本発明者らのネットワークへの酵母相互作用情報の転位なしでは、α−ｓｙｎは、末梢に置かれ、Ａｐ１ｂ１へのその接続（上述を参照）は失われ、ＬＲＲＫ２は完全に非存在であった（図２Ｂ）。よって、ＬＲＲＫ２およびα−ｓｙｎの包含は、頑健であり、特異的であり、酵母相互作用データによるヒトネットワークの増大に依存性である。
【０２８７】
ＬＲＲＫ２は、ＬＲＲＫ２−（Choら、２０１４年；G.  Liuら、２０１２年）およびα−ｓｙｎ（Chungら、２０１３年；Cooperら、２００６年）誘導性の毒性に以前に関係付けられた経路である、ＥＲからゴルジへの輸送（Ｎｓｆ１、Ｒａｂ１ａ）およびＥＲ品質管理（Ｓｔｕｂ１／Ｃｈｉｐ／Ｓｃａｒ６、Ｓｇｋ１、Ｓｙｖｎ１）に関与するタンパク質を介して、ヒト化α−ｓｙｎネットワークに関連付けられた。本発明者らのデータは、これらが鍵となる収束点となり得ることを示唆した。本発明者らは以前に、野生型α−ｓｙｎのＡ５３Ｔ突然変異および三倍化が、ニカストリンを含む、患者由来ニューロンのＥＲにおける特異的な輸送されるタンパク質の病的蓄積をもたらすことを示した（Chungら、２０１３年）。以前に生成されたＬＲＲＫ２突然変異体ｉＰＳｃ由来ニューロンを使用して、本発明者らは、この表現型を再現した（図１０）。分化開始４週間後もの早さで、ニカストリンは、同質遺伝子的突然変異補正済み対照と比較して、ＬＲＲＫ２Ｇ２０１９Ｓ細胞のＥＲに蓄積し（図２Ｄ）、α−ｓｙｎ突然変異を有する患者に由来するニューロンにおける以前に記載された病理を表現型コピーする。よって、ヒト化α−ｓｙｎネットワークは、別個の形態のパーキンソニズムにおける細胞病理の収束を正確に予測した。ニカストリン輸送欠損も、ＬＲＲＫ２ノックアウトマウス線維芽細胞において実証されており（Choら、２０１４年）、Ｇ２０１９Ｓ突然変異が、タンパク質輸送におけるＬＲＲＫ２関連機能の欠乏をもたらし得るという可能性を高める。
【０２８８】
α−ｓｙｎ毒性に対するゲノムワイドプール過剰発現および欠失スクリーン
【０２８９】
より網羅的な見解のため、本発明者らは、α−ｓｙｎ毒性に対する２種の追加的なゲノムワイドスクリーンを実行した（図１１Ａナンバー１）：１）ゲノムワイド欠失スクリーンは、欠失されると、それ以外にとっては毒性ではない低レベルのα−ｓｙｎに対する極端な高感度をもたらす非必須遺伝子を同定した（図１１Ａナンバー２；図１１；表Ｓ５）；２）ガラクトース誘導性過剰発現ライブラリーが、本発明者らのα−ｓｙｎ  ＨｉＴｏｘ株にまとめて形質転換された、プールスクリーン（図１１Ａナンバー３；補足図７；表Ｓ６）。３）プールスクリーンのため、本発明者らは、プラスミドＤＮＡを配列決定して、同様に形質転換されたＹＦＰ対照株由来のプラスミドＤＮＡ配列と比較して、選択的条件下で特異的に過剰にまたは過少に表される遺伝子を同定して、α−ｓｙｎ特異的修飾因子を同定する。これらは、それぞれ毒性の推定サプレッサーおよびエンハンサーである。プールスクリーンは、各ライブラリープラスミドを個々にα−ｓｙｎ株に形質転換し、成長を測定するよりもはるかに迅速であり、理論的にはより高感度である。
【０２９０】
これらのスクリーンは、およそ１０，０００種の潜在的遺伝的相互作用の検査を包含した（約５５００種の過剰発現、約４５００種の欠失）。ヒットの大規模検証後に（図１１Ｃおよび図１２Ｂ）、本発明者らは、３１８種の遺伝的修飾因子を回収した。極めて少ない重複が、欠失、対、過剰発現スクリーンにおいて回収された特異的遺伝子の間に存在した（図３Ｂ）。しかし、本発明者らは、表される生物学的経路における相当な重複を見い出した（後述するネットワーク解析を参照）。１６種の修飾因子が、本発明者らの研究室から独立した研究において出現した（Caraveoら、２０１４年；Chungら、２０１３年）、または本明細書で同定された（表Ｓ７）。これらのうち１４種は、本発明者らのスクリーンヒットとは別個であり、α−ｓｙｎ毒性の総計３３２種の遺伝的修飾因子をもたらす（図３Ｂ）。
【０２９１】
表Ｓ５：図３に関連する、アルファ−シヌクレインゲノムワイド欠失スクリーン修飾因子（α−ｓｙｎとの合成致死的相互作用による全てエンハンサー）。
【０２９２】
表Ｓ６：図３に関連する、アルファ−シヌクレインプール過剰発現スクリーン修飾因子。
【０２９３】
表Ｓ７：図３に関連する、アルファ−シヌクレイン毒性の追加的なロースループット「候補に基づく」修飾因子（仮説に基づく研究）。
【０２９４】
ＰＡＲＫおよび他の神経変性遺伝子の相同体は、酵母におけるα−ｓｙｎ毒性を修飾する
【０２９５】
α−ｓｙｎ毒性の修飾因子は、パーキンソニズムおよび他の神経変性疾患表現型の多くの公知遺伝的リスク因子の相同体を含んだ（図３Ａおよび表Ｓ１４）。これらは、とりわけ、小胞輸送（ｙＲＡＢ７Ｌ１、ｙＲＡＢ３９Ｂ、ｙＳＯＲＬ１、ｙＳＹＮＪ１／ＰＡＲＫ２０、ｙＶＰＳ３５／ＰＡＲＫ１７）、ｍＲＮＡ翻訳（ｙＡＴＸＮ２、ｙＥＩＦ４Ｇ１／ＰＡＲＫ１８）、ミトコンドリア品質管理／機能（ｙＣＨＣＨＤ２／１０）、金属イオン搬送（ｙＡＴＰ１３Ａ２）、転写調節（ｙＡＴＸＮ７）、代謝（ｙＤＨＤＤＳ）およびシグナル伝達（ｙＰＤＥ８Ｂ、ｙＰＰＰ２Ｒ２Ｂ／ＡＴＸＮ１２）に関与する遺伝子を含んだ。いわゆるＰＡＲＫ遺伝子座における遺伝子を含むこれらの遺伝子の多くは、ＰＤを定義するα−ｓｙｎ病理とは全く別個のニューロン病理に関係付けられた。本発明者らのスクリーンにおけるこれらの回収は、多様な神経変性疾患遺伝子に関連する神経毒性の機構が共有され得ることを示唆した。
【０２９６】
１９種のＰＡＲＫ遺伝子座のうち、９種は、明らかな酵母相同体を有する（表Ｓ８）。これらのうち４種は、本発明者らのスクリーンにおいて出現した：ｙＡＴＰ１３Ａ２（ＰＡＲＫ９）［酵母におけるＹＰＫ９］、ｙＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）［ＶＰＳ３５］、ｙＥＩＦ４Ｇ１（ＰＡＲＫ１８）［ＴＩＦ４６３１、ＴＩＦ４６３２］およびｙＳＹＮＪ１（ＰＡＲＫ２０）［ＩＮＰ５３］。第５の推定ＰＡＲＫ遺伝子、ｙＲＡＢ７Ｌ１（ＰＡＲＫ１６）［ＹＰＴ７］は、候補として検査されたときに、遺伝的修飾因子として出現した（後述を参照）。これらの遺伝子の相同体を偶然に回収する確率は、ｐ＝０．０００１３である（超幾何分布検定）。これらのｙＰＡＲＫ遺伝子のいずれも、ＡβまたはＴＤＰ−４３過剰発現スクリーンにおける修飾因子ではなかった（表Ｓ２）。これらの知見は、酵母におけるα−ｓｙｎスクリーンヒットの生物学的特異性を強調する。
【０２９７】
表Ｓ１４．図３に関連する、本発明者らのネットワークによってα−ＳＹＮ毒性に接続される神経変性遺伝子の概要。他に特に規定がなければ、パーキンソニズム遺伝学に関する最近の総説は、参考文献を提供する。ヒト遺伝子の明らかな酵母相同体が存在しない場合、「Ｎ／Ａ」が使用される（このような遺伝子は、本発明者らのヒト化ネットワークにおける「予測されるノード」として現れた）。赤色で強調された遺伝子は、古典的ＰＤ／ＰＤＤに強く関連し、α−ｓｙｎ（レビー型）病理を有することが公知であるまたは強く推定されるのいずれかである。これらの遺伝子の大部分は、ＰＤとは全く別個の疾患に関する。一部の遺伝子（ＥＩＦ４Ｇ１およびＵＣＨＬ１を含む）は、高度に議論の余地があるＰＤ遺伝子と考慮されるが、にもかかわらず、本発明者らのα−ｓｙｎ毒性ネットワークにおいて回収される。略語：ＡＤ：常染色体優性；ＡＬＳ：筋萎縮性側索硬化症。ＡＲ：常染色体劣性；ＣＢＤ：大脳皮質基底核変性症；ＤＡ：ドーパミン作動性ＤＬＢ：レビー小体型認知症；Ｅｎｈ：毒性のエンハンサー；ＧＷＡＳ：ゲノムワイド関連研究；ＮＢＩＡ：脳鉄蓄積による神経変性。ＯＥ：過剰発現スクリーン。ＰＤ：パーキンソン病；ＰＤＤ：パーキンソン病認知症；ポリＱ：遺伝子内のＣＡＧ反復伸長によるポリグルタミン（polygutamine）伸長；ＰＳＰ：進行性核上性麻痺；Ｓｕｐｐ：毒性のサプレッサー。「ＰＤ」が、α−ｓｙｎ（レビー小体型）病理に関連したパーキンソニズムを指すことに留意されたい。「パーキンソニズム」は、異なる（または未知の）病理による臨床表現型を指す。
【０２９８】
表Ｓ８：図３に関連する、「ＰＡＲＫ」遺伝子座および遺伝子。
【０２９９】
ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、α−ｓｙｎ毒性のゲノムスケール「マップ」を生成する
【０３００】
本発明者らは、３３２種のα−ｓｙｎ毒性修飾因子の相同体にＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔを適用して、ヒト化ネットワークまたは「マップ」を生成した（表Ｓ１、表Ｓ１０および表Ｓ１１；図３Ｂ；図１３における「完全α−ｓｙｎヒト化ネットワーク」）。神経変性に関係付けられる複数の遺伝子は、酵母ヒットに対する直接的相同性によって、または予測されるネットワークノードとして、このα−ｓｙｎネットワークにおいて出現した（図３Ｂ；図１３；表Ｓ１４）。
【０３０１】
本発明者らが、本発明者らのマップ（図３Ｂ）における「分枝」に遺伝子オントロジーを重ねたところ、様々な小胞媒介性搬送プロセスが優占した。定型ＰＤに関連する遺伝的リスク因子（ＳＮＣＡそれ自体、ＬＲＲＫ２、ＲＡＢ７Ｌ１、ＶＰＳ３５）は、小胞輸送遺伝子に富んだサブネットワークにおいて濃縮された（図３Ｂ）。対照的に、非レビー型神経病理、非定型パーキンソニズムまたは非パーキンソン病様神経変性表現型に関連する神経変性遺伝子の大部分（表Ｓ１４）は、小胞輸送ネットワークから遠隔にあった。ネットワーク「分枝」に富んだ生物学的プロセスの完全解析は、表Ｓ１２に提示されている。注目すべきことに、このヒト化ネットワークは、以前に同定されたドラッガブルな標的であるＮＥＤＤ４（Tardiffら、２０１３年）ならびにカルシニューリンおよびＮＦＡＴ（Caraveoら、２０１４年）が、α−ｓｙｎ毒性に影響を与える分子的な文脈を解明する（図３Ｂ）。
【０３０２】
さらに、α−ｓｙｎそれ自体およびＬＲＲＫ２の両方が、ちょうど過剰発現ネットワークにおけるもののようなノードとして予測される（図２Ａ）。３３２種の修飾因子の本発明者らのリストから生成されたＳｔｅｉｎｅｒ森のアンサンブルにおいて、α−ｓｙｎは、１００％において現れ、ＬＲＲＫ２は７０％において現れた。３３２種の遺伝子の１０００種のランダムセットにおいて、本発明者らが、本発明者らの遺伝的実験において回収された５種のｙＰＡＲＫ遺伝子（ｙＰＡＲＫ９、ｙＰＡＲＫ１６、ｙＰＡＲＫ１７、ｙＰＡＲＫ１８、ｙＰＡＲＫ２０）の組み込みを押し進めた場合であっても、α−ｓｙｎおよびＬＲＲＫ２は、ヒト化ネットワークの０．６％のみにおいて一緒に現れた。よって、α−ｓｙｎ毒性の酵母修飾因子は、ＰＤ関連タンパク質α−ｓｙｎおよびＬＲＲＫ２が決定的なネットワークノードとして出現した、特異的ヒト化ネットワークを生成した。
【０３０３】
ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、コヒーレントネットワークを生成した：同様のオントロジーの遺伝子を含む、生物学的に直感的な「ステム」を有する単一木ネットワーク（表Ｓ１０）における３３２種の酵母修飾因子遺伝子のうち２９５種（図３Ｂ）。酵母インタラクトームデータの転位なしでこれらの３３２種の修飾因子から生成されたネットワーク（図３Ｂ、挿入図；）は、それぞれ１３６、２および１２２種の酵母遺伝子を含む、３種の断片化されたネットワークを産生した（図３Ｂ、挿入図）。共通細胞プロセスにおける関与により生物学的に関連付けられるべき遺伝子は存在しなかった（図３Ｂ）。さらに、ＬＲＲＫ２およびＮＦＡＴは、組み込まれなかった。ＥＩＦ４Ｇ１およびＡＴＸＮ２の関係性等、検証できる仮説（図５および図６、後述）は、出現しなかったが、それは、これらのタンパク質が、異なるネットワークに収まったためである。ＤＡＰＰＬＥ（Rossinら、２０１１年）およびＰＥＸＡ（Tuら、２００９年）も、仮説生成に無用な高度に断片化されたまたは高密度な「毛玉」ネットワークを産生し（図１４）、著しいことに、ＬＲＲＫ２のような決定的なノードを含まなかった（図１５）。よって、ヒトインタラクトームを増大させるための酵母ネットワークの転位は、コヒーレントで生物学的に有意義なα−ｓｙｎネットワークを作製した。
【０３０４】
表Ｓ１０：図３に関連する、ヒト化アルファ−シヌクレイン完全ネットワーク（過剰発現、プール過剰発現、欠失スクリーン）、酵母−ヒトペア形成（インプットおよびＳＴＥＩＮＥＲＦＯＲＥＳＴ  ＥＮＳＥＭＢＬＥアウトプット）。
【０３０５】
表Ｓ１２．図３に関連する、ヒト化アルファ−シヌクレイン完全ネットワークにおける濃縮オントロジー。
【０３０６】
α−ｓｙｎ毒性マップにおけるエンドサイトーシスおよび逆行性輸送サブネットワークは、ＲＡＢ７Ｌ１（ＰＡＲＫ１６）およびＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）の酵母相同体を組み込む。
α−ｓｙｎマップにおいて、いくつかのパーキンソニズム遺伝子の相同体は、ＲＡＢ６Ａの酵母相同体であるＹＰＴ６周囲のサブネットワークにおいて癒合した（Soperら、２０１１年）（図４Ａ）。エンドソーム輸送に関与するタンパク質をコードするＹＰＴ７、ＶＴＨ１およびＶＰＳ３５が含まれていた。ＹＰＴ７は、ＰＡＲＫ１６遺伝子座のリード候補であるＲＡＢ７Ｌ１（Macleodら、２０１３年；Nallsら、２０１４年）の、また、メンデルの法則に従ったパーキンソニズムリスク因子ＲＡＢ３９Ｂ（Wilsonら、２０１４年）の緊密な相同体である。ＶＴＨ１は、細胞内選別（NykjaerおよびWillnow、２０１２年）に関与するタンパク質をコードする確立されたＡＤリスク修飾因子（Rogaevaら、２００７年）であるＳＯＲＬ１の緊密な酵母相同体である。ＶＰＳ３５は、古典的ＰＤのメンデルの法則に従ったリスク因子、ＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）と相同である（Zimprichら、２０１１年）。ＶＰＳ３５は、ＶＰＳ２６およびＶＰＳ２９と共に、エンドソーム区画からゴルジ区画へとカーゴを搬送するレトロマー複合体を含む。近日発表される研究において（Chungら  Cell  Systems  ２０１６年）、本発明者らは、ＶＳＰ２６およびＶＰＳ２９コアレトロマー成分の欠失が、α−ｓｙｎ毒性を強く増強することを示す。ゴルジからエンドソームへのおよびエンドサイトーシス輸送に関与する第４の遺伝子、ＩＮＰ５３は、メンデルの法則に従ったパーキンソニズム遺伝子ＳＹＮＪ１（ＰＡＲＫ２０）と相同である（Olgiatiら、２０１４年）。これらの遺伝子のうちいずれか１種の欠失は、野生型株において毒性ではなかった。しかし、低（無毒）レベルのα−ｓｙｎを発現する株におけるこれらの遺伝子のうちいずれか１種の欠失は、強く相乗的な成長欠損を産生した（表Ｓ５、図４Ｂおよび図１５Ａ）。重要なことに、酵母またはヒトＶＰＳ３５の異所性発現は、ＶＰＳ３５欠失によって誘導された毒性をレスキューしたが、疾患を引き起こす突然変異（ＶＰＳ３５−Ｄ６２０Ｎ）の発現は、レスキューしなかった（図４Ｃ）。最後に、ｙＲＡＢ７Ｌ１は、欠失された場合にα−ｓｙｎ毒性を増強したが、過剰発現された場合にこの毒性からレスキューした（図１５Ｂ）。
【０３０７】
α−ｓｙｎマップは、ΔＰＡＲＫ９（ＡＴＰ１３Ａ２）およびΔＰＡＲＫ１７（ＶＰＳ３５）感作酵母モデルにおける分岐する遺伝的相互作用プロファイルを予測する
【０３０８】
本発明者らのα−ｓｙｎマップの別個のサブネットワークに位置することの機能的帰結を検査するために、本発明者らは、ＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）およびＡＴＰ１３Ａ２（ＰＡＲＫ９）を比較した。ＡＴＰ１３Ａ２は、カチオン搬送および金属イオン恒常性に関係付けられる５型Ｐ−ＡＴＰａｓｅである（Kongら、２０１４年；Parkら、２０１４年；Ramonetら、２０１２年；TsunemiおよびKrainc、２０１４年）。ＡＴＰ１３Ａ２における突然変異は、ＰＤとは別個である、若年発症型パーキンソニズムまたはクフォー・ラケブ症候群をもたらす（Schneiderら、２０１０年）。ｙＡＴＰ１３Ａ２は、本発明者らの過剰発現スクリーンにおいてα−ｓｙｎ毒性を抑制し（図１Ｃ）、ｙＡＴＰ１３Ａ２の欠失は、α−ｓｙｎ毒性を強く増強した（図４Ｂ）。本発明者らのヒト化ネットワークにおいて、ＡＴＰ１３Ａ２は、ＶＰＳ３５から空間的に遠隔にあり、小胞輸送サブネットワークの十分に外側に位置した（図３Ｃおよび図４Ａ）。本発明者らは、この空間的分離が、根底にある生物学における差を反映するかについて答えを求めた。
【０３０９】
本発明者らは、同様の毒性を有する３種の株を生成した（図４Ｄ）。１種の株において、毒性は、α−ｓｙｎの過剰発現に起因した（ＨｉＴｏｘ）。他の２種の株において、中等度レベルのα−ｓｙｎ発現によって誘導される軽度毒性は、酵母ＡＴＰ１３Ａ２（以降、ΔＡＴＰ１３Ａ２／α−ｓｙｎ）またはＶＰＳ３５（以降、ΔＶＰＳ３５／α−ｓｙｎ）の欠失によって増強された。よって、これら３種の酵母株は、３種の形態の家族性パーキンソニズムに関連する細胞病理をモデリングした：２種は定型α−ｓｙｎ病理（α−ｓｙｎ増倍およびＶＰＳ３５（ＰＡＲＫ１７）関連パーキンソニズムに関連するＰＤ）により、１種は著しく異なる病理、ＰＡＲＫ９（ＡＴＰ１３Ａ２）による。
【０３１０】
ΔＡＴＰ１３Ａ２は、金属イオンストレスに対して細胞を感作するが（Kongら、２０１４年）、ΔＶＰＳ３５株は、逆行性輸送欠損を示し（Seamanら、１９９７年）、ΔＡＴＰ１３Ａ２およびΔＶＰＳ３５株が、α−ｓｙｎ毒性に対して差次的に感作されたことを示唆する。本発明者らは、本発明者らの７７種のα−ｓｙｎ過剰発現スクリーンヒットが、本発明者らのΔＶＰＳ３５／α−ｓｙｎおよびΔＡＴＰ１３Ａ２／α−ｓｙｎモデルの毒性に影響を与えたかについて答えを求めた。
