(57)【要約】複数の培養条件および灌流産生を使用して、タンパク質バリアントを産生する方法を開示する。【選択図】図１２
2020507336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
細胞培養を可能にするように構成された容器中に細胞の集団を提供すること；
（ａ−ｉ）第１の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ａ−ｉｉ）培養物から産物バリアント１を回収すること；
（ａ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を前記馴化培養培地へ添加すること；
（ａ−ｉｖ）随意に、前記第１の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること；
（ａ−ｖ）随意に、追加産物バリアント１を回収すること；
（ｂ−ｉ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ−ｉｉ）培養物から産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を前記馴化培養培地へ添加すること、
（ｂ−ｉｖ）随意に、前記第２の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること、
（ｂ−ｖ）随意に、追加産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｖｉ）随意に、（ｂ−ｉｉ）および（ｂ−ｖ）からの産物バリアント２を組み合わせること；
産物バリアント１のバッチから産物バリアント１を得ること；
産物バリアント２のバッチから産物バリアント２を得ること；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、
バリアント１（またはバリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、バリアント２（またはバリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法。
【請求項２】
少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産物バリアント１を回収すること；
（ｃ）第２の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｄ）産物バリアント２を回収すること；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、
産物バリアント１（または産物バリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、産物バリアント２（または産物バリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）での回収は、ステップ（ａ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、請求項２または３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
馴化培養培地の前記アリコートから産物バリアント１を回収することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）が、前記馴化培養培地へ置換培地を添加することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ｂ）が、前記第１の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
（ｂｉｉ）第２の量の産物バリアント１を回収することを含む、請求項５または７のいずれかの方法。
【請求項９】
ステップ（ｂｉｉ）における回収することが、さらなる馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前のステップの培養された培地へ置換培地を添加すること、ならびに請求項７および８および随意に請求項９に記載のステップを反復すること（例えば請求項７および８および随意に請求項９に記載のステップをＸ回（Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）反復すること）を含む、請求項８または９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
パラメーターについての標的値に到達した後に、前記細胞集団が、前記第２の条件下で培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記パラメーターが、産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地または他の条件の操作をして前記第２の条件を達成することを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記培地または他の条件の操作が、ｐＨ；ｄＯ２のレベル；かき混ぜ；温度；体積；前記細胞集団の密度；前記培養培地の構成要素の濃度；かき混ぜ；栄養素、薬物、阻害物質、もしくは他の化学的構成要素（例えば化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン）の存在もしくは量のうちの１つまたは複数を改変することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
異なる培養培地を前記細胞の集団へ添加することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞の集団の培養が灌流産生培養である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
第２の条件へ前記培地を移行する時に、灌流を中断することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
第２の条件へ前記培地が移行する時に、灌流液を廃液へ方向転換することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
産物バリアント１が、産物バリアント２の産生の間に、下流のユニット操作から取り出される、請求項１〜１９いずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
パラメーターについての標的値に到達するまで前記細胞を培養することを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｄ）での回収は、ステップ（ｃ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、請求項２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
馴化培養培地の前記アリコートから産物バリアント２を回収することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｄ）が、前記馴化培養培地へ置換培地を添加することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
（ｄ）が、前記第２の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
（ｄｉｉ）第２の量の産物バリアント２を回収することを含む、請求項２４または２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ステップ（ｄｉｉ）での回収は、さらなる馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前のステップの培養された培地へ置換培地を添加すること、ならびに請求項２６および２７および随意に２８に記載のステップを反復すること（例えば請求項２６および２７および随意に２８に記載のステップをＸ回（Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）反復すること）を含む、請求項２７または２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）〜（ｄ）が、同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される、請求項３〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記容器が、灌流モードでの操作を可能にするように構成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記容器が、培養の間の培地の取り出しおよび培地の添加を可能にするように構成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記容器が、可変直径のバイオリアクターを含む、請求項３１または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第１の産物バリアント（または第１の産物バリアントの調製物）が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数について、第２の産物バリアント（または第２の産物バリアントの調製物）とどのように異なるか評価することをさらに含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
第１の産物バリアント（または第１のバリアントの調製物）が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、第２の産物バリアント（または第２の産物バリアントの調製物）とは異なる、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
複数の産物バリアント（または産物バリアントの調製物）を産生することを含む、請求項１〜３７のうちの任意の方法であって、前記産物バリアント（または産物バリアントの調製物）のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上のその各々が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、互いに異なる、
前記方法。
【請求項３９】
前記第１の条件および／または第２の条件が、定常状態条件である、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記培地の操作が、以下の１つまたは複数の濃縮ボーラスを培養培地へ添加することを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法：
前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）。
【請求項４１】
前記培地の操作が、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の以下のうちの１つまたは複数の濃度を増加させることを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法：
前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）。
【請求項４２】
前記培地の操作が、
ａ）構成要素の濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加すること、または
ｂ）前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の構成要素の濃度を増加させること、
のうちの１つまたは両方を含み、
前記構成要素が、前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数から選択される、
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記培地の操作が、ＣｕＳＯ４を前記培養培地へ添加することを含む（例えばＣｕＳＯ４の濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のＣｕＳＯ４の濃度を増加させることによって、または両方によって）、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記培地の操作が、Ｎ−アセチルアルギニンを前記培養培地へ添加することを含む（例えばＮ−アセチルアルギニンの濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のＮ−アセチルアルギニンの濃度を増加させることによって、または両方によって）、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記培地の操作が、リジンを前記培養培地へ添加することを含む（例えばリジンの濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のリジンの濃度を増加させることによって、または両方によって）、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
本明細書において記載されるバリアント産物の調製物、または請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法によって作製されるかもしくは作製可能なバリアント産物の調製物。
【請求項４７】
複数のバリアント調製物であって、前記複数のものが、本明細書において記載される少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）、または請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法によって作製されるかもしくは作製可能な少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む、前記複数のバリアント調製物。
【請求項４８】
本明細書において記載される細胞の混合物によりチャージされた容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）。
【請求項４９】
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、第１の産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する前記方法の進行についての値を取得すること；
（ｃ）前記値へ応答して、前記１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する前記方法の進行を決定すること；および
（ｄ）随意に、１つまたは複数の標的パラメーターが到達された前記決定に応答して、前記培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること、
を含み、
それによって、複数の産物バリアントを作製する方法の進行を評価する、
複数の産物バリアント調製物を作製する方法の進行を評価する方法。
【請求項５０】
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される１つまたは複数の標的パラメーターに向けて産物バリアントを産生する前記方法の進行を評価すること；
（ｃ）前記１つまたは複数の標的パラメーターに向けた進行の前記評価に応答して、前記培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること；
および
（ｄ）前記第２の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、第２の産物バリアント（産物バリアント２）を含有する馴化培養培地を形成すること；
を含み、
それによって、産物バリアントを産生する方法を修飾する、
産物バリアントを産生する方法を修飾する方法。
【請求項５１】
前記回収された産物バリアント１が、例えば回収された全産物のパーセンテージとして、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント１である（例えば重量、体積、またはモル比によって）、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記回収された産物バリアント２が、例えば回収された全産物のパーセンテージとして、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント２である（例えば重量、体積、またはモル比によって）、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記回収された産物バリアント１が、前記第１の条件下で培養されない細胞の集団および培養培地から産生された産物に比較して、産物バリアント１について少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％までエンリッチされる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記回収された産物バリアント２が、前記第２の条件下で培養されない細胞の集団および培養培地から産生された産物に比較して、産物バリアント２について少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％までエンリッチされる、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
産物バリアント１の回収後に、前記回収された産物バリアント１を評価することをさらに含む、請求項１〜４５または５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記回収された産物バリアント１を評価することが、糖鎖付加、シアル酸付加、荷電、配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性、純度（例えば回収された産物が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント１である（例えば重量で、体積もしくはモル比で、または回収された全産物のパーセンテージとして））、活性、不活性バリアントの量、凝集する傾向、もしくは凝集、清澄性、脱アミド化、グリケーション、メチオニン酸化、または産生された産物バリアント１の量から選択される産物品質属性のうちの１つまたは複数のレベルを評価することを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
産物バリアント２の回収後に、前記回収された産物バリアント２を評価することをさらに含む、請求項１〜４５または５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記回収された産物バリアント２を評価することが、糖鎖付加、シアル酸付加、荷電、配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性、純度（例えば回収された産物が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント２である（例えば重量で、体積もしくはモル比で、または回収された全産物のパーセンテージとして））、活性、不活性バリアントの量、凝集する傾向、もしくは凝集、清澄性、脱アミド化、グリケーション、メチオニン酸化、または産生された産物バリアント２の量から選択される産物品質属性のうちの１つまたは複数のレベルを評価することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記回収された産物バリアントの評価に応答して、置換培地を添加するか、現在の条件下で前記細胞の集団をさらに培養するか、またはさらなる条件下で前記細胞の集団を培養するかどうかを決定することをさらに含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記複数のバリアント調製物が、単一の産生容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）から産生される、請求項１〜４５または５１〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記複数のバリアント調製物が、単一の産生容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）から、連続的に（例えば前記細胞の集団の前記培養を中断すること（例えば前記容器を空にすることおよび／またはクリーニングすること）無しに、活性のある産生のための条件を維持して）、産生される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記複数のバリアント調製物が、中断（例えば空にすること、クリーニングすること、およびさらなる条件下で前記細胞の集団の培養を再開すること）有りで類似の条件下で前記複数のバリアント調製物を連続して作製することから経過するよりも、短い時間で産生される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記複数のバリアント調製物が、中断（例えば空にすること、クリーニングすること、またはさらなる条件下で前記細胞の集団の培養を再開すること）有りで類似の条件下で前記複数のバリアント調製物を連続して作製することから消費または占有されるよりも、少数の資源（例えば機器、培養、エネルギーまたは人員）を消費または占有して産生される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
請求項４６に記載の調製物を含む、医薬組成物。
【請求項６５】
請求項４７に記載の複数のバリアント調製物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４６０，３８７号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、複数の異なる培養条件下で操作する培養系を使用して、生物学的産物（例えばタンパク質、例えばタンパク質バリアント）を産生するための方法、組成物およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
治療用タンパク質およびｍＡｂを含む認可された治療用産物は、典型的には治療される集団のサブセットにおいてのみ有効である。根本原因は必ずしも良く理解されているとは限らないが、エピジェネティック、遺伝、代謝、生活習慣、および患者間の他の違いに起因し得る。したがって、疾患それ自体および患者の両方の根本原因を理解し、より詳細なテーラーメード療法を開発する傾向が増加している。現在認識されている追加の複雑な問題は、たとえ各々の患者が同じ症状を示しても、疾患それ自体は患者間で異なり得るということである（例えば血液癌には１１の異なる形態があることが現在認識されている）（Ｅ．Ｐａｐａｅｍｍａｎｕｉｌ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１６；３７４：２２０９−２２２１）。精密かつ個人化された治療に向けたこの傾向の増加は、産物品質の属性においてより少ない変動を備えた治療用産物に頼ることが予想される。それらの産物品質の属性において各々より低い不均一性（すなわちより少ない変動）を備えた各々の治療用産物の複数のバリアントは、疾患不均一性および患者不均一性の両方を有効に取り扱うのに有用である可能性もある。
【０００４】
生物学的産物（組み換えタンパク質およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）等）を製造するための現行の方法は、典型的には産物品質の属性（糖鎖付加、シアル酸付加（ｓｉａｌｙａｔｉｏｎ）および荷電のバリアント等）における高い変動を備えた産物をもたらす（Ｐａｃｉｓ  ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ２０１１；１０８：２３４８−２３５８）。これらの方法は多くの場合、１〜１４日の範囲で培養された微生物細胞または動物細胞のフェドバッチ培養に頼っている。フェドバッチ培養を使用して産生された産物は典型的には不均一混合物であり、例えば哺乳動物細胞によって産生されるｍＡｂは、培養の中間点の間（７日目）で、培養の終了時近くで（１１日目〜１４日目）産生される同じｍＡｂよりもより高い比率の糖鎖付加タンパク質鎖を有し得る。培養の終了まで産物の収穫はなく、したがって産物は培養終結時に産物バリアントの不均一混合物である。現在使用される精製技法（クロマトグラフィーおよび濾過ステップ等）は、産物バリアントを精製することおよびより均一の産物を得ることができない。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、細胞の集団を提供すること、第１の条件下で細胞の集団を培養して、第１の産物バリアントを得ること、および第１の条件下で作製された第１の産物を回収すること、次いで第２の条件下で培養培地中の細胞の集団をさらに培養して、第２の産物バリアントを得ること、および第２の条件下で作製された第２の産物を回収することによって、それらの産物のより多くの産物バリアントおよびより均一な調製物のうちの１つまたは両方を得ることが可能であるという解明に、部分的に基づく。したがって、異なる産物の複数の調製物が作製され、各々の産物は均一性の増加のために至適化される。
【０００６】
