(57)【要約】特に乳癌患者に対するペプチドをベースにした免疫療法において有用なＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドを提供すること。  本発明は、抗原ペプチドＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１、ＨＥＲ２９０７−９１５、ＨＥＲ２４４４−４５３、ＨＥＲ２４６６−４７４、ＨＥＲ２４８４−４９３、ＨＥＲ２７８５−７９４、またはＨＥＲ２８５１−８５９を含むポリペプチド、該抗原ペプチド、それらをコードする核酸配列分子およびそれらを含有する医薬組成物等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導するＨＥＲ２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性抗原ペプチドを含むポリペプチドまたは変異ポリペプチド。
【請求項２】
抗原ペプチドがＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、ＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、ＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である抗原ペプチド。
【請求項４】
請求項１または２記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはその相補鎖である核酸配列分子。
【請求項５】
請求項４記載の核酸配列分子を含有するベクター。
【請求項６】
請求項１または２記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項７】
請求項１または２記載のポリペプチド、請求項３記載の抗原ペプチド、または請求項４記載の核酸配列分子を含む、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導するための医薬組成物。
【請求項８】
癌を処置するための、請求項７記載の医薬組成物。
【請求項９】
請求項１または２記載のポリペプチド、請求項３記載の抗原ペプチド、または請求項４記載の核酸配列分子によって特異的に誘導されるＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１０】
ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、またはＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）である抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１１】
ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を認識するＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞。
【請求項１２】
請求項２記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドを用い、ＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法。
【請求項１３】
請求項１または２記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドを使用して癌を処置する方法。
【請求項１４】
癌の処置における請求項１または２記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】  本発明は、ＨＥＲ２／ｎｅｕの癌抗原ペプチドに関する。更に詳細には、本発明は、細胞性免疫ならびに液性免疫を惹起できるＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチド、および該ペプチドを含有する癌ワクチン等に関する。
【背景技術】  生体における免疫システムは、癌に対して重要な役割を果たしている。この免疫システム（腫瘍免疫）では、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）が強力なエフェクターとして作用しており、腫瘍細胞内で産生された腫瘍抗原に対して応答して、長期間にわたって免疫を付与することができる。腫瘍抗原は特定細胞内で分解されて８−１１個のアミノ酸からなる抗原ペプチドとなり、これが主要組織適合性抗原であるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子と結合して腫瘍細胞表面上に提示される。このようにＨＬＡ分子によって腫瘍細胞表面上に提示された短いペプチド配列は、ＣＴＬによって認識される（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７，６０１−６２４，１９８９）。つまり、ＣＴＬは、この抗原ペプチドとＨＬＡとの複合体を認識して腫瘍細胞を傷害する。
ＨＬＡは、クラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原に大別される細胞膜抗原である。ＣＴＬにより抗原ペプチドとともに認識されるのはクラスＩ抗原であり、ほとんど全ての有核細胞上に発現している。ＨＬＡクラスＩ抗原はさらにＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃなどに分類され、その遺伝子には多型が存在する。そのうちのＨＬＡ−Ａ２４アレル（ａｌｌｅｌｅ）は日本人の約６０％（多くは、その９５％の遺伝型がＡ２４０２である）、コーカサス人の２０％、アフリカ人の１２％に、ＨＬＡ−Ａ２アレルは日本人の約４０％、中国人の約５３％、北アメリカ白人の約４９％、南アメリカ白人の約３８％、およびアフリカ黒人の約２３％にみられる。ＨＬＡ分子は、様々な腫瘍抗原の抗原提示に決定的な役割を果たしているとの報告がなされている（Ｂａｕｅｒ，Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｈｉｓｔｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ，ｅｄ．Ｔｅｒａｓｋｉ．Ｐ．Ｉ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ），ｐ９５５，１９８０；ＭｃＭｉｃｈａｅｌ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２，Ｓｕｐｐｌ．２，１９５−２０３，１９８０；Ｗｏｌｆｅｌ．Ｔ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７０，７９７−８１０，１９８９；Ｓｌｏｖｉｎ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，３０４２−３０４８，１９８６；Ｓｃｈｅｎｄｅｌ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，４２０９−４２２０，１９９３）。
したがって、ＨＬＡクラスＩ分子によって腫瘍細胞表面上に提示され、かつ、腫瘍特異的ＣＴＬによって認識される抗原ペプチドを同定することは、癌免疫療法において癌ワクチンとして用いるペプチドワクチンの開発につながるものと考えられている（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４３２−４３６，Ｊａｎ．１９９５）。