【０３１１】
本発明者らは、酵母モデルのそれぞれにおいてこれらのα−ｓｙｎ毒性修飾因子を発現させ、成長をモニターした。α−ｓｙｎ  ＨｉＴｏｘおよびΔＶＰＳ３５／α−ｓｙｎモデルに関して、６９／７７種の遺伝子が重複し（図４Ｅ、左）、これらの遺伝的形態のパーキンソニズムに関連する同様の病理と十分に相関する。注目すべきことに、重複する修飾因子は、小胞輸送遺伝子に富んだ（表Ｓ１３）。対照的に、３／７７種の修飾因子のみが、α−ｓｙｎ  ＨｉＴｏｘとΔＡＴＰ１３Ａ２／α−ｓｙｎとの間に共通して存在した（図４Ｅ、右）。これらは、それぞれ鉄およびマンガン恒常性（ＣＣＣ１）ならびにアクチン細胞骨格再編成（ＩＣＹ１、ＡＦＩ１）に関与した。注目すべきことに、金属イオン恒常性は、クフォー・ラケブ症候群（Schneiderら、２０１０年）およびその哺乳動物モデル（Parkら、２０１４年）に強く関係付けられる。よって、遺伝学的に、臨床的におよび神経病理学的に別個の神経変性疾患は、そうであるにもかかわらず、いくつかの鍵となる分子病理を共有することができる。
【０３１２】
表Ｓ１３．図４に関連する、アルファ−ＳＹＮ（ＨＩＴＯＸ）とアルファ−ＳＹＮ／ΔＶＰＳ３５株修飾因子との間の重複、および遺伝子濃縮。
【０３１３】
ｍＲＮＡ翻訳サブネットワークは、ＰＡＢＰＣ１、ＥＩＦ４Ｇ１およびＡＴＸＮ２にα−ｓｙｎを連結する
【０３１４】
α−ｓｙｎ毒性に対する本発明者らの過剰発現スクリーンにおいて、ＴＩＦ４６３２（以降、ｙＥＩＦ４Ｇ１−２）は、サプレッサーとして出現した。ＴＩＦ４６３２は、翻訳開始因子ＥＩＦ４Ｇ１の酵母相同体である。ゲノムワイド欠失およびプール過剰発現スクリーンは、開始因子および複数のリボソームサブユニットを含む、ｍＲＮＡ翻訳に関連する追加的な遺伝的修飾因子を同定した（図３Ｂおよび図５Ａ；表Ｓ５および表Ｓ６）。これらは、ＰＡＢＰＣ１（細胞質ポリ（Ａ）結合タンパク質コード）、相同体ＰＡＢ１；ＡＴＸＮ２相同体ＰＢＰ１；および酵母における第２のＥＩＦ４Ｇファミリー相同体、ＴＩＦ４６３１（以降、ｙＥＩＦ４Ｇ１−１）を含んだ。これらのヒットは、定量的ＰＣＲによって確認され（図５Ｂ、左）、これらの遺伝子の過剰発現は、バイオスクリーン（図５Ｂ、右）および／またはスポット（図１６）成長アッセイにおいてα−ｓｙｎ毒性を抑制した。異なるタンパク質症モデルにおける遺伝的実験は、α−ｓｙｎ毒性におけるこれらの修飾因子の効果が特異的であることを明らかにした（図１６）。よって、ｍＲＮＡ翻訳の撹乱は、単純に一般的なタンパク質毒性応答ではなかった。
【０３１５】
タンパク質翻訳は、ＰＤ患者由来ニューロンにおいて撹乱される
【０３１６】
本発明者らは、ｍＲＮＡ翻訳およびｍＲＮＡプロセシング経路における多数の遺伝的修飾因子を回収したため（図３および図５）、本発明者らは、タンパク質翻訳が、ＰＤ患者由来ニューロンを含む、細胞シヌクレイン症モデルにおいて撹乱されたかについて答えを求めた。タンパク質産生のバルク変化は、Ｓ３５放射標識メチオニンおよびシステインがタンパク質に組み込まれる速度を短時間「パルス標識付け」後に経時的に決定することにより、初期に評価された。ＨＥＫ（ヒト胎児由来腎臓）細胞および初代ラット皮質ニューロンにおけるα−ｓｙｎの過剰発現は、アミノ酸取込みを変化させずに、Ｓ３５−Ｍｅｔ／Ｃｙｓの蓄積を低減させた（図１７）。同様に、α−ｓｙｎＡ５３Ｔ突然変異を有する６〜８週齢ｉＰＳｃニューロンにおいて、タンパク質へのＳ３５−Ｍｅｔ／Ｃｙｓ組み込みは、同質遺伝子的突然変異補正済み対照と比較して低減された（図５Ｃ）。よって、本発明者らのα−ｓｙｎスクリーンおよびネットワーク解析は、シヌクレイン症の細胞モデルにおいて、バルクｍＲＮＡ翻訳におけるα−ｓｙｎ毒性の強い効果を同定した。ＥＩＦ２Ａのリン酸化（図１７Ｄ；図１８Ａ）またはＸＢＰ１スプライシング（図１８Ｂ）は、これらのニューロンにおいて変更されなかったため、この効果は、正準ＥＲストレス応答に起因し得なかった。
【０３１７】
酵母から患者ニューロンへの、ＡＴＸＮ２およびＥＩＦ４Ｇ１の保存された遺伝的相互作用
【０３１８】
本発明者らは次に、過剰発現された場合にα−ｓｙｎ毒性を抑制した２種の翻訳因子（ＡＴＸＮ２およびＥＩＦ４Ｇ１）のヒト相同体が、ニューロンにおけるタンパク質翻訳欠損を同様に反転できるか検査した。本発明者らは、ＥＩＦ４Ｇ１およびＡＴＸＮ２のニューロンアイソフォームを転写的に上方調節するためのＴＡＬＥ−ＴＦ構築物を生成した（Sanjanaら、２０１２年）（図５Ｄ、左）。次に、これらの構築物を、アデノ随伴ウイルスベクターにより、分化したα−ｓｙｎＡ５３ＴｉＰＳｃ由来ニューロン培養物に送達した。
【０３１９】
形質導入１０日後に、内在性ＥＩＦ４Ｇ１およびＡＴＸＮ２  ｍＲＮＡレベルは、定量的ＰＣＲによって測定された場合、およそ４倍増加した（図５Ｄ、右）。この増加した発現は、α−ｓｙｎＡ５３Ｔニューロンにおいて本発明者らが観察したバルクタンパク質翻訳における欠損を実質的に反転した（図５Ｅ）。ＥＩＦ４Ｇ１の過剰発現は、Ａ５３Ｔニューロンにおける翻訳を増加させたが、突然変異補正済み対照においては増加させなかった。ＡＴＸＮ２過剰発現は、突然変異体および対照細胞においてバルク翻訳を等しく増加させた（図５Ｆ）。
【０３２０】
よって、本発明者らの種間分子ネットワークは、ＰＤ患者由来ニューロンにおけるα−ｓｙｎとｍＲＮＡ翻訳因子との間の生物学的相互作用を予測した。これらのデータは、撹乱されたｍＲＮＡ翻訳が、α−ｓｙｎ毒性の重要な側面であるという議論を強化する。興味深いことに、本発明者らは、同質遺伝子的突然変異補正済み対照ニューロンと比較して、分化４および１２週間目のα−ｓｙｎＡ５３ＴｉＰＳｃ由来皮質ニューロンのリボソームフットプリンティング実験において、ｍＲＮＡ翻訳関連の転写物の翻訳減少の強いシグネチャーを同定した（図１９Ａおよび図１４Ｂ、図２０）。実際に、ｍＲＮＡ関連の翻訳因子、リボヌクレオタンパク質およびリボソームタンパク質は、α−ｓｙｎ毒性の本発明者らの遺伝的および翻訳的マップにおいて富んだだけでなく、ニューロン中のα−ｓｙｎのごく近傍におけるタンパク質の間においても富んだ（発表保留中、Chungら、Cell  Systems、２０１６年、図４；「空間的α−ｓｙｎマップ」、図２０Ａ）。さらに、多数のｍＲＮＡ翻訳タンパク質は、α−ｓｙｎと直接的に複合体形成した。遺伝的、翻訳的および空間的マップのこの収束は、α−ｓｙｎ毒性とｍＲＮＡ代謝との間の接続が、α−ｓｙｎ生物学に深く根付いたことを示唆する。
【０３２１】
考察
【０３２２】
本発明者らは、α−ｓｙｎミスフォールディングおよび誤輸送が、細胞生物学をどのように撹乱するかに関するコヒーレントな、システムレベル解析について記載する。ゲノムワイドスクリーンは、パン酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるα−ｓｙｎ発現の毒性帰結の修飾因子を同定した。本発明者らの鍵となるコンピュータ処理による寄与であるＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、酵母における豊富にアノテートされた分子相互作用を、Ｓｔｅｉｎｅｒ賞金収集アルゴリズムおよび洗練された種間相同性ツールとカップリングして、スクリーンヒットを「ヒト化」分子ネットワークとして視覚化した。ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔは、α−ｓｙｎ病理が、パーキンソニズムのヒト遺伝的リスク因子に深く接続されることを明らかにし、これらの接続が発生する分子経路をはっきりさせた。本発明者らは、遺伝学的に扱い易い生物におけるいずれかの生理的または病的プロセスのモデリングに容易に一般化できる、共同体のための価値ある資源としてＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔを想定する。
【０３２３】
神経変性における差し迫った課題は、高度に別個の病理に関連するが、そうであるにもかかわらず、同様の臨床表現型に収束する遺伝子が、分子レベルで関連するか否かを決定することである。本発明者らのネットワークは、古典的ＰＤを引き起こす遺伝子（Ogakiら、２０１５年）のみならず、異なる病理によるパーキンソニズムを引き起こす遺伝子、および他の神経変性表現型に関連する遺伝子にも、ひとまとめに、α−ｓｙｎを結び付けた（表Ｓ１４）。関係性は、α−ｓｙｎに高度に特異的であった。さらに、古典的ＰＤまたはα−ｓｙｎ病理に結び付けられた遺伝子（ＲＡＢ７Ｌ１、ＶＰＳ３５およびＬＲＲＫ２のような）は、小胞輸送関連サブネットワークにおいて濃縮された一方、「非定型」パーキンソニズムに結び付けられた遺伝子（ＡＴＰ１３Ａ２およびＡＴＸＮ２のような）は、別々のサブネットワークに存在した。いくつかの例について、本発明者らのネットワークは、マップ上の空間的位置に関連する収束性および分岐性の分子病理を明らかにした。よって、ＬＲＲＫ２およびα−ｓｙｎ病理は、撹乱されたタンパク質輸送のレベルで接続され、患者由来ニューロンにおいて確認された。別の例では、ＶＰＳ３５およびＡＴＰ１３Ａ２は、酵母における高度に別個の遺伝的修飾因子プロファイルを示した。他のネットワークおよびモデル生物研究は、α−ｓｙｎとＬＲＲＫ２（Choら、２０１４年；G.  Liuら、２０１２年）、ＲＡＢ７Ｌ１とＬＲＲＫ２との間（Macleodら、２０１３年）（Beilinaら、２０１４年）、ならびにＶＰＳ３５およびα−ｓｙｎとの間（Dhungelら、２０１４年）の接続を含む、本発明者らの結果に重要な支持を提供する。
【０３２４】
ＥＩＦ４Ｇ１（ＰＡＲＫ１８）およびＣＨＣＨＤ２を含む、本発明者らのネットワークによってα−ｓｙｎ毒性に接続される一部の遺伝子に関して、ヒト遺伝的データは、限定されるまたは議論の余地がある（Funayamaら、２０１５年；Z.  Liuら、２０１５年；Ogakiら、２０１５年）（Chartier-Harlinら、２０１１年；Nuytemansら、２０１３年）。別の遺伝子、ＲＡＢ７Ｌ１は、パーキンソニズム関連共通遺伝子バリアント（ＰＡＲＫ１６）と連鎖した２種の候補の１種である。本発明者らの解析は、このような遺伝子とα−ｓｙｎタンパク質症との間の接続を肯定し、これらの相互作用を置くための生物学的文脈を提供する。例えば、本発明者らは、翻訳因子ＥＩＦ４Ｇ１が、「ＰＤ遺伝子」と命名されるべきだと主張しない。しかし、ＥＩＦ４Ｇ１およびα−ｓｙｎ毒性は、ｍＲＮＡ生物学およびタンパク質翻訳におけるα−ｓｙｎの重要かつ以前に認識されない直接的効果の文脈において接続される。これは、本発明者らの遺伝的解析（図３）およびニューロンの本発明者らのｍＲＮＡ翻訳プロファイリング（図１９）における複数のヒットによって確認された。興味深いことに、新興の接続は、ｍＲＮＡ翻訳と他のパーキンソニズム関連遺伝子との間に出現している（Gehrkeら、２０１５年）（Martinら、２０１４年）。さらに、ｍＲＮＡ翻訳および代謝への接続が、ニューロンにおけるα−ｓｙｎの本発明者らの空間的マッピングにおいても確認された（Chungら、Cell  Systems  ２０１６年、添付の原稿）。このマップは、α−ｓｙｎが、ｍＲＮＡ翻訳およびタンパク質輸送に関与するタンパク質のごく近傍にあり、それと複合体形成することを明らかにし、このような撹乱が、ａ−ｓｙｎ毒性における上流または近位事象となり得ることを示唆する。
【０３２５】
最後に、ドラッガブルな標的と遺伝子ネットワークとの間の接続を同定することにより、本発明者らのアプローチから、処置が将来的に、特異的遺伝的病変に標的化され得る仕方が垣間見られる。本発明者らは、単一の臨床的または病理的診断の硬直化が、より微妙に異なる分子診断をもたらすことを想定する。このシナリオにおいて、遺伝的病変は、化合物標的にマッチされ、コンビナトリアル遺伝的病変が導入されて、特異的な遺伝的リスクおよび生物学を反映する、「個別化された」細胞モデルにおいて確認されるであろう。新興のゲノム編集技術は、このようなモデルが、患者由来細胞において開発され、ゲノムワイドスクリーニングが同様に実行されることを可能にするであろう（Hassonら、２０１３年；Khuranaら、２０１５年；Shalemら、２０１４年；Wangら、２０１４年）。これらは、疑いなく歓迎される進歩となるであろうが、単純なモデル生物において目を見張るような発展が続くであろう。酵母におけるバリオミックライブラリーは例えば、現在、酵母プロテオーム全体にわたる単一アミノ酸分解能での突然変異誘発を可能にし（Z.  Huangら、２０１３年）、表現型スクリーンにおける標的同定のための莫大な潜在力を解き明かす。本発明者らは、多面的な種間アプローチが、多くの複雑な疾患への決定的な洞察を明示し続け、おそらく、ポストゲノミクス時代における治療的な見込みを満たすであろうと心に描く。
【表Ｓ１−１】
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【表Ｓ１−２】
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【表Ｓ１−３】
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【表Ｓ２−１】
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【表Ｓ２−２】
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【表Ｓ２−３】
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【表Ｓ２−４】
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【表Ｓ３−１】
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【表Ｓ３−２】
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【表Ｓ４−１】
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【表Ｓ４−２】
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【表Ｓ４−４】
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【表Ｓ４−６】
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【表Ｓ４−２６】
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【表Ｓ４−３１】
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【表Ｓ５−１】
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【表Ｓ５−５】
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【表Ｓ６−１】
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【表Ｓ７−３】
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【表Ｓ８−１】
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【表Ｓ８−２】
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【表Ｓ１２−４４】
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【表Ｓ１２−７５】
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【表Ｓ１４−１】
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【表Ｓ１５−１】
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【表Ｓ１５−２】
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ＳＴＡＲ方法
実験モデルおよび対象詳細
酵母株：
【０３２６】
欠失スクリーンに関して、株は、ＢＹ４７４１バックグラウンドにあり、他の文献に詳細に記載されている（Baryshnikovaら、２０１０年；TongおよびBoone、２００６年）。
【０３２７】
欠失スクリーンおよび検証を除く全実験に関して、使用された酵母株は、ｗ３０３バックグラウンドにあった（ＭＡＴａ  ｃａｎ１−１００、ｈｉｓ３−１１，１５、ｌｅｕ２−３，１１２、ｔｒｐ１−１、ｕｒａ３−１、ａｄｅ２−１）。ベクター対照株は、ｔｒｐおよびｕｒａ遺伝子座に空ベクターを含有した（ｐＡＧ３０４Ｇａｌ、ｐＡＧ３０６ＧＡＬ）。ＮｏＴｏｘ  α−ｓｙｎ株は、その遺伝子座に挿入されて、緑色蛍光タンパク質に融合されたα−ｓｙｎ（α−ｓｙｎ−ＧＦＰ）を含有した（ｐＡＧ３０３Ｇａｌ−α−ｓｙｎ−ＧＦＰ）。ＩｎｔＴｏｘおよびＨｉＴｏｘ  α−ｓｙｎ株は、これおよびｔｒｐ遺伝子座に挿入されて、α−ｓｙｎ−ＧＦＰの複数のタンデムコピーを含有した（ｐＲＳ３０３ＧＡＬ−α−ｓｙｎ−ＧＦＰ、ｐＲＳ３０４ＧＡＬ−α−ｓｙｎ−ＧＦＰ）。ＩｎｔＴｏｘ株は、４〜５コピーのα−ｓｙｎを有する一方、ＨｉＴｏｘ細胞は、＞６コピーのα−ｓｙｎを有する。ＩｎｔＴｏｘ  α−ｓｙｎ株におけるＰＡＲＫ１７／ＶＰＳ３５またはＰＡＲＫ９／ＳＰＦ１遺伝子座を、カナマイシン抵抗性カセット（ＶＰＳ３５：：ｋａｎＭＸまたはＳＰＦ１：：ｋａｎＭＸ）で置き換えることにより、ΔＰＡＲＫ１７／α−ｓｙｎおよびΔＰＡＲＫ９／α−ｓｙｎを生成した。