したがって、一態様において、本発明は、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
細胞培養（例えば灌流培養）を可能にするように構成された容器中に細胞の集団を提供すること；
（ａ−ｉ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ａ−ｉｉ）例えばステップ（ａ−ｉ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることによって、培養から産物バリアント１を回収すること；
（ａ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を馴化培養培地へ添加すること；
（ａ−ｉｖ）随意に、第１の条件下で細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること；
（ａ−ｖ）随意に、例えばステップ（ａ−ｉｖ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることによって、追加の（例えば第２のバッチの）産物バリアント１を回収すること；
（ａ−ｖｉ）随意に、（ａ−ｉｉ）および（ａ−ｖ）からの（例えば第１のバッチおよび第２のバッチからの）産物バリアント１を組み合わせること；
（ｂ−ｉ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ−ｉｉ）例えばステップ（ｂ−ｉ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることによって、培養から産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を馴化培養培地へ添加すること、
（ｂ−ｉｖ）随意に、第２の条件下で細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること、
（ｂ−ｖ）随意に、例えばステップ（ｂ−ｉｖ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることによって、追加の（例えば第２のバッチの）産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｖｉ）随意に、（ｂ−ｉｉ）および（ｂ−ｖ）からの（例えば第１のバッチおよび第２のバッチからの）産物バリアント２を組み合わせること；
産物バリアント１のバッチから産物バリアント１を得ること（例えば精製すること）；
産物バリアント２のバッチから産物バリアント２を得ること（例えば精製すること）；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、
バリアント１（またはバリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、例えば
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、バリアント２（またはバリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法を特徴とする。
【０００７】
別の態様において、本発明は、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産物バリアント１（例えば産物バリアント１のバッチ（例えば第１の条件下で産生された））を回収すること；
（ｃ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｄ）産物バリアント２（例えば産物バリアント２のバッチ（例えば第２の条件下で産生された））を回収すること；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、
産物バリアント１（または産物バリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、例えば
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
で、産物バリアント２（または産物バリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法を特徴とする。
【０００８】
いくつかの実施形態において、方法は、例えば馴化培養培地のアリコートを得た後に、置換培地を馴化培養培地へ添加することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、取り出されたアリコート、添加された置換培養培地、または両方の体積は、独立して、全体の培養の体積または反応容器の容量の体積の５〜１００、１０〜１００、４０〜１００、６０〜１００、８０〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０、または２０〜８０％の間である。いくつかの実施形態において、取り出された量、添加された置換培養培地、または両方は、独立して、反応器操作の１日あたり反応器体積の０．１〜５、０．５〜５、０．３〜５、０．４〜５、０．１〜４、０．３〜４、または０．５〜４、１〜２、または１〜３倍の間である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、１日以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、またはそれ以上の日）の間第１の条件下で、培養される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、例えばパラメーターについての標的値に到達した後に、細胞集団は第２の条件下で培養される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、方法は、培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、方法は、ｐＨ；ｄＯ２のレベル；かき混ぜ；温度；体積；細胞集団の密度；培養培地の構成要素の濃度；栄養素、薬物、阻害物質、もしくは他の構成要素の存在もしくは量のうちの１つまたは複数を変更することを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、培養培地、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素の構成要素は、培地化合物（例えばＰＢＳ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、血清など）、ポリペプチド、非ペプチドシグナル分子（例えばＣａ＋２、ｃＡＭＰ、グルコース、ＡＴＰなど）、アミノ酸（例えばリジン）、糖（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルマンノサミン）、および水溶性金属化合物（例えば銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛），および鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ）））のうちの１つまたは複数を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、細胞の集団の培養は、灌流産生培養（例えば本明細書において記載されるような灌流産生培養、例えばそこで馴化培養培地は設定時間の間隔で連続的にまたは周期的に収穫される）である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、方法は、容器（例えば反応器、例えばバイオリアクター）中の培養培地が第２の条件へ移行する時に、灌流を中断する（例えば培養培地が第２の条件へ移行する時に灌流液は収集されず、第２の条件の達成に際して収集は再開されるだろう、例えば産物バリアント１が産物バリアント２によって実質的に置き換えられるまで、灌流液は収集されないだろう）こと、または培養培地が後続する条件へ移行する時に、灌流を中断することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、培養培地が第２の条件へ移行する時に、灌流液を例えば廃液へ方向転換する（例えば培養培地が第２の条件へ移行する時に、灌流液は廃液へ方向転換され、第２の条件の達成に際して収集は再開されるだろう）ことを含む。例えば第１の条件が満たされるまで（例えば産物バリアント１が産物バリアント２によって実質的に置き換えられる）、または培養培地が後続する条件へ移行する時に、灌流液は第１の目的地（例えば廃液）へ方向転換されるだろう。
【００１７】
いくつかの実施形態において、産物バリアント１は、例えば後続する産物バリアント（例えば産物バリアント２）の産生の間に、または後続する産物バリアント（例えば産物バリアント２）の産生後に、例えば液体（例えばバッファー）によりフラッシングすることによって、下流のユニット操作から取り出される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、方法は、パラメーター（例えば安定的な操作に関連するパラメーター、例えば培養の継続期間、培養物の生存率、生存細胞濃度、ｐＨ、ｄＯ２、温度、または培養の体積）についての標的値に到達するまで、細胞を培養することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態において、（ａ）、（ｃ）、または（ａ）および（ｃ）の両方の培養培地中の細胞の集団は、容器（例えば反応器、反応容器、または類似のもの）中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ａ）の培養培地中の細胞の集団および（ｃ）の培養培地中の細胞の集団は、同じ容器中に含まれる。いくつかの実施形態において、（ａ）の培養培地中の細胞の集団および（ｃ）の培養培地中の細胞の集団は、２つ以上の異なる容器中に含まれる。
【００２０】
いくつかの実施形態において、取り出されたアリコート、添加された置換培養培地、または両方の体積は、独立して、全体の培養の体積または容器（例えば反応器）の容量の体積の５〜１００、１０〜１００、４０〜１００、６０〜１００、８０〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０、または２０〜８０％の間である。いくつかの実施形態において、取り出された量、添加された置換培養培地、または両方は、独立して、容器（例えば反応器）操作の１日あたり容器（例えば反応器）体積の０．１〜５、０．５〜５、０．３〜５、０．４〜５、０．１〜４、０．３〜４、または０．５〜４、１〜２、または１〜３倍の間である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、置換培養培地の体積は、取り出されたアリコートの体積よりも少ないか、等しいか、または多い。
【００２２】
いくつかの実施形態において、取り出されたアリコート、添加された置換培養培地、または両方の体積は、独立して、全体の培養の体積または容器（例えば反応器）の容量の体積の５〜１００、１０〜１００、４０〜１００、６０〜１００、８０〜１００、５〜１０、５〜２０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、２０〜８０、２０〜６０、２０〜４０、または２０〜８０％の間である。いくつかの実施形態において、取り出された量、添加された置換培養培地、または両方は、独立して、容器（例えば反応器）操作の１日あたり容器（例えば反応器）体積の０．１〜５、０．５〜５、０．３〜５、０．４〜５、０．１〜４、０．３〜４、または０．５〜４、１〜２、または１〜３倍の間である。
【００２３】
いくつかの実施形態において、細胞の集団は、１日以上（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、またはそれ以上の日）の間第２の条件下で、培養される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、例えばパラメーターについての標的値に到達した後に、細胞集団は第３の条件下で培養される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、方法は、容器（例えば反応器、例えばバイオリアクター）中の培養培地が第３の条件へ移行する時に、灌流を中断する（例えば培養培地が第３の条件へ移行する時に灌流液は収集されず、第３の条件の達成に際して収集は再開されるだろう、例えば産物バリアント２が産物バリアント３によって実質的に置き換えられるまで、灌流液は収集されないだろう）こと、または培養培地が後続する条件へ移行する時に、灌流を中断することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、培養培地が第３の条件へ移行する時に、灌流液を廃液へ方向転換する（例えば培養培地が第３の条件へ移行する時に、灌流液は廃液へ方向転換され、第３の条件の達成に際して収集は再開されるだろう、例えば産物バリアント２が産物バリアント３によって実質的に置き換えられるまで、灌流液は廃液へ方向転換されるだろう）こと、または培養培地が後続する条件へ移行する時に、灌流液を廃液へ方向転換することを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、産物バリアント２は、例えば後続する産物バリアント（例えば産物バリアント３）の産生の間に、または後続する産物バリアント（例えば産物バリアント３）の産生後に、例えば液体（例えばバッファー）によりフラッシングすることによって、下流のユニット操作から取り出される。
【００２７】
いくつかの実施形態において、複数のものは、第３の条件下で作製された第３のバリアントの調製物（例えば第１のバリアントまたは第２のバリアントの調製物を作製するために本明細書において記載されるステップによって行われる第３の条件下で作製された第３のバリアントの調製物）を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、複数のものは、第４の条件下で作製された第４のバリアントの調製物（例えば第１のバリアントまたは第２のバリアントの調製物を作製するために本明細書において記載されるステップによって行われる第４の条件下で作製された第４のバリアントの調製物）を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、複数のものは、第５の条件下で作製された第５のバリアントの調製物（例えば第１のバリアントまたは第２のバリアントの調製物を作製するために本明細書において記載されるステップによって行われる第５の条件下で作製された第５のバリアントの調製物）を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態において、複数のものは、第Ｎの条件下で作製された第Ｎのバリアントの調製物（例えば第１のバリアントまたは第２のバリアントの調製物を作製するために本明細書において記載されるステップによって行われる第Ｎの条件下で作製された第Ｎのバリアントの調製物、そこで、Ｎは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上である）を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）は同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、ステップ（ａ）〜（ｄ）は同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、容器は、灌流モードでの操作を可能にするように構成される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、容器は、培養の間（例えばステップ（ａ）および（ｃ）のうちの１つまたは両方の間）の培地の取り出しおよび培地の添加を可能にするように構成される。
【００３５】
いくつかの実施形態において、方法は、産物バリアント１を精製することを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、方法は、産物バリアント２を精製することを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、産物バリアントは、細胞の集団が培養される容器から下流のユニット操作において精製される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、方法は、複数の調製物（例えば精製された調製物）を提供すること（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上の異なる産物バリアントの調製物（例えば精製された調製物）を提供すること）を含む。
【００３９】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載されるバリアント産物の調製物、または本明細書において記載される方法のうちの任意ものによって作製されるかもしくは作製可能なバリアント産物の調製物を特徴とする。
【００４０】
別の態様において、本発明は複数のバリアント調製物を特色とし、前記複数のものは、本明細書において記載される少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）、または本明細書において記載される方法のうちの任意ものによって作製されるかもしくは作製可能な少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む。
【００４１】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される細胞の混合物によりチャージされた容器（例えばバイオリアクター、例えば可変直径のバイオリアクター）を特徴とする。
【００４２】
別の態様において、本発明は、
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、第１の産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産生される産物バリアント１の量、第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する方法の進行についての値を取得すること；
（ｃ）値へ応答して、１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する方法の進行を決定すること；および
（ｄ）随意に、１つまたは複数の標的パラメーターが到達された決定に応答して、培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること、
を含み、
それによって、複数の産物バリアントを作製する方法の進行を評価する、
複数の産物バリアント調製物を作製する方法の進行を評価する方法を特徴とする。
【００４３】
別の態様において、本発明は、
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産生される産物バリアント１の量、第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される１つまたは複数の標的パラメーターに向けて産物バリアントを産生する方法の進行を評価すること；
（ｃ）１つまたは複数の標的パラメーターに向けた進行の評価に応答して、培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること；
および
（ｄ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、第２の産物バリアント（産物バリアント２）を含有する馴化培養培地を形成すること；
を含み、
それによって、産物バリアントを産生する方法を修飾する、
産物バリアントを産生する方法を修飾する方法を特徴とする。
【００４４】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される調製物を含む医薬組成物を特徴とする。
【００４５】
別の態様において、本発明は、本明細書において記載される複数のバリアント調製物を含むキットを特徴とする。
【００４６】
特別に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって共通して理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実践または試験において、本明細書において記載されるものに類似するかまたは等価である方法および材料を使用することができるが、好適な方法および材料が後述される。すべての出版物、特許出願、特許、および本明細書において言及される他の参照文献は、それらの全体を参照することによって援用される。加えて、材料、方法、および例は、単に説明的なものであり、限定を意図したものではない。見出し、副見出し、または番号付けしたもしくは文字入りの要素（例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）など）は、単に読み取りの容易性のために提示され、限定するものではない。本文書中の見出しまたは番号付けもしくは文字入りの要素の使用は、ステップもしくは要素がアルファベットの順序において遂行されること、またはステップもしくは要素が互いと必ず不連続であることを要求しない。本発明の他の特色、目的および利点は、記載および図面ならびに請求項から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の側面図である。
【図２】可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の側面図である。
【図３】可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の側面図である。
【図４】可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略図である。
【図５】可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略図である。
【図６】一様な直径を有する典型的なバイオリアクターの概略図である。
【図７】例示の可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略図である。
【図８】例示の可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略である。
【図９】例示の可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略である。
【図１０】例示の可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）の概略である。
【図１１】例示の可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）バイオリアクターの概略である。
【図１２】連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）としてデザインされた例示的な灌流バイオリアクターの概略である。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、生存細胞密度によって測定されるような、変動濃度の、ＣｕＳＯ４（Ａ）、リジン（Ｂ）、およびＮ−アセチルアルギニン（Ｃ）の細胞増殖に対する効果を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、産物（モノクローナル抗体）の荷電変動に対するリジン（Ａ）、ＣｕＳＯ４（Ｂ）、およびＮ−アセチルアルギニン（Ｃ）の効果を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｅは、２．０μＭまでＣｕＳＯ４濃度を増加させることが産物の荷電変動を調節することを示すグラフである。酸性ピーク（Ａ）、主要ピーク（Ｂ）、および塩基性ピーク（Ｃ）についてのパーセント面積における変化に加えて、スイッチ前とスイッチ後との間の荷電変動における変化（ＤおよびＥ）を示す。＊、ｐ＜０．０５；＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、単一の灌流反応器中で荷電変動の双方向性調節を示すグラフである。４日目と６２日目との間の、酸性ピーク（Ａ）、塩基性ピーク（Ｂ）、および主要（ｍｅａｎ）ピーク（Ｃ）についてのパーセント面積における変化を示す。栄養インプット（ＣｕＳＯ４、基本、またはリジン）間のスイッチのタイミングを表示する。
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｅは、２．０μＭまでＣｕＳＯ４濃度を増加させることが産物の荷電変動を可逆的に調節することを示すグラフである。酸性ピーク（Ａ）、主要ピーク（Ｂ）、および塩基性ピーク（Ｃ）についてのパーセント面積における変化に加えて、最初のスイッチ前の基本インプット条件とＣｕＳＯ４インプットの最中と基本へのスイッチバック後との間の荷電変動における変化（Ｄ）を示す。図１７Ｅは、基本とＣｕＳＯ４の最中との間の荷電変動における変化を示す。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｅは、１０ｍＭまでリジンの濃度を増加させることが荷電変動を調節することを示すグラフである。酸性ピーク（Ａ）、主要ピーク（Ｂ）、および塩基性ピーク（Ｃ）についてのパーセント面積における変化に加えて、基本条件ＣｕＳＯ４インプットとリジン増加条件との間の荷電変動における変化（ＤおよびＥ）を示す。＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｄは、産物の荷電変動プロファイルに対する指摘された処理の効果を示す代表的な電気泳動図である。最初の基本定常状態条件（８日目；図１９Ａ）、ＣｕＳＯ４定常状態条件（２１日目；図１９Ｂ；矢印は、主要（ｍｉｎ）ピークの塩基性側上の肩（ｓｈｏｕｌｄ）を指摘する）、第２の基本定常状態条件（２８日目；図１９Ｃ）、およびリジン定常状態条件（３８日目；図１９Ｄ；矢印は、７．５の等電点またはｐＩでの塩基性ピークのパーセント面積における増加を指摘する）についての荷電変動プロファイルを示す。