しかしながら、ペプチドワクチンとして使用できる可能性のあるヒト腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、ＭＡＧＥ（ｍｅｌａｎｏｍａ  ａｎｔｉｇｅｎ、メラノーマ抗原）などのわずかな例外を除き間接的にしか示されていない（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４，１６４３−１６４７，１９９１）。そのような遺伝子やペプチドを検出することは、かかる腫瘍免疫の存在を実証することになるが、メラノーマは残念ながら悪性腫瘍のわずか３％、また癌死亡率全体のわずか１％を占めるだけである（Ｆｒａｕｍｅｎｉ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．ＤｅＶｉｔａ，Ｖ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，ｐ．１５４，１９９３）。
近年、特に乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な因子として注目を集めているのが、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）である。このＨＥＲ２はヒト上皮増殖因子受容体の１つであり、そのＨＥＲ２遺伝子は、膜貫通型チロシンキナーゼ受容体をコードし、多くの固形癌、特に乳癌において高い頻度で過剰発現していることが認められている。このＨＥＲ２の過剰発現が発癌性への形質転換を惹起し、細胞増殖の促進と調節異常をもたらすことが明らかにされている。また、ＨＥＲ２の過剰発現と予後との相関関係が、多くの臨床研究において報告されている。特に、乳癌におけるＨＥＲ２の過剰発現は、乳癌の予後ならびに治療効果を予測する重要な指標として認識されている。
ＨＥＲ２の１つであるＨＥＲ２／ｎｅｕは、上皮増殖因子受容体と高い相同性を有する１８５キロダルトンの膜貫通型チロシンキナーゼ受容体である（Ｃａｕｓｓｅｎｓ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０，１１３２−１１３９，１９８５，１９８５；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１９，２３０−２３４，１９８６）。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、様々な上皮腫瘍において発現が高く、特に結腸直腸癌においてはその原発部位ばかりではなく転移領域においても高発現している（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（１），９４−９９，２００１）。更に、卵巣癌と乳癌の約３０ないし４０％に過剰発現していると報告されている（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，７０７−７１２，１９８９）。ＨＥＲ２／ｎｅｕは、数多くの悪性腫瘍に高発現しているのに対して、正常細胞では発現していないか、または低レベルでしか発現していないことから、プロトタイプＴＡＡとして考えられており、癌免疫療法の強力な抗原候補となり得る。
日本人とコーカサス人に最も共通しているアレルの１つであるＨＬＡ−Ａ２４に対する結合親和性を有するペプチドの中からＨＥＲ２／ｎｅｕのＣＴＬエピトープを同定したとの報告がある（Ｔａｎａｋａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８４（１），９４−９９，２００１）。この報告では、ＨＬＡ−Ａ２４結合性ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドであるコードＨＥ１（アミノ酸位置８−１６）：Ａｒｇ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕを、最も強い親和性を有し、ＣＴＬ誘導能を有するワクチン候補ペプチドとして同定している。他のＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドであるＨＥＲ２ｐ６３（Ａ）：Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ａｌａ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  ＬｅｕおよびＨＥＲ２ｐ６３（Ｔ）：Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕも、卵巣癌患者と健常人においてＣＴＬを誘導するとの報告がされている（Ｏｋｕｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０００，３０；３３３８−３３４６）。ＨＬＡ−Ａ２結合性ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドも数多く報告されている（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４３２−４３６，Ｊａｎ．１９９５；Ｆｉｓｋ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１，２１０９−２７１７，１９９５；Ｉｏａｎｎｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２２５，１９９３；Ｐｅｉｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２７：１１１５，１９９７；Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｒｅｓ，５８：７３２，１９９８；Ｂｒｏｓｓａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎ  Ｒｅｓ，５８：７３２，１９９８；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，６：４１９２，２０００；Ｋｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，８：３３９４，２００２；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２２：１４８１，２００２；Ｍｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ，８：３４０７，２００２；Ｓｃａｒｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｒｕ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏ，３１：３２６１，２００１；Ｓｃａｒｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６８：５９００，２００２）。
また、ＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチドのうち、ＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の膜貫通型膜部分からなるアミノ酸９個のペプチド（ＧＰ２、アミノ酸位置６５４−６６２）が卵巣癌と乳癌の両者のＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞中で幅広く発現され、それを癌特異的に認識するＣＴＬが見い出され（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４３２−４３６，Ｊａｎ．１９９５；Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３１９，２３０−２３４，１９８６；Ｆａｌｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３５１，２９０−２９６，１９９１）、ＧＰ２は癌免疫療法のペプチドワクチンとして有用であろうと考えられている（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４３２−４３６，Ｊａｎ．１９９５）。ＨＬＡ−Ａ２結合性ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドｐ３６９−３７７（ｐ３６９）を、癌免疫療法として、ＨＥＲ２／ｎｅｕを過剰発現している転移性乳癌、卵巣癌または結腸直腸癌のＨＬＡ−Ａ２陽性癌患者に対して使用した事例も報告されている（Ｚａｋｓ，Ｔ．Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８，４９０２−４９０８，Ｎｏｖ．１，１９９８）。