ヒトｉＰＳｃ系統：
【０３２８】
対照個体、および同質遺伝子的遺伝子補正済み対照と共にＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２を保有するＰＤ患者由来のｉＰＳＣを、以前に記載された通りに生成した（Reinhardtら、２０１３年）。皮膚生検、ヒト皮膚線維芽細胞培養、ｉＰＳ細胞生成、およびＡ５３Ｔ突然変異（α−ｓｙｎＡ５３Ｔ）を有する患者のための突然変異補正は、以前に記載されている（Cooperら、２００６年；Soldnerら、２０１１年）。この以前の刊行物において、Ａ５３Ｔ  ｉＰＳ系統は、ＷＩＢＲ−ＩＰＳ−ＳＮＣＡＡ５３Ｔと称された。全ｉＰＳｃ系統に関して、書面形式を使用して細胞提供に先立ち患者からインフォームドコンセントを得ており、プロトコールは、関連する施設内審査委員会によって承認された：ＬＲＲＫ２  ｉＰＳＣに関して、委員会は、テュービンゲン医学部および大学病院（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆａｃｕｌｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｔｕｂｉｎｇｅｎ）倫理委員会（Ethik-Kommission  der  Medizinischen  Fakultat  am  Universitatsklinikum  Tubingen）であり；Ａ５３Ｔ系統に関して、ボストン大学医学部キャンパス（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｍｐｕｓ）のＩＲＢおよび実験対象としてのヒトの使用に関するＭＩＴ委員会（ＭＩＴ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎｓ  ａｓ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔ）であった。
ＬＲＲＫ２突然変異体系統のための、ヒトｉＰＳＣ生成、および中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化
【０３２９】
若干の修正を加えたフロアプレートに基づくプロトコールを使用して、ｉＰＳＣをｍＤＡニューロンに分化させた（Kriksら、２０１１年；Schondorfら、２０１４年）。分化は、０〜１１日目にＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）に、０〜５日目にＳＢ４３１５４２（１０ｍＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に、１〜７日目にＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）、パルモルファミン（２ｍＭ、ＥＭＤ）およびＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に、ならびに３〜１３日目にＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３ｍＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）に曝露することに基づいた。ＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０μＭ  β−メルカプトエタノールを含有するノックアウト血清代替物培地（ＫＳＲ）において、マトリゲル（ＢＤ）上で細胞を１１日間成長させた。分化５日目に開始して、ＫＳＲ培地をＮ２培地に徐々にシフトさせた。１１日目に、培地を、ＣＨＩＲを（１３日目まで）、また、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（トランスフォーミング成長因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）およびＤＡＰＴ（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−Ｇｌｕｔ含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に９日間交換した。１８日目に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して解離し、分化培地（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、ｄｂｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３およびＤＡＰＴ）において、１５μｇ／ｍｌポリオルニチンおよび１μｇ／ｍｌラミニンで予めコーティングされたディッシュに高細胞密度条件下で再度プレーティングした。ＤＩＶ３０に、細胞を収集し、遠心分離後に、さらなる解析を行うまで細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。
α−ｓｙｎ突然変異体系統のためのヒト多能性幹細胞培養
【０３３０】
皮膚生検、ヒト皮膚線維芽細胞培養、ｉＰＳ細胞生成、およびＡ５３Ｔ突然変異（ＷＩＢＲ−ＩＰＳ−Ａ５３Ｔ）を有する患者のための突然変異補正は、以前に記載されている（Cooperら、２００６年；Soldnerら、２０１１年）。この以前の刊行物において、Ａ５３Ｔ  ｉＰＳ系統は、ＷＩＢＲ−ＩＰＳ−ＳＮＣＡＡ５３Ｔと称された。
【０３３１】
本発明者らの多能性幹細胞株は、ｈＥＳ培地［１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５％ノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）および４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］において、マイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に初期に維持された（５％０２、３％Ｃ０２）。手作業により、またはコラゲナーゼＩＶ型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて酵素により、培養物を５〜７日毎に継代した。分化に先立つ５０継代前後で、系統を、成長因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＤＭＥＭ：Ｆ１２において１：３０）で予めコーティングされたプレートに継代し、ｍＴＥＳＲ−１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養し（２１％０２、５％ＣＯ２）、その後、分化まで（継代４０〜９０における）、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１ｍｇ／ｍＬ）を用いて酵素により５〜７日毎に継代した。核型分析のため、細胞株の標準Ｇ−バンド染色体解析を、１０〜２０継代毎に行った（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ）。本発明者らは、２〜４週間毎に本発明者らの培養物のマイコプラズマ陰性状態を確認した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ、Ｌｏｎｚａ）。
初代ラット皮質培養物
【０３３２】
全動物研究は、ＭＩＴ実験動物委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）によって承認された。胎生期１８に麻酔された妊娠したスプラーグドーリーラットの帝王切開によって胚を収集した。２０分間３７℃のＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）消化、およびパスツールピペットによる粉砕（triutration）により、大脳皮質を単離および解離した。ポリオルニチンおよびラミニンコーティングされた９６ウェルプレートに、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５ｍＭグルタミン、２５μＭ  β−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてそれぞれ４×１０４個の細胞を播種した。培地の３分の１を、３〜４日毎に交換した。
方法詳細
酵母−対−ヒト相同性
【０３３３】
酵母およびヒトは、進化的に遠隔の種であるため、酵母タンパク質のヒト相同体を同定するために、本発明者らは、４階層メタ解析パイプラインを開発した。本発明者らのメタ解析は、配列レベルから開始し、そこでは、本発明者らは先ず、酵母およびヒトを越えて同様である遺伝子／タンパク質を同定する。本発明者らは次に、この解析を構造レベルまで拡張し、そこで、本発明者らは、構造的に、よって、より遠隔に、種を越えて同様であるタンパク質を調査する。次に、本発明者らは、ネットワークトポロジーに基づくアプローチを使用することにより、各種内で同様であるタンパク質を同定する。最後に、本発明者らは、アプローチを導入して、配列、構造およびネットワークトポロジーにわたって類似性を統合する。詳細を次に記す：
【０３３４】
１）配列類似性。酵母タンパク質とヒトタンパク質との間の配列類似性をコンピュータ処理するために、本発明者らは、ＢＬＯＳＵＭ６２置換マトリックスによるＮＣＢＩタンパク質ＢＬＡＳＴを使用した（Altschulら、１９９０年；１９９７年）。酵母タンパク質およびヒトタンパク質の全ペアに対して、配列類似性をコンピュータ処理した。本発明者らは、Ｅ−値閾値＝１Ｅ−５を使用して、有意性を決定した。本発明者らは、また、統合的オルソログ予測ウェブサーバーであるＤＩＯＰＴ（ＧＴＥｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１３年；Huら、２０１１年；Reinhardtら、２０１３年；Sodingら、２００５年）を使用して、酵母タンパク質毎にヒトオルソログを予測した。本発明者らは、フィルターをかけた酵母−ヒトタンパク質ペアの全てを、そのＢＬＡＳＴ  Ｅ−値、ビットスコアおよびＤＩＯＰＴスコアと一緒に保存した。
【０３３５】
２）進化的および構造的類似性。酵母およびヒトタンパク質毎に、本発明者らは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを適用して、マルチプル配列アラインメントを構築し、プロファイル隠れマルコフモデルを築いて、リモート進化シグネチャーをコードした。次に、本発明者らは、インプットとしてのプロファイル隠れマルコフモデルおよび二次構造アノテーションによるＨＨｐｒｅｄ（Kriksら、２０１１年；RobinsonおよびOshlack、２０１０年；Schondorfら、２０１４年；Sodingら、２００５年；Voevodskiら、２００９年）を適用して、酵母タンパク質およびヒトタンパク質の全ペアを比較した。配列類似性計算と同様に、本発明者らは、また、Ｅ−値＝１Ｅ−５閾値を使用した。本発明者らは、フィルターをかけた酵母−ヒトタンパク質ペアの全てを、それらのＨＨｐｒｅｄ  Ｅ−値およびビットスコアと共に保存した。
【０３３６】
３）ネットワークトポロジー（拡散成分解析；ＤＣＡ）。本発明者らのネットワークトポロジーアプローチの裏にある中心的な考えは、各ノードが、相互作用の保存されたパターンと共にネットワークにおける相同タンパク質を捕捉する、単一スコアの代わりの低次元ベクトルにより表され得るように、タンパク質レベルで機能的に関連するモジュールの捕捉を試みることである。最終目標（後述する「統合的アプローチ」を参照）は、種を越えてノードベクトルの低次元表現を比較して、他の生物における情報を得ることができるようになることである。しかし、明快なＰａｇｅＲａｎｋ様アプローチ（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１６年；Voevodskiら、２００９年）に従って、各ノードのベクトルをコンピュータ処理する場合、ネットワークノイズにより機能的類似性予測に不正確さが生じるであろう。よって、圧縮がノイズを減少させるという直観を使用して、本発明者らは、洗練された機械学習技法を使用して、ベクトルの次元を削減させる。本発明者らのアプローチは、ノイズを低減させ、機能的類似性等のトポロジカルネットワーク情報をより良く抽出することができることが示された（Bailly-Bechetら、２０１１年；Choら、２０１５年）。このアプローチは最近、Ｍａｓｈｕｐと呼ばれる方法に一般化された（Cho,  H.ら、２０１６年）。
【０３３７】
より公式には、Ａに、遺伝子またはタンパク質をそれぞれ表示するｎ個のノードを有する、（重みを加えた）分子相互作用ネットワークＧ＝（Ｖ；Ｅ）の隣接マトリックスを表示させる。ノードｉからノードｊへの推移の確率を保存する、推移確率マトリックスにおける各項目Ｂｉ，ｊは、
【数１】
2020507314.tif 000162
としてコンピュータ処理される。次に、収束まで、拡散アルゴリズムが、
【数２】
2020507314.tif 000163
として定義され、ここで、ｐは、ネットワーク中のローカルおよびグローバル情報の相対的影響を制御する再開の確率であり；ｅｉは、バイナリベクトルであり、ノードｉそれ自体に対しｅｉ（ｉ）＝１であり、他のノードｊに対してｅｉ（ｊ）＝０である。２個のノードの拡散パターンが、互いに同様である場合、両者が、他のノードに対してネットワーク中の近位の位置にあることを暗示し、これは、機能的類似性を潜在的に示唆する。実際には、この様式で得られる拡散ベクトルには、一部には、その高い次元数、ならびに本来のハイスループットネットワークデータのノイズおよび不完全性のせいで、依然としてノイズがある。ノイズおよび次元削減を目標に、本発明者らは、本来のベクトルよりもはるかに少ない次元を使用するノードの潜在ベクトル表現に基づく多項ロジスティックモデルにより各拡散ベクトルを近づける。特に、本発明者らは、ノードｉの拡散ベクトルにおけるノードｊに割り当てられた確率を：
【数３】
2020507314.tif 000164
（式中、上付き文字Ｔは、ベクトル転位を表示し；ｗｉおよびｘｉは、低次元ベクトルである）としてコンピュータ処理する。各ノードは、２種のベクトル表現、ｗｉおよびｘｉが与えられる。本発明者らは、ｗｉを文脈特色と呼び、ｘｉをノードｉのノード特色と呼び、両者は、ネットワークにおける固有のトポロジカル特性を捕捉する。この多項ロジスティック回帰モデルは、ネットワークにおけるあるノードと他のノードとの間の関連性のモデルに適用され、これは、ネットワークにおける全ノードにわたる別々の分布としてモデリングされ得る。全ノードのためにｗおよびｘベクトルを得るために、本発明者らは、拡散ベクトルｓｉとモデルベクトル
【数４】
2020507314.tif 000165
との間のＫＬ−発散（または相対的エントロピー）を最適化する：
【数５】
2020507314.tif 000166
【０３３８】
分散を最も良く説明するマトリックスデータの内部低次元線形構造を明らかにするＰＣＡと類似して、このアプローチは、ネットワークにおける接続性パターンが最も良く説明され得るように、全遺伝子の低次元ベクトル−空間表現をコンピュータ処理する。網羅的実験は、このような低次元ベクトルｗおよびｘが、ネットワーク内の機能的関連の同定においてより正確であることを示した（Choら、２０１６年；Tuncbagら、２０１３年）。
【０３３９】
４）統合的アプローチ。酵母およびヒト由来のタンパク質を比較するために、本発明者らは、両方のインタラクトームのトポロジーと共にこれらの間の配列／構造的類似性を考慮するために上述のＤＣＡ方法を拡張した。本発明者らは、配列および構造類似性スコアを確率分布に変換し、関連性ベクトルとパラメータ化された多項分布との間のカルバック・ライブラー（ＫＬ）発散を最小化することにより、疎らなベクトル表現のそれを含むノードの全ペアの特色ベクトルを一緒にコンピュータ処理した。
【０３４０】
そこで、公式には、本発明者らは、２種のインタラクトーム、酵母のＧＹおよびヒトのＧＨを有する。インタラクトーム内のトポロジカル類似性を捕捉するために、本発明者らは、ＧＹおよびＧＨにおいて別々に、記載された拡散アルゴリズムを行い、次いで、酵母タンパク質ｉの拡散ベクトル
【数６】
2020507314.tif 000167
およびヒトタンパク質ｊの拡散ベクトル
【数７】
2020507314.tif 000168
を得る。単一のネットワークにおけるＤＣＡと同様に、本発明者らは、また、酵母タンパク質毎にベクトル
【数８】
2020507314.tif 000169
を、ヒトタンパク質毎にベクトル
【数９】
2020507314.tif 000170
を割り当てる。明らかな相同体間の配列／構造的類似性に対し、本発明者らは、各酵母タンパク質ｉとそのヒト相同体ｊとの間のＢＬＡＳＴビットスコアを、
【数１０】