【図２０】注釈されたピーク群（酸性ピーク、主要ピーク、または塩基性ピーク）を示す代表的な電気泳動図である。酸性ピーク、主要ピークおよび塩基性ピークの総計を計算して、これらの群の％面積を決定した。酸性ピーク対塩基性ピークの決定は、主要（最も多量、ｐＩ７．２）ピークに対してバリアントがどの側で分離されかに基づいた。
【図２１】灌流反応器中のガラトース（ｇａｌａｔｏｓｅ）濃度の段階的な操作に応答した、パーセントガラクトシル化における変化を示すグラフである。
【図２２】図２１中で示される実験において、ガラクトース濃度の段階的な操作に応答した、パーセントガラクトシル化および反応器ガラクトース濃度の両方における変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
定義
「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、１つまたは１を超える（すなわち少なくとも１つ）の冠詞の文法的な対象物を指すように本明細書において使用される。一例として、「細胞」は１つの細胞または１を超える細胞を意味し得る。
【００４９】
本明細書において使用される時、「アリコート」という用語は、ある体積の溶液（例えば培養培地、馴化培養培地）を指す。一実施形態において、各々のアリコートは、体積に関して、例えば、各々のアリコートが、最小の体積（例えば事前に設定された最小値）；最小値と最大値（例えば事前に設定された最小値および／または最大値）との間の範囲内のもの；近似的に等しい値（例えば事前に設定された値）；または同じ体積（例えば事前に設定された値）を有するという条件を満たす。より多い量の液体（例えば馴化培養培地）が複数のアリコートへと分割される場合に、複数のものは、より多い量の全体に等しいか、またはより多い量全体未満であり得る。一実施形態において、アリコートが取り出され、置換培養培地が添加されるので、アリコートはバイオリアクターの体積（例えば培養体積）を超過し得る。一実施形態において、アリコートは、０．１〜５、０．２〜５、０．３〜５、０．４〜５、０．５〜５、０．５〜４、または０．５〜３の培養体積であり、そこで、培養体積はバイオリアクター中の培養の体積に対応する（例えば４０Ｌの培養を含有する５０Ｌのバイオリアクターは、４０Ｌの培養体積を有し、前記培養の０．５培養体積は２０Ｌであるだろう）。
【００５０】
本明細書において使用される時、「複数のアリコート」という用語は、１を超える（例えば２つ以上の）アリコートを指す。
【００５１】
本明細書において使用される時、「内在性の」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系からの任意の材料、またはそれらの内部で天然に産生された任意の材料を指す。
【００５２】
本明細書において使用される時、「外来性の」という用語は、生物体、細胞、組織もしくは系へ導入された任意の材料、またはそれらの外部で産生された任意の材料を指す。したがって、「外来性核酸」は、生物体、細胞、組織もしくは系へ導入された核酸、またはそれらの外部で産生された核酸を指す。一実施形態において、外来性核酸の配列は、天然に産生されないか、または外来性核酸が導入される生物体、細胞、組織もしくは系の内部で天然に見出され得ない。同様に、「外来性ポリペプチド」は、天然に産生されないか、または例えば外来性ポリペプチドが外来性核酸配列からの発現によって導入される、生物体、細胞、組織もしくは系の内部で天然に見出され得ない、ポリペプチドを指す。
【００５３】
本明細書において使用される時、「異種の」という用語は、異なる種から生物体、細胞、組織または系へ導入された場合の、１つの種からの任意の材料を指す。
【００５４】
本明細書において使用される時、「核酸」、「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」という用語は互換的に使用され、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）、またはそのＤＮＡもしくはＲＮＡの組み合わせ、およびその一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかにおけるポリマーを指す。「核酸」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡを包含するがこれらに限定されない。一実施形態において、核酸分子は、合成（例えば化学合成されるかまたは人工的である）または組み換えである。具体的に限定されなければ、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドに類似する様式で代謝される、天然ヌクレオチドのアナログまたは誘導体を含有する分子を網羅する。特別の指示のない限り、特定の核酸配列は、明示的に指示された配列に加えて。保存的に修飾されたそのバリアント（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、および相補的な配列も黙示的に網羅する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基により置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【００５５】
本明細書において使用される時、「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は互換的に使用され、ペプチド結合またはペプチド結合以外の手段によって共有結合で連結されたアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に限定はない。一実施形態において、タンパク質は、１を超える（例えば２、３、４、５、またはそれ以上の）ポリペプチドから構成され、その中で、各々のポリペプチドは共有または非共有性の結合／相互作用のいずれかによって別のものへ結び付けられる。ポリペプチドは、ペプチド結合またはペプチド結合以外の手段によって、互いに繋がれた２つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を包含する。本明細書において使用される時、この用語は、短鎖（例えばそれは当該技術分野において通常ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される）、およびより長い鎖（それは当該技術分野において一般的にタンパク質と称される）の両方を指し、それらについて多くのタイプがある。「ポリペプチド」は、例えばとりわけ生物学的に活性のある断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を包含する。
【００５６】
「産物」は、その用語が本明細書において使用される時に、細胞（例えば産物を産生するように修飾または操作された細胞）によって産生された（例えば発現された）分子（例えばポリペプチド（例えばタンパク質、例えば糖タンパク質）、核酸、脂質、サッカラデ（ｓａｃｃｈａｒａｄｅ）、ポリサッカライド、または任意のそのハイブリッド）を指す。一実施形態において、産物は天然に存在する産物を含む。一実施形態において、産物は天然に存在しない産物を含む。一実施形態において、産物の一部は天然に存在する一方で、産物の別の一部は天然に存在しない。一実施形態において、産物はポリペプチド（例えば組み換えポリペプチド）である。一実施形態において、産物は、診断用の使用または前臨床的な使用に好適である。別の実施形態において、産物は治療法用の使用に（例えば疾患の治療に）好適である。一実施形態において、本明細書において記載される細胞（例えば修飾または操作された細胞）は、発現を制御するかまたは産物をコードする、外来性核酸を含む。他の実施形態において、本明細書において記載される細胞（例えば修飾または操作された細胞）は、例えば核酸でなく、細胞中での産物の発現または構築を制御する、他の分子を含む。
【００５７】
本明細書において使用される時、「産物のバリアント」、「バリアント」、「産物バリアント」または類似する用語は、参照産物とは異なる産物の種を指す。例えば第１の条件のセット下で作製された第１の産物（第２の条件のセット下で作製された第２の産物とは異なる、構造または機能的特性を有する）は、バリアントである。典型的には、バリアントは、同じ細胞（複数可）または同じコード配列から発現される。例えば、産物の第１のバリアントは糖鎖付加され得るが、産物の第２のバリアントは異なって糖鎖付加され得る（例えばより高いかもしくはより少ない程度に糖鎖付加されるか、または少なくとも１つの異なる糖部分が付加される）。産物バリアントを識別する特性は、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性を包含し、糖鎖付加（例えばガラクトシル化）、シアル酸付加、荷電（例えばｐＩ）、配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）、治療有効性、凝集する傾向もしくは凝集の傾向、または活性を包含するがこれらに限定されない。産物バリアントを識別する特性は、産物品質属性とも呼ばれる。特定の産物品質属性に関して参照産物とは異なる産物バリアントは、そのようなものとして称され得る（例えば荷電（例えばｐＩ）に関して異なる産物バリアントは、荷電バリアントと称され得る）。バリアントは「調製物」またはバルク特性でも異なり、例えば、第１の産物バリアントの調製物は、均一性、純度、凝集の量、不活性バリアントの量、清澄性、またはシェルフライフで、第２の産物バリアントとは異なり得る。
【００５８】
本明細書において使用される時、「複数のバリアント」、「複数のバリアント調製物」、「複数の産物バリアント」という用語および類似のものは、１を超える（例えば２つ以上の）バリアント、バリアント調製物、産物バリアントなどを指す。
【００５９】
本明細書において使用される時、「条件」は、細胞の培養における増殖および／または遺伝子発現に影響を及ぼし得る、１つまたは複数の培養または環境のパラメーターの値を指す。第１の条件は、第１の産物バリアントの発現（例えば第１の産物バリアントを含有する馴化培養培地の形成）を促し得るが、第２の条件は、第２の産物バリアントの発現（例えば第２の産物バリアントを含有する馴化培養培地の形成）を促し得る。培養または環境パラメーターは、培地タイプ（例えばＰＢＳ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、血清、血清を含有する培地など）、１つまたは複数のポリペプチドのレベル、化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、非ペプチドシグナル分子（例えばＣａ＋２、ｃＡＭＰ、グルコース、ＡＴＰなど）のレベル、温度、ｐＨ、培養の細胞密度、ならびに栄養利用可能性を包含するがこれらに限定されない。定常状態条件（定常状態（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ）または定常状態（ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ）とも称される）は、細胞密度および１つまたは複数の産物品質属性が一定で維持される条件を指す。
【００６０】
生物学的生産の方法論
いくつかの実施形態において、生物学的製剤（組み換えタンパク質およびｍＡｂ等）は、微生物細胞（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、動物細胞（例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯまたはＮＳＯ）、真菌細胞（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）または昆虫細胞）、または植物細胞のバッチ培養、フェドバッチ培養または灌流培養において産生される。産物の産生に使用される細胞の集団および集団が増殖される培養培地は、産生培養物である。
【００６１】
いくつかの実施形態において、産生は、制御された条件（例えば温度、ｐＨ、溶存酸素、およびかき混ぜ）下で、炭水化物、アミノ酸、タンパク質、脂質、ビタミン、ヌクレオシド、および／または化学塩を含む培地中での、以前に凍結した細胞の小集団の培養によって開始される。細胞の十分な集団が生成され、治療産物タンパク質の産生が典型的には５０Ｌ〜２０，０００リットルの体積の範囲の産生培養で開始され得るまで、培養物は、漸増する体積においてこれらの条件下で拡張される。この培養の増殖相の継続期間は、動数時間（微生物培養）〜約３０日（物細胞培養について）で続き得る。
【００６２】
現在、産物の産生への２つの主要なアプローチ（バッチ産生またはフェドバッチ産生および灌流産生）がある。バッチ産生またはフェドバッチ産生において、産生培養全体は、規定の日に開始されてから通常１日〜２１日のいつでも収穫される。バッチ産生において、産生のために要求されるすべての栄養素および基質は、培養の開始から培養培地中に存在するが、フェドバッチ産生において、栄養素および／または基質は培養の間に培養の中へ添加または供給される。
【００６３】
灌流産生培養において、産生培養は、期間にわたって、連続的にまたは規定の間隔で収穫される。一実施形態において、約０．５〜３の培養体積が毎日収穫される。産物バリアントは、収穫された培養体積から精製され得る。いくつかの実施形態において、産生培養は、期間にわたって置換物（例えば新鮮な培養培地）により連続的にまたは間隔を置いて補充される。一実施形態において、培養は新鮮培地の等価な体積によって置き換えられる。いくつかの実施形態において、培養継続期間は、培養開始後３０日〜１５０日のいつでも（例えば４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０または１４０日）続き得る。
【００６４】
灌流培養による均一産物バリアントの産生
１つまたは複数の産物バリアントを産生する培養系（例えば灌流産生培養系）の使用による１つまたは複数の産物の調製の方法が、本明細書において開示される。一実施形態において、例えばバッチ産生培養またはフェドバッチ産生培養によって産生された産物に比較して、産物バリアントの調製物は、特性（例えば糖鎖付加、活性または均一性）に関して、至適化された均一性を有する。理論に拘束されることを望むものではないが、有意に異なる培養条件を含む期間（例えば産生培養の全体の継続期間）にわたって作製される産物バリアントを含む調製物ゆえに、フェドバッチおよびバッチの産生培養から産生される産物の不均一性が生じると考えられる。したがって、１を超える産物の形態が最終的な収穫された培養培地中に存在する。本明細書において記載される系から収穫されたより少量の周期的なアリコートは、おそらく、灌流培養から産物バリアントが産生されるより均一な細胞条件および環境条件の可能性に起因して、均一性の増加した産物バリアントを含む。
【００６５】
２つ以上の産物バリアントの調製物を産生する本明細書において記載される培養系（例えば灌流産生培養系）の使用による２つ以上の産物の調製の方法が、本明細書において開示され、各々のものは、至適化された均一性（例えばバッチ産生培養またはフェドバッチ産生培養によって産生された産物に比較して、特性に関して均一性が増加）が有る。いくつかの実施形態において、第１の産物バリアントは、第１の条件下で産生培養を培養することによって産生される。第１の条件下の産生培養から回収された産物のバッチ（例えば１つまたは複数のバッチ）は、第１の産物バリアントを含む。第２の産物バリアントは、第２の条件下で産生培養を培養することによって産生される。第２の条件下の産生培養から回収された産物のバッチ（例えば１つまたは複数のバッチ）は、第２の産物バリアントを含むだろう。
【００６６】
いくつかの実施形態において、条件は、培養パラメーターおよび／または環境パラメーターを含み、それらは、培地タイプ（例えばＰＢＳ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、血清、血清を含有する培地など）、１つまたは複数のポリペプチドのレベル、化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、非ペプチドシグナル分子（例えばＣａ＋２、ｃＡＭＰ、グルコース、ＡＴＰなど）のレベル、温度、ｐＨ、培養の細胞密度、ならびに栄養利用可能性を包含するがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、条件は、アミノ酸（例えばリジン）、糖（例えばガラクトースまたはＮ−アセチルマンノサミン）、または水溶性金属化合物のうちの１つまたは複数のレベル（例えば濃度または相対的レベル、例えば以前の条件と比べて増加または減少したレベル）を含む。条件の生成または維持における使用のためのアミノ酸および糖は、多様な共有結合性修飾（例えばアセチル化）を含み得る。条件の生成または維持において有用な水溶性金属化合物は、銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、および鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））を包含するがこれらに限定されない。
【００６７】
いくつかの実施形態において、本発明の調製の方法は、２を超える産物の調製物（例えば２を超える産物バリアント）を産生する。いくつかの実施形態において、培養は、第３、第４、第５、またはさらなる条件下でさらに培養され得る。第３、第４、第５、またはさらなる条件下の産生培養から回収された産物のバッチ（例えば１つまたは複数のバッチ）は、第３、第４、第５またはさらなる産物バリアントを含むだろう。
【００６８】
一実施形態において、方法は、第１のバリアントの調製物および第２のバリアントの調製物を提供する。一実施形態において、方法は、第３のバリアントの調製物を提供する。
【００６９】
一実施形態において、方法は、第４のバリアントの調製物を提供する。
【００７０】
一実施形態において、方法は、第５のバリアントの調製物を提供する。
【００７１】
一実施形態において、方法は、第６のバリアントの調製物を提供する。
【００７２】
一実施形態において、方法は、第７のバリアントの調製物を提供する。
【００７３】
一実施形態において、方法は、第８のバリアントの調製物を提供する。
【００７４】
一実施形態において、方法は、第９のバリアントの調製物を提供する。
【００７５】
一実施形態において、方法は、第１０のバリアントの調製物を提供する。
【００７６】
一実施形態において、方法は、第１１のバリアントの調製物を提供する。
【００７７】
一実施形態において、方法は、第１２のバリアントの調製物を提供する。
【００７８】
一実施形態において、方法は、第１３のバリアントの調製物を提供する。
【００７９】
一実施形態において、方法は、第１４のバリアントの調製物を提供する。
【００８０】
一実施形態において、方法は、第１５のバリアントの調製物を提供する。
【００８１】
一実施形態において、方法は、第１６のバリアントの調製物を提供する。
【００８２】
一実施形態において、方法は、第１７のバリアントの調製物を提供する。
【００８３】
一実施形態において、方法は、第１８のバリアントの調製物を提供する。
【００８４】
一実施形態において、方法は、第１９のバリアントの調製物を提供する。
【００８５】
一実施形態において、方法は、第２０のバリアントの調製物を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、産物バリアントの所望される産生が完了した後に、産生培養は次の条件下で培養される。いくつかの実施形態において、次の条件への転換後に、バイオリアクターの構成要素またはバイオリアクターの下流の構成要素は、前の産物バリアントが浄化される。いくつかの実施形態において、この浄化期間の間に、灌流液は収集されないか、または収集されて廃棄される。一旦バイオリアクターが安定的な操作に到達したならば、灌流液（例えば次の産物バリアントを含む灌流液）の収集および精製が再開され得る。
【００８７】
一実施形態において、１つまたは複数の産物バリアントまたはその調製物は、例えばバリアント間の異なる存在（例えばパラメーターのレベル、例えば糖鎖付加）について分析される。
【００８８】
産生のための適用
本明細書において開示される、産物（例えば産物バリアント）の調製の方法を使用して、多様な産物を産生するか、様々な細胞株を評価するか、またはバイオリアクターもしくはプロセシング容器もしくはタンク（またはより一般的には任意の供給源と共に）における使用のための様々な細胞株の産生を評価することができる。本明細書において記載されるデバイス、設備および方法は、原核生物細胞株および／または真核生物細胞株を包含する任意の所望される細胞株の培養に好適である。さらに、複数の実施形態において、デバイス、設備および方法は、懸濁細胞または足場依存性（接着性）細胞の培養に好適であり、医薬産物および生物医薬産物（ポリペプチド産物、核酸産物（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）、または細胞療法および／もしくはウイルス療法において使用されるもの等の細胞および／もしくはウイルス等）の産生のために構成された産生操作に好適である。
【００８９】
複数の実施形態において、細胞は、産物（組み換えの治療または診断用の産物等）を発現または産生する。より詳細に以下に記載されるように、細胞によって産生される産物の例としては、抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（特異的に抗原へ結合するが構造的に抗体に関連しないポリペプチド分子（例えばＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチンまたはＩｇＮＡＲ等））、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組み換えタンパク質（例えば糖鎖付加タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス療法（例えば抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法のためのウイルスベクター、およびウイルス免疫療法）、細胞療法（例えば多能性幹細胞、間充織幹細胞、および成体幹細胞）、ワクチンまたは脂質カプセル化粒子（例えばエキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ等）もしくはＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ等）、抗生物質、またはアミノ酸が挙げられるがこれらに限定されない。複数の実施形態において、デバイス、設備および方法は、バイオシミラーの産生のために使用され得る。
【００９０】
前述のように、複数の実施形態において、デバイス、設備および方法は、真核生物細胞（例えば哺乳動物細胞または下等真核生物細胞（例えば酵母細胞または糸状菌細胞等））、もしくは原核生物細胞（グラム陽性またはグラム陰性細胞等）、および／または真核生物細胞もしくは原核生物細胞の産物（例えば大スケール様式で真核生物細胞によって合成された、タンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ等））の産生を可能にする。本明細書において特別に明記されない限り、デバイス、設備および方法は、任意の所望される体積または産生能力を包含し、ベンチスケール、パイロットスケール、および十分な産生スケール能力を包含するがこれらに限定されない。
【００９１】
さらにそして本明細書において特別に明記されない限り、デバイス、設備および方法は、任意の好適な反応器（複数可）を包含することができ、撹拌タンク、エアリフト、ファイバー、マイクロファイバー、ホローファイバー、セラミックマトリックス、流動床、固定床、および／または噴流層バイオリアクターを包含するがこれらに限定されない。本明細書において使用される時、「反応器」は発酵槽もしくは発酵ユニットまたは他の反応容器を包含することができ、「反応器」という用語は「発酵槽」と互換的に使用される。例えば、いくつかの態様において、バイオリアクターユニットは、以下の、栄養素および／もしくは炭素源の供給、好適な気体（例えば酸素）の注入、発酵培地もしくは細胞培養培地の入口流および出口流、気体相および液体相の分離、温度の維持、酸素およびＣＯ２のレベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば撹拌）、ならびに／または洗浄／滅菌のうち１つもしくは複数またはすべてを遂行することができる。例示的反応器ユニット（発酵ユニット等）はユニット内に複数の反応器を含有し、例えばユニットは各々のユニット中に１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００またはそれ以上のバイオリアクターを有することができ、および／または、設備は設備内に単一もしくは複数の反応器を有する複数のユニットを含有し得る。様々な実施形態において、バイオリアクターは、バッチ、セミフェドバッチ、フェドバッチ、灌流、および／または連続発酵のプロセスに好適であり得る。任意の好適な反応器直径が使用され得る。複数の実施形態において、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの間の体積を有し得る。非限定例としては、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル４５００リットル５０００リットル６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル、および／または５０，０００リットルの体積が挙げられる。加えて、好適な反応器は、複数回使用、単回使用、使い捨て、または非使い捨てであり得、任意の好適な材料から形成され得、ステンレス鋼等の合金（例えば３１６Ｌまたは他の好適なステンレス鋼）およびインコネル、プラスチック、ならびに／またはガラスを包含する。