以上のように、ＨＬＡ拘束性ＣＴＬを誘導することができるいくつかの免疫原性を有するＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドがすでに報告されている。しかしながら、知る限りにおいては、これらのペプチドで誘導されたＣＴＬは、初期臨床試験においてｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を認識しなかった（ｚｕｍ  Ｂｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，２２４４−２２４７，Ａｐｒｉｌ  １５，２００２；Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１１，３３６３−３３６７，１９９７；Ｊａｇｅｒ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，１２１９８−１２２０３，２０００）。この失敗は、一部には、これらのペプチドの免疫原性が弱かったことによると思われる。
抗腫瘍免疫応答においては、ＣＴＬのみならずヘルパーＴ細胞も決定的な役割を果たしている。ヘルパーＴ細胞とＣＴＬの両方の応答を誘導することができる抗原ペプチドを同定し、それをワクチンとして導入できれば、癌免疫療法を効果的に実施できると考えられている。
かかる背景に基づいて、以下のようなＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドが報告されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，５２２８−５２３６，Ｓｅｐｔ．１５，２０００）。報告されているペプチド内のＣＴＬエピトープのアミノ酸配列を以下に示す（括弧内の数字はＣＴＬエピトープのアミノ酸開始位置を示す）：ＨＥＲ１１２４：Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｃｙｓ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ；ＨＥＲ７６５（７６８）：Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｐｒｏ；ＨＥＲ８２２（８２５）：Ｔｒｐ  Ｃｙｓ  Ｍｅｔ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｍｅｔ；ＨＥＲ８８３（８８８）：Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ；ＨＥＲ７６５（７６８）：Ｌｅｕ  Ａｓｐ  Ｇｌｕ  Ａｌａ  Ｔｙｒ  Ｖａｌ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｇｌｙ；ＨＥＲ８８３（８８６）：Ｉｌｅ  Ｌｙｓ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ；ＨＥＲ６０５（６０８）：Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｍｅｔ  Ｐｒｏ  Ｉｌｅ  Ｔｒｐ  Ｌｙｓ  Ｐｈｅ；ＨＥＲ６２（６５）：Ｌｅｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ；ＨＥＲ６４８（６５１）：Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｖａｌ。
ＨＥＲ２が乳癌などの多数の癌において高レベルで発現することから、液性免疫と細胞性免疫におけるターゲットになりうるとの報告がなされている（ｚｕｍ  Ｂｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅ，Ｃ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，２２４４−２２４７，Ａｐｒｉｌ  １５，２００２）。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原に対する細胞性および液性免疫応答は、相当の割合の乳癌ならびに卵巣癌患者に検出される（Ｐｅｏｐｌｅｓ，Ｇ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，４３２−４３６，Ｊａｎ．１９９５；Ｄｉｓｉｓ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４，１６−２０，１９９４）。また、ヒト型化抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であるハーセプチンが、その腫瘍がＨＥＲ２／ｎｅｕ抗原を過剰発現している乳癌患者において腫瘍を退縮させることが報告されている（Ｖｏｇｅｌ，Ｃ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２０，７１９−７２６，２００２；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ，Ｈ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２１，４６−５３，２００３）。
ＣＴＬエピトープペプチドとして同定されたペプチドのいくつかが、第１相臨床試験において細胞性ならびに液性免疫応答の両者を誘導する能力を有していることが（Ｍｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，９４：５４８−５６，２００３）、また細胞性免疫応答ならびに液性免疫応答の両者を誘導することができるペプチドが免疫原性を有するということが報告されている（Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｓｔａｔｅ，５７：８０−９２，２００３）。その生物学的役割はまだ解明されていないが、ワクチン投与後の血清中の抗ペプチド抗体のレベルがペプチドワクチンを投与した進行肺癌患者の生存と非常によく相関していることが判明した（Ｍｉｎｅ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉ．，９４：５４８−５６，２００３）。
以上のことから、細胞性および液性免疫応答の両者を誘導する新規なＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドを同定することは、効果の高いペプチドワクチンの開発および癌免疫療法の発展に重要であろう。
【発明の開示】
そこで本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２拘束性に細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）によって認識され、ＣＴＬを誘導し、かつ液性免疫を誘導する、ペプチドワクチンの新規候補として有用なＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドを同定し、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性癌患者に有効な癌免疫療法を提供することを目的としている。