2020507314.tif 000171
として確率分布へと正規化する。同様に、本発明者らは、また、各ヒトタンパク質ｊとその酵母相同体ｉとの間のＢＬＡＳＴビットスコアを、
【数１１】
2020507314.tif 000172
として確率分布へと正規化する。本発明者らは同様に、ＨＨｐｒｅｄビットスコアのために
【数１２】
2020507314.tif 000173
として、ＤＩＯＰＴスコアのために
【数１３】
2020507314.tif 000174
として同じ正規化を行う。各酵母タンパク質ｉとヒトタンパク質ｊとの間で、本発明者らは：
【数１４】
2020507314.tif 000175
として、多項ロジスティックモデルにより各正規化ビットスコア分布ベクトルを近づける。
【０３４１】
同じ分子ネットワークにおける遺伝子のための
【数１５】
2020507314.tif 000176
の定義と同様に、
【数１６】
2020507314.tif 000177
は、酵母遺伝子とヒト遺伝子との間の相同類似性を捕捉する。このような仕方で、異なるネットワーク中であっても、酵母およびヒト遺伝子は、同じベクトル空間において表される。
【０３４２】
最後に、本発明者らは、拡張ＤＣＡ目的関数を：
【数１７】
2020507314.tif 000178
（式中、αＢｌａｓｔ、αＨＨｐｒｅｄおよびαＤｉｏｐｔは、各類似性成分の重要性を整調するためのパラメータである）として最適化する。重要なことに、これらのベクトルを最適化することにより、本発明者らは、比較目的のため、分子ネットワーク接続性および配列類似性情報の両方を、同じベクトル空間へと統合する。
【０３４３】
そこで、本発明者らは、欲張りな方法を使用して、これらのパラメータを選択した。特に、本発明者らは、各項を増分的に加え、予測される酵母−ヒト相同性ペアの間の機能的一致に従って、項に対する最適または合理的な重みを見い出した。パラメータ選択手順の詳細は、後述する「パラメータ整調」セクションに見い出すことができる。その中に含まれる解析に基づいて、本発明者らは、αＢｌａｓｔ＝１０、αＨＨｐｒｅｄ＝５およびαＤｉｏｐｔ＝５を選択した。最後に、本発明者らは、酵母タンパク質ｉとヒトタンパク質との間の統合された相同関連
【数１８】
2020507314.tif 000179
をコンピュータ処理した。
【０３４４】
有意な相同性ペアを見い出すために、本発明者らは、全酵母−ヒトタンパク質ペアのためにｐｉｊをコンピュータ処理し、経験的バックグラウンド分布を構築した。本発明者らは、経験的ｐ値カットオフとして０．０００５を使用して、酵母タンパク質の推定ヒト相同体を予測し、ｐｉｊ＜０．５ｍａｘｋ｛ｐｉｋ｝の場合に相同体ｊを除去した。バックグラウンド分布は、ヒトおよび酵母遺伝子をランダムにペア形成することによって生成される。このカットオフを利用すると、４９２３種の酵母タンパク質と予測されるヒト相同体が存在し、ＢＬＡＳＴ（４０２３種の酵母タンパク質）およびＨＨｐｒｅｄ（４３１２種の酵母タンパク質）のカバレッジを大幅に改善した（図８Ａ）。
インタラクトームの前処理
【０３４５】
本発明者らは、ＳＴＲＩＮＧ  ｖ９．１（string-db.org）から酵母およびヒトインタラクトームの両方をダウンロードした。ＳＴＲＩＮＧにおいて、ｑｉｊは、インタラクトームにおけるエッジ毎に割り当てられた信頼値である。本発明者らは、「ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ」および「ｄａｔａｂａｓｅ」チャネルのみによる
【数１９】
2020507314.tif 000180
が含まれるように、予測される相互作用を除去し、相互作用ペア毎に信頼度を再度較正した。本発明者らは、また、低い信頼度のｑｉｊ＜０．２を有する相互作用ペアを除去した。前処理後に、本発明者らは、３７２０２６種の相互作用および６１６４種のタンパク質を有する酵母インタラクトーム、ならびに６４３８２２種の相互作用および１５３１７種のタンパク質を有するヒトインタラクトームを得た。
【０３４６】
ヒトネットワークのため、本発明者らは、また、２セットの最近発表された高品質バイナリヒトインタラクトームデータセット（７種の公共リポジトリから抽出された高品質の再度精選されたバイナリ相互作用由来の１１０４５種；および最近の酵母２ハイブリッド実験データセット由来の１３９４４種）を含めた（Geethaら、１９９９年；Huら、２０１１年；Rollandら、２０１４年）。これらの相互作用は、重みを加えられていなかったため、本発明者らは、これらのための信頼スコアを割り当てることを必要とした。優れた信頼値を推定するために、本発明者らは、ＢＩＯＧＲＩＤデータベース（ｖ３．２．１１６）から物理的バイナリ相互作用を全て抽出し、これらの相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの統計学をコンピュータ処理した。ＢＩＯＧＲＩＤ由来の相互作用は、大部分はハイスループット実験に由来し、バイナリであるため、本発明者らは、平均または中央値統計学を使用して、新たなバイナリ相互作用のための信頼スコアを割り当てた。ＢＩＯＧＲＩＤ相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの分位統計学は、２５％：０．３９１、５０％：０．６２０および７５％：０．７１７であった。ＢＩＯＧＲＩＤ相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの平均値は、０．５８８であった。よって、本発明者らは、これらのデータセットにおける各重みを加えられていないバイナリ相互作用に０．６信頼スコアを割り当てることが合理的であると考慮した。
【０３４７】
本発明者らは、本研究において神経変性タンパク質症をモデリングしていたため、脳特異的となるようにヒトインタラクトームをさらに剪定した。これを為すために、本発明者らは、脳において認識できるほど発現される遺伝子のみを含むように、ＧＴＥＸ遺伝子発現データセットを採用した（ＧＴＥｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１３年；Huら、２０１１年；Sodingら、２００５年）。特に、本発明者らは、ＲＰＫＭ方法によって３５７種のＧＴＥＸ脳ＲＮＡ−ｓｅｑデータセットを正規化した（RobinsonおよびOshlack、２０１０年；Sodingら、２００５年；Voevodskiら、２００９年）。次に、本発明者らは、（３５７種のＲＮＡ−ｓｅｑデータセットのうち少なくとも１種において）より大きい正規化脳発現レベルを有するタンパク質のみが含まれるように、本発明者らのヒトインタラクトームにフィルターをかけた。最終的に、本発明者らの脳特異的インタラクトームは、３６９６３４種の相互作用および１０３６５種のタンパク質を含有した。
酵母−対−酵母エッジによるヒトインタラクトームの増大（ヒト化ネットワークのみのため）
【０３４８】
遺伝的相互作用は、ヒトインタラクトームにおいて疎らであるため、本発明者らは、酵母インタラクトームからエッジを移動することにより、推論される相同性を使用してヒトインタラクトームを増大させた。これをなすために、本発明者らは、統合された相同関連ｐｉｊおよびｐｋｌが、ｐｉｊ＊ｐｋｌ＞０．２を満たすように、酵母タンパク質ｉおよびｌのペアが存在する場合、ヒトタンパク質ｊとｋとの間にエッジを加えた（上述の定義を参照）。この閾値は、増大された脳インタラクトームの作製が、酵母インタラクトームの密度（約０．０１９）と同様の密度（約０．０１８）を達成するように選択され、７５１２８２種の相互作用ペアが移動される。
賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森アルゴリズム
【０３４９】
本発明者らは、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）構築を使用して、酵母ネットワークおよび上述の増大されたヒト−酵母ネットワークを解析した（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１３年；２０１６年；Voevodskiら、２００９年）。ノード（遺伝子）セットＶおよびエッジ（相互作用）セットＥのネットワークＧ（Ｖ，Ｅ，ｃ，ｐ）（ここで、ｐ（ν）≧０は、各ノードν∈Ｖに賞金を割り当て、ｃ（ｅ）≧０は、各エッジｅ∈Ｅにコストを割り当てる）について、ＰＣＳＦの目標は、次の費用関数：
【数２０】
2020507314.tif 000181
（式中、κは、森Ｆにおける接続された成分または木の数であり；βは、ノード賞金とエッジコストとの間のトレードオフを定量化するパラメータであり；ｄ（ν）は、ノードνの次数であり；μは、ネットワークにおける多数の隣接を有するハブノードにペナルティーを科すためのパラメータである）を最小化するための木Ｆ（ＶＦ，ＥＦ）のセットを見い出すことである。このような仕方で、アルゴリズムは、実験データを連結する相対的に高い信頼性のエッジのネットワークを検索する。
【０３５０】
目的関数ｆ（Ｆ）を最適化するために、本発明者らは、コストωでエッジ（ν，ν０）によって各ノードｖ∈Ｖに接続されたネットワークに、追加のルートノードν０を導入した。このステップは、ＰＣＳＦ問題を賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ木問題（ＰＣＳＴ）に転換し、これは、以前に発表されたメッセージ伝達アルゴリズムによって解決することができる（Bailly-Bechetら、２０１１年；Choら、２０１５年）。木の解が得られた後に、本発明者らは、木の解からノードν０およびこれを指す全エッジを除去し、森の解を得た。森の解が、本来のＰＣＳＦに最適である場合にかつその場合に限り、木の解が、上述のＰＣＳＴに最適であることを示すことは困難ではない。メッセージ伝達アルゴリズムは、最適解を見い出すことは保証されないが、実際に非常によく機能し（Choら、２０１５年；Tuncbagら、２０１３年）、より重要なことに、酵母およびヒトインタラクトーム等の大型ネットワークを取り扱うことができない線形計画法のアプローチよりも相当に速い。
【０３５１】
ＰＣＳＦのコンピュータ処理による困難は、パラメータβ、ωおよびμを整調する仕方である。βは、ノードの賞金値のスケールを制御するため、本発明者らは、本発明者らの実験における本発明者らのスクリーン由来の各遺伝子に一定の賞金値（１００）を割り当てた。いずれかのパラメータの撹乱は、ネットワーク構造のトポロジーを潜在的に変化させ得、パラメータの選択を決定的なものとする（Altschulら、１９９７年；１９９０年；Ashburnerら、２０００年；Tuncbagら、２０１３年）。よって、単一セットのパラメータを選択する代わりに、本発明者らは、複数の合理的パラメータ設定からコンセンサスネットワークを得るためのアンサンブルアプローチを開発した。
【０３５２】
パラメータの範囲を決断するために、本発明者らは、次のように上界および下界を設定した：ＰＣＳＦのネットワーク解が、十分な数の予測されるタンパク質（これは、インプット賞金遺伝子の数の半分である）を含有した；ネットワーク解は、インプットネットワークにおける１０００個を超える隣接を有するハブノードを導入しなかった。本発明者らは、グリッドへとパラメータの範囲を離散化させ、ＰＣＳＦ実行のためのあらゆる可能なパラメータ組合せを列挙した。酵母ネットワークのため、βの範囲は｛１，２，４，６，８，１０，１２｝であり；ωの範囲は｛１，２，３，４，５，６，７，８｝であり；μの範囲は｛０．００１，０．００３｝であった。ヒト化ネットワークのため、βの範囲は｛４，６，８，１０，１２，１４，１６｝であり；ωの範囲は｛３，４，５，６，７，８，９，１０｝であり；μの範囲は｛０．００３，０．００５｝であった。本発明者らは、また、ＰＣＳＦプログラムにおけるデフォルトガウスノイズ設定を使用して、ＰＣＳＦ実行のためのエッジノイズをインジェクトして頑健性を検査した。各ＰＣＳＦパラメータ設定の解を得た後に、本発明者らは、全ての解のアンサンブルに現れる各可能なエッジの頻度をコンピュータ処理した。エッジの頻度は、異なるパラメータ設定を越えたエッジの頑健性の代替である。最後に、本発明者らは、インプットとして、全ての解のアンサンブルにおけるエッジおよびその頻度を採用し、最大全域木アルゴリズムを適用して、最も頑健な代表的ネットワークを見い出した。
【０３５３】
解における選択されたノードの有意性を評価するために、本発明者らは、インプットとして同数の酵母遺伝子のランダム選択を使用して同じＰＣＳＦおよびアンサンブルプロセスをシミュレートすることにより、各ノードにバックグラウンド分布を構築した。本発明者らは、賞金ノードリストのものと同一の次数分布を有するランダム遺伝子セットを使用して、バックグラウンド分布をコンピュータ処理した。特に、本発明者らは、それぞれ次数［１〜５］、［５〜１０］、［１０〜１００］および［＞１００］を有する遺伝子をそれぞれ含有する４種のカテゴリーへと、全酵母遺伝子をビニングした。次に、次数分布の統計学が、賞金ノードリストのものと同一となるように、ランダム遺伝子セットは、これらのカテゴリーからの置き換えなしでサンプリングされる。次に、本発明者らは、ＰＣＳＦを行い、１０００種のランダムセットから森の１００００種のランダムアンサンブルを生成して、バックグラウンドにおける各ノードの経験的分布をコンピュータ処理した。
【０３５４】
異なるタンパク質症に関する森の重複の有意性を評価するために（図１Ｄ）、本発明者らは、また、バックグラウンド分布としてこれらのランダムセットのペアワイズおよびトリプルワイズ交差を計算した。例えば、本発明者らは、α−ｓｙｎのために生成されたランダムアンサンブルと、ｔｄｐ−４３のためのランダムアンサンブルとをランダムにペア形成させ、その重複のサイズの分布をコンピュータ処理した。このような仕方で、本発明者らは、バックグラウンド分布を構築して、ネットワークのサイズ増加に単純に起因する比較される重複の有意性を評価した。経験的ｐ値もコンピュータ処理される。本発明者らの以前の結果と同様に、ペアワイズ重複は全て統計的に有意であった（ｐ＜＝０．００２）。トリプルワイズ交差のため、ｐ値は、さらにより有意であった（ｐ＜＝０．００１）。
酵母およびヒト化Ｓｔｅｉｎｅｒネットワークのためのノードおよびエッジセットアップ
【０３５５】
パラメータ化（上に記す）の差は別として、酵母ネットワークと「ヒト化」ネットワークとの間にはいくつかの重要な差が存在した。
【０３５６】
酵母ネットワークのため（図２）、「賞金ノード」は、酵母遺伝的スクリーン由来の修飾因子ヒットであった。懸賞されたノードのそれぞれは、任意賞金値として「１００」を割り当てられた。酵母ネットワークのためのエッジは、ＳＴＲＩＮＧ実験的およびデータベースエッジに由来した。上に記載されている通り、各エッジは、重みｑｉｊを割り当てられた。
【０３５７】
ヒト化ネットワークのため（図３および図４）、「賞金ノード」は、酵母遺伝的スクリーン由来の修飾因子ヒットとして同様に定義された。酵母−対−ヒトエッジは、酵母タンパク質とそれらのヒト相同体との間の相同性の強度によって重みを加えた（上述のｐｉｊ）。ヒト化ネットワークにおいて、これらは、赤色の三角形（スクリーン由来のヒットである）と青色の丸（ヒト相同体）との間に見られる一次連結である。酵母修飾因子の明らかなヒト相同体の１種が、公知パーキンソニズムまたは神経変性遺伝子（例えば、ＰＡＲＫ遺伝子座の遺伝子）であった場合、他の潜在的相同体よりも当該ノードの包含を好むように、０．５の任意報酬がｐｉｊに加えられた。最後に、ヒト化ネットワークにおけるヒトタンパク質間のエッジは、ＳＴＲＩＮＧに由来したが、上の「インタラクトームの前処理」および「酵母−対−酵母エッジによるヒトインタラクトームの増大」に記載されている通り、他のソースにも由来した。
コンピュータ処理によるパイプラインのためのパラメータ整調
【０３５８】
そこで、本発明者らは、本発明者らの論文において使用されるパラメータのための解析およびガイドラインを提供する。
【０３５９】
ＤＣＡ相同性ツールにおけるＢＬＡＳＴ、ＨＨｐｒｅｄおよびＤｉｏｐｔのための重み。
【０３６０】
あらゆる可能な組合せを列挙せずに最適なパラメータを選択することは不可能であるため、本発明者らは、拡張ＤＣＡ目的関数のパラメータ選択のための欲張りな解析を行った。特に、本発明者らは、各項を増分的に加え、項に最適または合理的な重みを見い出した。
【０３６１】
ＢＬＡＳＴは、配列相同性検出のための最も高感度な方法であるため、本発明者らは先ず、ＢＬＡＳＴのための合理的パラメータ区間を調査した。本発明者らは、拡張ＤＣＡ目的関数における２種のネットワークトポロジー項およびＢＬＡＳＴ項のみを保持し、｛１，２，５，１０，２０，１００｝のセットからアルファ＿ＢＬＡＳＴを列挙した。性能を評価するために、本発明者らは、方法セクションに概要を述べる通り、本発明者らの方法によって予測される上位５種の相同体の遺伝子オントロジー（ＧＯ）の平均精度をコンピュータ処理した。補足図２Ａにおいて、ＢＬＡＳＴ重みが、小さ過ぎる場合（＜１０）、本発明者らの方法が、ＢＬＡＳＴ由来の相同性情報を十分に活用できなかったことが容易に分かる。この重みが、１０を超えるまたはこれに等しかった場合、予測性能は、飽和されるようになって、本来のＢＬＡＳＴ方法よりも僅かな性能改善のみがもたらされた。重みが、大きくなり過ぎた場合（＝１００）、予測性能は降下し、ＢＬＡＳＴのものと同一であった。それは、ネットワークトポロジーの効果が縮小され、本発明者らの方法が、ＢＬＡＳＴの結果を単純に再構築したためである。よって、可能な値のより大型でより精緻化されたセットを列挙することにより、追加のコンピュータ処理によるコストにおけるより優れた選択が存在する可能性があるが、解析に基づいて、本発明者らは、ＢＬＡＳＴパラメータを１０に単純に固定した。