【００９２】
複数の実施形態において、そして本明細書において特別に明記されない限り、調製物を作製する方法による使用のための、本明細書において記載されるデバイス、設備、および方法は、特別に言及されない任意の好適なユニット操作および／または機器（かかる産物の分離、精製および単離のための操作および／または機器等）も包含することができる。任意の好適な設備および環境（従来の現場組み立て設備、モジュール式設備、可動式設備および仮設設備、もしくは他の好適な構築物、設備、ならびに／またはレイアウト等）が使用され得る。例えば、いくつかの実施形態において、モジュール式クリーンルームが使用され得る。加えてそして特別に述べられない限り、本明細書において記載されるデバイス、系、および方法は、単一の所在位置もしくは設備において収容および／もしくは遂行され得るか、またはあるいは、分離したもしくは複数の所在位置および／もしくは設備で収容および／もしくは遂行され得る。
【００９３】
非限定例として、および限定されずに、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号；同２０１２／００７７４２９号；同２０１１／０２８０７９７号；同２００９／０３０５６２６号；ならびに米国特許第８，２９８，０５４号；同第７，６２９，１６７号；および同５，６５６，４９１号（それらは全体が参照として本明細書に援用される）は、好適であり得る例示的な設備、機器、および／または系を記載する。
【００９４】
本明細書において記載される調製物を作製する方法は、広範囲のスペクトルの細胞を使用することができる。複数の実施形態において、細胞は真核生物細胞（例えば哺乳動物細胞）である。哺乳動物細胞は、例えばヒトまたは齧歯動物またはウシの細胞株または細胞系統であり得る。かかる細胞、細胞株または細胞系統の例は、例えばマウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＱＣｌ−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解細胞またはハイブリドーマ細胞株である。好ましくは、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞株である。一実施形態において、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態において、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、またはＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばＰｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核生物細胞は、鳥類の細胞、細胞株または細胞系統（例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６またはＥＢｖ１３等）でもあり得る。
【００９５】
一実施形態において、真核生物細胞は幹細胞である。幹細胞は例えば多能性幹細胞であり得、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）および間充織幹細胞（ＭＳＣ）を包含する。
【００９６】
一実施形態において、細胞は本明細書において記載される細胞のうちの任意のものの分化した形態である。一実施形態において、細胞は、培養における任意の初代細胞に由来する細胞である。
【００９７】
複数の実施形態において、細胞は、肝細胞（ヒト肝細胞、動物肝細胞または非実質細胞等）である。例えば、細胞は、プレーティング可能な代謝試験済みヒト肝細胞、プレーティング可能な誘導試験済みヒト肝細胞、プレーティング可能なＱｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁試験済みヒト肝細胞（１０名のドナーおよび２０名のドナーをプールした肝細胞を包含する）、ヒト肝臓のクッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一およびプールされたビーグル肝細胞を包含する）、マウス肝細胞（ＣＤ−１肝細胞およびＣ５７ＢＩ／６肝細胞を包含する）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  ＨａｎおよびＷｉｓｔａｒの肝細胞を包含する）、サル肝細胞（カニクイザルまたはアカゲザルの肝細胞を包含する）、ネコ肝細胞（ドメスティックショートヘアの肝細胞を包含する）、およびウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイトの肝細胞を包含する）であり得る。例示的な肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ（ＬＬＣ、６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、米国２７７０９）から市販で入手可能である。
【００９８】
一実施形態において、真核生物細胞は、下等真核生物細胞（例えば酵母細胞（例えばＰｉｃｈｉａ属（例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉおよびＰｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ属（例えばＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓまたはＫｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓａｅ、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ）、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属（例えばＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、Ｃａｎｄｉｄａ属（例えばＣａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ属（例えばＧｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、またはＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ等）である。種Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが好ましい。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株についての例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ；およびＣＢＳ７４３５である。
【００９９】
一実施形態において、真核生物細胞は、真菌細胞（例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、Ａ．ｏｒｚｙａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａ等）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ等）、Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ等）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ等）、Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ等）、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ等）、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ等）、Ｈｙｐｏｃｒｅａ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ等）、Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ等）、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ等）、Ｎｅｃｔｒｉａ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ等）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ等）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ等）、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ、Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ等）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ等）、またはＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ（Ｖ．ｄａｈｌｉａ等））である。
【０１００】
一実施形態において、真核生物細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９またはＭｉｍｉｃ（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）またはＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えば属Ａｍｐｈｏｒａ、Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ、Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ、Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ（シアノバクテリア）、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ、ＳｐｉｒｕｌｉｎａまたはＯｃｈｒｏｍｏｎａｓのもの）、または植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、コメ、コムギまたはＳｅｔａｒｉａ）、または双子葉植物（例えばキャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓまたはＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）からの細胞）である。
【０１０１】
一実施形態において、細胞は、細菌細胞または原核生物細胞である。
【０１０２】
複数の実施形態において、原核生物細胞は、グラム陽性細胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ等）である。使用され得るＢａｃｉｌｌｕｓは、例えばＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｎａｔｔｏまたはＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍである。複数の実施形態において、細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ３ＮＡおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８等）である。Ｂａｃｉｌｌｕｓは、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４）から得ることが可能である。
【０１０３】
一実施形態において、原核生物細胞は、グラム陰性細胞（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属の種またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ  １７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＯｒｉｇａｍｉ等に加えて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ株（例えばＢＬ−２１またはＢＬ２１（ＤＥ３）等）に由来するもの、それらのすべては市販で入手可能である）等）である。
【０１０４】
好適な宿主細胞は、例えば培養物コレクション（ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨおよびＢｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）等）から市販で入手可能である。
【０１０５】
複数の実施形態において、培養細胞は、治療使用のためのタンパク質（例えば抗体（例えばモノクローナル抗体）および／または組み換え体タンパク質）を産生するために使用される。複数の実施形態において、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸、または他の有用な生化学的な中間体もしくは代謝物質を産生する。例えば、複数の実施形態において、約４０００ダルトン〜約１４０，０００ダルトンを超える分子量を有する分子が産生され得る。複数の実施形態において、これらの分子は広範囲にわたる複雑性を有することができ、翻訳後修飾を包含し、糖鎖付加を包含する。
【０１０６】
複数の実施形態において、ポリペプチドは、例えばＢＯＴＯＸ、Ｍｙｏｂｌｏｃ、Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ、Ｄｙｓｐｏｒｔ（またはボツリヌス神経毒素の他の血清型）、アルグルコシダーゼα、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性性腺刺激ホルモンα、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン２、アルデスロイキン、テセロイリン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキン・ディフティトックス、インターフェロンα−ｎ３（注射剤）、インターフェロンα−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、Ｓｕｎｔｏｒｙ（γ−１ａ）、インターフェロンγ、チモシンα１、タソネルミン、ＤｉｇｉＦａｂ、ＶｉｐｅｒａＴＡｂ、ＥｃｈｉＴＡｂ、ＣｒｏＦａｂ、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、Ｒｅｂｉｆ、エプトテルミンα、テリパラチド、カルシトニン、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー（ウシ）、ドロトレコジンα、コラゲナーゼ、カルペリチド、組み換えヒト表皮増殖因子、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンα、エポエチンω、エポエチンβ、エポエチンα、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグα２５０、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ、エプタコグα（活性型）、組み換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト、組み換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組み換え体）、Ａｌｐｈｎｍａｔｅ、オクトコグα、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンα、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エクセナチド、プラムリンタイド、イニグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ、モルグラモスチム、トリプトレリン酢酸塩、ヒストレリン（Ｈｙｄｒｏｎ）、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド（ＡＴＲＩＧＥＬ）、ロイプロリド（ＤＵＲＯＳ）、ゴセレリン、Ｅｕｔｒｏｐｉｎ、ソマトロピン、メカセルミン、ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入用）、インスリンスリプロ、インスリンデテミル、インスリン（ＲａｐｉｄＭｉｓｔ）、メカセルミンリンファバート、アナキンラ、セルモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド、ミエロピド（ｍｙｅｌｏｐｉｄ）、Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ、グラチラマー酢酸塩、Ｇｅｐｏｎ、サルグラモスチム、オプレルベキン、ヒト、白血球由来のαインターフェロン、Ｂｉｌｉｖｅ、インスリン（組み換え体）、組み換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセニン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロンＡおよびインターフェロンα２、Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンα、Ａｖｏｎｅｘ、組み換えヒト黄体化ホルモン、ドルナーゼα、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンα、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、Ｚｅｍａｉｒａ、ＣＴＣ−１１１、Ｓｈａｎｖａｃ−Ｂ、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム、アガルシダーゼβ、アガルシダーゼα、ラロニダーゼ（ｌａｒｏｎｉｄａｓｅ）、酢酸プレザチド銅、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ、ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ、Ｔｒｉｃｏｍｉｎ、組み換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）１−８４、エポエチンδ、遺伝子導入抗トロンビンＩＩＩ、Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ、Ｖｉｔｒａｓｅ、組み換えインスリン、インターフェロンα、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オムナパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組み換え血清アルブミン、セルトリズマブ・ペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組み換えＣ１エステラーゼインヒビター、ラノテプラーゼ、組み換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、ＶＧＶ−１、インターフェロン（α）、ルシナクタント、アビプタジル、イカチバント、エカランチド、オミガナン、Ａｕｒｏｇｒａｂ、ペキシガナン酢酸塩、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデリンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、Ｆａｖｌｄ、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ、コリフォリトロピンα、ＴＨ−９５０７、テドグルチド、Ｄｉａｍｙｄ、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン、組み換えＧ−ＣＳＦ、インスリン、インスリン（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ）、インスリン（ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ＤｉａＰｅｐ２７７、インターフェロンβ、インターフェロンα−ｎ３、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、Ｘｅｒｅｃｅｐｔ、オペバカン、ＡＩＤＳＶＡＸ、ＧＶ−１００１、ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ、ランピルナーゼ、Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ、ルスプルチド、ＭＰ５２、シプリューセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、Ｉｎｓｅｇｉａ、ビテスペン、ヒトトロンビン、トロンビン、ＴｒａｎｓＭＩＤ、アルフィメプラーゼ、Ｐｕｒｉｃａｓｅ、テルリプレシン、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組み換えＦＧＦ−Ｉ、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン、アンジオスタチン、ＡＢＴ−５１０、ボーマン・バークインヒビター、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシンＶ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）、オザレリクス、ロミデプシン、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、Ｐｅｐｓｃａｎ、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１  ＡＴＮ−１６１、シレンギチド、Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ、Ｂｉｐｈａｓｉｘ、ＩＲＸ−２、ωインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、ＳＢ−２４９５５３、Ｏｎｃｏｖａｘ−ＣＬ、ＯｎｃｏＶａｘ−Ｐ、ＢＬＰ−２５、ＣｅｒＶａｘ−１６、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ネミフィチド、ｒＡＡＴ、ＣＧＲＰ、ペグスネルセプト、チモシンβ４、プリチデプシン、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、ＧＲＡＳＰＡ、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、エクサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン、Ｃａｒｄｅｖａ、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウロジラチン、デペレスタット、ヘマチド（ｈｅｍａｔｉｄｅ）、Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ、ｒＮＡＰｃ２、組み換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組み換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ  Ｐｒｏｌｙｓｅ、ＮｅｕｒｏＶａｘ、ＣＺＥＮ−００２、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エクセナチド（制御放出、Ｍｅｄｉｓｏｒｂ）、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ−９６０４、リナクロチド酢酸塩、ＣＥＴｉ−１、Ｈｅｍｏｓｐａｎ、ＶＡＬ、即効性インスリン（注射可能、Ｖｉａｄｅｌ）、インスリン（エリゲン）、組み換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、オルグ−３９１４１、Ｃｐｎ１０、タラクトフェリン、ｒＥＶ−１３１、ｒＥＶ−１３１、組み換えヒトインスリン、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト、インターフェロンα−ｎ３、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、Ｔａｕｆｅｒｏｎ、胆汁酸塩刺激性リパーゼ、Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ、アラリン（ａｌａｌｉｎｅ）ホスファターゼ、ＥＰ−２１０４Ｒ、Ｍｅｌａｎｏｔａｎ−ＩＩ、ブレメラノチド、ＡＴＬ−１０４および組み換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、ＳＥＭＡＸ、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、ＡＬＴＵ−１３５、組み換えノイラミニダーゼ、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ  Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ−Ｃ、ＰＴＨアナログ、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆ、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組み換えペストＦＩＶ、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７、ＰＲ１ペプチド抗原、突然変異ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンシン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）、ＷＴ１−ペプチド、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、Ｐｅｎｔｒｙｓ、Ｎｏｒｅｌｉｎ、ＣｙｔｏＦａｂ、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド、テルベルミン、ルピントリビル、レティキュロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、α−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンジオテンシン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２特異的免疫毒素、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、Ｃｏｍｂｏｔｏｘ、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスニズ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２、ＰＭ−０���７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７、Ｌ−１９ベースのｒａ（Ｌ−１９  ｂａｓｅｄ  ｒａ）、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／ＫＬＨ、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、ＣＢＰ−５０１、組み換えヒトラクトフェリン、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３−３６］、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７−３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、グリコＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン（ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド（ｓｉｆｕｖｉｒｔｉｄｅ）、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポイエチン受容体アゴニスト、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経増殖因子アンタゴニスト、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合、ＥＰ−１０４３、ｇｐＥ１、ｇｐＥ２、ＭＦ−５９、ｈＰＴＨ（１−３４）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、マルチエピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管標的化ＴＮＦ、デスモプレシン、オネルセプト、およびＴＰ−９２０１である。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ）、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（商標）／ＭＡＢ  ＴＨＥＲＡ（商標））エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（商標））、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、ペグリィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））、またはバイオシミラーおよびバイオベターを包含する他の好適なポリペプチドである。
【０１０８】
他の好適なポリペプチドは、以下におよびＵＳ２０１６／００９７０７４の表１中でリストされたものである。
【表１−１】
2020507336.tif 000003
【表１−２】
2020507336.tif 000004
【表１−３】
2020507336.tif 000005
【０１０９】
複数の実施形態において、ポリペプチドは、表２中で示されるような、ホルモン、凝血因子／凝固因子、サイトカイン／増殖因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン、またはペプチドである。
【表２−１】
2020507336.tif 000006
【表２−２】
2020507336.tif 000007
【表２−３】
2020507336.tif 000008
【０１１０】
複数の実施形態において、タンパク質は、多重特異性タンパク質（例えば表３中で示されるような二重特異性抗体）である。
【表３−１】
2020507336.tif 000009
【表３−２】
2020507336.tif 000010
【表３−３】
2020507336.tif 000011
【表３−４】
2020507336.tif 000012
【表３−５】
2020507336.tif 000013
【表３−６】
2020507336.tif 000014
【表４−１】
2020507336.tif 000015
【表４−２】
2020507336.tif 000016
【表４−３】
2020507336.tif 000017
【表４−４】
2020507336.tif 000018
【表４−５】
2020507336.tif 000019
【表４−６】
2020507336.tif 000020
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは癌細胞によって発現される抗原である。いくつかの実施形態において、組み換えポリペプチドまたは治療用ポリペプチドは腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原である。いくつかの実施形態において、組み換えポリペプチドまたは治療用ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌胎児抗原（ＣＥＡ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２）、表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、ＥｒｂＢ２、胎児アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、グロボＨ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様増殖因子受容体１、ルイスＹ、ＬＧ、Ｌｙ−６、メラノーマ特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ）、メソテリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ）受容体ＩＩ型、形質細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦα前駆体、およびその組み合わせから選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは活性化受容体であり、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）およびＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＫＩＲの活性化形態、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１つまたは複数の天然の細胞傷害性受容体、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５、およびその組み合わせから選択され、随意に、β２インテグリンはＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８またはＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、随意に、ＫＩＲの活性化形態はＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ４またはＫＩＲ−Ｓを含み、随意に、天然の細胞傷害性受容体はＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６またはＮＫｐ８０を含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは阻害性受容体であり、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−１／ＣＤ８５ｊ、ＫＩＲの阻害形態、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−Ｐ１Ａ、シグレック−３、シグレック−７、シグレック−９、およびその組み合わせから選択され、随意に、ＫＩＲの阻害形態はＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２またはＫＩＲ−Ｌを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは活性化受容体であり、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）、およびその組み合わせから選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、ポリペプチドは阻害性受容体であり、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈ１（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）、およびその組み合わせから選択される。
【０１１６】
他の例示的なタンパク質としては、Ｌｅａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，２００８，７：２１−３９（参照により本明細書に援用される）の表１〜１０中で記載される任意のタンパク質；または本明細書において記載される組み換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、アナログもしくは機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１７】
他の組み換えタンパク質産物は、非抗体スキャフォールドまたは代替のタンパク質スキャフォールド（ＤＡＲＰｉｎｓ、アフィボディおよびアドネクチン等であるがこれらに限定されない）を包含する。かかる非抗体スキャフォールドまたは代替のタンパク質スキャフォールドは、１もしくは２またはそれ以上（例えば１、２、３、４もしくは５またはそれ以上）の異なる標的または抗原を認識するかまたは結合するように操作され得る。
【０１１８】
可変直径のバイオリアクター
本明細書において開示される、産物（例えば産物バリアント）の調製の方法は、可変直径のバイオリアクター容器（ＶＤＢ）により使用され得る。可変直径のバイオリアクター容器が本明細書において記載され、液体培地および生物学的材料を保持するように構成された第１の直径を有する、第１の容器セクション、および液体培地が容器内で第１の体積から第２の体積へ増加され得るように第１の直径よりも大きい第２の直径を有する、第２の容器セクションを含み得る。いくつかの態様において、第１の容器セクションは０．３：１より大きいアスペクト比を有することができる。いくつかの態様において、第２の容器セクションは０．３：１より大きいアスペクト比を有することができる。いくつかの態様において、液体培地は接種物を含む。第１の容器セクションは最初の接種ステージのバイオリアクターであるように構成され得る。第２の容器セクションは増殖ステージのバイオリアクターまたはシードバイオリアクターであるように構成され得る。可変直径のバイオリアクター容器は少なくとも１つのかき混ぜ機をさらに含み得る。いくつかの態様において、バイオリアクターは、かき混ぜ機シャフト、インペラー、スパージャー、プローブポート、充填ポート、コンデンサー、ベントフィルター、消泡機プレート、サンプルポート、レベルプローブ、およびロードセルのうちの少なくとも１つをさらに含み得る。
【０１１９】
いくつかの態様において、可変直径のバイオリアクター容器は、哺乳動物細胞、植物細胞、微生物細胞、または昆虫細胞の増殖のために構成され得る。他の態様において、本明細書において開示される、産物（例えば産物バリアント）の調製の方法による使用のための可変直径のバイオリアクター系は、容器の直径が容器の高さに沿って変動するように第１の直径および第２の直径を有するバイオリアクター容器、かき混ぜ機がバイオリアクター容器の所与の液体高さで所望されるかき混ぜを提供するように配置されるバイオリアクター容器内のかき混ぜ機、ならびに第１の体積から第２の体積へバイオリアクター容器をスケールアップするように作動可能な制御系を含み得る。いくつかの態様において、第１の容器セクションは０．３：１より大きいアスペクト比を有し、第２の容器セクションは０．３：１より大きいアスペクト比を有する。第１の容器のセクションは、最初の接種ステージのバイオリアクターであり得る。第２の容器のセクションは、増殖ステージの容器セクションであり得る。可変直径のバイオリアクター系は、スパージャー、プローブポート、充填ポート、コンデンサー、ベントフィルター、消泡機プレート、サンプルポート、レベルプローブ、および／またはロードセルも含み得る。いくつかの態様において、可変直径のバイオリアクター系は哺乳動物細胞産生のために構成される。
【０１２０】
他の態様において、産物（例えば産物バリアント）の調製の方法は、増殖培地および接種物を第１の体積でバイオリアクターに接種すること、ならびに接種ステージの完了に続いて、追加の増殖培地をバイオリアクターへ添加してバイオリアクター体積を第２の体積へスケールアップすることを含む。いくつかの態様において、方法は、増殖ステージの完了に続いて、追加の増殖培地をバイオリアクターへ添加してバイオリアクター体積を第３の体積へスケールアップすることをさらに含み得る。いくつかの態様において、接種物は哺乳動物細胞である。他の態様において、バイオリアクターは０．３：１の最小アスペクト比を有することができる。
【０１２１】
可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）（本明細書において記載されるもの等）中の生物学的材料（微生物培養物および哺乳動物培養物等）のバイオリアクタープロセシングは、最小の接種物により開始する増殖条件を持続させ、増殖継続期間にわたる連続的および／またはボーラスの培地および／または供給添加を利用して細胞増殖を持続させるように、デザインされる。単一のＶＤＢ中での細胞の増殖および産生の達成によって、複数のより小さな体積バイオリアクターは消失され得る。単一のＶＤＢは、所望される産物の産生のために必要とされるバイオリアクター機器の全体的な設置面積を低減し、複数のシード反応器、複数のＣＩＰ、ＳＩＰ、開始操作、ポストラン操作を消失させ、複数のシードバイオリアクターの使用により現在観察される非対数細胞増殖またはラグ相効果を最小限にし、したがって全体的な設備操作を単純化し、時間および価格削減をもたらす。
【０１２２】
例えば、単一の２０，０００ＬのＶＤＢは、２００ＬのＮ−３、１０００ＬのＮ−２および５０００ＬのＮ−１シードバイオリアクターを置き換えることができる。単一のＶＤＢによって３つのシードバイオリアクターを置換することは、３００平方フィートを超えるクリーンルーム空間を節約することができることも推定される。
【０１２３】
いくつかの態様において、バイオリアクターの下方部分についての円錐状またはより小さな直径の円筒形状および上方部分についての円筒状デザインの利用は、１つのバイオリアクター内で制御可能なスケールアップを可能にし、混合および通気に関して重要なデザイン利益を提供する。例えば、可変直径の円錐状のまたはより小さな直径の円筒状の底のタンクの使用は、１：１より大きいアスペクト比（液体レベルでの液体高さ対容器幅）により、バルクの間により大きな体積培養まで酸素移動のための十分な液頭を備えた最小の接種体積を支援するように維持され得る。次いで培養体積を培地の添加を介してかさ高くして、細胞増殖を持続させることができる。代替の底部デザインは、典型的な固定直径の円筒形のタンクバイオリアクターデザインに比較して、より高いアスペクト比およびより少ない体積で操作する能力を可能にすることができる。
【０１２４】
本明細書において使用される時、「生物学的材料」は、生きているかもしくは死んだ細胞材料もしくはウイルス材料からすべてもしくは部分的になる粒子、ならびに／または細胞培養またはウイルス培養によって産生および発現された産物を意味することが理解される。例えば、これは、真核生物細胞または原核生物細胞（哺乳動物、細菌、植物、真菌等のもの）、ウイルス（タリモジーン・ラハーパレプベック（Ｔ−ＶＥＣ）等）、または他の所望される治療用産物もしくは生化学的産物を包含し得る。いくつかの態様において、「生物学的材料」は、細胞療法プログラムのために産生された細胞を包含する。いくつかの態様において、「生物学的材料」は、ウイルス療法（ウイルス遺伝子療法、ウイルス免疫療法または原生動物ウイルス療法を包含する）のために産生されたウイルスを包含する。いくつかの態様において、「生物学的材料」は、本明細書において記載されるような産物（例えば産物バリアント）の発酵産生のための細胞培養物またはウイルス培養物を包含する。いくつかの態様において、生物学的材料は、不活性材料（基質または固定化材料等）を包含し得る。さらに、本明細書において使用される時、「液体培地」は、典型的にはバイオリアクタープロセスにおいて使用される任意の液体（増殖培地、水、接種物および生物学的材料等）を意味することが理解される。液体培地は、液体培地中に懸濁されるか、乳化されるか、同伴されるか、またはそうでなければ存在する、固体粒子および/または気体を有し得る。
【０１２５】
図中で示されるように、可変直径のバイオリアクターは、単一のバイオリアクター容器内で接種物からシードおよび産生へと効率的スケールアップを可能にする複数の立体配置を有し得る。いくつかの態様において、バイオリアクター培地体積が、従来の垂直円筒の一様な直径の反応器に比べて少ない場合に、可変直径のバイオリアクターはより好適なアスペクト比を有し得る。少ない体積接種から生産量までの培地または供給の添加は、廃液が希釈され、新鮮な栄養素が連続的に導入および混合されるので、細胞増殖のための安定化した環境も提供する。いくつかの態様において、例示的な可変直径のバイオリアクターは、発酵プロセスのために構成することができ、バッチ、フェドバッチ、または連続産生もしくは灌流産生であり得、産生の方法は、バイオリアクター容器内での培養のステージおよび体積ステージに依存して変化し得る。例えば、最初の接種ステージの間に、バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスが使用され得る。次いで、一旦細胞増殖ステージが成熟に到達し、バイオリアクター体積がその所望される限界へスケールアップされれば、連続プロセスまたは灌流プロセスを利用され得る。本明細書において記載される可変直径のバイオリアクターは、任意の好適な材料から形成され、一回使用の使い捨ての系のために構成され得る。いくつかの態様において、反応器は、単一タイプ系または多重産物一式における使用ために構成され得る。
【０１２６】
さらに、可変直径のバイオリアクターは任意の所望される全体積を有するように構成され得る。より詳細に論じられるように、ＶＤＢは約２０，０００リットル（Ｌ）の全体積を有することができるが、例えば１，０００Ｌの全体積または場合によっては１０Ｌの全体積を備えたＶＤＢをデザインすることも可能である。例えば、１０Ｌの全体積ＶＤＢはプロセス開発またはスケールダウン研究のために使用され得るが、１０００Ｌの体積はパイロットスケールのバイオリアクターとして供することができる。図１〜３は、円錐状下方部分および円筒状上方部分を有し、それによって上部円筒状の部分の高さが変動されて様々な所望される体積を達成する、例示的な可変直径のバイオリアクターを図示する。
【０１２７】
図１は可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）１００を図示する。可変直径のバイオリアクター１００は、液体培地または生物学的材料の培養物（適切な細胞等）を保持するように構成された第１の直径を有する、第１の容器セクション１０２、および液体培地が容器１００内で第１の体積から第２の体積へ増加され得るように第１の直径よりも大きい第２の直径を有する、第２の容器セクション１０４を含む。可変直径のバイオリアクター１００は、少なくとも１つの入口（マンウェイ１０６等）および少なくとも１つの出口１０８も有する。
【０１２８】
図２は、図１中で示される可変直径のバイオリアクターの上部円筒状部分の高さと比べて、上部円筒状部分の高さが減少した、可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）２００を図示する。可変直径のバイオリアクター２００は、液体培地を保持するように構成された第１の直径を有する、第１の容器セクション２０２、および第１の直径よりも大きい第２の直径を有する、第２の容器セクション２０４を含む。可変直径のバイオリアクター２００は、少なくとも１つの入口（マンウェイ２０６等）および少なくとも１つの出口２０８も有する。
【０１２９】
図３は、図２中で示される可変直径のバイオリアクターの上部円筒状部分の高さと比べて、上部円筒状部分の高さが減少した、可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）３００を図示する。可変直径のバイオリアクター３００は、液体培地を保持するように構成された第１の直径を有する、第１の容器セクション３０２、および第１の直径よりも大きい第２の直径を有する、第２の容器セクション３０４を含む。可変直径のバイオリアクター３００は、少なくとも１つの入口（マンウェイ３０６等）および少なくとも１つの出口３０８も有する。
【０１３０】
図４は可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）４００を図示する。可変直径のバイオリアクター４００は、第１の容器セクション４０２、第２の容器セクション４０４、および第３の容器セクション４０６を含む。第１の容器セクションは、容器の高さに沿って変動する直径を有する（すなわち、第１の容器セクション４０２の直径および第２の容器セクション４０４の直径は、バイオリアクター４００の頂部に向かって増加する）。しかしながら示されるように、第３のセクション４０６の直径は、セクション４０６の全体にわたって比較的一様にとどまる。
【０１３１】
図５は可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）５００を図示する。可変直径のバイオリアクター５００は、第１の容器セクション５０２、第２の容器セクション５０４、および第３の容器セクション５０６を含む。第１の容器セクションは、ステップ状様式で容器の高さに沿って変動する直径を有する（すなわち、容器の上へ動くにつれて、第３の容器セクション５０６の直径は、第２の容器セクション５０４の体積より大きく、それは第１の容器セクション５０２の体積より大きい）。示されるように、この態様において、各々のステージの直径はステージの全体にわたって一様であり、ステップは第１のステージ５０２と第２のステージ５０４との間で増加し、別のステップは第２のステージ５０４と第３のステージ５０６との間で直径が増加する。
【０１３２】
図６〜９は、様々なバイオリアクターデザインの例示的なアスペクト比および体積を図示する。上記のように、アスペクト比は、容器の高さ対幅または直径として定義される。示されるように、図６〜９の反応器は、約０リットル〜２５，０００リットル（Ｌ）の間の範囲の体積を有し得る。
【０１３３】