本発明者らは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ特異的な細胞性免疫および液性免疫応答を誘導するＣＴＬエピトープペプチドを同定した。ＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性ペプチドに対するＩｇＧが、試験した癌患者の血清中に高頻度に検出された。また、これらペプチドが該患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）中においてペプチド特異的および腫瘍反応性ＣＴＬ活性を誘導することを見出し、本発明を完成した。
即ち、本発明は、
（１）  特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導するＨＥＲ２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性抗原ペプチドを含むポリペプチドまたは変異ポリペプチド；
（２）  抗原ペプチドがＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、ＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である、上記（１）記載のポリペプチド；
（３）  ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、ＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である抗原ペプチド；
（４）  上記（１）または（２）記載のポリペプチドまたは請求項３記載の抗原ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはその相補鎖である核酸配列分子；
（５）  上記（４）記載の核酸配列分子を含有するベクター；
（６）  上記（１）または（２）記載のポリペプチドまたは上記（３）記載の抗原ペプチドを特異的に認識する抗体。
（７）  上記（１）または（２）記載のポリペプチド、上記（３）記載の抗原ペプチド、または上記（４）記載の核酸配列分子を含む、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導するための医薬組成物；
（８）  癌を処置するための、上記（７）記載の医薬組成物；
（９）  上記（１）または（２）記載のポリペプチド、上記（３）記載の抗原ペプチド、または上記（４）記載の核酸配列分子、によって特異的に誘導されるＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞；
（１０）  ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、またはＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）である抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２４抗原との複合体を認識するＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞；
（１１）  ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）である抗原ペプチドとＨＬＡ−Ａ２抗原との複合体を認識するＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞；
（１２）  上記（２）記載のポリペプチドまたは上記（３）記載の抗原ペプチドを用い、ＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する方法；
（１３）上記（１）または（２）記載のポリペプチドまたは上記（３）記載の抗原ペプチドを使用して癌を処置する方法；
（１４）癌の処置における上記（１）または（２）記載のポリペプチドまたは上記（３）記載の抗原ペプチドの使用に関する。
また、本発明は、本発明の核酸配列分子、および／または個体由来の試料中の該ペプチドもしくは該ポリペプチドをマーカーとして分析し、該ペプチド関連疾病を診断する診断方法に関する。
本発明のＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドは、細胞性免疫ならびに液性免疫によって認識され、またそれらを惹起するので、癌ワクチンとして、あるいは該ペプチド関連疾病の診断等に有用である。
【図面の簡単な説明】  図１は、乳癌患者（Ｐｔ）３名と女性健常者（ＨＤ）１名の血清中におけるＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ペプチドに反応するＩｇＧの検出を示すグラフ。
図２は、吸収試験による抗ペプチドＩｇＧのペプチド特異性を示すグラフ。
図３は、ＨＬＡ−Ａ２４結合性ペプチド刺激により誘導されるＭＨＣ拘束性細胞傷害活性を示すグラフ。
図４Ａは、乳癌患者（Ｐｔ）６名の血清中におけるＨＬＡ−Ａ２結合性モチーフを有するＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ペプチドに反応するＩｇＧの検出を示すグラフ。
図４Ｂは、吸収試験による抗ペプチドＩｇＧのペプチド特異性を示すグラフ。
図５Ａは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞としてＳＫＯＶ３−Ａ２およびＳＫＯＶ３−ｎｕｌｌを使用。
図５Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞としてＳＫＯＶ３−Ａ２およびＳＫＯＶ３−ｎｕｌｌを使用。
図５Ｃは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞として１−８７細胞株（ＨＬＡ−Ａ２陽性）およびＱＧ５９（ＨＬＡ−Ａ２陰性）を使用。
図５Ｄは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬの細胞傷害活性を示すグラフ。標的細胞として１−８７細胞株（ＨＬＡ−Ａ２陽性）、ＱＧ５９（ＨＬＡ−Ａ２陰性）およびＰＨＡ芽球化細胞を使用。
図６Ａは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬのＭＨＣ拘束性およびＣＤ８＋Ｔ細胞依存性。標的細胞としてＴ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＡＴＣＣ寄託番号：ＣＲＬ−１９９２）を使用。
図６Ｂは、ＨＬＡ−Ａ２結合性ペプチド刺激により誘導されたＣＴＬのＭＨＣ拘束性ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞依存性、およびＣＴＬのペプチド特異的細胞傷害活性の確認。
図７は、ウェスタンブロットによる各種細胞株におけるＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の同定。
【発明を実施するための最良の形態】（ペプチドおよびポリペプチド）
１．本発明のペプチド
本発明の抗原ペプチドは、特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する、ＨＥＲ２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性ペプチドである。そのアミノ酸残基数は通常８−１１個、好ましくは９−１１個、より好ましくは９個または１０個である。その例として、ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）またはＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）などが挙げられる。「ＨＥＲ２３４２−３５０」とは、ＨＥＲ２／ｎｅｕの全アミノ酸配列のアミノ酸位置３４２−３５０に相当するペプチドを意味する。また、本明細書および図面において「ＨＥＲ２３４２−３５０」は、そのアミノ酸配列開始位置の番号により「ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ３４２」とも表記される。ＨＥＲ２／ｎｅｕの全アミノ酸配列は受託番号Ｐ０４６２６としてＧｅｎｅＢａｎｋに登録されている（配列番号１０）。