【０３６２】
本発明者らは、ＢＬＡＳＴ重みを固定した後に、ＨＨｐｒｅｄ項を加え、ＨＨｐｒｅｄ重みに対して同じ解析を行った。性能曲線（補足図２Ｂ）から、本発明者らは、最適ＨＨｐｒｅｄ重みが、５前後であることを観察した。おそらく、少なくとも一部には、ＢＬＡＳＴが、最も関連性がある相同性情報を既に捕捉している一方、ＨＨｐｒｅｄの結果は、追加の遠く離れた配列および構造的相同体を含むことによりＢＬＡＳＴを拡張するため、この重みは、ＢＬＡＳＴ重みよりも小さい。
【０３６３】
最後に、本発明者らは、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄ重みの両方を固定し、Ｄｉｏｐｔ重みの解析を行った（図７Ｃ）。Ｄｉｏｐｔに関して、重みが大き過ぎない限り（＜２０）、性能差は非常に小さかった。これは、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄの両方によって見逃されるいくつかの追加的な配列相同体のみを提供する、Ｄｉｏｐｔデータベースと一貫した。分かり易くするために、本発明者らは、同様に５に等しいその重みを加えることを選択した。
ＤＣＡ相同性ツールにおけるＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄのための有意性閾値
【０３６４】
本発明者らは、配列相同性または構造予測に典型的に使用される合理的にストリンジェントな閾値であることから、１Ｅ−５を選択した（Geethaら、１９９９年）。閾値の他の選択も可能であるが、本発明者らは、結果が、本発明者らの設定と認識できるほどには異ならないと考える。次のウェブサイトおよび論文は、１Ｅ−５が、タンパク質ＢＬＡＳＴのための合理的にストリンジェントカットオフであることを示す。
公知パーキンソン遺伝子の相同体に対する報酬
【０３６５】
本発明者らが、公知パーキンソン遺伝子の相同体に対する報酬値を加えた主要な理由は、賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森（ＰＣＳＦ）アルゴリズムが、最終ネットワークにおける全賞金ノードを含むことを保証されないからである。加えて、本発明者らの相同性ツールは、時折、一方には公知文献の支持があり他方にはない、２種の相同体に同様スコアを割り当てることがある。ＰＣＳＦアルゴリズムそれ自体は、接続性を考慮することにより大部分の正確な相同体を区別することができるが、本発明者らは、周知相同体に報酬を与えることにより、ノイズがさらに低減され得ることを見い出した。本発明者らのスクリーン由来の周知パーキンソン遺伝子の現存する相同体が、最終ネットワークに含まれるように、報酬パラメータ０．５が選択される。より大きい報酬値が、同様の効果も有し得ることが明らかであるが、本発明者らは、本発明者らのパイプラインにおけるこの報酬ヒューリスティックの効果を過剰に整調しないことを望んだため、このような選択を調査しなかった。
現存するインタラクトームのための信頼閾値および予測される連結
【０３６６】
ＳＴＲＩＮＧのための信頼閾値の選択は、実際に、偽陽性と真陽性との間のトレードオフである。ストリンジェントな閾値、例えば、０．８は、偽陽性の数を低減させることができるが、トランケートされた酵母およびヒトインタラクトームは、疎らで接続切断され過ぎているように思われた。このような閾値は、シグナル伝達経路または他の十分に研究され局在化された生物学的経路に対して良好に機能することができるが、本発明者らは、これが、機構の理解が不十分であり（また、「より幅広の網」を打つことがより適切であると思われる）、一見異質な疾患関連性遺伝子間の接続が十分に理解されていない、複雑なタンパク質症に適切なアプローチであるとは思わなかった。よって、本発明者らは、０．２を選択して、非常に低い信頼度の相互作用のみを除外し、依然として、インタラクトームの主要な接続性を維持した。
新たなハイスループットバイナリインタラクトームのための信頼スコア
【０３６７】
新たなハイスループットバイナリインタラクトームは、重みを加えられていないため、本発明者らは、適切なスコアを割り当てて、ＳＴＲＩＮＧ相互作用によりこれらを統合することを必要とする。適切な信頼値を推定するために、本発明者らは、一番最近のＢＩＯＧＲＩＤデータベースから全物理的バイナリ相互作用を抽出し、このような相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの統計学をコンピュータ処理した。ＢＩＯＧＲＩＤ由来の相互作用は、大部分はハイスループット実験に由来し、バイナリであるため、本発明者らは、平均または中央値統計学を使用して、新たなバイナリ相互作用のための信頼スコアを割り当てることができる。ＢＩＯＧＲＩＤ相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの分位統計学は、２５％：０．３９１、５０％：０．６２０および７５％：０．７１７である。ＢＩＯＧＲＩＤ相互作用のＳＴＲＩＮＧ信頼スコアの平均値は、０．５８８である。よって、本発明者らは、中央値および平均の統計学の両方に緊密に関連することから、０．６を割り当て、これを、現存するＳＴＲＩＮＧデータベースへと新たなハイスループットバイナリ相互作用を組み込むために合理的な割り当てと判断する。
賞金収集Ｓｔｅｉｎｅｒ森アルゴリズム（ＰＣＳＦ）のためのパラメータ
【０３６８】
上に記す通り、本発明者らは、アンサンブルアプローチを使用して、パラメータ選択の問題を回避した。ＰＣＳＦのためのパラメータのセットの有効性を決定するための明らかな仕方はない。さらに、いくつかのパラメータが存在するため、あらゆる組合せの列挙は、コンピュータ処理により実行不可能となる。この課題に取り組むために、上に記す通り、本発明者らは、広範囲の可能なパラメータを選択し、あらゆるパラメータ組合せによりＰＣＳＦを実行し、各パラメータ組合せから生成された単一のネットワークからアンサンブルネットワークを作製した。最終ネットワークが、ネットワークにおける８０％賞金ノードを接続することができるように、これらのパラメータは選択される。本発明者らのパラメータ範囲は、ユビキチンのような「欲張りな」過剰接続されたハブによって過度に歪められたネットワークも除外する。本発明者らの方法セクションに記す通り、本発明者らは、エッジ分布にノイズをインジェクトすることにより、頑健性をさらに検査した。いずれかのパラメータ化されたモデルと同様に、ここに主観性のエレメントが存在することに疑いの余地はないが、本発明者らは、おそらく可能となり得ると感じるのと同じくらい幅広さの苦痛を大いに受けた。最終的に、目的は、批判に耐え得る仮説を生成すること、または生物学的に有意義な相互作用を予測することである。
スポット形成アッセイ
【０３６９】
アミノ酸（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および２％糖を補充した、０．６７％アミノ酸不含酵母窒素塩基（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からなる合成培地において酵母を培養した。大部分の実験のため、細胞を先ず、グルコースを含有する合成培地において対数期中期まで成長させ、次いで２％ラフィノースを含有する合成培地において一晩再度培養した。次に、対数期中期の細胞を、ガラクトースを含有する合成培地において希釈した。典型的に、細胞を３０℃で６時間誘導した。
【０３７０】
出発ＯＤ６００＝１．０となるよう各株を希釈し、５倍連続希釈し、次いでガラクトースを含有する寒天プレート（誘導）またはグルコース（対照）プレート上にスポットした。
ΔＰＡＲＫ１７／α−ｓｙｎおよびΔＰＡＲＫ９／α−ｓｙｎ株における公知α−ｓｙｎ修飾因子に対するスクリーニング
【０３７１】
標準酢酸リチウム形質転換プロトコールを、９６ウェルプレートによる使用に適応させた（Cooperら、２００６年；D.  Gietzら、１９９２年；R.  D.  Gietzら、１９９５年）。形質転換後に、所望のプラスミドで形質転換した酵母の選択のためのウラシルを欠きラフィノースを有する合成培地において、飽和するまで細胞を成長させた。飽和したら、グルコースまたはガラクトースのいずれかを有する合成培地プレート上に細胞をスポットした。２日間成長させた後に、ガラクトースおよびグルコースプレートの写真を撮り、目視で解析した。平行した実験において、形質転換された酵母を、３８４ウェルプレートにおいて、３５μＬのガラクトース培地においてＯＤ６００＝０．０１となるよう再度希釈した。１８、２４および４８時間成長させた後にＯＤ６００を測定することにより（Ｔｅｃａｎ  ｓａｆｉｒｅ２）、３８４プレートにおける成長をモニターし、定量化可能な成長尺度を得た。
小分子（ＮＡＢ２）処理
【０３７２】
対照、ＴＤＰ−４３またはα−ｓｙｎ酵母株を、ラフィノースを含有する完全合成培地（非誘導）において対数期（ＯＤ６００約０．５）まで成長させた。次に、０．０１（ＴＤＰ−４３実験）および０．０２５（α−ｓｙｎ実験）のＯＤ６００となるよう、２％ガラクトースを含有する完全合成培地において培養物を希釈して、毒性タンパク質の発現を誘導した。ＮＡＢ処理のため、１０μＭ（α−ｓｙｎのため）または２０μＭ（ＴＤＰ−４３のため）を培養物に添加し、断続的に振盪しつつ３０℃で２日間、バイオスクリーン機器内でインキュベートした。
プールα−ｓｙｎ過剰発現スクリーン
【０３７３】
ＹＦＰ対照株およびα−ｓｙｎ株においてプール遺伝的スクリーンを実行した。大部分の酵母オープンリーディングフレームを表す酵母ＦＬＥＸ遺伝子ライブラリー（Huら、２００７年）を、アレイ化細菌ライブラリーストックからプールし、深９６ウェルプレートにおいて飽和するまで３７℃で成長させた。培養物をプールし、Ｑｉａｇｅｎマキシプレップキットを使用してプラスミドを単離した。次に、プールＦＬＥＸ遺伝子ライブラリーを、対照ＹＦＰまたはα−ｓｙｎ発現酵母株のいずれかにまとめて形質転換し、プラスミド選択のためのウラシルを欠く５枚の四角１５ｃｍ固体寒天プレート上で選択した。約６，０００種の酵母遺伝子のおよそ２００倍カバレッジを表す、およそ１０６ＣＦＵを得た。各プレートからコロニーを濯いで、プールし、２０％グリセロールに入れ、個々の使用チューブに等分し（約１００μＬ）、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で貯蔵した。
【０３７４】
次の通りにプールスクリーンを実行した。プール酵母ライブラリーのアリコートを氷上で解凍し、３×３０ｍＬフラスコにおいて３種の異なる濃度にＳＲａｆＵｒａで希釈した（約０．０２５、０．０５および０．１）。３０℃で一晩振盪した後に、０．４〜０．８の間のＯＤ６００を有する培養物を選択して、プールスクリーンを始めた。次に、ＳＧａｌ  Ｕｒａにおいて０．１のＯＤ６００となるよう培養物を希釈して、ＹＦＰまたはα−ｓｙｎのいずれかの発現を誘導した。ゼロ時として５０  ＯＤ単位を維持し、遠心分離し、水で洗浄し、凍結した。次に、必要に応じて適切な希釈を行いつつ、培養物を対数期成長に２４時間維持して、０．８より下にＯＤ６００を維持した。この時点の後に、培養に値する５０  ＯＤ単位を遠心分離し、水で洗浄し、ペレットを凍結した。
【０３７５】
次に、次の適応によりＱｉａｇｅｎミニプレップを使用して、酵母からプラスミドを単離した。５０  ＯＤ単位当たり５回のミニプレップを行った。細胞ペレットを緩衝液に再懸濁し、小型の酸洗浄されたビーズを用いたビーズビート法によって溶解した。ビーズを除去し、次いで、従来のミニプレッププロトコールにより溶解物を採取した。次に、５回のプレップ由来の精製されたプラスミドをプールした。次に、ＦＬＥＸ遺伝子プラスミドに含有される酵母ＯＲＦを、ＯＲＦを挟むａｔｔＲ  Ｇａｔｅｗａｙ配列にアニールするＰＣＲプライマーを使用して増幅した。ＨｉＦｉｄｅｌｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑを増幅に使用した。５０ｕＬ反応当たり５ｕＬ  ＤＮＡを使用し、試料当たり４回の反応を実施した。約６’の伸長時間による３０＋サイクルを使用して、より長いＯＲＦの増幅を確実にした。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲカラムを使用してＰＣＲ産物を精製した。次に、２マイクログラムのＰＣＲ産物を超音波処理し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｅｌｕｔｅ  ＰＣＲカラムにおいて精製し、ＯＤ２６０を再度解析した。次に、この産物をライブラリー生成のためのインプットとして使用し、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｅにより配列決定した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォームを使用して、およそ１億２千万種の４０ｂｐ単一末端リードを配列決定した。
【０３７６】
リードを、ボウタイにより酵母ＯＲＦ配列にマッピングした（Langmeadら、２００９年）。本発明者らは、Ｈｕら（Huら、２００７年）において報告された酵母ＯＲＦ、プラス、ＳＧＤに存在したが、Ｈｕらにおける記載由来の配列のリストに含まれていない９０３種のＯＲＦのＤＮＡ配列によりボウタイ指標を作製した。シードにおける２個のミスマッチ（−ｎ  ２）を許容し、シード長さを４０（−ｌ  ４０）とし、２個以上の場所にマッピングする全アラインメントを抑制し（−ｍ  １）、「−−ｂｅｓｔ」および「−−ｓｔｒａｔａ」を使用して、リードをマッピングした。マッピングされないリードをｆａｓｔｘ＿ｔｒｉｍｍｅｒ（hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/commandline.htmlにおけるワールドワイドウェブ上）によりトリミングして、最初の２０ｎｔを除去し、次のパラメータを使用してボウタイにより再度マッピングした：「−ｎ  ０  −ｌ  ２０  −−ｂｅｓｔ    −−ｓｔｒａｔａ      −ｍ  １」。アウトプットｓａｍファイルを構文解析して、各ＯＲＦにマッピングするリードの数を得た。ＲパッケージＮｏｉｓｅｑにより差次的発現解析を行った（Tarazonaら、２０１１年）。ＮＯＩＳｅｑは、カウントデータから差次的に発現される遺伝子を同定するためのノンパラメトリック方法である。ＮＯＩＳｅｑは、差次的発現の倍数変化値および確率を計算する。各遺伝子の差次的発現の確率（Ｐ−ｖａｌ）は、表セット内の全遺伝子の倍数変化差（Ｍ）−絶対的発現差（Ｄ）値の接合分布に由来する。
【０３７７】
（Ａ）どちらの実験も＞０．５のＰ−ｖａｌに関連しない場合を除いて、２種のプールα−ｓｙｎスクリーンにおいて一貫して上方または下方である（両方のスクリーンにおいて｜ｌｏｇ２倍数変化｜＞０．８）；（Ｂ）＞２．５の絶対値による平均倍数変化を有する（Ｐ−ｖａｌに関係なく）；（Ｃ）当該ソースと一貫したプールスクリーンにおいて倍数変化を有する、以前の実験法由来の公知修飾因子である場合、遺伝子は、検証のために選択した。ｇａｌ誘導性導入遺伝子の発現を変更することが期待されるであろうガラクトース代謝に関連する遺伝子のみならず、ＹＦＰ対照において｜ｌｏｇ２倍数変化｜＞１．０を有するいずれかの遺伝子（推定サプレッサーまたはエンハンサーと同じ方向で）も除外した。アレイ化α−ｓｙｎ過剰発現スクリーンヒットの本発明者らの以前の大規模特徴付けから得られる知識によって、閾値はガイドされた（図１を参照）。別の言い方をすれば、本発明者らの以前の過剰発現スクリーンを「絶対的基準」として使用して、プール過剰発現データを解析した。
プールスクリーンＱＰＣＲ立証
【０３７８】
プールスクリーン（「プールα−ｓｙｎ過剰発現スクリーン」方法）から生成された形質転換細胞を氷上で解凍し、生じたＯＤがおよそ０．０３、０．０５および０．１になるようＳＲａｆ−Ｕｒａにおいて希釈した。培養物を３０℃で一晩成長させ、０．４〜０．８のＯＤを有する培養物を誘導のために選択した。これらの培養物を、ＳＧａｌ−Ｕｒａにおいて０．１のＯＤになるよう希釈した。ゼロ時の時点を表す５０  ＯＤ単位をストックした。誘導された培養物を２４時間成長させ、２４時間の時点を表す５０  ＯＤ単位をストックした。Ｑｉａｇｅｎミニプレップキット（２７１０６）を使用してプラスミドを単離し、５種の試料において各時点に５０ＯＤ単位を分割した。Ｐ１緩衝液における細胞再懸濁後に、酸洗浄されたビーズを使用したビーズビート法によって細胞を溶解した。ビーズビート法の後に、試料からビーズを除去し、溶解物を標準ミニプレップキットプロトコールに付した。生じたプラスミドをプールし、ＱＰＣＲ解析に使用した。標準ａｔｔＦプライマーを、ＱＰＣＲ解析のためにｏｒｆ特異的リバースプライマー（産物＜１５０ｂｐのサイズとなるようにプライマー３によって生成された配列）と組み合わせて使用した。試料の正規化に使用された複数の陰性対照、および陽性対照を、全ＱＰＣＲプレートにおいて実行した。ＳＹＢＲ  緑色蛍光検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（７９００ＨＴ）において、生物学的３回複製の技術的３回複製を使用してＱＰＣＲ解析を実施した。増幅のためのプログラムは、４０サイクルの９５℃１５秒間および６０℃１分間を含んだ。