図６は、一様な直径を有する典型的なバイオリアクター６００である（すなわち可変直径のバイオリアクターでない）。典型的なバイオリアクター６００は、単一の容器セクション６０８のみを有し、バイオリアクターの高さ６０２、体積６０４、およびアスペクト比６０６を有する。典型的なバイオリアクター６００は、表１中で示されるバイオリアクターの高さ６０２およびアスペクト比６０６を有する。示されるように、少ない体積（例えば８００Ｌ）で、典型的な一様な直径反応器のアスペクト比は０．３よりも有意に低い。さらに、一様な直径バイオリアクターは、少なくとも０．６５以上のアスペクト比（それは図６中で約１０，０００Ｌの体積を提示する）で操作される必要がある。したがって、一様な直径バイオリアクターは、至適操作のための所望される培養体積を達成するように、培養体積を漸進的に増加させる複数のシードバイオリアクターを要求する。
【表５】
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【０１３４】
図７、８および９は、それぞれ２００Ｌ、１０００Ｌおよび４０００Ｌの複数のシードバイオリアクターを消失させるのに要求される、所望される体積での操作がすべて可能な異なる立体配置の可変直径のバイオリアクターを示す。
【０１３５】
図７は、バイオリアクターの高さ７０２、体積７０４、およびアスペクト比７０６を有する、例示的な可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）７００を図示する。示されるように、バイオリアクター７００は、第１の容器セクション７０８、第２の容器セクション７１０、および第３の容器セクション７１２を有する。例示的なバイオリアクター７００は、表２中で示されるバイオリアクターの高さ７０２、アスペクト比７０６、および体積７０４を有する。
【表６】
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【０１３６】
図８は、バイオリアクターの高さ８０２、体積８０４、およびアスペクト比８０６を有する、例示的な可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）８００を図示する。示されるように、バイオリアクター８００は、第１の容器セクション８０８、第２の容器セクション８１０、および第３の容器セクション８１２を有する。
【０１３７】
図９は、バイオリアクターの高さ９０２、体積９０４、およびアスペクト比９０６を有する、例示的な可変直径のバイオリアクター（ＶＤＢ）９００を図示する。示されるように、バイオリアクター９００は第１の容器セクション９０８および第２の容器セクション９１０を有する。例示的な反応器８００、９００は、表３中で示される、バイオリアクターの高さ８０２、９０２、およびアスペクト比８０６、９０６を有する。
【表７】
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【０１３８】
図１０および１１は、例示的な可変直径のバイオリアクター容器１０００および１１００を図示する。示されるように、可変直径のバイオリアクター１０００、１２００は、多様なポート、プローブ、スパージャー、および他の構成要素（かき混ぜ機シャフト、インペラー、スパージャー、プローブポート、充填ポート、コンデンサー、ベントフィルター、消泡機プレート、サンプルポート、レベルプローブ、およびロードセル等のうちの少なくとも１つ）を有することができる。
【０１３９】
図１０は、第１の容器セクション１００２および第２の容器セクション１００４を有するＶＤＢ１０００の概略図である。いくつかの態様において、第１の容器セクション１００２は、第１の容器セクション１００２が円錐形状であるように増加する直径を有する。第２の容器セクション１００４は、それが円柱形状を有するように、一定の直径を有することができる。示されるように、ＶＤＢ１０００は、バイオリアクターの全高さＡを有し得る。いくつかの態様において、バイオリアクターの全高さＡは、約５フィート〜約５０フィートの範囲中であり得る。例えば、バイオリアクターの全高さは、約２０フィートである。加えて、示されるように、バイオリアクターの上方部分は高さＢを有し、下方部分は高さＣを有し、バイオリアクターは液体高さＥを有し得る。液体高さＥは、どの生産段階が所望されるかに基づいて変動し得る。いくつかの態様において、下方部分の直径は高さＣに沿って変動し得る。いくつかの態様において、上方部分の直径は高さＢに沿って一定のままであり得る。
【０１４０】
本明細書において記載されるように、ＶＤＢバイオリアクターの直径は、バイオリアクターの全高さＡまたは下方部分の高さＣに沿って動くにつれて、変動し得る。示されるように、第１の容器セクション１００２は、下方部分高さＣの関数として増加する直径を有し得る。反応器高さＡの上への動きは、例えば直径を第２の直径Ｄ２、第３の直径Ｄ３、および第４の直径Ｄ４に増加させる。いくつかの非限定態様において、例えばＤ１は約１フィート〜約３フィートであり、Ｄ２は約１フィート〜約５フィートであり、Ｄ３は約２フィート〜約１０フィートであり、Ｄ４は約３フィート〜約２０フィートである。１つの非限定例として、ＶＤＢバイオリアクターの高さＡは約２０フィート、下方部分の高さＣ（円錐体高さ）は約１５フィート、上方部分直径（Ｄ４）は約１０フィート、底部直径（Ｄ１）は約２フィート、Ｄ２は約３．２５フィート、およびＤ３は約４．８フィートであり、約２４，９０９リットルの（Ｌ）全体積、１３，７８９Ｌの下方部分（円錐体）体積、および１１，１２０Ｌの上方部分（円筒）体積をもたらす。いくつかの態様（図１０中で示されるもの等）において、Ｄ４がＤ５に等しいように、上方部分が一様な直径を有し得ることに注目されたい。
【０１４１】
さらに、示されるように、下方部分は、下方部分のために所望される直径および体積を提供するのに好適な任意の角度であり得る角度θを有する円錐形状を有することができる。体積容量は凹んだ底部１０１６を有し得ることが認識され、角度のある頂点１０１８が単に説明の目的のために示され、反応器中に存在する必要がないことが認識される。さらに、ＶＤＢ１０００は、複数のかき混ぜ機インペラー１０１０ａ、１０１０ｂ、１０１０ｃおよび１０１０ｄを含む。かき混ぜ機インペラーは、特定の容器セクション１００２、１００４（特定のかき混ぜ機インペラー１０１０ａ、１０１０ｂ、１０１０ｃおよび１０１０ｄがその中に配置される）のために構成されたかき混ぜを提供するように構成され得る。示されるように、インペラー１０１０ｄは高さＨでバイオリアクター内に配置され、インペラー１０１０ｃは高さＩでバイオリアクター内に配置され、インペラー１０１０ｂは高さＪでバイオリアクター内に配置され、インペラー１０１０ａは高さＫであり得る。例えば、高さＨ、Ｉ、Ｊ、Ｋは、約１フィート〜約２０フィート中の範囲であり得る。いくつかの態様において、かき混ぜ機は、ＶＤＢ１０００の中点１０１１に沿って配置される単一駆動装置（図示せず）を有し得る。いくつかの態様において、ＶＤＢ１０００は、バイオリアクター１０００の全体にわたってバッフル１０１２を含み得る。示されるように、バッフル１０１２はバイオリアクターの高さＧまたはＦに沿って伸長することができる。いくつかの態様において、ＶＤＢ１０００は複数のポート１０１４を含み得る。ポート１０１４は、入口、出口、プローブ（ｐＨ、温度、酸素または他の所望されるプローブまたはセンサー等）であるように構成され得る。ＶＤＢ１０００は単一のインペラーも含み得る。
【０１４２】
図１１は例示的なＶＤＢバイオリアクター１１００の概略図である。ＶＤＢバイオリアクター１１００は、バイオリアクター培地を添加し取り出すように構成される入口ポート１１０２および底部出口弁１１０４を有する。ＶＤＢバイオリアクター１１００は、第１の容器セクション１１０２、第２の容器セクション１１０４、および第３の容器セクション１１０６を有し得る。バイオリアクターは、下部かき混ぜ機１１１０、中間かき混ぜ機１１１２、上部かき混ぜ機１１１４、ならびにかき混ぜ機モーターおよび駆動装置１１１６を含む、かき混ぜ機１１０８を有する。さらに、バイオリアクターは、空気または他の栄養素がバイオリアクター液体培地を介してバブリングされることを可能にするように構成された少なくとも１つのスパージャー１１１８を含み得る。加えて、バイオリアクターは、少なくとも１つのプローブまたは添加ポート１１２０を含み得る。バイオリアクターは、少なくとも１つのＣＩＰポート１１２２も含み得る。示されるように、バイオリアクターは、容器セクション１１０２および１１０４、１１０６の各々中に、スパージャー１１１８、プローブおよび添加ポート１１２０、ならびにＣＩＰポート１１２２を有するように構成され得る。バイオリアクターはバイオリアクター系の制御のために任意の好適な制御系を包含し、スパージング、液体の培地添加および取り出し、細胞の増殖および産生、酸素レベル、体積、温度、ｐＨ、ならびに他の所望される構成要素をモニタリングおよび制御することを包含する。いくつかの態様において、制御系は、連続様式またはバッチ式様式でバイオリアクター体積をスケールアップするように構成される。加えて、バイオリアクターは、その中に配置される少なくとも１つのバッフル１１２４を有し、それは、バイオリアクター接種物に対する不必要なストレス（それはアポトーシスを導き得る）を引き起こさずに、好適な混合条件を提供するように構成される。加えて、バイオリアクターは、外部断熱材を有し得る伝熱シェル１１２６を含み得る。ＶＤＢ１１００は単一のインペラーも含み得る。
【０１４３】
図１２は、例えば定常状態および／または擬似定常状態培養を得るための例示的な灌流バイオリアクターの概略図である（例えばその中で、細胞密度、栄養素、廃液副産物、および／または産物荷電バリアントは、経時的に一定に保持される）。いくつかの実施形態において、灌流バイオリアクターは修飾された連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）としてデザインされ得る（その中で、新鮮な栄養培地は、例えば供給ポンプを介して一定速度で主要培養タンクの中へ供給される）。いくつかの実施形態において、濃縮栄養ボーラスをタンクへ添加して、例えば１つまたは複数の栄養素の濃度を例えば所望される濃度へ急速または即座に変更することができる。タンクの含有物の体積は、例えば添加されている新鮮な栄養培地のものと釣り合った速度で、例えばタンクから一定して材料を取り出すことによって、一定で保持することができる。反応器スケールは、いくつかの実施形態において、反応器タンク中の材料の量の決定に使用され得る。いくつかの実施形態において、セルブリード（ｃｅｌｌ  ｂｌｅｅｄ）ポンプを使用して、細胞含有反応器溶出液（セルブリード）を槽から取り出す。いくつかの実施形態において、パーミエイト（ｐｅｒｍｅａｔｅ）ポンプ（例えば細胞保持デバイスの後ろに）を使用して、無細胞反応器溶出液（パーミエイト）を槽から取り出す。静電容量プローブを使用して、例えば生存細胞密度をモニターすることができ、例えば１０００ｋＨｚで測定された静電容量は、生存細胞密度のオフライン測定へ直線的に相関する。
【０１４４】
使用に際して、本明細書において記載される可変直径のバイオリアクターを使用して、１つまたは複数の産物（例えば１つまたは複数の産物バリアント、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の産物バリアント）を産生し、トレイン内で必要な反応器を単一のバイオリアクターへ限定することによって、床面積の有効な使用を可能にすることができる。具体的には、産物（例えば産物バリアント）の産生は、増殖培地および接種物を第１の体積でバイオリアクターに接種すること、ならびに接種ステージの完了に続いて、追加の増殖培地をバイオリアクターへ添加してバイオリアクター体積を第２の体積へスケールアップすることによって、単一のＶＤＢバイオリアクター中で達成され得る。いくつかの態様において、バイオリアクターの使用は、増殖ステージの完了に続いて、追加の増殖培地をバイオリアクターへ添加してバイオリアクター体積を第３の体積へスケールアップすることを含み得る。
【０１４５】
すなわち、接種バイオリアクターおよびすべての必要な後続増殖反応器またはシード反応器を単一のバイオリアクター容器の中へ圧縮することによって、特定のプラントの設置面積が最小限にされる。例えば、２０，０００リットル（Ｌ）の所望される産生体積のために、第１の容器セクション（すなわち接種容器セクション）、第２のシードセクションまたは増殖セクション、および第３のシードセクションまたは増殖容器セクションからなる、単一の２０，０００Ｌのバイオリアクターが使用され得る。例えば、第１の容器セクション（接種容器セクション）は、約１００Ｌ〜約２００Ｌの体積および約０．３：１〜約２：１の間の所望されるアスペクト比に対応する第１の直径を有し得る。次に、第２のシード容器セクションおよび第３のシード容器セクションは、所望されるアスペクト比の範囲を維持して、所望される２０，０００Ｌの量へバイオリアクター体積をスケールアップすることができる。例えば、アスペクト比は、約０．３：１〜約３：１の間で維持され得る。２０，０００Ｌのバイオリアクターユニットは、以下の：栄養素および／もしくは炭素源の供給、好適な気体（例えば酸素）の注入、発酵培地もしくは細胞培養培地流、気体相および液体相の分離、増殖温度の維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば撹拌）、ならびに／または洗浄／滅菌うちの１つもしくは複数またはすべてを遂行することができる。
【０１４６】
例えば、この２０，０００Ｌの例示的なバイオリアクターは、いくつかの態様において、増殖培地および接種物（哺乳動物細胞等）を第１の体積で接種され得る。この接種ステージにおいて、反応器は、反応器の体積が接種物の最初の増殖に好適であるように、第１の体積で接種され得る。所望される細胞増殖を可能にするのに好適な期間に続いて、バイオリアクターを第２の反応器体積へスケールアップして、接種物の第２の増殖ステージを達成することができる。すなわち、増殖のために要求される追加の増殖培地および任意の他の所望される構成要素をバイオリアクターへ添加して、接種ステージの完了に続いて、バイオリアクター体積を第２の体積へスケールアップすることができる。この第２の体積は、接種物のために必要とされる、所望の連続的な増殖条件に好適な任意の所望される体積であり得る。この第２の体積で、さらなる細胞増殖および分裂増殖は達成され得る。いくつかの態様において、第３、第４、または任意の増加数の体積の増殖ステージを利用して、所望される体積への反応器体積のスケールアップを継続させる。
【０１４７】
いくつかの態様において、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法は、
（ａｉ）ＶＤＢ中で培養（例えば増殖）培地および接種物を備えた第１の体積の接種によって細胞の集団を生成することならびに所望される体積へ後続してスケールアップすること；
（ａｉｉ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産物バリアント１（例えば産物バリアント１のバッチ（例えば第１の条件下で産生された））を回収すること；
（ｃ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｄ）産物バリアント２（例えば産物バリアント２のバッチ（例えば第２の条件下で産生された））を回収すること；
を含み、
それによって、複数のバリアント調製物を提供し、前記複数のものは、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含み、
産物バリアント１（または産物バリアント１の調製物）は、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、産物バリアント２（または産物バリアント２の調製物）とは異なる。
【０１４８】
番号付けされた実施形態
１．少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
細胞培養を可能にするように構成された容器中に細胞の集団を提供すること；
（ａ−ｉ）第１の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ａ−ｉｉ）培養から産物バリアント１を回収すること；
（ａ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を前記馴化培養培地へ添加すること；
（ａ−ｉｖ）随意に、前記第１の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること；
（ａ−ｖ）随意に、追加産物バリアント１を回収すること；
（ａ−ｖｉ）随意に、（ａ−ｉｉ）および（ａ−ｖ）からの産物バリアント１を組み合わせること；
（ｂ−ｉ）第２の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ−ｉｉ）培養から産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｉｉｉ）随意に、置換培地を前記馴化培養培地へ添加すること、
（ｂ−ｉｖ）随意に、前記第２の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生すること、
（ｂ−ｖ）随意に、追加産物バリアント２を回収すること；
（ｂ−ｖｉ）随意に、（ｂ−ｉｉ）および（ｂ−ｖ）からの産物バリアント２を組み合わせること；
産物バリアント１のバッチから産物バリアント１を得ること；
産物バリアント２のバッチから産物バリアント２を得ること；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、、
バリアント１（またはバリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、バリアント２（またはバリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法。
【０１４９】
２．前記複数のものが、第３のバリアントの調製物；第４のバリアントの調製物；第５のバリアントの調製物；第６のバリアントの調製物；第７のバリアントの調製物；第８のバリアントの調製物；第９のバリアントの調製物；第１０のバリアントの調製物；第１１のバリアントの調製物；第１２のバリアントの調製物；第１３のバリアントの調製物；第１４のバリアントの調製物；第１５のバリアントの調製物；第１６のバリアントの調製物；第１７のバリアントの調製物；第１８のバリアントの調製物；第１９のバリアントの調製物；および／または第２０のバリアントの調製物を含む、パラグラフ１の方法。
【０１５０】
３．少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を作製する方法であって、
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント１を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産物バリアント１を回収すること；
（ｃ）第２の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、産物バリアント２を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｄ）産物バリアント２を回収すること；
を含み、
それによって、少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む複数のバリアント調製物を提供し、、
産物バリアント１（または産物バリアント１の調製物）が、物理的特性、化学的特性、生物学的特性、または医薬特性で、産物バリアント２（または産物バリアント２の調製物）とは異なる、
前記方法。
【０１５１】
４．前記複数のものが、第３のバリアントの調製物；第４のバリアントの調製物；第５のバリアントの調製物；第６のバリアントの調製物；第７のバリアントの調製物；第８のバリアントの調製物；第９のバリアントの調製物；第１０のバリアントの調製物；第１１のバリアントの調製物；第１２のバリアントの調製物；第１３のバリアントの調製物；第１４のバリアントの調製物；第１５のバリアントの調製物；第１６のバリアントの調製物；第１７のバリアントの調製物；第１８のバリアントの調製物；第１９のバリアントの調製物；および／または第２０のバリアントの調製物を含む、パラグラフ３の方法。
【０１５２】
５．ステップ（ｂ）での回収は、ステップ（ａ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、パラグラフ３または４のいずれかの方法。
【０１５３】
６．馴化培養培地の前記アリコートから産物バリアント１を回収することをさらに含む、パラグラフ５の方法。
【０１５４】
７．ステップ（ｂ）が、前記馴化培養培地へ置換培地を添加することをさらに含む、パラグラフ５の方法。
【０１５５】
８．（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、パラグラフ７の方法。
【０１５６】
９．（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が、１つまたは複数の構成要素（化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン等）で、互いとは異なる、パラグラフ７の方法。
【０１５７】
１０．前記置換培養培地の体積が、取り出された前記アリコートの体積よりも少ないか、それに等しいか、またはそれよりも大きい、パラグラフ７〜９のうちの任意の方法。
【０１５８】
１１．（ａ）の培養培地中前記の細胞の集団が容器中に含まれる、パラグラフ７〜１０のうちの任意の方法。
【０１５９】
１２．取り出された前記アリコート、添加された前記置換培養培地、または両方の体積が、独立して、全体の培養の体積または前記容器の容量の体積の５〜１００％の間である、パラグラフ１１の方法。
【０１６０】
１３．取り出された前記量、添加された前記置換培養培地、または両方が、独立して、容器操作の１日あたり前記容器体積の０．１〜５倍の間である、パラグラフ１１の方法。
【０１６１】
１４．（ｂ）が、前記第１の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生することをさらに含む、パラグラフ７の方法。
【０１６２】
１５．（ｂｉｉ）第２の量の産物バリアント１を回収することを含む、パラグラフ７または１４のいずれかの方法。
【０１６３】
１６．ステップ（ｂｉｉ）における回収することが、さらなる馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、パラグラフ１５の方法。
【０１６４】
１７．前のステップの培養された培地へ置換培地を添加すること、ならびにパラグラフ１４および１５および随意に１６のステップを反復すること（例えばパラグラフ１４および１５および随意に１６のステップをＸ回（Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）反復すること）を含む、パラグラフ１５または１６のいずれかの方法。
【０１６５】
１８．（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、パラグラフ１７の方法。
【０１６６】
１９．（ａ）における前記培養培地および前記置換培地が、１つまたは複数の構成要素（化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン等）で、互いとは異なる、パラグラフ１７の方法。
【０１６７】
２０．前記置換培養培地の体積が、取り出された前記アリコートの体積よりも少ないか、それに等しいか、またはそれよりも大きい、パラグラフ１７〜１９のうちの任意の方法。
【０１６８】
２１．（ａ）の培養培地中の前記細胞の集団が容器中に含まれる、パラグラフ７〜２０のうちの任意の方法。
【０１６９】
２２．取り出された前記アリコート、添加された前記置換培養培地、または両方の体積が、独立して、全体の培養の体積または前記容器の容量の体積の５〜１００％の間である、パラグラフ２１の方法。
【０１７０】
２３．取り出された前記量、添加された前記置換培養培地、または両方が、独立して、容器操作の１日あたり前記容器体積の０．１〜５倍の間である、パラグラフ２１の方法。
【０１７１】
２４．異なる時間で得られたバリアント１を組み合わせることを含む、パラグラフ１５〜２３のうちの任意の方法。
【０１７２】
２５．複数の量、アリコート、またはバッチからの産物バリアント１を組み合わせることを含む、パラグラフ１５〜２４のうちの任意の方法。
【０１７３】
２６．前記細胞の集団が、前記第１の条件下で１日以上の間培養される、パラグラフ１〜２５のうちの任意の方法。
【０１７４】
２７．パラメーターについての標的値に到達した後に、前記細胞集団が、前記第２の条件下で培養される、パラグラフ１〜２６のうちの任意の方法。
【０１７５】
２８．前記パラメーターが、産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される、パラグラフ２７の方法。
【０１７６】
２９．前記パラメーターがさらに生存細胞濃度から選択され得る、パラグラフ２８の方法。
【０１７７】
３０．前記培地または他の条件の操作をして前記第２の条件を達成することを含む、パラグラフ１〜２９のうちの任意の方法。
【０１７８】
３１．前記培地または他の条件の操作が、ｐＨ；ｄＯ２のレベル；かき混ぜ；温度；体積；前記細胞集団の密度；前記培養培地の構成要素の濃度；かき混ぜ；栄養素、薬物、阻害物質、もしくは他の化学的構成要素（例えば化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン）の存在もしくは量のうちの１つまたは複数を改変することを含む、パラグラフ３０の方法。
【０１７９】
３２．異なる培養培地を前記細胞の集団へ添加することを含む、パラグラフ３１の方法。
【０１８０】
３３．前記細胞の集団の培養が灌流産生培養である、パラグラフ１〜３２のうちの任意の方法。
【０１８１】