「特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し、かつ特異的な抗体を誘導する」とは、特異的な細胞性免疫および液性免疫応答を誘導することを意味する。細胞性免疫および液性免疫応答の両者を誘導しうることから、高い免疫原性を有すると言える。
また、本発明の抗原ペプチドは、上記配列番号１ないし９のいずれか１つのアミノ酸配列で示されるペプチドと、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％を超える相同性を有する変異ペプチドであってもよい。このような相同性をもつペプチドは、少なくともＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる認識性の強さを指標にして選択することができる。これらペプチドのアミノ酸数は、ＨＬＡ分子と結合して抗原提示細胞表面上に提示されうる数であり、かつＣＴＬにより認識されるエピトープペプチドとしての性質を有する数であればよく、少なくとも約８個以上、好ましくは約９個以上、さらに好ましくは９個ないし１０個である。
本発明の抗原ペプチドを含むポリペプチドは、通常アミノ酸残基数８−５０個、好ましくは９−３０個であり、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる認識性の強さを指標にして選択される。含まれる抗原ペプチドは、ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）またはＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）、またはＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）が特に好ましい。
本発明の変異ポリペプチドは、前述のポリペプチドと好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％を超える相同性を有し、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる認識性の強さを指標にして選択されるポリペプチドである。
アミノ酸配列の相同性を決定する技術はそれ自体公知であり、例えば、アミノ酸配列を直接決定する方法、推定される塩基配列を決定後に該塩基配列に基づいてこれにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等を用いることができる。
変異ペプチドおよび変異ポリペプチドには、本発明の抗原ペプチドまたはポリペプチドのアミノ酸配列に対して、１個ないし数個のアミノ酸を欠失、置換、付加、挿入した、あるいは誘発変異を有するアミノ酸配列からなるペプチドが含まれる。欠失、置換、付加、挿入などの変異あるいは誘発変異を導入する手段はそれ自体公知であり、例えばウルマーの手法などを利用することができる。さらに、本発明のペプチドは、その構成アミノ基もしくはカルボキシル基などを修飾するなど、機能の著しい変更を伴わない程度に改変することも可能である。
なお、本明細書において、「本発明のペプチド」と単に記載した場合、特記なき限り、本発明の抗原ペプチドならびにポリペプチドおよびそれらの変異ペプチド、変異ポリペプチドを含んでいるものと理解すべきである。
本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬにより認識され、該ＣＴＬを活性化することができ、腫瘍抗原としての機能を有する。
本発明のペプチドは、通常のペプチド化学において公知の方法により製造することができる（ペプチド合成（丸善）１９７５年；”Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６；“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｖｏｌ．２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７６）。
２．本発明の抗原ペプチドの同定
本発明の抗原ペプチドは、ＨＥＲ２／ｎｅｕのアミノ酸配列（配列番号１０）の一部に相当し、かつＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性モチーフを有する候補ペプチドの中から、液性免疫による認識およびペプチド特異的ＣＴＬの誘導能に基づいて選択する。
液性免疫による認識は、ＨＥＲ２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２結合性ペプチドに反応するＩｇＧが、乳癌患者の血清中に検出できるかどうかを調べることによって検討することができる。ペプチド特異的ＩｇＧは、血清サンプルについて、候補ペプチドを使用してＥＬＩＳＡにより測定する。ペプチド特異的ＩｇＧは、血清サンプルを０．０５％ツイーン２０−ブロックエース（登録商標、ＭＥＧＭＩＬＫ、日本）で連続的に希釈し、希釈血清をペプチド固定プレートに添加して、二次抗体としてラビット抗ヒトＩｇＧ（γ）鎖特異的を用いて検出することができる。
ペプチド特異的ＣＴＬ誘導能については、初めに、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を候補ペプチドと共に培養し、対応するペプチドをパルスした標的細胞に対する、そのＰＢＭＣのＩＦＮ−γ産生能を測定する。次に、上記のＩＦＮ−γ産生を示したＰＢＭＣについて、更に標準６時間５１Ｃｒリリースアッセイにてペプチドパルス標的細胞に対する傷害性を測定してペプチド特異的ＣＴＬ誘導能を検討する。
３．本発明のペプチドの選択
本発明の抗原ペプチドの変異ペプチド、本発明の抗原ペプチドを含むポリペプチドおよびその変異ポリペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２４またはＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＴＬによる認識性の強さを指標にして選択することができる。ＣＴＬによる認識性は、それらペプチドをパルスした標的細胞に対する、それらペプチドの基礎となる抗原ペプチドに特異的なＣＴＬの、ＩＦＮ−γ産生および細胞傷害性により評価することができる。
（核酸配列分子）
本発明の核酸配列分子は、本発明のペプチドのアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドもしくはそれらに対する相補鎖であり、少なくとも約２４個以上の塩基からなる。核酸配列分子は、典型的遺伝子工学的方法に従い、例えば”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）のような標準的テキストの記載に従い容易に調製することができる。
本発明の核酸配列分子を含有するベクターは、遺伝子発現に常套的に用いられるベクターに本発明の核酸配列分子を組み込んだものであり、プラスミドベクターおよびウィルスベクターが含まれる。ウィルスベクターの例としては、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクチニアウィルス、ポックスウィルス、ポリオウィルス、またはシンドビスウィルス等が挙げられる。
（ＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性ＣＴＬ）
ＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性ＣＴＬは、乳癌や卵巣癌などの患者から得たＰＢＭＣを、本発明のペプチドまたは核酸配列分子を用いてＣＴＬエピトープペプチドを提示させた抗原提示細胞と共に培養することで誘導できる。ＣＴＬの誘導は、前述のようにＩＦＮ−γ産生および標準６時間５１Ｃｒリリースアッセイにて確認する。誘導したＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性ＣＴＬは、本発明のペプチドの効能の測定や、また、養子免疫療法にも利用可能である