プールスクリーン成長曲線解析
【０３７９】
Ｆｌｅｘ遺伝子過剰発現ライブラリーを使用して、個々の推定修飾因子のそれぞれをα−ｓｙｎ株において過剰発現させた。３種の独立したＵｒａ＋形質転換体をＳＲａｆ−Ｕｒａにおいて３０℃で一晩成長させた。培養物をＳＲａｆ−Ｕｒａにおいて継代培養し、０．４〜０．８のＯＤにおいて、誘導のためにＳｇａｌ−Ｕｒａにおいて希釈した。各単離株を３回複製してセットアップし、成長を１５分毎におよそ６０時間モニターした。
ゲノムワイド欠失スクリーン（合成遺伝子アレイ方法論）
【０３８０】
使用される方法は、基本的に以前に記載された通りであった（Baryshnikovaら、２０１０年；TongおよびBoone、２００６年）。簡潔に説明すると、欠失株を、ＹＰＤ＋Ｇ４１８プレートにピニングした。クエリー株（α−ｓｙｎおよび野生型対照）をＹＰＤにおける５ｍｌ一晩培養物において３０℃で成長させ、ＹＰＤプレート上に延展し、一晩成長させた。ＹＰＤ上に一緒にピニングすることにより、欠失株を各クエリー株に交配し、４８時間３０℃で成長させた。生じた二倍体をＳＤ／ＭＳＧ−Ｕｒａ＋Ｇ４１８にピニングし、２日間３０℃で成長させた。細胞を、胞子形成培地プレートにピニングし、２３℃で７日間インキュベートした。胞子をＳＤ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ＋カナバニン＋チアリシンにピニングし、２日間３０℃で成長させた。細胞を、新鮮ＳＤ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ＋カナバニン＋チアリシンにピニングし、１日間３０℃で成長させた。細胞を、ＳＤ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８にピニングし、２日間３０℃で成長させ、次いで、ＳＤ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８にピニングし、２日間３０℃で成長させた。初期スクリーンのため、細胞を、ＳＤ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８およびＳｇａｌ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８の両方にピニングし、スポット成長をモニターした。検証研究のため、細胞を、液体ＳＤ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８にピニングし、一晩３０℃で成長させ、次いで、ＳＤ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８およびＳｇａｌ／ＭＳＧ−Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ／Ｕｒａ＋カナバニン＋チアリシン＋Ｇ４１８の両方にピニングし、スポット成長をモニターした。次の通りにストック溶液（１０００×）を調製した：Ｇ４１８  ２００ｍｇ／ｍｌ、カナバニン５０ｍｇ／ｍｌ、チアリシン５０ｍｇ／ｍｌ。上述の方法を初期スクリーンに使用し、初期スクリーンヒットの検証のために９６ウェルプレートフォーマットを使用して、２回複製して反復した。
ＬＲＲＫ２突然変異体系統のためのヒトｉＰＳＣ生成、および中脳ドーパミン作動性（ＤＡ）ニューロンへの分化
【０３８１】
対照個体、および同質遺伝子的遺伝子補正済み対照と共にＧ２０１９Ｓ  ＬＲＲＫ２を保有するＰＤ患者由来のｉＰＳＣを、以前に記載された通りに生成した（Reinhardtら、２０１３年）。若干の修正を加えたフロアプレートに基づくプロトコールを使用して、ｉＰＳＣをｍＤＡニューロンに分化させた（Kriksら、２０１１年；Schondorfら、２０１４年）。分化は、０〜１１日目にＬＤＮ１９３１８９（１００ｎＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）に、０〜５日目にＳＢ４３１５４２（１０ｍＭ、Ｔｏｃｒｉｓ）に、１〜７日目にＳＨＨ  Ｃ２５ＩＩ（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ）、パルモルファミン（２ｍＭ、ＥＭＤ）およびＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）に、ならびに３〜１３日目にＣＨＩＲ９９０２１（ＣＨＩＲ；３ｍＭ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）に曝露することに基づいた。ＤＭＥＭ、１５％ノックアウト血清代替物、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０μＭ  β−メルカプトエタノールを含有するノックアウト血清代替物培地（ＫＳＲ）において、マトリゲル（ＢＤ）上で細胞を１１日間成長させた。分化５日目に開始して、ＫＳＲ培地をＮ２培地に徐々にシフトさせた。１１日目に、培地を、ＣＨＩＲ（１３日目まで）、また、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、アスコルビン酸（０．２ｍＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子、２０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ＴＧＦβ３（トランスフォーミング成長因子β３型、１ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ）、ジブチリルｃＡＭＰ（０．５ｍＭ；Ｓｉｇｍａ）およびＤＡＰＴ（１０μＭ；Ｔｏｃｒｉｓ）を補充したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ／Ｂ２７／Ｌ−Ｇｌｕｔ含有培地（ＮＢ／Ｂ２７；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に９日間交換した。１８日目に、細胞を、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して解離し、分化培地（ＮＢ／Ｂ２７＋ＢＤＮＦ、アスコルビン酸、ＧＤＮＦ、ｄｂｃＡＭＰ、ＴＧＦβ３およびＤＡＰＴ）において、１５μｇ／ｍｌポリオルニチンおよび１μｇ／ｍｌラミニンで予めコーティングされたディッシュに高細胞密度条件下で再度プレーティングした。ＤＩＶ３０に、細胞を収集し、遠心分離後に、さらなる解析まで細胞ペレットを−８０℃で貯蔵した。
α−ｓｙｎ突然変異体系統のためのヒト多能性幹細胞培養
【０３８２】
皮膚生検、ヒト皮膚線維芽細胞培養、ｉＰＳ細胞生成、およびＡ５３Ｔ突然変異（ＷＩＢＲ−ＩＰＳ−Ａ５３Ｔ）を有する患者のための突然変異補正は、以前に記載されている（Cooperら、２００６年；Soldnerら、２０１１年）。この以前の刊行物において、Ａ５３Ｔ  ｉＰＳ系統は、ＷＩＢＲ−ＩＰＳ−ＳＮＣＡＡ５３Ｔと称された。
【０３８３】
本発明者らの多能性幹細胞株は、ｈＥＳ培地［１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、５％ノックアウト血清代替物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１ｍＭグルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１ｍＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）および４ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］において、マイトマイシンＣ不活性化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）フィーダー層上に初期に維持された（５％０２、３％Ｃ０２）。手作業により、またはコラゲナーゼＩＶ型（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて酵素により、培養物を５〜７日毎に継代した。分化に先立つ５０継代前後で、系統を、成長因子低減マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；ＤＭＥＭ：Ｆ１２において１：３０）で予めコーティングされたプレートに継代し、ｍＴＥＳＲ−１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養し（２１％０２、５％ＣＯ２）、その後、分化まで（継代４０〜９０における）、ディスパーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１ｍｇ／ｍＬ）を用いて酵素により５〜７日毎に継代した。核型分析のため、細胞株の標準Ｇ−バンド染色体解析を、１０〜２０継代毎に行った（Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）。本発明者らは、２〜４週間毎に本発明者らの培養物のマイコプラズマ陰性状態を確認した（ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ、Ｌｏｎｚａ）。
胚様体（ＥＢ）形成によるヒト神経誘導
【０３８４】
以前に発表されたプロトコールを修正せずに使用した（Chungら、２０１３年；Huら、２００７年；J.-E.  Kimら、２０１１年）。このプロトコールは、完全性のためにここで反復された。
【０３８５】
分化を開始するために、０日目に、ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞コロニーを、５μＭ  Ｙ−２７６３２／ＲＯＣＫ阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で３０〜６０分間前処理し、ａｃｃｕｔａｓｅ（ＳｔｅｍＰｒｏ  Ａｃｃｕｔａｓｅ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）への５〜１０分間曝露後に単一細胞解離し、次いで、Ｎ２およびＢ２７を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である神経基盤（ＮＢ）培地に再懸濁した。Ｎ２およびＢ２７サプリメントは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手し、それぞれ１／２〜１％および１〜２％で使用した。細胞は、デュアルＳＭＡＤ阻害剤（Chambersら、２００９年；Langmeadら、２００９年）組換えヒトノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）２００ｎｇ／ｍＬおよび１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）ならびに５μＭ  Ｙ−２７６３２を補充したＮＢ培地において、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ  ８００マイクロウェル（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；プライミングおよびプレーティングは製造業者のプロトコールに従う；ウェル当たり２．４×１０６個の細胞）内にプレーティングした。ノギンおよびＳＢ４３１５４２は、神経分化プロトコールを通してこれらの濃度で培地に残った。
【０３８６】
１日目に、培地を１／２交換した。２日目までに、十分に形成された神経誘導されたＥＢ（ＮＥＢ）が、ＡｇｇｒｅＷｅｌｌにおいて典型的に観察され、ＮＢ培地において一晩ペトリ皿に移した（４個のＡｇｇｒｅＷｅｌｌウェル／ペトリ皿）。４日目に、ＮＥＢを、付着のために成長因子低減マトリゲル（ＤＭＥＭ：Ｆ１２において１：３０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングされたディッシュに移した。この日以降Ｙ−２７６３２を省略した。５日目〜１０日目に、付着したＮＥＢを、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および組換えヒトＤｋｋ１、２００ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）にその上曝露した。１０日目に、神経ロゼットを解剖し（Ｐ２０ピペットチップ）、ＤｎａｓｅＩ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したａｃｃｕｔａｓｅにおいて１０分間３７℃でインキュベートし、小型の細胞塊および単一の細胞へと穏やかに解離した。洗浄後に、ロゼットを、２０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＮＢ培地である神経前駆細胞（ＮＰＣ）培地において高密度（２００，０００／ｃｍ２）で、ポリ−Ｌ−オルニチンおよびラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ）で予めコーティングされたプラスチックディッシュに再度プレーティングし、１０μｍ  Ｙ−２７６３２を一晩補充した。典型的に、１個のＡｇｇｒｅｗｅｌｌ  ８００ウェルは、継代０における少なくとも１〜２個の６ウェルに十分なＮＰＣを提供した。
【０３８７】
その後、生存するＮＰＣは増殖した。培地交換は毎日行った。これは、神経分化前に最大１０回継代することができ、分化能を損なうことなく初期継代（ｐ１〜ｐ５）において凍結／融解に成功することができた。凍結培地は、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を有するＮＰＣ培地であった。
ヒト皮質神経分化
【０３８８】
以前に発表されたプロトコールを修正せずに使用した（Chungら、２０１３年；Huら、２００７年；J.-E.  Kimら、２０１１年）。このプロトコールは、完全性のためにここで反復された。
【０３８９】
神経分化を始めるために、ａｃｃｕｔａｓｅによりＮＰＣを解離し、マトリゲルコーティングされたＴ７５フラスコ（ＣｙｔｏＯｎｅ）に再度プレーティングした。翌日、培地を、組換えヒトＢＤＮＦおよびＧＮＤＦ（両者共に１０ｎｇ／ｍＬ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）ならびにジブチリルサイクリックＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ；５００μＭ）を補充した、ＦＧＦ−２を含まないＮＢ培地である神経分化（ＮＤ）培地に完全に交換した。その後、培地を１日おきに１／２交換した。７〜９日目に、分化しているニューロンを単一の細胞に穏やかに解離し、０．１％ウシ血清アルブミン（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した予め冷却したハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ；Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に再懸濁した。洗浄ステップ後に、細胞を、生化学的アッセイのためにポリオルニチンおよびラミニン（ＢＤ  Ｂｉｏｃｏａｔ）で予めコーティングされた６または２４ウェルプラスチックプレートにプレーティングした。培地を１／２、３日毎に最大１２週間交換した。
初代ラット皮質培養物
【０３９０】
胎生期１８に、麻酔した妊娠したスプラーグドーリーラットから帝王切開により胚を収集した。２０分間３７℃のＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ）消化、およびパスツールピペットによる粉砕により、大脳皮質を単離および解離した。ポリオルニチンおよびラミニンコーティングされた９６ウェルプレートに、Ｂ２７（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．５ｍＭグルタミン、２５μＭ  β−メルカプトエタノール、ペニシリン（１００ＩＵ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充したｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において、それぞれ４×１０４個の細胞を播種した。培地の３分の１を、３〜４日毎に交換した。
ｉＰＳニューロンのＡＡＶ−１形質導入
【０３９１】
立証されたＴＡＬＥ−ＴＦを含有するプラスミドは、エンドトキシンフリーに精製されており（Ｑｉａｇｅｎ）、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＡＶ−１）へのパッケージングは、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｅｙｅ  ａｎｄ  Ｅａｒ  Ｉｎｆｉｒｍａｒｙ／ＭＥＥＩ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌによって行われた（ミニスケール産生）。Ａ５３Ｔおよび突然変異補正済み皮質ニューロンは、０．２５〜０．７５×１０６細胞／ｃｍ２のプレーティング密度において４〜７週間熟成させた。細胞に、５００μｌ  ＮＤ培地において、単一のＴＡＬＥ−ＴＦまたはＴＡＬＥクローニング骨格単独を含有する、３０μｌのミニスケール産生されたＭＥＥＩ  ＡＡＶ−１力価を形質導入した。ＮＤ培地を、形質導入１２〜１６時間後に交換した。