３４．第２の条件へ前記培地を移行する時に、灌流を中断することを含む、パラグラフ３３の方法。
【０１８２】
３５．第２の条件へ前記培地が移行する時に、灌流液を廃液へ方向転換することを含む、パラグラフ３３の方法。
【０１８３】
３６．産物バリアント１が、産物バリアント２の産生の間に、下流のユニット操作から取り出される、パラグラフ１〜３５のうちの任意の方法。
【０１８４】
３７．パラメーターについての標的値に到達するまで前記細胞を培養することを含む、パラグラフ１〜３６のうちの任意の方法。
【０１８５】
３８．ステップ（ｄ）での回収は、ステップ（ｃ）において形成された馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、パラグラフ３〜３７のうちの任意の方法。
【０１８６】
３９．馴化培養培地の前記アリコートから産物バリアント２を回収することをさらに含む、パラグラフ３８の方法。
【０１８７】
４０．ステップ（ｄ）が、前記馴化培養培地へ置換培地を添加することをさらに含む、パラグラフ３９の方法。
【０１８８】
４１．（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、パラグラフ４０の方法。
【０１８９】
４２．（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が、１つまたは複数の構成要素（化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン等）で、互いとは異なる、パラグラフ４０の方法。
【０１９０】
４３．前記置換培養培地の体積が、取り出された前記アリコートの体積よりも少ないか、それに等しいか、またはそれよりも大きい、パラグラフ４０〜４２のうちの任意の方法。
【０１９１】
４４．（ｃ）の培養培地中前記の細胞の集団が容器中に含まれる、パラグラフ４０〜４３のうちの任意の方法。
【０１９２】
４５．取り出された前記アリコート、添加された前記置換培養培地、または両方の体積が、独立して、前記容器の容量の全体の培養の体積の５〜１００％の間である、パラグラフ４４の方法。
【０１９３】
４６．取り出された前記量、添加された前記置換培養培地、または両方が、独立して、容器操作の１日あたり前記容器体積の０．１〜５倍の間である、パラグラフ４４の方法。
【０１９４】
４７．（ｄ）が、前記第２の条件下で前記細胞の集団をさらに培養して、追加の馴化培地を産生することをさらに含む、パラグラフ４０の方法。
【０１９５】
４８．（ｄｉｉ）第２の量の産物バリアント２を回収することを含む、パラグラフ４０または４７のいずれかの方法。
【０１９６】
４９．ステップ（ｄｉｉ）での回収は、さらなる馴化培養培地のアリコートを得ることを含む、パラグラフ４８の方法。
【０１９７】
５０．前のステップの培養された培地へ置換培地を添加すること、ならびにパラグラフ４７および４８および随意に４９のステップを反復すること（例えばパラグラフ４７および４８および随意に４９のステップをＸ回（Ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）反復すること）を含む、パラグラフ４８または４９のいずれかの方法。
【０１９８】
５１．（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が同じである、パラグラフ５０の方法。
【０１９９】
５２．（ｃ）における前記培養培地および前記置換培地が、１つまたは複数の構成要素（化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン等）で、互いとは異なる、パラグラフ５０の方法。
【０２００】
５３．前記置換培養培地の体積が、取り出された前記アリコートの体積よりも少ないか、それに等しいか、またはそれよりも大きい、パラグラフ５０〜５２のうちの任意の方法。
【０２０１】
５４．（ｃ）の培養培地中前記の細胞の集団が容器中に含まれる、パラグラフ５０〜５３のうちの任意の方法。
【０２０２】
５５．取り出された前記アリコート、添加された前記置換培養培地、または両方の体積が、独立して、全体の培養の体積または前記容器の容量の体積の５〜１００％の間である、パラグラフ５４の方法。
【０２０３】
５６．取り出された前記量、添加された前記置換培養培地、または両方が、独立して、容器操作の１日あたり前記容器体積の０．１〜５倍の間である、パラグラフ５０〜５３のうちの任意の方法。
【０２０４】
５７．異なる時間で得られたバリアント２（例えば産物バリアント２の複数のバッチ、アリコートまたは量）を組み合わせること（例えば第１および第２の量またはバッチの産物バリアント２を組み合わせること）を含む、パラグラフ４８〜５６のうちの任意の方法。
【０２０５】
５８．複数の量、アリコート、またはバッチからの産物バリアント２を組み合わせることを含む、パラグラフ４８〜５７のうちの任意の方法。
【０２０６】
５９．前記細胞の集団が、前記第２の条件下で１日以上の間培養される、パラグラフ１〜５８のうちの任意の方法。
【０２０７】
６０．パラメーターについての標的値に到達した後に、前記細胞集団が、前記第３の条件下で培養される、パラグラフ１〜５９のうちの任意の方法。
【０２０８】
６１．前記パラメーターが、産生される産物バリアント２の量、前記第２の条件下で培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される、パラグラフ６０の方法。
【０２０９】
６２．前記パラメーターがさらに生存細胞濃度から選択され得る、パラグラフ６１の方法。
【０２１０】
６３．前記第３の条件を達成するための前記培地または他の条件の操作を含む、パラグラフ６０〜６２のうちの任意の方法。
【０２１１】
６４．前記培地または他の条件の操作が、ｐＨ；ｄＯ２のレベル；かき混ぜ；温度；体積；前記細胞集団の密度；前記培養培地の構成要素の濃度；かき混ぜ；栄養素、薬物、阻害物質、もしくは他の化学的構成要素（例えば化学塩、金属および金属イオン、アミノ酸、アミノ酸誘導体、糖組成物、ヘキソサミン、ｎ−アセチルヘキソサミン、ビタミン、脂質、ポリアミン、還元剤／酸化剤、バッファー組成物、またはホルモン）の存在もしくは量のうちの１つまたは複数を改変することを含む、パラグラフ６３の方法。
【０２１２】
６５．異なる培養培地を前記細胞の集団へ添加することを含む、パラグラフ６４の方法。
【０２１３】
６６．前記細胞の集団の培養が灌流産生培養である、パラグラフ１〜６５のうちの任意の方法。
【０２１４】
６７．第３の条件へ前記培地を移行する時に、灌流を中断することを含む、パラグラフ６６の方法。
【０２１５】
６８．第３の条件へ前記培地が移行する時に、灌流液を廃液へ方向転換することを含む、パラグラフ６６の方法。
【０２１６】
６９．産物バリアント２が、産物バリアント３の産生の間に、下流のユニット操作から取り出される、パラグラフ１〜６８のうちの任意の方法。
【０２１７】
７０．パラメーターについての標的値に到達するまで前記細胞を培養することを含む、パラグラフ１〜６９のうちの任意の方法。
【０２１８】
７１．前記複数のものが、第３の条件下で作製された第３のバリアントの調製物を含む、パラグラフ１〜７０のうちの任意の方法。
【０２１９】
７２．前記複数のものが、第４の条件下で作製された第４のバリアントの調製物（例えば前記第１のバリアントまたは第２のバリアントの前記調製物を作製するために本明細書において記載される前記ステップによって行われる第４の条件下で作製された第４のバリアントの調製物）を含む、パラグラフ７１の方法。
【０２２０】
７３．前記複数のものが、第５の条件下で作製された第５のバリアントの調製物（例えば前記第１のバリアントまたは第２のバリアントの前記調製物を作製するために本明細書において記載される前記ステップによって行われる第５の条件下で作製された第５のバリアントの調製物）を含む、パラグラフ７２の方法。
【０２２１】
７４．前記複数のものが、第Ｎの条件下で作製された第Ｎのバリアントの調製物（例えば前記第１のバリアントまたは第２のバリアントの前記調製物を作製するために本明細書において記載される前記ステップによって行われる第Ｎの条件下で作製された第Ｎのバリアントの調製物、そこで、Ｎは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０以上である）を含む、パラグラフ７３の方法。
【０２２２】
７５．ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）が、同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される、パラグラフ１または２のいずれかの方法。
【０２２３】
７６．ステップ（ａ）〜（ｄ）が、同じ容器（例えば産生培養容器）中で遂行される、パラグラフ３〜７５のうちの任意の方法。
【０２２４】
７７．前記容器が、灌流モードでの操作を可能にするように構成される、パラグラフ７６の方法。
【０２２５】
７８．前記容器が、培養の間の培地の取り出しおよび培地の添加を可能にするように構成される、パラグラフ７７の方法。
【０２２６】
７９．前記容器が、可変直径のバイオリアクターを含む、パラグラフ７５または７８のいずれかの方法。
【０２２７】
８０．産物バリアント１を精製することを含む、パラグラフ１〜７９のうちの任意の方法。
【０２２８】
８１．産物バリアント２を精製することを含む、パラグラフ１〜８０のうちの任意の方法。
【０２２９】
８２．産物バリアントが、前記細胞の集団が培養される前記容器から下流のユニット操作において精製される、パラグラフ８０または８１のいずれかの方法。
【０２３０】
８３．第１の産物バリアント（または第１の産物バリアントの調製物）が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数について、第２の産物バリアント（または第２の産物バリアントの調製物）とはどのように異なるか評価することをさらに含む、パラグラフ１〜８２のうちの任意の方法。
【０２３１】
８４．産物バリアント１の調製物を提供することをさらに含む、パラグラフ１〜８３のうちの任意の方法。
【０２３２】
８５．産物バリアント２の調製物を提供することをさらに含む、パラグラフ１〜８４のうちの任意の方法。
【０２３３】
８６．異なる産物バリアントの複数の調製物を提供することをさらに含む、パラグラフ１〜８５のうちの任意の方法。
【０２３４】
８７．第１の産物バリアント（または第１のバリアントの調製物）が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、第２の産物バリアント（または第２の産物バリアントの調製物）とは異なる、パラグラフ１〜８６のうちの任意の方法。
【０２３５】
８８．複数の産物バリアント（または産物バリアントの調製物）を産生することを含み、前記産物バリアント（または産物バリアントの調製物）のうちの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはそれ以上のその各々が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、互いに異なる、
パラグラフ１〜８７のうちの任意の方法。
【０２３６】
８９．３つの産物バリアント（または産物バリアントの調製物）を産生することを含み、その各々が、
糖鎖付加（例えばガラクトシル化）；
シアル酸付加；
荷電（例えばｐＩ）；
配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性；
純度；
活性；
不活性バリアントの量；
凝集する傾向、または凝集；
清澄性；
脱アミド化；
グリケーション；
プロリンアミド化；
ジスルフィド不均一性；
二量体化；
プロテアーゼ感受性またはタンパク質溶解性分解；および
メチオニン酸化
のうちの１つまたは複数で、互いに異なる、
パラグラフ８８の方法。
【０２３７】
９０．前記第１の条件および／または第２の条件が、定常状態条件である、パラグラフ１〜８９のうちの任意の１つの方法。
【０２３８】
９１．前記第３の条件が、定常状態条件である、パラグラフ６３〜６５のうちの任意の１つの方法。
【０２３９】
９２．前記培地の操作が、以下の：前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数の濃縮ボーラスを、前記培養培地へ添加することを含む、パラグラフ３０〜３２または６３〜６５のうちの任意の１つの方法。
【０２４０】
９３．前記培地の操作が、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の以下の：前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数の濃度を増加させることを含む、パラグラフ３０〜３２または６３〜６５のうちの任意の１つの方法。
【０２４１】
９４．前記培地の操作が、
ａ）構成要素の濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加すること、または
ｂ）前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の構成要素の濃度を増加させること、
のうちの１つまたは両方を含み、
前記構成要素が、前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数から選択される、
パラグラフ３０〜３２または６３〜６５のうちの任意の１つの方法。
【０２４２】
９５．前記培地の操作が、ＣｕＳＯ４を前記培養培地へ添加することを含む（例えばＣｕＳＯ４の濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のＣｕＳＯ４の濃度を増加させることによって、または両方によって）、パラグラフ９２〜９４のうちの任意の方法。
【０２４３】
９６．前記培地の操作が、Ｎ−アセチルアルギニンを前記培養培地へ添加することを含む（例えばＮ−アセチルアルギニンの濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のＮ−アセチルアルギニンの濃度を増加させることによって、または両方によって）、パラグラフ９２〜９４のうちの任意の方法。
【０２４４】
９７．前記培地の操作が、リジンを前記培養培地へ添加することを含む（例えばリジンの濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加することによって、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中のリジンの濃度を増加させることによって、または両方によって）、パラグラフ９２〜９４のうちの任意の方法。
【０２４５】
９８．前記容器が、バイオリアクター（例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）である、パラグラフ１１〜１３、２１〜２３、４３〜４５、５３〜５５、または７３〜７７のうちの任意の１つの方法。
【０２４６】
９９．本明細書において記載されるバリアント産物の調製物、またはパラグラフ１〜９８の方法のうちの任意のものによって作製されるかもしくは作製可能なバリアント産物の調製物。
【０２４７】
１００．複数のバリアント調製物であって、前記複数のものが、本明細書において記載される少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）、またはパラグラフ１〜９８の方法のうちの任意ものによって作製されるかもしくは作製可能な少なくとも産物の第１のバリアントの調製物（産物バリアント１）および産物の第２のバリアントの調製物（産物バリアント２）を含む、前記複数のバリアント調製物。
【０２４８】
１０１．本明細書において記載される細胞の混合物によりチャージされた容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）。
【０２４９】
１０２．
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、第１の産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
（ｂ）産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率から選択される１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する前記方法の進行についての値を取得すること；
（ｃ）前記値へ応答して、前記１つまたは複数の標的パラメーターに関して複数の産物バリアント調製物を作製する前記方法の進行を決定すること；および
（ｄ）随意に、１つまたは複数の標的パラメーターが到達された前記決定に応答して、前記培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること、
を含み、
それによって、複数の産物バリアントを作製する方法の進行を評価する、
複数の産物バリアント調製物を作製する方法の進行を評価する方法。
【０２５０】
１０３．複数の産物バリアント調製物をする前記方法が、パラグラフ１〜９８のうちの任意の１つの方法である、パラグラフ１０２の方法。
【０２５１】
１０４．
（ａ）第１の条件下で培養培地中の細胞の集団を培養して、産物バリアント（産物バリアント１）を含有する馴化培養培地を形成すること；
産生される産物バリアント１の量、前記第１の条件下での培養の継続期間、または培養物の生存率；
（ｃ）１つまたは複数の標的パラメーターに向けた進行の評価に応答して、前記培養培地または他の条件を操作して、第２の条件を達成すること；
および
（ｄ）前記第２の条件下で培養培地中の前記細胞の集団を培養して、第２の産物バリアント（産物バリアント２）を含有する馴化培養培地を形成すること；
を含み、
それによって、産物バリアントを産生する方法を修飾する、
産物バリアントを産生する方法を修飾する方法。
【０２５２】
１０５．（ｂ）の前記標的パラメーターが、生存細胞濃度をさらに含む、パラグラフ１０２〜１０４のうちの任意の方法。
【０２５３】
１０６．前記培地または他の条件の操作が、ｐＨ；ｄＯ２のレベル；かき混ぜ；温度；体積；前記細胞集団の密度；前記培養培地の構成要素の濃度；かき混ぜ；栄養素、薬物、阻害物質、もしくは他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）の存在もしくは量のうちの１つまたは複数を改変することを含む、パラグラフ１０２〜１０５のうちの任意の方法。
【０２５４】
１０７．異なる培養培地を前記細胞の集団へ添加することを含む、パラグラフ１０６の方法。
【０２５５】
１０８．前記培地の操作が、以下の：前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数の濃縮ボーラスを培養培地へ添加することを含む、パラグラフ１０２〜１０７のうちの任意の１つの方法。
【０２５６】
１０９．前記培地の操作が、前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の以下の：前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数の濃度を増加させることを含む、パラグラフ１０２〜１０７のうちの任意の１つの方法。
【０２５７】
１１０．前記培地の操作が、
ａ）構成要素の濃縮ボーラスを前記培養培地へ添加すること、または
ｂ）前記反応器に入れる前記培養培地（例えば置換培地）中の構成要素の濃度を増加させること、
のうちの１つまたは両方を含み、
前記構成要素が、前記培養培地の構成要素、栄養素、薬物、阻害物質、または他の化学的構成要素（例えばリジン、ガラクトース、任意の水溶銅化合物（例えば硫酸銅（Ｉ）または塩化銅）、任意の水溶性マンガン化合物（例えば塩化マンガン）、任意の水溶性亜鉛化合物（例えば塩化亜鉛）、任意の水溶性鉄化合物（例えば硫酸鉄（ＩＩ））、Ｎ−アセチルマンノサミン、酪酸ナトリウム、Ｎ−アセチルアルギニン、またはＬ−アルギニン）のうちの１つまたは複数から選択される、
パラグラフ１０２〜１０７のうちの任意の１つの方法。
【０２５８】
１１１．前記回収された産物バリアント１が、例えば回収された全産物のパーセンテージとして、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント１である（例えば重量、体積、またはモル比によって）、パラグラフ１〜９８のうちの任意の１つの方法。
【０２５９】
１１２．前記回収された産物バリアント２が、例えば回収された全産物のパーセンテージとして、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント２である（例えば重量、体積、またはモル比によって）、パラグラフ１〜９８のうちの任意の１つの方法。
【０２６０】
１１３．前記回収された産物バリアント１が、前記第１の条件下で培養されない細胞の集団および培養培地から産生された産物に比較して、産物バリアント１について少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％までエンリッチされる、パラグラフ１〜９８のうちの任意の１つの方法。
【０２６１】
１１４．前記回収された産物バリアント２が、前記第２の条件下で培養されない細胞の集団および培養培地から産生された産物に比較して、産物バリアント２について少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％までエンリッチされる、パラグラフ１〜９８のうちの任意の１つの方法。
【０２６２】
１１５．産物バリアント１の回収後に、前記回収された産物バリアント１を評価することをさらに含む、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１４のうちの１つの任意の方法。
【０２６３】
１１６．前記回収された産物バリアント１を評価することが、糖鎖付加、シアル酸付加、荷電、配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性、純度（例えば回収された産物が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント１である（例えば重量で、体積もしくはモル比で、または回収された全産物のパーセンテージとして））、活性、不活性バリアントの量、凝集する傾向、もしくは凝集、清澄性、脱アミド化、グリケーション、メチオニン酸化、または産生された産物バリアント１の量から選択される産物品質属性のうちの１つまたは複数のレベルを評価することを含む、パラグラフ１１５の方法。
【０２６４】
１１７．産物バリアント２の回収後に、前記回収された産物バリアント２を評価することをさらに含む、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１４のうちの１つの任意の方法。
【０２６５】
１１８．前記回収された産物バリアント２を評価することが、糖鎖付加、シアル酸付加、荷電、配列（例えばＮ末端配列またはＣ末端配列）均一性、純度（例えば回収された産物が少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント２である（例えば重量で、体積もしくはモル比で、または回収された全産物のパーセンテージとして））、活性、不活性バリアントの量、凝集する傾向、もしくは凝集、清澄性、脱アミド化、グリケーション、メチオニン酸化、または産生された産物バリアント２の量から選択される産物品質属性のうちの１つまたは複数のレベルを評価することを含む、パラグラフ１１７の方法。
【０２６６】
１１９．前記回収された産物バリアントの評価に応答して、置換培地を添加するか、現在の条件下で前記細胞の集団をさらに培養するか、またはさらなる条件下で前記細胞の集団を培養するかどうかを決定することをさらに含む、パラグラフ１１５〜１１８のうちの任意の方法。
【０２６７】
１２０．前記複数のバリアント調製物が、単一の産生容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）から産生される、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１９のうちの任意の方法。
【０２６８】
１２１．前記複数のバリアント調製物が、単一の産生容器（例えばバイオリアクター、例えば灌流バイオリアクターおよび／または可変直径のバイオリアクター）から、連続的に（例えば前記細胞の集団の前記培養を中断すること（例えば前記容器を空にすることおよび／またはクリーニングすること）無しに、活性のある産生のための条件を維持して）、産生される、パラグラフ１２０の方法。
【０２６９】
１２２．前記複数のバリアント調製物が、中断（例えば空にすること、クリーニングすること、およびさらなる条件下で前記細胞の集団の培養を再開すること）有りで類似の条件下で前記複数のバリアント調製物を連続して作製することから経過するよりも、短い時間で産生される、パラグラフ１２１の方法。
【０２７０】
１２３．前記複数のバリアント調製物が、中断（例えば空にすること、クリーニングすること、またはさらなる条件下で前記細胞の集団の培養を再開すること）有りで類似の条件下で前記複数のバリアント調製物を連続して作製することから消費または占有されるよりも、少数の資源（例えば機器、培養、エネルギーまたは人員）を消費または占有して産生される、パラグラフ１２１の方法。
【０２７１】
１２４．薬学的に有効な組成物として製剤化された、パラグラフ９９の調製物。
【０２７２】
１２５．パラグラフ９９の調製物を含む、医薬組成物。
【０２７３】
１２６．薬学的に許容される希釈物質、担体または賦形剤を含む、パラグラフ１２５の医薬組成物。
【０２７４】
１２７．１つまたは複数の薬学的に有効な組成物として製剤化された、パラグラフ１００の複数のバリアント調製物。
【０２７５】
１２８．パラグラフ１００の複数のバリアント調製物を含む、キット。