従って本発明のペプチドまたは核酸配列分子は、ＣＴＬ誘導剤として使用でき、またＨＥＲ２／ｎｅｕ反応性ＣＴＬの誘導方法に使用できるといえる。
（抗体）
本発明に係る抗体は、本発明のペプチドを免疫学的に認識することができるものであって、本発明のペプチドの抗原決定基を利用し作製することができる。この抗原決定基は、少なくとも５個、より好ましくは少なくとも８−１０個のアミノ酸で構成される。このアミノ酸配列は、配列番号１ないし９に記載のアミノ酸配列と完全に相同である必要はないが、少なくともこのアミノ酸配列からなるペプチドが、ＣＴＬによる認識性を有するものであることが必要である。
本発明の抗体は、本発明のペプチドまたはその抗原決定基をアジュバントの存在または非存在下で、単独または担体に結合して、動物に対して液性免疫応答および／または細胞性免疫応答等の免疫誘導を行うことによって産生することができる。担体は、それ自体が宿主に対して有害作用をおこさなければ、特に限定されるものではなく、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミン等を使用することができる。免疫される動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ等が好適に用いられる。得られたポリクローナル抗体は、好ましくは免疫アフィニティークロマトグラフィー法などのそれ自体公知の抗体回収法によって血清から取得することができる。
一方、モノクローナル抗体は、上記の免疫手段が施された動物から抗体産生細胞を回収し、それ自体公知の永久増殖性細胞へ導入することによって生産することができる。このようにして得られたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、精製用抗体、試薬、標識マーカー等として利用することができる。
（医薬組成物）
本発明に係る医薬組成物は、本発明のペプチド、核酸配列分子、ベクター、または抗体を、単独または複数組合せて利用することによって調製することができる。
具体的には、例えば、本発明のペプチドは、癌を処置するため、いわゆる癌ワクチンとして使用することができる。本発明のペプチドによって処置することができる癌として乳癌、卵巣癌等があげられるが、特に乳癌が好ましい。
１種類のペプチドのみでも癌ワクチンとして有効であるが、好ましくは複数種類のペプチドを組合せて使用するのがよい。癌患者のＣＴＬは、複数の腫瘍抗原を認識する細胞の集団であるので、１種類のペプチドを癌ワクチンとして使用するよりも、複数の異なる腫瘍抗原を組合せて癌ワクチンとして使用する方が、より高い効果が得られることが期待される。腫瘍抗原を組合せて使用する場合、本発明のペプチドから選ばれるペプチドを組み合わせて使用してもよい。
また、本発明に係る癌ワクチンは、細胞性および液性免疫の賦活のために、適当なアジュバントの存在または非存在下で、単独で使用するかまたは担体に結合して使用することができる。使用する担体は、それ自体人体に対して有害作用をおこさない限り、特に限定されるものではなく、例えば、セルロース、重合アミノ酸、アルブミン等を使用することができる。剤形としては、それ自体公知のペプチド製剤の手段を応用して適宜選択できる。その投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、一般的には活性本体として０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは０．１ｍｇ〜１０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数月に１回投与する。
本発明に係る医薬組成物は、例えば、ベクターに担持させて直接体内に導入する方法またはヒトから細胞を採取して体外で導入する方法などによって利用することができる。使用できるベクターとしては、例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等が挙げられるが、レトロウイルス系が好ましい。無論これらウイルスは複製欠陥性である。その投与量は、ＣＴＬによる認識性により変化するが、一般的には、上記抗原ペプチドをコードするＤＮＡ含量として０．１μｇ−１００ｍｇ／日／成人ヒト、好ましくは１μｇ−５０ｍｇ／日／成人ヒトである。これを数日ないし数月に１回投与する。
以下、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明は下記実施例によって一切限定されるものではない。
【実施例】［実施例１］
ＨＬＡ−Ａ２４結合性抗原ペプチド
（材料および方法）
１．サンプルおよび細胞株
乳癌と診断された１７名の患者から血清、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および組織を採取した。これらの乳癌組織中でのＨＥＲ２／ｎｅｕの発現程度を調べ、スコア０と１＋の癌組織をＨＥＲ２／ｎｅｕに対して陰性と判断し、他方スコア２および３の癌組織をＨＥＲ２／ｎｅｕに対して陽性と判断した。また、ＰＢＭＣと血清を９名の女性健常者（ＨＤ）から採取した。全ての血清は−８０℃で保存し、ＰＢＭＣは−１９６℃で凍結保存した。ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＨＬＡ−Ａ３／２８）と、そのＨＬＡ−Ａ２４トランスフェクトＳＫＯＶ３−Ａ２４は三重大学の好意により提供された（Ｏｋｕｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ＨＥＲ２−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  Ｋｄ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ）。ＣＩＲ−Ａ２４０２（ＨＬＡ−２４０２トランスフェクタント細胞株）は血液細胞白血病由来突然変異細胞株であり、熊本大学の好意により提供された（Ｄｒ．Ｍａｓａｆｕｍｉ  Ｔａｋｉｇｕｃｈｉ（Ｋｕｍａｍｏｔｏ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ、文献：Ｋａｒａｋｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＨＬＡ−Ｂ５１  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｓ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ＨＬＡ−Ａ，Ｂ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，３７：１３９−１４２，１９９３．）。また、ＰＢＭＣからのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）−芽球化Ｔ細胞は、Ｃｒリリースアッセイの標的細胞のネガティブコントロールとして使用した。
２．ペプチド特異的ＩｇＧの定量
図１に示される１０個のペプチドは委託合成したものを使用した。具体的には、ＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ペプチドであるＨＥＲ２８−１６、ＨＥＲ２６３−７１、ＨＥＲ２３４２−３５０（配列番号１）、ＨＥＲ２４４０−４４８、ＨＥＲ２４８５−４９３（配列番号２）、ＨＥＲ２５５３−５６１（配列番号３）、ＨＥＲ２９０７−９１５（配列番号４）、ＨＥＲ２９６８−９７６、ＨＥＲ２１０２２−１０３０、ＨＥＲ２１２１２−１２２０を本実験に用いた。