抗体
【表１−１】
2020507314.tif 000182
【表１−２】
2020507314.tif 000183
３５Ｓ−メチオニン／−システインによるタンパク質標識付け
【０３９２】
Ａ５３Ｔおよび突然変異補正済み皮質ニューロンを、０．２５〜０．７５×１０６細胞／ｃｍ２のプレーティング密度で４〜８週間熟成させた。タンパク質標識付けに先立ち、皮質ニューロン培養物を、メチオニンおよびシステインを含まない神経分化（ＮＤ）培地において９０分間維持した。ＮＤ培地は、１％（ｖ／ｖ）Ｂ−２７、０．５％（ｖ／ｖ）Ｎ−２および１％（ｖ／ｖ）ＧｌｕｔａＭＡＸサプリメント、１％（ｖ／ｖ）ＭＥＭ非必須アミノ酸、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン−ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ならびに１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＤＮＦおよびＧＤＮＦ（両者共にＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５００μＭ  ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補完したＤＭＥＭであった。タンパク質標識付けのため、ニューロン細胞培養物を、最終濃度１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンおよび−システイン（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を補充したＮＤ培地において様々な持続時間インキュベートした。冷ＰＢＳによる急速洗浄後に、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する緩衝液において溶解させた。試料を１００℃で５分間煮沸し、１０，０００ｇで１５分間スピンダウンした。上清を収集し、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。３５Ｓ標識された試料を、４〜１２％Ｎｕｐａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において泳動した。ローディング対照として、ゲルをＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色し、水におけるインキュベーションによって脱染した。その後、ゲルを１１．２％（ｖ／ｖ）サリチル酸および１０％グリセロール（ｖ／ｖ）において１５分間インキュベートした。ゲルを乾燥させ、リン光体スクリーン（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）に最小で４８時間露光させた。ホスフォロイメージャーＢＡＳ−２５００（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）を使用してスクリーンをスキャンし、各レーンの強度を測定することにより、３５Ｓ組み込みを決定した（ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅ解析ソフトウェアｖ２．２、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）。
サイトゾルにおける遊離３５Ｓ−メチオニン／−システイン
【０３９３】
ＧＦＰまたはαＳｙｎ−ＧＦＰのいずれかを過剰発現するラット初代ニューロンを、１００μＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−メチオニンおよび−システインと共に様々な持続時間インキュベートした。冷ＰＢＳによる急速洗浄後に、細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液において２０分間氷上で溶解し、遠心分離によってデブリを除去した。４体積の溶解物に対し１体積の１００％ＴＣＡを添加することにより、溶解物中のタンパク質を沈殿させ、１０分間４℃でインキュベートした。１４Ｋ  ｒｐｍにおける１０分間の遠心分離後に、上清を収集して、遊離３５Ｓ−メチオニン／−システインのサイトゾルプールを測定した。７ｍｌシンチレーションカクテル（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）に浸漬されている５μｌの試料によりＬＳ  ６５００液体シンチレーションカウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して定量化することにより、３５Ｓ組み込みを決定した。
細胞溶解およびエンドグリコシダーゼＨ消化
【０３９４】
細胞を、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４まで、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）ならびにタンパク質ホスファターゼ阻害剤カクテル１および２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する緩衝液において溶解し、氷／水スラリー中で２０分間インキュベートし、続いて、２回の凍結−融解サイクル（−８０℃／３７℃、各約１分間）を行った。１００，０００ｇ、４℃、３０分間の超遠心分離後に上清を収集した。ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してタンパク質濃度を決定した。製造業者の説明書に基づきエンドグリコシダーゼ（Ｅｎｄｏ）Ｈ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）消化を実施した。簡潔に説明すると、２０〜４０μｇバルクタンパク質を、１５．３μｌ反応体積においてアセンブルした；１．７μｌ変性緩衝液を添加し、試料を１０分間１００℃で煮沸した。次に、２μｌのＧ５緩衝液および１μｌのＥｎｄｏ  Ｈまたは１μｌのＨ２Ｏを、変性反応液に添加し、２時間３７℃でインキュベートした。
ウエスタンブロッティング
【０３９５】
Ｅｎｄｏ  Ｈ消化後のタンパク質輸送のため、タンパク質試料を、試料緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ６．８、４％（ｖ／ｖ）グリセロール、１８０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．０００３％（ｖ／ｖ）ブロモフェノールブルーおよび２％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ）において変性させ、１０％Ｔｒｉｓ−グリシンゲルにおいて泳動し、２０％メタノールによりＰＶＤＦ膜（ＢｉｏＲａｄ）に湿式転写した。ブロットを、１：１希釈のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＢＳにおいて１時間室温でブロッキングし、続いて、１：１希釈のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＳＴ）における一次抗体とのインキュベーションを４℃で一晩、穏やかに振動しつつ行った。ＰＢＳＴによる３回の５分間洗浄後に、ブロットを、１：１希釈のＯｄｙｓｓｅｙブロッキング緩衝液およびＰＢＳＴにおいて、ＩＲＤｙｅ  ６８０または８００にコンジュゲートされた抗マウスまたはウサギＩｇＧ（１：１０，０００、Ｒｏｃｋｌａｎｄ）等の二次抗体と共に２時間室温でインキュベートした。ＰＢＳＴによる３回の５分間洗浄および水による２回の洗浄後に、Ｏｄｙｓｓｅｙ定量的蛍光イメージングシステム（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットをスキャンし、Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアｖ２．１（Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してバンドを定量化した。
【０３９６】
他のウエスタンブロットのため、試料をＲＩＰＡ緩衝液において溶解し、８または１０％Ｎｕｐａｇｅ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のいずれかにおいて泳動し、ｉＢｌｏｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して転写した。ブロッキングは、ＰＢＳＴ中５％脱脂粉乳で行った。二次抗体および化学発光検出に関しては、ＨＲＰにコンジュゲートされた抗マウス、抗ウサギＩｇＧまたはアビジンを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共に使用した。
ＴＡＬＥ−ＴＦ設計
【０３９７】
ＡＴＸＮ２またはＥＩＦ２Ｇ転写物の転写開始部位（ＴＳＳ）の２００ｂｐ上流（５’）と５０ｂｐ下流（３’）との間を標的とするようにＴＡＬＥ−ＴＦを設計した。ＴＳＳ付近のこれらの領域内で、本発明者らは、ヒト腹内側前頭前皮質試料からＤＮＡｓｅＩ高感受性領域を同定した（Thurmanら、２０１２年、ＰＭＩＤ：２２９５５６１７）。これらのＤＮＡｓｅＩ  ＨＳ領域内で、本発明者らは、各転写物に５種のＴＡＬＥ−ＴＦを設計した。
【０３９８】
最初のチミジン（Ｔ）＋１２個の完全反復および１個の半反復からなる１４ｂｐゲノム配列を標的とするように各ＴＡＬＥ−ＴＦを設計した。以前に記載された通りにＰＣＲに基づくＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング戦略を使用して、各ＴＡＬＥ−ＴＦに、ＴＡＬＥ反復をｒＡＡＶ移入プラスミドにクローニングした（Konermannら、２０１４年；Sanjanaら、２０１２年；Tarazonaら、２０１１年）。ｒＡＡＶ移入プラスミドは、翻訳の間に切断される２Ａ連結ＥＧＦＰと共に合成ＶＰ６４アクチベータードメインに融合されたＴＡＬＥ骨格を含有した。
ＴＡＬＥ−ＴＦアセンブリ
【０３９９】
以前に記載されたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニングを使用して、１４−ｍｅｒ転写アクチベーター様エフェクター転写因子（ＴＡＬＥ−ＴＦ）を構築した（Sanjanaら、２０１２年）。遺伝子、ＡＴＸＮ２およびｅＩＦ４Ｇ１（転写物バリアント７）毎に、５種の異なるＴＡＬＥ−ＴＦが設計され、１４ｂｐ長の標的遺伝子座が、近位プロモーター領域に位置する（ＡＴＸＮ２  ＴＡＬＥ−ＴＦ＃１：５’−ＴＧＴＣＣＡＧＡＴＡＡＡＧＧ−３’（配列番号１）、＃２：５’−ＴＧＡＡＣＣＴＡＴＧＴＴＣＣ−３’（配列番号２）、＃３：５’−ＴＧＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＧＧ−３’（配列番号３）、＃４：５’−ＴＧＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＣＡ−３’（配列番号４）、＃５：５’−ＴＡＧＣＴＧＧＴＣＡＴＧＧＴ−３’（配列番号５）；ｅＩＦ４Ｇ１  ＴＡＬＥ−ＴＦ＃１：５’−ＴＧＴＣＡＣＧＴＧＡＣＧＧＧ−３’（配列番号６）、＃２：５’−ＴＧＴＧＧＣＴＧＴＣＡＣＧＴ−３’（配列番号７）、＃３：５’−ＴＣＡＡＡＧＴＴＣＧＧＧＡＧ−３’（配列番号８）、＃４：５’−ＴＣＧＣＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡ−３’（配列番号９）、＃５：５’−ＴＣＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧＣ−３’（配列番号１０））。ＴＡＬＥ−ＴＦ毎に、ＤＮＡ結合ドメインの正確な配列がサンガー配列決定によって立証され、非サイレント突然変異を有する全ＴＡＬＥ−ＴＦクローンを除外した。
リボソームフットプリントプロファイリング
【０４００】
リボソームフットプリントプロファイリングのため、１２週齢細胞を、シクロヘキシミド（１００ｕｇ／ｍＬ）で５分間３７℃にて処理して、翻訳伸長を停止させた。１００μｇ  ｍｌ−１シクロヘキシミドを含有する氷冷９．５ｍＭ  ＰＢＳ、ｐＨ７．３で細胞を２回洗浄し、溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、１００μｇ  ｍｌ−１シクロヘキシミド、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５００Ｕ  ｍｌ−１  ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓおよびプロテアーゼ阻害剤（１×完全、ＥＤＴＡフリー、Ｒｏｃｈｅ））を添加し、プレートから細胞を掻爬し、次いで２６ゲージ針により４回粉砕することにより溶解した。１，３００ｇ、１０分間、４℃で粗溶解物を遠心分離した後に、上清を除去し、液体窒素中でフラッシュ凍結した。溶解物を氷上で解凍し、その後、http://bartellab.wi.mit.edu/protocols.htmlで利用できる詳細なプロトコールを使用して以前に記載された通りに（Subtelnyら、２０１４年）、リボソームプロファイリングおよびｍＲＮＡ−ｓｅｑを実施した。４週齢細胞を３７℃成長培地で２回洗浄し、次いで、吸引によって培地を除去した後に、プレートを封着し、次いで液体窒素中に押し込んだ。次に、上に記載されている通り溶解緩衝液により細胞を溶解したが、ショ糖勾配を含む全溶液からシクロヘキシミドが除外された。氷上で解凍した後に、ＲＮａｓｅ  Ｉによる消化に先立ち、少量のシクロヘキシミドフリーゼブラフィッシュＲＰＦ溶解物を、４週齢細胞溶解物にスパイクした（Ａ２６０に基づき１０分の１）。
【０４０１】
以前に記載された通り、ＲＰＦおよびＲＮＡ−ｓｅｑタグをＯＲＦにマッピングした（Subtelnyら、２０１４年）。４週齢試料に存在するゼブラフィッシュリードを説明するために、ゼブラフィッシュおよびヒトゲノムまたはトランスクリプトームの両方を含む指標を作製し、これらのデータを組合せ指標にマッピングした。特有にマッピングするリードのみが考慮され、ゼブラフィッシュにマッピングするものは、解析から除外された。
【０４０２】
４週間および１２週間データセットのための翻訳プロファイリングにおける濃縮された経路を、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイト（software.broadinstitute.org/gsea/index.jspにおけるワールドワイドウェブ上で利用可）で利用できる遺伝子セット濃縮解析ツールによりコンピュータ処理した。
定量化および統計解析
現存する相同性予測アプローチとの比較
【０４０３】
酵母タンパク質と予測されるヒト相同体との間の機能的関連を評価するために、本発明者らは、本発明者らの方法、ＨＨｐｒｅｄおよびＢＬＡＳＴによって予測される上位５種の相同体の遺伝子オントロジー（ＧＯ）の平均精度をコンピュータ処理した（Altschulら、１９９７年；１９９０年；Ashburnerら、２０００年；Tuncbagら、２０１３年）（図８Ｂ）。酵母タンパク質は、２種以上の優れたヒト相同体を有することが多いため、本発明者らは、上位５種の相同体を選択した。相同体の精度を、酵母タンパク質と推定相同体との間の重複されるＧＯ標識のパーセンテージとして計算した。本発明者らは、ＧＯ精度測定基準が、多数の標識を有する予測される相同体および少数のＧＯ標識を有するクエリータンパク質を好むように、遺伝子当たりの割り当てられたＧＯ標識の数が、酵母とヒトプロテオームとの間で相当に変動し、解析を潜在的に偏らせたことを認めた。さらに、偽陽性は、この測定基準によって考慮されなかった。これらの課題に取り組むために、本発明者らは、酵母（またはヒト）遺伝子およびそのヒト（または酵母）相同体の特有のＧＯ標識の総数で割った重複するＧＯ標識の数である、広く使用されているＪａｃｃａｒｄ類似性スコアをコンピュータ処理した。４０２３種の酵母タンパク質に対するＢＬＡＳＴの精度は、３１．１％であった。ＢＬＡＳＴと併せてＨＨｐｒｅｄは、４３１２種の酵母タンパク質に対する精度の３２．６％を達成した。本発明者らの方法は、有意により大きい数の４９２３種の酵母タンパク質に対して３１．６％精度を得た。これはまた、ＢＬＡＳＴアウトプットによる４０２３種の酵母タンパク質におけるＢＬＡＳＴ（３２．０％対３１．１％精度および２５．２％対２４．３％Ｊａｃｃａｒｄ類似性）およびＨＨｐｒｅｄアウトプットによる４３１２種のタンパク質におけるＨＨｐｒｅｄ（３４．１％対３２．６％精度および２６．９％対２４．９％Ｊａｃｃａｒｄ類似性）よりも優れる。ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄを上回る改善は、有意であった（対応ｔ検定ｐ値＜０．０１）。
【０４０４】