【０２７６】
１２９．前記複数の各々のバリアント調製物が、容器の中へ分離してパッケージングされる、パラグラフ１２８のキット。
【０２７７】
１３０．少なくとも１つの容器が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント１である（例えば重量、体積もしくはモル比で、または存在する全産物のパーセンテージとして）、産物バリアント１を含む、パラグラフ１２９のキット。
【０２７８】
１３１．少なくとも１つの容器が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９または１００％の産物バリアント２である（例えば重量、体積もしくはモル比で、または存在する全産物のパーセンテージとして）、産物バリアント２を含む、パラグラフ１２９のキット。
【０２７９】
１３２．前記キットが、容器を含み；
、少なくとも１つの容器が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９もしくは１００％の産物バリアント１である（例えば、重量、体積もしくはモル比で、または存在する全産物のパーセンテージとして）、産物バリアント１を含むか、または少なくとも１つの容器が、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９もしくは１００％の産物バリアント２である（例えば、重量、体積もしくはモル比で、または存在する全産物のパーセンテージとして）、産物バリアント２を含み；
少なくとも１つの容器が、産物バリアント１および２産物バリアントの混合物を含む、
パラグラフ１２８のキット。
【０２８０】
１３３．前記細胞の集団が、少なくとも１つのＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、ＣＨＯ−ＧＳＫＯ細胞、ＣＨＯＸｃｅｅｄ細胞、またはＣＨＯ由来細胞を含む、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１９のうちの任意の方法。
【０２８１】
１３４．前記細胞の集団が、少なくとも１つのＨｅｌａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ（例えばＣＯＳ１およびＣＯＳ７）、ＱＣｌ−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ＣＨＯＫ１ＳＶ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１もしくはＣＨＯＺＮ細胞、またはそれに由来する任意の細胞を含む、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１９のうちの任意の方法。
【０２８２】
１３５．前記産物バリアントが、以下の：抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体模倣物（特異的に抗原へ結合するが構造的に抗体に関連しないポリペプチド分子（例えばＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチンまたはＩｇＮＡＲ等））、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組み換えタンパク質（例えば糖鎖付加タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス療法（例えば抗癌腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法のためのウイルスベクター、およびウイルス免疫療法）、細胞療法（例えば多能性幹細胞、間充織幹細胞、および成体幹細胞）、ワクチンまたは脂質カプセル化粒子（例えばエキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ等）もしくはＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ等）、抗生物質、またはアミノ酸のうちの１つまたは複数から選択される、パラグラフ１〜９８または１１１〜１１９のうちの任意の方法。
【実施例】
【０２８３】
実施例１：均一なタンパク質産物の産生
バイオリアクターユニット（例えば可変直径のバイオリアクター）は、使用に適切な製造環境（例えばＩＳＯグレード７）中で本発明の方法により収容されるだろう。凍結細胞は個別に融解され、培養培地を含有する第１の一回使用の（ＳＵ）産生容器へ接続されるだろう。開始された培養は、制御された条件（例えば温度、ｐＨ、溶存酸素、かき混ぜ）下で増殖されるだろう。一旦十分な培養物が増殖された（例えば培養が閾値密度に到達した）ならば、それは培養培地を含有する産生培養容器へ移されるだろう。産生培養容器は灌流モードで操作されることが可能であろう。産生培養（温度、ｐＨ、溶存酸素、かき混ぜ、培地）のための初期条件は、産物バリアント１を産生することが可能であろう。産物バリアント１を含有する灌流液は、精製された産物１をもたらす下流の精製ステップのシリーズを介して精製されるだろう。精製プロセスまたは他の培養後プロセスは、後続するバリアントの産生と同時に、または、いくつかもしくはすべての後続するバリアントのうちのいくつかもしくはすべてが産生された後に、行うことができる。
【０２８４】
一旦十分な量の産物バリアント１が産生されたならば、培養条件は操作されるだろう（例えばｐＨは低下もしくは上昇されるだろう、および／または異なる組成物の濃縮培地はバイオリアクターへ添加されるだろう）。灌流は中断される、および／または灌流液は廃液へ方向転換される。下流のユニット操作は、このステージの間に適切なクリーニングバッファーおよび消毒バッファーの使用を経由して産物バリアント１をクリーニングするだろう。一旦バイオリアクターが安定的な操作に到達したならば、灌流液の収集および精製を開始して、産物バリアント２を産生することができる。約２日が各々の産物バリアントの産生に要求され、したがって３０日の灌流培養継続期間にわたって、１５の異なる産物バリアントを産生することができるだろうことが想定される。産生される各々の産物バリアントの量は、培養の継続期間またはスケール（例えばより多い体積の潅流）のいずれかによって調整することができる。本発明は、広範囲の培養体積での操作における追加の柔軟性のためのバイオリアクターを提供するために、図１２中で示されるような従来の撹拌されるバイオリアクターまたは可変直径のバイオリアクターのいずれかにおける産生培養を用いるだろう。
【０２８５】
本明細書において記載される方法により、１つの灌流バイオリアクターは、類似するフェドバッチバイオリアクターまたは複数のフェドバッチ反応器よりも、はるかに短い期間で複数の産物バリアントを並列して産生することができる。より大きなスケール（例えば２０００Ｌ）では、凍結細胞の融解から産生培養の開始への継続期間は、フェドバッチ産生で３０日を超えてかかり得る。本明細書において記載される方法は、２日以下へ期間を低減することができる。
【０２８６】
実施例２：灌流反応器中での不均一タンパク質産物の産生
産物（例えばタンパク質）は、単一のバイオリアクター中の産物（例えばタンパク質）の複数の画分またはバリアントが得られる（例えば各々が異なる産物品質属性を備える）ように産生することができる。一実施例において、これらの画分は灌流バイオリアクター装置中で産生される。
【０２８７】
例示的な灌流バイオリアクター装置（図１２中で示されるように）は、定常状態細胞培養（それは擬似定常状態と称され得る）を得るようにデザインされ、その中で、細胞密度、栄養素、任意の化学物質、廃液副産物、または産物荷電バリアントのうちの少なくとも１つは、経時的に一定に保持される。装置は修飾された連続撹拌タンク反応器（ＣＳＴＲ）としてデザインされ、そこでは、新鮮な栄養培地は供給ポンプを経由して一定速度でタンクへ供給され、タンク含有物の量はタンクにおいて液体レベルが一定体積で維持されるように一定して取り出される。スケールおよび比例積分（ＰＩ）制御装置を使用して反応器体積を一定値で保って、全溶出液速度（一般的にパーミエイトポンプ速度およびセルブリードポンプ速度の総計として定義される）を制御する。ＰＩ制御装置は、反応器質量設定点の維持に必要とされる全溶出液速度を規定する。
【０２８８】
反応器内で、細胞を懸濁培養で増殖させる。細胞を、細胞保持デバイス（タンク出口流に所在する）を経由して反応器装置中で保持する。細胞保持デバイスは反応器中で細胞を保持する一方で、任意の液体可溶性構成要素がパーミエイトポンプを経由して反応器を自由に出ることを可能にする。液体可溶性構成要素は、栄養素、廃液副産物、およびタンパク質産物を包含する。細胞は好ましい条件下で連続的に分裂するので、分離細胞を含有する反応器溶出液の流れも用いられ、それはセルブリードポンプによって制御される。
【０２８９】
反応器細胞密度を、セルブリードポンプ速度の制御によって一定の設定点で維持した。この実施例において、生存細胞密度を静電容量プローブを使用して測定し、そこで、１０００ｋＨｚで測定される静電容量は、生存細胞密度のオフライン測定へ直線的に相関した。生存細胞密度値（静電容量測定を経由して決定される）は、ＰＩ制御装置（それはセルブリードポンプ速度を決定する）の中へ供給された。セルブリード速度は、反応器体積制御装置によって規定されるように、セルブリードに対する全溶出液流の割合を計算することによって決定された。この手法において、細胞密度は、細胞密度を測定するために静電容量を使用するフィードバック制御装置によって決定されるように、細胞増殖に等しい速度でセルブリードの流れを経由して細胞を取り出すことによって制御された。
【０２９０】
上で略述された灌流装置を使用して、異なる産物品質属性を備えた産物の複数の画分を得ることができる。これらの画分は複数の定常状態の生成によって産生され、各々は異なる品質属性（複数可）を備えた産物を産生する。これらの不連続の定常状態条件は、１つまたは複数の栄養素、または産物の品質属性（複数可）に影響を及ぼすことが公知の他の化学物質の新鮮な栄養供給中の濃度を変化させることによって生成される。一旦最初の定常状態に到達したならば（一定の細胞密度および産物品質属性レベルとして定義される）、１つまたは複数の栄養素、または産物品質属性に影響を及ぼす他の化学物質の反応器濃度は、産物品質属性に対する所望される効果に依存して、上昇または低下させられる。
【０２９１】
栄養素の反応器濃度を上昇させるために、その栄養素の濃縮ボーラスは、新鮮な栄養素供給中の栄養素濃度を所望される反応器濃度へと増加させながら、反応器へ同時に添加される。濃縮栄養素ボーラスは、栄養素の反応器濃度を新しい所望される定常状態濃度へと即座に上昇させるように、十分な栄養素を含有する。この手法において、反応器栄養素濃度における実質的には即時のステップ増加が得られる。栄養素ボーラスは、定常状態産物の品質属性画分を達成するのには必要ではないが、それはそうするのに要求される時間を短縮する役目を果たす。栄養素の反応器濃度を低下させるために、新鮮な栄養素供給中の栄養素濃度は、所望される反応器濃度へ単純に低下される。希釈ダイナミックスに起因して栄養素の反応器濃度が新しい定常状態値に到達するようにさせなくてはならないので、この事例において追加の時間が新しい定常状態を得るのに要求される。
【０２９２】
荷電バリアント
一実施例において、上で記載される灌流装置を使用して、異なる荷電バリアントプロファイル（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）についての産物品質属性）を備えた産物の複数の画分を得る。産物の荷電バリアントプロファイルに影響するために、荷電バリアントに対する効果を有する任意の化学物質または栄養素を使用できる。この実施例において、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）およびリジンを、荷電バリアントプロファイルに影響するために使用した。この事例において、モノクローナル抗体を発現するＧＳ−／−ＣＨＯ細胞株を使用して、産物を産生した。
【０２９３】
実施例３：荷電変動を調節する化学物質化合物を同定する振盪フラスコ実験
一実施例において、荷電変動の調節に使用することができる化学物質化合物を同定した。異なる３つの化学物質（ＣｕＳＯ４、リジン、およびカルボキシペプチダーゼ阻害物質（Ｎ−アセチルアルギニン））を評価した。簡潔には、ｍＡｂを発現するＬｏｎｚａ  ＧＳ−／−ＣＨＯ細胞を、ＣｕＳＯ４（０．４、１．２、２．０μＭ）、リジン（１０、２５、５０ｍＭ）、またはＮ−アセチルアルギニン（０．１、１、１０ｍＭ）を補足した培地中で振盪フラスコ中で５日間増殖した。５日目に、培地を収穫し、ｍＡｂをプロテインＡ樹脂上で精製し、精製されたｍＡｂの荷電変動を測定した。
【０２９４】
ＣｕＳＯ４の試験された用量のどれも、培養の細胞増殖（図１３Ａ）または代謝プロファイルのいずれかに影響を与えなかった。追加のＣｕＳＯ４の非存在に比較した場合に（主要：６４±０．６％、ｐ＜０．０１；塩基性：２１±０．１６％、ｐ＜０．０１；図１５Ａ〜１５Ｃ）、２．０μＭのＣｕＳＯ４は、主要ピークの存在量（６９±１．４％）を増加させる一方で、同時に塩基性ピークの存在量（１７±１．３％）を減少させた。
【０２９５】
生存細胞密度の低減によって明らかなように、５０ｍＭおよび２５ｍＭの両方の追加のリジンの添加は、細胞増殖の低減を引き起こした（図１３Ｂ〜１３Ｃ）。追加のリジン無しに比較した場合に（塩基性：２１±０．２％、ｐ＜０．００１；主要：６４±０．６％、ｐ＜０．００１；図１４Ａ）、１０ｍＭの追加のリジンは、塩基性ピークの存在量（２５±０．７％）を増加させ、同時に主要ピークの存在量（６１±０．６％）減少させた。リジンに類似して、Ｎ−アセチルアルギニンは、塩基性荷電バリアントの増加を引き起こす一方で、主要ピークを減少させる（図１４Ｃ）。しかしながら、Ｎ−アセチルアルギニンの効果は、リジンのものよりも着実でなく、細胞増殖（図１３Ｃ）または代謝プロファイルに影響しなかった。追加の２．０μＭのＣｕＳＯ４による補足に続いて、主要ピークの有意な増加および塩基性ピークの有意な減少が観察された（図１５Ｄ）。荷電バリアントのこれらの相対的量の変化も計算された（図１５Ｅ）（実施例４を参照）。
【０２９６】
この研究から、２．０μＭの追加のＣｕＳＯ４および１０ｍＭの追加のリジンは各々、灌流反応器中の荷電変動を調節するための有効な化学物質化合物として同定された。
【０２９７】
実施例４：灌流反応器中のＣｕＳＯ４による荷電変動調節
灌流反応器中での２５日の増殖に続いて、中空糸フィルターの灌流液側からの３０ｍＬの保持物を毎日取り出し、プロテインＡ精製および後続する荷電差異分析のために−８０℃で保存した。基本条件下での５日間（２５〜２９日目）の増殖に続いて、反応器中のＣｕＳＯ４の濃度を、栄養素ボーラスの添加を介して追加の２．０μＭのＣｕＳＯ４により即時で補足した。同時に、２．０μＭのＣｕＳＯ４の追加の濃度を含有する新しい培地バッグを、反応器を介して添付し、４日間潅流した。追加の２．０μＭのＣｕＳＯ４を導入して１日以内に、荷電変動プロファイルは新しい定常状態へ変化した。基本条件の荷電変動プロファイルに比較した場合に（主要：６８±０．５％、ｐ＜０．００１；塩基性：１４±０．３％、ｐ＜０．０５）、この新しい荷電変動状態は、主要ピークのより高い存在量（７２±０．３％）および塩基性ピークのより低い存在量（１１±０．３％）であった。これらの存在量の変化は、６％の主要ピークの相対的存在量の増加および１４％の塩基性ピークの相対存在量の減少に匹敵する（図１５Ｅ）。相対的存在量は、より高いＣｕＳＯ４濃度で観察された荷電バリアントと基本条件での荷電バリアントとの間の、基本条件での荷電バリアントに比べてパーセンテージとして表現された差である。この実験は、単一のバイオリアクターから２つの異なる荷電変動プロファイルを産生する能力を実証した。
【０２９８】
実施例５：灌流反応器中の２つの荷電変動の調節
単一の灌流反応器中で反対方向で荷電変動プロファイルを調節する能力を示すために、４つの交互ステップ変化：（ｉ）２．０μＭの追加のＣｕＳＯ４への増加、（ｉｉ）基本条件への復帰、（ｉｉｉ）１０ｍＭの追加のリジンへの増加、および（ｉｖ）基本条件への後続する復帰を遂行した。この実験の継続期間にわたって、中空糸フィルターの灌流液側からの３０ｍＬのサンプルを毎日引き抜き、ｍＡｂを精製し、荷電変動について分析した。定常状態値（荷電変動の平均によって決定されるような）を使用して、ステップ変化間の荷電変動の差を比較する。図１６Ａ〜１６Ｃは、酸性ピーク（図１６Ａ）、塩基性ピーク（図１６Ｂ）、および主要ピーク（図１６Ｃ）の各々についての経時的なパーセント面積の変化を示す。観察された変化を、後続する以下のパラグラフ中で詳細に記載する。
【０２９９】
２．０μＭのＣｕＳＯ４を灌流反応器へ捕捉することは、スイッチ前の定常状態（７１±０．５％、ｐ＜０．０００１）およびスイッチ後の定常状態（７１±０．２％、ｐ＜０．０００１）に比較した場合に、主要ピークの存在量（７４±０．２％）の有意な増加を引き起こした（図１７Ｂ）。加えて、主要ピーク存在量のこの変化は、スイッチ前の定常状態（１７±０．６％、ｐ＜０．０００１）およびスイッチ後の定常状態（１７±０．２％、ｐ＜０．０００１）に比較した場合に、酸性ピークの有意な減少（１５±０．３％）が付随した（図１７Ａ）。荷電変動におけるこれらの変化は、４％の主要ピークの相対的存在量の増加および８％の酸性ピークの相対的存在量の減少に匹敵する。塩基性ピークにおける実質的な変化は観察されなかった（図１７Ｃ）。ＣｕＳＯ４前とＣｕＳＯ４後の定常状態の荷電変動プロファイルとの間に有意差はなかったので、このデータは、ＣｕＳＯ４が可逆的様式で荷電変動を調節する能力を示す（図１７Ｄ〜１７Ｅ）。
【０３００】
１０ｍＭのリジンを灌流反応器へ捕捉することは、スイッチ前の定常状態（７１±０．２％、ｐ＜０．０００１）およびスイッチ後の定常状態（７０±０．２％、ｐ＜０．０００１）に比較した場合に、主要ピークの存在量（６４±０．２％）の有意な低減を引き起こした（図１８Ｂ）。加えて、１０ｍＭリジン補足に続いて塩基性ピークの存在量（２０±０．１％）は、スイッチ前の定常状態（１２±０．３％、ｐ＜０．０００１）およびスイッチ後の定常状態（１３±０．３％、ｐ＜０．０００１）に比較した場合に、有意に増加した（図１８Ｃ）。荷電変動におけるこれらの変化は、１０％の主要ピークの相対的存在量の減少および６２％の塩基性ピークの相対的存在量の増加に匹敵する。リジン前とリジン後の定常状態の荷電変動プロファイルとの間に有意差はなかったので、これらのデータは、リジンを使用して可逆的様式で荷電変動を調節できることを示す
【０３０１】
荷電変動における差を提示する例示的な電気泳動図を、図１９Ａ〜１９Ｄおよび２０中で示す。一般的に、ＣｕＳＯ４の効果は、主要ピーク（ｐＩ７．２）の塩基性側上の肩の発達によって明らかである（図１９Ｂ）一方で、リジンの効果は、主要ピーク（ｐＩ７．２）の低減および塩基性ピーク（特に７．５のｐＩのピーク）の発達により観察される（図１９Ｄ）。
【０３０２】
総合すると、これらのデータは、反対方向でのｍＡｂ品質属性の操作（すなわち化学物質１の添加による品質属性の存在量の増加に加えて、単一のバイオリアクター中の化学物質１の取り出し後の化学物質２の添加による同じ品質属性の存在量の減少）を実証する。
【０３０３】
実施例６：方法
この実施例において記載される方法を、本明細書において記載される実験（例えば実施例２〜５における）のために使用した。
【０３０４】
荷電変動分析のためのｍＡｂ精製
プロテインＡスピンカラムを使用して、産生されたｍＡｂを精製した。簡潔には、スピンカラムを、６００ｕＬの結合バッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）により最初に２回洗浄した。次いで４．８〜６．０ｍＬの灌流液を、６００ｕＬのアリコートで合計で８〜１０回の適用でプロテインＡスピンカラムへ適用した。結合に続いて、ｍＡｂを４００ｕＬの溶出バッファー（０．１Ｍのグリシン、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ３．５）の２回の添加により溶出し、６０ｕＬの１Ｍトリス、ｐＨ９．０の添加により中和した。後続して、各々のサンプル中のｍＡｂの濃度を以下のＨＰＬＣプロテインＡ方法論を用いて決定した。
【０３０５】
ＨＰＬＣプロテインＡのｍＡｂの定量化
ｍＡｂ定量化を、プロテインＡカラム（０．１ｍＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して達成した。方法は２つの移動相：（ｉ）結合バッファー（５０ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）および（ｉｉ）溶出バッファー（５０ｍＭのグリシン、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５）からなっていた。すべてにサンプルを、ＨＰＬＣ上への注入の前に結合バッファー中で１：１に希釈した。バッファーの流速は２ｍＬ／分で一定であった。各々のサンプルについてのＨＰＬＣ分析は、およそ２分間かかった。クロマトグラフィー法は以下の通りであった。最初の３０秒間１００％の結合バッファーをポンプで入れ、続いて、４６秒間１００％の溶出バッファー、次いで１４秒間１００％の結合バッファーにより再平衡化した。吸光度を２８０ｎｍの波長でダイオードアレイ検出器上で測定した。吸光度をｍＡｂの参照スタンダード調製物のスタンダードカーブに比較し、サンプル中のｍＡｂの量を計算した。
【０３０６】
荷電変動の分析
１５０ｕｇの精製されたｍＡｂを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ３０ｋＤａ分子量カットオフ遠心用フィルターへ添加し（三重で）、２０分間１４，０００ＲＣＦでの遠心分離によって体積２０〜３０μＬまで濃縮した。次いでこのサンプルを、１７５ｕＬのマスターミックス溶液（０．５％のメチルセルロース、２Ｍの尿素、１％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ  ｐＨ３〜１０、３％のＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ  ｐＨ６．７〜７．７、および５μＬ／ｍＬの以下のｐＩマーカー：５．８５、６．１４、８．１８）へ添加した。各々のサンプルを３０秒間高速でボルテックスで撹拌し、続いて、３分間９３００ＲＣＦで遠心分離した。次いで１５０μＬのサンプルを３００μＬの挿入物と共に２ｍＬバイアルの中へ移し、８℃で設定されたｉＣＥ  ３システムのオートサンプラーの中へ置いた。次いで荷電変動を、１５００Ｖで１分間の最初のフォーカスピリオド、続いて３０００Ｖで１１分間最終的なフォーカスピリオドにより測定した。
【０３０７】
データ分析および統計
電気泳動図をＥｍｐｏｗｅｒファイルとしてｉＣＥソフトウェアからエクスポートし、分析のためにＥｍｐｏｗｅｒへインポートした。電気泳動図中に存在するピークを積分し、各々のピークのパーセント面積を計算する、プロセシング方法をデザインした。これらの電気泳動図の各々について、７つのピークが、特に６．６、６．９、７．２、７．３、７．５および７．７のｐＩで、共通して観察された。面積によって、ｐＩ７．２での荷電バリアントが最も高いパーセント面積のバリアントを提示したので、主要ピークと判断された。分析のために、ｐＩ７．３、７．５および７．７でのバリアントは塩基性バリアントと判断されたが、６．６および６．９のｐＩのバリアントは酸性バリアントと判断された（例えば図２０中で示される例示的な電気泳動図を参照）。統計解析のために、これらのバリアントのそれぞれのパーセント面積の総計を一緒に加えて、ピーク面積の合計を得て、ピーク面積の合計と比べて各々のそれぞれの群のパーセント面積を計算した。次いでパーセント面積値を定常状態にわたって平均化し、平均を一般的に二元配置ＡＮＯＶＡ、続いてＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後解析を使用して比較した。
【０３０８】
実施例７：変動するガラクトシル化レベル
別の実施例において、上で記載される灌流装置を使用して、異なるガラクトシル化レベルを備えた産物の複数の画分を産生した。ガラクトシル化に対する効果を有する任意の栄養素を使用して、産物のガラクトシル化レベルに影響できることが意図される。この実施例において、ガラクトースを使用して、産物のガラクトシル化レベルに影響を及ぼした。反応器のガラクトース濃度を、不連続ステップ増加で０〜１０ｍＭの範囲中で調節した。次のステップ変化へ進行する前に、反応器中の産物のガラクトシル化を定常状態値に達するようにした。反応器の中へ供給されたガラクトース濃度は０、０．０１、０．０８６、０．７９および１０ｍＭであった。４６％、４６％、４６％、５２％および５８％の対応する定常状態ガラクトシル化値が達成された。図２１は、ガラクトース濃度のステップ増加および灌流装置中の経時的な産物パーセントガラクトシル化の対応する変化を示す。図２２は、指示されたタイムポイントで検出された反応器のガラクトース濃度をさらに重層する。例えばＤｏｗｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０１７  Ｎｏｖ；３３（６）：１６４７−１６６１（その全体は参照により本明細書に援用される）を参照されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
2020507336.tif 000049
【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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2020507336.tif 000067
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