そのうちで、ＨＥＲ２８−１６とＨＥＲ２６３−７１とはＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識されるペプチドとして報告されている。被験者にはＨＩＶキャリアはいなかったので、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するＨＩＶペプチド（ＲＹＬＲＤＱＱＬＬ）をネガティブコントロールとして使用した。血清中のペプチド特異的ＩｇＧレベルは、既報のようにＥＬＩＳＡによって測定した（Ｏｈｋｏｕｃｈｉ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｎ−ｍｕｔａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｔ  ｔｙｐｅ−Ｉ  ａｌｌｅｒｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ，５９：２５９−，２００２．、Ｋａｗａｍｏｔｏ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＩｇＧ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｔｏ  ＣＴＬ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｓ  ｅｉｔｈｅｒ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｏｒ  ｕｎｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎ  ａｔｏｐｉｃ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，６１：３５２−３６１，２００３．）。
血清または血漿サンプルは、０．０５％ツイーン２０−ブロックエース（ＭＥＧＭＩＬＫ、日本）で連続的に希釈し、希釈血清（１ウェル当り１００μＬ）をペプチド（１ウェル当り２０μｇ）固相化ＮｕｎｃＣｏｖａｌｉｎｋプレートに添加した。抗体はウサギ抗ヒトＩｇＧ（γ鎖特異的）を用いて検出した。
ＥＬＩＳＡの感度限度を決定するために、１４名の健常者（ＨＩＶ陰性）からの血清について、上記アッセイによって、ネガティブコントロールペプチドとしてのＨＩＶペプチドの反応性を調べた。ＥＬＩＳＡによる光密度の平均±ＳＤ値は０．０４０±０．０３０で示された。平均＋ＳＤ値（０．０７０）をカットオフ値として決定した。血清サンプル中の抗ペプチド抗体活性の特異性を試験するために、血清サンプル（０．０５％ＰＢＳＴでｘ１００倍希釈）１００μｌ（１ウェル当り）を、プレートウェル中の固相化ペプチド（１ウェル当たり２０μｇ／ｍｌペプチド溶液で固相化）に３７℃で２時間静置し結合させた。この結合操作を３度繰り返した後、ＥＬＩＳＡでその活性を試験した。
３．ＣＴＬ誘導
ＨＬＡ−Ａ２４陽性乳癌患者８名とＨＬＡ−Ａ２４陽性健常者５名からのＰＢＭＣをＣＴＬ誘導アッセイの対象として使用した。ペプチド特異的ＣＴＬの誘導のために、既報のように（Ｉｔｏ，Ｍ．，Ｓ．Ｓｈｉｃｈｉｊｏ，Ｙ．Ｍｉｙａｇｉ，Ｔ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｎ．Ｔｓｕｄａ，Ａ．Ｙａｍａｄａ，Ｎ．Ｓａｉｔｏ，ａｎｄ  Ｋ．Ｉｔｏｈ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＡＲＴ３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｅｄ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＴＬｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ＨＬＡ−Ａ２  ｓｕｂｔｙｐｅｓ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８８：６３３，２０００．）、ＰＢＭＣを９６ウェルミクロカルチャープレートのウェル中で各ペプチド（１０μＭ）を添加したＩＬ−２含有培地２００μＬを用いて培養した。
培養１４日目に、細胞を回収し、洗浄した後、対応するペプチドまたはネガティブコントロールペプチド（上記ＨＩＶペプチド）をパルスしたＣＩＲ−Ａ２４（ＨＬＡ−Ａ２４０２ｃＤＮＡをトランスフェクトした、形質細胞性白血病由来変異細胞株（Ｃ１Ｒ））に応答するＩＦＮ−γ産生能について試験した。１８時間培養した後、培養上清を集めてＥＬＩＳＡにてＩＦＮ−γを測定した。陽性応答を示すＰＢＭＣを回収して更にＩＬ−２だけと１０−１４日間培養して大量の細胞を得、標準６時間５１Ｃｒリリースアッセイに付した。抑制試験のために、それぞれ２０μｇ／ｍｌの抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｗ６／３２、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡ−Ａ２抗体（ＢＢ７．２、ＩｇＧ２ｂ）、抗ＣＤ８抗体（Ｎｕ−Ｔｓ／ｃ、ＩｇＧ２ａ）、抗ＨＬＡクラスＩＩ抗体（Ｈ−ＤＲ−１、ＩｇＧ２ａ）、抗ＣＤ４抗体（Ｎｕ−Ｔｈ／ｉ、ＩｇＧ１）を用いた。抗ＣＤ１４抗体（ＪＭＬ−Ｈ１４、ＩｇＧ２ａ）をコントロールとして使用した。Ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ−ｔ試験を用いて統計学的分析を行った。
（液性免疫によって認識されるペプチドの同定）
ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するＨＥＲ２／ｎｅｕ由来ペプチドに反応するＩｇＧが乳癌患者（ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍の患者１３名とＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性患者４名）と女性健常者（ＨＤ）８名の血清中に検出できるかどうかを調べた。
その結果、ペプチドＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１、ＨＥＲ２９０７−９１５およびＨＥＲ２９６８−９７６に反応する有意レベルのＩｇＧがそれぞれ８名、４名、４名、３名および１名のＨＬＡ−Ａ２４陽性乳癌患者から検出された。これら陽性の血清は、その腫瘍が免疫組織化学的試験によりＨＥＲ２／ｎｅｕ陰性であった１例（Ｐｔ１０）を除いて、全てＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍の患者由来のものであった。これに対して、残り５種類のペプチド（そのうちの２種類はＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＣＴＬによって認識されると報告されているＣＴＬエピトープペプチドである）に反応する有意レベルのＩｇＧは全く検出されなかった。また、８名の健常者のうち、１名、４名および１名の血清からそれぞれＨＥＲ２６３−７１、ＨＥＲ２３４２−３５０とＨＥＲ２５５３−５６１に反応する有意レベルのＩｇＧが検出された。
４例（Ｐｔ５、９、１３およびＨＤ７）の代表的結果を図１に示し、概要を表１に示す。
2005007694.tif 000002
抗ペプチドＩｇＧのペプチド特異性は吸収試験により確認した。その代表的結果を図２に示す。抗ＨＥＲ２５５３−５６１活性は、ネガティブコントロールとして使用したＨＩＶペプチドを含むＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有する無関係なペプチドによって吸収され、一方ＨＬＡ−Ｂ４６０１結合性モチーフを有するＨＩＶペプチドでは吸収されなかった。このことは、抗ＨＥＲ２５５３−５６１ペプチドＩｇＧの、ＨＬＡ−Ａ２４結合性モチーフを有するペプチドに対する交差反応を示唆している。