次に、本発明者らは、ヒトタンパク質の酵母相同体を見い出す際に本発明者らの方法を検査した（図３Ｃおよび図３Ｄ）。ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄを上回るカバレッジの改善は、酵母タンパク質からヒト相同体を生成するためよりもさらに大幅であった。本発明者らの方法は、１５２００種のタンパク質の相同体を予測したが、ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄは、ヒトプロテオームの相対的に小さい部分のみを網羅した（それぞれ７２４８および９５７７種）。精度測定基準もＤＣＡ方法を好んだ。本発明者らの方法は、ＢＬＡＳＴまたはＨＨｐｒｅｄがＧＯ精度およびＪａｃｃａｒｄ類似性スコアの両方における酵母相同体を見い出すことができるタンパク質においてＢＬＡＳＴ（５７．６％対５７％精度および２６％対２６．６％Ｊａｃｃａｒｄ類似性）およびＨＨｐｒｅｄ（５６％対５４．９％精度および２５％対２４．２％Ｊａｃｃａｒｄ類似性）を上回って予測力を改善した。これらの比較は全て、統計的に有意であった（対応ｔ検定により全ｐ値＜０．０１）。
【０４０５】
本発明者らはまた、本発明者らの相同性ツールを、最先端のＥｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ方法と比較した。Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａは、系統樹に基づくクラスタリングおよび複数の種を越えた解析により高い信頼度の相同体ペアを同定する。この配列に基づく方法は、精度のためのカバレッジを犠牲にし、これらのペアは、伝統的解析のための絶対的基準と考えられる（Vilellaら、２００９年）。本発明者らは、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ  ｖ８５をダウンロードし、本発明者らの相同性ツールにおいて使用される遺伝子名に遺伝子ｉｄをマッピングし、２４０９種の酵母遺伝子のための５０９３種の高い信頼度の酵母／ヒトペアを同定した。これらのペアの中に、３種の主要カテゴリーが存在する：「１対１」、「１対多」および「多対多」。本発明者らのＤＣＡ相同性ツールを評価するために、本発明者らは、これが、高い信頼度の酵母／ヒトペアに対して少なくとも同様に行うか、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａによって１対１、１対多または多対多として予測されるかチェックした。ヒトと酵母遺伝子との間のオルソロジー関係性は、それらの遠く離れた進化的距離のせいで不明瞭となり得るため、ＤＣＡおよびＥｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａは、特に多対多の事例に対して、異なる推定相同体を予測することができる。このような事例のため、本発明者らはまた、酵母タンパク質と予測される相同体との間で重複するＧＯ標識のパーセンテージとしてＧＯ精度をコンピュータ処理した。Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａによる明らかな１対１のペアのため、ＤＣＡは、１０４０種の遺伝子のうち２５種のみにおいて異なった。異なったこの２５種の遺伝子のうち、本発明者らの方法は、オントロジーマッチングに基づくＥｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ（０．３８８）と比較して、オントロジー予測において匹敵する精度を達成した（０．３９４）。「多対多（many2many）」予測カテゴリーに１５１８種のエントリーが存在した。これらのため、本発明者らの方法は、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ（０．４１２）と等価な正確なペア形成（０．４１４）を達成した。最後に、１対多の対応が予測される酵母遺伝子のため、２５３５種のエントリーが存在した。重ねて、本発明者らの方法は、Ｅｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａ（０．３９０）と同様の遺伝子オントロジー（０．３９１）により相同体を同定した。差の中で、本発明者らは、これらの大部分が、同じファミリー内の同様の遺伝子であることを観察した；さらに、これらの差は、統計的に有意ではない。よって、本発明者らのアプローチは、他のいずれかの絶対的基準酵母−対−ヒト相同体ペア形成の非存在下での偽陽性の代替である、高い信頼度のオルソロジーペアのための相同性予測を破壊しない。これらの結果から、本発明者らは、ＤＣＡが、同じインプット酵母遺伝子に対してＥｎｓｅｍｂｌ  Ｃｏｍｐａｒａと匹敵する酵母−対−ヒト精度を提供することを実証した。
【０４０６】
最近、Kachrooら（Kachrooら、２０１５年）は、配列によって明らかな相同体による相補性に関して４１４種の必須酵母遺伝子を慎重に検査した。よって、これらの４１４種の酵母／ヒト遺伝子ペアのそれぞれに対して、相補性アッセイは、相同性のバイナリで実験的に強い読み出し情報を提供した。Kachrooらは、これらの高い信頼度のペアのいずれが、実際の陽性相補性ペアである可能性が高いか予測するための方法を開発した。彼らは、配列特性、ネットワーク特色、転写および翻訳特色、ならびに発現存在量の慎重な手作業の精選を含む、１００種を超える特色を利用して、予測ツールを確立した。彼らは、この予測ツールが、実験的に検査される酵母／ヒトペアのサブセットにおいて訓練されて、別々の検査セットにおける機能的交換可能性を正確に同定し得ることを示した。ＤＣＡの統合の有効性を実証するために、本発明者らは、配列およびネットワーク情報のみを使用して、ＤＣＡに基づく分類子を訓練して、真の酵母−ヒト相補性ペアを予測した。特に、本発明者らのＤＣＡパイプラインの予測力をチェックするために、本発明者らは、本発明者らの接合ＤＣＡ学習パイプラインから得られる低次元遺伝子ベクトルに基づく分類子を築いた。酵母／ヒト遺伝子の各ペアに、本発明者らは、遺伝子ベクトルに基づく特色を築いて、それらの配列類似性およびそれらの分子ネットワークにおけるトポロジカルな役割を考慮した。要素毎の積ならびに２種の遺伝子ベクトルの差および和を含むこれらの特色を、勾配ブースト森分類子へのインプットとして使用した。本発明者らは、この分類子が、配列／ネットワーク特色のみに基づく本発明者らのより要素的な自動ＤＣＡツールのため、酵母とヒトとの間の機能的相補性も予測するように整調され得るかを検査した。本発明者らは、Ｋａｃｈｒｏｏら由来の酵母／ヒトペアにおける５倍相互検証により本発明者らのＤＣＡ分類子を訓練した場合、高い率の予測精度を達成した（ＡＵＣ＝０．８２、ＳＤ＝０．０８）。これは、Ｋａｃｈｒｏｏらの入り組んだ手作業の統合された方法に匹敵し、配列およびネットワークトポロジーのみに基づく本発明者らの自動相同性ツールが、この特異的相同性タスクのための分類子の訓練に十分であることを実証する。ＢＬＡＳＴおよびＨＨｐｒｅｄを含む配列類似性を単独で利用する方法が、ＤＣＡよりも性能が相当に悪かった（それぞれ０．７０および０．６９）ことは注目に値する。ネットワークトポロジーおよび配列類似性を有効に統合する本発明者らのＤＣＡに基づく分類子が、１００種を超える特色を利用するＫａｃｈｒｏｏらにおける方法と同じ程度に有効であり、よって、主要な時間のかかる手作業特色精選の障壁を克服することが明らかである。
ＰＣＳＦおよびヒト化Ｓｔｅｉｎｅｒネットワークの評価
【０４０７】
本発明者らは、２種の別々のデータセットにおいてＰＣＳＦを検査し、現存する方法と比較して大いに優れた性能を実証した。比較のため、本発明者らは、２種の一般的なアルゴリズム、ＤＡＰＰＬＥ（Rossinら、２０１１年）およびＰＥＸＡ（Tuら、２００９年）を同定し、これらを実行した。両方の方法が、シード遺伝子を採用し、シード遺伝子にまたがるサブネットワークを同定して、これらの遺伝子の可能な機能的相互接続性を明らかにする。第１のアルゴリズム、ＤＡＰＰＬＥは、ヒトインタラクトームにおける有意な直接的およびワンホップの間接的エッジを同定して、可能な限り多くのシード遺伝子を接続する。第２のアルゴリズム、ＰＥＸＡは、ＫＥＧＧまたはリアクトーム等、現存する経路アノテーションを利用して、シード遺伝子を網羅する。次に、統合および剪定が適用されて、接続された成分を連結し、ハンギング遺伝子を除去する。これらの比較のため、本発明者らは、本発明者らのＰＣＳＦ方法を提供するのと同じように、各アルゴリズムに、酵母−対−ヒト相同性連結を提供し、ヒトネットワークに酵母相互作用エッジをインジェクトした。疎らな直接的ネットワークは、隠れた遺伝子を同定することができないことから、ＤＡＰＰＬＥのため、本発明者らは、有意なワンホップの間接的エッジによる予測される高密度ネットワークを使用した。本発明者らは、酵母における１５種の完全スクリーン由来のヒットを精選した（Tong、２００４年）。これらのスクリーンにおいて、遺伝子は欠失されると共に、その遺伝的相互作用物質または修飾因子である。本発明者らは、ネットワークアルゴリズムのためのインプットとしてこれらの遺伝的修飾因子を使用した。不活性化された遺伝子は、アルゴリズムから隠れ、予測されるネットワークの評価に使用された。以前に発表された方法（Yeger-Lotemら、２００９年）から手掛かりを得て、そこで本発明者らは、予測される隠れたヒト遺伝子が、隠れた不活性化酵母遺伝子に帰属する特異的遺伝子オントロジー生物学的プロセス項のために有意に濃縮された場合（超幾何分布検定；ｐ値＜０．０１）、細胞応答の発見において成功したアルゴリズムを考慮した。本発明者らは、ＰＣＳＦおよび２種の代替方法：ＤＡＰＰＬＥ（Rossinら、２０１１年）およびＰＥＸＡ（Tuら、２００９年）によりヒト化ネットワークを生成した。これらのスクリーンのため、それぞれ６．６％および１３％であるＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡと比較して、ＰＣＳＦの成功率は、４７％であった。これらの結果は、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡを上回る、ＰＣＳＦの優れた性能を示唆する。
【０４０８】
ＰＣＳＦ、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡによって回収される遺伝子および予測される経路の関連性をより良く理解するために、本発明者らは、十分に制御されたシミュレーションを設計した。撹乱された経路の遺伝的スクリーンを模倣するために、本発明者らは、周知ヒト経路データベースＫＥＧＧ由来の個々の経路を選択し、各経路における全遺伝子を同定した（補足表Ｓ１５）。次に、本発明者らは、ストリンジェントＥｎｓｅｍｂｌの１対１のマッピングにより酵母相同体を同定した。本発明者らは、「撹乱された」として明らかな酵母相同体を有するこれらのヒト遺伝子を処理し、「バーチャル酵母遺伝的スクリーン」由来のヒットとしてそれらの相同体の遺伝的相互作用隣接遺伝子を選定した。これらのようなバーチャルスクリーンは、交絡因子として実験ノイズを最小化し、アルゴリズム性能のよりクリーンな評価を可能にする。本発明者らは、「真の」経路情報を知っているため、この方法を使用して、本来のＫＥＧＧ経路における「関連性」遺伝子が予測される（非シード）遺伝子として回収される頻度を定量化することにより、アルゴリズムの感度および特異性を検査することができる。本発明者らは、明らかな酵母相同体を有する少なくとも５種のヒト遺伝子を有する５０種のＫＥＧＧ経路を選択し、検査のために５０種の関連する「バーチャル」スクリーンを作製した（表Ｓ１５）。本発明者らは、２種の性能測定基準：精密度、すなわち、本来のＫＥＧＧ経路において示される予測される隠れた遺伝子のパーセンテージ、およびリコール、すなわち、予測される経路における隠れたノードとして示される本来のＫＥＧＧ遺伝子のパーセンテージを使用した。理想的には、これらの値は、完全な予測に対して１００％となるであろう。ＰＣＳＦに関して、平均精密度およびリコール値は、それぞれ６３％および７４％である。対照的に、ＤＡＰＰＬＥに関して、平均精密度およびリコール値は、それぞれ６％および４７％である一方、ＰＥＸＡに関して、これらは、それぞれ８％および８３％である。３種の精密度値の間の差は、大幅である：ＰＣＳＦは、非常にコンパクトなサブネットワーク内にはるかにより高い精密度を有する一方、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡの両方は、低い精密度による巨大な「毛玉」ネットワークを予測する。ＰＥＸＡが、おそらくＫＥＧＧ経路を使用してネットワークを築くため、非常に高いリコール値を有し、よって、予想通りに高いリコールを有することは注目に値する（ここでシミュレートされたスクリーンがＫＥＧＧ経路から生成されるため）；しかし、その精密度測定基準は非常に低い。
【０４０９】
表Ｓ１５。図２および図９に関連する、シミュレーションのためのＫＥＧＧ経路。
【０４１０】
さらに、本発明者らは、本発明者らが生成したシミュレートされた酵母遺伝的スクリーンにより、ネットワークへとインジェクトされた酵母遺伝的相互作用の有効性を検査し、本発明者らのＰＣＳＦ方法を他のアルゴリズム、ＤＡＰＰＬＥおよびＰＥＸＡと相互比較した。先ず、本発明者らは、インジェクトされた酵母相互作用を全て除去することにより、性能を検査した。ＰＣＳＦに関して、平均精密度およびリコール値は、それぞれ３７％および５４％である。ＤＡＰＰＬＥに関して、平均精密度およびリコール値は、それぞれ８％および２７％である。精密度およびリコール結果と比較すると（すなわち、ＰＣＳＦに関する６３％および７４％、対、ＤＡＰＰＬＥに関する６％および４７％）、酵母相互作用が除外された場合、ＰＣＳＦおよびＤＡＰＰＬＥの両方が、はるかにより低いリコールを有することが明らかである。よって、この解析は、「ヒト化」ネットワークへの酵母相互作用のインジェクションが、撹乱された遺伝子に遺伝的修飾因子の間の鍵となる接続を提供するというデータにより確認する。ＰＥＸＡに関して、酵母インジェクションによるものと同様に、平均精密度値は、９％である一方、リコール率は、再度、予想通りに非常に高い。第２に、本発明者らは、１０回の試行にわたりインジェクトされた遺伝的相互作用の部分をランダムに除去することの効果を検査した。平均精密度およびリコール値を図９に示し、これらの方法の精度とインジェクトされた酵母相互作用のパーセンテージとの間の関係性を実証する。注目すべき観察は、相互作用の＞４０％がインジェクトされると、性能が合理的になることである。ＰＥＸＡの性能は、上に記す通り、そのアルゴリズムにおけるヒトＫＥＧＧ経路情報を利用するため、相対的に未変化のままである。偽陽性および偽陰性の観点から、異なる方法の間に明らかにトレードオフがある。ＰＣＳＦは、コスト効率の良い実験的調査のための関連性遺伝子の小セットを同定するため、ＰＣＳＦは、本発明者らの本研究に対して最もよく機能する。
細胞に基づくアッセイのための統計的方法およびデータ解析
【０４１１】
全実験法のための試料サイズは、これらの研究における方法およびアッセイによる本発明者らの以前の大規模な経験に基づき選択した。哺乳動物細胞における大部分の実験のため、結果の頑健性および一貫性は典型的に、３種の生物学的複製が解析された後に確立される。図の説明文において特に明記しない限り、これは、全実験に要求される複製の標準的な数であった。全ヒトおよびラット細胞実験のため、次に、本分野において標準の適切な統計的検定によって有意性を決定した。実験内で比較するために２つの条件のみが存在した場合、両側ｔ検定を適用した。実験が、複数の条件を含む場合、多重比較事後検定による一元配置ＡＮＯＶＡを行った。次の予め確立された基準に基づきデータ点を除外した：１）誤差は、実験を行う際に特定の試料に導入された、２）値は、平均から２標準偏差よりも大きいまたはそれに満たない。酵母スポットアッセイのため、３種の生物学的複製（特に明記しない限り）が、目視により同じ傾向を実証した場合、結果は、有意と考えられた。図５Ｅに使用される方法は、図の説明文に概要を述べる。プールスクリーン酵母アッセイのため（図４Ａ、図１１）、リードおよびカットオフ閾値のための詳細な統計的方法は、上述の方法において供給されている。コンピュータ処理による解析のための統計的方法は、上述の方法セクションに詳細に記載されている。
データおよびソフトウェア利用能
【０４１２】
ＴｒａｎｓｐｏｓｅＮｅｔパイプラインは、http://transposenet.csail.mit.eduに記載されている。
【０４１３】
ＤＣＡ／Ｍａｓｈｕｐウェブポータルは、http://mashup.csail.mit.eduである。ＰＣＳＦウェブポータルは、http://fraenkel-nsf.csbi.mit.edu/omicsintegrator/である。
【０４１４】
参考文献：
【化１】
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【化２】
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【化３】
2020507314.tif 000186
【化４】
2020507314.tif 000187
【化５】
2020507314.tif 000188
【化６】
2020507314.tif 000189
【化７】
2020507314.tif 000190
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【化１３】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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