これらの知見に基づいて、ＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１およびＨＥＲ２９０７−９１５ペプチドおよび以前報告されたＣＴＬエピトープペプチド（ＨＥＲ２８−１６およびＨＥＲ２６３−７１ペプチド）について、ＣＴＬ誘導能を試験した（ＣＴＬ誘導能は、１０種類全部で行った；表１参照）。
（細胞性免疫によって認識されるペプチドの同定）
乳癌患者８名（ＨＥＲ２陽性腫瘍患者６名とＨＥＲ２陰性腫瘍患者２名）および女性健常者（ＨＤ）５名からのＰＢＭＣを６種類のペプチド（純度９０％以上）：ＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１ＨＥＲ２９０７−９１５ペプチド、ＨＥＲ２８−１６、ＨＥＲ２６３−７１ペプチドまたはコントロールとしてのＨＩＶペプチドとともにそれぞれ培養し、対応するペプチドをパルスしたＣ１Ｒ−Ａ２４細胞に応答したＩＦＮ−γ産生について試験をした。その結果も表１に示している。
上記８名の患者のうち、患者１名と２名において、それぞれＨＥＲ２８−１６ならびにＨＥＲ２６３−７１がペプチドに特異的なＩＦＮ−γ産生を誘導した。また、患者４名、５名、２名および１名において、それぞれＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１およびＨＥＲ２９０７−９１５が、ペプチドに特異的なＩＦＮ−γ産生を誘導した。更にこれらペプチドのいくつかは、２、３名の健常ドナーにおいてもかかる活性を誘導した。
これらのＰＢＭＣによって産生されたＩＦＮ−γのレベルは抗クラスＩ抗体（Ｗ６／３２）または抗ＣＤ８抗体によって有意的に抑制されるが、他の抗体によっては抑制されない。このことは、これらのＣＴＬ活性がＨＬＡクラスＩ拘束性ＣＤ８陽性Ｔ細胞によって担われていることを示唆している。
更に、ＳＫＯＶ３−Ａ２４細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陽性、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性）を標的細胞として用いて５１Ｃｒリリースアッセイを行い、上記陽性応答を示すＰＢＭＣにおいて有意レベルのＣＴＬが誘導されていることを確認した。一方、試験した全ての事例においてＳＫＯＶ３細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陰性、ＨＥＲ２陽性）およびＰＨＡ−芽球化Ｔ細胞（ＨＬＡ−Ａ２４陽性）は傷害されず、このことはこれら細胞に対するＣＴＬが誘導されていないことを示している。２つの事例（Ｐｔ１０、１３）の代表的結果を図３に示す。ネガティブコントロールとしてのＨＩＶペプチドで刺激したＰＢＭＣはかかる細胞傷害性を示さなかった。抗クラスＩ抗体による抑制試験により、この細胞傷害性のＨＬＡクラスＩ拘束性を確認した。
以上の結果より、ペプチドＨＥＲ２３４２−３５０、ＨＥＲ２４８５−４９３、ＨＥＲ２５５３−５６１およびＨＥＲ２９０７−９１５を、細胞性免疫および液性免疫の両者を誘導可能なＨＬＡ−Ａ２４結合性抗原ペプチドとして同定した。
［実施例２］
ＨＬＡ−Ａ２結合性抗原ペプチド
実施例１と同様の手法によりＨＥＲ２／ｎｅｕのＨＬＡ−Ａ２結合性抗原ペプチドを同定した。
表２に示す１２種類のペプチド（ＨＥＲ２４４４−４５３（配列番号５）、ＨＥＲ２４６６−４７４（配列番号６）、ＨＥＲ２４８４−４９３（配列番号７）、ＨＥＲ２７８５−７９４（配列番号８）およびＨＥＲ２８５１−８５９（配列番号９）を含む）に対する抗体のスクリーニング結果を表２に示す。また、６例の代表的結果を図４Ａに、ペプチド特異性の確認の結果を図４Ｂに示す。複数の血清で認識されたペプチドに関するＣＴＬ誘導の結果は表３に示す。なお、ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ３６９は、ＣＴＬが認識するコモンエピトープとして報告されているペプチドであり（Ｆｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ｐｒｏｔｏｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ｏｖａｒｉａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８１：２１０９−２１１７，１９９５．）、本実験ではコントロールとして用いている。
2005007694.tif 000003
2005007694.tif 000004
また、誘導されたＣＴＬのうち、細胞が増えた分について、５１Ｃｒリリースアッセイ、および抗体およびコールド標的細胞による抑制試験を行った。５１Ｃｒリリースアッセイによる細胞傷害活性の結果を図５に、抑制試験の結果を図６に示す。各種細胞株におけるＨＥＲ２／ｎｅｕタンパク質の発現は図７に示す。
以上の結果より、ペプチドＨＥＲ２４４４−４５３、ＨＥＲ２４６６−４７４、ＨＥＲ２４８４−４９３、ＨＥＲ２７８５−７９４、およびＨＥＲ２８５１−８５９を、細胞性免疫および液性免疫の両者を誘導可能なＨＬＡ−Ａ２結合性抗原ペプチドとして同定した。
産業上の利用の可能性
ＣＴＬエピトープペプチドに対して反応するＩｇＧは、癌患者のワクチン投与前の血清中ならびに健常者の血清中にしばしば検出される。また、ワクチン投与後の血清中の抗ペプチド抗体レベルは、ペプチドワクチンを投与した進行肺癌患者の生存と深く相関関係を有していた。更に、これらのペプチドに反応するＩｇＧは、アトピー性疾患を有する患者の血清中では不足しているかまたはバランスを失っているかである。癌患者における抗腫瘍免疫応答のメカニズムはいまだ明らかではないが、以上の結果は、これらペプチドに対するＩｇＧが種々の疾患に対する宿主防御において役割を果たしていることを示唆している。
抗ペプチドＩｇＧは、試験をした限りにおいては、ペプチドが由来したタンパク質には反応せず、またインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で腫瘍細胞の細胞増殖を直接阻害することも、腫瘍細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性を導き出すこともなかった。したがって、本発明における抗ＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドＩｇＧは、腫瘍細胞に対する直接的作用には役割を果たしていないようである。むしろ、これらの抗体は、腫瘍部位周辺の炎症反応の誘導を介して腫瘍部位に免疫適合細胞を浸潤させるのに関与していると考えられる。
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２４または−Ａ２陽性ならびにＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性乳癌患者に対するＨＥＲ２／ｎｅｕペプチドをベースにした免疫療法に対して扉が新しく開くことができることが期待される。
【図１】
2005007694.tif 000005
【図２】
2005007694.tif 000006
【図３】
2005007694.tif 000007
2005007694.tif 000008
2005007694.tif 000009
2005007694.tif 000010
2005007694.tif 000011
2005007694.tif 000012
2005007694.tif 000013
2005007694.tif 000014
2005007694.tif 000015
【図７】
2005007694.tif 000016
【配列表】
2005007694000001.xml
【国際調査報告】
2005007694.tif 000028
2005007694.tif 000029
2005007694.tif 000030
2005007694.tif 000031
2005007694.tif 000032
2005007694.tif 000033
2005007694.tif 000034
2005007694.tif 000035